(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ膵臓RNase Aのアミノ酸残基85番〜94番に対応するループ領域に少なくとも1個のアミノ酸置換を有する改変されたリボヌクレアーゼであって、リボヌクレアーゼインヒビターに対して結合アフィニティーが低下しており、リボ核酸分解活性を保持している前記改変リボヌクレアーゼ。
【請求項２】
改変リボヌクレアーゼがウシ膵臓リボヌクレアーゼAに由来する、請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
ウシ膵臓リボヌクレアーゼAのアミノ酸の88番位置のグリシン残基が正電荷を有するアミノ酸残基に置換された、請求項２に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項４】
正電荷を有するアミノ酸残基がアルギニンである、請求項３に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項５】
ウシ膵臓リボヌクレアーゼAのアミノ酸の88番位置のグリシン残基が負電荷を有するアミノ酸残基に置換された、請求項２に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項６】
負電荷を有するアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項５に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項７】
人為的改変によって操作された、対応する野生型リボヌクレアーゼAに比べてその構造が変化した改変リボヌクレアーゼAであって、その変化が(i)ウシ膵臓RNase Aのアミノ酸残基番号85〜94に対応する領域に始まり、(ii)リボヌクレアーゼインヒビターの結合に対して立体障害または静電的障害を与えるものである、前記リボヌクレアーゼA。
【請求項８】
請求項７に記載の改変リボヌクレアーゼを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の改変リボヌクレアーゼを含む、腫瘍細胞の増殖抑制用医薬組成物。
【請求項１０】
リボヌクレアーゼAをコードする改変遺伝子であって、ウシ膵臓リボヌクレアーゼAのアミノ酸85番〜94番に対応するコード領域に変異を有する改変遺伝子を作製すること、前記改変遺伝子を適切な宿主内で発現させること、発現されたリボヌクレアーゼAのリボヌクレアーゼインヒビターに対するアフィニティーを試験すること、
を含む、細胞障害特性を有する新規な改変リボヌクレアーゼAを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
新薬の開発は近年の種々のタイプの癌の治療における進歩に貢献してきた。しかしながら、ある種の癌は現在使用されている化学療法剤に抵抗性である。これらの悪性度は特に高い傾向があり、高い死亡率と関連している。既存の大部分の化学療法剤は望ましくない副作用も有している。従って、医学会および一般大衆の間の両方において悪性腫瘍および他のタイプの癌の治療のための新規化学療法剤の開発に関心がもたれ続けている。
ヒョウガエル（Ｒａｎａ ｐｉｐｉｅｎｓ）から単離された天然に存在するリボヌクレアーゼの一つは進行した手術不可能な膵臓癌患者およびフェーズＩ／ＩＩ試験における悪性の中皮腫において抗腫瘍活性を示している（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｔｉｍｅｓ Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ． ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９６）。このリボヌクレアーゼ（オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）と称する）の抗腫瘍活性は種々の固形癌を有する３５０人以上の患者において調べられ、転移性膵臓癌、進行した転移性乳癌、および悪性中皮腫に対して抗腫瘍活性を示している。オンコナーゼは現在フェーズＩＩＩのヒト臨床試験において膵臓癌および肝臓癌に対して使用されている。
【０００２】
一般に、オンコナーゼはヒトにおいて化学療法剤として使用するのに比較的安全に見える。オンコナーゼは例えば骨髄抑制、消化管毒性または粘膜炎のような従来の細胞障害性薬剤に伴う主要な毒性を全く生じさせない。オンコナーゼ治療された患者のおよそ１／３はインフルエンザ様（ｆｌｕ−ｌｉｋｅ）症状および末梢性浮腫を伴うまたは伴わない第３級関節痛を起こした。オンコナーゼの投与に伴う最も重大な合併症は腎機能の低下であり、フェーズＩ用量試験において見られた。腎機能の低下は用量低減に伴って可逆的であった。
【０００３】
種々のタイプの癌の治療に加えて、リボヌクレアーゼはＨＩＶに感染したヒトの治療にも有用なことがある。非細胞障害的濃度のオンコナーゼはいくつかの持続的にＨＩＶ感染したヒト細胞株においてＨＩＶ産生を顕著に阻害することが報告されている。
リボククレアーゼの細胞障害性はウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ； ＥＣ３．１．２７．５）のミリグラム量を注射された固形腫瘍で最初に証明された（Ｌｅｄｏｕｘ， Ｌ． Ｎａｔｕｒｅ １７６：３６−３７， １９９５； Ｌｅｄｏｕｘ， Ｌ． Ｎａｔｕｒｅ １７５：２５８−２５９）。より少ない量は腫瘍に対して効果がないことが見出されていた（ｄｅ Ｌａｍｉｒａｎｄｅ， Ｎａｔｕｒｅ １９２：５２−５４， １９６１）。低濃度で細胞障害性であるリボヌクレアーゼが雄ウシ精漿中に発見された（Ｆｌｏｒｉｄｉら、Ｉｔａｌ． Ｂｉｏｌ． Ｓｐｅｒ． ４３：３２−３６， １９６７； Ｄｏｓｔａｌら、Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． ３３：２６３−２７４， １９７３）。さらに強い細胞障害性を有するリボヌクレアーゼがカエル卵から単離され（Ａｒｄｅｌｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４５−２５１， １９９１）、このリボヌクレアーゼがオンコナーゼの名で臨床試験においてテストされているものである。
【０００４】
リボヌクレアーゼはＲＮＡの分解を触媒する。細胞障害性のためには細胞障害性リボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が必要であることが証明されている（Ｋｉｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１０５２５−１０５３０， １９９５； Ａｒｄｅｌｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４５−２５１， １９９１）。リボヌクレアーゼの細胞障害性にはリボ核酸分解活性を必要とするが、リボ核酸分解活性単独ではリボヌクレアアーゼ間に観察される細胞障害性の差異を説明するのに十分ではない。例えば、ＲＮａｓｅＡのリボ核酸分解活性はオンコナーゼよりもおよそ１０００培高いが、オンコナーゼはＲＮａｓｅＡよりもずっ強い細胞障害性を有している。従って、酵素の他の性質がこの違いを説明するに違いない。
脊椎動物細胞はリボヌクレアーゼの潜在的致死性効果から細胞を保護するリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＩ）を含んでいる。ＲＩは種々のアフィニティーでリボヌクレアーゼと結合する５０ｋＤａの細胞質タンパク質である。例えば、ＲＩはウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）スーパーファミリーのメンバーと１０−６から１０−１６Ｍの範囲のＫｉｓで、１０桁のオーダーにわたる阻害定数をもって結合する。
リボヌクレアーゼの細胞障害性はＲＩとリボヌクレアーゼトノ間の相互作用の強さに逆相関するようにみえる。例えば、ＲＮａｓｅ ＡはＲＩと高いアフィニティーで（Ｋｉ＝１０−１４Ｍ）結合するが細胞障害性でない。反対に、オンコナーゼはＲＩと比較的低アフィニティー（Ｋｉ＞１０−６Ｍ）で結合する。
【０００５】
いくつかの天然のリボヌクレアーゼはＲＩに結合しない。ウシ精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮａｓｅ）はアミノ酸配列においてＲＮａｓｅ Ａと８０％同一であるが、ＲＮａｓｅ Ａと異なり、ＢＳ−ＲＮａｓｅは２量体の形で存在する。ＢＳ−ＲＮａｓｅの４次構造はＲＩの結合を妨げ、それによってＲＩ存在下でもそのリボ核酸分解活性を維持することができることが示されている（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０８：５４７−５５０， １９９５； Ｋｉｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１０５２５−１０５３０， １９９５； Ｋｉｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７０： ３１０９７−３１１０２， １９９５）。オンコナーゼは１０４アミノ酸残基のタンパク質であり、ＲＮａｓｅ Ａと高いホモロジーがあるが、それにもかかわらずＲＩによる結合に抵抗性である。ＲＩ−オンコナーゼ複合体は１０−６Ｍ以上のＫｄを有し（Ｂｏｉｘら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５７：９９２−１００７， １９９６）、これはＲＩ−ＲＮａｓｅ Ａ複合体のＫｄよりも少なくとも１０８倍低い。
【０００６】
従って、オンコナーゼとＲＮａｓｅ Ａとに見られる異なる細胞障害性を説明する両者のキーとなる違いはオンコナーがＲＩによる阻害に耐性であるということである。正常な細胞は１：１の化学量論で非共有結合的にリボヌクレアーゼに結合するＲＩを産生し、リボヌクレアーゼ活性を阻害する。オンコナーゼがＲＩに対して結合アフィニティーが低いことはリボ核酸分解活性の効果的な阻害を妨げる。これがオンコナーゼが細胞障害性であるのに対してリボヌクレアーゼＡがそうでないと観察されることの最もよい説明である。
最近の研究において、マウスにおけるオンコナーゼおよびＲＮａｓｅ Ａの血漿消失率と組織分布が調べられ、オンコナーゼまたはＲＮａｓｅ Ａの注入の３時間後、オンコナーゼの５７％が腎臓に見られたが、一方ヒト膵臓リボヌクレアーゼのわずか０．９％しか腎臓に見られなかった（Ｓｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：４１８０， １９９６）。オンコナナーゼを与えられた患者に見られる腎機能の低下は腎臓からオンコナーゼタンパク質を効果的に消失させられない結果かもしれない。
【０００７】
好ましい治療用リボヌクレアーゼはオンコナーゼよりも速やかに腎臓から消失することのできる細胞障害性リボヌクレアーゼであろう。腎臓から速やかに消失する細胞障害性リボヌクレアーゼは腎臓障害をより起しにくいであろう。腎機能の低下はオンコナーゼにとって用量限定的であるために、腎機能に干渉しない細胞障害性リボヌクレアーゼは最適用量の決定においてより大きな自由度という利点を与え得るであろう。より毒性の低いリボヌクレアーゼは、例えば、特定のタイプの癌または特定の個人にたいして用量の増加がより効果的な治療を与えるであろう症例において、より高い用量で投与することができる。
【０００８】
オンコナーゼの臨床試験の被験者によって経験される副作用は免疫反応に通常伴う症状である。ヒョウガエルよりもヒトにより近い種のリボヌクレアアーゼは免疫反応をより起しにくいであろうと期待するのは合理的である。さらに免疫反応を起しにくいのはヒトリボヌクレアーゼであろう。免疫反応の強度はより多量の免疫原性タンパク質が投与されたときにより大きいであろう。従って、オンコナーゼよりもより高い比活性を有する細胞障害性リボヌクレアーゼはより効果的な化学療法剤である可能性がある。より少量のタンパク質の投与で効果的な細胞障害性を達成することが可能になるかもしれず、それによって免疫反応に伴う事象および症状の重篤性を低減するかもしれない。
抗腫瘍活性を有する新規な細胞障害性リボヌクレアーゼがヒトの癌の治療のために利用できる化学療法剤のスペクトルを増強するために必要とされている。
【０００９】
（発明の概要）
本発明の目的は、ヒトの疾病の治療に有用であろう、新規な、細胞障害性のリボヌクレアーゼを提供することである。
本発明の目的は新規な細胞障害性リボヌクレアーゼを提供するために野生型リボヌクレアーゼのアミノ酸配列を改変する方法を提供することである。
本発明は改変されたアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼであって、その改変されたリボヌクレアーゼがリボ核酸分解活性を維持し、かつ未改変リボヌクレアーゼよりもＲＩに対する結合アフィニティーが低く、野生型リボ核酸分解活性を維持しているリボヌクレアーゼである。
本発明はリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を改変して改変リボヌクレアーゼを作製する方法であって、この改変リボヌクウレアーゼはリボ核酸分解活性を保持し、かつＲＩに対して未改変リボヌクレアーゼよりも低い結合活性を有し、野生型リボ核酸分解活性を保持している。
本発明はまた、癌細胞に未改変リボヌクレアーゼよりもＲＩに対して低い結合活性を有し野生型リボ核酸分解活性を保持している改変リボヌクレアーゼの効果的量をデリバリーすることを含む、癌細胞の増殖を抑制する方法である。
本発明の他の目的、利点、および特徴は本明細書、図面および請求の範囲を検討すれば明らかになるであろう。
【００１０】
（実施の形態）
本発明は、対応する野生型リボヌクレアーゼと少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する改変操作されたリボヌクレアーゼであって、その野生型リボヌクレアーゼはＲＮａｓｅ Ａリボヌクレアーゼスーパーファミリーのメンバーのリボヌクレアーゼである。改変リボヌクレアーゼはリボ核酸分解活性を保持しており、未改変リボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼインヒビターに対する結合活性に比べて改変リボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼインヒビターに対する結合活性は低く、改変リボヌクレアーゼは増強した細胞障害性活性を示す。
以下の実施例には、低下したＲＩ結合活性、野生型リボ核酸分解活性および増強された細胞障害活性を有するＧ８８Ｒ ＲＮａｓｅ ＡおよびＧ８８Ｄ ＲＮａｓｅ Ａの二種の改変された膵臓リボヌクレアーゼＡ分子の設計、生産および特性解析が記載されている。本明細書の知見および方法論はＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーのどのリボヌクレアーゼにも適用できるであろう。
【００１１】
ＲＩに対するリボヌクレアーゼの結合アフィニティーを低下させるがリボ核酸分解活性に干渉しないどんなアミノ酸置換も本発明の実施において利用することができる。ＲＩとのアフィニティーを低下させるためにこの酵素の特定の部位を効果的に改変することができることが見出されている。Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａはアミノ酸残基８８番のグリシン残基の代わりにアルギニン残基を有している。同様に、Ｇ８８Ｄのアミノ酸残基８８番のグリシン残基はアスパラギン酸残基に置換されている。ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのアミノ酸残基８８番に対応する位置の他のアミノ酸残基置換は、特にそのアミノ酸残基が電荷を持つ側鎖を有している場合は、ＲＩに対する結合活性の変化を生じさせるであろう。このアミノ酸残基８８番付近の、ＲＩへの結合に立体阻害を生じさせる置換も効果的であろう。
【００１２】
ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基８５−９４によって規定されるループ領域中に生じ、そのような立体阻害を生じさせる他の改変はＲＩに対して結合アフィニティーが低下し、野生型リボ核酸分解活性を有し、増強された細胞障害活性を有する改変リボヌクレアーゼを生じさせるであろう。糖側鎖のような、この領域に結合して立体阻害を与える他の共有結合部分（ｍｏｉｅｔｙ）または側鎖もよく機能するであろう。
Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ ＡおよびＧ８８Ｄ ＲＮａｓｅ Ａを得るために使用したオリゴヌクレオチドはそれぞれ配列番号１および配列番号２に示した。遺伝コードの縮退を考慮すれば、Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ ＡおよびＧ８８Ｄ ＲＮａｓｅ Ａと同一の改変リボヌクレアーゼを得るために他のオリゴヌクレオオチドを使用することができることはよく知られたことである。本発明は、改変リボヌクレアーゼを作製する手段に関わりなく、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ Ａの８８番位置に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する改変リボヌクレアーゼを包含することを意図している。ウシ膵臓ＲＮａｓｅ Ａに加えて、ＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーの他のメンバーも本発明の実施に使用できることは当然に予想される。ウシ膵臓ＲＮａｓｅ Ａのアミノ酸残基８５−９４に対応するループ領域に生じる、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ Ａ以外のリボヌクレアーゼの改変が、ＲＩに対するアフィニティーが低下し、野生型リボ核酸分解活性を有し、増強された細胞障害性を有するリボヌクレアーゼを生じさせることが予測される。「ウシ膵臓ＲＮａｓｅ Ａのアミノ酸残基８５−９４に対応するループ領域」とは、２つのシステイン残基によって形成されるジスルフィド結合で定義される、約１０−１２アミノ酸残基を有するループを意味し、このループ領域はリボヌクレアーゼのＮ−末端からおよそ７５−８５アミノ酸残基から始まり、「ベストフィット」によればそのアミノ酸配列はウシＲＮａｓｅ Ａの残基８５番および９４番に対応する。
【００１３】
リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーは多くの哺乳動物、鳥類、は虫類、および両生類起源の相同（即ち、進化的に関連した）タンパク質の群を構成する。これらのタンパク質はそのポリペプチド鎖の類似したフォールディングを有し、ＲＮＡの切断を触媒する。このスーパーファミリーの記載はＢｅｉｎｔｅｍａらのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ １９９７、ｐｐ２４５−２６９に見ることができ、この記載は引用によって本明細書に含まれるものとする。
ヒトの疾病の治療に使用する細胞障害性リボヌクレアーゼの開発に有用であると期待されるウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのヒトホモログの例が５つある。これらの５つのホモログの各々にはＲＮａｓｅ Ａの１０−アミノ酸残基ループ領域に類似のループ領域が保存されている（表１）。
【００１４】
【表１】
表１
0003612020.tif 000002
【００１５】
「増強された細胞障害性」とは改変リボヌクレアーゼが対応する未改変リボヌクレアーゼよりも強い細胞障害性を示すことを言う。以下の実施例では、細胞障害性はヒト赤白血病細胞株Ｋ−５６２を用いて評価した。本発明の改変リボヌクレアーゼはＫ−５６２細胞に加えて他の腫瘍細胞に対して細胞障害性であることが予想される。
細胞増殖の阻害は改変または未改変リボヌクレアーゼで処理したＫ−５６２細胞の生存率％を計算することによって決定した。ここで、１００％生存率はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処理した生細胞数と考えた。
好ましくは、改変リボヌクレアーゼは少なくとも細胞生存率を約１０％低下させる。より好ましくは、改変リボヌクレアーゼは細胞生存率を少なくとも約２０％低下させる。最も好ましいは、改変リボヌクレアーゼは約５０％、あるいは約７５％程細胞生存率を低下させる。
【００１６】
本発明はまた、改変された細胞障害性リボヌクレアーゼを提供し、そのリボヌクレアーゼの効果的量を腫瘍細胞にデリバリーすることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。
「効果的量」とは、腫瘍細胞の増殖を有意に低減させるために必要とされるリボヌクレアーゼの量を意味する。
オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異導入を用いて、以下の実施例に記載したように幾つかの改変ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ種を設計し作製した。各改変リボヌクレアーゼは単一のアミノ酸残基が野生型ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡと異なるアミノ酸配列を有している。複数の置換を有する改変リボヌクレアーゼも本発明の実施に有用であることは予測される。
ＲＩはＲＮａｓｅ Ａと１：１の化学量論で非共有結合的に結合する。ＲＩとＲＮａｓｅ Ａとの複合体の３次元構造は２５ｎｍの解像度で決定されている（Ｒ−因子１９．４％）（Ｋｏｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１８３−１８６， １９９５）。この構造はＲＮａｓｅ Ａの１２４個のアミノ酸の２４個がＲＩと接触していることを明らかにした。ＲＮａｓｅ ＡのＲＩと接触するいくつかの領域は触媒部位とは異なることが見出された。
【００１７】
リボヌクレアーゼ細胞障害性におけるＲＩ−リボヌクレアーゼ相互作用の役割を更に明らかにするために、以下の実施例に詳述したように部位特異的変異導入を使用した。簡単に言うと、リボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列をこの配列の発現が特定のアミノ酸置換を含むリボヌクレアーゼを生じさせるように改変した。アルギニンまたはアスパラギン酸残基を指定するコドンで、ＲＩ残基と複数の接触を形成することが分かっている３個アミノ酸残基の一つをコードするコドンを置換した、種々の改変配列が開発された。ＡｒｇまたはＡｓｐ残基の導入はＲＩとＲＮａｓｅ Ａ との間に立体的および電気的反発の双方を生じさせることが予測される。このことはＲＮａｓｅ Ａ変異体のＲＩに対する結合アフィニティーの低下を生じさせると期待される。
【００１８】
（材料と方法）
ＤＮＡ変異導入
部位特異的変異導入によるＲＮａｓｅ Ａの改変は米国特許第５，３８９，５３７号に詳細に記載されており、この特許文献は本明細書に含まれるものとする。ＲＮａｓｅ ＡをコードするｃＤＮＡはｐＥＴ２２Ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｏｓｎ、ＷＩ）のＭｓｃＩおよびＳａｌＩ部位にライゲーションされた。このプラスミドはｐＢＸＲと命名され（ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ ８：２６１−２７３， １９９５）大腸菌内でＲＮａｓｅ Ａを発現させる。プラスミドｐＢＸＲのオリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異導入（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）を使用して特定の位置において特定のアミノ酸置換を有する改変ＲＮａｓｅ Ａ分子を作製した。８８番残基にアルギニン置換を有する改変ＲＮａｓｅ ＡをＧ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａと命名し、８８番残基にアスパラギン酸置換を有する改変ＲＮａｓｅ ＡをＧ８８Ｄ  ＲＮａｓｅ Ａと命名した。Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａを得るために使用したオリゴヌクレオチドは配列番号１に、Ｇ８８Ｄを得るために使用したオリゴヌクレオチドは配列番号２に示した。同様に、特に設計したオリゴヌクレオチドを用いて３８番のアミノ酸残基であるアスパラギン酸残基をアルギニン残基に置換し（Ｄ３８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａ）および、アミノ酸残基番号１０９のアラニン残基をアルギニン残基に置換した（Ａ１０９Ｒ ＲＮａｓｅ Ａ）。
【００１９】
タンパク質変異体の精製
ＲＮａｓｅ Ａ変異体は本質的に既に報告されたように（ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ ８：２６１−２７３， １９９５）精製した。オンコナーゼは北米産ヒョウガエルの卵から、Ｗｕら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１０６８６−１０６９３， １９９３）に記載されているように精製した。あるいは、オンコナーゼは実質的にＣｏｉｘら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５７：９９２−１００７）に記載されたように大腸菌発現系から精製した。
リボ核酸分解活性
変異リボヌクレアアーゼがポリマーＲＮＡの切断を触媒する能力をＵＶ分光法によって、既報のように（ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅとＲａｉｎｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３３：６０３１−６０３７， １９９４； ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅとＲａｉｎｅｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５２：３２８−３３６， １９９５）測定した。
抗腫瘍活性アッセイ
リボヌクレアーゼ抗腫瘍活性は既報のように（Ｋｉｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１０５２５−１−５３０， １９９５）評価した。オンコナーゼを陽性対照として含め、未改変ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡを陰性対照として含めた。ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２４３）の増殖に対する種々のリボヌクレアーゼの効果を以下のように評価した。細胞はＡＴＣＣの推奨にしたがって抗生物質を添加して維持した。Ｋ−５６２細胞に対するリボヌクレアーゼ細胞障害性は新規合成されるＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジン取込を測定することによって評価した。簡単にいうと、Ｋ−５６２細胞（０．５ｘ１０４／ウェル）を６９穴マイクロタイタープレートに９５μｌの体積で播いた。この細胞をリボヌクレアーゼの存在下で４４時間培養し、続いて、［３Ｈ］−チミジン（７．４ｋＢｑ）（０．２μＣｉ）で４時間パルスした。
【００２０】
ＰＨＤセルハーベスター（Ｃａｍｂｒｉｄｈｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｋ， Ｉｎｃ．； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いて細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、フィルターに数ｍｌの水を通すことによって溶解した。ＤＮＡおよび他の細胞性高分子はフィルターに保持され、ラベルを含む小分子はフィルターを素通りする。水でフィルターをよく洗浄した後、このフィルターをメタノールで乾燥させ液体シンチレーション計測器で計測した。
［３Ｈ］−チミジンの取込は実際にはＤＮＡ合成を測定するものである。［３Ｈ］−チミジンの取込の減少は細胞死というよりも細胞の静止を反映するものである。しかしながら、他のアッセイにより、オンコナーゼは細胞死をもたらすことが示されている（Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１０６８６−１０６９５）。
ＲＩに対する結合アフィニティー
種々のＲＮａｓｅ Ａ変異体の結合アフィニティをゲルを基礎としたアッセイによって定性的（Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１０６８６−１０６９３）および定量的（Ｓｔｏｎｅ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：４６２２−４６２８）に評価した。
熱安定性の測定
変異リボヌクレアーゼの熱安定性を評価し、それらの変異体が比較的高温（３７℃）に対する曝露に耐えるかどうかを測定した。融点が低くなった変異体は変性し活性を失うであろう。各変異体の熱安定性を紫外線または円偏光二色分光測定によって決定してＴｍを評価した。Ｔｍはタンパク質が半分フォールディングし、半分フォールディングしていない温度である。
結果
Ａｓｐ３８に対するアルギニン置換（Ｄ３８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａ）およびＡｌａ１０９に対するアルギニン置換（Ａ１０９Ｒ ＲＮａｓｅ Ａ）はこれらの変異体のＲＩに対する結合アフィニティーに対してほとんどまたは全く影響を与えないことが分かった。これらの変異体のリボ核酸分解活性はＲＩの存在下で低下した。対照的に、Ｇｌｙ８８をアルギニンまたはアスパラギン酸に置換した変異体ＲＮａｓｅ Ａ（それぞれ、Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａ、およびＧ８８Ｄ ＲＮａｓｅ Ａ）はＲＩに対する結合アフィニティーの低下を示し、これらの変異体はＲＩ存在下でも触媒活性を維持していた（表２）。
【００２１】
【表２】
表２
0003612020.tif 000003
【００２２】
変異ＲＮａｓｅ Ａ Ｇ８８ＲおよびＧ８８Ｄはヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２に障害性であったが、Ｄ３８Ｒ ＲＮａｓｅ ＡおよびＡ１０９Ｒ ＲＮａｓｅ Ａは細胞障害性でなかった（図１）。変異Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａは細胞増殖の阻害においてオンコナーゼとおよそ同程度に効果的であった。Ｇ８８Ｒ ＲＮａｓｅ Ａは５μＭのＩＣ５０を有していたが、オンコナーゼは０．７μＭのＩＣ５０を有していた（表２）。これらの結果は、ＲＩに対するリボヌクレアーゼの結合アフィニティーを改変し細胞障害性を増強することができることを示すものである。ＲＩ存在下で触媒活性を維持している改変リボヌクレアーゼは効果的な細胞毒素である。
【００２３】
癌の治療に効果的であるために、細胞障害性リボヌクレアーゼは体温において安定でなければならない。アミノ酸置換はタンパク質を熱変性により感受性にするため、改変リボヌクレアーゼの熱安定性を評価した。アルギニン置換およびアスパラギン酸置換はこの酵素の熱安定性に最小限の効果しか有しないことが見出された（表３）。
【００２４】
【表３】
表３
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【００２５】
腫瘍細胞の増殖を抑制するために、本発明の改変リボヌクレアーゼはどんな標準的な方法によってデリバリーしてもよい。一般的に使用されるデリバリーモードには筋肉内、静脈内、腹腔内、および腫瘍への直接注入が含まれる。リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼ活性を阻害せず選択したデリバリーモードに適した製薬的担体と一緒にしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のリボヌクレアーゼで処理した腫瘍細胞の生存性を示したものである。
【図１】
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