(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
果実、果種等の植物から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、最後に溶出されるピークに相当する成分を主成分として含む静菌剤を飲料添加物へと加工・処理する際の処理方法であって、
前記メジャーなピークは、カラムとしてShim Pack PREP-ODS(H)(4.6mmφｘ２５０ｍｍL)、検出器としてUV２８０ｎｍ、流量として１．０ｍｌ/ｍｉｎ、試料注入量として２０μｌ、移動相として１０ｍＭリン酸（Ｎａ）緩衝液（ｐＨ．２．６）又はアセトニトリル、カラム温度として４０℃という条件で、前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに、クロマトグラム中のピーク高さが１４８７６以上であり、
前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【請求項２】
果実、果種等の植物から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤を飲料添加物へと加工・処理する際の処理方法であって、
前記メジャーなピークは、カラムとしてShim Pack PREP-ODS(H)(4.6mmφｘ２５０ｍｍL)、検出器としてUV２８０ｎｍ、流量として１．０ｍｌ/ｍｉｎ、試料注入量として２０μｌ、移動相として１０ｍＭリン酸（Ｎａ）緩衝液（ｐＨ．２．６）又はアセトニトリル、カラム温度として４０℃という条件で、前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに、クロマトグラム中のピーク高さが１４８７６以上であり、
前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【請求項３】
果実、果種等の植物から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、最後のほうに溶出されるピークに属し、かつ、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤を飲料添加物へと加工・処理する際の処理方法であって、
前記メジャーなピークは、カラムとしてShim Pack PREP-ODS(H)(4.6mmφｘ２５０ｍｍL)、検出器としてUV２８０ｎｍ、流量として１．０ｍｌ/ｍｉｎ、試料注入量として２０μｌ、移動相として１０ｍＭリン酸（Ｎａ）緩衝液（ｐＨ．２．６）又はアセトニトリル、カラム温度として４０℃という条件で、前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに、クロマトグラム中のピーク高さが１４８７６以上であり、
前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【請求項４】
果実、果種等の植物から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、最後に溶出されるピークに相当する成分を主成分として含み、前記メジャーなピークは、カラムとしてShim Pack PREP-ODS(H)(4.6mmφｘ２５０ｍｍL)、検出器としてUV２８０ｎｍ、流量として１．０ｍｌ/ｍｉｎ、試料注入量として２０μｌ、移動相として１０ｍＭリン酸（Ｎａ）緩衝液（ｐＨ．２．６）又はアセトニトリル、カラム温度として４０℃という条件で、前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに、クロマトグラム中のピーク高さが１４８７６以上であることを特徴とする静菌剤。
【請求項５】
前記ポリフェノール画分はぶどう種子から得られたものである請求項４に記載の静菌剤。
【請求項６】
耐熱性好酸性菌に対して静菌作用を有する請求項４又は５に記載の静菌剤。
【請求項７】
請求項１から３いずれか記載の処理方法を経ることによって製造された飲料添加剤。
【請求項８】
酸性飲料に対して静菌作用を有する飲料添加剤である請求項７に記載の飲料添加剤。
【請求項９】
請求項７又は８いずれか記載の飲料添加剤を静菌性有効量含有する飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所定のポリフェノールを主成分とする静菌剤を飲料添加剤に加工・処理する際の処理方法、並びに、当該処理方法によって得られた飲料添加剤を含有する飲料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
赤ワインの常飲者に動脈硬化等の成人病（生活習慣病）が少ないというフレンチパラドックスという現象がよく知られているが、これは赤ワインに多く含まれるポリフェノールに起因するものであるということが提唱されている。また、このポリフェノールが有する疾病予防効果は、体内の活性酸素を抑制するという抗酸化機能に大きく起因するからではないかというようなことも言われている。
【０００３】
ポリフェノールについて、このような有用性が指摘されるようになったのは、多くのポリフェノールが備える抗酸化物質としての機能が大いに注目されたことに起因している。そして、酸化という現象それだけについて見てみた場合には、それが飲料の品質劣化の一因ともなっていることから、飲料業界の注目をも集めることになり、酸化防止剤としてのポリフェノールを飲料に添加することが本格的に検討されるようになった。
【０００４】
こうした中にあって、いくつかのポリフェノールについては、抗酸化剤としての飲料への添加が本格的に行われるようになってきたが、そのようになってきたのは、酸化による飲料の劣化が従来よりも問題視されるようになってきたことに加え、ポリフェノール自体が天然由来のものであり、健康志向の消費者に受け入れられやすいということも主な要因の一つとなっている。
【０００５】
【関連する技術】
このように、ポリフェノールの抗酸化物質としての機能とその有用性がよく知られるようになると、いきおい、その抗酸化機能に基づく抽出原料、抽出方法、応用範囲に関しての研究が中心に進められるようになった。
【０００６】
しかしながら、本発明者らがポリフェノ−ルに関して鋭意研究を重ねた結果、ポリフェノール（特に、プロアントシアニジンそれ自体及びプロアントシアニジンの近隣に抽出されてくる画分中のポリフェノール）が静菌作用を有するということが明らかになった。
【０００７】
更に、本発明者らは、所定の条件下、ＨＰＬＣでポリフェノールを分離した際に、ある画分が強力な静菌効果を有することをも併せて見出し、所定のポリフェノールを主成分とする静菌剤に関する本発明を完成するに至り、既に特許出願も行っている（特願平１１‐３３６９５８号）。即ち、本発明者らは、ポリフェノール画分の更なる分離により、従来よりも有効な静菌作用を有するポリフェノール画分を見出し、有効かつ有用な静菌剤及びそれを含有する飲料を既に提案しているのである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記の静菌剤及びそれを含有する飲料について鋭意研究を継続した結果、上記の静菌剤を添加した飲料を暫く放置した場合には、沈殿が発生してしまい、飲料の外観品質が低下する。
【０００９】
この場合において、沈殿が発生して外観品質が低下するということは、透明容器がメジャーとなっている現状では、軽んじることができない問題である。また、沈殿が発生するということは、即ち保存性にも問題があるということにつながり、最終的には飲料用の静菌剤としての使用に適さないということにもなる。
【００１０】
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、所定の有効な静菌作用を有するポリフェノール画分を含む静菌剤を添加した飲料において、これを暫く放置した場合でも沈殿の発生が生じないようにすることにある。
【００１１】
【発明を解決するための手段】
以上のような目的を達成するために本発明者らが鋭意研究を行った結果、上記静菌剤についてこれを一度冷却をして部分的固化させてから、それを解凍したときに生ずる沈殿をろ過するという処理を施した場合には、当該処理後の静菌剤を飲料に添加して暫く放置したとしても沈殿が生じないということを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち本発明においては、暫く放置した後に沈殿が発生しないようにするために有効な処理方法として、上記静菌剤についてこれを一度凍結させてから、それを解凍したときに生ずる沈殿をろ過するという処理を提供すると共に、当該処理後の静菌剤が添加された保存性の良い飲料を提供するものである。
【００１３】
より具体的には、本発明は、以下のような飲料及び静菌剤を提供する。
【００１４】
（１）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、最後に溶出されるピークに相当する成分を主成分として含む静菌剤を飲料添加剤へと加工・処理する際の処理方法であって、前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【００１５】
（２）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤を飲料添加剤へと加工・処理する際の処理方法であって、前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【００１６】
（３）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離したときに得られるピークの内のメジャーなピークの中で、最後のほうに溶出されるピークに属し、かつ、ＮＦ膜処理により消失するピークの部分を主成分として含む静菌剤を飲料添加剤へと加工・処理する際の処理方法であって、
前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【００１７】
（４）  果実、果種等から得られたポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーにより分離した場合に、より後に溶出されてくる画分をより多く含むように製造された静菌剤を飲料添加剤へと加工・処理する際の処理方法であって、前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【００１８】
（５）  前記逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーはＨＰＬＣであることを特徴とする（１）から（４）いずれか記載の処理方法。
【００１９】
（６）  プロアントシアニジンを主成分とする静菌剤を飲料添加剤へと加工・処理する際の処理方法であって、前記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、これを冷却することによって部分的固化させた後に解凍し、当該解凍後に発生した沈殿を限外濾過して除去する工程を含むことを特徴とする処理方法。
【００２０】
（７）  前記ポリフェノール画分はぶどう種子から得られたものであることを特徴とする（１）から（５）いずれか記載の静菌剤。
【００２１】
（８）  耐熱性好酸性菌に対して静菌作用を有する静菌剤であることを特徴とする（６）または（７）記載の静菌剤。
【００２２】
（９）  （１）から（６）いずれか記載の処理方法を経ることによって製造された飲料添加剤。
【００２３】
（１０）  酸性飲料に対して静菌作用を有する飲料添加剤であることを特徴とする（９）記載の飲料添加剤。
【００２４】
（１１）  （９）または（１０）いずれか記載の飲料添加剤を静菌性有効量含有する飲料。
【００２５】
［用語の定義等］
「静菌」とは、細菌を殺傷する作用までもは有しないが、細菌の生育・増殖を抑制し、細菌の活動に基づく製品飲料の変敗を防止できる作用を有することをいい、「静菌剤」とは、飲料に添加された場合に飲料の風味等に悪影響を及ぼすことなく飲料中で静菌作用を発揮し得るものを意味する。
【００２６】
「酸性飲料」というのは、典型的にはｐＨが３．０〜３．５程度の果汁飲料であるが、ｐＨが３．０〜４．０付近に調整されているスポーツドリンクやアイソトニック飲料、健康飲料なども含まれる。
【００２７】
「耐熱性好酸性菌」というのは、上記のような「酸性飲料」の中で生育し、増殖する細菌（好酸性菌）の中でも、「酸性飲料」において一般的に行われている加熱殺菌処理によっても死滅しない耐熱性のものを意味し、飲料業界において静菌のターゲットとされるものである。ここで、好酸性菌の中でも耐熱性のもの（耐熱性好酸性菌）は芽胞を形成するが、本発明に係る静菌剤は飲料中に生残した芽胞の発芽による増殖の防止に有効に作用することが認められる。
【００２８】
［ＨＰＬＣ］
「逆相分離用液体カラムクロマトグラフィー」は、疎水性固定相と親水性移動相の組み合せにより分離を行うカラムクロマトグラフィーのことを意味するが、これを行う場合には、固定相として非極性な固体（普通はシリカゲルの表面に疎水性基（炭化水素鎖）を化学結合した物質）或いは表面が疎水性の合成高分子を用い、移動相として水または水溶液、或いは水と良く混合する有機溶媒と水との混合液を用いる。「逆相分離用液体カラムクロマトグラフィー」その典型的なものは、オクタデシル基を結合したシリカゲルを充填し、溶離液として緩衝溶液を使用した「ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）」であり、後述の実施例でもこれを採用している。
【００２９】
［メジャーなピーク］
本明細書において「メジャーなピーク」というのは、数あるピークの中でも、顕著に目立つものを意味する。「静菌性有効量」は、静菌剤として使用するポリフェノールや画分の種類に応じて適宜決定する。
【００３０】
［部分的固化］
「部分的固化」というのは、対象物が完全な凍結体になるのではなく、一部が固体で一部が液体というような状態を形成していることをいう。そして、含水エタノールを冷却していくと、このような形態が発現する。
【００３１】
従って、上記静菌剤を含水エタノールに溶解させ、発生した沈殿を限外濾過して除去することにより得られた濾液を、好ましくは−３０℃から−４℃、更に好ましくは−２０℃から−７℃程度に冷却すると、完全な固体状の凍結体になるのではなく、どろっとしたシャーベット状のものを形成した状態となる。かかる状態にすることを、本明細書においては基本的に「冷却することによって部分的固化させた」と言っている。
【００３２】
［解凍］
「解凍」とは、固体のものに熱を加えて液体状態にすることをいうが、本明細書においては、冷却することによって部分的固化された静菌剤を、固形物が全く残存していない完全な液体状態にすることを主に意味する。
【００３３】
［ポリフェノール画分の抽出］
ポリフェノールを含有するものであれば、ブドウや茶等、あらゆる植物を本発明の原料とすることができる。なお、ブドウに関しては、特に種子部分については、未利用副産物の利用ともなるため、種子部分を利用するのも得策である。なお、種子部分については、有用なポリフェノールが多く含有されていることも、当該有用なポリフェノールを効率良く抽出する方法も、様々な研究がなされ、本発明者らによっても知見されている（特願平１１−２０９５７８号）。
【００３４】
ポリフェノール画分の抽出は水やエタノール等を溶媒として行う。なお、その後、抽出物の精度を高めるべく、適宜、酵素の添加や遠心分離等を行うことも可能である。
【００３５】
［限外濾過］
本発明における「限外濾過」は、いわゆる「膜濾過」の一種であり、基本的には分子量１０万以上のものを、好ましくは分子量８万以上のものを、より好ましくは分子量７万以上のものを、また場合によっては分子量５万以上のものを除く限外濾過のことを意味する。
【００３６】
ここで、分子量１０万以上のものを除く濾過処理を行った場合には沈殿の発生を十分に防止させることができず、この一方で、分子量２万以上のものを除く濾過処理を行った場合には、静菌作用を有する有効なポリフェノールの大部分（半分程度）が除去されてしまうこととなり、沈殿の発生は防止できたとしても、濾過処理による弊害が顕在化してきてしまうこととなる。
【００３７】
従って、本発明の目的を達成する上では、分子量１０万以上のものを除去する一方で、少なくとも分子量２万以上のポリフェノール、より好ましくは分子量５万以上のポリフェノールを残すような濾過処理を行う必要があり、そのような濾過処理としては、限外濾過処理が適しているのである。
【００３８】
なお、本発明において、限外濾過の代わりに珪藻土（褐色植物）濾過を施した場合には、飲料添加後の沈殿発生を阻止することはできない。
【００３９】
ここで、「珪藻土濾過」とは、充填された珪藻土を濾剤として採用した濾過処理のことを意味し、精製濾過処理の際には一般的に用いられている方法である。珪藻土処理を行うときには、例えば、グラスフィルター上に珪藻土を堆積させ、これを十分に充填させた状態でその上から試料を流し込んで濾過処理をする。
【００４０】
［ＮＦ膜処理］
「ＮＦ膜処理」とは、荷電型逆浸透膜もしくは荷電型限外濾過膜を利用して濾過する処理をいうが、これに使用されるナノ濾過膜は分画分子量が数百〜数千の荷電膜であり、電解質の透過を阻止する性質を有する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
［ポリフェノール類の検出］
ポリフェノール類の検出（定質・定量分析）は、常法に従って行う。ポリフェノール類の検出方法としては、例えば液体クロマトグラフィーによる分析法、酒石酸鉄法、Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法などが挙げられる。後に示す実施例においては、ポリフェノール量は全てＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（タンニン酸換算）で測定した。
【００４２】
ポリフェノールというものそれ自体は、殆ど全ての植物に含まれる物質であり、また、ポリフェノール自体の種類も多いことから、研究の当初からその成分と機能との関係についての実証は難しかった。しかし、ポリフェノールに対する研究が進むにつれ、このポリフェノールの一種であるプロアントシアニジンという成分が極めて優れた抗酸化機能を有するということが見出され（例えば、特開平３−２００７８１号公報、特開平９−２２１４８４号公報、特開平１１−８０１４８号公報）、現在では、この成分を多く有するブドウ種子からの抽出物が、酸化防止剤として食品添加物の一つに登録され（厚生省告示第１２０号の既存添加物名簿第３６７号記載）、商業的に生産され、販売されるに至っている。
【００４３】
プロアントシアニジンを多く含有するポリフェノールとして商業的に入手可能なものとしては、市販品であるグラヴィノール（商品名）を挙げることができ、実施に際しては、これを使用するのが好適である。グラヴィノール（商品名）は、エタノール／水の混合溶媒を用いてブドウ種子からプロアントシアニジンを抽出したものであり、製品として一般に販売されているものである。なお、飲料の静菌剤としては、このグラヴィノールをそのまま使用してもよいし、或いは、さらに分離処理（例えば、先に述べたＨＰＬＣによる分離）を行って使用するようにしてもよい。
【００４４】
因みに、グラヴィノール（商品名）の主成分であるプロアントシアニジンは、ポリフェノールの一種として、以下の表に示すところに位置付けられる成分である。
【００４５】
【表１】
0003623150.tif 000002
【００４６】
このプロアントシアニジンという物質は、カテキンが重合した縮合型タンニンであり、そして、それが備える強い抗酸化作用から、フランスにおいては医薬品（血管治療薬）として用いられているものでもある。
【００４７】
なお、プロアントシアニジンそれ自体に関しては、コーヒー飲料の品質安定法についての特許出願がなされてはいるが（特開平８‐２２８６８５号公報）、それは抗酸化作用を離れたものではなく、むしろその抗酸化作用に基づいた品質安定化を図ったものに過ぎない。
【００４８】
【実施例】
市販のグラヴィノール（商品名）を、下記の条件でＨＰＬＣにかけた。
【００４９】
【表２】
0003623150.tif 000003
【００５０】
その結果、図１に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００５１】
また、同じく市販のグラヴィノール（商品名）を、表２と同等の条件下でＨＰＬＣにかけたところ、図２に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００５２】
更に、液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物（特願平１１−２０９５７８号）を、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ、図３に示されるようなクロマトグラムが得られた。また、ブドウ種子から熱水抽出することにより得られたブドウ種子抽出物についてこれをＮＦ膜処理したものを、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ、図４に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００５３】
そして更に、お茶から得られたカテキンを、基本的には図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけたところ（但し、溶出の速度を遅くするために２０分以降のグラジエント（アセトニトリルの添加量の増分（即ち、溶離液の極性の下げ方））を適宜小さくするようにした（表２の下部分の右端参照））、図５に示されるようなクロマトグラムが得られた。
【００５４】
これらの図から明らかなように、図１に示されるグラヴィノール（商品名）のＨＰＬＣクロマトグラムでは、メジャーなピークとして、「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」の３つのピークが得られており、これは図２のものも同様である。
【００５５】
そして、この中で最後に溶出されてくるメジャーピークである「ピーク３」と同様のピークは、液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである図３のものにも見られるが（図３中の「ピーク３’」）、熱水抽出したものをＮＦ膜処理した図４や、お茶から得られたカテキンのＨＰＬＣクロマトグラムである図５には見られない。
【００５６】
なお、最後に溶出されてくるメジャーピークである「ピーク３」（或いは「ピーク３’」）については、分子量が高いポリフェノールが多く含有されていると考えられるため、その実体は、プロアントシアニジンであろうことが予測されるが、現時点では、確証を得られるまでには至っていない。しかしながら、少なくとも、最後に溶出されてくるメジャーピークと同程度のプロアントシアニジンが含有されていたということが何らかの方法によって検出された場合には、本発明に係る静菌剤であろうと推測することができる。
【００５７】
【実施例１】
ここでまず、市販のグラヴィノール（商品名）を、一般的な混濁タイプスポーツ飲料（果汁３％、可溶性固形分１Ｂｒｉｘ未満、ｐＨ約３．８）、混濁タイプ果汁飲料（果汁１０％未満、可溶性固形分７〜８Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．０）、透明タイプ果汁飲料（果汁１０％未満、可溶性固形分４〜５Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．２）のそれぞれに添加し、そこに耐熱性好酸性菌２種（ＤＳＭ２４９８株（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、ＡＴＣＣ４９０２５株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を「胞子数１０００個／５００ｍｌ  ＰＥＴボトル」の割合で接種し、経過を見た。各試験区の母数は３であり、菌が接種された飲料は、３７℃で１４日間放置された。
【００５８】
以下の表３に、本実施例に係る抽出物の添加量（但し、抽出物中に含まれる総ポリフェノールの濃度に換算してある）を変化させた場合の結果を示す。
【００５９】
【表３】
0003623150.tif 000004
【００６０】
この表３では、製品中での菌の増殖及びそれに伴う異味・異臭がしたものを＋としている（なお、表３中、「＋」「−」の符号につき、カンマの左３つがＤＳＭ２４９８株の結果を、カンマの右３つがＡＴＣＣ４９０２５株の結果を示す）。
【００６１】
この結果により、市販のグラヴィノール（商品名）においては、ポリフェノール濃度が１０ｐｐｍ以上となるように飲料に混合した場合には、飲料の種類を問わず、静菌効果があるということが分かる。
【００６２】
【実施例２】
次に、ポリフェノール画分を、上述したようにＨＰＬＣによって分離したときに得られるメジャーなピーク（「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」（図１））について、それぞれ静菌効果を比較してみることとした。そして、そのためにはまず、グラヴィノールをポリフェノール換算０．５％の溶液とし、その３６ｍｌをＨＰＬＣにより「ピーク１」、「ピーク２」及び「ピーク３」の３画分に分離した。そして、分離された各部分について、回収後に濃縮・希釈をして７．２ｍｌとした。ピーク比較による回収率を、以下の表に示す。
【００６３】
【表４】
0003623150.tif 000005
【００６４】
上記各画分の回収率を考慮し、グラヴィノール（商品名）のポリフェノール換算１０ｐｐｍ添加相当となるように、各画分を混濁タイプスポーツ飲料に添加した。この混濁タイプスポーツ飲料を５００ｍｌＰＥＴボトルに８５℃ホットパック充填後、耐熱性好酸性菌（ＤＳＭ２４９８株）を「胞子数１０００個／５００ｍｌＰＥＴボトル」の割合で接種し、閉栓した後に１分３０秒間転倒保持し、冷却した。
【００６５】
静菌の効果は、３５℃１４日間培養後、製品液１ｍｌの混釈培養により、菌の増殖の有無で確認した。また、いずれの画分が静菌作用を有するのかを一層明確にするため、単独添加、混合添加の双方を行った。
【００６６】
その結果、下表のような結果が得られた。
【００６７】
【表５】
0003623150.tif 000006
【００６８】
この表５では、製品中での菌の増殖があったものを＋としているが、この結果から明らかなように、単独添加、混合添加のいずれにおいても「ピーク３」の画分が飲料に添加されている場合に、菌の増殖が抑制されていることが認められた。
【００６９】
従って、上記実施例１によれば、グラヴィノール（商品名）に静菌作用があるということが立証され、この実施例２によれば、グラヴィノール（商品名）を逆相液体カラムクロマトグラフィーによって分離したときの最後に溶出される画分の中に静菌作用を備える成分が含まれているということが明らかになった。
【００７０】
よって、グラヴィノール（商品名）を逆相液体カラムクロマトグラフィーによって分離したときに最後に溶出される画分を常法に従って取り出し、当該画分の部分を飲料に添加することによって、飲料中において静菌作用を発現させることができることが明らかである。
【００７１】
【実施例３】
次に、異なる抽出方法で抽出したブドウ抽出物、並びに他のポリフェノールの静菌作用について、それらを相互に比較した。具体的には、（１）水／エタノールの混合溶媒を使用して抽出されたブドウ種子抽出物であるグラヴィノール（商品名）、（２）液化炭酸ガスで抽出されたブドウ種子抽出物、（３）熱水抽出されたブドウ種子抽出物をＮＦ膜濾過処理したブドウ種子抽出物、（４）緑茶カテキン製剤、をそれぞれ一般的な混濁タイプスポーツ飲料（果汁３％、可溶性固形分１Ｂｒｉｘ未満、ｐＨ約３．８）に添加し、そこに耐熱性好酸性菌（ＤＳＭ２４９８株）を「胞子数１０００個／５００ｍｌ  ＰＥＴボトル」の割合で接種し、経過を見た。各試験区の母数は２であり、菌が接種された飲料は、３７℃で１４日間放置された。
【００７２】
以下の表６に、本実施例に係る抽出物の添加量（但し、抽出物中に含まれる総ポリフェノールの濃度に換算してある）を変化させた場合の結果を示す。
【００７３】
【表６】
0003623150.tif 000007
【００７４】
この表６では、製品中での菌の増殖及びそれに伴う異味・異臭がしたものを＋としている。
【００７５】
この結果から、ブドウ種子抽出物をＮＦ膜で濾過をした場合には、ブドウ種子抽出物中から静菌作用が消失してしまうということが分かる。上述したように、これは、最後に溶出されて来る「ピーク３」もしくは「ピーク３’」に相当するピークが、ＮＦ膜処理を経ることによって消失してしまうからであると考えられるため、この現象からも、「ピーク３」もしくは「ピーク３’」の部分に静菌作用があることの事実の裏付けがなされている。
【００７６】
同様に、緑茶カテキンに静菌作用が無いのは、元々「ピーク３」もしくは「ピーク３’」に相当するピークが存在しないためであると考えられる。
【００７７】
【実施例４】
本発明は、ぶどう種子抽出物（例えばグラヴィノール（商品名））を使用して、以下のようなフローに従って実施することができる。
【００７８】
【表７】
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【００７９】
ここで、上記の表７に示されるフローに従い、グラヴィノール２．５％の含水エタノール溶解液（総ポリフェノール約１％）にＵＦ２０，０００の限外濾過膜、ＵＦ５０，０００の限外濾過膜、及びＵＦ１００，０００の限外濾過膜を用いて本発明を実施した場合において、得られた静菌剤を飲料添加剤として飲料（透明タイプ果汁飲料：果汁１０％未満、可溶性固形分８〜９Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．９）に添加したものを放置（４８〜１２０時間程度）して沈殿の発生を見た結果、以下のような結果が得られた（なお、添加量は、各処理液の飲料への添加濃度で示す）。
【００８０】
【表８】
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【００８１】
この表に示されるように、ＵＦ１００，０００の限外濾過膜を用いて本発明を実施した場合には沈殿の発生が見られたものの、ＵＦ２０，０００の限外濾過膜及びＵＦ５０，０００の限外濾過膜を用いて本発明を実施した場合には、いずれも沈殿の発生は見られなかった。
【００８２】
次に、表７に示されるフローに従い、ＵＦ２０，０００の限外濾過膜及びＵＦ５０，０００の限外濾過膜を用いて本発明を実施した場合において、得られた静菌剤を飲料添加剤として飲料（透明タイプ果汁飲料：果汁１０％未満、可溶性固形分８〜９Ｂｒｉｘ、ｐＨ約３．９）に添加した場合の静菌効果の発現について調べた結果、以下のような結果が得られた（なお、添加量は、各処理液の飲料への添加濃度で表す。）。
【００８３】
【表９】
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【００８４】
因みに、各処理液について、これをＨＰＬＣにかけた結果が図２（未処理の場合）、図６（ＵＦ５０，０００の限外濾過膜の場合）及び図７（ＵＦ２０，０００の限外濾過膜の場合）に示されている。
【００８５】
このような表９、並びに図２、図６及び図７の結果より、ＵＦ２０，０００の限外濾過膜を使用した場合にはポリフェノールロスが大きく、静菌作用の低下が見られるようである。
【００８６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明により、所定のものから所定のポリフェノールを採取し、或いは、ポリフェノール画分を逆相分離用液体カラムクロマトグラフィーで分離することにより、天然由来の飲料用静菌剤を製造することができ、この画分を飲料中に混合することにより静菌作用を有する飲料とすることができるが、この過程において、前記飲料用静菌剤に対して冷却をして部分的固化後に生じた沈殿を濾過するという処理を施すことによって、静菌剤添加後の飲料に、当該飲料の外観品質を低下させるような沈殿の発生を防ぐことができるようになる。
【００８７】
これにより、天然由来のポリフェノール含有性の飲料用静菌剤を添加した飲料を透明容器に安心して充填できるようになり、当該飲料の安定性も確保される。言い換えれば、本発明により、天然由来のポリフェノール含有性の飲料用静菌剤を好適な飲料添加剤、特に透明容器に充填された飲料に好適な飲料添加剤を製造することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】市販のグラヴィノール（商品名）をＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である（表２参照）。
【図２】市販のグラヴィノール（商品名）を、表２の条件下でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】液化炭酸ガス抽出を行って得られたブドウ種子抽出物を、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】ブドウ種子から熱水抽出することにより得られたブドウ種子抽出物についてＮＦ膜処理したものを、図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】お茶から得られたカテキンを、表２の条件（下部分の右端）でＨＰＬＣにかけた結果得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】冷却することによる部分的固化→解凍→濾過（ＵＦ５０，０００の限外濾過膜の場合）を経た静菌剤を図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果を示すチャート図である。
【図７】冷却することによる部分的固化→解凍→濾過（ＵＦ２０，０００の限外濾過膜の場合）を経た静菌剤を図２と同じ条件でＨＰＬＣにかけた結果を示すチャート図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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