(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス属95-74株を培地中で培養し、以下の式(I)で表されるサイトトリエニンＩまたはIIを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするサイトトリエニンＩまたはIIの製造方法。
【化１】
0003726980.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、IV、その製造方法、およびそれを有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【従来の技術】
近年の研究により、多くの癌遺伝子産物がシグナル伝達分子として働いており、それらの活性化が細胞の異常増殖に結びついていることが明らかとなりつつある。数多くの癌遺伝子産物が発見されているが、半数以上の癌遺伝子がチロシンキナーゼをコードしており、これら癌遺伝子が細胞の癌化および癌形態の維持に密接に関与していることが判明しつつある。そこで、これらの癌遺伝子産物の機能を抑制する化合物は抗腫瘍物質としての可能性が示唆されており、このような新しい作用機序を有する抗腫瘍剤の開発が望まれている。
一方、抗腫瘍物質に関しては、既に多数の化合物が医薬品として実用化されているが、新規な構造を有する抗腫瘍性化合物に対しては、不断の希求があるといえよう。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の希求に応えるものであり、抗腫瘍活性を示す新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、IV、その製造方法、およびそれを有効成分とする抗腫瘍剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、埼玉県志木市の田にて採取した土壌から分離された、ストレプトマイセス属に属する放線菌 95-74株が抗腫瘍活性を有する物質を生産することを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の一般式 (I)又は(II)で表される新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを提供するものである。
【０００３】
【化２】
0003726980.tif 000002
【０００４】
本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、IVは、ストレプトマイセス属に属する、サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIV生産菌を培地に培養し、サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。本発明で使用するサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIV生産菌の好ましい例としては、ストレプトマイセス属95-74 株が挙げられる。
本発明はさらに、新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを有効成分とする抗腫瘍剤を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、IVは以下の式で表される。
【０００６】
【化３】
0003726980.tif 000003
【０００７】
本発明の物質サイトトリエニンＩ、II、III 、IVは、ストレプトマイセス属に属する微生物により生産可能であるが、その具体例としてはストレプトマイセス属 95-74株が挙げられる。ストレプトマイセス属 95-74株は以下の菌学的性質を有する。
【０００８】
【表１】
0003726980.tif 000004
【０００９】
【表２】
0003726980.tif 000005
【００１０】
【表３】
0003726980.tif 000006
【００１１】
上記表１、２、３の生物学的性質に基づき、本発明にかかわる菌株はストレプトマイセス属に属するすることが判明した。なお、当該菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研菌寄第 15904号として寄託されている（FERM P-15904）。
上記菌株、放線菌ストレプトマイセス属 95-74株を培養し、当該培養物から新規物質サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIV (以下「本発明化合物」とも記載する) を採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねストレプトマイセス属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを精製、単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、あるいは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、あるいは反復して使用することが可能である。
【００１２】
以上のようにして製造される新規なサイトトリエニンＩ、II、III 、IVは、後述の試験例に示すように抗腫瘍活性を有する。
本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを有効成分とする抗腫瘍剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量 (使用量) が適宜決定される。例えば、本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを有効成分とする抗腫瘍剤の場合、その投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤型としては、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤又は注射剤もしくは座剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて、既知の方法で製造される。また、上記のサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを有効成分として含有する抗腫瘍剤の臨床的投与量は、年齢、体重、患者の感受性、症状の程度により異なるが、通常効果的な量は、成人一日 0.1 mg 〜１g 程度であり、一日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により上記の範囲外の量を用いることができる。
【００１３】
また化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、細胞の成長を抑制する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤形としては、例えば、粉末または顆粒等の固形剤もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤等を挙げることができる。通常、上記サイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを有効成分とする癌細胞成長抑制の効果的な使用量範囲は１×10-3〜100 μg/mLであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例等を記載して本発明を具体的に記載する。
製造例１
グルコース  ２％、大豆粉 2.5％、可溶性澱粉  １％、酵母 0.4％、肉エキス 0.1％、食塩 0.2％、リン酸第二カリウム 0.005％の組成の培地 (pH 6.5) に、前記菌株ストレプトマイセス属 95-74株を接種して28℃で96時間振盪培養を行った。
培養液 1.8 Lを80％アセトン２Ｌを用いて抽出した。吸引濾過、減圧濃縮後得られた水溶液をpH 7.0に調製し、2.6 Ｌの酢酸エチルで３回抽出を繰り返した。抽出後、全ての酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮し、褐色のシロップ 571 mg を得た。
このシロップ 571 mg を酢酸エチル／メタノール(9:1) 1mL に溶解し、酢酸エチル／メタノール (9:1)で調製したシリカゲルカラム〔市販の Sep-Pak（登録商標）CARTRIDGE PLUS SILICA （直径 10 mm、長さ 30 mm) と充填式カラム（10mL注射筒) (Silica gel:直径 20 mm、長さ 50 mm) と連接] に浸潤させ、酢酸エチルーメタノール溶液を配合割合を順次に変えて (90:10, 50:50) それぞれ 60 mLずつ流し、最後にメタノール 60 mLを流した。活性物質は酢酸エチルーメタノール溶液 (90:10)の画分に溶出した。これを減圧濃縮することによって484 mgの褐色油状物質を得た。
【００１５】
続いて、ODS カラム (直径 20 mm、長さ 250 mm;カプセルパック、資生堂社製) と62.5％含水メタノール溶出溶媒を用いて流速 9.0 mL/分と検出波長 230 nm の条件下で分取高速液体クロマトグラフィーにより、精製を行った。この結果、淡黄色粉末として本発明化合物サイトトリエニンＩ及びIIをそれぞれ64.4 mg と 9.8 mg ずつ得た。
なお、サイトトリエニンIII 及びIVは、本培養生産物中より同様な精製行程で単離可能であるが、それぞれ容易に塩化鉄 (III)を用いた酸化反応によって、サイトトリエニンＩ及びIIより容易に変換可能である（図８）。また、サイトトリエニンIII 及びIVは、それぞれハイドロサルファイトナトリウムを用いた還元反応によって容易にサイトトリエニンＩ及びIIに変換可能である（図９）。
以下に当該精製標品サイトトリエニンＩ、II、III 、及びIVの物理化学的性質を表４及び表５に、サイトトリエニンＩ及びIIのNMR スペクトルデータを表６、表７に示す。
【００１６】
【表４】
0003726980.tif 000007
【００１７】
【表５】
0003726980.tif 000008
【００１８】
【表６】
0003726980.tif 000009
0003726980.tif 000010
【００１９】
【表７】
0003726980.tif 000011
0003726980.tif 000012
【００２０】
本発明化合物の活性は以下の方法に従って測定した。
試験例１
サイトトリエニンＩ、II、III 、IVの v-srcts-NRK細胞（温度感受性ラウス肉腫ウィルスを感染させたラット腎細胞）の正常形態への復帰作用
多くの癌遺伝子はチロシンキナーゼをコードしている。その中で v-srcは非受容体型チロシンキナーゼをコードしていて、細胞をトランスフォーム形態へ導くと考えられている。 v-srcts-NRK細胞は温度感受性のv-SRC 遺伝子がトランスフォームされており許容温度（32℃）においては癌形態を示し、非許容温度（39℃）においては正常形態を示し、許容温度下において正常形態を誘導する薬剤は SRC蛋白質の機能および SRC蛋白質に関わる情報伝達系を阻害すること、癌細胞の増殖を選択的に阻害することが示唆される。
v-srcts-NRK細胞は、通常、10％牛血清を含む Eagle's MEM培地にて32℃、５％炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。許容温度（32℃）において、一連の希釈系列のサイトトリエニンＩ、II、III 、IVを添加し、18時間後の正常形態誘導能を解析した。結果を表８に示す。
【００２１】
【表８】
0003726980.tif 000013
【００２２】
表８の結果は、本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、及びIVが抗腫瘍剤とし有効であることを示している。
試験例２
サイトトリエニンＩ、II、III 、及びIVの細胞周期阻害効果
細胞は、Ｍ期、G1期、Ｓ期、G2期という一連の過程からなる細胞周期を回転することにより分裂・増殖する。この細胞周期の制御機構に異常が生じると恒常性に乱れが生じ、癌や免疫疾患になる可能性が高まる。
v-srcts-NRK細胞は温度感受性のSRC 遺伝子がトランスフォームされており許容温度（32℃）においては癌形態を示し多くのＳ期の細胞が観測され、非許容温度（39℃）においては正常形態を示しG0/G1 期の細胞が多く観測される。許容温度下においてＳ期進行を阻害し正常形態を誘導する薬剤は SRC蛋白質の機能および SRC蛋白質に関わる情報伝達系を阻害すること、癌細胞の増殖を選択的に阻害することが示唆される。
【００２３】
v-srcts-NRK細胞は、非許容温度（39℃）で培養すると細胞周期がG0/G1 期で停止し、これを許容温度（32℃）にシフトダウンすると細胞はＳ期に進行し増殖を繰り返す。シフトダウンと同時に一連の希釈系列のサイトトリエニンＩ、II、III 、又はIVを添加し、18時間後の細胞周期のＳ期進行をフローサイトメトリーにより解析した。結果を表９に示す。
【００２４】
【表９】
0003726980.tif 000014
【００２５】
表９の結果は、本発明のサイトトリエニンＩ、II、III 、IVが抗腫瘍剤とし有効であることを示している。
試験例３
サイトトリエニンＩ、II、III 、及びIVの癌細胞増殖抑制効果
ヒト白血病細胞 K562 及び HL-60を RPM 1640 培地 (10％の牛胎仔血清を含む) で5%  炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養した。これに一連の希釈系列のサイトトリエニンＩ、II、III 、IVを加え、17時間培養した後、MTT 試薬を加えて生育を計測した。その結果を表１０に示す。
【００２６】
【表１０】
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【００２７】
表１０の結果は、本発明のサイトトリエニン  Ｉ、II、III 、及びIVが抗腫瘍剤とし有効であることを示している。
試験例４
サイトトリエニン  Ｉ、II、III 、及びIVの抗菌活性
サイトトリエニン  Ｉ、II、III 、及びIVをブイヨン培地（被検菌：バクテリア，３７℃，１日培養）、サブロー培地（被検菌：カビ，２８℃，２日培養）中で寒天希釈法によって試験した。最小阻止濃度を表１１に示す。
【００２８】
【表１１】
0003726980.tif 000016
【００２９】
製剤例１（注射・点滴剤）
サイトトリエニンＩ、II、III 、或いはIV 10mg を含有するように、粉末ブドウ糖 5g を加えてバイアルに無菌的に分配し密封し、窒素、ヘリウムなどの不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、0.85％生理的食塩水 100 ml を添加して静脈内注射剤とし、一日、10-100 ml を症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
製剤例２（顆粒剤）
サイトトリエニンＩ、II、III 、或いはIV 1g 、乳糖 98g  及びヒドロキシプロピルセルロース 1 gを各々取り、よく混合した後、常法に従って粒状に形成し、これをよく乾燥して瓶、ヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日、100-1000 mgを症状に応じて経口投与できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイトトリエニンＩ〔図１ａ〕及びII〔図１ｂ〕のメタノール中の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図２】サイトトリエニンＩの赤外線吸収スペクトル (KBr)を示す。
【図３】サイトトリエニンIIの赤外線吸収スペクトル (KBr)を示す。
【図４】サイトトリエニンＩの 1H NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図５】サイトトリエニンIIの 1H NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図６】サイトトリエニンＩの13C NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図７】サイトトリエニンIIの13C NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図８】サイトトリエニンＩ及びIIからサイトトリエニンIII 及びIVへの変換を示す。
【図９】サイトトリエニンIII 及びIVからサイトトリエニンＩ及びIIへの変換を示す。
【図１】
0003726980.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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