(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蒸煮あるいは煮沸した大豆を、培養系の塩分を５重量％以下の条件下で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のかびを用いて固形培養し、得られた培養物から５０℃以上の水で抽出することを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、食品、健康食品などに使用することができる阻害活性が強く、臭いがなく、摂取し易いα−グルコシダーゼ阻害剤の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼ阻害剤は、小腸の微絨毛に局在するα−グルコシダーゼを阻害し、食後の血糖値の急上昇及びそれに続くインスリン値の上昇を抑制することが、Diabate Medicine, 10, 688(1993)に報告され、人間及び人間以外の動物においても炭水化物（特に、澱粉由来のオリゴ糖、シュクロース等）の代謝を抑制するために、例えば血糖上昇抑制作用を示し、過血糖症状及び過血糖に由来する肥満症、糖尿病などの種々の疾患の改善に有用である。また、α−グルコシダーゼ阻害剤を添加して製造した食品は、代謝異常の患者食に適しており、さらに代謝異常予防食として健康な人にも適している。
【０００３】
本出願人は、先に特願平１０−２３９３２６号で、中華料理の食材としても用いられているトウチ（豆鼓）が、強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有するということを報告した。トウチは蒸煮した大豆を１０重量％以上の高塩分中で固形培養させたもので、トウチ中にも１０重量％以上の塩分が含まれているので、健康食品として日常に摂取する場合は、塩分を極力抑えたものが望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、塩分を抑えて上記の固形培養を行うと、納豆菌のような細菌が繁殖するためか、培養物から納豆のような臭いが発生してしまうという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を鋭意研究していたところ、蒸煮した大豆を、培養系の塩分を５重量％以下の条件でアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のかびを用いて固形培養して得られる培養物であっても、それを５０℃以上の水で抽出することによって阻害剤の臭いを消失させることができ、しかも阻害活性を更に向上させ得ることを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下本発明について具体的に説明する。
本発明に用いられる大豆は、ミソ、醤油、食料油、豆腐、納豆、凍豆腐、モヤシ等の原料となるものであり、生大豆、乾燥大豆、大豆粉等いずれも用いられる。まず大豆は水に浸漬した後、蒸煮あるいは煮沸されるのであるが、かかる浸漬の条件としては、大豆を１０〜３０℃の水に１〜１８時間漬ける。また、蒸煮あるいは煮沸の条件としては、大豆を蒸器に入れて、蓋をして下から水蒸気を送って蒸煮前（浸漬後）の大豆に比べて重量が１．０２〜２倍となるまで０．２〜２時間程度蒸煮したり、沸騰水に入れて３０〜３６０分間煮沸する。
【０００７】
大豆はもともと自然界で０．１重量％程度の塩分を含有し、蒸煮あるいは煮沸した大豆でも０．０５重量％程度の塩分を含有するので、そのまま次のかびつけ工程に入ってもよいが、固形培養の安定性をはかるため、かかる系の塩分が５重量％以下（好ましくは１重量％以下）になる範囲で塩分を添加してもよい。かかる塩分が５重量％を越えると後で抽出操作を行っても塩分が抽出物中に混入し、摂取時に著しく塩辛いあるいはまずくなるので阻害剤の脱塩処理を施す必要があり不適当である。
【０００８】
塩分としては塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸カルシウム等が挙げられ、かかる塩分は、試料をイオン交換水で希釈して、デジタル塩分計（積水化学工業社製『ＳＳ−３１Ａ』）を使用して測定して求める。
【０００９】
蒸煮あるいは煮沸の後固形培養を行うのであるが、まずかび付けから実施する。かかるかびとしては醤油、もろみ、トウチ、みそ等の製造に用いられるもので、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のかびが用いられ、例えば、アスペルギルス  アルバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｂｕｓ  ＩＦＯ４０３９）、アスペルギルス  キャンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ  ＩＦＯ４３８９）、アスペルギルス  ニーズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ１００７４）、アスペルギルス  グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ  ＡＴＣＣ１００５９）、アスペルギルス  オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＦＯ４１３５）、アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ＩＦＯ５８３９）、アスペルギルス  インディカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１５０５４）、アスペルギルス  スルフレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１１９０４）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＦＯ４３４３）、アスペルギルス  ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＩＦＯ４２００）、アスペルギルス  タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ  ＡＴＣＣ１２６６９）等が挙げられる。
具体的には、『ハイ・ソーヤ』、『マイルド・Ｓ』、『スリーダイヤ』、『ダイヤモンドＣ』、『うすむらさき』、『宝菌』、『白醤油用菌』、『改良焼酎用菌』（以上いずれも株式会社樋口松之助商店製）等の市販品が挙げられる。
かび付けする場合のかびの添加量は特に制限されないが、大豆に対して０．０００１〜１０重量％程度である。かび付けの方法としては蒸煮あるいは煮沸した大豆にかびを振りかけたり、一度培養した容器や発酵室に残存しているかびと該大豆を接触させる等の方法が挙げられる。
【００１０】
かび付け後固形培養を開始する。固形培養温度は１０〜５０℃程度（好ましくは２５〜４５℃）、湿度８０〜１００ＲＨ％（好ましくは９０〜１００ＲＨ％）で、１２〜１２０時間（好ましくは４８〜９６時間）実施される。
更に必要に応じて得られた培養物を５〜４０℃で、２〜１２０日程度放置して熟成工程を行ってもよい。
発酵終了後、必要に応じて大豆表面に付着しているかびを落す為に水洗する。
【００１１】
次にかかる培養物を５０℃以上の水で抽出するのであるが、好ましくは６０℃以上の水で抽出する。水の温度が５０℃未満では、阻害活性の向上が見られず、更に培養物中に発生する臭い成分の除去ができず不適当である。
【００１２】
上記の５０℃以上の水で抽出するには、培養物に１〜３０倍重量（好ましくは２〜１５倍重量）の水を加え、昇温すればよい。抽出時間は９０℃までの抽出温度では５〜２０時間、９０℃を越えると１〜１０時間程度でよい。また、必要であればオートクレーブ等を利用して１００℃以上で０．２〜５時間抽出することができる。抽出法としては、特に制限はないが、通常撹拌抽出あるいは浸漬抽出が用いられる。
得られた抽出液は濾過、遠心分離、膜分離等により固形分を取除いた後、必要に応じてケイソウ土で脱色してから、濃縮乾固、フリーズドライ、スプレードライ等の方法で粉末化するのが好ましい。
【００１３】
かくして得られたα−グルコシダーゼ阻害剤は、血糖上昇抑制作用を有しているので、水、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールなどの液状担体や、でんぷん、セルロースなどの固形担体などの無毒性担体で希釈して、アンプル剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤などの医薬品、健康食品として代謝異常の患者食又は予防薬、糖尿病の予防薬、あるいは抗肥満食、ダイエット食として用いることができる。さらに、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有する上記製剤を、食前、食中、食後、食間などに服用することにより、喫食による血糖濃度の増加を抑制することができる。
【００１４】
本発明の阻害剤は、トウチを５０℃未満の水で抽出した場合に比べて２〜１００００倍の阻害活性を持つので、摂取量としては、乾燥粉末として、０．００１〜１０ｇ／日が好ましく、特に０．０１〜３ｇ／日が好ましい。
【００１５】
本発明の製造法で得られたα−グルコシターゼ阻害剤は、塩分が少なく、臭いがないので、例えば、以下のような食品に添加可能である。
（１）農水産加工品
はるさめ、こしあん、こんにゃく、パン、麺類（即席めん、パスタ、生めん、乾めん）、餅、シリアル食品、大豆加工品（豆腐、豆乳、納豆、凍豆腐）、水産加工品〔練り製品、（かに風味）蒲鉾、（魚肉）ハム、（魚肉）ソーセージ、（魚肉）ウィンナー、ふりかけ、お茶づけのり〕、卵含有食品（スープ、丼等）、缶詰（シーチキン、オイルサーディン、焼鳥）、レトルト食品（カレー、シチュー、スパゲティー）、みそ汁、スープ
（２）乳製品
牛乳、加工乳、乳酸菌飲料、バター、チーズ、練乳、粉乳
（３）調味料
味噌、醤油、うま味（風味）調味料、（粉末）天然調味料、ソース、ドレッシング、焼き肉のたれ、みりん、カレー、シチュー、香辛料、スパイス、ヨーグルト
【００１６】
（４）健康食品（栄養補助食品）
▲１▼サポニン含有食品（オタネニンジン根含有食品、エゾウコギ含有食品）▲２▼糖含有食品〔オリゴ糖（フラクトオリゴ糖含有食品、イソマルトオリゴ糖含有食品、ガラクトオリゴ糖含有食品）、多糖類（シイタケ含有食品、ムコ多糖、蛋白含有食品、コンドロイチン硫酸含有食品、マンネンタケ（霊芝）含有食品、キチン、キトサン含有食品）〕
▲３▼ミネラル含有食品（カルシウム含有食品、アルファルファ含有食品、プルーンエキス食品、β−カロチン含有食品）
▲４▼油脂含有食品
ビタミンＥ含有油脂〔麦（小麦、鳩麦）胚芽油、大豆胚芽油、米胚芽油〕エイコサペンタエン酸含有食品、大豆レシチン含有食品、γ−リノレン酸含有食品（月見草油、ボラージ油）、ドコサヘキサエン酸含有食品
▲５▼蛋白質含有食品
大豆蛋白含有食品、カゼイン、ホエー蛋白、鯉加工食品
▲６▼タウリン
かき加工食品、シジミ加工食品、緑イ貝加工食品
【００１７】
（５）その他
スッポン加工食品、アミノ酸代謝異常用食品、流動食（病食）
また、下記のような、糖を多量に含有する食品にも添加可能であるが、本発明の効果が明確に発現しない場合もあり、下記のような食品に添加する場合は、食品の製造時に糖含有量をできるだけ低くしたり、人工甘味量を用いて低糖分としたものに添加するのが好ましい。
（６）菓子
ケーキ、ムース、（粉末）デザート、アイスクリーム、飴、チョコレート、グミ、キャンディー、クッキー、ウエハース、ゼリー
（７）飲料
清涼飲料（炭酸飲料、果実飲料、スポーツドリンク、栄養飲料）、嗜好飲料（コーヒー、ココア、麦汁）
【００１８】
上記（１）〜（７）における添加量としては、上記食品に対して、乾燥粉末として、０．０１〜８０重量％が好ましく、特に１〜７０重量％が好ましい。
更に本発明の効果を阻害しない範囲で、甘味剤、保存剤、分散剤、着色剤、酸化防止剤等も併用することができる。更に、その他の公知のα−グルコシダーゼ阻害剤であるバリエナミンやアミノシクリトールなどのα−グルコシダ一ゼ阻害剤を併用してもよい。
【００１９】
【実施例】
以下本発明について例を挙げて具体的に説明する。尚、以下の記述で「％」とあるのは、特に断りのない限り重量％である。
実施例１
大豆１０００ｇを２５℃の水１０リットルに３時間浸漬して重量を１１００ｇにした後、蒸器に入れて１００℃で１時間蒸煮して１３００ｇの煮豆（塩分含有量は０．０５％）を得た。かかる煮豆を発酵室の竹かごの上に並べてに市販の醤油製造用のかび（株式会社樋口松之助商店製『マイルド・Ｓ』）１０ｇを均一にふりかけて添加して、３５℃、湿度１００ＲＨ％で７２時間固形培養した。培養終了後大豆を水で洗浄して大豆表面のかびを水洗し、室温で２４時間風乾して培養物８２０ｇを得た。
該培養物を４リットルの水に１時間浸漬後、該浸漬液をオートクレーブに入れて、１．４ｋｇ／ｃｍ2（ゲージ圧）、内温１３５℃で１時間抽出した。得られた抽出液からざるを用いて大きな残渣を除去した。得られた濾液と、該残渣に再度４リットルの水を加えてざるで濾過して得られた濾液とを合わせて、遠心分離（条件１０００×ｇ）した。得られた上澄み液にケイソウ土１００ｇを加えて撹拌して脱色し、濾過して抽出液７．８リットルを得た。その後ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤３２０ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを以下のように評価した。
【００２０】
（阻害活性）
・ラット小腸からの二（三）糖加水分解酵素（α−グルコシダーゼ）の調製
冷凍保存しておいたラット小腸（空腸）を解凍し、粘膜をピンセットで押出すように採取した。該粘膜に５倍重量の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、冷却しながらホモゲナイズした。その後遠心分離（４℃、２１０００×ｇ、６０分）し、得られた沈殿物に５倍重量になるように１％トリトンＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、可溶化処理（４℃、６０分）を行った。これを超遠心分離（４℃、１１００００×ｇ、９０分）し、この上清を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析（４℃、２４時間）し、酵素液とした。
【００２１】
・酵素（α−グルコシダーゼ）活性の測定
酵素活性は市販のキットを用い、基質としてはシュクロースを用いた。
標準反応液組成は、６０ｍＭ基質溶液（シュクロースを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．３に溶解したもの）０．７ｍｌ、被験物質溶液（それぞれの分画成分の水、有機溶剤を完全に除去した後、５０％ジメチルスルホキシド水溶液に溶解）０．２ｍｌ、上記酵素液０．１ｍｌ（計１．０ｍｌ）とした。これを３７℃、１５分間反応させ、２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌを用いて反応を停止させ試験液とした。
次に９６穴マイクロプレートに１穴あたり発色試薬〔グルコースＢテストワコー（和光純薬製）〕２００μｌに試験液５０μｌ（酢酸エチル等は留去したもの）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製、ＭＯＤＥＬ５５０）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。基質溶液の代りに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を加えた時の吸光度をブランク値とし、この値を差し引いた値をＡ490sとした。被験液の代りに５０重量％ジメチルスルホキシド水溶液を加えた時の吸光度をコントロール値（Ａ490c）とし、下式によりα−グルコシダーゼ阻害活性を求めた。測定は２回行い、平均値を測定値とした。
α−グルコシダーゼ阻害活性（％）＝[(Ａ490c−Ａ490s)/Ａ490c]×１００
【００２２】
（臭い）
得られた阻害剤の臭いを以下のように評価した。
○・・・全く無臭である。
△・・・かすかに納豆臭がする。
×・・・強い納豆臭がする。
【００２３】
（摂取し易さ）
○・・・塩辛くなく、大豆のうまみが出て摂取し易い。
×・・・塩辛いあるいは大豆特有の臭いが強くて１ｇ以上摂取するのは苦痛である。
【００２４】
実施例２
実施例１の終了後、実施例１と同じ発酵室において、かび（株式会社樋口松之助商店製『マイルド・Ｓ』）の替りに、実施例１で用いた竹かごに付着していた培養物中のかびで、同例と同じ煮豆を３５℃、湿度１００ＲＨ％で７２時間かびを固形培養し、培養終了後大豆を水で洗浄して大豆表面のかびを水洗し、室温で１２時間風乾して培養物８２０ｇを得た。
該培養物を４リットルの水に１時間浸漬後、該浸漬液をオートクレーブに入れて、１．４ｋｇ／ｃｍ2（ゲージ圧）、１３５℃で１時間抽出した。その後実施例１と同様に処理して抽出液７．８リットルを得、ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤３５０ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを実施例１と同様に評価した。
【００２５】
実施例３
実施例１において固形培養の温度を３７℃にした以外は同様に培養し培養物８２０ｇを得た。かかる培養物を陶器の器に入れて、蓋をして３５℃で４０日間後発酵させて培養物７８０ｇを得た。
該培養物を４ｌの水に１時間浸漬後、該浸漬液をオートクレーブに入れて、１．４ｋｇ／ｃｍ2（ゲージ圧）、１３５℃で１時間抽出した。その後実施例１と同様に処理して抽出液７．８リットルを得、ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤２９０ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを実施例１と同様に評価した。
【００２６】
実施例４
実施例１におけるオートクレーブに代えて、鍋を用いて抽出温度を６０℃にして抽出した。その後実施例１と同様に処理して抽出液７．８リットルを得、ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤２００ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを実施例１と同様に評価した。
【００２７】
比較例１
大豆１０００ｇを水１０リットルに３時間浸漬した後、蒸器に入れて１００℃で１時間蒸煮して１８００ｇの煮豆（塩分０．１％）を得た。かかる煮豆に塩を２００ｇ添加（塩分１０％）してから実施例１と同様に発酵させて培養物９６０ｇを得た。
該培養物を実施例１と同様に抽出し、同様に処理して抽出液８リットルを得、ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤４００ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを実施例１と同様に評価した。
【００２８】
比較例２
実施例１で得られた培養物８２０ｇを４ｌの水に１時間浸漬後、４０℃で１時間抽出した。その後実施例１と同様に処理して抽出液７．８リットルを得、ロータリーエバポレータで濃縮乾固して阻害剤６０ｇを得た。かかる阻害剤の阻害活性、臭い、摂取の容易さを同じく評価した。
【００２９】
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【００３０】
【発明の効果】
本発明では、煮沸した大豆を、培養系の塩分が５重量％以下となる条件でアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のかびで固形培養して得られた培養物から５０℃以上の水でα−グルコシダーゼ阻害剤を抽出することにより、摂取し易く、臭いもなく、強い阻害活性を示すα−グルコシダーゼ阻害剤が製造できる。