(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させることによりＧ６Ｐまたは／およびＮＡＤＰＨを不活性化させ；
この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定する
ことにより、該試料中の該特定成分を定量する方法。
【請求項２】
ＧＬＤＨが、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとの両方に作用できるＧＬＤＨである請求項１に記載の特定成分を定量する方法。
【請求項３】
試料中の特定成分を定量するためのキットであって、
ｉ）  α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びに、
ｉｉ）  酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬であってかつホスファターゼ及びＮＡＤＨを含む第２試薬
を含むキット。
【請求項４】
予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤＰ+依存性共役脱水素酵素、そのＮＡＤＰ+依存性共役脱水素酵素の基質及びＮＡＤＰＨを作用させることにより当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させることによりＮＡＤＰＨを不活性化させ；
この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定する
ことにより、該試料中の該特定成分を定量する方法。
【請求項５】
試料中の特定成分を定量するためのキットであって；
ｉ）α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤＰ+依存性共役脱水素酵素、そのＮＡＤＰ+依存性共役脱水素酵素の基質及びＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びに、
ｉｉ）酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬であってかつホスファターゼ及びＮＡＤＨを含む第２試薬
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分を定量する方法であって特に臨床検査において有効な方法である。
更に詳しくは、本発明は、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて発生したアンモニウムイオンに基づいて特定成分を測定する場合、試料中に当初から存在する内因性アンモニウムイオンを酵素反応により消去し、正確に該特定成分を測定する方法に関するものである。
更に本発明は、アンモニウムイオンに基づいて特定成分を測定する場合に限定されず、より広範囲の物質に基づいてより広範囲の特定成分を測定することのできる汎用性のある、試料中の特定成分を定量する方法である。
本明細書においては、次の常用される略語を使用することもある。
α−ＫＧ        ：  α−ケトグルタル酸
ＧＬＤＨ        ：  グルタミン酸脱水素酵素
ＮＡＤＨ        ：  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
ＮＡＤＰＨ      ：  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ：  ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを示す
ＮＡＤ＋          ：  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型
ＮＡＤＰ＋        ：  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型
ＮＡＤ（Ｐ）＋    ：  ＮＡＤ＋  またはＮＡＤＰ＋  を示す
Ｇ６Ｐ          ：  グルコース６−リン酸
Ｇ６ＰＤＨ      ：  グルコース６−リン酸脱水素酵素
ＡＴＰ          ：  アデノシン５′−三リン酸
ＧＴＰ          ：  グアノシン５′−三リン酸
【０００２】
【従来の技術】
試料中の特定成分を測定するとき、試料等にアンモニウムイオンが存在すると、その特定成分を正確に測定できないことがある。例えば、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、そのアンモニウムイオンの量を測定することにより、該特定成分の量を測定する場合、その試料に当初からアンモニウムイオンが含まれているときは、該特定成分の量を正確に測定できにくい。
そのような特定成分として、尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルシウムイオン等が知られている。これらの成分は、以下の式のように、アンモニウムイオンを酵素反応により発生させて、測定できる。
【０００３】
【化１】
ウレアーゼによる尿素窒素の測定
0003614967.tif 000002
【０００４】
【化２】
0003614967.tif 000003
【０００５】
【化３】
0003614967.tif 000004
【０００６】
【化４】
0003614967.tif 000005
【０００７】
【化５】
0003614967.tif 000006
【０００８】
【化６】
0003614967.tif 000007
【０００９】
上記式に示されるように酵素反応によりアンモニウムイオンを発生させて特定成分を測定しようとするとき、試料中に当初からアンモニウムイオンが存在する場合にかかる内因性アンモニウムイオンが測定値に正誤差を与えて、該特定成分を正確に測定することはできない。そのため、内因性アンモニウムイオンを、あらかじめ、消去しておくことが必要となる。一方、尿素窒素などの測定すべき試料中の生体成分は不安定であるため、測定はなるべく迅速に、しかもできるだけ温和な条件で行われるのが望ましい。この様な条件に適している内因性アンモニウムイオンの消去方法は、酵素を使用した方法である。そのような方法として、以下の式に示されるように、内因性アンモニウムイオンとα−ＫＧとをＧＬＤＨの存在下、グルタミン酸に変換させて該アンモニウムイオンを消去する方法（ＧＬＤＨ法）が考えられる。
【００１０】
【化７】
0003614967.tif 000008
【００１１】
この方法は、補酵素として、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用しなければならない。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは３２０〜３６０ｎｍの領域の波長に大きな吸収をもつ。一方、測定しようとする試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて特定成分を測定するときも、前記した反応式から明らかなように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いており、従ってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの反応前後のこの領域の波長における吸光度の増減を利用して測定することも多い。この場合、該特定成分を測定しようとすると、試料中の内因性アンモニウムイオンを消去するために用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが残存し、そのためＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が多くなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの干渉をうけ、測定可能な吸光度の範囲を越えてしまい、該特定成分の測定値が正確でなくなることがある。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自身は、還元作用があるので、大量に使用すると、試料中の特定成分を測定する方法のうちでも特に酸化反応を利用して特定成分を測定しようとする方法に悪影響を与える。よって、従来のＧＬＤＨ法により内因性アンモニウムイオンを消去するときは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを大量に使用しなければならないので、ＧＬＤＨ法による消去方法は、使用しにくいという欠点がある。
【００１２】
ＧＬＤＨ法の改良法で、かつ、少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用する方法も、提案されている。すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが酸化されて生じるＮＡＤ（Ｐ）＋  を、ＧＬＤＨ以外の脱水素酵素（以下、共役脱水素酵素と記載することもある）とその基質の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生することで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを少量にする方法も知られている。このような共役脱水素酵素を用いる方法としては、以下の式に示すように、イソクエン酸及びイソクエン酸脱水素酵素を用いるイソクエン酸脱水素酵素法（特開昭６２−６７００）、グルコース及びグルコース脱水素酵素を用いるグルコース脱水素酵素法（特開平５−１０３６９７）が知られている。
【００１３】
【化８】
0003614967.tif 000009
【００１４】
イソクエン酸脱水素酵素法においては、用いられるイソクエン酸脱水素酵素は、金属要求性なので、ＥＤＴＡ等のキレート化剤を添加することにより、反応が停止する。従ってこのキレート化剤を、アンモニウムイオンの消去反応後に特定成分の測定に用いる試薬と一緒に添加することにより、アンモニウムイオンの消去反応を停止させるとともに、目的とする特定成分の定量を行う方法が採用されている。一方、臨床検査分野では、一般に、血液を採取する際、血液を凝固をさせないためにＥＤＴＡやクエン酸等のキレート化剤を血液に添加し、カルシウムイオンをキレート化する。このような処理をした生体試料を測定するとき、上記のイソクエン酸脱水素酵素法では、イソクエン酸脱水素酵素の反応が阻害され、アンモニウムイオンの消去反応が阻害されやすい。また、試料中の特定成分として臨床的に意義があるロイシンアミノペプチダーゼを測定する際に、前記反応式で示したようにロイシンアミドを基質に用いる場合、内因性アンモニウムイオンの存在は測定誤差を及ぼすので、あらかじめ消去することが望ましいが、イソクエン酸脱水素酵素法を用いると、キレート化剤が試薬中に存在することになるので、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋で活性化されるロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害してしまう。さらに、前記反応式で示したようにトランスグルタミナーゼによって試料中の特定成分としてカルシウムイオンを定量しようとするときも、内因性のアンモニウムイオンを消去することが望ましいが、キレート化剤を利用するイソクエン酸脱水素酵素法を用いると、カルシウムイオンがキレート化されてしまうので、使用できない。このように、金属要求性の酵素を用い、かつ、アンモニウムイオンが反応中間体である試料中の特定成分の測定方法においては、内因性アンモニウムイオンの消去法としては、このようなイソクエン酸脱水素酵素法は適切ではない。
【００１５】
一方、グルコース脱水素酵素法においても、該酵素法で基質として使用されるグルコースの影響により測定できる特定成分の範囲が限定される等の問題がある。
即ち、臨床検査分野用の自動分析装置を用いる場合、尿素窒素などと同時にグルコースを測定することが一般化されているので、グルコース脱水素酵素法においては、基質として用いるグルコースがグルコースの測定系に影響を及ぼす可能性がある。そのため、この分野でのグルコース脱水素酵素法の使用は限定されてしまう。
また、グルコース脱水素酵素法の問題点のひとつに、グルコース脱水素酵素の阻害剤に適当なものがないことがあげられる。現に、特開平５−１０３６９７に記載されている阻害剤は、モノヨード酢酸であるが、モノヨード酢酸は、タンパク質、特に酵素のＳＨ基に特異的に反応する物質の一種で、アルコール脱水素酵素やホスホグリセルアルデヒド脱水素酵素等の、活性中心にＳＨ基をもつ酵素の活性を阻害してしまう物質であるため、このような阻害剤を用いると、試料中の特定成分の測定に利用する酵素が限定されてしまう。
したがって、試料中の特定成分を測定する方法で内因性アンモニウムイオンが存在すると特定成分を正確に測定できない場合において、使用に際して汎用性をもち、かつ、特定成分を正確に測定できる、内因性アンモニウムイオンの消去方法が求められていた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中に、アンモニウムイオンが当初から存在すると特定成分を正確に測定できない場合、あらかじめ、その試料中のアンモニウムイオンを消去する方法を提供することである。また、試料中のアンモニウムイオンを消去することにより、試料中の該特定成分を正確に測定する方法及びそれに用いるキットを提供することである。
更に本発明は、アンモニウムイオンに基づいて特定成分を測定する場合に限定されず、より広範囲の物質に基づいてより広範囲の特定成分を測定することができる汎用性のある、試料中の特定成分を測定する方法及びそれに用いるキットを提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
〔Ａ〕本発明者らは、上記現状に鑑み、試料中に予め存在するアンモニウムイオンの影響を受けない、試料中の特定の生体成分の正確な測定方法について鋭意、検討した。その結果、内因性アンモニウムイオンに、α−ＫＧとＧＬＤＨとを作用させて内因性アンモニウムイオンをグルタミン酸に変換させるＧＬＤＨによる内因性アンモニウムイオンの消去法において、Ｇ６ＰＤＨを共役脱水素酵素として用いるＧＬＤＨ法の改良法、即ち、内因性アンモニウムイオンに、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、高濃度の内因性アンモニウムイオンを短時間で消去できることを見い出した。
また、かかるアンモニウムイオンの消去反応後に、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させながら、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ及びＧＬＤＨをＮＡＤＰＨではなくＮＡＤＨとともに作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、試料中の特定成分を正確に精度良く測定できることを見出した。
また、かかるアンモニウムイオンの消去反応後に、特にホスファターゼを作用させてＧ６Ｐおよび／またはＮＡＤＰＨを不活性化させ、この不活性化と同時もしくはその後に、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、試料中の特定成分を極めて正確に精度良く測定できることを見出した。
本発明は上記した知見に基づいて完成されたものである。
【００１８】
従って、本発明は、試料にα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去することを特徴とする、該アンモニウムイオンの消去方法である。
更に本発明は、予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；
次いで、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させながら、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定する
ことにより、該試料中の該特定成分を定量する方法である。
更に本発明は、予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させることによりＧ６Ｐまたは／およびＮＡＤＰＨを不活性化させ；
この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定する
ことにより、該試料中の該特定成分を定量する方法である。
【００１９】
更に本発明は、試料中の特定成分を定量するためのキットであって、
ｉ）  α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びに、
ｉｉ）  酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬であってかつＮＡＤＨを含む第２試薬
を含むキットである。
更に本発明は、上記のキットにおいて、第２試薬に更にホスファターゼを含む試料中の特定成分を測定するためのキットである。
【００２０】
〔Ｂ〕上記〔Ａ〕において述べた発明のうち、アンモニウムイオンの消去反応後に、特にホスファターゼを作用させてＧ６Ｐおよび／またはＮＡＤＰＨを不活性化させ、この不活性化と同時もしくはその後に、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンを測定することにより、試料中の特定成分を測定する発明に基づいて、本発明者らは更に検討を行った。
その結果、消去反応後にホスファターゼを作用させて、消去反応に用いた試薬を不活性化させる手法は、アンモニウムイオンに基づいて試料中の特定成分を測定する場合に限定されず、より広範囲の物質に基づいてより広範囲の特定成分を測定する方法に適用できることを見出し、更に汎用性のある本発明の方法を完成させた。
【００２１】
従って、更に本発明は、予め、試料に、特定物質除去酵素反応のための必須成分としてホスファターゼの基質となり得る成分を含む特定物質除去酵素反応試薬を、作用することにより、当初から試料中に存在している特定物質を消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させることによりホスファターゼの基質となり得るその成分を不活性化させ；
この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により特定成分から特定物質を生成させる試薬を作用し、生成した特定物質を定量する
ことを特徴とする試料中の特定成分を定量する方法である。
更に本発明は、試料中の特定成分を定量するためのキットであって；
ｉ）  特定物質除去酵素反応のための必須成分としてホスファターゼの基質となり得る成分を含む、特定物質除去酵素反応試薬；及び
ｉｉ）酵素作用により特定成分から特定物質を発生させて特定成分を測定する試薬であって、かつ、ホスファターゼを含む特定成分測定用試薬；
を含むキットである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
上記〔Ａ〕及び〔Ｂ〕において述べた発明について、以下に詳細に説明する。
【００２３】
〔Ａ〕−１．本発明のアンモニウムイオン消去方法
本発明のアンモニウムイオン消去方法は、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去することを特徴とする、該アンモニウムイオンの消去方法である。
本発明のアンモニウムイオン消去方法を式で示すと以下の通りである。
【００２４】
【化９】
0003614967.tif 000010
【００２５】
〔Ａ〕−２．本発明の特定成分定量方法
本発明の特定成分定量方法は、本発明のアンモニウムイオン消去方法を利用したものである。すなわち、本発明の特定成分定量方法は、予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；次いで、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させながら、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、該試料中の該特定成分を定量する方法である。
【００２６】
本発明の特定成分定量方法は、アンモニウムイオンの消去反応（以下、第１段階と記載することもある）、次いで、特定成分の測定反応（以下、第２段階と記載することもある）の２段階により実施できる。
第１段階では、予め、試料にα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去する。
第１段階終了の後、第２段階では、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させながら、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより試料中の特定成分を定量する。
【００２７】
本発明の特定成分定量方法を、特定成分として試料中の尿素窒素を測定する場合を例にとって式で示すと以下のようになる。
【００２８】
【化１０】
試料中の尿素窒素の測定
第１段階
0003614967.tif 000011
第２段階
【化１１】
0003614967.tif 000012
【００２９】
本発明の特定成分定量方法は、上記式から判るように、第１段階及び第２段階とも、α−ＫＧ及びＧＬＤＨの作用により、アンモニウムイオンがグルタミン酸に変換する反応を含む。しかし、第１段階ではＧＬＤＨが作用する補酵素はＮＡＤＰＨであり、第２段階ではＧＬＤＨが作用する補酵素はＮＡＤＨであり、この点が相異なる。
本発明の特定成分定量方法の第１段階では、ＮＡＤＰＨは、アンモニウムイオンを消去するために作用させる成分の１つであるが、少量にできることに特徴がある。アンモニウムイオン消去の際、ＮＡＤＰＨは、α−ＫＧ、グルタミン酸及び当初から試料中に存在するアンモニウムイオンの作用によりＮＡＤＰ＋  に変換される。第１段階では、同時に、そのＮＡＤＰ＋  は、Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐの作用によりＮＡＤＰＨに戻され、戻されたＮＡＤＰＨは、さらに、アンモニウムイオン消去反応に再使用される。したがって、第１段階ではアンモニウムイオンを消去するためのＮＡＤＰＨは少量ですむ。
【００３０】
本発明の特定成分定量方法では、第２段階においてＮＡＤＨの減少を測定することによって、試料中の特定成分を定量する。
ところで、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの水溶液の濃度を測定するときは、それらは互いに類似した性質を持つので、互いに同様な方法で測定することが多い。そのため、水溶液中のＮＡＤＨを測定するときは、ＮＡＤＰＨが混在していると測定しにくいことが多い。
例えば、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨの水溶液とは、ともに波長３２０〜３６０ｎｍの領域で吸収をもつので、その波長領域におけるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの水溶液の吸光度を測定することにより、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの濃度を測定できる。そこで、本発明の特定成分定量方法の第２段階で試料中のＮＡＤＨの減少を波長３２０〜３６０ｎｍでの吸光度で測定することにより試料中の特定成分を定量する場合に、高濃度のＮＡＤＰＨが反応液に混在するときには、波長３２０〜３６０ｎｍにおける反応液の吸光度は、測定可能範囲である吸光度値２程度を大きく越えてしまうときがあり、試料中のＮＡＤＨの減少を波長３２０〜３６０ｎｍでの吸光度で測定することができにくい問題がある。
【００３１】
一方、本発明の特定成分定量方法においては、第２段階での反応液中に、第１段階で使用したＮＡＤＰＨが存在している。しかし、本発明の特定成分定量方法においては、そのＮＡＤＰＨは少量なので、第２段階で、試料中のＮＡＤＨの減少を波長３２０〜３６０ｎｍでの吸光度で測定する際、反応液の吸光度を、測定可能範囲である吸光度値２以下に調整できる。
第２段階では、ＮＡＤＨの減少量を測定することにより試料中の特定成分を定量する。
すなわち、酵素作用により試料中の特定成分から生成したアンモニウムイオンは、ＧＬＤＨとα−ＫＧの作用により、波長３２０〜３６０ｎｍに吸収を持つＮＡＤＨを、波長３２０〜３６０ｎｍにほとんど吸収を持たないＮＡＤ＋  に変化させる。従って、その波長の反応液の吸光度の減少量を測定することにより、そのＮＡＤＨの減少を測定でき、また一方、ＮＡＤＨの減少量は、酵素作用により試料中の特定成分から生成したアンモニウムイオンの量に依存するので、ＮＡＤＨの減少量を測定することにより試料中の特定成分の量を定量することができる。
【００３２】
しかし、第２段階では、酵素作用により試料中の特定成分から生成したアンモニウムイオンは、第１段階で使用し残存しているＮＡＤＰＨにも作用する。第２段階では、試料中の特定成分の測定は、該アンモニウムイオンによるＮＡＤＨへの作用に依存するので、該アンモニウムイオンによるＮＡＤＰＨへの作用は、特定成分定量の際、誤差の原因になる。
この残存ＮＡＤＰＨの影響を回避するには、Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤＰ＋  依存性酵素であり、ＮＡＤ＋  及びＮＡＤＨには作用しないことを利用するが、通常、主に、以下に示す２つの方法を採用するのが好ましい。
【００３３】
ｉ）ＮＡＤＰＨの使用量をＮＡＤＨの使用量より少なくする方法
第１段階で用いたＮＡＤＰＨの残存ＮＡＤＰＨの影響を回避する一つの方法は、第１段階では、ＮＡＤＰＨの使用量を、第２段階のＮＡＤＨの使用量に比べ、極端に少なく、すなわち、好ましくは１／１０以下の重量、より好ましくは１／２００〜１／２０の重量にする方法である。
【００３４】
このような条件下では、第２段階では、酵素作用により特定成分から発生するアンモニウムイオンは、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとに作用するが、ＮＡＤＨの量がＮＡＤＰＨに比べ多いので、ほとんどＮＡＤＨに作用する。一方、この第２段階では、第１段階で使用され第２段階で残存しているＧ６ＰＤＨおよびＧ６Ｐは、ＮＡＤ＋  には作用しないが、ＮＡＤＰ＋  には作用する。そのため、特定成分から発生したそのアンモニウムイオンの作用によりＮＡＤＰＨから変換されたＮＡＤＰ＋  は、Ｇ６ＰＤＨおよびＧ６Ｐの作用により、ＮＡＤＰＨに戻される。すなわち、第２段階の系では、ＮＡＤＰＨの減少は見掛上、起こりにくく、系内のＮＡＤＰＨ量はほぼ一定で、ＮＡＤＨの減少のみが起こる。したがって、ＮＡＤＰＨによる特定成分定量への影響がほぼ無視できる。
【００３５】
ｉｉ）  ホスファターゼを利用する方法
第１段階で用いたＮＡＤＰＨの残存ＮＡＤＰＨの影響を回避する他の方法は、予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；次いで、ホスファターゼを作用させてＧ６Ｐまたは／およびＮＡＤＰＨを不活性化させ、この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより；該試料中の該特定成分を定量する方法である。
【００３６】
この方法では、第２段階でホスファターゼを作用させることに特徴がある。
Ｇ６Ｐまたは／およびＮＡＤＰＨを不活性化させるとは、Ｇ６Ｐまたは／およびＮＡＤＰＨのリン酸エステル部分を加水分解し、Ｇ６ＰＤＨの酵素反応を実質的に消去することをいう。
ホスファターゼを利用する方法を、特定成分として試料中の尿素窒素を測定する場合を例にとって示すと以下の式のようになる。
【００３７】
【化１２】
試料中の尿素窒素の測定
第１段階（アンモニウムイオン消去反応）
0003614967.tif 000013
第２段階
アンモニウムイオン消去反応の停止
0003614967.tif 000014
【００３８】
ホスタファーゼを利用する方法の場合、通常、第１段階で、試料に、後述する本発明のキットの構成成分の１つであるα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ及びＮＡＤＰＨを含む第１試薬を添加して当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去した後、得られる溶液に、第２段階では、本発明のキットのもう１つの構成成分である、酵素反応により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる第２試薬中にホスファターゼを含むものを、添加して、試薬中の特定成分を定量できる。
【００３９】
この方法の場合、ホスファターゼを含む第２試薬の添加の後、初めのうちは、酵素作用により試料中の特定成分から生成するアンモニウムイオンは、α−ＫＧ及びＧＬＤＨの作用により、ＮＡＤＨとともに、ＮＡＤＰＨをも減少させ、それぞれ、ＮＡＤ＋  、ＮＡＤＰ＋  に変換させる。このとき、ＮＡＤＨの減少もＮＡＤＰＨの減少も、反応液の波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度の減少をさせる。したがって、ＮＡＤ＋  またはＮＡＤＰ＋  が、それぞれ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに戻らなければ、酵素作用により試料中の特定成分から生成するアンモニウムイオンは、反応液の波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度の減少に反映し、その結果、反応液の波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度の減少を測定すれば、試料中の特定成分を正確に測定できるはずである。しかし、第１段階で使用し第２段階で残存しているＧ６ＰＤＨと、Ｇ６Ｐとは、その変換されたＮＡＤ＋  をＮＡＤＨに戻さないが、その変換されたＮＡＤＰ＋  をＮＡＤＰＨに戻す。そのため、第２段階の初めのうちは、反応液の波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度の減少を測定しても、試料中の特定成分を正確に測定できにくい。
【００４０】
一方、この方法の第２段階では、ホスファターゼはＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに、Ｇ６Ｐをグルコースに、それぞれ変換して、Ｇ６ＰＤＨの反応を実質的に停止する。ホスファターゼの作用によりＮＡＤＰＨまたは／およびＧ６Ｐが実質的に不活性化された後は、酵素作用により試料中の特定成分から生成するアンモニウムイオンは、α−ＫＧ及びＧＬＤＨの作用により、ＮＡＤＰＨによる影響なしで、ＮＡＤＨのみをＮＡＤ＋  に変換させる。その結果、ホスファターゼの作用によりＮＡＤＰＨまたは／およびＧ６Ｐが実質的に消去された後には、反応液の波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度の減少は、ＮＡＤＨの減少に依存する結果、波長３２０〜３６０ｎｍにおける一定時間当たりの反応液の吸光度の減少を測定することにより、試料中の特定成分を正確に測定できる。
【００４１】
〔Ａ〕−３．試料中の特定成分を定量するためのキット
以上に述べた本発明の特定成分定量方法は、本発明のキットを用いて実現できる。
本発明のキットは、
試料中の特定成分を定量するキットであって、
ｉ）  α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ、及びＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びに、
ｉｉ）  酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬であってかつＮＡＤＨを含み、好ましくは更にホスファターゼを含む第２試薬
を含むキットである。
すなわち、本発明の特定成分定量方法は、試料に、本発明のキットに用いる第１試薬を加えて、第１段階の反応をすることにより試料中のアンモニウムイオンを消去し、次いで、第１段階終了後の溶液に、そのまま、本発明のキットに用いる第２試薬を加えて第２段階の反応・測定することにより特定成分を定量して実現できる。
【００４２】
本発明のキットは、ＧＬＤＨの種類からは、次のものが好ましい。
ｉ）本発明のキットにおいて、第１試薬に用いるＧＬＤＨがＮＡＤＰ＋  依存性ＧＬＤＨ、若しくはＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとの両方に作用できるＧＬＤＨであり、かつ、第２試薬にＮＡＤ＋  依存性ＧＬＤＨを含むキット；
ｉｉ）本発明のキットにおいて、第１試薬に用いるＧＬＤＨがＮＡＤＰ＋  依存性ＧＬＤＨであり、かつ、第２試薬にＮＡＤ＋  依存性ＧＬＤＨ、若しくはＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとの両方に作用できるＧＬＤＨを含むキット；または
ｉｉｉ）本発明のキットにおいて、第１試薬に用いるＧＬＤＨが、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとの両方に作用できるＧＬＤＨであり、かつ、第２試薬にＧＬＤＨを含まないキット
を用いるのが好ましい。
上記ｉ〜ｉｉｉ）のキットのうち、特に上記ｉｉｉ）のキットが、試薬を調製するとき簡単で、好ましい。
【００４３】
〔Ａ〕−４．本発明のアンモニウムイオン消去方法、特定成分定量
方法及びキットについての詳細な説明
以上に述べた本発明のアンモニウムイオン消去方法、特定成分定量方法及びキットについて、以下に更に詳細に説明する。
【００４４】
本発明において、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンもしくは内因性アンモニウムイオンとは、主に、測定処理前から試料中に存在していたアンモニウムイオンを言う。ただし、本発明のキットに用いる第１試薬に混在しているアンモニウムイオンも含めるものとする。
【００４５】
本発明において、試料とは、特定成分を含むものであれば特に限定しない。血清、血しょう、尿、及びそれらを処理した液、並びにそれらのモデルサンプルを例示できる。汎用の生化学自動分析装置を使用するときは、試料は、通常、１〜１００μｌ  使用すると良い。
【００４６】
本明細書において、ＧＬＤＨは、ＥＣ１．４．１．３のように、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとの両方に作用できるものが好ましい。
本発明のキットに用いられる第１試薬のＧＬＤＨの濃度は、特に限定されないが、好ましくは１０〜５００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは２０〜２００ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
第１試薬のαーＫＧの濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは５〜１５ｍＭである。
第１試薬に用いられるＧ６ＰＤＨは、ＮＡＤＰ＋  に反応し、かつ、ＮＡＤ＋  に反応しないものであれば、由来は特に限定されない。第１試薬のＧ６ＰＤＨの濃度は、好ましくは１〜５０ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１０ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
第１試薬のＧ６Ｐの濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは５〜１５ｍＭである。
【００４７】
本発明のキットに用いられる第１試薬のＮＡＤＰＨの濃度及び第２試薬のＮＡＤＨの濃度は、第１試薬と第２試薬とを混合した直後の液の、波長３２０〜３６０ｎｍでの吸光度が、測定可能領域である吸光度値２以下であるように調製することが好ましい。
本発明のキットに用いられる第１試薬のＮＡＤＰＨの濃度は、通常、０．０１〜０．４ｍＭ、好ましくは０．０３〜０．３ｍＭである。
前記した本発明の特定成分定量方法の第１段階であるアンモニウムイオン消去反応に用いられるＮＡＤＰＨの量は、第２段階である特定成分の測定反応に用いられるＮＡＤＨの量と比べて、通常、同程度か少なくてよく、好ましくはＮＡＤＨの量の０．０５〜１倍、さらに好ましくは０．１〜０．５倍の範囲である。前記したように、第１段階で用いたＮＡＤＰＨの残存ＮＡＤＰＨの第２段階における影響を回避するためにホスファターゼを使用しない場合には、特にＮＡＤＰＨの量は、ＮＡＤＨの１／１０以下が好ましく、特に１／２００〜１／２０が好ましい。このような観点からも第１試薬のＮＡＤＰＨの濃度が決定される。アンモニウムイオンの消去に必要なＮＡＤＰＨの量は、少ないと反応が進みにくいことがある。第１試薬のｐＨは、通常９〜１１である。適当な緩衝剤を用いて第１試薬を調製することができる。
以上に述べた第１試薬を試料に添加することによってアンモニウムイオン消去反応を実施することができる。
【００４８】
本発明のキットにおける、酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成する試薬に用いられる第２試薬の成分のうち、第１試薬に含まれているものは、省略することができる。例えば、試料中の尿素窒素を定量するキットの場合、ＧＬＤＨやα−ＫＧを省略することができる。本発明のキットに用いられる第２試薬のＮＡＤＨの濃度は、通常、０．２５〜１．２５ｍＭ、好ましくは０．４〜１．０ｍＭである。
第２試薬にホスファターゼを含ませる場合、第２段階で残存していると考えられるＮＡＤＰＨの量に応じてホスファターゼの量を決定すれば良いが、通常、１〜５０ｕｎｉｔ／ｍｌ、好ましくは５〜３０ｕｎｉｔ／ｍｌである。
第２試薬に用いるホスファターゼは、ＮＡＤＰＨまたは／およびＧ６Ｐを不活性化するものであれば限定しないが、反応性の良好さから、通常、アルカリホスファタ−ゼが好ましい。
本発明の特定成分定量方法では、試料１容量に対し、本発明のキットに用いる第１試薬を、通常１０〜２００容量、好ましくは８０〜１２０容量用いるとよい。また、試料１容量に対し、第２試薬を、通常２〜５０容量、好ましくは２０〜４０容量用いるとよい。
【００４９】
本発明の特定成分定量方法では、通常、試料と、本発明のキットに用いる第１試薬とを混合し、１〜２０分、好ましくは１〜１０分、混合液を撹拌し、さらに、その混合液と本発明のキットに用いる第２試薬とを混合し、１〜１０分、好ましくは１〜５分撹拌する。その第２試薬にホスファターゼを含むときは、その第２試薬が混合されたことにより、ホスファターゼの作用によりＮＡＤＰＨまたは／およびＧ６Ｐが実質的に消去された後、すなわち、通常、第２試薬が混合されて１〜５分経過した後、好ましくは１〜３分経過した後に、一定時間当たりのＮＡＤＨの減少量を測定することにより試料中の特定成分を定量することができる。
【００５０】
本発明の特定成分定量方法の第１段階である第１試薬を用いたアンモニウムイオン消去反応において、反応溶液のｐＨは、好ましくは７〜１１、さらに好ましくは８〜９．５である。ｐＨが７未満または１１を越えると、反応が進行しにくいことがある。アンモニウムイオン消去反応のための緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液等を使用できる。アンモニウムイオン消去反応の温度は、通常、１０〜５０℃である。
【００５１】
本発明の特定成分定量方法において、酵素作用によりアンモニウムイオンを発生させることができる定量可能な特定成分としては、
ウレアーゼの作用による尿素窒素、クレアチニンデイミナーゼ作用によるクレアチニン、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼの作用によるクレアチニン、クレアチナーゼの作用によるクレアチン、自己の作用によるロイシンアミノペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼの作用によるカルシウムイオンを例示できる。これらの特定成分の測定については、前記した「従来の技術」の項において反応式によって示した通りである。
【００５２】
ウレアーゼの作用による試料中の尿素窒素の測定方法に用いる試薬としては、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。第１段階で試料中のアンモニウムイオンを、本発明のアンモニウムイオン消去方法で消去し、第２段階で試料中の尿素窒素からウレアーゼ等の作用によりアンモニウムイオンを生成させながら、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、およびＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、試料中の尿素窒素を測定できる。この第２段階では、ホスファターゼの作用により、第１段階で使用し第２段階で残存するＮＡＤＰＨまたは／およびＧ６Ｐを実質的に消去することが好ましい。
【００５３】
試料中のクレアチニンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチニンデイミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。または、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００５４】
試料中のクレアチンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００５５】
試料中のロイシンアミノペプチダーゼの測定方法に用いる試薬としては、ロイシンアミド、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００５６】
試料中のカルシウムイオンの測定方法に用いる試薬としては、トランスグルタミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。通常、これらの特定成分の測定反応のための試薬を第２試薬として、試料中の特定成分を測定するキット中に含むことができる。ただし、これらの試薬の中で、アンモニウムイオンの本発明消去反応に含まれている成分に関しては、省略することができる。
【００５７】
上記した特定成分であるクレアチニン、クレアチン、ロイシンアミノペプチダーゼ及びカルシウムイオンを測定するために用いる各試薬は、従来採用されている公知の量を用い、公知の条件下で、試料中の特定成分と反応させて酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを発生させる。次いでこの発生したアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨおよびＮＡＤＨが作用し、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、特定成分であるクレアチニン、クレアチン、ロイシンアミノペプチダーゼ及びカルシウムイオンをそれぞれ測定することができる。
【００５８】
〔Ｂ〕−１．ホスファターゼを利用した汎用性のある本発明の特定成分定量方法
以下に、ホスファターゼを利用した汎用性のある本発明の特定成分定量方法について詳述する。
前記〔Ａ〕−２のｉｉ）  の項において説明した、アンモニウムイオン消去反応後にホスファターゼを作用させて、消去反応に用いた試薬を不活性化させる手法は、アンモニウムイオンに基づいて試料中の特定成分を測定する場合に限定されず、より広範囲の物質に基づいてより広範囲の特定成分を測定する方法に適用できることを見出し、汎用性のある本発明の特定成分定量方法を完成させた。
【００５９】
本発明のホスファターゼを利用した汎用性のある特定成分定量方法は、
予め、試料に、特定物質除去酵素反応のための必須成分としてホスファターゼの基質となり得る成分を含む、特定物質除去酵素反応試薬を、作用することにより当初から試料中に存在している特定物質を消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させてホスファターゼの基質となり得るその成分を不活性化させ；
この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により特定成分から特定物質を生成させる試薬を作用し、生成した特定物質を定量する
ことを特徴とする試料中の特定成分を定量する方法
である。
ここで、特定物質とは、前記〔Ａ〕の発明の項において述べたアンモニウムイオンに相当する物質であり、試料中の特定成分を定量する際に、該特定成分から生成させる物質であり、この特定物質を実際に定量することによって、試料中の特定成分を定量することができる。
【００６０】
本発明のホスファターゼを利用した汎用性のある特定成分定量方法においては、まず、第１段階の特定物質除去酵素反応試薬を用いた酵素反応では、ホスファターゼの基質となり得る成分を必須成分として用いて特定物質を消去する。次いで、第２段階では、ホスファターゼを添加して、第１段階で用いたホスファターゼの基質となり得るその成分を不活性化することにより、その特定物質除去酵素反応を実質的に中止しながら、これと同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分から特定物質を生成させる試薬を作用させて、生成する特定物質を定量することにより、試料中に当初から存在する特定物質の影響を排し、試料中の特定成分を正確に測定することができる。
【００６１】
本発明の特定成分定量方法の第２段階においては、ホスファターゼを作用させた初期のうちは、酵素作用により特定成分から生成する特定物質は、特定物質除去酵素反応に、一部消費されるので、そのため、その特定物質を正確に測定することは難しい。しかし、ホスファターゼの作用により、第１段階の必須成分であり第２段階で残存しているホスファターゼの基質が、実質的に消去されると、特定物質除去酵素反応は、実質的に停止される。したがって、特定物質除去酵素反応が実質的に停止された後、一定時間当りの、酵素作用により特定成分から生成する特定物質の変化量を測定することにより、試料中の特定成分を正確に測定できる。なお、試料中の特定成分を正確に測定するため、第２段階で添加したホスファターゼは、第２段階中、酵素作用により特定成分から特定物質が生成される反応、および特定物質を測定するための反応には関与しないことが好ましい。
【００６２】
〔Ｂ〕−２．特定成分定量方法のためのキット
本発明のホスファターゼを利用した汎用性のある特定成分定量方法は、本発明の以下のキットを用いて実現できる。
本発明のキットは、試料中の特定成分を定量するキットであって；
ｉ）  特定物質を除去する酵素反応のための必須成分としてホスファターゼの基質となり得る成分を含む、特定物質除去酵素反応試薬及び
ｉｉ）酵素作用により特定成分から特定物質を発生させて特定成分を測定する試薬であって、かつ、ホスファターゼを含む特定成分測定用試薬；
を含むキットである。
【００６３】
〔Ｂ〕−３．特定成分定量方法の具体的な説明
本発明の特定成分定量方法において、特定物質除去酵素反応のための必須成分としてホスファターゼの基質となり得る成分としては、具体的には、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＧＴＰを例示できる。
ホスファターゼの基質となり得る成分がＮＡＤＰＨの場合は、測定対象となる試料中の特定成分として、尿素窒素、クレアチニン等を例示できる。ホスファターゼの基質となり得る成分がＡＴＰの場合は、特定成分として、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼを例示できる。ホスファターゼの基質となり得る成分がＧＴＰの場合は、特定成分として、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼを例示できる。
以下に、それぞれの特定成分定量方法について具体的に説明する。
【００６４】
ｉ）ＮＡＤＰＨをホスファターゼの基質となり得る成分として用いた特定成分定量方法
ＮＡＤＰＨをホスファターゼの基質となり得る成分として用いた本発明の特定成分定量方法においては、アンモニウムイオンが特定物質に相当する。従って、先ず、試料に、ＮＡＤＰＨを含むアンモニウムイオン除去酵素反応試薬を作用させて、当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し、次いでホスファーゼを作用させてＮＡＤＰＨを不活性化し、酵素反応により測定しようとする試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬を作用させて、生成したアンモニウムイオンを定量することによって、特定成分を定量できる。
【００６５】
かかる定量方法において、ＮＡＤＰＨを含むアンモニウムイオン除去酵素反応試薬として、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素、そのＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素の基質及びＮＡＤＰＨからなる試薬が挙げられる。また、試料中の特定成分の定量方法としては、特定成分から生成させたアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤＨを作用させて、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、試料中の特定成分を定量する方法が好ましく挙げられる。
【００６６】
従って、ＮＡＤＰＨをホスファターゼの基質としてなり得る成分として用いた本発明の特定成分定量方法の好ましい例として、以下の方法が挙げられる。
即ち、予め、試料に、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素、そのＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素の基質及びＮＡＤＰＨを作用させることにより当初から試料中に存在するアンモニウムイオンを消去し；
次いで、ホスファターゼを作用させることによりＮＡＤＰＨを不活性化させ；この不活性化と同時もしくはその後、酵素作用により試料中の特定成分からアンモニウムイオンを生成させ、生成するアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、及びＮＡＤＨを作用させ、そのＮＡＤＨの減少を測定する
ことにより該試料中の該特定成分を定量する方法である。
第１段階のα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素、そのＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素の基質及びＮＡＤＰＨを試料に作用させてアンモニウムイオンを消去する工程を式で示すと以下の通りである。
【００６７】
第１段階
【化１３】
0003614967.tif 000015
ただし、Ｘ，Ｙ，Ｚは、好ましくは、以下のａ〜ｅのいずれかの組合せから選ばれる
ａ）  Ｘ＝Ｇ６Ｐ，Ｙ＝ＮＡＤＰ＋  依存性Ｇ６ＰＤＨ，
Ｚ＝６−ホスホグルコノ−δ
−ラクトン；
ｂ）  Ｘ＝ギ酸＋Ｈ２  Ｏ，Ｙ＝ＮＡＤＰ＋  依存性ギ酸脱水素酵素，
Ｚ＝Ｈ２  ＣＯ３  ；
ｃ）  Ｘ＝グリセルアルデヒド３−リン酸，
Ｙ＝ＮＡＤＰ＋  依存性グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素，
Ｚ＝１，３−ジホスホグリセリン；
ｄ）  Ｘ＝グロン酸，Ｙ＝グルクロン酸レダクターゼ（ＮＡＤＰ＋  依存性），Ｚ＝グルクロン酸；
ｅ）  Ｘ＝イソクエン酸＋マグネシウムイオン，
Ｙ＝ＮＡＤＰ＋  依存性イソクエン酸脱水素酵素，
Ｚ＝α−ＫＧ
【００６８】
上記式から明らかなように、ＮＡＤＰ＋  依存性共役脱水素酵素系は、ａ）〜ｅ）に示したものから好ましく選択される。
ａ）におけるＸがＧ６Ｐ、ＹがＧ６ＰＤＨの場合については前記した〔Ａ〕の項で説明した本発明の特定成分定量方法と同じである。従って、ホスファターゼの基質としてなり得る成分がＮＡＤＰＨである、汎用性のある特定成分定量方法においても、前記した〔Ａ〕の項で詳述した特定成分定量方法と同様に、ＮＡＤＰＨは少量ですむ。その結果、第２段階で、特定成分を定量するときにＮＡＤＰＨによる影響を回避することができる。
また、Ｘ，Ｙの試薬量は、第１段階でＮＡＤＰ＋  がＮＡＤＰＨに適当に変換でき、その結果、第１段階で使用するＮＡＤＰＨを少量にするように、適宜、選択することができる。
【００６９】
第２段階では、第１段階終了の液に、そのまま、ホスファターゼを添加してＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋  を不活性化させることによりアンモニウムイオン（特定物質）除去酵素反応を停止し、これと同時もしくはその後、酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬を添加し、生成したアンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤＨを作用させて、そのＮＡＤＨの減少を測定することにより、試薬中の特定成分を定量することができる。
このようにして、試料中の特定成分である尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダーゼ及びカルシウムイオンを定量することができる。
第２段階における工程を式で示すと以下の通りである。
【００７０】
第２段階
初期（ホスファターゼによる不活性化）
【化１４】
0003614967.tif 000016
【化１５】
0003614967.tif 000017
【００７１】
【化１６】
0003614967.tif 000018
【化１７】
0003614967.tif 000019
【００７２】
【化１８】
0003614967.tif 000020
【００７３】
【化１９】
0003614967.tif 000021
【００７４】
第２段階で用いるホスファターゼとしては、アルカリホスファターゼが好ましい。
上記式で示した酵素作用により特定成分からアンモニウムイオンを生成させる試薬は、前記〔Ａ〕の項で詳述した特定成分定量方法のものをそのまま、同様に使用できる。
生成したアンモニウムイオンの定量は、前記〔Ａ〕の項の特定成分定量方法で詳述したとおり、一定時間当りの、反応液中のＮＡＤＨの減少を、波長３２０〜３６０ｎｍの吸光度で測定することが好ましい。
ホスファターゼの基質となり得る成分がＮＡＤＰＨである、本発明の汎用性のある特定成分定量方法は、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨの代わりに、上記ＸおよびＹを用いた以外は、前記〔Ａ〕−２のｉｉ）  で詳述した残存ＮＡＤＰＨの影響を回避する本発明の特定成分定量方法を、そのまま、使用できる。
【００７５】
ｉｉ）  ホスファターゼの基質となり得る成分がＡＴＰである特定成分定量方法
ＡＴＰをホスファターゼの基質となり得る成分として用いた本発明の特定成分定量方法としては、測定対象である試料中の特定成分がグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼであり、試料中の特定成分を測定するために該特定成分から酵素反応により生成させる特定物質がピルビン酸である、特定成分定量方法が挙げられる。
従って、この方法では、先ず、試料に、ＡＴＰを含むピルビン酸除去酵素反応試薬を作用させて、当初から試料中に存在するピルビン酸を消去し、次いでホスファターゼを作用させてＡＴＰを不活性化し、酵素反応により測定しようとする試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼからピルビン酸を生成させる試薬を作用させて、生成したピルビン酸を測定することによって、試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼを定量できる。
この方法を、反応式により具体的に示すと以下の通りである。
【００７６】
グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼの測定
【化２０】
0003614967.tif 000022
【００７７】
上記反応式に示したように、試料中の特定成分として、試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼを測定する場合、そのグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼの作用によりアラニン、２−オキソグルタル酸からピルビン酸（特定物質）を生成させ、その生成したピルビン酸に乳酸脱水素酵素およびＮＡＤＨを作用させてＮＡＤＨの減少を３２０〜３６０ｎｍの吸光度を測定することにより試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（特定成分）を測定することができる。このとき、試料にピルビン酸（特定物質）が当初から存在していると、試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（特定成分）を正確に測定しにくい。従って、あらかじめ、試料中のピルビン酸を消去する必要がある。そこで、この場合、第１段階で、試料に、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＡＴＰ、炭酸イオンを添加して、試料中に当初から存在しているピルビン酸を、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＡＴＰ、炭酸イオンの作用により消去する。第２段階では、第１段階の終了後の液に、そのまま、ホスファターゼを添加してＡＴＰをＡＤＰに変換させることによりピルビン酸消去反応を停止し、これと同時もしくはその後、そのグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼの作用によりアラニン、２−オキソグルタル酸からピルビン酸（特定物質）を生成させ、その生成したピルビン酸に乳酸脱水素酵素およびＮＡＤＨを作用させてＮＡＤＨの減少を３２０〜３６０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍでの吸光度を測定することにより、試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（特定成分）を正確に測定できる。
ピルビン酸の消去方法に用いる試薬はいずれも公知のものであり、またその消去反応も通常の酵素反応に従って実施できる。ＡＴＰの不活性化に用いるホスファターゼはアルカリホスファターゼが好ましい。また、試料中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼにアラニンと２−オキソグルタル酸を添加してピルビン酸を生成させる反応、及び生成したピルビン酸に乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを作用させてＮＡＤ＋  を生成させる反応は、いずれもそれ自体は公知の酵素反応であり、通常の条件を採用することによって実施できる。
【００７８】
ｉｉｉ）  ホスファターゼの基質となり得る成分がＧＴＰである特定成分定量方法ホスファターゼの基質となり得る成分がＧＴＰである、本発明の特定成分定量方法としては、測定対象である試料中の特定成分がグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼであり、試料中の特定成分を測定するために該特定成分から酵素反応により生成させる特定物質がオキサロ酢酸である特定成分定量方法を例示できる。
【００７９】
この定量方法では、先ず、試料に、ＧＴＰを含むオキサロ酢酸除去反応試薬を作用させて、当初から試料中に存在するオキサロ酢酸を消去し、次いでホスファターゼを作用させてＧＴＰを不活性化し、酵素反応により測定しようとする試料中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼからオキサロ酢酸を生成させる試薬を作用させて、生成したオキサロ酢酸を測定することによって、試料中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼを定量できる。
この定量方法を、反応式により更に具体的に示すと以下の通りである。
【００８０】
グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼの測定
【化２１】
0003614967.tif 000023
【００８１】
試料にオキサロ酢酸（特定物質）が当初から存在していると、試料中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（特定成分）を正確に測定しにくい。そこで、あらかじめ、試料中のオキサロ酢酸を消去する必要がある。従って上記反応式に示したように、第１段階で、試料に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよびＧＴＰを添加して、試料中に当初から存在しているオキサロ酢酸を消去する。第２段階では、第１段階の終了後の液に、そのまま、ホスファターゼを添加してＧＴＰをＧＤＰに変換させることによりオキサロ酢酸消去反応を停止し、これと同時もしくはその後、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼの作用により、アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸からオキサロ酢酸（特定物質）を生成させ、その生成したオキサロ酢酸に、リンゴ酸脱水素酵素およびＮＡＤＨを作用させて、ＮＡＤＨの減少を３２０〜３６０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍでの吸光度を測定することにより、試料中のグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（特定成分）を正確に測定できる。
オキサロ酢酸の消去反応、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼによるオキサロ酢酸の生成反応、及び生成したオキサロ酢酸にリンゴ酸脱水素酵素とＮＡＤＨを作用させてＮＡＤ＋  を生成させる反応は、いずれもそれ自体は公知の酵素反応であり、通常の条件を採用することによって、実施できる。
【００８２】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。以下に示す実施例及び比較例における測定は、日立製作所製７１５０型自動分析装置を用いて行った。
実施例１  アンモニウムイオン０ｍｇ／ｄｌ  または１５０ｍｇ／ｄｌ  、及び尿素窒素９５ｍｇ／ｄｌ  を含む試料の試料中の尿素窒素の測定
試料：
▲１▼尿素窒素９５ｍｇ／ｄｌ  を含む水溶液
▲２▼アンモニウムイオン約１５０ｍｇ／ｄｌ  及び尿素窒素９５ｍｇ／ｄｌ  を含む水溶液の２種類を用いた。
第１試薬：
第１試薬は、
0003614967.tif 000024
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
第２試薬：
第２試薬は、
グッド緩衝液                                              １００ｍＭ
α−ＫＧ                                                  １２ｍＭ
ウレアーゼ                                                １０ｕｎｉｔ／ｍｌ
ＮＡＤＨ                                                  １．００ｍＭ
アルカリホスファターゼ                                    １０ｕｎｉｔ／ｍｌ
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
【００８３】
測定：
試料３μｌに第１試薬３００μｌを加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬７５μｌを加えて３７℃で１分間放置する。その後、３４０ｎｍの波長で２分間、吸光度の変化（一定時間あたりの吸光度変化量）を測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。なお、比較のため、第２試薬添加後、３分間放置し、ついで吸光度の変化を測定する。
結果：
結果を以下の表１に示す。この試薬で測定すると、試料中に１５０ｍｇ／ｄｌ  のアンモニウムイオンが混在していても、混在していないときと同様の値を示すことがわかる。
【００８４】
比較例１  ＮＡＤＰＨのかわりにＮＡＤＨを第１試薬に入れる場合の試料の尿素窒素の測定
試料：
実施例１と同様の試料を使用した。
第１試薬：
第１試薬は、
0003614967.tif 000025
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
第２試薬：
実施例１と同様の第２試薬を使用した。
測定：
上記の試薬を用い、実施例１と同様の操作を実施した。
結果：
以下の表１に示す結果を得た。アンモニウムイオンが混在しているとき測定不能になることがわかる。
【００８５】
実施例２  第２試薬にアルカリホスファターゼを入れない場合の試料中の尿素窒素の測定
試料：
実施例１と同様の試料を使用した。
第１試薬：
実施例１と同様の第１試薬を使用した。
第２試薬：
第２試薬は、
グッド緩衝液                                              １００ｍＭ
α−ＫＧ                                                  １２ｍＭ
ウレアーゼ                                                １０ｕｎｉｔ／ｍｌ
ＮＡＤＨ                                                  １．００ｍＭ
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
測定：
上記の試薬を用い、実施例１と同様の操作を実施した。
結果：
以下の表１に示す結果を得た。アンモニウムイオンが混在していると正確な測定ができなくなる。また、アンモニウムイオンの混在の有無にかかわらず、第２試薬添加後、１〜３分の反応速度と３〜５分の反応速度では、１０％近く異なることがわかる。
【００８６】
実施例３  イソクエン酸脱水素酵素及びホスファターゼを用いた場合の試料中の尿素窒素の測定
試料：
実施例１と同様の試料を使用した。
第１試薬：
0003614967.tif 000026
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
第２試薬：
グッド緩衝液                                              １００ｍＭ
α−ＫＧ                                                  １２ｍＭ
ウレアーゼ                                                １０ｕｎｉｔ／ｍｌ
ＮＡＤＨ                                                  １．００ｍＭ
ホスファターゼ                                            １０ｕｎｉｔ／ｍｌ
を含み、かつ、ｐＨ９．０の水溶液を用いた。
測定：
実施例１の測定と同様に測定した。
結果：
得られた結果は以下の表１に示した。ホスファターゼ及びイソクエン酸脱水素酵素を用いた場合にも尿素窒素を良好に測定できることがわかる。
【００８７】
【表１】
0003614967.tif 000027
【００８８】
実施例４  尿素窒素測定の希釈直線性
試料：
尿素３２１ｍｇを精製水１００ｍｌに溶解し（１５０ｍｇ／ｄｌ  尿素窒素水溶液）  、この溶液を１０／１０として１０段階希釈した溶液及び精製水を使用した。
第１試薬：
実施例１と同様の第１試薬を使用した。
第２試薬：
実施例１と同様の第２試薬を使用した。
測定：
実施例１と同様の操作を実施した。
結果：
表２及び図１に示す結果を得た。希釈直線性が尿素窒素約１５０ｍｇ／ｄｌ  まであることがわかる。
【００８９】
【表２】
0003614967.tif 000028
【００９０】
【発明の効果】
試料中の特定成分を測定する際に、内因性アンモニウムイオンにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ、Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＨ及びＮＡＤＰＨを作用させて、試料中に当初から存在する内因性アンモニウムイオンを予め除去する本発明の方法によれば、測定時に誤差を与えやすい、試料中の内因性のアンモニウムイオンを効率良く消去することができ、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。とくに、本発明によれば、試料中のあらかじめ存在する高濃度のアンモニウムイオンを短時間で消去でき、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。また、臨床検査で汎用されている生化学自動分析装置でも測定することができる。したがって、臨床検査に寄与することで大である。
また、ホスファターゼを利用した本発明の試料中の特定成分を特定物質に基づいて測定する方法によれば、測定時に誤差を与えやすい、試料中の特定物質を効率良く消去し、試料中の特定成分から特定物質を発生させ、発生した特定物質を定量することにより、試料中のその特定成分を正確に定量することができる。また、臨床検査で汎用されている生化学自動分析装置でも測定することができる。更に、特定物質除去反応をキレート剤でなく、ホスファターゼで停止させるので、特定成分を測定するのに、金属イオンが存在しても構わない。したがって、種々の特定成分を測定できる。したがって、臨床検査分野に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】１５０ｍｇ／ｄｌ  の尿素窒素を１０段階希釈したものを測定試料として、本発明の測定を行った場合の結果を示すグラフである。横軸は希釈系列、縦軸は尿素窒素の測定値を示す。
【図１】
0003614967.tif 000029