(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４℃の海水中に維持した降海期後タイセイヨウサケに１０3.5ＴＣＩＤ50の力価で腹腔内注射すると、該魚に膵疾患の症候を発生するウイルスであって、
（ａ）該ウイルスが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ９４０９０７３１で受託されている株、または該受託されたウイルス株と類似の遺伝子型及び／または表現型特性を有する近縁株であり、且つ
（ｂ）該ウイルスが、回復期の抗魚類膵疾患ウイルス（ＦＰＤＶ）抗血清または該受託ウイルス株Ｖ９４０９０７３１に対する抗血清と血清学的に反応するものである
ウイルス。
【請求項２】
実質的に他のウイルスまたは微生物材料を含まない請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のウイルスを含む、魚類膵疾患に対抗するためのワクチン。
【請求項４】
弱毒化または不活化形態の請求項１または２に記載のウイルスを含む請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
請求項１または２に記載のウイルスに選択的に結合し得る抗体を含む魚類膵疾患用診断試薬。
【請求項６】
マーカー、発色団、蛍光団、重金属、酵素標識、または抗体標識を有する請求項５に記載の診断試薬。
【請求項７】
固定化形態である請求項５または６に記載の診断試薬。
【請求項８】
請求項１または２に記載のウイルスを単離する方法であって、膵疾患を患う魚を同定し、感染組織をチヌークサケ胚細胞と同時に培養し、同時培養した細胞をチヌークサケ胚細胞に継代し、ウイルス粒子を単離することからなる方法。
【請求項９】
前記感染組織が膵または腎であり、チヌークサケ胚細胞との同時培養を２８日間実施する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
魚類膵疾患を診断する方法であって、
１）検査試料を請求項５から７のいずれか一項に記載の診断試薬と接触させて試薬複合体を生成するステップ；
２）任意の洗浄ステップ：及び
３）前記試薬複合体の存在及び必要によっては濃度を測定し、該検査試料中のウイルスの存在または量を決定するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
前記検査試料が、血液試料、または当該魚が含まれていた水の試料である請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
魚類膵疾患の原因物質である新規のウイルスを提供する。該ウイルスを使用し、該疾患のワクチン及び／または診断方法を提供し得る。
【０００２】
【従来の技術】
膵疾患（ＰＤ）はタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏｎ  ｓａｌａｒ  Ｌ）に感染する深刻な疾患である。該疾患は、膵外分泌組織の損失並びに繊維症、心筋及び骨格筋ミオパシーを含む膵臓の病変を惹起する。ニジマス、ｗｉｌｄ  Ａｔｌａｎｔｉｃ  ｓａｌｍｏｎなどの他のサケ亜目もＰＤに感染し得ると考えられている。
【０００３】
ＰＤの発生は、１９８４年にＭｕｎｒｏらによってＨｅｌｇｏｌａｎｄ  Ｍｅｅｒｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ  ３７：５７１−５８６（１９８４）に初めて記載されたが、ＰＤは早くも１９７６年には認識されていた。ＰＤは、ノルウェー、アイルランド、フランス、スペイン及び米国西部を含む世界中の主要なサケ養殖国の全てで報告されている（Ｋｅｎｔら，Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈ．７：２９−３１（１９８７）；Ｐｏｐｐｅら，Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈ．９（４）：８３−８５（１９８９）；及び、Ｒａｙｎａｒｄら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ  １，ｐ２−４（１９９２）参照）。
【０００４】
ＰＤは、塩水に入って１年目の魚に感染し、海洋ケージ内に維持された養殖魚内で急速に広がることが知られている。Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ９：９５−９８（１９８６））は、感染魚はやせ細り、食欲が無く、不活発であって、ケージの隅に群がる傾向があり、水平位置を維持できないと報告している。一次的な膵病変に加え、Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（前出）は、ＰＤに感染した魚は重症の変性心筋症を示すと報告している。これらの知見はＭｕｒｐｈｙらによる後の研究（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １５：４０１−４０８（１９９２））で確認されており、彼らは、ＰＤ感染魚においては心筋及び骨格筋ミオパシーが一層悪化することを見い出した。
【０００５】
アイルランドでは１９８８〜１９９２年の間に、海水初年度に当たる降海期サケについて報告された致死数のうちＰＤは１５〜２０％を占める。生産損失の点でアイルランド工業に対する推定コストは現時点で約２５百万ポンド／年であると考えられている。１９９４年時点でのノルウェー、スコットランド及びアイルランドの生産高は以下のようである。
【０００６】
0003676449.tif 000002
ＭｃＶｉｃａｒらは、ＰＤは感染性物質によって惹起されると推定した。この仮説は、該疾患の感染性病因を示している種々の研究者による疫学的研究及び伝播実験の結果によって裏付けされている（ＭｃＶｉｃａｒ，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ６７：７１−７８（１９８７）；ＭｃＶｉｃａｒ，Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈ．１０：８４−８７（１９９０）；Ｒａｙｎａｒｄら，Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．１５：１２３−１２８（１９９３）；及び、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９２）前出  参照）。最近になってＨｏｕｇｈｔｏｎ（１９９４）１８：１０９−１１８は、ＰＤを接種した後の魚は再感染に対して耐性となり、これは、ＰＤが感染性物質によって惹起されるという説を裏付けるものであると報告している。しかしながら、多数の試みがなされたにも拘わらずこれまでに感染性物質は単離されていない（ＭｃＶｉｃａｒ（１９８７）前出；Ｍｕｎｒｏ  前出；及び、Ｍｕｒｐｈｙ  前出  参照）。
【０００７】
本発明は、ＰＤの原因物質の単離を初めて報告するものである。該原因物質は大きさが６５．５±４．３ｎｍの球状ウイルスであることが見い出され、本明細書ではＦＰＤＶウイルスと称する。突起を除くと該ウイルスは直径４６．８±２．５ｎｍを有し、クロロホルム及びｐＨに感受性を示し、ＢＵＤＲによる阻害に対して耐性を示し、電子顕微鏡によって形態を調査すると、トガウイルス群のメンバーとの類似性を有する。トガウイルスファミリーは、アルファウイルス（２７種）、ルビウイルス（１種）及びＡｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓｅｓ（１種）の３つの属からなり、淡水サケ幼魚及び海洋降海期後サケに接種すると、膵、心臓、及び骨格筋の形態的変化を伴なう膵疾患を生じる。
【０００８】
１つの態様において本発明は魚類膵疾患ウイルス（ＦＰＤＶ）を提供する。
【０００９】
ＦＰＤＶはトガ様ウイルスであり、電子顕微鏡で測定すると６４〜６６ｎｍの粒径を有すると共に１．２ｇ／ｍｌの塩化セシウム中密度を有する、エンペロープを備えた球状粒子からなる。１４℃の海水中に維持した降海期後タイセイヨウサケに１０3・5ＴＣＩＤ50で腹腔内注射すると、該魚に膵疾患の症候を発生し、即ち食欲不振となり、膵胞状細胞壊死、心臓壊死及び骨格筋ミオパシーを発症する。
【００１０】
ＦＰＤＶとは、本発明者は、上記特性を有するウイルスを意味する。本発明は特定のＦＰＤＶウイルス株に制限されないが、本発明の実施態様は、単離された特定のＦＰＤＶ株及びその近縁株に関して記載する。「近縁株」とは、本発明者らは、単離された株と類似の遺伝子型及び／または表現型特性を有する任意の株を意味する。特にこの表現は、実質的に同じ機能的活性を保持する、若干変性された形態のウイルスを含む。即ち、例えば幾つかのアミノ酸またはヌクレオチドの追加、欠失または変更はウイルスの機能的活性に、あるとしても極めて僅かな影響しか与えない。
【００１１】
特に、ＦＰＤＶとは、本発明者らは、回復期の抗ＦＰＤＶ抗血清または受託ＦＰＤＶサンプル（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．Ｖ９４０９０７３１）に対する抗血清と血清学的に反応する魚ウイルスを意味する。とりわけ、ＦＰＤＶは、間接蛍光抗体試験（ＩＦＡ）において上記抗血清のいずれかと陽性反応を示す魚ウイルスである。
【００１２】
望ましくは本発明のウイルスは、実質的に他のタイプのウイルスまたは微生物材料を含まない形態である。
【００１３】
ＦＰＤＶサンプルは、１９９４年９月７日付けでＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，英国（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ９４０９０７３１で受託されている。
【００１４】
更に本発明は、ＦＰＤＶから誘導されたポリペプチド（この用語はかかるポリペプチドの機能的均等物または部分を含む）を提供する。本明細書に使用される「ポリペプチド」なる用語は、分子の大きさに関して限定されず、個々の小ペプチド及び大タンパク質を含む。
【００１５】
本発明のポリペプチドは任意の慣用方法によって製造し得る。例えばポリペプチドは、活性または弱毒化形態のＦＰＤＶをタンパク質分解処理するなどして、かかる形態のＦＰＤＶから回収することにより製造し得る。適当なタンパク質分解剤は当業者には公知であるが、例えばトリプシンまたはペプシンといった酵素、硫酸または塩酸といった化学試薬が挙げられる。洗剤を使用してウイルス調製物を可溶化し、活性であり得る全タンパク質を調製することもできる。或いは、本発明のポリペプチドは遺伝子操作技術によって製造することもできる。例えば、ヌクレオチド配列の適当なタンパク質コーディング部分を発現させ、必要なポリペプチドを生成することができる。必要とされる遺伝子操作技術は当業者には公知であるが、簡単に言えば、ＦＰＤＶ  ＲＮＡゲノムの少なくとも適当な部分のｃＤＮＡコピーを作製する。ｃＤＮＡ生成に適したプライマーとしては、オリゴＴプライマー、関連ウイルスのヌクレオチド情報から設計されたプライマー、またはランダムな配列で生成されたプライマーが挙げられる。次いでＤＮＡを適当なベクター内に置き、必要によってはそれによってコードされるタンパク質を適合性宿主によって発現させることができる。任意のステップとして、適当な発現制御配列の挿入、組換えベクターのクローン増殖、及び要求される組換え構築物の選択が含まれる。
【００１６】
遺伝子操作技術の一般参考文献として、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２が挙げられる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、（その機能的均等物または部分を含む）ＦＰＤＶの全てのポリペプチドを含み、ウイルス粒子の構造的または非構造的役割を有するポリペプチドを含む。ＦＰＤＶの構造的ポリペプチドに関してはＦＰＤＶのコア及びエンベロープポリペプチドが挙げられる。本発明は更にＦＰＤＶの表面エピトープを含むポリペプチドを包含する。本発明は更に非グリコシル化及びグリコシル化形態のポリペプチドも包含する。
【００１８】
更に本発明は、ＦＰＤＶゲノムの少なくとも一部から誘導されるヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。
【００１９】
従って本発明は、少なくとも一部が、タンパク質コーディング領域を含み得るＦＰＤＶゲノムの少なくとも一部から誘導されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
「から誘導される」なる表現は、ＲＮＡであろうとＤＮＡであろうと、一本鎖であろうと二本鎖であろうと、ＦＰＤＶのゲノムの少なくとも一部と同一のコピー及び相補的なコピーを含む。「から誘導される」なる表現は更に、発現されるポリペプチドのアミノ酸配列に（遺伝子コードの縮重による）影響を及ぼさない変更を含む配列、並びに、（発現されるポリペプチドの機能を含む）機能に実質的に不利な作用を惹起しないヌクレオチドの欠失、追加または置換によって修飾された配列を含む。
【００２１】
特に本発明の遺伝子構築物は、天然ＦＰＤＶゲノム及びそのｃＤＮＡ均等物を包含する。更に本発明の遺伝子遺伝子構築物は、ＦＰＤＶゲノムの少なくとも一部から誘導されるヌクレオチド配列を含む全ての組換え構築物を含む。かかる組換え構築物は、ＦＰＤＶの特定のポリペプチドまたはポリペプチド群のみを発現するように設計することもできるし、非ＦＰＤＶ（外来）発現制御配列を含むこともできる。或いは、組換え構築物はＦＰＤＶの発現制御配列を含んでもよいし、必要によっては非ＦＰＤＶ（外来）タンパク質コーディング配列を含んでもよい。
【００２２】
特定の実施態様においては、本発明は、上記のごとき遺伝子構築物を含む（クローニングまたは発現ベクターのごとき）ベクターを含む。ベクターには、細菌及び酵母宿主細胞用の慣用クローニング及び発現プラスミド、並びに、真核細胞系中でのＦＰＤＶタンパク質の発現に有用となり得るワクシニアのごとき真核ウイルスベクターが含まれる。かかるベクターを使用して適当な宿主細胞を（クローニングまたは発現の目的で）形質転換し得、この形質転換細胞も本発明の別の態様を形成する。ＦＰＤＶ自体による形質転換に適した宿主細胞としては、チヌークサケ胚（ＣＨＳＥ−２１４）細胞、タイセイヨウサケ細胞系及びニジマス細胞系が挙げられる。しかしながら、生成されたベクターがＦＰＤＶから誘導されるヌクレオチド配列の一部のみからなる場合は、ベクターと適合性のある宿主細胞系を選択することがより適当となり得る。ウイルス性出血性敗血症ラブドウイルスの発現に首尾よく使用されているＥ．ｃｏｌｉ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉのごとき原核性宿主細胞や、培養物中の酵母、藻類及び魚類、昆虫または哺乳動物細胞を含む真核宿主細胞を挙げることができる。バキュロウイルス発現系を使用する場合には昆虫細胞は特に有効であり得る。適当な宿主細胞は当業者には公知である。
【００２３】
特に本発明のベクターは、ＦＰＤＶゲノムの遺伝子操作物をベースにして非ＦＰＤＶポリペプチドのコーディング配列を含み、その非ＦＰＤＶポリペプチドを発現し得る。
【００２４】
遺伝子構築物、ベクター及び形質転換宿主細胞を使用してポリペプチド、特にＦＰＤＶポリペプチドを発現し得る。
【００２５】
非ＦＰＤＶポリペプチドは例えば、魚類疾患原因物質由来のポリペプチドであり得る。ベクターはワクチンとして有用であり得、ベクターに感染させた魚において非ＦＰＤＶポリペプチドが発現すると、魚類疾患原因物質に対する免疫応答が誘起される。
【００２６】
現場暴露及び実験的暴露の後、魚はＰＤに対する強力な免疫を獲得することが立証されている（Ｒａｙｎａｒｄら，Ｄｉｓ  Ａｑｕａｔ  Ｏｒｇ  １５，１２３−１２８（１９９３）参照）。ＦＰＤＶの単離により、ＰＤの素早い診断を助成すると共にこの重要な魚類疾患の病因及び流行のより完全な研究の支援となる抗原及び核酸検出系の開発が可能となる。本発明の遺伝子構築物及びポリペプチドは、ＦＰＤＶに対するワクチン及び／または診断材料を製造するのに有用となり得る。
【００２７】
更に本発明は、ＦＰＤＶまたはＦＰＤＶから誘導されたポリペプチド（その機能的均等物及び部分を含む）を含む、ＰＤに対するワクチンを提供する。特にＦＰＤＶはワクチンベクターとして使用し得る、即ちワクチン製造に特に有用な発現ベクターとして遺伝子操作し得る。
【００２８】
本発明ワクチンは例えば弱毒化または不活化形態のＦＰＤＶ自体とし得る。不活化形態のＦＰＤＶは、ＦＰＤＶ試料を例えば５０℃以上に加熱したり、クロロホルムで処理し、ｐＨを調整したり、または任意の他の適当な手段によって製造し得る。弱毒化形態のＦＰＤＶは、多くの場合に異なる種の細胞培養物においてウイルスを長期間継代するか、または次第に高い温度で増殖させ、高温により適合する集団を選択することにより製造し得る。プラークサイズによって変種株を選択するプラーク精製方法の開発は他のウイルスに使用されており、ここでも適当となり得る。或いはワクチンは、ＦＰＤＶのポリペプチド、好ましくは魚（特にタイセイヨウサケ）において免疫原性であるポリペプチドを含み得、即ち該ポリペプチドは当該魚において免疫反応を誘発する。このようなポリペプチドは、任意の慣用手段、例えば遺伝子操作技術を使用して製造することができる。
【００２９】
他のトガウイルスに対するワクチンも当分野において公知であり、適当なワクチンを製造する方法を当業者は使用し得る。Ｒｏｅｒｉｇら，Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｄｒｉｅｓｍａｎ編，Ｂｒｏｎｓｏｎ  ＆  Ｋｅｎｎｅｄｙ  １９８５，ｐ１４２、及びＬｅｏｎｇら，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （１９９３）ｐｐ２２５−２４０が挙げられる。
【００３０】
上述のごとく発現ベクターとしてＦＰＤＶを使用し、適当なＦＰＤＶワクチンまたは非ＦＰＤＶワクチンを、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）に類似の方法で製造し得る。ＳＦＶについて言えば、感染性ＲＮＡを転写し得る全長ｃＤＮＡクローンが製造されており、且つＳＦＶが分子生物学的に解明されていることから、ＲＮＡ複製タンパク質をコードするｃＤＮＡをキャプシドタンパク質をコードするｃＤＮＡから容易に分離し得る。キャプシドタンパク質をコードするサブゲノムｍＲＮＡは感染細胞から単離することができる。この分離を使用し、ＲＮＡ複製タンパク質のみをコードするＲＮＡを包む正常ウイルスキャプシドを含む「非複製」ＳＦＶ粒子を製造することができる。かかる粒子は、個々のｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってそれぞれ合成された２種の異なるＲＮＡを有する細胞を同時トランスフェクトすることにより製造される。転写物１はＲＮＡ複製の作用を担うタンパク質をコードし、転写物２はキャプシド及びエンベロープを構成するタンパク質をコードする。トランスフェクト細胞内で、両ＲＮＡが複製及び翻訳される。パッケージングシグナルを有することから、複製タンパク質をコードするＲＮＡのみがキャプシドに封じ込められる。ＲＮＡ複製能をコードするｃＤＮＡ中に外来遺伝子を取込むことで、ＳＦＶを極めて有効な発現系として使用し得るようになった。即ち、修飾転写物１でトランスフェクトされた細胞は外来タンパク質を発現する。ＳＦＶのベクターワクチンとしての潜在能力は、細胞が修飾転写物１及び転写物２で同時トランスフェクトされた時に実現される。この場合は、細胞に感染し防御免疫応答を誘起し得る外来タンパク質を効果的に産生する「非複製」ＳＦＶ粒子が産生される結果となる。
【００３１】
必要によっては、上記ワクチンを幼若サケ、例えば淡水期のサケに投与することができる。ワクチンは、魚を含む水に直接添加することができる。或いは、魚（または魚サンプル）に直接接種することもできる。魚サンプルのみを接種する場合、ワクチン接種した魚に接触することにより、免疫が他の魚に賦与され得る。
【００３２】
別の態様において本発明は、ＦＰＤＶまたはその成分に選択的に結合し得る物質を含む、ＰＤに対する診断試薬を提供する。
【００３３】
前記物質の例としては、ＦＰＤＶ自体またはそのポリペプチドに選択的に結合し得る抗体または他のタンパク質、ＦＰＤＶ、そのオリゴ糖またはグリコシル化ポリペプチドに選択的に結合し得るレクチン、及びＦＰＤＶゲノムの少なくとも一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
必要によっては本発明診断試薬は、放射性標識、発色団、蛍光団、重金属、酵素標識、抗体標識などのマーカーを含み得る。また必要によっては本発明の診断試薬は（例えばビーズ、ロッド、容器表面または膜上に）固定し、検査すべき試料を前記診断試薬と直接接触させることができる。
【００３５】
本発明の診断試薬中の前記物質として使用し得るＦＰＤＶに特異的な抗体は本発明の別の態様を形成する。必要であれば、該抗体はモノクローナル抗体とし得る。
【００３６】
更に別の態様において本発明は、ＦＰＤＶを単離する方法を提供する。該方法は、ＰＤを患う魚、好ましくは（Ｍｕｎｒｏら，前出によって定義される）急性期ＰＤの魚を同定することを含む。感染組織（例えば膵または腎）をチヌークサケ胚（ＣＨＳＥ−２１４）細胞と一緒に適当な期間、例えば最高３５日間、特に約２８日間同時培養する。次いで、同時培養した細胞をＣＨＳＥ細胞で継代である。
【００３７】
本発明は更に、ＰＤを診断する方法であって、
１）検査試料を本発明の診断試薬と接触させて試薬複合体を生成するステップ；
２）任意の洗浄ステップ；及び
３）試薬複合体の存在及び必要によっては濃度、即ち該試料中のＦＰＤＶの存在または量を測定するステップ
を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明の診断方法は、ＦＰＤＶを含む疑いのある任意の試料において実施し得る。例えば魚の組織試料（例えば腎、脾、心臓、膵、肝、腸、または血液）に該診断処理を実施し得る。一般には、血液試料を試験して、非致死的診断とするのが好ましい。魚を含むのに使用されていた水の試料に本発明診断試験を実施することもできる。
【００３９】
本発明は更に、ＦＰＤＶを製造する方法及びＦＰＤＶから誘導されるポリペプチドを製造する方法も提供する。
【００４０】
【実施例】
以下、非限定的な実施例を参照して本発明を更に説明する。
【００４１】
実施例１
ウイルスの単離及び細胞培養
細胞培養
ウイルス単離のため、チヌークサケ胚細胞系（ＣＨＳＥ−２１４，Ｎｉｍｓら，１９７０）を全実験に使用した。使用した他の細胞は、ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ  ｐａｐｕｌｏｓｕｍ  ｃｙｐｒｉｎｉ（ＥＰＣ）、ｆａｔｈｅａｄ  ｍｉｎｎｏｗ（ＦＨＭ）、ｂｌｕｅｇｉｌｌ  ｌｅｐｏｎｉｓ  ｍａｃｒｏｃｈｉｒｕｓ（ＢＦ２）、タイセイヨウサケ（ＡＳ）、ニジマス生殖腺（ＲＴＧ−２）及びニジマス線維芽（ＲＴＦ）細胞であった。細胞を、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％−非必須アミノ酸、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）Ｇｉｂｃｏ，Ｓｃｏｔｌａｎｄを補充した、アール塩及び炭酸水素ナトリウム２．２ｇ／ｌを含むイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）中に維持した。細胞を１５０ｃｍ2フラスコまたは２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５２４）において２０℃で増殖させた。
【００４２】
プレートを、密閉容器内で３％ＣＯ2／９７％空気雰囲気下でインキュベートした。ウイルス単離の間細胞を維持するため、抗生物質をペニシリン５００ＩＵｍｌ-1、ストレプトマイシン硫酸塩５００μｇ  ｍｌ-1、アンホテリシンＢ  ０．６２５μｇ  ｍｌ-1に増やし、ＦＢＳを２％に減らしたＭＥＭからなる維持培地（ＭＥＭＭ）を使用した。
【００４３】
原ウイルス単離
アイルランド西海岸の養殖タイセイヨウサケにおいて膵疾患を発症した急性期の２０匹の個々の魚から、腎、脾、心臓、肝、膵及び腸の試料を採取した。各魚から得た試料を別個に処理した。
【００４４】
同時培養
同時培養によって単離するため、各腎の半分のアリコートを２ｍｌシリンジに入れ、１６ゲージ皮下ニードルを通して１０ｍｌの維持培地（ＭＥＭＭ）中に押し込むことにより断片化した。得られた組織片の懸濁液を、２４時間前に調製しておいた単層のＣＨＳＥ−２１４細胞に接種した。１ｍｌの組織懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルに接種し、１５℃で２８日間またはＣＨＳＥ細胞中に継代した場合は細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベートし、凍結及び溶解することなく、更に２８日間インキュベートした。
【００４５】
組織ホモジネート
各魚から得た腎の残りの部分と他の組織とをプールし、乳鉢及び乳棒を使用し、ＭＥＭＭを用いて１０％ホモジネートを調製した。これらを２５００ｇで１５分間遠心し、上清０．１ｍｌを、ＭＥＭＭ中の最終希釈度１：２０、１：５０及び１：１００で、ＣＨＳＥ−２１４細胞を含む２４ウェルプレート中に接種した。これらを１５℃で最高２８日間またはＣＨＳＥ細胞中に継代した場合はＣＰＥが見られるまでインキュベートし、１５℃で更に２８日間インキュベートした。
【００４６】
ＣＨＳＥ−２１４細胞中でのウイルス増殖曲線
ＣＨＳＥ−２１４細胞中でのウイルス増殖を、２４ウェルプレート内のＣＨＳＥ−２１４細胞にＦＰＤＶ０．１ｍｌを、感染多重度（ＭＯＩ）１  ＴＣＩＤ50／細胞で接種し、ウイルスを１５℃で１時間吸収させることにより測定した。接種材料を取り出し、細胞をＭＥＭＭで３回洗浄してから、１ｍｌ  ＭＥＭＭで置き換えた。接種後（ＰＩＤ）０、２、４、６、８、１０、１２、１４、２１及び２８日目に、アッセイのため試料を以下のように取り出した。細胞外ウイルス試料に対しては、４つのウェルのそれぞれから培地の半分を取り出し、プールし、８００×ｇで５分間遠心して細胞を除去した。上清は細胞外ウイルスを含んでいた。全ウイルス試料に対しては、残りの０．５ｍｌの培地を、掻き取ることで取り出した付着細胞と合わせてプールし、一旦凍結及び溶解した。１５℃で１４日間インキュベートしたＣＨＳＥ−２１４細胞において滴定することにより、両試料のウイルス感染度をそれぞれ評価した。この一連の全ての試験の５０％最終点を、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（１９３８）Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７の方法によって推算した。
【００４７】
細胞培養物中でのウイルス増殖
本実験室において製造されたｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｃｙｐｒｉｎｉ（ＥＰＣ）、ｆａｔｈｅａｄ  ｍｉｎｎｏｗ（ＦＨＭ）、ｂｌｕｅｇｉｌｌ  ｌｅｐｏｎｉｓ  ｍａｃｒｏｃｈｉｒｕｓ（ＢＦ２）、タイセイヨウサケ（ＡＳ）（Ｆｌｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、ニジマス生殖腺（ＲＴＧ）細胞及びニジマス線維芽細胞（ＲＴＦ）系においてＦＰＤＶの細胞変性効果を調査した。培養物に、１０7ＴＣＩＤ50ｍｌ-1を含むウイルスプールの１０倍希釈物を接種し、１５℃でインキュベートし、ＣＰＥの出現を１４日間にわたって調査した。ＣＰＥは全く認められず、ＣＨＳＥ−２１４細胞において培養液を滴定することにより培養物のウイルス増殖を検査した。全ての培養物を、同じ細胞内で１５℃で１４日間更に継代し、廃棄する前に、ＣＨＳＥ−２１４細胞中でのウイルス増殖を検査した。
【００４８】
結果
ウイルス単離
実験を行った２０個の腎組織のうち２つからウイルスが単離された。これらは、ＣＨＳＥ−２１４細胞と一緒に２８日間同時培養し、更にＣＨＳＥ−２１４細胞系において継代させた。元の同時培養物にはＣＰＥは見られなかった。しかしながら、継代すると、１０日間インキュベートした後に、塞穴性及び空胞性で外観が不規則な小さな独立した細胞群が認められた。ＣＨＳＥ−２１４細胞中で更に４回継代すると、ＣＰＥの範囲が拡大された（図１参照）。１０8・5ＴＣＩＤ50／ｍｌのウイルス力価が常に得られた。感染細胞のほとんどは単層に付着したままであった。どの培養物にもシンシチウムまたは封入体は認められなかった。接種組織ホモジネートのどれからもウイルスは単離されなかった。
【００４９】
ＣＨＳＥ−２１４細胞における細胞変性作用の様相
継代初期には、小さな独立した細胞群は塞穴性及び空胞性であり、外観は不規則であった。これらは、単層の３／４が作用を受けるまで、３週間にわたって拡大した。感染細胞は培養プレートの表面から離れなかった。ウイルスが細胞に受け入れられると、ＣＰＥは早くも４日目に現れ、通常は１４日目までに完全となった。
【００５０】
種々の細胞培養物における増殖
ＣＨＳＥ−２１４細胞におけるウイルスの増殖を図２に示す。全ウイルスレベルは接種後６〜８日目までに最高となり、細胞外ウイルスは接種後約１１目にピークに達し、接種後１４日目まで高いままであった。ＡＳ、ＢＦ２、ＦＨＭ、ＥＰＣまたはＲＴＧ−２細胞系においてはＣＰＥは認められず、これらの細胞中でのＦＰＤＶが増殖した形跡はなかった。しかしながら、ＲＴＦ細胞系においてはＣＰＥは認められたなかったものの、ＦＰＤＶ力価は、これらの細胞の第１及び第２継代において１０6ＴＣＩＤ50ｍｌ-1に達した。
【００５１】
実施例２
クロロホルム感受性
０．０５ｍｌのクロロホルムを１ｍｌのウイルスに添加することにより、クロロホルムに対する感受性を評価した。混合物を周囲温度で１０分間振盪してから４００×ｇで５分間遠心し、クロロホルムを除去した。残った感染性ウイルスを、ＣＨＳＥ−２１４細胞中で滴定することにより検出した。対照は、クロロホルムの代わりに０．０５ｍｌのＭＥＭＭを１ｍｌのウイルスに添加したものからなった。感染性膵壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）及びウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳ）もまた、それぞれ陰性（非感受性）及び陽性（感受性）ウイルス対照として含めた。
【００５２】
結果
単離体及びＶＨＳウイルスの感染性は、クロロホルムに暴露したあと低下しており、必須脂質を含むエンベロープの存在が示された。
【００５３】
【表１】
0003676449.tif 000003
【００５４】
これに対して、ＩＰＮＶの感染性は同様に処理しても影響を受けなかった。
【００５５】
実施例３
ｐＨ３．０における安定性
０．１ｍｌのウイルスを、ｐＨ３．０に調整したＭＥＭ０．９ｍｌに添加し、４℃に４時間維持し、１５℃で１４日間インキュベートしたＣＨＳＥ−２１４細胞において滴定するで残留感染性ウイルスを検査することにより、ｐＨ３．０における安定性を評価した。対照としてｐＨ７．２のＭＥＭ添加したＦＰＤＶを用いて実験を繰り返した。ＩＰＮＶをｐＨ３．０で安定なウイルス対照として含め、感染性造血系壊死ウイルス（ＩＨＮ）をｐＨ３．０感受性対照として使用した。
【００５６】
結果
【００５７】
【表２】
0003676449.tif 000004
【００５８】
単離体の感染性は、ｐＨ３．０に暴露したときに失われた。ＩＰＮＶは影響を受けなかった。
【００５９】
実施例４
熱安定性
ウイルス懸濁液のアリコートを１５、２５、３７、４５、５０、５５または６０℃で３０分間加熱し、氷水に浸漬することにより急冷した。残っている感染性ウイルスの濃度を、１５℃で１４日間インキュベートしたＣＨＳＥ−２１４細胞において滴定することにより評価した。
【００６０】
結果
感染性は、４、１５、２５℃では影響を受けないが、３７及び４５℃では低下した。５０℃で３０分後には感染性ウイルスは検出されなかった。
【００６１】
【表３】
0003676449.tif 000005
【００６２】
実施例５
血球凝集反応
ニワトリ、モルモット、ニジマス、及びタイセイヨウサケ赤血球を用いて血球凝集試験を実施した。Ｕ字形底面９６ウェルプレートにおいて、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中の赤血球細胞の０．８％懸濁液０．１ｍｌを、力価１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌのＣＨＳＥ−２１４細胞において調製したＦＰＤＶプール０．１ｍｌに添加し、４℃、１５℃及び３７℃でインキュベートした。１、３及び１８時間後に検査を実施した。
【００６３】
結果
どの温度でも、選択したどの赤血球でも、血球凝集は認められなかった。
【００６４】
実施例６
核酸阻害試験
ウイルスを、ＤＮＡ阻害物質５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＵＤＲ）の存在下で、チミジンがある場合とない場合とで増殖させることにより、ウイルスの核酸の種類を決定した。ＣＨＳＥ−２１４細胞を含む３つの２４ウェルプレートの各々の１グループ４つのウェルに、１０倍に希釈したウイルス０．１ｍｌを接種し、１５℃で１時間吸収させた。各プレートに１ｍｌの、ＭＥＭＭのみ、ＭＥＭＭと１ｍＭ／ｍｌのＢＵＤＲ、またはＭＥＭＭと１ｍＭ／ｍｌのＢＵＤＲと１ｍＭ／ｍｌのチミジンを加えた。プレートを１５℃で１４日間インキュベートし、ＣＰＥについて検査した。ＢＦ２細胞中で増殖させた魚ＲＮＡ（ＩＰＮ）及びＤＮＡウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓ）を対照として含めた。
【００６５】
結果
【００６６】
【表４】
0003676449.tif 000006
【００６７】
単離体及びＩＰＮＶのウイルス力価は培地中のＢＵＤＲの存在に影響されなかったが、魚ＤＮＡウイルスは阻害された。このことから、単離体のゲノムはＲＮＡからなることが判る。
【００６８】
実施例７
陰性比較ＥＭ試験
ＥＭ検査用のウイルス懸濁液は、ＦＰＤＶ感染細胞培地を、予め固定しないで使用したものと、グルタルアルデヒド（２％終濃度）を４℃で１時間かけて添加し、次いで１００，０００×ｇで４時間超遠心し、ペレットを数滴の蒸留水中に再懸濁させてから使用したものとからなった。カーボン被覆銅グリッドを１滴のウイルス懸濁液の上に載せ、１０分間放置した。過剰な液体を排し、グリッドを２％ホスホタングステン酸（ＰＴＡ）（ｐＨ７．２）で１分間染色し、それをＨｉｔａｃｈｉｅ  Ｈ７０００透過型ＥＭにおいて倍率５０，０００倍で検査した。
【００６９】
結果
ＥＭ検査前にグルタルアルデヒド中に固定しなかったウイルス調製物はほとんど破壊された粒子を含んでおり、固定前に無傷のビリオンを保存する必要があることが示された。
【００７０】
グルタルアルデヒド固定材料のＥＭ検査から、６５．５±４．３ｎｍの円形粒子の存在が明らかとなった（図３）。これらは不規則な構造の内側コアを有し、その周囲をクラブ様の突起に見える外側フリンジが取り巻いていた。一部破壊された粒子も多く存在した。未固定調製物においては、完全な粒子は数個しか見られず、このことは、遊離ビリオンは脆弱であり、ＥＭ検査の準備中に容易に破壊されたことが判る。
【００７１】
実施例８
ウイルスの増殖及び濃度
ＣＨＳＥ−２１４細胞におけるウイルスの増殖
２４ウェルプレート内のＣＨＳＥ−２１４細胞に０．１ｍｌのＦＰＤＶを多重度１．０ＴＣＩＤ50／細胞で接種し、１５℃で１時間吸収させることにより、ＣＨＳＥ−２１４細胞中でのウイルス増殖を測定した。次いでウイルスを取り出し、細胞をＭＥＭＭで２回洗浄してから、１ｍｌのＭＥＭＭで置き換えた。接種後、０、７、１１、１４、２１、２８日目に、アッセイのため試料を以下のように取り出した。４つのウェルのそれぞれから培地の半分を取り出し、プールし、８００×ｇで５分間遠心して細胞を除去した。残りの０．５ｍｌの培地を、掻き取って取り出した付着細胞と合わせてプールし、一旦凍結及び溶解した。１５℃で１４日間インキュベートしたＣＨＳＥ−２１４細胞において滴定することにより、両試料のウイルス感染度をそれぞれ評価した。
【００７２】
塩化セシウム濃度勾配遠心
ＦＰＤＶをＣＨＳＥ−２１４細胞にＭＯＩ  １で接種した。細胞及び培地（４００ｍｌ）を接種後８日目に回収し、一旦−７０℃で凍結及び溶解してから、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ３５アングルローターにおいて１０，０００×ｇで３０分間遠心し、細胞破片を除去した。上清を１００，０００×ｇで４時間超遠心した。得られたペレットを全部で２ｍｌのＰＢＳｐＨ７．２中に再懸濁させ、５ｍｌの１．３ｇ／ｍｌ  ＣｓＣｌ及び４．５ｍｌの１．２２ｇ／ｍｌ  ＣｓＣｌからなる不連続ＣｓＣｌ濃度勾配の上に重層した。これを１００，０００×ｇ，４℃で１９時間遠心した。２０個のフラクションを回収し、１５℃で１４日間インキュベートしたＣＨＳＥ−２１４細胞中で感染性を試験した。感染性ウイルスを含むフラクションの密度を屈折計を使用して測定した。
【００７３】
結果
１．０８〜１．２６ｇ／ｍｌの密度を有するＣｓＣｌ濃度勾配由来のフラクション中で感染性が検出された。密度１．２ｇ／ｍｌで最高の感染性が認められ、このフラクションは更に、ＥＭ調査によって評価すると最大数の完全ウイルス粒子を含んでいた。
【００７４】
実施例９
血清学的試験
感染性造血系ウイルス（ＩＨＮ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳ）、感染膵壊死ウイルス株Ｓｐ、Ａｂ及びＶＲ−２９９（ＩＰＮＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）及び風疹ウイルスに対する過剰免疫ウサギ血清による中和についてＦＰＤＶを試験した。等量の２００ＴＣＩＤ50／０．１ｍｌのＦＰＤＶを、２倍に希釈した抗血清０．１ｍｌに添加し、１５℃で１時間インキュベートした。混合物を２４ウェルプレート内の１ウェル当たり０．１ｍｌのＣＨＳＥ−２１４細胞中に接種し、１時間吸収させ、１ｍｌのＭＥＭＭを添加し、１５℃で１４日間インキュベートし、培養液のＣＰＥの形跡を一日おきに顕微鏡で検査した。Ｒｅｅｄ及びＭｅｕｎｃｈ，１９３８，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７の方法によって力価を計算した。
【００７５】
結果
ＦＰＤＶは、ＩＨＮＶ、ＶＨＳＶ、ＩＰＮＶ、ＥＡＶ、ＢＶＤまたは風疹に対する抗血清によって中和されず、これらのウイルス群には関係ないことが判る。
【００７６】
実施例１０
伝播実験
１）材料及び方法
ａ）淡水魚
平均体重２０ｇ±２．９ｇのタイセイヨウサケ幼魚を、１０〜１２℃の一部再循環湧水を含む、直径１．２ｍの円筒形タンク内に維持した。魚を、順応させるために接種前２週間かかるタンク内に維持し、市販の餌を充足するまで与えた。１０匹の魚から組織を採取し、感染性膵壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）及び膵疾患の存在を検査した。接種前に、３−アミノ安息香酸エチルエステル（ＭＳ２２２）を用いて魚を麻酔した。
【００７７】
ｂ）海洋魚
平均体重８７ｇの降海期後タイセイヨウサケを、１２〜１５℃の流動系内の海水を含む２×１．５ｍのタンク内に維持した。魚を、順応させるために接種前２週間維持し、１０匹の魚から得た組織試料をＩＰＮＶの存在について培養し、膵疾患の形跡を組織学的に検査した。
【００７８】
２）実験方法
接種材料１
ウイルスをＣＨＳＥ−２１４細胞に感染多重度１  ＴＣＩＤ50／細胞で接種し、１５℃で８日間インキュベートした後に回収することにより、ＦＰＤＶプールを調製した。一旦−７０℃で凍結及び溶解することによって細胞を破壊し、１０，０００×ｇで３０分間遠心することにより細胞破片を除去した。得られたウイルスプール、力価１０7・0ＴＣＩＤ50／ｍｌを０．２２μ多孔度Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過し、０．１ｍｌを１００匹の魚の各々の腹腔内に接種した。５０匹のひれを切り取った未接種の魚を各タンクに接触魚として加えた。
【００７９】
接種材料２
対照として、１００匹の魚にウイルス感染細胞と全く同様に調製した未感染ＣＨＳＥ−２１４細胞由来の溶解物を接種し、更に５０匹の接触対照魚を加えた。
【００８０】
サンプリング
接種後６または７、１０、１４または１５、２１、２８、３５、４２日目に、組織検査のため、１０匹の試験魚及び１０匹の対照魚から心臓、脾、腎、肝、ｃａｅｃａｅ／膵、及び筋の試料を採取した。２８日目までに、ウイルス単離のために、心臓、脾、腎及びｃａｅｃａｅ／脾の試料を同じ魚から採取した。接種後１４または１５、２１、２８、３５及び４２日目に５匹の接触魚を取り出し、組織検査のために組織試料を採取した。１４または１５及び２１日目のみに、ウイルス単離用の試料を接触魚から採取した。
【００８１】
組織分析
組織検査用試料を緩衝塩類溶液ｐＨ７．０中の１０％ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンろう中に埋め込み、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓｍｉｃｒｏｔｏｍｅにおいて５μ切片に切断した。これらをヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００８２】
ウイルス単離
組織を、乳鉢及び乳棒を使用してＭＥＭＭ中１０％ホモジネートとして調製し、２，５００×ｇで１５分間遠心し、ＣＨＳＥ−２１４細胞を含む２４ウェルプレートの２つのウェルの各々に、最終希釈度１：２０及び１：１０で接種し、１５℃で２８日間インキュベートした。
【００８３】
陰性であると見なす前に、ＣＰＥを示さなかった試料を更にＣＨＳＥ−２１４細胞中に継代した。
【００８４】
結果
淡水サケ幼魚の臨床的及び病理的病変
ウイルスを淡水サケ幼魚に接種すると、一部の幼魚で食餌が止まり、便放出が認められた。接種後（ｐ．ｉ．）６〜１０日に急性膵胞状組織壊死が検出された。壊死の分布は限局性から拡散性までであった。１４〜２１日の間に、多くの魚が著しい胞状組織損失を示したが、生き残った胞状組織のポケットは特に数匹の魚のランゲルハンス島及び大きいほうの小葉内管の周囲に検出された。周辺胞状組織に若干の繊維症があった。膵病変を有する全ての魚で、ｐ．ｉ．６日目、同時多重限局性のミオサイト壊死及び変性が検出された。接種後３週目に、心臓は細胞過剰と見られ、ミオサイト核拡大を伴なうミオサイト及び心内膜下細胞の明らかな増殖があった。ｐ．ｉ．２１日目から若干の骨格筋病変が検出された。接触魚は２週間遅れて同様の病変を発症した。陰性対照においては組織病変は検出されなかった。
【００８５】
海水伝播実験における臨床的及び病理的病変
７日目までに、ＦＰＤＶを接種した魚は無食欲となり、タンク内の便放出物が増加した。７日目から、限局性から極度の拡散性の胞状細胞壊死と同時に多重限局性心筋壊死が一貫して認められた。１５日目から骨格筋線維変性が検出され、赤色及び白色骨格筋線維の両方に影響が及ぼされた。これらの筋病変は、３５及び４２日目には頻度及び重症度が上昇した。２１日目に認められた典型的な病変を図４〜７に示す。全ての共住魚は２週間遅れて同様の病変を発症した。対照魚には臨床徴候または病変は検出されなかった。
【００８６】
伝播実験におけるウイルスの単離
接種魚の全ての組織から接種後の種々の時点でウイルスが単離され（表５）、心臓組織は最も高い率を与えた。
【００８７】
【表５】
0003676449.tif 000007
【００８８】
同じタンクの接触魚はウイルスで感染されたが、対照魚はウイルスを含まないことが判った。海水魚の結果を表６に与える。伝播実験のどの段階でもＩＰＮウイルスは検出されなかった。
【００８９】
【表６】
0003676449.tif 000008
【００９０】
組織分析結果のまとめを表７及び８に示す。
【００９１】
【表７】
0003676449.tif 000009
【００９２】
陰性対照においては病変は検出されなかった。
【００９３】
【表８】
0003676449.tif 000010
【００９４】
陰性対照においては病変は検出されなかった。
【００９５】
実施例１１
不活化魚類膵疾患ウイルス（ＦＰＤＶ）ワクチン
実験方法
実験の目的
アジュバントを添加した不活化ＦＰＤＶをサケ幼魚に接種すると、魚を生きたＦＰＤＶによる攻撃から防御し得るかどうか試験する。
【００９６】
材料及び方法
ワクチン製造に使用したウイルス
１１回継代したＦＰＤＶをＣＨＳＥ細胞中で増殖させ、接種後６日目に回収し、１０００×ｇで１５分間遠心した。得られた上清６００ｍｌをＡｍｉｃｏｎフィルターに通し、力価１０7・5ＴＣＩＤ50ｍｌ-1の濃縮ＦＰＤＶ２５ｍｌを生成した。
【００９７】
ウイルス不活化方法
Ａ．上記のごとく調製したＦＰＤＶ  １０ｍｌ  ＋  ０．２％β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）  ＋  ２滴のＮａＯＨ；
Ｂ．上記のごとく調製したＦＰＤＶ  １０ｍｌ  ＋  ０．１％ホルマリン（３５〜３８％）；
Ｃ．ＭＥＭＭ（維持培地）。
【００９８】
Ａ、Ｂ及びＣのアリコートを＋４℃で２４時間維持してから、適当なアジュバントを添加した。アジュバントは、ウイルスを不活化してから添加し、ウイルス及び対照を受容し、最初の不活化から８日後に魚に接種した。
【００９９】
ワクチン接種方法
魚：平均体重２７ｇのサケ幼魚を淡水流動系内にワクチン接種前１または２週間維持した（水温１０〜１４℃）。
【０１００】
ワクチン接種前に、１グループ当たり５匹の魚から血液及び組織試料を採取した。
【０１０１】
０．１ｍｌのＡ及びＢのごとく調製した不活化且つアジュバント添加ＦＰＤＶ並びにアジュバント対照グループＣ（ＭＥＭＭ＋アジュバント）を１グループ当たり５０匹の魚の腹腔内（Ｉ／Ｐ）に接種した。
【０１０２】
サンプリング
ＦＰＤＶで攻撃する１週間前に、各グループから１０匹の魚を選択した。
【０１０３】
血液及び組織病理分析試料を採取し、膵疾患（ＰＤ）の形跡を検査した。
【０１０４】
ＰＤの形跡は組織分析によってもウイルス単離によっても認められなかった。
【０１０５】
攻撃方法
９回継代した生きたＦＰＤＶ（１０4・5ＴＣＩＤ50ｍｌ-1）０．１ｍｌを３つの試験グループの各魚に、ワクチン接種後２８日目にＩ／Ｐ接種した。
【０１０６】
第４のグループＤをなす５０匹のナイーブなワクチン接種していない魚に、同量のＦＰＤＶをＩ／Ｐ接種し、陽性対照として作用させた。
【０１０７】
攻撃の１０日及び１４日後に、各グループの５匹の魚から試料を採取した。
【０１０８】
抗体試験のための血液試料、ウイルス単離のための腎及び心臓組織試料、及び組織分析のために幽門部ｃａｅｃａ、心臓及び筋試料を採取した。
【０１０９】
【表９】
0003676449.tif 000011
【０１１０】
実施例１２
細胞培養物中のＦＰＤＶ抗原の検出のための間接蛍光抗体試験（ＩＦＡ）
概要
該試験は、ＦＰＤＶ抗体を含む血清を、ウイルスに感染している疑いのあるＣＨＳＥ細胞に添加することを含む。ウイルスが存在するならば、抗体は存在する抗原に結合する。次いでウサギにおいて産生された抗サケＩｇＭを添加すると、それは結合抗体に付着する。この付着は、蛍光顕微鏡を使用すると緑色蛍光として見えるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた抗ウサギ血清を添加することにより検出し得る。
【０１１１】
材料
４５，０００個のＣＨＳＥ−２１４細胞を１カバーガラス当たり０．５ｍｌの増殖培地（ＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）中に播種することにより、該細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）内で直径１１ｍｍカバーガラス上で増殖させた。培養物を、使用前に、３％ＣＯ2／空気混合物を含む密閉容器内で２０℃で４８時間インキュベートした。
【０１１２】
陽性血清−ＦＰＤＶ感染サケの回復期血清を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で１／５０に希釈したもの；
陰性対照血清−ＰＢＳで１／５０に希釈したＦＰＤＶに対する抗体を含まないサケ血清；
ウサギ抗サケＩｇＭ−Ｓｏｒｅｎ  Ｓｃｈｉｅｒｂｅｃｋ  ＆  Ｃｏ，Ｈｅｌｓｉｎｇｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋから市販のものをＰＢＳで１／５０に希釈したもの；
抗ウサギＩｇ／ＦＩＴＣ−Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍ．Ｌａｂｓ．，Ｂｅｒｋｓ，Ｅｎｇｌａｎｄから市販のものをＰＢＳで１／１０００に希釈したもの。
【０１１３】
方法
ＦＰＤＶを含む疑いのある材料を、１ｍｌ  ＭＥＭＭ（維持培地）を含むウェル内のカバーガラスに添加し、３％ＣＯ2／空気混合物を含む密閉容器内で１５℃で５日間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで２回洗浄し、アセトン中に５分間固定し、使用するまで＋４℃で保存した。疑うべき試料を含まない陰性対照培養物と、ＦＰＤＶを含む陽性対照培養物も同様に調製した。
【０１１４】
試験カバーガラスと対照カバーガラスとに５０μＬの陽性血清及び陰性血清を添加し、加湿した１００ｍｍ2ペトリ皿内で３５℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを添加して、試薬対照としてカバーガラスを分離した。全てのカバーガラスをＰＢＳで６分間（２分間ずつ３回）濯ぎ、過剰なＰＢＳをティッシュペーパーで吸い取った。５０μＬの抗サケＩｇＭを全てのカバーガラスに添加し、３５℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで６分間更に濯ぎ、５０μＬの抗ウサギ／ＦＩＴＣを全てのカバーガラスに添加し、それを３５℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで６分間、最後の濯ぎを行い、カバーガラスを、Ｌａｂｏｐｈｏｔ  ２蛍光顕微鏡において倍率４０倍の対物レンズを用い、緩衝グリセロール塩類溶液ｐＨ９．２下で検査した。陰性対照においては蛍光が不在であるが、陽性対照と同様の緑色の蛍光は、培養物中にＦＰＤＶが存在することを示している。
【０１１５】
実施例１３
サケ血清中のＦＰＤＶに対する抗体を検出する間接蛍光抗体試験（ＩＦＡ）
概要
該試験は、ＦＰＤＶ感染ＣＨＳＥ−２１４細胞にサケ血清を添加することを含む。ＦＰＤＶに対する抗体が血清中に存在するならば、それはウイルス感染細胞に結合する。ウサギにおいて産生された抗サケＩｇＭを調製物に添加し、結合抗体に付着させる。この付着は、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光として見えるフルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた抗ウサギ血清を添加することにより認識される。
【０１１６】
材料
１ｍｌ当たり２００，０００個の細胞を含むＣＨＳＥ−２１４細胞懸濁液にウイルスを多重度１で添加し、４０μＬを、１２ウェルマルチスポットスライド（Ｈｅｎｄｌｅｙ，Ｅｓｓｅｘ）の各ウェルに播種することにより、ＦＰＤＶ感染細胞を作製した。培養物を密閉容器内で３％ＣＯ2／空気雰囲気下に２０℃で２４時間インキュベートした。次いでそれらを１５℃のインキュベーターに移して更に３日間インキュベートした後、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で２回濯ぎ、アセトンで５分間固定し、使用するまで＋４℃で保存した。ウイルスを含まない対照ＣＨＳＥ−２１４培養物も同様に作製した。
【０１１７】
試験血清−抗体試験用サケ血清；
陽性対照血清−血清中和抗体試験（ＳＮＴ）によって中和抗体を有することが判っているサケ血清；
陰性対照血清−ＳＮＴによると抗体を含まないサケ血清；
ウサギ抗サケＩｇＭ−Ｓｏｒｅｎ  Ｓｈｉｅｒｂｅｃｋ  ＆  Ｃｏ，Ｈｅｌｓｉｎｇｏｒ，デンマークから市販されているもの；
抗ウサギＩｇ／ＦＩＦＣ−Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍ．Ｌａｂｓ．Ｂｅｒｋｓ，英国から市販されているもの。
【０１１８】
方法
ＦＰＤＶ陽性及び陰性マルチスポットウェルに、ＰＢＳ  ｐＨ７．２で１／２０に希釈したサケ試験血清３０μＬを重層した。ＰＢＳで１／２０に希釈した陽性及び陰性血清も別のウェルに入れた。各スライドの２つのウェルには対照としてＰＢＳを添加し、スライドを加湿した１００ｍｍ2ペトリ皿内で３５℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで濯いだ後（２分間ずつ３回の濯ぎ）、ＰＢＳで１／５０に希釈した抗サケＩｇＭ  ３０μＬを全てのウェルに加え、スライドを３５℃で更に３０分間インキュベートした。ＰＢＳで６分間濯いだ後、ＰＢＳで１／１００に希釈した抗ウサギＩｇＭ  ３０μＬを各ウェルに加え、スライドを３５℃で３０分間インキュベートした。最後の濯ぎをＰＢＳで６分間行い、４０倍対物レンズ及びＬａｂｏｐｈｏｔ  ２蛍光顕微鏡を使用し、スライドを緩衝グリセロール塩類溶液ｐＨ９．２下に置いて蛍光の存在を検出した。試験血清及び陽性血清のウェルには明らかな緑色蛍光が認められたが、対照にはそれがないことから、かかる血清中のＦＰＤＶに対する抗体の存在が示された。同じ方法を使用して抗体滴定が実施される。
【０１１９】
実施例１４
ウイルスＲＮＡ：14Ｃウリジン
トリチウムよりは一般的に使用されないが、Ｘ線フィルムを使用して検出可能であるが故にこの標識を選択した。
【０１２０】
標識した細胞外ウイルスを高速でペレット化し、ホルムアルデヒド−ゲル電気泳動による分析のために抽出した。標識中（２〜５日目）にＡｃｔ  Ｄが存在した最初の実験では、ゲル上に標識は検出されなかった。
【０１２１】
Ａｃｔ  Ｄで処理した感染細胞中に存在するＲＮＡも試験した。ＮＰ４０溶解法によって抽出すると、分子量が小さいほど高い濃度で標識ＲＮＡのスミア（ｓｍｅａｒ）が認められた。明らかな候補ウイルスＲＮＡは検出されなかった。
【０１２２】
Ａｃｔ  Ｄの不在下で14Ｃ及び3Ｈ−ウリジンで標識した大量の細胞外ウイルスをペレット化し、Ｇｅｎｓｙｓ  ＲＮＡ単離法によって抽出した。（感染細胞由来の）標識リボソームＲＮＡの極めて優れた分解能を有するホルムアルデヒドゲルにおいて、高速ペレットウイルスＲＮＡはスミアとして移動した。ほとんどのＲＮＡは、移動度においてｔＲＮＡまたはそれより若干大きいものに対応する低い分子量であったが、スミアの大きさは５０００ｎｔ（大きめのｒＲＮＡ種）より大きく広がった。このゲルを長時間露光すると、一方は大きさが２８Ｓ  ｒＲＮＡに相当し、他方は約１０〜１５ｋｂに対応する位置に、２つの不鮮明なバンドの存在が示された。大きいほうの種は、トガウイルス／フラビウイルスで予想されるものと同様の移動度を有する。小さいほうのＲＮＡは、本発明者らはトガウイルスによって産生されるサブゲノムＲＮＡを検出したと説明することができる。
【０１２３】
実施例１５
魚類膵疾患ウイルス（ＦＰＤＶ）トランスフェクション結果
（ａ）感染ＣＨＳＥ細胞から抽出したＲＮＡ（細胞内ＲＮＡ）、及び（ｂ）組織培養物上清中に存在するウイルスから抽出したＲＮＡ（細胞外ウイルスＲＮＡ）を用いたトランスフェクションはうまく実施された。
【０１２４】
ＲＮＡ調製
（ａ）細胞内ＲＮＡ
７５ｃｍ2プラスチックフラスコ内の単層ＣＨＳＥ細胞をＦＰＤＶ（典型的には１０4ＴＣＩＤ50）に感染させた。これは、２ｍｌのＭＥＭ培地中に含まれるウイルスを１時間吸収させ、次いで１７ｍｌの無血清培地を加えることにより実施した。感染後７日目に培地を取り出し、細胞をフラスコから掻き取って氷冷ＰＢＳ中に入れた。１５００ｇで５分間遠心することにより作製した細胞ペレットを「ＲＮＡアイソレーター」（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を使用して抽出した。通常通りに、１ｍｌの抽出試薬を用いて２つのフラスコから細胞を抽出した。
【０１２５】
（ｂ）細胞外ウイルスＲＮＡ
感染ＣＨＳＥ細胞由来の上清培地（通常は容積７００〜９００ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ濾過及びＢｅｃｋｍａｎ  ８  ｘ  ７０ｍｌ固定アングルローターを使用して３５０００ｒｐｍで４時間超遠心して５または６倍に濃縮し、粗ウイルスペレットを生成すると、それは高力価のウイルス感染性を有することが判った。通常通りに、３００〜４５０ｍｌの上清から誘導された粗ウイルスペレットを１ｍｌの「ＲＮＡアイソレーター」試薬を用いて抽出した。
【０１２６】
トランスフェクション
ＲＮＡペレットを、−２０℃のＥｔＯＨ中に保存した後、１２０００ｇで１０分間遠心し、２０μｌのＲＮＡａｓｅ非含有水中に溶解した。通常通りに、約０．２５フラスコ単層に含まれる細胞から誘導した細胞内ＲＮＡと、５０〜１００ｍｌ上清から誘導した細胞外ウイルスＲＮＡとを使用した。“Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ”（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）試薬を用い、製造業者推奨の方法を使用してトランスフェクションを実施した。簡単に述べるとこれには、ＲＮＡ溶液を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む組織培地と混合し、２４ウェルＣｏｓｔａｒプレート内で増殖させた半集密ＣＨＳＥ細胞を混合物（１００μｌ／１．５ｃｍ直径ウェル培養物）と一緒に５〜６時間インキュベートしてから、試薬トランスフェクション混合物を維持培地と置き換えることが含まれる。培養物のＣＰＥを毎日検査した。トランスフェクトした培養物を継代して４〜６日後、ときおりウイルスＣＰＥが認められた。継代処理は通常はトランスフェクションの８日後に実施される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａは未感染ＣＨＳＥ−２１４細胞（倍率７５０倍）の写真を示し、ｂはＦＰＤＶ感染後８日目のＣＨＳＥ−２１４細胞（倍率７５０倍）の写真を示す。
【図２】ＣＨＳＥ−２１４細胞におけるＳＰＤＶの増殖を示すグラフである。
【図３】グルタルアルデヒドで固定したＦＰＤＶ感染ＣＨＳＥ−２１４細胞培養液の透過型電子顕微鏡写真である。ほとんどのウイルス粒子は表面突起を有するが、内部構造の詳細はほとんど不明である。Ｂａｒ＝１００ｎｍ。
【図４】接種後２１日目の、ＦＰＤＶにより誘起された典型的な膵病変である膵胞状細胞の損失を示す写真である。Ｂａｒ＝５０μｍ。
【図５】接種後２１日目の膵病変と同時に起こった多重限局性心筋（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｉｃ）壊死を示す（→）写真である。Ｂａｒ＝２０μｍ。
【図６】接種後２１日目の筋内膜結合組織の増加、筋線維鞘細胞の増殖、及び筋線維のヒアリン変性を示す、有酸素（赤色）骨格筋の変性を示す写真である。Ｂａｒ＝５０μｍ。
【図７】筋線維核及び筋含有物の食作用を示す無酸素（白色）骨格筋線維のヒアリン変性を示す写真である。Ｂａｒ＝５０μｍ。
【図８】ウイルス単離体の写真である（倍率１００，０００倍）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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