(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原としての分子量約６０ｋｄと６５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントと、検体中の抗変性低密度リポ蛋白抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前記検体中の抗変性低密度リポ蛋白抗体を測定する方法。
【請求項２】
前記変性アポＢ蛋白フラグメントは、金属イオンにより変性されたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記金属イオンは銅イオンである請求項２記載の方法。
【請求項４】
分子量が２０ｋｄないし５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントを抗原としてさらに用いる請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記免疫測定法がウェスタンブロット法である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記免疫測定法が酵素免疫測定法である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
分子量約６０ｋｄと６５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントを含む、抗変性低密度リポ蛋白抗体測定試薬。
【請求項８】
前記変性アポＢ蛋白フラグメントは、金属イオンにより変性されたものである請求項７記載の試薬。
【請求項９】
前記金属イオンは銅イオンである請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
分子量が２０ｋｄないし５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントをさらに含む請求項７ないし１０のいずれか１項記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症の臨床診断に有用な、変性低密度リポ蛋白（以下、「 変性ＬＤＬ」ということがある）に対する抗体の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症は血中のＬＤＬが変性を受け、マクロファージに取り込まれて血管壁に沈着することが要因といわれている。血中には同時に変性ＬＤＬに対する抗体が出現しこの抗変性ＬＤＬ抗体を検出することは各種動脈硬化症の進行の程度を検査する上で臨床上有用な指標の１つとして注目されている（CLIN., CHEM., 40, 882, 1994)。
【０００３】
しかし、抗変性ＬＤＬ抗体の検出は欧米にて僅かに報告されているに過ぎない（CLIN., CHEM., 40, 882, 1994 及びArterioscular Thromb., 14, 1892, 1995)。それらの抗変性ＬＤＬ抗体の検出は、ヒト血中から超遠心分離機により分離したＬＤＬを酸化変性させた変性ＬＤＬを使用する酵素免疫測定法による検出法であったが、この方法で得られた変性ＬＤＬは不安定で、臨床試料を検体とした抗変性ＬＤＬ抗体の検出に利用した場合、一定した検出結果を得ることができず実用的ではなかった。従来これより他に抗変性ＬＤＬ抗体の検出法に関する報告もなく、抗変性ＬＤＬ抗体の検出の有用性を確認し、臨床検査の分野に普及することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、検体中の抗変性ＬＤＬ抗体を精度良く検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、抗原として変性ＬＤＬを用いるのではなく、変性ＬＤＬを構成する蛋白成分である変性アポＢ蛋白の特定のフラグメントを用いて検体中の抗変性ＬＤＬ抗体と抗原抗体反応を行わせることにより、検体中の抗変性ＬＤＬ抗体を精度良く測定することができることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、抗原としての分子量約６０ｋｄと６５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントと、検体中の抗変性低密度リポ蛋白抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前記検体中の抗変性低密度リポ蛋白抗体を測定する方法を提供する。また、本発明は、分子量約６０ｋｄと６５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントを含む、抗変性低密度リポ蛋白抗体測定試薬を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法により測定される抗変性ＬＤＬ抗体は、マクロファージに取り込まれて血管壁に沈着する、動脈硬化症の原因となる変性ＬＤＬに対する抗体である。従って、本発明の方法に供される検体は、必ずしも限定されるわけではないが、通常、血液又は血清若しくは血漿のような血液成分である。
【０００８】
本発明の方法には、抗原として変性アポＢ蛋白フラグメントが用いられる。アポＢ蛋白及びアポＢ蛋白フラグメント自体はこの分野において周知であり、これらはＬＤＬを構成する成分である。アポＢ蛋白は周知の脱脂操作（新生化学実験講座、4, 257, 1993)によりＬＤＬから抽出することができる。また、アポＢ蛋白フラグメントは、ＬＤＬをゲル濾過クロマトグラフィー（蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂２版、232, 1994)やＳＤＳ電気泳動操作（新生化学実験講座、4, 229, 1993)にかけることにより分離することができる。アポＢ蛋白フラグメントとしては複数のものが存在するが、ＳＤＳ電気泳動により分離される分子量約６０ｋｄと６５ｋｄのフラグメント、及びこれらに加えてさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量５ｋｄ〜２０ｋｄの画分を回収することにより回収されるフラグメントを好ましく用いることができる。
【０００９】
本発明の方法において抗原として用いられるアポＢ蛋白フラグメントは、変性されたものである。変性処理は、アポＢ蛋白又はアポＢ蛋白フラグメントをＬＤＬから分離した後に行うこともできるし、まず、ＬＤＬを変性処理した後、該変性ＬＤＬから変性したアポＢ蛋白又はアポＢ蛋白フラグメントを分離することもできる。変性処理は、ＬＤＬ又はアポＢ蛋白もしくはアポＢ蛋白フラグメントを、公知の方法（Arterioscular Thromb., 14, 1892, 1995)により、金属イオン、活性酸素、過酸化水素、紫外線又は酸化酵素で処理することにより行うことができる。
【００１０】
ここで、変性処理に用いられる金属イオンとしては、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオン、鉛イオンなどを挙げることができ、これらのうち銅イオンが特に好ましい。銅イオンで処理する場合、処理されるＬＤＬ又はアポＢ蛋白若しくはアポＢ蛋白フラグメントの濃度は特に限定されないが、３０〜３００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、また、銅イオン濃度は、特に限定されないが１０〜１００μＭ程度が好ましい。また、処理温度は、特に限定されないが２０〜４０℃程度が好ましく、反応時間は１〜１８時間程度が好ましい。
【００１１】
紫外線により蛋白の変性を行う場合、処理されるＬＤＬ又はアポＢ蛋白若しくはアポＢ蛋白フラグメントの濃度は特に限定されないが、３０〜３００μｇ／ｍｌ程度が望ましく、紫外線はＵＶランプ下で１〜１８時間程度が好ましい。
【００１２】
酸化酵素により変性を行う場合には、酸化酵素としてはペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ等を挙げることができる。特にペルオキシダーゼが好ましく、処理されるＬＤＬ又はアポＢ蛋白若しくはアポＢ蛋白フラグメントの濃度は特に限定されないが、３０〜３００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、ペルオキシダーゼ活性は特に限定されないが１００〜１０００Ｕ／ｌ程度で２０〜４０℃にて１〜１８時間程度の処理時間が好ましい。
【００１３】
上記の変性アポＢ蛋白フラグメントを抗原として用い、検体中の抗変性ＬＤＬ抗体を測定する。変性アポＢ蛋白フラグメントと抗変性ＬＤＬ抗体との反応は抗原抗体反応であるから、周知の免疫測定法のいずれによっても検体中の抗変性ＬＤＬ抗体を測定することができ、免疫測定法の態様は全く限定されるものではない。すなわち、反応形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等のいずれであってもよく、また、標識で分類すれば酵素免疫法、放射免疫法、蛍光法等のいずれであってもよい。これらの免疫測定方法自体はこの分野において周知である。周知のように、免疫測定法により、標的物質の検出および定量の両方が可能であるから、本発明で言う「測定」には存在の検出と定量の両者が包含される。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
ヒト血清６ｍｌを分画超遠心法（新生化学実験講座、4, 181, 1993) に従って２ｍｌのＬＤＬ分画を分離し、１００μＭの硫酸銅存在下で３時間、酸化的に変性させて変性ＬＤＬを得た。得られた変性ＬＤＬをエタノール／エーテルにより公知の方法（新生化学実験講座、4, 257, 1993) に従って脱脂し、１ｍｇの変性アポＢ蛋白を得た。得られた変性ＬＤＬ及び変性アポＢ蛋白の各々１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（新生化学実験講座、4, 229, 1993) に従って３０ｍＡの一定電流で泳動し、泳動後、泳動ゲル中の蛋白質を１ｍＡ／ｃｍ2 の一定電流でポリビニルジフェニル膜に転写した。転写膜に試料を満たし１８時間反応させ、洗浄後にペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を２時間反応させ、洗浄後にジアミノベンチジン及び過酸化水素水を満たして抗変性ＬＤＬ抗体を検出した。
【００１６】
その結果を図１に示す。図１に示されるように、従来の変性ＬＤＬ同様、本発明の変性アポＢ蛋白を使用する方法においても、抗変性ＬＤＬ抗体は同一な約６０ｋｄ及び６５ｋｄの２つのフラグメントと結合するものとして検出された。このことは、本発明により従来と同一な抗変性ＬＤＬ抗体が検出できることを示すとともに、分子量約６０ｋｄ及び６５ｋｄの変性アポＢ蛋白フラグメントが抗変性ＬＤＬ抗体検出の指標として有用であることを示している。
【００１７】
実施例２
実施例１と同様な方法で得た変性ＬＤＬをスーパーロース６ＨＲカラム（ファルマシア社製）にて常法（蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂２版、232, 1994)に従ってゲル濾過を行い、分子量２０〜５ｋｄの分画０．５ｍｌを変性アポＢ蛋白フラグメントとして得た。得られた変性アポＢ蛋白フラグメント及び実施例１で得られた変性ＬＤＬ及び変性アポＢ蛋白の各々を９６穴マイクロプレートに２μｇ／穴となるように加え、４℃で２４時間放置後、０．０５％Tween20 （商品名）添加リン酸緩衝液で洗浄後、試料（健常人又は動脈硬化症患者の血清）を１００μｌ加えて室温３０分間反応させた。反応後、洗浄を繰り返し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリ抗体を１００μｌ加えて室温で３０分間反応させた。洗浄後、トリメチルベンチジン過酸化水素水を加えて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１８】
結果を図２に示す。図２は変性ＬＤＬを使用する従来法に比して変性アポＢ蛋白蛋白又は変性アポＢ蛋白フラグメントを使用した本発明による方法が試料中の抗変性ＬＤＬ抗体を動脈硬化症患者と関連付けて検出できることを示しており、本発明が臨床試料を検体とした変性ＬＤＬ抗体検出に有効であることを示している。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、抗変性ＬＤＬ抗体を精度良く検出できる方法及びそのための試薬が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例におけるウェスタンブロット法の結果を示す図である。
【図２】健常人及び動脈硬化症患者の血清を検体とし、本発明に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検体中の抗変性ＬＤＬ抗体を測定した結果を示す図である。
【図１】
0003706193.tif 000002
【図２】
0003706193.tif 000003