(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞における真核生物アルカリホスファターゼの生産方法であって、
(a)  配列番号５で表される遺伝子配列の、複数の異なるベクターへのクローニング、(b)  酵母の形質転換、(c)  発現、および(d)  アルカリホスファターゼの精製の各工程を含んでなり、
第１のベクターが、第１の選択マーカーに対する耐性遺伝子を有し、
前記耐性遺伝子および前記遺伝子配列がゲノムに組込まれた形質転換体を、低濃度の第１の選択マーカーを含む栄養培地で増殖させることによって選択し、
遺伝子コピー数を多重形質転換によって増大させ、その際、多重形質転換体を、選択圧を増大させた栄養培地で増殖させることによって選択し、
第２の選択マーカーに対する耐性遺伝子を有する第２のベクターを加え、
遺伝子コピー数を第２のベクターによる多重形質転換によって増大させ、その際、多重形質転換体を、選択圧を増大させた栄養培地で増殖させることによって選択し、そして
前記の両選択マーカー耐性遺伝子および前記遺伝子配列の複数のコピーが安定した形で組込まれたクローンを選択する、
ことを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
メチロトローフ酵母細胞が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピチア・パストリス(Pichia pastris)またはハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)が酵母株として使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号５で表されるDNA。
【請求項５】
配列番号５で表される配列を含むベクター。
【請求項６】
本質的にpHAP10-3である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
pHAP10-3由来の発現カセット全体を含むベクター。
【請求項８】
本質的にpHAP10-3/9Kである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載のベクターで形質転換された宿主株。
【請求項１０】
ベクターpHAP10-3/9Kおよび／または請求項５もしくは６に記載のベクターで形質転換された宿主株。
【請求項１１】
ピチア・パストリスまたはハンゼヌラ・ポリモルファが宿主株として使用される、請求項１０記載の宿主株。
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクターで形質転換されたピチア・パストリスX-33株。
【請求項１３】
真核生物の高活性アルカリホスファターゼの生産方法であって、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の宿主株において酵素を発現させることを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、真核生物アルカリホスファターゼの組換え生産および発現方法に関する。また本発明は、比活性3000U/mg以上の真核生物の高活性アルカリホスファターゼをコードするコドン最適化DNAに関する。さらに本発明は、酵母細胞における発現用のベクターへの該DNAの挿入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリホスファターゼ(AP)は、亜鉛を含有する二量体の非特異的ホスホモノエステラーゼであり、原核生物ならびに真核生物、例えば大腸菌(E.coli)および哺乳動物に存在する(McCombら, 1979, Alkaline Phosphatases Plenum Press, New York)。各種アルカリホスファターゼの一次構造の比較から、高度の相同性が示された(大腸菌APと哺乳動物APとの相同性は25〜30％。Millan, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989 Clin. Chim. Acta 186, 133-150)。
【０００３】
ヒトおよび高等動物においては、APファミリーは異なる遺伝子座に位置する４個のメンバーを含む(Millan, 1988 Anticancer Res. 8, 995-1004; Harris, 1989 Clin. Chim. Acta 186, 133-150)。アルカリホスファターゼファミリーには、組織特異的AP(胎盤AP(PLAP)、生殖細胞AP(GCAP)および腸管AP(IAP))、ならびに非組織特異的AP(TnAP)（主に肝臓、腎臓および骨に分布する）が含まれる。
【０００４】
従来公知のAPにおける決定的な特徴は、哺乳動物APの触媒活性（大腸菌APよりもkcats値が10〜100倍高い）には大きなばらつきがあるということである。哺乳動物APの中でウシ腸管由来のAP(bIAP)が最も高い比活性を示す。この特徴のために、bIAPは、該当する酵素のコンジュゲートを診断試薬として使用したり、DNAの脱リン酸化のために使用したり、といった生化学的用途において魅力的である。ウシ腸管由来の、様々な大きさの比活性を有する種々のアルカリホスファターゼが存在するということが、EP 0 955 369およびManesら (1998), J. Biol. Chem. 273 No.36. 23353-23360に記載されている。これまで、低活性(3000U/mg以下)の真核生物アルカリホスファターゼの組換え発現が、様々な真核細胞系、例えばCHO細胞(bIAP I、WO93/18139; Weissigら, 1993, Biochem. J. 260, 503-508)、COS細胞(ヒト胎盤AP、Bergerら, 1987, Biochemistry 84, 4885-4889)またはバキュロウイルス発現系(ヒト胎盤AP、Davisら, 1992, Biotechnology 10, 1149-1150)に関して記述されている。ウシ腸管由来の、より活性の高いAP(比活性＞3000U/mg)のCHO細胞における発現も記載されている(bIAP II, IIIおよびIV、Manesら, 1998, J. Biol. Chem. 273 No.36, 23353-23360)。しかしながら、これらの発現系でアルカリホスファターゼを発現させることの欠点は、発現量が低いことであり、そのため、特に高活性APの組換え体の生産は経済性に見合わないものになる。
【０００５】
大腸菌などの原核細胞の発現宿主において真核生物のアルカリホスファターゼを発現させることは原理的に可能であるが(ヒト胎盤AP、BeckおよびBurtscher, 1994 Protein Expression and Purification 5, 192-197)、原核生物で発現させたアルカリホスファターゼはグリコシル化されていない。このグリコシル化は特に酵素コンジュゲートの調製には必須である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、グリコシル化された、高い比活性を有する真核生物アルカリホスファターゼを生産するのための強力かつ安定な発現方法であって、発現量が高いことからそのようなアルカリホスファターゼの経済的な生産を可能にし、さらに、例えば比活性および熱安定性に関して、高活性または低活性の天然型アルカリホスファターゼ(例えばRoche Diagnostics GmbH, Biozyme, オリエンタル酵母、から市販されている)と同等の特性を有する酵素が得られるような方法を開発することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、本発明にしたがって、酵母、特にメチロトローフ(methylotrophic)酵母における高い比活性を有する真核生物アルカリホスファターゼの生産方法であって、
(a)ある１つの遺伝子配列の、複数の異なるベクターへのクローニング、
(b)酵母の形質転換、
(c)発現、および
(d)アルカリホスファターゼの精製
の各工程を含んでなり、
(i) 第１のベクターが、第１の選択マーカーに対する耐性遺伝子を含有し、
(ii) 該耐性遺伝子および前記遺伝子配列がゲノムに組込まれた形質転換体を、低濃度の第１の選択マーカーを含む栄養培地で増殖させることによって選択し、
(iii) 遺伝子コピー数を多重形質転換によって増大させ、その際、多重形質転換体を選択圧を増大させた栄養培地で増殖させることによって選択し、
(iv) 前記遺伝子配列と共に第２の選択マーカーに対する耐性遺伝子を含有する第２のベクターを加え、
(v)前記第２のベクターによる多重形質転換によって遺伝子コピー数を増大させ、その際、多重形質転換体を選択圧を増大させた栄養培地で増殖させることによって選択し、そして
(vi)前記の両耐性遺伝子および前記遺伝子配列の複数のコピーがゲノムに安定した形で組込まれたクローンを選択する、
ことを特徴とする方法によって達成される。
【０００８】
好ましい遺伝子配列は、3000U/mg以上、特定の場合には7000U/mg〜約10,000U/mgの比活性を有する真核生物アルカリホスファターゼをコードするDNA配列である。例えば配列番号１で表されるDNA配列が本発明に好適であることが分かった。特に好ましいのは、配列番号１の遺伝子配列とアミノ酸レベルで一致するコドンを最適化したDNA配列である。コドンの最適化とは、例えば配列番号１の各コドンをサイレント突然変異によって最適化することを意味し、すなわち、アミノ酸レベルでは何ら影響を与えないで、選択された発現宿主により要求されるとおりに翻訳を増大させるためにDNAレベルでの変更を加えることであり、それにより、例えば、配列番号５で表される遺伝子配列が得られる。しかしながら、アルカリホスファターゼ、例えばbIAPI、III、IVなど(DE 198 19 962およびEP 0 955 369)をコードし、場合によってはコドンを最適化されている、配列番号１以外の、配列を、ベクターに組込むことも可能である。本発明の方法においては、配列番号５で表される、コドンを最適化した遺伝子配列を使用するのが特に好ましい。次いで、該当する遺伝子配列を、形質転換される宿主に応じて選択される１個または複数のベクターにクローニングする。
【０００９】
メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス(Pichia pastoris)酵母、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、およびその他の酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)またはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosacccharomyces pombe)などが酵母宿主として特に好適である。好適なベクターは、当業者には公知であり、例えば、pPICZαA、pIIC9K、Yesベクター、pTEF1/Zeo、pVDI(例えばInvitrogen)である。上記のようにして形成される発現ベクターは、種々のピチア・パストリス株に形質転換され、安定した形でそのゲノム内に組込まれる。酵母ゲノムへの安定な組込みは、その後の、例えば真核生物の高活性アルカリホスファターゼの大容量での発酵における生産の際に選択圧を必要としないという利点を有する。ゲノムへの安定な組込みとは、発現ベクターが、例えばピチア・パストリスのゲノム内に相同組換えによって組込まれ、したがって遺伝により世代から世代へと永久的な構成要素として受け継がれることを意味する(Cregg, J.M.ら, Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376-3385)。
【００１０】
多重形質転換によってメチロトローフ酵母における遺伝子コピー数を増大させると同時に、適当な選択マーカー、例えば抗生物質(Zeocin(登録商標)もしくはGeneticin(G418)など)を用いて、あるいは栄養要求性マーカーを用いて選択圧を増大させた。その後は、ゲノムに発現ベクターの複数のコピーが安定に組込まれたクローンのみが生存し得る。選択マーカーとして使用する抗生物質の濃度がより高い場合に耐性であるためには、クローンが耐性タンパク質を産生する量が増大する必要である。これは、例えば、高活性アルカリホスファターゼのための発現カセットとともに選択マーカーとして使用する抗生物質に対する耐性遺伝子を含む発現ベクターの多重組込みによって達成できる。
【００１１】
高発現量を有する、強力かつ安定な発現方法において経済的に真核生物アルカリホスファターゼを製造するという目的は、上記手段(i)〜(vi)を組み合わせることによりはじめて達成できた。したがって、例えば、これらの手段を使用せずに配列番号１で表されるbIAPII遺伝子を含む発現ベクターによるピチア・パストリス株X-33の形質転換を行った場合、所望の結果が得られなかった（実施例１および２参照）。この手段(i)〜(vi)を使用しない方法は、CHO細胞におけるbIAPIIの発現(Manesら, 1998, J. Biol. Chem. 273 No.36, 23353-23360)と比較すると、発現量をかなり増大させることができたが、組換えアルカリホスファターゼを経済的に生産できるものではない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法にとって好ましい手段の一つは、コドンを最適化した遺伝子配列の合成である。各コドンを酵母における発現に対して最適化するためには、真核生物の高活性アルカリホスファターゼをコードする約1.5kBpの長さの遺伝子を完全に新規合成することが必要であった。必要に応じて、配列番号４で表される真核生物の高活性アルカリホスファターゼのアミノ酸配列の逆翻訳(retranslation)によって、または縮重コードを利用することによって各コドンを最適化することができた。この目的のために、該遺伝子を54〜82ヌクレオチド長の28個のオリゴヌクレオチドに分割した。該オリゴヌクレオチドは、その5'末端と3'末端がそれぞれ隣接するオリゴヌクレオチドと相補的に重複するセンス鎖断片とアンチセンス鎖断片の交互配列として設計した。重複する領域は、それぞれにおいて、その後のPCR反応におけるアニーリング反応中に非特異的結合をほぼ回避できるように選択した。該遺伝子の5'末端および3'末端にあるオリゴヌクレオチドは、コード領域の上流および下流に、後に配列番号５で表される合成遺伝子の発現ベクターへ挿入するために使用できる制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を有するものとした。この場合、制限エンドヌクレアーゼEcoRIに対する認識部位を上流に組込み、制限エンドヌクレアーゼAsp718に対する認識部位を下流に組込んだ。オリゴヌクレオチドの配列を配列番号６〜３３に示す。
【００１３】
遺伝子合成はPCR反応で行った。この目的のために、まずコード領域を３つのセグメント（オリゴヌクレオチド６〜15、16〜23、24〜33）に分割し、これらのセグメントを別々のPCR反応で作製した。重複している相補オリゴヌクレオチドを用いたPCR反応での遺伝子合成において、遺伝子断片を段階的に伸長させて完全長の産物を生成し、それに続くサイクルで増幅させた。このプロセスにおけるアニーリング温度は融解温度が最も低い重複領域に依存する。
【００１４】
次いで、３つのセグメントをアガロースゲル電気泳動で分析した。期待どおりの長さの産物をQIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲルから単離し、さらにPCR反応で合成を行って完全な遺伝子産物を生成した。このプロセスにおいて、まず、完全長の遺伝子の5'末端および3'末端のプライマーを加えずにPCR反応を５サイクル行って、最初に、３つのセグメントから、期待どおりの長さの遺伝子産物の断片を少数だけ形成させた。アニーリング温度は融解温度が最も低い重複する領域に応じて変わる。その後、末端プライマーを加え、融解温度が最も低いプライマーのアニーリング温度に一致するように、アニーリング温度を上昇させた。さらに25サイクル行って期待した長さの遺伝子断片を大量に増幅させた。
【００１５】
PCR生成混合物をアガロースゲル電気泳動で分析し、期待どおりの大きさを有する遺伝子断片を単離した（QIAquickゲル抽出キット／Qiagen）。
【００１６】
かかるPCR断片のクローニング、ピチア・パストリスの形質転換および発現は実施例３に記載する。
【００１７】
高活性アルカリホスファターゼのコドンを最適化した遺伝子によって、発現量を、野生型遺伝子を用いた最初の実験に対して３倍に増大させることができた。
【００１８】
しかしながら、これらのクローンは、高活性アルカリホスファターゼの経済的な生産方法を提供するものではなかった。
【００１９】
ピチア・パストリスにおいて異種タンパク質および同種タンパク質の発現量を増大させ得る手段の１つは、多重形質転換によって細胞中の遺伝子コピー数を増大させることである。この手段によって、転写産物、すなわち標的遺伝子のmRNAが増大し得る。発現ベクターを含有するクローンの多重形質転換によって遺伝子コピー数が増大すると同時に、その後、選択マーカーとして使用する抗生物質の濃度を上昇させた栄養プレートで形質転換体を増殖させる際の選択圧が増大する。この方法においては、最初の形質転換サイクルにより少なくとも１コピーの発現ベクターがすでに取り込まれている発現クローンを再びコンピテントにして（実施例１参照）、再度発現ベクターで形質転換する。数コピーの発現ベクターがゲノムに組込まれた形質転換体を、より高い選択圧を有する栄養プレート、すなわち選択マーカーとして使用する抗生物質（例えばZeocin（登録商標））の濃度を最初の形質転換サイクルの時よりも上昇させたプレートで平板培養することによって選択する。そのために、選択マーカーとして使用する抗生物質について、最初の形質転換サイクルで得られたクローンが依然として増殖可能な最高濃度を測定し、さらなる形質転換の後に、選択マーカーとして使用する抗生物質のYPDS寒天プレート中の濃度をその測定した閾値よりも高くする。発現ベクターのコピー数が増大するにつれて発現ベクターの構成要素である耐性遺伝子のコピー数も増大し、よって選択マーカーとして使用する抗生物質がより高濃度になった場合に対する耐性も増大する。栄養プレート中で選択マーカーとして使用する抗生物質の濃度を変化させることによって（約100〜2000μg/ml、実施例４参照）、様々なコピー数の発現ベクターをゲノム内に含むクローンを選択することも可能である。
【００２０】
ピチア・パストリスなどの酵母における異種タンパク質および同種タンパク質の発現量の増大に使用できるさらなる手段は、多重選択による遺伝子コピー数の増大である。これを達成するために、標的遺伝子（例えば配列番号５で表される高活性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子）および選択マーカーとして使用する第１の抗生物質（例えばZeocin(登録商標)）に対する耐性遺伝子を含む発現カセットを含有する発現ベクターを用いた多重形質転換によりすでに最適化されている発現クローンを、標的遺伝子（例えば配列番号５で表される高活性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子）および選択マーカーとして使用する第２の抗生物質（例えばGeneticin(G418)）に対する耐性遺伝子を含む第２の発現ベクターで形質転換する。その後、その形質転換体を第２の抗生物質を選択マーカーとして含む栄養プレートで平板培養すると、選択マーカーとして使用する第１の抗生物質に対する耐性遺伝子を含む発現ベクターのコピーに加えて、選択マーカーとして使用する第２の抗生物質に対する耐性遺伝子を含む発現ベクターをも少なくとも１コピーは取り込んでいるクローンのみが選択される。次いで、これらの発現クローンは、選択マーカーとして使用する第２の抗生物質に対する耐性遺伝子を含む発現ベクターを用いるさらなる多重形質転換に付することができる（実施例５参照）。
【００２１】
多重形質転換手段と二重選択とを組み合わせることによって、発現量を、コドンを最適化した遺伝子を含む第１の形質転換サイクルから得られたクローンの発現量の４倍に増大させることができた。
【００２２】
組換えアルカリホスファターゼは、原理的には当業者に公知の抽出法によって、例えば、Protein Purification, Springer Verlag, Robert Scopes編(1982)にしたがってバイオマスから抽出できる。7000U/mg以上の比活性を有する純粋なバンドの産物は、クロマトグラフィーによる分離法、特に疎水性カラム材料および陽イオン交換体を用いる方法によって得られる。
【００２３】
精製された産物をN-末端配列決定に付して、該組換え型高活性アルカリホスファターゼを特性決定した。
【００２４】
ドミナント配列EAEAEFLIPA（配列番号３６）が決定された。この配列は、AP「LIPA」のN-末端配列（配列番号３７）および構築産物のリンカーペプチドEAEAEF（配列番号３８）と明確に関連している。このリンカーペプチドは、遺伝子配列のベクターへのクローニング法の計画において形成されるものであり、Kex2シグナルペプチダーゼ(例えばInvitrogen)によるα-因子シグナルペプチドの切断により生成する。
【００２５】
組換え型アルカリホスファターゼ産物と天然型アルカリホスファターゼの安定性を比較検討した。それらのサンプルについて、その溶液を熱ストレス(55℃)に付した場合、同等の結果が得られた。
【００２６】
したがって、本発明は、まず、ウシ腸管などの哺乳動物細胞に由来する組換え型アルカリホスファターゼであって、ウシ腸管由来の天然型高活性アルカリホスファターゼと同等の特性を有し、グリコシル化されている組換え体の経済的な生産を可能にする方法を記述するものである。
【００２７】
また本発明は、ピチア・パストリスにおいて高活性アルカリホスファターゼの遺伝子を発現させるためのコドンを最適化した遺伝子配列である、配列番号５で表されるDNA配列にも関する。
【００２８】
本発明のさらなる主題は、配列番号５を含むベクター、特に好ましくは図２に示したベクターpHAP10-3である。pHAP10-3は、市販のベクターpPICZαA（Invitrogen）に、AOX 1プロモーターの制御下に配列番号５で表される本発明の遺伝子を組込んだものである。
【００２９】
本発明のさらなる主題は、本発明のベクターで形質転換された宿主株である。ベクターpHAP10-3で形質転換されたピチア・パストリスX-33株が特に好ましい。
【００３０】
別の好ましいベクターは、AOX 1プロモーター、サッカロミセス・セレビシエ由来のα-因子のシグナルペプチド、シグナルペプチドの下流に正確なリーディングフレームでクローニングされている、高活性アルカリホスファターゼをコードする配列番号５で表されるコドン最適化標的遺伝子、およびAOX 1転写終結領域を原則的に含むpHAP10-3由来の発現カセット全体を含有するベクターである（図３参照）。市販のベクターpPIC9K(Invitrogen)、および配列番号５で表される合成遺伝子を含むpHAP10-3由来の発現カセットを含むベクターpHAP10-3/9Kが特に好ましい。
【００３１】
ベクターpHAP10-3およびpHAP10-3/9Kは、最終的に産生されるクローンが両ベクターのコピーを含むので、同等に適切である。
【００３２】
本発明のさらなる主題は、pHAP10-3/9Kベクターで形質転換されている宿主株である。しかしながら、YESベクター、pYD1、pTEF1/ZEO(Invitrogen)などの当業者に公知のその他のベクターならびにサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウィア・リポリチカ、特にピチア・パストリスX-33などの当業者に公知のその他の株も本発明においては好適である。ベクターpHAP10-3/9Kで形質転換されたピチア・パストリスX-33株は本発明にとって特に好ましい。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明の１個または数個のベクター、特にpHAP10-3ベクターまたはpHAP10-3/9Kベクターで形質転換された宿主株においてタンパク質を発現させることによって真核生物の高活性アルカリホスファターゼを生産する方法である。本発明のベクターで形質転換されたピチア・パストリス株が本発明の方法には特に好ましい。これに関して、pHAP10-3ベクターおよびpHAP10-3/9Kベクターで形質転換されたピチア・パストリスX-33株が特に好ましい。
【００３４】
【実施例】
実施例１：
bIAPII遺伝子のクローニング
まず、配列番号１(EP 0 955 369; Manesら、1998, J. Biol. Chem. 273 No. 36, 22353-23360)で表されるbIAPII遺伝子の上流および下流に、PCR法ならびに配列番号２および配列番号３で表される適切なプライマーを選択することにより、ピチア・パストリス用の発現ベクター内へのクローニングに適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を付与した。本実施例では、上流にはEcoRIに対する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を、そして、下流にはAsp718 Iに対する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を連結した。
【００３５】
該PCR断片をEcoRIおよびAsp718 I (Roche Diagnostics GmbH)で再切断し、再び単離し(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いた)、続いて、EcoRIおよびAsp718 I (Roche Diagnostics GmbH)を用いて直鎖状にして単離しておいた(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いた)発現ベクターpPICZαA(Invitrogen)のベクター断片に連結した。このベクター内では、bIAPII遺伝子は、AOX 1プロモーター(ピチア・パストリス由来のアルコールオキシダーゼ１に対するプロモーターであり、メタノールで誘導可能)の制御下にあり、サッカロミセス・セレビシエ由来のα因子のシグナルペプチドの下流に正しいリーディングフレームでクローニングされている。次に、このようにして挿入された遺伝子断片にエラーがないことを制限酵素切断分析および配列決定により調べた。このようにして作製した真核生物の高活性アルカリホスファターゼをコードするbIAPII遺伝子を含む発現ベクターをpHAP-1と名付けた(図１参照)。
【００３６】
ピチア・パストリスへのpHAP-1の形質転換
pHAP-1のピチア・パストリスX-33への形質転換、およびその後のゲノムへの組込みのために、ベクターをまずSacI(Roche Diagnostics GmbH)を用いて直鎖状にした。形質転換は、Gene Pulser II (Biorad)を用いてエレクトロポレーションにより実施した。
【００３７】
そのために、YPD培地(Invitrogen)5mlにピチア・パストリス野生型株のコロニーを接種し、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。次に、200mlの新しいYPD培地(Invitrogen)に、前記の一晩培養した培養液を1：2000希釈になるように、再度接種を行い、OD600が1.3〜1.5になるまで、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。その細胞を遠心分離し(1,500 x g/5 分)、ペレットを200mlの氷冷滅菌水(0℃)に再懸濁した。その細胞を再び遠心分離し(1,500 x g/5 分)、100mlの氷冷滅菌水(0℃)に再懸濁した。該細胞をさらに遠心分離し、10mlの氷冷(0℃)1 M ソルビトール(ICN)に再懸濁した。細胞をもう一度、遠心分離し0.5mlの氷冷(0℃)1 M ソルビトール(ICN)に再懸濁した。このようにして得られた細胞を、氷冷下に保ち、形質転換に即時に使用した。
【００３８】
約1μgの直鎖状にしたpHAP-1ベクターDNAを80μlの細胞懸濁液に添加し、完全に混合してから氷冷(0℃)しておいたエレクトロポレーション用のキュベットに移し入れ、さらに5分間氷上に置いてインキュベートした。続いて、該キュベットをGene Pulser II (Biorad)に移し、1kv、1kΩ、および25μFにて形質転換を実施した。エレクトロポレーション後、1Mソルビトール(ICN)1mlを該混合液に添加して、続いて、その100〜150μlを100μg/mlのZeocin(登録商標) (Invitorgen)を含むYPDS寒天プレート(Invitorgen)上に播いた。そして、そのプレートを30℃で2〜4日間インキュベートした。
【００３９】
ラスター(raster) MD（＝最少デキストロース）プレートにそのクローンを接種し、それらをさらに解析した。増殖クローンを採取し、20μlの滅菌水に再懸濁し、それを17.5Uのリチカーゼ(Roche Diagnostics GmbH)(1時間、37℃)を用いて溶解し、bIAPII発現カセットの組込みが正確であることを、PCR法により直接的に確認した。
【００４０】
形質転換の際に発現カセットが完全な形でゲノムに組込まれたクローンを、その後の発現実験に使用した。
【００４１】
高活性アルカリホスファターゼの発現
BMGY培地(Invitrogen)3mlに陽性クローンを接種し、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。続いて、600nmでのODを測定し、OD600が１となるように、再度BMMY培地(Invitrogen)10mlに接種した。BMMY培地(Invitrogen)には、メタノール(Mallinckrodt Baker B.V)が含まれており、このメタノールにより、AOX 1プロモーターを介する高活性アルカリホスファターゼの発現が誘導される。
【００４２】
振盪培養用フラスコを30℃で振盪しながらインキュベートし、24時間ごとにサンプルを採取してOD600を測定した。高活性アルカリホスファターゼの発現について活性試験を実施し、さらに誘導するために0.5％メタノール(Mallinckrodt Baker B.V.)を添加した。発現実験は96時間にわたって実施した。
【００４３】
実施例２：
高活性アルカリホスファターゼの活性試験
実施例１の発現培養液500μlを採取し、OD600を測定し、細胞を遠心分離した。上清を保存し、細胞ペレットを溶解するためにOD600の値に応じた量のY-PER(商標)(50〜300μl/Pierce)に再懸濁し、室温で1時間振盪した。続いて、この溶解液を遠心分離(15,000 x g/5分)して細胞の破片を取り除き、上清を新しい反応容器に移した。そして、該溶解液の5μlを活性試験に用いた。
【００４４】
活性試験の原理は以下の通りである：
0003657895.tif 000002
405nmの吸光度の増大を測定する。
【００４５】
50μlの4-ニトロフェニルホスフェート溶液(0.67mol/ｌ 4-ニトロフェニルホスフェート、ナトリウム塩(Roche Diagnostics GmbH))を3mlのジエタノールアミンバッファー(1mol/ｌ ジエタノールアミン(Merck)、pH9.8、0.5 mmol/l MgCl2 (Riedel de Haen))に添加し、該混合液を37℃でインキュベートした。続いて、5μlの細胞溶解液を添加することにより反応を開始し、37℃で吸光度の変化を3分間測定し、この結果からΔA/分を算出した。
【００４６】
そして、活性を以下の式に従って算出した；
0003657895.tif 000003
発現培養物の培地上清中の活性を同様の方法で測定した。この場合も、反応は、5μlの上清を加えることにより開始したが、さらに0.5mMのZnCl2を添加した。この場合の上記の算出は係数Xを用いずに実施した。
【００４７】
実施例３：
遺伝子合成からのPCR断片のクローニング
PCR断片をEcoRIおよびAsp718 I (Roche Diagnostics GmbH)で再切断し、再び単離して(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いた)、続いて、EcoRIおよびAsp718 I (Roche Diagnostics GmbH)を用いて直鎖状にして単離しておいた(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いる)発現ベクターpPICZαA(Invitrogen)のベクター断片に連結した。このベクターでは、合成遺伝子は、AOX 1プロモーター(ピチア・パストリス由来のアルコールオキシダーゼ１に対するプロモーターであり、メタノール(Mallinckrodt Baker B.V.) で誘導可能)の制御下にあり、サッカロミセス・セレビシエ由来のα因子のシグナルペプチドの下流に正しいリーディングフレームでクローニングされる。次に、このようにして挿入された遺伝子断片にエラーがないことを制限酵素切断分析および配列決定により調べた。このようにして作製した真核生物の高活性アルカリホスファターゼをコードする合成遺伝子を含む発現ベクターをpHAP10-3と名付けた(図2参照)。
【００４８】
ピチア・パストリスへのpHAP10-3の形質転換
pHAP10-3のピチア・パストリスX-33への形質転換、およびその後のゲノムへの組込みのために、ベクターをまずSacI(Roche Diagnostics GmbH)で直鎖状にした。形質転換は、Gene Pulser II (Biorad)を用いてエレクトロポレーションにより実施した。そのために、YPD培地(Invitrogen)5mlにピチア・パストリスのコロニーを接種し、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。次に、200mlの新しいYPD培地(Invitrogen)に、上記の一晩培養した培養液を1：2000希釈になるように、再度接種を行い、OD600が1.3〜1.5になるまで、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。その細胞を遠心分離し(1,500 x g/5 分)、ペレットを200mlの氷冷滅菌水(0℃)に再懸濁した。該細胞を再び遠心分離し(1,500 x g/5 分)、100mlの氷冷滅菌水(0℃)に再懸濁した。該細胞をさらに遠心分離し、10mlの氷冷(0℃)1 M ソルビトール(ICN)に再懸濁した。細胞を再度遠心分離し0.5mlの氷冷(0℃)1 M ソルビトール(ICN)に再懸濁した。このようにして得られた細胞を、氷冷下に保ち、形質転換に即時に使用した。
【００４９】
約1μgの直鎖状にしたpHAP10-3ベクターDNAを80μlの細胞懸濁液に添加し、完全に混合してから氷冷(0℃)しておいたエレクトロポレーション用のキュベットに移し入れ、さらに5分間氷上に置いてインキュベートした。続いて、該キュベットをGene Pulser II (Biorad)に移し、1kv、1kΩ、および25μFにて形質転換を実施した。エレクトロポレーション後、1Mソルビトール(ICN)1mlを該混合液に添加して、続いて、その100〜150μlを100μg/mlのZeocin(登録商標) (Invitorgen)を含むYPDS寒天プレート(Invitorgen)上に播いた。そして、そのプレートを30℃で2〜4日間インキュベートした。
【００５０】
ラスター(raster) MD（＝最少デキストロース）プレートにそのクローンを接種し、それらをさらに解析した。増殖クローンを採取し、20μlの滅菌水に再懸濁し、17.5Uのリチカーゼ(Roche Diagnostics GmbH)(1時間、37℃)を用いて溶解し、合成AP発現カセットが正確に組込まれていることを、PCR法により直接的に確認した。
【００５１】
形質転換の際に発現カセットが完全な形でゲノムに組込まれたクローンを、その後の発現実験に使用した。
【００５２】
高活性アルカリホスファターゼの発現
BMGY培地(Invitrogen)3mlに陽性クローンを接種し、30℃で振盪しながら一晩インキュベートした。続いて、600nmでのODを測定し、OD600が１となるように再度10mlのBMMY培地(Invitrogen)に接種した。BMMY培地(Invitrogen)には、メタノール(Mallinckrodt Baker B.V.)が含まれており、このメタノールにより、AOX 1プロモーターを介する高活性アルカリホスファターゼの発現が誘導される。
【００５３】
振盪培養用フラスコを30℃で振盪しながらインキュベートし、24時間ごとにサンプルを採取してOD600を測定した。高活性アルカリホスファターゼの発現について活性試験を実施し、さらに誘導するために0.5％メタノール(Mallinckrodt Baker B.V.)を添加した。発現実験は96時間にわたって行った。
【００５４】
高活性アルカリホスファターゼの活性試験
発現培養液500μlを採取し、OD600を測定し、細胞を遠心分離した。上清を保存し、細胞ペレットを、溶解するためにOD600の値に応じた量のY-PER(商標)(50〜300μl/Pierce)に再懸濁し、室温で1時間振盪した。続いて、この溶解液を遠心分離(15,000 x g/5分)して細胞の破片を取り除き、上清を新しい反応容器に移した。そして、該溶解液の5μlを活性試験に用いた。
【００５５】
活性試験は上述のとおり実施した。
【００５６】
実施例4：
多重形質転換による発現量の増加
発現実験から得た最良のクローンを、さらに、上述のとおりエレクトロポレーションのために調製し、1μgの直鎖状pHAP10-3ベクターDNAを用いて再び形質転換し、該形質転換混合物を1000〜2000μg/mlのZeocin(登録商標) (Invitrogen)を含むYPDS寒天プレート(Invitrogen)で平板培養した。その結果、ゲノム中に発現ベクターpHAP10-3の複数個のコピーが組込まれ、それにより適切な耐性遺伝子(この場合ではZeocin(登録商標))の複数個のコピーも組込まれているクローンしか増殖できない程度まで選択圧が増加した。Zeocin(登録商標)耐性タンパク質はストレプトアロテイカス・ヒンダスタナス(Streptoalloteichus hindustanus; Chalmels, T.ら、Curr. Genet. 20 (1991), 309-314; Drocourt, D.ら、Nucleic Acid Research 18 (1990), 4009)のブレオマイシン(bleomycin)遺伝子の産物であり、化学量論的濃度比でZeocin(登録商標)と結合することにより、細胞にZeocin(登録商標)に対する耐性を付与する。YPDS寒天プレート中のZeocin(登録商標)の濃度が高くなるほど、Zeocin(登録商標)に定量的に結合して細胞の増殖を可能にするためには、細胞はより多くの耐性タンパク質を生成しなければならない。例えば、耐性遺伝子の多重コピーがゲノムに組込まれた場合には、これが可能である。上述のように、ラスター(raster) MDプレートに上記クローンを再度接種し、haAP発現カセットが正しく組込まれていることを上述のとおりPCR解析により調べた。続いてまた、haAP活性を上述のとおり試験した。
【００５７】
実施例5：
第2の選択圧を用いることによる発現量の増加
Zeocin(登録商標)が2000μg/mlを上回る濃度に増加すると、高活性アルカリホスファターゼの発現量が向上しなかった。配列番号5に示す遺伝子(該遺伝子は、高活性アルカリホスファターゼをコードし、かつ酵母における発現に対してコドンを最適化したものである)の発現クローン内での遺伝子のコピー数をさらに増加させるために、実施例３および4で得られた最も高い発現量を示す発現クローンのゲノム内にさらなる発現ベクターを組込み、その組込みを、第2の選択圧、好ましくはG418(Roche Diagnostics GmbH)により選択した。この目的のために、AOX1プロモーター、サッカロミセス・セレビシエに由来するα因子のシグナルペプチド、配列番号５に示す、コドンを最適化した高活性アルカリホスファターゼに対する遺伝子、およびAOX1転写終結領域を含むpHAP10-3由来の完全な発現カセットを後述の適切に選択したプライマーを用いてPCR法により単離して、ベクターpIC9Kにクローニングし、ピチア・パストリスのゲノムへの該ベクターの組込みをG418 (Roche Diagnostics GmbH) により選択した。プライマーは配列番号34および35に示している。
【００５８】
PCR生成混合物は、アガロースゲル電気泳動により分析した。予測どおりの大きさを持つ遺伝子断片を単離し(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いた)、SacIおよびNotI((Roche Diagnostics GmbH)で再び切断し、続いてアガロースゲルから再び単離し(QIAquick ゲル抽出キット/Qiagenを用いた)、SacI/NotI (Roche Diagnostics GmbH)を用いて直鎖状にしたpIC9Kから単離したベクター断片に連結した。これにより、pHAP10-3由来の完全な発現カセットがpPIC9K内に同様の形で確実に存在することになる。挿入断片を、制限酵素切断分析、および隣接領域を利用して配列決定することにより確認した。このようにして作製した発現ベクターをpHAP10-3/9Kと名付けた(図３参照)。
【００５９】
pHAP10-3による多重形質転換により得られたhaAP発現量の最も高いクローンを、上述の通りエレクトロポレーション用に調製し、SacI(Roche Diagnostics GmbH)を用いて直鎖状にしたpHAP10-3/9K由来のベクター断片1μgで上述の通り形質転換した。形質転換混合物を1Mソルビトール(ICN)中で4℃にて1〜3日間保存し(G418耐性を形成させるため)、その100〜200μlを1、2、および4 mg/mlのG418(Roche Diagnostics GmbH)を含むYPDプレート(Invitrogen)に播き、30℃で3〜5日間インキュベートした。得られたクローンを、上述の通り活性試験を行って、真核生物の高活性アルカリホスファターゼの発現の増加について調べた。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pICZαA(Invitrogen)中にbIAPII遺伝子を含む発現ベクターpHAP-1のプラスミドマップを示す図である。
【図２】  pPIC9K(Invitrogen)中に合成遺伝子を含む発現ベクターpHAP10-3のプラスミドマップを示す図である。
【図３】  pPIC9K(Invitrogen)中に合成遺伝子を含む発現ベクターpHAP10-3/9Kのプラスミドマップを示す図である。
【符号の説明】
YPD：酵母ペプトンデキストロース、YPDS：酵母ペプトンデキストロースソルビトール、BMGY：緩衝化グリセロール複合培地、BMMY：緩衝化メタノール複合培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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