(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
静的状態の血液サンプルにおける標的成分を分類する分析方法であって、
全血液サンプル（12）を提供する工程と；
全血液サンプルを、全血液サンプルの標的成分（84）と選択的に結合するように形成した蛍光化合物（84）で染色する工程と；
試薬を全血液サンプル（12）へ添加して、赤血球を実質的に溶解させずに、全血液サンプルにおける赤血球の凝集を阻止する工程と；
赤血球が標的成分の分類を妨害することのない励起波長を有する光で蛍光化合物（84）を励起する工程と；
静的状態の血液サンプルにおいて、蛍光化合物の蛍光を検出して標的成分（88）を分類する工程とを含む、分析方法。
【請求項２】
前記染色する工程は、蛍光化合物（84）を、全血液サンプル（12）の細胞亜群、白血球、ウィルス、血小板、細菌、原虫類、寄生虫、DNA分子およびRNA分子からなる群のうちの１つと結合させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記染色する工程は、前記試薬を添加する工程の後で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬を添加する工程は、全血液サンプルに対し、等張性溶液、高張性溶液、緩衝溶液、サンプル（12）のpHを変える試薬、清浄剤、HCl溶液、NaOH溶液、アルキル両性イオン化合物、ポリソルベート20、ポリオキシエチレン（20）、ソルビタンモノラウレート、両性イオン清浄剤、式ｎ−デシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、式ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、式ｎ−テトラデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、または式ｎ−オクチル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、からなる群のうちの１つを添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬を添加する工程は、乾燥試薬を添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光化合物を励起する工程は、550nmより大きい波長を有するレーザー光を提供する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光化合物を励起する工程は、550nmより大きい発光波長を有する蛍光化合物を提供する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光化合物を励起する工程は、600〜650nmまたは650〜700nmの範囲の発光波長を有する蛍光化合物を提供する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
蛍光化合物および全血液サンプルを、蛍光化合物が全血液サンプルの標的成分と結合するようにインキュベーションする工程と；
該混合物の一部を一定容積の室へ入れる工程とを含み、該混合物は均一なヘマトクリット層を提供する、請求項１から請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光化合物および全血液をインキュベーションする工程は、前記蛍光化合物を添加する工程の後で行なわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物の一部を室へ入れる工程は、５〜60マイクロメートルの範囲のヘマトクリット層を提供する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物の一部を室へ入れる工程は、10〜200マイクロメートルの範囲の深さの走査毛細管を提供する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合物の一部を室へ入れる工程は、100マイクロメートルの深さの走査毛細管を提供する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光化合物を添加する工程は、500nmより大きい発光波長を有する蛍光化合物を提供する工程を含む、請求項１から請求項13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光化合物を添加する工程は、650〜700nmの範囲のピーク発光波長を有する蛍光化合物を提供する工程を含む、請求項１から請求項14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光化合物を添加する工程は、モノクロナール抗体と結合するシアニン染料を提供する工程を含む、請求項１から請求項15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
公知数の微粒子を全血液サンプルへ添加して、室における混合物の容積を判定する工程をさらに含む、請求項１から請求項16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
室と；
全血液サンプルと；
実質的に赤血球を溶解させずに赤血球の凝集を阻止する試薬と；
蛍光染料および標的サンプル粒子を標識化するリガンドを含む蛍光複合体と；
を含み、
前記全血液サンプル、前記試薬および前記蛍光複合体は、前記室に配置されて均一なヘマトクリット層を形成する、静的状態のサンプル調製物。
【請求項１９】
前記室は、10〜200マイクロメートルの範囲の深さ、好ましくは100マイクロメートルの深さを有する走査毛細管である、請求項18に記載のサンプル調製物。
【請求項２０】
前記蛍光複合体は、全血液サンプル内に含まれる白血球に発現された抗原に対し特異的である抗体と共有結合した蛍光染料を含む、請求項18または請求項19に記載のサンプル調製物。
【請求項２１】
ヘマトクリット層は、５〜60マイクロメートルの範囲の深さを有する、請求項18に記載のサンプル調製物。
【請求項２２】
前記希釈剤は、等張性生理食塩溶液である、請求項18に記載のサンプル調製物。
【請求項２３】
前記試薬は、等張性溶液、高張性溶液、緩衝溶液、サンプル（12）のpHを変える試薬、清浄剤、HCl溶液、NaOH溶液、アルキル両性イオン化合物、ポリソルベート20、ポリオキシエチレン（20）、ソルビタンモノラウレート、両性イオン清浄剤、式ｎ−デシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、式ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、式ｎ−テトラデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、または式ｎ−オクチル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する化合物、からなる群のうちの１つである、請求項18に記載のサンプル調製物。
【発明の詳細な説明】
この出願は、1994年５月２日に出願の特許出願第08/236,342号の一部係属出願であり、これは今では放棄された1993年２月17日に出願の特許出願第08/018,762号の一部係属出願である。これらの出願の各々は参考のためにここに組み込まれる。
発明の背景
本発明は一般に化学および微生物学的分析技術の分野に関し、さらに詳しくは細胞の組分けおよび分類のための血液サンプルを調製する新規の改善された方法に関する。
免疫学的研究の始めから、研究者は生物学的液体において特定の粒子を分類、同定および分析することができることを望んできた。とくに、哺乳動物である患者の体液はしばしば標的細胞成分を分類するために分析される。たとえば、血液は、CD4またはCD8表面抗原を陽性に発現する全血液の容積の単位当たりのＴ−リンパ球の絶対数を測定するために分析される。CD4/CD8血液試験は、進行の異なった段階を通じてヒト免疫欠失ウィルス（HIV）の進行および特に後天的免疫不全症候群（AIDS）に対するウィルス感染の急性発現の診断を測定するために重要である。AIDSウィルスだけの診断に必要な試験の量は、細胞分類のための簡単で十分な方法のための要求に供給されている。
この目的を遂行するために、研究者は特定細胞の特徴または特性にしたがって細胞と結合する蛍光マーカーで特定細胞を標識化する方法を発展させた。初期には免疫学者は白血球の核を染色する蛍光染料を使用した。染料または着色剤からの蛍光は白血球を分類しそして同定するのを容易にした。モノクロナール抗体技術の大きな躍進により間もなくモノクロナール抗体と蛍光染料との抱合ができるようになった。これは免疫学者がこれらの表面抗原したがって細胞を分類しクラス分けする可能性を広げた。
蛍光強度の非常に精度の高い定量測定を行うことができる光検出装置の出現、すなわち自動細胞分類装置の新規可能性が出現した。流動細胞計測器は蛍光発光を検出するための蛍光センサーとともに発達した。顕微鏡スライドを走査しそして標的血液細胞を自動的に同定し分類するために走査装置が出現した。
自動蛍光分析のためのこのような新規装置が出現した結果、精度を危うくすることなく非常に簡単に細胞を分類する新規の向上したサンプル調製および提示技術に対する要求が出てきた。このような技術の一般的目的は、分析上の可能性を拡大し、信頼性を向上し、調製が簡単で、サンプルの取扱を最小化し、そしてサンプルを取扱う間の病気感染の危険性が低下することである。
流動細胞計測器はサンプルにおける異なった細胞の迅速で正確な細胞分類を行う利点を有するがしかし全血液の容積当たりの細胞の正確な分類を直接行うことはできない。流動細胞計測器は、直線状流路において光源の前に細胞のサンプルまたは粒子を提供して各細胞または粒子とレーザとの相互作用を測定する。流路は液体の下方に流れる流れからなり、ここの中心へ細胞を一度に放出する。
レーザービームは各細胞を破壊し、これにより幾つかの方向にレーザー光を散乱させる。光検出器は各散乱を検出するために空間的に配置されている。蛍光検出器はまた、細胞からの蛍光発光を測定するために利用することも可能である。検出器から集めたデータの統計的分析を使用して細胞の特性を決定しそして分類することができる。流動細胞計測法の欠点は、サンプルの調製方法およびサンプルの提供方法の両方に関する不所望な結論を含む。まず、流動細胞装置は、赤血球および血漿成分ならびに蛍光マーカーを除去する一連のサンプル調製工程を必要とする。工程は、細胞特にしばしば脆い不健康な細胞を損傷することがある。全体的なサンプル調製技術の誤りの限界は、各処理工程または統計的分類技術による複合である。さらに、たとえば遠心分離、濾過、溶解、細胞洗浄等の多くの工程は、絶対容積の関数として粒子を完全にカウントする能力を大きく損なうことなしには遂行することができない。
たとえば、サンプルにおける白血球の分類およびクラス分けのために血液のサンプルを調製する通常の方法は、赤血球を溶解しそしてサンプルを遠心分離して過剰の赤血球の残渣を血漿から除去するための工程を含む。溶解は、理想的には、赤血球の全てを破壊しそして白血球は破壊しないであろう。しかしながら、その理想は行うことが実際には困難でそして溶解の効果は患者によって異なる。たとえば患者の中には弱い白血球を有する者がいる。溶解剤は弱い白血球を損傷するかもしれない。他の患者、特にAIDS患者は、溶解剤に高い耐性を持つ赤血球を作る。このようなサンプルには複数の溶解剤を適用する必要があり、細胞分類分析の目的物および標的物である白血球への損傷の大きな危険を起こさせるより効力の強い溶解剤が必要である。
遠心分離または重力分離は、同様に不完全な分離方法である。遠心分離を溶解とともに行う場合、白血球を液体とともに混合し、溶解した細胞残渣を遠心分離して、遠心分離容器の底へ遠心分離する。次いで、白血球を残渣からデカントする。不幸なことに、遠心分離は完全でなく、溶解しない粒子の幾つかが細胞残渣と混合したままであろう。分離技術たとえば遠心分離およびデカンテーションが関係する場合はいつでも、分離技術によりもたらされる誤差のために、単位容積当たりの標的細胞の正確な量を正確に測定することができない。たとえば、公知量の血液を赤血球溶解後に遠心分離する場合、溶解した赤血球からの残渣は沈降層に沈殿する。次いで、白血球含有血漿を残渣からデカントする。注意のいかんに係わらず、白血球の中には溶解赤血球からの残渣とともにキュベットに残ったもままのものもあるであろう。その結果、残渣から分離された白血球の次の計測は、最初のサンプルに含まれる白血球の数の正確な計測ではない。
蛍光を使用して細胞の標的サブクラスを検出および分類する場合、この赤血球の存在が光学的干渉を起こすので赤血球を溶解する。二つのタイプの干渉が赤血球を厄介者にする。最初に、赤血球は、200nm−500nmの範囲の波長の光を吸収する。蛍光放電のレーザー光がこの範囲で生じる場合、蛍光マーカーおよび蛍光放電を刺激する光は非常に弱くなるであろう。第二に、赤血球および他の血漿たんぱく質は自己蛍光性である。血液のこられの成分は、フルオロポアまたは光により刺激されると蛍光を発する分子を天然に含む。蛍光マーカーは、活性化のエネルギーおよび赤血球の自己蛍光を同様に避けて放電する蛍光エネルギーを有するように選択されなければならない。
流動細胞計測技術の他の欠点は、空気虫で運ばれうる微小ミストと同様に、霧状の小滴の形態でノズルからサンプルを放出することである。流動細胞計測法を使用する技術者は、霧状の粒子を吸入するかさもなければこれに曝されるであろう。サンプルが病気に感染した血液または他の生物学的危険物質であると、技術者は感染の危険に曝される。したがって、これらの霧状粒子の放出により起きる感染の危険を排除するサンプル調製方法が必要である。
流動細胞計測法のためのサンプル調製は、血球の物理的構造を損なうことなく菌およびウィルスを殺滅する固定液または固定剤の使用を含む。ホルムアルデヒドは、感染物を破壊するためにサンプルへ添加される一般的固定液である。固定液の使用には少なくとも二つの欠点がある。第一に、固定剤は物理的構造を損なうことなく“細胞を殺滅”する。しかしながら、細胞における幾つかの形態学的変化が固定液により起こる。したがって、固定したサンプルからのデータは、未処理血液から得られるデータとは異なる。第二に、固定液は希釈工程へ添加される。サンプルを混合し、処理し、希釈しまたは遠心分離する毎に、処理工程が全体的手段へ加わる。一工程の誤差は単独では重要ではないであろう；しかしながら、誤差が各測定工程からの誤差と組み合わさると、全体の工程は合計した不所望な誤差の限界を有するかもしれない。したがって、取扱工程の数が最も少なく最も簡単になりうる分析技術は、これらが容積測定をより正確にするので蛍光測定装置を使用する研究者および実施者に有利である。
容積測定分類（すなわち、単位容積当たりの細胞の測定）は、診断の目的に重要であるので、流動細胞計測法を使用して容積測定を行う幾つかの試みがこれまで提案されてきた。一般的技術の一つは、細胞選別機のような装置を用いて細胞の全てをカウントして決まった容積のサンプルにおけるある種の群の細胞の合計数を分類することである。次いで、標準として働く細胞タイプの比として標的細胞の数をカウントする他のサンプルを調製する。標準細胞に対する標的細胞の比に単位容積当たりの標準細胞の数を掛けると、固定容積における標的サンプルの数の容積測定による概算が得られる。しかしながら、各細胞分類からの誤差の限界は一緒に組み合わされる。容積計測分類を一つの測定で行うことができれば、容積測定細胞計測装置の精度を概して向上させることができる。
流動細胞計測装置のために容積細胞分類の精度を向上させる他の試みは、調製技術を行う前に、決まった数の蛍光微粒子（たとえば、ビーズ）と決まった量のサンプルを混合することを要する。一般的には、分類のために標的とする細胞と同じ蛍光ラベルで微粒子を標識化する。しかしながら、微粒子におけるマーカーの濃度は、一般には微粒子における標識化粒子の濃度の強度の５−10倍である。蛍光発光の大きさに基づくゲートを、標的細胞と微粒子を区別するようにセットすることができる。誤差は、標的細胞が異常に高い抗体濃度を有する場合または微粒子の幾つかが蛍光濃度を低下させた場合、この技術へ導入される。微粒子が標的粒子と区別できないことはないことをゲート制御技術が確実にするとしても、この技術は一つの容積結果を得るために二つの測定を必要とする。二つの測定の誤差は組合わさって、微粒子技術を一つの測定で単位容積当たりの細胞の数を測定するもっと直接的な技術よりも精度を低下させる。
微粒子の予め決めた数を血液の一定の量と混合後、サンプルを処理する。処理工程の間、幾つかの微粒子は、一般にポリスチレンで作られているが、標的細胞のものと異なった密度を有するので、失われるであろう。したがって、サンプルは、微粒子が不均衡に沈降しないように断続的な混合の必要性がある。
細胞分類の他の公知システムは、顕微鏡技術と蛍光標識化とを組み合わせた蛍光顕微鏡法である。このようなシステムは細胞のサブクラスを同定および分類するための自動走査顕微鏡を含む。サンプル調製は、蛍光染色または標識化血球（標的細胞）を含むサンプルを顕微鏡スライドに塗り付けることを含む。光源を使用して、顕微鏡ガラスの背景にある格子に対し細胞へ照射する。格子一つ当たりの細胞の数をカウントしそして平均化して蛍光染色細胞の量を計る。この方法は他の細胞タイプに対する一つの細胞タイプの比を測定することができるが、塗り付けられたスライドの顕微鏡による分類は単位容積当たりの細胞の数を直接測定することはできない。
さらに、手動により細胞数を計測する場合、人為的誤差および技術者間の正確性の変動の機会が多い。スライドに塗った細胞の数を計測する自動化技術は、スライドを横切る面積の単位当たりの細胞をより正確にカウントする能力を向上するが、しかし自動化蛍光顕微鏡法に適合する細胞調製の方法は単位容積当たりの標的細胞の数を直接測定することができない。
同様に顕微鏡スライドとともにビーズを使用して、スライドにおける全血液の容積測定分類を行うこともできる。一つの技術は、実質的に圧縮不可能な微粒子（たとえばビーズ）を一定の容積の液体サンプルと混合し、その後サンプルを処理しそしてスライドに塗り付ける。標的細胞の微粒子に対する比×容積の単位当たりの微粒子の数を用いて、単位容積当たりの標的細胞の数を評価する。しかしながら、この技術には溶解工程が避けられない。流動細胞計測法で微粒子を用いた同じ問題の全てが、蛍光顕微鏡法による微粒子の使用に対して等しく当てはまる。
したがって、容積測定による細胞分類の正確性および効率性を向上し同時にサンプルの調製を簡易化する新規の向上したサンプル調製および分析方法に対する必要性がある。このような方法は、遠心分離、デカント、細胞溶解および細胞洗浄のような分離および処理工程を排除する場合、さらに好ましい。分析は、サンプルの容積が微粒子添加剤または固定液の必要なく保存されそして正確に分析される場合、特に都合がよい。全血液を分析して正確な容積測定による細胞の同定をすることができる能力およびサンプル全体またはサンプルの一部のいずれかから分類することができる能力はこのような分析技術の臨床的および診断的適用を広く拡大しそして向上するであろう。
発明の概要
簡単に、そして一般的に言えば、本発明は画像形成装置（imaging instrument）による全血液サンプルの蛍光染色した標的成分の分類のための新規の向上した分析を含む。同様に、本発明は全血液から調製されたサンプル調製物を含む。全血液サンプルは、血球および血液の他の粒子成分たとえばヘマトクリットが室たとえば走査毛細管の内部に均一に分散するように室内部で静的な状態で画像形成装置へ提供される。サンプル調製方法は、全血液の単位容積当たりの標的成分の量が非−定量的調製工程の排除により保存されることを確実にする。さらに、均一なヘマトクリット層を作る技術は画像形成装置へ標的成分の最適な提供をもたらす。代表的な標的成分は、特定の表面抗原たとえばCD4およびCD8を発現する白血球を含む。
一定した容積の室たとえば走査毛細管において静的な全血液サンプルの画像形成することを試みた場合、予期せぬ問題が生じる。サンプルの静的な提供は、赤血球の凝集すなわち“ローレックス作用（Rouleaux effect）”を含む。ローレックス作用は、サンプルを通して凝集した赤血球のウェブの原因であり、ヘマトクリット層の不均一な分散を起こす。この効果は、静的血液において迅速に生ずるが、しかし攪拌により可逆的である。通常、ローレックス効果はレオロジー条件下では生じない。このローレックス作用の最終的結論は、不可能ではないにしても、画像形成装置による細胞検出はより困難であるということである。
本発明の分析の一つの利点は、これが、ローレックス作用を排除することである。赤血球の凝集を避けるために、全血液サンプルへ試薬を添加して、赤血球の形状を変化させ、赤血球の表面特性を変え、または赤血球が残っている環境、たとえば血漿を変性させる。好ましい試薬は、蛍光特性を有さず、赤血球を溶解せず、抗原−抗体相互反応と干渉せず、そして化学的分解を起こすことなく固体へ還元し、その間効果的に細胞凝集を阻止する。
効果的試薬は赤血球の形状を変えるかまたは細胞の表面たんぱく質の表面化学性を変える清浄剤を含む。たとえば、短鎖アルキル両性イオン化合物が効果的であることがわかっている。同様に、試薬は赤血球の形状を幾何学的に変える穏やかな低浸透圧の塩溶液であってもよい。さらに、サンプルのpHを変えて赤血球に同様な影響を与えるようにしてもよい。これに代わって、簡単な希釈剤たとえば等張性生理食塩溶液の定量的量をサンプルへ添加し、ヘマトクリットを明らかに分離し、血漿におけるたんぱく質濃度を低下させて細胞の凝集を予防するのに十分なようにしてもよい。
本発明方法により作られる血液サンプルは、走査毛細管中に実質的に均一に分散したヘマトクリット層を有する。白血球および赤血球の均一な分散は幾つかの利点を有する。均一なヘマトクリット層を有する利点は、非結合の蛍光化合物からのバックグラウンドノイズのより均一なレベルが得られるということである。蛍光染料が赤血球を透過しないので、均一なヘマトクリット層は均一なヘマトクリット層を有するために必須である。均一なヘマトクリット層を有することは非結合蛍光化合物を含む血漿の容積が走査毛細管中で均一に置き代わっていることを確実にする。これにより、非結合蛍光化合物の量が走査毛細管中にほぼ一定に残っており、バックグラウンド蛍光の相対的に均一なレベルを維持することが確実になる。
調製の第一の工程は、全血液のアリコートを得ることである。全血液のアリコートを、予め選択した量の蛍光染料および標的粒子を標識化するリガンド複合体と混合する。CD4抗原を発現するリンパ球を検出することに使用する複合体は、反応性シアニン染料と結合したCD4抗原に高度な親和性を有するモノクロナール抗体であることが好ましい。蛍光染料は、励起光および発光する蛍光光線の赤血球による自己蛍光および回折が最小になるように選択される。
予め選択された量の蛍光複合体は、標的成分と適切に結合するかまたはこれに蓄積するために十分なリガンドまたは抗体があるように選択される。過剰の染料およびリガンドは、妥当な時間で標的粒子の十分な標識化を確実にすることが必要である。しかしながら、サンプルにおける過剰の蛍光染料濃度は、標的成分からの蛍光が非結合蛍光染料により作られる蛍光の存在下に検出されるのに十分な強度の反応を作るように選択される。同様に、サンプルおよび蛍光複合体は、蛍光複合体の十分量を標的成分と結合してサンプルにおける非結合蛍光複合体からの蛍光シグナルと区別される標的成分からの蛍光シグナルを提供するような十分な時間インキュベーションされる。インキュベーション期間は、標的成分における蛍光複合体の飽和を許すように十分であることが好ましい；しかしながら、飽和は必須というわけではない。その結果得られた混合物により画像形成装置が標的成分からの蛍光のピーク強度を検出することができるようになり、これにより標的成分を正確性および効率性の向上したレベルで容積測定により分類することができる。
好ましい実施態様においては、赤血球の凝集を阻止する定量的量の試薬を、全血液サンプルのアリコートおよび蛍光染料−リガンド複合混合物へ添加してもよい。これに代わって、蛍光複合体へ添加する前に、試薬を全血液サンプルへ添加してもよい。同様に、試薬を蛍光複合体と混合して、両方を全血液サンプルへ一緒に添加してもよい。血液サンプル、蛍光複合体および試薬混合物を、画像形成装置によって調査するために室へ供給する。蛍光複合体のインキュベーション後に混合物を室へ入れてもよいしまたは混合物を室でインキュベーションしてもよい。
画像形成装置による調査のための好ましい室は、一般的にはガラスまたはプラスチック製の走査毛細管である。走査毛細管の長さおよび幅は、一般的には水平な走査平面を画成し、この上で画像形成装置がpixel−by−pixelベースでサンプルを調査する。画像形成装置は、走査毛細管上へ焦点を集めるレーザー光源を使用して、走査スポット画成する横断面直径を有する走査平面に対し垂直の円形領域を照射する。画像形成装置は蛍光複合体を刺激し、非結合複合体および標的成分と結合したものの蛍光発光を検出する。分析されるサンプルの容積は、画像形成装置により走査される毛細管の長さ×毛細管の内腔の横断面積と等しい。
走査毛細管と組み合わせたこのような画像形成装置の使用は、感染性のウィルスまたは細菌で汚染されるかもしれない血液サンプルが画像形成装置の持久性部分と決して接しないという利点を有している。血液サンプルが走査毛細管に含まれるので、空気中へ運ばれる霧状粒子がない。したがって、固定液は必要ではない。すなわち、本発明の方法は全血液の安全で効果的な分析を提供するものである。
概略すると、本発明方法は、全血液と蛍光複合体の選択した量を混合し、混合物を一定期間インキュベーションし、凝集を阻害するために試薬を添加し、そして走査毛細管へ混合物のアリコートを吸い込む工程を含む。一連の工程は所望の結果を得るために不可欠というわけではない。走査毛細管の内腔は、走査通路に沿って円柱状領域を照射しカラムからの蛍光反応を定期的に測定する画像形成装置により信号が送られる。方法はさらに、複数の処理工程たとえば溶解、過剰の抗体の洗い出し、そしてサンプルの遠心分離などにより起こされる誤差を避けることによりサンプル調製技術を簡素化することにより細胞分類精度を向上する。さらに、調製されたサンプルを走査毛細管に含ませ、画像形成装置の作業部分に決して接触しないようにする。したがって、全血液分析はサンプルにおける感染菌およびウィルスを殺滅するための固定液を必要としない。本発明のこれらのおよび他の特徴ならびに利点は、本発明の原則を実施例を用いて説明する添付の図面と組み合わせて、以下のさらに詳細な記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、全血液のサンプルを含む走査毛細管の一部切り欠き透視図である。
図1Aは、図１の1Aにより限定した領域における図１の拡大断片図である。
図２は、毛細管内の照射カラムを限定するレーザー光のビームにより横切られる図１の走査毛細管の断片部分の模式図である。
図3A−Ｅは、相当する蛍光反応の棒グラフ図上部に様々な照射された画素の正面図である。
図4Aは、均一なヘマトクリット層を有するサンプルを横断する一本の走査ラインに沿って検出される蛍光のグラフである。
図4Bは、均一なヘマトクリット層を有するサンプルを横断する一本の走査ラインに沿って検出される蛍光のグラフである。
図５は、ローレックス作用による一緒に積み重ねた複数の赤血球の拡大図である。
図6Aは、不均一なヘマトクリット層を有する三つの標的細胞を有する図１の走査毛細管の横断面図である。
図6Bは、図6Aのサンプルに沿って横断する走査ラインにより作られる蛍光シグナルのグラフである。
図７は、赤血球と接触する光波の図である。
図８は、250−900nmの波長を有する光の範囲における赤血球の吸収スペクトルである。
図９は、励起光の様々な波長に対する赤血球自己蛍光の強度のグラフである。
図10は、早いおよび遅い抗体／抗原結合反応に対する結合反応速度を示す反応速度図である。
図11は、インキュベーションのセット時間後のCD4抱合“Cy5"で標識化した細胞からの平均ピーク高さを示す度数分布図である。
図12−14は、実施例１−３に概略する工程によりそれぞれ調製されたサンプルの散乱プロットである。
図15−18は、様々なピークレベルにおける蛍光強度を有する細胞の数を比較する度数分布図である。
図19は、本発明により調製されそして画像形成装置により信号が送られたサンプルおよび本発明により調製され流動細胞計測器により調査されたサンプルの効果を比較するために何人かの患者からの細胞計測数を比較する。
好ましい実施態様の記載
本発明の分析は、走査毛細管において生物学的液体たとえばヒト全血液のサンプルを調製しそして提供するものである。生物学的液体は、様々なタイプおよびサブクラスの、液相たとえば血漿および血球や血小板のような粒子を含む固相を有する。図１は床面を備えた内腔を有する走査毛細管10である。毛細管は一定の容積を有するサンプル12を含む。サンプルは液体14および粒子16からなる。走査毛細管におけるサンプルは、毛細管の内腔床面に平行な走査平面と呼ばれる平面領域を走査する画像形成装置による調査に対し提供される。
図1Aについて、標識化粒子22および24はそれぞれ粒子層または液体層において懸濁される。標的成分22および24は蛍光マーカーで標識化される粒子のサブクラスである。たとえば、血球のサブクラスは白血球、血小板または白血球の様々な小群たとえばリンパ球または異なったリンパ球のサブクラスである。他の生物学的液体の標的成分は、細菌、ウィルス、現虫類、または寄生虫でもよい。蛍光マーカーは、細胞の特徴、たとえば特異的表面抗原の集団の発現にしたがって細胞と特異的に結合するように選択される。特異的タイプの表面抗原との結合に有効な蛍光マーカーは、あるタイプの表面抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体を蛍光染料と抱合することによって作られる。サンプルにおける蛍光マーカーは、全血液サンプル中で非結合であるかまたは標的細胞上もしくはその内部に蓄積されていてもよい。
好ましい実施態様の方法は、1994年５月２日に出願された係属出願中の米国特許出願第08/236,645号に開示された画像形成装置の走査計を用いて使用するのに適しており、この出願はここに参考として編入する。画像形成装置は本発明の主題の方法と適合するが、装置については実施例を参照し、そして制限するものではない。このような画像形成装置は、図２に示すように走査毛細管を横切るガウスウエスト（gausian waist）の形にレーザー光のビームを狭くする。ガウスウエストは走査毛細管における円柱状領域を照射し、これはガウスウエストの直径×カラムの内腔の深さに等しい。照射された円柱状領域が毛細管を通過すると、これがその通路にある蛍光物質を励起する。円柱状領域からの蛍光を光検出器で検出して蛍光シグナルを作り、これをデジタルサンプル器により一連のデジタルデータサンプルへ定期的にサンプリングする。
各々のデジタルデータサンプルは、サンプリングの時点における照射カラムから発光する蛍光の量に相当する。サンプリングの時点における照射カラムの位置を表す領域は画素領域と言われる。各画素領域は、各デジタルデータサンプルに相当する照射カラムの瞬間撮影である。サンプリングの速度は、レーザーが各データポイントにより表される画素領域が先行する連続的なデータポイントに相当する画素領域とオーバーラップするようにサンプルを横断して移動する速度と調和される。
標的細胞が画素領域内に位置する場合、相当するデータポイントは増加する蛍光測定値を表わす。増加する蛍光測定値はピークとして数字的に検出されうる。ピークを分類して一定容積の毛細管における標的細胞の数を測定することができる。したがって、サンプルは生物学的液体内の標的粒子の正確な検出を促進するために調製されなければならない。
サンプルを調製し提供するための本発明の方法を、特定の表面抗原を発現する白血球のサブクラスの分類のために白血球を調製することと関係して説明することができる。細胞分類の標的である血球の特定のクラスを標的細胞と称し、標的細胞を同定する特定の表面抗原を標的抗原と称する。
好ましい実施態様の方法は、サンプルにおける赤血球からの光吸収、自己蛍光および散乱のような光学的干渉を最小化する励起波長および発光波長を有するモノクロナール抗体または同様のリガンドと抱合しうる蛍光化合物、たとえば染料または他の発蛍光団を選択することにより、蛍光マーカーを選択する工程で始まる。このような染料を選択することの利便性により、赤血球を溶解することなくサンプルを調製することができ、これにより粒子のより正確な容積計測ができるようになる。
好ましい実施態様の他の工程は、分析に使用する蛍光マーカーの量を注意深く選択することである。分析の目的はサンプル調製の工程を通じて全血液の容積を保存することおよびできるだけ少ない全血液を取り扱うことであるので、過剰の非結合マーカーを細胞から洗い出すことができない。したがって、選択された蛍光マーカーの量は、蛍光マーカーが細胞を検出することができるであろう十分な量で標的細胞と結合することができるぐらい十分でなければならない。他方、濃度は、非結合蛍光化合物により起こされる蛍光およびシグナルが細胞からの蛍光シグナルを消さない程度に十分低くなければならない。細胞の容積置換により増えた溶液における蛍光化合物の濃度は、細胞と結合した蛍光マーカーの数より著しく低くなければならない。
モノクロナール抗体と抱合する蛍光染料を含む蛍光マーカーの予め決められた量を全血液の容積と混合することができる。好ましい一つの実施態様において、蛍光マーカーを一定容積の液体で公知容積の血液へ添加して血液における標的細胞の容積測定決定を行うことができる能力を維持するようにしてもよい。蛍光マーカーを血液へ添加する別の方法は、全血液を添加する前に混合容器におけるフィルムへ蛍光マーカーを蒸着することを含む。乾燥した蛍光マーカーを使用することにより、蛍光マーカーと混合したときとほとんど同じ容積を維持することができる。蛍光マーカーを乾燥形で血液と一緒にする場合、糖の同様な量を蒸着前に蛍光マーカーの液体溶液へ添加することが好ましい。蒸発時に、染料−抗体複合体および糖は血漿によりさらに容易に溶解するマトリックスを形成する。
サンプルを蛍光マーカーと組み合わせた後、画像形成装置により走査毛細管を走査する前に一定期間インキュベーションしなければならない。本発明の一実施態様ではサンプルを走査毛細管に入れる前にインキュベーションを開始するが、これは代わってスキャン毛細管にサンプルがある間に全体または一部で始まるようにしてもよい。血液サンプルを毛細管へ引き込む時、血球が毛細管の長さを通して均一に引き込まれ、充填の間に蒸発またはメニスカス効果（meniscus effect）が起こるかもしれないる。先端はサンプルが引き込まれる方の毛細管の端部である。好ましい実施態様の方法は、スキャン毛細管の先端を除くこのカラムの全長を走査することによりこの変動を補正する。また、毛細管の端部に沿って細胞の不均一な分散があるかもしれない。
細胞サブセットの定量化はいくつかの方法で行われうる。一つの方法は、容積または断面積がわかっている室を使用し、そして着色されているがしかしほとんど希釈されていない血液を導入することである。室の全部または一部を調査することができる。計測した蛍光現象の数を調査した室の容積で割ると、血液の単位容積当たりの現象に達することができる。定量的希釈を血液において行い容積の分かっている室を使用した場合、単位容積当たりの現象を希釈因子で割って血液の単位容積当たりの現象を得る。室の容積または走査の長さが分かっていない場合、間接的技術たとえばビーズのような微粒子の分かっている数をサンプルへ添加したりまたはバックグラウンド蛍光のレベルを定量化することにより、走査した容積を測定することができる。これらの方法はあまり望ましくはないが、しかし注意を払えばこの分析方法で効果的に行うことができる。二つ以上の細胞現象の比が必要なだけで絶対的数ではない場合、希釈を定量化しまたは走査毛細管の正確な容積を知ることは重要でないかもしれない。この場合、この分析の利点は主に、サンプル取扱および汚染の可能性の低下、溶解の必要性の排除、ヘマトクリット層を伸ばすことによる検出の向上である。その他は、当業者によりこの分析を用いて細胞現象の情報を得ることを計画し、これらは単に幾つかの方法の例示である。
本発明の分析はまた試薬または他の添加剤を添加して赤血球の凝集を阻止しそして走査毛細管の床面を横断するヘマトクリットの滑らかな層を作り出すことを含む。試薬の一つのタイプは、細胞凝集に関与する接着力を克服するように働く等張性生理食塩溶液のような希釈剤である。細胞凝集についての他の処理は生理学的条件からpHを変え、低張液を添加し、細胞の形状を変えまたは細胞の表面化学を変化させる清浄剤を添加することを含む。試薬の添加工程の目的は、毛細管を通じて均一なヘマトサイト層を作ることである。
サンプルにおける均一なヘマトクリット層の必要性は、ヘマトクリット層およびバックグラウンドノイズの間の関係から起こる。この関係をより十分に理解するために、一定の直径および深さの５個の画素すなわち走査カラムを示す図３を参照されたい。各画素は非結合蛍光マーカーとともに幾つかの血漿を含む。図示した各画素領域は異なった量の標識化（標的）および非標識化細胞を含む。各走査カラムは異なったレベルの蛍光強度を作るであろう。
図３の画素Ａは細胞物質を含まず、しかし溶解した蛍光マーカー84の一定量と血漿82だけを含む。光からの測定した蛍光反応は、前記棒グラフにおいて棒90により表される。画素Ｂは画素における血漿の半分を置換する非標識化細胞86を含む。レーザー光源で刺激すると、画素Ｂからの蛍光反応が画素Ａからの蛍光反応のほぼ半分であろう。画素Ｂからの相当する反応は、画素Ｂの下の棒チャートにおいて棒92により表される。画素Ａおよび画素Ｂを比較すると、赤血球による蛍光マーカーを含む血漿の置換は蛍光の量において比例的に低下することが明らかである。
画素Ｃは赤血球86を充填したカラムを表し、赤血球のほとんど全てが血漿82に溶解している非結合蛍光マーカー84と置換する。したがって、わずかに少量の蛍光発光が画素Ｃにおいて検出される。好適な蛍光反応は画素Ｃの下の棒チャートにおいて相当する棒94で示される。したがって、置換の原則は、不均一なレベルのヘマトクリットのためにバックグラウンド蛍光における効果を示す。バックグラウンド蛍光は、画素において非標識化細胞の数が少なくなるほど増加し、画素に非標識化細胞が多くなると低下する。
画素Ｄは、血漿82の約半分を置換する非標識化細胞86を含む。さらに、画素は蛍光標識化抗体で標識化された標的細胞88を含む。非結合蛍光マーカーにより起こされる蛍光反応の量は、画素Ｄの下の棒チャートにおいて相当する棒100の低い部分96により表される。非結合抗体からのバックグラウンド蛍光反応に相当する低い部分96は、画素Ｂにおいて非結合抗体のほぼ同量からのバックグラウンド蛍光を示す棒92とほぼ同じである。蛍光マーカーで標識化された標的細胞により起こされる蛍光反応の部分は、相当する棒100の上部98により示される。明らかに、そしてCD4抗原を発現するリンパ球が代表的であるが、バックグラウンド蛍光は標識細胞のものとほぼ同じである。細胞および非結合抗体から得られる蛍光の合計は加法的である。
画素Ｅは、画素Ｃと同じ充填した細胞86を含む。しかしながら、画素Ｅは、蛍光マーカーで標識化された標的細胞88を含み、そして画素の底部に位置する。標的細胞に付いた蛍光マーカーの量は、画素Ｄに含まれる標的細胞に付く蛍光マーカーの量と同じである。非結合マーカーからの蛍光反応は、棒106の下部102により表される。棒106の下部102の大きさは画素Ｄに相当する棒94の大きさと同じである。標的細胞からの蛍光反応は、棒106の上部104で示され、そして追加した非結合細胞86による同じ散乱および吸収のために画素Ｄにおいて標的細胞からの蛍光反応を示す棒100の上部98よりもいくらか少ない。
図３に示すように、特定の画素領域から起こる蛍光反応は、その画素領域に含まれる蛍光マーカーの量の加法である。この原則は、画素または走査カラム全体が光により刺激されるという仮定に基づく。測定された蛍光反応の合計は、画素における赤血球により刺激された蛍光マーカーの吸収または回折のためにいくらか減少するであろう。前記説明は均一なベースラインを得るためにヘマトクリットの均一な分布の重要性を教示するものである。一般に、ヘマトクリット層は全血液の容積の50％を置換する。したがって、毛細管の長さに沿った50％までのヘマトクリットの分布の変動は、画素から画素のバックグラウンド蛍光の変動に相当する変化を有するであろう。バックグラウンド蛍光が実質的に変化する場合、低い抗原密度の標的細胞からの小さなピークは検出不可能になるであろう。
図4Aを参照すると、一本の走査ラインのデジタルデータ値のグラフを以下の実施例１の方法により調製した。走査ラインは、照射カラムが走査毛細管の幅を一回横断した時に生じるデータポイントにより表される。ベースライン110は、均一なヘマトクリット層を有するサンプルにより起こされる。ピーク108は、バックグラウンドシグナルのほぼ1/2と等しいベースラインを超える高さを有することが明らかである。このようなシグナルの高さは、特定のリンパ球、たとえばいわゆるＢ−細胞から検出されるピークの代表的なものである。バックグラウンドを越える高さのピークは、ピーク高さがベースライン110における最大変動の５倍以上であるので、バックグラウンドの強度のほんの一部だけである。最大変動とは、ピークとして検出されない走査ラインに沿った最も高い値からベースラインの最低値を引いたものとして定義される。
図4Bは、走査ラインに沿った画素に相当するデータポイントを表わす。サンプルは、ここの実施例２に概略した工程にしたがって調製される。細胞凝集を排除するための工程はなんら取られなかった。したがって、走査ラインは滑らかでない。ピーク108と同じ大きさの視覚的ないずれかのピークはベースラインから区別できないかもしれない。たとえば、図4Bにおける走査ライン113におけるデータポイント112は、ピーク108とほぼ同じ大きさである。したがって、不可能ではないとしても、どのデータポイントが標的成分からのピーク値であるかまたはバックグラウンド蛍光における変動であるかを画像形成装置が決定することは難しいであろう。
滑らかでないバックグラウンドシグナルは、細胞の凝集が起こる場合特に面倒である。細胞凝集は血球の物理的特性であり、ヘマトクリット層を通じて、血球の不均一な分布を起こす。赤血球は、別の赤血球における別の表面分子へ接着する傾向にある表面分子からなる外側膜または表面を有する。細胞が凝集する傾向は、円板の両凹部形状により促進される。図５は、赤血球と細胞凝集またはローレックス作用との関係を示す。赤血球は両側が凹状の円板形である。赤血球は、タイヤの積み重ねと同じように端と端を繋ぐように配向すると、かなり大きな量の細胞表面接触が細胞間に生じる。赤血球間の接着引きつけ力とユニークな両凹部形状の組合せにより、ローレックス作用が起きる。赤血球の端と端とを繋ぐ積み重ねは、赤血球の列150により図示される。細胞の積み重ねは必ずしも端と端というようには起こらない。特に、円板の両凹部は一緒に積み重ねられた一つ以上の近接する細胞の周囲に張りつくであろう。細胞152は細胞153,154及び155に付く。
赤血球がローレックス作用に従ってそれ自身で配向する様々なやり方により、静止した血液サンプル中に積み重ね細胞のウェブができる。サンプルの静止状態は細胞凝集に都合が良い。動いている細胞の動的エネルギーは、しばしばローレックス作用を起こす比較的弱い接着力を負かすのに十分である。したがって、ローレックス作用は細胞分析のレオロジー方法たとえば流動細胞計測法においては重要ではないが、しかし本発明の特徴であるような形態学的技術では重要なことである。ローレックス作用は血液凝固または凝集と同じではない。結合力は細胞物質の共有結合によっては起こされず、そしてサンプル混合によって可逆的である。
ローレックス作用は、実質的に一定なバックグラウンド蛍光のゴールを打ち負かし、これにより、画像形成装置が細胞を検出する能力に悪影響を与える。細胞は、細胞に結合している蛍光マーカーの濃度がベースライン上に強めた蛍光発光を起こさせるので、検出可能である。赤血球は毛細管において蛍光物質の量を置換する。置換が不均一で画素と画素の間で大きく変動する場合、誤差のある凹凸のあるベースラインが得られる。その結果、別のピークを検出することは不可能である。
図6Bは、不均一に分布した細胞118を含む走査毛細管10を横断して走査する走査ラインからの蛍光反応のグラフである。図6Aは、幾つかの赤血球がローレックス作用のために均一には分布していない相当するサンプルを示す。サンプルは、走査ラインに沿って切断され図6Aのグラフにおいてパターンを起こす。走査カラムは走査ライン131に沿って標識化細胞120,122および124を検出する。レーザービームがサンプルを横断して走査すると、レーザービームが赤血球の列または群に出会うとバックグラウンドシグナルは低下する。これは主に、積み重なった細胞の群が多量の血漿に置き代わるという事実により起こされる。したがって、その特定の画素にはより少ない数の非結合蛍光マーカーが存在する。
走査ライン131に沿った他の位置は、赤血球の数がより少ない。このような位置では血漿は少なく置換され、これにより多量の抗体が細胞に含まれそしてより高いバックグラウンドシグナルを起こす。ローレックス作用が細胞のない領域に続いて積み重なった細胞のパターンを起こすので、ローレックス作用を有するサンプルのベースラインシグナルは誤差があるかまたはノイズがある。蛍光マーカーの濃厚な量で標識化した細胞がサンプルに存在する場合、これらはしばしばバックグラウンドノイズに隠される。たとえば、細胞120は赤血球のない領域に位置する。したがって、細胞ピーク126は溶液において比較的高い数の蛍光マーカーにより高められる。積み重ねられた細胞の群の中に見られる標的細胞122は、等しい高さのピーク128を作る。細胞122は充填された細胞によって囲まれるので、ピークを検出するのが難しい。同様に、細胞124は積み重なった細胞の領域と細胞のない領域との間にあるので、これに相当するピーク130を検出するのが最も困難である。
ローレックス作用は、表面分子の接着特性を変えるかまたは赤血球の円板−様形状を変化させることにより処理されうる。赤血球のそれぞれの表面の間の接着力を低下させる一つの方法は、希釈剤たとえば等張性生理食塩溶液を添加することである。血液血漿の組成物は分子間の接着力に寄与すると思われる。希釈剤で血液血漿を薄めることにより、細胞の接着特性は低下し、より均一なヘマトサイト層が得られる。好ましい実施態様において、血液の100μｌを血液175μｌで希釈し、ローレックス作用を効果的に低下させることが見いだされた。希釈剤に対する全血液の希釈比1:1が効果的であることがわかった。希釈剤に対する全血液の希釈比4:1が細胞凝集を排除する効果を有することがわかった。
ローレックス作用の結果、少なくとも一部で、細胞が円板−様形状となる。したがって、いずれかの試薬または添加剤たとえば細胞の形状を変える清浄剤がローレックス作用を排除するために働くであろう。一つの可能性のある方法は、生理学的条件からいずれかの方向にpHを変える緩衝剤を添加することである。pHにおける小さな変化は、赤血球の十分な溶解を起こすことなく細胞の形状を効果的に変えることができる。しかしながら、もし溶液を延長した期間インキュベーションすると、細胞は実際に破裂するであろう。溶液のPHを変える理想的方法は、HClまたはNaOHの穏やかな溶液を加えることである。穏やかな低張液もまた、溶液において赤血球の浸透圧を変えることにより、赤血球の形状を変える効果を有する。ローレックス作用に対する緩衝化処理と同様に、低張液は実際に赤血球の幾らかの溶解を起こすであろう。
いくつかの清浄剤が、ローレックス作用を有効に阻止することが発見されている。清浄剤の使用は高張性溶液、等張性希釈剤および緩衝溶液の使用以上の利点を有する。清浄剤は蒸発して、固体を形成し、そしてサンプルと混合することができる。乾燥添加剤は全血液を希釈せず、赤血球の容量測定による分類を向上する。もし化合物が、１）白血球における抗体／抗原反応を変化させず、２）かなりの量の赤血球の溶解を起こさず、３）自己蛍光せず、そして４）乾燥形になるまで蒸発されうる場合、赤血球の表面分子の繰り返しによって起こされる接着効果を低下しまたは赤血球の形状を変化させるいずれの清浄剤添加も許容可能である。
両性イオン清浄剤、特に短鎖の両性イオン清浄剤がローレックス作用を有効に処理する。たとえば商標名“ツヴィッタージェント（ZWITTERGENT）３−08"（カリフォルニア州のカリバイオケム社（CALIBIOCHEM,Inc.California））で販売されているｎ−オクチルN,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが、ローレックス作用処理時に有効でありそして赤血球を溶解するのに最小の効果を有することがわかった。他のより長い鎖のアルキル両性イオン化合物はローレックス作用を有効に処理するが、しかし赤血球を溶解しやすい傾向にある。長鎖両性イオン化合物は、“ツヴィッタージェント３−10"の商標名で市販されているｎ−デシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；“ツヴィッタージェント３−12"の商標名で市販されているｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；および“ツヴィッタージェント３−14"の商標名で市販されているｎ−テトラデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む。
“ツヴィッタージェント”化合物は蒸発前に蛍光マーカーへ添加されてもよい。サンプル調製技術の目的および要求に応じて、蛍光マーカーを全血液とともに混合する前または後にこれを固体形状で添加してもよい。十分な清浄剤を全血液へ添加して、全血液における清浄剤10−100ミリモルの溶液を作る。好ましい実施態様は、十分な清浄剤を添加して全血液における清浄剤30ミリモルの溶液を作ることである。他の通常の清浄剤を使用してもよい。例として、許容可能であることがわかっている清浄剤のいくつかには、ポリソルベート20;ポリオキシエチレン（20）；ソルビタンモノラウレートであり、これはイリノイ州、ロックフォードのピエールスケミカル社（Pierce Chemical,Rockford Illonois）から商標名“ツィーン（Tween）”で購入することができる。ローレックス作用を処理するのに有効であることがわかっている非−イオン性清浄剤は、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル；オクチルフェノキシポリエトキシエタノールであり、これはイリノイ州、ロックフォードのピエールスケミカル社から商標名“トリトン（TRITON）Ｘ−100"で購入することができる。
血液の容量計測による分類のゴールは、粒子の容量に対する比を壊す処理工程がサンプル調製技術から除かれる場合、実質的に促進される。たとえば、サンプルを遠心分離して液体から粒子を分離する場合、技術は、液体から分離される粒子が最初の容量で存在する粒子の全量を表すことを常に保証するとは限らない。したがって、容量計測分析は、分離工程または不必要なサンプルの処理が必要な場合に困難である。
蛍光標識化粒子を分析する分析において一定の容積を保存することに伴う最も困難な問題の一つは、シグナル吸収、シグナル拡散または回折および自己蛍光の形で赤血球により起こされる光学的干渉である。図７は、赤血球142を横切る光を図示する。光波140のほとんどが赤血球を通過するが、波144は吸収されそして波146は散乱する。波148は赤血球の自己蛍光により作る光を示す。
赤血球は、白色光に曝されると十分な量の光を吸収する。図８は異なった波長で赤血球から吸収された光の量を示す。垂直軸は吸収の強度を表わす。水平軸は光の異なった波長を表わす。グラフが示すように、200−500nmの波長の間のほとんどの光は赤血球により吸収される。赤血球を除去することなく全血液サンプルを走査する目的のために、550nm以上の波長を有するレーザー光を使用すべきである。すなわち、550nmを越える波長を有する励起光は、633nmで赤色ヘリウムネオン（HeNe）レーザーを含むが、これが好ましい光源である。ダイオードレーザーが同様に許容可能であり、特にほぼ700ナノメートル（nm）の波長の光を発光するものである。
赤血球はまた自己蛍光を作る。図９は、励起の異なった波長における赤血球の自己蛍光のグラフである。自己蛍光は、波長310nm、500nmおよび630nmでピークである。しかしながら、500nm以上の自己蛍光の量は、バックグラウンド蛍光の強度および標識化標的成分からの蛍光の強度と比較した場合、画像形成装置による標的成分の検出には重要なバリヤーではないほど十分に小さい。
別のタイプの光学干渉は回折または散乱である。光が対象物に当たると、一定量の光が細胞を通過するよりむしろ細胞の表面から回折するであろう。したがって、赤血球はレーザー光源の強度または蛍光マーカーからの蛍光放電の強度を弱めるであろう。吸収および自己蛍光と異なり、回折はこれが回折する光の波長に十分依存するとは限らない。
分析における光学的干渉の量を最小限にするための試みを維持することにおいて、蛍光染料を、550nm以上の波長を有する光源により活性化されるように選択してもよい。赤色HeNeレーザーは、約633nmにピーク波長を作り、光学干渉のレベルを弱めることなく全血液サンプルを効果的に励起することがわかている。同様に、染料は赤色HeNe光により活性化されそして好ましくは約550nm以上にピーク蛍光波長を作るように選択されなければならない。シアニン群からの染料はこの要求に合致することがわかっている。“CY5"および“CY5.5"はシアニン群からの染料であり、赤色HeNeレーザーと一緒の使用に効果的である。これらは両方とも、ペンシルバニア州、ピッツバーグのバイオロジカル  ディテクション  システムズ社（Biological Detection Systems,Inc.,Pittsburgh,Pennsylvania）からこのブランド名で入手可能である。“CY5"は667nmの波長でピーク発光を有し、発光スペクトルは約630nm〜800nmである。“CY5.5"は695nmの波長でピーク発光を有し、発光スペクトルは約650nm〜780nmである。染料からの蛍光発光の大部分は550nm以上であるので、蛍光複合体から発光する光は赤血球によりほとんど吸収されない。
レーザー光源および染料のタイプの選択は、容積計測測定のためにサンプルを調製する方法を作る全体的目的に重要である。たとえば吸光度のような光学干渉の排除は、赤血球が溶解されないことを意味する。溶解工程の排除は、サンプルの容積計測分類を阻害する問題工程を除去することである。
図２に関して、照射したカラム56は、ガウスウエストの直径58により限定される。カラムの深さ60は走査毛細管の内側直径に相当し、好ましくは毛細管の長さに沿って一定である長方形の断面を有する内腔62を有する。走査平面に対して垂直な角度で測定される走査毛細管内腔の深さは、カラムの深さを限定する。
走査毛細管内腔62の好ましい深さは特定の分析に依存する。毛細管の最小深さはサンプルにおける標的細胞または他の粒子の大きさに相当する。これは、走査毛細管の入口がサンプルにおける細胞により詰まらないことを保証する。このような詰まりは血球の直径と同じ大きさの内腔深さを有する毛細管において起きやすい。毛細管の詰まりはヘマトクリットを不均一にし、これは容積計測分析の目的を失敗させる。したがって、10μ以上の内腔深さの毛細管を全血液とともに使用するのが好ましい。
走査毛細管の深さの上限は、光学干渉のために減少するシグナルまたはレーザー12がサンプルを通過する能力および蛍光が血球中を移動する能力により決定される。実験は、毛細管の実際の深さがヘマトクリット層の深さに依存することを示す。ヘマトクリット層が薄いと、その結果、赤血球からの光学干渉が少なくなる。しかしながら、ヘマトクリット層が厚いと、一つのサンプルで多量の血液を走査することができる。したがって、サンプルを希釈すると、実際の毛細管の幅はこれに比例して増加する。
実験データによれば、100マイクロメートル以上のヘマトクリット層は波長633nmの赤色HeNeレーザーにより実質的に不透過である。15−30マイクロメートルのヘマトクリット層が少しの困難だけで調査可能である。15マイクロメートル以下のヘマトクリットは少なくないレベルの光学干渉を起こす。ヘマトクリット層は一般に全血液の容積の約1/2を占めるので、全血液に対し好ましい走査毛細管の深さは約30−60マイクロメートルである。血液対希釈剤ほぼ1:3のファクターにより希釈された血液にこれらの同じ考えを適用すると、100−200マイクロメートルの深さの走査毛細管が許容可能である。
走査毛細管の実際の深さは、非結合染料および／または蛍光マーカーたとえば抗体−染料抱合体の血液サンプル濃度に依存するであろう。毛細管の深さおよび非結合蛍光マーカー濃度は、標識化標的細胞からの蛍光がサンプルにおける非結合蛍光マーカーにより生じるバックグラウンド蛍光以上で検出可能であるようにバランスが取られる。バックグラウンド蛍光は非結合蛍光マーカーからの蛍光発光である。蛍光マーカーは溶液中で非結合のままであり、レーザービームにより励起されて蛍光発光を作る。非結合マーカーの過剰量の存在は細胞の分類と干渉するであろう。細胞物質からの非結合抗体の除去は、たとえば比重分離または細胞洗浄のような分離技術により行われるだけである。このような分離工程はまた標的成分を除去することもあり、容積計測細胞分類の精度が低下する。
したがって、細胞から非結合抗体を除去する分離技術をなくすことにより、最初の容積を保存する細胞分類技術を提供することが望ましい。そうすることにより、全血液の与えられた容積における細胞のより正確なカウントを行うことができる。交換すべきこと（trade off）は、非結合抗体が溶液に残らなければならないということである。したがって、細胞をバックグラウンドノイズ以上で検出可能にするような抗体濃度を選択することが重要である。
抗体の最適結果を得るための正確な量は、試行錯誤により測定されなければならない。殆どの場合、0.1−25.0μｇの範囲の抗体の塊状物は、血液1mlと結合して過剰の干渉を起こすことなく標的細胞を効率的に標識化するであろう。好ましい実施態様において、“CY5"または“CY5.5"染料で標識化された抗−CD3、抗−CD4または抗CD8抗体の0.5−5.0μｇの間のいずれかが、蛍光標識化細胞からのシグナルを追い出すことなく血液サンプル1mlを標識化するための蛍光マーカーの有効な量である。
最適結果を生じるであろう蛍光マーカーの濃度は主として二つの要因、カラムの深さおよび標的細胞におけるマーカーの濃度に困るであろう。カラムの深さが大きいと、少ない蛍光マーカーを使用する。細胞が細胞の置換された容積の単位当たりの蛍光マーカーの高い濃度を有する場合、蛍光マーカーのより高い濃度が許容可能である。
図３はどのようにして細胞がバックグラウンド蛍光以上で検出されるかを示すものである。画素Ｄは、図示するようにほぼ50％容積の血漿および標的白血球を含む。画素Ｄにおけるバックグラウンドからの蛍光反応は、ほぼ50％容積の血漿を含むが標的白血球を含まない画素Ｂと同じであろう。画素Ｄからの全蛍光発光および画素Ｂからの全蛍光発光の大きさにおける差は、標的細胞上またはにおいて蛍光マーカーの濃度による。この濃度は、細胞の置換または容積により標的細胞に結合した抗体の数を割ることにより表される。マーカーは蛍光標識化抗体と細胞の表面抗原との結合を含む幾つかの方法で細胞と結合する。他の蛍光マーカーは細胞膜から移動してデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）に蓄積される。
細胞と結合している蛍光マーカーの濃度は、蛍光マーカーが結合することのできる部位の数を含む幾つかの要素に因る。たとえば、CD4陽性ヘルパーＴ−リンパ球は、蛍光標識化抗−CD4モノクロナール抗体が多分結合することができるその表面においてほぼ50,000個の抗原を有する。他方、細胞におけるDNAの量は特定の染料分子に対する十億の桁の結合部位に提供される。
蛍光結合モノクロナール抗体に対する結合部位の数を理解するために、標的抗原として定義されうる標的細胞の表面においてモノクロナール抗体が特異的抗原と結合することが理解されなければならない。標的抗原の数は細胞における抗原の総数と同じではない。細胞は表面において何百という異なったタイプの抗原を有し、標的抗原の集団のみが細胞の表面において多数の蛍光標識化モノクロナール抗体に影響を及ぼす。
標的細胞の表面における蛍光結合抗体の濃度は、抗原に対する特定抗体の結合親和力により影響される。抗体の結合親和力は、各抗体−抗原対に対する特異性が特徴である。これは特に、これらが結合するであろう抗原の選択性であるモノクロナール抗体では本当である。親和力は、抗体および抗原におけるそれぞれの結合部位の化学的特性および構造の機能である。
親和力は、結合動的力学によって説明される。図10は、一つの抗原タイプとモノクロナール抗体の二つの異なったタイプの反応についての反応曲線である。温度、抗体濃度、細胞当たりの抗原結合部位の数が同じである事実にもかかわらず、二つの反応は異なった速度で進行する。曲線134は、相対的に低い抗体−抗原親和力（A1）である場合に反応が進行する速度を示す。曲線136は、相対的に高い抗体−抗原親和力（A1）である場合に反応が進行する速度を示す。インキュベーション時間t1後に、親和力A2との反応は親和力A1との反応より二倍ほど多く抗体と結合するであろう。
図11は、異なったインキュベーション時間後に蛍光染料と結合した抗−CD4抗体で標識化した細胞についてのピーク高さをプロットするグラフである。Ｙ軸はピーク強度である。ピーク強度は細胞と結合する抗原の数と比例する。グラフに沿った各ポイントは、同様な時間の間隔で検出されたピークの数の平均の高さである。サンプルがより長くインキュベーションされると、蛍光結合抗体の濃度がより密接に飽和点に接近するであろう。
走査する前にインキュベーション時間を延長すると特定細胞において蛍光結合抗体の濃度を増加するが、しかし延長したインキュベーションは非常に望ましくない副作用、非特異的結合の発生を有する。非−特異的結合は、抗体が特異的に標的としない抗原に抗体が結合する現象である。抗体は、鍵と鍵孔の適合性を有する特異的抗原と結合しうる免疫グロブリン分子である。これは特に本発明による分析に好ましくは使用されるモノクロナールについて本当である。特定の状況下に、均一なモノクロナール抗体はこれが特徴的にそして特異的に結合する抗原よりも表面たんぱく質と結合するであろう。非−特異的結合はあらゆる分析において問題ではない。これが特定の分析における因子である場合、非特異的結合はしばしば好ましい熱力学的および動的特性を低下する。
インキュベーションを行う温度の増加は、蛍光結合抗体が標的細胞における標的抗原と結合する速度を非常に増加することができる。体温で全血液液のサンプルにおいて抗原と蛍光結合抗体との結合は、室温で同一条件下に行うよりもより迅速な速度で行う。サンプルの温度の増加は、分析の前にサンプルを冷却する場合特に重要である。
結合動力学はまた溶液における抗体の濃度によっても影響される。高濃度の抗体は細胞が飽和点に迅速に達することをできるようにする。抗体の低濃度は同じ飽和レベルに達するまでにより長いインキュベーション時間を必要とする。抗体の理想的濃度を測定する場合、より短時間でより早い反応動力学およびより高い飽和レベルを伴う利点はバランスが取られ、その結果、サンプルにおいて溶解したままの非結合抗体のより高い濃度により起こされるより高いバックグラウンドノイズが起こる。
たとえば抗体−抗原親和力および抗原集団のような因子は、当業者の管理の範囲ではかならずしも必要ではない。このような因子はどうやってサンプルが走査毛細管で調製されうるかということにおいて限定をもたらす。他の因子は本発明により、細胞以上にピークを検出するスキャナーの能力を最小にするように調節されうる。抗体で標識化した標的細胞からの蛍光シグナルを最大にするように操作されうるインキュベーションの長さ、インキュベーションの温度および溶液における抗体の濃度は変動可能である。
実施例１
血液を、健康なヒト患者からEDTAバキュテイナーチューブ（ベクトン−ディキンソン、カリフォルニア州、サンジョゼ（Becton−Dickenson,San Jose,CA））へ引き入れた。血液を５分間ロックして、次いでキャップを外した。100μｌを正確なピペット（マサチューセッツ州、ウバーンのピペットマン、レイニン  インスツルメンツ社（Pipetman,Ranin Instruments,Woburn,Mass.）で除いた。次いで血液を0.6mlポリプロピレン微量遠心分離管へ入れた。チューブの底に、二つの染料標識化抗体を乾燥形で入れた。第一の抗−CD4（Leu−3a,ベクトン−ディキンソン社）は“CY5.5"染料（BDSシステムズ社）と結合し、第二は、“CY5.0"染料（BDSシステムズ社）と結合した抗−CD3（ベクトン−ディキンソン社）であった。これらの結合体を保存するために、抗体を、２％ウシ血清および４％スクロース溶液の一部として乾燥した。血液100μｌで再度もどすと、最終抗体濃度は1.0μg/ml（μg/ml）および1.5μg/mlであった。
微量遠心分離管を５秒間ぐるぐる回して、抗体中で混合し、次いで、20分間インキュベーションした。0.038 x 0.40 x 60.0mmの寸法のガラス製の微量毛細管（ビトロ  ダイナミックス社、ニュージャージー州ロッカウェイ（Vitro Dynamics Inc.,Rockaway,N.J.））を、プラスチックホルダー上に水平に置いた。20分間インキュベーションした後、血液を５秒間ぐるぐる回した。10μｌを毛細管の一端へピペットで滴加した。溶液をほぼ１分間毛細管へ入れた。毛細管の中心40mmを、ここに記載したようにHeNeに基づく走査装置により調査した。
図12はサンプルの調査から発生する二次元散乱プロットである。散乱プロットにおける各点は画像形成装置により検出されたピークを表す。Ｙ軸における蛍光強度のＸ軸における蛍光強度の比により、細胞の小群を識別する。不均一なヘマトクリット層のために、細胞は殆ど識別不可能であった。
実施例２
実施例１と同じ手法を行ったが、ただ、清浄剤（ツヴィッタージェント３−08,カリボケム社（Calibochem,Inc.））を抗体とともに乾燥した。血液で再水和化すると、これは30mMの濃度で存在した。両性イオン性清浄剤の添加は、均一なヘマトクリット層を作る。図13は、実施例２の方法にしたがって調製されたサンプルの散乱プロットを表す。散乱プロットは、３個の別々の小群を示す。群200はCD4＋/CD3＋である細胞である。群202はCD3＋のみの細胞である。群204はバックグラウンドノイズである。すなわち、試薬の添加により標的成分の適切な分類ができるようになる。
実施例３
実施例１に記載したものと同じ手法を、インキュベーション工程を通して行った。この時点で、２％ウシ血清を含むリン酸緩衝化生理食塩溶液174μｌを添加して血液をインキュベーションし、ぐるぐる回した。希釈した血液10μｌを、0.10×067×60mlのガラス製微量毛細管（ビトロ  ダイナミックス社）の一端へ滴加し、毛細管作用により微量毛細管に約15秒間で充填した。
図14は、実施例３の方法にしたがって調製されたサンプルの散乱プロットを表す。緩衝溶液の添加により、均一なヘマトクリット層が得られる。散乱プロットは細胞の３個の異なった小群を示す。群206はCD4＋/CD3＋である細胞である。群208はCD3＋のみの細胞である。群210はバックグラウンドノイズである。ここでも、画像形成装置により標的成分が適切に分類される。
実施例４
抗凝固化静脈血100mlを、濃度1.0μg/mlで“CY5.5"染料と結合したCD4モノクロナール抗体（Leu−3a,ベクトン−ディキンソン）とともにインキュベーションした。20分間インキュベーションした後、血液100μｌを４個の微量遠心分離管へ添加した。次いでこれらを10分間1000rpmで回転させて細胞から血漿を分離した。第一の管はそのままであった。血漿10μｌを第二の管から除去し、第三の管から20μｌを、第四の管からは30μｌであった。次いで、サンプルを５秒間ぐるぐる回した。
ヘマトクリット濃度を、スタットスピン（Statspin）３装置（マサチューセッツ州、ノルウッドのスタットスピンテクノロジーズ社（Statspin Technologies,Norwood,MA））を用いて各サンプルについて測定した。各サンプル10μｌを、0.1×0.67×80.0mlの毛細管に入れ、毛細管の中心において40mmを画像形成装置を用いて走査した。毛細管が100μｍ厚であるので、ヘマトクリットのパーセント割合は毛細管におけるヘマトクリットのμ厚さに直接転化されうる。図15−18はそれぞれ４個のヘマトクリットレベルについて細胞の数対ピーク強度のヒトスグラムを示す。CD4の群は46および52％ヘマトクリットレベルでバックグラウンドノイズ以上に明らかに区別されるがしかし60または80％レベルでは区別できない。したがって、ヘマトクリット層を約60μ以下まで減少させる必要がある。
実施例５
21人の患者からの血液サンプルを、実施例１に記載した方法を用いてCD4について分析した。同じ患者からのサンプルを、FACS走査流動細胞計測器（カリフォルニア州、サンジョゼのベクトン  ディキンソン社）を用いてCD4について分析した。製造業者により提供された手順および試薬を用いて流動細胞計測分析を行った。回帰直線の傾斜は1.051であった。二つの方法の間の“Ｒ角状”の関連性は、0.994であった。図19は回帰分析を示すプロットである。
本発明の幾つかの特定の形を図示しそして記載するが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができる。したがって、添付の請求の範囲によるもの以外は、本発明を制限することを意図するものではない。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図４Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図７】
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【図１２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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