(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚移植用ストローの一端を密封し、その中に希釈液を入れ、冷却して希釈液の凍結体とし、この凍結体上に接するようにガラス化低温保存液を入れ、それと同時あるいはその前または後に胚を注入した後、ストローの他端を密封し、これを液体窒素で冷却してガラス化することを特徴とする哺乳動物の胚移植用ストローの製造方法。
【請求項２】
請求項１の方法で得ることができる、希釈液の凍結体と、胚を含むガラス化低温保存液との二成分からなり、胚移植用ストローの下端に希釈液凍結体があり、その希釈液の凍結体に直接接して胚を含むガラス化低温保存液がある哺乳動物の胚移植用ストロー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウシ等の哺乳動物胚をガラス化低温保存し、胚移植時にこれを用いて直接移植することのできる胚移植用ストロー及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウシの受精卵移植において、凍結胚を融解後凍結ストローのまま移植することは、融解後の耐凍剤の除去の操作を大きく簡素化する。今までに、緩速凍結により凍結された胚を、融解後ストロー内で凍結溶液と希釈溶液を混和させることによって耐凍剤の除去を行い、凍結ストローで直接移植する方法（Suzuki et al.,1983; Leibo,1984; Chupin et al.,1984) 、凍結メディウムに蔗糖を添加し、融解後凍結ストローで直接移植する方法 (Massip et al.,1987; Kajiwara et al.,1988; Suzuki et al.,1989) 、あるいは、耐凍剤にエチレングリコール (Dochi et al.,1991)、プロピレングリコール (Suzuki et al.,1990) を用いることにより、耐凍剤を除去することなく直接移植する方法が報告されている。
【０００３】
Massip et al.(1987) は、ガラス化されたウシ胚を融解後ストロー内で希釈することにより、直接移植する可能性を示唆している。ガラス化低温保存液は耐凍剤を高濃度に含み毒性が高く、長時間のガラス化低温保存液への暴露は胚の生存率の低下を招く。従って、ガラス化低温保存の場合、融解後ストロー内で希釈溶液と凍結溶液を短時間で混和させる方法を適用することが望ましい。
融解後ストロー内で希釈液と凍結溶液を混和させる方法は、凍結溶液と希釈溶液を空気層で分け、融解後ストローを指で弾くことにより空気層を浮き上がらせ、凍結溶液と希釈溶液を混合させ耐凍剤の除去を行うものである。しかし、この方法は、空気層の大きさによって上手く混合しないことが経験された。即ち、空気層が大きすぎる場合、ストローを指で弾くと空気層が小さく分裂してしまい、浮き上がらなかったり、小さすぎる場合は凍結溶液と希釈溶液が凍結前に混合してしまうことがしばしばあった。この様に、この方法は凍結前のストローへ凍結溶液および希釈溶液の充填において、適切な空気層の大きさにするために微妙な操作が要求される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このようなガラス化低温保存液と希釈液との間に空気層を設けることなく、従って使用時にストローを指で弾いて空気層を浮き上がらせることなく両液を容易に混合することのできる胚移植用ストロー及びその製造法の提供を課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決する手段について鋭意検討したところ、−20〜−25℃では、希釈液〔例えば、0.5 M 蔗糖- リン酸緩衝液(PBS) 〕は氷結するが、ガラス化低温保存液は液体の状態のままであることを見出した。そして、この知見に基づいて、希釈液をストロー中に入れ、−20〜−25℃に冷却し、希釈液を凍結させ、この上にガラス化低温保存液を注入し、それと同時あるいはその前または後にガラス化低温保存液で平衝化された胚を入れ、これを液体窒素中で冷却しガラス化させると希釈液とガラス化低温保存液とは両者が混合されることなく保存することができ、融解後ストローを指で弾くことなくガラス化低温保存液と希釈液とを混合させることができた。特にガラス化低温保存液としてエチレングリコール及びジメチルスルフォキシドの混合液を使用すると、約２分間でガラス化が可能であり、従来ガラス化に長時間を要していた操作が短時間ですみ、高い生存性で、しかも高い成功率で胚移植に成功した。本発明は、このような知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）胚移植用ストローの一端を密封し、その中に希釈液を入れ、冷却して希釈液の凍結体とし、この凍結体上に接するようにガラス化低温保存液を入れ、それと同時あるいはその前または後に胚を注入した後、ストローの他端を密封し、これを液体窒素で冷却してガラス化することを特徴とする哺乳動物の胚移植用ストローの製造方法。
（２）上記１の方法で得ることができる、希釈液の凍結体と、胚を含むガラス化低温保存液との二成分からなり、胚移植用ストローの下端に希釈液凍結体があり、その希釈液の凍結体に直接接して胚を含むガラス化低温保存液がある哺乳動物の胚移植用ストロー。
【０００７】
本発明における希釈液には、組織培養液あるいは蔗糖やトレハロース等の糖類を溶解させた組織培養液等を用いることができる。これらの溶液の凝固点は、ガラス化低温保存液の凝固点より高い温度にある。ストロー内の希釈液を予め凍結させ、それに接する様にガラス化低温保存液を注入すると、ガラス化低温保存液は希釈液と混ざり合うことがないので好ましい。また、ガラス化低温保存液はエチレングリコール、ジメチルスルフォキシド（DMSO) 、プロパンジオール、グリセロール等の凝固点が希釈液のそれよりも低温にあるものが使用される。このガラス化低温保存液は、これらを単独で使用してもよく、またこれらを混合してもよい。またさらに、ダルベッコリン酸緩衝液等で希釈して用いてもよい。
【０００８】
本発明について胚移植用ストローの製造法を示して説明すると、まず、ストローの一端を密封し、これを冷媒の中に浸漬する。この冷媒としては、メタノール、エタノール等のような凍結保存するときの温度が、液体窒素等の温度より高い温度であるものが用いられる。この冷却されたストロー中に希釈液を入れ、希釈液を凍結させる。希釈液は 140〜160 μl 程度の量使用する。ここで希釈液が凍結したことを確認した上で、ガラス化低温保存液を注入する。ガラス化低温保存液は、10〜20μl 程度用いる。このガラス化低温保存液を注入した段階では、希釈液は凍結しているが、ガラス化低温保存液はガラス化していない。これに予め濃度の薄いガラス化低温保存液中で浸漬して平衝させた哺乳動物の胚をストロー内のガラス化低温保存液のカラムに入れる。この胚の注入はガラス化低温保存液の注入と同時あるいはその前又は後であってもよい。その後、ストローの上端を密封し、これを液体窒素あるいは液体窒素ガス中に静置して胚をガラス化させる。その後、これを液体窒素中でガラス化のまま保存する。使用時には20℃程度の水に浸漬すると融解される。このカラムをガラス化低温保存液の方を上にして垂直に立てると約５分間程度のうちにガラス化低温保存液と希釈液とが混合される。これをただちに受卵メスの胚移植に使用すると高い確率で受胎を行うことができる。なお、ストローは、従来の胚移植に用いられるストローを使用することができ、また密封は低温で品質を損なわない限りどのようなものでも使用することができるが、プラスチックプラグが実用的に使用される。
【０００９】
また、哺乳動物には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等が用いられる。またガラス化低温保存液はエチレングリコールとジメチルスルフォキシドとの混合液を用いるのが保存中胚を死滅させることがなく、またこれに血清アルブミンのような蛋白質を少量加えるとその緩衝作用によって胚を一層安定に低温保存することができる。しかも、エチレングリコール及びメチルスルフォキシド混合液への胚の浸漬時間は約２分間でガラス化が可能であり、従来ガラス化に長時間を要していた操作が簡略となった。
【００１０】
本発明の胚移植用ストローを用いて次の実験を行って、本発明の結果を確認した。
【００１１】
実験材料：
胚： ICR♀マウスに過排卵処置を施し、得られた胚盤胞を次の実験１及び２に供した。また、過排卵処置を施したホルスタインあるいは和牛雌ウシより、人工授精から７日後に非手術的に桑実胚から胚盤胞までの胚を回収し、実験３に供した。
ガラス化低温保存液：エチレングリコール、ジメチルスルフォキシドおよび４mg／mlのウシ血清アルブミンが添加された修正ダルベッコリン酸緩衝液(PBS) を、容積比１：１：２で混合した溶液をガラス化低温保存液（VSi)として用いた。ガラス化低温保存液をPBS で50％に希釈した溶液を平衝溶液とした。希釈溶液には0.5 M の蔗糖を添加したPBS が用いられた。
【００１２】
実験１
（１）実験方法：−20〜−25℃に冷却されたVSi への平衝時間について検討を行った。図１に示すように、まず希釈溶液（0.5 M 蔗糖-PBS液) を含むストローを−20〜−25℃に冷却されたデューワー缶内のメタノールに浸し、希釈溶液を凍結させ（図1-1)、その凍結した希釈溶液の上にVSi を20μl オートピペットにより充填した（図1-2)。そうすることにより、希釈溶液とVSi は空気層を狭まず直接接触しているが混合せず、しかもVSi は固体化していない状態にある。胚はプラスチックシャーレ中の50％-VSiに室温で１分間浸漬、ついで−20〜−25℃に冷却されたアルコール中のストロー内のVSi カラムに 0.5, 2, 5, 10分間浸漬後（図1-3)、プラスチックプラグで封をし（図1-4)、液体窒素ガス中に静置して２分間冷却させた後、液体窒素中で保存された。使用時には、ガラス化されたサンプルを20℃の水に浸漬して融解した。ストローはVSi カラムの方を下にして垂直に立てられたまま５分間静置され、ガラス化低温保存液と希釈液とを混合した。次いでストロー内容はプラスチックシャーレに移され。１分以内に胚が回収された。胚はPBS 中で数回洗浄後、M16 により培養された。胚の生存性は培養24時間で拡張胚盤胞への発育により判定された。
（２）実験結果：融解、培養後の生存率は、VSi への浸漬時間 0.5, 2, 5および10分ではそれぞれ51％、93％、87％および75％であった。浸漬時間 0.5分の場合の生存率は他の区に比較して有意に低く (P<0.001; vs 2, 5分、P<0.05; vs10分) 、10分のそれは２分に比較して有意に低かった（P<0.05) （図２参照）。従って、浸漬時間は２〜５分程度が好ましい。
【００１３】
実験２
（１）実験方法：融解後の希釈時間の影響について検討を行った。胚は50％-VSiに室温下で１分間、−20〜−25℃のVSi に２分間浸漬され、実験１のようにしてガラス化された。融解後、ストローはVSi の方を下にして垂直に立てたまま10、30および60分間室温下で静置され、ガラス化低温保存液と希釈溶液が混合された。胚のストローからの回収、培養および生存性の判定は実験１のようにして行った。
（２）実験結果：希釈時間10、30および60分の場合の生存率は、それぞれ91％、87％および76％であった。希釈時間60分の生存率は、10分のそれに比較して有意に低かった (P<0.05) 。希釈時間10分及び30分の生存率は、実験１の希釈時間５分のそれと同等であった（図３）。
【００１４】
実験３
（１）実験方法：上記の方法をウシ胚に試みた。人工授精後７日目に回収された桑実胚から胚盤胞までの胚を、実験１のようにしてガラス化した。融解後胚をストローから取り出すことなく、凍結ストローを移植ストローとし、発情から７日目の受卵牛に移植した。融解から移植までの時間は15〜30分であった。移植後21〜35日目に超音波診断装置により妊娠鑑定を行った。
（２）実験結果：10頭の受卵牛の移植を行い、６頭の受胎が確認された（表１）。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
以上述べたとおり、ガラス化胚の直接移植のために、融解後ガラス化低温保存液と希釈溶液をストロー内で混和させ耐凍剤の除去を行う方法を試みた。まず、マウス胚盤胞を用い２つの予備実験を行った。まず、低温下（−20〜−25℃）でのVSi への最適浸漬時間が調べられ、２分が最も高い生存率をもたらすことが明らかとなった。次いで、融解後の蔗糖溶液中での希釈時間の影響について調べ、30分以内であれば、生存性に影響しないこと、60分以上では生存性が低下することが明らかとなった。この方法をウシ胚で試みた結果、10頭の受卵牛への移植で６頭の受胎が確認された。
次に、本発明の実施例を示す。
【００１７】
【実施例１】
（１）直接移植用ストローの調製
10〜20μl の空気層をはさんで0.5 M 蔗糖-PBS 140〜160 μl を含む0.25mlストローをデューワー缶内の−20〜−25℃のメタノール中に浸し、0.5 M 蔗糖-PBSの凍結を行う。
別に、エチレングリコール、ジメチルスルフォキシドおよび４mg／mlのウシ血清アルブミンを添加したダルベッコリン酸緩衝液(PBS) の容積比１：１：２の比で混合された溶液をガラス化低温保存液とした。
次に、前記の凍結した希釈液の0.5 M 蔗糖-PBSの上に20μl のこのガラス化低温保存液を直接接するように注入した。一方、過排卵処置されたホルスタインより、人工授精から７日後に非手術的に回収された桑実期の胚を、ガラス化低温保存液をPBS で50％希釈した溶液である平衝溶液に、室温で１分間浸漬した。この平衡化させた胚をガラス化低温保存液を注入したストローの中にピベットで入れ、ストローの上端をプラスチックプラグで密封し、液体窒素ガス中で２分間冷却した。このストローを液体窒素中で保存した。
【００１８】
（２）移植用ストローの使用
ウシに移植するさいに、この凍結ストローを取り出し、20℃の水に浸漬して融解し、ストローはガラス化低温保存液の方を下にして垂直に立て、５分間放置してガラス化低温保存液と希釈液とを混合した。これを融解胚をストローから取り出すことなく、この移植用ストローのまま、発情から７日目の受卵牛に移植した。移植後21〜35日目に超音波診断装置により妊娠鑑定を行ったところ、妊娠が確認された。
【００１９】
【実施例２】
ウシ桑実胚を10%-グリセロールと20%-プロパンディオールを４mg/ml のウシ血清アルブミンが添加された修正ダルベッコのリン酸緩衝液(PBS) に混合した溶液(VS1) に室温下で10分間浸漬した。次いで、−20〜−25℃に冷却されたストロー内で1Mシュクロース-PBSの上に重層された25%-グリセロールと25%-プロパンディオールをPBS に混合した溶液〔Massip et al., Cryo-Letters 7, 270(1986)〕(VS2液）中に胚を移した。10分後、ストローを液体窒素ガス中に移し、 2分間冷却し、その後液体窒素中で保存した。融解後、ストローをVS2 の方を下にして垂直に立てられたまま５分間室温下で静置させ、ガラス化低温保存液と希釈溶液とを混合し、胚をストローから取り出すことなく、凍結ストローを移植ストローとし、発情から７日目の受卵牛に移植した。融解から移植までの時間は15〜30分であった。移植後21〜35日目に超音波診断装置により妊娠鑑定を行った。
その結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
【実施例３】
ディッシュ内の40% エチレングリコール、18% フィコール、0.3MシュクロースをPBS に混合した液〔Kasai et al., J.Reprod.Fertil 89, 91(1991)〕(EFS液) に、ウシ桑実胚を室温下で１分間浸漬した。次いで胚を−20〜−25℃に冷却されたストロー内で0.5Mシュクロース-PBS液の上に重層された EFS液に移した。１分以内にストローを液体窒素ガス中で２分間冷却し、その後液体窒素中で保存した。融解後、ストローをEFS の方を下にして垂直に立てたまま５分間室温下で静置し、ガラス化低温保存液と希釈溶液とを混合した。胚をストローから取り出すことなく、冷凍ストローを移植ストローとし、実施例１と同様に移植し、妊娠鑑定を行った。
その結果を表３に示す。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
【発明の効果】
本発明の移植用ストローは、融解時何の操作をすることなく、ストロー内のガラス化低温保存液と希釈液とが融解混合し、自然に希釈が行なわれ、胚保存ストローのままで移植が可能である。
従って、従来のようにストローを指ではじいてストロー内の空気層が分裂してガラス化保存液と希釈液とが混合しないというような欠点が生じない。さらに融解すると同時にガラス化低温保存液と希釈液とが混合されるので、融解後に胚がガラス化低温保存液に暴露されている時間を可能な限り最小限に制限でき、ガラス化低温保存液の毒性の胚への影響を少くし、胚の死滅する確率を低くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の哺乳動物胚移植用ストローの製造手順を示す模式図。
【図２】実験１の−20〜−25℃のガラス化低温保存液に胚を浸漬したときの浸漬時間が胚の生存性に及ぼす影響を示す。
【図３】実験２の希釈時間が胚の生存性に及ぼす影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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