(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチアナ属植物からのマルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体をコードする＿ヌクレオチドの配列を含む核酸単離物であって、該PI前駆体は少なくとも３つのドメインからなり、該少なくとも３つのドメインは該ドメイン内でプロセシングしたときに少なくとも３つのペプチドを生成し、該少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも１つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該少なくとも３つのペプチドの残りの少なくとも１つはトリプシン特異的な部位を有し、該PI前駆体をコードするヌクレオチド配列が、ドメイン１（配列番号３のアミノ酸残基１〜58）またはドメイン２（配列番号３のアミノ酸残基59〜116）から選ばれる少なくとも１つのドメイン、およびドメイン３（配列番号３のアミノ酸残基117〜174）、ドメイン４（配列番号３のアミノ酸残基175〜232）、ドメイン５（配列番号３のアミノ酸残基233〜290）およびドメイン６（配列番号３のアミノ酸残基291〜343）よりなる群から選ばれる少なくとも２つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸単離物。
【請求項２】
該PI前駆体が_4つのドメインからなる請求項１に記載の核酸単離物。
【請求項３】
該PI前駆体が_5つのドメインからなる請求項１に記載の核酸単離物。
【請求項４】
該PI前駆体が_6つのドメインからなる請求項１に記載の核酸単離物。
【請求項５】
該PI前駆体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオチド配列であるか、または配列番号１に示すヌクレオチド配列または該配列に相補的なヌクレオチド配列に高厳格条件下でハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列である、請求項４に記載の核酸単離物。
【請求項６】
ニコチアナ属植物からのマルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体をコードする＿ヌクレオチドの配列を含む核酸単離物であって、該PI前駆体は少なくとも３つのドメインからなり、該少なくとも３つのドメインは該ドメイン内でプロセシングしたときに少なくとも３つのペプチドを生成し、該少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも１つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該少なくとも３つのペプチドの残りの少なくとも１つはトリプシン特異的な部位を有し、該PI前駆体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１に示すヌクレオチド配列であるか、または配列番号１に示すヌクレオチド配列または該配列に相補的なヌクレオチド配列に高厳格条件下でハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列であることを特徴とする核酸単離物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸単離物によってコードされる、ニコチアナ属植物からの単離マルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体。
【請求項８】
ニコチアナ属植物からの単離マルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体であって、少なくとも３つのドメインからなり、該少なくとも３つのドメインは該ドメイン内でプロセシングしたときに少なくとも３つのペプチドを生成し、該少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも１つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該少なくとも３つのペプチドの残りの少なくとも１つはトリプシン特異的な部位を有し、該PI前駆体のアミノ酸配列が少なくとも３つのドメインに対応し、該少なくとも３つのドメインのうちの少なくとも１つはドメイン１（配列番号３のアミノ酸残基１〜58）またはドメイン２（配列番号３のアミノ酸残基59〜116）であり、該少なくとも３つのドメインのうちの残りの少なくとも２つはドメイン３（配列番号３のアミノ酸残基117〜174）、ドメイン４（配列番号３のアミノ酸残基175〜232）、ドメイン５（配列番号３のアミノ酸残基233〜290）およびドメイン６（配列番号３のアミノ酸残基291〜343）よりなる群から選ばれることを特徴とする_PI前駆体。
【請求項９】
_4つのドメインからなる請求項８に記載の_PI前駆体。
【請求項１０】
_5つのドメインからなる請求項８に記載の_PI前駆体。
【請求項１１】
_6つのドメインからなる請求項８に記載の_PI前駆体。
【請求項１２】
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、請求項11に記載のPI前駆体。
【請求項１３】
請求項８に記載の_PI前駆体をプロテアーゼでプロセシングして得られる単離ペプチド。
【請求項１４】
配列番号３に示すアミノ酸配列＿のアミノ酸残基25〜82（配列番号５）、アミノ酸残基83〜140（配列番号６）、アミノ酸残基141〜198（配列番号７）、アミノ酸残基199〜256（配列番号８）およびアミノ酸残基257〜314（配列番号９）＿よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の単離ペプチド。
【請求項１５】
ニコチアナ属植物からのマルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体＿をコードする＿ヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物であって、該PI前駆体は少なくとも３つのドメインからなり、該少なくとも３つのドメインは該ドメイン内でプロセシングしたときに少なくとも３つのペプチドを生成し、該少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも１つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該少なくとも３つのペプチドの残りの少なくとも１つはトリプシン特異的な部位を有し、該PI前駆体をコードするヌクレオチド配列が、ドメイン１（配列番号３のアミン酸残基１〜58）またはドメイン２（配列番号３のアミノ酸残基59〜116）から選ばれる少なくとも１つのドメイン、およびドメイン３（配列番号３のアミノ酸残基117〜174）、ドメイン４（配列番号３のアミノ酸残基175〜232）、ドメイン５（配列番号３のアミノ酸残基233〜290）およびドメイン６（配列番号３のアミノ酸残基291〜343）よりなる群から選ばれる少なくとも２つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、該遺伝子構築物がさらに該核酸分子の発現を可能とする発現手段、植物細胞中での複製を可能とする複製手段、または植物細胞ゲノム中への該核酸分子の安定な組み込みを可能とする組み込み手段を含むことを特徴とする遺伝子構築物。
【発明の詳細な説明】
本発明は一般に、プロテイナーゼインヒビター、その前駆体およびそれをコードする遺伝子配列に関する。
ヌクレオチド配列および核酸配列は、本明細書において引用文献の後に記載する配列番号（SEQ ID NO）によって言及する。SEQ ID NOの一般的な要約は実施例の前に記載してある。
ナス科（Solanaceae）およびマメ科（Fabaceae）に属する幾つかの種類の植物は、傷に対する応答の結果としてその貯蔵器官や葉にセリンプロテイナーゼインヒビターを蓄積する（ブラウン（Brown）およびライアン（Ryan）、1984;リチャードソン（Richardson）、1977）。これらタンパク質の抑制活性は、微生物および動物由来の広範囲のプロテイナーゼに対して向けられるが、植物のプロテイナーゼに向けられることは稀である（リチャードソン、1977）。これらインヒビターは、病原体および捕食者に対して植物を保護することに関与していると思われている。ジャガイモの塊茎およびマメ科植物の種子では、これらインヒビターは貯蔵タンパク質の10％またはそれ以上を占めることがあり（リチャードソン、1977）、トマトやジャガイモの葉（グリーン（Green）およびライアン、1972）およびアルファルファ（ブラウンおよびライアン、1984）では、昆虫の攻撃または他のタイプの傷から48時間以内にプロテイナーゼインヒビターは可溶性タンパク質の２％のレベルまで蓄積することがある（ブラウン＆ライアン、1984;グラハム（Graham）ら、1986）。これらインヒビターはまた、野生型のトマト、リコペルシコン・ペルビアヌム（Lycopersicon peruvianum）の未熟果にも高レベル（全可溶性タンパク質の50％まで）で存在する（ピアス（Pearce）ら、1988）。
トマトおよびジャガイモにおいて２つのファミリーのセリンプロテイナーゼインヒビターが存在する（ライアン、1984）。Ｉ型のインヒビターは、単一の反応部位でキモトリプシンを抑制する小さなタンパク質（モノマーの分子量8100）である（メルビル（Melville）およびライアン、1970;プランケット（Plunkett）ら、1982）。II型ファミリーのインヒビターは、一般に、２つの反応部位を有しており、その一方はキモトリプシンを抑制し、他方はトリプシンを抑制する（ブライアント（Bryant）ら、1976;プランケットら、1982年。II型インヒビターは12,300のモノマー分子量を有する（プランケットら、1982）。プロテイナーゼインヒビターＩは、黄化タバコ（ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum））の葉中に蓄積し（クオ（Kuo）ら、1984）、フィトフトラ・パラシチカ・ヴァル・ニコチアナ（Phytophthora parasitica var.nicotianae）からのエリシタは、タバコ細胞懸濁培養液中でのプロテイナーゼインヒビターＩの蓄積を誘発することがわかった（リッカウアー（Rickauer）ら、1989）。
他のプロテイナーゼインヒビターを同定すること、および病原体や捕食者に対する保護の優れたトランスジェニック植物の開発での使用の可能性を探る必要性が存在する。本発明に従い、プロテイナーゼインヒビター前駆体をコードする遺伝子配列をクローニングした。該前駆体は複数のプロテイナーゼインヒビタードメインを有しており、プロテイナーゼインヒビター発現の優れた広範囲のトランスジェニック植物を開発するうえで有用であろう。かかる植物は、病原体や捕食者に対する防御特性が優れているであろう。本発明の遺伝構築物はまた、昆虫（それ自体捕食者であるか、または植物病原体の宿主として働く）による食物摂取に対するワクチンを開発するうえでも有用であろう。組換え前駆体またはモノマー性のインヒビターはまた、局所噴霧や動物が食物を消化するのを助けるのに有用であろう。
従って、本発明の一つの態様は、植物からのII型セリンプロテイナーゼインヒビター（PI）前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該前駆体は少なくとも３つのPIモノマーを含み、該モノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位であり、該モノマーの他のもののうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位である。
本発明において「核酸分子」とは、RNAまたはDNA（たとえばcDNA）であって、一本鎖または二本鎖であり、直線状または共有結合により閉じたものである。核酸分子はまた、全遺伝子またはその実質部分に対応するゲノムDNA、そのフラグメントまたはその誘導体であってよい。ヌクレオチド配列は、ゲノムクローンまたはcDNAクローンの天然に存在するヌクレオチド配列に対応していてよく、または単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有していてよい。核酸分子中のかかる変異はすべて、少なくとも一つのモノマーまたはその活性部位をコードする能力を保持しているか、または他の種の同じもしくは類似の遺伝子配列のためのハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーとして有用である。
PI前駆体は、好ましくは少なくとも４つのPIモノマー、さらに好ましくは少なくとも５つのPIモノマー、さらに一層好ましくは少なくとも６つのPIモノマーを含む。さらに好ましくは、PI前駆体はさらにシグナル配列を含む。本発明のPI前駆体は、個々のモノマーに開裂するためのプロセシング部位であるアミノ酸配列を含む。
本明細書において使用する「前駆体」なる語は、前駆体分子そのものの有用性を限定したり、PI活性が発現される前に核分子がまずモノマーにプロセシングされることを要求することを意図するものではない。該前駆体分子はPI活性を有しており、本発明は該前駆体および該前駆体の個々のモノマーに関する。
さらに、本発明は、ハイブリッドII型セリンPI前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。その際、該前駆体は異なるPIからの少なくとも２つのモノマーを含む。かかる少なくとも２つのモノマーは、個々のモノマーにプロセシングされ得ないように修飾することもできるし、またはそのようにプロセシングされる能力を保持させることもできる。好ましくは、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの他方はトリプシン特異的な部位を有する。少なくとも３つのモノマーを有するのが好ましく、少なくとも４つのモノマーを有するのがさらに好ましく、少なくとも５つのモノマーを有するのがさらに一層好ましく、少なくとも６つのモノマーを有するのがもっと一層好ましく、その場合、少なくとも２つは異なるPIからのものである。最も好ましい態様において、これらモノマーの少なくとも一つはチオニン（thionin）である。かかるハイブリッドPI前駆体および／またはそのモノマーは、「多価」な、すなわち広範囲の病原体や捕食者に対して（たとえば、真菌および昆虫の両者に対して）活性な分子を生成させるのに特に有用である。従って、本明細書において「PI前駆体」というときはハイブリッド分子をも包含するものである。
本発明は、下記ヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1）および対応アミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を有するニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）由来の核酸分子の単離を例として挙げる。
0003657980.tif 000002
0003657980.tif 000003
しかしながら、上記例示は、本発明が他の植物からの等価なまたは実質的に同様の核酸分子をも包含することを理解したうえでのことである。「等価な」および「実質的に類似の」とは、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、抗体反応性、モノマー組成および／または前駆体のプロセシングによるモノマー生成のレベルにおいて等価および実質的に類似であることを意味する。たとえば、SEQ ID NO:1の配列と比較した場合に少なくとも55％、たとえば約60〜65％、70〜75％、80〜85％および90％以上のパーセントの配列類似性を有するヌクレオチド配列は本発明の主題の核酸分子に「実質的に類似」していると考えられる。ただし、そのような実質的に類似の配列が、上記のように少なくとも３つのモノマー、好ましくは４つ、５つまたは６つのモノマーを有するPI前駆体をコードすることを条件とする。
特に好ましい態様において、本発明の核酸分子はさらに、転写解読枠の5'側のシグナル配列および／またはコード領域の3'側のヌクレオチド配列をもコードして下記のような完全なヌクレオチド配列（SEQ ID NO:2）およびその実質的に類似性の変異体を提供する。
0003657980.tif 000004
0003657980.tif 000005
0003657980.tif 000006
従って、本発明の好ましい態様は、ニコチアナ・アラタ由来のII型セリンPI前駆体または該前駆体もしくは少なくとも一つのドメインに対して少なくとも55％の類似性を有する配列をコードするかまたは該コード配列に相補的なSEQ ID NO:1または２に示すヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。その際、該前駆体はシグナルペプチドおよび少なくとも５つのモノマーを含み、該モノマーのうちの一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該モノマーの残りの４つはトリプシン特異的な部位を有する。
さらに好ましい態様において、該核酸分子はcDNA分子であり、SEQ ID NO:1または２に一般に示すヌクレオチド配列または本明細書において定義するように該配列の全体またはそのドメインに実質的に類似な配列を含む。
本発明の他の態様は、キモトリプシン特異的な部位かまたはトリプシン特異的な部位のいずれかを有する単一のII型セリンPIをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該PIは、少なくとも３つのモノマーを有し、そのうち少なくとも一つがキモトリプシン部位を有し残りがトリプシン部位を有する前駆体PIの一つのモノマーである。しかしながら、本発明の前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記に定義のごとくであるのが好ましい。
最も好ましい態様において、植物は自家不和合性の遺伝子型S1S3、S3S3またはS6S6を有するニコチアナ・アラタ（リンク（Link）およびオット（Otto））であり、核酸分子は成熟植物の柱頭および花柱から単離しうる遺伝子配列から単離しうるまたは該配列に相補的なものである。対応mRNAは約1.4kbであり、cDNAは６つの保存されたドメインを有し。そのうち最初の２つのドメインは100％同一でありキモトリプシン特異的な部位（Leu−Asn）を有する。第三、第四および第五のドメインは95〜98％の同一性を有し、トリプシンに特異的な部位（Arg−Asn）を有する。第六のドメインもまたトリプシン特異的な部位を有するが、主に3'配列の相違により（表１参照）第三、第四および第五のドメインに対する同一性は低い（79〜90％）。本発明の好ましいPIインヒビターは約42〜45kDaの分子量を有し、約29アミノ酸のシグナル配列を有する。
モノマー性PIのＮ末端配列は、PI前駆体タンパク質の予測される配列中の６つの各繰り返しドメインにおいて表示されている。それゆえ、PI前駆体タンパク質は６つの部位で開裂されて７つのペプチドを生成すると思われる。これら７つのペプチドのうち６つのペプチド（ペプチド２、３、４、５、６および７）（図１、それぞれ、残基25〜82［SEQ ID NO:5］、83〜140［SEQ ID NO:6］、141〜198［SEQ ID NO:7］、199〜256［SEQ ID NO:8］、257〜314［SEQ ID NO:9］および315〜368［SEQ ID NO:9］）はモノマー性PIと同じ分子量（約6kDa）を有し、同じＮ末端配列を有する。ペプチド７はトリプシンまたはキモトリプシンに対する共通部位を有しない。ペプチド１（残基１〜24［SEQ ID NO:4］、図１）は6kDaよりも小さく、異なるＮ末端を有し、精製したモノマー性PI調製物中で検出されなかった。ペプチド１とペプチド７とは、これら２つのペプチド間で形成されたジスルフィド結合により正しいコンホメーションに保持されたペプチド１上の抑制部位として機能的なプロテイナーゼインヒビターを形成すると思われる。
本発明を一つの仮定に限定することを意図するものではないが、PI前駆体は、たとえばAsn−Asp結合の開裂に関与するプロテアーゼによってプロセシングを受けて生物学的に活性なモノマーを生成するのかもしれない。さらに詳しくは、プロセシング感受性の配列はR1−X1−X2−Asn−Asp−R2（式中、R1、R2、X1およびX2は以下に定義する通り）である。かかる配列の発見により、プロテアーゼ感受性配列の開裂により植物中でプロセシングを受けうるペプチドおよびポリペプチドを製造することが可能となるであろう。本発明の該観点に従い、アミノ酸配列：
−X1−X2−Asn−Asp−
（式中、X1およびX2はいかなるアミノ酸であってもよいが、両方ともLys残基であるのが好ましい）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドが提供される。プロテアーゼ感受性配列はまた、
R1−X1−X2−ASN−ASP−R2
（式中、X1およびX2は同じであるのが好ましく、両方ともLys残基であるのが好ましく、R1およびR2は同じかまたは異なるＤまたはＬアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非アミノ酸残基または分子、たとえば当業者に明らかなように、アルキル（たとえば、メチル、エチル）、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシル、ジエニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロ（たとえば、Cl、Br、Ｉ、Ｆ）、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシ、チオール、スルホニル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシおよびアルキルアリールオキシなどである）としても表示される。アルキル、置換アルキル、アルケニルおよび置換アルケニルなどは、直鎖および分枝鎖分子、低級（C1〜C6）および高級（C6以上）誘導体を意味する。「直鎖」なる語は、上記すべての置換基を包含する。
最も好ましい態様において、プロテアーゼ感受性ペプチドは
R1−X1−X2−Asn−Asp−R2
（式中、R1およびR2は同じかまたは異なるペプチドまたはポリペプチドであり、X1およびX2はともにLys残基である）である。
かかるプロテアーゼ感受性ペプチドは、適当な宿主中またはインビトロで発現させることにより大きな分子を該プロテアーゼ感受性ペプチド間に位置するペプチドにプロセシングすることができるように、同じかまたは異なるモノマー間に置くことができる。
本発明はまた、配列：
−X1−X2−Asn−Asp−
（式中、X1およびX2は好ましくは同じであり、最も好ましくは両方ともLys残基である）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。かかる核酸分子は、たとえば、プロテアーゼ感受性配列によって個々のペプチドまたはモノマーにプロセシングされうる前駆体ポリペプチドをコードする一層大きなヌクレオチド配列の一部であってよい。
本発明のプロテアーゼ感受性ペプチドは、複（ポリ）価および／または多価「前駆体」を生成するうえで特に有用であり、該前駆体は各モノマーが同じかまたは異なっており、各モノマーは抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗真菌活性、抗病原体活性および／または抗捕食者活性などの同じかまたは異なる活性を有する。
本発明の該観点を一つの仮定または提唱された作用機構に限定することを意図するものではないが、プロテアーゼはAsn残基に隣接して、さらに詳しくはAsn−Asp残基間で作用すると思われる。
本発明はまた、植物から単離したII型セリンPI前駆体にも関する。該前駆体は、少なくとも３つのPIモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの残りの少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有する。このPI前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記核酸分子によってコードされているのが好ましい。本発明はまた、該前駆体を構成する個々のモノマーにも関する。本発明はまた、上記のように異なるPIからの少なくとも２つのモノマーを含むハイブリッド組換えPI前駆体分子にも関する。
単離したPIまたはPI前駆体は、組換えの形態であっても、および／または生物学的に純粋であってもよい。「生物学的に純粋」とは、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスクロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを含む少なくとも一つの精製工程を施したPI、PI前駆体および／またはその混合物の調製物を意味する。該調製物は、重量、活性抗体、反応性および／またはアミノ酸含量により決定して少なくとも20％のPI、PI前駆体またはその混合物を含むのが好ましい。さらに好ましくは、該調製物は、30〜40％、50〜60％または少なくとも80〜90％のPI、PI前駆体またはその混合物を含む。
PIまたはその前駆体は、天然に存在するものであってもよいし、または上記核酸変異体によってコードされるような変異体であってもよい。PIまたはその前駆体はまた、そのアミノ酸配列または炭水化物および／または脂質残基などの非タンパク質成分に対して置換、欠失および／または付加を有していてよい。
組換えおよび単離PI、PI前駆体およびその混合物は、研究室試薬として、抗体の産生に、局所的に投与する殺虫剤並びに経口的に摂取する殺菌剤として有用である。
組換えPIまたはPI前駆体は、殺虫剤として、単独または１または２以上の担体またはBT結晶タンパク質などの他の殺虫剤と組み合わせて提供される。
本発明のPIは、病害虫の増殖または感染および真菌、細菌および昆虫などの病原体に対して、植物の器官、たとえば柱頭を防御する働きを有すると考えられる。それゆえ、PI前駆体（このものは、モノマー性PI自体のモノマーにプロセシングされうる）を発現しうるトランスジェニック植物を生成するのに用いることのできる遺伝的構築物を開発する必要性が存在する。
従って、本発明の他の態様は、植物由来のII型セリンPI前駆体またはそのモノマーをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物を包含する。その際、該前駆体は少なくとも３つのPIモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、残るモノマーのうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有し、該遺伝子配列はさらに、該核酸分子の発現を可能にする発現手段、植物細胞中での複製を可能にする複製手段、または該核酸分子の植物細胞ゲノム中への安定な組み込みを可能にする組み込み手段を含む。発現は、発育に伴ってまたは感染に応答して、たとえば存在するPI制御配列によって、制御されるのが好ましい。核酸分子の発現が高められることによって、天然に存在する植物中に認められるレベルに比べてPIの内生レベルが大きくなるのが好ましい。または、本発明のPI前駆体cDNAはプロモーター配列を得るのに用いることができ、該プロモーター配列を今度は遺伝子構築やその操作に用いて等価な内生プロモーターの過剰発現を可能とすることができる。他の態様において、PI前駆体は上記のようなハイブリッド分子である。
本発明のさらに別の態様は、上記遺伝子配列および／または核酸分子を有し、必要によりPIおよび／またはPI前駆体またはハイブリッドPI前駆体の産生レベルを上昇させ、高め、あるいは一層迅速にすることのできるトランスジェニック植物に関する。この植物は穀物植物またはタバコ植物であるのが好ましいが、PIまたはPI前駆体の核酸分子を発現することができる限り他の植物を用いることもできる。トランスジェニック植物がPI前駆体を産生する場合には、該植物は前駆体をさらにモノマーにプロセシングしてもよし、またはプロセシングしなくてもよい。または、該遺伝子配列は、昆虫に伝播するためのウイルスまたは細菌ベクターの一部であってもよく、それによって昆虫中の病原体を制御し、結果的に該病原体の植物への伝播を妨害することができる。
本発明のさらに他の態様において、PI前駆体またはその１または２以上のモノマーに対する抗体が提供される。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、発現ライブラリーにおいてPIまたはPI前駆体クローンをスクリーニングするうえで、または発酵液、上澄み液または植物抽出液中のPIまたはPI前駆体を精製するうえで有用である。
本発明の遺伝子構築物はまた、昆虫の消化管中に住まわせて、該昆虫自体または該昆虫中の植物病原体に有害な作用をさせたり、または動物の消化管中への導入を容易にして植物物質の消化を容易にしたりするために用いることもできる。
つぎに、本発明を以下の図面および実施例により記載するが、これらに限られるものではない。
図面：
図１は、pNA−PI−２挿入物の核酸配列（SEQ ID NO:2）およびニコチアナ・アラタPIタンパク質の対応アミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列はヌクレオチド１〜97によりコードされており、これらアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。インヒビターの反応部位残基は囲ってある。ニコチアナ・アラタPI配列は、６つの類似のドメイン（ドメイン１、残基１〜58、ドメイン２、残基59〜116、ドメイン３、残基117〜174、ドメイン４、残基175〜232、ドメイン５、残基233〜290、ドメイン６、残基291〜343）を有する。
図２は、ニコチアナ・アラタの種々の器官からのRNAのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（N.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス（N.Sylvestris）の柱頭および花柱から単離したRNAのゲルブロットは、cDNAクローンNA−PI−２とハイブリダイズした。St、柱頭および花柱;Ov、子房;Po、花粉;Pe、花弁;Se、萼片;L、傷のない葉;L4、傷から４時間後の葉;L24、傷から24時間後の葉;Nt、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱;Ns、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱;Na、ラムダ−DNAのHind III制限断片。
NA−PI−２クローンは、２つのmRNA種（1.0および1.4kb）とハイブリダイズした。大きい方のmRNAは柱頭および花柱において主としてみられ、一方、小さい方のmRNA種は他の組織において一層明らかに認められた。高厳格洗浄後、柱頭および花柱からの1.0kb mRNAはNA−PI−２プローブにもはやハイブリダイズしない。
図３は、柱頭および花柱でのNA−PI−２に相同なRNAのインシトゥ局在を示す写真表示である。
（ａ）32P標識したNA−PI−2 cDNAプローブとハイブリダイズさせた後の1cm長の芽の柱頭および花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真
（ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層;v、維管束;tt、導管;s、柱頭組織
cDNAプローブは柱頭の細胞を強く標識し、維管束への幾つかのハイブリダイゼーションも認められる。表皮、皮層または導管へのハイブリダイゼーションは認められなかった。スケール棒＝200μｍ
図４は、ニコチアナ・アラタのゲノムDNAのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素EcoR IまたはHind IIIで消化し放射性標識したNA−PI−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムDNAのゲルブロット分析。サイズマーカー（kb）は、ラムダ−DNAのHind III制限断片である。
EcoR Iにより２つのハイブリダイズする断片（11kbおよび7.8kb）が得られたが、Hind IIIからは３つの大きなハイブリダイズする断片（16.6、13.5および10.5kb）が得られた。NA−PI−２クローンは、少なくとも２つの成員からなる小さな多重遺伝子族に属すると思われる。
図５は、ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるPI活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであった。
図６は、ニコチアナ・アラタの柱頭からのPI精製の工程を示す。
（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−50ゲル濾過クロマトグラフィー。PI活性はプロフィールの後期に溶出した。
（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの20％w/v SDS−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Laemmli）、1970）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて示す。約6kDのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼインヒビター活性とともに溶出した。
（ｃ）精製手順の種々の段階でのPI含有フラクションのSDS−PAGEによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物（５μｇ）；レーン２、80％w/v硫酸アンモニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出したPIタンパク質（１μｇ）。
PIは6kDのタンパク質であり、柱頭からの非フラクション化緩衝液可溶性抽出物中の主要な成分である。
図７は、ニコチアナ・アラタおよびジャガイモおよびトマトPI II cDMAからのNA−PI−２クローンによりコードされるPIタンパク質のハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（1982）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて作成した。
（ａ）ニコチアナ・アラタPIタンパク質のハイドロパシープロフィール。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインをＩ〜VIとして表示してある。6kD PI種を産生するための推定開裂部位を含む親水性領域には矢印を付してある。これら部位における開裂により生成されるペプチドに対応する領域は、キモトリプシンインヒビターに対してはＣで、トリプシンに対してはＴで、２つの両側の配列に対してはｘで表示してある。
（ｂ）ジャガイモPI IIタンパク質のハイドロパシープロフィール（サンチェス−セラーノ（Sanchez−Serrano）ら、1986）。PI IIタンパク質中の２つの繰り返しドメインをＩおよびIIで表示してある。PCI−１を産生するための推定開裂部位には矢印を付してあり、PCI−１の領域にはマークを付してある。
（ｃ）トマトPI II cDNAによってコードされるポリペプチドのハイドロパシープロフィール（グラハムら、1985）。２つのドメインにはＩおよびIIの表示を付してあり、プロセシング部位の可能性のある残基には矢印を付してある。これら部位は親水性と予測される領域中には存在せず、それゆえ、開裂産物にはマークを付していない。
図８は、生育中の花の柱頭中のPIタンパク質のイムノブロット分析を示す。
（ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。
（ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク質のSDS−PAGEであり、５μｇの各抽出物を負荷した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（LKB・ロー・モレキュラー・ウエイト（LKB Low Molecular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンで示してある。
（ｃ）抗PI抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルのイムノブロット。
生育中の花の柱頭には、抗PI抗体に結合する約42kD、32kD、18kDおよび6kDの４つのタンパク質が含まれる。42kDおよび18kD成分は、花が成熟するにつれて濃度が減少していくのに対して、6kD PIタンパク質は開花の直前に最大濃度に達する、32kD成分（二重線として現れる）のレベルは、花の発育の間有意に変化しない。
図９は、ニコチアナ・アラタからの6kDプロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示す。
A.  逆相HPLCクロマトグラフィーによる6kD PIの分離
４つの主要なピークが、約15.5分（ピーク１）、20.5分（ピーク２）、22.5分（ピーク３）、24分（ピーク４）の保持時間にて得られた。各ピークにおけるペプチドは、Ｎ末端分析および質量分析の両者の組み合わせにより同定した。C1およびT1〜T4についてはＢを参照。
B.  PI前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペプチド:C1、キモトリプシンインヒビター、T1〜T4、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル配列を除いて描写してある。
0003657980.tif 000007
６つの繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜343、図１）。
0003657980.tif 000008
非繰り返し配列（アミノ酸344〜368、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセシング部位を示す。
C.  cDNAクローンから予測され精製タンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたC1およびT1〜T4のアミノ酸配列。各ペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸は、電子スプレー（electro−spray）質量分析計を用いた正確な質量測定により得られた。C1およびT1インヒビターは、５つのアミノ酸において異なっている。（太字）。これらアミノ酸のうちの２つは反応部位に位置しており（下線）、他の２〜３の残基はカルボキシ末端に位置している。ペプチドT2〜T4は３つのアミノ酸が変化しており（囲み）、これらはC1とT1との間では保存されている。ペプチドT2およびT3は互いに同一である。質量分析を用い、Ｎ末端およびＣ末端における正確でないトリミングのために他の形態のC1およびT1〜T4が存在することを示した。すなわち、幾つかの形態は残基１または残基53が失われており、他のものは残基１および残基53の両方が失われている（表２参照）。
図10は、前駆体PIタンパク質のプロセシング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。
太字で示した配列は、精製PIタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイナスの番号を付した配列は、cDNAクローンから予測されるフランキング配列である。予測された前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。
図11は、バクロウイルス発現系で生成されたPI前駆体、およびエンドプロテイナーゼAsp−Ｎによるアフィニティー精製PI前駆体の消化後に得られた生成物を示す。
A.組換えバクロウイルスにより生成されたPI前駆体
発育の緑芽段階におけるニコチアナ・アラタ柱頭からアフィニティーおよびHPLC精製したPI前駆体（レーン１）および組換えバクロウイルスにより生成されたアフィニティー精製PI前駆体（レーン２）を含むイムノブロット。電気泳動的にニトロセルロースに移す前に、タンパク質を15％w/v SDS−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分画した。このブロットを、柱頭からの6kD PI種に対してウサギ中で産生させた抗体とともにインキュベートした。組換えウイルスは、柱頭によって産生されたPI前駆体タンパク質と同じサイズの42kDの免疫反応性のタンパク質を産生した（矢印）。
B.エンドプロテイナーゼAsp−ＮによるPI前駆体の開裂
銀染色した15％SDS−ポリアクリルアミドゲル。１、バクロウイルスにより産生され酵素なしでインキュベートしたPI前駆体。２、前駆体なしでインキュベートした酵素。6kD、ニコチアナ・アラタ柱頭から精製した約6kDのPIペプチド。1m、5m、30m、１分、５分および30分のインキュベーション後に産生された反応生成物。2hおよび24h、２時間および24時間のインキュベーション後の反応生成物。約６〜7kDのペプチドは、前駆体のインキュベーションの１分以内に酵素により検出された。24時間後には６〜7kDのペプチドのみが検出された。レーン１における42kDよりも小さなバンドは、バクロウイルス発現系における翻訳の成熟前の停止により生成された末端の欠失した形態の前駆体によるものである。
図12  ASP−Ｎ消化により前駆体から得られたペプチドの逆相HPLCによる分取クロマトグラフィー
PI前駆体のAsp−Ｎ消化によって生成されたペプチドのHPLCプロフィール。主要なピークは、19分（Asp−N1と称する）および21分（Asp−N2と称する）の保持時間を有していた。これらピークフラクション（１＆２）中のペプチドは、柱頭からの6kDペプチドよりもSDS−PAGE上でわずかにゆっくりとした移動度を有していた。Asp−N1およびAsp−N2のプロテイナーゼ抑制活性をトリプシンおよびキモトリプシンに対して試験した。
図13は、柱頭からのPI前駆体、PIペプチド、該PI前駆体からインビトロで生成したPIペプチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。
材料および方法において記載するように、1.0μｇのトリプシンまたはキモトリプシンを抑制する能力についてPI前駆体およびPIペプチド（０〜1.0μｇ）を試験した。抑制活性は、プロテイナーゼをPIとともにインキュベートした後に残留するプロテイナーゼ活性のパーセントとして表し、PIなしでインキュベートしたプロテイナーゼの活性を100％の残留活性とした。実験は２回行い、その平均値をプロットした。平均値からの変動は８％またはそれ以下であった。
図14は、コントロールの人工食餌、ダイズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチアナ・アラタPI上で飼育したテレオグリルス・コモデュス（T.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋／−標準誤差）をmgで示す。横軸は週を示す。ニコチアナ・アラタPIで飼育したコオロギは、実験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示した。
SEQ ID NOの要約
SEQ ID NO:1   ニコチアナ・アラタPI前駆体のコード領域
SEQ ID NO:2   ニコチアナ・アラタPI前駆体の完全長のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:3   SEQ ID NO:1に対するアミノ酸配列
SEQ ID NO:4   SEQ ID NO:2の残基１〜24（ペプチド１）
SEQ ID NO:5   SEQ ID NO:2の残基25〜82（ペプチド２）
SEQ ID NO:6   SEQ ID NO:2の残基83〜140（ペプチド３）
SEQ ID NO:7   SEQ ID NO:2の残基141〜198（ペプチド４）
SEQ ID NO:8   SEQ ID NO:2の残基199〜256（ペプチド５）
SEQ ID NO:9   SEQ ID NO:2の残基257〜314（ペプチド６）
SEQ ID NO:10  SEQ ID NO:2の残基315〜368（ペプチド７）
SEQ ID NO:11  6kD PIタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
SEQ ID NO:12  6kD PIタンパク質のＮ末端アミノ酸配列
実施例１
1.材料および方法
植物材料
自家不和合性の遺伝子型S1S3、S3S3およびS6S6を有するニコチアナ・アラタ（リンクおよびオット）植物を、すでに記載されているように（アンダーソンら、1989）、標準温室（glasshouse）条件下にて保持した。傷に対する応答の誘発を回避するために器官を液体窒素中に直接回収し、必要なときまで−70℃で貯蔵した。遺伝子発現に対する傷の影響を調べるため、透析クリップで中心葉脈を押し潰すことによって葉を傷つけた。傷をつけてから４時間および24時間後に葉を回収した。
PIをコードするcDNAクローンの同定およびシークエンシング
ニコチアナ・アラタ（遺伝子型S3S3）の成熟花から単離した柱頭および花柱からポリアデニル化RNAを調製し、ラムダgt10（アンダーソンら、1989）中でcDNAライブラリーを構築するのに用いた。ニコチアナ・アラタ（遺伝子型S3S3およびS6S6）の柱頭および花柱からのmRNAから一本鎖の32P標識cDNAを調製し、Ｓ遺伝子型特異的でない高度に発現されたクローンについてライブラリーをスクリーニングするのに用いた（アンダーソンら、1989）。両Ｓ遺伝子型からのcDNAプローブに強くハイブリダイズしたプラークを選択し、クロスハイブリダイゼーションに基づいてグループに分けた。各グループの最も長いクローンをM13mp18およびpGEM3zf＋中にサブクローニングし、アプライドバイオシステムズモデル373A自動シークエンサーを用いてシークエンシングを行った。標準アプライドバイオシステムズプロトコールに従い、染色プライマーおよび染色ターミネーターの両サイクルシークエンシングを行った。SeqEdTM配列編集ソフトウエア（アプライド・バイオシステムズ）を用いて共通配列を作成した。これらクローンに相同な配列をGenBankデータベースでサーチした。ニコチアナ・アラタPIクローンの６つのドメイン間での配列の類似性の程度が高いため、非繰り返し3'配列（ヌクレオチド1117〜1137、1188〜1203および1247〜1267）、および繰り返し領域の開始の前の5'配列（ヌクレオチド74〜98）に対してシークエンシングプライマーを作成した。加えて、pNA−PI−２挿入物をエンドヌクレアーゼHae IIIで制限処理することにより、ヌクレオチド622および970で切断して３つのフラグメントを生成させた。これらフラグメントをpGEM7zf＋中にサブクローニングし、M13前プライマーおよび逆プライマーを用いて両方向にシークエンシングを行った。pNA−PI−２挿入物の繰り返し特性のため、培養物を６時間以上増殖させた場合にファージミドおよびプラスミドベクターの両方で不安定となった。
RNAゲルブロット分析
全RNAを単離し、すでに記載されたようにして（アンダーソンら、1989）、1.2％w/vアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離した。RNAをHybond−Ｎ（アマーシャム）に移し、ランダムヘキサヌクレオチドを用いて32Pで標識したpNA−PI−２からの挿入物でプローブを行った（１×108cpmμg-1;1×107cpmml-1）（ファインベルク（Feinberg）およびフォーゲルスタイン（Vogelstein）、1983）。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション（68℃にて）をアンダーソンらによる記載（1989）と同様にして行った。フィルターを２×SSC、0.1％w/v SDSまたは0.2×SDS、１％w/v SDS中で68℃で洗浄した。
インシトゥハイブリダイゼーション
インシトゥハイブリダイゼーションをコーニッシュ（Cornish）ら（1987）による記載に従って行った。pNA−PI−２からの挿入物（100ng）をランダムヘキサヌクレオチドプライミングにより108cpmμg-1の比活性に標識することによりプローブを調製した（ファインベルクおよびフォーゲルスタイン、1983）。標識したプローブを沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液（50μｌ）中に再懸濁させ、５μｌを切片に適用した。切片をカバーグラスで覆い、50％v/vホルムアルデヒドを入れた閉じた箱中で40℃にて一夜インキュベートした。インキュベーション後、切片を室温にて４×SSC、室温にて２×SSC、および40℃にて１×SSC中で順番に40分間洗浄した。スライドを乾燥させ、室温にてＸ線フィルム（CronexMRF32、デュポン）に直接暴露した。ハイブリダイズした切片を水中の0.025％x/vトルイジンブルーで対比染色し、Eukitt（カール・ツァイス（Carl Zeiss）、フライブルク、FRG）中に積載した。放射能写真を切片上に移して、合成物を示した。
DNAゲルブロット分析
バーナツキー（Bernatzky）およびタンクスレイ（Tanksley）（1986）の手順により、ニコチアナ・アラタの若葉からゲノムDNAを単離した。DNA（10μｇ）を制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびHind IIIで完全に消化し、0.9％w/vアガロースゲルの電気泳動による分離し、20×SSC中のウエットブロッティングによりHybond−Ｎ（アマーシャム）に移した。フィルターをプローブし、RNAブロット分析の場合と同様にして洗浄した。
タンパク質抽出物の調製
組織を液体窒素中で凍結し、乳鉢および乳棒中で細かい粉末に破砕することにより植物材料から可溶性タンパク質を抽出した。粉末化した組織を、100mMトリス−HCl、pH8.5、10mM EDTA、2mM CaCl2、14μＭβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液中に抽出した。10,000gで15分間遠心分離することにより不溶性の物質を除いた。ブラッドフォード（Bradford）（1976）の方法によりウシ血清アルブミン（BSA）を標準として用いてタンパク質濃度を評価した。
プロテイナーゼインヒビターアッセイ
リッカウアー（1989）の記載に従い、タンパク質抽出物および精製タンパク質をトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性についてアッセイした。１μｇのトリプシン（TPCK−処理；シグマ）および３μｇのキモトリプシン（TLCK−処理；シグマ）に対して抑制活性を測定した。トリプシンおよびキモトリプシンによるそれぞれの合成基質、Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌアルギニンメチルエステル（TAME）およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（BTEE）の加水分解の速度を、これら酵素の抑制されなかった活性とした。抽出物の抑制活性は、プロテアーゼを抽出物とともにプレインキュベートした後に残留するコントロールのプロテアーゼ活性のパーセントとして表した。柱頭からのPIペプチド、PI前駆体およびAsp−Ｎプロセシングしたペプチドを、クリステラー（Christeller）ら（1989）による記載に従って抑制活性についてアッセイした。
ニコチアナ・アラタPIタンパク質の精製
柱頭（1000;10g）を液体N2中で細かい粉末に破砕し、緩衝液（100mMトリス−HCl、pH8.5、10mM EDTA、2mM CaCl2、14μＭβ−メルカプトエタノール、4ml/g組織）中に抽出した。最初の精製工程であるゲル濾過の前に抽出物を濃縮するため、抑制活性を80％w/v硫酸アンモニウムで沈殿させたが、すべてのプロテイナーゼ抑制活性を沈殿させるには濃縮が必要であった。
硫酸アンモニウムペレット5mlの0.15M KCl、10mMトリス−HCl、pH8.1中に再懸濁し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−50カラム（2cm×100cm）上に負荷した。このカラムから溶出しプロテイナーゼ抑制活性を有するフラクション（10ml）をプールし、キモトリプシン−セファロースCL4Bのアフィニティーカラム［製造業者の指示により100mgのTLCK−処理α−キモトリプシン（シグマ）を15mlのセファロースCL4B（ファルマシア）に架橋させたもの］に負荷した。結合したタンパク質を7m尿素、pH3で溶出する（5mlフラクション）前に、カラムを10容量の0.15M KCl/10mMトリス−HCl pH8.1で洗浄した。溶出液を200μｌの1Mトリス−HCl pH8で直ちに中和し、脱イオン水に対して充分に透析した。
アミノ酸配列分析
精製PIタンパク質を、ガス相シークエンサー上の自動エドマン分解に供する前に逆相HPLCマイクロポアカラム上のクロマトグラフィーにかけた（マウ（Mau）ら、1986）。グレゴ（Grego）ら（1985）の記載に従い、フェニルチオヒダントリン（PTH）アミノ酸をHPLCにより分析した。
ニコチアナ・アラタPIに対するポリクローナル抗血清の製造
以下のようにしてグルタルアルデヒドを用いて精製プロテイナーゼインヒビター（図6c、レーン３）を担体タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）（シグマ）にコンジュゲートした。1mgのPIタンパク質をH2O（1.5ml）中に溶解し、0.5mlの0.4Mリン酸緩衝液（pH7.5）中のKLH（0.3mg）と混合した。20mMグルタルアルデヒド（1ml）を室温で撹拌しながら５分間かけて滴下した。混合物を室温で30分間撹拌し、グリシン（0.25ml）を加え、混合物をさらに30分間撹拌した。ついで、コンジュゲートしたタンパク質を通常の食塩水（0.8％w/v NaCl）に対して充分に透析した。各注射についで100μｇの当量のPIタンパク質を用いた。最初の注射にはフロントの完全アジュバントを用い、その後の２回のブースター注射には不完全アジュバントを用いた。抗血清のIgGフラクションを製造業者の指示に従ってプロテインＡセファロース（ファルマシア）上で分離した。
タンパク質ゲルブロット分析
タンパク質抽出物を15％w/v SDS−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し（レムリ、1970）、Bio−Rad Trans−BlotRSemi−dry電気泳動トランスファーセル（12V、20分）を用いて25mMトリス−HCl、192mMグリシン、20％v/vメタノール中のニトロセルロースに移した。負荷およびタンパク質の移動は、膜上のタンパク質をPonceau S（ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）、1988）で染色することによりチェックした。膜を３％w/vウシ血清アルブミン中で１時間ブロックし、抗PI抗体（１％w/v BSA、トリス緩衝食塩水中に２μg/ml）とともに室温にて一夜インキュベートした。製造業者の推奨に従い、ビオチン化ロバ抗ウサギIgG（1/500希釈、アマーシャム）およびアマーシャムビオチン−ストレプトアビジンシステムを用いて結合抗体を検出した。
エンドプロテイナーゼAsp−ＮによるPI前駆体のタンパク質加水分解
アフィニティー精製したPI前駆体（0.25mg）を100mM NH4HCO3、pH8.5中のエンドプロテイナーゼAsp−Ｎ（２μｇ）とともに37℃にて全量1mlで48時間インキュベートした。反応生成物を、分析的ブラウンリー（Brownlee）RP−300アクアポア（Aquapore）カラム（C8、７μｍ、4.6×100mm）を用いた逆相HPLCにより分離した。カラムを0.1％v/v TFA中で平衡化し、ペプチドを以下のプログラムで溶出した:0〜25％Ｂ（0.089％v/v TFA中の60％v/vアセトニトリル）を５分間かけて負荷し、ついで25〜42％勾配のＢを40分間かけて負荷し、最後に42〜100％勾配のＢを５分間かけて負荷する。流速は1.0ml/分であり、ペプチドを215nmにおける吸光度により検出した。各ピークを手動で回収し、凍結乾燥した。UV検出器上での215nmにおける各ピークで得られた応答により濃度を推定した。
2.PI前駆体遺伝子のクローニング
PI cDNAクローンの単離および特徴付け
cDNAライブラリー（ニコチアナ・アラタの成熟花の柱頭および花柱から単離したmRNAより調製）を、自家不和合性の遺伝子型を伴わない高度に発現された遺伝子のクローンについてスクリーニングした。ジャガイモおよびトマトのII型プロテイナーゼインヒビター（ソーンバーグ（Thornburg）ら、1987;グラハム（Graham）ら、1985）とある程度の配列同一性を有するタンパク質をコードするクローンを選択した。最も大きいクローン（NA−PI−２）は1191ヌクレオチドの転写解読枠を有し、1360塩基対の長さであった。このニコチアナ・アラタクローン（NA−PI−２）の核酸配列（SEQ ID NO:2）および予測されるアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を図１に示す。Ｎ−グリコシル化の可能性のある部位は存在しない。
驚くべきことに、このニコチアナ・アラタcDNAクローンは、完全ではないが高度の配列同一性を有する６つの繰り返しドメインを有するタンパク質をコードしている（図１）。これら各ドメインには反応性部位の可能性のある部位が含まれている（図１中に明示してある）。ニコチアナ・アラタPIの推定反応部位の残基は、キモトリプシンを特異的に抑制する２つの部位（Leu5−Asn6、Leu63−Asn64）およびトリプシンに対して特異的な４つの部位（Arg121−Asn122、Arg179−Asn180、Arg237−Asn238およびArg295−Asn296）を有するインヒビターと一致している。
NA−PI−２の繰り返し構造がクローニングによる人為的な産物でないことを確かめるため、別の３つのcDNAクローンをシークエンシングしたところ、NA−PI−２と同一であることがわかった。
表１は、PI前駆体の６つのドメインのアミノ酸同一性のパーセントを比較したものである。
PI mRNAの一過性で空間的な発現
ニコチアナ・アラタの種々の組織から単離した全RNAを、図２に示すRNAゲルブロット分析においてPI cDNAクローンでプローブした。1.0および1.4kbの２つのハイブリダイズするメッセージが、花柱（柱頭を含む）から単離した全RNA中に存在した。大きい方のメッセージ（この組織において主要なものである）のみが、cDNAクローンNA−PI−２（1.4kb）をコードするのに充分なサイズである。小さい方のメッセージは、より高い厳格さにおいてはcDNAプローブで検出されない。約1.4kbの相同なメッセージはまた、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・シルベストリスの花柱から単離したRNA中にも存在した（図２）。
花の他の器官（花粉を除く）では、両メッセージとも低レベルで検出することができたが、より小さいRNA種が一層たくさん認められえた。花粉RNAにはハイブリダイゼーションは認められなかった。葉のRNAにはハイブリダイズする種が認められなかったガ、機械的な傷をつけてから24時間後には1.0および1.4kbの２つの種が検出された。この場合には、小さい方のメッセージ（1.0kb）の方がたくさん認められた。
未熟な（1cm長）芽の花柱の縦切片への放射性標識したニコチアナ・アラタPI cDNAのインシトゥハイブリダイゼーションを図３に示す。該cDNAに相同なRNAは柱頭の細胞に強く結合し、維管束へは弱く結合した。皮層組織、導管組織または花柱の表皮ではハイブリダイゼーションは検出されなかった。同じパターンのハイブリダイゼーションは、成熟した受容性の（receptive）花においても観察された。ハイブリダイゼーションの前にリボヌクレアーゼＡで処理したコントロールの切片は標識されなかった。
ゲノムDNAブロット分析
cDNAクローンNA−PI−２を図４に示すDNAゲルブロット（EcoR IかHind IIIのいずれかで消化したゲノムDNAが含まれる）上得でプローブとして用いたEcoR Iにより２つのハイブリダイズするフラグメント（11kbおよび7.8kb）が得られ、Hind IIIからは３つの大きなハイブリダイズするフラグメント（16.6、13.5および10.5kb）が得られた。
ニコチアナ・アラタの種々の組織中でのPI活性の分布
ニコチアナ・アラタの種々の器官の粗製抽出物によるトリプシンおよびキモトリプシンの抑制を図５に示す。柱頭抽出物がトリプシンおよびキモトリプシンの両方に対して最も有効なインヒビターであった。柱頭抽出物は萼片抽出物に比べて８倍までの抑制活性を有し、花柱、花弁、葉および傷つけた葉からの抽出物に比べると20倍以上の抑制活性を有していた。
ニコチアナ・アラタ柱頭からのPIの精製
ニコチアナ・アラタの柱頭を緩衝液中に抽出し、80％w/v硫酸アンモニウムで沈殿させることにより抑制活性を濃縮した。沈殿を再溶解し、セファデックスＧ−50上でゲル濾過することにより分画した。図6aおよび6bに図示したプロフィールにおいて、プロテイナーゼインヒビターに比べて抽出物中の殆どのタンパク質は早く溶出した。プロテイナーゼ抑制活性を有するフラクションをプールし、キモトリプシン−セファロースのアフィニティーカラムに負荷した。PI活性は約6kDのタンパク質とともに溶出し、図示6cに示す20％SDS−ポリアクリルアミドゲル上で単一のバンドとして移動するように思われた。精製の種々の段階におけるPIの純度をSDS−PAGEにより評価した（図6c）。精製したインヒビターは、粗製の抽出物中の存在する抑制活性の約50％を表していた。
6kD PIタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列
精製PIタンパク質からＮ末端アミノ酸配列DRICTNCCAG（T/K）KG（それぞれ、SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:12）を得た。このアミノ酸配列は、図１中の位置25、83、141、199、257および315から開始されるcDNAクローンの導かれた配列中の６つの地域に対応する。このＮ末端配列の位置11には、トレオニンおよびリジンの両方が検出された。このことは、図１において下線を引いた配列で始まる６つのペプチドの混合物からなる精製インヒビターと一致する。最初の２つのペプチドは該位置にトレオニンを含み、一方、他の４つのペプチドは該位置にリジンを有する。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインに対するこれらペプチドの相対位置を図７に図示する。これら６つの予測された6kDペプチドのうち５つは、キモトリプシンかまたはトリプシンのいずれかに対する反応部位を有している（図１および７）。６番目のペプチドは他の５つのペプチドよりもアミノ酸が４つ短く（58アミノ酸）、抑制部位を含有していないので活性でない。Ｎ末端からのペプチド（図７におけるｘ）はキモトリプシン反応性の可能性のある部位を有するが、はるかに短い（24アミノ酸）。
ニコチアナ・アラタ中でのPIタンパク質の分布
キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートした精製PIタンパク質に対してポリクローナル抗血清を産生した。該抗体はイムノブロット分析において精製6kD PIタンパク質と強く反応し、成熟花からの全柱頭および花柱抽出物において6kDおよび32kDタンパク質（二重線として出現）にのみ結合した。図８は、抗PI抗血清でプローブした、発育の種々の段階（1cm長の芽から成熟した花まで）での花からのタンパク質抽出物を含有するイムノブロットである。長さが1cmから5cmの芽では、6kDおよび32kDタンパク質に加えて約18kDおよび42kDの大きな交差反応性タンパク質が検出された。これら18kDおよび42kDタンパク質は成熟につれて濃度が減少したが、6kDタンパク質は開花の直前にピーク濃度に達した。32kDタンパク質は花の成熟の間、比較的一定に推移した。
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実施例２
PIモノマーの精製および同定
1.材料および方法
逆相クロマトグラフィーによる6kD PI種の分離
柱頭（21,000）を破砕し、PIタンパク質の精製についての記載と同様にして抽出した。セファデックスＧ−50ゲル濾過カラム（5cm×800cm、分離当たり3000の柱頭）上でのゲル濾過の後、ペプチドを凍結乾燥し、ベックマンHPLCシステムゴールド（Gold）上のブラウンリーRP−300C8逆相カラム（10×250mm）に負荷し、0.1％v/vトリフルオロ酢酸（TFA）およびアセトニトリル勾配（０〜10％を５分間、10〜25％を40分間、および25〜60％を10分間）により5ml/分にて溶出した。ピークのフラクション（フラクション１、２、３および４）を回収し、凍結乾燥した。
電子スプレー質量分析
改変ヒューレット−パッカード（Hewlett−Packard）モデルHP1090L液体クロマトグラフ上のブラウンリーRP−300C8逆相カラム（150×20mm内径の融解石英毛管カラム）上に水（2.0μｌ）中の各PI調製物（フラクション１、２、３および４）（20ピコモル）を負荷し、１μl/分の流速および25℃のカラム温度にてアセトニトリルの直線勾配（0.05％v/v TFAから0.045％v/v TFA/60％v/vアセトニトリル、30分間）で溶出することにより、HPLC溶出液のオンライン質量分析を行った。6mm行路長のＵ字型軸ビーム毛管流セルを有するスペクトラルフィジックス（Spectral Physics）前光学スキャニング検出器（LCパッキングス（LC Packings）、オランダ）を用い溶出液を215nmにてモニターした。電子スプレーイオン化（EAI）源（アナリティカ（Analytica）、ブランフォード、コネチカット州）を備えたフィニガン−マット（Finningan−Mat）トリプル四極子質量分析計（モデルTSQ−700、サンホセ、カリフォルニア州）で質量スペクトルを得た。電子スプレー針を−4kVの電圧差にて陽イオンモードで操作した。被覆（sheath）液は２−メトキシエタノールであり、手動ポンプ駆動により１μl/分にて分配した（ハーバード・アパレイタス（Harvard Apparatus）、サウスナチック、マサチューセッツ州）。窒素乾燥ガス条件は以下の通りであった；ヒーターの温度、275℃；圧力、15psi;流速、15stdL/分。窒素被覆ガスを33psiで供給した。ガス状窒素を沸騰した液体窒素源から得た。ペプチドを上記オンライン毛管RP−HPLCにより1.0μl/分にてESI源中に導入した。３秒の速度にてm/z400〜2000でスキャニングしてスペクトルを得た。データの回収および換算をフィニガンBIOMASSTMソフトウエアを用いてDec5100コンピューター上で行った。
2.結果
ニコチアナ・アラタ柱頭からの個々の6kD PI種の分離および同定
精製した6kD PI調製物中に存在すると予測された約6kDの６つのペプチドのうち５つを逆相HPLCクロマトグラフィーにより互いに分離した。４つのピークが得られ（図9a）、各ピーク中のペプチドを電子スプレー質量分析により同定した（表２）。PI前駆体中での位置およびキモトリプシンまたはトリプシン活性部位の存在に従ってペプチドをC1、T1、T2、T3およびT4と称した（図9b）。最初のHPLCピーク（図9a）はキモトリプシンインヒビターC1に対応し、第二のピークはT2およびT3（互いに同一）およびT4（T2およびT3とは位置32における一つのアミノ酸のみが異なる）の混合物からなる。第三のピークにはペプチドT1が含まれ、第四のピークはT1、T2/T3およびT4の混合物からなる（表２）。
プロセシングの部位は正確には決定しなかったが、図10に示す配列中のアスパラギン酸残基（Ｎ）とアスパラギン残基（Ｄ）との間に位置していると思われる。アスパラギン残基に対する特異性を有するプロテアーゼは、未熟なダイズ種子およびカボチャの子葉からの液胞から単離されている（スコット（Scott）ら、1992、ハラ−ニシムラ（Hara−Nishimura）ら、1991）。このことは、ニコチアナ・アラタの柱頭中の乳頭およびその下の分泌細胞の液胞中のPIの免疫金（immunogold）局在と一致する（アトキンソン、1992）。ニコチアナ・アラタPIの場合は、ペプチドホルモンと類似のプロセシングも可能である。なぜなら、可能な各6kDペプチドは二塩基性残基（Lys−Lys、図10中の位置−２＆−３）を側部に有するからである。しかしながら、かかるシステムは植物においては記載されておらず、これら二塩基性残基は分子表面にプロセシング部位を呈示する予測された親水性ループの形成に預かっていると考える方がよいようである。
質量分析からのデータは、いったん最初の開裂が起こったら新たなカルボキシ末端はトリミングされていくことを示している（図10）。EEKKN配列（SEQ ID NO:14）は完全に除去されるがトリミングは完全ではなく、ときにはさらにアミンさんが除去される。立体障害がトリミングがさらに進むのを防ぐ。場合によってはアスパラギン酸もＮ末端から除去される。
実施例３
組換えバクロウイルスベクターを用いた昆虫細胞（Sf9）培養液中でのPI前駆体の製造
PI前駆体をコードするcDNA（図１）をプラスミドベクターpV1392のEcoR I部位に挿入した。該プラスミドベクターは、BamH1部位にマルチクローニング部位が挿入されている他はpVL941（ルックナウ（Lucknow）およびサマーズ（Summers）、1989）と同じである。pRH11と称するプラスミドは、多核体（polyhedrin）プロモーターによって指令される転写の方向に関して正しい方向にてPI cDNAを含有する。バクロウイルスDNAおよびpRH−11をスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に同時トランスフェクションすることにより組換えバクロウイルスを得た。組換えウイルス（相同組換えによって得られた）をプラーク精製し、タンパク質産生のために昆虫細胞に感染させる前に増幅させた。組換えバクロウイルスの産生、該ウイルスの滴定およびSf9細胞の維持および感染に関するすべての手順はキング（King）およびポッセ（Posse）（1992）から得た。PI前駆体を産生させるため、大フラスコ（175cm2）中の単層のSf9細胞が集密に達した時点で高力価の組換えウイルスで５〜10pfu/細胞の多数の感染により感染させた。感染の４日後に培養液を回収し、遠心分離により清澄化し、柱頭からの6kD PI種について記載したのと同様にしてキモトリプシン−セファロースアフィニティーカラムに適用することによりPI前駆体を精製した。7M尿素、pH3中でカラムから溶出したPI前駆体を1Mトリス−HCl緩衝液（pH8）で直ちに中和し、Milli−Ｑ水に対して充分に透析し、ダイアフロー（Diaflow）YM10フィルターを用いた超遠心分離により20〜50倍に濃縮し、−20℃にて凍結保存した。
感染した昆虫細胞から前駆体を産生させるため、PI前駆体をコードするcDNAクローンをバクロウイルスベクター中に組み込んだ。昆虫細胞は42kDのタンパク質を産生したが、このものは柱頭からの6kD PIペプチドに対して産生させた抗体と交差反応し、キモトリプシンアフィニティーカラムに結合した。この42kDタンパク質は、ニコチアナ・アラタの未熟な柱頭中で産生される42kD前駆体とサイズが同じであり（図11）、Ｎ末端配列LysAlaCysThrLeuAsn（SEQ ID NO:13）を有しており、シグナル配列が昆虫細胞によって正確にプロセシングされたことを示している（図１）。これら結果に基づき、バクロウイルス発現系で産生された該42kDタンパク質は、いまやPI前駆体と呼ぶことになるであろう。この42kD PI前駆体はキモトリプシンに対しては抑制活性を有するが、トリプシンに対しては抑制活性を有していなかった（図13）。このPI前駆体をエンドプロテイナーゼAspNによってプロセシングして約6kDの安定なペプチドが得られ、これを逆相HPLCにより部分精製した（図12）。これらペプチドは柱頭から分離した6kDペプチドに等価なトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性を有しており、トリプシン抑制活性を活性化するには前駆体のプロセシングが必要であるが、キモトリプシン活性についてはすべてについて必要でないことを示していた。AspNはアスパラギン酸残基に隣接して（図10におけるAsn−１とAsp1との間）特異的に開裂しトリミング活性を有していないので、インビトロで生成したペプチドはＣ末端に配列EEKKN（SEQ ID NO:14）が存在する他は柱頭で産生させたものと同じであろう。このことは、活性な6kD PIペプチドを得るにはＮ末端およびＣ末端の正確なプロセシングを必要としないことの新たな証拠を提供する。Asp−N1はトリプシンに比べてキモトリプシンの抑制において一層有効であり、それゆえ主としてC1類似体であると思われる（図9b）。Asp−N2は一層有効なトリプシンインヒビターであり、おそらくT1〜T4類似体を含有している。
実施例４
種々の昆虫からの未分画消化管抽出物におけるプロテアーゼ活性に対するPIの効果
クリステラーら（1992）の手順を用いて消化管プロテアーゼに対するPIの活性を以下のようにして測定した。インヒビターの１μＭのアリコート（０〜10μｌ、消化管中に存在するプロテアーゼに対して少なくとも５倍過剰）を10mM CAPS緩衝液（pH10）（150μｌ）と混合し、各昆虫消化管抽出物（０〜15μｌ）と30℃にて20分間プレインキュベートした。C14−標識したカゼイン基質（400μｇタンパク質、比活性25,000〜75,000dpm mg-1）（50μｌ）を加えることにより反応を開始し、反応を停止させるために冷30％（w/v）TCA（50μｌ）を加えるまで反応を続けた。氷上で30分間インキュベートした後、未消化のタンパク質を20℃にて10,000gで５分間遠心分離にかけてペレット化した。上澄み液を除き、シンチレーション液と混合し、放射能を測定した。ルシラ・セリカタ（L.sericata）およびクリソムヤ・ルフィファシエス（C.rufifacies）の場合に10mMトリス−HCl（pH8.0）を用いた他はpH10にてアッセイを行った。
表３は、レピドプテラ（Lepidoptera）、コレオプテラ（Coleoptera）、オルトプテラ（Orthoptera）およびジプテラ（Diptera）の種々の成員の消化管中のプロテアーゼに対するプールした6kD PIペプチド（C1、T1、T2/T3、T4）、トリプシンインヒビターT2/T3およびT4の混合物、およびキモトリプシンインヒビターC1の抑制活性を示す。殆どの場合、プールしたペプチドおよびトリプシンインヒビターは、試験した昆虫に依存して37〜79％の範囲の抑制程度にて消化管プロテアーゼに対して等価な効果を有していた。これらインヒビターは、ジャガイモ塊茎の蛾であるフトリマエ・オペルクレラ（P.opercullela）の消化管プロテアーゼに対しては殆ど効果は認められなかった。キモトリプシンインヒビターC1もまたプロテアーゼの活性に影響を与えたが、５つの場合（ウイセアナ・セルビナタ（W.cervinata）、ルシラ・セリカタ、コステリトラ・ゼアランディカ（C.zealandica）、プラノトルトリックス・オクト（P.octo）、サトウキビ地虫（sugar cane grub））にはトリプシンインヒビターよりも有効性が低かった。
実験の詳細は図14の説明に記載してある。ニコチアナ・アラタPIは、コオロギの体重を減少させるうえでタイズバウマン−バークインヒビターよりも一層有効であった。昆虫の中腸の酵素を抑制するプロテイナーゼインヒビターの能力と昆虫飼育試験において昆虫の生育を遅らせるうえでの有効性との間に良好な相関関係が存在することが示された（クリステラーら、1992）。図14は、インビトロアッセイで黒色野生コオロギ（テレオグリルス・コモデュス（T.commodus））の消化管プロテアーゼを70％抑制したプールPIが、10週間の期間にわたって行った飼育試験においてコオロギの生育を30％遅らせたことを示している。インビトロアッセイと飼育試験との間の相関関係は、最近になってヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）の生育および発達について研究しているジョンストン（Johnston）と彼の同僚（1993）によって確かめられた。
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表３の説明
NaPI＝プールしたニコチアナ・アラタプロテイナーゼインヒビター
C1＝ニコチアナ・アラタキモトリプシンインヒビター（HPLCからのピーク１）
T2/T3、T4＝ニコチアナ・アラタトリプシンインヒビター（HPLCからのピーク２）
ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）、ヘリコベルパ・アルニゲラ（Helicoverpa armigera）、タバコの青虫、レピドプテラ
ヘリオチス・プンクチゲラ（Heliothis punctigera）、ヘリコベルパ・プンクチゲラ（Helicoverpa punctigera）  自生の青虫、レピドプテラ
テレオグリルス・コモデュス  黒色野生コオロギ、オルトプテラ
アグロチス・インフサ（Agrotis infusa）  普通のネキリガ、成虫はモンヤガ（Bogong moth）として知られる、レピドプテラ
ウイセアナ・セルビナタ  ポリナ（Porina）、ニュージーランドに自生、レピドプテラ
ルシラ・セリカタ  緑クロバエ、ジプテラ、pH8にてアッセ
クリソムヤ・ルフィファシエス  毛深い蛆クロバエ、ジプテラ、pH8にてアッセイ
アホジウス・タスマニア（Aphodius tasmaniae）  タスマニアの草地虫＝黒頭牧草コフキコガネ（cockchafer）、コレオプテラ
コステリトラ・ゼアランディカ  ニュージーランドの草地虫、コレオプテラ
スポドプテラ・リトゥラ（Spodoptera litura）  熱帯産アワヨトウの幼虫（armyworm）、レピドプテラ
フトリマエ・オペルクレラ  ジャガイモ塊茎の蛾、レピドプテラ
エピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittana）  薄褐色のリンゴ蛾（ハマキムシ（leafroller））、レピドプテラ
プラノトルトリックス・オクト  緑頭のハマキムシ、レピドプテラ
クテノプセウスチス・オブリクアナ（Ctenopseustis obliquana）  褐色頭のハマキムシ、レピドプテラ
サトウキビ地虫
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配  列  表
配列番号:1
配列の長さ:1104塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列：
0003657980.tif 000012
配列番号:2
配列の長さ:1360塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:97...1200
配列：
0003657980.tif 000013
0003657980.tif 000014
0003657980.tif 000015
配列番号:3
配列の長さ:368アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000016
0003657980.tif 000017
配列番号:4
配列の長さ:24アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000018
配列番号:5
配列の長さ:58アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000019
配列番号:6
配列の長さ:58アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000020
配列番号:7
配列の長さ:58アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000021
配列番号:8
配列の長さ:58アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000022
配列番号:9
配列の長さ:58アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000023
配列番号:10
配列の長さ:54アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003657980.tif 000024
配列番号:11
配列の長さ:13アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号:12
配列の長さ:13アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号:13
配列の長さ:6アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号:14
配列の長さ:5アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
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【図１】
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0003657980.tif 000031
0003657980.tif 000032
0003657980.tif 000033
0003657980.tif 000034
【図２】
0003657980.tif 000035
【図３】
0003657980.tif 000036
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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