(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２１から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるビフィドバクテリウム属細菌用プライマー。
【請求項２】
配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを使用することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定方法。
【請求項３】
（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の特異的検出方法。
【請求項４】
（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の特異的定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いるビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定・解析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物等の腸内細菌叢を同定・解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。特にビフィドバクテリウム属細菌は、グラム陽性の多型性桿菌でヒト腸内フローラにおける最優勢菌群のひとつであり、この菌種は、宿主に対して腸管感染防御作用、免疫機能の増強作用、栄養、腸内腐敗の抑制作用などの生理作用を持っており、この菌種分布を把握することは重要である。現状ではその手段として、種々の選択培地を組み合わせて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００３】
菌種の同定、腸内細菌叢の解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑であった。
【０００４】
また、ヒトや動物の腸内に生息しているビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、発酵生産物（乳酸又は酢酸等）、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われている（INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 21, No.4, p.276〜294(1971)）。
【０００５】
しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑であり、試験者の熟練を要する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定・解析を行うには、長期間を要し、また操作が煩雑である等の問題があった。
従って、本発明の目的は、ビフィドバクテリウム属細菌菌種を迅速、簡便に同定・解析し得る方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
斯かる現状に鑑み本発明者は鋭意研究を行ったところ、ビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループに特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見出し、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便にビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１〜２１から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるビフィドバクテリウム属細菌用プライマーを提供するものである。
【０００９】
また本発明は、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを使用することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定方法を提供するものである。
【００１０】
更に本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の特異的検出方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のプライマーのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いた。
【００１２】
プライマーは、本発明者がシークエンシングを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Genbank等）や本発明者が比較対象として新たにシークエンスを行って得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種（基準株）は、具体的には、ビフィドバクテリウム・アングラータム(Bifidobacterium angulatum)ＡＴＣＣ２７５３５株、ビフィドバクテリウム・アニマーリス(Bifidobacterium animalis)ＡＴＣＣ２５５２７株、ビフィドバクテリウム・ボウム(Bifidobacterium boum)ＪＣＭ１２１１株、ビフィドバクテリウム・チョエリナム(Bifidobacterium choerinum)ＡＴＣＣ２７６８６株、ビフィドバクテリウム・デンティウム(Bifidobacterium dentium)ＡＴＣＣ２７５３４株、ビフィドバクテリウム・ガリカム(Bifidobacterium gallicum)ＪＣＭ８２２４株、ビフィドバクテリウム・ガリナラム(Bifidobacterium gallinarum)ＪＣＭ６２９１株、ビフィドバクテリウム・インディカム(Bifidobacterium indicum)ＪＣＭ１３０２株、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)ＡＴＣＣ１５６９７株、ビフィドバクテリウム・マグナム(Bifidobacterium magnum)ＪＣＭ１２１８株、ビフィドバクテリウム・メリシカム(Bifidobacterium merycicum)ＪＳＭ８２１９株、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)ＪＣＭ１２００株、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム  サブスピーシーズ・グロボッサム(Bifidobacterium pseudolongum ss.globosum)ＪＣＭ５８２０株、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム  サブスピーシーズ・シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum ss. pseudolongum)ＪＣＭ１２０５株、ビフィドバクテリウム・プロラム(Bifidobacterium pullorum)ＪＣＭ１２１４株、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム(Bifidobacterium ruminantium)ＪＣＭ８２２２株、ビフィドバクテリウム・サエクラレ(Bifidobacterium saeculare)ＤＳＭ６５３１株、ビフィドバクテリウム・ズブティル(Bifidobacterium subtile)ＤＳＭ２００９６株、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス(Bifidobacterium denticolens)ＤＳＭ１０１０５株、ビフィドバクテリウム・イノピオナータム(Bifidobacterium inopionatum)ＤＳＭ１０１０７株、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium catenulatum)ＡＴＣＣ２７５３９株であり、これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録した。
【００１３】
ビフィドバクテリウム属の菌種間でアライメントを行った。その結果、全部で９ケ所ある可変領域のうちＶ２エリアとＶ３エリアに、多くの菌種に特異的な配列があることがわかった（図１）。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・インファンティスはＶ６エリアに、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム及びビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムはＶ１エリアとＶ６エリアに両者を区別できる配列があることがわかった（図２）。そこで上記領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。また、オリゴヌクレオチドの長さは、１７〜２１ｂ．ｐであり、これらは操作上最も好適な長さである。しかし、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜数十ｂ．ｐの塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００１４】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び２記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１５】
また、配列番号３及び４記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１６】
また、配列番号５及び６記載の塩基配列を有するものはビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１７】
また、配列番号７及び８記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１８】
また、配列番号９及び１０記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１９】
また、配列番号１１及び１２記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Bifidobacterium angulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２０】
配列番号１３及び１４記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム(Bifidobacterium catenulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２１】
また、配列番号１５及び１６記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２２】
また、配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ガリカム(Bifidobacterium gallicum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２３】
更に、配列番号７及び１９記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２４】
また、配列番号７及び２１に記載のプライマーは、Ｂ．ロンガムのみならずＢ．インファンティス、Ｂ．ズイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら３菌種は系統的に非常に近縁の種であり、細胞壁のペプチド鎖、ムレイン（酸）が同一であること、また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーも７０％前後であり、また前述のようにＢ．ロンガムグループが認識できるので、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定において特に支障なく使用することができる。
【００２５】
更に、配列番号１４及び２０に記載のプライマーは、Ｂ．カテヌラータム及びＢ．シュードカテヌラータムの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら２菌種についても同様の理由からＢ．カテヌラータムグループと認識できるので、同様に支障なく使用できる。
【００２６】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その種特異性は、ビフィドバクテリム属細菌と代表的な腸内細菌の１６ＳｒＲＮＡに対するプライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記のうち、Ｂ．アドレスセンティス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．シュードロンガム、Ｂ．カテヌラータム、Ｂ．アングラータム、Ｂ．シュードカテヌラータム、Ｂ．ガリカム、Ｂ．インファンティスに対するプライマーの特異性に問題はなかった。一方、Ｂ．ロンガムに対するプライマーは、Ｂ．ズイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら２菌種は系統的に非常に近縁の種であり、またＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーも７５〜７８％であり、また１６ＳｒＲＮＡ配列の類似性も９９．７％を超えることから同一菌種に再分類されるべきで、両者を区別できなくても特に支障がないと考えられる。
【００２７】
本発明のプライマーは、このように特異性を有するため、これらを用いたビフィドバクテリウム属細菌用選択培地ＴＯＳ、ＭＰＮ上に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの簡易同定を行うことができる。
また、本発明のプライマーを用いれば、培養を行うことなく、各個体の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループレベルでの分布の調査が可能である。このような方法としては例えば次の方法が挙げられる。
【００２８】
まず、糞便等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのサンプルとする。
糞便等の希釈液からＤＮＡを抽出する方法としては、定法であるＭａｒｍｕｒ法、その変法である酵素法、及びベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、純粋培養した細菌等から抽出したＤＮＡに対しては、前述の方法の他、フェノール法等も好適に使用しうる。また、菌体の一部をバッファー又は滅菌水に懸だくし、９５℃、１５分程度加熱したものを、テンプレートとして、ＰＣＲに供することも可能である。
【００２９】
抽出されたＤＮＡに種又はグループ特異的プライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、種又はグループ特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。通常、ＰＣＲ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライマーを１組として用いることが好ましい。例えば、配列番号１及び２に係るプライマーを用いれば、多種類存在する細菌群のうち、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスのＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間で増幅反応が起こり、これを同定することができる。このように２種類のプライマーを組にして用いる場合は、両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせになるようにする必要がある。また、ＰＣＲ反応を行う際、アニーリングの温度はほぼ一定に設定してあるので、５種類のプライマーを同時に検定することも可能である。また、ＰＣＲを行う際に、予め鋳型のＤＮＡ量を段階希釈し、検出限界を求め同様の解析を行えば、目的とする菌種の定量化も可能である。
【００３０】
このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌種又は系統的に近縁な種からなるグループを同定することができる。
【００３１】
また、本発明のプライマーは、菌種又は系統的に近縁な種からなるグループ特異的な配列を有しているため、単独でもプローブとして使用できる。更に、本発明のプライマー単独もしくは複数と他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチドとを組み合わせても用いることができる。
【００３２】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内等の解析も行える。現状では、ビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループ以外を検出することは不可能であるものの、ビフィドバクテリウム属細菌の分布、菌数が分かれば、健康状態等様々な情報が得られる。更に、その他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度にビフィドバクテリウム属細菌菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの同定を行うことができる。また、他の菌種特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。更に、解析の結果から消化管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  プライマーの設計及び合成：
ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースより得られたビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者らが解読した上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、種特異的なプライマーの設計を行った。可変領域のうちＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ６エリアに菌種特異的配列が認められたので、これをターゲットとしてプライマーを作成した。プライマーの二本鎖形成能は、塩基配列中のＧＣ含量と塩基数に依存するため、ＧＣ含量に伴って塩基数に差異が生じた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。
【００３６】
【表１】
0003667104.tif 000002
【００３７】
実施例２  プライマーを用いた菌種の同定及び菌種特異性の確認：
本発明のプライマーが、実際に種特異性を有しているかを確認するため、以下の実験を行った。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表２及び３に示す、３１菌種４７株のビフィドバクテリウム属細菌と、９属１５菌種の代表的腸内細菌とをＧＡＭ broth 培地（ニッスイ社製）に一晩純粋培養した。このとき、嫌気性細菌は嫌気的に好気性細菌は好気的に培養した。こうして得た菌体６２種類各々から、ガラスビーズを用いたフェノール法により、ＤＮＡを抽出した。
【００３８】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ（ＮＨ4）2 ＳＯ4，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，０．４５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２００μＭ  ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ２００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに、各々０．２５μＭプライマー，０．９ＵＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），１０ｎｇテンプレートＤＮＡを含む反応液で、Ｈｙｂａｉｄ  Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）により、９４℃５分の熱変性の後９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。この条件で、（１）のサンプル６２種類と本発明のプライマーとを反応させた。
【００３９】
（３）プライマーの種特異性の検討
（２）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無により、プライマーの特異性を判定した。１％LO.3Agarose(タカラ社製)で、ミューピットにより１００Ｖ、２５分電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅで染色後、ＵＶランプ下でバンドの有無を観察した。その結果は表２、３に示す通り、プライマーはビフィドバクテリウム属細菌特異的にバンドを形成した。具体的には、ターゲットとするB. adolescentis ４株からは目的とするＰＣＲ産物が得られたが、他のBifidobacterium 及び腸内菌からは目的とするサイズのＰＣＲ産物が得られず、この特異的プライマーBiADO によりB. adolescentis の特異的な検出が可能であることがわかった。同様に、他のBifidobacterium 菌種特異的プライマーの特異性を調べたところ、BiBIF、BiBRE、BiANG、BiPDLは、それぞれB. bifidum、B. breve、B. angulatum、B.pseudolongumを特異的に検出できることがわかった。
【００４０】
一方、BiLONgはＢ．ロンガム以外にもＢ．インファティス、Ｂ．ズイスのＤＮＡを鋳型としてもＰＣＲ産物が生じた。しかし、この三者は系統的に非常に近縁な種であり、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性も７０％前後であることから今後同一菌種に再分類される可能性が高い。したがってこれら３菌種はＢ．ロンガムグループとしても認識でき、表現性状も似ていることから、これらを明確に区別できなくても特に支障はないと考えられる。BiCATgもＢ．カテヌラータム以外にＢ．シュード−カテヌラータムのＤＮＡを鋳型としてもＰＣＲ産物が生じることがわかった。しかし、この場合も両者は系統的に非常に近縁な種であり、今後同一菌種に再分類される可能性が高い。したがって、これらを明確に区別できなくても特に支障はないと考えられる。
【００４１】
また、同様にBiPSC、BiGAL、BiLON、BiINFについても試験した。結果を表４〜６に示す。
【００４２】
【表２】
0003667104.tif 000003
【００４３】
【表３】
0003667104.tif 000004
【００４４】
【表４】
0003667104.tif 000005
【００４５】
【表５】
0003667104.tif 000006
【００４６】
【表６】
0003667104.tif 000007
【００４７】
実施例３  プライマーを用いたヒト腸内細菌叢の菌種同定及び解析：
（１）糞便のサンプリング
ヒト大便サンプルから直接抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行うことで、培養を行うことなくビフィドバクテリウム属細菌を菌種レベルで検出することを試みた。サンプルとしては、健常な成人男性８名の糞便を採取したものを用いた。成人男性は４名ずつミルミル（当社実施品：１本あたり平均でLactobacilus acidophilusを２×１０9、Bifidobacterium bifidumを１０9、Bifidobacterium breveを１０10含有）投与群と非投与群とに分け、サンプリング前後の発酵乳投与の有無による腸内細菌叢への影響も併せて検討した。すなわち、両群への発酵乳等生菌含有食品投与を４週間止めた後、４名にはミルミルを１日３本食後飲用させ、他の４名には、細菌が含まれておらず他の成分の組成は同一の偽ミルミルを同量飲用させた。飲用開始４週間後、糞便を採取して、TE buffer にて洗浄し、５０mgずつ分割して−８０℃で保存した。
【００４８】
（２）ＤＮＡの抽出
酵素法を用いて、ＤＮＡの抽出を行った。サンプルを５００μｌの５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−１０ｍＭ  ＮａＣｌに浮遊し、凍結と融解を２回繰り返した。その後１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌアクロモペプチダーゼ溶液と７．５μｌの５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、２５μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液を加え、３７℃で６０分反応した。更に、２０％ＳＤＳ溶液（ｆｉｎａｌ  １．５％）と４μｌの１０ｍｇ／μｌプロテイナーゼＫ溶液を加え、３７℃で６０分反応させた。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール処理を行った。次に１／２０倍容のＲＮａｓｅＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で６０分反応し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール処理後、エタノール沈殿した。沈殿を４００μｌ  ＴＥｂｕｆｆｅｒに溶かして、限外濾過チューブＣ３  ＬＴＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した。また、紫外線領域の吸光度を測定してＤＮＡの収量を求めた。
【００４９】
（３）ＰＣＲ反応
実施例２（２）と同様の条件で、（１）のサンプルと各プライマーとを反応させた。
【００５０】
（４）ＰＣＲ産物の確認
電気泳動により、ＰＣＲ産物の確認を行ったところ、ミルミル投与群では、全ての検体で投与菌と同じ菌種のビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベが検出された。非投与群においては、ビフィドバクテリウム・ビフィダムが４名中２名、ビフィドバクテリウム・ブレーベが４名中１名から検出された。これらの菌が、元々腸内に常在していた菌であるのか投与された菌であるのかは確認できなかった。一方、ビフィドバクテリウム・カテネラータム、ビフィドバクテリウム・ロンガムは８名全てから検出され、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスも８名中７名から検出されたことから、これらはヒト成人に広く分布しているものと推測される。結果は表７に示す。
【００５１】
【表７】
0003667104.tif 000008
【００５２】
実施例４  プライマーを用いた野性株の菌種同定：
まず、ビフィドバクテリウム属野性株の菌種同定を、作成したプライマーにより試みた。表８の各株からＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行って、どのプライマーを使用したときに増幅産物が得られるかを調べた。
【００５３】
一方、従来の方法として、最も高精度な同定方法であるＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験も行ったところ本発明のプライマーによる結果とこの結果は一致していた（表８）。また、（21. Scardovi, V.1984. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen, 1924, 472, p1418-1434. In N.R.Krieg and J.G.Holt(ed), Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1. The Williamd & Wilkins Co., Baltimore.)でも菌種同定を行ったところ、本発明のプライマーによる結果とほぼ同様の結果が得られた（表８）。
【００５４】
【表８】
0003667104.tif 000009
【００５５】
ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験においてＢ．カテヌラータムとＢ．シュードカテヌラータム、Ｂ．ロンガムとＢ．インファンティスは、近縁種どうしであるため、お互い高いホモロジーを示したが、一方が２０％程度もう一方よりも高いことから判別可能であった。
【００５６】
実施例５
成人のビフィドバクテリウム菌種分布の解析
合計で成人３３検体の糞便から抽出したＤＮＡを鋳型として各菌種特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、それぞれの個体のビフィドバクテリウムの菌種構成を調べた（表９）。このデータをもとに、それぞれの菌種の分布状況（検出率）を求めたところ、これら６菌種のうち最も広くヒト成人の腸管内に分布していたのはＢ．ロンガムの７０％で、ついでＢ．アドレスセンティス５８％、以下、Ｂ．シュードカテヌラータムの５５％、Ｂ．ビフィダム４２％、Ｂ．ブレーベ１５％、Ｂ．アングラータムが６％となっていて、Ｂ．インファンティスとＢ．ガリカムは検出されなかった。
【００５７】
乳児のビフィドバクテリウム菌種分布の解析
同様に生後１ケ月の乳児２７検体のビフィドバクテリウムの菌種構成を調べ（表１０）、それぞれの菌種の分布状況（検出率）をもとめたところ、最も検出率の高かったのは、Ｂ．ブレーベ７０％で、以下Ｂ．インファンティスの４１％、Ｂ．ロンガム３７％、Ｂ．ビフィダム２２％、Ｂ．カテヌラータム グループの１９％、Ｂ．アドレスセンティス７．４％、Ｂ．アングラータム３．７％となっていた。
【００５８】
方法
成人サンプル
健康成人３３名の糞便サンプルを用いた。被験者は我々の知る限りにおいて、腸疾患を持たず、サンプリング前の１週間は抗生物質の投与やヨーグルトなどの生菌の含まれる食品を摂取していない。
【００５９】
乳児サンプル
生後１ケ月の健常な母乳栄養児２７名について調べた。乳児は１９９７年に長崎大学附属病院で、通常分娩により生まれた。どの乳児も消化器系の異常はなく、また抗生物質の投与も受けていない。
【００６０】
糞便からのＤＮＡの抽出
健常な成人から採取した糞便１０mgをもちい、Ｚｈｕらのベンジルクロライド法に従ってＤＮＡを抽出した。糞便中に多く含まれるＰＣＲの阻害物質を除去する目的で、検体を１mlのＴＥに懸濁し、１５０００rpmで遠心分離後上清を捨てるという操作を３回繰り返した。このサンプルを２５０μｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４０mM  ＥＤＴＡ，pH９．０）に浮遊し、５０μｌの１０％ＳＤＳを加えて凍結・融解を３回繰り返した。１５０μｌのベンジルクロリドを加え、Ｍｉｃｒｏ  Ｉｎｃｕｂａｔｅｒ  Ｍ−３６（ＴＡＩＴＥＣＨ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により５０℃で３０分激しく振とうした。反応後、３Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅを１５０μｌ添加し、氷中に１５分間静置した。１５０００rpmで１０分間遠心分離を行い、上清を別のチューブにとって等量のイソプロパノールを加え、析出したＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを１００μｌのＴＥに溶解し、１μｌを鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００６１】
ＰＣＲの条件
ＰＣＲ反応は、総量を２５μｌとし、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、各２５μＭプライマー、０．９Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、１μｌテンプレートＤＮＡを含む反応液で、ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ）により行った。反応液は、テンプレートＤＮＡの二本鎖の解離のため９４℃で３分加熱した後、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒を３５サイクルで行った。
増幅産物は１％アガロースで電気泳動後、臭化エチジウムで染色してＵＶ下でバンドの有無を観察した。
【００６２】
【表９】
0003667104.tif 000010
【００６３】
【表１０】
0003667104.tif 000011
【００６４】
実施例６  プライマーを用いた各菌種の菌体数の比較定量：
（１）検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度の検討
各プライマーが目的とする配列をＰＣＲ増幅するための鋳型ＤＮＡ量の下限を検討したところ、１００fg程度まで可能であった。そこで、糞便から抽出したＤＮＡの量を変えて各プライマーによるＰＣＲ反応を行えば、各菌種の比較定量が可能であると考えられた。そこで、成人男性２名（Adult D及びAdult F）に実施例３と同様にミルミルを投与し、その糞便中、すなわち腸内細菌叢を解析するため、糞便より抽出した鋳型ＤＮＡを１０ngから１０fgまで１０倍段階希釈し、菌株の比較定量化を図ることとした。
【００６５】
（２）細菌群の比較定量化
まず、各濃度の鋳型ＤＮＡと本発明のプライマーとを実施例２と同様の条件にてＰＣＲ反応に供した後、バンド形成の有無により細菌叢中に存在する菌種を同定した。その結果、ビフィドバクテリウム属細菌菌種により、検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度が異なっていた（表１１、表１２）。このとき、検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度が低いプライマー程、そのプライマーに特異的な菌種の濃度が高いものと予想される。
【００６６】
【表１１】
0003667104.tif 000012
【００６７】
【表１２】
0003667104.tif 000013
【００６８】
また、一方ビフィドバクテリウム属細菌に特異的な選択培地であるＭＰＮ培地、バクテロイデス属細菌に特異的な選択培地であるＶＬＭ−Ｂ培地、及び各種細菌の増殖培地であるＶＬＭ培地にて、上記の糞便サンプルを１０8倍希釈したものを培養し、培養後のコロニー数から総ビフィドバクテリウム属細菌数、総バクテロイデス属細菌数、総細菌数を算出した。また、これに合わせてビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌数も算出した。その結果、総ビフィドバクテリウム属細菌数はAdult Dで１．９×１０8Adult Fで２．７×１０10であり、ビフィドバクテリウム・ブレーベ菌数が４．６×１０7、ビフィドバクテリウム・ビフィダム菌数が６．４×１０7であった。その他の各菌数は表１３、表１４に示す。
【００６９】
【表１３】
0003667104.tif 000014
【００７０】
【表１４】
0003667104.tif 000015
【００７１】
本発明のプライマーにより、最も低濃度で検出できたビフィドバクテリウム属細菌は、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループであり、次に低濃度で検出できたビフィドバクテリウム・アドレセンティスよりも１０倍低濃度であった。このため、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループは最優勢の菌種であると考えられ、Adult Dでコロニー数から求めた総ビフィドバクテリウム属細菌数が１．９×１０10であったことと合わせて、その菌数は１０10オーダーと考えられた。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムは共に１００pgで弱く検出されていた。これは弱く検出された濃度の約１００分の１〜１０００分の１であったので、両者の菌数は１０7〜１０8オーダーと推察され、コロニー数から求めた値と合致していた。ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムは成人にはあまり一般的な菌種でないため、上記において検出されたものはミルミル由来の株であると考えられる。
【００７２】
また、Adult Fにおいてもビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループは最も低濃度で検出されており、最優勢の菌種であることが示唆された。また、Ｂ．ブレーベ及びＢ．ビフィダムは１pgで弱く検出されており、Adult D と比べて１０〜１００倍の菌数が存在することが示唆され、コロニー数から算出した菌数と合致していた。このように、本発明のプライマーを用いた定量結果とコロニー数から算出した菌数は合致しており、本発明のプライマーを用いた定量方法の定量性が確認された。
【００７３】
【配列表】
＜１１０＞  株式会社  ヤクルト本社；財団法人ヤクルト・バイオサイエンス研究財団（KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA;ZAIDAN HOJIN YAKULT・            BIO SCIENCE KENKYU ZAIDAN ）
＜１２０＞  ビフィドバクテリウム属細菌用プライマー
＜１３０＞  Ｐ０３５６１００８
＜１５０＞  ＪＰ  １９９７−２１９５６７
＜１５１＞  １９９７─８─１４
＜１６０＞  １９
＜２１０＞  １
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １
ctccagttgg atgcatgtc  19
＜２１０＞  ２
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ２
cgaaggcttg ctcccagt  18
＜２１０＞  ３
＜２１１＞  ２１
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ３
ccacatgatc gcatgtgatt g  21
＜２１０＞  ４
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ４
ccgaaggctt gctcccaaa  19
＜２１０＞  ５
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ５
ccggatgctc catcacac  18
＜２１０＞  ６
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ６
acaaagtgcc ttgctccct  19
＜２１０＞  ７
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ７
ttccagttga tcgcatggtc  20
＜２１０＞  ８
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ８
gggaagccgt atctctacga  20
＜２１０＞  ９
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ９
cacatgagcg catgcgag  18
＜２１０＞  １０
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １０
tccactcaac acggccgaa  19
＜２１０＞  １１
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １１
cagtccatcg catggtggt  19
＜２１０＞  １２
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １２
gaaggcttgc tccccaac  18
＜２１０＞  １３
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １３
gatccgggag tttgctgcc  19
＜２１０＞  １４
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １４
cgaaggcttg ctcccgat  18
＜２１０＞  １５
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １５
atccatcagg ctttgcttgg  20
＜２１０＞  １６
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １６
gaggccatat ctctacggct  20
＜２１０＞  １７
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １７
taataccgga tgttccgctc  20
＜２１０＞  １８
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １８
acatccccga aaggacgc  18
＜２１０＞  １９
＜２１１＞  ２０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  １９
ggaaacccca tctctgggat  20
＜２１０＞  ２０
＜２１１＞  １７
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ２０
cggatgctcc gactcct  17
＜２１０＞  ２１
＜２１１＞  １８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Artificial Sequence
＜４００＞  ２１
tcscgcttgc tccccgat  18
【図面の簡単な説明】
【図１】ビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のうちＶ２及びＶ３エリアを比較した図
【図２】ビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のうちＶ６及びＶ１エリアを比較した図
【図１】
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【図２】
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