(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ試料中において、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する方法であって、
ａ）  前記ＤＮＡ試料の存在下で複数のプライマーの混合物を用いてＰＣＲ反応を行い、ここで、前記複数のプライマーは、前記第１の遺伝子に相補的な２またはそれ以上のプライマーおよび前記第２の遺伝子に相補的な１またはそれ以上のプライマーからなり、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を複数のプローブとハイブリダイズさせ、ここで、前記複数のプローブは、前記複数のプライマーのそれぞれに対して１またはそれ以上のプローブが対応するように設計され、各プローブの配列は、そのプローブに対応するプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができるように選択され、かつ、各プローブの配列は、そのプローブに対応するプライマーとブレーキングポイントとの間に別のプライマーが設計されている場合には前記別のプライマーからの伸長産物とハイブリダイズしないように選択され；そして
ｃ）  各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルの強度を測定して、前記第１の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブと、前記第２の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブとを同定することにより、キメラ遺伝子を検出する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
ＤＮＡ試料中において、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する方法であって、
ａ）  前記ＤＮＡ試料の存在下で、前記第１の遺伝子に相補的なプライマーおよび前記第２の遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ここで、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を複数のプローブとハイブリダイズさせ、ここで、前記複数のプローブは、前記第１の遺伝子の配列において前記第１の遺伝子に相補的なプライマーとブレーキングポイントの間の領域の配列に相補的であるように設計されている２またはそれ以上のプローブ、および、前記第２の遺伝子の配列において前記第２の遺伝子に相補的なプライマーとブレーキングポイントの間の領域の配列に相補的であるように設計されている１またはそれ以上のプローブからなり；そして
ｃ）  各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルに基づいてキメラ遺伝子を検出する、
の各工程を含む方法。
【請求項３】
第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出するためのキットであって、前記第１の遺伝子に相補的な２またはそれ以上のプライマー、前記第２の遺伝子に相補的な１またはそれ以上のプライマー、および複数のプローブを含み、ここで、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され、前記複数のプローブは、前記複数のプライマーのそれぞれに対して１またはそれ以上のプローブが対応するように設計され、各プローブの配列は、そのプローブに対応するプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができるように選択され、かつ、各プローブの配列は、そのプローブに対応するプライマーとブレーキングポイントとの間に別のプライマーが設計されている場合には前記別のプライマーからの伸長産物とハイブリダイズしないように選択されることを特徴とするキット。
【請求項４】
第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出するためのキットであって、前記第１の遺伝子に相補的なプライマー、前記第２の遺伝子に相補的なプライマー、および複数のプローブを含み、ここで、各プライマーの配列はプライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され、かつ、前記複数のプローブは、前記第１の遺伝子の配列において前記第１の遺伝子に相補的なプライマーとブレーキングポイントの間の領域の配列に相補的であるように設計されている２またはそれ以上のプローブ、および、前記第２の遺伝子の配列において前記第２の遺伝子に相補的なプライマーとブレーキングポイントの間の領域の配列に相補的であるように設計されている１またはそれ以上のプローブを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キメラ遺伝子の存在および結合部位（ブレーキングポイント）を同定するための方法およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
肉腫には様々な染色体異常が伴うことが知られており、肉腫の病型と、染色体転座によるキメラ遺伝子の形成との間に相関があることが示唆されている。
【０００３】
キメラ遺伝子とは、２種類の遺伝子がそれぞれ途中で切断され、互いにその切断部位で結合して形成される融合遺伝子である。キメラ遺伝子が形成されることにより、キメラ遺伝子を構成する各遺伝子の機能が不全となること、または形成されたキメラ遺伝子が新たな機能蛋白質を発現することが、肉腫の疾患原因となると推察されている。キメラ遺伝子は、ゲノムレベルでの染色体組み換えが起こり、そのブレーキングポイントにある遺伝子同士が融合して形成されるものであり、ゲノムのレベルでは通常はイントロン位置で結合が生ずる。次に、ｍＲＮＡへの転写とその後のスプライシングにより融合ｍＲＮＡが形成され、それが翻訳されることにより、キメラ蛋白質が形成される。
【０００４】
このようなキメラ遺伝子の構造については、次のことが知られている。特定の２種類の遺伝子で形成されるキメラ遺伝子は１種類であるとは限らず、例えば遺伝子Ａ（３個のエクソンで構成）と遺伝子Ｂ（３個のエクソンで構成）で形成されるキメラ遺伝子の場合では、遺伝子Ａのエクソン２の３‘側末端と遺伝子Ｂのエクソン２の５’側末端が結合したもの、遺伝子Ａのエクソン２の３‘側末端と遺伝子Ｂのエクソン３の５’側末端が結合したものなど、複数のキメラ遺伝子が混在して形成される事例もある（図１を参照）。また、キメラ遺伝子のブレーキングポイントは、各遺伝子のエクソン末端部位であることが知られている。
【０００５】
現在までに肉腫との関連が知られているキメラ遺伝子の種類を表１に示す。この標柱にも示されるように、各肉腫に対応するキメラ遺伝子が１種類であるとは限らず、複数の種類のキメラ遺伝子が１種類の肉腫の原因である事例や、複数のキメラ遺伝子が混在して肉腫から検出される事例も知られている。
【０００６】
【表１】
0003623495.tif 000002
【０００７】
さらに、種々のタイプの白血病においてもキメラ遺伝子が関連することが知られている。白血病において見いだされている染色体転座の例としては、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）；  ＡＭＬ１−ＭＴＧ８、ｔ（１２；２１）；  ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ｔ（５；１４）（ｑ３３；ｑ３２）、ｔ（１６；２１）；  ＦＵＳ／ＥＲＧ、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１１）などが挙げられる。
【０００８】
従来、キメラ遺伝子を検出するためには、個々のキメラ遺伝子について、ブレーキングポイントを挟むプライマーを設計し、ＰＣＲにより予測される長さの増幅産物が形成されることを確認するか、または増幅産物を配列決定する方法が用いられてきた。しかし、多種類のキメラ遺伝子についてそれぞれ別個のチューブでＰＣＲ反応を行うことは、操作が煩雑であり、少量の試料では実施が困難である。また、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを非特異的に増幅させた後に、結合部位特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出する方法も知られているが、この方法では高い検出感度を得ることができない。
【０００９】
したがって、当該技術分野においては、複数のキメラ遺伝子を検出する簡便な方法が求められている。
【００１０】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
特表平８−５００９６４
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複数のプライマーを混合物として１チューブで用いるＰＣＲ増幅反応により、複数のキメラ遺伝子について、存在するキメラ遺伝子およびそのキメラ遺伝子の形成形態、すなわちブレーキングポイントの同定を可能とする方法ならびにキットを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＤＮＡ試料中において、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する方法を提供する。本発明の方法は、
ａ）  前記ＤＮＡ試料の存在下で複数のプライマーの混合物を用いてＰＣＲ反応を行い、ここで、前記複数のプライマーは、前記第１の遺伝子に相補的な２またはそれ以上のプライマーおよび前記第２の遺伝子に相補的な１またはそれ以上のプライマーからなり、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を、前記複数のプライマーにそれぞれ対応する複数のプローブとハイブリダイズさせ、ここで、各プローブの配列は、対応するプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができ、かつ、対応するプライマーの伸長方向に別のプライマーが存在する場合には前記別のプライマーからの伸長産物とハイブリダイズしないように選択され；そして
ｃ）  各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルの強度を測定して、前記第１の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブと、前記第２の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブとを同定することにより、キメラ遺伝子を検出する、
の各工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の別の観点においては、ＤＮＡ試料中において、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する方法が提供される。該方法は、
ａ）  前記ＤＮＡ試料の存在下で、前記第１の遺伝子に相補的なプライマーおよび前記第２の遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ここで、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を複数のプローブとハイブリダイズさせ、ここで、前記複数のプローブは、前記第１の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる２またはそれ以上のプローブ、および前記第２の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる１またはそれ以上のプローブからなり；そして
ｃ）  各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルに基づいてキメラ遺伝子を検出する、
の各工程を含む。
【００１４】
本発明のさらに別の観点においては、本発明は、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出するためのキットを提供する。該キットは、前記第１の遺伝子に相補的な２またはそれ以上のプライマー、前記第２の遺伝子に相補的な１またはそれ以上のプライマー、および前記プライマーにそれぞれ対応する複数のプローブを含み、ここで、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択され、各プローブの配列は、対応するプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができ、かつ、対応するプライマーの伸長方向に別のプライマーが存在する場合には前記別のプライマーからの伸長産物とハイブリダイズしないように選択されることを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらに別の観点においては、本発明は、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出するためのキットを提供する。該キットは、前記第１の遺伝子に相補的なプライマー、前記第２の遺伝子に相補的なプライマー、前記第１の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる２またはそれ以上のプローブ、および前記第２の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる１またはそれ以上のプローブを含み、ここで、各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように選択されることを特徴とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡ試料中において、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する方法を提供する。第１の遺伝子と第２の遺伝子とは、翻訳の方向に関していずれが上流側であってもよい。第１の遺伝子と第２の遺伝子との間の結合部位がブレーキングポイントである。
【００１７】
本発明の方法の工程ａにおいては、ＤＮＡ試料の存在下で複数のプライマーの混合物を用いてＰＣＲ反応を行う。ＤＮＡ試料は、被験者から得た試料からｍＲＮＡを調製し、これに相補的なｃＤＮＡを合成することにより調製することができる。プライマー混合物には、第１の遺伝子に相補的な２またはそれ以上のプライマーおよび第２の遺伝子に相補的な１またはそれ以上のプライマーが含まれる。各プライマーの配列は、プライマーがブレーキングポイントに向かって核酸を伸長させるように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかから選択される。
【００１８】
工程ｂにおいては、工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を、複数のプローブとハイブリダイズさせる。これらの複数のプローブは、工程ａにおいて用いた複数のプライマーのそれぞれと対応しており、各プローブは対応するプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる。したがって、各プローブの配列は、対応するプライマーの伸長方向の領域の配列に相補的であるように選択される。対応するプライマーの伸長方向に別のプライマーが存在する場合には、プローブはこの別のプライマーからの伸長産物とハイブリダイズしないように選択される。例えば、工程ａにおいて第１の遺伝子に相補的なプライマー１およびその下流のプライマー２を用いてＰＣＲ増幅を行った場合、工程ｂにおいて、プライマー１に対応するプローブ１は、プライマー１からの伸長産物にハイブリダイズするが、プライマー２からの伸長産物とはハイブリダイズしないように、すなわちプライマー１と２の間の領域に相補的であるように選択される。一方、プライマー２に対応するプローブ２は、プライマー２の伸長方向の領域に相補的であるように選択され、プライマー１からの伸長産物とプライマー２からの伸長産物との両方とハイブリダイズすることができる。これらの複数のプローブを配置したＤＮＡアレイを作製し、これを用いてハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１９】
工程ｃにおいては、各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルの強度を測定して、第１の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブと、第２の遺伝子に相補的なプローブのうち最も強いシグナルを与えるプローブとをそれぞれ同定する。第１の遺伝子および第２の遺伝子におけるこれらのプローブの位置を解析することにより、キメラ遺伝子のブレーキングポイントを判定することができる。なお、ハイブリダイゼーションシグナルが得られなかった場合、またはいずれか一方の遺伝子に相補的なプローブについてのみシグナルが得られた場合には、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子は存在しないと判定される。
【００２０】
次に、図面を参照して本発明の実施態様をより詳細に説明する。図１−図５は、本発明の方法を用いたキメラ遺伝子の検出の具体例を示す。検出すべきキメラ遺伝子が、遺伝子Ａ（エクソン１，エクソン２，エクソン３）と遺伝子Ｂ（エクソン１、エクソン２、エクソン３）とのキメラであって、遺伝子Ａが遺伝子Ｂの上流になるよう融合される場合、キメラ遺伝子は、例えば図１に示されるような種々の結合パターンの構造でありうる。試料中のキメラ遺伝子がいずれの結合パターンを有するものであるかを判定するために、図２に示されるように、ＰＣＲ増幅用プライマー１−６およびこれに対応する検出用プローブ１−６を設計する。
【００２１】
プライマーは、遺伝子Ａの各エクソンについてはセンス鎖の配列を、遺伝子Ｂの各エクソンについてはアンチセンス鎖の配列をそれぞれ選択する。好ましくは、これらのプライマーの位置は、予測されるＰＣＲ増幅産物が、ブレーキングポイントからの距離が５０−１５０ｂｐとなるように、すなわち全長１００ｂ−３００ｂのＰＣＲ産物が得られるように選択する。キメラ遺伝子検出を行う対象サンプルは通常パラフィン切片であることが多く、サンプル中のｍＲＮＡがＲＮＡ分解酵素により分解が進んでいる可能性が高いため、プライマー間の距離が５００ｂを越えると、ＰＣＲ反応の効率が非常に低くなる可能性がある。プライマーの選択においては、各プライマーの特異性が高い；融解温度がＰＣＲ反応に適した温度（例えば約５８−６３℃の範囲内）である；分子内に二次構造を形成しない；プライマーどうしがハイブリダイズしない等の、当該技術分野において知られるプライマー選定の基準も考慮すべきである。プライマーの長さは、好ましくは１２−３０ヌクレオチド、より好ましくは１５−２５ヌクレオチドである。
【００２２】
プローブとしては、プライマーからの伸長産物を検出することができるように、各プライマーの３’側の配列を選択する。プローブは１本鎖でも２本鎖でもよく、１本鎖の場合、その配列はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれであってもよい。検出時のバックグランドを低下させるためには、１本鎖であって対応するプライマーと同じ側の鎖であることが好ましい。プローブの長さは、好ましくは２０−１００ヌクレオチド、より好ましくは４０−６０ヌクレオチドである。
【００２３】
これらのプライマー１−６の混合物の存在下で、試料から調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ増幅においては、増幅産物の検出を容易にするために、ビオチン等で標識したヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば、試料中に存在するキメラ遺伝子の結合パターンが遺伝子Ａ（エクソン１）−遺伝子Ｂ（エクソン２）であるとき、図３に示されるように、プライマー１とプライマー５、およびプライマー１とプライマー６との間で増幅反応が生じ、２種類の増幅産物が得られる。このとき、プライマー１とプライマー５の方が距離が短いため、増幅効率が高くなり、より多くの量の増幅産物が生成するはずである。
【００２４】
次に、これらの標識ＰＣＲ増幅産物を、プローブ１−６を用いてハイブリダイゼーションにより検出する。プローブ１−６をそれぞれＤＮＡアレイの所定の位置にスポットすることにより、キメラ遺伝子検出用ＤＮＡアレイを調製し、これを用いてハイブリダイゼーションを行う。このようなハイブリダイゼーション検出用ＤＮＡアレイの作製方法、ならびにこれを用いてハイブリダイゼーションを行う方法は、当該技術分野においてよく知られている。プライマー１とプライマー５との間の増幅産物（多量）はプローブ１およびプローブ５とハイブリダイズし、プライマー１とプライマー６との間の増幅産物（少量）はプローブ１、プローブ５およびプローブ６とハイブリダイズする。したがって、検出結果は、図４に示されるように、プローブ１およびプローブ５のスポットが陽性となり、プローブ６のスポットが弱い陽性となる。
【００２５】
以上のようにして、ＤＮＡアレイでのハイブリダイゼーションの結果から、試料中に遺伝子Ａと遺伝子Ｂとのキメラ遺伝子が存在し、そのブレーキングポイントは、遺伝子Ａのエクソン１の３’末端と、遺伝子Ｂのエクソン２の５’末端であることがわかる。
【００２６】
同様に、遺伝子Ａと遺伝子Ｂから形成される可能性のあるいくつかのキメラ遺伝子について予測される検出結果を図５に示す。
【００２７】
本発明の別の観点においては、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出する本発明の方法は、１対のプライマーを用いて実施される。この方法の工程ａにおいては、ＤＮＡ試料の存在下で、第１の遺伝子に相補的なプライマーおよび第２の遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。工程ｂにおいては、工程ａから得られたＰＣＲ反応生成物を複数のプローブとハイブリダイズさせる。ここで用いられる複数のプローブは、第１の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる２またはそれ以上のプローブ、および第２の遺伝子に相補的なプライマーからの伸長産物とハイブリダイズすることができる１またはそれ以上のプローブからなる。工程ｃにおいては、各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナルに基づいて、キメラ遺伝子を検出する。下記の実施例２において示されるように、２またはそれ以上のプローブのいずれに対してハイブリダイゼーションシグナルが得られるかを解析することにより、キメラ遺伝子の存在およびブレーキングポイントの位置を同定することができる。
【００２８】
さらに、本発明の方法は、複数のキメラ遺伝子について検出する場合にも適用可能であり、肉腫の原因となっているキメラ遺伝子が未知の状態のサンプルについて、一度の検査によりどのタイプのキメラ遺伝子が関連しているかを同定すること、ならびにそのキメラ遺伝子のブレーキングポイントを同定することが可能である。この場合、検出を行いたいキメラ遺伝子に対応するプライマーセットを全て添加（この時、各キメラ遺伝子で想定される構成に対応するプライマーセットも全て加える）してＰＣＲを実施する。検出を行いたい全てのキメラ遺伝子に対応し、かつ、各キメラ遺伝子の予想される全ブレーキングポイントの組み合わせに対応する検出用プローブを配置したＤＮＡアレイを用いて、得られた標識ＰＣＲ増幅産物とのハイブリダイゼーションを行うことにより、存在するキメラ遺伝子の同定ならびにそのブレーキングポイントの同定を一度の検査により行うことが可能である。
【００２９】
本発明のさらに別の観点においては、上述の本発明の方法において用いられるプライマーおよびプローブのセットを含む、第１の遺伝子と第２の遺伝子とのキメラ遺伝子を検出するためのキットが提供される。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例１．繊維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）に関与するキメラ遺伝子の検出
公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｓ７４５２９、Ｘ７２９９５、Ｘ７２９９６、Ｘ７２９９７、Ｘ７２９９８）に基づいて、ＥＷＳ側に２種類、ＷＴ１側に１種類のＰＣＲプライマー、および検出用の４種類のプローブを設計した。検出すべきキメラ遺伝子の構造、ならびにプライマーとプローブの位置を図６に示す。ここでは、プローブとしてはプライマーと同一の鎖上の配列を選択した。各プローブはＤＮＡ合成機を用いて製造し、ナイロンフィルタに図７に示す配置および量でスポットして、検出用ＤＮＡアレイを作成した。
【００３２】
ＤＳＲＣＴを有すると診断された２名の患者の生検から作製したパラフィン包埋切片のそれぞれから総ＲＮＡを調製し、ランダムプライマーおよびオリゴｄｔプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した（ｃＤＮＡ試料Ｄ３，Ｄ５）。対照としては、ＨｅＬａ細胞株より総ＲＮＡを抽出後４０μｌをＤｎａｓｅ処理し、ランダムプライマーおよびオリゴｄｔプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
【００３３】
これらのｃＤＮＡをテンプレートとして、上述の３種類のＰＣＲプライマーを混合したものを用いて、ビオチン−ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲ反応を実施し、ビオチン標識ＰＣＲ増幅産物を得た。反応条件は図８に示すとおりである。反応生成物をエタノール沈澱し、５０μｌの蒸留水に溶解し、１００℃、５分間熱変性させて氷冷した後、検出用ＤＮＡアレイを用いて５５℃でハイブリダイゼーションを行った。
【００３４】
検出用ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションの結果を図９に示す。ｃＤＮＡ試料Ｄ３からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５と弱く、ＴＭＬＰ６と強くハイブリダイズし、ＷＴ１側プローブＴＭＬＰ１５と弱くハイブリダイズした。ｃＤＮＡ試料Ｄ５からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５と弱く、ＴＭＬＰ６とやや強く、ＴＭＬＰ７と強くハイブリダイズし、ＷＴ１側プローブＴＭＬＰ１５と強くハイブリダイズした。これらの結果から、Ｄ３はＥＷＳとＷＴ１とのキメラ遺伝子を有しており、そのブレーキングポイントはＥＷＳのエクソン８の３’側であると判定された。また、Ｄ５はＥＷＳとＷＴ１とのキメラ遺伝子を有しており、そのブレーキングポイントはＥＷＳのエクソン１０の３’側であると判定された。
【００３５】
次に、Ｄ３およびＤ５からのＰＣＲ産物を直接シークエンシングしたところ、ブレーキングポイントについての上記の判定結果が正しいことが確認された。
【００３６】
実施例２．１対のプライマーを用いる繊維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）に関与するキメラ遺伝子の検出
公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｓ７４５２９、Ｘ７２９９５、Ｘ７２９９６、Ｘ７２９９７、Ｘ７２９９８）に基づいて、ＥＷＳ側に１種類、ＷＴ１側に１種類のＰＣＲプライマーを設計した。検出用のプローブとしては実施例１で作成した４種類のプローブを用い、検出ＤＮＡアレイは実施例１と同様にして作成した。検出すべきキメラ遺伝子の構造、ならびにプライマーとプローブの位置を図１０に示す。ここでは、プローブとしてはプライマーと同一の鎖上の配列を選択した。
【００３７】
実施例１において調製したｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ試料Ｄ５）をテンプレートとして、上述のＰＣＲプライマーを用いて、ビオチン−ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲ反応を実施し、ビオチン標識ＰＣＲ増幅産物を得た。反応条件およびハイブリダイゼーションの条件は実施例１に記載されるとおりである。
【００３８】
検出アレイとのハイブリダイゼーションの結果を図１１に示す。ｃＤＮＡ試料Ｄ５からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５と弱く、ＴＭＬＰ６とやや強く、ＴＭＬＰ７と強くハイブリダイズし、ＷＴ１側プローブＴＭＬＰ１５と強くハイブリダイズした。Ｄ５はＥＷＳとＷＴ１とのキメラ遺伝子を有しており、そのブレーキングポイントはＥＷＳのエクソン１０の３’側であると判定され、実施例１と同じ結果を与えた。すなわち、１対のプライマーと複数のプローブを用いた場合でも、ブレーキングポイントを判定することが可能であった。
【００３９】
実施例３．ユーイング肉腫に関与するキメラ遺伝子の検出
ユーイング肉腫に関与することが知られている複数のキメラ遺伝子を検出するために、公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ３２７０６６、Ｓ７２６２１、Ｓ７２８６５、Ｕ３５６２２）に基づいて、５種類のＰＣＲプライマーと、検出用の７種類のプローブを設計した。検出すべきキメラ遺伝子の構造、ならびにプライマーとプローブの位置を図１２に示す。ここでは、プローブとしてはプライマーと同一の鎖上の配列を選択した。各プローブはＤＮＡ合成機を用いて製造し、ナイロンフィルタに図１３に示す配置および量でスポットして、検出用アレイを作成した。
【００４０】
ユーイング肉腫を有すると診断された６名の患者の生検から作製したパラフィン包埋切片のそれぞれから総ＲＮＡを調製し、ランダムプライマーおよびオリゴｄｔプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した（ｃＤＮＡ試料：ｅｗ４、ｅｗ７およびｅｗ８）。対照としては、ＨｅＬａ細胞株より総ＲＮＡを抽出後４０μｌをＤｎａｓｅ処理し、ランダムプライマーおよびオリゴｄｔプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
【００４１】
これらのｃＤＮＡをテンプレートとして、上述の５種類のＰＣＲプライマーを混合したものを用いて、ビオチン−ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲ反応を実施し、ビオチン標識ＰＣＲ増幅産物を得た。反応条件は図１４に示すとおりである。
【００４２】
ＰＣＲ反応の終了後、試料４μｌを９６μｌの２回蒸留水に溶解し、１００℃で５分間の熱変性を行い、氷上で急冷した後、検出用ＤＮＡアレイを用いて５５℃でハイブリダイゼーションを行った。結果を図１５に示す。
【００４３】
ｃＤＮＡ試料ｅｗ４からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５およびＦｌｉ−１側プローブＴＭＬＰ１０とハイブリダイズした。この結果から、ｅｗ４はＥＷＳとＦｌｉ−１とのキメラ遺伝子を有しており、そのブレーキングポイントはＥＷＳのエクソン７の３’側であると判定された。ｃＤＮＡ試料ｅｗ７からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５およびＥＲＧ１ｅ側プローブＴＭＬＰ１１−１ｅとハイブリダイズした。この結果から、ｅｗ７はＥＷＳとＥＲＧ１ｅとのキメラ遺伝子を有しており、そのブレーキングポイントはＥＷＳのエクソン７の３’側であると判定された。ｃＤＮＡ試料ｅｗ８からのＰＣＲ産物は、ＥＷＳ側プローブＴＭＬＰ５、Ｆｌｉ−１側プローブＴＭＬＰ１０およびＥＲＧ１ｅ側プローブＴＭＬＰ１１−１ｅとハイブリダイズした。この結果から、ｅｗ８はＥＷＳとＦｌｉ−１とのキメラ遺伝子およびＥＷＳとＥＲＧ１ｅとのキメラ遺伝子の両方を有していると判定された。
【００４４】
次に、ｅｗ４およびｅｗ７からのＰＣＲ産物を直接シークエンシングしたところ、ブレーキングポイントについての上記の判定結果が正しいことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キメラ遺伝子の種々の結合パターンの例を示す。
【図２】図２は、本実施態様において用いられるプライマーおよびプローブの位置を示す。
【図３】図３は、本実施態様において得られるＰＣＲ増幅産物の例を示す。
【図４】図４は、本実施態様において得られるハイブリダイゼーションの結果の例を示す。
【図５】図５は、本実施態様においていくつかのキメラ遺伝子について予測される検出結果の例を示す。
【図６】図６は、実施例１においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたプライマーとプローブの位置を示す。
【図７】図７は、実施例１においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたＤＮＡアレイを示す。
【図８】図８は、実施例１においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたＰＣＲ反応条件を示す。
【図９】図９は、実施例１においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１０】図１０は、実施例２においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたプライマーとプローブの位置を示す。
【図１１】図１１は、実施例２においてＤＳＲＣＴキメラ遺伝子の検出に用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例３においてユーイング腫瘍キメラ遺伝子の検出に用いたプライマーとプローブの位置を示す。
【図１３】図１３は、実施例３においてユーイング腫瘍キメラ遺伝子の検出に用いたＤＮＡアレイを示す。
【図１４】図１４は、実施例３においてユーイング腫瘍キメラ遺伝子の検出に用いたＰＣＲ反応条件を示す。
【図１５】図１５は、実施例３においてユーイング腫瘍キメラ遺伝子の検出に用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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