(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターに機能可能に接続されたポリヌクレオチドであって、昆虫に対して経口的毒性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列を有するポリヌクレオチドの変異体であり、配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダイゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが10％w/vのPEG(ポリエチレングリコール、M.W.約8000)、7％w/vのSDS、0.6 x SSC、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、5mMのEDTA、及び100mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で60℃にて行われる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ハイブリダイゼーションにおける洗浄が68℃にて0.25ｘ SSC、0.2％ SDSで行われる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを発現させるトランスジェニック植物細胞。
【請求項５】
昆虫に対して経口的毒性を有する組換えタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号12および配列番号47からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であり、前記変異体をコードするヌクレオチドが配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダーゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが10％w/vのPEG(ポリエチレングリコール、M.W.約8000)、7％w/vのSDS、0.6 x SSC、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、5mMのEDTA、及び100mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で60℃にて行われる、前記タンパク質。
【請求項６】
ハイブリダイゼーションにおける洗浄が68℃にて0.25ｘSSC、0.2％ SDSで行われる、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項５に記載のタンパク質を与えることを含む、昆虫を防除する方法。
【請求項８】
タンパク質が昆虫の接近が可能なトランスジェニック植物によって産生され、前記トランスジェニック植物中に存在する、請求項7に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌から分離された毒素および殺虫剤としての当該毒素の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自家所有者、ピクニックにでかける人々、庭師、農業従事者、および作物への昆虫被害の結果によりその農作物における投資がしばしば壊滅または減少させられるその他の人々にとって、多くの昆虫は広く害虫と見做される。特に成育期間が短い地域では、栽培者にとって顕著な昆虫被害は全ての利益の喪失と作物収量の劇的な減少を意味する。特定の農産物の供給不足は、食品加工業者、続いて食用植物およびこれらの植物に由来する製品の最終消費者にとって常に高コストをもたらす。
作物および花舟への昆虫の被害の防止および厄介な害虫の排除は、典型的には強力な有機害虫駆除剤および広範な毒性を有する殺虫剤に依存する。これらの合成生成物は環境に対して、さらにそのような薬剤に曝される者に対してあまりに過酷であるということで公衆の攻撃を受けることとなった。非農業的状況においても同様に、自家所有者は、昆虫を自宅に寄せつけないことに、また戸外での食事に昆虫を殺す必要がないことに満足を覚えるであろう。
【０００３】
化学殺虫剤の広範囲な使用は、農業従事者、当該殺虫剤を製造する企業、政府機関、関心公衆団体および一般大衆に環境と健康上の懸念を惹起した。より侵襲性の少ない害虫制御方法は、社会の環境に対する懸念と、昆虫制御機構を解明する生物学的手段の進歩の両方によって促進された。生物学的制御剤は化学殺虫剤に対して有望な選択肢を提供する。
それぞれの進化発達段階で生物は、自分自身の存続と生存を強化する多様な手段を獲得する。防御と攻撃の手段として生物学的分子を使用することは動物界および植物界を通して知られている。さらに、遺伝子工学の比較的新しい手段によって生物学的殺虫剤の改変が可能になり、特定の問題に対して特定の解決が得られる。
【０００４】
そのような薬剤の１つ、Bacillus thuringiensis(Bt)は効果的な殺虫性薬剤であり、広く産業的に用いられている。実際、Ｂｔ細菌殺虫剤は限定された毒性を有するタンパク質であり、収穫した日に人間の食用作物として用いることができる。目標とされていない生物に対しては;このＢｔ毒素は消化可能な非毒性タンパク質である。
また別の既に知られている生物学的昆虫制御剤の類は、殺虫性細菌共生者の媒介動物として知られているある種の線虫類である。殺虫性細菌を含む線虫は昆虫の幼虫に侵入する。続いて細菌は幼虫を殺し線虫は幼虫の死体の中で増殖する。続いて線虫の子どもは体内から死体を食べる。このようにして生産された細菌含有線虫の子どもは続いて新たな別の幼虫に侵入することができる。
【０００５】
これまでにSteinernemaおよびHeterorhabditis属の殺虫性線虫が昆虫制御剤として用いられた。明らかに、線虫の各属は特定の細菌の宿主となる。Heterorhabditis属の線虫では、共生細菌はPhotorhabdus luminescensである。
これらの線虫は効果的な昆虫制御剤であるが、それは現時点では高価でさらに製造し、維持し、昆虫制御のために線虫を散布させることが困難である。
当技術分野では、ホトルハブダス ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)から殺虫性毒素を分離できることが知られている。この毒素は、鱗翅目および鞘翅目昆虫の幼虫に注入されたときにのみ活性を有する。このことが、線虫またはその共生細菌の殺虫性特性の効果的な開発を不可能にしている。大切なことは、散布後もその生物学的特性を保持する殺虫性毒素のより実際的で、非労働集約型の薬剤送達方法であろう。経口活性を有するPhotorhabdus属が産生する毒素を見つけることが強く所望される。これらの毒素の分離と使用は有効であるという理由から所望される。出願人らが発見するまで、これらの毒素は分離されたことがなく、また性状を調べられたこともなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
天然の毒素は、Photorhabdus属の増殖細菌細胞が産生し分泌するタンパク複合体で、特に興味のあるものはPhotorhabdus luminescens種が産生するタンパク質である。約１０００ｋＤａの分子量サイズをもつタンパク複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で多数の成分タンパク質に分離させることができる。この毒素はヘモリジン、リパーゼ、Ｃ型ホスホリパーゼまたはヌクレアーゼ活性を含まない。この毒素は、多数の昆虫に曝露投与したとき顕著な毒性を示す。
本発明は、投与が容易な殺虫性タンパク質とともに異種系における毒素の発現を提供する。
本発明はまた、多くの昆虫目に対して機能する活性をもちさらに効果的な殺虫性毒素の薬剤送達方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、異種プロモーターに機能可能に接続されたポリヌクレオチドであって、昆虫に対して経口的毒性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列を有するポリヌクレオチドの変異体であり、配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダイゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが25℃、３ｘ SSC、0.1％ SDS下において行われる、前記ポリヌクレオチド。本発明は、このようなポリヌクレオチドを含む、または発現させ得るトランスジェニック植物細胞でもある。
また、本発明は、昆虫に対して経口的毒性を有する組換えタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号12および配列番号47からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であり、前記変異体をコードするヌクレオチドが配列番号11および配列番号46からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダーゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが25℃、３ｘ SSC、0.1％ SDS下において行われる、前記タンパク質である。また、本発明は、このようなタンパク質を含む、または発現させ得るトランスジェニック植物細胞でもある。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の目的、利点および特徴は以下の明細書から明らかになるであろう。
本発明は、昆虫に対して経口毒性を有するPhotorhabdus属由来の極めて稀な殺虫性毒素類の発見を目的とする。Photorhabdusの固有の特性はその生物発光である。Photorhabdusは種々の起源から分離することができる。そのような起源の１つは線虫、より具体的にはHeterorhabditis属の線虫である。また別の起源は人間の創傷から得られる臨床サンプル由来である（Farmerら、J．Clin．Microbiol．27:1594-1600(1998)を例えば参照）。これらの死物寄生株はアメリカ菌培養収集所（ロックビル、メリーランド）に、ＡＴＣＣ＃４３９４８、４３９４９、４３９５０、４３９５２として寄託されており、この文献は参照により本明細書に含まれる。他のものも殺虫性毒素を産生するPhotorhabdus細菌を含む可能性があるだろう。環境中のそのような起源は陸性または水性由来のいずれでも可能であろう。
Photorhabdus属は、分類学的には腸内細菌科の菌と定義されるが、この科に関しては非定型的なある種の特徴を有する。例えば、この属の株は硝酸塩還元陰性、黄色および赤色色素産生性、並びに生物発光性である。この後者の特徴は腸内細菌科では知られてない。Photorhabdusは最近になってXenorhabdusとは別の属として記載された(Boemareら。、Int．J．Syst．Bacteriol．43:249-255(1993))。この相違は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験、表現型の相違（例えばカタラーゼおよび生物学的発光の有無(有（Photorhabdus）無(Xenorhabdus))、線虫宿主の種類（Xenorhabdus;(Steinernematidae)、Photorhabdus;(Heterorhabditidae)）を基にしている。細胞脂肪酸の比較分析(Janseら、Lett．Appl．Microbiol．10:131-135(1990);Suzukiら、J．Gen．Appl．Microbiol．36:393-401(1990))は、PhotorhabdusのXenorhabdusからの分離を支持する。
【０００９】
本明細書で開示する株収集がPhotorhabdusを含むことを確認するために、Photorhabdusと特定し、さらに他の腸内細菌科およびXenorhabdus種と区別するために認知されている特徴に基づいてこれらの株の性状を調べた（Farmer，Bergy's Manual of Systemic Bacteriology,１巻、510-511;Akhurst & Boemare，J．Gen．Microbiol．134:1835-1845(1988);Boemareら、Int．J．Syst．Bacteriol．43:249-255(1993)、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。調べた特徴は以下のとおりであった：グラム染色陰性桿菌、微生物のサイズ、コロニー色素沈着、封入体、カタラーゼの存在、硝酸塩還元能、生物学的発光、色素取り込み、ゼラチン水解、選択培地ので増殖、増殖温度、嫌気性条件下での生存および運動性。脂肪酸分析は、本明細書の株は全て単一のPhotorhabdus属に属することを確認するために用いた。
【００１０】
現在のところ、Photorhabdus属細菌は単一の限定された種、Photorhabdus luminescence（ATCC標準株#29999、Poinarら、Nematologica 23:97-102(1977)）を含む。種々の関連株が文献に記載された(Akhurstら、J．Gen．Microbiol．134:1835-1845(1988);Boerareら、Int．J．Sys．Bacteriol．43:249-255(1993);Putzら、Appl．Environ．Microbiol．56:181-186(1990)）。本明細書では多数の株の性状を調べた。そのような株は実施例の表１８に挙げた。現在のところPhotorhabdus属に規定されるのはただ１つの種（luminescence）のみであるので、luminescence種の特徴を本明細書の株の特徴として用いた。図５で分かるように、これらの株は極めて多様である。luminescence種の特徴の幾つかを有し、しかも現在のところPhotorhabdus luminescenceの特徴として認識されていないいくつかの異なる特質を有する他のPhotorhabdus種が将来出現することは予期せぬことではない。しかしながら、本発明の範囲は、それらの特徴および性状にもかかわらず、昆虫制御剤としての機能的活性を有するタンパク質を産生する一切のPhotorhabdus種または株を含む。
【００１１】
さらにまた、本明細書で具現するように、Photorhabdus属の細菌は、本明細書で規定するように機能的な活性を有するタンパク質を産生する。特に興味深いものは、Photorhabdus luminescence種によって産生されるタンパク質である。本明細書の発明はここに開示する株に全く限定されるべきではない。これらの株は、Photorhabdusの多様な分離株によって産生されるタンパク質は昆虫をこれに曝したとき有毒であることを初めて例証する。したがって、本発明に含まれるものは、本明細書で明らかにする特徴をもつ株およびその全ての変異株とともに、本明細書で開示する機能的活性を有するPhotorhabdus属の一切の株または種である。
【００１２】
特定の意味を有し本明細書で用いられるいくつかの用語があるが、それらは以下のとおりである。
本明細書では"機能的な活性"とは、該タンパク毒素が、経口的に活性であるか、または毒性効果を有しているか、または摂食を妨害させるか停止させて（昆虫の死を引き起こすか否かにかかわらない）、昆虫制御剤として機能することを意味する。昆虫が遺伝子導入植物の発現、製剤化タンパク組成物、噴霧可能タンパク組成物、毒餌マトリックスまたは他の薬剤送達系によってもたらされた有効量の毒素と接触するとき、典型的にはそめ結果は昆虫の死であるか、または昆虫は毒素を昆虫に利用させる元となる餌を食べることができない。
【００１３】
"Photorhabdus毒素"という用語を用いるとき、当該用語はPhotorhabdus微生物株によって産生される、昆虫に対して機能的な活性を有する一切のタンパク質を指すが、この場合、Photorhabdus毒素は噴霧可能な組成物として製剤化されるか、遺伝子導入植物によって発現されるか、毒餌マトリックスとして製剤化されるか、バキュロウイルスを介して分布させられるか、または他の利用可能な一切の宿主もしくは薬剤送達系を用いて分布させられる。
本明細書で考察されるタンパク毒素は典型的には"殺虫剤"と呼はれる。本明細書では"殺虫剤"とは、本明細書でさらに定義するように、タンパク質が"機能的な活性"を有し、昆虫制御剤として用いられることを意味する。
【００１４】
"オリゴヌクレオチド"という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの短い鎖から成る巨大分子を意味する。そのような鎖の長さは少なくとも１個のヌクレオチドであるが、典型的には約１０から１２ヌクレオチドの範囲である。オリゴヌクレオチドの長さの決定は当技術分野で周知で、本明細書で限定すべきものではない。したがって、オリゴヌクレオチドは１０未満でもよく、１２より大きくてもよい。
本明細書で用いられるように、"有毒"または"毒性"という用語は、Photorhabdusによって産生される毒素が、本明細書で定義するように"機能的な活性"を有することを意味する。
本明細書で用いられるように、"遺伝物質"とは全ての遺伝子、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意味する。
【００１５】
表１８で報告する選択株の醗酵ブロスを用いて、Photorhabdus属による殺虫性毒素産生の幅、これら毒素の殺虫スペクトルを決定し、さらに毒素複合体の精製のための出発材料が提供される。本明細書で性状を調べた株は昆虫の多様な目に対して経口毒性を有することが示された。そのような昆虫目には、Coleoptera、Homoptera、Lepidoptera、Diptera、Acarina、HymenopteraおよびDictyopteraが含まれるが、これらに限定されるものではない。
他の細菌毒素に関しては、この細菌の集団内の変異率は、現存の配列と僅かに異なる多くの関連毒素を生じる。本明細書で興味のある毒素は、本明細書で開示するように暴露に際して多様な昆虫に毒性を有するタンパク複合体を産生するものである。好ましくは、この毒素はColeoptera、Homoptera、Lepidoptera、Diptera、Acarina，HymenopteraおよびDictyopteraに対して活性を有する。本発明は、本明細書の株およびその一切の誘導株によって産生されるタンパク毒素とともに、Photorhabdusによって産生される全てのタンパク毒素と同種のタンパク毒素を包含することを意図する。これらの同種タンパク質は配列が異なるかもしれないが、本明細書で述べるこれらの毒素とは機能が異なることはない。同種毒素は３００ｋＤａから２０００ｋＤａの間のタンパク複合体を含み、さらに少なくとも２つのサブユニットを含むことが意図される。この場合、１つのサブユニットはペプチドで、他のサブユニットと同じでも異なっていてもよい。種々のタンパクサブユニットが同定され、本明細書の実施例で開示される。典型的には、該タンパクサブユニットは約１８ｋＤａから約２３０ｋＤａ、約１６０ｋＤａから約２３０ｋＤａ、約１００ｋＤａから１６０ｋＤａ、約８０ｋＤａから約１００ｋＤａ、および約５０ｋＤａから約８０ｋＤａである。
【００１６】
上記で考察したように、いくつかのPhotorhabdus株が線虫から分離された。幾つかの線虫（線虫門の細長い筒状の寄生虫）は、好ましい増殖環境として昆虫の幼虫を利用する能力を進化させた。昆虫の幼虫は、成長する線虫のために摂食源および増殖のための環境を提供する。ある種の線虫による幼虫の侵入に続く劇的な作用の１つは幼虫の死である。幼虫の死は、ある種の線虫では殺虫性毒素を産生する細菌の存在によって生じる。この毒素は幼虫の増殖を拘束し、摂食能力を抑制する。
興味深いことには、昆虫寄生線虫は、当該線虫との共生増殖のために固有の適応を示す特定の細菌種の宿主であるらしい。この研究を開始して暫くの間、細菌のXenorhabdusの呼称はXenorhabdusおよびPhotorhabdusに再分類された。
【００１７】
Photorhabdus属の細菌はHeterorhabditus線虫の共生細菌であるという性状を有し、一方、Xenorhabdus種はSteinernema種の共生細菌である。命名法に於けるこの変化は本明細書にも反映されているが、命名法におけるこの変化は、本明細書に開示する本発明の範囲に全く影響を与えない。
本明細書に開示するペプチドおよび遺伝子は、J．Bacteriology誌の"著者への指示(Instructions to Authors)"(i-xiiページ、1996年、１月)（この文献は参照により本明細書に含まれる）に最近発表されたガイドラインにしたがって名称を付与した。以下のペプチドおよび遺伝子がPhotorhabdus株Ｗ−１４から分離された。
【００１８】
【表１】
0003657593.tif 000002
（括弧内の配列はトリプシン消化で得られた内部アミノ酸配列を示す）
【００１９】
上記に挙げた配列はゲノム領域でグループ分けされている。ｔｃｂＡ遺伝子は、実施例で説明するように２つのタンパクフラグメントＴｃｂＡおよびＴｃｂＡiiiとして大腸菌で発現された。いくつかの配列をタンパク質分解によって切り取って、遺伝子導入用市販品のためにより高い活性をもつ毒素を得ることは有益であろう。
【００２０】
本明細書で開示する毒素は、当該毒素が機能的な活性（これが昆虫制御戦略の開発の鍵であるが）を有するという点において極めて特異的である。昆虫制御略の開発では、生物の消化管を避けて当該生物に直接タンパク質を注射してタンパク分解過程を遅らせまたは妨害することが可能である。そのような場合には、該生物に投与されるタンパク質は、変性、非特異的分解または高等生物の免疫系による排除までその機能を保持するであろう。殺虫性毒素の昆虫への注射は実験室でのみ応用が可能で、さらに容易に注射できる大型の昆虫について可能である。本明細書で開示する殺虫性タンパク毒素は、経口消化または毒素との接触後にその毒性活性を表すという観察は、該タンパク毒素を昆虫の餌に取り込ませることの可能性を専らあてにする昆虫制御計画の開発を可能にする。そのような計画の結果は昆虫の毒餌であろう。
【００２１】
Photorhabdusの毒素は昆虫に精製形で投与してもよい。この毒素はまた約１から約１００ｍｇ／リットルブロスの量で薬剤分布させてもよい。これは、製剤の条件、接種源の条件、毒素分離技術などにしたがって変動するであろう。この毒素は異種原核細胞または真核細胞宿主で初めに発現された滲出分泌物または細胞タンパク質として投与してもよい。細菌は、典型的には当該タンパク質が発現される宿主である。真核細胞宿主には植物、昆虫および酵母が含まれるが、これらに限られるものではない。また別にはこの毒素は、細菌により、または野外で遺伝子導入植物により、またはバキュロウイルスベクターにより昆虫で産生させてもよい。典型的にはこの毒素は、昆虫の餌に１種または２種以上の毒素を混ぜることによって昆虫に導入されるであろう。
【００２２】
摂食昆虫に対する完全致死率は有用であるが、有意義な毒性を達成するためには要求されない。もし昆虫が毒素を避けるかまたは摂食を中止するならば、たとえ毒素の効果が致死量以下であったとしてもこの回避行動は幾つかの応用例で有用であろう。例えば、昆虫耐性遺伝子導入作物植物を所望する場合、昆虫が当該植物を接触するのをためらうことは該昆虫に対する致死的毒性と同様に有用である。なぜならば、究極の目的は該植物の保護であって当該昆虫を死滅させることではないからである。
毒素を昆虫の餌に混ぜるために他の多くの方法がある。一例として、本明細書に開示したようにタンパク質溶液を噴霧して当該毒素タンパク質を幼虫の摂食源に混ぜることが可能である。また別には、精製タンパク質を無害な細菌に遺伝子工学によって導入し、続いてこれを培養して増殖させ、さらに摂食源に用いるかまたは該昆虫を撲滅しようとする地域の土壌に定着させる。また、該タンパク質を昆虫の摂食源に遺伝子工学的に直接導入することもできる。例えば、多くの昆虫の幼虫の主要な摂食源は植物成分である。
【００２３】
Photorhabdus毒素の殺虫特性をコードする遺伝成分を、特定の害虫が摂食する植物のゲノムに組み込むことによって、該摂食用植物を食べた後で成虫または幼虫は死滅するであろう。単子葉および双子葉に属する多くの植物が形質転換された。遺伝子導入農作物は果物および野菜とともに商業的に重要である。そのような作物にはトウモロコシ、コメ、ダイズ、カノラ（canola）、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、綿花、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれるが、これらに限られるものではない。外来遺伝成分を植物細胞に導入し、さらに該導入遺伝子を安定的に維持し発現させるためにはいくつかの技術がある。そのような技術には、微粒子上に被覆された遺伝物質の直接細胞導入の促進が含まれる（米国特許４９４５０５０号(Cornell)および同５１４１１３１号(DowElanco)）。植物はアグロバクテリウム関連技術を用いて形質転換できる（米国特許５１７７０１０号（University of Tpledo）、同５１０４３１０号(Texas A&M)、欧州特許出願公開公報第０１３１６２４Ｂ１号、欧州特許出願公開公報第１２０５１６号、同１５９４１８Ｂ１号および同１７６１１２号(Schilperoot)、米国特許５１４９６４５号、同５４６９９７６号、同５４６４７６３号および同４９４０８３８号、並びに同４６９３９７６号(Schilperoot)、欧州特許出願公開公報第１１６７１８号１２９０７９９号、３２０５００号(全てMaxPlanck)、欧州特許出願公開公報第６０４６６２号および６２７７５２号（Jaapan Tobacco）、欧州特許出願公開公報第０２６７１５９号および０２９２４３５号並びに米国特許５２３１０１９号（全てCiba Geigy）、米国特許５４６３１７４号および４７６２７８５号(ともにCaigene）、米国特許５００４８６３号および５１５９１３５号(ともにAgracetus)を参照のこと）。他の形質転換技術にはウィスカー（Whiskers）の技術（米国特許５３０２５２３号および５４６４７６５号（ともにZeneca）を参照のこと）が含まれる。電気穿孔術（Electroporation technology）もまた植物の形質転換に用いられた（ＷＯ８７／０６６１４号（Boyce Thompson Institute）、同５４７２８６９号および５３８４２５３号（ともにDekalb）、ＷＯ９２０９６９５号およびＷＯ９３２１３３５号(ともにPGS)を参照のこと）。
【００２４】
これらの形質転換に関する特許および刊行物は参照により本明細書に含まれる。植物を形質転換させる多くの技術だけでなく、外来遺伝子と接触する組織の種類も同様に変化をもたせることができる。そのような組織には胎児性組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、ヒポコチル、メリステムなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。ほとんど全ての植物組織は、当技術分野の適切な技術を用いて分化中に形質転換させることができる。
また別の変動因子は、選別マーカーの選択てある。具体的マーカーとして何を選択するかは当業者の自由裁量であるが、以下の選別マーカーのいずれも使用することができ、さらに、本明細書に挙げられていない選別マーカーとして機能しえる他の何れの遺伝子も用いることができる。そのような選別マーカーには、トランスポゾンＴｎ５（ＡｐｈＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（これは、抗生物質（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８）に対する耐性をコードする）とともに、グリホセート；ヒグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノスリシン（ビアロホス）；イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン除草剤（例えばクロロスルフロン）；ブロモキシニル、ダラポンなどに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
選別マーカーの他に、レポーター遺伝子を用いることが望ましい。いくつかの例では、選別マーカーを使用しないでレポーター遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子は、受容生物または組織には典型的には存在しないかまたは発現されない遺伝子である。レポーター遺伝子は典型的には、何らかの表現型の変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は文献に記載されている（K．Weisingら、Ann．Rev．Genetics 22:421(1988)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。好ましいルポーター遺伝子はグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である。
形質転換技術に関係なく、植物プロモーターをベクターに包含させることによって植物細胞でPhotorhabdus毒素を発現できるように適応させた遺伝子伝達ベクターに好ましくは当該遺伝子を取り込ませる。植物プロモーターの他に、種々の起源のプロモーターが、外来遺伝子を発現させるために植物細胞で有効に用いられる。例えば、細菌由来のプロモーター（例えばオクトピンシンセターゼプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、マンノピンシンセターゼプロモーター）、ウイルス由来プロモーター(例えばカリフラワーモザイクウイルス(３５Ｓおよび１９Ｓ))などを用いることができる。植物プロモーターには、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーターおよび組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限られるものではない。プロモーターはまた、転写効率を改良することができるある種のエンハンサー配列成分を含むことができる。典型的なエンハンサーにはＡｄｈ−イントロン１およびＡｄｈ−イントロン６が含まれるが、これらに限定されない。構成的プロモーターも用いることができる。構成的プロモーターは、全ての細胞型で常に連続的な遺伝子発現を誘導する（例えばアクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターも例えば葉または種子のような特定の細胞または組織型での遺伝子発現をもたらし（例えばゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ）、これらのプロモーターもまた使用できる。プロモーターは、植物組織および器官で活性を有するのと同様に植物の発育時の一定段階でもまた活性を有する。そのようなプロモーターの例には花粉特異的、胎児特異的、トウモロコシの穂の毛特異的、綿花繊維特異的、根特異的、種子エンドスパーム(endosperm)特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ある種の環境下では、誘導可能なプロモーターを用いることが望ましいであろう。誘導可能なプロモーターは、特異的シグナル（例えば生理的シグナル（熱ショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物およびストレス）に反応して遺伝子の発現をもたらす。植物で機能する他の望ましい転写および翻訳成分も用いることができる。植物特異的な多くの遺伝子伝達ベクターが当技術分野で知られている。
さらに、植物で細菌遺伝子の高い発現を得るためには、細菌遺伝子が植物の細胞質でより効果的に発現するようにそれらを再操作することが好ましいことが知られている。トウモロコシは、形質転換の前に細菌遺伝子を再操作して植物での毒素の発現レベルを高めることが好ましい植物の１つである。再操作の理由の１つは、天然の細菌遺伝子のＧ＋Ｃ含有量が極めて低い（Ａ＋Ｔ含有量が高いという結果になる）ということである。この結果は、Ａ＋Ｔが極めて豊富であることが知られている植物遺伝子制御配列を模倣するまたは複製する配列の作製であろう。植物内に導入される遺伝子のＤＮＡ内にＡ＋Ｔに富むいくつかの配列（例えば遺伝子プロモーターに通常見出されるＴＡＴＡボックス領域）が存在するということは、遺伝子の異常な転写をもたらす可能性がある。他方、転写ｍＲＮＡに存在する他の調節配列（例えばポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＵＡＡＡ）または前駆体ｍＲＮＡのスプライシングに必要な小型の核ＲＮＡ）の存在は、ＲＮＡの不安定性につながるかもしれない。したがって、再操作した細菌遺伝子デザイン（より好ましくは植物最適化遺伝子と称される）の目標の１つは、より高いＧ＋Ｃ含有量をもつＤＮＡ配列、および好ましくは代謝酵素をコードする植物遺伝子のそれに近いものを作製することである。植物最適化遺伝子のデザインのまた別の目標は、Ｇ＋Ｃ含有量が高いというだけでなく、その配列変化を修飾（変更）することによって翻訳を妨げないＤＮＡ配列を作製することである。
【００２７】
高Ｇ＋Ｃ含有量を有する植物の例はトウモロコシである。下記の表は、Ｇ＋Ｃ含有量がトウモロコシでどのように高いかを示している。トウモロコシの場合のように、他の植物のＧ＋Ｃ含有量もまた高いと考えられる。
【００２８】
【表２】
表１．
0003657593.tif 000003
a 遺伝子類の数は括弧内に示す。
b 標準偏差は括弧内に示す。
c 統合群の平均は全体の平均の計算では無視した。
【００２９】
表１のデータについては、遺伝子のコード領域はGenBank(レリース71)の登録から抽出し、塩基組成はマックベクター（登録商標）プログラム(MacVectorTM，IBI，New Haven，コネチカット)を用いて計算した。イントロン配列は計算では無視した。Ｉ群およびＩＩ群の貯蔵タンパク遺伝子配列はそれらの塩基組成における顕著な相違で区別した。
遺伝暗号の余剰性（すなわちいくつかのアミノ酸は１つ以上のコドンによって特定される）によって許容される柔軟性のゆえに、異なる生物または異なる種類のゲノムの進化は余剰コドンの異なる用い方をもたらした。この"コドンの偏り"はタンパクコード領域の平均塩基組成に現れる。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含有量をもつ生物は余剰コドンの第三位にＡまたはＴを有するコドンを利用し、一方、高いＧ＋Ｃ含有量をもつものは第三位にＧまたはＣを有するコドンを利用する。遺伝子のｍＲＮＡ内に"マイナー"コドンが存在することによって、特に該マイナーコドンに対応する稼働ｔＲＮＡの相対的なゆとりが低い場合は当該ｍＲＮＡの絶対翻訳率が低下すると考えられる。これを拡大すれば、個々のマイナーコドンによる翻訳率の低下は、多数のマイナーコドンについて少なくとも累積的であるということである。したがって、マイナーコドンの含有量が比較的高いｍＲＮＡはそれに対応して翻訳率が低いであろう。この翻訳率は、該当コードタンパク質の低レベルの合成によって体現される。
【００３０】
細菌遺伝子の再操作のために植物のコドンの偏りを決定する。コドンの偏りは、植物がそのタンパク質をコードするために用いる統計的コドン分布である。この偏りを求めた後で対象遺伝子のコドンの％頻度を求める。植物が好んで用いる主要コドンが、第二および第三の好ましいコドンとともに求められるべきであろう。対象タンパク質のアミノ酸配列を逆に翻訳し、その結果、生じた核酸配列が天然の細菌遺伝子と同じタンパク質をコードするが、生じた核酸配列は所望の植物の第一の好ましいコドンに対応するようにした。新規な配列は、変更によってつくり出された制限酵素部位に関して分析される。さらに第二または第三の好ましい選択コドンで当該コドンを置換することによって、この特定した部位を変更する。対象遺伝子の転写または翻訳に影響を与える配列内のその他の部位は、エクソン：イントロン５'または３'結合部、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルである。さらにこの配列を分析し、ＴＡまたはＧＣ対の頻度を減少させるために修飾する。これらの対の他に、約４つ以上の同じ残基を有するＧまたはＣ配列ブロックも当該配列の転写に影響を与える。したがって、これらのブロックもまた第一または第二の選択コドンなどをその次に好ましい選択コドンで置換することによって変更される。好ましくは、この植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、約２２％から約３７％の第二の選択コドンを、さらに１５％から０％の第三の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。最も好ましくは、植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、少なくとも約２２％の選択コドンを、約７．５％の第三の選択コドンを、さらに約７．５％の第四の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。上記に述べた方法は、当業者が、特定の植物にとって外来性である遺伝子を修飾し、その結果該遺伝子を植物内で最適に発現させることを可能にする。本方法は、現在審査中の条件付き米国特許出願６０／００５４０５号（1995年10月13日出願、この文献は参照により本明細書に含まれる）でさらに詳述されている。
【００３１】
したがって、植物最適化遺伝子をデザインするために、形質転換される特定の植物についての遺伝子ＤＮＡ配列に関して編集したコドンの偏り表から確定した非余剰性遺伝暗号を用いて、該毒素のアミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳する。得られたＤＮＡ配列（これはコドンの用い方においては完全に均質である）をさらに修飾して、より高いコドンの多様性を有するという他に、計画的な制限酵素部位の配置、所望の塩基組成、および遺伝子の転写または生成ｍＲＮＡの翻訳に干渉するおそれのある配列の除去を図る。
細菌遺伝子がプラスチドで発現される場合には、該細菌遺伝子はもっと容易に植物で発現されるであろうという学説がある。したがって、遺伝子を植物発現に最適にすることなく細菌遺伝子を植物で発現させ、タンパク質の高発現を得ることは可能かもしれない（例えば米国特許４７６２７８５号、５４５１５１３号および５５４５８１７号を参照のこと、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３２】
商品として遺伝子導入植物を開発するための課題の１つは耐性の管理である。これはBacillus thuringiensis毒素に関して特にいえる。商業的にBacillus thuringiensisを開発している企業は多く、耐性Ｂｔ毒素に関してはこれまで懸念が多かった。昆虫の耐性に関する管理についてのこれまでの戦略はPhotorhabdusによって産生される毒素を例えばＢｔのような草食性昆虫タンパク毒素(Ciba Geigy)または他の毒素と混ぜることであろう。噴霧可能なようにこの組み合わせを製剤化するか、または分子として組み合わせることができるであろう。植物は、昆虫毒素を産生するPhotorhabdus遺伝子および他の昆虫毒素遺伝子(例えばＢｔ)で形質転換できるであろう。
欧州特許出願公開公報第０４００２４６Ａ１は、２種のＢｔ（この２種の遺伝子は何でもよい）による１つの植物の形質転換を開示する。１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む遺伝子導入植物を製造するまた別の方法は、各植物が１つの昆虫耐性遺伝子を含む２種の植物を製造することである。これらの植物を慣習的な交配技術を用いて戻し交配し、１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む植物を製造する。
【００３３】
植物最適化遺伝子を含む形質転換植物の製造に加えて、細菌遺伝子の再操作にとって望ましいと思われる他の薬剤送達系が存在する。同じように摂食源として昆虫誘因性をもつ分子と毒素の殺虫活性とを融合させた、遺伝学的に操作して容易に分離可能なタンパク毒素を作出し、標準的で周知の技術を用いて細菌または真核細胞で発現させることができる。研究室で精製した後、"はめ込み式"毒餌を含むそのような毒素薬剤は標準的な昆虫補足用ハウジングに梱包できる。
別の薬剤送達系はバキュロウイルスベクターに毒素の遺伝物質を取り込ませることである。バキュロウイルスは、特定の昆虫宿主（Photorhabdus毒素の好ましい標的である昆虫を含む）に感染する。Photorhabdus毒素の発現構築物を含む感染性バキュロウイルスを昆虫被害地域に導入し、それによって感染昆虫を毒で汚染させる。
【００３４】
殺虫特性の伝達には、タンパク発現ベクターに組み込まれたPhotorhabdus毒素のアミノ酸配列をコードする核酸配列が必要である。当該ベクターはそれが生存する宿主にとって適切なものでなければならない。殺虫特性を有するタンパク質をコードする核酸配列を得る方法の１つは、毒素のアミノ酸配列（その大部分は下記で詳述する）から推定される情報を用いて、Photorhabdusから該毒素を産生する天然の遺伝物質を分離することである。下記で説明するように、毒素活性をもたらすタンパク質を精製する方法もまた開示する。
下記に述べるようにＮ−末端アミノ酸情報を用いて、当該毒素の最初のアミノ酸をコードするＤＮＡ塩基の全て（または部分）に対して相補的なオリゴヌクレオチドを構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドを放射能標識して、Photorhabdus株から分離した遺伝物質から構築したゲノム遺伝子ライブラリーから当該遺伝物質を分離するために分子プローブとして用いることができる。この遺伝子ライブラリーは、プラスミド、コスミド、ファージまたはファージミドベクターでクローニングできる。このライブラリーで大腸菌を形質転換し、毒素に対して作製した抗体または昆虫毒素のための直接アッセイを用いて、形質転換細胞による毒素産生についてスクリーニングすることができるであろう。
【００３５】
このアプローチはオリゴヌクレオチド一式の産生を必要とする。なぜならば、縮退遺伝暗号のために、１つのアミノ酸は数個の３ヌクレオチドの組み合わせによってコードされえるからである。例えば、アミノ酸のアルギニンは核酸トリプレット、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＧＧによってコードされえる。どのトリプレットが毒素遺伝子のその位置で用いられるかを予想することはできないので、可能性のあるトリプレットの各々を用いてオリゴヌクレオチドを調製する必要がある。経口毒素を完成させるために必要なタンパクサブュニットの全てを回収するためには、１つのタンパクサブユニットに対応する１つ以上のＤＮＡ分子が、充分な数のオリゴヌクレオチドプローブを構築するために必要であろう。
【００３６】
精製タンパク質のアミノ酸配列から、毒素の生産に必要な遺伝物質は容易に分離することができ、さらに分子生物学の技術分野で習熟した者にとって周知のいくつかの技術の何れかを用いて発現ベクターに全体または部分をクローニングすることができる。典型的な発現ベクターはＤＮＡプラスミドであるが、コスミド、ファージミドおよびファージを含む（ただしこれらに限定されない）他の伝達手段もまた用いることができる。ブラスミドの複製のために必要なまたは望ましい特性(例えは複製起点および抗生物質耐性または他の形態の選別マーカー(例えばStreptomyces hygroscopicusまたはViridochromogenesのｂａｒ遺伝子))に加えて、タンパク発現ベクターは通常発現カセットを必要とする。これは、対象の遺伝子の転写および翻訳に必要なｃｉｓ−作動性配列を含んでいる。原核細胞での発現に必要なｃｉｓ−作動性配列は、真核細胞および植物で必要とされるものとは異なっている。
【００３７】
真核細胞発現カセットは、対象の遺伝子に対して上流（５'）に転写プロモーター、転写終結領域（例えばポリＡ付加部位）および対象の遺伝子の最初のコドンの上流にリボソーム結合部位を必要とする。細菌細胞の場合にベクターに含むことができる有用な転写プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合プロモーターである。本明細書で先に述べたように、プロモーターはｍＲＮＡの転写を効果的に促進することが知られている。また対象の遺伝子から上流に、該ベクターはシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができるが、これは、宿主細胞の特定の部分（例えば細胞表面）に共有結合によって連結されたタンパク質を誘導することが分かっている。
昆虫ウイルスまたはバキュロウイルスは、ある種の昆虫に感染または悪い影響を与えることが知られている。昆虫に対するウイルスのこの影響は緩徐で、ウイルスは昆虫の摂食を停止させない。したがって、ウイルスは害虫制御剤として有用なようには見えない。Photorhabdus毒素遺伝子をバキュロウイルスベクターに結合させることによって、ウイルスの致死性を高めながら当該毒素を伝達する有効な方法が提供される。さらに、異なるバキュロウイルスは異なる昆虫に対して特異性を有するので、特定の毒素を用いて特定の害虫を選択的に標的とすることが可能である。該毒素遺伝子に対して特に有用なベクターは核多角体病ウイルスである。このウイルスを用いる伝達ベクターは既に記載され、外来遺伝子を昆虫に伝達するために選択されるベクターとなっている。ウイルス−毒素遺伝子リコンビナントは、経口的に伝達可能な形態として構築できる。通常、バキュロウイルスは中腸の腸管粘液を介して昆虫に感染する。強力なウイルスのコートタンパクプロモーターの後ろに挿入された毒素遺伝子は発現されて迅速に感染昆虫を殺すであろう。
【００３８】
昆虫ウイルスもしくはバキュロウイルスまたは本発明のタンパク毒素のための遺伝子導入植物による薬剤送達系の他に、このタンパク質は、例えば米国特許４６９５４５５号、４６９５４６２号、４８６１５９５号（ただしこれらに限定されない）（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）のBacillus thuringiensis被包化技術を用いて被包化できる。本発明のタンパク毒素のまた別の薬剤送達系は毒餌マトリックスへの該タンパク質の製剤化である。この製剤は続いて地上または地下昆虫毒餌ステーションで用いることができる。そのような技術の例にはＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２３９８９号（この文献は参照により本明細書に含まれる）が含まれるが、ただしこれに限定されない。
上記で述べたように、当該タンパク質を本来の宿主ではない宿主で発現させる場合は、該タンパク質をコードする配列を変更することが必要となるかもしれない。なぜならば、他の宿主で好んで使用されるコドンはPhotorhabdusの場合と異なる可能性があるからである。そのような場合には、該コード配列に対して埋め合わせとなる変更が行われないかぎり、新しい宿主での翻訳は極めて効率が悪いであろう。さらに、新しい宿主のタンパク質との抑制性交差反応を避けるために、または新しい宿主での該タンパク質の殺虫特性を高めるために、アミノ酸配列に対する変更が望ましいであろう。遺伝子的に修飾された毒素遺伝子は、例えば毒性強化もしくは低下、昆虫の耐性発達の変化、安定性の変化または標的種特異性の変化を示す毒素をコードするかもしれない。
【００３９】
該毒素をコードするPhotorhabdus遺伝子の他に、本発明は、該毒素タンパク質と相同なアミノ酸バイオポリマーをコードし、さらに経口消化の後で昆虫種においてPhotorhabdusタンパク質の毒性効果を保持する関連核酸配列を含むことを意図する。
例えば、本発明で用いられる毒素は、結果として死がもたらされる前に先ず幼虫の摂食を抑制するように思える。Photorhabdus毒素の核酸配列またはその制御配列を操作することによって、毒素遺伝子を植物に配置した遺伝子工学技術者は、例えば摂食抑制活性を保ち、その一方で幼虫に対する絶対的な毒性を取り除くために当該タンパク質の能力またはその作用態様を調節することができるであろう。この変化によって、全ての標的昆虫を根絶させるという環境系に対する不必要で劇的な影響を与えることなく、形質転換植物が収穫まで残存することが可能となろう。該毒素をコードする遺伝子のそのような変更の全て、または該遺伝子によってコードされるタンパク質のそのような変更の全てか本発明の範囲内に包含される。
【００４０】
包含される他の核酸の変更には、該毒素の有効性を改善するために昆虫の幼虫の特定の部分に毒素を誘導するために照準用配列を付加することが含まれる。
ＡＴＣＣ５５３９７、４３９４８、４３９４９、４３９５０、４３９５１、４３９５２株はアメリカ菌培養収集所(12301，Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA)に寄託された。Ｗ−１４天然毒素(ATCC55397)のアミノ酸および核酸配列データは下記に提示する。毒素のゲノムＤＮＡの細菌宿主からの分離は本明細書で例証する。
標準的技術および分子生物的技術を用い、さらにそれらは本明細書で開示される。更なる情報は、分子クローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバー研究所出版部(J．Sambrook，E.F．Fritsch & T．Maniatis(1989))で見出される（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
以下の略語は実施例を通して用いられる：Ｔｒｉｓ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸；ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド；Ｘ−ｇａｌ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド；ＣＴＡＢ＝臭化セチルトリメチルアンモニウム；ｋｂｐ＝キロ塩基対；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｉ＝それぞれアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイノシンの２'−デオキシヌクレオシド５'−三燐酸塩；ＡＴＰ＝アデノシン５'三燐酸塩。
【００４１】
【実施例】
実施例１ P．lumlnescens由来毒素の精製と精製毒素の経口的薬剤送達後の毒性の証明
本発明の殺虫性タンパク毒素は、P．luminescensＷ−１４株（ATCC Access #55397）から精製された。P．luminescensのストック培養を１．５％寒天に２％プロテオースペプトン＃３（すなわちＰＰ３、Difco Laboratories，デトロイト、ミシガン）を含むペトリ皿で２５℃で保温し毎週継代して維持した。細菌の一次形態コロニーを１リットルフラスコ中の０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（トゥイーン６０、Signla Chemical Company，セントルイス、ミズーリ）補充２００ｍｌのＰＰ３ブロスに摂取した。回転シェーカーで３０℃で７２時間ブロス培養を増殖させた。毒素タンパク質をトゥイーンの非存在下または存在下で増殖させた培養から回収することかできる。しかしながらトゥイーンの非存在下では増殖細菌の形態および該細菌によって産生されるタンパクプロフィールは影響を受ける。トゥイーンの非存在下では、種々のシフトが生じ、少なくとも特定された１つの毒素サブユニットの分子量に関するかぎり約２００ｋＤａから約１８５ｋＤａへとシフトする。
【００４２】
この７２時間培養を１００００×ｇで３０分遠心して細胞と残屑を除去した。殺虫活性を含む上清分画を傾けて流し出し、適切な容量の１．０ＭのＫ2ＨＰＯ4を添加して５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4とする。水酸化カリウムを添加してｐＨを８．６に調整した。続いてこの上清分画を、５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル(Pharmacia LKB Biotechnology)と混合した。この毒性活性をＤＥＡＥ樹脂に吸着させた。続いてこの混合物を２．６×４０ｃｍカラムに注入し、５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4で室温で流速３０ｍｌ／時間で洗浄して、溶出液を安定した２８０ｎｍＵＶ吸収基準ラインに到達させた。続いて溶出液が再び安定した２８０ｎｍ基準ラインに達するまでカラムを１５０ｍＭ ＫＣｌで洗浄した。最後にカラムを３００ｍＭ ＫＣｌで洗浄し、分画を採集した。
【００４３】
毒素を含む分画を集め、０．２ミクロン孔の膜フィルターを用いて濾過滅菌した。続いて毒素を濃縮し、さらに分子量カットオフが１００ｋＤａの限外濾過膜（Centriprep 100，Amicon Division-W.R．Grace and Company）を用いて４℃で１００ｍＭ ＫＰＯ4（ｐＨ６．９）に平衡化した。毒素濃縮物の３ｍｌを２．６×９５ｃｍのセファシルＳ−４００ＨＲゲル濾過カラム（Pharmacia LKB Biotechnology)の上部に積載した。溶離液は１００ｍＭＫＰＯ4（ｐＨ６．９）で、これを１７ｍｌ／時間の流速で４℃で流した。溶出液を２８０ｎｍでモニターした。
分画を集め毒素活性について調べた。クロマトグラフィーの分画の毒性をManduca sextaの幼虫を用いて生物学的アッセイで調べた。分画を直接昆虫の食餌（マイマイガ用コムギ麦芽餌、ICN Biochemicals Division-ICN Biomedicals，Inc.）に適用するか、または第４もしくは第５齢幼虫の第一前肢から５μｌのサンプルを３０ゲージ注射針を用いて血体腔注射によって投与した。処置群の各幼虫の体重は２４時間間隔で記録した。昆虫が摂食を停止し、処置した昆虫餌を消費し数日以内に死んだ場合、または分画を注射して２４時間以内に死んだ場合に毒性があったと推定した。
【００４４】
毒性分画を集め、Centriprep-100を用いて濃縮し、続いて７．５ｍｍ×６０ｃｍのＴＳＫ−ＧＥＬＧ−４０００ＳＷゲル透過カラムを用い１００ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ６．９）溶離液を０．４ｍｌ／分で流しながらＨＰＬＣで分析した。この分析によって、毒素タンパク質は約３３．６分の保持時間でカラムから溶出する単一のシャープなピークに含まれることが明らかにされた。この保持時間は概算分子量１０００ｋＤａに相当する。ピーク分画を更なる精製のために集め、一方このタンパク質を含まない分画は廃棄した。ＨＰＬＣから溶出したピークは２１８および２８０ｎｍでＵＶ光を吸収したが４０５ｎｍでは吸収しなかった。４０５ｎｍの吸収は、ゼノラブジン(xenorhabdin)抗生物質化合物の属性であることが示された。
集めたピーク分画の非変性アガロースゲル(Metaphor Agarose，FMC BioProducts)での電気泳動によって、２つのタンパク複合体が当該ピークに存在することが示された。このピーク材料（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）を、１．５％アガロースの積載用ゲル（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）および１．９％アガロースの解析用ゲル（２００ｍＭトリスーホウ酸塩（ｐＨ８．３）で緩衝）で標準的緩衝液条件（陽極緩衝液１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）;陰極緩衝液０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン）下で分離した。フェノールレッドの追跡用色素がゲル端に達するまで、ゲルに１３ｍＡの定常電流を１５℃で流した。クマシーブリリアントブルー染色を用いて２本のタンパクバンドをアガロースゲルで可視化させた。
【００４５】
より遅く移動するバンドを"タンパクバンド１"と呼び、より速く移動するバンドを"タンパクバンド２"と呼んだ。２本のタンパクバンドはほぼ等量で存在した。クマシー染色アガロースゲルは、ゲルの未染色部分から２本のタンパクバンドを正確に切り出すためのガイドとして用いた。タンパクバンドを含む切り出した細片をふやかし、少量の滅菌水を加えた。コントロールとして、タンパク質を含まないゲルの一部分もまた切り出し、タンパク質を含むゲルと同じ態様で処理した。１００ｍＭトリス−ホウ酸塩（ｐＨ８．３）に１００ボルト（定常電圧）で２時間電気泳動してゲル片からタンパク質を回収した。また別に、タンパク質は、等容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）をゲル片に加え、続いて３０℃で１６時間保温することによってゲル片から受動的に溶出させた。これによってタンパク質は緩衝液中に拡散させられ続いてこのタンパク質を採集した。
【００４６】
ＨＰＬＣ精製毒素（３３．６分ピーク）およびアガロースゲル精製毒素を用いた昆虫毒素テストの結果は抽出物の毒性を明示した。１．５μｇのＨＰＬＣ精製タンパク質の注射は２４時間以内の死亡をもたらした。アガロースから受動的溶出または電気泳動溶出で回収したタンパクバンド１および２は両方とも注射では致死的であった。これらのサンプルについての概算タンパク質濃度は５０ｎｇ／幼虫未満であった。タンパクバンド１または２を注射された幼虫群間での体重増加と死亡率の比較によって、タンパクバンド１は注射による送達ではより毒性が強いことが示された。
ＨＰＬＣ精製毒素を幼虫の餌に７．５μｇ／幼虫の濃度で適用したとき、幼虫の体重増加の停止をもたらした（調べた２４匹の幼虫で）。幼虫は摂食を始めたが、毒素処理餌の極めて少しの部分を消費した後、幼虫は毒素によって誘発された病理兆候を示し始め、摂食を停止した。昆虫の糞粒は変色し、大半の幼虫は下痢の症状を示した。７−１０日間にわたって餌にそれぞれ５μｇ毒素を適用したとき有意の死亡率が得られた。
【００４７】
アガロース分離タンパクバンド１は、２００ｎｇ／幼虫の投与量で顕著に幼虫の体重増加を抑制した。同様な濃度のタンパクバンド２を与えた幼虫では抑制されず、コントロールの幼虫と同じ率で体重は増加した。１２匹の幼虫には溶出タンパク質を与え、４５匹の幼虫にはタンパク質含有アガロース片を与えた。これら２組のデータは、タンパクバンド１はManduca sextaに対して経口的に毒性を有することを示した。この実験では、タンパクバンド２はManduca sextaには毒性をもたないようであった。
変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパクバンド１および２の更なる分析によって、各バンドはいくつかのより小さなタンパクサブユニットを含むことが示された。タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色で可視化し、その後最大の感度を達成するために銀染色を施した。
【００４８】
２本のバンドのタンパクサブユニットは非常に類似していた。タンパクバンド１は８個のタンパクサブユニット（２５．１、５６．２、６０．８、６５．６、１６６、１７１、１８４および２０８ｋＤａ）を含む。タンパクバンド２は、２５．１、６０．８および６５．６ｋＤａタンパク質が存在しないという点を除いて同一のプロフィールを有していた。５６．２、６０．８、６５．６および１８４ｋＤａタンパク質がタンパクバンド１の複合体中にほぼ等しい濃度で存在し、当該複合体の全タンパク質含有量の８０％またはそれ以上を占めていた。
天然のＨＰＬＣ精製毒素をさらに以下のように性状を調べた。毒素は易熱性で、６０℃（２５０゜F）で１５分加熱した後、M．sextaの幼虫に注射または餌として与えたとき死亡させまたは体重増加を抑制させるその能力を失った。リパーゼ、Ｃ型ホスホリパーゼ、ヌクレアーゼ、または赤血球細胞溶血活性を検出するためにアッセイをデザインし、精製毒素を用いて実施した。これらの活性のいずれも存在しなかった。抗生物質ゾーン抑制アッセイもまた実施した。精製毒素はグラム陰性もしくは陽性細菌、酵母または糸状菌の増殖を抑制することができなかった。このことはこの毒性はゼノラブジン抗生物質ではないことを示唆している。
天然のＨＰＬＣ精製毒素を、M．sexta以外の昆虫を殺す能力について調べた。表２では、この実験でＨＰＬＣ精製P．luminescens毒素によって殺される昆虫が列挙されている。
【００４９】
【表３】
表２．P. luminescens毒素により死亡する昆虫
0003657593.tif 000004
【００５０】
実施例２殺虫剤の効用
Photorhabdus luminescensの効用及び毒性を、更に特徴づけた。Photorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスは、下記に従って調製した。生産培地は、ミリ-Q（登録商標）脱イオン水を溶媒とする、２％バクト・プロテオース・ペプトン（登録商標）#3（PP3、ディフコラボラトリー社、デトロイト、ミシガン）であった。播種培養フラスコは、デロング(Delong)首を備えた500mlの３枚板（tribaffie）フラスコ中の培地175mlからなり、カプット(Kaput)で覆い、温度121℃(250゜F)で、20分間高圧滅菌した。生産フラスコは、デロング首を備えた500mlの３枚仕切り板フラスコ中の2.8リットル中50mlからなり、シンエツ(Shinetsu)シリコーンフォームクロージャーで覆った。これらは、温度121℃(250゜F)で、45分間高圧滅菌した。播種培養は、振幅5.08cm（２インチ）で旋回振盪しているインキュベーターにおいて、28℃、150rpmでインキュベートした。16時間増殖した後、この播種培地の１％を、該生産フラスコ中に入れ、収穫前に２４時間増殖した。毒素の産生は、対数増殖期に明らかであった。この微生物のブロスを、１リットルの遠心管に移し、かつ細胞バイオマスをペレットとした（４℃、2500rpmで、30分間[R.C.F.=〜1600]、HG-4LローターRC3、ソルバル(Sorval)遠心機、ヂュポン社、ウィルミントン、デラウェア）。最初のブロスを、４℃で、８〜16時間冷却し、少なくとも２時間再度遠心分離し（前述の条件）、放置時に沈殿したムコ多糖類と推定されるものを除去することによって、更にブロスを透明にした。（別の加工法は、両方の工程を組合わせ、かつ前述と同じ条件で、16時間の透明化遠心分離を使用した。）。その後、このブロスを、バイオアッセイ又はろ過の前に、４℃で貯蔵した。
【００５１】
このブロスから精製されたPhotorhabdus培養ブロス及びタンパク質の毒素（複数）は、多くの昆虫に対して活性（死亡及び／又は成長阻害、羽化の低下）を示した。更に詳細に述べると、昆虫目のコレオプテラ(Coleoptera)の一員である、ハムシモドキ（幼虫及び成虫）、コロラドジャガイモハムシ、及び芝の地虫(turf grubs)に対する活性が認められた。コレオプテラ目の他の一員は、コメツキムシ、花粉の甲虫(pollen beetle)、トビハムシ、種子の甲虫(seed beetle)、及びゾウムシを含んだ。同様にホモプテラ(Homoptera)目の一員である、アスターヨコバイに対する活性も認められた。ホモプテラ目の他の一員は、多くの宿主に特異的なアブラムシ種に加え、プラントヨコバイ(planthopper)、ヨーロッパナシキジラミ、リンゴサッカ(apple sucker)、カイガラムシ、コナジラミ及びアワフキを含んだ。前述のブロス及び精製された分画も、同じくシロイチモンジヨウトウガ、イラクサキンウワバ、黒色ネキリムシ、タバコの芽食虫(budworm)、ヨーロッパアワノメイガ、オオタバコガ及びヒメハマキに対して活性を示した。
【００５２】
この目の他の典型的一員は、イガ、インディアンミールモス(Indian mealmoth)、ハマキムシ、アオムシ、ワタキロバガ、ミノムシ、束部テンマクケムシ、芝のガ（sod webworm）、及びシロナガヤであった。活性は、ディプテラ(Diptera)目の一員であるミバエ及び力の幼虫に対しても認められた。ディプテラ目の他の一員は、エンドウのユスリカ、ニンジンのハエ、キャベツ根のハエ、キスジノハムシ、タマネギのハエ、ガガンボ、イエバエ及び各種の力種である。同じくフシアリ、オデロウスイエアリ(oderous house ant)、及び小クロアリ(little black ant)を含む目の一員である、オオアリ及びアルゼンチンアリ(Argentine ant)に対する活性も認められた。
【００５３】
前述のブロス／分画は、昆虫の個体数を減少するために有用であり、かつ昆虫の個体数を阻害する方法において使用した。この方法は、前述の活性物を、昆虫を不活性化するのに十分な量、昆虫の場所(locus)に塗布することを含むことができる。結果を表３に示した。
ハムシモドキ幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Photorhabdusル培養ブロス（ろ過滅菌し、細胞を含まない）又は精製したHPLC分画を、それぞれ、対照培地又は10mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0に希釈した後の30μlアリコートを、人工飼料0.25mlの表面（〜1.5cm2）に、直接塗布した。この飼料プレートを、滅菌フローフード中で風乾し、かつこれらのウェルには、不稔卵からふ化した一匹の新生虫ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（diabrotica undecimpun howardi）（南部ハムシモドキ、SCR）、人工飼料で成長した第２齢のSCR、又はメトロミックス（登録商標）中で生育したトウモロコシ苗木で飼育した第２齢のディアブロティカ・ビルジフェラ・ビルジフェラ（Diabrotica virgifera virugifera）（西部ハムシモドキ、WCR）を群らがらせた。第２齢の幼虫は、飼料投与前に秤量した。これらのプレートに封をし、湿らせた生育用チャンバーに置き、適当な期間27℃に保った（SCR新生虫及び成虫については４日間、WCR幼虫については２〜５日間、第２齢のSCRについては７〜14日間）。死亡率及び測定体重は、指示されたようにスコア化した。一般に、全ての試験において、１処置について16匹の虫を使用した。対照の死亡率は、下記のものである：新生幼虫については＜５％、甲虫成虫については５％。
【００５４】
コロラドジャガイモハムシに対する活性を、下記の方法で試験した。Photorhabdus培養ブロス又は対照培地を、24ウェルの組織培養プレートのウェル中に保持された、標準人工飼料1.5mlの表面(〜2.0cm2)に塗布した。各ウェルに、50μlの処置を行い、風乾した。次に、個々の第２齢のコロラドジャガイモハムシ（レプチノタルサ・デセムリネアタ(Leptinotarsa decelimeata)、CPB)幼虫を、この飼料の上に置き、かつ４日後の死亡率をスコア化した。全ての試験について、１処置につき10匹の幼虫を用いた。対照の死亡率は3.3％であった。
マメコガネの地虫(Japanese beetle grub)及び甲虫に対する活性は、下記の方法で試験した。芝の地虫（ポピィア・ジャポニカ(Popillia japonica)、第２〜３齢）を、群生した芝から採取し、実験室内で、土壌／ピート混合物で、追加食餌としてニンジンのスライスを与え、養った。芝の甲虫は、局所的なフェロモンで捕獲し(pheromone-trapped)、かつ実験室内では、プラスティックの容器で、食餌としてカエデの葉を与えて養った。未希釈のPhotorhabdus培養ブロス又は対照培地を、ハムシモドキの人工飼料（30μl/1.54cm2、甲虫）又はニンジンのスライス（幼虫）に塗布した後、両ステージを飼料ウェル中に単独で配置し、死亡率及び摂食を観察した。両方とも、摂食（及び糞排泄）量の明らかな減少が認められた。
【００５５】
カの幼虫に対する活性は、下記の方法で試験した。このアッセイは、96個のウェルの微量滴定プレートで行った。各ウェルは、水溶液（Photorhabdus培養ブロス、対照培地又は水）200μl、及び約20匹の、１日齢の幼虫（アエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)）を含んだ。１処置につき６個のウェルを実施した。結果を、群生の２時間後に調べ、かつ３日間の観察期間にわたり変化しなかった。対照の死亡率は、調べなかった。
ミバエに対する活性を、下記の方法で調べた。購入したドロソフィア・メラノガステル(Drosophia meganogaster)培地を、乾燥培地50％、及び水、対照培地又はPhotorhabdus培養ブロスのいずれかの液体50％を用いて調製した。これは、１処置につき３個の飼育バイアルの各々の中に、乾燥培地8.0mlを入れ、及び適当な液体8.0mlを加えることによって達成した。その後、10日後期(late)齢のドロソフィア・メラノガステルのうじを、各バイアルに加えた。これらのバイアルは、室温で、天井に蛍光灯のついた実験用ベンチの中に置いた。さなぎ又は成虫の数を、暴露の３，７及び10日後に測定した。ミバエさなぎ用飼料へのPhotorhabdus培養ブロスの混合物では、10日目の羽化が、水又は対照培地（３％減少）と比べ、わずか（17％）であるが有意の減少を示した。
【００５６】
アスターヨコバイに対する活性を、下記の方法で試験した。アスターヨコバイ（マクロステレス・セベリニ(Macrosteles severini)）に関する摂取アッセイは、外部と接触せずに、この活性物を摂取することができるようにデザインした。この活性物／"食品"溶液の容器は、35×10mmのペトリ皿の底面の中央に２個の穴があるように製造した。5cm（２インチ）四方のパラフィルムM（登録商標）を、この皿の表面を覆うように置き、かつ"O"型リングでしっかり締めた。次に、28.3g（loz.）のプラスティックカップに、約７匹のヨコバイを群がらせ、このカップの頂上に前述の容器を配置し、パラフィルムをはずした。その後試験溶液を、穴を通じてこの容器に入れた。未希釈のPhotorhabdus培養ブロスを使用する試験においては、このブロス及び対照培地を、水に対して透析し、対照の死亡率を低下した。死亡率は、対照死亡率が26.5％であった２日目について報告した。精製した分画（200mgタンパク質/ml）を使用する試験において、ショ糖の５％の最終濃度を、全ての処置において用い、アスターヨコバイの生存率を高めた。このアッセイは、照射間隔が16/8である、28℃で、相対湿度が70％のふ化器において行った。このアッセイは、72時間後の死亡率について等級付けした。対照の死亡率は、5.5％であった。
【００５７】
アルゼンチンアリに対する活性を、下記の方法で試験した。100％Photorhabdus培養ブロス、対照培地又は水の1.5mlアリコートを、2.0mlの透明なガラスバイアルにピペットで移した。これらのバイアルを、適当な処置で湿らせた歯科用綿芯で栓をした。各バイアルを、８〜12匹のアルゼンチンアリ（リネピセマ・フミレ(LinePithefma humile)）の成虫を入れた、個別の60×16mmのペトリ皿に置いた。１処置にっいて３個を試験した。バイオアッセイプレートを、室温で、天井に蛍光灯がついた実験用ベンチに置いた。死亡率は、暴露の５日後に読み取った。対照の死亡率は、24％であった。
【００５８】
オオアリに対する活性は、下記の方法で試験した。黒色オオアリの働きアリ（カンポノタス・ペンシルバニカス(Camponotus pennsylvanicus)）を、インディアナポリス(IN)のダウエランコ(DowElanco)農場の木から採取した。Photorhabdus培養ブロスによる試験は、下記の方法で実施した。プラスティックのバイオアッセイ容器（18.1cm×7.6cm（71/8"×3"））の各々に、15匹の働きアリ、紙製隠れ家、及びプラスティックの一口用グラスに入れたブロス又は対照10mlを置いた。一口用グラスのふたに開けた穴を通して、綿芯を伝って、アリに処置が届くようにした。全ての処置は、５％ショ糖を含んだ。バイオアッセイは、暗所、室温で行い、かつ19日目に等級付けした。対照の死亡率は、９％であった。アリの人工飼料に利用したアッセイ用に送達する精製した分画は、前述の処置（精製した分画又は対照溶液）と、プラスティック試験管の中で、処置0.2ml／飼料2.0gの割合で混合した。精製された分画の最終的なタンパク質濃度は、101μg／飼料g未満であった。１処置につきアリ10匹、水、隠れ家及び処理した飼料を、封をしたプラスティック容器に入れ、かつ加湿したふ化器の中で、暗所、27℃で養った。10日目に、死亡率をスコア化した。対照の死亡率は調べなかった。
【００５９】
様々な鱗翅類の幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Photorhabdus培養ブロス又は精製した分画は、標準の人工飼料0.25mlの表面（〜1.5cm2）に、それぞれ対照培地又は10mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0のいずれかに希釈した後の30μlアリコートで、直接塗布した。これらの飼料プレートは、滅菌したフローフード中で風乾し、かつこれらのウェルに、１匹の新生幼虫を群がらせた。ヨーロッパアワノメイガ（オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)）及びオオタバコガ（ヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea)）の卵は、商業的供給源から入手し、かつ社内でふ化したが、シロイチモンジョウトウガ（スポドプテラ・エキシグア(Spodoptera exigua)）、イラクサキンウワバ(トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni))、タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)）、ヒメハマキ(ラスペイレシア・ポモネラ(Laspeyresia pomonella))及び黒色ネキリムシ（アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)）の幼虫は、社内で調達した。幼虫を群がらせた後、飼料プレートに封をし、加湿した生育用チャンバーの中に置き、暗所、27℃で、適当な期間養った。死亡率及び体重測定は、Photorhabdus培養ブロスについては５〜７日目に、及び精製した分画については４〜７日目に、スコア化した。一般に、全実験において、１処置につき昆虫16匹を使用した。対照培地に関する対照死亡率は、４〜12.5％の範囲であり、かつPhotorhabdusバッファーに関しては10％未満であった。
【００６０】
【表４】
表３．様々な昆虫目／種の死亡率及び成長阻害に対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロス及び精製した毒素分画の作用
0003657593.tif 000005
Mort= 死亡率、G.I.＝成長阻害、na＝適用できず、nt＝試験せず、a.f.＝抗摂食
【００６１】
実施例３  土壌への適用に関する殺虫剤の効用
Photorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスを、土壌又は土壌混合物（メトロミックス（登録商標））に直接適用した場合の、ハムシモドキに対する活性を示した。メトロミックス（登録商標）中の新生SCR及WCRに対する活性を、下記の方法で試験した（表４）。試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のCL614）を用いて行った。根が約３〜６cmに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、乾燥メトロミックス（登録商標）50gを入れた、591mlの透明なプラスティックカップに、植えた。その後、20匹の新生SCR又はWCRを、この苗木の根に直接置き、かつメトロミックス（登録商標）で覆った。群生する間に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量50mlを散布(drench)した。散布した後、このカップに封をして、かつ明所、室温で、７日間放置した。その後、この苗木を洗浄し、メトロミックス（登録商標）を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋のいずれかに等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６２】
土壌中の新生SCRに対する活性を、下記の方法て試験した（表５）。この試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のCL614）を用いて行った。根が約３〜６cmに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、レバノン(IN)の前年トウモロコシを栽培した畑から採取した土壌150gを入れた、591mlの透明なプラスティックカップに、植えた。この土壌は、それまで殺虫剤処理を行っていない。20匹の新生SCRを、この苗木の根に直接置き、かつ土壌で覆った。群生後に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量50mlを散布した。散布した後、封をしないカップを、相対湿度が高い（80％）チャンバーで、25℃（78゜F）でインキュベートした。その後、この苗木を洗浄し、土壌を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋に等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６３】
【表５】
表４．群生後に散布した後のハムシモドキに対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））
0003657593.tif 000006
【００６４】
【表６】
表５．群生後に散布した後のハムシモドキに対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスの作用（土壌）
0003657593.tif 000007
【００６５】
Photorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスの、メトロミックス（登録商標）中の第２齢の芝の地虫に対する活性を、下記の方法で行った試験で観察した（表６）。591mlの透明なプラスティックカップに、乾燥メトロミックス（登録商標）約50gを入れた。その後このメトロミックス（登録商標）を、50容量％希釈したPhotorhabdusブロス溶液全量50mlを散布した。粗ブロスの希釈は、水で行い、50％ブロスは、粗ブロス25mlに、水25mlを加えて、総量50mlとした。
通常の培地濃度を50％希釈したものである、プロテオースペプトン#3(PP3)の１重量／容量％溶液を、ブロス対照として使用した。散布した後、５匹の第２齢の芝地虫を、湿らせたメトロミックス（登録商標）の表面に置いた。元気な芝地虫の幼虫は、メトロミックス（登録商標）の中に、即座に穴を掘って潜り込んだ。
１時間以内に穴を掘って潜らなかった幼虫は、除外し、新たな幼虫と交換した。
このカップに封をして、かつ暗所、28℃のふ化器に入れた。７日後、メトロミックス（登録商標）から幼虫を取り出し、死亡率をスコア化した。活性は、対照に対する死亡率の割合で示した。
【００６６】
【表７】
表６．群生前に散布した後の芝の地虫に対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-1 4）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））
0003657593.tif 000008
＊は、幼虫の死亡／生存の比を示す。
【００６７】
実施例４  葉への適用に関する殺虫剤の効用
Photorhabdusブロスのヨーロッパアワノメイガに対する活性を、ブロスをトウモロコシの葉の表面に直接塗布した場合について調べた（表７）。このアッセイにおいて、Photorhabdusブロスを、培養培地で100倍希釈し、かつ切り採ったトウモロコシの葉の表面に、葉表面の〜6.0μl/cm2の割合で、手で塗布した。これらの葉を、風乾し、等しい大きさの細片（約５×５cm（約２×２インチ））に切断した。これらの葉を丸め、ペーパークリップで固定し、底面に２％寒天を0.63cm（0.25インチ）入れた、28g(loz)の一口用プラスチックグラスの中に置き、湿らせた。その後、新生ヨーロッパアワノメイガ12匹を、前述の丸めた葉の上に置き、カップに封をした。５日間、暗所、27℃でインキュベートした後、これらの試料を、摂食による損傷及び回収された幼虫について、スコア化した。
【００６８】
【表８】
表７．切り採ったトウモロコシ葉に群生前に塗布した後のヨーロッパアワノメイガに対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスの作用
0003657593.tif 000009
【００６９】
新生タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)）に対する前述の培養ブロスの活性を、葉の浸漬法を用いて明らかにした。新鮮な綿の葉を、植物から切り採り、かつ葉のディスクを、18.5mmのコルクの穴あけ器で切断した。このディスクを、対照培地(PP3)、又は10kDaフィルターを備えたアミコン社（ビバリー、MA）のプロフラックスM12接線方向のろ過システムを用いて、約10倍に濃縮したPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスに、個々に浸漬した。過剰な液体を取り除き、かつ真っ直ぐにしたペーパークリップで、該ディスクの中心を貫通させた。その後、このペーパークリップを、１％寒天を2.0ml含む28g(loz)の一口用プラスチックグラスの中に、打ち込んだ。これは、葉が寒天の上方に吊り下げられた状態にした。この葉ディスクを乾燥した後、１匹の新生タバコのハマキガの幼虫を、該ディスクの上に置き、カップに蓋をした。その後このカップを、ポリ袋内に入れ封をし、かつ暗所、27℃のふ化器に、５日間放置した。この時点で、残っている幼虫及び葉材料を秤量し、葉の損傷を測定した（表８）。
【００７０】
【表９】
表８．綿葉の浸漬アッセイにおけるタバコの芽食虫に対するPhotorhabdus luminescens（菌株W-14）培養ブロスの作用
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【００７１】
実施例５  パートＡ
毒素ペプチド成分の特徴
引き続き行われた分析において、実施例１で単離されたバンドの毒素タンパク質のサブユニットを、30:0.8の比（アクリルアミド：BIS-アクリルアミド）の７％SDSポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分解した。このゲルマトリックスは、比較的大きいタンパク質の分解をより容易にする。実施例１において、バンド１及びバンド２のサブユニットの分子量を推定するのに用いたゲルシステムは、38:0.18の比（アクリルアミド：BIS-アクリルアミド）の18％ゲルであり、これは、広範な領域で大きさによる分離ができるが、高分子量成分については、分解能が低い。
【００７２】
この分析においては、８個ではなく10個のタンパク質バンドに分解された。表９は、10個の分解されたバンドの計算上の分子量を示し、かつこれらの条件下で推定された分子量を、先の実施例の分子量と直接比較している。追加のバンドが、本実施例で使用された異なる分離条件下で検出されたことは、驚くべきことではない。前述の分子量推定値及び新たな推定値の間の変動も、分解条件の差異によってもたらされたと予想される。本実施例の分析において、改善された分解能の結果、比較的大きい分子量の推定値は、実施例１よりもより正確であると考えられる。しかしながら、これらは、SDS-PAGE分析を基に推定され、この方法は典型的には分析としては正確ではなく、かつペプチドの推定値をもたらし、かつこれは、翻訳後修飾又は翻訳時修飾のために、更に代わり得る。
【００７３】
アミノ酸配列は、10個の分解されたペプチド中の５個のN-末端について決定した。表９は、これらのタンパク質の分子量及び同定された配列を、相互に関連付けている。配列番号２において、ある分析は、５位のプロリン残基は、アスパラギン(asn)でありうることを示した。配列番号３において、ある分析は、13及び14位のアミノ酸残基は、いずれもアルギニン(arg)であることを示した。配列番号４において、ある分析は、６位のアミノ酸残基は、アラニン(ala)又はセリン（ser）のいずれかであることを示した。配列番号５において、ある分析は、３位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸(asp)であることを示した。
【００７４】
【表１０】
表９．
0003657593.tif 000011
＊新たな推定値は、SDS-PAGEを基にしたもので、遺伝子配列を基にしたものではない。SDS-PAGEは、分析としては正確ではない。
【００７５】
実施例５、パートＢ
毒素ペプチド成分の特徴
新たなN-末端配列である配列番号１５、Ala Gln Asp Gly Asn Gln Asp Thr Phe Phe Ser Gly Asn Thrは、前記実施例５パートＡにおいて説明された天然のHPLCで精製された毒素から単離されたペプチドを更にN-末端配列決定することによって得られた。TcaAiiと称されるこのペプチドは、254位に始まり、かつ491位に至り、ここでTcaAiiペプチドは、配列番号４を開始する。遺伝子配列を基にして推定されたこのペプチドの大きさは、25,240Daである。
【００７６】
実施例６  毒素ペプチド成分の特徴
更に別の分析において、この毒素タンパク質複合体は、Photorhabdus luminescensの増殖培地（ツイーンを含まずに培養した後）から、10〜80％の硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程（モノQ）及び２種の分子サイジングクロマトグラフィー工程により、再び単離した。これらの条件は、実施例１で使用したものと類似していた。最初の分子サイジング工程において、第二の生物学的活性のピークは、約100±10kDaに認められた。タンパク質測定を基に、この分画は、約860±100kDa（天然）のより大きい、又は第一の活性ピークよりも、20〜50倍活性が低かった。この単離実験の間に、出発時の生物学的活性のかなりの部分を保持した約325±50kDaのより小さい活性ピークも、分解された。この325kDaのピークは、前述の860kDaのピークに、関連、もしくは由来したと考えられた。
【００７７】
この分析においては、56kDaタンパク質が分解された。このタンパク質のN-末端配列を、配列番号６に示した。注目すべきは、このタンパク質が、配列番号５のN-末端と、著しい同一性及び保存性を共有することであり、これは、これら２種が、ある遺伝子ファミリーの別個の一員によってコードされ得ること、及び各遺伝子によって産生されたタンパク質が、この殺虫性毒素複合体において両方を操作することができるように十分類似していることを示唆している。
二番目に顕著な185kDaタンパク質は、表９のタンパク質３と同等の量、一貫して存在するので、これは同じタンパク質又はタンパク質断片であろう。この185kDaタンパク質のN-末端は、配列番号７に示した。
【００７８】
追加のN-末端アミノ酸配列のデータが、同じく単離されたタンパク質から得られた。決定されたN-末端配列はいずれも、表９で同定されたタンパク質とは一致しなかった。他のタンパク質が、単離された調製物中に存在した。このようなタンパク質の１種は、推定分子量が108kDaであり、かつ配列番号８に示したN-末端配列を有した。二番目のこのようなタンパク質は、推定分子量が80kDaであり、かつ配列番号９に示したN-末端配列を有した。
ほぼ325kDaに活性ピークを伴うこのタンパク質物質を、大きさで分析すると、ほぼ51、31、28及び22kDaのバンドが認められた。いずれも分子量を電気泳動の移動度で決定したので、これらの分子量は、バッファーのイオン強度の差、電気泳動の電位差などに起因した誤差作用を受けた。当業者は、明確な分子量値は、これらの標準的方法を用いては決定することができないこと、及び各々が変動をうけやすいことを、理解するであろう。このような大きさのタンパク質は、より大きい最初の毒素複合体において認められた、より大きいタンパク質種（約200kDaの大きさ）の分解産物であると仮定された。
【００７９】
最後に、いくつかの調製物は、配列番号10に示されたN-末端配列を有するタンパク質を含んでいた。この配列は、巨大なタンパク質複合体の構造形成機能が知られている補助(accessory)タンパク質である、公知のシャペロニンタンパク質との相同性が強かった。本出願人は、このような構造形成機能か、配列番号10に同定されたタンパク質に起因するとはみなさないが、これは、その構造形成にシャペロンタンパク質が関連しているような、説明された毒素タンパク質複合体の存在と矛盾しない。更に、このようなタンパク質は、毒性を有することが直接示唆されることはないが、このタンパク質にとって、タンパク質毒素全体の構造的性質を決定することは重要であり、その結果、経口的デリバリー後のin vivoにおける、該複合体の毒性又は耐用度に貢献するであろう。
引き続きプロテイナーゼKに対する該タンパク質毒素複合体の安定性の分析を行った。該複合体を、プロテイナーゼKが10倍モル過剰量存在する条件で、24時間インキュベートした後、活性はほとんど失活した（経口投与の死亡率は、約５％に低下した。）ことが結論づけられた。これらのデータは、前述の毒素がタンパク質性であることを裏付けている。
この毒性は、更に透析膜によっても保持され、天然の毒素複合体の大きさが大きいことが再度裏付けられた。
【００８０】
実施例７  Photorhabdus毒素の単離、特徴及び部分的アミノ酸配列決定単離及びN-末端アミノ酸配列決定：
実施例５及び６に平行して行われた１組の実験において、典型的には２〜３リットルのPhotorhabdusブロスに、最終濃度が10又は20％のいずれかになるように結晶硫酸アンモニウムをゆっくり添加し調節することによって、Photorhabdusタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿を行った。４℃で１時間攪拌した後、この材料を１2,000×gで、30分間遠心分離した。上清を80％硫酸アンモニウムで調節し、４℃で１時間攪拌し、かつ12,000×gで、60分間遠心分離した。このペレットを、その容量の1/10量の10mM Na2PO4、pH7.0中で再懸濁し、同じリン酸バッファーで、４℃で一晩透析した。透析された材料を、12,000×gで、１時間遠心分離し、イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【００８１】
HR 16/50 Qセファロース（ファルマシア社）陰イオン交換カラムを、10mM Na2PO4、pH7.0で平衡にした。遠心分離し、透析した硫酸アンモニウムペレットを、このQセファロースカラムに、1.5ml/分の速度で加え、かつ光学濃度（O.D.280）が0.100未満に達するまで、平衡化バッファーを、3.0ml/分で大量に流し洗浄した。次に、60分間かけて、０から0.5MまでのNaCl勾配を3ml/分で、もしくは60分間にわたり、0.1M、0.4M及び最後は1.0MのNaClを用いる一連の溶出工程のいずれかを、各々該カラムに流した。分画を収集し、セントリプレップ(Centriprep)100を用いて濃縮した。あるいは、タンパク質を、0.1M NaClで溶出せずに、単一の0.4M NaCl洗浄液で溶出することができる。
【００８２】
濃縮したQセファロースの2mlアリコート試料を、10mM Na2PO4、pH7.0で平衡にしたHR 16/50スペロース12（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、0.5ml/分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、240分間、0.5ml/分で洗浄し、かつ２分間ずつ試料を収集した。間隙容量の物質を収集し、かつセントリプレップ100を用いて濃縮した。濃縮したスペロース12の試料の2mlのアリコートを、10mM Na2PO4、pH7.0で平衡にしたHR 16/50セファロース4B-CL（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、0.5ml/分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、0.5ml/分で、240分間洗浄し、２分間ずつ試料を収集した。
【００８３】
溶出されたタンパク質のピークを、セファロースCL-4B樹脂を使用したゲルろ過カラムに適用することによって、２回目の分画を施し、〜30kDaから1000kDaの範囲のタンパク質を分離した。この分画を、２種のピークについて分解し；小さいピークが間隙容量（＞1000kDa）で、及び大きいピークが、見かけの分子量約860kDaで溶出した。１週間以上、連続的に試料をゲルろ過に晒したところ、前述の大きいピークから生じるように見え、おそらく限定的タンパク質分解によると思われる、第三のピーク（約325kDa）の段階的出現が認められた。これらの３種のピークに関して行ったバイオッセイは、この間隙ピークは活性を持たないが、860kDaの毒素複合体が高い活性を有し、かつ325kDaのピークは、かなり可能性はあるが、より活性が少ないことを示した。異なる発酵生成物に由来するセファロースCL-4Bの毒素複合体のピークのSDS-PAGE分析は、"P"及び"S"と称される、２種の異なるペプチドパターンを明らかにした。これら２種のパターンは、分子量、及びそれらの分画中のペプチド成分濃度の差が際立っていた。"S"パターンは、最も頻繁に産生され、４個の高分子量ペプチド（＞150kDa）を有する一方で、"P"パターンは、３個の高分子量ペプチドを有した。これに加え、"S"ペプチド分画は、ヨーロッパアワノメイガに対して、２〜３倍より強い活性が認められた。この偏りは、接種の虫齢及び／又は年数を経た培養(agedculture)の増殖因子を基にした他の因子に起因した、タンパク質発現の変動に関連するであろう。
【００８４】
"P"及び"S"ペプチドパターンと定義されたピーク毒素複合体分画のミリグラム量に、分取的SDS-PAGEを施し、かつトリスーグリシン（セプラバフ（登録商標））で、PVDF膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写し取った。ブロットは、アミノ酸分析及びN-末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。"S"パターン中の３種のペプチドは、前述の例において同定された配列と比較して、独特のN-末端アミノ酸配列を有した。下記配列番号13で説明された201KDa(TcdAii)ペプチドは、配列番号１(TcbAii)と、33％のアミノ酸同一性及び50％の類似性を共有した(表10、表10において縦の線は、アミノ酸の同一性を示し、かつ点線はアミノ酸の同類置換を意味した。)。
【００８５】
配列番号14の197kDaの第二のペプチド(TcdB)は、配列番２(TcaC)と、42％の同一性及び58％の相同性を有した。更に、第三のペプチド205kDaは、TcdAiiを意味した。これに加え、限定されたN-末端アミノ酸配列である配列番号16(TcbA)は、少なくとも235kDaのペプチドであるが、これはクローン化された配列番号11の遺伝子(tcbA)から推定された、配列番号12のアミノ酸配列と、相同性が同じであり、配列番号１(TcbAii)に相当する推定されたアミノ酸配列を有した。これは、より大きい235+kDaペプチドが、発酵時に、タンパク質分解的に、201kDaペプチド（TcbAii）(配列番号１)へと処理され、おそらく該分子の活性化を生じることを示している。更に別の配列において、前述の実施例５で報告された配列番号５(TcaBii)として最初に報告された配列は、３位に、グリシン(Gly)ではなくアスパラギン酸残基(Asp)を、並びに８及び９位に、それぞれ、２個の追加のアミノ酸Gly及びAspを含むことがわかった。更に別の２種の配列、配列番号２(TcaC)及び配列番号３(TcaBi)においては、追加のアミノ酸配列が得られた。N-末端分析に送られた"S"調製物と同一である試料を用いて、デンシトメーターによる定量を行った。この分析は、201kDa及び197kDaペプチドが、それぞれ、"S"パターン中のクマーシーブリリアントブルーで染色されたタンパク質全体の7.0％及び7.2％であり、かつ他の豊富なペプチドに匹敵する量で存在することを示した。これらのペプチドが、他の細菌性毒素、例えば様々なCryl Bt毒素などで認められた状況に対し、タンパク質相同体、類似体を表すことが推測された。これらのタンパク質は、そのN-末端アミノ酸配列で、40〜90％相同性が変動し、これは毒性断片を包含している。
【００８６】
内部アミノ酸配列決定：毒素ペプチド遺伝子のクローニングを促進するために、選択されたペプチドの内部アミノ酸配列を、下記の方法で得た。"P"又は"S"ペプチドパターンであると決定されたピーク2A分画のミリグラム量に、分取SDS-PAGEを施し、かつトリス−グリシン（セプラバフ（登録商標））で、PVDF膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写しとった。ブロットは、アミノ酸分析及びN-末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。TcbAii（配列番号１を含む）、TcdAii及びTcaBi（配列番号３を含む）と称される３種のペプチドに、ハーバードマイクロケム社でトリプシン消化を施し、その後HPCLクロマトグラフィーで、個々のペプチドを分離した。N-末端アミノ酸分析は、選択されたトリプシンペプチド断片について行った。ペプチドTcaBi（205kDaペプチド）について配列決定された、２個の内部ペプチドは、TcaBi-PT111（配列番号17）及びTcaBi-PT79（配列番号18）と称される。ペプチドTcaBi（68kDaペプチド）について配列決定された、２種の内部ペプチドは、TcaBi-PT158（配列番号19）及びTcaBi-PT108（配列番号20）と称される。ペプチドTcbAii（201kDaペプチド）について配列決定された、４種の内部ペプチドは、TcbAii-PT103（配列番号21）、TcbAii-PT56（配列番号22）、TcbAii-PT81（a）（配列番号23）、及びTcbAii-PT81(b)（配列番号24）と称される。
【００８７】
【表１１】
表１０．
0003657593.tif 000012
【００８８】
実施例８Photorhabdus luminescensW-14ゲノムDNAのコスミドライブラリーの作製、及び毒性タンパク質調製物を含むペプチドをコードしている遺伝子を単離するためのスクリーニング
異種宿主における、Photorhabdusの昆虫毒性タンパク質の生成、及び他の使用のための必須条件として、これらのペプチドをコードしている遺伝子を、単離し、かつ特徴づけることが必要である。この目的は、平行して詳細に調べられる。ひとつの方法では、後述するように、その後発現ライブラリーからのクローンの単離に使用されるような、精製された毒素に対して生じた、モノクローナル及びポリクローナル抗体の使用を基にしている。別の方法は、本実施例において説明したように、PCR増幅に使用するための縮重オリゴヌクレオチドを設計するための、N-末端及び内部のアミノ酸配列データの使用を基にしている。いずれの方法も、各遺伝子の単離、及びそれらのDNA塩基配列の決定を可能にするために、該ペプチドをコードしている遺伝子を含むDNAクローンの同定に使用することができる。
【００８９】
ゲノムDNAの単離：Photorhabdus luminescensの菌株W-14（ATCC寄託番号55397）を、２％プロテオースペプトン#3寒天（ディフコラボラトリー社、デトロイト、MI）上で増殖し、かつ殺虫性毒素の受容能(competence)を、前記実施例１の方法を用いて、通過後に反復されたバイオアッセイにより維持した。振盪培養物50mlを、２％プロテオースペプトン#3培地を含む、175mlの仕切り付きフラスコ中で作製し、28℃かつ150rpmで、約24時間増殖した。この培養物15mlをペレット化し、かつDNA単離のために解凍するまで、その培地中で、-20℃で凍結した。この解凍した培養物を、遠心分離し（700×g、30分間）、かつ浮遊しているオレンジ色のムコ多糖物質を除去した。残りの細胞物質を、遠心分離し（25,000×g、15分間）、細菌細胞をペレット化し、かつこの培地を取り除いた。
【００９０】
分子生物学における最近のプロトコール（Ausbelらの編集、ジョン・ウィリー・ソン社(1994)）の2.4.1節に記載されたCTAB法を適用して、ゲノムDNAを単離した（塩ショック(salt shock)を含み、及び全ての容量を10倍に増量した点を変更した。）。ペレット化した細菌細胞を、TFバッファー（10mMトリス-HCl、1mMEDTA、pH8.0）中で再懸濁し、最終容量を10mlにし、その後5M NaClを12ml添加し；この混合物を、15,000×gで、20分間遠心分離した。得られたペレットを、TE 5.7ml中で再懸濁し、かつこの懸濁液に、10％SDS 300ml及び20mg/mlプロテイナーゼK 60ml（ギブコBRTプロダクツ社、グランド・アイランド、；滅菌蒸留水を溶媒とする）を添加した。この混合物を、37℃で１時間インキュベートし；その後、リゾチーム10mg(ウォーシングトン・バイオケミカル社、フリーホールド、NJ)を添加した。添加の45分後に、5M NaCl 1ml及びCTAB/NaCl溶液800ml（10重量／容量％CATB及び0.7M NaCl）を添加した。この調製物を、65℃で10分間インキュベートし、次に緩やかに攪拌し、更にインキュベートし、かつ約20分間攪拌し、細胞物質が透明化するのを補助した。クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（24:1、容量／容量）を等量添加し、緩徐に混合し、かつ遠心分離した。等量のPCI（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、50:49:1、容量／容量／容量、1Mトリス-HCl、pH8.0で平衡にした；インターマウンティンサイエンティフィック社、カイスビル、UT）で２回抽出した後、このDNAを、イソプロパノール0.6容量で沈殿した。
【００９１】
このDNA沈殿物を、ガラス棒でゆっくり取り出し、70％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、かつ2ml STE（10mMトリス-HCl、pH8.0、10mM NaCl、1mM EDTA）に溶解した。この調製物は、260nmで光学濃度を測定したところ（すなわちOD260）、DNAを2.5mg/ml含有していた。
この単離されたゲノムDNAの分子の大きさの範囲は、ライブラリーの作製に適すると評価した。CHEFゲル分析を、パルスウェーブ760変換器を備えたバイラドCHEF-DR II装置（バイオラドラボラトリー社、リッチモンド、CA）上で、0.5×TBEバッファー（44.5mMトリス-HCl、pH8.0、44.5mM H3BO3、1mM EDTA）を用い、1.5％アガロース（シーケム（登録商標）LE、FMCバイオプロダクツ社、ロックランド、ME）ゲル中で行った。この操作パラメーターは：初期A時間、３秒；最終A時間、12秒；200ボルト；操作温度、４〜18℃；操作時間、16.5時間であった。臭化エチジウムで染色し、紫外線下でこのゲルを検査し、このDNAの大きさが30〜250kbpの範囲であることが示された。
【００９２】
ライブラリーの作製：このPhotorhabdusゲノムDNA調製物を、部分的Sau3A １で消化した。この方法は、Ausbel（前掲）の3.1.3節に基づいた。ほとんど最適の結果が得られるまで、様々な条件下で、より小さい規模で反応を実行することで適合させた。様々な条件で、規模拡大したいくつかの大量反応を行い、結果を、CHEFゲル上で分析し、かつ最良の大規模調製物のみについて、先に進めた。最適な場合、PhotorhabdusゲノムDNA200μlを、Sau3A １（ニューイングランド・バイオラボ社、"ＮＥＢ"、ビバリー、MA）1.5ユニットと共に、全量2mlの1X NEB4バッファー（該製造業者から10×で供給）中で、37℃で、15分間、インキュベートした。この反応を、PCI 2mlを添加することによって停止し、かつ8000×gで10分間、遠心分離した。上清に、5M NaClを200μlと、氷冷したエタノール6mlを添加した。この調製物を、-20℃で30分間冷却し、その後12,000×gで15分間、遠心分離した。上清を除去し、かつ沈殿を40℃の真空炉で乾燥し、その後STE 400μlに再懸濁した。
【００９３】
分光光度学的アッセイは、投入したDNAの約40％を回収したことを示した。消化されたDNAは、CPMBの5.3.2節（前掲）に従い、ショ糖密度勾配上で大きさで分画した。10％から40％（重量／容量）の直線状のショ糖密度勾配を、ウルトラ−クリアー（登録商標）チューブ（ベックマンインスツルメンツ社、パロアルト、CA）中で、勾配作製器を用いて調製し、かつ該DNA試料を、最上部に乗せた。遠心分離（26,000rpm、17時間、ベックマンSW41ローター、20℃）後、分画（約750μl）を、この勾配の最上部から採取し、かつCHEFゲル電気泳動（前述）で分析した。大きさが20〜40kbpのSau3A １断片を含有する分画を選択し、かつAusbel（前掲）の5.3.3節の方法を変更して（全ての溶液の量を、約6.3倍に増量）、DNAを沈殿した。一晩沈殿した後、DNAを、遠心分離（17,000×g、15分間）により収集し、乾燥し、TEに再度溶解し、最終容積80μlとし、かつ3M酢酸ナトリウム8μl及びエタノール220μlを添加して、再沈殿した。前述の遠心分離により収集されたペレットを、TE 12μl中で再懸濁した。DNA濃度を、ホウファ-TK0100蛍光光度計（ホウファーサイエンティフィックインスツルメンツ社、サンフランシスコ、CA）を用いて、ヘキスト33258染料（ポリサイエンス社、ワーリントン、PA）蛍光定量法で測定した。大きさで分画されたDNAの約2.5μlが、回収された。
【００９４】
コスミドpWE15 DNA（ストラータジーン社、ラホラ、CA）30μgを、制限酵素BamH 1(NEB)100ユニットで、製造業者のバッファー（最終容量が200μl、37℃、１時間）を溶媒として、完全に消化した。この反応物を、PCI 100μlで抽出し、かつDNAを、3M酢酸ナトリウム及び-20℃の無水エタノール550μlを添加することによって、水相から沈殿した。-70℃で20分間放置した後、このDNAを、遠心分離（17,000×g、15分間）により収集し、真空で乾燥し、かつ10mMトリス-HCl、pH8.0、180μlに溶解した。これに、10×CIPバッファー（100mlトリス-HCl、pH8.3;10mM ZnCl2;10mM MgCl2）20μlを添加し、かつ1:4に希釈した仔ウシの腸のアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN）1μl（0.25ユニット）を添加した。37℃で30分放置後、下記を添加し：0.5M EDTA pH8.0を2μl；10％SDSを10μl；20mg/mlプロテイナーゼK（前述）を0.5μlであり、引き続き55℃で30分間インキュベートした。PCI 100μl及びフェノール（インターマウンティンサイエンティフィック社、1Mトリス-HClで平衡化、pH8.0）100μlで連続抽出した後、脱リン酸化したDNAを、7.5M酢酸アンモニウム72μl及び-20℃のエタノール550μlの添加により沈殿し、氷上で30分間インキュベートし、前述のように遠心分離した。沈殿したDNAを、-20℃の70％エタノール500μlで１回洗浄し、真空で乾燥し、かつTEバッファ-20μlに溶解した。
【００９５】
大きさで分画したSau3A １断片の、BamH １で消化しかつリン酸化したpWE15ベクターへのライゲーションを、Ausbelの3.3節のプロトコールを変更（すなわち、製造業者によって供給された、予備混合した10×ライゲーションバッファーを使用）して、T4リガーゼ(NEB)を用いて達成した。ライゲーションは、総量20μlについて、15℃で一晩行い、引き続き-20℃で貯蔵した。
DNA約1μgを含有する、コスミドDNAライゲーション反応物4μlを、市販のパッケージングエクストラクト（ギガパック（登録商標）IIIゴールドパッケージングエクストラクト、ストラータジーン社）を用いて、製造業者の指示に従って、λバクテリオファージにパッケージした。パッケージした調製物は、使用時まで４℃で貯蔵した。下記のギガパック（登録商標）IIIゴールドプロトコール（コスミドライブラリーのタイタリング(titering)）に従い、このパッケージしたコスミド調製物を、エシェリキア・コリXL1ブルーMR細胞（ストラータジーン社）への導入に使用した。XL1ブルーMR細胞を、0.2重量／容量％マルトースと10mM MgSO4を含有する、LB培地（g/L:バクト−トリプトンが10;バクト酵母抽出物が５；バクト寒天が15；NaClが５（ディフコラボラトリー社、デトロイト、M I））中で、37℃で増殖した。
【００９６】
５時間増殖した後、細胞を、700×g（15分間）でペレット化し、10mM MgSO4 6ml中に再懸濁した。培養物の濃度を、10mM MgSO4で、OD600=0.5に調節した。パッケージしたコスミドライブラリーを、滅菌したSM培地（0.1M NaCl、10mM MgSO4、50mMトリス-HCl、pH7.5、0.01重量／容量％ゼラチン）で1:10又は1:20に希釈し、かつ希釈した調製物25μlを、希釈したXL1ブルーMR細胞25μlと混合した。この混合物を、25℃で30分間インキュベートし（振盪せず）、その後LBブロス200μlを添加し、かつインキュベーションを、時々緩く攪拌しながら、約１時間継続した。この培養物のアリコート（20〜40μl）を、アンピシリンを100mg/l含む、LB寒天プレート（すなわちLB-Amp100）上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。増幅せずにこのライブラリーを保存するために、単一のクローンを採取し、かつ滅菌した96ウェルのマイクロウェルプレートの個々のウェルに接種し；各ウェルには、テリフィックブロス（TB培地：バクトトリプトンが12g/l、バクト酵母抽出物が24g/l、0.4容量％グリセロール、17mM H2PO4、72mM K2HPO4）75μlと、アンピシリン100mg/l（すなわちTB-Amp100）を入れ、かつ一晩、37℃でインキュベートした（振盪せず）。
【００９７】
96ウェルプレートを、コピープレートに複写した後、フィルター滅菌したTB:グリセロール（1:1、容量／容量、アンピシリン100mg/lは有又は無）を75μl／ウェルずつ、このプレートに添加し、これを手短に100rpm、37℃で振盪し、その後パラフィルム（登録商標）（アメリカンナショナル社、グリニッジ、CT）で封をし、-70℃のフリーザーに静置貯蔵した。コピープレートを、マスタープレートと同じように増殖処理した。全部で40個のこのようなマスタープレート（及びそれらのコピー）を調製した。
【００９８】
放射標識したDNAプローブによるライブラリースクリーニング：放射性標識したプローブでプロービングするためのコロニーフィルターを調製するために、前述のライブラリーの96ウェルプレート10個を、25℃で解凍した（ベンチ表面は室温）。96の先が尖った部分を備えたレプリカプレーティング器具を用いて、TB-Amp100を75μl／ウェル含む、新たな96ウェルコピープレートに接種した。このコピープレートを、37℃で一晩増殖し（静置）、その後100rpm、37℃で、約30分間振盪した。増殖しなかったものを分離するために、全部で800のコロニーを、このコピープレート上に出現させた。前記レプリカ器具を用いて、バイオアッセイプラスチックディッシュ（Nunc、243×243×18mm;カーティンマティソンサイエンティフィック社、ウッドデールIL）中の、固形LB-Amp100（100ｍl／ディッシュ）上に配置した、マグナNT;(MSI社、ウェストボロ、MA)ナイロン膜（0.45μm、220×250mm）の上に、この96ウェルアレーのデュプリケートの痕跡(impression)を接種した。これらのコロニーを、前述の膜の上で、37℃で、約３時間増殖した。
【００９９】
陽性対照コロニー（GZ4配列インサートを含む細菌クローン、下記参照）を、クロラムフェニコール35mg/lを補充したLB培地（すなわちLB-Cam35）について、セパレートのマグナNT膜（Nunc．、0.45μm、82mmの円形）上で増殖し、かつこのライブラリーコロニー膜に沿って処理した。膜上の細菌コロニーを溶菌し、かつゲニウス（登録商標）システムユーザーガイド2.0版（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、IN）のプロトコールに従って、DNAを、変性かつ中和した。0.5N NaOHと1.5M NaClに15分間浸漬したフィルターペーパー上に、膜をコロニー側が上になるように置いて、変性し、かつ1Mトリス-HCl、pH8.0、1.5M NaClに15分間浸漬したフィルターペーパー上で中和した。ストラータジーン社のUVストラタリンカーを自動架橋(auto crosslink)に設定して用いて、UV架橋した後、この膜を、乾燥状態25℃で、使用時まで保存した。膜を、単一の96ウェルプレートのデュプリケートの痕跡を含む細片に切り揃え、その後CPMB（前掲）6.4.1節の方法で、広く洗浄した：3×SSC、0.1重量／容量％SDS中で、25℃で３時間洗浄した後、同じ溶液で、65℃で１時間洗浄し、次にハイブリダイゼーション工程（20×SSC＝3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）のための調製物中の、２×SSCで洗い流した。
【０１００】
tcaC遺伝子の特異的ゲノム断片の増幅：精製したTacCペブチド分画に関して決定されたN-末端アミノ酸配列（ここでは配列番号２として示す）を基に、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールS4Psh）を、アプライドバイオシステムABI394 DNA/RNAシンセサイザー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、CA）で、標準的βシアノエチル化学により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、８時間、55℃で脱保護し、水に溶解し、分光光度計による測定で定量し、かつ使用するために希釈した。このプールは、TacCペプチドのN-末端の決定されたアミノ酸配列と一致した。決定されたアミノ酸配列及び対応する縮重したDNA配列を、下記に示し、ここでA、C、G及びTは、標準のDNA塩基であり、Iはイノシンを表す：
アミノ酸  Met  Glu      Asp            Ser       Pro  Glu    Val
Ｓ４ｐｓｈ  ５      ＡＴＧ    ＣＡ（Ａ／Ｇ）    ＧＡ（Ｔ／Ｃ）    （Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｔ／Ａ）  ＣＣＩ    ＧＡ（Ａ／Ｇ）  ＧＴ    ３’
縮重オリゴヌクレオチドの別のセットを、合成し（プールP2.3.5R）、配列番号17の決定されたアミノ酸配列に関するコード鎖の完全性を示した：
アミノ酸  Ala           Phe     Asn     Ile        Asp      Asp    Val
コドン 5'GCN         TT(T/C)  AA(T/C) AT(A/T/C)  GA(T/C)  GA(T/C) GT3'
Ｐ２．３．５Ｒ  ３’ＣＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）  ＡＡ（Ａ／Ｇ）  ＴＴ（Ａ／Ｇ）  ＴＡ（Ｔ／Ａ／Ｇ）    ＣＴ（Ａ／Ｇ）    ＣＴ（Ａ／Ｇ）  ＣＡ３’
【０１０１】
これらのオリゴヌクレオチドは、Photorhabdus菌株W-14（前記参照）から調製されたゲノムDNA由来の特異的DNA断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR（登録商標）、ロッシュモレキュラーシステム社、ブランチュバーグ、NJ）のプライマーとして使用した。
【０１０２】
典型的な反応物（50μl）は、各プライマープールP2Psh及びP2.3.5Rを125pmol、ゲノム鋳型DNAを253ng、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々10nmol、１×ゲネアンプ（登録商標）PCRバフッファー、並びにアムプリタック（登録商標）DNAポリメラーゼを2.5ユニット（両方ともロシュモレキュラーシステム社から入手；10×ゲネアンプ（登録商標）バッファーは、100mMトリス-HCl、pH8.3、500mM KCl、0.01重量／容量％ゼラチン）を含有した。増幅は、94℃（1.0分間）、55℃（2.0分間）、72℃（3.0分間）、その後7.0分間72℃の伸長期間の35サイクルを用い、パーキンエルマーセタスDNAサーマルサイクラー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、CA）中で行った。増幅生成物は、TEAバッファー（40mMトリス-酢酸、2mM EDTA、pH8.0）中で、２重量／容量％ヌシーヴ（登録商標）3:1アガロース（FMCバイオプロダクツ社）を通す電気泳動で分析した。このゲルを臭化エチジウム（0.5μg/ml）で染色し、紫外線下て検出することにより、大きさが250bpと推定される特異的生成物が多くの他の増幅生成物中に認められた。
【０１０３】
およそ250bp生成物を含有しているゲルの部分を切り、小さいプラグ（直径0.5mm）を取り出し、PCR増幅（40サイクル）用の鋳型の供給に使用した。この反応物（50μl）は、ゲノム鋳型DNAを除いて、前述と同じ内容物を含有した。増幅後、この断片の末端を平滑にし、かつ１ユニットのT4DNAポリメラーゼ(NEB)、1nmol ATP、及び2.15ユニットのT4キナトゼ（ファルマシアバイオテク社、ピスケートウェイ、NJ）と共に、25℃で20分間、インキュベートすることによって、リン酸化した。
DNA断片は、TEAを溶媒とする１重量／容量％GTG（登録商標）アガロース(FMC)を通す電気泳動により、残留するプライマーから分離した。見かけの大きさ250bpの断片を有するゲル切片を切り取り、かつそのDNAを、キアエックスキット（キアゲン社、チャストウォース、CA）を用いて抽出した。
【０１０４】
この抽出されたDNA断片を、制限酵素Sma １で完全に消化したプラスミドベクターpBC KS(+)（ストラータジーン社）にライゲートし、かつ前述のpWE15 DNAプローブに関して説明したのと同様の方法で抽出した。典型的なライゲーション反応物（16.3μl）は、１×ライゲーションバッファー(50mMトリス-HCl、pH7.4；１０mM MgCl2；10mMジチオスレイトール；1mMスペルミジン；1mM ATP；100mg/mlウシ血清アルブミン)を溶媒として、消化されたpBCKS(+)DNAを100ng、250bp DNA断片を70ng、1nmol[Co(NH3)6]Cl、及びT4 DNAリガーゼを3.9 Weissユニット（コラボラチブバイオメディカルプロダクト社、ベッドフォード、MA）を含有した。
【０１０５】
14℃で一晩インキュベートした後、供給者の指示に従って、ライゲーションした生成物を、凍結したコンピテントエシェリキア・コリDH5α（ギブコBRL）に形質転換し、IPTS（119μg/ml）及びX-ガル（50μg/ml）を含有する、LB-Cam35プレート上に配置した。独立した白色コロニーを採取し、かつプラスミドDNAを、変更されたアルカリ溶解／PEG沈殿法（PRISM（登録商標）簡易反応ダイデオキシ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キットのプロトコール；ABI／パーキンエルマー社）により、調製した。このインサートDNAの両方の鎖のヌクレオチド配列を、T7プライマー[pBC KS(+)塩基601-623:TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG]及びLacZプライマー[pBC KS(+)塩基792-816:ATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCl、及びPRISM（登録商標）配列決定キット（ABI／パーキンエルマー社）のプロトコールを用いて決定された。組込まれていない染色したターミネーターであるジデオキシリボヌクレオチドは、セントリーセップ100カラム（プリンストンセパレーション社、アデルフィア、NJ）を、製造業者の指示に従って通すことによって、除去した。このDNA配列は、ABIモデル373A DNAシークエンサー（ABI／パーキネルマー社）を用いて、これらの試料を分析することによって得られた。２種の単離体GZ4及びHB14のDNA配列は、図１に詳細に説明したものが認められた。
【０１０６】
この配列は、下記の特徴を持つ：i)塩基1-20は、S4Psh縮重オリゴヌクレオチドの64の可能性のある配列のひとつを表す、ii）アミノ酸1-3及び6-12の配列は、TacCのN-末端について決定されたもの（配列番号２）と正確に一致する、iii)コードされた４番目のアミノ酸は、セリン残基ではなく、システイン残基であり、この差異は、セリンコドンの縮重内でコードされている（前記参照）、iv）コードされた５番目のアミノ酸は、プロリンであり、配列番号２で示されたTcaC N-末端配列に対応している、V)塩基257-276は、縮重プールにデザインされた192の可能性のある配列のひとつをコードしている、Vi)塩基268-270に導入されたTGA終結コドンは、対応する位置で該オリゴヌクレオチドプールに組込まれた縮重に対する相補性の結果であり、かつ対応する遺伝子の短い読み枠を示すものではない。
【０１０７】
TcaCペプチド遺伝子特異性プローブの標識
夫々100pモルのP2Pshプライマー及びP2.3.5Rプライマー、鋳型としてのプラスミドGZ4またはHE14 10ng、夫々20nモルのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、Amplitaq（登録商標）DNAポリメラーゼ５単位、１ｘ濃度のGeneAmp（登録商標）緩衝液を上記と同じ温度レジメのもとに使用して、上記276塩基に相当するＤＮＡフラグメントを100μlの反応容積でPCR（登録商標）により増幅した（35サイクル）。増幅産物をQiaexキットにより１％GTG（登録商標）アガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。
プラスミドHB14鋳型から抽出された増幅産物（約400ng）を５つのアリコートに分け、製造業者の指示に従ってハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して32P-dCTPで標識した。とり込まれなかった放射性同位元素を供給業者の指示に従ってNucTrapプローブ精製カラム（ストラタゲン）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡ産物の比活性をシンチレーションカウントにより測定したところ、3.11×108dpm/μgであった。この標識されたＤＮＡを使用してゲノムライブラリーの800の員から調製された膜を探査した。
【０１０８】
TcaCペプチド遺伝子特異性プローブによるスクリーニング
放射能標識されたHB14プローブを約10分間沸騰させ、次いで"最小hyb"溶液に添加した［注："最小hyb"方法をCERESプロトコル;"制限酵素断片長多型研究マニュアルバージョン4.0"，節4-40及び4-47;CERES/NPI，Salt Lake City，UTから採用する。NPIは現存していないが、その継承者がLinkage Geneticsとして運用している］。"最小hyb"溶液は10％w/vのPEG(ポリエチレングリコール、M.W.約8000)、7％w/vのSDS、0.6XのSSC、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液（95g/lのNaH2PO4・1H2O及び84.5g/lのNa2HPO4・7H2Oを含む1Mの原液から）、5mMのEDTA、及び100mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む。膜を素早く乾燥ブロットし、次いで、プレハイブリダイゼーションを用いないで、膜の５ストリップを、"最小hyb"75ml及び2.6ng/mlの放射能標識されたHB14プローブを含む二つのプラスチックボックスの夫々に入れた。これらを60℃で徐々に振とうしながら一夜インキュベートした。フィルターを夫々約10分間にわたって25℃で"最小hyb洗浄液"(0.25XのSSC、0.2％のSDS)中で３回洗浄し、続いて同溶液中で60℃で徐々に振とうしながら２回の30分間の洗浄を行った。
【０１０９】
フィルターをライト−タイト・オートラジオグラフィーカセット中でサランラップR（ダウ・ブランド、Indianapolis，IN）で覆われた紙の上に置き、４時間にわたって-70℃で２種のデュポン・クロネックス・ライトニング・エンハンサー＋C1エンハンサー(シグマ・ケミカル社，St.Lois，MO)を用いてX-Omat X線フィルム（コダック，Rochester，NY）に露出した。現像（通常の写真操作）後に、有意なシグナルが更に弱く、更に不規則なシグナルのハイバックグラウンドの間で両方の反復試験で明らかであった。再度、フィルターを約４時間にわたって68℃で"最小hyb洗浄液"中で洗浄し、次いで再度カセットに入れ、フィルムを-70℃で一夜露出した。12の可能な陽性を二重の96ウェル・コロニー陥凹の両方について強いシグナルにより同定した。シグナルは陰性の対照膜（pWE15を含むXL1ブルーMR細胞のコロニー）では見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性の対照膜（PCR産物のGZ4分離物を含むDH5α細胞）で見られた。
【０１１０】
12の推定ハイブリダイゼーション−陽性コロニーを凍結された96ウェルライブラリープレートから回収し、固体LB-Amp100培地で37℃で一夜増殖させた。次いでそれらを固体LB-Amp100にパッチした（３／プレート、＋３種の陰性対照：pWE15ベクターを含むXL1ブルーMR細胞）。膜（マグナNTナイロン、0.45ミクロン）の二つの組をハイブリダイゼーションのために調製した。フィルターをパッチプレートのコロニーの上に直接置き、次いでそれを付着バクテリア細胞とともに除去し、以下のようにして処理することにより第一組を調製した。第二組のフィルターをLB-Amp100培地を含むプレートに入れ、次いで細胞をパッチプレートからフィルターに移すことにより接種した。37℃で一夜増殖後に、フィルターをプレートから除去し、処理した。
【０１１１】
フィルターのバクテリア細胞を溶解し、夫々のフィルターをプラスチックプレート中の0.5NのNaOHのプール(1.0ml)に３分間にわたってコロニー面を上にして置くことによりＤＮＡを変性した。フィルターをペーパータオルで乾燥ブロットし、次いでそのプロセスを新しい0.5NのNaOHで繰り返した。乾燥ブロッティング後に、フィルターを夫々1Mのトリス-HCl、pH7.5の1.0mlのプールに３分間入れることにより中和し、乾燥ブロットし、新しい緩衝液で再度中和した。これに続いて0.5Mのトリス-HCl、pH7.5＋1.5MのNaClのプールで２回の同様のソーキング（夫々５分間）を行った。乾燥ブロッティング後に、そのＤＮＡをフィルター（上記のとおり）にUV架橋し、フィルターを3X SSC約100ml＋0.1％(w/v)のSDS中で洗浄した(25℃、100rpm)(４回、夫々の洗浄について夫々新しい溶液で30分間)。次いでそれらを２時間にわたって65℃、50rpmで最小容積のプレハイブリダイゼーション溶液［6X SSC＋夫々１％w/vのフィコール400(ファーマシア)、ポリビニルピロリドン（平均M.W．360,000;シグマ）及びウシ血清アルブミンフラクションＶ;（シグマ）］に入れた。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、ライブラリー膜の先のハイブリダイゼーションから保存されており、95℃で５分間変性されたHB14 32P標識プローブで置換した。50rpmで振とうしなからハイブリダイゼーションを60℃で16時間行った。
【０１１２】
標識プローブ溶液の除去後に、膜を25℃(50rpm、15分間)で3X SSC（夫々約150mlの洗浄液）中て３回洗浄した。次いてそれらを0.25X SSC＋0.2％のSDS（最小hyb洗浄液）中で68℃で３時間洗浄し(50rpm)、1.5時間にわたって25℃で上記のＸ線フィルムに露出した（無エンハンサースクリーン）。この露出はコスミド分離物22G12、25A10、26A5、及び26B10について非常に強いハイブリダイゼーションシグナルを明らかにし、またコスミド分離物8B10では非常に弱いシグナルを明らかにした。シグナルは陰性対照(pWE15)コロニーでは見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性対照膜（PCR産物のGZ4分離物を含むDH5α細胞）で見られた。
【０１１３】
tcaB遺伝子の特定のゲノムフラグメントの増幅
精製されたTcaBiペプチドフラクションについて決定されたＮ末端アミノ酸配列（本明細書中配列番号３として開示される）に基いて、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールP8F）をペプチドTcaCについて記載されたようにして合成した。決定されたアミノ酸配列及び相当する縮重ＤＮＡ配列を以下に示し、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは通常のＤＮＡ塩基であり、Ｉはイノシンを表す。
アミノ酸    Leu    Phe  Thr  Gln     Thr  Leu     Lys Glu Ala Arg
Ｐ８Ｆ    ５’    (C/T)TI TTT  ACI  CA(A/G) ACI  (C/T)TI AAA GAA GCI (A/C)G 3'
縮重オリゴヌクレオチドの別の組を合成し(プールP8.108.3R)、TcaBi-PT108内部ペプチドの決定されたアミノ酸配列（本明細書中配列番号20として開示される）についてコードストランドの相補物に相当した。
アミノ酸    Met  Tyr     Tyr    Ile         Gln       Ala      Gln
コドン      ATG  TA(T/C) TA(T/C) AT(T/C/A) CA(A/G) GC(A/C/G/T) CA(A/G)
アミノ酸    Gln
コドン    CA(A/G)
P8.108.3R 3' TAC  AT(A/G) AT(A/G) TA(A/G/T) GT(T/C) CGI         GT(T/C)
ＧＴ  ５’
【０１１４】
ホットスタート50チューブTM（モレキュラー・パイオープロダクツ社，San Diego,CA）を使用してこれらのオリゴヌクレオチドをPCRのプライマーとして使用してフォトラブダス(Photorhabdus)株W-14（上記を参照のこと）から調製されたゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡフラグメントを増幅した。典型的な反応液(50μl)は、１ｘGeneAmpR緩衝液中にそれぞれ２ｎモルのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPとともに夫々25pモルのプライマープールP8F及びP8.108.3R（下層）、並びに１ｘGenemAMpR緩衝液中にゲノム鋳型DNA230ng、それぞれ８ｎモルのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、および2.5単位のAmpliTaqRポリメラーゼ（上層）を含んでいた。増幅をTcaCペプチドについて記載されたようにして35サイクルにより行った。増幅産物をTEA緩衝液中で0.7％w/vのシーケムRLEアガロース(FMC)による電気泳動により分析した。推定サイズ1600bpの特定産物を観察した。
４種のこのような反応液をプールし、増幅されたDNAをTcaCペプチドについて記載されたようにしてQiaexキットにより1.0％のシーケムRLEゲルから抽出した。P8Fプライマープール及びP8.108.3Rプライマープールを使用して、抽出されたＤＮＡを配列決定（PRISMTM配列決定キット）の鋳型として直接使用した。
【０１１５】
夫々の反応液は鋳型ＤＮＡ約100ng及び25pモルの一種のプライマープールを含み、TcaCペプチドについて記載されたようにして通常のプロトコルに従って処理した。P8Fプライマーの延長から誘導された配列の分析は短いＤＮＡ配列（及びコードされたアミノ酸配列）を明らかにした。
GAT GCA TTG  NTT  GCT
Asp Ala Leu (Val) Ala
これは配列番号３（TcaBi）として開示されたＮ末端ペプチド配列の一部に相当する。
【０１１６】
TcaBiペプチド遺伝子特異性プローブの標識
ゲル精製されたTcaBi DNAフラグメント約50ngを上記のようにして32P-dCTPで標識し、取り込まれなかった放射性同位元素をNICKカラムR（ファルマシア）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡの比活性を測定したところ、６x109dpm/μgであった。この標識されたＤＮＡを使用してTcaC-ペプチド特異性プローブにハイブリッドを形成したゲノムライブラリーの員から調製されたコロニー膜を探査した。
TcaC-プローブライブラリースクリーン（上記を参照のこと）で同定された12のコロニーを含む膜を毎回約30分間で１リットルの0.1X SSC＋0.1％のSDS中で２回沸騰することにより放射性TcaC-特異性標識からストリッピングした。放射性標識の除去を６時間のフィルム露出でチェックした。次いでストリッピングされた膜を先に調製したTcaBiペプチド特異性プローブとともにインキュベートした。標識ＤＮＡを10分間の沸騰により変性し、次いで60℃で"最小hyb"溶液100ml中で１時間インキュベートされたフィルターに添加した。この温度で一夜のハイブリダイゼーション後に、プローブ溶液を除去し、フィルターを以下のようにして洗浄した（全て、0.3X SSC＋0.1％のSDS中）。25℃で５分間にわたって１回、新しい溶液中で60℃で１時間にわたって１回、そして新しい溶液中で63℃で１時間にわたって１回。通常の操作によるＸ線フィルムへの1.5時間の露出後に、４つの強くハイブリッドを形成するコロニーを観察した。これらは、TcaC-特異性プローブによれば、分離物22G12、25A10、26A5、及び26B10であった。
同TcaBiプローブ溶液を等容積（約100ml）の"最小hyb"溶液で希釈し、次いでゲノムライブラリーの800の員を含む膜をスクリーニングするのに使用した。
上記のようなハイブリダイゼーション、洗浄、そしてＸ線フィルムへの露出後に、４種のコスミドクローン22G12、25A10、26A5、及び26B10のみがこのプローブに強くハイブリッドを形成することがわかった。
【０１１７】
TcaCペプチド及びTcaBiペプチドをコードする遺伝子を含むサブクローンの単離、及びそのＤＮＡ塩基配列の決定
株XL1ブルーMR中の３種のハイブリダイゼーション陽性コスミドを30℃でTB-Amp100中で一夜振とう(200rpm)しながら増殖させた。細胞を遠心分離により回収した後、製造業者のプロトコルに従って市販のキット(BIGprepTM、５プライム３プライム社，Boulder，CO)を使用してコスミドＤＮＡを調製した。一種のコスミド、26A5のみをこの操作により成功裏に単離した。制限酵素EcoR 1(NEB)で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、およそのサイズ14、10、8(ベクター)、5、3.3、2.9、及び1.5kbpのフラグメントを検出した。３種の同株からコスミドＤＮＡを単離しようとする第二の試み（８mlの培養；TB-Amp100、30℃）は沸騰ミニプレプ方法(EvansG.及びG.Wahl.，1987，"Cosmid vectors for genomic walking and rapidrestri-ction mapping"，Guide to Molecular Cloning Techniques.Meth.Enzymology，152巻，S.Berger及びA.Kimmel編集，604-610頁）を利用した。
【０１１８】
一種のコスミド、25A 10のみをこの方法により成功裏に単離した。制限酵素EcoR 1(NEB)で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、このコスミドはコスミド26A5で先に見られたのと同じ断片化パターンを示した。
26A5コスミドＤＮＡ0.15μgのサンプルを供給業者のプロトコルによりE.coli DH5α細胞(ギブコBRL)50mlを形質転換するのに使用した。その株の単一コロニー分離物をTB-Amp100 4mlに接種し、37℃で８時間増殖させた。クロラムフェニコールを225μg/mlの最終濃度で添加し、インキュベーションを更に24時間続け、次いで細胞を遠心分離により回収し、-20℃で凍結した。26A5コスミドＤＮＡの単離は全ての容積を50％増加し、夫々の工程でボルテックスではなく攪拌または軽い混合を用いることにより改良された通常のアルカリ溶解ミニプレプ（Maniatisらの上記引用文献、382頁）によるものであった。ＤＮＡペレットを70％のエタノール中で洗浄した後、それを25μg/mlのリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム）を含むTEに溶解した。
【０１１９】
GZ4誘導プローブ及びTcaBiブローブにハイブリッドを形成するEcoR 1フラグメントの同定
コスミド25A10(XL1ブルーMR細胞から)約0.4μg及びコスミド26A5（クロラムフェニコール増幅されたDH5α細胞から）約0.5μgを約15単位のEcoR 1(NEB)で85分間にわたって夫々消化し、一夜凍結し、次いで65℃で５分間加熱し、0.7％のアガロースゲル中で電気泳動にかけた（シーケムRLE、１ｘTEA、80ボルト、90分間）。そのＤＮＡを上記のようにして臭化エチジウムで染色し、紫外線のもとに写真撮影した。コスミド25A10のEcoR 1消化産物は完全消化であったが、コスミド26A5のサンプルはこれらの条件下で部分消化されたにすぎなかった。ＤＮＡフラグメントを含むアガロースゲルをデプリネーション(depurination)、変性及び中和にかけ、続いて全てAusubelら(CPMB)上記引用文献)の節2.9に記載されたようにして高塩(20X SSC)プロトコルを使用してマグナNTナイロン膜にサザンブロッティングした。次いで移入されたＤＮＡを前記のようにしてナイロン膜にUV架橋した。
【０１２０】
プラスミド分離物GZ4のインサートに相当するTcaCペプチド特異性ＤＮＡフラグメントを上記のようにして100mlの反応容積でPCRにより増幅した。３種のこのような反応からの増幅産物をプールし、上記のようにしてQiaexキットにより１％のGTGRアガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。上記のようにしてハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、ゲル精製されたＤＮＡ(100ng)を6.34x108dpm/μgの比活性に32P-dCTPで標識した。
32P標識されたGZ4プローブを10分間沸騰し、次いで"最小hyb"緩衝液に添加し（1ng/mlで）、消化されたコスミドＤＮＡフラグメントを含むサザンブロット膜を添加し、50rpmで穏やかに振とうしながら60℃で４時間インキュベートした。次いで膜を夫々約５分間で25℃で３回洗浄し（最小hyb洗浄液）、続いて夫々30分間にわたって60℃で２回洗浄した。ブロットを約30分間にわたって-70℃でフィルム（エンハンサースクリーンを使用）に露出した。GZ4プローブはこれらの２種のコスミド、26A5及び25A10の両方の5.0kbp(見掛サイズ)EcoR 1フラグメントに強くハイブリッドを形成した。
【０１２１】
膜を0.1X SSC＋0.1％のSDS中て約30分間沸騰することにより放射能をストリッピングし、放射性標識の不在をフィルムへの露出によりチェックした。次いでそれをコロニー膜（上記）をスクリーニングするのに先に使用された"最小hyb"緩衝液中で60℃で3.5時間にわたって（変性）TcaBiプローブとハィブリッドを形成し、前記のようにして洗浄し、二つのエンハンサースクリーンを使用して-70℃で40分間にわたってフィルムに露出した。両方のコスミドでは、TcaBiプローブが約5.0kbpのEcoR 1フラグメントと軽くハイブリッドを形成し、約2.9kbpのフラグメントと強くハイブリッドを形成した。
前記のコスミド26A5 DNA（DH5α細胞から）のサンプルをＤＮＡの起源（これから関係するバンドをサブクローン化する）として使用した。このＤＮＡ(2.5μg)を30μlの合計容積で1.5時間にわたって約３単位のEcoRI 1（NEB）で消化して、ゲル電気泳動により確認して部分消化産物を得た。pBC KS(+)DNA(ストラタゲン)10μgを20μlの合計容積で1.5時間にわたって20単位のEcoRI 1で消化して、電気泳動により確認して完全消化をもたらした。両方のEcoRI 1切断ＤＮＡ製剤を水で50μlに希釈し、夫々に等容積のPCIを添加し、その懸濁液を穏やかに混合し、小型遠心分離機中で回転させ、水性上澄みを回収した。ＤＮＡをエタノール150μlにより沈殿させ、その混合物を-20℃で一夜置いた。遠心分離及び乾燥後に、EcoR1消化したpBC KS(+)をTE100μlに溶解した。部分消化された26A5をTE20μlに溶解した。ＤＮＡ回収をフルオロメトリーによりチェックした。
【０１２２】
別々の反応において、EcoR 1消化したpBC KS（+）DNA約60ngを部分消化されたコスミド26A5 DNA約180ngまたは270ngとつないだ。T4リガーゼ及びニュー・イングランド・バイオラブズからの緩衝液を使用して、結合を20μlの容積で15℃で５時間行った。無菌TEで100μlに希釈された結合混合物を供給業者の指示に従って凍結したコンピテントDH5α細胞(ギブコBRL)を形質転換するのに使用した。種々の量(25〜200μl)の形質転換された細胞を、1mMのIPTG及び50mg/lのX-galを含む新たに調製した固体LB-Cam35培地に塗布した。プレートを37℃で約20時間インキュベートし、次いで約３時間にわたって暗所で冷却して挿入選択のために着色を強化し。白色のコロニーを同組成のパッチプレートに取り、37℃で一夜インキュベートした。
選択されたパッチプレートの夫々の２種のコロニーリフトを以下のようにして調製した。白色のコロニーを新しいプレートに取った後、円形のマグナNTナイロン膜をパッチプレートに押しつけ、膜を持ち上げ、ライブラリーコロニー膜について上記されたようにして変性、中和及びUV架橋にかけた。過剰の細胞デブリをティッシュで軽くふき取ることを含み、架橋されたコロニーリフトを激しく洗浄した。"最小hyb"プロトコルに従って、一つの組を前記GZ4(TcaC)プローブ溶液とハイブリッドを形成し、他の組を前記TcaBiプローブ溶液とハイブリッドを形成し、続いてライブラリーコロニー膜について記載されたようにして洗浄し、フィルムに露出した。GZ4プローブのみ、GZ4プローブ及びTcaBiプローブの両方、またはTcaBiプローブのみとハイブリダイゼーションシグナルを示すコロニーを更なる研究のために選択し、細胞を前記のIPTG及びX-galを含むLB-Cam35培地に単一コロニー単離のためにストリーキングした。
【０１２３】
16種の異なる分離物からの約35の単一コロニーを液体LB-Cam35培地に取り、37℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、プラスミドＤＮＡをManiatisら（上記引用文献、368頁）に従って通常のアルカリ溶解ミニプレプにより単離した。ＤＮＡペレットをTE＋25μg/mlのリボヌクレアーゼＡに溶解し、ＤＮＡ濃度をフルオロメトリーにより測定した。EcoR 1消化パターンをゲル電気泳動により分析した。下記の分離物を有益なものとして採取した。分離物A17.2は再度つながれたpBC KS(+)のみを含み、（陰性）対照に使用した。分離物D38.3及びC44.1は夫々pBC KS(+)に挿入された2.9kbpのTcaBiとハイブリッドを形成するEcoR 1フラグメントのみを含む。pDAB2000及びpDAB2001と称されるこれらのプラスミドが夫々図２に示される。
分離物A35.3はpBC KS(+)に挿入された約5kbpのGZ4とハイブリッドを形成するEcoR 1フラグメントのみを含む。このプラスミドをpDAB2002と称した（また、図２に示される）。これらの分離物はＤＮＡ配列決定の鋳型を与えた。
前記BIGprepTMキットを使用して、プラスミドpDAB2000及びpDAB2001を調製した。培養物(30ml)をTB-Cam35中で２のOD600まで一夜増殖し、次いでプラスミドを製造業者の指示に従って単離した。ＤＮＡペレットを夫々100μlのTEに再度溶解し、サンプル保全性をEcoR 1消化及びゲル電気泳動分析によりチェックした。
【０１２４】
配列決定反応を二重反復試験で実験し、一つの反復試験は鋳型としてpDAB2000DNAを使用し、他の反復試験は鋳型としてpDAB2001 DNAを使用した。GZ4/HB14 DNAの配列決定について上記されたように、ジデオキシ色素ターミネーターサイクル配列決定方法を使用して、反応を行った。初期配列決定実験はプライマーとして上記LacZプライマー及びT7プライマー、＋TcaBi PCR増幅産物の決定された配列をベースとするプライマー(TH1=ATTGCAGACTGCCAATCGCTTCGG、TH12=GAGAGTATCCAGACCGCGGATGATCTG)を使用した。 夫々の配列決定アウトプットの整列及び編集後に、夫々をパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ部門SeqEd 675ソフトウェアにより解読されるようなクロマトグラフィーデータの積分に応じて250〜350塩基にトランケートした。新規プライマーに適した配列を選択することにより、その後の配列決定"工程"を行った。二三の例外があるが、プライマー(上記のようにして合成した)は50％ G+C組成を有し、長さが24塩基であった。この方法による配列決定を約2.9kbpのEcoR 1フラグメントの両方のストランドについて行った。
【０１２５】
ＤＮＡ配列決定の鋳型として更に利用するために、分離物pDAB2002からのプラスミドＤＮＡをBIGprepTMキットにより調製した。上記のようにして配列決定反応を行い、分析した。初期に、T3プライマー(pBS SK（+）塩基774-796:CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG)及びT7プライマー(pBS SK（+）塩基621-643:GCGCGTAATACGACTCACTATAG)を使用して隣接ベクター配列からインサートＤＮＡまて読み取る配列決定反応を開始した。プライマーの別の組(GZ4F:GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC;TH13:GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC;TH14:ATGTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACATAAC;及びLW-1-204:GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC)をつくって内部配列から開始し、これらをサブクローン化TcaC-ペプチドPCR産物の縮重オリゴヌクレオチド媒介配列決定により前もって決定した。配列決定の初期ラウンド中に生じたデータから、プライマーの新規な組を設計し、約5kbpのフラグメントの完全長をウォーク(walk)するのに使用した。合計55オリゴプライマーを使用して、連続配列の合計4832bpの同定を可能にした。
【０１２６】
pDAB2002のEcoR 1フラグメントインサートのＤＮＡ配列をpDAB2000/pDAB2001分離物の決定された配列の一部と組み合わせる場合、合計6005bpの連続配列を生じた（本明細書中、配列番号25として開示される）。長い読み取り枠を相当するアミノ酸に翻訳した場合、その配列はメチオニン残基（翻訳の開始）の直後に塩基19-75によりコードされたTcaBi Ｎ末端ペプチド（配列番号３として開示される）を明らかに示す。上流に潜在的リボソーム結合部位（塩基1-9）があり、下流に、TcaBi-PT158内部ペプチド（本明細書中、配列番号19として開示される）が塩基166-228でコードされる。更に下流に、同読み取り枠中に、塩基1738-1773で、TcaBi-PT108内部ペプチドをコードする配列（本明細書中、配列番号20として開示される）が存在する。また、同読み取り枠中に、塩基1897-1923で、TcaBiiＮ末端ペプチド（本明細書中、配列番号５として開示される）がコードされ、読み取り枠がヌクレオチド3586-3588にある翻訳終止コドンまで中断されないで存続する。
【０１２７】
TcaBi-PT108をコードする配列の末端とTcaBiiコード領域の開始の間のイン−フレーム(in-frame)終止コドンの欠如、及びTcaBiiコード領域の直ぐ上流の認識できるリボソーム結合部位の欠如は、ペプチドTcaBii及びTcaBiが配列番号25中の塩基対16で開始する3567bpの単一読み取り枠によりコードされ、おそらく後翻訳開裂により1189アミノ酸(131,586ダルトン;本明細書中、配列番号26として開示される)の単一の一次遺伝子産物から誘導されることを示す。TcaBiiＮ末端ペプチドに直ぐに先行するアミノ酸がペプチドTcaBiのＣ末端アミノ酸に相当する場合、TcaBii（627アミノ酸）の予想質量はSDS-PAGEにより観察されたサイズ(68kDa)より若干高く、70,814ダルトンである（本明細書中、配列番号28として開示される）。このペプチドは1881塩基対の連続ストレッチ（本明細書中、配列番号27として開示される）によりコードされるであろう。TcaBiの天然Ｃ末端はTcaBi-PT108のＣ末端に若干近くにあるものと考えられる。PT108の分子量［3.438kDaにのペプチドのＮ末端アミノ酸配列分析中に測定］は30アミノ酸のサィズを予測する。TcaBiコード領域のＣ末端［配列番号28の位置604にあるGlu］を指示するのにこのペプチドのサイズを使用して、TcaBiの誘導サイズは、更に実験上の観察と一致して、604アミノ酸または68,463ダルトンであることが測定される。
【０１２８】
1686塩基対のTcaBiiペプチドコード領域（本明細書中、配列番号29として開示される）の翻訳は60,789ダルトンの予想質量を有する562アミノ酸（本明細書中、配列番号30として開示される）のタンパク質を生じ、これは観察された61kDaと良く一致する。
潜在的リボソーム結合部位(塩基3633-3638)はtcaB読み取り枠の終止コドンの48bp下流に見られる。塩基3645-3677に、ペプチドTcaCのＮ末端をコードする配列（配列番号２として開示される）が見られる。このＮ末端ペプチドにより開始される読み取り枠は塩基6005まで中断されないで存続する（2361塩基対、本明細書中、配列番号31の最初の2361塩基対として開示される）。完全TcaCペプチド（見掛サイズ約165kDa;約1500アミノ酸）をコードする遺伝子(tcaC)は約4500bpを含むであろう。
また、コスミド26A5のクローン化EcoR 1フラグメントを含む別の分離物、E20.6を前記GZ4プローブ及びTcaBiプローブに対するその相同性により同定した。この株により宿されたプラスミド(pDAB2004、図２)のＤＮＡのEcoR 1消化産物のアガロースゲル分析は推定サイズ2.9、５、及び3.3kbpのインサートフラグメントを明らかにした。プラスミドpDAB2002の配列から指示されたプライマーから開始されたＤＮＡ配列分析は、pDAB2004の3.3kbpのEcoR 1フラグメントがpDAB2002に代表された5kbpのEcoR 1フラグメントに隣接して存在することを明らかにした。
【０１２９】
pDAB2002中に発見された2361塩基対読み取り枠はpDAB2004中の別の2094塩基［本明細書中、配列番号31の塩基対2362〜4458として開示される）について中断されないで存続する。親コスミド26A5 DNAを鋳型として使用するＤＮＡ配列分析がその読み取り枠の連続性を確認した。要するに、その読み取り枠(TcaC配列番号31)は4455塩基対を含み、かつ1485アミノ酸［本明細書中、配列番号32として開示される］のタンパク質(TcaC)をコードする。166,214ダルトンの計算分子サイズはTcaCペプチドの推定サイズ(165kDa)と一致し、誘導アミノ酸配列はTcaC N末端配列［配列番号２］について開示されたものと正確に適合する。
発見された配列中の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを設計するのに使用された配列番号17に相当するアミノ酸配列の欠如は、分離物GZ4及びHB14（これらは初期ライブラリースクリーンにおいてプローブとして使用された）中に見られるPCR産物の発生がその縮重プール中のプライマーの一つによる逆ストランドプライミングにより偶発的に生じたことを示す。更に、誘導タンパク質配列は本明細書中配列番号18として開示された内部フラグメントを含まない。これらの配列は、プラスミドpDAB2004がTcaCペプチドの完全コード領域を含むことを明らかにする。
【０１３０】
実施例９ TcbAiiペプチドをコードする遺伝子のフォトラブダス ゲノムライブラリーのスクリーニング
この実施例はTcbAiiペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡクローンを同定するのに使用した方法、その遺伝子の単離、及びその部分ＤＮＡ塩基配列の決定を記載する。
プライマー及びPCR反応 昆虫活性製剤のTcbAiiポリペプチドは約206kDaである。このペプチドのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１として開示される。このアミノ酸配列の一部をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの４種のプール（"フォワード（Forward）プライマー":TH-4、TH-5、TH-6、及びTH-7）を実施例８に記載されたようにして合成し、以下に示す。
【０１３１】
【表１２】
表１１．
0003657593.tif 000013
【０１３２】
加えて、内部ペプチド製剤(TcbAii-PT81)の一次配列（"ａ"）及び二次配列（"ｂ"）を決定し、夫々、本明細書中、配列番号23及び配列番号24として開示する。以下に示されるように、配列番号23のペプチドの−部をコードする配列の逆補体をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドの４種のプール("リバース(Re-verse)プライマー":TH-8、TH-9、TH-10及びTH-11)を同様に設計し、合成した。
【０１３３】
【表１３】
表１２．
0003657593.tif 000014
【０１３４】
これらのプライマーの組をPCR反応に使用して、実施例６で調製されたゲノム フォトラブダス・ルミネセンスW-14 DNAからTcbAiiをコードする遺伝子フラグメントを増幅した。AmpliWaxTMゲム(gems)並びにその他のパーキン・エルマー試薬及びプロトコルを使用して、全てのPCR反応を"ホット・スタート"技術を用いて行った。典型的には、MgCl2、dNTP、10ｘGeneAmpR PCR緩衝液II、及び、プライマーの混合物（全容積11μl）を、単一ワックスビードを含む管に添加した[10 x GeneAmpR PCR緩衝液IIは100mMは100mMのトリス-HCl、pH8.3、および500mMのKClを含む。管を２分間にわたって80℃に加熱し、冷却した。ワックスシールの上に10 x GeneAmpR PCR緩衝液II、DNA鋳型、及びAmpliTaqR DNAポリメラーを含む溶液を添加した。ワックスシールの融解及び熱サイクルによる成分の混合後に、最終反応条件は、50μlの容積、10mMのトリス-HCl、pH8.3、50mMのKCl、2.5mMのMgCl2、夫々200μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、1.25mMの単一フォワードプライマープール、1.25μMの単一リバースプライマープール、1.25単位のAmpliTAq DNAポリメラーゼ、及び170ngの鋳型ＤＮＡであった。
反応液をサーモサイクラー（実施例８と同様）に入れ、下記のプログラムで実験した。
【０１３５】
【表１４】
表１３．
0003657593.tif 000015
【０１３６】
縮重プライマープールを使用して、一連の増幅を三つの異なるアニーリング温度（55℃、60℃、65℃）で行った。65℃におけるアニーリングによる反応はアガロース電気泳動後に目視できる増幅産物を有していなかった。60℃のアニーリングレジメを有し、プライマーTH-5+TH-10を含む反応は、2.9kbpに相当する移動度を有する増幅産物を生じた。更に少ない量の2.9kbpの産物をプライマーTH-7+TH-10を用いるこれらの条件下で生じた。反応を55℃でアニールした場合、これらのプライマー対は更に多くの2.9kbpの産物を生じ、またこの産物をプライマー対TH-5+TH-8及びTH-5+TH-11により生じた。付加的な非常に不鮮明な2.9Kbpのバンドがプライマー対TH-7+TH-8、TH-9、TH-10、またはTH-11からの増幅産物を含むレーン中で見られた。
クローニング及びＤＮＡ配列決定に充分なPCR増幅産物を得るために、プライマーTH-5+TH-10を使用して10の別々のPCR反応を設定し、55℃のアニーリング温度で上記条件を使用して行った。全ての反応液をプールし、2.9kbpの産物を上記のようにしてアガロースゲルからQiaex抽出により精製した。
TcbAii内部ペプチドについて決定された付加的な配列が本明細書中配列番号21及び配列番号22として開示される。前記のように、これらのペプチドのアミノ酸配列の一部をコードする配列の逆補体に相当する縮重オリゴヌクレオチド(リバースプライマーTH-17及びTH-18)をつくった。
【０１３７】
【表１５】
表１４．
0003657593.tif 000016
【０１３８】
【表１６】
表１５
0003657593.tif 000017
【０１３９】
縮重オリゴヌクレオチドTH-18及びTH-17を、鋳型としてのフォトラブダス・ルミネセンスW-14 DNA及び5-(フォワード)プライマーとしてのTH-4、TH-5、TH-6、またはTH-7を用いる増幅実験に使用した。これらの反応は夫々約4kbp及び4.5kbpの産物を増幅した。これらのＤＮＡをアガロースゲルからナイロン膜に移し、TH-5+TH-10プライマー対により増幅された2.9kbpの産物から調製された32P-標識プローブ（上記のとおり）とハイブリッドを形成した。4kbp及び4.5kbpの増幅産物の両方が2.9kbpのプローブに強くハイブリッドを形成した。これらの結果を使用して図３に示されたようなTcbAii内部ペプチド配列を規制する地図をつくった。プライマー間のおよその距離を図３にヌクレオチド数で示す。
【０１４０】
2.9kbpのTcbAiiをコードするフラグンントのＤＮＡ配列
精製した2.9kbpのフラグメント（先に調製した）約200ngをエタノールで沈殿させ、水17mlに溶解した。25pモルのTH-5プールをプライマーとして用いて、この半分を配列決定鋳型として使用し、別の半分をTH-10プライミングの鋳型として使用した。配列決定反応は実施例８に示されたとおりであった。TH-10プライマープールを使用して、信頼できる配列を生じなかった。しかしながら、TH-5プライマープールとの反応は、以下に開示された配列を生じた。
0003657593.tif 000018
この配列に基いて、配列決定プライマー(TH-21、5'-CCGGGCGACGTTTATCTAGG-3')を設計し、補体塩基120-139を反転し、ゲル精製した2.9kbpのTcbAiiをコードするPCRフラグメントの5'末端（即ち、TH-5末端）に向かって重合を開始した。決定された配列を以下に示し、TcbAii配列番号１の生化学的に決定されたＮ末端ペプチド配列と比較する。
【０１４１】
TcbAii2.9kbp PCRフラグメント配列確認
［下線を施したアミノ酸＝縮重オリゴヌクレオチドによりコードされる］
0003657593.tif 000019
生化学的に決定されたアミノ酸配列に対する誘導アミノ酸配列の相同性から、2.9kbp PCRフラグメントがTcbAコード領域に相当することが明らかである。次いでこの2.9kbpフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用してTcbAiiをコードする遺伝子を含むコスミドについて実施例８で調製されたフォトラブダスW-14ゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【０１４２】
Photorhabdusコスミドライブラリーのスクリーニング
実施例８に記載されたようなベーリンガー・マンハイムのハイ・プライム標識キットを使用して、2.9kbpのゲル精製したPCRフラグメントを32Pで標識した。コスミドライブラリーからの約800のコロニーのレムナント(remnant)を含むフィルターを前記（実施例８）のようにしてスクリーニングし、陽性クローンを単離コロニーについてストリーキングし、再度スクリーニングした。３種のクローン(8A11、25G8、及び26D1)は幾つかのスクリーニング工程及び結合工程により陽性結果を生じた。TcbAii特異性プローブのハイブリダイゼーションが実施例８で同定された４種のコスミド（これらはtcaB遺伝子及びtcaC遺伝子を含む）のいずれでも観察されなかった。コスミド8A11、25G8、及び26D1からのＤＮＡを制限酵素BglII、EcoRIまたはHindIII（単独または互いの組み合わせ）で消化し、フラグメントをアガロースゲルで分離し、実施例８に記載されたようにしてナイロン膜に移した。
【０１４３】
膜を4.5kbpフラグメント（プライマーTH-5+TH-17によるPhotorhabdusゲノムＤＮＡの増幅により生成した）から調製された32P標識プローブとハイブリッドを形成した。コスミドＤＮＡ8A11及び26D1から生じたパターンは同膜について同様に切断されたゲノムＤＮＡで生じたパターンと同一であった。コスミド8A11及び26D1はゲノムTcbAiiをコードする遺伝子座の正確な代表であることが結論される。しかしながら、コスミド25G8はゲノムＤＮＡよりわずかに大きい単一BglIIフラグメントを有する。これはベクター内のインサートの位置決めに由来し得る。
【０１４４】
tcbAをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
コスミド26D1の膜ハイブリダイゼーション分析は、4.5kbpプローブが単一の大きいEcoR 1フラグメント（9kbpより大きい）にハイブリッドを形成することを明らかにした。このフラグメントをゲル精製し、実施例８に記載されたようにしてpBC KS(+)のEcoR 1部位につないでプラスミドpBC-S1/R1を生成した。実施例８に記載された操作を使用して、このプラスミドのインサートＤＮＡの部分ＤＮＡ配列を隣接ベクター配列からの"プライマーウォーキング"により決定した。更に別の配列を先に決定された配列から設計された新規なオリゴヌクレオチドからの延長により生じた。別法により同定されたtcbA遺伝子について決定されたＤＮＡ配列（下記の実施例12に記載されたように本明細書中配列番号11として開示される）と比較した時に、完全相同性がヌクレオチド1-272、319-826、2578-3036、及び3068-3540(合計塩基=1712)について見られた。両方のアプローチがTcbAiiペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを同定するのに使用し得ることが結論された。
【０１４５】
tcbA遺伝子の誘導アミノ酸配列の分析
配列番号11として同定されたＤＮＡフラグメントの配列は、誘導アミノ酸配列が本明細書中配列番号12として開示されるタンパク質をコードする。幾つかの特徴がTcbAiiタンパク質をコードする配列としてのその遺伝子の同定を証明する。  TcbAiiＮ末端ペプチド(配列番号１:Phe Ile Gln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala)はアミノ酸88-100としてコードされる。TcbAii内部ペプチドTcbAii-PT81(a)（配列番号23）はアミノ酸1065-1077としてコードされ、TcbAii-PT81(b)（配列番号24）はアミノ酸1571-1592としてコードされる。更に、内部ペプチドTcbAii-PT56（配列番号22）はアミノ酸1474-1488としてコードされ、内部ペプチドTcbAii-PT103(配列番号24)はアミノ酸1614-1639としてコードされる。この遺伝子はPhotorhabdus・luminescens株W-14の殺虫剤タンパク質製剤から単離されるようなTcbAiiペプチドをコードする真正クローンであることが自明である。
【０１４６】
ペプチドTcbAiiとして単離されたタンパク質は、更に長いペプチドの開裂から誘導される。この証拠は、TcbAiiＮ末端ペプチド配列番号１をコードするヌクレオチドが更に長い読み取り枠の261塩基(配列番号11)(87Ｎ末端近位アミノ酸をコードする)により先行されるという事実により与えられる。この読み取り枠は大きいペプチドTcbAのＮ末端配列に相当し、かつ本明細書中配列番号16として開示されるアミノ酸配列Met Gln Asn Ser Leuをコードするヌクレオチドで開始する。TcbAはTcbAiiの前駆体タンパク質であると考えられる。
【０１４７】
tcbA遺伝子、tcaB遺伝子及びtcaC遺伝子の関係
tcaB遺伝子及びtcaC遺伝子は密接に関連し、単一ｍＲＮＡとして転写し得る（実施例８）。tcbA遺伝子は、tcaBクラスター及びtcaCクラスターを宿しているコスミドと明らかに重ならないコスミドで産生される。何となれば、夫々のゲノムライブラリースクリーンが異なるコスミドを同定したからである。しかしながら、tcbA遺伝子とのtcaB遺伝子及びtcaC遺伝子によりコードされたアミノ酸配列の比較は相同性の実質的な程度を明らかにする。アミノ酸保存（マックベクターTM配列分析ソフトウェアのタンパク質アラインメントモード、スコアリングマトリックスpam250、ハッシュ値=2;コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ，R-ochester，NY）が図４に示される。図４中の夫々のパネルのスコアラインについて、上カラット（＾）は相同性または保存アミノ酸変化を示し、また下カラット（ｖ）は非相同性を示す。
【０１４８】
この分析は、残基1739から1894までのTcbAペプチドのアミノ酸配列がTcaBiペプチドのアミノ酸441-603（P8の全627アミノ酸の162;配列番号28）に高度に相同であることを示す。加えて、TcbAアミノ酸1932-2459の配列はペプチドTcaBiiのアミノ酸12-531（全562アミノ酸の520;配列番号30）に高度に相同である。TcbAペプチド（配列番号12）が2505アミノ酸を含むことを考慮すると、それのＣ近位末端にある合計684アミノ酸(27％)はTcaBiペプチドまたはTcaBiiペプチドに相同であり、その相同性が推定TcaBプレプロテイン（配列番号26）の配置に共直線状に配置される。TcbA相同性中のサイザブル(sizeable)ギャップはTcaBプレプロテインのTcaBi部分とTcaBii部分の間の結合と一致する。明らかに、TcbA遺伝子産物及びTcaB遺伝子産物は進化的に関連し、それらがPhotorhabdus中で或る種の共通の機能を共有することが提案される。
【０１４９】
実施例10 Photorhabdusブロース中の亜鉛−メタロプロテアーゼの特性決定：プロテアーゼ抑制、分類、及び精製
プロテアーゼ抑制アッセイ及び分類アッセイ：基質として水に溶解したFITC-カゼイン（0.08％最終アッセイ濃度）を使用して、プロテアーゼアッセイを行った。タンパク質分解反応をPhotorhabdusブロース25μlを含む適当な緩衝液中で25℃で１時間行った(合計反応容積150μl)。また、サンプルをジチオスレイトールの存在下及び不在下で分析した。インキュベーション後、等容積の12％のトリクロロ酢酸を添加して未消化のタンパク質を沈殿させた。0.5時間の沈殿及びその後の遠心分離後に、上澄み100μlを96ウェル・ミクロタイタプレートに入れ、その溶液のpHを等容積の4NのNaOHの添加により調節した。次いで夫々485nm及び538nmの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンIIフルオロメトリー・プレートリーダーを使用してタンパク質分解を定量した。プロテアーゼ活性をpH5.0-10.0の範囲で0.5単位の増分で試験した。下記の緩衝液を50mMの最終濃度で使用した：酢酸ナトリウム(pH5.0-6.5);トリス-HCl(pH7.0-8.0);及びビス−トリスプロパン（pH8.5-10.0）。観察された一種以上のプロテアーゼのクラスを同定するために、粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビター(最終濃度0.5μg/μl)で処理し、次いで上記基質を使用してpH8.0でプロテアーゼ活性について試験した。使用したプロテアーゼインヒビターはE-64（Ｌ−トランス−エポキシサクシニルロイシルアミノ［４−，−グアニジノ］−ブタン）、３，４−ジクロロイソクマリン、ロイペプチン、ペプスタチン、アマスタチン、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)及び1,10フェナントロリンを含んでいた。
【０１５０】
pH範囲にわたって行われたプロテアーゼアッセイは、実際に約8.0のpHで最大活性を示す一種以上のプロテアーゼが存在することを明らかにした(表16)。DTTの添加はプロテアーゼ活性に影響しなかった。次いで粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビターで処理した（表17）。上記インヒビターによる粗ブロースの処理は１，10フェナントロリンが50μgの最終濃度で添加された時に全プロテアーゼ活性の完全な抑制を生じることを明らかにした。IC50は2mg/mlの粗ブロース溶液100μl中5μgであった。これらのデータは、Photorhabdusブロース中に見られる最も多い一種以上のプロテアーゼが酵素の亜鉛−メタロプロテアーゼクラスからのものであることを示す。
【０１５１】
【表１７】
表１６．Photorhabdus luminescens （株W-14) の１日目の産生に見られるプロテアーゼ活性に関するpHの効果
0003657593.tif 000020
a.Flu.単位＝蛍光単位（最大＝約28,000; バックグラウンド＝約2200）
b.％はpH8.0 における最大に対する活性である。
【０１５２】
【表１８】
表１７．Photorhabdus luminescens （株W-14) の１日目の産生に見られるpH８におけるプロテアーゼ活性に関する異なるプロテアーゼインヒビターの効果
0003657593.tif 000021
a.修正Flu.単位＝蛍光単位−バックグラウンド(2200 flu.単位）
b.抑制％はpH8.0 におけるプロテアーゼ活性に対するものである
c.インヒビターをメタノールに溶解した。
d.インヒビターをDMSOに溶解した。
【０１５３】
Photorhabdus毒素について実施例５に記載されたようにして透析された10-80％の硫酸アンモニウムを50mMのNa2PO4、pH7.0で平衡にされたＱセファロースカラムに適用することにより、亜鉛−メタロプロテアーゼの単離を行った。徹底的な洗浄後に、0-0.5MのNaCl勾配を使用して毒素タンパク質を溶離した。生物活性及びタンパク質の大半を0.15〜0.45MのNaClで溶離した。しかしながら、タンパク質分解活性の大半が0.25-0.35MのNaClフラクション中に存在し、若干の活性が0.15-0.35MのNaClフラクション中に存在することが観察された。0.25-0.35MのNaClフラクションのSDS PAGE分析は約60kDaの主要ペプチドバンドを示した。0.15-0.25MのNaClフラクションは同様の60kDaのバンドを含んでいたが、低い相対タンパク質濃度であった。スペロース12HR 16/50カラムを使用するこのフラクションのその後のゲル濾過はSDS PAGE分析により主として（合計の染色タンパク質の90％より大）58.5kDaバンドを含む57.5kDaで移動する主要ピークを生じた。上記の種々のプロテアーゼインヒビターを使用するこのフラクションの付加的な分析は、プロテアーゼが亜鉛−メタロプロテアーゼであることを測定した。醗酵１日目のPhotorhabdusブロース中に存在するプロテアーゼ活性の殆ど全てが約58kDaの亜鉛−メタロプロテアーゼに相当した。
【０１５４】
一種以上の亜鉛−メタロプロテアーゼの第二の単離において、３日間にわたって増殖されたW-14Photorhabdusブロースを採取し、Schrrlidt,T.M.，Bleakley,B.及びNealson,K.M．1988に記載されたようにしてゼラチンと組み合わされたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用してプロテアーゼ活性を視覚化した。SDSランニングゲル(5.5x8cm)を、0.1％のゼラチン最終濃度(バイオラドEIA銘柄試薬;Richmond CA)を水に溶解後に混入した12.5％のポリアクリルアミド（アクリルアミド／ビス−アクリルアミドの40％原液;シグマ・ケミカル社，St.Louis，MO）でつくった。SDS-スタッキングゲル(1.0x8cm)を0.1％のゼラチンとまた組み合わされた５％のポリアクリルアミドでつくった。典型的には、試験すべきタンパク質2.5μgをジチオスレイトール(DTT)を含まないSDS-PAGE装填緩衝液0.03ml中で希釈し、ゲルに装填した。タンパク質をSDS運転緩衝液(Laemmli,U.K.1970，Nature 227，680)中で０℃で8mAで電気泳動にかけた。
【０１５５】
電気泳動が完結した後、ゲルを２時間にわたって2.5％(v/v)のトリトンX-100中で洗浄した。次いでゲルを１時間にわたって37℃で0.1Mのグリシン(pH8.0)中でインキュベートした。インキュベーション後、ゲルを固定し、メタノール−酢酸−水(30:10:60、vol./vol./vol.;シグマ・ケミカル社)中0.1％のアミドブラックで一夜にわたって染色した。プロテアーゼ活性をタンパク質分解及びその後のとり込まれたゼラチンの拡散のために暗色のアミドブラック染色されたバックグラウンドに対する明るい領域として視覚化した。58kDa、41kDa、及び38kDaのタンパク質分解活性により生じた少なくとも三つの異なるバンドが観察された。
【０１５６】
W-14の３日培養ブロース中の異なるプロテアーゼの活性アッセイを、基質としての水に溶解されたFITC-カゼイン(0.02％の最終アッセイ濃度)を使用して行った。タンパク質分解実験を37℃で0-0.5時間にわたって0.1Mのトリス-HCl(pH8.0)中で0.15mlの全容積中の異なるタンパク質フラクションで行った。反応を水に溶解された12％のトリクロロ酢酸(TCA)の等容積の添加により停止した。室温で0.25時間のインキュベーション後に、サンプルを10,000xgで0.25時間にわたって遠心分離し、アリコート0.10mlを除去し、96ウェル・ミクロタイタプレートに入れた。次いでその溶液を等容積の2Nの水酸化ナトリウムの添加により中和し、続いて夫々485nm及び538nmの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンIIフルオロメトリープレートリーダーを使用して定量した。FITC-カゼインを異なるプロテアーゼ濃度で37℃で0〜10分間使用して、活性測定を行った。活性の単位を1000の蛍光単位／分を生じるのに必要とされる酵素の量と任意に定義し、また比活性をプロテアーゼ1mg当たりの単位と定義した。
【０１５７】
２種の亜鉛−メタロプロテアーゼインヒビター；１，10フェナントロリン及びＮ−（ａ−ラムノピラノシルオキシヒドロキシホスフィニル）−Leu-Trp（ホスホルアミドン）を使用して抑制研究を行い、夫々100％のエタノール及び水に溶解したインヒビターの原液を使用した。原液濃度は典型的には１，10フェナントロリン及びホスホルアミドンの夫々について10mg/ml及び5mg/mlであり、インヒビターの最終濃度は反応当たり0.5-1.0mg/mlであった。全ての亜鉛メタロプロテアーゼのインヒビターである１，10フェナントロリンによる３日目のW-14粗ブロースの処理は全てのプロテアーゼ活性の完全な排除をもたらし、一方、サーモリシン様プロテアーゼ(Weaver,L.H.，Kester,W.R.,及びMatthews,B.W．1977．J．Mol.Biol．114，119-132)のインヒビターであるホスホルアミドンによる処理はプロテアーゼ活性の約56％低下をもたらした。残留タンパク質分解活性を追加のホスホルアミドンで更に低下することができなかった。
【０１５８】
３日目のW-14Photorhabdusブロースのプロテアーゼを以下のようにして精製した。アミコンM-12濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型SIY100を使用して、ブロース4.0リットルを濃縮した。アミコンM-12濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型SIY100を使用して、サイズ100kDa未満の天然タンパク質を有するフロースルー物質(3.8L)を0.375Lに濃縮した。レテンテート(retentate)物質は10-100KDaのサイズの範囲のタンパク質を含んでいた。この物質を、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム(Framigton、MA)ボロスR50HQ強陰イオン交換パッキングを詰め込まれたファーマシアHR16/10カラムに装填した。タンパク質を5ml/分の流量でカラムに装填し、続いてA280=0.00まで未結合タンパク質を洗浄した。その後、40分で0-1.0MのNaClのNaCl勾配を使用して7.5ml/分の流量でタンパク質を溶離した。フラクションを上記のようにしてプロテアーゼ活性について分析し、活性フラクションをプールした。タンパク質分解活性フラクションを50％(v/v)の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で希釈し、10mMのリン酸ナトリウムで平衡にされたファーマシアHR10/10モノＱカラムに装填した。カラムをA280=0.00まで緩衝液で洗浄した後、１時間にわたって0-0.5MのNaClのNaCl勾配を使用して2.0ml／分の流量でタンパク質を溶離した。
【０１５９】
フラクションをプロテアーゼ活性について分析した。最大量のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールした（ホスホルアミドン感受性活性は下記のように41/38kDaのプロテアーゼのためである）。これらのフラクションは0.15-0.25MのNaClの範囲で溶離することがわかった。また、優性のホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ活性を含むフラクション、58kDaのプロテアーゼをプールした。これらのフラクションは0.25-0.35MのNaClの範囲で溶離することがわかった。次いでホスホルアミドン感受性プロテアーゼフラクションをミリポア・ウルトラフリーR-15遠心分離フィルター装置バイオマックス-5K NMWL膜を使用して0.75mlの最終容積に濃縮した。この物質を、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)/0.1MのNaCl中で平衡にされたファーマシア・セファデックスG-50で詰め込まれたファーマシアHR10/30カラムに0.5ml/分の流量で適用した。次いで最高のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールし、ミリポア・ウルトラフリーR-15遠心分離フィルター装置バイオマックス-50K NMWL膜で遠心分離した。上記のタンパク質分解活性分析は、この物質がホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性のみを有することを示した。ホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ、58kDaのタンパク質をプールし、続いて、ミリポア・ウルトラフリーR-15遠心分離フィルター装置バイオマックス-50K NMWL膜中で濃縮し、ファーマシア・スーパーデックス-75カラムで更に分離した。プロテアーゼを含むフラクションをプールした。
【０１６０】
精製された58kDa及び41/38kDaの精製されたプロテアーゼの分析は、両方の型のプロテアーゼが１，10フェナントロリンで完全に抑制されるが、41/38kDaのプロテアーゼのみがホスホルアミドンで抑制されることを明らかにした。粗ブロースの更なる分析は、１日目のW-14ブロースのプロテアーゼ活性が41/38kDaのプロテアーゼのために全プロテアーゼ活性の23％を有し、３日目のW-14ブロースで44％に増大することを示した。
タンパク質純度を試験し、アミノ末端配列を得るための通常のSDS-PAGE分析を、インテグレーテッド・セパレーション・システムズ(Natick，MA)から購入した4-20％の勾配ミニプラス・セプラゲルズを使用して行った。アミノ末端配列決定すべきタンパク質を下記の精製後にPVDF膜にブロットし(プロブロットTM膜;アプラィド・バイオシステムズ，Foster City，CA)、0.1％のアミドブラックで視覚化し、切除し、配列決定のためにケンブリッジ・プロケム(Cambridge，MA)に送った。
【０１６１】
３日経過したW-14ブロースからの58kDa（配列番号45）及び41/38kDa（配列番号44）のプロテアーゼの演繹アミノ末端配列は夫々DV-GSEKANEKLK（配列番号45）及びDSGDDDKVTNTDIHR（配列番号44）であった。
41/38kDaのプロテアーゼの配列決定は幾つかのアミノ末端を明らかにし、夫々の末端がタンパク質分解により除去される付加的なアミノ酸を有する。38kDa及び41kDaのポリペプチドに関する一次配列、二次配列、三次配列及び四次配列の試験は先に示された配列の演繹を可能にし、これらの２種のプロテアーゼが相同であることを明らかにした。
【０１６２】
実施例11、パートＡ
TcbAペプチドをコードする遺伝子に関する抗体の使用によるPhotorhabdusゲノムライブラリーのスクリーニング
上記配列決定と平行して、好適な探査及び配列決定をTcbAiiペプチド（配列番号１）に基いて行った。上記実施例１及び２に記載されたようにしてバクテリア培養ブロースを調製し、その毒素を精製することにより、この配列決定を行った。
ゲノムＤＮＡをグレースの昆虫組織培地中で増殖したPhotorhabdus・luminescens株W-14から単離した。バクテリアを250mlの三角フラスコ中で28℃で250rpmで約24時間にわたって培地５ml中で増殖した。培地100mlからのバクテリア細胞を5000xgで10分間にわたってペレットにした。上澄みを捨て、次いで細胞ペレットをゲノムＤＮＡ単離に使用した。
Ausubel(上記文献)の節2.4.3に記載陛れたCTAB方法の改良を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。工程６中に"バクテリアゲノムＤＮＡの大規模CsCl prep"と題する節に従った。この時点で、付加的なクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)抽出を行い、続いてフェノール／クロロホルム／イソアミル(25:24:1)抽出工程及び最後のクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)抽出を行った。
【０１６３】
ＤＮＡを0.6容積のイソプロパノールの添加により沈殿させた。沈殿したＤＮＡをフッキングし、曲げたガラス棒の端部のわまりに巻付け、最終洗浄液としての70％のエタノールに素早く浸漬し、TE緩衝液３mlに溶解した。
280/260nmにおける光学密度により推定したＤＮＡ濃度は約２mg/mlであった。
このゲノムＤＮＡを使用して、ライブラリーを調製した。
ゲノムＤＮＡ約50μgをSau3A1で部分消化した。次いでNaCl密度勾配遠心分離を使用して部分消化されたＤＮＡフラグメントをサイズ分別した。アガロースゲル電気泳動により測定して12kb以上の平均サイズを有するＤＮＡフラグメントを含むフラクションをプラスミドBluScript(ストラタゲン，La Jolla，California)につなぎ、E.coli DH5αまたはDHB10株に形質転換した。
別に、そのタンパク質の精製アリコートをタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてウィスコンシン大学(Madison)にあるバイオテクノロジーハイブリドーマセンターに送った。送られた物質は65℃で変性された天然バンド１及び２を含むHLPC精製フラクションであり、その20μgを４匹のマウスの夫々に注射した。未免疫マウスからの脾臓細胞を安定なミエローマ細胞系と融合した後、安定なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系を回収した。モノクローナル抗体をハイブリドーマから回収した。
【０１６４】
別に、天然アガロースゲル精製バンド１（実施例１を参照のこと）を採取することによりポリクローナル抗体を生じ、次いでそのタンパク質を使用してニュージーランド白ウサギを免疫した。バンドを天然アガロースゲルから切除し、ゲル片を65℃に素早く加熱してアガロースを融解し、アジュバントで直ちに乳化することによりタンパク質を調製した。フロイント完全アジュバントを一次免疫化に使用し、フロイント不完全を１ケ月間隔で３回の追加の注射に使用した。夫々の注射について、タンパク質50〜100マイクログラムを含む乳化バンド１約0.2mlを多皮下注射によりウサギの背中に送出した。最初の注射の10日後に血清を得、追加の採血を３週間にわたって毎週行った。血清補体を56℃で15分間加熱することにより不活化し、次いで-20℃で貯蔵した。
次いでモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用して、エピトープにより検出し得る抗原の発現についてゲノムライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンをニトロセルロースフィルターコロニーリフトで検出した。陽性クローンのイムノブロット分析を試みた。
【０１６５】
イムノブロット及びサザン分析の両方により特定されたクローンの分析はクローンの５種のクラスの暫定的な分析をもたらした。
クローンの第一クラス中に、ここでTcbAiiと称されるペプチドをコードする遺伝子があった。この遺伝子の完全ＤＮＡ配列(TcbA)を得た。それが配列番号11として示される。その配列が配列番号１の内部配列をコードするという確認は、配列番号11の読み取り枠により生じた演繹アミノ酸配列からアミノ酸番号88にある配列番号１の存在により実証される。これは配列番号12を参照することにより確認でき、これは配列番号11により生じた演繹アミノ酸配列である。
毒素ペプチドの第二クラスはTcaBi、TcaBii及びTcaCと上記されたセグメントを含む。ポリクローナル抗血清によるライブラリーのスクリーニング後に、毒素遺伝子のこの第二クラスを異なるサイズのタンパク質を産生する幾つかのクローンにより同定し、これらの全てがイムノブロットでポリクローナル抗体と交差反応し、またサザンブロットでＤＮＡ相同性を共有することがわかった。配列比較は、それらが上記TcaB及びTcaCと称される遺伝子複合体に属することを明らかにした。
【０１６６】
また、抗体毒素クローンの三つのその他のクラスをポリクローナルスクリーンで単離した。これらのクラスはポリクローナル抗体と交差反応するタンパク質を産生し、またサザンブロッティングにより測定されるようにこれらのウラスとＤＮＡ相同性を共有した。これらのクラスがクラスIII、クラスIV及びクラスＶと称された。また、クラスＩ、II、III、及びIVと交差反応したモノクローナルを同定することが可能であった。これは、全てが高いタンパク質相同性の領域を有することを示唆する。こうして、P.luminescens細胞外タンパク質遺伝子は進化的に関連している遺伝子のファミリーに相当する。
この生物中に含まれる毒素ペプチドに進化的に関連する変化があり得るという概念を更に押し進めるために、二つのアプローチを試みて関連タンパク質の存在についてP.luminescensのその他の株を試験した。これをゲノムＤＮＡのPCR増幅並びにポリクローナル抗体及び及びモノクローナル抗体を使用するイムノブロット分析の両方により行った。
結果は、関連タンパク質がP.luminescens株WX-2、WX-3、WX-4、WX-5、WX-6、WX-7、WX-8、WX-11、WX-12、WX-15及びW-14により産生されることを示す。
【０１６７】
実施例11、パートＢ
クラスIII毒素クローン-tccの配列及び分析
更なるＤＮＡ配列決定を実施例11、パートＡに記載されたクラスIII E.coliクローンから単離されたプラスミドについて行った。ヌクレオチド配列はこのゲノム遺伝子座で三つの近くに結合された読み取り枠であることが示された。この遺伝子座をtccと称し、三つの読み取り枠をtccA配列番号56、tccB配列番号58及びtccC配列番号60と称する（図6B）。
tccA読み取り枠からの演繹アミノ酸は、その遺伝子が105,459Daのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をTccAと称した。このタンパク質の最初の12アミノ酸は、毒素複合体の一部として先に同定された、108kDaのタンパク質、配列番号７から得られたＮ末端配列と適合する。
tccB読み取り枠からの演繹アミノ酸は、この遺伝子が175,716Daのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をTccBと称した。このタンパク質の最初の11アミノ酸は、185kDaの推定分子量を有するタンパク質、配列番号８から得られたＮ末端配列と適合する。
tccCの演繹アミノ酸配列は、この読み取り枠が111,694Daのタンパク質をコードすることを示し、そのタンパク質産物をTccCと称した。
【０１６８】
実施例12
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の特性決定
本明細書に記載されたコレクションがrhotorhabdus株を含むことを証明するために、これらの株をPhotorhabdusの特徴であり、かつそれをその他の腸内細菌科及びキセノラブダスspp.(Farmer,J.J.1984．Bergey's Manual of Systemlc Bacte-riology，1巻，510-511頁(KreigN.R．及びHolt,J.G．編集)．Williams&Wilkins,Baltimore.;Akhurst及びBoemare，1988，Boefrlareら，1993)から区別する認識された微生物学的形質に関して評価した。これらの特徴的な形質は以下のとおりである。グラム染色陰性ロッド、幅0.5-2μm及び長さ2-10μmの生物サイズ、赤色／黄色のコロニー着色、結晶性封入体の存在、カタラーゼの存在、硝酸塩を還元できないこと、生物発光の存在、成長培地から色素を吸収できること、プロテアーゼ産生について陽性、37℃未満の成長温度範囲、嫌気性条件下の生存及び積極的な運動（表18）。基準のエシェリキア・コリ株、キセノラブダス株及びPhotorhabdus株を比較のために全ての試験に入れた。総合の結果は、全ての株が腸内細菌科及びPhotorhabdus属の一部であることと合致する。
【０１６９】
ルミノメーターを使用して夫々の株の生物発光を証明し、発色の定量的かつ相対的測定を得た。相対的な発光単位の測定について、夫々の株からのブロース（細胞及び培地）を培養液中の接種後の三つの時間間隔（６、12、及び24時間）で測定し、バックグラウンド明度（未接種の培地及び水）と比較した。種々のブロースからの発光の測定の前に、シパー(sipper)セルを使用するギルフォード・システムズ(Ob-erlin，OH)スペクトロメーター中で吸光度(560nM)を測定することにより細胞密度を確かめた。次いで明度を測定する前に適当な希釈を行った（光学密度を1.0単位に基準化するため）。次いで希釈したブロースのアリコートをキュベット（夫々300μl）に入れ、バイオーオービット1251ルミノメーター(Bio-Orbit Oy，Twiku，Finland)中で読み取った。夫々のサンプルに関する組込み時間は45秒であった。サンプルを連続的に混合（じゃま板付きキュベット中で回転させた）し、その間に読み取って酸素利用能を得た。陽性試験をバックグラウンドルミネセンスの５倍以上（約５−10単位）であると決めた。加えて、コロニー明度を写真フィルムオーバーレイで検出し、暗室中の適合後に目視で検出した。夫々の株のグラム染色特性を、グラム染色コントロールスライド(フィッシャー・サイエンティフィック，Pitts-burgh，PA)と一緒に使用した市販のグラム染色キット(BBL，Cockeysville，MD)で確かめた。
【０１７０】
次いでツァイス顕微鏡(Carl Zeiss，Germany)100Xオイル浸漬対物レンズ（10X接眼倍率及び2X本体倍率）を使用して顕微鏡評価を行った。生物サイズ、細胞の記載及び封入体（対数期増殖後の封入体）に関する個々の株の顕微鏡試験を、オイル浸漬による湿潤取付けスライド（10X接眼倍率、2X本体倍率及び40X対物倍率）及びマイクロメーターを含む位相差顕微鏡（Akhurst,R.J.及びBoemare,N.E．1990．Entomopathogenic Nematodes in Biological Control(Gaugler,R．及びKaya，H.編集)．75-90頁．CRC Press,Boca Raton,USA.;Baghdi-guian S.，Boyer-Gig1ioM.H.，Thaler，J.O.，Bonnot G.，Boemare,N．1993．Biol．Cell 79，177-185）を使用して行った。コロニー着色をラベル指示により調製されたバクト栄養寒天(ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI)に接種後に観察した。インキュベーションが28℃で起こり、５−７日後に記載を生じた。酵素カタラーゼの存在について試験するために、試験生物のコロニーを栄養寒天プレートから小さいプラグで除去し、ガラス試験管の底部に入れた。家庭用過酸化水素溶液１mlを管の側面を下に穏やかに添加した。気泡（推定上、酸素）が直ちにまたは５秒以内に現れた時に陽性反応を記録した。
【０１７１】
また、未接種栄養寒天及び過酸化水素溶液の対照を試験した。硝酸塩還元について試験するために、夫々の培養物をバクトニトレートブロース［ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI］10mlに接種した。28℃で24時間のインキュベーション後に、亜硝酸塩生成を２滴のスルファニル酸試薬及び２滴のα−ナフチルアミン試薬の添加により試験した（ジフコ・マニアル、第10編、ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI，1984を参照のこと）。明瞭なピンク色または赤色の発生が硝酸塩からの亜硝酸塩の生成を示す。成長培地から色素を吸収する夫々の株の能力を色素ニュートラル・レッドを含むバクト・マッコンキィ寒天；色素ブロモチモール・ブルーを含むバクト・タージトール−７寒天及び色素エオシン−Ｙを含むバクトEMB寒天（ジフコ・ラボラトリーズ，Detrolt，MIからの寒天、全てをラベル指示に従って調製した）で試験した。これらの培地への接種後に、色素吸収を28℃で５日のインキュベーション後に記録した。これらの後者の培地における成長が腸内細菌科の員に特徴的である。夫々の株の運動性を、ラベル指示に従って調製されたバクト運動性試験培地（ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI）の溶液を使用して試験した。バット−スタブ(butt-Stab)接種を夫々の株を用いて行い、運動性を接種物のラインから広がる成長の拡散ゾーンにより巨視的に判断した。多くの場合、運動性をまた湿潤取付けスライドのもとに培養液から顕微鏡で観察した。
【０１７２】
夫々の株に関する生化学的栄養評価を、BBLエンテロチューブII（ベントン、ディキンソン、ドイツ）を使用して行った。インキュベーションを28℃で５日おこなった以外は製品指示に従った。結果はPhotorhabdusに関する先の引用論文と一致した。プロテアーゼの産生を、ラベル指示に従ってつくられたバクトゼラチン（ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI）プレートを使用してゼラチンの加水分解を観察することにより試験した。培養物を接種し、プレートを28℃で５日間インキュベートした。異なる温度における成長を評価するために、寒天プレート［脱イオン水中２％のバクト寒天（ジフコ、Detroit，MI）を含む２％のプロテオースペブトン＃３］を接種物の共通の源からストリーキングした。プレートをネスコRフィルムでシールし、３週間までにわたって20℃、28℃及び37℃でインキュベートした。37℃で成長を示さないプレートは28℃のインキュベーターに１週間移した後に細胞生存度を示さなかった。Photorhabdus株に関する酸素要求を下記の方法で試験した。液体チオグリコレートブロース培地（ジフコ、Detroit，MI）へのバット−スタブ接種を行った。管を室温で１週間インキュベートし、次いで培養物を成長の型及び程度について試験した。指示薬レサズリンは培地酸化のレベルまたは好気生活ゾーンを示す（ジフコ・マニュアル、第10編、ジフコ・ラボラトリーズ，Detroit，MI）。試験したPhotorhabdus株について得られた成長ゾーン結果は条件的嫌気性微生物の結果と一致した。
【０１７３】
【表１９】
表１８ホトルハブダス株の分類学的形質
評価した形質*
0003657593.tif 000022
【０１７４】
【表２０】
表１８．つづき
0003657593.tif 000023
*  -  A=グラム染色、B=結晶性封入体、C=生物発光性、D=細胞形態、E=運動性、F=硝酸塩還元、G=カタラーゼの存在、H=ゼラチン加水分解、I=色素吸収、J=着色、K=EMB寒天における成長、L=マッコンキィ寒天における成長、M=タージトール-7寒天における成長、N=条件的嫌気性、O=20℃における成長、P=28℃における成長、Q=37度における成長、ａ：＋ ＝形質について陽性、- ＝形質について陰性，rd=棒状、S=属ディスクリプター内のサイズ、RO=赤色-オレンジ、LR=明るい赤色、R=赤色、O=オレンジ、Y=黄色、T=褐色、LY=明るい黄色、YT=黄褐色およびLO=明るいオレンジについて陽性または陰性
【０１７５】
細胞脂肪酸分析は属レベル及び種レベルでバクテリア特性決定について認められた手段であり(Tornabene,T.G．1985．Lipid Analysis and the Relationship to Chemotaxonomy in Methods in Microbiology，18巻，209-214.;Goodfellow，M.及びO'Donnell,A.G．1993．Roots of Bacterial Systematics in Handbook of New Bacterial Systematics（Goodfellow，M．及びO'Donnell,A.G.編集）3-54頁London:Academic Press Ltd.)(これらの文献が参考として本明細書に含まれる）、これらを使用して本発明者らのコレクションが属レベルで関連することを確かめた。培養物を、微生物ID(MIDI，Newark，DE，USA)微生物同定系(MIS)を使用する脂肪酸メチルエステル分析(FAME)のために外部の契約研究所に輸送した。MIS系は25mmx0.2mmの５％のメチルフェニルシリコーン石英シリカキャピラリーカラムを備えたヒューレット・パッカードHP5890Aガスクロマトグラフからなる。水素をキャリヤーガスとして使用し、炎イオン化検出器が自動サンプラー、インテグレーター及びコンピューターと協力して機能する。コンピューターはサンプル脂肪酸メチルエステルを微生物脂肪酸ライブラリー及び既知脂肪酸の較正混合物と比較する。契約研究所により選択されたように、株を分析の前にトリプチカーゼ大豆寒天で28℃で24時間増殖した。サンプルの抽出を通常のFAME方法に従って契約研究所により行った。Photorhabdus以外のluminescensバクテリアグループについて株の直接の同定がなかった。クラスター分析（これは分離物のグループの脂肪酸プロフィールを比較する）を行った時、株脂肪酸プロフィールが属レベルで関連していた。
【０１７６】
本発明者らのコレクション中のPhotorhabdus株の進化上の多様性を、夫々の株からのゲノムＤＮＡを使用してPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)媒介ゲノムフィンガープリンティングの分析により測定した。この技術は種々のバクテリア種のゲノム中に存在する反復ＤＮＡ配列のファミリーに基いている（Versalovic,J.，Schneider,M.，DEBruijn,F.J.及びLupski,J.R．1994．Methods Mol.Cell.Biol.，5，25-40に概説されている）。これらの三つ、反復遺伝子外パリンドーム配列（REP）、腸内細菌の反復遺伝子内コンセンサス(ERIC)及びBOX要素がバクテリアゲノムの編成に重要な役割を果たすものと考えられる。ゲノム編成は選択により成形されるものと考えられ、密接に関連するバクテリア株のゲノム内のこれらの要素の差別的な分散がこれらの株を区別するのに使用し得る(例えば、Louws,F.J.，Fulbright,D.W.，Stephens,C.T．及びDEBruijn,F.J．1994．Appl.Environ．Micro．60，2286-2295.)。Rep-PCRはこれらの反復配列に相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してそれらの間にある可変サイズのＤＮＡフラグメントを増幅する。得られた産物を電気泳動により分離して夫々の株についてＤＮＡ"フィンガープリント"を確立する。
【０１７７】
本発明者らの株からゲノムＤＮＡを単離するために、細胞ペレットをTE緩衝液(10mMのトリス-HCl、1mMのEDTA、pH8.0)中で最終容積10mlに再度懸濁させ、次いで5MのNaCl 12mlを添加した。この混合物を15,000xgで20分間遠心分離した。得られるペレットをTE5.7ml中で再度懸濁させ、10％のSDS300μ1及び20mg/mlのプロテイナーゼＫ(ギブコBRLプロダクツ，Grand Island，NY)60μlを添加した。この混合物を37℃で１時間インキュベートし、次いでリゾチーム約10mgを添加し、その混合物を更に45分間インキュベートした。次いで5MのNaCl 1ml及びCTAB/NaCl溶液(10％w/vのCTAB、0.7MのNaCl)800μlを添加し、その混合物を65℃で10分間にわたって穏やかに攪拌してインキュベートし、次いで更に20分間にわたってインキュベートし、攪拌して細胞物質の透明化を助けた。等容積のクロロホルム／イソアミルアルコール溶液(24:1、v/v)を添加し、穏やかに混合し、次いで遠心分離した。次いで２回の抽出を等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(50:49:1)を用いて行った。ゲノムＤＮＡを0.6容積のイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡをガラス棒で除去し、70％のエタノールで２回洗浄し、乾燥させ、STE(10mMのトリス-HCl、pH8.0、10mMのNaCl、1mMのEDTA)2mlに溶解した。
【０１７８】
次いでＤＮＡを260nmにおける光学密度により定量した。PhotorhabdusゲノムＤＮＡのrep-PCR分析を行うために、下記のプライマーを使用した。REP1R-I;5'-IIIICGICGICATCIGGC-3'及びREP2-I;5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'。下記の25μlの反応液を使用してPCRを行った。7.75μlのH2O、2.5μlの10X LA緩衝液(パンベラ・コーポレーション，Madison，WI)、16μlのdNTP混合物（夫々2.5mM）、１μlの夫々のプライマー(50pM/μl)、１μlのDMSO、1.5μlのゲノムＤＮＡ(0.075-0.480μg/μlの範囲の濃度）及び0.25μlのタカラEX Taq(パンベラ・コーポレーション，Madison，WI)。
【０１７９】
下記の条件を使用してPCR増幅をパーキン・エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー(Norwalk，CT)中で行った。95℃／７分、次いて94℃／１分、44℃／１分、65℃／８分、続いて65℃で15分の35サイクル。サイクル後に、反応液25μlを6Xゲル装填緩衝液（H2O中0.25％のブロモフェノールブルー、40％w/vの蔗糖）５μlに添加した。次いで15x20cmの１％アガロースゲルを、夫々の反応液８μlを使用してTBE緩衝液（0.09Mのトリス−ボレート、0.002MのEDTA）中で実験した。ゲルを45vで約16時間実験した。次いでゲルを20μg/mlの臭化エチジウム中で１時間にわたって染色し、TBE緩衝液中で約３時間にわたって脱色した。次いでゲルのポラロイド（登録商標）写真をUV照明下で撮影した。夫々の株に関する特定サイズのバンドの存在または不在を写真からスコアに付け、数値分類学ソフトウェアプログラム、NTSYS-pc（エクセター・ソフトウェア、Setauket，NY）に類似性マトリックスとして入力した。
【０１８０】
同時に評価したE.coli株HB101及びキサントモナス・オリザエpv．オリザエ（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）の対照は公表された論文(Versalovic,J.，Koeuth,T.及びLupski,J.R.1991．Nucleic Acids Res．19，6823-6831;Vera Cruz,C.M.，Halda-Alija,L.，Louws，F.，Skinner,D.Z.，George,M.L.，Nelson,R.J.，DE Bruijn,F.J.，Rice,C．及びLeach,J.E．1995．Int.Rice Res.Notes，20，23-24;Vera Cruz,C.M.，Ardales，E.Y.，Skinner,D.Z.，Talag,J.，Nelson,R.J.，Louws,F.J.，Leung,H.，Mew,T.W．及びLeach,J.E．1996．Phytopathology(夫々、印刷中))に一致するＰＣＲ"フィンガープリント"を生じた。次いでPhotorhabdus株からのデータをNTSYS-pc内の一連のプログラム;SIMQUAL(定性データに関する類似性)で分析して類似性係数（ジャカード係数を使用する）及びSAHN（連続の凝集性のヘアアーチカル(Heirarchical)かつ巣状(Nested))クラスタリング［UPGMA(算術平均による未計量のペアーグループ方法)方法を使用する］のマトリックス（これは関連株をグルーピングし、フェノグラム（図５）として表し得る）を生じた。COPH（コフェネチック(cophenetic)値）プログラム及びMXCOMP（マトリックス比較）プログラムを使用してコフェネチック値マトリックスを生じ、これとクラスタリングが基いている初期のマトリックスの間の相関関係を比較した。得られる基準化マンテル統計値(r)を生じ、これはクラスター分析の適合度の目安である(r=0.8-0.9は非常に良好な適合を表す)。本発明者らの場合、ｒは0.919である。それ故、本発明者らのコレクションはPhotorhabdus属の代表的な容易に区別できる株の多様なグループを含む。
【０１８１】
実施例13    種々のPhotorhabdus株により産生された一種以上の毒素の殺虫剤実用性
種々のPhotorhabdus株の初期の"種子"培養物を、２％のプロテオースペプトン＃３(PPS)(ジフコラボラトリーズ、Detroit，MI)液体培地175mlにカプット(Kaput)で覆われたデロング(Delong)口を有する三つのじゃま板付きフラスコ500ml中で一次変異体サブクローンを接種することにより生じた。夫々の種子培養の接種物はオイル−オーバーレイ寒天スラント培養物またはプレート培養物に由来した。接種後に、これらのフラスコをロータリー・シェーカーで16時間にわたって28℃で150rpmでインキュベートした。次いでこれらの種子培養物を夫々の株の所定の醗酵のための一様な接種源として使用した。更に、後対数期の種子培養物を無菌鉱油でオーバーレイし、将来の再懸濁のために無菌マグネチック攪拌棒を加え、培養物を暗所で室温で貯蔵して、毒素応答状態で接種物の長期保存を得た。
【０１８２】
生産ブロースを、新しい２％のPP3培地に１％の活発に成長している種子培養物（例えば、新しい培地175ml当たり1.75ml）を添加することにより接種した。ブロースの生産は500mlの三つのじゃま板付きフラスコ（上記を参照のこと）、またはシリコンフォームクロージャーで覆われた2800mlのじゃま板付き凸形底部のフラスコ（体積500ml）中で起こった。生産フラスコを上記条件下で24〜48時間インキュベートした。インキュベーション後に、ブロースを無菌の１Ｌのポリエチレンびんに分配し、10℃で１時間にわたって2600xgで回転させ、細胞及びデブリペレットからデカントした。次いで液体ブロースをワッマンGF/D（2.7μM保持）及びGF/B（1.0pM保持）ガラスフィルターにより真空濾過してデブリを除去した。更なるブロース浄化を、0.5μMのオープンーチャンネルフィルターを使用して接線方向の流れの微量濾過装置(ポール・フィルトロン、Northborough，MA)で得た。必要な場合、付加的な浄化を、ブロースを（４℃に）冷却し、数時間にわたって2600xgで遠心分離することにより得ることができた。これらの操作後に、0.2μMのニトロセルロース膜フィルターを使用してブロースをフィルター滅菌した。次いで無菌ブロースを生物学的アッセイ、生化学的分析に直接使用し、または10,000MWカット−オフのM12限外濾過装置（アミコン，Beverly MA）または10,000MW孔サイズを有する遠心分離濃縮機（ミリポア，Bedford,MA及びポール・フィルトロン、Northborough，MA）を使用して濃縮した。遠心分離濃縮機の場合、ブロースを約２時間にわたって2000xgで回転させた。10,000MWの透過物を相当する保持物に添加して10,000MWより大きい成分の所望の濃縮を得た。処理されたブロースサンプルの熱不活化を、サンプルを10分間にわたって砂充填加熱ブロック中で100℃で加熱することにより得た。
【０１８３】
異なるPhotorhabdus株からの一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体は昆虫の集団を減少するのに有益であり、昆虫の遺伝子座に有効な昆虫不活化量の活性な記載された物質を適用することを含む昆虫集団の抑制方法に使用された。上記のようにして醗酵されたPhotorhabdus株の選択されたグループのブロースから観察された殺虫活性の幅の実証が表19に示される。付加的な殺虫活性はブロースの増大された濃度により、または異なる醗酵方法を使用することによりこれらの株で検出し得ることが可能である。タンパク質と関連する活性と一致して、試験した全ての株の殺虫活性は熱不安定であった（上記を参照のこと）。
【０１８４】
種々のPhotorhabdus株からの一種以上の培養ブロースは幾つかの昆虫に対し異なる殺虫活性（死亡率及び／または成長抑制、減少された成体発生）を示す。更に詳しくは、その活性はコーン・ルートワーム(corn rootworm)幼虫及びボール・ウィービル(boll weevil)幼虫(これらは昆虫目コレオプテラ(Coleoptera)の員である）に対して見られる。コレオプテラのその他の員として、コメツキムシ幼虫、花粉カブトムシ、ノミハムシ、種子カブトムシ及びコロラド・ジャガイモカブトムシが挙げられる。また、活性がアスター・リーフホッパー(aster leafhopper)及びコーン・プラント・ホッパー(corn plant hopper)に対し観察され、これらはホモプテラ(Homoptera)目の員である。ホモプテラのその他の員として、プラントホッパー(planthopper)、ピア・プシラ(pear psylla)、アップル・サッカー(apple sucker)、カイガラムシ、コナジラミ、スピトル・バッグ(spittle bugs)並びに多数の宿主特異性アリマキ種が挙げられる。また、ブロース及び一種以上の精製毒素複合体はタバコ・バッドワーム(budworm)、タバコ・ホーンワーム(hornworm)及びヨーロピアン・コーン・ボラー(European corn borer)(これらはレピドプテラ(Lepidoptera)目の員である)に対し活性である。この目のその他の典型的な員はビート・アーミィワーム(beet armyworm)、キャベツルーパー(cabbage looper)、ブラック・カットワーム(black cutworm)、コーンイアーワーム(corn earworm)、コドリング・モス(codling moth)、イガ、インディアン・ミールモス(Indian mealmoth)、ハマキムシ、アオムシ、コットン・ボールワーム(cotton bollworm)、ミノムシ、イースタン・テント・キャタピラー(Eastern tent caterpillar)、ソッド・ウェブワーム(sod webworm)及びフォール・アーミィワーム(fall armyworm)である。また、活性がミバエ幼虫及び蚊幼虫（これらはジプテラ(Diptera)目の員である）に対して見られる。ジブテラ目のその他の員はピー・ミッジ(pea midge)、カラット・フライ(carrot fly)、キャベツ・ルート・フライ(cabbage root fly)、カブ・ルート・フライ(turnipr-oot fly)、タマネギ・フライ(onion fly)、ガガンボ及びイエバエ並びに種々の蚊種である。また、一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体による活性が２斑点クモダニに対して見られ、これはアカリナ(Acarina)目の一員であり、これはストロベリークモダニ、ブロードマイト(broad mites)、シトラス・レッド・マイト(Citrus red mite)、ヨーロピアン・レッド・マイト(European redmite)、ピアー・ラストマイト(pear rust mite)及びトマト・ラセット・マイト(tomato russet mite)を含む。
【０１８５】
コーン・ルートワーム幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上のPhotorhabdus培養ブロース(0-15倍に濃縮、フィルター滅菌)、２％のプロテオースペプトン＃３、一種以上の精製毒素複合体[0.23mg/ml]または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を40μlのアリコート中の人工食（Rose,R.I.及びMcCabe,J.M．(1973)．J.Econ.Entomol．66,(398-400)）の表面（約1.5cm2）に直接適用した。毒素複合体を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中で希釈した。食事プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、ウェルに表面滅菌卵から研化された単一の新生子ジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルジ(Diabrotica undecimpunctata howardi)(サザン・コーン・ルートワーム(Southern corn rootworm，SCR))を発生させた。プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間（３〜５日）にわたって27℃に保った。次いで死亡率及び幼虫重量測定をスコアにつけた。一般に、処理当たり16匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は一般に５％未満であった。
【０１８６】
ボール・ウィービル（アントモナス・グランジス(Anthomonas grandis)に対する活性を以下のようにして試験した。濃縮（１〜10倍）Photorhabdusブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を60μlのアリコート中で人工食（ストーンビル・イエロー・レピドプテラン(Stoneville Yellow lepidopteran)食）0.35gの表面に適用し、乾燥させた。単一の12〜24時間のボール・ウィービル幼虫を食事に入れ、ウェルをシールし、25℃で50％RHで５日間保った。次いで死亡率及び幼虫重量を評価した。対照死亡率は０〜13％の範囲であった。
【０１８７】
蚊幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。そのアッセイを96ウェル・ミクロタイタプレート中で行った。夫々のウェルは200μlの水溶液（10倍濃縮した一種以上のPhotorhabdus培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、一種以上の毒素複合体0.23mg/mlまたはH2O）及び約20匹の生後１日の幼虫（アエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)）を含んでいた。処理当たり６のウェルがあった。結果を発生後３〜４日に読み取った。対照死亡率は０〜20％であった。
【０１８８】
ミバエに対する活性を以下のようにして試験した。50％の乾燥培地及び50％の水、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、10倍に濃縮した一種以上のPhotorhabdus培養ブロース、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を使用して、購入したドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)培地を調製した。乾燥培地4.0mlを処理当たり３個の育成バイアルの夫々に入れ、適当な液体4.0mlを添加することによりこれを行った。次いで10匹の後期虫齢のドロソフィラ・メラノガスターうじを夫々25mlのバイアルに加えた。バイアルを蛍光天井ライトのもとに室温で実験ベンチで保持した。さなぎまたは成体カウントを露出の15日後に行った。成体発生を水及び対照培地と比較した（０〜16％の減少）。
【０１８９】
アスター・リーフホッパー成体(マクロステルス・セベリニ(Macrosteles severini))及びコーン・プラントホッパー若虫（ペレグリヌス・マイジス(Peregrinus maidis)）に対する活性を、その他の外部接触なしに活性物質の摂取を可能にするように設計した摂取アッセイで試験した。活性物質／"食物"溶液の溜を35X10mmのペトリ皿の底部の中央に２つの孔をつくることによりつくる。２インチのパラフィルムＭR正方形を皿の上部を横切って置き、“Q”リングで固定する。次いで１オンスのプラスチックカップに約７匹のホッパーを発生させ、溜をカップの上にパラフィルムを下にして置く。次いで試験液を孔を通って溜に添加する。10倍濃縮した一種以上のPhotorhabdus培養ブロースを使用する試験において、ブロース及び対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に対して透析し、蔗糖（５％まで）を得られる溶液に添加して対照死亡率を低下した。また、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を試験した。死亡率を３日目に報告する。アッセイを16/8光期間で28℃、70％RHでインキュベーター中に保った。アッセイを72時間で死亡率について等級付けした。対照死亡率は６％未満であった。
【０１９０】
レピドプテラン幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上の濃縮(10倍)Photorhabdus培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を40μlのアリコート中で通常の人工レピドプテラン食（ストーンビル・イエロー食）の表面（約1.5cm2）に直接適用した。食物プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、単一の新生子幼虫を発生させた。ヨーロピアン・コーン・ボラー（オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)）及びタバコ・ホーンワーム(マンジュカ・セクスタ(Manduca sexta)）を市販源から入手し、ハウス内で孵化し、一方、タバコ・バッドワーム(ヘリオジス・ビレセンス(Heliothis virescens)）幼虫を内部で供給した。幼虫を発生させた後、食物プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間にわたって27℃で暗所に保った。死亡率及び体重測定を５日目にスコアにつけた。一般に、処理当たり16匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は対照培地について一般に４〜12.5％の範囲であり、リン酸緩衝液について10％未満であった。
【０１９１】
２斑点クモダニ(テトラニカス・ウルチカエ(Tetranychus urticae))に対する活性を以下のようにして試験した。若いカボチャ植物を単一子葉にトリミングし、一種以上の10倍濃縮ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［0.23mg/ml］または10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で噴霧して流下させた。乾燥後、植物にクモダニの混合集団を発生させ、72時間にわたって実験温度及び湿度に保った。次いで生存ダニをカウントして防除のレベルを測定した。
【０１９２】
【表２１】
表１９  異なるPhotorhabdus株からのブロースの観察された殺虫スペクトル
0003657593.tif 000024
【０１９３】
【表２２】
表１９  つづき
0003657593.tif 000025
* ＝対照に対し25％以上の死亡率及び／または成長抑制
**＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；タバコ・ホーンワーム、４；サザン・コーン・ルートワーム、５；ボール・ウィービル、６；蚊、７；ミバエ、８；アスター・リーフホッパー、９；コーン・プラントホッパー、10；２斑点クモダニ
【０１９４】
実施例14 非W-14Photorhabdus株： 精製、特性決定及び活性スペクトル精製
以下のプロトコルはW-14の精製について開発されたものと同様であり、バイオアッセイ（実施例13を参照のこと）で測定してサザン・コーン・ルートワーム（SCR）に対し最も活性を有するフラクションを精製することに基いて確立された。典型的には、実施例13に記載されたようにして濾過されたブロース４〜20Lを受け取り、アミコンM-12濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型SIY100を使用して濃縮した。保持物は100kDaより大きい分子サイズからなる天然タンパク質を含み、一方、フロースルー物質は100kDa未満のサイズの天然タンパク質を含んでいた。SCRに対する活性の大半が100kDa保持物中に含まれていた。次いで保持物を、濾液がA280<0.100に達するまで10mMのリン酸ナトリウム（pH=7.0）で連続的に透析濾過した。特にことわらない限り、この時点からの全ての操作を10mMのリン酸ナトリウム（pH7.0）で特定されるような緩衝液中で行った。
【０１９５】
次いで保持物を約0.20Lの最終容積まで濃縮し、0.45mmのナルゲンTMフィルムウェア無菌濾過ユニットを使用して濾過した。濾過された物質をパーセプチブ・バイオシステム・スプリントRHPLC系を使用して緩衝液中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム・ポロスR50HQ強イオン交換マトリックスで詰め込まれたファーマシアHR16/10カラムに7.5ml/分で装填した。装填後、A280<0.100に達するまでカラムを緩衝液で洗浄した。次いでタンパク質を50mlの全容積について20分間にわたって0.4MのNaClを含む緩衝液を使用して2.5ml/分でカラムから溶離した。1.0MのNaClを含む緩衝液を使用してカラムを同流量で更に20分間にわたって洗浄した（最終容積=50ml）。0.4M及び1.0MのNaClで溶離したタンパク質を別々の透析バッグ（スペクロタ／ポーR膜MWCO:2000）に入れ、12Lの緩衝液中で４℃で一夜透析した。SCRに対する活性の大半が0.4Mのフラクション中に含まれていた。0.4Mのフラクションを、0.75ml/分の流量を使用してセファロースCL4B（ファーマシア）で予め詰め込まれたファーマシアXK 26/100カラムへの20mlの適用により更に精製した。フラクションをA280ピークプロフィールに基づいてプールし、ミリポア・ウルトラフリーR15遠心分離フィルター装置バイオマックス-50K NMWL膜を使用して0.75mlの最終容積まで濃縮した。標準物質としてウシγグロブリンを用いるバイオラド・タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定した。
【０１９６】
特性決定
SCR毒素複合体の天然分子量を、緩衝液中でセファロースCL4Bで予め詰め込まれたファーマシアHR 16/50を使用して測定した。次いで既知分子サイズのタンパク質を使用してカラムを較正し、それにより毒素のおよその天然分子サイズの計算を可能にした。表20に示されるように、毒素複合体の分子サイズは株Hbで777kDaから株WX-14で1,900kDaまでの範囲であった。また、毒素複合体の収率は0.8mg/Lを産生する株WX-12から7.0mg/Lを産生する株則まで変化した。
毒素複合体に見られるタンパク質を、SDS-PAGE分析を使用して個々のポリペプチドサイズについて試験した。典型的には、夫々の株からの毒素複合体のタンパク質20mgを２〜15％のポリアクリルアミドゲル（インテグレーテッド・セパレーション・システムズ）に装填し、バイオラドSDS-PAGE緩衝液中で20mAで電気泳動にかけた。電気泳動の完結後に、ゲルをバイオラド・クーマシーブルーR-250（メタノール：酢酸：水；40:10:40v/v/v）中0.2％）中で一夜染色した。続いて、ゲルをメタノール：酢酸：水；40:10:40(v/v/v)中で脱色した。次いでゲルを15分間にわたって水ですすぎ、モレキュラー・ダイナミクス・パーソナル・レーザー・デンシトメーターRを使用してスキャンした。レーンを定量し、分子サイズをバイオラド高分子量標準物質と比較して計算し、これは200-45kDaの範囲であった。
【０１９７】
夫々の株からのSCR毒素複合体を含む個々のポリペプチドのサイズを表21にリストする。個々のポリペプチドのサイズは株WX-1で230kDaから株WX-7で見られるような16kDaのサイズまでの範囲であった。株Hbを除く夫々の株は160-230kDa範囲、100-160kDa範囲、及び50-80kDa範囲である毒素複合体を含むポリペプチドを有していた。これらのデータは、毒素複合体が株によりペプチド組成及び成分を変化し得るが、全ての場合に毒素特性が大きいオリゴマータンパク質複合体からなることが明らかであることを示す。
【０１９８】
【表２３】
表２０．
0003657593.tif 000026
a セファロースCL4Bを詰め込んだファーマシアHR 16/50カラムを使用して測定された天然分子量
b 培養ブロースから回収された毒素複合体の量
【０１９９】
活性スペクトル
表21に示されるように、株Hm及びH9から精製された毒素複合体を種々の昆虫に対する活性について試験した。株W-14からの毒素複合体は比較のためであった。アッセイを実施例13に記載されたようにして行った。全ての３種の株からの毒素複合体はタバコ・バッドワーム、ヨーロピアン・コーン・ボラー、サザン・コーン・ルートワーム、及びアスター・リーフホッパーに対し活性を示した。更に、株Hm及びW-14からの毒素複合体がまた２斑点クモダニに対し活性を示した。加えて、W-14からの毒素複合体が蚊幼虫に対し活性を示した。これらのデータは、毒素複合体が、昆虫の或る種の目の間に活性の類似性を有するとともに、昆虫のその他の目に対し異なる活性を示し得ることを示す。
【０２００】
【表２４】
表２１  W-14 Photorhabdusからの精製毒素複合体中のペプチドの推定サイズ(kDa)
0003657593.tif 000027
【０２０１】
【表２５】
表２２．
0003657593.tif 000028
* ＝25％より大きい死亡率または成長抑制
**＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；サザン・コーン・ルートワーム、４；蚊、５；２斑点クモダニ、６；アスター・リーフホッパー、７；ミバエ、８；ボール・ウィービル
【０２０２】
実施例15 Photorhabdusタンパク質毒素複合体のサブ−フラクション
Photorhabdusタンパク質毒素複合体を実施例14に記載されたようにして単離した。次に、毒素約10mgを1ml／分の流量で20mMのトリス-HCl、pH7.0で平衡にされたモノQ5/5カラムに適用した。280nmにおける光学密度が基準線吸光度に戻るまで、カラムを20mMのトリス-HCl、pH7.0で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を1ml／分で30分間にわたって20mMのトリス-HCl、pH7.0中０〜1.0MのNaClの線形勾配で溶離した。フラクション1mlを集め、サザン・コーン・ルートワーム(SCR)バイオアッセイ（実施例13を参照のこと）にかけた。活性のピークをSCRバイオアッセイで夫々のフラクションの一連の希釈液により測定した。SCRに対する二つの活性ピークを観察し、Ａ（約0.2〜0.3MのNaClで溶離した）及びＢ（0.3〜0.4MのNaClで溶離した）と称した。活性ピークＡ及びＢを別々にプールし、下記の３工程操作を使用して両方のピークを更に精製した。
【０２０３】
固体(NH4)2SO4を上記タンパク質フラクションに1.7Mの最終濃度まで添加した。次いでタンパク質を1ml／分で50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH７中1.7Mの(NH4)2SO4で平衡にされたフェニル−スペロース5/5カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を0.5ml／分で1.7Mの(NH4)2SO4、０％のエチレングリコール、50mMのリン酸カリウム、pH7.0〜25％のエチレングリコール、25mMのリン酸カリウム、pH7.0((NH4)2SO4なし)の線形勾配で溶離した。フラクションを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に対し一夜透析した。SCRに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
最高の活性を有するフラクションをプールし、１ml／分で20mMのトリス-HCl、pH7.0で平衡にされたモノQ5/5カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を20mMのトリス-HCl、pH7.0中０〜1MのNaClの線形勾配により１ml／分で溶離した。
【０２０４】
精製の最終工程について、上記の最も活性なフラクション(SCRバイオアッセイにより測定した)をプールし、第二のフェニルースペロース5/5カラムにかけた。固体(NH4)2SO4を1.7Mの最終濃度まで添加した。次いでその溶液を１ml/分で50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7中1.7Mの(NH4)2SO4で平衡にされたそのカラムに装填した。カラムに結合したタンパク質を1.7Mの(NH4)2SO4、50mMのリン酸カリウム、ｐＨ7.0〜10mMのリン酸カリウム、pH7.0の線形勾配で0.5ml／分で溶離した。フラクションを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に対し一夜透析した。SCRに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
ピークＡからの上記の３工程操作による最終精製タンパク質を毒素Ａと称し、ピークＢからの最終精製タンパク質を毒素Ｂと称した。
【０２０５】
毒素Ａ及び毒素Ｂの特性決定及びアミノ酸配列決定
SDS-PAGE中に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は２種の主要（全クーマシー染色タンパク質の90％より大）ペプチド：192kDa(夫々A1及びB1と称する)及び58kDa（夫々A2及びB2と称する）を含んでいた。毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は天然PAGE中に唯一の主要バンドを明らかにし、A1及びA2が一種のタンパク質複合体のサブユニットであり、かつB1及びB2が一種のタンパク質複合体のサブユニットであることを示した。更に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方の天然分子量はゲル濾過クロマトグラフィーにより860kDaであることが測定された。A1対A2の相対モル濃度はSDS-PAGEゲルのデンシトメトリー分析により測定して１対１の当量であると判断された。同様に、B1ペプチド及びB2ペプチドは同じモル濃度で存在した。
【０２０６】
毒素Ａ及び毒素Ｂを10％のSDS-PAGE中で電気泳動にかけ、PVDF膜にトランスブロットした。ブロットを夫々ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムにアミノ酸分析及びＮ末端アミノ酸配列決定のために送った。B1のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１、tcbA遺伝子のTcbAii領域(配列番号12、位置87-99)と同一であることが決定された。特異なＮ末端配列をペプチドB2について得た（配列番号40）。ペプチドB2のＮ末端アミノ酸配列はtcbA遺伝子の誘導アミノ酸配列のTcbAiii領域(配列番号12、位置1935-1945)と同一であった。それ故、Ｂ毒素は主として２種のペプチド、TcbAii及びTcbAiiiを含み、これらが同じ遺伝子産物、TcbAから誘導されることが観察された。
A2のＮ末端配列（配列番号41）はTcbAiiiペプチド及びその他のペプチドと比較して特異であった。A2ペプチドをTcdAiiiと称した（実施例17を参照のこと）。配列番号６はアミノ酸配列配列番号40及び配列番号41の混合物であることが決定された。
【０２０７】
更に、ペプチドA1及びA2を内部アミノ酸配列決定にかけた。内部アミノ酸配列決定について、毒素Ａ10μgを10％のSDS-PAGE中で電気泳動にかけ、PVDF膜にトランスブロットした。ブロットをアミドブラックで染色した後、夫々TcdAii及びTcdAiiiと称されるペプチドA1及びA2をブロットから切除し、ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムに送った。ペプチドをトリプシン消化、続いてHPLCクロマトグラフィーにかけて個々のペプチドを分離した。Ｎ末端アミノ酸分析を選択されたトリプシンペプチドフラグメントについて行った。ペプチドA1の二つの内部アミノ酸配列（TcdAii-PK71、配列番号38及びTcdAii-PK44、配列番号39）はtcbA遺伝子のTcbAii領域の演繹アミノ酸配列（配列番号12）と有意な相同性を有することがわかった。同様に、ペプチドA2のＮ末端配列（配列番号41）及び二つの内部配列（TcdAiii-PK57、配列番号42及びTcdAiii-PK20、配列番号43）はまたtcbA遺伝子のTcbAiii領域の演繹アミノ酸配列（配列番号12）と有意な相同性を示した。
【０２０８】
上記結果を要約すると、毒素複合体はSCRに対し少なくとも二つの活性タンパク質毒素複合体、毒素Ａ及び毒素Ｂを有する。毒素Ａ及び毒素Ｂはそれらの天然分子量及びサブユニット分子量が同様であるが、それらのペプチド組成が異なる。毒素Ａは主要ペプチドとしてTcdAii及びTcdAiiiを含み、また毒素Ｂは主要ペプチドとしてTcbAii及びTcbAiiiを含む。
【０２０９】
実施例16 TcbAペプチドの開裂及び活性化
毒素Ｂ複合体において、ペプチドTcbAii及びTcbAiiiは単一遺伝子産物TcbAに由来する（実施例15）。TcbAペプチドからTcbAii及びTcbAiiiへのプロセシングはおそらく一種以上のPhotorhabdusプロテアーゼ、そしておそらく実施例10に記載されたメタロプロテアーゼの作用によるものである。或る場合には、PhotorhabdusW-14ブロースをプロセシングした時、TcbAペプチドが、ペプチドTcbAii及びTcbAiiiに加えて主要成分として毒素Ｂ複合体中に存在することが注目された。毒素Ｂ複合体の精製について記載された（実施例15）のと同じ操作を使用してW-14ブロースの毒素複合体フラクションからペプチドTcbAを濃縮した。最終精製物質を4-20％の勾配のSDS-PAGE中で分析し、主要ペプチドをデンシトメトリーにより定量した。TcbA、TcbAii及びTcbAiiiは全タンパク質の夫々58％、36％、及び６％を構成することが測定された。これらのペプチドの同定をSDS-PAGE及びモノ特異性抗体を使用するウェスタンブロット分析でそれらの夫々の分子サイズにより確認した。このフラクションの天然分子量を測定したところ、860kDaであった。
【０２１０】
上記精製物質を精製された38kDa及び58kDaのW-14Photorhabdusメタロプロテアーゼ（実施例10）、及び対照酵素としてのトリプシン（シグマ，MO）で処理することにより、TcbAの開裂を評価した。標準反応液は100μlの合計容積中に上記精製フラクション17.5μg、1.5単位のプロテアーゼ、及び0.1Mのトリス緩衝液、pH8.0からなっていた。対照反応について、プロテアーゼを省いた。その反応混合物を37℃で90分間インキュベートした。反応の終了時に、20μlを採取し、4-20％の勾配SDS-PAGE中の電気泳動分析のために直ちにSDS-PAGEサンプル緩衝液とともに沸騰させた。SDS-PAGEから、38kDa及び58kDaのプロテアーゼ処理の両方において、ペプチドTcbAii及びTcbAiiiの量が約３倍増加し、一方、TcbAペプチドの量が比例して減少したことが測定された（表23）。選択されたペプチドの相対減少及び増強をウェスタンブロット分析により確かめた。更に、開裂された物質のゲル濾過は、複合体の天然分子量が同じままであったことを明らかにした。トリプシン処理後に、ペプチドTcbA及びTcbAiiを小さいペプチドに非特異的に消化した。これは、38kDa及び58kDaのPhotorhabdusプロテアーゼがペプチドTcbAをペプチドTcbAii及びTcbAiiiに特異的にプロセシングし得ることを示した。
【０２１１】
残りの80μlの反応混合物のプロテアーゼ処理対照及び未処理対照を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で連続希釈し、SCRバイオアッセイにより分析した。幾つかの希釈液中の活性を比較することにより、38kDaのプロテアーゼ処理はSCR殺虫活性を約３〜４倍に増加することが測定された。プロテアーゼ処理における残存昆虫の成長抑制はまた対照よりも苛酷であった（表23）。
【０２１２】
【表２６】
表２３．プロテアーゼ処理によるペプチドTcbAからペプチドTcbAii及びTcbAiii への変換及び活性化
0003657593.tif 000029
* : アッセイ中の給餌の５日後に生存昆虫の平均体重を測定することによる成長抑制の指標
【０２１３】
実施例17 TcdAiiペプチドをコードする遺伝子のライブラリーのスクリーニング
配列番号17（内部ペプチドTcdAii-PT111N末端配列）及び配列番号18（内部ペプチドTcdAii-PT79Ｎ末端配列）として記載されたTcdAiiペプチドをコードする遺伝子のクローニング及び特性決定を完結した。配列番号17（表24）及び配列番号18（表25）のアミノ酸配列並びにこれらの配列の逆補体をコードするするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８に記載されたようにして合成した。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を以下に示す。
【０２１４】
【表２７】
表２４．配列番号17のための縮重オリゴヌクレオチド
0003657593.tif 000030
【０２１５】
【表２８】
表２４  続き
0003657593.tif 000031
【０２１６】
【表２９】
表２５．配列番号18のための縮重オリゴヌクレオチド
0003657593.tif 000032
【０２１７】
【表３０】
表２５．つづき
0003657593.tif 000033
*  IUPAC-IUBに従い、ヌクレオチドに対するコードは、Y=CまたはT、H=A、C、またはT、N=A、C、GまたはT、K=GまたはT、R=AまたはG、およびM=AまたはC。
【０２１８】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてP2.3.6.CBまたはP2.3.5．を使用し、リバースプライマーとしてP2.79.R.1またはP2.79R.CBを使用し、鋳型としてPhotorhabdusW-14ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーP2.79.2またはP2.79.3をフォワードプライマーとして使用し、またP2.3.5R、P2.3.5RI、及びP2.3R.CBをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのP2.79.R.1またはP2.79R.CBと組み合わせたフォワードプライマーとしてのP2.3.6.CBを含む反応のみにおいて、2500塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントTcdAii-PT111がペプチドフラグメントTcdAii-PT79にアミノ近位にあることを示す。
【０２１９】
2500bp PCR産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターpCRTMII（インビトロゲン，San Diego,CA）につなぎ、２種の分離物（HS24及びHS27）のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマー及び前記配列決定方法を使用して測定した。両方の単離物の配列は同じであった。新規プライマーを決定された配列に基いて合成し、付加的な配列決定反応を開始するのに使用してインサート［配列番号36］の合計2557塩基を得た。配列番号36によりコードされた部分ペプチドの翻訳が配列番号37として開示された845アミノ酸配列を生じる。TcdAiiペプチドフラグメントのこの部分のタンパク質相同性分析はタンパク質TcbA［配列番号12］の残基542-1390に対する実質的なアミノ酸相同性（68％の類似性；53％の同一性）を明らかにする。それ故、配列番号36により一部表される遺伝子が同様のタンパク質を産生するが、TcbAと同一のアミノ酸配列を産生しないことが明らかであり、それはおそらくTcbAタンパク質と同様であるが、同一ではない生物活性を有する。
【０２２０】
更に別の場合、配列番号９（内部ペプチドTcdAii-PK44配列）、及び配列番号41（TcdAiii58kDaＮ末端ペプチド配列）として記載されたペプチドTcdAii-PK44及びTcdAiii58kDaＮ末端ペプチドをコードする遺伝子を単離した。配列番号39（表27）及び配列番号41（表26）、並びにこれらの配列の逆補体をコードするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８、及びそれらのＤＮＡ配列に記載されたようにして合成した。
【０２２１】
【表３１】
表２６．配列番号41のための縮重オリゴヌクレオチド
0003657593.tif 000034
【０２２２】
【表３２】
表２６．つづき
0003657593.tif 000035
【０２２３】
【表３３】
表２７．配列番号39のための縮重オリゴヌクレオチド
0003657593.tif 000036
【０２２４】
【表３４】
表２７．つづき
0003657593.tif 000037
【０２２５】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてA1.44.1またはA1.44.2を使用し、リバースプライマーA2.3RまたはA2.4Rを使用し、鋳型としてPhotorhabdusW-14ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーA2.1またはA2.2をフォワードプライマーとして使用し、またA1.44.1R及びA1.44.2Rをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのA2.3Rと組み合わせたフォワードプライマーとしてのA1.44.1またはA1.44.2を含む反応のみにおいて、1400塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントTcdAii-PK44がTcdAiiiの58kDaペプチドフラグメントにアミノ近位にあることを示す。
【０２２６】
1400bp PCR産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターpCRTMIIにつないだ。４種の分離物のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマーと配列の似ているプライマーを使用し、また前記配列決定方法を使用して測定した。全ての分離物の核酸配列は縮重プライマー配列に相当する領域において予想されたように異なっていたが、これらのデータから演繹されたアミノ酸配列は先に決定されたペプチドに関する実際のアミノ酸配列（配列番号41及び配列番号39）と同じであった。
先に調製したＤＮＡ（配列番号36）を含む放射能標識プローブによる実施例８に記載されたW-14ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは５種のハイブリッド形成性コスミド分離物、即ち、17D9、20B10、21D2、27B10、及び26D1を同定した。これらのコスミドは配列番号11または配列番号25として記載された遺伝子に相当するプローブで先に同定されたものとは異なった。制限酵素分析及びＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは、配列番号36のＤＮＡを含む領域をスパンするおよそのサイズ3.7、3.7、及び1.1kbpの３種のEcoR Iフラグメントを同定した。この実施例で調製された放射能標識された1.4kbpのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用するW-14ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは同じ５種のコスミド（17D9、20B10、21D2、27B10、及び26D1）を同定した。また、EcoR I消化コスミドＤＮＡに関するＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは2.5kbpのTcdAii遺伝子プローブで見られたのと同じEcoR Iフラグメントのサブセットに関するハイブリダイゼーションを示し、両方のフラグメントがゲノムＤＮＡでコードされることを示した。
【０２２７】
クローン化EcoR IフラグメントのＤＮＡ配列決定は2516アミノ酸（配列番号47）の282.9kDaをコードする7551塩基対（配列番号46）の中断されない読み取り枠を明らかにした。このタンパク質のアミノ酸配列の分析はペプチドTcdAiiの全ての予想された内部フラグメント（配列番号17、18、37、38及び39）及びTcdAiiiペプチドＮ末端（配列番号41）並びに全てのTcdAiii内部ペプチド（配列番号42及び43）を明らかにした。TcdAii及びTcdAiiiとして単離され、同定されたペプチドは、配列番号46として開示されたtcdAと称される読み取り枠の夫々の産物である。更に、配列番号47は位置89で開始することを示し、配列番号13として開示された配列（これは約201kDaのサイズのペプチドのＮ末端配列である）は配列番号46から生じた初期タンパク質が配列番号12について先に開示されたタンパク質と同様の方法でプロセシングされることを示す。加えて、そのタンパク質は更に開裂されて、配列番号48によりコードされ、配列番号49（TcdAiiペプチド）として開示されたサイズ209.2kDaの産物、及び配列番号50によりコードされ、配列番号51（TcdAiiiペプチド）として開示されたサイズ63.6kDaの産物を生じる。
【０２２８】
こうして、配列番号46の産物から誘導された毒素Ａ（実施例15）として同定された殺虫活性は、配列番号47として開示された282.9kDaの完全長タンパク質により例示されるように、プロセシングされて配列番号49及び51として開示されたペプチドを生じるものと考えられる。毒素Ｂ（実施例15）として同定された殺虫活性は、配列番号12として開示された280.6kDaのタンパク質により例示されるように、配列番号11の産物に由来するものと考えられる。このタンパク質はタンパク質分解処理されて配列番号53として開示された207.6kDaのタンパク質（これは配列番号52によりコードされる）、及び配列番号40として開示され、更に配列番号55として開示されたＮ末端配列を有する62.9kDaのペプチド（これは配列番号54によりコードされる）を生じる。
配列番号12及び配列番号47として開示されたタンパク質のアミノ酸配列比較は、それらが69%の類似性及び54%の同一性を有することを明らかにする。進化的関係のこの高い程度はこれらのペプチドの全アミノ酸配列中で一様ではないが、タンパク質のカルボキシ末端に向かって高い。何となれば、配列番号51（配列番号47から誘導された）及び配列番号55（配列番号12から誘導された）として開示されたペプチドは76％の類似性及び64％の同一性を有するからである。
【０２２９】
実施例18 Photorhabdus（株W-14）ブロースの噴霧適用によるトウモロコシ植物に関するヨーロピアン・コーンボラー誘発葉損傷の防除
昆虫幼虫により生じる植物損傷を軽減する一種以上のPhotorhabdus毒素の能力を、Photorhabdusブロースで処理されたトウモロコシ植物に発生されるヨーロピアン・コーンボラー（オストリニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)）により生じる葉損傷を測定することにより実証した。Photorhabdus株W-14からの醗酵ブロースを生産し、実施例13に記載されたようにして限外濾過(10,000MW細孔サイズ)を使用して約10倍に濃縮した。次いで得られる濃縮ブロースを、0.2ミクロンのニトロセルロース膜フィルターを使用してフィルター滅菌した。未接種の２％プロテオースペプトン＃３の同様に調製したサンプルを対照目的で使用した。トウモロコシ植物（ダウエランコ(DowElanco)所有の同系繁殖系）を温室（日中27℃；夜間22℃、約50％RH、14時間の日の長さ、必要により散水／施肥）中で無土壌混合物を含むポット中で種子から栄養成長期７または８まで育成した。
【０２３０】
試験植物を日中約22℃;夜間18℃の温度で、人工光を使用しないて、部分遮蔽し、約50％のRHで必要により散水／施肥して温室中でランダム化完全ブロック設計（３レプ／処理、６植物／処理）で配置した。処理（未接種培地及び濃縮Photorhabdusブロース）をシリンジスプレーで適用し、2.0mlを渦巻きで直接（約６インチ）適用し、追加の2.0mlを渦巻きの上約１フィートから円形運動で適用した。加えて、植物の１グループは処理を受けなかった。処理が乾燥した後（約30分間）、12の新生子のヨーロピアン・コーン・ボラー幼虫（市販源から卵を入手し、室内で誘化させた）を渦巻きに直接適用した。１週間後、改良グスリースケール(Guthrie Scale)(Koziel,M.G.，Beland,G.L.，Bowman,C.，Carozzi,N.B.，Crenshaw.R.，Crossland,L.，Dawson,J.，Desai,N.，Hill.,M.，Kadwell,S.，Launis,K.,Lewis,K.，Maddox,D.，McPherson,K.，Meghji,M.Z.，Merlin,E.，Rhodes,R.，Warren,G.W.，Wright,M．及びEvola,S.V．1993)Bio/Technology,11，194-195)を使用して、植物を葉への損傷についてスコアをつけ、スコアを統計上比較した［Ｔテスト(LSD)p<0.05及びタキィスチューデント化レンジ(HSD)テストp<0.1］。結果を表28に示す。参考として、１のスコアは損傷なしを表し、２のスコアはピンホール侵入のない巻かれていない葉に対する"ウィンドーパン"損傷を表し、また５のスコアは三つより多い葉について明らかな細長い病変及び／または中ろくフィーディング(feeding)を有する葉侵入（病変＜１インチ(2.54cm)）を表す。これらのデータは、フラクションを含むブロースまたはその他のタンパク質が噴霧可能な配合で送出された時またはタンパク質もしくはその部分をコードする遺伝子またはその誘導体がトランスジェニック植物または微生物を介して送出される時に特定の昆虫ペストに対する保護を与え得ることを示す。
【０２３１】
【表３５】
表２８．トウモロコシに対するヨーロピアン・コーン・ボラー誘発葉損傷に関するPhotorhabdus培養ブロースの効果
0003657593.tif 000038
異なる文字を有する平均は統計上異なる（p<0.05またはp<0.1)
【０２３２】
実施例19 E.coli中の発現のための遺伝子の遺伝子操作
構築の要約
一連のプラスミドを構築してエシェリキア・コリ中でPhotorhabdusW-14のtcbA遺伝子を発現した。プラスミドのリストを表29に示す。夫々の構築並びに得られたE.coli発現データの要約を以下に簡単に記載する。
【０２３３】
【表３６】
表２９．tcbA遺伝子の発現プラスミド
0003657593.tif 000039
略号：Kan=カナマイシン、Chl=クロラムフェニコール、Amp=アンピシリン
【０２３４】
pDAB634の構築
実施例９に、TcbAiiプローブにハイブリッドを形成する大きいEcoR Iフラグメントが記載される。このフラグメントをpBC(ストラタゲン，La Jolla CA)にサブクローン化した。配列分折は、このフラグメントが8816塩基対であることを示す。そのフラグメントは位置571に開始ATGを有し、位置8086に終止TAAを有するtcbA遺伝子をコードする。それ故、そのフラグメントはATGの上流にPhotorhabdusＤＮＡの570塩基対を有し、TAAの下流に730塩基対を有する。
【０２３５】
プラスミドpAcGP67B/tcbAの構築
下記のプライマーを使用してtcbA遺伝子をPCR増幅した。5'プライマー(S1Ac51)5'TTT AAA CCA TGG GAA ACT CAT TAT CAA GCA CTA TC3'及び3'プライマー(S1Ac31)5'TTT AAA GCG GCC GCT TAA CGG ATG GTA TAA CGA ATA TG 3'。下記の反応でパンベラ(Madison，Wisconsin)からのタカラLA PCRキットを使用して、PCRを行った。57.5mlの水、10mlの10X LA緩衝液、16mlのdNTP（夫々2.5mMの原液）、20mlの夫々のプライマー(10pモル/ml)、300ngのW-14 tcbA遺伝子を含むプラスミドpDAB634及び１mlのタカラLA Taqポリメラーゼ。サイクル条件は30サイクルについて98℃／20秒、68℃／５分、72℃／10分であった。予想される約7526bpのPCR産物をTBE(100mMのトリス、90mMのホウ酸、１mMのEDTA)緩衝液中0.8％のアガロースゲル中で単離し、キアゲン(Chatsworth，California)からのQlaex IIキットを使用して精製した。精製tcbA遺伝子をNco I及びNot Iで消化し、バキュロウイルス移入ベクターpAcGP67B(ファーミンゲン(San Diego，California))につなぎ、DH5 αE.coliに形質転換した。次いでtcbA遺伝子をpAcGP67Bから切断し、pET27bに移入してプラスミドpDAB635をつくった。tcbA遺伝子中のミスセンス突然変異をpDAB635中で修復した。
【０２３６】
修復されたtcbA遺伝子は配列番号11に示された配列からの二つの変化；アスパラギン71をセリン71に変化する212におけるA>G及びアラニン77をスレオニン77に変化する229におけるG>Aを含む。これらの変化は両方とも提案されたTcbAiiＮ末端の上流である。
pET15-tcbAの構築
pDAB635のtcbAコード領域をベクターpET15bに移入した。ショットガン結合を使用してこれを行い、ＤＮＡを制限酵素Nco I及びXho Iで切断した。得られた組換え体をpET15-tcbAと称する。
【０２３７】
プラスミドpET15-tcbAからE.coli中のTcbAの発現
E.coli中のtcbAの発現を、Studierら(Studier,F.W.，Rosenberg,A.，Dunn,J.，及びDuben-dorff,J.，(１９９０)クローン化遺伝子の発現を誘導するためのT7 RNAポリメラーゼの使用Methods Enzymol.，185:60-89)により既に記載された方法の改良により得た。コンピテントE.coli細胞株BL21(DE3)をプラスミドpET15-tcbAで形質転換し、100μg/mlのアンピシリン及び40mMのグルコースを含むLB寒天に塗布した。形質転換細胞を数百の単離コロニー／プレートの密度まで塗布した。37℃一夜のインキュベーション後に、細胞をプレートからこすり落とし、100μg/mlのアンピシリンを含むLBブロース中で懸濁させた。典型的な培養容積は200-500mlであった。０時に、培養密度(OD600)は実験に応じて0.05-0.15であった。0.15-0.5の密度が得られるまで、培養物を三つの温度（22℃、30℃または37℃）の一つで振とうし、その時点でそれらを１mMのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド(IPTG)で誘導した。培養物を指定温度で４〜５時間インキュベートし、次いで処理するまで４℃に移した(17〜72時間)。
【０２３８】
プラスミドpET15-tcbAからE.coli中で発現されたTcbAの精製及び特性決定
TcbAペプチドを発現するE.coli培養物を以下のようにして処理した。細胞を17,000xGで遠心分離により回収し、培地をデカントし、別の容器中で保存した。  M12(アミコン，Beverly MA)濾過系及び100kD分子量カット−オフフィルターを使用して、培地を約８倍に濃縮した。濃縮培地を陰イオン交換カラムに装填し、結合したタンパク質を1.0MのNaClで溶離した。1.0MのNaCl溶離ピークはサザン・コーン・ルートワーム(SCR)幼虫に対し死亡を生じることがわかった（表30）。1.0MのNaClフラクションを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0に対し透析し、濃縮し、セファロースCL-4B(ファーマシア，Piscataway，New Jersey)によるゲル濾過にかけた。天然W-14毒素複合体としての計算分子量（約900kDa）に相当するCL-4B溶離プロフィールの領域を回収し、濃縮し、幼虫に対しバイオアッセイを行った。
【０２３９】
回収した900kDaのフラクションは殺虫活性を有することがわかり（表30を参照のこと）、症候解滅(symptomology)が天然W-14毒素複合体により生じた症候解滅と同様であった。このフラクションをプロテイナーゼＫ及び熱処理にかけ、両方の場合の活性を排除または低下し、その活性が性質上タンパク様であるという証拠を得た。加えて、試験した活性フラクションは抗TcbAiiモノクローナル抗体で試験した時にイムノブロットアッセイでTcbAペプチド及びTcbAiiiペプチドについて免疫学的に陽性であった。
【０２４０】
【表３７】
表３０．イムノブロットアッセイ及びSCRバイオアッセイの結果
0003657593.tif 000040
PK= プロテイナーゼＫ処理２時間；熱処理＝100 ℃で10分間; ND= 検出されず;NT= 試験せず。対照サンプルと比較した死亡率及び成長抑制に関するスコアリング系; 5-24％＝“＋”、25-49 ％＝“++” 、50-100％＝“+++”
【０２４１】
細胞ペレットを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH=7.0に再度懸濁させ、バイオーネブTM細胞ネブライザー(グラスーコル社，Terra Haute，IN)中の通過により溶解した。ペレットをDNaseで処理してＤＮＡを除去し、17,000xgで遠心分離して細胞ペレットを細胞上澄みから分離した。上澄みフラクションをデカントし、0.2ミクロンのフィルターで濾過して大きい粒子を除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したタンパク質を1.0MのNaClで溶離し、透析し、50,000ダルトンの分子量カット−オフでバイオマックスTM(ミリポア・コーポレーション，Bedford，MA)濃縮装置を使用して濃縮した。濃縮フラクションを、セファロースCL-4Bビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。このようにして調製した物質に関するバイオアッセイを表30に示し、"TcbA細胞Sup"と称する。
【０２４２】
多量の物質を取り扱う別法において、細胞ペレットを10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH=7.0に再度懸濁させ、コンテス・グラス社(Vineland，NJ)の40mlの組織粉砕機を使用することにより充分に均一にした。細胞デブリを25,000xgで遠心分離によりペレット化し、細胞上澄みをデカントし、0.2ミクロンのフィルターに通し、ポロスHQ50ビーズを詰め込んだファーマシア10/10カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。0.0〜1.0MのNaCl勾配を行うことにより結合したタンパク質を溶離した。TcbAタンパク質を含むフラクションを合わせ、50kDa濃縮装置を使用して濃縮し、ファーマシアCL-4Bビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。約900kDaの分子量のTcbAオリゴマーを含むフラクションを回収し、20mMのトリス緩衝液pH=7.3で平衡にしたファーマシアモノQ10/10カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【０２４３】
0.0〜1.0MのNaClの勾配を使用して組換えTcbAタンパク質を溶離した。組換えTcbAは約0.3-0.4MのNaClの塩濃度でカラムから溶離し、同じモル濃度で天然TcbAオリゴマーがモノQ10/10カラムから溶離される。組換えTcbAオリゴマーは表30中の実験と同様のバイオアッセイ実験でSCR死亡率を生じることがわかった。
【０２４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の毒素の配列遺伝子の一部として用いたクローン化ＤＮＡ分離物の対合を示す。
【図２】  配列決定工程で用いた３つのプラスミドのマップである。
【図３】  幾つかの部分ＤＮＡフラグメント間の関係を示すマップである。
【図４Ａ】  ＴｃｂＡiiおよびＴｃａＢiiタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図４Ｂ】  ＴｃｂＡiiおよびＴｃａＢiiタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図５】  Photorhabdus株の樹状図である。Photorhabdus株の関係はｒｅｐ−ＰＣＲで規定された。図５の上部の軸は、ｒｅｐ−ＰＣＲの得点に基づく株間の％類似性を示す（すなわち、0.0（類似性なし）から1.0（１００％類似性））。右軸の数字と文字は調べた種々の株を示す。すなわち、１４＝Ｗ−１４、Ｈｍ＝Ｈｍ、Ｈ９＝Ｈ９、７＝ＷＸ−７、１＝ＷＸ−１、２＝ＷＸ−２、８８＝ＨＰ８８、ＮＣ−１＝ＮＣ−１、４＝ＷＸ−４、９＝ＷＸ−９、８＝ＷＸ−８、１０＝ＷＸ−１０、ＷＩＲ＝ＷＩＲ、３＝ＷＸ−３、１１＝ＷＸ−１１、５＝ＷＸ−５、６＝ＷＸ−６、１２＝ＷＸ−１２、ｘ１４＝ＷＸ−１４、１５＝ＷＸ−１５、Ｈｂ＝Ｈｂ、Ｂ２＝Ｂ２、４８から５２＝ＡＴＣＣ４３９４８からＡＴＣＣ４３９５２。水平線を分けている垂直の線は水平線ベースにある株または株群の間の関係の度合い（例えば株Ｗ−１４は株Ｈ９およびＨｍと約６０％類似である）を示している（これは上部の軸と垂直線との外挿交点から読む）。
【図６Ａ】  Ｗ−１４株のゲノムマップである。
【図６Ｂ】  Ｗ−１４株のゲノムマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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