(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のアミノ末端の修飾の有無を識別する方法であって、タンパク質のアミノ末端及び分子内のアミノ基の全てにエドマン試薬をカップリングさせる工程と、前記アミノ末端のアミノ酸を環化して遊離する工程と、前記アミノ酸の遊離により露出したアミノ末端の第２番目のアミノ基に蛍光性を有するエドマン試薬をカップリングさせる工程と、紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含むことを特徴とするタンパク質の識別方法。
【請求項２】
タンパク質を検出する方法であって、タンパク質に蛍光を有するエドマン試薬をカップリングさせる工程と、弱酸のアルコール溶液で洗浄する第１洗浄工程と、アルコールで洗浄する第２洗浄工程と、微アルカリ性水溶液により塩基性にする第３洗浄工程と、紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含むことを特徴とするタンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の識別方法及びタンパク質の検出方法に関し、詳しくは、タンパク質のアミノ末端の修飾の有無を簡単に識別するためのタンパク質の識別方法及び電気泳動等により分離したタンパク質を高感度で検出することができる検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質（ペプチド類も含む）の構造を分析するための方法として、天然の細胞のタンパク質を単純な分離法で分離した後、あるいは、分離せずにそのまま、一次元又は二次元の電気泳動法により分離し、分離した各タンパク質についてエドマン分解法を適用することが、生物工学，医学，農学等の分野で広く行われている。
【０００３】
前記エドマン分解法は、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に、フェニルイソチオシアナート等のエドマン試薬と称されている物質を反応（カップリング）させた後、Ｎ末端のアミノ酸を環化させて遊離し、これを分析するもので、エドマン試薬のカップリングと環化遊離とを繰り返して行うことにより、タンパク質の構造を同定するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、植物タンパク質においては、全タンパク質の約半数は、そのＮ末端がアセチル基等によって修飾（ブロック）されていることが実験的に示されており、動物細胞等においても１０〜３０％のタンパク質のＮ末端が修飾されている。このようにＮ末端が修飾されていると、すなわち、タンパク質のＮ末端におけるアミノ基が露出していないと、前記エドマン分解法を実施した際に、タンパク質のＮ末端とエドマン試薬とのカップリング反応が発生せず、Ｎ末端のアミノ酸の遊離も生じないため、エドマン分解法では、このようなＮ末端が修飾されているタンパク質の分析を行うことができない。
【０００５】
したがって、Ｎ末端が修飾されていることを知らずにタンパク質に対してエドマン分解法を行うと、無駄な時間や実験費用を費やすことになる。一般に、一つのタンパク質に対して１０時間以上の時間がかかり、数万円のランニングコストがかかるため、僅かな数のタンパク質であっても問題であり、例えば、二次元電気泳動で２０００種類のタンパク質が分離され、その半数の１０００種類のタンパク質のＮ末端が修飾されていたとすると、このＮ末端が修飾されているタンパク質に対する実験には、計り知れない時間の浪費と実験費用の無駄が発生することになる。
【０００６】
また、前記電気泳動法は、タンパク質を分離する点では非常に優れた方法であり、生物又は細胞のもつ全タンパク質の分離同定を同時に一気に行おうとする、いわゆる「プロテオーム」課題であり、「ゲノム」課題と相補的に行われてきており、二次元電気泳動法の需要は、益々大きくなりつつある。しかし、このような二次元電気泳動法によりタンパク質を分離した後、分離されたタンパク質を検出する方法として、従来は、タンパク質を染色することにより行っており、染色液として各種のものが開発されている。
【０００７】
ところが、従来の染色法では、タンパク質を保持している膜等も一緒に染色されてしまったり、染色物質を十分に除去できなかったりすることから、検出感度に悪影響を与えていた。このため、より高感度でタンパク質を検出することができる方法の開発が望まれていた。
【０００８】
そこで本発明は、タンパク質のＮ末端の修飾の有無を簡単に識別することができ、タンパク質の分析を効率よく行うことができるとともに、極微量のタンパク質の検出を高感度で行うことができるタンパク質の識別方法及びタンパク質の検出方法を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のタンパク質の識別方法は、タンパク質のＮ末端の修飾の有無を識別する方法であって、タンパク質のＮ末端及び分子内のアミノ基の全てにエドマン試薬をカップリングさせる工程と、前記Ｎ末端のアミノ酸を環化して遊離する工程と、前記アミノ酸の遊離により露出したＮ末端の第２番目のアミノ基に蛍光性を有するエドマン試薬をカップリングさせる工程と、紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含むことを特徴としている。
【００１０】
すなわち、本発明のタンパク質の識別方法は、通常の電気泳動法等により分離したタンパク質、例えば、ポリアクリルアミド上で電気泳動により分離したタンパク質のスポット（バンド）をポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）等の膜に電気転写した後、これらのタンパク質に微アルカリ性下、例えばトリメチルアミン水溶液で微アルカリ性とした状態でスルホン酸フェニルイソチオシアナート（Ｓ−ＰＩＴＣ）やフェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）等のエドマン試薬を反応させ、各タンパク質のＮ末端のα−アミノ基及び分子内のリジン残基のε−アミノ基の全てにエドマン試薬をカップリングさせて修飾する第１カップリング工程と、酸性下で、例えばトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）の蒸気中でＮ末端のアミノ酸を閉環し、アニリノチアゾリン（ＡＴＺ）を生成させてＮ末端の第１番目のアミノ酸を環化して遊離する遊離工程と、第２のエドマン試薬として、９−アミノフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）のような蛍光性を有するエドマン試薬を、微アルカリ性下で、前記アミノ酸の遊離により露出したＮ末端の第２番目のアミノ基に反応・カップリングさせてフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）化する第２カップリング工程と、紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含んでいる。
【００１１】
上記方法によれば、Ｎ末端がアセチル基等によって既に修飾されているタンパク質は、第１カップリング工程においてＮ末端にはエドマン試薬がカップリングできず、分子内のε−アミノ基にのみエドマン試薬がカップリングした状態となる。このε−アミノ基にカップリングしたエドマン試薬は、次の遊離工程では遊離しないため、このタンパク質は、全てのアミノ基がエドマン試薬やアセチル基等によって修飾された状態になる。したがって、第２カップリング工程においては、露出したアミノ基が存在しないため、エドマン試薬との反応が発生せず、最初にＮ末端が修飾されていたタンパク質には蛍光性を有するエドマン試薬はカップリングしない。
【００１２】
一方、Ｎ末端が修飾されていなかったタンパク質は、第１カップリング工程でＮ末端にエドマン試薬がカップリングし、遊離工程でＮ末端のアミノ酸が遊離してＮ末端の第２番目のアミノ基が露出した状態になるので、第２カップリング工程でこの露出したアミノ基に蛍光性を有するエドマン試薬がカップリングする。
【００１３】
このように、Ｎ末端が修飾されていなかったタンパク質にのみ蛍光性を有するエドマン試薬がカップリングした状態になるため、第２カップリング工程終了後に所定の波長を有する紫外線ランプを照射することによって、蛍光を発したタンパク質はＮ末端が修飾されていないものであることが識別でき、蛍光を示さないＮ末端が修飾されているタンパク質と区別することができる。また、通常の染色による可視光線での識別ではなく、蛍光の有無により識別するので、識別感度を大幅に向上させることができる。
【００１４】
また、本発明のタンパク質の検出方法は、タンパク質に蛍光を有するエドマン試薬をカップリングさせる工程と、弱酸のアルコール溶液で洗浄する第１洗浄工程と、アルコールで洗浄する第２洗浄工程と、微アルカリ性水溶液により塩基性にする第３洗浄工程と、紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含むことを特徴としている。
【００１５】
すなわち、本発明のタンパク質の検出方法は、最初に、前述のように、ポリアクリルアミド上での電気泳動等により分離し、ＰＶＤＦ等の膜に電気転写したタンパク質に、微アルカリ性下で前記ＦＩＴＣのような蛍光性を有するエドマン試薬を反応させ、タンパク質のＮ末端のα−アミノ基や分子内のリジン残基のε−アミノ基にこれをカップリングさせる工程を行う。次に、弱酸のアルコール溶液、例えば少量の酢酸を含むメタノールで膜を洗浄して中性にし、かつ、試薬を洗い流し（第１洗浄工程）、アルコール、例えばメタノールで膜を洗浄した後（第２洗浄工程）、微アルカリ性水溶液、例えばトリメチルアミン水溶液をスプレーして膜を塩基性にし（第３洗浄工程）、乾燥させた後に紫外線ランプを照射して蛍光スポットを検出する工程とを含んでいる。
【００１６】
上述のように、膜に保持されたタンパク質に蛍光性を有するエドマン試薬をカップリングさせた後、弱酸のアルコール溶液で洗浄する工程、アルコールで洗浄する工程、塩基性にする工程からなる洗浄操作を行うことにより、膜に付着したエドマン試薬のほとんどを除去することができ、紫外線ランプで蛍光を検出する際のバックグラウンドを大幅に低減することができる。これにより、ピコモルレベルの極微量のタンパク質を検出することができる。このとき、前記蛍光性を有するエドマン試薬は、タンパク質のＮ末端のα−アミノ基及び分子内のリジン残基のε−アミノ基の全てにカップリングした状態になるので、Ｎ末端が修飾されているタンパク質も、Ｎ末端が修飾されていないタンパク質も、同時に検出することができる。
【００１７】
また、上記弱酸のアルコール溶液で洗浄する工程、アルコールで洗浄する工程、塩基性にする工程からなる洗浄操作は、これを前記タンパク質の識別方法における第２カップリング工程後の洗浄操作に適用することにより、上記同様に、識別時のバックグラウンドを低減させて識別能力を高めることができる。
【００１８】
さらに、本発明では、タンパク質のＮ末端の修飾の有無の識別やタンパク質の検出に用いる蛍光性を有する物質として、エドマン試薬の一種を使用しているので、引き続いて従来と同様のエドマン分解を行うことにより、タンパク質の配列分析を行うことができる。また、前述のＮ末端の修飾の有無の識別操作によってＮ末端が修飾されていないタンパク質の位置を知ることができるので、このときと同じ条件で二次元電気泳動等の分離操作を行い、識別操作での蛍光発生位置に対応したスポットを用いることにより、通常のエドマン分解によるタンパク質の分析を行うことができる。なお、前記識別方法でＮ末端が修飾されているとされたタンパク質は、適当な方法で断片化またはデブロックすることによって配列分析を行えばよい。
【００１９】
【実施例】
次に、本発明のタンパク質の識別方法の一実施例を図１を参照しながら説明する。図１は、本発明のタンパク質の識別方法における各工程の流れを示す工程図である。
【００２０】
まず、常法により二次元電気泳動法を行ってタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜上に電気的にタンパク質をブロッティングした。このタンパク質をブロッティングしたＰＶＤＦ膜をメタノール溶液に常温で２分間浸した後、これを取出してＳ−ＰＩＴＣ水溶液（１８０ｍｇ／２０ｍｌ）をスプレーし、さらに、２分後に１０重量％のトリメチルアミン水溶液をスプレーして４５分間常温で反応させた（第１カップリング工程）。この反応により、各タンパク質のＮ末端のα−アミノ基及び分子内のリジン残基のε−アミノ基の全てにエドマン試薬がカップリングした状態になる。次いで、ｐＨを中性にし、かつ、余分なＳ−ＰＩＴＣを洗い流すために、１０容量％の酢酸水溶液を３回新しく変えつつ膜の洗浄を行い、その後、膜を完全に乾燥させた。
【００２１】
乾燥状態の膜をＴＦＡ蒸気中に入れ、空封して１６時間常温に放置し、前記Ｓ−ＰＩＴＣがカップリングしているＮ末端の第１番目のアミノ酸を環化してＡＴＺ化合物を生成させた後、膜をメタノール中で３回洗浄してＴＦＡ及びＡＴＺ化合物を除去した（遊離工程）。
【００２２】
次に、ＦＩＴＣのメタノール溶液（４０ｍｇ／２０ｍｌ）をスプレーし、２分後に１０重量％トリメチルアミン水溶液をスプレーして９０分間常温で反応させた。この反応により、Ｎ末端の第２番目のアミノ基が露出したタンパク質のＮ末端にＦＩＴＣがカップリングした状態になる（第２カップリング工程）。
【００２３】
最後に、１０容量％の酢酸メタノール溶液で３回洗浄してＰＶＤＦ膜を中性にし、かつ、試薬を洗い流し（第１洗浄工程）、メタノールで十分に洗浄した後（第２洗浄工程）、再び１０％トリメチルアミン水溶液を軽くスプレーしてＰＶＤＦ膜を塩基性にした（第３洗浄工程）。洗浄後の膜を十分に乾燥させた後、紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を照射したところ、黄緑色の蛍光を発したスポットが検出された。このとき、ＰＶＤＦ膜の蛍光バックグラウンドは、ほとんどなかった。また、蛍光を発したスポットを切り取ってプロテインシーケンサーにかけたところ、第３番目以降の配列を分析することができた。
【００２４】
実施例２
実施例１の第１カップリング工程において、Ｓ−ＰＩＴＣ水溶液をＰＩＴＣメタノール溶液（１８０ｍｇ／２０ｍｌ）に代え、反応後の洗浄を１０重量％の酢酸メタノール溶液に代えた以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果、実施例１と同じ位置に黄緑色の蛍光スポットが検出された。
【００２５】
なお、第１カップリング工程においてＳ−ＰＩＴＣを使用すると、Ｓ−ＰＩＴＣは、反応性が高く、取扱いも容易であるという利点を有しているが、リジンの配列の所でε−アミノ基にＳ−ＰＩＴＣがカップリングした状態になっているため、通常のエドマン分解の場合のＨＰＬＣでの流出位置が異なることに注意する必要がある。一方、ＰＩＴＣを使用した場合は、通常のリジンの溶出位置と同じであるという便利さはあるが、カップリング反応の迅速性が十分であるとは限らない欠点がある。
【００２６】
実施例３
実施例１と同様に調製したＰＶＤＦ膜をメタノール溶液に常温で２分間浸した後、これを取出してＦＩＴＣのメタノール溶液（４０ｍｇ／２０ｍｌ）をスプレーし、２分後に１０重量％のトリメチルアミン水溶液をスプレーして９０分間常温で反応させた。次に、１０容量％の酢酸メタノール溶液で３回洗浄してＰＶＤＦ膜を中性にし、かつ、試薬を洗い流し（第１洗浄工程）、メタノールで十分に洗浄した後（第２洗浄工程）、再び１０重量％のトリメチルアミン水溶液を軽くスプレーしてＰＶＤＦ膜を塩基性にした（第３洗浄工程）。洗浄後の膜を十分に乾燥させた後、紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を照射したところ、黄緑色の蛍光を発したスポットが検出された。このとき、ＰＶＤＦ膜の蛍光バックグラウンドは、ほとんどなかった。
【００２７】
また、蛍光を発したスポットは、実施例１及び実施例２での数より多く、また、従来の染色法で行ったときよりも微量のスポットを検出することができた。さらに、実施例１及び実施例２で蛍光を発したスポットの位置は、本実施例で蛍光を発したスポットの一部であった。本実施例では蛍光を発したが、実施例１，２で蛍光を発しなかった位置のスポットを切り取ってプロテインシーケンサーにかけてみたが、配列を分析することはできなかった。このことから、このタンパク質（ペプチド）は、そのＮ末端が何らかで修飾されていたものと判断される。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のタンパク質の識別方法によれば、電気泳動法等により分離した各タンパク質におけるＮ末端の修飾の有無を確実に識別することができ、タンパク質やペプチドにおけるアミノ酸配列の分析を効率よく行うことができる。また、本発明のタンパク質の検出方法は、極微量のタンパク質やペプチドを高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のタンパク質の識別方法における各工程の流れを示す工程図である。
【図１】
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