(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸断片試料を電気泳動し、その検出データに基づいて核酸の塩基配列を決定する方法において、
塩基配列決定の前処理として、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させて頂点波形の総面積が最大になる検出データの移動量を求める検出データ移動工程を含むことを特徴とする塩基配列決定方法。
【請求項２】
核酸断片試料を電気泳動し、その検出データに基づいて核酸の塩基配列を決定する方法において、
塩基配列決定の前処理として、４種類の塩基に対応する４種類の検出データに基づいて仮の塩基配列を一旦決定する仮の塩基配列決定工程と、
予め設定された基準塩基に対応する検出データにおける前記仮の塩基配列の決定に用いたピークを基準ピークとし、４種類の検出データを重ねた状態で、前記基準塩基以外の塩基に対応する検出データにおける前記仮の塩基配列の決定に用いたピークのうちから前記基準ピークに挟まれた対象ピークを検出データごとに少なくとも１つ選出し、前記対象ピークの前後の前記基準ピークとの間隔が等しくなる検出データの移動量を求める検出データ移動工程と、を含むことを特徴とする塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記仮の塩基配列決定工程を、請求項１に記載の検出データ移動工程を行なった後に行なう請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの核酸の塩基配列を決定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
４種類の塩基（アデニンＡ、シトシンＣ、グアニンＧ、チミンＴ）に対応して異なる標識色素（Dye）をもつ核酸断片試料を電気泳動する際、標識色素の種類に起因して核酸断片試料の移動度が変化する場合がある。かかる場合、従来の塩基配列決定方法では、４種類の塩基に対応する４種類の検出データにおいて、ある塩基に対する検出データを基準として、標識色素に起因する移動度の差がなくなるような移動度補正用の関数（近似多項式等）を用いて、残る検出データの位置情報を変換している。この移動度補正用の関数を作成するには、手動操作で位置情報をティーチング（入力）する方法や、関数作成用のフラグメントを前もって電気泳動させて、その検出データにおけるピークの出現位置から既定値としての移動度補正用の関数を作成しておく方法等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
予め移動度補正用の関数を作成しておく方法では、電気泳動の再現性が高いことが前提である。しかし、必ずしもこれは当たっておらず、電気泳動は行なう毎に微妙に違っているものである。
さらに、予め移動度補正用の関数を作成しておく方法では、ゲルやポリマーなどの泳動媒体の濃度を変えた場合又は泳動媒体自体を変えた場合に、温度や印加電圧等の他の泳動条件を再設定するために、いろいろな泳動条件で泳動評価する必要が生じる。しかし、泳動媒体や温度、印加電圧などの泳動条件毎に移動度補正用の関数をもたせることは非常に煩雑な操作である。
【０００４】
そこで本発明は、塩基配列決定の前処理として、実際の核酸断片試料泳動時の検出データから移動度補正用の関数を適宜作成できる核酸の塩基配列決定方法を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸断片試料を電気泳動し、その検出データに基づいて核酸の塩基配列を決定する方法であって、第１の局面は、塩基配列決定の前処理として、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させて頂点波形の総面積が最大になる検出データの移動量を求める検出データ移動工程を含む塩基配列決定方法である。
ここで頂点波形とは、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で最も高い波形のみを結んだ波形を言う。
【０００６】
図２は、２種類の塩基に対応する２種類の検出データ（実線と破線）のピーク部分を示す図であり、（Ａ）は補正前、（Ｂ）は（Ａ）の頂点波形の総面積、（Ｃ）は補正後、（Ｄ）は（Ｃ）の頂点波形の総面積を示す。
異なる移動度をもつ２種類の塩基に対応する標識核酸断片試料の移動度が補正されていない状態においては、一方の塩基の検出データにおけるピーク（破線）が他方の塩基の検出データにおけるピーク（実線）と重なってしまう（（Ａ）参照）。これらの検出データからその頂点波形のみを追跡して総面積を求めた場合（（Ｂ）斜線部参照）、標識核酸断片試料の移動度の違いによりピークが重なっている部位があるので、移動度が正しく補正されていてピークが重なっていない場合（（Ｃ）参照）の頂点波形の総面積（（Ｄ）斜線部参照）より小さくなる。すなわち、頂点波形の総面積が最大になることが移動度補正の必要条件になる。よって、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、移動度補正用の関数を直線的シフト（直線的移動）として、残る検出データを前後方向に移動させて頂点波形の総面積が最大になる検出データのシフト量（移動量）を求める。
【０００７】
本発明の第２の局面は、塩基配列決定の前処理として、４種類の塩基に対応する４種類の検出データに基づいて仮の塩基配列を一旦決定する仮の塩基配列決定工程と、予め設定された基準塩基に対応する検出データにおける上記仮の塩基配列の決定に用いたピークを基準ピークとし、４種類の検出データを重ねた状態で、基準塩基以外の塩基に対応する検出データにおける上記仮の塩基配列の決定に用いたピークのうちから基準ピークに挟まれた対象ピークを検出データごとに少なくとも１つ選出し、対象ピークの前後の基準ピークとの間隔が等しくなる検出データの移動量を求める検出データ移動工程とを含む塩基配列決定方法である。
【０００８】
仮の塩基配列決定工程により、４種類の塩基に対応する４種類の検出データに基づいて、ピーク間隔のチェックルールを若干緩めにして仮の塩基配列を決定する。検出データ移動工程により、移動度補正用の関数を直線的シフトとして、基準塩基以外の塩基に対応する検出データの対象ピークと前後の基準ピークとの間隔が等しくなるように検出データの移動量を求める。
【０００９】
これらの方法は、電気泳動における４種類の塩基に対応する核酸断片試料の移動度が大幅に異ならない限り、十分に融通性をもっている。また、予め移動度補正用の関数をもつ必要がなく、さらに移動度補正用の関数を得るための電気泳動ももちろん必要ではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法において、仮の塩基配列決定工程を、本発明の第１の局面を構成する検出データ移動工程を行なった後に行なうことが好ましい。その結果、仮の塩基配列決定工程におけるピークの検出精度を向上させることができ、ひいては最終的に決定した塩基配列の信頼性を向上させることができる。
【００１１】
【実施例】
本発明の第１の局面にかかる方法を行なうためには、一般的には、４種類の塩基のうちいずれか１つの塩基の検出データを基準としてシフト量を他の３種類の塩基の検出データについて負から正の範囲で適当にふって、頂点波形の総面積を計算するプログラムを実行させ、その総面積が最大になる３種類の検出データのシフト量を答えとして得る。しかし、この計算は単純であるがかなりの負担を計算機に与える。以下に、この処理を簡略及び高速化する実施例の説明を行なう。
【００１２】
図１は一実施例を示すフローチャートである。
例えば反応試薬キットとしてBigDye（Applied Biosystems 社の登録商標）ターミネータを使用して調整した標識核酸断片試料を電気泳動し、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを得る（ステップＳ１）。
反応試薬キットとしてBigDyeターミネータを使用した場合、グアニンＧ又はチミンＴに対応する標識核酸断片試料の移動度は、アデニンＡ又はシトシンＣに対応する標識核酸断片試料の移動度に比べて速い。また、アデニンＡとシトシンＣの移動度の差は無視できる範囲である。したがって、アデニンＡの検出データとシトシンＣの検出データを基準検出データとし、グアニンＧの検出データとチミンＴの検出データを正側（遅らせる側）に移動させ（ステップＳ２）、頂点波形の総面積の計算を行なう（ステップＳ３）。このように、反応試薬キットに依存する塩基の種類毎の標識色素が標識核酸断片試料の移動度に与える影響の程度が予めわかっていれば、大幅に処理を高速化できる。
【００１３】
頂点波形の総面積が最大になるグアニンＧの検出データ及びチミンＴの検出データのシフト量を求め（ステップＳ４）、グアニンＧの検出データ及びチミンＴの検出データの位置情報を補正する（ステップＳ５）。
図１の実施例において、ステップＳ１からステップＳ５までは、本発明の第１の局面にかかる塩基配列決定方法を構成する検出データ移動工程によるものである。
【００１４】
図３は、２種類の塩基に対応する２種類の検出データ（実線と破線）のピーク部分を一方の検出データ（破線）のピークがテーリングを起こしている状態で示す図であり、（Ａ）は補正前、（Ｂ）は補正後を示す。
４種類の塩基に対応する４種類の検出データのうちいずれか又は全部の検出データのピークがリーディングやテーリングを起こしている場合、例えば図３（Ａ）に示すように、２種類の塩基の検出データのうち、一方の検出データ（破線）のピークがテーリングを起こしている場合、本発明の第１の局面にかかる塩基配列決定方法を適用したときシフト量がずれてしまう虞れがある。
そこで、図１の実施例では、本発明の第１の局面を構成する検出データ移動工程（ステップＳ１からステップＳ５）を行った後、本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法を実行する。
【００１５】
図１に戻って説明を続けると、本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法を行なうには、まず、ピーク間隔のチェックルールを少し甘めにした上で一度ベースコール（塩基配列決定処理）を行なって仮の塩基配列を決定し、検出ピークの位置情報を得る（ステップＳ６）。
次に、予め設定された基準塩基、この実施例ではアデニンＡとシトシンＣの検出データを基準検出データとし、グアニンＧの検出データ又はチミンＴの検出データにおいて仮の塩基配列に使用したピークの前後両方に基準検出データの基準ピークを検出した場合に、そのピークを対象ピークとして選出する（ステップＳ７）。
【００１６】
対象ピークと、対象ピークの前後の基準ピークとのピーク間隔を求める（ステップＳ８）。例えば、図３（Ａ）に示すように、対象ピーク（破線）と前側の基準ピーク（実線）のピーク間隔ｆが１０、対象ピーク（破線）と後ろ側の基準ピーク（実線）のピーク間隔ｂが１４であるとする。このとき、対象ピークを含む検出データを２だけ後ろ方向（遅い方向）に移動してやれば、対象ピークの前後の基準ピークとのピーク間隔ｆ，ｂが等しくなり（ステップＳ９）、移動度が補正されたことになる（図３（Ｂ）参照）。
【００１７】
ステップＳ７からステップＳ９では、一度目のベースコール（ステップＳ６）で検出したピークの中から、ピークとして確度の高い（信用度の高い）ものについてステップＳ７とＳ８の操作を複数行なって、基準塩基以外の塩基、この実施例ではグアニンＧとチミンＴの検出データのシフト量をいくつか算出し、それぞれの検出データについてシフト量の平均値や中央値を取るなどして、ステップＳ９でグアニンＧの検出データとチミンＴの検出データのシフト量を得る。
【００１８】
この実施例では、BigDyeターミネータにおいて、アデニンＡとシトシンＣを基準塩基とし、グアニンＧの検出データとチミンＴの検出データについて幾つか算出した各検出データのシフト量の中央値をそれぞれ計算してシフト量とする。この場合、グアニンＧ又はチミンＴの検出データに含まれる対象ピークを選出する際、対象ピークの前後の基準ピークはアデニンＡもしくはシトシンＣであればどちらでも構わないし、前後がアデニンＡとシトシンＣの組み合わせであっても構わない。さらに同一塩基が連続している場合、例えばＡＧＧＧＣとＣＧＧＧＡとＡＧＡは、グアニンＧのシフト量の計算として同じものと考えることができる。
【００１９】
図１に戻って実施例の説明を続けると、ステップＳ９で算出したシフト量に基づいて検出データの位置情報を補正する（ステップＳ１０）。その後、ベースコールを行なって塩基配列を決定する（ステップＳ１１）。
図１の実施例において、ステップＳ６は本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法を構成する仮の塩基配列決定工程によるものであり、ステップＳ７からステップＳ１０までは、本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法を構成する検出データ移動工程によるものである。
【００２０】
図１の実施例では、例えばサンガー反応試薬や泳動媒体の問題で、ピーク検出データが対称形でない場合でも、本発明の第１の局面にかかる塩基配列決定方法に第２の局面にかかる塩基配列決定方法を追補すれば、ほぼ完全な移動度の補正を行なうことができる。
【００２１】
ゲルやポリマーなどの泳動媒体の濃度を変えた場合、あるいは泳動媒体自体を変えた場合に、温度や印加電圧等の泳動条件を再設定するために、いろいろなパターンで泳動評価する必要が生じるが、そのような場合でも、本発明の第１の局面にかかる塩基配列決定方法は原理が簡単かつ普遍的なので、特に手を加える必要もなく利用できる。仮にピーク間隔が歪みになるコンプレツション部位（収縮している部位）があっても、一般的には全体に比べ僅かな領域なので、本発明の第１の局面にかかる塩基配列決定方法にかかる統計的手法にとっては問題にならない。
【００２２】
本発明の第２の局面にかかる塩基配列決定方法は、第１の局面にかかる塩基配列決定方法による検出データの補正をさらに信頼性の高いものにするのに有用であるが、標識核酸断片試料について、塩基の種類に対応する標識色素に起因する移動度の差が小さい場合には単独でも有用である。
上記実施例ではBigDyeターミネータを使用して調製された標識核酸断片試料の検出データを用いているが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の標識色素をもつ標識核酸断片試料の検出データにも適用することができる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の核酸の塩基配列決定方法にかかる第１の局面では、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させて頂点波形の総面積が最大になる検出データの移動量を求める検出データ移動工程を含むようにした。第２の局面では、４種類の塩基に対応する４種類の検出データに基づいて仮の塩基配列を一旦決定する仮の塩基配列決定工程と、予め設定された基準塩基に対応する検出データにおける上記仮の塩基配列の決定に用いたピークを基準ピークとし、４種類の検出データを重ねた状態で、基準塩基以外の塩基に対応する検出データにおける上記仮の塩基配列の決定に用いたピークのうちから基準ピークに挟まれた対象ピークを検出データごとに少なくとも１つ選出し、対象ピークの前後の基準ピークとの間隔が等しくなる検出データの移動量を求める検出データ移動工程とを含むようにした。いずれの局面の本発明を実施しても、実際の核酸断片試料泳動時の検出データから移動度補正用の関数を適宜作成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  一実施例を示すフローチャートである。
【図２】  ２種類の塩基に対応する２種類の検出データ（実線と破線）のピーク部分を示す図であり、（Ａ）は補正前、（Ｂ）は（Ａ）の頂点波形の総面積、（Ｃ）は補正後、（Ｄ）は（Ｃ）の頂点波形の総面積を示す。
【図３】  ２種類の塩基に対応する２種類の検出データ（実線と破線）のピーク部分を一方の検出データ（破線）のピークがテーリングを起こしている状態で示す図であり、（Ａ）は補正前、（Ｂ）は補正後を示す。
【図１】
0003671844.tif 000002
【図２】
0003671844.tif 000003
【図３】
0003671844.tif 000004