(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用物質に膜認識シグナルを含むポリペプチドのＮ末端側を結合させる有用物質の送達方法において、
当該膜認識シグナルとして、当該ポリペプチドのＣ末端側に存在するものであり、且つ、Ｎ末端側から、
（１）２個から３０個までの範囲で疎水性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列と、
（２）Arg-Argというアミノ酸配列とが、
上記順序で連続したペプチドを使用することを特徴とする有用物質の送達方法。
【請求項２】
有用物質を環状化合物に包接し、当該環状化合物に膜認識シグナルを含むポリペプチドのＮ末端側を結合させる有用物質の送達方法において、
当該膜認識シグナルとして、当該ポリペプチドのＣ末端側に存在するものであり、且つ、Ｎ末端側から、
（１）２個から３０個までの範囲で疎水性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列と、
（２）Arg-Argというアミノ酸配列とが、
上記順序で連続したペプチドを使用することを特徴とする有用物質の送達方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の有用物質の送達方法において、上記膜認識シグナルとして、-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-Argという配列を有するペプチドを使用する有用物質の送達方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の有用物質の送達方法において、上記膜認識シグナルとして、-Ala-Ala-Ala-Leu-Leu-Leu-Arg-Argという配列を有するペプチドを使用する有用物質の送達方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の有用物質の送達方法において使用する膜認識シグナルであって、Ｎ末端側から、
（１）２個から３０個までの範囲で疎水性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列と、
（２）Arg-Argというアミノ酸配列とが、
上記順序で連続したペプチドであることを特徴とする膜認識シグナル。
【請求項６】
-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-Argという配列を有するペプチドである請求項５に記載の膜認識シグナル。
【請求項７】
-Ala-Ala-Ala-Leu-Leu-Leu-Arg-Argという配列を有するペプチドである請求項５に記載の膜認識シグナル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、これまで膜透過が困難で注射以外の投与方法しかなかった有用物質、例えば生理活性ポリペプチドホルモン等の経口投与化を始めとして、脳内治療剤投与の新しい方法の道を開く、即ち細胞外から細胞内へと膜透過するための膜認識シグナルに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物は、細胞膜によって細胞内の環境を外界から区別し、外界と異なる濃度のイオンや水溶性物質を細胞内に保つことができる様に構成されている。このように、細胞膜は、静的なバリアーとして働くだけでなく、細胞外から栄養物を積極的に吸収し、且つ産物の分泌や代謝、また老廃物の排泄を行なっている。しかしながら、細胞膜の持つ上記の様な選択的な機能は、レセプターを介した細胞内への取り込みの場合を除き、グルコース以上の大きさの非電解質に対してはバリアーとして働くことになる。
【０００３】
この機能は、生体防御の上からも重要であり、例えば身体のために必要な栄養素を選択的に吸収する消化管の吸収上皮細胞、あるいは身体の各組織に栄養素やＯ２  を与え老廃物や代謝物と交換する血管の内皮細胞、更には、脳における脳血漿関門を構成する脳内血管内皮細胞、免疫系における非自己認識のための抗原ペプチドの取り込み等、夫々の細胞の生体内における役割りは様々であり、その例を探すにいとまがないほどである。ところが、これらの細胞に見られる選択性機能は、却って身体に必要な薬物の吸収を妨げたりし、特に脳においては、脳血漿関門という強力なバリアーとなって、脳細胞に薬物投与をする上での大きな障害因子となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
生体膜は、リン脂質とタンパク質を主成分とし、一般的にシンガー・ニコルソン（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｎｉｃｏｌｓｏｎ  ）の流動モザイク説による構築を主として考えられており、膜透過に関するあらゆるモデルは、これを元に組み立てられている。
【０００５】
これまで膜透過に関して、非電解質でしかも大きさの上でグルコースを遥かに超える様々な物質、例えば生理活性物質の様な分子量の大きな有用物質を吸収させるためにいくつかの方法が試みられてきた。上記の様な物質の吸収を容易にするための１つの手段として、膜の透過性を高める方法がある。即ち膜透過を促進する物質を同時に添加したり、生体膜の主たる構成成分であるリン脂質を用いて作製したリポソームを使って膜融合により透過する方法が試みられている。このとき生体膜の透過性を高める物質としては、ホスホリパーゼに代表される酵素活性を持つもの、生体膜面に穴を形成するもの、或は界面活性剤に見られる様に膜に組み込まれて膜の本来の姿（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ）を非特異的に壊すものにおよそ大別される。もっとも、上記ホスホリパーゼ類は、結果として膜の本来の姿（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ）を壊す脂質を膜に蓄積し、非特異的な膜崩壊を起こすことから、これも広義の意味では、界面活性剤のカテゴリーに含まれるものである。いずれにしても、これらの物質は、膜に対して物理的な障害を与えることにより目的の有用物質を膜透過させるものである。
【０００６】
一方、生体膜の主たる構成成分であるリン脂質を用いて作製した、一種のソフトカプセルとも言うべきリポソームに、有用物質を包接させて投与する方法は、少なくとも膜に対する物理的障害を与えない点で優れたものといえる。ところがリポソームは、一般に細胞極性を持たない培養細胞や、浮遊細胞への膜融合による膜透過を可能にするが、前述したような細胞極性をもつ極めて分化能の高い細胞、即ち消化管における吸収上皮細胞に見られる様な栄養素の選択的な吸収、或は脳血漿関門を形成する血管上皮細胞などの細胞に見られる選択的な透過などにおける様な高い選択性に対しては、言い替えれば選別機能の高い細胞膜に対しては、融合すること自身はなはだ困難であるといえる。こうした点で、リポソームによる細胞への導入は、あくまで物理的であり、生理的な方法とは言えない。しかも、リポソーム自身の安定性がたいへん悪いことに加え、有用物質の包接も困難なことが、この方法の利用法を限りなく制限したものにしている。
【０００７】
本発明はこうした状況の下になされたものであって、その目的は、これまで膜透過が困難で注射以外の投与方法しかなかった有用物質、例えば生理活性ポリペプチドホルモン等の経口投与を始めとして脳内治療剤投与の新しい方法の道を開く為の膜認識シグナルを提供する点にある。但し、ここに示す膜透過のための膜認識シグナルは、飽くまで細胞外から細胞内への移行を促すものであり、これまで知られている細胞内から細胞外へ導く、即ち連続する疎水性アミノ酸からなる分泌シグナルとは異なるものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成した本発明の構成とは、ポリペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端が、１個の塩基性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で塩基性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列である点に要旨を有する膜認識シグナルである。
【０００９】
また本発明は、ポリペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端が、１個の疎水性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で疎水性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列である点にも要旨を有するものである。
【００１０】
更に、本発明は、ポリペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端のいずれか一方が、
（１）１個の塩基性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で塩基性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列であり、残る一方が
（２）１個の疎水性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で疎水性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列である
様な構成を採用しても良い。
【００１１】
また本発明の目的は、ポリペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端が、ポリペプチド化合物側から、
（１）１個の疎水性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で疎水
性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列と、
（２）１個の塩基性アミノ酸であるか、または２個から３０個までの範囲で塩基
性アミノ酸が連続して形成されるアミノ酸配列が、
上記順序で連続したアミノ酸配列である構成を採用しても達成される。
【００１２】
【作用】
本発明者らは、膜透過のための認識シグナルを確認するために、その核（コアー）部分に複式抗原タンパク質（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、「ＭＡＰ」と略記する）システムを用いた。このＭＡＰシステムは、トマリア（Ｄ．Ａ．Ｔｏｍｌｉａ）らによって開発されたスターバースト  デンドリマー型（Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  型）のペプチドであり（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２９，１３８（１９９０））  、タム（Ｊ．Ｐ．Ｔａｍ  ）らによって示された（Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９（１９８８）  ）放射状に分岐したリシン（Ｌｙｓ）  分子の核（Ｌｙｓｙｌ  ｃｏｒｅ）からなるものである。
【００１３】
その結果、ポリペプチド化合物におけるＮ末端またはＣ末端のアミノ酸やアミノ酸配列が、細胞膜へ生理的な侵入をはかる上で、極めて重要な役割を果たしていることを見出した。そしてこのアミノ酸またはアミノ酸配列が特定の構成を有するポリペプチド化合物は、有用な膜認識シグナルとなり得ることを見出し、本発明を完成した。更にこの様な膜認識シグナルにおいて、前述した様なリジン核に相当する部分を、１つにはサイクロデキストリンのような環状化合物に置き換えて薬物を包接するか、或は生理活性ポリペプチド等の有用物質に直接的に置き換えて結合させてプロドラック化する等の様々な方法を採用することによって、有用物質の膜透過が容易に達成されることになる。
【００１４】
本発明が完成された経緯を説明しつつ、本発明の作用について説明する。本発明者らは、リシン（Ｌｙｓ）  を用いたＭＡＰコアーを用いて、膜透過のための認識シグナルとして、分枝先端ペプチドにアルギニン−ロイシン−ロイシン（Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  ）を結合させたＤＢＰ−３（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ−３）を合成して、その大腸透過性を確認し、その解析を進めてきた。
【００１５】
その結果、ＤＢＰ−３の構造は、ＭＭ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ；分子力場）およびＭＤ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ；分子動力学）から、Ｌｙｓｙｌ  ｃｏｒｅを中心にして、分枝先端ペプチドで囲まれていることが分かった。従って、全てのＡｒｇ  残基は周辺に位置し、正電荷を有するグアニル基間の距離は９〜２０Åと長くなり、電気的反発を小さくしている。またＤＢＰ−３の構造安定化には、水素結合の寄与が重要である。更に、水素結合は、周辺のＡｒｇ  残基を中心に形成され、Ｌｙｓｙｌ  ｃｏｒｅ内での水素結合形成は比較的少なく、Ｌｙｓｙｌ  ｃｏｒｅの構造柔軟性を窺わせる。
【００１６】
ＤＢＰ−３のＣ末端のカルボニル基は、アルギニン残基と水素結合を形成して、分子内部に入っている傾向が見られた。一方、Ｎ末端はアルギニン残基は水素結合系から外れ、外側に向いている傾向がある。
【００１７】
本発明で用いる塩基性アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ  ），リシン（Ｌｙｓ  ）、或はヒスチジン（Ｈｉｓ  ）のいずれでもよいが、より好ましくはＡｒｇ  とＬｙｓ  である。またその配列はＡｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ａｒｇ−Ｌｙｓ，Ｌｙｓ−Ａｒｇ  を始めとして、連続するアミノ酸個数や組合せは任意であるが、そのアミノ酸数の上限は日常的手法で容易に合成し得る範囲として３０個程度が好ましい。また、膜認識する上で、Ｃ末端側アミノ酸が塩基性であることが好ましいが、下記の疎水性アミノ酸であっても良い。
【００１８】
また本発明で用いる疎水性アミノ酸として、アラニン（Ａｌａ），バリン（Ｖａｌ），ロイシン（Ｌｅｕ），イソロイシン（Ｉｌｅ），プロリン（Ｐｒｏ），フェニルアラニン（Ｐｈｅ），メチオニン（Ｍｅｔ），トリプトファン（Ｔｒｐ）  等があげられ、その個数や組み合わせは任意であるが、そのアミノ酸数の上限は３０個程度が好ましい。また立体構造の点からすれば、より好ましい疎水性アミノ酸はロイシン（Ｌｅｕ）  である。
【００１９】
Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸配列を異にする場合の組み合わせは任意であるが、例えば＋Ｈ３Ｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ，  ＋Ｈ３Ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓや、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＣＯＯ−  ，  Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＣＯＯ−  等を適当に選ぶことができる。
【００２０】
塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸からなるペプチド配列によって膜透過システムを構成する場合におけるその組み合わせは任意であるが、より好ましい組み合わせとして、ポリペプチド化合物側からＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ  があげられるが、さらに好ましくは、これらのアミノ酸配列が、Ｃ末端側にあることである。
【００２１】
尚本発明で示されるアミノ酸の光学異性体は、すべてＬ型であり、そのペプチド合成は、Ｂｏｃ  法あるいはＦｍｏｃ法など、公知の方法を用いて行なえば良い。また本発明の膜認識シグナルは、ポリペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸やアミノ酸配列が上記の様な構成であることが重要であり、前記Ｌｙｓｙｌ  ｃｏｒｅに相当する部分については、特に限定するものはなく、生活性ポリペプチド等の様な有用物質は勿論のこと、あらゆるポリペプチド化合物を含むものである。また膜透過性を考慮すると、該ポリペプチド化合物の分子量は１００万程度以下のものが好ましい。
【００２２】
【実施例】
本発明者らは、これまで水、あるいは電解質以外の物質を全く吸収しないとされている大腸をモデル器官として、膜透過のための認識シグナルペプチドとＭＡＰコアーからなる人工分子を合成し、この分子が、大腸を透過することを確かめた。人工分子として、（Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）８−Ｌｙｓ４−Ｌｙｓ２−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ  の分子構成を有する前記ＤＢＰ−３を、ポリマーサポートにｐ−Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｒｅｓｉｎ（Ｗａｎｇ  Ｒｅｓｉｎｓ）を用いて、Ｆｍｏｃ法により合成した。ここで合成した人工分子は、ＯＤＳ  系カラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより単一品に精製するとともに質量分析およびプロテイン分析装置によりこれらが分子設計（分子量：５７４５．２５）どうりであることを確認した。ＤＢＰ−３の分子モデルを、図１に示す。尚図中Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）  ，Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）  ，Ｋはリシン（Ｌｙｓ）を夫々示す。
【００２３】
大腸透過試験に用いる大腸は、雄性ＳＤ系ラット（体重：１５０ｇ）より摘出し、反転小腸法に準じて行なった。即ち、外液（クレブス・リンゲル液，ｐＨ７．４）に、ＤＢＰ−３を添加し、Ｏ２  気相化、３７℃で６０分浸漬培養後、内液と外液が混ざらないように取り出した。大腸透過の確認は、内液、外液を凍結乾燥後、ＤＢＰ−３の標品とともにグリセリンゲルを用いたＳＤＳ−ゲル電気泳動法にかけ、ＤＢＰ−３の標品を同一位置上の明瞭なバンドとして検出するとともに、ニトロセルロース膜に転写し、そのバンドをパンチングにより打ち抜き、手順に従ってプロテイン分析装置にかけてそのバンドがＤＢＰ−３であることを確認することにより、膜透過を確認した。
【００２４】
【発明の効果】
本発明は以上の様に構成されており、これまで膜透過が困難で注射以外の投与方法しかなかった有用物質、例えば生理活性ポリペプチドホルモン等の経口投与を始めとして脳内治療剤投与の新しい方法の道を開く、膜透過のための膜認識シグナルを提供し得ることとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＢＰ−３の分子モデルを示す模式図である。
【図１】
0003618111.tif 000002