(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩（Ｂ）とをプロテアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質Ａと基質Ｂおよびこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液からなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項２】
該ペーストは、更に有機溶媒を基質Ａおよび基質Ｂの濃度が上記の濃度となる量含まれている請求項１に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを利用してペプチド合成する際に、高濃度基質ペーストを用いたアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは加水分解酵素として、タンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に幅広く利用されている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成に関する研究も増加している。
しかしながら、基質となるアミノ酸の水に対する溶解度は必ずしも高くなく、低濃度基質を用いざるをえない場合も多い。
【０００３】
一般に、反応平衡定数Ｋｃは質量保存則に従い、次のように表すことができる。
0003621271.tif 000002
（Ｓ１、Ｓ２：基質濃度    Ｐ：生産物濃度）
従って、基質濃度を高めることで高い生産物濃度を得ることができる。
【０００４】
プロテアーゼを用いたペプチド合成の例として、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＺＡＰＭと略記することがある。）が挙げられる。
ところで、上記合成に用いられる基質のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下ではＺＡと略記することがある。）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＰＭと略記することがある。）は、いずれも水に対する溶解度が１〜１．５Ｍ程度と低いため、数百ｍＭ程度の基質を用いた報告例が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
先に述べたように、高濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度を得ることが期待でき、また、反応器容積の低減も可能である。
しかしながら、基質の水等に対する溶解度が低いために、高濃度基質での反応のメリットが享受できないのが現状である。
従って、本発明の目的は、プロテアーゼを用い、高基質濃度でジペプチド（アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル）を合成することができる方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、ＺＡの粉末とフェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅＯＲと略記することがある。）塩酸塩の粉末及び極少量のアルカリ性水溶液を混合してペースト状としたものに酵素を加えて反応を行わせたところ、高収率で目的物質ＺＡＰＭが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、Ｎ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩（Ｂ）とをプロテアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質Ａと基質Ｂ及びこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液とからなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明のプロテアーゼを用いるアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方法は、反応の基質であるＮ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＲ）塩酸塩を、これら基質およびアルカリ性水溶液とからなるペーストに高濃度で含むものを使用することが特徴である。
以下では、Ｎ−置換アスパラギン酸をＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（ＺＡ）で代表させて、又、フェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩をＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ）塩酸塩で代表させて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【０００８】
本発明においては上記のペーストを調製する方法は、両基質とアルカリ水溶液とが混合されてペースト状となる方法であれば、どのような方法でもよく、特に制限されない。
ペーストを調製する際のＺＡとＰＭの混合比は特に限定されないが、ＺＡ／ＰＭが０．１〜１．５（モル比）程度が好ましい。
また、アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの一般的なアルカリの水溶液が用いられる。
アルカリ水溶液の使用量は、ＺＡとＰＭの濃度が、これらの水に対する溶解度以上の濃度となる量であり、ペプチドの収量を高めるうえから出来るだけ高濃度となる量が望ましい。アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、１５Ｎ〜飽和溶液が好ましい。
【０００９】
また、上記のペーストに更に有機溶媒を含有させることもできる。有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジエチレングリコール、グリセロール、エタノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。有機溶媒の添加量は特に限定されないが、両基質濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量が望ましい。
【００１０】
本発明で使用するプロテアーゼとしては、例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテーアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、反応が進行する濃度であれば特に限定されない。
また、本発明における反応温度は４０〜６０℃が好ましく、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。
【００１１】
本発明で使用するＺＡ以外のＮ−置換アスパラギン酸としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、ＰＭ塩酸塩以外のフェニルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩としては、例えば、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなどの塩酸塩が挙げられる。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。文中の％は特に断らない限り重量基準である。
【００１３】
実施例１
ＰＭ粉末２１５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）  およびＺＡ粉末２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に２０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液９０μｌを加え、よく混合してペースト状とした。ペースト中の各物質の濃度は、ＰＭ、ＺＡともに１１．１Ｍである。上記ペーストにサモアーゼ（大和化成株式会社製）５０ｍｇを加えて混合し、５０℃で反応を行った。反応液組成はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分析した。反応８時間後に４．７ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１４】
実施例２〜４
実施例１と同様に、表１に示す濃度条件で反応を行った。反応８時間後に得られたＺＡＰＭの量を同表に示す。
表１
0003621271.tif 000003
【００１５】
実施例５
実施例１でペーストにジエチレングリコール１００μｌを加えて、実施例１と同様に反応させた。基質濃度はＰＭ、ＺＡとも５Ｍである。反応８時間後に１６４．９ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１６】
実施例６
ＰＭの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用いる以外は実施例２と同様にして反応させた。反応８時間後に２０８．７ｍｇのペプチドを得た。
【００１７】
【発明の効果】
以上の本発明によれば、ペースト状基質を用いることにより、基質の溶解度に関わらず高濃度の基質を用いてペプチド合成が可能となった。その結果、反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、５Ｍ濃度の基質を用いた場合では１００ｍＭ濃度の基質を用いた場合の５０分の１の反応器容積で製造を行うことが可能となり、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を著しく向上させることができる。