(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
速度ブランク法を用いて、主測定波長として450±10 nmを使用する、光学測定による試料中のアルカリホスファターゼの測定法であって、遊離ヘモグロビンを含有する、またはヘモグロビンベースで製造された代用血液を含有する試料を測定する測定法。
【請求項２】
血清または血漿試料において測定を行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
代用血液が、誘導体化された、変性した、もしくは架橋されたヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビンまたは組換えによって作成されたヘモグロビンを含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料が6500 mg/dlまでのヘモグロビン含量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
速度ブランク法を用いて、主測定波長として450±10 nmを使用する、アルカリホスファターゼの測定法であって遊離ヘモグロビンまたは代用血液によって引き起こされる妨害を排除するための方法。
【請求項６】
速度ブランク法を用いたアルカリホスファターゼ測定法において、遊離ヘモグロビンによる、または代用血液による妨害を除去するための、主測定波長450±10 nmの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビンの妨害を避けるために、速度ブランク法と組み合わせて主要な測定波長として４５０ ± １０ ｎｍを使用することを特徴とする、光学測定によって試料中のアルカリホスファターゼを測定するための方法、遊離のヘモグロビンまたは代用血液による妨害を排除するための方法、および遊離ヘモグロビンまたは代用血液による妨害を防ぐために主要な測定波長を速度ブランク法と組み合わせて使用することに関する。
【０００２】
溶血は少なからず、アナライトの定量に関わるある種の診断法の妨げとなることが知られている。溶血は、たとえば、赤血球の細胞膜に対する機械的作用、浸透圧の作用、化学作用または酵素の作用による赤血球の破壊であると理解される。溶血の結果として、血色素ヘモグロビン（Ｈｂ）が遊離され、もはや試料から除去することは不可能である。ヘモグロビンの存在が問題であるのは、一つには、ヘモグロビンの吸収スペクトルが場合によっては検出すべき物質および指示薬（色原体）のスペクトルと相当程度重複し、光度検定において測定エラーとなりかねないためである。他方、ヘモグロビンはまた、試料の成分と化学的に反応して、やはり誤った測定結果に至る可能性のある物質を生成することも考えられる。
【０００３】
ヘモグロビンを基に製造される代用血液が最近、大量の失血の後などに治療目的でますます高頻度に使用されつつある。代用血液中のヘモグロビンは、天然物でも合成品でもよい。しばしば、Ｈｂ様化合物も使用される。ヘモグロビン含量が通常５００ｍｇ／ｄｌ以下である溶血に対して、代用血液による治療の間には、血清または血漿中のＨｂ含量は２０００ ｍｇ／ｍｌを越えることもある。このため、代用血液含有試料における妨害は、溶血性試料よりも、多くの場合相当に顕著であるが、これはヘモグロビンまたは合成類似品がまさに最初から遊離の状態で存在するためである。
【０００４】
遊離ヘモグロビンによる妨害は、光度計によるアルカリホスファターゼの定量において特に重大である。アルカリホスファターゼを測定するためには、４−ニトロフェノールの生成を４０５から４１５ ｎｍ（吸光度の増加）で測定する。ヘモグロビンも４１５ ｎｍに吸収を有する。ヘモグロビンの存在はつぎの２点でアルカリホスファターゼの測定を妨害する：一方では、Ｈｂスペクトルはアルカリ性媒質中で経時的に変化し（吸光度の増加）、他方では、一定のＨｂ含量を超えると計器の光度計の限界に達してしまうことである。
【０００５】
先行技術において、血清または血漿試料の分析に関するヘモグロビンの分光学的および化学的影響を除去するために様々な方法が公表されている。
【０００６】
Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９／９， １８０４−１８１０ （１９９３）におけるＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋの報告によれば、ヘモグロビンによるアルカリホスファターゼ測定の妨害はＨｂスペクトルの経時変化によって引き起こされる。この妨害は、数学的な補正計算によって取り除くことができる（試料中のＨｂ濃度の測定および、測定されたＨｂと同量のＨｂによるアルカリホスファターゼに関する測定値の補正）。
【０００７】
ＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋによって言及された数学的補正は、少なくとも８００ ｍｇ／ｄｌ ＨｂまでのＨｂの影響を取り除くことができるが、あまり使いやすいとは言えない。なぜなら、追加してＨｂ含量を測定し、その後さらに数学的補正を行なう必要があるからである。
【０００８】
ＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋ（上記）は、いわゆる速度−ブランク測定法による、妨害を除去するためのもう一つの方法を報告している。また、速度−ブランク測定法による溶血妨害の補正が、ＥＰ−Ａ−０ ６９５ ８０５に記載されている。この方法では、試料に含まれる成分を実際に光度計で測定する前に、試料の溶血の程度を判定するために、試料は予備的な反応にかけられる。その後得られた測定値は、つぎに、妨害成分がそれによって測定エラーの原因となるような量と、溶血の程度とを相互に関連づけることによって決定された値によって補正される。
【０００９】
ヘモグロビンによる妨害は、Ｈｂ含量が約１２００ ｍｇ／ｄｌ以下の場合のみ速度−ブランク測定法によって取り除くことができるが、これはＨｂ含量がこれより高いと光度計の限界に達してしまうためである。これは溶血の妨害を取り除くには十分であるかも知れないが、代用血液による妨害を除去するためには全く不十分である。
【００１０】
ヘモグロビンの妨害を取り除くためのもう一つの方法が、アルブミンの定量について公表され（ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４５７２８）、ここではヘモグロビンの妨害の除去は主波長と第２の波長の特別な組み合わせによって達成された。しかしながら、ここで言及された波長はアルカリホスファターゼの測定には使用することができない。なぜなら、上記の波長では４−ニトロフェノールに関する測定シグナルはもはや得られないからである。
【００１１】
公表されたＷＯ ９７／４５７３３によれば、個々のＵＶ検定において第２の波長５４６および５７０を使用することによって、ヘモグロビンによる妨害を排除することができる。しかしながら、この方法は、主測定波長が３４０ｎｍであるような酵素のＵＶ検定についてしか用いることができない。第２の測定波長５４６または５７０ ｎｍを使用するだけで、Ｈｂによる妨害を完全に取り除くことができるが、アルカリホスファターゼの測定のように主測定波長が４１５ ｎｍ付近であるような酵素の発色検定については、これは不可能である。
【００１２】
米国特許第５，７６６，８７２号によれば、５７７ ｎｍの第２の波長が、アミラーゼ測定において溶血による妨害を低減する。しかしながら、引用された測定データはＨｂ含量５００ ｍｇ／ｄｌですでに８％までの、測定値の有意なずれが存在することを示す。このことは、溶血による妨害を排除するためには十分であるかも知れないが、もっと高濃度のＨｂ（代用血液で治療中に生じるような）では、主測定波長として約４１５ ｎｍを使用するため、測定値の上記のようなずれはもっと大きくなり、Ｈｂ妨害の十分な除去はもはや不可能となると考えられる。
【００１３】
先行技術においては、代用血液含有試料において生じるような高濃度のＨｂ存在下で妨害なしに実行することのできるアルカリホスファターゼ測定法は知られていない。
【００１４】
したがって、目的とするのは、先行技術の欠点を十分に克服するような、試料中のアルカリホスファターゼを測定するための改良された方法を開発することである。より詳細には、アルカリホスファターゼ測定時の、ヘモグロビンによる、およびヘモグロビンを基にした代用血液による、妨害を排除するための単純で使いやすい方法を提供することを目指す。
【００１５】
この目的は、請求の範囲においてより詳細に説明される、光学測定によって試料中のアルカリホスファターゼを測定するための方法によって達成される。この方法は、速度ブランク法と組み合わせて、４５０±１０ ｎｍを主測定波長として使用することを特徴とする。
【００１６】
驚くべきことに、主波長を変更し、速度ブランク法を使用する場合に、アルカリホスファターゼ測定のＨｂによる妨害を効果的に取り除くことができることが分かった。主波長の変更だけ、または速度ブランク法の使用だけではＨｂ妨害の満足できる排除には不十分である。
【００１７】
４−ニトロフェノールの吸収スペクトルのために、４１５ ｎｍのみならず、４５０±１０ ｎｍでもアルカリホスファターゼを測定することが可能である。ここで主測定波長は検出反応の通常の極大吸収ではなくてその近傍にあるが、得られた測定シグナルはそれにもかかわらずアルカリホスファターゼの正確な測定には十分である。
【００１８】
新たな主測定波長として４５０±１０ ｎｍを選択することによって、それだけでヘモグロビンによる妨害がわずかに減少するが、驚くべきことに４５０±１０ ｎｍの主波長を速度ブランク法と組み合わせることによってのみ完全な妨害の排除が得られる。
【００１９】
本発明の方法によって、アルカリホスファターゼ測定のヘモグロビンによる、またはヘモグロビン様化合物による妨害を、はじめて単純な方法で、少なくとも３０００ ｍｇ／ｄｌのＨｂ含量まで除去することが可能となる。Ｈｂ妨害の除去に関する上限は、光度計の性能によって決まる限界である。したがって、本発明の方法は、６５００ ｍｇ／ｄｌのヘモグロビン含量まで、妨害をうまく除去することが期待される。
【００２０】
本発明の速度ブランク法において、試料の溶血の程度を判定するために、試料に含まれる成分を実際に光度測定する前に、試料を予備的な反応に供する。続いて得られた、測定すべき成分に関する測定値を、つぎに、妨害成分が測定エラーの一因となるその量と、溶血の程度を相関させることによって決定された値によって補正する。溶血による妨害について補正するために速度ブランク法を使用すること自体は、たとえば、ＥＰ−Ａ−０ ６９５ ８０５において、ならびにＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋによるＣｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９／９， １８０４−１８１０ （１９９３） において、報告されている。
【００２１】
速度ブランク法のために使用される第２の測定波長は、本発明にとって重要でない。また、予備的反応および主反応を測定するための時間帯の長さは決定的に重要というわけではない。予備的反応および主反応の吸光度変化を１から４分までの時間にわたって測定するのが適当であるということが判明した。
【００２２】
本発明の方法は遊離ヘモグロビンの存在するあらゆる試料の測定に適している。本発明の意味において遊離ヘモグロビンという用語は、これを無傷な赤血球に存在するヘモグロビンと区別するために使用される。遊離ヘモグロビンを含有する試料の例は、溶血性の血清もしくは血漿試料であり、または代用血液を含む試料である。本発明の意味において、遊離ヘモグロビンという用語に該当する代用血液の例は、ヘモグロビン、より詳細にはヒトヘモグロビンまたはウシヘモグロビンの誘導体化された、重合した、改変された、もしくは架橋された誘導体、たとえばＤＣＬヘモグロビン（ジアスピリン−架橋ヘモグロビン）、または組換え技術によって作成されたヘモグロビンである。
【００２３】
本発明はまた、アルカリホスファターゼを測定するための方法において、遊離ヘモグロビンによって引き起こされた妨害を除去するための方法に関する。この方法は、主測定波長として４５０±１０ ｎｍを速度ブランク法と組み合わせて使用することを特徴とする。
【００２４】
本発明のさらなる主題は、アルカリホスファターゼ測定法において、遊離ヘモグロビンによる、またはヘモグロビンから製造された代用血液による妨害を排除するために、速度ブランク法と組み合わせて主測定波長４５０±１０ ｎｍを使用することである。
【００２５】
本発明は下記の実施例によって説明される。
【００２６】
実施例
ａ）ヘモグロビン含有試料の調製
Ｈｂ含有溶液を貯留血清の一部に添加し、Ｈｂ含量を少なくとも３０００ ｍｇ／ｄｌとした。同じ貯留血清の別の同一容量部分を等量のＮａＣｌ溶液（１５４ ｍｍｏｌ／ｌ）と混合した。つぎに、両方の部分を互いに異なる割合で混合し、最低ではＨｂを含有せず、最高では少なくとも３０００ ｍｇ／ｄｌのＨｂを有する一連のＨｂ濃度の１１試料を得た。
【００２７】
ｂ） ＳＦＢＣ法によるアルカリホスファターゼの測定
Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅの推奨にしたがって、Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｖｏｌ． ３５， ２７１ （１９７７）による測定
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１アナライザーによって、アルカリホスファターゼの測定を行なった。
【００２８】
下記の試薬を使用した：
試薬１： ９３０ ｍｍｏｌ／ｌ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールバッファーｐＨ １０．５；
１．０３ ｍｍｏｌ／ｌアスパラギン酸マグネシウム
試薬２： ９３０ ｍｍｏｌ／ｌ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールバッファーｐＨ １０．５；
１．０３ ｍｍｏｌ／ｌアスパラギン酸マグネシウム；
９８ ｍｍｏｌ／ｌ リン酸４−ニトロフェニル
検査法は下記の通りである：２５０μｌの試薬１を試料１１μｌに加え、５分後に試薬２を５０μｌ添加した。比較測定のために、アナライトをさらに５０秒後に測定したが、その間吸光度の変化をその後の４分間に測定した。下記の主測定波長（λ１）および第二の測定波長（λ２）をともに測定のために使用した：λ１／λ２ ＝ ４１５／６６０ ｎｍ（予め機器を設定）、４１５／５７０ ｎｍおよび４５０／６６０ ｎｍ（対照）。さらに、もう一つの対照としてＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋによって報告された速度ブランク測定法によってアルカリホスファターゼを測定した（４１５／６００ ｎｍ ＲＢとして言及される）。
【００２９】
本発明によるアナライトの測定のために、λ１／λ２ ＝ ４５０／６６０ ｎｍの測定波長の組み合わせを使用した。速度ブランク測定法に関しては、試料に試薬１を添加した後、３．０ − ４．９分の間、予備的反応の吸光度変化を測定し、さらに主反応の吸光度変化を試料に試薬１を添加後７．９ − ９．８分間にわたって測定した。これはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１アナライザーでの測定ポイント［１０］−［１６］および［２５］−［３１］に相当する。結果を４５０／６６０ ｎｍ ＲＢと表記した列に示す。
【００３０】
本発明の測定結果ならびに対照測定の結果を下記の表１に示す。新規の主波長４５０ ｎｍと速度ブランク法を本発明の組み合わせで使用することによって、他の測定波長の組み合わせと比べて、または主波長４１５ ｎｍの速度ブランク測定法と比較して、Ｈｂを含有する代用血液による妨害をかなり減少させることができる。
【００３１】
【表１】
Ｕ／１において３７℃で測定されたアルカリホスファターゼの含量
0003612279.tif 000002
＊上記の場合、架橋されたヘモグロビンを使用した。