(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相及び／又は固相中の被検体を定性的及び／又は定量的に検出するための方法であって、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて検出されるべき磁気ラベルとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が用いられ、そしてそれらの磁化の緩和が測定変数として測定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
磁気緩和測定により液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて検出されるべき磁気ラベルとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が用いられ、測定条件下で、該粒子のブラウン（Brownian）緩和がネール型（Neel−type）緩和より迅速に進行することを特徴とする方法。
【請求項３】
振動数の関数として複合体磁化率を測定することにより、液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて検出されるべき磁気ラベルとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が用いられ、ここで測定条件下での該粒子のブラウン緩和がネール緩和より迅速に進行することを特徴とする方法。
【請求項４】
液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被検体に結合する構造特異的物質が、
ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、次に、
ii）これらの標識された構造特異的物質が、測定されるべき液体の又は固定化されたサンプルにおいて用いられ、前記測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁場により磁化され、そして前記外部からの場を遮断した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被検体が、最初に、
ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、次に、
ii）これらの磁気的に標識された被検体が、測定されるべき液体の又は固定化されたサンプルにおいて用いられ、該サンプルに前記被検体に特異的に結合する物質が添加され、そして前記測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁場により磁化され、そして前記外部からの場を遮断した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項６】
固相に結合した被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被検体に結合する構造特異的物質が、最初に、
ｉ）測定の時間範囲において緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、それにより測定条件下でブラウン緩和がネール型緩和より短い緩和時間を有するように、前記強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が選択され、次に
ii）これらの磁気的に標識された物質が、測定されるべき固定化されたサンプルにおいて用いられ、そして前記測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁場により磁化され、そして前記外部からの場を遮断した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定され、この測定が、未結合の前記磁気マーカーと前記被検体に結合した前記磁気マーカーとの間の緩和挙動の相違により行なわれる、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
測定の時間範囲において緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子により、検出されるべき被検体が標識され、ここで測定条件下で、前記粒子のブラウン緩和がネール型緩和より短い緩和時間を示し、そして更に、前記被検体に特異的に結合する物質が前記測定されるべきサンプルに添加されるか、又は前記被検体に特異的に結合する物質が前記サンプル中に固定化されて存在することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
液相中に存在する被検体を定量的に検出するための方法であって、前記被検体に結合する構造特異的物質が、最初に、
ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、ここで測定条件下での前記粒子のブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間を示し、次に、
ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべきサンプルにおいて用いられ、そして該測定されるべきサンプルが、外部から適用される磁場により磁化され、そして前記外部からの場を遮断した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定され、未結合の前記マーカーに対する前記被検体に結合した前記磁気マーカーとの間の緩和挙動の相違が分析のために用いられる、
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
検出されるべき被検体が強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、ここで測定条件下で、前記粒子のブラウン緩和がネール緩和より短い緩和時間を有し、そして更に、前記被検体に特異的に結合する物質が前記測定されるべきサンプルに添加されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出のために、振動数の関数としての複合体磁化率の測定が用いられることを特徴とする請求項１又は４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記構造特異的物質が、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジン及びストレプトアビジンのようなビオチンに特異的に結合する物質、レセプターに特異的に結合するアゴニストもしくはそれらのアンタゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターに結合するアゴニストが、サイトカイン、リンホカイン、又はエンドセリンであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記構造特異的物質が、105〜1015（mol/l）−１の範囲の結合定数を有することを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
前記構造特異的物質が、107〜1015（mol/l）−１の範囲の結合定数を有することを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１５】
磁場センサーとして、超電導量子干渉計（SQUID）、誘導コイル、フラックスゲート（flux gate）磁力計、巨大磁気抵抗センサー、又は磁気抵抗性コンバーターが用いられることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
測定がサンプル中の２以上の異なる被検体で行われることを特徴とする請求項１〜15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
識別され得るブラウン又はネール緩和時間を有する２以上の強磁性又はフェリ磁性物質が用いられることを特徴とする請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
磁気緩和測定により、又は振動数の関数として複合体磁化率の測定により、液相及び固相中の被検体を定量的に検出するための化合物の使用であって、該化合物が、構造特異的物質又は検出されるべき物質との強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子の組合せからなり、ここで測定条件下での前記粒子のブラウン緩和が、ネール緩和より迅速に進行することを特徴とする、当該化合物の使用。
【請求項１９】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜400nmの範囲の粒径を有することを特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜100nmの範囲の粒径を有することを特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、オリゴマーもしくはポリマー炭水化物、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、及び／又は脂質から作られたシェルで安定化されることを特徴とする請求項１〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜400nmの範囲の粒径を有することを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、１〜100nmの範囲の粒径を有することを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
前記強磁性及びフェリ磁性物質が、オリゴマーもしくはポリマー炭水化物、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、界面活性剤、ポリマー及び／又は脂質の覆いで安定化されることを特徴とする請求項18,22又は23に記載の使用。
【請求項２５】
前記構造特異的物質が、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジン及びストレプトアビジンのようなビオチンに結合する物質、レセプターに特異的に結合するアゴニストもしくはそれらのアンタゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質であることを特徴とする請求項18,22又は23に記載の使用。
【請求項２６】
受精、組織適合性、アレルギー学、感染学、衛生学、遺伝学、ウィルス学、細菌学、毒物学、病理学、環境分析又は医療診断における請求項１〜17の何れか１項に記載の方法又は19〜21のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
受精、組織適合性、アレルギー学、感染学、衛生学、遺伝学、ウィルス学、細菌学、毒物学、病理学、環境分析又は医療診断における請求項18,22又は23に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
構造特異的物質との強磁性もしくはフェリ磁性物質の組合せ使用、又は請求項１〜17いずれか１項に記載の方法もしくは19〜21のいずれか１項に記載の方法により検出されるべき被検体との強磁性もしくはフェリ磁性物質の組合せの使用。
【請求項２９】
構造特異的物質との生分解可能フェリ磁性又は強磁性物質の組合せからなり、それにより体液中での体温での構造特異的物質との前記フェリ磁性又は強磁性物質の組合せのブラウン緩和時間が、ネール緩和時間より短いことを特徴とする請求項１〜17の何れか１項に記載の方法又は19〜21のいずれか１項に記載の方法に用いるための化合物の使用。
【請求項３０】
前記フェリ磁性又は強磁性物質が生分解可能な酸化鉄であることを特徴とする請求項29に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、請求の範囲を特徴とするもの、即ち液体及び固体相において被検体を磁気緩和測定（magnetorelaxometrischen）で定性的及び／又は定量的に検出するための方法、磁気緩和測定での検出のための化合物、並びにそれらの分析及び免疫磁気記録法（Immunomagnetographie）における使用に関する。
イムノシンチグラフィーは、以下にマーカーとしても言及される放射能標識構造特異的物質により生体内の病的構造を検出するのを可能にすることが知られている。この目的に、γ線でラベルされた抗体又は抗体フラグメントが通常用いられる。更に、例えばペプチド又はオリゴ核酸もしくはポリ核酸のような他の構造特異的物質も用いられ、又は調査される。しかしながら、特異的に結合した放射能の部分は一般に、全てのこれらの部分において小さい。結果として、これらの研究の場合、特異的に結合せず、これにより血液中に循環するか、又は肝臓、腎臓、輸出性尿路、又は膀胱のような器官中に蓄積するマーカーのレベルは極めて高い。多くの場合、この高いバックグラウンド放射は病的構造の適切な検出を妨げる。それゆえ、Panchapakesan〔Immunol.Cell.Biol.,10（1992）295〕及びZiegler〔New England Journal of Medicine,324（1991）430〕は、イムノシンチグラフィーを改良する方法を示す。このような方法は、EP 0 251 494にも記載される。それらのほとんどの方法の目的は、特異的に結合する放射能の除去を加速することである。
更に、生体内の病的構造に局在化するために常磁性もしくは超常磁性物質と接合した抗体又は抗体フラグメントの使用が種々の場合に提案されている。今日まで、磁化率の変化に基づく核スピン断層撮影又は磁力測定（WO 93/05818及びWO 91/15243）がこのようなラベルされた抗体のための検出方法として与えられている。これらの検出方法の場合、マーカーの未結合の部分のため、及び組織の磁化率及び緩和率の自然の変化のためのシグナルの可変部分の問題も存在している。更に、その方法は、しばしば少し小さな量の特異的に結合したマーカーを検出することができるのに十分な感度がない。
しかしながら、結合したマーカーの部分のみを検出することを可能にし、これにより未結合のマーカーの程度により影響を受けない方法は知られていない。
定量的イムノアッセイ及び他の結合アッセイ（例えばレセプター結合アッセイ）は、種々の組成のサンプルにも生物的に関連し得る極めて大量の物質を測定することを可能にすることも知られている。しかしながら一般に、アッセイ中のサンプル当り１つのパラメータのみがこの方法において決定される。存在する種々の測定方法の１つは、T.Chard〔An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,4th ed.,Elsevier Science Publishers,Amsterdam（1990）〕である。全ての結合アッセイの基礎はアイソトープでラベルされた化合物の高い検出感度であり、又はリガンド−レセプター反応の高い特異性でのいくつかの他の手段による。
しかしながら、周知のアッセイ方法は、次の欠点がある：
同じサンプル内で種々の被検体を同時に測定するための方法は、被検体への種々の放射能、蛍光又は酵素標識プローブの結合に基づく。この場合、被検体の定量的測定のためのプローブの未結合又は結合活性は、次の分離及び洗浄の後に一般に測定される。この場合、利用できる異なるプローブラベルの量は、かなり限定される。これにより、例えばプローブラベルとしての異なるラジオアイソトープの場合、個々のシグナルの量的正確さの迅速な損失を導くいわゆるオーバーラッピング現象がおこる。プローブラベルとしての種々の酵素の組合せは、その系における酵素反応の同時測定を許容する反応条件についての必要な調査により、その実行可能性が更に妨げられることによるかなりの問題を引きおこす。
その方法の感度は、例えばマトリックスとプローブとの間の非特異的相互作用により、又はプローブの部分への限られた標識能力により、限定される。その方法を上手く行うには、得られたサンプル材料が精密に検査されることが必要とされる（例えば、全血液からの血清又は血漿の生産、有機溶媒でのサンプルの抽出、クロマトグラフィー法を用いる被検体の濃縮）。
その方法を上手く行うために、結合及び未結合レセプター又はリガンドの分離に用いられる分離及び洗浄ステップがほとんどの場合に本質的である。
ラジオイムノアッセイを行うために、高価で取扱いの複雑な放射性核種を用いることが必要である。
実際、以前に用いたマーカーの保存は、それらが不安定である（ラジオイムノアッセイ）ため新しく作られなければならないか、又は環境的影響への感受性により反応するかのいずれかであるので、しばしば問題を引きおこす。
それゆえ本発明の目的は、先行技術の欠点を克服し、特に放射性物質及び結合したマーカーの程度を用いることなく、未結合のマーカーの先の分離を必要とせず、保持部位を検出することができる新しい方法及び物質を開発することである。
この目的は本発明により達成される。
液体及び／又は固体相における被検体の定性的及び／又は定量的検出が、イムノアッセイ又は他の結合アッセイで同定されるべき磁気ラベリングとして強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を用いる場合に可能になり、そしてそれらの磁化が測定変数として測定されることを見い出した。
以下に、イムノアッセイ又は他の結合アッセイを行うための周知の方法の欠点を克服する方法が最初に記載される。
本発明による方法は、（以下に被検体としても言及される）同定されるべき物質又は構造特異的物質と組み合わされた以下に磁気ラベリングとしても言及されるコロイド状強磁性又はフェリ磁性物質を用いることに基づく。このような、本出願に更に詳説される被検体又は構造特異的物質との磁気ラベリングの本発明による組合せも磁気マーカーとして以下に言及される。コロイド状物質又はコロイド状粒子という言葉の使用を通して、コロイドの大きさの範囲における粒子又は物質の径の範囲、即ち1nm〜約1000nmの範囲とほとんどの場合水性である適切な分散媒体中の分散された相としてのそれらの使用との両方が記載される。改良された保存性及び輸送性を確実にするために、コロイド状物質又は粒子は乾燥形態又は凍結されて存在し得；しかしながら、測定が行われる場合、それらは分散された状態で液相に存在する。
更に、本方法は、磁気ラベリング又は磁気マーカーを磁化した後、磁化の緩和を測定することを可能にする特別の測定技術に基づく。本願により詳細に記載される本発明によるこのような測定方法は、磁石緩和測定（Magnetrelaxometrie）もしくは磁気緩和測定又は磁石緩和測定検出（magnetrelaxometrische）としても以下に言及される。
本発明の重要な原理は、外部磁場を除去した後、自由に動くことができる強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子の磁化を２つの異なるメカニズム：
ｉ）時定数が粒子をとりまくパラメータを主に反映するシェルを含む粒子の流体力学的径、液状担体の粘度、及び温度に依存することにより、周囲の液体内部の全コロイド状粒子の回転；このメカニズムは以下Brownian緩和又は外来性超常磁性としても言及される及び
ii）時定数が用いられる粒子の材料及び形状（用いられる粒子材料の異方性定数）、容量及び温度に極めてセンシティブに依存することによる、コロイド状粒子内の内部磁化ベクターの回転；これらは基本的に粒子の固有のパラメータであり；このメカニズムは以下に
0003607297.tif 000002
緩和又は固有超常磁性としても言及される
によって測定時間内に緩和することである。
本発明による目的は、イムノアッセイ又は他の結合アッセイにおいて、そのBrownian緩和が未結合状態における測定条件下で
0003607297.tif 000003
緩和により速い強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を同定されるべき磁気ラベリングとして用いることにより達成される。結合により引きおこされる、主要な緩和メカニズムの変化又は粒子容量のスケールアップのため、このような強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子の使用が、測定サンプル中に同時に存在する未結合の磁気マーカーに加えて、結合した磁気マーカーの部分を特異的に測定することを可能にする。
本発明による方法の場合、センシティブな測定方法を用いることにより、液相又は固相の両方において行われ得る極めて高感度な結合特異的イムノアッセイ又は他の結合アッセイが、強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子を用いて組み立てられる。特に高感度の測定方法として、サンプルを磁場で磁化した後、及びその場を除去した後、（例えば超電導量子干渉装置（SQUIDs）、インダクションコイル、フラックスゲート磁力計、巨大磁気抵抗センサー、又は磁気抵抗コンバーターのような）高感度の磁場ディテクターにより、磁化の緩和が測定され得、又はサンプルの複合体磁化率が磁場の度数の関数として測定され得る。
更に、本発明による液相及び固相における被検体の磁石緩和測定定量検出のための方法において、最初に被検体に結合する構造特異的物質が強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子でラベルされる。
これらの磁気的に標識された構造特異的物質は、測定されるべき液体又は固定化されたサンプルにおいて用いられ、測定されるべきサンプルは、外側から適用された磁場により磁化される。外部の場が除かれた後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定される。
測定結果の評価は、当業者に周知である方法に従って、以下に記載される直接的アッセイ法においても行われる。
本発明による液相及び固相における被検体の磁石緩和測定定量検出のための方法は、被検体を最初に
ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識し、そして、
ii）これらの磁気的に標識された被検体を測定されるべき液体又は固体サンプルに用いて、被検体に特異的に結合する物質を加え、そして測定されるべきサンプルを外部から適用される磁場により磁化させ、外部磁化を除去した後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定される。
測定結果の評価は、当業者に周知である方法において、以下に記載される比較アッセイ法、即ち、イムノアッセイ又はラジオアッセイに用いられるような方法と同様の方法においても行われる。
先の両方の場合において、結合により変化される磁気ラベリング又は磁気マーカーの複合体感受率の測定は、分析のための頻度の関数としても用いられ得る。
例外的な場合にのみ先に行われ得る結合したマーカーと未結合のマーカーとの区別は、それらの異なる緩和メカニズムの使用又は結合により引きおこされる磁気マーカーの緩和時間の影響により可能になる。
固相に結合した被検体は、特に最初に
ｉ）測定の時間範囲に緩和する強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、それにより強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が、測定条件下で、Brownian緩和が
0003607297.tif 000004
緩和より短い緩和時間を有するように選択され、そして
ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべき固定化されたサンプルに用いられ、そして測定されるべきサンプルが外部から適用される適切な強度の磁場により磁化され、そして外部の場が除去された後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定され、それにより固相に結合した磁気マーカー及び未結合の磁気マーカーの異なる緩和行動が分析に用いられる。
被検体に結合する構造特異的物質により、本発明により同定され得る。測定変数として、サンプルの複合体磁化率度数の関数として測定され得る。
この場合も、構造特異的物質のかわりに同定されるべき被検体を磁気ラベリングに組合わせることが可能である。
液相において、本発明による被検体は、特に、最初に
ｉ）強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子で標識され、それにより強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子が、測定条件下で、Brownian緩和が
0003607297.tif 000005
緩和より短い緩和時間を有するように選択され、そして
ii）これらの磁気的に標識された物質が測定されるべきサンプルに用いられ、そして測定されるべきサンプルが外部から適用される適切な強度の磁場により磁化され、そして外部の場が除去された後、磁気マーカーの磁化の緩和が磁場センサーにより測定され、それにより未結合の磁気マーカーに対する被検体と結合した磁気マーカーの異なる緩和行動が分析に用いられる。
被検体に結合する構造特異的物質により、検出され得る。測定変数として、サンプルの複合体磁化率度数の関数として測定され得る。
この場合も、構造特異的物質のかわりに同定されるべき被検体を磁気ラベリングに組合わせることが可能である。
構造特異的物質は、特定の構造に特異的に結合する全ての物質として定義される。構造特異的物質は、特に、抗体、抗体フラグメント、ビオチン又はアビジン及びストレプトアビジンのようなビオチンに結合する物質、サイトカイン、リンホカイン、エンドセリンもしくはそれらのアンタゴニストのようなアゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、リポ蛋白質等として定義される。構造特異的物質としては、その結合定数が105〜1015（mol/l）-1の範囲である物質が好ましい。特に好ましいのは、その結合定数が107〜1015（mol/l）-1の範囲である物質である。
同定されるべき構造特異的物質又は被検体は、免疫化学、ペプチド化学及び蛋白質化学と同様である方法によって、強磁性又はフェリ磁性粒子で標識され得る。特に有利なのは、同定されるべき構造特異的物質又は被検体と強磁性又はフェリ磁性粒子の安定化シェルを形成する物質との間の共有結合である。特に適切な方法の例は、カルボジイミドによる活性化及びカップリング〔Jakoby and Wilchek,eds.;Methods Enzymol.（1974）34〕、次に更なる安定化のために任意に還元される過ヨウ素酸塩を炭水化物を含む化合物へ露出した後のシック塩基の形成（Wichek and Bayer,eds.,Methods Enzym.184:177）、グルタルジアルデヒドによるカップリング（Heitzmann and Richards,Proc.Natl.Acad.Sci USA 71（1974）3537）、チオール開裂物質とのブロモアセチル化粒子の架橋（Angerer et al.;Cell 9（1976）81）及び還元性アルキル化（Bayer et al.;J.Histochem.Cytochem.24（1976）933）である。
強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子は、任意に例えば蛋白質、炭水化物のような他のアジュバント及び天然、合成、部分合成表面活性物質等の存在下で、粒子を製造後に構造特異的物質の溶液内に直接入れることにより、又は構造特異的物質の存在下で直接製造することにより、同定されるべき構造特異的物質又は被検体から作られた安定化シェルでも作られ得る。
これらの粒子を含む適切なコロイド状粒子及び懸濁液は、例えばWO 92/12735、WO 92/22586、EP 0 186 616及びUS 4,101,435に記載される。
本発明による方法は、例えば受精、組織適合性、アレルギー学、毒物学、病理学、環境分析及び医療診断に用いられ得る。
本発明の他の目的は、自由に動くことができる強磁性又はフェリ磁性粒子のコロイド状懸濁液及び同定されるべき構造特異的物質又は被検体からなる、磁石緩和測定検出のための化合物である。ここで構造特異的物質は、特に、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、又はアビジン及びストレプトアビジンのようなビオチンに結合する物質、サイトカイン、リンホカイン、エンドセリン又はそれらのアンタゴニストのようなレセプターに特異的に結合するアゴニスト、他の特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、リポ蛋白質等として定義される。
磁石緩和測定検出のための化合物は、識別され得る緩和時間とのいくつかの強磁性又はフェリ磁性粒子の組合せからもなり得る。なぜなら、個々に識別され得る測定結果は、緩和時間の極めてせまい分布及び／又はサンプル内の種々の構造特異的物質又は被検体についての磁気モーメント各々を有する異なる磁気ラベリングの使用を通して達成され得る。結果として、いくつかの被検体の直接同時の定量測定が可能になる。
懸濁媒体として、コロイド状粒子が自由に動くことができる全ての液体が適している。特に適切なのは、水、表面活性アジュバントの水溶液、例えば界面活性剤又はオリゴマーもしくはポリマー炭水化物及び蛋白質、並びにアルコール、例えばグリセロール及びポリエチレングリコールとの水の混合物である。懸濁媒体は、例えば一般的な塩のような浸透圧を変化させるアジュバントを更に含み得る。更に、例えばホスフェートのようなpHを決定する緩衝物質が含まれ得る。
強磁性又はフェリ磁性コロイド状材料から、同定されるべき構造特異的物質又は被検体と共に作られた化合物は、任意に他のアジュバント、例えば乾燥を容易にし、又は（例えば凍結乾燥物として）乾燥産物の安定性を増加させるものと組み合わせて、乾燥形態でも存在し得る。
被検体を見い出すのは、分離及び洗浄ステップで、又はそれらなしで行われ得る。結合した磁気マーカーと未結合の磁気マーカーとの間の分離ステップで測定を行うことにおいて、本発明による全ての強磁性又はフェリ磁性コロイド状物質が、磁気緩和測定検出のための磁気ラベリングとして用いられ得る。これらの場合において、Brownian緩和時間及び
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緩和時間に関する特別の要求はもはや行われる必要はない。
物理的メカニズムに基づく結合の同定のため、非特異的測定シグナル（マトリックス現象）は大きく除外される。これによりその過程の特異性は構造特異性物質の“本当の”特異性（抗体の交差反応、リガンドの非特異的結合）にのみ依存する。
本発明による方法の高い感度のため、一般に出くわす結合アッセイの検出限界下にあることが容易である。
磁気ラベリングの物質として、磁気緩和測定検出に適した媒体中にコロイド状に分散され得るすべての強磁性又はフェリ磁性材料が用いられ得る。結合及び非結合磁気マーカーの間の分離ステップなしに行われる磁気緩和検出のための物質を用いる場合、測定条件下の磁気ラベリングの
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緩和時間は磁気マーカーのBrownian緩和時間より長くなければならない。特に適しているのは、10-8〜10-1秒の範囲の水性媒体中のBrownian緩和時間及び10-8秒超の
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緩和時間を有する全ての強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子である。分離ステップなしに測定を行うために、用いられる分散媒体の粘度は、懸濁媒体が基本的にBrownian緩和の時定数を決定するので、強磁性及びフェリ磁性粒子の緩和時間並びに測定時間に適合されなければならない。
好ましいのは、特に、その
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緩和時間がBrownian緩和時間より長い鉄、酸化鉄、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト、コバルト、ニッケル、ニッケルフェライト、コバルトフェライト及び二酸化クロムから作られた強磁性又はフェリ磁性コロイド状粒子である。
せまい分布の粒径及び／又は磁気モーメントを有する磁気ラベリングの使用が一般に有利である。せまい分布の粒径を有する画分への磁気ラベリングの分離は、例えばクロマトグラフィー法により、又は特定のろ過方法（例えばガラスキャピラリーシステム又はタンジェントろ過（tangential filtration））により、分子ふるいを用いることにより、又は遠心により、行われ得る。出来る限り均一であるモーメントを有する磁気ラベリングが、例えば磁気勾配場における分類により作られ得る。
強磁性及びフェリ磁性物質は、オリゴマーもしくはポリマー炭化水素、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、界面活性剤、他のモノマー、オリゴマー、又はポリマー及び／又は脂質から作られたシェルで安定化され得る。
強磁性及びフェリ磁性物質の粒径は有利には、1nm〜400nmの間である。特に好ましいのは、1nm〜100nmの粒径である。
本方法によれば、磁石−緩和測定検出は、最初に、適切な磁場により研究されるべきサンプルを磁化することを可能にし、次のその磁気マーカーの磁気緩和を測定する測定配置で行われる。本実施例で用いた磁石緩和測定検出のための測定配置を図１に示す。全ての他の既に周知である方法（JP−235774及びWO 91/15243）と対照的に、本発明による方法における磁化の緩和の測定において、それは測定される磁場の存在下での静磁化でなく、むしろ磁場の欠損下での時間変化である。これによるデータは利用できるマーカーの結合状態に基づくデータのみである。更に、反磁性又は常磁性構成物又は混入物による測定シグナルの影響がこれにより避けられる。更に、測定感度は決定的に増加する。
磁場の存在下での例えばSQUIDのような高感度センサーにより磁場を適切に変化させることによるマーカーの振動数依存の磁化の測定（振動数の関数としての複合体磁化率の決定）を行うことが更に可能である。この場合、別個に決定され得る反磁性又は常磁性構成物の振動数依存性と反対に、磁気マーカーの磁化率の特定の振動数依存性が用いられる。また、この方法は、WO 91/15243で提唱される超常磁性物質の磁化率を決定するための方法から異なる。WO 91/15243においては、磁気マーカーの磁化率の振動数も、この特性を用いるための方法も記載されていない。
本発明の他の態様は、血液中を循環するマーカーから影響を受けずに保持部位及び特異的に結合したマーカーの程度を検出することを可能にする方法に関する。これらの方法において、先行技術のシンチグラフィー方法を行うことを避けることができない過去のもののような放射能物質の使用が避けられる。
本発明による方法は、液体中の結合した及び未結合の磁気マーカーの間の緩和時間の差、並びに磁気マーカーが固相に結合することによる支配的な緩和メカニズムの変化が生体内の物質又は構造の磁石緩和測定検出のためにも用いられ得るという事実に基づく。このような方法は、以下に免疫マグネトグラフィー又はイムノマグネトグラフィーとしても言及される。
測定の時間範囲内でヒトに用いられる緩和性磁気マーカーの空間的分布の生体内測定は、次の２つの異なる測定方法によって行われ得る。
1.有利な体積で可能な限り均一な磁場の形成、その場の除去、そしてマルチチャンネルセンサーによる緩和性磁場の空間的分布の測定。前記センサーは可能な限り完全に測定対象物を囲うべきである。十分な測定情報を形成するために、測定対象物の連続的推察（Abrasterung）での繰返し測定も可能である。
2.空間内に限定された局所的な場の連続的な形成、その場の除去、そして単一チャンネルセンサーによる緩和性磁場の空間的分布の測定。マルチチャンネルセンサーの使用も可能である。
両方の方法において、測定対象物の磁化と全ての３つの空間的方向において結果として生ずる磁場の測定との両方の可能な限り多くのデータを得ることが好ましい。
測定は、生体電流の磁場の分析にも用いられるようなモデルにより記載され得る。磁気双極子、多極子又は多重双極子のモデルが基質として用いられる。モデル、特に双極子又は多極子の部位の特別のパラメータは、測定データとモデルパラメータとの間の偏差を最小にとる適切な近似方法によって見い出される。これらのパラメータは、磁化粒子の空間的分布に基づく情報を提供する。
同様の試みは、生体電流の磁場の分析について周知であり、証明されている。
免疫マグネトグラフィーに適した方法及び化合物として、磁石緩和測定検出について言及される全ての方法及び物質が用いられ得る。
免疫マグネトグラフィーを行うのに特に適しているのは、生分解可能な適合する磁気ラベリングである。これは、酸化鉄からなる磁気ラベリングが特に適している。
生体内で結合特異的磁石緩和測定検出を行うために、体液で体温において構造特異的物質と共にヒトの体に導入される強磁性又はフェリ磁性物質の組合せのBrownian緩和時間が
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緩和時間より短いことが必要である。
免疫マグネトグラフィーにおいて、構造特異的物質は特に同定されるべきヒトの体の構造に特異的に結合する全ての物質として規定される。特に適しているのは、抗体、抗体フラグメント、レセプターに特異的に結合するアゴニストもしくはそれらのアンタゴニスト、特異的ペプチド及び蛋白質、レセプター、酵素、酵素基質、ヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、炭水化物、又はリポ蛋白質である。レセプターに結合するアゴニストの中で、特にサイトカイン、リンホカイン、又はエンドセリンが適している。
更に適しているのは、105〜1015（mol/l）-1の範囲の結合定数を有する全ての構造特異的物質である。特に適しているのは、107〜1015（mol/l）-1の範囲の結合定数を有する全ての構造特異的物質である。
以下の実施例は、本対象を限定する目的でなく、本発明の対象をより詳細に説明するのに用いられる。
実施例１
以下にアンチコラーゲンIIIとして言及されるコラーゲンIIIに対するモノクローナル抗体100μｇを0.1M重炭酸ナトリウム溶液500μｌ中に溶かす。1l当り1molのFeを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱懸濁液（Meito Sangyo）1mlをSephadexカラム（Pharmacia PD10）を通して0.1M重炭酸ナトリウムで緩衝する。その懸濁液に10mmolの過酸化ナトリウム0.5mlを加える。その溶液を２時間、暗所に放置する。次にそれを0.1M重炭酸ナトリウム溶液でPD10を通して溶出する。その溶液にアンチコラーゲンIII溶液を加える。その混合物を４℃で３時間、暗所に放置する。次に5mgのNaBH4を固体として加え、簡単にかきまぜる。その混合物を４℃で８時間、暗所に放置し、次に（以下にmag−アンチコラーゲンIIIとして言及される）磁鉄鉱でラベルされたアンチコラーゲンIIIをリン酸緩衝された一般的塩溶液（以下、PBS、pH7.4）でPD10カラムを通して溶出する。
200μｌの緩衝液（リン酸緩衝された一般的な塩溶液（PBS））中に５μｇのコラーゲンIIIの溶液をポリスチレンサンプリング容器内でインキュベートする。次にその液相を捨てる。そのサンプリング容器を0.1％（以下RBSTとして言及される）Tween▲Ｒ▼20を含むリン酸緩衝された一般的な塩溶液で３回、流す。200μｌのPBST中のmag−アンチコラーゲンIII  ５μｌをサンプルに加える。それを室温で１時間、インキュベートする。次にそのサンプルを、スクイドディテクター下4cmに2mTの強度の場内の磁気的にシールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後400ミリ秒に、100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で、減少する場から緩和を同定する。コラーゲンIIIを含むサンプルの緩和シグナルは図２に示される。
実施例２
pH7.4のPBS緩衝液200μｌ中のコラーゲンＶ  ５μｌの溶液をポリスチレンサンプリング容器内でインキュベートする。次に、その液相を捨てる。そのサンプリング容器をpH7.4のPBST洗浄緩衝液で３回洗浄する。200μｌのPBST中の実施例１により作られたmag−アンチコラーゲンIII  ５μｌをサンプルに加える。それを室温で１時間、インキュベートする。次に、サンプルをSQUIDディテクターの下4cmで2mTの強度で場の中の磁気的にシールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後、サンプルを測定する。磁場を切った後400ミリ秒に、緩和測定を100秒間にわたって行う。コラーゲンを含むサンプル中において、測定信頼度の限界内で減衰する磁場は検出され得ない（図３を参照のこと）。
実施例３
100μｌのグルタルジアルデヒド溶液（水中３％）を1mlのPBS中100μｇのコラーゲンIIIの溶液に加える。その溶液を４℃で24時間、撹拌して、次に遠心してとる。その沈殿は沈殿した架橋されたコラーゲンIIIを含んでいる。その架橋されたコラーゲンIIIを1mlのPBS中に懸濁する（サンプル１）。100μｌのグルタルジアルデヒド溶液（水中３％）を1mlのPBS中100μｇのコラーゲンＶの溶液に加える。その溶液を４℃で24時間、撹拌し、次に遠心してとる。そのペレットは沈殿した架橋されたコラーゲンＶを含んでいる。架橋されたコラーゲンＶを1mlのPBS中に懸濁する（サンプル２）。実施例１のmag−アンチコラーゲンIII懸濁液の各々をサイクル１及び２に加える。それを37℃で１時間、インキュベートする。次に両方のサンプルをSQUIDディテクターを通して2mTの強度で磁場内のシールドされたチャンバー内で磁化する。磁場を切った後400ミリ秒に、緩和測定を行う。サンプル１の場合、減衰する場を測定する。サンプル２の場合、減衰する場は検出され得ない。
実施例４
PBS（pH7.4）中1.9mg/mlのコラーゲンIII溶液10mlから、次の希釈液:10,000ng/ml、1,000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/mlの各々5mlを作る。
各々の希釈液からポリスチレンチューブ（2.5ml容量）に各々1mlで３回、ピペットする。それを37℃で１時間、阻害する。次にそのチューブの成分を捨てる。そのチューブを各々1mlのPBSTで３回、洗浄する。
実施例１により作られた磁鉄鉱標識抗体の1:100希釈液1mlを各々のチューブに加える。そのチューブを室温で１時間、放置する。次にそのサンプルを図１に概説される測定配置で磁化（2mT）し、磁場を切った後、100秒間にわたって緩和を測定する。磁場を切った後200ミリ秒及び100秒の測定された磁束密度Ｂの差の評価をサンプル中のコラーゲン濃度に基づく図４に再現する。
実施例５
以下にアンチコラーゲンIIIと言及されるコラーゲンIIIに対するモノクローナル抗体100μｇを0.1M重炭酸ナトリウム溶液500μｌ中に溶かす。リッター当り1molのFeを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱懸濁液1mlを0.1M重炭酸ナトリウムでSephadexカラム（Pharmacia PD10）を通して緩衝する。その溶液を２時間、暗所に放置する。次に、それを0.1Mの重炭酸ナトリウム溶液でPD10を通して溶出する。アンチコラーゲンIII溶液を懸濁液に加える。次に5mgのNaBH4を固体として加え、簡単にかきまぜる。その混合物を４℃で８時間、暗所に放置する。次に（mag−アンチコラーゲンIIIとして以下に言及される）磁鉄鉱標識されたアンチコラーゲンIIIをリン酸緩衝された一般的な塩溶液（PBS、pH7.4）でPD10カラムを通して溶出する。
mag−アンチコラーゲンIII懸濁液の各々20μｌを、更に0.1％のPBSTを含むpH7.4のリン酸緩衝された一般的な塩溶液390μｌで希釈し、各々の500μｌの容量を有するポリアクリル酸が作られた３つのサンプリング容器内に充填する。ヒト血清アルブミンの水溶液（ml当りアルブミン1mg）100μｌを第１のサンプリング容器に加える（サンプル１）。PBST中のコラーゲンの溶液（ml当り１μｇのコラーゲン）100μｌを第２のサンプリング容器に加える（サンプル２）。PBST中コラーゲンIIIの溶液（ml当り１μｇのコラーゲン）100μｌの第３のサンプリング容器に加える（サンプル３）。蛋白質溶液を加えた後200秒に、サンプルを図１に概説される測定配置で磁化（2mT）し、そして磁場を切った後20ミリ秒に、各々の場合１秒で始まる磁気緩和を測定する。サンプル１及び２において、減衰する磁場は測定の信頼度の限界内で検出され得ない。しかしながら、サンプル３において、減衰する磁場が検出され得る。サンプリング容器を空にし、各々500μｌのPBSTを３回、流した後、測定をくり返す。測定信頼度の限界内で減衰する磁場が検出され得るサンプリング容器はない。
実施例６
100μｇのアビジンを500μｌの0.1M重炭酸ナトリウム溶液中に溶かす。リッター当り1molのFeを有し、粒径約40nmのデキストランコートされた磁鉄鉱懸濁液1mlを0.1M重炭酸ナトリウムで、Sephadexカラム（Pharmacia PD10）を通して緩衝する。10mmolの過酸化ナトリウム溶液0.5mlをその懸濁液に加える。その溶液を暗所で２時間、放置する。次にそれを0.1M重炭酸ナトリウム溶液でPD10を通して溶出する。アビジン溶液を懸濁液に加える。その混合物を４℃で３時間、暗所に放置する。次に5mgのNaBH4を固体として加え、簡単にかきまぜる。その混合物を４℃で８時間、暗所に放置する。次に（以下、mag−アビジンとして言及される）磁鉄鉱標識されたアビジンをリン酸緩衝された一般的な塩溶液（PBS、pH7.4）でPD10カラムを通して溶出する。
1mgのウシ血清アルブミンをビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと接合し（以下ビオチンアルブミンと呼ぶ）、PBSで１μg/mlの濃度に希釈する。
1mlのビオチン−アルブミン希釈液をポリスチレンサンプリング容器内で室温で３時間、インキュベートする。次にその液相を捨てる。そのサンプリング容器を0.1％Tween▲Ｒ▼20を含むリン酸緩衝された一般的な塩溶液（PBST）で３回洗浄する。そのサンプルに５μｌのmag−アビジンを加える。それを室温で１時間、インキュベートする。次に、そのサンプルをスクイドディテクター下4cmで2mTの強度で場内に磁気的にシールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後400ミリ秒に、100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で、減衰する磁場を測定する。
PBS中のウシ血清アルブミンの希釈液（0.1mg/ml）1mlをポリスチレンサンプリング容器内で室温で３時間、インキュベートする。次に、その液相を捨てる。そのサンプリング容器を、0.1％Tween▲Ｒ▼20を含むリン酸緩衝された一般的な塩溶液で３回洗浄する。そのサンプルに５μｌのmag−アビジンを加える。それを室温で１時間、インキュベートする。次にそのサンプルを、スクイドディテクター下4cmで、2mTの強度で場内に磁気シールドされたチャンバー内で磁化する（図１を参照のこと）。磁場を切った後400ミリ秒に、100秒間にわたって、緩和測定を行う。サンプル中で、測定信頼度の限界内で減衰する磁場は測定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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