(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATCC 55445の確認特性を有する微生物Streptomyces WYEC 108の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
感染しやすい植物において微生物が菌類感染に対する保護を与えることができる請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
ATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108の生物学的に純粋な培養物；および
送達媒体
を含む組成物。
【請求項４】
送達媒体が少なくとも１種の次の成分：
アルギン酸塩ゲル、草炭、砂およびひきわりトウモロコシ
を含む請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
送達媒体が窒素源を含む請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
送達媒体が草炭、砂、ひきわりトウモロコシおよび窒素源を含む請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
窒素源が塩化アンモニウムである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Streptomyces WYEC 108の生物学的に純粋な培養物がStreptomyces WYEC 108の胞子を含む請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
菌類感染に対して植物を保護するのに有用な組成物であって、
適切な容器中にATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108および送達手段を含む組成物。
【請求項１０】
ATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108により産生された抗菌性代謝物の調製物；および
送達媒体
を含む組成物。
【請求項１１】
組成物がさらにStreptomyces WYEC 108の細胞および胞子を含む請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
植物の菌類感染に対する感染性を減少させる方法であって、
ATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108を植物の根に送達する工程を含む方法。
【請求項１３】
植物の菌類感染に対する感染性を減少させる方法であって、
ATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108を含む組成物に種子を浸漬する工程；および
適切な成長培地に種子を植え付ける工程
を含む方法。
【請求項１４】
組成物がさらにアルギン酸塩ゲルを含む請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
菌類感染に対して植物を保護する方法であって、
ATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108の培養物を提供する工程；
前記培養物を含む送達媒体を調製する工程；および
前記送達媒体を植物に送達する工程
を含む方法。
【請求項１６】
植物の成長を促進する方法であって、
種子または幼植物に、送達媒体ならびにATCC 55445の確認特性を有するStreptomyces WYEC 108細胞;Streptomyces WYEC 108胞子；およびStreptomyces WYEC 108により産生された抗菌性代謝物からなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む組成物を供給する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、土壌伝播性植物病原体の増殖を抑制し、植物の成長を促進することができるStreptomyces細菌の新規株に関する。
発明の背景
菌類植物病原体は、農業および園芸業における深刻な経済的損失の原因である。多くの異なる種類の菌類植物病原体が報告されている：これらの病原体は、立ち枯れ病、白腐れ病、赤腐れ病および根腐れ病のような植物の病害を起こす。かかる病害は新生幼植物を枯らし、植物の生長力を減退させ、作物収量に悪影響を及ぼす。
菌類感染を最小にするため、花壇向き（bedding）植物の苗床は、蒸気滅菌したかまたは化学的に処理した土壌中で、幼植物を成長させることができる。しかし、また、かかる処理は、土壌菌類と通常競合する微生物を含む、有用な微生物を、土壌から除去する。かかる場合、菌類病原体が偶然に侵入した場合、この病原体が急速に蔓延し、広範囲の病害を引き起こすことがある。
農業の定植（setting）では、植物病原体菌類に汚染された土壌は特定の作物を成長させるのに不適切なことがある。例えば、ミシガン州および他のダイズ成長州でのダイズ生産は、菌類Phytophera megasperma（Filinowおよびlockwood、1985）のために生じるフィトフソラ（Phytophthora）根腐れ病により著しく制限されることが多い。Pythium菌類の種は、カリフォルニア州、ワシントン州およびアイダホ州のいたるところの土壌に広く分布している。Pythium ultimumは、遭遇する最も普通の病原体種であり、幼植物の発生前立ち枯れ病および発生後立ち枯れ病に関連する。この種は、これらの州の土壌ならびに他の州および他の国の土壌で生育するコムギ、エンドウおよびヒヨコマメならびに他の作物の重大な病原体である（Trapero−Casas et al.、1990;StanghelliniおよびHancock、1970;KraftおよびBurke、1971;Westerlund et al.、1988）。菌類植物病原体を制御するのに化学物質を使用することは、コストが高く、効力に欠け、しかも菌類の耐性株が生じることからあまり行われない。さらに、化学的殺菌剤を用いるのは、環境への配慮から好ましくない。
本発明の目的は植物の菌類病原体感染を減少させる生物学的制御手段を提供することにある。
発明の開示
上述の目的を、菌類植物病原体の増殖を阻害するのに効果的な多数の放線菌を単離することにより達成した。特に、この明細書でStreptomyces WYEC 108と称する（この明細書ではWYEC 108ともいう）、単離した放線菌の１種は、立ち枯れ病、根腐れ病、白腐れ病および赤腐れ病として通常知られている植物病害を起こす病原体を含む、広範囲の菌類植物病原体に対して強力な拮抗作用を示す。したがって、本発明の一つの観点は、Streptomyces WYEC 108の生物学的に純粋な培養物である。
また、本発明では、Streptomyces WYEC 108で植物の種子または植物の根を処理するのに適切な種々の組成物を示す。かかる組成物は、菌類感染に対する植物の感染性を減少させ、処理した植物の成長を促進するのに有用である。好適例では、かかる組成物はStreptomyces WYEC 108の生物学的に純粋な培養物と送達媒体（delivery medium）とを含む。特定例では、送達媒体はアルギン酸塩ゲル、草炭、砂またはひきわりトウモロコシを含むことができる。一例において、本発明は、Streptomyces WYEC 108と一緒に、草炭、砂およびひきわりトウモロコシを含む送達媒体を包含する。他の例では、送達媒体は、１グラム当たり少なくとも105のコロニー形成単位の送達媒体を含む。
他の例では、本発明は、Streptomyces WYEC 108を含むアルギン酸塩ゲルのペレットを包含する。かかるペレットを、成長している植物の根に直接添加するか、または園芸土壌もしくは農業土壌に直接添加して、植物病原性菌類により生じる植物に対する損害を減少することができる。
本発明は、菌類感染に対する植物の感染性を減少させる方法をも包含する。一例として、この方法には、植物の根にStreptomyces WYEC 108を送達することが含まれる。他の例では、この方法には、Streptomyces WYEC 108を含む組成物に種子を浸漬し、しかる後コーティングした種子を適切な生育培地にまくことが含まれる。この方法では、適切な組成物に、Streptomyces WYEC 108を含むアルギン酸塩ゲルが含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Streptomyces WYEC 108の螺旋鎖（chains spirales）（上）および胞子表面（下）を示す走査型電子顕微鏡写真を含む。
図２には、Pythium種を感染させた土壌で成長したヒヨコマメ植物を示す。右側の植物は、Streptomyces WYEC 108で処理した種子から発芽した。左側に示す植物は、未処理の種子から発芽した。
発明の詳細な説明
本発明では、土壌から多数の放線菌株を単離する。これらの株の多くは、レタス、ヒヨコマメおよびコショウを含む、植物において菌類病原体の効果を減少させるのに有効であることが示される。特に、本発明では、この明細書でStreptomyces WYEC 108と称する株を単離する。株WYEC 108は、幼植物の発生前立ち枯れ病および発生後立ち枯れ病、根腐れ病、赤腐れ病および白腐れ病を起こす病原体を含む、広範囲の菌類植物病原体に対して強力な拮抗作用を示す。このように、株WYEC 108は、これらの植物病原体による感染に対し、植物を保護するのに用いることができる生物制御剤として特に適切である。したがって、Streptomyces WYEC 108は、菌類感染に対する植物の感染性を減少させる方法において有用である。このように、Streptomyces WYEC 108で処理した植物は、菌類感染の影響を減少させることを示す。感染性未処理植物の菌類感染は、かかる植物の特定の成長特性に悪影響を及ぼす。例えば、菌類病原体に曝された未処理植物は、菌類病原体に曝されない植物に比較して、植物の高さ、植物のバイオマスおよび作物収量をかなり減少させる。本発明の好適例では、Streptomyces WYEC 108で処理し、次いで菌類病原体に曝した植物は、菌類病原体に曝した未処理植物に比べ、植物の高さ、植物のバイオマスおよび作物収量の著しい減少を殆ど示さない。より好適な例では、Streptomyces WYECで処理し、菌類病原体に曝した植物は、未処理の、病原体に曝していない植物と同様の成長特性を示す。最も好ましい例では、Streptomyces WYEC 108で処理し、菌類病原体に曝した植物の成長特性は、未処理の、病原体に曝していない植物の成長特性より優れていることを示す。
株WYEC 108は、根圏ミクロフローラからの競合の存在下に、植物の根に定着する。株WYEC 108は、蒸気滅菌した土壌中で成長するレタス植物、および農場で成長するコショウ植物の成長力を高めることが示された。
また、送達媒体に組み入れるのに適切な株WYEC 108の栄養細胞または胞子を産生する手段が、本発明に包含される。株WYEC 108の栄養細胞および胞子ならびに送達媒体を含む組成物は、長期の貯蔵寿命を有し、植物に株WYEC 108を送達するのに適切であることが示される。
材料および方法
細菌増殖培地
すべての細菌増殖培地を蒸留水を用いて調製し、使用前にオートクレーブにより滅菌した。すべての細菌試料を標準的な無菌実験室技術を用いて操作し、純度を維持した。
YGM（酵母抽出物／グルコース／無機塩）培地には、0.6％（wt/vol）の酵母抽出物〔米国、ミシガン州、デトロイト所在のディフコラボラトリーズ社（Difco Laboratories）〕、1.0％（wt/vol）のグルコース、およびリン酸無機塩溶液〔5.3gのNa2HPO4、1.98gのKH2PO4、0.2gのMgSO4.7H2O、0.2gのNaCl、0.05gのCaCl2.2H2O、脱イオン化H2Oの１リッター当たり1.0mLの微量元素（PridhamおよびGottlieb、1948）;pH7.1〜7.2〕が含まれる。この微量元素溶液は、100mLの蒸留水中の0.64gのCuSO4.5H2O、0.11gのFeSO4.7H2O、0.79gのMnCl2.4H2O、0.15gのZnSO4.7H2Oからなる。
ReddiおよびRao（1971）から変更したWYE（水／酵母抽出物／寒天）培地には、唯一の炭素源および窒素源として酵母抽出物〔オキソイド社（Oxoid）、0.25g/L〕、および寒天（Oxoid、18.0g/L）が含まれる。この培地は、緩衝剤K2HPO4（0.5g/L）でpH7.2〜7.4に処理した。
WYEC（水／酵母抽出物／セルロース／寒天）は、WYE寒天に薄い重層寒天を添加した。重層寒天には、蒸留水中に0.25g/Lのセルロース〔ソルカフロク、シグマケミカル社（Solka Floc,Sigma Chemical Co.）〕および18.0g/Lの寒天が含まれる。
CYD（カザアミノ酸（casamino acid）／酵母抽出物／デキストロース  寒天〕培地には、蒸留水中に、カザアミノ酸（Difco:0.5g/L）、酵母抽出物（OxoidまたはDifco:0.8g/L）、Ｄ−グルコース（0.4g/L）、K2HPO4（2.0g/L:pH7.2〜7.4）、および18.0g/Lの寒天が含まれる。
ReddiおよびRao（1971）から変更した、YCED（カザアミノ酸／酵母抽出物／デキストロース／寒天）培地には、酵母抽出物（Oxoid、0.3g/L）、カザアミノ酸（Difco、0.3g/L）、Ｄ−グルコース（0.3g/L）、および寒天（Oxoid、18.0g/L）が含まれる。この培地を緩衝剤K2HPO4（2.0g/L）で処理した。
CYPT（セルロース／酵母抽出物／ペプトン／混合抽出物／寒天）には、セルロース（Solka Flock,Sigma Chemical Co.;5.0g/L）、酵母抽出物（1.0g/L）、ペプトン（Oxoid、1.0g/L）、リン酸塩緩衝液（K2HPO4、0.75g/L）、寒天（18.0g/L）、および培地中の100mLの蒸留水を置換する混合抽出物（100mL/L）が含まれる。この培地は直接注ぎ、重層寒天としては用いなかった。
MSSC（無機塩／デンプン／カゼイン／寒天;Turhan、1981）には、NaCl（2.0g/L）、MgSO4.17H2O（0.05g/L）、CaCO3（0.02g/L）、FeSO4.18H2O（0.01g/L）、およびKNO3（2.0g/L）からなる無機塩溶液と、可溶性デンプン（10.0g/L）およびカゼイン（0.3g/L）を含む有機成分と、寒天（18.0g/L）とが含まれる。この培地を緩衝剤K2HPO4（2.0g/L）で処理した。
胞子形成培地（ATCC培地番号５）には、酵母抽出物（1.0g/L）、牛肉抽出物（1.0g/L）、トリプトース（tryptose）（2.0g/L）、FeSO4（0.01g/L）、グルコース（10.0g/L）、および寒天（15.0g/L）が含まれる。この培地をオートクレーブにかける前に、pH7.2に調整した。（第17版ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophages）。
CYG培地には、蒸留水中にカザアミノ酸（酸加水分解物）（5.0g/L）、酵母抽出物（5.0g/L）およびグルコース（10.0g/L）が含まれ、pH7.1〜7.2に調整した。
送達媒体（以下に示すような比の、砂／ひきわりトウモロコシ／水、または草炭／砂／ひきわりトウモロコシを含む）を、用いる前に蒸気滅菌により滅菌した。滅菌は、代表的にオートクレーブで３回、それぞれ90分間処理することにより行った。
細菌増殖物の収集
Streptomyces WYEC 108の菌糸体成長のために、500mLのYGM培地（pH7.1〜7.2）を含む１リッターのエーレンマイヤーフラスコに、20mLの保存培養物（実施例IIに記載したように調製）を接種し、250rpmで振盪しながら、30℃で３日間インキュベーションした。次いで、菌糸体を5,000rpmで10分間遠心分離することにより収集した。あるいはまた、菌糸体および胞子がエーレンマイヤーフラスコの底に沈殿するまで、培養物を放置することにより、菌糸体を収集した。次いで上清培地を別の容器に移し、濃縮した菌糸体と胞子の懸濁液を、直接送達媒体に接種するために使用した。
また、固体培地（例えば、胞子形成寒天）上で増殖させることにより、細胞および胞子を産生した。寒天表面をこすり取り、蒸留水中に入れることにより、菌糸体および胞子を胞子形成寒天から収集した。次いで、この胞子と菌糸体との懸濁液を混合して、送達媒体に直接入れた。
Streptomyces WYEC 108の胞子を産生するために、1,200mLのYGM培地を含む２リッターのエーレンマイヤーフラスコに、それぞれ50mLの保存培養物を接種し、250rpmで振盪しながら、30℃で12〜18日間インキュベーションした。9,000rpmで10分間遠心分離することにより、胞子を収集した。
菌類病原体
Pythium ultimum PuMXLを英国、BN17 6LPウェストサセックス州、リトルハンプトン、ワーシングロード所在のHorticulture Research InternationalのDepartment of Microbiology and Crop Protectionのカルチャーコレクションから得た。白腐れ病菌類Phanerochaete ChrysosporiumおよびCoriolus Versicolor、赤腐れ病菌類Postia Placenta、Caldariomyces fumago、およびGloeophyllum trabeum；土壌伝播性菌類病原体Rhizoctonia solani、Fusarium sambucinctum、Geotrichum candidum、およびVerticillium dahliaeを米国、アイダホ州、マスコウ、アイダホ大学、細菌学部、Don L.Crawford教授のカルチャーコレクションから得た。Phthium irregulare、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora parasitica、Sclirotinia cepivorum、およびSclerotinia sclerotiorumを、米国、アイダホ州、マスコウ、アイダホ大学、植物土壌昆虫科学部（Department of Plant Soil Entomology Science）、Dr.Wesley Chumのカルチャーコレクションから得た。Fusarium oxysporumを、米国、アイダホ州、マスコウ、アイダホ大学、森林資源学部（Department of Forest Resources）、Dr.Arthur D.Partridgeのカルチャーコレクションから得た。すべての培養物は、ポテトデキストロール寒天上、またはひきわりトウモロコシ寒天上で維持し、25℃で増殖させた。これらの株を、得た際に”病原体”として確認したが、それらの病原性について再試験はしていない。
バイオアッセイ土壌
バイオアッセイに用いるために、Phythium ultimumで自然に汚染された土壌を、米国、アイダホ州、マスコウ近郊のパロウス（Palouse）地区の種々の場所から収集した。この土壌は、前の２つの季節にコムギおよびエンドウを収穫した畑からの上面15cmから収集した。Phythium種の土壌個体群を次のようにして決定した:50mLの滅菌した蒸留水中に1.0gの風乾した土壌を加えた土壌希釈物を、渦巻き管混合機（Vortex tube mixer）を用いて入念に混合した。よく混合した希釈物の0.1mL試料を、３日経った２％水寒天（water agar）プレート上に小飛沫として配置した（StanghelliniおよびHancock、1970）。プレートを25℃でインキュベーションし、存在するPhythium種の証明および数を決定するために、フルオレセンスイルミネーションを有する低出力（×10）解剖顕微鏡を用いて定期的に読み取った。最終的な個体群を評価する前に、各プレート上のコロニーを12、48および72時間インキュベーション後に検査した。確認は、顕微鏡下のPhythium種の菌類菌糸体の形態学的特性、および２％（w/v）の水寒天プレート上の増殖パターンに基づいて行った。２％（w/v）水寒天上で増殖する純粋培養物の菌類コロニーを、視覚による確認のための対照として用いた（StanghelliniおよびHancock、1970;Stasz et al.、1980）。
この土壌の試験は、P.ultimumおよびP.irregulareの個体群密度が、それぞれ、接種の際に354±15および194±11cfu/g風乾土壌である。（Spring、1992）ことを示した。他のPhthium種の個体群密度は、57±9cfu/g風乾土壌であった。P.ultimumおよびP.irregulareは、収集した土壌から単離した最も優勢な種であった。
実施例１
菌類病原体に対して拮抗作用を示す放線菌株の単離
放線菌株を、４種の根圏に関連する土壌試料、および４種の根圏に関連しない土壌試料から単離した。次いで、これらの株を菌類植物病原体の阻害剤としての有用性について試験した。
放線菌の単離
放線菌単離体を、一連の希釈／展開プレート技術（serial−dilution/spread−technique）により、８種の土壌から単離した。希釈物（10-5〜10-7）を種々の寒天単離培地上で培養した。これらの培地の組成は上記”材料および方法”で示す。放線菌単離体を、単離した単離培地により明示した。例えば、WYEC 108はWYEC培地上で単離し、YCED 9はYCED培地上で単離した。一般に、かかる培地は、真正細菌の（eubacterial）増殖および菌類増殖を効果的に制御し、増殖の遅い放線菌の単離を促進する有機炭素に乏しい。WYEおよびYCED寒天が特に効果的な単離培地であるので、これらを優先的に使用した。希釈プレートを、25℃で４〜10日間インキュベーションして、放線菌に胞子を形成させ、次いで、コロニーを選び取り、精製用のWYEまたはYCED寒天プレート上にすじ状に塗った。純粋なコロニーをこれらのプレートからYCED寒天斜面またはCYD寒天斜面に移し、胞子形成するまで、25℃または37℃でインキュベーションし、用いるまで５℃で貯蔵した。保存培養物を３〜４週間毎に移し替えた。
土壌
（ｉ）根圏に関連しない土壌
土壌の試料（100〜200g）を、米国、ウェストサセックス州、ラスティングトンの培養ローズ園（土壌S1）；ウェストサセックス州、リトルハンプトンのHorticulture Research International（H.R.I.）農場のコムギ畑の並びの間（土壌S2）；サウスウォールス州、ワインドクリフの堅木保安林からの森林土壌（forest soil）（土壌S6）；およびウェストサセックス州、サウスダウンズ、ハスティングスヒルの、しばしばヒツジを放牧した牧草地（土壌S7）を含む、英国の４個所の土壌プロファイルの上面7.5〜10cmから採取した。これらの土壌は根圏に関連しないと考えられたが、これらの土壌には種々の量の植物の根が含まれていた。
（ii）根圏に関連する土壌
４個所からの根圏に関連する土壌試料を、基本的にはMiller et al.（1990）の方法により調製した。土壌３（S3）は、英国、ウェストサセックス州のH.R.I.のローズ園内のダンデリオン植物（Taracum officinale）の根に関連した。土壌（S5）は、コムギの根に関連し、S2と同一の畑、英国、ウェストサセックス州、リトルハンプトンのH.R.I.農場のコムギ畑から採取した。また、土壌４（S4）も、コムギの根に関連するが、英国、ウェストサセックス州、サウスダウンズウェイ沿いのビグノーヒルの畑からのものである。土壌８（S8）は、ナタネ植物の根に関連し、ウェストサセックス州、サウスダウンズ、ハスティングスヒルの、しばしばヒツジを放牧した牧草地である、土壌S7のサンプリング位置に隣接する畑から採取した。
土壌から単離した放線菌は、根圏に関連しない土壌（S1、S2、S6およびS7）または根圏に関連する土壌（S3、S4、S5およびS8）に分けることができる。3g（湿重量）の試料を（３回）100℃で58時間乾燥し、次いでそれらの重量を測定しなおすことにより、すべての土壌の水分含量を決定した。1:1の土壌：水スラリーを入念に混合し、固体を２時間沈殿させ、さらに上清のpHを測定することにより、土壌のpHを測定した。収集後、用いるまで（24〜48時間）、土壌を４℃で貯蔵した。単離体が放線菌株であることを、これらの株により形成されたコロニーが代表的な放線菌コロニー（胞子を含む空中菌糸体を有する堅くて革のよう）であることを示す視覚試験により確認した。さらに、これらの株の放線菌としての同一性の確認を顕微鏡により行った。
増殖のためのpH範囲の測定
各々の放線菌単離体を、pH5.5〜8.0で増殖する能力について試験した。培養物は、100mM濃度のK2HPO4緩衝液およびKH2PO4緩衝液を組合せて用いてpH5.5、6.0、6.5、7.0および8.0に処理した、CYD寒天のプレート上にスポット接種（spot−inoculate）した。各培地の最終的pHをオートクレーブ処理の直前に、その最終的値に調整した。培養物を25℃または37℃での５〜７日のインキュベーション後に、増殖について検査した。プレートを、わずかにしか増殖しないかもしくは増殖が観察されない（±）、いくらか増殖（＋もしくは＋＋）、または著しく増殖（＋＋＋）として視覚的に評価した。
表Ｉに示すように、根圏に関連する土壌は、根圏に関連しない土壌のほぼ２倍の単離体を与えた。各単離体を、pH5.5〜pH8.0の範囲のCYD寒天培地上での増殖について試験した。すべての単離体は、pH6.5〜8.0で増殖した。９種の単離体だけがpH6.0で増殖せず、57種（21％）がpH5.5で増殖しなかった。pH5.5で増殖するものの増殖は、単離体によってわずかなものから著しいものまで変化した。CYD寒天上で強く胞子形成する能力も、５〜10日インキュベーションした後のコロニーを視覚観察および顕微鏡観察することにより観察した。
0003612071.tif 000002
インビトロでの拮抗作用アッセイ
82種の単離体を、CYD寒天上でよく増殖し、強く胞子を形成するそれら単離体の能力に基いて選択した。
これらの単離体がP.ultimumの増殖を阻害する能力を試験するために、インビトロのプレートアッセイを用いた。各放線菌を、ひきわりトウモロコシ寒天（CMA）プレート上の、中央の片側にすじ状に接種した。この培養物を、約８日間または培養物が胞子を形成するまで、25℃でインキュベーションした。次いで活発に増殖するP.ultimum菌糸体を含むCMA寒天ブロック（0.5cm2）を、プレートの中央に無菌的に配置した。インキュベーションを96時間継続した。48時間および96時間後、このプレートを、P.ultimum増殖の阻害について試験した。放線菌コロニーの方向のP.ultimum菌糸体増殖が遅れるかまたは妨げられる場合、阻害とした。
この試験の結果を表IIに示す。
0003612071.tif 000003
0003612071.tif 000004
96時間後、５種の単離体（WYEC 108、YCED 9、YWE 91、WYE 90、およびYCED 106）は、P.ultimumに対し極めて強い拮抗作用を示し、４種の単離体（YCED 1、YCED 106、WYE 97、およびWYE 98）は、強い拮抗作用を示し、さらに他の10種の単離体は弱い拮抗作用を示した。残りの単離体は、拮抗作用がないか、または極めて弱い拮抗作用を示すにすぎなかった。P.ultimumの増殖を明確に阻害する培養物は、根菌に関連する土壌から単離したものと根菌に関連しない土壌から単離したものとの間でほぼ等しく分けられた。
pH5.5で増殖する70種の単離体も、白腐れ病菌類、Phanerochaete chrysosporiumに対する単離体のインビトロでの拮抗作用について、ひきわりトウモロコシ寒天（CMA）上で試験した。13種の単離体は、表IIIに示すような白腐れ病菌類の若干の程度の拮抗作用を示した。拮抗作用の程度は、阻害領域のサイズにより定義されるような、極めて強い（＋＋＋）から比較的弱い（＋）まで変化した。P.Chrysosporiumに対して拮抗作用を示す５種の培養物（WYEC 108、WYE 78、WYE 90、YCED 9、およびMSSC 2）を、さらに追加の白腐れ病菌類（Coriolus Versicolor）および２種の赤腐れ病菌類（Postia PlacentaおよびGloeophyllum trabeum）に対して、CMA上で試験した。４種の単離体（MSSC 2、YCED 9、WYE 90、WYEC 108）は、上述の白腐れ病および赤腐れ病菌類に対し極めて強い拮抗作用を示した。１種の単離体、WYEC78は、２種の白腐れ病菌類に対してだけ強い拮抗作用を示した。
0003612071.tif 000005
レタス幼植物における放線菌単離体の活性を測定するためのインビトロバイオアッセイ
Lynch et al.（1991、1992）の生物制御アッセイを用いて、12種の単離体を、レタス（Latuca sativa）種子の発芽および生長における効果についてアッセイした。
植物の制御のための、9cmの直径のプラスチックポットをレタスポッティングミックスで満たし、ペトリ皿を用いて詰めた。10個のレタス種子をポッティングミックスの上面に配置し、わずかにその中に押し込んだ。次いで、ポットをトレイ上の水の床中に配置して、発芽が明らかになるまで（約３日）、20〜22℃の暗所でインキュベーションした。次いで、これらのトレイを15〜25℃に維持した温室中の毛管マット（capillary matting）に移し、必要に応じて水を与えた。各ポットで発芽した幼植物の数を、18日までの間定期的に計数した。
放線菌単離体で処理した植物のために、ポットを、特定の放線菌の胞子を接種したポッティングミックスで満たした。ポッティングミックスにCYD保存斜面からの胞子を、108〜109cfu/gポッティングミックス（乾燥重量）の平均レベルにまで接種した。ポッティングミックスのcfu/gをCYD寒天プレート上の生存数を計数することにより接種の時に決定した。次いで、レタス種子を上述のように植え、少量の接種したポッティングミックスを用いて被覆し、しかる後対照と同様に処理した。
特定の放線菌および立ち枯れ病菌類、Pythium ultimum（株PuMXL、Lynch et al.、1991）で処理した植物のために、混合物にも約200の胞子嚢/gミックス（乾燥重量）で菌類病原体を接種した。Lynch et al.（1991、1992）の方法を用いて、病原体の胞子嚢を産生し、ポッティングミックスに接種した。胞子嚢の計数を血球計（haemocytometer）を用いて行い、さらにP.ultimum株の病原性を、レタスに移すことによる使用前に確認した。
すべての処理において、ポットを５回反復して調製した。温室中で、ポットを”ガード植物（guard plant）”により囲まれたランダムブロック配列に設置した；ガード植物は条件の均質性を提供し、緩衝剤として作用するようにはたらく。植え付け後18日で、植物を収集し、最終的立木（stand）の発生を測定し、さらに湿重量および乾燥重量（地上の葉および茎）を測定した。植物の湿重量および乾燥重量をポット当たりの総mgバイオマスとして、さらに植物当たりの平均mgバイオマスとして記録した。値は、５回の反復値の平均±標準偏差として示した。このように、各値は処理当たりの50個の種子に基づいていた（10個の種子をそれぞれ植えた５回の反復ポット）。種子の発芽割合および最終的立木値を同様にして計算した。
0003612071.tif 000006
病原体の不存在下（表では”−P1"と記す）では、正常植物を発芽しかつ産生する種子の割合における、放線菌接種ポットと対照ポット（放線菌を含まない）との間に有意差はなかった。すべての場合において、種子発芽および生長は≧98％に達した。しかし、放線菌の存在により、１〜３日だけ種子の生長が遅れることが多かった（データは示さず）。同様に、病原体が存在しないと、一般に植物シュートの重量は、新鮮および乾燥重量のいずれの測定においても、放線菌接種ポットと対照ポットとの間に有意差がなかった。WYEC 107を接種したポットは例外であり、放線菌の存在により植物バイオマスの収量がかなり増加した。
病原体の存在（＋P1）により、植え付け後20日のポット当たりの正常植物数は、平均して病原体で処理しない対照ポットにおける10.0の9.8に比較して、対照ポットにおける10.0の3.6に達した。しかし、特定の放線菌の存在により、病原体接種ポットで、正常植物の数にわずかであるが有意な改善が見られた。12種の放線菌のうち７種（YCED 85、YCED 64、WYEC 107、WYEC 106、YCED 71、WYE 88、およびWYE 21）は、正常植物の収量を有意に改善した。これら放線菌のうち、YCED 85、YCED 64、およびWYE 21も、病原体のみの対照に比べ植物の乾燥重量での収量を有意に改善した。また、WYE 21は病原体のみの対照に比べ植物の新鮮重量での収量をも有意に改善した。正常植物の収量を有意に改善しなかった１種の株（MSSC 1）は、植物シュート収量の新鮮重量および乾燥重量を有意に改善した（表IV、第５および７欄）。したがって、MSSC 1はこの明細書で用いる量より少ないP.ultimumの投与量に対して植物を保護するのに有用であることがわかった。
実施例II
Streptomyces WYEC 108の単離
株WYEC 108をBergey's Manual of Systematic Bacteriology（1986）により規定されているようなStreptomyces属の形態学的特徴に基づきStreptomyces種と確認した。WYEC 108は中空菌糸体に胞子の鎖を生成する糸状体細菌である。上述したように、Streptomyces WYEC 108は、英国の８個所から採取した土壌から単離した多数の放線菌の１種として単離した。他の放線菌とともに、Streptomyces WYEC 108は、英国、ウェストサセックス州、サウスダウンズ、ハスティングスヒルの畑のナタネ植物の根に関連する根圏土壌から一連の希釈／展開プレート技術により単離した。この土壌の希釈物（10-5〜10-7）を単離寒天培地WYE上で培養した。希釈プレートを25℃で４〜10日間インキュベーションして、放線菌のコロニーを増殖させ、胞子形成された。次いで、これらのコロニーを精製するために、選び取り、WYEC寒天プレート上にすじ状に塗った。純粋なWYEC 108のコロニーをこれらのプレートからCYD寒天斜面に移し、胞子形成するまで25℃でインキュベーションし、さらに用いるまで４℃に貯蔵した。保存培養物を３〜４週ごとに移し代えた。
Streptomyces WYEC 108の確認
上述のようにして、単離した放線菌株を、CYD寒天上でよく増殖し、激しく胞子形成する放線菌株の能力について試験した。次いで、多数の単離体を、植物病原体Pythium ultimatumのインビボ増殖の阻害能について試験した。また、これらの単離体を、白腐れ病菌類Phanerochaete ChrysosporiumおよびCoriolus versicolus、ならびに赤腐れ病菌類Postia PlacentaおよびGloeophyllum trabeumに対するインビトロ拮抗作用について試験した。これらの試験の結果として、これらの株の１種、この明細書でStreptomyces WYEC 108と称する株を、その有利な特性に基づいて選択した。
カザアミノ酸／酵母抽出物／デキストロース（CYD）プレート上で増殖したStreptomyces WYEC 108のコロニーを、走査型電子顕微鏡により試験した。試料の調製は以下のように行った：
（１）CYDプレート上のStreptomyces WYEC 108のコロニーを、0.2Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1.5％グルタルアルデヒド溶液で被覆し、少なくとも２時間固定した；（２）これらのコロニーを0.2Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液を用いて、前の溶液をピペットで吸引しこの緩衝液に置き換えることにより、徹底的に洗浄した（２×）。試料が乾燥しないように注意した；（３）次いで、これらのコロニーを、これらのコロニーを含む寒天の”プラグ”を採取することにより除去した；（４）これらの”プラグ”を個々のメッシュ容器に配置し、100％エタノール中で脱水した（２×）（米国、ニュージャージー州、フィリップスバーグ所在のJ.T.Baker Inc.）；（５）次いで、これらの試料を、臨界点乾燥”バム（bomb）”中で乾燥し、コロイド銀処理塗料（colloidal silver conducting paint）を個々の標本スタブ（stub）上にのせた。次いでこれらの試料を60＼40金−パラジウムでコーティングし、走査型電子顕微鏡で観察した。図１は、Streptomyces WYEC 108の螺旋の鎖（上）および胞子表面（下）を示す走査型電子顕微鏡写真である。胞子表面は比較的平滑であることが観察された。
また、株WYEC 108の種々の生理学的特性を測定した：株WYEC 108はペプトン−酵母−鉄寒天およびペプトン−鉄寒天（米国、ミシガン州、デトロイト所在のDifco Lab.）上で、メラニンまたはH2Sをそれぞれ産生しなかった。CYDプレート上でStreptomyces WYEC 108により産生された胞子塊（mass）の色は灰色であった。この株は45℃で増殖しなかった。Streptomyces WYEC 108は、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology（1986）により規定されているような種Streptomyces lydicusに属することができる。このように、この生物はStreptomyces lydicus WYEC 108と称することができる。簡潔さのために、この明細書では、この生物をStreptomyces WYEC 108、または単にWYEC 108と称する。
ATCC受入番号
Streptomyces WYEC 108の寄託は、1993年６月29日に、米国、メリーランド州、ロックビル所在のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に、ブダペスト条約の規定にしたがって行った。この株はATCC受入れ番号第55445号を与えられた。
Streptomyces WYEC 108の保存培養物の調製
短期間の使用には、Streptomyces WYEC 108を、25℃のCYD寒天または胞子形成寒天斜面上で、胞子形成するまでインキュベーションし、使用するまで４℃で貯蔵した。培養物を長期間貯蔵するために、単一の寒天斜面またはプレートからの胞子を10mLの滅菌YGM培地に懸濁させることにより、10mLの胞子懸濁液を調製した。次いで、この胞子懸濁液を用いて100mLのYGM（酵母抽出物／グルコース／無機塩）培地を含む250mLのエーレンマイヤーフラスコに接種した。次いで、これらのフラスコを、250rpmで振盪しながら、30℃で32〜36時間インキュベーションして、標準接種物を準備した。
また、YGM増殖標準接種物からの試料を、−70℃での長期保存に適したグリセロール培養物を作製するため、および凍結乾燥のために用いた。
実施例III
Streptomyces WYEC 108による菌類植物病原体のインビトロ拮抗作用
多数の選択した菌類植物病原体の増殖を阻害するStreptomyces WYEC 108の能力を、コロニー増殖阻害により測定した。Streptomyces WYEC 108をひきわりトウモロコシ寒天（CMA）（米国、ミシガン州、デトロイト所在のDifco Lab.）プレートの中央の片側にすじ状に接種した（streak−inoculate）。接種したプレートを、培養物が胞子形成するまで、25℃で約８〜12日間インキュベーションした。胞子形成は、肉眼での観察による灰色空中菌糸体の量および胞子として検出することができた。胞子形成は位相差顕微鏡（×1,000）により観察した。特定の菌類植物病原体の活発に増殖する菌糸体を含む5mm直径のCMA寒天ディスクを、菌類培養物の前縁（leading edge）から採取し、この寒天プレートの中央に無菌的に配置した。これらのプレートを、試験菌類がStreptomyces WYEC 108を含まない対照プレートの縁部に達するまで、25℃でインキュベーションした。菌類増殖の阻害は、Streptomyces WYEC 108の影響下の菌類病原体の放射状増殖と対照プレート上での増殖だけとの比を測定することにより定量した。菌類増殖の阻害割合を、選択した病原体菌類に依存する48、96、および192時間インキュベーション後に記録した。バイオアッセイは、５個のプレート上で反復し、阻害を別々に測定して、平均±標準偏差として記録した。
これらのインビトロバイオアッセイでの、結果を表Ｖに示す。このデータは、Streptomyces WYEC 108が立ち枯れ病（Pyhthium ultimum）、根腐れ病（Pythium ultimum、Rhizoctonia solani、Fusarium solani、およびPhytophthora cinnamomi）、白腐れ病（Phanerochaete chrysosporiumおよびCoriolus versicolor）、赤腐れ病（Postia placentaおよびGloeophyllum trabeum）ならびに葉および茎腐れ（Sclerotinia種）菌類を含む広範な菌類植物病原体に対する極めて強い拮抗作用を有することが示された。
0003612071.tif 000007
実施例IV
種子処理としてのStreptomyces WYEC 108の使用
Streptomyces WYEC 108細胞が植物病原体に対し植物を保護する効力を、発芽していないヒヨコマメ種子に株WYEC 108を適用し、次いでこれらの種子を菌類病原体P.ultimatumおよびP.irregulareに汚染された土壌中で培養することにより決定した。
株WYEC 108により産生される細胞外代謝物を、エーテル抽出により培養物から抽出した。菌類感染について、これら代謝物が新生ヒヨコマメ幼植物に与える効果についても測定した。
Streptomyces WYEC 108の増殖
株WYEC 108細胞の増殖のために、500mLのYGM（pH7.1〜7.2）を含む１リッターのエーレンマイヤーフラスコに、20mLの保存培養物を接種し、細胞塊を産生するために、250rpmで振盪しながら、30℃で３日間インキュベーションした。抗菌性代謝物を産生するために、500mLのCYD（pH7.1〜7.2）を含む１リッターのエーレンマイヤーフラスコに、20mLの保存培養物を接種し、250rpmで振盪しながら、30℃で７日間インキュベーションした。
Streptomyces WYEC 108および抗菌性代謝物による種子の処理
Streptomyces WYEC 108の菌糸体懸濁液を5,000rpmで10分間遠心分離することにより500mLの３日経ったYGM液体培養物から収集した。収集した菌糸体を、滅菌した３％（W/W）アルギン酸ナトリウム溶液の200〜300mLで1.0〜1.2×104cfu/mLの培養物密度に再懸濁した。次いで、ヒヨコマメ種子をよく混合した細胞−アルギン酸塩懸濁液に添加し、これらの種子を、滅菌した蒸留水中の0.25MのCaCl2に一つずつ移した。これらの種子を以下に記載するような生物制御アッセイに用いた。
Streptomyces WYEC 108により産生された抗菌性代謝物を、以下のように精製した形態で得た。７日経った500mLの培養物を濾過して、細胞を除去し、次いで抽出漏斗（extraction funnel）を用いて150mLのエーテルで抽出した。次いでエーテルを真空で蒸発させることにより除去し、得られた抽出物を1.5mLの蒸留水に再溶解した。次いで、この溶液を無菌の0.45μｍフィルタによりフィルタ滅菌し、10mLの３％（W/W）アルギン酸ナトリウム溶液に添加した。精製した抗菌性代謝物を用いて、植物を菌類感染から保護することができる。実質的にWYEC 108細胞を含まないように、抗菌性代謝物を精製するのが好ましい。しかし、抗菌性代謝物と一緒のWYEC 108細胞および／または胞子の調製物も、菌類植物病原体に対して効果的である。抗菌性代謝物−アルギン酸塩懸濁液を上述のように生物制御アッセイで使用するためにヒヨコマメの種子に適用した。
インビボ生物制御アッセイ
自然にP.ultimumおよびP.irregulareisで汚染された土壌は上記”材料および方法”で記載した。この農業土壌をこのインビボ生物制御アッセイに用いた。土壌pHは、土壌：水スラリー（1:1）を入念に混合し、固体分を２時間沈殿させ、さらに上清のpHを測定することにより、pH5.6に決定した。この土壌を切り刻み、入念に混合して、幼植物ポット（深さ10cm×直径10cm）に入れた。
インビボ生物制御アッセイは、Streptomyces WYEC 108または抗菌性代謝物で処理した発芽していないヒヨコマメの種子を、汚染された土壌に植え付けることにより行った。これと同一の土壌に植え付けた未処理種子を対照として使用した。
この方法には以下の工程が含まれる：
１）1cmの草炭を各ポットの底に入れて、通気および排水を確保しつつ、土壌の損失を防ぐ。
２）幼植物ポットを汚染された土壌で満たした。
３）次いで、ポットの底から給水し土壌を浸潤させた。土壌表面が浸潤した後、未処理ヒヨコマメ種子および処理したヒヨコマメ種子をその土壌上に置き、これと同一の1.5〜2.0cm深さの土壌で覆った。頂部は、真下の湿った土壌のカラムから、毛管現象により湿潤した。10個の種子を３回の反復されたそれぞれの幼植物ポットに植え付けた。土壌に肥料は添加しなかった。乾燥を最小限にし、固まるのを防ぐため、幼植物が発生するまでポットを清浄なプラスチックで覆った。追加の水は必要に応じて、幼植物の発生後初期段階に、ポットの上面に噴霧した。実験は光12時間と闇12時間の光周期サイクル（16,000Lux）を用いる15〜30℃の温室で行った。
ヒヨコマメ幼植物発生の計数を定期的に行い、最終的発生の計数を20日後に行った。発生データを各処理の平均としてまとめた。Streptomyces WYEC 108が生物制御剤として作用する能力は、発生の総数、植物の高さ、および植物の新鮮重量を、生物制御剤で処理していない種子から成長した対照植物と比較して求めた。この生物制御アッセイの結果を表VIに示す。
0003612071.tif 000008
Streptomyces WYEC 108細胞およびこれらの細胞により産生された抗菌性代謝物は、ヒヨコマメのPythium立ち枯れ病を減少させた。
種子をStreptomyces WYEC 108細胞でコーティングした場合、植物は活発に成長した。Streptomyces WYEC 108細胞でコーティングしたヒヨコマメの種子から発芽した植物の高さおよび新鮮重量に比べ、対照（未処理）ヒヨコマメ種子から発生した植物の高さおよび新鮮重量は、かなり減少した。未処理ヒヨコマメ種子からの発生は、自然にP.ultimumおよびP.irregulareで汚染された土壌に種子を植え付けた場合、P.ultimumにより生じる種子腐れ病および発生前立ち腐れ病のため、極端に減少した（6.7％の発生率）。対照的に、接種前にStreptomyces WYEC 108細胞で処理した種子の発生は、63.3％であった。アルギン酸塩単独で処理した種子は、発生率の増加が見られなかった。根毛の消失および根の変色を含む、Pythium根腐れ病の代表的症状は、対照種子から発生したヒヨコマメの収集した根で顕著であったが、これらの症状は、Streptomyces WYEC 108細胞で処理した種子から成長した植物には見られなかった。対照では、ヒヨコマメに対する損傷は主として、種子腐食（seed decay）、および発生前立ち腐れ病の形態であった。発生し成長したヒヨコマメ幼植物は発育を妨げられ、それら植物の根はP.ultimumが激しく感染していた。図２では、生物制御アッセイから得られたヒヨコマメ植物を並べて比較した。左側に示す、対照植物は、未処理種子から発生したもので、大量の根の感染および二次根の欠落を示すのに対し、右側に示す、Streptomyces WYEC 108でコーティングした種子から発生した植物は、良好な成長および二次根および根毛の通常の形成を示した。
エーテル可溶性代謝物の形態の抗菌性代謝物で処理したヒヨコマメ種子の発生は、対照種子のもの（6.7％）よりも高かった（33.3％）が、Streptomyces WYEC 108細胞でコーティングした種子のもの（63.3％）よりも低かった。抗菌性代謝物で処理した種子から発生した植物は、対照植物に比べ、活発に成長し、一層長い根および一層高密度の根毛の発達を示した。
実施例Ｖ
Pythium ultimumによる根の感染および種子腐れにおけるStreptomyces WYEC 108の効果
実施例IVに記載したような、自然にPythium ultimumで汚染された土壌中で成長したヒヨコマメ幼植物の、WYEC 108で予め処理したものおよび予め処理しないものを試験して、P.ultimum感染についての株WYEC 108の効果を測定した。
P.ultimumによる根の感染は、20日間の成長後収集した対照（未処理）ヒヨコマメ幼植物を用いて研究した。また、根腐れ病を生じるP.ultimumも、これらの対照植物の腐った根から単離した。P.ultimumの単離は、最初に水道水でヒヨコマメの根（小根および根毛）から土壌を洗浄し、これらの根を無菌蒸留水で２回すすぐことにより行った。変色し腐った根をかみそり刃で無菌的に切り取り、３日経った２％水寒天プレート上に置いた。これらのプレートを室温で24〜48時間インキュベーションし、位相差顕微鏡（×40）下で観察した。感染したヒヨコマメの根からの増殖するP.ultimumを、新鮮な２％水寒天に継代培養し、次いで、上述したように確認した（IngramおよびCook、1990）。
P.ultimumによる種子腐れ病を、20日後に収集した腐った対照種子を用いて研究した。腐った種子の一部を、滅菌した爪楊枝を用いて３日経った２％水寒天プレート上に置き、室温で24〜48時間インキュベーションした。これらのプレートを上述のように試験した。
Pythiumは、自然に汚染された土壌中で成長する未処理ヒヨコマメの根に感染することが観察された。P.ultimumは、腐った種子および根から単離した最も優勢な種であった。P.irregulareは通常あまり観察されなかった。
Streptomyces WYEC 108による根の定着を、実施例IIに記載したStreptomyces WYEC 108細胞−アルギン酸塩懸濁液で処理した種子から発生した20日経ったヒヨコマメ植物の根において試験した。また、これらの植物を、実施例IIに記載したように、自然にP.ultimumおよびP.irregulareで汚染された土壌中で成長させた。これらの植物を幼植物ポットから除去し、水道水で静かに洗浄して付着する根圏土壌を除去した。次いで、これらの根を無菌蒸留水ですすいだ。根の試料を、根の一部をグラススライド上に置き、メチレンブルーを滴加し、次いでこのスライドをカバースリップで覆うことにより、顕微鏡観察のために調製した。次いで、位相差顕微鏡（×1000）を用いて調製した試料を観察した。
種子上に存在するStreptomyces WYEC 108は発生する根と接触した。根の伸長に従い、Streptomycesは伸長する根毛および先端と一緒に運ばれた。Streptomyces WYEC 108は、主根、二次根、根毛および先端で広範囲に定着することが観察された。Streptomyces WYEC 108でコーティングされた種子から発生した植物は、WYEC 108でコーティングしない種子から発生した対照植物よりも健康で、一層長い根を有し、より高い密度の根毛が存在した。この相違は、根の生物制御剤の定着にはっきりと関連した。生物制御剤が定着した根は、根の病害の症状をなんら示さなかった。Streptomyces WYEC 108は、固有の根圏ミクロフローラからの競合の存在下に根への優れた定着を示した。
抗菌活性
Streptomyces WYEC 108が植物の根に定着し、抗菌性代謝物を産生する能力に加え、WYEC 108はまた菌類細胞壁および菌類卵胞子を溶解することが観察された。走査型電子顕微鏡を用いることにより、Streptomyces WYEC 108の菌糸が、Pythium ultimumの菌糸および卵胞子を含む、菌類の菌糸および卵胞子の表面に定着することが示された。これらの定着した菌糸および卵胞子は、最も可能性があるものとしてはキチナーゼおよびセルラーゼのような、Streptomyces WYEC 108による細胞外酵素の排出の結果として、WYEC 108により減少する。Streptomyces WYEC 108は、これらの酵素のいずれをも産生することが示された。また、Streptomyces WYEC 108は、ある範囲の他の細胞外分解酵素をも産生すると考えられる。
実施例VI
Streptomyces WYEC 108の送達媒体への組み入れ
生存するStreptomyces WYEC 108胞子の長期保存および農業実習での使用に適した組成物を、次のように調製した。500mLのYGM培地（pH7.0〜7.1）を含む１リッターのエーレンマイヤーフラスコに20mLの保存培養物を接種し、250rpmで振盪しながら、30℃で３日間インキュベーションした。インキュベーション後、この培養物を5,000rpmで10分間遠心分離することにより収集した。収集した物質を1600mLの10％YGM中に再懸濁し、滅菌した400mLの蒸留水に溶解した8gのNH4Clと混合した。次いで、２リッターの細胞とNH4Clとの混合物を、９−２−１（w/w）の比の砂−水−ひきわりトウモロコシ混合物からなる4kgの滅菌した送達媒体を含むプラスチック容器に接種した。培養物のインキュベーション前に、送達媒体を２回滅菌した（121℃で３時間）。次いで、この混合物を25℃で10〜14日間インキュベーションして、混合物中に存在する胞子の数を最大にした。Streptomyces WYEC 108は、10〜14日のインキュベーション中に胞子を産生して、送達媒体のcfu/gが増加した〔平均レベルで108〜109cfu/g送達媒体（乾燥重量）〕。次いで、この混合物を用いるまで４℃で貯蔵した。
あるいはまた、YGM培地の代わりに、CYG培地中で細胞および胞子を産生させることができる。遠心分離による細胞の収集にかわるものとして、細菌の菌糸および胞子が沈殿するように、培養フラスコを静置することもできる。しかる後、澄んだ上清を別の容器に移し、濃縮した菌糸／胞子懸濁液を直接送達媒体に接種する。この収集法を用いる場合、細菌増殖培地（YGMまたはCYG）が適切な窒素源であるため、NH4Clを培地に添加する必要はない。
実施例VII
レタス幼植物の発生および新鮮重量に及ぼすStreptomyces WYEC 108の影響
Streptomyces WYEC 108がレタスの成長に及ぼす効果を測定するために、レタスの種子を上記実施例VIに記載したようにStreptomyces WYEC 108を含む送達媒体中、または蒸気滅菌した土壌中で成長させた。総数30個の種子を各増殖培地に植え付け（４×13.5cmのポット当たりに１個の種子）、21日間の成長後に発生を記録した。35日間の成長後、生きた植物生長物を収集することにより、新鮮重量を測定した。新鮮重量を平均値として記録した。結果を以下の表VIIに示す。
0003612071.tif 000009
これらの結果は、Streptomyces WYEC 108を用いたレタス種子の処理が幼植物の発生度数および新鮮重量を高めることを示す。
実施例VIII
畑における送達媒体中のStreptomyces WYEC 108の使用
インビボ生物制御アッセイを行い、上述の送達媒体にStreptomyces WYEC 108を組み入れた場合の、Streptomyces WYEC 108の生物制御剤としての有効性を測定した。
Streptomyces WYEC 108を産生し、上記実施例VIIに記載したように、YGM培地中で３日間増殖させたStreptomyces WYEC 108を、送達媒体に組み入れた。送達媒体中での最初のStreptomyces WYEC 108個体群は、ポットに幼植物を植え付ける直前にCYDプレート上でプレート計数することにより、約1.0〜1.2×105cfr/g土壌であると測定された。次いで、この処理した土壌を用いて、幼植物ポットを満たした（4cmに13.5cm）。
対照植物は蒸気滅菌した土壌（100℃で60分間滅菌した）を含むポット中で成長させた。
次いで、コショウ幼植物（ピーマン、トウガラシ）を、蒸気滅菌した土壌のみ、またはStreptomyces WYEC 108を含む送達媒体を接種した蒸気滅菌土壌の混合物を含む幼植物ポットに植え付けた。温室での６週間の成長後、これらの植物を農場に移植した。450±17cfu/gのPhytophthora parasiticaを含む送達媒体の100gを、移植前に植え付け孔に接種した。
植物の高さを移植後55日で測定し、平均値として記録した。植物バイオマスは、移植後110日間培養した後、収集し、植物の新鮮重量を測定することにより決定した。その際、形成されたコショウの数および植物当たりのコショウの重量を平均値として記録した。これらの農場試験の結果を表VIIIに示す。
0003612071.tif 000010
表VIIIに示すように、P.parasitica欠損下でWYEC 108を用いたコショウ幼植物の処理により、植物の高さ、バイオマス、コショウの数およびコショウの収量が、WYEC 108を受け入れていない対照植物に比較して、統計学的に有意に増加した。表VIIIの横の第３行および４行の比較により、株WYEC 108がP.parasiticaの有害な効果に対し、コショウを保護することがわかる。さらに、P.parasiticaを含まない未処理植物に比較して、P.parasitica欠損下に株WYEC 108で処理した植物の成長は有意に高められた。
この例に記載した実験に加え、WYEC 108は、菌類感染に対しある範囲の植物を保護するのに効果的であることが示された。試験した植物は以下の表IXに示す植物を含む。
0003612071.tif 000011
実施例IX
液体培地中でのStreptomyces WYEC 108胞子の産生
生物制御剤は、輸送用および農業用の調時（timing）パターンに合致するよう長期間生き残る必要がある。特に、生物制御組成物中では、株WYEC 108の栄養細胞よりも胞子を使用することにより、生物制御剤組成物の貯蔵寿命を高められる。この理由は、胞子が悪条件の下で、非常に長い時間、生存力を保持するからである。
代表的に、Streptomyces種の胞子は固体培地上でしか産生されない。しかし、以下に述べるように、次の方法が液体培地中で胞子を産生するのに適していることが見出された。
1,200mLのYGM培地（pH6.5）を含む２リッターのエーレンマイヤーフラスコに、50mLの保存培養物（実施例IIに記載したように生産した）をそれぞれ接種し、250rpmで振盪しながら、30℃で12〜18日インキュベーションした。培養物中での胞子の産生は、位相差顕微鏡（×1,000、メチレンブルーで染色）で観察することにより監視した。胞子を、9,000rpmで10分間遠心分離することにより収集した。
しかる後、これらの胞子を、1,600mLの滅菌した10％YGM液体培地中に再懸濁させ、蒸留水中に8gのNH4Clを含む400mLの無菌溶液を添加した（最終的胞子密度を1.0〜1.2×107cfu/mLにした）。次いで、この混合物を、9:2:1（w/w）の比の砂、水およびひきわりトウモロコシからなる滅菌した送達媒体、4kgに直接接種した。送達媒体を、これらの胞子を接種する前に、オートクレーブで２回滅菌した（121℃で３時間）。
ここに記載された方法で、液体培地中に直接に胞子を産生させることにより、この混合物をさらにインキュベーションする必要がなくなる。次いで、胞子を含む送達媒体を、用いるまで４℃に貯蔵した。
ここに記載した液体培養法により産生した胞子を、４℃で４ヶ月貯蔵した後、生存力について試験した。胞子懸濁液の1mLを100mLの滅菌した10％YGM液体培地（pH6.5）を含むフラスコに接種し、250rpmで振盪しながら、30℃でインキュベーションした。胞子の発芽を位相差顕微鏡（×1,000、メチレンブルーにより染色）により観察した。胞子は約８日で完全に発芽した。この簡単な観察試験は、この貯蔵期間後の生存力が喪失しないことを示した。
送達媒体（砂、水、ひきわりトウモロコシ;9:2:1）に組み入れたStreptomyces WYEC 108の生存力について、次のようにして試験した。Streptomyces WYEC 108を含む送達媒体の1.0g試料を連続して希釈し、CYD寒天プレート上で培養した。コロニーが形成されるまで、プレート25℃でインキュベーションした。30日間貯蔵した試料で、108〜109cfu/g送達媒体（乾燥重量）の平均レベルを記録した。
あるいはまた、胞子形成寒天の寒天プレートからの胞子を、10〜20mLの無菌蒸留水またはYGMブイヨン中に再懸濁し、10〜100グラムの送達媒体と混合し、1012〜1014cfu/g培地の生存数を得た。次いで、この混合物を風乾し、入念に混合して、用いるまで４℃で貯蔵した。この組成物は、追加の送達媒体で、任意所望の一層低いcfu/gの最終的な生存数に希釈することができる、濃縮した生成物である。
実施例Ｘ
アルギン酸塩ゲル組成物の安定性
Streptomyces WYEC 108の菌糸体を5,000rpmで10分間遠心分離することにより、500mLの３日経ったYGM液体培養物から収集した。収集した菌糸体を125mLの10％YGM中に再懸濁し、125mLの滅菌した５％（w/v）のアルギン酸ナトリウム溶液を、1.0〜1.2×104cfu/mLの培養物密度になるまで添加した。Streptomyces WYEC 108の菌糸体を含むアルギン酸塩ペレットは、細胞−アルギン酸塩懸濁液を１敵ずつ、滅菌した蒸留水中の0.25MのCaCl2に添加することにより形成した。
この方法により形成したアルギン酸塩ペレットの生存力を決定するために、その後、培養物を含むアルギン酸塩ペレットを、滅菌したプラスチック製ペトリ皿（10cm×10cm）に広げ、層流無菌エアフッド中で１時間乾燥した。ペレット化したStreptomyces WYEC 108は、その後の25℃で６〜８カ月間の貯蔵により容易に胞子形成した（108〜109cfu/g乾燥アルギン酸塩ビーズの平均レベル）。これらの胞子は、25℃の滅菌した水中でインキュベーションする場合、容易に発芽した。これらの胞子の発芽を位相差顕微鏡（×1,000の倍率、メチレンブルーで染色）により観察した。
実施例XI
Streptomyces WYEC 108を含む送達媒体の好ましい組成物
好適例において、放線菌株の単離方法、これらの株の生物制御剤としての有用性についての試験の方法、これらの生物制御剤を菌糸体の形態でおよび胞子として生産する方法、適切な送達媒体の製造方法、および好適例では、Streptomyces WYEC 108の製造方法を上述したが、本発明を、本発明の範囲を逸脱することなく複数の方法で変更することができることは当業者には明らかである。
以下には、特に好適な例の記載と一緒に、本発明の他の例を説明する。
最適培養条件
株WYEC 108の増殖のための最適条件には、20〜30℃間の温度、5.5〜7.5間のpH、および200rpm〜300rpm間の発酵槽混合速度が含まれる。Streptomyces WYEC 108は、代表的に30℃、pH6.5、および200rpmでの72時間の振盪といった培養条件で、YGM液体培地中、バイオマス／リッターで約5.3乾燥重量グラムの最大細胞収量に達する（対数期の終わりまで）。対数増殖期中の倍加時間は約10時間である。72時間のインキュベーション時間を、対数期細胞の一層高い接種レベルを用いることにより、有意に減少させることができる。
あるいはまた、胞子を、胞子形成寒天のような固体寒天培地上で産生させることができる。これらの胞子は、10％YGMのような適切な液体培地にこすり取ることにより、直接に収集することができる。このアプローチにより、培養物の液体増殖の必要がなくなり、製造工程が短縮される。
好ましい送達媒体および他の送達媒体
Streptomyces WYEC 108を園芸の定植および農業の定植で使用するために、送達媒体にStreptomyces WYEC 108を混合した。実施例VIは、９−２−１（w/w）の比の砂−水−ひきわりトウモロコシを含む送達媒体の１つの組成物を記載する。送達媒体の組成物が、生成制御剤が必要とされる特定の用途により指定されることは、当業者に理解することができる。例えば、クレー、ひる石、コムギふすま、トウモロコシの稲軸またはチキンなどの種々の有機充填剤および無機充填剤を、送達媒体に添加することができる。送達媒体の成分比は、きめ、および要求される物理的特性に基づいて決定される。例えば、水分保持能のような特性、容易な取扱いおよび運搬のための軽量性、菌糸体ならびに植物の根の成長および広がりの空間を提供するための有孔性が重要である。あるいはまた、Streptomyces WYEC 108の栄養菌糸または胞子をアルギン酸塩懸濁液に添加して、この株上にアルギン酸塩を捕らえた（alginated−entrapped）ペレットを生成することができる。アルギン酸塩ペレットの製造方法は、この分野の技術において知られており、さらにLewis et al.への米国特許、第4,668,512号明細書に記載されている。他の成分、例えば肥料も、これらのペレットに混合することができる。
好適例では、本発明者らは、1:3.5:1の重量／重量比の草炭−砂−ひきわりトウモロコシを含む送達媒体が、特に好ましいことを決定した。この比は、農業および園芸用途での、この生成物の使用に適切な密度および水分持能を提供する。しかし、上述したように、これらの成分および他の成分の他の比率が、送達媒体として許容される。例えば、他の有効な送達媒体には、草炭（620g）−砂（3,380g）−ひきわりトウモロコシ（270g）−キチン（10g）が含まれる。
一例として、上述したように、YGMブイヨン中で増殖したStreptomyces WYEC 108菌糸体を含む約1.6リッターの収集した培養物ブイヨン（対数期細胞：例えば、約72時間培養物）に、400mLのNH4Cl無菌溶液（400mLの蒸留水に8gのNH4Clを含む）を追加し、草炭、砂、およびひきわりトウモロコシからなる4kgの滅菌した送達媒体を含むプラスチック容器に接種した。Streptomyces WYEC 108の接種前に、この送達媒体を２回滅菌した（121℃で３時間）。接種した容器を30℃で、10〜14日インキュベーションし、胞子の形成を最大にした。次いで、使用するまで、容器を４℃で貯蔵した。
送達媒体中でのNH4Clの使用は、Streptomyces WYEC 108の発芽する胞子の窒素源を提供する。当業者に知られているように、NH4Clの代わりに他の窒素源をこの目的のために使用することができる。例えば、この明細書で記載したように、送達媒体に混合する前に、細菌増殖培地（例えば10％のYGM）中に胞子を再懸濁する場合、この窒素源の添加は必要ない。本発明の好適例では、送達媒体は十分な量の窒素源を含む。当業者に知られているように、”十分な量”の窒素源を含むことの決定は、特定の窒素源の量の増加もしくは減少による発芽度数に与える効果、または窒素源を変更することによる効果を測定することにより行うことができる。窒素源の十分な量は、Streptomyces WYEC 108の胞子またはStreptomyces WYEC 108の発芽を促進する特定の窒素源の量である。
他の例では、実施例XIに記載したように、Streptomyces WYEC 108の胞子を液体培地中で産生し、好ましい送達媒体に直接組み入れ、次いで４℃で貯蔵する。
本発明の好適例では、Streptomyces WYEC 108を、少なくとも１×105cfu/gの終濃度になるよう、送達媒体に添加する。さらに好適な例では、送達媒体中のStreptomyces WYEC 108の終濃度は１×105cfu/g〜１×108cfu/gの間である。
実施例XII
Streptomyces WYEC 108を含む送達媒体の組成物の詳細な説明
Streptomyces WYEC 108を含む送達媒体の好ましい組成物を、以下に述べる方法により大規模に製造する。記載された方法のすべてを、標準的な無菌技術（例えば、UV光−滅菌した層流チャンバー）を用いて行い、最終消費者により包装バッグが開封されるまでの無菌状態を保証する。
細胞の産生
１）Streptomyces WYEC 108のCYD斜面からの胞子を、10mLの無菌YGMまたはCYGブイヨン（pH6.5）中に懸濁させる。この接種懸濁液をフラスコ培養物に接種するために用いる。
２）100mLのYGM（pH6.5）を含む６個の250mLのフラスコに接種する。接種物として、フラスコ当たり10mLの胞子懸濁液を用いる。接種後、フラスコを200rpmで振盪しながら、30℃で約36時間インキュベーションする。
３）1.1リッターのYGMブイヨン（pH6.5）を含む６個の2.0リッターのフラスコのそれぞれに、上述のように調製した菌糸体接種物（フラスコ当たり100mLの接種物）を接種する。接種後、フラスコを200rpmで振盪させながら、30℃で約24〜48時間以上（４日まで）インキュベーションする。このものは発酵槽のための接種物となる。
発酵
上述のようにして調製した7.2リッターの保存培養物を、40リッターの無菌YGMブイヨン（pH6.5）を含む発酵槽に接種する（＝15容量％の接種物；このアプローチは、実際と同様の高密度の細胞懸濁液を用いて接種することである）。発酵槽を、かき混ぜながら（200rpm）、30℃で約72時間（対数期の終わり近くまで）操作した。
発酵槽収集
１）WYEC 108細胞（約72時間インキュベーションした後）を含む発酵培養物ブイヨンを、無菌の20リッタープラスチックボトル中に無菌的に収集する。
２）無菌のNH4Cl溶液を、収集した培養物ブイヨンに添加し、このものは、なおWYEC 108細胞を含む（3.2リッターの収集した培養物ブイヨン当たり、800mLの蒸留水中に溶解した16gのNH4Clを用いる）。次いで、得られた1.2リッター量のNH4Cl含有細胞懸濁液を、前もって調製した送達媒体に接種する前に、このボトルを振盪することにより、よく混合する。
送達媒体の調製
１）送達媒体の各成分を別々に秤量し、大きなサイズの滅菌可能なパン、または他の適切な容器に添加する。組み合わせた混合物を送達媒体とする。この送達媒体は、草炭、砂、およびひきわりトウモロコシ（540g:2700g:540g;1:3.5:1w/w比）からなる。
２）送達媒体を入念に混合し、強いアルミニウム箔または精製綿で覆い、次いで２度滅菌した（121℃で１回90分間、滅菌時間の間に12時間おく）。
３）第２回の滅菌後、株WYEC 108およびNH4Cl溶液を含む収集した培養物（上述のように調製）の接種前に、送達媒体を室温にまで冷却する。
草炭、砂、水、ひきわりトウモロコシ、およびNH4Clの組成物を作製するための送達媒体へのStreptomyces WYEC 108の混和
１）WYEC 108−NH4Cl溶液を含む約0.5リッターの収集した培養物ブイヨン（上述のようにして調製）を、3.78kgの送達媒体を含む必要なだけ多くの予め滅菌したプラスチック容器のそれぞれに、完全に組み入れる。
２）次いで、接種した容器を、30℃で10〜40日間（20日までのインキュベーションが最適であることができる）インキュベーションし、しかる後、これらを用いるまで４℃で貯蔵する（この組成物は数カ月間安定である）。
取扱いおよび輸送
１）小さな滅菌したショベルまたは同等の道具を用いて、好ましくは、UV−滅菌した層流フッド中で、Streptomyces WYEC 108を含む完成した組成物を、無菌の三層プラスチックバッグに、無菌的に移す。
２）次いで、充填したバッグを結び、輸送用の0.0425m3（1.5ft3）の可動ボックスに入れる。次いで、各ボックスを強力なテープで封印する。
実施例XIII
Streptomyces WYEC 108を含む組成物の幼植物苗床への組み入れ
実施例XIIに記載したようなStreptomyces WYEC 108生物制御剤および送達媒体を含む組成物を、1.0〜1.2×105cfu/g土壌以外の最終的なStreptomyces濃度に、苗床花壇向き土壌またはポッティングミックスと混合する。幼植物処理を次に示す。
１）草炭の約1.0cmを各ポット（または床）の底に入れ、通気および排水を確保しながら、土壌（またはポッティングミックス）の損失を防ぐ。
２）次いで、農業用（苗床またはポッティングミックス）土壌により、幼植物のポットを、ポット（または床）の上面から下約3cmまで満たす。次いで、これらのポット（床）に給水して浸潤させる。
３）次いで、Streptomyces WYEC 108および送達媒体を含む組成物の約1.5cmを、各ポット（床）の上面に添加する。所望の場合、さらにこの組成物を苗床花壇向き土壌またはポッティング土壌と予め混合して、容量を増加させ、cfu/g計数を調節することができる。しかし、最適な効力のために、cfu/gを最終的な混合において少なくとも105cfu/gに維持する必要がある。
４）種子を調製した幼植物ポットの表面に置き、次いで追加の1.5cm（およそ）の苗床花壇向き土壌またはポッティング土壌／ミックスを用いて被覆する。
５）次いで、少量の水を湿った土壌および種子に添加する。
６）乾燥を最小にするためおよび硬化（crustings）を防ぐために、幼植物発生まで、これらのポットを、代表的に清浄な黒色プラスチックで覆う（この処理は水分が制御されている場合には必要がない）。
７）幼植物の発生後、必要によりポット（または床）の上面に追加の水を噴霧する。
本発明の具体例および好適例を示したが、当業者であれば、本発明および本発明の一層広い観点から逸脱することなく、種々の変更および修正を行うことができることは明らかである。したがって、本出願人は、添付した請求の範囲が本発明の正確な真意および範囲内に入るかかる種々の変更および修正のすべてをカバーすると考える。
参考資料
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【図１】
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【図２】
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