(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  次のアミノ酸配列（１）：
0003614183.tif 000071
から成る軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域、及び
（ｂ）ヒトＬ鎖定常（Ｃ）領域、
から成る、ヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体Ｌ鎖。
【請求項２】
（ａ）  次のアミノ酸配列（２）：
0003614183.tif 000072
から成る重（Ｈ）鎖Ｖ領域、及び
（ｂ）ヒトＨ鎖Ｃ領域、
から成るヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体Ｈ鎖。
【請求項３】
（ａ）  次のアミノ酸配列（３）：
0003614183.tif 000073
から成るＨ鎖Ｖ領域、及び
（ｂ）ヒトＨ鎖Ｃ領域、
から成るヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体Ｈ鎖。
【請求項４】
（１）（ａ）  次のアミノ酸配列（１）：
0003614183.tif 000074
から成る軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域、及び
（ｂ）ヒトＬ鎖定常（Ｃ）領域、
から成るＬ鎖；並びに
（２）（ａ）次のアミノ酸配列（２）：
0003614183.tif 000075
から成る重（Ｈ）鎖Ｖ領域、及び
（ｂ）ヒトＨ鎖Ｃ領域、
から成るＨ鎖；
から成る、ヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体。
【請求項５】
（１）（ａ）  次のアミノ酸配列（１）：
0003614183.tif 000076
から成る軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域、及び
（ｂ）ヒトＬ鎖定常（Ｃ）領域、
から成るＬ鎖；並びに
（２）（ａ）  次のアミノ酸配列（３）：
0003614183.tif 000077
から成る重（Ｈ）鎖Ｖ領域、及び
（ｂ）ヒトＨ鎖Ｃ領域、
から成るＨ鎖；
から成る、ヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の再構成ヒト抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２に記載の再構成ヒト抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項３に記載の再構成ヒト抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６に記載のＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る組換えベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る組換えベクター。
【請求項１２】
請求項６に記載のＬ鎖をコードするＤＮＡ及び請求項７に記載のＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る組換えベクター。
【請求項１３】
請求項６に記載のＬ鎖をコードするＤＮＡ及び請求項８に記載のＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る組換えベクター。
【請求項１４】
請求項９に記載の組換えベクター及び請求項１０に記載の組換えベクターにより同時形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
請求項９に記載の組換えベクター及び請求項１１に記載の組換えベクターにより同時形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１２に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
請求項１３に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１８】
請求項４に記載の再構成ヒト抗体の製造方法において、請求項１４に記載の形質転換体を培養し、そして培養物から当該再構成ヒト抗体を採取することを含んで成る方法。
【請求項１９】
請求項５に記載の再構成ヒト抗体の製造方法において、請求項１５に記載の形質転換体を培養し、そして培養物から当該再構成ヒト抗体を採取することを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項４に記載の再構成ヒト抗体の製造方法において、請求項１６に記載の形質転換体を培養し、そして培養物から当該再構成ヒト抗体を採取することを含んで成る方法。
【請求項２１】
請求項５に記載の再構成ヒト抗体の製造方法において、請求項１７に記載の形質転換体を培養し、そして培養物から当該再構成ヒト抗体を採取することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とから成るヒト／マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓｈｅｐｅｄ）ヒト抗体およびそれらの抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖に関する。
【０００２】
本発明はさらに、上記の抗体特にそのＶ領域をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトＩＬ−６に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【０００３】
【従来の技術】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一連の細胞により生産される多機能サイトカインである。このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そして宿主防御機構において中心的役割を演ずる（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ，７４，１−１０，１９８９）。このものは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮する。
【０００４】
ＩＬ−６遺伝子の異常発現が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発病に関与することが示唆されている（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１，４４３−４４９，１９９０；Ｃｌｅｉｎ，Ｂ．ら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔ．１，１９３−２０１，１９９０）。従って、ＩＬ−６の機能を阻害する抗体はヒト患者における治療剤として有用であることが期待される。
【０００５】
現に、形質細胞腫を有する末期患者を治療するためにヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体を用いた臨床研究において、形質細胞腫細胞の増殖のブロック、並びに循環Ｍ蛋白質、血清カルシウム、血清ＩｇＧ及びＣ−反応性蛋白質の低下が示された（Ｋｌｅｉｎ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ，７８，１１９８−１２０４，１９９１；Ｋｌｅｉｎ，Ｂら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，７７４−７７６，１９９２）。
【０００６】
マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法的価値は制限される。さらに、マウス抗体は、予定された効果を妨害するのみならず、患者における不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなくして頻回投与することはできない。
【０００７】
これらの問題を解決するため、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待することができる。
【０００８】
さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそれ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，１９８９）。
【０００９】
マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト抗体可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体可変領域を作製する。
【００１０】
次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト抗体定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと極く一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲは超可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１１】
再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４，７７３−７８３，１９９１；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，１９９１；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２；Ｃｏ．Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９−１１５４，１９９２；及びＳａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１−６，１９９３を参照のこと。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
前記のごとく、再構成ヒト抗体は治療目的のために有用であると予想されるが、ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しない。従って、特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，８５１−８５６（１９９３））。
【００１３】
本発明者らはヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２がｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験でＩＬ−６の機能を強く阻害し、従って、ＩＬ−６関連疾患に対する治療剤として期待できることを見い出した（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ら、第２１回日本免疫学会総会、学術集会記録、２１，１１６，１９９１）。従って、本発明は、ヒトＩＬ−６に対する、免疫原性の低い抗体を提供しようとするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２の再構成ヒト抗体に関する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、マウスモノクローナル抗体ＳＫ２の再構成ヒト抗体並びにキメラ抗体の製造のための遺伝子工学的方法に関する。
【００１５】
具体的には、本発明は、
（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−６に対するキメラ抗体、さらには、
（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、及び
（２）ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域から構成されるヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２の再構成ヒト抗体に関する。
本発明はまた、前記種々の抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖のポリペプチド、およびそれらをコードするＤＮＡに関する。
さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含んで成る発現ベクターおよび
それら発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−６に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト抗体の製造方法に関する。
【００１６】
【具体的な説明】
マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをクローン化するためには、マウスモノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを調製した後、既知の方法により一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的とするＤＮＡを増幅することで得られる。この全ＲＮＡの供給源として、ヒトＩＬ−６に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することが必要である。この様なハイブリドーマとして、ＳＫ２を挙げることができる。ハイブリドーマＳＫ２の作製方法を参考例１に後記する。
【００１７】
（１）全ＲＮＡの採取
本発明において、全ＲＮＡを採取するため、ハイブリドーマ細胞を破壊し、グアニジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾配遠心を行った（ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４，１９７９）が、すでに他の蛋白質の遺伝子をクローニングする際に用いられた方法、例えばバナジウム複合体等のリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処理を行う（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１４３，１９７９）方法を用いることができる。
【００１８】
（２）一本鎖ｃＤＮＡの採取
上記の如くして得た全ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得るには、全ＲＮＡを鋳型にして、その３′末端にあるｐｏｌｙＡ鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写酵素で処理して全ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する（Ｌａｒｒｉｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４，１９８９）ことができる。また、その時に、ランダムプライマーを用いてもよい。
【００１９】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるマウス抗体Ｖ領域の増幅
次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記ｃＤＮＡからマウス抗体Ｖ領域の特異的増幅を行う。マウス抗体Ｖ領域の増幅には、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．らＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１に記載されているプライマーを用いることができる。ハイブリドーマＳＫ２が産生するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のクローニングに用いるプライマーを決定するにあたり、Ｈ鎖およびＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決める必要がある。
【００２０】
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）を用いて、ＳＫ２抗体のタイピングを行った結果、ＳＫ２抗体はκ型Ｌ鎖およびＣγ１型のＨ鎖を有することが明らかになった。ＳＫ２のタイピングについて参考例２に後記する。
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてマウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域を増幅するため、配列番号：１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００２１】
前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００２２】
なお、本実施例では５′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有するものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でもよい。
【００２３】
次に、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩで切断した後、低融点アガロースまたはカラム〔ＰＣＲ産物精製用キット（ＱＩＡＧＥＮ等）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ等）など〕により、分離・精製を行う。他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
【００２４】
クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法例えば、シークエネース  バージョン２．０（ユナイテッドステイツバイオケミカルコーポレーション社製）を用いて行うことができる。
目的とするＤＮＡのクローン化及びその配列決定を実施例１及び２に具体的に記載する。
【００２５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
Ｌ鎖及びＨ鎖の各対のＶ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  １９８３）。
【００２６】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。
【００２７】
これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から見出すことができ、実施例３において具体的に説明する。
【００２８】
キメラ抗体の作製
ヒトＩＬ−６に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を形成することを確かめる必要がある。この目的のため、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１に記載されるモノクローナル抗体ＳＫ２のクローン化されたＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒトＩＬ−６抗体のアミノ酸配列を既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領域と比較した。
【００２９】
モノクローナル抗体ＳＫ２のマウスＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒトＩＬ−６抗体が得られる。
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んで成る。
【００３０】
前記ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＬ鎖ＣκあるいはＨ鎖Ｃγ１やＣγ４を各々挙げることができる。
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−１６９２８）。
【００３１】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
キメラ抗体の作製を実施例４に記載する。
【００３２】
マウスＳＫ２κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてサブクローンし、ヒトゲノムＬ鎖Ｃκ鎖領域をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。マウスＳＫ２抗体のγ１型Ｈ鎖リーダー及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いてサブクローン化し、ヒトγ−１Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。
【００３３】
特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、マウスＳＫ２のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列の導入により転写効率を上げるように工夫されている）。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＳＫ２のＶ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。
【００３４】
マウスＳＫ２抗体中に存在するＶ領域と同じＶ領域を有するキメラＳＫ２抗体の作製に加えて、キメラＳＫ２抗体の第二のバージョン（ＮＴＳ）を作製した。キメラＳＫ２抗体ＮＴＳにおいては、Ｈ鎖Ｖ領域中の位置３０のアミノ酸がアスパラギンからセリンに変えられている。
【００３５】
マウスＨ鎖サブグループＩ（Ｆｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１２９１５，１９９１）に属するマウスＨ鎖Ｖ領域においては、位置３０の最も典型的なアミノ酸はセリンである（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）。
【００３６】
マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域中の位置３０に非典型的なアミノ酸であるアスパラギンを有することの重要性を評価するため、位置３０を典型的なアミノ酸であるセリンに変えた。この変更は、ＰＣＲ−変異誘発法（Ｍ．Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５，５４０４，１９８９）を用いてＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列中に必要な変更を行うことにより達成された。キメラＳＫ２抗体は、もとのＳＫ２抗体と同様にＨ鎖Ｖ領域の位置３０にグリコシル化部位を有するのに対して、変異型キメラＳＫ２抗体ＮＴＳはグリコシル化部位を有しない。
【００３７】
キメラＳＫ２抗体はヒトＩＬ−６に結合する活性を示した。キメラＳＫ２抗体ＮＴＳも同様にヒトＩＬ−６に結合する。従って正しいマウスＶ領域がクローン化されそして配列が決定されていたことが示された。また、ＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のグリコシル化は、ＳＫ２抗体の結合活性のためには必要でないことが示された。
【００３８】
再構成ヒトの抗体の構築
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウスＳＫ２抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較した。その結果を表１にまとめる。
【００３９】
【表１】
0003614183.tif 000002
【００４０】
マウスＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセンサス配列に最も類似しており、６０．３％の相同性が存在する。マウスＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩＩ（ＨＳＧＩＩ）のコンセンサス配列に最も類似しており、５９．２％の相同性が存在する。
【００４１】
ヒト抗体中のＶ領域との比較から、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域のＦＲを選択することが可能である。再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＨＳＧＩ）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩＩ（ＨＳＧＩＩ）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのがよく、さらにサブグループ内で、できるだけ相同性の高いものを選ぶことが最善であろう（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）。
【００４２】
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計における第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することであった。マウスＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域は、サブグループＩに属するヒトκ型抗体Ｌ鎖Ｖ領域に最も類似していた（表１）。マウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに６３％の類似性を示した。従って、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩのＦＲを使用した。
【００４３】
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョンを設計した。第一のバージョン（バージョン「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３〜３２７，１９８８）（ＷＯ９２−１９７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」）と同一であり、そしてマウスＣＤＲはマウスＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一とした。第二のバージョン（バージョン「ｂ」）はバージョン「ａ」と比べて、ヒトＦＲ３中の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。
【００４４】
すなわちバージョン「ａ」の設計に使用した修飾されたＲＥＩのＦＲにおいては位置７１はフェニルアラニンであるのに対し、バージョン「ｂ」においては、位置７１のフェニルアラニンがマウスＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域中に見出されるようにチロシンに変えられている。表２は、マウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域、ＲＥＩのＦＲ及び再構成ＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
【表２】
0003614183.tif 000003
注：ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐａｌｍ，Ｗ．ら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５）とは異なるアミノ酸の位置を示す。
【００４６】
マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲはサブグループＩＩに属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似している（表１）。マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩＩの１構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域ＤＡＷ（Ｐｒｅｓｓ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１７，６４１，１９７０）に非常に類似していた（６０．８％）。さらには、ＣＤＲのサイズもマウスＳＫ２抗体とヒト抗体ＤＡＷとの間で非常に類似していた。このため、ヒト抗体ＤＡＷのＦＲを、再構成ヒトＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として用いた。
【００４７】
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンを設計した。バージョン「ａ」においてはＦＲはＤＡＷのそれと同じであり、バージョン「ｂ」においてはヒトＦＲ１中の３０位のみが異っている。すなわち、バージョン「ａ」においては３０位のアミノ酸はセリンであり、バージョン「ｂ」の３０位のアミノ酸はアスパラギンである。
表３は、マウスＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域、ＤＡＷのＦＲ、並びに再構成ＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」及び「ｂ」のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
【表３】
0003614183.tif 000004
【００４９】
再構成ヒトＳＫ２抗体の作製
再構成ヒトＳＫ抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体的に記載する。
本発明の再構成ヒトＳＫ２抗体は、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
から構成される。
【００５０】
好ましい態様においては、前記Ｌ鎖Ｖ領域は配列番号５２又は５３に示されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖Ｖ領域は配列番号５４又は５５に示されるアミノ酸配列を有する。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトκＣ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトγ−１Ｃ領域、ヒトγ−４Ｃ領域等である。
【００５１】
再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗体を生産せしめる（例えば、ＷＯ９１−１６９２７）。
【００５２】
あるいは、再構成Ｌ鎖をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せしめる。
以上のようにして目的とするキメラ抗体あるいはヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体あるいはヒト型化抗体は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することができる。
【００５３】
なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体あるいはヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡアガロースカラムを用いて行うことができる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体あるいはヒト型化抗体は分離・精製することができる。
【００５４】
ヒトＩＬ−６に対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００５５】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ  −ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−ＶＬ  −ＨＣＫ  等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（図２を参照のこと）（ＷＯ９２−１９７５９）が含まれる。
【００５６】
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７  １０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，１９９０）に従えば容易に実施することができる。
【００５７】
複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）ＩＩあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【００５８】
【実施例】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１．ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化
ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化した。
【００５９】
１．全ＲＮＡの調製
ハイブリドーマＳＫ２からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９）により記載されている方法に従って調製した。すなわち、ハイブリドーマＳＫ２の細胞を２０ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネートを遠心管中の５．３Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０ローター中で３１，０００ｒｐｍ  にて２０℃で２４時間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【００６０】
ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗浄し、そして１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％  ＳＤＳを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５０μｌ中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した後、３７℃にて２０分間インキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００μｌに溶解した。
【００６１】
２．一本鎖ｃＤＮＡの合成
Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４（１９８９）により記載されている方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のようにして調製した全ＲＮＡの約５μｇを４０ｍＭ  ＫＣｌ，６ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ，０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ，０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ，０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ，３５μＭ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、４８ユニットのＲＡＶ−２逆転写酵素（ＲＡＶ−２：Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ２；Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２５ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）緩衝液１０μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を３７℃にて６０分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のために直接使用した。
【００６２】
３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＰＨＣ−２（Ｔｅｃｈｎｅ社）を用いてＰＣＲ法を行った。
（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅
ＰＣＲ法に使用するプライマーは、マウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする配列番号：１〜１１に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及びマウスκ型Ｌ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする配列番号：１２に示すＭＫＣ（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を用いた。
【００６３】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社）、０．２５μＭのそれぞれのＭＫＶプライマー、２．７５μＭのＭＫＣプライマー及び一本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有する。これを５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて１．５分間そして次に９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００６４】
（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示すＭＨＣ−Ｇ１（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を使用した。
【００６５】
ｃＤＮＡの増幅は、１μＭのＭＨＶプライマーと１μＭのＭＨＣ−Ｇ１プライマーの組合せとして各々のＭＨＶ１〜１２プライマーについて別々に増幅した点を除いて、前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を行った。
【００６６】
４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を低融点アガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国）にて精製し、そして１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で１０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。
【００６７】
この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を１０ユニットの制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、１．５％低融点アガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
【００６８】
約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。
【００６９】
こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端にＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａＩ接着末端を有する。
【００７０】
５．連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター約０．１μｇと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ  ＡＴＰ，０．１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び２ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する反応混合物中で、１６℃にて１６時間反応させ連結した。
【００７１】
次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞２００μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【００７２】
この形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５ｍｌ中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７３】
こうして得られた、ハイブリドーマＳＫ２に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐｓｋ２−ｋ２と命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＳＫ２に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐＵＣ−ＳＫ２−ＶＨ  と命名した。
【００７４】
実施例２．ＤＮＡの塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  社製，米国）を用いて決定した。
まず、前記のようにして得られたプラスミド約３μｇを０．２Ｎ  ＮａＯＨにより変性し、配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添付の処方に従って３５Ｓ−ｄＡＴＰより標識した。
【００７５】
次に、標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後、ゲルを１０％メタノール及び１０％酢酸により固定し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることにより塩基配列を決定した。
プラスミドｐｓｋ２−ｋ２に含まれるマウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示す。また、プラスミドｐＵＣ−ＳＫ２−ＶＨ  に含まれるマウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２７に示す。
【００７６】
なお、前記プラスミドｐＵＣ−ＳＫ２−ＶＨ  を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ−ＳＫ２ＶＨ  ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５年４月２１日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２６９としてブダペスト条約に基き国際寄託された。
【００７７】
実施例３．ＣＤＲの決定
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
【００７８】
この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表４に示す如く決定した。
【表４】
0003614183.tif 000005
【００７９】
実施例４．クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＳＫ２抗体の作製）
発現ベクターの作製
キメラＳＫ２抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＳＫ２κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐｓｋ２−ｋ２及びｐＵＣ−ＳＫ２−ＶＨ  をＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９参照）（図１を参照のこと）に導入した。
【００８０】
Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＫ２Ｋ２Ｂ（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＫ２Ｈ１Ｓ（配列番号：３０）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋａｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄＩＩＩ  制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＳＫ２Ｋ２Ａ（配列番号：２９）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマー６４ｈｃｈ−Ａ（配列番号：３１）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように設計した。
【００８１】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，２５０μＭ  ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１００ｐｍｏｌｅ  ずつの各プライマー、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐｓｋ２−ｋ２又はｐＵＣ−ＳＫ２−ＶＨ  ）、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ酵素を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油で覆い、９４℃にて最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００８２】
ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｈｅ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１０９）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有する鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣ−ＳＫ２ＶＬ  と命名した。プラスミドｐＵＣ−ＳＫ２ＶＬ  を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ−ＳＫ２ＶＬ  ）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５年４月２１日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２７０としてブタペスト条約に基き国際寄託された。正しいＤＮＡ配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＨｉｎｄＩＩＩ  −ＢａｍＨＩ断片を切出し、Ｈ鎖Ｖ領域については発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ  −ｇγ１に導入してＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１を得、Ｌ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ−ＶＬ  −ｇｋに導入してＨＥＦ−ＳＫ２ｋ−ｇｋを得た。
【００８３】
さらに、Ｈ鎖Ｖ領域に於いて、ほとんどの抗体のＨ鎖は、位置３０のセリンが保存されているが、マウスＳＫ２抗体Ｈ鎖においては位置３０がアスパラギンであることから、キメラＳＫ２抗体の抗原結合活性に対するこの変化の効果を検討するため、ＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１を鋳型として後方プライマーＳＫ２Ｈ１Ｓと前方プライマーＳＫ２ＨＭ１Ｂ（配列番号：３２）及び前方プライマー６４ｈｃｈ−Ａと後方プライマー（ＳＫ２ＨＭ１）（配列番号：３３）の組合せを用いてＰＣＲ変異誘導法により、位置３０がアスパラギンからセリンに変るように設計した。
【００８４】
変異型Ｈ鎖Ｖ領域は、プライマーＳＫ２Ｈ１ＳとＳＫ２ＨＭ１Ｂ、又はプライマーＳＫ２ＨＭ１と６４ｈｃｈ−Ａを用い、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１を用い、前記と同様にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅の後、２つのＰＣＲ生成物を低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のＰＣＲのために用いた。
【００８５】
１μｇずつの２つの第一ＰＣＲ生成物及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を９４℃にて２分間、５０℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベートした後、１００ｐｍｏｌｅ  ずつの外部プライマー（ＳＫ２Ｈ１Ｓ及び６４ｈｃｈ−Ａ）を加えた。ＰＣＲ混合物を５０μｌの鉱油で覆い、そして前記と同じ条件で第二ＰＣＲを行った。４１２ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  及びＢａｍＨＩで消化し、そして発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ  −ｇγ１に挿入し、配列決定の後、正しい配列を含むプラスミドＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ＮＴＳを得た。
【００８６】
ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション
キメラＳＫ２抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−ＳＫ２ｋ−ｇｋと、ＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１又はＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ＮＴＳのいずれかとを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０７  細胞／ｍｌの０．８ｍｌのアリコートに加え、１，９００Ｖ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【００８７】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を２μｇ／ｍｌ含有するか、又は含有しない１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）に加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、５倍量の結合緩衝液で平衡化したプロテインＡアガロースカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット、ＢｉｏＲａｄ）に適用した。カラムを１５倍量の結合緩衝液で洗浄し、次に５倍量の溶出緩衝液で溶出した。溶出液を濃縮し、そしてマイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩衝液をＰＢＳに変えた。
【００８８】
ＥＬＩＳＡ
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次の様にして調製した。９６穴プレートを、ＳＫ２が認識するエピトープとは異るヒトＩＬ−６のエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，９５１−９５６，１９８８）でコートし、ブロッキングの後、組換えヒトＩＬ−６を添加した。キメラＳＫ２抗体のサンプルを順次希釈して、各穴に加え、次にアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８９】
結合阻害測定のため、ＥＬＩＳＡプレートを次の様にして調製した。９６穴プレートを、ヒトＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対して特異的なマウスモノクローナル抗体ＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２９００−２９０７，１９８９）によりコートし、ブロッキングの後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）（Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８，６７３−６７６，１９９０）を加えた。サンプルを順次希釈して、ビオチン化ＩＬ−６と共に各穴に加え、次いでアルカリホスファターゼ結合ストレプタビディンを加えた後、前記のようにして、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９０】
抗原結合測定の結果を図４に示し、結合阻害測定の結果を図５に示す。Ｈ鎖Ｖ領域の３０位がアスパラギンである。キメラ抗体およびＨ鎖Ｖ領域の３０位がセリンに変異しているキメラ抗体（ＮＴＳ）は、ツニカマイシンによる糖付加阻害の影響を受けることなく、同様の抗原結合性及び結合阻害活性を示した。従って、Ｈ鎖Ｖ領域の３０位のアミノ酸の変異及び糖鎖の有無は抗原結合性に何ら影響を与えないことが明らかになった。
【００９１】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いたマウスＳＫ２抗体の糖鎖の分析
マウスＳＫ２抗体からＦａｂ断片およびＦｃ断片をＩｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて調製し、次にＮ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を用いて脱グリコシル化された断片を調製した。
【００９２】
これらの断片をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そして次にクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ，ＢｉｏＲａｄ社製）により染色するか、又は電気泳動的にニトロセルロースフィルターに移行させた。Ｆｄ断片に付加されている糖を分析するため、フィルターをレクチンのパネル（Ｌｅｃｔｉｎ−Ｌｉｎｋ，Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）にかけた。
【００９３】
図３に示すごとく、マウスＳＫ２抗体からのＦｄ断片はＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいて約３４ｋｄ及び３３ｋｄのバンドを示し、この比率は約１：１であった。Ｎ−グリカナーゼにより脱グリコシル化されたＦｄ断片は約２９ｋｄの分子量を示し、これはＦｄ断片のアミノ酸組成から計算した値と一致した。また、３４ｋｄのＦｄ断片と３３ｋｄのＦｄ断片は種々のレクチンに対して異る反応性を示した。
【００９４】
すなわち３４ｋｄのＦｄはＤａｔｕｒａ  Ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＳＡ）＋、Ｒｉｃｉｎｕｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＲＣＡ）＋＋、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｃｔｉｎ（ＰＨＡ−Ｅ）＋＋＋、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ）−、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）−であるのに対して、３３ｋｄのＦｄはＤＳＡ−，ＲＣＡ＋，ＰＨＡ−Ｅ＋＋＋，ＣｏｎＡ−，ＷＣＡ−であった。これらの結果、マウスＳＫ２抗体は、Ｈ鎖Ｖ領域に少なくとも２つのタイプのＮ型糖鎖を有することが明らかになった。
【００９５】
実施例５．再構成ヒトＳＫ２抗体の作製
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。この方法を図６に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する再構成ヒト抗体ＳＫ２（バージョン「ａ」）の作製のために８個のＰＣＲプライマーを使用した。外部プライマーＡ（配列番号：３４）及びＨ（配列番号：３５）は、ｐＵＣベクターのＤＮＡ配列とハイブリダイズするように設計された。
【００９６】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＢ（配列番号：３６）、Ｃ（配列番号：３７）及びＤ（配列番号：３８）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲ−グラフティングプライマーＥ（配列番号：３９）、Ｆ（配列番号：４０）及びＧ（配列番号：４１）はアンチ−センスＤＮＡ配列を有しそしてそれぞれプライマーＢ，Ｃ及びＤの５′−末端のＤＮＡ配列に対する相補的ＤＮＡ配列（１５〜３５ｂｐ）を有する。
【００９７】
第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｇ、及びＤ−Ｈを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製した。第一ＰＣＲからの４つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた（ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーＡ及びＨを加えて、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増幅した（第２ＰＣＲ）。前記ＰＣＲにおいては、ヒト抗体ＲＥＩからのＦＲに基く再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするプラスミドｐＵＣ−ＲＶＬ−ＰＭ１ａ−４（ＷＯ９２−１９７５９）を鋳型として用いた。
【００９８】
第一ＰＣＲ段階においては、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫＣｌ，２５０μＭ  ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌｅ  の各プライマー及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する１００μｌのＰＣＲ混合物を用いた。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆膜した。最初に９４℃で変性した後、９４℃にて１分間、５０℃又は５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応サイクルを行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００９９】
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｅ（１８７ｂｐ），Ｂ−Ｆ（８７ｂｐ），Ｃ−Ｇ（１５２ｂｐ）及びＤ−Ｈ（６５ｂｐ）を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいては、１μｇの各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２分間、５０℃にて２分間及び７２℃にて２分間で２サイクルインキュベートし、そして次に１００ｐｍｏｌｅ  の各外部プライマー（Ａ及びＨ）を加えた。ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして前記と同一の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【０１００】
第二ＰＣＲにより生じた３９９ｂｐのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ  −ｇｋにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５２に示す。
【０１０１】
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」を、ＰＣＲを用いる変異誘発によって作製した。変異原プライマーＦＴＹ−１（配列番号：４２）及びＦＴＹ−２（配列番号：４３）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計した。プラスミドＨＥＦ−ＲＶ１−ＳＫ２ａを鋳型ＤＮＡとして用いた。最終ＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ−発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ  −ｇｋにクローニングしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５３に示す。
【０１０２】
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＤＡＷのＦＲをコードするＤＮＡ配列をＶ領域（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）の「ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ」に基いて設計し、そしてマウスＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつなげることにより、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１０３】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄＩＩＩ  認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。
こうして設計したＤＮＡ配列を６個のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１０４】
６個のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：４４〜４９に示す。これらのオリゴヌクレオチドは９３〜９６塩基の長さを有し、２０〜２４ｂｐのオーバラップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内の３個、すなわち、ＨＰ１（配列番号：４４）、ＨＰ３（配列番号：４６）及びＨＰ５（配列番号：４８）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他の３個、すなわち、ＨＰ２（配列番号：４５）、ＨＰ４（配列番号：４７）及びＨＰ６（配列番号：４９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これら６個のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアセンブリーの方法を図７に示す。
【０１０５】
２ｐｍｏｌｅ  ずつの６種のオリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間のから成る３サイクルのインキュベーションを行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。５０μｍｏｌｅずつのＨＰ１及びＨＰ６を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３０サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１０６】
４４８ｂｐのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  及びＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ  −ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａに含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５４に示す。
【０１０７】
バージョン「ｂ」を、ＰＣＲ法による変異誘発を用いて作製した。変異原プライマーＲＳＫ２−ＳＴＮＡ（配列番号：５０）及びＲＳＫ−ＳＴＮＢ（配列番号：５１）を、３０位のセリンがアスパラギンに変る様に設計した。プラスミドＲＶＨ−ＳＫ２ａを鋳型ＤＮＡとして使用した。最終ＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  により消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ  −ｇγ１にクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂに含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５５に示す。
【０１０８】
再構成ヒトＳＫ２抗体の各鎖を評価するため、まず、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖のための２種類の発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａ（バージョン「ａ」）及びＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂ（バージョン「ｂ」）のいずれかと、キメラＳＫ２抗体Ｈ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞を前記のようにして同時トランスフェクションし、前記のようにして抗体生成物を回収した後、前記のようにして抗原結合測定にかけた。
【０１０９】
この結果を図８に示す。図８に示すように、陽性対照としてのキメラ抗体（ＣｈＬ／ＣｈＨ）と、再構成Ｌ鎖バージョン「ａ」とキメラＨ鎖とから成る抗体（ＲＶＬａ／ＣｈＨ）、と再構成Ｌ鎖バージョン「ｂ」とキメラＨ鎖とから成る抗体（ＲＶＬｂ／ＣｈＨ）との間には抗原結合性に差がなく、７１位におけるチロシン残基のフェニルアラニン残基への変化は抗原結合性に影響を与えないことが示された。
【０１１０】
次に、再構成ヒト化ＳＫ２抗体Ｌ鎖の２つのバージョンと再構成ヒト化ＳＫ２抗体Ｈ鎖の２つのバージョンとの組合せを評価するため、ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａとＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａ、ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａとＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂ、ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂとＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａ、又はＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂとＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂとによりＣＯＳ細胞を同時トランスフェクションし、前記のようにして得られた抗体について抗原結合測定を行った。その結果を図９に示す。図９から明らかな通り、再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒトＶ鎖とのすべての組合せが、キメラＳＫ２抗体に匹敵する良好な抗原結合性を示した。
【０１１１】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ  −ＳＫ２ｂを含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬ  ＳＫ２ｂ）、およびプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ  −ＳＫ２ａを含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＨ  ＳＫ２ａ）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５年４月２１日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２６７、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４２６８としてブダペスト条約に基き国際寄託された。
【０１１２】
これに対して、図１０に示すように、結合阻害（ＩＬ６とＩＬ−６Ｒと結合を阻害する抗体の能力）測定においては、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖バージョン「ｂ」（ＲｖＬｂ）と再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖バージョン「ａ」（ＲｖＨａ）との組合せのみが、マウスモノクローナル抗体ＳＫ２及びキメラＳＫ２抗体に匹敵する結合阻害活性を示し、この組合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。
【０１１３】
他方、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖バージョン「ａ」（ＲｖＬａ）と再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖バージョン「ａ」（ＲｖＨａ）との組合せ、及びＲｖＬａとＲｖＨｂとの組合せは低い結合阻害活性を示し、Ｌ鎖中の７１位にフェニルアラニンを有する抗体は良好な抗原結合活性を示すが機能的抗原結合部位を再形成することが示唆された。
これらのことからヒト抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１領域に於けるループ構造には、７１位のチロシンは機能的な抗原結合部位を再構成するのに必須であると言える。
【０１１４】
参考例１． ハイブリドーマＳＫ２の作製
抗−ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはヒトＩＬ−６で免役したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１をポリエチレングリコールを用いた常法により融合して作製した。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する活性を指標としたスクリーニングを行い、結合阻害活性を有する１７種のクローンを得た。これらのクローンをマウスの腹腔内に移植し、得られた腹水をプロテインＡアガロースカラムにかけ、精製マウスモノクローナル抗体を得た。
【０１１５】
参考例２． マウスモノクローナル抗体ＳＫ２のタイピング
ハイブリドーマＳＫ２から産生されるマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＬ鎖およびＨ鎖のタイプを調べるために、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）を用いてタイピングを行った。その結果、ＳＫ２抗体はκ型軽鎖およびγ１型重鎖を有することが明らかになった。
【０１１６】
【配列表】
0003614183.tif 000006
【０１１７】
0003614183.tif 000007
【０１１８】
0003614183.tif 000008
【０１１９】
0003614183.tif 000009
【０１２０】
0003614183.tif 000010
【０１２１】
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【０１２２】
0003614183.tif 000012
【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
0003614183.tif 000029
【０１４０】
0003614183.tif 000030
【０１４１】
配列番号：２６
配列の長さ：３７９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン：ｐｓｋ２−ｋ２
特徴：  １．．６０    ｓｉｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ
６１．．２７９  ｍａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ
配列
【０１４３】
0003614183.tif 000031
【０１４４】
0003614183.tif 000032
0003614183.tif 000033
【０１４５】
0003614183.tif 000034
【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
0003614183.tif 000041
【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
0003614183.tif 000050
【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
0003614183.tif 000066
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【０１７９】
0003614183.tif 000068
【０１８０】
0003614183.tif 000069
0003614183.tif 000070
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のために有用な、ヒトＥＦＩ−αプロモーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−ＶＬ  −ｇｋ及びＨＥＦ−ＶＨ  −ｇγ１を示す。
【図２】図２は、本発明の抗体ペプチドの発現のために有用な、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示す。
【図３】図３は、ＳＫ２抗体がグリコシル化されていることを示す電気泳動図である。
【図４】図４は、ヒトＩＬ−６に結合する本発明のキメラ抗体の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−６へのＩＬ−６の結合を阻害する本発明のキメラ抗体の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイヤグラムである。
【図７】図７は、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイヤグラムである。
【図８】図８は、ヒトＩＬ−６への結合についての、再構成ヒトＬ鎖＋キメラＨ鎖から成る抗体の能力を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒトＩＬ−６への結合についての、本発明の４種類の再構成ヒトＳＫ２抗体の能力をキメラ抗体のそれと比較して示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する本発明の４種類の再構成ヒト化ＳＫ２抗体の能力を、ＳＫ２キメラ抗体及びマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のそれと比較して示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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