(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで細胞中にポリヌクレオチドを導入する方法であって、組成物に該細胞を接触させることを包含し、該組成物が、膜透過性両親媒性ペプチドと結合した所望のポリヌクレオチドを含む、上記方法。
【請求項２】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記組成物がさらに脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記組成物がさらにポリアミンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記両親媒性ペプチドがβシート構造を取り得る両親媒性ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記βシート構造の両親媒性ペプチドは、第１面が正に帯電し第２面が実質的に中性であるように第１面および第２面を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記両親媒性ペプチドが環状ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記環状ペプチドがチロシジンおよびグラミシジンＳからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記組成物がグラミシジンＳおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記組成物が約１：１より大きいモル比でグラミシジンＳおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記組成物が約５：１より大きいモル比でグラミシジンＳおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記ペプチドがｐＨに依存してαヘリックス構造を取り得る両親媒性ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記両親媒性ペプチドのαヘリックスは、第１面が実質的に帯電し第２面が実質的に中性であるように第１軸面および第２軸面を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記第１面が負に帯電している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物に前記細胞を接触させることを包含し、ここで、前記両親媒性ペプチドがＧＡＬＡ配列（配列番号１０）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質がジオレオイルホスファチジルコリンである請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質がジパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質がモノメチルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記両親媒性ペプチドが、前記ポリヌクレオチドの電荷を中性化できるだけの量存在する請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドを真核細胞の亜細胞成分にもたらすための組成物であって、
ポリヌクレオチドと；
該ポリヌクレオチドを真核細胞の細胞質膜を通して輸送し得る、該ポリヌクレオチドに機能的に結合した膜透過化成分であって、該膜透過化成分は両親媒性ペプチドを含む膜透過化成分と；
を含む、組成物。
【請求項２０】
両親媒性ペプチドがＧＡＬＡ配列（配列番号１０）を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドが環状ペプチドを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記環状ペプチドがグラミシジンＳおよびチロシジンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記環状ペプチドがグラミシジンＳを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
さらに脂質を含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
更にポリアミンを含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記両親媒性ペプチドがβシート構造をとり得る両親媒性ペプチドを含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記両親媒性ペプチドが、第１面が正に帯電し、第２面が実質的に中性であるように第１面及び第２面を有する請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
さらにジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
グラミシジンＳとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル比が１：１以上である請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
グラミシジンＳとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル比が５：１以上である請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記両親媒性ペプチドがｐＨに依存してαヘリックス構造をとり得る両親媒性ペプチドを含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記αヘリックス構造が、第１面が実質的に帯電し、第２面が実質的に中性であるように第１軸面及び第２軸面を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１面が負に帯電している請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第１面が正に帯電している請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記脂質がジオレオイルホスファチジルコリンである請求項２４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記脂質がジパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項２４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記脂質がモノメチルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項２４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記両親媒性ペプチドが、前記ポリヌクレオチドの電荷を中性化できるだけの量存在する請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴヌクレオチド送達及び遺伝子治療の分野にある。特に、本発明は、自己構築(self-assembling) ポリヌクレオチド送達システムであって、これには、ポリヌクレオチドの所望のアドレス（所在地）への送達を補助し、該ポリヌクレオチドと非共役結合を介して結合される成分が含まれる。本システムの成分には、ＤＮＡマスキング（遮蔽）成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化(permeabilization)成分並びに、亜細胞(subcelluer)局在性成分が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、生命に危険な遺伝子疾患であり、塩素輸送における異常によって特徴付けられる（マクファーソン(McPherson) ＆ドーナー(Dorner)、1991年）。この疾患の遺伝子座は、嚢胞性繊維症膜通過コンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子における変異に対して追跡された。Ｊ．Ｒ．リオルダン(Riordan) ら、Science (1989) 245:1066-1073；Ｂ．ケレン(Kerem) ら、Science (1989) 245:1073-1080。欠陥ＣＦＴＲの相補又は置換によって基本的な遺伝子の欠陥を修正することは、ＣＦに対する究極の治療法である。遺伝子治療は、遺伝子のin vivo 送達及び発現であり、欠陥遺伝子を置換するために用いることができる、急速に発達した科学である。
【０００３】
遺伝子治療は、既に実行可能である。Ｔ．フリードマン(Friedmann) 、Science,(1989) 244:1275-1281；Ｍ．ブルーストーン(Bluestone) 、Biotechnol.,(1992) 10:132-134 。ポリヌクレオチドの送達のためのシステムとポリマーは、当該技術分野において既知である。Ｐ．Ｌ．フェルナー(Felgner) 、Adv.Drug Delivery Rev., (1990) 5:163-187。アデノウィルスベクターは、in vivo でコットンラット(cotton rat)の肺へＣＦＴＲを輸送するために用いられた。Ｍ．Ａ．ローゼンフェルド(Rosenfeld) ら、Cell,(1992) 68:143-155。in vivo での高いレベルのトランスフェクションがアデノウィルスベクターによって報告されている一方で、非ウィルス性の送達システムは多くの利点を有し、精力的に開発されるべきである。ローゼンフェルドら、前述；Ｍ．Ａ．ローゼンフェルドら、Science,(1991) 252:431-434。
【０００４】
過去１０年の間に、 in vitro における哺乳類細胞へ機能性遺伝子を導入するために、多くの方法が開発されてきた。これらの技術は、標的細胞を体内から摘出し処理して、トランスフェクトされた細胞を増幅し、その後、当該患者に戻すことができるならば、遺伝子治療に適用される。この選択は、ＣＦ患者には不可能である。現在、最高のin vivo トランスフェクション効率は、レトロウィルス（ブルーストーン、前述）及びアデノウィルス（ローゼンフェルドら、前述）によってもたらされる。しかし、この効率は変動し、ウィルスを基礎とする遺伝子送達がウィルス感染又は癌を引起し得ることが考えられる。最初のヒトに対する臨床的な試行は、レトロウィルスベクターの急性合併症を伴わなかったが、長期の合併症の可能性が、患者の十分なモニタリングを要求する。Ｋ．コルネッタ(Cornetta)ら、Human Gene Ther.,(1991) 2:3-14。
【０００５】
遺伝子治療用のプラスミドＤＮＡコンストラクトの使用におけるウィルス主体ベクターの使用の危険性及び概念的な利益（Ｐ．Ｌ．フェルナーら、Nature, (1991) 349:351-352において論じられている) は、遺伝子輸送のための多くの生理学的及び化学的な方法の開発を平行して引き起こしている。最も熱心に研究されたシステムは、細胞をリン酸カルシウム又はカチオン性促進剤で処理することに関連している（フェルナーら、前述）。他の一般的な方法は、膜の生理的な穿孔中にＤＮＡを注入すること（Ｍ．Ｒ．キャペッチ(Capecchi)、Cell, (1980) 22:479-485)又は、細胞膜の透過化若しくは剥離の間の能動的な取込み（フェルナーら、前述) に関連している。それぞれの方法は、本質的に積極的であり in vitro においてのみ適用可能である。
【０００６】
本発明は、ウィルスビヒクルを使用せずに行う直接的な遺伝子送達の分野にある。遺伝子送達のための非ウィルスキャリアは、多くの障壁を克服することができなければならない。即ち、循環系において残らなければならず、選択された細胞を標的とすることができなければならず、ＤＮＡを細胞質へ導入することができなればならず、ＤＮＡを核へ輸送できなければならない。
【０００７】
マスキング    in vivo で遺伝子を直接送達することについての懸念は、望ましい細胞の目的地に達するために十分長い、循環系におけるポリヌクレオチドの残存能である。 “マスキング”、即ち、ポリヌクレオチドの保護は、この懸念を処理するひとつのやり方である。
【０００８】
微粒子状物質（例えば赤血球ゴースト、再構築ウィルスエンベロープ及びリポソーム）は、遺伝子輸送における保護として一部用いられている。Ｃ．ニコラウ(Nicolau) ら、Crit.Rev.Ther.Drug Carr.Sys.,(1989) 6:239-271 ；Ｒ．Ｊ．マニオ(Mannio)ら、Biotechniques (1988) 6:682-690。最も成果を挙げているリポソーム系は、カチオン性脂質試薬であるジオレイルオキシトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を用いる。Ｐ．Ｌ．フェルナーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1987) 84:7413-7417 。ＤＯＴＭＡは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と混合して、試薬、リポフェクチン（商品名）を形成する。リポフェクチン（商品名、以下省略）を用いることの利点は、カチオン性リポソームが簡単にＤＮＡと混合して、細胞へ添加されることである。ＤＮＡをリポソームの内部へカチオン性試薬によって被包化する必要はない。リポフェクチンは、培養系においてリポーター遺伝子をヒト肺上皮細胞へ輸送すること（Ｌ．ルー(Lu)ら、Pfugers Arch.,(1989) 415:198-203）、気管内経路によってラットへＣＡＴ遺伝子を導入すること（Ｔ．Ａ．ハジンスキ(Hazinski)ら、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.,(1991)4:206-209)、並びに、気管内及び静脈内経路によってマウスへＣＡＴ遺伝子を導入すること（Ｋ．Ｌ．ブリガム(Brigham)ら、Am.J.Med.Sci.,(1989) 298:278-281；Ａ．ボウ(Bout)ら、“Abstracts of the 1991 Cystic Fibrosis Conference"、要約、第87、(1991)) に用いられている。約５０％の気道上皮細胞が、βガラクトシダーゼリポーター遺伝子を一時的に発現した（ハジンスキら、前述）が、発現レベルは、定量的でなかった。ステロイド感受性プロモーターに結合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）は、ラット肺へトランスフェクトされた場合、発現を、デキサメタゾンによって正方向に制御できた。ハジンスキら、前述。細胞障害性は、高濃度のリポフェクチンによって問題となる。
【０００９】
ＤＯＴＭＡのための置換体には、リポポリアミン（Ｊ．レフラー(Loeffler)ら、J.Neurochem. (1990) 54:1812-1815) 、親脂性ポリリジン（Ｘ．ゾー(Zhou)ら、Biochim.Biophys.Acta.,(1991) 1065:8-14) 及び、カチオン性コレステロール（Ｘ．ガオ(Gao) ら、Biochem.Biophs.Res.Comm.,(1991) 179:280-285)が含まれる。これらは、培養系において遺伝子輸送を仲介するために用いられている。リポフェクチンによってもたらされるトランスフェクション率に関していくつか改良された（約３倍）が、毒性が問題として残っている。カチオン性脂質を用いるトランスフェクションに寄与する機構の研究は、著しく欠落していた。過去の手段は、送達システムがＤＮＡを細胞へどのように導入するかについて組織的に研究するよりは、異なるカチオン性脂質を合成して、トランスフェクションアッセイに試すことであった。ＤＯＴＭＡ／ＰＥリポソームは、アニオン性リポンソームによる二重層の融合を実行することができ（Ｎ．ダッツガンス(Duzgunes)ら、Biochem. (1989) 28:9179-9184) 、これは、形質膜を介したＤＮＡの直接的なエントリーが、ＤＯＴＭＡの作用方式に関連していると示唆している。カチオン性脂質システムを用いる高い効率のトランスフェクションは、ＰＥの取込みを必要とし、これはおそらく、ＰＥが膜融合を促進する膜内脂質中間体を形成することができるためである。膜透過化及び膜融合におけるＰＥの役割は、広く研究されている。例えば、Ｍ．−Ｚ．ライ(Lai) ら、Biochem. (1985) 24:1646-1653；Ｈ．エレンズ(Ellens)ら、Biochem.(1986) 25:285-294 ；Ｊ．ベンツ(Bentz) ら、Biochem.(1987) 26:2105-2116)。
【００１０】
細胞のターゲティング    効率的な遺伝子輸送は、選択された細胞に対するＤＮＡのターゲティングを必要とする。近年、リセプター仲介エンドサイトシスに基づく手法が遺伝子輸送のために説明されている。Ｇ．Ｙ．ウー(Wu)ら、J.Biol.Chem. (1987) 262:4429 ；Ｇ．Ｙ．ウーら、J.Biol.Chem.(1988) 263:14621-14624。細胞特異的リガンド−ポリリジン複合体は、核酸に電荷相互作用によって結合している。得られた複合体は、標的細胞によって取り込まれる。ウーら、前述は、リガンドとしてのアシアロオロソムコイドによる当該送達システムを用いて、in vivo におけるヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びラット肝細胞の効率的なトランスフェクションを報告した。ハケット(Huckett) ら、Biochem.Pharmacol. (1990)40:253-263は、インシュリンに向けたターゲティング後のＨｅｐＧ２細胞における酵素活性の安定的な発現を報告した。結局、ワグナー(Wagner)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1990) 87:3410-3414 、及び(1991) 88:4255-4259 では、ヒト白血病細胞株Ｋ−５６２へのプラスミドのトランスフェリン−ポリカチオン仲介送達及びその後のコード化ルシフェラーゼ遺伝子の発現が観察された。しかし、記載された送達システムは、ポリリジンリンカーによってＤＮＡに連結された高分子量のターゲティング（標的に向かって行く）タンパク質に基づいている。これらの巨大リガンド−ポリカチオン結合体は、サイズ及び組成において異種起源となり、化学的に十分定義されてなく、再生様式での調製が難しい（ウーら、前述；ワグナーら、前述）。しかも、多くのリセプター仲介システムにおいて、クロロキン又は他の細胞内運搬の崩壊剤が、高いレベルのトランスフェクションのために要求される。ある研究では、アデノウィルスがリセプター仲介システムの遺伝子送達を促進するために用いられている。Ｄ．Ｔ．クリエル(Curiel)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1991) 88:8850-8854。
【００１１】
これらの研究をまとめると、遺伝子を、リセプター仲介エンドサイトシスによって哺乳類細胞の内部へ送達することができ、外因性ＤＮＡのフラクションが分解を免れて核へ入り、発現することが示される。発現レベルは低く、これは恐らく細胞質への外来ＤＮＡのエントリーが制限されるためである。
【００１２】
電荷中性化及び膜透過化    遺伝子の直接送達は、ポリヌクレオチドにおける大きな負の電荷の中性化能及び、標的細胞の膜の透過能（しばしば、付随的である）によって補助される。ポリヌクレオチド電荷を中性化して膜透過化及び輸送を補助するポリカチオンの使用は既知である。フェルナーら、前述。カチオン性脂質は、またこの目的のために用いられている。Ｐ．Ｌ．フェルナーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,(1987) 84:7413-7417；エプスタイン(Eppstein)らの米国特許第4,946,787 号。特定のカチオン性脂質は、リポポリアミン及びリポインターカラント(lipointercalants)と呼ばれ、これらも既知である。Ｊ．−Ｐ．バール(Behr)、Tet.Lett. (1986) 27:5861-5864 。
【００１３】
亜細胞局在性    ポリヌクレオチドが、標的細胞へ一旦入ると、遺伝子の直接送達は、適当な亜細胞位置への遺伝子の指向能に補助され得る。デオキシリボヌクレオチドの送達のための自明な標的の１つは核である。このプロセスに補助することが知られているリガンドは、核局在性ペプチド又はこれらの核局在性配列を含むタンパク質である。Ｃ．ディングウォール(Dingwall)ら、TIBS (1991) 16:478-481。
【００１４】
Ｙ．カネダら、Science (1989) 243:373-378は、再構築ウィルスエンベロープによってもたらされたトランスフェクション効率が、外来遺伝子が核タンパク質と共に標的細胞へ同時送達される場合に、増加することを示している。核タンパク質と混合したＤＮＡは、アルブミンと混合されたＤＮＡに関したトランスフェクションにおいて、控えめな増加を示す（カネダら）。ＤＮＡは、核局在性配列（ＮＬＳ）、ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｙｓ−ｖａｌを含むタンパク質（Ｐ．Ａ．シルバー、Cell (1991) 64:489-497) をプラスミドと結合した場合、より容易に核へ取り込まれるという仮定がある。タンパク質におけるＮＬＳは、核膜孔を通って輸送するよう指示している。１４アミノ酸の核局在性配列は、種々の巨大分子且つ更に黄金粒子（１５０Å直径）に結合しており、細胞質へ導入された際に、核へ迅速に取り込まれる（Ｄ．Ｒ．ファインドレイ(Findlay) ら、J.Cell.Sci.Supp. (1989) 11:225-242；シルバー、前述) 。核エントリーが、首尾よく安定したトランスフェクションについて、確率制限しているという考えは、細胞質へマイクロインジェクションされたプラスミドＤＮＡが、細胞のトランスフェクションをもたらすことができない（１０００以上の細胞質注入でトランスフェクションが認められない）が、核への直接的なプラスミドのマイクロインジェクションが、５０％以上のマイクロインジェクションされた細胞でトランスフェクションをもたらしたという発見にも支持されている。キャペッチら、前述。プラスミドにおける核局在性シグナルの結合が、核へプラスミドＤＮＡの輸送を誘発するならば、トランスフェクション効率は増加することができる。我々は、ＮＬＳ及び他のリガンドを所望のポリヌクレオチドへ結合する新規な方法を提案する。
【００１５】
最後に、発明者らは、トランスフェクション効率が、ＤＮＡを種々のカチオン性タンパク質を用いて凝縮した場合に増加することを証明している。Ｔ．Ｉ．チクコネンコ(Tikchonenko) ら、Gene (1988) 63:321-330；Ｍ．ボッガー(Bottger)ら、Biochim.Biophys.Acta. (1988) 950:221-228；ワグナーら、前述。ＤＮＡ凝縮がトランスフェクションを増加する理由は、すぐには明示されない。これはＤＮＡの細胞取込みを増加し得る（ワグナーら、前述）が、細胞中のより大量の無傷（インタクト）なＤＮＡをもたらし得るヌクレアーゼ活性に対するＤＮＡの感受性を減少してしまう。
【００１６】
ポリヌクレオチド結合    上述したクラスの分子の１つと結合する遺伝子の直接輸送は、これらの成分のＤＮＡの結合維持能によって更に補助される。ウーら、前述は、ポリカチオンポリリジンに対してリガンドを共有的に結合することによって、ポリヌクレオチドとそのリセプターリガンドを結合した。ワグナーら、前述は、ポリリジンに加えて、ＤＮＡインターカレーター、エチジウムホモダイマー（５，５′−ジアゾデカメチレン−ビス（３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジウム）ジクロライドハイドロクロライドに対して、該リガンドも共有的に結合した。Ｐ．Ｅ．ニールセン(Nielsen) 、Eur.J.Biochem. (1982) 122:283-289 は、９−アミノアクリジンと特定のビス−アクリジンに対する共有的な結合によって、ＤＮＡに対する光親和性を結び付けた。
【００１７】
上記文献のどこにも、標的細胞の標的亜細胞位置へ循環性ポリヌクレオチドを運ぶことに関連した問題の複合的な側面に向けたポリヌクレオチド送達のためのシステムは、記述されていない。本発明は、ポリヌクレオチドを１以上の下記機能性成分の組み合わせと結合することによって、これらの問題を処理する。即ち、これらの成分とは、ＤＮＡマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分である。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題および手段】
前述の直接遺伝子送達の問題の観点では、本発明は、１以上の、好ましくは２以上の下記機能性成分、即ち、ＤＮＡマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分の組み合わせ物を用いる自己構築ポリヌクレオチド送達システムを意図している。本システムの各成分は、その指示された機能を実行することができ、また要求されたポリヌクレオチドにより構築又は分解することもできる。例えば、特定の成分は、それのために所望された機能を実行するために、ポリヌクレオチドから分離しなければならないであろう。
【００１９】
従って、本発明の主な目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の亜細胞成分にもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞の細胞質膜を通過してポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分に結合したポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の核へもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識成分に結合したポリヌクレオチドを含む。
【００２１】
本発明の更に他の目的は、真核細胞の核へポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識成分と、真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分との両方に結合したポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
本発明の更なる目的は、真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞の細胞質から真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドを送達することができる亜細胞局在性成分を結合したポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
本発明の更に他の目的は、真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、ポリヌクレオチド、該真核細胞を認識することができる細胞認識成分、該真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分、該真核細胞の細胞質から該真核細胞の亜細胞成分へポリヌクレオチドを送達することができる亜細胞局在性成分並びに、ポリヌクレオチドの循環半減期を延ばすことができるマスキング成分を含む。
【００２４】
本発明の他の目的は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムに有用な成分を提供することであり、これは、下記式、
【００２５】
【化１１】
0003688278.tif 000002
【００２６】
を有し、ここで、ｎ及びｍは各々、独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは反応性結合基であり、Ｙは細胞表面リセプターリガンド、亜細胞局在性配列及び膜透過化成分からなる群から選択される。
【００２７】
本発明の更に他の目的は、反応性インターカレート成分を提供することであり、
これは、下記式、
【００２８】
【化１２】
0003688278.tif 000003
【００２９】
を有し、ここで、ｎ及びｍは各々、独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは反応性基である。
【００３０】
【発明の実施の形態】
定義：
“ポリヌクレオチド”という用語を本文において用いる場合、これには、１本鎖、２重又は多重鎖形態のいずれかで１以上のヌクレオチドのＲＮＡ又はＤＮＡ配列が含まれる。 “ポリヌクレオチド”は、一般的にポリデオキシリボヌクレオチド（２′−デオキシ−Ｄ−リボース又はその修飾形態を含む）即ちＤＮＡ、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース又はその修飾形態）即ちＲＮＡ、並びに、プリン若しくはピリジミン塩基のＮ−グリコシド又はＣ−グリコシド、或いは修飾プリン若しくはピリジミン塩基、又は非塩基性(abasic)ヌクレオチドである全ての他のポリヌクレオチドの型を言う。ポリヌクレオチドは、プロモーター領域、オペレーター領域、構造領域、終結領域、及びこれらの結合又は遺伝的に関連した他の全ての物質をコードし得る。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、また当該技術分野において一般に理解されるように１以上の “置換" 結合物（リンケージ) も含み得る。これらの置換結合物の幾つかは非極性であり、膜を横切るポリヌクレオチドの望ましい拡散能に寄与している。その他は、ポリヌクレオチドの生分解能の増加又は減少に寄与している。(生分解能は、例えば増加された又は減少されたヌクレアーゼ感受性に影響される。）  これらの “置換" 結合物は、慣用の他の結合物例えば、ホスホロチオエート又はホスホロアミデートが、一般的に有効な文献中で記述されたように合成されたものとして本文中で定義される。同様のポリヌクレオチドにおけるこのような全ての結合物が、同一である必要ない。
【００３２】
ポリヌクレオチドの糖部分における修飾、例えば１以上の水酸基がハロゲン、脂肪族基と置換、又はエステル、アミンとして官能化される等の場合、又は、リボース若しくはデオキシリボースが他の機能的に均等な構造物と置換する場合も含まれる。塩基部分の修飾には、アルキル化プリン若しくはピリミジン、アセチル化プリン若しくはピリミジン又は、他のヘテロ環が含まれる。このような “アナログプリン" 及び “アナログピリミジン" は、当該技術分野において一般に知られているようなものであり、これらの多くは化学療法剤として用いられている。特に、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格は、非糖質骨格例えばペプチド又はＰ．Ｅ．ニールセンら、Science (1991) 254:1497-1500に記述されているようなポリマー骨格の他の型と置換され得る。
【００３３】
用語 “機能性成分" を本文において用いる場合、これには、ＤＮＡマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分並びに、亜細胞局在性成分が含まれる。
【００３４】
“ＤＮＡマスキング成分”という用語を本文において用いる場合、これは、ポリヌクレオチドの全部又は一部をマスクして、循環系内に存在する分解薬（例えばヌクレアーゼ）による攻撃を阻止することによって、その循環性半減期を延ばすことができる分子を言う。
【００３５】
“膜透過化成分”という用語を本文において用いる場合、膜を横切るポリヌクレオチドの通過を補助する全ての成分を言う。従って、この用語は、電荷中性化成分を一部含み、これは通常、ポリカチオンであって、ポリヌクレオチドの大きな負電荷を中性化し、ポリヌクレオチドが膜の疎水性内部を横断できるようにする。多くの電荷中性化成分は、膜透過化物(permeabilizer) として作用することができる。膜透過化は、また両親媒性分子によりもたらされる。
【００３６】
膜透過化物は、普通の不透過性の分子を細胞膜を横断するように援助し、細胞の細胞質への入口をもたらすことができる分子である。膜透過化剤は、ペプチド、胆汁酸塩、糖脂質、糖質、リン脂質又は界面活性剤分子としてもよい。膜透過化剤は、しばしば、ある部分が疎水性であり他の部分が親水性であるような両親媒特性を有し、膜とこれらとの相互作用を可能にする。
【００３７】
用語 “リポソーム" を本文において用いる場合、球状の二重層に配列された両親媒性脂質から構成された小胞を言う。リポソームは、通常、小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）又は多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）に分類される。ＳＵＶ及びＬＵＶは、定義上では、１つの二重層を有し、一方、ＭＬＶは、多くの凝集された二重層を含む。リポソームは、水性の内部に又は二重膜の間に親水性分子を捕獲すること、又は二重層の内部に疎水性分子を捕獲することによって、種々の物質を被包するために用いられ得る。
【００３８】
リポソームは、その大きさ、組成及び電荷に依存して、広範な特性を示す。例えば、わずかなパーセントの不飽和脂質を有するリポソームは、極僅かに透過し易くなる傾向があるが、コレステロール又は他のステロールを取り込んだリポソームは、より堅固で透過性が劣る傾向にある。リポソームは、正、負又は中性に荷電することができ、これは親水性基に依存している。例えば、コリン主体の脂質は完全に中性の電荷を備え、リン酸塩及び硫酸塩主体脂質は負電荷を与え、グリセロール主体脂質は一般に負に帯電し、ステロールは、一般に溶液中で中性だが、帯電している基を有する。
【００３９】
“細胞認識成分”という用語を本文において用いる場合、これは、標的細胞の表面上の成分を認識することができる分子を言う。細胞認識成分には、細胞表面抗原に対する抗体、リセプター仲介エンドサイトシスに関連するようなものを含む細胞表面リセプターのためのリガンド、ペプチドホルモン等が含まれる。
【００４０】
“ＤＮＡ結合部分”は、非共有様式で核酸と相互作用する分子又はその部分を言う。ＤＮＡ結合部分には、主溝及び副溝バインダーが含まれ、これは、二重らせんＤＮＡの主溝又は副溝と結合することによってＤＮＡに相互作用すると考えられる分子である。ＤＮＡ結合部分は、またＤＮＡインターカレーターを含み、これは、ヌクレオチド塩基対の間に平行に挿入することによって、ＤＮＡへインターカレートすると思われる平面分子又は分子の平面部分である。ＤＮＡ結合部分は更にポリカチオンを含み、これは、ＤＮＡ骨格の負電荷に結合すると思われる。単一鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、治療的な鎖（ストランド）として用いられる場合、本文中で説明される相補的な “リンカー鎖”が、 “ＤＮＡ結合部分”として機能的に作用し得る。
【００４１】
ＤＮＡ結合部分は、 “反応性基”によって本発明の機能性成分に共有結合され得る。これらの反応性基は、該機能性成分上の求核基と容易に反応する。このような反応性基（それ自身の反応性求核基に相当する）には、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（アミン）、マレイミド及びマレイミドフェニル（スルフヒドリル）、ピリジルジスルフィド（スルフヒドリル）、ヒドラジン（糖質）並びにフェニルグリオキサール（アルギニン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
“亜細胞局在性成分”という用語を本文中で用いる場合、これは、標的細胞中の亜細胞成分を認識することができる分子を言う。認識される亜細胞成分には、核、リボソーム、ミトコンドリア及び葉緑体が含まれる。特別の亜細胞局在性成分には、 “核局在性成分”が含まれ、これは、分子を核へ運ぶことを補助するもので、核局在性ペプチド及びアミノ酸配列が含まれると知られている。
【００４３】
組成物：
本発明の一部である組成物は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムにあり、これは、１以上、好ましくは２以上の下記機能性成分、即ちＤＮＡマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分と組み合わせたポリヌクレオチドを用いる。このシステム中の各要素は、指示された機能を実行することができ、また所望されるポリヌクレオチドにより構築又は分解することができる。本システムの個々の要素、並びにこれらの要素を作製するための方法及び中間体も本発明の一部として意図されている。本システムの具体例を図１に示している。
【００４４】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、単一鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとし得る。治療的価値を有する三本鎖又は四本鎖ポリヌクレオチドも、本発明の範囲内にあると意図されている。二本鎖ＤＮＡの例には、構造遺伝子、オペレータ制御及び終結領域を含む遺伝子、並びに、自己複製システム例えばプラスミドＤＮＡが含まれる。
【００４５】
単一鎖ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、リボザイム並びに、三重形成オリゴヌクレオチドが含まれる。この “治療鎖”は、延長された活性を有するために、これは好ましくは、ヌクレオチド結合物の幾つか又は全部として、安定な、非ホスホジエステル結合物を有する。このような結合物には、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート又は、アルキル基がメチル又はエチルであるＯ−アルキルホスホトリエステル結合物が含まれる。
【００４６】
これらの単一鎖ポリヌクレオチドにとって、投与される組成物の一部として治療鎖に対して相補的な鎖を調製することが好ましい。この相補鎖は、 “リンカー鎖”と呼ばれ、細胞に入った後に分解されるように、通常、ホスホジエステル結合を用いて合成される。この “リンカー鎖”は、独立した鎖とすることもでき、又は、治療鎖が本質的に折り畳まれて、それ自身にハイブリダイズするように、治療鎖に共有的に結合若しくはこれの単なる延長とすることもできる。
【００４７】
リンカー鎖は、またその３′若しくは５′末端上に、又はリンカーの糖若しくは骨格上で、機能性成分として作用し、治療鎖の活性を促進する官能性を有することもできる。例えば、ホスホジエステルリンカー鎖は、ターゲティングリガンド例えば葉酸誘導体を含むことができ、これは標的細胞を認識して内在化を可能にする。このリンカーが分解耐性結合物から構成される相補的治療鎖に結合している場合、この二重鎖は内在化され得る。一旦、細胞内部に入ると、リンカーは分解して治療鎖を放出することができる。このやり方では、治療鎖は、結合された更なる官能性を有することはなく、また、その機能は非必須部分によって妨害されない。この戦略を、全てのアンチセンス、リボザイム又は三重鎖形成ポリヌクレオチドに適用することができる。これは、抗ウィルス性、抗細菌性、抗新生物性、抗炎症性、抗増殖性、抗リセプター遮断性又は抗輸送性のポリヌクレオチド等を送達するために用いられる。
【００４８】
独立した “リンカー鎖”は、治療鎖に対して直接相補的な配列を有し、１対１の様式でハイブリダイズするように合成され得る。或いは、リンカー鎖は、該リンカー鎖の５′領域が治療鎖の５′領域とハイブリダイズし、リンカー鎖の３′領域が治療鎖の３′領域にハイブリダイズして、下記の連鎖状の構造を形成するように構築され得る。
【００４９】
【化１３】
0003688278.tif 000004
【００５０】
この連鎖は、治療性核酸の見かけの分子量が増加し、その薬物動態特性及びターゲティングリガンド：治療リガンド比を最適な治療効果を達成するように調整することができるという利点を有する。
【００５１】
機能性成分
ＤＮＡマスキング成分    本システムのＤＮＡマスキング要素は、ポリヌクレオチドの全部又は一部をマスキングすることができる分子であり、それゆえ、循環系において存在する分解剤による攻撃を阻止することによって循環性半減期を延ばす。
【００５２】
本発明では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、後述するように慣用の方法によってＤＮＡ結合部分と共有結合的に結合することができ、ＤＮＡマスキング成分として用いることができる。ＰＥＧは、約７００〜約２００００ダルトン、好ましくは約１８００〜６０００ダルトンの分子量を有し、好ましくは、約１：４〜１：１００、より好ましくは約１：２０の割合（ＰＥＧ分子：ＤＮＡ塩基対）で存在する。
【００５３】
或いは、ＤＮＡは脂質との結合によってマスクされ得る。ある具体例では、ＤＮＡは、例えば、スゾッカ(Szoka) らの米国特許第4,394,448 号に記述されるような標準的なリポソーム中に包まれる。この特許の明細書を援用して本文の一部とする。他の具体例では、ＤＮＡを、エプスタインらの米国特許第4,897,355 号に記述されるようなものに類似する合成カチオン性脂質と反応させる。これらのカチオン性脂質は、下記の一般式を有し、
【００５４】
【化１４】
0003688278.tif 000005
【００５５】
式中、ｎは、１〜８の整数であり、Ｒ1 及びＲ2 は、同一又は異なる６〜２４の炭素原子を有するアルキル若しくはアルケニルであり、Ｒ3 は、水素原子、１〜１０の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ4 は、正に帯電した１〜３０の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで、炭素原子の少なくとも１つはＮＲ′で置換されてもよく、Ｒ′は、水素、１〜１０炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−Ｎ−Ｒ′部分として機能することができる好ましい基は、トリス（アミノエチル）アミン（ＮＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2)3 Ｎ、アグマチン（デカルボキシアルギニン）Ｈ2 Ｎ（ＣＨ2)4(＝ＮＨ）ＮＨ2 、３−アミノエチル−１，３−プロパンジアミンＨ2 Ｎ（ＣＨ2)3 ＮＨ（ＣＨ2)2 ＮＨ2 、３−ジメチルアミノプロピルアミン（ＣＨ3)2 ＮＨ（ＣＨ2)3 ＮＨ2 、イミノビス（Ｎ，Ｎ′）ジメチルプロピルアミンＮＨ((ＣＨ2)3 Ｎ( ＣＨ3)2)2 、イミノビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、ビス（プロピルアミン）（ＮＨ2(ＣＨ2)3)2 ＮＨ、スペルミジン及びスペルミンであり、ここで、これらの基は、その１つの窒素原子によって脂質分子に結合している。
【００５６】
特に好ましい具体例では、合成カチオン脂質は、合成カチオン尾部脂質であり、これは、下記式、
【００５７】
【化１５】
0003688278.tif 000006
【００５８】
を有し、式中、ｎは６〜２４の整数であり、Ｙは水素、エタノールアミン、コリン、グリセロール、セリン及びイノシトールから成る群より選択され、Ｒ1 は、６〜２４炭素原子を有するアルキル又はアルケニルであり、Ｒ3 は水素、１〜１０炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ4 は、正に帯電した１〜３０の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで炭素原子の少なくとも１つは、ＮＲ′と置換してもよく、ここでＲ′は、水素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−Ｎ−Ｒ′部分として機能することができる好ましい基は、トリス（アミノエチル）アミン（ＮＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2)3 Ｎ、アグマチン（デカルボキシアルギニン）Ｈ2 Ｎ（ＣＨ2)4(＝ＮＨ）ＮＨ2 、３−アミノエチル−１，３−プロパンジアミンＨ2 Ｎ（ＣＨ2)3 ＮＨ（ＣＨ2)2 ＮＨ2 、３−ジメチルアミノプロピルアミン（ＣＨ3)2 ＮＨ（ＣＨ2)3 ＮＨ2 、イミノビス（Ｎ，Ｎ′）ジメチルプロピルアミンＮＨ((ＣＨ2)3 Ｎ( ＣＨ3)2)2 、イミノビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、ビス（プロピルアミン）（ＮＨ2(ＣＨ2)3)2 ＮＨ、スペルミジン及びスペルミンであり、ここで、これらの基は、その１つの窒素原子によって脂質分子に結合されている。
【００５９】
上述の合成カチオン性脂質が、ＤＮＡに結合している場合に、該ＤＮＡを効率よくマスクすることがわかっている。どの方法にも本発明を限定することなく、脂質は、ある様式でＤＮＡを被包化する単層構造を形成すると考えられる。
【００６０】
細胞認識成分    本システムの細胞認識要素は、標的細胞の表面上の成分を認識することができる分子であり、後述するように慣用の方法によってＤＮＡ結合部分と共有結合的に結合する。細胞認識成分には、細胞表面抗原に対する抗体、リセプター仲介エンドサイトシスに関連するものを含む細胞表面リセプターのリガンド、ペプチドホルモン等が含まれる。本発明によって意図される特定リガンドには、糖質リガンド例えばガラクトース、マンノース、マンノシル−５−ホスフェート、フコース、シアル基、Ｎ−アセチルグルコサミン又はこれらの基の組み合わせが、例えば血液群の糖脂質若しくは種々の分泌性タンパク質に見出されるもののような複合糖質として含まれる。他のリガンドには、葉酸塩、ビオチン、細胞表面若しくは細胞内リセプターと相互作用することができる種々のペプチド、例えば、化学誘因性(chemoattractant) ペプチド、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ａｒｇ−ａｓｐ−グリシン配列を含むペプチド若しくは、ｃｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｖａｌ−ｔｒｐペプチド、シスチン残基を含むペプチド又は、ヒト免疫不全ウィルスのＧＰ−１２０のような細胞表面タンパク質と相互作用するペプチド、並びに、ＣＤ４と相互作用するペプチドが含まれる。他のリガンドには、Ａ．ハートラー(Hertler) とＡ．フランケル(Frankel) 、J.Clin.Oncol. 7:1932-1942 によって記述されるような抗体若しくは抗体フラグメントが含まれる。該抗体の特異性は、細胞表面上に発現され得る多種のエピトープに向けることができ、これには組織適合性巨大分子、自己免疫抗原、ウィルス性、寄生虫性若しくは細菌性タンパク質が含まれる。他のタンパク質リガンドには、ホルモン例えば成長ホルモン及びインシュリン、又はタンパク質成長因子例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、上皮増殖因子、塩基性及び酸性繊維芽細胞成長因子等が含まれる。他のタンパク質リガンドに、細胞表面リセプターを通して働く種々のサイトカインを含むことができ、これには、インターロイキン２、インターロイキン１、腫瘍壊死因子及び、このような巨大分子からの適当なペプチドフラグメントが含まれる。
【００６１】
膜透過化成分    本システムの膜透過化要素は、膜を横切ってポリヌクレオチドの通過を補助する分子である。ＤＮＡマスキング成分として上述したリポソーム及び合成カチオン性脂質が、また膜透過化成分として機能し得る。
本発明の膜透過化成分には、また、ポリヌクレオチド上の大きな負電荷を中性化するポリカチオンが含まれる。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ（リジン−アルギニン）及び同様のポリペプチド並びにポリアミンが含まれる。ポリカチオンの他のクラスは、下記式、
【００６２】
【化１６】
0003688278.tif 000007
【００６３】
を有するカチオン性胆汁酸塩であり、式中、Ｘ及びＹは、独立して、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ3 は、水素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ4 は、正に帯電した１〜３０の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで炭素原子の少なくとも１つは、ＮＲ′と置換してもよく、ここでＲ′は、水素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−Ｎ−Ｒ′部分として機能することができる好ましい基は、トリス（アミノエチル）アミン（ＮＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2)3 Ｎ、アグマチン（デカルボキシアルギニン）Ｈ2 Ｎ（ＣＨ2)4Ｃ(＝ＮＨ）ＮＨ2、３−アミノエチル−１，３−プロパンジアミンＨ2 Ｎ（ＣＨ2)3 ＮＨ（ＣＨ2)2 ＮＨ2 、３−ジメチルアミノプロピルアミン（ＣＨ3)2 ＮＨ（ＣＨ2)3 ＮＨ2 、イミノビス（Ｎ,Ｎ′) ジメチルプロピルアミンＮＨ((ＣＨ2)3 Ｎ( ＣＨ3)2)2 、イミノビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、ビス（プロピルアミン）（ＮＨ2(ＣＨ2)3)2Ｈ、スペルミジン及びスペルミンであり、ここでこれらの基は、その１つの窒素原子によって胆汁酸塩に結合している。
【００６４】
他の具体例では、本発明の膜透過化成分は、両親媒性カチオン性ペプチドである。両親媒性カチオン性ペプチドは、ペプチドがカチオン性の面と中性、疎水性の面とを有すると思われるような天然の立体配位を有するペプチドである。好適具体例では、該ペプチドは環状ペプチドである。本発明の両親媒性カチオン性環状ペプチドの例は、グラミシジンＳ（この構造は図２に示されている）及びチロシジンである。該ペプチドは、また、幾つか又は全て、天然に生成するＬ立体配位に対して逆の、Ｄ立体配位にあるアミノ酸を含むことができる。
【００６５】
特に好ましい具体例では、膜透過化要素は、両親媒性カチオン性環状ペプチドに加えて、（１）脂質、又は（２）単純ポリアミンのいずれか、又はこの両方を含む。
本発明の脂質は、リポソームを形成することができる両親媒性分子であり、天然形態で又はリポソームとして、いずれも必要濃度で投与したときに、実質的に非毒性である。好適な脂質は、一般に、極性即ち、親水性末端と、非極性即ち疎水性末端を有する。好適な脂質には、タマゴのホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステリルホスホリルコリン、３，６，９−トリオキサオクタン−１−オル−コレステリル−３−オル、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、並びに他のヒドロキシコレステロール若しくはアミノコレステロール誘導体（例えば、Ｋ．Ｒ．パテル(Patel) ら、Biochim.Biophys.Acta.(1985) 814:256-64を参照のこと) が含まれるが、これに限定されない。脂質は、好ましくはリポソームの形態で添加される。
【００６６】
添加ポリアミンは、好ましくは、スペルミン又はスペルミジンである。
膜透過化要素は、環状ペプチド並びに任意的なリン脂質及びポリアミンであり、同時に又は逐次的に、該組成物へ添加され得る。好ましくは、環状ペプチドが最初に添加され、リン脂質又はポリアミンが、その後に添加される。添加環状ペプチド対添加ポリアミンのモル比は、好ましくは、約１：１〜約１：３である。添加環状ペプチド対添加リン脂質のモル比は、好ましくは、約１：１〜約１：２０である。
【００６７】
亜細胞局在性成分    本システムの亜細胞局在性要素は、標的細胞中の亜細胞成分を認識することができる分子であり、これは後述するように慣用の方法によってＤＮＡ結合部分に共有結合される。特定の亜細胞成分には、核、リボソーム、ミトコンドリア及び葉緑体が含まれる。
本発明の好適具体例では、亜細胞局在性成分は、核局在性成分である。核局在性成分には、定義されたアミノ酸配列の既知のペプチド、及びこれらのペプチドを含む一層長い配列が含まれる。既知のペプチド配列の１つは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の７ペプチド、ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｙｓ−ｖａｌである。他のペプチドには、インフルエンザウィルス核タンパク質の１０ペプチド、ａｌａ−ａｌａ−ｐｈｅ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｌｅｕ−ａｒｇ−ｖａｌ−ｌｅｕ−ｓｅｒ、及びアデノウィルスＥ１ａタンパク質の配列、ｌｙｓ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏが含まれる。他の配列は、Ｃ．ディングウォールら、TIBS (1991) 16: 478-481 に認めることができる。
【００６８】
他の具体例では、亜細胞局在性成分は、リソソーム局在性成分である。リソソームを標的とする既知の成分は、配列ｌｙｓ−ｐｈｅ−ｇｌｕ−ａｒｇ−ｇｌｎを含むペプチドである。更に他の具体例では、亜細胞局在性成分は、ミトコンドリア局在性成分である。ミトコンドリアを標的とする既知の成分は、配列ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｓｅｒ−ｌｅｕ−ａｒｇ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｉｌｅ−ａｒｇ−ｐｈｅ−ｐｈｅ−ｌｙｓ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｔｈｒ−ａｒｇを含むペプチドである。
【００６９】
ＤＮＡ結合部分
本システムのＤＮＡ結合部分とは、非共有様式で核酸と相互作用する機能性成分の部位を言う。この部分は、慣用手法によって又は後述するようにして機能性成分の残りと共有結合する。ＤＮＡ結合部分は、好ましくは、主溝及び副溝バインダー、ＤＮＡインターカレーター又は一般的なＤＮＡバインダーである。単一鎖ポリヌクレオチドの場合では、ＤＮＡ結合部分は、前述したようにリンカー鎖とすることもできる。このような場合に、機能性部分例えば細胞認識又は亜細胞局在性成分は、リンカー鎖に共有結合する。
【００７０】
好適な具体例の１つでは、ＤＮＡ結合部分は、主(major-)又は副溝(mainor-groove) バインダーである。主又は副溝バインダーは、ＤＮＡの該主又は副溝バインダーに結合する又は “入っている”と知られている部分である。これらのバインダーには、ジスタマイシンＡ及びヘキスト染料３３２５８が含まれる。
【００７１】
他の具体例では、ＤＮＡ結合部分は、非特異的ＤＮＡバインダー例えばポリカチオンである。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ（リジン−アルギニン）並びに同様のポリペプチド及びポリアミンが含まれる。
【００７２】
他の好ましい具体例では、ＤＮＡ結合部分は、ＤＮＡインターカレーターである。ＤＮＡインターカレーターは、平坦な多環式分子例えば、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体である。
特定の好適な具体例では、このインターカレーターは、２つの共有結合した平坦な多環式分子からなるダイマーである。本発明の平坦な多環式ダイマー部分は、下記の構造、
【００７３】
【化１７】
0003688278.tif 000008
【００７４】
を有し、式中、
Ｚは結合であり、各ｎ及びｍは、独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり；
Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択される。
ｎ及びｍの値は、ＤＮＡ中のインターカレート化されたアクリジンモノマーの間隔を決定するので重要である。ｎ及びｍのより好ましい値は、各々３及び４である。ビス−アクリジンダイマーでは、Ａｒ1 及びＡｒ2 は共にアクリジンであり、これが好ましい。
【００７５】
この好ましいＤＮＡ結合部分は、機能性部分に共有結合的に結合され得、この部分は、前述したような細胞認識部分、亜細胞局在性部分又は膜透過化部分である。ｐの値は、機能性部分からのインターカレーターの分離を決定する。ｐの好ましい値は、０〜８である。
【００７６】
ＤＮＡ結合部分は、多重コピーの、又は１以上の機能性部分に共有結合されることができる。例えば、ビス−アクリジンダイマーは、図１３に示されるように肝細胞のアシアロオロソムコイドリセプターに結合する３つのガラクトース残基と結合し得る（図１３中の化合物２６を参照のこと）。
【００７７】
ＤＮＡ結合ダイマーを機能性部分へ結合する好適な方法は、下記式、を有する前駆体に関連している。
【００７８】
【化１８】
0003688278.tif 000009
【００７９】
式中、ｎ及びｍは各々独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサルファイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される反応性基である。
【００８０】
好ましい具体例では、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、アクリジンであり、ｐは４であり、Ｘはｐ−マレイミドフェニルである。その後、このインターカレート部分は、機能性部分のスルフヒドリル基によって機能性部分に結合（カップリング）し、例えば下記式を有する二価機能性成分が得られる。
【００８１】
【化１９】
0003688278.tif 000010
【００８２】
式中、Ｙは機能性成分であり、ｎ及びｍは各々独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり、
Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサルファイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される反応性基である。
【００８３】
生分解性リンカー例えば、配列−ｌｙｓ−ｌｙｓ−を有するペプチドは、インターカレーターに機能性成分を結合することに、また用いられ得る。
本発明の更に他の具体例では、平坦な多環式ダイマーは、下記の式、
【００８４】
【化２０】
0003688278.tif 000011
【００８５】
を有し、式中、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、
各ａａは独立してアミノ酸であり、
ｘ及びｚは、１〜１００から独立して選択された整数であり、
ｙは０〜５の整数であり、
ａａ1 及びａａ2 はリジン残基であり、
Ｎ1 及びＮ2 は、ａａ1 及びａａ2 のリジンのε−アミノ基からの窒素である。
【００８６】
ポリヌクレオチド送達システムの有用性
本発明のポリヌクレオチド送達システムは、治療状況に有用である。治療用途では、本発明のシステムは、種々の様式の投与に配合されることができ、これには、全身性及び局所若しくは局在的な投与が含まれる。技術及び配合は、一般にRemington's Pharmaceutical Sciences 、マック出版社(Mack Publishing Co.)、イーストン、ペンシルバニア州、最新版に見出すことができる。
【００８７】
全身性投与では、非経口投与例えば注射が好ましく、これには、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下が含まれる。肺の疾患の処理には、該ポリヌクレオチド送達システムの実施は、吸入によって又は、肺へ直接的に本システムを取り付けることによって行われる。
【００８８】
注射では、本発明のシステムは、液体溶液中、好ましくは、生理学的に適合した緩衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液中に配合される。更に、本システムを、固体形態で配合し、使用の直前に再溶解又は懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。
【００８９】
全身性投与は、また経粘膜又は経皮的なやり方によってもでき、また本システムを、経口又は鼻腔内若しくは吸入エアロゾルで投与することができる。経粘膜的又は経皮的投与では、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤が配合に用いられる。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与には胆汁酸塩及びフコジン酸誘導体が含まれる。更に、界面活性剤も透過を促進するために用いられ得る。経粘膜投与は、例えば、鼻の噴霧によって、又は座薬を用いて行われ得る。経口投与には、本システムは、慣用の経口投与形態例えばカプセル、錠剤、強壮剤に配合される。
【００９０】
局所投与には、本発明のシステムは、軟膏(ointments,salves)、ゲル又はクリームに、当該技術分野では一般に知られているようにして配合される。
【００９１】
下記の実施例は、説明のみを意図するもので、本発明を限定するためのものではない。
【００９２】
【実施例】
実施例１
グラミシジンＳのトランスフェクション
リポフェクチンは、合成カチオン性脂質であり、ジオレイロキシトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を、ホスファチジルエタノールアミンと組み合わせて、負に帯電したＤＮＡと電荷複合体を形成している。この複合体は、細胞膜と融合して、ＤＮＡを細胞質へ送達すると考えられている。他の手段は、負帯電脂質及びホスファチジルエタノールアミンから構成されるｐＨ感受性リポソームを用いる。Ｃ．Ｙ．ワン(Wang)ら、Biochem.(1989) 28:9508-9514 。送達機構は、エンドソーム内のｐＨが酸性となる場合に、リポソームの二重層が不安定になり、エンドソームの膜と融合する、リポソームのエンドサイトシスに関連している。リポソームの内容物は、その後、細胞の細胞質へ導入される。Ｃ．−Ｊ．チュウ(Chu)ら、Pharmaceut.Res.(1990) 7:824-834 。
【００９３】
我々は、哺乳類細胞でのＤＮＡの送達及び発現について、ｐＨ感受性コレステリルヘミサクシネート（Ｃｈｅｍｓ）／ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）リポソーム組成物と、グラミシジンＳ／ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／ＤＮＡ複合体とに対してリポフェクチンを比較した。強いプロモーターとホタルのルシフェラーゼ又はβガラクトシダーゼとを含むプラスミドを、遺伝子輸送に指標として用いた。
【００９４】
細胞トランスフェクションプロトコール
ＣＶ−１、ｐ３８８Ｄ１、ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞を、ＵＣＳＦ細胞培養施設から得た。リポフェクチン試薬を、製造物説明書に記述されているように用いた（ギブコ−ＢＲＬ、ガイザースブルグ、メリーランド州）。ＫＤ８３細胞をＤＮＡＸ（パロアルト、カリフォルニア州）から入手した。細胞を６０ｍｍディッシュ当たり０．５〜１×１０6 細胞の密度で植付け、３７℃５％ＣＯ2 下で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する適当な培地中で成育させた。リポソーム、リポフェクチン又はグラミシジンＳ／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ複合体のいずれかと共にインキュベーションする前に、細胞を、２ｍｌのＦＣＳ非含有ＤＭＥ  Ｈ−２１培地で１度洗浄した。その後、トランスフェクションシステムを、２ｍｌの同一培地中へ添加した。ある実験では、トランスフェクションは、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥ  Ｈ−２１中で行われた。５時間後に培地を取り除き、１０％ＦＣＳを含む３ｍｌの適当な培地に移した。ルシフェラーゼ活性を、記述されているように（Ａ．Ｒ．ブラジール(Brasier) ら、Biotechniques (1989) 7:1116-1122)４８時間後に測定した。簡単に言えば、細胞を、Ｃａ2+及びＭｇ2+非含有氷冷リン酸緩衝液で２回洗浄し、溶解緩衝液（１％トライトン含有）中２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７．８）４００μｌで処理して、剥がした。遠心後、１００μｌの上清を最適量の５０ｍＭ  ＡＴＰと混合した。その後、Ｄ−ルシフェリン（シグマ、１００μｌの１ｍＭ溶液）を注入し、生物発光測定器（バイオルミネセンス・アナリティカル・ラボラトリーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、最初の１０秒間、放射光を集中した。上清中のタンパク質を、ブラッドフォルド(Bradford)の技術（バイオラドキット）を用いてアッセイした。結果は、細胞タンパク質のｍｇ当たりの光単位量で表した。
【００９５】
ルシフェラーゼアッセイ
３つの異なるウィルスルシフェラーゼ遺伝子プロモーター、ＲＳＶ、ＳＶ４０及びＣＭＶの効力を比較するために、我々は、幾つかの哺乳類細胞株を対応するリポフェクチン複合プラスミドによりトランスフェクトした。各々のディッシュの細胞は、上述のような１０μｌのリポフェクチンと組み合わされた２μｌのプラスミドを受け取った。プロモーターの強度は、対応するプラスミドによって４８時間でのルシフェラーゼ発現によって概算された。ＣＭＶプロモーター（ｐＣｌｕｃ４プラスミド）は、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びｐ３８８Ｄ１細胞において最も高いルシフェラーゼ発現を引起し、一方ＳＶ４０プロモーター（ｐＳＶ２プラスミド）は、ＣＶ−１細胞において、より効力があった。それゆえ追加実験には、ｐＳＶ２プラスミドをＣＶ−１細胞に、及びｐＣｌｕｃ４を他の細胞株に用いた。
【００９６】
リポソーム特徴付け
プラスミド被包化効率は、ファイコール密度勾配において被包化プラスミドと、非被包化のプラスミドとを分離した後に、測定された。添加された総ＤＮＡ量の約２２±３％が、被包化された。リポソームの直径は、動的光散乱によって測定し、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、ＤＯＰＣ／ＣＨＥＭＳ及びＰＳ／Ｃｈｏｌリポソームに対して、各々、３７２±３８ｎｍ、２９５±６５ｎｍ及び４６４±２０ｎｍであった（結果は、３つの独立した光散乱測定の平均±ＳＤである）。
【００９７】
Ａ．グラミシジンＳ及びホスファチジルエタノールアミン
典型的な複合体調製物を、２０μｇのプラスミドＤＮＡを、ポリスチレン管において３００μｌの３０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ９中に希釈することによって作製した。グラミシジンＳを、ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から、２ｍｇ／ｍｌの濃度まで、３０ｍＭ、ｐＨ９のトリスＣｌ緩衝液に希釈した。２０μｌの希釈グラミシジンＳ（即ち、４０μｇ）溶液を、ＤＮＡに添加して、素早く混合した。その後、１７０nmolのリポソームを、ＤＮＡ／グラミシジンＳ混合物へ、１滴ずつゆっくりと添加した。リポソームを、４μmol の脂質をロータベーパーを用いて窒素下で乾燥し、４ｍｌの３０ｍＭ  ｐＨ９のトリスＣｌ緩衝液で、この薄膜を再水和して調製した。次いで、リポソームを浴音波処理器を用いてアルゴン下で３０分間音波処理した。この複合体の直径を、動的光散乱によって測定した。他のペプチドには、チロシジン（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルス）、ポリミキシンＢ（シグマ）及びポリリジン１００（シグマ）が含まれ、これらもＤＮＡと脂質を有する複合体を形成するために用いた。
【００９８】
トランスフェクション効率を、上述のようにＣＶ−１細胞におけるルシフェラーゼの発現を測定することによってモニターした。これらの３つのトランスフェクションシステムにおいて添加されたＤＮＡの量を比較する用量反応性を、図３に示す。細胞タンパク質ｍｇ当たりの光単位量を対数スケールでＹ軸にプロットし、添加されたＤＮＡの量をＸ軸にプロットした。白い四角はグラミシジンＳ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−ＤＮＡ複合体を用いた結果である。この複合体は、リポフェクチンを用いて得られたものよりも１０倍大きいレベルの発現を誘導し、ｐＨ感受性リポソームを用いたものよりも１０００〜１００００倍大きいレベルの発現を誘導した。
【００９９】
Ｂ．グラミシジンＳ−ＤＮＡ比の効果
グラミシジンＳ−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるグラミシジンＳの量を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びＤＯＰＥ（１７０nmol）で変化させた以外は、実施例１Ａで記述したように調製した。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例１で記述したように測定した。結果は図４に示され、これは、ＤＮＡの電荷がグラミシジンにおける電荷によって中性化する場合に、グラミシジンＳ−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を用いた最大発現が起こることを説明している。
【０１００】
Ｃ．脂質濃度の効果
グラミシジンＳ−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるＤＯＰＥの量を、一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びグラミシジンＳ（４０μｇ）で変化させた以外は、実施例１で記述したように調製した。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例１で記述したように測定した。結果は図５に示され、これは、ＤＯＰＥが無い場合では、発現が低いことを示している。グラミシジンＳ−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を用いた最大発現は、ＤＯＰＥ対グラミシジンＳの比が５／１：モル／モルを越える場合に起こる。
【０１０１】
Ｄ．脂質型の効果
グラミシジンＳ−脂質−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるリン脂質の型を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びグラミシジンＳ（４０μｇ）で変化させた以外は、実施例１で記述したように調製した。用いられた脂質組成は、ＤＯＰＥ；ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）：２／１、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、モノメチルＤＯＰＥ（ｍｍＤＯＰＥ）；ジメチルＤＯＰＥ（ｄｍＤＯＰＥ）；ＤＯＰＣ及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）であった。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例１で記述したように測定した。結果は図６に示され、これは、ルシフェラーゼ活性の発現が、ＤＯＰＥ又は複合体中ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ：２／１の混合物を用いて最大となることを示している。ルシフェラーゼ活性は、ＤＯＰＥのアミノ基が２（ｄｍＤＯＰＥ）又は３メチル基（ＤＯＰＣ）で置換される場合に、かなり減少する。コード化遺伝子の発現も、ＤＰＰＥを用いた場合にかなり減少する。この後者の脂質は、飽和アシル鎖及び高い転移温度を有し、これは、ＤＰＰＥのアシル鎖が一連の試験された他の脂質よりも一層流動性が低いことを意味する。
【０１０２】
Ｅ．添加された非両親媒性の正帯電スペルミジンの効果
実施例２で示されるデータは、グラミシジンＳ−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体による遺伝子発現が、ＤＮＡにおける負帯電がグラミシジンにおける正帯電によって中性化される場合に、最大になることを示す。電荷中性化又は膜透過化が、本システムを用いた遺伝子輸送において、より重要であるかを決定するために、グラミシジンＳによって付与される正電荷が、正に帯電したポリアミド、スペルミジンによって、どんどん置換させた。グラミシジンＳ−脂質−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるグラミシジンＳの量を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）で変化させた以外は、実施例１で記述したように調製した。ＤＮＡを中性化するために要求される必要な正電荷は、スペルミジンによって供給された。該複合体を、１７０nmolのＤＯＰＥによって、又は用いずに調製した。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例１で記述したように測定した。結果は、細胞タンパク質ｍｇ当たりの光単位量で示されるルシフェラーゼ活性によって、下記表１に挙げられている。最初の活性は、常に、複合体中にＤＯＰＥが存在する場合に一層大きくなった。ＤＯＰＥが存在しない場合では、スペルミジンによってグラミシジンＳによる正電荷を連続的に置換することは、二相応答を引き起こす。ルシフェラーゼの発現は、ＤＯＰＥの存在下で得られる最大応答よりも約１００倍小さい値まで、最初に増加する。グラミシジンＳによる電荷中性化のパーセントが２５％より低い場合には、トランスフェクション活性は全くなくなった。
従って、グラミシジンＳの膜透過化機能は、電荷中性化機能よりも一層重要である。
【０１０３】
【表１】
0003688278.tif 000012
【０１０４】
Ｆ．他の正帯電ペプチドの使用
ペプチド−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるペプチドの型を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びＤＯＰＥ（１７０nmol）で変化させた以外は、実施例１で記述したように調製した。用いられたペプチドは、ポリミキシンＢ、環状カチオン性ペプチド即ちポリリジン、直鎖カチオン性ペプチド即ちチロシジン、グラミシジンＳに類似した構造を有するが１つの正電荷のみを含む環状カチオン性ペプチド並びにグラミシジンＳであった。ルシフェラーゼプラスミドも、リポフェクチンを用いて細胞へトランスフェクトされた。複合体をＣＶ−１細胞へ添加し、実施例１で説明したようにルシフェラーゼ活性を測定した。図７は、グラミシジンＳが最も大きい発現レベルであり、関連した環状ペプチド、チロシジンがそのすぐ後に続いていることを示している。両方の環状ペプチドは、細胞へのＤＮＡの輸送の際にリポフェクチンよりも優れていた。活性は、他の２つのペプチド、ポリミキシンＢ及びポリリジンによっても認められたが、これら２つのカチオン性ペプチドにより仲介されるルシフェラーゼ発現のレベルは、グラミシジンＳ又はチロシジンにより誘導される場合よりも劣っていた。
【０１０５】
Ｇ．ＤＮＡデンドリマー複合体及びＤＮＡ−ポリリジン複合体仲介トランスフェクションの比較
ポリリジンのようなポリアミンポリマーに対するより良い化学的に定義された交換物を見出すために、我々は、スターバースト(Starburst)(商品名) デンドリマー（樹状体）微粒子、トマリア(Tomalia) ら、前述、としても知られている親水性分岐ポリカチオン高分子体を用いて、ＤＮＡによって、又はＤＮＡ及び透過化両親媒性ペプチド、ＧＡＬＡによって、複合体を形成した。Ｒ．パレンテ(Parente) ら、Biochemistry (1990) 29:8720-8728。複合体を、ポリスチレン管において、１２μｇのｐＣｌｕｃ４プラスミドを６６０μｌのＨＢＳ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に希釈することによって調製した。ポリリジン（シグマ・ケミカル社）又は５世代スタートバースト（商品名、以下、省略）デンドリマー微粒子（１nmol）（ポリサイエンス社）を、３４０μｌのＨＢＳに溶解し、ＤＮＡ溶液へゆっくりと（１滴ずつ）添加した。これらの条件下では、ポリリジンのエプシロン位アミノ基からの、又は該デンドリマーの末梢アミンからの正電荷は、プラスミドの負電荷よりも１．３倍過剰である。ペプチドＧＡＬＡを添加する場合、ＧＡＬＡにおける負電荷が該デンドリマーにおける過剰な電荷を中性化するように添加した。この混合物を、室温での最終添加後に３０分間静置して、その後、５００μｌの該混合物をＣＶ−１細胞へ添加した。トランスフェクションプロトコールを、上述のように実施した。この実験では、最もよいトランスフェクションプロトコールは、ＧＡＬＡ−デンドリマー−ＤＮＡ複合体で達せられ、次いで、デンドリマー−ＤＮＡそれから、ポリリジン−ＤＮＡで達せられた。結果は、下記表２に示してある。
【０１０６】
【表２】
0003688278.tif 000013
【０１０７】
実施例２
反応性及び機能性化スペルミジンビス−アクリジンの合成
スペルミジンビス−アクリジン誘導体（図８に合成が示されている）を、１×１０4 （ｐＨ７．４；０．２Ｍ  ＮａＣｌ）より大きい親和定数を有する二重鎖核酸へインターカレートさせ、ＤＮＡに対する種々のターゲティング分子を結合するように用いることができる。糖質、ペプチド、ホルモン、ビタミン、補因子、タンパク質又は抗体を、ターゲティングリガンドとして全て用いることができる。
【０１０８】
Ａ．スペルミジンビス−アクリジン
体の所定の部位に核酸を向けるためのスキームは、二重鎖ＤＮＡへの細胞表面成分と相互作用するリガンドのインターカレーションに基づいている。スペルミジンの選択的Ｎ4 −アシル化の手順は、Ｎ1 ，Ｎ8 −ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スペルミジンを出発物質として用いて、報告されている。Ｒ．Ｊ．バーゲロン(Bergeron)ら、Synthesis (1982) 689-692。我々は、この方法を用いて（図８）酸機能性化ガラクトシル誘導体９(n=1)及び９′(n=4)をＮ1 ，Ｎ8 −ｔＢｏｃ保護スペルミジン（１５）の二級アミノ基に連結して、得られたガラクトシル化スペルミジン１７及び１７′を、脱保護の後に、標準的な化学手順により９−フェノキシアクリジンを用いて更にアルキル化し、ビスインターカレーター化合物２１及び２１′へそれを変換した。カルボン酸機能性化ガラクトシル誘導体の合成は、詳細に記述され（Ｊ．ヘスラー(Haensler)ら、Biochim.Biophys.Acta. (1988) 946:95-105)、これらは広い範囲の糖質リガンドに簡単に適用可能である（Ｍ．Ｍ．ポンピポン(Ponpipom)ら、J.Med.Chem. (1981) 24:1388-1395 。表題の化合物を総収率３０％で得て、ＮＭＲ及び質量分析計のデータは、この提案された構造と矛盾しない。
【０１０９】
Ｂ．活性化スペルミジンビス−アクリジン
上記スキームに基づいて、ペプチドをスペルミジンビス−アクリジン誘導体に結合するための色々な方法が開発されている。Ｎ1 ，Ｎ8 −ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スペルミジン(15)は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）（４）によりＮ4 −アシル化され、脱保護され、アクリジン環とカップリングして、マレイミド基を有するビスインターカレーター（２０）を作製した。単一化合物を、ケイ酸におけるクロマトグラフィー精製後に、２５％総収率で得た。ＮＭＲ及び質量分析計の結果は、定められた構造と矛盾しない。
【０１１０】
Ｃ．ＮＬＳに連結したスペルミジンビス−アクリジン
ＮＬＳペプチド、ＰＫＫＫＲＫＶ（カネダら、前述）及び同一組成であるが異なる配列の対照ペプチドを、ＡＢＩ自動ペプチド合成機において、Ｎ末端システイン残基を用いて合成した。その後、システインペプチドを、マレイミド基含有インターカレーター（図９）に結合して、二重鎖核酸へ固定（アンカー）することができる。
【０１１１】
Ｄ．生分解性リンカー
ｌｙｓ−ｌｙｓペプチド結合から成る生分解性リンカーを、図１０に示されるようにして合成する。図では、ガラクトース残基を、未保護アミンに配置する。或いは、２つの隣接したリジン残基を含む保護ペプチドを、固相合成によって合成する。ペプチドは、膜透過化機能又はターゲティング機能をもたらし、アクリジン残基を、リジン上の２つのε−アミノ基に添加する。
【０１１２】
実施例３
ガラクトシル化インターカレーター及びアグルチニンによるｐＣｌｕｃ４プラスミドのゲル遅延アッセイ
実施例２のガラクトシル化ビス−アクリジン２１及び２１′（２１′は、ガラクトースが３つの余分の炭素によってスペルミジンビス−アクリジンと区別されている２１のホモログ（同属体））が、ＤＮＡに結合している間に可溶性リセプターと相互作用できるかを決定するために、我々は、ゲルシフトアッセイを用いた。このアッセイでは、ガラクトース結合タンパク質、リシナス・コミュニス（Ricinus Communis）レクチンＲＣＡ120 を、ガラクトシル−ビス−アクリジン−ＤＮＡ複合体と共にインキュベートした。このタンパク質が該複合体と相互作用して、該複合体がＤＮＡと結合したままの場合に、ＤＮＡは、電気泳動ゲルへ移動しない。プラスミドｐＣｌｕｃ４の各試料（２μｌ；１４０ｎｇ）を、１３．５ｐｍｏｌの２１又は２１′と混合して、表示の際に、１μｌ（３３．３ｐｍｏｌ）のＲＣＡ120 を、過剰のフリーなガラクトース（１．３５nmol）と添加した。室温での３０分のインキュベーションの後に、試料を０．０４Ｍ  トリスアセテート緩衝液システム（ｐＨ７．６）を用いて０．８％アガロースゲルに電気泳動させ、エジチウムブロマイドで染色してＤＮＡを可視化した（図１１）。
【０１１３】
ガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンのｐＣｌｕｃ４プラスミドへのインターカレーションは、化合物２１′（レーンＢ）又は２１（レーンＥ）と複合化した場合にプラスミドに認められる遅延によって示される。ビス−アクリジンのＤＮＡへのインターカレーションは、超らせん形態から弛緩環状形態への変化をもたらし、これはゆっくりと移動する。
【０１１４】
プラスミド−ガラクトース複合体のガタクトースに対する可溶性リセプターへの結合可能性は、リシナス・コミュニスのレクチンＲＣＡ120 の存在下で、複合体の殆ど完全な遅延によって示される（レーンＣ及びＦ）。ＲＣＡ120 はダイマーであり、末端のβ−Ｄ−ガラクトース残基に選択される２つの結合部位を有し、従って、プラスミド−ガラクトース複合体に架橋することもできる。化合物２１又は２１′と複合化した場合のプラスミドｐＣｌｕｃ４とのＲＣＡ120 の相互作用は、ゲルへ浸透しない巨大な凝集体の形成をもたらす。この相互作用は、プラスミドが２１とよりも２１′と複合化する場合に、より一層効果的であるようだ。プラスミドに架橋するために、ＲＣＡ120 は、隣接するプラスミド間に存在する静電反発を打開しなければならない。従って、化合物２１′によってもたらされる複合体の場合のように、スペーサーアームによってガラクトースをプラスミドの表面から離すことは、レクチンの結合をより容易にする。多価の相互作用の結果として、ＲＣＡ120 により形成されるプラスミド凝集体は、かなり安定であり、１００倍過剰な競合する１価のリガンド例えばガラクトースによって分解されない（レーンＤ及びＧ）。
【０１１５】
実施例４
エチジウムブロマイド置換アッセイを用いたビス−アクリジンの二重鎖ＤＮＡへの結合
ウシ胸腺ＤＮＡに対するビス−アクリジンの親和性は、二重鎖核酸からのエチジウムブロマイドの置換によって概算された（ニールセン、前述）。エチジウム置換を、ＤＮＡから放出される際に起こるエチジウムブロマイド蛍光（ｅｘ．＝５４０ｎｍ、ｅｍ．＝６１０ｎｍ）の減少によってモニターした。エチジウムブロマイドに相関するビス−アクリジンの結合定数は、ＩＣ50によって概算される。この研究では、記述されたように（ニールセン、前述）合成されたスペルミジンビス−アクリジントリヒドロクロライド（ＳＢＡ・３ＨＣｌ）を、参照化合物として用いた。３つの正電荷の１つを失った結果、スペルミジンビス−アクリジンのＮ4 アミノ基が、化合物２１（Ｇａｌ−ｂＡ・２ＨＣｌ）のターゲティング糖質によってアミド結合に引き込まれる際に、親和性における僅かだが顕著な減少が認められる。しかし、我々は、スペルミジンビス−アクリジンが高く正に帯電したＮＬＳペプチドＰＫＫＫＲＫＶに連結される際に、親和性における増加を推測した。Ｇ．カラップ(Karup) ら、Int.J.Peptide Protein Res. (1988) 32:331-343。種々の実施例でＤＮＡに対するターゲティングリガンドを攻撃するように合成された種々のビスアクリジン結合体の結合定数が、表３に示されている。
【０１１６】
【表３】
0003688278.tif 000014
【０１１７】
種々のビス−アクリジンにおける結合定数は、２−Ｍｅｒによる非共同競合結合を介した直線格子についての４−Ｍｅｒの結合親和性を測定する方法（Ａ．ウォルフェ(Wolfe) 及びＴ．メエハン(Meehan)、J.Mol.Biol.,223:1063-1087, 1992)及びエチジウムブロマイドに対する５．３×１０-6Ｍの内因性解離定数を用いることによって、エチジウムブロマイド置換アッセイから算出された。
【０１１８】
実施例５
ビス−アクリジンガラクトシルリガンドの細胞表面リセプターへのＤＮＡターゲット能
ガラクトシルターゲティングリガンドを含有するビス−アクリジンインターカテーターのターゲティング能を制御する因子を証明するために、ラット肝細胞を、ラット肝臓から単離し、５％ウシ胎仔血清及び抗生物質を含有するＭＥＭ培地３ｍｌに、６０ｍｍペトリ皿中で１０6 肝細胞の密度で培養した。肝細胞が、アシアロオロソムコイドを結合することによってガラクトースリセプターを有することが示されることによって、肝細胞は、ガラクトースリセプターを有することが示される。３７℃で１８時間後に培地を取り除き、１ｍｌのＭＥＭで置換した。その後、１００μｌの水中、ＳＢＡ・３ＨＣｌ、Ｇａｌ−３−ｂＡ、Ｇａｌ−６−ｂＡ又はＧａｌ3 −Ｌｙｓ2 −ｂＡと複合化された１μｇの 125Ｉ標識化プラスミドＤＮＡを、培養皿に添加した。インターカレーター対プラスミド比は、５００：１又は１０００：１であった。細胞を、更に１時間３７℃で培養し、その後にゆすぎ、タンパク質を１ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）中で消化した。細胞溶解物を、放射能活性についてカウントし、タンパク質を測定した。細胞結合プラスミドの量をｎｇのプラスミド／ｍｇの細胞タンパク質で表示し、複合化剤の機能としてグラフ化した（図１２）。３つ全てのガラクトシルビス−アクリジン化合物が、ＤＮＡと結合し（表２）、可溶性ガラクトース結合タンパク質と相互作用することができる（実施例３）が、Ｇａｌ3 −Ｌｙｓ2 −ｂＡのみは、細胞表面リセプターと相互作用することができた。従って、細胞表面リセプターへの効果的なターゲティングは、細胞表面リセプターと相互作用することができるＧａｌ3 −Ｌｙｓ2 −ｂＡ（合成は、図１３及び実施例６に示されている）によってもたらされる一層長いスペーサーアームを必要とする。
【０１１９】
実施例６
３つのターゲティングリガンドを含む生分解性ビス−アクリジン：
トリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンの合成
この分子の完全な合成は、図１３に示されている。
Ｌ−リジル−Ｌ−リジンビス−トリフルオロアセテート（２２）の合成：  Ｎ−ε−ＢＯＣ−Ｌ−リジン（６０３ｍｇ、２．４５mmol）及びＮ−Ｎ−ε−ビス−ＢＯＣ−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロフェニルエステル（２．２８ｇ；４．９mmol）を、６４０μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．７mmol）を含有する４０ｍｌのＮ−メチルモルホリン中で混合した。該混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌し、ろ過して不溶性の微量な未反応Ｎ−ε−ＢＯＣ−Ｌ−リジンを取り除いて、高減圧下で乾燥状態まで蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ3 ／ＣＨ3 ＯＨ／Ｈ2 Ｏ  ９：１：０．１系で溶出されるシリカゲルカラム中で精製して、１．２２ｇの精製ＢＯＣ−保護化リジンダイマーを得た；収率は８７％であった。
脱保護：  ７００ｍｇ（１．２mmol）のＢＯＣ−保護化リジンダイマーを含有する冷フラスコ（ドライアイス）に、５ｍｌのＴＦＡを添加した。この混合物を室温まで温めて、アルゴン下で攪拌した。３０分間の攪拌後、トリフルオロ酢酸を減圧下で蒸発させた。残渣をアセトン中に取り出し、蒸発させた（５回）。最終的に、該残渣を、１４ｍｌの水に再溶解し、８ｍｌのクロロホルムで３回抽出して、凍結乾燥して、４８０ｍｇの表題の化合物を得た；収率は８０％であった。
【０１２０】
保護化トリガラクトシルリジンダイマー：  Ｎα−〔Ｎα−Ｎε−ビス（６−（１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル−Ｎε−（６−１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジン（２３）の合成：
５０５μｌのトリエチルアミン（３．６mmol）を含有する８ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｌ−リジル−Ｌ−リジンビス−トリフルオロアセテート（４００ｍｇ；０．８mmol）の溶液に、ｐ−ニトロフェニル−６−（１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノエート（１．４４ｇ；２．４mmol）を添加した。この混合物を、アルゴン下で一晩攪拌して、乾燥状態まで蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム上のクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨＣｌ3 ／ＣＨ3 ＯＨ／Ｈ2 Ｏ  ９０：１０：０．５で溶出して、４６３ｍｇの表題の化合物を得た；収率は３５％であった。
ＭＳ：  計算値：Ｃ73Ｈ112 Ｎ4 Ｏ32Ｓ3   ｍ／ｚ＝１６５２、実測値：ｍ／ｚ＝１６５３．６（Ｍ＋Ｈ）＋、ｍ／ｚ＝１６７７．６（Ｍ＋Ｎａ）＋、ｍ／ｚ＝１６９３．６（Ｍ＋Ｋ）＋．
【０１２１】
選択的にブロックされたスペルミジンとの反応：
Ｎ４−〔Ｎα−〔Ｎα，Ｎε−ビス（６−（１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル−Ｎε−（６−１−チオ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル〕−Ｎ１，Ｎ８−ビスＢＯＣ−スペルミジン（２４）の合成：
化合物２３（１３２ｍｇ；８０μmol ）を、５ｍｌの無水塩化メチレン中、ＤＣＣ（２０ｍｇ；９７μmol ）の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（１１ｍｇ、９６μmol ）によるエステル化によって活性化した。アルゴン下、室温での４時間の攪拌後、ウレア沈殿物をろ過によって取り除き、ろ過物を減圧下で蒸発させた。乾燥残渣を、３ｍｌのアセトニトリルに再溶解し、１４μｌのトリエチルアミン（１００μｌ）を含有する３ｍｌのアセトニトリル中のＮ１，Ｎ８−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルスペルミジン）塩酸（３０ｍｇ；８０μmol ）の溶液へ、１滴ずつ添加した。該混合物をアルゴン下、室温で４８時間更に攪拌し、減圧下で蒸発させて、残渣をシリカゲルカラム中で精製して、ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2 Ｏ  ９０：１０：１で溶出して、７１ｍｇの表題の化合物を得た；収率は４５％であった。
【０１２２】
脱保護：  Ｎ４−〔Ｎα−〔Ｎα，Ｎε−ビス（６−（１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル−Ｎε−（６−（１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル〕スペルミジン（２５）の合成：化合物２４（７１ｍｇ；３６μmol ）を、化合物１７（実施例２Ａを参照のこと）について前述されたように脱保護した。ｔＢＯＣ保護基を、５ｍｌのＴＦＡで３０分間処理してスペルミジンリンカーから取り除き、アセチル保護基をＣＨ3 ＯＨ／ＮＥｔ3 ／Ｈ2 Ｏ  ５：４：１の混合物で一晩処理してガラクトシル頭部基から取り除いた。スペルミジン誘導体のビストリフルオロアセテート塩を、小型バイオラド  ＡＧ  １Ｘ２（ＯＨ- ）カラムに該塩の水溶液を通すことによって、フリーのアミンに変換した。糖質及びアミンについて陽性の分画を、一緒に集めて凍結乾燥して、３６ｍｇの化合物２５を得た；収率は７９％であった。
【０１２３】
アクリジン結合：  Ｎ４−〔Ｎα−〔Ｎα，Ｎε−ビス（６−（１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル−Ｎε−（６−（１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル〕−Ｌ−リジル〕−Ｎ１，Ｎ８−ビス−アクリジンスペルミジン（２６）（ “Ｇａｌ3 −Ｌｙｓ2 −ｂＡ”）の合成：化合物２５（３６ｍｇ；２８．５μmol ）及び１８ｍｇの９−フェノキシアクリジンを、３ｇのフェノールに８０℃で溶解し、該溶液を、アルゴン下８０℃で更に２時間攪拌した。その後、該混合物を約４０℃まで冷やし、１５ｍｌのエーテルに注いで、アミノアクリジンを沈殿させた。黄色の沈殿物を、濾紙上にろ過によって回収し、４ｍｌのブタノール／エタノール混合物３：１中に再溶解した。その後、この溶液を約１ｍｌまでの蒸発により濃縮し、ビス−アクリジン誘導体をシリカゲルにおけるクロマトグラフィーによって単離して、ｎ−ブタノール／ピリジン／酢酸／水６：２：１：２で抽出して、３４ｍｇの表題の化合物を得た；収率２１％であった。
ＭＳ：  計算値：Ｃ81Ｈ117 Ｎ9 Ｏ20Ｓ3   ｍ／ｚ＝１６３１、実測値：ｍ／ｚ＝１６３２．８（Ｍ＋Ｈ）＋、ｍ／ｚ＝１６５４．８（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【０１２４】
実施例７
核局在性配列を用いたトランスフェクションアッセイ
微量の５ｋｂの放射性ヨウ素化プラスミド（ＣＭＶ−βＧａｌ）を含む５μｌのトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）と、実施例２−Ｃの核局在性ペプチド−ビス−アクリジン結合物８nmolを含む５０μｌの水とを、４５μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８）中で、溶液中８０μｇのｐＣｌｕｃ４（１２３ｎｅｑ．ｂｐ）に添加した。プラスミド対ペプチド結合物の比は、１：３００であった。室温での１時間の静置後に、１００μｌのトリス−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ９）を該複合体へ添加して、得られた溶液を、ｐＨ感受性リポソームの調製のために、６００μｌのエーテル中に溶解した１２μmol の脂質（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ  ２：１、モル比）と混合した。
ＤＮＡ−ペプチド複合体を含有する小胞を、ファイコール密度勾配にリポソームを浮かせることによって、未被包化物質から分離した。被包化効率（２０％±４％）を、動的光散乱（コルターＮ４、コルトロニクス）によって測定した。
【０１２５】
細胞を４μｌのリポソーム−被包化プラスミド（１００μｌのリポソーム溶液）を用いて、３７℃５時間でトランスフェクトして、リシフェラーゼ活性を生物発光計において４８時間後にカウントした。表４は、測定された光単位量／ｍｇ細胞タンパク質を、リポソーム内容物の機能として示している。値は、３回の測定の平均である。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
ｐＨ感受性リポソームが、宿主細胞の細胞質へその内容物を送達するならば、裸のプラスミドは、核を透過することができなければならない。
ペプチド−ビス−アクリジン結合物が分解からＤＮＡを保護しないならば、観察されたトランスフェクション促進は、増加された核エントリーの結果でなければならない。４〜５倍増加したトランスフェクションは、公開された結果と一致しており（カネダら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：３７５−３７８）、これは、ＤＮＡに結合して、核へのＤＮＡエントリーを促進するタンパク質を用いている。ＳＮＬペプチドとＷＴｃｙｓペプチドの両方が発現を増加し、核へＤＮＡを向ける便利な技術である。
【０１２８】
実施例８
カチオン性胆汁酸塩の合成
Ａ．α−ベニズルエステルの−コール酸アミド、Ｎε−ｔＢＯＣ−アミノリジンの調製
合成は、Ｓ．ベルグストロン(Bergstrom) ら、Acta.Chem.Scand.,(1953) 7:1126に基づいている。２０４ｍｇ（０．５００ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計り、２．５ｍｌのジオキサン及び７０μｌ（０．５００ミリモル）のトリエチルアミンを、このチューブへ添加した。この混合物を、氷浴中で、溶液が固体化するまで（約１２℃）冷やした。６５μｌ（０．５００ミリモル）のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チューブを振り、氷浴へ戻した。或いは、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時点の温度に３０分間、維持した。
【０１２９】
Ｎα−ベニズルエステル  Ｎε−ＴＢＯＣリジン（０．５００ミリモル）及び７０μｌ（０．５００ミリモル）のトリエチルアミンを０．６ｍｌの水に懸濁した。該混合物を氷浴中で冷し、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を他の０．５ｍｌの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、氷浴中に１／２時間置き、その後、室温まで温めた。
【０１３０】
有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させ、残渣を３ｍｌまでの水に解かした。５％水性炭酸ナトリウムを、ｐＨが９になるまで１滴ずつ添加した。該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。
水相残渣に、０．５Ｎの塩酸をｐＨが４になるまで添加した。該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。
水相残渣のｐＨを、０．５Ｎの塩酸で４までに調整し、３ｍｌのエチルアセテートへ５回抽出した。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で乾燥状態になるまで蒸発させ、２８４ｍｇの無色の粉末溶融物を得た。ε−アミンのためのｔＢｏｃ保護基を、標準方法で取り除き、コール酸の正に帯電したリジン誘導体を得た。同様の方法で、コール酸の他の正に帯電した誘導体を調製することができる。
【０１３１】
Ｂ．トリス（２−アミノエチル）アミンのコール酸アミドの調製
多重アミン基が、活性化コール酸へカップリングすることに有効である場合、該アミノ酸を、実施例８Ａで記述したように調製された６倍量の活性化胆汁酸塩に添加する。合成は、バルグストンら、前述、の方法に基づいている。２０４ｍｇ（０．５００ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計る。２．５ｍｌのジオキサン及び７０μｌ（０．５００ミリモル）のトリエチルアミンを添加する。氷浴中で、溶液が固体化するまで（約１２℃）冷やす。６５μｌ（０．５００ミリモル）のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チューブを振った後に、氷浴へ戻した。或いは、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時点の温度に３０分間、維持した。
【０１３２】
（３００ミリモル）のトリス（２−アミノエチル）アミン及び０．６ｍｌの水中、７０μｌ（０．５００ミリモル）のトリエチルアミンを添加する。氷浴中で冷やし、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を他の０．５ｍｌの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、氷浴中に１／２時間置き、その後、室温まで温めさせた。
有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させる。残渣を３ｍｌまでの水に解かす。５％水性炭酸ナトリウムを、ｐＨが７になるまで１滴ずつ添加する。該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持する。
水相残渣に、０．５Ｎの塩酸をｐＨが４になるまで添加する。３ｍｌのエチルエーテルで３回抽出して、水相を保持する。
水相残渣のｐＨを、０．５Ｎの塩酸で４までに再調整し、３ｍｌのエチルアセテートへ５回抽出する。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で乾燥状態になるまで蒸発させて、トリス（アミノエチル）アミンのコール酸アミドを得る。
【０１３３】
実施例９
ポリエチレングリコール−ビス−アクリジンの合成
ＰＥＧ結合ビス−アクリジンスペルミジンを下記の標準化学的に合成し、それは、下記の工程に関連する。
【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
活性化モノメトキシＰＥＧ分子又は活性化ＰＥＧ分子を調製する方法は、沢山ある。好ましい方法は、Ｄ．ラーウッド(Larwood) とＦ．スゾッカ、J.LabelledComp.& Radiopharm. (1984) 21:603-614 に記述されている。ポリエチレングリコール  １９００  カルボニルイミダゾールメチルエーテルを、２ｍｌの乾燥塩化メチレン中、５３０ｍｇ（０．２８mmol）の乾燥ＰＥＧ  １９００  モノエチルエステルを取り、７８ｍｇ（０．４６mmol）のカルボニルジイミダゾール及び１０ｍｇ（０．１１mmol）のイミダゾール（ナトリウム塩）に添加して調製した。一晩攪拌した後、６ｍｌの乾燥塩化メチレンを添加し、該混合物を３．７５ｍｌの水で抽出し、それから無水ナトリウムサルフェートで乾燥した。ろ過後、溶媒と取り除き、定量的に得た。或いは、該溶媒を取り除いて、得られた油分を、−２０℃でクロロホルム／ジエチルエーテルにより再結晶した。得られたイミダゾールカルバメート白色結晶を、よく冷やした漏斗を通してろ過し、少量のジエチルエーテルでゆすいで、すぐに使用した。
【０１３６】
イミダゾールカルバメート（０．１ｍＭ）を、０．１２５ｍＭのＮ，Ｎ′−ビス−（９−アクリジニル）−４−アザ−１，８−ジアミノオクタン（ “ビス−アクリジン−スペルミジン”、これは、Ｐ．ニールセン、Eur.J.Biochem. 122:283-289,1992 に記述されているように調製した）に添加し、フェノールに溶解して、アルゴン下で２時間反応を進ませる。該混合物を乾燥状態にして、黄色の生産物を、まず冷エタノールで、次いでジエチルエーテルで洗浄する。ＰＥＧをカルバメート結合を介して、ビス−アクリジンスペルミジンの二級アミンに結合し、モノメトキシＰＥＧ−ビス−アクリジンスペルミオジンを形成する。これは水に可溶性である。
【０１３７】
同様の方法で、非ブロック化ＰＧＥ（分子量６０００）を、上述のように活性化してビスイミダゾールカルバメートＰＥＧを形成する。このビスイミダゾールカルバメートＰＥＧは、２．５倍量のビス−アクリジンスペルミジンと反応させて、ビス（ビス−アクリジンスペルミジン）−ＰＥＧ  ６０００を形成する。
ＰＥＧ及びモノメトキシＰＥＧのための種々の型の活性化剤が、ウッドル(Woodle)らの米国特許第5,013,556 号に記載されている。これらの方法を、種々の化学を介してビス−アクリジン分子に結合することができる反応性ＰＥＧを生成するために、用いることができる。例えば、モノメトキシ−ＰＥＧを含むスルフヒドリルは、実施例２Ｂのマレイミド含有ビス−アクリジンに結合することができる。
【０１３８】
実施例１０
ＰＥＧ−ビス−アクリジンによるＤＮＡマスキング
ＰＥＧ分子を用いてＤＮＡの表面をマスクすることができ、ＤＮＡを、長期間にわたって循環させることができる。放射性ヨウ素化プラスミドＤＮＡを、実施例９で合成されたようなモノメトキシ−ＰＥＧ  １９００−ビス−アクリジンスペルミジンと、２０ｂｐ−ＤＮＡ対１ＰＥＧ分子の比で、３０分間室温で混合する。少量の複合体、ＰＢＳ０．２ｍｌ中の５μｇのＤＮＡを、１２匹のマウス群の各々へ、尾静脈を介して注入する。マウスを、注入後の種々の期間で犠牲死させる。血液及び他の器官を取り出して、各器官に結合した放射能活性を測定する。モノメトキシＰＥＧ−ビス−アクリジンスペルミジンに複合化してないＤＮＡを、マウスの第２群へ注射する（対照マウス）。１０分後に、１５％の放射能活性プラスミドＤＮＡが、対照マウスの血液中に残存するが、モノメトキシＰＥＧ−ビス−アクリジンスペルミジンＤＮＡ群では、顕著に大きいレベルの放射能標識化プラスミド−ＰＥＧ複合体が循環系に残存することは、ＰＥＧ−ビス−アクリジンスペルミジンによるＤＮＡ分子の明確なマスキング効果を示している。
【０１３９】
実施例１１
レシチンアシルアミンマスキング剤の合成
ポリヌクレオチドマスキング脂質の合成は、標準的な化学によって達成され、例えばＣ．ピジョン(Pidgeon) ら、Anal.Biochem.(1989) 176:36-47 に記載されている。
【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
レシチンイミダゾリドとアミン反応剤との最終反応は、レシチンイミダゾリドの形成後すぐに行われる。レシチンイミダゾリド（０．１ｍＭ）を、クロロホルム中のアミン（０．７ｍＭ）の溶液へ添加する。このカップリングに好適なアミンは、明細書中に挙げられている。
室温での２時間後に、反応混合物を、２倍量の水／メタノールに添加し、そしてｐＨを１０に調整する。レシチン結合アミンを、有機相へ抽出する。その後、有機相を０．１Ｍの塩化ナトリウムで洗浄し、有機相を乾燥状態にする。得られたアシルアミンレシチンを、ポリヌクレオチドの表面をマスクするために用いる。
種々のリゾレシチン分子を、レシチン−ＣＯＯＨを調製するために用いることができ、これには、ドデシル、ミリストイル、パルミトイル、オレイル若しくはフィタニル又はステアリルが含まれる。他の頭部基例えばエタノールアミン又はホスファチジン酸を、活性化工程で好適に保護され、反応の最後に脱保護されるならば、レシチンに換えることができる。
【０１４２】
実施例１２
レシチンアシルアミンによるＤＮＡマスキング
実施例１１のレシチンアシルアミンを、エタノール溶液からのＤＮＡへ、ＤＮＡ上の各リン酸基に対して１の正電荷の割合で、添加することができる。該分子を、ＤＮＡの表面をマスクするために用いて、ＤＮＡを長期にわたって循環可能にすることができる。少量の複合体、ＰＢＳ０．２ｍｌ中、５μｇのＤＮＡを、１２匹のマウス群の各々へ尾静脈を介して注入する。マウスを、注射後の種々の時期で犠牲死させる。血液及び他の器官を取り出し、各器官に結合した放射能活性を測定する。レシチンアシルアミンに複合化していないＤＮＡを、第２の群のマウスへ注射する（対照マウス）。１０分後に、１５％の放射活性プラスミドＤＮＡが対照群のマウスにおける血液中に残存しているが、モノメトキシＰＥＧ−ビス−アクリジンスペルミジンＤＮＡ群において顕著に大きいレベルの放射標識化プラスミドＰＥＧ複合体が循環系に残存することは、レシチンアシルアミンによるＤＮＡ分子の明確なマスキング効果を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリヌクレオチド送達システムの具体例を示したものであり、ここで、ＮＬＳは核局在性配列であり、ＭＤは膜透過化成分であり、リガンドは細胞認識成分である。
【図２】グラミシジンＳの構造を示している。
【図３】リポフェクチンと、ｐＨ感受性リポソームと、グラミシジンＳ／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ複合体とを用いたルシフェラーゼトランスフェクション効率を比較している。
【図４】トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ対ＤＮＡ比の影響を示している。
【図５】トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ対ＤＯＰＥ比の影響を示している。
【図６】トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ／脂質／ＤＮＡ複合体の脂質の型の影響を示している。
【図７】トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ／脂質／ＤＮＡ複合体におけるグラミシジンＳの他のペプチドの置換の影響を示している。
【図８】ターゲティング糖質及び／又は反応性マレイミドをスペルミジンビス−アクリジンに結合するための合成スキームを示している。
【図９】ペプチドをマレイミド−スペルミジンビス−アクリジンに結合するための基本スキームを示している。
【図１０】分解可能なＬｙｓ−Ｌｙｓペプチドビス−アクリジンに結合するための合成スキームを示している。
【図１１】実施例３のゲル遅延アッセイの結果を示している。
【図１２】幾つかのガラクトシルビス−アクリジンの、肝細胞へのプラスミドＤＮＡを運ぶ能力を示している。
【図１３】実施例６のトリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンの合成スキームを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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