(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エバネッセント場において蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡であって、
前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、
前記光源から射出された光を環状に回折させる回折手段と、
前記回折した光を集光する第１集光手段と、
前記第１集光手段を透過した光を集光させる第２集光手段と、
前記第２集光手段を透過した光を試料に照射する対物レンズと
を含む全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記試料に照射される光が環状となるように、前記透過光の一部を遮光するマスクを有する、請求項１に記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記回折手段が回転する、請求項１又は請求項２に記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記回転する回折手段の回転軸が光源から射出された光の軸と一致していない、請求項３に記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記回折手段が回折拡散板であって、その回折拡散板が、その面の方向を維持したまま振動する、請求項１〜４のいずれかに記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に環状の光が入射し、その環状の光の主光線が円筒面上を進行する、請求項１〜５のいずれかに記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に、前記第２集光レンズを透過した光の焦点が位置する、請求項１〜 ６のいずれかに記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項８】
エバネッセント場において蛍光色素を励起させる照明光学系であって、
前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、
前記光源から射出された光を環状に回折させる回折手段と、
前記回折した光を集光する第１ 集光手段と、
前記第１ 集光手段を透過した光を集光させる第２ 集光手段と、
前記第２ 集光手段を透過した光を試料に照射する対物レンズとを含む照明光学系。
【請求項９】
前記試料に照射される光が環状となるように、前記透過光の一部を遮光するマスクを有する、請求項８に記載の照明光学系。
【請求項１０】
前記回折手段が回転する、請求項８又は請求項９に記載の照明光学系。
【請求項１１】
前記回転する回折手段の回転軸が光源から射出された光の軸と一致していない、請求項１０に記載の照明光学系。
【請求項１２】
前記回折手段が回折拡散板であって、その回折拡散板が、その面の方向を維持したまま振動する、請求項８〜１１のいずれかに記載の照明光学系。
【請求項１３】
前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に環状の光が入射し、その環状の光の主光線が円筒面上を進行する、請求項８〜１２のいずれかに記載の照明光学系。
【請求項１４】
前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に、前記第２ 集光レンズを透過した光の焦点が位置する、請求項８〜１３のいずれかに記載の照明光学系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、エバネッセント場において蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡に関する。
【従来の技術】
蛍光顕微鏡は、その照射された光の波長よりも長い波長の光を出す蛍光色素を励起させ、その蛍光を観察することによって試料を観察する顕微鏡である。
【０００２】
より具体的には、まず試料に蛍光色素を結合させる。その蛍光色素は、その振動モーメントと同一の方向の偏光成分を有する光によって励起され蛍光を発する。その蛍光を観察する顕微鏡が蛍光顕微鏡である。
【０００３】
そのような蛍光顕微鏡の中でも、試料面に照射した光を全反射させる蛍光顕微鏡を全反射蛍光顕微鏡という。全反射型蛍光顕微鏡は、例えば光を、水溶液とガラスとの境界の試料面に臨界角よりも大きな角度で入射させ、その入射光を全反射させ、その試料面近傍に発生するエバネッセント場により水溶液中の試料を照明する顕微鏡である。
【０００４】
従来の全反射型蛍光反射顕微鏡では、試料面に一方向からレーザー光が照射されてエバネッセント場が作られていた（例えば非特許文献１）。ここで、エバネッセント場の偏光方向はレーザー光の偏光方向と、試料面に対するレーザー光の入射方向で決定されるが、一方向から試料面にレーザー光が照射される従来の全反射型蛍光反射顕微鏡では、ある方向の振動モーメントを有する色素を励起させ蛍光を発せさせることができない。例えば、レーザー光が全反射する界面をｘｙ平面とし、全反射するレーザー光の走る光線がｘｚ平面上にあると規定すると、例えば、レーザー光の偏光の向きがｙ軸方向に偏光している場合、生成されるエバネッセント場の偏光成分はｙ軸方向のみである。また、ｘｚ平面を走るレーザー光が、その進行する方向に垂直でありかつｘｚ平面内にある軸に偏光している場合、生成されるエバネッセント場の偏光成分は主にｚ軸方向とごくわずかなｘ軸方向の偏光成分のみである。すなわち、入射するレーザー光の偏光がどのようなものであろうと、生成されるエバネッセント場に含まれるのは、ｙ軸方向とｚ軸方向の偏光成分が主であり、ｘ軸方向の偏光成分はほとんど含まれていないため、振動モーメントがｙ軸またはｚ軸を向いている蛍光色素しか十分に励起することはできない。
【０００５】
その結果、試料面に一方向からレーザー光が照射される従来の全反射型蛍光反射顕微鏡では、試料の向いている方向によってはその試料を観察することができない。
【０００６】
【非特許文献１】
Tokunaga, M., Kitamura, K., Saito, K., Iwane, A. H., and Yanagida, T. (1997). Single molecule imaging of fluorophores and enzymatic reactions achieved by objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemical and Biophysical Research Communications 235, 47-53
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以下に記載された目的の１以上を達成するものである。
【０００８】
本発明は蛍光色素と結合した試料の方向によらず、その試料が存在するかどうかを観測することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、蛍光色素と結合した試料の方向によらず、蛍光色素１分子を可視化できるので、１カ所に集まった蛍光色素の個数が数えられるようにすることを目的とする。例えば、蛍光色素でラベルされた生体分子を観察すれば、生体分子がどのようなユニットで会合しているのかという情報を定量的に決めることを目的とする。また例えば、同じ生体分子を観察しながら、水溶液の条件を変えて会合・分離のダイナミクスを定量化できる全反射型蛍光顕微鏡または照明光学系を提供すること目的とする。
【００１０】
本発明は、試料が水中にあっても観測できる全反射型蛍光顕微鏡または照明光学系を提供することを目的とする。
また、本発明は、ＮＭＲや結晶後のＸ線解析と異なり、水溶液中で活性を持ったタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子の立体構造の変化を解析できる全反射型蛍光顕微鏡または照明光学系を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エバネッセント場において蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡であって、前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、光を回折させる回折手段と、集光手段と、対物レンズとを含む全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
【００１２】
本発明は、エバネッセント場において蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡であって、前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、前記光源から射出された光を回折させる回折手段と、前記回折した光を集光する第１集光手段と、前記第１集光手段を透過した光を集光させる第２集光手段と、前記第２集光手段を透過した光を試料に照射する対物レンズとを含む全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
【００１３】
また、本発明は、エバネッセント場において蛍光色素を励起させる照明光学系であって、前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、光を回折させる回折手段と、集光手段と、対物レンズとを含む照明光学系を提供する。
【００１４】
本発明は  エバネッセント場において蛍光色素を励起させる照明光学系であって、前記エバネッセント場を作るための光を射出する光源と、前記光源から射出された光を回折させる回折手段と、前記回折した光を集光する第１集光手段と、前記第１集光手段を透過した光を集光させる第２集光手段と、前記第２集光手段を透過した光を試料に照射する対物レンズとを含む照明光学系を提供する。
【００１５】
前記光源から射出される光は、円偏光またはランダム偏光であるレーザー光であることが好ましい。
【００１６】
また、前記光源から射出された光が、前記回折手段により、光を環状に回折させることが好ましい。
【００１７】
前記試料に照射される光がもれ光の少ない環状となるように、前記透過光の一部を遮光するマスクを有することが好ましい。
【００１８】
前記マスクは、前記第１集光レンズと第２集光レンズとの間に配置させることが好ましい。
【００１９】
前記回折手段が回転することが好ましい。また、前記回転する回折手段の回転軸が光源から射出された光の軸と一致していないことがさらに好ましい。
【００２０】
前記回折手段が回折拡散板（diffractive diffuser）であって、その回折拡散板が、その面の方向を維持したまま振動することが好ましい。
【００２１】
また、前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に環状の光が入射し、その環状の光の主光線が円筒面上を進行することが好ましい。
【００２２】
前記対物レンズのバックフォーカルプレーン上に、前記第２集光レンズを透過した光の焦点が位置することが好ましい。
【００２３】
ここで、前記環状の光は環の厚みを有しながら進行するが、その環の厚みの中央を光路とする光を主光線という。また、バックフォーカルプレーンとは、平行に走る２本の光が、試料面から対物レンズに入射したとき、対物レンズによってそれらの光が集光する位置をいう。
【実施の形態】
以下、図面を参照して、本発明の一つの実施の形態について詳細に説明する。
【００２４】
図１は、本発明にかかる全反射型蛍光顕微鏡の照明光学系を示す図である。
【００２５】
この全反射型蛍光顕微鏡の照明光学系１００は、左から、レーザー光源１、回折手段としての回折拡散板（diffractive diffuser）２、第１集光手段としての第１集光レンズ３、マスク６、第２集光手段としての第２集光レンズ４、対物レンズ５を含むように構成される。また、対物レンズ５の右側に、試料面７がある。
【００２６】
図２は、マスク６の構成を示す図である。マスク６は、環状スリット部１０とアルミニウム蒸着によって遮光された遮光部１１で構成される。
【００２７】
マスク６においては、直径の異なる２つの同心円で囲まれている環状スリット部１０は光を透過させ、そのほかの部分である遮光部１１では遮光させる。
【００２８】
次に、全反射型蛍光顕微鏡における、レーザー光源１から射出され試料面７に到達するまでのレーザー光の光路を説明する。
レーザー光源１から射出される光は、円偏光またはランダム偏光であるレーザー光であることが好ましい。
【００２９】
レーザー光源１から射出されたレーザー光は回折拡散板（diffractive diffuser）２に入射する。回折拡散板２に入射したレーザー光は環状に回折され、その回折光は円錐面状に広がる。ここで、回折拡散板２として、ThorLab社のD0740A（635ナノメートル波長のレーザで開き角10.3度）を用いる。
【００３０】
回折拡散板２はレーザー光源１から射出されたレーザー光の光軸と平行な軸を回転軸として回転している。その回転速度は、蛍光信号を記録するための装置の時間分解能よりも速いことが好ましい。通常１秒間に１０回転以上であることが好ましい。また例えば、３３ミリ秒／フレームの通常のビデオ記録の場合には、回折拡散板２の回転速度は１秒間に３０回転以上であることが好ましい。回折拡散板２を回転させない場合、集光レンズの異なる部分を通過したレーザー光が再び重なるため、試料面７において干渉縞が発生し、結果として蛍光色素の励起むらが生じる場合がある。
【００３１】
そこで、回折拡散板２を回転させることによって、前記干渉縞のパターンを時間的に変化させ、試料面７における均一な光の強度を実現させることができる。その結果、前記干渉縞による蛍光色素の励起むらが生じることを防止できる。
【００３２】
また、その回転軸はレーザー光源１から射出された光の軸と一致していないようにする。１回転の間に、レーザー光が回折拡散板の異なる部分に当たるため、干渉縞のパターンを効率的に消すことができるからである。回転軸と前記光の軸は、回折拡散板２の大きさの範囲内で互いに離れていることが好ましい。一般に、２ｍｍ以上離れていることが好ましい。例えば回折拡散板２の大きさが直径約５ｍｍの円盤形状である場合、回折拡散板の回転軸と前記光の軸との距離は２〜４ｍｍ、であることが好ましい。
【００３３】
また、上述のように回折拡散板２を回転させる以外にも、回折拡散板２をその回折拡散板２の面の方向を維持したまま振動させることによって、前記励起むらを防止できる。前記振動の振幅は回折拡散板２の大きさの範囲内で大きい方が好ましい。また、前記振動の振動数は、蛍光信号を記録するための装置の時間分解能より速いことが好ましい。
【００３４】
回折拡散板２によって広がった光は、中空の円錐状、すなわち環状の光となって進行することが好ましい。この環状の光は第１集光レンズ３によって集光される。例えば、レーザー光は波長５３２ナノメートルである緑のレーザー光を、回折拡散板２はThor Lab D0740Aの回折拡散板を用いることができる。また、第１集光レンズ３として、例えば、焦点距離が１００ｍｍであるメレスグリオ社のアクロマティックレンズを用いることができる。
【００３５】
第１集光レンズ３によって集光された光はマスク６に入射する。環状スリット部１０を有するマスク６の構成により、マスク６を通過した光は、ほぼ完全に環状の光となって進行し、第２集光レンズ４に入射する。例えば、回折拡散板２を通過した光には、中央を直進するもれ光が含まれるが、そのもれ光はマスク６によって遮光されることとなる。図２に示されているように、マスク６は、例えば、内直径が１４．６ｍｍ、外直径が１４．９ｍｍである２つの同心円の円周の間を光が透過できるような環状スリット部１０と、アルミニウムが蒸着されている遮光部１１とから構成される板を用いることができる。
【００３６】
バックフォーカルプレーンで光を集光させるため、主光線に沿って進行する光はe-BFPで集光するように設計することが好ましい。さらに、マスク６は、e-BFP（バックフォーカルプレーンの共役面）の位置に置かれることが望ましい。光が集光している位置に置くと最も効率的にもれ光をカットできるからである。なお
【００３７】
前記環状の光は環の厚みを有しながら進行するが、その環の厚みの中央を光路する光を主光線２０という。第２集光レンズ４に入射する前に、前記環状の光の主光線２０は、e-SP（試料面の共役面）で焦点を結ぶ。
【００３８】
第２集光レンズ４によって、前記環状の光の主光線２０が円筒面上を進行するように、光学系を設計する。試料面７において、全方位からの入射する光が同じ領域で重なるようにするためである。また、第２集光レンズ４は、図１に示すように、対物レンズ５のバックフォーカルプレーン８上で焦点を結ぶように設計される。試料面７において、全方位から入射する光の各部分が平行光になるようにするためである。平行光でないと、照明される領域においてエバネッセント場のｘｙｚ軸方向のそれぞれの成分が均一とならないからである。
【００３９】
第２集光レンズ４は、例えば、焦点距離が２２０ｍｍであるシグマ光機社のアクロマティックレンズを用いることができる。
【００４０】
第２集光レンズ４を透過し、バックフォーカルプレーン８を通過した環状の光は対物レンズ５によって試料面７で焦点を結ぶように集光され照射される。試料面７には環状の光が照射される、すなわち様々な方向から同時に試料面７に光が照射されることになる。発生するエバネッセント場は３次元（ｘ，ｙ，ｚ）のすべての偏光成分を持つこととなる。これによって、異なる方向の振動モーメントを有するあらゆる蛍光色素を励起させ蛍光を発せさせることができ、したがって、試料がどのような方向を向いていてもその試料を観察することができる。
【００４１】
試料面７は、例えば、蛍光色素と結合したタンパク質を含む水溶液（試料）とその水溶液と接しているガラスとの境界面によって構成される。このような試料面７に、対物レンズ５から投影された光が全反射するように前記ガラス側から照射され、水溶液側の試料面７の近傍にエバネッセント場が発生する。エバネッセント場におけるエバネッセント波の浸透深さは浅いため、試料の表面に極めて近い蛍光色素のみが励起されて発光し、極薄の光学断面が創世される。他方、エバネッセント場の外側は蛍光が最小になる。その結果、観察対象について、極めて高いコントラストの像が形成される。
【００４２】
なお、蛍光色素の発光による光は、通常の蛍光顕微鏡と同様に観測される。例えば、赤色の波長の光を反射し、緑色の波長の光を透過させるダイクロイックミラー（不図示）を第２集光レンズ４および対物レンズ５との間に配置する。これによって、蛍光色素が発光して得られた赤色の光は対物レンズ５を透過してダイクロイックミラーで反射され、その光を分析することができる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の全反射型蛍光顕微鏡によって、その蛍光色素と結合した試料の方向によらず、その試料が存在するかどうかを観測することができるようになる。
【００４４】
本発明の全反射型蛍光顕微鏡によって、蛍光色素と結合した試料の方向によらず、蛍光色素１分子を可視化できるので、１カ所に集まった蛍光色素の個数が数えられる。その結果、蛍光色素でラベルされた生体分子を観察すれば、生体分子がどのようなユニットで会合しているのかという情報を定量的に決めることができる。例えば、同じ生体分子を観察しながら、水溶液の条件を変えて会合・分離のダイナミクスを定量化できるようになる。
【００４５】
また、本発明の全反射型蛍光顕微鏡では、試料が水中にあっても観測できる。したがって、活性を維持した状態のタンパク質をそのまま観測することができる。
【００４６】
本発明により、ＮＭＲや結晶後のＸ線解析と異なり、水溶液中で活性を持ったタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子の立体構造の変化を解析できるようになる。特に、本発明の顕微鏡は１分子を観測対象とすることに適している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  全反射型蛍光顕微鏡の照明光学系を示す図
【図２】  マスクの構成を示す図
【符号の説明】
１  レーザー光源
２  回折拡散板
３  第１集光レンズ
４  第２集光レンズ
５  対物レンズ
６  マスク
７  試料面
８  バックフォーカルプレーン
１０  環状スリット部
１１  遮光部
２０  主光線
１００  全反射型蛍光顕微鏡の照明光学系
【図１】
0003671227.tif 000002
【図２】
0003671227.tif 000003