(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．００１％〜１０％の、レチノール、レチニルエステル、およびこれらの混合物とからなる群より選択される化合物と、
（ｂ）０．０００１％〜５０％の次式で表わされるＮ−置換脂肪酸アミド：
0003667772.tif 000018
［式中、
Ｒ1は、炭素原子１〜１０個を有するアルキルまたはアルコキシ、
Ｒ2は、炭素原子８〜２５個を有するアルキルまたはアルケニル、
Ｒ3は、リン酸エステル］、及び、
（ｃ）化粧品に許容できるビヒクル
とを含むスキンケア組成物。
【請求項２】
濃度１００μＭの前記Ｎ−置換脂肪酸アミドが、生体外ミクロソームアッセイによる測定でＬＲＡＴ又はＡＲＡＴ触媒作用レチノールエステル化を少なくとも２０％抑制する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
濃度１００μＭの前記Ｎ−置換脂肪酸アミドが、生体外ミクロソームアッセイによる測定でＬＲＡＴ又はＡＲＡＴ触媒作用レチノールエステル化を少なくとも４０％抑制する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記レチニルエステルが、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、およびこれらの混合物からなる群より選択される請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記レチニルエステルが、リノール酸レチニルである請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
化合物（ａ）がレチノールである請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、脂肪酸アミドとレチノールまたはレチニルエステルとを含有するスキンケア組成物と、このような組成物の皮膚への適用を含んだ方法とに関する。
発明の背景
レチノール（ビタミンＡ）は、人体において自然に生成する内因性化合物であり、正常上皮細胞の分化に必須のものである。天然および合成ビタミンＡ誘導体は、種々の皮膚の障害の治療に広範囲に使用されてきており、また皮膚の回復あるいは再生薬剤として使用されてきた。レチノイン酸は、種々の皮膚状態、例えば、にきび、しわ、乾癬、加齢による斑点、しみの治療のために利用されてきた。例えば、Ａ．バールクイスト（Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ）らのジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、第９４巻、Ｄ．Ｂ．ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）とＷ．Ｊ．カンリフ（Ｃｕｎｌｉｆｆｅ）（１９９０年）、４９６〜４９８ページや、Ｃ．Ｎ．エリス（Ｅｌｌｉｓ）らの『皮膚におけるレチノールの薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ）』、バセル（Ｖａｓｅｌ）、カーガー（Ｋａｒｇｅｒ）、第３巻、１９８９年、２４９〜２５２ページや、Ｎ．Ｊ．ロウ（Ｌｏｗｅ）らの『皮膚におけるレチノールの薬理学』第３巻、１９８９年、２４０〜２４８ページや、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／１９７４３号などを参照されたい。
レチノールやレチノールのエステルの使用は、レチノイン酸よりも好ましいと考えられている。レチノールは人体で自然に産出され、レチノイン酸よりもずっと安全であると考えられている。レチノールのエステルが生体内で加水分解されると、レチノールが生成する。レチノールエステルおよびレチノールは、次の機構により皮膚内で代謝的にレチノイン酸に転化すると考えられている。
0003667772.tif 000002
しかしながら、内因的に使用されたレチノールの大部分は、迅速に不活性脂肪酸エステルへと転化して、上皮細胞（ケラチノサイト）に貯蔵される。レチノールの不活性レチニルエステルへのエステル化は、細胞内における、酵素のアシルＣｏＡレチノールトランスフェラーゼ（ＡＲＡＴ）の触媒作用によるアシルＣｏＡからの脂肪酸アシル基の移動、または酵素のレシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）の触媒作用によるホスファチジルコリンからのアシル基の移動、によって起こる。これらのエステル化反応は、ケラチノサイト内で非常に効率的であり、細胞性レチノイドの大部分（９５％）はレチニル脂肪酸エステルとして存在する。従って、残念なことであるが、レチノールおよびレチニルエステルはレチノイン酸よりも安全に使用できるが、皮膚に対する利点においてはレチノイン酸よりも効果がない。
本発明は、その一部において、ある種のＮ−置換脂肪酸アミド類がこれらのエステル化反応を抑制し、それによってレチノイン酸への転化に利用されるレチノール量を増加させることでレチノールの効果が増大する、という発見に基づいている。従って、これらＮ−置換脂肪酸アミド類と、レチノールまたはレチニルエステルとの混合物は、レチノイン酸と同様の効果を示すものであるが、レチノイン酸よりも安全に使用される。先行出願のヨーロッパ特許出願第ＥＰ  ０  ７４２  ００５号（ユニリーバー（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、優先権主張日１９９５年５月８日）、公告１９９６年１１月１３日（本出願の優先権主張日より後である）では、脂肪酸アミドとレチノールまたはレチニルエステルとの組合わせについてを開示している。しかしながら、第ＥＰ  ０  ７４２  ００５号では、本発明の特定のＮ−置換脂肪酸アミド類、即ち、窒素原子において分岐したアルコキシ基含有置換基を有する脂肪酸については教示していない。
発明の開示
本発明は、その一部において、皮膚調整組成物を含み、この組成物は、
（ａ）０．００１％〜１０％のレチノールまたはレチニルエステルと、
（ｂ）０．０００１％〜５０％の式Ｉで表わされるＮ−置換脂肪酸アミド：
0003667772.tif 000003
［式中、
Ｒ1は、炭素原子１〜１０個を有するアルキルまたはアルコキシ、
Ｒ2は、炭素原子８〜２５個を有するアルキルまたはアルケニル、
Ｒ3は、炭素原子１〜５個を含むアルキル、またはリン酸エステル］、及び、
（ｃ）化粧品に許容されるビヒクルとを含む。
また本発明は、本発明の組成物を皮膚に局所的に使用することを含む皮膚調整美容法（cosmetic method of conditioning skin）を提供する。さらには、本発明は、本発明の組成物を皮膚に局所的に使用することを含む皮膚へのレチノイン酸の効果と同様の効果を達成する美容法を提供する。
本明細書で使用する「調整（conditioning）」という用語は、以下の一つまたは複数の意味をもつ。乾燥肌、光損傷肌、しわの出現、加齢による斑点及び／又は老化肌、の予防及び／又は治療、角質層の柔軟性の増加、皮膚色の淡色化、皮脂分泌の調節、一般的な皮膚の質の向上。
式ＩのＮ−置換脂肪酸アミドは、好ましくは、濃度１００μＭで、生体外ミクロソームアッセイ（後述する）による測定において、ＬＲＡＴまたはＡＲＡＴの触媒作用によるレチノールのエステル化の少なくとも２０％を抑制することが本発明の一部として発見された。従って、本発明の組成物中に式ＩのＮ−置換脂肪酸アミドが存在することで、化粧品組成物におけるレチノールまたはレチニルエステルの性能が実質的に改善される。
好ましい実施態様の説明
他の指示がない限り、すべての量は、最終組成物の重量を基準に表している。
本発明の組成物は、第一の重要な成分として、レチノールおよびレチニルエステルからなる群より選択される化合物を含む。「レチノール」という用語は、特に以下のレチノール異性体を含む。全トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール。好ましい異性体は、全トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。最も好ましくは、全トランス−レチノールであり、これは広範な商業的入手性のためである。
レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は、上で定義している。本発明においての使用に適したレチニルエステルは、レチノールのＣ1〜Ｃ30エステルであり、好ましくはＣ2〜Ｃ20エステル、最も好ましくはＣ2、Ｃ3およびＣ16エステルであり、これらはより一般的に入手しやすいからである。レチニルエステルの例を挙げると、限定するわけではないが、パルミチン酸レチニル、ギ酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、酪酸レチニル、吉草酸レチニル、イソ吉草酸レチニル、ヘキサン酸レチニル、ヘプタン酸レチニル、オクタン酸レチニル、ノナン酸レチニル、デカン酸レチニル、ウンデカン酸レチニル、ウラリン酸レチニル、トリデカン酸レチニル、ミリスチン酸レチニル、ペンタデカン酸レチニル、ヘプタデカン酸レチニル、ステアリン酸レチニル、イソステアリン酸レチニル、ノナデカン酸レチニル、アラキドン酸レチニル、ベヘン酸レチニル、リノール酸レチニル、オレイン酸レチニルが含まれる。
本発明において使用する好ましいエステルは、最も商業的入手性があり従って最も安価であるため、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニルから選ばれる。リノール酸レチニルも、その有効性のため好ましい。
レチノール及び／又はレチニルエステルは、本発明の組成物において０．００１％〜１０％の量が使用され、好ましい量は０．０１％〜１％、最も好ましい量は０．０１％〜０．５％である。
本発明の組成物の第二の重要な成分は、式Ｉで表わされるＮ−置換脂肪酸アミドである。
0003667772.tif 000004
式中、
Ｒ1は、炭素原子１〜１０個を有するアルキルまたはアルコキシ、
Ｒ2は、炭素原子８〜２５個を有するアルキルまたはアルケニル、
Ｒ3は、炭素原子１〜５個を含むアルキル、またはリン酸エステルである。
好ましくは、Ｒ1は、１〜５個の炭素原子、最も好ましくは１個または４個の炭素原子を含む直鎖飽和アルキルまたはアルコキシ基である。
Ｒ2は、好ましくは１０〜２０個の炭素原子、最も好ましくは１０〜１８個の炭素原子を含む直鎖不飽和アルケニル基である。
最適には、Ｒ2はリノール酸残基である（Ｃ18:2）。
Ｒ3は、好ましくはメチル基またはリン酸エステルであり、最も好ましくはコリンまたはグリコールのリン酸エステルである。
最も好ましくは、Ｎ−置換脂肪酸アミドは、以下の式ＡおよびＢの化合物から選択される。
0003667772.tif 000005
0003667772.tif 000006
Ｎ−置換脂肪酸アミドは、本発明の組成物中に０．０００１％〜５０％、好ましくは０．０１％〜１０％、最も好ましくは０．１％〜５％、の範囲の量が含まれる。
式ＩのＮ−置換脂肪酸アミドは、濃度１００μＭで、生体外ミクロソームアッセイによる測定において、ＬＲＡＴまたはＡＲＡＴの触媒作用によるレチノールのエステル化の少なくとも２０％を抑制することが好ましい。
生体外ミクロソームアッセイ
ミクロソームは、Ｊ．Ｃ．サーリ（Ｓａａｒｉ）とＤ．Ｌ．ブレッドバーグ（Ｂｒｅｄｂｅｒｇ）、『レチナール仮想上皮中のＣｏＡおよび非ＣｏＡ依存性レチノールエステル化（ＣｏＡ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ＣｏＡ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｔｉｎｏｌ  Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｆｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）』ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２６３巻、８０８４〜９０ページ、１９８８年、に記載のように入手される。
０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液と、５ｍＭのジチオスレイトールと、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと、４０マイクロモルのパルミトイルＣｏＡと、４０マイクロモルのジラウロイルホスファチジルコリンと、１０マイクロモルのレチノールと、試験化合物または溶媒ブランクと、を含む溶液に、ウシレチナール色素上皮細胞から単離したミクロソーム分画を加えて、３７℃で１時間インキュベーションする。インキュベーション後に、反応を同体積のエタノールを加えて停止させ、生成したレチニルエステル（ＬＲＡＴ触媒作用反応で生成するラウリン酸レチニルとＡＲＡＴ触媒作用反応で生成するパルミチン酸レチニル）をヘキサンで抽出する。ヘキサン層を取り出し、窒素雰囲気下で蒸発させ、得られた残渣を、３．９×３００ｍｍＣ18逆相カラムに８０％メタノールのテトラヒドロフラン溶液移動相と蛍光検出器（３２５ｎｍ励起、４８０ｎｍ発光）を用いたＨＰＬＣによる分析を行ない、レチニルエステルを定量する。溶媒ブランクの存在下で生成したエステル量を１００％として、これを試験した化合物のエステル生成の抑制率パーセントの計算に使用する。対照実験として、ミクロソームの一定分量を５分間煮沸して失活させると、エステル形成の少なくとも９５％が抑制される結果が得られる。
本発明の好ましい実施態様においては、Ｎ−置換脂肪酸アミドは、濃度１００μＭでＬＲＡＴまたはＡＲＡＴの触媒作用によるレチノールのエステル化を少なくとも４０％抑制するものが選択される。
化粧品に許容されるビヒクル
本発明による組成物は、レチノール及び／又はレチニルエステルおよびＮ−置換脂肪酸アミドのための希釈剤、分散剤または担体として作用させるための、化粧品に許容されるビヒクルも含み、これによって組成物を皮膚に使用する場合に広がりやすくなる。
水以外のビヒクル又は水に更に添加するビヒクルには、液体および固体の皮膚軟化剤、溶媒、湿潤剤、増粘剤及び粉体を包含し得る。特に好ましい非水系担体は、ポリジメチルシロキサン及び／又はポリジメチルフェニルシロキサンである。本発明のシリコーン類は、粘度範囲が２５℃で１０〜１０，０００，０００ｍｍ2／ｓ（センチストークス）に入るものを使用できる。特に望ましいものは、低粘度および高粘度シリコーンの混合物である。これらのシリコーンは、商標名ビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）、ＳＥ、ＳＦとしてゼネラル・エレクトリック・カンパニー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から、そして２００および５５０シリーズとしてダウ・コーニング・カンパニー（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できる。本発明の組成物において使用可能なシリコーンの量は、組成物の重量に対して、５％〜９５％、好ましくは２５％〜９０％である。化粧品に許容されるビヒクルは、組成物重量の、通常５％〜９９．９％、好ましくは２５％〜８０％を占め、他の化粧品添加物が存在しなければ、組成物の残りの部分を占める。ビヒクル重量に対して、好ましくはビヒクルは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０重量％が水である。好ましくは、組成物重量に対して、水は少なくとも本発明の組成物の５０重量％、最も好ましくは６０〜８０重量％を占める。
任意の皮膚に対して有益な材料および化粧品添加物
油および油性材料が、乳化剤とともに存在すると、使用する乳化剤の平均親水−親油平衡（ＨＬＢ）に主に依存して、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンのどちらかを得ることができる。
本発明の組成物は、好ましくは日焼け止め剤を含む。日焼け止め剤には、一般に紫外光を遮断するために利用する材料が含まれる。化合物の例として、ＰＡＢＡ、シンナメート、サリチレートの誘導体が挙げられる。例えば、メトキシ桂皮酸オクチル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）を使用することができる。メトキシ桂皮酸オクチルおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれ商標パーソル（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン−３として市販されている。エマルジョンに使用される日焼け防止剤の正確な量は、太陽のＵＶ放射からの所望の保護程度に依存して変化させることができる。
他の任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）より選択され、これらの脂肪酸は、全細胞の原形質膜形成に必須のものであり、ケラチノサイトのＥＦＡ欠乏は細胞の過剰増殖を引き起こす。ＥＦＡの補給によって、これは矯正される。またＥＦＡは、表皮の脂質生合成を促進し、表皮のバリア形成のための脂質を生成する。必須脂肪酸は、好ましくは、リノール酸、γ−リノレン酸、ホモ−γ−リノレン酸、コルンビン酸（columbinicacid）、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、ティムノドン酸（timnodonic acid）、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物、より選択される。
さらに別の好ましい任意成分は、アゾール類、例えば、クリンバゾール、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、エコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、ブトコナゾール、スルコナゾール、リオナゾール、およびこれらの混合物、より選択される。本発明の組成物中は、アゾールを０．００１〜５０重量％、好ましくは０．００１〜１０重量％、最も好ましくは０．１〜５％の量で含むことができる。
皮膚軟化剤は、しばしば本発明の化粧品組成物に混合される。このような皮膚軟化剤の量は、全組成物重量に対して０．５％〜５０％、好ましくは５％〜３０％の間の範囲となることができる。皮膚軟化剤は、エステル、脂肪酸やアルコール、ポリオールや炭化水素などの一般化学物質類に分類することができる。
エステルは、モノおよびジエステルであってもよい。脂肪酸ジエステルの許容される例には、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジエチル、ダイマー酸ジイソプロピル、コハク酸ジオクチルが含まれる。許容される分岐鎖脂肪酸エステルには、ミリスチン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸イソプロピル、パルミチン酸イソステアリルが含まれる。許容される三塩基酸エステルには、トリリノール酸トリイソプロピルおよびクエン酸トリラウリルが含まれる。許容される直鎖脂肪酸エステルには、パルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイルユーケート（ｏｌｅｙｌ  ｅｕｒｃａｔｅ）、オレイン酸ステアリルが含まれる。好ましいエステルには、ココ−カプリレート／カプレート（ココ−カプリレートおよびココ−カプレートの混合物）、プロピレングリコールミリスチンエーテルアセテート、アジピン酸ジイソプロピル、オクタン酸セチルが含まれる。
適切な脂肪酸アルコールおよび脂肪酸には、１０〜２０個の炭素原子を有する化合物が含まれる。特に好ましいものは、セチル、ミリスチル、パルミチルおよびステアリル、のアルコールおよび酸などの化合物である。
ポリオールの中で皮膚軟化剤として機能する可能性のあるものは、直鎖および分岐鎖アルキルポリヒドロキシル化合物である。例えば、プロピレングリコール、ソルビトール、グリセリンが好ましい。また、ポリプロピレングリコールやポリエチレングリコールなどの高分子ポリオールも使用できる。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透促進剤として特に好ましい。
皮膚軟化剤として機能しうる炭化水素の例としては、１２〜３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。具体的な例としては、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、イソパラフィン類が含まれる。
本発明の化粧品組成物に含まれる他の種類の機能性成分としては、増粘剤がある。増粘剤は、組成物に対して、通常０．１〜２０重量％、好ましくは０．５重量％〜１０重量％が存在できる。増粘剤の例としては、架橋ポリアクリレート材料が挙げられ、Ｂ．Ｆ．グッドリッチ・カンパニー（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）より商標名カーボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）として入手できる。キサンタン、カラゲナン、ゼラチン、カラヤゴム、ペクチン、イナゴマメゴムなどのゴム類も使用できる。ある状況では、増粘作用は、シリコーンや皮膚軟化剤としても作用する物質により行われることもある。例えば、粘度が１０センチストークスを超えるシリコーンゴムや、ステアリン酸グリセロールなどのエステルは、二つの機能性を有する。
本発明の化粧品組成物には、粉体を混合することもできる。
これらの粉体には、白亜、タルク、カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学修飾ケイ酸アルミニウムマグネシウム、有機修飾モンモリロナイト粘土、水和ケイ酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、アルミニウムスターチオクテニルスクシネート、およびこれらの混合物が含まれる。
他の添加物の微量成分も、本発明の化粧品組成物に混入することができる。これらの成分として、着色剤、乳白剤、香料が含まれる。これらその他の添加物微量成分の量は、組成物重量に対して０．００１％〜２０％までの範囲をとることができる。
組成物の使用
本発明の組成物は、主として人間の皮膚への局所的な使用のための製品、特に皮膚の調整と平滑化およびしわの出現や老化肌の防止や減少のための薬剤を意図したものである。
使用する場合は、組成物の少量、例えば１〜１００ｍｌ、を適当な容器またはアプリケーターから皮膚の露出領域に使用し、必要であるならば、次いで手や指や適当な器具を用いて組成物を皮膚に広げる及び／又は擦りこむ。
製品の形状および容器
本発明の局所的皮膚治療組成物は、ローション、クリーム、またはゲルとして適するように配合することができる。組成物は、適当な容器に入れて、その粘度および消費者の使用目的に適合させることができる。例えば、ローションやクリームは、びんやロールボールアプリケーター、または噴霧剤駆動エアゾール装置、または指による操作に適したポンプを取り付けた容器、の中に入れることができる。組成物がクリームである場合は、単純に非変形容器や搾り出し容器、例えばチューブやふた付きびんの中に貯蔵することができる。組成物は、米国特許第５，０６３，０５７号に記載のように、カプセル内に入れることもできる。
従って、本発明は、本明細書で定義した化粧品に許容される組成物を含む密閉容器もまた提供する。
以下の具体的な実施例により、本発明をより詳細に説明する。
材料および方法
細胞培養
新生児包皮からトリプシン処理により分離したヒトケラチノサイトを、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）ハムズ（Ｈａｍｓ）Ｆ１２（１：１）培地／１０％ウシ胎児血清中、放射線照射３Ｔ３マウス繊維芽細胞存在下において増殖させ、分割ケラチノサイトコロニーを確立した。細胞は、第二継代まで上記条件で増殖させ、後の使用のために冷凍保存した。冷凍した第二継代クラチノサイトは、解凍して上記培地で培養し、５日目の増殖後、クロネチクス・コーポレーション（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）のケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ）である０．１５ｍＭのＣａを含有する無血清ＭＣＤＢ１５３ベース培地、またはＧＩＢＣＯの０．０９ｍＭのＣａを含有するケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）に培地を変えた。７日目の、細胞が８０〜９０％の集密状態の時に、トリプシン処理を行ない、種々の実験のために無血清培地で培養した。
トランスグルタミナーゼアッセイ
トランスグルタミナーゼアッセイとケラチノサイトの分化
表皮の最終的分化の過程の間に、角化膜（ＣＥ）として知られる厚さ１５ｎｍのタンパク質層が、細胞周辺の内部表面に形成される。ＣＥは、表皮中で発現する少なくとも二種の異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）の触媒作用によるＮ−（γ−グルタミル）リシンのイソジペプチド結合形成により互いが架橋した多数の別個のタンパク質より構成される。トランスグルタミナーゼＩ（ＴＧアーゼＩ）は、表皮の分化層、特に顆粒層、において多量に発現するが、未分化基底表皮においては存在しない。従って、ＴＧアーゼＩは、表皮ケラチノサイト分化の有用なマーカーであり、高ＴＧアーゼ濃度はより分化した状態であることを示す。ＥＬＩＳＡに基づいてＴＧアーゼＩ抗体を利用したＴＧアーゼアッセイを使用して、以下の実施例における培養ケラチノサイトの分化状態の評価を行った。
実施例１においては、以下の手順を使用した。
ケラチノサイト（前述のように培養したもの）を、９６ウェルプレートで、ウェル当たり２００μｌの培地中３，０００細胞の密度で培養した。４日間の培養の後、培地を試験化合物を含む培地に交換した（一試験当たり６レプリカ）。細胞は、さらに７２時間培養し、その後培地を吸引してプレートを−７０℃で保存した。フリーザーからプレートを取り出し、細胞をＰＢＳで洗浄した。滅菌水１００μｌを加えて、細胞を−７０℃で冷凍して凍結割断を行ない、その後解凍した。細胞に、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン）を加えて、室温（Ｒ／Ｔ）で１時間保った後、新鮮な一定分量洗浄緩衝液で洗浄した。バイオメディカル・インダストリーズ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）より入手した第一抗体モノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼマウス抗体（ＩｇＧ）を洗浄緩衝液で１：２，０００に希釈したもの５０μｌを細胞に加えて３７℃で１時間保温し、その後洗浄緩衝液で二度洗浄した。続いて、第二抗体（Ｆａｂフラグメント、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）より入手したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ）を洗浄緩衝液で１：４，０００に希釈したもの５０μｌを細胞に加えて３７℃で１時間保温し、その後洗浄緩衝液で二度洗浄した。基質溶液（ｏフェニレンジアミン４ｍｇと３０％Ｈ2Ｏ2３．３μｌを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に加えたもの）を細胞に加え、アルミニウム箔下の暗所においてＲ／Ｔで５分間保った。４ＮのＨ2ＳＯ4５０μｌを加えて、反応を停止させた。試料の吸光度を、４９２ｎｍでプレートリーダーを用いて読み取った。六つのレプリカのうち、四つは両方の抗体で処理を行ない、二つは第二抗体のみで処理を行った（すなわち、酵素結合抗体のバックグラウンド結合を測定するため）。ＴＧアーゼ量を、各処理の読み取り値からバックグラウンドの値を引いて求め、両方の抗体で処理したレプリカについて平均±ｓ．ｄ．を求めた。
実施例３においては、以下の手順を用いた。
ケラチノサイト（前述のように培養したもの）を、９６ウェルプレートで、ウェル当たり２００μｌの細胞培養培地中３，０００細胞の密度で培養した。４日間の培養の後、培地を試験化合物を含む培地に交換した（一試験当たり６レプレカ）。細胞は、さらに７２時間培養し、その後培地を吸引してプレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから取り出した後に、細胞をさらに冷凍して凍結割断を行ない、その後解凍してＰＢＳで三度洗浄した。細胞は、ＴＢＳ／５％ＢＳＡ緩衝液を加えて室温（Ｒ／Ｔ）で１時間保った。次に、バイオメディカル・テクノロジーズ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）より入手したモノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ（ＩｇＧ）マウス抗体（第一抗体）をＴＢＳ／１％ＢＳＡ緩衝液で１：２，０００に希釈したもの１００μｌを細胞に加えて、３７℃で２時間保温した後、洗浄緩衝液（ＴＢＳ／１％  ＢＳＡ／０．０５％  トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）で六度洗浄した。次に、アマシャムより入手したＦａｂフラグメント、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（第二抗体）を洗浄緩衝液で１：４，０００に希釈したもの１００μｌを細胞に加えて、３７℃で２時間保温して、その後洗浄緩衝液で三度洗浄し、さらにＰＢＳで三度洗浄した。細胞に基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン４ｍｇと３０％Ｈ2Ｏ2３．３μｌを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に加えたもの）を加えて、アルミニウム箔下の暗所においてＲ／Ｔで５分間保った。反応を、４ＮのＨ2ＳＯ4５０μｌを加えて停止させた。試料の吸光度を、４９２ｎｍでプレートリーダー内で読み取った。六つのレプリカのうち、四つは両方の抗体で処理を行ない、二つは第二抗体のみで処理を行った（すなわち、酵素結合抗体のバックグラウンド結合を測定するため）。トランスグルタミナーゼＩ（ＴＧアーゼＩ）量を、各処理の読み取り値からバックグラウンドの値を引いて求め、両方の抗体で処理したレプリカについて平均±ｓ．ｄ．を求めた。
ＤＮＡアッセイ
細胞の処理後に測定したＴＧアーゼＩ量は、細胞数の影響を受ける可能性があり、すなわち細胞数が多ければ検出されるＴＧアーゼ量も多くなる。ＴＧアーゼＩは、同一ウェル中の細胞のＤＮＡ含量に応じて規格化し、これによって細胞数の違いによる変動はなくなった。各細胞は事実上同一のゲノムを有し、従って同一のＤＮＡ量を有するため、ＤＮＡの定量は、ケラチノサイト細胞数を含めて細胞数の指標として特に有用である。したがって、ウェルに含まれる細胞の全ＤＮＡ含量は、ウェル中の細胞数に直接比例する。ＤＮＡの定量を、ＴＧアーゼデータの細胞数による規格化に使用した。
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートで、ウェル当たり２００μｌの培地中３，０００細胞の密度で培養した。４日間の培養の後、培地を試験化合物を含む培地に交換した（一試験当たり６レプリカ）。細胞は、さらに７２時間培養し、その後培地を吸引してプレートを−７０℃で少なくとも１．５時間保存した。プレートをフリーザーから取り出し、３０分間かけて解凍した。１００μｌ／ウェルのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）色素（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加えて、１５分間定温放置し、カバーを付けた後に蛍光計で読み取りを行った（励起３６０ｎｍ、発光４６０ｎｍ）。色素溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄して、ＴＧアーゼアッセイに備えた。
実施例１
ケラチノサイト分化状態を変化させることにおいて、レチノイン酸はレチノールよりも効果的である。
レチノイン酸（ＲＡ）およびレチノール（ＲＯＨ）を添加した後の、細胞のＤＮＡ含量で規格化したトランスグルタミナーゼ量への影響を調べ、その結果を表１に示した。
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試験を行ったレチノイン酸の全濃度、すなわち２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍ、２．５×１０-9Ｍ、におけるケラチノサイト分化の減少は、対応する２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍ、２．５×１０-9Ｍのレチノール処理と比較して、より顕著であった。トランスグルタミナーゼ量の減少は、レチノイン酸およびレチノールのどちらについても用量に依存した。このことは、表皮分化に関してレチノイン酸がレチノールよりも高い抑制効果を示すことと矛盾しない。
実施例２
生体外ミクロソームにおけるレチノールのエステル化
ミクロソームは、Ｊ．Ｃ．サーリとＤ．Ｌ．ブレッドバーグ、『レチナール仮想上皮中のＣｏＡおよび非ＣｏＡ依存性レチノールエステル化』ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２３巻、８０８４〜９０ページ、１９８８年、に記載のように入手される。
０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液と、５ｍＭのジチオスレイトールと、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと、４０マイクロモルのパルミトイルＣｏＡと、４０マイクロモルのジラウロイルホスファチジルコリンと、１０マイクロモルのレチノールと、試験化合物または溶媒ブランクと、を含む溶液に、ウシレチナール色素上皮細胞から単離したミクロソーム分画を加えて、３７℃で１時間保温した。保温後に、反応を同体積のエタノールを加えて停止させ、生成したレチニルエステル（ＡＲＡＴ触媒作用反応で生成するパルミチン酸レチニルとＬＲＡＴ触媒作用反応で生成するラウリン酸レチニル）をヘキサンで抽出した。ヘキサン層を取り出し、窒素雰囲気下で蒸発させ、得られた残渣を、３．９×３００ｍｍＣ１８逆相カラムに８０％メタノールのテトラヒドロフラン溶液移動相と蛍光検出器（３２５ｎｍ励起、４８０ｎｍ発光）を用いたＨＰＬＣによる分析を行ない、レチニルエステルを定量した。溶媒ブランクの存在下で生成したエステル量を１００％として、これを試験した化合物のエステル生成の抑制率パーセントの計算に使用した。対照実験として、ミクロソームの一定分量を５分間煮沸して失活させると、エステル形成の少なくとも９５％が抑制される結果が得られた。
得られた結果を表２Ａおよび２Ｂにまとめた。
表２Ａにおける化合物は、濃度１００μＭで試験した。表２Ｂにおける化合物は、濃度１０μＭで試験した。
式Ｃの化合物は、本発明の範囲には入らないが、同様に試験を行った。
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表２Ａおよび２Ｂの結果から、Ｒ2が７個を超える炭素数を有するＮ−置換脂肪酸アミド（すなわち式ＡおよびＢ）は、ＬＲＡＴおよびＡＲＡＴ触媒作用エステル化反応の有力な抑制剤であることが分かる。
実施例３
表３に挙げた化合物およびその組み合わせの、ケラチノサイト分化への影響を調べた。結果は、対照に対する％で表記した。トランスグルタミナーゼ量はＤＮＡで規格化した。
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２．５×１０-7Ｍレチノイン酸は、ケラチノサイトＴＧ１量を抑制するのに効果的であった（対照量に対して６９％）。２．５×１０-7Ｍレチノールおよび１０-4Ｍ式Ａ化合物は、単独で使用した場合は、ケラチノサイトＴＧアーゼＩ抑制効果が低くなった。しかしながら、２．５×１０-7Ｍレチノールと１０-4Ｍ式Ａ化合物を組み合わせた場合は、ケラチノサイトＴＧアーゼＩを対照量に対して５８％まで抑制した。また、この実施例は、ミクロソームアッセイと細胞培養データの良い相関を証明している。
実施例４〜９は、本発明による局所的組成物の例である。組成物は、従来法により処理することができる。これらは化粧用途に適したものである。特にこれらの組成物は、しわ、荒れ、乾燥、薄片状、加齢及び／又はＵＶ損傷皮膚の外観および触感を改善する用途に適しており、さらに健康な皮膚を劣化から防止または遅延させる用途に適している。
実施例４
本実施例は、本発明の組成物を含む高分散相の油中水型エマルジョンの例である。
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実施例５
本実施例は、本発明の組成物を含む水中油型クリームの例である。
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実施例６
本実施例は、本発明の組成物を含むアルコール性ローションの例である。
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実施例７
本実施例は、本発明の組成物を含む別のアルコール性ローションの例である。
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実施例８
本実施例は、本発明の組成物を含むサンケアクリームの例である。
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実施例９
本実施例は、本発明の組成物を含む非水性スキンケア組成物の例である。
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実施例で試験を行った化合物は、以下の供給先より入手できる。
化合物                  供給先
レチノール              Ｓｉｇｍａ
パルミチン酸レチニル    Ｓｉｇｍａ
レチノイン酸            Ｓｉｇｍａ
Ｎ−置換脂肪酸アミド    ユトレヒト大学（オランダ）