(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトオリゴ糖とマンノースおよび／またはα−マンノシル糖化合物を含有する溶液にα−マンノシル基転移酵素を作用させる工程および該工程で生成したマンノシル−マルトオリゴ糖にシクロデキストリン合成酵素を作用させる工程よりなることを特徴とするシクロデキストリンのグルコシル基の水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリンの新規製造方法。
【請求項２】
α−マンノシル基転移酵素をｐＨ３〜１０および温度２０〜９０℃の条件で作用させる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
シクロデキストリン合成酵素をｐＨ３〜１０および温度２０〜９０℃の条件で作用させる請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シクロデキストリンのグルコシル基にα結合でマンノシル基が結合したマンノシル−シクロデキストリンの新規製造方法に関する。詳しくはα−マンノシル基転移酵素およびシクロデキストリン合成酵素の反応を利用するα−マンノシル糖化合物とマルトオリゴ糖からの効率的なマンノシル−シクロデキストリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記することもある。）は、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
【０００３】
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質を取り込む性質を有している。ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。
【０００４】
最近、医薬品工業の分野では、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞およびマクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
【０００５】
以前、我々は上述した現状に鑑み、ＣＤとα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に、α−マンノシル基転移酵素を作用させることによって、ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤの開発に成功している。
【０００６】
しかし、マンノシル基転移酵素の転移反応を利用して、直接マンノシル−ＣＤを合成するこれまでの方法は収率の面に問題があり、より効率的なマンノシル−ＣＤの製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は鋭意検討を重ねた結果、α−マンノシル糖化合物とマルトペンタオースなどのマルトオリゴ糖に市販のα−マンノシル基転移酵素を作用させ、α結合でマンノシル基を転移結合させたマンノシル−マルトオリゴ糖を合成し、これにシクロデキストリン合成酵素を作用させることによって、ＣＤのグルコース残基に直接マンノシル基が結合したマンノシル−ＣＤを効率良く合成することができることを見出した。我々はこの知見に基づいて本発明を完成したのである。
【０００８】
すなわち、本発明はマルトオリゴ糖とマンノースおよび／またはα−マンノシル糖化合物を含有する溶液にα−マンノシル基転移酵素を作用させる工程および該工程で生成したマンノシル−マルトオリゴ糖にシクロデキストリン合成酵素を作用させる工程よりなることを特徴とするシクロデキストリンのグルコシル基の水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリンの新規製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明により得られる上記分岐ＣＤは、図１に示す構造式Ｉ〜III で表すことができる。
【００１０】
本発明に係わる分岐ＣＤは、マルトオリゴ糖とマンノースおよび／またはα−マンノシル糖化合物を含有する溶液にα−マンノシル基転移酵素を作用させる工程およびこの工程で得られたマンノシル−マルトオリゴ糖にシクロデキストリン合成酵素を作用させる工程によって製造することができる。
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるマルトオリゴ糖は、グルコースがα−１，４結合した一連のオリゴ糖であり、その鎖長は限定されるものではないが、通常は炭素数１０個程度までのオリゴ糖が用いられる。これらの中でマルトテトラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオースなどが好ましく、特にマルトペンタオースが好適に用いられる。これらは粗製物，精製物のいずれであってもよく、また混合物であってもよい。
【００１２】
次に、本発明に用いる糖供与体であるα−マンノシル糖化合物としては、通常はメチル−α−マンノシド，エチル−α−マンノシド，フェニル−α−マンノシド，パラニトロフェニル−α−マンノシド、α−マンノオリゴ糖などのα−マンノシル基を含む配糖体やオリゴ糖、あるいは多糖やその部分分解物およびそれらの混合物（マンノースとの混合物も含む）などがある。
【００１３】
本発明に用いるα−マンノシル基転移酵素としては、マルトオリゴ糖と糖供与体、すなわちマンノースまたはα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に作用させたとき、α−マンノシル糖化合物を分解し、そのα−マンノシル基をマルトオリゴ糖にα結合で転移させ、マンノシル−マルトオリゴ糖を合成するもの、またはマンノースとマルトオリゴ糖の縮合反応を触媒し、マンノシル−マルトオリゴ糖を合成するものであればよく、種々の酵素が使用可能である。
【００１４】
このα−マンノシル基転移酵素は、自然界に広く分布しているものである。通常は、タチナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来の酵素、サザエや肝臓（ウシ，ラット，ヒト）などの動物由来の酵素、さらにはアルスロバクター・オーレセンス，アスペルギルス・ニガーなどの微生物由来の酵素がよく用いられているが、好ましくはタチナタマメ由来の酵素を用いる。
【００１５】
該転移酵素の作用により生成するマンノシル−マルトオリゴ糖はマンノシル−ＣＤの合成に利用されるが、このものは粗製物，精製物あるいは混合物のいずれであっても使用可能である
【００１６】
次に、本発明に用いるシクロデキストリン合成酵素としては、微生物に由来するものが用いられ、通常はバシルス・ステアロサーモフィラスあるいはバシルス・サーキュランスなどに由来するものが使用される。
【００１７】
本発明の方法において、マンノシル−マルトオリゴ糖を合成する反応は、次の条件で行われる。マルトオリゴ糖と糖供与体を含む溶液（水溶液または懸濁液）は、通常マルトオリゴ糖の濃度が約１〜９０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは2.５〜５０％（Ｗ／Ｗ）、糖供与体の濃度が約１〜９０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは2.５〜５０％（Ｗ／Ｗ）である。なお、マルトオリゴ糖に対する糖供与体の比率（重量）は、使用する糖供与体の種類によって異なるが、通常0.１〜５０倍の範囲、好ましくは0.３〜２倍の範囲とするのが適当である。
さらに、マンノシル−ＣＤを合成する反応については、マンノシル−マルトオリゴ糖の濃度が通常約１〜９０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは2.５〜２５％（Ｗ／Ｗ）となるように設定して行う。
【００１８】
また、マンノシル−マルトオリゴ糖を合成する反応およびマンノシル−ＣＤを合成する反応は、いずれもｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度２０〜９０℃、好ましくは４０〜７０℃の条件にて実施することが適当である。使用酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が0.１時間〜２週間、好ましくは１時間〜１週間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
次に、以上のような方法で得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフィーにかけて、反応生成物を分画・分取した後、酵素分解法，ＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定および高速液体クロマトグラフィーの溶出時間，13Ｃ−ＮＭＲにより構造解析を行った結果、図１に示す構造式Ｉ〜III で表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００２０】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
メチル−α−マンノシド２０ｇ，マルトペンタオース１０ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.５）４2.５ｍｌに溶解させた後、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を１１単位加え、５５℃で１週間反応させた。反応終了後、反応液の一部をアミノ系カラム（東ソー製、TSK-GEL Amide-80、4.６×２５０ｍｍ、溶媒６５％アセトニトリル、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図２に示す。転移生成物の生成率は、使用したマルトペンタオースの１５％であった。
【００２１】
次いで、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィー（昭和電工製、ガードカラム；Asahipak NH2P-130G: 本カラム;Asahipak NH2P-50 、溶媒６８％アセトニトリル、流速2.５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃）にかけて転移生成物を1.５ｇ（収率５％：原料基準）分取した。この転移生成物はグルコアミラーゼ消化後、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼにより、マルトペンタオース，マルトテトラオース，マルトトリオースおよびマンノースに分解された。また、13Ｃ−ＮＭＲ解析による結果は、図３に示したように、グルコースの６位炭素に低磁場シフトが見られることから、グルコースの６位にマンノースが結合した６−マンノシル−マルトペンタオース（６5 −Ｏ−，６4 −Ｏ−，６3 −Ｏ−マンノシル−マルトペンタオースの混合物）であることが確認された。
【００２２】
このマンノシル−マルトペンタオース６０ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.２）2.１ｍｌに溶解させた後、バシルス・ステアロサーモフィラス由来のシクロデキストリン合成酵素（林原生物化学研究所製）を３３単位加え、４０℃で１０分間反応させた。反応前後の反応液の一部をＯＤＳ系のカラム（ＹＭＣ製、YMC-Pack ODS-AP302、4.６×２５０ｍｍ、溶媒３％メタノール、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、室温）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図４，図５に示す。生成物Ａ，Ｂ，Ｃ全てを合わせると生成率は１６％であった。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液をＯＤＳ系のカラム（ＹＭＣ製、YMC-Pack ODS-AP302、4.６×２５０ｍｍ、溶媒３％メタノール、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、室温）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて精製した生成物Ａ，Ｂ，Ｃをそれぞれ４ｍｇ，４ｍｇ，１ｍｇ（収率はそれぞれ７％，７％，２％）分取した。
【００２３】
上記方法で単離された生成物Ａは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１１３４であることが判った。また、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとα−ＣＤに分解された。さらに、13Ｃ−ＮＭＲ解析結果を図６に示すように、α−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式Ｉ）であることが確認された。
【００２４】
上記方法で単離された生成物Ｂは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１２９６であることが判った。また、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとβ−ＣＤに分解された。このことから、上記の結果も踏まえて、生成物Ｂはβ−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式II）であることが確認された。
【００２５】
さらに、上記方法で単離された生成物Ｃは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１４５８であることが判った。また、タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとγ−ＣＤに分解された。このことから、上記の結果も踏まえて、生成物Ｃはγ−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式III ）であることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、マンノシル基転移酵素とシクロデキストリン合成酵素を用いて、ＣＤ分子中のグルコシル基の水酸基にα−１，６結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤを効率よく得ることができる。このマンノシル−ＣＤは、医薬品分野のほか食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明により得られるマンノシル−ＣＤの構造を示す。
【図２】  実施例の転移反応液（α−マンノシダーゼ添加後）の高速液体クロマトグラフである。
【図３】  実施例の転移生成物の13Ｃ−ＮＭＲのスペクトルである。
【図４】  実施例の合成反応液（シクロデキストリン合成酵素添加前）の高速液体クロマトグラフである。
【図５】  実施例の合成反応液（シクロデキストリン合成酵素添加後）の高速液体クロマトグラフである。
【図６】  実施例の生成物Ａの13Ｃ−ＮＭＲのスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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