(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチルアリルピロリン酸からクリサンテミル二リン酸への変換を触媒し得るクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードするクローン化DNAであって、該クローン化DNAは、ストリンジェントな条件下で、配列番号10を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そしてここで、該クローン化DNAが、キク科のクリサンテミル二リン酸シンターゼ含有種またはピレトリン生産種より抽出および精製される、クローン化DNA。
【請求項２】
前記種が、キク科のChrysanthemum、Artemisia、Santolina、Anacyclus、またはTagetesからなる群より選ばれる、請求項１に記載のクローン化DNA。
【請求項３】
前記クローン化DNAがChrysanthemumcinerariaefoliumより抽出および精製される、請求項２に記載のクローン化DNA。
【請求項４】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼが、配列番号１を含むＮ末端アミノ酸配列を含む、請求項３に記載のクローン化DNA。
【請求項５】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼが、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項４に記載のクローン化DNA。
【請求項６】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼが、配列番号1の残基７〜残基18からなるアミノ酸配列に対する抗体と免疫学的に交差反応する、請求項１に記載のクローン化DNA。
【請求項７】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼが、配列番号9または配列番号10を含むヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、精製されたクリサンテミル二リン酸シンターゼに対する抗体と免疫学的に交差反応する、請求項１に記載のクローン化DNA。
【請求項８】
前記クローン化DNAが、配列番号10であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のクローン化DNA。
【請求項９】
ジメチルアリルピロリン酸からクリサンテミル二リン酸への変換を触媒し得るクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードするクローン化DNAであって、該クローン化DNAは、配列番号10のヌクレオチド配列、または配列番号10のヌクレオチド配列によりコードされるクリサンテミル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、クローン化DNA。
【請求項１０】
請求項１に記載のDNAを含有するDNA組換えベクター。
【請求項１１】
請求項２に記載のDNAを含有するDNA組換えベクター。
【請求項１２】
請求項３に記載のDNAを含有するDNA組換えベクター。
【請求項１３】
請求項６に記載のDNAを含有するDNA組換えベクター。
【請求項１４】
請求項８に記載のDNAを含有するDNA組換えベクター。
【請求項１５】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１に記載のDNAで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１６】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項２に記載のDNAで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１７】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項３に記載のDNAで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１８】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項６に記載のDNAで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１９】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項８に記載のDNAで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２０】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１０に記載のDNA組換えベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２１】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１１に記載のDNA組換えベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２２】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１２に記載のDNA組換えベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２３】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１３に記載のDNA組換えベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２４】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、請求項１４に記載のDNA組換えベクターで形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が酵母の株である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が細菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞がEscherichia coliである、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性が発現され、酵素的に(＋)-トランス-異性体を生産するように、異種構成性プロモーターの制御下で請求項１に記載のクリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子を含む、遺伝子的に操作されたDNA分子。
【請求項３０】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼが、配列番号９を含むヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子によりコードされる、請求項２９に記載の遺伝子的に操作されたDNA分子。
【請求項３１】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子が配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の遺伝子的に操作されたDNA分子。
【請求項３２】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子が配列番号１を含むＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項２９に記載の遺伝子的に操作されたDNA分子。
【請求項３３】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子が、配列番号１の残基７〜残基18からなるアミノ酸配列に対する抗体と免疫学的に交差反応するクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードする、請求項２９に記載の遺伝子的に操作されたDNA分子。
【請求項３４】
前記クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子が、配列番号９または配列番号１０を含むヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、精製されたクリサンテミル二リン酸シンターゼに対する抗体と免疫学的に交差反応するクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードする、請求項２９に記載の遺伝子的に操作された植物クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子。
【請求項３５】
前記構成性プロモーターが、細菌プロモーターおよびウイルスプロモーターからなる群から選択される、請求項２９に記載の遺伝子的に操作された植物クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、クリサンテミル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子(CDS)、およびピレトリン生産におけるその使用に関する。詳細には、クリサンテミル二リン酸シンターゼをChrysanthemum cinerariaefoliumから精製し、Ｎ末端領域のアミノ酸配列、およびトリプシン消化より得られた内部断片由来のアミノ酸配列を決定し、そして配列をコードする遺伝子を同定し、そして一部配列決定した。CDS遺伝子は、天然の立体特異性配置の菊酸の酵素的生産に有用であり、ピレトリンの経済的に実現可能な合成に極めてよく用い得る。
発明の背景
除虫菊の殺虫特性は、民間昆虫学にまで遡って長年知られており、そして安全に使用され、取り扱われており、家庭内、およびペット、ヒト、家畜、および食用植物にまで普及している。除虫菊は、Chrysanthemum cinerariaefoliumおよびChrysanthemum coccineumにより生産される化合物に適用される名称であって、これらの植物は花の油胞内で、ピレトリン類として知られる６種の密接に関連したエステル(図１参照)を生産し、そして貯蔵する。これらのうち最も強力なものがピレトリンＩおよびIIである。抽出時、これらのピレトリン化合物は、哺乳類に対して比較的低い毒性の非持続性殺虫剤である。除虫菊という用語はまた、ピレトリンエステルを含有するピレトリン系の花(pyrethrin flowers)由来の市販エキスを示すのに用いられる。
工業的には、除虫菊エキスは、乾燥させた除虫菊花をヘキサンで抽出後、脱ロウし、そして脱色して約20%のピレトリン類および80％の不活性植物物質または溶媒を含む混合物を得ることにより得られる。この原エキス(technical extract)は、米国環境保護局に登録されており、そして多くの最終製品を処方するのに用いる商業上の標準品目である。花の生産はケニアおよびその周辺国が中心であり、タスマニアおよびニューギニアでもいくらか生産が試みられている。除虫菊花は、米国では商業的に育成されてはいないが、米国菜園のキク科(Compositae)(ヒナギク、キンセンカなど)のいくつかは、おそらくこれらの化合物を生産すると思われる。オレゴン州およびアリゾナ州でC. cinerariaefoliumの栽培が検討されてはいるが、これは未だ現実的な商業源ではない。
最近、環境上、より安全性の高い農薬が使用される傾向にあり、除虫菊の需要が高まっているが、その供給は比較的一定を保っている。市場での需要量は供給量の４倍を超えており、このためピレトリン類を化学的に生産する経済的に安価な方法の発見の必要性が生じている。
ピレトリンよりも有効かつより持続性の合成ピレスロイド類が開発されているが、これらの改良物は毒性の増大、および毒性残余の持続を伴う。合成ピレスロイド類と比較して、ピレトリンは、昆虫の幅広いスペクトルに対して高有効性であるが、なお環境面でも安全であるという好ましい特徴を有する。ピレトリン類の供給を増大させるためには、現在用いられている抽出／単離方法を、(１)回収率の増加、(２)不活性植物物質による汚染の減少、および(３)特定の比率の６種類のピレトリン類の分配などの要因において改良し得る。あるいは、ピレトリン類を化学的に合成し得る。合成ピレトリンから最適活性を得るためには、不正確な立体異性体では殺虫剤として有意に活性が劣るため、１つまたは複数の分子が、正確な三次元の空間的配置(立体化学)を有していなければならない。有機合成方法を利用するピレトリン類の立体特異的合成は可能ではあるが、費用がかなりかかるため、花からのエキスへの依存が継続している。ピレトリン類の合成において予想される反応を図２および３に模式的に示す。
ピレトリン分子は２つの異なる部分から構成されている：置換シクロプロピルカルボン酸および不飽和ケト-アルコール実体。この分子のシクロプロピルカルボン酸部、菊酸またはピレトリン酸(pyrethric acid)は、複雑な立体化学を有する。菊酸は４つの異性体を得ることが可能な２つの不斉中心を含有する。ピレトリン酸も同様の不斉中心を含有しており、さらにビニル側鎖中にシス-トランス異性の可能性を有し、８つの可能な異性体を得る。
ピレトリン酸エステル(pyrethrate esters)のシクロプロパン部、(＋)-トランス-菊酸および(＋)-トランス-トランス-ピレトリン酸の絶対的立体配置は化学的[Crombie, L. (1954) J. Chem. Soc., London, 470]、および分光的[Begley, M. J.ら (1972) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1276]に決定されている。天然に存在する配置は、ラセミ混合物またはいずれの合成異性体よりも殺虫剤としてより活性が大きい。立体化学が複雑であり、そしてこのため菊酸を立体およびエナンチオ特異的に調製することが困難なので、本物質に対する生物学的アプローチが経済的に実現可能な方法として注目されている。
レスロロン類(rethrolones)とは、殺虫性ピレトリンエステルのケト-アルコール成分に適用される総称であり、密接に関連したシクロペンテノン類の一群である。いくつかの研究により、14C-酢酸塩由来の標識がこの分子のレスロロン部上に見出され、14C-メバロン酸塩由来の標識は見出されないことから、この分子のレスロロン部は菊酸とは異なる経路により合成されることが示されている。具体的な情報は得られていないが、リノール酸のような脂肪酸はピレトリン分子のレスロロン部分の生合成中間体であることが示唆されている[Vick, B.A.ら (1984) Plant physiol. 75:458; Vick, B.A.ら (1987) Plant Physiol. 85:1073; Crombie, L.ら (1985) Perkin Trans. I, p.1393; Hildebrand, D.F. (1989) Physiol. Plant 76:249]。
レスロロンケト-アルコールは、４位に１個の不斉炭素、および２位にシス-トランス異性となり得る側鎖中の１つまたは複数の二重結合を有する。従って、各ケト-アルコールに４個までの立体異性体を有することが可能である。天然のエステル中には(＋)型のみが存在し、そして天然の立体配置は殺虫剤としてより活性が大きいことが明らかにされている[Elliot, M.ら (1971) J. Chem. Soc., p.2548; Katsuda, Y.ら (1958) Bull. Arg. Chem. Soc. Japan 22:427]。
ピレトリン分子のシクロプロパン部、菊酸またはピレトリン酸の生合成は、出発物質としてメバロン酸から生じることが確立されている。[Pattenden, G.ら (1973) Tetrahedron Lett. 36:3473; Abou-Donia, S.A.ら (1973) Tetrahedron Lett. 36:3477; Crombie, L. (1980) Pesticc Sci. 11:102; Pattenden, G. (1970) Pyrethrum Post 10(4):2; Levy, L.W.ら (1960) Pyrethrum Post 5(4):3]。
図２の１〜４の反応はメバロン酸をジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)(クリサンテミル二リン酸に対する提唱された五炭素前駆体)に変換する全ての生物で生じる。これらの反応を担う酵素群は精製されている。イソペンテニルピロリン酸(イソペンテニル二リン酸ともいう)およびDMAPPは、ステロール類、色素、および特定のビタミン類を包含する多くの代謝物の前駆体である。イソペンテニル二リン酸とDMAPPとの相互変換(反応４)を担う酵素はイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ(EC 5.3.3.2)であり、種々の動物および細菌[Satterwhite, D.M. (1985) Meth. Enzymol. 110:92)、および植物(例えば、Capsicum、Dogbo, O.ら (1987) Biochem. Biophys. Acta 920:140; スイセン類、Lutzow, M.ら (1988) Biochem. Biophys. Acta 959:118;およびトマト、Spurgeon, S.L.ら (1984) Arch. Biochem. Biophys. 230(2):446-454)から精製されている。
菊酸はキク(Chrysanthemum)、マンジュギク(Tagetes)、ヨモギ(Artemisia)、およびサントリーナ(Santolina)の種を包含する、キク科の特定のメンバーにおいて合成されることが報告されている[Zito, S.W.ら (1985) 米国特許第4,525,455号、Banthorpeら (1977) Phytochemistry 16:85]。２分子のDMAPPが縮合してクリサンテミル二リン酸(クリサンテミルピロリン酸ともいう)を生産する(図２中反応５)ことが示唆された[Casida, J.E. (1973) Pyrethrum, The Natural Insecticide, Casida, 編, Academic Press, New York, pp. 101-120; Manitto, P. (1981) Biosynthesis of Natural Product, WileyおよびSons, New York, pp. 94-95]。今回新規に提唱されたＣ-５単位の組み合わせの厳密なメカニズムは不明であるが、「非頭-尾」型縮合であることが示唆されており、従って、他のほとんどのイソプレノイド類の合成を招くような反応とは異なっていた。クリサンテミル二リン酸の形成を担う酵素の精製については何も報告されておらず、このためDMAPPがこの中間体に対する直接の前駆体であることは確立されていない。ZitoおよびStaba(米国特許第4,525,455号)は、C. cinerariaefolium由来の無細胞ホモジネートを用いて、14C-メバロン酸および14C-イソペンテニル二リン酸の両者が14C-クリサンテミル二リン酸を生成することを明らかにしている。Artemisia annuaおよびSantolina chamaecyparissusの祖酵素ホモジネートを用いて、Banthorpe、D.V. (1977) Phytochemistry 16:85は、14C-DMAPPおよび14C-ジメチルビニルカルビノールがクリサンテミル二リン酸に変換されることを示した。ZitoおよびStabe(上記)による研究から、本質的に全ての活性が100,000×g上清中に見られ、プロ色素体画分およびミトコンドリア画分中にはほとんどもしくは全く活性が認められなかったことから、クリサンテミル二リン酸を形成する酵素およびピレトリン形成に関するその他の酵素はサイトゾル型であることが示されている。
DMAPPからクリサンテミル二リン酸を形成する推定縮合反応を担う酵素は、クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)と呼ばれ、プレニルトランスフェラーゼである。プレニルトランスフェラーゼ(EC 2.5.1.x)はイソプレノイド二リン酸を別のイソプレノイド二リン酸または非イソプレノイド受容体への転移を触媒する。単一の酵素がDMAPPからクリサンテミル二リン酸への変換に関与する様であるが、均一に精製した場合でも２種の触媒活性を示す別の異なるプレニルトランスフェラーゼの酵素機能に類似している[Dogbo, O.ら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7054]。このプレニルトランスフェラーゼタンパク質はフェトエンシンターゼと呼ばれ、ゲラニルゲラニル二リン酸の二分子を結合してプレフィトエン二リン酸を生成し、そしてさらにプレフィトエン二リン酸をフィトエンに変換する。同様に、スクアレンシンテターゼは、Mg2+および還元型ピリジンヌクレオチド存在下で、二分子のファルネシル二リン酸の二段階還元縮合によりスクアレンを形成する。
ピレスロイドは、ピレトリン分子と化学的に同類の天然に存在しない殺虫性化合物を意味する。化学的に合成された極初期のピレスロイド類のいくつかは、殺虫活性を有する菊酸の単純置換ベンジルエステル、例えば４-アリルベンジルクリサンテメートであった。1965年に、菊酸と５-ベンジル-３-フリルメチルアルコールとのエステル、すなわちレスメトリン(resmethrin)が合成され、そしてイエバエに対してピレトリンＩのおよそ20倍の活性があることが見出された。ビオレスメトリン(bioresmethrin)、(＋)-トランス-レスメトリンは、レスメトリンを構成する混合物を形成するいくつかの異性体のうち最も高い活性を示す。ビオレスメトリンはイエバエに対してレスメトリンの２倍の活性を有し、そしてDDT[1,1,1-トリクロロ-2,2-ビス-(p-クロロ-フェニル)エタン]の約50倍の活性を有する。
1970年代には、３種類のピレスロイド類である、ペルメトリン、シペルメトリン(cypermethrin)、およびデカメトリン(decamethrin)(デルタメトリン(deltamethrin))が化学的に合成され、そして高い安定性および高い本質的殺虫活性を有することが見出された。これらの化合物はアルコール部分を変え、そして分子の菊酸部の側鎖上にハロゲン置換基を付加することにより生成される。α-シアノ基を導入すると活性が約３倍になり、そしてジハロビニル基で置換し、エステル基に対して側鎖をトランス型からシス型にするとさらに活性が上昇した。これら活性ピレスロイド類の合成については、初期の段階から新しいピレスロイド類の検索について激しい競争が展開され、そして現在でも多くの国が、この分野における研究開発プログラムを抱えている。
現在実行可能なピレスロイド類の合成方法では、一般にあらゆる可能な異性体の混合物が生成され、各異性体が異なるレベルの生物活性を有する。通常、この生成物はラセミ混合物として市販されている。さらに、異なる異性体は、実行可能な技術の分離能力に依存して、種々の程度で分離され、そしてピレスロイドの分離型も市販されている。唯一、一例だけ、単一の活性異性種として市販されているピレスロイドがある。例えば、デルタメトリンは、現在のところ、単一の異性体、即ち最も活性のあるD-シス異性体として市販されている唯一のピレスロイドである。
発明の要旨
本発明はジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)のクリサンテミル二リン酸(クリサンテミルピロリン酸ともいう)への変換を触媒する精製クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)活性を初めて提供する。精製酵素は自然および解離の両条件下で分子量およそ40,000ダルトンであり、よって、単量体型で活性を有すると思われる。単離されたCDSのＮ末端アミノ酸配列を表２、配列番号１に示す。cDNAクローンによりコードされる予想アミノ酸配列を図４、配列番号10に示す。
本発明はまた、クリサンテミル二リン酸シンターゼの精製に有用な方法を提供する。本発明の特定の実施態様に従い、この酵素をChrysanthemum cinerariaefoliumより単離した。このCDS酵素はまたキク科の他のクリサンテモール(chrysanthemol)生産またはピレトリン生産Chrysanthemum、Artemisia、Santolina、Anacyclus、またはTagetes種より単離され得る。CDS酵素は総酵素活性に対して、少なくともおよそ1,000倍増大されるに等しいレベルにまで精製される。
本発明の目的は、クリサンテミル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列をコードするDNA断片を提供することである。本発明の特定の実施態様では、C. cinerariaefoliumのCDSタンパク質をコードするcDNAおよび該cDNAを含むDNA組換えベクターが提供される。CDSタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列もまた提供される。本発明のさらなるに実施態様では、C. cinerariaefoliumのCDSタンパク質をコードするゲノムDNAおよび本ゲノムDNAを含む組換えベクターが提供される。
本発明の目的はまた、本発明のクリサンテミル二リン酸シンターゼの全部または一部のアミノ酸配列を、本発明のストリンジェントな条件下またはそれに等しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることにより、クリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子の検出および単離のためのヌクレオチドプローブとして、使用することである。本発明の特定の実施態様では、例えば配列番号１または配列番号10のアミノ酸配列の全部または一部をコードするヌクレオチドプローブを利用して、キク科のクリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子を検出および単離する。このようなクリサンテミル二リン酸シンターゼヌクレオチドプローブはまた、化学的に変化させたクリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子および本発明のクリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子と同一の配列を有する合成遺伝子とハイブリダイズするために用いられる。
本発明の目的はまた、CDSタンパク質をコードするDNAを含有するDNA組換えベクターで形質転換し、CDS酵素反応の代謝産物を生産能をし得る宿主細胞(例えば、酵母、細菌など)を提供することである。例えば、宿主細胞中のCDS酵素活性の産物は、クリサンテミル二リン酸であり、これは順次宿主のホスファターゼによって分解されて、クリサンテミルアルコールを生成する。クリサンテミル二リン酸およびクリサンテミルアルコールの両者は、Chrysanthemum種に見出される天然の異性体の正確な立体化学、即ち(＋)-トランス-配置を有する。
さらに本発明の目的は、ピレトリン類生産の生物学的および化学的工程の組み合わせを利用したピレトリンの合成方法を提供することである。ピレトリン合成の生合成方法は、本発明によって生産されるCDS酵素活性を利用して、クリサンテミル二リン酸ならびにその対応アルコールおよび酸の立体化学的に正確な異性体[(＋)-トランス-異性体]を、ピレトリン分子のさらなる化学合成のための提供する。本発明の特定の実施態様において、ピレトリン合成の組換え合成方法は、そのDNAの発現能を有する宿主細胞(例えば酵母、細菌など)に形質転換されるクリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)をコードするDNA断片を利用し、そして発現したCDS活性が(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸を生産し、次にそれがピレトリン類およびその誘導体の合成に用いられる。
本発明はまた、生物学的工程および化学的工程の組み合わせを利用して、(＋)-トランス-ピレスロイド類の合成方法を提供することを意図する。ピレスロイド合成方法は、本発明により生産されるCDS酵素活性を利用して、ピレスロイド分子のさらなる化学合成のための基質として、例えばクリサンテミル二リン酸ならびにその対応アルコールおよび酸の立体化学的に正確な異性体[(＋)-トランス-異性体]を提供する。本発明の特定の実施態様において、ピレスロイド合成の組換え合成方法は、そのDNAの発現能を有する宿主細胞に形質転換されるCDSをコードするDNA断片を利用し、そして発現したCDS活性が(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸を生産し、次にそれが所望のピレスロイドの合成に用いられる。本発明は単一のピレスロイド異性体の生産方法を提供する。
また本発明において、ステロール類、カロチノイド類、ドリコール類、およびユビキノン類を包含する数種類の代謝物の合成に利用される基質の(＋)-トランス-異性体の合成方法を提供することが意図される。この代謝物合成方法は、本発明により生産されるCDS酵素活性を利用して、立体化学的に正確な異性体、即ち(＋)-トランス-異性体を提供する。本発明の特定の実施態様において、代謝物合成の組換え合成方法は、そのDNAの発現能を有する宿主細胞に形質転換されるCDSをコードするDNA断片を利用し、そして発現したCDS活性が(＋)-トランス-異性体を生産し、それが所望の代謝物の合成に利用される。
本発明の目的はまた、CDSタンパク質に対する抗体を提供することである。抗CDSポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、CDSに特異的に結合する。抗CDS抗体は、例えば、診断(例えば宿主細胞におけるクローン化CDSの形質転換成功の検出における)または試薬(例えばCDSの単離精製のためのアフィニティークロマトグラフ技術における)などに有用である。
本発明の目的はさらに、本発明のCDSタンパク質を含有する試薬を提供することであり、例えばピレトリン類、ピレスロイド類、もしくはそれらの中間体の生産に利用され得る。また、本発明のCDSタンパク質は、樹脂マトリックス上、例えばDEAE-セファデックスまたはフェニルセファロース上に固定化され得、そして、例えばピレトリン類およびピレスロイド類の生産用の試薬触媒として、もしくは、アフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして用いられ得、そしてたとえば対応抗体の精製において用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ピレトリン分子の化学構造を表す。
図２は、菊酸の生合成のスキームを示す。
図３は、ピレトリンの複合的化学および生物学的調製のスキームを示す。
図４は、C. cinerariaefoliumより単離されたCDSタンパク質をコードするヌクレオチド配列および、コードされたCDSの推定アミノ酸配列を示す。最初のｍｅｔコドンはヌクレオチド番号239-241を占め、表２のCDSタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は389位から448位の間のヌクレオチド配列に対応する。1217位から1255位の間のヌクレオチド配列は、ピーク２のCDSトリプシン処理ペプチド(表４)に対応する。1265位から1297位の間の配列は、ピーク５のCDSトリプシン処理ペプチド(表７）に対応する。1301位から1351位の間の配列は、ピーク6のCDSトリプシン処理ペプチド(表8)に対応する。そして、1355位から1390位の間の配列は、ピーク４のCDSトリプシン処理ペプチド(表５)に対応する。
図５は、HPLCヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの溶出プロフィールを示し、SDS-PAGEで均一の40,000ダルトンのタンパク質が精製されたことを示す。
図６は、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)の合成における化学構造を示す。
発明の詳細な説明
明細書および請求の範囲中で使用される主旨または範囲を明確にするために、次の定義を定める。
本明細書で用いられる用語クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)は、２分子のジメチルアリルピロリン酸から(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸(クリサンテミルピロリン酸ともいう)への変換を触媒し得る酵素を意味する。この用語は、天然型または化学的改変型の単離されたCDSを意味するか、またはCDS酵素活性を有する化学合成酵素を意味する。
本明細書で用いられる用語クリサンテミル二リン酸シンターゼ活性は、２分子のDMAPPから(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸への酵素的変換を意味する。
本明細書で用いられる用語精製クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)は、精製レベルが総酵素活性に対して少なくともおよそ100倍、好ましくはおよそ500倍であり、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分子量およそ40,000ダルトンであり、そしてヒドロキシアパタイト高性能液体クロマトグラフィー(HPLC-HA)上で単一のピークとして移動することを特徴とする、精製クリサンテミル二リン酸シンターゼを意味する。
本明細書で用いられる用語ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするは、オリゴマー間の選択的ハイブリダイゼーションを可能にして非識別ハイブリダイゼーションを排除する、温度、イオン強度、および反応時間に関する最適な反応条件下で行われるハイブリダイゼーションを意味する。本発明の特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)含有6×SSC媒体中で温度49℃で一晩行った後、0.1% SDS含有6×SSC媒体中で45℃で約10分間の洗浄を３回行った。
本明細書で用いられる用語SSC媒体は、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムから本質的になる溶液を意味する。１×SSC媒体は、0.15M塩化ナトリウムおよび0.01Mクエン酸ナトリウムを含有する溶液を意味する。
本明細書で用いられる用語ピレトリン類生産の組換え合成方法は、基質分子の酸化、エステル化などの既知の化学反応と、クリサンテミル二リン酸の正確な立体異性体を酵素的に生産するクリサンテミル二リン酸シンターゼの遺伝子を発現させるための組換え分子生物学技術とを組み合わせた、ピレトリンを分子合成する方法を意味する。
本明細書で用いられる用語ピレトリン類生産の生合成方法は、基質分子の酸化、エステル化などの既知の化学反応と、クリサンテミル二リン酸の正確な立体異性体を酵素的に生産するクリサンテミル二リン酸シンターゼ酵素を用いる工程とを組み合わせた、ピレトリン分子を合成する方法を意味する。
本明細書で用いられる用語ピレスロイドは、種々のChrysanthemum種の花に存在する、天然に存在するピレトリン化合物に関連した天然には存在しない殺虫性剤化合物を意味する。ピレトリンの重要な構造的特徴は、シクロプロパン環である。
本明細書で用いられる用語(＋)-トランス-ピレスロイドは、(＋)-トランス-クリサンテミル部分またはその誘導体を含有するピレスロイド構造を意味する。
本明細書で用いられる用語生化学試薬組成物は、精製、検出、分析、もしくは合成反応、生化学反応、または免疫学的反応における基質または中間体としての使用のための試薬として有用な、クリサンテミル二リン酸シンターゼを含有する組成物を意味する。
クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)は、２分子のジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)のクリサンテミル二リン酸への縮合を触媒する。菊酸は、シクロプロパン環構造内の２つの不斉炭素原子のために４つの立体異性体として存在し得るが、天然の異性体は(＋)-トランス配置を有する。本酵素によって触媒される、DMAPPをクリサンテミル二リン酸に変換する反応は、正確な立体化学を有する生産物の異性型を生産する。本発明で単離されるCDSタンパク質は、解離および非解離の両条件下で、およそ40,000ダルトンの分子量を有することが見出された。本酵素は、単量体型で生物学的に活性であった。本酵素は、例えばcinerariaefolium、coccineum、balsamitaなどの種々のChrysanthemumの種、ならびにキク科の他のピレトリン生産属から単離され得る。
精製クリサンテミル二リン酸シンターゼについては、先行技術において報告されていない。ZitoおよびStabaの研究、米国特許第4,525,455号から、クリサンテミル二リン酸を形成する酵素およびピレトリン形成に関与する他の酵素は、本質的に全ての活性が100,000×g上清中に見出され、プロ色素体(protoplastid)画分およびミトコンドリア画分中には、活性がほとんどから全く認められなかったことから、サイトゾル型であることが示された。特に、全細胞の完全体を安定化するためにポリビニルピロリドンを抽出培地に添加したことから[leibovitzら、 (1986) Cancer Genet. Cytogenet. 19:11-19]、表１の精製スキームにおいて、そして実施例１に詳述のように、CDSのサイトゾルフラクション化が確認される。これらの条件下において、本質的に全てのCDS酵素活性が上清画分中に見出された。
本発明の特定の実施態様において、C. cinerariaefoliumの花芽を、アスコルビン酸塩、ショ糖、マグネシウムイオン、β-メルカプトエタノール、セリンプロテアーゼインヒビター、およびポリビニルピロリドンを含むトリス C1[2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオールクロリド]緩衝液、pH7.6で抽出した。
ホモジネートは、滑らかなペーストが得られるまで、乳鉢-乳棒、ホモジナイザー、またはブレンダーのような機械的手段によって、もしくは当該分野で知られる非機械的手段によって行った。CDSはまた、C. cinerariaefoliumおよび関連のキク植物の葉またはシュートから、およびその組織培養懸濁液から抽出され得る。ポリビニルピロリドンは、フェノール性化合物がCDS活性を阻害するのを防止するための好ましい添加剤であったが、グリセロールまたは他のポリオール類もまた用いられ得る。
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可溶化タンパク質におけるプロテアーゼのタンパク質分解作用を阻害するために、フェニルメチルスルホニルフルオリドが好んで使用されたが、他に知られている特異的または一般的インヒビター、例えばEDTA、EGTA、ベンズアミジン、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン、アンチパインなども利用され得る。生物活性に重要なスルフヒドリル基の酸化を防止するために、チオール還元剤を添加した。ジチオトレイトール(DTT)が好ましい試薬であったが、当該分野で知られる他のチオール化合物、例えばジチオエリトリトール、2-メルカプトエタノール、グルタチオンなどもまた利用され得る。Mg2+はCDSの酵素活性の補因子であることが明らかにされた。本酵素反応の補因子としてMn2+およびZn2+がMg2+に代わり得たが、これらはMg2+ほど有効ではないことが分かった。
最初の精製工程は、中性または微酸性の塩、例えばNaCl、Na2SO4、および好ましくは(NH4)2SO4による、塩誘導性タンパク質沈殿によって行った。本発明の好ましい実施態様において、CDS酵素は30-55%硫酸アンモニウムフラクション中に濃縮された。この(NH4)2SO4フラクションに全ての酵素活性が存在した。酵素活性のもともとの量は、粗ホモジネート中で少なめに見積もられたと思われた。
イオン交換クロマトグラフィー上での精製により、約９単位/mgタンパク質の比活性でCDS調製物を得た(表１参照)。疎水相互作用(フェニルセファロース)クロマトグラフィー上での次の精製により、粗ホモジネート酵素活性に比べて約100倍高められたCDS酵素調製物が得られた。約45単位/mg タンパク質の比活性を示すフェニルセファロースフラクションは、SDS-PAGEゲルで約40,000ダルトンの２本のタンパク質のバンドを示した。電気泳動ゲルから溶出されたこの40,000ダルトンのタンパク質「ダブレット(doublet)」より、配列番号１のＮ末端アミノ酸配列を得た(表２)。
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多くのイオン交換樹脂および疎水性樹脂が当該分野で知られており、そしてクロマトグラフィー精製工程に対する代替的マトリックスとして使用され得る[例えば、Rossomondo (1990) Meth. Enzymol. 182:309-317、およびKennedy (1990) Meth. Enzymol. 182:339-343参照]。クロマトグラフィーの工程により、酵素活性の全単位が失われた。酵素活性の不活化として現れる酵素の見かけ上の不安定性により、タンパク質の分解が生じ得るか、このことは、精製フラクションのSDSゲル電気泳動上でのおよそ2000ダルトンしか差のない２本のタンパク質バンドの出現により示唆される。当該分野で知られる種々の植物プロテアーゼインヒビターが、精製手順中のタンパク質の分解を防止するために抽出培地に添加され得る。
CDSの更なる精製をHPLCイオン交換クロマトグラフィーおよびHPLC吸着クロマトグラフィー上で行った。本発明の好ましい実施態様において、HPLC-DEAEクロマトグラフィーに続いてHPLCヒドロシキアパタイト(HA)を実施したが、多くの種々のイオン交換および吸着樹脂が当該分野で利用可能であり、そして代替的マトリックスがあらゆるタンパク質精製工程で用いられ得る[例えば、Rossomando (1990) Meth. Enzymol. 182:309-317；Gorbunoff (1990) Meth. Enzymol.182:329-339;およびChiczおよびRegnier (1990) meth. Enzymol. 182:392-421参照]。本発明の好ましい実施態様において、複合クロマトグラフィー手順により、複製のレベルが約1,100倍上昇し、SDS-PAGE上で見かけの分子量が40,000ダルトンである単一のタンパク質バンドが得られ、HPLC-ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー上で単一のピークとして移動し、そして表３に示すような配列番号２のＮ末端アミノ酸配列が得られた。HPLC-HA複製CDSに対して観察されたSDS-PAGE上の単一のタンパク質バンドは、フェニルセファロースフラクションに対して観察された「ダブレット」タンパク質バンドの低い方のバンドに対応した。HPLC-HA複製CDSについて観察されたＮ末端アミノ酸配列(配列番号２；表３)は、フェニルセファロース精製CDSに対して得られた配列(配列番号１；表２)とほぼ同等に対応した。
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トリプシン消化に供した後HPLCを行ったHPLC-HA複製CDSタンパク質は、５つのトリプシン処理フラグメントを生じ、これらをアミノ酸配列決定に供した。CDSの種々のトリプシン処理フラグメントについてのアミノ酸配列を表４〜９に示す。ピーク２のCDSトリプシン処理フラグメントから、表４に示す13アミノ酸配列が得られた。
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トリプシンの配列に対応する配列を有する８アミノ酸フラグメントが、少量成分としてピーク２に見出された。ピーク３は可視シグナルを生成しなかった。
ピーク４は２つの成分を含む。多量成分[ピーク４(ａ)]は表５の12アミノ酸配列を有したが、少量成分[ピーク４(ｂ)]は、表６に示す７アミノ酸配列を有した。
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ピーク５のCDSトリプシン処理フラグメントから、表７の11アミノ酸配列が得られた。
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ピーク４(ｂ)において同定された６アミノ酸配列(少量成分)は、ピーク５について決定した４位から９位までの配列と同一であり、そしておそらく、重複しているトリプシン処理フラグメント内の共通領域を規定する。ピーク６のフラグメントから表８の18アミノ酸配列が得られたが、ピーク７は表９に示す11アミノ酸配列を有するトリプシン処理フラグメントを含んでいた。
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ピーク７の成分について決定された10アミノ酸配列は、ピーク６の成分について得られた、８位および９位を除く２位から11位までの配列に類似した。
本発明の特定の実施態様において、C. cinerariaefolium由来のクリサンテミル二リン酸シンターゼの特性が、フェニルセファロースクロマトグラフィーで精製されたタンパク質フラクションにおいて調べられた。Mg2+が酵素反応の補因子であることが分かった。MgSO4の至適濃度は３〜５mMであった。Mn2+およびZn2+のような他の２価金属イオンも補因子として使用し得たが、これらは、Mn2+での活性と比較して、より低いCDS活性を与えた。ヨードアセトアミドはクリサンテミル二リン酸シンターゼ活性を不活化しないことが分かったので、活性部位のスルフヒドリル基は酵素活性に重要ではないことが示唆される。この特徴はクリサンテミル二リン酸活性のアッセイに有利であって、ここでDMAPPについて競合するイソペンテニルピロリン酸(IPP)イソメラーゼがヨードアセトアミドで阻害され得る。最大の酵素活性に至適な温度はおよそ30℃〜32℃であり、および至適pHはおよそ7.8であることが分かった。
CDSタンパク質の部分アミノ酸配列からの情報を用いて、本発明のクリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)をコードするDNAフラグメントが得られた[Wood (1987) Meth. Enzymol. 152:443-447およびMatsudaira (1990) Meth. Enzymol. 182:602-613]。このアプローチについては、トマトcDNAライブラリー由来の配列の単離および同定が記載されている[Kingら、 (1988) Plant Mol. Biol. 10:401-412]。アミノ酸配列の情報から、核酸化学合成の既知の方法を用いて、そして好ましくはApplied Biosystems DNA合成機によるホスホルアミダイト法を用いて、対応する短い(11-20ヌクレオチド)または長い(30-100ヌクレオチド)オリゴヌクレオチドが合成される[Matteucciら、 (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185; Beaucageら、 (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859; Hillら、 (1989) Recombinant DNA Methodology; およびWuら、(編)、Academic Press, pp.622-623]。アミノ酸配列の異なる領域に対応する数個の異なるオリゴヌクレオチドが合成される。好ましくは、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドかハイブリダイゼーションプローブとして利用される。遺伝子コードの重複性のため、実際のヌクレオチド配列には多くの可能性が存在する。オリゴヌクレオチドは高度の特異性でその相補的配列とハイブリダイズし、そして全てのヌクレオチドが塩基対となる二本鎖のみが形成されることから、特定の位置では混合塩基を伴うか、または縮重位置でイノシンを伴う[Ohtsukaら、 (1988) J. Biol. Chem. 260:2605-2608]多数のオリゴヌクレオチドプローブが使用される。本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、最も縮重の少ない領域、すなわち配列番号１(表２)の残基11-18に対応するコドンを含むように商業的に合成された(Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX)。合成オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を表10に示す(配列番号９)。23ヌクレオチド長配列は、１個のイノシン塩基を含み、32倍の重複性およびおよその最小TM=54℃を有する。
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cDNAライブラリーは、KimmelおよびBerger(1987) Meth. Enzymol. 152:307-359が略述した手順に従い、C. cinerariaefoliumの未熟花のmRNAから構築された。本発明の１つの実施態様において、cDNAは、Stratagene Zap cDNA合成キットを用いて、ポリＡ富化RNAから合成された。このcDNAはStratagene Lambda Zapベクターにクローニングされた。CDSタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列(配列番号10)を図４に示す。389位から448位までの配列は、表２に示すCDSタンパク質のＮ末端領域をコードする遺伝子の部分を含む。遺伝子の1217位と1255位との間のヌクレオチド配列は、ピーク２のCDSトリプシン処理ペプチド(表４)に対応する。1265位と1297位との間のヌクレオチド配列は、ピーク５のCDSトリプシン処理ペプチド(表７)に対応する。1301位と1351位との間のヌクレオチド配列は、ピーク６のCDSトリプシン処理ペプチド(表８)に対応する。そして、1355位と1390位との間のヌクレオチド配列は、ピーク４のトリプシン処理ペプチド(表５)をコードする。
当該分野において周知のとおり[例えば、Glover (1984) Gene Cloning, BrammerおよびEdidin (編)、Chapman and Hall、NY参照]、cDNAライブラリー作製、および適切なDNA組換えベクター (例えばプラスミドのpUCファミリー、またはλgt10ファージベクターまたはλgt11ファージベクター)へのcDNAクローニングについてのストラテジーは他にもある。本発明の特定の実施態様において、DNA組換えベクターは、クローニング部位に近接するバクテリオファージプロモーターを有し、ここで単に異なるRNAポリメラーゼを使用することによってcDNAのいずれかの鎖に特異的に転写物が作製される。このようにして生成されるRNAは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得るか、または無細胞タンパク質合成系で翻訳され得る。
本明細書に記載の遺伝子的に操作された組換えDNA分子の構造的配置および特定の因子に対して、遺伝子発現の活性を破壊することなく改変が行われ得ることが当該分野において理解されている。例えば、エンハンサー調節因子および/またはプロモーター(例えば、好ましくは構成性プロモーター)の選択において、本発明の組換えDNA分子の機能に有意に影響を与えることなく置換が行われ得ることが考慮される。遺伝子発現の最適化もまた、異なる調節因子および特定の因子の多数のコピーの互いに対するおよびTATAボックスの位置に対する配置、方向、およびスペースから生じることもまた理解されており、このことは本明細書の開示の教義により当業者に明らかである。
本発明の好ましい実施態様において、cDNAライブラリーが、Ｎ末端CDSタンパク質配列由来の標識合成オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングされた。本発明の代替的な実施態様において、cDNAライブラリー内の個々の組換え体が、抗原の発現(抗体認識)について、または表現型の発現(すなわち酵素活性)についてスクリーニングされ得る。組換えcDNAライブラリー由来のクローン化配列を選択する手順については、Kimmel (1987) meth. Enzymol. 152:393-339に記載されている。
強いハイブリダイゼーションのシグナルを示すcDNAクローンが、CDSアミノ酸配列に対する相補性を確認するために配列決定される。さらに、cDNAによってコードされるタンパク質は、DMAPPをクリサンテミル二リン酸に変換する酵素活性を有することが明らかにされている。これは、例えば、適切なRNAポリメラーゼによってクローンの配列を転写し、次に市販のウサギ網状赤血球リゼイトまたはコムギ胚芽抽出物インビトロ翻訳系内でmRNAを翻訳することによって、行われる。
本発明の別の実施態様において、CDSタンパク質の存在は免疫学的に検出された。例えば、SDS-PAGEゲルから精製および単離されたCDSタンパク質に対して生じた抗体は、精製された40,000ダルトンのCDSタンパク質と交差反応することが明らかにされた。また、植物抽出物およびクローン化CDS遺伝子の産物由来のCDS活性を不活化および沈殿させるために、CDS特異性抗体が利用される。当該分野の標準的方法に従って、CDSタンパク質に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体が調製される。このタイプの免疫学的試験は、例えば、レシピエント生物におけるクローン化CDS遺伝子の発現の最適化のために、さらに利用される。
本発明は、さらにCDSのゲノムクローンの単離を考慮している。ゲノムDNAは、HerrmannおよびFrischauf (1987) Meth. Enzymol. 152:180-189に記載の方法に従って単離される。PCRに基づく方法が、部分タンパク質配列[例えば、Aartsら、(1991) Plant Mol. Biol. 16:647]またはcDNAフラグメントプローブ[例えば、Kingら (1988) Plant Mol. Biol. 10:401-412]を用いてゲノムDNAから遺伝子をクローニングするために用いられる。このゲノムCDS遺伝子は、特に天然の5'系が酵素活性の全発現に必要とされる宿主系において、CDSを発現させるためにcDNAの代わりに利用され得る。
本発明はまた、本発明のcDNAまたはcDNAフラグメントのプローブを使用するキク科のクリサンテミル二リン酸シンターゼ遺伝子の単離を考慮している。同様に、これらのcDNAまたはcDNAフラグメントのプローブは、ハイブリダイゼーションにより、化学的に変化されたクリサンテミル二リン酸遺伝子および本発明のクリサンテミル二リン酸遺伝子と同一の配列を有する合成遺伝子を検出するために利用される。
本発明の目的は、酵素的にクリサンテミルアルコールを生産してピレトリン化学合成の基質として供することである。クリサンテミルアルコールを生産するための最適な方法の一つは、クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)をコードするクローンを、所望のアルコールを精製する発現系(例えば、酵母、細菌(E. coli、B. subtilisなど))に導入することである。例えば、工業的酵母は、優性の選択マーカーを使用する遺伝子の形質転換に適している。好ましくは、(ａ)クリサンテミルアルコールの異化活性が低いまたは認められられないこと、(ｂ)クリサンテミル二リン酸を対応アルコールに切断する能力、および(ｃ)成長培地中にアルコールを分泌し、そして高レベルのアルコールに耐性である強い能力に対して、酵母が選択される。
クリサンテミル二リン酸は、異なる経路によって酵母中でクリサンテミルアルコールに変換され得る。例えば、酵母は、液胞に関連する酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼの両者を含む。アルカリ性ホスファターゼは、液胞膜タンパク質であることが報告されている。形質転換酵母細胞におけるこの化合物の過剰生産から起こる高濃度のクリサンテミル二リン酸が存在すると、クリサンテミル二リン酸は液胞内に輸送され、そこで酵素的にクリサンテミルアルコールに変換される。別の方法では、制限濃度のリン酸塩中で酵母が生育されるが、リン酸塩を保存するために酵母細胞をクリサンテミル二リン酸からリン酸基を切断するように誘導する。あるいは、酵母内で生産されるクリサンテミル二リン酸が単離され、そして続いてインビトロで化学的または生化学的に対応アルコールに変換される。
酵母の形質転換技術については、文献で詳細に記載されている。植物タンパク質を含む種々の外来性タンパク質の発現の成功が報告されている[Goodeyら (1987) Yeast Biotechnology, (Berryら、編)、Allen Unwin, pp.401-429; Tagueら(1987) J. Cell. Biol. 105:1971; Rothsteinら (1984) Nature 308:622; Parentら (1985) yeast 1:83]。
酵母内で生産されるクリサンテミルアルコールがピレトリン合成の基質として使用される。本発明は、発酵ブロス(fermentation broth)からクリサンテミルアルコールを単離する方法、例えば蒸気蒸留を含む方法を考慮している。この方法は好ましいが、他の技術も、一次または二次代謝物の生産およびそれに続く生産物またはその誘導体の回収の最適化に適用し得ることが理解される。
本発明の目的はさらに、既知の化学合成反応と組み合わせて本発明のCDS遺伝子を利用してピレトリン類を合成することである。レスロロン部分(ヒドロキシシクロペンテノン)、Chrysanthemum cinerariaefoliumのピレトリンエステルのアルコール成分の合成は、既知の方法、例えばRomanetおよびSchlessinger (1974) J. Am. Chem. Soc. 96:3701により記載のラセミ体レスロロンの高効率合成ルート；Bradsherら (1954) J. Am. Chem. Soc. 76:114およびHerrmannら (1973) Tetrahedron Lett. 47:4707により記載の高回収率の出発物質の調製に関する合成手順に従って実施される。図３に図式的に表した通り、次に、レスロロン部分をピレトリンＩまたはピレトリンIIの生産のために、当該分野で既知の合成反応を用いて、菊酸またはピレトリン酸とエステルを形成させる。ピレトリン誘導体、ピレスロイド類、およびピレスロイド誘導体は、所望のピレトリンまたはピレスロイド分子に対して適切なシクロプロピルおよびケト-アルコール部分が選択される場合に、図３に表したのと同様のストラテジーに従って、同様に合成される。
本発明−精製CDS酵素および対応遺伝子−により、正確な立体異性体のクリサンテミル二リン酸の合成が可能であって、これは次にピレトリン分子およびその誘導体の化学合成のための基質として利用される。合成手順全体に含まれる反応のいくつかを図３に表す。本発明の特定の実施態様においては、例えばDaltonら、米国特許第4,225,694号記載の通りに、クリサンテミル二リン酸をクリサンテミルアルコールに変換し、これを酸化剤の存在下で対応の酸に酸化する。次に、本発明は、当該分野において既知のエステル化の手順を用いる、菊酸とレスロロンとの結合を考慮している。その結果得られたピレトリンエステルを、既知の酸化剤、および大量生産に適した条件下で最も高収率が得られる反応条件を用いて、相互変換される。
以下に示したことを除いて、クローニング、DNAの単離、増幅、および精製に関する標準的技術、合成遺伝子構築に関する標準的技術、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限酵素などを含む酵素反応に関する標準的技術、PCR技術、および種々のタンパク質分離および生成技術は、既知であり、そして当業者によって通常用いられる技術である。多くの標準的技術が、Maniatisら (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Wu(編) (1979) Meth. Enzymol. 68; Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; Wuら (1983) Meth. Enzymol. 100および101; GrossmanおよびMoldave (編) (1980) Meth. Enzymol. 65; Miller (編) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; OldおよびPrimrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; SchleifおよびWensink (1982) Practical Method of Molecular Biology; Glover (編) (1985) DNA Cloning VolＩおよびII, IRL Press, Oxford, UK; HamesおよびHiggins (編) (1985) Nucleic Acid Hybridazation, IRL Press, Oxford UK; Setlow, Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York;およびDeutscher (編) (1990) Guide to Protein Purification, Academic Press, New Yorkに記載されている。使用した略字および命名は、当該分野において標準と考えられるものであって、そして本明細書に引用された業界雑誌などにおいて通常使用されている。
本発明の目的は、本明細書に記載の方法および技術の周知の変形、改変、または等価物を用いて、過度の実験を行わずに達成され得ることが、当業者により理解される。当業者はまた、詳細に記載される手段以外の代替手段が、本明細書に記載の組換え分子の機能的特徴を達成するために当該分野で利用可能であるか、および本発明の組換え分子の機能的等価物を達成するためにこれらの代替物を如何に用いるかを理解する。例えば、合成クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)遺伝子または化学的に変化させた遺伝子が、特異的CDS酵素活性の達成のために、天然に存在するCDS遺伝子の代わりに利用され得る。本発明は、当業者により理解され、そして本明細書の開示の趣旨および範囲に含まれるこれらの変形、改変、代替、および等価物を含有することが意図される。
下記の実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例１：クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)の精製
(ａ)CDS酵素活性のアッセイ
クリサンテミル二リン酸シンターゼ(CDS)は、２分子のジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)のクリサンテミル二リン酸への変換を触媒する。CDS活性は、DMAPPのクリサンテミル二リン酸への変換とそれに続くクリサンテミルアルコールへの切断により調製されるクリサンテミルアルコールのガスクロマトグラフィー(GC)分析により測定した。DMAPPは市販されていなかったことから、実施例６に記載の通りPoulterらの方法に従って合成した。DMAPPのクリサンテミル二リン酸への変換は、下記の成分を含む１ml容量中で行った：100mMトリス-HCl pH7.8、0.5mM DTT、３mM MgSO4、１mM DMAPP、およびアリコートの酵素。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を阻害するために、精製手順の初期工程中に、反応混合物中に１mMヨードアセトアミドもまた加えた。インキュベーション時間は、31℃で15〜30分またはそれより長く(活性のレベルに依存する)、その後反応を停止するため５分間の煮沸を行った。
クリサンテミル二リン酸のクリサンテモールへの変換は、200μlの0.5mMグリシンpH10.4＋24μlの50mM ZnCl2を添加することによって、煮沸したアッセイ溶液のpHを調整することにより得られた。次に約400単位のアルカリ性ホスファターゼを添加し、反応混合物を15分間37℃でインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼとインキュベートした後、0.3mlの飽和NaCl溶液および0.2mlの塩化メチレンを各アッセイチューブに添加した。このチューブを30秒間ボルテックスミキサーで撹拌し、そして遠心分離して有機層を清澄化した。次に４μlの塩化メチレン溶液をFFAP (Alltech)ガスクロマトグラフィーカラムに、135℃で注入した。ピーク面積とR-トランス-クリサンテミルアルコール標準曲線とを比較することにより、クリサンテミルアルコールレベルを定量した。
本酵素について同定されている唯一の補因子は、Mg2+である。MgSO4の至適濃度３〜５mMである。Mn2+およびZn2+のような他の金属についても調べると、これらはMg2+の場合と比較してより低いCDS活性を与えた。最大活性に対する至適温度は30℃〜32℃で、そして至適pHは約7.8である。
(ｂ)精製スキーム
１. 植物材料
Chrysanthemum cinerariaefoliumの植物を、温度15〜23℃および18時間 明/６時間 暗サイクルを維持する温室内で生育させた。苗をまず、生育チャンバー内で、６週間４℃で処理し、次に温室に移すことによって、開花を誘導した。次に、毎週全ての花芽を回収し、そして植物を株分けすることにより、植物の開花を持続させた。
２. 初期抽出
花弁が出現して開き始める頃、しかし、花弁が充分に出現して地面に落下する前に花芽を採取した。花梗部を除去し、そして芽を直ちに氷上に置いた。特に記載しない限り、後の抽出手順は４℃で行った。芽１g当たり0.4gの不溶性ポリビニルポリピロリドン(polyvinylpolypyrrolidone)(PVP)を加えた５mlの抽出緩衝液中で芽を粉砕した。抽出緩衝液は、100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、100mMアスコルビン酸、100mMショ糖、100mMβ-メルカプトエタノール(β-ME)、および５mM硫酸マグネシウムから成った。ステンレススチールブレンダー内の30秒間の初期の粗粉砕、それに続くSorvall Tissue Mizerによる２分間の粉砕の２工程で粉砕を行った。粉砕した材料を、Beckman JA-21遠心機内の250mlまたは500mlポリスチレンボトル中で15分間、15,000×gで遠心分離した。上清をデカントして保存し、そしてペレットを別の50〜100mlの抽出緩衝液で抽出した。上清(上記の通り遠心分離した)をデカントし、そして最初の上清に添加し、そしてペレットを捨てた。合わせた上清をmiracloth (Calbiochem)で濾過した。濾過物各20mlに対して、１gのCell Debris Remover (Whatman, Hillsboro, OR)を添加し、激しく混合し、そして10分間撹拌せずに置いた。混合物をWhatman 541フィルターで濾過し、そして濾過物を保存した。
３. 硫酸アンモニウム沈殿
硫酸アンモニウムを15分間にわたってゆっくりと添加することによって、硫酸アンモニウム(分子生物学試薬用、Sigma Chemical Co., St Louis, MO)で、上に記載の抽出物を30%飽和とした。この30%飽和溶液を30分間の撹拌によって平衡化し、そして15,000×gで15分間、Beckman JA-21遠心分離器内で遠心分離した。ペレットを捨て、そして上清をmiraclothにより濾過した。この上清を、15分間にわたって硫酸アンモニウムをゆっくりと添加することによって、硫酸アンモニウムで55%飽和とし、そして30分間の撹拌によって平衡化した。この55%飽和溶液を15,000×gで20分間、Beckman JA-21遠心分離器内で遠心分離した。上清を捨て、以後の精製のためにペレットを保持した。この時点で、沈殿した材料は、-70℃で保存し得たか、または以後の精製のために直接使用し得た。典型的に、５〜10の抽出物を生成し、そして数週間にわたって貯蔵し、そして次にこれらの抽出物からのペレットを氷上で融解し、合わせて、そしてアリコート(約10〜12mlのスラリー)当たりおよそ300mgのタンパク質を得るために再等分した。タンパク質のこれらのプールを再び-70℃で貯蔵し、そして以後の精製の直前に融解した。
４. 予備陰イオン交換クロマトグラフィー
約300mgタンパク質の貯蔵硫酸アンモニウムアリコートをイミダゾール緩衝液[20mMイミダゾール、pH7.0、１mM硫酸マグネシウム、0.5mMジチオトレイトール(DTT)]中に再懸濁して、総容量40mlとした。再懸濁した材料をSW-28ローターを具備するBeckman L8-55超遠心機内で遠心分離し、そして45分間22,000rpmで操作した。上清を0.8μmシリンジ用セルロースアセテートフィルターによって濾過した。
KWIKTM脱塩カラム(Pierce, Rockford, IL)を通過させることによって、濾過物から残留硫酸アンモニウムを除去した。30ml脱塩カラム用に、9mlの濾過物を予め平衡化したカラムに透過させ、そして次に10mlの緩衝液を供してタンパク質フラクションを溶出させた。
脱塩溶液を５M NaClの溶液で75mM NaClとし、そして次に、Toyopearl DEAR-650M (TosoHaas, Montgomerville, PA)を充填し、そして75mM NaClを伴うイミダゾール緩衝液で平衡化した1.5×8cm Econocolumn (Bio-Rad, Hercules, CA)に供した。タンパク質を流速４ml/分で供した。タンパク質をカラムに加えた後、280nmでの吸光度がベースライン付近になるまで、同じ流速を用いて、75mM NaClを含むイミダゾール緩衝液で洗浄した。次に160mlのイミダゾール緩衝液中75mM〜200mM NaCl勾配により、１ml/分の速度で、タンパク質を溶出した。
各フラクション由来のアリコートをアッセイしてCDS活性の位置を決定した。活性フラクションはおよそ120mM NaClで溶出した。
５. 疎水相互作用クロマトグラフィー(HIC)
予備DEAEクロマトグラフィー由来の活性フラクション(各３〜４ml)を、固体NaClを添加することによって個々に２M NaClとした。フラクションを、イミダゾール緩衝液中２M NaClで平衡化した１mlのPhenyl Sepharose CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ)スラリーを充填した５ml容のディスポーザブルポリスチレンカラム(Pierce)に供した。イミダゾール緩衝液中1.0M、0.5M、0.3M、0.2M、および0M NaClの５mlを段階的に添加することによってタンパク質を溶出させた。ピーク活性は0M洗浄液中に溶出した。
この時点で、酵素は、30%までグリセロールを添加し、続いて-20℃で貯蔵することによって貯蔵され得たか、または直ちに以後の精製に使用され得た。
典型的な抽出物からの結果を表１に示す。表１に示した通り、フェニルセファロースの工程により、60〜70%の活性が失われた。活性の喪失はおそらく、カラムの選択および特定のカラムフラクションにおける酵素の不安定性による。
CDSタンパク質をSDS-PAGEゲル上で同定した。CDSタンパク質の天然の分子量は、フェニルセファロース、ヒドロキシアパタイト、およびサイズ排除クロマトグラフィー由来の副およびピークCDS活性フラクション(SDS-PAGEゲル上でも分析した)を比較することにより、40,000±5,000ダルトンと測定された。フェニルセファロースクロマトグラフィー後に得られたタンパク質フラクションをSDS-PAGE上で泳動させると、約40,000ダルトンの位置にタンパク質の「ダブレット」が観察された。ダブレットの２つのタンパク質は、常にCDS活性と相関する、いくつかの実験から得られた唯一のタンパク質であった。これらの２つのタンパク質はSDS-PAGEゲル上で明瞭に分離し、そして分子量がおよそ1,000から2,000ダルトン異なった。
６. HPLC陰イオン交換クロマトグラフィー(AX)
新鮮なあるいは貯蔵のHIC由来の活性フラクションを、１×10cm Protein-PakTMDEAE 8HRカラム(Waters, Milford, PA)に供した。ほとんどの場合、タンパク質はグリセロールで貯蔵されており、このためカラム添加時の初期流速を、カラムの圧力の限界を超えないように調整した。グリセロール中で貯蔵しておいたタンパク質での一般的なHPLCの展開のために、次のパラメータを使用した。カラムを、５mM硫酸マグネシウムおよび0.5mM DTTを伴う20mM 2-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ-2-[ヒドロキシメチル]-1,3-プロパンジオール(Bis-Tris)緩衝液、pH6.3で平衡化した。タンパク質を流速0.5ml/分でカラムに加えた。この流速で、約20分後、280nmでの吸光度がベースラインに回復した。Bis-Tris中100mM NaClへの10分間の勾配を1.5ml/分に流量を増加させて与え、続いてBis-Tris中100mM Naclから300mM NaClへの50分の直線勾配を流速を変えずに与えた。この手順を用いて、活性フラクションがおよそ190mM NaClで溶出した。
７. HPLCヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(HA)
HPLC-AX由来の活性フラクションについて、リン酸緩衝液で予め平衡化したKWITTMカラムを用いて5mM硫酸マグネシウムおよび0.5mM DTTを伴う１mMリン酸緩衝液、pH6.8に交換した。１mMリン酸緩衝液中のタンパク質を、１mMリン酸緩衝液で平衡化した4.0mm×7.5cmヒドロキシアパタイトHCA-カラム(Mitsui Toatsu、Rainin, Woburn, MAより購入)に供した。この手順中は流速を1.0ml/分に保った。20分間の１mMリン酸塩を含む勾配、続いて40分間の１mMリン酸塩〜200mMリン酸塩の直線勾配でタンパク質を溶出させた。この手順を用いて、およそ50mMリン酸塩で活性フラクションが溶出した。
溶出プロフィールを図５に示す。これは、主な溶出ピーク内に含まれるフラクションにおいて、CDS活性と40,000ダルトンタンパク質濃度とが一致することを示している。この時点で、SDS-PAGEおよび逆相HPLCで測定されたように、均一性が達成された。単一のタンパク質が、SDS-PAGEゲル上で40,000ダルトンの位置で同定された。この単一タンパク質は、以前の精製工程から得られた、タンパク質の「ダブレット」の下のバンドに対応した。
(ｃ)CDSのトリプシン消化
約100pmolのDEAE-HA精製CDSタンパク(容量を約4mlから約100μlに乾燥した)を20mMのNH4HCO3で作成した。トリプシンでの消化のために、４Mの尿素および1.6mMのDTTでCDS溶液を作成し、そして70℃で15分間加熱した後、イミダゾールを添加して濃度5mMとして、さらに室温で15分間インキュベートし、続いて140μlのH2Oを添加した。次にトリプシン(改変、配列決定用、Promega, Madison, WI)を添加して濃度を1.5mg/mlとし、そしてこの混合物を一晩37℃でインキュベートした。
CDSのトリプシン処理フラグメントを、逆相HPLC(Waters 625LC System、486 Absorbance detector、625ポンプ)を用いて精製した。トリプシン消化物を2.1×250mmカラム(Vydac C18 Vydac Hesperia, CA、カタログ番号218TP52)上に加え、そして0.15μl/分の流速で、１分当たり２本のチューブで集めたフラクション中に溶出させた。溶出は、２回蒸留水中の0.1%トリフルオロ酢酸(Ａ)および95%アセトニトリル中の0.1%トリフルオロ酢酸(Ｂ) の混合物の段階勾配を用いて実施した。溶出は96%Ａおよび４%Ｂからなる混合物で開始し、60分で溶出混合物を68%Ａおよび32%Ｂに変更し、90分で37%Ａおよび63%Ｂの混合物を用い、そして105分では混合物は16%Ａおよび84%Ｂを含んだ。溶出物質を214nmでモニターした。トリプシン処理フラグメントをUniversity of Utah Core facilityでApplied Biosystem 477Aプロテインシークエンサーを用いて配列決定した。表11に記載のピークを分析し、そして配列決定した。
0003722489.tif 000012
(ｄ)免疫化学
アジュバント(完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント(Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT))を伴う10〜20pmolのタンパク質(フェニルセファロースクロマトグラフィー後に観察された約40,000ダルトン「ダブレット」CDSタンパク質の上または下のバンドのいずれか)の腹膜腔内(IP)注射により、マウスに抗体を生じさせた。４週間および6.5週間後に、不完全フロイントアジュバントを伴うあるいは伴わない、CDSタンパク質の上または下のバンドの５〜10pmolを用いて、追加免疫を行った。ウエスタンブロット用の免疫学的活性物質として、血清を使用した[Towbinら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354; 米国特許第4,452,901号(1984)]。ニトロセルロース上に固定化したタンパク質に特異的に結合した抗体を、Towbinら (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354を改変し、試薬の供給者(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA)の指示に従って125I-プロテインＡ法により可視化した。
「上の」バンドCDSタンパク質に対してマウスにおいて惹起された抗体は、２つのフェニルセファロース精製CDS「ダブレット」タンパク質と交差反応したが、「下の」バンドのCDSタンパク質に対して生じた抗体は、２つのフェニルセファロース精製CDS「ダブレット」タンパク質と交差反応し、そしてフェニルセファロースCDSタンパク質「ダブレット」の「下の」バンドに対応するヒドロキシアパタイト精製CDSタンパク質とも交差反応した。
本発明の好ましい実施態様において、配列番号１の残基７から残基18までのアミノ酸配列を有するようにペプチドを化学合成した。この合成ペプチドを抗原として用いてウサギを免疫した。企業(例えば、Research Genetics, Huntsville, Al)において、ウサギの免疫を行った。1.0mlのトリス-緩衝化生理食塩水中に溶解し、そして1.0mlフロイント完全アジュバントで乳化した0.75mgの合成CDSペプチドで初回免疫を行った。混合物の半分(1.0ml)を皮内注入し、そして残りを皮下注入した。次の追加免疫は、フロイント不完全アジュバント中の0.75mgのタンパク質を用いて２および６週目に皮下注入によって行った。ウエスタンブロット上では、合成CDSペプチドに対する抗体は、フェニルセファロース精製由来の上下両バンドの「ダブレット」タンパク質と交差反応し、そして「ダブレット」の40,000ダルトンの「下の」バンドに対応するヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー由来の精製CDSタンパク質とも交差反応した。
実施例２:クリサンテミル二リン酸シンターゼのクローニング
ほとんど情報が入手され得ない特定のタンパク質をコードするDNA配列の単離のための強力なアプローチは、部分アミノ酸配列を得、そして対応する推定ヌクレオチド配列をプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることである。このアプローチは、トマトcDNAライブラリー由来の特定の配列の単離および同定のために近年使用された[Kingら (1988) Plant Mol. Biol. 10:401]。クリサンテミル二リン酸シンターゼの精製では少量のタンパク質しか得られないため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製後に行われるマイクロシークエンシングアプローチを用いた[Matsudaira (1990) Meth. Enzymol. 182:602-613]。ゲル電気泳動の組み合わせに続いて不活性マトリックス上にエレクトロブロッティング(electroblotting)することにより、直接配列し得る純粋な試料が得られる。精製CDSタンパク質について決定されたＮ末端配列を表２に示す(配列番号１)。
遺伝子コードの重複のため、任意の所定のタンパク質をコードする遺伝子内のヌクレオチド配列には多くの可能性がある。特定の位置で混合塩基を伴う複数のプローブを用いることによって[Davissonら (1986) Bioorg. Chem. 14:46]、およびまた縮重位置のいくつかで合成イノシンを用いることによって[Ohtsukaら (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608]、この障害を回避し得る。
クリサンテミル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子を単離するための最初の工程として、KimmelおよびBerger (1987)上記の方法を用いて、C. cinerariaefolium花mRNAのcDNAライブラリーを構築した。C. cinerariaefoliumの未熟花からライブラリーに対するmRNAを単離し、そしてStratagene Zap cDNA合成キットを用いてポリＡに富んだRNAからcDNAを合成した。このcDNAをStratagene Lambda Zapベクターにクローニングした。
縮重の最も少ない領域(表２の配列番号１の残基11-18)をコードするように、C. cinerariaefoliumのCDSのＮ末端アミノ酸配列から、対応オリゴヌクレオチドプローブを合成した(Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, TX)。初めに候補クローンを選択するためにオリゴヌクレオチドプローブ(表10)を用いた。ハイブリダイゼーションを一晩、49℃で、0.5%SDSを含む６×SSC媒体中で行い、続いて45℃、0.1%SDSを含む６×SSC媒体中で10分間の洗浄を３回行った。
そのライブラリー由来の約100万個のプラークをスクリーニングし、そしてオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした１個のクローンを同定した。そのバクテリオファージ内の挿入物はおよそ1.7キロベースであって、40キロダルトンのタンパク質をコードするのに充分であった。CDSタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列を図４に示す。このcDNAがクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードすることの確認は、DNA配列決定および/または酵素機能の発現から得られる。これらの理由のため、cDNAクローニングにおいて使用したプラスミドベクターは、ポリクローニング部位に隣接するバクテリオファージプロモーターを含んでいる。従って、直鎖状にした組換えプラスミドを適切なDNA依存性RNAポリメラーゼとともにインキュベートすると、クローニング部位に挿入されたC. cinerariaefoliumのcDNAをインビトロで転写し得る。異なるプロモーターがポリクローニング部位のいずれかの側に存在することから、単に異なるRNAポリメラーゼを用いることによって、転写物をcDNAのいずれかの鎖に特異的に生成し得る。このようにして作製されるRNAは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得るか、または無細胞タンパク質合成系内で翻訳され得る。
同様にして、C. cinerariaefolium花のゲノムライブラリー由来のCDS遺伝子を単離するために、CDSをコードするcDNAの異なる領域に対応するいくつかの合成オリゴヌクレオチドを利用し得る。C. cinerariaefolium花由来のゲノムDNAは、当該分野で既知の方法、例えば、MurrayおよびThompson (1980) Nucl. Acids Res. 8:4321-4325、およびHerrmanおよびFrischauf (1987)上記の手順を用いて調製し得、そして製造者(例えば、BRL)の指示に従って制限酵素で切断し得る。標識オリゴヌクレオチドプローブとのゲノムDNAフラグメントのハイブリダイゼーションは、当該分野で利用可能な方法、例えばKingら (1988) Plant Mol. Biol. 10:401-412に従って行われ、C. cinerariaefolium由来のCDSの１つまたは複数の遺伝子を同定するために用いられる。
一旦、オリゴプローブと強いハイブリダイゼーションシグナルを示すcDNAクローンが同定されると、これらを配列決定して、これらが既知のアミノ酸配列に対して相補的であることが確認される。さらに、候補cDNAが実際にクリサンテミル二リン酸シンターゼをコードすることを明らかにするため、このcDNAによってコードされるタンパク質は、DMAPPをクリサンテミル二リン酸に変換する酵素活性を有することが明らかにされている。RNA転写物は、適切なRNAポリメラーゼによって選択的に転写される。次にこの転写物は、ウサギ網状赤血球リゼイトまたはコムギ胚芽抽出物インビトロ翻訳系(BRLより入手可能)内で翻訳され、タンパク質産物が酵素活性について試験される。
CDSタンパク質に対して生じた抗体は、分析上および診断上、例えば、翻訳産物が酵素活性を示さないときの条件下で極めて有用である。このようにCDS活性を示し得ない条件下では、クローンがCDSをコードするcDNAを含むことの証明として、CDSに対する抗体を用いてクローン化遺伝子の産物と反応させることが認められている。次にレシピエント生物内におけるクローン化CDS遺伝子の発現を最大限に活用し得る[Bauwら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4806]。
遺伝子発現のために完全長または充分な長さのcDNAが確実に得られるようにするために、テンプレートしてゲノムDNAを用いて、単離された短いcDNAフラグメントのPCR増幅を実施し得る。これは、cDNAクローン内からプライマーを作製する逆PCR(inverse PCR)を用いることによって行われ得る[Ochman, H.ら (1988) Genetics 120:621]。
発現の低いmRNAはcDNAライブラリー内で充分に示されないという問題を解決するために、CDS cDNAの最初のクローニング時にPCRを使用する。最近の報告では、部分タンパク質配列を用いてゲノムDNAから遺伝子をクローニングするPCRに基づく方法が記載されている[Aarts, J.M.M.J.G. (1991) Plant Mol. Biol. 16:647;およびOchmanら (1988) Genetics 120:621-623]。１つのタンパク質の２つまたはそれを超えるCNBrフラグメントについて得られる配列情報を用いて、各フラグメントの領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーを両方向で作製し、そして増幅用プライマーの対方向(pairwise)の組み合わせを試験することによって、遺伝子のセグメントを増幅する。１つの組み合わせによって、２つのフラグメント間の領域が増幅される。次にこの増幅産物を、cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用し得る(より長いプローブからより強いシグナルが得られ、従って、よりポジティブな同定が得られる)。あるいは、増幅産物を、逆PCR反応に使用されるべき生産物から外向きになるようにし得る。
実施例３：クリサンテミルアルコールの代謝/分泌のための
酵母のクリーニング
本計画の目的は、クリサンテミルアルコールを生産してピレトリン化学合成のための基質として供給することである。クリサンテミル二リン酸シンターゼをコードするクローンを同定した後、クリサンテミルアルコールを生産する最も好都合な方法は、このクローンを酵母に形質転換し、そして酵母細胞にクリサンテミル二リン酸を対応アルコールに変換させることである。工業用酵母は現在、優性選択マーカーを用いる遺伝子形質転換に適している。酵母株のコレクションは例えば、ATCC、Rockville, MD；University of California, DavisのLinda Bisson博士；Zeagen, Fort Collins, Coなどから入手可能である。酵母をスクリーニングすることについては、いくつかの特性がある。第一に、クリサンテミルアルコール異化活性がかなり低いまたは全く認められないことについて酵母を選択する。第二に、アルコールを分泌し、そして成長培地中の高レベルのアルコールに耐性である能力が強いことについて酵母を選択する。さらに、クリサンテミル二リン酸をアルコールに切断する能力について酵母を選択する。酵母は、液胞に関連する酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼの両者を含む。アルカリ性ホスファターゼは、液胞膜タンパク質であることが明らかにされている。クリサンテミル二リン酸は、ホスファターゼがそれを分解するために液胞内に輸送され、そしてこれは、形質転換された酵母細胞内のこの化合物の過剰生産の結果として生じ得る。リン酸塩制限下で生育させると、酵母細胞はクリサンテミル二リン酸の蓄積を停止し、そしてまたリン酸塩を保存しようとしてクリサンテミル二リン酸からリン酸基を切断し、そしてクリサンテモールを分泌することが可能である。あるいは、クリサンテミル二リン酸を単離し、続いてこれをアルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼにより酵素的に、または重炭酸ナトリウムまたは希釈水酸化ナトリウムのいずれかによる塩基性加水分解によって化学的に、対応アルコールへ変換する。
酵母の形質転換技術は過去10年間の間に発達し、そして文献に詳細に記載されている。植物タンパク質を包含する種々の外来性タンパク質の発現の成功が報告されている[Goodeyら (1987)上記；Tagueら (1987)上記；Rothsteinら (1984)上記；Parentら (1985)上記]。多くの宿主およびベクターが公式に入手可能である。例えば蒸気蒸留によるクリサンテミルアルコールの生産および回収ができる適切な株および生育条件の選択は、当該分野で一般的な手順を用いて決定される。
実施例４：酵母ブロスからのクリサンテモールの単離
発酵ブロスからクリサンテミルアルコールを単離する方法として蒸気蒸留を利用できる実現性について決定した。成長培地中にクリサンテミルアルコールの0.1%混合物があると、酵母株、UCD522に致死的であることが知られている。この値をブロス内に存在するクリサンテミルアルコールの最大量と仮定して、２つの混合物を調製した。１つは水１リットル中に１mlのクリサンテミルアルコールを含み、そして第２のものは遠心分離によって清澄化した酵母ブロス１リットル中に１mlのクリサンテミルアルコールを含んだ。次に混合物を大気圧で蒸留し、そして50mlのフラクションを回収した。次に各フラクションを３×20mlのペンタンで抽出した。ペンタンフラクションをメスフラスコで既知量に希釈し、そしてガスクロマトグラフィーにより分析した。１mlのクリサンテミルアルコールを100%対照として用いて、標準を調製した。個々のフラクションについて下記の表12に掲載した百分率は、この標準に対する。
0003722489.tif 000013
酵母ブロス内の代謝物の安定性および表12に記載の回収率は、例えば蒸気蒸留手順によって、発酵ブロスからクリサンテミルアルコールを単離できる実現性を示す。
実施例５：クリサンテミルアルコールのピレトリンへの化学変換
(ａ)レスロロン部分の合成
ヒドロキシシクロペンテノン類(レスロロン類)は、Chrysanthemum cinerariaefoliumにおいて見出されたピレトリンエステル類のアルコール成分である。これらケト-アルコール類の合成についてはかなり注目されており、そして種々のシクロペンテノン類の調製について多くの方法が知られている。レスロロン類の合成に関する文献としては、特にRomaneおよびSchlessinger (1974) J. Am. Chem. Soc. 96)(11):3701-3702；Curran (1983)上記；Shonoら (1976)上記；Takahashiら (1981)上記；およびHiroharaら (1985)上記が挙げられる。
(ｂ)クリサンテモールの菊酸への酸化
ジメチルアリルピロリン酸の酵素的縮合の直接産物はクリサンテミル二リン酸である。必要であれば、二リン酸基の遊離アルコールへの加水分解が、重炭酸ナトリウムまたは希釈水酸ナトリウムのいずれかによる塩基性加水分解によって達成される。クリサンテミルアルコールの菊酸への酸化は、この反応に通常使用される種々の酸化剤の１つを用いて実施される。例えば、Singhら (1979) Tetrahedron Lett. 35(14):1789は、二酸化珪素上でクロム酸ピリジニウムを用いてこの酸化に対する良好な収率を報告しており、そしてDaltonら (1980)米国特許第4,225,694号は、二酸化ルテニウム存在下でアルカリ金属の過ハロゲン酸塩または次亜ハロゲン酸塩を用いた場合の77%の収率を報告した。他の研究者らは、その他種々の方法、例えば、Daltonら (1975)米国特許出願第616,260号；Daltonら (1980)米国特許第4,225,694号に加えて、Jones試薬[Bhatら (1981) Indian J. Chem. Sect. B, 20(B)(3):204]、Sarett試薬[Sasakiら (1973) J. Org. Chem. 38(24):4095]、および三酸化クロム[Gopichandら (1975) Indian J. Chem. 13:433]により良好な結果が得られていることを報告した。
(ｃ)ピレトリンＩ生産のための菊酸およびレスロロン類のエステル化
菊酸およびレスロロン類の調製にはともに多くの種々のシンターゼがあるため、これら２成分の結合に関して極めて多くの研究がなされてきた。最も有効なエステル化方法では、触媒量のトルエンスルホン酸および穏やかな加熱、トリエチルアミン、またはジシクロヘキシルジイミドおよびN-ジメチルアミノピリジンを利用する、(Martelら、米国特許第4,489,093号；Agrimiro-Marcosら、ドイツ国特許第3,445,504号；Kovacsら、ドイツ国特許第3,023,718号；Schwarzeら、欧州特許出願第31,023号；Martelら、米国特許第3,997,586号；Mastuiら、欧州特許出願第50,454号；Ackermannら、フランス国特許第2,478,085号)。Crombieら (1985) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, p.1393による別の方法では、ピレトリンＩを結晶セミカルバゾン類(セミカルバジド塩酸塩、酢酸ナトリウム、ピリジン)として単離し、高収量の産物を得た。もしくは、オキサリルクロリドで処理することにより菊酸の酸塩化物を調製し得、そして次にピリジン中で撹拌しながらレスロロンとエステルを形成させ得る。高収量の調製について最も効率的な手順であると決定された方法は、エステル化反応を採用した方法である。
(ｄ)ピレトリンII生産のためのアリル基の酸化
クリサンテモールおよび/または菊酸のピレトリン酸への変換とそれに続くピレトリンＩおよびピレトリンIIの形成を行うために、当該分野には利用可能な方法がある。図３に示すスキームは、このような１つの手順を概略したものであって、ここでクリサンテモールは菊酸またはピレトリン酸に酸化され、続いて両者ともレスロロン部分とエステルを形成してピレトリンＩまたはIIを生成する。
別の実施態様では、オレフィン部分の切断(オゾン分解などによる)によって対応アルデヒドを形成し、続いてアルキルトリフェニルホスホニウム試薬[Science (1980) 207:42-44参照]の存在下でWittig反応によって、菊酸がピレトリン酸に変換される。次に菊酸からのピレトリンＩの合成について本明細書に要約した一般的な合成手順を用い、さらにピレトリン酸のメチルエステル側鎖を遮断することに注意しながら、ピレトリン酸とレスロロンとのエステルを形成させてピレトリンIIを生成する。
実施例６：ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)の化学合成
Poulterおよび共同研究者の方法[Dixitら (1981) J. Org. Chem. 46:1967；Davissonら (1986) Bioorg. Chem. 14:46；Davissonら (1986) J. Org. Chem. 51:4768; およびDavissonら (1985) Meth. Enzymol. 110:130]によって、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)を合成した。市販のジメチルアリルブロミド(3-メチル-2-ブテン-1-イルブロミド)を、新たに調製したトリス(テトラ-n-ブチルアンモニウム)水素ピロリン酸で処理し[Dixitら (1981) J. Org. Chem. 46:1967-1970およびDavissonら (1986) J. Org. Chem. 51:4768]、そして得られた物質をDMAPPのアンモニウム塩に変換した(図６参照)。
[1-3H]DMAPPを、Davissonら (1986)上記の確立された文献的方法に従って調製する。
実施例７：ピレスロイド類の生合成
(＋)-トランス-菊酸を所望の環状アルコールでエステル化することにより、(＋)-トランス-ピレスロイド類を生成する。特定の異性体である(＋)-トランス-菊酸を、DMAPPの(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸への酵素的変換、続いてクリサンテミル二リン酸のクリサンテミルアルコールへの変換およびそのアルコールを対応する酸に酸化することによって生成する。本発明の精製CDSを利用することにより(実施例１)、好ましくはCDSをコードするDNAフラグメントを利用してクリサンテミル二リン酸の天然の[(＋)-トランス-]異性体の生産のためにCDS活性を発現させることによって(実施例２参照)、クリサンテミル二リン酸の天然の異性体の酵素的合成が達成される。(＋)-トランス-クリサンテミル二リン酸の対応アルコールへの変換を実施例３に記載の通り行う。実施例４の手順に従って(＋)-トランス-クリサンテミルアルコールを単離し、そして実施例５(ｂ)に記載の通り酸化して菊酸とする。
(＋)-トランス-菊酸を所望の環状アルコール、例えば3-フェノキシベンジルアルコール、3-フェノキシベンズアルデヒド、3-フェノキシベンジルシアノヒドリン、5-ベンジル-3-フリルメチルアルコール、それらの誘導体などでエステル化する。菊酸および所望のアルコールを利用する活性ピレスロイド類の合成方法は、公式に利用可能である。例えば、Carter, S. W. (1989) 「公衆衛生および保菌害虫制御における合成ピレスロイド類使用の概評(A Review of the Use of Synthetic Pyrethroids in Public Health and Vector Pest Control)」Pesticide Science 27:316-374；Cromby, L. (編)「Recent Advances in Chemistry of Insect Control II.」Royal Society of Chemistry Special Publication No.79；Elliott, M. (1989)「ピレスロイド類 - 初期の発見、近年の発展、および将来(The Pyrethroids - Early Discovery, Recent Advances and the Future)」Pesticide Science 27:337-351；Hill, I.R. (1989)「水棲生物およびピレスロイド類(Aquatic Organisms and Pyrethroids)」Pesticide Science 27:429-457 ；Leahey, J.P. (1985)「The Pyrethroid Insecticides」Taylor & Francisにより出版；Naumann, K. Chemistru of Plant Protection, 第４および５巻 - 「Synthetic Pyrethroids Parts I and II」Springer Verlagにより出版；Saini, R.K.ら (1989)「Earias vinellaのフェンバレレート選択およびサイパーメトリン選択株における殺虫耐性および交差耐性の発達(Development of Insecticide Resistance and Cross-Resistance in Fenvalerate-and Cypermethrin-Selected Strains of Earias vinella)」Pesticide Science 25:289-295；およびWatkinson,I.A. (1989)「ピレスロイド類および害虫処置の経済性(Pyrethroids and the Economics of Pest Management)」Pesticide Science 27:465を参照。ピレスロイド類の誘導体は、例えば、非エステルピレスロイド類、珪素置換ピレスロイド類、ハロゲン化ピレトリン類などを含めるように処方し得る。
この手順により生産された(＋)-トランス-ピレスロイドは、所望の活性光学異性体であり、そして単一の異性体種として存在する。本発明によって、単一の所望する異性体種を得るために、現在当該分野でラセミ混合物を分離する必要性が排除される。
実施例８：代謝物の生合成
本出願人の発明のCDS活性によって得られる(＋)-トランス-異性体は、ステロール類、カロチノイド類、ドリコール類、およびユビキノン類を含む数種類の代謝物の合成に利用される。続く所望の基質の天然の(＋)-トランス-異性体の生産のために、本発明の精製CDSを利用して(実施例１)、または好ましくはCDSをコードするDNAフラグメントを利用してCDS活性を発現させて(実施例２)、クリサンテミル二リン酸の天然の異性体の酵素的合成が達成される。所望のイソプレノイド化合物、例えばステロール、カロチノイド、ドリコール、ユビキノンなどの合成において有用な方法はBiosynthesis of Isoprenoid Compounds、Porter, J.W.およびSpurgeon, S.、(編)、第１巻、Wiley, New York, pp.255-292のCroteau (1981)；Biosythesis of isoprenoid Compounds、Porter, J.W.およびSpurgeon, S.L.、(編)、第１巻、Wiley, New York, pp.283-374のCane, D.E. (1981)；およびBiosynthesis of Isoprenoid Compounds、Porter, J.W.およびSpurgeon, S.L.、(編)、第１巻、Wiley, New York, pp.414-441のPoulter, C.D.およびRilling, H.C. (1981)において見いだされている。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：エレンバーガー, スザンヌ  アール.
バイザー, ギャレン  ディー.
ベル, ラッセル  エヌ.
ハッセイ, チャールズ  イー., ジュニア
シュタック−エイデンズ, ドナ  エム.
スウェッドランド, ブラッドリー  ディー.
(ii)発明の名称：クリサンテミル二リン酸シンターゼ、対応遺伝子、およびピレトリン合成における使用
(iii)配列数：10
(iv)連絡住所
(A)住所人：グリーンリー  アンド  ウィナー, ピー. シー.
(B)番地：スイート  201, マンハッタン  サークル  5370
(C)市：ボールダー
(D)州：コロラド
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：80303
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン  リリース #1.0、バージョン #1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：WO
(B)出願日：1994年６月21日
(C)分類：
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US 08/082,844
(B)出願日：1993年６月25日
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：
(B)登録番号：34,464
(C)照会／記録番号：22-90A PCT
(ix)電話回線情報：
(A)電話：(303)499-8080
(B)テレファックス：(303)499-8089
(C)テレックス：823189
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：20アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：1..20
(D)他の情報：／記＝「フェニルセファロースクロマトグラフィー後のCDSのＮ末端アミノ酸配列」
(xi)配列：配列番号１：
0003722489.tif 000014
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：14アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iv)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：Modified-site
(B)存在位置：1..14
(D)他の情報：／標識＝Xaa
／記＝「Xaaは、明確に同定され得なかった残基である」
(xi)配列：配列番号２：
0003722489.tif 000015
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：13アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
0003722489.tif 000016
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：12アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号４：
0003722489.tif 000017
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：Modified-site
(B)存在位置：1..7
(D)他の情報：／標識＝Xaa
／記＝「Xaaは、明確に同定され得なかった残基である」
(xi)配列：配列番号５：
0003722489.tif 000018
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号６：
0003722489.tif 000019
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：Modified-site
(B)存在位置：1..15
(D)他の情報：／標識＝Xaa
／記＝「Xaaは、明確に同定され得なかった残基である」
(xi)配列：配列番号７：
0003722489.tif 000020
(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：Modified-site
(B)存在位置：1..11
(D)他の情報：／標識＝Xaa
／記＝「Xaaは、明確に同定され得なかった残基である」
(xi)配列：配列番号８：
0003722489.tif 000021
(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA (genomic)
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：modified-base
(B)存在位置：1..23
(D)他の情報：／修飾塩基＝ｉ
／記＝「15位のＮ＝イノシン」
(xi)配列：配列番号９：
0003722489.tif 000022
(2)配列番号１０の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：1625塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：239..241
(D)他の情報：／記＝最初のメチオニンコドン
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：389..448
(D)他の情報：／記＝「表２のCDSタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対応する」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：1217..1255
(D)他の情報：／記＝「ピーク２のCDSトリプシン処理ペプチドのＮ末端アミノ酸配列 (表４) に対応する」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：1265..1297
(D)他の情報：／記＝「ピーク５のCDSトリプシン処理ペプチドのＮ末端アミノ酸配列 (表７) に対応する」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：1301..1351
(D)他の情報：／記＝「ピーク６のCDSトリプシン処理ペプチドのＮ末端アミノ酸配列 (表８) に対応する」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：misc_feature
(B)存在位置：1355..1390
(D)他の情報：／記＝「ピーク４のCDSトリプシン処理ペプチドのＮ末端アミノ酸配列 (表５) に対応する」
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表わす記号：CDS
(B)存在位置：239..1423
(xi)配列：配列番号１０：
0003722489.tif 000023
0003722489.tif 000024
0003722489.tif 000025
【図１】
0003722489.tif 000026
【図２】
0003722489.tif 000027
【図３】
0003722489.tif 000028
【図４Ａ】
0003722489.tif 000029
【図４Ｂ】
0003722489.tif 000030
【図４Ｃ】
0003722489.tif 000031
【図５】
0003722489.tif 000032
【図６】
0003722489.tif 000033