(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex:MHC）クラスＩ分子に結合する能力を有し、ヒト乳頭腫ウイルス（Human Papilloma Virus:HPV）タイプ16（HPV16）の蛋白質E6もしくはE7に由来するアミノ酸配列、またはHPV18の蛋白質E6もしくはE7に由来するアミノ酸配列、あるいはこれらのアミノ酸配列のシステイン残基の少なくとも１つがアラニン残基、セリン残基もしくはα−アミノ酪酸残基で置換されたこれらアミノ酸配列の類似配列を含み、９〜12のアミノ酸の長さを有するペプチド。
【請求項２】
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1と結合する能力を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
KLPQLCTEL（HPV16蛋白質E6の残基18〜26）
QLCTELQTT（HPV16蛋白質E6の残基21〜29）
LCTELQTTI（HPV16蛋白質E6の残基22〜30）
ELQTTIHDI（HPV16蛋白質E6の残基25〜33）
LQTTIHDII（HPV16蛋白質E6の残基26〜34）
TIHDIILEC（HPV16蛋白質E6の残基29〜37）
IHDIILECV（HPV16蛋白質E6の残基30〜38）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
FAFRDLCIV（HPV16蛋白質E6の残基52〜60）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
PLCDLLIRC（HPV16蛋白質E6の残基102〜110）
TLHEYMLDL（HPV16蛋白質E7の残基７〜15）
YMLDLQPET（HPV16蛋白質E7の残基11〜19）
MLDLQPETT（HPV16蛋白質E7の残基12〜20）
RLCVQSTHV（HPV16蛋白質E7の残基66〜74）
TLEDLLMGT（HPV16蛋白質E7の残基78〜86）
LLMGTLGIV（HPV16蛋白質E7の残基82〜90）
GTLGIVCPI（HPV16蛋白質E7の残基85〜93）
TLGIVCPIC（HPV16蛋白質E7の残基86〜94）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニンが残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
KLPDLCTEL（HPV18蛋白質E6の残基13〜21）
SLQDIEITC（HPV18蛋白質E6の残基24〜32）
LQDIEITCV（HPV18蛋白質E6の残基25〜33）
EITCVYCKT（HPV18蛋白質E6の残基29〜37）
KTVLELTEV（HPV18蛋白質E6の残基36〜44）
ELTEVFEFA（HPV18蛋白質E6の残基40〜48）
FAFKDLFVV（HPV18蛋白質E6の残基47〜55）
DTLEKLTNT（HPV18蛋白質E6の残基86〜96）
LTNTGLYNL（HPV18蛋白質E6の残基93〜101）
TLQDIVLHL（HPV18蛋白質E7の残基７〜15）
FQQLFLNTL（HPV18蛋白質E7の残基86〜94）
QLFLNTLSF（HPV18蛋白質E7の残基88〜96）
LFLNTLSFV（HPV18蛋白質E7の残基89〜97）
LSFVCPWCA（HPV18蛋白質E7の残基94〜102）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1と結合する能力を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項６】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、次の物質：
YRDGNPYAV（HPV16蛋白質E6の残基61〜69）
WTGRCMSCC（HPV16蛋白質E6の残基139〜147）
MSCCRSSRT（HPV16蛋白質E6の残基144〜152）
TTDLYCYEQ（HPV16蛋白質E7の残基19〜27）
EIDGPAGQA（HPV16蛋白質E7の残基37〜45）
HVDIRTLED（HPV16蛋白質E7の残基73〜81）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2と結合する能力を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項８】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQFR（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KFYSKISEY（HPV16蛋白質E6の残基75〜83）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
RHYCYSLYG（HPV16蛋白質E6の残基84〜92）
SLYGTTLEQ（HPV16蛋白質E6の残基89〜97）
TTLEQQYNK（HPV16蛋白質E6の残基93〜101）
QQYNKPLCD（HPV16蛋白質E6の残基97〜105）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
HLDKKQRFH（HPV16蛋白質E6の残基125〜133）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
CCRSSRTRR（HPV16蛋白質E6の残基146〜154）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
KCDSTLRLC（HPV16蛋白質E7の残基60〜68）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2と結合する能力を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項１０】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
TGRCMSCCR（HPV16蛋白質E6の残基140〜148）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
VCPICSQKP（HPV16蛋白質E7の残基90〜98）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24と結合する能力を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項１２】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、次の物質：
MHQKRTAMF（HPV蛋白質E6の残基１〜９）
LQTTIHDII（HPV蛋白質E6の残基26〜34）
VYCKQQLLR（HPV蛋白質E6の残基38〜46）
LLRREVYDF（HPV蛋白質E6の残基44〜52）
VYDFAFRDL（HPV蛋白質E6の残基49〜57）
PYAVCDKCL（HPV蛋白質E6の残基66〜74）
KCLKFYSKI（HPV蛋白質E6の残基72〜80）
EYRHYCYSL（HPV蛋白質E6の残基82〜90）
HYCYSLYGT（HPV蛋白質E6の残基85〜93）
CYSLYGTTL（HPV蛋白質E6の残基87〜95）
RFHNIRGRW（HPV蛋白質E6の残基131〜139）
RAHYNIVTF（HPV蛋白質E7の残基49〜57）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【請求項１３】
予防または治療に有効な量の請求項１〜請求項12のいずれか１項に記載のペプチド、および製薬に適した担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含む、HPV16および／またはHPV18に関連する病気の予防または治療用の薬剤組成物。
【請求項１４】
予防または治療に有効な量の、HPVに対し有効なＴ細胞応答を誘引し得る請求項１〜12のうちのいずれかに記載のペプチド、および製薬に適した担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含む、HPV16および／またはHPV18に関連する病気の予防または治療用の薬剤組成物。
【請求項１５】
予防または治療に有効な量の、HPVに対し有効なHLAクラスＩ制限CD8+細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘引し得る請求項１〜12のうちのいずれかに記載のペプチド、および製薬に適した担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含む、HPV16および／またはHPV18に関連する病気の予防または治療用の薬剤組成物。
【請求項１６】
HPVに対し有効な、HLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答をヒト個人に予防的、治癒的に誘引するための請求項１〜請求項12のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７】
HPVに対し有効な、HLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答をヒト個人に予防的、治癒的に誘引するための薬剤組成物を製造するための請求項１〜請求項12のいずれか１項に記載のペプチドの使用方法。
【請求項１８】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex:MHC）クラスＩ分子に結合する能力を有し、ヒト乳頭腫ウイルス（Human Papilloma Virus:HPV）タイプ16（HPV16）の蛋白質E6もしくはE7に由来するアミノ酸配列、またはHPV18の蛋白質E6もしくはE7に由来するアミノ酸配列、あるいはこれらのアミノ酸配列のシステイン残基の少なくとも１つがアラニン残基、セリン残基もしくはα−アミノ酪酸残基で置換されたこれらアミノ酸配列の類似配列を含む、９〜12のアミノ酸の長さを有するペプチドを使用して、HPVに対し有効な、HLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答をヒト個人に予防的、治癒的に誘引するための薬剤組成物を製造することを特徴とする薬剤組成物の製造方法。
【請求項１９】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1と結合する能力を有する請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２０】
前記ペプチドは、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
KLPQLCTEL（HPV16蛋白質E6の残基18〜26）
QLCTELQTT（HPV16蛋白質E6の残基21〜29）
LCTELQTTI（HPV16蛋白質E6の残基22〜30）
ELQTTIHDI（HPV16蛋白質E6の残基25〜33）
LQTTIHDII（HPV16蛋白質E6の残基26〜34）
TIHDIILEC（HPV16蛋白質E6の残基29〜37）
IHDIILECV（HPV16蛋白質E6の残基30〜38）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
FAFRDLCIV（HPV16蛋白質E6の残基52〜60）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
PLCDLLIRC（HPV16蛋白質E6の残基102〜110）
TLHEYMLDL（HPV16蛋白質E7の残基７〜15）
YMLDLQPET（HPV16蛋白質E7の残基11〜19）
MLDLQPETT（HPV16蛋白質E7の残基12〜20）
RLCVQSTHV（HPV16蛋白質E7の残基66〜74）
TLEDLLMGT（HPV16蛋白質E7の残基78〜86）
LLMGTLGIV（HPV16蛋白質E7の残基82〜90）
GTLGIVCPI（HPV16蛋白質E7の残基85〜93）
TLGIVCPIC（HPV16蛋白質E7の残基86〜94）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２１】
前記ペプチドは、HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
KLPDLCTEL（HPV18蛋白質E6の残基13〜21）
SLQDIEITC（HPV18蛋白質E6の残基24〜32）
LQDIEITCV（HPV18蛋白質E6の残基25〜33）
EITCVYCKT（HPV18蛋白質E6の残基29〜37）
KTVLELTEV（HPV18蛋白質E6の残基36〜44）
ELTEVFEFA（HPV18蛋白質E6の残基40〜48）
FAFKDLFVV（HPV18蛋白質E6の残基47〜55）
DTLEKLTNT（HPV18蛋白質E6の残基86〜96）
LTNTGLYNL（HPV18蛋白質E6の残基93〜101）
TLQDIVLHL（HPV18蛋白質E7の残基７〜15）
FQQLFLNTL（HPV18蛋白質E7の残基86〜94）
QLFLNTLSF（HPV18蛋白質E7の残基88〜96）
LFLNTLSFV（HPV18蛋白質E7の残基89〜97）
LSFVCPWCA（HPV18蛋白質E7の残基94〜102）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２２】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1と結合する能力を有する請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２３】
前記ペプチドは、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、次の物質：
YRDGNPYAV（HPV16蛋白質E6の残基61〜69）
WTGRCMSCC（HPV16蛋白質E6の残基139〜147）
MSCCRSSRT（HPV16蛋白質E6の残基144〜152）
TTDLYCYEQ（HPV16蛋白質E7の残基19〜27）
EIDGPAGQA（HPV16蛋白質E7の残基37〜45）
HVDIRTLED（HPV16蛋白質E7の残基73〜81）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２４】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2と結合する能力を有する請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２５】
前記ペプチドは、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KFYSKISEY（HPV16蛋白質E6の残基75〜83）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
RHYCYSLYG（HPV16蛋白質E6の残基84〜92）
SLYGTTLEQ（HPV16蛋白質E6の残基89〜97）
TTLEQQYNK（HPV16蛋白質E6の残基93〜101）
QQYNKPLCD（HPV16蛋白質E6の残基97〜105）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
HLDKKQRFH（HPV16蛋白質E6の残基125〜133）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
CCRSSRTRR（HPV16蛋白質E6の残基146〜154）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
KCDSTLRLC（HPV16蛋白質E7の残基60〜68）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２６】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2と結合する能力を有する請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２７】
前記ペプチドは、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、次の物質：
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
TGRCMSCCR（HPV16蛋白質E6の残基140〜148）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
VCPICSQKP（HPV16蛋白質E7の残基90〜98）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２８】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24と結合する能力を有する請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項２９】
前記ペプチドは、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、次の物質：
MHQKRTAMF（HPV蛋白質E6の残基１〜９）
LQTTIHDII（HPV蛋白質E6の残基26〜34）
VYCKQQLLR（HPV蛋白質E6の残基38〜46）
LLRREVYDF（HPV蛋白質E6の残基44〜52）
VYDFAFRDL（HPV蛋白質E6の残基49〜57）
PYAVCDKCL（HPV蛋白質E6の残基66〜74）
KCLKFYSKI（HPV蛋白質E6の残基72〜80）
EYRHYCYSL（HPV蛋白質E6の残基82〜90）
HYCYSLYGT（HPV蛋白質E6の残基85〜93）
CYSLYGTTL（HPV蛋白質E6の残基87〜95）
RFHNIRGRW（HPV蛋白質E6の残基131〜139）
RAHYNIVTF（HPV蛋白質E7の残基49〜57）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項18記載の薬剤組成物の製造方法。
【請求項３０】
HPV16の蛋白質E6から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
FAFRDLCIV（HPV16蛋白質E6の残基52〜60）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
PLCDLLIRC（HPV16蛋白質E6の残基102〜110）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３１】
HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次の物質：
KTVLELTEV（HPV18蛋白質E6の残基36〜44）
ELTEVFEFA（HPV18蛋白質E6の残基40〜48）
FAFKDLFVV（HPV18蛋白質E6の残基47〜55）
DTLEKLTNT（HPV18蛋白質E6の残基88〜96）
LTNTGLYNL（HPV18蛋白質E6の残基93〜101）
TLQDIVLHL（HPV18蛋白質E7の残基７〜15）
FQQLFLNTL（HPV18蛋白質E7の残基86〜94）
QLFLNTLSF（HPV18蛋白質E7の残基88〜96）
LFLNTLSFV（HPV18蛋白質E7の残基89〜97）
LSFVCPWCA（HPV18蛋白質E7の残基94〜102）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３２】
HPV16の蛋白質E6から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、次の物質：
YRDGNPYAV（HPV16蛋白質E6の残基61〜69）
WTGRCMSCC（HPV16蛋白質E6の残基139〜147）
MSCCRSSRT（HPV16蛋白質E6の残基144〜152）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３３】
HPV16の蛋白質E6から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、次の物質：
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KFYSKISEY（HPV16蛋白質E6の残基75〜83）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
RHYCYSLYG（HPV16蛋白質E6の残基84〜92）
SLYGTTLEQ（HPV16蛋白質E6の残基89〜97）
TTLEQQYNK（HPV16蛋白質E6の残基93〜101）
QQYNKPLCD（HPV16蛋白質E6の残基97〜105）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
HLDKKQRFH（HPV16蛋白質E6の残基125〜133）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
CCRSSRTRR（HPV16蛋白質E6の残基146〜154）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３４】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、次の物質：
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
TGRCMSCCR（HPV16蛋白質E6の残基140〜148）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
VCPICSQKP（HPV16蛋白質E7の残基90〜98）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３５】
HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導され、ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、次の物質：
VYCKQQLLR（HPV蛋白質E6の残基38〜46）
LLRREVYDF（HPV蛋白質E6の残基44〜52）
VYDFAFRDL（HPV蛋白質E6の残基49〜57）
PYAVCDKCL（HPV蛋白質E6の残基66〜74）
KCLKFYSKI（HPV蛋白質E6の残基72〜80）
EYRHYCYSL（HPV蛋白質E6の残基82〜90）
HYCYSLYGT（HPV蛋白質E6の残基85〜93）
CYSLYGTTL（HPV蛋白質E6の残基87〜95）
RFHNIRGRW（HPV蛋白質E6の残基131〜139）
RAHYNIVTF（HPV蛋白質E7の残基49〜57）および
ヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、上記のアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の少なくとも１つが、アラニン残基、セリン残基またはα−アミノ酪酸残基によって置換された誘導体
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３６】
９〜12のアミノ酸の長さを有する請求項30〜請求項35のうちのいずれかに記載のペプチド。
【請求項３７】
予防または治療に有効な量の、HPVに対し有効なＴ細胞応答を誘引し得る請求項30〜請求項36のうちのいずれかに記載のペプチド、および製薬に適した担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含むHPV16または／およびHPV18に関連する病気の予防または治療用の薬剤組成物。
【請求項３８】
予防または治療に有効な量の、HPVに対し有効なHLAクラスＩ制限CD8+細胞障害性Ｔ細胞応答を誘引し得る請求項30〜請求項36のうちのいずれかに記載のペプチド、および製薬に適した担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含むHPV16または／およびHPV18に関連する病気の予防または治療用の薬剤組成物。
【請求項３９】
HPVに対し有効な、HLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答をヒト個人に予防的、治癒的に誘引するための薬剤組成物を製造するために請求項30〜請求項36のいずれか１項に記載のペプチドの使用方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はヒト乳頭腫ウイルス（Human Papilloma Virus:HPV）の蛋白質から誘導される新しいペプチドと頚部癌のようなヒト乳頭腫ウイルスに関連する病気に対するヒト個人の予防と治療のための薬剤組成物にそれらを用いる方法に関する。
発明の背景
ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）は、世界的にみて５番目に多い癌であり、婦人の癌による死亡の第２番目の原因である頚部癌の病因に関係している。また、他のHPV関連の癌を考慮に入れた場合、癌による世界的にみた死亡数の10％までがHPVに関係している。HPVは、約８キロベースの標準二重環状DNAウイルスである。現在まで60以上の遺伝子型について述べられてきており、その内のいくつかは癌に関係がある。
HPV−DNAは、頚部異形成障害および頚部癌腫に認められ、同障害が悪性に進展する場合、HPVの確率は79％まで増大する。頚部癌腫に関連した最も重要なHPVのタイプはHPV16とHPV18であり、この内、HPV16だけでHPVが原因である可能性のある頚部癌腫の50％以上の原因となっている。
いくつかのHPVのDNAが配列された。DNAオープンリーディングクレームは初期領域（Ｅ）と後期領域（Ｌ）に分割することができる。Ｅ領域は、ウイルスの複製とトランスフォーメーションに必要な蛋白質についてのコーディングである。
Ｌ領域は、ウイルスキャプシド蛋白質をコード化する。E6およびE7蛋白質は、HPV−誘発異常細胞増殖の病因に関与しており、これらの遺伝子は、HPV感染に関連した頚部癌から採取された組織または腫瘍細胞において発現される。
さらにHPV16とHPV18のE6とE7の遺伝子は、HPV感染によって引き起こされた細胞の増殖の刺激の少なくとも一部がE6およびE7ウイルス蛋白質によるものであることを示している。他のHPV遺伝子の不存在下で、細胞培養において上皮細胞トランスフォーメーションを誘発することができる。
細胞障害性Ｔリンパ球（Cytotoxic T Lymphocytes:CTL）は、ウイルス感染に対する抵抗性およびウイルス誘発腫瘍に対する免疫監視において非常に重要である（考察:Kast and Meliefによる,1991）。最近になり、いくつかのウイルス系において、抗原特有のCTLによって認識されペプチドによるワクチン接種はラットにおいて致死ウイルス感染を防止し、腫瘍の成長を遅らせることが示された（考察:Kast and Melief,1991およびRbeinholdsston Ljunggren et al.,1992）。
我々は、P.Cresswellが発生させ、供給した抗原プロセシング欠陥細胞系174CEM.T2を用いて、MHCクラスＩの分子の溝に結合するウイルスペプチドの固定に成功した（Salter and Cresswell,1986参照）。この細胞系はヒトのMHCクラスＩ  HLA−A2.1およびHLA−B5対立遺伝子を表しており、この内、HLA−A2.1分子だけが外性的に付加されたペプチドにより細胞表面上で安定化することができる部分的に中空で不安定な分子として発現される。ペプチドによる培養が、このMHC分子の細胞表面発現の増加につながるならば、このことは、このペプチドがHLA−A2.1の溝に結合し、従って、CTLにより認識される候補である可能性があるということを示唆している。HLA−A2.1分子は西ヨーロッパコーカソイド人種に最も多く存在するHLA分子である。この人種の約50％がこの対立遺伝子を発現する。HPV16およびHPV18（Seedorf et al.,1985）のE6およびE7蛋白質のアミノ酸配列を用いて、全E6およびE7領域に及んでいる可能性のあるノナペプチド（すなわち、９アミノ酸長ペプチド）をすべて我々は発生させた。各アミノ酸をこれらの９量体ペプチドのための出発アミノ酸として用いた。各ペプチドに各々、上記の試験を行い、HLA−A2.1分子に結合する能力を決定した。HPV16に関しては、上記の試験において、我々はHLA−A2.1分子に結合したペプチドを全部でHPV16  E6領域において10ペプチド、HPV16  E7領域において８ペプチドを同定した。HPV18に関しては、全部でHPV18  E6領域で９ペプチドおよびHPV18  E7領域で５ペプチドがHLA−A2.1分子に結合すると上記の試験において同定した。これは、HLA−A2.1陽性のヒトにワクチンとしてHPV16とHPV18が重要な候補ペプチドであることが同定されたことを示唆している。
第２の方法を用いて、さらに少しHPVペプチドを結合するHLA−A2.1のリストの拡大と、他のHLA分子、すなわちHLA−A1,HLA−A3.2,HLA−A11.2およびHLA−A24の分子に結合するHPV16  E6およびE7ペプチドの決定に成功した。前記第２の方法は精製クラスＩの分子および放射性同位元素を使って識別された一致ペプチドを用いた競合免疫化学ペプチド−MHC結合試験から成る。
発明の概要
本発明の目的は、頚部癌および／または腫瘍と、他のHPVに関連する病気、特にHPV16および／またはHPV18に関連する病気の予防および治療に用いうる合成ペプチドを提供することである。
本発明の他の目的は、頚部癌および／または腺腫と他のHPVに関連する病気、特にHPV16および／またはHPV18に関連する病気の予防と治療の方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、頚部癌および／または腺腫と、他のHPV関連の病気、特にHPV−16および／またはHPV18に関連の病気の予防と治療に用いられる薬剤組成物を提供することである。
この発明は、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）の蛋白質から誘導されたアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスＩ分子に結合する能力を有するペプチドを提供する。
また本発明は、HLA−A2.1,HLA−A1,HLA−A3.2,HLA−A11.2またはHLA−A24蛋白質のようなHLA分子に結合する能力があるために、HPV16および／またはHPV18に対して予防的または治療的Ｔ細胞応答を誘導することができるヒトワクチン中に含まれるべき候補ペプチドのHPV16とHPV18とのE6およびE7領域のアミノ酸配列から誘導される特別のペプチドも提供する。
本発明の新しいペプチドは、識別用具としての薬剤組成物およびHPV16および／またはHPV18に起因する病気の予防と治療またはHPV16および／またはHPV18の感染を抑制する効果のある他の条件に有用である。
本発明の好適な実施例の中で、前記アミノ酸配列はHPV16の蛋白質E6またはE7から誘導される。本発明の他の好適な実施例では、前記アミノ酸配列は、HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導される。
好ましくは、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有する。
さらに詳細には本発明は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次のものから成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
AMFQDPQER（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
KLPQLCTEL（HPV16蛋白質E6の残基18〜26）
QLCTELQTT（HPV16蛋白質E6の残基21〜29）
LCTELQTTI（HPV16蛋白質E6の残基22〜30）
ELQTTIHDI（HPV16蛋白質E6の残基25〜33）
LQTTIHDII（HPV16蛋白質E6の残基26〜34）
TIHDIILEC（HPV16蛋白質E6の残基29〜37）
IHDIILECV（HPV16蛋白質E6の残基30〜38）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
FAFRDLCIV（HPV16蛋白質E6の残基52〜60）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
PLCDLLIRC（HPV16蛋白質E6の残基102〜110）
TLHEYMLDL（HPV16蛋白質E7の残基７〜15）
YMLDLQPET（HPV16蛋白質E7の残基11〜19）
MLDLQPETT（HPV16蛋白質E7の残基12〜20）
RLCVQSTHV（HPV16蛋白質E7の残基66〜74）
TLEDLLMGT（HPV16蛋白質E7の残基78〜86）
LLMGTLGIV（HPV16蛋白質E7の残基82〜90）
GTLGIVCPI（HPV16蛋白質E7の残基85〜93）
TLGIVCPIC（HPV16蛋白質E7の残基86〜94）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
さらに詳しくは本発明は、HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合する能力を有し、次のものから成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
KLPDLCTEL（HPV18蛋白質E6の残基13〜21）
SLQDIEITC（HPV18蛋白質E6の残基24〜32）
LQDIEITCV（HPV18蛋白質E6の残基25〜33）
EITCVYCKT（HPV18蛋白質E6の残基29〜37）
KTVLELTEV（HPV18蛋白質E6の残基36〜44）
ELTEVFEFA（HPV18蛋白質E6の残基40〜48）
FAFKDLFVV（HPV18蛋白質E6の残基47〜55）
DTLEKLTNT（HPV18蛋白質E6の残基86〜96）
LTNTGLYNL（HPV18蛋白質E6の残基93〜101）
TLQDIVLHL（HPV18蛋白質E7の残基７〜15）
FQQLFLNTL（HPV18蛋白質E7の残基86〜94）
QLFLNTLSF（HPV18蛋白質E7の残基88〜96）
LFLNTLSFV（HPV18蛋白質E7の残基89〜97）
LSFVCPWCA（HPV18蛋白質E7の残基94〜102）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
本発明の他の好適な実施例に従えば、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有する。
さらに詳細には本発明は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合する能力を有し、次のものから成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
YRDGNPYAV（HPV16蛋白質E6の残基61〜69）
WTGRCMSCC（HPV16蛋白質E6の残基139〜147）
MSCCRSSRT（HPV16蛋白質E6の残基144〜152）
TTDLYCYEQ（HPV16蛋白質E7の残基19〜27）
EIDGPAGQA（HPV16蛋白質E7の残基37〜45）
HVDIRTLED（HPV16蛋白質E7の残基73〜81）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
本発明の他の好適な実施例に従えば、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有する。
さらに詳細には本発明は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合する能力を有し、次のものから成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
AMFQDPQFR（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KFYSKISEY（HPV16蛋白質E6の残基75〜83）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
RHYCYSLYG（HPV16蛋白質E6の残基84〜92）
SLYGTTLEQ（HPV16蛋白質E6の残基89〜97）
TTLEQQYNK（HPV16蛋白質E6の残基93〜101）
QQYNKPLCD（HPV16蛋白質E6の残基97〜105）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
HLDKKQRFH（HPV16蛋白質E6の残基125〜133）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
CCRSSRTRR（HPV16蛋白質E6の残基146〜154）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
KCDSTLRLC（HPV16蛋白質E7の残基60〜68）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
本発明の他の好適な実施例に従えば、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有する。
さらに詳細には本発明は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合する能力を有し、次のものから成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
AMFQDPQFR（HPV16蛋白質E6の残基７〜15）
IILECVYCK（HPV16蛋白質E6の残基33〜41）
CVYCKQQLL（HPV16蛋白質E6の残基37〜45）
VYCKQQLLR（HPV16蛋白質E6の残基38〜46）
QQLLRREVY（HPV16蛋白質E6の残基42〜50）
IVYRDGNPY（HPV16蛋白質E6の残基59〜67）
YAVCDKCLK（HPV16蛋白質E6の残基67〜75）
AVCDKCLKF（HPV16蛋白質E6の残基68〜76）
VCDKCLKFY（HPV16蛋白質E6の残基69〜77）
KISEYRHYC（HPV16蛋白質E6の残基79〜87）
ISEYRHYCY（HPV16蛋白質E6の残基80〜88）
LIRCINCQK（HPV16蛋白質E6の残基107〜115）
TGRCMSCCR（HPV16蛋白質E6の残基140〜148）
CMSCCRSSR（HPV16蛋白質E6の残基143〜151）
SCCRSSRTR（HPV16蛋白質E6の残基145〜153）
HYNIVTFCC（HPV16蛋白質E7の残基51〜59）
YNIVTFCCK（HPV16蛋白質E7の残基52〜60）
CCKCDSTLR（HPV16蛋白質E7の残基58〜66）
VCPICSQKP（HPV16蛋白質E7の残基90〜98）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
本発明の他の好適な実施例に従えば、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有する。
さらに詳細には本発明は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列がヒトのMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合する能力を有し、次の物質から成るグループから選ばれたものであるペプチドを提供する；
MHQKRTAMF（HPV蛋白質E6の残基１〜９）
LQTTIHDII（HPV蛋白質E6の残基26〜34）
VYCKQQLLR（HPV蛋白質E6の残基38〜46）
LLRREVYDF（HPV蛋白質E6の残基44〜52）
VYDFAFRDL（HPV蛋白質E6の残基49〜57）
PYAVCDKCL（HPV蛋白質E6の残基66〜74）
KCLKFYSKI（HPV蛋白質E6の残基72〜80）
EYRHYCYSL（HPV蛋白質E6の残基82〜90）
HYCYSLYGT（HPV蛋白質E6の残基85〜93）
CYSLYGTTL（HPV蛋白質E6の残基87〜95）
RFHNIRGRW（HPV蛋白質E6の残基131〜139）
RAHYNIVTF（HPV蛋白質E7の残基49〜57）
ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合しうるこれらのアミノ酸配列のいずれか１つのフラグメント、同質体、イソ体、誘導体、遺伝的変異体、または保存変異体。
本発明はさらに、予防的、治療的に効果のある量の前記本発明に従うペプチドを含む薬剤組成物、薬理的に有効な担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントを提供する。好ましくは、前記薬剤組成物はHPVに有効なＴ細胞応答、特にHLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答を誘引しうる前記本発明に従うペプチドを含む。
加えて本発明は、頚部癌と他のHPV関連の病気を予防し、治療するのに効果的な量の本発明に従ってペプチド、さらに詳細には、HPVに対し有効なＴ細胞応答、特にHLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞応答を誘引しうる免疫原的形状の本発明に従ったペプチドをヒト個人に投与することを有するヒトの頚部癌とHPV関連の病気の予防または治療の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、174CEM.T2細胞上に発現されたHLA−A2.1と240HPV16  E6およびE7ノナペプチドの結合の分析結果である。（ペプチドを加えない）バックグラウンド蛍光レベルは、70の任意の平均蛍光レベルに設定された。ペプチドの結合は、バックグランド蛍光レベルの２倍に達したとき正であるとみなされた。18の結合ペプチドは、１〜18と番号を付され、この番号は表１中の番号に相当する。
図２は、174CEM.T2細胞上に発現されたHLA−A2.1と247HPV18  E6およびE7ノナペプチドの結合の分析結果である。（ペプチドを加えない）バックグラウンド蛍光レベルは、70の任意の平均蛍光レベルに設定された。ペプチドの結合は、バックグラウンド蛍光レベルの２倍に達したとき正であるとみなされた。14の結合ペプチドは、１〜14と番号を付され、この番号は表II中の番号に相当する。
図３は、HPV16ペプチド（ペプチドはMLDLQPETT、表Ｉ中のNo.13配列同定番号15）に対する、健康なドナーの血液のヒトのリンパ球の第1CTL応答を示すクラフである。
バルク＝CTLの多量培養、クローン＝極限希釈からのCTLクローン、irr.ペプチド＝関連性のないペプチド（対照）、E/T比＝エフェクタとターゲットとの比
発明の詳細な説明
本発明は、HPVの蛋白質から誘導される、ヒトMHCクラスＩ分子に結合し得るアミノ酸配列を有するペプチドを示すものである。他のウイルスに対する我々自身の経験に顧みれば、HLAクラスＩ制限CD8+細胞毒Ｔ細胞を誘導するための最良の候補者はペプチドと最も強く結合することである。
本発明の最も好ましい実施例は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV16の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表Ｉ参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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本発明の最も好ましい実施例は、HPV18の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A2.1に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV18の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表II参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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本発明の最も好ましい実施例は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A1に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV16の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表III参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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本発明の最も好ましい実施例は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A3.2に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV16の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表IV参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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本発明の最も好ましい実施例は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A11.2に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV16の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表Ｖ参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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本発明の最も好ましい実施例は、HPV16の蛋白質E6またはE7から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記アミノ酸配列は、ヒトMHCクラスＩ対立遺伝子HLA−A24に結合し得るペプチドに関するものである。特にこのようなペプチドはHPV16の記載の領域から誘導される次のアミノ酸配列から成る（表VI参照。アミノ酸は、アミノ酸の１文字コードによって識別される）。
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これらのデータは、上で述べたペプチドが同定された配列の単純ポリペプチドであることを暗示している。しかし、これらのペプチドの相同体、イソ体または遺伝的変異体は、細胞内環境の内外に存在する。本発明は、該HLA分子に結合する場合には、上記のペプチドの相同体、イソ体または遺伝的変異体のすべてを含む。
ペプチドの相同体であるポリペプチドは、表Ｉ〜VI中に述べられたアミノ酸配列に関して、少なくとも40％、好ましくは60％、さらに好ましくは75％保存されているアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
上記ペプチドの他の変異体が本発明の範囲内に含まれるということは当業者に理解されるであろう。これは特に同類アミノ酸置換体によってのみ合成される、上記のペプチドとは異なるいかなる変異体をも含む。システイン含有ペプチドが、合成と処理の間に空気による酸化を受けやすいということはよく知られているので、特にＡ（アラニン）、Ｓ（セリン）、α−アミノ酪酸などによるＣ（システイン）の置換体が含まれる。このような多くの同類アミノ酸置換体は、Taylorによって述べられたものとして述べられている（1986）。
ここにおいて上で示されたペプチドまたはそのフラグメントには、ポリペプチドが該HLA分子に結合するならば、同類アミノ酸置換によるものであれ、欠失または他の過程によるものであれ、アミノ酸配列におけるいかなる変異体も含まれる。ペプチドのフラグメントは、前記ポリペプチドが該HLA分子に結合している場合には、５またはそれ以上の過程のアミノ酸配列を有する小さいペプチドでもよく、前記配列は、前記ポリペプチドが該HLA分子に結合している場合の、表Ｉ〜VIに開示されている配列である。
上述のペプチドよりも大きなペプチドが適当な個体（たとえばHLA−A2.1結合ペプチドの場合の、HLA−A2.1に陽性の個体）におけるHPV16またはHPV18種CTL応答を誘導し、表Ｉ〜VI中で述べたような（部分的）アミノ酸配列またはその同類置換体を含む場合には、それらのペプチドは、特に本発明の範囲に含まれる。このようなポリペプチドは、30アミノ酸までの長さを有するものでよく、好ましくは、27アミノ酸までの長さである。しかし、最も好ましい範囲は９〜12、さらに好ましくは９〜11または９〜10であり、さらに厳密には９アミノ酸の長さを有するペプチドである。
本発明は、遺伝子工学であれ、固相技術によるペプチド合成等であれ、あらゆる手段によって作られるポリペプチドの使用を含む。前述のペプチドには、末端において種々な化学的変更がなされたものもあり得、これも本発明の範囲内である。
また他の化学的変更、特に環状や２量体から成る配列も可能である。「誘導体」という語は、このように変更されたペプチドすべてをカバーすることを意図している。
本発明のポリペプチドは、生殖器の疣贅、頚部の癌等のHPV16もしくはHPV18に関連する病気の治療や予防のために有効である。
どの用途の場合にも、これらのペプチドは、免疫原性の形で用いられる。これらのペプチドは比較的短いので、免疫原性を付与する脂質等の担体物質との接合が必要となることや、またはアジュバントの使用を必要とすることもある。
本発明のポリペプチドの予防的、または治療的服用量は勿論、患者群（年令、性別、体重など）、治療すべき状態の程度、本発明の個々のポリペプチド、投与のルートによって異なる。本発明により同定されたポリペプチドの効果的な投与を達成することができる。投与ルートは、薬学の分野で周知の投与形式は勿論、適切な投与ルートであればいかなるものも用いることができ、加えてこれらのポリペプチドは、制御された放出手段および／または吐出装置によって投与することも可能である。これらはまた他の有効な物質、特にインターロイキン−２などのようなＴ細胞を活性化する物質と組み合わせて投与することも可能である。
本発明のペプチドは、また診断用途のような他の目的のためにも用いられる。たとえば本発明に従うペプチドによる予防接種が成功したかどうかをチェックするために用いてもよい。これらは前記ペプチドが予防接種された個人のＴ細胞を活性化できるかどうかをテストすることによって、試験管内で行うことができる。
次の実施例は、本発明を説明したものであるが、これに限定されるものではない。
例１
材料
ペプチド合成剤：
Abimed AMS  422（Abimed Analysen−Technik GmbH,Langenfeld,Germany）
合成ポリマー：
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高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）装置：
ペプチドの分析および精製に使用されたHPLCシステムは、以下のものより成る：オートサンプラー2157,HPLCポンプ2248,可変波長モニターVWM2141,柱形炉2155,低圧ミキサー，（これらはすべてPharmacia Nederland B.V,Woerden,The Netherlands製）,Star  LC−20ドットマトリックスプリンター（Star Micronics Co.,Ltd製）。部品はすべて、Tandon  PCA  S1/386sxコンピュータ（Tandon Computer Benelux B.V.,Amsterdam,The Nethetlands製）によって制御。
凍結乾燥装置：
Virtis Centry（The Virtis Company,Inc.,Gardiner（NY）,USA製）。Christ Alpha RVC vacuospin（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH,Osterude am Hare,Germany製）に接続されたAlcatel 350c真空ポンプ（Alcatel CIT,Malakoff,France製）を装備。
遠心分離機：
MSE  Mistral  6L（Beun de Ronde,Abcoude,The Netherlands製）。
質量分析計：
Bioionプラズマ脱離質量分析計（PDMS）（Applied Biosysteams,Inc.,Foster City（CA）,USA製）。
アミノ酸分析：
Hp Aminoquant（Hewlett Packard,Amstelveen,The Netherlands製）
化学薬品：
化学薬品はすべて、別段の記載がない限り、更に精製を行うことなく使用した。
Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ酸はＬ構成のもので、以下の側鎖保護基を有している:Asp,Glu,Tyr,SerおよびThrの場合ｔ−Bu（テルト−ブチル）,His,AsnおよびGlnの場合Trt（トリチル）,Argの場合Pmc（2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル）,Lysの場合Boc（テルト−ブチルオキシカルボニル），すべてNovasynで、購入はPharmacia Nederland B.V.,Woerden,The Netherlandsより行う。
ピペリジンはAldrich Chemie Benelux N.V.,Brussels,Belgiumより購入した。
BOP（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェイト）はRichelieu Biotechmologies,St−Hyacinthe,Canadaより入手した。
Ｎ−メチルモルフォリン（NMM,Janssen Chimica,Tilburg,The Netherlands）を使用の前に、大気圧にてNaOHより蒸留した。
Ｎ−メチルピロリジン（NMP,Aldrich Chemie）は、使用の前に窒素雰囲気下で真空蒸留された（b.p.78−80℃,18mmHg）。
アセトニトリル（HPLCグレード）はRathburn Chemicals Ltd.,Walkerburn,Scotlandより購入した。
エーテル（Baker Analyzedグレード）、ペンタン（Bakerグレード）および酢酸（Baker Analyzedグレード）はJ.T.Baker B.V.,Deventer,TNe Netherlandsより購入した。
エタンチオールはFluka Chemie,Brusels,Belgiumより入手した。
ジクロロメタンおよびN,N−ジメチルアセトアミド（DMA）はJanssen Chimica,Tilburg,The Netherlandsより購入した。
トリフルオロ酢酸（TFA,Z.S.グレード）はMerck−Schuchardt,Hohenbrunn,Germanyより入手した。
使い捨てのもの：
PTFEフィルターを含むポリプロピレン反応容器はAbimed Analysen−Technik GmbH,Langenfeld,Germanyより購入した。
使用されるその他の使い捨てのものはすべてポリプロピレン製でSarstedt B.V.,Etten−Leur,The Netherlandsより入手した。
試験条件：
別段の記載がない限り、試験はすべて室温にて実施された。すべてのFmoc防御アミノ酸、合成ポリマー、ペプチド、およびTFAを−20℃にて保存した。
ペプチドの合成
自動化マルチプルペプチド合成装置（Abimed AMS  422）における固相法によって合成した（Gausepohl and Frank,1990;Gausepohl et al.,1990参照）。
ペプチドを種々のランで作り、各々のランにおいて48の異なるペプチドが同時に合成された。
ポリスチレン基質上のポリエチレングリコールスペーサアームのグラフト重合体であるTangel S  AC（Rapp et al.,1990;Sheppard and Williams,1982）が樹脂として使用された（40−60mg/ペプチド,10μmol  Fmocアミノ酸ローディング）
NMPにおいて90μｌの0.67M  BOP（Gausepohl et al.,1988;Castro et.al,1975）と,NMP2/1（体積／体積）において20μｌのNMM,およびNMP（６倍以上）において適切なFmocアミノ酸（Fields and Noble,1990）の0.60M溶液100μｌとの混合物を各反応溶液に加えることによって反復カップリングを実施した。反応時間の70％のところで約50μｌのジクロロメタンを各反応容器に加えた。
Fmoc−脱防護がピペリジン/DMA  1/4（体積／体積）0.8mlを各反応容器に３回添加することによって行われた。
カップリングと脱防護の回数は合成の進行と共に増加させたが、各々30分と３分３回でスタートした。
カップリングおよびFmoc−脱防護の後、1.2mlDMAで６回洗浄を行った。必要な一連の順序を達成し終え、最後のFmoc防護が除去された後、このペプチジル樹脂をDMA,ジクロロメタン，ジクロロメタン／エーテル  1/1（体積／体積）およびエーテルの各々によって念入りに洗浄し、乾燥した。
ペプチドの開裂および単離
各反応容器に５分間隔で200μlTFA/水19/1（体積／体積）を６回添加することにより該樹脂からのペプチドの開裂および側鎖防護基の除去を行い、このようにして、自由カルボキシルペプチドを生成した。Trp−含有ペプチドについては、TFA/水／エタンチオール  18/1/1（体積／体積／体積）を使用した。
最初のTFA添加の２時間後に、10mlエーテル／ペンタン  1/1（体積／体積）の添加によって混合ろ液よりペンタンを沈殿させ、−20℃に冷却した。該ペンタンを遠心分離により単離した（−20℃,2500g,10分）。
エーテル／ペンタン  1/1（体積／体積）と共にペレット処理を行い、同じ遠心分離装置による単離を行った後、該ペプチドを15分間、45℃で乾燥した。
該ペプチドの各々を2mlの水（または2mlの10体積％酢酸）に溶解させ、該溶液を３分間液体窒素中にて凍結させ、遠心分離（1300prm,8−16時間）を行い、凍結乾燥させた。
分析および精製
ペプチドの純度は、逆相HPLCによって決定した。約50nmolのアリコートを10μｌ  30体積％酢酸に溶解した。この溶液の内、30μｌを３成分溶剤システムを備えたRP−HPLCシステムに適用した。A:水、B:アセトニトリル、C:水中の２体積％TFA。
傾斜溶出（1.0ml/分）を90％A,5％B,5％Ｃから20％A,75％B,5％Ｃまで30分実施した。検出は214nmであった。
任意に採取された試料をPDMSにおける質量分析により分析した。31の結合ペプチドをすべてPDMSにおける質量分析により、およびHp Aminoquantにおける加水分解後定量アミノ酸分析によって分析した。分析された全試料の内、計算質量と測定質量の差は、使用した装置の製造者により明記された試験誤差（0.1％）の範囲内であった。アミノ酸の組成はすべて予測した通りであった。
例２
ペプチド
凍結乾燥された240のHPV16ペプチドと247のHPV18ペプチド全部の内より、5mgを計量し、1mlの蒸留水に溶解し、5N  NaOHによりpH12に調整した。容易に溶解しないペプチドを150μｌの氷状の100％酢酸（CH3COOH,Merck Darmstadt,Germany:56−1000）で処理し、その後、蒸留水にて希釈した5N  NaOHでpHを７に中和した。それでもまだ溶解していないペプチドを100mlの5N  NaOHで処理し、pHを12とし、その後、蒸留水中にて、10％の氷酢酸でpH7に中和した。
細胞
174CEM,T2細胞をIscoveの改良Dulbecco培地（Biochrom KG Seromed Berlin,Germany:F0465）中で培養し、100IU/mlペニシリン（Biocades Pharma,Leiderdorp,The Netherlands）,100ug/mlカナマイシン（Sigma St.Louis USA:K−0254）,2mMグルタミン（ICN Biomedical Inc.Costa Mesa,CA,USA:15−801−55）および小ウシ胎児の10％血清（FCS,Hyclone Laboratories Inc.Logan,Utah USA:A−1115−Ｌ）を追加した。細胞を、腐植化空気中５％CO2、37℃の温度で、３日間2.5×105/mlの濃度で培養した。
ペプチド結合
174CEM.T2細胞をFCSのない培地中にて２度洗浄し、２×106細胞/mlの濃度までの血清を含まない培地に置いた。この懸濁液より40μｌをＶ底96ウェルプレート（Greiner GmbH,Frickenhausan,Germany:651101）中に、各ペプチドの希釈液（1mg/ml）10μｌと共に入れた。最終濃度は８×104174CEM.T2細胞を有する200μg/mlペプチドである。この溶液を静かに３分間撹拌し、そのあと腐植化空気中５％CO2、37℃にて16時間の培養が行われた。次いで細胞を100μｌ  0.9％NaCl,0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma St.Lauis,USA:A−7409）,0.02％NaN3（Merck Darmstadt,Germany:822335）で１回洗浄した。1200rpmの遠心分離機回転にかけた後、ペレットを４℃で30分間、HLA−A2.1固有マウスモノクローナル抗体BB7.2の飽和量50μｌ中にて再懸濁した。次いで細胞を２度洗浄し、1:40の希釈、および全250mlの体積でフルオレセインイソシアネイト（Tago Inc Burlingame,CA,USA:4350）と接合させるヤギ抗−マウスIgGにより30分間培養させた。
最後の培養の後、細胞を２度洗浄し、フルオレセインをFACScanフローサイトメーター（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ.USA）にて488nmで測定した。結果は図１（HPV16ペプチド）および図２（HPV18ペプチド）に各々示した。
174CEM.T2細胞系は“中空で”不安定なHLA−A2.1分子を発現し、これらの分子はペプチドがこれらの分子のペプチドを示す溝に結合している場合には安定化することができる。容易に減成しない安定化HLA−A2.1分子は分析されたペプチドの結合の結果である。これはHLA−A2.1分子の細胞表面発現の増加を導く。
結果
174CEM.T2細胞により発現されるHLA−A2.1分子に結合できるHPV16とHPV18のE6およびE7領域ペプチドを同定するために、HPV16とHPV18のE6およびE7のアミノ酸配列を試験した（４）。E6およびE7領域の各アミノ酸を、９アミノ酸長ペプチドの第１アミノ酸として使用した。この方法で、HPV16とHPV18のE6およびE7の全領域をカバーした。９アミノ酸長ペプチドは、HLA−A2.1分子の溝に結合す６ペプチドの長さに関して現在知られているルールに適合しているので（Kast and Melief,1991による考察）、これを選択した。実際上の理由のために、第１番目の一連の試験においては、アラニン残渣を、試験されたペプチドにおいて自然配列において発生するシスティン残渣の代わりに使用した。その後、第２番目の一連の試験は、自然配列のシスティン残渣を含むペプチドで実施された。
表ＩのNo.1〜18のペプチドおよび表IIのNo.1〜14のペプチドだけが（システィン残渣の代わりにアラニン残渣を含むペプチドを含む）、例２に述べたようなHLA−A2.1分子との結合を示している174CEM.T2細胞の平均HLA−A2.1蛍光として測定されるHLA−A2.1分子の発現を有意に調節することができた。222＋233の他のペプチドの中にはこれができるものはなかった。蛍光測定の結果は表VIIおよびVIIIに挙げ、図１および図２に示した。これらのペプチドは、表Ｉおよび表IIの番号に従って番号付けをした。
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蛍光指数レベル０に設定された（ペプチドを付加しない）バックグランド蛍光により、ペプチドの結合は、蛍光レベルが
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であった場合には正とみなされた。
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これらの試験は、限られた一部のペプチドだけが、HLA−A2.1分子に結合する能力を有しており、従って、CTLはHLA分子に結合される場合にのみ、ペプチドを認識するので、これらのペプチドがヒトCTLによって認識されるべきHPV16およびHPV18のＥ領域の唯一の候補であることを示している。
例３
本例は、プロセシング欠陥細胞系174CET.T2を用いて、HPVペプチドに対する一次免疫応答の生体誘発を示している。
174CET.T2細胞（T2）におけるHLA−A2.1の発現は、該ペプチドを含む培地中でT2細胞をインキュベーションすることによって増加する。T2細胞は、多量のHLA−A2.1に結合する該ペプチドを表しており、従って優れた抗原提示細胞（APC）である。以下に述べた応答誘発法では、T2細胞系が、APCとして使用され、応答個体細胞としてフィコール後単核細胞が用いられた。
方法
１）T2上HLA−A2.1のペプチド負荷
２×106細胞/mlの濃度のT2細胞をT25フラスコ（Becton Dickinson,Falcon,Plymouth Engeland cat.nr.3013）により37℃で２時間、血清を含まないIMDM（＝Iscoves Modified Dulbecco′s Medium;Biochem KG,Seromed Berlin,Germany,cat.nr.F0465）中にて、グルタミン（2mM,ICN Biochemicals Inc.,Casta Meisa,USA,cat.nr.15−801−55）、抗生物質（100IU/mlペニシリン（Brocades Pharma,Leiderdorp,The Netherlands）,100μg/mlカナマイシン（Sigma,St.Louis,USA;K−0245））および80μg/ml濃度の選択されたペプチドMLDLQPETT（＝JWK3;SEQ  ID  No:15）と共にインキュベーションした。
２）T2（APC）のミトマイシンＣ処理
これらのインキュベーションされたT2細胞をスピンダウンさせ、続いて血清を含まないRPMI（Gibo Paislan,Scotland,cat.nr.041−02409）培地中で１時間、37℃にてミトマイシンＣ（50μg/ml）により、20×106細胞/mlの濃度に処理した。
３）一次免疫応答誘発のための準備
96ウエルＵ底プレート（Costar,Cambridge,USA,cat.nr.3799）の全ウエルを、50μｌの血清を含まない完全RPMI培地（グルタミン（2mM,ICN Biochemicals Inc.,Coasta,Meisa,USA,cat.nr.15−801−55），ペニシリン（100IU/ml,Brocades Pharma,Leiderdorp,The Netherlands）、カナマイシン（100μg/ml,Sigma,St.Louis;K−0245））および80μg/ml濃度のペプチドMLDLQPETT中にて、100,000マイトマイシンＣ−処理T2細胞で満たした。
４）応答個体細胞
応答個体細胞は、HLA−A2.1サブタイプドナー（＝C.B.）の単核周辺血液リンパ球（PBL）である。PBLは、Ficoll処置（Ficoll調製:Nycomed−pharma,Oslo,Norway,cat.nr.10503のリンパ球調整）による軟層より分離し、RPMI中にて２回洗浄した。分離および洗浄後、PBLを30％ヒトのプールされた血清（HPS）（HPSは混合リンパ球培養にて抑制機能について試験する）により、完全なRPMI培地中にて再懸濁した。
５）一次免疫応答インキュベーション
50μｌ培地における400,000PBL−C.B.を、T2細胞ですでに充填された96ウエルＵ底プレートの各ウエルに添加し、５％  CO2および90％湿度のインキュベータ中にて37℃で７日間培養した。
６）再刺激（７日）
PBLインキュベーション後７日目に、ペプチドMLDLQPETTおよびT2細胞（ヘッダ１−５）,PBL−C.B.をペプチドMLDLQPETTにより再刺激した。この目的のために、96ウエルから全細胞と培地を収集した。生存している細胞をFicoll処置により単離し、RPMI中で洗浄した。新しい96ウエルＵ底プレートにおいてこれらの生存細胞の内50,000細胞を、15％HPSを有する50μｌの完全RPMI培地と共に各ウエルに接種した。各ウエルごとに、20,000のオートロガス、照射（3000ラド）PBL、および50,000オートロガス、照射（10,000ラド）EBV−形質転換Ｂ−リンパ球（＝EBV−C.B.）を15％HPSと80μg/mlの濃度のペプチドMLDLQPETTを含む50μｌ完全RPMIと共に添加した。これらの細胞を５％CO2,90％湿度のインキュベーション中にて、37℃で７日間培養した。
７）再刺激（14日）
PBLインキュベーション後14日目に、ペプチドMLDLQPETTおよびT2細胞（ヘッダー１−５）、PBL−C.B.をペプチドMLDLQPETTにより再刺激した。このようにするために、ヘッダー６における手順を繰り返す。
８）限界希釈によるクローニング
PBLインキュベーション後21日目に、ペプチドMLDLQPETTおよびT2細胞、細胞および培地を96のウエルより採取した。生存可能細胞をFicoll処置により単離し、15％HPSを含む完全なRPMI中で洗浄した。この大量の生存可能細胞を、限界希釈によりクローン化した。新しい96ウエルＵ底プレート（Costar,Cambridge,USA,cat.nr.3799）の各ウエルに、15％HPSを含む50μｌ完全RPMI培地を100の生存可能細胞（＝HPV16バルク抗MLDLQPETT）と共に添加した。他の新しい96ウエルＵ底プレートに対しても、ウエルのための細胞の数以外は正確に繰り返した。続くプレートは各ウエルごとに10.1.または0.3の細胞を含んでいた。すべてのウエルに対し、４つの異なるドナーの20,000のプールされた照射（3000ラド）PBLと３つの異なるHLA−A2.1ドナー（VU−41518JY）の10,000のプールされた照射（10,000ラド）EBV形質転換Ｂ細胞を15％HPSと40μg/mlの濃度のペプチドMLDLQPETT、２％の濃度のロイコアグルチニン（Pharmacia,Uppsala,Sweden,cat.nr.17−063−01）、120IU/mlの濃度のヒト組換IL−２（Eurocetus,Amsterdam,The Netherlands）を含む50μｌ完全RPMI培地と共に添加した。
９）エキスパンド  クローン
各ウエルに以下のものを添加し100μｌの最終体積とする。
−25,000生存可能細胞
−20,000照射PBL−プール（ヘッダ−８の場合と同様）
−10,000照射EBV−プール（ヘッダ−８の場合と同様）
−２μｇペプチドMLDLQPETT
−6IU組換IL−２
49日目に細胞障害試験を、エフェクター細胞として65クローンと１バルクおよび標的細胞としてT2（該ペプチドMLDLQPETTを含むまたは含まない）により実施した。バックグラウンド溶菌は、無関係な（しかしHLA−A2.1結合）ペプチド、ATELQTTIHと共にインキュベートされたT2細胞の溶菌として定義されている。
HPV16バルク（C.B.）抗MLDLQPETTは、溶菌MLDLQPETT増感T2細胞に固有のものであると思われた。クローンはすべて特異性のものではなかった。
新しい限界希釈をHPV16バルク（C.B.）抗MLDLQPETT細胞（ヘッダ−８＋９の場合と同様）によって行った。
この新たな限界希釈より28日後に、５つのクローン（ID10,ID12,ID19,ID26,ID92）と１バルクにより、細胞障害試験を実施した。代表的クローンを図３に示した。
例４
この例は、免疫化学ペプチド−MHC結合試験を示すもので、この試験は、HLA−A1,A2.1,A3.2,A11.2およびA24分子に結合するHPV16蛋白質E6およびE7ペプチドの決定に使用された。
この方法は、共通ペプチドに基づいて、精製クラスＩの分子と同位体置換識別合成樹脂製プローブを利用している。クラスＩの分子との結合のために試験された競合ペプチドは同位体置換共通ペプチドとのこの結合について競合している。HLA−A1,A2.1,A.3.2,A11.2およびA24分子を以下の細胞系から各々単離した:EBV（Eppstein Barr Virus）形質転換細胞系Steinlin,EBV形質転換細胞系JY,EBV形質転換細胞系GM3107,細胞系BVRおよびEBV形質転換細胞系KT3。大量培養の後、細胞をNP40（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）中に溶解させ、このライゼートを不活化セファロースCL4BおよびProtAセファロースの２本のプレカラムに通した。次に、クラスＩの分子を、B2,23.2（抗HLA−ＢおよびHLA−Ｃ）と抗ヒトHLAと接合するProtAセファロースビードを用いて、新和性クロマトグラフにより、細胞ライゼートから精製した。このライゼートからまずB2.23.2カラムに繰り返し通して、ＢおよびＣ分子をとった。次いで残っているHLA−Ａ分子をW6/32カラムにより捕獲し、1mM  Tris  pH6.8で中和したpH11.5  DEA/1％OGで溶出し、Amicon30kpカートリッジにおける限外ろかにより濃縮した。
結合試験のために、（通常10−50nMの範囲内）同位体置換識別合成プローブの15％の結合に至った。MHCの量を、約5nMの同位体置換識別ペプチドおよび１μＭ  β2Mおよび（最終濃度1mM  PMSF,1.3mM  1,10−フェナントロリン、73μＭペプスタチンA,8mM  EDTA,200μＭ  Ｎ−α−ｐ−トシルーＬ−リシン  クロロメチルケトンを有する）プロテアーゼ阻害剤の反応混液の存在下で、（通常10mg〜1ng/mlの範囲内で）試験すべき同位体置換識別のされていない滴定量の競合ペプチドと共に0.05％NP40−PBS中でインキュバートした。２日後に、23℃にて、MHC結合放射能の割合をSette et al（1992）によって述べられているように、TSK2000ゲルろかにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。
プローブペプチドを、Buns et al（1987）によって述べられたクロルアミンＴ法を用いてヨウ素化した。前述のHLA分子のため使用されたプローブペプチドの配列はA1についてはYLEPAIAKY,A2.1についてはFLPSDYFPSV、A3.2についてはKVFPYALINK,A11.2についてはAVDLYHFLK,A24についてはAYIDNYNKFであった。
種々の試験で得られたデータの比較を可能とするために、同位体置換識別のされていないプローブペプチドの阻害に対する正の制限のための50％阻害用量（IC50）を、試験された各ペプチドに対する50％阻害用量で割ることにより、各ペプチドについての相対結合の程度を計算した。該プローブに対する50％阻害用量値は、A1では81nM,A2.1では5nM,A3.2では30nM,A11.2では9nM,A24では22nMであった。
各競合ペプチドを２〜４の完全に独立した試験においてテストした。システインを含むペプチドは合成および取り扱い時の（空気による）酸化を受けるので、これらのペプチドはシステインの代わりにアラニンで合成された。任意に、競合ペプチドは、それらが以下の比：
1.0−0.1,0.1−0.01,0.01−0.001,＜0.001
になる場合には、各々、優れた結合剤、中等結合剤、弱結合剤、負の結合剤として分類された。
結果は表IX〜XIIIに示した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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