(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーンするための方法であって、配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合する前記化合物の能力を決定することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記炎症性サイトカインがインターロイキン１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
IL-1又はこれらに機能的に類似する炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法であって、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号２に対して少なくとも95％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合する前記化合物の能力を測定することを含んで成る方法。
【請求項４】
IL-1又はこれらに機能的に類似する炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法であって、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合する前記化合物の能力を測定することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炎症メディエイター，たとえばインターロイキンＩＬ−１及びＩＬ−１βの開放を抑制するための新規治療標的物としてのジアリールスルホニルウレア（ＤＡＳＵ）結合タンパク質（ＤＢＰ）の同定に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症性疾患、たとえばリウマチ様関節炎は、炎症状態を促進し、そして／又は維持するサイトカインの過剰生成により特徴づけられる。それらの中で、ＩＬ−１（α及びβ形の両者）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及びＩＬ−１８が良く知られている（Dinarello, C. A. Blood 87 : 2095-2147 (1996) ; Aggarwal, B. B. and Natarajan, K. Eur. Cytokine Netw. 7 : 93-124 (1996) ; Ushio, S.など. 、J. Immunol. 156 : 4274-4279 (1996)) 。生成細胞からの開放の後、それらのサイトカインは、サイトカインシグナリングカスケードを開始するために標的細胞上の特定の受容体に結合する。疾病工程におけるそれらの重要性の結果として、それらのサイトカインの生成及び／又は活性の調節を目的とする治療アプローチが所望される。
【０００３】
ほとんどのサイトカインは、粗面小胞体及びゴルジ体から成る構成分泌装置を通して細胞から分泌されるが、しかしＩＬ−１及びＩＬ−１８は典型的でない経路により運ばれる（Rubartelli, A.など．、EMBO J. 9 : 1503-1510 (1990)) 。
非伝統的輸送経路のための必要性は、シグナル配列を欠くポリペプチドとしてのＩＬ−１及びＩＬ−１８の合成の結果である（Auron, P. E.など、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 7907-7911 (1984) ; March, C. J. など、Nature 315 : 641-647 (1985) ; Ushio, S. など、J. Immunol. 156 : 4274-4279 (1996)) 。
【０００４】
このシグナル又はリーダー配列は典型的には、細胞から開放される予定になっているポリペプチドのアミノ末端で見出される（von Heijne, G. J. Membrane Biol. 115 : 195-201 (1990))。シグナル配列は、小胞体中に新しく合成されたポリペプチドを向けるための分子アドレスとして作用する。新しく合成されたＩＬ−１（プロＩＬ−１）及びＩＬ−１８（プロＩＬ−１８）はこの配列を欠いているので、それらは生成細胞の細胞質区画内に蓄積する。
【０００５】
それらの同時一局在化の他に、プロＩＬ−１β及びプロＩＬ−１８はまた、プロテアーゼカスパーゼＩによりプロセッシングされるべきであり（Thornberry, N. A. など、Nature 356 : 768-774 (1992) ; Ghayur, T.など、Nature 360 : 619-623 (1997))；この分解が標的細胞受容体に結合するのに有能なサイトカインの生物学的に活性な成熟形を生成する。プロＩＬ−１αは、タンパク質分解活性化のためにこの必要条件を共有しない（Moseley, B. など、J. Biol. Chem. 262
: 2941-2944 (1987))。
【０００６】
類似する非伝統的経路により輸送される他のポリペプチドは次のものを包含する：Ｍｉｆ−関連タンパク質（ＭＲＰ）８／１４（Rammes, A.など、J. Biol. Chem. 272 : 9496-9502 (1997))、基本的な線維芽細胞成長因子 (Abraham, J.A. Science 233 : 545-548 (1986)) 、ガレクチン (Cleves, A. E. など、J. Cell. Biol. 133 : 1017-1026 (1997))、ＩＬ−１受容体アンタゴニストの形（Haskill, S. など、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 3681-3685 (1991)) 、チオレドキシン (Rubartelli, A.など、J. Biol. Chem. 267 : 24161-24164 (1992))；及びＶＰ２２及びＴａｔを含むいくつかのウィルス的にコードされたポリペプチド（Ensoli, B.など、J. Virol. 67 : 277-287 (1993) ; Elliott, G. and O'Hara, P. Cell 88 : 223-233 (1997))。
【０００７】
リポ多糖（ＬＰＳ）−処理された単球及びマクロファージは、多量のプロＩＬ−１βを生成するが、しかし成熟サイトカインの開放は二次刺激の不在下で無効果である（Hogquist, K. A. など、J. Immunol. 147 : 2181-2186 (1991) ; Perregaux, D.など、J. Immunol. 149 : 1294-1303 (1992)) 。プロＩＬ−１βのタンパク質分解成熟及び成熟サイトカインの開放の両者は、次の多くの異なった刺激のいづれかによりＬＰＳ−活性化された細胞を処理することによって増強される：
【０００８】
細胞外ＡＴＰ、細胞溶解性Ｔ−細胞、高濃度のＬＰＳ、イオノファア様分子、トキシン、低張ストレス、及び機械的ストレス（Hogquist, K. A. など、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 8485-8489 (1991) ; Perregaux, D. and Gabel, C. A. J. Biol. Chem. 269 : 15195-15203 (1994) ; Walev, I. など、Eur. Mol. Biol. Org. J. 14 : 1607-1614 (1995) ; Bhakdi, S.など、J. Clin. Invest. 85 : 1746-1753 (1990) ; Chin, J. and Kostura, M. J. J. Immunol. 151 : 5574-5585 (1993))。
【０００９】
重要なことには、刺激−結合されたサイトカイン後翻訳プロセッシングは、薬理学的介入に対して敏感である。従って、種々の非感受性アニオン輸送インヒビター、たとえばエタクリン酸及びテニダップ (tenidap ）は、プロＩＬ−１βの刺激−連結された後翻訳プロセッシングを阻止することができる（Laliberte, R. など、J. Immunol. 153 : 2168-2179 (1994) ; Perregaux, など、J. Immunol. 157 : 57-64 (1996) ; Perregaux, など、J. Immunol. 160 : 2469-2477 (1998)) 。それらの剤は、活性刺激の性質とは無関係な、ＩＬ−１後翻訳プロセッシングの効果的インヒビターである。さらに、それらの阻害効果は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両者の外面化における完全な抑制として明示される。
【００１０】
ＤＡＳＵと称する新規な一連の剤が、刺激−連結された後翻訳プロセッシングの有能なインヒビターとして同定されている。それらの化合物は１９９７年１月２７日に出願されたアメリカ特許出願第０６／０８６，９３９号（その開示は引用により本明細書に組込まれる）に記載され、そして請求されている。ＩＬ−１及びＩＬ−１８は炎症の重要な仲介物であり、そしてそれらの機能のインヒビターは疾病の動物モデルにおいて治療的軽減を付与するので（Cominelli, F. など、J. Clin. Invest. 86 : 972-980 (1990) ; Akeson, A. L.など、J. Biol. Chem. 271 : 30517-30523 (1996) ; Caron, J. P.など、Arthritis Rheum. 39 : 1535-1544 (1996) ; Okamura, H.など、Nature 378 : 88-91 (1995) ; Rothwell, N. J. Clin. Invest. 100 : 2648-2652 (1997)) 、刺激−連結された後翻訳プロセッシングの工程を破壊する剤は炎症仲介物により維持される障害のヒト及び動物における処理のために有用であることが予測される。それらは、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、ぜん息、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、神経変性、アテローム硬化症及び乾癬を包含する。
【００１１】
【本発明の説明】
本発明は、それらの剤のサイトカイン阻害活性を仲介する２種のＤＡＳＵ結合タンパク質（ＤＢＰ）に対応するタンパク質及びＤＮＡ配列の同定に関する。ＤＢＰは、刺激−連結された後翻訳プロセッシングを破壊する構造的にユニークな薬物をスクリーンするために使用され得る。ＤＢＰに結合する化合物はまた、炎症性疾患の処理における治療剤としても使用され得る。
本発明はさらに、ＤＢＰに結合する薬物の医薬組成物に関する。
【００１２】
次の略語が、この特許を通して使用される：
ＡＴＰ        ：アデノシン三リン酸
ＤＡＳＵ      ：ジアリールスルホニルウレア
ＤＢＰ        ：ジアリールスルホニルウレア結合タンパク質
ＥＳＴ        ：発現された配列標識
ＧＳＴ        ：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
ＨＰＬＣ      ：高性能液体クロマトグラフィー
ＩＬ          ：インターロイキン
kDa          ：キロドルトン
ＬＣ−ＭＳ    ：液体クロマトグラフィー−質量分光計
ＬＰＳ        ：リポ多糖
ＰＡＧＥ      ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒ            ：組換え体
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＳＤＳ        ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＬＣ        ：薄層クロマトグラフィー
ＴＮＦα      ：腫瘍壊死因子α
【００１３】
１の態様において、本発明は、炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法に関し、ここで、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号１に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合する前記化合物の能力を決定することを含んで成る。
前記炎症性サイトカインがインターロイキン１である方法が特に好ましい。
【００１４】
もう１つの態様において、本発明は、炎症性成分により特徴づけられる疾病状態を有する哺乳類の処理方法に関し、ここで配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号１に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合できる、化合物又は医薬的に許容できる前記化合物の塩、エステル又はプロドラッグを、その処理の必要な哺乳類に投与することを含んで成る。
【００１５】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、医薬的キャリヤー及び医薬的活性量の化合物、又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを含んで成る医薬組成物に向けられ、ここで前記化合物は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号１に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合できる。
【００１６】
さらにもう１つの態様において、本発明は、炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法に向けられ、ここで前記方法は配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合する前記化合物の能力を決定することを含んで成る。
炎症性サイトカインがインターロイキン１である方法が特に好ましい。
【００１７】
もう１つの態様において、本発明は、炎症性成分により特徴づけられる疾病状態を有する哺乳類の処理方法に向けられ、ここで前記方法は、配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合できる、化合物又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを、そのような処理の必要な哺乳類に投与することを含んで成る。
【００１８】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、医薬的キャリヤー及び医薬的活性量の化合物、又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを含んで成る医薬組成物に向けられ、ここで前記化合物は、配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに結合できる。
【００１９】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法に向けられ、ここで前記方法は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号３に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合する前記化合物の能力を決定することを含んで成る。
炎症性サイトカインがインターロイキン１である方法が特に好ましい。
【００２０】
もう１つの態様において、本発明は、炎症性成分により特徴づけられる疾病状態を有する哺乳類の処理方法に向けられ、ここで前記方法は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号３に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合できる、化合物又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを、そのような処理の必要な哺乳類に投与することを含んで成る。
【００２１】
さらにもう１つの態様において、本発明は、医薬的キャリヤー及び医薬的活性量の化合物、又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを含んで成る医薬組成物に向けられ、ここで前記化合物は、配列番号３のポリペプチド、又は配列番号３に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合できる。
【００２２】
さらにもう１つの態様において、本発明は、炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物の能力についてスクリーニングするための方法に向けられ、ここで前記方法は配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号４に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合する前記化合物の能力を決定することを含んで成る。
炎症性サイトカインがインターロイキン１である方法が特に好ましい。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、炎症性成分により特徴づけられる疾病状態を有する哺乳類の処理方法に向けられ、ここで前記方法は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号４に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合できる、化合物又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを、そのような処理の必要な哺乳類に投与することを含んで成る。
【００２４】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、医薬的キャリヤー及び医薬的活性量の化合物、又は前記化合物の医薬的に許容できる塩、エステル又はプロドラッグを含んで成る医薬組成物に向けられ、ここで前記化合物は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号４に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドに結合できる。
もう１つの態様において、本発明は、化合物１−（４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレアに向けられる。
もう１つの態様において、本発明は、化合物１−（１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセン−４−イル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレアに向けられる。
【００２５】
図１は、ＤＡＳＵ結合タンパク質を同定するために使用される２種のエポキシド−結合ＤＡＳＵの構造を示す。
【００２６】
図２は、ＡＴＰ−刺激されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしてのエポキシド−含有ＤＡＳＵの利用性を示す。Ａ）ＬＰＳ−活性化されたヒト単球が示される濃度の試験剤により前処理され、次にＡＴＰと共に（試験剤の連続した存在下で）インキュベートされた。続いて、培地が収穫され、そしてそれらのＩＬ−１β含有率がＥＬＩＳＡにより決定された：個々の試験剤濃度で生成されたＩＬ−１βの量が試験剤の不在下で回収されるＩＬ−１βの１％として示される。Ｂ）ＬＰＳ−活性化されたヒト単球が示される濃度の化合物２により６０分間、処理され、この後、培養培地がＡＴＰを含むが、しかし前記化合物を欠いている新鮮な培地により交換された。続いて、培地が収穫され、そしてそれらのＩＬ−１β含有率がＥＬＩＳＡにより決定される。検出されるＩＬ−１βの量が、ＤＡＳＵ化合物により前処理されていない単球から回収されるＩＬ−１βの％として示される。
【００２７】
図３は、細胞結合タンパク質を同定するためのプローブとしての放射性ラベルされたエポキシド−含有ＤＡＳＵの利用性を示す。Ａ）示される濃度の〔14Ｃ〕ＤＡＳＵ化合物（化合物１）又は異なった〔14Ｃ〕ＤＡＳＵ化合物（化合物２）（底部）により処理されたヒト単球から単離された可溶性ポリペプチドがＳＤＳＰＡＧＥにより分別され、そして放射性ラベルされたポリペプチドがホスホルイメージャー分析により検出された。３種の高くラベルされた種の見掛け分子質量がkDa で右側に示されている。Ｂ）単球が示される濃度の化合物１により前処理され、その後、それらがＩＬ−１β後翻訳プロセッシングを促進するためにＡＴＰにより処理された。
【００２８】
細胞外開放されたＩＬ−１β（ＥＬＩＳＡにより検出された）が、化合物１により前処理されていない細胞から回収されたＩＬ−１βの％（％対照）として示される。同じＡＴＰ−処理された単球の細胞抽出物から回収された可溶性ポリペプチドがＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析され、この後、放射性ラベルされたタンパク質がホスホルイメージャー分析により検出された。３種の放射性ラベルされた主要ポリペプチドに関連する放射能の量が化合物１濃度の関数としてそれぞれ個々の種について観察される最大ラベリングの％（％最大）として表わされる。
【００２９】
図４は、ＤＢＰ−３２についてのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。下線を引かれたアミノ酸残基は、放射性ラベルされたＴＨＰ−１細胞ポリペプチドにおけるエドマン配列分析及び／又は質量分光計により同定された残基を示す。
図５は、ＤＢＰ−３１についてのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。下線を引かれたアミノ酸残基は、放射性ラベルされたＴＨＰ−１細胞ポリペプチドにおけるエドマン配列分析及び／又は質量分光計により同定された残基を示す。
図６は、ＤＢＰ−３１とＤＢＰ−３２との間の配列類似性を示す。それらの２種のアミノ酸配列が Clustal技法により一列配列された。太字の残基は、前記２種の配列において同一である残基である。
【００３０】
図７は、組換えＤＢＰが化合物２を結合する能力を保持することを示す。Ａ）ｒＤＢＰ−３２，ｒＤＢＰ−３１、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のサンプルが、示される濃度の化合物２と共にインキュベートされ、この後、それらはＳＤＳ  ＰＡＧＥにゆだねられ、そして乾燥されたゲルがホスホルイメージャーを用いて分析された。Ｂ）ｒＤＢＰ−３１が、非−エポキシド含有ＤＡＳＵ（化合物４）の存在又は不在下で５００nMの化合物２と共にインキュベートされ；化合物２に対する化合物４のモル比が示される。サンプルがＳＤＳＰＡＧＥにより分離され、続いてホスホルイメージャー分析を行ない；個々の条件は二重反復して実施された。
【００３１】
図８は、インビトロにおいてヒト単球によるＡＴＰ−誘発されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての非−エポキシド含有ＤＡＳＵの有用性を示す。Ａ）ＬＰＳ−活性化された／〔35Ｓ〕メチオニン−ラベルされた細胞が示される濃度の非−エポキシド含有ＤＡＳＵ化合物３により前処理され、そして次に、ＤＡＳＵの連続した存在下でＡＴＰに暴露された。開放されたＩＬ−１βが免疫沈殿され、そして免疫沈殿物がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され；ゲルのオートラジオグラムが示される。左側の矢印は、３１kDa のプロＩＬ−１β、２８kDa の他の切断生成物、及び１７kDa の成熟ＩＬ−１βの予測される移動位置を示す。Ｂ）１７kDa のＩＬ−１βとして回収された放射能の量が決定され、そして化合物３の濃度の関数として示される。
【００３２】
図９は、ＡＴＰ−誘発されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての多くの構造的に関連するＤＡＳＵを比較する。ＬＰＳ−活性化された単球が、示される化合物の存在下でＡＴＰにより処理され、この後、培地中に放されたＩＬ−１βがＥＬＩＳＡにより測定された。それぞれ個々のＤＡＳＵについて１μＭの濃度で観察される阻害の程度（非処理対照に対する％阻害率）が示される。
【００３３】
図１０は、インビトロでネズミ腹膜マクロファージによる細胞溶解性Ｔリンパ球−介在性ＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての非−エポキシド含有ＤＡＳＵの有用性を示す。Ａ）ＬＰＳ−活性化された／〔35Ｓ〕メチオニン−ラベルされた細胞が示される濃度の化合物３により前処理され、そして次に、同種異系細胞溶解性Ｔリンパ球の調製物と共に又はそれを伴わないで（ＣＴＬを含まない）同時培養された（ＤＡＳＵの連続した存在下で）。
【００３４】
４時間の同時培養の後、開放されたＩＬ−１βが免疫沈殿により回収され、そして沈殿物がＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析され；免疫沈殿物のオートラジオグラムが示される。３５kDa ，２８kDa 及び１７kDa のネズミＩＬ−１βの予測される移動位置が矢印により示される。Ｂ）免疫沈殿された１７kDa 種に関連する放射能の量が決定され、そして個々の化合物３の溶液についてＤＡＳＵの不在下で回収される％として表わされる。
【００３５】
図１１は、サイトカインインヒビターとしての化合物３の選択性を示す。ヒト単球は、ＬＰＳにより刺激され、そして１μＭの化合物３の存在又は不在下でＡＴＰにより処理される。続いて、培地が収穫され、そして特定のＥＬＩＳＡキットを用いて、種々のサイトカインのそれらの含有率についてアッセイされた。化合物３の存在及び不在下で生成されたＩＬ−１β，ＩＬ−６及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＲＡ）のレベルが示される。
【００３６】
図１２は、マウスへの経口投与の後、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両者の開放を阻害するＤＡＳＵの有用性を示す。マウス腹膜マクロファージが、ＬＰＳによりインビボで刺激され、そして続いて、種々の量の化合物３により投与された動物においてＡＴＰにより処理された。腹膜洗浄液が収穫、そして特定のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＬ−１の含有率についてアッセイされた。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βのレベルが測定され、そしてビークルにより処理されたマウスの腹膜マクロファージから放されるそれらのレベルの％として示される。
ＤＡＳＵ結合タンパク質に対応するＤＮＡ及びタンパク質配列が同定される方法、及び刺激−連結された後翻訳プロセッシングのインヒビターとしてそれらのタンパク質に結合する剤の使用が下記に記載される。
【００３７】
ＤＢＰの発見：
刺激−連結されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングを阻害するそれらの能力に基づけば、ＤＡＳＵはサイトカイン輸送経路に関与する１又は複数の細胞タンパク質に結合すべきであることが推定された。それらを同定するために、不可逆性共有アダクトを形成するためにタンパク質上の官能基と反応することができるエポキシド基を含む放射性ラベルされたＤＡＳＵ類似体から合成され；２種のそのような剤、すなわち化合物１及び２の構造は図１に示されている。それらの剤のいづれかによるヒト単球の連続的な処理は、ＡＴＰ−誘発されたＩＬ−１β生成における用量−依存性阻害をもたらした（図２Ａ）。
【００３８】
対照的に、同じ実験条件下で構造的に異なったエポキシド−含有剤２−（４−ニトロフェノキシメチル）−オキシランによる処理は、ＩＬ−１輸送を阻害しなかった（図２Ａ）。従って、エポキシド自体ではない、ＤＡＳＵ剤に関連する構造的特徴は、サイトカイン阻害応答を達成する必要があることである。単球が化合物２により６０分間、前処理され、そして前記化合物の不在下でＡＴＰにより処理される場合、ＩＬ−１β生成は抑制されたまま存続した（図２Ｂ）。この不可逆性は、化合物２が細胞タンパク質に共有結合し、そしてこの相互作用がサイトカイン後翻訳プロセッシングの阻害を担当していることを示唆した。
【００３９】
エポキシド−含有ＤＡＳＵにより共有結合されるポリペプチドを同定するために、〔14Ｃ〕ラベルされた誘導体が合成され、そしてそれらの放射性プローブにより処理された細胞が窒素キャビテーションにより破壊され、そして可溶性膜画分中に分離され；続いて、それらの画分がＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより別々に分析された。放射性ラベルされた膜−関連ポリペプチドは、１００nM〜１０μＭの濃度の放射性ラベルされたリガンドによるＬＰＳ−活性化された単球の処理の後、検出されなかった。
【００４０】
対照的に、いくつかの放射性ラベルされたポリペプチドが、化合物１又は２により処理された細胞に由来する単球抽出物の可溶性画分に検出された（図３）。
３種の最とも顕著な放射性ラベルされたポリペプチドは、３１，３２及び５６kDa の見掛け質量を有した。個々のポリペプチドのラベリングの程度は、〔14Ｃ〕ラベルされたＤＡＳＵの濃度に依存した。別の実験において、〔14Ｃ〕化合物１により処理された細胞が、ＳＤＳゲル分析の前、ＩＬ−１βの後翻訳プロセッシングを促進するためにＡＴＰに暴露された。
【００４１】
ＤＡＳＵ−処理された細胞は、ＩＬ−１生成において用量−依存性阻害を示した（図３Ｂ）。３１kDa のＤＢＰのラベリングについての濃度−依存性は、ＩＬ−１β後翻訳プロセッシングの阻害性との逆相互作用を示した（図３Ｂ）。３２及び５６kDa のＤＡＳＵ結合タンパク質のラベリングは、サイトカイン応答を阻害し、そしてＤＢＰ−３１を最大にラベルするために必要とされるよりも、最大のラベリングを達成するためにより高い濃度の〔14Ｃ〕化合物１を必要とした（図３Ｂ）。
【００４２】
ＤＢＰの同定
〔14Ｃ〕化合物１により処理されたヒトＴＨＰ−１細胞は、類似する組の３種の放射性ラベルされた可溶性ポリペプチドを生成した。従って、〔14Ｃ〕化合物によりラベルされたＴＨＰ−１細胞が、ラベルされたポリペプチドの単離のための出発源として使用された。それらの細胞から調製された可溶性画分がアニオン交換カラムに適用され；３１kDa の〔14Ｃ〕−ラベルされたポリペプチドはアニオン交換樹脂に結合しなかった。
【００４３】
対照的に、３２及び５６kDa の種は結合し、そして続いて、塩化ナトリウムグラジエントにより溶離された。精製のこの段階で放射性ラベルされた３２kDa のポリペプチドは、１次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で別々のクーマシーブルー染色ポリペプチドと共に同時移動した。同様に、５６kDa のポリペプチドは、２次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、別々のクーマシーブルー染色ポリペプチドと共に同時移動した。従って、それらの工程のポリペプチドがゲルから切除され、そして配列分析にゆだねられた（下線参照のこと）。
【００４４】
他方では、３１kDa 種は、追加の精製を必要とした。アニオン交換カラムを通して移動する材料が、 Superose １２ＨＲ  １０／３０カラム上でクロマトグラフィー処理され；３０〜４０kDa の見掛け分子量を有する単一の放射性ラベルされたピークが溶出した。ピーク画分がプールされ、濃縮され、そして含まれるポリペプチドが２次元ゲル電気泳動により分別された。単一の放射性ラベルされたポリペプチドが、明白なクーマシーブルー染色ポリペプチドに対応する２次元ゲル上に検出された。このポリペプチドが切除され、そして配列分析にゆだねられた。
【００４５】
３１，３２及び５６kDa のゲル−精製された〔14Ｃ〕化合物１−ラベル化されたポリペプチドの別々のトリプシン消化により生成されたペプチドが、逆相ＨＰＬＣにより分別され、そしてエドマン分解及び質量分光計の組合せにより分析された。さらなる分析がＬＣ−ＭＳを用いて実施された。個々のタンパク質に対するいくつかの実験からの結果が次の要約に組合されている。
【００４６】
ＤＢＰ−５６：トリプシンペプチドが、損なわれていないペプチドに対する質量測定値、及び衝突によるそれらの断片化の結果に基づくＭＳ／ＭＳデータの両者を付与する、自動化されたモデルにおけるＬＣ−ＭＳにより分析された。データのコンピューターに基づく評価は、カルボキシルエステラーゼとしてのＤＢＰ−５６の決定的同定を提供した。このタンパク質は、ＤＢＰ−５６の質量と一致する、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに基づく６０kDa の見掛けＭｒを示す（Munger, J. S. など、J. Biol. Chem. 266 : 18832-18838 (1991))。
【００４７】
ＤＡＳＵがカルボキシルエステラーゼ活性を阻害するかどうかを評価するために、インビトロ酵素アッセイが、ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼ及び人工基質ｐ−ニトロフェニルプロピオネートを用いて確立された（Krisch, K. Biochem. Biophys. Acta 122 : 265-280 (1966)) 。１００μＭの化合物２との同時インキュベーションは、観察される酵素活性を６７％減じ、これは、ＤＡＳＵ類似体がカルボキシルエステラーゼインヒビターであることを示す。
【００４８】
しかしながら、他のＤＡＳＵ類似体の分析は、カルボキシルエステラーゼが、ヒト単球によりＩＬ−１β生成を阻害するそれらの化合物の能力と相互関係しなかったことを示した。従って、カルボキシルエステラーゼとエポキシド−含有ＤＡＳＵとの相互作用は、サイトカイン後翻訳プロセッシングに対するそれらの効果に関連しているとは思われない。むしろ、エポキシド−含有剤を結合するカルボキシルエステラーゼの能力が生体異物の代謝におけるその役割に影響を及ぼすことができる（Munger, J. S. など、前記）。
【００４９】
ＤＢＰ−３２：損なわれていないＤＢＰ−３２のＮ−末端配列分析は、続くサンプルのＣＮＢｒ分解が内部配列の短いセグメントの決定を可能にするが、タンパク質が阻止されたことを示した（下記を参照のこと）。ゲル−精製されたＤＢＰ−３２のトリプシン消化物がＨＰＬＣにより分別され、そして２２０nmでのピークが集められ、そして配列分析にゆだねられた。得られる配列は、細胞内膜に関連する塩化物チャネルであることが報告されているタンパク質に由来する理論的なトリプシンペプチドと適合した（受託番号Ｕ９３２０５；Valenzuela, S. M. など、J. Biol. Chem. 272 : 12575-12582 (1997))。
【００５０】
図４は、ｃＤＮＡから予測されるようなこのタンパク質のアミノ酸配列を示し（図４Ｂ）；ＤＢＰ−３２のタンパク質配列決定により同定されたペプチド断片が横たえることによって示される。ＤＢＰ−３２のトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ分析は、配列のさらなる確証的な適用範囲を付与した。ＣＮＢｒ−切断されたタンパク質の配列決定の結果は、ｃＤＮＡによりコードされる開始剤メチオニンが成熟タンパク質において後翻訳的に除去されるが、しかし修飾されたＮ−末端の性質はまた知られていないことを示した。
【００５１】
このポリペプチドの予測されるアミノ酸配列は、４．８のｐＩを有する２６．９kDa のポリペプチドに対応する。このポリペプチドは、ウシ上皮細胞から単離された６４kDa の塩化物チャネル、及びラット脳に見出される３１kDa の塩化物チャネルに対して配列相同性を示す（Landry, D.など、J. Biol. Chem. 268 : 14948-14955 (1993) ; Duncan, R. R. など、J. Biol. Chem. 272 : 23880-23886 (1997))。エドマン配列決定は、Ｕ９３２０５配列におけるグルタミン酸63に対応するアミノ酸残基がＴＨＰ−１細胞ポリペプチドにおいて実際的にグルタミンであることを示し；この差異が真の多型現象を表わすかどうかにかかわらず、ＤＮＡ配列決定誤差、又は後翻訳修飾の結果は知られていない。
【００５２】
ＤＢＰ−３１：損なわれていないＤＢＰ−３１のＮ−末端配列分析は、このタンパク質がまた阻止されたことを示した。ゲル−精製されたＤＢＰ−３１のトリプシン消化及びその消化物のＨＰＬＣ分別に続いて、多くのピーク画分が自動エドマン配列決定及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにゆだねられた。寄託されたヒトｃＤＮＡ（受託番号Ｕ９０３１３；図５）によりコードされる予測されるトリプシンペプチドに適合するいくつかのペプチド配列が得られた。
【００５３】
同じ消化物からの２種のトリプシンペプチドは、Ｕ９０３１３配列のすぐ上流に位置し、そして発現された配列標識（たとえばＨ８１４４４及びＮ４６０６７）においてそれと隣接する、最初の寄託され（１９９７年２月２０日）、そして適合されたＤＮＡ配列としＵ９０３１３データベースエントリーに与えられる配列により包含されなかった。これは、ＤＢＰ−３１の負のＮ−末端が、初め寄託されたようなＵ９０３１３に提供される配列の上流に存在したことを示した。
【００５４】
クローンＮ４６０６７の注意した配列分析は、Ｕ９０３１３により予測され、そして２９−残基アミノ末端延長部を有する完全な配列をコードする読取り枠を生成した。この延長部は、Ｕ９０３１３において原因不明の２種のペプチドを含み、ここでその１つの（ＩＹＳＭＲ）は前記延長部の３個のＣ−末端残基及び不完全配列Ｕ９０３１３の２個のＮ−末端残基を含んだ。このヒトポリペプチドについて予測されるＭｒは、２７，５６８Daであり、そして６．４のｐＩを有する。
【００５５】
寄託された配列が不完全である本発明者の発見のデータベースエントリー＃Ｕ９０３１３の共同寄託者（Dr. M. D. Story ）への個人的な情報伝達に続いて、そのエントリーは現在、完全な配列を表わすために更新されている。
ＤＢＰ−３１及びＤＢＰ−３２タンパク質配列の一列配列は、それらの２種のタンパク質が配列類似性を共有することを示す（図６）。それらの完全な配列を通して、１９％の絶対的同一性が観察され；アミノ末端に近い領域（ＤＢＰ−３２の残基２４−３８及びＤＢＰ−３１の残基３２−４６）が特に十分に保存される（図６）。従って、ＤＢＰ−３１及びＤＢＰ−３２は、同じタンパク質ファミリー又はスーパーファミリーのメンバーであると思われる。
【００５６】
ＤＢＰ−３１／３２のクローニング及び発現
ＤＢＰ−３１及びＤＢＰ−３２の融合パートナーとして細菌グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする別々の細菌発現ベクターが構築され、そして細菌を形質転換するために使用された。適切なインデューサーの存在下で、それらの細菌は多量の融合ポリペプチドを生成した。組換え（ｒ）ポリペプチドが、グルタチオン−セファロース上での親和性クロマトグラフィー処理により可溶性細胞抽出物から単離された。続いて、単離された融合タンパク質がトロンビンにより分解され、十分な長さのｒＤＢＰ−３１及びｒＤＢＰ−３２ポリペプチドが生成され、そして個々の単離されたポリペプチドの質量がエレクトロスプレー質量分光計により決定され、そして所望する生成物のための予測される値と一致せしめられた。
【００５７】
ｒＤＢＰは、それらの組換え生成物が正しく折りたたまれ、そして機能的であることを示す、〔14Ｃ〕化合物２と相互作用するそれらの細胞相当物の能力を保持し；従って、それらは新規ＤＢＰ−結合薬物を発見するために企画されたスクリーニング実験への使用のための確かなタンパク質である。ｒＤＢＰ−３１及びｒＤＢＰ−３２の両者が濃度依存性態様で〔14Ｃ〕化合物２によりラベルされた（図７Ａ）。対照的に、細菌グルタチオンＳ−トランスフェラーゼは、同一の条件下で〔14Ｃ〕化合物２によりラベルされなかった（図７Ａ）。
【００５８】
損なわれていない細胞において観察されるように、ｒＤＢＰ−３２をラベルするために必要とされるよりも低いＤＡＳＵ濃度が、ＤＢＰ−３１をラベルするために必要とされた（図７Ａ）。〔14Ｃ〕化合物２によるＤＢＰ−３１のラベリングが、化合物４、すなわち非エポキシド含有ＤＡＳＵ類似体との同時インキュベーションにより阻害された（図７Ｂ）。このタイプの競争アッセイは、この目的のために実施され得る唯一のアッセイ形ではないが、ｒＤＢＰに結合するために放射性ラベルされたＤＡＳＵと競争することができる剤を同定するために使用され得る。
【００５９】
刺激−連結されたＩＬ−１後翻訳プロセッシングのインヒビターとしてのＤＡＳＵのインビトロ実証
正常な志願者から単離されたヒト単球がＬＰＳにより活性化され、そして〔35Ｓ〕メチオニンによりラベルされた。次に、それらの細胞が、ＩＬ−１βのタンパク質分解成熟及び開放を通常促進するＡＴＰによりＤＡＳＵ化合物３の不在又は存在下で処理された。化合物３の不在下で、ＡＴＰはＩＬ−１βの１７kDa の成熟形の開放を促進せしめた（図８Ａ）。化合物３が培地に添加され、そしてＡＴＰ暴露の期間を通して維持される場合、培地に開放される１７kDa のＩＬ−１βの量は低められた（図８Ａ）。阻害の程度は、培地に添加されるＤＡＳＵの濃度に依存した（図８Ｂ）。図９は、多くの構造的に関連するＤＡＳＵがサイトカイン応答を阻害するよう作用することができることを示す。
【００６０】
刺激−連結されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのＤＡＳＵによる阻害は、初期刺激に無関係であり、そしてＡＴＰ−誘発された工程に制限されない。効果的なＩＬ−１β後翻訳プロセッシングを開始するためにインビトロで使用されて来た他の方法は、同種細胞溶解性Ｔリンパ球によりネズミ腹膜マクロファージを処理することである（Hogquistなど、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 8485-8489 (1991) ; Perregaux, など、J. Immunol. 157 : 57-64 (1996)）。ＬＰＳ−活性化された／35Ｓ−メチオニン−ラベルされたマウス腹膜マクロファージは、同種細胞溶解性Ｔリンパ球の調製物により処理される場合、１７kDa の成熟ＩＬ−１βを開放する（図１０Ａ）。
【００６１】
対照的に、前記Ｔリンパ球の不在下でインキュベートされる場合、ＬＰＳ−活性化されたマクロファージはＩＬ−１βをほとんど開放しなかった（図１０Ａ）。細胞溶解性Ｔリンパ球／マクロファージ同時培養物内への化合物３の包含は、細胞外成熟サイトカイン種の低い生成を導びいた（図１０Ａ）。５０％阻害（ＩＣ50）を達成するために必要とされる化合物３の濃度は、４２５nMであることが推定された（図１０Ｂ）。従って、ＤＡＳＵは、種々の外因性シグナルにより達成され得るサイトカイン輸送経路におけるある段階を阻止することができる。この通常の段階は、ＤＢＰの作用の部位を表わすと推定される。
【００６２】
対照的に、ＤＡＳＵは、構成細胞分泌装置を通過するサイトカインの開放を阻害しない。この選択性は、化合物３の不在又は存在下でインキュベートされた単球により条件づけされた増殖培地のサイトカイン含有率を比較することによって容易に実証される。ＬＰＳ／ＡＴＰにより活性化された細胞に由来する、単球により条件づけされた培地は、構成分泌装置を通して開放される、高レベルのＩＬ−１β、及び高レベルの２種の他のサイトカイン、すなわちＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＲＡ）及びＩＬ−６を含んだ（図１１）。
【００６３】
化合物３の存在下で維持された単球から収穫されたならし培地は、ＩＬ−１βをほとんど含まなかった（図１１）。対照的に、対照単球のならし培地におけるそれらのレベルに関して、化合物３−処理された単球から回収された培地は、比較レベルのＩＬ−１ＲＡ及びＩＬ−６を有した（図１１）。従って、ＤＡＳＵは、単球／マクロファージからの輸送が刺激−誘発された輸送機構に依存する、ポリペプチドの開放を選択的に阻害すると思われる。
【００６４】
ＤＡＳＵが、マウスへの投与の後、ＩＬ−１生成を阻害することの実証
マウスの腹腔中へのＬＰＳの注入は、内在性腹膜マクロファージによるプロＩＬ−１βの生成を導びくが、しかし成熟サイトカインの形成及び開放は、腹腔中への後翻訳プロセッシングのインジューサー、たとえばＡＴＰの続く注入を必要とする（Griffiths, R. J. J. Immunol. 154 : 2821-2828 (1995))。ＤＡＳＵがインビボで、ＩＬ−１βの後翻訳プロセッシングを妨げることができることを実証するために、マウスが化合物３により経口投与され、そして次に、腹腔ＬＰＳ／ＡＴＰアッセイにゆだねられ；続いて、細胞フリー腹膜洗浄液に回収されるＩＬ−１βの量がＥＬＩＳＡにより評価された。
【００６５】
化合物３は、ＩＬ−１βの生成を用量依存的に阻害した（図１２）。同様に、この剤は、類似する有効性を伴って、ＩＬ−１αの刺激−誘発された開放性を阻止した（図１２）。従って、このＤＡＳＵの経口投与が、ＩＬ−１の生成を阻害するための治療アプローチを表わす。
ＤＢＰの一般的有用性は、炎症性障害への使用のための改良された治療性を示すことができる特定の薬物についてのスクリーニングを可能にすることである。ＤＢＰ−３１及びＤＢＰ−３２、又は当業者のそれらのタンパク質生成を可能にするそれらの配列をコードするＤＮＡが、それらのポリペプチドに結合する化合物の能力を測定するためのアッセイを確立するためにインビトロで使用され得る。
【００６６】
ＤＢＰ−３１／３２に結合する剤は、非伝統的な刺激−連結された後翻訳プロセッシングにより具体化されるサイトカイン、たとえばＩＬ−１及びＩＬ−１８の生成のインヒビターとして使用される。従って、哺乳類へのそれらの剤の投与は、炎症性サイトカインの過剰生成により特徴づけられる疾病を処理するための方法を構成する。それらの疾病は、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、神経変性、発作、敗血症、アテローム硬化症、及びぜん息を包含する。
ＤＢＰに結合する化合物はまた、医薬組成物を生成するためにも使用され得る。
【００６７】
【実施例】
材料及び方法
〔14Ｃ〕−１−（４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレア（１）及び〔14Ｃ〕−１−（１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセン−４−イル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレア（２）の合成
〔14Ｃ〕−ラベルされた１及び２を、テトラヒドロフラン中、水素化ナトリウムを用いて、それぞれ、〔14Ｃ〕−４−イソシアネート−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−５−インダセンＸ及び〔14Ｃ〕−５−クロロ−２−イソシアネート−１，３−ジイソプロピル−ベンゼンVIIIにより２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホンアミドVIをカップリングすることによって調製した。ラベルされたイソシアネートを、スキーム１に示されるように、テトラヒドロフラン又はトルエンにおいて、４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニルアミン VII又は１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−５−インダセン−４−イルアミンIXのいづれか及びトリエチルアミンと14Ｃ−ホスゲンとを反応せしめることによって調製した。
【００６８】
２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホンアミドVIの合成はスキーム２に示されている。市販の１−（３−ブロモ−４−フルオロフェニル）−エタノンＩ、エチレングリコール及び微量のｐ−トルエンスルホン酸のトルエン溶液のDean-Stark蒸留は、２−（３−ブロモ−４−フルオロ−フェニル）−２−メチル−（１，３）−ジオキソランIIを付与した。−７８℃でのテトラヒドロフラン中、ｎ−ブチルリチウム、二酸化硫黄、ジクロロメタン中、Ｎ−クロロスクシンイミド、及び水性水酸化アンモニウムによるIIの連続的処理は、２−フルオロ−５−（２−メチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）ベンゼンスルホンアミド IIIを付与した。
【００６９】
アセトニトリル中、フェニルトリメチルアンモニウムトリブロミドによる IIIの臭素化が、５−（２−ブロモメチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミドIVを付与し、これをジオキサン中、水性塩酸による処理が５−ブロモアセチル−２−フルオロベンゼンスルホンアミドＶを付与した。メタノール中、硼水素化ナトリウムによるＶの還元、続く、希水酸化ナトリウムによる処理はVIを付与した。
【００７０】
【化１】
0003706353.tif 000002
【００７１】
（ａ）ＮａＨ、テトラヒドロフラン；（ｂ）14Ｃ−ホスゲン、トリエチルアミン、トルエン；（ｃ）14Ｃ−ホスゲン；トリエチルアミン、テトラヒドロフラン。＊は、14Ｃ放射性ラベルの位置を示す。
スキーム１．化合物１及び２の合成
２（３−ブロモ−４−フルオロ−フェニル）−２−メチル−（１，３）ジオキソランII
トルエン２００ml中、２５ｇ（０．１１５モル）の１−（３−ブロモ−４−フルオロ−フェニル）−エタノンＩ（Fluorochem）、２０ml（０．３４５モル）のエチレングリコール及び微量のｐ−トルエンスルホン酸の溶液を、Dean-Starkにより還流下で１２時間、加熱し、水を分離した。その反応を、室温に冷却し、希炭酸水素ナトリウム溶液により洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして溶媒を蒸発し、３０ｇ（１００％）のIIを油状物として得た。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2   単一スポット材料Ｒｆ  ０．０４０。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（１．５２，ｓ，３Ｈ），（３．６７，ｍ，２Ｈ），（３．９５，ｍ，２Ｈ），（７．３４，ｍ，１Ｈ），（７．４０，ｍ，１Ｈ），（７．６３，ｍ，１Ｈ）。
【００７２】
【化２】
0003706353.tif 000003
【００７３】
（ａ）ＴｓＯＨ、エチレングリコール、トルエン；（ｂ）ＢｕＬｉ、ＴＨＦ；（ｃ）ＳＯ2 ；（ｄ）ＮＣＳ、塩化メチレン；（ｅ）ＮＨ4 ＯＨ；（ｆ）Ｐｈ（ＣＨ3)3 ＮＢｒ3 、アセトニトリル；（ｇ）ＨＣｌａｑ、ジオキサン；（ｈ）ＮａＢＨ4 、メタノール。
【００７４】
スキーム２．VIの合成
２−フルオロ−５−（２−メチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）−ベンゼンスルホンアミド III
ｎ−ＢｕＬｉ〔ヘキサン中において１．６Ｍ、５０ml（０．０８モル）〕を、−７８℃で２００mlのテトラヒドロフラン中、２０．８８ｇ（０．０８モル）の２−（３−ブロモ−４−フルオロ−フェニル）−２−メチル−（１，３）ジオキソランIIの溶液に滴下した。−７８℃で２時間の撹拌の後、ＳＯ2 を１５分間、泡立てた。反応を室温に暖ため、そして一晩、撹拌した。１５０mlのＣＨ2 Ｃｌ2 中、１０．８ｇ（０．０８モル）のＮＣＳの溶液を添加し、そして反応を１時間、撹拌した。
【００７５】
揮発物を真空下で蒸発し、そして褐色の残留物をＣＨ2 Ｃｌ2 によりスラリーし、そして濾過した。濾液を、３０％のＮＨ4 ＯＨ  ２００mlにより処理し、そして３時間、撹拌した。ＣＨ2 Ｃｌ2 層を分離し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして蒸発した。残留物を、ＣＨ2 Ｃｌ2 により粉砕し、そして濾過し、８．１ｇ（７７％）の IIIを得た；ｍｐ  １４９−１５０℃。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１  単一スポットの材料Ｒｆ  ０．５。 1Ｈ  ＮＭＲ（３００MHz 、ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（１．６０，ｓ，３Ｈ），（３．７０，ｍ，２Ｈ），（４．０５，ｍ，２Ｈ），（７．４１，ｔ，１Ｈ），（７．７１，広いｓ，３Ｈ），（７．８４，ｄｄ，１Ｈ）。
【００７６】
５−（２−ブロモメチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミドIV
２０mlのＣＨ3 ＣＮ中、８．４ｇ（０．０２２５モル）のフェニルトリメチルアンモニウムトリブロミドの溶液を、１００mlのＣＨ3 ＣＮ中、５．２ｇ（０．０２２モル）の２−フルオロ−５（２−メチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）−ベンゼンスルホンアミド IIIの溶液に滴下した。反応を室温で１時間、撹拌した。溶媒を真空下で蒸発した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、水により洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして蒸発せしめた。
【００７７】
残留物を、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／Ｅｔ2 Ｏ（９／１）により溶出する、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、４．６ｇ（６２％）のIVを油状物として得た。ＣＨ2 Ｃｌ2 ／Ｅｔ2 Ｏ：９／１  単一スポットの材料Ｒｆ  ０．３０。 1Ｈ  ＮＭＲ（３００MHz ＣＤＣｌ2 ）δ：（３．６８，ｓ，２Ｈ），（３．８０，ｍ，２Ｈ），（４．２１，ｍ，２Ｈ），（５．１５，広いｓ，２Ｈ），（７．２６，ｔ，１Ｈ），（７．７５，ｍ，１Ｈ），（８．１５，ｄｄ，１Ｈ）。
【００７８】
５−ブロモアセチル−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミドＶ
５０mlのジオキサン及び２ＮのＨＣｌ  １０ml中、１．５ｇ（４．４ｍモル）の５−（２−ブロモメチル−〔１，３〕ジオキソラン−２−イル）−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミドIVの溶液を、５時間、還流下で加熱し、次に室温に冷却した。溶媒を真空下で蒸発し、そして残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、水により洗浄し、そしてＮａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめた。
【００７９】
残留物を、ＥｔＯＡｃにより溶出するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、９００mgの物質を得、これをＭｅＯＡｃから再結晶化し、７００mg（５４％）のＶを得た；ｍｐ  １５３−１５８℃。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ／Ｅｔ2 Ｏ：７／３  単一スポットの材料Ｒｆ  ０．６０。 1Ｈ  ＮＭＲ（３００MHz ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（５．２０，ｓ，２Ｈ），（７．６３，ｔ，１Ｈ），（７．８６，広いｓ，２Ｈ），（８．３２，ｍ，２Ｈ）。
【００８０】
２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホンアミドVI
２０mlのＭｅＯＨ中、０．５ｇ（１．７ｍモル）の５−ブロモアセチル−２−フルオロ−ベンゼンスルホンアミドＶの溶液を０℃に冷却した。２６mg（０．６７ｍモル）のＮａＢＨ4 を添加し、そしてその反応を０℃で１５分間、撹拌した。１ＮのＮａＯＨ  ４mlを添加し、そして反応を０℃で４時間、撹拌した。反応を、希ＨＣｌの添加によりpH６に調節した。
【００８１】
揮発物を蒸発し、そして残留物のＥｔＯＡｃに溶解し、Ｈ2 Ｏにより洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして蒸発した。生成物を、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１により溶出するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、１８０mg（４８％）のVIを得た；ｍｐ  １００−１０３℃。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１  単一スポット物質Ｒｆ  ０．６５。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（２．８２，ｍ，１Ｈ），（３．１４，ｍ，１Ｈ），（４．０６，ｍ，１Ｈ），（７．４０，ｔ，１Ｈ），（７．５６，ｍ，１Ｈ），（７．６６，ｍ，３Ｈ）。
【００８２】
４−クロロ−２−イソシアネート−１，３−ジイソプロピル−ベンゼンVIII（ラベルされていない）
１２５mlのテトラヒドロフラン中、８．９ｇ（０．０４２モル）の４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニルアミン VII（Ｎ−クロロスクシンイミド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドによる市販の２，６−ジイソプロピルアミンの処理により調製される）及び４．６６ｇ（０．０４６モル）のトリエチルアミンの溶液に、トルエン中、ホスゲンの１．９３Ｍ溶液２３．８ml（０．０４６モル）を添加した。
【００８３】
反応を室温で１５分間、次に７０℃で１５分間、撹拌した。溶媒を真空下で蒸発した。残留物をヘキサンに溶解し、そして１０％ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ヘキサンにより溶出するシリカゲルプラグ上で精製し、ラベルされていないVIII９．４５ｇ（９５％）を油状物として得た。ＴＬＣ：Ｈｅｘ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ：２／１  単一のスポット物質Ｒｆ  ０．７０。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＣＤＣｌ3 ）δ：（１．２０，ｄ，１２Ｈ），（３．１９，septet, ２Ｈ），（７．０６，ｓ，２Ｈ），（２．１３，ｔ，４Ｈ），（２．８５，ｍ，８Ｈ），（６．９３，ｓ，１Ｈ）。
【００８４】
４−イソシアネート−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセンＸ（ラベルされていない）
２５mlのテトラヒドロフラン中、１．７７ｇ（０．０１モル）の１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセン−４−イルアミンIX（Vejdelekなど、Coll. Czech Chem. Comm. 42 : 3094 (1977)及び１．１１ｇ（０．０１１モル）のトリエチルアミンの溶液に、トルエン中、ホスゲンの１．９３Ｍ溶液５．７ml（０．０１１モル）を添加した。その反応を室温で１５分間及び７０℃で１５分間、撹拌した。
【００８５】
溶媒を真空下で蒸発した。残留物をヘキサンに溶解し、そして１０％ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ヘキサンにより溶出するシリカゲルのプラグ上で精製し、１．７９ｇ（９０％）のラベルされていないＸを得た；ｍｐ  ４０−４１℃  ＴＬＣ：Ｈｅｘ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ：２／１  単一スポットの物質Ｒｆ  ０．７０。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＣＤＣｌ3 ）δ：（２．１３，ｔ，４Ｈ），（２．８５，ｍ，８Ｈ），（６．９３，ｓ，１Ｈ）。
【００８６】
１−（４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼン−スルホニル〕−ウレア（１）（ラベルされていない）
水素化ナトリウム〔鉱油中、６０％分散液、２３mg（０．５７ｍモル）〕を、１０mlのテトラヒドロフラン中、１１３mg（０．５２ｍモル）の２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホンアミドVI及び１３６mg（０．５７ｍモル）の４−クロロ−２−イソシアネート−１，３−ジイソプロピル−ベンゼンVIIIの溶液に添加した。室温で３時間の撹拌の後、溶媒を真空下で蒸発した。残留物を２ＮのＨＣｌにより酸性化し、次にＥｔＯＡｃにより抽出した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして真空下で蒸発した。
【００８７】
残留物を、ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１により溶出するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、１９０mg（８１％）の１を得た；ｍｐ１２６−１３０℃。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１  単一スポットの物質Ｒｆ  ０．７０。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（０．９７，ｍ，１２Ｈ），（２．７６，ｍ，１Ｈ），（２．９３，ｍ，１Ｈ），（３．１０，ｍ，１Ｈ），（４．０５，ｍ，１Ｈ），（７．０４，ｓ，２Ｈ），（７．３５，ｍ，１Ｈ），（７．５０，ｍ，１Ｈ），（７．７７，ｍ，２Ｈ）。
【００８８】
１−（１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセン−４−イル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホニル〕−ウレア（２）（ラベルされていない）
水素化ナトリウム〔鉱油中、６０％分散液、３０mg（０．７５ｍモル）〕を、１４８mg（０．６８ｍモル）の２−フルオロ−５−オキシラニル−ベンゼンスルホンアミドVI及び１５０mg（０．７５ｍモル）の４−イソシアネート−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセンＸの溶液に添加した。室温で１２時間、撹拌した後、溶媒を真空下で蒸発した。残留物を２ＮのＨＣｌにより酸性化し、次にＥｔＯＡｃにより抽出した。
【００８９】
ＥｔＯＡｃ層をＮａ2 ＳＯ4 上で乾燥せしめ、そして真空下で蒸発した。残留物をヘキサンにより粉砕し、そして濾過し、２１０mg（７５％）の２を得た；ｍｐ  ９７−１０２℃。ＴＬＣ：ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ：９／１  単一スポットの物質Ｒｆ  ０．６５。 1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz ＤＭＳＯ−Ｄ6 ）δ：（１．９６，ｍ，４Ｈ），（２．４７，ｍ，４Ｈ），（２．７４，ｍ，５Ｈ），（３．１１，ｍ，１Ｈ），（４．０６，ｍ，１Ｈ），（６．９０，ｓ，１Ｈ），（７．４９，ｔ，１Ｈ），（７．６１，ｍ，１Ｈ），（７．７８，ｄｄ，１Ｈ），（８．０５，ｓ，１Ｈ）。
【００９０】
〔14Ｃ〕−４−クロロ−２−イソシアント−１，３−ジイソプロピル−ベンゼン VII
４−クロロ−２，６−ジイソプロピルフェニルアミン VII塩酸塩（０．０４５ｇ、０．１８ｍモル、２当量）をエーテルに分散し、そしてトリエチルアミン（５７ml、０．４１ｍモル、４．５当量）を添加した。その溶液を綿プラグを通して濾過し、そしてエーテルのほとんどを真空下で蒸発した。透明無色な残留油状物を無水トルエン（３ml）に取り、そして真空マニホールドに固定した。溶液をガス抜きし、液体窒素槽において冷却し、そして排気した。〔14Ｃ〕ホスゲンガス（５５mCi ／ｍモルで５mCi ）を含むアンプルをマニホールドに固定し、そしてそのシステムを排気した。
【００９１】
次に、マニホールドをポンプから分離し、アンプルを破壊し、そして〔14Ｃ〕ホスゲンを、冷却された反応容器中への真空移行を可能にした。２０分後、冷却槽を取り除き、そして反応混合物を室温に暖めた。次に、それを窒素によりバックフラッシュし、そして８０℃に１時間、加熱し、その後、出発材料は残存しなかった（ラジオ−ＴＬＣ）。混合物を室温に冷却し、そし真空下で濃縮した。黄色の油状物をシリカゲル（ヘキサン）の小さなプラグを通して濾過し、５mCi の〔14Ｃ〕−５−クロロ−２−イソシアント−１，３−ジイソプロピルベンゼンVIIIを得た（ラジオ−ＴＬＣ（ヘキサン）によれば９９％以上放射化学的に純粋である）。
【００９２】
〔14Ｃ〕−４−イソシアント−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセンＸ
トルエン（３５ml）中、〔14Ｃ〕ホスゲン（５７mCi ／ｍモルで３５mCi ）の溶液を０℃に冷却し、そしてトルエン（２ml）中、トリエチルアミン（０．５０ml、３．６ｍモル、６当量）及び１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−５−インダセン−４−イルアミンIX（０．１７ｇ、０．１ｍモル、１．６当量）の溶液を添加した。
【００９３】
１５分後、その反応を水槽から取り出し、そして３０分間にわたって室温に暖め、この後、ラジオ−ＴＬＣ分析は、所望する生成物が９３％で存在したことを示した。反応混合物を真空下で濃縮し、そしてシリカゲルのプラグを通して濾過した（ヘキサン）。ヘキサンに溶解しない実質的な白色放射性固体が形成した。濾液の濃縮は、９mCi の〔14Ｃ〕−４−イソシアント−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−５−インダセンＸを付与し、これはラジオ−ＴＬＣ（ヘキサン）によれば９９％の純度であった。
【００９４】
〔14Ｃ〕−１−（４−クロロ−２，６−ジイソプロピル−フェニル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレア（１）
〔14Ｃ〕−５−クロロ−２−イソシアント−１，３−ジイソプロピルベンゼンVIII（５５mCi ／ｍモルで１．０８mCi ）及び２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホンアミドVI（９５mg、０．０２２ｍモル、１．１当量）を、新しく蒸留されたテトラヒドロフランに溶解し、そして水素化ナトリウム（２mg）を添加した。５分後、ラジオ−ＴＬＣは、完全な反応を示した。その反応混合物を真空下で濃縮し、水（５ml）に溶解し、そしてエーテルにより抽出した。次に、水性層を２ＮのＨＣｌにより酸性化し、そして酢酸エチルにより抽出した。組合された酢酸エチル層を乾燥せしめ、濾過し、濃縮し、そして残留物をクロマトグラフィー処理（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）、０．８４mCi の〔14Ｃ〕化合物１（ラジオ−ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によれば、９９％以上の純度）を付与した。
【００９５】
〔14Ｃ〕−１−（１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−Ｓ−インダセン−４−イル）−３−〔２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホニル〕−ウレア（２）
〔14Ｃ〕−４−イソシアント−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−５−インダセンＸ（５７mCi ／ｍモルで０．９mCi ）を、テトラヒドロフラン（５ml）に溶解し、そして２−フルオロ−５−オキシラニルベンゼンスルホンアミドVI（４．２mg、０．１９ｍモル、１．２当量）を添加し、続いて水素化ナトリウム（２mg）添加した。１５分後、出発材料はラジオ−ＴＬＣによれば、残存しなかった。その反応混合物を真空下で濃縮し、そして残留物を０．２ＭのＨＣｌ（５ml）に溶解し、そして酢酸エチル（３×５ml）により抽出した。組合された有機層を乾燥せしめ、濃縮し、そして残留物をクロマトグラフィー処理し（ＥｔＯＡｃ）、０．５８mCi の〔14Ｃ〕化合物２（ラジオ−ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によれば、９９％以上の純度）を付与した。
【００９６】
ＩＬ−１β生成アッセイ−ＥＬＩＳＡ方法
ヒト単球を、正常な志願者から集められたヘパリン化された血液から単離した。血液１００mlを、５％のＦＢＳ、２５mMの Hepes、pH７．３、２mMのグルタミン、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（維持培地）２０mlにより希釈した。次に、この懸濁液３０mlを、１５mlのリンパ球分離培地（Organo Technicon）上に積層し、そして臨床学的遠心分離機において１４００rpm で３０分間、室温で遠心分離した。
【００９７】
得られる単核細胞層を収穫し、維持培地により希釈し、そして細胞を遠心分離によりペレット化した。回収された細胞を、反復された遠心分離によって維持培地により洗浄した。９６ウェルプレート中の個々のウェルを、０．１mlの維持培地中、２×１０5 個の単核細胞により接種し；単核を２時間、付着せしめ、次に、培地（非付着細胞を含む）を０．１mlの新しい培地により交換し、そして単球を３７℃で一晩インキュベートした。
【００９８】
単球を、１０ng／mlのＬＰＳ（Ｅ．コリ；血清型Ｏ５５：Ｂ５）により２時間、活性化し、この後、培地を、０．１mlのＲＰＭＩ１６４０（２０mMの Hepes、pH６．９、１００単位／mlのペニシリン、１００μｇ／mlのストレプトマイシン、示される濃度の試験剤を含む１％ＦＢＳ（開放培地）を含む）により交換し；化合物をＤＭＳＯに溶解し、そしてすべてのウェル中の最終ＤＭＳＯ濃度を０．２％で維持した。１５分間のインキュベーションの後、２mMのＡＴＰを個々のウェル中に導入し（pH７に前もって調節された２０mMのＡＴＰ  １１μｌ）、そして培養を３７℃でさらに３時間インキュベートした。続いて、細胞を遠心分離により除去し、培地上清液を収穫し、そして培地サンプル内のＩＬ−１βレベルを特定のＥＬＩＳＡキット（R and D Systems ）により決定し；個々のデータ点は四回の重複決定の平均である。
【００９９】
単球ならし培地を調製するために、血液２００mlからの単核細胞を上記リンパ球分離培地プロトコールにより収穫し、そしてマクロファージ培養のために企画された血清フリー培地（Gibco ）４０mlに懸濁した。４個の１０cm皿の個々を、単核細胞懸濁液１０mlにより接種し、そして培養物を３７℃で２時間インキュベートし、単球の結合を可能にした。非結合リンパ球を含む培地を廃棄し、そして１００ng／mlのマクロファージ−コロニー刺激因子を含む新しい血清フリー培地１０mlを個々の皿に添加した。単球を３７℃で一晩インキュベートし、この後、培地を、２５mMの Hepes、pH６．９、１％のＦＢＳ及び１０ng／mlのＬＰＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地７．５mlにより交換した。
【０１００】
３時間インキュベーションの後、化合物３をいくつかの培養物中の培地中に導入し、１μＭの最終濃度を達成し；ＤＡＳＵをジメチルスルホキシド中、濃縮された原液として調製し、そしてすべての培養物における最終ジメチルスルホキシド濃度が０．２％で維持されるよう培地に添加した。この点で、ＡＴＰを導入し、２mMの最終濃度を達成し、そしてその培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。次に、培地を収穫し、遠心分離により透明にし、そしてサイトカイン−特異的ＥＬＩＳＡキット（R and D Systems ）も用いてサイトカインレベルの決定のために使用した。
【０１０１】
ＩＬ−１β生成アッセイ−代謝方法
ヒト単核細胞を、５％のウシ胎児血清及び２５mMの Hepes（pH７．３）を含むＲＰＭＩ１６４０培地２mlを含む６−ウェルクラスター皿中に接種した（１×１０7 個の細胞／ウェル）。単球を２時間、付着せしめ、その後、上清液を廃棄し、そして結合された細胞を２mlの維持培地により１度すすいだ。結合された単球を、５％ＣＯ2 環境下で３７℃で一晩インキュベートした。
【０１０２】
細胞をＬＰＳ（１０ng／ml）により２時間、活性化し、次に、１％の透析されたウシ胎児血清、２５mMの Hepes、pH７．２及び８３μCi／mlの〔35Ｓ〕メチオニン（Amersham Corp. Malvern PA.  １０００Ci／ｍモル）を含むメチオニン−フリーＲＰＭＩ１６４０培地１mlにおいて６０分間ラベリングした。ラベルされた細胞を２mlの開放培地によりすすぎ、この後、試験剤を含む開放培地１mlを添加し、そして細胞を３７℃で１５〜６０分間インキュベートした。この点で、２mMのＡＴＰを含む新しい開放培地（試験剤の不在又は存在下で）を添加し、サイトカイン後翻訳プロセッシングを開始せしめた。
【０１０３】
細胞及び培地を、３時間の刺激−誘発されたプロセッシングの後に分離し、そして培地を遠心分離により透明にし、細胞及び／又は細胞残骸を除去し；得られ上清液を収穫し、そして Triton Ｘ−１００、０．１mMのＰＭＳＦ、１mMのヨード酢酸、１μｇ／mlのペプスタチン、及び１μｇ／mlのロイペプチン溶液において、それらの試薬の濃縮された原液の添加により１％に調節した。
【０１０４】
付着性単球を、２５mMの Hepes、pH７、１％の Triton Ｘ−１００、１５０mMのＮａＣｌ、０．１mMのＰＭＳＦ、１mMのヨード酢酸、１μｇ／mlのペプスタチン、１μｇ／mlのロイペプチン及び１mg／mlのオボアルブミンから成る抽出緩衝液１mlの添加により溶解し；この抽出緩衝液５０μｌを、培地上清液の透明化の後に得られるペレットに添加し、そしてそれらのサンプルをその対応する細胞抽出物と組合した。氷上での３０分間のインキュベーションの後、培地及び細胞抽出物の両者を、ＴＬＡ４５ローターを用いての Beckmanテーブルトップ超遠心分離機（Beckman  Instruments, Palo Alto., CA）による４５，０００rpm で３０分間の遠心分離により透明にした。
【０１０５】
ＩＬ−１βを、３μｌのウサギ抗−ヒトＩＬ−１β血清（Collaboratire Biochemical Products Bedford, MA. ）の添加により細胞及び培地サンプルの界面活性剤抽出物から免疫沈殿せしめた。４℃で２時間のインキュベーションの後、Protein Ａ−Sepharose (Sigma）の１０％懸濁液０．２５mlを個々の管に添加し、そして得られる免疫複合体を遠心分離により回収した。ビーズ−結合された複合体を、１０mMのトリス、pH８、１０mMのＥＤＴＡ、１％の Triton Ｘ−１００、０．４％のデオキシコレート、０．１％のＳＤＳの溶液により５度、洗浄し、そして５０mMのトリス（pH６．８）により１度、洗浄した。
【０１０６】
最終ペレットを、０．１mlの離解緩衝液に懸濁し、そして３分間、煮沸し；ビーズを遠心分離により除去し、そして前記離解された免疫沈殿物上清液を、ＳＤＳゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーによる分析の前、−２０℃で貯蔵した。ゲルを、乾燥する前、Amplify (Amersham ）にソークした。種々の種のＩＬ−１βに関連する放射能の量の定量化を、Ambis Image Analysis System (San Diego, CA）の使用により、又はホスホルイメージャー分析により決定した。
【０１０７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹膜洗浄液により単離されたネズミマクロファージを、ウェル皿（Natrixにより予備被覆されている）中に接種し；１×１０6 個の細胞を、５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２mlを含むウェルに添加した。一晩のインキュベーションの後、それらの細胞を、ＬＰＳ（１μｇ／mlで７５分間）により刺激し、そして次に、２５mMの Hepes、１μｇ／mlのＬＰＳ、及び１％の透析されたＦＢＳを含むメチオニン−フリー最小必須培地１mlにおいて、〔35Ｓ〕メチオニン（８０μCi）と共に６０分間ラベリングした。
【０１０８】
ラベルされた細胞を、２５mMの Hepes、pH７．３、１μｇ／mlのＬＰＳ及び１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により洗浄し、この後、同種細胞溶解Ｔリンパ球を含む同じ培地１mlを、化合物３の不在又は存在下で導入し；２０：１の比のリンパ球：マクロファージを使用した。細胞溶解性Ｔリンパ球調製物を、先立って、前記のようにして、Ｂａｌｂ／ｃマウスから得られた、照射された標的脾臓細胞により刺激されたＣ５７／Ｂ１マウスエフェクター脾臓細胞間のインビトロ混合されたリンパ球反応を確立することによって調製した（Perregaux など、J. Immunol. 157 : 57-64 (1996)。
【０１０９】
４時間の同時培養の後、培地を収穫し、そして遠心分離により細胞及び／又は細胞残骸を洗浄し、そして開放されたＩＬ−１βを上記のようにして免疫沈殿により回収した。免疫沈殿物をＳＤＳゲル電気泳動により分析し、そして１７kDa のＩＬ−１β種に関連する放射能の量を、 Ambis Image分析により決定した。
【０１１０】
ＤＡＳＵ結合タンパク質の同定
ヒト単球（上記のようにして単離され、そして６cmの皿上にプレートされた）を、〔14Ｃ〕化合物により３mlの開放培地（ＦＢＳを欠失する）において６０分間、処理し、この後、細胞を、５％ＦＢＳを含む開放培地５mlにより２度洗浄し、そして２５mMの Hepes、pH７、１５０mMのＮａＣｌ、１μｇ／mlのペプスタチン、１μｇ／mlのロイペプチン、０．５％サポニンの溶液１mlに懸濁した。溶解物を超遠心分離により透明にし、そして回収された可溶性画分を、それぞれ１μｇ／mlのペプスタチン及びロイペプチンを含む１０mMのトリス（pH８）の溶液中に、Centricon ３０濃縮単位の使用により交換した。
【０１１１】
ＤＡＳＵ結合タンパク質の精製のために、４×１０9 個のＴＨＰ−１細胞を、懸濁培養として、低張培地（２７mMのＮａＣｌ、０．９mMのＣａＣｌ2 、０．５mMのＭｇＣｌ2 、０．５３mMのＫＣｌ、０．２９mMのＫＨ2 ＰＯ4 、２０mMの Hepes、pH７、５mMのグルコース、５mMのＮａＨＣＯ3 、１０ng／mlのＬＳＰ）１００mlにおいて、１０μＭの〔14Ｃ〕化合物１と共に３７℃で６０分間、インキュベートし、その後、細胞を遠心分離により収穫し、ＰＢＳにより洗浄し、そして２５mMの Hepes、pH７、３０mMのＫＣｌ、３０mMのナトリウムグルコネート、０．９mMのＣａＣｌ2 、０．５mMのＭｇＣｌ2 、１μｇ／mlのロイペプチン、１μｇ／mlのペプスタチンの溶液５０mlに懸濁した。
【０１１２】
この細胞懸濁液をＮ2 キャビテーション（１５分間、６５０psi での）により破壊し、そして得られる溶解物を超遠心分離により透明にした。その上清液を、２０mMのトリス、pH８、２０mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＣｌ2 、１mMのＫＣｌ、１μｇ／mlのペプスタチン及び１μｇ／mlのロイペプチンの溶液により平衡化された１０mlの HiTrap Ｑカラム（Pharmacia ；２つの５mlの HiTrap Ｑカラムを連続的に配置することによってアセンブルされたカラム）に適用し、そしてカラムを、２０〜２５０mMのＮａＣｌの２００mlの線状グラジエントにより溶出した。個々の画分のアリコートを、液体シンチレーションカウンティングによりモニターし、そしてピーク画分をプールした。個々のピークのサンプルをＳＤＳサンプル緩衝液により離解し、そしてＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより分析した。
【０１１３】
配列の分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でクーマシーブルー染色バンドとして単離されたタンパク質サンプルのトリプシン消化に続いて、トリプシン消化物を、Hewlett-Packard １０９０クロマトグラフィーを用いて実施される逆相ＨＰＬＣにより分別した。典型的には、 Vydacカラムタイプ２１８ＴＰ５２（２．１mm×２５cm）が、０．２ml／分の流速及び次の溶媒を用いて使用された：溶媒Ａ、水中、０．１％のトリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ、アセトニトリル中、０．０８５％のトリフルオロ酢酸。使用される本発明の主要原理は、次の文献に記載されている： Rosenfeldなど、Anal. Biochem. 203 : 173-179 (1992) ; Femandezなど、Anal. Biochem. 218
: 112-117 (1994）。
【０１１４】
使用される流速及びカラムタイプのマイナーな変更は、時々行なわれた。２２０nmでの吸光度により検出されるピークは、手動的に集められ、必要なら、SpeedVac (Savant Instruments）において、及び Perkin-Elmer Applied  Biosystems Procise ４９４Ａタンパク質配列決定システムを用いての自動化されたエドマン分解及びＨＰＬＣによるアミノ酸分析にゆだねられる超遠心分離管において、遠心分離濃縮により体積を減じられた。得られるデータを観察し、そしてModel ６１０ソフトウェア（Perkin-Elmer Applied  Biosystems）を用いて解釈した。
【０１１５】
ＤＢＰ−３１及びＤＢＰ−３２のクローニング及び発現
ＤＢＰ−３１をコードするｃＤＮＡをクローン化するために、受託番号Ｎ４６０６７からの配列を用いて、センス及びアンチセンスプライマーを企画した。センスプライマー（５′−AGGATCCACGATGTCCGGGGAGTCAG−３′）（配列番号５）はＢａｍＨＩ部位を含み、そしてアンチセンスプライマー（５′−CGAATTCAGAGCCCATAGTCACAG−３′）（配列番号６）はｐＧＥＸ２Ｔ発現ベクター（Pharmacia, Piscataway, NJ ）中への挿入のためのＥｃｏＲＩ部位を含んだ。ＰＣＲ反応を１４サイクル（９４℃で２０秒、６５℃で２０秒、及び７２℃で６０秒）実施した。得られる二本鎖ＤＮＡ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１１６】
予測されるサイズのフラグメントをQlAquickゲル切除キット（Qiagen Venlo, NL）によりアガロースゲルから切除し、ｐＧＥＭＴクローニングベクター（Promega, Madison, WI）中に連結し、そしてコンピテントＥ．コリＤＨ５αサブクローニング効能細胞（Gibco BRL Grand Isle, NY）を形質転換した。１００μｇ／mlのアンピシリン、０．５mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド及び４０μｇ／mlのＸｇａｌを含むＬＢプレート上での一晩の増殖の後、白色コロニーを選択し、そして液体培養における増殖により拡張した。それらの培養物から回収されたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そして得られる制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分析した。正しいサイズの挿入体（７４０bp）を含むプラスミドを、ＤＮＡ配列分析により分析した。
【０１１７】
発現のために、ＤＢＰ−３１  ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位で、細菌発現ベクター、ｐＧＥＸ２Ｔ（Pharmacia Piscataway, NJ）中にクローン化し、そしてＥ．コリＤＨ５α細胞を再び形質転換し、そして１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。陽性コロニー（制限酵素消化により確かめられた）を選択し、そしてプラスミドＤＮＡをQlAquickキットにより単離した。次に、ＢＬ２１〔ＤＥ３〕細胞（Novagen Madison, WI ）を、プラスミドのＤＮＡにより形質転換し、そして１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上で増殖した。
【０１１８】
単一コロニーを選択し、そして５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ml中に接種し、そしてそれらの培養物を、振盪しながら（２２５rpm ）３７℃で一晩、増殖せしめた。次に、新鮮なＬＢ培地による種子培養物の１〜１０倍希釈溶液を調製し、そして拡大培養物を、ＯＤ600 が０．４〜０．６の値に達するまで（約１〜１．５時間）、振盪しながら（２２５rpm ）、３７℃で維持した。融合タンパク質の合成を誘発するために、次に、５０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを導入し、そしてその培養物を３７℃でさらに２時間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離により収穫し、そして得られる細胞ペレットを−２０℃で凍結した。
【０１１９】
ＤＢＰ−３２のクローニングのために使用されるプライマーは、ヒトＥＳＴ受託番号Ｘ８７６８９のヌクレオチド配列に基づいて企画された。前方（５′−TACGGATCCATGGCTGAAGAACAACCGC−３′）（配列番号７）及び逆方向（５′−GTAGGATCCTTATTTGAGGGCCTTTGCCAC−３′）（配列番号８）プライマーが、ＢａｍＨＩ部位を含むよう企画された。クローニング及び発現は、ＤＢＰ−３２について上記で使用されたプロトコールに類似するプロトコールで実施された。
【０１２０】
凍結されたＤＢＰ−３２発現細胞ペレット（培養物２ｌからの細胞ペースト８．２ｇ）を、２０mMのトリス、pH８、０．１％の Triton Ｘ−１００、５mMのＤＴＴ、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１mMのＥＤＴＡ、２５μｇ／mlのロイペプチン、１μｇ／mlのペプスタチン及び５μｇ／mlのアプロチニンから成る溶解緩衝液２５mlに懸濁した。リゾチームを添加し、１mg／mlの最終濃度を達成し、そしてその懸濁液を氷上で３０分間インキュベートした。この点で、ＭｇＣｌ2 を添加し、１０mMの最終濃度を達成し、そしてＤＮアーゼ（細胞ペースト１ｇ当たり１０μｇ）を導入し；その懸濁液を氷上で３０分間インキュベートした。
【０１２１】
その懸濁液を、３０〜４５秒間隔で３〜４度、音波処理した（４０％能力／パワー４）。次に、細胞抽出物を遠心分離により透明にし（１８，０００×ｇで３０分間）、そして上清液を回収した。ＧＳＴ−ＤＢＰ−３２を、グルタチオンセファロースの１mlカラムへのこの調製物１４mlの適用により（サンプルは０．５ml／分で適用された）、可溶性抽出物から回収した。抽出物の適用の後、カラムをリン酸緩衝溶液１４mlにより１ml／分で洗浄した。
【０１２２】
次に、結合されたＧＳＴ−融合タンパク質を、２０mMのグルタチオンを含む０．１ＭのトリスＨＣｌ（pH８）溶液の適用により溶出し；それぞれ１mlの画分を集め、そしてＯＤ280 を測定することによってタンパク質をモニターした。ピーク画分をプールし、そしてリン酸緩衝溶液により平衡化された８mlのFast Desalting Column ＨＲ  １０／１０（Pharmacia Piscataway, NJ）上で脱塩した。緩衝液交換されたタンパク質画分をプールし、そしてジチオトレイトールを添加し、５mMの最終濃度を達成した。
【０１２３】
ＧＳＴ−ＤＢＰ−３２融合タンパク質を、１／２００の比（μｇに基づく）のトロンビンにより２５℃で２．５時間、処理し、この後、消化物を、２０mMのトリス（pH８）により平衡化された Mono Ｑ  ＨＲ  １０／１０（Pharmacia ）に適用し、サンプルを４ml／時の速度でカラム上に負荷し、この後、カラムを２０mMのトリス（pH８）により１０分間、洗浄した。２０mMのトリス（pH８）中、０〜３０％の１ＭのＮａＣｌのグラジエントを３０分間適用し、ＤＢＰ−３２フラグメントを溶出し；ピーク画分をプールし、そしてジチオトレイトールにより５mMに調節した。最終精製段階として、ＤＢＰ−３２調製物をグルタチオンセファロースの小さなカラム上に通し；通過物を集め、そしてプールし、９８％の純度のＤＢＰ−３２を得た。
【０１２４】
ＤＢＰ−３１を類似する方法により精製し、但し、 Mono Ｑアニオン交換クロマトグラフィー段階が排除された。精製された生成物の電子スプレー質量分析は、２種の組換え由来のポリペプチドの個々が予測される質量を有したことを示した。それらの生成物のアミノ末端は、ＧＳＴとＤＢＰ融合パートナーとの間に配置されるトロンビン−分解性リンカーに由来する短い配列を有し；これは、ＤＢＰ−３２の場合、 Gly−Ser であり、そしてＤＢＰ−３１の場合、 Gly−Ser −Thr であった。
【０１２５】
ｒＤＢＰのラベリング
〔14Ｃ〕化合物２により放射性ラベルされるｒＤＮＡ−由来のＤＢＰの予測される能力を実証するために、精製されたＤＢＰ又は細菌ＧＳＴ（１μｇ）のサンプルを、〔14Ｃ〕化合物を含む、２５mMの Hepes（pH７．３）、３０mMのＫＣｌ、３０mMのナトリウムグルコネート、０．９mMのＣａＣｌ2 、０．５mMのＭｇＣｌ2 及び１mMのＤＴＴの溶液２０μｌ中に希釈した。３７℃での６０分間の処理の後、６倍に濃縮されたLaemmuliサンプル緩衝液（Laemmuli, U. K. Nature 227 : 680-685 (1970))４μｌを添加し、そしてサンプルを５６℃で５分間、加熱した。離解されたサンプルを、１２％ポリアクリルアミドミニゲル（Novex ）上で分離し、その後、乾燥されたゲルを、ホスホルイメージャー分析により分析した。競争実験を、同じラベリング型式で、４℃で３０分間、実施した。
インビボＩＬ−１β生成アッセイ
マウスに０．５mlのＰＢＳ中、１μｇのＬＰＳを、ｉ．ｐ．注射した。１時間後、化合物３を０．５％メチルセルロースにおいて経口投与した。さらに１時間後、ＰＢＳ  ０．５ml中、ＡＴＰ、すなわち二ナトリウム塩（３０mM）のｉ．ｐ．注射を行ない；ＡＴＰ溶液のpHを、注射の前、７．３に調整した。１５分後、マウスを、頸部脱臼により殺害し、そして腹腔を、１０単位／mlのヘパリンナトリウム塩、０．２５mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／mlのロイペプチン、１μｇ／mlのペプスタチン及び１mMのＥＤＴＡを含む氷冷却ＰＢＳ溶液３mlにより洗浄した。洗浄液におけるＩＬ−１α及びＩＬ−１βを、 Endogem（ＩＬ−１α）及び Genzyme（ＩＬ−１β）からの市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【０１２６】
【配列表】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＡＳＵ結合タンパク質を同定するために使用される２種のエポキシド−結合ＤＡＳＵの構造を示す。
【図２】ＡＴＰ−刺激されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしてのエポキシド−含有ＤＡＳＵの有用性を示す。
【図３】細胞結合タンパク質を同定するためのプレートとしての放射性ラベルされたエポキシド−含有ＤＡＳＵの有用性を示す。
【図４】ＤＢＰ−３２についてのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図５】ＤＢＰ−３１についてのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図６】ＤＢＰ−３１とＤＢＰ−３２との間の配列類似性を示す。
【図７】組換えＤＢＰが化合物２を結合する能力を保持することを示す。
【図８】ヒト単球によるＡＴＰ−誘発されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての非−エポキシド含有ＤＡＳＵの有用性を示す。
【図９】ＡＴＰ−誘発されたＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての多くの構造的に関連するＤＡＳＵの比較を示す。
【図１０】ネズミ腹膜マクロファージによる細胞溶解性Ｔ−リンパ球介在性ＩＬ−１β後翻訳プロセッシングのインヒビターとしての非−エポキシド含有ＤＡＳＵの有用性を示す。
【図１１】サイトカインインヒビターとしての化合物３の選択性を示す。
【図１２】マウスへの経口投与の後、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両者の開放を阻害するＤＡＳＵの有用性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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