(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検ヒト血液中の赤血球と、該被検ヒト血液中の液体成分と、緩衝液とを混合し、該混合液中での赤血球の凝集を測定することから成る前記被検ヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９の測定方法。
【請求項２】
前記混合液は、被検ヒト血液に緩衝液を加えることにより得られる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記混合液は、被検ヒト血液の血球成分と液体成分とを分離した後、該血球成分と、該液体成分と、緩衝液とを混合することにより得られる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記混合液のｐＨは4.8 ないし6.5 である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記混合液中の赤血球濃度は0.3 〜5.0 v/v%である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
赤血球の凝集は、前記混合液の温度を４℃ないし３７℃にして測定される請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
赤血球の凝集の測定は目視により行なわれる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの血液中のヒトパルボウイルスＢ１９の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトパルボウイルスＢ１９感染症の臨床症状は、伝染性紅斑、無形成発作、産婦人科領域における胎児水腫、成人におけるリウマチ様関節症が報告されている。
【０００３】
ヒトパルボウイルスＢ１９は赤芽球系細胞でのみ増殖し、細胞を破壊するので、感染が成立すると血中の赤芽球系細胞が急激に減少する。そのため感染前から機能的な赤血球数が少ない血液疾患患者は、危険な領域まで赤血球が減少し重篤な状態になる。さらに、通常では一過性の感染で終了するが、免疫不全状態にある患者では活動性持続性感染となり、赤芽球の破壊が継続的に起き、その結果減少した赤血球の補給が困難になり危機的な貧血状態が続く。一般に胎児もまた免疫系が未熟なため、ヒトパルボウイルスＢ１９感染により急激な貧血から水腫状態になり死亡に至る。最近では、ヒトパルボウイルスＢ１９の感染時に見られる臨床像が、急性脳炎や急性心筋炎など多岐にわたっていることが明らかになった。
【０００４】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、わが国で最初の感染が報告されてから数年おきに流行が見られている。最近では１９８０〜８１年、１９８６〜８７年、１９９１〜９２年に全国的な流行が見られた。感染経路は、ウイルス血症時期にうがい液からウイルスが検出されることから、飛沫感染及び手指を通した接触感染によるものが主流であると言われていた。しかし、最近になって血中ウイルス保有者（初期の不顕性感染者）の献血に由来した、輸血及び第８因子等の血液製剤による感染も明らかになってきた。
【０００５】
以上のように、ヒトパルボウイルスＢ１９は、臨床上重要な疾患であり、数年間隔で流行し、輸血及び血液製剤を通しても感染を起こすことからその診断法の確率が急務となっていた。
【０００６】
ヒトパルボウイルスＢ１９が感染した場合、１週間以内にウイルス血症になるが、症状としては軽い感冒様症状か無症状である。そのため、ヒトパルボウイルスＢ１９感染者は、ウイルス血症期間中にヒトパルボウイルスＢ１９感染を認識せずに過ごす場合がほとんどである。
【０００７】
一般的に、ウイルス感染の診断はウイルスの検出が最も確実である。従来ではヒトパルボウイルスＢ１９の検出はドットブロットハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により行なわれていた。しかし、ドットブロットハイブリダイゼーション法は操作が煩雑でルーチン向きではない。また、ＰＣＲ法は施設間で基準に差があるため結果に統一性が欠けているし、ＰＣＲのための装置と試薬を必要とし、それほど迅速でもない。また、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原検出ＥＩＡは上市されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便、迅速、かつ安価にヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９を測定する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、ヒトパルボウイルスＢ１９のレセプターが、赤血球表面上に存在するＰ抗原であることに着目し、ヒトパルボウイルスＢ１９と赤血球上のＰ抗原との凝集反応を利用した測定系を確立できないか研究した。その結果、ヒト血液中に仮にヒトパルボウイルスＢ１９が存在しても血液中で赤血球の凝集が起きることはないにもかかわらず、ヒトパルボウイルスＢ１９が存在する場合には、血液に緩衝液を加えることにより赤血球の凝集が起きることを見出し、この現象を利用することにより凝集反応を利用したヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９の測定系を確立することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、被検ヒト血液中の赤血球と、該被検ヒト血液中の液体成分と、緩衝液とを混合し、該混合液中での赤血球の凝集を測定することから成る前記被検ヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９の測定方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、まず、被検ヒト血液中の赤血球と、該被検ヒト血液中の液体成分と、緩衝液とを混合する。ここで、血液中の液体成分とは血清又は血漿を意味する。なお、この混合により得られる混合液中には、他の成分、例えば白血球や血小板のような血球成分や、その他の通常血液中に存在する種々の成分が含まれていてもよい。また、緩衝液中には、ウシ血清アルブミン、ゼラチンや浸透圧調整のためのグルコース等の成分が含まれていてもよい。
【００１１】
上記の混合は、最も簡便には、全血に緩衝液を加えることにより行なうことができる。血球成分と血清又は血漿に分離した検体（以下、「 血球分離検体」と言うことがある）を用いる場合には、該血球成分と血清又は血漿と緩衝液とを混合する。この場合、血球成分に緩衝液を加えた血球浮游液と、血清又は血漿に緩衝液を加えた溶液とを混合することが好ましい。また、血球が既に血餅となっている場合には、常法により血餅を可溶化したもの又はこれから回収した赤血球を用いる。
【００１２】
混合液のｐＨは好ましくは4.8 〜6.5 、さらに好ましくは4.8 〜5.4 、最も好ましくは5.0 である。また、混合液中の赤血球の濃度は好ましくは0.3 〜5.0 v/v%、最も好ましくは１ v/v% である。
【００１３】
次いで、上記混合液を静置して赤血球の凝集反応を行なう。凝集反応を行なう場合の混合液の温度は４〜３７℃が好ましく、１５〜２５℃がさらに好ましい。凝集反応の時間は特に限定されないが、通常６０分間〜１２０分間程度が適当である。
【００１４】
もし、血液の液体成分中にヒトパルボウイルスＢ１９が存在するならば、ヒトパルボウイルスＢ１９がその対応レセプターである赤血球表面上のＰ抗原と反応することにより、凝集が生じる。一方、血液中にヒトパルボウイルスＢ１９が存在しない場合には赤血球の凝集は起きない。従って、この凝集を測定することにより、被検ヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９を測定することができる。
【００１５】
凝集の測定は、従来の凝集法により免疫分析と同様に行なうことができる。例えば、凝集は目視により測定することができ、この場合には、被検ヒト血液中にヒトパルボウイルスＢ１９が存在するか否かを知る、定性的な測定、すなわち該ウイルスの検出を行なうことができる。あるいは、目視により凝集を測定する場合であっても、血清又は血漿を段階希釈しておき、どの希釈倍率まで凝集が目視観察されるかにより該ウイルスを定量ないしは半定量することも可能である。また、従来の凝集法と同様に、混合液の吸光度や濁度を測定することにより、赤血球の凝集を定量することもできる。このように、本発明で言う「 測定」には、該ウイルスの検出並びに定量及び半定量が包含される。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１    全血（血球未分離血液）を用いたヒトパルボウイルスＢ１９の検出
(1)   被検血液
他の方法によりヒトパルボウイルスＢ１９が陽性と判定されたヒト全血  ３例
【００１８】
(2)   緩衝液の調製
蒸留水約８００ｍｌに、リン酸水素二ナトリウム（最終濃度0.002 Ｍ、以下同じ）、リン酸二水素カリウム（0.098 M ）、塩化ナトリウム（0.15 M) 、グルコース（5 g/l ）、ゼラチン（0.3 g/l)、ウシ血清アルブミン（0.2% w/v) を加え、１Ｍリン酸水素二ナトリウムでｐＨを5.0 に調整した後で蒸留水で1 リットルに調製した。
【００１９】
(3)  血液希釈液の調製
上記被検血液を緩衝液で１００倍（ヘマトクリット0.4%)希釈した。
【００２０】
(4)  凝集反応
(3)で調製した血液希釈液を凝集用プレートに１ウェルにつき３０μｌずつ加え、軽く振盪した後常温（１５〜２５℃、以下同じ）で９０分間静置した。
【００２１】
(5)   結果
目視により凝集を判定したところ、被検検体３例全てについて凝集が認められた。これにより、本発明の方法により、簡便かつ迅速にヒトパルボウイルスＢ１９の検出が可能であることが確認された。
【００２２】
実施例２    血球分離検体を用いた検出方法
(1)   検体
ヒトパルボウイルスＢ１９陽性の血球分離検体３例、すなわち、検体１、検体２、検体３の各々の赤血球と血漿（すなわち各赤血球と各血漿はそれぞれ同一の血液検体から得られたもの）並びにヒトパルボウイルスＢ１９陰性の血球分離検体３例、すなわち、検体４、検体５、検体６の各々の赤血球と血漿（すなわち各赤血球と各血漿はそれぞれ同一の血液検体から得られたもの）
【００２３】
(2)   緩衝液の調製
実施例１に同じ
【００２４】
(3)   血球の調製
他の方法によりヒトパルボウイルスＢ１９が陽性又は陰性と判定された検体血液に、2.2%クエン酸／0.8%クエン酸ナトリウム／2.2%ブドウ糖を加えて放置し、血球と血漿に分離した。
【００２５】
(4)   凝集反応
１）凝集用プレート上に、サンプルアプライ用の１レーンを残して緩衝液を１ウェルにつき３０μｌ加えた。サンプルアプライ用のレーンに緩衝液で１００倍に希釈した血漿を１ウェルにつき６０μｌ加え、そのうち３０μｌを隣のレーン（緩衝液を加えてある）に加え、ピペットで撹拌し、うち３０μｌをさらに隣のレーン（緩衝液を加えてある）に加え、同様の操作を繰り返して段階希釈した。最後のレーンでは攪拌後３０μｌを廃棄した。
２）血球を緩衝液に1.0%(v/v) となるよう懸濁し、上記プレートに１ウェルにつき３０μｌずつ加え、軽く振盪した後常温で９０分間静置した。
【００２６】
(5)   結果
各ウェル中の赤血球の凝集を目視により観察した。結果を下記表１に示す。
【００２７】
【表１】
0003706190.tif 000002
【００２８】
表１に示されるように、ヒトパルボウイルスＢ１９陽性の検体については、目視により血漿希釈倍率１６００倍〜１２８００倍まで凝集が確認された。一方、陰性検体については、測定した全ての血漿希釈倍率において凝集は観察されなかった。以上より、実施例１と同様、簡便かつ迅速な手技である本法によりヒトパルボウイルスＢ１９の検出が可能であることが確認された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、簡便、迅速、安価にヒト血液中のヒトパルボウイルスＢ１９を測定することができる方法が提供された。本発明の方法では、凝集法のための抗原担持担体として、被検検体中の（すなわち被検者自身の）赤血球を用いているため、赤血球由来の非特異的反応が軽減されるので、正確な測定を行なうことができる。