(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘムに対する表面レセプターを有する細胞に対して、リポソームを標的化するキットであって、以下の手段：
ヘムとリポソームの表面とを化学的にカップリングする手段、および
結果として生じるヘムとカップリングした該リポソームを、ヘムに対する表面レセプターを有する細胞に投与し、それにより該細胞に対してリポソームを標的化する、手段、
を備える、キット。
【請求項２】
前記細胞に送達されるべき化合物を前記リポソームと結合させる手段をさらに備える、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記リポソームが、結合のために利用可能な一級アミンを有する化合物を含み、そして前記ヘムが該一級アミンを介して該リポソームと共有結合する、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
送達されるべき前記化合物が核酸である。請求項２に記載のキット。
【請求項５】
前記化合物が前記リポソーム中に取り込まれる、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記化合物が前記リポソームの表面に結合する、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
前記リポソームがカチオン性リポソームである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記化合物が、前記リポソームに結合している前記ヘムと結合する、請求項４に記載のキット。
【請求項９】
前記核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、三重鎖ヘリックス形成分子、遺伝子、ウイルスベクター、プラスミド、およびタンパク質コード配列からなる群より選択される、請求項４に記載のキット。
【請求項１０】
リポソームと結合した化合物を、ヘムに対する表面レセプターを発現している細胞に送達するための組成物であって、該組成物がリポソームを含有し、
ここで該リポソームが、
（ｉ）その表面と化学的にカップリングしたヘム；および
（ｉｉ）それらと結合している送達されるべき化合物；
を有する、
組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが結合のために利用可能な一級アミンを有する化合物を含み、そして前記ヘムが該一級アミンを介して該リポソームと共有結合する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
送達されるべき前記化合物が核酸である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、三重鎖ヘリックス形成分子、遺伝子、ウイルスベクター、プラスミド、およびタンパク質コード配列からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化合物が前記リポソーム中に取り込まれる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化合物が前記リポソームの表面に結合している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームがカチオン性リポソームである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、前記リポソームに結合している前記ヘムと結合している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
ヘムに対する表面レセプターを有する細胞に対して標的化されたリポソームであって、該リポソーム表面に共有結合したヘム；およびヘムに対する表面レセプターを有する細胞に送達されるべき化合物を含む、リポソーム。
【請求項１９】
前記送達されるべき化合物が核酸である、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、三重鎖ヘリックス形成分子、遺伝子、ウイルスベクター、プラスミド、およびタンパク質コード配列からなる群より選択される、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記化合物が前記リポソーム中に取り込まれている、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２２】
前記化合物が前記リポソームの表面に結合している、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２３】
前記リポソームがカチオン性リポソームである、請求項２２に記載のリポソーム。
【請求項２４】
前記化合物が、前記リポソームに結合している前記ヘムと結合している、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２５】
前記リポソームが結合のために利用可能な一級アミンを有する化合物を含み、そして前記ヘムが該一級アミンを介して該リポソームと共有結合している、請求項１８に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、一般に、オリゴヌクレオチドの標的化細胞型への送達に関し、そして特に、ヘムレセプターを発現する細胞に特異的に結合し、かつ取り込まれる分子をその外表面に有するマイクロパーティクルを使用した手段に関する。
標的化薬物送達は、意図する部位に十分な用量を到達させるために非常に高い用量で投与すると薬物が毒性であり得る場合、薬物が非常に高価である場合、または薬物が、迅速に除去または分解を受ける場合のような数多くの状況において必要とされる。標的化細胞への薬物の送達、ならびにより最近ではオリゴヌクレオチドおよび遺伝子の送達は、キャリアの操作、製造方法、および標的化分子の付加によって調整されている。薬物は従来は経口送達のために錠剤またはカプセル中にカプセル化されているが、標的化送達、およびオリゴヌクレオチドおよび遺伝子のような、体内のヌクレアーゼの存在に非常に感受性の高い分子の送達のためには、より洗練されたビヒクル中へのカプセル化が必要とされる。
局所放出のためのリポソームおよびポリマービヒクルを用いたオリゴヌクレオチドの送達の報告がなされているが、現時点では公に入手可能なデバイスは存在しない。リポソームは、基本的には、水性コアの周囲にシェルを形成するリン脂質二重層からなる。利点として、外層の親油性が細胞の外膜層を「模倣」し、そして種々の細胞に比較的容易に取り込まれることが挙げられる。欠点としては、送達の非特異的性質が挙げられる。ポリマービヒクルは、代表的には、生分解性（例えば、ポリ乳酸（polylactic acid））または非生分解性（例えば、エチレン酢酸ビニル（ethylenevinyl acetate））のいずれかである生体適合性ポリマーから形成されるマイクロスフェアおよびマイクロカプセルからなる。ポリマーデバイスの利点のうちのいくつかは、製造の容易さ、および高い担持能（loading capacity）、ナノメーターからミクロンまでの直径のサイズ範囲、ならびに制御放出および分解プロファイルである。しかし、ポリマービヒクルの標的化は、リポソームと同様の問題を残している。特にことわりのない限り、リポソームおよび小ポリマービヒクルの両方を、本明細書において「マイクロパーティクル」という。
標的化薬物送達のために多くの異なる系が提案されてきた。最も一般的に使用されている方法は、マイクロパーティクルキャリアの表面に特異的抗体を共有結合させることである。核酸を効率的に送達することが示されている系は少ししかない。
核酸に基づく治療薬を含む種々の薬物の送達のためのリポソームの使用は、Thierry,A.T.ら、Cancer Comm,.1, 311-316（1989）；およびThierry,A.T.ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.,190. 952-960（1993）によって報告されている。リポソームは、カプセル化した物質を血清酵素による分解から保護するので、潜在的に有用である。また、リポソームは、肝臓への薬物の送達に対して明らかな利点を提供する。なぜならLiu,D.ら、Biochim.Biophys.Acta,1104, 95-101（1992）によって報告されているように、その脂質組成およびサイズに依存して、マウスに静脈注射されたリポソームの70％までが、迅速に肝臓に局在化し得るからである。
肝細胞は、アシアログリコプロテインまたはトランスフェリンのような分子に対する表面レセプターを有し、そしてChowdhury,N.R.ら、J.Biol Chem.268., 11265-11271（1993）によって記載されているように、これらのタンパク質が、肝細胞への特定の分子のリガンド指向性送達の基礎として使用されている。
イムノリポソーム（immunoliposome）（すなわち、特定の標的分子に対する抗体を有するリポソーム）もまた、薬物送達を指向させるために使用されている。しかし、このような複雑なリガンドをリポソーム表面にカップリングさせることは、多くの問題を呈する。これらの問題は、主として、抗体がポリペプチドまたは糖質成分を有し、そしてそのため複数の反応基を含むという事実に起因する。このような複雑なリガンド分子とリポソームの外表面の一級アミノ基との間にカルボジイミド（carbodiimide）媒介性ペプチド結合形成を行う試みは、リポソームとリガンドとの間の所望の分子間カップリングに加えて、かなりの分子内カップリングおよびリガンド分子間の分子間カップリングを引き起こす結果となり得る。さらに、このカップリングは、結果として顕著な数の所望されないリガンド構造となり得、反応の効率を低下させ得るので、調節することが困難である。タンパク質リガンドはまた免疫原性であり、そしてそのため免疫反応を誘起するか、あるいは身体の免疫系によるクリアランスを生じるかのいずれかであり得る。
従って、本発明の目的は、抗体または他のタンパク質を用いることなく、特定の細胞型への送達のためにマイクロパーティクルを標的化する手段を提供することである。
本発明のさらなる目的は、特にアンチセンスおよびリボザイムのような核酸型分子を特定の細胞型に効率的かつ確実に送達する組成物を提供することである。
発明の要旨
リボザイムおよびアンチセンスのような核酸分子およびオリゴヌクレオチド、タンパク質、糖質、および合成有機分子および合成無機分子、またはそれらの組合せを包含する化合物の有効濃度を、ヘム（heme）に対するレセプターを発現する細胞、特に肝細胞に標的化送達するための、効率的な方法および組成物が提供される。ヘムがマイクロパーティクルの外表面にインターカレートされるかあるいは共有結合されて、ヘムを有するマイクロパーティクルが形成される。好ましい実施態様において、マイクロパーティクルはリポソームであり、送達されるべき化合物は、ヘムを有するマイクロパーティクルの表面または脂質二重層間に取り込まれるかあるいは結合する。次に、マイクロパーティクルは、取り込まれた化合物での処置が必要な患者、例えば、肝疾患の患者に投与される。なぜなら肝細胞はヘムに結合する細胞の代表だからである。ヘムに対するレセプターを発現する細胞は、ヘムを有するマイクロパーティクルに結合する。リポソームの脂質組成は、取り込まれた化合物の細胞による取り込みを促進する。
【図面の簡単な説明】
図１は、モル比7:12:5のジミリストイルホスファチジルグリセロール（dimyristoyl phosphatidylglycerol）、コレステロール（cholesterol）、およびホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine）から形成されたリポソーム（「DMPG/CH/PEリポソーム」）に対するヘミン（hemin）の結合のグラフであり、100マイクロリットルのリポソームに結合するヘミンのマイクロモル対20mgヘミン/mlのマイクロリットル（50μgと2mgの間のヘムを生じる）として測定した。
図２は、DMPG/Ch/PEリポソームに対するヘムの結合に対するPEレベルの効果のグラフであり、結合ヘムのマイクロモル（×105）対PEのマイクロモルとして測定した。ヘムの量は、2mgで一定に保持したが、リポソームの形成において使用したホスファチジルエタノールアミンのレベルは０から３マイクロモルまで変化させた。
図３Ａおよび３Ｂは、ヘムを含むリポソーム（図３Ａ）およびヘムを含まないリポソーム（図３Ｂ）によって、37℃または４℃のいずれかで、HepG2細胞に結合とするか、または取り込まれた、リポソームカプセル化放射活性の百分率のグラフである。一定量（1mg）のヘムを結合のために使用した。
図４Ａおよび４Ｂは、結合反応における、37℃（図４Ａ）または４℃（図４Ｂ）での結合／取り込みされる放射活性の百分率対10mg/mlのヘムのマイクロリットルのグラフである。結合反応において０〜２mgへのヘムの漸増量を使用すると、漸増量のヘムがリポソームに結合して検出された。
発明の詳細な説明
ヘムを有するマイクロパーティクルを用いて、核酸に基づく治療薬、他の薬物、および非治療化合物を含む化合物を特定の細胞に標的化送達する方法および組成物が提供される。送達のために標的化される細胞はヘムに対するレセプターを発現する細胞であり、それによって化合物または化合物の組合せを担う、ヘムを有するマイクロパーティクルに特異的に結合する。次いで、細胞は結合したマイクロパーティクルを取り込み、そして次にマイクロパーティクルに会合した化合物は、細胞内に放出される。
ヘムを有するマイクロパーティクルは、ヘムレセプターを発現する細胞（例えば、肝細胞）に優先的に結合し、そして取り込まれるので、有効用量のために必要とされる薬物または他の化合物の量は、顕著に低減されるという利点を与える。このような標的化送達はまた、非標的化送達法における比較的高い薬物濃度の使用で起こり得る全身的な副作用を低減させる。
マイクロパーティクル
本明細書で使用されるマイクロパーティクルは、リポソーム、ビロソーム（virosome）、ならびに合成ポリマーおよび天然ポリマーから形成されるマイクロスフェアおよびマイクロカプセルを包含する。一般に、マイクロパーティクルは、ナノメーターから50ミクロン未満までの範囲の直径を有し、好ましくは、注射による投与のためには１ミクロンと10ミクロンとの間であり、最も好ましくは細胞による取り込みのためには５ミクロン未満である。
リポソーム
リポソームは、Kimら、Biochim.Biophys.Acta 728, 339-348（1983）；Liu,D.ら、Biochim.Biophys.Acta 1104, 95-101（1992）；およびLeeら、Biochim.Biophys.Acta.,1103, 185-197（1992））（本明細書中に参考として援用される）によって報告されているような標準的な方法によって製造され得る。
多くの異なる脂質成分を用いた多くのリポソーム処方物が、種々のインビトロ細胞培養物および動物実験において使用されている。リポソームの性質を決定するパラメーターが同定され、そして、例えば、Lee,K.D.ら、Biochim.Biophys.Acta.,1103, 185-197（1992）；Liu,D.,Mori,A.およびHuang,L.,Biochim.Biophys.Acta,1104, 95-101（1992）；Wang,C.Y.およびHuang,L.,Biochem.,28, 9508-9514（1989）のような文献で報告されている。
簡潔に述べると、有機溶媒に溶解された選択された脂質を混合し、そして減圧下、ガラス管の底で乾燥させる。カプセル化されるべき物質を含む水性緩衝溶液を用いて、穏やかに撹拌して脂質薄膜を再水和する。水和した脂質小胞またはリポソームを遠心分離によって洗浄し、そして濾過し、そして４℃で貯蔵し得る。この方法は、Thierry,A.R.およびDritschilo,Aの「アンチセンス活性のための、非修飾の、ホスホロチオエート化（phosphorothioated）され、リポソームにカプセル化されたオリゴデオキシヌクレオチドの細胞内利用性」Nuc.Ac.Res.20:5691-5698（1992）に、より詳細に記載されている。
ポリマーマイクロパーティクル
ポリマーマイクロカプセルおよびマイクロスフェアの作製方法は、当業者には公知であり、そして溶媒蒸発、溶媒キャスティング、スプレードライ、および溶媒抽出が挙げられる。有用なポリマーの例としては、多糖（polysaccharide）、ポリ無水物（polyanhydride）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリヒドロキシ酸（polyhydroxy acid）、ならびにタンパク質およびペプチドが挙げられる。好ましいポリマーは、ポリ乳酸、ポリグレコール酸（polyglycolic acid）、およびそれらのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸である。
他のマイクロパーティクル
ビロソームまたはポリアミノ酸（例えば、ポリ-L-リジン）の粒子のような他の生体適合性粒子もまた使用され得る。これらの物質にヘムを結合するための方法として、ポリマーマイクロパーティクルおよびリポソームに関して以下に記載する方法と同様の方法が使用される。
ヘムおよびヘム誘導体
金属ポルフィリン（metalloporphyrin）は、その構造がポルフィリン（porphyrin）環を含み、この環がその中心に内側に向き合った４つの窒素原子で保持された鉄またはマグネシウムのような補欠（prosthetic）金属原子を含む、有機化合物である。金属ポルフィリンは、グロビン、ミオグロビンおよびチトクロームのような種々のタンパク質と会合して、そしてクロロフィルのような色素分子中に見出されている。このようなタンパク質は金属ポルフィリン部分およびアポタンパク質とよばれるこのタンパク質の残余部分からなる。
ヘモグロビンおよびチトクローム中に見いだされる共通の金属ポルフィリンであるヘムは、動物細胞中で、フェロケラターゼによる鉄原子とプロトポルフィリン（protoporphyrin）IXとの錯形成によって合成される。ヘモグロビンにおいては、ヘム分子は可逆的酸素結合能を与え、他方、チトクローム中ではヘムは電子移動において機能する。ヘムは平面分子であり、そして二本鎖DNA中にインターカレートし得（Aft,R.L.およびMueller,G.C.,J.Biol.Chem.（1983）,258, 12069-12072,（1993）；Carvilin,M.J.ら、Nucleic Acids Res.11, 6121-6139（1983））、そして脂質二重層内にインターカレートし得る（Cannon,J.B.,ら,Biochem.23, 3715-3721（1984）；Tipping,E.,らBiochem.J.180, 327-337（1979））。ヘムは２つのカルボキシル基を含み、これらはアミノ基含有分子とのペプチド結合形成のための部位として働き得る。ヘムは塩化ヘムの形態で安価な試薬として容易に入手可能である（ヘミン，Sigma Chemical Co.,St.Louis.MO）。
ヘモグロビンの分解は、老化した赤血球の循環からの除去の一環として、肝臓および脾臓の主要な機能である。ヘモグロビン中のアポタンパク質、すなわちグロビンは、その構成アミノ酸へと分解し、そしてヘムは最初にヘムオキシゲナーゼによってビリベルジン（biliverdin）に分解する。次にビリベルジンは、さらにビリベルジンレダクターゼによってビリルビン（bilirubin）に還元される。ヘムの代謝の間の、肝臓によるヘムの結合および取り込み機構に関していくつかの不一致が存在するようである。いくつかの証拠は、ヘムがヘモペキシン（hemopexin）（Smith,A.およびMorgan,W.T.,J.Biol.Chem.,259, 12049-12053（1984））またはアルブミン（Sinclair,P.R.,ら、Biochem.J.,256, 159-165（1988））のようなキャリアタンパク質と複合して肝臓への輸送されることを示唆しており、他方、他のデータは、ヘムが、キャリアを必要とせず、肝細胞膜に直接結合し得ることを示唆している（Galbraith,R.A.,J.Hepatol.,10, 305-310（1990））。ヘムの肝細胞への結合にキャリアタンパク質が関与しているいないに関わらず、ヘムレセプターが肝細胞（Galbraith,R.A.,J.Hepatol.,10, 305-310（1990））および他の細胞型（Galbraith,R.A.らJ.Biol Chem.,260, 12198-12202（1985））の原形質膜上で同定されており、そしてこの表面レセプターは、ヘムに特異的に結合する。ヘムレセプターは内在性膜タンパク質であり、見かけの分子量は115キロダルトン（kD）であり、肝臓の膜タンパク質全体の0.5%までを構成し得る。
細胞表面上のプロトポルフィリンレセプターの性質は、いまだ明らかではない。ヘムの代わりに使用し得るヘム誘導体は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（dioleoylphosphatidyl ethanolamine）（これは、エタノールアミン（ethanolamine）残基に結合したヘム分子を有している）のようなアミノジグリセリド（aminodiglyceride）、または以下のような、ヘム基が直接グリセロールに結合した他のジグリセリド（diglyceride）である：
0003691850.tif 000002
これらの脂質は、リポソームの形成の際に、直接、含有され得る。
本明細書において特に指示のない限り、ヘムおよび適切なヘム誘導体は「ヘム」と総称される。
ヘムの取り込み方法
ヘムは、イオン結合または共有結合のいずれがによりマイクロパーティクルに結合され得るか、あるいはリポソームのリン脂質二重層中にインターカレートされ得、最も好ましくは、他のタンパク質への吸着およびインビボでのリポソームからの除去を避けるために共有結合され得る。
ポリマーマイクロパーティクルへの結合
ヘムをポリマーに共有結合により架橋する方法は公知である。ヘム分子は、２つのペンダントカルボキシル基（pendant carboxyl group）、２つのペンダントアルケン基（pendant alkene group）、および４つのメチル基（methyl group）を有する。カルボキシル基は、ポリマーをヘム分子にイオン結合または共有結合で連結するために用いられ得る。アルケン基およびメチル基は、ラジカルを形成し得、これらはポリマーをヘム分子に共有結合で連結するために用いられ得る。ポリマーをヘム分子に連結するために、ポリマーは、カルボキシル基、アルケン基、またはメチルラジカルと反応してイオン結合または共有結合を形成する少なくとも１つの反応基を有する必要がある。ポリマーとヘム分子とを架橋するために、ポリマーは少なくとも２つの反応基を有さねばならない。
イオン結合（ionic linkage）：ヘム分子中のカルボキシル基は、ポリマー上のアミン基（amine group）と酸−塩基反応で反応してイオン結合を形成し得る。カルボキシル基はまた、Ca++のような多価イオンを用いてポリマー上のヒドロキシ基（hydroxy group）と反応してカップリングをもたらし得る。
共有結合（covalent linkage)：ヘム分子中のカルボキシル基は、有機合成の当業者に公知の手段によって、例えば、DCCのような脱水剤を用いて、ポリマー上のペンダントのヒドロキシ基、アミン（amine）基、チオール（thiol）基、またはカルボキシ基と反応され得る。得られる産物は、それぞれ、エステル（ester）、アミド（amide）、チオエステル（thioester）、および無水物（anhydride）である。代表的な方法は、Larock、「Comprehensive Organic Transformation」、VCH、New York、966-972（1989）に掲げられ、本明細書中に参考として援用されている。
ヘム分子中のペンダントアルケン基は、フリーラジカル開始剤を用いてアルケン基を含むポリマーに共有結合的にカップリングされ得る。あるいは、ヘム分子の存在下、アクリレートモノマー（acrylate monomer）のような不飽和モノマーを重合して、ヘムユニットを取り込む別のコポリマーを形成し得る。
ペンダントメチル基は、UVまたはガンマ照射に供されると、ラジカルを形成する。メチル基は、ヘム分子上のメチル基をポリマーの存在下でUVまたはガンマ照射に供することにより、ペンダント脂肪族（aliphatic）炭素−水素（carbon-hydrogen）結合、炭素−塩素（carbon-chlorine）結合、または炭素−臭素（carbon-bromine）結合を含むポリマーにカップリングされ得る。
リポソームへの結合
リポソームの他の表面に共有結合されたヘムを有するリポソームを製造するために、リポソームの脂質組成は、ヘムへの共有結合のために利用可能な一級アミノ基を有するアミノ脂質（aminolipid）または他の化合物を含まねばならない。ヘムは、適切な化学反応を介して肝細胞に送達されるべき任意の分子にカップリングされ得る。例えば、存在するホスファチジルエタノールアミン（PE）またはジオレオイルPEは、ヘムとの結合のためにリポソームの外表面上の一級アミノ基を提供する。
ヘムのリポソームへの共有結合は、ヘム上のカルボキシル基とリポソーム表面上の一級アミノ基との間の共有ペプチド結合形成を促進する任意の試薬または方法により媒介され得る。例えば、カルボジイミドは、共有結合を促進し、そしてリポソームの外表面上の一級アミノ基にヘムを結合するために用いられ得る試薬として周知である。これは、R.R.C.New（編）（1992）Liposomes：a practical approach、179-180頁、IRL Press、Oxfordに記載されており、その教示は本明細書中に援用されている。ヘムをリガンドとして用いることの利点の１つは、各分子が２つのカルボキシル基のみを含みかつアミノ基を含まず、従って、ヘムが、ヘム自体に、あるいは、リポソームの脂質二重層の外表面上に含まれる一級アミノ基以外にいかなるにもカップリングし得ないことである。
カップリングの効率は、標準的方法を用いて、放射標識したヘムを用いてまたは分光学的検査によりモニターされ得る。これらは、例えば、Galbraithら、J.Biol.Chem.、260、12198-12202（1985）；Fuhrhopら、Porphyrins and Metalloporphyrins（K.M.Smith編）、804-807頁（Elsevier、Amsterdam 1975）に記載されており、これは本明細書中に参考として援用されている。
ヘミンは脂質二重層中にインターカレートすることが公知であり、そして自然にリポソームと会合することが示されている。しかし、リポソーム中にインターカレートするヘムは、リポソームから、血中に存在するヘモペキシンのようなヘム結合タンパク質に、非常に効率的に移行され得る。これは望ましくなく、そして送達ビヒクルの効率を減少させる。ヘムのアミノ脂質への共有的付着は、リポソームの外表面上のヘム分子を安定化し、そしてヘムを有するリポソームが血流中に注入されると、リポソームからのヘムの除去を防ぎ得る。
マイクロパーティクルに取り込まれるべき化合物
種々の薬物および化合物は、ヘムを有するマイクロパーティクルを用いて特定の細胞および器官に送達され得、これらには、核酸に基づく化合物（例えば、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、糖質、合成有機分子および合成無機分子、モニター用剤（monitoring agent）、およびこれらの組み合わせが挙げられ、他に特定されなければ、本明細書中では「治療化合物」という。好ましい実施態様では、治療化合物は、核酸であり、特に、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー（aptamer）、三重鎖分子（triplex molecule）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この群に入る化合物の例は、トランスフェクション用のDNAおよびRNA、ならびに細胞内分子を標識するための化合物を含み、これらは例えば、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413-7417;Leeら、Biochim.Biophys.Acta、1103、185-197（1992）に記載されている。任意の治療増強剤または機能増強剤が取り込まれ得、例えば、欠損が存在する肝臓酵素がヘムシステムを用いて送達され得る。
マイクロパーティクルにおける化合物の取り込みの方法
一般に、送達されるべき化合物は、直接またはヘムへのカップリングを介してのいずれかで、マイクロパーティクル内に取り込まれる。リポソームの場合、物質は、脂質二重層内または脂質二重層間に取り込まれ得、あるいはイオン結合または共有結合のいずれかでリポソームの外側に結合され得る。ポリマーマイクロパーティクルの場合は、化合物は、固体のポリマーマイクロパーティクル（一般的にはマイクロスフェアという）全体に分散され得るか、または、外側のポリマー層とは異なる物質から形成されるコア（一般的にはマイクロカプセルという）内に取り込まれ得るか、あるいは、ポリマーマイクロパーティクルの外表面に結合され得る。化合物がマイクロパーティクルの表面に結合される場合、送達されるべき化合物を、ヘムと同時にマイクロパーティクルに結合することが好ましくあり得る。
好ましくは、化合物がマイクロパーティクルの調製の間に存在する場合、化合物はマイクロパーティクル内にカプセル化される。これは、ポリマーマイクロパーティクルについては比較的標準的であり、ここで化合物はポリマー溶液中に混合されて、次いでマイクロパーティクルに形成される。リポソームの場合、例えば、Kimetら、1983；Liuら、1992；Leeら、1992に記載されているように、物質は、再懸濁緩衝液中で、または脂質とともに乾燥されて、リポソームの形成の間に取り込まれる。疎水性化合物または他の化合物は、脂質二重層間でリポソーム中に取り込まれ得る。これは、リポソームの形成の間（すなわち、乾燥工程の前）に物質を含むことによるか、あるいは、リポソームが形成された後に物質を添加し、そして分子内の疎水性の分布に基づく自然な会合に依存することによる。また、二重層の内側または外側に他の結合分子をつなぎ止め得る疎水性領域を有する貫膜ペプチド（membrane-spannning peptide）を加工し得る。
あるいは、カチオン性リポソームは、カチオン性側基を十分量で含有する１以上の脂質を含む混合物を用いて調製され得、この混合物から形成されたリポソームは、正味の正の電荷を有し、負に荷電した化合物をイオン結合する。カチオン性リポソームは、核酸との会合のための大きな受容能力を有する。この研究は、４μgの脂質（ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（dioleoyl trimethylammonium propane）：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（dioleoyl phospatidylethanolamine）1:1モル濃度混合物）が、少なくとも１μgのDNAを結合すること、およびこれが添加された用量の100%であることか証明され、このことは、この脂質が飽和されていないことを意味する。
これは、最も正に荷電した脂質に対するDNAの結合の化学量論の代表例である。
カチオン性リポソームを製造するために用いられ得る正に荷電した脂質の例は、アミノ脂質ジオレオイルPE（これは、正に荷電した一級アミノ頭部基（head group）を有する）；ホスファチジルコリン（これは、一級アミンではない正に荷電した頭部基を有する）；および最近設計されたN[1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（N[1-（2,3-dioleyloxy）propyl]-N,N,N-triethylammonium）（「DOTMA」、Felgner,P.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413-7417（1987）；Felgner,P.L.ら、Nature、337、387-388（1989）；Felgner,P.L.ら、Advanced Drug Delivery Reviews、5、163-187（1990）に記載されている）を含む。
カチオン性リポソームは、核酸に基づく化合物のような負に荷電した化合物を送達するために特に有用であり、これらのリポソームの正に荷電した外表面にイオン結合する。種々のカチオン性リポソームが、インビトロおよびインビボの両方で細胞に核酸または核酸−タンパク質複合体を送達するのに非常に効果的であることが既に示されている。これはFelgner,P.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413-7417（1987）；Felgner,P.L.ら、Advanced Drug Delivery Reviews、5、163-187（1990）；Clarenc,J.P.ら、Anti-Cancer Drug Design、8、81-94に報告されている。予め形成されたカチオン性リポソームとDNAとの会合の後、膜が、おそらく隣接するリポソームの融合により添加された核酸を捕獲する複合体を再整列しそして形成すると仮定されている。
カチオン性リポソームは、上記のように、化合物の取り込みの前に、または好ましくは化合物の取り込みの後に、ヘムと結合またはインターカレートされ得る。例えば、ヘムを有するカチオン性リポソームは、負に荷電した薬物または他の化合物と混合され得、次いで正電荷−負電荷相互作用を介してリポソームの表面とイオン結合により複合体化される。
一級アミノ脂質以外の脂質、すなわち、ヘム部分が適切な化学反応を介して付着され得る他の官能基を有する脂質はまた、付着の手段として利用され得る。
別の方法において、オリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞中への取り込みのためのヘム分子またはその誘導体に直接結合され得る。オリゴヌクレオチドは、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、または三重鎖分子であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドの合成後、C2またはC6アミノ改変剤（modifier）が、リボザイム5'末端にカップリングされ得る。オリゴヌクレオチドは、アンモニアで脱保護されて、標準的プロトコルを用いてHPLCにより精製される。ヘムは、実施例１に記載されるようにカルボジイミドを用いてリボザイムの5'アミノ基に付着される。
リボザイムは、肝細胞中への送達のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマー、または三重鎖分子で置き換えられ得る。本質的に、同一の方法が、肝臓中への送達のために、タンパク質、遺伝子、ウイルスベクター、または任意の他の治療薬を結合するために用いられ得る。１つの例は、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスのような向肝性（hepatotropic）ウイルスを阻害するための、ara-AMPを肝臓に送達するためのヘムへの使用である。ara-AMPは、ウイルスの生活環の逆転写段階を妨害することにより、HBVの複製に阻害的であるヌクレオシドアナログである。向肝性ウイルスの複製に阻害的である他のヌクレオシドアナログもまた、それらのヘムへの化学結合の後、感染した肝臓細胞中に導入され得る。
ヘムをヌクレオチドまたはタンパク質に結合する他の方法は、カルボジイミドのような試薬を用いるまたはイオン性会合によるカップリング反応を介するポリリジン（polylysine）のような正に荷電した分子を介するものである。リボザイムまたは他のオリゴヌクレオチドを、ヘム−ポリリジン複合体に添加し、室温で15分間インキュベートし、リボザイムをポリリジン複合体と会合させる。RNAは、リジン部分の正の電荷およびRNAの負の電荷のために主としてイオン性相互作用によりポリリジンと会合する。
処置方法
リポソームは、好ましくは全身投与され、最も代表的には、標的化細胞への化合物の送達に有効な量で、静脈内投与または腹腔内投与により投与される。有用な他の投与経路としては、経皮、経粘膜、および経腸経口が挙げられる。一般的に、個体に投与されるリポソームと会合した化合物の総量は、同一の所望または意図された効果のために投与されなければならない非会合化合物の量よりも少ない。有効量はまた、投与様式が、レプリコン、またはベクター駆動アプローチ（例えば、それが有している配列を増幅するレトロウイルスベクター）によるか、あるいは化学合成されたリボザイムアプローチによるかに依存する。
標的化された疾患は、任意の肝臓病であるが、この方法は、肝臓にいかなるものをも集中させるために用いられ得る。
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによりさらに理解される。
実施例１：ヘム結合リポソームの調製およびヘムの結合の測定
一級アミノ脂質を含有するリポソームを、標準的方法を用いて作製した（Thierry,A.T.ら、Cancer Comm.、1、311-316（1989））。脂質を、粉末としてまたはクロロホルム中に溶解されてのいずれかで、Sigma Chemical Co.（St.Louis、Missouri）またはAvanti Polar Lipids、Aalabaster、Alabamaのいずれかから入手し、そして−20℃で乾燥して保存した。
ヘムのリポソームへの結合に対するヘム濃度の依存性を決定するための最初の実験では、以下の標準リポソームを調製した。468μl（10mg/ml）（6.9μmol）のジミリストイルホスファチジルグリセロール（dimyristoyl phosphatidyl glycerol）（DMPG）、260μl（10mg/ml）（12μmol）のホスファチジルエタノールアミン（PE）および172μl（10mg/ml）（5μmol）のコレステロールを室温で滅菌ガラス試験管中で合わせて、真空デシケーター中で55℃にてボルテックスしながら媒介を蒸発させ、乾燥した混合された脂質の薄膜にした。10μlのリン酸緩衝化生理食塩液（PBS）をこの薄膜に添加し、そして試験管を回転させて薄膜を一様に水和させた。水和させた薄膜を一晩放置した。リポソームは、PBSの漸増添加と繰り返してボルテックスすることにより翌日に形成された。最後に、リポソームを10mlのPBSで２回洗浄し、400μlのPBS中に懸濁し、そして結合まで４℃で保存した。
ヘミンを0.2 N NaOH中に20mg/mlに溶解して室温で一晩回転させることによりヘムを調製した。このストック溶液を、暗所で４℃にて１週間まで保存した。結合のために、ヘム溶液のpHを約pH７まで下げた。カップリング剤であるカルボジイミドは、酸性pHで最も良く作用するが、ヘムは、pH７以下では溶液から出現し始める。従って、カップリングを、可能な限りpH７に近いpHで行った。90μlの１N HClを0.2 N NaOH中の20mg/mlのヘミンの500μlに添加し、そしてこの混合物の最終容量を蒸留水で１mlにして、10mg/mlの最終ヘム濃度を得た。
500μlの結合物を、200μlのN-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（N-ethyl-N'-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride）（EDC）（10mg/ml）、100μlのリポソーム、および０〜200μlの間のヘム（10mg/ml、蒸留水で2200μlにした）を含む1.5mlのEPPENDORFTM遠心チューブ中で調製した。反応物を、室温で一晩暗所にて回転させた。次いで、各調製物を、１mlの0.2 N NaOHで３回洗浄し、各回毎にEPPENDORFTM遠心分離機で14,000rpmにてリポソームを遠心分離した。リポソームペレットを、最終的に200μlの蒸留水中に取り出した。
リポソームに結合したヘムの量を、Furhop,J.H.およびSmith,K.M.、Porphyrins and metalloporphyrins（K.M.Smith編）、804-807頁（Elservier、Amsterdam 1975）の方法を用いて分光学的に測定した。簡単にいえば、還元型ヘムおよび酸化型ヘムの、それぞれ534nmおよび546nmでの吸光度の差を、吸光係数で乗ずると、サンプル中のヘム濃度の尺度を与える。100μlのリポソームを700μlの蒸留水に添加し、これに、500μlのピリジンヘモクローム（pyridine hemochrome）（ピリジン、１N NaOH、水、2:1:2）を添加した。このサンプルを、２つの部分に分け、１つの部分に数粒のナトリウムジチオナイト（sodium dithionite）を添加し、そして他の部分に10μlの１mg/mlのカリウムフェリシアネート（potassium ferricyanate）を添加した。これらの２つのサンプルからのスペクトルを、500〜600nmの範囲にわたってとり、そしてサンプル中に存在するヘムの濃度を算出した。結果を図１に示し、そしてこれは用いたヘム濃度にわたり、リポソームに結合したヘムの量がカップリング反応でのヘムの増加に伴って増加したことを示す。反応の効率はかなり低く、そして高いヘム濃度で減少し、これは、カップリングが飽和可能であったことを示す。
実施例２：ヘムの結合に対するリポソーム中のPEレベルの変化の影響
リポソームを正確に上述の通り調製したが、混合物中に含まれるPEの量を０μmolから12μmolまで変化させた。これらの調製物を400μlの蒸留水中に希釈し、そして100μlを２点平行の結合反応において上記のように用いた。リポソームを上述の通り３回洗浄し、次いで200μlの蒸留水中に懸濁した。リポソームの100μlのサンプルに結合したヘムを、上記の分光学的方法により測定した。
結果を図２に示す。０〜0.6μmolのPEの範囲にわたって、リポソームに結合したヘムの量は、それらの形成において用いたPEの量に依存し、これはPE依存性ペプチド結合がおそらく生じていることを示している。0.6μmolのPEが、リポソームへの最大カップリングを与えるのに最適なレベルであるようであった。というのは、リポソームにより結合されたヘムの量が、この量より多いPEレベルでプラトーになったからである。
しかし、リポソーム中にPEが含まれない場合、十分洗浄して非結合ヘムを除去した後でさえヘムの相当な結合が存在した。このことは、ヘムが、共有結合試薬であるカルボジイミドを必要とすることなくリポソームに結合し得ることを示す。しかし、ヘムは脂質二重層にインターカレートすることが知られており、そしてこのタイプのインターカレート結合において、ヘムレセプターによる認識のために外向きでないかもしれないので、そして共有結合されないヘムは血清中のヘム結合タンパク質によりリポソームから取り除かれ得るので、培養物中の細胞へのヘム−リポソームの結合を調べるために実施される研究のためには、ヘム−リポソームをカルボジイミドを用いて調製した。
実施例３：細胞培養物におけるヘムリポソームの肝細胞への結合
２つの研究を実施した：
実験１。DMGE：PE：コレステロールリポソームを上述通りに調製した。但し、10μlの蒸留水の代わりに10μlの[α-32P]dCTP標識オリゴヌクレオチド（約100ng）を、乾燥脂質薄膜を再水和させるために用いた。リポソームの細胞への結合を追跡するための標識として放射活性を用いた。取り込まれなかった放射活性を、上記のようにリポソームを洗浄することにより除去した。ヘムを上記のように放射活性標識リポソームに結合させ、そして得られたヘム結合リポソームを最終的に80μlのPBS中に取り出した。コントロールのリポソームを同一の調製プロトコールを用いるがヘムを省いて調製した。10μlの各リポソームを、６ウェルディッシュ中の２mlの結合緩衝液（PBS＋100mMグルコース）中で、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を発現するHepG2肝細胞（「Acs細胞」、Sells,M.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84, 1005-1009（1987）に記載）に、４点平行で添加した。Acs細胞を、ストックプレートをトリプシン処理し、細胞を取り出し、洗浄し、そして１ウェル当たり１×106細胞で６ウェルディッシュ中に再プレートすることにより調製した。細胞を、再プレートの３日後に用い、これは約70％コンフルエントであった。100μlの培地を、添加した放射活性カウントの測定のために、各ウェルから取り出した。１組のディッシュを37℃で、別の組を４℃で３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして正確にGalbraithら、J.Hepatol.,10, 305-310（1990）に記載のように培養ウェルから取り出し、そして結合したカウントをPackard 3330 Liquid Scintillation Spectrometerを用いて測定した。この実験を４℃および37℃で実施し、リポソームの細胞表面への結合と取り込みとを区別した。なぜなら、細胞取り込みは４℃ではほとんどないからである。図３Ａ（37℃）および図３Ｂ（４℃）に示される結果は、ヘム結合リポソームが、ヘムなしで結合されたコントロールのリポソーム（ヘムなし）またはリポソーム単独（Lipo.）より顕著に大きな程度で、肝細胞に結合し、そして肝細胞により取り込まれる（ヘム欄を参照のこと）ことを示す。この実験において、ヘムリポソームの結合および取り込みはコントロールより10倍より大きく、平均して添加用量のほぼ９％に達する。これらの結果は、ヘムのリポソームへの結合が、このインビトロ系におけるリポソームの結合および取り込みを増強し得ることを示す。
実験２。標識DMPG：PE：コレステロールリポソームを上述通りに調製し、そしてヘムを、200μl、20μl、または０μlのヘム（10mg/ml）のいずれかを含有する反応混合物中で、上記のようにリポソームに結合させた。細胞培養物への送達のためにリポソームを200μlのPBS中に希釈し、そして少量のサンプルを実施例１に記載のヘム結合の測定のために取り出した。Acs細胞を本質的に上述通りに調製したが、１ウェル当たり５×105細胞を６ウェルプレートに分注し、リポソームの添加前３日間静置した。使用前に、細胞を２mlのPBSで２回洗浄し、そして２mlの結合緩衝液を各ウェルに戻した。20μlの各リポソーム調製物を各ウェル中にピペッティングし、混合し、そして100μlのサンプルを０時間結合の測定のために取り出した。１組の４点平行のウェルを37℃に置き、別の組の２点平行を氷上で２時間置いた。リポソームを実験１で上記したように細胞から洗浄し、そして細胞を室温で15分間１mlの溶解緩衝液（１Ｍ NaOH、１％SDS）での処理後溶解させた（Galbraith,R.A.ら、J.Hepatol.,10, 305-310（1990））。細胞溶解物をシンチレーションバイアルに移し、そして１mlのPBSを培養ウェルに添加して、細胞溶解物の痕跡を採集した。サンプルを上述のように処理およびカウントした。
この実験の結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。結果は、図３Ａおよび図３Ｂに示される結果に類似しているが、最も多い量のヘムを含有するリポソームとヘムを全く含有しないリポソームとの間での37℃での結合および取り込みの差異は、実験１におけるより小さい：10倍（1000％）の増加に比較して約10％の増加。
結合したヘム結合リポソームの百分率は両実験においてほぼ同じであった（例えば、９％）。また、第２の実験において、ヘム結合リポソームは、以前のデータと一致して、４℃でコントロールのリポソームより多くの肝細胞への結合を促進した。結合されたヘムが増加するにつれて、結合されそして取り込まれるリポソームの量の段階的な増加が存在するようであった。これらの実験からのデータは、肝細胞が、おそらくリポソーム中またはリポソームの表面上のヘムの存在により促進されるようであるリガンド−レセプター機構により、インビトロでのリポソーム送達のための標的となることを示す。コントロールとヘム結合リポソームとの間の４℃および37℃での結合および取り込みの差異は、リポソーム会合の２段階機構の存在を示す。この２段階機構は、その両方がヘムの存在に依存している。
実験例４：ヘムのオリゴヌクレオチドへの直接結合
リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、または三重鎖分子が、肝臓の肝細胞への取り込みのために、ヘム分子またはその誘導体に直接結合され得る。一例として、Ｂ型肝炎ウイルスのRNAのε領域に対するリボザイムをDNA／RNA合成機（Applied Biosystems,Sunnyvale,CA）において、製造者のプロトコルに従って合成した。最後のヌクレオチドの添加後に、Ｃ２またはＣ６アミノ改変剤（Glen Research,Sterling,VA）をリボザイムの5'末端にカップリングさせた。オリゴヌクレオチドをアンモニア中で脱保護し、そして標準的なプロトコルを用いてHPLCにより精製した。ヘムを、実施例１に記載のようにカルボジイミドを用いて、リボザイムの5'アミノ基に付着させた。ヘム−リボザイム結合体を、水を数回交換して４℃で透析することにより精製した。精製したヘム−リボザイム複合体を肝細胞への取り込みのために用いた。
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実施例５：ポリリジンを介するオリゴヌクレオチド治療薬のヘムへの結合
ヘムをヌクレオチドまたはタンパク質に結合させる別の方法は、ポリリジンのような正に荷電した分子による方法である。ポリリジンはリジン部分の連続的な単位からなっている。10mg／mlのポリリジン水溶液（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）（pH5.5）をヘムの0.5mg／ml溶液（pH5.5）と混合し、そして10mg／ml（最終濃度）のカルボジイミドを用いて４℃で一晩共有結合させた。結合した物質を水に対して透析して、過剰なヘムを除去した。0.1mlのヘム−ポリリジン複合体に0.1ml H2O中100μｇのリボザイムの溶液を添加し、そして室温で15分間インキュベートして、リボザイムをポリリジン複合体と会合させた。RNAは、主にイオン性相互作用によってポリリジンと会合する。このイオン性相互作用は、リジン部分の正電荷とRNAの負電荷とに起因する。リボザイム−ポリリジン−ヘム複合体を、実施例１に記載のように肝細胞への取り込みのために用いた。
0003691850.tif 000004
この方法は、負電荷を保有する任意の治療薬を肝細胞に送達するために改変され得る。例えば、ヘムポリリジン複合体は、アンチセンス分子、アプタマー、三重鎖分子、遺伝子、ウイルスベクター、プラスミド、または任意のタンパク質を送達するために用いられ得る。
ヘムを有するマイクロパーティクル、およびこのようなヘムレセプターを発現する細胞への化合物のマイクロパーティクル指向性送達の使用方法の改変および変型は、上述の詳細な説明から当業者に明らかである。このような改変および変型は、添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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