(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大きなＤＮＡ分子の順序付き制限地図を決定する方法であって、
ＤＮＡ分子を流れ場で流すと同時に延伸する工程と、
流れる延伸されたＤＮＡ分子を制限酵素で切断して、制限フラグメントを生成する工程と、
制限フラグメント間の切断部位に対応するギャップの外観に関して個々の分子を観察する工程と、
個々の分子から生成された制限フラグメントのサイズ及び順序を決定して、順序付き制限地図を構成する工程と
含む方法。
【請求項２】
流れ場が、加速する流速を提供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
大きなＤＮＡ分子の順序付き制限地図を決定する方法であって、
ＤＮＡ分子を含有するサンプルに反復可能な制御された方法で外力を加え、それにより、ＤＮＡ分子を延伸する工程と、
延伸された分子を制御して、ＤＮＡ分子を延伸された状態に維持する工程と、
オリゴヌクレオチドをｒｅｃＡタンパク質の存在下でＤＮＡ分子上の所定の制限部位にハイブリダイズさせて、３本鎖複合体を形成する工程と、
ＤＮＡ分子の、該ハイブリダイゼーション複合体によって保護されていない部分を改変する工程と、
ｒｅｃＡタンパク質及びオリゴヌクレオチドをＤＮＡ分子から取り出す工程と、
ＤＮＡ分子の非改変部分を、該所定の制限部位を認識する制限酵素で切断して、制限フラグメントを生成する工程と、
制限フラグメント間の切断部位に対応するギャップの外観に関して個々のＤＮＡ分子を観察する工程と、
個々のＤＮＡ分子の切断から得られた制限フラグメントのサイズ及び順序を決定して、順序付き制限地図を構成する工程と
を含む方法。
【請求項４】
延伸された分子を、アガロース中で制御する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
大きなＤＮＡ分子の順序付き制限地図を決定する方法であって、
大きな縮合されたＤＮＡ分子を含有するサンプルを、正電荷を帯びた面を提供するために前処理されたガラス面に塗布する工程と、
大きなＤＮＡ分子を正電荷を帯びた対イオンで解縮合し、解縮合したＤＮＡ分子を正電荷を帯びたガラス面に付着させる工程と、
ＤＮＡ分子を制限酵素で切断して、制限フラグメントを生成する工程と、
制限フラグメント間の切断部位に対応するギャップの外観に関して個々のＤＮＡ分子を観察する工程と、
制限フラグメントのサイズ及び順序を決定して、順序付き制限地図を構成する工程と
を含む方法。
【請求項６】
該決定工程が、ＤＮＡ分子又は制限フラグメントの見かけ長さを内部サイズ標準に対して計測する及び／又はＤＮＡ分子又は制限フラグメントの蛍光強さを内部サイズ標準に対して計測することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
大きなＤＮＡ分子から生成される制限フラグメントのサイズを決定する方法であって、
ＤＮＡ分子を含有するサンプルに反復可能な制御された方法で外力を加え、それにより、ＤＮＡ分子を延伸する工程と、
延伸した分子を制御して、ＤＮＡ分子を延伸された状態に維持する工程と、
大きなＤＮＡ分子を制限酵素で切断して、制限フラグメントを生成する工程と、
制限フラグメントの個々の制限フラグメントを観察する工程と、
制限フラグメントの見かけ長さを内部サイズ標準に対して計測する及び／又は制限フラグメントの蛍光強さを内部サイズ標準に対して計測することにより、制限フラグメントのサイズを決定する工程と
を含む方法。
【請求項８】
ＤＮＡ分子を標識する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、米国厚生省国立総合医科学研究所により授与された契約番号第ＧＭ３７２７７号の下での米国政府の支援によってなされ、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本願は、１９８８年９月１５日出願第０７／２４４，８９７号、１９８９年４月５日出願第０７／３３３，５３１号及び１９９２年５月４日出願第０７／８７９，５５１号である米国特許願のそれぞれの一部継続出願であり、これによって、該特許出願のそれぞれの内容全体が参照によりここに組み込まれる。特許願第０７／８７９，５５１号は、該特許願第０７／２４４，８９７号の一部継続出願である。
【０００３】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動、顕微鏡測定、分光分析及び分子生物学の分野において、例えば、個々の粒子の寸法を観測かつ決定し、様々な寸法の粒子を含有する試料の重量分布を決定して、ポリマー分子の特性を明らかにする方法に関する。より詳しくは、本発明は、例えば、粒子、例えば核酸が外力、例えば制限酵素による消化に付されたときの、それらの位置及びコンホメーションの変化を測定すること、並びにそれらの長さ及び直径又は半径を測定することによってそれらの特性を明らかにするための、分光分析による方法と組み合わせた顕微鏡測定及び／又は分光分析の使用に関連する。
【０００４】
【背景技術】
伝統的には、粒子である試料の分子量分布は、摂動する力に付された粒子が適切な媒体、例えば、粒子を寸法に従って分離させる媒体中を移動する速度を測定することによって決定されている。粒子の寸法、及び特定の力が適用されたときに、媒体中のそれらの移動速度を関係付ける数学的関係が計算されている。
【０００５】
沈降法は、粒子寸法を測定するための周知の手法であるが、ポリマーに適用したとき、この方法は、約５０〜１００キロ塩基（Kb）の最大寸法を有する分子に限定される。より大きい分子をこの手法によって測定しようとするのは、主として、沈降係数が遠心速度に鋭敏であるために、おそらく分子の寸法を過少評価することになると思われる［Kavenoff et al., Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., P381 (1974) を参照されたい］。
【０００６】
寸法によってポリマー粒子を分離するもう一つの一般的な方法は、ゲル電気泳動によるもの［例えば、Freifelder, Physical Biochemistry, W.H. Freeman (1976)を参照されたい］であり、制限消化物を分離するのに特に有用である。要約すると、ポリマー粒子を溶解したアガロース又はポリアクリルアミドのゲルへの電場の適用は、小さい粒子を、大きい粒子より速い速度でゲル中を移動させる。それぞれのバンド中のポリマーの分子量は、既知の長さのポリマー断片の移動度と未知の物質の移動度の比較によって算出される。それぞれのバンド中のポリマーの量は、着色したバンドの幅及び／又は色強度（光学密度）に基づいて評価することができる。しかしながら、この形式の評価は、通常、きわめて正確であることはない。
【０００７】
本発明者らが開発し、米国特許第４，４７３，４５２号明細書に記載したパルス場電気泳動は、ここで、参照によってここに全体的に組み込まれるが、ゲル中の比較的大きいＤＮＡ分子の分離が、従来の電気泳動を用いた分離よりも改良されている。この手法によれば、従来の既知の電気泳動法に用いられる連続場ではなく、計画的に交番した電場を用いて粒子を分離する。より詳しくは、粒子の質量に関連する周波数で、強い強度と弱い強度との間で相互には同期せずに交番する、相互に横断する、等しい強度の電場を用いて粒子を分離する。この力は、全体として電場のそれぞれの方向に対して横断する方向に粒子を移動させる。ここで用いられる限りで、用語「横断する」は、９０°又はそれに近い角度に限定されず、他の実質的な交差の角度を包含することに、ここでは留意しなければならない。
【０００８】
間接的な測定手法、例えば上記のそれによって分子量を決定することによる最も重大な問題の一つは、直接測定されるパラメータ、例えば移動速度は、分子寸法のわずかな差に比較的鈍感なことである。したがって、粒子寸法分布の精密な決定を得るのは困難である。不安定な傾向があり、１個の長さが数インチである分子を含有する生体ポリマー試料の場合には、精度の不足は、特に問題となりうる。
【０００９】
多分散試料中の粒子寸法分布を決定する既知の方法には、他のものより良好な分解能を与えるものもあるが、ほとんど同一寸法の粒子同士を識別するのに必要とされるような高い分解能を与える従来の既知の手法は、あるとしても、少数であるにすぎない。ゲル浸透クロマトグラフィーや沈降法は、わずかに約Ｍ1/2(Ｍ＝分子量）の分解能を与えるにすぎない。標準的なアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動は、−log Ｍとして変動する分解能を与える。パルス電気泳動の手法は、異常に大きい分子を分離するには効果的であるが、標準的電気泳動よりはるかに良好な分解能を与えることはない。したがって、類似する寸法の粒子、例えば、長さが数分の１％異なる粒子同士を識別するために、上記の測定手法を用いては、不正確であり、問題がある。
【００１０】
より高い質量（即ち、約６００Kbまで）の粒子は、ゲル（例えば、ポリアクリルアミド）の濃度を０．０３５％という低さにまで低下し、電場強度を低下することによって、従来のゲル電気泳動を用いて分解できる。しかしながら、この方法でも問題がある。最も著しくは、ゲル濃度の劇的な低下は、機械的に不安定であり、より少ない試料しか装荷できないゲルを生じさせることである。低下ゲル濃度及び電場強度を用いて、非常に大きいＤＮＡを分解するために電気泳動を実施することは、完了するのに１週間又はそれ以上を必要とする。更に、低下ゲル濃度は、小さい分子の分離を達成しないために、広範囲の粒子寸法を有する試料中の分子を分離するのに有用ではない。したがって、広範囲の粒子寸法を有する分子を含む試料を分離しようとするならば、数回の電気泳動の実施、例えば、最初は、より大きい分子の分離、次いで、より小さい分子のさらなる分離を必要とする。
【００１１】
その他の当技術に既知の粒子測定の手法は、大量の試料中に存在する一定の分子（例えば、試料中の最大分子、又は平均分子寸法）の寸法を決定することには役立つが、与えられた試料中の種々の長さの多数のポリマーを測定するためには実用的でない。当技術に周知である粘弾性リコイル手法［Kavenoff et al.,「Chromosome-sized DNA molecules from Drosophila」, Chromosa, Vol.41, p1 (1973) を参照されたい］は、コイルされた分子を、溶媒流の場（例えば、移動する２枚のプレートの間で液体を摂動させたときに生ずる場）中で延伸させ、最大分子が緩和状態へ復帰するのに要する時間を決定することを含む。緩和時間は、緩和の時間中に運動する同心回転子の回転を監視することによって測定する。この手法は、大きいＤＮＡ分子に適用したときに、試料の測定がＭ1.66として変動する点で極めて精密であるが、試料中の最大分子以外の分子を寸法決定するのには有用ではない。
【００１２】
当技術に既知である光散乱の手法（例えば、準弾性光散乱）を用いると、粒子の寸法及び形状は、ジムプロット、即ち当技術に既知であるデータ解析法によって決定される。これらの手法では、寸法依存度は、Ｍ1 として変動する。光散乱は、測定しようとする分子が置かれている溶液が純粋、即ち塵埃その他のいかなる汚染物もないことを必要とし、したがって、ＤＮＡ試料を寸法決定するには不適当である。更に、これは、様々な寸法の粒子を有する試料の重量分布ではなく、試料中の粒子の平均重量を決定することにのみ役立つにすぎない。
【００１３】
個々の分子を測定するための当技術に既知である更にもう一つの粒子測定手法は、限定された精度を有する粒子寸法の測定法を提供する。個々の緩和したＤＮＡ分子の平均寸法及び形状は、蛍光顕微鏡下で分子を観察し、球形又は楕円体の形状を有する分子の長軸と短軸とを測定することによって決定されている［Yanagida et al., Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., Vol47, p177 (1983)を参照されたい］。この手法は、分子を摂動せずに自由溶液中で実施する。
【００１４】
電気泳動の際の小さいＤＮＡ分子の運動が観察されている［Smith et al., Science, Vol.243, p203 (1989) を参照されたい］。この出版物に開示された方法は、非常に大きいＤＮＡ分子の観察には適切でなく、分子を測定する手法は、考察されていない。
【００１５】
ポリマー分子のような粒子の実用的な重量決定は、直接測定されるパラメータの寸法依存度を最大化することだけでなく、必要な試料の量、分析を完了するのに要する時間、及び測定の精度のような要因にも依存する。ゲル浸透クロマトグラフィーは、時間がかかり、大量の試料を必要とすることがある。従来のゲル電気泳動のような方法は、比較的時間がかかり、程々の量の試料を必要とすることがあり、そして非常に大きいＤＮＡ分子を寸法決定できない。
【００１６】
分子の寸法決定は、ＤＮＡ配列決定から下等真核生物の染色体ＤＮＡの寸法測定までの、事実上ゲノム解析のあらゆる側面に関連する基本的な操作である。キロ塩基で示される分子寸法は、多くの生物についてセンチモルガンに変換され、またその逆も行われ、これらの寸法を決定するのに、一般的には電気泳動が用いられる。代表的な分子生物学者が実施しているとおり、核酸の寸法決定技術における基本は、過去１０年間に大きくは変化してはいない。これは、ゲル電気泳動の単純性、及び多様な試料を平行的に処理できるその可能性を考慮すれば、理解できる。ゲルから得られたデータは、容易に解釈することができる。遺伝子の寸法が与えられるだけで、ゲル電気泳動の手法は、これらの解析に十分に適合する。制限消化物の特性を明らかにすることから、連続した梯段方法での配列決定の際の１塩基の差の識別に至るまで、ゲル電気泳動は、ＤＮＡの寸法解析のための精選された方法である。ＰＣＲ［Mullis, Methods in Enzymol., Vol.155, p335-350 (1987) ］反応の結果でさえ、寸法分析によってモニターされることが多い。パルスゲル電気泳動は、この範囲をはるかに拡大して、下等真核生物からの染色体ＤＮＡを包含する［Schwartz, Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., Vol.47, p189 (1983); Schwartz, Cell, Vol.37, p67 (1984); Carle, Nucleic Acids Res., Vol.12, p5647 (1984); Chu, Science, Vol.234, p1582 (1986); Clark et al., Science, Vol.241, p1203 (1988)］。パルス電気泳動は、非常に大きいＤＮＡ分子を分離できるため、その適用は、大きなゲノムの地図作成を単純化し、大きなＹＡＣｓ（イーストの人工染色体）を生成するのに必要な手段を与えている［Barlow et al., Trends in Genetics, Vol.3, p167-177 (1987); Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.88, p5744 (1991)］。しかしながら、パルス電気泳動は、１０年以上も前に開発されたものである［Schwartz, Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., Vol.47, p189 (1983)及びSchwartz, Cell, Vol.37, p67 (1984)］。重要な寸法決定法の進歩の驚くべき不足は、従来の、及びパルス電気泳動の分子的機構の理解においてなされた進歩と対照的である［Zimm, Quart. Rev. Biophys., Vol.25, p171 (1992); Deutsch, Science, Vol.240, p992 (1988) ］。
【００１７】
分子寸法の決定は、ここ１０年間であまり進歩していないが、ゲノム解析のもう一面、即ちＤＮＡ検出技術は、顕著に進歩した。これらの発展は、ゲルに基づく方法論と並んで細胞遺伝学の分野にもインパクトを与えた。一つの推進力は、Human Genome Initiative （ヒトゲノム計画）と、大規模な地図作成及び配列決定によってヒトゲノムやモデル生物のゲノムの特性を明らかにするその目標とであった。ほ乳類の大きいゲノム全体を解析することを目指す新たな目標は、ＤＮＡの地図作成や配列決定の精度の増大及び大きな処理量を包含する。必要とされる進歩の第一ラウンドは、部分的には、洗練された画像処理法［Glazer, Nature, Vol.359, p859 (1992); Quesada, BioTechniques, Vol.10, p616 (1991); Mathies, Nature, Vol.359, p167 (1992)］、新規なＤＮＡ検出手法、及び新規なＤＮＡラベル化／画像システム［Glazer, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.87, p3851 (1990); Beck, Nucleic Acids Res., Vol.17, p5115 (1989)］の組み合わせから到来している。ゲル電気泳動に基づく技術の自動化には、操作員を必要としない機能のための、明確な、比較的紛らわしくない検出システムが要求される［Lehrach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, p39-81 (1989); Larin, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.88, p4123 (1991) ］。コンピュータによる洗練された方法は、使用可能なデータを困難な条件から自動的に抽出できる。地図作成への完全に統合された取り組み方の良い例は、これらの技術的取り組み方のすべてを、「メガＹＡＣｓ」［Bellanne-Chantelot et al, Cell, Vol.70L, p1059 (1992) ］と結合して、これらのＹＡＣｓの信頼度に固有の問題は有するものの、報告量を劇的なまでに最大に高めたCohen 研究所から得られる［Anderson, Science, Vol.259, p1684 (1993)］。
【００１８】
真核生物の染色体に関する物理的地図の構成は、ＤＮＡの地図作成及び配列決定のための現在の方法論の多くが、本来はゲノムではなく遺伝子を解析するよう設定されたことに、部分的には起因して、面倒かつ困難であるために、現状では、ＰＣＲやブロットハイブリッド形成のような手順の自動化が奨励されている［Chumakov, Nature, Vol.359, p380 (1992)］。真核染色体からのＤＮＡ配列を順序付け、そして寸法決定する工程では、二つの手法が基本的な役割を果たしている。電気泳動の方法は、長い鎖に対してさえ良好な寸法分解能という長所があるが、大量のＤＮＡを必要とする。試料源は、ゲノムＤＮＡ又はＹＡＣｓを包含する［Burke, Science, Vol.236, p806 (1987)］。単一分子的手法、例えばその場での蛍光ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）は、単に限定された数の染色体を利用する［Manuelidis, J. Cell Biol., Vol.95L, P619-625 (1982) ］が、まだパルス電気泳動のそれに匹敵する寸法決定能力を達成していない。理想的には、正確な制限地図を非常に迅速に構成するために、電気泳動の寸法決定能力をＦＩＳＨの固有の整列化能力と結合することが可能であると思われる。
【００１９】
すべてを勘案して、様々な物理的及び遺伝学的手法の発展は、全染色体やヒトゲノム全体の完全な物理的地図の作成に向けて期待されたよりはるかに達成されることが可能になっている［Bellanne-Chantelot et al., Cell, Vol.70L, p1059 (1992)； Chumakov et al., Science (1992); Mandel et al., Science, Vol.258, p103 (1992)］。この進歩にもかかわらず、状況は、下記の領域で改善することができる。
【００２０】
ＹＡＣｓを指紋化するために、染色体ＤＮＡを数種類の酵素で消化し、次いでブロットし、ときには、数種類の異なる反復配列とハイブリッド形成させる［Bellanne-Chantelot et al., Cell, Vol.70L, p1059 (1992); Stallings et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.87, p6218 (1990); Ross et al., Techniques for the Analysis of Complex Genomes, Academic Press, San Diego, California USA (1992) ］。ここでは、ハイブリッド形成によって特異的に特定される制限断片を寸法決定するために、電気泳動が用いられる。そのような分析に利用できるデータ密度は、比較的低い。例えば、代表的なアガロースゲル中の与えられた領域で、１００以上のバンドを識別するのは困難である。その上、同じ寸法である制限断片は、相互に分離できず、注意深い特異的ハイブリッド形成によってのみ識別できるにすぎない。そのために、指紋は、整列化制限地図を同じ酵素、又は寸法母集団の正確なヒストグラムさえ用いて作成しようとしたならば得られるであろうものとほぼ同じ量の情報を提供することはない。そのようなヒストグラムは、蛍光強度バンドの困難な測定によってゲルからのみ得ることができるにすぎない。
【００２１】
ゲルは、時間がかかる。ゲルを注入するのは時間や手間がかかり、実施するには何分も何日もかかり、そしてサザン分析を実施するのに数日かかることもあるが、確かにゲルは平行試料分析の機会を与え、多重手法［Church et al., Science, Vol.240, p185 (1988)］を用いると、この巨大な能力は、おそらく最大化されているものの、寸法決定結果を、デジタル化し、自動的に作表するには困難であることが多い。
【００２２】
一般的に実施されるアガロースゲルについての電気泳動による寸法分解能は、質量を超えることがほとんどない。それでも、限定された条件下では、より大きな寸法分解能を得ることができる［Calladine, Journal of Molecular Biology, Vol.221, p981 (1991) ］。より大きな寸法分解能は、より高度な情報内容を有する、より簡単な指紋を可能にするものと思われる。パルス電気泳動の手法は、一定の状況下では寸法分解能を高めることができるが、これらの結果は、非常に狭い寸法範囲以外では、解釈するのが困難なことがある。最終的には、これらの測定された寸法は、非常に大きなＤＮＡ分子については範囲が限定される寸法マーカーに依存する。パルス電気泳動については、決定された寸法は、いくつかの寸法マーカー間に不適切に内挿されることが多い。
【００２３】
（iv）使用可能な感度は、外来の手法による以外は、ピコグラム以下の範囲に限定される［Glazer et al., Nature, Vol.359, p859 (1992); Quesada, BioTechniques, Vol.10, p616 (1991)］。しかしながら、現在一般的な燐光画像システムは、多少は感度を向上させ、定量をより容易にしている。使用可能な感度範囲は、分析できる試料のタイプを規定することになる。例えば、単一複写のほ乳類ゲノムのハイブリッド形成は、初心者にとって挑戦的である。ゲノムＤＮＡの末端ラベル部分消化の地図作成は、感度が伴わないために、しばしば不成功［Smith et al., Nucleic Acids Res., Vol.3, p2387 (1976) ］であるために、大規模な解析をゲノムＤＮＡの試料で実施するのは困難である。このことは、クローン化できない領域、再配列及び削除による問題を包含するそれらの制限にもかかわらず、クローン化したゲノム材料に頼ることを必要とする。ＹＡＣｓは、そのような大きなゲノム断片のクローン化を可能にし、多くの地図作成の取り組み方のための基盤として有用であるものの、完全な地図作成用試剤ではなく、そのために、大いに注意して用いなければならない［Anderson, Science, Vol.259, p1684 (1993); Vollrath et al., Science, Vol.258, p52 (1992); Foot et al., Science, Vol.258, p60 (1992)］。
【００２４】
ここでの文書の引用は、ここに引用されたいずれの文書も当技術に適切であるとの承認、又は引用された文書が本願の請求範囲の特許性のための熟慮された材料であるとの承認として意図したものではない。これらの文書の、日付けに関する陳述又は内容に関する表示は、すべて、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付け又は内容の正しさに関するいかなる承認をも構成しない。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分子寸法、分子量、寸法分布、重量分布及び／又は均一、不均一若しくは多分散の酵素切断地図を決定、あるいは分子試料を改質するために、ポリマー及び粒子を含む、大きな分子又は小さな分子の特性を物理的に明らかにするための方法を提供する。
【００２６】
本発明は、より早い効率的な方法を用いて、分子寸法、重量及び切断又は制限地図の少なくとも一つを決定することができ、それは、また関連技術として知られている方法よりも優れた分析結果を提供することができる。
【００２７】
本発明は、また極めて鋭敏な方法、例えば、二三の分子又は単一分子と同じように少量の試料を用いる方法により、一つ又はそれ以上の分子を寸法決定することができる。
【００２８】
また、広範囲の寸法を有する分子を含有する多分散試料のための正確な寸法情報が提供され、同様に従来の既知の技術を用いるよりも更に迅速にこの情報が提供される。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、多分散試料中の変形しうる分子及び変形できない分子を含む個々の分子を媒体中に置き、この分子に外力を適用し、これにより物理的変化（特に、コンホメーション及び／又は位置の変化）を引き起こし、次いでこれらの変化を観察し、かつ測定することにより、この分子の特性を明らかにすることを含む。この方法は、適当な顕微鏡（この顕微鏡は、場合により分光分析装置に連結することができ、したがって、小さすぎて可視化できない分子が更に検出できる）により検出される最小の分子、及び線状コンホメーションに延伸される時に長さで数インチまである大きな分子を含む、種々の寸法の分子の特性を明らかにするために有用である。従来の技術を使用する時顕微鏡スライドの上に破壊することなく置くことができない、剪断に鋭敏な分子（例えば、大きな分子）は、本発明によりこれらを媒体に入れるまえに分子を折りたたみ（凝縮）、次いで媒体に入れた後にひろげることにより測定される。本発明は、光学顕微鏡下で可視化され又は検出できる多くのタイプの分子の特性を明らかにするために有用である。幾つかの非限定例は、多糖類、ポリペプチド、タンパク質及び核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明において、変形しうる分子は、それらが外力を受ける時に、コンホメーション（形状）及び位置を変える傾向を有する分子である。変形できない粒子又は分子は、外力を受ける時でさえかなり安定なコンホメーションを有する傾向を示すが、位置の変化を受けることはできる。変形しうる分子は、通常、可逆的に変形可能であり、例えば、それらは外力を受ける時にコンホメーションを変え、次いで力の適用が終了した時に元の形状に匹敵し得る構造に戻る。
【００３１】
本発明は、折り曲げられ、コイル及び／又は超コイルされており、かつ延伸、屈曲、捩れ、収縮などのコンホメーション変化、及び回転、移動などの位置変化を受けているポリマー分子を測定するために特に有用である。本発明は、ある種の媒体中にある分子に外力が適用されている時に特に有用である。しかしながら、力がかかっていない自由な溶液が使用される時には、分子にコンホメーション又は位置の変化を引き起こすために外力の適用は必要でない。
【００３２】
顕微鏡で観察するのに十分に大きい分子は、可視化法、例えば、顕微鏡画像の直接観察により測定される。別法として、特に粒子が画像化される（受入れられる分解能で見る）には小さすぎる場合、粒子は、いずれかの適切な分光分析技術と組み合わせた顕微鏡を用いて測定される。
【００３３】
有用な分光分析法の幾つかの非限定例は、屈折率又は蛍光二色性の測定と組み合わせたレーザーによる偏光放射線の使用、又は冷却荷電結合装置、シリコン強化ターゲット装置、及びマイクロチャンネルプレート検出器のような敏感なビデオカメラを使用することを含む。
【００３４】
小さな分子と大きな分子、例えば、染色体を含む大小のＤＮＡ分子の両方の混合物を含有する試料は、試料中の各分子が同時に測定されることにより、迅速に寸法決定される。本発明の方法は、バルクで試料の特性を明らかにする従来の既知の方法とは異なり、個々の、別々の分子（又は他の粒子）のコンホメーション及び位置の変化を測定することを含む。本発明の方法は、単一分子から多数の分子の範囲に及ぶ、任意の数の分子を測定するために適用することができる。多数の分子を含有する試料が測定される場合には、一時に観察される分子の数は部分的には顕微鏡の視野及び分子が互いに分離している程度に依存する。外力を適用した後の、別々の個々の分子の観察又はその緩和の役割の測定は、完全な解放又は測定したパラメータの区別を許す。
【００３５】
本発明に使用する媒体は、任意の適切な物質である。好ましくは、この媒体は、緩和した分子を比較的一定の位置に保つが、外力を受ける分子の運動は許す。しかしながら、自由な溶液も使用できる。分子運動の測定のために、適切な媒体は、その寸法、及び多分その化学的組成に応じて、異なる速度で異なる分子にコンホメーションと位置の変化を許す媒体である。
【００３６】
本発明の多くの用途に対して、好適な媒体は、ゲル又は液体である。好ましくは、この媒体は非対流性であるが、これは絶対的な必要性ではない。この媒体は、不活性であってもなくてもよい。適切な媒体の選択は、一部には測定される分子の寸法、分子が位置と形状を変える傾向、及び所望の測定の正確さに応じて異なる。例えば、大きな分子（又は類似の寸法の他の分子）が測定される時には、大きな孔径を有するゲルが使用されることが好ましい。
【００３７】
分子に加えられる外力は、変形不能又は変形可能な分子にコンホメーション又は位置の変化をもたらす任意の力である。例えば、この力は電場、溶媒流の場又は磁場であるが、これらのタイプに限定されない。この力は、方向、期間及び強度を変えることができる。分子を摂動するために有用な方法は、電気泳動の使用又は部位特定酵素消化、例えばＤＮＡ分子の制限酵素消化によるものである。
【００３８】
本発明で測定される変化のタイプは、主として延伸及び緩和速度並びに長さ及び直径（又は半径）の測定を含む、コンホメーション又は形状の変化、並びに媒体中での、配向及び回転並びに移動の変化を含む位置の変化を含む。分子は、コンホメーション若しくは位置又はその両方で変化することができる。異なるタイプの変化が、本発明の種々の実施態様により測定されている。
【００３９】
コンホメーション及び位置の変化を測定する技術は、必ずしも限定されないが、顕微鏡（単独で）及び分光分析装置と組み合わせた顕微鏡を含む。有用な分光分析技術の幾つかの非限定例は、複屈折、直線偏光又は円偏光二色性、及び蛍光強度の検出を含む。
【００４０】
顕微鏡下で見ることができるのに十分に大きい分子は、分子を可視化する（画像化する）ことにより測定できる。非限定例として、光学顕微鏡又は走査／トンネル顕微鏡を用いることができる。分子が直接に見られる一方、コンピューター化画像プロセッサー（例えば、ここで記載されたようにか、又は関連技術の当業者に示されているように）に接続された低光感度ビデオカメラに顕微鏡を結合することが有用であり、これは受取画像をデジタル化又は記録することにより、一連の写真、映画にさえも記録する。この画像プロセッサーは、それ自体コンピューターを含むか、又は画像に基づいたデータを処理するコンピューターに結合することができる。コンピューター化装置の使用は、それぞれの個々の分子の運動を同時に測定することを可能にする。更に、互いの分子の関連を検出でき、そして単一分子の幾つかの異なるパラメータを同時に測定することができる。
【００４１】
場合により、この顕微鏡及び画像プロセッサーは、分光分析装置に接続される。この技術は、可視化するに小さすぎる分子に対して特に有用であるが、同様により大きな粒子を寸法決定するためにも有用である。
【００４２】
コンホメーションと位置の変化の測定を寸法測定に変換するために、一般に分子が外力を受ける時に既知の寸法の分子の物理的変化に関するデータを発生させる（又は別に得る）ことが必要である。「マーカー（Markers)」は、分子量の既知の値を有する分子のパラメーターを測定することにより開発されている。分子量と、測定される特定のコンホメーション及び位置の変化間の関係を確立するために、この情報をコンピューター又はデータプロセッサーに入力にしてもよい。好ましくは、このマーカーは、未知の寸法の分子に類似の化学構造の分子（例えば、両分子は、類似の化学成分を含有する）であり、その理由は、緩和、再配向及び回転の速度は、分子組成に依存するからである。しかしながら、これは、一つ以上の他の変数、例えば、ポリマー寸法、組成、分子量、ｐｋａ、アミノ酸又は核酸配列などに依存し、したがって、この“マーカー”が、未知の寸法の分子の組成と類似の組成を有することは必ずしも必要ではない。
【００４３】
剪断に鋭敏な分子は、従来の方法を使用して顕微鏡スライド上にこれらを載せる時に破壊を受ける分子である。本発明の別の特徴により、分子を顕微鏡スライド上に載せる時の破壊を阻止するために、これを媒体中に置く前にこのような分子をより高い密度のコンホメーションに折りたたんでよい。これらは、いったん媒体中に置かれると、これらはひろげられて、より小さい分子と同じ方法により測定することができる。
【００４４】
本発明の第一の実施態様では、コイルされ、折り曲げられるか又はそうでなければ自然に緩和され、折り曲げられか若しくは複合されたコンホメーションである、蛍光で着色され、変形しうる分子が、媒体に置かれ、そして外力を加えることにより一時的に変形され、関連づけられ、広げられ、分離され、切断され又は延伸されている。力の適用を停止する時に、分子の緩和又は戻り時間（例えば、分子が、はじめの、本来の状態に戻るのに必要な時間）は、分子運動又は変化の直接の顕微鏡観察又は顕微鏡と分光分析装置の少なくとも一つにより測定される。別法として、延伸の動力学は、外力の開始後に、分子の延伸を追跡することによって測定される。速度測定は、種々の方法、例えば、単位時間あたり変化の量を測定することにより計算することができる。未知の寸法の分子の変化の速度は、補間又は外挿によるように、既知の寸法の分子の速度に基づいて測定される。
【００４５】
例えば、当業者に既知の粘弾性測定技術で、この実施態様による液体中の分子の緩和時間は、約Ｍ1.66として変わる。ゲル中では、分解能は、Ｍ2-4 程度に高いと思われる。これは、分子がゲル又は限定するマトリックス中で折りたたまれ、それらの緩和時間が溶液中よりもゲル中でずっと大きいことを示す理論的原理に基づいている（例えば、DeGennes, P.E. Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell Univ. Press. N.Y. (1979)を参照）。
【００４６】
第二の実施態様では、変形可能又は変形不能な分子の再配向時間が測定されている。分子が、最初に一つの方向に摂動力を受け、そしてこの摂動の方向が、例えば、９０°又は別の横の角度、例えば１０−９０°、２０−９０°、３０−９０°、４０−９０°、５０−９０°若しくは任意の角度、又はその点の値により変わる時に、小さな分子は、それら自身で迅速に再配向し、そして新しい経路に沿って新しい移動を開始する。他方、より大きな分子は、これらが電場の方向に再配向されるまで実質的に不動のままである。次いで、これらも、また新しい方向へ動き始める。この時までには、より小さい分子は、先へ動いているであろう。外力に関して分子の位置が変化する速度の測定は、例えば、単位時間あたりの位置の変化（例えば、横及び／又は回転の運動）を測定することによって測定される。
【００４７】
第三の実施態様では、一連の外力を加える時に分子が回転する速度が測定されている。この方法は、特に例えば、小さなＤＮＡ分子のような棒状分子、及び比較的一定のコンホメーションで保たれている細長い分子に適用可能である。本発明による“回転時間”は、特定の一連の外力を加える時に、分子が、特定の角度増分の位置回転、例えば、３６０°を受けるために必要な時間の量である。
【００４８】
周期的にパルス方向、強度及び長さを切り換えることにより、分子は、回転するにつれてわずかに前後に動かされる。これは、回転を容易にし、そして自動車が前方運動と後方運動を交互にすることにより平行なパーキングスペースの中又は外へと操作される方法に類似している。しかしながら、自動車と異なって、棒状又はコイル分子は、回転するにつれて若干曲がる。パルス化ルーチンは、また有用な測定、例えば、回転時間を分子寸法に関係させる測定を提供するために、一般に変形しうる分子を不変のコンホメーションに保つように作用することができる。
【００４９】
既知の寸法の分子に対する再配向及び／又は回転速度のデータは、再配向及び／又は回転速度と分子寸法間の関係を開発するために用いることができ、次いで、多分散試料に存在するそれらのような、類似の組成と未知の寸法の種々のポリマー分子の寸法を決定するために用いることができる。再配向及び回転速度は、位置変化を直接に観察する顕微鏡（好ましくは画像処理と組み合わせて）を使用するか、又は分光分析測定と顕微鏡を組み合わせて測定することができる。このようにして、これらの実施態様は、中程度及び大きい分子に対して有用であるばかりでなく、また容認し得る分解能で画像形成するには小さすぎる分子にも有用である。
【００５０】
本発明のなお別の実施態様では、媒体中に置かれている分子の長さが、顕微鏡を使用して直接に測定されている。この技術は、任意の数の分子の分子寸法の直接測定法を提供する。この技術は、一般に、例えば、外力の適用の間又は分子を延伸した力の終了のすぐ後に、延伸された状態にある変形された分子の曲線の長さを測定することを含む。しかしながら、この方法は、また細長い形状を有する変形不能な分子に適用でき、そしてこのような分子の測定は、測定を行う前に外力の適用を必要としない。好ましくは、この実施態様は、前記のものと同一の顕微鏡と画像形成装置を使用する。
【００５１】
第五の実施態様では、媒体に懸濁された分子又は他の分子の直径（又は半径）が測定されている。摂動力の適用は、任意であり、その理由は、分子が緩和状態にあり、そして分子が球形又は楕円体である時に、変形しうる分子の直径が測定されることが好ましいからである。この実施態様は、変形可能又は変形不能である分子を測定するために使用でき、そしてコンピューター化画像形成装置に結合された光学顕微鏡の使用を含む。
【００５２】
これら五つの実施態様は、前記のパラメータの幾つか又はすべては、一つ又はそれ以上の分子に対して同時に測定されるように組み合わせることができる。
【００５３】
本発明の第六の実施態様は、従来の方法を使用して顕微鏡スライドの上に載せられる場合に破壊する傾向を示す非常に大きな分子を寸法決定するために特に向けられている。要約すると、この新規な技術は、これらを媒体中に置く前にそれらを凝縮させる試剤を用いて分子を折りたたみ、次いでこの分子を媒体中に置いた後に分子をひろげることを含む。次いで、第一〜第五の実施態様の方法により分子寸法を決定する。小さな領域に非常に多数の分子を置くことが望ましい時に、例えば、ミクロ注入におけるように、分子が大きくなく又は剪断に鋭敏でない場合でさえも、また分子を化学的に折りたたむ方法を使用することができる。
【００５４】
本発明は、核酸分子を地図化するための新規な技術を提供する。例えば、核酸がマトリックス中に置かれ、次いで消化される時に、その断片は、コンピューター化装置により整列され、そして前記の方法により寸法決定される。かくして、消化物の順序が、迅速かつ正確に決定される。
【００５５】
本発明の別の特徴は、分子の部分にプローブをハイブリッド形成させることにより核酸分子を配列化することを提供する。核酸を、媒体中に置き、そこに適切な所望のプローブを加える。少なくとも一つの制限酵素が、また加えられてもよい。反応は、適当な手段、例えば、ＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）及び／又はマグネシウムイオンの添加により開始させる。プローブが、ハイブリッド形成した後に、それらは、前記の方法、即ち、顕微鏡（単独で）又は分光分析装置と組み合わせた顕微鏡により検出される。
【００５６】
したがって、本発明は、個々の分子の寸法及び分子の多分散試料の重量分布を決定する正確な方法を提供する。従来技術に優る本発明の別の重要な利点は、まさに最大の分子ではなく、多分散中の分子のそれぞれの分子のための測定可能なパラメータが決定されることにある。さらなる利点は、（１）一分子のみが必要であり、そして試料は非常に小さく、例えば、ただ一つ又はごくわずかの分子からなるものでよく、（２）測定は、試料中のそれぞれの寸法に対して一つの代表的な分子に基づくことができ、（３）この技術は、非常に大きな分子（従来の既知技術により測定するには大きすぎる分子）に対して用いることができ、（４）データは、コンピューターにより効率よく処理でき、（５）測定は、従来技術で既知の方法よりも迅速に行われ（例えば、特に数週間を要する遅い電気泳動法と比較して）、及び（６）測定が極めて正確であることである。
【００５７】
本発明は、また、動物又はヒトゲノムのような真核生物の構成及び構造を決定するための、新規な、超迅速方法を用いて、染色体寸法のＤＮＡ分子及び会合した複合体の分析方法を提供することができる。方法は、ヒトのような動物の母集団での多数の個人のための高分解地図作成を可能にするものを提供する。
【００５８】
そのような方法は、染色体寸法のＤＮＡ分子からの高分解配列地図を迅速に創り出すための、光学地図化を含むことができ、それは非電気泳動方法である。光学地図化は、制限酵素消化の間に単一のＤＮＡ分子を蛍光的に画像化して配列地図を調製する。次いで、得られた断片は、本発明による単一分子方法の一つにより寸法決定される。ほ乳類ゲノムの地図化を容易にするために、光学地図化は、正確さと処理量の増大に加えて、数百塩基からなる断片を地図化するための寸法決定に拡張して用いることができる。これを完成するために、分子緩和に基づく、進歩した強度測定技術及び寸法決定方法が、本発明により用いることができ、同様に改良した試料室(chamber) 設計及び固定技術を用いることができる。
【００５９】
単一ＤＮＡ分子へのハイブリッド形成を含む配列特定配列の位置測定のための検出方法：
ＲｅｃＡタンパク−仲介ハイブリッド形成方法は、本発明により、光学地図化を含むことができる方法により大きなＤＮＡの配列を正確に地図化することを提供する。大きな標的分子を、ハイブリッド形成部位で分子中に生成された可視化間隙を介して、特定の部位で、画像化し、位置測定し、そして定量化することができる。そのような配列位置測定技術は、処理量及び多機能性を改良するために、本発明において、寸法決定方法及び試料取扱技術と組み合わせることができる。本発明の別の方法は、ハイブリッド形成部位の直接の画像化であり；これは、ＲｅｃＡオリゴヌクレオチドフィラメントを、ハイブリッド形成部位を直接に可視化しうる光学的に検出しうる異なるタイプの標識(tag) に接合することに基づいている。また、エネルギー移送技術は、画像化により検出されるように、標識をつけたＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成の特性及び有効度を高めるために用いることもできる。
【００６０】
ゲノムＤＮＡ又はＹＡＣｓを用いる地図化での処理量の増大：
多くの単一分子方法は、本発明で、ＹＡＣｓ又はゲノムＤＮＡから製造される地図を劇的に増大させるように組み合わせることができる。大きな処理量、流れに基づく光学的地図化システムは、本発明による、例えば高分解の、整列された制限地図を調製することにより提供される。本発明によるＲｅｃＡ援用制限エンドヌクレアーゼ切断（ＲＡＲＥ）は、ゲノムを大きな断片に選択的に切断することができる。ＲＡＲＥ及び関連する技術は、クローニング又は配列化の必要なしに、大きなゲノム領域を迅速に地図化する光学地図化の方法を提供する。
【００６１】
そのような光学地図化の方法は、例えば分子寸法弁別の程度を上げるための寸法決定方法を適用することにより複雑なほ乳類のゲノムの分析方法を提供する。これらの適用が、ポリマー分子、例えばＤＮＡの緩和現象が、寸法依存性の程度が高いことを顕著に示すことの発見により促進された。また、本発明の方法の大きな処理量のインターフェース(interface) が、提供される。高分解度と大きな処理量の組み合わせは、好ましくは、本発明の方法で、与えられた種又は動物の下位群の全母集団の高分解地図を提供するために用いられる。地球上のゲノムの比較のための個々の高分解地図を目録化することの価値は莫大であり、例えば遺伝的特質の分析、及び多くの遺伝的要因からもたらされる、複雑な遺伝性の疾患を検出するための診断方法に用いられる。これら及び他の利点は、以下の詳細な記載から容易に明らかになるだろう。
【００６２】
本発明は、媒体中のラベル化又は非ラベル化分子の物理的及び／又は化学的特性を明らかにするための方法を提供する。そのような特性は、分子が外力を受けている間又はその後に、外力を受けた分子の、長さ、寸法、制限地図、重量、質量、配列、コンホメーション若しくは構造の変化、ｐＫａの変化、分布、粘度、緩和の時間、再配向及び回転、又はその他の特性の少なくとも一つを、制限されずに、含むことができる。
【００６３】
他の適用の内、これらの測定は、分子寸法を決定するために用いることができる。本発明は、分子が、ある形態の媒体中に置かれたとき、多分散試料（例えば、異なる寸法の分子を含む試料）でのポリマー分子の寸法決定するのに適切であり、従来の方法を用いて顕微鏡スライド上に載せる場合には破壊される、非常に大きな分子、例えば大きな核酸を測定するのに有用である。いくつかの実施態様において、外力により変形されるか、若しくは再配置された後か、又は、その間に、分子が測定されている。本発明のこの方法は、それらが緩和された（非摂動）コンホメーションであるときに、コイルされてるか、又は多分超コイルさえされている核酸及び他のポリマーの試験のために特に適切である。
【００６４】
分子の多分散試料の分子量分布を決定するための方法は、異なる分野の種々のもので有用である。例えば、高分子化学で、オリゴマーの特性は、しばしばその分子量分布に依存している。特定の物質が、好ましい特性を示すことが見いだされ、そのオリゴマーの正確な組成が知られていないとき、ポリマーの分子量分布の分析が、同定の目的のために用いられる。分子生物学において、ＤＮＡ制限酵素消化の試料のような多分散試料の分子量分布は、ＤＮＡの構成についての貴重な情報を提供する。この情報は、染色体地図作成及び広い範囲の分子遺伝学特性を明らかにするために用いられる。
【００６５】
分子は、媒体、例えば、溶媒、粉末、ガラス又はゲルに置かれる。他の好適な媒体も使用できる。分子を含む媒体は、顕微鏡スライド上に載せられるか又は分子を顕微鏡下で見ることができるように何か他の方式で置かれる。特定の媒体の好適性は、部分的には使用されるべき測定技術に応じて異なる。摂動を必要とする測定技術は、変形しうる分子がコンホメーション又は位置を変えることができる媒体の使用を必要とする。光学顕微鏡下で直接に観察されるときには、好適な媒体は、分子を明確に見ることができるものである。顕微鏡が複屈折測定と組み合わされるときには、好適な媒体は、対流を阻止しそして観察された信号の寸法依存性を高めるものである。更に、この媒体自体は、好ましくは実験条件の間比較的著しい複屈折を含まない。
【００６６】
蛍光強度の測定に基づく分子の特性明確化手法は、媒体としてマトリックス（例えば、分子運動を部分的に制限する媒体）を用いて大きく促進される。本発明の方法に対して、媒体は、好ましくは溶液又はゲルである。アガロース及びポリアクリルアミドは、本発明で使用するに十分に適している。好適な溶媒の例は、グリセロール／水、ポリデキストラン／水、及び有機溶媒を含む。しかしながら、これらの例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６７】
好適実施態様において、アガロース、約１００，０００ダルトンの平均分子量を有する寒天から得られる多糖類が、水性緩衝液（代表的には１％溶液）に溶解され、そして放置して冷却され、ゼラチンに似た剛性ゲルを形成する(Jelhoに見られるように）。このゲルマトリックスは、水素結合を通してお互いにアニールされたアガロースポリマー鎖の三次元網目構造からなる。このアガロースゲルを加熱すると流体状態に戻り、このために、このゲルは、ちょうどゼラチンのように可逆であると言われている。アガロースゲルの重要な特徴は、その途方もなく大きな平均孔径である。アガロースゲル中の孔ポイドは、現在完全に特性が明らかにされていないけれど、これらは、幅約０．３ミクロンであると考えられ、かつより小さいポイドをも含む。その大きな孔径と不活性の故に、アガロースは、ＤＮＡゲル電気泳動に使用されるが、これは、ＤＮＡ分子がゲル中で延伸しかつ運動することができるからである。
【００６８】
蛍光顕微鏡が使用されるべき場合には（又は、蛍光強度が、他の手段により測定されるべき場合には）、この分子は一般に着色される。着色工程は当業者に周知である。本発明で有用なステイン又は発色団は、エチジウムブロマイド及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むが、これに限定されない。殆どのタイプの分子は、これらが画像形成される前のあるときに着色され、かつこれらが媒体中に置かれる前又はその後に着色されてもよい。
【００６９】
変形しうる分子が媒体に置かれ、そしてスライド上に載せられるときには、分子を摂動するために幾つかの可能な方法がある。幾つかの非限定方法は、下記の通りである：（１）分子が、電場の適用により摂動され、これは、マトリックスを通してＤＮＡのような荷電分子を動かし、クッキーねり粉形成機を通して動くにつれて変形するように、コイルされたコンホメーションを歪める。これは、ゲル電気泳動に含まれる現象である、（２）流れ場が、液体アガロース／ＤＮＡ（又は選択のポリマー）中に発生し、次いで分子含有液体は著しいコイル緩和を阻止するのに十分に速く、低温急冷で急速にゲル化される。この方法は、分子が荷電されていても、されていなくても有用である。（３）電気泳動効果を使用して、場勾配（位置と共に強度を変化する電場）を有する非荷電分子が、分子電子雲を歪ませることにより動かされ、かくして引きつけうる双極子を誘導する。電気泳動は、アガロースのようなマトリックス中で使用できると思われる。
【００７０】
電気泳動を使用することの利点の一つは、非荷電分子が電場の適用に応じて動かないので、ＤＮＡ分子が、ＤＮＡ含有媒体中に存在していてもよい他の分子から、区別されることである。他のものからＤＮＡ分子を区別する別の可能な方法は、ＤＮＡを増やすことである。
【００７１】
測定前に、分子が摂動されるべき、例えばコンホメーション及び位置の変化を受けるべき程度は、変わることができる。例えば、コイルされた分子が部分的にのみ解コイルされるように摂動されるときでさえ分子緩和に関して有用なデータが得られる。
【００７２】
前記のように、本発明により分子を摂動する好適な方法の一つは、電気泳動を含む。顕微鏡との使用に適する電気泳動法が、分子を摂動するために本発明により用いることができる。電気泳動は、場合により本発明で別の働きをする。試料寸法があまり大きく又は複雑ですべてを一時に顕微鏡下で見ることができないときには、分子をサブ試料に分離し、次にこれを別々に画像形成してよい。
【００７３】
観察及び測定するための分子の電気泳動は、場合により米国特許第４，６９５，５４８号に記載されているように、パルス場電気泳動の用途又は下記のパルス化され配向された電気泳動の用途に適している試料室を用いる。これらの技術は、場角度を制御する能力のために、再配向及び／又は回転時間を測定することが望ましい場合に特に有用である。
【００７４】
本発明者により開発され、出願番号０７／２４４，８９７号の主題であるパルス化され配向された電気泳動（ＰＯＥ）は、持続時間、強度及び方向で変わることのできる一連のパルスのベクトル合計により定義される有効な場角度で場角度を発生しかつ変える短い電気パルスを使用することにより試料中の多分散ポリマー分子の分離を改良する。パルス時間及びパルス強度は、分離を行うように変調される。ＰＯＥは、また画像形成中有効な場角度の発生のために有用である。必要な計器は、顕微鏡に容易に適合する。
【００７５】
ＰＯＥのための代表的実験室計器を第１図に示し、そして略式図を第２図に示す。
【００７６】
第１図に図示される装置は、米国特許第４，４７３，４５２号に記載されたものの縮小物に類似しているが、ＰＯＥ計器が分離した電極配列の二極動作を可能にする２セットのダイオード３４を有する点で異なる。このダイオード３４を複連動継電器（図示せず）に置き換えて同様な電気分離を提供することができる。しかしながら、非常に速い（１秒より小）パルス化が必要であるときにはダイオード３４を使用することが最良である。
【００７７】
第１図及び第２図に示すように、本発明に使用される縮小電気泳動試料室５０は、標準カバースリップの寸法に割りあてる。ダイオード３４に接続している電極４２′がある（第２図）。所望の電場を発生させるために、白金電極４２′が第２図に示されるように内部接続される。特に、ｄ−ｃ電源２８は、継電器３０にｄ−ｃ電力を供給し、これは、電源２８からのｄ−ｃ電力に選択された出力を接続するようにコンピューター３２により制御される。コンピューター３２は、また電源の電圧が変えられるようにｄ−ｃ電源２８を制御する。継電器３０へ出力は、各電極に対する各ダイオード３４を通して電極４２′に接続される。
【００７８】
第１図に示すように、縮小ＰＯＥ装置は、ホルダー５２を有し、これは、顕微鏡ステージに適合する。アガロースゲルを保持するスライド５４は、ホルダーの中に配置され、そして電極４２は、アガロース電気接続性灯心４４で３０％グリセロール−アガロースの小滴を置くスライド５４／ゲル／カバースリップのサンドイッチと電気接触している。グリセロールは、ゲルの乾燥を防ぐ。ホルダー５２の一部である電気コネクタ４６は、双極性ダイオード３４及び第２図に示すパルス化計器に連結している。
【００７９】
米国特許第４，４７３，４５２号に記載された計器の場合のように、現在例示される計器は、互いに直角である電場を発生し、これは、下記のような選択されたパルス化ルーチンにより相互に同期せずに高い強度と低い強度の間で交代し、そして発生した電場のそれぞれの方向に対して横の全方向でゲルマトリックスを通して増加的に分子を移して分離を行う。
【００８０】
電極設計のこの新規な二極性により、なんらの著しい電極誘導場歪みなしに高強度と低強度を交代させることに加えて、所望により、同時に極性を変えることが可能である。
【００８１】
電極配列の配置よりむしろパルス化ルーチンによる有効な場角度の決定が、他の場合では困難であろう分子配向（及び分離）をさせる。下記の実施例４に示すように、ＰＯＥは、ＤＮＡ画像形成実験に使用されている。第１図及び第２図に示し、実施例４に用いられている電気泳動装置は、従来のパルス場電気泳動に教示されるように電極を動かすことにより場角度を変えることは、顕微鏡段階の物理的制限により実際的でないから、米国特許第４，６９５，５４８号のものより好適である。しかしながら、ＰＯＥ装置の使用は、分子が他の手段により十分に摂動できるときには本発明を実施するために必要ではない。ほぼ顕微鏡スライドの寸法である装置を用いる従来の電気泳動は、荷電分子を摂動するための別の好適な方法である。
【００８２】
本発明の好適な実施態様において、ポリマー分子を含有する小さな電気泳動試料室が、顕微鏡スライド上に置かれ、そしてポリマー分子が光学顕微鏡の下で観察される。第３ａ図に示すように、単一分子の画像形成は、画像プロセッサー６６に接続され、次にビデオモニタ６８に接続されている低い光レベル感度ビデオカメラ６４に結合したエピ蛍光顕微鏡６２（励起光は、レーザー６０のように、前記の試料から生ずる）を用いて行われる。本発明のここでのエピ蛍光顕微鏡の使用は、Yanigida et al., Appliciation of Fluorescence in the Biomedical Science (eds. Taylor, D.L. et al.) p321-345 (Alan R. Liss, Inc. New York, 1986) により最初に開発された方法の拡張である。高パワー化油浸対物レンズ５８が、好ましくは顕微鏡に用いられる。重要な要件は、光を有効に集める大きな数字の口径を有する対物レンズを使用することである。シリコン強化ターゲット（ＳＩＴ）カメラ又はマイクロ−チャンネルプレート検出器を、使用して光子をカウントする感度の点まで押し上げる。画像プロセッサーは、ビデオカメラからの画像をデジタル化し、処理し、そして記憶することを目的とするコンピューターである。この種の画像プロセッサーは、当業者に既知である。画像は、コントラストを生じるように徹底的に増強され、灰色レベルの擬似色表示を提供し（色彩は“着色する”昔の黒色映画で行われるものと異なることなく、任意に画像を増強するように指定できる）、そして視野の中で対象物をカウントすることを含む特性分析を提供する。エピ蛍光顕微鏡を用いて、４′，６−ジアミノジノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）のような適当な発色団で着色された単一ＤＮＡ分子を見ることができる。
【００８３】
この可視化技術の最小寸法測定は、顕微鏡分解能により限定され、これはこのときにはＤＮＡ分子中で約０．１ミクロン又は約３００ヌクレオチド塩基である。この長さは、小さなバクテリア遺伝子に対応するが、しかしながら若干のＤＮＡ分子は、ヒトの染色体のように数インチの長さである。試料中の幾つかの分子を同時に見ることができるので、また多くの分離した分子の寸法を同時に測定することができる。
【００８４】
本発明による分子を寸法決定するための別法は、分光分析的に分子を測定することを含む。顕微鏡と組み合わせたときに、この技術は、あまり小さいので満足すべき分解能で画像形成できない分子を寸法決定するために特に有用であり、実施例６に詳細に記載されている。また中程度又は大きい寸法の分子のためにも用いることができる。これらの技術を用いる分解能は、光子カウントにより測定されるように信号／雑音により単純に限定される。
【００８５】
本発明の好適実施態様により測定される寸法パラメータは、摂動された分子の緩和又は延伸速度、異なる方向で摂動力を受ける分子の再配向速度及び／又は回転速度、摂動された分子の曲線の長さ、並びに球形又は楕円体の分子の直径を含む。それぞれの実施態様は、測定されるパラメータと分子寸法間の数学的関係に基づいている。
【００８６】
第一の好適実施態様は、外力の適用が終了した後に摂動された分子が緩和した状態に戻るために要した時間の測定を含む。緩和動力学の測定は、実施例１−４に記載されている。この実施態様は、部分的には緩和時間と分子寸法を数学的に関連させる原理に基づいている。
【００８７】
曲線の長さを測定するような他の方法よりむしろ緩和を使用してフラグメント寸法を測定することの重要な利点は、正確な測定を得るためにＤＮＡ分子は、全部延伸される必要がないことにある。測定された緩和時間は、コイルの延伸の程度に無関係である。これは、粘弾性技術を用いてＤＮＡ緩和時間を測定することに対して明らかに示されている（Massa, D.J. Biopolymers 12; p1071-1081 (1973) ）。
【００８８】
第二の好適実施態様は、少なくとも一つの外力、例えば、異なる方向で連続する電場を受けた分子の再配向の測定を含む。これは、実施例６で下記に示され、かつ図４Ａ及び図５Ｊに示されている。再配向速度が基づいている原理は、蛍光顕微鏡／画像処理を用いて発明者により研究されている。下記実施例に記載のようにこの方法を使用して、パルス場電気泳動の間、ＤＮＡ分子のプロブ（球状小塊）トレインは、非常に複雑な方式でかつこの工程の間適用された電場で配向し、整合が完了、例えば、分子が適用された場で整列されるまで、電気泳動移動度が遅延する。場方向が変化すると、プロブトレインは、幾つかの新しい方向に同時に動く（即ち、このプロブは、若干独立して動いているように見える）。結果として、プロブトレインのある部分は、適用場で再配向することに支配され、そしてプロブの残りをゲルを通して生じた通路に沿って引っ張る。完全なプロブトレイン整列のために必要な時間は、寸法で直接的に変わる；即ち１０mb（１mb＝１，０００kb）分子は、再配向するために１時間を要し、一方１０kbは、同様な場強度において、単に１０秒を要する。この現象を図４に示す。再配向は、光学顕微鏡及び分光分析法と組み合わせた顕微鏡を含めて、種々の方法で測定される。
【００８９】
本発明の第三の実施態様は、異なる方向で連続する電場を受けた分子の回転時間の測定を含む。ある意味で、分子の回転は、一連の増分再配向段階を必要とし、そのそれぞれは、分子が特定の角度増分、例えば、３６０°の回転を受けるまで、分子が同一方向で更に回転することを引き起こす。この実施態様は、外力の適用で著しくコンホメーションを変えない、小さいＤＮＡ分子のような硬い、棒状分子の特性を明らかにするために特によく適している。しかしながら、分子のコンホメーションがかなり一定に保たれ、好ましくは棒状又は細長いコンホメーションである場合には、大きな分子もこの方法により寸法決定できる。これは、パルス化ルーチンを適用することにより行われ、これは分子の寸法、形状及び多分組成にも、適している。
【００９０】
非限定例として、分子は、お互いに、９０°で適用される正弦波で変化する電場の存在で回転する。硬い、棒状分子又は延伸された分子は、長軸又は短軸の周りで回転する。長軸の周りの回転は、最大の分子量依存性を有し、回転拡散は、約Ｍ3 として変わる。ボートプロペラが水中で回転するように、分子を単純に回転しようと試みるならば、ゲル又は何か他の限定物の中に浸漬された棒状分子の回転運動は困難となる。ゲルが使用されるときには、マトリックスは、海草がボートプロペラの回転に影響するように分子の回転に影響する。かくして、パルス化ルーチンが適用され、これは、また、分子の前後運動を与え、これによって回転を容易にする。
【００９１】
このパルス化ルーチンは、アルゴリズムにより定義できる。一般的に述べると、このアルゴリズムは、角度増分、時間、電場強度などの変数に依存し、そして次にこれらは異なる変数の関数である。かくして、使用できるアルゴリズムのタイプは無数である。
【００９２】
本発明に対する好適なパルス化ルーチンは次の通り定義される：
【００９３】
【数１】
0003650617.tif 000002
【００９４】
θi は、ラジアン又は度で、場角度であり、
ｉ＝ｌ−ｎ、ここで完全な回転にはｎ／Σ＊θi ／i ＝１＝２π又は３６０°であり、
Δｔは、秒でパルス長さであり；
ｔは、秒で時間であり；
ｋ1 及びｋ2 は、連続した同一パルスの数であり、そして
Ｐは、パルス化ルーチンであり、これはくり返される）
【００９５】
前記のルーチンを使用して、各セットのパルスＰが開始されるときに適当なパルスが加えられる分子は、（θi+1 −θi)ラジアン又は度で回転する。また、この分子は、
【００９６】
【数２】
0003650617.tif 000003
【００９７】
の方向で移され（側方へ動く）、これによって回転を容易にする。
【００９８】
前記の等式で、Δｔは一定であるが、しかしながら、これはこの場合に必要ではない。
【００９９】
【数３】
0003650617.tif 000004
【０１００】
は、何れかの変数又は一連の変数の関数である。例えば、Ｅは、全経過時間及び／又は角度増分の関数である。また、すべての角度増分の合計が、３６０°である必要はなく、一部又は全部の回転の何れかの数でよく、これが十分な正確さの測定を提供する。
【０１０１】
分子の回転速度を測定するための特定のセットの条件を実施例７に記載している。
【０１０２】
本発明の第四の好適実施態様により、ポリマー分子のような分子の寸法を測定する有用な方法は、光学顕微鏡を用いて分子を可視化し、その曲線の長さを測定する（ロープの長さを測定することに等価）ことにある。蛍光学顕微鏡が、適当な発色団で着色された単一ポリマー分子を画像形成できることが下記の実施例４並びに図４及び図５に示されている。信じ難いことには、このポリマー直径寸法がわずかちょうど２０オングストロームであるとして、単一分子が容易に可視化される。分子が延伸し、コンピューター化画像形成装置を使用して可視化分子の長さを測定するならば、測定の寸法依存性は、約Ｍ1 として変わる。長さの測定は、実施例１０で詳細に記載するように、制限消化物のようなＤＮＡ断片を寸法決定し、そして整列するのに特に有用である。
【０１０３】
第五の好適実施態様は、緩和した分子の直径を測定することを含む。曲線の長さの測定と同様に、分子を着色し、媒体中に分子を置くことなどの工程により分子直径の測定を行った。しかしながら、測定の前に分子を摂動することは必要でない。代りに、球形又は細長い楕円体を有する分子が緩和した状態にあるときにこの分子が測定される。球の体積は、Ｒ3 （ここで、Ｒは半径である）に比例し、そして楕円体の体積はａｂ2 （ここで、ａは長軸の半径であり、そしてｂは短軸の半径である）に比例しているので、この技術に対して分解能は、約Ｍ33として変わる。この技術により測定される分子は、変形可能である必要はない。この技術は、すべての寸法のＤＮＡ分子を寸法決定するために有用であり、そして今、顕微鏡スライド上にうまく載せうる大きなＤＮＡ分子を寸法決定するために、並びに密に詰められた分子を寸法決定するために有用である。
【０１０４】
大きなＤＮＡ分子のような大きな分子は、破壊を引き起こすことなく顕微鏡スライド上に載せることが難しく、そして本発明者は、新規な技術を用いてこの問題を提示し、これは本発明の別の面である。代表的なヒトの染色体は、長さで数インチに延伸する単一ＤＮＡ分子を含む。自然は、直径でわずか数ミクロンと測定される細胞の中に大体６フィートのＤＮＡを適合させる賢明なパッケージング機構を提供している。しかしながら、これらの大きなＤＮＡは、破壊に対して非常に鋭敏である。例えば、分子を破壊することなく、大きなＤＮＡ分子の溶液を注入し、ピペットを用い、又はかきまぜることはできない。したがって、大きなＤＮＡ分子を用いる操作は、非常に困難である。数年前、発明者が、破壊なしに大きなＤＮＡ分子を調製するゲルに基づく方法を開発し、これはまたそのままの分子を使用する生化学を可能にする、（参照、米国特許第４，６９５，５４８号）。この方法は、挿入法と称されそして下記のように操作する：細胞を洗浄し、そして３７℃に保った低ゲル化温度アガロースと混合する。この細胞−アガロース混合物をモールドにピペットで入れ、（スラブゲルのウェルに適合する小ブロックを製造する）そしてゲル化するままにする。生成したブロック又はこれらが名付けられる“挿入体”を次にＥＤＴＡ、プロテアーゼ及び洗剤を含有するリシス(lysis) 溶液に入れる。このリシス溶液は挿入体の中に拡散し、細胞を溶解し、そしてもとのままの裸のＤＮＡ分子を結合したタンパク質からとり除く。非常に大きなコイルは、一般に拡散できないので、このＤＮＡ分子は、マトリックスから拡散しない。
【０１０５】
本発明は、液体アガロース中に懸濁されたとき、少なくともメガ塩基（１メガ塩基＝１百万塩基＝６６０×１０6 ダルトン）までのＤＮＡ分子が、顕微鏡スライド上に載せられたときに、剪断に対して保護されることの発明に基づいている。しかしながら、２又は３メガ塩基より大きい分子、又は分子の１００％の一体性が確保されねばならない状態に対して、この工程は有効ではない。
【０１０６】
本発明の第六の実施態様は、顕微鏡スライド上に１メガ塩基より大きい分子を置くことを含む前記の問題を改良している。凝縮剤を用いてゲル結合ＤＮＡ（挿入体から得られるような）を小さな耐剪断性球に折りたたみ、これをイオン性化合物、例えば、塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムのような塩の添加で、一度搭載されると折り曲げられることのない、プロトコールを開発した。好ましくは、この凝縮剤は、スペルミンである。更に実施例１０に記載するこのスペルミンプロトコールは、何ら検出しうるような剪断仲介破壊なしに、最大の既知のＤＮＡ分子及び更に大きな分子さえも容易に搭載することができる。スペルミンの使用が好ましいが、分子を折りたたむために好適な物質は特定の分子に折りたたみを引き起こす何れかの物質、例えば、分子に選択的にそれ自体を溶媒和物にさせる凝縮剤を含む。この物質の例は、スペルミジン、アルコール及びヘキサミンコバルトを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明の第七の好適実施態様は、制限酵素を使用してＤＮＡ分子地図を作成するため本発明の前記の実施態様の特別な適用に関する。制限地図を構成するための従来既知の方法は、制限酵素と共にＤＮＡをインキュベートし、そして通常のゲル電気泳動又はパルス電気泳動を用いて得られた断片を寸法で分離することを含む。寸法分離は、断片の数と寸法に関する情報を提供するが、断片の相対位置又は未切断ＤＮＡ分子上の切断部位に関する情報は提供されない。制限酵素により消化される分子を、画像形成する顕微鏡を用いることにより、（１）寸法分解度は、緩和動力学を測定することにより正確に決定され、（２）相互の断片の位置が決定でき、そして（３）単に一つの分子が消化されることを要する（しかしながら、多くの分子が平行して画像処理されることができる）。唯一の限界は、試料ホルダー上の空間である。
【０１０８】
要約すると、顕微鏡を用いる制限地図作成は、顕微鏡スライド上に大きなゲル埋込みＤＮＡ分子を載せ、これらをある長さに延伸し（分子が完全に延伸されることは必要でない）、次いで分解を誘発することを含む。可視化又は分光分析法を用いて、断片位置を知り、そして１〜４の実施態様で概説した方法を用いてその寸法を測定する。本発明のこの特徴による好適実施態様は、実施例１１に詳細に記載されている。
【０１０９】
地図作成の第一工程は、分子あたりの切断のヒストグラムを調べて分子中の切断部位の数及び相当する切断パターンを決めることである。異なる制限酵素による酵素的切断の速度は、変えることができるので、タイミングの注意深い調整が重要である。切断は、早過ぎる反応は断片を整列させないので、好ましくは分子固定が完了した後にのみ起こる。非限定的例として、このタイミングの問題は、本発明により、アガロース−ＤＮＡ溶液を制限酵素と３７℃で予備混合し、次いでＭｇ++を観察野に拡散してゲルを乱すことなく反応を起こさせることにより解決することができる。すべての可能な切断部位は、同時に現れなかった；それに反して、切断は、通常相互に５分以内に現れた。典型的な搭載試料は、単一観察野内に約３〜４分子を含んでよく、そして全体でそれらの略５０〜９５％が、一つ又はそれ以上の切断の証拠を示した。
【０１１０】
次の工程は、得られた制限断片の寸法を決めるために用いることができる。この目的のために、本発明による二つの相補的方法が開発されており、一つは関連する断片の蛍光強度に基づき、第二のものは明確な相対的長さの測定に基づいている。
【０１１１】
顕微鏡に基づく強度測定は、カメラ制御及び照射強度を含む、多くの変わりうる要因に依存しているので、実施するのが難しい。二つの断片（同じ親分子から）の相対強度を計算することにより、断片の一つは、他のものための内部強度の参照として働く。相対強度は、知られているか又は独立に決定された染色体寸法により倍数化してキロ塩基に変換される。図１０Ａは、光学的に測定され、電気泳動に基づく測定から誘導された報告されている値に対してプロットしたイースト染色体 Not I制限断片の一連のもののために測定した寸法を示している。対角線に近い点は、よく一致している。二つの６０Kb未満の短い断片及び低分解の８−ｂｉｔ染色体５及び８データを除外すると、プールされたＳＤは、３６kbであった（図１０Ａ、挿入図）。平均変動係数は、１６％であり、これはルーチンの電気泳動での寸法決定と同程度である。報告された結果との相関は、優れている：平均相対誤差は、５％であり、一方報告されている誤差は平均４％である。部分的に、強度の正規化の手順のために、正確さは、非常に小さな断片のために低くなり、寸法の一致は、３０−及び５５−kbＤＮＡの測定のために、乏しい。蛍光強度測定は、上述の値のそれのほとんど２倍のそれらの断片の寸法を報告している。
【０１１２】
相対蛍光強度測定の有効性の一つの試験は、分子緩和状態の使用可能範囲にわたり断片強度の不変性をモニターすることである。この必要性は、制限断片が寸法で大きく異なるとき、最も精密に試験される。強度は、測定された分子の長さでの３〜４倍の変化にもかかわらず広い寸法範囲にわたり相対的に一定に保持されることが見い出されている。この有利な効果は、部分的に温和な固定条件に寄与することができるので、ブラウン運動は、Ｚ軸に沿って、延伸したコイルを振動させることができ；この動きは、生ビデオモニターで明確に観察される。１〜５間隔にわたり枠を平均すると、観察しうるほとんどのＤＮＡは、焦点面を通りかつゲル孔内に移動している。
【０１１３】
相対見かけ長さの測定のために、ゲル−埋入制限断片のそれぞれは、平均で同等のコイル密度を有すると仮定されている。次いで、制限断片の見かけの長さは、４分子のような少ない分子から正確な寸法を得るように平均される。相対見かけ長さは、染色体寸法により倍数化してキロ塩基に変換することができる。見かけの長さの相対的決定は、蛍光強度測定でのように、制限断片の同じ組に対して、標準化することができ、そしてそれらの結果（図１０Ｂ）は、同様の１６％の平均相対誤差（３０−及び９０−kb断片を除いて）を示す。このプールされたＳＤは、４７kb（図１０Ｂ、挿入図）であり：変動係数は、これらの非限定的例で、２９％であった。
【０１１４】
長さの測定は、例えば焦点外の画画像が、強度に基づく測定を歪めるとき、焦点外である断片を評価するために用いることができる。加えて、小さな断片の寸法決定は、強度でよりも長さでの方がよい。
【０１１５】
単一分子寸法方法論：
光学的地図化は、単一分子を寸法化するための方法に依存し、高分解制限地図の作成及び正確さは、本発明のそのような方法により提供される。非限定的例として、五つの単一分子寸法決定方法が、見かけ相対長さ、蛍光強度比、ゲル中の緩和、基底線、及びＯＭＣ（光学的輪郭地図）を含み、提供される。これらは、二つの群に分類することができ：分子摂動又は外力を必要とする技術及び何も必要としない技術である。
【０１１６】
単一分子の蛍光強度測定及び見かけ長さ測定のような非−摂動寸法決定技術は、それらが、試料室を搭載した精巧な顕微鏡及び付随する制御化電子装置を必要としないので、用いるのに好都合である。加えて、非−摂動寸法決定技術は、平行測定のために非常に適合している。非−摂動の組のためのそれらのいくつかの利点にもかかわらず、本発明の摂動に基づく寸法決定技術は、高い正確度及び分解度を与えるものとして、ポリマーの特性を明らかにし、染色体の地図化のために非常に有用である。
【０１１７】
図１２は、報告された制限地図と比較した本発明の光学地図化により作成された整列した制限地図の三つのタイプを示している。図１３−Ｆは、選択された相当する処理された、Not I で消化された異なるイースト染色体ＤＮＡの蛍光顕微鏡写真を示している。これらの画像は、固定された分子での成長している間隙の外観により連続的消化を明確に示している。そのようなデータから、断片の整列は、あらゆる時間間隔、例えば０．０７〜２００ｓ、又はあらゆる範囲又はそれの点の値、例えば１〜３０ｓで得られた時間−経過の画像の挿入により決定することができる。観察された分子は動く傾向にあり、ときどき他の分子で乱されるので、「切断配列」又は「切断移動」の検査は、分子−分子相互作用の解放を単純化する。光学的（長さ又は強度）及び電気泳動に基づく地図の間に、一致があるべきと期待されており、それが、優れていることが見出されている。制限地図の第三のタイプ（例えば、図１２）は、長さ−及び強度−誘導データを組み合わせている；小さな制限断片（１００〜２０、又はここでのあらゆる範囲若しくは値、例えば＜６０kb）は、長さにより寸法決定することができるが、一方強度測定は、地図を完成するために必要とされる残余の断片寸法を提供することができる。
【０１１８】
図１３Ａは、その輪郭の長さのほぼ３分の１に延伸され、かつ固定された比較的小さなイースト染色体（４２０kb）の画像の非限定的例を示している。約（例えば、２００〜５００又はここでのいかなる範囲若しくは値）未満の染色体ＤＮＡ分子は、溶融アガロース中で速やかに緩和するので、ゲル化を促進するために低温での広がった形態でトラップされている。分子緩和過程は、間隙を生成させることができ、切断断片末端で球を形成することができるが、一方親分子末端は実質的に固定されて残ることに注意すべきである。この寸法範囲の分子は、親分子末端で、不均衡に大きな球を形成することができる。切断部位での断片緩和の動きは、ポリマーレプテーション理論（図１３Ａ−Ｆ、１４及び１５）により予測されるように、非切断分子により占められた初めのゲル孔をなぞることを観察することができる。これらの分子の特性は、分子寸法及び切断部位の数にかかわらず、保存することができる。約５０〜１００kb、例えば９０kb未満の断片は、図１３Ｂ、Ｃ及びＦ並びに１５で示されるように、しばしば完全に球を形成して緩和する。断片数、寸法及び整列で変わる制限消化の結果は、同様に寸法決定されるが、異なる分子の混合物の特性を容易に明らかにするのに用いることができる。図１３−Ｃ並びに図１３−Ｅ及びＦは、二つのそのような染色体混合物から得られた結果を示している。初めの例で、染色体５（図１３Ｃ）の小さな末端制限断片は、それを染色体８から区別するように働く。第二の例（図１３Ｅ及びＦ）は、単純切断は、同様に寸法決定した分子を区別することができ、十分な分解を与えることができる。これらの剪断感受性のメガ塩基寸法決定ＤＮＡ分子は、小さな破解で搭載することができ、低い倍率（例えば、８０〜５００×に比較して、４０〜８０×、例えば６３×）の顕微鏡対物レンズの手段で地図化することができる。
【０１１９】
図１４及び図１５は、パルス場ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）と、一連の遺伝子的に地図化された配列とのハイブリッド形成から作成された地図との比較による光学的地図化によって、染色体９のCsp I 消化から作成された、整列された制限地図（及び相当する蛍光顕微鏡写真）を示している。染色体３及び１１は、当技術に知られている。画像データの偏見による選択や処理を避けるために、光学的地図は、作成された後、電気泳動から得られたデータによってチェックすることができる。光学的地図とパルス電気泳動地図との完全な一致が期待され、通常、優れて一致していることが見出される。
【０１２０】
大規模な地図が誤差なしに作られることは、まれである。光学的地図化によって作成される地図は、断片数の正しくない決定や、本発明者らの断片の寸法決定方法の、正確さの限界に由来する誤差を含むことがある。対称に近い地図を有するＤＮＡは、一方の端を特定しないと、分解度を増すために最善に平均化できないので、地図の極性を、補助的な方法によって確定しなければならない。寸法決定の精度の期待水準が与えられるならば、断片は、１０以上、２０、３１、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５１、又はそれらのあらゆる範囲若しくはその点の値で検出することができる。
【０１２１】
本発明の光学的地図化は、頻繁に切断する酵素によって発生した制限断片（３００〜１００，０００bp又は５００〜１０，０００bp又はその中のあらゆる範囲若しくはその点の値）の検出と定量を可能にする技術的進歩により、ほ乳類のゲノムに拡張することができる。よく特性を明らかにされた断片の整列された整列群は、次いで、ランダムに切断された、例えば、２００〜２，０００kbの大きさ又はその中のいかなる範囲若しくはその点の値のゲノムのＤＮＡから作成された、高分解度の整列された制限地図から構成することができる。ＹＡＣｓ又はコスミドも、また、同様に解析してゲノム地図と比較し、整列を容易にすることができる。試料室の設計、試料の取扱、画像解析及び情報における工学的変更が、それは全ゲノムの迅速な地図化と、より重要なことに、各生物のプロトタイプに対するよりも個人の母集団に対する配列情報の知識を、拡大することを可能にする大きな処理量の方法を提供する。
【０１２２】
本発明の第八の好ましい実施態様は、ハイブリッド化プローブを用いて、核酸の配列を地図化することに関する。この技術により、核酸、プローブ（特性を明らかにされた核酸）及び特定の条件下で、組み換えうる酵素が、マトリックス中で組み合わされる。このプローブは、どのような実際的な長さのものでよく、適切なラベル化剤でラベル化されていてよい。制限酵素が使用されるならば（例えば、プローブが制限酵素を使用なしでは、ターゲット分子に侵入できない場合）、それは適切な酵素、例えばＤＮＡプローブの従来のラベル化のために当技術で既知のものでよい。限定的でない特定の例として、有用な制限酵素は、ＲｅｃＡである。
【０１２３】
ハイブリッド形成は、適切な手段、例えば、顕微鏡スライドの中にＡＴＰ及びマグネシウムイオンを拡散させることによって、開始できる。
【０１２４】
プローブは、ターゲット分子にハイブリッド形成され、少なくとも二つの異なる方法で可視化できる。第一に、プローブが十分に大きい場合には、直接に可視化できる。例えば、１kbより大きいプローブは、現在利用できる顕微鏡装置を使用して多分可視化できる。第二に、発色団又は他の適切なラベル化剤がプローブに結合されて、可視的にか、又は分光分析的に検出できる。例えば、テキサスレッド又はローダミン、並びに他の発色団を使用できる。
【０１２５】
プローブが、ターゲット分子にハイブリッド形成した後に、プローブの位置を地図化するために、少なくとも二つの好ましい方法がある。しかしながら、他の方法も、また、本発明の範囲内である。第一の好ましい選択肢として、ターゲット分子の曲線の長さが測定できる。光学顕微鏡を使用するときは、全体に延伸されない線状の領域を位置づけし、定量するために、蛍光強度の測定を使用できる。プローブの位置は、その特徴的な性質、例えば、発色団、放射性標識及び／又は寸法に基づいて位置決定される。第二の好ましい選択肢として、ターゲット分子を限定酵素で切断し、すべての断片を、本発明の方法で寸法決定し、測定する。ハイブリッド形成された断片の位置を、上記の方法の一つ、例えば、分子の直接的可視化法、又は分光分析技術と組み合わせた顕微鏡測定によって決定する。すべての断片を寸法決定し、次いで、ラベル化された断片からターゲット分子のいずれかの端までの距離を、容易に計算できる。特定の制限消化物上のプローブの正確な位置は、さらなる消化のために新しい酵素を添加して地図化でき、次いでこれらの断片を可視的に地図化できる。
【０１２６】
本発明の光学的地図化への好ましい方法は、直接の、制限部位の整列化された地図化を可能にする制限酵素消化の間に、着色された、単一の脱タンパクＤＮＡ分子を画像化することである。要約すると、溶融アガロースに溶解したＤＮＡ分子を延伸し、ゲル化の間、そこに固定するために、流れ場（又は他の場）が用いられる。ゲル化工程は、延伸された分子を、酵素的切断の間に、かなりの緩和から、ランダムコイルのコンホメーションに制限する。制限酵素は、溶融アガロース−ＤＮＡ混合物に添加され、切断は、ゲル化した混合物（顕微鏡のスライドに載せられた）の中に拡散したマグネシウムイオンによって誘発される。切断部位は、画像化された分子の中に生じる間隙として可視化することができる。結果として生じた断片は、二つの方法、即ち、生成物の相対的な蛍光強度の測定により、また固定ゲルの中の相対的な見かけのＤＮＡ分子の長さを測定することによって、寸法決定される。地図は、続いて、ただ１個の分子を利用するよりも、精度を上げ、望ましくない分子又は断片を排除することを可能にする少量の分子を平均して、寸法決定された断片の整列を記録することによって構成される。リアルタイムの制限断片の整列と、速くて正確な寸法決定技術との組み合わせのゆえに、光学的地図の作成は、非常に迅速である。この光学的地図化は、低若しくは高真核染色体又はＹＡＣｓの、分析的な電気泳動、クローン化ライブラリー、プローブ又はＰＣＲプライマーの必要なしに、整列された制限地図を迅速に作成するための、強力な、新しい技術を提供する。増大した技術的改良は、ほ乳類の染色体の、迅速な高分解度地図化と、ＹＡＣｓの整列化を可能にするに違いない。
【０１２７】
光学的地図化において、着色された、単一の脱タンパクＤＮＡ分子は、直接の、制限部位の整列された地図化を可能にする制限酵素消化の間に画像化される。要約すると、光学的地図化に包含される工程は、流れ場（又は主として、電気的若しくは他の場）が、溶融アガロースに溶解したＤＮＡ分子を延伸し、ゲル化の間、そこに固定するために用いられる。ゲル化工程は、延伸された分子を、酵素による切断の間に、かなりの緩和から、ランダムコイルのコンホメーションに制限する。アガロース−ＤＮＡ混合物にすでに存在する制限酵素の活性は、ゲル化した混合物（顕微鏡のスライドに載せられた）の中に拡散したマグネシウムイオンによって誘発される。切断部位は、画像化された分子の中に生じる間隙として可視化することができる。得られた断片は、二つの方法、即ち、生成物の相対的な蛍光強度の測定により、及び固定ゲルの中の相対的な見かけのＤＮＡ分子の長さを測定することにより、寸法決定される。地図は、次いで、単に寸法決定された断片の順序を記録することによって構成される（３．２．vii 項参照）。ただ１個の分子を利用するよりも、少量の分子を平均化する方が、精度を上げ、望ましくない分子又は断片を排除することを可能にする。リアルタイムの制限断片の整列化と、速くて正確な寸法決定技術との組み合わせのゆえに、光学的地図の作成は、迅速である。この方法は、分析的な電気泳動、クローン化ライブラリー、プローブ又はＰＣＲプライマーの必要なしに、低真核染色体又はＹＡＣｓの、整列された制限地図を迅速に作成するための、強力な、新しい技術を開く。
【０１２８】
ゲノム分析のための光学的地図化の最適化は、代替の分子固定技術；分析的電気泳動によらない新しい寸法決定法；地図化の必要性によって仕立てられた新しい画像処理法；及び４）制限地図作成のための新しい方法であり、これらの代替技術は、今や本発明によって提供される。これらの成果を、次の小区分に記載する。
【０１２９】
（ｉ）ゲル固定並びに張力及び切断のもとでのＤＮＡの緩和機構：
２００nmの長さ（６００kb）の大きな単一のＤＮＡ分子は、溶液中でランダムコイルであり、それは平均直径８nmの緩く詰められた球として可視化することができる（６１）。光学的地図化は、このようなＤＮＡ分子の延伸と、光学顕微鏡による画像化の前に急速に緩和することを妨げるために、その場所での固定で始まる。画像化を成功させるためには、固定された分子は、焦点の浅い平面に置かれなければならない。ゲルのなかの延伸された分子は、機械的に、引き伸ばされたバネのように挙動する。固定された分子は、張力のもとにあり、それはコイルの緩和の間に開放されて、ランダムコンホメーションになる。アガロースゲルに埋め込まれたＤＮＡ分子は、電気泳動の間、たがいに張力のもとにある一連のコイルセグメントのつながれたプール（connected pool）としてモデル化され、プールの間のコイルセグメントを往復させる自由エネルギーの変化に関連づけられ、式：
【０１３０】
ｆi = 3KT/(2nib)((a2/nib2)-1)+(KT/b)lnC
（式中、Ｋは、ボルツマン定数であり、ａは、ゲルの細孔径であり、ｎi は、会合したコイルセグメントの数であり、ｂは、コイルセグメントの長さであり、Ｔは、温度であり、そしてＣは、コイルセグメントの構造に関する定数である）によって与えられる力（ｆi)が計算される。この結果は、プールの間に現われる張力が、細孔容積に含まれるセグメントの数とは逆の関係にあることを示している。このことは、いっぱいに伸びきり、延伸された分子が、コンパクトな、緩和されたものより大きい張力のもとにあることから起こる。
【０１３１】
大きなＤＮＡ分子は、好都合なことに、溶融アガロース中で流れの力によって伸びきり、次いでその場所で、アガロースのゲル化により、電場をかけることなく、急速に固定される。実験的に、ゲル化速度は、温度と、アニーリング条件の最適化とで調節される。発明者らの解析では、ＤＮＡコイルは、臨界的に引き伸ばされねばならない。多すぎると、分子は画像化が困難になり；少なすぎると、切断部位を現わすのに十分な張力がない。過度に伸ばされた分子は、画像化画素あたり少なすぎる蛍光色素しか与えないので、測定された分子の強度は、バックグランドの値に近づく。それに加えて、固定の工程は、切断部位を現わすいくらかのコイルの滑りを可能にするように、十分に穏和でなければならない。これら及び他を考慮して、分子の大きさを、その曲線の外郭の長さの約２０％の幅で得るように、固定条件を実際的に最適にすることができる。
【０１３２】
光学的地図化を含む単一分子の制限消化は、制限酵素の切断部位を、断片がよりランダムなコンホメーションに緩和するときに、固定された分子に現われた間隙として検出する。異なる制限酵素による酵素切断の速度がいろいろなので（６４）、タイミングの注意深い調節が重要である。早すぎる反応が断片を同期させる企てを混乱させるので、切断は、分子の固定が完了した後にのみ起こらなければならない。このタイミングの問題は、アガロース−ＤＮＡ溶液と制限酵素の３７℃における予備混合と、視野の中へのマグネシウムイオンの拡散による反応の誘発によって、ゲルを乱すことなしに解消できる。間隙のほかに、切断は、また、切断部位における断片の端の、光るＤＮＡの凝縮されたプール又は「球」の出現により信号を送る。これらの球は、切断の直後に形成され、端部において顕著なコイル緩和からの結果として得られる。このセグメントのプール形成は、実際の切断から間隙として現われることがある、焦点外のセグメントを区別するのを助けることから、地図の作成に有用である。切断は、生成した間隙の出現と、切断部位におけるセグメントの光るプールの拡大の両方によって、確実に記録される。
【０１３３】
地図の構成−断片数の決定：
ここに記載するように、大規模な制限地図が、最初に電気泳動より導き出されたデータから構成されてきた。それとは逆に、本発明は、第一段階として、分子内の切断の数の決定を含む。分子内の切断部位は、Ｍｇ2+の添加の後、不規則な時間に現われる傾向がある。すべての可能な切断部位は、同時に出現するとは限らず；事実、切断は、通常、ここに記載される条件のもとで、他の切断の５分以内に出現する。消化の程度は、断片の数と寸法の両方を含む多くの要因に依存する。切断部位の正確な数は、部分的消化の結果のヒストグラム解析によって決定することができる（分子は、分類され、整理され、切断の数が数えられる）。典型的には、この解析には１０〜２０分子で十分であり、その分子が寸法を測定して強さと長さで正しく平均できる、最大の切断部位数を含有する区分では、正確な数を与えることができる。
【０１３４】
相対強度による断片の寸法決定：
第二段階は、得られた制限断片の寸法を決めることができる。この目的のために、一つは相対的な断片の蛍光強度に基づき、第二は見かけの相対的な長さの測定による、二つの相補的な方法が使用できる。しかしながら、どちらの方法も絶対値を与えることはできないが、それぞれは容易に標準化できる。前述のゲル固定技術も、また、分子全体を焦点にもってくることができるので、強度測定のための天然の基質を生み出す。ゲル固定は、分子のさしわたしを２５０μm の大きさにすることができる。焦点外の分子のセグメントは、それらの強度が、どのような単純な方法でも量に比例しないので、強度の測定には使用できない。ここに関連した観察は、顕微鏡下での分子の画像化に使用される焦点の深度が約０．２μm であるのに対し、流体中の完全に緩和した７００kbのＤＮＡ分子の流体力学的直径が８μm であることから予想されるように、延伸した分子がかなり緩和したとき、その量の大部分が焦点外に動きだすことである。
【０１３５】
顕微鏡の中でのＤＮＡ断片の絶対的な蛍光強度は、カメラの感度の制御及びランプの輝度のような、多くの変数の１種又は２種以上によって測定され、それゆえ、測定するのに望ましい量ではない。２個の断片（同じ親分子よりの）の相対強度の計算によって、該断片は、他に対する内部強度基準値として扱うことができる。相対強度は、既知の、又は独立に決定された染色体の寸法により倍数化してkbに換算される。
【０１３６】
単一のＤＮＡ分子の寸法決定、取扱及びその特性をあきらかにするための他の方法論：
光学的地図化を用いる既知の配列の地図化：
本発明によって、ＲｅｃＡタンパク質を、大きなターゲットＤＮＡ分子の中の、Ｄ−ループ発色団でラベルされた同族体の系列に使用し、次いで、この複合体を正確に位置づけるための光学的地図化を行うことにより、特定の配列を単一のＤＮＡの上に位置づけることができる。しかし、アキレスのかかと（６６）技術、及び特にＲＡＲＥ（６７、６８）の開発により、EcoR Iメチラーゼ作用をブロックするためのＲｅｃＡ−プローブ−ターゲット複合体を使用するＲＡＴＥ技術も、また、本発明の方法に用いることができる。複合体の除去は、ターゲット分子を、メチル化されない部位でのみEcoR I切断で傷つきやすくする。明らかに、ＲＡＲＥ技術は、ＤＮＡを、与えられた既知の配列のどの位置でも切断することができる。ターゲットが、クロマチンの代わりに伸び切った裸のＤＮＡなので、高分解度型のＦＩＳＨが開発された。
【０１３７】
光学的地図化をＲＡＲＥと組み合わせて、低真核性染色体又はＹＡＣｓの高分解地図を作成することができる。図８に、イーストの染色体のＤＮＡ分子を切断した結果を示している。イーストLEU 2 及びLEU 16の遺伝子からの、５０bpを含有するオリゴヌクレオチドを合成し、顕微鏡上のＲＡＲＥ分析に使用した。図８Ａに示されているものは、EGR 16オリゴヌクレオチドを用いた、Candida albicansの染色体５の、ＲＡＲＥを媒介した切断である（６９）。ＲＡＲＥに媒介されたS. cerevisiae の染色体III の切断の強度比から得られ、１１０kb及び２３５kbの断片が得られている光学的地図化のデータ（５個の分子の蛍光強度比が、整理され、平均された）と比較して、電気泳動的に得られたデータは、１００kb及び２４５kbの断片であった。電気泳動的に導き出されたCandida albicansの公刊された地図は、光学的地図化の２５０kb及び９５０kbのデータと比較して、１８０kb及び１，０２０kbの断片を生成した。この光学的地図化には、６個の分子が平均された。
【０１３８】
光学的地図化と組合されたＲＡＲＥは、本発明によって、ヒトゲノムの迅速な制限地図化に対する非常に強力な組み合わせを提供する。ＲＡＲＥは、パルス電気泳動を用いて精製した、最初に切り取られた特定のほ乳類ゲノム領域に使用できる。また、例えば、光学的地図化は、限定されたゲノム領域についての制限地図を作成するのに使用できる。
【０１３９】
単一分子を用いる寸法決定：
コイルの緩和動力学による分子の寸法決定：
蛍光顕微鏡は、ゲル電気泳動（５３、５９、７０）における単一のＤＮＡ分子のコンホメーション動力学の研究に用いられてきた。ゲル電気泳動におけるＤＮＡコンホメーションの実験的及び理論的な研究の両方が、ＤＮＡ分子は、循環的に起こる様式で、いっぱいに伸び切って長いフック形状を形成し、密なコンホメーションに緩和し直すことを示している（１９、５３、６３、７１）。フック形状コンホメーションは、ＤＮＡ分子をいっぱいに伸ばし、摂動させる電場が切られるとき、単一分子の緩和動力学はそれらを簡単に画像化し、長さ変化を測定し、定量化することができる。この測定法は、ばねをいっぱいに伸ばし、それを放し、ばねが巻かれた緩和した状態に縮み戻るのを観察することにより再コイル動力学をモニターすることに似ている。伝統的には、粘弾性技法（６１）が、緩和時間（τ）の測定に使用され、それにより分子量を決定することができる。しかしながら、このような分子量決定には厳しい限定が課せられ、溶液中最大の分子のみを、寸法決定することができる；寸法についてのスペクトルは測定できない。
【０１４０】
分子画像化技術（例えば、蛍光顕微鏡法）の使用により、並行して測定を行うことができ、また、各分子のコンホメーション動力学を別々に測定するので、寸法分布を決定することができる。緩和動力学を研究するための別の余儀ない理由がある：随伴する緩和時間（τ）は、寸法に強く依存し、τが（分子量)1.5-3に比例するため、寸法区別は優れている。この方法は、配列決定を除いて他のどの技法にも卓越している。決定された寸法依存性は、選択された緩和モードによって変化する。
【０１４１】
通常、溶液中で出会う、ジム−ローズ相関（７２、７３）に対応する迅速なコイル緩和時間を、初めに測定することができる。ゲルマトリックスにおいて、長さＬ（これは、実際には初期の管の長さである）をもつ、いっぱいに伸ばされたＤＮＡ分子は、式：
【０１４２】
＜Ｌ（ｔ）＞＝Ａｅｘｐ（−ｔ／τ）＋＜Ｌｅ＞  （７４、７５）
（式中、τは、緩和時間であり、ｔは、時間であり、括弧は、集合平均を表す）のように緩和するであろう。Ｌ（ｔ）は、分子の輪郭の長さではないが、ここでは顕微鏡によって画像化された、見かけの分子の長さと解釈することができる。Ｌｅは、平衡の分子管長さであり、指数的減衰の平坦領域として測定される。Ｌは、ここに述べたように、寸法決定の方法の「ベースライン」の基礎を形成する。
【０１４３】
迅速なコイル緩和時間の測定は、簡単に実施される。臭化エチジウムにより着色された大きなＤＮＡ分子を、１％アガロースに包埋し、そして、ＳＩＴカメラ（低光度感光装置）を備え、コンピューター内蔵の画像化ボートセットにインターフェイスされているエピ蛍光顕微鏡に載せる。顕微鏡試料室の電極を、分子がフック形状を形成するようにパルスし、また、緩和の間、長さを、ＮＩＨ画像（Wayne Rasband)マクロプログラム用言語で書かれた特別のプログラムによって自動的に測定する。適用された場が切られるとき、ＤＮＡ分子の緩和が開始する。一つの対数的緩和時間が、一連のイースト染色体ＤＮＡについて計算され、図９（４７）に示されるように、イン−イン対寸法（Mark-Houwink plot)プロットとして描かれる。この線の傾きは、緩和時間（τ）＝定数（寸法)1.45(kb）であるτに対する分子量の依存性を与える。
【０１４４】
ベースライン測定法によるＤＮＡ分子の寸法決定：
代表的なＤＮＡ緩和プロットは、見かけ・長さ対時間として、４回の緩和の平均であるプロット点を与える。このようなプロットは、測定された長さは、指数様式で減少し、そして重要なことには、分子が球状のランダムコンホメーションまで完全に緩和しないことを示す。代わりに、準平衡構造は、指数的減衰の終わりを告げる、厚くなり、短い棒状の物体であり、その長さが、プロットのベースラインである。加えて、非常にゆっくりとした緩和過程は、まだ起こっているが、異なった性質で、質量の３乗に比例することができる時間スケールのものである。使用される時間スケール（例えば、何百秒）内での長さの測定は、「ベースライン」といわれる平衡値にまで落ち着く。ベースラインの値は、ＤＮＡ寸法で直線的に変化し、再現性はよい。即ち、緩和の測定は、二つの方法で寸法を決める：１）緩和時間、τ、による決定及び２）ベースラインによる決定。
【０１４５】
光学的輪郭最大化：
ＤＮＡ分子は、該ＤＮＡの一端を固定すると、比較的弱い電場の作用によって、ほとんど全体的に延伸できる（５９、７６、７７）。長さは、蛍光顕微鏡を使用して、延伸された分子を画像化することにより、簡単に測定できる。しかしながら、大きな直鎖状ＤＮＡ分子を固定するのは厄介であり、これまでの延伸の研究は、どのような系統的方法においても、長さを分子の大きさと関連させることを試みてはいなかった。
【０１４６】
光学的輪郭最大化（ＯＣＭ）と名づけられた実際的な寸法決定の方法は、緩いゲルマトリックスのなかで、電気泳動の間に線状ＤＮＡ分子が障害物に引っかかったときに、それが準安定なフック形状を形成し、数秒間持続できることの発見に基づく（４６）。この緩いマトリックスは、カバースリップとアガロースゲルの境界面に見出される。観察された最大の、フック形状の輪郭の長さは、迅速に集められた画像により決定でき、その最大長さは、報告された寸法（２４０〜６８０kb（４６））に関して直線関係を示す。要約すると、ＯＣＭは、非常に精密な寸法測定を提供し、それは、パルス場電気泳動による解析から導き出される大部分の結果よりも優れている。
【０１４７】
ゲル中のＤＮＡ分子の分光学的研究：
蛍光二色性分光計（（７８〜８０）と同様）は、逆転顕微鏡に取りつけて組み立てることができ；この顕微鏡は、また、ＳＩＴビデオカメラを装着して、コンピューターに内蔵されたビデオ−デジタル化ボードに接続できる。このような分光学的装置の大きな利点は、Boredjo とHolzwarth のもの（７８〜８０）とは対照的であり、顕微鏡−分光計の組み合わせを使用して、少量の分子の分光データを収集するだけでなく、分子を画像化できることである。画像化と分光データは、いくぶん相補的であり、これらの組み合わせは、電気泳動系の特徴をほとんど完全に残すことを可能にする。画像化の実験が、全体のコイルコンホメーションの機構を解明することから、蛍光二色性が、Rayleighの限界（およそ１個のゲル細孔の大きさ）を越える解像度で、平均のコイル配向をモニターすることを考慮されたい。このような装置は、本発明において、電気泳動の間の大きなＤＮＡ分子の画像化された分子動力学を、二色比の変化と関連させるのに使用できる。
【０１４８】
前述のように、光学的地図化は、多くの新しい単一な高分子現象を包含する新しい物理地図化方法であり、結果として、単一のＤＮＡから、整列された制限地図の迅速な作成をもたらす。制限断片は、最小の摂動で光学的に寸法決定され、多数の分子が、並行して解析できる。
【０１４９】
本発明に使用される以下の方法は、改善された寸法決定の能力を提供する。見かけの部分消化を減少、又は排除する新しい方法も、また、提供される。
【０１５０】
光学顕微鏡測定のための単一ＤＮＡ分子固定方法：
光学的地図化は、代表的には直径が数ミクロンの、ランダムコイルとして溶液中に存在する大きな裸のＤＮＡ分子を解析する。これらの分子は、部位を特定する切断の結果である断片の画像の分離がなされる前に、伸び切って、平面に固定されなければならない。伸びた大きなＤＮＡ分子に流体の流れを供給し、続いてゲル化して、その場所でそれらを固定するために、溶融アガロースが使用される。ゲル固定は、分子を平面内に保つには十分に堅く、切断部位が観察できるような、切断の上のいくらかの滑りを可能にする。実際、どのようにアガロースが大きなＤＮＡ分子を固定できるのかは、よくわからない。早すぎる緩和を防ぎ、切断部位が形成されたときに、より信頼性のある検出を可能にし、処理量を改善するために、より再現性のある固定が、延伸の程度を調節することによって得られる。
【０１５１】
（ｉ）ゲル固定工程の理解と特徴づけ：
アガロースがどのように分子を捕捉し、固定するかは、少ししかわかっていないが、ゲルによる固定は、光学的地図化の基本的な構成要素である。アガロース繊維が、ＤＮＡ分子を物理的にロックして封じ込め、それによって、それらをそこに固定することは、まだ確かではない。前述のように、ＤＮＡゲルの電気泳動において、ゲル繊維−ＤＮＡ間の相互作用もまた重要な役割を果たすであろう。実際、ゲルによる固定の機構の特徴を完全に明らかにすることは、光学的地図化を越えて、単一分子の広範囲の方法に応用可能な改良された分子固定技術に導くであろう。前述のように、延伸された分子のゲルによる固定は、ゲル繊維−ＤＮＡ間の相互作用と、特に分子末端における緩和効果との組み合わせから、結果として得られることが期待される。
【０１５２】
このような異なった相互作用は、ゲルで固定化された分子の、ＤＮＡの寸法とゲル濃度が変化した一連の試料におけるＤＮＡセグメントの分布の研究によって、特徴を明らかにできる。本発明の光学的地図化のために開発された強度測定技術も、また、本発明の、固定された、単一のＤＮＡ分子の、主軸に沿っての強度プロフィールを、搭載後の時間の関数として作成するのに使用できる（図１０参照）。時間とともに変化するこれらの強度プロフィールの解析により、強度が変わらない領域として、埋め込まれた分子に沿って捕捉点を位置決定し、及び／又は特徴を明らかにすることができる。言い換えると、固定され、延伸されたコイルは、緩和することを試み、コイルセグメントは、細孔容積の内外に動く。妨害、即ち強い繊維−ＤＮＡ相互作用があると、コイルセグメントは、その位置を越えて緩和できないであろう。更に捕捉の度合を評価するために、系を、注意深く測定された電場によって摂動させ、強度の測定を行い、結果として得られる動きを画像化することができる。これらの解析から、ＤＮＡのkbあたりの捕捉点の平均数を、全コイル寸法とゲル濃度との関数として決定できる。固定でのイオン強度及び二価対イオン効果も、また、測定できる。
【０１５３】
ゲル濃度の効果：
光学的地図化に使用されるゲルの濃度は、最適化されていない；しかし、０．１〜３％のＬＧＴ（低ゲル化温度）アガロース、又は１％のＬＧＴアガロースのような、その中のあらゆる範囲又は値のものが使用できる。ゲル化が埋め込まれた分子を固定するので、ゲルの濃度を系統的に変化させて、固定の度合及び最終的には分子緩和速度を穏やかにしなければならない。例えば、高いゲル濃度は、大きいものに比べて、小さい断片のために望ましく、このことは緩和を遅らせ、これらのより小さい断片の本発明者らの解析を容易にするであろう。更に、ゲル濃度は、ゲル化の機構に影響し、より小さい分子が、実質的な緩和が生じる前の広げられたコンホメーションで捕捉される。そのような機構とそれらの捕捉への効果は、ＤＮＡの寸法（３０〜１，０００kb）の範囲に対してゲルの濃度を系統的に変化させること、並びに早期に起こる緩和に対する分子の安定化及び見かけの切断効率でのその効果を研究することによって、決定できる。分子緩和は、前述のように、長さを時間の関数として測定することによって評価され、切断は、光学的地図化の手順を用いて記録される。
【０１５４】
（iii）大きなＤＮＡ分子のガラスへの接着：
Yanagidaは、短く延伸されたＤＮＡ分子が、Ｍｇ+2の存在でガラスに粘着でき、蛍光顕微鏡で画像化できることを示している（８１）。この粘着は、個々の蛍光色素で着色されたＤＮＡ分子のフィルムを露出できるほど安定であり、数分間もちこたえた。この技術は、本発明によって、大きなＤＮＡ分子を、ガラススライド（ガラススライドを塩化マグネシウム溶液に浸してＭｇ+2を担持させた）に「担持」されたマグネシウムイオンに展開し、固定するのに適用できる。本発明者らの手順は、次のことからなる：分離されたイーストの染色体の、アガラーゼで処理された電気泳動ゲルのスライス（ここで、アガラーゼは、アガロースを小さな糖類に消化している）から得られ、スペルミンで凝縮された分子を、マグネシウムを担持させたガラスの上の薄層に展開した。スペルミン凝縮は、剪断力で起こる破断を実質的に防止することを、含むことができる。該スペルミン濃度は、担持したガラスの中で得られるマグネシウムが分子を解凝縮し、同時にガラス表面に粘着できるように、制御される。引続く光学的地図化は、通常行われるようにＭｇ+2を添加する代わりに、ガラスに固定された分子に制限酵素を添加する改良によって実施される。もし、堅い固定条件のために切断部位が容易に現れないなら、次には、過度に固定された分子を緩めるのを助けるために、少量のＥＤＴＡを添加する。
【０１５５】
ガラスに固定された分子は、それらのゲルに固定された一方の分子よりも、いくつかの利点を有している：即ち、１）分子がカバースリップに付着しているので、画像が非常にシャープで明るい（散乱させ、あいまいにさせるゲルがない）；２）画像は、場の蛍光バックグランドが少ない、アガロースゲルは外来の蛍光をもつ、比較的に低純度の製品である；３）明るく、鮮明な画像は、完全に自動化されたルーチンによる作業が容易である；そして、４）よりしっかりと固定できるので、分子をより効果的に展開することができる。この最後の利点は、本来的により多く、より小さい断片からなる、より高分解度の地図を生み出すためには、重要な要件である。
【０１５６】
（iv）電場を用いる分子の展開と固定：ＤＮＡ分子は、蛍光顕微鏡で示されるように、ゲル電気泳動の間に、伸び切り、かなり延伸することができる（５３、６２）。電気泳動の間に電場が分子を延伸するが、この状態を、電場なしでどのように維持するかは、明らかではない。事実、ゲル電気泳動の間延伸を維持する試みは、ＤＮＡ分子の寸法を明らかにするには、いくらかの緩和が必要であるという分離機構とは対照的である。
【０１５７】
例えば、前述のような本発明者らの捕捉の研究から、そこにある全分子を捕捉又は錨止めするように働いている電気泳動しているコイルセグメントが画像化されている。高い電場強度は、アガロースゲル電気泳動の間にこれらを錨形成させるのに使用でき、これらの錨は、場が取り除かれた後も、例えば１時間又はそれ以上、持続できる。捕捉され、固定された分子は、電気泳動には役立たないが、まさに光学的地図化に適した分子コンホメーションである。このような、電気泳動に効果のない分子を捕捉する条件の利用は、本発明の本発明者らの光学的地図化のための分子を効果的に捕捉する。したがって、分子の寸法（２００〜１，０００kb）の範囲について、場の強度の条件の系統的変化及び得られた長さ及び延伸状態の持続時間の測定は、上記のように、光学的地図化の解析技術に、本発明により用いることができる。アガロースゲルの濃度も、また、系統的に変化させることができる。このようにして、光学的地図化のための最適の延伸条件を確立することができる。
【０１５８】
単一分子の寸法決定方法：
光学的地図化は、本発明のこのような方法によって、単一分子の寸法決定、及び高分解かつ高精度の制限地図の構築を提供できる方法に依存している。非限定的な例として、相対見かけ長さ、蛍光強度比、ゲル中での緩和、ベースライン及びＯＣＭ（光学的輪郭地図化）を包含する５種類の、単一分子の寸法決定方法が提供される。これらは、二つのグループに分類するのが有益である：分子摂動を必要とする技術、及びそれを必要としない技術である。単一分子の蛍光強度及び見かけ長さの測定のような、摂動を要しない寸法決定技術は、試料室をもつ精巧な顕微鏡及びそれに伴う制御のためのエレクトロニクスを必要としないので、使用に好都合である。それに加えて、摂動を要しない寸法決定技術は、また、並行測定に好適である。このような、摂動を要しない分類のいくつかの利点にもかかわらず、本発明の摂動に基づく寸法決定技術は、それらが高い精度と分解度を与えることから、予期しなかった優れた結果を提供する。
【０１５９】
少なくとも５００bpのＤＮＡ断片を光学的に寸法決定するいくつかの方法を、例えば以下のように、本発明によって提供することができる。
【０１６０】
相対見かけ長さ及び強度の測定：
前述のように、整列された染色体制限地図は、相対強度及び相対長さの測定により、本発明によって得ることができる。分子を、まず制限酵素を含有するアガロースゲル中で延伸し、固定する。次いで、マグネシウムイオンを拡散させて、消化を誘発し、ＤＮＡ分子中に間隙を成長させて制限部位を可視化する。この方法は、一つの分子を直接に可視化できるので、簡単で効果的であり、優れた感度を有する。顕微鏡試料室は、それに開けられた穴をもつスライド、ゲル及びカバースリップからなっていてよい。分子を伸ばし、又は取扱うための電場をかける電極を使用しないけれども、有益に系を摂動させる電場をかけることも可能である。相対見かけ長さと相対強度の両方による寸法決定の方法が、最良の結果を得るためには、断片が延伸されたままであることを必要とするのを考慮されたい。ゲルによる固定は完全でなく、ほぼ最適に固定されている断片は、寸法決定の試みを混乱させ、早すぎる緩和を起しがちである。更に、ゲルマトリックスへのＤＮＡの固定は、切断部位の観察を妨害することができ、切断部位は、可視的な間隙を生み出すための局部的な緩和を必要とする。
【０１６１】
上記を考慮して、光学的地図化の間、単なる搭載から、より使用に適し、より精密なデータが得られるように、分子を摂動させるために電場を使用することができる。ＤＮＡ分子を延伸し、又は動かすように、電場を制御でき；これらの摂動は、緩和した分子を延伸して、相対強度と長さの測定を可能にするであろう。摂動は、また、存在するが、間隙のような他の方法で可視化できない切断部位が現われるように、部分的に切断された分子を明瞭にあらわにする。発明者らの実験室からの最近の予備的なデータは、実際に、電場が見かけの部分消化の程度を減少させることを示している。電気的摂動は、光学的地図化の間、試料室を用いて行われる。付加的な改良は、単に試料室全体にアガロースとＤＮＡを満たすことである。
【０１６２】
輪郭の長さの測定のための代替的な方法：
線状ＤＮＡ分子を、電場を用いて、緩いゲルマトリックス中で一時的に延伸し、次いでそれらを、光学的な長さ測定によって寸法決定する、光学的輪郭最大化（ＯＣＭ（４６））は、寸法決定の方法と名づけられ、分子は、緩いマトリックスの中で、障害物に引っかかって伸び切り、フック形状に似たコンホメーションを形成している。注意すべきことには、比較的弱い電場（例えば、５〜３０ボルト/cm 、例えば２０ボルト/cm ）が、束縛又は一時的に引っかかったＤＮＡ分子を完全に延伸するのに十分である（４６、５９、７７）。もしフックの腕部が、同様の寸法を有するならば、そのとき、該分子は、全輪郭長さの近くまで伸び切ることができる。ＯＣＭによる寸法決定の正確さと精度は、パルス電気泳動に基づく測定と同等又はそれ以上で、非常に高い。
【０１６３】
ＯＣＭは、知られているように、分子を延伸させる物理的効果、及び分子の長さをリアルタイムで測定する新しい画像処理法を用いることにより、本発明の大きな処理量の方法を提供するために改良することができる。容易に作られ、電気泳動分子に作用して、それを全輪郭長さの近くまで延伸している、異なる摩擦力に対する理想的な状態を与える流体−ゲル境界面は、ＯＣＭにおけるのとよく似ている。分子の正味の延伸力は、液相に対するゲルマトリックス中のＤＮＡの摩擦係数の相違で決まる。より正確には、図１１に示すように、ＤＮＡ分子がゲル−流体境界面を通って電気泳動するとき、流体の摩擦力は、ゲルマトリックス中に見られる摩擦力よりもはるかに小さい。これらの力は、代表的には少なくとも１０倍少なく（５５）、差はゲルの濃度によって変わる。分子のコンホメーションは、ゲルマトリックス中では動的であるが、平均すると比較的密である。摩擦力は、分子がゲルマトリックスから自由溶液に溶け込むときに減少し、分子を横断して、延伸させるのに十分な力を与える。分子がマトリックスから完全に引き出された直後に、延伸力は、消滅し、分子は緩和して、密な自由溶液コンホメーションに戻る。電場を逆にすると、自由分子をゲルマトリックス中に戻すように送り；そこで、所望の精度により、必要により何回も長さの測定をくり返し、平均することができる。
【０１６４】
約２０〜５０分子／分の速度で境界面を通る、電気泳動分子によって、大きな処理量が達成される。輪郭の長さを測定し、同じ技術及び光地図化のために開発されたコンピューターアルゴリズムより蓄積されたデータから作表することができ、そしてＳＩＴカメラからの画像の非限定的な例のような画像化されたコイル緩和測定は、迅速にデジタル化し、フレームを平均し、フレーム速度３０/sで、１６bit のファイルに蓄積する。例えば、１２０ファイルのフレームバッファーを、コンピューターで解析で用いることができる。これは、１２０の５１２×５１２画素の画像を、４秒ほどの短時間に、デジタル化し、蓄積できることを意味する。単純に画像の寸法を減らすことで、画像のより迅速な蓄積ができ、この場合、同じハードウェアが、４８０の１２８×１２８画素の画像を蓄積できる。処理アルゴリズムは、このようにして、約１０画像（平均４〜１６フレームをまとめて）を２０秒間隔で集めることにより、５〜１０分子を同時に寸法決定できる。１Gbyte のハードディスクを蓄積手段として用いて、２，０００近くの完全なフレーム画像、又は１，０００〜２，０００分子の寸法決定されたデータを蓄積できる。処理アルゴリズムは、バッチモードで動くように設定でき、１Gbyte に相当する画像データを、展開シートに作表した１，０００〜２，０００の寸法決定されたものに処理するのに、約３〜５時間を要する。これらの処理時間は、補助者のいない操作に基づくが、オペレーターによる方法も用いることができ、人手による同定や、解析のための分子のマーキングを便利にする。
【０１６５】
高い画像品質は、画像処理を容易にする。流体中で得られたＤＮＡの蛍光画像は、ゲルよりも明るく、シャープで、蛍光を発する人工物が比較的少ない。したがって、それらは信頼性のある二進法又はデジタル画像に変換でき、それらは容易に発明者らの処理アルゴリズムによって受け入れられるので、補助者のいない画像処理に理想的である。この大きな処理量の寸法決定方法は、複雑さを増大する一連の Not I消化イースト染色体混合物（ＤＮＡ３０〜９００kbを含有する）を用いて、試験し、基準化することができる。単一の測定の精度を計算する統計的解析を行うことができ、この方法の究極の正確さを決定した。複雑な混合物の十分な解析のために必要な最少分子数を確立するために、信頼区間を決定する。この解析は、使用できる寸法分解度と寸法識別度の水準を決定する助けになるであろう。ノイズと系統的誤差の原因を検出し、可能なかぎり排除する。寸法の下限５〜２０kb及び増大した上限が、境界面からの既知の距離を相殺し、コイルの端だけをモニターすることにより、顕微鏡の視界より大きい輪郭長さの分子が寸法決定されることから、本発明によって得られる。
【０１６６】
コイル緩和による寸法決定に対する流体境界面系：
ここに論じられたように、ゲル中のコイル緩和を定量し、発明者らの理論的及び実験的な計算と観察に基づいて、分子の寸法に対する数学的関係を導き出した。この測定された緩和時間は、分子量に対して非常に鋭敏であり、長さの測定値が、その最良の値でわずかに（分子量)1で変化するのに対し、（分子量)1.66 で変化する。与えられた寸法分布の中で、最大の分子が、測定される緩和を支配するので、不均一混合物中の小さい分子は、試料室で解析できない（８３）。不運にも、この方法では寸法分布を決定できないので、分子生物学で最も標準的な解析に使用することは、実行不可能である。もちろん、顕微鏡の下で、個々の分子鎖は、独立して、どのような混合物も効果的に解放して観察される。
【０１６７】
コイル緩和は、本発明によって、自由溶液中の上記のゲル−流体境界面系を用いて、不均一な試料の寸法決定のための、迅速で鋭敏な技術を提供するために、自由溶液中で測定でき、これは、発明者らの現在の研究に継続している。Yanagidaと同僚らは、蛍光顕微鏡を使用して、溶液中の単一分子のコイルコンホメーションの動力学を測定し、寸法に容易に関係づけられる信頼できる平均分子径を得ている（４４）。電気的複屈折（８４）及び二色性（８５）のような、他の光学的方法も、剪断に基づく粘弾性技術のように、同様な重量依存性緩和を決定している。
【０１６８】
ゲル−流体境界面系は、自由溶液中の緩和の測定に、ほとんど理想的な条件の組を提供する：即ち、１）延伸の程度が、電場の強さ又はゲル濃度を変えることによって容易に制御できる；２）延伸条件が、一様で再現性がある；３）場を逆転させて、分子を境界面より再抽出できるので、くり返し測定が簡単である；そして、４）全体として、実験条件が制御でき、測定は、顕微鏡において重要と考えられる、十分に明確な視野で測定が行われる。
【０１６９】
緩和時間を、前項に記載したゲル−流体境界面を通る分子の電気泳動によって決定し（図１１Ａ〜Ｃ参照）、最初に、ゲルに基づく緩和測定のために開発した同じ技術を用いる。これらの決定は、緩和の程度を定量するために、周期的な間隔を置いて、光学的長さの測定を用いる。測定された分子の長さの変化を、時間の関数として、単一の対数減衰にあてはめ、緩和時間を得る。溶液緩和の機構は、コイルセグメントが、管、換言すれば連結したゲル細孔の中を動くとは限らないことから、ゲルに基づくものとはいくらか異なる。自由溶液中では、延伸されたＤＮＡ分子は、引き抜かれる長球面の楕円体の面から、より対称的な、球形のコンホメーションに発展することによって緩和する（４４）。緩和時間も、また、自由溶液中ではより短い（一般に１０倍少ない（５５））：例えば、５００kbの分子は、４秒の緩和時間を有する。しかし、溶液の緩和時間は、溶液粘度に逆比例するので、小さい分子についての測定は、単にグリセリン又はスクロースを添加して粘度を上昇させることにより、好都合な時間スケールにして行うことができる。溶液基準の緩和測定によって示されるより短い緩和時間は、大きな処理量の方法にとって利益であることは、重要である。
【０１７０】
画像の収集手順は、実質的には、前項に述べた手順と同一であり、同じ画像を、長さと緩和の測定に用いることができる。画像処理のルーチンは、緩和しているコイルの集まりの周囲の楕円体に合うように改良でき、組み合わされた長軸と短軸を、緩和の進行の測定に用いる。前項に述べたように、一組の分子を基準に用い、緩和依存寸法決定条件を確立する。これらの測定の精度と正確さを決めるために、統計的解析を使用できる。
【０１７１】
蛍光強度測定のためのゲル−流体境界面系の提供：
単一分子蛍光強度法を、光学的地図化の間に形成される、アガロースゲルに埋め込まれた制限断片の相対蛍光強度の測定に使用できる。制限断片の相対蛍光強度は、その相対質量とよく関連し、これらの測定は、Saccharomyces cerevisiaeのいくつかの染色体の予備的な光学的地図の構築に用いられている。一般に、蛍光強度の測定は、顕微鏡から導き出された画像で定量するのは困難であり、相対的測定が、一種の内部標準を与える。誤差が相対的でなくて絶対的なので、この方法にはいくつかの欠点がある。このことは、例えば、２０kbの標準偏差が、９００kbと寸法決定された断片と、６０kbの断片とに等しく適用されることを意味する。換言すれば、変動係数（平均／標準偏差）は並みはずれて大きく変動することがあり、大きな断片よりも小さな断片を不利にするであろう。
【０１７２】
ゲル−流体境界面系を、本発明において、単一の分子の高分解蛍光強度測定に使用できる。測定精度を上げることができ、これらの測定に作られた寸法限界を下げる。増大した寸法決定能力は、同時に三つの寸法決定方法を使用して、精度と正確さ（長さ、緩和及び強度）を増し；ゲル−流体境界面系が、ゲルによる固定よりも一貫して光学的に平らな分子を作ること；分子延伸の程度が、ゲルによる固定よりも制御しやすいこと；及びゲルを排除することが、蛍光を発する人工物がより少ないよりシャープで明るい、画像を与えることのような、これらに限定されるものではないが、多くの要因から生じる。前述のように、高品質の画像は、自動的に画像処理することをより容易にする。
【０１７３】
強度の定量には、分子が焦点内にあることが必要である。ゲル−流体境界面系は、光学的に平らな延伸された分子を生じさせる。より正確には、高出力、高口径数の対物レンズは、約０．２μm の焦点深度を有している（８６）ので、光学的に平らな、又は全体が焦点の中にある分子は、この値に匹敵する薄さの箱に完全に入っていなければならない。
【０１７４】
分子は連続的にゲル−流体境界面系で電気泳動されるので、強度測定は、運動しているターゲットについて行わねばならない。潜在する問題は、運動による激しい歪みを避けるために、またフレームを平均するために時間が限られているので、迅速に画像を捕えなけらばならないことである。しかし、短い観察時間に対しては、より高い照明水準（ノイズに対してより大きいシグナルを与える）を、有意な破壊や脱色なしに用いることができる。フレームの平均は、ノイズを減らし、グレイレベルの数を増すために用いることができる。例えば、発明者らは、ビデオの約１秒である１６bit フレームバッファー及び平均３２フレームのついた８bit のデジタイザーを用いる。これは、ほぼ８，２００の水準の強度を含有する１３bit の画像を与える。もし画像をもっと迅速に捕えられたら、結果の画像は、より少ない水準の強度を含有する。電場を止めることは、画像を平均する時間を増やす一つの方法である。しかし、分子は、ただちに緩和しはじめ、部分的に焦点外に動いてしまう。
【０１７５】
運動の問題は、分子がまだアガロース中に部分的に埋め込まれている間に画像化を始めることによって、解決できる。この時点では、分子はまだアガロースマトリックス中に埋め込まれているので、早い運動はしていない。長い分子が完全に視界にあることを確実にするために、異なる程度の延伸を得るように、電場を変えることができる。強度測定のために分子を中位に延伸し、次いで場の強さを増して、長さの測定のために完全な延伸を誘発し、分子がゲルから完全に離れた後に緩和時間を定量するような初期条件を与えるように、コンピューターに接続されてプログラム化しうる入力供給を用いて、場の強さを系統的に試験することもできる。非限定的な例として、運動による有意な歪みの影響には、平均のために１６フレーム、又は０．５秒は危険ではない。これは１１bit のデータを生み出し、ほとんどの強度の決定のために十分な分解度を与える；満足すべき結果は、わずか８bit のデータでも得られている。
【０１７６】
相対強度の測定で起こる誤差を最小にするには、多数の内部標準を試料の中に置いて、照明が不均一であることから起こる蛍光の非直線性を、かなり減少又は排除することができる。好ましい内部標準は、いくつかの必要条件に適合する：即ち、１）ＤＮＡに粘着することを避けるために、負に荷電している；２）ＤＮＡ−蛍光色素複合体と同じ吸収及び発光の波長である蛍光；並びに３）測定されるべき試験ＤＮＡ分子と容易に区別できる。小さいＤＮＡ分子（２０〜５０kb）を、内部標準として用いることができる。これらの分子は、測定する試料全体に分散しており、好ましくは、照明及び電気泳動の条件（例えば、自由溶液中）で、試料ＤＮＡと同様に反応する。相対質量を定量するための内部標準は、同じ親分子からの隣接する制限消化生成物を用いる代わりに用いられる。これらの定量を最適化するために、標準として使用するＤＮＡを系統的に変動させて、異なる寸法の標準を用い、それらの相対蛍光強度を測定する。必要に応じて、経験的修正率を計算して、直線性を確実にする。
【０１７７】
蛍光強度の測定による小さいＤＮＡ断片の寸法決定：
光学的地図化の寸法の下限は、最近では３０kbであり、より小さい断片に分解度を拡張することは、有用であろう。そういうわけで、蛍光顕微鏡を使用して、５００bpのように小さいＤＮＡ断片の正確な寸法決定、例えば６bpの認識部位をもつ制限酵素を使用して、大きいＤＮＡ分子の高分解地図を得るのに、重要な工程である。
【０１７８】
少量の蛍光発色団を含有する分子の蛍光強度の従来法による測定は、低い信号強度と、低い信号／ノイズ水準の問題で悩まされている。実質的に、顕微鏡による光子の計数レベルが試料の蛍光を越えたレベルに達したとき、顕微鏡は迷光で満たされている。この装置の蛍光寿命の可能性は、迷光とバックグランドの蛍光を除く精巧なフィルター系として適用することができる（８７、８８）。この方法は、本発明者らのＳＩＴに基づくシステムに関連して、低い光の検出能力を有意に増加させることが期待される。
【０１７９】
画像化蛍光寿命顕微鏡の心臓部は、コイル化画像強化電荷連結装置、又は単にＩＣＣＤである。この低ノイズ装置は、単一の光子計数水準に近づいた、著しく低い光の条件で画像化することができる（８６）。信号／ノイズ能力は、フレームを平均するＳＩＴカメラの、少なくとも二倍は良好である（８９）。該ＩＣＣＤは、また、大部分の蛍光プローブの寿命より短い５nsまで拾うことができる。このカメラの増巾段階は、マイクロチャネル板からなり、それは光電子増幅管の束のように機能して、少量の光子が電子なだれを誘発し、その電子は蛍光体スクリーンに衝突して明るい画像を調製する。蛍光体スクリーンの画像は、光ファイバーカプラーによって、増巾器に接続されたＣＣＤチップに送られ、チップに生じた画像をカメラ制御器にダンプし、デジタル化する（９０、９１）。同様の装置は、軍の夜間可視装置にしばしば用いられている。上記のように、増巾器が入口になるので、それはカメラのシャッターのように開閉できる。しかし、この「シャッター」は、非常に速く、５×１０6 ：１より大きな開閉比を有する。該ＩＣＣＤは、本発明の方法のように、固定され、運動しない試料で使用されるときに、定量的な仕事のための好ましい画像化システムである。
【０１８０】
信号／ノイズ比を最小にするには、ＩＣＣＤの、開閉の特徴の利用は、励起パルスが終った後にのみにシャッターを開くようにして、迷光と照明源からの散乱は実質的に排除される。したがって、制御され、注意深い画像収集の時間の下で蛍光から排他的に発生した発光光子は、結合されていない発光又は迷蛍光から蛍光寿命に基づいて区別できる。
【０１８１】
非限定的な例として、臭化エチジウム−ＤＮＡ複合体に対して、結合種の寿命が２１．１ns（９３）であり、そこで約３t が最適であるべきであるので、染料レーザーを５２５nmに調整し、ゲート幅を６３nsとした。結合されていない臭化エチジウムの、水中の蛍光の寿命がわずか１．６nsなので、遊離の蛍光色素の発光は、励起ラスターの様式にほぼ従い、それに対して容易に選択される。他のバックグランド蛍光源は、浸漬オイル、ガラススライド、及び試料の不純物を含み、これらの蛍光源からの蛍光も、この技術によって弱められる。
【０１８２】
ゲートを通ったパルスを、時間を調節して、蛍光の減衰と同期させる。ゲートのパルス発生器を、蛍光色素−ＤＮＡ複合体の蛍光寿命の間、高電圧の信号を生むように時間を調節する。この高電圧パルスは、電子シャッターを開閉する。照明を、シャッターが閉じているときだけ励起が存在するように、８nsのＦＷＨＭ持続でパルスさせる。フィルターの排除は、光の処理量を増し、他の望ましくない蛍光源を除いた。レーザー励起のくり返し速度は、変動でき（１〜１００Hz）、蛍光発光は、ＩＣＣＤヘッドに電荷として集められ；結果として得られた画像は、強さが量に比例する明るいスポットから構築される。
【０１８３】
限定されないが、Continuum Corporation のＮｄ−ＹＡＧで励起されるＴｉサファイア可変固体レーザー、及びLambda Physik のエキシマで励起される染料レーザーの、２種類のナノセコンドレーザーが、これらの方法に適している。
【０１８４】
このようなシステムの感度及び寸法分解度は、臭化エチジウムで着色されたラムダバクテリオファージＤＮＡの EcoRI消化物を用いて評価することができる。上記のシステムで画像を発生させ、単一の分子に相当するスポットの強度を、発明者らの画像処理ルーチンによって作表する。次いで、これらを、断片寸法の数に相当する強度の数を図示するヒストグラムに整理する。この種の解析は、合成シリコーンマトリックスを通って流れるＤＮＡ分子によって行うことができる（９４）。これらの測定の精度と正確さは、ヒストグラム解析で特定の区分幅の設定を用いて計算することができる。
【０１８５】
ＤＮＡ断片は、好ましくは完全に焦点の近くにある。もし断片が焦点外にあれば、強度の値は、同じ寸法の分子で変わることがある。分子が焦点内にあることを確実にするために、ガラス表面を清浄にするのに、ＤＮＡ分子が粘着したマグネシウムイオンを用いることができる。他の方法は、溶液又はゲル中のＤＮＡ断片をガラス表面に広げる遠心力を包含してよい。
【０１８６】
不均一な照明は、照明の注意深い調整と、光学的地図化での相対強度の測定のために開発された処理ルーチンの使用とを組み合わせて、修正することができる。実質的に、このルーチンは、局部的に取り囲んでいる画素を位置づけ、それらの強度の値を、局部的なバックグランドの値の計算に用いる。局部的なバックグランドの値は、不均一な照明を補償し、このようにして、明暗の修正として働く。
【０１８７】
他の蛍光色素、例えば、配列特異性の異なる程度を有するもの、並びに、もし適切ならば、エチジウムホモ二量体及びエチジウム−アクリジンオレンジヘテロ二量体のような、配列の相補的バイアスを有する蛍光色素を使用できる。結合していない蛍光色素を取り除くことにより、コントラストを更に増すことができる。エチジウムモノアジド（Molecular Probes, Inc.）は、光化学的な手段により、高収率で共有結合的にＤＮＡと結合して、結合していない化合物は、搭載する前に、ラベル化ＤＮＡから容易に抽出できる。
【０１８８】
十分に同定された一連のＤＮＡ断片を、内部の蛍光を発する標準として、試料に添加する。蛍光強度の標準の濃度を、どのようなヒストグラム解析でも、それらが容易に同定できるように調節する。質量と蛍光強度との間には、直線に近い関係が期待される。
【０１８９】
蛍光寿命顕微鏡も、また、より大きい断片（５０〜１，０００kb又は１〜１，０００，０００kb）の、強度を基準にした寸法決定を改良するために使用できる。
【０１９０】
純粋な試料の制限消化について得られた上記の寸法決定分析の結果は、光学的指紋であることができ、ゲル電気泳動から導き出された光学的指紋（ハイブリッド形成工程なしに）に類似している。副次的な方法は、特定の個人又は母集団若しくは下位母集団のゲノムのＤＮＡ及びＹＡＣｓから、整列された地図を調製するこの改良された寸法決定方法を用いることができる。
【０１９１】
単一のＤＮＡ分子へのハイブリッド形成による特定の配列の位置決定方法：
光学的地図化が、配列された制限地図を作成するが、これらの地図は、単独では、染色体に並んだ既知配列又は遺伝子を正確に位置決定することはできない。最新の、その場所でのハイブリッド形成技術（９６〜９９）は、単一のコピー遺伝子の位置を決めることができ、解凝縮したクロマチンを大量に用いる傾向のために、位置決定の分解度は、確実に増加してる（９８、９９）。検出されたＤＮＡ座が可能な限り遠く離れるように、クロマチンをできるだけ大きく広げる。このアイデアの究極の拡張は、単一のＤＮＡ分子を、その分子輪郭の長さに相当するまで伸ばし、次いで固定することである。光学的地図化及び／又はＲＡＲＥは、Saccharomyces cerevisae 若しくはCandida albicans、又は高等動物、例えばヒトの他の遺伝子のような、ゲノムのＤＮＡの精密地図に用いることができる。
【０１９２】
遺伝子の位置は、このように、単一の、延伸され、固定された分子について、ＲＡＲＥに仲介された単一の制限切断を寸法決定するための光学的地図化を用いて決定でき、寸法決定の分解度は、パルス場の電気泳動によって得られるものに匹敵する。
【０１９３】
大きな裸のＤＮＡ分子の上の配列を精密に位置決定する方法は、顕微鏡を用いて、二重鎖分子に、ＲＡＲＥ−仲介ハイブリッド形成の標識づけと検出を可能にする、本発明の技術を含むことができる。これらの新しい方法は、部分的に、ターゲットのＤＮＡと複合体形成（６８）させる前に、ＲｅｃＡ−オリゴヌクレオチドのフィラメントにラベルすることに基づいている。検出は、蛍光ビーズ、及びアルカリ性ホスファターゼを用いて標識された化学ルミネッセンスに基づく。単一の分子を光学的に地図化する、標識化ＲｅｃＡフィラメントによるハイブリッド形成は、その場所でのサザン分析に類似している。
【０１９４】
遺伝子の位置決定のためにＲＡＲＥを用いる光学的地図化法の提供：
ＲＡＲＥの部位は、光学的地図化を用いて、大きいＤＮＡ分子上で検出することができる。しかし、形成された複合体の直接検出は、切断による間隙を検出する必要を排除し、既知の配列の詳細な地図化のための新しい方法の組の形成の試金石として働く。直接検出の戦略で、標識ＲＡＲＥの結合部位は、分子に沿って、主要な分子とは色の異なる明るいスポットとして現れる。もちろん、この色の相違は、必要なコントラストを与える。これは、ＤＡＰＩで着色された染色体に対する異なる色のプローブによる、その場所でのハイブリッド形成に類似している。
【０１９５】
可視化ＲＡＲＥの切断：
光学的地図化と組合されたＲＡＲＥの切断を使用して、単一の裸のＤＮＡ分子上の特定の遺伝子を地図化できる。多くの重要な実験的変数が、KoobとSzybalski によって開発されたプロトコール（６６、６７）を用いて、純粋な断片の収率を増すように、ＲＡＲＥの反応を最適化し；（光学的輪郭地図化）；発明者らの、電気的に処理し、系を摂動させる電極を有し、更に改良された試料室を用いて、ＲＡＲＥの切断を可視化し；ＲＡＲＥの切断の可視化を多数の部位に拡張し；そして最適光学的地図化の間、ＲＡＲＥを他の制限酵素消化と組み合わせて、最適化を提供する。これを行うために、ＲＡＲＥを、搭載した試料上で行い、続いて、他の酵素を視野中に拡散し、酵素を、光学的地図化のためにマグネシウムイオンを添加するのに用いた同じ空間に単に添加した。
【０１９６】
光学的にＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成の検定のための結合させた蛍光ビーズ：
単一の蛍光ビーズは、ちょうど直径が０．０１μm の最も小さいものを含めて、蛍光顕微鏡によって容易に画像化される（Rayleighの限界を越えているが、このビーズは、明るいスポットとして現れる）。蛍光ビーズは、個々のビーズが強く蛍光を発し、形態的に区別でき、異なるスペクトル特性の広範囲の蛍光色素が入手でき、容易にオリゴヌクレオチドと結合することから、画像処理のために単一のＤＮＡ分子をラベルする、良好な方法である。例えば、Molecular Probes, Inc.は、６種のスペクトル範囲（色）で、カルボキシレート、アビジン又はストレプトアビジンで被覆され、寸法が０．０１〜２μm の間で変わるラテックスビーズを販売している。カルボキシレートで改質され、ストレプトアビジンで被覆されたビーズは、それらをＤＮＡ分子に結合させるのに、多くの選択肢を与える。
【０１９７】
オリゴヌクレオチドの合成は、寸法の異なる蛍光ビーズ（０．０１〜０．０５μm)を、ＲＡＲＥ条件を最適にするために、共有結合で結合させることができる。アガロースゲルを容易に拡散することからは小さいビーズほど好ましいが、大きいビーズほど、その大きな表面積のゆえに、誘導化するのが容易である（１００）。同じ寸法の蛍光ビーズは、ゲルを通る電気泳動で、蛍光によって画像化されている（１０１）。これらの改質オリゴヌクレオチドを用いるＲｅｃＡフィラメントの形成と、ＲＡＲＥ試験システムでの官能性によるその形成の検定が、また、使用できる。この試験システムは、イーストの LEU 2遺伝子の６０塩基領域と、染色体III に位置しているターゲット LEU 2遺伝子である。ＲＡＲＥプロトコールを続ける：即ち、ＲｅｃＡフィラメントをこのオリゴヌクレオチドから作り、細かく刻んだイーストゲル挿入物に拡散させ、続いて、 EcoRIメチラーゼで処理して、目標複合体を抽出し、 EcoRIで消化する。次いで、消化された試料を、分析のために、パルス場に流し出す。ビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、ＲｅｃＡで官能性のフィラメントを形成することが以前に示されているので、接合オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン−ビオチン結合のスキームを用いることができ、このフィラメントが目標ＤＮＡと複合した後にビーズを加える機会を与える（１０２）。
【０１９８】
顕微鏡の上のＲｅｃＡ複合体の検出は、ターゲット分子に結合した蛍光ビーズの可視化を必要とし、酵素の添加は必要でなく、マグネシウムイオンを拡散させることなく、あらかじめメチル化を実施することもない。顕微鏡での仕事のために、電気泳動で分離された染色体のＤＮＡが、全ゲノム物質の代わりに用いられる。試料は、発明者らの、イースト染色体の試験システムからなることができ；あらかじめ地図化された配列をもつ他の染色体もまた使用できる。単離されたイースト染色体のゲルのバンドを、ビーズの大きさの小片に細分し、ＲＡＲＥ緩衝液中で平衡化し、溶融し、３７℃で再平衡化する。次いで、ビーズに連結されたＲｅｃＡフィラメントを、溶融した混合物に添加して、ターゲットの配列部位にフィラメント複合体を形成させ；溶融したアガロース中での混合は、アガロースゲルを通っての拡散よりも効果的である。溶融ＲｅｃＡ−ビーズ−ＤＮＡ混合物を、次いで、ＤＡＰＩで着色し、光学的地図化のために、顕微鏡スライドの上に広げる。最後に、ビーズ位置の地図化のために、長さと強度を測定する。「Ｒｅｄ」ビーズ（Molecular Probes, Inc.）は、ＤＡＰＩの青い蛍光に対するコントラストを与えるのに用いることができる。
【０１９９】
標識化ＲｅｃＡフィラメントからのバックグランドの減少：
ＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成の効率は、フィラメント寸法（塩基中の）及び濃度（１９４）に大きく依存する。ラベル化ＲｅｃＡフィラメントの量は、光学に基づいた方法に関連しているに違いない：多過ぎる遊離の蛍光ビーズフィラメントは、標的分子との複合体で存在している画像化ビーズを覆い隠すことができる。以下の簡単な作用は、もしそれが起きればこの問題を排除することができる。
【０２００】
ラベル化フィラメントの量を注意深く滴定し、対照の品質に対する好都合な観察のためにハイブリッド形成の最小の必要効率に平衡させる。ＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成は、ＲＡＲＥメチル化及び制限酵素切断工程を必要としないので、ハイブリッド形成の効率は、受け入れうる結果のために、臨界的に最適化されるべきではない。
【０２０１】
非結合フィラメントは、透析を通して拡散することができ、又はゲル固定系中の温和な電気泳動は、選択的にフィラメントを観察野から除き、そして多くのより大きな標的フィラメント複合体をそこに残す。もし必要ならば、さらなるＲｅｃＡタンパクを安定のために加えることができる。
【０２０２】
ＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成の蛍光検出の提供：
サザンブロットでの非−同位体元素検出のためのオリゴ核酸の化学発光ラベル化及び他の技術は、他の利点（１０５）の内で、その高い感度のために、一般的になりつつある。一般に、アルカリホスファターゼは、オリゴヌクレオチドに結合しており（これを行うための数種類の方法があり、商業的に入手できる系）、それは、次いで標的のＤＮＡとハイブリッドを形成する。ハイブリッドの形成に続いて、化学発光性材料、一般に１，２−ジオキサンが加えられ、それは、迅速に分解して化学発光発生化合物になる。光は、最大値４７０nmで発光し、化学的環境に依存して２〜３０分の半減期である。
【０２０３】
高感度化学発光及び高品質市販キットが得られるならば、化学発光は、本発明で、光学地図化のために開発した技術を用いて単一ＤＮＡ分子でのＰＡＲＥを光学的に検出するために用いることができる。例えば、アルカリホスファターゼは、オリゴヌクレオチド（１０６）又はビオチン−ストレプトアビジン結合スキーム（１０７；市販で入手しうるキットで）に共有的に結合することができる。次いで、この共役オリゴヌクレオチドは、ＲｅｃＡフィラメントに調製し、前項に記載されているように、ＲＡＲＥ効果を試験した。ビオチン−ストレプトアビジン仲介アルカリホスファターゼ結合の一つの利点は、過剰なビオチン化アルカリホスファターゼは、容易に系外へ透析され、孤立した化学発光を減少させることである。化学発光検出システムは、ＲＡＲＥと共に、かつここで記載された工程のほとんどで用いる光学地図化で用いることができる。溶融アガロース中のＲｅｃＡ−オリゴヌクレオチド（アルカリホスファターゼに結合している）−標的ＤＮＡ複合体を、次いで光学的地図化のために搭載する。酵素的切断のためにマグネシウムイオンを拡散する代わりに、ＲＡＲＥ部位の視覚化のために化学発光システムで必要とされているジオキサンを拡散させる。次いで、この化学発光活性は、ＩＣＣＤカメラ（１０５）を用いて顕微鏡を通して視覚化することができる。全体の分子を画像化するために、ＤＮＡ−蛍光色素の蛍光を用いことができ、初めの化合物が化学発光で消色又は妨害されるならば、異なる蛍光色素が用いられる。
【０２０４】
標識化ＲｅｃＡフィラメントからバックグランドを減少させるために画像化されたエネルギー移動の使用：
別の方法は、蛍光色素をラベルしたＤＮＡとオリゴヌクレオチドへ結合されたビーズの間のエネルギー移動を促進することである。励起は、ＤＮＡ−蛍光色素複合体を供与体とすること及びビーズを受容体とすることから選択することができる。これは、このビーズが、受容体の１００オングストローム又はそれ未満以内であるときに蛍光を発することができることを意味する。しかしながら、移動の効率は、距離により劇的に低下する（１０８）。異なる顕微鏡フィルター組み合わせの蛍光顕微鏡を用いるエネルギー移動画像化は、供与体、受容体及び供与体−受容体の対を視覚化することができ；これらは、好都合には照明路の内と外で滑らせる。蛍光収量に強固に結びついているそれらの蛍光色素は、結合により劇的に増大するので、ここで用いるための良好なエネルギー移動受容体は、エチジウムブロマイド又はその同族二量体（１１０）である。多分効果的な挿入材料ではないけれども、遊離の蛍光色素は、供与体として働くことができることに関連している。もし遊離の発色団が問題であることを証明すれば、このフィラメントは、二つの部分に分けられ、蛍光ビーズは、頭−頭様式で結合し、それ故にそれらはエネルギー移動画像化のために受容体−供与体対として働くであろう。別の関連は、ラテックスビーズは、悪名高く凝集する傾向があるが、その問題は、発色団の適当な選択及び使用で解決することができる（Molecular Probes, Inc., Portland, Ore.）。凝集に対して保証する方法は、イオン強度に対する注意深い配慮、及びTritonＸ−１００洗浄剤又はＢＳＡにより、ビーズ上にいくらかの電荷を維持することである。
【０２０５】
ゲノムＤＮＡ又はＹＡＣｓを用いた地図化での処理量の増大：
ＹＡＣｓの電気泳動の指紋は、集められた努力において、多くの整列群での重要な技術である（ｉ、１１−１３、３２、３３、３８）。操作に関連した多くのゲルは、自動化されているが、運転、分析及び多数のゲルの結果を一覧表にする仕事は、ルーチンからは程遠い。自動化の主な障害の一つは、ゲル電気泳動である。それは、遅く、そしてバンド位置を高い信頼度と正確さで一覧表化された数に自動的に変換するにはしばしば困難がある。手動の介在が、結果をチェックしモニターするために、しばしば必要である。サザンブロッティング及びハイブリッド形成工程は、指紋工程を完了するために必要であり、この方法は、自動化したとき、また、困難を伴うやっかい事である（１１、３８−４１、１１１、１１２）。
【０２０６】
ＲＥＲＥに基づく地図化方法：
光学的地図化による迅速染色体指紋化、簡単な試み：
ここで記載された蛍光強度測定方法論を用いて真核生物染色体の迅速指紋化が、どのようなハイブリッド形成もなしに本発明により達成することができる。例えば、ＹＡＣ指紋の分析に含まれる工程が、記載されている：ＹＡＣｓを持つイーストは、ゲル挿入物に組み込まれ（３、５５）、そしてそれらのＤＮＡ類は、低いゲル化温度アガロースを用いたパルス場電気泳動を用いて分離される。同定されたＹＡＣゲルのバンドは、切断され、別々の管又は一緒に、一連の酵素で消化される。搭載及び固定の技術は、この提案で記載されたものから選択される。好ましくは、マグネシウムイオンは、標準技術を用いてゲルバンドからＤＮＡ類を抽出した後に、小さな分子をスライド上に固定するために用いられる。寸法分布は、ここで記載した蛍光強度測定から決定される。
【０２０７】
頻繁からまれな切断の範囲の一連の異なる制限酵素により調製された指紋類は、整列群形成及び整列を査定することにより評価される。ＹＡＣｓは、伝統的なバルク方法を用いて消化され、それらの断片は、画像化され、次いで顕微鏡で連続的に分析される。実際に、所望ならば、ロボットが、顕微鏡のためのスライドを調製するように計画することもできる。
【０２０８】
整列した染色体制限地図の迅速作成：
染色体は、左右の腕をもつので、染色体の極性は、末端の最も特異的配列と適当なハイブリッド形成及び得られたハイブリッド（９）を画像化することにより、単一分子で確証することができる。Smith-Birnsteil の部分消化分析の適合性は、光学的地図化の技術を用いて迅速な染色体地図化に用いることができる。
【０２０９】
ほ乳類の大きなゲノムの光学的地図化：
Ferrin及びCamerini-Otero（６８）は、二つのＲＡＲＥ部位が、寸法を決定しうるほ乳類のゲノム延伸物に選択的に切断するように計画することができ；次いで、パルス場ゲル上で非切断ゲノムＤＮＡから分離することができることを示した。これらの著者らは、Koob及びSzybalski （６７）と同様に、これらの切断され、分離されたゲノム部分は、物理地図研究のための遺伝子座−特定ライブラリーを構築するために用いることができることを示唆した。これらのライブラリーは、例えば、整列群を一緒に結合させること又はクローン化できない領域の地図化を助ける。ゲルから得られ、切断された、少量のゲノム化ＤＮＡの直接の地図化が、好都合に、クローニングの工程及び人工物を取り除くが、再入手したＤＮＡの濃度は、ＰＣＲ及び光学的地図化を除いて、一般に、直接の分析には不十分である。
【０２１０】
ＲＡＲＥは、本発明において、光学地図化により更に分析するために、ほ乳類ゲノムからの大きな領域を切断分析するために用いることができる。ヒトの胆嚢性繊維症遺伝子は、Ferrin及びcamerini-Otero（６８）により記載されたＲＡＲＥオリゴヌクレオチドの同じいくつかの組として、試験システムとして用いることができる。一連の十分に調べられたＳＴＳ（１１８）マーカーは、別の試みである。しかしながら、このような分析は、もしそうでなければ異なる。このＲＡＲＥ生成物は、パルス場ゲル上のHeLa細胞ゲノムＤＮＡから分離され、次いで、決定は、最適の地図化のためにゲルバンドを削除する場所でサザン分析に基づいて行われる。このＲＡＲＥ生成物は、純粋ではないが、非常に含量豊富であり；それらの純度は、一連のヒトプローブへのサザンハイブリッド形成により定量化することができる。分析されたゲノムＤＮＡの光学的地図化のために、６及び８塩基対認識制限酵素の一連のものは、詳細に、報告されているもの（１１５−１１７）と比較して、光学的地図化の結果に用いることができる。制限地図を完成させるに必要な分子の数は、断片増強の程度を含む多くの要因に依存するだろう。内部断片のＲＡＲＥ−仲介切断は、また、所望でないものから分子を光学的に選択する手段として用いることができる。
【０２１１】
流れに基づく地図化システム：
流れ細胞測定は、その目的を達成するために、その名前が意味するように、流れに強く依存しており、試料の異なるタイプの試料を適合させるために流れのシステムを完成させるために、１０年の努力が費やされた（１１９、１２０）。しかし、流れ細胞測定の欠点は、染色体では可能であるが、大きな裸のＤＮＡ分子では、ルーチン的に分類することができないことである。これは、大きなＤＮＡは、典型的な流れ細胞測定装置で発生する剪断の力により容易に破壊されるので、理解しうることである。温和な溶媒流れ場は、蛍光顕微鏡により見られるように、流体中での大きなＤＮＡ分子を見かけの破壊なしに移動させるために、（例えば、１００×２０μm の開口で、５×１０-2nl/sec）を用いることができる。剪断の低い速度（剪断は、流れを横切る距離で溶媒の溶媒速度の変化である）を有する溶媒流れ場は、ほ乳類の染色体に含まれるそれらのように大きなＤＮＡ分子を延伸させかつ整列させることを促進することができる（６１、８３、８５、１２１）。染色体のような寸法のＤＮＡ分子の粘弾性測定（６１、８３、１２２）は、引き続く緩和測定のために長い分子を引き伸ばすために流れ場に依存している。溶媒流れは、また、 Smith及びBustamanteにより、束縛されているラムダバクテリオファージＤＮＡコンカテマー（７７）を延伸させるために用いられている。更に、Yanagida及びその共同研究者は、かれらの先駆者的ＤＮＡ画像化の仕事（４４、８１）で、溶媒流れを分子を伸ばすために用いた。温和な流れ場は、大きなＤＮＡ分子を破壊しなかった。
【０２１２】
試料室を搭載した顕微鏡は、同時に流れと大きな分子を引き伸ばすために、以下のこと意図して用いることができる：１）画像化に関して、試料室流れ特性並びにＤＮＡ安定化及び延伸での効果、２）流れ速度での分子延伸の制御、３）分子のでき事の同時観察で、流れ分子に対する試薬及び酵素の引き渡しシステムの開発；流された分子を画像化及び寸法決定するための本発明者らのソフトウエアの適合化；このシステムを用いての迅速制限地図化。
【０２１３】
流れ試料室設計流体：
流体流れ場及び電場は、いくらかの相補的工学の必要度、ｋを持っているので、両方の効果を利用するように計画された試料室は、頑丈であり、かつ柔軟であるべきである。この試料室は、ゲルに埋め込まれたＤＮＡ分子を解放するように計画されている；それらの試料は、ゲルに挿入されるか又は電気泳動ゲルバンドから切り取られることができる。ＤＮＡ分子は、ゲルから薄膜空間へ観察のために移動される。この流れ場は、二つの操作を同時に実行する。それは、ＤＮＡ分子を「抽出領域」から観察野に移動し、光学測定のために、流れの中の大きなＤＮＡ分子を引き伸ばし、かつ位置づける。
【０２１４】
流された分子からの同期させた地図：
光学地図化を完成するために、分子を整列させ、切断を誘発させるために場のなかで延伸させたのちに、制限酵素又はマグネシウムイオンが流れ試料室中で消化を開始させるために用いられる。それらの工程を制御することは、重要である。制限酵素は、例えばマグネシウムイオンの添加により誘発されねばならない、そして得られた断片が視野外へ流れるまえに、その切断物が画像化されねばならない。更に、制限断片は、同期相を残すためにそれらの相対位置を保持すべきである。乱流の回避は重要であり、そのような困難を処理する流れ細胞測定技術での文献は豊富である。必要ならば、試料室は、流速を速めるように構築（漸減形状で容易に達成される）されるので、切断されたとき、断片は効果的に分離されるだろう。断片の寸法は、既知の、報告されている方法により決定される。大きな断片（例えば、＞３０kb）は、蛍光強度比、見かけ及び絶対長さ、並びに流れ停止で行われる緩和測定を用いて寸法決定される。小さな断片（例えば、＜３０kb）は、ゲル−液体境界系のために前述した強度方法及び高感度が必要ならば蛍光寿命方法を用いて寸法決定することができる。流速、照明強度及び画像化時間に関連して、ここで折衷方法を用いてもよく、それは、用いうるグレイレベル（ビット深さ）に影響している。
【０２１５】
損傷が少ない測定は、試験管中で行われた制限消化の寸法分布を決定する。完全消化は、指紋を調製することができるが、末端ラベル化分子（ビーズを用いて）の部分消化は、十分に整列された地図を調製することができる。流された「その場での制限消化」が、断片を混乱させるならば、この地図は、整列されておらず、有用な指紋ではない。
【０２１６】
ヒトゲノム（類）のための迅速地図：
流れに基づく制限地図化システムを作成する主要な目的は、速度であり、ゲルに基づく装置に比べて、分析技術の単純な自動化である。ここで記載した流れシステムの処理量は、５〜５００kb分子／分を画像化することができるか；又は更に、５〜１０分子、例えば２５〜５，０００kb分子／分を、平行して画像化できる。１時間で、１５０mgb を、処理することができ、それは、１．５ヒト染色体に匹敵する。２４時間で、一人のヒトゲノムのＤＮＡの量を画像化できる。これらの数は、都合よく、６１ＹＡＣｓ／日／人のCohen 実験室のＹＡＣ指紋化処理量に匹敵し；この速度は、単にコンピューターファイル段階に対するフィルムを記載している。ここで記載されている光学に基づく系においての可能な大きな処理量は、その高い情報量と組み合わされて、そのような迅速地図化を提供する。
【０２１７】
もし５００kb分子が、流されながら消化されるならば、整列された制限地図の作成は、５００kb断片あたりに行われた切断の数及び寸法決定の正確さに依存して、それらの断片から高い信頼度で行われる。明らかに、５００kb断片あたりの切断が多いことは、整列群形成を簡単にする。この流れ−切断方法に問題があれば、前述したSmith-Birnsteil の部分消化の方法を、また用いることができる。要約すれば、整列した制限地図は、地図化（又は指紋化）ＹＡＣｓを整列群に形成及び内部整列を決定させるために有用である。５０kb断片の、整列された、正確な制限地図は、整列群の同定のために必要とされるより少ない重複のために、適用範囲のために必要とされるゲノム同等物の数を減少させる。更に、これらの地図は、関連するゲノム構造及び構成を研究するための重要な資源である。ゲノムＤＮＡの良好な資源は、部分的に消化され５００kb重複断片を生成する、流れ分類染色体からのものであることができる。ここで、再び光学地図化は、理想的には、この比較的乏しい（ＤＮＡ分子の数の意味で）ＤＮＡの資源の問題とすべきである。光学地図化は、電気泳動に基づく方法よりもより大きな情報密度でデータを調製することができるので、単一分子から生成させた十分に正確に寸法決定された断片で、ハイブリッド形成−指紋化なしに、整列群を構築することができる。
【０２１８】
比較において、電気泳動法は、不十分にしか分布の特性を明らかにしないし、多重断片型からなるゲルバンドを分析するためにハイブリッド形成を必要とする。アガロースゲルを操作し、いずれかの明確さで１００の別々のバンドに分離することは、一般的ではない。この方法は、指紋化した大きなＹＡＣｓを用いた、大部分成功したCohen の仕事に類似した、地球的方法で、全体のゲノム分析のために適切である。
【０２１９】
整列させた制限地図は、簡単な指紋よりも多くの情報を提供するので、整列群形成のためには、簡単な非整列制限指紋よりも重複が少ないことが必要である。しかしながら、これらの５００kb部分消化断片は、非整列又は部分整列地図を調製するためにそれらを消化してより簡単に指紋化することができる。必要ならば、そのような指紋化は、サザンブロット（１１、３８）で通常用いられている同じ方法でLINE-1（１１、１２６）のような配列のＲｅｃＡ−仲介ハイブリッド形成で増加させることができる。
【０２２０】
要約すると、本発明の中型−塩基寸法決定方法は、顕微鏡を用いて分子の特性を明らかにすることを含む。分子、特に小さな、又は中間−寸法の分子は、媒体中に置かれ、次いで従来の技術によりスライド上に載せられる。大きな分子は、スペルミン凝縮剤を用いて、破壊の問題を避けて、顕微鏡スライドに搭載される。ある点において、この分子は、着色されてもよい。この分子は、電場の適用により媒体中で摂動を受けることができる。次いで、この場を閉じて、分子を、平均して球形若しくは楕円体であるその平衡コンホメーション、又はある位置を仮定するように緩和させる。ビデオカメラに接続した画像処理装置が、分子を数え、そしてそれらの形状変化を追跡する。分子の緩和、再配向、回転の動力学、並びにそれらの長さ及び直径が自動的に計算され、そして画像化された分子のすべてに対する分子量が、確立された関係から計算される。
【０２２１】
【実施例】
本発明を更に十分に示すために下記の例を提示するが、その範囲を限定するものとして意図するものではない。
【０２２２】
実施例１．
顕微鏡のためのＤＮＡの調製
Ｇ．バクテリオファージをFangman, W. L. Nucl. Acids Res., 5，p653-665 (1978) に記載されるように成長させ、そしてそのままのウィルスを１／２×ＴＢＥ緩衝液（１Ｘ：８５mM  Trizma Base, Siqma Chemical, St.Louis, MO)、８９mMホウ酸及び２．５mM２ナトリウムＥＤＴＡ）に溶解し、次にエタノールで沈殿させることによりＤＮＡを調製した：この工程は、パルス電気泳動及び顕微鏡分析により判断してＤＮＡを剪断しなかった。
【０２２３】
ＤＮＡ溶液（０．１μg/μl 、１／２×ＴＢＥ中）を１／２×ＴＢＥ中の１．０％低ゲル化温度アガロース(Sea Plaque, FMC, Rockport, ME）、０．３μg/mlＤＡＰＩ(Sigma Chemical)、１．０％２−メルカプトエタノールで希釈し（約０．１〜０．２ng/al アガロース）そして６５℃に保った。ＤＮＡ以外のすべての物質を０．２ミクロンフィルターに通して蛍光破壊層を減じた。パルス化電気泳動を使用して実験条件により融解することが可能なＤＮＡをチェックし、そして問題がないことが判明した。
【０２２４】
実施例２．
ゲル中の画像形成ＤＮＡ
実施例１の試料を顕微鏡スライドの上に置いた。試料を封入するために、ピペットマンと剪断を減ずるために端部を切り離したピペットチップを使用して予熱したスライドとカバースリップに約３μl のＤＮＡ−アガロース混合物を注意深く移した。図１及び図２に示すような縮小パルス電気泳動装置に調製したスライドを配置した。すべての残りの工程を室温で行った。試料を数分間予備電気泳動しそしてデータが回収される前に緩和するにまかせた。クロントロールタイム(Chrontrol, San Diego, CA)又はＩＢＭ  ＡＴコンピューターに収められ、Hewlett Packard ６１１５Ａ精密電源により給電されるアドロンデータ発生ボードの何れかでパルス場を発生させた。フルークデジタルマルチメーター(J. Fluke, Everett, WA）に接続された補助電極で場強度を測定した。ＤＡＰＩ蛍光のために適したエピ蛍光光学機器を備えたZeiss Axioplan顕微鏡(Carl Zeiss, West Germany)及び Zeiss１００×Plan Neofluar 油浸対物レンズを試料可視化のため使用した。蛍光的にラベルしたＤＮＡに光損傷を避けるため中程度密度フィルターを使用して励起光を減衰した。２４００シリコン補強ターゲット（ＳＩＴ）カメラ(Hamamatsu, Middlesex, NJ)をＩＣ−１画像プロセッシングシステム(Inovision, Research Triangle Park, NC）と結合させて使用して顕微鏡からビデオ画像を処理した。各５又は６秒の割合で連続して画像を得て、時間コースあたり２００ほどのデジタル画像を記憶できた。各デジタル化時間経過画像は、３０Hzで得られた８フレームの積分から得、これはコイル運動による縞を避けるために十分に速かった。時間経過取得が完了した後に、顕微鏡を焦点外に導き、そしてバックグランド画像を得た。初めに、バックグランド画像のコピーを減衰することによって各時間経過画像を処理し、平均バックグランド強度は平均時間経過画像強度の８２％であった。この減衰したバックグランドを時間経過画像から控除し、得られた画像を線状延伸コントラスト増巾アルゴリズムに付した。Polaroid Freeze Frame ビデオ画像レコーダー(Polaroid, Cambridge, MA）を使用して処理画像の写真を得た。
【０２２５】
実施例３．
ゲル中での分子の摂動
実施例２の分子をＰＯＥにより摂動した。選択された比の一連の比較的短い正規パルスを使用することによりＰＯＥを行い、長時間の後に、この場の一つの極性を切り換えた。この切り換え時間と正規場の比は、パルス時間と場角度のパルス電気泳動変数に類似している。
【０２２６】
ＰＯＥ実験を記載するために使用した用語は次の通りである：３，５−８０秒パルス、３ボルト/cM 。「３，５−８０秒」とは３秒のパルス南−北、続いて５秒のパルス東−西：この３，５秒サイクルの８０秒後に、５秒のパルスの極性を別に８０秒間（西−東）に変え、そして含まれる分子に対してジグザグ階段通路を形成する。パルス強度は、３ボルト/cM であった。
【０２２７】
本例においては、エピ蛍光顕微鏡をＰＯＥ法と組み合わせて、電気泳動の間にＤＮＡコンホメーション及び位置の変化の一般的研究を可能にする。図２に示す適合した顕微鏡試料室を用いるＰＯＥ法を本実験に使用し、一方、オンとオフにスイッチされる通常の電場を使用した。長軸の周りで分子を回転するために必要であるように、電場を種々の角度で適用するときにはＰＯＥは、ある種の利点を供する。
【０２２８】
図１及び図２は適合したＰＯＥ試料室の線図を示す。
【０２２９】
実施例４．
ゲル中の分子緩和の観察及び測定
ＰＯＥを６００秒（３，５−８０秒パルス、３ボルト/cm)間行った後に実施例１−３のＧバクテリオファージＤＮＡの緩和を観察した。
【０２３０】
画像プロセッサーを使用して、例えば「特性分析」を通して、緩和過程の画像形成を定量化し、自動化する。図３（ａ）に示すように、連続した画像をデジタル化し、記憶した後に特性分析を行う。次いで、この画像プロセッサーが画像中の分離した対象物を確認し、それらを数え、そして形状によりそれらの特性を明らかにする。例えば、コンピューターは、歪んだコイルを収集するために有効な楕円軸（長軸及び短軸）を測定し、そして緩和過程の間にコイルが球状コンホメーションに近づく時間の関数として、これらの特性を計算する。他のタイプのコンピューター化測定も、またＤＮＡの特性を明らかにすることができる。
【０２３１】
１２秒間隔で得られた図５に示す画像は、９６秒時間間隔にわたって幾つかの分子の緩和を示す。（ａ）では、幾つかのコイルが、適用された場が切られた後の３秒を示している。このコイルは、顕微鏡分解能の限界まで測定されるように、適用電気パルスにより画定された同じ波形階段通路（矢印でマークされた分子を見よ）を介して緩和するように見える。（ｃ）では、分子は二つに分割されたものとして示され、そして（ｊ）では、すべてのコイルは、丸い、延伸していないコンホメーションに緩和した。（ｊ）に示す棒は、長さ１０μm である。
【０２３２】
実施例５．
緩和動力学の測定により一つ又はそれ以上の分子の分子量決定
緩和動力学の測定による分子
実施例１〜３の方法により画像形成のための既知の分子量の分子を調製し、そして実施例１〜４の方法により分子の緩和時間を測定する。画像形成により緩和時間データを収集し、分子量と類似の組成のＤＮＡ分子の緩和時間の間の数学的関係を計算するために用いる。次に、未知の寸法の分子の試料の緩和時間を測定し、そして既知の寸法の分子に基づいて決定した数学的関係を用いて分子の寸法を計算する。
【０２３３】
実施例６．
ゲル中の再配向速度の測定により一つ又はそれ以上の分子の分子量決定
適用された電場により誘起されるような再配向を測定することによってアガロース又はポリアクリルアミドゲルのようなマトリックス中で、任意の寸法のポリマー、しかし特に小さすぎて画像形成できないもの（約０．１μm 未満）を寸法決定する。自由溶液中で再配向測定を行えるが、不必要なポリマー対流及び運動を阻止するので、マトリックスが適している。加えて、マトリックスの存在は、再配向機構が異なるので、部分的には寸法感度を高める。その実験的機能及び多分１５から２０メガ塩基の非常に高い寸法分解能の故に、ＰＯＥは再配向時間を測定するために特に有用である。ＤＮＡ分子のような硬いポリマー（１５０塩基対未満の寸法）は、棒状で溶液中に存在し、回転拡散係数（長軸の周りにスピンしようとすると棒により感知される摩擦）は、Ｍ3 として変わる。顕微鏡を使用して、画像化されるに十分大きな分子を可視化し、そして画像からその再配向時間を決定する。任意の寸法の分子、特に小さすぎて可視化できないものに対して、分光分析法により視野の中で各棒の再配向を測定するのが好ましい。二つのこのような方法を下記に詳細に記載し、即ち蛍光二色性及び複屈折である：
【０２３４】
１）立体的に予知できる方法で結合する発色団（エチジウムブロマイドをＤＮＡ分子の中に挿入する）をポリマー分子に結合する。偏光放射線を用いて発色団を励起する。全蛍光強度を測定することは一時的に各分子の配向情報を提供する。増感マイクロ−チャンネルプレート検出器を使用して顕微鏡場の中で各分子の蛍光放射線を測定する。
【０２３５】
２）複屈折測定で分子の配向動力学を追跡する。複屈折技術は屈折率の変化を測定し、これは溶液又はマトリックス中のマクロ分子の配向と容易に相関する。ＤＮＡ分子がゲル電気泳動を受けている間に複屈折測定を行う。電場を適用するときに、ＤＮＡ分子は延伸し、場で整列し、これによって屈折率を変化させる。時間と共に複屈折の変化を測定することによって、分子は適用された電場で配向するので、ＤＮＡプロプトレイン運動の詳細を理解することができる。
【０２３６】
更に特に、小さい周波数差だけ異なるレーザー線（赤色光）の二つの直角の偏光面の相差（二つの周波数レーザーにより供される）を測定することによって複屈折測定を行う。分子が、パルスコントローラー８２により発生される適用電場（ＰＯＥ試料室中７４）で整列するにつれて、屈折率は分子整列と共に変化する。光は、検出器７６により検出され、そして透過放射線で相差を生じ、この数値をレーザー７０で供される標準と比較することにより相検出器７８（図３ｂ）で測定される。時間の関数として（場適用の時間）得られる相差データをデジタル化し、そして後の検索と分析のためにコンピューター８０に記憶させる。
【０２３７】
図１及び図２に示した計器は、必要な場を適用して分子再配向を引起こさせる。多くの異なる回転機構が、場の中で分子を最適に寸法決定するために記載されている。例えば、ポリマー試料で共鳴周波数を見出すために回転場周波数を掃去できる。
【０２３８】
実施例７．
ゲル中の分子の回転時間の測定による一つ又はそれ以上のＤＮＡ分子の分子量決定
棒状又は硬いコイル状の形状の分子を、実施例１〜４におけるように調製しかつ観察するが、ただしアガロースゲルよりむしろアクリルアミドを選択的に使用できる。
【０２３９】
実施例６に記載した技術の何れか一つを使用して顕微鏡に基づくシステムでコイル又は棒の回転の速度を測定する。分子がその中心の周りでスピンするにつれて正弦波で変化する信号について測定する。この正弦波信号を使用して棒の長さの３乗として変わる、回転摩擦係数に正弦波信号の時間を適合させることにより、ポリマー寸法又は分子量を決定する。換言すると、正弦波信号から測定されるような測定角速度（ラジアン／秒）は、自由溶液中で３乗される棒の長さとして変わる（Boersma, S. (1960) J. Chem. Phys. 32: p1626-1631, p1632-1635）。
【０２４０】
定数ｔで、提案されたシリーズの実験に対する条件を下記に示す。
【０２４１】
【表１】
0003650617.tif 000005
【０２４２】
したがって、最初の例では、５ボルト/cm パルスの、対、３つ組又は他の組が反対方向に０．１ミリ秒間連続的に適用され、各連続したセットのパルスの最初の方向が出発点から時計方向に１０度だけ増加する。
【０２４３】
既知の分子量の分子をゲルに入れ、そして前記の電場を適用するときにその回転速度を測定する。回転時間データを収集し、かつ分子量と特定のゲル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の回転時間の間の数学的関係を計算するために用いる。次に好ましくは同様の電場を用いて、未知の寸法の分子の回転時間を測定し、既知の寸法の分子に基づいて決定した数学的関係を用いて分子の寸法を計算する。
【０２４４】
実施例８．
ゲル中のＤＮＡ分子の曲線の長さの測定により一つ又はそれ以上の分子の分子量の決定
既知の分子量の分子に対して実施例１〜４の方法を行う。分子が摂動状態にある間に分子の曲線の長さの測定を、分子を可視化することによって収集し、これを用いて分子量と長さの間の数学的関係を計算する。類似の組成及び未知の寸法の摂動された分子の曲線の長さを実施例１〜４の方法を用いて測定し、既知の寸法の分子に基づいて決定された数学的関係を用いて分子の寸法を計算する。図４及び図５は、曲線長さ測定を行うことができる摂動された分子を示す。
【０２４５】
実施例９．
ゲル中のＤＮＡ分子の直径の測定により一つ又はそれ以上の分子の分子量の決定
既知の分子量の分子に対して実施例１〜４の方法に従うが、ただし分子が完全に緩和した状態にあるときに測定を行う。実質上球状又は楕円体のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の単数又は複数の直径の測定値を収集し、用いてゲル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の分子量と直径の間の数学的関係を計算する。次に未知の寸法の分子の直径を測定し、既知の寸法の分子に基づいて決定した数学的関係を用いて分子の寸法を計算する。図４（ａ）及び図５（ｊ）は、直径測定を行うことができる緩和した分子を示す。
【０２４６】
実施例１０．
画像形成のための大きなＤＮＡ分子の調製
挿入法及びパルス電気泳動を用いて、Saccharomyces cerevisiaeからの染色体ＤＮＡ分子を調製し、かつ分離した。比較的低温の融解を許すようにした調製のため低ゲル化温度アガロースゲル（FMC, Rockland, Main)を使用した。紫外線はＤＮＡ分子を破壊するので、所望のバンドをゲルから切出し、ゲルから切出されたエチジウム着色側面縁部分で先導し、これを次に３０１nmトランスイルミネーター装置で写真化した。次いで、このバンドを秤量し、そして室温で３時間水中で１０倍過剰の１０mMのスペルミンで平衡させた。ＤＮＡを凝縮するにはスペルミンは非常に低いイオン強度環境を必要とし、そして幸運にも電気泳動に使用した緩衝液は低いイオン強度であり、したがって平衡工程の必要性を排除した。この平衡させた試料を次に２時間７４℃で炉で融解し、融解後にＤＡＰ１（１μg/ml) 及び２−メルカプトエタノール（１％）を加えた。融解したアガロース／ＤＮＡ混合物３μl を、予熱した顕微鏡スライドに塗布し、そして混合物がゲル化する前にカバースリップを上面に載せた。次に、１００×Plan Neofluar 対物レンズを適合したZeiss Axioplanエピ蛍光顕微鏡を用いて、このスライドを観察すると、カバースリップサンドイッチの縁を通して、塩の添加により凝縮されることができる小さな強く輝く球を示した。
【０２４７】
前記のように、スペルミンは低イオン強度の環境で特に有用である。他方、ＤＮＡ分子が高いイオン環境に置かれる場合には、同じタイプの凝縮効果がアルコールで得られる。これらの例の何れもが本発明の範囲を限定するものとして意図されるつもりはない。
【０２４８】
実施例１１．
Schizosaccharomyces pombe 染色体ＤＮＡ分子の制限地図化
Schizosaccharomyces pombe のＤＮＡ、寸法で３、６及び８−１０メガ塩基の三つの染色体上に分配された約１７〜１９メガ塩基のゲノム寸法を有する菌のＤＮＡを実施例１０の方法により、凝縮と非崩壊により、顕微鏡のために調製した。３〜５μl アガロース混合物は、約０．１ngのＤＮＡ、０．５％のｂ−メルカプトエタノール、１μg/mlＤＡＰ、１００μg/ml牛血清アルブミン（アセチル化物; Bethesda Research Laboratories, Gaitherburg, MD)及び１０〜２０単位の適当な制限酵素を含有する。この混合物を短時間３７℃に保ち、顕微鏡スライド上に注意深く搭載し、次にカバースリップを上に載せた。制限酵素で分解の前に、二つの方法の一つでこのＤＮＡを延伸する：
【０２４９】
（１）カバースリップを動かすことにより液体スライド／アガロース／カバースリップサンドイッチを場合によりわずかに剪断し、又は（２）例えば、図３に記載したＰＯＥ機器を用いて電場を適用する。ゲルが硬化すれば、１０mM塩化マグネシウム溶液をサンドイッチの中に拡散させる。マグネシウムイオンが、ＤＮＡ／酵素複合体に達するときに、この酵素は、ＤＮＡ分子を切断する。
【０２５０】
顕微鏡装置を用いて一端から他端までＤＮＡ鎖を追跡し、そして切断部位を注目することにより制限切断部位の位置を決定する。これらの部位は、鎖中で間隙として現われ、これは酵素消化の前には連続している。次の下記のことを含む本発明の顕微鏡方法により断片の各々の寸法を決定する：（１）各断片の曲線の長さを測定すること、（２）断片が緩和するにまかせ、そしてその直径を測定すること、（３）適用された電場又は流れ場（ゲルを通して溶媒を動かすことにより生ずるように）で各断片のコンホメーションを摂動し、そしてコンホメーション及び位置の変化の直接可視検出又は分光分析と組み合わせた顕微鏡で緩和動力学を測定すること。大きな分子に対して直接可視観察が適しているが、小さすぎて画像形成できない断片に対して他の方法が十分に適している。
【０２５１】
蛍光顕微鏡を用いて観察するときに、得られた試料は、三つの異なる寸法で、Ｍ0.33として変わる直径を有する多数の輝く球を示し、これは球の体積に対する式４／３πＲ3 に基づいている。また、このゲルは、マグネシウムイオンが存在するときにのみ活性である制限酵素を含有する。
【０２５２】
実施例１２．
単一ＤＮＡ分子へ核酸プローブのその場所でのハイブリッド形成
前記の実施例１〜４に記載したように、顕微鏡のための核酸を調製する。核酸分子を含有するアガロース媒体は、またラベル化プローブ及びプローブによりターゲット分子の鎖組み換えを仲介する、組換え酵素、ｒｅｃＡを含有する。鎖組み換えと対合は、Ｄループ化により起こる（参照、Radding. C., Ann. Rev. Genet. 16: p405-37 (1982)）。ＡＴＰ及びマグネシウムイオンを加えて反応を開始させる。実施例１１に記載するようにこれらの成分は、スライド／ゲル／カバースリップサンドイッチの中に拡散する。この反応を３７℃でインキュベートする。異なるラベルを有するプローブを用いて多くの異なるターゲット分子を同時に分析する。
【０２５３】
前記に特に記載したもの以外の本発明の方法の変法は、本発明の範囲内である。例えば、分子の他のパラメーターを測定でき、そして種々のタイプの顕微鏡及び分光分析装置を使用できる。分子回転を行うためのパルス化ルーチンを変更できる。前記の技術の組み合わせも考えられる。例えば、種々のタイプの外力、媒体及び分光分析技術の組み合わせは、本発明の範囲内である。更に、測定技術は、何回もくり返すことができ、そして各トライアルからの測定を平均することができる。
【０２５４】
実施例１３．
光学的地図作成によって構成したSaccharomyces cerevisiaeの染色体の整列制限地図
画像の光学地図化（例えば図６に示したような）は、画像を着色にする；制限酵素による消化の間に、着色された、単一の、脱タンパクＤＮＡ分子を；制限部位の直接整列地図化を可能にする。要約すると、流れ場（又は、原理的に、又は別の種類の電場）を用いて、溶融アガロースに溶解したＤＮＡ分子を延伸させ、ゲル化の間にその場に固定する。
【０２５５】
非限定的な例として、１．００％のSeakem低温融解アガロース（ＦＭＣ）、１／２×ＴＢＥ（４２．５mM Trizma Base、４４．５mMのホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ２ナトリウム）を用い、イーストの染色体ＤＮＡ（イースト菌株：ＡＢ９７２）をパルス電気泳動によって分析した［Schwartz et al., Cell, Vol.37, p67 (1984) ］。切断ゲルバンドをＴＥ（１０mMのトリス−Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）中でくり返し平衡させた。ゲルを包埋し、次いで、精製した染色体を、０．１ mg/mlのアセチル化ウシ血清アルブミン、１％のβ−メルカプトエタノール、０．１％のTritonＸ−１００（Boehringer Manheim社、膜品質）及び０．２μg/mlの４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有する、マグネシウムを含まぬ制限緩衝液中でゆっくり攪拌しつつ、４℃で一晩で平衡させた。体積が５０〜１００μl の範囲で平衡させた試料を７２℃、５分間で融解し、次いで、３７℃に冷却した。酵素約０．３〜０．５μl(２〜１４単位／μl)をスライド上に展開した。酵素反応の温度は、メーカーによる勧告のとおりであった。β−メルカプトエタノールは、光分解を防止するために加え［M. Yanagida et al., Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylor et al., eds., Alan R. Liss, N.Y. USA, p321-345 (1986)］、電気泳動を用いた消化に対する何らかの有害な作用について、この濃度で試験した。代表的には、７μl の体積の融解した試料を、広口ピペットチップを用いて１８×１８mmカバーグラス上に（ゆっくりと）移し、スライド上に素早く置いた。タイミング及びゲルの急冷は、延伸を制御するのに決定的に重要である。そうして、反応室（reaction chamber）を鉱油で密閉して、蒸発を防ぎ、アガロースを４℃で少なくとも３０分間ゲル化させてから、５０mMＭｇＣｌ2 を開放空間中に拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）及びIII(３４５kb）については、分子の早すぎる緩和を防ぎつつ、ゲル化を早めるために、注型前にスライドを冷デシケーター（４℃）に入れた。より遅く緩和する、より大きい染色体については、スライドを室温に保った。このスライドは、３７℃で温度制御した顕微鏡の載物台に載せた(Csp Iを除く、３０℃）。ゼラチン工程は、酵素切断の間に、延伸した分子がランダムコイルコンホメーションへと認め得るまでに緩和するのを抑える。溶融アガロース−ＤＮＡ混合物に制限酵素を加え、ゲル化した混合物（顕微鏡のスライドに載せた）中に拡散したマグネシウムイオンによって、切断を誘発する。切断部位は、画像化された分子における増大する間隙として可視化される。ＤＮＡ分子は、エピ蛍光（ＵＶ励起及び青色発光のための４８７９０１フィルターパック）のために備えたZeiss Axioplan又はAxiovert１３５顕微鏡、及びHammamatsuＣ２４００ＳＩＴカメラと結合させた１００倍又は６３倍のPlan-Neofluar 対物レンズ(Zeiss社）を用いて画像化した。カメラの制御を調整して、強度範囲のいずれかの末端でデジタイザーを飽和させるのを避けるように注意した。２０秒ごとに、３２のビデオフレームを８ビットにデジタル化し、Macintosh に基づくBiovision 画像プロセッサ、又はPixel パイプラインデジタイザー（Perceptics社）を用いて積分して、１３ビットの精度を得た。コンピュータ制御のシャッターを用いて、１画像あたり１．５秒に照明を限定し、代表���な実験について全体で約１３５〜２５５秒とした。中位密度フィルターを用いて、照明強度を、対物レンズで測定して１００μW 未満に保持した。対照実験は、これらの条件下でＤＮＡ分子に対する損傷を全く示さなかった。デジタル化した画像は、ディスクに直接記録し、テープに保管した。得られた断片は、二通りに：即ち、生成物の相対蛍光強度を測定すること、及び固定用ゲル中でのＤＮＡ分子の相対見かけ長さを測定することによって、寸法決定した。その後、寸法決定した断片の順序を単に記録するのみによって、地図を構成した。長さ及び相対蛍光強度は、請求に応じて著者から入手できる（電子メール：huff@ mcclb0.med.nyu.edu）、Wayne Rasband によるMacintosh 用のＮＩＨ画像の改良版を用いて、１６ビットの精度へと計算した。要約すると、初めの未処理画像を拡大フォーマットに表示し、ＤＮＡを手描きでトレースすることによって、上書きの画像を作成した。長さの地図は、この上書きから直接作成した。強度の計算のためには、１３ビットの原データの画像を平滑化し、フォアグランド画素全体を網羅するよう５倍に拡大した。上書きに記された画素のそれぞれについて、合成したバックグランド値を周囲の画素の、距離と共に減少する、記された画素すべてに対して０である荷重による荷重平均として計算した。これらの値は、ＤＮＡが不在であったならば測定されたはずの値に近似させることを意図している。ある特定のＤＮＡ断片の強度は、断片の全画素の合計からそれに合致するバックグランド画素を減じたものであった。断片の面積は、２倍に拡大した初めの上書きであった。劣悪な焦点によるものを除いて、上書きの画像を有した原データの各フレームについて、この工程をくり返した。１回の切断に続く５葉の画像について、強度の結果を平均し、その２断片の相対寸法を、ｘ／（ｘ＋ｙ）及びｙ／（ｘ＋ｙ）として計算した。断片ｙが、その後ｕ及びｖへと切断するならば、ｕの寸法に対しては（ｙ／（ｘ＋ｙ））（ｕ（ｕ＋ｖ））を用いる。得られる数は、その後の解析の目的のための単一の試料を構成する。唯一つの分子を利用するのではなく、少数の分子を平均することは、正確度を向上させ、望ましくない分子を排除する。試料を平均し、ｎ−１の自由度でのｔ分布、及び試料の標準偏差を用いて、平均に対する９０％信頼区間を計算した。この計算は、データが正規分布からの無作為試料を表すならば、有効である。母集団の平均が信頼区間内に入る９０％の可能性が存在する。染色体Ｉについては、報告された信頼区間は、短い断片からの下方限界と長い断片からの上方限界とを採用することによって見出した。母集団の標準偏差に対する９０％信頼区間は、試料の標準偏差、試料の数、及びｎ−１の自由度でのカイ二乗分布を用いて計算した。この区間の中点を用いて、母集団の標準偏差を算定した。変動係数（ＣＶ）は、試料の平均で除した、算定した母集団の標準偏差である。プールした標準偏差は、偏差の平均の平方根である。相対誤差は、報告された値で除した、本発明者らの値と報告された値との差である。光学的地図形成は、制限断片のリアルタイムでの整列化と、迅速で正確な寸法決定手法とを結合したために、非常に迅速である。光学的地図作成は、分析用電気泳動、クローン化ライブラリー、プローブ又はＰＣＲのプライマーの必要性なしに、真核染色体又はＹＡＣｓの整列化制限地図を迅速に作成するための、強力な新技術である。増大した技術改善は、ほ乳類染色体の迅速で高分解度の地図作成、及びＹＡＣｓの整列化を可能にするに違いないと思われる。
【０２５６】
ゲルの固定、並びに張力及び切断下でのＤＮＡ関連の機構：２００μm の長さ（６００kb）の単一の大きいＤＮＡ分子は、溶液中ではランダムコイルであって、直径が平均８μm の緩やかに詰められた球として可視化できる（Roberts, 1975)。光学的地図作成は、そのようなＤＮＡ分子を延伸し、その場に固定して急速な緩和を阻害してから、光学顕微鏡によって画像化することで始まる。固定された分子は、上首尾に画像化するには浅い焦点面内に置かなければならない。ゲル中で延伸した分子は、機械的には、伸びたばねのように挙動し［Schwartz, Koval （1989）］、固定された分子は張力下にあり、コイルの緩和の間にランダムなコンホメーションへと解放される。しかし、過剰な固定は、光学的地図作成のためには望ましくなく、それは、制限切断部位は、増大する間隙として検出かつ画像化されるためには、緩和しなければならないからである。
【０２５７】
Zimm［Zimm, (1991)］は、電気泳動の間に、アガロースゲルに包埋されたＤＮＡ分子を、相互に張力下にあるコイルセグメントの一連の結合されたプールとしてモデル化し、プールの間を往復するコイルセグメントの自由エネルギーの変化に伴う力（ｆｉ）は、ｆｉ＝３ｋＴ／（２ｎｉｂ）（（ａ２／ｎｉｂ２）−１）＋（ｋＴ／ｂ）ＩｎＣ［Chumakov, Nature, Vol.359, p380 (1992)］によって与えられることを計算したが、ここで、ｋは、ボルツマン定数であり、ａは、ゲルの細孔径であり、ｎｉは、関与するコイルセグメントの数であり、ｂは、コイルセグメントの長さであり、Ｔは、温度であり、そしてＣは、コイルセグメントの構造に関係する定数である。この結果は、プール間に発生する張力は、細孔容積に含まれるセグメントの数に反比例することを示す（式１）。したがって、延伸され、延伸した分子は、緻密な、緩和したそれより大きい張力下にあると結論される。
【０２５８】
大きいＤＮＡ分子は、流れの力によって溶融アガロース中で延伸し、次いで、アガロースのゲル化によって、電場の適用なしにその場で急速に固定することができる。１．００％のSeakem低温融解アガロース（ＦＭＣ）、１／２×ＴＢＥ（４２．５mM Trizma Base、４４．５mMのホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ２ナトリウム）を用い、イーストの染色体ＤＮＡ（イースト菌株：ＡＢ９７２）をパルス電気泳動によって分析した［D.C. Schwartz and C.R. Cantor, Cell, Vol.37, p67 (1984）］。切断ゲルのバンドをＴＥ（１０mMのトリス−Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）中でくり返し平衡させた。ゲルを包埋し、次いで、精製した染色体を、０．１ mg/mlのアセチル化ウシ血清アルブミン、１％のβ−メルカプトエタノール、０．１％のTritonＸ−１００（Boehringer Manheim社、膜品質）及び０．２μg/mlの４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有する、マグネシウムを含まぬ制限緩衝液中でゆっくり攪拌しつつ、４℃で一晩で平衡させた。体積が５０〜１００μl の範囲で平衡させた試料を７２℃、５分間で融解し、次いで、３７℃に冷却した。酵素約０．３〜０．５μl(２〜１４単位／μl)をスライド上に展開した。酵素反応の温度は、メーカーによる勧告のとおりであった。β−メルカプトエタノールは、光分解を防止するために加え［M. Yanagida et al., Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylor et al., eds., Alan R. Liss, N.Y. USA, p321-345 (1986)］、電気泳動を用いた消化に対する何らかの有害な作用について、この濃度で試験した。代表的には、７μl の体積の融解試料を、広口ピペットチップを用いて１８×１８mmカバーグラス上に（ゆっくりと）移し、スライド上に素早く置いた。タイミング及びゲルの急冷は、延伸を制御するのに決定的に重要である。そうして、反応室を鉱油で密閉して蒸発を防ぎ、アガロースを４℃で少なくとも３０分間ゲル化させてから、５０mMＭｇＣｌ2 を開放空間中に拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）及びIII(３４５kb）については、分子の早すぎる緩和を防ぎつつ、ゲル化を早めるために、注型前にスライドを冷デシケーター（４℃）に入れた。より遅く緩和する、より大きい染色体については、スライドを室温に保った。このスライドは、３７℃で温度制御した顕微鏡の載物台に載せた(Csp Iを除く、３０℃）。実験的には、ゲル化の速度論は、温度、及びアニーリング条件の最適化によって制御される。本発明者らの分析のためには、ＤＮＡコイルを臨界的に延伸しなければならない。即ち、過多ならば、分子は画像化するのが困難になり、過少ならば、切断された部位を露出させるには不充分な張力しか存在しない。１．００％のSeakem低温融解アガロース（ＦＭＣ）、１／２×ＴＢＥ（４２．５mM Trizma Base、４４．５mMのホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ２ナトリウム）を用い、イーストの染色体ＤＮＡ（イースト菌株：ＡＢ９７２）をパルス電気泳動によって分析した［D.C. Schwartz and C.R. Cantor, Cell, Vol.37, p67 (1984）］。切断ゲルのバンドをＴＥ（１０mMのトリス−Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）中でくり返し平衡させた。ゲルを包埋し、次いで、精製した染色体を、０．１mg/ml のアセチル化ウシ血清アルブミン、１％のβ−メルカプトエタノール、０．１％のTritonＸ−１００（Boehringer Manheim社、膜品質）及び０．２μg/mlの４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有する、マグネシウムを含まぬ制限緩衝液中でゆっくり攪拌しつつ、４℃で一晩で平衡させた。体積が５０〜１００μl の範囲で平衡させた試料を７２℃、５分間で融解し、次いで、３７℃に冷却した。酵素約０．３〜０．５μl(２〜１４単位／μl)をスライド上に展開した。酵素反応の温度は、メーカーによる勧告のとおりであった。β−メルカプトエタノールは、光分解を防止するために加え［M. Yanagida et al., Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylor et al., eds., Alan R. Liss, N.Y. USA, p321-345 (1986)］、電気泳動を用いた消化に対する何らかの有害な作用について、この濃度で試験した。代表的には、７μl の体積の融解試料を、広口ピペットチップを用いて１８×１８mmカバーグラス上に（ゆっくりと）移し、スライド上に素早く置いた。タイミング及びゲルの急冷は、延伸を制御するのに決定的に重要である。そうして、反応室を鉱油で密閉して蒸発を防ぎ、アガロースを４℃で少なくとも３０分間ゲル化させてから、５０mMＭｇＣｌ2 を開放空間中に拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）及びIII(３４５kb）については、分子の早過ぎる緩和を防ぎつつ、ゲル化を早めるために、注型前にスライドを冷デシケーター（４℃）に入れた。より遅く緩和する、より大きい染色体については、スライドを室温に保持した。このスライドは、３７℃で温度制御した顕微鏡の載物台に載せた(Csp Iを除く、３０℃）。過剰に延伸させた分子は、１画像画素あたり過少な蛍光色素を提示するため、分子の測定強度がバックグランド値に近づく。その上、固定工程は、いくらかのコイルのずれが、切断部位を露出させるのに充分なだけ穏やかでなければならない。これら及び他の考慮を斟酌して、その曲線の輪郭の長さの約２０％に及ぶ分子を形成するよう、本発明者らの固定条件を最適化した。
【０２５９】
アガロースのゲル化によってＤＮＡ分子が捕捉される機構は知られていない。画像化され、延伸された分子は、鎖の緩和の証拠であるコイルの明るい円形のプールをその末端に示す（図８及び１０）。このプールの寸法は、１〜３μm の範囲にわたる。セグメントのプールは、内部にも形成され、次いで、コイルの張力の局所的個所が相互に平衡するにつれて、消滅するのが観察される。ＤＮＡ分子が、それが跨る隣接するゲル細孔の列内で緩和するにつれて、セグメント密度は増大し、隣接する細孔空間内にセグメントが溢出するのをさえ認められる。詳細な緩和機構は複雑なものである［de Gennes et al., Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell University Press (1979)］。間隙は、延伸したポリマーの立体配置エントロピーが緩和状態のそれより低いことから、分子が効果的な張力を受けるために出現する。単純な記述的水準では、この過程は、隙間のない管内に閉じ込められた、側面に孔を有する延伸させた厚いゴムの帯の緩和を観察することに譬えられる。切断は、分子内に新たな末端を生成することによって、そしておそらくは、捕捉された断片をエネルギーの局所的な最小値から解放する機械的摂動を生起することによっても緩和を加速する。
【０２６０】
高開口数の顕微鏡の対物レンズは、染色されたＤＮＡ分子の明るく、高コントラストではあるが、非常に浅い焦点深度の画像を形成することができる。実験的には、焦点を合わせようとする長い分子については、約０．２μm の厚さの平面内にそれが存在しなければならない。本発明者らのゲル固定の方法は、光学的に測定される限りでこの０．２μm の公差以内にある分子の可視化を、再現可能なように許す。この驚くべき光学的平坦度は、ゲル化の前にガラス表面の間に形成された、流体の放物線形の流体流の図形から得られる。更に、溶解したアガロース及びＤＮＡ分子は、層流を促進する一方で、乱流の開始を防ぐことによって、この効果を強化し得る［Atkins (1992）］。
【０２６１】
最後に、大きいＤＮＡ分子のゲル固定は、特に生化学的反応を可視化できる事象と結合できるときは、他のシステムにも幅広く適用できるのに充分なだけ簡便である。
【０２６２】
単一分子の制限消化：光学的地図作成は、よりランダムなコンホメーションへと断片が緩和するにつれて、固定された分子に出現する間隙として、制限酵素切断部位を検出する（図１３、１５）。異なる制限酵素による酵素的切断の速度は変りうる［Wells et al., Genetics, Vol.127, p681 (1981)］から、タイミングの注意深い調整が決定的に重要である。切断は、早すぎる反応は、断片を同期させる試みを打ち砕くため、分子の固定が完了した後にのみ生じなければならない。このタイミングという問題は、アガロース−ＤＮＡ溶液を制限酵素と３７℃で混合しておき、ゲルをかき乱すことなく、マグネシウムイオンを視野内に拡散させることにより、反応を誘発することによって解決された。１．００％のSeakem低温融解アガロース（ＦＭＣ）、１／２×ＴＢＥ（４２．５mM Trizma Base、４４．５mMのホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ２ナトリウム）を用い、イーストの染色体ＤＮＡ（イースト菌株：ＡＢ９７２）をパルス電気泳動によって分析した［D.C. Schwartz and C.R. Cantor, Cell, Vol.37, p67 (1984) ］。切断ゲルのバンドをＴＥ（１０mMのトリス−Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）中でくり返し平衡させた。ゲルを包埋し、次いで、精製した染色体を、０．１ mg/mlのアセチル化ウシ血清アルブミン、１％のβ−メルカプトエタノール、０．１％のTritonＸ−１００（Boehringer Manheim社、膜品質）及び０．２μg/mlの４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有する、マグネシウムを含まぬ制限緩衝液中でゆっくり攪拌しつつ、４℃で一晩で平衡させた。体積が５０〜１００μl の範囲で平衡させた試料を７２℃、５分間で融解し、次いで、３７℃に冷却した。酵素約０．３〜０．５μl(２〜１４単位／μl)をスライド上に展開した。酵素反応の温度は、メーカーによる勧告のとおりであった。β−メルカプトエタノールは、光分解を防止するために加え［M. Yanagida et al., Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylor et al., eds.,  Alan R. Liss, N.Y. USA, p321-345 (1986) ］、電気泳動を用いた消化に対する何らかの有害な作用について、この濃度で試験した。代表的には、７μl の体積の融解試料を、広口ピペットチップを用いて１８×１８mmカバーグラス上に（ゆっくりと）移し、スライド上に素早く置いた。タイミング及びゲルの急冷は、延伸を制御するのに決定的に重要である。そうして、反応室を鉱油で密閉して蒸発を防ぎ、アガロースを４℃で少なくとも３０分間ゲル化させてから、５０mMＭｇＣｌ2 を開放空間中に拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）及びIII(３４５kb）については、分子の早すぎる緩和を防ぎつつ、ゲル化を早めるために、注型前にスライドを冷デシケーター（４℃）に入れた。より遅く緩和する、より大きい染色体については、スライドを室温に保持した。スライドは、３７℃で温度制御した顕微鏡の載物台に載せた(Csp Iを除く、３０℃）。間隙とは別に、切断部位での断片の末端へのＤＮＡの明るく凝縮されたプール又は「球体」の出現によっても、切断を信号化した。これらの球体は、切断の直後に形成され、末端に好んで生じるコイル緩和の結果として生じる（図１３、１５）。セグメントのこのプールの形成は、間隙として実際の切断から出現し得る、焦点が合っていないセグメントを区別するのを助けるため、地図の作成に役立つ。切断は、増大する間隙の出現と、切断部位でのセグメントの拡大する明るいプールとの双方によって、より信頼できるように記録される。
【０２６３】
地図の構成−断片数の決定：大規模な制限地図は、電気泳動で導かれたデータから主として構成されている。方法の新たな１組が、顕微鏡に基づく手法を用いて、単一のＤＮＡ分子からなることができる試料について断片を寸法決定し、整列化するために開発されている。最初の工程は、１分子内の切断部位の数を決定することである。１分子内の切断部位は、Ｍｇ2+添加後の不規則な時間に出現する傾向がある。可能なすべての切断部位は、同時に出現することはなく、代りに、切断は、ここに記載した条件下では、通常、相互の５分以内に出現する。消化の程度は、断片の数と寸法との双方を包含する多数の要因に依存する。Not I で消化したイースト染色体の選ばれた１組についての光学的地図作成によって得られた消化結果を、図７に表示する。幸運にも、公刊されたNot I 制限酵素の地図は、すべてのS. cerevisiae の染色体について入手可能であり［Link（1991）］、光学的地図作成の方法論の信頼できる基準形成を可能にしている。
【０２６４】
スライドに載せた代表的な試料は、ただ１個の視野内に約３〜５個の分子を含み、全体では、そのうちのおおよそ５０〜９５％が、ここに記載した基準による１個所又はそれ以上の切断の証拠を示す。図７のヒストグラムは、公刊された結果を上回る切断部位の総数は極めて少ないことを示している。Not I で消化された染色体Ｖについての切断頻度の結果（図７Ｂ）は、充分に切断された分子の数は、１回だけ切断された分子すべてのそれの約半数であることを示す。完全な消化に対応する値は、載せた試料中には、同一寸法の染色体Ｖ及びVIIIのＤＮＡ分子の同等の分布が存在すると仮定することによって計算される。これらの染色体についてのNot I 制限地図は、染色体Ｖは３個所の切断部位を有するが、VIIIは２個所のみ有するにすぎないことを明らかにする。染色体XIの切断頻度のデータ（図７Ｃ）は異なり、切断された分子すべての２５％は、充分に消化された（２個所の切断部位）ことが認められる。見かけ上低い頻度についての説明は、この染色体は、より大きい断片よりも光学的に検出するのが困難な３０kbの寸法のNot I 断片を形成するというものである。この結果は、切断を横切る張力は、おそらく断片の寸法に依存性であるため、より小さい延伸した断片が、より少ない張力を適用させることを考慮すると、意外ではない。更に、切断部位を横切るコイルの張力は、その同定のために必要とされることから、さらなる切断は、最終的には緩和して、分子の張力全体を減少させ、それ以上の切断の観察を妨げる断片を、形成するものと思われる。最後に、染色体XIII及びXVI のような、非常に大きい、１メガ塩基の寸法の分子が展開されていて、これらのデータ（図７Ｄ）は、分子のおおよそ半数は、観察できる切断能力によって、載物の際に完全に消化（１回の切断）されることを示している。
【０２６５】
ヒストグラムの解析によって決定された切断の最大数は、その分子が寸法についての強度及び長さの測定によって適正に平均化できる切断部位の最大の数を収容する区分である。
【０２６６】
切断の検出に対するコイル緩和の影響：小さい断片が関与する事例とは別に、不完全な消化が図７のヒストグラムのすべてに認められる。可能な事例は、写真照射の人工物から、顕微鏡の試料室の現在の設計による相互作用までの範囲にわたるが、ここで観察された部分的消化は、間隙、又は明確な球体を形成できない緩和様式による、与えられた切断部位でのコイルの不完全な緩和に大部分が帰せられる。現実の実施の際は、様々な異なる緩和様式が観察され、そのいくつかが図８に描かれている。緩和様式は、切断の検出を促進する（８−Ｄ）ことも、妨害する（８−Ｈ）こともできる。電場又は流れ場の適用は、そのような部位での緩和を誘発し、それらの検出を許すのに用い得ると思われる。平行する電気泳動の実験は、類似の実験的条件下での実質的に完全な消化を示す［Hernandez]。
【０２６７】
興味深いことに、染色体Ｉについてのデータは、ほとんど完全な消化を示す（９５％；図７Ａを参照されたい）。消化の下での染色体Ｉの画像（図１３Ａ）は、予測された１回のみの切断が観察された後に、図８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄで解釈されたとおり、切断部位の末端のみが緩和するにすぎず、セグメントの明るいプールがその末端に累積する（２０分子）が、残余の末端は、その場で固定されるように見えることを示している。緩和したコイルセグメントの明るいプールは、上記のとおり、ゲル固定されたＤＮＡ分子の末端に累積する。
【０２６８】
おそらく、アガロースに包埋された染色体Ｉの末端は、一種の分子リベットとして挙動して（図９）、それと、介在する分子のセグメントとの間に発生する張力に反応して、切断検出のための理想的な機械的条件を与えるのである。狭い範囲の相互作用が優る結果、延伸した分子の末端に存在する緩和したコイルの量は、寸法の何らかの閾値より上の分子量を有して、あまり変動しない可能性が高いと思われる。そのために、相対的に短い分子、例えば染色体Ｉは、より長いそれ、例えば染色体XIII及びXVI より大きい比率の緩和したコイルセグメントをその末端に含むと思われる。
【０２６９】
相対強度による断片の寸法決定：第二の工程は、得られた制限断片を寸法決定することである。この目的のために、二通りの相補的な方法を用いることができ、一つは、断片の相対蛍光強度に基づき、第二は、相対見かけ長さの測定に基づく。しかし、いずれの方法も絶対値を与えることはないが、それぞれ、容易に標準化できる。幸運にも、上記のゲル固定の手法は、分子全体を焦点内に導入できることから、強度測定のための天然の基質を生成する。ゲル固定は、２５０μm にも及ぶ分子を平坦化することが可能である。焦点が合っていない分子のセグメントは、いかなる単純な方法でもそれらの強度が量に比例しないため、強度測定に用いることができない。ここで、適切な観察とは、延伸した分子が実質的に緩和したとき、その質量の大部分が、予測したとおり、焦点外に移動することであって、それは、流体中で充分に緩和した７００kbのＤＮＡ分子の水力学的直径が８μm であるのに、顕微鏡下で分子を画像化するのに用いられる焦点深度は、約０．２μm であるからである。
【０２７０】
顕微鏡内でのＤＮＡ断片の絶対蛍光強度は、多くの変数、例えばカメラの感度制御やランプの明るさによって決定され、それゆえ、測定するのに望ましい量ではない。（同じ親分子からの）２個の断片の相対強度を計算することによって、断片の一方が、他方に対する強度の内部参照として役立つことができる。相対強度は、既知又は独立に決定された染色体サイズを乗じることによって、kbに換算される。長さ及び相対蛍光強度は、請求に応じて著者から入手できる（電子メール：huff@ mcclb0.med.nyu.edu)、Wayne Rasband によるMacintosh 用ＮＩＨ画像化の改良版を用いて、１６ビットの精度へと計算した。それ以上の詳細も入手できる（原稿を作成中）。要約すると、初めの未処理画像を拡大フォーマットで表示し、ＤＮＡを手描きでトレースすることによって、上書きの画像を作成した。長さの地図は、この上書きから直接作成した。強度の計算のためには、１３ビットの原データの画像を平滑化し、フォアグランド画素全体を網羅するよう５倍に拡大した。上書きに記された画素のそれぞれについて、合成したバックグランド値を周囲の画素の、距離とともに減少する、記された画素すべてに対して０である荷重による荷重平均として計算した。これらの値は、ＤＮＡが不在であったならば測定されたはずの値に近似させることを意図している。特定のＤＮＡ断片の強度は、断片の全画素の合計からそれに合致するバックグランド画素を減じたものであった。断片の面積は、２倍に拡大した初めの上書きであった。劣悪な焦点によるものを除いて、上書きの画像を有した原データのフレームのそれぞれについて、この工程をくり返した。切断に続く５葉の画像について、強度の結果を平均し、２個の断片の相対寸法をｘ／（ｘ＋ｙ）及びｙ／（ｘ＋ｙ）として計算した。断片ｙがその後ｕ及びｖへと切断されるならば、ｕの寸法に対しては（ｙ／（ｘ＋ｙ））（ｕ（ｕ＋ｖ））を用いる。得られる数は、その後の解析の目的のための単一の試料を構成する。光学的輪郭最大化の手法は、少数の分子を含有する試料を寸法決定するのに用いることができる［Guo, Nature, Vol.359, p783 (1992) ］。図１０Ａは、光学的に測定し、電気泳動に基づく測定に由来する公刊された値［Link, Genetics, Vol.127, p681 (1991)］に対してプロットした、一連のイースト染色体の Not I制限断片についての強度の値を示す。斜線に近い点は、良く一致している。低精度（８ビット）の強度データに基づいた染色体Ｖ及びVIIIの結果を無視し、６０kb未満の短い２個断片を無視すると、プールされた標準偏差は３６kbであり（図５Ａ、挿入図）、変動係数の平均は１６％であって、定型的なパルス電気泳動による寸法決定に匹敵する。公刊された結果との相関関係は優れ、相対誤差の平均が５％であるのに対して、公刊された誤差は平均４％である［Link, Genetics, Vol.127, p681 (1991)］。試料を平均し、ｎ−１の自由度でのｔ分布、及び試料の標準偏差を用いて、平均に対する９０％信頼区間を計算した。この計算は、データが正規分布からの無作為試料を表すならば有効である。母集団の平均が信頼区間内に入る９０％の可能性が存在する。染色体Ｉについては、報告された信頼区間は、短い断片からの下方限界と長い断片からの上方限界とを採用することによって見出した。母集団の標準偏差に対する９０％信頼区間（図１０の挿入グラフ）は、試料の標準偏差、試料の数、及びｎ−１の自由度でのカイ二乗分布を用いて計算した。この区間の中点を用いて、母集団の標準偏差を算定した。変動係数（ＣＶ）は、試料の平均で除した、母集団の算定された標準偏差である。プールされた標準偏差は、変差の平均の平方根である。相対誤差は、報告された値で除した、本発明者らの値と報告された値との差である。強度正規化の手順に部分的に起因して、精度は、非常に小さい断片については、より低くなり、寸法の一致は、３０及び５５kbの測定については劣っている。蛍光強度の測定は、下記の確定値のほとんど２倍でこれらの断片を寸法決定する。これらの測定のバックグランドを補正するアルゴリズム、及びデータ収集の過程を変えることは、精度を有意に向上させるに違いないと思われる。
【０２７１】
相対蛍光強度測定の有効性の一つの試験は、使用可能な範囲の分子緩和条件にわたって断片の強度の恒常性をモニターすることである。この必要条件は、制限断片が寸法的に大きく異なるとき、最も厳格に試験される。図１１は、３種類の代表的な寸法について、絶対強度を分子長の測定に対比した結果を示す。これらの結果は、測定された分子長の３〜４倍の変化にもかかわらず、広い寸法範囲にわたって強度が相対的に一定のままであることを示している。この有益な効果は、部分的には、固定条件が穏やかである結果、ブラウン運動がｚ軸沿いに延伸したコイルを振動させることに帰せられる。即ち、この運動は、消化が進行するにつれて、生のビデオモニターで明確に観察される。１秒間隔でフレームを平均することによって、ほとんどのＤＮＡが、焦点面を通過して、ゲル細孔内を移動するときに観察される。
【０２７２】
相対見かけ長さによる断片の寸法決定：見かけの長さの測定の物理的根拠は単純である。即ち、ゲルに包埋された制限断片のそれぞれは、平均して等しいコイル密度を有すると仮定される。即ち、各断片は、多少とも延伸されるような同じ変化を有するため、形成された多数の搭載物の長さの平均は、相対寸法の良い尺度を与える。再び、相対見かけ長さは、染色体寸法を乗じることによって、kbに換算される。長さ及び相対蛍光強度は、請求に応じて著者から入手できる（電子メール：huff@ mcclb0.med.nyu.edu）、Wayne Rasband によるMacintosh 用ＮＩＨ画像化の改良版を用いて、１６ビットの精度へと計算した。それ以上の詳細も入手できる（原稿を作成中）。要約すると、初めの未処理画像を拡大フォーマットで表示し、ＤＮＡを手描きでトレースすることによって、上書きの画像を作成した。長さの地図は、この上書きから直接に作成した。強度の計算のためには、１３ビットの原データの画像を平滑化し、フォアグランド画素全体を網羅するよう５倍に拡大した。上書きに記された画素のそれぞれについて、合成したバックグランド値を周囲の画素の、距離とともに減少する、記された画素すべてに対して０である荷重による荷重平均として計算した。これらの値は、ＤＮＡが不在であったならば測定されたはずの値に近似させることを意図している。ある特定のＤＮＡ断片の強度は、断片の全画素の合計からそれに合致するバックグランド画素を減じたものであった。断片の面積は、２倍に拡大した初めの上書きであった。劣悪な焦点によるものを除いて、上書きの画像を有した原データのフレームのれぞれについて、この工程をくり返した。切断に続く５葉の画像について、強度の結果を平均し、２個の断片の相対寸法をｘ／（ｘ＋ｙ）及びｙ／（ｘ＋ｙ）として計算した。断片ｙがその後ｕ及びｖへと切断されるならば、ｕの寸法に対しては（ｙ／（ｘ＋ｙ））（ｕ（ｕ＋ｖ））を用いる。得られる数は、その後の解析の目的のための単一の試料を構成する。そうして、制限断片の見かけの長さを換算して、４分子という少数から良好な正確度を得る。試料を平均し、ｎ−１の自由度でのｔ分布、及び試料の標準偏差を用いて、平均に対する９０％信頼区間を計算した。この計算は、データが正規分布からの無作為試料を表すならば有効である。母集団の平均が信頼区間内に入る９０％の可能性が存在する。染色体Ｉについては、報告された信頼区間は、短い断片からの下方限界と長い断片からの上方限界とを採用することによって見出した。母集団の標準偏差に対する９０％信頼区間（図１０の挿入グラフ）は、試料の標準偏差、試料の数、及びｎ−１の自由度でのカイ二乗分布を用いて計算した。この区間の中点を用いて、母集団の標準偏差を算定した。変動係数（ＣＶ）は、試料の平均で除した、母集団の算定された標準偏差である。プールされた標準偏差は、変差の平均の平方根である。相対誤差は、報告された値で除した、本発明者らの値と報告された値との差である。相対見かけ長さの測定を、蛍光強度の測定の際のように、同じ１組の制限断片と照合したが、これらの結果（図１０Ｂ）は、１６％という類似の平均相対誤差を示している（３０及び９０kbの断片を除く）。プールされた標準偏差は４７kbであり（図１０Ｂの挿入図）、変動係数の平均は２９％であった。
【０２７３】
見かけの分子長の測定は、強度の測定より確固としているが、低精度であり、その結果、同等な正確度を達成するためには、追加の測定を必要とする。しかし、長さの良好な測定は、わずかに焦点が合っていない断片から得ることができるが、不鮮明な、焦点が合っていない画像は、強度に基づく測定を混乱させることになる。長さによる小さい断片の寸法決定は、強度によるよりも良好であった。３０kbの断片は、長さでの４４kbそして強度で７０kbの寸法であり、５５kbの断片は、長さでの４９kbであり、そして強度での８８kbであった。光学的地図作成には限定された試料数がつきものであるとすれば、結果を交叉検定するために二通りの寸法決定方法を有することは、上首尾の地図の作成に極めて重要である。
【０２７４】
長さ及び強度の測定に基づく地図の構成：図１２は、[Link, Genetics,Vol.127, p681 (1991)］と比較した光学的地図作成によって形成した３形式の整列化制限地図を示す。示された棒は、図１０にプロットしたように Not I制限断片の寸法決定解析の結果に対応する。図１３は、Not I で消化した異なるイースト染色体ＤＮＡ分子の、選ばれ、処理された蛍光顕微鏡写真を示す。１．００％のSeakem低温融解アガロース（ＦＭＣ）、１／２×ＴＢＥ（４２．５mM Trizma Base、４４．５mMのホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ２ナトリウム）を用い、イーストの染色体ＤＮＡ（イースト菌株：ＡＢ９７２）をパルス電気泳動によって分析した［D.C. Schwartz and C.R. Cantor, Cell, Vol.37, p67 (1984) ］。切断ゲルのバンドをＴＥ（１０mMのトリス−Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）中でくり返し平衡させた。ゲルを包埋し、次いで、精製した染色体を、０．１mg/ml のアセチル化ウシ血清アルブミン、１％のβ−メルカプトエタノール、０．１％のTritonＸ−１００（Boehringer Manheim社、膜品質）及び０．２μg/mlの４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール２塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有する、マグネシウムを含まぬ制限緩衝液中でゆっくり攪拌しつつ、４℃で一晩で平衡させた。体積が５０〜１００μl の範囲で平衡させた試料を７２℃、５分間で融解し、次いで、３７℃に冷却した。酵素約０．３〜０．５μl （２〜１４単位／μl)をスライド上に展開した。酵素反応の温度は、メーカーによる勧告のとおりであった。β−メルカプトエタノールは、光分解を防止するために加え［M. Yanagida et al., Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylor et al., eds., Alan R. Liss, N.Y. USA, p321-345 (1986)］、電気泳動を用いた消化に対する何らかの有害な作用について、この濃度で試験した。代表的には、７μl の体積の融解試料を、広口ピペットチップを用いて１８×１８mmカバーグラス上に（ゆっくりと）移し、スライド上に素早く置いた。タイミング、及びゲルの急冷は、延伸を制御するのに決定的に重要である。そうして、反応室を鉱油で密閉して蒸発を防ぎ、アガロースを４℃で少なくとも３０分間ゲル化させてから、５０mMＭｇＣｌ2 を開放空間中に拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）及びIII （３４５kb）については、分子の早すぎる緩和を防ぎつつ、ゲル化を早めるために、注型前にスライドを冷デシケーター（４℃）に入れた。より遅く緩和する、より大きい染色体については、スライドを室温に保持した。スライドは、３７℃で温度制御した顕微鏡の載物台に載せた(Csp Iを除く、３０℃）。これらの画像は、固定された分子での増大する間隙の出現によって、進行する消化を明確に示す。そのような断片のデータから、２０秒ごとに得られた経時的画像の点検から順序を決定した。ＤＮＡ分子は、エピ蛍光（ＵＶ励起及び青色発光のための４８７９０１フィルターパック）のために備えたZeiss Axioplan又はAxiovert１３５顕微鏡、及びHammamatsuＣ２４００ＳＩＴカメラと結合させた１００倍又は６３倍のPlan-Neofluar 対物レンズ(Zeiss社）を用いて画像化した。カメラ制御を調整して、強度範囲のいずれかの末端でデジタイザーを飽和させるのを避けるように注意した。２０秒ごとに、３２のビデオフレームを８ビットにデジタル化し、Macintosh に基づくBiovision 画像プロセッサ、又は Pixelパイプラインデ���タイザー（Perceptics社）を用いて積分して、１３ビットの精度を得た。コンピュータ制御のシャッターを用いて、１画像あたり１．５秒に照明を制限し、代表的な実験について全体で約１３５〜２５５秒とした。中性密度フィルターを用いて、対物レンズで測定して１００μW 未満に照明強度を保った。対照実験は、これらの条件下でＤＮＡ分子に対する損傷は全く示さなかった。デジタル化した画像は、ディスクに直接記録し、テープに保管した。観察した分子は、移動する傾向があり、ときには他の分子と混同されることがあるため、「切断中の配列」又は「切断中の映画」の検査が、分子−分子相互作用の解放を簡単にする。光学的地図（長さ又は強度）と電気泳動に基づく地図との一致は優れている。第三の形式の制限地図（「Ｃｏｍ」、図７）は、長さ及び強度に由来するデータを組み合わせることから得られる。即ち、小さい制限断片（＜６０kb）からのデータは、長さによって寸法決定したが、強度の測定は、地図を完成するのに必要な残りの断片の寸法を与える。
【０２７５】
図１４は、光学的地図作成によって、染色体III 及びXIのRsr IIによる消化、並びに染色体XIの Asc Iによる消化から作成した整列化制限地図を示すが、図１５は、代表的な消化物の対応する蛍光顕微鏡写真を示す。４７kbの母集団のプールされた標準偏差を用いて信頼区間を計算して、相対見かけ長さが得られる。染色体、酵素、平均±９０％信頼kb（試料数）の順に、Ch. III 、Rsr II、２６４＋／−２７（８）、８６＋／−２７（８）；Ch. XI、Asc I 、４２＋／−５５（２）、１９５＋／−５５（２）、２４２＋／−５５（２）；Ch. XI、Rsr II、６７＋／−４５（３）、１２７＋／−４５（３）、２２１＋／−４５（３）、２６０＋／−４５（３）。３６kbの母集団のプールされた標準偏差を用いて信頼区間を計算して、相対蛍光強度が得られる。Ch. III 、Rsr II、２５６＋／−２１（８）；Ch. XI、Asc I 、８０＋／−４２（２）、１７７＋／−４２（２）、１８１＋／−４２（２）、２３７＋／−４２（２）；Ch. XI、Rsr II、８４＋／−３４（３）、１２５＋／−３４（３）、２２６＋／−３４（３）、２４０＋／−３４（３）。これらの結果を独立に証明するために入手できる公刊された地図は、皆無である。最初に、切断頻度データ（図７に類似）から切断部位の最大数を決定することによって、これらの地図を構成する。次いで、充分に切断された分子からの断片を長さ及び強度によって寸法決定し、平均するための区分へと分類する。相対蛍光強度の測定は、長さが測定される断片を分類するのに用いる。明らかに、隣接する断片は、平均するための隣接する区分に入らなければならない。消化物における特徴的なパターン、例えば、非常に小さいものの次に位置する非常に大きい断片は、正確な分類を容易にする。部分的消化物からのデータも、地図を確認するのに用いた。部分的消化物からのデータは、予測される部分的断片長を計算し、それらを観察されたデータと比較することによって、充分に切断された分子から構成した地図を確認するのに用いた。
【０２７６】
非常に長い分子、例えばＤＮＡ分子の物理的地図作成への分析的方法の新規な１組が、本発明によって提供されるが、これは、単純で、本来的に非常に迅速である。イーストの染色体に関するほとんどリアルタイムでの地図作成方法が実行されているが、これは、この方法論の究極的な可能性からははるかに隔たっている。クローン化、電気泳動、サザン分析及びＰＣＲを含む、ほとんどの従来のゲノム解析の手段を迂回しているため、光学的地図作成の速度のさらなる増大は、ロボット工学又は自動化における進歩に基づいていない［Chumakov, Nature, Vol.359, p380 (1992)］。試料室の設計、試料の取扱い、画像の解析及び情報科学における単純な工学的進歩が、ゲノム全体を迅速に地図作成することや、より重要なことに、配列情報の知識を、それぞれの生物の原型ではなく個体の母集団にまで拡大することが可能な、高処理量の方法を利用可能にするに違いないと思われる［Cavalli-Sforza, Am. J. Hum. Genet., Vol.46, p649 (1990) ］。
【０２７７】
雑誌論文若しくは抄録、公開されたか、又は相当する米国若しくは外国の特許出願、発行された米国若しくは外国の特許、あるいは他のいかなる参考文献も含めて、ここに引用したすべての参考文献は、参照によって、引用された参考文献中に提示されたすべてのデータ、表、図面及び本文を含めて全体的にここに組み込まれる。更に、ここに引用された参考文献中で引用された参考文献の内容全体も、参照によって全体的に組み込まれる。
【０２７８】
既知の方法の工程、慣用の方法の工程、既知の方法、又は従来の方法に対する参照は、決して、本発明のいかなる側面、記載又は実施態様も、関連技術に開示され、教示され、若しくは示唆されていることの承認ではない。
【０２７９】
特定の実施態様に関する前述の記載は、本発明の全般的性格を全く充分に明示していると思われるため、当分野の範囲内の知識（ここに引用された参考文献の内容も含む）を適用することによって、他者は、不適当な実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなしに、そのような特定の実施態様を容易に変更し、及び／又は様々な用途のために適合させることができる。したがって、ここに提示された教示及び指針に基づき、そのような適応及び変更は、開示された実施態様の等価物の意味並びに範囲の中にあるものとする。ここでの語法又は用語は、説明の目的のためであって、限定するものではないため、本明細書の用語又は語法は、ここに提示された教示及び指針に鑑み、技量を有する技術者によって、当分野の通常知識と組み合わせて解釈されるべきであることが理解されなければならない。
【０２８０】
参考文献
【０２８１】
【表２】
0003650617.tif 000006
【０２８２】
【表３】
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【０２８３】
【表４】
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【０２８４】
【表５】
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【０２８５】
【表６】
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【０２８６】
【表７】
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【０２８７】
【表８】
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【０２８８】
【表９】
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【０２８９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、蛍光顕微鏡研究に特に適した電気泳動顕微鏡の試料室(chamber) の略示図である。
【図２】図２は、本発明に使用できる電気泳動試料室の典型的な試料室電極の相互連絡を示す部分略示図及び部分ブロック線図である。
【図３】図３におけるＡ−Ｂは、本発明による媒体中のＤＮＡ分子の顕微鏡研究に用いられる方法の略示図及び複屈折を測定するための方法を示すより詳細な線図である。
【図４】図４におけるＡ−Ｉは、Ｇバクテリオファージが異なる方向での二つの連続して起る電場におかれた時の、ＤＮＡ分子コンホメーション及び位置変化を示している。
【図５】図５におけるＡ−Ｊは、実施例４で記載された蛍光顕微鏡実験により明らかにされたように、６００秒間の電気泳動の後でのＧバクテリオファージＤＮＡの緩和の間でのＤＮＡ分子コンホメーション及び位置変化を示している。
【図６】図６は、光学地図化を示し、ここでＤＮＡ分子及び制限酵素は、マグネシウムなしで溶融したアガロースに溶解されている。このＤＮＡ分子は、混合物がスライドとカバースリップの間にはさまれているとき、発生した流れにより引き伸ばされている。延伸した分子は、アガロースゼラチンにより場所に固定されている。ゲル中のマグネシウムイオンは、消化を開始させ、そして切断部位は、分子断片が緩和したとき成長する間隙のように見える。
【図７Ａ】図７Ａは、分子寸法及び切断部位の数での変化を示す Not I切断頻度での光学地図化のヒストグラムを示す。切断頻度は、顕微鏡野中（典型的には３〜５分子を含む）に存在する分子中での切断を数えることにより記録された。約半分の場合に、切断がないことを示し、記録されなかったので、これは、非切断分子の数を過小評価している。期待された切断部位の数及び染色体寸法は、（１４）から、７（Ａ） Ch. 1、１（２４０kb）である。染色体対Ｖ及びVIII、及びXIII及び XVIは、同じ量で共存する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、分子寸法及び切断部位の数での変化を示す Not I切断頻度での光学地図化のヒストグラムを示す。切断頻度は、顕微鏡野中（典型的には３〜５分子を含む）に存在する分子中での切断を数えることにより記録された。約半分の場合に、切断がないことを示し、記録されなかったので、これは、非切断分子の数を過小評価している。期待された切断部位の数及び染色体寸法は、（１４）から、７（Ｂ）、Ch. V 及びVIII、３及び２（５９５kb）である。染色体対Ｖ及びVIII、及びXIII及び XVIは、同じ量で共存する。
【図７Ｃ】図７Ｃは、分子寸法及び切断部位の数での変化を示す Not I切断頻度での光学地図化のヒストグラムを示す。切断頻度は、顕微鏡野中（典型的には３〜５分子を含む）に存在する分子中での切断を数えることにより記録された。約半分の場合に、切断がないことを示し、記録されなかったので、これは、非切断分子の数を過小評価している。期待された切断部位の数及び染色体寸法は、（１４）から、７（Ｃ）Ch. XI、２（６７５kb）である。染色体対Ｖ及びVIII、及びXIII及び XVIは、同じ量で共存する。
【図７Ｄ】図７Ｄは、分子寸法及び切断部位の数での変化を示す Not I切断頻度での光学地図化のヒストグラムを示す。切断頻度は、顕微鏡野中（典型的には３〜５分子を含む）に存在する分子中での切断を数えることにより記録された。約半分の場合に、切断がないことを示し、記録されなかったので、これは、非切断分子の数を過小評価している。期待された切断部位の数及び染色体寸法は、（１４）から、７（Ｄ）Ch. XIII及び XVI、 １（９５０及び９７５kb）である。染色体対Ｖ及びVIII、及びXIII及び XVIは、同じ量で共存する。
【図８】図８におけるＡ−Ｈは、一回切断、ゲル固定、延伸した分子のいくつかの制限断片緩和モードを示している。水平の矢印は、緩和の方向を示している。Ａに示されたモードは、切断まえの固定された分子であり、Ｂ−Ｅは、検出しうる切断分子を生成する可能な緩和モードであり、そしてＦ−Ｈは、検出できない切断分子の緩和モードである。
【図９】図９は、コイル末端でのセグメントのプール又は「球」を形成する可能な緩和の仕方を模式的に示している。アガロースゲルは、分子がとりうる自由空間でのｐｅｇの系として示されている。ゲルｐｅｇは、ゲル化の間に埋め込まれたＤＮＡ分子と交差することができ、多分それを取り込むことができる。プール領域に位置するこのコイルセグメントは、関連する下位−コイル領域を含み、それらの間で伸びきったコイルよりもより高いエントロピーを持っている。これらのプールは、ある環境、特にこのセグメントプールのかたまりが交差しているコイルのそれに近づいているならば、分子のリベットとして働く。
【図１０Ａ】図１０Ａは、報告されている結果に対しプロットされた、記載されたように計算された S. cerevisiae染色体類、Ｉ、Ｖ、VIII、XI、XIII及び XVIからの Not Iエンドヌクレアーゼ制限断片のための光学地図化寸法決定の結果を示している。この対角線は、参照のためである。典型的断片の画像は、この図に示されている。実施例１３を参照のこと。挿入図は、母集団標準偏差（kb）の評価を示している。誤差の線は、平均（主図）又は標準偏差（挿入図）で９０％信頼性（７）であること表している。図１０Ａは、断片寸法の相対的強度決定を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、報告されている結果に対しプロットされた、記載されたように計算された S. cerevisiae染色体類、Ｉ、Ｖ、VIII、XI、XIII及び XVIからの Not Iエンドヌクレアーゼ制限断片のための光学地図化寸法決定の結果を示している。この対角線は、参照のためである。典型的断片の画像は、この図に示されている。実施例１３を参照のこと。挿入図は、母集団標準偏差（kb）の評価を示している。誤差の線は、平均（主図）又は標準偏差（挿入図）で９０％信頼性（７）であること表している。図１０Ｂは、断片寸法の相対的見かけの長さを示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、見かけの長さに対する正規化絶対強度の分散プロットを示している。個々の画像からの絶対強度が、計算され（６）、そして光学地図化に用いた典型的な時間間隔（１０〜１５分）にわたり、見かけの長さに対してプロットされた。それぞれの試料に対して、初めの強度は、５個の隣接する画像の群からの絶対強度値を平均し、そして最も大きな値をとり求めた。数個の試料からのこの値は、その試料のための初めの強度により、それぞれの画像からの値を除して正規化された。（Ａ）染色体Ｉ１２０kb   Not I断片、７試料。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、見かけの長さに対する正規化絶対強度の分散プロットを示している。個々の画像からの絶対強度が、計算され（６）、そして光学地図化に用いた典型的な時間間隔（１０〜１５分）にわたり、見かけの長さに対してプロットされた。それぞれの試料に対して、初めの強度は、５個の隣接する画像の群からの絶対強度値を平均し、そして最も大きな値をとり求めた。数個の試料からのこの値は、その試料のための初めの強度により、それぞれの画像からの値を除して正規化された。（Ｂ）染色体XI  ２８５kb   Not I断片、４試料。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、見かけの長さに対する正規化絶対強度の分散プロットを示している。個々の画像からの絶対強度が、計算され（６）、そして光学地図化に用いた典型的な時間間隔（１０〜１５分）にわたり、見かけの長さに対してプロットされた。それぞれの試料に対して、初めの強度は、５個の隣接する画像の群からの絶対強度値を平均し、そして最も大きな値をとり求めた。数個の試料からのこの値は、その試料のための初めの強度により、それぞれの画像からの値を除して正規化された。（Ｃ）染色体XI  ３６０kb   Not I断片、４試料。
【図１２】図１２は、S. cerevisiae 染色体ＤＮＡ分子の光学地図化の結果の Not Iエンドヌクレアーゼ制限地図と、報告されている地図（Ｌ＆Ｏ）の模式的比較である。地図は、長さ（Ｌｅｎ）、強度（Ｉｎｔ）又は両者の組み合わせ（Ｃｏｍ）から構成されている。光学的地図化データのための棒の長さは、図１０Ａ−Ｂでプロットされている平均に比例しており、典型的な画像は、図１３Ａ−Ｆに示されている。
【図１３】図１３におけるＡ−Ｆは、ＤＡＰＩで汚染し、 Not I制限エンドヌクレアーゼ切断でのアガロースゲル中に埋め込まれた S. cerevisiae染色体ＤＮＡ分子の典型的蛍光顕微鏡画像を示している。染色体ＤＮＡ分子は、実施例１３及び引用の参照例に記載されているように調製し、固定された。画像は、平滑化及び希薄化バックグランド画像を用いて背景較正され、１６−ビットの精度を用いて平滑化し、引き伸ばされた。画像は、切断部位を強調する矢印とともに、 Not I消化の展開を示している。間隔は、Ｍｇ+2の添加から測定された時間である。１３（Ａ） Ch. I（２４０kb)、２０及び６０秒；１３（Ｂ）Ch. XI（６７５kb）、５００、８８０及び１，１６０秒；１３（Ｃ） Ch. V（５９５kb）、２００、２４０、５２０秒；１３（Ｄ）Ch. VIII（５９５kb）、４４０、１，２２０及び１，３６０秒；１３（Ｅ）Ch. XIII（９５０kb）、１００及び５６０秒；１３（Ｆ） Ch. XVI（９７５kb）、 ４６０及び５６０秒。棒の長さ、５μm 。１００×対物倍率を（１３Ａ−Ｄ）の画像結果に対して用い、６３×対物倍率を（１３Ｅ及びＦ）に対して用いた。
【図１４】図１４は、 S. cerevisiae染色体III 及びXIのRsr II及び Asc Iエンドヌクレアーゼ制限消化からの光学地図化の結果を示している。地図は、完全切断の長さ（Ｌｅｎ）又は強度（Ｉｎｔ）データから構成され、部分切断長さを用いて精密化した。棒の長さは、計算された平均に比例し、典型的な画像は、図１５に示されている。切断の数は、図７でのようにして決定された。
【図１５】図１５におけるＡ−Ｃは、Rsr II又は Asc I制限エンドヌクレアーゼ切断の間でＤＡＰＩで着色され、アガロースゲル中に埋め込まれた S. cerevisiae染色体分子の蛍光顕微鏡画像を示している。染色体ＤＮＡ分子は、消化され、図１３でのように分析された。画像は、切断部位を強調する矢印とともに、 Not I消化の展開を示している。１５（Ａ）Ch. III 、Rsr II、１，１００及び１，８２０秒；１５（Ｂ）Ch. XI、Rsr II、２０、６００、９２０、１，０６０秒；１５（Ｃ）Ch. XI、 Asc I、１，１６０、１，５００、１，７８０、１，９４０秒。 SR II、 Csp Iに対するアイソシゾマーが、また、用いられ、同一の結果を与えた。棒の長さ、５μm 。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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