(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列を含む乳酸菌検出用ＤＮＡ分子またはその相補的ＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列のうち１番目から100番目までの塩基配列の全部またはその連続する15〜25塩基からなる一部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子またはその相補的ＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち30番目から100番目までの塩基配列の全部またはその連続する15〜25塩基からなる一部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子またはその相補的ＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列のうち少なくとも40番目から57番目までの塩基配列を含む、請求項２または３記載のＤＮＡ分子またはその相補的ＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同定する方法。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、および、少なくとも１種のユニバーサルプライマーを用いて、試料中に存在する微生物の核酸を増幅する工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
検出すべき乳酸菌がビール混濁能を有するものである、請求項５ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
配列番号１に示される塩基配列を含む、乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、乳酸菌の検出に使用できるＤＮＡ分子および該ＤＮＡ分子を用いて乳酸菌を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビールの保存に際して、ビール中に混入した微生物、特にある種の乳酸菌が増殖してビールを混濁させるなどの有害な作用を呈し、その結果、ビールの品質が低下することが従来より問題となっている。
このようなビール有害菌としては、ラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス  カゼイ（L.casei）などいくつかの乳酸菌が指摘されており、これらを迅速に検出または同定するための多くの方法が従来より検討されている。
【０００３】
例えば、抗原抗体反応を用いた方法（特開平4-197167号公報）や、特定のプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法（ASBC Journal.51,63(1993)）などが開発されている。しかしながら、これらの方法は特定の乳酸菌を検出するための技術であり、他の有害菌の検出漏れが生じる可能性があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができない乳酸菌を検出または同定するためのＤＮＡ分子を提供することである。本発明の別の目的は、既知の乳酸菌検出用プライマーで検出できない乳酸菌を迅速に検出または同定する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、既知のプライマーで検出できないある種の乳酸菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を明らかにし、その一部をプライマーとして試料、特にビール中に存在しうる有害な微生物の核酸に作用させたところ、特定の乳酸菌を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、配列番号１に示される塩基配列の一部または全部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子を提供する。また、本発明は、前記のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同定する方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号１に示される塩基配列を含む、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を提供する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の乳酸菌検出用ＤＮＡ分子は、配列番号１に示される塩基配列の一部または全部を含むものである。ここで、「ＤＮＡ分子」とは、２個以上のヌクレオチドを含む分子をいうものとする。配列番号１は、乳酸桿菌Lactobacillus sp. DA1 の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示している。上記Lactobacillus sp. DA1 は、ビール工場から分離された乳酸桿菌であり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年４月22日付けで寄託され、その微生物受託番号は、FERM BP-4652である。上記塩基配列の中から任意の箇所を選択することができるが、配列の塩基数は少なくとも10ｂｐ程度が必要であり、高い検出感度を得るためには、約15〜約25ｂｐであることが好ましい。また、菌に対する選択性を上げるためには、配列番号１に示される塩基配列のうち、可変領域に相当する１番目から100番目までの塩基配列、特に30番目から100番目までの塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡ分子が望ましい。具体例としては、配列番号１に示される塩基配列のうち40番目から57番目までの塩基配列（配列番号２に示す。）を含むＤＮＡ分子が挙げられる。
【０００７】
上記のような塩基配列を含むＤＮＡ分子または該ＤＮＡ分子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出することができる。上記ＤＮＡ分子あるいは上記ＤＮＡ分子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子は、ABI Model 392 and 394 DNA/RNA Synthesizer 操作説明書等に記載の公知の方法に従い化学合成によって作成することができる。
【０００８】
試料中の乳酸菌の検出または同定のためには、上記ＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子を放射性元素、蛍光色素等で標識した後、これをプローブとして試料中に存在する微生物の核酸とハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション法、これらのＤＮＡ分子をプライマーとして用いて、試料中に存在する微生物の核酸を増幅する方法を利用することができるが、検出感度の面からは後者の方法を利用することが好ましい。
【０００９】
以下に、本発明の検出または同定方法の一例について説明するが、この方法は、上記ＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子をプライマーとして用いて、試料中に存在する微生物の核酸を増幅する工程を含むものである。
まず、試料から、メンブレン濾過等の方法で微生物を分離する。試料としては、製品ビール、熟成前の若ビール、回収酵母等の全ての醸造工程サンプル等を挙げることができる。分離した微生物からそのまま、あるいは、分離した後さらに培養増殖させてから、核酸を抽出する。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド、およびこれらの混合物のいずれであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。また、この核酸は、二本鎖および一本鎖のいずれであってもよいが、二本鎖であることが好ましい。ＰＣＲ法を用いれば微量のサンプルでも検出できるので、例えば菌体数が少なくとも20個であれば十分検出可能である。
【００１０】
微生物からの核酸の抽出方法としては、従来知られているいかなる方法を用いても良く、例えば、微生物をガラスビーズで粉砕した後、フェノール／クロロホルムで抽出する方法、溶菌酵素処理による抽出方法、オートクレーブにて溶菌後抽出する方法、界面活性剤処理による抽出方法などを用いることができる。
本発明の上記のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、および、少なくとも１種のユニバーサルプライマーを用いて、抽出された核酸をＰＣＲ法により増幅する。プライマーは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよいが、ＰＣＲ法による核酸の増幅効率を上げるためには、一本鎖であることが好ましい。また、プライマーが二本鎖である場合には、ＰＣＲ法に使用する前にその鎖を分離する処理を行うことが好ましい。ユニバーサルプライマーは全ての細菌に共通な配列を有するプライマーであり、その一例として、Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics John Wiley & Sons Ltd.(1991)P.133 のＴＡＢＬＥ６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシングプライマーを挙げることができるが、それに限定されることはない。下記の表１に、上記文献のＴＡＢＬＥ６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシングプライマーの一部を示す。本発明のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、および、ユニバーサルプライマーの組み合わせは、一方がセンスプライマーで他方がアンチセンスプライマーであるような組み合わせであればよく、例えば、配列番号１に示す１〜100番目の塩基配列の中からセンスプライマーを設定し、表１に示したユニバーサルプライマーのアンチセンスプライマーと組み合わせることができる。このうち、配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ分子と９０７ｒとの組み合わせが好ましい。
【００１１】
【表１】
0003677056.tif 000002
【００１２】
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼは95℃の耐熱性を有するものであればその起源は問わない。ＰＣＲ法の反応条件として、変性温度は90〜95℃、アニーリング温度は40〜60℃、伸長温度は70〜75℃、サイクル数10回以上が好ましいが、これに限定されず、通常ＰＣＲ法に使用できる条件であればよい。
得られた反応生成物は、アガロースゲルを用いた電気泳動法等の検出または同定手段により分離され、増幅産物の有無が確認される。このような方法により、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1、Lactobacillus sp. BG2 、Lactobacillus sp. SE3 と同等な性質、つまり、ビール中で増殖するにもかかわらず、ブレビス等の既知のビール有害乳酸菌プライマーでは検出されない性質の乳酸桿菌を検出または同定することができる。これらの乳酸桿菌は、ビール混濁能を有するものであることがわかっている。従って、本発明の方法により、ビール中に存在する有害な菌を検出または同定することが可能となる。
【００１３】
さらに、本発明の検出または同定方法を従来の検出または同定方法と組み合わせることにより、乳酸菌、特に、ビール混濁能を有する乳酸菌をより完全に検出または同定することができる。
次に本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
〔実施例１〕
乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1、sp. BG2 およびsp. SE3 の調製
市販のビールあるいはビール工場から分離されたヘテロ型発酵乳酸菌のうち、ビール中で増殖可能で、かつ、抗 Lactobacillus brevis JCM1170 血清による抗原抗体反応（特開平4-72570号公報）において反応しない菌株３種を選び、Lactobacillus sp. DA1（以下、「ＤＡ１菌」と記す）、sp. BG2（以下、「ＢＧ２菌」と記す）およびsp. SE3（以下、「ＳＥ３菌」と記す）とした。
【００１５】
〔実施例２〕
ＤＡ１菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定
例１で調製したＤＡ１菌を乳酸菌検出培地Ｍ−ＮＢＢ培地（MBAA Technical Quarterly, 22, 61 (1985))で４日間、25℃で培養した。
菌体培養液１ｍｌを1.5ｍｌ容サンプルチューブに入れ、遠心分離をおこなった。沈殿を回収することにより菌体を集菌した後、滅菌蒸留水100μｌで２回洗浄した。菌体を滅菌蒸留水100μｌに懸濁させ、150μｌのフェノール：クロロホルム（１：１）（以下、「Ｐ／Ｃ」と記す。）と0.4ｇのガラスビーズ（粒径106μｍ以下）の入った1.5ｍｌ容サンプルチューブに加えて、ミキサーで１分間攪拌した。遠心分離して、水層を別チューブに移し、100μｌのＰ／Ｃで再抽出し、水層を得て、これをＤＮＡ抽出液とした。
【００１６】
図１に示した３つのフラグメントＡ、ＢおよびＣを増幅するために、細菌に共通なユニバーサルプライマー（表１参照）を３対（Ａ．２７ｆ（配列番号３）−９０７ｒ（配列番号４）、Ｂ．５３０ｆ（配列番号５）−１３９２ｒ（配列番号６）、およびＣ．１１１４ｆ（配列番号７）−１５２５ｒ（配列番号８））用意した。ＰＣＲ法はGene Amp PCR reagent kit（パーキン  エルマー  シータス社製）を用いて表２の反応液組成でおこなった。反応は、サーマルサイクラーモデル480（パーキン  エルマー  シータス社製）中で、変性を94℃、１分間、アニーリングを50℃、１分間、伸長を72℃、１分間順次おこなう工程を25サイクル繰り返すことにより行った。
【００１７】
【表２】
0003677056.tif 000003
【００１８】
増幅された断片を0.7％アガロースゲルで電気泳動した後切り出し、ＤＮＡＣＥＬＬ（第１科学薬品社製）を用いてゲルから溶出させた。ゲルから溶出させた断片をＰ／Ｃで抽出し、エタノール沈殿により得られたＤＮＡを精製ＤＮＡテンプレートとした。
次に、ＡＬＦ  ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア社製）を用い、ＦＩＴＣで蛍光標識したユニバーサルプライマー（表１参照）を適宜使用して、常法に従い、Ｄｙｅプライマー法によるジデオキシ法により、得られたＤＮＡの配列決定をおこなった。ジデオキシ法はAuto Cycle Sequencing Kit(ファルマシア社製）を用いておこなった。反応液組成、反応条件は表３に  示す。なお、反応はサーマルサイクラー480中でおこなった。
【００１９】
【表３】
0003677056.tif 000004
【００２０】
得られた塩基配列を、配列番号１、並びに、図２〜４に示す。比較のために、キリンビール（株）ビール研究所で決定されたラクトバチルス  ブレビス  Ｌ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号９、並びに、図２〜４に示す。図２〜４は、ＤＡ１菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（上段に示す）およびラクトバチルス  ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（下段に示す）を比較したものである。図２〜４中、線で結んだ部分は、ＤＡ１菌とラクトバチルス  ブレビスＬ６３との間で相同性のある配列部分である。
【００２１】
図２〜４からわかるように、ＤＡ１菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、全体にわたってラクトバチルス  ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と異なっている。特に上流100ｂｐまではかなり異なっている。ラクトバチルス属においては５’末端近辺が可変領域であることが知られている（System Appl. Microbiol.15,123(1992) ）。そこで、ＤＡ１菌の１〜100ｂｐまでの領域について、ジーンバンクに納めれている塩基配列とのホモロジーサーチをおこなったところ、90％以上のマッチングを示すＤＮＡは存在しなかった。従来の、例えばラクトバチルス  ブレビスをターゲットにしたプライマーはこの領域の配列を利用したものであり（例えば、前記ASBC Journalに記載のプライマー（配列番号10））、そのプライマーを用いても本菌を検出できないことが予想される。そのほかの既知の乳酸菌検出用プライマーについても同様である。
【００２２】
〔実施例３〕  配列番号２の塩基配列を有するプライマーの製造
配列番号１に示される塩基配列のうち40番目から57番目までの塩基配列を有するプライマーをABI DNA シンセサイザーモデル392 を用いて合成した。
得られたプライマーの塩基配列を配列番号２に示す。
【００２３】
〔実施例４〕  配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いた乳酸菌の検出および同定
ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ３菌、ラクトバチルス  ブレビス(JCM1170) 、カゼイ(ATCC25303) 、ファーメンタム(JCM1560) およびプランタラム(JCM1149) （これらの菌と同じ種に分類される菌の中に、ビール混濁能を有するものが存在することが報告されている）の各菌をＭ−ＮＢＢ培地で、２〜14日間、25℃で培養した。培養液を例２と同様の方法で処理して、ＤＮＡ抽出液を得た。これについて、例３で製造したプライマー（配列番号２）およびユニバーサルプライマー９０７ｒ（配列番号４）を用いてＰＣＲ法をおこなった。反応条件は例２と同様であった。得られた反応生成物をアガロースゲルによる電気泳動（150Ｖ，１時間）に供した。
【００２４】
その結果、ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ３菌のみに約900ｐｂｓのバンドが検出された。
【００２５】
〔比較例１〕
ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ３菌のＤＮＡ抽出液について、配列表２の塩基配列を有するプライマーの代わりに、ブレビス特異プライマー（配列番号10）、カゼイ特異プライマー（配列番号11）、ファーメンタム特異プライマー（配列番号12）、プランタラム特異プライマー（配列番号13）を用いてＰＣＲ法を行ったほかは、例４の手順を繰り返した。ここで、いずれのプライマーもＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイザーで合成した。
【００２６】
その結果、どのプライマーを用いた場合にも、バンドは確認できなかった。
従って、配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いることにより、既知のプライマーを用いても検出や同定ができないある種の乳酸菌を検出および同定することができることが明らかとなった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができない乳酸菌を検出および同定できるＤＮＡ分子が提供された。
また、本発明により、従来の方法では検出できない乳酸菌を迅速に検出または同定することができるようになった。
さらに、本発明により、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が提供された。
【００２８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１４７５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：乳酸菌
株名：Lactobacillus sp. DA1
配列
CGTTGGCGGC GTGCCTAAAT AACATGCAAG TCGAACGAGG TCTCCTAACT GATAGCTGGT   60
GCTTGCATCA GCTTGACGAT AGATCTGACC GAGTGGCGAA CTGGTGAGTA ACACGTGGGT  120
AACCTGCCCA GAAGAAGGGG ATAACACCTG GAAACAGATG CTAATACCGT ATAACAACGA  180
GAACCACATG GTTCTCGTTT GAAAGATGGC TTTTATGCTA TCGCTTCTGG ATGGACCCGC  240
GGCGTATTAG CTAGTTGGTG AGATAATAGC TCACCAAGGC AATGATACGT AGCAGACCTG  300
AGAGGGTAAT CTGCCACAAT GGGACTGAGA CACGGCCCAT ACTCCTACGG GAGGCAGCAG  360
TAGGGAATCT TCCACAATGG ACGAAAGTCT GATGGAGCAA CGCCGCGTGA GTGAAGAAGG  420
GTTTCGGCTC GTAAAACTCT GTTGTTAGAG AAGAACGACC GTGAGAGCAA CTGCTCACGG  480
TGTGACGGTA TCTAACCAGA AAGTCACGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG  540
TAGGTGGCAA ACGTTGTCCG GATTTATTGG GCGTAAAGCG AGCGCAGGCG GTTTTCTAAG  600
TCTGATGTTG AAACTTCGGC TTAACCGGAG AAGTGCATCG GAAACTGGAT AACTTGAGTG  660
CAGAAAAGGA CAGTGGAACT TCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGATATA TGAAGGAACA  720
CCAGTGGCGA AGGCGGCTGT CTGGTCTGCA TCTGACGCTG AGGCTCGAAA GCATGGGTAG  780
CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAT GCCGTAAACG ATGAATGCTA GGTGTTGGGA  840
GGTTTCCGCC TCTCAGTGCC GCAGCTAACG CATTAAGCAT TCCGCCTGGG GAGTACGACC  900
GCAAGGTTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GACCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT  960
AATTCGATGC TACGCGAAGA ACCTTACCAG GACTTGACAT CTTCTGTTAA CCTAAGAGAT 1020
TAGGTGTCCC CTTCGGGGGC AGAATGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG 1080
TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG TCTTTAGTTG CCAGCATTAA 1140
GTTGGGCACT CTAGAGAGAC TGCCGGTGAT AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA 1200
TCATCATGCC CCTTATGTCC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACGGTA CAACGAGTTG 1260
CGAAACCGCA AGGTCAAGCT AATCTCTTAA AGCCGTTCTC AGTTCGGATT GCAGGCTGCA 1320
ACTCGCCTGC ATGAAGTTGG AATCGCTAGT AATCGTGGAT CAGCATGCCA CGGTGAATAC 1380
GTTCCCGGGT CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGTCG 1440
GTTGGATAAC CTTTACGGAG TCCGCCGCCT AAGGT                            1475
【００２９】
配列番号：２
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＧＴＣＴＣＣＴＡＡＣ  ＴＧＡＴＡＧＣＴ                            １８
【００３０】
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴ  ＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ                        ２０
【００３１】
配列番号：４
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣ  ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ                        １０
【００３２】
配列番号：５
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧ  ＣＣＧＣＧＧ                                １６
【００３３】
配列番号：６
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧ  ＴＧＴＡＣ                                  １５
【００３４】
配列番号：７
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧ  ＣＡＡＣＣＣ                                １６
【００３５】
配列番号：８
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ  ＴＣＣＡＧＣＣ                              １７
【００３６】
配列番号：９
配列の長さ：１５０３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ラクトバチルス  ブレビス
株名：Ｌ６３
配列
GGCATGCCTA ATACATGCAA GTCGAACGAG CTTCCGTTGA ATGACGTGCT TGCACTGATT   60
TCACCAATGA AGCGAGTGGC GAACTGGTGA GTAACACGTG GGAAATCTGC CCAGAAGCAG  120
GGGATAACAC TTGGAAACAG GTGCTAATAC CGTATAACAA CAAAATCCGC ATGGATTTTG  180
TTTGAAAGGT GGCTTCGGCT ATCACTTCTG GATGATCCCG CGGCGTATTA GTTAGTTGGT  240
GAGGTAAAGG CCCACCAAGA CGATGATACG TAGCCGACCT GAGAGGGTAA TCGGCCACAT  300
TGGGACTGAG ACACGGCCCA AACTCCTACG GGAGGCAGCA GTAGGGAATC TTCCACAATG  360
GACGAAAGTC TGATGGAGCA ATGCCGCGTG AGTGAAGAAG GGTTTCGGCT CGTAAAACTC  420
TGTTGTTAAA GAAGAACACC TTTGAGAGTA ACTGTTCAAG GGTTGACGGT ATTTAACCAG  480
AAAGCCACGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGTGGCA AGCGTTGTCC  540
GGATTTATTG GGCGTAAAGC GAGCGCAGGC GGTTTTTTAA GTCTGATGTG AAAGCCTTCG  600
GCTTAACCGG AGAAGTGCAT CGGAAACTGG GAGACTTGAG TGCAGAAGAG GACAGTGGAA  660
CTCCATGTGT AGCGGTGGAA TGCGTAGATA TATGGAAGAA CACCAGTGGC GAAGGCGGCT  720
GTCTAGTCTG TAACTGACGC TGAGGCTCGA AAGCATGGGT AGCGAACAGG ATTAGATACC  780
CTGGTAGTCC ATGCCGTAAA CGATGAGTGC TAAGTGTTGG AGGGTTTCCG CCCTTCAGTG  840
CTGCAGCTAA CGCATTAAGC ACTCCGCCTG GGGAGTACGA CCGCAAGGTT GAAACTCAAA  900
GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAA GCTACGCGAA  960
GAACCTTACC AGGTCTTGAC ATCTTCTGCC AATCTTAGAG ATAAGACGTT CCCTTCGGGG 1020
ACAGAATGAC AGGTGGTGCA TGGTTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGT 1080
CCCGCAACGA GCGCAACCCT TATTATCAGT TGCCAGCATT CAGTTGGGCA CTCTGGTGAG 1140
ACTGCCGGTG ACAAACCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA AATCATCATG CCCCTTATGA 1200
CCTGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGACGG TACAACGAGT CGCGAAGTCG TGAGGCTAAG 1260
CTAATCTCTT AAAGCCGTTC TCAGTTCGGA TTGTAGGCTG CAACTCGCCT ACATGAAGTT 1320
GGAATCGCTA GTAATCGCGG ATCAGCATGC CGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA 1380
CACCGCCCGT CACACCATGA GAGTTTGTAA CACCCAAAGC CGGTGAGATA ACCTTCGGGA 1440
GTCAGCCGTC TAAGGTGGGA CAGATGATTA GGGTGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTAGGA 1500
GAA                                                               1503
【００３７】
配列番号：１０
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧ  ＡＧＣＴＴＣＣ                              １７
【００３８】
配列番号：１１
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧ  ＧＴＣＧＧＣ                                １６
【００３９】
配列番号：１２
配列の長さ：１１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧ  ＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧ  Ｔ                    １１
【００４０】
配列番号：１３
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
ＴＡＣＣＣＧＣＡＴＡ  ＡＣＡＡＣＴＴＧＧ                      １９
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１６ＳｒＤＮＡ；ユニバーサルプライマー２７ｆおよび９０７ｒを用いて増幅される断片Ａ；ユニバーサルプライマー５３０ｆおよび１３９２ｒを用いて増幅される断片Ｂ；およびユニバーサルプライマー１１４ｆおよび１５２５ｒを用いて増幅される断片Ｃの模式図である。
【図２】図２は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およびラクトバチルス  ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較したものである。
【図３】図３は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およびラクトバチルス  ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較したもの（図２の続き）である。
【図４】図４は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およびラクトバチルス  ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較したもの（図３の続き）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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