(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールデヒドロゲナーゼにクリスタリンを含有せしめることを特徴とする酵素活性の安定化方法。
【請求項２】
コレステロールデヒドロゲナーゼ溶液にクリスタリンを含有せしめることを特徴とする該溶液中の酵素活性の安定化方法。
【請求項３】
クリスタリンがα−クリスタリンである請求項１又は請求項２記載の安定化方法。
【請求項４】
クリスタリンを含有する安定なコレステロールデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項５】
クリスタリンがα−クリスタリンである請求項４記載の安定なコレステロールデヒドロゲナーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生理活性蛋白質の安定化方法に関する。より詳細にはクリスタリン（Crystallin）を生理活性蛋白質の溶液に含有せしめることによる、該生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より各種の生理活性蛋白質及び生理活性ペプチドが報告されている。しかしながらそれらは熱などに対して不安定なものが多く、安定性を十分に確保するための様々な試みがなされている。
【０００３】
例えば酵素は、温和な条件で触媒作用を示す為、従来より、臨床検査、生化学、食品工業等の分野で酵素の利用が盛んに行われている。特に臨床検査分野において用いられる各種生体成分測定用キットでは、従来は凍結乾燥した酵素を含有する試薬を、用時適当な緩衝液などで溶解して酵素溶液とし、用手法或いはオートアナライザーによる生体成分測定に適用していた。
【０００４】
この溶解して得られた酵素含有試薬は測定に使用する場合の温度、化学物質、他の蛋白質等の影響を受けやすく、長期の使用を可能ならしめるために試薬中の酵素の安定性を高める目的で、従来より各種の添加剤が検討されてきた。更に、最近になって、緩衝液中に測定に必要な試薬類を既に溶解してそのままオートアナライザー等に適用できる、いわゆる液状試薬なるキットの要望が高まっている。
【０００５】
これまでは、酵素試薬などは凍結乾燥した形態で供給されることが常であったため、凍結乾燥時に酵素の失活、変性を防止する方法について種々研究がなされてきている。例えばグルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等のアミノ酸又は蛋白質、シュクロース、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカプトエタノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトール等の多価アルコールをそれぞれ添加する方法等が一般的な酵素の安定化方法として知られている。
【０００６】
また、溶液中での安定化効果を発揮する添加物としては、酵素毎に種々の組み合わせが報告されている。例えば、リン酸塩とグルコースオキシダーゼを組み合わせる方法（特開平3-139278）、アデノシン三リン酸とグリセロールキナーゼを組み合わせる方法（特開昭59-21390）、ＦＡＤ、キレート剤とＬ−α−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭59-14788）、シュウ酸、フタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルタル酸などとグリセロリン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭60-126084）、グリセリン、ヨウ化カリウム、界面活性剤等の特定割合とコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭57-79885）、マグネシウムイオンとコレステロールエステラーゼを組み合わせる方法（特公昭61-21076）、アルコキシフェノールとペルオキシダーゼの組み合わせ（特開昭64-63380）、アミノピリンとペルオキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭61-224987）などが挙げられる。
【０００７】
一般的な酵素に適用できる方法としては、デキストラン等の水溶性高分子を酸化したのち還元剤でアルデヒド体とし、このものに酵素を共有結合で固定化させる安定化方法（特開昭64-60380）がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記に述べたように、酵素溶液に安定化剤を添加する方法は、酵素の種類により、添加する安定化剤が異なるのが一般的であり、酵素の種類により添加する安定化剤を選択する必要があった。又、安定化剤の安定化作用は、酵素との非特異的な相互作用によることが多く、そのために高濃度に添加する必要があった。
【０００９】
また、各種の酵素を特異的に安定化する効果のある添加物が、酵素を用いた臨床検査用キットに添加された場合、オートアナライザーを用いた多項目検査においては、その測定に支障を与えることがあり、使用が制限される等の問題点を有していた。例えば、コレステロールエステラーゼの安定化剤としてのマグネシウムイオンの添加は、同一セルを用いるオートアナライザーにおいてはマグネシウムの測定にプラスの誤差を与え、グルコースオキシダーゼの安定化にリン酸塩を使用したキットは同様に無機リンの測定に誤差を与えることとなる。
【００１０】
また、汎用性のある安定化剤としての牛血清アルブミンは濁りの発生、腐敗等の問題があった。
【００１１】
このように、溶液中の酵素の変性を防止し、更に活性の低下を防ぎ、長期間安定化する方法で、なおかつ他の測定系に影響を与えない効率的で汎用的な方法は従来は知られていなかった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、溶液中で生理活性蛋白質を安定化する効率的且つ汎用的方法を求め鋭意検討した。そして、生理活性蛋白質溶液中にクリスタリンを添加することにより、効率的且つ汎用的に生理活性蛋白質を安定化できることを知り、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は生理活性蛋白質にクリスタリンを添加し、生理活性蛋白質とクリスタリンとの特異的な相互作用により生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
【００１４】
本発明の対象とする生理活性蛋白質としては、酵素や各種の生理活性ポリペプチド等であり、とりわけ酵素を対象として安定化する効果が認められる。
【００１５】
酵素は動物、植物及び微生物由来のいずれでもよく、その種類としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素等のいずれでもよい。また、酵素の分子量、１次構造、２次構造、立体構造、４次構造（オリゴマー状態）の違いにも左右されない。
【００１６】
より具体的に示すと、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、アシラーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、アシルCoAオキシダーゼ、アシルCoAシンセターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロフォスフェイトオキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ムタロターゼ、ペルオキシダーゼ等を対象とすることができる。
【００１７】
本発明の対象となる生理活性蛋白質溶液の濃度としては特に限定されるものではないが、溶液状態であれば通常例えば数μg/mlから数mg/mlの範囲である。
【００１８】
本発明に使用するクリスタリンとは、動物の水晶体に特異的に存在する蛋白であり、レンズの透明度を維持する役目がある蛋白として知られている。このクリスタリンはα−クリスタリンとβ−クリスタリンの２形がほぼ等量に存在するとされ、魚類、両生類、ほ乳類のレンズにはこのほかにγ−クリスタリンも含まれている。また爬虫類、鳥類の場合にはδ−クリスタリンがあることが知られている。更に、α−クリスタリンはαＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン等に分類されている。
【００１９】
これらのクリスタリンは、ヒート・ショック・プロテイン（heat shock protein）の一種であり、最近は水晶体以外の組織にも存在が確認され、その作用が注目されている。
【００２０】
本発明には、何れの起源からのクリスタリンも使用できるが、供給源の安定性から動物眼球由来のクリスタリンが利用できる。また、より好ましくは、α−クリスタリンが挙げられる。
【００２１】
クリスタリンは、例えば新鮮な牛の眼球よりProc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻, 10449-10453頁（1992）記載の方法によって調製することができる。
【００２２】
その精製度合いは、本発明である生理活性蛋白質を安定化させる効果が発揮される程度であればよく、その添加量としては特に限定されない。
【００２３】
溶液状態の酵素に対する添加量について具体的に挙げれば、通常、酵素の0.01倍モル濃度以上で使用する。より好適には、0.05〜１倍モル濃度で使用する。
【００２４】
クリスタリンは、上記記載したように単一の生理活性蛋白質の安定化効果を発揮するばかりでなく、複数の生理活性蛋白質成分を含有する場合においても効果を発揮することができる。例えば、複数の酵素反応を利用して生体成分を測定する臨床検査用キット組成においても各酵素による相互の影響を回避することができる。
【００２５】
即ち、通常臨床検査用に使用される酵素は通常は充分に精製されているが、僅かに夾雑する雑蛋白やキット系に含まれる他の成分（例えば、界面活性剤等）、他の酵素（共役酵素等）が相互に影響を及ぼしあい、キットでは酵素単独よりもその酵素活性が不安定になることが多く、更に液状試薬では濁りを発生することも多い。
【００２６】
本発明の方法はこれらの影響に対して、キット系での配合された各種酵素間での相互作用による活性の低下や濁りの発生等をも押さえることができる。
【００２７】
また、クリスタリンを添加した酵素は溶液状態のみならず、凍結乾燥時の失活を防ぐこともでき、凍結乾燥品の溶解時に発生しやすい濁りの生成を防ぐことも可能である。
【００２８】
更にまた、クリスタリンはそれ自体が生理活性を有するものではないため、クリスタリンを配合した場合でも主たる活性を阻害したり、他に影響を及ぼすこともなく、全ての生理活性蛋白質に適用することが可能である。
【００２９】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
尚、各実施例における各種の酵素活性は以下のようにして測定した。
▲１▼コレステロールデヒドロゲナーゼ活性測定法
コレステロール溶液（１mg／ml）２ml、pH8.5のβ-NAD+溶液（３mg／ml）１mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３１】
▲２▼コレステロールエステラーゼ活性測定法
リノール酸コレステロール溶液（0.4mg／ml）１ml、pH7.0の発色試薬（0      .3mg／ml  アミノアンチピリン、１mg/ml  フェノール、３u/ml  ペルオキシダーゼ、0.5u/ml  コレステロールオキシダーゼ）２mlに酵素溶液0.      1mlを加え37℃で反応し、500nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのコレステロールを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３２】
▲３▼Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼ活性測定法
発色試薬（アミノアンチピリン0.6mg／ml、フェノール1.5mg／ml及びペルオキシダーゼ４単位／ml）1.5ml、pH７のDL−α−グリセロリン酸２Na・６      H2O溶液（0.65mg／ml）1.5mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で反応し、505n      mの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのH2O2を生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３３】
▲４▼グリセロールキナーゼ活性測定法
ATP-2Na（３mg／ml）１ml、pH9.8のβ-NAD+溶液（１mg／ml）１ml、グリセロール溶液（9.2mg／ml）１ml及びG-3PDH（1700単位／ml）0.02mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３４】
【実施例】
実施例１  コレステロールデヒドロゲナーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのコレステロールデヒドロゲナーゼの安定性を測定した。
0003696267.tif 000002
クリスタリンの添加量：コレステロールデヒドロゲナーゼの1/10モル量
測定時間：１〜４時間
その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0003696267.tif 000003
【００３６】
明らかにクリスタリンを添加することによってコレステロールデヒドロゲナーゼの活性が安定化されている。また、クリスタリンが添加されていない試料溶液は濁りを生じたが、クリスタリンを添加した試料溶液については全く濁りの生成は認められなかった。
【００３７】
実施例２  Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの安定性を測定した。
0003696267.tif 000004
クリスタリンの添加量：Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの                            1/10モル量
測定時間：１〜６日
その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
0003696267.tif 000005
【００３９】
明らかにクリスタリンを添加することによってＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活性が安定化されている。
【００４０】
実施例３  コレステロールエステラーゼのクリスタリンによる安定化効果
以下の試薬組成において37℃でのコレステロールエステラーゼの安定性を測定した。
0003696267.tif 000006
上記の試薬組成に10mMのコール酸ナトリウムを加えた場合と10mMのコール酸ナトリウムとクリスタリンを1/10Ｍ添加した場合を比較した。
測定時間：１〜３日
その結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
0003696267.tif 000007
【００４２】
クリスタリンを添加することによってコール酸ナトリウム添加によるコレステロールエステラーゼの活性低下を防止することができることが明らかである。
【００４３】
実施例４  グリセロールキナーゼ、ペルオキシダーゼ及びＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼを添加したキット系での各酵素のクリスタリンによる37℃での安定化効果
対象として単独の酵素についてクリスタリンの効果を測定した。
0003696267.tif 000008
その結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
0003696267.tif 000009
【００４５】
クリスタリンを添加することによって各酵素は安定化する。グリセロールキナーゼ及びペルオキシダーゼは元来比較的安定なためクリスタリンの効果としては明確にでていない。しかしながら、Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼついては、実施例２と同様に試薬組成が変化してもその安定性を改善する効果は明らかである。
【００４６】
上記の各酵素を配合したキット系の処方におけるクリスタリンの効果を測定した。使用した酵素及び試薬組成は上記と同一にした。尚、クリスタリンの添加量は酵素総量の1/10モル量とした。
その結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】
0003696267.tif 000010
【００４８】
クリスタリンを添加しないキット系においては配合した酵素が相互に作用し、クリスタリンを添加しない場合の酵素単独の場合よりも酵素の安定性が低下している。それと比較して、クリスタリンを添加したキット系では酵素単独にクリスタリンを添加する効果と同様な安定性が得られる。更に、ＡＴＰなどの安定性も改善されている。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により生理活性蛋白質の安定性が改善され、更に各々の酵素が相互に及ぼす影響も回避することができ、臨床検査分野に用いる臨床検査用の酵素試薬の液状での安定性を改善することができる。また、クリスタリンは測定系に影響を及ぼさないため、いずれの系にも安定剤として広く使用することができる。