(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニンの摂取が制限された患者が日常的に摂取することが可能な、フェニルアラニン含量の少ない一定品質のペプチド混合物の製造法であって、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水溶液に、１種又は２種以上の蛋白分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離したアミノ酸から選択されたフェニルアラニンの量を経時的に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質に含まれるフェニルアラニンの総量に対する遊離したフェニルアラニンの量の割合を算出し、その算出した値が予め設定された特定の範囲の８５〜９５％内に達したときに直ちに加水分解を停止し、分解液中の遊離したフェニルアラニンを適宜の方法で除去してフェニルアラニン含有量を低い値で一定にした一定品質のペプチド混合物を製造することを特徴とするフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法。
【請求項２】
遊離したフェニルアラニンの量の測定が、酵素膜センサーを用いて行われる請求項１に記載のフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、フェニルアラニンの摂取を制限する必要のあるアミノ酸代謝異常症、特にフェニルケトン尿症患者が日常的に摂取することが可能であるフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を、常に安定した状態で、一定の品質で製造する方法に関する。
本明細書において、百分率は、特に断りのない限り重量による表示である。
【０００２】
【従来の技術】
フェニルケトン尿症（以下ＰＫＵと記載することがある）は、アミノ酸の一つであるフェニルアラニン（以下Ｐｈｅと記載することがある）をチロシンに変換するフェニルアラニン水酸化酵素が先天的に欠如しているため、Ｐｈｅが、血中に蓄積され、神経系の障害、発育障害を惹起する先天性代謝異常症である。従って、ＰＫＵ患者は、体内にＰｈｅが蓄積しないよう医師の指導のもとに、Ｐｈｅの摂取量を厳密に制御しなければならないのである。
【０００３】
一方、Ｐｈｅは、蛋白質に通常３〜５％程度含まれている普通のアミノ酸であるため、従来、ＰＫＵ患者は、食品若しくは乳児用調製乳の蛋白質成分の一部又は全部を、Ｐｈｅを含まないアミノ酸混合物に置換して摂取しなければならなかった。しかしながら、このようなアミノ酸混合物は、アミノ酸特有の不快な風味を呈するとともに、腸管での浸透圧が高いために下痢を惹起する等の欠点があった。そのため、風味が良く、かつ食事療法に好適なＰＫＵ患者用蛋白質源が、患者、その家族又は医師から待望されていた。
【０００４】
その一つの方法として、ＰＫＵ患者用蛋白質源としてκ−カゼイングリコマクロペプチド（以下ＧＭＰと記載することがある）を用いる方法が開示されている（特開平４−１２６０５１号公報）。ＧＭＰは、そのアミノ酸配列中にＰｈｅを全く含まず、また分子量が８，０００ダルトンと大きく浸透圧上昇の問題もほとんどないためＰＫＵ患者用蛋白源として有効である。しかしながら、ＧＭＰを単離するための操作が極めて繁雑であり、工業的生産のためには不都合であった。しかも、最近の栄養学的知見によれば、蛋白質よりもオリゴペプチドの方が消化吸収に優れていることが明らかになっている。
【０００５】
ＰＫＵ患者用蛋白質源にオリゴペプチドを用いた他の例として、蛋白質を蛋白分解酵素で分解し、Ｐｈｅ含量の少ない画分をゲル濾過により回収し、低フェニルアラニンペプチド（以下ＬＰＰと記載することがある）を用いる方法がある［ジャーナル・オブ・フード・サイエンス(Journal of Food Science)、第４１巻、第１０２９〜１０３２ページ、１９７６年及び特開昭６１−６８４２６号公報］。
【０００６】
更に、蛋白質を水系下で、エキソペプチダーゼで処理するか、又はエンドペプチダーゼで処理後エキソペプチダーゼで処理し、芳香族アミノ酸をほとんど含まないポリペプチドと遊離芳香族アミノ酸又は芳香族アミノ酸を末端に有する低分子ペプチドを活性炭を用いて吸着し、逆浸透膜又はイオン交換性電気透析膜を用いて低分子物質を分離し、ＬＰＰを製造する方法が開示されている（特公平２−５４０７０号公報）。これらの方法により、ＬＰＰを工業的に製造することが可能となった。
【０００７】
一方、蛋白分解酵素で原料の蛋白質を分解してペプチドを製造する場合、いくつかの従来技術を例示すれば次のとおりである。
１）蛋白質をエンド型蛋白分解酵素及びエキソ型蛋白分解酵素共存の水系下で、０．５〜１０時間酵素分解し、苦味の極めて少ない平均鎖長３〜１０のオリゴペプチドを得ることを特徴とするオリゴペプチド混合物の製造法が開示されている（特開昭６２−１４３６９７号公報）。
【０００８】
２）カゼイン溶液をカラムに充填した固定化酵素で部分分解する方法において、カゼイン溶液の通液速度を制御してカゼインの部分分解物を製造する方法が開示されている（特公平３−３１４２１号公報）。
【０００９】
３）原料蛋白質の抗原性を認めなくなるまで、かつ、原料蛋白質に含まれる芳香族アミノ酸が、９０％以上遊離アミノ酸になるまで分解し、ゲル濾過法によりペプチド部分を回収することことにより、抗原性を呈さず、分子量１，０００ダルトン以下、遊離アミノ酸含有量が２０％以下、芳香族アミノ酸含有量が全アミノ酸の１．０％以下の低分子量ペプチドの製造法が開示されている（特開平２−１３８９９１号公報）。
【００１０】
４）獣乳κ−カゼイン由来のグリコポリペプチドの蛋白分解酵素加水分解物であって、フィッシャー値が３０から６０の範囲であるペプチド混合物を製造する方法において、分解率が５〜２５％となった時点で加熱処理し、酵素を失活させる方法が開示されている（特開平２−３００１３７号公報）。
【００１１】
５）牛乳ホエー蛋白質を、生体内で生ずる蛋白質消化をシミュレーションし得る蛋白質分解酵素と接触させることにより、加水分解を、生成物中に残留蛋白質がほとんど含有しなくなるまで、即ち、１２％トリクロル酢酸に沈殿しうる窒素を含有しなくなるまで、及び少なくとも５０％のペプチドが２〜５のアミノ酸を含有し、遊離アミノ酸の量が１５％以下であるペプチド混合物を得るまで継続することを特徴とする牛乳ホエー蛋白質からのペプチド混合物の製造法が開示されている（特公昭６２−６１０３９号公報）。
【００１２】
６）乳蛋白質の加水分解物が、分子量１，０００以下であり、芳香族アミノ酸の９０％以上が遊離アミノ酸であって、ヒト皮膚細胞に対して増殖賦活作用を有し乳蛋白質の抗原性を有しないことを特徴とする化粧料及び皮膚外用剤が開示されている（特開平４−２６６０４号公報）。
【００１３】
７）乳蛋白質を固定化蛋白分解酵素で分解して蛋白分解物を製造する方法において、ペプチドセンサーでペプチド濃度を測定する方法及びペプチドの平均鎖長を測定する方法が開示されている（食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合編、「実践バイオリアクター」、第１６６〜１８４ページ、食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合発行、１９９０年）。
【００１４】
８）小麦グルテンを固定化蛋白分解酵素で分解してグルテン分解物を製造する方法において、グルテン分解物の疎水性を逆相クロマトグラフィーで経時的に計測して泡末安定性に優れたグルテン分解物が製造できることが開示されている（食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合編、「実践バイオリアクター」、第１０６〜１２６ページ、食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合発行、１９９０年）。
【００１５】
９）味噌、醤油等の発酵食品の製造、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸発酵における工程管理において、目的生産物である遊離アミノ酸量を測定することが知られている（食品工業、第３４巻、第１６号、第１〜１１ページ、１９９１年）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術に示されるように、従来、蛋白質分解酵素で原料の蛋白質を分解してペプチド混合物を製造する場合、分解反応の終点を、反応時間、蛋白溶液の通液速度等を指標とするか、又は分解物の分解率、疎水度等の測定により決定するか、のいずれかであったが、これらの方法では、刻々変化する分解物の理化学的性状、特に遊離のアミノ酸量を正確に把握することが極めて困難であった。
【００１７】
従って、従来のペプチド混合物の製造法においては、製造バッチごとにペプチド混合物が含有する遊離アミノ酸量及び組成が異なり、ペプチド混合物の品質が一定しないという致命的な欠点があった。しかも、酵素反応を再現性よく実施するためには、反応温度、ｐＨ、酵素力価、基質濃度等を厳密に制御しなければならず、そのため工業的スケールでは作業性も劣り、一定のアミノ酸遊離率を得ることは事実上困難であった。
【００１８】
このことは、高品質のＬＰＰを製造する場合においても次のような致命的な欠点を有することを意味している。前記のとおり、蛋白質を蛋白分解酵素で分解する工程を含むＬＰＰの製造法において、ペプチド混合物のＰｈｅ含量を低下させるための方法は、蛋白分解酵素により蛋白質を加水分解することにより蛋白質から十分量のＰｈｅを遊離させ、遊離したＰｈｅをゲル濾過、活性炭吸着等により除去するという原理に基づいており、蛋白質の蛋白分解酵素による加水分解工程の制御が高品質のＬＰＰを製造するための重要な技術となっている。
【００１９】
即ち、Ｐｈｅの遊離が不十分であった場合には、酵素分解反応に続くゲル濾過又は活性炭処理により除去されるＰｈｅ量が少なくなるため、ペプチド混合物のＰｈｅ含量が高くなり、これはＰＫＵ患者用として不適当なものとなる。また、Ｐｈｅの遊離が過剰の場合（換言すれば酵素分解反応が過度に進行した場合）、Ｐｈｅ以外のアミノ酸遊離率も高くなるために風味が著しく悪化し、浸透圧も高くなるため、不快な味、下痢症状の発生等のため治療効果が極めて低下する不都合があり、その改善が強く要請されている状況にあった。即ち、高品質のＬＰＰを製造するためには、蛋白質の蛋白分解酵素による加水分解工程において得られるペプチド混合物の遊離Ｐｈｅ量が、常に一定となることが極めて重要な課題である。
【００２０】
本発明者らは、常に一定の品質が得られるペプチド混合物の製造法を発明し、既に特許出願（出願番号未着。以下先願と記載することがある）した。先願の方法は、「一定品質のペプチド混合物の製造法であって、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水溶液に、１種若しくは２種以上の蛋白分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離した特定アミノ酸の量を経時的に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質に含まれる特定アミノ酸の総量に対する遊離した特定アミノ酸の量の割合を算出し、その算出した値が予め設定された特定の範囲内に達したとき直ちに加水分解を停止することを特徴とするペプチド混合物の製造法。」である。
【００２１】
このような状況の中で、本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、常に安定した状態で、一定の品質のＰｈｅ含量の少ないペプチド混合物を得るために、鋭意研究を行なった結果、蛋白質の蛋白分解酵素による加水分解工程において、分解液中に遊離したＰｈｅの量を、経時的、かつ短時間で測定し、原料蛋白質に含まれているＰｈｅの総量との割合を算出し、その値が予め設定した特定の範囲内に達したときに直ちに分解反応を停止し、遊離したＰｈｅを除去することにより、簡便に、Ｐｈｅ含量の少ないペプチド混合物が得られることを見い出し、本発明を完成した。
【００２２】
本発明の目的は、特にＰＫＵ患者が日常的に摂取することが可能である、品質が良好なフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を簡便に製造し得る新規な方法を提供することにある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、フェニルアラニンの摂取が制限された患者が日常的に摂取することが可能な、フェニルアラニン含量の少ない一定品質のペプチド混合物の製造法であって、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水溶液に、１種又は２種以上の蛋白分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離したアミノ酸から選択されたフェニルアラニンの量を経時的に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質に含まれるフェニルアラニンの総量に対する遊離したフェニルアラニンの量の割合を算出し、その算出した値が予め設定された特定の範囲の８５〜９５％内に達したときに直ちに加水分解を停止し、分解液中の遊離したフェニルアラニンを適宜の方法で除去してフェニルアラニン含有量を低い値で一定にした一定品質のペプチド混合物を製造することを特徴とするフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法であり、遊離したフェニルアラニンの量の測定が、酵素膜センサーを用いて行われることを望ましい態様としてもいる。
【００２４】
次に本発明について詳述する。
本発明の出発原料として使用する原料蛋白質は、獣乳、卵、魚肉、畜肉等に由来する動物性蛋白質、大豆、小麦等に由来する植物性蛋白質、又はこれらの任意の混合物であり、特に限定されるものではない。また、蛋白質を予め軽度に加水分解した分解物であって、更に蛋白分解酵素により分解し得る大きい分子量のペプチド混合物を出発原料とすることもできる。
【００２５】
原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質を、蛋白質換算で１０％前後の濃度で水に溶解し、殺菌及び蛋白質の酵素分解を効率よく行うため、６５〜９０℃の温度範囲で５〜３０分間加熱処理してもよい。次いで溶液のｐＨをアルカリ又は酸溶液を用いて使用する蛋白分解酵素の至適ｐＨ付近に調整し、原料水溶液を調製する。
【００２６】
次いで、前記原料水溶液に蛋白分解酵素を添加するが、蛋白分解酵素の添加は一括添加、又は少量に分割して添加する逐次添加であってもよい。使用する蛋白分解酵素としては、動物由来（例えば、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等）、植物由来（例えば、パパイン、ブロメライン等）、微生物由来（例えば、酵母、カビ、細菌、放線菌、乳酸菌等）のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼがあげられるが、エンドプロテアーゼとしては、Ｐｈｅ等の芳香族アミノ酸に対して親和性のあるものが好ましく、例えば、ペプシン、キモトリプシン等が望ましい。エキソプロテアーゼとしては、Ｐｈｅ等の芳香族アミノ酸を末端に有するペプチドに対してペプチダーゼ活性を示すものが好ましく、黒麹菌、放線菌、酵母等に由来するエキソペプチダーゼを好適な例として示すことができる。
【００２７】
Ｐｈｅを十分に遊離させるためには、前記のエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼとを組み合わせて用いることが望ましく、原料蛋白質溶液に一括添加により、又はエンドプロテアーゼを添加した後一定時間経過後にエキソプロテアーゼを添加し、段階的に、分解反応を実施することもできる。添加する酵素量は、例えば、エンドペプチダーゼを原料蛋白質１ｇ当たり５０００〜１００００ＰＵＮ単位、エキソペプチダーゼを原料蛋白質１ｇ当たり１０〜５０活性単位の添加を、望ましい態様として例示することができる（ＰＵＮ単位及び活性単位については後記する）。
【００２８】
所定量の酵素を添加した原料水溶液を、通常、酵素の至適温度に所定時間保持して蛋白質の酵素による分解を開始するが、分解中に微生物の増殖が懸念される場合は、必要に応じて酵素の至適温度より高温域または低温域の温度に所定時間保持して蛋白質の酵素による加水分解を行なうこともできる。しかしながら、酵素の至適温度よりも極端に異なる温度範囲では、加水分解反応の効率が低下するので、通常４０〜６０℃の温度範囲が望ましい。
【００２９】
加水分解の開始後、分解液中に遊離したＰｈｅの量を経時的に、かつ短時間に測定するが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記載することがある）、酵素膜センサー［例えば、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）］等を用いることができ、特に望ましい態様としてオンラインにより測定する方法を例示することができる。これらにより、分解液中に遊離したＰｈｅの量を経時的に、かつ短時間に測定し、出発原料である蛋白質又は予め軽度に加水分解した蛋白質に含まれるＰｈｅの総量に対する遊離したＰｈｅの量の割合が予め設定された特定の範囲に達したとき、ただちに分解液中の酵素を失活又は除去し、加水分解を停止する。該ペプチド混合物をＰＫＵ患者に供することを考慮すると、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した蛋白質に含まれるＰｈｅを高度に遊離して除去する必要があるので、前記特定の範囲は、８５〜９５％を例示することができ、望ましくは８８〜９２％である。
【００３０】
分解液中の酵素の失活又は除去は、常法による加熱処理、限外濾過膜等を用いる分解液からの酵素の除去等により実施することができる。加熱処理の加熱温度と保持時間は使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。加熱処理又は濾過処理による酵素の失活又は除去工程には、相当の時間を要し、この間に分解が進行するおそれがある場合には、所定の条件のもとに、分解の進行程度（Ｐｈｅの遊離速度）を、試験により予め測定し、その結果に基づいて加水分解を停止する前記特定の範囲を決定し、設定するのが望ましい。
【００３１】
分解液中の酵素の失活又は除去後、常法により分解液を冷却し、セライト濾過、精密濾過、限外濾過、遠心分離等の方法により分解液から沈殿を除去する。得られた分解液からのＰｈｅ等の芳香族アミノ酸の除去は、適宜の方法、例えば、ゲル濾過法、吸着樹脂法、活性炭吸着法等を単独又は組合わせて実施することができる。ゲル濾過剤としては、排除限界分子量１０，０００ダルトン以下、望ましくは２，５００ダルトン以下のものを使用し、芳香族アミノ酸に吸着性をもつ疎水性側鎖、例えば、カルボキシル基、ブチル基、フェニル基、疎水性部位をもつゲル担体を、特に好適な例として示すことができる。このようなゲル濾過剤としては、セファデックスＧ−１０（ファルマシア社製）、セルロファインＧＣＬ−２５（生化学工業社製）等、また、活性炭としては、例えば、白鷺（武田薬品工業社製）等を例示することができる。
【００３２】
ゲル濾過剤又は活性炭をカラムに充填し、このカラムに分解液を通液する。溶出液としては水又は芳香族アミノ酸の吸着性を高めるため２〜１５％のエタノール水溶液を使用することができる。芳香族アミノ酸の除去操作は、分解液にゲル濾過剤又は活性炭を投入し、所定時間静置し、芳香族アミノ酸を吸着させるバッチ法式により実施することもできる。
【００３３】
前記の方法によって得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の溶液を、公知の方法により濃縮して濃縮液とすることもでき、また、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末とすることもできる。得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の溶液、その濃縮液又はその粉末は、通常の食品原料と同様にＰＫＵ患者用の食品原料として使用し、各種ＰＫＵ患者用の食品を製造することができる。
【００３４】
前記ＰＵＮ単位及び活性単位は、次のとおりである。
エンドペプチダーゼのＰＵＮ単位は、カゼイン［ハマーシュタイン(Hammerstein) 。メルク社製］にエンドペプチダーゼを作用させ、３０℃で１分間に１μｇのチロシンに相当するアリルアミノ酸のフォリン試薬での呈色反応を示す酵素活性が１ＰＵＮ単位である。
【００３５】
また、エキソペプチダーゼの活性単位は、次の方法により測定した。エキソペプチダーゼを含有する粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解し酵素溶液とする。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社製。以下Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを加え３７℃で５分間反応させた後、３０％の酢酸溶液２ｍｌを加えて反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。エキソペプチダーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量が１活性単位であり、次式により算出した。
活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ）
（ただし、前記の式において、Ａ及びＢは、それぞれ波長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニトロアニリンの吸光度である）
【００３６】
次に試験例を示して本発明を詳述するが、本発明においては、次の試験方法を採用した。
（１）アミノ酸組成の測定方法
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ぎ酸処理後、６Ｎ塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸自動分析機（日立製作所製。８３５型）により分析し、アミノ酸の質量を測定した。
【００３７】
（２）遊離アミノ酸組成の測定方法
スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸自動分析機（日立製作所製。８３５型）により分析し、遊離アミノ酸の質量を策定した。そして前記アミノ酸組成の分析で得られた各アミノ酸の質量に対する遊離アミノ酸質量の百分率を算出した。
【００３８】
（３）遊離Ｐｈｅ量の測定方法
遊離アミノ酸濃度測定用酵素膜センサー（旭化成工業社製）を装着したバイオテックアナライザー（旭化成工業社製）により遊離アミノ酸量を測定し、この値と予め予備実験により求めた遊離Ｐｈｅ率との相関値から分解液中の遊離Ｐｈｅ量を測定した。
【００３９】
（４）ＨＰＬＣ
Inertsil PREP-ODSカラム（ＧＬサイエンス社製。６．５×２５０ｍｍ）をＨＰＬＣ（島津製作所製）に装着し、分解液０．１ｍｌを供給し、溶離液（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）に対する溶離Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）の割合が１００分間で５０％となる濃度勾配で１．５ｍｌ／分の流速で溶出を行った。
【００４０】
（５）分解率
ケルダール法により試料の全窒素を、ホルモール滴定法により試料のホルモール態窒素を、それぞれ測定し、これらの値から次式により算出した。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素）／（全窒素）×１００
【００４１】
試験例１
この試験は、従来から採用されているペプチド混合物の製造方法、即ち、▲１▼反応時間を指標にして酵素分解を停止する方法、▲２▼分解率を指標にして酵素分解を停止する方法、及び▲３▼本発明の方法［酵素膜センサー（バイオテックアナライザー。旭化成工業社製）］とにより、ペプチド混合物を製造し、得られたペプチド混合物中の遊離Ｐｈｅ量、及びこのペプチド混合物から遊離Ｐｈｅを除去して得られるＰｈｅ含量の少ないペプチド混合物のＰｈｅ含量に及ぼす影響を比較検討した。
【００４２】
１）試料の調製
前記▲１▼の方法では、酵素分解反応を１５時間で停止したこと、前記▲２▼の方法では、酵素分解を分解率が３０％に達したときに停止したこと、及び前記▲３▼の本発明の方法では、分解液中の遊離Ｐｈｅ濃度を経時的に、かつ短時間で測定し、Ｐｈｅの遊離率が９０％に達した時点で酵素分解を停止したことを除き、実施例１と同一の方法により牛乳乳清蛋白質溶液の加水分解をそれぞれ５回反復して実施し、合計１５種類のペプチド混合物を調製した。更に、これらの３種類の方法により得られた分解液から、それぞれ、実施例１と同一の方法により遊離Ｐｈｅを除去し、試料を調製した。
【００４３】
２）試験方法
各分解液の遊離Ｐｈｅ量及び各試料中の全Ｐｈｅ量を、それぞれ前記の方法により測定し、５回の結果の平均値と標準偏差を算出した。
【００４４】
３）試験結果
この試験結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、各方法で得られた試料の遊離Ｐｈｅ量の標準偏差は、▲３▼の本発明の方法が最も小さく、５回反復して製造した場合でも品質が安定しており、次いで▲２▼の方法の変動が少なく、▲１▼の方法は最も変動が大きく品質が不安定であることが認められた。また、これらの３種類の方法により製造した試料中の全Ｐｈｅの値及び標準偏差も、▲３▼の本発明の方法が最も低値を示し、品質が安定していることが認められた。
尚、酵素の種類、原料蛋白質の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４５】
【表１】
0003682994.tif 000002
【００４６】
試験例２
この試験は、試験例１とは異なる原料蛋白質及び分解条件で加水分解を行った場合の各方法を比較するために実施した。
１）試料の調製
前記試験例１の▲１▼の方法では、酵素分解反応を２０時間で停止したこと、前記試験例１の▲２▼の方法では、酵素分解を分解率が３５％に達したときに停止したこと、前記試験例１の▲３▼の本発明の方法では、分解液中の遊離Ｐｈｅ濃度を経時的に、かつ短時間で測定し、Ｐｈｅの遊離率が９０％に達した時点で酵素分解を停止したこと、を除き、実施例２と同一の方法により牛乳カゼインの加水分解をそれぞれ５回反復して実施し、合計１５種類の分解液を調製した。更に、これらの３種類の方法により得られた分解液から、それぞれ、実施例２と同一の方法により遊離Ｐｈｅを除去して試料を調製した。
【００４７】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によった。
【００４８】
３）試験結果
この試験結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなように、各方法で製造した分解液の遊離Ｐｈｅ量の標準偏差は、▲３▼の本発明の方法が最も小さく、５回反復して製造した場合でも品質が安定しており、次いで▲２▼の方法の変動が少なく、▲１▼の方法は最も変動が大きく品質が不安定であることが認められた。また、これらの３種類の方法により製造した試料中の全Ｐｈｅの値及び標準偏差も、▲３▼の本発明の方法が最も低値を示し、品質が安定していることが認められた。
尚、酵素の種類、原料蛋白質の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４９】
【表２】
0003682994.tif 000003
【００５０】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
市販の乳清蛋白質濃縮物（ラクプロダン８０。デンマークプロテイン社製。蛋白質含量７５％）１００ｇを１０％の濃度で脱イオン水に溶解し、６５℃で３０分間加熱殺菌し、４５℃に保持し、水酸化ナトリウムでｐＨを８．５に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）１５万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ単位）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）１５万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ単位）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）単位（乳清蛋白質１ｇ当たり５０００ＰＵＮ単位）、プロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）８００活性単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１０．７活性単位）を添加し、加水分解を開始し、酵素膜センサー［バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）］を用いて経時的に、かつ短時間でこの分解液の遊離Ｐｈｅ量を測定し、遊離Ｐｈｅ率が９０％に達した時点で８５℃、１０分間加熱して酵素を失活させ、酵素分解を停止し、セライト濾過法により沈殿物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチド混合物約７３ｇを得た。
【００５１】
得られた凍結乾燥物５ｇを１０％の濃度で水に溶解し、セファデックスＧ−１０（ファルマシア社製）を充填した５ｃｍ×１５ｃｍカラムに通液し、脱イオン水を用いて溶出し、フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を回収し、溶出液を凍結乾燥し、フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物約２．２ｇを得た。
【００５２】
前記製造法を３回反復して得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり０．２％であり、３回の製造におけるＰｈｅの量にはほとんど差異が認められなかった。
【００５３】
実施例２
市販牛乳カゼイン（ＡＬＡＣＩＤ。ニュージーランドデイリーボード製。蛋白質含量９０％）２００ｇを脱イオン水に懸濁し、１０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して溶解し、脱イオン水で１２％の濃度に調整し、９０℃で５分間加熱殺菌し、５０℃に保持し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）７２万ＰＵＮ単位（カゼイン蛋白質１ｇ当たり４０００ＰＵＮ単位）を添加して加水分解を開始し、開始５時間後にアクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）９０万単位（カゼイン蛋白質１ｇ当たり５０００ＰＵＮ単位）を添加し、加水分解を継続し、ＨＰＬＣ（島津製作所製）を用いて、経時的に、かつ短時間でこの分解液の遊離Ｐｈｅ量を測定し、遊離Ｐｈｅ率が９０％に達した時点で、８５℃で１０分間加熱して酵素を失活し、酵素分解を停止させ、分画分子量が３０００ダルトンの限外濾過膜（旭化成工業社製）により沈殿物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチド混合物約１６５ｇを得た。
【００５４】
得られた凍結乾燥物１５０ｇを２０％の濃度で水に溶解し、粉末活性炭［白鷺（武田薬品社製）］３５ｇを投入し、４℃で１５時間静置し、のち濾過して活性炭を除去し、吸着樹脂（ＫＳ−３５。北越炭素工業社製）１９０ｍｌを充填したカラムに５ｍｌ／分の流速で通液し、溶出液を凍結乾燥し、フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物約１１２ｇを得た。
【００５５】
前記製造法を３回反復して得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり０．３％であり、３回の製造におけるＰｈｅの量にはほとんど差異が認められなかった。
【００５６】
実施例３
市販の乳清蛋白質濃縮物（ラクプロダン８０。デンマークプロテイン社製。蛋白質含量７５％）５００ｇ及び市販の大豆蛋白粉末（ＳＵＰＲＯ。不二製油社製。蛋白質含量９０％）５００ｇを脱イオン水に１０％の濃度で溶解し、７０℃で５分間加熱殺菌し、５５℃に保持し、水酸化カリウムでｐＨを９に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）１２３万７５００ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり１５００ＰＵＮ単位）、パパインＷ−４０（天野製薬社製）１６５万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ単位）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）３３０万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり４０００ＰＵＮ単位）及びプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）１６５００活性単位（蛋白質１ｇ当たり２０活性単位）を添加して加水分解を開始し、酵素膜センサー（バイオテックアナライザー（旭化成工業社製））を用いて経時的に、かつ短時間でこの分解液の遊離Ｐｈｅ量を測定し、遊離Ｐｈｅ率が８８％に達した時点で、９０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、セライト濾過法により沈殿物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチド混合物約７２０ｇを得た。
【００５７】
得られた凍結乾燥物１００ｇを１０％の濃度で水に溶解し、セルロファインＧＣＬ−２５（生化学工業社製）を充填した３７ｃｍ×１５ｃｍカラムに通液し、脱イオン水を用いて溶出し、フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を回収し、凍結乾燥し、フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物約５２ｇを得た。
【００５８】
前記製造法を３回反復して得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり０．４％であり、３回の製造におけるＰｈｅの量にはほとんど差異が認められなかった。
【００５９】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明は、フェニルケトン尿症患者の摂取に適当したフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の新規な製造法であり、本発明の方法により、フェニルアラニン含有量が低い値で一定し、高品質の製品を簡便に製造することが可能であり、本発明方法により製造されるフェニルアラニン含有量の少ない一定品質のペプチド混合物は、従来製品にみられるような風味及び浸透圧上の欠点がなく、フェニルケトン尿症の乳幼児、成人、及び妊産婦の食事における蛋白源として広く利用できる。