(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
0003657989.tif 000049
（式中、
R1は、CH2CH2NH2、CH2CN、又はCH2CONH2;
R2は、Ｈ又はOH;
RIは、C9−C21アルキル、C9−C21アルケニル；
RIIは、（CH2）2-4NRIVRV；
RIIIは、Ｈ；
RIVは、Ｈ又はC1−C4アルキル；
RVは、Ｈ又はC1−C4アルキル）
を有する化合物又はその酸付加塩及び／もしくは水和物、あるいは当てはまる場合は、その幾何異性体もしくは光学異性体又はそのラセミ混合物。
【請求項２】
式
0003657989.tif 000050
（式中、
R1は、CH2CH2NH2;
R2は、OH;
RIは、9,11−ジメチルトリデシル；
RIIは、CH2CH2NH2;
RIIIは、水素）
を有する請求項１に記載の化合物又はその酸付加塩。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、抗真菌剤及び抗ニューモシスチス剤として有用でありうるアザシクロヘキサペプチド化合物に関する。
通常の薬剤に耐性の単離株の数が増加しているために抗真菌剤及び抗ニューモシスチス剤が現在必要とされている。更に、通常の薬剤はそれらの有用性に制限を加えるやや高レベルの毒性を有する。最後に、AIDSに罹患している患者のような免疫低下患者の感染の感受性をかんがみると特に、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）肺炎の発生が増加している。
発明の概要
本発明の化合物である化合物Ｉ（配列番号１−６）は、４−ヒドロキシオルニチン部分の５−炭素（以後“Ｃ−５−orn"）でシクロヘキサペプチド環に結合している窒素及びプロリン成分の５員環の４−位置に結合しているヒドロキシ基を有することを特徴とする。上記化合物は、式（Ｉ）
0003657989.tif 000002
（式中、
R1は、CH2CH2NH2、CH2CN、又はCH2CONH2;
R2は、Ｈ又はOH;
RIは、C9−C21アルキル又はC9−C21アルケニル；
RIIは、Ｈ、C1−C4アルキル、C3−C4アルケニル、（CH2）2-4OH、（CH2）2-4NRIVRV、CO（CH2）1-4NH2;
RIIIは、Ｈ、C1−C4アルキル、C3−C4アルケニル、（CH2）2-4OH、（CH2）2-4NRIVRV;
RIVは、Ｈ又はC1−C4アルキル；
RVは、Ｈ又はC1−C4アルキル）又は医薬的に許容可能なその酸付加塩及び／もしくは水和物によって表わされる。
本発明はまた、上記化合物を含む医薬組成物並びに抗真菌剤として、及びニューモシスチス・カリニ感染の治療と防止のために使用する方法に関する。
特に、R1がCH2CH2NH2;R2がOH;RIが9,11−ジメチルトリデシル;RIIがCH2CH2NH2;RIIIが水素である化合物が好ましい。
明細書及び請求の範囲において、化学式又は化学名は、全ての光学異性体及び立体異性体並びにラセミ混合物を包含するものとする（このような異性体及び混合物が存在する場合）。
アルキルという用語は、直鎖、分岐鎖、又は環状鎖の炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチルなどを指す。
シクロアルキルという用語は、炭素原子間に交互二重結合即ち共鳴二重結合を有しない３〜15個の炭素原子を含むアルキルの一種を指す。
アルケニルという用語は、例えばビニル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン−４−イル、２−ベテン−４−イル、１−ペンテン−５−イルなどのような基を指す。
アルコキシという用語は、例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ、ヘプトキシ、ドデシルオキシなどのような直鎖又は分岐鎖のオキシアルキル基を指す。
酸付加塩として適切な医薬的に許容可能な塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、ホスホン酸、過塩素酸などの無機酸の塩；酒石酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、アレイン酸、フマル酸、シュウ酸などの有機酸の塩；及び当業者公知の他の実質的に非毒性の酸付加塩が含まれる。
本発明のアザ誘導体の代表的な核（化合物Ｉ）及びこれらの化合物の配列番号を以下の表に示すことができる。ペプチド核は、置換基RI、RII、RIIIにかかわらず同一であり、配列番号は核の違いによって振り分けられているので、アミンと塩は同一の配列番号を持つ。
0003657989.tif 000003
上記化合物は、低級アルコール、及びジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジンなどの極性非プロトン性溶媒に可溶である。上記化合物は、ジエチルエーテル及びアセトニトリルなどの溶媒に不溶である。
本発明の化合物は、抗生物質として、特に抗真菌剤又は抗原生動物剤として有用である。抗真菌剤として、上記化合物は糸状菌及び酵母の両方の抑制に有用である。上記化合物は、特に哺乳動物での真菌感染、特にC.albicans，C.tropicalis，C.pseudotropicalisなどのCandida種、C.neoformansなどのCryptococcus種、及びA.fumigatus，A.flavus，A.nigerなどのAspergillus種が原因の感染の治療での使用のために適合している。上記化合物はまた、下記のように、免疫低下患者が特に感受性のあるニューモシスチス・カリニ肺炎の治療及び／又は予防に有用である。
本発明の化合物は、式
0003657989.tif 000004
を有する化合物から、“Ｃ−５−orn"（即ちヘミアミナル（hemiaminal））位置の酸素原子が最終的に窒素に置換される一連の反応により製造できる。製造のための出発物質（化合物Ａ）は、RIが9,11−ジメチルトリデシルであり、米国特許第5,021,341号（1991年６月４日発行）に記載のように、主要炭素源としてマンニトールを富化した栄養培地でZalerion arboricolaATCC20868を培養して生産されうる天然産物でありうる。
出発物質の配列番号を以下の表に示す。
0003657989.tif 000005
反応の順序を以下のスキームで示す。
0003657989.tif 000006
0003657989.tif 000007
工程Ａにおいて、出発物質である化合物Ａ（配列番号７−12）、アルキルチオール又はアリールチオール、及び酸を、無水条件下非プロトン性溶媒中で、以下の表に示される化合物Ｂ（配列番号13−18）の生成反応が起こるのに十分な時間、反応させる。アミノエチルチオールがこの工程で有用であることが知見された。
0003657989.tif 000008
工程Ａで適切な酸には強有機酸及び無機酸などがある。強有機酸の例はショウノウスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸である。無機酸には塩酸、臭化水素酸などがある。ショウノウスルホン酸が好ましい。
適切な溶媒にはDMF、DMSO、１−メチル−２−ピロリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（HMPA）などがある。DMF又はDMSOが好ましい。
反応を一般的には外界温度で１〜約10日行う。
反応を行うには、シクロヘキサペプチド化合物、チオール化合物、酸を一緒に、反応が実質的に終わるまで適切な溶媒中で撹拌する。それから反応混合物を水で希釈し、溶離液として10−40％アセトニトリル／水（0.1％トリフルオロ酢酸含有）を使用する逆相樹脂でのフラッシュクロマトグラフィーにかける。トリフルオロ酢酸を以後“TFA"という。所望生成物を含む分画を濃縮し、凍結乾燥し、凍結乾燥物質を分取高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製する。
HPLC用の適切なカラムには“ZORBAX"（DuPont）、“DeltaPak"（Waters）、“Bio−Rad"（Bio−Rad）、“LICHROPREP"RP18（E.Merck）などの商標名又は商品名で販売されている市販のカラムがある。特定のカラムを実施例で挙げている。
工程Ｂで、化合物Ｃ（配列番号13−18）、即ちスルホンを化合物Ｂの酸化によって得る。適切な酸化剤には“OXONE"（KHSO5・KHSO4・K2SO4  2:1:1、Aldrich  Chemicals）、メタクロロペルオキシ安息香酸、ペルオキシ酢酸などがある。ヘミアミナル炭素に結合している原子が依然として硫黄なので、化合物Ｃの配列番号は化合物Ｂのものと同じである。即ち上記スルホンの配列番号は以下の通りである。
0003657989.tif 000009
チオエーテル（化合物Ｂ）のスルホン（化合物Ｃ）への酸化を約２モル量の酸化剤を使用して行う。１モル量の酸化剤を使用すると、生成物はスルホキシドであり、スルホキシドはその後スルホンに変換されうる。スルホキシドを、アザ化合物の生成での中間体として使用できるが、スルホンが好ましい。２モル量をわずかに超える酸化剤を使用する。
反応を水性媒質、好ましくはアセトニトリルと水の混合物で行う。ほぼ等量が好ましいが、1:9〜9:1の範囲を使用できる。
反応を行う場合、酸化剤を、1:1アセトニトリル／水中の化合物Ｂ（配列番号13−18）の溶液に加え、混合物を、化合物Ｃを得る反応が終わるのに十分な時間、一般的には約30分〜１時間、外界温度に放置する。
反応が終わった後、化合物を、水での希釈及びクロマトグラフィーにより反応混合物から回収する。逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーがこの精製工程に好適である。好ましい溶出剤は、５％ステップグラジエントの30−45％アセトニトリル／水（0.1％TFA）である。適切な分画を凍結乾燥し、所望のスルホン中間体即ち化合物Ｃ（配列番号13−18）を回収する。この中間体は不安定の傾向にあり、従って単離をできるだけ迅速に行うべきである。
化合物Ｃを、“Ｃ−５−orn"に直接結合した窒素を有する化合物に変換できる。フローダイアグラムに示すように、化合物Ｃのアルカリ金属アジドとの反応により、その位置にアジドを生成させる（化合物Ｄ）が、一方アミン化合物（アンモニア又はアミン）との反応により、“Ｃ−５−orn"位置にアミノ基を生成させる（化合物Ｉ）。化合物Ｄは、本発明の大部分の化合物にとって重要な中間体である。化合物Ｄは“Ｃ−５−orn"に窒素を有するが、生成物ではないので、化合物Ｄに別の配列番号を与える。化合物Ｄの配列番号を以下の表に示す。
0003657989.tif 000010
アジドは、HPLC分析により測定されるアジド生成の反応を完成させるのに十分な時間非プロトン性溶媒中、外界温度で撹拌しながら、スルホン（化合物Ｃ、配列番号13−18）の溶液にアルカリ金属アジドを加えることにより獲得できる。その後反応混合物をトリフルオロ酢酸のような酸の水溶液で希釈し、それから反応混合物から所望のアジド（化合物Ｄ）を分離するためにクロマトグラフィーにかける。５％ステップグラジエントの10−25％アセトニトリル／水（0.1％TFA）を使用する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーが、上記方法のために好適である。
アジド（化合物Ｄ）を還元して、本発明の生成物（化合物Ｉ、配列番号１−６）の一つである遊離アミノ基を有する化合物とすることができる。
氷酢酸などの溶媒中でアジド化合物（化合物Ｉ）をPd/Cと混合し、バルーン圧で10〜20時間水素化することにより、還元を行うことができる。それから生成物を、濾過により触媒を最初に除去して回収し、濾液を凍結乾燥し、アミン化合物（配列番号１−６）を得る。該アミン化合物中でアミンは第１級アミンである。
このように得たアミンを、以下に記載する置換アミンに変換できる。
−NRIIRIIIが−NHCH2CH2NH2又は総括的に−HN（CH2）2-4NRIVRVで表される化合物Ｉは、ジアミンH2N（CH2）2-4NRIVRVをスルホン（化合物Ｃ、配列番号13−18）と反応させる方法によりスルホンから製造できる。
反応を、上記した非プロトン性溶媒中で、外界温度で行う。約10倍モル過剰量のアミン化合物を使用する。反応を１〜数時間かけて行う。
この反応を行う場合、適切なアミンを、無水非プロトン性溶媒中のスルホン溶液に加え、反応混合物を外界温度で撹拌し、“Ｃ−５−orn"での置換基が−NRIIRIIIである化合物Ｉ（配列番号１−６）を得る。その後所望化合物を、トリフルオロ酢酸水溶液による希釈とその後のクロマトグラフィーにより回収できる。５％ステップグラジエントで10−25％アセトニトリル／水（0.1％TFA）で溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーが好適である。適切な分画を凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸塩として生成物を回収できる。
該トリフルオロ酢酸塩を水に溶解させ、Bio−Rad  AG2−X8（Cl-）polyprepカラムに通し、塩酸塩として生成物を回収することにより、トリフルオロ酢酸塩を変換できる。
上記のように製造し、記載した第１級アミノ基−NH2を有するアミンをそれから通常の方法によりアルキル化すると、置換されたアミノ基を得ることができる。簡単にいえば、適切に置換されたハロゲン化アルキルをアミン（化合物Ｉ、NRIIRIII＝NH2;配列番号１−６）と、非プロトン性溶媒中塩基の存在下反応させて、アルキル化を行うと、一置換アミン（化合物Ｉ、NRIIRIII＝NHRII、RIIはC1−C4アルキル、C3−C4アルケニル、（CH2）2-4OH、（CH2）2-4NRIVRV）を得ることができる。該一置換アミンは通常の方法により、反応混合物から回収できる。
上記のように製造され、第１級アミノ基−NH2を有するアミンを通常の方法でアシル化すると、アシル化アミノ基を得ることができる。意図されるアシル基はCO（CH2）1-4NH2である。これは第１級アミノ基であるので、アシル化する酸のアミノは、アシル化を行う前に、ベンジルオキシカルボニル基などで保護される。ペンタフルオロフェニルエステルなどの活性化エステルが好適に使用される。非プロトン性溶媒中、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下、外界温度で、１〜数時間かけて、アシル化を行い、アシル化された生成物を得ることができるが。反応混合物をメタノールで希釈し、HPLCで精製して、生成物を回収することができる。保護基を、通常の水素化分解により除去できる（化合物Ｉ、−NRIIRIII＝−NHCO（CH2）1-4NH2）。
ヘミアミナル位置のアミノ基が全部置換されている、即ちRIIもRIIIも水素でないアミン化合物は、
0003657989.tif 000011
好適にはスルホン（化合物Ｂ、配列番号19−24）を適切に置換されたアミンRIIRIIINHと反応させて製造できる。反応を、反応が起こる十分な時間をかけてスルホンの撹拌溶液にアミンを加えることにより行う。生成物は、分取HPLCによる精製と適切な成分の凍結乾燥により回収できる。
本発明はまた酸付加塩を包含する。通常の単離工程により得られた化合物は酸付加塩として得られる。一般的にそれはトリフルオロ酢酸塩としてである。このように得られた塩を水に溶解し、所望のアニオンを担持するアニオン交換カラムに通すことができる。所望の塩を含む溶出液を濃縮し、塩を固体生成物として回収できる。
本発明の化合物は多くの真菌、特にCandida種に対し活性を有する。抗真菌性は、１％デキストロースを含むYeast  Nitrogen  Base（DIFCO）培地で行うミクロブロス希釈アッセイで特定のCandida生物に対する最低殺真菌濃度（MFC）測定で表すことができる。
代表的アッセイでは、化合物を100％ジメチルスルホキシド（DMSO）に初期濃度5mg/mlで溶解させる。溶解した後、薬剤保存液を、最終DMSO濃度が約10％であるように水で希釈して濃度512μg/mlにする。それからその溶液を、96穴プレート（各穴はYNDB  0.075ml含有）の第１列にマルチチャンネルピペッターで分配し、薬剤濃度を256μg/mlにする。第１列の化合物を列毎に２倍希釈し、最終薬剤濃度を256〜0.12μg/mlにする。
試験する生物の４時間培養液を分光光度計で600nmを使用して調整し、0.5McFarland  Standardに等しくする。この懸濁液をYNDB中に1:100に希釈し、細胞濃度を１−５×104コロニー形成単位（CFU）/mlにする。懸濁液のアリコート（0.075ml）をミクロタイタープレートの各穴に植菌し、最終細胞植菌５−25×103CFU/ml、最終薬剤濃度128〜0.06μg/mlにする。各アッセイでは薬剤を含まない対照穴の１行と細胞を含まない対照穴の１行がある。
インキュベーションの24時間後、ミクロタイタープレートをシェーカー上で穏やかに振盪させ、細胞を再懸濁する。MIC−2000イノキュレーターを使用して、96穴ミクロタイタープレートの各穴からのサンプル1.5μｌをSabouraud dextrose寒天（SDA）を含むsingle reservoir inoculumプレートに移す。植菌されたSDAプレートを24時間35℃でインキュベートし、それから最低殺真菌濃度（MFC）を測定する。MFCは生育しないか１スポット当り４コロニー未満の最低薬剤濃度と定義される。
真菌に対して化合物のin  vivo効果は、以下のin  vitroアッセイで証明することができる。
C.albicansMY1055の一晩SDA培養物からの生育物を滅菌生理的食塩水に懸濁し、細胞濃度を血球計数器計測で測定し、細胞懸濁液を3.75×105細胞/mlに調整する。その後、この懸濁液の0.2mlを、最終植菌量が7.5×104細胞／マウスになるようにマウスの尾静脈にI.V.投与する。
その後、種々の濃度の化合物Ｉの水溶液を、腹腔内（I.P.）に、１日に２度（b.i.d.）、４日連続で、上述した方法でC.albicansに前もって感染させた18〜20gの雌のDBA/2マウスに投与することでアッセイを行う。蒸留水を対照としてC.albicansに攻撃されたマウスにI.P.投与する。７日後、マウスを炭酸ガスで殺し、対の腎臓を無菌的に取出し、滅菌生理的食塩水5mlを含む滅菌ポリエチレンバッグに入れる。腎臓をバッグの中でホモゲナイズし、滅菌生理的食塩水で連続的に希釈し、アリコートをSDAプレートの表面に広げる。このプレートを35℃で48時間インキュベートし、酵母のコロニーを計測し、腎臓1g当りのコロニー形成単位（CFU）を測定する。
本発明の化合物はまた、免疫低下患者のPneumocystis carinii感染を防止又は軽減するのに有用でありうる。本発明の化合物の治療目的又は抗感染目的としての効力は、免疫抑制ラットでの研究で実証されうる。
Sprague−Dawleyラット（体重約250g）を、数週間、飲料水中のデキサメタゾン（2.0mg/L）で免疫抑制し、低タンパク質食餌で維持し、潜伏感染からのニューモシシスチス肺炎の進行を誘導する。薬剤投与前に、ラットを殺し、Pneumocystis carinii肺炎（PCP）の存在を確認する。５匹のラット（体重約150g）に、１日に２回、４日間、ビヒクル（蒸留水）0.25ml中の化合物を皮下（sc）注射する。ビヒクル対照も行う。治療期間中、全ての動物に飲料水中にデキサメタゾンと低タンパク質食餌を与え続ける。治療が終わった後、全ての動物を殺し、肺を取出し、処理し、病気の程度を染色スライドの顕微鏡分析で決定する。未治療対照又は溶媒対照の肺の嚢胞の数と比較したとき、嚢胞の防止又は減少が治療ラットの肺のスライドで見られる。
化合物を通常の製剤混合技術に基づき医薬として許容可能な担体と新規医薬組成物に処方するとき、顕著な特性が最も有効に利用される。
新規組成物は、少なくとも抗真菌剤又は抗ニューモシスチス剤として治療有効量の活性化合物を含む。一般的に組成物は化合物Ｉを少なくとも１重量％含む。使用前に希釈される適切な濃縮組成物は90重量％以上含みうる。組成物には、経口投与、局所投与、非経口投与（腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈投与を含む）、経鼻投与、座薬投与、又は通気法に適切な組成物がある。化合物Ｉを所望の媒質のために適切な成分とよく混合して組成物を予めパックできる。
経口投与用に処方される組成物は、液体組成物又は固体組成物でありうる。液体製剤の場合、治療薬剤は、水、グリコール、油、アルコールなどの液体担体と共に処方でき、カプセル及び錠剤などの固体製剤の場合、澱粉、糖、カオリン、エチルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、カオリン、タルク、乳糖などの固体担体；一般的に、ステアリン酸カルシウムなどの湿潤剤；結合剤、崩壊剤などと共に処方できる。投与が容易なため、錠剤及びカプセルが最も有利な経口投与形態の一例である。投与の簡便さと投与の画一さのために、組成物を単位投与形態（以下に定義）に処方することは特に有利である。単位投与形態の組成物は本発明の一面を構成する。
注射用にも組成物を処方でき、そのような組成物は油性ベヒクル中又は水性ベヒクル（たとえば水中の0.85％塩化ナトリウムもしくは５％デキストロースなど）中の懸濁液、溶液、またはエマルションのような形態をとることができるし、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの処方剤を含むことができる。緩衝剤及び生理的食塩水又はグルコースなどの添加物を、溶液を等張にするために加えることができる。点滴静脈投与のために、化合物をアルコール／プロピレングリコール又はポリエチレングリコールに溶解することもできる。これらの組成物はまた、アンプル又は多数回投与容器（multidose container）として、好ましくは保存剤を加えて単位投与形態で提供できる。あるいは、活性成分は、投与の前に適切なベヒクルと再構成するための粉末形態でありうる。
明細書と請求の範囲で使用する“単位投与形態”という用語は、各単位が所望の治療効果を生ぜしめるように計算された所定量の活性成分と医薬担体を含む、物理的に別個の単位を指す。このような単位投与形態の例は錠剤、カプセル、丸薬、粉末小包、オブラート、アンプル中又は多数回投与容器中で計測された単位などがある。本発明の単位投与は一般的に化合物の一つを100〜200mg含むであろう。
化合物が抗真菌用である場合、如何なる投与法も使用できる。真菌感染の治療の場合、通常経口投与又は静脈投与を使用する。
化合物をニューモシスチス感染の防止に使用する場合、直接、肺及び気管支を治療することが望ましい。この理由のため、吸入法が好ましい。吸入投与の場合には、本発明の化合物は、加圧パック又は噴霧器からエアロゾル噴霧の形態で便利にも送達される。吸入のための好ましい送達システムは計量された投与吸入（MDI）エアロゾルであり、これはフルオロカーボン又は炭化水素などの適切な噴霧剤中に化合物Ｉを懸濁又は溶解させて処方することができる。
本発明の化合物は、錠剤、カプセル、局所用組成物、通気用粉末、座薬などとして使用できるが、水中及び水性媒質中での本発明の化合物の溶解度により注射用組成物での使用に適合できるし、またエアロゾル噴霧に適切な液体組成物での使用に適合できる。
以下の実施例により本発明を説明するが、実施例が制限を加えるものと理解されるべきでない。
実施例１
0003657989.tif 000012
工程A:中間体アミノエチルチオエーテル（配列番号15）の製造
無水N,N−ジメチルホルムアミド40ml中の１−［4,5−ジヒドロキシ−N2−（10,12−ジメチル−１−オキソテトラデシル）オルニチン］−５−（３−ヒドロキシグルタミン）−６−（４−ヒドロキシプロリン）エチノカンジンＢ（echinocandin B）500mg（0.47mmol）、２−アミノエタンチオール塩酸塩5.34g（47mmol）、（1S）−（＋）−10−ショウノウスルホン酸109mg（0.47mmol）の溶液を、25℃で２−６日間又は出発物質が消えるために十分な期間撹拌する。反応液を水40mlで希釈し、10％アセトニトリル／水に充填した“LICHROPREP"（E.Merck）RP18（40−63μm,15g）でフラッシュクロマトグラフィーにかける。カラムを10−40％アセトニトリル／水で溶出し、各グラジエントステップで２個の120ml分画を集める。分析用HPLC（Zorbax  Rx  C18,40％アセトニトリル／水/0.1％トリフルオロ酢酸、210nm）で測定した適切な分画を濃縮し、凍結乾燥する。残渣を分取HPLC（ZORBAX  C18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で更に精製し、所望の化合物をトリフルオロ酢酸塩（分子量1238）として得る。
工程B:スルホン（配列番号15）への酸化
上記のように得たチオエーテルの混合物（0.358mmol）を1:1アセトニトリル／水  15mlに溶解し、“OXONE"（過硫酸水素カリウム1.06mmol当量）を加える。約１時間後、溶液を等量の水で希釈し、即座に、２％ステップグラジエントで、0.1％TFAを含む35−45％アセトニトリル／水で溶出する逆相C18フラッシュクロマトグラフィーを使用してクロマトグラフィーにかける。生成物を含む分画を凍結乾燥し、分子量が1270の生成物を得る。
工程C:スルホンのアジド（配列番号21）への置換え
上記のように製造したスルホンの混合物（0.257mmol）を無水DMF10mlに溶解する。リチウムアジド（0.257mmol）を固体として加え、混合物を約４−24時間撹拌する。混合物を５％ステップグラジエントで、30−65％アセトニトリル／水で溶出する逆相C18フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。逆相HPLC（RP−18,40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で測定した適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥をし、粗生成物を得る。分取逆相HPLC（C18、40−45％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）による更なる精製により分子量1090の所望の精製された化合物を得る。
工程D:アジドからアミン（配列番号３）への還元
（上記のように得た）アジド化合物（0.126mmol）と10％Pd担持木炭（100−150mg）の混合物を氷酢酸（10ml）に懸濁する。反応容器に最初は窒素、次に水素を流入させる。アミン生成物へ完全に還元するために十分な時間、典型的には２〜24時間、１大気圧の水素ガスを維持する。触媒を濾過で除去し、濾液を凍結乾燥し、粗アミンを得る。分取逆相クロマトグラフィー（C18、35−41％アセトニトリル／水/0.1％TFA、３％ステップグラジエント、210nm）で更に精製してもよい。生成物含有分画を凍結乾燥し、分子量1178の精製化合物を得る。
実施例２
0003657989.tif 000013
実施例１工程Ｂに記載したように得たスルホン混合物（0.945mmol）を、無水DMF20mlに溶解し、エチレンジアミン（9.45mmol）を加える。約１−12時間、又は分析用HPLC分析（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−40％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置の所望生成物とそのβ−Ｃ−５  ornエピマーを得る。このように得られるトリフルオロ酢酸塩を少量の脱イオン水に溶解し、Bio−Rad  AG2−X8（Cl-）polyprepカラムに通し、更にカラムを水で洗浄する。生成物含有溶出液を凍結乾燥し、所望の生成物を分子量1180の二塩酸塩として得る。
実施例３
0003657989.tif 000014
実施例１工程Ｂに記載したように得たスルホン混合物（0.945mmol）を、無水DMF20mlに溶解し、ｎ−ブチルアミン（9.45mmol）を加える。約１−12時間、又は分析用HPLC分析（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−50％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置の所望生成物とそのβ−Ｃ−５  ornエピマーを得る。トリフルオロ酢酸塩として
単離される生成物は分子量1234を有する。
実施例４
0003657989.tif 000015
実施例１工程Ｂに記載したように得たスルホン混合物（0.945mmol）を、無水DMF20mlに溶解し、エタノールアミン（9.45mmol）を加える。約１−12時間、又は分析用HPLC分析（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−40％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置で分子量が1222の所望生成物を得る。
実施例５
0003657989.tif 000016
工程A:中間体ニトリル化合物（配列番号２）の製造
N,N−ジメチルホルムアミド3.0ml中の１−［4,5−ジヒドロキシ−N2−（10,12−ジメチル−１−オキソテトラデシル）オルニチン］−５−（３−ヒドロキシグルタミン）−６−（４−ヒドロキシプロリン）エチノカンジンB250mg（0.23mmol）の溶液を調製した。塩化シアヌル64mgを一度に加え、混合物を5.5分間撹拌し、直ちに2M酢酸ナトリウム0.55mlで反応を止めた。この混合物を、分取HPLC（“ZORBAX"C8、アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm、277nm）で精製した。分析用HPLC（“ZORBAX"C8,45％水／アセトニトリル/0.1％TFA、1.5ml/分、210nm、277nm）で測定した適切な生成物含有分画をプールし、凍結乾燥し、所望のニトリル化合物45mgを98％を超える純度で白色固体として得た。1H  NMR（400MHz,CD3OD）δ7.12（d,1H）,6.74（d,1H）,5.31（m,1H）,2.83（dd,1H）,2.72（dd,1H）,2.42（m,1H）,1.21（d,3H）;FAB−MS（Li）,m/e1054（Ｍ＋Ｈ＋Li）。
工程B:ニトリルのアミン（配列番号１）への還元
メタノール2.0ml中の（工程Ａで上記のように製造された）ニトリル38.5mg（0.036mmol）の溶液に、CoCl2・6H2O32mg（0.25mmol）を加えた。次にホウ水素化ナトリウム46mg（34当量）を数回に分けて加えた。混合物を、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。分取HPLC（“ZORBAX"C8、45％水／アセトニトリル、210nmおよび277nm）で、反応混合物を精製した。分析用HPLC（“ZORBAX"C8,45％水／アセトニトリル/0.1％TFA、1.5ml/分、210nmおよび277nm）で測定した適切な分画をプールし、凍結乾燥し、所望アミンのトリフルオロ酢酸塩13mg（純度は98％を超える）を白色固体として得た。FAB−MS（Li）,m/e1058（Ｍ＋Ｈ＋Li）。
工程C:アミノエチルチオエーテル（配列番号13）の製造
無水N,N−ジメチルホルムアミド4ml中の上記の工程Ｂで製造したアミン（0.047mmol）、２−アミノエタンチオール塩酸塩（4.7mmol）、（1S）−（＋）−10−ショウノウスルホン酸（0.047mmol）の溶液を、25℃で、２−６日間又は出発物質が消失するのに十分な期間撹拌する。反応液を水4mlで希釈し、10％アセトニトリル／水中に充填した“LICHROPREP"（E.Merck）RP18（40−63μm,1.5g）でフラッシュクロマトグラフィーを行う。カラムを10−40％アセトニトリル／水で溶出し、各グラジエントステップで２個の12ml分画を集める。分析用HPLC（Zorbax  Rx  C18,30％アセトニトリル／水/0.1％トリフルオロ酢酸、210nm）で測定した適切な分画を濃縮し、凍結乾燥する。残渣を、分取HPLC（ZORBAX  C18、30％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で更に精製し、所望の異性体化合物（複数）を二トリフルオロ酢酸塩として得るが、両方共分子量1338を有する。
工程D:スルホン（配列番号13）への酸化
上記のように得たチオエーテルの混合物（0.036mmol）を、1:1アセトニトリル／水1.5mlに溶解し、“OXONE"（過硫酸水素カリウムの0.106mmol当量）を加える。約１時間後、溶液を等量の水で希釈し、即座に、２％ステップグラジエントで、0.1％TFA含有35−45％アセトニトリル／水で溶出する逆相C18フラッシュクロマトグラフィーを使用するクロマトグラフィーにかける。生成物含有分画を凍結乾燥し、分子量1370の生成物を得る。
工程E:スルホンのエチレンジアミンによる置換（配列番号１）
上記の工程Ｄに記載したように得たスルホン混合物（0.094mmol）を、無水DMF2.0mlに溶解し、エチレンジアミン（0.94mmol）を加える。約１−12時間又は分析用HPLC分析（RP−18、30％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−30％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置の所望の生成物及びそのβ−Ｃ−５  ornエピマーを得る。このように得たトリフルオロ酢酸塩を少量の脱イオン水に溶解し、Bio−Rad  AG2−X8（Cl-）polyprepカラムに通し、更にカラムを水で洗う。生成物含有溶出液を凍結乾燥し、所望の生成物を分子量1166の二塩酸塩として得る。
実施例６
0003657989.tif 000017
工程A:保護されたグリシンによるアシル化
実施例１工程Ｄで得たアミノ化合物（0.10mmol）を、窒素雰囲気下、無水N,N−ジメチルホルムアミド1mlに溶解する。ジイソプロピルエチルアミン（0.11mmol）とＮ−カルボベンジルオキシグリシンペンタフルオロフェニルエステル（0.15mmol）を加え、１−12時間又は分析用HPLC（“ZORBAX"C18、50％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nmおよび277nm）で判定して反応が終わるまで、反応液を撹拌する。混合物をメタノール1mlで希釈し、分取HPLC（“ZORBAX"C18、70％水／アセトニトリル/0.1％TFAから50％水／アセトニトリル/0.1％TFAまで、２段階グラジエント、210nmおよび277nm）で精製し、分子量1255の所望のグリシル化化合物を得る。
工程B:カルボベンジルオキシで保護されたグリシン化合物の水素化分解
上記工程Ａのように得たカルボベンジルオキシで保護された純粋の化合物（0.075mmol）を、メタノール3ml、水1ml、氷酢酸0.2mlの混合物に溶解する。次に、10％パラジウム担持木炭50mgを加え、反応容器に最初は窒素、それから水素を流入させる。反応液を、１大気圧の水素下、数時間急速に撹拌する。触媒を濾過で除去し、揮発性物質を減圧下回転蒸発により除去する。残渣を水2mlに溶解し、凍結し、凍結乾燥し、所望の脱保護アミン生成物を固体として得る。所望生成物は分子量1181を有する。
実施例７
0003657989.tif 000018
工程A:スルホンのアジドによる置換（配列番号19）
実施例５工程Ｄに記載したように製造したスルホンの混合物（0.257mmol）を、無水DMF10mlに溶解する。リチウムアジド（0.257mmol）を固体として加え、混合物を約４−24時間撹拌する。５％ステップグラジエントで、20−55％アセトニトリル／水で溶出する逆相C18フラッシュクロマトグラフィーで、混合物を精製する。逆相HPLC（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で測定した適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、粗生成物を得る。分取逆相HPLC（C18、30−40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で更に精製すると、分子量1190の所望の精製化合物を得る。
工程B:アジドのアミン（配列番号１）への還元
（工程Ａで上述したように得た）アジド化合物（0.126mmol）と10％Pd担体木炭（100−150mg）の混合物を氷酢酸（10ml）に懸濁する。反応容器に最初は窒素、それから水素を流入させる。アミン生成物へ完全に還元するために十分な時間、典型的には２−24時間１大気圧の水素ガスを維持する。触媒を濾過で除去し、濾液を凍結乾燥し、所望のアミンを分子量1170の二酢酸塩として得る。
実施例８
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実施例５工程Ｄに記載したように得られたスルホン混合物（0.094mmol）を、無水DMF2.0mlに溶解し、Ｎ−メチル−Ｎ−アリルアミン（0.945mmol）を加える。約１−12時間又は分析用HPLC分析（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−40％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置で、分子量1332の所望の生成物を得る。
実施例９
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実施例５工程Ｄに記載したように得たスルホン混合物（0.094mmol）を、無水DMF2.0mlに溶解し、N,N−ジメチルエチル−1,3−ジアミノプロパン（0.945mmol）を加える。約１−12時間又は分析用HPLC分析（RP−18、40％アセトニトリル／水/0.1％TFA、210nm）で判定して出発スルホンが完全に消失するまで、混合物を撹拌する。５％ステップグラジエントで、10−40％アセトニトリル／水/0.1％TFAで溶出する逆相（C18）フラッシュカラムクロマトグラフィーにより、混合物を分離する。適切な分画をプールし、凍結し、凍結乾燥し、α−Ｃ−５  orn配置で、分子量1363.5の所望の生成物を得る。
以下の実施例により本発明の化合物を含有する代表的組成物を説明する。
実施例Ａ
実施例５の化合物500mgを含有する圧縮された錠剤1000個を以下の組成物から製造する。
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細かく粉末化した成分をよく混合し、10％澱粉ペーストと共に顆粒にする。顆粒を乾燥し、圧縮して錠剤にする。
実施例Ｂ
各々が上記化合物500mgを含有する硬ゼラチンカプセル1000個を以下の組成物から製造する。
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成分の均質な混合物を混合して製造し、それを使用して２ピースの硬ゼラチンカプセルに入れる。
実施例Ｃ
以下の組成を有するエアロゾル組成物を製造することができる。
0003657989.tif 000023
実施例Ｄ
以下の組成を有する注射用溶液250mlを通常の方法により製造できる。
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出発物質の製造
RIが9,11−ジメチルトリデシルである出発物質、化合物Ａ−３（配列番号３）を、1991年６月４日発行の米国特許第5,021,341号に記載の通り主要炭素源としてマンニトールを富化させた栄養培地でZalerion arboricolaATCC20868を培養して生産させることができる。
RIが天然産物とは異なる基である出発物質は、栄養培地の中の天然産物に脱アシル化酵素を実質的な脱アシル化が起こるまで作用させて、天然産物の親油基を脱アシル化して得られる。脱アシル化酵素は最初は、Experentia34,1670（1978）又は米国特許第4,293,482号に記載の通り、pseudomondaceae科又はactinoplanaceae科の微生物を培養して得られた。
脱アシル化シクロペプチドを回収し、その後適切な活性エステルRCOZ（Ｚはハロゲン、ペンタクロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ｐ−ニトロフェノキシなど）と混合して再アシル化し、所望のアシル基を有する化合物を得る。
［配列表］
配列番号:1
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
ハイポセチカル:NO
アンチ−センス:NO
配列
0003657989.tif 000025
配列番号:2
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000026
配列番号:3
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000027
配列番号:4
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000028
配列番号:5
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000029
配列番号:6
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000030
配列番号:7
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000031
配列番号:8
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000032
配列番号:9
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000033
配列番号:10
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000034
配列番号:11
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000035
配列番号:12
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000036
配列番号:13
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000037
配列番号:14
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000038
配列番号:15
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000039
配列番号:16
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000040
配列番号:17
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000041
配列番号:18
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000042
配列番号:19
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000043
配列番号:20
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000044
配列番号:21
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000045
配列番号:22
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000046
配列番号:23
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
0003657989.tif 000047
配列番号:24
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：環状
配列の種類：ペプチド
配列
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