(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型因子ＩＸおよび不活性型因子ＩＸを含有する溶液中の因子ＩＸの精製方法であって、下記工程を特徴とする方法：
該溶液をアニオン交換樹脂に適用すること、
該アニオン交換樹脂を第１の洗浄液で洗浄すること、
該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得ること、
ここに該第１の溶離液は該第１の洗浄液の導電率および該溶液の導電率のうち高い方よりも低い導電率を有するものであり、
該溶離物をヘパリン様樹脂に適用すること、
該ヘパリン様樹脂を第２の溶離液で溶離して第２の溶離物を得ること、
該第２の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用すること、ついで
該ヒドロキシアパタイト樹脂を第３の溶離液で溶離して第３の溶離液を得ること。
【請求項２】
該第１の洗浄液の導電率が該溶液の導電率よりも高いか等しいものである請求項１の方法。
【請求項３】
該第１の洗浄液が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムからなる群より選択される溶液を含むものである請求項２の方法。
【請求項４】
該第１の洗浄液が２００ｍＭ塩化ナトリウムである請求項３の方法。
【請求項５】
下記工程：
該第３の溶離物を固定化金属アフィニティー樹脂に適用し、次いで、
該固定化金属アフィニティー樹脂を第４の溶離液で溶離して第４の溶離物を得ること
をさらに特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項の方法。
【請求項６】
該第１の溶離液が、カルシウム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より選択される２価カチオンを含むものである請求項１ないし５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
該第１の溶離液が１０ｍＭカルシウムである請求項６の方法。
【請求項８】
該アニオン交換樹脂が、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および４級アミノエタン（ＱＡＥ）からなる群より選択されるメンバーである正に帯電した基を有するものである請求項１ないし７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
該アニオン交換樹脂がQ-Sepharose Fast Flow（商標）である請求項８の方法。
【請求項１０】
該ヘパリン様樹脂が、ヘパリン、セルロースの硫酸エステル、スルフィルプロピル（ＳＰ）、カルボキシルおよびカルボキシメチルからなる群より選択されるメンバーである負に帯電した基を有するものである請求項１ないし９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
該ヘパリン様樹脂がMatrex Cellufine Sulfate（商標）である請求項１０の方法。
【請求項１２】
該第２の溶離液が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群より選択されるメンバーである請求項１ないし１１のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
該第２の溶離液が５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,０.５０Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０である請求項１２の方法。
【請求項１４】
該第３の溶離液が、リン酸塩および硫酸塩からなる群から選択されるメンバーである請求項１ないし１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】
該第３の溶離液が０.５Ｍリン酸カリウム,０.２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該ヒドロキシアパタイト樹脂が、セラミック−ヒドロキシアパタイトおよびBioGel-HTからなる群より選択されるメンバーである請求項１ないし１５のいずれか１項の方法。
【請求項１７】
該ヒドロキシアパタイト樹脂がセラミック−ヒドロキシアパタイトである請求項１６の方法。
【請求項１８】
該固定化金属アフィニティー樹脂が、Fractogel-EMD-Chelate（商標）、Chelating-Sepharose（商標）、Matrex Cellufine Chelate（商標）およびPOROS 20MC（商標）からなる群より選択されるメンバーである請求項５ないし１７のいずれか１項の方法。
【請求項１９】
該第４の溶離液が置換物質である請求項５ないし１８のいずれか１項の方法。
【請求項２０】
該置換物質が、イミダゾール、ＥＤＴＡ、グリシン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓからなる群より選択されるメンバーである請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
一般的には、本発明は、新規蛋白回収および精製方法に関し、より詳細には、因子ＩＸの回収および精製のための新規方法に関する。
発明の背景
現在、組み換え法の出現は、適当に形質転換された宿主細胞内での高レベルの蛋白の生産を可能にする。分泌蛋白については、目的蛋白の精製は、宿主細胞培地からの単離および精製を必要とする。典型的には、培地は選択栄養素（例えば、ビタミン類、アミノ酸、コファクター、無機質）およびさらなる増殖因子／補足物（インスリンおよび可能なさらなる外来性蛋白を包含）を含有する。ならし培地は目的分泌生成物のみならず、さらに分泌された有意な量の宿主細胞蛋白および他の物質（例えば、核酸、膜小胞）を含有する。高レベルで発現されても、目的生成物はならし培地中に存在するすべての蛋白のうちの少量のものであるかもしれない。形質転換宿主細胞により分泌される蛋白が目的生成物の性質とはまったく異なった性質（例えば、電荷、分子サイズ、アミノ酸組成）を有することは意外なことではない。同様に、選択された分泌宿主細胞蛋白は目的生成物の特性と非常に類似した特性を示すかもしれず、そのことにより重要な課題が精製に用いるプロセスに課せられる。ならし培地からの組み換え蛋白の精製のためのプロセスの開発が行われているが、使用条件（分離のための大きな利益を得るために、分泌蛋白間のわずかな相違を利用するするための使用できる条件）が目的生成物の変性により限定されるということは重要であり、そのことにより、存在する他のすべての宿主細胞蛋白からの目的生成物の分離が困難となっている。
上記分泌宿主蛋白のほかに、ならし培地は、目的生成物をコードしているが種々雑多に発現された遺伝子に由来する生成物を含んでいるかもしれない。これらは最終薬剤物質として望ましいものではなく、例えば、糖鎖付加、硫酸化、ガンマカルボキシレーション、または生物学的活性に潜在的に必要な他の修飾のごときある種の翻訳後修飾を欠く生成物形態を包含する。さらに、目的生成物の蛋白分解的に分解された形態もならし培地に存在するかもしれず、それらを精製途中で除去する必要があるが、それらは目的生成物に非常に近似している。不幸なことに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーのごときたいていのアプローチは、これらの望ましくない形態から、ヒトの治療という状況に使用されるに必要な目的生成物の分離の程度を提供しないかもしれない。所望生成物と汚染混入物質との間のわずかな相違（例えば、わずかな電荷の相違、分子サイズのわずかな相違）をフルに利用するためには、強力な変性剤の使用がしばしば必要である。しかしながら、かかる変性剤は、生物学的活性の損失、新たな抗原部位の発現、および選択された翻訳後修飾物の化学的分解の潜在的促進をもたらす可能性がある。
類似の特性を有する分子（例えば、発現遺伝子の修飾形態）からの目的生成物の分離のほかに、所望生成物と特異的に反応するならし培地中に存在する成分から所望生成物を分離する必要があることを認識することは重要である。目的蛋白が正に帯電している場合、それは負に帯電している分子に結合する傾向があり、そのことは伝統的方法による生成物の精製を困難にする。
本発明に関する一般的背景は以下のごとし。Yan,USPN4981952（１９９１年１月１日）およびYan,et al.Bio/Technology 8:655（１９９０年６月）には、ビタミンＫ依存性蛋白の精製のための偽アフィニティーアイオン交換クロマトグラフィーの使用が開示されている。Josic,et al.J.Chrom.632:1(1993)には、他のビタミンＫ依存性蛋白からの因子ＩＸの分離のためのヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの使用が開示されている。Suomela,Thromb.Res.7:101(1975);Suomela,Eur.J.Bio.Chem.71:145(1976);およびSuomela,Thrombos.Haemostasis.35:211(1976)には、種々のクロッティング因子および因子ＩＸ血漿変種の分離におけるヒドロキシアパタイトの使用が記載されている（炭水化物部分、例えばシアル酸およびガラクトースの含量の相違による電荷の相違に基づく）。しかしながら、Reekers,et al.Haemostasis 1:2(1972)には、ヒドロキシアパタイトが因子ＩＩ、ＶＩＩおよびＩＸを互いに分離できず、またこれらを他の血漿蛋白からも分離できないことが示されている。Schwinn,et al.USPN 4411794には、濃度５０〜２００ｍＭのカルシウム存在下においてヒドロキシアパタイトを用いる血液クロッティング因子の部分精製が開示されている。Feldman,et al.Biotech.Blood Proteins 227:63(1993)およびRoberts,et al.Vox Sang 67(suppl.1):69(1994)には、酸性化および銅荷電キレートセファロース（因子ＩＸがヒト・血漿から低収率で得られた）を用いるウイルス感染性の低減が開示されている。
典型的には、研究者は伝統的クロマトグラフィー法を用いて所望生成物を精製してきた。しばしば、かかる方法はヒトの治療用製品に望まれる純度および均一性のレベルまでの生成物の精製が不十分である。研究者は、目的蛋白が特異的相互作用する固定化リガンドに結合するアフィニティークロマトグラフィーの使用によりこの困難を克服しようとした。適当な洗浄後、リガンド−蛋白相互作用を破壊することにより所望生成物を溶離することができ、しばしば、有意に純粋な溶離物が得られる。しかしながら、ならし培地中に存在する修飾形態からの所望生成物の分離の場合に、１工程のアフィニティークロマトグラフィー法は不十分であるかもしれず、他のアフィニティー樹脂および／または伝統的分離法と組み合わせて使用しなければならない。高分解能アフィニティークロマトグラフィー工程（例えば、固定化モノクローアル抗体を用いる免疫アフィニティー精製）でさえも、相互作用部位が共通しているために他の成分から所望生成物の十分に分離できないかもしれない（例えば、目的生成物に存在するエピトープが蛋白分解された形態の生成物にも存在する場合）。
したがって、かかる困難を効果的に克服する蛋白精製法に対する必要性が当該分野において存在し続けている。
発明の簡単な概要
因子ＩＸを含有する溶液をアイオン交換樹脂に適用し、樹脂から因子ＩＸを溶離するのに必要な導電率よりも低い導電率を有する溶液で該アニオン交換樹脂を洗浄し、該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得て、該溶離物をヘパリンまたはヘパリン様（例えば、負に帯電したマトリックス）樹脂に適用し、該ヘパリンまたはヘパリン様樹脂を第２の溶離液で溶離して第２の溶離物を得て、該第２の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用し、次いで、該ヒドロキシアパタイト樹脂を第３の溶離液で溶離して精製因子ＩＸを含有する第３の溶離物を得ることを特徴とする、溶液中の因子ＩＸの精製方法が本発明により提供される。第１の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用してもよい。また、該方法は、第３の溶離物を固定化金属アフィニティー樹脂に適用し、次いで、固定化金属アフィニティー樹脂を第４の溶離液で溶離して精製因子ＩＸを含有する第４の溶離物を得ることをさらに特徴としてもよい。本発明方法によれば、因子ＩＸは血漿由来のもの、培養細胞により発現されたもの、あるいは当業者に知られたように組み換え的に製造されたものであってよい。好ましくは、第１の洗浄液は、因子ＩＸをカラムから溶離するのに必要な導電率よりも低く、一般的には、負荷溶液および第１の溶離液バッファーの導電率よりも高いかまたは同等の導電率を有する溶液を含む。この導電率は、第１の溶離物中に存在することになる混入蛋白の大部分を除去するのに十分なものである。適当な第１の洗浄液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムのごとき塩溶液を含み、適当なバッファー剤を含有していもよい。適当な濃度範囲は、因子ＩＸを溶離することなく汚染混入物質を除去するのに有効なものであり、２５ｍＭないし２００ｍＭの塩、好ましくは２００ｍＭの塩化ナトリウムを包含する。第１の溶離液は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム、亜鉛、コバルトおよびニッケルのごとき２価カチオンを含む。適当な濃度範囲は、因子ＩＸの溶離に効果的なものであり、例えば、５ないし１００ｍＭの範囲、好ましくは５０ｍＭのｐＨ約８.０のＴｒｉｓのごときバッファー剤、５０ないし２５０ｍＭの範囲、好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌ、および５ないし２０ｍＭの範囲、好ましくは約１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する溶液を包含する。
適当なアニオン交換樹脂は、ジエチルアミノエステル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、および４級アミノエタン（ＱＡＥ）のごとき正に帯電した基を有する樹脂を包含し、Q-Sepharose Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow、Poros-Q、Fractogel-TMAE、Fractogel-DMAE、およびQAE-Toyopearlを包含するが、好ましい樹脂はQ-Sepharose Fast Flow（Pharmacia）である。
第２の溶離液は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを伴ったＴｒｉｓのごときバッファー中の適当な塩であってよく、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,０.５０Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０が好ましい。適当なヘパリンまたはヘパリン様樹脂は、ヘパリン、セルロースの硫酸エステル、スルフィルプロピル（ＳＰ）、カルボキシル、およびカルボキシメチルのごとき負に帯電した基を有する樹脂を包含し、Matrex Cellufine Sulfate、Heparin Sepharose、Heparin Toyopearl、Carboxy Sulfon、Fractogel EMD-SO3、およびFractogel-EMD COOを包含するか、好ましいのはMatrex Cellfine Sulfateである。
第３の溶離液はリン酸塩および硫酸塩のごとき塩であってよく、０.５Ｍリン酸カリウム、０.２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２が好ましい。適当なヒドロキシアパタイト樹脂は、セラミック−ヒドロキシアパタイト、Biogel HT等のごときリン酸カルシウムを含有するものを包含するが、セッラミック−ＨＡが好ましい。固定化金属アフィニティー樹脂は、Fractogel-EMD-Chelate、Chelating-Sepharose、Matrex Cellufine Chelate、およびPOROS 20MCを包含するが、本発明にはFractogel-EMD-Chelateが好ましい。第４の溶離液は、イミダゾール、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、グリシン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓのごときキレーターを含有するバッファー溶液であるが、好ましいのは２０ｍＭリン酸カリウム,１５ｍＭイミダゾール、０.１Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１である。
本発明方法により製造される因子ＩＸ組成物も本発明により提供される。そのようにして製造された因子ＩＸは２４０〜４００Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を有し、約２４０Ｕ／ｍｇであってもよい。
発明の詳細な説明
本明細書の用語「因子ＩＸ」は、血漿、形質転換細胞系から単離された因子ＩＸ、ならびに宿主細胞培養培地から単離された組み換え的に生産された因子ＩＸを包含するがこれらに限らない。
本明細書の用語「アニオン交換樹脂」は、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、イエチレンイミン（ＰＥＩ）、および４級アミノエタン（ＱＡＥ）のごとき正に帯電した部分（中性ｐＨにおいて）を有する樹脂を包含し、例えば、Q-Sepharose Fast Flow（Pharmacia）、DEAE-Sepharose Fast Flow、DEAE-Toyopearl、QAE-Toyopearl,POROS-Q、Fractogel-DMAE、Fractogel-TMAE、Matrex Cellufine DEAE等を包含するがこれらに限らない。
本明細書の用語「第１の洗浄液」は、アニオン交換カラムから因子ＩＸを溶離させるのに必要な導電率よりも低い導電率を有する溶液を包含するがこれに限るものではなく、一般的には、その導電率は、負荷溶液の導電率および第１の溶離液の導電率よりも高いかまたはそれらと同等である。この導電率は、第１の溶離物中に存在することになる混入蛋白の大部分を除去するのに十分なものである。適当な第１の洗浄液は塩溶液であってよく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを包含し、適当にバッファー化することができる。典型的には、低濃度（２５ｍＭ塩）から高濃度（２００ｍＭ塩）にいたる濃度範囲であり、２００ｍＭ塩化ナトリウムが好ましい。
本明細書の用語「第１の溶離液」は、約０.０５Ｍの濃度のバッファー剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、２価カチオン不存在下では樹脂から溶離するには十分でない濃度（例えば、約０.１０Ｍ〜０.２０Ｍ）の塩（例えば、ＮａＣｌ）、および低濃度（約０.０１Ｍ）の２価カチオン（例えば、ＣａＣｌ2）を含むｐＨ８の溶液を包含するが、これに限らない。好ましくは、「第１の溶離液」は「第１の洗浄液」よりも低い導電率を有する。
本明細書の用語「ヘパリン」樹脂および「ヘパリン様」樹脂を互いに交えて使用し、それらはヘパリン、セルロースの硫酸エステル、スルフィルプロピル（ＳＰ）、カルボキシル、およびカルボキシメチルのごとき負に帯電した基を有する樹脂を包含し、Fractogel EMD-SO3、Carboxy Sulfon、Fractogel-EMD COO、Heparin Sepharose、Matrex Cellufine Sulfate、およびを包含するがこれらに限らない。
本明細書の用語「第２の溶離液」は、約０.０５Ｍの濃度のバッファー剤（例えばＴｒｉｓ）、因子ＩＸと負に帯電した樹脂支持体との相互作用を破壊するに十分な濃度（例えば０.０５Ｍ）の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4）を含むｐＨ８.０の溶液を包含するが、これに限らない。本発明プロセスに用いる場合には、第２の溶離液はその後のプロセス工程、すなわちヒドロキシアパタイトに適合すべきである。
本明細書の用語「ヒドロキシアパタイトカラム」は、例えばBioGel-HTおよびセラミック−ヒドロキシアパタイトのごときリン酸カルシウムゲル支持体を包含するが、これらに限らない。
本明細書の用語「第３の溶離液」（および「第２のリン酸塩バッファー」）は、因子ＩＸと樹脂との相互作用を破壊するに十分な濃度（例えば、約０.２０Ｍなたはそれ以上）のバッファー剤（例えば、リン酸塩または硫酸塩）および因子ＩＸとヒドロキシアパタイト樹脂との電荷相互作用を最小化するに十分な濃度で存在する塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）を含む中性ｐＨ（ｐＨ７.２）の溶液を包含するが、これに限らない。用語「第１のリン酸塩バッファー」は、不活性形態の因子ＩＸをヒドロキシアパタイト樹脂から除去するに十分な濃度のバッファー剤（例えば、リン酸塩または硫酸塩）を含む溶液を包含するが、これに限らない。
本明細書の用語「固定化金属アフィニティー樹脂」（ＩＭＡＣ）は、多価カチオンに結合し、調和して機能しうる固定化官能基（例えば、イミノジ酢酸）を含む樹脂を包含し、Chelating-Sepharose、Fractogel-EMD-Chelate、POROS 20MC、およびMatrex Cellufine Chelateがあるが、これらに限らない。結合金属イオンをいくつかの可能な選択物から選択することができ、銅、ニッケル、カドミウム、コバルト、鉄、亜鉛またはストロンチウムがあるが、これらに限らない。
用語「第４の溶離液」（「置換物質」ともいう）は、ＩＭＡＣ樹脂支持体に結合因している子ＩＸと置換するが、樹脂支持体の固定化されている金属イオンとの置換が最小である化合物を包含し（これに限らない）、グリシン、ヒスチジン、ｔｒｉｓ、イミダゾール、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等があるがこれらに限らない。置換物質の適当濃度は結合アフィニティーにより変化し、実験的に条件を評価することにより確認できることを、当業者は容易に理解する。典型的には、低濃度（例えば、５〜１５ｍＭの置換物質）ないし高濃度（例えば、１００〜２００ｍＭの置換物質）の範囲の濃度である。
因子ＩＸについていう比活性「Ｕ／ｍｇ」は、プールされた血漿または単離血漿を用い、精製ＩＸを標準物質として用いるインビトロ（ＡＰＴＴ）クロッティングアッセイにおいて決定される生物学的活性を包含するが、これに限らない。ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、色素によるアッセイ（例えば、Bradford法、Lowry法）または２８０ｎｍにおける吸光度を包含するいくつかの適当に確認された方法により蛋白濃度を決定することができる。因子ＩＸ欠損血漿を用いるPittman,D.,et al.,Blood 79:389-397(1992)の方法により因子ＩＸの活性を決定する。
図１はプロセスの概要を示す。示された工程の順序は目下好ましい順序であるが、所望ならば順序を入れ替えることができ、工程を省力することができることが当業者により理解されるであろう。
本発明によれば、まず、約０.６μｍの孔サイズの十字フロー濾過膜用いる精密濾過（ＭＦ）により細胞をならし培地から除去する。深さ０.４５μｍのフィルターで濾過することにより、精製用の無細胞ならし培地を調製してもよい。次いで、無細胞ならし培地を限外濾過により濃縮することができ、次いで、所望ならば、第１のクロマトグラフィー工程に負荷するための適当なバッファー中に透析濾過する。別法として、適当なバッファーで平衡化した第１のクロマトグラフィーカラムに無細胞ならし培地を直接負荷してもよい。
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最初のプロセス工程であるＵＦ／ＤＦ＃１には、無細胞因子ＩＸ含有ならし培地の限外濾過による濃縮、次いで、透析濾過が必要である。因子ＩＸが第１のクロマトグラフィーカラムに結合することは必要ないとしても、この工程は低分子量細胞培養培地成分の除去に効果的である。かかる成分は最初のクロマトグラフィーカラムに結合するかもしれず、それにより因子ＩＸに対するカラム容量が低下する。その後の処理のために、ＵＦ／ＤＦ＃１を用いて因子ＩＸを適当なバッファー溶液中に置換する。
第１のクロマトグラフィー工程、すなわちQ-Sepharose Fast Flow(FF)（Pharmacia）によるアニオン交換において、因子ＩＸが捕捉され、ＵＦ／ＤＦ＃１濃縮物プール中に存在する宿主細胞成分から精製される。Q-SepharoseFFカラムは因子ＩＸを吸着し、操作ｐＨよりも高い等電点を有する混入している宿主細胞蛋白は、カラムを素通りすることによりプロセスの流れから除去される。次いで、緩やかに結合している汚染混入物質を除去する前に、因子ＩＸが吸着しているカラムを洗浄し、溶離用に調製するバッファーの導電率を調節する。
典型的には、バッファーのイオン強度を増加させることにより結合蛋白をQ-Sepharose FFから溶離させる。しかしながら、因子ＩＸの精製プロセスは、例えば塩化カルシウムをバッファーに添加することにより活性因子ＩＸを溶離する偽アフィニティーアニオン交換モードにおいてこの樹脂を使用する。この２価カチオンは、活性形態の因子ＩＸを樹脂から溶離させる。この溶離バッファーとともにいくつかのあまり活性でない因子ＩＸもQ-Sepharose FFカラムから溶離されるかもしれない。選択された不活性形態の因子ＩＸおよび他の混入宿主細胞蛋白はカラムに結合したままである。Q-Sepharose FF工程により因子ＩＸの純度が有意に向上する。
第２のクロマトグラフィー工程において、Q-Sepharose FF溶離物プールを希釈せずに直接Matrex Cellulose Sulfateカラム上に負荷する。因子ＩＸはカラムに吸着するが、他の混入蛋白（例えば、Q-Sepharose FF溶離物中に存在する可溶性ＰＡＣＥおよび他の宿主細胞蛋白）はカラムを素通りすることによりプロセスの流れから除去される。低イオン強度バッファーでカラムを洗浄してすべての未結合蛋白を除去する。塩（例えば、塩化ナトリウム）を用いてバッファーのイオン強度を増加させることにより因子ＩＸを溶離する。
第３のクロマトグラフィー工程、すなわちCeramic-HAカラムクロマトグラフィーを行っている間に不活性な因子ＩＸ形態のさらなる除去を行う。Matrex Cellufine Sulfate溶離物プールのｐＨを約７.５に合わせ、次いで、溶離物プールをCeramic-HAカラム上に直接負荷する。因子ＩＸはカラムに吸着する。Ceramic-HAカラムをバッファーで洗浄して緩やかに結合している汚染混入物質を除去し、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム,０.１８５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.２）で洗浄して固く結合している汚染混入物質（不活性形態の因子ＩＸを包含する）を除去する。高濃度のリン酸カリウム（例えば、２００ｍＭまたはそれ以上,ｐＨ７.２）を溶離液として用いるステップ−ワイズ様式で、結合している活性因子ＩＸを溶離させる。
第４のクロマトグラフィー工程、すなわちFractogel EMD-Chelate-Cu(II)クロマトグラフィーにより、まだ生成物の流れに存在している低レベルの混入宿主細胞蛋白を除去する。Ceramic-HA溶離物プールをFractogel EMD-Chelate-Cu(II)カラムに直接負荷する。因子ＩＸおよび多くの汚染混入蛋白がカラムに吸着する。バッファー中の低濃度のイミダゾール（例えば、約１５ｍＭ）により精製活性因子ＩＸがカラムから溶離され、残存する混入宿主細胞蛋白はカラムに結合したままとなることにより生成物の流れから除去される。
最後に、限外濾過、次いで、ポリソルベート８０不含であること以外は）処方バッファーと同じバッファー中への透析濾過（ＵＦ／ＤＦ＃２）によりFractogel EMD-Chelate-Cu(II)溶離物プールを濃縮する。適当な処方バッファーは、ヒスチジン、グリシン、蔗糖、およびポリソルベート８０（それぞれ１０ｍＭ、２６０ｍＭ、１％、および０.００５％であってもよい）を含む。透析濾過が完了したら、因子ＩＸを目的濃度にまで濃縮する。生成物プールをＵＦ／ＤＦ＃２装置から取り、ポリソルベート８０を目的濃度０.００５％となるまで添加することにより処方する。次いで、因子ＩＸ薬剤物質をサンプリングし、ラベルを貼り、次いで、約−８０℃で保存する。最終プロセス工程であるＵＦ／ＤＦ＃２は、有意な蛋白変性または損失なしに精製因子ＩＸ薬剤物質を濃縮し透析濾過することにおいて有効である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元および非還元）は、プロセス全体の質を評価するための１の方法である。各工程は８０％ないし１００％の回収率であり、因子ＩＸの平均の正味の収率は約５１％である。精製プロセスに供する前のクロッティング活性と因子ＩＸ薬剤物質（プロセス途中の試料および保持液として取ったものを除く）の全クロッティング活性からプロセス全体の収率を決定する。
下記実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は説明のみを目的とし、特許請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１は限外濾過／透析濾過による蛋白の濃縮を説明する。実施例２はQ-Sepharose Fast Flow偽アフィニティーイオン交換クロマトグラフィーによる因子ＩＸの精製に関する。実施例３はMatrex Cellulose Sulfateクロマトグラフィーによる因子ＩＸの精製を説明する。実施例４はヒドロキシアパタイトを用いる蛋白精製に関する。実施例５は固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる蛋白精製を説明する。実施例６は限外濾過／透析濾過による蛋白の濃縮および処方に関する。
実施例１−限外濾過／透析濾過による蛋白濃縮
十字フロー膜濾過を用いる限外濾過／透析濾過（ＵＳ／ＤＦ＃１）を行って無細胞ならし培地を濃縮しバッファー交換することができる。十字フロー装置に使用する膜は、分子量に基づいて物質を分離する選択的透過性フィルターとして役立つ。因子ＩＸのごとき高分子の溶液成分は膜により保持され、無機塩類およびバッファー成分のごとき低分子成分は多孔性膜構造中を自由に通過し、透過液中に除去される。
置換バッファーを保持液に添加するよりも早い速度で十字フロー装置からバッファーを取る場合、蛋白溶液は濃縮される。バッファーが膜を通って出て行くのとほぼ同じ速度で置換バッファーを十字フロー保持液に添加する場合、最初のバッファーは連続的に希釈される（蛋白の透析濾過）。これらの条件下で、低分子量の成分は容易に交換され、蛋白濃度は一定のままである。保持液の５倍の体積のバッファーの添加により、理論上最初のバッファーの９９％またはそれ以上が置換される。
使用前に、ＵＦ／ＤＦ＃１システムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.５で平衡化する。無細胞ならし培地を、最初の無細胞ならし培地の体積を基準として約２０倍に濃縮する。次いで、濃縮無細胞ならし培地をバッファー中に透析濾過する。保持液の少なくとも５倍の体積のバッファーが膜を通過して時点で透析濾過を完了し、理論上、無細胞ならし培地に存在する塩類および他の低分子量成分の９９％またはそれ以上が除去される。
透析濾過が完了したならば、必要な場合、保持液を濃縮する。次いで、残留している因子ＩＸ生成物をリザーバーおよび配管から回収するのに十分なバッファーで装置を洗う。次いで、プールをＵＦ／ＤＦ容器からポンプで出し、オートクレーブ済み０.２μｍフィルターで濾過してきれいな容器中に入れる。さらに処理するまでＵＦ／ＤＦ＃１プールを２ないし８℃で保存する。
実施例２−Q-Sepharose Fast Flow偽アフィニティーアニオン交換クロマトグラフィーによる因子ＩＸの精製
Q-Sepharose Fast Flow(FF)（Pharmacia）は、短いリンカーを介して４級アミン基を共有結合して誘導体化された架橋アガロースマトリックスからなる強アニオン交換樹脂である。操作ｐＨにおいて正味の負電荷を有する酸性蛋白（因子ＩＸのごとき）および他の多イオン性物質は電荷相互作用によりQ-Sepharose FFに結合する。典型的には、導電率の大きい溶液によりこれらの電荷の相互作用を破壊することにより結合成分はQ-Sepharose FFから個々に溶離される。しかしながら、因子ＩＸ精製プロセスには偽アフィニティーモードのQ-Sepharose FF樹脂を用いる。低濃度（１０ｍＭ）の塩化カルシウムを含有する溶液を用いて因子ＩＸをカラムから溶離する。溶離バッファー中のカルシウムイオンを含めることは因子ＩＸのコンホーメーション変化を引き起こし、樹脂からの溶離を引き起こす。
Q-Sepharose FFを用いてＵＦ／ＤＦ＃１保持液から因子ＩＸを捕捉し、非荷電汚染混入物質および塩基性汚染混入物質を除去し（カラムへの負荷中に未結合フラクション中に出る）、因子ＩＸ（不活性形態の因子ＩＸを包含）を酸性蛋白から分離し（それらは樹脂に結合するが、バッファーへの塩化カルシウム添加によっては溶離されない）、濃縮された因子ＩＸのプロセスの流れを次の精製プロセスであるクロマトグラフィー工程、すなわちMatrex Cellufine Sulfateへと送る。
この工程に関するすべてのクロマトグラフィー操作を２ないし８℃で行ってもよい。まず、Q-Sepharose FFカラムに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０をチャージし、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０で平衡化する。ＵＦ／ＤＦ＃１保持液をQ-Sepharose FFカラムに負荷し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,２００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０でカラムを洗浄する。この最初の洗浄により、全員荷物がカラムを通り、緩やかに樹脂に結合している負荷物中の非吸着性不純物ならびに汚染混入物質が系から洗い出されることが確実となる。次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０でカラムを洗浄して導電率を下げて溶離に備える。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１００ｍＭ ＮａＣｌ,１０ｍＭ ＣａＣｌ2,ｐＨ８.０でカラムから因子ＩＸを溶離し、溶離生成物をを１本のピークとして集める。Q-Sepharose FF溶離物をサンプリングし、さらなる処理を行うまで２ないし８℃で保存する。カラムを再生して再使用してもよい。
実施例３−Matrex Cellufine Sulfateクロマトグラフィーによる因子ＩＸの精製
Matrex Cellufine Sulfateは、硫酸エステルで誘導体化された球形セルロースビーズからなる。ヘパリン結合ドメインを含む蛋白のアフィニティー精製のための固定化ヘパリンアナログとしてそれを用いることができる。それは負に帯電した硫酸官能基を有するので、それをカチオン交換クロマトグラフィーに用いてもよい。操作ｐＨにおいて正味の正電荷を有する塩基性蛋白、他の多イオン性物質、ならびにヘパリン結合蛋白は樹脂に結合し、溶液のイオン強度を増加させると溶離する。Q-Sepharose FF溶離物プール中の因子ＩＸ以外の宿主細胞蛋白を除去するための因子ＩＸ精製プロセスにおいてMatrex Cellufine Sulfate樹脂を用い、さらにヒドロキシアパタイトカラム負荷に適するバッファー条件を提供してもよい。
この工程のすべてのクロマトグラフィー操作を２ないし８℃で行ってもよい。負荷工程の準備のために、Matrex Cellufine Sulfateカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で平衡化する。Q-Sepharose FF溶離物プールを平衡化されたMatrex Cellufine Sulfateカラムに直接負荷し、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,１０ｍＭ ＣａＣｌ2,ｐＨ８.０で洗浄して、すべての負荷物がカラムを通り、弱く結合した不純物が系から除去されることを確実にする。次に、溶離の前にカラムを洗浄してカルシウムイオンを除去する。
洗浄工程完了後、Matrex Cellufine Sulfateカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０で溶離し、溶離物を１つのＵＶ吸収溶離物プールとして集める。Matrex Cellufine Sulfate溶離物プールをサンプリングし、さらに処理するまで２ないし８℃で保存する。カラムを再生し、再使用してもよい。
実施例４−ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いる蛋白精製
セラミック−ヒドロキシアパタイト（Ceramic-HA）は、大きな機械的強度を有する球形多孔質粒子からなる合成形態のリン酸カルシウムである。Ceramic-HAは、主に電荷相互作用に基づいて、広範囲の電荷および等電点の蛋白を分離する。因子ＩＸは、ほぼ中性ｐＨにおいてCeramic-HAに結合する酸性蛋白である。典型的には、バッファー溶液にリン酸塩を添加することにより、酸性蛋白はCeramic-HAから溶離される。目的分子の特性により溶離に必要なリン酸塩濃度は変動し、そのことにより結合蛋白が個々に溶離される。Ceramic-HAを因子ＩＸ精製プロセスに用いて、Matrex Cellufine Sulfate溶離物プール中の不活性因子ＩＸおよび他の汚染混入物質を除去し、溶離物バッファーを最終クロマトグラフィー工程に適合したものにする。最終クロマトグラフィー工程が固定化金属アフィニティークロマトグラフィーであるので、Ceramic-HAの溶離に使用するバッファーをＩＭＡＣに適合するように選択する。このことによりプロセスに差し挟む透析濾過または他のバッファー交換法を省略する。金属イオンと固定化リガンドとの相互作用を破壊するので、Ｔｒｉｓ、グリシン、ヒスチジンのごときバッファーはＩＭＡＣに適合しない。
負荷のための準備において、Ceramic-HAカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.５で平衡化する。Matrex Cellufine Sulfate溶離物プールを希ＨＣｌで滴定してｐＨ７.５とし、Ceramic-HAカラムに直接負荷する。負荷完了後、カラムをバッファー（すべての負荷物がカラムを通り、）で洗浄して緩く結合した汚染混入物質がカラムから除去されることを確実にする。次に、カラムを５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4,１８５ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２で洗浄して不活性形態の因子ＩＸをプロセスの流れから除去する。
洗浄工程完了後、結合した因子ＩＸを５００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4,２００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２で溶離し、因子ＩＸ溶離物を１つのＵＶ吸収溶離物プールとして集める。溶離物プールをサンリングし、さらなる処理を行うまで２ないし８℃に保存する。カラムを再生し、再使用してもよい。
実施例５−固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる蛋白精製
Fractogel-EMD-Chelateは、遷移状態の金属イオンが結合しうるイミノジ酢酸官能基で誘導体化されたメタクリレートポリマーからなる。精製プロセスでの使用準備において、硫酸銅溶液を用いて樹脂に銅をチャージする。固定化銅イオンと相互作用しうる蛋白はカラムに保持され、相互作用しない汚染混入物質は未結合フラクション中に素通りする。イミダゾール含有溶液を用いて結合蛋白を溶離させる。Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)工程を蛋白精製プロセスに用いて、固定化金属イオンに結合しないかまたは因子ＩＸの溶離に必要なイミダゾールよりも高濃度のイミダゾールを必要とする汚染混入物質をプロセスの流れから除去する。このクロマトグラフィー工程を表すために、用語ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）を使用する。
負荷のための準備において、未チャージの（固定化金属イオンのない）Fractogel-EMD-Chelateカラムを、１００ｍＭ酢酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ４.０で洗浄し、次いで、２００ｍＭ ＣｕＳＯ4,５００ｍＭ ＮａＣｌをチャージする。１００ｍＭ酢酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ４.０、次いで、２００ｍＭイミダゾール,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１で洗浄することにより緩く結合した銅イオンを除去する。次いで、Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)樹脂を２００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4,２００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１で平衡化する（平衡化Ｖ）。Ceramic-HA溶離物プールを、平衡化したFractogel-EMD-Chelate-Cu(II)カラムに直接負荷する。
負荷完了後、平衡化バッファーでカラムを洗浄して、すべての負荷物がカラムを通ることを確実にする。２０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4,１５ｍＭイミダゾール,１００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１を用いて樹脂に結合した因子ＩＸを溶離する。Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)溶離物を１つのＵＶ吸収プールとして集める。集めた後、溶離物プールを、カラム溶離物１リットルあたり２０ｍＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.０で希釈する。さらに処理するまで溶離物プールを室温に保存する。
実施例６−限外濾過／透析濾過＃２による蛋白の濃縮および処方
因子ＩＸを選択バッファーに移すために、限外濾過／透析濾過工程を用いる。十字フローＵＦ／ＤＦは非クロマトグラフィー分離法であり、これを用いて溶液中の物質の濃縮およびバッファー交換を行うことができる。供給液を選択的透過性膜表面に平行に流し、膜の保持液側に圧をかけて、膜表面における水および溶質の相対的透過性に基づく輸送を行わせる。これらの環境において、低分子量の供給液中の成分は自由に膜の孔を通過して透過フラクション中に至り、高分子量物質（例えば、因子ＩＸ）は膜により保持され、保持フラクションを形成する。この方法において、水およびバッファー塩をFractogel-EMD-Chelate-Cu(II)溶離物プールから除去することができ、因子ＩＸを目的濃度にまで濃縮することができる。
十字フローシステムの螺旋溝カートリッジコンポーネントを、まず１０ｍＭヒスチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖,ｐＨ６.８で平衡化する。次いで、Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)溶離物プール（前以て５００ｍＭ ＴＥＴＡで希釈）を、蛋白濃縮に備えて十字フロー装置のステンレス製保持液加圧容器に移す。
移すことが完了したら、正味の正の経膜圧力をかけながら保持溶液をポンプで連続的に加圧容器から螺旋溝カートリッジを通して加圧容器に戻す。この操作を行っている間、目盛り付き収集容器を用いて透過フラクション体積を測定することにより保持液体積を連続的にモニターする。
目的保持液体積に達したならば、保持液プールを選択バッファー中に透析濾過する。この操作の間、透過液がシステムから流出するのと同じ速度で透析濾過バッファーを加圧容器中にポンプで送り、そのことにより保持液体積を一定に維持する。
透析濾過工程完了後、限外濾過を用いて保持液フラクションを目的体積にまで濃縮する。保持液加圧容器からの流出フラクションを止め、目的体積の選択バッファーで螺旋溝カートリッジ中の保持液フラクションを保持液加圧容器中に洗い込む。濃縮され、透析濾過された因子ＩＸ生成物をポンプで加圧容器から風袋を計っておいたプール用ビンに取る。
因子ＩＸ生成物プールを１０ｍＭヒスチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖,１％ポリソルベート８０,ｐＨ６.８で希釈してポリソルベート最終濃度０．００５％とする。次いで、生成物を完全に混合し、０.２μｍフィルター（前以て１０ｍＭヒスチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖,０．００５％ポリソルベート８０,ｐＨ６.８にて平衡化）で濾過して脱パイロジェン化したテフロン製ビンに入れる。次いで、蛋白をサンプリングし、ラベルを貼り、液体窒素で素早く凍結して−８０℃で保存する。
組み換え的に製造された因子ＩＸの形質転換宿主細胞からの精製によって本発明方法を説明したが、該方法は、天然の細胞中に存在する因子ＩＸの精製にも使用でき、溶液または血漿、細胞ホモジネート物、細胞培養上清、あるいは単離細胞サブフラクションからの蛋白の精製に使用できる。本発明を特定の方法および組成物について説明したが、本発明を考慮して当業者が変更および修正を行うことが理解される。
上記の説明的実施例に記載された本発明における多くの修飾および変更は当業者により行われると予想され、したがって、添付した請求の範囲にあるような限定のみが本発明に課されるはずである。したがって、特許請求されている本発明の範囲内にあるすべてのかかる均等な変更を添付した請求の範囲がカバーすると考えられる。