(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自由電子金属表面を有する金属薄膜の表面が、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカー、並びに、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマー、で処理されてなる金属薄膜であって、前記（１）の有機リンカーが、２種以上の分子種を用いて形成されるものであって、金属表面に固定される第一の分子種が硫黄原子を含有する官能基を有するアミノ酸又はその誘導体であり、そして、第二の分子種が、グルタルアルデヒドであり、かつ前記（２）のポリマーが、ポリマーの主鎖又は側鎖にアミノ基を有するポリマーである金属薄膜。
【請求項２】
第一の分子種が、システイン又はそのエステル誘導体である請求項１に記載の金属薄膜。
【請求項３】
ポリマーが、アミノ糖を含有する多糖類である請求項１又は２に記載の金属薄膜。
【請求項４】
ポリマーが、キトサンである請求項３に記載の金属薄膜。
【請求項５】
ポリマーが、ポリ低級アルキレンイミンである請求項１又は２に記載の金属薄膜。
【請求項６】
金属薄膜の片面のみが処理されている請求項１〜５のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項７】
金属薄膜の薄膜の厚さが５０〜１０００ｎｍである請求項１〜６のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項８】
金属薄膜の金属が、金、銀、銅、アルミニウム又はクロムのいずれか１種である請求項１〜７に記載の金属薄膜。
【請求項９】
金属薄膜の金属が、金である請求項８に記載の金属薄膜。
【請求項１０】
ポリマーにさらに、検出用試薬が直接又は検出用試薬に結合し得る官能基を有するスペーサーを介して検出用試薬が結合している請求項１〜９のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項１１】
スペーサーが、ポリマーに結合し得る官能基及び検出用試薬に結合し得る官能基を有する有機化合物である請求項１０に記載の金属薄膜。
【請求項１２】
検出用試薬に結合し得る官能基が、カルボキシル基又はその反応性誘導体である請求項１１に記載の金属薄膜。
【請求項１３】
検出用試薬が、蛋白質である請求項１０〜１２のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項１４】
蛋白質が抗原又は抗体である請求項１３に記載の金属薄膜。
【請求項１５】
金属薄膜が、基板に密着している請求項１〜１４のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項１６】
基板がプリズムである請求項１５に記載の金属薄膜。
【請求項１７】
金属薄膜が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）用の金属薄膜である請求項１〜１６に記載の金属薄膜。
【請求項１８】
自由電子金属表面を有する金属薄膜の表面を、金属表面に固定され得る官能基及び他の官能基を有する第一の有機化合物で処理して、当該第一の有機化合物を金属表面に固定し、次いで当該第一の有機化合物の金属表面に固定されていない他の官能基と化学反応をし得る第二の有機化合物を反応させて、前記第一の有機化合物と当該第二の有機化合物とを結合させることからなる有機リンカーが導入された請求項１〜１７のいずれかに記載の金属薄膜を製造する方法。
【請求項１９】
自由電子金属表面を有する金属薄膜の表面に、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカーを導入し、次いでこれに、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマーを前記有機リンカーと反応させてこれを結合させ、さらに、当該ポリマーに直接又は検出用試薬に結合し得る官能基を有するスペーサーを介して検出用試薬を結合又は吸着させてなる、請求項１８に記載の金属薄膜を製造する方法。
【請求項２０】
検出用試薬が、蛋白質である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛋白質が抗原又は抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する際に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用の金属薄膜が請求項１〜１７のいずれかに記載の金属薄膜を使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項２３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する際に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用の金属薄膜を請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法で測定中に処理し、次いで試料を添加して測定を行うことを特徴とする請求項２２に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれかに記載の金属薄膜を使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７に記載の金属薄膜又はそのポリマー部分に検出用試薬を結合し得る官能基を有するスペーサーを結合させた金属薄膜に、順次又は同時に検出用試薬及び試料を添加して、検出用試薬と試料中の物質との動向を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検出、同定又は定量する方法。
【請求項２６】
検出用試薬と試料中の物質との動向が、抗原−抗体反応である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカーであって、当該有機リンカーが、２種以上の分子種を用いて形成されるものであって、金属表面に固定される第一の分子種が硫黄原子を含有する官能基を有するアミノ酸又はその誘導体であり、そして、第二の分子種が、グルタルアルデヒドである有機リンカー、
（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマーであって、当該ポリマーの主鎖又は側鎖にアミノ基を有するポリマー及び、
（３）金属薄膜からなる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量するためのキット。
【請求項２８】
さらに、（４）検出用試薬及び必要のよりこれをポリマーに結合させるためのスペーサーを包含してなる請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の金属薄膜を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリマーが結合した有機リンカーで表面処理された金属薄膜、それを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置、及び、それによる試料を検出、同定又は定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、感染症の検査や診断の分野において免疫測定法が広く利用されている。一般に、通常の感染症では体内に多量の抗体が作り出され、この抗体の有無を見分けることで診断を行っている。また、血清、尿、唾液など体液中の成分(血糖値、コレステロールなど)の値も、患者の病態を把握し治療方針を検討するうえで大切なパラメータとなっている。
診断の際、試料の採取量には制約があり、頻回の採取は難しいため測定法には高い精度(再現性)と感度が要求される。しかも目的成分は、通常生体試料という複雑なマトリックス中に微量しか含まれていないため、信頼度の高い分析結果を的確に得ることは極めて重要である。
【０００３】
一方、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance :ＳＰＲ）センサーは、金や銀などの金属薄膜表面に発生する表面プラズモン共鳴現象を検出するデバイスである。表面プラズモンとは、金属−誘電体界面に生じる電子の疎密波の一種であり、その波数は金属薄膜表面に接する数１００ｎｍまでの試料の厚さや光学特性（誘電率、屈折率）によって変化する。この変化を直接測定することは不可能なため、ＳＰＲセンサーではレーザー光を試料の反対面から当てエバネッセント波を発生させ、これが表面プラズモンと共鳴する時のレーザーの入射角度変化（SPR angle shift)を測定することで表面の状態の変化を間接的に測定するのが一般的な方法となっている。
【０００４】
このセンサーは、１９７１年にクレチュマン（Kretschmann）により光励起による表面プラズモン励起法が確立され、それから１１年後になってＳＰＲが初めてナイランダー（Nylander）らによってセンサーとしてガスセンシングに応用された例が報告された。このセンサーは試料の存在によるバルクの屈折率変化を捕らえた単純なものであったが、１９９０年頃までには、試料液中のアルコール濃度等を対象としたこの種のセンサーの開発がさかんに行われた。
【０００５】
１９８０年代後半には、チオール、スルフィド類等の金表面に対する自己吸着の研究が行われ、カルボン酸やアミノ基など様々な官能基をもったアルキルチオール類で金表面を修飾した自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）の研究例が報告された。
１９９３年には、金表面の自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）上に電荷を有するもうひとつの層を形成させた、２層構造の活性部位に抗原-抗体などの特異的な反応を示すリガンドを固定したバイオセンサーが開発され、定性、定量分析や反応プロセスの解明などに用いられるようになった（Stelzle, M., et al., J. Phys. Chem., 97, 2974-2981 (1993)）。
【０００６】
また、この頃から小型化を目的とした光ファイバー型SPRセンサーの研究例が報告され始め、従来の光源の波長を一定にし、試料への共鳴の起こる入射角を測定する方法から、光の入射角を一定にし波長を変化させるセンサー装置が開発された。１９９５年以降は、ＳＰＲセンサーを利用した多くのセンシング例が報告され、特にバイオセンサーの分野でセンサーの高感度化や新規リガンド測定を目的とした数多くの研究例が報告されている。
【０００７】
ＳＰＲ化学センサーの開発において、センシング部の金属薄膜に何らかの修飾を施すことが要求され、ＳＰＲセンサーをバイオセンサーに応用させるには、官能基を有するポリマーの金属薄膜への修飾が考えられる。
金属薄膜に金薄膜を用いる場合、金へのチオール、スルフィド類の自己吸着性（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ）を利用する修飾法が考えられ、実際にＳＰＲバイオセンサーにおけるセンサー表面へのリガンドの固定化にはＡｕ薄膜上に自己吸着したアルカンチオールをリンカーレイヤーとして、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）層を導入しそのＣＭＤ層に固定化する方法が報告されている。ＣＭＤ層の役割は固定するリガンド量の増加、金薄膜への生体分子の非特異的結合防止などである。チオール、スルフィド類の修飾方法は、ＣｌａｉｒｅＥ．Ｊｏｒｄａｎらの論文（Jordan,C.E., et al., Langmuir, 1994, 10,3642-3648）では１ｍＭのチオールのエタノール溶液に１ｈ、金薄膜を浸すだけで９０％の吸着率という簡単なもので、吸着の評価はＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）やＳＰＲ角変化を見ることで可能である。
【０００８】
また、特表平４−５０１６０５号には、金属表面に結合する層の上にヒドロゲルなどの生適合性多孔質マトリックスの層を設けてなる検出表面についての発明が記載されており、特表平４−５０１６０６号には二官能性又は多官能性分子を用いるセンサーユニットについての発明が記載されており、また、特表平４−５０１６０７号にはセンサー表面にリガンドが結合したセンサーを用いる巨大分子の特性の決定方法についての発明が記載されている。特表平７−５０７８６５号には可逆的結合受容体を含む固定化された結合パートナーを含む固体支持体を用いて試料中の関心のある分析対象物を検出する方法及び装置についての発明が記載されている。また、ＷＯ９６／１０１７８には、自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）上に膜形成蛋白質又は脂質を結合させた気質表面の製造方法についての発明が記載されている。
【０００９】
ＳＰＲセンサーは、エバネッセント波を用いて間接的に試料の状態変化を測定するデバイスであるので、測定に使われるレーザー光の通る部位と試料の存在する部位が異なるので、従来の光学センサーと比較して次のような利点がある。
１．センサー表面で起こる試料の屈折率変化がリアルタイムで検出できるので、実験の進行状況および速度論的な関係を知ることができる。
２．測定に使用するレーザー光が試料溶液中を通過しないので、試料溶液の着色、濁りや気泡などの影響を受けにくい。
３．センサー基盤表面から１μｍほどの、ごく狭い領域での光学特性が検出されるので、必要とする試料溶液の量が極めて少なくてすみ、バックグランドノイズの影響を受けにくい。
しかしながら、従来のセンサー表面の処理ではＳＰＲの感度が良好ではなく、また、反応性も充分でなくリアルタイムでの測定には実用的なものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、センサー表面を様々な特性や機能を有する高分子を用いて化学修飾することで、より多くの生体成分を検出できるセンサーデバイスを提供することを目的としている。具体的には、金属薄膜をセンサー基盤として用い、デバイスとして表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance :ＳＰＲ）装置を使用して、抗原-抗体反応を利用した高感度免疫センサーを提供することを目的としている。さらに、糖質結合タンパク（Concanavalin A :ConA)を利用した新規糖質センサーを提供することを目的としている。
また、本発明はこれらの新規なセンサー用の金属薄膜、それを用いたＳＰＲ装置、それを用いた試料の検出、同定又は定量方法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、自由電子金属表面を有する金属薄膜の表面が、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカー、並びに、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマー、で処理されてなる金属薄膜に関する。より詳細には、本発明は、当該ポリマーが、キトサン又はポリエチレンイミンなどのアミノ基を有するポリマーである前記金属薄膜に関する。
【００１２】
また、本発明は、前記ポリマーにさらに、検出用試薬が直接又は検出用試薬に結合し得る官能基を有するスペーサーを介して検出用試薬が結合している金属薄膜に関する。
本発明の金属薄膜は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定用の高感度のセンサー薄膜として有用である。
【００１３】
また、本発明は前記金属薄膜の製造方法、これを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による測定方法、そのためのキット、及び、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定装置に関する。
【００１４】
本発明の金属薄膜の表面は、（１）一方が金属薄膜表面に固定されている有機リンカー層、（２）有機リンカー層に結合するポリマー層、（３）ポリマー層に直接又はスペーサーを介して結合する検出用試薬層からなるものである。
【００１５】
本発明の有機リンカー層は、金属表面に固定され得る官能基とポリマーと結合し得る官能基の間が、炭素原子、酸素原子、及び、窒素原子からなる群から選ばれる原子からなり、直鎖部分が２〜２０原子、好ましくは２〜１５原子、より好ましくは２〜１０原子である直鎖状若しくは分枝状又は環状の化学構造を有するものであればよく、単一の分子種であってもよいが、２種以上の分子種を用いて設計されるものであってもよい。２種以上の分子種を用いる場合には、比較的反応性に富む官能基を使用することができ、短時間で且つ安価に有機リンカー層を形成することがでるので、より好ましい本発明の態様となる。
【００１６】
本発明の有機リンカー層を形成する金属表面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカーの「金属表面に固定され得る官能基」としては、金属表面と化学結合により固定される官能基であってもよいが、吸着により固定され得る官能基であってもよい。このような官能基としてはメルカプト基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原子を含有するものが好ましい。また、「ポリマーと結合し得る官能基」としては、使用するポリマーが含有している官能基に応じて種々の官能基を選択することができる。例えば、ポリマーがアミノ基を含有している場合には、カルボキシル基やカルボニル基などを選択することができるし、ポリマーがカルボキシル基を含有している場合には、アミノ基や水酸基などを選択することができる。
本発明におけるカルボニル基は、アルデヒド基やケト基を包含するものであり、好ましくはアルデヒド基である。
【００１７】
本発明の有機リンカーとして単一の分子種を用いる場合には、例えば、メルカプト基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原子を含有する官能基を有する炭素数２〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜１２の脂肪酸を使用することができる。より具体的には、例えば、１１−メルカプト−ウンデカン酸が挙げられる。
【００１８】
より好ましい本発明の有機リンカーとしては、２種以上の分子種を用いて形成されるものが挙げられる。金属表面に固定される第一の分子種としては、「金属表面に固定され得る官能基」としてメルカプト基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原子を含有する官能基を有し、かつ、第二の分子種と化学結合を形成し得る他の反応性の官能基を有する有機化合物が挙げられる。反応性の官能基としては、第二の分子種と化学結合を形成し得るものであればよく、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。反応性や入手の容易さからメルカプト基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原子を含有する官能基を有するアミノ酸又はその誘導体が好ましく、より具体的にはシステインアルキルエステルが好ましい。アルキルエステルとしては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のアルキルエステルが好ましい。より具体的には、システインメチルエステル、システインエチルエステルなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の有機リンカーを形成する第一の分子種に結合する第二の分子種としては、第一の分子種の反応性の官能基に化学結合し得る官能基を有し、次のポリマー層を形成するポリマーに結合し得る官能基を有する有機化合物であり、これらの官能基としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニル基などが挙げられる。好ましい第二の分子種としては、例えば、反応性に富むカルボニル基を有する化合物が好ましく、より具体的にはグルタルアルデヒドなどが挙げられる。
本発明の有機リンカーを形成する分子種としては、種々の有機化合物の組み合わせが存在するが、好ましい組み合わせとしては、第一の分子種としてシステインメチルエステルを用い、第二の分子種としてグルタルアルデヒドを用いたものが挙げられ、このものは官能基を特別な活性化操作（例えば、カルボキシル基を活性エステルにするなどの。）をすることなく反応が進行するので好ましい本発明の態様とすることができる。
【００２０】
本発明の有機リンカーを金属表面に固定する方法としては、有機リンカーとなる化合物を金属に接触させることにより行うことができる。接触させる前に金属表面を水酸化カリウムなどのアルカリで洗浄しておくことが好ましい。金属表面との接触は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒や水などの存在下に行うのが好ましい。
次いで、必要に応じて第二の分子種を反応させることにより、有機リンカー層を形成することができる。この場合に必要に応じて、反応に関与する官能基を活性化してから行うこともできる。
【００２１】
本発明のポリマー層を形成するポリマーとしては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニル基などの有機リンカー中の「ポリマーに結合し得る官能基」と結合し得る反応性の官能基を有し、かつ、検出用試薬又は検出用試薬を結合するためのスペーサーを結合し得る官能基を有するポリマーである。これらのポリマー中の「反応性の官能基」と「検出用試薬などに結合し得る官能基」とは異なる官能基であってもよいが、同種じ官能基であってもよい。好ましい官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニル基などが挙げられる。
有機リンカー中の「ポリマーに結合し得る官能基」がアルデヒド基などのカルボニル基の場合には、第一級アミノ基を有するポリマーが好ましい。ポリマー中の第一級アミノ基は、ポリマーの主鎖に結合するものであってもよいが、ポリマーの側鎖に結合するものが好ましい。
【００２２】
本発明のポリマーを例示すれば、ポリアルキレンイミンや多糖類、ポリリジンなどが挙げられるが、ポリ低級アルキレンイミンやアミノ糖を含有する多糖類が好ましい。
ポリアルキレンイミンはアルキレンジアミンの重合体が挙げられ、側鎖部分に第一級アミノ基が存在している重合体が好ましいが、重合後に化学修飾により側鎖部分に第一級アミノ基を導入したものであってもよい。アルキレンジアミンとしては、炭素数２〜１０、好ましくは２〜６のアルキレン基を有するジアミンであり、好ましくはエチレンジアミンが挙げられる。好ましいアルキレンジアミンの重合体としては、例えば、次式で示される繰り返し単位を有するポリエチレンイミンが挙げられる。
【００２３】
【化１】
0003657790.tif 000002
【００２４】
多糖類としては、アミノ糖を含有する多糖類が好ましく、アミノ糖が重合したものでも、アミノ糖が部分的に導入されているものでもよいが、キトサンのようにアミノ糖が重合した多糖類が好ましい。たま、多糖類にアミノ基などの反応性の官能基を導入したものであってもよい。
これらのポリマーの分子量は、ポリマーの種類によっても異なるが、一般的には、１，０００〜１，０００，０００、好ましくは５，０００〜１，０００，０００、より好ましくは５，０００〜５００，０００程度である。
【００２５】
有機リンカーとポリマーとを結合させる方法としては、これらを溶媒の存在下に直接反応させることもできるが、反応性が充分でない場合にはこれらの官能基を活性化、例えば、活性エステル化などにより活性化させて、反応させることもできる。
原料物質として、システインメチルエステル、グルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンを用いた場合の本発明の金属薄膜の処理法を、図１に示す。金属薄膜を温めた水酸化カリウム水溶液に数回つけることで洗浄した後、Ｌ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に浸すことにより図１の（１）の状態とし、これを、グルタルアルデヒド水溶液で処理して図１の（２）の状態にし、これにポリエチレンイミン水溶液を浸して図１の（３）のポリエチレンイミン膜を有するセンサープローブとすることができた。
【００２６】
また、原料として、システインメチルエステル、グルタルアルデヒド及びキトサンを用いた場合の本発明の金属薄膜の処理法を、図２に示す。図２では、さらに、スペーサーとしてα−ブロム酢酸が使用されている。
図１に示した方法と同様な方法により、金属薄膜を洗浄した後、Ｌ−システインメチルエステルＤＭＦ溶液及びグルタルアルデヒド水溶液で処理して有機リンカー部分を調製し、これに１％キトサン水溶液を接触させることによりキトサンを固定化してセンサープローブを調製した。次いで、キトサンをα−ブロム酢酸の水酸化ナトリウム溶液でカルボキシル化して、カルボキシメチル（スペーサー部分）化されたＣＭ−キトサンセンサープローブを調製した。
【００２７】
本発明の検出用試薬としては、試料中の特定の物質を検出、同定又は定量することができる試薬であって、前記ポリマーに吸着又は結合などにより固定できるものでれば特に制限はないが、カルボキシル基やアミノ基などの官能基を有するものが好ましい。好ましい検出用試薬として、蛋白質が挙げられる。より詳細には、抗原又は抗体が挙げられる。
本発明の検出用試薬を直接前記したポリマー層に固定することもできるが、固定するに当たって必要に応じてスペーサーとなる物質を用いて両者を固定することもできる。スペーサーとしては、多官能性の種々の物質を使用することができる。比較的長鎖の物質を使用することもできるが、炭素数が２〜１５、好ましくは２〜１０程度の短いものが好ましい。スペーサーとして使用される化合物としては、例えば、α−ブロム酢酸、α−クロル酢酸などのハロカルボン酸、グルタル酸、アジピン酸、スベリン酸などのジカルボン酸などが挙げられる。
【００２８】
図３に、図１に示したポリエチレンイミン膜を有する金属薄膜にスペーサーとしてスベリン酸を用い、活性エステル化法により検出用試薬（図３中ではリガンドとして示されている。）を固定する方法を示す。
図４に、図２に示したＣＭ−キトサンセンサープローブに検出用試薬（図４中ではリガンドとして示されている。）を固定する方法を示す。図４中のＥＤＣは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを示し、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシサクシンイミドを示す。
【００２９】
本発明の金属薄膜に使用される金属としては、自由電子を有する金属であればよく、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、クロムなどが挙げられる。好ましい金属は、金であるが、銀、銅、アルミニウなども好ましい金属である。金属薄膜は金属を延ばして製造されるものであってもよく、また、基板に蒸着などの方法で形成されるものであってもよい。金属薄膜の厚さは、測定可能な厚さであれば特に制限はないが、５０〜１，０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜５００ｎｍ程度である。
【００３０】
表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance :ＳＰＲ）装置に本発明の金属薄膜を使用する場合には、プリズムなどの基板に本発明の金属薄膜が密着されて使用される。
図５に本発明の金属薄膜の調製法と、表面プラズモン共鳴装置の概要を示す。図５に示されるように本発明の金属薄膜を調製法としては、バッチ法とオールフローインジェクト法（ＡＦＩ法）がある。バッチ法は、有機リンカー層、ポリマー層、検出用試薬などを形成させるための必要な物質（図５中ではＡ液、Ｂ液、Ｃ液として示されている。）で金属薄膜を処理して、処理された金属薄膜（センサープローブ）を調製した後、これをＳＰＲ装置にセットして試料を添加して測定する方法である。
【００３１】
また、ＡＦＩ法は、ＳＰＲ装置にセットされた金属薄膜に順次、処理溶液を金属薄膜に流すことにより、セットされた金属薄膜を所望の状態に処理するものである。より詳細には、図５に示されるように、ＨＰＬＣ用のポンプなどのポンプにより常時緩衝液など（例えば、ランニングバァファー（ｐＨ７．４  １０ｍＭＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）／Ｔｕｅｅｎ））を、流速が０．１〜１．０、好ましくは０．２〜０．４ｍｌ／ｍｉｎで流しておき、必要な時に各反応試薬を含有する溶液をインジェクターから注入することで、金属薄膜（センサープローブ）に供給させることにより必要な処理を行うことができる。そして、この間測定を継続することも可能であり、金属薄膜の測定面の反対側で生起している反応を、反応系に直接光やマイクロ波などの測定線を照射することなく反応系を測定することができる。
【００３２】
ＡＦＩ法は、測定を継続しつつ金属薄膜の表面を処理することができるので、表面の状態をリアルタイムで把握することができる。また、金属薄膜の表面に固定された検出用試薬と試料中の物質との相互の動向（化学反応などの）を逐次測定し観察することができる。
本発明はバッチ法及びＡＦＩ法のいずれの方法をも包含するものである。
【００３３】
材料に目的とする性能、機能を付与するためには材料表面を分子レベルで設計し機能特性をもたせることが重要となってくる。そのため、今日の臨床化学分野における抗原-抗体反応や、セルレセプター認識を用いた生体物質のセンシングにおいてそのセンサー材料表面及び、生体物質間の相互作用を含めた反応プロセスの理解は大切な課題となっている。
【００３４】
本発明では、様々な官能基を有する高分子を用いてセンサー表面を構築することで、幅広い物質の固定化、検出に利用できるセンサープローブを構築することを目的とした。具体的には、金薄膜をセンサー基盤として用い、デバイスとして表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance :ＳＰＲ)装置を使用して、センサー表面の設計を行った。
【００３５】
より具体的には、抗原-抗体反応を利用した高感度免疫センサーを開発するために、タンパク質を固定化するに当たって、金表面を修飾する膜として、異なる官能基を有する高分子であるポリエチレンイミン（polyethyleneimine(PEI)）、及びキトサン（chitosan）に着目した。ＰＥＩ膜は膜中に存在する一級アミンを、キトサン膜はカルボキシル基を活性化させて、タンパク質中のアミノ基とバインディングサイトを持たせ、そこに抗原を化学結合させてセンサ−膜を作製した。  本発明では、この作製方法として、従来から行われているバッチ法の他に、すべての試薬をフロ−系に導入して固定化するオ−ルフロ−型固定化法も開発した。作製したセンサ−膜に、抗体が特異的に結合した際のＳＰＲアングルシフトによりその定量を行った。
【００３６】
また、糖質結合タンパク（Concanavalin A :ConA)を利用した新規糖質センサーの開発においては、まず、糖質としてグルコースを測定対象とした。ＣｏｎＡの特性として、ｐＨ７付近でグルコースとの４つのバインディングサイトを持っているためグルコースに対する吸着性は高い。しかし、あらかじめＣｏｎＡとグルコースを混合し、バインディングサイトがいくつかグルコースと結合したものを作用させると、その選択的吸着性は低下し、この変化は、ＣｏｎＡの濃度を一定とすれば、混合するグルコース濃度に対応してくると考えた。この特性を利用し、Ａｕ表面をグルコースユニットで修飾してやることで、そこに吸着するＣｏｎＡの濃度から逆にグルコース濃度の測定を行った。
【００３７】
本発明の方法は、特にポリマー層に直接又はスペーサーを介して固定された抗原又は抗体と、試料中の抗体又は抗原との反応を測定するのに有利な方法でである。
例えば、抗体タンパク質を多量に固定化し、高感度に検出するため、金属表面を修飾する膜材としては、異なる官能基を有する高分子であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びカルボキシメチル化キトサン（ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）が特に好ましい。ＰＥＩは膜中に存在する一級アミンを、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎはカルボキシル基を活性化し、抗体と特異的に反応するリガンドを化学結合させてセンサ−プローブ表面を構築した。
【００３８】
本発明ではこれらの表面を作製する際、従来から行われているバッチ法に加え、すべての試薬をフロ−系に導入して固定化するオ−ルフロ−インジェクト（ＡＦＩ）法も検討した。作製したセンサ−プローブを利用して、具体的には、プロテインＡ−ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）、抗ヒト免疫グロブリンＧ（ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ）−ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）系におけるＳＰＲ応答を検討した。
【００３９】
今回の実験に使用したＳＰＲセンサー（ＤＫＫ製）は、図５に示すフロースルーのシステムが実行できるものである。
ＡＦＩ法により実験を行う場合には、ＨＰＬＣ用のポンプによって常時ランニングバァファー（ｐＨ７．４  １０ｍＭＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）／Ｔｕｅｅｎ）を流速０．２〜０．４ｍｌ／ｍｉｎで流しておき、各試料溶液をインジェクターから注入することで、ＳＰＲ装置中のセンサープローブと接触させ、そのデータをコンピューターによって出力している。
【００４０】
次に本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。本発明のより具体的な説明において使用する略号を、以下にまとめて示しておく。
【００４１】
化合物
ＢＳＡ；ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin）。
ＢＳ３；スベリン酸ビス（スルホサクシンイミドイル）（Bis(sulfosuccinimi          dyl) suberate。
ＣＡＰ；セルロースアセテートフタレート（Cellulose acetate phtalate）。
ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ；カルボキシメチルキトサン（Carboxymeyhylated                          chitosan）。
ＥＤＣ；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  （1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide）。
ＨＢＳ；ＨＥＰＥＳ緩衝液（HEPES Buffer Saline）。
ｈＩｇＧ；ヒト免疫グロブリンＧ（human immunoglobulin G）。
ＮＨＳ；Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）。
ＰＥＩ；ポリエチレンイミン（Polyethylene imine）。
【００４２】
溶媒
ＡｃＯＨ  ；酢酸（Acetic Acid ）。
ＤＭＦ；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-Dimethylformamide）。
ＥｔＯＨ；エタノール（Ethanol）。
ｉ−ＰｒＯＨ；イソプロパノール（Isopropanol）。
【００４３】
まず、金薄膜を７０℃ほどに温めた１ＭＫＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭ  Ｌ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に、２４時間浸すことにより、図１の（１）の状態とした。これを、５％グルタルアルデヒド水溶液で２時間処理して図１の（２）の状態とし、次いで２％ＰＥＩ水溶液に２時間浸し図１の（３）で示されるのＰＥＩ膜センサープローブを得た。
【００４４】
このようにして調製されたセンサープローブの有機リンカー部分の表面構造は、一部のグタルアルデヒドが２分子のシステインのアミノ基と結合して２個のアルデヒド基を消費した状態のものなどがあり、分子が金属表面に規則正しく整列している自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）の状態とは異なる状態を形成しているものと考えられる。詳細な金属表面の状態はＸＰＳなどの表面分析を利用しその厚さを測定することにより把握することができるであろう。
【００４５】
次に、作製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーによるベースラインが安定した後、膜中に存在する未反応のグルタルアルデヒドを０．１Ｍ  グリシン溶液をインジェクトすることでブロックした。この後、ＰＥＩ膜中の一級アミンをスペーサーであるＢＳ３で活性化させ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを固定化した時の結果を図６に示し、次いで、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを添加した時の結果を図７に示す。
【００４６】
図６及び図７は、ＳＰＲの測定結果であり、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス（アーク秒（１度は３６００アーク秒））を示す。
図６中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点でのレスポンスΔθは６０４アーク秒であった。
図７中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、（３）は０．１ｍｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示している。ｈＩｇＧを添加した時点でのレスポンスΔθは１５０アーク秒であった。
【００４７】
次に、オールフロ−インジェクト法（ＡＦＩ法）による金属薄膜の処理を検討した。
金薄膜を洗浄した後、直接ＳＰＲ装置にセットし、そこからすべての試薬をフロ−系に導入して固定化した。即ち、１０ｍＭＬ−システインの水：エタノール１：４溶液、１０％グルタルアルデヒド水溶液、１％ＰＥＩ水溶液を順にインジェクトしてＰＥＩ膜プローブを作製し、ＢＳＡを固定化した。結果を図８及び図９に示す。
図８中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）は１０ｍＭＬ−システインを添加した時点を、（３）は１０％グルタルアルデヒドを添加した時点を、（４）は１％ＰＥＩを添加した時点をそれぞれ示している。
【００４８】
図９中の、（ａ）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（ｂ）は１ｍＭのＢＳ３を添加した時点を、（ｃ）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（ｄ）はグリシンｐＨ３を添加した時点を、（ｅ）はｐＨ８．５で０．１Ｍのエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ示している。（ｄ）のグリシンを添加した時点でのレスポンスΔθは静電的相互作用に起因するもので３３４アーク秒であり、共有結合による相互作用に起因するものが１１３０アーク秒であった。
【００４９】
次に、ＰＥＩ膜センサープローブ表面への非特異的吸着の抑制について検討した。センサーを作製する際、体液中に存在する多種のタンパク質のセンサー膜表面への非特異的吸着は、検出感度やその選択性を低下させる主な原因として指摘されている。前記した実験においても、ＰＥＩ膜表面にＢＳＡを接触させた時、全吸着量の内の１／４から１／３程度の非特異的吸着（グリシン／塩酸ｐＨ３．０を接触させた時に脱離した分）が見られた。これは、膜中に多数残存するアミンがプロトン化することで持つプラスチャージによるＢＳＡとの静電的相互作用が主な原因であると考えられる。
【００５０】
そこで、タンパク質をＰＥＩ膜プローブに固定化する際、ｐＨ７．４  ＨＢＳＴ／バッファーの代わりにｐＨ５．３酢酸バッファーを使用し反応時のｐＨを変化させた時の結果を図１０に示す。
図１０中の、（１）はｐＨ５．３酢酸バッファーを添加した時点を、（２）はスペーサーのＢＳ３を１ｍＭ添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加した時点をそれぞれ示している。グリシンを添加した時点でのレスポンスΔθはそれぞれ８６０及び６２０アーク秒であった。
【００５１】
また、ｐＨ７．４バッファーで、ＢＳ３をスペーサーとして用いずに、膜中のアミノ基を１００ｍＭグリオキル酸（Ｇｌｙｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ）と反応させカルボキシル化し、膜全体のチャージバランスをとり、これを０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液で活性化した後、ＢＳＡを固定化した際の結果を図１１に示す。
図１１中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳバッファーを添加した時点を、（２）は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは１２１１アーク秒であり、グリシンを添加した時点のレスポンスΔθは６７３アーク秒であった。
【００５２】
この結果、反応時のｐＨやセンサープローブ表面のチャージバランスを変えることにより、ＢＳＡの非特異的吸着を減少させることはできなかった。
ＢＳＡなどのタンパク質は、全体としてプラスかマイナスのどちらかの電荷をもっていることが多いが、各分子内にはプラスチャージとマイナスチャージの両方の部位をもっているため、ｐＨの変化や全体としてプローブ表面のチャージのバランスをとってみても、タンパク質分子中の各部位すべてを膜表面に吸着しにくい状態にするのは困難である。タンパク質の種類により、非特異的な吸着を防ぐ最適なｐＨ、及びチャージ状態は決まってくるのであろうが、血清中など多種のタンパク質が存在する中でＰＥＩ膜免疫センサープローブとして測定する際、ｐＨやチャージバランスを変えての測定は全く意味を持たない。
【００５３】
そこで、チャージを持つ膜中の未反応のアミノ基どうしを、グルタルアルデヒドで架橋することで不活性にしてチャージを抑制すると共に、残ったアルデヒド基による活性部位の増加を考えた。このプローブの活性化部位に検出する抗体と特異的に反応するリガンドを固定化し、これをＰＥＩ膜センサープローブとした。この反応を模式化して図１２に示す。
【００５４】
以上の実験から、ＰＥＩ膜センサープローブの基礎特性として次のように考えられる。アミノ基を持つリガンドの固定化が行えたことから、ＰＥＩ膜センサ−プローブの作製が従来から行われているバッチ法に加えて、すべての試薬をフロ−系に導入して作製するオ−ルフロ−インジェクト（ＡＦＩ）法でも行えることが確認できた。
フロー系による試料と表面との接触時間は１０分程度であるので、図１に示す反応はすべてがこの時間内で進行することがわかった。ＡＦＩ法は、これまでに確立されている作製に数十時間かかる他のセンサープローブと比較し、簡便、迅速なプローブの作製方法として有用な方法と考えられる。
バッチにより作製したＰＥＩ膜プローブとフローによるプローブのＢＳＡの固定化量を比較すると(図６及び図８、図９）、フロー系の方が２．８倍大きなレスポンスとして検出されている。しかし、ＢＳＡ固定化のための活性剤であるＢＳ３の応答は、フロー系の方が小さくなっており、ＢＳＡの固定化量と逆になっている。作成した２つのプローブの表面構造に何らかの違いがあることに起因していると考えられる。
【００５５】
また、問題となるＰＥＩ膜表面へのタンパク質の非特異的吸着量を小さくするため、可能なかぎり高い濃度のＢＳ３およびＥＤＣ／ＮＨＳを接触させて、膜中の官能基を活性化させることや、余ったアミノ基を十分にブロックしていく必要がある。タンパク質の吸着の少ない物質として知られている、エーテル結合を多く含んだエチレングリコールユニットを持つ試薬を膜表面の設計の際に導入することも１つの方法として考えられる。
【００５６】
次に、センサープローブのアプリケーションとして、ＰＥＩ膜中のバインディングサイトに抗ｈＩｇＧおよびｐｒｏｔｅｉｎＡを結合させ、これらに高い特異性と強い結合力をもつ人間の免疫グロブリン抗体、ｈＩｇＧを濃度を変化させて接触させたときのレスポンスをそれぞれ測定し、ｈＩｇＧの定量を行った。
また、ｐｒｏｔｅｉｎＡとの弱い結合性をもつマウス−ＩｇＧ、全く結合性を示さないチキンＩｇＧ（ｃｈｉｃｋｅｎ−ＩｇＧ）を接触させることでプローブ表面へのタンパク質の非特異吸着量について検討した。測定に用いた８種類のプローブを図１３にまとめる。
【００５７】
まず図１３のＮｏ．８のプローブを用いて測定を行った時のｈＩｇＧ検出のリアルタイムプロットを図１４に示した。
図１４中の、（１）はＨＢＳ／ＮＨＳバッファーを添加した時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は２００μｇ／ｍｌの抗ｈＩｇＧを添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点を、（５）はグリシンを添加した時点を、（６）は０．１ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点を、（７）は１．０ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点をそれぞれ示している。
【００５８】
バッファーが定流している状態でＥＤＣ／ＮＨＳをインジェクトして（図１４の（２）の時点）、膜中のカルボキシル基を活性化し、抗ｈＩｇＧを接触させたところ、ＳＰＲアングルシフトで、２１００ａｒｃｓｅｃｏｎｄほどの固定化量がみられた。図１４の（４）、（５）の時点で、ｐＨ８．５エタノールアミン、ｐＨ３．０グリシン溶液により、チャージで吸着している抗ｈＩｇＧを脱離させると共に、残った膜中の活性化部位をブロックした。ここまでで、ｈＩｇＧ測定のためのセンサープローブの作製が完了し、ｈＩｇＧを濃度を変化させて膜に接触させ、得られるレスポンスを検出した。まず、０．１μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧをインジェクトした結果、ほとんど検出されなかったので、塩酸を流して膜の状態を戻し、１０倍の濃度の１μｇ／ｍｌを接触させたところ、２８８ａｒｃ  ｓｅｃｏｎｄのレスポンスが検出された。その後、６０、１６０、再び６０μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを順にインジェクトした結果、それぞれの濃度に対応したレスポンスを得ることができた（図１５参照）。
【００５９】
それぞれのプローブごとに得られたデータに基づき検量線を作成し、活性化方法による違い（図１３のＮｏ．２−Ｎｏ．６、Ｎｏ．４−Ｎｏ．８）、および作製方法による違い（図１３のＮｏ．５−Ｎｏ．６、Ｎｏ．７−Ｎｏ．８）について検討を行った（図１６及び図１７参照）。図１６中の左側はＢＳ３で活性化したバッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したバッチ法によるものであり、黒三角印及び白四角印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、黒丸印及びバツ印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。図１７中の左側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したバッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したＡＦＩ法のよるものであり、白四角印及び白丸印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、バツ印及び白菱形印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。
また、非特異抗体の吸着量についてもＮｏ．１、５、６チップを比較することで検討した（図１８参照）。図１８中のグレーの棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌである。
ＰＥＩ膜中のアミノ基をＢＳ３を用いて活性化した結果と、グリオキシル酸でカルボキシル基にし、膜表面全体のチャ−ジバランスをとり、これをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した場合について図１６で比較検討した。
【００６０】
その結果、プロテインＡ−ｈＩｇＧ系において、カルボキシル基を導入した表面の方が得られる検量線の直線性が高いうえに、検出感度も増加することがわかった。これは、図１８の非特異抗体の吸着量をみても、プロ−ブＮｏ．５のＥＤＣ／ＮＨＳ活性の方が、Ｎｏ．１のＢＳ３活性と比較してマウス（Ｍｏｕｓｅ）、チキン（Ｃｈｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧともに、ｈＩｇＧの量と相対的にみて吸着量がおさえられ、検出精度が高くなった結果とも一致している。
前記したＢＳＡの固定化の実験においては、ＰＥＩにカルボン酸を導入することでＢＳＡの非特異的吸着量は増加したが、今回の抗原−抗体反応においては、等電点などタンパク質の複雑な構造の違いにより、マウス（Ｍｏｕｓｅ）、チキン（Ｃｈｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧの膜への非特異吸着は膜にマイナスのチャージを導入することで防げることがわかった。
【００６１】
図１７で、このカルボン酸を導入した系についてＡＦＩ法、バッチ法と分けて検量線を作製した。その結果、フロー系で作製したプローブについても、バッチ法と同等の検出感度、直線性を得られた。また、図１８に示す様に、ＡＦＩ法で作製したＰＥＩ膜はバッチ法と比較して非特異的吸着が減少した。これはチップ表面の膜構造（アミノ基の配向性など）に何らかの違いがあるためだとおもわれる（図１９参照）。例えば、１９図に示されるように吸着ホモポリマー型や、投錨型ポリマー（cerminally-anchored）型などが考えられる。ＡＦＩ法による金属、特に金基盤表面へのタンパク質の固定化はこれまでに報告例がなく、簡便、迅速かつ再現性のよいセンサープローブの作製法として有用な方法であると考えられる。
これらの結果より、タンパク質の非特異的吸着の少ない膜表面の設計には膜表面の電荷の制御が1つの重要なファクターであることがわかり、膜材や作製方法をさらに検討することで、検出特性や検出能はさらに改善される。
【００６２】
また、タンパク質は一般に高分子表面に接触すると徐々に接点を増やし、そのコンフォメーションを変化させることが有り、自然な状態の性質が損なわれる。さらに、その活性サイトが表面との接点になっていたり、立体的に障害されるように配置されても活性を落としてしまう。リガンド固定化の際にその配向性を制御していくことも、検出精度の増加につながる。
【００６３】
次に、アミノ糖を含有するポリマーを膜に使用することについて検討した。
キチン（chitin）はポリアミノ糖であり、キトサン（chitosan）はキチンのアセチル基が部分的に加水分解されたもので、Ｄ−グルコースアミンのβ−（１，４）−重合体である。
chitin、chitosanは甲殻類、昆虫類の組織支持体であるため、生体との親和性がよく、酵素によって生体内で分解される。このことを利用して、医療材料として吸収性縫合糸や人工皮膚などに用いられている。また、免疫活性を有すること、タンパク質などの体液中成分の吸着が少ないことからドラッグデリバリーシステムの担体としても利用されている。さらにchitosanの誘導体は、アシル基の長さにより光学異性体の選択的吸着性があるので、ＨＰＬＣでラセミ混合物の分離に用いられている。
【００６４】
本発明では、キトサンの高い生体適合性と、ＰＥＩ膜センサープローブで問題となったタンパク質の非特異的吸着のない性質を利用して、キトサン膜免疫センサープローブの作製を試みた。
まず、ＰＥＩの時と同様に、金薄膜を７０℃ほどに温めた１Ｍ、ＫＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭ  Ｌ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に２４時間浸した後、これを５％グルタルアルデヒド水溶液に２時間浸けた。これに１％キトサン水溶液を２４時間接触させることでキトサンを固定化した。次に、キトサン中のＯＨ基を２ＭのＢｒＣＨ２ＣＯＯＨ／１Ｍ ＮａＯＨ溶液に１２時間浸すことでカルボキシル化し、カルボキシメチル化キトサン（ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）センサープローブを作製した（図２参照）。
【００６５】
ＰＥＩ膜プローブによる測定と同様に、作製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーによるベースラインが安定した後、膜中の−ＣＯＯＨ基を、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液をインジェクトして活性化した後、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを固定化した時の結果を図２０に示す。
図２０中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは１５０アーク秒であった。
【００６６】
キトサン膜にＢｒＣＨ２ＣＯＯＨを浸すことで膜中の−ＯＨ基を−ＣＯＯＨ基にし、これを活性化した後、ＢＳＡを固定化したところ、図２０に示すように１５０アーク秒のレスポンスが得られた。その際、ＢＳＡの固定化量はＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜プローブ中に存在するＣＯＯＨ基の量に依存すると考えられる。そこで、キトサンをカルボキシル化する際に、バッチ法によりプローブ表面で行うものから、あらかじめカルボキシル化率の高いＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを合成し、これを表面に固定化することでリガンドの固定化量増加を試みた。
【００６７】
キトサン１．０ｇ、ラウリルスルホン酸ナトリウム０．１ｇを４５％ＮａＯＨ水溶液７０ｍｌ中にゆっくり加え、４℃に保ちながら溶解するまで１時間ほど攪拌した。これを−２０℃で、１２時間ほど放冷した後、ｉ−ＰｒＯＨ１２５ｍｌ、ＣｌＣＨ２ＣＯＯＨ２８．４ｇを加えて７２時間反応させた。続いて、２ＭＨＣｌを加えていき、白色の結晶を９．８７２７ｇ得た。
次に、この結晶０．５ｇを１０％ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌに溶解させた後、４ＭＨＣｌをｐＨ１になるまで加えた。これに、大量のアセトンを加えることで結晶を析出させ、吸引ろ過により０．７ｇのＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを得た。
【００６８】
前記の方法で合成したＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを前と前記したスキームと同様な方法でセンサープローブに固定化しカルボキシル基を活性化したが、この系ではＢＳＡを固定化することはできなかった。スキーム中に反応のいかないステップがあると考えられる。グルタルアルデヒドの固定化までは反応が進むことがわかっているので、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎをモノレイヤ−に固定化する反応がネックになっていると予想された。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを合成する際、糖のアミノ基もカルボキシル化されるため、ポリマー中の−ＮＨ２基の量が少なくなっていること、−ＮＨ２基がポリマーの主鎖に直接ついているため自由度がなく、反応性が低いことが原因になっていると思われる。そこで、別の反応径路に変えてキトサン膜センサ−プローブの作製を行った。
【００６９】
金薄膜を洗浄した後、１０−３ＭのＨＳ−Ｃ１０Ｈ２０ＣＯＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に２時間、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳの１：１混合溶液に４０分浸した後、先程の２％ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ水溶液に２時間つけることで、ｃｈｉｔｏｓａｎ膜センサープローブＩＩの作製を行った。このプローブを用いて、膜中の−ＣＯＯＨ基を、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液で活性化し、２００μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを固定化した後、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡの膜への吸着を測定した結果を図２１に示す。
図２１中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点を、（５）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは７２０アーク秒であった。
【００７０】
反応系を変えることで、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを基盤に固定化することができた。キトサンの性質から、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜プローブではＰＥＩ膜にみられたタンパク質（ＢＳＡ）の膜への非特異的吸着は、ほとんどみられなかった。それを確かめるため、プローブにキトサンおよびＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを固定化し、それらを活性化しないでＢＳＡを接触させた時の様子を図２２及び図２３に示す。
図２２中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）を添加した時点を、（３）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加下時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは５０アーク秒であった。
図２３中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは１００アーク秒であった。
【００７１】
キトサンはその性質のとおり非特異吸着はほとんどみられなかったが、その誘導体であるＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎも、膜中に多量のカルボキシル基が存在しているにも関わらず、５００ｕｇ／ｍｌというかなり高濃度のＢＳＡを接触させた時のレスポンスは１００アーク秒と非常に小さな値となった。これによりＰＥＩ膜プローブ作製課程で行ったプローブ表面の電荷のブッロクはＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜では必要ないことが確認できた。
【００７２】
次に、ＰＥＩと同様にＡＦＩ法によるキトサン膜センサープローブの調製を行った。ＰＥＩ膜センサープローブの時と同様に金薄膜をＳＰＲ装置にセットし、そこからすべての試薬をフロ−系に導入して固定化するオ−ルフロ−系固定化法を試みた。結果を図２４に示す。
図２４中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はモノレイヤーのエタノール溶液を添加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳの０．２Ｍ／０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１％ＣＭ−キトサンを添加した時点を、（５）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθが観測された。
【００７３】
ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜センサ−プローブの作製をフロ−系で試みた結果、フローで行った系でもＢＳＡを固定化することができたが、そのレスポンスわ僅かであった。これは、フロ−系での各試薬と膜表面との接触時間が約１０分であることから、時間的に反応が充分ではないステップがあると考えられる。フロ−でのＰＥＩ膜の作製が行えることから、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎをモノレイヤ−に固定化する反応がネックになっていると予想され、これはおそらく問題となった固定化部位であるＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ中の−ＮＨ２基がポリマーの主鎖に直接ついているため自由度がなく、反応性が低いことが原因になっていると考えられる。ポリマーの主鎖ではなく、側鎖に自由度の大きなアミノ基などの官能基を有するようにポリマーを修飾することにより、より反応性のあるポリマーとすることができると考えられる。
【００７４】
これまでの実験結果より、合成したCM-chitosanを基盤に固定化したセンサープローブの作製がバッチ法で行え、アミノ基を持つリガンドの検出がＳＰＲシグナルとして確認できた。その際、ＰＥＩ膜プローブにみられたタンパク質（ＢＳＡ）の膜への非特異的吸着は、ほとんどみられなかった。
このプローブのＡＦＩ法へ適用することもできるが、−ＮＨ２基がポリマーの主鎖に直接ついているため自由度がなく、反応性が低いことが原因となって、バッチほうに比べて充分な反応性がみられないことがある。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ合成にもう１ステップ加えて、アミノ基に親水性の高いスぺーサーを導入し、モノレイヤーとの結合部位の自由度を高めることによっても、この問題は解決できると考えられる。
【００７５】
また、CM-chitosanの水溶性が低いことも、プローブを作製するうえで問題点のひとつになっている。一般にキトサンは数十万の分子量をもっており、これが小さくなるにつれて水溶性が増していくことがわかっている。分子量の小さいキトサンを使用して、CM-chitosanを合成することで、基盤に固定化されやすくなると予想される。その時の反応条件として酸性度が高すぎると、アミノ基の求核性がプロトン化することで失われ反応が進まなくなるので、中性よりやや塩基性側で反応を行うのが適当だと考えられる。
【００７６】
さらに、本発明は抗原-抗体反応を利用した高感度免疫センサーを提供する。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎセンサープローブのアプリケーションとして、ＰＥＩ膜と比較するためバインディングサイトにプロテインＡを結合させ、これらに高い特異性と強い結合力をもつ人間の免疫グロブリン抗体、ｈＩｇＧを濃度を変化させて接触させたときのレスポンスをそれぞれ測定し、ｈＩｇＧの定量を行った。Ｎｏ．５、６のＰＥＩ膜プローブの結果と合わせた検量線を図２５に示す。図２５中の丸印はＰＥＩ膜プローブを用いたＡＦＩ法によるものであり、四角印はＰＥＩ膜プローブを用いたバッチ法によるものであり、三角印はＣＭ−キトサン膜プローブを用いたバッチ法によるものである。
【００７７】
また同様に、プロテインＡとの弱い結合性をもつマウス−ＩｇＧ、全く結合性を示さないチキン（ｃｈｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧを接触させることでプローブ表面へのタンパク質の非特異吸着量について検討し、ＰＥＩ及び市販品であるＣＭＤ膜プローブと比較したデータを図２６に示す。図２６中のグレーの棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌである。
【００７８】
ＰＥＩ膜と比較し応答感度は１／４程度に低下したが、この膜は以前に考察したように非特異的抗体の吸着が全くみられず、市販品であるＣＭＤ膜プローブと比較しても、高い検出精度を得ることができた。
これまでに、オリゴエチレンモノレイヤーで表面を被服されたプローブは、タンパク質の非特異的な吸着を抑制することが報告されており、同様な傾向がＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ、ＣＭＤ膜プローブでもみられた。
【００７９】
これまでは、タンパク質の吸着性を電荷と親疎水性の点から論じてきたが、この特異的性質を表面付近の水と膜の相互作用という観点から考えてみたい。
水は生命に不可欠な溶媒としての重要性から、また４℃付近で最も密度が高くなり、他の液体に比べて著しく大きな比熱を持つといった特異的性質のため、古くから非常によく研究されてきた。
この水の性質は、分子同士が互いに水素結合することにより形づくられる「構造」に由来するが、その構造に関しては未解決の問題が多く残されている。また、タンパク質や高分子をはじめとする水溶性高分子が、水との相互作用によってその構造や性質、機能に大きく影響を受けることや、逆に高分子の水和水や高分子ゲル中の水が、運動性、凍結−融解挙動等の性質においてバルク水と異なることが知られている。
一般に、高分子表面の水は、自由水とポリマーに束縛された水に分類することができ、束縛の強さによって、ポリマー表面に形成される水和層の状態が異なってくる。この表面水和層の状態が、タンパク質の表面への吸着性を決定する要因の１つであるといわれている。
【００８０】
ポリエチレングリコール、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ、ＣＭＤの化学構造に共通する点として、いずれもエーテル結合を分子内部に持っており、この部位により膜表面に形成される水和層が、タンパク質の非特異的な吸着を抑制するのではないかと予想される。
【００８１】
本発明は、ＰＥＩ膜センサープローブの作製法として従来のバッチ法に加え、オールフローインジェクト（ＡＦＩ）法を提供したものであり、ＡＦＩ法で作製したＰＥＩ膜は、バッチ法と同等の高い応答感度が得られ、非特異抗体の吸着量も小さかった。また、タンパク質の非特異的吸着の少ない膜表面の設計には膜表面の電荷の制御が１つの重要なファクターであることがわかり、膜材や作製方法をさらに検討することで、検出特性や検出能はさらに改善されると考えられる。さらに、ＡＦＩ法で作製したＰＥＩ膜は、バッチ法と比較して非特異的吸着が少ないうえ、検出精度も高くなることがわかった。これはプローブ表面の膜構造（アミノ基の配向性など）に何らかの違いがあるためだとおもわれる。ＡＦＩ法による、金属表面へのタンパク質の固定化はこれまでに報告例がなく、簡便、迅速かつ再現性のよいセンサープローブの作製法として有用な方法と考えられる。
【００８２】
本発明のＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜に基づくセンサープローブの検討では、ＡＦＩ法及びバッチ法による作製を行い、プロテインＡを固定化してｈＩｇＧを検出した。その結果、ＰＥＩ膜の場合と比較して応答感度は１／４程度に低下したが、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜は非特異的吸着が全くみられなかった。
これらの結果より、タンパク質の非特異的吸着の少ない膜表面の設計には膜表面の電荷の制御が１つの重要なファクターであることがわかり、膜材や作製方法をさらに検討することで、検出特性や検出能はさらに改善されると考えられる。
【００８３】
本発明のセンサープローブの効果をより明確にするために、公知のデキストラン膜センサーチップとの比較試験を行った。デキストラン膜は既にカルボキシメチル化されているので、本発明のＰＥＩ膜と同様に０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳの１：１混合液で活性化して両者にプロテインＡを固定した。
これに、濃度０．１、１．０、１０、４５、９０、２００μｇ／ｍｌのｈＩｇＧをそれぞれのセンサーに流した。本発明のＰＥＩ膜の経時変化を図２７に示す。また、これらの実験で得られた両者の検量線を図２８に示す。図２８の左側が本発明のＰＥＩ膜のものであり、右側はデキストラン膜のものである。
【００８４】
この結果、図２８からもわかるように、本発明のＰＥＩ膜ではｈＩｇＧ濃度が０．１〜９０μｇ／ｍｌ、デキストラン膜では１０〜２００μｇ／ｍｌの範囲でほぼ直線性を示すことがわかり、本発明のＰＥＩ膜のほうがその応答感度において約２０倍も大きく、そのために検出限界も低くなっている。
このように、本発明のポリマー膜、特にＰＥＩ膜は、比較的簡単な化学構造を有するポリマーを使用することにより、簡便で、安価な、しかも高感度のセンサープローブであることがわかる。
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
実施例１
金薄膜を７０℃ほどに温めた１ＭＫＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭ  Ｌ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に、２４時間浸すことにより、図１の（１）の状態とした。これを、５％グルタルアルデヒド水溶液で２時間処理して図１の（２）の状態とし、次いで２％ＰＥＩ水溶液に２時間浸し図１の（３）で示されるのＰＥＩ膜センサープローブを得た。
【００８６】
実施例２
実施例１で作製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーによるベースラインが安定した後、膜中に存在する未反応のグルタルアルデヒドを０．１Ｍ  グリシン溶液をインジェクトすることでブロックした。この後、ＰＥＩ膜中の一級アミンをスペーサーであるＢＳ３で活性化させ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを固定化した時の結果を図６に示し、次いで、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを添加した時の結果を図７に示す。
【００８７】
実施例３
実施例２において、タンパク質をＰＥＩ膜プローブに固定化する際、ｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーの代わりにｐＨ５．３酢酸バッファーを使用し反応時のｐＨを変えて実施例２と同様に行った。結果を図１０に示した。
【００８８】
実施例４
また、実施例２においてｐＨ７．４  ｂｕｆｆｅｒで、スペーサーとしてＢＳ３の代わりに１００ｍＭ  グリオキシ酸ル（ＯＨＣ−ＣＯＯＨ）と反応させカルボキシル基を導入し、膜全体のチャージバランスをとり、これを０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液で活性化した後、ＢＳＡを固定化した。この結果を図１１に示した。
【００８９】
実施例５
スペーサーによりカルボキシル基を導入したセンサープローブに緩衝液を流し、バッファーが定流している状態でＥＤＣ／ＮＨＳをインジェクトして、膜中のカルボキシル基を活性化し、抗ｈＩｇＧを接触させたところ、ＳＰＲアングルシフトで、２１００ａｒｃｓｅｃｏｎｄほどの固定化量がみられた。次いで、ｐＨ８．５エタノールアミン、ｐＨ３．０グリシン溶液により、チャージで吸着している抗ｈＩｇＧを脱離させると共に、残った膜中の活性化部位をブロックした。ここまでで、ｈＩｇＧ測定のためのセンサープローブの作製が完了した。
ｈＩｇＧを濃度を変化させて膜に接触させ、得られるレスポンスを検出した。１μｇ／ｍｌを接触させたところ、２８８ａｒｃ  ｓｅｃｏｎｄのレスポンスが検出された。その後、６０、１６０、再び６０μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを順にインジェクトした結果、それぞれの濃度に対応したレスポンスを得ることができた。
結果を図１４及び図１５に示した。
【００９０】
実施例６
それぞれのプローブごとに実施例５と同様にして得られたデータに基づき検量線を作成し、活性化方法による違い（図１３のＮｏ．２−Ｎｏ．６、Ｎｏ．４−Ｎｏ．８）、および作製方法による違い（図１３のＮｏ．５−Ｎｏ．６、Ｎｏ．７−Ｎｏ．８）について同様にして行った。結果を図１６及び図１７に検量線として示した。
また、非特異抗体の吸着量についても図１３のＮｏ．１、５、６チップを比較することで検討した。結果を図１８に示した。
【００９１】
実施例７
実施例１のＰＥＩの時と同様に、金薄膜を７０℃ほどに温めた１Ｍ、ＫＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭ  Ｌ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に２４時間浸した後、これを５％グルタルアルデヒド水溶液に２時間浸けた。これに１％キトサン水溶液を２４時間接触させることでキトサンを固定化した。
次に、キトサン中のＯＨ基を２ＭのＢｒＣＨ２ＣＯＯＨ／１Ｍ ＮａＯＨ溶液に１２時間浸すことでカルボキシル化し、カルボキシメチル化キトサン（ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）センサープローブを作製した（図２参照）。
【００９２】
実施例８
ＰＥＩ膜プローブによる測定と同様に、作製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーによるベースラインが安定した後、膜中の−ＣＯＯＨ基を、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液をインジェクトして活性化した後、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを固定化した時の結果を図２０に示す。
【００９３】
実施例９
キトサン１．０ｇ、ラウリルスルホン酸ナトリウム０．１ｇを４５％ＮａＯＨ水溶液７０ｍｌ中にゆっくり加え、４℃に保ちながら溶解するまで１時間ほど攪拌した。これを−２０℃で、１２時間ほど放冷した後、ｉ−ＰｒＯＨ１２５ｍｌ、ＣｌＣＨ２ＣＯＯＨ２８．４ｇを加えて７２時間反応させた。続いて、２ＭＨＣｌを加えていき、白色の結晶を９．８７２７ｇ得た。
次に、この結晶０．５ｇを１０％ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌに溶解させた後、４ＭＨＣｌをｐＨ１になるまで加えた。これに、大量のアセトンを加えることで結晶を析出させ、吸引ろ過により０．７ｇのＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを得た。
【００９４】
実施例１０
金薄膜を洗浄した後、１０−３ＭのＨＳ−Ｃ１０Ｈ２０ＣＯＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に２時間、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳの１：１混合溶液に４０分浸した後、実施例９で製造した２％ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ水溶液に２時間つけることで、キトサン膜センサープローブＩＩを製造した。このプローブを用いて、膜中の−ＣＯＯＨ基を、０．４Ｍ  ＥＤＣ／０．１Ｍ  ＮＨＳ  １：１混合溶液で活性化し、２００μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを固定化した後、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡの膜への吸着を測定した結果を図２１に示す。
【００９５】
実施例１１
実施例２と同様にして、ＡＦＩ法によりキトサン膜センサープローブの調製を行った。ＰＥＩ膜センサープローブの時と同様に金薄膜をＳＰＲ装置にセットし、そこからすべての試薬をフロ−系に導入して固定化するオ−ルフロ−系で固定化法を行った。結果を図２４に示す。
図２４中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はモノレイヤーのエタノール溶液を添加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳの０．２Ｍ／０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１％ＣＭ−キトサンを添加した時点を、（５）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθが観測された。
【００９６】
実施例１２
ＰＥＩ膜を０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳの１：１混合液で活性化して、これにプロテインＡを固定した。
これに、濃度０．１、１．０、１０、４５、９０、２００μｇ／ｍｌのｈＩｇＧをそれぞれのセンサーに流した。ＡＦＩ法によるＰＥＩ膜の経時変化の結果を図２７に示す。図２７中の１，０００Ｒ．Ｕは１ｎｇ／ｍｍ２である。
また、この実験で得られた検量線を図２８の左側に示す。
【００９７】
比較例１
デキストラン膜を用いて実施例１２と同様に行った。その結果得られた検量線を、図２８の右側に示す。
【００９８】
【発明の効果】
本発明は、簡便、迅速かつ再現性のよいＳＰＲ測定用のセンサープローブとして有用な金属薄膜を提供するものであり、本発明のセンサープローブは高感度で、高精度のものであり、かつ、簡便で安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、原料物質として、システインメチルエステル、グルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンを用いた場合の本発明の金属薄膜の処理法を示す。
【図２】図２は、原料として、システインメチルエステル、グルタルアルデヒド及びキトサンを用いた場合の本発明の金属薄膜の処理法を示す。
【図３】図３は、本発明のポリエチレンイミン膜を有する金属薄膜にスペーサーとしてスベリン酸を用い、活性エステル化法により検出用試薬（図３中ではリガンドとして示されている。）を固定する方法を示す。
【図４】図４は、図２に示したＣＭ−キトサンセンサープローブに検出用試薬（図４中ではリガンドとして示されている。）を固定する方法を示す。
【図５】図５は、本発明の金属薄膜の調製法と、表面プラズモン共鳴装置の概要と、本発明の金属薄膜のバッチ法とオールフローインジェクト法（ＡＦＩ法）の概要を示す。
【図６】図６は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＳＰＲの測定結果であり、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス（アーク秒（１度は３６００アーク秒））を示す。図６中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点でのレスポンスΔθは６０４アーク秒であった。
【図７】図７は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＳＰＲの測定結果であり、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス（アーク秒（１度は３６００アーク秒））を示す。図７中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、（３）は０．１ｍｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示している。ｈＩｇＧを添加した時点でのレスポンスΔθは１５０アーク秒であった。
【図８】図８は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＡＦＩ法によるＳＰＲの測定結果である。図８中の、（１）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）は１０ｍＭＬ−システインを添加した時点を、（３）は１０％グルタルアルデヒドを添加した時点を、（４）は１％ＰＥＩを添加した時点をそれぞれ示している。
【図９】図９は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＡＦＩ法によるＳＰＲの測定結果である。図９中の、（ａ）はｐＨ７．４  ＨＢＳ  Ｔ／バッファーを添加した時点を、（ｂ）は１ｍＭのＢＳ３を添加した時点を、（ｃ）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（ｄ）はグリシンｐＨ３を添加した時点を、（ｅ）はｐＨ８．５で０．１Ｍのエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ示している。
【図１０】図１０は、本発明のＰＥＩ膜を用い、緩衝液としてｐＨ５．３酢酸バッファーを用いたときのＳＰＲの測定結果である。図１０中の、（１）はｐＨ５．３酢酸バッファーを添加した時点を、（２）はスペーサーのＢＳ３を１ｍＭ添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加した時点をそれぞれ示している。
【図１１】図１１は、本発明のＰＥＩ膜を用い、膜中のアミノ基を１００ｍＭグリオキル酸と反応させカルボキシル化したときのＳＰＲの測定結果である。図１１中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳバッファーを添加した時点を、（２）は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加した時点をそれぞれ示している。
【図１２】図１２は、本発明のＰＥＩ膜の未反応のアミノ基どうしを、グルタルアルデヒドで架橋することで不活性化するようすを模式的に示したものである。
【図１３】図１３は、本発明の測定に用いた８種類のプローブをまとめて示したものである。
【図１４】図１４は、本発明の図１３に記載のＮｏ．８のプローブを用いて測定を行った時のｈＩｇＧ検出のリアルタイムプロットを示したものである。図１４中の、（１）はＨＢＳ／ＮＨＳバッファーを添加した時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は２００μｇ／ｍｌの抗ｈＩｇＧを添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点を、（５）はグリシンを添加した時点を、（６）は０．１ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点を、（７）は１．０ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点をそれぞれ示している。
【図１５】図１５は、ｈＩｇＧを濃度を６０、１６０、再び６０μｇ／ｍｌｈＩｇＧに変化させて膜に接触させ、得られるレスポンスを示したものである。
【図１６】図１６は、本発明のセンサープローブを用いた検量線を示す。図１６中の左側はＢＳ３で活性化したバッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したバッチ法によるものであり、黒三角印及び白四角印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、黒丸印及びバツ印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。
【図１７】図１７は、本発明のセンサープローブを用いた検量線を示す。図１７中の左側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したバッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したＡＦＩ法のよるものであり、白四角印及び白丸印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、バツ印及び白菱形印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。
【図１８】図１８は、本発明のセンサープローブを用いたときの非特異抗体の吸着量を示す。図１８中のグレーの棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌである。
【図１９】図１９は、センサープローブの表面の膜構造をもし九滴に示したものである。
【図２０】図２０は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２０中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ示している。
【図２１】図２１は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２１中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を添加した時点を、（４）はエタノールアミンを添加した時点を、（５）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。
【図２２】図２２は、活性化をせずに本発明のＣＭ−キトサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２２中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）を添加した時点を、（３）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加下時点をそれぞれ示している。
【図２３】図２３は、活性化をせずに本発明のＣＭ−キトサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２３中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。
【図２４】図２４は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用いたＡＦＩ法によるＳＰＲ測定の結果を示す。図２４中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）はモノレイヤーのエタノール溶液を添加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳの０．２Ｍ／０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１％ＣＭ−キトサンを添加した時点を、（５）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。
【図２５】図２５は、本発明のプローブを用いたときの検量線を示す。図２５中の丸印はＰＥＩ膜プローブを用いたＡＦＩ法によるものであり、四角印はＰＥＩ膜プローブを用いたバッチ法によるものであり、三角印はＣＭ−キトサン膜プローブを用いたバッチ法によるものである。
【図２６】図２６は、本発明のセンサープローブを用いたときの非特異抗体の吸着量を示す。図２６中のグレーの棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌである。
【図２７】図２７は、本発明のＰＥＩ膜にプロテインＡを固定したセンサーを用いた、各種濃度のｈＩｇＧにおける経時変化を示したものである。図２７中の１，０００Ｒ．Ｕは１ｎｇ／ｍｍ２である。
【図２８】図２８は、実施例１２及び比較例１で得られた検量線を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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