(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003682974.tif 000042
［式中、
Ｂは、ヘパリン； ヒルジン；コルヒチン；ビンカアルカロイド；タキソール；物質Ｐ； インターフェロンγ；ならびに式：
【化７】
0003682974.tif 000043
（式中、Ｚ’はＨまたは金属配位位置を表し；
Ｒ’は、Ｒ’’または式：
【化８】
0003682974.tif 000044
で示される基であり、ここでそれぞれのＲ’は、独立に水素原子またはアルキル基であり、Ｒ’’およびＲ’’’は独立に水素原子またはアルキル基であり、ｍおよびｎはそれぞれ０または１にすることができる）
または式：
【化９】
0003682974.tif 000045
（式中、ｎは２、３または４であり、ｍは１または２であり、ｐは１〜６である）
で示されるキレート試薬と放射性金属との錯体；
からなる群より選択され、
ＲおよびＲ1は１個から３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基であり、ここで、ＲおよびＲ1の一方は少なくとも１２個の炭素原子を有し、ＲおよびＲ1の直鎖状炭素原子の合計は少なくとも２３個であり、
Ｒ2は次の式のスペーサ成分を表し：
−（Ｑ’−Ｒ4）q−Ｑ−（Ｒ3）p−
ここでＲ3は脂肪族炭化水素を表し、Ｒ4は脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素、複素環式またはＣＨ2Ｃ（ＣＯ2Ｈ）＝ＣＨで構成される基の中から独立に選択し、ＱおよびＱ’は、アミド（−ＮＨＣＯ−）、チオ尿素（−ＮＨＣＳＮＨ−）、 アシルヒドラゾン（−ＣＨ＝ＮＨＮＣＯ−）、 エステル（−ＣＯＯ−）、 尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−）、カルバマート（−ＮＨＣＯ2−） 結合で構成される官能結合基から独立に選択したものであり；ＱおよびＱ’は、さらに独立に原子価結合を表すことができ；前記脂肪族炭化水素は１個から１２個の直線状炭素原子を備え；前記芳香族炭化水素は６個から１２個の炭素原子を備え；ｎは１であり；ｐは０または１であり；ｑは０ないし４であり、ｑが２以上のとき、各Ｑ’は同一であっても、異なっていてもよく；但し、ＱおよびＱ’の少なくとも１つは、アミド（−ＮＨＣＯ−）、チオ尿素（−ＮＨＣＳＮＨ−）、 アシルヒドラゾン（−ＣＨ＝ＮＨＮＣＯ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−）、カルバマート（−ＮＨＣＯ2−） 結合で構成される官能結合基から選択され、かつ、ｑ＝０のとき、Ｑは原子価結合ではなく、
ＸおよびＸ1は同一または異なる値をとることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ3）2またはＳｅを表し、
Ｙは、＝ＣＲ8−、＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−、＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−、あるいは＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−から選択した結合基を表し、ここでＲ8はＨ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、あるいはＣＨ（ＣＨ3）2から選択され、
Ｚは、Ｈ、アルキル、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ2ＮＨ2、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ−（アルキル）2、ＮＨ−アシル、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、ＮＯ2、またはハロゲン 基から選択した置換基を表し、前記Ｚ置換基で構成されるアルキル基は１個から４個の炭素原子を備え、さらに、
Ａは薬学的に許容可能な陰イオンを表す］
で示される化合物。
【請求項２】
Ｂを、コルヒチン、ビンカアルカロイドおよびタキソールよりなる群から選択することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｂがビンブラスチンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｂがヘパリン である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｂがヒルジンである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
【化２】
0003682974.tif 000046
上記の式で与えられることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
【化３】
0003682974.tif 000047
上記の式で与えられることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
【化４】
0003682974.tif 000048
上記の式で与えられることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
以下の式で与えられる化合物であって
【化６】
0003682974.tif 000049
ここでＲおよびＲ1は１個から３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基であり、ここで、ＲおよびＲ1の一方は少なくとも１２個の炭素原子を有し、ＲおよびＲ1の直鎖状炭素原子の合計は少なくとも２３個であり；
ＸおよびＸ1は同一または異なる値にすることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ3）2またはＳｅを表し；
Ａは薬学上許容することができる陰イオンを表し；
Ｍは、銅、テクネチウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、イットリウム、金、エルビウム、ホルミウムあるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択した放射性金属を表し；ｎは２、３あるいは４である；ｍは１あるいは２である；ｐは１から６であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｂが、キレート試薬と放射性金属の形の錯体である、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９８８年５月２日に出願された、“バイオ作用性物質をバイオ粒子表面膜へ結合するための化合物、組成、および方法”と題する米国特許出願番号１８９，１９２の一部継続出願である。
【発明の分野】
本発明は、治療薬、および任意には診断薬などのバイオ作用性物質を、生存可能な細胞とウイルス、生存不可能な担体粒子を含む生体適合粒子へ結合するための化合物、組成、および方法に関するものである。本発明はまた、このような化合物の調整に使用する開始物質と中間物に関するものである。さらに本発明は、治療薬、および任意に診断薬をｉｎ  ｖｉｖｏで部位選択的に供給するための化合物の使用に関するものである。
【発明の背景】
疾患と他の病的状態の治療のための治療薬の供給は、様々な方法によって達成することができる。それらには、経口、静脈内、皮下、経皮、筋肉内投与、あるいは局所的適用が含まれる。一部の治療薬の場合、現行の供給方法では、全身性の副作用を及ぼすことなく疾患部位へ十分な量を供給すること、または、意図する治療効果を生むための十分な間、疾患部位に治療物質を十分に保持しておくことが不可能である。
病的細胞種の増殖を防止あるいは低減する薬物は、有害あるいは制御不可能な細胞増殖を伴う様々な疾患の治療と制御に不可欠なものである。しかし、抗増殖物質はその定義上、ある種の細胞にとって毒物とならざるをえない。疾患細胞種を制御するために必要な分量が、患者の正常な細胞にとって有毒あるいは致命的になることがあるため、これらの薬物の全身的投与はしばしば実現不可能である。この困難は、有害細胞の増殖部位に抗増殖物質を直接投与することによって避けることができる。また、正常な細胞種の移動および損傷を制限しながら有害な細胞の増殖を効果的に制御するために、疾患部位に抗増殖薬を保持するための機構が必要である。
抗増殖物質の部位特異的な供給と保持が特に効果的な特定の疾患と状態について、以下に簡潔に記述する。これらの各状態は、特に有害な細胞種の増殖を含み、治療のための全身投与による薬物療法が最適な結果を生んでいないものである。
１．血管形成術後の再閉塞および再狭窄
冠状血流を制限または閉塞するアテローム硬化性病変は、冠状動脈心疾患に関連する死亡の主要な原因である。経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）、あるいは冠状動脈バイパス移植術による直接的手術が用いられてきた。
ＰＴＣＡの主な難点は、血管形成術後の血管閉鎖の問題であり、それにはＰＴＣＡの直後に起こるもの（急性再閉塞）と、長い期間内で起こるもの（再狭窄）の両方がある。
血管形成術後の再狭窄は、血管形成術の処置によって起こる動脈内壁の損傷に対する反応である。その正確な機構は依然として調査中であるが、一般的には、動脈中間層の平滑筋細胞の増殖と、細胞が増殖を続ける内側（内膜）層に向かう、これらの細胞の移動を含む。増殖は、通常は損傷後７〜１４日以内に内膜内で停止する。
症候性再閉塞の患者は、再度のＰＴＣＡまたは冠動脈バイパス移植を必要とする。ＰＴＣＡを受けた患者の高比率（３０〜５０％）の患者が再狭窄を経験するため、冠動脈疾患の治療法としてのＰＴＣＡの成功が明確に制限される。
薬理学的手法によって再狭窄を防ぐ試みは、通常は様々な薬剤の全身的投与を必要とし、一般的には成功しない。
再狭窄の防止のために活発に研究されているいくつかの抗増殖薬について、以下に詳細に記述する。
ａ．ヘパリンとヘパリン断片
ヘパリンは、広範囲に硫酸化されたα−Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの反復二糖類ユニットで構成される高度に陰イオン性の異質性グリコサミノグリカンである。ヘパリンの治療上の主要な用途は抗凝固薬である。しかし、ヘパリンはまた、血管の平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含むいくつかの異なる細胞種の成長を抑制することが知られている。四糖類と同程度に小さいヘパリン断片は、抗凝固作用が弱いか、あるいは抗凝固作用を持たないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抗増殖作用を備えていることが見出されている。Ｃａｓｔｅｌｌｏｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０２：１９７９〜１９８４（１９８６）。
ヘパリンは、高親和性結合部位を介してＳＭＣの細胞表面に結合し、細胞内に取り込まれる。さらにヘパリンは、トリドデシルメチルアンモニウム塩化物被膜とのイオン性結合を介して、シリコン、Ｍｙｌａｒ▲Ｒ▼、Ｄａｃｒｏｎ▲Ｒ▼、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの様々な人工表面にも結合することができる。Ｇｒｏｄｅら、Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔ．Ｏｒｇａｎｓ、１５：１（１９６９）を参照。
ヘパリンの抗増殖性作用が、これらの物質に対して結合した場合にも保持されるかどうかについてのデータは存在しない。
ｂ．コルヒチン
コルヒチンは、自然に見出されるアルカロイドで、急性通風性関節炎の治療的管理に使用する。コルヒチンは、有糸分裂紡錘体線維形成を妨げ、分裂中期で細胞分裂を抑止することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで植物および動物の細胞分割を阻止する。このコルヒチンの作用は、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチンの作用と同様のものである。アテローム硬化性腸骨動脈を持つウサギに毎日コルヒチンを投与したところ、バルーン損傷後４週に血管造影に観察された再狭窄の程度が減少したことが最近報告された。Ｃｕｒｒｉｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８０、１１〜６６（１９８９）。
しかし、最近の臨床研究では、１ｍｇ／日のコルヒチンでは、バルーン血管形成術を受けた患者の再狭窄の発生を減少させることはできなかった。Ｃ．Ｇｒｉｎｅｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４：ＩＩ−３６５（１９９１）。毒性による制限のために、患者は１ｍｇ／日を超える投与量を許容することができないが、この投与量によって生じるヒトの血中コルヒチン濃度はウサギにおける研究の場合よりも１０倍から２０倍低いことが見積もられている。
ｃ．他の薬品
動物モデルで用いられ、筋肉内膜の肥厚化を減少させた他の薬品は、以下の通りである：（１）アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）抑制因子（Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１８６〜１８８（１９８９）；（２）Ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ（Ｃ．Ｌｕｎｄｅｒｇａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１７（Ｓｕｐｐｌ．Ｂ）：１３２Ｂ〜１３６Ｂ（１９９１））；Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ（Ｌ．Ｊｏｎａｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：２３０３〜０６（１９８８））；（４）ヤギ抗ウサギ血小板由来成長因子抗体（Ｇ．Ｆｅｒｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１１２９から１１３２（１９９１））；（５）Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ（Ｇ．Ｎｅｍｅｃｅｋ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．、２４８：１１６７〜１１７４（１９８９））；（６）Ｔｒａｐｉｄｉｌ（Ｍ．Ｌｉｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８１：１０８９〜１０９３（１９９０）；および、（７）インターフェロン−ガンマ（Ｇ．Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４：１２６６〜７２（１９９１））。
血管形成術後の再狭窄を治療するための経口投与など全身への薬品供給の使用は、一定間隔での周期的投与を必要とし、その結果、疾患部位における治療薬濃度の周期的な変動が生じる。さらに、患者が薬物の全身的投与を受けなければならない２０〜３０日の期間を過ぎると、通常は摂取された薬物の９９％以上が、薬物によって肝臓または腎臓で処理される。これは、重大な副作用の可能性を表している。
２．慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチは、関節の慢性的滑膜炎によって特徴付けられる慢性病である。慢性関節リウマチ炎を治癒する方法は現在は存在しないが、治療として認められているものの一つは、冒された関節内の、炎症を起こした柔組織の除去を伴う滑膜切除である。Ｎ．Ｇｓｃｈｗｅｎｄ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、（ｅｄｓ．Ｗ．Ｎ．Ｋｅｌｌｙら）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、ｐｐ．１９３４〜１９６１（１９８９）。滑膜切除は、外科的、化学的、放射線薬学的に達成することができる。外科的滑膜切除は、痛みに対する待期的効果を備えることが示された。しかし、ほとんどの症例で、手術後数年以内に滑膜炎の再発が起きている。さらに、外科的滑膜切除は、各関節について一回しか実施することができず、比較的小さい関節では実施が困難である。化学的滑膜切除は、外科的滑膜切除に代わる効果的方法であることが示されてきたが、軟骨と骨に現在使用できる薬品の毒性によってその使用が限定されている。
化学的滑膜切除に代わる方法としての放射性同位元素による滑膜切除は、滑膜の増殖を抑制するようにみえる。しかし、知られている限りでは、現在用いられている供給システムが、冒された関節の固定化の延長を必要とすることと、リンパ節、脾臓、肝臓への放射性同位元素の全身的照射の許容値を低減するために、短寿命で市販が困難な同位元素の使用が必要であるため、放射性同位元素による滑膜切除の使用は限定されている。滑膜切除部位からの放射性同位元素の漏出は、慢性関節リウマチの初期治療のためのこの方法の開発上、第一に考慮すべき点である。
３．卵巣癌
卵巣癌は、女性の癌による死亡の主因の第４位である。上皮癌は、卵巣の悪性疾患のおよそ８０％から９０％を占める。上皮癌は最初は表面を伝わって、あるいはリンパ性に広がって身体全体に広がる。卵巣外に広がった最も一般的な型は、原発腫瘍の表面から広がった細胞の経腹膜性散在である。
卵巣癌の主要な治療としては、通常は疾患初期に癌細胞が腹膜腔に入り、外科的に除去することができないため、完治はまれである。外部ビーム放射線治療も、手術の前後にしばしば用いられるが、一回の照射値は腹部器官（肝臓、腎臓、胃、腸）の照射許容限界値に制限される。腹膜腔に照射する放射性のコロイド状金またはリンの腹腔内点滴注入が、過去には使用されていた。しかし、放射線の配分が不均一で小腸での合併症が起こるため、その使用は減少している。単クローン抗体が、腹腔内に供給された放射性同位元素のための賦形剤として、最近試験が行われている。現在までに卵巣癌の治療に認可された単クローン抗体共役は存在しない。
化学療法は、進行した卵巣癌患者の最も一般的な治療形式である。現在卵巣癌に対して使用されている薬物は、余命を数年延ばすことがある。しかし、それらは推奨全身投与量では、顕著な副作用を示す。
４．乾癬
乾癬は、皮膚クラチノサイトの制御不能な成長に発展し、炎症と潰瘍を形成する一般的な慢性皮膚疾患である。乾癬の包括的な治療法は現在まで存在しない。
現在の乾癬の治療には、全身的なものと局所的なものの両方がある。両方の型の治療ともに効果的であるが、それらは重大な副作用を起こすことがある。乾癬の全身的治療には、主に、コルチコステロイドとメトトレキセートのような細胞毒化合物の投与が含まれる。局所的治療には、抗菌性あるいは抗真菌性整剤、木タール、太陽光への暴露あるいは紫外線を用いた光線療法、あるいは、局所的ステロイドの適用が含まれる。局所的コルチコステロイドは、他のどのような理学的治療法よりも乾癬に多く用いられている。しかし、通常の局所的治療は、簡単に擦りとられたり、洗い流されてしまう欠点があり、長期の有効性が損なわれる。さらに、コルチコステロイドの局所的使用は末梢血管への浸透と、そこからの全身循環への浸透によって、有害な全身性蓄積の原因となる傾向があり、その使用が限定される。
深刻な副作用を示すことなく、疾患部位へ治療薬をより高い濃度で長く保持することを可能にするような薬物療法の投与法は、上記の状態の治療に有効であることが明らかになるであろう。
最近の研究努力は、標的特異的治療薬または診断薬の開発において、例えばレセプターリガンド、あるいは抗原抗体相互作用などの特異的生物学的相互作用の利用に集中してきた。他の有望な研究分野には、標的特異的細胞、あるいは適切な診断薬、治療薬を含む小胞（例えばリポソーム）が含まれる。特に単クローン抗体は、これらの細胞または小胞に標的特異性を提供するために用いられてきた。これは比較的新しい技術であるため、このように標的を定めた薬物治療が、真に効果的で信頼できるというわけではない。
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０００８７では、各種の化合物、組成、その調整方法、および細胞形態あるいは生理的機能に対して感知しうる損傷作用を生み出すことのない、細胞あるいはウイルスのようなバイオ粒子の表面膜へのバイオ作用性物質の結合の使用が記述されている。化合物は、一般式Ｒ−Ｂ−Ｒ1をもち、Ｂは例えば治療薬あるいは診断薬などのバイオ作用性物質を表し、ＲおよびＲ1の少なくとも一方は、化合物にある程度の脂肪親和性を提供してバイオ粒子の表面膜との安定した結合を可能にするように選択された炭化水素置換基である。ここで述べた化合物を含む組成は、化合物とバイオ粒子の外側表面膜との間の安定した結合のための適切な結合手段によって構成される。これらの組成は、あらかじめ決定した部位に対する、本来のあるいは獲得した親和性を備える選択したバイオ粒子に化合物を安定に結合させることによって、あらかじめ決定された部位特異的作用をｉｎ  ｖｉｖｏで発揮するためと、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオ粒子を導入することによって、あらかじめ決定した部位にバイオ粒子がバイオ作用性物質を運搬してその目的の作用を生むようにするために利用する。
【発明の要約】
本発明の一つの側面に従って、例えば細胞あるいはウイルスなど脂質を含むバイオ粒子に、治療上有効な物質を結合させる能力を備える化合物が提供される。本発明の化合物は、化合物を十分に非極性にすることによって、脂質を含む生体適合粒子の脂質成分にｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏのどちらか一方で安定して結合するように選ばれた、少なくとも１個の炭化水素置換基に、結合成分によって安定に結合している治療上有効な物質で構成されるバイオ作用性成分を含む。本化合物は、治療薬と結合成分の間を分離する、治療作用を媒介するスペーサ成分を任意に含む。
さらに本発明の化合物は、変化するが予測可能であるような、バイオ膜の脂質成分との結合の安定性を備えることによって特徴付けられる。本化合物は少なくとも９０％の表面膜保持係数（ＭＲＣ）と、少なくとも３０％の膜結合安定性を備えるのに十分なだけ非極性である。さらに本発明の化合物は、直接投与あるいは担体によって選択した部位に治療薬を一度供給すれば、当分の間そこにとどまり、その意図した効果を生み出すのに十分な分量がとどまるように用いるうえで十分に安定である必要がある。膜保持係数および膜結合安定性を決定する方法については以下に記述する。
本発明に従って上述の化合物は、治療薬の選択的な供給と、選択した部位へのその保持のために使用する。本発明の好ましい側面に従って、治療薬は、細胞増殖を伴う疾患あるいは他の病的状態の治療に有効な抗増殖作用を備える。抗増殖薬は、放射線治療物質あるいは化学治療物質によって構成することができる。好ましい実施例によれば、本発明は、放射線治療物質がキレート薬および放射性金属で構成されるような化合物を提供する。他の好ましい実施例では、本発明の化合物は、選択した細胞内機能を妨げることが可能な物質に加えて、ヘパリン、ヒルジンおよびその誘導体のような化学治療物質で構成される。
本発明の別の側面によって、化学治療物質を本発明の化合物に対して放出可能に抱合させることができる。これらの化学治療物質は、例えば、化合物から放出された場合のみにそのバイオ作用を示すコルヒチン、ビンカアルカロイド、タキソールおよびその誘導体で構成される群から選択することができる。これらの化合物は、以下”チューブリン”過程と呼ぶチューブリン合成重合、脱重合、あるいは、分解および／または機能を妨げる。例えば、結合成分に抱合している間は本質的に不活性であるようなコルヒチン類似体が結合した、酸切断コルヒチン誘導体が提供される。本化合物は、選択された部位に供給され、最終的に細胞内に取り込まれる。化合物の取り込みは、結合成分からコルヒチン成分を切断するｐＨの低減によって達成する。遊離したコルヒチン誘導体は、チューブリン過程を妨げるという、意図した生物学的作用を及ぼすことが可能である。
本発明のさらに別の側面によって、生物学的媒質と適合しうる本発明の化合物で構成される薬学的製剤が提供される。
本発明のもう一つの側面によって、疾患あるいは他の病的状態の治療に用いる治療上有効な物質で構成され、さらに任意に診断薬を含む本発明の様々な化合物を使用する方法が提供される。
本発明の化合物は、好ましくは疾患の部位に保持するためにｉｎ  ｖｉｖｏ供給で直接投与する。別の方法では、化合物を疾患部位に供給する担体粒子に本化合物を結合することができる。直接ｉｎ  ｖｉｖｏ供給は、血管形成術後の再狭窄、慢性関接リウマチ、卵巣癌、乾癬のような状態の治療に特に好ましく、以下にさらに詳細に記述する。
本発明は、疾患部位へ治療薬を供給するために現在利用できる化合物および方法に比べて、数多くの明白な利点を備えている。特に本発明の化合物は、身体の選択した部位に対し、その部位の細胞構造と安定して結合することによって供給と保持を行うことができる。現存する供給法は、全身性の副作用なしに疾患部位に十分な投与量を供給すること、あるいは治療物質を疾患部位に当分の間保持して目的の治療効果を生じるのに十分な長さの保持を行うことが不可能である。本発明の化合物は、疾患部位において治療上有効な投与量を達成することができる。例えば、放射性同位元素の全身的な分布が非常に有害となる放射線治療の場合、本発明の化合物は、必要な部位への放射線治療物質の安定した結合と保持を可能にし、関節の固定や極度に短寿命の同位元素を必要とすることなく、同位元素の全身的な分布を抑制する。
本発明の他の顕著な利点は、最初は外部の細胞膜と安定に結合し、その後は通常の膜通過過程を経て細胞内に取り込まれるように化合物を調整できることである。この特徴は、放出可能に抱合した治療物質で構成されるように本発明の化合物を調整できることとともに、選択した細胞内への潜在的に毒性のある物質の供給を可能にし、そこで活性化してその治療効果をそれらの細胞だけに及ぼし、身体内の他の細胞には及ぼさないようにすることが可能である。この方法には、アンチセンスＲＮＡあるいはＤＮＡの供給をも含めることができる。
本発明のさらに別の利点は、ここに記述した化合物の、細胞および他の生体適合粒子への結合が、本質的に脂質親和力によって生じることである。このことは、細胞膜が個々の蛋白質部分に存在し、さらに大きな脂質部分には存在しないため、脂質との結合が細胞膜の重要な機能領域に干渉する機会を減らすことから、特に細胞の場合に重要である。細胞にバイオ作用性物質を供給するために、膜蛋白質と細胞レセプタへの結合に頼る従来の方法では、しばしば機能的な能力が減少してしまう。
細胞の脂質領域との結合によって実現する、付随的な明白な利点が存在する。脂質領域は細胞表面領域の大部分によって構成されるため、数多くの脂質結合化合物を配置することが可能であり、その結果、高い濃度の治療薬を形質膜内に入れることができる。それに加えて、本発明の化合物はその脂肪親和性の特徴によって膜脂質内に安定して結合するので、標準的な生理的塩に対して比較的溶解しにくい。したがって、これらの化合物が一度膜に結合すると、それらはそこに効果的に閉じ込められ、容易に分離することができなくなる。その結果、細胞からの漏れが最小限になり、それによって有害な全身性の作用を最小にする。
【図面の簡単な説明】
ここに以下の図面を参照する。
図１は、局所的に注入した物質Ｐの血管反応と、本発明の物質Ｐ−脂肪親和性シアニン抱合体とを比較した試験結果を示す図である。上方のグラフは物質Ｐに関するものであり、下方のグラフは抱合体に関するものである。
図２は、物質Ｐと本発明の物質Ｐ−脂肪親和性シアニン抱合体のそれぞれの投与量−反応関係を示す図であり、それぞれ物質Ｐ拮抗薬［Ｄ−Ｐｒｏ2、Ｄ−Ｔｒｐ7,9］−ＳＰの非存在下および存在下を示す。
図３は、蛍光／周波数ヒストグラムの系列を示す図で、点は個々の細胞を表す；ｘ軸の原点からの点の距離の増大は赤の蛍光強度（ＬＦＬ２信号）の増大を表し、ｙ軸の原点からの点の距離の増大は緑の蛍光強度（ＬＦＬ１信号）の増大を表す。
図４は、本発明の物質Ｐ脂肪親和性シアニン色素抱合体の、時間の関数として求めたｉｎ  ｖｉｖｏでの赤血球への結合の安定性を表すグラフである。
図５は、放射性ヨウ素（125Ｉ）と結合した脂肪親和性シアニンの、異なる４種類の人口表面、すなわちｓｉｌａｓｔｉｃゴム（ＳＩＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）への保持の程度を表す棒グラフである。点で描いた棒は、最初に各表面に結合した放射性ヨウ素（125Ｉ）と結合した脂肪親和性シアニンの分量を表す；黒い棒は６時間の連続的血液潅流後にとどまった分量を表す。対をなす棒に付随する数字は、結合した化合物の最初の分量の保持率である。
図６は、抗凝固性脂肪親和性シアニン抱合体で標識した担体細胞の、基準濃度のトロンビンによって生成したフィブリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発生を抑制する能力を試験した実験のデータを示す図である。非抱合の抗凝固剤の濃度反応を比較のために提供する。トロンビン反応の抑制率（ｙ軸）を、試験した化合物のモル濃度（下方のｘ軸；対数目盛）、試験標本当たりの担体細胞の数（上方のｘ軸；対数目盛）の関数として記録した。
【好ましい実施例の説明】
Ｉ．定義
以下に示す用語および表現を、本発明の記述の引例として、以下のように定義する：
１．バイオ作用性成分−バイオ作用性成分とバイオ作用性物質という用語は、ここではヒトまたは動物の治療、診断、予防、あるいは他の治療に有効な広範囲の様々な物質を指すために用いる。これらの用語には、生物学的作用を及ぼすことができるあらゆる物質が含まれる。
２．生体適合粒子−ここで使用する”生体適合粒子”という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与で重大な副作用を起こさないものである限り、例えばｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞など生存可能な実体に加えて、リポソーム、リポ蛋白などの生存不可能な実体の両方を含む。
”生理的機能を備える生存可能な生体適合粒子”という表現は、ここではあらゆる生存可能な細胞または膜を含むウイルスを指す。さらに、ここで使用するように、”細胞”という用語には、白血球、各種の腫瘍細胞などの真核細胞と、細菌などの原核細胞、さらに、例えば中国ハムスター卵巣細胞、イーストなどの培養哺乳類細胞、および赤血球、赤血球ゴーストや血小板などの非核細胞が含まれる。以下の本発明の詳細な説明は、生体の細胞を特に参照して記載する。しかし、細胞に関して記述する内容は、一般的に膜を含むウイルスに対しても同様に適用されることを理解する必要がある。さらに、本発明に従う治療薬の部位選択的供給を実施するうえで、目的の供給部位に対する自然な、あるいは獲得した親和性を備えていれば、生存不可能な実体を生存可能な実体に適切に置き換えることができることを理解する必要がある。例えば、リポソームは、肝臓または脾臓に供給するための治療有効物質の担体として使用することができる。
３．診断薬−ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験による生理的条件あるいは状態の検出、測定、または分析を促進する能力を備える化合物あるいは物質を指す。本発明の化合物は、身体の外側から検出可能な、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析のために入手した体液または生検内で検出可能なリポーター分子として、二重の機能を果たすことができる。
４．発色団−少なくとも一つの選択した光の波長の吸収によって、視覚的、または装置を用いることによって検出することが可能な物質を指す。
５．治療上有効な物質−生体の異常あるいは病的な条件の予防、軽減、治療または治癒の能力を備える物質を指す。これらには、生理的身体機能を維持、増大、低減、制限、または破壊する能力を備える物質と同様に、生体の微生物または抗原を抑制、殺傷、改良あるいは保持することによって生体を保護する物質が含まれる。治療上有効な物質には、治療上の効用を備える薬剤あるいは薬物を含む。
６．化学治療物質−その治療効果が物質の化学的特徴に起因するような治療上有効な物質を指す。化学治療物質には、例えば、非放射性薬剤を含むことができる。それらには小さな分子と、脂質、炭水化物、蛋白質あるいはＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸のようなさらに複雑な分子を含めることができる。
７．放射線治療物質−その治療効果が放射性に起因するような治療上有効な物質を指す。適切な放射線治療物質は、放射性同位元素で構成することができる。好ましくは、バイオ作用性成分は、186Ｒｅ、90Ｙ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、あるいは153Ｓｍなどの各種の放射性治療核種との錯体をなすキレート薬で構成する。
８．抗増殖薬−細胞の増殖を阻止、減少、または防止する能力を備える治療上有効な物質を指す。
ＩＩ．化合物の説明
本発明の化合物は、治療上有効な物質を部位選択的に供給することが求められる様々な薬理療法に有効である。本発明の好ましい実施例によれば、治療上有効な物質は放射線治療物質、あるいは化学治療物質の抗増殖薬である。別の実施例では、本発明の化合物は、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの追跡、および／または検出を可能にする発色団または放射性核種のような診断薬で構成することができる。したがって、本発明の化合物は、例えばバイオ作用性成分として治療上有効な物質、および結合成分としての検出可能な発色団で構成することができる。
本発明の化合物を構成する診断薬は、技術に精通した者に周知である様々な分析法によって検出することが可能な異なる種類の中から選択することができる。検出可能な蛍光化合物は、好ましくは、例えばオキシカルボシアニン、インドカルボシアニン、チオカルボシアニン、あるいはアクリジン色素とその誘導体を含むシアニン色素およびその誘導体である。他の有効な蛍光化合物には、例えばスチリルピリジン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、あるいはジフェニルヘキサトリエン色素およびその誘導体が含まれる。
有効な診断薬には、ビオチンまたは特異的抗体のような検出を促進するリガンドがさらに含まれる。他の有効な診断薬は、金属と錯体をなすキレート化物質であり、これらは直接的あるいは間接的に検出することができる。適切なキレート−金属錯体は、原子番号が２１から４９の遷移金属系列から選択した同位元素、例えばインジウム１１１あるいはテクネチウム９９ｍで構成することができる。このような錯体は、担体細胞の細胞質膜に対して結合し、身体内への供給後にガンマカメラを用いた画像化を可能にするように放射性にすることができる。キレート化物質はさらに、例えば関心部位にある特定の作用を生じることによって間接的に検出可能な金属イオンと錯体を構成することが可能である。例えば常磁性元素の錯体は、近傍の核の緩和時間に影響を与えることができるので、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって検出することができる。キレート−金属錯体は、原子番号２１から２９の遷移金属系列、あるいは原子番号５９から６６のランタニド系列から選択した金属イオンがこうした用途に適している。
望ましい場合には、放射性同位元素を含む化合物を本発明の各種の使用例に用いることができる。125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、35Ｓ、あるいは75Ｓｅのような放射性同位元素を、バイオ作用性成分、発色団あるいは化合物の炭化水素尾部に存在する、豊富に存在し自然に見出される非放射性形の原子に置き換えることができる。非ゼロスピン状態（例えば19Ｆ）をもつ同位体を本発明の化合物に導入し、ＭＲＩ技法によってその存在を検出できるようにすることができる。
治療への適用のためには、186Ｒｅ、90Ｙ、あるいは67Ｃｕなどの様々な治療放射性核種と錯体を構成する、上述の種類のキレート薬によってバイオ作用性成分を構成することができる。
本発明による治療への適用のために、さらに蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白、あるいはペプチドを含む蛋白様物質を適切な結合成分を介して、適切な長さの炭化水素尾部に結合することができる。代表的なバイオ作用性蛋白様物質は、イムノゲン、トキシン、ホルモン、酵素、抗原、抗体、および抗体断片である。このような治療上有効な蛋白質は、上述した種類の脂肪親和性発色団に有利に抱合体となり、以下に例証する脂質を含む様々なバイオ粒子との変動し予測可能な結合の安定性によって、結果として生じる抱合体が顕著になる。
治療への他の適用では、結合する細胞の細胞体内において移動および循環形態の変動を可能にする炭水化物で、バイオ作用性成分が構成される。この方法で適用可能な種類の炭水化物の一つにはシアリン酸が含まれる；他の種類としては、グリコサミノグリカンが含まれる。例えば、シアリン酸を含む構成を赤血球の形質膜に適用し、膜上のシアリン酸の数量を増大させることができる。荷電した基の数の増大は、肝臓で除去される前の循環する赤血球の寿命を増大させる。
バイオ作用性成分は、組織特異的レセプタ、あるいは標的器官内の細胞上のレセプタと結合することが可能なリガンドの形にすることもできる。このようなリガンドを含む化合物は、例えば担体細胞に結合した場合に、特異的な器官の部位への移動を促進する。
本発明の化合物は、特に注射、輸液、カテーテル法および局所的適用を含む様々な方法によって、身体内の選択した部位に直接供給することができる。例えば自系、同種異系、あるいはｚｅｎｏｇｅｒｉｃ細胞などの担体生体適合粒子に本発明の化合物を結合させ、バイオ作用性物質の標的を定めた供給を促進させることもできる。特に限定しない限り、以下に記載する考察は、疾患部位への直接的な供給あるいは担体賦形剤の調整のどちらかによる、生存可能な細胞への本発明の化合物の結合を意味する。本発明の一つの目的は、治療薬または放射性同位元素を結合することができ、細胞の外側の膜を構成する脂肪二重層の中に溶解することができる化合物を提供することである。本発明の化合物を介した治療物質の供給は、疾患部位に直接供給した場合に、これらの物質を疾患の領域の細胞に高い濃度で、他の方法では達成できないような長期間にわたって保持することを可能にする。さらに、本発明の化合物を使用することによって、全身的に投与すると毒性をもちうるような治療薬の使用を可能にする。
本発明の化合物の細胞上への作用の方法は多様であり、以下の項目に依存する：（１）結合させる細胞の種類；（２）脂肪親和性尾部の性質、長さおよび数量；（３）治療する身体部位；（４）バイオ作用性成分の性質；そして（５）化合物に結合させたバイオ作用性成分がその作用を細胞上に生じる機構。本発明の化合物は細胞上に沈着し、最初は形質膜の外側の脂質二重層に付着する。膜成分は内側に自然に通じているので、これらの化合物も細胞の内側に取り込まれる。これが起こる速度は個々の細胞の種類、その成長状態とその活動あるいは刺激の程度に応じて変化する。
本発明の化合物に対して抱合している放射線治療物質のような抗増殖薬の一部の種類は、それらが外側の膜あるいは細胞内のどちらに位置していても作用する。これらの薬剤は核を損傷する放射線を放出し、放射線が十分に透過した場合は、周囲の細胞の成長も同様に抑制する。成長を抑制するために細胞内成分と物理的に相互作用しなければならない薬物は、本発明の化合物が細胞内に取り込まれたのちにはじめて有効となる。コルヒチンのような極度に毒性の強い薬物の場合は、脂肪親和性成分に抱合体にすることができ、不活性形態で外側の膜に結合させ、細胞には毒性をもたない他の作用方法が考案されている。その後、抱合体が内側に移動するに従って、特別に用意された結合（以下の例で詳細に記述する）が、抱合体からの薬物の放出を可能にし、その抗増殖性作用を及ぼすことを可能にする。
ＩＩＩ．一般式
本発明の範囲内の化合物は以下の式で与えられる：
0003682974.tif 000002
ここでＢは治療上有効な物質で構成されるバイオ作用性成分を表し、ＲおよびＲ1は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は直線状または分岐状であり、一つまたはそれ以上の非極性官能基によって脱置換あるいは置換され、ＲおよびＲ1の少なくとも一方は炭化水素置換基で構成され、その鎖の長さは、膜結合能力を化合物に提供するのに有効なだけの長さを備え、Ｒ2はスペーサ成分を表し、ｎは０または１であり、Ｌは、ｎ＝０のときに非芳香族結合成分であるという条件下で、ｎ＝０のときにＢとＲおよびＲ1の少なくとも一方との間、またｎ＝１のときにＲ2とＲおよびＲ1の少なくとも一方との間に安定した結合を提供する結合成分を表す。
ここで使用する”非極性官能基”という表現は、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ハロゲン、Ｎ（アルキル）2、Ｓｅ−アルキル、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯ−アルキル、Ｓｉ（アルキル）3、Ｏ−Ｓｉ（アルキル）3、および同様のものを指す。
結合成分（Ｌ）は、飽和あるいは非飽和脂肪族リンカーまたは脂環、芳香族を含む環構造であり、それは単環式、多環式、単素環式、複素環式、溶解あるいは非溶解でありうる。
好ましくは、結合成分は発色団である。本発明の化合物への発色団の結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の追跡を促進する。この目的に有効な発色団には、シアニン、アクリジン、ピリジン、キノリン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、およびジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体が含まれる。
本発明の範囲内の好ましい化合物の種類は、以下の式で与えられる：
0003682974.tif 000003
ここでＢはバイオ作用性物質を表し、ＲおよびＲ1は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は１個から３０個の炭素原子を備え、直線状または分岐状であり、前記置換基は一つまたはそれ以上の非極性官能基によって非置換あるいは置換され、Ｒ2は次の式のスペーサ成分を表す：
0003682974.tif 000004
ここでＲ3は脂肪族炭化水素を表し、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素、複素環式またはＣＨ2Ｃ（ＣＯ2Ｈ）＝ＣＨで構成される基の中から独立に選択し、
0003682974.tif 000005
はアミド、チオ尿素、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、ケタール、アセタール、オルトエステル、エステル、無水物、ジスルフィド、尿素、カルバミン酸塩、イミン、アミン、エーテル、炭酸塩、チオエーテル、スルホンアミド、カルボニル、アミジンおよびトリアジン結合で構成される官能結合基から独立に選択したものである；
0003682974.tif 000006
は、さらに独立に原子価結合を表すことができ、脂肪族または脂環式炭化水素は１個から１２個の直線状炭素原子を備え、芳香族炭化水素は６個から１２個の炭素原子を備える；ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔはそれぞれ０または１である。
ＸおよびＸ1は同一または異なる値をとることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ3）2またはＳｅを表す；
Ｙは、＝ＣＲ8、＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−、＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−、あるいは＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−ＣＲ8＝ＣＲ8−から選択した結合基を表し、ここでＲ8はＨ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、あるいはＣＨ（ＣＨ3）2から選択する；
Ｚは、Ｈ、アルキル、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ2ＮＨ2、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ−（アルキル）2、ＮＨ−アシル、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）2、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＯ2、ハロゲン、Ｓｉ（アルキル）3、あるいはＯ−Ｓｉ（アルキル）3、Ｓｎ（アルキル）3、またはＨｇ−ハロゲン基から選択した置換基を表し、前記Ｚ置換基で構成されるアルキル基は１個から４個の炭素原子を備える；さらに、Ａは生物学的に適合しうる陰イオンを表す。高度に安定な生体膜結合を必要とする適用のためには、式（ＩＩ）のＲおよびＲ1の一方が少なくとも１２個の炭素原子を備え、ＲおよびＲ1の直線状炭素原子の合計が少なくとも２３個になるようにしなければならない。
様々なスペーサ成分（Ｒ2）は、既知の合成方法に従って、シアニン頭部基とバイオ作用性成分の間で、頭部基とバイオ作用性成分のどちらか一方あるいは両方に存在する適切な官能基を介して容易に結合することができる。このような目的のために、種類の異なる多数の生体機能（ホモ生体機能とヘテロ生体機能）スペーサ試薬が技術文献に報告されてきた。Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、９１：５８０〜６０９（１９８３）を参照。これらのスペーサ成分は反応基の種類、疎水性、親水性、長さ、および反応基を結合している構造が切断可能か、切断不可能かによって異なっている。
上述のように、スペーサ基の官能結合は、アミド（−ＮＨＣＯ−）、チオ尿素（−ＮＨＣＳＮＨ−）、ヒドラゾン（＝ＮＨＮ−）、アシルヒドラゾン（＝ＮＨＮＣＯ−）、ケタール（−Ｏ−Ｃ（アルキル）2−Ｏ−）、アセタール（−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−Ｏ−）、オルトエステル（−Ｃ（Ｏ−アルキル）2−Ｏ−）、エステル（−ＣＯＯ−）、無水物（−ＣＯＯＣＯ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−）、カルバミン酸塩（−ＮＨＣＯ2−）、イミン（＝Ｎ−）、アミン（−ＮＨ−）、エーテル（−Ｏ−）、炭酸塩（−Ｏ−ＣＯ2−）、チオエーテル（−Ｓ−）、スルホンアミド（−ＳＯ2−ＮＨ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、およびアミジン（−ＮＨＣ＝（ＮＨ▲＋▼−））にすることができる。
放射線治療のための好ましい実施例では、Ｂは特にレニウムまたはイットリウムのような放射性金属との錯体をなすキレート薬を表す。化学療法のための好ましい実施例では、Ｂはヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンブラスチンあるいはその類似体を表し、それらのすべては抗増殖薬である。化学療法のための他の好ましい実施例では、Ｂはペプチドを表す。上記の式ＩＩに含まれる、物質Ｐとして知られるペプチドの誘導体が赤血球に安定して結合し、自由、すなわち非抱合体のペプチドに比べて循環における治療効果の引き延ばしを提供することが見出された。非抱合体の形では循環において比較的短寿命であるような他の治療上有効な物質に対し、同様に生物学的利用能の増大を実現できることが期待されている。
例えば組み合わせ治療および組み合わせ診断のような、本発明の化合物の特定の適用では、式ＩのＢをビオチンにすることが有効である。
ＩＩＩ．本発明の化合物の調整
１．脂肪親和性に機能化したシアニン
上記の式（ＩＩ）の化合物は、以下の一般式に従う脂肪親和性シアニン前駆体から簡単に調整される：
0003682974.tif 000007
ここでＲ、Ｒ1、Ｘ、Ｘ1、Ｙ、Ｚは、式ＩＩの化合物に関して上記で定義したものであり；さらに
Ｒ2は次の式のスペーサ成分を表す：
0003682974.tif 000008
ここでＲ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、
0003682974.tif 000009
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔは、式ＩＩの化合物に関して上記で定義したものである；また
Ｗは、アミノ（−ＮＨ2）、α−ハロアセトアミド（−ＮＨ  ＣＯＣＨ2−ｈａｌ）（ｈａｌ＝ハロゲン）、イソチオシアン酸塩（−ＮＣＳ）、ハロゲン、イソシアン酸塩（−ＮＣＯ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、ヒドラジノ（−ＮＨＮＨ2）、アシルヒドラジド（−ＣＯＮＨ−ＮＨ2）、例えばベンゾフェノンなどのケトン（−ＲＣＯ）、ジチオピリジル（−ＳＳ−Ｃ5Ｈ5Ｎ）、水硫（−ＳＨ）、アルデヒド（−ＨＣＯ）、無水物（−ＣＯＯＣＯ−アルキル）、スクシンイミドエステル（−ＣＯＯＣ4Ｈ4ＮＯ2）、水酸（−ＯＨ）、スルホニルハロゲン化物（−ＳＯ2−ｈａｌ）、イミドエステル（−Ｃ（＝ＮＨ）ＯＣＨ3）、エポキシド（−Ｃ2Ｈ3Ｏ）マレイミジル（−ＮＣＯＣＨ＝ＣＨＣＯ）およびアジド（−Ｎ3）基から選択した反応性官能基を表す。
本発明の化合物の調整に適した前駆体は上記の式の置換基Ｗとして反応性アミン（ＮＨ2）基を備え、様々な合成法に従って調整することができるが、その一つの方法を反応機構１で説明し、下記の例で詳細に考察する。
機構１に従い、ＧａｌｅとＷｉｌｓｈｉｒｅの方法（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、３０：６９３（１９７７））に従って２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（市販品）をＮ−ヒドロキシメチルフタルアミド（市販品）と反応させ、化合物（１）を生成させ、これをさらに対応するアルコールと４−スルホン酸クロルベンゼン塩化物からＳｏｎｄｅｒｍａｎｎの方法（Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、７４９：１８３〜１９７（１９７１））によって調整したアルキル  ４−スルホン酸クロルベンゼンと反応させ、中間物（２）を生成させる。基本的な手順に従って濃縮した塩酸中で加熱することによって（２）のフタルイミド保護基を除去して化合物（３）を生成し、続いてそれをギ酸メチルで処理して（４）を生成させる。２−メチル−ベンゾオキサゾール（市販品）あるいは２、３、３−（３Ｈ）トリメチルインドレニンとアルキル４−スルホン酸クロルベンゼンのどちらかによるアルキル化によって化合物（５）を調整する。その後化合物（５）を、米国特許番号２、６４７、０５４に記述されている方法と類似の方法を用いてＮ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジン（市販品）と反応させることによって（６）を生成させる。次に、塩基（酢酸ナトリウムまたはトリエチルアミン）の存在下でアルコール中で撹拌することによって中間物（４）と（６）を混合し、（７）を生成させる。Ｄｈａｗａｎらの方法（Ｏｒｇｎ．Ｐｒｅｐ．ａｎｄ  Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．、７（２）８５〜８８（１９７５））による（７）の脱保護化によって、アミノ誘導シアニン（８）を生成させる。
アミノシアニン（８）は、部位特異的薬物の供給に役立つ抱合体を生成するために、適切な官能基（例えばＣＯ、ＣＯＯＨ）を含む治療薬に直接結合させることができる。さらに、アミノシアニン（８）は、他のバイオ作用性成分と抱合体を作ることができる他の広範囲なシアニン誘導体の調整のために、非常に用途の広い中間物である。また、化合物（８）は多数のホモ−およびヘテロ−二官能スペーサ成分と反応して、脂肪親和性シアニン成分とそれに結合したバイオ作用性物質との間に分離を提供する用途には理想的な分子である。
結果として生じたシアニン誘導体上のアミン置換基は、周知の反応法を用いて他の官能基へ直接的に変換することができる。例えば、イソチオシアン酸官能基への変換は、Ｃｏｓｔａらの方法（Ｊ．ｏｆ  Ｌａｂ．Ｃｏｍｐｄｓ．ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２７（９）：１０１５（１９８９））によって、チオホスゲンによる処理によって実現することができる。
アミン基と１、４−テレフタル酸ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって、ＯＯＣ−アリール−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分によるシアニン頭部基へのスクシンイミジル官能基の結合が提供される。結果として生じた化合物は、安定な結晶固体として分離および精製することができる。
ジメチルホルムアミド中における置換アミノ基のｐ−ニトロフェニルヨード酢酸塩（市販品）による単純なアシル化によって、アルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分によってシアニン頭部基に結合した反応性ヨード置換基が提供される。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（市販品）によるアミン基の処理によって、ピリジルジチオ官能基とアルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。
γ−チオブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水硫官能基とアルキル−ＯＣＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。同様に、γ−ブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水酸基とアルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。
２．蛋白質／ペプチド脂肪親和性シアニン抱合体
上記に一般的に記述したように調整した脂肪親和性シアニン前駆体を、異なる数多くの合成法を用いて蛋白質またはペプチドに結合させ、式ＩＩの化合物を提供することができる。
上述したような脂肪親和性リンカー誘導体に対する蛋白質またはペプチドの結合は、蛋白質またはペプチド上に存在するアミン基（すなわち、末端α−アミノ基またはリシンのεアミノ基）を介して行うことができる。別の方法としては、蛋白質またはペプチドを適切なシアニン前駆体に結合するために、カルボキシル基またはチオール基（システイン残留物が存在する部分）を使用することができる。このような結合反応を実施するのに適した条件は、技術に精通した者にとって周知である。
ポリペプチドのα−アミノ基と脂肪親和性シアニン前駆体の抱合体のための一つの方法は、Ｗｅｔｚｅｌらの方法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１、１１４（１９９０）による修正を用いるものである。これは、ｐＨ６におけるヨード酢酸無水物（市販品）を用いたポリペプチドのアシル化によってヨード酢酸アミド誘導体を形成し、次にそれを上述のように調整した水硫基−誘導脂肪親和性シアニン化合物と反応させ、優れた安定性を備えるチオエーテル結合形成を介して抱合体を形成することを含む。
リシンのε−脂肪族アミノ基を介した抱合体は、平衡によってアミンの限られた分画のみが脱プロトン化されて反応性となるような、ｐＨ８．５を超える点で最良の状態で達成される。このアミノ基は、上述したいくつかのアミノ反応性脂肪親和性リンカー化合物との高い反応性を備えなければならない。例えば、イソチオシアン酸誘導リンカー化合物は、水性条件下で高い安定性を示し、リシンの側鎖と反応してチオ尿素結合を介して結合した抱合体を形成することができる。
上述のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカー化合物は、このように形成されたアミド抱合体が非常に安定しているため、リシンとの反応にとって特に優れた試薬である。この反応は、この特殊な誘導体の水性条件下での加水分解は競合する副反応であるため、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒中での無水条件下で実施することが好ましい。上記の式ＩＩＩのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカーをリシン残留物のアミノ基とｕｎｄｅｃａペプチド、物質Ｐの位置３で抱合させる反応については、以下に詳細に記述する。
ペプチドまたは蛋白質のＣ末端アミノ酸残留物上と同様、グルタミン酸とアスパラギン酸残留物の側鎖に存在するカルボキシル酸基は、上述のアミン誘導脂肪親和性シアニン化合物を用いた選択的抱合が可能な部位である。この反応は、ＨｏａｒｅとＫｏｓｈｌａｎｄの方法を修正したもの（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２：２４４７〜２４５３（１９６７）に従って１−エチル−３−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド（市販品）のような水溶性カルボジイミドを用いて実施することができ、あるいは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９：５４５２（１９７４）に記述された方法の修正に従って、Ｗｏｏｄ  ｗａｒｄの試薬Ｋ、２−エチル−５−フェニル−イソオキサゾリウム−３−スルホン酸塩（市販品）を用いることによって実施することができる。その結果生じた抱合体を、安定なアミノ結合を介して結合する。
不活性な抱合体がつねに生じるため、官能基化した誘導体の、生物学的活動に必須のペプチドまたは蛋白質の反応基への結合は避けなければならない。しかし、脂肪親和性シアニン誘導体からペプチドまたは蛋白質を切断可能なスペーサ成分によって解放することができれば、この問題を解決することができる。
上述の化合物の脂肪親和性により、それらの一部は代表的な水性の緩衝系に十分溶解しない。薬物の可溶性あるいは活性のある立体配座を維持するために水性条件を必要とする抱合反応は、通常は有機溶媒で改良した水性溶媒中で実施する必要がある。ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、およびアルコールのような溶媒は水と混合することができ、脂肪親和性シアニン誘導体を可溶性にして目的の抱合体を生じさせるうえで有効である。
本発明の化合物は、形成した特定の化合物の大きさ、電荷、あるいは脂肪親和性を利用する各種の標準精製法によって精製することができる。ペプチドで構成される治療薬に特に有効な精製法は、Ｂｏｈｌｅｎらの方法である（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：３０６〜１０（１９８０）。
３．ビオチン化した脂肪親和性シアニン
本発明のビオチン化した脂肪親和性シアニン化合物は、好ましくは次の式で与えられる：
0003682974.tif 000010
ここでＲ、Ｒ1、Ｒ8はすでに定義した通りであり、ｍは０から６の値をとる。このようなビオチン化した誘導体は、ビオチン反応、あるいは上記の式ＩＩＩの官能基化脂肪親和性シアニン化合物を用いたビオチン誘導体によって調整することができる。この反応に使用するビオチン誘導体は好ましくは次の式で与えられる：
0003682974.tif 000011
ここでＥは、前記反応性官能基によって置換することができるレービル基を備える化合物の残留物を表し、Ｗおよびｍは、０、１、または２である。
例えば、反応機構１に従って調整した型のアミノ官能基化シアニン誘導体（８）を、Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｆｉｎｎ、Ｋｉｓｏの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１００：３５８５（１９８７））に従って、市販のアミン反応性ビオチン誘導体、（＋）−ビオチン  ４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ６−（ビオチンアミド）カプロン酸塩および６（（６（（ビオチノイル）−アミノ）ヘキサノイル）アミノ）カプロン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンンイミジルエステルと反応させ、上記の式ＩＶのビオチン−脂肪親和性シアニン抱合体を形成させることができるが、ここでそれぞれｍ＝０、１、２である。これらの抱合体は、ビオチン成分と抱合体の脂肪結合成分の間のスペーサ腕の長さが異なっている。このようなスペーサ腕の作用は、ビオチン化化合物の意図する適用によって重要となることがある。長いスペーサ腕は、アビジン中の”深い”ビオチン結合部位とビオチン抱合体を結合する能力にとって、有利な作用を備えることが示されている。
ｍａｌｅｉｍｉｄｏ、α−ヨードアセトアミド、ヒドラジノおよびアミノなどの反応性官能基との他の種類のビオチン誘導体は市販されており（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、１９８９〜９１）、上述の様々な官能基化脂肪親和性リンカー化合物との結合に用いることができる。適切な反応機構は、技術に精通した者によって明らかである。
さらに、種類の異なる多数のスペーサ成分を、両者の前駆体上の適切な官能基によって、シアニンとビオチン成分の間に結合することができる。このようなスペーサの結合のための反応機構は、技術に精通した者には周知である。
４．放射性同位元素によって置換した脂肪親和性シアニン
放射性ハロゲン化シアニンの調整に役立ち、本発明の方法で有利に使用することができる脂肪親和性トリブチルチンの合成を反応機構２に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。
反応機構２に従って、Ｂｌａｉｋｉｅら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３１３（１９２４））とＭｏｒｅａｕら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．、９、（３）：２７４〜２８０（１９７４））によって記述された方法を用いてヨードアニリン（市販品）から調整した５−ヨード−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）を、アルキル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（すでに記述したように調整）によってアルキル化して（１０）を生成させる。無水酢酸中で（１０）をＮ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジンで処理し、次にビニル中間物（１１）を与える。次に、酢酸ナトリウムの存在下でエタノール中で撹拌して中間物（１１）と（５）（後者はすでに記述したように調整）を結合させる。この反応混合物を酢酸銀を用いて焼入れし、塩化ナトリウムを加えてインドシアニンを与える（１２）。次に、触媒、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）の存在下でｂｉｓ−（トリ−ｎ−ブチルチン）を用いて（１２）を加熱することを含むＡｚｉｚｉａｎらの方法（Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．、２１５：４９〜５８（１９８１））によって、（１２）から化合物（１３）を調整することができる。これに続いて、トリブチルスタニル誘導体（１３）を緩やかな条件下で、例えばＷｉｌｂｕｒらの方法を修正した方法（Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．、３０：２１６〜２２６（１９８９）によって、容易に放射性ハロゲン化することができる。さらに、Ｗｅｉｓｓらの方法（Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｍｐｄｓ．＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＸＸＶＩ：１０９〜１０（１９８９）を変形した方法を使用して、（１２）への放射性ハロゲンの導入を達成することができる。
放射性ハロゲンの導入に使用することができる別の脂肪親和性シアニン誘導体は、Ｓｎ（Ｂｕ）3基を−ＨｇＸ、で置換した（１３）の類似体であり、ここでＸはハロゲンを表す。化合物（１２）のハロゲン置換基の環の位置は、当然ながら適切に選択した開始物質に変更することができる。例えば、Ｂａｓｓｉｇｎａｎａらの方法（Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ．、１９（１１）、１８８５（１９６３））に従って調整した６−ヨード−メチルベンゾチアゾールを、対応する６−ヨード誘導体を提供するために使用することができる。
５．切断可能なコルヒチン−脂肪親和性シアニン抱合体
酸によって切断可能な結合を備えたコルヒチン−シアニン抱合体を、適切に官能基化した活性コルヒチン誘導体を選択することによって調整することができ（Ｂｒｏｓｓｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３：２３１１、２３１９（１９９０）によって記述されたように行う）、シス−アコニチル、アセタール、オルトエステル、エステル、ケタール、無水物、あるいはヒドラゾンなどの結合を介して、適切に官能基化した脂肪親和性シアニン誘導体にそれを結合させることができる。
シス−アコニチル結合を介した結合は、Ｓｈｅｎらによって記述された方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０２、３：１０４８〜１０５４（１９８１）を用いて実現することができる。この方法は、薬物（例えばデスアセチルコルヒチン）の遊離アミノ誘導体および脂肪親和性シアニンのアミノ型と、無水シス−アコニチル（市販品）との結合を含む。
アセタール、オルトエステル、またはケタール結合を介した結合は、Ｓｒｉｎｖａｓａｃｈａｒらによって記述された方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、２５０１〜２５０９（１９８９））を修正して用いることによって、適切に官能基化したコルヒチンとシアニン誘導体によって達成することができる。
ヒドラゾン結合を介した結合は、Ｌａｇｕｚｚａらによって記述された方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３２：５４８〜５５５（１９８９））を修正して用いることによって実施することができる。この方法は、薬物のアルデヒド型と脂肪親和性シアニンのヒドラジド型との結合を含む。
本発明による切断可能なコルヒチン−シアニン抱合体の合成を反応機構３に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。
機構３に従って、アミノ官能基化したシアニン（８）をグルタル酸（市販品）のモノメチルエステルと結合させ、メチルエステル誘導体（１４）を生成し、メタノール中でヒドラジンによって処理することによって、ヒドラジノ誘導体（１５）を提供する。
コルヒチン成分をデアセチルコルヒチン（市販品）で反応させて調整し、酸中間物を生成し、次にカルボニルイジイミダゾールの付加によってそれをｉｎ  ｓｉｔｕで活性化し、アシルイミダゾールを形成させ、それをテトラブチル水素化ホウ素アンモニウムによって還元することによってアルコール（１７）を提供する。塩化クロム酸ピリジニウムによる（１７）の酸化によって７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１８）を生成し、次にそれをヒドラジノ誘導体（１５）と結合させて、コルヒチンとシアニン成分が酸で切断可能なアシルヒドラゾン結合を介して結合した抱合体（１９）を与える。機構３で中間物として生成した７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンは、本発明の一部を構成する新しい化合物である。必要な場合には、メチルチオ、または他のカルコゲンを含む基を、コルヒチンの核の位置１０の部分でメトキシ基に置換することができる。
さらに、デアセチルチオコルヒチン（Ｓｈｉａｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、６４、６４６〜６４８（１９７５）によって記述されたように調整）から、機構３に示したアルデヒド（１８）の調整と同一の反応経過を用いて、より効果の大きな７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルチオコルヒチン類似体を作ることができる。さらに、このチオコルヒチンの誘導体は、同一の結合条件を用いてヒドラジノ誘導体（１５）に対して結合させ、酸によって切断可能な抱合体を提供することもできる。
コルヒチン類似体を抱合体から放出させる動力学を、コルヒチンとシアニン成分の間のヒドラゾン結合の種類を変えることによって変更することができる。例えば、スルホニルフェニルヒドラゾンとフェニルヒドラゾン結合を介して抗体−薬物抱合体の結合が、対応するアシルヒドラゾン誘導体よりもゆっくりとした放出動力学を提供したことをＭｕｅｌｌｅｒら報告した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１：３２５〜３３０（１９９０））。
６．ヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体
安定なカルバミン酸塩結合によって結合し、本発明に有効なヘパリン−シアニン抱合体の合成法を反応機構４に示し、以下の例で詳細に記述する。
機構４に従って、アミノ官能基化したシアニン（８）を、Ｅｃｋｅｒｔらの方法（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｑｌ．、２６（９）：８９４〜９５（１９８７））に従い、トリホスゲンを用いた処理によって高度な反応性をもつイソシアン酸塩誘導体（２０）に変換する。イソシアン酸塩誘導体（２０）は、さらに分離あるいは精製することなく、Ｄｏｎｇの方法（”親水性スペーサ基を備えたヘパリン化し断片化したポリウレタン尿素表面”、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｔａｈ大学、１９９０）を修正して用いてジメチルホルムアミド／ホルムアミドの混合溶媒の中でヘパリンナトリウムと直ちに反応させ、ヘパリンのヒドロキシル基がカルバミン酸塩結合形成（あるいは尿素結合形成を介したアミノ基によって）を介してシアニンに共有結合で結合したヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体（２１）を提供する。さらに炭素スペーサ腕を、市販の試薬Ｎ−Ｂｏｃ−６アミノカプロン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、技術に精通した者に周知の反応によってヘパリンとシアニン成分の間で結合させることもできる。
ヘパリンは多数の遊離ヒドロキシル基を備えているため、反応における試薬の化学量論を制御することによって、ヘパリン分子ごとの多数のシアニン基を当然ながら変更することができる。必要な場合には、疎水的相互作用クロマトグラフィによってヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体を遊離ヘパリンから精製することができる。
別の方法として、Ｋｉｎらの記述した方法（Ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｎａｌｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐ．１１６〜１３０）を修正して用いることによって、ヘパリン−シアニン抱合体を調整することができる。この方法は、カルボジイミド試薬を用いてヘパリンのカルボン酸基をアミノ官能基化シアニンに結合させることを含む。ヘパリンのカルボン酸基の２０％に及ぶ割合が、バイオ活性を失うことなく誘導されたことを、Ｅｂｅｒｔらが測定した（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．９９、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８２）。
７．放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体
放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体を合成する方法を、反応機構５に示し、ここで金属にはレニウム、インジウム、銅、あるいはパラジウムで構成される群から一つを選択する。機構５に従って、ＢａｉｄｏｏとＬｅｖｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３１、４０、５７０１〜５７０４（１９９０））によって記述されたように調整した二官能キレート薬（２２）をアミノ官能基化シアニン（８）と反応させ、誘導体（２３）を生成する。次に化合物（２３）を適切な酸化状態で金属溶液と反応させ、金属錯体（２４）を生成する。機構５は、使用金属がレニウムである場合に得られる中性金属錯体の構造を描いている。正確な構造と、経過の錯体の電荷は使用する金属と選択した二官能キレートの正確な構造に依存する。
金属を希土類金属から選択した場合の放射性金属錯体脂肪親和性シアニン抱合体を調整する方法を機構６に示す。
（２５）の構造をもつ二官能基化ポリアミノカルボン酸塩キレートを、欧州特許出願番号０３５３４５０  Ａ１に記述された方法に従って調整することができる。機構６に従って、キレート（２５）をｐＨ９〜９．５でアミノ官能基化シアニン（８）と反応させ、キレートとシアニン成分が安定なチオ尿素結合を介して結合している化合物（２６）を生成する。次に、同様に上述の欧州特許出願に記述されている方法に従って、化合物（２６）を適切な緩衝系中で放射性金属塩溶液と反応させ、最終の放射性金属錯体−シアニン抱合体（２７）を生成する。
機構６の図に使用したＭ（ＰＡ−ＤＯＴＡ）は、ポリアミノ−カルボン酸塩キレートと、機構６に示した中間物（２６）のスペーサ成分（−（ＣＨ2）2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−）の部分で構成される放射性金属錯体を指す。化合物２７の放射性金属錯体成分の３次元構造は、Ｓｐｉｎｌｅｔら（Ｉｎｏｒｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．、２３：４２７８〜４２８３（１９８４）によって記述されたものと同様であると予想される。
他の種類の二官能ポリアミノカルボン酸塩キレートが知られており、技術に精通する者に周知の他の反応によって、官能基化したシアニンに結合させることができる。例えば、Ｓｕｎｄｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈａｍ．、１７：１３０４（１９７４）を参照。
窒素を含む他の四歯状キレートと、硫黄を含む四歯状キレートが知られており、技術に精通するものに周知の反応によって、適切に官能基化したシアニンに結合させることができる。例えば、Ｒａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１２：５７９８〜５８０４（１９８０）を参照。
ＩＶ．生体適合粒子へ結合する本発明の結合化合物
本発明の化合物上で置換された炭化水素尾部の多数の直線状炭素は、化合物とバイオ粒子の表面膜の間に目的の程度の安定した結合を達成するうえで重要な要因である。単一の炭化水素尾部を備える化合物、例えばアクリジン誘導体の安定した結合を達成するためには、直線状炭素の数を２３またはそれ以上にする必要がある。本発明に従って調整されたシアニン誘導体における経験は、二つまたはそれ以上の炭化水素尾部を備える化合物では、尾部の一つが少なくとも１２炭素の長さの直線部分を備え、炭化水素尾部の直線状炭素原子の数の合計を少なくとも２３個にする必要があることを示している。化合物の構造に依存して、一つの細胞から他の細胞への漏出または転換は通常は起こらない。一般に、炭化水素尾部が長いほど、脂肪親和性が高い。しかし、３０個を超える直線状炭素原子を備える炭化水素尾部は、バイオ作用性成分と、炭化水素尾部を提供するために使用した作用物質が同一の溶媒に溶けないことがあり、炭化水素尾部をバイオ作用性成分に結合するための化学が非常に困難になるため、問題となることがある。したがって、尾部が結合する結合成分の化学的性質によって、炭化水素尾部の長さには実質的な制約があることがある。
”尾部”が結合する結合成分の構造的な違いもまた、膜結合の安定性に大きな影響を与える。正に帯電した結合成分、例えばシアニン、スチリルピリジン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、あるいはジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体は、負に帯電した膜への化合物の結合と保持に貢献することがある。中性あるいは負に帯電した結合成分もまた、バイオ膜からの制御された放出を実現するのに役立つことがある。
結合成分、炭化水素尾部、およびスペーサ成分またはバイオ作用性成分の間の安定した結合は、場合によっては、本発明が提供する治療上の利益を実現化するために、治療上有効な物質を必要な時間および必要な分量で部位選択的に保持するうえで、本質的となりうるものである。
結合成分（Ｌ）は、本発明の化合物に必要な安定度を与えて、選択した供給部位に目的の治療上の利益を実現するために十分なだけの時間および分量で化合物が存在するように選択しなければならない。この目的のために、上記の式Ｉの化合物の結合成分は、ｎ＝０のときにバイオ作用性成分（Ｂ）とＲおよびＲ1の少なくとも一方の間に安定した結合を提供し、さらにｎ＝１のときには、スペーサ成分（Ｒ2）とＲおよびＲ1の少なくとも一方との間に安定した結合を提供しなければならない。結合基によって与えられた必要な結合安定性を備える化合物は、治療上有効な脂肪親和性抱合体の直接投与の場合には、保持時間に基づいて決定することができ、あるいは、疾患部位へ抱合体を担体を介して供給する場合には、循環の時間に基づいて決定することができる。すなわち、治療上有効な本発明の脂肪親和性抱合体の保持時間、あるいは循環時間は、治療上有効な成分の非抱合体形での保持時間あるいは循環時間よりも大きくなければならない。
本発明が提供する治療上の利益を実現するうえで、保持時間あるいは循環時間の増大は重要な因子であるが、求める治療上の利益を提供するのに十分な分量の化合物が疾患部位に存在あるいは蓄積することも同様に重要な因子であり、これも本発明の化合物の結合の安定性に依存する。
保持時間あるいは循環時間の決定は、特に以下の例９、１０、および１２に例示するように、技術に精通する者に周知の様々な方法で実施することができる。求める効果を生じるために必要な本発明の治療上有効な脂肪親和性抱合体の分量の決定は、しばしば治療薬にあてはまるように、特別な方法によらない。本発明の実施時に用いられる治療上有効な物質の多様性、それによって治療することが可能な数多くの疾患の状態、そして治療を受ける患者の状態の変動のため、必然的にこうならざるをえない。したがって、本発明による治療を受けている患者の反応を周期的に監視し、疾患部位における治療上有効な物質の存在量あるいは蓄積量が、求める治療効果を生じるのに十分であるかどうかを決定する必要がある。
本発明の化合物は、生存可能な細胞あるいは他の生体適合粒子の外側の膜に、生存可能性に対して初期の有害な作用を及ぼすことなく結合させるように作成することができ、または、即時あるいは遅延させた細胞増殖抑制性または細胞毒作用を及ぼすように作成することができる。細胞毒バイオ作用性成分による細胞毒性の範囲を決定するためには、例えば、細胞を本発明の化合物に対して、細胞毒と抱合体をなしていない化合物や濃度ゼロを含む様々な濃度でさらす。その後、細胞をトリパンブルー、またはヨウ化プロピジウムにさらす（Ｆ．Ｃｅｌａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５７：６３０（１９６７））。これらの色素は、生存する細胞から正常に除去され、死んだ細胞の膜だけを透過する。適切な培養時間ののち、顕微鏡あるいはフロー細胞計によって細胞を検査し、染色された細胞の割合（死亡率）を測定する。
本発明の化合物の担体細胞への結合も、担体として標的への供給を実施する能力にとって重要な細胞の機能に対し、感知できるような有害な作用を及ぼさない。例えば、一定の適用の実施にとって、担体細胞が適切に分割することが重要であることがある。一方、分割能力あるいは、期待する適用に対して細胞に必要な他の能力に何の作用も及ぼさないようないくつかの機能を、使用する化合物が変化させることがある。したがって、このような化合物は、本発明における使用目的のための細胞の機能に対して、感知しうる有害な作用を及ぼさないとみなすことができる。本発明の化合物によって生じる、本発明の実施に対して重要性をもちうる細胞機能への作用を測定する方法については、米国特許番号４、８５９、５８４、ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４：２１７２〜７７（１９８９）とＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１１７：２０５−１４（１９８９）に記述されている。本発明の化合物を再現可能な形で、求める細胞機能に有害な作用を生じることなく標的または担体細胞の形質膜に結合するために細胞結合手段を選択する場合は、二つの基準を満たす必要がある。細胞結合手段は、（ｉ）化合物を結合する生体適合粒子に対して等張であり、収縮または腫脹を起こさず、細胞に損傷を与えることがないように等浸透圧性濃度（哺乳類細胞の場合およそ２６０〜３４０ｍＯｓモル）である必要があり、さらに（ｉｉ）本発明の化合物が、細胞の形質膜内に一定の濃度で結合できるように溶解可能であることが必要である。可溶解性時間経過実験（米国特許番号４、７８３、４０１、Ｍ．Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｋ．、４３：３８７〜３９７（１９８８））は、部分的にのみ水溶性、形質膜に安定に結合するように作用する化合物は、イオン溶液（例えばリン酸塩緩衝食塩水、培地など）に溶解させたときに沈澱しうるようなミセルあるいは凝集物のどちらか一方を形成する傾向をもち、形質膜内への化合物の結合の減少、あるいは望ましくない不規則な結合を生じることを示した。
放射性同位元素化合物についての同様な実験方法を適用することが可能であり、化合物の安定性は、ベータあるいはガンマ計数器を用いて測定することができる。あらゆる場合に、各時点における前記等浸透圧溶液の上澄み液中の本発明の化合物の分量を、エタノールを溶媒として用いたこのような化合物の試料と比較することで、標識細胞には適切ではないが、化合物の最大溶解度に対しては役に立つ（全体として）。
細胞の形質膜に結合する本発明の化合物の適切な濃度の決定には、化合物によって生じる目的の作用、化合物を結合させる細胞の種類を含む、いくつかの因子を考慮しなければならない。一般に、最初の目的は、できるだけ多くの治療薬を細胞膜内に結合させることである。これは、治療化合物を疾患部位に直接供給すること、あるいは治療化合物をｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に結合させ、修正した細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで再導入することによって実現することができる。細胞の形質膜内への治療薬の結合を最大化することによって、相対的に少ない投与量を投与すること、あるいは目的の位置に到達して目的の作用を与えるために必要な担体細胞の数を少なくすることが可能になる。細胞を介した治療薬の供給の場合、細胞内に結合した化合物の分量は、細胞の生存能力あるいは細胞が目的の位置に移動する能力に関して、担体細胞に負の変化がまったく見られないような程度にまでのみ増大させる必要がある。
本発明の化合物は、血清および他の脂肪を含む物質の非存在下で担体細胞あるいは他の生体適合粒子に適用する。細胞を身体から分離、あるいは培養から取り出し、血清を含まないように洗浄する。等浸透圧調整薬を含む組成を形成させるために、それらを通常はイオン溶液以外に、本発明の化合物の適切な濃度（１０-5から１０-7Ｍ）で懸濁する。化合物の細胞への結合は、通常は１０分以内に完了し、自系または異種の血清を付加することによって結合反応が停止する。次に、血清を含む媒質中（５〜１０％  ｖ／ｖ）で細胞を洗浄し、適用に応じて培養に配置するか、あるいは受容者に注入する。
ここで記述した種類の化合物の細胞への結合法は、米国特許番号４、７８３、４０１に詳細に記述されており、その開示の全体は、ここで完全に記述しているが、引例によって本明細書に統合されている。
他の細胞結合法には、本発明の化合物を食塩水に懸濁してミセルを形成させることが含まれる。次に、その懸濁液に細胞を入れると、食作用細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球）だけが優先的に標識される。この方法で、本発明の化合物を食作用細胞に選択的に向かわせることができる。Ｍ．Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、４３：３８７〜９７（１９８８）。
本発明の化合物、組成、方法の代表的な適用について、特定の薬物療法に関して以下に記述する。
Ｖ．本発明の化合物の使用法
Ａ．一般治療法
１．同位体治療への適用
脂肪を含む生体適合粒子の脂肪成分の中と、放射性で高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）を放出するキレートイオンに対して結合する能力をもっていることから、疾患部位に放射線治療を提供するために本発明の化合物を使用することができる。キレート化した本発明の化合物と適切な放射性イオン（例えば、67Ｃｕ、90Ｙ、186Ｒｅ、α線放出体）の安定した錯体を最初に形成し、錯体を分離し、上述した通常の細胞結合法を実施することによって、細胞を本発明の化合物で標識する。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を原発病巣から分離し、ＩＬ−２中で拡大し、上述したように放射線治療物質に結合させ、静脈内に注入する。標識した細胞は転移性疾患の部位を追跡し、転移性腫瘍細胞を殺す放射線を放出し、それによってＴＩＬの治療効果を増大させ、さらに、おそらく疾患の軽減の達成に必要な細胞数を低減する。同様に、転移性部位に移動する他の種類の細胞を、局所的な放射線治療の供給に利用することができる。
２．細胞膜に特異的蛋白質を結合することによる細胞の標的化
他の実施例では、本発明の化合物は、その内部に蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白、あるいはペプチドを含む蛋白様物質を、バイオ作用性成分として結合させる。これらの化合物を上記に記述したように細胞に結合させ、それに加えて、前記化合物の炭化水素鎖を形質膜内に包埋し、それによって特異的な細胞型の表面に蛋白質を配置する。
上述の方法を、ヒトのフィブリンに対する単クローン抗体を例えば赤血球などの担体細胞表面に結合させ、フィブリン凝塊部位へ供給するために使用することができる。
同様な方法を、ヒトの細胞表面の腫瘍抗原の単クローン抗体を例えば単球またはリンパ球などの担体細胞を介して腫瘍部位に供給するために使用することができる。担体細胞（例えば赤血球）表面へ適用することによって、組織のプラスミノゲンアクチベータを同様に供給することができる。
必要な場合は、上述の治療を組み合わせて使用することができる。したがって、ヒトのフィブリンに結合する単クローン抗体を細胞（例えば赤血球）の表面に結合し、次にそれをさらにフィブリン溶解化合物（例えばｔＰＡ、スト  プトキナーゼ、ウロキナーゼ）に結合させることができる。単クローン抗体は、担体細胞のフィブリンへの結合と、結合後に多数の治療用フィブリン溶解化合物を供給することを可能にする。
これらの治療上有効な蛋白質を、上述の一般的な調整法に従って、脂肪親和性発色団に抱合体させることができる。
上述の技法は、様々な他の治療上有効な蛋白質あるいはペプチドを、細胞、ウイルス、リポソームまたはＬＤＬなどの適切な生体適合粒子に結合させ、それによって循環内における蛋白様物質の生物学的利用能を大きく引き伸ばすために使用することができる。
蛋白質結合生体適合粒子は、放射性画像化化合物、あるいは磁気共鳴画像化化合物を用いて上述のように同位元素によって標識することができる。その結果として生じたバイオ粒子を患者に注入し、それによって細胞を疾患部位に移動させ、標準的なガンマシンチグラフィまたは核画像化を用いて画像化し、治療薬の効果を評価することができる。
３．ワクチンのための細胞への蛋白質の結合
本発明の他の適用では、それに対して保護的な抗体生成が望まれるような、蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白あるいはペプチドでありうる抗原を、任意に結合基を含み、細胞（例えば赤血球、単球）の表面に結合させるためバイオ作用性成分として利用する。このように修正した細胞を、抗原性補強剤の存在下および非存在下で注入する。注入の時間間隔は抗原の性質に依存するが、一般的には、２週間を下回らない各時間間隔ごとに１０6の細胞を注入することができる。
抗原に対する抗体濃度を、標準的なＥｌｉｓａ法によって監視する。細胞免疫濃度は、免疫化細胞への増殖あるいは細胞毒反応を求めることによって測定することができる。
４．細胞表面の修正による移動形態の変更
この手法の他の適用では、本発明の化合物を用いて、シアリン酸またはグリコサミノグリカンを細胞の形質膜に結合することができる。特異的な化合物を上述のように等浸透圧媒質に入れる。例えば赤血球を溶液の中に入れると、形質膜への化合物の結合が生じる。血清の付加によって反応を停止させ、その後媒質を含む食塩水で細胞を洗浄し、注入の準備が完了する。
赤血球は循環の中を移動し、未成熟細胞の間は、その表面に多量のシアリン酸を備えている。赤血球が成長するに従って、細胞当たりのシアリン酸の分量が減少して、脾臓および肝臓のマクロファージが赤血球の膜の抗原を認識できるようになり、それによってそれらを循環から取り除く。赤血球の膜内に結合するシアリン酸の分量を適切に増大させることにより、循環の中での赤血球の寿命を延ばすことができる。赤血球の寿命を延ばす能力は、移植患者あるいは貧血患者にとって有益となりうる。骨髄移植患者が移植を受けたときには、彼ら自身の赤血球を製造できるようになるまでに数週間を要する。彼ら自身の赤血球の寿命を延ばすためにこの手法を用いることによって、必要な場合には、貧血を起こすことなく患者は複数回の骨髄移植を受けることができる。
貧血のある個体の場合、貧血は赤血球の寿命の低下、または赤血球の生産率の低下によって貧血が起こることがある。どちらの場合でも、赤血球の寿命を延ばすことによって貧血が減少する。
５．治療作用のための光力学化合物の供給
癌を治癒させるための光力学治療は、熱心な研究が行われている領域である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ−Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｖｏｌｕｍｅ  ８４７、”Ｎｅｗ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｃ．Ｎｅｃｋｅｒｓ、Ｅｄｉｔｏｒ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８７））。これらの化合物の多くは、フタロシアニン類またはヘマトポルフィリン類である。すべて６００〜８００ｎｍの領域の光を吸収し、その過程で励起状態の酸素を生成する。
本発明の方法論を用いて、化合物の脂肪親和性誘導体を作成し、次に等浸透圧溶液中に溶解させる。腫瘍選択的細胞（例えばＴＩＬ）をこれらの化合物で標識し、細胞を患者に注入する。その後腫瘍選択的細胞は微小転移巣部位へ移動する。４８時間以内に、光力学分子が吸収する領域の強い光線に患者をさらし、生成した励起状態の酸素が腫瘍細胞を殺す。さらに、担体細胞も殺されて炎症を生じ、それによって死んだ細胞を除去するためにさらに多くの免疫細胞が集まり、腫瘍に対する毒性が高まる。光力学作用を供給するこの方法では、担体細胞は、腫瘍部位へ治療薬を選択的により多く蓄積する必要がある。一部の例では、体腔内（例えば胸膜腔）における腫瘍沈着への本発明の化合物の直接的な適用は部位への保持を補助し、手術時にさらに有効な体腔内照射治療を可能にする。
Ｂ．治療上有効な物質の直接供給による特異的疾患あるいは病的状態の治療
１．血管形成術後の再閉塞および再狭窄
連続的な血流の存在下であっても、人工的表面だけでなく、局所的血管部位に本発明の化合物を保持できることが実験的に示された（以下の例８および１２を参照）。さらに、治療上有効な物質で構成される本発明の化合物中で生物学的作用を保持できることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで示された（以下の例４、１３および１５を参照）。
動物モデル系の研究によって、血管形成術後の再狭窄を引き起こす一次的細胞増殖と移動は、血管形成術後およそ７〜２１日以内に起こることが明らかになった。したがって、この発生を防ぐためには、血管形成術後７〜１０日目まで修復した動脈の平滑筋細胞に抗増殖薬を保持する必要がある。適切な抗増殖薬で構成された本発明の化合物を血管形成術後に損傷した血管壁に供給し、化合物に抱合させた非増殖薬を損傷した細胞に保持させることができる。このように、大きな投与量の抗増殖薬を損傷した細胞に直接提供することができ、本発明の化合物を用いることによって、全身性の薬物供給の場合よりも長い時間にわたって損傷した部位に保持することができる。例えば、血管形成術において、薬物供給カテーテルによる抗増殖薬の直接の沈着は、血管形成術の部位の細胞膜に薬物を結合させることを可能にするのに対し、結合していない薬物はすべて、手術中に動脈から流れてしまう。カテーテルを取り除いても、休止細胞に結合した薬物は外側膜にとどまるか、あるいは間隙空間を移動して深い細胞層に到達する。これらの細胞が活動あるいは成長状態になった場合は、膜成分が内部に動くに従って本発明の化合物は細胞内に移動する。一度細胞内に入ると、その抗増殖作用を発揮することが可能になる。したがって、適切な抗増殖薬で構成される本発明の化合物を主として疾患部位に供給し、肝臓あるいは腎臓で一度に処理される薬物の分量を最小にして、重大な副作用の発生を抑えることができる。
好ましい実施例においては、血管形成術後の再狭窄の治療に有効な本発明の化合物は、ヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンカアルカロイド、タキソールおよびその誘導体などの抗増殖薬で構成される。培養中の平滑筋細胞へのヘパリンの適用、あるいは動脈損傷後の動物への投与は、成長の低下と、筋内膜の肥厚化および細胞増殖の低減を引き起こす。ヘパリンで構成される本発明の化合物は、一つあるいはそれ以上の細胞壁成分との間の疎水性相互作用によって、これらの細胞内部に取り込まれるよりも、内側動脈壁の外側細胞膜上にとどまるように構成される。これとは対照的に、チューブリン過程を妨げるコルヒチンのような抗増殖薬は、その抗増殖作用を及ぼすためには、細胞内に取り込まれる必要がある。この例においては、内側壁の動脈細胞内に急速に内在化できるように本発明の化合物を合成することが好ましい。好ましい実施例では、酸で切断可能な抱合体として本発明の化合物のバイオ作用性成分でコルヒチンが構成される。コルヒチンは、その抱合体の形では不活性である。しかし、細胞内酸小胞内への化合物の取り込みは、化合物からの薬物の放出を引き起こし、それによって活性化する。したがって、活性コルヒチンは、その作用部位の細胞内に供給され、その部位のチューブリン過程を阻止し、それによって細胞分割を阻止する。
本発明での使用に特に好ましいものは、次の式で与えられるような、コルヒチンを含む酸で切断可能な化合物である：
0003682974.tif 000012
他の有効なコルヒチンを含む化合物は、次の式で与えられる：
0003682974.tif 000013
本発明の実施での使用を考慮した他の抗増殖薬には以下の薬物が含まれる：アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）抑制因子、アンギオペプチン、シクロスポリンＡ、カルシウムチャンネル遮断薬、ヤギ−抗ウサギ血小板由来成長因子抗体、Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ、Ｔｒａｐｉｄｉｌ、インターフェロンγ、および陽イオン成長因子の結合のための重陰イオン。
２．慢性関節リウマチ
本発明の化合物は、慢性関節リウマチの治療に特に適している。それらは、リンパ節、脾臓あるいは肝臓に対して顕著な全身性の放出を行うことなく、関節への大量の治療薬の保持を可能にするための、化学あるいは放射線滑膜切除を実施する手段を提供する。あらゆる現存の供給システムに対する大きな利点は、本発明の化合物を治療を必要とする組織自体に均一に供給し、これらの細胞に保持することである。本発明の放射線治療用化合物の場合、化合物から放出された放射能が、滑膜の細胞に治療効果を引き起こす。下記の例に詳細を記述するように、基本的に身体中のすべての化合物が治療を行った関節に見出され、注入した化合物の約７０％が６日目にそこにとどまっていた。この局所的で長期の保持は、それぞれの放射線滑膜切除術に必要な放射性同位元素量を低減し、従来の治療で、関節から放出された放射性同位元素に全身的にさらされることによって起こる副作用を低下させる。
放射線滑膜切除に特に好ましい本発明の放射線治療化合物は、以下に例示するように、適切な放射性同位元素に結合させて合成することができる。例えば、（１）窒素と硫黄を含むキレート、あるいは（２）窒素と酸素を含むキレートのどちらか一方と放射性金属で錯体を構成する。放射性同位元素は、放射性のハロゲン、銅、イットリウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、ヨウ素、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、金、あるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択することができる。
本発明に使用する好ましい化合物は次の式で与えられる：
0003682974.tif 000014
ここでＬ、Ｒ、Ｒ1、およびＲ2は上記の式Ｉで定義したものである；
ＺはＨまたは金属配位位置を表す；
0003682974.tif 000015
ここでそれぞれのＲ'は、独立に水素原子、あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基、あるいは置換された低いアルキルで、ここで置換基はあらゆるエステルにすることができ、Ｒ"および
0003682974.tif 000016
は独立に水素原子あるいはアルキル基で、ｍおよびｎはそれぞれ０または１にすることができる；さらに、Ｍは、レニウム、インジウム、銅、およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。
好ましい実施例では、上記の式ＶＩＩＩの化合物は次の式で与えられる：
0003682974.tif 000017
ここでＲおよびＲ1は、１個から約３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基である；ＸおよびＸ1は同一または異なる値にすることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ3）2あるいはＳｅを表す；
Ａは薬学上許容することができる陰イオンを表す；
ＺはＨあるいは金属配位位置を表す；
0003682974.tif 000018
ここでそれぞれのＲ'は独立に水素原子あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基を表し、あるいは置換された低いアルキル基で、置換基はあらゆるエステルにすることができ、Ｒ"および
0003682974.tif 000019
は独立に水素原子またはアルキル基であり、ｍとｎはそれぞれ０または１にすることができる；Ｍはレニウム、インジウム、銅およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。
本発明で使用する他の特に好ましい化合物は、次の式で与えられる化合物である：
0003682974.tif 000020
ここでＭは、レニウム、インジウム、銅またはパラジウムなどの放射線治療物質を表す。
他の有効な化合物は次式で与えられる：
0003682974.tif 000021
ここでＲおよびＲ1は、１個から約３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基である；ＸおよびＸ1は同一または異なる値にすることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ3）2またはＳｅを表す；
Ａは薬学上許容することができる陰イオンを表す；
Ｍは、銅、テクネチウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、イットリウム、金、エルビウム、ホルミウムあるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択した放射線治療物質を表す；ｎは２、３あるいは４である；ｍは１あるいは２である；ｐは１から６である。
３．卵巣癌
化学治療薬または放射線治療薬で構成される本発明の化合物は、これらの薬物を卵巣腫瘍細胞増殖部位に高濃度で直接供給することを可能にする。さらに、治療薬を腹膜腔内に長時間にわたって保持し、それによって腫瘍細胞の散在を阻止する。また、これらの薬物の全身的供給システムによる高濃度での投与に伴う顕著な副作用を起こすことなく、これを実現することができる。
本発明の化合物は、手術後の治療としてＴｅｎｃｋｈｏｆｆカテーテルを用いて腹膜腔内に供給することができ、あるいは再側腹開腹術、および手術時の補助治療として供給することができる。
酸切断可能なコルヒチンを含む本発明の化合物は、すでに記述したように、卵巣腫瘍細胞の抗増殖治療にも有効である。上述したように、これらの分子は細胞の外側の膜に非毒性の形でとどまることが期待される。しかし、化合物の残りの部分から化学治療薬が切り離されている細胞内に化合物が取り込まれた場合には、化学治療物質がその抗増殖作用を及ぼすことができる。
４．乾癬
コルチコステロイドで構成される本発明の化合物を、乾癬の治療に有効に用いることができる。それらは乾癬病変の部位に大量の薬物の保持を提供し、それによって、ケラチノサイトと免疫細胞の増殖を減少する薬物の有効性を高める。さらに、病変部位への本発明の化合物の保持は、毒性をもつ可能性のある化合物を循環系の中に透過させることを防ぐ。これによって、２週間に及ぶ一連の適用後に、抗増殖薬の高い血清濃度のために治療を停止する必要がなくなるという臨床的な利益を生じる。
本発明の他の適用に従って、アテローム硬化症の初期の検出のために、血小板あるいは低密度のリポ蛋白（ＬＤＬ）で、アテローム硬化性斑沈着部位を突き止めることができる。標準的な勾配法を用いて個体の血液から血小板を分離し、次に、任意の診断成分としてインジウムあるいはテクネチウムで標識し、静脈内に再注入する。ここで記述した種類の化合物を血小板に結合する適切な方法は、米国特許番号４、７６２、７０１に記述されている。次の４８時間以内に、動脈壁の斑形成部位に放射標識血小板が蓄積し、ガンマカメラを用いてその部位のガンマ放出を検出することができる。
同様に、標準的な超遠心分離法によってＬＤＬを精製し、顕著な脂肪含有量と、生体適合粒子の脂肪領域に対する本発明の化合物の結合親和性を利用して、本発明の化合物で標識する。これらの放射標識ＬＤＬは、再注入後にアテローム硬化斑集中部位に蓄積し、核画像化による検出を可能にする。単球がアテローム硬化斑に蓄積することも知られており、そのため、その形成の検出に利用することができる；その唯一の限界は、放射標識に適した数の単球を精製する可能性である。
さらに、血小板が血栓症部位（例えば冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、血管内移植片）と、器官の移植後の急性拒絶反応部位に蓄積することが知られている。したがって、標準的方法によって分離され、本発明の化合物と方法を用いて放射標識された自系血小板もまた、薬物療法と組み合わせて、このような疾患過程の非侵襲的診断を可能にする。
さらに、放射性金像イオンに結合させるためにキレートを用いることができるが、上記の式Ｉの化合物で、放射性同位元素を例えば放射性のヨウ素、炭素、窒素、硫黄、リンまたはセレン原子を分子の構成成分とする蛍光および非蛍光化合物を生成することも可能である。放射標識された本発明の化合物を用いた十分なエネルギーのγ線を放出する化合物は、ガンマシンチグラフィを用いて検出することができる。同位元素が低エネルギー非透過ベータ放出元素の場合、標準的なベータ計数法を用いて化合物を研究用に使用することができる。
ビオチン化した本発明の脂肪親和性化合物を、多目的試薬として作用させることができる。例えば、通常は非付着性の細胞を、選択した表面に急速に付着させるためにこれらの化合物を使用することができる。これは、固定化した細胞を必要とするような分析、すなわち単一の細胞を時間的に監視する分析にとって重要である。本発明のビオチン化した化合物で細胞母集団を標識すれば、ストレプタビジンに結合する表面に、その結果生じた標識細胞を接触させ、細胞を急速にその表面に付着させる。細胞の分析を直ちに開始することができる。ビオチン化した化合物と結合させた蛍光によって、実験中に細胞を視覚的に監視する便利な手段を提供する。
さらに、蛍光細胞で標識した化合物を、成長する細胞の監視と、蛍光の希薄化による成長速度の測定に利用することができる。（米国特許番号４、８５９、５８４）。この方法では、標識化合物の蛍光が自己蛍光にまで減少すると、５〜８倍加時間（細胞の種類による）で感度が低下する。蛍光色素を抱合させたストレプタビジンを、例えばビオチン化したシアニンにここに記述したように結合させることにより、蛍光の増幅を実現することができる。この方法によって、色素の蛍光が自己蛍光にまで低下したのちでも、標識細胞を確認することができる。さらに高い感度が必要な場合には、ビオチン化した本発明の化合物に対して放射標識ストレプタビジンを結合させることができ、標識細胞を確認するためにオートラジオグラフィを実施することができる。ビオチン化した本発明の化合物の別の適用は、蛋白質結合である。いくつかの大きな蛋白質の場合、上記の式ＩＩＩに示すように、本発明の脂肪親和性化合物に蛋白質を共有結合で結合することによって、蛋白質を細胞に結合させることは不可能である。このような場合には、別の結合機構として、アビジン−ビオチン結合対がある。この目的のために、ビオチン化した本発明の化合物を用いて標的細胞を標識し、大きな蛋白質をアビジン、あるいは適切なアビジンの誘導体、例えばストレプタビジンに抱合させる。次に、ビオチン化した細胞をアビジン−蛋白質抱合体にさらすことによって、蛋白質が細胞に安定に結合する。
Ｃ．製薬製剤
本発明の化合物で構成される製薬製剤は、食塩を含まない等浸透圧溶液、あるいは薬学的に許容可能な液体賦形剤のような適合性生物学的媒質と組み合わせた投与に好都合なように作成することができる。後者には、各種の不活性油、例えばオリーブ油やピーナッツ油などの植物油、あるいは高度に生成した鉱物油が含まれる。選択した媒質の活性成分の濃度は、化合物の性質、および治療する疾患または病的状態に応じて異なる。
製薬製剤を投薬単位形態で構成することが、投与の簡便性、投薬の均一性にとって特に有利である。ここで使用する投薬単位形態とは、治療を受ける患者に適合した物理的に分離した製薬製剤単位を指す。各投薬単位は、選択した薬剤の担体と結合して、目的の治療効果を生じるように計算した有効成分量を含むようにしなければならない。細胞増殖を阻止するため、あるいはある一定の分類の患者の他の病的状態を治療するための適切な投薬単位を決定する方法は、技術に精通した者には周知である。例えば、放射線滑膜切除の場合、様々なコロイド状の形で投与した約５ｍＣＩの90Ｙ（半減期２．７日、ベータエネルギー２．２ＭｅＶ）、あるいは３００ｍＣｉの165Ｄｙ（半減期２．３時間、ベータエネルギー１．３ＭｅＶ）の投与量が臨床的な有効性を示した。Ｐ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、９：１６５〜１６７（１９８２）；Ｃ．Ｓｌｅｄｇｅら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、１８２：３７〜４０（１９８４）。標準的な線量計測法を用いて、２００ｍＣｉ／μモルの特異的活性で調整した約０．０５μモルの適切な化合物（例えば反応機構５の化合物２３）の注入によって提供される約１０ｍＣｉの投与量の186Ｒｅ（半減期３．７日、ベータエネルギー０．９８ＭｅＶ）によって、同様な治療効果が得られることが見積もられた。他の放射線治療同位元素も技術上知られている。Ｗ．Ｖｏｌｋｅｒｔら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３２：１７４〜１８５（１９９１）。さらに、本発明の他の化合物も、これらの薬物の効果的な投与量での供給に有効であるとみなされる。
腫瘍の放射線治療においては、単クローン抗体を用いて供給した場合、固化した腫瘍の放射線治療の滅菌投与量として、８０Ｇｙの投与量が示された。Ｊ．Ｈｕｍｍ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ、２７：１４９０〜１４９７（１９８６）。細胞表面膜に対する結合と内在化は、これらの治療の有効性を高めることが期待されている。Ｊ．Ｈｕｍｍ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ、３１：７５〜８３（１９９０）。８０Ｇｙの投与量は、２００ｍＣｉ／μモルの特異的活性で調整された約０．８ｎモルの化合物２３の注入によって提供される。さらに、この化合物や他の本発明の化合物は、技術上知られている他の放射線治療同位元素の供給に利用できることが期待されている。Ｗ．Ｖｏｌｋｅｒｔら、ｓｕｐｒａ．。他の種類の抗癌放射線治療薬と同様に、本発明の化合物を腫瘍組織内、散在した腫瘍を含む体腔内、あるいは腫瘍を供給している血管内などに直接供給することができる。Ｃ．Ｈｏｅｆｎａｇｅｌ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ、２：１０７〜１３２（１９９１）。
血管形成術後の再狭窄の治療において、十分な分量の本発明の化合物を病態生理学的部位に供給できることを示すために、Ｇｒｉｎｅｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４：ＩＩ−３６５（１９９１）によって、１ｍｇ／日のヒト治療投与量のコルヒチンが投与されたが、再狭窄を防ぐことはできず、２ｎｇ／ｍｌあるいは５ｎＭ（ｍ．ｗ．コルヒチン＝３９９．４）の最大血漿濃度を生じたことに言及しておくことができる。Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ（１９８３）、ｐｐ．１５１〜１５２。（ｉ）ウサギによる同様なコルヒチンの吸収および分布；（ｉｉ）平均的な３ｋｇの体重のウサギ、および（ｉｉｉ）体重７０ｋｇの平均的なヒトの場合を仮定し、０．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量がＣｕｒｒｉｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８０：ＩＩ−６６（１９８９）によって用いられ、ウサギにおいて２８ｎｇ／ｍｌまたは７０ｎＭの血漿濃度で再狭窄を防ぐことに成功した。したがって、再狭窄を防ぐための濃度は、臨床試験で達成した濃度の１４倍であることを、ウサギにおけるコルヒチン濃度が示した。本発明の化合物は、上述の適合する結合媒質中に１００μＭ、すなわち、動物研究で有効であることが示された濃度の１４００倍にまで調整することができ、血管形成術時にカテーテルを用いて動脈壁に直接供給することができる。
本発明の製薬製剤は、好ましくは注射、腹膜腔内輸液、あるいはカテーテル法によって投与する。さらに、一部の症例では経口投与、あるいはエーロゾル投与などの他の投与法も有効であることがある。
製薬製剤を適切な間隔で投与することができる。本発明の化合物の性質により、反復投与は不要であると考えられる。製薬製剤の投与頻度の決定は、関連する医療技術に精通した者には周知である。あらゆる場合に、いずれの個別の症例の適切な間隔は、通常は患者の状態、および治療する病的状態の種類によって決まる。
以下の例は、本発明をさらに詳細に記述するために提供されるものである。これらの例は、本発明の特定の側面を説明することを意図しているものであり、本発明の制限をとみなすことはできない。
例１
膜保持係数の決定
膜保持係数（ＭＲＣ）は、与えられた化合物が細胞の形質膜にいかに十分に保持されているかという点に関する情報を提供するものであり、以下に記載したように決定する。
モデル膜として使用する赤血球ゴーストの生成は、全血液を３００×ｇで１５分間遠心分離し、血漿を除去し、０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムで細胞ペレットの再懸濁を行うことによって行う。１０、０００×ｇの１０分間の遠心分離によって塩化アンモニウムからゴーストをペレット化する。細胞からのヘモグロビンの完全な放出を実現するために、この塩化アンモニウム洗浄処理を少なくとも５回反復する。装置による分析あるいは蛍光顕微鏡法による標識されたゴーストの検出を可能にするような濃度、さらに上述した個々の適用のために細胞を標識する際に用いたのと同じ濃度で、問題の化合物でゴーストを標識する。以下の測定のために、問題の化合物の保存溶液を２×１０3のモル濃度のエタノールで調整し、化合物の作業用希釈液を、等浸透圧性スクロース（５２ｇ／５００ｍｌ蒸留水）で調整した。約１×１０9ゴースト／ｍｌの濃度の化合物の作業用希釈液で１０分間ゴーストの培基をしたのち、ゴーストをペレット化するために試料を１０、０００×ｇで遠心分離し、試料から染色溶液を吸引した。１０％のウシ血清（ＰＢＳ−ＦＢＳ）を含む１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水に標識したゴーストを再懸濁した。三重化した２０ｕｌアリクォットを、存在する全化合物量を測定するために各試料から取り出した。試料を上述のように遠心分離し、存在する全非結合化合物量の定量的測定のための上澄み液から三重化２０ｕｌアリクォットを取り出した。
サンプリングののち、上澄み液を吸引し、赤血球ゴーストのペレットを１．０ｍｌのＰＢＳ−ＦＢＳに再懸濁し、上述のように再度サンプリングした。この方法を少なくとも６回反復し、急速に放出された化合物を検出できるようにし、さらにゆっくりと放出される化合物の検出もできるように２４時間またはそれ以上の時間ののちに監視を行った。各試料中に存在する化合物量の測定のため、２０ｕｌアリクォットを攪拌によって３．０ｍｌのｎ−ブタノールに抽出した。膜の残骸を除去するために試料を３０００×ｇで遠心分離し、ブタノール分画の化合物濃度を分析した。各試料の蛍光単位を測定するために、分析する特定の化合物の最大励起と放出波長を用いて、この方法で蛍光化合物を分析した。放射標識化合物はブタノール抽出が不要であり、ベータまたはガンマ計数装置を用いて直接分析することができる。
上述のように各試料中に存在する化合物量を測定することにより、洗浄または固定した各時点のＭＲＣの計算が可能になる。値は次の式で与えられる：
((CT - CS)/CT *100
ここでＣTは全試料中に存在する化合物量（化合物の分析に使用する方法によって決まる単位）を表し、ＣSは、特定の時点で上澄み液中に存在する化合物量を表す。ＭＲＣ値の比較によって、本発明の化合物を同定する基準が定義されるが、これらの基準は：１）各洗浄段階で測定したＭＲＣ値が少なくとも約９０の値であること、および２）少なくとも２４時間の間のＭＲＣ値の割合の差が約１０％未満であることである。
0003682974.tif 000022
下記の表Ｉに示したデータは一つの実験結果であり、ＭＲＣ測定例を示す。表Ｉでは、Ａ〜Ｃで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここで各化合物中のＸおよびＸ1はＣ（ＣＨ3）2を表し、ＺおよびＺ1はＨを表し、さらにＲ／Ｒ1はＣ−５／Ｃ−５（化合物Ａ）、Ｃ−１０／Ｃ−１０（化合物Ｂ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｃ）を表す；Ｄ〜Ｋで表す化合物は同様に式ＸＩＩＩの化合物であり、ここでＺおよびＺ1はＨを表し、Ｒ／Ｒ1はＣ−１４／Ｃ−３（化合物Ｄ）、Ｃ−１８／Ｃ−３（化合物Ｅ）、Ｃ−２０（３、７、１１、１５−テトラメチルヘキサデシル）／Ｃ−３（化合物Ｆ）、Ｃ−２２／Ｃ−３（化合物Ｇ）、Ｃ−２０／Ｃ−３（化合物Ｈ）、Ｃ−１８／Ｃ−８（化合物Ｉ）、Ｃ−１８／Ｃ−５（化合物Ｊ）、Ｃ−２２／Ｃ−３（化合物Ｋ）を表す；また、Ｌ〜Ｎで表す化合物は上記の式ＸＩＶの化合物であり、ここでＺおよびＺ1はそれぞれ、（３および６の環の位置での）Ｎ（ＣＨ3）2を表し、Ｚ2はＨを表し、Ｒは、Ｃ−２２（化合物Ｌ）、Ｃ−１８（化合物Ｍ）、Ｃ−２６（化合物Ｎ）を表す。化合物Ｋでは、陰イオンは塩化物であり、その他残りのすべての化合物では、陰イオンはヨウ化物である。
0003682974.tif 000023
上記の表Ｉに記載したＭＲＣ値は、上述の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０００８７中ですでに記述したように、細胞内化合物変換分析から得た結果との優れた相関を示している。
例２
膜結合安定性の決定
水相（例えば、細胞外媒質）から液体炭化水素相（例えば、生体膜の炭化水素内部）への炭化水素鎖変換の自由エネルギーは、分岐の程度、非飽和の程度、および炭化水素鎖中のメチレン基の数に依存することが知られている。メチレン−炭化水素相互作用の自由エネルギーは、水性媒介に最も近いメチレン基では最小で、それに続くメチレン基では増大し、炭化水素基が４個またはそれ以上の炭素を膜の脂質内部にもつ非極性炭化水素を含む溶媒中の炭化水素に見出されるものとほぼ等しくなる。したがって、本発明の化合物のような、極性をもつ頭部基と直線状の４個あるいはそれ以上の炭素で構成される炭化水素尾部（単数あるいは複数、対称あるいは非対称）を含むあらゆる構造について、炭化水素溶媒中に完全に浸した時に、ほぼ等しい結合エネルギーを与えるような炭素等価物の数を、以下のように計算することができる：
炭化等価物＝０＋．２５＋．５＋．７５＋ｎ−４（＋）０＋．２５＋．５＋．７５＋ｍ−４（＋）・・・ここでｎは、最初の尾の直線状炭化水素の数と等しく、ｍは、第２の尾の直線状炭化水素の数と等しい。
本発明の化合物の炭素等価物と、その膜保持係数（ＭＲＣ）との間に相関が存在することは、上記の例１に記述したように、実験的に決定した。例えば、１８−１９個を超える炭素等価物を備える本発明の化合物は、９０またはそれ以上のＭＲＣを備え、細胞内化合物変換分析において、標識細胞と非標識細胞の間の最小の変換を示す（上記を参照）。したがって、これらの化合物もｉｎ  ｖｉｖｏで標識された細胞との結合の優れた安定性を示すことが期待される。しかし、驚くべきことにこれはあてはまらない。実際に、異なるＭＲＣを示している本発明の化合物のいくつかは、僅かに１０％だけ異なる本発明の複数の化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで１０倍異なる低下率を示す。
本発明の化合物と方法の様々な実際の適用において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物と生物膜との間の結合の安定性をいくつかの予測基準を用いて評価できることが重要である。例えば、腫瘍部位への治療放射性核種の供給などの適用では、化合物の損失が、放射性核種による非腫瘍部位への毒性作用の生成を引き起こしうるので、膜への非常に安定した結合が必要となる。一方、治療薬供給率の制御を必要とする適用にとっては、生体膜からの化合物のより急速な損失が望ましいことがある。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出される条件を近似する条件下でＭＢＳを測定する分析について、以下に記述する。
この分析を実施するうえで、生理的濃度を近似する血清アルブミン（５％）を使用する。さらに、本発明の多くの化合物は、５％のアルブミンを含む食塩水中への溶解度が低いため、限定した体積の“生理的”液体を含む閉じた系で、２４時間以内に膜内での溶解度と周囲の媒質内での溶解度の間の平衡を達成させる。標識細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでさらす体積の大きな液体の作用を十分に近似するために、アルブミンを含む体積を固定した食塩水に、数を低減した標識膜ゴーストを懸濁することによってＭＢＳの分析を実施する。２４時間の時点で、十分に混合した懸濁液をサンプリングすることによって存在する標識の総量を測定する；次に、膜ゴーストを遠心分離によりペレット化し、上澄み液に放出された標識の分量を測定し、全標識の割合として表す。懸濁液１ｍｌ当たりのゴースト数に対して保持率をプロットし、５×１０7ゴースト／ｍｌと、４×１０8ゴースト／ｍｌ間の曲線の下の部分でＭＢＳを測定する。この分析では、無限の膜結合安定性を示す化合物は３．５×１０10のＭＢＳとなり、この最大ＭＢＳに対する比率として結果を表す。
次表は、上記の例１で記述したＭＲＣ測定と、本例のＭＢＳ測定から得たデータを、本発明の化合物の代表的な試料についてそれぞれ記載したものである。Ｏ〜Ｔで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ1はＣ（ＣＨ3）2を表し、ＺおよびＺ1はＨを表し、Ｒ／Ｒ1は、Ｃ−１２／Ｃ−１０（化合物Ｏ）、Ｃ−２２／Ｃ−１２（化合物Ｐ）、Ｃ−１４／Ｃ−３（化合物Ｑ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｒ）、Ｃ−１６／Ｃ−１６（化合物Ｓ）、Ｃ−２２／Ｃ−１４（化合物Ｔ）を表す。
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前記の表から、ＭＢＳ分析によって、ＭＲＣがほぼ同一だがｉｎ  ｖｉｖｏで異なる生体膜との結合安定性を示す化合物を識別できることがわかる。
本発明の様々な適用において、適切な結合の特徴で化合物を選ぶためにＭＢＳ分析を用いることの付加的な利点は、膜結合安定性に対する頭基構造の変化の作用を確認できることであるのに対し、ＭＲＣ分析では、これは不十分にしか実施できない。下記の表ＩＩＩに見られるように、炭化水素尾部の長さ（対称構造および非対称構造の比較ができるように炭素等価物として表した）と頭部基構造とは、ともに膜結合安定性に対して顕著な作用を備えることができるが、低い炭素等価物数から中程度の炭素等価物数の場合は頭基の作用の方がより顕著である。したがって、本発明の適用（例えば、放射性金属キレート、蛋白質、ペプチド、放射性核種、およびその類似物）に役立つ様々な官能基を備える他の種類の頭部基に対しても同様の作用を求めることができ、頭部基の作用と、望ましい膜結合安定性に達するために必要な炭素等価物との間の平衡を見積もることができる。少なくとも約３０％またはそれ以上のＭＢＳを備える化合物は、ここに記述した種類の本発明の適用上有益であることが期待される。さらに、炭素等価物の数が一定に維持された場合でも、頭部基上の置換基が膜結合安定性に対して顕著な作用を備えうることも観察することができる。下記の表ＩＩＩに見られるように、ＡＣ化合物とＡＤ化合物は頭部基置換基が異なるだけであるが、各ＭＢＳは非常に異なっている。
表ＩＩＩでは、Ｕ，Ｗ，Ｙで表す化合物は上記の式ＸＩＩＩの化合物であり、ここで各化合物のＸおよびＸ1はＯを表し、ＺおよびＺ1はＨを表し、Ｒ／Ｒ1は、Ｃ−２２／Ｃ−３０（化合物Ｕ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｗ）、Ｃ−１８／Ｃ−１８（化合物Ｙ）を表す；さらに、Ｖ、Ｘ、ＡＡで表す化合物も式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ1はＳを表し、ＺとＺ1はＨを表し、Ｒ／Ｒ1はＣ−２２／Ｃ−３（化合物Ｖ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｘ）、Ｃ−１８／Ｃ−１８（化合物ＡＡ）を表す。
ＡＢ、ＡＣ、ＡＤで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ1は（ＣＨ3）2を表し、Ｚ1はＨを、さらにＲ／Ｒ1は、Ｃ−１４／Ｃ−２２（化合物ＡＢ）、Ｃ−１４／Ｃ−３（化合物ＡＣ、ＡＤ）を表す。化合物ＡＢでは、Ｚは−ＣＨ2−ＮＨＯＣＨを表す。化合物ＡＣでは、ＺはＨを表す。化合物ＡＤでは、Ｚは以下に示すような非切断可能コルヒチン誘導体を表す。
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表ＩＩＩに示した多くの対称性色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから製品として入手することができる。
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例３
化合物の調整
ａ．５−アミノメチル−１’−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３’、３’−テトラメチルインド−カルボシアニンヨウ化物
表題の化合物を反応機構１に従って上述のように調整した。以下の記述では、括弧中に示す数字は反応機構１に示した対応する数字の試薬を示している。得られた生成物は化合物８の式で与えられ、ＸおよびＸ1がＣ（ＣＨ3）2を、Ｒ／Ｒ1がＣ14Ｈ29／Ｃ22Ｈ45を表し、ＡはＩを表す。
５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（１）を、Ｇａｌｅら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、３０：６９３（１９７７）の方法を修正して調整した。２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（２３．８５ｇ、０．１５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１５０ｍｌの濃硫酸に溶解させた。次に、氷浴槽内にフラスコを置き、Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミド（２６．５５ｇ、０．１５モル、Ｆｌｕｋａ）を３０分以上にわたって一部ずつ加えた。氷浴槽を取り外し、溶液を室温で５日間攪拌した。次に反応混合物を２００ｇの粉砕氷上に注ぎ、必要に応じて氷を付加することによって温度を３５℃以下に保ちながら、５０％のＮａＯＨ溶液でｐＨを９．０に調整した。その結果得られた沈澱物を濾過によって集め、蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させた。未加工の生成物を塩化メチレン／ヘキサンから再結晶化し、５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニンを生成させる（１）（３０ｇ、６３％）。
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０００８７に記述された方法を用いて、ドコサニル４−クロルベンゼンスルホン酸塩を調整した。
テトラジシル４−クロルベンゼンスルホン酸塩を、同様の方法で調整した。５−（Ｎ−フタルイミド−アミノメチル）−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（６．３６ｇ，２ｍｍｏｌ）と、テトラデシル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（７．６２ｇ、２ｍｍｏｌ）を結合し、両者を１３０℃で２時間加熱した。次に反応混合物を室温まで冷却し、未加工生成物を純粋な５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−１−テトラデシル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２）（１０．２３ｇ、７２％）、ｍ．ｐ．＝１４１℃を生成するために、酢酸エチルから再結晶化した。
２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（６．２６ｇ、０．０４モル  Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ｎ−ドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２０．０２ｇ、０．０４モル）をもとに攪拌しながら３時間１４０℃で加熱した。その後反応混合物をワックス状固体になるように室温まで冷却した。次にその固体をエタノール（２５０ｍｌ）に溶解させ、２００ｍｌの飽和ＫＩ溶液を付加し、その溶液を３０分間攪拌した。１リットルの冷水を加え、さらに１５分間攪拌を継続した。その結果得られた沈澱物を集め、蒸留水で２度洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。未加工物質を塩化メチレン／ヘキサンから再結晶化し、純粋な１−ドコサニル−２、３、３−（３Ｈ）トリメチル−インドレニウムヨウ化物（５）（１４．５ｇ、６１％）、ｍ．ｐ．＝１０７〜１１０℃を生成した。
１−ドコサニル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウムヨウ化物（８．９４ｇ、０．０１５モル）、Ｎ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジン（２．９４ｇ、０．０１５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）と無水酢酸（６０ｍｌ）を冷却器を取り付けた丸底フラスコに入れ、アルゴンでフラスコを浄化し、その後、冷却器を乾燥管に接続した。そのフラスコをあらかじめ加熱した（１６０℃）油浴槽に入れ、６０分間還流した。次にフラスコを油浴槽から取り出しし、室温まで冷却した。その後、１リットルの三角フラスコに移し、エタノール（６０ｍｌ）と、続いて６０ｍｌの飽和ＫＩ溶液で希釈し、その混合物を３０分間攪拌した。冷水（８００ｍｌ）を加え、さらに１５分間攪拌を続けた。沈澱した生成物を濾過によってて集めて蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させて、２−（β−アセトニルイドビニル）−１−ドコサニル−３、３−（３Ｈ）ジメチルインドレニウムヨウ化物（６）（１０．５２ｇ、９５％）、ｍ．ｐ．＝９８〜１００℃を生成した。さらに生成を行うことなく未加工生成物を使用した。
５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−１−テトラデシル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウム４−クロロベンゼン−スルホン酸塩（２）（１４．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）を３００ｍｌの濃縮したＨＣｌ中に溶解させた。その溶解をゆっくりと１１５℃まで加熱し（泡立ちに注意）、２２時間還流させた。その後この混合物を室温まで冷却し、氷浴槽内に入れた。温度を１５℃から２０℃の間に保ちながら、水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨ９．０に調整した。その後、その溶液を蒸留水で２倍の容積に希釈し、塩化メチレン（３×２００ｍｌ）で抽出した。塩化メチレン抽出物を結合し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して黄色の油（３）（６．９ｇ、９０％）として５−アミノメチル−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリンを生成した。
５−アミノメチル−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（３）（１４．８８ｇ、３８．７５ｍｍｏｌ）を、メチルホルマート（７５ｍｌ）中に溶解し、アルゴン下で還流（５５℃）するために２４時間加熱した。次に溶液を室温まで冷却し、メチルホルマートを蒸発させた。残留物をヘキサンから再結晶化し、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−３、３ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（４）（１０．８５ｇ、６８％）を生成した。
２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−３、３−（３Ｈ）−ジメチルインドレニウムヨウ化物（６）（７４０ｍｇｓ、１ｍｍｏｌ）と、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（４）(３３０mg、０．８ｍｍｏｌ）と、無水酢酸ナトリウム（１５０mg、１．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール中で溶解させ、室温で２４時間攪拌した。その後その溶液を２５０ｍｌの三角フラスコに移し、エタノール（２０ｍｌ）と飽和ＫＩ溶液（２０ｍｌ）で希釈し、その混合物を３０分間攪拌した。１００ｍｌの冷水を付加することによって生成物を沈澱させ、その結果得た溶液を１５分間攪拌した。濾過によって沈殿物を集め、蒸留水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。未加工生成物（８７０mg）を二つの群に分け、それぞれをｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、メチレン塩化物中に１０％のイソプロパノール）によって精製し、純粋な１'−ドコサニル−５（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３、３'、３'テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（７）（４１４mg、５２％）を生成した。
１００ｍｌｓの濃縮ＨＣｌ：メタノール溶液（１１ｍｌの濃縮ＨＣｌと１２０ｍｌｓのメタノールを混合して調整）を、１’−ドコサニル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（７）（２５０ｍｇｓ）に付加し、溶液を室温で１６〜２４時間攪拌した。その後その溶液を氷水（１００ｍｌ）で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えて、ｐＨを７．５〜８．０に調整した。その後水相を塩化メチレン（２×１００ｍｌ）で抽出し、その結合有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、濃縮し（Ｂｕｃｈｉ浴槽  温度＜３０℃）、その後高圧下で乾燥させて生成物を得た（８）（２４０ｍｇｓ、９８％）。
ｂ．２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−アミノメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物
さらに表題の化合物を反応機構１に従って調整した。以下の記述中においても、括弧中に示した数字は反応機構１に示した対応する数字の試薬を示している。得られた生成物は化合物（８）の式を備え、ＸがＣ（ＣＨ3）2、Ｘ1が酸素、Ｒ／Ｒ1がＣ14Ｈ29／Ｃ22Ｈ45、Ａがヨウ化物を表している。
上述のように調整した２−メチルベンゾキサゾール（２．６５ｇ、１９．９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）とドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（１０．０ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液を１６０〜１７０℃（油浴槽温度）で６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで冷却し、その結果として得られた固体塊を塩化メチレンから再結晶化し、純粋１−ドコサニル−２−メチルベンゾキサゾリウム−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（５）（７．３ｇ、５８％）、ｍ．ｐ．＝１２４〜１２５℃を生成した。
１−ドコサニル−２−メチル−ベンゾキサゾリウム−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（５）（１．５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ'−ジフェニル−ホルムアミジン（０．４６２ｇ、２．３６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と無水酢酸（７ｍｌ）の攪拌した溶液を、油浴槽内（あらかじめ１６０℃まで加熱）で３０分間還流した。室温まで冷却し、その混合物を無水エタノール（１５ｍｌ）で希釈し、次に飽和カリウムヨウ化物溶液（１０ｍｌ）で希釈して３０分間攪拌した。その後水（１５０ｍｌ）を加え、沈澱した生成物を濾過して集め、水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。乾燥した未加工生成物を、酢酸エチルから再結晶化し、純粋２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（６）（１．５１ｇ、９０％）、ｍ．ｐ．＝６７−６８℃を生成した。
上記の３ａのように調整した２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（６）（１．１０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３−ジメチル−２−メチレンヨウ化物（４）（６３ｍｇｓ、１．５３ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）およびエタノール（２５ｍｌ）を、１時間加熱した還流した。その後溶液を室温まで冷却し、三角フラスコに移してエタノール（４０ｍｌ）と飽和ＫＩ溶液で希釈した。その後この混合物を３０分間攪拌し、２００ｍｌの冷水を加え、この溶液を塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン抽出物を混合し、硫酸マクネシウムで乾燥させ、濾過し、未加工生成物を得るために濃縮した。この生成物を、ｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中に５％のメタノール）で精製し、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（７）（３０５ｍｇｓ、２０％）を生成した。
上記のａのように調整した２５ｍｌｓの濃縮ＨＣＬ：メタノール溶液を、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（７）（５０ｍｇｓ）に加え、その溶液を室温で１６〜２４時間攪拌した。その後その溶液を氷水（３０ｍｌ）で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えることによってｐＨを７．５〜８．０に調整した。その後塩化メチレン（２×５０ｍｌ）で水相を抽出し、硫酸ナトリウムで結合有機相を乾燥させ、濾過して濃縮し（Ｂｕｃｈ浴槽  温度０〜５℃）、その後高圧下で乾燥させ、生成物を作成した（８）（４８ｍｇｓ、９９％）。
Ｃ．５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物のテレフタロイルＮ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル誘導体
室温、アルゴン大気下でカニューレ管を用いて、乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍｌ）内でテレフタル酸のジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの攪拌した溶液（１００ｍｇｓ、０．２７８ｍｍｏｌ）（塩化テレフタロイルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって調整）に、上記の例３ａのようにテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中で調整した５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物の溶液を加えた。その結果得た溶液を２時間攪拌し、その後Ｂｕｃｈｉ上で濃縮した。その結果得た未加工生成物をｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中に５％のメタノール）で精製し、表題の化合物（１０１ｍｇｓ、３４％）を提供した。
ｄ．物質Ｐ−５−脂肪親和性シアニン抱合体
物質Ｐ（２１ｍｇｓ、０．０１３ｍｍｏｌ）と、上記の例３ｃの生成物（３０ｍｇｓ、０．０２４ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、乾燥ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）内で、０〜２℃のアルゴン大気内でトリエチルアミン（６０ｕｌ）を加え、その結果得られた溶液を０〜２℃で４時間攪拌した。その後、トリフルオロ酢酸（１００ｕｌ）を付加することによって反応生成物を急冷し、その溶液を２５０ｍｌのフラスコに移し、水（８０ｍｌ）で希釈して一晩凍結乾燥させた。その結果得られた試料をオクタデシルシリカゲルのカラムを通すことで精製し、最初は８０：２０：１（メタノール：水：トリフルオロ酢酸）で非抱合ペプチドを溶離し、次に１００：２：１（メタノール：水：トリフルオロ酢酸）で目的の生成物を溶離した。ペプチド−脂肪親和性シアニン抱合体を含む分画を混合し、Ｂｕｃｈｉ上で濃縮し、その残留物を水（５０ｍｌ）から凍結乾燥させて紫色の粉状の純粋抱合体を生成した（１４ｍｇｓ、４０％）。ｈｐｌｃによる純度は９０％以上であり、遊離した物質Ｐより０．０２％小さかった。このようにして得られた抱合体は、以下の構造式で与えられる（物質Ｐのアミノ酸配列を示すために従来の３文字記号を使用）：
0003682974.tif 000027
ペプチドとシアニンリポーターの両者がスペーサ成分にアミノ結合を介して結合しているため、結果として生じた抱合体は、各々ｉｎ  ｖｉｖｏでは比較的安定なはずである。
ｅ．２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（＋）−ビオチンアミドメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物
上記の例３ｄに記述したように調整した２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−アミノメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリジン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（５３ｍｇｓ、０．０５５ｍｍｏｌ）の溶液を、ジメチルホルムアミド内、アルゴン気体下で氷浴槽内で冷却した。この溶液に、（＋）−ビオチン４−ニトロフェニルエステル（２３ｍｇｓ、０．６３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加し、その後イミダゾール（１６ｍｇｓ、０．２３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と溶液を氷浴槽内で１時間攪拌し、室温で一晩おいた。その後、反応混合物をＢｕｃｈｉ内で高圧化で濃縮し、残留物にｆｌａｓｈクロマトグラフィを実施（シリカゲル、塩化メチレン中７．５％メタノール、その後塩化メチレン中１０％メタノール）、表題の化合物を生成した（２２ｍｇｓ、３６％）。
ｆ．５−｛６−（６−（＋）−ビオチノイルアミドヘキサンアミド）−ヘキサンアミドメチル｝−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物
上記例３ｅに記述したものと同様の方法を、以下の分量の試薬に対して再度使用した：上記のように調整した５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（９０ｍｇｓ、０．０９ｍｍｏｌ）と、６［（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイルアミノ］カプロン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（５５ｍｇｓ、０．０９７ｍｍｏｌ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と、ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）とイミダゾール（２０ｍｇｓ、０．２４ｍｍｏｌ）。Ｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）によって、表題の化合物（２７．５ｍｇｓ、２１％）を生成した。
化合物２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（６−｛（＋）−ビオチンアミド｝−ヘキサミドメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムと、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（６−（６（＋）−ビオチノイルアミドヘキサミド）−ヘキサミドメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウム塩は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジイル６−（ビオチンアミド）カプロン酸塩と、６［６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイルアミノ］カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとから、それぞれ同様に調整した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手）。
ｇ．Ｎ−ｎ−ドコサニル−Ｎ'−ｎ−テトラデシル−５−トリブチルスタニル−３、３、３'、３'−テトラメチルインド−カルボシアニン塩化物
反応機構２に従って表題の化合物を合成した。得られた生成物は、化合物（１３）の式で与えられ、ＸおよびＸ1はＣ（ＣＨ3）2を表し、Ｒ／Ｒ1はＣ22Ｈ45／Ｃ14Ｈ29を表し、ＡはＣｌを表している。４−インドフェニルヒドラジンを、Ｂｌａｉｋｉｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３１３：２９６（１９２４）の方法を用いて調整した。水（１００ｍｌ）に溶解させた硝酸ナトリウム（１６．５６ｇ、０．２４モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、氷水（６００ｍｌ）中の４−イオドアニリン（４３．９ｇ、０．２０モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）と０〜２℃まで冷却した濃塩酸（２００ｍｌ）との溶液に、４５分間以内に一滴ずつ加えた。その反応混合物を、０〜２℃でさらに３０分間攪拌し、その後反応混合物の温度を０〜２℃の間に維持しながら、ｃ．ＨＣｌ（１５０ｍｌ）中の塩化スズ（ＩＩ）（１５１．６８ｇ、０．８モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を９０分間以上にわたって一滴ずつ加えた。この付加ののち、結果として得た溶液を室温まで温めて、３時間攪拌した。その後、溶液から分離した黄色い固体を濾過によって集め、氷水（８００ｍｌ）中に入れ、２５％の水性水酸化カリウムでｐＨを１０に調整した。その結果得た固体を濾過によって集め、少量の水で洗浄し、真空下で乾燥させた。その後、その生成物をトルエン（４００ｍｌ）中に入れ、不溶性不純物を除去するために濾過した。ヘキサン（１２００ｍｌ）を加え、冷蔵庫で冷却しながら、分離した黄色の針状物を濾過によって集め、ヘキサン（１００ｍｌ）で洗浄し、高真空下で乾燥させ、純粋４−イオドドフェニルヒドラジン（２３．３６ｇ、５０％）、ｍ．ｐ．＝９４℃を生成した。
Ｍｏｒｅａｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．、９（３）：２７４−２８０（１９７４）の方法を修正して、５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）を調整した。４−インドフェニル−ヒドラジン（２３．３６ｇ、０．０９９８モル）と、エタノール（１００ｍｌ）中の２−メチルブタノン（８．５９ｇ、０．０９９８モル）を、３時間還流した。その後、エタノール（１００ｍｌ）中に溶解させた濃縮硫酸（９．９２ｇ、０．０９９８モル）を、一時間以上にわたって一滴ずつ加え、その結果得られた溶液をさらに３時間還流した。室温まで冷却したのち、沈澱した固体を濾過によって除去し、濾液を８０ｍｌまで濃縮し、その後氷水中に注いだ。その後水性溶液を塩化メチレンで抽出し、混合有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、濃縮して、未加工生成物を生成した（２６．９ｇ、９５％）。純粋な生成物５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）（１６．７ｇ、５９．０％）は、ｂ．ｐ．８１〜８８℃で０．０３ｍｍＨｇの真空蒸留後に得た。
５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（２．８５ｇ、０．０１モル）とｎ−ドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸（５．５５ｇ、０．０１モル）を連続的に４時間攪拌しながら１３０℃（油浴槽温度）まで加熱した。その後冷却した反応混合物を、酢酸エチルから再結晶化し、Ｎ−ｎ−ドコサニル−５−イオド−２、３、３−トリメチルインドリニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（１０）（４．６２ｇ、５９％）ｍ．ｐ．＝１１８℃のタンニン結晶を提供した。
２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（６．３６ｇ、０．０４モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）とｎ−テトラデシル−４−クロルベンゼン−スルホン酸塩（１５．５２ｇ、０．０４モル）の両者を１３０〜１３５℃（油浴槽温度）で３時間連続的に攪拌しながら加熱熱した。その後未加工試料をエタノール（２００ｍｌ）中に溶解させ、次に飽和ヨウ化カリウム溶液（５０ｍｌ）とともに３０分間攪拌した。冷水（５００ｍｌ）を加え、沈澱物を濾過によって集め、冷水で十分に洗浄した。乾燥した未加工物を酢酸エチルから結晶化し、集めた結晶をエーテルで十分に洗浄し、乾燥させて、Ｎ−テトラデシル−２、３、３−トリメチルインドリニウムヨウ化物（５）（１２．８ｇ、６６．８％）ｍ．ｐ．９７℃を生成した。
Ｎ−ドコサニル−５−イオド−２、３、３−トリメチルインドリニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２．３６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン（０．５９ｇ、３．０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と、無水酢酸（２０ｍｌ）を５０ｍｌの丸底フラスコに入れ、それをアルゴン大気下で還流冷却器と攪拌棒に設置した。その後、このフラスコをあらかじめ１７０℃の一定な温度に加熱した油浴槽内に入れ、混合物を６０分間還流した。次に、その反応フラスコを室温まで冷却し、５００ｍｌの三角フラスコに移した。その後、そのフラスコを氷浴槽内に入れ、飽和ヨウ化カリウム溶液を加えた。１５分間攪拌したのち、冷水（２５０ｍｌ）を加え、混合物をさらに１５分間攪拌した。沈澱した生成物、Ｎ−ｎ−ドコサニル−５−イオド−２−（β−アセトニリドビニル）−３、３−ジメチルインドリニウムヨウ化物（１１）（２．３７ｇ、９１％）ｍ．ｐ．＝１７０℃（ｄｅｃｏｍｐ）を濾過によって集め、乾燥させた。
Ｎ−ドコサニル−５−イオド−２−（β−アセトニリドビニル）−３、３−ジメチルインドリニウムヨウ化物（５１１ｍｇｓ、０．５９ｍｍｏｌ）と、Ｎ−テトラデシル−２、３、３−トリメチルインドリニウムヨウ化物（２３３ｍｇｓ、０．４７ｍｍｏｌ）と、無水エタノール（１５ｍｌ）中の無水酢酸ナトリウム（４８ｍｇｓ、０．５９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で２４時間攪拌した。その後深紅色の混合物を三角フラスコに移し、エタノール（２５ｍｌ）で希釈した。その後水（２５ｍｌ）に溶解させた酢酸銀（４９２ｍｇｓ、２．９５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加し、その溶液を１５分間攪拌した。次にエタノール（２５ｍｌ）と飽和塩化ナトリウム溶液を加え、連続的に１５分間攪拌した。その後その溶液を分離漏斗に移し、水（２００ｍｌ）で希釈し、塩化メチレン（２×１００ｍｌ）で抽出した。その有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、蒸発させ、未加工生成物を提供した。未加工生成物をｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、最初に塩化メチレン中５％のメタノール、続いて塩化メチレン中に８％のメタノール）で精製し、Ｎ−ドコサニル−Ｎ'−テトラデシル−５−イオド−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１２）（２７２ｍｇ、５８％）を生成した。
Ｎ−ドコサニル−Ｎ'−テトラデシル−５−イオド−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１２）（２００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、乾燥トルエン（１５ｍｌ、水酸化カルシウムから新たに蒸留）中に溶解させ、得られた溶液をアルゴン大気を通して発泡させることによって、ガス抜きを行った。次にＢｉｓ−（ｎ−トリブチルチン）（０．２３７ｍｌ、０．４７ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射器で加え、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．３４ｍｇｓ、２．０ｕｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加した。得られた溶液をアルゴン下で４８時間還流した。その後トルエンを真空下で除去し、その残留物にｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中５％メタノール）を実施し、表題の化合物を得た（１３）（７１mg、３１％）。Ｆｏｕｎｄ  Ｍ＋、１１２２Ｃ71Ｈ123Ｎ2Ｓｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  １１２２。
化合物（１３）は、Ｗｉｌｂｕｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３０：２１６〜２２６（１９８９）によって記述された方法を用いた放射性ハロゲン原子との結合のための用途の広い中間体である。
ｈ．186Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体
上記に示した反応機構５に従って、表題の化合物を調整した。この反応に示す参照番号は反応機構５の数字に対応している。得られた化合物は化合物２４の式で与えられ、ＸおよびＸ1はＣ（ＣＨ3）2を表し、Ｒ／Ｒ1はＣ14Ｈ29／Ｃ22Ｈ45を表し、ＡはＩを表している。
二官能キレート剤である、４００μＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した化合物２２（８４．５ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）を（８）（６６．８ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を含む梨型フラスコに連続的に加えた。この溶液を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィ（ＴＣＬ；シリカ、９０：１０  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）によって反応経過を継続した。４時間後、ヘキサンによって反応混合物を希釈し、７５：２５のＴＨＦ：ヘキサン溶液を作成し、短経路シリカゲル（２０ｇ）カラムに入れた。溶離液がブロモクレゾールグリーンの陰性反応を示すまで、余剰化合物２２を５０：５０のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶離した。溶剤の組成を９０：１０のＣＨ2Ｃ12：ＭｅＯＨに変更し、化合物２２を溶離した。その溶剤を減圧下で蒸発させ、６５．０ｍｇの化合物２３を生成した。
高磁場の1Ｈ  ｎｍｒ（３００ＭＨｚ）は、以前にホルミルで保護された化合物８で見られたように、３．９ｐｐｍから４．５ｐｐｍまでのベンジルメチレン陽子の低磁場シフトを示した。４．５ｐｐｍと８．４ｐｐｍでの信号の相対積分（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は１：１の結合比を示した。
生成物の化合物２３は、ＨＣｌガス／エタノール溶液の付加によってＨＣｌ塩に変換した。シュウ酸のエタノール溶液を酸化防止剤として加え、溶液を蒸発させ、蒸留した固体を窒素下で貯蔵した。
０．１ＮのＮａＯＨ（０．１８１ｍＣｉ／ｎｍｏｌ）１０７μｌ中の６０ｎｍｏｌのＮａ186ＲｅＯ4を、１５０μｌの変換キレート溶液（２００ｍｇのクエン酸、４０ｍｇのＳｎＣｌ2２Ｈ2Ｏおよび２０ｍｇのゲンチジン酸を２ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解）に加え、続いて０．１ＭのＮａＯＨ４３μＬを加えた。その溶液を１分間、渦状に攪拌し、５５℃で１０分間加熱した。エタノール（０．６ｇｍＬ）を反応混合物に加え、続いて化合物２３（０．８ｍｇ、０．６９μｍｏｌ）のエタノール溶液３００μＬを加えた。溶液を１５秒間渦状に攪拌し、加熱を１時間継続した。
反応混合物をｓｅｍｉｐｒｅｐＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｎｏｖａｐａｋ、７．５×３００ｍｍ）に入れ、Ａ：Ｂを５０：５０の勾配からＢ１００％まで、流速４．０ｍＬ／分で３０分以上にわたって溶離した。（溶媒Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と０．０５％ゲンチジン酸を含む７５：２５のＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ。溶媒Ｂは、０．１％のＴＦＡと０．０５％のゲンチジン酸を含む２０：８０のＣＨ3ＣＮ：ＴＨＦ）。約２０分間溶離した分画を、表題化合物を含む分画として確認した。
上記の分画を、溶媒１（Ｈ2Ｏ中に０．０５％のゲンチジン酸）１で１：１に希釈し、最初に１０ｍＬの溶媒２（ＥｔＯＨ中に０．０５％のゲンチジン酸）、続いて１０ｍＬの溶媒１で洗浄したＳｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｃ−１８、Ｗａｔｅｒｓ  ３６８０５）に入れた。カラムを１０ｍＬの溶媒１、１５０μＬの溶媒２と、および３００μＬの溶媒２で溶離した。Ｎ2気流によって１０μＬの体積までその溶媒を蒸発させ、その後ＥｔＯＨで４０μＬまで希釈した。
た。特異的活性は、１８１ｍＣｉ／μｍｏｌの理論値に対して、１８６±２１ｍＣｉ／μｍｏｌであった。生成物の回復は、全Ｒｅ−１８６の９％未満であった。１日後にＨＰＬＣによって放射性純度を測定し９４％未満であることを見出した。不純物（〜５％）の大部分空洞体積（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）で見出し、遊離過レニウム酸塩と考えられた。
ｉ．７−Ｎ（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルチシン脂肪親和性シアニンヒドラゾン抱合体と、酸切断性の測定
（ａ）調整
上記の反応機構３に記載した一般的方法に従って表題の化合物を調整した。ここにおける引例番号は、反応機構３に示した数字と対応している。得られた生成物は化合物１９の式で与えられ、ＸおよびＸ1＝Ｃ（ＣＨ3）2、Ｒ／Ｒ1＝Ｃ14Ｈ29／Ｃ22Ｈ45、ＡはＣｌを表す。
５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（化合物８）を、ＲがＣ14Ｈ29；Ｒ1がＣ22Ｈ45；ＸおよびＸ1＝Ｃ（ＣＨ3）2である反応機構１の一般的方法を用いて調整した。
ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ、リチウム水酸化アルミニウムから蒸留）中で、モノメチルグルタル酸塩の攪拌溶液（０．１４ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２６．５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で加えた。この混合物を氷浴槽内で冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２２６．６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を徐々に室温まで温め、さらに３時間攪拌した。次に、その反応混合物を新たに調整した化合物８（７００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の含むフラスコに移し、この反応混合物を室温で３０時間攪拌し続けた。その後ジメチルホルムアミドを高圧下で除去し、結果として得られた未加工生成物を無水エタノール（２５０ｍｌ）と水（２５０ｍｌ）で希釈した。その後、酢酸銀（４３４ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌したのち、飽和塩化ナトリウム溶液（１００ｍｌ）を加え、その混合物をさらに３０分間攪拌した。水層を塩化メチレン（４×１００ｍｌ）で抽出し、混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中で２．５％、続いて１０％のメタノールで溶離）を実施し、５−［Ｎ−（モノメチルグルタリル）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１４）（５２０ｍｇ、６３％）を生成した。
得られた５−［Ｎ−（モノメチルグルタリル）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物（５２０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の無水エタノール中の攪拌した溶液に、無水ヒドラジン（５ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をゆっくりと室温で加えた。その反応混合物を２時間連続的に攪拌し、その後、回転蒸発させて濃縮し、その残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％、続いて３０％のメタノールで溶離）を実施し、５−［Ｎ−（モノヒドラジノ）グルタリル−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物（１５）（１１０ｍｇ、２７％）を生成した。
無水グルタル酸（１１１．２ｍｇ、０．９７５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で塩化メチレン（５ｍｌ）中の攪拌したデアセチルコルヒチン（１６）（０．２９０２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に加え、その反応混合物を室温で２時間連続的に攪拌した。その後、塩化メチレンを回転蒸発で除去し、未加工生成物を高真空下で乾燥させ、７−（Ｎ−グルタリル）デアセチルコルヒチン（０．３９７ｇ、１００％）を固体として生成した。
次に、カルボニルジイミダゾール（０．１９７ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ、水素化リチウムアルミニウムから新たに蒸留）中で７−（Ｎ−グルタリル）デアセチルコルヒチン（０．３９７ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌したものに室温で加え、その反応混合物を室温で２時間攪拌し続けた。この時間内に溶液中に沈澱物が形成された。ジメチルホルムアミドを真空蒸留によって除去し、残留物を塩化メチレン（５ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にテトラブチルアンモニウム水素化ホウ素（２５０ｍｇ、０．９７２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その反応混合物を３時間攪拌した。次にこれを水（５０ｍＬ）の中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン（２×２５ｍＬ）で再抽出した。混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。その未加工生成物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）を実施し、７−Ｎ−（５−ヒドロキシルペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１７）（７２ｍｇ、２５％）を生成した。
塩化メチレン（５ｍＬ）中の７−Ｎ−（５−ヒドロキシルペンタノイル）デアセチルコルヒチン（７２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）溶液に、室温でピリジニウムクロルクロム酸塩（４１．３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を２時間攪拌した。その後、それを水（５０ｍＬ）中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン（２×２５ｍＬ）で再抽出した。結合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。得られた残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）を実施し、７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１８）（３５ｍｇ、４９％）を油として生成した。
無水エタノール（２０ｍｌ）中の５−［Ｎ−グルタリル（モノヒドラジノ）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物溶液（１１０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（４０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むフラスコに加え、その反応混合物を２０時間攪拌した。その後エタノールを回転蒸発によって除去し、その残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％のメタノール）を実施し、表題の化合物を提供した。（１９）（２６．５ｍｇ、２７％）。この化合物の２００ＭＨｚプロトンＮＭＲの積算は１：１の結合比を示し、高速原子衝突質量分光法（グリセロール／チオグリセロール複合体）では、生成イオンＣ90Ｈ135Ｎ6Ｏ8の期待されるＭ+に対応し、Ｍ+＝１４２９を示した。さらにこの生成物は、以下に記述する条件に従って、逆相高圧流体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって特徴付けられ、５５分間の保持時間を備えていた。３５０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて、９８％の純度であることが見出された。０．３０％未満の遊離７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（保持時間＝１２分）がこの生成物中に検出された。
使用したＨＰＬＣシステムは、Ｗ６００Ｅ勾配コントローラとＵ６Ｋ注入装置およびＭｏｄｅｌ  ９９０フォトダイオード配列検出装置を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｍｏｄｅｌ  ６００Ｅ溶媒供給装置で構成されている。クロマトグラフィの条件は、以下の通りである：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（フェニル、４μｍ、３．９ｍｍ×１５ｃｍ）；Ｍｏｂｉｌｅ相：溶媒Ａ＝水：メタノール：アセトニトリル：ＰＩＣ  Ａ試薬（水）（３９５：２５：８０：４）、溶媒Ｂ＝水：メタノール：アセトニトリル：ＰＩＣ  Ａ試薬（水）（２２５：２５：２５０：４）、溶媒Ｃ＝メタノール：水：ＰＩＣ  Ａ試薬（水）（４９０：１５：４）。勾配条件：２０分以上で１００％（Ａ）から６０％：４０％（Ａ：Ｂ）、その後１０分以上で１００％（Ｃ）まで、さらに４０分で１００％（Ｃ）。流速：２ｍＬ／分。検出：２４０〜５７５ｎｍのフォトダイオード配列。
（ｂ）酸切断性の測定
７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンを生成するヒドラゾン抱合体（１９）の酸加水分解率を、異なる３種類のｐＨにおけるＨＰＬＣによって調査した。
緩衝液をＧｏｍｏｒｉの、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、１６：１３８（１９５５）の記述した方法に従って調整した。ＨＰＬＣ条件と保持時間は、上述のものと同一であった。７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンの検出限界は、３５０ｎｍにおいて約１００ｎｇとした。
５０μｌのヒドラゾン抱合体溶液（１ｍｇ／ｍｌメタノール）を、目的のｐＨのクエン酸塩リン酸塩緩衝液（２００μｌ）を含むねじ蓋付きガラスびんに加えて、調査する化合物溶液を調整した。ガラスびんを閉じ、ＨＰＬＣ（３５０ｎｍにおける検出）によって溶液を分析し、残っている抱合体（１９）、さらに２４時間後と４８時間後に生成した７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンを調べた。各ｈｐｌｃ注入は２００μｌであった。
ｐＨ４．２１、５．７４、７．３５における加水分解の結果を以下に要約した。
ｐＨ４．２１：２４時間後において、（１９）の７８％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に１００％が切断された。
ｐＨ５．７４：２４時間後において、（１９）の４５％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に１００％が切断された。
ｐＨ７．３５：２４時間後において、（１９）の３６％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に７７％が切断された。
ＨＰＬＣによって検出されたヒドラゾン抱合体の遊離コルヒチンヒドロリシス生成物だけが化合物（１８）のアルデヒドであると考えられた。
（ｊ）ヘパリン脂肪親和性シアニン抱合体
表題の化合物を、上記の反応機構４に記載した一般的方法に従って調整した。この引例番号は、反応機構４の数字に対応している。得られた生成物は化合物２１によって表される種類の式を備え、ＸおよびＸ1＝Ｃ（ＣＨ3）2、Ｒ／Ｒ1＝Ｃ14Ｈ29／Ｃ22Ｈ45、Ａ＝Ｃｌである。
上述したように化合物８を調整した。
新たに調整した化合物８（１８．０ｍｇ、１８．０μｍｏｌ）を、ＮＭＲ管中で、重水素化クロロホルム（０．５ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解させた。その後トリエチルアミン（５μｌ、０．０３６ｍｍｏｌ）、続いてトリホスゲン（１．９５ｍｇ、６．７μｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、この混合物を２分間振った。その後、プロトンＮＭＲを実施し、化合物（８）で見られたようにベンジル陽子中の３．９５から４．９５へのシフトを示し、生成物５−イソシアン酸メチレン−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（２０）の形成を示した。
イソシアン酸塩の重水素化したクロロホルム溶液（２０）を回転蒸留によって濃縮し、その残留物をジメチルホルムアミド（４ｍｌ、乾燥させて蒸留）の中に溶解させ、急速に攪拌した。このように急速に攪拌した溶液に、ヘパリンのホルムアミド溶液（９．４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ、０．００１６ｍｍｏｌ）を加え、さらにフラスコに蓋をし、室温で２０時間攪拌した。次に濾過によって不溶性物質を除去し、濾過液を５０℃で高真空下で回転蒸留によって濃縮した。残留物を水（２０ｍｌ）と塩化メチレンの混合物に加えた。水層を分離し、塩化メチレンで再度洗浄した。次に、水性溶液を透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜  ＭＷＣＯ：１０００）に入れ、水を透析し、その後凍結乾燥させて、ピンク色の固体を生成した（２４．３ｍｇ）。この物質をさらに精製することなく、化合物２１と未反応ヘパリンの混合物であるとみなした。それを、生物学的評価のために使用した（例１４を参照）。
例４
治療上有効な蛋白質を脂肪親和性分子に抱合させることの生物学的作用
上記の例３ｄで生成した化合物のｉｎ  ｖｉｖｏのレセプタ薬理学を、Ｕ．Ｆｏｒｓｔｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２３４：１０５５〜６１（１９８７）が記述した方法と同様にして、血液を潅流させたウサギの後肢標本で調査した。ペントバルビタールで麻酔し、人工的に換気させたウサギのカニューレを挿入した頚動脈から血液を取り出し、定速ローラーポンプを用いて医療等級のｓｉｌａｓｔｉｃ管内を通過させ、カニューレを挿入した大腿動脈に導いた。大腿動脈床における末端潅流圧（ｍｍＨｇ）を、微小圧変換器（Ｍｉｌｌａｒ）が大腿カテーテル先端の僅か先に位置するように潅流管を通るようにして測定した。最初に、末端潅流圧が全身平均動脈圧に近付くようにポンプ速度を調整し、その後残りの各実験の間は血流を一定に維持した。その後、抵抗の変動は、オームの法則が記述するのと同様に末端潅流圧に従って次のように変化する：
血管抵抗＝潅流圧／血流
したがって、各実験時に血流を一定に維持することによって、圧力の低下が血管拡張を意味し、圧力の上昇が血管収縮を意味するように、末梢潅流圧の変化が直接血管抵抗に反映される。したがって、血管の生物学と、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管平滑筋の緊張に作用を及ぼすと考えられる物質の薬理学を分析するために、潅流系への直接的な注入を利用することができる。
図１は、物質Ｐと例３ｄの抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの反応の定性的な同一性を示す。物質Ｐと抱合体の両者が、潅流したウサギの後肢標本に局所的に注入したときに、短時間の投与量に関連した後肢潅流圧の低下を生じている。これらの拡張薬の反応は、物質Ｐの既知の血管薬理学と完全に一致している。例えば、Ｊ．Ｂｅｎｙら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３９８：２７７から８９（１９８８）を参照。
図２に見られるように、物質Ｐと抱合体の反応の間には定量的な差が存在する。物質Ｐの平均投与量閾値はおよそ０．００３ｐｍｏｌｅｓの潅流圧の低下が起こることを必要としているのに対し、圧力の最大の低下は３〜１０ｐｍｏｌｅｓの投与量範囲で達成されている。潅流圧の低下を引き起こすのに必要な抱合体の最小投与量は物質Ｐの場合よりも大きく、１〜１０ｐｍｏｌｅｓであり、最大の低下は１０００ｐｍｏｌｅｓのときに達成している。論理関数によって物質Ｐと抱合体について計算したＥＤ50値は、それぞれ０．１３と３４ｐｍｏｌｅｓであり、物質Ｐの効力が２５０倍大きいことを示している。しかし、どちらの物質も通常のレセプタの相互作用に一致する平行な投与量−反応曲線の勾配を示した。さらに図２は、既知の物質Ｐの拮抗薬である［Ｄ−ＰＲＯ2、Ｄ−Ｔｒｐ7,9］−物質Ｐの注入時の物質Ｐと抱合体の投与量−反応関係も示している。このＤアミノ酸との位置３における合成ペプチドは、内因性物質Ｐと外因性に投与した物質Ｐのニューロン、行動および血管作用に拮抗することが報告されてきた。物質Ｐと抱合体の両者に対する潅流圧の低下は、拮抗薬が存在するときの両化合物の投与量−反応曲線の右側への平行な移動によって分析されるように、［Ｄ−ＰＲＯ2、Ｄ−Ｔｒｐ7,9］−物質Ｐによって抑制される。拮抗薬存在下での投与量−反応曲線の右向きの移動の大きさは、物質Ｐと抱合体に関して同様であり、これらの二つの物質が共通のレセプタ部位に作用することをさらに示唆している。図２に記載したデータは、３頭のウサギを含む試験に基づいたものであり、最大反応から拮抗薬非存在下での物質Ｐまでの潅流圧の平均（±ＳＥＭ）変化率として表している。
上記に加えて、対応する非抱合脂肪親和性シアニンの１および１０ｎｍｏｌｅｓの濃度における投与が、血管弛緩作用をまったく示さなかったことが実験的に確認された。さらに、βアドレナリン受容体作用薬であるイソプロテレノールの１、１０、１００ｐｍｏｌｅｓの濃度における投与もまた、潅流圧の投与量に関連した低下を生じたが、それはＳＰ拮抗薬［Ｄ−ＰＲＯ2、Ｄ−Ｔｒｐ7,9］−ＳＰによって拮抗されることはなく、ＳＰレセプタに対する［Ｄ−ＰＲＯ2、Ｄ−Ｔｒｐ7,9］−ＳＰの特異性を示した。
１ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のウサギ血清アルブミンを加えたリン酸塩緩衝食塩水に懸濁した、洗浄したウサギの赤血球に例３ｄの抱合体（１００ｕＭ）を容易に結合させ、両者をともにｅｘ  ｖｉｖｏで培養した。抱合体の蛍光成分によって、フロー血球計算法を用いたＲＢＣでの素早い検出が可能になる。抱合体で標識したウサギのＲＢＣをウサギの後肢内に注入すると、潅流圧の低下が生じ、その大きさは注入した細胞の数に関係する。別の実験は、１０6〜１０9個のＲＢＣの注入によってウサギの後肢標本の潅流圧が大きく低下したことを示した。抱合体で標識したＲＢＣの標本を上澄み液分画と細胞分画に分離し、それを上記のＲＢＣ緩衝液に再懸濁して再注入すると、上澄み液分画が本来の細胞懸濁液の生物学的活性の大部分を含み、抱合体がＲＢＣを拡散させる能力を備えていることを示す。ＲＢＣの洗浄を繰り返すことによって血管拡張作用を備える上澄み液分画が生じ、ＲＢＣからの、抱合体の放出能力の延長を示唆する。
前述の実験から、上記の例３ｄの物質Ｐ脂肪親和性シアニン抱合体は自然の物質Ｐの作用と定性的に同様な血管拡張作用を備え、このような作用は物質Ｐレセプタの既知の拮抗薬によって拮抗されうるものであることが理解される。これらの実験結果は、脂肪親和性リポーター分子との化学的抱合に関わらず、物質Ｐとそのレセプタの相互作用が維持されることを示す傾向がある。
例５
脂肪親和性シアニンで誘導させた物質Ｐの構造と生物学的相互作用への細胞結合の効果の測定
例３ｄの抱合体の物質Ｐ成分が構造的に受けておらず、末梢赤血球（ＲＢＣ）の表面に認識可能であることを測定するために、２ｍｌのヒトＲＢＣ（１０6細胞／ｍｌ）を抱合体（１０μＭ；赤の蛍光性）を用いて標識し、その後フロー血球計算法を使用して調査した。この調査の結果を図３Ａ〜Ｃに示す。特別に、未処理のＲＢＣと抱合体で標識したＲＢＣを分析して以下のことを測定した：
１．抱合体が細胞表面上に結合していること（図３Ａの比較）。
２．イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を抱合したヤギ抗ウサギ抗体が抱合体標識ＲＢＣあるいは非標識細胞に非特異的に結合すること（図３Ｂの比較）、あるいは
３．ウサギ抗物質Ｐ抗体＋ＦＩＴＣ抗ウサギ抗体が抱合体標識ＲＢＣに特異的に結合すること（図３Ｃの比較）。
図３Ａでは、未染色ＲＢＣの検査では、バックグラウンドの自己蛍光（緑（ＬＦＬ１）と赤（ＬＦＬ２）の軸の起点の近くに位置する細胞母集団）のみを示したが、抱合体標識細胞は、非標識細胞に比べて赤の蛍光信号の増大を示した。
図３Ｂでは、図３Ａの結果に比べ、緑の蛍光信号（ＬＦＬ１）の小さな増大によって証拠付けられるように、フルオレセインで染色したヤギ抗ウサギ抗体による抱合体標識細胞の処理が、この抗体がＲＢＣに対して最小の非特異的結合のみを行ったことを示した。
図３Ｃは、ウサギ抗物質Ｐ抗体を用いて一次試薬として間接的に蛍光標識し、その後二次試薬としてヤギ抗ウサギ抗体でフルオレセイン染色した非標識ＲＢＣあるいは抱合体標識ＲＢＣの蛍光ヒストグラムを示す。抱合体標識細胞では、細胞上に顕著な量の緑および赤の蛍光が検出可能であり（ＬＦＬ１信号が図３Ｂよりも増大）、細胞結合抱合体に対する特異的結合を示している。この蛍光の増大は、抱合体で標識しなかったＲＢＣでは認められなかった。したがってこの方法は、物質Ｐが抗物質Ｐ抗体によって抗原性にＲＢＣの表面上に”認識”されたことを示し、赤血球上における物質Ｐの構造の存在と維持を確認する。
例６
赤血球細胞上における物質Ｐ−脂肪親和性シアニン抱合体のＩｎ  Ｖｉｖｏでの安定性の測定
上記の例３ｄの抱合体で標識した赤血球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの特徴を調査するために、２頭のウサギのそれぞれから得た０．５ｍｌの新鮮な抗凝固化血液を抱合体（最終濃度１０μＭ）で標識し、血液を採取した同一のウサギに再注入した。抱合体による標識後、注入に先立って標識細胞のアリクウォットをフロー血球計算法を用いて検査し、標識が適切に行われたことを確認した。標識細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に続いて、３０分、１、２、３、４、および７日目の時点で血液標本を取り出し、フロー血球計算法を用いて細胞の蛍光性を検査した。
本調査の結果を図４のグラフに示したが、そのグラフから、標識細胞からの抱合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの分離が比較的ゆっくりとした速度で起こることを理解することができる。標識細胞に関する蛍光（対数蛍光強度）は５〜６日間の半減期で低下したが、自然の物質Ｐの循環における寿命は分単位であった。
したがって、上記の実験結果から、治療薬を備える脂肪親和性分子によるバイオ粒子の標識は、治療薬の非経口投与において革新的な供給賦形剤を提供することが明らかになる。
例７
色素結合、細胞の生存可能性および膜結合安定性に対するヨウ化の作用
本化合物の化合物へのヨウ素原子の付加が、その細胞標識特性に対して実質的に影響を及ぼさないことを実証するために、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの取り込み、標識後の細胞の生存可能性、および膜保持の測定を以下の化合物について実施した：
0003682974.tif 000028
0003682974.tif 000029
前述の反応機構１に記載し、上記の例３に記述した一般的な方法に従って、化合物Ｔ、ＡＡ、ＡＢを調整することができる。
ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４：２１７２〜２１７７（１９８９）が記述したように、５、１０、２０μＭの標識濃度と、化合物ＡＡとＡＢについては５または１０μＭの標識濃度で回復と生存可能性を計算した。しかし、化合物ＡＡとＡＢでは２０μＭの標識濃度において生存可能性と回復が７０〜８０％に低下した。
１個の細胞当たりに結合した化合物分子の数を、１０μＭの化合物で標識した細胞について測定した。最終再懸濁と計数後に洗浄した細胞から１０6個の細胞のアリクウォット（１０ｕｌ）を取り出し、２５０μｌの１００％エタノールとの混合物によって細胞膜から化合物を抽出し、蛍光ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩとフィルターの組み合わせを用いて抽出物２００μｌの蛍光強度を測定した。１００％エタノール中で作成し、ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩで測定した既知の化合物濃度のキャリブレーション曲線から各抽出物の化合物濃度を測定した。次に、既知の抽出物濃度、抽出物の全容積、および既知の抽出した細胞数から細胞１個当たりの化合物の分子数を計算した。計算値は、化合物Ｔが（４．０±０．４）×１０6、化合物ＡＡが（１．３±０．２）かける１０6、化合物ＡＢが（２．５±０．７）×１０6であった。
ＮＨ4Ｃｌ溶解によって調整した赤血球膜ゴーストを用いて相対的な膜保持を測定した（ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、ｓｕｐｒａ）。ゴーストを１０μＭの化合物を用い、４×１０8／ｍｌ、室温で前述の方法を使用して５分間標識した。しかし、ＰＢＳを含む１ｍＭのＥＤＴＡと５％のＢＳＡを使用して標識後の洗浄を実施した。最終洗浄ののち、４×１０8／ｍｌでＰＢＳ＋ＥＤＴＡ＋５％ＢＳＡにゴーストを再懸濁し、３７℃で２４時間培養した。２４時間の時点で二倍にした５０μｌのアリクウォットを、ａ）ゴーストの十分に混合した懸濁液（存在する全化合物の測定用）、およびｂ）ゴーストを１２、５００×ｇで１５分間ペレット化した残りの上澄み液（存在する未結合化合物の測定用）から取り出した。２００μｌの１００％エタノールの混合物によってアリクウォットを抽出し、各抽出物の蛍光強度を蛍光ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩを使用して測定した。保持された化合物の割合を次の式によって計算した：
全化合物−非結合化合物×１００
全化合物
計算値は、化合物Ｔが（９１．９±２．９）％、化合物ＡＡが（９７．７±０．２）％、化合物ＡＢが（９６．８±１．３）％であることを見出した。
前述の実験に基づいて、本発明のヨウ化化合物が、非ヨウ化化合物と同等またはより優れた膜保持特性を示すという結論を得た。赤血球膜内への結合は、等価な濃度の非ヨウ化化合物に比べてある程度低かったが、その分子サイズと分子量が大きいことから予想されるように、この差が、上述の種類の細胞標識適用における有効性を変化させるほど大きいとは思われない。
例８
人工的表面への保持
本発明の化合物が人工的表面に保持される能力を分析するために、１００％エタノール中の放射性ヨウ素（125Ｉ）と結合した脂肪親和性シアニン（上記の化合物１２、反応機構２、例３ｇ）を、医療用ｓｉｌａｓｔｉｃ（ＳＩＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、およびポリエチレン（ＰＥ）を含む複数の種類の異なるプラスチック管の短い断片の管腔面に接触するように配置した。１０分間にわたって化合物が管に接触してとどまることができるようにし、その後取り出して管をＰＢＳで静かに流した。標識した管の基線放射能測定を行ったのち、約３０ｍｌの抗凝固処理を施していない新鮮なヒトの血液を含む閉じた管の回路に断片を接続した。管の回路をローラーポンプに通過させ、血液を６時間循環させた。６時間後に管の断片を取り外し、ＰＢＳを静かに流して付着した血液をすべて取り除き、放射能を計測した。この実験の結果を図５に図式的に示す。管腔面の放射性ヨウ素を結合させた化合物／ｍｍ2（棒グラフのｘ軸）をピコグラムで表すことができるように、管断片の長さ、直径、および放射性ヨウ素を結合させた本発明の化合物の特異的活性を記録した。図５は、開始時に最大量の放射性ヨウ素が結合した化合物がＰＶＣ管に結合し、ＰＥに結合した化合物が最小であったことを示している。６時間後に血液と接触した管への最大の保持を示したのはＰＶＣ（最初に保持された放射能の９７．６±２．１％）であり、ＰＣへの保持は最小であった（最初に保持された放射能の５６．０±１０．４％）。しかし、すべてに管について平均の保持は５０％を超えており、ＰＶＣでは１００％近くまで達し、本発明の化合物が、生物学的液体との接触していても長期間人工的表面にとどまる能力を備えていることを示した。したがって、本発明の化合物は、生物作用性物質の人工的表面への保持に有効となりうる。
例９
腫瘍内注入後の186Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とＮａ186ＲｅＯ4のＩｎ  Ｖｉｖｏでの保持
過剰なゲンチジン酸を除去し、ｉｎ  ｖｉｖｏの投与前のｐＨ調整の必要を回避するためにエタノールによる生成物の溶離に先立ってＳｅｐＰａｋを約１０ｍＬの蒸留水で洗浄した点を除き、基本的に例３ｈに記述した方法に従って186Ｒｅキレート脂肪親和性シアニン抱合体を調整した（反応機構５の化合物２４）。真空蒸発後、濃縮した貯蔵溶液をエチルアルコール中で約２５μＬの最終容積にした（約５００μＭの濃度の化合物２４；約１２３ｍＣｉ／μモルの特異的活性）。ｉｎ  ｖｉｖｏ注入のための、約５〜６μＣｉの186Ｒｅを含む化合物２４とＮａ186ＲｅＯ4の調整を以下のように行った。Ｎａ186ＲｅＯ4（ＮＥＺ３０１、０．１ＮのＮａＯＨ中）を３００ｍＯｓＭの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、ｐＨ紙を用いてｐＨが７．０であることを確認し、次にその調整剤を０．２２μｍのフィルターを通して再滅菌した。化合物２４を滅菌３００ｍＯｓＭグルコースで希釈した。滅菌した５０μＬのハミルトン注射器に５．０μＬのＮａ186ＲｅＯ4または化合物２４の調整剤を滅菌法を用いて入れた。各調整の計数基準を提供し、全身画像の崩壊補正と生物分布測定のための基準として用いるために、別々のアリクウォットを取り出した。
腫瘍内注入後の上述の調整剤の保持を以下のように評価した。腫瘍内注入前の５〜６日間に、メスのＣ５７Ｂｌ／６マウスの右後肢への、滅菌ハンクス緩衝食塩水に懸濁した約１×１０6生存腫瘍細胞の接種物を用いた皮内注入によって、成長したＭＣ３８腺癌小結節を導入した。０日目に動物に再麻酔を行い、アルコール綿棒を用いて右後肢を滅菌し、化合物２４の５．０μＬのアリクウォットまたはＮａ186ＲｅＯ4を腫瘍小結節内に直径約５ｍｍで直接注入した。約１０秒間にわたって注入を実施し、さらに注入完了後５〜１０秒間その位置に針を保持して、背圧をすべて消散させ、注入部位における漏出を最小にした。注入の直後（１０〜１５分以内）と４日間にわたって毎日、１４０±２０ｋｅＶのエネルギーウインドウを使用し、ＧＥのＳｔａｒｃａｍ３００システムを用いて動物と計測基準を画像化した。２日目と４日目に画像化を終えたのち、動物群を犠牲にして各種の器官を集めて計量し、186Ｒｅの生物分布を評価するためにｃｐｍ／ｇｍを測定した。
選択した器官の４日目の186Ｒｅの生物分布を表ＩＶのＡに示す。結果は、注入した総数に対する、特定の器官からの回収の崩壊補正後の比率で表している。器官と腫瘍はその大きさが著しく異なっているので、各器官に見出した186Ｒｅの相対濃度を表ＩＶＢで比較している。結果は、１ｇの組織塊に見出される注入数の比率を崩壊補正を行って表している。腫瘍あるいは全身に対応する関心領域（ＲＯＩ）を確認することによって、全身のシンチグラフィ画像を分析した；次に、各関心領域の数量を注入後の時間の関数として求めた。腫瘍内の標識の局在化を、腫瘍ＲＯＩの数量と全身ＲＯＩの数量の比として計算した（表Ｖの２列目および３列目）。身体内の標識の保持率を、全身ＲＯＩの数量と基準ＲＯＩの数量の比として計算した（表２、４列目と５列目）。
表ＩＶと表Ｖのデータは、腫瘍内部位からの186Ｒｅの漏出の大きさが、化合物２４の形での放射性核種の投与によって大きく減少していることを示している。さらにこれらのデータは、腫瘍内保持を測定するために用いた二つの異なる方法（全身ガンマシンチグラフィと直接励起）の間における優れた一致を示している。
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例１０
186Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とＮａ186ＲｅＯ4の関節内注入後のＩｎ  Ｖｉｖｏ保持
本発明の化合物の二つの特性は、治療上の有効性とともに、部位選択的な投与と保持を実現するうえで重要である：
ａ）非結合治療薬に比べた場合の、適用部位への保持の強さと、
ｂ）部位への注入後のその分布形態（不均質と均質）。
蛍光あるいは放射標識化合物を用いて、レニウムを含む化合物の関節腔内の滑膜内層への供給に基づいて、これらの特性を分析した。
186Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構５の化合物２４）を例３ｈに記述したように調整し、濃縮貯蔵溶液をエチルアルコール中で約４０μＬの最終容積にした。ｉｎ  ｖｉｖｏ注入のために、以下のようにして化合物２４の調整剤とＮａ186ＲｅＯ4を作成した。Ｎａ186ＲｅＯ4（ＮＥＺ３０１、０．１ＮのＮａＯＨ中）を３００ｍＯｓＭの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、ｐＨ紙を用いてｐＨが７．０であることを確認し、次にその調整剤を０．２２μｍのフィルターを通して再滅菌した。滅菌した３００ｍＯｓＭグルコースで化合物２４を希釈し、滅菌した０．１ＮのＮａＯＨの付加によってｐＨを７．０に調整した（グルコース希釈液に緩衝液が存在しないことと、ゲンチジン酸が最終調整剤に存在し、未調整のｐＨ１〜２を生じているという事実を必要とする）。滅菌した２５Ｇ×５／８インチの針を備えた１．０ｍＬのツベルクリン注射器を計量し、約０．１ｍＬのＮａ186ＲｅＯ4、あるいは化合物２４の調整剤を滅菌法を用いて入れ、注入前の重量を求めるために再計量を行った。さらに、各調整剤のｃｐｍ／μＬを求めるために、アリクウォットを取り出した。
関節内注入後の上述の調整剤の保持を、以下のようにして評価した。体重３〜４ｋｇのメスのニュージーランドホワイトウサギを、ケタミンとキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）を用いて麻酔し、膝の部位を慎重に剃り、ヨウ素の溶液で消毒した。滅菌法を使用して膝を約１２０°に屈曲させて膝蓋骨を一時的に側方へ移動させ、関節空間内へ皮膚を通って針を中央に挿入し、約０．１ｍＬの化合物２４（３頭の動物）あるいはＮａ186ＲｅＯ4調整剤（２頭の動物）を注入し、針を取り出して膝蓋骨を正常な位置に戻した。注射器を再計量し、注入前後の重量の間の差を計算し（注入物の密度を１．０ｇ／ｍＬと仮定）、各調整剤の既知の体積のアリクウォットの計数によって得たｃｐｍ／μＬ値に測定した体積を掛けて、注入した化合物２４またはＮａ186ＲｅＯ4の正確な体積と作用を求めた。関節内注入の５〜１０分後以内に、既知の体積の血液（約１ｍＬ）を耳中心動脈から取り出した。尿と便を独立に採取できるケージに動物を入れ、６日間にわたって観察した。それぞれの日に血液を取り出し、それまでの２４時間に排出されたすべての尿を集め、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  Ｍｏｄｅｌ  ５００３ガンマ計測器を使用して既知の体積の血液と尿のアリクウォットのｃｐｍ／ｍＬを求めた。総血液生産量を、全体重の５．５％と血液のｃｐｍ／ｍＬに基づいて見積もった；総尿量を、２４時間の尿体積と尿とｃｐｍ／ｍＬに基づいて計算した。便については有意な分量を検出しなかった。０、１、４、および６日目にＧＥのＳｔａｒｃａｍ  ３００システムを約１２０〜１５０ｋＥＶのエネルギーウインドウで使用してガンマシンチグラフィを実施した。６日目に、血液および尿標本の採取後に動物を犠牲にし、各種の器官を集めて計測し、186Ｒｅの生物分布の評価のためにｃｐｍ／ｍＬを測定した。
化合物２４およびＮａ186ＲｅＯ4の血液中における循環濃度と、注入後６日間にわたる期間に尿中に排出された分量を表ＶＩに示す。選択した器官の６日目における186Ｒｅの分布を表ＶＩＩに示す。表ＶＩおよび表ＶＩＩのすべての結果は、崩壊の補正後の注入量に対する比率で表している。表ＶＩおよび表ＶＩＩのデータは、血液濃度、尿排出量、および他の器官への蓄積によって測定した関節内空間からの186Ｒｅの漏出の大きさが、化合物２４の形での放射性核種の投与によって大きく減少したことを示している。さらに、ガンマシンチグラフィ画像からの特定の関心領域（膝および／または全身）の分量の測定によって、膝への保持の評価を行い、表ＶＩＩＩに示した。これらの結果も、化合物２４の形で放射性核種を投与したときの保持の大きな改善を示している。
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例１１
関節内注入後の脂肪親和性シアニン抱合体の滑膜における分布
関節内注入後の滑膜細胞による結合の均質性あるいは不均一性を評価するために、３００ｍＯｓＭでｐＨ７．０のグルコース内の化合物Ｔ（上記の例２を参照）のヨウ化塩１０μＭ溶液約０．１ｍＬを例１０に記述したように膝の中に注入した。１時間後に動物を犠牲にし、注入を行った膝関節と行っていない膝関節の両方を切開した。薄い切片を切開するためには鉱物質除去が必要であり、鉱物質除去を行う媒質は本発明の化合物を組織から除去してしまうため、全関節の横断切片は実現不可能であった。したがって、膝蓋骨の下に入れて滑膜腔との境界を形成する膝蓋下脂肪パッドを慎重に除去し、ドライアイス上で急速に凍結させ、凍結切片が調整されるまで−８０°で貯蔵した。厚い（１０μ）低温槽切片を切断し、スライドガラスに付着させ、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡によって分析した。
脂肪パッド切片（注入を行った膝と行わなかった膝）の光学顕微鏡写真は、滑膜細胞が、脂肪パッドの関節空間に面する表面に薄く暗い線状に切片の内側の縁に沿って層をなしていることが、１００倍の拡大率で調べたときに観察された。（滑膜層は、正常な関節では僅かに１から２つの細胞の厚さであるが、関節炎の関節では過剰増殖によって厚みを増している）。残りの組織は、主に大きな脂肪細胞によって構成されていた。注入を行った膝から青の励起光を当てたときの切片の照明は、明るく比較的均一な標識の存在が基本的に滑膜細胞層に限定されていることを示し、一方、脂肪細胞領域あるいは注入を行わなかった膝は、非常に暗い緑の自己蛍光のみを示した。
例１２
血管内部位への脂肪親和性シアニン抱合体の保持
本発明の化合物が一度適用された血管内部位にとどまるかどうかを調べるために実験を実施し、その実験では、例２に記述したように調整した125Ｉで置換した脂肪親和性シアニン（化合物１２、反応機構２）を麻酔したウサギの大腿動脈の管腔表面に適用した。大腿動脈を外科的に分離し、小さな近心の側枝に短長のＰＥ１０管でカニューレを挿入した。側枝の周囲の１ｃｍの動脈部分を閉塞させ、125Ｉで置換した化合物１２を含む溶液２０〜５０μｌをカニューレを通して閉塞部分に投与し、５〜１０分間とどまるようにした。その後125Ｉで置換した化合物をカニューレに沿って取り出して側枝を恒久的に接合し、血流を回復させるために大腿動脈の閉塞を取り除き、大腿の切開を閉じた。次に、Ｌｕｄｉｕｍ  Ｍｏｄｅｌ  ２２００  Ｓｃａｌｅｒ  ＲａｔｅｍｅｔｅｒとＭｏｄｅｌ  ４４−１７  ２インチｃｒｙｓｔａｌを用いて、125Ｉの検出用に最適化したウインドウで125Ｉの放射能をその後３週間にわたって選択した時間で観察した。
結果として得られたデータの図による分析は、２相の放出過程において、適用物質（放射能）の３４．０±１０．９％（平均±ｓｅｍ、ｎ＝４）が最初の２４時間後に動脈にとどまり、最初の放出半減期が０．７７±０．２９日であることを示した。しかし、最初の２４時間後ののちには、残りの物質は非常にゆっくりと放出され、放出の半減期は１５．２４±２．８９日であった。したがって、血管内適用部位からの放出が遅いことから、顕著な量の125Ｉ置換化合物を適用後少なくとも３週間に検出することができた。
例１３
Ａ１０細胞に対するＩｎ  Ｖｉｔｒｏでのコルヒチン脂肪親和性シアニン抱合体の抗増殖作用
本発明の化合物の抗増殖作用を調べるために、筋原細胞として増殖し、表現型的に平滑筋細胞に類似した細胞に成長する、Ａ１０細胞と胚のラットの胸大動脈に由来するクローン細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究を実施した（Ｂ．ＫｉｍｅｓとＢ．Ｂｒａｎｄｔ、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．９８：３４９（１９７６）。通常は、１２槽の平板で２５００〜１０、０００のＡ１０細胞／ｃｍ2を１０％子ウシ血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）に接種し、３７℃で２４時間かけて付着させ、安定化させた。次に、試験物質を必要な濃度で適切な細胞結合媒質に調整し、平板培養の培地を吸引したのち、個々の槽に３７℃で僅かに１０分間だけ入れた。次に処理物を吸引し、媒質を含む非処理の培地で槽を４回洗浄し、研究の期間中は非処理の１０％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭを含む培地に入れた。処理適用後の異なる時間に、３つの槽を吸引し、吸引物を保存して、０．２５ｍｌの０．２５％トリプシンで槽を処理して付着した細胞を除去した。トリプシンの細胞に対する酵素作用を、余分な蛋白質（１．７５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ）の付加によって停止させ、吸引物を槽に戻し、結果として得た細胞懸濁液のアリクウォットをＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＺＭとＳａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔａｎｄ  ＩＩ）で計測した。細胞数は、成長領域（槽底の表面領域）のｃｍ2当たりの細胞数に規格化した。
下記の表ＩＸに示すように、本発明の化合物（化合物１９、反応機構３、例３ｉ、ここでは”コルヒチン抱合体”と呼ぶ）で処理した細胞培養における７日後の増殖は、賦形剤で処理した最大の成長の僅かに５．２％であった。顕著な細胞結合の蛍光が見られ（フロー血球計算法によって測定）、コルヒチン抱合体のＡ１０細胞への結合の存在を示した。反対に、同一の初期濃度の非抱合コルヒチンで処理した細胞の存在は、賦形剤処理細胞の細胞密度の半分でしかなく、本発明の化合物で得たものの約１０倍の細胞数の上昇を示した。したがって、本発明の化合物は、僅かに１０分間の暴露にも関わらず母体化合物の抗増殖作用のＡ１０細胞内への顕著な保持を可能にし、同じ方法で適用した非抱合コルヒチンよりもはるかに大きな抗増殖作用を示した。
例１４
抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体の生体膜への結合
本発明の抗凝固薬化合物を生体膜へ安定して結合することができるかどうかを評価するために、上記の例１に記述したようにウサギの赤血球ゴーストでｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究を実施した。２×１０8ゴースト／ｍｌを、（１）抗凝固薬を含まない誘導脂肪親和性シアニン（反応機構１、例３ａの化合物７）、（２）抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構４、例３ｊの化合物２１）、または（３）蛍光イソチオシアン酸塩標識ヘパリン（ＦＩＴＣヘパリン）で、１０μＭ、２０μＭ、および２０μＭの濃度でそれぞれ標識した。次にゴーストをさらに洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡと５％のＢＳＡを含むリン酸塩緩衝食塩水中に３７℃で２４時間入れた。試料を撹拌し、各試料から５０μｌのアリクウォットを取り出し、マイクロタイター平板培養槽の２００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００▲Ｒ▼の中に入れた（全懸濁液蛍光を意味する）。元の試料を１０分間遠心分離し、５０μｌのゴースト上澄み液の試料を取り出し、２００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００▲Ｒ▼の中に入れた（液相中のみでの遊離蛍光を意味する）。全試料の蛍光を、蛍光光度マイクロタイター平板培養リーダーで測定した。結合した蛍光を、未染色ゴーストからのバックグラウンドの補正後に、全体から遊離蛍光を減算することによって求めた；結合および遊離蛍光を全蛍光で割り、１００を掛けることによって、遊離および結合蛍光の比率をそれぞれ求めた。
以下の表Ｘに示した結果は、本発明の抗凝固薬抱合体は、抗凝固薬を含まない本発明の化合物の９４．６９％の保持と比べて、２４時間後にゴーストの膜に９０．９４％結合しており、優れた膜保持を示したことを表している。ＦＩＴＣヘパリンは、２４時間後にとどまっていた蛍光が僅かに３７．６３％であり、不十分な保持しか得られなかった。この数値は、ゴースト上のＦＩＴＣヘパリンの蛍光信号がバックグラウンド蛍光強度を僅かに上回る程度であったことから、ＦＩＴＣヘパリンの実際の保持率の過大評価であると考えられ、これらの数値から計算した結合および遊離率は、その精度に疑問が残る。しかし、以下のデータは、本発明の化合物は、蛍光ヘパリンとは異なり、生体膜上に十分保持されていることを明らかに示している。
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例１５
生体膜表面に結合したときの抗凝固薬−脂肪親和性シアニン抱合体の抗凝固薬保持特性
本発明の化合物の抗凝固特性が、生体膜表面上に被膜したときに保持されるかどうかを調べるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を実施し、本発明の化合物の凝固酵素トロンビンを阻止する能力を分析した。ウサギの赤血球ゴーストを１０μＭの抗凝固剤−脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構４、例３ｊの化合物２１）で最初に標識し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで４回洗浄し、次に様々な数量のゴースト／ｍｌに希釈した。既知の分量のゴーストをマイクロタイター平板培養槽中に入れ、化合物の既知の標準濃度によって生じる蛍光と、観察された蛍光を比較することによって、ゴースト上の化合物２１の濃度を分析した。次に、ＫｒｔｅｎａｎｓｋｙとＭａｏ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２１１：１０（１９８７）によって報告されたものと同様の方法によって活性分析を実施し、その分析では、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液中の１：１０に希釈したヒト血漿１００μｌ、様々な濃度の標識したゴーストあるいはトロンビン阻止剤を含む５０μｌのＰＢＳ、そして一定量（０．５ｎＭ）のトロンビンを含む５０μｌのＰＢＳを、マイクロタイター平板培養槽に加え、分光光度平板培養リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）で４０５ｎｍにおける吸光度の変化を６０分にわたって記録した。阻止剤で処理した槽から得たデータを、阻止剤の非存在下で得た吸光度領域の阻止率として表した。代表的な実験から得られたデータを図６に示す。ヘパリン（●）および本発明の抗凝固薬抱合体（○）のそれぞれの３変数非線形論理回帰によって得たＥＣ50値である１．０３ｎＭおよび２１．２３ｎＭ（＠１．４３×１０7ゴースト／２００ｕｌ）は、生体膜に適用したときに、本発明の化合物は親化合物に比べて、トロンビン阻止薬としての効果が２０培よりある程度少ない大きさだけ小さいことを示している。しかし、同時に分析した順次希釈したゴーストを含まない上澄み液（◇）がトロンビン阻止作用をまったくもっていないことから、この阻止作用はすべての膜に結合している。したがって、本発明の化合物は、生体膜に結合したときにおいても、依然として強力な抗トロンビン作用を提供する。
本発明の様々な側面を、特定の好ましい実施例、すなわち化学療法および放射線療法の抗増殖化合物の合成と使用に関して上記に記述し、例示してきた。しかし、他の数多くの実施例が、技術に精通した者には明らかである。例えば、様々な疾患状態あるいは病的状態の治療または分析のために、他の化学療法および放射線療法の抱合体を合成し、使用することができる。さらに、本発明の化合物と方法を、抗菌薬、抗真菌薬、あるいは抗炎症薬などの他の種類の薬物の部位選択的供給と保持の開発のために使用することができる。したがって、本発明は、具体的に記述し、例示した実施例に限定されるものではなく、以下の請求範囲の範囲から離脱しない範囲で変形と修正を行うことができる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図４】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図５】
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【図６】
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