(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖末端を有してなる修飾ポリ乳酸。
【請求項２】
１つ以上の水酸基と保護された官能基とを有する分岐ペプチドの水酸基を重合開始点とするラクチドのアニオン重合を行う工程を含む、請求項１記載の修飾ポリ乳酸の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の修飾ポリ乳酸を構成成分としてなる生分解性ミクロスフィア。
【請求項４】
ポリ乳酸と請求項１記載の修飾ポリ乳酸とを混合し、エマルジョン形成を行ってミクロスフィアを調製する工程を含む、請求項３記載の生分解性ミクロスフィアの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖末端を有してなる修飾ポリ乳酸およびその製造方法に関するものである。さらに本発明は、該修飾ポリ乳酸を構成成分としてなる生分解性ミクロスフィアおよびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ポリ乳酸は、優れた力学的強度や生体適合性を有すると共に、生体内で分解吸収される性質を有することから、生医学用材料として幅広く応用されている。たとえば、特開平１−２１６９１８号には、ポリ乳酸を用いた生理活性ポリ乳酸微粒子が、特開平２−５０４０２５号には、ポリ乳酸を用いた多層ポリマーマイクロカプセルが、特開平５−５０３５０４号には、ポリ乳酸を用いたドラッグデリバリーのための多孔性ミクロスフィアが提案されている。しかし、ポリ乳酸はアミノ基やカルボキシル基といった反応性の官能基を有しておらず、化学修飾などにより、新たな機能を付与することは困難であった。
【０００３】
そこで、本発明者らは、側鎖に反応性のイオン性官能基を有するデプシペプチドとポリ乳酸の共重合体を開発し、さらにＯ／Ｗ型エマルジョン法により調製したミクロスフィア表面には反応性官能基が露出していることを報告している（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００，４３６−４４１，１９９９）。しかし、この方法により得られる共重合体は、分子鎖上に反応性の官能基が点在するランダム共重合体であり、ミクロスフィア上に導入できる反応性官能基の数には限界があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明によって解決しようとする課題は、分子鎖の末端に多数の反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖を有する修飾ポリ乳酸およびその製造方法を提供することにある。さらに、本発明の課題は、前記修飾ポリ乳酸を用いて製造される、表面に多数の反応性官能基を有する生分解性ミクロスフィア、およびその製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
［１］  反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖末端を有してなる修飾ポリ乳酸、
［２］  １つ以上の水酸基と保護された官能基とを有する分岐ペプチドの水酸基を重合開始点とするラクチドのアニオン重合を行う工程を含む、前記［１］記載の修飾ポリ乳酸の製造方法、
［３］  前記［１］記載の修飾ポリ乳酸を構成成分としてなる生分解性ミクロスフィア、
［４］  ポリ乳酸と請求項１記載の修飾ポリ乳酸とを混合し、エマルジョン形成を行ってミクロスフィアを調製する工程を含む、前記［３］記載の生分解性ミクロスフィアの製造方法、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖末端を有してなる新規な修飾ポリ乳酸（以下では、単に本発明の修飾ポリ乳酸と呼ぶ）に関する。
【０００７】
本明細書において「分岐ペプチド鎖」とは、天然または非天然の複数のアミノ酸が分岐して結合したペプチド鎖をいう。分岐ペプチド鎖は、一種類のペプチドから構成されていてもよく、複数の種類のペプチドから構成されていてもよい。
【０００８】
本発明の修飾ポリ乳酸は、分岐ペプチド鎖に反応性官能基を有しており、その反応性官能基の具体例としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、硫酸基、アルデヒド基等が挙げられる。前記具体例の中でも、親水性と反応性が高く、容易にイオン化させることができるという観点から、アミノ基、カルボキシル基が特に好ましい。本発明の修飾ポリ乳酸に含有される反応性官能基は、一種類の官能基のみでもよく、複数の種類の官能基を含んでいてもよい。
【０００９】
本発明の修飾ポリ乳酸に含有される、反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖末端の好ましい例として、例えば、下記の式（１）または式（２）により表される分岐ペプチド鎖末端等が挙げられる。
【００１０】
【化１】
0003722476.tif 000002
【００１１】
本発明の修飾ポリ乳酸は、該修飾ポリ乳酸を使用して製造される生分解性ミクロスフィアに対して、薬剤や種々の生理活性物質を固定化するといった各種機能を付与するという観点から、その分岐ペプチド鎖末端に、好ましくは２個以上、より好ましくは４個以上の反応性官能基を有することが望ましい。
【００１２】
本発明の修飾ポリ乳酸のポリ乳酸部分の重合度は、特に限定されることはないが、ポリ乳酸部分の凝集力を利用してミクロスフィアを調製する観点から、２０以上が好ましく、５０以上が特に好ましい。ポリ乳酸の重合度は、後述する重合反応時の開始剤に対するラクチドの比（Ｍ／Ｉ）により適宜調整することができる。
【００１３】
本発明の修飾ポリ乳酸のＭｎは、特に限定されることはないが、ポリ乳酸部分の凝集力を利用してミクロスフィアを調製する観点から、３０００以上が好ましく、１００００以上が特に好ましい。
【００１４】
本発明の修飾ポリ乳酸のＭｗは、特に限定されることはないが、ポリ乳酸部分の凝集力を利用してミクロスフィアを調製する観点から、３０００以上が好ましく、１００００以上が特に好ましい。
【００１５】
本発明の修飾ポリ乳酸のＭｗ／Ｍｎは、特に限定されることはないが、ポリ乳酸部分の凝集力を利用してミクロスフィアを調製する観点から、５以下が好ましく、２以下が特に好ましい。
【００１６】
本発明の修飾ポリ乳酸の製造方法は、１つ以上の水酸基と保護された官能基とを有する分岐ペプチドとラクチドとを用いて、該分岐ペプチドの水酸基を重合開始点とするラクチドのアニオン重合を行う工程を含む。
【００１７】
前記修飾ポリ乳酸の製造方法に使用される１つ以上の水酸基と保護された官能基とを有する分岐ペプチドの調製は、特に限定されることはないが、１つ以上の水酸基と１つ以上のアミノ基もしくはカルボキシル基を有する化合物に対し、側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸をくり返し縮合反応させることにより合成することができる。例えば、リシン分岐ペプチドについては、Ｌ−リシンと２−アミノエタノールとを出発物質として縮合反応を繰り返し、１つのフリー水酸基と４つの保護されたアミノ基を有するリシン分岐ペプチドを合成することができる。また、グルタミン酸分岐ペプチドについては、Ｌ−グルタミン酸と３−ヒドロキシプロピオン酸を出発物質として縮合反応を繰り返し、１つのフリー水酸基と４つの保護されたカルボキシル基を有するグルタミン酸分岐ペプチドを合成することができる。
【００１８】
前記分岐ペプチドの水酸基を重合開始点とするラクチドのアニオン重合は、まず末端水酸基を常法によりアルコキシドに変換する。次いで、この分岐ペプチドアルコキシドの１００倍当量のラクチドを加えて、ＴＨＦ中、室温で３０分間攪拌する。アルコキシドに対して等モル以上の酢酸を系中に加えて反応を停止させる。得られた重合物を少量のクロロホルムに溶解し、メタノールを貧溶媒として再沈殿を数回行い、減圧下で乾燥する。得られたポリマーの分岐ペプチド鎖部分の保護基を脱離させることにより所望の修飾ポリ乳酸が得られる。
【００１９】
本発明はまた、本発明の修飾ポリ乳酸を構成成分としてなる生分解性ミクロスフィアに関する。
【００２０】
本発明の生分解性ミクロスフィア表面上の反応性官能基の数は、高い反応性の獲得という観点から、ミクロスフィア１グラム当たり、５μｍｏｌ以上が好ましく、１０μｍｏｌ以上がより好ましく、３０μｍｏｌ以上が特に好ましい。ミクロスフィア表面上の反応性官能基の数は、後述するミクロスフィア調製時の修飾ポリ乳酸とポリ乳酸の混合比により適宜調節することができる。
【００２１】
本発明の生分解性ミクロスフィアの平均粒径は、特に限定しないが、単位重量あたりの表面積を大きくするという観点から、１００μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。
【００２２】
本発明の生分解性ミクロスフィアの製造方法は、ポリ乳酸と本発明の修飾ポリ乳酸とを混合し、エマルジョン形成を行い、ミクロスフィアを調製する工程を含む。ここで、修飾ポリ乳酸は、エマルジョン形成時にその末端がイオンの形になっていることが好ましい。修飾ポリ乳酸の末端をイオンの形に変換する方法としては、エマルジョン形成前に塩基または酸により末端を処理する方法でもよいし、エマルジョン形成時の水相に希酸または希アルカリ水溶液を使用することにより末端を処理する方法でもよい。ここで用いるポリ乳酸は未処理のポリ乳酸であり、分子量は、特に限定されないが、１００００以上が好ましい。
【００２３】
ポリ乳酸と本発明の修飾ポリ乳酸とを混合し、エマルジョン形成を行なう工程は、より詳細には、例えば、修飾ポリ乳酸と未修飾のポリ乳酸との混合物における修飾ポリ乳酸の重量分率（以下、分岐骨格導入率と称することがある）が１０％となるようにこれらを混合したものを１０ｍｌの塩化メチレンに溶解させ、プロペラ型攪拌器によって１０００ｒｐｍで攪拌している３００ｍｌの希酸もしくは希アルカリ溶液（例えば、リシン分岐ペプチド末端ポリ乳酸の場合は、１／３０００Ｎ塩酸、グルタミン酸分岐ペプチド末端ポリ乳酸の場合は、１／３０００水酸化ナトリウム水溶液）に滴下して６０分間攪拌することにより、Ｏ／Ｗエマルジョンを調製する。
【００２４】
本発明の生分解性ミクロスフィアの製造方法の一例として、末端に４個のアミノ基を有する分岐ペプチド鎖を有してなる修飾ポリ乳酸からのミクロスフィアの製造方法を説明する。すなわち、末端に４個のアミノ基を有する分岐ペプチド鎖を有してなる修飾ポリ乳酸を未処理のポリ乳酸と混合し、希塩酸を水相としたＯ／Ｗ型のエマルジョン法によりミクロスフィアを調製することができる。
【００２５】
本発明の生分解性ミクロスフィアは、生体内で分解吸収される性質を有することから、生医学的材料としての用途を有する。また、ミクロスフィア分子表面の反応性官能基により薬剤や種々の生理活性物質を固定化することも可能であり、反応性を有する生体内吸収性材料として医療分野を始めとする様々な用途への応用が可能である。
【００２６】
【実施例】
実施例１
グルタミン酸分岐ペプチドの合成
１）３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）2 の合成
【００２７】
【化２】
0003722476.tif 000003
【００２８】
仕込み量
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰＡ）  ０．５４ｇ（６ｍｍｏｌ）
ＨＣｌ・Ｇｌｕ（ＯＥｔ）2                 １．１９ｇ（５ｍｍｏｌ）
ＷＳＣ・ＨＣｌ                            １．３８ｇ（７．２ｍｍｏｌ）
ＴＥＡ                                    ７７４μｌ（５ｍｍｏｌ）
【００２９】
合成方法
３−ＨＰＡのクロロホルム溶液（１０ｍｌ）にＷＳＣ・ＨＣｌのクロロホルム（３０ｍｌ）溶液を氷冷下で加え、１時間攪拌した。別に、ＴＥＡで脱塩したＧｌｕ（ＯＥｔ）2 のクロロホルム（３０ｍｌ）溶液を先の溶液に氷冷下で滴下し、氷冷下で２時間、室温で１６時間攪拌した。その後、溶媒を減圧下で濃縮した。この溶液を１０重量％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４重量％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、その後減圧濃縮することで粘性のある液体を得た。同定はＴＬＣ、1 Ｈ−ＮＭＲにて行なった。
【００３０】
収量  ５４５ｍｇ
収率  ３６％
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５８（展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝５：１）
発色：ヨウ素
1 Ｈ−ＮＭＲ（δ＝１．２６，ｑ，６Ｈ，ＯＣＨ2 ＣＨ3 ），（δ＝２．２１，ｍ，２Ｈ，ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯ）
（δ＝２．３４，ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ），（δ＝２．４９−２．５８，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ）
（δ＝３．６８−３．９０，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ），（δ＝４．１３，ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ2 ＣＨ3 ）
（δ＝４．５１，ｍ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ）
【００３１】
２）３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＣＯＯＨ）2 の合成
【００３２】
【化３】
0003722476.tif 000004
【００３３】
仕込み量
３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）2     ５４５ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）
１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液              ４．７ｍｌ（４．７ｍｍｏｌ）
【００３４】
合成方法
３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＯＥｔ）2 をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液４．７ｍｌを氷冷下で加え、室温で３０分攪拌した。反応の進行をＴＬＣで確認した後、溶媒を除いた。再度超純水を加えて溶解し、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（担体：アンバーライト１２０Ｂ）で脱塩・精製し、粘性のある液体を得た。
収量  ４０９ｍｇ
収率  ９７％
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．１（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝５：１）
発色  カルボン酸、ヨウ素
1 Ｈ−ＮＭＲ（δ＝２．２１，ｍ，２Ｈ，ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＨ），（δ＝２．３４，ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ），
（δ＝２．４９−２．５８，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ），（δ＝３．６８−３．９０，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ），
（δ＝４．２，ｍ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ）
【００３５】
３）３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ3 （ＣＯＯＢｚｌ）4   （（Ｂｚｌ）4 −Ｅ3 ）の合成
【００３６】
【化４】
0003722476.tif 000005
【００３７】
仕込み量
３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＣＯＯＨ）2   ３８６．３ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）2 ・Ｔｏｓ      ２．１１ｇ（４．２２ｍｏｌ）
ＷＳＣ・ＨＣｌ                    ７４２ｍｇ
ＴＥＡ                            ５４４μｌ
【００３８】
合成方法
３−ＨＰＡ−Ｇｌｕ（ＣＯＯＨ）2 のクロロホルム（２０ｍｌ）溶液にＷＳＣ・ＨＣｌのクロロホルム（３０ｍｌ）溶液を氷冷下で加え、１時間攪拌した。この溶液に、ＴＥＡであらかじめ脱塩しておいたＧｌｕ（ＯＢｚｌ）2 のクロロホルム（２０ｍｌ）溶液を先の溶液に氷冷下で滴下し、氷冷下で２時間、室温で１６時間攪拌した。その後、溶媒を減圧下で濃縮した。この溶液を１０重量％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４重量％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、その後減圧濃縮することで粘性のある油状物を得た。それを冷凍庫で一晩保存することで淡黄色の固体を得た。この固体をメタノールで洗浄することで白色の固体を得た。同定はＴＬＣ，ＥＳＩ−ＭＳ，1 Ｈ−ＮＭＲにて行なった。
収量  ３００ｍｇ
収率  ３５％
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．７６（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝５：１）
発色  ＵＶ、ヨウ素
ＥＳＩ−ＭＳ（測定モード：ポジティブ）
（Ｂｚｌ）4 −Ｅ3 の分子量  ８３７
測定値
８３８．９（Ｈ+ 付加），８６０．８（Ｎａ+ 付加），８７６．６（Ｋ+ 付加）1 Ｈ−ＮＭＲ（δ＝２．２１，ｍ，６Ｈ，ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），（δ＝２．３４，ｍ，６Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ），
（δ＝２．５３，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ），（δ＝３．７９，ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2 ＣＨ2 ），
（δ＝４．０，ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＢｚｌ），（δ＝４．５，ｍ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＮＨＣＨ）
（δ＝５．１，ｄ，８Ｈ，ＣＨ2 Ｐｈ），（δ＝７．３，ｍ，２０Ｈ，Ｐｈ）
【００３９】
実施例２
リシン分岐ペプチドの合成
１）（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓの合成
【００４０】
【化５】
0003722476.tif 000006
【００４１】
仕込み量
リシン塩酸塩          １．８２ｇ（１０ｍｍｏｌ）
（Ｂｏｃ）2 Ｏ        ６．３ｇ（２９．０ｍｍｏｌ）
【００４２】
合成方法
リシン塩酸塩に１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液１０ｍｌを加え脱塩し、ついでこれに水／ジオキサン（１／２  体積／体積）の混合溶媒を加え、これに（Ｂｏｃ）2 Ｏと１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌとを加えて室温で６時間攪拌した。反応終了後ＫＨＳＯ4 水溶液で溶液のｐＨを２．３に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後減圧濃縮した。最後にｎ−ヘキサンで再沈殿を２回行い、粘性のある油状物を得た。同定は、ＴＬＣ，1 Ｈ−ＮＭＲにて行った。
収量・収率  ２．５ｇ（７０％）
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３８（溶出液：クロロホルム：メタノール＝１０：１）
発色  ヨウ素、カルボン酸
1 Ｈ−ＨＮＲ（ＣＤＣｌ3 ）
ｄ＝１．３（ｂｒｏａｄ，２２Ｈ，Ｂｏｃ，およびＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），１．５〜１．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），３．１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2 ＮＨＣＯＯ），４．１（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），４．４（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2 ），４．８（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ）
【００４３】
２）（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥの合成
【００４４】
【化６】
0003722476.tif 000007
【００４５】
仕込み量
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓ            ８００ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）
２−アミノエタノール（ＡＥ）    １２０ｍｌ（２．０ｍｍｏｌ）
ＷＳＣ・ＨＣｌ                  ３８３ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）
【００４６】
合成方法
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓのクロロホルム溶液にＷＳＣ・ＨＣｌを室温で加えて１５分攪拌した。そこに、２−アミノエタノールを氷冷下にて加え、２時間攪拌した。その後、室温で１６時間攪拌した後、不溶性のウレアを濾去。濾液を１０重量％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４重量％炭酸水素ナトリウム水溶液→飽和食塩水の順で洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、その後減圧濃縮することで粘性のある油状物を得た。同定はＴＬＣ，1 Ｈ−ＮＭＲにて行った。収量・収率  ４０７ｍｇ（５０％）
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４９（溶出液：クロロホルム：メタノール＝１０：１）
発色  ヨウ素
1 Ｈ−ＨＮＲ（ＣＤＣｌ3 ）
ｄ＝１．３（ｂｒｏａｄ，２２Ｈ，Ｂｏｃ，およびＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），１．５〜１．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），３．１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2 ＮＨＣＯＯ），３．４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ），３．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）４．１（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），４．４（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2 ），４．８（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ），６．８（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨＣＯ）
【００４７】
３）（ＮＨ2 ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥの合成
【００４８】
【化７】
0003722476.tif 000008
【００４９】
仕込み量
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥ    ２８０ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）
４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン          ４ｍｌ（１６ｍｍｏｌ）
【００５０】
合成方法
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥのジオキサン溶液に４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液を４ｍｌ室温で加え３０分攪拌した。反応終了後減圧濃縮して粘性のある油状物を得た。脱保護の同定は1 Ｈ−ＮＭＲにてＢｏｃ基に由来するｄ＝１．０のピークの消失を確認して行った。
収量・収率１７２ｍｇ（９８％）
1 Ｈ−ＨＮＲ（Ｄ2 Ｏ）
ｄ＝１．３（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），１．５（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），１．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），３．１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2 ＮＨ2 ），３．４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ），３．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）４．１（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），
【００５１】
４）（Ｂｏｃ）4 −Ｌｙｓ3 −ＡＥ（（Ｂｏｃ）4 −Ｋ3 ）の合成
【００５２】
【化８】
0003722476.tif 000009
【００５３】
仕込み量
（ＮＨ2 ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥ      ４００ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓ            ８６４ｍｇ（２．４０ｍｍｏｌ）
ＷＳＣ・ＨＣｌ                  ４５８ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）
ＴＥＡ
【００５４】
合成方法
（Ｂｏｃ）2 −Ｌｙｓのクロロホルム溶液にＷＳＣ・ＨＣｌを加え室温で１５分攪拌した。そこにあらかじめＴＥＡで脱塩しておいた（ＮＨ2 ）2 −Ｌｙｓ−ＡＥのクロロホルム／メタノール溶液を加え、氷冷下で２時間、室温で１６時間攪拌した。溶液を減圧濃縮した後、１０重量％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４重量％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、その後減圧濃縮することで粘性のある油状物を得た。次いでこれをポンプで直引きすることで白色の粉末を得た。同定はＴＬＣ，1 Ｈ−ＮＭＲにて行った。
収量・収率  ６００ｍｇ（７７％）
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３８（溶出液：クロロホルム：メタノール＝１０：１）
発色  ヨウ素
1 Ｈ−ＨＮＲ（ＣＤＣｌ3 ）
ｄ＝１．３（ｂｒｏａｄ，５２Ｈ，Ｂｏｃ，およびＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），１．５〜１．７（ｂｒｏａｄ，１２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），３．１（ｓ，６Ｈ，ＣＨ2 ＮＨＣＯＯ），３．４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ），３．７（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）４．１（ｂｒｏａｄ，１Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ），４．３（ｂｒｏａｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ）
【００５５】
実施例３および４
分岐ペプチド鎖末端を有する修飾ポリ乳酸（Ｅ3 −ＰＬＡ，Ｋ3 −ＰＬＡ）の合成
実施例１、２で得られた分岐ペプチドの水酸基を重合開始点として、ラクチドの溶液系アニオン開環重合を行った。得られたポリマー末端に導入された分岐ペプチドユニットの保護基の脱保護を経て、反応性官能基を末端に４つ配する新規な分岐ペプチド鎖末端を有してなるポリ乳酸を得た。
【００５６】
【化９】
0003722476.tif 000010
（式中、ｎは、それぞれ独立した正の整数である）
【００５７】
重合操作
操作は窒素ガスで満たしたグローブボックス内にて行った。実施例１、２で得られた分岐ペプチドのＴＨＦ溶液に、分岐ペプチドに対して３当量のカリウムナフタレンを加えて室温で１０分攪拌し、末端水酸基をアルコキシドに変換した。次いでこの溶液に、あらかじめ所定の濃度になるように調製しておいたラクチドのＴＨＦ溶液を一気に加え重合を開始した。室温で３０分攪拌した後酢酸（５ｍｌ、加えたカリウムナフタレンに対して当量）を加えて重合を停止した。その後、貧溶媒にメタノールを用いて再沈殿を２回行い得られたポリマーを精製し、デシケーター内で減圧乾燥した。同定はＧＰＣ，1 Ｈ−ＮＭＲにて行った。重合結果を以下に示す。
【００５８】
【表１】
0003722476.tif 000011
【００５９】
ポリマーへの分岐ペプチド鎖の導入率（置換度（ＤＳ））は、1 Ｈ−ＮＭＲにより求めた。グルタミン酸分岐ペプチド鎖の導入率はポリ乳酸部分に由来する末端メチン基の吸収（式（３）のｂ、δ＝４．４）とベンジル基に由来するベンゼン環の吸収（式（３）のａ、δ＝７．３）との比、リシン分岐ペプチド鎖の導入率はポリ乳酸部分に由来する末端メチン基の吸収（式（４）のｅ、δ＝４．４）とリシン側鎖のアミノ基隣のメチレン基の吸収（式（４）のｄ、δ＝３．０）との比から算出した。また、分岐ペプチド鎖が未反応で混在している場合は、分岐骨格の水酸基隣のメチレンピークがｄ＝３．６付近に現れる。しかしそのピークは存在せず式（３）のｃおよび式（４）のｆのピークがｄ＝４．２に現れていたことから、未反応の分岐骨格は含まれていないことが示された。
【００６０】
【化１０】
0003722476.tif 000012
【００６１】
脱保護操作
【００６２】
ｉ）Ｂｚｌ基の脱保護
（Ｂｚｌ）4 −Ｅ3 −ＰＬＡ（Ｍｎ＝９８００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８，ＤＳ＝０．２５）５００ｍｇにＴＦＡを１ｍｌ加え溶解させた後に、１Ｍ−ＴＦＭＳＡ／チオアニソール／ＴＦＡ溶液５ｍｌを加え、氷冷下で１時間、室温で３０分攪拌した。その後、大量の冷ジエチルエーテルにて再沈殿を行い、得られたポリマーを減圧下乾燥させた。同定は、1 Ｈ−ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ3 ）にてベンゼン環の吸収の消失をもって確認した。
収量・収率  ４８０ｍｇ（９５．６％）
【００６３】
脱保護前（左側）および脱保護後（右側）の1 Ｈ−ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ3 ）チャートを図１に示す。図１に示すように、脱保護後にベンゼン環由来のピーク１が消失したことから脱保護が完全に進行したことを確認した。また、ＧＰＣ（溶出液：ＴＨＦ）により、主鎖の分解が起きていないことも確認した。
【００６４】
ｉｉ）Ｂｏｃ基の脱保護
（Ｂｏｃ）4 −Ｋ3 −ＰＬＡ（Ｍｎ＝１１０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９、ＤＳ＝０．４１）４００ｍｇをクロロホルム２ｍｌに溶解させ、そこにＨＢｒ／ＡｃＯＨ  １ｍｌを加え室温で５分攪拌した。次いで大量の冷ジエチルエーテルにて再沈殿（( ３）を行いポリマーの精製を行い、減圧下で乾燥させた。脱保護の同定は1 Ｈ−ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ3 ）にてＢｏｃ基に由来するｄ＝１．４のピークの消失を確認することで行った。
収量・収率  ３３０ｍｇ（８２．５％）
【００６５】
図２に脱保護前（左側）および脱保護後（右側）の1 Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。ここに示すようにＢｏｃ基由来のピーク２が消失していることから脱保護が完全に進行していることが示された。また、ＧＰＣより脱保護前後で主鎖の分解が起こっていないことも確認した。
【００６６】
実施例５および６
分岐ペプチド鎖を末端に有してなる修飾ポリ乳酸のミクロスフェアＭＳ（Ｅ34- −ＰＬＡ  １０重量％）（実施例５）、ＭＳ（Ｋ34+ −ＰＬＡ  １０重量％）（実施例６）の調製
仕込み量
ＭＳ（Ｅ34- −ＰＬＡ  １０重量％）
ＰＬＡ                            ２５０ｍｇ
Ｅ3 −ＰＬＡ                      ２５０ｍｇ
１／１０００Ｎ  ＮａＯＨ水溶液    １００ｍｌ
超純水                            ２００ｍｌ
【００６７】
ＭＳ（Ｋ34+ −ＰＬＡ  １０重量％）
ＰＬＡ                            ３８９ｍｇ
Ｋ3 −ＰＬＡ                      １２１ｍｇ
１／１０００Ｎ  ＨＣｌ水溶液      １００ｍｌ
超純水                            ２００ｍｌ
【００６８】
使用した修飾ポリ乳酸の特性
Ｅ3 −ＰＬＡ：Ｍｎ＝８９００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８，分岐骨格導入率２５％
Ｋ3 −ＰＬＡ：Ｍｎ＝１０９００，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８，分岐骨格導入率４１％（分岐骨格導入率の測定方法は1 Ｈ−ＮＭＲ以上の修飾ポリ乳酸およびポリ乳酸の水酸基末端のメチンピークと分岐ペプチド鎖中のピーク（リシンの場合ε−ＣＨ2 、グルタミン酸の場合α−ＣＨ）との積分比により算出した。）
【００６９】
合成方法
ポリ乳酸（粉末）と修飾ポリ乳酸（Ｅ3 −ＰＬＡまたはＫ3 −ＰＬＡ）（粉末）を修飾ポリ乳酸の重量分率が１０％となるように混合したのち、塩化メチレン１０ｍｌに加えて溶解した。得られたポリマーの塩化メチレン溶液１０ｍｌを、１０００ｒｐｍで攪拌している水相３００ｍｌに滴下して加え室温で６０分間攪拌した。次いで攪拌容器外側に設置していた温浴を４０℃まで上げた後、溶液を１０００ｒｐｍで攪拌しながらアスピレーターで攪拌容器内を減圧し液中乾燥を行い塩化メチレンを除去した（減圧操作は６０分間行なった）。溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０分×３回）にかけミクロスフィア（以下ではＭＳとよぶ）を洗浄した後、凍結乾燥にかけることでＭＳを得た。得られたＭＳは以下の通りであった。
【００７０】
ＭＳ（Ｅ34- −ＰＬＡ  １０重量％）（実施例５）：収量（収率）３１１ｍｇ（６２．２％）；平均粒径３．２１μｍ；
ＭＳ（Ｋ34+ −ＰＬＡ  １０重量％）（実施例６）：収量（収率）２４４ｍｇ（４８．８％）；平均粒径３．９４μｍ；
【００７１】
比較例１
シクロ［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］の合成
１）Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）の合成
【００７２】
【化１１】
0003722476.tif 000013
【００７３】
仕込み量
Ｌ−Ａｓｐ  ５０ｇ（３７５ｍｍｏｌ）
８０重量％硫酸  ５０ｇ（濃硫酸４２ｇ＋水８ｇ、４１３ｍｍｏｌ）１．１当量ベンジルアルコール  １２０ｇ（１．１５ｍｏｌ）３当量
【００７４】
合成方法
Ｌ−Ａｓｐと８０重量％硫酸を１Ｌ−三つ口フラスコに加え、７０℃の油浴上でよく攪拌してＬ−Ａｓｐを溶解させた。その後、ベンジルアルコールを滴下漏斗で滴下した。滴下終了後、２時間かき混ぜてから、つぎにエバポレーターを用いて反応混合物を同温度で２時間減圧濃縮して水分を取り除いた。炭酸水素ナトリウム７０ｇ（８３３ｍｍｏｌ、２．２当量）を含む純水２５０ｍｌ中に反応混合物を投入しよくかき混ぜ、生成した沈殿を純水で４回、エタノールで１回、ジエチルエーテルで３回洗浄した。洗浄した白色の沈殿を１リットルのナス型フラスコに入れて純水を用いて再結晶を行った。再結晶で得られた沈殿物を濾過し、純水で３回、エタノールで１回、ジエチルエーテルで３回洗浄し、もう一度この再結晶の行程を繰り返した。
【００７５】
収量  ２１．８ｇ
収率  ２６．０％
ＴＬＣ  溶出液：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：カルボン酸発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．４９
1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ／ＮａＯＤ）
δ（ｐｐｍ）＝３．０（ｄ，２Ｈ，ＣＨ3 ），４．３（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），５．１（ｓ，２Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ），７．４  （ｍ，５Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ）
【００７６】
２）Ｎ−ブロモアセチル−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）の合成
【００７７】
【化１２】
0003722476.tif 000014
【００７８】
仕込み量
Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）    ５．０ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）
ＴＥＡ                    ６．３２ｍｌ（４５．４ｍｍｏｌ）２．０当量
ブロモアセチルブロミド    ４．２３ｍｌ（４４．８ｍｍｏｌ）２．０当量
【００７９】
合成方法
Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）を１００ｍｌ−三つ口フラスコに入れ、ｐ−ジオキサン５０ｍｌに溶解させ１０℃に冷却し、ＴＥＡを加えた。そこに４０ｍｌのｐ−ジオキサンに溶かしたブロモアセチルブロミドを滴下漏斗で３０分かけて滴下し、そして滴下終了後２時間攪拌する。反応停止後、反応混合液に１００ｍｌのジエチルエーテルを加え、不溶物を濾過し、飽和食塩水１００ｍｌで４回洗浄した。無水硫酸マグネシウムを入れ２時間攪拌した。その後、不溶物を濾過しエバポレーターを用いて減圧濃縮した。この段階ではこれ以上の精製は行わず、ＴＬＣにより同定した。
ＴＬＣ溶出液：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：カルボン酸発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．６４
【００８０】
３）シクロ［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］の合成
【００８１】
【化１３】
0003722476.tif 000015
【００８２】
合成方法
４５０ｍｌの脱水ＤＭＦを１Ｌ−三つ口フラスコに入れ、炭酸水素ナトリウ５．０ｇ（５９．５ｍｍｏｌ）を加え、油浴で６０℃に加温し、これに５０ｍｌの脱水ＤＭＦに溶解させたＮ−ブロモアセチル−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）を含む混合物を４時間かけて滴下漏斗で滴下した。その後、４８時間攪拌した。反応停止後、不溶物を濾過し減圧濃縮する。反応混合液に１００ｍｌの酢酸エチルを加え、飽和食塩水１００ｍｌで３回洗浄し、有機層に無水硫酸ナトリウムを入れ、２時間攪拌した。不溶物を濾過し、エバポレーターを用いて減圧濃縮する。精製は、カラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル、展開溶媒：酢酸エチル）で３回行い、その後酢酸エチルにて再結晶を３回した。同定は、ＴＬＣにて行った。
収量４０６ｍｇ
収率６．９％
ＴＬＣ溶出液：酢酸エチル
検出：カルボン酸発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．５３
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ（ｐｐｍ）＝３．０（ｄ，２Ｈ，ＣＨＣＨ2 ），４．５（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），４．７（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ2 ＣＯ），５．１（ｓ，２Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ），７．３（ｍ，５Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ）
【００８３】
比較例２
シクロ［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］の合成
１）Ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）の合成
【００８４】
【化１４】
0003722476.tif 000016
【００８５】
仕込み量
Ｌ−Ｌｙｓ・ＨＣｌ  ２０．０ｇ（１０６ｍｍｏｌ）
ＣｕＣＯ3 ・Ｃｕ（ＯＨ）2 ・Ｈ2 Ｏ  ２２．０ｇ（９３．２ｍｍｏｌ）０．８８当量
ＮａＨＣＯ3   １８．０ｇ（２１２ｍｍｏｌ）２．０当量
Ｚ−Ｃｌ  ２６．６ｍｌ（１６７ｍｍｏｌ）１．６当量
【００８６】
合成方法
Ｌ−Ｌｙｓ・ＨＣｌを水２８０ｍｌに溶解し、これにＣｕＣＯ3 ・Ｃｕ（ＯＨ）2 ・Ｈ2 Ｏを加えて１．５時間１００〜１１０℃に加熱攪拌し、室温放置後濾過した。この濾液を氷冷下で激しく攪拌しながらＮａＨＣＯ3 とＺ−Ｃｌを数回に分けて３０分で加え、５時間氷冷下で攪拌した。そして沈殿物を濾過し、冷水、エタノール、アセトン、ジエチルエーテルで洗浄した。沈殿物をＥＤＴＡ二ナトリウム塩を溶解した水２７０ｍｌに懸濁し、錯体の色がなくなるまで２時間８０度に温めて攪拌した。混合物を室温まで冷却した後、濾過し、冷水で洗浄した。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩を少量加えた５０重量％−酢酸で３回再結晶し、冷水、エタノール、ジエチルエーテルで洗浄した。
ＴＬＣ溶出液：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：カルボン酸発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．５０
1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ／ＮａＯＤ）
δ（ｐｐｍ）  ＝１．３（ｑ、２Ｈ，ＣＨ2 ＣＨ），１．５（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2 ）2 ），３．０（ｔ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2 ），３．２（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），５．１，（ｓ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ2 ），７．３（ｍ，５Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ）
【００８７】
２）Ｎ−ブロモアセチル−Ｌｙｓ（Ｚ）の合成
【００８８】
【化１５】
0003722476.tif 000017
【００８９】
仕込み量
Ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）          ５．０ｇ（１７．８ｍｍｏｌ）
ＴＥＡ                    ３．７２ｍｌ（２６．７ｍｍｏｌ）１．５当量
ブロモアセチルブロミド    ２．３０ｍｌ（２６．７ｍｍｏｌ）１．５当量
【００９０】
合成方法
Ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）を１００ｍｌ−三つ口フラスコに入れ、ｐ−ジオキサン５０ｍｌに溶解させ１０℃に冷却し、ＴＥＡを加えた。そこに４０ｍｌのｐ−ジオキサンに溶かしたブロモアセチルブロミドを滴下漏斗で３０分かけて滴下し、そして滴下終了後２時間攪拌する。反応停止後、反応混合液に１００ｍｌのジエチルエーテルを加え、不溶物を濾過し、飽和食塩水１００ｍｌで４回洗浄した。無水硫酸マグネシウムを入れ２時間攪拌した。その後、不溶物を濾過しエバポレーターを用いて減圧濃縮した。この段階ではこれ以上の精製は行わず、ＴＬＣにより同定した。
ＴＬＣ  溶出液：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２  体積／体積／体積
検出：カルボン酸発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．８３
【００９１】
３）シクロ［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］の合成
【００９２】
【化１６】
0003722476.tif 000018
【００９３】
合成方法
４５０ｍｌの脱水ＤＭＦを１Ｌ−三つ口フラスコに入れ、炭酸水素ナトリウ５．０ｇ（５９．５ｍｍｏｌ）を加え、油浴で６０℃に加温し、これに５０ｍｌの脱水ＤＭＦに溶解させたＮ−ブロモアセチル−Ｌｙｓ（Ｚ）を含む混合物を４時間かけて滴下漏斗で滴下した。その後、４８時間攪拌した。反応停止後、不溶物を濾過し減圧濃縮する。反応混合液に１００ｍｌの酢酸エチルを加え、飽和食塩水１００ｍｌで３回洗浄し、有機層に無水硫酸ナトリウムを入れ、２時間攪拌した。不溶物を濾過し、エバポレーターを用いて減圧濃縮する。精製は、カラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル、展開溶媒：酢酸エチル）で３回行い、その後酢酸エチルにて再結晶を３回した。同定は、ＴＬＣにて行った。
収量８００ｍｇ
収率１４％
ＴＬＣ溶出液：酢酸エチル
検出：ニンヒドリン発色、ＵＶ  Ｒｆ値＝０．４５
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ（ｐｐｍ）＝１．５−１．９（ｍ，６Ｈ，ＣＨ（ＣＨ2 ）3 ），３．２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2 ＮＨ），４．０（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），４．７（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2 ），５．０（ｓ，２Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ＣＨ2 ），５．３（ｓ，１Ｈ，ＣＨ2 ＮＨ），７．３
（ｓ，５Ｈ，Ｃ6 Ｈ5 ），８．０（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮＨ）
【００９４】
比較例３
ポリ［（Ｇｌｃ−Ａｓｐ）−ランダム−ＬＡ］の合成
１）ポリ｛［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］−ランダム−ＬＡ｝の合成
【００９５】
【化１７】
0003722476.tif 000019
（式中、ｎは正の整数であり、ｙは１未満の正の数である）
【００９６】
仕込み量
Ｌ−ラクチド  １．３７ｇ（９．５ｍｍｏｌ％）
シクロ［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］  ０．１３ｇ（０．５ｍｍｏｌ％）
２−エチルヘキサン酸スズ（II）  ４．０５ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ％）
【００９７】
合成方法
アルゴンガスで満たしたグローブボックス内で、重合管にシクロ［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］とラクチドを入れ、ＴＨＦ溶液中で２−エチルヘキサン酸スズ（II）を加え、少量のＴＨＦで器壁を洗い流し、すり付き二方コックをかぶせた。その後、重合管をドライボックスより取り出し、冷却用の液体窒素でＴＨＦを固化させた。続いてこの重合管をバキュームラインにつなぎ、脱気・アルゴン置換・脱気を３セット繰り返した後、水で解凍し、再び液体窒素で固化させる操作を３回繰り返した。その後、ＴＨＦを完全に除去後、重合管の封管を行い、１６０℃もしくは１６０℃（２分）、次いで１３５℃のオイルバス中で４８時間保持することによって開環共重合反応を行った。反応終了後、焼き玉法により開管し、得られた粘性液体をクロロホルムに溶解させ、ジエチルエーテルにより再沈殿を行い、ポリ｛［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］−ランダム−ＬＡ｝を得た。収量  １．４３ｇ
収率  ９１％
Ｍｎ  ３．８×１０4 
Ｍｗ／Ｍｎ  ２．７
デプシペプチドユニット導入率４．０ｍｍｏｌ（デプシペプチドユニット導入率はＬＡユニットのメチル基とデプシペプチドユニットのメチレン基のプロトン比より算出）
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ（ｐｐｍ）＝１．５（ｓ，ＣＨ3 ），３．０（ｓ，ＣＨＣＨ2 ），４．６（ｓ，ＯＣＨ2 ＣＯ），４．７（ｓ，ＣＨ），５．１（ｓ，ＣＨ2 Ｐｈ），５．２（ＣＨＣＨ3 ），７．３（ｍ，Ｐｈ）
【００９８】
２）ポリ［（Ｇｌｃ−Ａｓｐ）−ランダム−ＬＡ］の合成
【００９９】
【化１８】
0003722476.tif 000020
（式中、ｎは正の整数であり、ｙは１未満の正の数である）
【０１００】
仕込み量
ポリ｛［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］−ランダム−ＬＡ｝  １．００ｇ
ＴＦＭＳＡ  ４．４２ｍｌ
チオアニソール  ５．８９ｍｌ
トリフルオロ酢酸  ５０ｍｌ
【０１０１】
合成方法
ポリ｛［Ｇｌｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）］−ランダム−ＬＡ｝を１Ｍ−ＴＦＭＳＡ、チオアニソール／ＴＦＡ溶液に溶解させ、氷冷下で３０分間攪拌する。反応後、冷ジエチルエーテルを用いて再沈殿を３回行った。
収量  ８５０ｍｇ
収率  ８５．０％
Ｍｎ  ４．８×１０4 
Ｍｗ／Ｍｎ  ２．３
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ（ｐｐｍ）＝１．５（ｓ，ＣＨ3 ），３．０（ｓ，ＣＨＣＨ2 ），４．７（ｓ，ＣＨ），５．２（ｓ，ＣＨＣＨ3 ）
【０１０２】
比較例４
ポリ［（Ｇｌｃ−Ｌｙｓ）−ランダム−ＬＡ］の合成
１）ポリ｛［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］−ランダム−ＬＡ｝の合成
【０１０３】
【化１９】
0003722476.tif 000021
（式中、ｎは正の整数であり、ｙは１未満の正の数である）
【０１０４】
仕込み量
Ｌ−ラクチド  ２．７４ｇ（９．５ｍｍｏｌ％）
シクロ［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］  ０．３２ｇ（０．５ｍｍｏｌ％）
２−エチルヘキサン酸スズ  ８．１０ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ％）
Ｍ／Ｉ  １０００    温度および時間  １１５℃（２日間）
【０１０５】
合成方法
アルゴンガスで満たしたグローブボックス内で、重合管にシクロ［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］とラクチドを入れ、ＴＨＦ溶液中で２−エチルヘキサン酸スズ（II）を加え、少量のＴＨＦで器壁を洗い流し、すり付き二方コックをかぶせた。その後、重合管をドライボックスより取り出し、冷却用の液体窒素でＴＨＦを固化させた。続いてこの重合管をバキュームラインにつなぎ、脱気・アルゴン置換・脱気を３セット繰り返した後、水で解凍し、再び液体窒素で固化させる操作を３回繰り返した。その後、ＴＨＦを完全に除去後、重合管の封管を行い、１１５℃のオイルバス中で４８時間保持することによって開環共重合反応を行った。反応終了後、焼き玉法により開管し、得られた粘性液体をクロロホルムに溶解させ、ジエチルエーテルにより再沈殿を行い、ポリ｛［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］−ランダム−ＬＡ｝を得た。
収量  ２．５３ｇ、収率  ８２％
Ｍｎ  １．３×１０4 、Ｍｗ／Ｍｎ  ２．７
デプシペプチドユニット導入率  ２．６ｍｍｏｌ％
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ（ｐｐｍ）＝１．２−２．０（ｍ，ＣＨ（ＣＨ2 ）3 ），５．１（ｓ，ＣＨ2 Ｐｈ）１．５（ｓ，ＣＨ3 ），５．２（ｓ，ＣＨＣＨ3 ），３．０（ｓ，ＣＨ2 ＮＨ），５．４（ｓ，ＣＨ2 ＮＨ），４．３（ｓ，ＣＨ），７．３（ｍ，Ｐｈ），４．６（ｓ，ＣＯＣＨ3 ）
【０１０６】
２）ポリ［（Ｇｌｃ−Ｌｙｓ）−ランダム−ＬＡ］の合成
【０１０７】
【化２０】
0003722476.tif 000022
（式中、ｎは正の整数であり、ｙは１未満の正の数である）
【０１０８】
仕込み量
ポリ｛［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］−ランダム−ＬＡ｝  ２．００ｇ
２５％−ＨＢｒ／ＣＨ3 ＣＯＯＨ    ４．６０ｍｌ
【０１０９】
合成方法
ポリ｛［Ｇｌｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）］−ランダム−ＬＡ｝をクロロホルムに溶解させ、氷冷下で２５重量％−ＨＢｒ／ＣＨ3 ＣＯＯＨを加えて６０分攪拌する。その後、冷ジエチルエーテルにて再沈殿を行う。得られたポリマーを乾燥後クロロホルムに溶解させて、ＴＥＡで脱塩し、冷ジエチルエーテルで再沈殿を行なう。
【０１１０】
1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ（ｐｐｍ）＝１．２−２．０（ｍ，ＣＨ（ＣＨ2 ）3 ），１．５（ｓ，ＣＨ3 ），３．０（ｓ，ＣＨ2 ＮＨ），４．３（ｓ，ＣＨ），４．６（ｓ，ＣＯＣＨ3 ），５．２（ｓ，ＣＨＣＨ3 ）
【０１１１】
比較例５および６
ポリ［（Ｇｌｃ−Ａｓｐ）−ランダム−ＬＡ］あるいはポリ［（Ｇｌｃ−Ｌｙｓ）−ランダム−ＬＡ］を用いたランダム共重合型ＭＳの合成
合成方法
１０ｍｇのポリ［（Ｇｌｃ−Ａｓｐ）−ランダム−ＬＡ］（比較例５）あるいはポリ［（Ｇｌｃ−Ｌｙｓ）−ランダム−ＬＡ］（比較例６）の塩化メチレン溶液１ｍｌに超純水５ｍｌ加えて、スパチュラで激しく混ぜつつ、バス型ソニケーターで１０分間超音波照射し、さらにプローブ型ソニケーターにて５分間超音波を照射した。得られたＯ／Ｗエマルジョンを予め準備しておいた約４０ｍｌのＰＶＡ水溶液にゆっくり注ぎ攪拌した。その間に加熱、減圧を繰り返しながら完全に塩化メチレンを除去した。この懸濁液を超遠心分離機（１００００ｒｐｍ）を用いて分離し、その得られた沈殿を超純水で数回洗浄したあと凍結乾燥を行いＭＳを得た。
【０１１２】
試験例１
実施例５、６で得られたＭＳおよび比較例５、６で得られたＭＳについて、コロイド滴定を用いて、ＭＳ単位重量あたりの官能基量（Ｂ）を定量し、仕込み段階で含まれる単位重量あたりの官能基量（Ａ）に対する割合（表面官能基の露出度）を求めた。結果を表２に示す。
【０１１３】
【表２】
0003722476.tif 000023
【０１１４】
表２より、本発明の修飾ポリ乳酸を構成成分とするミクロスフィア表面には、比較例のミクロスフィアと比べて、多数の反応性官能基が露出していることがわかる。
【０１１５】
試験例２
ポリ乳酸ミクロスフィア表面にアミノ基およびカルボキシル基が露出している場合、溶液のｐＨ変化に伴って官能基のプロトンの解離状態が変化し、それにより表面の電荷が変化すると考えられる。そこで、実施例５のＭＳ（Ｅ34- −ＰＬＡ  １０重量％）について、ｐＨのミクロスフィア表面の電位に与える影響をζ電位測定により検討した。
【０１１６】
ζ電位の測定方法
レーザーゼータ電位計（大塚電子  ＥＬＳ−６０００）を用いて測定した。各ｐＨに調製した０．０５ｍｇ／ｍｌのＭＳ水溶液から５ｍｌを取り出し、これを測定セルに流し込み２５℃条件下で測定を行なった。この際、溶液のイオン強度はＮａＣｌを用いて０．０１Ｍに調節した。
【０１１７】
その結果、ｐＨが大きくなるに従いζ電位がより負になることがわかった。また、ｐＨ３〜７にかけてζ電位が大きく変化し、他のｐＨ（ｐＨ＞７）でほぼ一定値となった。これは、ｐＨ３からｐＨ７へと変化するに従い、ミクロスフィア表面に露出しているカルボキシル基のプロトンが解離し、ｐＨ７以上ではほぼ完全にカルボキシル基のプロトンが解離したと考えることが出来る。実際、グルタミン酸のｐＫａはｐＫ1 ＝２．１９、ｐＫ2 ＝４．２５であり、本試験例の結果と良く一致している。このことからも、実施例５のミクロスフィアの分子表面にはカルボキシル基が多数露出していることが確認された。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明によれば、分子鎖の末端に多数の反応性官能基を有する分岐ペプチド鎖を有してなるポリ乳酸およびその製造方法が得られる。さらに、多数の反応性官能基を有してなるポリ乳酸を用いて製造される、表面に多数の反応性官能基を有する生分解性ミクロスフィアおよびその製造方法を得られる。このミクロスフィアは、ポリ乳酸の分子上に薬剤や種々の生理活性物質を固定化することも可能であり、反応性を有する生体内吸収性材料として、医療分野を始めとする様々な用途への応用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（Ｂｚｌ）4 −Ｅ3 −ＰＬＡおよび（Ｂｚｌ）4 −Ｅ3 −ＰＬＡの脱保護後の1 Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】図２は、（Ｂｏｃ）4 −Ｋ3 −ＰＬＡおよび（Ｂｏｃ）4 −Ｋ3 −ＰＬＡの脱保護後の1 Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【符号の説明】
１  ベンゼン環由来のピーク
２  Ｂｏｃ基由来のピーク
【図１】
0003722476.tif 000024
【図２】
0003722476.tif 000025