(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ。
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：
（ａ）配列表の配列番号１で示される過ギ酸酸化ウシインシュリンＢ鎖における３番目のＡｓｎ  と４番目のＧｌｎ  の間の結合、４番目のＧｌｎ  と５番目のＨｉｓ  の間の結合、９番目のＳｅｒ  と１０番目のＨｉｓ  の間の結合、１４番目のＡｌａ  と１５番目のＬｅｕ  の間の結合、１５番目のＬｅｕ  と１６番目のＴｙｒ  の間の結合、２０番目のＧｌｙ  と２１番目のＧｌｕ  の間の結合、２４番目のＰｈｅ  と２５番目のＰｈｅ  の間の結合及び２９番目のＬｙｓ  と３０番目のＡｌａ  の間の結合を切断する。
（ｂ）配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける８番目のＴｈｒ  と９番目のＬ−ドーパの間の結合、９番目のＬ−ドーパと１０番目のＬｙｓ  の間の結合を切断する。
（３）至適ｐＨ：  ９．５〜１０
（４）至適温度：５０〜５５℃
（５）至適ＮａＣｌ濃度：５％
（６）分子量：４４，０００
（７）阻害剤：フェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害される。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ。
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける９番目のＬ−ドーパと１０番目のＬｙｓ  の間の結合を切断する。
（３）至適ｐＨ：  ８．５〜９
（４）至適温度：６０〜６５℃
（５）分子量：４０，０００
（６）阻害剤：ｐ−クロロメルクリ安息香酸により阻害される。
【請求項３】
下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ。
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける８番目のＴｈｒ  と９番目のＬ−ドーパの間の結合を切断する。
（３）至適ｐＨ：  ８〜８．５
（４）至適温度：４５〜５０℃
（５）分子量：２２，０００
（６）阻害剤：エチレンジアミン四酢酸により阻害される。
【請求項４】
請求項１〜３の少なくとも１項に記載のプロテアーゼ生産能を有するアルテロモナス属細菌を培地に培養して、培養物中に該プロテアーゼを生成蓄積させ、該培養物からこれを採取することを特徴とするプロテアーゼの製造法。
【請求項５】
ムラサキイガイ足糸分解能を有するAlteromonas peptidysin微工研菌寄第１２８７５号株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、海洋汚損生物の一種であるムラサキイガイを除去することを目的とした、ムラサキイガイ足糸分解能を有するプロテアーゼ、その製造法及び該プロテアーゼ生産能を有する新規細菌、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ムラサキイガイ等の海洋付着生物は、船底や養殖施設、発電所の取水路等に付着し、様々な被害を与えている。そのため、これらの汚損生物の除去は、従来、水圧や人力等による物理的手段、あるいは亜硫化銅や有機錫化合物等を使った化学的除去法が行われてきた。しかし、これらの方法は、人的危険を伴う多大な労力と出費を必要とし、更には、環境を汚染するという欠点を有していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ムラサキイガイ足糸の分解除去が目的であり、それを達成すべく鋭意研究を行い本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
海洋付着生物は色々な様式で付着しているが、その中でムラサキイガイは、Ｌ−ドーパ、４−ヒドロキシプロリンを含むフェノール性タンパクとコラーゲン等からなる足糸で付着している。
本発明者らは、ムラサキイガイ足糸を基質として海洋より細菌を採取し、その中からムラサキイガイ足糸だけを栄養源として生育できる細菌、即ちムラサキイガイ足糸分解能を有する新規な細菌を分離した。更に、本新規細菌の産生するムラサキイガイ足糸を分解できる３種のプロテアーゼを単離した。
１．本細菌のスクリーニングは以下の通り行った。
（１）一次スクリーニング
一次スクリーニング培地は洗浄前処理した足糸を濾過海水に０．５  ％（Ｗ／Ｖ）  入れ、加熱殺菌したもので、試験管に入れた本培地１０ｍｌに  １００μｌ  の採取した海水を添加し、２０℃で１０日間振とう培養した。濁度を測定し、ＯＤ６６０  ＞０．３  まで増殖した分解活性の高いものを選択した。この増殖した培養液をマリンアガー２２１６培地に１００  μｌ塗布し菌株を単離した。
（２）  二次スクリーニング
二次スクリーニングにより得られた海洋細菌をマリンブロス２２１６培地でＯＤ６６０  ＝１．０  まで培養した。培養液を１０，０００回転／分で１５分遠心し、その上清を得た。この上清２００  μｌと０．２  μ以下の大きさに粉末篩分した足糸１０ｍｇを５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．５  ）中で３０℃、１時間反応させ、しかる後、１００  ℃、１０分の加熱により反応を停止させた。反応液を１０，０００回転／分で５分遠心し、遠心上清中の遊離したペプチドをニンヒドリン法により定量した。なお、１酵素単位（Ｕ）は上記実験条件下で１分間に足糸から遊離されるヒドロキシプロリンの１μｍｏｌ  に相当する４４０ｎｍ  における吸光度を与える場合の活性度として表した。また、一次スクリーニング培地に、マリンブロス２２１６培地でＯＤ６６０  ＝１．０  に培養した一次スクリーニングで得られた海洋細菌を１００  μｌ接種し、２０℃、１５日間培養後、基質乾燥重量を測定した。これら２つの結果を併せて２次スクリーニングとし、最も分解活性の高い菌を選択した。
２．二次スクリーニングにより選択した本発明の細菌の性状は以下の通りである。
（１）形態的性状
ａ．全長１μｍ、全幅３００  〜４００ｎｍ  の桿菌で、走査型電子顕微鏡下で図１に示されるもの。
【０００５】
ｂ．長さ約２μｍの鞭毛を一本持ち、それは極毛である。
ｃ．運動性：あり
（２）生理学的性状
ａ．グラム染色：  グラム陰性である。
ｂ．糖発酵：      発酵しない。
【０００６】
ｃ．菌体色素：    茶色の色素を産生する。
ｄ．好塩性：      １〜１０％のＮａＣｌ濃度で生育する。
ｅ．ゼラチン分解：分解する。
ｆ．ＤＮＡ分解：  分解する。
ｇ．ＧＣ含量：    ４２．４％
３．本発明の新規細菌の分類上の位置の決定は、次の通り行った。
（１）属の決定
細菌は上記の形態学的及び生理学的性状よりアルテロモナス  （Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属と同定した。
（２）種の決定
アルテロモナス属にはバージェイ式分類法により１１種が知られている。バージェイ式分類法により本細菌の分類を試みたところ、公知種とは一致しなかった。公知１１種の中でバージェイ式分類法で一番近縁であったＡ．ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ  と本種の性状を表１及び表２に示す。
【０００７】
表１及び表２において、記号「＋」は９０〜１００  ％の菌株で陽性であること、記号「ｄ」は１０〜８９％の菌株で陽性であること、記号「−」は１０％未満の菌株で陽性であるか、全く認められないこと、記号「Ｓｔ」は桿菌を表す。
【０００８】
【表１】
0003609102.tif 000002
【０００９】
【表２】
0003609102.tif 000003
ａ．本細菌は４０℃で生育するが、Ａ．ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ  は生育しない。
ｂ．本細菌はコハク酸、フマル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンを利用できるが、Ａ．ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ  は利用できない。
【００１０】
また、本種とＡ．ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ  及び対照としてＡ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとのＤＮＡの相同性を検討した結果を表３に示す。
【００１１】
【表３】
0003609102.tif 000004
ａ．本細菌とＡ．ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ  とのＤＮＡの相同性は５〜１０％である。
ｂ．本細菌とＥ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとのＤＮＡの相同性は１％以下である。
以上の性状の相違から、本細菌はアルテロモナス属の新種であると結論し、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎと命名した。
【００１２】
本細菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２８７５号として寄託されている。
本発明は、また、下記の理化学的性質を有する３種のプロテアーゼをも提供するものである。
Ａ．下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ（以下「Ｅｎｚ−Ｆ２０  」という。）
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：
（ａ）配列表の配列番号１で示される過ギ酸酸化ウシインシュリンＢ鎖における３番目のＡｓｎ  と４番目のＧｌｎ  の間の結合、４番目のＧｌｎ  と５番目のＨｉｓ  の間の結合、９番目のＳｅｒ  と１０番目のＨｉｓ  の間の結合、１４番目のＡｌａ  と１５番目のＬｅｕ  の間の結合、１５番目のＬｅｕ  と１６番目のＴｙｒ  の間の結合、２０番目のＧｌｙ  と２１番目のＧｌｕ  の間の結合、２４番目のＰｈｅ  と２５番目のＰｈｅ  の間の結合及び２９番目のＬｙｓ  と３０番目のＡｌａ  の間の結合を切断する（図２参照）。
【００１３】
（ｂ）配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける８番目のＴｈｒ  と９番目のＬ−ドーパ（Ｄｏｐａ）の間の結合、９番目のＬ−ドーパ（Ｄｏｐａ）と１０番目のＬｙｓ  の間の結合を切断する（図３参照）。
（３）至適ｐＨ：  ９．５〜１０
（４）至適温度：５０〜５５℃
（５）至適ＮａＣｌ濃度：５％
（６）分子量：４４，０００
（７）阻害剤：フェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害される。
Ｂ．下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ（以下「Ｅｎｚ−Ｆ３０  」という。）
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける９番目のＬ−ドーパ（Ｄｏｐａ）と１０番目のＬｙｓ  の間の結合を切断する（図３参照）。
（３）至適ｐＨ：  ８．５〜９
（４）至適温度：６０〜６５℃
（５）分子量：４０，０００
（６）阻害剤：ｐ−クロロメルクリ安息香酸により阻害される。
Ｃ．下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ（以下「Ｅｎｚ−Ｆ１５  」という。）
（１）  作用：ムラサキイガイ足糸分解能を有する。
（２）基質特異性：配列表の配列番号２で示されるデカペプチドにおける８番目のＴｈｒ  と９番目のＬ−ドーパ（Ｄｏｐａ）の間の結合を切断する（図３参照）。
（３）至適ｐＨ：  ８〜８．５
（４）至適温度：４５〜５０℃
（５）分子量：２２，０００
（６）阻害剤：エチレンジアミン四酢酸により阻害される。
【００１４】
本発明のプロテアーゼは、例えば、該プロテアーゼ生産能を有するアルテロモナス属細菌を培地に培養して、培養物中に該プロテアーゼを生成蓄積させ、該培養物からこれを採取することにより製造することができる。
ここで用いられるアルテロモナス属細菌としては、例えば前述したＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎが挙げられる。
【００１５】
前記製造法における好ましい条件を以下に示す。
（１）培地：            マリンブロス２２１６（ＤＩＦＣＯ）  又はこれに類するもの
（２）培養温度：            １０〜４０℃（至適温度、３０℃）
（３）培養ｐＨ：        ６〜１１（至適ｐＨ、ｐＨ７）
（４）  培養ＮａＣｌ濃度：  １〜１０％（至適ＮａＣｌ濃度、５％）
（５）培養時間：      ６時間以上（至適培養時間、４８時間）
（６）培養回転数：    ６０〜１２０  回転／分（至適回転数、１００  回転／分）
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）Ａ．ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎの産生するムラサキイガイ足糸分解能を有する新規プロテアーゼの製造例
１００ｍｌ  の一次スクリーニング培地（滅菌海水に０．５  ％（Ｗ／Ｖ  ）の殺菌済の足糸を入れた培地）に、マリンブロス２２１６培地でＯＤ６６０  ＝１．０  まで培養したＡ．ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎを１００  μｌ  添加し、２５℃で一週間振とう培養した。培養液を１０，０００回転／分で１５分遠心分離し、その上清を得た。足糸分解活性を測定したところ、乾燥重量で基質残存率が３６．４％、足糸分解比活性が１，６００  Ｕ／ｍｇを示した。足糸分解比活性の値は、市販、既存のプロテアーゼの値を大きく上回るものであった（図４に示す）。
【００１７】
（実施例２）Ａ．ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎの産生するムラサキイガイ足糸分解能を有する新規プロテアーゼの製造例
２Ｌの三角フラスコ内の４００ｍｌ  のマリンブロス２２１６培地でＡ．ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎを２日間培養した。１０，０００回転／分、１５分の遠心分離でその上清を得た。これに硫酸アンモニウムを添加し、その４０〜６０％画分を得た。この沈澱を０．０２Ｍのトリスバッファー（ｐＨ７．２  ）に溶解し、超純水で十分透析した。凍結乾燥後、セファクリルＳ−１００ＨＲでのゲルクロマトグラフィー、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、ＣＭクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（ゲルクロマトグラフィー）により足糸分解能を有するプロテアーゼの精製を行った。
【００１８】
その結果、３種の新規プロテアーゼ、Ｅｎｚ−Ｆ１５  、Ｅｎｚ−Ｆ２０  及びＥｎｚ−Ｆ３０  を得た。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、ムラサキイガイ足糸分解能を有し、海洋汚損生物であるムラサキイガイの除去に有用な新規プロテアーゼを提供することができる。
【００２０】
【配列表】
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【００２１】
0003609102.tif 000006
【００２２】
0003609102.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｓｉｎの生物形態を示す電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明のプロテアーゼの過ギ酸酸化ウシインシュリンＢ鎖に対する特異性を示す図である。
【図３】本発明のプロテアーゼのデカペプチドに対する特異性を示す図である。
【図４】ムラサキイガイ足糸分解活性の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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