(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する装置であって、
テストサンプル溶液を収容可能な複数の容器と、前記各容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する手段を備えた自動サンプラーと、
支持液体を収容可能な容器と、
テストサンプル溶液、支持液体および前記膜を受け入れ可能な、上面が大気に開放されている灌流チャンバであって、該チャンバ内に含まれる溶液と電気的に接触可能な基準電極を備えた灌流チャンバと、
前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を前記灌流チャンバに移送し、支持液体の容器から支持液体を前記灌流チャンバに移送する手段と、前記テストサンプルおよび前記支持液体を、前記灌流チャンバから取り去る手段と、
その内部に電極を備え、前記灌流チャンバ上を移動可能に位置し、高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置している前記膜のパッチの表面を提供するパッチ・ピペットと、
前記パッチ・ピペット電極および前記基準電極に電気的に接続され、前記テストサンプルを前記灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れる電流を測定する手段と、
を備えた装置。
【請求項２】
テストサンプルおよび支持液体を前記灌流チャンバに移送する手段が、前記灌流チャンバ上に取付けられ、テストサンプルおよび支持液体を前記灌流チャンバ内に放出する孔を有するＵ型管を備えた請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項３】
膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する装置であって、
テストサンプル溶液を収容可能な複数の容器と、前記各容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する手段を備えた自動サンプラーと、
支持液体を収容可能な容器と、
テストサンプル溶液、支持液体および前記膜を受け入れ可能な、上面が大気に開放されているマイクロ灌流チャンバであって、その容積が約５マイクロリットルないし約５０マイクロリットルで、該チャンバ内に含まれる溶液と電気的に接触可能な基準電極を備えたマイクロ灌流チャンバと、
前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を前記マイクロ灌流チャンバに移送し、支持液体の容器から支持液体を前記マイクロ灌流チャンバに移送する手段と、前記テストサンプルおよび前記支持液体を、前記マイクロ灌流チャンバから取り去る手段と、
その内部に電極を備え、前記マイクロ灌流チャンバ上を移動可能に位置し、高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置している前記膜のパッチの表面を提供するパッチ・ピペットと、
前記パッチ・ピペット電極および前記基準電極に電気的に接続され、前記テストサンプルを前記マイクロ灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れる電流を測定する手段と、
を備えた装置。
【請求項４】
さらに、前記マイクロ灌流チャンバから廃液を吸い出す手段を備えた請求の範囲第３項に記載の装置。
【請求項５】
前記容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する前記自動サンプラーの前記手段が、注入ポンプとそれに接続されたニードルを備えた請求の範囲第３項に記載の装置。
【請求項６】
管状コイルが、前記マイクロ灌流チャンバの中に導入されたサンプルの体積を定量的に測定するために前記テストサンプルを移送する手段と直列に配置されている請求の範囲第３項に記載の装置。
【請求項７】
ベースと、前記ベースに設けられた孔と、前記ベースの底部にわたる透明手段とを有し、前記孔及び前記透明手段は協働して、マイクロ灌流チャンバの前記側壁と底部とを構成し、前記マイクロ灌流チャンバは上面が大気に開放されており、更に、前記マイクロ灌流チャンバ内の液体と接触するように配置された基準電極と、液体を前記マイクロ灌流チャンバの中に導入する手段と、液体を前記マイクロ灌流チャンバから吸い出す手段と、前記基準電極を電気計測装置に電気的に接続する手段とを有するマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項８】
前記チャンバの底部を形成する前記透明手段は、透明なカバーガラスである請求の範囲第７項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項９】
前記ベースは、少なくとも前記マイクロ灌流チャンバの側壁を構成する孔の表面上に蒸着されたハロゲン化銀の被覆を有する銀を備え、それにより、前記チャンバ内に入っている液体と電気的に接触をするようになった前記ベースの基準電極を提供する請求の範囲第７項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１０】
前記ベースは、少なくとも前記マイクロ灌流チャンバの側壁を構成する孔の表面上に蒸着された塩化銀の被覆を有する銀を備える請求の範囲第７項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１１】
前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約５マイクロリットルないし約５０マイクロリットルである請求の範囲第１０項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１２】
非導電性材料で形成されたベースと、前記ベースに設けられた孔と、前記ベースの底部の透明カバー手段とを有し、前記孔と前記透明カバー手段は協働して、マイクロ灌流チャンバの側壁と底部を構成し、前記マイクロ灌流チャンバは上面が大気に開放されており、更に、前記マイクロ灌流チャンバの側壁を貫通して前記ベースに設けられ、かつ、前記マイクロ灌流チャンバの中に入っている液体と電気的に接触するように配置された基準電極と、液体を前記マイクロ灌流チャンバに導入する手段と、液体を前記マイクロ灌流チャンバから吸い込む手段と、前記基準電極を電気計測装置に電気的に接続する手段とを有するマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１３】
前記電極が、粒状の銀とハロゲン化銀との混合物により取り囲まれた銀製ワイヤを有する請求の範囲第１２項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１４】
前記電極が、粒状の銀と塩化銀との混合物によって取り囲まれた銀製ワイヤを有する請求の範囲第１２項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１５】
液体を前記マイクロ灌流チャンバの中に導入する前記手段は、前記チャンネルを構成するように前記透明カバー手段と協働する、前記ベースに設けられた溝であり、前記チャンネルの近位端は、前記マイクロ灌流チャンバと連通しており、更に、前記ベースの上に設けられた孔は、前記チャンネルの遠位端と連通し、かつ、液体を前記マイクロ灌流チャンバの中に導入するために、そこに連結された流入ダクトを持つようになっている請求の範囲第１２項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１６】
前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約５マイクロリットルから約５０マイクロリットルである請求の範囲第１５項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。
【請求項１７】
灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する方法であって、内部に電極を有するパッチ・ピペットが前記膜の表面でギガオームシールに係合したチップを有し、前記灌流チャンバ内には前記灌流チャンバに収容された溶液と接触するようになった基準電極が設けられ、前記灌流チャンバは上面が大気に開放されており、
移動特性がベースライン基準として確認されるべきイオンを含む支持液体を前記灌流チャンバに連続的又は定期的に導入し、
同じ支持液体に溶解された前記テストサンプルの１つを、テストサンプル溶液を保持した複数の容器を有する自動サンプラーを用いて、前記灌流チャンバに定期的に装入し、
前記テストサンプルを前記灌流チャンバに導入する前後の両方で、前記ピペット・電極と前記基準電極とに接続された電気測定手段回路を流れる電流を測定し、かかる手順を繰り返す、
灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する方法。
【請求項１８】
前記支持液体を前記灌流チャンバに連続的に導入し、過剰な支持液体を吸引し、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液体と共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミングする請求の範囲第１７項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロ灌流チャンバは、約５マイクロリットルから約５０マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバである請求の範囲第１８項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は生体膜のイオン移動チャンネルを研究するのに利用されるパッチ固定法を実施するための装置に関し、より詳細には、高処理量を有し、且つ化合物のほんの僅かなテストサンプル、すなわち、ほんの少量の液体キャリヤを利用し、個々の膜パッチについて短時間で多くのテストを実施することのできるかかるパッチ固定装置に言及する。本発明は化学物質又は化合物のスクリーニングのために提示され、高処理量を提供し、且つテストすべき溶液及びサンプルの低容積ですむ新規な電気生理学薬取扱い及び適用にもっと広く言及する。本発明は又本発明の装置を利用するためのいくつかの方法を含む。
先行技術
マイクロピペットを使用して膜のパッチを電気的に隔離すること及び電圧−固定条件下でそのパッチをイオンチャンネルを研究することの一般的な考えはプフルエガ  アーチ（Ｐｆｌｕｅｇｅｒ  Ａｒｃｈ）３７５；２１９−２７８，１９７８年「細胞外パッチ固定、生体膜の個々の開放チャンネルの中の電流を解明する方法」にネーハー，サクマン，及びステインバックによって概説されている。彼らが発見したことは、アセチルコリンを収容するピペット(ＡＣＨ)を筋肉細胞膜の表面に押しつけることによって、彼らがＡＣＨ−活性イオンチャンネルの開閉に帰する電流の不連続のジャンプを見ることができたことである。しかしながら、彼らの仕事がピペットのガラスと膜との間のシールの抵抗（１０−５０ＭΩ）がチャンネルの抵抗（−１０ＧΩ）に対して大変小さい事実によって制限された。かかるシールから生じる電気ノイズは抵抗に逆比例し、イオンチャンネルを通る電流を分かり難くする程大きく、イオンチャンネルのコンダクタンスはＡＣＨチャンネルのコンダクタンスよりも小さい。電気ノイズはまたピペットの電圧を、生ずるシールを通る大電流により浴の値と異なる値に固定することを妨げた。
ガラスピペットを火仕上げし、ピペットが細胞の表面と接触するときピペットの内部に僅かな吸引を付与することによって、ノイズ（大きさの程度）を生物学的関心事の殆どのチャンネルを研究することができるレベルまで減じ、且つこれらの研究をすることができる電圧範囲を大きく伸ばした大変高い抵抗（１−１００ＧΩ）のシールを得ることができたことを発見した。この改良されたシールは「ジガーシール」と呼ばれ、ピペットは「パッチピペット」と呼ばれてきた。パッチ固定法を開発する仕事について、ネーハ及びサクマンは生理学及び医学部門で１９９１ノーベル賞を授与された。
イオンチャンネルは細胞膜を横切る無機イオンの移動を引き起こす膜貫通型蛋白質である。イオンチャンネルは活動電位、シナプス伝達、ホルモンの分泌、筋肉の収縮等の発生およびタイミングのような種々の過程に関係する。多くの薬はそれらの特殊な効果をイオンチャンネルの転形を経て発揮する。例は脳の電圧依存Ｎａ+−チャンネルを遮断するフェニトイン及びラモトリジンのような抗てんかん化合物、スムースな筋肉細胞の電圧依存Ｃａ2+−チャンネルを遮断するニフェジピン及びジルチアゼムのような抗高血圧薬、及び膵臓のＡＴＰＫ＋−チャンネルを遮断するグリベンクラミド及びトルグタミドのようなインシュリン放出の刺激薬である。イオン−チャンネル活性の化学的に誘導される転形に加えて、パッチ固定法により科学者は電圧依存チャンネル操作を行うことができた。これらの方法はパッチピペットの電極の極性を調整すること、及び塩水組成を変えて浴溶液中の自由イオンレベルを調整することを含む。
パッチ固定法は生物学及び医薬の主要な開発を代表する、と言うのはこのパッチ固定法により単一のイオンチャンネル蛋白質の中を通るイオンの流れの測定を可能にし、且つ又薬に対する単一のイオンチャンネル応答の研究を可能にするからである。簡単に言えば、普通のパッチ固定法では、細い（直径が＜１μｍ）ガラス製ピペットが使用される。このパッチピペットの先端を細胞膜の表面に押しつける。ピペットの先端は細胞に対して気密にシールし、膜の小さなパッチ内の数個のイオンチャンネル蛋白質を隔離する。これらのチャンネルの活性を電気的に測定することができ（単一のチャンネル記録）、或いは別のやり方として、パッチ固定を破ることができて細胞膜全体のチャンネル活性の測定を可能にする（全体の細胞記録）。
単一チャンネル記録及びセル全体記録の両方の間、個々のチャンネル特殊型の活性を、膜を横切って「電圧固定」を負荷することによってなお一層分解させることができる。フィードバック閉回路を使用することによって、「電圧固定」は膜を横切って電圧勾配を負荷して全チャンネル活性を制限し不連続チャンネル特殊型の溶解を可能にする。
そのような実験における溶解率及び電圧制御は見事であり、しばしば、ミリセカンドの範囲であり、あるいは、マイクロセカンドの範囲ですらある。しかしながら、薬学上のスクリーニングにおける一般的な方法としてのパッチ固定法の主要な障害は、日当たり（典型的には１、２日程度）に試験することができる化合物の数が限られていることである。また、セル及びパッチの周囲で行われる溶解変化が非常に低速であるということが重要な障害となるかもしれない。
パッチ固定技術の処理量を決定する重要な制限は、溶解された化合物を灌流されたセルおよびパッチに導く供給装置の性質である。通常のパッチクランプの構成において、セルは、生理塩水によって連続的に灌流された大きな実験チャンバ（０．２ないし２ｍｌ）の中に置かれる。次に入口を少数の供給びんに連結された弁に切り換えることによって化合物が与えられる。しかしながら、この従来技術には多くの問題が存在する。第１に、化合物の数がアプリケーション装置に一回に連結されるびんの数によって制限されることである。この数は通常６より小さい。第２に、支持液体及び試験されるサンプルの必要な容量が極めて多いことである。第３に、セル及びパッチの周囲の溶解化合物を変化させるために必要な時間が通常のパッチクランプ実験にしては長いことである。第４に、試験される化合物の導入及びアプリケーションが非常に多くの手による操作及び中断を含み、従ってセル／ピペット連結の完全性を危険にさらすことである。
Ｕ管や他の装置のようなチャンネルを調整した神経伝達体（neurotransmitter）を活性化するための化合物を局部的なアプリケーションを行うための精巧な装置の開発は、実際上のアプリケーション時間を、多くの場合受入れられる１０ないし１００ｍｓｅｃまで短縮させる。しかしながら、この速いアプリケーション装置によって換えられなければならないバス溶液の容積はまったく大きく、多数の化合物を一日にスクリーニングするための限られた容量となっている。このことが目下、医療産業において、これらの手順をとることを制限している。重要な理由は、Ｕ管を満たす供給装置の不撓性と小容積にある。これらの装置は従来のパッチ固定実験で使用される装置と事実上同じであり、それ故これらの装置の不便さによってなお苦しめられている。
発明の目的
本発明によれば、驚くことにパッチ固定技術を自動サンプラーに組合わせることを可能としたが、特に、該技術が自動サンプラーから発生する振動や電気ノイズのような障害に敏感でありせいぜい不可能すなわち不作動の組合せであると見做されていたという事実により、この組合せは当業者に対し当初非自明であった。
本発明の目的は、自動薬剤処理及びアプリケーション装置を提供し適応させること、さらにイオンチャンネル移送の結果を測定するために化学物質あるいは化合物をスクリーニングする電子式生理学装置において該装置を利用することであり、新規なこの装置は処理量が多く流体容量がと少ないものである。
本発明の目的はさらに、スクリーニングの速度を早くすることに加え、試験されるいかなる化合物の必要量も少なくし、これによって製薬会社の商業的スクリーニングに適した最初の電子的生理学試験装置を提供することである。
本発明の目的はさらに、極端に小さい容積のマイクロ灌流チャンバを有する新規なマイクロ灌流チャンバ構造を提供することである。
本発明はさらに付加的な目的として、本発明による装置を利用するパッチ固定技術を実施する新規な方法を提供することである。本発明の上述した及び他の目的、利点、及び特徴的主要点は、実施例について添付図面と一緒に検討される以下の説明から明らかになり、添付図面においては符合する参照番号が多数の図にわたって符合する要素を示している。
発明の概要
次いで、出願人が発明であると信じているものは、とりわけ、以下のものを、単独で、或いは、組み合わせて、を含む。
膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認するための装置であって、
テストサンプル溶液を収容するようになった複数の容器と、前記各容器から前記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのテストサンプルを受け器に排出するための手段とを備えた自動サンプラーと、
支持液体を収容するようになった容器と、
テストサンプル溶液と、支持液体と、前記膜とを受け入れるようになった灌流チャンバを有し、該灌流チャンバが、前記灌流チャンバ内に収容された溶液と電気的に接触するようになった基準電極を備え、
前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を、その容器から支持液体を、前記灌流チャンバに移送するための手段と、前記テストサンプル及び前記支持液体を前記灌流チャンバから取り去るための手段と、
内部に電極を備え、前記灌流チャンバ上に移動可能に位置決めされ、高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置決めされた前記膜のパッチの表面を提供するようになったパッチ・ピペットと、
前記パッチ・ピペット電極及び前記基準電極に電気的に接続された、前記テストサンプルを前記灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れる電流を測定するための手段と、
を有する装置。
テストサンプルおよび支持液体を前記灌流チャンバに移送するための手段が、前記灌流チャンバ上に取付けられ、テストサンプル及び支持液体を前記灌流チャンバ内に放出するための孔を備えたＵ型管を有する、前記装置。
膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認するための装置であって、
テストサンプル溶液を収容するようになった複数の容器と、前記各容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのテストサンプルを受け器に排出するための手段を備えた自動サンプラーと、
支持液体を収容するようになった容器と、
テストサンプル溶液と、支持液体と、前記膜とを受け入れるようになったマイクロ灌流チャンバを有し、該マイクロ灌流チャンバの容積が約５マイクロリットル乃至約５０マイクロリットルであり、前記マイクロ灌流チャンバが、該マイクロ灌流チャンバに収容された溶液と電気的に接触するようになった基準電極を備え、
前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を、その容器から支持液体を、前記マイクロ灌流チャンバに移送するための手段と、前記テストサンプル及び前記支持液体を、前記マイクロ灌流チャンバから取り去るための手段と、
内部に電極を備え、前記マイクロ灌流チャンバ上に移動可能に位置決めされ、高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置決めされた前記膜のパッチの表面を提供するようになったパッチ・ピペットと、
前記パッチ・ピペット電極及び前記基準電極に電気的に接続された、前記マイクロ灌流チャンバへの前記テストサンプルの導入前後に、前記両電極を流れる電流を測定する手段と、
を有する装置。
前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットル乃至約１５マイクロリットルの範囲にある前記装置。
前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットル乃至約１２マイクロリットルの範囲にある前記装置。
前記マイクロ灌流チャンバから廃液を吸い出すための手段を備えた装置。
前記容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのサンプルを受け器に排出するための前記自動サンプラーの前記手段が、注入ポンプと該注入ポンプに連結されたニードルを備えた装置。
前記マイクロ灌流チャンバに導入されたサンプルの容積を量的に確認するための管状コイルが、前記テストサンプルを移送するための手段と直列に位置決めされている装置。
また、マイクロ灌流チャンバアセンブリは、ベースと、このベースに設けられた孔と、上記ベースの底の上の透明手段とを有し、これら孔および透明手段は、マイクロ灌流チャンバの両側壁および底を形成するように協働しており、また、マイクロ灌流チャンバアセンブリは、マイクロ灌流チャンバの中の液体と接触するように配置された基準電極と、マイクロ灌流チャンバの中に液体を導入するための手段と、マイクロ灌流チャンバから液体を吸い出すための手段と、基準電極を電気的な測定機器に電気的に接続するための手段とを有する。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの底を形成する透明手段は透明なカバーグラスである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイクロ灌流チャンバの両側壁を形成する少なくとも上記孔の面の上に付着されたハロゲン化銀からなるコーティングを備えた銀を有し、これにより、マイクロ灌流チャンバの中に収容された液体と電気的に接触するようになった上記ベースの基準電極を提供する。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイクロ灌流チャンバの両側壁を形成する少なくとも上記孔の面の上に付着された塩化銀のコーティングを有する銀を備えている。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイクロ灌流チャンバの両側壁を含むその全ての面の上に付着された塩化銀のコーティングを備えた銀を有する。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバは、円筒状、截頭円錐状、長円状である。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は、約５マイクロリットルないし約５０マイクロリットルである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルないし約１５マイクロリットルである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルないし約１２マイクロリットルである。
マイクロ灌流チャンバアセンブリは、非導電性材料から作られたベースと、このベースに設けられた孔と、上記ベースの底の透明カバー手段とを有し、これら孔および透明カバー手段は、マイクロ灌流チャンバの両側壁および底を形成するように協働しており、また、マイクロ灌流チャンバアセンブリは、上記ベースに設けられてマイクロ灌流チャンバの側壁を貫通して延び且つマイクロ灌流チャンバの中に収容された液体と電気的に接触するように配置された基準電極と、マイクロ灌流チャンバに液体を導入するための手段と、マイクロ灌流チャンバから液体を吸い出すための手段と、基準電極を電気的な測定機器に電気的に接続するための手段とを有する。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースはプラスチック材料からなる。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記プラスチック材料は、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、あるいはポリカーボネートである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記基準電極は、粒状の銀とハロゲン化銀との混合物によって囲まれた銀ワイヤからなる。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記基準電極は、粒状の銀と塩化銀との混合物によって囲まれた銀ワイヤからなる。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記粒状の銀および塩化銀は、上記銀ワイヤに付着されている。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記のマイクロ灌流チャンバに液体を導入するための手段は、上記ベースに設けられて、その近位端がマイクロ灌流チャンバと連通するチャンネルを形成するように上記透明カバー手段と協働する溝と、上記ベースの頂に設けられて、上記チャンネルの遠位端と連通し且つマイクロ灌流チャンバに液体を導入するために上記チャンネルに連結された流入路を備えた孔とからなる。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は約５マイクロリットルないし約５０マイクロリットルである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は約１０マイクロリットルないし約１５マイクロリットルである。
このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバの容積は約１０マイクロリットルないし約１２マイクロリットルである。
灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する方法であって、内部に電極を有するパッチ・ピペットが前記膜の表面でギガオームシールに係合したチップを有し、前記チャンバ内には前記チャンバに収容された溶液と接触するようになった基準電極が設けられ、
移動特性がベースライン基準として確認されるべきイオンを含む支持液体を前記チャンバに連続的又は定期的に導入し、
同じ支持液体に溶解された前記テストサンプルの１つを、テストサンプル溶液を保持した複数の容器を有する自動サンプラーを用いて、前記チャンバに定期的に装入し、
前記テストサンプルを前記チャンバに導入する前後の両方で、前記ピペット・電極と前記基準電極とに接続された電気測定手段回路を流れる電流を測定し、かかる手順を繰り返す、
灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する方法と、
前記支持液体を前記灌流チャンバに連続的に導入し、過剰な支持液体を吸引し、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液体と共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミングするかかる方法と、
前記マイクロ灌流チャンバは、５マイクロリットルから約５０マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、
前記マイクロ灌流チャンバは、約１０マイクロリットルから約１５マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、
前記マイクロ灌流チャンバは、約１０マイクロリットルから約１２マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、
前記支持液体を前記灌流チャンバに定期的に導入し、過剰な支持液体を吸引し、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液体と共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミングするかかる方法と、
前記自動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、かつ前記支持液体および前記テストサンプルを順次前記灌流チャンバに導入するように前記自動サンプラーをプログラミングするかかる方法と、
テストサンプルと支持液体の両方を少量ずつ用い、前記灌流チャンバは、約５から５０マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであり、前記自動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、前記自動ンプラーは初めに前記容器の１つから１容量の支持溶液を吸引し、この支持溶液を前記マイクロ灌流チャンバに入れ、前記自動サンプラーは前記容器の１つからテストサンプルを順次吸引し、このテストサンプルをマイクロ灌流チャンバに入れて前記チャンバ内の前記支持液体と置換し、前記支持液体が前記マイクロ灌流チャンバ内にあるときと、前記テストサンプルが前記マイクロ灌流チャンバ内にあるときの両方で電気測定を行うかかる方法と、
前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１５マイクロリットルであるかかる方法と、
前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１２マイクロリットルであるかかる方法と、
前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらすかかる方法と、
前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらすかかる方法と、
が提供される。
図面の説明
図１は、本発明のいくつかの実施形態を実施する際に組み合わせて用いられる構成要素の集成装置全体の略図である。
図２は、本発明の連続流れ法を実施する際に用いられる場合の装置の一部の略図である。
図３は、本発明のＵ型管法を実施する際に用いられる場合の改造された装置の一部の略図である。
図４は、本発明の停止流れ法を実施する際に用いられる場合の改造された装置の一部の略図である。
図５は、本発明の一実施態様にかかるマイクロ灌流チャンバ・プレートの平面図である。
図６は、図５の６−６線における図５に示すマイクロ灌流チャンバ・プレートの横断面図である。
図７は、本発明の別の実施態様にかかるマイクロ灌流チャンバ・プレートアセンブリの平面図である。
図８は、図７に示されるアセンブリのマイクロ灌流チャンバ・プレートの平面図である。
図９は、図７に示されるアセンブリのマイクロ灌流チャンバ・プレートの底面図である。
図１０は、図８の１０−１０線における横断面図である。
図１１は、電圧依存性カルシウムチャネルに対する基準化合物の影響を表示するグラフである。
図１２は、カルシウム活性化カリウムチャネルに対するテスト化合物の影響を表示するグラフである。
好ましい実施形態の説明
本発明は、自動サンプラー、例えば、ＨＰＬＣ装置とともに用いられる自動サンプラーを利用したパッチ固定法を実施する装置を提供するものであり、数多くの実験を、短時間の間に、実施する非常に迅速な手段を提供するものである。本発明はまた、少量のテストサンプルおよび少量の支持液体のみを利用して、パッチ固定実験を実施可能にするものである。また、本発明は、非常に少量のテストサンプルおよび非常に少量の支持液体のみを利用しつつ、パッチ固定研究を支えることのできるマイクロ灌流チャンバのためのいくつかの新規な構造を提供するものである。本発明はまた、新規な装置を利用して、パッチ固定実験を実施するためのいくつかの異なった手法を提供するものである。
図１を参照すると、本発明を実施するための構成要素のアセンブリ全体が示されている。図示の装置は、「連続流れ法」と呼ばれる本発明の実施態様を実施するのに用いられるよう特に設計されている。しかしながら、このアセンブリは、わずかな設計変更によって、以下に説明する本発明の他の実施態様を実施するために利用することができる。構成要素のアセンブリ１０は、ファラディ・ケージ１４を支持するエア・テーブル１２を有している。ファラディ・ケージ１４内には、テーブルトップ１８を支持するブリッジ１６が設けられている。一般に、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）装置とともに用いられ、複式連結バルブ２２を備えた自動サンプラー２０（ギルソンモデル（Gilson Model）231sl)が、注入ポンプ２４および蠕動ポンプ２６（ギルソンモデル（Gilson Model）Miniplus 3)とともに、テーブルトップ１８上に取付けられている。テスト化合物溶液が、自動サンプラー・トレー２１内に配置されたサンプル容器２８内に含まれている。自動サンプラー２０の構成部品であるニードル３０が、容器２８間で横方向および鉛直方向に移動可能に設けられている。ニードル３０をすすぎ洗いするのに用いられた溶液を収集するすすぎステーション２３が設けられている。注入ポート３２が、多連結形バルブ２２と連通している。注入ポンプ２４は、ダクト４０によってニードル３０に結合されており、これにより、動作時においては、ニードル３０は、自動サンプラー・トレー２１内の特定の位置で、測定された量の液体をあらかじめ選択されたサンプル容器２８から吸い上げる。ニードル３０はテストされるべきサンプル溶液を吸い込むと、注入ポート３２まで移動してこの中にサンプルを注入する。
例えば、生理食塩水のような流体を収容する支持流体容器３４が、ファラディ・ケージ１４内に設けられている。廃棄物収集容器３６もまた、ファラディ・ケージ１４内に設けられている。流体をアセンブリの種々の構成要素間で移送するために、複数のダクトが、これら種々の構成要素を互いに連結している。たとえば、ダクト３８が支持流体容器３４を蠕動ポンプ２６に、ダクト３９が支持流体容器３４を注入ポンプ２４に、ダクト４０がニードル３０を注入ポンプ２４に、ダクト４２がバルブ２２を廃棄物収集容器３６に、ダクト４４が蠕動ポンプ２６を多連結形バルブ２２に、ダクト４８が注入ポート３２を多連結形バルブ２２に、ダクト５０がすすぎステーション２３を廃棄物収集容器３６に、ダクト５２が蠕動ポンプ２６を廃棄物容器３６に、それぞれ、連結している。
ステージ５６を有する顕微鏡５４（Nomarski optics,Olympus model EPC-9)が別のテーブル上に、倒立状態に取付けられている。顕微鏡それ自体は、テーブルの可動部分に取り付けられている。少なくとも一つの電子式マイクロマニプレータ５８（Eppendorf)もまた、顕微鏡のステージ５６上に取付けられ、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１および従来型パッチピペット６２が取り付けられたパッチピペット電極ホルダ６０を支持しており、これは、電圧及び電流固定ループを完成するよう他の電極を保持するのが好ましい。マイクロ灌流チャンバ７２を含むマイクロ灌流チャンバ・プレート６４が顕微鏡ステージ５６に取り付けられている。供給ダクト６６が多連結バルブ２２からの出口をマイクロ灌流チャンバ・プレート６４の入口に連結し、廃棄物ダクト６８がマイクロ灌流チャンバ・プレート６４の廃棄物ポートを廃棄物を除去するための真空源に連結している。デッドスペースをできるだけ少なくするためには、バルブ２２の出口からマイクロ灌流チャンバ７２までの距離は１０ｃｍである。パッチピペット６３内の電極と基準電極は、いずれもプレ増幅器（ヘッドステージ）６１に接続されている。電線７６がプレ増幅器（ヘッドステージ）６１を電圧増幅器７８に接続している。電線７７が、マイクロ灌流チャンバ７２内の基準電極をプレ増幅器（ヘッドステージ）６１に接続している。その他の電圧または電流固定電極用電線は、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１によって所望の電流または電圧勾配を達成するよう設計された増幅器に接続される。電圧増幅器７８はコンピュータ８０に電気的に接続され、コンピュータは、テスト中の膜または細胞のイオンチャネル蛋白質をイオンが通過したことを指示する電気的インパルスを測定するのに用いられる。パッチピペットホルダ６０を備えた電子式マイクロマニプレータ５８は、顕微鏡ステージ５６の右側部に取り付けられている。
細胞または膜に対してハッキリとした適用を得るため、そしてわずかな量のテストサンプルおよび支持液体のみを利用するために、バルブ２２の出口は、マイクロ灌流チャンバにできるだけ近接して、あるいは、Ｕ型管が用いられる場合には、このＵ型管にできるだけ近接して配置すべきである。したがって、自動サンプラーはそれ自体、図１に示されるように、ファラディ・ケージ内で、パッチ固定増幅器７８のヘッドステージ（前置増幅器）６１及びテスト中の膜と接触しているパッチピペット６２に近接して配置されている。これにより、潜在的に深刻な２つの問題が生じる。
１）電気ノイズ。交流電圧で動作させる必要のある任意の装置をファラディ・ケージ内に導入すると、５０ヘルツまたは６０ヘルツの電磁放射線源が生じることになる。これは、パッチピペット６２内の電極（アンテナとして動作する）によってピックアップされやすく、したがって、電流信号が妨害される。しかしながら、設備全体のすべての金属パーツを慎重に共通の高品質の接地用導体にアースすることにより、この問題は本質的に解決されることになる。過度の電気ノイズの発生を避けるためには、自動サンプラー２０の重要な部品をアースして、遮蔽するよう特に気配りする必要がある。他の自動サンプラーを用いる場合、これらは、図１に示される設備で用いたギルソンモデルと比較して、効果的にアースすることは一層困難であるかもしれないが、これら自動サンプラーを別のファラディ・ケージ内に遮蔽することが必要になる場合がある。
２）振動。振動は、ニードル３０がサンプル容器２８相互間で移動するとき、自動サンプラー２０によって生じる。これには、次の２つの言外の意味がある。(1)ピペット６２に伝達される振動は、細胞取付け記録モードおよび細胞全体の記録モード中のギガシール（ギガオーム級のシール）を必然的に破壊することになる。(2)弱い機械的振動でも、これが電流信号中に見える低周波電気ノイズに変換される場合がある。しかしながら、図１に示されるブリッジ形設備では、これら両方の問題は回避される。
本手法は、イオンチャネルを有する膜をマイクロ灌流チャンバ７２内に置くことによって実施される。好ましくは、培養細胞を載せた小さなカバーガラス７４（2.8ｍｍ）をマイクロ灌流チャンバ７２内に挿入することにより、パッチ固定法が実施される。次いで、パッチ電極ピペット６２を、カバーガラス７４上に支持された膜と接触するようになるまで、マイクロ灌流チャンバ７２内へ下降させる。ギガシール（ギガオーム）がパッチピペット６２の端部と生体膜との間に形成されるまで、吸引力をパッチピペット６２に及ぼす。テストが、次いで実施される。電気信号が、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１に取り付けられたパッチピペット６２内の電極によって検出され、次いで、電線７６によって図１に示す電圧増幅器７８およびコンピュータ８０に伝送される。マイクロ灌流チャンバ内の溶液と接触している基準電極(図示せず)がプレ増幅器（ヘッドステージ）６１の接地端子に接続されている。
パッチ固定手法においては、テストされるべき化合物に適したプロトコールに応じて、種々の支持溶液を使用できる。カルシウム活性化カリウムチャンネルの記録に用いられる標準溶液は、１４０ｍＭのＫＣ１、１ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、1.3ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含んでいる。この組成を用いると、溶液中の遊離カルシウムの濃度が0.3ｍＭになる。ＥＧＴＡ濃度を1.07ｍＭに変えることにより、カルシウムイオンにより誘起されるＫ−チャネル活性化を達成でき、その結果、溶液中の遊離カルシウム濃度は1.0ｍＭとなる。テスト化合物は、選択したアッセイのプロトコールに応じて、支持溶液中に溶解される。すべてのテスト化合物溶液および生理食塩水は、本装置で使用する前に濾過される。
本発明の方法を連続流れに使用した場合には、図１を参照すると、支持液体の連続流が蠕動ポンプ２６によって得られる。定期的に、自動サンプラー２０は選択したサンプルバイアル２８から、特定量のテスト化合物を吸引し、これを注入ポート３２を経て、管状ループ７０内へ導入する（全ループ充填方式）。サンプル体積、ループ容積、流量は任意である。導入後、多連結形バルブ２２の出口が切り替わり、ループ内容物がバルブからマルチ灌流プレートまでのダクト６６によって、マイクロ灌流チャンバ７２内へ導かれ、この灌流チャンバ７２から、過剰の流体が吸出しによって除去される。テスト化合物を操作する時間は、ループサイズ及び流量によって決定される。化合物のウォッシュアウト（washout)は注入の時間間隔によって随意的に決定される。自動サンプラーはあらかじめ定められたプログラムに従って、チャンバ溶液を自動的に取り替える。ウォッシュアウト期間の間にテストされる化合物の数は、選択したプロトコールに応じて様々である。
従来の連続流れ方式と比較した場合の本発明の連続流れ方式の特定の利点は次の通りである。
(１)テスト溶質の自動切替え。
(２)自動サンプラーとパッチ固定増幅器との間の大きな範囲で融通性のある調整。
(３)化合物操作の融通性、実験中のプログラムの変更等。
(４)化合物のテスト直前における化合物の自動溶解（これは不安定な物質にとって重要である）。
(５)個々の操作ごとの間のキャリーオーバを回避するためのニードル及び注入ポートの自動すすぎ。
図２を参照すると、図１に示される装置を用いる本発明の連続流れ法の詳細が概略的に示されている。動作原理を説明すると、蠕動ポンプ２６によって生理食塩水または他の支持液体を、定常状態で、バルブ２２を通じ、マイクロ灌流チャンバ７２に圧送する。また、流体を真空によって、ダクト６８を経て、マイクロ灌流チャンバ７２から連続的に吸い出す。操作手順は次のように連続して行われる。
ａ）少量の空気を、注入ポンプ２４によって、ニードル３０内へ吸引する。
ｂ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、特定量のサンプルを吸い込ませる。
ｃ）ニードル３０を注入ポート３２まで移動させ、管状ループ７０にサンプルを導入させる（通常は、ループ容積の３倍であり、過剰量は多連結形バルブ２２の出口５を通して排出する）。
ｄ）多連結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物は、バルブ２２からマイクロ灌流チャンバ７２までのダクト６６内に注入される。
ｅ）多連結形バルブバルブ２２は連続流れモードに切り替わり、生理食塩水は、分取されたサンプルのテストの後も、流れ続ける。
ｆ）次の操作が開始される前に、ニードル３０をすすぎステーション２３内ですすぎ洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ溶液を、支持液体容器からのダクト３９を通って、支持流体容器３４から吸い上げ、ニードル３０を通じて、すすぎステーション２３で廃棄する。注入ポート３２を、リザーバ食塩水をバルブ２２内へ導入することによって、出口５を通して、廃棄された廃棄物溶液を用いて、すすぎ洗いする。
図３を参照すると、本発明の別法の実施態様が示されており、この実施態様はＵ型管法を実施するのに利用される。この自実施態様の方法を実施するのに利用される構成要素は、図１に示されるものと実質的に同一である。ただし、テストサンプルを、Ｕ型管８２の底部に設けられた孔８３を通じて、灌流チャンバ７３内に放出する点が異なっている。
Ｕ型管方式のような従来型の迅速操作方式は、自動サンプラーを含む本発明の装置によって容易に実施される。細胞を、上述の連続流れ法で用いた灌流チャンバよりもやや大きな灌流チャンバ内に置く。これによって、Ｕ型管の位置決めが容易になる。自動サンプラーは、上述の連続流れ法で動作するのとほとんど同じ仕方で、Ｕ型管法でも動作する。膜は、蠕動ポンプ２６により、蠕動ポンプ２６から灌流チャンバ７３までのダクト６７を通って、定常状態で圧送される標準生理食塩水により連続的に灌流される（このダクトは、多連結形バルブ２２を通らない）。また、流体は、ダクト６８及び蠕動ポンプを経て、灌流チャンバ７３から連続的に吸い出される。蠕動ポンプはまた、標準生理食塩水をＵ型管８２中へ連続的に圧送する。流体は、多連結形バルブ２２を通り、ダクト６４を介して、Ｕ型管に圧送される。流体の流れに起因して、Ｕ型管内の圧力が減少するので、少量の流体が灌流チャンバ７３から孔８３を通って、Ｕ型管内へ吸い出される。連続流れ法におけるように、薬剤サンプルを管状ループ７０内へ導入する。多連結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物は、多連結形バルブ２２の出口ポートから、Ｕ型管８２までのダクト６９内へ注入される。Ｕ型管８２の出口に設けられた電磁バルブ８４を閉じると、Ｕ型管内の圧力が上昇し、その結果、薬剤サンプルの一部が孔８３を通って、灌流チャンバ７３内へ圧送される。薬剤サンプルのテスト完了後、バルブ８４を再び開き、孔８３を通る薬剤サンプルがそれ以上流れないようにする。灌流チャンバの連続吸出しにより、薬剤サンプルが灌流チャンバから迅速に灌流される。
操作時間は随意であり、これはバルブの閉鎖期間によって決定される。Ｕ型管を用いるには、図３に示されるような大きな実験用灌流チャンバが必要である。Ｕ型管を、別個のマイクロマニピレータ上に置き、顕微鏡で見ながら、誘導して位置決めする。
Ｕ型管方式の利点は、これが、トランスミッタにより調整されるチャネルの検討に必要な迅速な操作時間と自動サンプラーの大容量で容積が小さいという要求とを兼ね備えていることである。
図３は、Ｕ型管方式で生じる際のフローパターンを示している。このパターンは、上述の連続流れ法のパターンと本質的には同一である。動作原理を説明すると、蠕動ポンプ２６により、食塩水を、蠕動ポンプ２６から灌流チャンバ７３までのダクト６７を通って、定常状態で圧送する（このダクトは、多連結形バルブ２２を通らない）。また、流体を、ダクト６８及び蠕動ポンプを経て、灌流チャンバ７３から連続的に吸い出す。蠕動ポンプはまた、標準生理食塩水をＵ型管８２内へ連続的に圧送する。流体は、多連結形バルブ２２を通り、ダクト６９を介して、Ｕ型管に圧送される。一般的操作手順は次の通りである。
ａ）少量の空気を図１に示される注入ポンプ２４によって、ニードル３０内へ吸引する。
ｂ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、特定量のサンプルを吸い込ませる。
ｃ）ニードル３０を注入ポート３２まで移動させ、管状ループ７０にサンプルを導入させる（通常は、ループ容積の３倍であり、過剰量は出口５を通って排出される）。
ｄ）多連結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物は、多連結形バルブ２２の出口ポートからＵ型管８２までのダクト６９内に注入される。
ｅ）操作は、電磁バルブ８４によるＵ型管出口の閉鎖によって生じる。
ｆ）電磁バルブ８４を再び開くと、標準生理食塩水の流れがＵ型管内のサンプルにとって代わる。サンプル溶液は、ダクト６７から圧送され、ダクト６８を通って吸引される標準生理食塩水の連続流れによって、灌流チャンバ７３から灌流される。
ｇ）次の操作を開始する前に、ニードル３０をすすぎステーション内ですすぎ洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ食塩水をバルブ２２に導入することにより、注入ポート３２を出口５から廃棄される廃棄物溶液によりすすぎ洗いする。
溶液の量及びテスト化合物に関する要件を絶対最少限に制限するためには、本発明による停止流れ法（stop flow technique)が開発された。
図４を参照すると、停止流れ法を実施するための構成要素のうち、いくつかがわずかに修正された構成が示されている。注入ポート３２、多連結形バルブ２２および管類を含むデッドスペースの総量が、ここでは特に重要である。したがって、管状ループ７０は、短い真っ直ぐな管片８６で置き換えられている。その目的は、テスト溶液の経路を短くし、それによって、必要な溶液の量を少なくすることにある。溶液の量は、バルブの入口および出口の特定の連結法（非ループ方式）によって、１５マイクロリットルまで減少される。この修正例では、自動サンプラーの動作は、ＨＰＬＣ自動サンプラーで用いられた動作原理とは多少異なる。しかしながら、一般原理は単純であり、自動サンプラーは、特定量をサンプルバイアルから吸い込み、これを、マイクロ灌流チャンバ１００内に直接導入する。このプロセスは次のように実施される。
ａ）少量の空気を、図１に示される注入ポンプ２４によって、ニードル３０内へ吸引する。
ｂ）図１に示される蠕動ポンプ２６を注入直前に自動的に作動させ、マイクロ灌流チャンバ１００内の過剰の流体を吸い出す。
ｃ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、テスト溶液（コントロール溶液＋テスト化合物）または食塩水だけを２００マイクロリットル吸い込ませる。
ｄ）ニードル３０を注入ポートまで移動させる。サンプラーのオプションとしての「部分ループ充填方式」を用いて、注入された最初の２０マイクロリットル（これは、空気を含んでいる場合がある）を廃棄物バルブ出口５及びダクト４２を通して排出する。
ｅ）バルブを切り替え、ダクト６８によりチャンバ１００から過剰流体を連続的に吸出しつつ、残りの１８０マイクロリットルの溶液をマイクロ灌流チャンバ１００に直接導入する（導入時間は１５秒であるが、原理的には任意である）。
ｆ）注入後、ポンプおよび液体の流れを所望の期間にわたって停止させ、イオン移送量を指示する手段として必要な電気的測定値を取り、その値をコンピュータによって記録する。
ｇ）次の操作を開始する前に、ニードル３０をすすぎステーション内ですすぎ洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ食塩水をバルブ２２の出口５の中へ導入することによって、注入ポートをすすぎ洗いする。
停止流れ方式の利点は主として、要求されるサンプルの量が非常に少ないこと（全体で最高２２０マイクロリットル）である。灌流チャンバ容積の約２０倍未満の灌流が使用可能であれば、総容積をそれに応じて減少させることができる。本発明に従って行った実験の示すところによれば、ちょうど１００マイクロリットル（全体で１４０マイクロリットル）注入することによって、９０％を越える置換が得られる。このように少量しか要求されないため、多くの場合、合成により及び／又は天然物から単離される少量の化合物に基づく化学的ライブラリー全体の電気生理学的テストが可能になる。
そのうえ、本発明によれば、きわめて小さなマイクロ灌流チャンバを有するマイクロ灌流チャンバアセンブリのいくつかの実施態様が開発されている。これらマイクロ灌流チャンバの使用により、きわめて少量のテストサンプル及び支持液体を分析し、それによりテスト操作に必要な時間を大幅に減少させることのできる装置が得られる。
図５及び図６を参照すると、極小容積マイクロ灌流チャンバアセンブリ８８の一実施形態が示されている。このチャンバは非常に小さなサイズのものなので、２本の電極を灌流チャンバ１００内に配置するにはスペースが不十分である。したがって、基準電極は、チャンバ構造の一体部分でなければならない。図５及び図６に示す実施形態では、チャンバアセンブリ８８は、薄い塩化銀層９２で被覆された銀のディスク９０を有している。銀のディスク９０と塩化銀層９２とは協働して、基準電極として作用する。銀のディスク９０は厚さが１mm、直径が６mmである。３mmの孔９４が、ディスクの中央に設けられており、マイクロ灌流チャンバ１００のキャビティを形成している。銀線９６が銀のディスク９０にハンダ付けされている。塩化銀層９２を銀のディスク９０の表面に形成するには、銀のディスク９０を塩化ナトリウム水溶液中に置き、別の銀線をカソードとして利用するとともに、ディスクをアノードとして接続した状態でこのディスクを２時間にわたって電気分解する。電極のショートを防止するために、少なくとも孔９４の表面全体を塩化銀で被覆する必要がある。好ましくは、孔８４の表面を含め、銀のディスク９０全体を塩化銀で被覆する。直径４０mm、厚さ０．１mmのカバーガラス９８が、被覆された銀製ディスク９０の底面に、孔９４を覆って、接着され、マイクロ灌流チャンバ１００の透明な底部を形成している。マイクロ灌流チャンバ１００の容積は、５マイクロリットルないし５０マイクロリットルであるのがよい。マイクロ灌流チャンバの容積が１０マイクロリットルないし１５マイクロリットルであると、一層望ましい結果が得られる。ただしテストの対象である材料のほんのわずかなサンプルおよび少量の支持液体を利用して、各テストの所要時間を短くするためには、好ましい範囲は１０マイクロリットル〜１２マイクロリットルである。各種溶液は全て、入口１０２を通って、チャンバに入り、出口１０４を通ってチャンバから吸い出される。
培養細胞を、標準培養器内の小さなカバーガラス（厚さ0.1mm、直径2.8mm）７４上の単分子層内で成長させることができる。実験を行う前に、単一のカバーガラス７４を薄っぺらな鉗子でマイクロ灌流チャンバ１００の底部に移し、これに食塩水をかける。最終抵抗が２〜６ＭΩの標準型パッチ固定具である図１に示されるパッチピペット６２を、図１、図２、図３および図４に示されるように、上から下降させる。パッチピペット６２の中には銀−塩化銀電極６３が設けられており、このパッチピペットは、ＨＥＫＡエレクトロニクス社により開発された標準型のパッチピペット・ホルダー６０で支持されている。ピペット先端の直径は、約１μｍである。したがって、吸引力によりピペットを充填したり、ピペットの再充填を行っても、溶液は、毛管作用による力に起因して、定位置にとどまる。ピペットとテストの際に用いられる膜との間のギガシールを生じさせるには、わずかな吸引力を口で及ぼすだけでよい。パッチピペット６２内に設けられている電極６３は、プレ増幅器（ヘッドステージ）６３に電気的に接続され、プレ増幅器は、コンピュータ８０に電気的に接続されたパッチ固定増幅器７８に電気的に接続されている。銀線９６は、銀のディスク９０と塩化銀層９２とからなる基準電極に電気的に接続されている。基準電極は銀線９６に接続され、さらに、銀線は、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１の接地端子に電気的に接続されている。イオンチャネル移送に対するテスト中の各サンプルの影響は、パッチピペット６２内に設けられている電極及び基準電極により、電流の形で測定され、コンピュータ８０で記録される。
図７、図８、図９および図１０を参照すると、別の実施態様におけるマイクロ灌流チャンバアセンブリ１０６が示されている。図７に示されるように、アセンブリ１０６は、顕微鏡ステージ５６の中央孔にぴったりと嵌まり込むように設計された金属の支持ディスク１０８を有している。支持ディスク１０８に設けられた孔内には、図８および図９に詳細に示されるマイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０が設けられている。マイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０の材質は非導電性材料であるのが良く、その中には、メチルメタクリレート、ボリスチレン、ポリ塩化ビニル、フェノールホルムアルデヒド、その他の多くの材料を含むプラスチックがある。直径が約３mmの孔１１２がマイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０に設けられている。溝１１４がマイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０の底部に設けられ、カバーガラス１１６とディスク１１０の底部に接着されている。カバーガラス１１６は、孔１１２と協働して、マイクロ灌流チャンバ１１８を形成している。カバーガラス１１６は、溝１１４と協働して、テストされるべき液体サンプルと支持食塩水をマイクロ灌流チャンバ１１８内に導入するためのチャネル１１７を形成している。孔１２０がディスク１１０の上壁に設けられ、液体をチャネル１１７内に導入するためのポートとして機能している。管１２２が孔と図１に示される自動サンプラーの多連結形バルブ２２とを結合している。小径の銀−塩化銀ペレット電極１２４が、ディスク１１０の上面に設けられた溝１２６に埋め込まれていて、基準電極として働く。ペレット電極１２４は、銀と塩化銀の混合物を、カリフォルニア州所在のイン・ビーボー・メトリック社から入手した銀線の周りに押し固めて形成したものである。電極１２４から延びる電線は、図１に示す増幅器ヘッドステージ７８に直接接続されている。
たとえば、符号７２、１００または１１８で示されるマイクロ灌流チャンバからの過剰流体の吸出しは、チャンバの全容量のうち、多くの部分が１秒ごとに吸い出されるため、小さなチャンバの場合、特定の問題を提起する。ごく小さなプラスチックチューブ１２８（エッペンドルフ・ジローダー・チップ）を用いた非常に滑らかな吸出し操作を利用することができ、これは液体表面レベルの変動を回避する上で必要不可欠である。液体表面が変化しやすいと、変化するバックグラウンドノイズが生じ、また、細胞あるいはパッチに対する機械的応力が増大する場合があり、それによって、記録期間が制限される。
以下の実施例により、本発明の実施方法に関する明確な理解が得られるであろう。ただし、これら実施例は例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
実施例１
連続流れ法：ひよこの後根神経節細胞のカルシウム電流を、上述し、図７ないし図１０に図示したように、自動サンプラーと注入ポンプと蠕動ポンプと、容積が１２マイクロリットルのマイクロ灌流チャンバとを有する装置を利用して、連続流れ法を用い、全細胞記録法によって確認した。
Ｃａ2+電流を次のピペットおよび浴溶液を用いて他の電流から遮断した。
ピペット：ＣｓＣｌ（１００ｍＭ）、ＣｓＦ（２０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（４ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）。
浴：ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（４ｍＭ）、ＣａＣｌ2（２ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＴＴＸ（μＭ）。高カルシウム濃度によりＫ＋電流が遮断され、ＴＴＸ（テトロドトキシン）によりＮａ+電流が遮断される。
電圧依存性カルシウムチャネルに対する５つの公知の標準剤であるフェニトイン、アミロリド（amiloride)、ω−コノトキシン（conotoxin)ＭＶＩＩＡ、ベイ（Bay)Ｋ−8644、ニフェジピン（nifedipine）の作用を次々にテストし、これを図１１に報告している。図は、−７０ｍＶの静止電位から０ｍＶまでの５ミリセカンドの減極電圧段階により誘起された最大電流に関する一連の記録をを示している。化合物を５００マイクロリットルのアリコートで灌流した。フェニトインとアミロリドを、それぞれ、時間軸上の０分、１５分の時点で注入したが、これらはいずれも、電流には影響を及ぼさず、これにより、カルシウムイオンチャネルに対する影響がないことがわかる。３０分の時点で、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡの５００マイクロリットルアリコートを注入した。ω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、グラフ上に記録されている電流の変調により明らかなように、Ｎ型のカルシウムチャネルに対して親和性を有する。グラフは又、これから明らかにわかるようなウォッシュアウトはないので、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合は非可逆的であったことを示している。ベイＫ−8644は、経時的にみて、ウォッシュアウトから明らかなように、Ｌ型カルシウムチャネルを可逆的に刺激する。ニフェジピンはＬ型カルシウムチャネルを遮断する。
したがって、本発明は、周知の生理活性を有する化合物による灌流操作に対するパッチ固定法隔離式膜イオンチャネルの応答を確認する際に有用であることが判明している。この結果は、５つの化合物が、単一の膜標本を用いて、１時間に過ぎない時間でテストされたことを示し、また生理的反応の有効範囲を示している。実際には、操作期間だけでなく操作の間のウォッシュアウト期間を含む未知の化合物のスクリーニングは短く、従って、１０ないし２０の化合物を１時間でスクリーニングできる。（特に実施例２参照）。
実施例２
停止流れ方式：培養した人の冠状平滑筋細胞のカリウム電流を、上述し、図７ないし図１０に図示したように、自動サンプラーと注入ポンプと蠕動ポンプと容積が１２マイクロリットルのマイクロ灌流チャンバとを有する装置を利用し、停止流れ方式を用いて、摘出裏返しパッチ法（excised inside out patch）により確認した。
ピペットおよび浴溶液の組成は次の通りである。
ピペット：ＫＣｌ（１４０ｍＭ）、ＣａＣｌ2（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（１ｍＭ）、ＥＧＴＡ（1.3ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）。
浴：ＫＣｌ（１４０ｍＭ）、ＣａＣｌ2（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（１ｍＭ）、1.07ｍＭ〜2.0ｍＭのＥＧＴＡ。遊離Ｃａ2+濃度をＥＧＴＡの濃度によって求めた。全てのテスト化合物を0.3μＭの遊離Ｃａ2+とともに浴溶液中に溶解させた。
カルシウム活性化カリウムチャネルに対する未知化合物の作用をテストし、図１２に報告している。実験プロトコールでは、食塩水（黒丸で示す）を用いて、間欠式ウォッシュアウト法（intermittent washout）で、未知化合物（白丸で示す）を、次々に灌流した（３００マイクロリットル）。各操作を２分間にわたり続け、これは６つのデータ点として報告されている。パッチには多チャネルが存在し、これらの活性を、遊離カルシウム濃度が低い（0.3μＭ）の浴溶液によって、低レベル（全活性のうち２０％）に調節した。このレベルは、未知のテスト化合物の考えられる活性化効果と遮断効果の両方を検出できるよう選択された。種々の時間間隔を置いて、濃度が１μＭの遊離カルシウムイオン（□で示す）を含む食塩水を用いて、灌流法で活性化を誘起した。０．５μＭの遊離カルシウムイオンを含む食塩水を用いた灌流操作を最後にテストした。（＊で示す）。１μＭの濃度における２５の未知化合物のこのテストでは、基底カルシウム活性化カリウム電流からの変化を誘起した化合物はなかったが、膜標本のカリウムチャネルは、カルシウム濃度が高い（1.0μＭ）食塩水にさらされると特徴的な高いカリウム電流を示した。
したがって、本発明は、少量のテスト化合物を迅速かつ連続して分析できる方式を提供するものであることが判明している。このテストは、２５を越える数の未知化合物を２時間の間にスクリーニングしたことに鑑みて注目に値する。このテストは、高濃度のカルシウムイオンを含む食塩水による灌流方式において誘起されるＫチャネルの間欠的な完全活性化によって実証された。この高いカルシウム誘起カリウム電流は、膜標本から得ることができる電流応答の範囲を示し、活性化合物を検出するのに必要な感度を明示している。
本発明は、パッチ固定法を実施する際、ＨＰＬＣ自動サンプラーを用いる新規な方法を提供する。これにより、多数のテストを比較的短時間で実施できる。本発明は又、非常に小さなマイクロ灌流チャンバを含む新規なマイクロ灌流チャンバアセンブリを使用しており、それによって、非常に少量のテストサンプル溶液及び支持溶液を利用すればよく、しかも、各テストに必要な時間が短縮される。また、本発明は、別の利点をもたらすパッチ固定法を実施するためのいくつかの新規な手法を含んでいる。本発明は更に、非常に小さなチャンバを利用し、一体形電極を有する新規なマイクロ灌流チャンバ構造を含んでいる。
以下の請求の範囲において、「膜」という用語は、全細胞または部分的な細胞膜を示すものとして用いられている。
本発明の好ましい実施形態を添付の図面に示すと共に上述したが、当業者であれば、本発明の精神又は範囲から逸脱すること無く本発明の多くの設計変更例、改造例、構成要素の置換例及び他の均等例を想到できるので、開示した実施態様そのもの、又は、図示説明した作用方法そのものに限定されないことが理解されるべきであり、したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲に記載された事項にのみ基づいて定められるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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