(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶成分とキラヤ、大豆、ビート、ユッカのいずれか１種または２種の水及び／またはアルコール抽出成分であるサポニンを配合することを特徴とする甲殻類感染症抑制飼料組成物。
【請求項２】
茶成分とキラヤ、大豆、ビート、ユッカから抽出した１種以上の精製サポニンを配合することを特徴とする甲殻類感染症抑制飼料組成物。
【請求項３】
キラヤサポニンと緑茶抽出物を配合することを特徴とする甲殻類感染症抑制飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は甲殻類感染症の病原体に対し、その増殖を抑制し、該病原体の感染力の低下あるいは消失効果を有する甲殻類感染症抑制飼料組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、甲殻類の養殖技術が確立され、世界各国においてクルマエビ属を中心とした甲殻類の養殖産業が発展してきている。このような状況下、養殖飼料の散逸による底質の悪化や過密養殖等の環境悪化にともない、甲殻類感染症が多発し甚大な被害をもたらしている。
甲殻類感染症としては、病原性細菌によるビブリオ病，糸状菌症および病原性ウィルスによるバキュロウィルス性，ラブドウィルス性感染症が挙げられる。
【０００３】
これら感染症に対する防除対策として、現在、ビブリオ病をはじめとする細菌感染症に対して抗生物質ではオキシテトラサイクリン，合成の抗菌剤ではオキソリン酸が用いられており、飼料に添加して投与するか又は甲殻類を薬液中で薬浴させる方法が行われている。しかし、薬剤の多用にともないそれら薬剤に対する耐性菌の出現や薬剤の体内への残留性等が問題となり、薬剤投与による感染症抑制効果が望めなくなってきている。
【０００４】
また、これら抗生物質や合成抗菌剤に代わる防除対策として、現在、水産動物の生体防御機能を活性化し、感染症に対する抵抗力を付与する方法や抗菌性の天然物を使用する方法が注目されている。通常、生体防御機能は抗体を介する体液性免疫機能、あるいはマクロファージ，好中球などの貪食細胞を介する細胞性免疫機能を活性化することにより高めることができる。体液性免疫機能を活性化する方法としてはワクチンが知られており、水産用ワクチンではアユのビブリオ病不活化ワクチンが実用化されている（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ，魚病研究，１９（３）  ，１８１ー１８５（１９８４）  ，Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ，魚病研究，５０，７７１ー７７４（１９８４ａ），１８（４）  ，１８５ー１９０  （１９８４ｂ）  ，川合・楠田，魚病研究，２０（２／３）  ，４１３ー４１９（１９８５）  ）。また、細胞性免疫機能の活性化方法としては、細胞性免疫機能活性化物質を経口投与する方法が注目され、現在、その活性化物質としてリポポリサッカライド，ペプチドグリカン，レバミゾール，β−１，３−グルカン等が知られており、これらが水産動物の感染症防除に有効であることが報告されている。
しかしながら、甲殻類等の無脊椎動物は抗体を介した免疫機能を有さず、ワクチンによる有効な予防方法がなかった。近年、クルマエビのビブリオ病細菌性疾病に対して、その病原体の不活化ワクチンを経口法，注射法および浸漬法による予防効果が確認されているが、実用化には至っていない。
また、ワクチン以外の感染症に対する防除方法としては、例えば、抗菌性を有する天然物を添加した飼料として平成４年特許出願公告第７５７４５号公報では水産動物の感染症の病原菌に対する天然抗菌活性物質として植物精油およびその成分を養殖魚用飼料に配合し利用する技術が開示されている。また、細菌性疾病の予防・治療剤として平成４年特許出願公開第１０３５３７号公報では緑茶抽出物を用いた養殖魚感染症に対する予防および治療剤に関する技術が開示されており、平成４年特許出願公開第３６０８３９号公報では養殖魚の細菌性疾病に対しユーカリ抽出物およびその成分を利用する養殖魚感染症の予防および治療剤が開示されている。以上が抗菌性天然物を利用した養殖魚感染症，特に細菌性感染症の予防・治療法の例示であるが、実用的な面での効果が低いという欠点を有する。平成５年特許出願公開第３０８９０８号公報では養殖魚類甲殻類の飼料に茶成分を含有させることを特徴とする魚類甲殻類の感染症に対する治療方法が開示されているが、この例示でも実用的効果は薄い。
一方、ウィルス性感染症に対しては、今だ有効な薬剤が開発されておらず、効果的な防除対策がないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、甲殻類感染症に対し抗生物質あるいはワクチン等に代わる効果的で、安全性の高い実用的な感染防除方法の開発が強く望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために、甲殻類感染症の防除方法として種々の研究を重ねた結果、われわれが日常飲用している茶の抽出物が、甲殻類の病原体に対して強い抗菌活性および抗ウィルス活性を有すること，また、サポニンが甲殻類の細胞性免疫機能のうち、マクロファージ，顆粒球などの貪食細胞の貪食能を高める効果を有することを見出した。さらに、茶成分とサポニンの両成分を配合した甲殻類の飼料を調製し、経口投与による甲殻類感染症の抑制効果について試験をおこなったところ、茶成分またはサポニン単独の場合よりも顕著な感染症抑制効果を見出した。すなわち、本発明は、甲殻類感染症の病原体に対し、その増殖を抑制し、該病原体の感染力の低下あるいは消失効果を有する茶成分及びサポニンを配合してなる甲殻類感染症防除組成物に関する。
【０００７】
本発明の茶成分とは、緑茶などの非醗酵茶，ウーロン茶などの半醗酵茶，紅茶などの醗酵茶の茶全草もしくはその一部，例えば木部，根，茎，葉，実等の生もしくは乾燥物のそのまま、もしくは部分醗酵物および完全醗酵物，もしくはそれらの混合物を水（熱水を含む），エタノール，メタノール，イソプロピルアルコール，アセトン，酢酸エチル，ヘキサン，クロロホルム，石油エーテルなどの有機溶剤，または水とこれら有機溶剤の混合液等を用いて抽出したものであるが、その抽出物をさらに精製して純度を高めたものであっても問題はなく、例えば、緑茶，ウーロン茶，紅茶もしくはそれらの混合物の抽出物があげられる。好ましくは、緑茶の熱水抽出物を精製した製品であるサンフェノン（太陽化学（株）製，登録商標）をあげることができる。これら茶成分の製造法は、水及び／または有機溶剤による茶抽出液を分画分子量６，０００  〜１００，０００  である限外濾過膜を通過させ、濃縮・乾燥により精製粉末を得ることができ、平成２年特許出願公開第６４９９号公報に詳細に例示される。
【０００８】
本発明のサポニンとは、キラヤ、大豆、ビート、ユッカの植物に含まれるサポニンの精製品またはサポニンを含有する植物の粗抽出物または粗抽出物を精製して得られる精製サポニンである。これらサポニンは各植物体を粉砕し、水，好ましくは熱水，エタノールもしくは有機溶剤，または水と有機溶剤の混合液等で抽出，精製し得ることができる。抽出条件は、特に限定するものではないが室温あるいは  ４０〜６０℃加温下でおこなうことが望ましい。甲殻類養殖用飼料に添加して使用する場合、大量のサポニンの供給が要求され、これに適するサポニンとしてはキラヤサポニン，大豆サポニン，ビートサポニン，ユッカサポニンをあげることができる。この中で、キラヤ皮抽出物より得られるキラヤサポニンが好ましい。
【０００９】
キラヤ皮抽出物は、南米のチリ，ボリビア，ペルー地域に分布するシャボンの木（学名：Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌ．  ）とよばれるバラ科の常緑高木の樹皮から得られた抽出物である。キラヤ皮抽出物はキラヤサポニン（キラヤ酸をアグリコンとするトリテルペン系の配糖体）を含有する。キラヤサポニンは優れた界面活性作用を有し、この作用を利用して、現在、キラヤ皮抽出物が天然の起泡剤、乳化剤として食品に応用されている。
【００１０】
キラヤサポニンについては、哺乳動物に対する経口投与で、その抗体産生能力を高める作用が知られており、その作用機作として腸管からの抗原蛋白質の吸収を促進すること、また、抗体産生にかかわるＢ細胞やＴ細胞を活性化することが報告されている。しかし、キラヤサポニンまたはキラヤ皮抽出物の経口投与で魚類及び甲殻類の細胞性免疫機能、特に、貪食細胞の遊走能及び貪食能を高めるということは知られていない。
【００１１】
本発明の甲殻類感染症抑制飼料組成物における茶成分とサポニンの配合量は、使用目的に応じて適宜選択することができる。通常、飼料に対して茶成分  ０．０５  〜５％，サポニン  ０．００５〜１％の配合量を選択する。配合方法としては、例えばブレンダーを使用する場合、茶成分とサポニンを混合し、均質化することで得られる。
【００１２】
本発明における甲殻類とは、クルマエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）  ，ウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ）  ，バナナエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｒｇｕｉｅｎｓｉｓ）  ，コウライエビ（Ｐｅｎａｅｕｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等のクルマエビ族（Ｐｅｎａｅｉｄｅａ  ）やコエビ族（Ｃａｒｉｄｅａ  ），オトヒメエビ族（Ｓｔｅｎｏｐｏｄｉｄｅａ）等の甲殻類である。
【００１３】
本発明における甲殻類感染症とは、ビブリオ属に属するビブリオ菌やロイコスリックス属に分類される糸状菌の細菌性病原体による感染症およびバキュロウィルスやラブドウィルスのウィルス性病原体による感染症を言う。
【００１４】
本発明の甲殻類感染症抑制飼料組成物の性状としては、粉末状，顆粒状，ペレット状等どのような形状であってもよいが、エビ類への経口投与を目的とした場合、ペレット状に成型することが最も望ましい。また、エビ類幼生への経口投与を目的とした場合、噴霧乾燥機や流動造粒乾燥機等により微粒子粉末状に加工することが望ましい。
【００１５】
本発明においては、エビ類の公知飼料成分を基本飼料組成として茶成分とサポニンを配合するだけでよく、成エビ類に対してはペレット状（１〜２．５ｍｍ  ×  ５〜１５ｍｍ）に，幼エビ類に対しては微粒子粉末状（粒径５０〜２００μｍ）の飼料に加工することが望ましい。
さらに、魚類飼料に通常用いられている摂餌誘引・促進物質（イノシン酸，アミノ酸，ペプチド，ベタイン，プロリン，アラニン，メチオニン，アルギニン，ヌクレオチド，グリシン，アスパラギン酸，イソロイシン，フェニルアラニン，チロシン，リジン，セリン，ロイシン，ヒスチジン，イノシン，バリン，スレオニン，グルタミン酸等）やビタミン類（ビタミンＣ，Ｅ，Ｂ１  ，Ａ，Ｄ，Ｂ２  ，Ｂ６  ，Ｂ１２，Ｋ等），ミネラル類（Ｃａ，Ｐ，Ｋ，Ｎａ，Ｍｇ，Ｃｌ，Ｍｎ，
Ｆｅ，Ｃｕ，Ｚｎ，Ｍｏ等），抗酸化剤（トコフェロール，アスコルビン酸，エトキシキン，ＢＨＡ，ＢＨＴ等）など適宜配合することができる。
【００１６】
本発明の飼料組成物は、エビ類感染症の抑制を目的として利用する。投与量は、緑茶の熱水および溶剤抽出等による抽出物の場合、薬浴法では  ０．０１  〜１％溶液，飼料添加法では  １ｍｇ〜１０ｇ／尾／日である。サポニンは、飼料に対して  ０．０００１  〜０．００１％の添加が望ましい。飼料に対しては、茶抽出物  ０．００５％以下，サポニン  ０．０００１％以下の濃度では、サポニンとの併用による抗菌活性の増強作用が期待されない。また、茶抽出物  ５０％を越える濃度ではエビ類の摂餌性に影響を及ぼす場合がある。
【００１７】
本発明に用いられる緑茶の熱水および有機溶剤により得られた抽出物の成分組成は、（＋）−カテキン，（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレート，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレート，（−）−エピガロカテキンおよび（−）−エピガロカテキンガレートより選ばれるタンニン類を１種または２種以上含有することが好ましく、特に好ましくは（−）−エピガロカテキンガレートを高濃度含有することが望ましい。
【００１８】
本発明によれば、茶成分とサポニン配合の飼料，薬剤等をエビ類に経口法あるいは浸漬法等により投与すれば、試験例に示したようにエビ類感染症を効果的に抑制することができる。その抑制メカニズムについては、エビ類等の無脊椎動物の生体防御機構が脊椎動物のものと著しく異なるため不明な点が多いが、エビ類の体内において投与された茶成分とサポニンがエビ類感染症の病原体の表面に付着することにより、病原体の増殖を抑制し、その病原性，付着感染力等を消去すること，さらにサポニンが甲殻類の貪食細胞を活性化し病原体を貪食，消去することによるものであると推測される。
【００１９】
以下、実施例および試験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、使用したサポニンはキラヤサポニンであるが、他のサポニン（大豆，ビート，ユッカ）を使用してもほぼ同様の結果が得られた。
【００２０】
【実施例】
実施例１．エビ類のビブリオ病抑制飼料の調製
茶成分としてサンフェノン（太陽化学（株）製）を  ０．１％  配合させた茶成分配合エビ類ビブリオ病抑制飼料を調製した。すなわち、エビ類基本飼料粉末  １００ｋｇに対してサンフェノン  １００ｇおよび水３０リットルを加え混合した後、ミートチョッパーにて直径２ｍｍ，長さ約５ｍｍのペレットに成型した。蒸し工程処理をおこない、８０℃の流動乾燥機で水分含量１０％以下になるように乾燥し、エビ類ビブリオ病抑制飼料  １００ｋｇを得た。なお、エビ類基本飼料粉末の処方を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２
キラヤサポニン液２０ｍｌを澱粉分解物  ２０ｇに吸着させた後、ビール乾燥酵母  ９６０ｇを混合して粉末化（プレミックス）し、実施例１のペレット成型方法により上記プレミックス品を１％配合させたエビ類感染症抑制飼料  １００ｋｇを調製した。
【００２３】
実施例３
大豆サポニン液  ２０ｍｌ  を澱粉分解物  ２０ｇに吸着させた後、ビール乾燥酵母９６０ｇを混合して粉末化（プレミックス）し、実施例１のペレット成型方法により上記プレミックス品を１％配合させたエビ類感染症抑制飼料  １００ｋｇを調製した。
【００２４】
実施例４
ビートサポニン液  ２０ｍｌ  を澱粉分解物  ２０ｇに吸着させた後、ビール乾燥酵母  ９６０ｇを混合して粉末化（プレミックス）し、実施例１のペレット成型方法により上記プレミックス品を１％配合させたエビ類感染症抑制飼料  １００ｋｇを調製した。
【００２５】
実施例５
キラヤサポニン液２０ｍｌを澱粉分解物  ２０ｇに吸着させたのち、サンフェノン１００ｇ，ビール乾燥酵母  ８６０ｇを混合して粉末化（プレミックス）し、実施例１のペレット成型方法により上記プレミックスを１％配合させたエビ類感染症抑制飼料  １００ｋｇを調製した。
【００２６】
実施例６．エビ類のウィルス性感染症抑制微粒子飼料の調製
茶成分としてサンフェノン，サポニンとしてキラヤサポニンを表２の処方で配合したエビ類感染症抑制微粒子飼料を調製した。粉末  ５００ｇ  を水  ５リットルに溶解させ、スプレードライヤー（入口温度  １５０℃，出口温度  ８０℃）で乾燥粉末として、その粉末について流動乾燥造粒機で粒状化し、エビ類感染症抑制微粒子飼料５００ｇを得た。
エビ類感染症抑制微粒子飼料の処方を表２に示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
試験例１．各種ビブリオ病の魚病原因細菌の緑茶抽出物に対する感受性を調べた。
緑茶に対して１０倍量の熱水を加え、３０分間撹拌しながら抽出後、液層部のみを濾過，濃縮し、凍結乾燥品を緑茶の熱水抽出物とした。
上記の緑茶熱水抽出物に水を加えたものを試料とし、寒天平板希釈法を用いて各種魚病原因細菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ，μｇ／ｍｌ）を求めた。
各細菌を  １．５％ＮａＣｌ加ブレインハート・インフュージョン寒天培地上に１白金耳塗抹し、２５℃，２４時間培養後の試験結果を表３に示した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
試験例２．クルマエビのビブリオ病に対する茶成分およびキラヤサポニンの効果（感染実験）
平均体重１１ｇのクルマエビを１６尾ずつの４群に分け、試験群にはそれぞれ実施例１，２および５で調製した茶成分配合，キラヤサポニン配合および茶成分とキラヤサポニン配合のエビ類感染症抑制飼料を、対照群にはエビ類基本飼料を用い、それぞれエビ体重あたり１％量／日で２１日間投与した。
投与開始８日目から、クルマエビのビブリオ病原因菌  Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．の滅菌海水懸濁液  １．１×１０４  ＣＦＵ  ／ｍｌをエビ第６腹節筋肉に  ０．１ｍｌずつ接種した。
感染後１４日間、各群の斃死の有無を観察するとともに、斃死エビからのＶｉｂｒｉｏ  ｓｐ．の菌分離を試みた。
【００３１】
各区の感染後１４日目の生存数より生残率を求め、図１に示した。
対照群は感染後５日目で１６尾すべてが斃死した（生残率０％）。一方、茶成分のみ，サポニンのみの投与群ではそれぞれ１２尾斃死（生残率２５％），１３尾斃死（生残率１８．８％）であったが、茶成分とサポニンを合わせた投与群では８尾斃死（生残率５０％）と明らかに相乗効果が認められた（ｐ＜０．０１）。
また、斃死したエビの心臓及びリンパ様器官からは感染に用いた菌が分離された。
【００３２】
試験例３．クルマエビ幼生のバキュロウィルス性中腸腺壊死症に対する茶成分およびキラヤサポニンの効果（感染実験）
クルマエビのゾエア期幼生を５０尾ずつの４群に分けた。試験群には、実施例６で調製した茶成分およびキラヤサポニンを配合した微粒子飼料をゾエア期からポストラーバ期（ＰＬ１０）の幼生に  １０ｍｇ（１尾あたりの１日量として約  ０．２ｍｇ）を７日間投与した。対照区には、実施例６の対照微粒子飼料を同様に投与した。感染方法は、−８０℃で保存していたバキュロウィルス性中腸腺壊死症（ＢＭＮ）によって斃死したエビを解凍し、その３ｇを滅菌海水  ３０ｍｌ  中でホモジナイズした後、０．２２μｍのミリポアフィルターでろ過したろ液をゾエア期幼生を収容した水槽に１０ｍｌずつ入れて感染を試みた。感染後１０日間の各区における斃死尾数を調べ、生残率を求めた。
【００３３】
試験群および対照群におけるクルマエビ幼生の生残率変化を図２に示した。対照区の生残率が０％であったのに対し、茶成分投与区では２０％，キラヤサポニン投与区では１０％，茶成分とキラヤサポニン投与区では４４％であり、各投与区と対照区の生残率には有意な差（ｐ＜０．０１）が認められた。
【００３４】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下のとおりである。
（１）茶成分とサポニンを配合することを特徴とする甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（２）サポニンがキラヤの水及び／またはアルコール抽出成分である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（３）サポニンが大豆の水及び／またはアルコール抽出成分である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（４）サポニンがビートの水及び／またはアルコール抽出成分である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（５）サポニンがユッカの水及び／またはアルコール抽出成分である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（６）サポニンがキラヤ、大豆、ビート、ユッカのいずれか１種または２種の水及び／またはアルコール抽出成分である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（７）サポニンがキラヤから抽出し精製したキラヤサポニンである前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（８）サポニンが大豆から抽出し精製した大豆サポニンである前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（９）サポニンがビートから抽出し精製したビートサポニンである前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１０）サポニンがユッカから抽出し精製したユッカサポニンである前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１１）サポニンがキラヤ、大豆、ビート、ユッカから抽出した１種以上の精製サポニンである前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１２）サポニンがキラヤサポニンであり、茶成分が緑茶抽出物である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１３）茶成分が緑茶である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１４）茶成分がウーロン茶である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１５）茶成分が紅茶である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１６）茶成分が水及び／または有機溶剤による抽出物である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１７）茶成分が水及び／または有機溶剤による茶抽出液を分画分子量６，０００  〜１００，０００  である限外濾過膜を通過させて得られた前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１８）茶成分が（＋）−カテキン，（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレート，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレート，（−）−エピガロカテキンおよび（−）−エピガロカテキンガレートより選ばれるタンニン類を１種または２種以上である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（１９）感染症が細菌性感染症である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
（２０）感染症がウィルス性感染症である前記（１）記載の甲殻類感染症抑制飼料組成物。
【００３５】
【発明の効果】
従来、甲殻類感染症の防除は、抗生物質や合成抗菌剤等の薬剤投与により実施されており、近年、薬剤大量投与による甲殻類体内への薬物残留の問題，薬剤耐性菌出現の問題等により薬剤に代わる甲殻類感染症防除方法の開発が望まれている。また、甲殻類のウィルス性感染症に対しては今だ有効な薬剤もなく、甲殻類養殖においては多大な被害をもたらしている。
本発明は、茶成分とサポニンを含有することにより、従来の薬剤耐性菌の出現頻度の減少や薬物の体内残留の抑制などの効果が期待できる。
このような現状において、本発明によりはじめて、安全性の高い天然物成分を配合した甲殻類感染症抑制飼料組成物を用いることにより、甲殻類感染症を効果的に防除でき、産業上非常に貢献大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】クルマエビのビブリオ病に対する茶成分およびキラヤサポニンの効果の図である。
【図２】クルマエビ幼生のバキュロウイルス性中腸腺壊死症に対する茶成分およびキラヤサポニンの効果の図である。
【符号の説明】
試験区１  茶成分０．１％添加区
試験区２  キラヤサポニン０．０２％添加区
試験区３  茶成分０．１％とキラヤサポニン０．０２％添加区
試験区５  茶成分０．１％とキラヤサポニン０．０２％添加区
対照区    無添加区
【図１】
0003623994.tif 000005
【図２】
0003623994.tif 000006