(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光子エネルギーが２８０ｅＶ〜５５０ｅＶで、波長幅が１ｅＶ以下の単色化されたＸ線を出すＸ線光源と、前記Ｘ線光源からのＸ線により１ｓ電子が励起される二重結合を含む分子で染色された試料を収容するとともに前記Ｘ線光源からのＸ線が透過する窓を有する試料容器とを有するＸ線顕微鏡を用いた顕微鏡法であって、
前記試料容器の窓を構成する窓材はπ*軌道を持たない有機分子または炭素化物を用いたものであり、前記窓を透過したＸ線による前記染色された試料の１ｓ電子の励起によって発生する、前記Ｘ線の吸収または蛍光を観察することを特徴とするＸ線顕微鏡法。
【請求項２】
前記Ｘ線の波長を可変とする請求項１記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項３】
前記試料を染色する分子が５員環または６員環を含む化合物である請求項１記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項４】
前記試料を染色する分子がベンゼン環を含む化合物である請求項１記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項５】
前記試料を染色する分子が２重結合を含む蛍光色素である請求項１記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項６】
前記染色された試料のＣ，Ｎ，Ｏの１ｓ電子を励起し、π*軌道に前記Ｘ線を吸収することを特徴とする請求項１記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項７】
前記染色された試料のＣ，Ｎ，Ｏの１ｓ電子を励起し、π*軌道に吸収させる請求項６記載のＸ線顕微鏡法。
【請求項８】
前記染色された試料のＣの１ｓ電子をπ*励起し、Ｘ線を吸収させる請求項７記載のＸ線顕微鏡法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な高機能のＸ線顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、Ｘ線光源やＸ線光学系の技術開発が進み、その応用技術としてＸ線顕微鏡が提案されている。この様な顕微鏡には様々なタイプがある。例えば、図１〜３の様にウォルタータイプに代表される斜入斜光学系、回析効果を用いたフルネルゾーンプレート、２枚の球面鏡にＸ線多層膜鏡を蒸着した直入斜型のシュバルツシルド光学系等、様々な結像素子を利用した顕微鏡システムが開発されている。この他、結像素子を用いず、直接Ｘ線フィルムやフォトレジストに試料像を記録する直接密着撮影法も古く行われている。
特に、Ｘ線は電子線様に生体試料に与えるダメージが少ないので有用であり、生体試料を濡れたままで、高解像度かつ無染色で観察できる新しい生物顕微鏡として注目されている。とりわけ、「水の窓」と呼ばれる波長４２．７〜２３．６Åの波長領域では、Ｘ線は炭素又は窒素による吸収が最も大きく、しかも酸素と水素からなる水分子に対しては高い透過率を持ち、主構成原子が炭素である蛋白質の透過像を、水中でも良好なコントラストで観察できる。波長４２．７Åは炭素のＫ吸収端に、波長２３．６Åは酸素のＫ吸収端にそれぞれ対応する。
【０００３】
Ｘ線の吸収像の撮影原理は炭素及び窒素の１ｓ電子の内殻電離過程に基づいている。近年までは、この撮影原理が注目されたが、この内殻電離過程とは異なる生体分子の分子軌道への内殻励起過程を用いたＸ線顕微法が提案されている。この時用いられるＸ線の波長は、炭素のＫ吸収端よりほんの僅か長い波長である。内殻励起過程による吸収過程は共鳴吸収であり、このＸ線顕微法は内殻電離過程を用いたそれよりも高感度である。
【０００４】
生体分子の分子軌道への内殻電離過程及び内殻励起過程を用いたＸ線顕微法の原理図を図４に示す。即ち、図４−１は内殻電離過程を用いたＸ線顕微法を示すもので、「水の窓」と呼ばれる波長４２．７〜２３．６Åの波長領域のＸ線により細胞内の炭素又は窒素の１ｓ電子を電離させ、このときのＸ線の吸収像を得ることができ、これを用いてＸ線の吸収像を得るのである。一方、図４−２は内殻励起過程を用いたＸ線顕微法の原理図で、Ｘ線により炭素の１ｓ電子を生体分子の電子に占有されていない分子軌道に励起する方法である。この方法は、一種の共鳴吸収過程であり、Ｘ線の強い吸収が期待できる（参考文献 Y.Iketakiet.al:Rev.Sci.Instrum.66(1995)982)。しかも、該分子軌道は分子固有のエネルギー準位を持つのでＸ線の共鳴波長を選択することにより、特定の分子のみの吸収像を見ることができるので、内殻電離過程を用いたＸ線顕微法よりも優れた方法と言える。
【０００５】
内殻励起過程で重要な役割を果たす分子軌道は、π＊軌道と呼ばれる反結合性の分子軌道であり、通常は空軌道である。このπ＊軌道は、生体分子を構成する炭素の２ｐ軌道が他原子の軌道と２重結合する場合に多く見られる。例えば、ベンゼン環や窒素塩基ではＸ線の波長が４３．５Å（２８５ｅＶ）前後で強い吸収線をもつ。これらの、吸収線のエネルギー位置は「水の窓」領域の長波長側の限界よりも１Å程度更に長波長側にある（光子エネルギーにして５ｅＶ程度低エネルギー側）。
しかし、この様に優れたＸ線顕微法でも適応限界があることが判明した。すなわち、観察できる生体分子が、ベンゼン環や窒素塩基を有する一部の分子に限定されていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は従来のＸ線顕微法を更に適応限界を拡げ、生体細胞内の選択した化学基の吸収像等を観察できるよう種々検討した結果、特定のＸ線の光子エネルギーを用いること及び特定の強い軟Ｘ線吸収を生じさせるπ＊軌道を持つ分子で核化学基のラベリング又は染色を行うことによって、所期の目的を達成することができることを見出し、本発明を完成したもので、本発明は新規な高機能のＸ線顕微法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、光子エネルギーが２８０ｅＶ〜５５０ｅＶで、波長幅が１ｅＶ以下の単色化されたＸ線を出すＸ線光源と、前記Ｘ線光源からのＸ線により１ｓ電子が励起される二重結合を含む分子で染色された試料を収容するとともに前記Ｘ線光源からのＸ線が透過する窓を有する試料容器とを有するＸ線顕微鏡を用いた顕微鏡法であって、前記試料容器の窓を構成する窓材はπ*軌道を持たない有機分子または炭素化物を用いたものであり、前記窓を透過したＸ線による前記染色された試料の１ｓ電子の励起によって発生する、前記Ｘ線の吸収または蛍光を観察することを特徴とするＸ線顕微鏡法である。
【０００８】
以下、本発明の原理について説明する。
蛍光分析化学又は生物学においては、生体細胞分子の特定の化学基を蛍光団をもつ分子で修飾（ラベリング）を行い（以下この様な分子をラベラーと呼ぶ）、ラベリングした該分子よりの蛍光を観察することにより生体細胞の構造や組成を解析する技術が発達している。例えば、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅや５−（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−２，４−ｐｅｎｔａｄｉｅｎａｌは蛋白質のアミノ基（Ｎ端）と結合し、強い紫外蛍光を発する。また、Ｏ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｓｏｕｒｅａは蛋白質のカルボニル基（Ｃ端）と結合し、強い紫外蛍光を発する。更に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｈｒｉｄｙｌｅｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅは細胞内での重要な役割を果たす情報伝達物質Ｃａ２＋をラベリングする。この他、４−Ｆｌｕｒｏｒｏ−７−ｓｕｌｆｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ，ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔは例えばアミノ酸の一種であるシステインのＳＨ基と結合し、３８５ｎｍ励起で強い５１５ｎｍの蛍光を発する。
【０００９】
これらの分子は何れも強い蛍光を発するという特徴を持っているが、その理由は、これらの分子の分子軌道の構造に起因する。すなわち、これらの分子には確実に二重結合を有する化学基をもつ。そして二重結合がある場合、π電子が存在する。これらの電子は通常π軌道と呼ばれる分子軌道に存在し、紫外または可視光によって高次の占有されていないπ軌道や反結合性のπ＊軌道に、容易に励起される。そして、これらの励起状態より、基底状態に脱励起するとき強い蛍光を発する。
【００１０】
ところで、π軌道やπ＊軌道を量子化学的に考察すると、これらの分子軌道は一般に、分子を構成する原子の２ｐ軌道の線形結合で形成される。すなわち、
【００１１】
【化１】
0003635381.tif 000002
【００１２】
ここで、χｉ（ｒ）はｉ番目の分子構成原子の２ｐ軌道の波動関数、Ｃｉは規格化定数を示す。
【００１３】
原子の２ｐ軌道は、光励起により１ｓ軌道の電子と強い相互作用をもつ。すなわち、量子力学によれば１ｓ軌道の電子は、光励起を行う場合２ｐ軌道へ高い遷移確率を持つ。そこで、炭素原子において１ｓ電子が各ｐ軌道へ遷移する場合と、１ｓ電子が電離する場合の吸収断面積を計算した結果、図５のようになった（Y.Iketaki et.al:Rev.Sci.Instrum.66(1995)982参照)。
図５によれば、１ｓ電子が２ｐ軌道へ遷移する場合には１５０Ｍｂ（１５０×１０~18ｃｍ2）程度の値を持ち、「水の窓」の励起波長を用いた１ｓ電子が電離する場合と比較すると１００倍以上の強い吸収をもつことが分かる。
【００１４】
一般に、生体分子内では原子軌道を存在しないが、式（１）の様に原子軌道が線形結合した分子軌道が存在する。従って、分子構成原子の１ｓ電子が該分子軌道に遷移する内殻励起過程による共鳴吸収が可能となる。式（１）によれば、π軌道やπ＊軌道の波動関数は分子の構成原子の２ｐ軌道線形結合であり、構成原子である炭素、窒素、酸素の１ｓ電子が電子により占有されていないπ＊の分子軌道へ遷移する場合の吸収断面積も大きな値を持つ。
【００１５】
ベンゼン分子を初めとする６員環分子において、１ｓ電子が各ｐ軌道へ遷移する場合の計算結果を図６に示す。図６によれば、「水の窓」の励起波長を用いた１ｓ電子が電離する場合と比較すると光子エネルギーが２８５ｅＶ前後で６倍程度大きな吸収断面積を持つ。この他、６員環分子以外にも２重結合をもつ分子であれば、「水の窓」のよりも光子エネルギーが若干小さい領域（「水の窓」の励起波長よりも若干長い）において同様に非常に強い内殻励起過程による非常に強い共鳴吸収がある。
【００１６】
以上の議論から、蛍光分析で用いるラベラーは豊富に二重結合が含まれるので内殻励起過程を起こす波長を持つ軟Ｘ線に対する吸収ラベラーとしても機能する。すなわち、生体分子内のアミノ基を初めとする特定の化学基をラベリングして、内殻励起過程を生じさせる共鳴する波長のＸ線を用いて、生体試料の透過像を撮影すれば特定の化学基のみの分布像が得られる。しかも、該共鳴による吸収は非常に強いので微量な量の化学基を検出できるので、この様なラベリング又は染料技術を導入することにより従来のＸ線顕微法と比較すると格段に高機能のＸ線顕微法が実現する。
【００１７】
本原理を実現する際には、２つの必要条件を満たす必要がある。
１）ラベラーとしては二重結合に含む分子を用いる。
２）ラベラーの持つ内殻励起過程を生じさせる共鳴ラインよりも波長幅（あるいは光子エネルギー幅）の狭いバンド幅のＸ線を用いること。
また、生体用顕微鏡に限定した場合、機能を上げる付帯条件として、
３）ウェットな試料を撮影できるために、Ｘ線が水分子に吸収されないことも挙げられる。
以下、１）、２）、３）について具体的に考察をしてみる。
【００１８】
１）について
一般にラベラーは、Ｈ，Ｃ，Ｎ，Ｏを主成分として、その他若干のＳ，Ｂｒ，Ｐｂ等を含む有機分子である。したがって、Ｃ，Ｎ，Ｏの１ｓ電子がラベラーのπ軌道又はπ＊軌道に光励起される場合の吸収ラインを利用するのが有利である。その場合の、共鳴吸収線の光子エネルギー（又は波長）は、各種有機分子の例をとると、過去の理論又は実験の論文より調べることができ、おおよそ推測がつく。以下、列挙する。
ｉ）Ｃ：１ｓ→π＊  ２８０〜３００ｅＶ（４４Ａ〜４１Ａ）
a)M.N.Piancastelli et.al, J.Chem.Phys.90(1989),1987〜
ii）Ｎ：１ｓ→π＊  ３９０〜４１０ｅＶ（３２Ａ〜３０Ａ）
b)J.A.Horsley et.al, J.Chem.Phys.83(1985),6099〜
iii）Ｏ：１ｓ→π＊  ５２０〜５５０ｅＶ（２４Ａ〜２２Ａ）
c)I.Ishii et.al, J.Chem.Phys.87(1987),830〜
d)N.Kosugi et.al, J.Chem.Phys.97(1992),8842
以上の領域で１ｓ→π＊を含む、様々な内殻励起過程による吸収ピーク群が観測されている。この他のＳ，Ｂｒ，Ｐｂ等の重元素の場合、１ｓ→π＊に限らず２ｐ，２ｓ，３ｓ，３ｐ，３ｄ……を始めとして、様々な内殻軌道よりの吸収ピークが２０００ｅＶ以下で観測されている。従って、以上にあげた波長帯域のＸ線を利用すれば、本Ｘ線顕微法を効果的に適応できる。
【００１９】
２）について
また、ａ），ｂ），ｃ）の文献より、１ｓ→π＊遷移に伴う最も強い吸収ピークに着目すると大体、１ｅＶ程度のライン幅を持っている。従って、少なくとも光子エネルギー幅１ｅＶ以下のバンド幅のＸ線を用いることが必要条件となる。それ以上のバンド幅で、透過像を撮影すると、吸収に関与しない波長が混入するために著しくコントラストが低下する。従って、必然的に上記のバンド幅以下の高い分解能をもつ波長分散性のある光学素子や単色化した光源を用いることを意味する。
【００２０】
３）について
ウェットな試料を撮影できるために、Ｘ線が水分子に吸収されないことが必要条件である。これは即ち、水分子中の酸素原子のＫ吸収端より長い波長（２３．６Ａより波長領域）の軟Ｘ線を用いることを意味する。
この様に、本原理を用いれば特定の化学基を分別できる従来法を上回る高機能の軟Ｘ線顕微法が実現できる。
【００２１】
本発明を詳細に述べる。
本発明のＸ線顕微法では使用するＸ線の光子エネルギーは２０００ｅＶ以下で、波長幅が１ｅＶ以下の単色化されたＸ線である。Ｘ線の光子エネルギーは２０００ｅＶ以下とした理由は先に述べたように、１ｓ電子を初めとして、２ｐ，２ｓ，３ｓ，３ｐ，３ｄ……の様々な内殻軌道よりの吸収ピークが２０００ｅＶ以下で観測されることによる。そして、特にＸ線の光子エネルギーが２８０ｅＶ〜５５０ｅＶであり、しかも波長可変であることが好ましい。
【００２２】
本発明のＸ−線顕微法で観測できる生体分子をより広く適用するため試料となる生体分子を２重結合を含む分子でラベリングを行う。ラベリングを行うことによってこれらの分子のＣ，Ｎ，Ｏの１ｓ電子を励起、π＊に吸収するのを利用するのである。Ｃ，Ｎ，Ｏの１ｓ→π＊吸収として２８０〜５５０ｅＶのＸ線の光子エネルギーを利用するのである。特に、２８０〜２９０ｅＶの光子エネルギーのＸ線を用いれば、炭素原子の１ｓ電子がπ＊軌道に遷移するときの吸収像を得ることになる。この際、Ｘ線の光子エネルギーは炭素の１ｓ電子の電離エネルギーより小さくなるので、純粋にπ＊軌道のつくる影のみ良いＳ／Ｎで撮影できる。具体的には染色する分子が５員環または６員環を含む化合物、特にベンゼン環を含むものが好ましい。更に本発明で使用される染色する分子としては先に述べたように蛍光分析化学の分野でラベラ−として使用されている化合物は何れでもよく、その二、三を列挙すると、次の通りである。
１）チオール基のラベラー（Ｒ−ＳＨ）
ジスルフィードの交換反応を起こす分子やリアールハライドなどがあり、ＳＨ基の特異的反応を利用するマレイミド基を持つ分子。
例えば、４−ｆｌｕｏｒｏ−７−ｓｕｌｆａｍｏｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ，２，２−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６，６’−ｄｉｎａｐｈｔｈｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，Ｎ−（９−Ａｃｒｉｄｉｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ
２）カルボキシ基のラベラー（Ｒ−ＣＯＯＨ）
プロメチル基を反応活性基とするもの。
例えば、４−Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ，３−Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｔｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２−ｏｎｅ
３）アミノ基のラベラー（Ｒ−ＮＨ，Ｒ−ＮＨ２）
イソチオシアネート基、フェロセニルイソチオシアネート基、ニトロアリールハライド、酸クロリド基を活性基とするもの。
例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ｉｓｏｍｅｒ−１，４−〔４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａ）ｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌａｚｏ〕ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，４−Ｃｈｌｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ，４−Ｆｌｕｒｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ，３−Ｃｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎｙｌｅ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌ−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ，Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ，Ｓｕｌｆｏｒｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１  ａｃｉｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ
４）アルデヒド基のラベラー
例えば、１，２−Ｄｉａｍｉｎｏ−４，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，２，２’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（１−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）
５）水酸基のラベラ
酸クロリド等が利用される。
例えば、
３−Ｃｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎｙｌｅ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌ−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎ，
６）蛋白質の疎水ポケットのラベラー
例えば、３，６−Ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１０−ｄｏｄｅｃｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，４−Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ，４−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ
７）細胞内カルシウムイオンのラベラー
例えば、・Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄｅ，ｔｅｔｒａｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ・Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｈｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉ・１−〔２−Ａｍｉｄｏ−５−（２，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−６−ｈｙｄｒｏｚｙ−３−ｏｘｙ−９−ｘａｎｔｈｅｎｙｌ〕−２−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄｅ
８）細胞内のｐｐＨのラベラー
例えば、２’，７’−Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４ｏｒ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，３’−Ｏ−Ａｃｅｔｙｌ−２’，７’−ｂｉｓ（（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４ｏｒ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ｄｉａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ
９）細胞膜のラベラー（リン脂質、生体膜）
例えば、１，３−Ｂｉｓ（１−ｐｈｒｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ，１−（４−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｈｅｎｙｌ）−６−ｐｈｅｎｙｌ−１，３，５−ｈｅｘａｔｒｉｅｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ
１０）ＤＮＡをはじめとする核酸のラベラー
例えば、４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）
また、本発明の顕微鏡法においては、試料容器の窓材として試料との相互作用を生じないように、π＊軌道を持たない有機分子又は炭素化物を利用する。
更に本願発明を実施例を用いて具体的に説明する。
【００２３】
【実施例及び比較例】
実施例１
本実施例では、Ｏ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ塩酸塩を用いた染色法を示す。この化合物が次のような構造式を有し、ケトン基またはアルデヒド基と結合し、ラベル化を行う。
【００２４】
【化２】
0003635381.tif 000003
【００２５】
この化合物はベンゼン環を持ち、光子エネルギー２８５ｅＶ前後で炭素１ｓ→π＊遷移に伴う強いＸ線の吸収ピークをもつ。本実施例では、代表的なタバコモザイクウイルスを例にとり、このウイルスの蛋白質分子中のケトン基またはアルデヒド基をラベリングする場合を考える。タバコモザイクウイルスの形状は、１６×３００ｎｍ棒状であり、ウイルスの蛋白質は１５８個のアミノ酸分子で構成される２１３０個の小集団の蛋白質からなる。アミノ酸分子１個に対して、ケトン基またはアルデヒド基を有するペプチド結合が１個存在する。従って、タバコモザイクウイルスは１５８×２１３０のケトン基またはカルボニル基をもつ。そこで、Ｏ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅでタバコモザイクウイルスのケトン基またはアルデヒド基をラベリングしたときの１ｓ→π＊遷移に伴う最も強い吸収を見積もる。
本発明者らが先に発表した論文（Y.Iketaki et.al:Rev.Sci.Instrum.66(1995)982）によれば、ベンゼン分子１個あたりの吸収断面積σは２５Ｍｂ（２５×１０~18ｃｍ2程度であり、内殻励起による線吸収係数μは、σと単位体積あたりのケトン基またはアルデヒド基の密度の積で与えられる。染色されたタバコモザイクウイルスの共鳴波長における線吸収係数μは１３／μｍとなる。この値は通常の蛋白質の「水の窓」領域の波長の線吸収係数の倍以上の値をもつ。
顕微鏡のコントラストＣは、色々なコントラストの領域をもつ試料の最大透過率Ｉｍａｘと対象とする領域の透過率Ｉが分かると、式（２）で与えられる。
【００２６】
【化３】
0003635381.tif 000004
【００２７】
Ｘ＝１６ｎｍのサイズのタバコモザイクウイルスの透過率Ｉは式（３）で与えられるので、
【００２８】
【化４】
0003635381.tif 000005
【００２９】
タバコモザイクウイルスのコントラストは０．１程度となる。この値は、「水の窓」領域の波長を用いる従来技術と比較すると、２倍以上となる。この事実は、本技術により非常に高い感度で蛋白質を検出できることを示している。
【００３０】
実施例２
実施例１で使用したＯ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅにかえて、次に列挙した各種のラベラー分子を適宜選択使用することによって、生体細胞の特定の化学基、分子、構造を選別できる。
基本的には、先に列挙した各種のラベラー分子の様な複雑な分子を利用しなくても、官能基と少なくとも１つの２重結合をもつ分子であれば、本発明のＸ線顕微法のラベラーとして機能することができる。
【００３１】
【表１】
0003635381.tif 000006
【００３２】
【表２】
0003635381.tif 000007
【００３３】
【表３】
0003635381.tif 000008
【００３４】
【表４】
0003635381.tif 000009
【００３５】
【表５】
0003635381.tif 000010
【００３６】
【表６】
0003635381.tif 000011
【００３７】
【表７】
0003635381.tif 000012
【００３８】
【表８】
0003635381.tif 000013
【００３９】
【表９】
0003635381.tif 000014
【００４０】
【表１０】
0003635381.tif 000015
【００４１】
【表１１】
0003635381.tif 000016
【００４２】
【表１２】
0003635381.tif 000017
【００４３】
【表１３】
0003635381.tif 000018
【００４４】
【表１４】
0003635381.tif 000019
【００４５】
【表１５】
0003635381.tif 000020
【００４６】
【表１６】
0003635381.tif 000021
【００４７】
【表１７】
0003635381.tif 000022
【００４８】
【表１８】
0003635381.tif 000023
【００４９】
【表１９】
0003635381.tif 000024
【００５０】
【表２０】
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【００５１】
【表２１】
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【００５２】
【表２２】
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【００５３】
【表２３】
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【００５４】
【表２４】
0003635381.tif 000029
【００５５】
【表２５】
0003635381.tif 000030
【００５６】
【表２６】
0003635381.tif 000031
【００５７】
【表２７】
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【００５８】
【表２８】
0003635381.tif 000033
【００５９】
【表２９】
0003635381.tif 000034
【００６０】
【表３０】
0003635381.tif 000035
【００６１】
【表３１】
0003635381.tif 000036
【００６２】
【表３２】
0003635381.tif 000037
【００６３】
【表３３】
0003635381.tif 000038
【００６４】
【表３４】
0003635381.tif 000039
【００６５】
【表３５】
0003635381.tif 000040
【００６６】
【表３６】
0003635381.tif 000041
【００６７】
【表３７】
0003635381.tif 000042
【００６８】
【表３８】
0003635381.tif 000043
【００６９】
【表３９】
0003635381.tif 000044
【００７０】
【表４０】
0003635381.tif 000045
【００７１】
実施例３
本発明は化学状態の選別の他に、Ｘ線顕微鏡像のコントラストの制御も可能とする。図６によれば、ベンゼンの１ｓ→π＊遷移に伴う吸収断面積の光子エネルギーの依存性であるが、吸収ピークは約１ｅＶ程のバンド幅を持つ。もし、共鳴ラインのバンド幅より一桁程度狭いバンド幅で単色化されてしかも波長可変のＸ線光源を用いて透過画像を撮影すると、容易にコントラストが調整できる。本例において、実施例１と同じ様にタバコモザイクウイルスの蛋白質をＯ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅでラベリングする場合を想定する。
例えば、文部省高エネルギー物理学研究所フォトンファクトリーのビームーラインＢＦ−ＢＬ２は、光子エネルギー２８５ｅＶ前後でバンド幅５０ｍｅＶ程度の分光されたＸ線を取り出すことができる。この様なＸ線光源を用いて、１ｓ→π＊遷移の共鳴ラインピークの先頭値の光子エネルギーでラベリングしたタバコモザイクウイルスを撮影を行うと、実施例１で示した様に０．１程度のコントラストが得られる。しかし、共鳴ラインピークの先頭値よりも２５０ｍｅＶ程度低い光子エネルギーで撮影すると、吸収断面積が半減するのでコントラストが半減する。この様に、撮影するＸ線の光子エネルギー（波長）を選択することで、コントラストが変化する。タバコモザイクウイルスよりも大きいサイズでしかも蛋白質を多量に含む細胞では必要以上にコントラストがつきすぎ、微細構造の観察が不可能となる。この様な場合、本発明を用いれば、Ｘ線の光子エネルギーの選択によりコントラストが任意に調整できる。これに対して、「水の窓」と呼ばれる波長４２．７〜２３．６Ａの波長領で撮影する内殻電離型の吸収過程を用いた方法では図（８）に示すように線吸収係数の変化が穏やかな為、本発明の様な技術を用いることができず、コントラストは繁雑で高度の技術を要する試料の厚み調整に頼っていた。
【００７２】
実施例４
本発明では、微小な構造の吸収像を得るための吸収効果を増幅する技術をも可能にする。観察しようとする化学基の密度をＮ、ラベラーのＸ線吸収断面積をσχとすると線吸収係数μは（４）で与えられる。
【００７３】
【化５】
0003635381.tif 000046
【００７４】
従来法では、観察しようとする化学基の密度Ｎが少なければ、式（４）より吸収像を得るのが大変困難になる。しかし、本発明ではラベラーの分子設計で解決できる。
基本的に、内殻電子がπ＊軌道へ遷移する場合の吸収断面積はラベラー分子の持っている二重結合の数に比例する。したがって、ラベラー分子に二重結合をもつ側鎖を必要な数だけ付加すれば、ラベラー分子のＸ線の吸収断面積を比例して高めることができる。付加する側鎖の数をｍ、Ｘ線の吸収断面積をσsとすると
、
【００７５】
【化６】
0003635381.tif 000047
【００７６】
となり、従って線吸収係数は式（６）の様になる。
【００７７】
【化７】
0003635381.tif 000048
【００７８】
例えばＯ−（４−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅは二重結合を有するベンゼン環を一つしか含まないが、さらにｍ個のベンゼン環を側鎖を付加すると、タバコモザイクウイルスに関しては線吸収係数は式（７）の様になる。
【００７９】
【化８】
0003635381.tif 000049
【００８０】
従って、ベンゼン環を５つ付加すればコントラスト０．５まで増加し、タバコモザイクウイルスの像を強調できる。
【００８１】
実施例５
本技術は、生体試料の試料容器の設計も容易にする。一般に、生体用Ｘ線顕微鏡で用いられる波長領域の光は大気中で減衰が激しく、一般に全システムが真空容器内に収容される。従って、濡れたままの生体試料は超薄膜の窓でできた試料容器内に封入され、真空中で試料は乾燥しない工夫がなされている。一般に、用いられる薄膜の材料は、「水の窓」領域及びその近傍でＸ線の透過率が高く、同時に薄膜にしやすいものを選択する。その際、２重結合を持たない有機材料より選択すると、炭素の１ｓ→π＊遷移を利用して撮影すると透過率が高く、強度のある有機薄膜を薄膜材料として利用できる。例えば、ポリエチレンは２重結合を持たない代表的な飽和した高分子であり、したがってπ＊の分子軌道を有しない。従って、４４〜４３。７Ａ（２９０〜２８０ｅＶ）の波長領域で非常に高い透過率を持つことが期待できる。
図９は、実際にＪ．Ｒ．Ｒａｂｅ等によって測定されたポリエチレンフィルムのＸ線透過特性である（Ｊ．Ｒ．Ｒａｂｅ  ｅｔ．ａｌ．：Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  １５９（１９８８）２７５）。図８によればポリエチレンフィルムは、２８７ｅＶ以下で非常に高い透過率を持つことが分かる。内殻励起過程を用いた顕微鏡法において、Ｘ線の波長が４３．５Ａ（２８５ｅＶ）前後で強い吸収線をもつラベラーのベンゼン環の吸収像を撮影する場合には、該フィルムは最適な試料容器の窓材である。
【００８２】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明においては光子エネルギー２０００ｅＶ以下で、波長幅が１ｅＶ以下の単色化されたＸ線を用い、特に試料を２重結合を含む分子で染色することることによって、従来の内殻電離過程によるＸ線顕微法の場合に比してコントラストがつき易く、Ｘ線の光子エネルギーの選択によりコントラストが任意に調整で、高機能のＸ線顕微法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来のウォルタ−型Ｘ線顕微鏡の光学系を示す説明図
【図２】  フレネルゾーンプレートの正面図
【図３】  シュワルツシルド光学系を示す説明図
【図４】  内殻電離過程と内殻励起過程との説明図
【図５】  炭素原子１ｓ電子が各ｐ軌道に励起した場合の光子エネルギーと断面積との関係図
【図６】  ベンゼン１ｓ電子がπ＊の分子軌道へ遷移する場合の光子エネルギーと断面積との関係図
【図７】  水及び蛋白の波長に対する吸収係数との関係図
【図８】  ポリエチレンの光子エネルギーに対する強度との関係図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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