(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、以下：
ＶＴＣＧ（配列番号１）、
ＶＴＣＧ−ＮＨ２（配列番号２１）、および
ＲＶＴＣＧ−ＮＨ２（配列番号２）、
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチド化合物の有効量を含む、薬学的組成物であって、ここで該組成物は、腫瘍細胞の転移を阻害することによって腫瘍を処置する、組成物。
【請求項２】
少なくとも１種の薬学的に受容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は一般にトロンボスポンジン-様活性を保有するトロンボスポンジン（ＴＳＰ）のペプチド断片及び合成類似体に関する。同ペプチドはＴＳＰの生物活性を保持し、類似の挙動をして、細胞接着及び異なる細胞系への付着を強力に促進したりあるいは阻害する。同ペプチドは恐らくＴＳＰの細胞接着領域（ドメイン）が関与するメカニズムによってであると考えられるが、腫瘍細胞転移を仲介することが以前から知られており、転移阻害剤としての用途が期待されている。これらのペプチドは又別な生物学的及び薬学的用途、例えば（ａ）細胞の組織培養用フラスコへの付着の促進又は阻害、（ｂ）傷の癒合促進、血管新生促進、及び移植組織の受容促進、及び（ｃ）抗血小板凝集用試薬としての使用、及び種種の病気治療での診断薬としての用途がある。
【０００２】
【従来の技術（背景）】
トロンボスポンジン（トロンビン感受性蛋白質又はＴＳＰとして知られる）は３個の同一でジスルフィド結合したポリペプチド鎖からなる分子量450,000の蛋白質である(Lawler et al., J. Cell Biol. (1986) 101:1059ー71)。ＴＳＰは生理学的活性物質、例えばトロンビン及びコラーゲンに反応して血小板により分泌される(Lawler, J. Blood (1986) 67:112ー123)。ＴＳＰは３％の血小板全蛋白質と２５％の全血小板 α-粒状蛋白質(granular protein)からなる(Tuszynski, G.P. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:12240ー12245)。他の細胞、例えば繊維芽細胞(Jaffe, E.A. et al., (1983) Natl. Acad. Sci. USA 80:999-1002)、平滑筋細胞(Raugi, G.J. et al., (1982) J. Cell Biol. 95:351ー354)及び内皮細胞（McPhearson, J. et al., J. Biol. Chem. 256:11330-11336)でもＴＳＰが合成される。ＴＳＰはある種の腫瘍組織、例えばメラノーマ細胞(Varani, J. et al., (1989) Clin. Expl. Metastasis 7:319-329)、偏平(squamous)肺癌腫(Riser, B.L. et al., (1988) Exp. Cell Res. 174:319-329)、及び乳癌腫(Pratt, D.A. et al., (1989) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25:343-350) 中で発見されている。更に以下の培養腫瘍細胞、即ち繊維肉腫、横紋筋肉腫、グリオブラストーマ、ウィルム(Wilm's)腫瘍、神経芽細胞腫、奇形癌腫、絨毛膜癌腫、メラノーマ、及び肺癌腫がＴＳＰを合成することが示された(Mosher, D.F., (1990) Annu. Rev. Med. 41:85-97)。最近多くの研究がなされて、ＴＳＰが細胞−細胞間及び細胞−基層間接着で主要な役割を演ずることが示された(Tuszynski, G.P. et al., (1987) Seminars in Thrombosis Hemostasis 13:361-368; Mosher, D.F., (1990) Annu. Rev. Med. 41:85-97)。ＴＳＰは細胞付着、血小板凝集、及び転移動物実験モデルのマウス中で肺癌腫コロニー生成を促進する(Tuszynski, G.P. et al., (1987) Science 236:1570-1573, Tuszynski G.P. et al., (1988) Blood 72:109-115)。ＴＳＰの接着での役割は更に大部分の組織の細胞外マトリックスがＴＳＰを含むことが観察されて支持されている。
【０００３】
ＴＳＰは、種々の巨大分子例えば血漿及びマトリックス成分と特定的に相互作用する線状のポリペプチド領域からなっている。例えばＴＳＰはヘパリン(Yabkowitz, R. et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:10888-10896)、フィブリノーゲン(Tuszynski, G.P. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:12240ー12245)、コラーゲン(Mumby, S.M. et al., (1984) J. Cell Biol. 98:10888-10896)、 及びプラスミノーゲン(Depoli, P. et al., (1989) Blood 73:976-902)と錯体を形成する。ＴＳＰの構造は種々の動物種中で保持されることは、ヒト蛋白質に対する抗体がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ及びシチメンチョウからのＴＳＰと交差反応するという事実からも示される(Switalska, H.I. etal., J. Lab Clin. Med. 106:690-700)。
【０００４】
トロンボスポンジンは、排除クロマトグラフィ(Lawler et al., J. Biol. Chem. (1978) 253:8609-16)、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィ(Tuszynski et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:12240ー12245)、 塩化バリウム沈殿法(Alexander et al., Biochem. J. (1984) 217:67ー71)及びアニオン交換ＨＰＬＣ (Clezarolin et al., J. Chromatog. (1984) 296:249-56)をはじめとして多くの方法によって精製されている。
【０００５】
ＴＳＰの完全なアミノ酸配列はLawler et al., J. Cell Biol. (1986) 103:1635-48; Kobayashi et al., Biochemistry (1986) 25:8418-25; Dixit et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. (1986) 83:5449-53; 及びHennessy et al., J. Cell Biol. (1989) 108:729ー36)を初めとして多くの研究グループによって作成されたＤＮＡクローンから推論されている。
【０００６】
細胞接着は多細胞生体の発達及び生存にとって重要である。細胞接着過程は複雑で多くの細胞外蛋白質例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン及びＴＳＰ、及び多くの細胞レセプターファミリー、例えばインテグリン及び細胞接着分子(ＣＡＭ)を必要とする。これらの分子は正常細胞及び腫瘍細胞の両方に含まれ、近年非常に強力に研究されている。
【０００７】
アミノ酸配列、Ａrg-Ｇly-Ａsp(ＲＧＤ)はフィブロネクチン中の細胞付着領域として確認された(Pierschbacher, M.D. 及びRuoslahti, Ek., (1984) Nature (London) 309:30-32)。 これと同一か又は関連した配列が多くの蛋白質中で発見され、フィブリノーゲンのような巨大分子の細胞結合部位として作用する(Ginsberg, M.D. et al., (1985) J. Biol. Cehm. 260:11891-11896)。しかし、ラミニンの接着機能はＲＧＤ配列に基づかず、アミノ酸配列チロシン-イソロイシン-グリシン-グリシン-セリン-アルギニン(ＹＩＧＳＲ)を含むＢ１鎖のペプチド断片によるもののようである(Sasaki, M. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci 84:935-938)。ＲＧＤ及びＹＩＧＳＲ配列を含む合成ペプチドは細胞接着を促進する。
【０００８】
フィブロネクチン及びラミニンの接着領域を基本として含んだ合成ペプチドと医療に使用することは最近報告されている。Humphries et al. (1986) Science 233：467-470が初めてペンタペプチドＧＲＧＤＳをＢ16-Ｆ10マウスメラノーマ細胞と一緒に注射してC57BL/6マウス中の肺コロニー形成を劇的に阻害することを示した。ラミニン(ＹＩＧＳＲ)から誘導された別の合成ペプチドも又C57BL/6マウス中でＢ16-Ｆ10メラノーマ細胞の転移を劇的に妨害した。(Kleinman, H.K. et al., (1987) Science 238:1132-1133; Kleinman, H.K. et al., (1990) Proc. Natl．Acad. Sci. USA 87:2279-2283)。これらペプチドの阻害活性は、腫瘍細胞が転移を開始して内因性ラミニン及びフィブロネクチンによって標的臓器の血管床へ接着しようとするのに対し、これらペプチドがそれと競合するために起こるものであろう。
【０００９】
転移は腫瘍細胞が一つの場所から他の場所へリンパ液又は血液循環によって移動することを含んだ段階的過程であり、動物中の血小板が減少することにより動物中の転移が効果的に抑えられる(Gasic et al, (1968) Proc. Natl. Acad. Sci．USA 48:46ー52)ので、血小板が転移進行で特殊な役割を演じていると考えられていた。ＴＳＰは全アルファ粒状血小板-分泌蛋白質２５％からなるので、ＴＳＰが腫瘍細胞が血液によって移動して遠くの臓器に転移するのに主要な役割を持っていると考えられよう。事実、ＴＳＰはマウスモデル実験で腫瘍細胞転移を促進することが示された(Tuszynski et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47:4130-4133)。更に血小板の活性化を伴う現象、例えば接着蛋白質の分泌、血小板凝集、蛋白質分解酵素の活性化、及び凝血の連続反応活性化は全て腫瘍細胞転移で重要な役割を演ずることが示された(Gasic, G.J., (1984) Cancer Metastasis Rev. 3:99-116)。
【００１０】
細胞外マトリックスの一部である接着蛋白質は多くの種類の細胞の移動、成長及び形態を制御する。細胞外マトリックス蛋白質は腫瘍細胞レセプターと相互作用し、基底膜コラーゲンに腫瘍細胞を種々の方法で接着する。例えばメラノーマ細胞をin vitroでラミニンと一緒にすると腫瘍細胞の基底膜への接着能力が上がり、肺腫瘍のコロニーができる(Barsky, S.H. et al., (1984) J. Clin. Inv. 74:843-848; Terranova, V.P. et al., (1984) Science 226:982-985)。
【００１１】
上記の情報を検討してみると、ＴＳＰは多様なそして臨床的に重要な過程、例えば細胞移動、傷の癒合、神経再生、及び腫瘍細胞転移で重要な役割を演じることができる。これらの過程の病態生理学を分子レベルで更に良く理解するために、ＴＳＰの生物活性一つ一つを、ＴＳＰの特定の小領域(subdomain)及びオリゴペプチドに帰属させることにより貴重な情報が得られよう。ＴＳＰ及びＴＳＰレセプター領域(ドメイン)の構造を詳細に知ることにより、ＴＳＰの病態生理学活性、例えばＴＳＰによる腫瘍細胞転移形成を遮断することができるＴＳＰ拮抗性ペプチドを設計するのに使用することができる。
【００１２】
ＴＳＰは３個のI、II、及びIII型の繰り返しを示す類似のペプチド配列を含んでいる(Lawler及びHynes, (1986) J. Cell Biol. 103:1635-1648)。３個の繰り返しはそれぞれ６個のシステイン残渣を含む約６０個のアミノ酸からなる。I型の繰り返しは、多くの種類の蛋白質中に見られるペプチド断片を有する相同蛋白質(homology)である。我々は、他の蛋白質中に全体的に保持されるか、又は全体的に保持され、１個又は２個のアミノ酸が置換されているＴＳＰ中(ＶＴＣＧ)のテトラペプチド配列を同定した。保持配列の分布状態を下記表１に示した。
【００１３】
【表１】
0003706151.tif 000002
0003706151.tif 000003
本発明は広範囲な生物、予防及び治療分野で用途のある自然のままのトロンボスポンジンの生物活性と似た活性を有するか、又は同生物活性を阻害するトロンボスポンジン断片及びその同族体を提供する。
【００１４】
【発明の概要】
今トロンボスポンジンの特定領域から得られる１種のペプチド断片又はその合成同族体が広範囲な用途を有することが発見された。これらペプチドはその接着活性によって、哺乳動物体内での腫瘍細胞転移、細胞接着及び血小板凝集を修正し、そして阻害できる。同ペプチドはまた、傷の癒合に、診断剤として、そしてその他関連分野でも有用である。同ペプチドは細胞付着を促進することができ、そのため最適細胞培養表面作成、各種補綴材料の誘導、及び周囲組織の結合を促進することができる。医療装置も又そのような基質を使用して細胞を体内表面に引き付けることができるし、あるいは移植の前に目的の型の細胞を特定表面での成長を促進する様設計できる。本発明のＴＳＰペプチド及び同族体はトロンボスポンジン-様活性を有することが示されている。
【００１５】
それ故、本発明はその一つとして
下記式
【００１６】
【化６】
Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2
式中
Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好ましくはアルギニンであり、
Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好ましくはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選ばれる、
Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカルボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む保護された又は保護されない末端カルボキシル基であるか、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
によって同定される、トロンボスポンジン-様活性を有するポリペプチドを指向したものである。
【００１７】
本発明は又、上記ポリペプチド化合物を、薬学的に受容できる液体、ゲル又は固体担体と共に薬学的組成物である。同組成物の治療的に効果のある量を投与すると、動物、特に脊椎動物例えば哺乳動物及び鳥類に対するトロンボスポンジン-様活性を効果的に強化したり、あるいは阻害したりできる。
【００１８】
【詳細な説明】
本発明によれば、哺乳動物生体内でトロンボスポンジン活性を阻害するか、それに似た活性を発揮できるある種のトロンボスポンジン断片及び同族体が提供される。
【００１９】
Ａ．定義
”トロンボスポンジン-様活性”はここではトロンボスポンジンの公知の生物活性に類似している活性として定義される。これらの活性として、細胞接着促進活性、細胞分裂促進活性、細胞走化活性、及び止血活性、そしてこれらの活性から誘導される全ての活性、例えば腫瘍細胞、微生物又は寄生虫変態活性、血小板凝集活性、繊維素溶解活性、及び免疫調節が挙げられる。
【００２０】
”抗変態活性”はここでは腫瘍細胞変態を防ぐか、またはその程度及び大きさを大きく低下させるか、または一次固体腫瘍の退行を阻害するかまたは引き起こす能力として定義される。
【００２１】
”傷癒合活性”はここでは傷癒合速度を増加させる、あるいは治癒過程の結果を改善する（即ちおびえを少なくし、触覚刺激に対する応答を良くする等）能力として定義される。
【００２２】
”血管生成活性”はここでは血管またはリンパ管生成を阻害するかまたは強化する能力として定義される。
【００２３】
”成長因子活性”はここでは細胞増殖を抑制するか、または促進する能力として定義される。
【００２４】
”細胞接着活性”はここでは細胞、好ましくは動物細胞が基質に付着するのを促進するか、または阻害する能力として定義される。
【００２５】
本発明ポリペプチド化合物アミノ酸残基の配列、中心テトラペプチド、及びそれらの好ましい実施態様は特定のサブクラスのある特性を有するアミノ酸として定義される。
【００２６】
アミノ酸残基は一般に以下の４つの主要サブクラスに分類される。
【００２７】
酸性：即ち残基は生理学的ｐＨの下ではＨを失ってマイナスに荷電しており、水溶液によって引き付けられて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーション（立体配座）の表面に来る。
【００２８】
塩基性：即ち、残基は生理学的ｐＨの下ではＨと会合してプラスに荷電しており、水溶液によって引き付けられて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーションの内部に入って来る。
【００２９】
中性／非極性：即ち、残基は生理学的ｐＨの下では荷電せず、水溶液によって反発されて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーションの内部に入って来る。
【００３０】
中性／極性：即ち、残基は生理学的ｐＨの下では荷電せず、水溶液によって引き付けられて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーションの外部に来る。
【００３１】
勿論、個々の残基分子が集まっている場合に統計的にその一部の分子が荷電し、また他の一部がしないことがあることは理解されよう。荷電しているということをより適切に定義すると、個々の分子がかなりのパーセンテージで（少なくとも約２５％）が生理学的ｐＨの下で荷電している状態を指す。
【００３２】
アミノ酸残基は更に環状であるか、または非環状であるかによって、残基の側鎖置換基に関して、そしてそれが大きいかあるいは小さいかなど、自明の分類法でサブクラスに分類される。残基は、それが合計で３個又はそれ以下の炭素原子を含んでいるときは小さいと考えられている。小さな残基は勿論非環状である。上記方式による分類を、天然に存在するアミノ酸に適用すると以下のようになる。
【００３３】
酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；
塩基性／非環状：アルギニン及びリシン；
塩基性／環状：ヒスチジン；
中性／極性／小：グリシン、セリン及びシステイン；
中性／極性／大／非環状：トレオニン、アルパラギン及びグルタミン；
中性／極性／大／環状：チロシン；
中性／非極性／小：アラニン；
中性／非極性／大／非環状：バリン、イソロイシン、ロイシン、及びメチオニン；
中性／非極性／大／環状：フェニルアラニン、及びトリプトファン。
【００３４】
蛋白アミノ酸プロリンは、中性／非極性／大／環状の分類に入るが、その効果がペプチド鎖の２次コンホメーションに関係のあるのであるので、別に分類されている。
【００３５】
ある種の普通に見られる非天然アミノ酸、例えばデスアミノチロシン(des Tyr)、アグマチン(Agm)、ｎ-ホルミルトリプトファン(f-Trp)、α-アミノイソ酪酸(Aib)、及びザルコシン(Sar)、スタチン、オルニチン(Orn)、ホモリシン、ホモセリン、ホモアルギニン、ノルロイシン、(Nle)、 ノルバリンもまた本発明の化合物に含めることができる。デスアミノチロシンはＮ-末端で取り込まれる。アグマチン及びスタチンはＣ-末端で取り込まれる。上記定義に従えば、ｎ-ホルミルトリプトファンは中性／非極性／大／環状、ザルコシンは中性／非極性／小、α-アミノイソ酪酸は中性／非極性／非環状、オルニチンは塩基性／非環状、ホモリシンは塩基性／非環状、ホモセリンは中性／極性／小、  ホモアルギニンは塩基性／非環状、ノルロイシンは中性／非極性／大／非環状そしてノルバリンは中性／非極性／大／非環状である。
【００３６】
本発明のポリペプチド化合物を記載するのに使用した命名法は、従来の慣習に従ったもので、アミノ基を各アミノ酸の左側に置き、カルボキシル基を右側に置く。本発明の選択された特定実施態様では、末端アミノ基及びカルボキシル基は特に示さないが、特に断らなければ、生理学的ｐＨでペプチドが取ると考えられている形をしているものと理解されたい。アミノ酸構造式では各残基は一般にアミノ酸慣用名に対応した１文字、又は３個の文字で表され、以下のようになる。
0003706151.tif 000004
本明細書において、特に表現でことわらなければ、例えば "[Ｄ-Ｘn]"の記号で示さなければ、光学異性体を有するアミノ酸残基は全てＬ-型を意味している。
【００３７】
本発明の範囲内にある化合物は、開示した式を色々な方法で修正することにより得ることができ、その間こうして得られたポリペプチド化合物の活性は維持される。例えばこれらの化合物のアミノ酸は正常には天然のＬ光学異性体の形をしているが、１個又はそれ以上、通常は２個又はそれ以下が、好ましくは１個のアミノ酸が光学的異性体のＤ型で置き換えることができ、又は同ポリペプチド化合物からなる分子中でＤ,Ｌラセミ混合体を得ることができる。
【００３８】
更に本発明の化合物中に、同活性が維持される限り、ジスルフィド結合を存在させるか又は無くすることができる。当技術分野の熟達者は、分枝状又は環状鎖が、アミノ又はカルボキシル部分を含むアミノ酸側鎖基とペプチド結合を形成することにより製造できることは認識されよう。そのような側鎖基を有するアミノ酸として、例えばグルタミン酸（カルボキシル基）、アルパルギン酸(カルボキシル基）、及びリシン(アミノ基）が挙げられる。分枝鎖及び環状鎖は又硫黄を含む側鎖基を有するアミノ残基、例えばシステインとの間で共有ジスルフィド結合を形成することにより製造できることができる。
【００３９】
ここで使用されているように、”保護されている”末端アミノ基とは、ペプチド合成で伝統的に使用されて来ている各種アミノ末端保護基のいずれかと結合した末端アミノ基を指す。適当な基として、例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニル、芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル、及び脂肪族ウレタン保護基、例えばtert-ブトキシカルボニルあるいはアダマンチルオキシカルボニルなどが挙げられる。Gross及びMienhofer編集、The Peptides, 第３巻、３ - ８８頁（Academic Press，New York, 1981)には適当な末端アミノ末端保護基が数多く記載されている。
【００４０】
ここで使用されているように、”保護されている”カルボキシル基とは、各種カルボキシル末端保護基のいずれかと結合した末端カルボキシル基を指す。当技術分野の熟達者にとって既に明らかなように、適当な基としてはtert-ブチル、ベンジル、又はその他のエステル又はエーテル結合を通じて末端カルボキシル基に結合する受容可能な基が挙げられる。
【００４１】
化合物内に含まれるアミノ酸残基、特にカルボキシ又はアミノ末端にある残基は又、メチル化、アミド化、アセチル化、又はその他の化学基、例えばそれらの活性に悪影響を及ぼさずに循環半減期、プロテアーゼに対する抵抗性、及び同化合物の溶解性を変えられる基で置換することにより改質できる。
【００４２】
上記定義に加えて、下記の略号を本発明の記述に当たって使用してきた。
【００４３】
ＢＣＡ        ビシンコニン酸
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
t-ＢＯＣ      t-ブトキシカルボニル
Ｂzl          ベンジル
℃            摂氏温度
ＤＣＭ        ジクロロメタン
ＤＩＥＡ      ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ      Dulbeccoの最少必須培地
ＤＭＦ        ジメチルホルムアミド
ＨＦ          弗化水素
ＨＯＢＴ      1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＬＰＣ      高速液体クロマトグラフィ
ｍＢＨＡ      メチルベンズヒドリルアミン
μｇ           マイクログラム
μｌ           マイクロリットル
ｍｌ          ミリリットル
ｍＭ          ミリモル
ｎｍ          ナノメーター
ＮＭＰ        Ｎ-メチルピロリドン
％            パーセント
ＰＡＭ        フェニルアセトアミドメチル
ＰＢＳ        燐酸緩衝液
ＴＦＡ        三弗化酢酸
Ｂ．好ましい実施態様
本発明のポリペプチド化合物は全て
下記式
【００４４】
【化７】
Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2
式中
Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好ましくはアルギニンであり、
Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好ましくはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選ばれる、
Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカルボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む保護された又は保護されない末端カルボキシル基であるか、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
からなる中核トリペプチド配列を含んでいる。
【００４５】
特に好ましい実施態様は下記の配列からなる群れから選択される配列である。
ＶＴＣＧ (配列番号Ｎo. １）
ＶＴＣＧ-ＮＨ2  及び
ＲＶＴＣＧ-ＮＨ2
本発明の範囲内の化合物は、当技術分野で良く知られている方法、例えば固相ペプチド合成法によって化学的に合成することができる。同合成は、α-アミノ保護アミノ酸を使用してペプチドのカルボキシル末端から開始する。t-ブチルオキシカルボニル(Boc)が全てのアミノ基に、たとえ他の保護機が適している場合でも、使用することができる。Stewart et al., "固相ペプチド合成"、 W.H. Freeman Co., San Francisco (1969)及びMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2159(1963)、Vale et al., Science 213, 1394-1397(1981)、及びMarke et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981)を参照されたい。使用できるその他の合成法にはHougtonの方法、Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5132 (1981)、あるいは特に小さな分枝状又は環状鎖状ペプチドを従来の液相法に入る方法で合成するなどが挙げられる。液相法は他の合成法と共に、"Principle of Peptide Synthesis" M. Bodansky 編集（Springer-Verlag 1984)に記載されている。これらの、及びその他のペプチド合成法が、米国特許第3,862,925号、 第3,842,067号、 第3,972,859号、 第4,105,602号、 第4,683,291号、第4,244,946号及び第4,305,872号にも例示されている。
【００４６】
これらの化合物は手動による方法、あるいは自動的に、例えばApplied Biosystems社430A ペプチド合成器(Foster City,  カリホルニア)又はBiosearch SAM II 自動ペプチド合成器(Biosearch社、 San Rafael, カリホルニア)を使用し、メーカーの準備したマニュアルの指示にしたがって合成することができる。
【００４７】
合成したペプチドの純度は９５％以上が好ましいが、それ以下でも許容できる。環状ペプチドを得られるのは、２個のシステインアミノ酸が結合している場合、あるいはアミノ酸残基がジスルフィド結合を含んでいる場合で、これはペプチドの希薄水溶液をＫ3[Ｆe(ＣＮ)6]で酸化して形成することができる。その他の当技術分野で公知の環化法も利用できる。本発明の安定した環状ペプチドは又隣あっていないアミノ酸残基間でペプチド結合を形成させても製造することができる。このようなペプチド結合形成法はSchiller et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1985) 25:171に示されている。
【００４８】
本発明の化合物を合成する過程で、本発明の開示に従って作られる中間体がそれ自体有用な化合物であり、従って本発明の範囲に入ることはペプチド合成分野の通常の熟達者には直ちに理解されよう。
【００４９】
もしくは本発明の選ばれた化合物は、よく知られた方法に従って製造した組み替えＤＮＡの発現によって製造することができる。そのような製造法はそのような化合物を大量に製造する場合に、あるいはその代替実施態様として望ましい。
Ｃ．投与
本発明の化合物は、健全な動物中でトロンボスポンジン-様活性を有する。本発明の化合物、及び同化合物を含む組成物はトロンボスポンジン本来の効果を阻害したり、それと同様の効果を発揮したりする生理学的効果を有することが示されており、治療及び予防で多くの用途、例えば癌の治療、傷の治癒、血栓又は血栓溶解、血管形成、あるいは細胞付着で使用される。
【００５０】
かくして、本発明は又、本発明の化合物を効果量含むか、その無毒性付加塩、アミド及びエステルを含む組成物、これらは単独でも良い、を提供し、上に述べた医療的な恩恵を提供する。このような組成物は又、生理学的に許容できる液体、ゲル、あるいは固体状希釈剤、アジュバント(補佐剤)、及び賦形剤と一緒にして提供することもできる。
【００５１】
これらの化合物及び組成物は獣医学的な用途で動物に、例えば家畜に、ヒトにおいては臨床的な用途で、外の治療剤と同ような方法で投与することができる。一般に治療的効果に必要な投与量は約１μｇないし300 μｇ／ｋｇ、より普通には10 μｇないし30 μｇ／ｋｇ体重である。さもなければこれらの範囲内の投与量を長時間、通常24時間以上、目的とする医療効果が得られるまで連続的に点滴して投与することができる。
【００５２】
一般にはこのような組成物は注射剤として溶液又は懸濁液の形に、溶液又は懸濁液調製に適した固体状に調製される。液剤は注射の直前に調製することもできる。薬剤は乳化することもできる。活性成分は場合により、生理学的に耐性のある、そして活性成分と相溶性である希釈剤及び賦形剤と混合することもできる。適当な希釈剤及び賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、その他及びそれらの混合物である。更に希望されれば本組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、安定剤、あるいはｐＨ緩衝剤、その他を含むことができる。
【００５３】
本組成物は従来法により、非経口的に注射、例えば皮下又は静脈内注射により投与される。更にその他の投与法に適した配合物には、座薬、鼻腔内エアロゾル及び場合によっては経口用配合物が挙げられる。座薬用の従来の結合剤及び賦形剤には例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリドが挙げられ、このような座薬は0.5％ないし10％、好ましくは１％ないし２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口用配合物には通常使用される賦形剤、例えば薬剤グレード（品質等級）のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、その他を含んでいる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出配合物、又は粉末剤の形を取り、10％ないし95％、好ましくは25％ないし70％の活性成分を含んでいる。これらの経口用配合物はペプチドが吸収されるまで保護するように設計した配合物からなる。
【００５４】
本ペプチド化合物は中性又は塩の形で組成物中に配合することができる。薬学的に受容できる無毒性塩としては酸付加塩（遊離アミノ基と形成）が挙げられ、無機酸、例えば塩酸、又は燐酸又は有機酸、例えば酢酸、オキザル酸、酒石酸、マンデル酸その他と形成する。遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、その他から誘導することができる。
【００５５】
本発明のトロンボスポンジン-様活性を示す化合物のほかに、本発明の化合物はまた、有用な化合物合成の中間体として使用することもできる。
【００５６】
本発明の化合物はそれ自体単独重合させることができ（即ち、(ペプチド)n）るか、あるいは他のペプチドと相互に複合重合（即ち(ペプチド１)-(ペプチド２)）できる。同化合物はまた、ジスルフィド又はその他の方法によって環化することができる。同化合物はまた、生物適合性の(biocompatible)高分子化合物、例えばＢＩＯＴＯＬTMポリマー(W.R. Grace 社、コネチカット)と抱合体(conjugate)を形成することもできる。
【００５７】
何かの説に縛られることを望む訳ではないが、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対してアゴニスト（作動薬）又はアンタゴニスト(拮抗薬)として作用すると信じられている。これらの化合物はまた、サーカムスポロゾアイト蛋白、トロンボスポンジン関連の名称のない蛋白質、アンチスタチン、プロペルジン補体蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストとしても作用する。更に本発明の化合物は、（天然のトロンボスポンジンと比較して）形状が小さいので、それらが示す性質は、他の一般的な接着化合物、例えばＲＧＤ-含有化合物(その配列は100を超える蛋白質に見られる)及びフィブロネクチンの作用とは対立するものであるので非常に特定的なものと言える。本発明のペプチド化合物の副作用はこれらの広範囲に接着する化合物と比較して大きく低下している。
【００５８】
Ｄ．使用
先に述べたように、本発明の化合物は各種の生物学、予防学あるは治療学の分野で使用することができる。これらの化合物がトロンボスポンジン-様活性が役割を演ずる病気状態あるは条件を防ぎあるいは治療するのに有用であることは予期されたことである。これらの病気状態及び条件は、転移、創傷治癒、血栓状態、血管生成、及び細胞増殖である。勿論これらに制限されない。本発明の化合物に対する抗体はまた、治療剤、治療剤、あるいは他の化合物の担体としても有用である。本化合物はまた、生物医療機器中でも使用することができる。
【００５９】
多くの生体外及び生体内検査がトロンボスポンジン-様活性を有する化合物を証明するのに使用することができる。これらの検査には、細胞接着検査、血小板凝集検査、及び細胞増殖検査が含まれる。ただこれだけに制限されるものではない。
【００６０】
転移
転移とは、病気が体の一つの場所から、それと関係の無い場所へ、あたかも悪性腫瘍細胞が血流又はリンパ液によって移動するかのように広がる現象である。転移は腫瘍細胞の内皮への接着、内皮の引っ込み、基底膜のマトリックス分解、及び腫瘍細胞の血液流への侵入と連続的に進むメカニズムによって起こると信じられている。この連携をいずれかの段階で遮ることが出来れば、転移性癌の治療及び予防に役立てることができよう。
【００６１】
天然のトロンボスポンジン分子は腫瘍細胞転移を増強することが示された(Tusuzynski et al., Cancer Research (1987) 47:4130-4133)。トロンボスポンジンによる増強作用は、現在のところ充分には理解されていない。
【００６２】
抗転移活性は同化合物が in vitroでメラノーマ細胞と結合する能力(Tusuzynski et al., Anal. Bio. (1990) 184:189-191)、及び腫瘍コロニーの大きさ及び数を減少させる能力(Tusuzynski et al., Cancer Research (1987) 47:4130-4133)として特徴づけられる。
【００６３】
本発明の化合物は抗転移剤として有用であり、特に抗肺癌転移剤として有用である。これらの化合物は転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポンジンに反応する細胞の接着を阻害する。同化合物はまた、腫瘍コロニーの数を減少させ、同時にその大きさを縮小させる。
【００６４】
このような抗転移活性が発生するメカニズムは数多くある。同ペプチドが細胞毒性であるか、又は細胞増殖を抑制する。細胞増殖抑制剤として、同化合物はその作用として、(１) 細胞分裂を抑制する、(２) 血管生成を抑制する、(３) 補体経路を及びそれに関連するキラー細胞を活性化することができる。
【００６５】
本発明の化合物はまた、生物医学機器に用途を持っている。同化合物は転移性腫瘍細胞接着を促進する能力を有するので、生物医学機器に同化合物を塗布し、血液及びリンパ液から循環する腫瘍細胞を除去することが可能である。生物医学機器は又肝癌細胞をつかまえるのに有用である。
【００６６】
本発明の化合物のもう一つの用途は、目的とする毒素、医薬、ホルモン、又は転移性腫瘍細胞に対する造影剤の担体として、診断あるいは治療目的で使用することである。これらの担体は又肝癌細胞とも結合しよう。
【００６７】
創傷治癒
傷が治癒することは傷が塞がる過程であり、炎症、血管生成、コラーゲンの析出、そして上皮被覆(epithelialization)の４つの必須段階に分けることができる。４段階全てが傷の治癒でそれぞれ役割を演ずる。
【００６８】
創傷治癒活性は、同化合物が血管生成で示す能力、コラーゲン析出及び in vivo スポンジモデル中でのＤＮＡ合成を活発化する能力、あるいは 傷の深さが部分的な、又は実際と同じ深さの in  vivo 創傷モデルで、同化合物が傷の治癒を改善する、又は治癒時間を短縮する能力によって確認される。
【００６９】
抗血小板凝集
血小板凝集は損傷した組織からの出血を停止させる正常な、そして有益な過程である。しかし、血小板凝集は下記の心臓血管治療、例えば、血管生成、血栓分解治療、又は血管移植で問題を引き起こす。血小板は、α-粒状血小板分泌蛋白質全体の中で２５％にも及ぶＴＳＰ蛋白を含んでいる。それゆえ、ＴＳＰ分子中に保持され、血小板表面にあるレセプターと結合するペンタペプチド配列を含むペプチドを導入することにより、血小板が凝集し、そして血餅を形成するのを防ぐことができる。
【００７０】
このペンタペプチドを基剤とした薬剤は、現在市販されている他の血餅溶解剤(例えばｔＰＡ、ストレプトキナン）を使用する血管生成、及び血栓溶解剤溶解治療の補助財として期待される。同補助剤は、出血を悪化させず、又合成抗血小板薬剤に共通な副作用の危険は持っていない。更に同ペプチドは（例えば心臓バイパス手術で使用される）孔直径の小さい移植血管を開いたまま保持するのを助けることができる。卒中の危険のある患者にも同じように応用出来ると考えられる。
【００７１】
抗血小板活性は、(１) 洗浄血小板中でのＡＤＰ又はトロンビン-誘発血小板凝集の阻止、(２) 血小板リッチ血漿中でのＡＤＰ-誘発血小板凝集の阻止、及び  (３) in vivo 測定のコラーゲン-誘発血小板凝集の阻止をはじめとする、多くの検査法によって確認される。
【００７２】
血管生成
血管生成は血管及びリンパ管の生成である。血管生成は、発生中、創傷治癒、固形腫瘍の成長に必須である。血管生成は複雑な過程であり、上皮細胞の出現及び移動、その増殖及び管状構造への分化、そして管周辺基底膜マトリッックスの製造を必要とする（Herbert et al. 1988, J. Cell, Biol. 106:1365ー1373)。血管生成は腫瘍の発生、成長及び転移にも必須である。血管生成を防止すれば固形腫瘍の成長を抑制できる。本発明の化合物を使用することにより、血管生成の多段過程の中の１段又は複数段を阻害することができ、それ故このようなペプチドは転移を阻害して臨床的に有用であることができる。本発明の化合物は血管生成の転形、特に創傷治癒を強化するのに有用であり、腫瘍の成長を阻害するか又は予防する。本発明の化合物は又糖尿病性網膜症、新生血管性緑内障、関節リウマチの抑制及び予防にも有用である。血管生成の標準検査法は当技術分野ではよく知られている。これらの検査法としては、各種細胞系列を使用した増殖及び移動の研究、コラーゲナーゼ阻害法、及び in vivo チキン漿尿膜上での血管新生法(ＣＡＭ検査)が挙げられる。
【００７３】
接着及び細胞付着
本発明のぺプチドは、細胞培養に最適の表面を作成するために、そして周辺の組織との結合を促進する補綴材料用に使用することができる。これらペプチドは細胞付着蛋白質として、例えば未処理合成プラスチック樹脂、特に異なる膜利用で使用される材料、例えばニトロセルロース又はポリスルホン、及び同様の材料の疎水性表面を同ペプチドで処理することにより、細胞付着基質を与えるのに有用であることができる。同ペプチドの細胞付着性は又、ポリペプチドを共有結合で固体支持体例えばゲル又は合成樹脂、又は長鎖ポリサッカリドに結合させることにも使用できる。この後者の方法は異なるアフィニティクロマトグラフィ用途のために使用できる。このようなペプチドを用いたもう一つの重要な応用は、市販細胞付着表面でペプチドを使用することで、それにより、粒子にゼラチンを塗布し、時計皿中で可能な量よりも遥かに少ない量の媒体中で、同じ付着細胞の成長を可能にしている。医療装置はこのようなペプチドを使用して細胞を in vivo表面に付着させるか、又は希望の型の細胞が、移植前に特定表面上で成長するのを促進するよう設計することができる。例えば膜への細胞の塊の付着、内皮細胞の補綴用血管上、又は移植血管上での育成である。このようなペプチドは創傷治癒を助ける移植用パッチに塗布するなどの用途がある。
【００７４】
抗体
本発明のペプチド化合物を指向した抗体は、モノクローナル及びポリクローナルの両方とも、同ぺプチドが誘導される主題の蛋白質の単離及び同定で有用であり、本発明は又このような抗体からなる。抗体を作成するために当技術分野で公知である多くの技術のいずれをも使用することができる。このような一技術で、ポリクローナル抗体が、動物、例えばウサギに本発明の化合物１種又はそれ以上を注射することにより合成することができる。注射後、動物は自然にこれら化合物に対する抗体を生産する。抗体水準が充分なレベル迄上昇すると、抗体を含む血液、抗血清と呼ばれる、は動物から取り出され、化合物に特異的な抗体が抗血清中の他の抗体から、たくさんある中の一つの分離法（例えばアフィニティクロマトグラフィ）によって単離される。モノクローナル抗体は Kohler 及びMilstein (Nature 256, pp. 495-497 (1975) の技術を使用して作成できる。
【００７５】
本発明の化合物は又標識試薬を用いるイムノアッセイ（免疫検定法）で使用する抗血清を製造するのにも使用することができる。ポリペプチドは、ジアルデヒド、特に炭素数が４ないし６個で脂肪族であるジアルデヒド又はカルボジイミドを使用すると抗原と抱合させるのに便利である。これらの化合物及び免疫試薬は各種の試薬、例えば発色団、蛍光発色団、例えばフルオレセイン又はローダミン、放射性同位元素、例えば125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は3Ｈ、あるいは磁気化した粒子で、この技術分野で良く知られた方法により標識することができる。これらの標識化合物及び試薬、又はそれらを認識し、特定的に結合できる標識試薬は、例えば診断薬などの用途がある。生物試験片から誘導した試料は、本発明の化合物と共通の抗原決定基を有する物質の存在及び量について検定することができる。
トロンボスポンジンレベルは、転移性乳癌患者及び結腸患者の血清中では上昇する(Tuszynski et al., Thrombosis Haemostas (1989) 62:418、 及びSmith et al., Proceeding American Association of Clinical Oncology (1990) 9:6)。
本発明のペプチドに対する抗体は、各種の癌、例えば消化管（胃、結腸、及び直腸）癌腫瘍、乳癌腫瘍、及び肝癌腫瘍（これらに制限されない）の診断／予断検定で試薬として有用である。
【００７６】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体は多くの癌治療で治療薬として使用することができる。第一番に、抗体はトロンボスポンジンを隔絶する(sequestr)のに使用することができる。二番目に、同抗体は腫瘍細胞表面に存在するトロンボスポンジンを遮断するのに使用することができる。三番目に細胞毒性薬剤、ホルモン、又は造影剤を抗体とカップリングさせて癌治療に使用することができる。四番目に生物医学機器に抗体を塗布して、血清から過剰のトロンボスポンジンを除去するか、又はその表面に付着したトロンボスポンジンを有する細胞を除去するのに使用することができる。
【００７７】
本発明のペプチドは又細胞抽出物、又は細胞膜からトロンボスポンジン細胞表面レセプターを単離するのに使用することができる。標準的にはアフィニティクロマトグラフィを使用することができる。トロンボスポンジン細胞表面レセプターはトロンボスポンジン同族体をより良く発達させるために、又は過剰のトロンボスポンジンを血清から除去するために使用することができる。
【００７８】
以下、実施例によって本発明を説明する。これらは本発明を何等制限しない。
【００７９】
【実施例】
本発明のペプチドは従来のペプチド合成法によって合成することができる。従来法として好ましくは Int. J. Pept. Proc. Res. 21, 57-63 (1983) に記載されている工程を使用する。Merrifiedの固相合成法も好ましい (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Science 150, 178-185 (1965); Ibid. 232, 341-347 (1986))。 固相法でＣ-末端カルボキシアミドを有するペプチドを合成するときは、一般に保護したα-アミノ酸を適当な樹脂、例えばフェニルアセトアミドメチル(ＰＡＭ)ポリスチレン樹脂、又はp-メチルベンズヒドリルアミン(ｍＢＨＡ)樹脂にカップリングさせて、ペプチドのＣ-末端から開始する。合成の際必要に応じて適当なアミノ酸側鎖保護基を使用する。かくしてアルパルギン酸はベンジルエステルによって β-カルボキシル基上で保護され、アルギニンはトシル基によってグアニジノ基上で保護される。目的のペプチドを合成してからペプチドを樹脂から外し、保護基を除くために試薬、例えば弗化水素(ＨＦ)で処理する。得られたペプチドは次いで高速クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)又は同様なペプチド精製法によって精製することができる。固相法ペプチド合成法の確立された操作法の背景となっている情報は Stewart及びYoung著、"Solid Phase Peptide Synthesis" (固相ペプチド合成法) (W.H. Freeman社、サンフランシスコ）1969 発行でみることができる。
【００８０】
上記記載に従って、以下に示す操作が新規な合成ペプチドの化学合成で使用された。
【００８１】
【実施例１】
Ｃ-末端アミドを有するペプチド配列ＶＴＣＧ(配列ＩＤ Ｎo. １)の合成
Ｃ-末端アミド用4-メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）の適当な樹脂をポリプロピレン製の網目パケット(一種の小さな容器）（孔径：64 μ)内に封入した。パケット全てを塩化メチレンの入っている共通の容器に入れ、激しく撹拌して樹脂を洗浄し、膨潤させた。続く段階は全て、激しく撹拌して充分な量の溶媒を確実に移行させた。次いでＮ-α-ブトキシカルボニルを５５％濃度の三弗化酢酸／塩化メチレン溶液を使用して酸分解を３０分間実施して除き、アミノ酸基を三弗化酢酸塩の形で残す。パケットを塩化メチレン（２回）、イソプロパノール（２回）、更に塩化メチレン（２回）で洗浄して過剰の三弗化酢酸を除去し、中性にする。三弗化酢酸塩はパケットを５％ジイソプロピルエチルアミンの塩化メチレン溶液で、３回、それぞれ２分間洗浄して中和した。続いて塩化メチレンで２回洗浄して過剰の塩基を除去した。パケットは共通容器から取り出し、中和に先立ってコンピュータによる情報から準備調整したそれぞれ0.2Ｍのアミノ酸溶液に加えた。同じ量の0.2 Ｍジプロピルカルボジイミドを添加してカップリング反応を活性化した。室温で１時間カップリングさせてから、パケットをジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄し、共通容器に戻した。この操作を各アミノ酸毎に繰り返した。得られたペプチドを、92.5％弗化水素／7.5％アニソールと、-１０℃ないし０℃で90分間以上反応させ、開裂反応を行った。アニソールは側鎖保護基除去の結果生ずるカルボカチオンと反応するスカベンジャーとして使用した。この溶液をＮ2を強く流し、次いでアスピレーター真空で除去し、その間温度は０℃に維持した。残ったアニソールはエチルエーテルで２回洗浄して除いた。得られたペプチドは10％酢酸で抽出した。
【００８２】
粗ペプチドの純度は、Vydac C-18カラムを装備したBeckman System Goldを使用した分析用 RP-HPLC により、流速１ml/minでチェックした。使用した溶媒系は、0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸のアセトニトリル溶液(Ｂ)とを、30分間５ - 65％Ｂの濃度勾配で使用し、215μｍ波長で吸収を測定した。精製は、Waters社製Pak Nodule Radial Compression C18 カラム（24 cm x 5 cm、 10 - 20 μ)を装備したWaters delta社製、3,000 分離用 HPLCによって実施した。溶媒系は0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸アセトニトリル溶液であった。各種の直線的な濃度勾配を用いて波長230ｎｍで吸収を測定し、40ｍｌの画分を回収した。各画分はBeckman 分析系で分析した。目的の画分は一緒にし、凍結乾燥した。最終の乾燥製品はもう一度分析用RP-HPLCを使用して分析した。
【００８３】
【実施例２】
ペプチド配列ＶＴＣＧ（配列ＩＤＮｏ．１）酸の化学合成
Ｃ-末端酸用フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）の適当な樹脂をポリプロピレン製の網目パケット(一種の小さな容器）（孔径：64 μ)内に封入した。パケット全てを塩化メチレンの入っている共通の容器に入れ、激しく撹拌して樹脂を洗浄し、膨潤させた。続く段階は全て、激しく撹拌して充分な量の溶媒を確実に移行させた。次いでＮ-α-ブトキシカルボニルを５５％濃度の三弗化酢酸／塩化メチレン溶液を使用して酸分解を３０分間実施して除き、アミノ酸基を三弗化酢酸塩の形で残す。パケットを塩化メチレン（２回）、イソプロパノール（２回）、更に塩化メチレン（２回）で洗浄して過剰の三弗化酢酸を除去し、中性にする。三弗化酢酸塩はパケットを５％ジイソプロピルエチルアミンの塩化メチレン溶液で、３回、それぞれ２分間づつ洗浄して中和した。続いて塩化メチレンで２回洗浄して過剰の塩基を除去した。パケットは共通容器から取り出し、中和に先立ってコンピュータによる情報から準備調整したそれぞれ0.2Ｍのアミノ酸溶液に加えた。同じ量の0.2 Ｍジイソプロピルカルボジイミドを添加してカップリング反応を活性化した。室温で１時間カップリングさせてから、パケットをジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄し、共通容器に戻した。この操作を各アミノ酸毎に繰り返した。得られたペプチドを、91.5％弗化水素／7.5％アニソールと、-１０℃ないし０℃で90分間以上反応させ、開裂反応を行った。アニソールは側鎖保護基除去の結果生ずるカルボカチオンと反応するスカベンジャーとして使用した。この溶液をＮ2を強く流し、次いでアスピレーター真空で除去し、その間温度は０℃に維持した。残ったアニソールはエチルエーテルで２回洗浄して除いた。得られたペプチドは10％酢酸で抽出した。
【００８４】
粗ペプチドの純度は、Vydac C-18カラムを装備したBeckman System Goldを使用した分析用 RP-HPLC により、流速１ml/minでチェックした。使用した溶媒系は、0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸のアセトニトリル溶液(Ｂ)とを、30分間５ - 65％Ｂの濃度勾配で使用し、215μｍ波長で吸収を測定した。精製は、Waters社製Pak Nodule Radial Compression C18 カラム（24 cm x 5 cm、 10 - 20 μ)を装備したWaters delta社製、3,000 分離用 HPLCによって実施した。溶媒系は0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸アセトニトリル溶液であった。各種の直線的な濃度勾配を用いて波長230ｎｍで吸収を測定し、40ｍｌの画分を回収した。各画分はBeckman 分析系で分析した。目的の画分は一緒にし、凍結乾燥した。最終の乾燥製品はもう一度分析用RP-HPLCを使用して分析した。このペプチドの、精製後の典型的な HPLC クラマトグラフィの図を図２に示した。
【００８５】
【実施例３】
その他のペプチドの化学合成
実施例１及び２の方法、更にInt. J. Pept. Proc. Res. 21, 57-65 (1983)の方法を適当に改良した方法に従って、下記のペプチドを合成した。本発明の全てのペプチドは標準ＬＡＬ検査法を使用してその内部毒について試験を行い、内部毒はないことが判った。
【００８６】
ＲＶＴＣＧ-ＮＨ2 (配列ＩＤＮｏ．２）
【００８７】
【実施例４】
各種細胞のＴＳＰ及びペプチドへの接着
この実施例では一連のペプチドを試験して、ペプチドの種々細胞への結合能力をトロンボスポンジンと比較した。この検査で使用した細胞はＢ16Ｆ10メラノーマ細胞、ヒト肺癌腫瘍細胞、ウシ内皮細胞、及びウサギ平滑筋細胞である。トロンボスポンジンは転移ではその接着性によって作用すると信じられている。検査法は一般にTuszynski et al., (Anal. Bio. (1990) 184:189-91)が、細胞の本発明のトロンボスポンジン断片又はその同族体に接着する能力を評価するのに示した方法に従って開発されたものである。この検査法では、(Tuszynski et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:12240-5 によって精製されたトロンボスポンジンを正の調節として使用し、かき集めたペプチドＶＣＴＧＳＣ、ＡＮＫＫＨＹＦ、及びＴＣＶＣＧＳを負の調節として使用した。本発明のトロンボスポンジン同族体は実施例１ないし３に記載してあるように合成した。２μｇのペプチド又は対照蛋白質を96個のウェルを持ったミクロタイタープレートのウェルで一晩風乾した。ウェルはHEPES-緩衝溶液で洗浄し、１％濃度脂肪酸フリーＢＳＡのHEPES-緩衝液溶液でブロックした。
【００８８】
各種細胞を成育させ、対数相成長期間中に標準法で収穫した。収穫した細胞は血清を含まないDulbeccoの最小必須培地(ＤＭＥＭ)(Flow Laboratoriesから入手）で２回洗浄、５ｍＭのグルコースと100 μＭの塩化マグネシウムを含む HEPES緩衝液に懸濁し、最終濃度を２ x 105細胞／ｍｌにした。各種配位子を含むマイクロタイタープレートのウェル毎に200,000個の細胞を懸濁させ、同プレートをＣＯ2インキュベーター中37℃で30分間培養した。非付着性細胞は吸引して取り除き、ウェルは2,000 μｌのＰＢＳで３回洗浄した。細胞会合性蛋白質の合計量を、付着している細胞を 200 μｌのPierce BCA 処理溶液で直接溶かし込んで測定した(Pierce Chem. 社の冊子： Booklet No. 23225(1987))。マイクロタイタープレートは接着性 myler シート（ポリエステルシートの１種）カバーし、60℃で30分間培養した。プレートは室温に冷却し、カバーしたシートを除き、ウェル個々の吸収を波長562ｎｍでマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した(Biotek社、 Burlington, バーモント州）。吸収は経験的に決めた変換因子を用いて付着細胞の数に変換した。
【００８９】
結果を図１ないし４に示す。それによると、本発明のペプチドは種種の細胞系列で接着性を示すことが判る。
【００９０】
【実施例５】
ペプチドのＢ16Ｆ10肺癌腫瘍細胞転移への効果
本発明のペプチド化合物の抗転移活性を証明するのに使用された in vivo モデルはTuszynski et al., (Cancer Res. (1987) 47:4130-4133)によって記載されている。簡単に言うと、Ｃ57ブラックマウスに、制御緩衝液(Hepes 緩衝塩溶液、 ｐＨ 7.4) 又は本発明の指示したペプチド化合物１ｍｇのどちらかの存在下に、１ x 105個のＢ16Ｆ10マウスメラノーマ細胞を注射した。各化合物に対して５又は６匹の動物を使用した。検査で試験したペプチドはトリパンブルー色素排除試験法で測定したところ、細胞生存率に対して効果を示さなかった。更に１ｍｇ／ｍｌでペプチドは24時間共同培養しても細胞を成長させなかった。14日後、マウスを屠殺して、肺癌腫瘍の数を数えた。
【００９１】
図５に示した結果は、本発明のペプチドが抗転移活性を有していることを示している。バーグラフは処置グループで観察された肺癌腫瘍の平均数を示し、エラーバーは平均標準偏差を表している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のペプチドがＢ16Ｆ10メラノーマ細胞の接着を阻止する能力を示している。
【図２】図２は本発明のペプチドがヒト肺癌腫瘍細胞の接着を阻止する能力を示している。
【図３】図３は本発明のペプチドがウシ内皮細胞の接着阻止能力を示している。
【図４】図４は本発明のペプチドがラビット平滑筋細胞接着阻止能力を示している。
【図５】図５は本発明のペプチドが in vivo 抗転移活性を有していることを実証している。
【表２】0003706151.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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