(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンより選ばれる一以上のペルフルオロカーボンを含む液体分散相及び水性連続相を有し、さらに蛋白質、ポロキサマー（poloxamer）、リン脂質及びフッ素含有活性剤より選ばれる両親媒性物質を有し、当該分散相の濃度が水性連続相に対する相対比率で0.05〜5.0重量／容量％であり、両親媒性物質の濃度が0.001〜6.0重量／容量％である液／液エマルジョンを含む、安定な生体適合性超音波造影剤。
【請求項２】
ペルフルオロカーボンがペルフルオロプロパン又はペルフルオロペンタンである請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項３】
ペルフルオロカーボンがペルフルオロプロパンである請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項４】
ペルフルオロカーボンがペルフルオロブタンである請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項５】
ペルフルオロカーボンがペルフルオロペンタンである請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項６】
両親媒性物質が、液体分散相に適合した相対HLBを有する、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項７】
両親媒性物質が、生体適合性蛋白質からなる、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項８】
両親媒性物質が、少なくとも一つの界面活性剤を含む、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項９】
蛋白質が、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブリン、血清グロブリン、ヘモグロビン、ミオグロビン及びイムノグロブリンからなる群から選択される、請求項７に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１０】
両親媒性物質が、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオン性ブロックポリマーからなる、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１１】
両親媒性物質が、フッ素含有界面活性剤からなる、請求項６に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１２】
分散液が、ビスコーゲンを更に含有する、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１３】
ビスコーゲンが、グルコース、イオヘクソール（iohexol）、イオパミドール（iopamidol）、イオペントール（iopentol）、ソルビトール、シュクロース及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項12に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１４】
ビスコーゲンが、1.1cP以上の粘性を生成するのに十分な濃度で存在する、請求項12に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１５】
ビスコーゲンが、0.001〜75重量／容量％の濃度で存在する、請求項12に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１６】
液体分散相が、1000nm以下の平均径を有する粒子を含む、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１７】
水性媒質が、酸性化剤、アルカリ性化剤、抗菌性保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート化剤、錯化剤、溶解剤、湿潤剤、溶媒、懸濁剤、粘性増強剤及び張性剤から選択される添加剤を含む、請求項１に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１８】
添加剤が、水性媒質のモル浸透圧（osmolarity）が少なくとも250mOmである濃度で存在する、請求項17に記載の生体適合性超音波造影剤。
【請求項１９】
ペルフルオロヘキサンを含む液体分散相及び水性連続相を有し、更に蛋白質、ポロキサマー、リン脂質及びフッ素含有活性剤より選ばれる両親媒性物質を有し、当該分散相の濃度が水性連続相に対する相対比率で0.05〜5.0重量／容量％であり、両親媒性物質の濃度が0.001〜6.0重量／容量％である液／液エマルジョンを含む、動物の超音波造影に使用するための生体適合性超音波造影剤。
【請求項２０】
次の工程：
（１）  請求項１に記載の安定な生体適合性を有する造影剤を調製すること；
（２）上記分散液を造影すべき動物に投与し、当該液体分散相がミクロバブルを形成するのに十分な時間維持すること；そして
（３）上記ミクロバブルが分布されている動物の部位に超音波をスキャンすること；
からなる、非ヒト動物における超音波造影方法。
【請求項２１】
液体分散相が、脂肪族炭化水素、有機ハロゲン化合物及び６又はそれ以下の炭素原子を有するエーテルよりなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
次の工程：
（ａ）  少なくとも一つの両親媒性物質を水と混合して水性連続相を形成すること；
（ｂ）  40℃未満の沸点を有する液体を当該連続相に添加すること；
（ｃ）  手で、機械的に又は超音波の作用によって、5000nm未満の平均径の粒子の液／液エマルジョンを形成するのに十分な時間、混合物を細分化すること；
からなる、請求項１に記載の安定な生体適合性超音波造影剤の製造方法。
【請求項２３】
次の工程：
（ａ）  少なくとも一つの両親媒性物質を水と混合して水性連続相を形成すること；
（ｂ）  40℃未満の沸点を有する所定量の気体を当該連続相に添加し；そして
（ｃ）  上記気体を凝縮して平均径5000nm未満の粒子の分散相を有する液／液コロイド分散液を形成すること；
からなる、請求項１に記載の安定な生体適合性超音波造影剤の製造方法。
【請求項２４】
次の工程：
（ａ）  請求項１に記載の安定な生体適合性を有する造影剤を調製すること；
（ｂ）  上記分散液を造影すべき非ヒト動物に投与すること；そして
（ｃ）  上記ミクロバブルが分布されている動物の部位に超音波をスキャンすること；
からなる、動物における超音波造影方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、1993年１月25日に出願された係属中の出願であるS.N.08/008,172号の一部継続出願である、1993年11月８日に出願された係属中の出願であるS.N.08/148,284号の一部継続出願である。
発明の関連分野
本発明は、生物医学的な利用を目的とした、水性コロイド分散液から成る造影剤に関する。特に、本発明は液体−液体乳濁液に関し、乳濁液中に分散された液体が温度あるいは圧力によって誘起される、分散液から分散気体への相転移（phase  shift）を受けて、医療診断上有益な方法で超音波エネルギーを反射するのに効果的な分散気体の形に変換されることに関する。
発明の背景
エコー心電図検査法（echocardiography）を含めた超音波診断で利用される造影剤が多数報告されている。このような主題についての総説が、Ophir  and  Parker,Ultrasound  in  Med.＆  Biol.（1989）,15:319−333に見い出される。コントラスト効果に密接に関連する性質である、これらの薬剤から生じる音波の逆散乱は、それらの薬剤が、固体、液体、あるいは気体として所有している特有の性質に帰することが出来る。固体と液体は音波を同じ程度に反射するが、気体はもっと効果的に反射することが知られており、超音波造影剤の開発のための好適な媒体である。
超音波用の既知の液体造影剤には乳濁液と水溶液が含まれている。これらについて、上記の総説の著者らは以下のように述べている。「水性基剤中のある種の脂質からなる液体乳濁液を用いるというアイディアはフィンク（Fink）らによって試験された（1985年）。しかし、残念ながらこれらの実験では逆散乱の増強は全く観測されなかった。」
既知の固体造影剤としてはコラーゲンミクロスフェアがある。しかしながら、固体−液体界面の音波の逆散乱の弱さが、それらの広範な利用を妨げている。
既知の気体造影剤としては、水性媒質中に、種々の両親媒性物質を添加することによって、あるいは、粘性を増大する物質、および固体粒子あるいはリポゾームとしての気体前駆体によって、安定化された微小気泡（microbubbles）がある。しかしながら、リポゾームは水溶性の気体しか含有できず、そのため、形成される微小気泡の安定性に限度がある。というのは、特に安定な微小気泡を形成する化学薬品の多くの特徴的な物理的性質の一つは、水に不溶解性であることであるからである。固体粒子は、使用直前に再調製しなければならないが、大量の調製が必要であり、微小気泡は、固体粒子が完全に溶解してしまうとすぐに消滅してしまうことから、素早く使用しなければならない。本発明者自身の先の米国出願S.N.07/761,311は超音波造影剤としての気体の相対的な有用性を決定する方法に関するものであり、そしてその目的にかなった特に有用な気体を確認している。
超音波ドップラーシグナルの強度を増強するために、研究中の生物の体温以下の温度で沸騰する液体の注入を利用した研究が示されている（Ziskin  MC,Bonakdarpour  A,Weinstein  DP,Lynch  PR:Contrast  Agents  For  Diagnostic  Ultrasound.Investigative  Radiology  7:500−505,1972）。この研究においては、多数の溶液あるいは液体が犬に対して動脈内に注入された。そしてドップラーシグナルが注入部の5cm内側で測定された。この研究は以下のように報告している。「我々が調べた薬剤のうち最も大きな造影効果をもたらしたエーテルは、体温で激しく沸騰する液体であり、従って、気泡の非常に活発な発生源として作用している。」報告はさらに次のように述べている。「しかしながら、エーテルは大量に注入されると有毒である。我々の実験では20mLの注入が致命的であった。」この論文は、それ以上の超音波造影剤としての利用に適した、物質の安定化方法については論議していない。非コロイド状エーテルは、有効な造影剤の必要性が最も大きい静脈内投与のためには有毒であり過ぎる。
フルオロカーボン類を含む乳濁液の生体適合性は重大な安定性に関する事項である。例えば、Clarkらは、フルオロカーボンの選択に関する記述の中で以下のように述べている（Clark  LC,Becattini  F,Kaplan  S:Can  fluorocarbon  emulsions  be  used  as  artificial  blood?（フルオロカーボン乳濁液は人工血液として使用可能か？）Triangle  11:115−122,1972）。「フルオロカーボン類の蒸気圧は０から約640torrの範囲にある。勿論、400torr以上の蒸気圧を持つものは、血流中に注入されたときに沸騰するので使用できない。」そして、同じ論文中の後の方で彼らは「50torr以上の蒸気圧を持つフルオロカーボンが静脈内に与えられると数時間のうちに死亡し、胸を開いても肺はつぶれない。」と述べている。同じ著者のL.C.Clarkは20年後に同じような結論を報告している。「HNCL（hyperinflated  non−collapsible  lungs,過剰膨張非崩壊肺）を防ぐか和らげる実用的な方法が見い出せず、他の動物でHNCLが起こるなら、150℃以上で沸騰するフルオロカーボン類だけが安全であると考えられる。」（Clark  CL,Hoffmann  RE,Davis  SL:Response  of  the  rabbit  lung  as  ａ  criterion  of  safety  for  fluorocarbon  breathing  and  blood  substitutes（フルオロカーボン呼吸および血液代用品に対する、安全性の基準としてのうさぎの肺の応答）Biomat.,Art.Cells  ＆  Immob.Biotech.,20:1085−1099,1992）
液体−液体乳濁液の安全性はもう一つの問題を提起する。乳濁液の安定性および溶解性から安定性を予測する能力について多くの知見が蓄積されている。そして後者の予測理論はオストワルドの熟成理論（Ostwald  ripening  theory）と呼ばれている（Kabalnov  AS,Shchukin  ED;Ostwald  Ripening  Theory:Applications  To  Fluorocarbon  Emulsion  Stability（オストワルド熟成理論：フルオロカーボン乳濁液の安定性に対する適用）,Advances  in  Colloid  and  Interface  Science,38:69−97,1992）。この論文は、簡単にいうと、乳濁液の分散相液体が連続相に溶けやすければ溶けやすいほど、乳濁液はそれだけ不安定になるということを述べている。同じ著者らは25℃におけるドデカフルオロペンタン乳濁液の安定性を試験した（Kabalnov  AS,Makarov  KN,Shcherbakova  OV:Solubility  of  fluorocarbons  in  water  as  ａ  key  parameter  determining  fluorocarbon  emulsion  stability（フルオロカーボン乳濁液の安定性を決定するキーパラメーターとしてのフルオロカーボン類の水への溶解度）,J.Fluorine  Chemistry,50:271−284,1990）。彼らは、それらの乳濁液が1.4×10-18cm3/sのオストワルド熟成速度を有することを決定した。この速度定数を有用な用語になおすと、211nmの初期サイズであったKabalnovらのドデカフルオロペンタン乳濁液が、11nm/秒あるいは660nm/分の粒子の平均径増大速度を得ることを示している。このような粒子成長速度では、乳濁液は１分以下の貯蔵寿命しかなく、したがってコマーシャル製品としては役に立たないものである。
かくして、比較的製造しやすく、生体適合性があり、そして、使用しやすく、長い貯蔵寿命をもった効果的な超音波造影組成物に対する要求が出てきた。
発明の要約
これらの要求に応じるために、本発明は液−液型の安定なコロイド分散液に関する。該コロイドは、超音波造影研究の対象とされている生物の体温、典型的には約37−40℃の温度以下の沸点を有する液体分散相からなっている。これらの乳濁液は好ましくは、−20から37℃の間の沸点を有する分散相液体からなっている。
好ましくは、液体分散相は、炭素原子数が６あるいはそれ以下で、分子量の上限が約300である、脂肪族炭化水素、有機ハロゲン化物、エーテル、あるいはそれらの組合せからなる化学薬品の群から選択される。有機ハロゲン化物の中では、安定な乳濁液を形成できること、そして、比較的毒性がないことからフッ素含有化学薬品が好ましい。特に、ｎ−ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、シクロペンタン、ブタン、シクロブタン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、ドデカフルオロネオペンタン、パーフルオロシクロペンタン、およびそれの混合物が好ましい。好ましくは、コロイド分散液は、該分散相を0.05から5.0％  w/vの濃度で含有している。最も好ましくは、該濃度範囲は0.5から3.5％  w/vである。
該コロイド分散液は、分散液体と水との間の界面張力を26ダイン/cm以下に低下できる陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、および両性イオン界面活性剤を含む各種の両親媒性物質を加えることによって安定化される。最も好ましくは、これらの物質は商標名ゾニル（Zonyl）で表されるシリーズおよびポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオン性ブロックコポリマーのようなフッ素含有界面活性剤を含む、非イオン性合成界面活性剤の混合物である。
該コロイド分散液の液体連続相は水性媒質を含んでいる。該媒質は、分散相の安定化あるいは製剤を生体適合性にさせのに役立つ種々の添加剤を含むことができる。容認できる添加剤には、酸性化試薬、アルカリ性化試薬、抗菌性保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート化剤、イオヘゾール（iohexol）あるいはイオパミドール（iopamidol）のようなトリヨードベンゼン誘導体を含む懸濁化および／または粘性増加剤、および張性剤などが含まれている。好ましくは、pHを調節する試薬、張性を調節する試薬および粘性を増大させる試薬が含まれている。最も好ましくは、少なくとも250mOsmの張性が、ソルビトールあるいはスクロースのように、同時に粘性も増大させる試薬によって達成されることである。
コロイド分散液は、連続相中の分散相の懸濁液を、機械的エネルギー、手動エネルギー、あるいは音波エネルギーを適用することによってさらに細分化することによって、典型的に形成される。連続相中へ分散相を凝縮することも利用することができる。好ましい方法は高圧による細分化を利用することである。
発明の詳細な説明
本発明は、医学的診断および家畜診断に利用するために生じさせた超音波影像におけるコントラストを増強する試薬に関する。当該試薬は生体適合性コロイド分散液からなり、その分散液中の分散相が、その製造プロセスの条件下では液体であり、目的の生物に投与する時点、あるいはその近辺で相転移を受けて分散気体あるいは球状泡に変化する。
以下の学術用語に与えられた範囲を含め、本発明および特許請求の範囲の明確かつ充分な理解をもたらすために、本発明に関連する以下の定義が与えられている：
コロイド分散液：分散媒質あるいは連続液体相を形成している少なくとも一種の第二の物質に不溶性であり、微細に分割され、そして全体に平均に分布されている液体あるいは気体（分散相）としての少なくとも第一の物質を有する系。
生体適合性：過度な毒性または生理学的影響や薬理学的影響なしに、生きている生物体内あるいは生物体上で生物体に受容される方法でその機能をはたすことができること。
液体：含まれている一種あるいは複数の物質が、特有の流動容易性を示し、分散傾向は殆どあるいは全く示さず、そして比較的高い非圧縮性を示す物体の状態。
気体：非常に低い密度、非常に低い粘度、温度や圧力の変化に伴う比較的大きな膨張および収縮、そしてどんな容器にも全体に一様に分布される自然な性質によって固体状態や液体状態から区別される一種または複数の物質からなる物体の状態。
相転移（Phase  Shift）：温度および／または圧力の変化による液体と気体の間の状態の変化。
球状泡（Kugelschaum）:Manegoldの分類による二つの形の泡のうちの一つ（Manegold,E.「Schaum,Strassenbau,Chemie  und  Technik（泡、通路組織、化学および技術）」Heidelberg,1953、詳しくは文献による）。特に、球状泡あるいは球形の泡は大きく隔てられた球形の泡からなっており、多面体に近い形で、分散相を隔てているゆるい曲面の薄膜（lamellar  films）を有する泡からなる多面体状泡（polyederschaum）あるいは多面体形の泡から区別される。
低沸点液体：標準の圧力状態下で、40℃以下の沸点をもつ液体。本発明で有用な低沸点液体は炭化水素、有機ハロゲン化物、およびエーテルを含み、いずれの場合も炭素原子数６あるいはそれ以下の分子であるが、それらに限定されるものではない。
脂肪族炭化水素：アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、およびシクロアルケン類有機化合物の群。これらのうちで約40℃以下の沸点を持つ化合物（６あるいはそれ以下の炭素原子を持つ化合物）だけであり、そして、この発明の一部を形成する目的物への投与ののち、液体から気体への相転移を受けることの出来る化合物である。本発明で有用な脂肪族炭化水素は、それらに限定されるものではないが、以下の化学薬品の群から選択された化合物を含んでいる：イソブタン；イソブチレン;1−ブテン;1,3−ブタジエン;n−ブタン;2−ブテン｛トランス｝;2−ブテン｛シス｝；ビニルアセチレン;1−ブチン；ネオペンタン；ブタジイン;1,2−ブタジエン；シクロブタン;1−ブテン,3−メチル；シクロプロパン,1,1−ジメチル;1,3−ジオキソラン−２−オン,4−メチル;3−ブテン−２−オン,4−フェニル｛トランス｝;1,5−ヘプタジイン;1,4−ペンタジエン;2−ブチン；ブタン,2−メチル；シクロプロパン,1,2−ジメチル｛トランス,dl｝;1−ブチン,3−メチル;1−ペンテン;1−ブテン,2−メチル;1,3−ブタジエン,2−メチル;1−ブテン−３−イン,2−メチル；イソプレン；シクロプロパン，エチル;n−ペンタン；シクロブタン，メチル;2−ペンテン｛トランス｝;2−ペンテン｛シス｝；シクロプロパン,1,2−ジメチル｛シス｝；および１−ノネエン−３−イン。
有機ハロゲン化物：少なくとも１つの炭素原子あるいは硫黄原子を含有し、そして少なくとも１つのハロゲン原子、即ち、塩素、臭素、フッ素、あるいはヨウ素を含有している化合物の群。これらのうち、約40℃以下の沸点を持つ群のメンバー（６あるいはそれ以下の炭素原子を持つメンバー）だけであり、本発明の一部を形成する40℃までの体温を有する生物への投与により、相転移を受けることのできるメンバーである。このような有機ハロゲン化物の例は以下の化合物を含む：メタン，テトラフルオロ；メタン，クロロトリフルオロ；エタン，ヘキサフルオロ；エタン，ペルフルオロ；メタン，フルオロ；エチレン，テトラフルオロ；サルファヘキサフルオリド；メタン，ブロモトリフルオロ；メタン，ジフルオロ；および類似化合物。
エーテル:2つの炭化水素基あるいはそれらの誘導体が酸素原子によって連結されている有機化合物のクラス。本発明の目的のために、以下の化合物が利用できるエーテルの例であるが、これが全てではない：メチルエーテル、エチルメチルエーテル、メチルビニルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、1,2−エポキシプロピルエーテル、ジエチルエーテル、エチルビニルエーテル、およびビニルエーテル。
フッ素含有化合物：少なくとも１つのフッ素原子を含有する化合物。有用なフッ素含有化合物は有機ハロゲン化物として上記されている。後記の実施例にも示されている。
本発明のコロイド分散液は、乳濁液（emulsion）あるいはミクロ乳濁液（microemulsion）があげられる。
乳濁液（Emulsion）：他の液体中に分散された不溶性の液体のコロイド分散液であって、小滴の形をなし、その直径は、一般に、100nmと3000nmの間であり、分散相と連続相の屈折率が、一致していなければ典型的には光学的に不透明である。このような系は、その応用あるいは相当する関連の系によって一般的に明らかにされているように、両親媒性物質や粘度増強剤を添加することによって増強される限定された安定性しか持っていない。
ミクロ乳濁液（Microemulsion）：両親媒性物質にって安定化された水と水不溶性の液体からなる、安定な液体状の単相および光学等方性のコロイド分散液であり、感知できる程度の光散乱性を有し（光学的には透明あるいは乳状であるが透過光で見ると赤色を帯びているか黄色味がかっていることを意味している）、粒子の直径は、一般に、5nmと大体140nmの間である。
本発明の好ましい具体例において、コロイド分散液は安定性を改善するために１種あるいはそれ以上の両親媒性物質を含有している。
両親媒性物質：界面に強く吸着され、通常は界面張力を極端に減少させるがバルク相の濃度には小さな変化しかもたらさない物質。例としては、以下の物質が含まれる。合成界面活性剤；生体適合性蛋白質，脂質，ステロール，アルギン酸，セルロース誘導体のような天然物質；および微細に分割された有機あるいは無機の微粒子。
有機微粒子固体：糖類、蛋白質類、アミノ酸類、脂質類、核酸類、その他が含まれる。
無機微粒子固体：アルミナ、炭酸塩、重炭酸塩、珪酸塩、アルミナ珪酸塩、リン酸塩、その他が含まれる。
界面：物体の２つの別個で確認できる相の間に存在する物理学的な領域あるいは境界であり、ここでは、液体−液体、液体−固体、固体−気体、および液体−気体に限定する。
界面張力：物体の２つの別個で確認できる相の間の界面に存在する長さ当りの力。
安定性：最初に調製し、包装してから、コロイド分散液が、特定の政府の規制機関によって公にされているGood  Manufacturing  Practiceの指針に従って確立されている同一性、強度、質、および純度に関して全ての化学的および物理学的明細を満足し続けている期間の時間経過である。
界面活性剤：化学的過程で製造されるかあるいは天然の起源あるいは過程から精製される両親媒性物質の群である。これらは、この技術分野でよく知られているように、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および両性イオンであり得る。このように物質は、Emulsion:Theory  and  Practice（乳濁液：理論と実際）,Paul  Becher,Robert  E.Krieger  Publishing（出版社）,Malabar,Florida,1965、に報告されており、詳しくは文献による。
本発明のコロイド分散液の連続相は水性媒質である。
水性媒質：酸性化試薬、アルカリ性化試薬、抗菌性保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート化剤、錯化剤、可溶化剤、湿潤剤、溶剤、懸濁化および／または粘性増加剤、張性剤、加湿剤、あるいはその他の生体適合性物質のような薬理学的に容認できる添加物を含有することが出来る水含有液体である。以上のカテゴリーにしたがって目録化された成分表は、U.S.Pharmacopeia  National  Formulary（米国薬局方国家処方集）,1990,pp.1857−1859に見ることができ、詳しくは文献による。
本発明の好ましい具体例は、生体適合性蛋白質、フッ素含有界面活性剤、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオン性ブロックコポリマー、および界面活性剤からなる群から選ばれた少なくとも１種の両親媒性物質を利用することを含む。
ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオン性ブロックコポリマー:BASF  Performance  Chemicals,Parsippany,New  Jerseyから商標名Pluronicとして利用できる界面活性剤、およびpoloxamer  108、188、217、237、238、288、338、407、101、105、122、123、124、181、182、183、184、212、231、282、331、401、402、185、215、234、235、284、333、334、335、および403のCTFA名称によって指定される界面活性剤の群からなる界面活性剤である。
フッ素含有界面活性剤:1つあるいはそれ以上のフッ素を含有する界面活性剤である。本発明で有用なフッ素含有界面活性剤は、全てではないが下記の群から選ぶことができる:Du  Pont,Wilmington,DE,から商標名Zonylで利用可能なテロマーＢ含有フッ素化界面活性剤（Zonyl  FSA、FSP、FSE、UR、FSJ、FSN、FSO、FSC、FSK、およびTBSが含まれている）、3M  Industrual  Chemical  Products  Division,St.Paul,MNから商標名Fluoradで販売されているフルオロ化学薬品界面活性剤（FC−95、FC−98、FC−143、FC−170C、FC−171、FC−430、FC−99、FC−100、FC−120、FC−129、FC−135、FC−431、FC−740が含まれている）、Mathisらによって報告されているペルフルオロアルキルポリ（オキシエチレン）界面活性剤（J.Am.Chem.Soc.,106,6162−6171（1984）、詳しくは文献による）、Serratriceらによって報告されているフルオロアルキルチオ−エーテルポリ（オキシエチレン）界面活性剤（J.Chim.Phys.,87,1969−1980（1990）、詳しくは文献による）、Zarifら（J.Am.Oil  Chem.Soc.，66,1515−1523（1989）、詳しくは文献による）のペルフルオロアルキル化ポリヒドロキシル化界面活性剤、Atochm  North  America,Philadelphia,PA、から商標名Forafacで利用可能なフルオロ界面活性剤などである。
生体適合性蛋白質：原料には無関係であって、動物、植物、あるいは微生物など組織の抽出によって得られるか、あるいは組換え体生物工学から得られる蛋白質である。そして、その蛋白質が、過度の毒性、生理学的影響、あるいは薬理学的影響を示さず、受容できる方法で本発明のコロイド分散液を安定化する機能をはたすことが出来る蛋白質である。受容出来る生体適合性蛋白質は以下の群から選ぶことが出来る。アルブミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファフェトプロテイン、アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、Ｃ−反応性蛋白、癌胚抗原、セルロプラスミン、補体、クレアチンホスフォキナーゼ、フェリチン、フィブリノーゲン、フィブリン、トランスペプチダーゼ、ガストリン、血清グロブリン、ヘモグロビン、ミオグロビン、イムノグロブリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リポ蛋白、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、フルファ−１−血清蛋白質フラクション、アルファ−２−血清蛋白質フラクション、ベータ蛋白質フラクション、ガンマ蛋白質フラクション、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、およびその他の蛋白質。
この発明のコロイド分散液を製造するための好ましい方法は細分化である。別の製造方法は凝縮である。
細分化（comminution）：手動あるいは機械的に混合するか、あるいは超音波の作用によって発生された機械的エネルギーを用いて、液体状分散および連続相を一緒に混合し、分散相の粒子の大きさを大きな粒子から必要な大きさに減少させることによってコロイド分散液を形成する方法である。適切な混合は、米国特許No.4,533,254に報告されているように（詳しくは文献による）、Microfluidic's  Model  110  Microfluidizer装置中で達成できる。許容できる別法は、Rannie  High  Pressur  Laboratory  Homogeniser,Model  Mini−Lab,type  8.30Hあるいは同等の装置を用いる方法である。
凝縮：気体の分散相から出発して、その分散相を液体連続相に接触させておき、そして、その系の温度、あるいは圧力、あるいは温度と圧力の両方を変化させることによって分散気体から分散液体への相変化を誘導し分散相の粒子の大きさを分子集合体から必要な大きさに増大させることによってコロイド分散液を形成する方法である。
本発明は以下の実施例によって、さらに具体的に理解される。
実施例１
ジスキン（Ziskin）らによって記述（先に引用した）されているように、低沸点液体が純粋液体としてよりも微細に分散された分散液として存在していることの臨界性が、両者の状態の音波後方散乱を測定することによって決定された。
低沸点液体のコロイド分散液または純粋液体の生物体に対する投与をシミュレートするために２つの溶液を用意した。これらをヒューレット・パッカード・モデル（Hewlett  Packard  Model）77020超音波スキャナーにより5.0MHzで走査し、得られた像をソニーES  VHSテープに記録した。次いで、テープからのアナログ像を、ソフトウエアパッケージのグローバル・ラボ・イメージ・ソフトウエア（Global  Lab  Image  Software）（データ・トランスレーション、マールボロ、マサチューセッツ）を使用してデジタル型に転換した。次に4900ピクセル（70x70ピクセルサイズの）領域内のグレースケールの強度を、実施例19のコロイド分散液または多量の純粋ドデカフルオロペンタンを37℃で平衡させた1000mLの水のビーカーに注入する前後に測定した。
測定は２から154のグレースケールで実施した。後記の実施例19の乳濁液（3.4マイクロモルのドデカフルオロペンタンを含む）0.1mLの注入前の像の強度は4.27であった。この乳濁液0.1mLの注入は、注入後５秒で236、注入後52秒で182に強度を変えた。
同様の実験を純粋ドデカフルオロペンタン0.2mLの注入により実施した。これは、1111ミクロモルのドデカフルオロペンタンに相当し、上記の実験の300倍以上である。注入前の像の強度は4.9であった。これは注入後５秒で7.7に、注入後52秒で5.0に増加した。
この２つの実験（強度／量）の比較は、コロイド分散液は、液体から気体への相転移をも受ける単なる液体の投与に比べ、超音波ビームを走査する際、27,000倍の効果を有することを示す。
実施例２
液体分散相に適する化学薬品の選択は、ある程度、超音波によって研究される生物体の体温に左右される。例えば、ヒトの体温は37℃であるので、37℃以下で液体から気体への相転移、すなわち、沸騰、をする液体は、本発明のコロイド分散液において特に有用である。同様にして、下記の表は、研究される生物体により液体分散相を選択する際のガイダンスとして使用することができる。
0003621413.tif 000002
実施例３
後記の実施例45の方法と基準に基づいて、有機ハロゲン化物を細分化してコロイド分散液を形成した。
具体的には、以下のものを含む100mLの量の配合物を調製した：ポロキサマー488,2.5％  v/v;フッ素含有界面活性剤ゾニル（Zonyl）FSN2.5％  v/v;ペルフルオロオクタン酸ナトリウム,pH7.0,0.1％  w/v;塩化ナトリウム,0.9％,w/v;およびドデカフルオロペンタン,2.0％,v/v。低剪断混合の後、これらを４℃でマイクロフルイダイザー・モデル110Y中において８回の通過により細分化した。乳状の乳濁液は血清の容器に分別し、密封した。
72時間以内に、粒度とサイズ分布をニコンプ・モデル（Nicomp  Model）370（ニコンプ・パーティクル・サイジング、サンタ・バーバラ、カリフォルニア）を使用して19℃で測定した。乳濁液のガウス分析による平均径は標準偏差48％で90.1nm（ナンバー平均）であった。体積平均径は316nmであった。
実施例４
粒度とサイズ分布は、乳濁液調製中に種々の段階でまたは異なる条件下で測定した。
ペルフルオロオクタン酸ナトリウム,pH7.2,2.5％,w/vおよびドデカフルオロペンタン,2.0％,w/vを含む20mLの乳濁液を調製した。これらの成分を水に添加し、懸濁液を４℃に冷却した。エマルシフレックス（Emulsiflex）−1,000（アヴェスチン社、オタワ、カナダ）を使用して、最終細分化前に溶液を“予備混合”した。２つの10mLシリンジ間での溶液の20回の通過に続いて、白い乳状の懸濁液をニコンプ（Nicomp）370に入れて、粒度を測定した。この予備混合懸濁液は、452nm（ナンバー平均）と2398nm（体積平均）の平均粒度を有していた。
次いで、最終乳濁液を、エマルシフレックス（Emulsiflex）−1,000（アヴェスチン社、オタワ、カナダ）を7MPaまでの圧力で手動で操作して、８回の通過による細分化により形成した。乳濁液粒子はさらに小さく、ナンバー平均径が201nm,体積平均径が434nmであった。
物質の無菌充填は、物質を0.45ミクロン無菌フィルター（ゲルマン・アクロディスク、アン  アーバー、ミシガン）を通して行った。最終の無菌コロイド分散液は、ナンバー平均径が160nmであった。
実施例５
細分化直後の乳濁液の平均径測定は、配合物の最終安定度の有用なテストである。下記の乳濁液がこの点を例証する。
２％プルロニック（Pluronic）Ｐ−123および2.6％ゾニル（Zonyl）FSOを含む２％,v/vのドデカフルオロペンタン乳濁液を、後記の実施例19の方法により調製した。平均粒径は標準偏差35％で151nmであった。乳濁液は物理的外観と粒度により判断すると、少なくとも６週間は安定していた。
同じ配合物に0.25％ペルフルオロオクタン酸ナトリウムを添加した。この添加が界面張力を減らすので、これは配合物をさらに安定化させるものと推測されたが、この界面活性剤が乳濁液の界面で生じさせる高い陰イオン電荷密度が、現実に小さい粒子の生成を防止する。事実、直後の粒度測定は標準偏差106％で1060nmの平均粒径を示した。この乳濁液は数日ほどで減成した。
実施例６
乳濁液の粒度分布は、遠心分離により測定することができる。後記実施例19の乳濁液のサンプルを、ホリバ（Horiba）CAPA−700パーティクル・アナライザー（ホリバ・インストルメンツ、アーヴィン、カリフォルニア）に入れた。粒子が1.66g/cu  cmの密度を有すると仮定すると、粒度分布は下記の如くであった。
粒度範囲（ミクロン）              体積パーセント
0.0−0.5                                    12
0.5−1.0                                    26
1.0−1.5                                    22
1.5−2.0                                    15
2.0−2.5                                    ７
2.5−3.0                                    ０
実施例７
本発明の乳濁液の長期安定性を測定した。後記実施例19記載の乳濁液を19℃に調製し、ニコンプ370を使用して粒度を間隔をとって測定した。結果を下記の表に示す。
時間（日）                        平均粒径（nm）
５                                           194
13                                           216
19                                           245
27                                           258
33                                           289
41                                           283
47                                           306
61                                           335
89                                           305
この乳濁液は初期においては、最初の１か月は194nmから289nmに急速に成長した。しかし、それ以後は成長は大部分止まった。直径対時間のグラフの曲線を外挿すると、この乳濁液に対する少なくとも１年間の安定性が確証される。
実施例８
後記実施例19記載の乳濁液を使用して、種々のルートにより投与されたこれらコロイド分散液の造影能力をテストした。約20kgの雑種犬をバルビツル酸ナトリウムで麻酔をかけ、実施例38に記載の方法により超音波実験に供した。
0.2mL/kgの静脈注射は、注射後１分以内に心臓の左右の心室に強いコントラストシグナルを生じた。0.5mL/kgの投与は、リンパ管系、肝臓、腎臓、心臓および中枢神経系などを含む試験したすべての器官において強いドップラーシグナルを生じた。
内皮、皮膚内、あるいは筋肉内ルートによる0.5mLの注射は局部コントラストを生じ、骨筋系の検査を可能にした。実施例42の乳濁液50mLを950mLの塩水に稀釈して調製した溶液1,000mLを経口ルートにより投与し、胃内および十二指腸内管腔内投与を効果的にした。胃腸系の管腔が増大され、肝臓、脾臓、内部生殖器官をよりよく見ることができた。
後記実施例42の乳濁液10mLを膀胱内ルートにより投与し、膀胱をよく見えるようにした。
上記の具体例は、他の投与ルートによっても本発明のコロイド分散液で有用な超音波コントラストを与えるために使用され得る。具体的には、乳濁液は下記のルート、すなわち、腹内、動脈内、関節内、きょう膜内、頸部内、頭蓋内、管内、硬膜内、病巣内、小房内、腰部内、壁内、眼内、オペラティブ内、頭頂部内、腹膜内、胸膜腔内、肺内、脊椎内、胸腔内、気管内、鼓膜内、子宮内および心室内ルートのいずれかにより投与できる。これらのルートによる投与法は、1990年マクミラン出版社発行の、DP・スワンソン（Swanson）、HM・チルトン（Chilton）、JH・スラル（Thrall）編集の「ファーマシューティカルス  イン  メディカル  イメイジング」などの標準的な放射線学テキストに見ることができ、詳しくは文献による。
上述の器官や器官系の他にも、肺、胸部、前立腺、内分泌系も公知の手段で研究することができる。本発明の薬剤で研究することのできる医学的状態は数多くある。例として、新陳代謝、外傷、先天性、腫瘍性、感染性の病気が挙げられる。これらの状態における超音波造影の利用に関する記述は、1991年ボストンのモスビー・イヤー・ブック発行の、CM・ルマック（Rumach）、SR・ウィルソン（Wilson）、JW・チャーボノー（Charboneau）編集の「ディアグノスティック  ウルトラサウンド」に見ることができ、詳しくは文献による。
実施例９
本発明のコロイド分散液は、0.00001％w/vから166％w/vまでの範囲の濃度での超音波シグナルで、コントラスト効果を発揮する。
１％の乳濁液（例えば実施例42の乳濁液）を10倍に稀釈し（1mLから7mLの緩衝液を添加して）、0.1mLの一定分量を1000mLの水に37℃で添加し、超音波強度を測定すると、後方散乱に実質的な増加が見られる。具体的には、実施例１記載の系で測定したシグナル強度は、上記添加後１分以内に2.7から9.8に増加する。より大きな稀釈では、後方散乱はバックグラウンドから区別できない。このように、分散相物質の濃度の下限は0.00001％である。
5mLのドデカフルオロペンタンを後記実施例25記載の界面活性剤混合物を含む5mLの水に添加し、懸濁液を実施例４の方法により５分間細分化すると、166％w/vの乳濁液が生成する。これはただちに生物体に、例えば経口で、投与でき、良好な超音波コントラストをもたらす。この量は、これより高い濃度では不安定となる配合物が生成されるので、分散相物質の濃度の上限の濃度を意味する。
実施例10
蛋白質を本発明のコロイド分散液を安定化するために使用できる。高強度超音波を使用して、非水性液体（例、マイクロカプセル）を充填した蛋白質のミクロスフェアの水性懸濁液を合成できる。これらは、米国特許第4,718,433号および第4,774,958号の超音波コントラスト剤とは異なる。後者はガスのみ含み、サスリック（Suslick）とグリンスタッフ（Grinstaff）（サスリック  KS;グリンスタッフ  MW:非水性液体の蛋白質マイクロカプセル化、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ112:7807−7809,1990）に記載された方法に従っている。この文献は高沸点非水性液体（超音波コントラスト剤としては不適当）の使用を記載するのみで、低沸点非水性液体一般や有機ハロゲン化物の使用、特に非水性液体としての使用を開示していない。
蛋白質のミクロスフェアは、ヒトの血清アルブミンもしくはヘモグロビンから高強度超音波プローブ（ヒート・システムズ、W375、20KHz、0.5インチ、チタニウム  ホーン）で合成できる。典型的には、５％ペンタンまたは３％ジエチルエーテルと５％アルブミンを、23℃およびpH7.0で約150W/sqの音波で３分間照射する。得られる分散液は、ガウス分布と約2.3ミクロンの平均粒径を有する。その粒径を４℃で２か月まで維持する。
アルブミンもしくはヘモグロビンの他に、下記の蛋白質、すなわち、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファフェトプロテイン、アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、Ｃ反応性蛋白質、癌胚抗原、セルロプラスミン、補体、クレアチンホスホキナーゼ、フェリチン、フィブリノーゲン、フィブリン、トランスペプチダーゼ、ガストリン、血清グロブリン、ミオグロビン、免疫グロブリン、ラクテートデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リポプロテイン、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルファ−１−血清蛋白質画分、アルファ−２−血清蛋白質画分、ベータ蛋白質画分、ガンマ蛋白質画分およびガンマグルタミルトランスフェラーゼも使用できる。
ペンタンもしくはジエチルエーテルの他に、その他の脂肪族炭化水素、有機ハロゲン化物、エーテルも、ペンタンについて上記したように使用できる。
実施例11
乳濁液またはミクロ乳濁液としてのコロイド分散液の粒度と、相転移によって形成されるミクロバブルのサイズとの関係を測定できる。
後記実施例27の乳濁液の一定分量をニコンプ370に入れ、19℃で操作して液体乳濁液の平均粒度は231.7nmと測定された。器具の温度コントロールを37℃に調整し、約５分かけて温度平衡化後、粒度を再測定した。形成されたミクロバブルの分散液は、1701.5nmの平均粒度を有しており、7.34倍にサイズが増加した。
気体または液体としての分散液の相対的密度がわかれば、分散サイズの予期される変化も計算できる。例えば、Ｗ・ブレーカー（Braker）、Ａ・モスマン（Mossman）、マテソン（Matheson）著の「ガス・データ・ブック」はそのようなデータを含む。オクタフルオロシクロブタンを検査していると、1Lの液体が圧力760mmHg,温度15℃で188Lの気体を産生することがわかる。球の容積は容積の立方根による球の直径に相関するので、オクタフルオロブタン乳濁液粒子の相転移は5.7倍の直径の増加をもたらすことになる。
実施例12
本発明の乳濁液の安全性は、ミニブタで劇的に実証されている。米国特許第4,718,433号および第4,774,958号の開発と主題のもとでの、商標アルブネックス（Albunex）の超音波コントラスト剤は、ブタにおいて重大な血液動力学効果を示す（オステンセン  J;ヘーデ  R;ミレング  Y;エッジ  T;ホルツ  Ｅ）。アルブネックスのミクロスフェアの静脈注射は、ブタにトロンボキサンを介した肺高血圧症を引き起こすが、サルやウサギには引き起こさない（アクタ・フィジオル・スカンジ（Acta  Physiol  Scand）144:307−315、1992）。kg当たり0.001−0.05mLまでの投与では高血圧症が起こる。kg当たり0.05mLをゆっくり注入した後、１匹のブタが死亡した。
上記文献の手続を使用して、ハロタン麻酔の下に30kgのミニブタで実験を行った。結果を下記の表に示す。
投与（mL/kg）   累積投与（mL/kg）  血液動力学効果
0.01              0.01             無
0.02              0.03             無
0.05              0.08             無
0.10              0.18             無
0.20              0.38             無
0.30              0.68             無
0.40              1.08             無
0.50              1.58             無
0.60              2.18             無
0.60              2.78             無
0.80              3.58             無
0.30              3.88             無
2.00              5.88             疲労呼吸
すべての投与が良好な心臓のコントラストをもたらした。0.4/kg以上の投与は、肝臓のドップラー増大をももたらした。
結論として、本発明の乳濁液をミニブタにおけるアルブミンのミクロスフェアの致死量の40倍量注射しても、最低限の過渡効果（transient  effects）を示した。アルブネックスによる効果の限界用量は、アルブミンのミクロスフェアのkg当たり0.001mL,つまり、本発明のコロイド分散液効果の限界用量の2000倍低い。
実施例13
選択した分散相のための適当な親水親油バランス（HLB）数を有する両親媒性物質の選択は、コロイド分散液の安定性のために重要である。HLB数を測定する１つの方法は、種々の界面活性剤混合物の界面張力を測定することである（HLB法の良い一般的な概説は、「エマルジョンズ」：理論と実践、ポール・ベッチャー、上記に関連するpp.232−252、に見られる）。
プルロニック（Pluronic）Ｐ−123とプルロニック（Pluronic）Ｆ−127の混合物を形成し、特定のHLB数を有する１％溶液を調製し、ドデカフルオロペンタンに対する溶液の界面張力（IFT）をクルス・ドロップ・ボリューム・テンショメーター（Kruss  Drop  Volume  Tensiometer）DVT−10（クルス  USA、シャーロット、NC）を使用して４℃で測定した。結果を下記の表に示す。
HLBと界面張力の関係
Ｐ−123    Ｆ−127   HLB  IFT（ダイン/cm）
1.00          0.00    ８        27.07
0.86          0.14    10        23.94
0.75          0.25    12        23.58
0.60          0.40    14        22.48
0.50          0.50    15        22.80
0.40          0.60    16        23.16
0.25          0.75    19        23.61
0.00          1.00    22        26.36
上記データはグラフにすると、ドデカフルオロペンタンに対するHLBが約14であることを示す。HLB数14の陰イオン、非イオン、陽イオンあるいは両性イオンの界面活性剤などの両親媒性物質の使用は、上記液体分散相の乳濁液に最大の安定性を与えることになる。
実施例14
液体分散相と液体連続相の間の界面張力は、コロイド分散液の安定性に重要な影響をもたらすので、配合物を開発するために使用できる。
オストウオルド（Ostward）熟成理論は、粒度安定性の界面張力に対する強い依存性を予期させる（カバルノフ  AS;シュチュキン  EDにより論評されている、オストウオルド熟成理論：フルオロカーボン乳濁液の安定性への応用、アドバンス  イン  コロイド  アンド  インターフェース  サイエンス、38:69−97、1992、詳しくは文献による）。その理論は、安定性と界面張力は互いに反比例すると予期している。例えば、界面張力の５倍低下をもたらす両親媒性物質を添加できれば、安定性において５倍の増加が得られる。
ドデカフルオロペンタンに対する水溶液（すべてv/v溶液で現す）中の種々の両親媒性物質の界面張力を４℃で測定し、実施例13に記載されているように、各配合物から乳濁液を調製した。
プルロニックＰ−123、１％とドデカフルオロペンタンは、27.1ダイン/cmの界面張力を有しており、安定した乳濁液を生成しなかった。
プルロニックＦ−127,1％およびドデカフルオロペンタンは、26.4ダイン/cmの界面張力を有しており、安定した乳濁液を生成しなかった。
ゾニル（Zonyl）FSO,1％およびドデカフルオロペンタンは、5.8ダイン/cmの界面張力を有しており、安定した乳濁液を生成した。
プルロニックＰ−123,0.33％、プルロニックＦ−127,0.33％、ゾニルFSN,0.33％およびドデカフルオロペンタンは、14.1ダイン/cmの界面張力を有しており、安定した乳濁液を生成した。
プルロニックＰ−123,1％、ゾニルFSO,1％、塩化ナトリウム,1％、ペルフルオロオクタノエートナトリウム,0.5％およびドデカフルオロペンタンは、2.71ダイン/cmの界面張力を有しており、安定した乳濁液を生成した。
このように、26ダイン/cm以下の界面張力を有する両親媒性物質が、安定した乳濁液を生成するためには必要であった。関連する知見は、その他の有機ハロゲン化物あるいは脂肪族炭化水素やエーテルで得られる。
実施例15
液体連続相の粘性は、コロイド分散液の安定性に重要な影響をもたらすので、配合物を開発するために使用できる。
オストウオルド熟成理論は、粒度安定性の粘性に対する強い依存性を予期させる（実施例14のカバルノフ  ASらを参照）。その理論は、安定性と粘性は互いに正比例すると予期している。例えば、粘性の５倍増加をもたらすビスコーゲン（Viscogens）（粘度増強剤）を添加できれば、一般に、安定性において５倍の増加が得られる。
ビスコーゲンの例として、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、イオヘキソール、他のヨード化Ｘ線コントラスト物質、デキストロース、ポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。後記実施例38の乳濁液は、５％ポリエチレングリコール（PEG）200を使って、または使わないで調製したが、粘度1.1cPとなり安定性を生み出した。５％PEGを含む乳濁液は、より大きな安定性を示した。
実施例16
後記実施例44と18の乳濁液の分散液からの超音波後方散乱は、ヒューレット・パッカード・モデル（Hewlett  Packard  Model）77020超音波スキャナーで測定し、本発明のコロイドの相転移の相対的潜在力を測定した。そのコロイドは室温では液体−液体乳濁分散液であるが、ロング他（米国特許第7,767,610号、第4,987,154号、およびJP第2196730号）、デイビス他（EP第245019号）、およびJP第1609986号およびJP第63060943号、に記載されているように、安定した乳濁液との投与によりミクロバブルとなり、またEP467031、EP458745、WO9115244、US5088499、5123414、US4844882、US4832941、US4466442、US4276885、に記載されているように、本物の空気のミクロバブルとの投与によりミクロバブルとなり、詳しくは文献による。
空気のミクロバブルは下記の方法で作られた。0.5mLの空気を10mLシリンジに入れ、プルロニックＦ−68の1.0％、v/v溶液を別の10mLシリンジに入れて最初のシリンジに三方コックで接続する。２つのシリンジ間を液体と空気をすばやく前後に通過させる。およそ５回の通過で空気と液体は混合し、液体は乳状の白い外観となる。混合を全部で20回の通過により続ける。250mLの水に添加された1.0mLの気体分散液サンプルが、肝臓組織（４＋強度）に類似する強度をもつ超音波像を与えた。驚くべきことに、空気のマイクロバブルが生じた超音波後方散乱の強度は、急速に低下し、５分以内に後方散乱は基本線に戻った。この持続性の欠如は空気のミクロバブルの診断上の利用を限定する。
一方、37℃で250mLの水に添加した1.1から10.0mLのペルフルオロヘキサン乳濁液は、流血（０−１＋強度）に類似する強度をもつ超音波像を与え、これらの配合物は極めて高い投与でのみ超音波コントラストを生じることを示し、そのことはその一般的利用を限定する。
37℃の水250mLに稀釈した1.0mLのドデカフルオロペンタンのサンプルは、ミクロバブル溶液（４＋強度）の強度をもつ超音波像を与え、診断上十分役に立つ時間である10分以上維持された。
付け加えると、この３つの実験溶液はすべて、ほとんど同様に見える不透明な視覚上は濁った溶液であった。これらの実験は、本発明の超音波コントラスト剤は従来の超音波コントラスト剤より大きな持続性および／または潜在力を診断上役に立つ程度まで示すことを実証するものである。
実施例17
実施例19のコントラスト剤のサンプル1.0mLを、21−ゲージの針の付いた1.0mLシリンジで容器から取り出し、約0.2mLをガラス製スライド上にのせた。液体の上にガラス製のカバースリップをのせ、サンプルをアイ・ピース・マイクロメーター、温度調整チェンバー、35−mmカメラ、パナソニック・ビデオ・カメラの付いた光学顕微鏡のステージの上にのせた。
乳濁液を21℃の油−浸漬で検査した。この温度で乳濁液は0.2−0.3ミクロンの粒子から成り、すばやいブラウン運動を行っていた。
温度調整を37℃に変え、乳濁液を観察して像を記録した。温度が上昇するにつれて、粒子はそれぞれサイズが突然大きくなり、ついに37℃で乳濁液は１−３ミクロンのバブルの集まりとなつた。バブルは液体乳濁液と違って、容易に変形された。しかし、それらは合体しないようであった。40分の実験後、マイクロバブルの集まりは変わることなく安定していた。
実施例18
液体分散相のある部分は、造影する生物体の体温で液体から気体に相転移するという臨界性が、この場合は37℃の体温を使用したが、超音波コントラスト剤としての利用性に対してそれぞれ異なる液体分散相を有する一連の乳濁液を37℃で超音波造影させることによりテストされた。
下記の配合物を調製あるいは入手して、1.0mLの一定分量を37℃で1000mLの水に入れた。１−ヨードペルフルオロオクタンで生成した乳濁液は、ロング他（米国特許第4,767,610号および第4,987,154号、JP第2196730号）の開示する方法により調合した。ペルフルオロデカリンによる乳濁液は、JP特許第1609986号とJP第63060943号の開示により調合した。トリオレアンによる乳濁液は、デイビス他（EP第245019号）の開示する方法により調合した。これらの特許の内容は、詳しくは文献による。超音波像は添加前後に溶液から得られ、結果は増加が観察された時間の長さのパーセントで現した。
0003621413.tif 000003
上記したように、好ましい配合物は37℃以下で完全な相転移を受ける乳濁液である。20Torr以上の周囲温度で蒸気圧を有する高蒸気圧液体ペルフルオロヘキサンとペルフルオロオクタンは、攪拌した塩あるいは20Torr以下の周囲温度で蒸気圧を有するペルフルオロデカリンと対照させると、いくらかコントラストを示した。このことはこれらの化合物を超音波コントラスト剤として使用することの利点を示すとも言えるが、これらの物質による増加のメカニズムは完全には解明されていないし、約40℃あるいはそれ以下で沸騰する物質と比べて実際役に立つとは考えられない。
実施例19
本発明の超音波コントラスト剤は、下記の装置と工程により作られる。装置：マイクロフルイダイザー（Microfluidizer），モデル110Y,インタラクション  チェンバー圧力  14,000PSI;圧力容器,316スチール,5Lおよび12Lサイズ；フィルター，セルロースアセテート,0.22ミクロン；フィルターホルダー,142mm。下記の溶液を作成した。25％（w/v）ソルビトール,12L;2.5％w/vペルフルオロオクタン酸ナトリウム（PCR社、ゲインズビル、フロリダ）;60gプルロニックＰ−123、60gゾニルFSO、7mL2.5％ペルフルオロオクタン酸ナトリウム溶液,1L、溶解を助けるソニケート（ストック界面活性剤溶液）。マイクロフルイダイザーにソルビトール溶液を注いだ。インタラクション  チェンバー、チューブ、冷却コイルは、細分化工程中は氷片で覆う。氷浴中の攪拌バー付き5L圧力容器に、次いで下記のもの:500mLのソルビトール溶液、500mLのストック界面活性剤溶液、800mLの水、200gのドデカフルオロペンタンを添加する。容器を窒素で45分間10PSIまで加圧する。14,000PSIで懸濁液を45分間マイクロフルイダイザーに通す。25％ソルビトールを8L含む容器に、乳濁液を４℃で移し、よく混合する。正圧を使用して100mL容器に乳濁液を移し、その工程において物質を0.22ミクロンのフィルターに通す。容器に蓋をして密封する。フッ素含有界面活性剤やポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオンブロック共重合体などの本実施例の両親媒性物質は、許容できる安定性を有する配合物を生成する。
実施例20
0.4mLのｎ−ペンタン（アルドリッチ・ケミカル、ミルウォーキー、ウィスコンシン）を、2.0mLの水に４℃で添加した。２つの透明な分離した相が得られた。塩化ナトリウムを添加し（10％w/v溶液0.4mL）、総量が2.8mLとなるようにした。ホスファチジルレシチン（シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ）をおよそ135mg攪拌しながら添加し、得られたスラリーを激しい渦攪拌により混合した。乳状の白い溶液が、５分以内に２相に分離した。エタノールを0.1mLの分量で混合しながら添加し、総量1.74mLとした。２相混合物の外観には何ら変化がなかった。本実施例の配合物は、良好な生体外超音波後方散乱特性を示し、炭素原子数６以下で総原子数が17の脂肪族炭化水素の利用性を示す。
実施例21
乳状の懸濁液を、1.80mLの水、0.2mLの10％塩化ナトリウム、0.1mLのエタノール、100mgのレシチンを添加して形成した。ドデカフルオロペンタン（PCR、ゲインズビル、フロリダ）を0.1mL添加し混合した後、２相を得た。ｎ−ペンタンを0.1mL添加し、次いでドデカフルオロペンタンの一定分量を0.2mL添加して、ドデカフルオロペンタンの総量を20％v/vとした。得られた懸濁液を混合し、２つの乳状の相と１つの小さな透明な相の３相を得た。追加の塩化ナトリウムを添加して溶液を７％とし、1mLのエタノールの一定分量を添加したが、懸濁液の特質には何ら変化がなかった。本実施例の配合物は、良好な生体外超音波後方散乱特性を示し、炭化水素とフルオロカーボンの混合物の利用性を示す。
実施例22
ドデカフルオロペンタン2.0mLに330mgのレシチンを添加した。混合後、1.0mLの水を加えて懸濁液をさらに混合した。乳状のコロイド分散液が形成された。乳状のコロイド分散液が形成され、この場合自然発生の両性イオン界面活性剤であるが、両親媒性物質としての単一界面活性剤の利用性を示した。有用なコントラスト剤を、配合物中のドデカフルオロペンタンをエーテルに代えても調製することができる。ジエチルエーテルが特に役立つコントラストシグナルを与えることがわかった。メチルエーテル、ビニルエーテルなどの関連する化合物も同様に有用である。
実施例23
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）46gを0.72mLの水と8.00mLのドデカンに添加した。ペンタノールの一定分量1.47mLをゆっくりと添加した。初期には、懸濁液は透明な液体に白い“繊維状（filamentous）の"SDSを含んでいた。ペンタノール1.0mLの添加と穏やかな混合により、SDSが実質的に溶解した。混合しながらペンタノール0.5mLを添加すると、室温で10−15分後に透明な単相のミクロ乳濁液ができた。この配合物はやや貧弱な音波後方散乱を生じ、ここではドデカン（沸点216℃）を挙げているが、沸点が約40℃より大きい液体分散相を含むコロイド分散液は、本発明の目的においては超音波コントラスト剤としては適さないことを明示した。
実施例24
実施例23の水、ペンタノール、ドデカン、ドデシル硫酸ナトリウムのミクロ乳濁液の組成物を、ミクロ乳濁液の組成限界を決定するために変化させた。下記の混合物を室温で調製し、攪拌30分後の外観を観察した。
0003621413.tif 000004
加熱（約45℃以上）すると５−９のマイクロ乳濁液は乳状になり、再び室温まで温度を下げると青みをおびた透明になつた。この外観上の可逆的な変化は、少なくとも６回の温度シフトサイクルを通じて繰り返された。
実施例25
オクチルアミン（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ）0.51mLを水1.0mLに添加し、透明な溶液を形成した。1.0mLのオクタンを添加すると、透明な溶液は乳状になった。0.49mLのオクタン酸を添加すると、溶液はゲルになった。3.6MのKOH溶液の0.17mLの一定分量はゲルを溶解し、透明なマイクロ乳濁液を生成した。混合しながら0.1mLの一定分量に水を５回添加すると、透明なマイクロ乳濁液を生成し続けた。６回目の添加は、透明な乳濁液を乳状のコロイド分散液に変えた。本実施例は、陽イオン界面活性剤を含む両親媒性物質での脂肪族炭化水素含有乳濁液の調合を示している。
実施例26
1.0mLのドデカフルオロヘプタノール（PCR）を1.0mLのドデカフルオロペンタンに添加し、透明で均質な溶液を形成した。同量のドデカフルオロペンタンにオクタフルオロペンタノールを添加したものは、２つの透明な非混合相を生成した。2.0から4.0mLの水をドデカフルオロヘプタノール／ドデカフルオロペンタンに添加すると、２つの非混合相が生成した。４℃に冷却すると、２つの透明相が３つの透明相に変化した。
実施例27
10％（v/v）フルオラド（Fluorad）FC−430（3Mケミカル、セントポール、ミネソタ）の水溶液を、100mLの水に10mLのFC−430を室温で添加混合して調製した。この溶液5mLに1.0mLのドデカフルオロペンタンと1.0mLのオクタフルオロペンタノールを添加し、乳濁液を生成した。
実施例28
10％v/vFC−430溶液2.0mLを2.0mLのドデカフルオロペンタンに添加すると、２つの相が生成した。0.3mLのドデカフルオロヘプタノールを添加すると、乳状の白い乳濁液が生成した。
実施例29
1mLの1.26Mの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（AMP）ペルフルオロオクタノエートを1.0mLのドデカフルオロペンタンと1mLの25％プルロニックF68に添加すると、乳状液体の２相が生成した。0.05mLのドデカフルオロヘプタノールを添加すると、単一相のコロイド分散液が生成した。
実施例30
2.0mLの15％（v/v）プルロニックF68溶液を、氷上の2.0mLのドデカフルオロペンタンと0.2mLのドデカフルオロヘプタノールに逐次添加した。三方コックと２番目の5mLガラス製シリンジに接続した5mLガラス製シリンジに混合物を取り、シリンジの間を前後に強制的に通過させると、濃い白い乳濁液が生成した。
実施例31
2.0mLの15％プルロニックF68、2.0mLのドデカフルオロペンタン、2.0mLの0.2MのAMPペルフルオロオクタノエート、0.1mLのドデカフルオロヘプタノール、を４℃で逐次添加して混合物形成した。三方コックと２番目の5mLガラス製シリンジに接続した5mLガラス製シリンジに混合物を取り、シリンジの間を前後に強制的に通過させると、濃い白い乳濁液が生成した。
実施例32
2.0mLの15％プルロニックF68、0.5mLのH2Oに溶解したＤ−ソルビトール（シグマ）、0.2mLのドデカフルオロペンタノール、および2.0mLのドデカフルオロペンタン、を４℃で逐次添加して混合物形成した。三方コックと２番目の5mLガラス製シリンジに接続した5mLガラス製シリンジに混合物を取り、シリンジの間を前後に強制的に通過させると、濃い白い乳濁液が生成した。
実施例33
2.0mLの15％（v/v）プルロニックＦ−68、0.40mLの0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）ペルフルオロオクタノエート、pH7.2の2.0mLのドデカフルオロペンタン、を４℃で逐次添加して混合物形成した。三方コックと２番目の5mLガラス製シリンジに接続した5mLガラス製シリンジに混合物を取り、シリンジの間を前後に強制的に通過させると、白いコロイド分散液が生成した。
実施例34
60mLの25％プルロニックF68、24mLの1,1,7−Ｈ−ドデカフルオロヘプタノール、75.8gのドデカフルオロペンタン、を４℃で逐次添加して混合物形成した。30ccシリンジ、三方コックを使用して40回の手動による通過で、混合物を回分式混合により細分化した。混合物を、8.0mLの25％プルロニックF68,2.0mLの50％Ｄ−ソルビトール、1.0mLのpH7.2の0.1Mトリスペルフルオロオクタノエートからなる溶液で逐次２回1:10に稀釈し、さらにシリンジパスで細分化した。この配合物を、体重20−30gのマウスに尾の静脈注射により投与し、７日間観察した。結果を下記の表に示す。
投与（mK/Kg）  観察結果
20          生存
25          病的であるが生存
30          病的であるが生存
40          生存せず
この生物適合性コロイド分散液は、調製後少なくとも２週間安定していた。
実施例35
下記の配合物を調製した。1.0mLの25％ポリエチレングリコール3550、1.0mLの50％ソルビトール、3.0mLの15％（w/v）プルロニックＦ−68、3.0mLの20％（w/v）フルオロサーファクタントFC430、0.4mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、および1.0％（v/v）ドデカフルオロペンタン。混合物を音波エネルギーを適用する水浴ソニケーター中で、４℃で10分細分化すると、乳状のコロイド分散液が生成した。
実施例36
異なる量の両親媒性物質を含む水性媒体の一連の溶液を形成し、配合物の基剤としてテストした。
溶液Ａ:6.0mLのプルロニック（Pluronic）Ｆ−68の25％溶液、6.0mLのPEG3350の50％溶液、0.60mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、および2.4mLのH2Oを含む透明溶液。
溶液Ｂ:1.18mLのプルロニックF68の25％溶液、6.0mLのPEG3350の50％溶液、0.12mLのトリスペルフルオロオクタノエート、および7.7mLのH2Oを含む透明溶液。
溶液Ｃ：ゲル状沈殿物を含む濁った溶液を、6.0mLの50％PEG3350、0.75mLのトリスペルフルオロオクタノエート、および1.5mLのH2Oを混合して得た。この溶液は脈管内投与では生体適合しないが、経口、腹膜内、直腸内、子宮内投与では生体適合性を有する。
溶液Ｄ：透明な溶液を、6.0mLの25％（w/v）プルロニックＦ−68、6.0mLの50％（w/v）PEG3350、0.6mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、および2.4mLのH2Oを混合して得た。
溶液Ｅ：透明な溶液を、6.0mLの50％（w/v）PEG3350、7.5mLの20％（w/v）FC−430,0.75mLのトリスペルフルオロオクタノエート、および0.75mLのH2Oを混合して得た。
溶液Ｆ：透明な溶液を、1.8mLの25％（w/v）プルロニックＦ−68、6.0mLの50％（w/v）PEG3350、0.12mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、および7.7mLのH2Oを混合して得た。
溶液Ｇ：小さな沈殿物を含む透明な溶液を、3.0mLのプルロニックＦ−68、3.75mLの（w/v）FC−430、6.0mLのPEG3350、0.68mLのトリスペルフルオロオクタノエート、および1.57mLのH2Oを混合して得た。
7.0mLの溶液Ａ−Ｇに、0.14mLのドデカフルオロペンタンを４℃で添加した。三方コックを使用して２つのシリンジ間を40回通過させることにより、コロイド分散液を生成した。
配合物Ｄをマウスに尾の静脈注射により投与したところ、LD50は20ml/kgであった。配合物ＦとＧは10ml/kgで有毒であった。
実施例37
45mLの20％PEG3350、237gのプルロニックＦ−68、0.225mLのフルオラドFC−171、2.25mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、および10％（v/v）ドデカフルオロペンタンを混合して調合した。これを２つのシリンジの三方コック装置で混合して細分化した。
この配合物は溶血テストでは生体適合した。全血液をEDTA含有の排気した収集管に、心臓内穿刺（2.0mL）によりラットから集めた。血液一定分量0.10mLを前記配合物の一定分量0.20mLに添加し、100mg/kgの静脈投与後に得られたピーク血液レベルをシミュレートした。血液を配合物と２分間混合し、サンプルを遠心分離した。上澄み液は透明で、ペレットは濃い赤で、このような極めて多量な投与でも溶血しないことを示した。この配合物は急性毒性のテストでも生体適合性を有し、20mL/kgで静脈投与したマウスに軽い疲労呼吸をもたらしただけであった。
実施例38
水性媒体にドデカフルオロペンタンと両親媒性物質を含む配合物を、超音波コントラスト剤としての生体適合性と利用性をテストした。90mLの20％PEG3350、474mgのプルロニックＦ−68、0.45mLのフルロラドFC−171および4.5mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエートからなるストック溶液を混合し、透明な溶液を生成した。上記の9.0mLに0.18mLのドデカフルオロペンタンを添加した。コロイド分散液を、２つの5mLシリンジ間で細分化させて形成した。
ケラー  MW、ファインシュタイン  SB、ワトソン  DDによって記載されたモデルにしたがって、エコー心電図検査を32kgのイヌで行った：音波破砕コントラストの末梢静脈注射後の効果的左心室の不透明化，実験的評価，アメリカン・ハート・ジャーナル114,570d（1987）。上記配合物の11回の投与が、0.05から0.75mL/kgの投与で静脈注射でなされた。0.05mL/kgの投与は、注射直後に左右の心室のコントラスト増強をわずかに与えたにすぎない。0.10から0.75mL/kgの間の投与はすべて、診断上役立つ心室の増強を与えた。注射は血流力学のパラメーターに最小限の効果をもたらした。
10％ドデカフルオロペンタン乳濁液を上記により調製された水性媒体に形成すると、２％の配合物に比べてコントラスト増強が生じた。この配合物を0.20および0.25mL/kg投与すると、静脈内投与後、最小限の血液動力学変化で、強い心室不透明化が生じた。
実施例39
高密度、高粘度の生体適合性水性媒体を連続相として含む乳濁液を調製した。それには0.06mLの15％プルロニックF68,0.06mLのゾニルFSO−100、0.12mLの５％ゾニルFSN−100、0.146mLの0.1Mトリスペルフルオロオクタノエート、pH7.2、4.47mLの76％w/vイオヘキゾール（オムニパック350、スターリング・ウィンスロップ、ニューヨーク）、および0.6mLのドデカフルオロペンタンが含まれていた。安定した配合物を２つのシリンジでの混合による細分化で形成した。他の高密度のヨウ化Ｘ線コントラスト物質を、イオパミドール、イオバーソル、イオペントール、イオディキシモールおよび他の関連する化合物などのイオヘキゾールの代わりに使用することができる。連続相媒体として水のみを使用すると、ボトルでの調合後急速に沈降するコントラスト剤が生成した。これは高密度、高粘度の生体適合性水性媒体の連続相としての利用性を示している。
実施例40
一連のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレングリコール非イオンブロック共重合体の、ドデカフルオロペンタンの液体−液体乳濁液の配合物を安定化させるときの、両親媒性物質として働く能力についてテストした。下記の溶液を形成した。
Ａ−:1.9mLの25％プルロニックＦ−68および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｂ−:1.9mLのプルロニックＬ−121および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｃ−:1.9mLのプルロニックＬ−122および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｄ−:1.9mLのプルロニックＬ−121および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｅ−:1.9mLのプルロニックＬ−101および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｆ−:1.9mLのプルロニックＬ−92および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｇ−:1.9mLのプルロニックＬ−81および0.04mLのドデカフルオロペンタン
Ｈ−:1.9mLのプルロニックＰ−123および0.04mLのドデカフルオロペンタン
上記溶液を密封ガラス管に入れ、４℃で10分間渦混合した。分散ドデカフルオロペンタン相粒子のサイズと数を目視で得た。溶液Ｈは最小の粒子を生成した。
実施例41
相対的親水親油バランス（HLB）は、最大の安定性を達成するために、非イオン界面活性剤溶液を最も効果的に活用する方法である。このことは、エマルジョンズ：セオリー  アンド  プラクティス、ポール・ベッチャー（Paul  Becher）、1965、ロバート  E.クリーガー  パブリッシング・カンパニー、マルバ−、フロリダ、詳しくは文献による。プルロニックL61（HLB3.0）とF68（HLB29）の溶液を混合し、下記の式にしたがって中間のHLB値を樹立した。
HLB＝fL61［L61のHLB］＋ff68［F68のHLB］
実際の溶液、計算で得たHLB値、最終配合物（ドデカフルオロヘキサンの２％v/v乳濁液）の安定性を下記の表に示す。
0003621413.tif 000005
この作業で確立したペルフルオロヘキサンの相対HLBは６−８である。ペルフルオロヘキサン乳濁液の最大の安定性は、化学構造には関係なく６−８の相対HLB値を有する両親媒性物質を使用することにより獲得することができる。
実施例42
本発明の超音波コントラスト剤の大量の調製には、下記の装置と工程を含む：マイクロフルイダイザー、モデル110Y、インタラクション  チェンバー圧力14,000PSI;圧力容器、316スチール、5Lおよび12Lサイズ；フィルター、セルロースアセテート、0.22ミクロン；フィルターホルダー、142mm。下記の溶液を作成した:25％（w/v）ソルビトール,12L;60gプルロニックＰ−123;60gゾニルFSO,1L、溶解を助けるソニケート（ストック界面活性剤溶液）。マイクロフルイダイザーにソルビトール溶液を注ぐ。インタラクション  チェンバー、チューブ、冷却コイルは、細分化工程中は氷片で覆う。氷浴中の攪拌バー付き5L圧力容器に、次いで下記を添加する:500mLのソルビトール溶液、500mLのストック界面活性剤溶液、800mLの水、200gのドデカフルオロペンタン。容器を窒素で45分間10PSIまで加圧する。14,000PSIで懸濁液を45分間マイクロフルイダイザーに通す。25％ソルビトールを8L含む容器に、乳濁液を４℃で移し、よく混合する。正圧を使用して100mL容器に乳濁液を移し、その工程において物質を0.22ミクロンのフィルターに通す。容器に蓋をして密封する。
実施例43
本発明の調製には、下記の装置と工程を含む：マイクロフルイダイザー、モデル110Y、インタラクション  チェンバー圧力14,000PSI;圧力容器、316スチール、5Lおよび12Lサイズ；フィルター、セルロースアセテート、0.22ミクロン；フィルターホルダー、142mm。下記の溶液を作成した:62.5％（w/v）ソルビトール,10L;41.75gプルロニックＰ−123;41.75gゾニルFSO,2.5L、溶解を助けるソニケート（ストック界面活性剤溶液）。マイクロフルイダイザーにソルビトール溶液を注ぐ。インタラクション  チェンバー、チューブ、冷却コイルは、細分化工程中は氷片で覆う。氷浴中の攪拌バー付き5L圧力容器に、次いで下記を添加する:1800mLのストック界面活性剤溶液:200gのドデカフルオロペンタン。容器を攪拌しながら窒素で45分間10PSIまで加圧する。5000PSIで30分間、14,000PSIで60分間懸濁液をマイクロフルイダイザーに通す。62.5％ソルビトールを8L含む容器に、乳濁液を４℃で移し、よく混合する。正圧を使用して100mL容器に乳濁液を移し、その工程において物質を0.22ミクロンのフィルターに通す。容器に蓋をして密封する。
実施例44
本発明の調製には、下記の装置と工程を含む：マイクロフルイダイザー、モデル110Y、インタラクション  チェンバー圧力14,000PSI;圧力容器、316スチール、5Lおよび12Lサイズ；フィルター、セルロースアセテート、0.22ミクロン；フィルターホルダー、142mm。下記の溶液を作成した:33.3％（w/v）スクロース,20L;150.0gプルロニックＰ−123、150.0gゾニルFSO,2.5L、溶解を助けるソニケート（ストック界面活性剤溶液）。マイクロフルイダイザーにスクロース溶液を注ぐ。インタラクション  チェンバー、チューブ、冷却コイルは、細分化工程中は氷片で覆う。氷浴中の攪拌バー付き5L圧力容器に、次いで下記を添加する:1800mLのストック界面活性剤溶液;333gのドデカフルオロペンタン。容器を攪拌しながら窒素で60分間10PSIまで加圧する。インタラクション  チェンバーを−3.0℃に冷却する循環水浴で、14,000PSIで60分間懸濁液をマイクロフルイダイザーに通す。33.3％、w/vのスクロースを18L含む容器に、乳濁液を４℃で移し、45分間混合する。正圧を使用してあらかじめ冷却した20mL容器に乳濁液を移し、その工程において物質を0.22ミクロンのフィルターに通す。容器に蓋をして密封する。
実施例45
本発明の分散相は、配合物が投与され、投与後超音波により検査される生物体の体温もしくはそれ以下の沸点を有する生体適合性化学物質からなるべきであり、その化学物質の十分な量が検査中に得られた超音波データにおいて診断上役立つ変化を与えるような気体状の分散液となるものでなければならない。実施例２には多くの種の体温の表が掲載されており、ここに開示される配合物のための適当な分散相を選択するために使用できる。
ある条件のもとでは、例えば、発熱状態の生物体あるいは空気圧が低い標高の高いところにある医療施設でなされる研究などでは、生物体の平常体温より18℃まで高い沸点を有する化学物質は、そのような超音波コントラスト剤の分散相として役立つ。
分散相低沸点液体を選択するための上限温度を設定して、下限は製造法により決定される。もし入手可能な装置が密封容器のみで、コロイド分散液調製中反応容器を加圧できない場合は、連続相の凝固温度もしくはそれ以上の沸点を有する分散相のみ使用できる。例えば、およそ25％w/vのイオヘキゾールを含む連続相は、−６℃に近い凝固点を有する。そのような連続相を使用して、−６℃以上で沸騰する低沸点液体はいずれも冷却のみで液化することができる。
しかし、例えば、圧力平方インチ当たり30lbで働く窒素タンクで、反応容器を加圧できる場合は、連続相の凝固点より低い温度で沸騰する低沸点液体でもいずれも液化して分散することができる。
実施例44は、連続相の凝固点以上で沸騰する分散相液体で乳濁液を生成する方法を記載しているが、後記実施例48は、圧力と連続相液体の凝固点以下で沸騰する分散相液体での冷却の両方を適用して乳濁液を生成する方法を記載している。明らかに、どの化学物質も正圧を使用すればより効率よく分散して、低沸点を含む実質的蒸気圧でこれらの物質の蒸発を低下させる。
分散相液体の適当な沸点を決定して、有用な現実の化学物質は、CRCや同様に概論などの標準的テキストを参照して、すみやかに決定できる。すべてではないがいくつかの低沸点液体を沸点により整理したものを以下に示す。
0003621413.tif 000006
0003621413.tif 000007
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化学物質群の指定
1   脂肪族炭化水素および／または誘導体
2   芳香族炭化水素および／または誘導体
3   有機ハロゲン化物および／または誘導体
6   エーテルおよび／または誘導体
7   アルデヒドおよび／または誘導体
9   カルボン酸および／または誘導体
10  アミンおよび／または誘導体
11  その他
実施例46
分散液は、実施例45に挙げた原理と規準による共沸混合物群からも選択できる。すべてではないがいくつかの二成分共沸混合物を沸点とともに以下に示す。
アセトン（21％）−ペンタン（79％）32℃；エチルエーテル（48％）−イソプレン（52％）33℃；エチルエーテル（44％）−メチルホルメート（56％）28℃；エチルエーテル（98.8％）−水（1.2％）34℃；イソプレン（86％）−２−メチル−２−ブタン（14％）34℃；塩化イソプロピル（99％）−水（１％）35℃；塩化メチルビニル（99.1％）−水（0.9％）33℃；ペンタン（98.6％）−水（1.4％）34℃；ビニルエチルエーテル（98.5％）−水（1.5％）34℃。
すべてではないがいくつかの三成分共沸混合物を沸点とともに以下に示す。
アセトン（7.6％）−イソプレン（92％）−水（0.4％）32℃；二硫化炭素−メタノール−メチルアセテート37℃；二硫化炭素（55％）−メタノール（７％）−メチルアル（38％）35℃。
実施例47
本発明のコロイド分散液は従来の超音波コントラスト用乳濁液とは、分散相の少なくともある部分は生物体への投与後浸出するか蒸発する点で異なる。独特の液体−気体界面を有するこの分散物質の存在は、音波ビームの強い後方散乱用の基剤を提供する。
分散気体相乳濁液の存在の１つのテストは、分散から圧力変化への超音波後方散乱のレスポンスである。純粋の分散液は圧縮力に対して非常に鈍感であるが、気体状コロイド分散液は加圧されると、気体の圧縮と有効後方散乱断面における減少により、音波後方散乱の減少を示す。
実施例１の実験装置を使って、密封したビーカー中の音波後方散乱を吸音窓を通してテストした。次に圧力を装置にかけ、音波後方散乱を記録した。音波後方散乱は加圧にしたがって著しく変化したので、分散相は部分的に気体状態で含有されていると結論された。
実施例48
本発明の配合物は、液体状態からの細分化よりも気体状態からの分散相の縮合により、下記の装置と工程による作ることができる：マイクロフルイダイザー、モデル110Y、インタラクション  チェンバー圧力14,000PSI;圧力容器、316スチール、5Lおよび12Lサイズ；フィルター、セルロースアセテート、0.22ミクロン；フィルターホルダー、142mm。下記の溶液を作成した:36％イオヘキゾール,10L;41.75gプルロニックＰ−123;41.75gゾニルFSO,2.5L、溶解を助けるソニケート（ストック界面活性剤溶液）。マイクロフルイダイザーにイオヘキゾール溶液を注ぎ、容器全体を−６℃まで冷却した。インタラクション  チェンバー、チューブ、冷却コイルは、縮合工程中は氷片で覆った。氷浴中の攪拌バー付き5L圧力容器に、1800mLのストック界面活性剤溶液を添加した。プロパンのタンク（沸点−42℃）をガス締め取り付け部品でインタラクション  チェンバーに取り付け、インタラクション  チェンバーに200gのプロパンを充填した。容器全体を攪拌しながら窒素で45分間10PSIまで加圧した。5,000PSIで30分間、14,000PSIで60分間懸濁液をマイクロフルイダイザーに通した。水を8L含む容器に、乳濁液を４℃で移し、よく混合し、正圧を使用して100mL容器に移し、その工程において物質を0.22ミクロンのフィルターに通した。容器に蓋をして密封した。
実施例45のその他の低沸点物質を含む他の乳濁液も、分散相を変化させ、分散相物質を液化するのに十分な圧力と温度に調整して、同様に調製することができる。
実施例49
分散相は、配合物が投与され、投与後超音波により検査される生物体の体温以下の沸点を標準的な圧力条件下で有する化学物質から構成することができる。実施例45は、選択した化学物質の沸点と製造工程のパラメーターを考慮して得られる温度範囲に基づいて分散相に好適な化学物質を如何にして選択するかを検討している。
標準的な圧力条件下における沸点は約37℃以下が好ましいことが決定されたので、存在する原子の総数により化学物質を選択することが、超音波コントラスト剤として好適な物質を選択するもう一つの方法を提供することがわかった。存在する原子の総数により整理した好適な化学物質の表は、すべての好ましい化学物質は４と17の原子の間に含まれていることを示す。
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実施例50
好ましい実施態様において、分散相は、配合物が投与され、投与後に超音波により検査される生物体の体温以下の沸点を標準的な圧力条件の下で有する化学物質から構成される。実施例45は、選択した化学物質の沸点と製造プロセスのパラメーターを考慮して得た温度範囲に基づいて分散相に好適な化学物質を如何にして選択するかを検討している。
ペンタン（ドデカハイドロペンタン）とペルフルオロペンタン（ドデカフルオロペンタン）の沸点は、それぞれ36−37℃、28−29℃である。これは分散相として好適な化学物質を選択するのに良好な温度範囲である。したがって、５個の炭素原子と適宜の水素原子およびフッ素原子を含む化学物質は、28−37℃の沸点を有し、好適な分散相化学成分を形成する。下記の好適な化学物質のリストには、５個の炭素原子と適宜の水素原子およびフッ素原子を含む化学物質が全部ではないが含まれる。例えば、C5HxFy:
1,3−シクロペンタジエン,5,5−ジフルオロ−；シクロブタン，
１−フルオロ−３−メチレン−;2H−フルオリニウム；シクロブタン，（フルオロメチレン）−；メチレン，
シクロブチルフルオロ−;2,4−シクロペンタジエン−１−イル,2−フルオロ−;2H−フルオリニウム，イオン（−１），
（デロク−2,3,4,5,6）−;6−フルオロニアビシクロ（3.1.0）ヘキサン;6−フルオロニアビシクロ（3.1.0）ヘックス−２−エン，
ヒドロキシド，インナ−  ソルト；フルオリン（２＋）,1,3−ペンタジエン−１−イル−５−イリデン−;1,3−ペンタジエン，フルオリン  コンプレックス；
フルオラニウム；シクロペンチン,4−フルオロ−；シクロブテン,3−（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン，
1,1,2,2,3,3−ヘキサフルオロ−；トリシクロ（1.1.1.01,3）ペンタン，フルオロ−，イオン（１−）；スピロ（2.2）ペンタン，
フルオロ−，イオン（−１）；トリシクロ（1.1.1.01.3）ペンタン，フルオロ−；シクロペンタン,1,2−ジフルオロ−，トランス−；シクロブタン,1,1−ジフルオロ−３−メチレン;1,3−シクロペンタジエン，
２−フルオロ−;1,3−シクロペンタジエン,1−フルオロ−；ビシクロ（1.1.1）ペンタン，
1,3−ジフルオロ−;1,3−シクロペンタジエン,1,2,3,4,5−ペンタフルオロ−，ダイマー;1,3−シクロペンタジエン
1,2,3,4−テトラフルオロ;1,3−シクロペンタジエン，
1,2,3,4,5−ペンタフルオロ−；シクロペンテン，
1,2,3,3,4,5−ヘキサフルオロ−；シクロブタン,1,1,2,2,3−ペンタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；シクロブテン，
3,3,4,4−テトラフルオロ−１−メチル−；シクロブタン,1−フルオロ−１−メチル−；ビシクロ（2.1.0）ペンタン,2,2,3,3−テトラフルオロ−；シクロペンテン,3,3−ジフルオロ−;1,3−1,3−シクロペンタジエン,5−フルオロ−；シクロブタン，
２−（ジフルオロメチレン）−1,1,3,3−テトラフルオロ−；スピロ（2.2）ペンタン，
1,1,2,2,4,4−ヘキサフルオロ−；ビシクロ（1.1.1）ペンタン,1−フルオロ−；シクロペンテン，
4,4−ジフルオロ−；シクロブタン，（ジフルオロメチレン）−；シクロブタン，
1,1−ジフルオロ−２−メチレン−；スピロ（2.2）ペンタン,1,1−ジフルオロ−；シクロブタン，
1,1,3,3−テトラフルオロ−２−メチレン−；シクロブタン，
２−（ジフルオロメチレン）−1,1−ジフルオロ−，スピロ（2.2）ペンタン,1,1,4,4−テトラフルオロ−；シクロプロパン，
1,1−ビス（トリフルオロメチル）−；スピロ（2.2）ペンタン,1,1,2,2−テトラフルオロ−；トリシクロ（1.1.0.02.4）ブタン，
（トリフルオロメチル）−；スピロ（2.2）ペンタン,1,4−ジフルオロ−；スピロ（2.2）ペンタン，
1,2−ジフルオロ−；スピロ（2.2）ペンタン，フルオロ−；ビシクロ（1.1.0）ブタン，
１−（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン,1,2−ジフルオロ−，シス−；シクロプロパン，
（1,1,2−トリフルオロメチル）−；シクロプロパン，（1,1−ジフルオロエチル）−；シクロプロパン，
（1,2,2−トリフルオロエチル）−；シクロプロパン，（2,2−ジフルオロエチル）−；シクロプロパン，
（２−フルオロエチル）−；シクロプロピル,1−フルオロ−2,2ジメチル−；シクロプロピル,1−フルオロ−2,3−ジメチル−；
シス−；シクロブタン，（トリフルオロメチル）−；フルオリラニウム，トリメチル−；シクロペンチリウム，
１−フルオロ−；シクロプロパン,1,1−ジフルオロ−２−メチル−２−（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン，
１−フルオロ−2,3−ジメチル−，（1.アルファ.,2.アルファ.,3.アルファ．）−；シクロプロパン，
１−フルオロ−2,3−ジメチル−，（1.アルファ.,2.ベータ.,3.ベータ．）−；シクロプロパン，
１−エチル−２−フルオロ−；シクロプロパン,1−エチル−２−フルオロ，トランス−；シクロプロパン，
１−フルオロ−2,3−ジメチル−，（1.アルファ.,2.アルファ.,3.ベータ．）−；シクロブタン,,
1,1,2−トリフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン,1−（ジフルオロメチル）−１−フルオロ−２−メチル−，
トランス−；シクロプロパン,1−（ジフルオロメチル）−１−フルオロ−２−メチル−，シス−；シクロブタン，
1,1,2,2,3−ペンタフルオロ−３−メチル−；シクロブタン，
1,1,2,3−テトラフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン，（２−フルオロエテニル）−；シクロプロパン，
（１−フルオロエテニル）−；ビシクロ（2.1.0）ペンタン,5.5−ジフルオロ−；シクロブテン，
1,4,4−トリフルオロ−３−メチレン−；シクロプロパン,2−エテニル−1,1−ジフルオロ−，
ホモポリマー；シクロブタン,3−（ジフルオロメチレン）−1,1−ジフルオロ−；シクロプロパン，
1,1,2−トリフルオロ−２−（トリフルオロビニル）−；シクロペンテン,1−フルオロ−；シクロプロパン,2−エチル−1,1−ジフルオロ−；シクロプロペン,3,3−ジフルオロ−１−（ペンタフルオロエチル）−；シクロプロパン，
１−メチル−２−（トリフルオロメチル）−，シス−；シクロプロパン,1−メチル−２−（トリフルオロメチル）−，
トランス−；シクロプロパン,1−メチレン−２−（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン，
1,1,2,2,3,3,4,5−オクタフルオロ−；シクロプロパン,1−（ジフルオロメチル）−１−フルオロ−２−メチル，
シス−；シクロプロパン,1−（ジフルオロメチル）−１−フルオロ−２−メチル−，トランス−；シクロペンタン，
1,1,2,2,3,3,4−ヘプタフルオロ−;1,3−シクロペンタジエン,1,2,4,5,5−ペンタフルオロ−，
ダイマー;1,3−シクロペンタジエン,1,2,3,5,5−ペンタフルオロ−，ダイマー;1,3−シクロペンタジエン，
1,2,3,5,5−ペンタフルオロ−;1,3−シクロペンタジエン,1,2,4,5,5−ペンタフルオロ−；シクロペンタン，
1,2,3,4,5−ペンタフルオロ−，ステレオアイソマー；シクロペンタン，
1,1,2,3,4,5−ヘキサフルオロ−，ステレオアイソマー；シクロブテン,3−フルオロ−１−メチル−；シクロペンテン,1,4,5,5−テトラフルオロ−；シクロペンテン,3,3,4,4−テトラフルオロ−；シクロペンテン，
3,3,4,4,5−ペンタフルオロ−；シクロペンテン,1,4,4,5,5−ペンタフルオロ−；シクロペンテン，
1,3,3,4,4,5−ヘキサフルオロ−；シクロプロパン，（2,2,2−トリフルオロエチル）−；シクロペンタン，
1,1,2,3,3,4,5−ヘプタフルオロ−；シクロブテン,2,3,3−トリフルオロ−１−（トリフルオロメチル）−；シクロペンテン，
1,2,3,3,4,5,5−ヘプタフルオロ−；シクロペンテン,1,2,3,3,4,4,5−ヘプタフルオロ−；シクロブテン，
3,3,4,4−テトラフルオロ−１−（トリフルオロメチル）−；シクロペンテン,1,3,3,4,4,5,5−ヘプタフルオロ−；シクロプロパン，
２−フルオロ−1,1−ジメチル−；シクロペンタン,1,1,2,2,3,4,5−ヘプタフルオロ−；シクロブタン，
1,1,2,2−テトラフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン，フルオロ−；シクロペンテン，
1,2,3,3,4,5−ヘキサフルオロ−；トランス−；シクロペンタン,1,1−ジフルオロ−；シクロペンタン，
1,1,2,3,3,4,5−ヘプタフルオロ−；ステレオアイソマー；シクロペンタン,1,1,2,3,3,4,5−ヘプタフルオロ−，
ステレオアイソマー；シクロペンタン,1,1,2,3,3,4,5−ヘプタフルオロ−，シス，シス−；シクロペンテン，
1,3,3,4,5,5−ヘキサフルオロ−；シクロペンテン,1,2,3,3,4,5−ヘキサフルオロ−，シス−；シクロペンタン，
1,1,2,3,4,5−ヘキサフルオロ−，ステレオアイソマー；シクロペンタン,1,1,2,3,4,5−ヘキサフルオロ−，（2.アルファ.,3.アルファ.,4.ベータ.,5.アルファ．）−；シクロペンタン,1,1,2,3,4,5−ヘキサフルオロ−，
ステレオアイソマー；シクロペンテン,1,3,4,4,5,5−ヘキサフルオロ−；シクロペンテン，
3,3,4,4,5,5−ヘキサフルオロ−；シクロペンテン,1,2,3,4,5−ペンタフルオロ−；シクロペンテン，
1,3,4,5,5−ペンタフルオロ−；シクロペンタン,1,1,2,2,3,3,4,5−オクタフルオロ−；シクロペンタン,1,1,2,2,3,4,4,5−オクタフルオロ−；シクロペンタン,1,1,2,3,4,5−ヘキサフルオロ−；シクロプロパン，
２−エテニル−1,1−ジフルオロ−；シクロプロパン,1,1,−ジフルオロ−2,3−ジメチル−，トランス−；シクロプロパン,1,
１−ジフルオロ−2,3−ジメチル−，シス−；シクロブタン,1,1,2,2−テトラフルオロ−３−メチレン−；シクロブタン,1,1,2,2,3,4−ヘキサフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン，ノナフルオロ−；シクロブタン，
1,1,2,2−テトラフルオロ−３−メチル−；シクロプロパン,1,2−ビス（トリフルオロメチル）−；シクロブテン，
1,3,3,4,4−ペンタフルオロ−２−メチル−；シクロプロパン,1,1−ジフルオロ−2,3−ジメチル−；シクロプロパン,1−メチル−１−（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン,1,1−ジフルオロ−2,2−ジメチル−;1−ブチン，
1,3,4,4,4−ペンタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−;1,3−ペンタジエン，
1,1,2,3,4,5,5,5−オクタフルオロ−；シクロブテン，
1,2,3,3,4−ペンタフルオロ−４−（トリフルオロメチル）−;1,3−ペンタジエン，
1,1,2,3,4,5,5,5−オクタフルオロ−；スピロ（2.2）ペンタン，オクタフルオロ−；ペンタジエン，
オクタフルオロ−;1,2−ブタジエン,1,1,4,4,4−ペンタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−;1,2−ペンタジエン，
1,1,3,4,4,5,5,5−オクタフルオロ−；シクロプロパン，ペンタフルオロ（トリフルオロビニル）−;1,3−ペンタジエン，
1,1,2,3,4,5,5,5−オクタフルオロ−;1,4−ペンタジエン,1,1,2,3,3,4,5,5,−オクタフルオロ−；シクロプロペン，
3,3−ジフルオロ−1,2−ビス（トリフルオロメチル）−；シクロペンテン，オクタフルオロ−;1,3−ブタジエン，
1,1,2,4,4−ペンタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；シクロブテン，
1,3,3,4,4−ペンタフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−;2−ペンチン,1,1,1,4,4,5,5,5−オクタフルオロ−;2−ペンテン，
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5−デカフルオロ−;1−ブテン，
1,1,3,3,4,4,4−ヘプタフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン，
1,1,2,3−テトラフルオロ−2,3−ビス（トリフルオロメチル）−，シス−；シクロプロパン，
1,1,2,3−テトラフルオロ−2,3−ビス（トリフルオロメチル）−，トランス−;2−ペンテン，
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5−デカフルオロ−；シクロプロパン，ペンタフルオロ（ペンタフルオロエチル）−；シクロプロパン，
1,1,2,3−テトラフルオロ−2,3−ビス（トリフルオロメチル）−；シクロプロパン，
1,1,2,2−テトラフルオロ−3,3−ビス（トリフルオロメチル）−；シクロペンタン，デカフルオロ−，ラジカル  イオン  （１−）;2−ペンテン,1,1,1,2,3,4,4,5,5,5−デカフルオロ−;2−ブテン，
1,1,1,2,4,4,4−ヘプタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；ペンチリデン，
1,2,2,3,3,4,4,5,5,5−デカフルオロ−;1−ブテン，
1,1,2,3,4,4,4−ヘプタフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；ペンテン，デカフルオロ−；シクロブタン，
ペンタフルオロ（トリフルオロメチル）−;1−ペンテン,1,1,2,3,3,4,4,5,5,5−デカフルオロ−；シクロペンタン，
デカフルオロ−;2−シクロブテン−１−オン,2,3,4,4−テトラフルオロ−；フラン，テトラフルオロ−；シラン，
テトラキス（トリフルオロメチル）−；シラン，トリフルオロ（ノナフルオロブチル）−；ペンタン，
1,1,1,2,2,4,5,5,5−ノナフルオロ−；ペンタン,1,1,1,2,2,3,5,5,5−ノナフルオロ−；ペンタン，
1,1,1,2,2,3,3,4,5−ノナフルオロ−；ペンタン,1,1,1,2,3,3,5,5,5−ノナフルオロ−；プロパン，
1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−メチル−２−（トリフルオロメチル）−；ブタン，
1,1,1,2,4,4−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；ペンタン,1,1,2,2,3,3,4,4,5−ノナフルオロ−；ブタン，
1,1,1,4,4,4−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；プロパン，
1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2,2−ジメチル−；ペンタン,1,1,3,3,5,5−ヘキサフルオロ−；ブタン，
1,1,1,2,3,3−ヘキサフルオロ−２−メチル−；ペンタン，ヘキサフルオロ−；ペンタン,1,2,3,3,4,5−ヘキサフルオロ−；ブタン，
２−（ジフルオロメチル）−1,1,1,2−テトラフルオロ−；ブタン，
1,1,1−トリフルオロ−２−（トリフルオロメチル）−；ブタン−１−13C,4,4,4−トリフルオロ−３−（トリフルオロメチル）−；ペンタン，
1,1,1,5,5,5−ヘキサフルオロ−；ペンタン,1,1,1,2,3,3−ヘキサフルオロ−；ペンタン,2,2,3−トリフルオロ−；ペンタン，
2,2,4−トリフルオロ−；ブタン,1,1,1−トリフルオロ−２−メチル−；ブタン,1,1,1−トリフルオロ−２−メチル−；ブタン，
1,2,2−トリフルオロ−３−メチル−；ブタン,1,3,3−トリフルオロ−２−メチル−；ブタン，
2,2,3−トリフルオロ−３−メチル−；ブタン,1,1,1−トリフルオロ−２−メチル−；ブタン，
1,1,2−トリフルオロ−３−メチル−；ペンタン,1,1,2−トリフルオロ−；プロパン，
1,1,1−トリフルオロ−2,2−ジメチル−；ペンタン,1,1,1−トリフルオロ−；ブタン,1,1,1−トリフルオロ−３−メチル−；シラン，
（ノナフルオロブチル）−；シラン，ジメチルビス（トリフルオロメチル）−；シラン，（ジフルオロメチル）
（フルオロメチル）メチル（トリフルオロメチル）−；シラン，ビス（ジフルオロメチル）ビス（フルオロメチル）−；シラン，
（3,3,3−トリフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロピル）−；シラン，トリメチル（トリフルオロメチル）−；シラン，トリフルオロ（１−メチルプロピル）；シラン，（ジフルオロメチル）（フルオロメチル）ジメチル−；シラン，
トリス（フルオロメチル）メチル−；シラン，（1,1−ジメチルエチル）トリフルオロ−；シラン，
トリフルオロ（２−メチルプロピル）−；シラン，メチル（3,3,3−トリフルオロプロピル）−；シラン，ブチルトリフルオロ−；
実施例51
好ましい実施態様において、分散相は、配合物が投与され、投与後に超音波により検査される生物体の体温以下の沸点を標準的な圧力条件下で有する化学物質から構成される。実施例45は、選択した化学物質の沸点と製造プロセスのパラメーターを考慮して得た温度範囲に基づいて分散相に好適な化学物質を如何にして選択するかを検討している。
フルオロカーボンは、低い毒性、良好な乳化性および低い水溶性を有しており、持続性のあるミクロバブルとなるものであり、以下の分散相を選択する化学物質として特に好適なものである。
1,2,2−トリス（トリフルオロメチル）プロパン・2,2−ビス（トリフルオロメチル）プロパン・
２−メチル−２  トリフルオロメチル  プロパン・テトラキス（トリフルオロメチル）シラン・
メチル  トリス（トリフルオロメチル）シラン・ビス（トリフルオロメチル）ジメチル  シラン・
トリフルオロメチル  トリメチル  シラン  1,1−ビス（トリフルオロメチル）−2,2,3,3−テトラフルオロ
シクロプロパン・1,1−ビス（トリフルオロメチル）シクロプロパン・1,1−ビス
（トリフルオロメチル）2,2  ジフルオロ  シクロプロパン・1,1−ジメチル
（−2,2,3,3）−テトラフルオロ  シクロプロパン・2,2  ジフルオロ  １−メチル−１−トリフルオロメチル
シクロプロパン・1,2−ビス（トリフルオロメチル）−1,2,3,3  テトラフルオロ  シクロプロパン
（シス＋トランス）・1,2−ビス（トリフルオロメチル）−1,2−ジフルオロ  シクロプロパン（シス＋
トランス）・1,2−ビス（トリフルオロメチル）−3,3  ジフルオロ  シクロプロパン・1,2−ビス
（トリフルオロメチル）シクロプロパン（シス＋トランス）1,1,2,2,4,4,5,5−オクタフルオロ  スピロ
〔2.2〕ペンタン・1,1,2,2,−テトラフルオロ  スピロ〔2.2〕ペンタン・1,1,4,4−テトラフルオロ
スピロ〔2.2〕ペンタン・1,1,5,5−テトラフルオロ  スピロ〔2.2〕ペンタン・3,3,4,5
テトラフルオロ  フラン・トリス（トリ  フルオロメチル）ホスフィン・1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,
デカフルオロ  シクロペンタン  1,2,2,3,4,4,5,5−オクタフルオロ  ビシクロ〔1.1.1〕ペンタン・
2,2,4,4,5,5  ヘキサフルオロ  ビシクロ〔1.1.1〕ペンタン・1,2,2,3,4,4−ヘキサフルオロ
ビシクロ〔1.1.1〕ペンタン・1,2,2,3−トリフルオロ  ビシクロ〔1.1.1〕ペンタン
2,2,3,3−テトラフルオロ  ビシクロ〔1.1.1〕ペンタン・1,2,2,3,3,4,4−ペンタフルオロ
−１−トリフルオロメチル  シクロブタン,2,2,3,4,4−ペンタフルオロ−１−トリフルオロメチル
ビシクロ〔1.1.0〕ブタン,2,2,4,4−テトラフルオロ  １−トリフルオロメチル  ビシクロ〔1.1.0〕
ブタン・ビシクロ〔2.1.0〕  ペンタン．
実施例52
下記の乳濁液を調製し、実施例18に記載の方法によりテストした。
すべての溶液を塩水中の２％溶液とした。各化学物質0.1ccを5ccの塩水で、三方コックを25回通過させて細分化した。混合物1.0mLを、1000mLの攪拌された水を含む水浴に、1.2μｍのフィルターで37℃でただちに注入した。次いで得られた後方散乱をヒューレット・パッカード77020A超音波システムを使用して5.0mHzで記録した。
0003621413.tif 000027
最低の沸点と最高の蒸気圧を有する化学物質ドデカフルオロペンタンは、最も長く持続し、最大の後方散乱（最も明るいコントラスト）を生じ、それから４−５分かけてゆっくり減少した。高沸点および低蒸気圧を有する化学物質ノナンとペルフルオロデカリンは、所定の後方散乱（ドデカフルオロペンタンより顕著ではない）を生じ、ノナンより大きな後方散乱を与えるペルフルオロデカリンと共に1.5分以内にすみやかに減少した。エタン、ジクロロエタンおよびハロタン（halothane）も、最低限度の後方散乱を生じ、１分以内に基本線まで減少した。塩水と空気の混合物は、５−10秒持続した最小の後方散乱を与えた。
塩＋空気の持続性の程度を１とすれば、ドデカフルオロペンタンは24倍となる。後方散乱の強度を０から５まで定性的にランク付けすると、塩＋空気は０に、ドデカフルオロペンタンは５になり、ノナン、1,2−ジクロロエタン、ハロタン、ペルフルオロデカリンはそれぞれ0.5、0.25、0.25および2.0となる。
実施例53
この研究の目的は、本発明の乳濁液をニュージランド・ホワイトラビットに、超音波コントラストを生じる量で、静脈内投与して、HNCL症候群（ハイパーインフレイテッド・ノンコラプシブル・ラング・シンドローム）を生じることの可能性を見きわめることであった。HNCL症候群は多数のフルオロカーボン乳濁液により生じているが、例をあげれば、20％フルオゾル（Fluosol,登録商標）、F.D.A.承認静脈注射用ペルフルオロケミカル乳濁液（JP第1609986号特許に記載され、詳しくは文献による）、ペルフルオロオクチルブロマイド含有乳濁液（US第4987154号特許に記載され、詳しくは文献による）および他のフルオロカーボン乳濁液（EP第231091号、JP第63060943号、US第4859363号、US第5171755号およびJP第21196730号の特許あるいは出願に記載され、詳しくは文献による）がある。HNCL症候群生成のメカニズム、その潜在的可逆性ならびに治療的意義はまだ不明である。この症候群の特徴は、死体解剖で高膨脹した肺が容積が増え、平均密度が減り、組織に投与されたフルオロカーボンが見つかることである。HNCLの発見者であるルランド・クラーク（Leland  Clark）は、「もしHNCLが他の種（例ヒト）に生じれば、150℃以上で沸騰するフルオロカーボンのみが安全と考えられる」と述べている（クラークLCら、Biomat.、Art.Cells  ＆  Immob.Biotech.,20,1085−1099、詳しくは文献による）。
雄のニュージランド・ホワイトラビット４グループ（１グループ３匹）に、実施例44の乳濁液を0.2あるいは1.0mL/kg,フルオゾル（アルファ・セラピューテック社）を24mL/kg、塩を24mL/kg投与した。投与量は超音波コントラストを生じる投与量に基づいて選んだ。体重、食物の消化、治療的観察が投与中および投与直後になされた。投与後24時間して、ラビットは安楽死させ、肺を切開して膨脹の程度を調べ、肺の重さと容積を測定し、組織中のペルフルオロカーボンの存在をヘッドスペースアナライザーを使用して、ガスクロマトグラフィーにより測定した。
塩水あるいは実施例44の乳濁液を投与されたラビットの肺は、死体解剖では正常で、胸部切開で崩壊した。フルオゾルを投与されたラビットの肺は、中位ないし重大な膨脹を示した。
肺の重さあるいは肺の重さ対体重の割合における、各グループ間の治療に関連する変化は見られなかった。実施例44の乳濁液を投与されたラビットにおける肺の密度測定は、コントロールに比べ変化しなかった。フルオゾルの投与は肺の容積における175％増加、肺対体重の割合における185％増加、コントロールに比べたときの肺の密度における45％低下をもたらした。これらの変化は非常に重要である（ｐ＝0.001）。
ドデカフルオロペンタンは、実施例44の乳濁液を投与されたグループの動物からとった肺組織の分析では検出されなかった。フルオゾルは、ガスクロマトグラフィーによる分析では４つの主要ピークと１つの小さなピークを含む。５つのすべてのピークが、フルオゾルを投与された動物のヘッドスペース組織サンプルのガスクロマトグラムに見つかった。
研究の条件のもとでは、良好な超音波コントラストを生じる投与量での実施例44の乳濁液の単一投与では、肺膨脹、重さ、密度に何ら効果を示さず、肺組織にドデカフルオロペンタンの検出可能なレベルを生ぜず、ラビットにおいてHNCL症候群を生じるとは考えられない。
従来技術に記載の方法により生成された乳濁液は、超音波コントラストを生じるのに必要な投与量でこの安全な状態を生じ、一方驚くべきことには、29℃で沸騰するフルオロカーボンで、本出願に記載の方法により調製された乳濁液は、HNCLを生じなかった。
実施例54
ビーグル犬に実施例44の乳濁液0.05、0.10、および0.15mL/kgを５−８秒かけて単一静脈内投与し、各種の時間を決めた血液サンプルを得、ドデカフルオロペンタン含有量を有効なガスクロマトグラフィー検定により測量することにより、薬物動力学的研究を行った。12匹の雄、12匹の雌からなる24匹のイヌを使って、３つの投与グループに別けて研究を行った。
データを一括インプットと一次アウトプットにより二つのコンパートメント  モデルに合わせた。雄と雌とに分けての比較、あるいは３つの投与グループの比較では格別の相違はなかった。
分布相は0.9分から1.3分に及んだ。放出相は30分から48分に及んだ。tmax（２番めの区画室における最大濃度に対する時間）は、5.1分から6.6分に及んだ。これらの放出時間を、数か月間測定した従来技術のフルオロカーボン乳濁液の放出時間と比較した（上記クラークらを参照）。明らかに、数時間で体を通過する造影剤が好適である。
実施例55
ドデカフルオロペンタン（沸点28−29℃）、ドデカフルオロペンタンと沸点20.0℃のデカフルオロブタンの混合物、およびペルフルオロシクロペンタン（沸点22.5℃）の乳濁液を調製して、エコー能をテストした。乳濁液は界面活性剤としてフルオラド170Cを含み、水浴ソニケーターからの音波エネルギーを適用して生成した。エコー能は、各乳濁液0.2mLを1000mLの水に37℃で1.2ミクロンのフィルターを通して添加し、実施例１に記載の方法によりビデオ密度を測定することによりテストした。ドデカフルオロペンタン含有乳濁液は、58.5ユニット（2.9のバックグラウンド）の投与後グレイスケール強度を６秒間生じ、フルオロカーボンの混合物は、同条件のもとで3.0から133.3への増強を生じ、ペルフルオロシクロペンタンは、3.6から158.9という最大の増強を生じた。このように、低い沸点のフルオロカーボンの方が、高い沸点のフルオロカーボンより大きなエコー能を生じた。
実施例56
有用な超音波コントラスト剤配合物が、低沸点の化学物質の分散液を、超音波検査を受ける生物体の体温でかなりの程度まで蒸発することのない化学物質から構成される分散相を含有する乳濁液で安定化させて調製される。例えば、US第4,767,410号、US第4,987,154号、JP第2196730号、JP第1609986号、JP第63060943号およびEP第245019号に記載され、詳しくは文献に示さているように、高沸点分散相からなるフルオロカーボンまたはハイドロカーボンを含む乳濁液は、後方散乱効率が高蒸気圧化学物質の添加により大きく高められる配合物の基剤を生成することができる。例えば、レシチン安定ペルフルオロオクチルブロマイド乳濁液は、ペルフルオロシクロペンタン（沸点＝22℃）を細分化前に分散相に添加すると、エコー能を顕著に増加させた。他の低沸点有機ハロゲン化物、炭化水素、エーテルも同じ効果を有する。
本発明は、特定の好適な実施態様に関連する事項により記載されたが、当該技術分野における当業者が種々の変更ないし修正を適宜行い得ることはいうまでもない。したがって、後記の特許請求の範囲は限定して解釈されるべきではなく、開示された発明の主題から通常の手段により導き出される適宜の変更ないし修正をも含み得るものとみなされるべきである。