(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラチア（Serratia）属に属する微生物菌株またはその体内酵素を、リン酸基供給源の存在下、式：
【化１】
0003667359.tif 000008
で示される５−フルオロウリジンに作用させて、式：
【化２】
0003667359.tif 000009
で示される５−フルオロウリジン−５’−モノホスフェートを得ることを特徴とする、５−フルオロウリジン−５’−リン酸エステルの製造法。
【請求項２】
カンジダ（Candida）属に属する微生物菌株またはその体内酵素を、ガラクトースおよびリン酸基供給源の存在下、式：
【化３】
0003667359.tif 000010
で示される５−フルオロウリジン−５’−モノホスフェートに作用させて、式：
【化４】
0003667359.tif 000011
で示される５−フルオロウリジン−５’−ジホスフェートガラクトースを得ることを特徴とする５−フルオロウリジン−５’−リン酸エステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、５−フルオロウリジン−５'−リン酸エステルの製造法、具体的には、５−フルオロウリジン−５'−モノホスフェート（５−ＦＵＭＰ）および５−フルオロウリジン−５'−ジホスフェートガラクトース（５−ＦＵＤＰＧal）またはその塩の微生物学的製造法および５−ＦＵＤＰＧalを有効成分とする制癌活性医薬組成物に関する。
【０００２】
５−ＦＵＭＰは、式：
【化５】
0003667359.tif 000002
で示される化合物であって、それ自体制癌活性を有することが知られている。また、５−ＦＵＤＰＧalは、式：
【化６】
0003667359.tif 000003
で示される化合物であって、化合物自体は公知である。それ自身の制癌活性はないが、細胞膜に存在する特異的なピロホスファターゼの作用で５−ＦＵＭＰに変換された後に制癌活性を発揮する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
上記５−ＦＵＭＰの製造法としては、式：
【化７】
0003667359.tif 000004
で示される５−フルオロウリジン（５−ＦＵＲ）にリン酸化剤（例えばオキシ塩化リン）を反応させる方法が知られている（特開昭５１−９５０８１号）。しかしながら、この方法では、５−ＦＵＭＰの他にウリジンの２'または３'位の水酸基がリン酸化された化合物が副生し、これら副生物の分離、除去には手間がかかるという難点があった。また、５−ＦＵＲに対してオキシ塩化リンとトリメチルホスフェートまたはトリエチルホスフェートを作用させて５−ＦＵＭＰを製造する方法も知られている（特開昭６０−１７０００号）。この方法では、前記の副生物の生成を回避することはできるが、収率が約６％と非常に低い不利益がある。加えて、いずれの方法においても、試薬中に水分がごく僅かでも存在すれば反応が阻害されるため、５−ＦＵＲをはじめとする試薬や溶媒は、予め厳密にその水分を除去しなければならないという煩雑さを伴っている。
【０００４】
また、５−ＦＵＤＰＧalや５−フルオロウリジン−５'−ジホスフェートグルコース（５−ＦＵＤＰＧlc）のような５−ＦＵＲの糖リン酸エステルの製造法については、５−ＦＵＭＰにモルフォリン、次いでジシクロヘキシルカルボジイミドを作用させた後、グルコース−１−リン酸を反応させることにより、５−ＦＵＤＰＧlcを製造する方法が知られている（特開昭６０−１７０００号）。この製造法は、試薬として使用する糖−１−リン酸がグルコース−１−リン酸の場合には安価であるため有効な方法であると言えるが、ガラクトース−１−リン酸などその他のものである場合には極めて高価であるため、経済的な観点からその適用性が大きく妨げられる可能性がある。
【０００５】
本発明者らは、上記した従来技術の持つ種々の問題点を解決すべく、鋭意研究した結果、セラチア（Serratia）属に属する微生物の細胞内に存在するヌクレオシドホスホトランスフェラーゼによるリン酸基転移反応およびカンジダ（Candida）属に属する微生物の細胞内に存在するガラクトース代謝酵素系に着目し、これらを利用して５−ＦＵＲの５−ＦＵＭＰへの変換および５−ＦＵＭＰの５−ＦＵＤＰＧalへの変換を行うことに成功し、これに基づいて５−ＦＵＭＰおよび５−ＦＵＤＰＧalの工業的な生産方法を確立するに至ったものである。
【０００６】
また、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)は核酸合成代謝拮抗剤の一種で、１９５７年に合成されて以来、癌組織への親和性が高く、消化器癌をはじめとして各種固形癌に対する広いスペクトルを示すことから広く臨床に供せられてきた。最近、抗腫瘍効果増強、スペクトル拡大及び副作用軽減を目指して、多くの誘導体が合成され臨床研究も進められている。
【０００７】
ところで、動物細胞の細胞膜には特異性の異なる数種の糖ヌクレオホスファターゼ（ＮＰＰ）が存在することが知られている（Ｗ.Ｄeppert et al.：Ｊ.ＣellＰhysiol.,９０，４１−５２（１９７６），Ｅrwin Ｂischoff et al.：Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.,６２，２７９−２８３（１９７６））。一方、本発明者の１人である田中らはある種の癌細胞の細胞膜に特異的なＮＰＰが多く存在することを知り、さらに、５−ＦＵＤＰＧal等の５−ＦＵＲ糖ヌクレオチドアナログがそれ自身制癌活性はないかまたは弱いが、このＮＰＰの作用で５−ＦＵＭＰに変換された後に制癌活性を発揮するとの知見を得て本発明を完成した。
【０００８】
５−ＦＵＲの糖ヌクレオチドアナログの制癌剤としての利用については、５−フルオロウリジン−５’−ジホスフェートグルコース（５−ＦＵＤＰＧlc）が知られている（特開昭６１−１５８９２５号）。しかし、これまで５−ＦＵＤＰＧalについての制癌活性についての開示はない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の要旨は、セラチア属に属する微生物菌株またはその体内酵素を、リン酸基供給源の存在下、５−ＦＵＲに作用させて、５−ＦＵＭＰを得ることを特徴とする、５−フルオロウリジン−５'−リン酸エステルの製造法、およびカンジダ属に属する微生物菌株またはその体内酵素を、ガラクトースおよびリン酸基供給源の存在下、５−ＦＵＭＰに作用させて、５−ＦＵＤＰＧalを得ることを特徴とする５−フルオロウリジン−５'−リン酸エステルの製造法である。
【００１０】
本発明の第２の要旨は５−フルオロウリジン−５’−ジホスフェートガラクトース（５−ＦＵＤＰＧal）および薬理学的に許容され得るそれらの塩を含む制癌活性医薬組成物である。上記のような特徴を有する化合物である５−ＦＵＤＰＧalは、正常細胞に障害を与えず癌細胞のみを特異的に攻撃する可能性を有しており、制癌剤につきものの重篤な副作用を減少させることができる。
【００１１】
本発明において、出発原料として使用する５−ＦＵＲは、リボースの１位の炭素原子に５−フルオロウラシルが結合したものであるが、５−フルオロウラシルは、極めて有効な制癌剤として知られている。その作用機作は生体内でリボシル化およびリン酸化を受けて５−フルオロ−２'−デオキシウリジン−５'−リン酸となり、これがデオキシウリジル酸をチミジル酸に転換するチミジル酸合成酵素を阻害することによりＤＮＡの合成を抑制する。またＲＮＡにもウラシルの代わりに取り込まれ、異常タンパク質合成を促して細胞を死滅させる。このことから、５−ＦＵＲが５−フルオロウラシルの作用機作に依存する作用を微生物に与えるであろうことが容易に考えられる。
【００１２】
また、上記の５−フルオロ−２'−デオキシウリジン５'−リン酸は、上記のように間接的にＤＮＡ合成を抑制する以外に、ＤＮＡ中に５'−チミジル酸の代わりに取り込まれ、塩基対形成に異常を引き起こす突然変異誘起性がある。５−ＦＵＭＰは、５−フルオロ−２'−デオキシウリジン５'−リン酸分子中のデオキシリボース部分がリボースである以外は全く同様の構造を持つ化合物であるから、５−ＦＵＭＰもまた本発明に使用する微生物に何らか（たとえばＲＮＡ合成抑制）の影響を与えるであろうことが考えられる。
【００１３】
このように、５−ＦＵＲおよび５−ＦＵＭＰは微生物に対し生育抑制など何らかの負の影響を与えるであろうことが容易に考えられる化合物であるにもかかわらず、現実には、本発明において、それらによる使用微生物に対する悪影響は実質的に認められず、５−ＦＵＭＰや５−ＦＵＤＰＧalが良好に生産される。
【００１４】
本発明方法に従って、５−ＦＵＲを５−ＦＵＭＰに変換するには、５−ＦＵＲに適当な媒質中においてリン酸基供給源の存在下にセラチア属に属する微生物またはその細胞内に存在する酵素を作用させればよい。
通常は、セラチア属に属する微生物自体が使用され、その典型的な例としては、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）ＩＦＯ  3046を挙げることができる。
【００１５】
リン酸基供給源としては、５−ＦＵＲに導入されるリン酸基を供給できる物質であれば特に制限はなく、特にリン酸基を有する有機化合物、たとえばベンジルリン酸、シアノエチルリン酸、テトラクロルピロリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸などを挙げることができる。
【００１６】
媒質としては水性媒質が使用され、上記した５−ＦＵＲとリン酸基供給源のほか、必要に応じてセラチア属微生物の生育に必要な栄養源が含まれていていてもよい。水性媒質は、ｐＨ３〜５、好ましくはｐＨ４前後に調節する。反応実施に際しては、温度を約４０℃〜６０℃、好ましくは４５〜５０℃に保つことが望ましい。
【００１７】
反応後、生成した５−ＦＵＭＰを精製するには、常法に準じてこれを行えばよい。たとえば、反応液から菌体を除去して得られた液体成分を吸着剤（たとえば活性炭）に吸着、溶出させ、溶出液についてさらにイオン交換樹脂（たとえばDowex IX8（ＣＩ型））のカラムを用いて精製を行い、該当フラクションに吸着剤（たとえば活性炭）を加えて目的物を吸着させた後、適宜の溶離液（たとえばアンモニア水）を用いて溶出する。溶出液を適当に濃縮した後、適当な塩形成剤（たとえば酢酸バリウム、酢酸ナトリウム）を加え、さらに水混和性有機溶媒（たとえばエタノール）を加えることによって生ずる沈澱を集め、５−ＦＵＭＰを塩（たとえばバリウム塩、ナトリウム塩）の形で得る。
【００１８】
また、本発明方法により５−ＦＵＭＰを５−ＦＵＤＰＧalに変換するには、５ーＦＵＭＰを適当な媒質中においてガラクトースとリン酸基供給源の存在下にカンジダ属に属する微生物またはその細胞内に存在する酵素を作用させればよい。通常は、カンジダ属の微生物それ自身を使用すればよく、その典型的な例は、カンジダ・サイトアナ（Candida saitoana）ＩＦＯ  ０７６８である。
【００１９】
リン酸供給源としては、リン酸基を有する無機物が好んで使用され、その具体例としてはリン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２０】
媒質としては水性媒質が使用され、上記したガラクトースとリン酸基供給源に加え、必要に応じ、使用微生物の生育に必要な栄養源を含有してもよい。
【００２１】
反応後、生成した５−ＦＵＤＰＧalを精製、回収するためには、５−ＦＵＭＰの場合と同様、反応液から菌体を除去した後、吸着剤（たとえば活性炭）およびイオン交換樹脂（たとえばＤowex IX8（ＣＩ型））のカラムを用いて処理すればよい。
【００２２】
本発明は、５−ＦＵＭＰおよび５−ＦＵＤＰＧalの製造のいずれの場合も、その製造過程において取り扱い易く、かつ事後処理の面でも処理し易い水溶媒体を使用できる点で工業的に有利である。
【００２３】
なお、本発明において、特に５−ＦＵＭＰをバリウム塩の形で採取し、必要に応じこれをそのまま使用して５−ＦＵＤＰＧalに変換することは、上記５−ＦＵＭＰのバリウム塩が水に難溶性であるため、回収が容易であり、かつ精製が容易である点で有利である。
【００２４】
なお、このような水に難溶性であるバリウム塩はそのままの形ではカンジダ属の菌体中には取り込まれないことが予測され、かつそのような菌体に対し有害物質であることが予測されるにもかかわらず、現実には高収率で５−ＦＵＭＰから５−ＦＵＤＰＧalへの変換が達成される点において、予想外の効果を奏するものということができる。
【００２５】
さらに、５−ＦＵＤＰＧalの合成に用いられる微生物による合成法は他の化合物にも適用ができ、糖を結合した化合物も比較的安価に合成できることから、実用的な他の５−ＦＵＲの糖ヌクレオチドアナログ、例えば、５−フルオロウリジン−ジホスフェートグルコース（５−ＦＵＤＰＧlc）、５−フルオロウリジン−ジホスフェートグルコース−Ｎ−アセチルグルコサミン（５−ＦＵＤＰＧlcＮＡc）の開発が可能である。
【００２６】
５−ＦＵＤＰＧalを含む制癌活性医薬組成物は、正常細胞に障害を与えず癌細胞のみを特異的に攻撃する可能性を有しており、制癌剤につきものの重篤な副作用を減少させることができる。
【００２７】
制癌活性試験
５−ＦＵＲおよび５−ＦＵＭＰを対照物質として５−ＦＵＤＰＧalの培養癌細胞に対する作用について検討した。
１．材料
(１)細胞
正常細胞
(1)ＮＨＤＦ細胞(正常ヒト皮膚線維芽細胞)、(2)３Ｔ３細胞(マウス線維芽細胞)
腫瘍化細胞
(3)３Ｔ３細胞(ＳＶ４０形質転換細胞)、(4)Ｂ１６−ＦＯ細胞(マウス黒色腫細胞)、(5)ＬＬ／２細胞(マウス肺癌細胞)、(6)ＮＳ−１（マウス骨髄腫細胞）、(7)Ｘ６３−Ａｇ８（マウス骨髄腫細胞）、(8)ＳＰ２／０（マウス骨髄腫細胞−脾細胞）、(9)ＨｅＬａ２２９（ヒト子宮頚癌細胞）、(10)Ｋ−５６２（ヒト白血病細胞）、(11)ＭＯＬＴ−３（ヒト白血病細胞）
以上はいずれも液体窒素細胞保存容器中に保存されていたものを、解凍して使用した。
(２)薬剤
５−ＦＵＲはシグマケミカルより購入し、５−ＦＵＭＰおよび５−ＦＵＤＰＧalは分与されたものである。
【００２８】
２．方法
(１)細胞を５×１０4個／ウエルの濃度で１０％ＦＣＳ加ＭＥＭ培地(日水製薬)に懸濁し、９６ウエル平底マイクロプレート(ヌンク)に播種し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において２４時間培養した。
(２)薬剤をＭＥＭ培地に溶かし、メンブランフィルターにより濾過除菌した後に、所定の濃度に調整し、１ウエル当たり２０μlずつ分注した。
(３)３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において所定の時間培養後、培養上清を除去しＰＢＳで２回洗浄した。
(４)ＰＢＳ中の６μＭ Ｃalcein−ＡＭ(モレキュラープローブ)溶液を１００μlずつウエルに分注し３７℃に２時間放置した。
(５)サイトフロー２３００(ミリポア)により、励起波長４８５nm, 蛍光波長５３０nmにて蛍光を測定した。培地のみのウエルの蛍光強度を１００とした時、薬剤を入れたウエルの蛍光強度の比を細胞の生存率（％）とした。
【００２９】
３．結果
結果を表に示す。
【表１】
薬物添加(0.01μmol／ml)培地中で４日間培養した各種細胞の生存率(％)
細胞名            由来           5-FUDPGal      5-FUMP      5-FUR
正常細胞
１. NHDF     正常ヒト皮膚線維芽細胞  69.0±12.3   20.2± 0.5  20.7± 2.7
２. 3T3        マウス線維芽細胞    94.2±11.7   66.6± 7.8  47.5± 2.6
癌細胞
３. 3T3(形質転換) SV40形質転換細胞  2.3± 0.1    2.1± 0.1   2.2± 0.1
４. B16-FO     マウス黒色腫細胞    20.2± 5.6   18.6± 1.0  15.4± 1.7
５. LL/2         マウス肺癌細胞    11.5± 2.6    6.9± 0.5   4.6± 0.3
６. NS-1       マウス骨髄腫細胞    56.6± 3.0   54.6± 0.1  54.8± 0.4
７. X63-Ag8    マウス骨髄腫細胞    22.8± 1.1   22.5± 0.5  19.8± 0.8
８. SP2/0    マウス骨髄腫細胞-脾細胞  18.0± 3.0    8.5± 0.1   6.4± 0.3
９. HeLa229    ヒト子宮頸癌細胞    17.9± 0.8   15.8± 0.3  15.9± 0.3
10. K-562        ヒト白血病細胞    32.3± 9.4   27.3± 0.8  25.8± 1.3
11. MOLT-3       ヒト白血病細胞    18.0± 0.3   17.8± 0.3  18.0± 0.3
(平均値±SD)
【００３０】
３Ｔ３細胞及びＮＨＤＦ細胞のような正常細胞は５−ＦＵＤＰＧalに対しては抵抗性を示したが、５−ＦＵＲ及び５−ＦＵＭＰには程度の差はあるが感受性を示した。９種の癌細胞はいずれもこれらの薬剤に対して感受性を示し、生存率が低下した。特に、３Ｔ３腫瘍化細胞(形質転換)及びＬＬ／２細胞(マウス肺癌細胞)がこれらの薬剤に対して非常に強い感受性を示し、ついでＢ１６−ＦＯ細胞(マウス黒色腫細胞)、Ｘ６３−Ａｇ８（マウス骨髄腫細胞）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫細胞-脾細胞）及びＨｅＬａ２２９（ヒト子宮頸癌細胞）およびＭＯＬＴ−３（ヒト白血病細胞）がかなり強い感受性を示した。また、Ｋ−５６２（ヒト白血病細胞）およびＮＳ−１（マウス骨髄腫細胞）が、これらの薬剤に対しても感受性を示した。
【００３１】
図１に０.０１μmol／mlの濃度の薬剤の入った培地中で４日間培養後の細胞の感受性の差を、正常細胞である３Ｔ３細胞およびＮＨＤＦ細胞、癌細胞である３Ｔ３細胞(形質転換)、Ｂ１６−ＦＯ細胞(マウス黒色腫細胞)及びＬＬ／２細胞(マウス肺癌細胞)について示した。３Ｔ３細胞及びＮＨＤＦ細胞のような正常細胞は５−ＦＵＤＰＧalに対しては抵抗性を示したが、５−ＦＵＲ及び５−ＦＵＭＰには程度の差はあるが感受性を示した。３種の癌細胞はいずれもこれらの薬剤に対して強い感受性を示し生存率が低下することが理解される。
【００３２】
さらに、培地に５−ＦＵＤＰＧalを添加後４日間培養した時点での、細胞の生存率と薬物濃度との関係を図２に示した。
０.０００１μmol／ml以下の濃度では正常マウス線維芽細胞である３Ｔ３細胞及び腫瘍化した３Ｔ３細胞はともに生存率は約１００％であり、低下しなかった。０.００１μmol／ml以上の濃度では腫瘍化した３Ｔ３細胞の生存率は１０％以下に低下したが、正常３Ｔ３細胞の生存率はやや低下したのみであった。Ｂ１６−ＦＯ細胞(マウス黒色腫細胞)及びＬＬ／２細胞(マウス肺癌細胞)の癌細胞では０.００１μmol／ml以上の５−ＦＵＤＰＧal濃度で生存率の急激な低下が認められた。ＮＨＤＦ細胞(正常ヒト皮膚線維芽細胞)は３Ｔ３細胞よりも低濃度の５−ＦＵＤＰＧalで生存率の低下が認められたものの、前述の癌細胞よりは感受性が低かった。
【００３３】
４．結論
５−ＦＵＤＰＧalの培養癌細胞及び正常細胞に対する作用について対照物質として、５−ＦＵＲ及び５−ＦＵＭＰを用い比較検討した。その結果、正常細胞は５−ＦＵＤＰＧalに対しては抵抗性を示したが、５−ＦＵＲ及び５−ＦＵＭＰには程度の差はあるが感受性を示した。癌細胞については、使用した９種類の癌細胞が、いずれもこれらの薬剤に対して強い感受性を示した。
これらの結果より、５−ＦＵＤＰＧalは、対照とした５−ＦＵＲおよび５−ＦＵＭＰと比較して、正常細胞に対する毒性が弱く、５−ＦＵＤＰＧalの癌細胞への選択毒性を有することが判明した。
【００３４】
本発明の５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を実際の治療に用いる際には、患者の病態や用法に応じてさまざまな剤型のものが使用される。このような剤型の例としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの内用剤、軟膏、パップ剤などの外用剤、注射剤あるいは坐剤などを挙げることができる。
【００３５】
これらの医薬組成物はその剤型に応じ、製剤学上使用される手法により生理学的に許容される無毒の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、溶解剤などの添加剤と適宜混合し、周知の方法に従い調整することにより製造できる。
【００３６】
例えば散剤または細粒剤は、５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩に必要に応じ、賦形剤、結合剤、崩壊剤などの添加剤を加え、粉末または微粒状として散剤または細粒剤とする。また、必要に応じて着色剤、芳香剤、矯味剤などを加えることができる。さらには適当なコーティング剤で剤皮を施してもよい。
【００３７】
顆粒剤は、５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩に必要に応じ、賦形剤、結合剤、崩壊剤などの添加剤を加えて均等に混和した後、粒状とし、粒子をそろえて製する。顆粒剤には、必要に応じて着色剤、芳香剤、矯味剤などを加えることができる。また、適当なコーティング剤で剤皮を施してもよい。
【００３８】
錠剤は通例、５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩に必要に応じ、賦形剤、結合剤、崩壊剤などの添加剤を加えて均等に混和したものを顆粒状とした後、周知の方法に従い打錠して製することができる。錠剤にはまた必要に応じて着色剤、矯味剤などを加えることができる。さらに適当なコーティング剤で剤皮を施し、糖衣錠、フィルムコート錠、腸溶錠などにすることができる。
【００３９】
カプセル剤は例えば、５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩に必要に応じ、適当な賦形剤などの添加物を均等に混和したもの、または粒状にしたものを適当な大きさのカプセルに充填して製する。あるいは充填内容物に腸溶性や特効性などの特性を与えるためのコーティングを施した後、充填してもよい。
【００４０】
坐剤は適当な基剤に必要ならば乳化剤、懸濁化剤などを加え、これに５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩を加えて混和して均等にした後、一定の形状に成型して製する。本剤には適当な剤皮で被包することができる。また、必要に応じて保存剤を加えてもよい。
【００４１】
注射剤は例えば、５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩の一定量を溶剤に溶解、懸濁もしくは乳化して一定容量とした後、アンプルなどの注射剤用の容器に充填、密封して製することができる。あるいは、適当な賦形剤と混合後、凍結乾燥し用時溶解型の注射剤としてもよい。本剤には、所望により安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤などの添加剤を加えることができる。また、血液あるいは体液と等張にするための等張化剤やｐＨを調節するためのｐＨ調整剤、あるいは局所麻酔剤などの無痛化剤を加えてもよい。
【００４２】
本発明の医薬組成物を実際の治療に用いる際の投与量は、対象となる患者の年齢、体重、性別、症状などを考慮して適宜増減されるが、一般に５−ＦＵＤＰＧalとして経口投与の場合、通常成人１日当たり０.５〜５mg／kg体重の範囲で、非経口投与の場合、通常成人１日当たり０.２〜２mg／kg体重の範囲で使用される。
【００４３】
また、本発明の５−ＦＵＤＰＧalまたはその生理学的に許容される塩を有効成分とする制癌剤は、単独で用いる他に既存の制癌剤と併用あるいは配合することも可能である。係る制癌剤としては、例えばカルモフール、シタラビンオクホスファート、テガフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤、シクロホスファミド、カルボニン、塩酸ニムスチン、ダカルバジン、ラニムスチンなどのアルキル化剤、マイトマイシン、クロモマイシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ネオカルチノスタチンなどの抗腫瘍性抗生物質やアセグラトン、エトポシド、塩酸プロカルバジン、クエン酸タモキシフェン、塩酸ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチンなどを挙げることができる。
【００４４】
毒性試験
本発明の５−ＦＵＤＰＧalの急性毒性（ＬＤ50）について検討したところ、Ｊｃｌ：ＩＣＲ系マウスの尾静脈内に単回注入した結果、ＬＤ50値は３００mg／kg以上であった。
【００４５】
５−ＦＵＤＧalを含む制癌剤は、正常細胞に障害を与えず癌細胞のみを特異的に攻撃する可能性を有しており、制癌剤につきものの重篤な副作用を減少させることができる。
【００４６】
【実施例】
本発明を以下の実施例で更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例により何ら制限を受けるものではない。
実施例１
肉エキス５g、ペプトン１５g、塩化ナトリウム５g、リン酸一水素カリウム５gを含む液体培地１リットル（ｐＨ７.０）に、あらかじめ同液体培地５mlで一晩振盪培養したセラチア・マルセッセンスＩＦＯ  3046を加え、３０℃で一晩振盪培養した。培養液より菌体を遠心分離して集め、蒸留水にて洗浄した後、再び蒸留水に懸濁（５００mg湿重／ml）して得た菌体懸濁液２０mlを１M酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）３０ml、１０mM硫酸亜鉛・７水和物１０ml、１００mM５−ＦＵＲ２０ml（２ミリモル）および３５０mMｐ−ニトロフェニルリン酸２０mlの各溶液と混合し、反応液の全容積を水で１００mlとした。本混合液を４７℃で２４時間ゆるやかに振盪した。反応液について高速液体クロマトグラフィーで検出を行ったところ、５−ＦＵＭＰの合成効率は８４.４％であった。遠心分離によって菌体を除去した上清のｐＨを３.８に合わせ、クロマト用活性炭１０gにて５−ＦＵＭＰを吸着させた。活性炭を約１リットルの水で洗浄後、エタノール：アンモニア水：水（50：5：45）２００mlで溶出した。
【００４７】
溶出液よりエタノールおよびアンモニアを減圧下に除去した後、Dowex IX8（３×２０cm）のカラムに通して目的物を吸着させた後、１リットルの蒸留水でカラムを洗浄した。未反応の５−ＦＵＲはすべてこのフラクションに回収された。次いで、０.０１Ｎの塩酸２リットルおよび０.１Ｍの塩化リチウムを含む０.０１Ｎの塩酸２リットルにて、塩化リチウム濃度０〜０.１Mまでの直線的な濃度勾配をつくり、５−ＦＵＭＰを溶出した。５−ＦＵＭＰは、０.０５Mの塩化リチウムを含むフラクションの前後に回収された。このフラクション（約１リットル）を約１００mlまで濃縮した後、クロマト用活性炭１０gを加えて５−ＦＵＭＰを吸着させ、水１リットルで洗浄後エタノール：アンモニア水：水（50：5：45）２００mlで溶出した。これを１０mlまで減圧濃縮し、酢酸バリウム４９１mg（１.６ミリモル）を加えた。生成した沈澱を遠心分離し、エタノール：水（２：１）（２０ml×２回）、更にエタノール（２０ml×２回）で洗浄した。沈澱を減圧乾燥し、白色粉末状の５−ＦＵＭＰのバリウム塩を得た。
【００４８】
0003667359.tif 000005
【００４９】
1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ
炭素の位置  1H-NMR，δH（ppm，結合定数Ｊ(Hz)）  13C-NMR，δC（ppm）
６       ８.１１（d,６.４）
１'      ５.９０（dd,４.９,１.５）            ９０.７９
２'      ４.２９（t,５.２）                   ７５.８６
３'      ４.３１（t,５.２）                   ７１.９８
４'      ４.２０（m）                         ８５.９１(d，８.８)
５'      ４.０２（ddd,１２.０,５.５,３.１）   ６５.９７
３.９７（ddd,１２.０,５.５,３.４）
【００５０】
実施例２
乳糖１００g、ペプトン４g、酵母エキス４g、リン酸二水素カリウム４g、リン酸一水素二アンモニウム４g、硫酸マグネシウム・水和物２gを含む液体培地（ｐＨ６.２）２リットルにあらかじめ同液体培地１００mlで一晩振盪培養したカンジダ・サイトアナＩＦＯ 0768を加え、３０℃で一晩振盪培養した。培養液より菌体を遠心分離で集め、蒸留水にて３回洗浄した後、減圧下で十分に乾燥させた。実施例１で得られた５−ＦＵＭＰのバリウム塩５３６mg（１ミリモル）、Ｄ−ガラクトース１.８g、４００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）２５ml、１２０mM硫酸マグネシウム・７水和物５.０mlおよび上記乾燥菌体５g（均一な状態にまで粉末化した）を混合し、さらに蒸留水を加えて全容を５０mlとした反応液を３０℃で１４時間振盪した。反応液について高速液体クロマトグラフィーで検出した５−ＦＵＤＰＧalの合成効率は９４％であった。
【００５１】
遠心分離によって菌体を除去して得られる上清のｐＨを３.８とした後、クロマト用活性炭５gにて５−ＦＵＤＰＧalを吸着させた。実施例１に記載の方法に従って活性炭より５−ＦＵＤＰＧalを溶出した。溶出液より減圧下にエタノールおよびアンモニアを除去し、さらに実施例１記載の方法に従ってＤowex IX8のカラムを用いるクロマトグラフィーを行い、活性炭に吸着、溶出後、最終的にバリウム塩として５−ＦＵＤＰＧalの白色粉末を得た。クロマトグラフィーの条件は、実施例１と同様であるが、ただし塩化リチウムの濃度勾配は、０.０５〜０.１Ｍとした。５−ＦＵＤＰＧalは塩化リチウム濃度０.０７Ｍを含むフラクションの前後で溶出し、この時点で既に５−ＦＵＭＰは初期値の約１％まで減少しており、５−ＦＵＭＰと５−ＦＵＤＰＧalを完全に分離することが出来た。
【００５２】
0003667359.tif 000006
【００５３】
0003667359.tif 000007
【００５４】
【製剤例】
次に示すような処方に従い、各種製剤を製した。ただし、剤型の種類および処方はここに挙げたものに限るものではない。
製剤例１（散剤）
５−ＦＵＤＰＧal２ｇをとり、乳糖を加え全量を１００ｇとし、均等に混和して散剤とした。
【００５５】
製剤例２（顆粒剤）
５−ＦＵＤＰＧal２ｇ、乳糖７０ｇ、トウモロコシデンプン１０ｇおよびヒドロキシプロピルセルロース５ｇをとり、均等に混和した後、流動層造粒機を用いて造粒した。得られた造粒物を乾燥、整粒したものに結晶セルロース１２ｇおよびステアリン酸マグネシウム１ｇを加えてよく混合し、顆粒剤を製した。
【００５６】
製剤例３（カプセル剤）
５−ＦＵＤＰＧal２ｇ、乳糖１５０ｇ、結晶セルロース３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース１６ｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｇをとり、均等に混和したものをゼラチン製硬カプセルに充填し、硬カプセル剤１０００カプセルを製した。
【００５７】
製剤例４（錠剤）
５−ＦＵＤＰＧal２ｇ、乳糖１４０ｇ、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース２６ｇを加えて均等に混和した後、流動層造粒機を用いて造粒した。得られた造粒物にステアリン酸マグネシウム２ｇを加えて打錠して錠剤１０００錠を製した。
【００５８】
製剤例５（注射剤）
５−ＦＵＤＰＧal１ｇをとり、注射用水１０００ｍｌに溶解した後、塩酸を用いてｐＨ７.５に調節する。得られた溶液を精密濾過機にて濾過滅菌した後、容量１ｍｌのガラス製アンプルに充填し、密封、滅菌、乾燥してアンプル入注射剤１０００アンプルを製した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ５−ＦＵＲ、５−ＦＵＭＰおよび５−ＦＵＤＰＧalに対する正常細胞及び癌細胞の感受性の差を示す棒グラフである。
【図２】  ５−ＦＵＤＰＧalの正常細胞及び癌細胞への作用を示す折れ線グラフである。
【図１】
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【図２】
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