(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に空洞部を有するタンパク質および化合物半導体の原料となる元素のイオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に前記化合物半導体のナノ粒子を形成させる工程を含むナノ粒子の製造方法であって、
タンパク質、II族元素イオン、およびVI族元素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内にII族−VI族化合物半導体のナノ粒子を形成させる工程を含み、
前記溶液が、前記II族元素イオンが中心金属であって、アンモニアが配位子である錯イオンを含む、ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記溶液が、さらにアンモニウムイオンを含む、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質の空洞部内に、前記錯イオンが含まれている、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記VI族元素イオン（Ｘ２−）の前記溶液中への供給は、Ｈ２ＮＣＸＮＨ２が前記溶液中に添加されることによる、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記ＸがＳｅである、請求項４に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記ＸがＳである、請求項４に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
前記II族元素が亜鉛（Ｚｎ）またはカドミウム（Ｃｄ）であり、前記VI族元素がイオウ（Ｓ）またはセレン（Ｓｅ）である、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
前記ナノ粒子がＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳおよびＺｎＳからなる群から選択される少なくとも一つの化合物半導体から形成されている、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質またはＴＭＶタンパク質の少なくとも一つである、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子を形成した後、タンパク質を熱処理によって除去する工程をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物半導体のナノ粒子の製造方法、該製造方法によって製造されたナノ粒子及び該製造方法の製造工程で生成されたナノ粒子とタンパク質からなる複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの機能材料開発の主流は、所望の機能を発現させる新規化合物の探索、合成によって行なわれている。しかしながら、近年は、物質をナノメートルサイズまでに微細化したナノ粒子を作製することで、バルク状態では得られない新機能を発現させることが望まれるようになっている。特に、半導体や金属化合物を中心とする無機材料のナノ粒子化が強く望まれている。
【０００３】
半導体ナノ粒子は、エネルギー準位の量子化によりエネルギー準位が互いに離れた状態となり、かつそれらがナノ粒子の粒径の関数として制御されるようになる。よって、半導体ナノ粒子において、半導体結晶の基礎吸収の長波長側吸収端よりもわずかに低エネルギーに現れる励起子吸収帯のピーク位置は半導体ナノ粒子の粒径を変えることで制御することができ、バルクとは異なる電磁波の吸収及び発生能を示すことから、発光材料や記憶材料としての使用が期待されている。
【０００４】
例えば、II族−VI族化合物半導体であるＣｄＳｅ、ＺｎＳｅは、蛍光を発することが知られているが、その蛍光波長は、粒子のサイズ（粒径）によって異なる。このような半導体ナノ粒子の量子効果を工学的に利用するためには、粒径が均一なナノ粒子を作製することが必要となる。
【０００５】
従来、ナノ粒子を作製する方法は、物理的粉砕法および化学的合成法などによって行なわれている。例えば、物理的粉砕法は、セラミックスを焼成する際の出発材料を得るために広く用いられている。また、化学的合成法としては、長鎖の有機化合物の間で、塩化金酸を還元することによって金のナノ粒子を作製する方法などがある。ここで、長鎖の有機化合物は、金粒子が成長して巨大化することを阻害している。
【０００６】
また、有機化合物とナノ粒子との複合体を作り、化学反応させて均一な粒子を作る方法もある。この応用としては、ＳＡＭ膜を形成するための材料に金原子を固定し、上記材料を金原子を中心にして集合させることによって、表面にＳＡＭ膜が形成された金のナノ粒子を得る方法もある。さらに、ナノ粒子を形成する材料を含むミセルをつくり、ミセル中での化学反応を用いてナノ粒子を作製することも行われている。
【０００７】
しかしながら、上述の従来の方法では粒径が均一なナノ粒子を得ることは難しい。例えば、物理的粉砕法では、そもそも粒径をミクロンサイズよりも小さくすることが困難であり、ナノメートルオーダーに近づいたとしても粒径を一定にするメカニズムがない。このため、得られるナノ粒子の粒径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、化学的合成法では、化学反応を利用しているため、これもまた得られるナノ粒子の粒径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、所要時間、コストの面でも非常に不利である。
【０００８】
一方、バイオテクノロジーを他分野に応用する試みの一つとして、金属化合物を保持する機能を有するタンパク質であるアポフェリチンに金属または金属化合物を取り込ませ、ナノオーダーの均一なサイズのナノ粒子を作製しようという研究がある。ナノ粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
【０００９】
アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリチンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰の鉄分はフェリチンの形で体内に貯蔵される。そして、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポフェリチンに戻る。
【００１０】
図１は、アポフェリチンの構造を示す模式図である。図１に示すように、アポフェリチン１は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高いｐＨ安定性を示す。アポフェリチン１の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があり、外部と保持部４とはチャネル３を介してつながっている。例えば、アポフェリチン１に２価の鉄イオンが取り込まれる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユニット内にあるferrooxidase center（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ  ）結晶の形で保持部４に保持される。保持部４に保持された金属原子を含むナノ粒子の粒径は、保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなっている。
【００１１】
このアポフェリチンを用いて、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を保持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体も作製されている。
【００１２】
現在までに、マンガン（例えば、非特許文献１参照）、ウラン（例えば、非特許文献２参照）、ベリリウム（例えば、非特許文献３参照）、アルミニウム（例えば、非特許文献４参照）、亜鉛（例えば、非特許文献５参照）、コバルト（例えば、非特許文献６参照）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリチンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の粒径も、アポフェリチンの保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
【００１３】
自然界において、鉄原子を含むナノ粒子がアポフェリチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
【００１４】
アポフェリチン１の外部と内部とを結ぶチャネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７〜８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷を持っているＦｅ2+イオンは静電相互作用によりチャネル３に取り込まれる。
【００１５】
アポフェリチン１の保持部４の内表面には、チャネル３の内表面と同じく，ｐＨ７〜８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出しており、チャネル３から取り込まれたＦｅ2+イオンはferroxidase centerで酸化され、内部の保持部４へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ）結晶の核形成が起こる。
【００１６】
その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、粒径６ｎｍのナノ粒子が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオンの取り込みと酸化鉄からなるナノ粒子形成の概略である。
【００１７】
なお、ここまで鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズム及び酸化鉄を内包したアポフェリチンの調製法について述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについては、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。
【非特許文献１】
Ｐ．Ｍａｃｋｌｅ，１９９３，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，８４７１−８４７２；  Ｆ．Ｃ．Ｍｅｌｄｒｕｍら，１９９５，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，５９−６８
【非特許文献２】
Ｊ．Ｆ．Ｈａｉｎｆｅｌｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１１０６４−１１０６８
【非特許文献３】
Ｄ．Ｊ．Ｐｒｉｃｅ，１９８３，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１０８７３−１０８８０
【非特許文献４】
Ｊ．Ｆｌｅｍｉｎｇ，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７８６６−７８７０
【非特許文献５】
Ｄ．Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．Ｊｏｓｈｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７９，３１１６−３１１９
【非特許文献６】
Ｔ．Ｄｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｖ．Ｔ．Ｓｔａｒｋ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３９，２０００，１８２８−１８３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、上述の方法によって空洞部内に取り込むことができるのは、特定の金属または金属化合物に限定されていた。
【００１９】
本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、粒子径が均一な半導体ナノ粒子を得ることができるナノ粒子の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のナノ粒子の製造方法は、内部に空洞部を有するタンパク質および化合物半導体の原料となる元素のイオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に前記化合物半導体のナノ粒子を形成させる工程を含むナノ粒子の製造方法であって、タンパク質、II族元素イオン、およびVI族元素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内にII族−VI族化合物半導体のナノ粒子を形成させる工程を含み、前記溶液が、前記II族元素イオンが中心金属であって、アンモニアが配位子である錯イオンを含む。
【００２１】
尚、本明細書でいうII族元素とは、周期表第１２族元素のことであり、具体的にはＺｎおよびＣｄを意味する。VI族元素とは、周期表第１６族元素のことであり、具体的にはＯ、Ｓ、およびＣｅを意味する。
【００２２】
好ましくは、前記タンパク質の空洞部内に、前記II族元素イオンを中心金属とする錯イオンが含まれている。
【００２３】
例えば、前記溶液が、さらにアンモニウムイオンを含む。
【００２４】
好ましくは、前記VI族元素イオン（Ｘ２−）の前記溶液中への供給は、Ｈ２ＮＣＸＮＨ２が前記溶液中に添加されることによる。例えば、前記Ｘは、ＳｅまたはＳである。
【００２５】
例えば、前記II族元素が亜鉛（Ｚｎ）またはカドミウム（Ｃｄ）であり、前記VI族元素がイオウ（Ｓ）またはセレン（Ｓｅ）である。
【００２６】
例えば、前記ナノ粒子がＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳおよびＺｎＳからなる群から選択される少なくとも一つの化合物半導体から形成されているものである。
【００２７】
例えば、前記タンパク質が、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質またはＴＭＶタンパク質の少なくとも一つである。
【００２８】
また、前記ナノ粒子を形成した後、タンパク質を熱処理によって除去する工程をさらに含むものであってもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によると、粒径が均一なII族−VI族化合物半導体のナノ粒子が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００３３】
（実施形態１）
本実施形態では、均一な粒径のＣｄＳｅからなる半導体ナノ粒子を作製するために、Ｃｄ2+とＳｅ2-とをタンパク質の直径数ナノメートルの空洞内で反応させる。タンパク質としては、以下に示す条件を満たすものを用いることができる。
【００３４】
まず第１に、一定の大きさの空洞を内部に有する。
【００３５】
第２に、空洞の表面がプラスまたはマイナス電荷を有し、且つ外部に対して電位差を有する。
【００３６】
第３に、空洞と外部とを結ぶチャネルが存在する。
【００３７】
第４に、チャネルは、イオンが通過可能な大きさを有し、イオンの通過を妨げる障害を持たない。
【００３８】
第５に、ナノ粒子を作製するための化学反応条件下で、十分安定である。
【００３９】
上記第１から第５までの条件を満たすタンパク質であれば、単一のサブユニットから構成されているタンパク質であっても、複数のサブユニットから構成されているタンパク質であっても良い。また、タンパク質は、その空洞部の形状が球状のものに限定されることはなく、ロッド状、リング状等の空洞部を有するものであっても良い。上記第１から第５までの条件を満たすタンパク質は多数存在し、代表的なタンパク質として、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ならびにウイルスタンパク質などが挙げられる。ウイルスタンパク質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＬＡ−１、Ｐｏｌｙｏｍａ、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Ｐｏｌｉｏ等のウイルスのタンパク質が挙げられる。好ましくは、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスタンパク質を用いることができる。本実施形態の方法によると、使用するタンパク質の空洞部の形状、大きさに応じたナノ粒子が形成されることになる。本明細書におけるナノ粒子とは、長径５０ｎｍ以下であって、粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げるのであれば、長径１ｎｍ〜５０ｎｍの粒子がナノ粒子に該当する。
【００４０】
タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することが容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。したがって、上記第１の条件を満たすタンパク質を調製することは容易である。
【００４１】
本実施形態では、金属または金属化合物を保持する機能を有するタンパク質であるアポフェリチンを利用する。
【００４２】
次に、アポフェリチンを用いてＣｄＳｅからなる半導体ナノ粒子を内包したタンパク質からなる複合体（以下、ＣｄＳｅ−アポフェリチン複合体ともいう）を作製する方法を、図２を参照しながら具体的に説明する。図２は、本実施形態の半導体ナノ粒子の製造方法を表すフローチャートである。なお、以下に示す本実施形態の方法の全ての工程は、室温にて２００ｍｌスケールで実施される。また、特に記載のない限り、ここで用いる用語「溶液」は、溶媒として水を用いた溶液を意味する。
【００４３】
まず、図２に示すように、ステップＳｔ１において、５０ｍｇ／ｍｌのアポフェリチン溶液、１００ｍＭの酢酸カドミウム溶液、１Ｍの酢酸アンモニウム溶液、１００ｍＭのアンモニア水を用意する。また、少量のエタノール（１０μｌ程度）にセレノ尿素（Ｈ２ＮＣＳｅＮＨ２）を溶解させ、これを１００ｍＭ濃度になるように純水を加えて１００ｍＭのセレノ尿素溶液を用意する。なお、セレノ尿素は水に溶解すると不安定であるので、次に述べる工程の直前にセレノ尿素溶液を調製する。
【００４４】
次に、ステップＳｔ２において、上記ステップＳｔ１で用意した各溶液を混合し、全体の容量が２００ｍｌになるまで純水を加えることによって、反応溶液を調製する。上記の反応溶液におけるアポフェリチン、酢酸カドミウム、酢酸アンモニウム、セレノ尿素およびアンモニアの各濃度は、図３に示す通りとなっている。なお、図３は、ステップＳｔ１およびステップＳｔ２を表す模式図である。
【００４５】
つづいて、図３に示すように、反応溶液を攪拌しながら反応を進行させる。上記反応溶液では、調製した直後から反応が自発的に開始する。本実施形態では、さらに反応溶液の攪拌を一昼夜に亘って行なう。ここで生じる反応は急速ではないが、数分から数時間で完結する。この操作により、アポフェリチンの保持部内にＣｄＳｅが導入され、ＣｄＳｅ−アポフェリチン複合体（以下、単に複合体とも称す）が生成される。
【００４６】
次に、ステップＳｔ３において、反応溶液を容器に入れ、遠心分離機を用いて毎分３０００回転、２０分の条件で遠心分離し、沈殿を除去する。このとき、上澄み液中には、複合体が分散された状態で存在している。
【００４７】
次に、ステップＳｔ４において、沈殿を除去した後の上澄み液をさらに毎分１００００回転、３０分の条件で遠心分離し、複合体を沈殿させる。
【００４８】
次に、ステップＳｔ５において、上記ステップＳｔ４で得られた沈殿を１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液に懸濁し、複合体溶液を作製する。ここでは、特にｐＨ調整を行わなくてもよい。
【００４９】
以上のようにして、ＣｄＳｅからなる半導体ナノ粒子を内包するアポフェリチン、すなわちＣｄＳｅ−アポフェリチン複合体が得られる。
【００５０】
ここで、上記ステップＳｔ２においてＣｄＳｅ−アポフェリチン複合体が形成されるメカニズムを推測して、図４を参照しながら説明する。図４は、ＣｄＳｅ−アポフェリチン複合体が形成されるメカニズムを説明するための模式図である。なお、図４では、理解を容易にするために、図１に示すアポフェリチンをさらに単純化して示している。このため、図４においても、図１と共通の参照符号を用いている。
【００５１】
上記ステップ２において、反応溶液中で起こっていると推測される反応は、次に示す反応式１で表される。
【００５２】
【化１】
0003683265.tif 000002
【００５３】
図４に示すように、上記反応溶液の条件では、アンモニウムイオン（ＮＨ4+）が多数存在する条件となっている。このため、カドミウムイオン（Ｃｄ2+）の大半は、錯イオンである[Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+となって安定化する。従って、［Ｃｄ（ＮＨ3）4］2+の濃度とＣｄ2+の濃度との関係は、「［Ｃｄ（ＮＨ3）4］2+の濃度＞＞Ｃｄ2+の濃度」となっている。
【００５４】
アポフェリチン１の保持部４の表面は、マイナス電荷に帯電しているため、 [Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+は、矢印Ａに示すようにチャネル３を通って保持部４内に導入される。この結果、[Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+が保持部４内で高濃度に濃縮される。
【００５５】
セレノ尿素は電荷を持たないため、アポフェリチン１の保持部４内と外部とで均等に存在する。セレノ尿素は、室温で水に溶解すると、ゆっくりではあるが直ちに分解を始める。全ての分解には数時間かかり、Ｓｅ2-が発生する。
【００５６】
アポフェリチン１の保持部４内で発生したＳｅ2-は、高濃度に濃縮された[Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+から供給されるＣｄ2+が存在するため、直ちに反応してＣｄＳｅが析出し、結晶化する。
【００５７】
Ｃｄ2+およびＳｅ2-は、ＣｄＳｅになると水に不溶性であるため可逆的にイオン化することはない。このため、アポフェリチン１の保持部４内では、溶液中の[Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+およびセレノ尿素の濃度が低下する。従って、アポフェリチン１の保持部４内と外部とで濃度勾配が生じ、外部に存在する[Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+およびセレノ尿素が、矢印ＡおよびＢに示すように、チャネル３を通ってアポフェリチン１の保持部４内に導入される。アポフェリチン１の保持部４内では、 [Ｃｄ（ＮＨ3）4]2+およびセレノ尿素からのＣｄ2+およびＳｅ2-の供給が終わるまで、ＣｄＳｅの生成反応が繰り返される。
【００５８】
一方、アポフェリチン１の外部では、反応開始時点からＣｄ2+が非常に少ないので、発生したＳｅ2-がＣｄ2+と反応する速度は非常に遅い。従って、アポフェリチン１の外部では、ＣｄＳｅがほとんど生成しない。すなわち、アポフェリチン１の空洞部内で優先的に各イオンを反応させることができる。
【００５９】
なお、セレノ尿素は反応の直前に水に溶解させているが、水中ではセレノ尿素は不安定で、その結果反応溶液を調製すると同時にセレノ尿素のセレン原子が電離し、反応溶液中にＳｅ2-が供給されると考えられる。このため、本実施形態では、アポフェリチン１の保持部４内でＳｅ2-が不足しないように、Ｓｅ2-がＣｄ2+の５倍量となるように、セレノ尿素を過剰に添加している。
【００６０】
ここで、本実施形態のステップＳｔ１において、アンモニアの添加量を変えて、ＣｄＳｅのナノ粒子を形成させ、ステップＳｔ２の直後に反応溶液を電子顕微鏡で観察した様子を図５（ａ）〜（ｃ）に示す。図５（ａ）〜（ｃ）は、反応溶液に添加するアンモニア水を調節し、反応溶液中でのアンモニア（ＮＨ３）の濃度をそれぞれ０ｍＭ、０．５ｍＭおよび１．０ｍＭとしたときのナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。なお、酢酸アンモニウムから解離するアンモニアはごく微量であり、ここで示すアンモニアの濃度にはほとんど影響しないと考えられる。ＣｄＳｅの半導体ナノ粒子は、代表的には、図５（ａ）、（ｂ）および（ｃ）中の白抜きの矢印で示されている。
【００６１】
図５（ａ）〜（ｃ）に示すように、ＣｄＳｅの半導体ナノ粒子の形成は、アンモニアの濃度に依存しており、アンモニアの濃度が０．５ｍＭである場合にナノ粒子の形成が最も良好である。
【００６２】
図５（ａ）に示す反応溶液はｐＨ６．６であり、図５（ｂ）に示す反応溶液はｐＨ７．４であり、図５（ｃ）に示す反応溶液はｐＨ７．９である。従って、アンモニアは、Ｃｄ2+に配位して安定化すると同時に、緩衝剤の入っていない反応溶液を高ｐＨに保ち、ＣｄＳｅが析出しやすくする働きもあると考えられる。このため、反応溶液のｐＨは、ｐＨ７．０以上９．５以下の範囲内に保つことが好ましい。なお、アンモニアを表１の混合率で２００００まで上げても同様の効果は得られる。
【００６３】
以上のような反応機構が想定されることから、それぞれの化学物質の混合比率は、アポフェリチンの分子数を１として、表１に示す範囲内の分子数であることが望ましいと考えられる。
【００６４】
【表１】
0003683265.tif 000003
【００６５】
以上に述べた製造方法によって、アポフェリチン内に優先的にＣｄＳｅからなる半導体ナノ粒子を形成することができる。
【００６６】
アポフェリチンを含めて、タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。このため、本実施形態で用いるアポフェリチンが有する空洞状の保持部は、全て同じ形状である。
【００６７】
従って、本実施形態のように、タンパク質の内部で化学反応によって半導体ナノ粒子を作製すれば、半導体ナノ粒子の粒径がタンパク質により規定されるので、粒径が均一な半導体ナノ粒子が得られる。反応溶液を図３に示すものとなるようにした本実施形態において得られたＣｄＳｅナノ粒子は、球状であり、その直径は、６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【００６８】
なお、本実施形態ではタンパク質としてアポフェリチンを用いたが、アポフェリチンの代わりにＤｐｓタンパク質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状タンパク質）を用いれば、粒径が４ｎｍの半導体ナノ粒子を作製することができる。さらに、アポフェリチンの代わりにＣＣＭＶおよびＴＭＶ等のウイルスタンパク質などを用いても、それぞれのタンパク質が有する内部の保持部の形状に応じた半導体ナノ粒子を作製することができる。
【００６９】
また、本実施形態では、ＣｄＳｅからなる半導体ナノ粒子を作製する場合について説明したが、他のII族−VI族化合物半導体、例えばＺｎＳｅ、ＣｄＳおよびＺｎＳ等からなる半導体ナノ粒子を作製する場合にも、本実施形態とほぼ同じ方法を適用することができる。
【００７０】
例えば、ＺｎＳｅからなる半導体ナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いた酢酸カドミウム溶液の代わりに、酢酸亜鉛溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。
【００７１】
また、ＣｄＳからなる半導体ナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたセレノ尿素溶液の代わりに、チオ尿素（Ｈ２ＮＣＳＮＨ２）溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。
【００７２】
ＺｎＳからなる半導体ナノ粒子を作製する場合、酢酸カドミウム溶液の代わりに酢酸亜鉛溶液を、セレノ尿素溶液の代わりにチオ尿素溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。
【００７３】
尚、II族−VI族化合物半導体は、直接遷移のワイドバンドギャップ半導体であり、ナノ粒子としての特性に加えてかかる特性をも利用でき、さまざまな用途に有用である。
【００７４】
以下の実施形態では、本実施形態において作製されたナノ粒子およびナノ粒子−タンパク質複合体の利用例を説明する。
【００７５】
（実施形態２）
ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳおよびＺｎＳ等からなる半導体ナノ粒子は、内部の電子順位が量子化されており、蛍光波長がその粒径で変化することが示されている。そこで、図６（ａ）および（ｂ）に示すように、異なる粒径の半導体ナノ粒子を細胞のアクチンフィラメントと核とにそれぞれ結合させておき、単一の波長で励起することによって、異なる蛍光色を発現させ、簡単に細胞中の２つのタンパク質の移動や位置を観察する方法が報告されている（Ｒ．Ｆ．Ｓｅｖｉｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻、１９９８年、１９３０〜１９３１ページ、Ｍ．Ｂｒｕｃｈｅｚ Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻、１９９８年、２０１３〜２０１６ページ、およびＷ．Ｃ．Ｗ．Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻、１９９８年、２０１６〜２０１８ページ）。
【００７６】
これまで細胞などの蛍光観察にはローダミンなどの蛍光染色剤が用いられていた。しかし、ローダミンなどの蛍光染色剤は蛍光そのものが弱く、しかも数秒でクエンチングと呼ばれる蛍光退色が起こり発光しなくなる。また、ローダミンなどの蛍光染色剤では、蛍光が赤方（長波長側）への伸び（レッドテイリングと呼ばれる）、他の蛍光染色剤の蛍光領域まで進入して、クロストークが発生する。さらに、蛍光を観察するために照射する励起光波長と、蛍光染色剤からの蛍光波長との差が数十ｎｍ程度であるため、急峻な波長フィルターが必要である。このため、蛍光染色剤の数だけ励起光装置と波長フィルターとが必要となって蛍光観察装置（例えば、蛍光顕微鏡）の構成が複雑となる。蛍光観察装置の構成が複雑になると、光量の確保が難しくなり、明るいレンズが必要となる。従って、蛍光観察装置の設計が難しくなり、蛍光観察装置の値段もきわめて高価となる。
【００７７】
しかし、上記の報告で説明されている、異なる粒径のＣｄＳｅからなるナノ粒子を用いた蛍光観察では、励起光として蛍光波長から離れた短波長側の１つ波長の光（例えば紫外線）を用いればよい。蛍光の色は、ＣｄＳｅからなるナノ粒子の粒径で決まるので、レッドテイリングが無く、フィルターも不要となり、蛍光観察装置の構成が簡単になる。従って、光量の確保が容易になり、簡単で安価な蛍光顕微鏡を用いても、鮮明な蛍光観察が可能になる。
【００７８】
つまり、数種類の粒径毎に、粒径が均一なＣｄＳｅの半導体ナノ粒子が得られれば、きわめて安価に細胞内のタンパク質をラベルして蛍光観察することができるようになる。
【００７９】
しかしながら、従来の物理的粉砕法や化学合成法などでは、作製されたＣｄＳｅおよびＺｎＳｅの半導体ナノ粒子の粒径が一定でなく、様々な蛍光波長の粒子が混在してしまう。従って、従来の物理的粉砕法や化学合成法などで作製された半導体ナノ粒子を蛍光ラベル用として、そのまま使用できない。このため、上記の報告では、ＣｄＳｅおよびＺｎＳｅの半導体ナノ粒子を蛍光ラベル材料として使用するために、ナノメートルオーダーの粒径によって分離する精密な精製工程が必要となっている。従って、半導体ナノ粒子の量産性が非常に低く、蛍光観察するためのコストも非常に高い。
【００８０】
また、従来の方法による半導体ナノ粒子の作製時には、半導体ナノ粒子の表面が被覆されていないので、分散および凝集を制御することが難しい。これを回避するために、上記の報告では、半導体ナノ粒子の表面を有機材料でコーティングすることが提案されている。しかしながら、半導体ナノ粒子の表面を有機材料でコーティングするための工程が更に追加されるので、更に半導体ナノ粒子の量産性が低く、蛍光観察するための製造コストも非常に高くなる。
【００８１】
一方、上記実施形態１で得られる半導体ナノ粒子は、粒径が均一である。従って、半導体ナノ粒子を保持する保持部の直径が異なる数種類のタンパク質を用いれば、数種類の粒径毎に、粒径が均一であるＣｄＳｅの半導体ナノ粒子が容易に得られ、半導体ナノ粒子を粒径によって分離する精密な精製工程が不要となる。従って、きわめて安価に細胞内のタンパク質をラベルして蛍光観察することができるようになる。
【００８２】
さらに、上記実施形態１で得られる半導体ナノ粒子−タンパク質複合体では、タンパク質の表面にはアミノ酸残基が露出している。表面に露出しているアミノ酸残基は、組み換えなどの遺伝子工学的な手法で改変することが可能である。このことによって、半導体ナノ粒子−タンパク質複合体の表面の任意の位置に、正や負の電荷を帯びさせる、あるいは疎水性または親水性を付与することが可能となる。従って、半導体ナノ粒子の表面を有機材料等でコーティングすることなく、半導体ナノ粒子の分散および凝集を制御することができる。
【００８３】
また、半導体ナノ粒子−タンパク質複合体において、タンパク質の一部のアミノ酸を化学修飾することによって、他のタンパク質と相互作用させることができる。具体的には、図７を参照しながら説明する。図７（ａ）および（ｂ）は、抗体を利用して半導体ナノ粒子−タンパク質複合体でタンパク質をラベルする方法を表す模式図である。
【００８４】
半導体ナノ粒子−タンパク質複合体Ｃ１は、図７（ａ）に示すように、Ｄｐｓタンパク質１１とＣｄＳｅの半導体ナノ粒子１４ａとからなる複合体である。Ｄｐｓタンパク質１１の表面には、タンパク質Ｘを特異的に認識する抗体Ｉｘのうちの、タンパク質Ｘに結合しない側の末端（Ｈ鎖のＣ末端）が結合されている。
【００８５】
半導体ナノ粒子−タンパク質複合体Ｃ２は、図７（ｂ）に示すように、アポフェリチン１とＣｄＳｅの半導体ナノ粒子４ａとからなる複合体である。アポフェリチン１の表面には、タンパク質Ｙを特異的に認識する抗体Ｉｙのうちの、タンパク質Ｙに結合しない側の末端（Ｈ鎖のＣ末端）が結合されている。
【００８６】
つまり、半導体ナノ粒子−タンパク質複合体Ｃ１およびＣ２は、２種類の異なる粒径毎に、粒径が均一なＣｄＳｅの半導体ナノ粒子を内包している。また、半導体ナノ粒子−タンパク質複合体Ｃ１は、タンパク質Ｘに特異的に結合し、半導体ナノ粒子−タンパク質複合体Ｃ２は、タンパク質Ｙに特異的に結合する。従って、単一の波長の励起光（例えば紫外線）を照射することによって、タンパク質ＸおよびＹ毎に異なる蛍光色を発現させ、簡単に細胞中の２つのタンパク質の移動や位置を観察することができる。
【００８７】
以上に述べたように、上記実施形態１で得られる半導体ナノ粒子−タンパク質複合体は、半導体ナノ粒子がタンパク質で覆われる構成となっているので、タンパク質を改変することによって、蛍光を利用した生体の観察に利用することが容易である。
【００８８】
なお、本実施形態では、蛍光材料としてＣｄＳｅの半導体ナノ粒子を用いた例を説明をしたが、その他の蛍光材料（ＺｎＳｅ、ＣｄＳおよびＺｎＳ等）を用いても、当然同じ効果が得られる。
【００８９】
（実施形態３）
本実施形態では、上記実施形態１において作製されたナノ粒子−タンパク質複合体を利用して形成されるドット体をフローティングゲートとして含む不揮発メモリセルについて説明する。
【００９０】
図８（ａ）〜図８（ｄ）は、本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【００９１】
まず、図８（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３を熱酸化法によって形成する。その後、６ｎｍ程度の粒径を有するナノ粒子からなるドット体１０４を基板上に形成する。なお、ドット体１０４を基板上に形成する方法については、後述する。
【００９２】
次に、図８（ｂ）に示す工程で、基板上に、スパッタ法またはＣＶＤ法により、ドット体１０４を埋めるＳｉＯ2膜を堆積する。
【００９３】
次に、図８（ｃ）に示す工程で、基板上にＡｌ膜を堆積する。つづいて、フォトレジストマスクＰｒ１を用いて、ＳｉＯ2膜およびＡｌ膜のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜１０５及び制御ゲート電極となるＡｌ電極１０６を形成する。このとき、ゲート酸化膜１０３のうちフォトレジストマスクＰｒ１で覆われていない部分は除去されるので、その上のドット体１０４も同時に除去される。その後、フォトレジストマスクおよびＡｌ電極１０６をマスクとして不純物イオンの注入を行なって、第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂを形成する。
【００９４】
その後、図８（ｄ）に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜１０８の形成と、層間絶縁膜１０８へのコンタクトホール１０９の開口と、コンタクトホール１０９内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ１１０の形成と、第１、第２アルミニウム配線１１１ａ、１１１ｂの形成とを行なう。
【００９５】
本実施形態では、基板としてｐ型Ｓｉ基板を用いたが、ｎ型Ｓｉ基板を用いてもよく、さらに、ＧａＡｓをはじめとする化合物半導体その他の半導体により構成される基板を用いてもよい。
【００９６】
次に、図８（ａ）に示す工程において、ドット体１０４を基板上に形成する方法を、図９および図１０を参照しながら以下に説明する。なお、ドット体１０４を基板上に形成する方法は、以下に説明する方法には限定されず、他の公知の方法を適用することも可能である。
【００９７】
まず、図９（ａ）に示す工程で、上記実施形態１で得られたナノ粒子−タンパク質複合体（以下、複合体と略す）１５０を用意し、この複合体１５０を基板１３０の表面上に配置する。このことによって、複合体１５０が基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置された複合体膜が形成される。なお、基板１３０とは、図８（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３が熱酸化法によって形成されたものを指す。以下の説明においても同様である。
【００９８】
次に、図９（ｂ）に示す工程で、複合体１５０のうちのタンパク質１４０を除去して、ナノ粒子１０４ａのみを残存させることによって、基板１３０上にドット体１０４を形成する。
【００９９】
ここで、図９（ａ）に示す工程において、複合体１５０を基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置する、すなわち、基板１３０の表面上に２次元状に配列および固定する方法について説明する。本実施形態では、以下に、特開平１１−４５９９０号公報に記載の方法を図１０を参照しながら説明する。
【０１００】
まず、図１０（ａ）に示すように、複合体１５０を分散した液体１６０を用意する。本実施形態では、液体１６０として、２０ｍＭのＮａＣｌ溶液と２０ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液との混合液（ｐＨ５．８）にナノ粒子−タンパク質複合体を分散した液体を用いる。なお、ＭＥＳとは２−モルホリノエタンスルホン酸を意味する。
【０１０１】
つづいて、図１０（ｂ）に示すように、ＰＢＬＨ（Ｐｏｌｙ−１−Ｂｅｎｚｉｌ−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を注射器などで静かに液体１６０の表面に展開する。このことによって、液体１６０の表面にＰＢＬＨからなるポリペプチド膜１７０が形成される。この後、液体１６０のｐＨを調節しておく。
【０１０２】
次に、図１０（ｃ）に示すように、時間の経過に伴って複合体１５０がポリペプチド膜１７０に付着し、複合体１５０の２次元結晶ができる。これは、ポリペプチド膜１７０が正電荷を帯びているのに対し、複合体１５０は負電荷を帯びているからである。
【０１０３】
次に、図１０（ｄ）に示すように、ポリペプチド膜１７０上に基板１３０を載置して（浮かべて）、ポリペプチド膜１７０を基板１３０に付着させる。
【０１０４】
次に、図１０（ｅ）に示すように、基板１３０を取り出せば、ポリペプチド膜１７０を介して、複合体１５０の２次元結晶が付着した基板１３０を得ることができる。
【０１０５】
次に、図９（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する。
【０１０６】
タンパク質は一般に熱に弱いため、複合体１５０のうちのタンパク質１４０の除去は、熱処理によって行なう。例えば、窒素等の不活性ガス中において、４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、タンパク質１４０およびポリペプチド膜１７０が焼失し、基板１３０上にはナノ粒子１０４ａが２次元状に、高密度で、且つ高精度で規則正しく配列したドット体１０４として残存する。
【０１０７】
以上のようにして、図９（ｂ）に示すように、複合体１５０に保持させたナノ粒子１０４ａを、基板１３０上に２次元状に出現させ、高密度且つ高精度に配列したドット体１０４を形成することができる。
【０１０８】
図８（ｄ）に示すように、本実施形態のメモリセル１００は、制御ゲートとして機能するＡｌ電極１０６と、ソースまたはドレインとして機能する第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリセルトランジスタ）を備え、フローティングゲートとして機能するドット体１０４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジスタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモリセルである。
【０１０９】
この不揮発性メモリセルは、二値を記憶するメモリとしての機能が得られるが、ドット体１０４に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制御することで、三値以上の多値メモリを実現することもできる。
【０１１０】
データの消去の際には、酸化膜を介したＦＮ（Fowler-Nordheim）電流や直接トンネリング電流を利用する。
【０１１１】
また、データの書き込みには、酸化膜を介したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネルホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
【０１１２】
本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートが量子ドットとして機能できる程度に粒径の小さいナノ粒子により構成されているので、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込み、消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
【０１１３】
また、本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートを構成するナノ粒子の粒径が均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特性が各ナノ粒子間で揃っており、これらの操作において制御が容易に行なえる。
【０１１４】
上記のメモリセルの製造において、図８（ｂ）に示す工程で、ドット体１０４を埋め込むようにＳｉＯ2膜１０５を堆積する際には、スパッタ法が用いられることが多い。
【０１１５】
これまでにアポフェリチンを用いて得られている鉄、コバルト等のナノ粒子はアポフェリチンの内部では酸化物として存在する。このため、鉄、コバルト等のナノ粒子を利用してドット体を形成する場合、図８（ｂ）に示す工程においてナノ粒子を電荷保持特性を有するドット体とするためには、ナノ粒子を還元する必要がある。
【０１１６】
しかしながら、本実施形態で用いる、上記実施形態１によって得られるＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＦｅＰｔおよびＣｏＰｔ等からなるナノ粒子は、還元しなくとも電気保持特性を備えている。このため、ナノ粒子の還元工程を行なう必要がなくなる。従って、ドット体形成の際のコストを下げることが可能になる。
【０１１７】
（その他の実施形態）
上記実施形態３で示したように、本発明によれば、ナノ粒子を基板上にナノメートルスケールで集積することも可能である。従って、例えば、蛍光を生じる半導体ナノ粒子間における光エネルギーの授受を利用する演算素子を作製することも可能であると考えられる。
【０１１８】
本発明によれば、粒径が均一な半導体ナノ粒子が得られる。粒径が均一な半導体ナノ粒子に、励起光を照射すると、特定の波長の蛍光を放出する。
【０１１９】
また、ＦｅＰｔおよびＣｏＰｔからなるナノ粒子を作製する場合にも、実施形態１とほぼ同じ方法を適用することができる。
【０１２０】
ＦｅＰｔからなるナノ粒子を作製する場合、実施形態１で用いた酢酸カドミウム溶液の代わりに硫酸アンモニウム鉄溶液を、セレノ尿素溶液の代わりにＫ2ＰｔＣｌ4溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、実施形態１に述べた通りである。
【０１２１】
ＣｏＰｔからなるナノ粒子を作製する場合、具体的には、実施形態１で用いた酢酸カドミウム溶液の代わりに酢酸コバルト溶液を、セレノ尿素溶液の代わりにＫ2ＰｔＣｌ4溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、実施形態１に述べた通りである。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の半導体ナノ粒子は、粒径が均一であるため、その特性を利用して種々の発光材料、記憶材料に利用可能である。例えば、ケミカルセンシング、ＤＮＡのシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、蛍光偏光イノムアッセイ、時間ゲートイノムアッセイ、時間分解イノムアッセイ、酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、濾過試験、及び標的化タギングなどに利用可能である。また、本発明の半導体ナノ粒子を、ポリマー等とブレンドして薄膜状とし、ディスプレイパネル、発光ダイオード、光ディスクの超解像膜、光導波路等に用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】アポフェリチンの構造を示す模式図である。
【図２】半導体ナノ粒子の製造方法を表すフローチャートである。
【図３】図２に示すステップＳｔ１およびステップＳｔ２を表す模式図である。
【図４】図２に示すステップＳｔ２において起こっていると思われる反応を表す模式図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、ナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【図６】（ａ）および（ｂ）は、異なる粒径の半導体ナノ粒子を細胞のアクチンフィラメントと核とにそれぞれ結合させた状態を表す模式図である。
【図７】（ａ）および（ｂ）は、抗体を利用して半導体ナノ粒子−タンパク質複合体でタンパク質をラベルする方法を表す模式図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【図９】ドット体を基板の表面上に２次元状に配列および固定する方法を示す工程断面図である。
【図１０】複合体を基板の表面上に２次元状に配列および固定する方法について説明する図である。
【符号の説明】
【０１２４】
１    アポフェリチン
３    チャンネル
４    保持部
４ａ、１４ａ    半導体ナノ粒子
１１  タンパク質
Ｃ１、Ｃ２      半導体ナノ粒子−タンパク質複合体
Ｉｘ、Ｉｙ      抗体
Ｘ、Ｙ          タンパク質
１０１    ｐ型Ｓｉ基板
１０２    素子分離酸化膜
１０３    ゲート酸化膜
１０４    ドット体
１０５    シリコン酸化膜
１０６    Ａｌ電極
１０７ａ  第１ｎ型拡散層
１０７ｂ  第２ｎ型拡散層
１０８    層間絶縁膜
１０９    コンタクトホール
１１０    タングステンプラグ
１１１ａ  第１アルミニウム配線
１１１ｂ  第２アルミニウム配線
１３０    基板
１４０    タンパク質
１５０    ナノ粒子−タンパク質複合体
１６０    液体
１７０    ポリペプチド膜
【図１】
0003683265.tif 000004
【図２】
0003683265.tif 000005
【図３】
0003683265.tif 000006
【図４】
0003683265.tif 000007
【図５】
0003683265.tif 000008
【図６】
0003683265.tif 000009
【図７】
0003683265.tif 000010
【図８】
0003683265.tif 000011
【図９】
0003683265.tif 000012
【図１０】
0003683265.tif 000013