(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポ蛋白Ａ-I（以下、ａｐｏＡ-Iと称することがある）を構成するアミノ酸のうちアミノ酸番号２２７番目から２４３番目までの配列に対応する１７個のアミノ酸よりなる抗動脈硬化ペプチド。
【請求項２】
式：ＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ、または式：ＶＳＦＫＳＡＫＥＥＴＴＫＫＬＮＴＱ[式中の各構成要素は、Ｄ：アスパラギン酸、Ｎ：アスパラギン、Ｔ：トレオニオン、Ｓ：セリン、Ｅ：グルタミン酸、Ｑ：グルタミン、Ｐ：プロリン、Ｇ：グリシン、Ａ：アラニン、Ｖ：バリン、Ｍ：メチオニン、Ｉ：イソロイシン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｋ：リジン、Ｈ：ヒスチジン、Ｒ：アルギニン、Ｗ：トリプトファン]で示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載の抗動脈硬化ペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のペプチドを含有する抗動脈硬化剤。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のペプチドを含有する経皮的冠動脈形成術（Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty：以下、ＰＴＣＡと称することがある）後狭窄予防薬。
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は粥状動脈硬化に起因する疾病の治療、予防に有用なペプチド並びに該ペプチドを含有する抗動脈硬化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】
今日、先進国では虚血性心疾患及び虚血性脳疾患等の虚血性疾患が癌と並んで死因の大きな部分を占めている。虚血性疾患の大部分は粥状動脈硬化を基盤として発症しているので、そのため粥状動脈硬化の治療に有効な薬剤の開発が望まれている。粥状動脈硬化の発生のメカニズムはRussel Rossの"Injury to Response"説が今日広く受け入れられている(Ross R., Nature,362,p.801-(1993))。即ち、血管の内皮細胞は障害を受けたり、あるいは高脂血症、ウイルス感染、高血圧などの刺激を受けると平滑筋の増殖を促進する種々のgrowth factorを産生する。その結果、平滑筋が増殖して内膜の肥厚を生ずる。さらに内皮細胞はモノサイトやＴ細胞の接着因子を発現させて内皮下へそれらの細胞を呼び入れる。内皮下へ入ったモノサイトはマクロファージとなり、スカベンジャーレセプターを発現して、変性した低密度リポ蛋白質(Low Density Lipoprotein (以下、ＬＤＬと称することがある))コレステロールを無制限に取り込み、泡沫細胞となって粥状動脈硬化の病巣を形成する。粥状動脈硬化が冠状動脈にできた場合、内腔を狭窄して狭心症を引き起こし、また粥状動脈硬化巣が破綻すれば血栓を形成して不安定狭心症や心筋梗塞などの重篤な疾病を招来する。脳動脈に粥状動脈硬化が発生した場合には脳梗塞あるいは脳内出血を起こす原因となる。また、下肢支配動脈(腎下部大動脈から大腿動脈)の場合は閉塞性動脈硬化症を引き起こす。このように粥状動脈硬化は重大な疾病の原因となっている。
【０００３】
血清のコレステロールは主に２種類のリポ蛋白質によって運搬されている。１つは肝臓で合成されたコレステロールや食事由来のコレステロールを末梢組織に運ぶＬＤＬであり、２つ目は末梢組織で余剰となったコレステロールを肝臓に運ぶ高比重リポ蛋白質(High Density Lipoprotein(以下、ＨＤＬと称することがある))である。肝臓に戻されたコレステロールは胆汁酸として排泄される。ＬＤＬによって運ばれるコレステロールをＬＤＬコレステロール、ＨＤＬによって運ばれるコレステロールをＨＤＬコレステロールと呼んでいる。粥状動脈硬化の発生と進展にはＬＤＬコレステロールが密接に関係しており、一方ＨＤＬコレステロールは粥状動脈硬化巣に蓄積しているコレステロールを引き抜いて肝臓へ送る役割をしていることから、抗粥状動脈硬化的に作用するとされている(Philips M.C. et al. Biochem. Biophys. Acta, 906:p.223- (1987))。疫学的にも血清コレステロール量と心疾患の発生率が相関すること(Kannel W. B., et al. The Framingham Study. Ann. Intern. Med., 74:p.1-, (1971))及びＨＤＬコレステロール量と心疾患の発生率は逆相関すること(Miller N. E., et al. Lancet, 2:p.965-,(1977))が知られている。
【０００４】
このことより虚血性疾患の発症を予防する方法として、まず血清コレステロールを低下させることが考慮され得るが、それには種々の方法が知られている。例えば、生体内でのコレステロールの合成を阻害するＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素の阻害剤、胆汁酸の再吸収を阻害してコレステロールから胆汁酸への転換を亢進させるイオン交換樹脂剤、ＬＤＬを生成するＶＬＤＬの合成を阻害するニコチン酸剤等がある。また、酸化ＬＤＬの生成を抑制するプロブコール等の薬剤も使われている。これらの薬剤の組み合わせによりＬＤＬコレステロールを低下させて退縮が認められたとの報告もあるが(Brown G., et al. N. Engl. J. Med., 323:p.1289-, (1990))、これらの薬剤は作用メカニズムとして粥状動脈硬化巣に直接作用するものではないので、期待し得る効果としては粥状動脈硬化の進展の抑制である。一方、粥状動脈硬化は前述したコレステロールの他に糖尿病、高血圧、喫煙及び肥満等もリスクファクターに挙げられている。粥状動脈硬化の進展の抑制を図るには上述した薬剤によるコレステロールの管理だけでは不十分である。
【０００５】
粥状動脈硬化の最も望ましい治療法は病巣を退縮させることである。粥状動脈硬化巣はコレステロールを低下させると退縮が起こることが知られている(Blankenhorn D. H., et al. JAMA, 257:p.3233-,(1987))。このことからＬＤＬコレステロールを選択的に体外循環によって取り除くＬＤＬアフェレーシス療法が開発されている。この療法は冠動脈狭窄や下肢動脈の狭窄、閉塞を退縮に導く治療法として認められている。しかしながらＬＤＬコレステロールをほとんど無になるまで下げてもリバウンド(rebound)が起こって、３週間で元のレベルに戻ってしまうので、２週間に１回の反復施行が必要であり、さらに退縮を生じさせるには年単位の施行期間が必要であるため、患者の負担が極めて大きい治療法である。
【０００６】
粥状動脈硬化の望まれている治療法は薬剤の投与によって非観血的に病巣の治癒を導くことである。この方法としてＨＤＬの抗粥状動脈硬化作用が注目されている。Badimonらは高脂食を投与して粥状動脈硬化を作らせたウサギにＨＤＬを静脈内注射して粥状動脈硬化巣を退縮させたことを報告している(Badimon J.J., et al. J. Clin. Invest., 85:p.1234-,(1990))。また、ＨＤＬを構成する主要なアポ蛋白であるapolipoprotein A-I(ａｐｏＡ-I)を使って人工ＨＤＬを調製し、抗動脈硬化剤とする方法が試みられている(特許公報 特開昭61-152632)。さらに、高脂食を与えて動脈硬化を作らせたウサギにａｐｏＡ-Iを静脈内注射して動脈硬化の進行を抑制する試みが行なわれている(Maciejko J. J., et al. Arteriosclerosis, 2:p.407a-,(1982))。
【０００７】
これに対して、ＨＤＬの抗粥状動脈硬化作用については生理学的な面から疑問視する意見が出されている。即ち、ＨＤＬコレステロールの低下ないし欠損する遺伝性疾患の全てが冠状動脈疾患を高率に発症するわけではないこと(Durrington P. N., Lancet, 342:p.1315-,(1993))、高ＨＤＬコレステロール血症でも冠状動脈疾患を認める症例が報告されていること(山下静也ほか 動脈硬化 13:p.981-,(1985))、ａｐｏＡ-Iノックアウトマウスでも動脈硬化は必ずしも進展するわけではないこと(Li H., et al. Arterioscler. Thromb., 13:p.1814-,(1993))等の知見があるためであり、これらはＨＤＬ及びａｐｏＡ-I共に粥状動脈硬化の防御に直接関係していないことを示していると考えられるからである。これによれば、ＨＤＬコレステロールは心疾患の疫学上の単なるマーカーに過ぎないことになる。このようにＨＤＬの抗粥状動脈硬化作用のメカニズムについては現在のところ不明な点が多い。
【０００８】
本発明はＨＤＬの抗動脈硬化作用の機序を明らかにすべく、特にａｐｏＡ-Iの抗粥状動脈硬化作用の役割について鋭意検討した結果、驚くべきことにａｐｏＡ-IのＣ末端ペプチドが完全分子型のａｐｏＡ-Iでは効果がない場合でも著しい抗粥状動脈硬化作用を示し、さらに、完全分子型のａｐｏＡ-Iでは認められないＨＤＬコレステロールの上昇も引き起こすことを見出し、該知見を基に本発明を完成するに至った。従って、本願発明の目的は、粥状動脈硬化の進展を抑制し退縮を促進させることによって、粥状動脈硬化を基盤として発病する疾病を治療する薬剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上述の目的を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、下述する知見を得、該知見に基づいて更なる研究の結果、本願発明の完成に至ったものである。
即ち、本発明者は高脂食を投与して高脂血症状態を作らせたウサギに遊離の完全分子型ウサギａｐｏＡ-Iを静脈内に注射した時、接種したａｐｏＡ-Iが血清中で分解を受けることを見出した。そこでａｐｏＡ-Iの分解物の抗動脈硬化作用を調べたところ、ａｐｏＡ-IのＣ末端領域のペプチドが著しい抗粥状動脈効果作用を示すことを見出し、これらの知見に基づき本願発明を完成した。
該ペプチドは化学合成によって、または大腸菌、酵母等の微生物あるいはＣＨＯ細胞等の動物細胞を宿主として用いた遺伝子組換え技術によって得ることができる。さらに、完全分子型ａｐｏＡ-Iを適当なプロテアーゼで処理して、ａｐｏＡ-Iより切り出された該ペプチドを採取して得ることもできる。ａｐｏＡ-Ｉを構成するアミノ酸のうちアミノ酸番号２２７番目から２４３番目までの配列に対応する１７個のアミノ酸を含むペプチドまたはその類似体は、いずれも抗粥状動脈硬化作用を期待しうるが、ヒトに用いる場合には、下記のアミノ酸配列で示されるアミノ酸よりなるペプチドが特に好ましい。
【００１０】
ヒト    ペプチドA(Peptide A)  ＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ
ヒト    ペプチドB(Peptide B)  ＶＳＦＫＳＡＫＥＥＴＴＫＫＬＮＴＱ
式中、記号は次のように定義される。［Ｄ:アスパラギン酸、Ｎ:アスパラギン、Ｔ:トレオニン、Ｓ:セリン、Ｅ:グルタミン酸、Ｑ:グルタミン、Ｐ:プロリン、Ｇ:グリシン、Ａ:アラニン、Ｖ:バリン、Ｍ:メチオニン、Ｉ:イソロイシン、Ｌ:ロイシン、Ｙ:チロシン、Ｆ:フェニルアラニン、Ｋ:リジン、Ｈ:ヒスチジン、Ｒ:アルギニン、Ｗ:トリプトファン］
【００１１】
薬効を調べるためにウサギ動脈硬化症モデルを作製して検討を行なった。この動物実験ではウサギａｐｏＡ-Iの227番目から243番目のアミノ酸配列に対応する下記のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。
ウサギ  ペプチドC(Peptide C)  ＡＳＶＱＮＬＶＤＥＡＴＫＫＬＮＴＱ
なお、ヒト、ウサギ、イヌ及びラットのそれぞれのａｐｏＡ-Iのアミノ酸配列を比較すると、Ｃ末端領域の237番目から243番目までが４種ともに完全に一致している。従って、ａｐｏＡ-IのＣ末端領域の237番目から243番目に対応するペプチドに抗動脈硬化作用の本態が存在することが推定される。
これらのペプチドを含有する薬剤は薬学的に有効な担体等と調合されて好適に製剤化され、静脈注射剤、経口剤、経皮薬及び経粘膜薬として用いることができる。
【００１２】
【発明の作用並びに効果】
本願発明によってもたらされるペプチドの作用は以下の方法で確認した。
ペプチドCをウサギ体重あたり５０μg/kg〜５mg/kg、好ましくは１mg/kgを投与して、高脂食例えば０.５％コレステロールを添加した飼料等で飼育して大動脈等の動脈に生じる粥状動脈硬化の発生を抑えること、及びＨＤＬコレステロールが上昇することを指標として確認することができた。また、高脂食を与えて飼育して予め粥状動脈硬化を作らせたウサギにペプチドCを５０μg/kg〜５mg/kg、好ましくは１mg/kg投与して、大動脈及び冠状動脈を摘出し、それらにできた粥状動脈硬化の病巣が退縮することから確認することができた。
さらに、動物の動脈例えばウサギの頸動脈をバルーンカテーテルで障害したＰＴＣＡ(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty)後の再狭窄モデルを作製し、次いでペプチドC ５０μg/kg〜５mg/kg、好ましくは１mg/kgをウサギのＰＴＣＡ後再狭窄モデルに投与して、バルーンによる障害を受けた頸部動脈を摘出し、内膜の肥厚を測定することによって確認し得た。
従って、本願発明によってもたらされるペプチドを本態とする抗動脈硬化剤並びにＰＴＣＡ後の再狭窄予防薬によって、完全分子型ａｐｏＡ-I等従来の薬剤で達成することのできなかった驚くべき効果を期待することができる。
【００１３】
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
実施例 １
(ペプチドの調製 1)
請求項１に記載のペプチドを以下に示す方法で合成した。ペプチドの合成はアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製 430A Peptide Synthesizerを用い、t-Ｂｏｃアミン酸の対称性無水物で合成を行なった。次に、アニソール・ジメチルサルファイド・パラチオクレゾール中に溶かした合成ペプチドを０〜５℃のフッ化水素酸の存在下で１時間反応させて脱保護を行なった。この方法は、S. Sakakibaraによる方法 (Ball. Chem. Soc. Jpm. 40: p.2164-, (1967))である。この粗結晶を２Ｎ酢酸に溶解して抽出し、凍結乾燥を行なった。これをアプライドバイオシステムズ社製Brownleeカラム(直径１０mm、長さ２５０mm)を用い、０.１％ Trifluoroacetic acid(ＴＦＡ)溶液と０.０９％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル(Acetonitrile)溶液でグラジエント(０→１００％)をかけることによって精製した。この時のペプチドA、ペプチドB及びペプチドCのクロマトグラフを第１図に示す。
【００１５】
実施例 ２
(ペプチドの調製 2)
ファルマシア社製のCNBr-activated Sepharose 4Bを用いて、エラスターゼ(Elastase)をリガンドとしたElastase-Sepharose 4Bを作製した。即ち、１０mgのElastase(シグマ社)を０.５Ｍ ＮａＣｌを含む０.１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液(ｐＨ ８.３)５０mlに溶解し、CNBr-activated Sepharose gel １０mlを加えて室温で１時間カップリングさせて作製した。このElastase-Sepharose 4B gel １０mlに０.０１Ｍ リン酸緩衝化生理食塩水(phosphate buffered saline:ＰＢＳ)(ｐＨ ７.４)でウサギａｐｏＡ-Iを５mg/mlの濃度に溶解した溶液１００mlを混合し、３７℃で３日間ローテーターで攪拌した。３０００rpmで１０分間遠心処理してゲルを分離し、この上清をPoly LC社のpoly hydroxyethyl aspartamideカラムに通液し、１０mM Triethylamine Phosphateを含む７０％アセトニトリル緩衝液と１０mM Triethylamine Phosphateを含む４０％アセトニトリル緩衝液のグラジエント(５％→１００％)で分離精製を行なった。ピーク３がペプチドCで、ピーク４がＣ末端側のペプチドが欠損したdegraded ａｐｏＡ-I(以下、D.ａｐｏＡ-Iと称することがある)である。
【００１６】
実施例 ３
(粥状動脈硬化の進展の抑制)
ニュージーランドホワイト種の雄性ウサギ(ｎ=１０)にペプチドCを体重１kgあたり１mgの割合で、２日に１回、計３０回静脈内注射した。また、遊離のウサギａｐｏＡ-Iを体重１kgあたり５mg、２日に１回、計３０回静脈内注射した。対照群として生理食塩水を接種した。接種開始と同時に０.５％コレステロールを含む日本農産固型RG-RO飼料を１５０g/日/匹投与して、６０日間飼育した。また、１５日毎に採血して血清総コレステロール量及びＨＤＬコレステロール量を測定した。飼育６０日目に解剖して胸部腹部大動脈を摘出した。胸部腹部大動脈は１０％中性ホルマリンで１晩固定した後、SudanIVにて脂質染色を行なった。SudanIVで染色された領域を画像解析装置(エプソン社)を使って面積を測定した。その結果ペプチドC接種群は対照群よりも有意(p<0.05)に病変面積が小さく、ペプチドCの接種によって動脈硬化の発生と進展が抑制されることが判った。一方、遊離の完全分子型ａｐｏＡ-I接種群では病変面積は対照群と差は観られず、抗粥状動脈硬化作用は認められなかった(以上表１参照)。
さらに、ペプチドC接種群は対照群に比べて有意(p<0.05)にＨＤＬコレステロールの上昇が認められ、血清総コレステロールでは、対照群よりも有意(p<0.05)に低いことが明らかとなった。これに対して遊離のａｐｏＡ-IはＨＤＬコレステロール量及び血清総コレステロール量共に対照群との間に差は認められなかった
。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
実施例 ４
(粥状動脈硬化の退縮作用)
ニュージーランドホワイト種の雄性のウサギに０.５％コレステロールを含むRG-RO飼料を１５０g/日/匹、１０５日間投与した。１０６日目より正常食に替えて飼育し、１６５日目からペプチドC、遊離のウサギａｐｏＡ-I、ウサギD.ａｐｏＡ-Iを接種した。ペプチドCの場合は体重１kgあたり１mg、ａｐｏＡ-Iの場合は体重１kgあたり５mg、D.ａｐｏＡ-Iの場合は体重１kgあたり１mgの割合で２日に１回、計３０回耳静脈内注射を行なった。飼育２２５日目に解剖して、胸部腹部大動脈を摘出し、１０％ホルマリンにて１晩固定した。この後SudanIVにて粥状動脈硬化巣を染色し、染色された領域を画像解析装置で面積の測定を行なった。その結果、ペプチドC接種群は胸部腹部大動脈に於いて対照群よりも有意に病変面積が小さく粥状動脈硬化の退縮を引き起こしていることがわかった。一方、遊離のａｐｏＡ-I及びD.ａｐｏＡ-I接種群では対照群と差は認められなかった(表２参照)。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
実施例 ５
(ＰＴＣＡ後の再狭窄に対する効果)
体重２.５〜３.０kgのニュージーランドホワイト種の雄性ウサギの外頸動脈より、Baxter社製2Fr.Fogarty Catheterを総頸動脈に向けて挿入し、４００mmHgの圧力でバルーンを膨らませて３回擦過することにより血管内皮を剥離してＰＴＣＡ後の再狭窄動物モデルを作製した。バルーン処置直後からペプチドCを体重１kgあたり１mgを毎日耳静脈へ注射した。１４日目に総頸動脈を３％グルタルアルデヒド液で潅流固定した後摘出し、Resorcin-Fuchsin染色した病理組織標本を作製して内膜の肥厚を測定した。ペプチドC接種群は対照群よりも内膜の肥厚が少なく、ＰＴＣＡ後の再狭窄の予防に効果のあることが判明した(表３参照)。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  合成ペプチドの精製に関するもので、化学合成したペプチドの高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)による精製のクロマトグラフを示す図である。Ａのpeak2がペプチドA、Ｂのpeak1がペプチドB、Ｃのpeak1がペプチドCを示す。
【図２】  ａｐｏＡ-Iからの本願発明のペプチドの精製に関するもので、peak3が分子量2,000のペプチドC、peak 4が分子量26,000のD.ａｐｏＡ-Iを示す。
【図３】  ウサギ血清中のＨＤＬコレステロール量(mg/dl)の経日変化を示す。
【図４】  ウサギ血清中の総コレステロール(mg/dl)の経日変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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