(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の可変領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する可変領域を含む軽鎖、および配列番号４の可変領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する可変領域を含む重鎖、を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ATCC番号12020で示されるハイブリドーマ細胞株またはその子孫。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗体の有効量および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗体の有効量および薬学的に受容可能な賦形剤を含むワクチン。
【請求項６】
進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を伴う個体において免疫応答を惹起するための組成物であって、請求項１または２に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項７】
進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を伴う個体において免疫応答を惹起するための、請求項５に記載のワクチン。
【請求項８】
前記進行性のヒト乳脂肪球関連疾患が乳ガンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
標識抗ヒト乳脂肪球（HMFG）抗体を受容した個体から標識抗HMFG抗体を除去するための組成物であって、請求項１または２に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１０】
腫瘍細胞に結合した抗ヒト乳脂肪球（HMFG）抗体の存在を検出する方法であって、該腫瘍細胞と請求項１または２に記載の抗体とを、該抗HMFG抗体に結合させるのに充分な時間接触させる工程、および該抗HMFG抗体に結合される請求項１または２の該抗体の存在を検出する工程を包含する方法。
【請求項１１】
個体において抗ヒト乳脂肪球免疫応答を検出する方法であって、
(a)該個体由来の生物学的試料と請求項１または２に記載の抗体とを、請求項１または２の該抗体と請求項１または２の該抗体に結合する抗体との間で安定な複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程、および(b)形成された任意の安定な複合体を検出する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を有する個体において、ヒト乳脂肪球関連疾患を緩和するための組成物であって、請求項１または２に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項１３】
抗ヒト乳脂肪球抗体を検出または定量するためのキットであって、
適切なパッケージング中に請求項１または２に記載の抗体を含む、キット。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の前記抗体が検出可能な標識を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を伴う個体において免疫応答を惹起するためのワクチンであって、請求項１または２に記載の抗体の有効量を含む、ワクチン。
【請求項１６】
前記進行性のヒト乳脂肪球関連疾患が乳ガンである、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
標識抗ヒト乳脂肪球（HMFG）抗体を受容した個体から標識抗HMFG抗体を除去するためのワクチンであって、請求項１または２に記載の抗体を含む、ワクチン。
【請求項１８】
進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を有する個体において、ヒト乳脂肪球関連疾患を緩和するためのワクチンであって、請求項１または２に記載の抗体の有効量を含む、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
関連出願への相互参照
本出願は、1995年12月20日に出願された、米国仮特許出願第＿＿＿号（以前の米国特許出願第08/575,762号（代理人照会番号30414-20003.00）および1996年１月29日に出願された、米国仮特許出願第＿＿＿号（以前の米国特許出願第08/591,965号（代理人照会番号30414-20003.00）の利点を請求するものであり、それらの全ては本明細書中に参考として援用される。
政府の援助による研究の下で行われた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、研究の一部を、米国国立衛生研究所から得た研究奨励金（RO1 CA 47860,CA 56701,PO1 CA 59306,CA 57165,RO1 CA 6000,UO1 65748およびCRF奨励金PO1 CA 42767）の援助でなされた。米国連邦政府は本発明に、ある権利を有する。
技術分野
本発明は、モノクローナル抗イディオタイプ抗体に関する。より詳細には、本発明は、ヒト乳脂肪球（HMFG）の特異的なエピトープに対する免疫応答を誘発する抗イディオタイプ抗体11D10、ならびに11D10に対するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に関する。
発明の背景
広範な医学研究および多くの進歩にもかかわらず、依然としてガンは米国における主な死亡原因の第２位である。女性においては、乳ガンが最も一般的なガン死亡の原因である。従来の治療様式（例えば、外科手術、放射線療法、および化学療法）が広く用いられ、そして多くの成功例が存在する一方、なお有意な失敗例が、特に固形腫瘍について存在する。乳ガンのようなガンによる死亡率は依然として高く、別の治療様式が強く求められている。
腫瘍細胞、または腫瘍由来のワクチンを使用するヒトのガンの免疫治療は、いくつかの理由のために実現を妨げられてきた。大量の、または精製された腫瘍関連抗原を得ることは一貫して困難である。これらは、しばしば化学的に不明確であり、そして精製が困難である。さらに、これらには腫瘍抗原に対する免疫生物学的応答能の問題が残されている。すなわち、言い換えれば、ガン患者が自己の腫瘍に対する免疫応答を効果的に増大させ得るか否かという問題である。腫瘍関連抗原（TAA）は、しばしば「自己（self）」の一部であり、そして通常、抗原に対する寛容（例えば、Ｔ細胞媒介性抑制）のために、腫瘍保有宿主中において非常に乏しい免疫応答を誘発する。さらに、ガン患者は免疫抑制されている傾向があり、ある種のＴ細胞依存性抗原にしか反応しない。
免疫生物学者は、分子環境を変化させることにより、（免疫応答の誘発に関して）弱い抗原を強い抗原に変換させ得ることを習得している。ハプテンキャリアの変更は、Ｔ細胞ヘルパー細胞を活性にし、免疫応答全体をより強力にする。従って、キャリアの変更はまた、寛容性抗原を有効な抗原に変換し得る。McBridgeら（1986）Br.J.Cancer 53:707。しばしば、ガン患者の免疫学的状態は抑制されており、その結果、患者は特定のT-依存性抗原に応答し得るにすぎず、他の抗原形態には応答し得ない。これらを考慮すると、抗原をワクチンとして患者に使用する前に、腫瘍関連抗原への分子の変更を導入することは意味がある。不運なことに、これはほとんどの腫瘍抗原について達成不可能である。なぜなら、それらは十分に同定されておらず、そして、その精製が非常に困難であるからである。
Lindemann((1973)Ann.Immunol.124:171-184)およびJerne((1974)Ann.Immunol.125:373-389)のネットワーク仮説は、エピトープ構造を、抗体の表面で発現されるイディオタイプの決定因子に変換するための優れたアプローチを提供する。このネットワーク概念によれば、所定の腫瘍関連抗原での免疫化は、この腫瘍関連抗原に対する抗体（Ab1という）の産生を生じ、次いでこのAb1は、Ab1に対する一連の抗イディオタイプ抗体（Ab2という）を作製するために使用される。これらのAb2分子のいくつかは、Ab1により同定された腫瘍関連抗原の三次元構造を事実上模倣し得る。Ab2βと呼ばれるこれらの特定の抗イディオタイプは、Ab1のパラトープに適合し、そして腫瘍関連抗原の内部イメージを発現する。Ab2βは、オリジナルの腫瘍関連抗原によって誘導されるものと類似の特異的な免疫応答を誘導し得、これにより、代理の腫瘍関連抗原として使用され得る。Ab2βでの免疫化は、Ab1によって同定される対応するもとの腫瘍関連抗原を認識する、抗-抗イディオタイプ抗体（Ab3）の作製を導き得る。このAb1様の反応性のために、Ab3またはAb1'とも呼ばれ、Ab3がAb1由来の他のイディオタイプと異なり得ることを示す。
ガン処置に対する可能性のある有望なアプローチは、抗イディオタイプ抗体を使用する免疫療法である。この治療の形態では、腫瘍関連タンパク質を介して腫瘍に対する患者の免疫系を刺激するための努力において、腫瘍関連タンパク質のエピトープを模倣する抗体が投与される。WO 91/11465は、ヒトにおいて霊長類の抗イディオタイプ抗体を使用して、悪性細胞または感染性因子に対して免疫応答を刺激する方法を記載している。しかし、腫瘍に対する治療レジメにおいて、全ての抗イディオタイプ抗体が使用され得るわけではない。第１に、Ab1に対して惹起された抗体はほんの一部のみがAb1のパラトープに対するそれらの反応性を制限されている（すなわち、宿主の他の可能性のある抗体と共通の特徴に非反応性である）。第２に、抗イディオタイプ抗体は必ずしも免疫原性ではない。第３に、たとえ抗イディオタイプが免疫応答を誘発しても、ごく一部のこれらの免疫原性の抗イディオタイプが、腫瘍抗原に対して免疫応答を誘発し、そして特異性の低い他の抗原に対して誘発しない。さらに、異なるガンは広範に変化している分子および臨床的特徴を有するので、抗イディオタイプ治療は、場合に応じて、腫瘍の起源および抗原発現に基づいて評価されるべきであることが示唆される。
腫瘍関連抗原に構造的に類似している抗Idモノクローナル抗体は、ガン患者における抗原置換物として使用される。Herlynら、(1987)PNAS 84:8055-8059;Mittlemanら、(1992)PNAS 89:466-470;Chatterjeeら、(1993)Ann.N.Y.Acad.Sci.690:376-377。抗Idは、免疫原性の状況において、腫瘍関連抗原の部分的アナログを提供することが提唱されている。
ヒト乳脂肪球（HMFG）は、乳房上皮細胞によって母乳に分泌される乳脂肪球であり、そして血漿膜に包まれた脂肪滴からなる。このように、HMFGは上皮膜結合型抗原の豊富な供給源である。HMFGの抗原成分の一つは高分子量の、乳ガンならびに卵巣、肺、および膵臓のような他のガンに関連する膜結合型ムチンである。このムチンはcDNA由来の既知のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。半精製したHMFGはいくつかの供給源から少量が入手可能で、そして血漿学的アッセイに使用され得る。Petersonら、(1990)Hybridoma 9:221-235。しかし、HMFGは、単離および精製することが非常に困難で、そして精製されたHMFGは患者の免疫あるいは動物実験には使用できない。さらに、HMFG上のいくつかのエピトープが正常の組織、特に非貫通型糖タンパク質と共通であるため、インタクトなHMFG分子での免疫は有害である可能性のある自己免疫応答を誘発し得る。腫瘍関連エピトープに対する免疫応答は、これに対して、はるかにより望ましい。
HMFGの成分を認識する一連のマウスモノクローナル抗体（mAbs）は、主としてヒト乳ガンに関連し、ほとんどの正常な細胞には関連しないことが記述されてきた。Chatterjeeら、(1993)Ann.N.Y.Acad.Sci.690:376-377;Cerianiら(1983)Somatic Cell Genet.9:415-427。これらのmAbの中で、MC-10(BrE-1)が、高密度で存在する高分子量(分子量400,000)の80％を超える乳ガン細胞のムチン様タンパク質に最も制限されて特異的に反応し、そして、肺上皮内層および腎細管のようないくつかの正常な組織に最小限に発現されている。Cerianiら(1983);Cerianiら(1990)Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 3:181-198。
再発した乳ガンは標準的な治療では治療不可能である。したがって、この疾患に対する新たな治療的アプローチが必要である。本発明は、モノクローナル抗イディオタイプ抗体（11D10）をヒト以外の霊長類におけるHMFGに対する免疫応答を誘発する抗原（Ag)として提供することにより、先行技術における欠陥を克服する。これらは、進行性のHMFG関連のガン（乳ガンなど）を有する患者における抗腫瘍免疫の処置に有用であり得る。
本明細書中で引用した全ての出版物は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の要旨
本発明は、ヒト乳脂肪球（HMFG）の高分子量ムチンに対する免疫応答を惹起し得るマウス抗イディオタイプ抗体11D10を提供する。本発明はまた、抗イディオタイプ抗体11D10の可変領域の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、11D10、11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物およびワクチンを包含する。本発明にはまた、11D10、11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドを使用する診断キットおよび方法が包含され、この方法には、HMFG関連腫瘍を処置する方法が含まれる。
さらに、本発明の目的は、乳ガンなどのHMFG関連疾患を有する患者において抗腫瘍免疫性を誘導するための、抗イディオタイプ（抗Id）モノクローナル11D10ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組成物および使用方法を提供することである。
従って、１つの局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ATCC寄託番号第12020号またはその子孫によって産生されるモノクローナル抗イディオタイプ抗体11D10を包含する。
別の局面では、本発明はATCC寄託番号第12020号と呼ばれるハイブリドーマ細胞株またはその子孫を包含する。
別の局面では、本発明はまた、モノクローナル抗イディオタイプ抗体11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。ここで、このポリペプチドは、11D10の可変領域の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。
別の局面では、本発明は、少なくとも15の連続するヌクレオチドの領域で構成される単離されたポリヌクレオチドであって、この領域は、その領域が配列番号５から配列番号14までとは安定なハイブリッドを形成しない条件下で、配列番号１の軽鎖可変コード配列からなるポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し得るポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、少なくとも15の連続するヌクレオチドの領域で構成される単離されたポリヌクレオチドであって、この領域は、その領域が配列番号15から配列番号32までとは安定なハイブリッドを形成しない条件下で、配列番号３の重鎖可変コード配列からなるポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し得るポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドを含むクローニングベクターおよび発現ベクターである。本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞もまた、含まれる。
本発明の別の局面は、モノクローナル抗イディオタイプ抗体11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドである。ここで、このポリペプチドは、11D10の可変領域由来の少なくとも５つの連続したアミノ酸の配列を含む。
別の局面では、HMFGと相同性のある領域を含む11D10ポリペプチドが提供される。
別の局面では、本発明は、11D10ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。ポリマー性11D10ポリペプチドおよび11D10ポリペプチドを含むヒト化抗体もまた、本発明に含まれる。
別の局面では、本発明は有効量の11D10、11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドを含む薬学的組成物およびワクチンを包含する。
別の局面では、本発明は、進行性のHMFG関連疾患を有する個体において、抗HMFG免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、有効量の11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリペプチドを個体に投与する工程を包含する。
本発明の別の局面は、抗ヒト乳脂肪球（HMFG）抗体を受容した個体から抗HMFG抗体を除去するための方法であり、この方法は、11D10を投与する工程を包含する。
別の局面では、本発明は、腫瘍細胞に結合した抗HMFG抗体の存在を検出する方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞と11D10とを抗HMFG抗体に結合させるのに充分な時間接触させる工程、および抗HMFG抗体に結合した任意の11D10の存在を検出する方法の工程を包含する。
別の局面では、個体において抗HMFG免疫応答を検出するための方法が提供される。これらの方法は、個体由来の生物学的試料と11D10を、11D10と11D10に結合する抗体との間に安定な複合体を形成することを可能にする条件下で接触させる工程、および形成された任意の安定な複合体を検出する工程を包含する。
別の局面では、生物学的試料において11D10に結合する抗体を検出するための方法が提供される。これらの方法には、個体から得た試料由来の抗体と11D10または11D10ポリペプチドとを、安定な抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程、およびもしあれば形成された安定な複合体を検出する工程を必要とする。
本発明の別の局面は、進行性のヒト乳脂肪球関連疾患を有する個体で、ヒト乳脂肪球関連疾患を緩和する方法である。これらの方法には有効量の11D10の個体への投与を必要とする。
別の局面では、本発明はまた、適切なパッケージング中に11D10、11D10ポリペプチドあるいは11D10ポリヌクレオチドを含む検出キットあるいは定量キットを提供する。
本発明の上記および他の目的は、下記の詳細な説明および図面により、当業者に容易に明らかになる。ここで、本発明の好ましい実施態様のみが、単に本発明の実施における最善の形態として例示のために示され、そして記載される。容易に理解されるように、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって改変され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、11D10の軽鎖可変領域および隣接する残基のcDNA配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。CDRおよびフレームワーク領域が示される。正確な翻訳は、アミノ酸-18に対してはＡまたはアラニンを、そして、アミノ酸81に対してはＥまたはグルタミン酸を示すべきである。
図２は、11D10の重鎖可変領域および隣接する残基のcDNA配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図３は、11D10の軽鎖可変領域（配列番号２のアミノ酸１〜107；図3A）および重鎖可変領域（配列番号４のアミノ酸１〜118；図3B）のアミノ酸配列を示す。各可変領域は、４つのフレームワーク領域および３つのCDRからなる。図3Aでは、アミノ酸81に対しての正確な翻訳はＥまたはグルタミン酸を示すべきである。
図４は、データベース調査において11D10軽鎖可変領域をコードする配列と最も近密に適合した10個のポリヌクレオチドを示す。これらの配列は配列番号５から配列番号14の呼称を有する。
図５は、データベース調査において11D10重鎖可変領域をコードする配列と最も近密に適合する10個のヌクレオチド配列を示す。これらの配列は配列番号15から配列番号32の呼称を有する。ダッシュは配列３に相同でない省略した領域に対応する。
図６は、11D10の抗Id特異性（IgG1,κ）を示す棒グラフである。種々のマウスモノクローナルタンパク質および抗HMFG（乳房TAA）抗体に対する125I-標識11D10（約25,000cpm）の結合を直接RIAを使用して決定した。モノクローナルタンパク質のアイソタイプは以下のとおりである：MC-10（BrE-1,IgG2b,κ）第１の棒；IE3（IgGI,κ）第２の棒；4DC6（IgG1,I）、第３の棒；BrE-3（IgG1,κ）第４の棒；Hy-Clone IgG2b、第５の棒；Hy-Clone IgG3、ｋ、第６の棒；IgG3,Hy-Clone IgA、第７の棒；およびMOPC 104E(IgM,I)、第８の棒；RWP1-1(IgG2b,ｋ）、第９の棒。
図７は、精製Ab2によるMCF-7およびSKBR3細胞へのMC-10（BrE-1）の結合の阻害を表すグラフである。黒丸は11D10のMCF-7細胞への結合についての競合を示し；白丸は11D10のSKBR3細胞への結合を示し；白四角は3H1のMCF-7またはSKBR3細胞への結合を示す。
図８は、ELISAによる、乳房ガン細胞株SKBR3への吸収したポリクローナルマウスおよびウサギAb3血清ならびにmAb3の結合の結合を示したグラフである。白丸は11D10−2F7（mAb3）を示し；黒丸はマウスAb3血清を示し；白三角はウサギAb3血清を示し；白四角は1E3コントロールを示す。
図９は、mAb3ならびにポリクローナルマウスおよびウサギAb3血清によるMC-10（BrE-1）のSKBR3細胞への結合の阻害を示したグラフである。黒丸はウサギ（Ab3）血清（#123）を示し；白丸は11D10-2F7（mAb3）を示し；白四角はマウスAb3血清を示し；白三角は免疫前の血清（コントロール）を示す。
図10は、ニトロセルロースペーパー上のHMFGのmAb1およびmAb3でのトランスブロット分析のハーフトーン複写物である。レーン１、MC-10（10μg/ml）；レーン２、IE3 IgG1（コントロール；50μg/ml）；レーン３、mAb3 IgG1（50μg/ml）。
図11は、11D10抗Id反応性抗体の乳ガン患者の血清における発現レベルを示したグラフである。
図12は、RIAによる、Ab1（mAb MC-10）の11D10（Ab2）への結合のサル（PRO 723）Ab3血清による阻害を表したグラフである。黒丸は３回の免疫後の血清を示し；白丸は２回の免疫後の血清を示し；黒四角は１回の免疫後の血清を示し；×は免疫前の血清を示す。
図13は、ELISAによる、サルAb3血清の乳ガン細胞株MCF-7への結合を示した棒グラフである。目の粗い斜線の棒は免疫前の血清を示し；斜線の棒は免疫血清を示し；白棒はコントロール血清を示す。点線はサルAb3血清のメラノーマ細胞株M21/P6への結合を示す。
図14は、ELISAによる、サルAb3血清の半精製HMFGへの結合を示した棒グラフである。第１の棒、免疫血清；第２の棒、免疫前血清；第３の棒、コントロール血清；第４の棒、ウシ血清アルブミン（BSA）。
図15Aおよび15Bは、MCF-7細胞のサルAb3血清での免疫フローサイトメトリー分析を示す。図15Aでは、腫瘍細胞を免疫前血清および11D10で免疫したサル由来のAb3血清（１：100希釈）と反応させた。図15Bでは、HMFGを発現しないMOLT-4細胞を免疫前血清および11D10に対して惹起された免疫サルAb3血清と反応させた。
図16は、ELISAによる、精製サルAb3のHMFGまたは精製CEAへの結合を示した棒グラフである。図の左部は、HMFGでコートしたプレートを示し；図の右部はCEAでコートしたプレートを示す。図の左部では、第１の棒はAb3を示し；第２の棒はコントロールAb3を示し；第３の棒はPBS-BSAを示す。図の右部では、第１の棒はAb3を示し；第２の棒はPBS-BSAを示し；第３の棒は抗CEAを示す。
図17は、HMFGまたは精製CEAでのスロットブロット分析のハーフトーン複写物である。ポリビニリデンジフルオリド膜に異なる濃度のHMFG（レーン１および２）ならびにCEA（レーン３および４）を吸収させた。膜をAb1（レーン１）、精製Ab3（レーン２および３）ならびに抗CEA mAb（コントロールAb1）（レーン４）とインキュベートした。
図18は、Ab1のMCF-7細胞への結合の精製Ab3による阻害を示したグラフである。白丸は11D10で免疫したサルから精製したAb3を示し；黒丸はコントロール3H1で免疫したサルから精製したコントロールAb3を示す。
図19は、サル末梢血単核球（PBM）を用いるＴ細胞増殖アッセイを表した棒グラフである。グラフの左側部分は11D10で刺激したPBMを示し；グラフの右側部分は3H1で刺激したPBMを示す。各部分半分について、左のボックスはサル#872由来のPBMを示し；右側部分はサル#723由来のPBMを示す。白棒は免疫前の血清を示し；黒棒は免疫後の血清を示す。
図20は、ラジオイムノアッセイで測定した場合の、11D10投与後の患者の血清（患者#1）中のAb3の反応性を示すグラフである。白丸は免疫前血清を示し；黒丸は免疫後血清を示す。
図21は、Ab1の11D10への結合の患者血清（患者#1）による阻害を示したグラフである。白丸は免疫前血清を示し；黒丸は免疫後血清を示す。
図22は、患者末梢血リンパ球によるＴ細胞増殖を示す棒グラフである。各対の棒については、白棒は免疫前細胞を示し；黒棒は免疫後細胞を示す。試験した刺激剤は以下のとおりである：培地、第１の対の棒；11D10、第２の対の棒；3H1、第３の対の棒；PHA、第４の対の棒。
図23は、11D10の軽鎖（配列番号２のアミノ酸41〜60、34〜56、および85〜107）ならびに重鎖（配列番号４のアミノ酸43〜62）の可変領域ならびにHMFGの縦列反復配列（配列番号33および配列番号34）の間の選択したアミノ酸配列比較を示す。マッチしたアミノ酸を実線で示す。
図24は、11D10ポリヌクレオチドの発現のための汎用ワクシニアベクター（プラスミド）であるpVVの構築のスキームを示す。白のボックスはワクシニアTK遺伝子を示し；斜線のボックスは7.5Kのワクシニアプロモーターを示す。制限部位は以下のとおりである：A,Apa I;Ns,Nsi I;C,Cla I;E,Eco RI;P,Pst I;Nc,Nco I;Sm,Sma I。(E)および(C)は、それぞれ、潜在的なEco RIおよびCla I部位を示す。３つの終止コドンをS1、S2、およびS3で示す。VLおよびVRはワクシニア隣接配列の左部および右部を示す。TKおよび7.5Kを、ワクシニアの野生型WR株由来DNAを用いたPCRにより得た。
図25は、11D10融合タンパク質の生産に適切なプラスミド（図25A）およびキメラ（図25B）を示す。
図26（Ａ〜Ｃ）は、11D10可変領域のアミノ酸配列を、GenBankデータベース検索から得た15の免疫グロブリン軽鎖および重鎖の配列と比較したリストである。パネルＡは成熟11D10軽鎖可変領域（配列番号２に含まれる）にもっとも近い配列を示し；パネルＢは成熟11D10重鎖可変領域（配列番号４に含まれる）にもっとも近い配列を示す。11D10と同一である残基を点（．）で示し；重鎖VDJ結合についてのアライメントを改善するために導入したギャップを二重線（＝）で示す。パネルＣは軽鎖および重鎖の可変領域コンセンサス配列（配列番号47および配列番号48）を示し、そしてそれらを11D10の配列と比較する。11D10の可変領域は重鎖のVDJ結合について独特のスプライシングの差異を示し、そして原型配列からの追加の18点の差異が軽鎖および重鎖の両方において位置づけられた。
図27Ａおよび27Ｂは、11D10へのAb1の結合の、患者の血清による阻害を示すグラフである。図27Ａは患者#1（白四角）、#2（白菱形）、#3（白丸）、#5（白三角）および#7（格子模様付四角）についてのデータを示す。図27Ｂは患者#6（白四角）、#8（白菱形）、#9（白丸）、#11（白三角）および#12（格子模様付四角）についてのデータを示す。白丸は免疫前の血清を示し；黒丸は免疫後の血清を示す。
図28は、ラジオイムノアッセイ（RIA）測定した、11D10の投与後の患者の血清由来のアフィニティー精製したAb3の反応性を示す棒グラフである（患者#5（第１の対の棒）、#6（第２の対の棒）および#1（第３の対の棒））。第４の対の棒（「X」）は、無関係の患者のAb3を示す。第５の対の棒はMC10を示し；第６の対の棒はリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を示す。各対の棒では、黒棒はIgGを示しそして白棒はIgMを示す。白丸は免疫前の血清を示し；黒丸は免疫後の血清を示す。
図29Aおよび29Bは、患者の末梢血リンパ球によるＴ細胞増殖を示す棒グラフである。各対の棒に対して、白棒は免疫前を示し；黒（または斜線の）棒は免疫後の細胞を示す。図29Aは患者#1についてのデータを示す。図29Bは患者#5についてのデータを示す。試験した刺激物は以下のとおりである：11D10、第１の対の棒；4DC6、第２の対の棒；PHA、第３の対の棒；培地、第４の対の棒。
発明を実施するための形態
本発明者らは、免疫寛容から逃れ、そして乳ガン関連抗原である、ヒト乳脂肪球（HMFG）の異なりそして特異的なエピトープに対する特異的免疫応答を誘導する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体11D10を見出した。11D10によって誘発される免疫応答は典型的には液性応答および細胞性応答の両方を含む。したがって、11D10はHMFG関連疾患を処置することにおいて有用であると予想される。11D10を産生するハイブリドーは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約款のもとに、1996年１月17日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.20852）に寄託された。これは受託番号12020を与えられた。11D10の完全な記載（その生成および特徴付けを含む）は、共有特許出願番号08/575,762（米国仮出願番号＿＿；代理人照会番号30414-20003.00）に見出される。
ガン患者はしばしば免疫抑制され、そして種々の腫瘍関連抗原（TAA）（HMFGを含む）に対して寛容である。このようなTAAに対する活性な免疫応答を引き起こすことは、ガン治療における重要な挑戦を表わす。本発明は、内部イメージ抗原を用いるワクチン治療に対するネットワーク理論アプローチを用いる。所定の抗原での免疫化により、抗原に対する抗体の産生が生じる。本明細書で用いる「Ab1」は、抗腫瘍モノクローナル抗体を表わし；「Ab2」は抗イディオタイプモノクローナル抗体を表わし：そして「Ab3」は抗-抗イディオタイプモノクローナル抗体を表わす。
本発明者らは、HMFGが、自己抗原でない全ての試験した哺乳動物においてHMFGに対する免疫応答（液性および／または細胞性）を誘発することにおいて、11D10が有効であることを見いだした。重要なことに、本発明者らはまた、11D10が、進行性のHMFG関連疾患（特に乳ガン）の患者において免疫応答を誘発することも見いだした。このことは、特に重要である。なぜなら、これらの患者の多くが、その以前の処置またはその疾患のいずれかの性質、あるいはその両方のため、中程度にまたは重篤に日和見（compromised）であり、そしてしばしば11D10を最終手段として受けたからである。特定の理論に固執することは望ましくないが、免疫応答の誘発が生じ得る一つの方法は、11D10の結合部位が、HMFGにおけるエピトープに部分的に類似している領域を提示し得ることである（より高い免疫原性を与える他のエピトープに対して）。11D10のエピトープに類似しているHMFGのエピトープは、抗HMFG mAb MC-10(Ab1)（これはHMFG上の異なりそして特異的なエピトープを認識する）によって同定され、そしてこれを同系BALB/cマウスを抗Id mAb 11D10の産生のために免疫するために使用した。これらの研究は、本発明の抗体が、免疫応答の生成、および進行性の疾患を有する個体における乳ガンのようなHMFG関連疾患の処置に有用であることを示す。本発明者らはまた、11D10が高腫瘍負荷を有する個体におけるHMFG関連疾患の処置においても有効であると信じている。これはまた、Ab1および／またはAb3の検出のためにも有用である。
本発明者らはまた、11D10の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列およびそれによりコードされる11D10のポリペプチドフラグメントも見いだした。それゆえ、本発明は、抗イディオタイプ抗体11D10をコードするポリヌクレオチド配列およびその機能的に等価なフラグメント、11D10のポリペプチドフラグメント、これらの11D10ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを産生するための組換え方法、11D10ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチン組成物、11D10ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む診断キット、ならびに11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドを使用する方法を包含する。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、乳ガンのようなHMFG関連疾患の評価および処置に有用である。本発明の11D10ポリヌクレオチドおよび11D10ポリペプチドのこれらおよび他の使用は、以下でより詳細に議論される。
11D10軽鎖および重鎖定常領域の全配列は決定されていないが、他のマウス免疫グロブリン分子の配列と同一かまたはほとんど同一であることが予測される。
マウスκ軽鎖定常領域については、２つのタンパク質アロタイプをコードする４つの遺伝的アロタイプがSolinら（1993）Immunogenetics 37;401-407（本明細書中で参照として援用される）によって発表されている。Solinらの図１は、マウスおよびラット免疫グロブリンκ鎖遺伝子配列を示し、異なる株のκ鎖定常領域内の配列を比較し、そしてアロタイプの差異を強調する。BALB/c、PL、SJL、およびM.spretusについてのκ鎖定常領域配列が含まれる。他の天然に生じるアロタイプも可能である。
新生マウス由来のマウスγ1重鎖定常領域DNA配列が、Honjoら（1979）Cell 18:559-568（本明細書中で参照として援用される）によって公表された。Honjoらの図５は、生殖系列DNA配列を、コードされたタンパク質配列とともに示す。上記の線で、マウスミエローマMOPC 21より得られた別のタンパク質配列が示される。他の天然に生じるアロタイプも可能である。
11D10軽鎖可変領域の配列に最も近密にマッチした10のデータベースDNA配列の間では、いずれも同一ではなかった。11D10 DNA配列との約８〜27の差異があり、それらは約６〜17アミノ酸の差異に相当する。第６にマッチした配列（呼称>gb/M59920/MUSIQKAA3）はマウスκVJ生殖様配列であり、そしておそらく11D10軽鎖が由来した原型遺伝子を代表する。11D10 DNA配列は、生殖系列配列とは14の位置で異っており、これらは約７アミノ酸の点差異に相当する。
11D10重鎖可変領域の配列に最も近密にマッチした10のデータベースDNA配列の間では、いずれも同一ではなかった。10の内の９の配列が、VDJ結合内のスプライシングの差異により、３〜12塩基対長かった。さらに、結合部の外側に11D10 DNA配列と比較して約15〜43点の差異があり、これは約11〜23アミノ酸の差異に相当する。
従って、少なくとも約18アミノ酸の差異が、11D10 DNAによりコードされるアミノ酸配列と、最も近密にマッチしたデータベースDNAによりコードされる配列との間に存在した。この点差異は、抗体を生成するために用いた動物における抗体産生細胞の発達の間に、生殖系列配列の体細胞性変異によって生じたと考えられる。
11D10可変領域のアミノ酸配列を、他の公知の免疫グロブリン分子と比較した（実施例２）。11D10に対する軽鎖および重鎖両方のポリペプチド可変領域配列は独特であった。
11D10軽鎖可変領域の配列に最も近密にマッチした50のデータベースアミノ酸配列の間では、いずれも同一ではなかった。11D10は、15の最も近密な配列からは最低で７、そして平均で約12の置換差異で異なっており、これは可変領域にわたって非保存的置換を含んだ。
11D10重鎖可変領域の配列に最も近密にマッチした50のデータベースアミノ酸配列の間では、いずれも同一ではなかった。以下は、比較から演繹される主要な点を要約する。
最も近密にマッチした配列は、残基１と残基98の間で11の置換を有し（VDJ結合の前）、残基98以降で７つの置換差異を有した。
11D10は、長さがほとんどの重鎖配列と１〜５残基異なっていた。
11D10と50のマッチした配列との間には、平均約30の挿入、欠失、および置換の差異があった。
図26パネルＣは、11D10アミノ酸軽鎖および重鎖配列のデータベース配列由来のコンセンサス配列との比較を提供する。重鎖VDJ結合についてのスプライシングの差異の他に、少なくとも18の差異が11D10とコンセンサス配列の間に存在し、これはおそらく抗体成熟の間に体細胞性変異から生じたものと思われる。点差異は軽鎖および重鎖可変領域にわたって生じる。
11D10免疫学的活性を有する11D10誘導体を開発することにおいて特に関心があるのは、重鎖VDJ結合の部分を含む11D10ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の領域である。また、11D10アミノ酸配列または配列番号５から配列番号32によりコードされるアミノ酸配列の間の少なくとも１つの、好ましくは２つの、より好ましくは３つ以上の点差異にわたる領域にも関心がある。
本発明の有用な物質およびプロセスは、11D10および11D10をコードするポリヌクレオチドの提供により可能となる。これらの配列は、例えば、HMFG関連疾患の処置のためのワクチンとして、あるいはAb1および／またはAb3の存在を検出するための試薬として有用であり得るポリペプチドの設計を可能にする。さらに、これらの配列は、11D10の標的領域の検出および増幅のためのプローブまたはプライマーとして有用なポリヌクレオチド、ならびにワクチンとして有用な11D10ポリヌクレオチドの設計を可能にする。
定義
本明細書中で使用される用語「11D10」、「11D10抗体」、および「11D10モノクローナル抗体」は、ATCCで寄託された11D10ハイブリドーマ細胞株により産生される免疫グロブリンを示すのに互換的に使用される。11D10の産生および特徴付けは実施例１に記載される。11D10は、主に乳癌細胞により高密度で発現されているヒト乳脂肪球（HMFG）（human milk fat globule）の個々のおよび特異的なエピトープに少なくとも部分的に類似しているエピトープを含む抗イディオタイプ抗体（Ad2）である。異なる生物学的機能は、11D10に関連しており、これは、限定されないが、Ab1および／またはAb3への結合、ならびにHMFGに対する免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する能力を含む。他で特定しない限り、用語「インタクトな11D10」は、11D10分子全体のアミノ酸配列をいう。11D10の「フラグメント」は、11D10の一部である。「11D10」の定義には、11D10の重鎖および軽鎖の可変領域全体を含有し、そして標準的なイムノアッセイによりMC-10に結合可能なインタクトな抗体の酵素的切断および/または化学的処理により生産されるフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、およびF(ab')）もまた含まれる。
本明細書で用いるように、11D10の「免疫学的活性」は、以下の活性のいずれかをいう：（ａ）Ab1(MC-10)に結合する能力；（ｂ）特異的な様式で11D10のMC-10(Ab1)への結合またはMC-10のHMFGへの結合を阻害する能力；（ｃ）特異的免疫応答、特に抗体（体液性）応答および／またはＴ細胞応答、ならびにそれから生じるフェクター機能を誘発する能力。抗体応答には、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)のような抗体媒体性機能、および補体依存性細胞傷害性(CDC)が含まれる。Ｔ細胞応答には、ヘルパーＴ細胞機能、細胞傷害性Ｔ細胞機能、炎症インデューサーＴ細胞、およびＴ細胞抑制が含まれる。免疫学的活性は、ラジオイムノアッセイ（RIA）、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、補体結合、オプソニン作用、Ｔ細胞増殖の検出、および種々の51Cr放出アッセイのような、当該分野で公知の標準的な方法を用いることによって測定可能である。これらの方法は当該分野で公知であり、特に本明細書中に記載する。これらの基準のいずれかに従う特異的免疫応答を誘発し得る化合物は、「免疫原性」であるといわれる。「免疫原性」は、特異的な体液性および／または細胞性免疫応答を誘発する能力をいう。
11D10の「活性」、「機能」、または「特徴」は、互換的に使用され、そして11D10の種々の特性をいう。11D10機能の例として、Ab1および／またはAb3への結合、Ab3の誘導、ならびに／あるいは細胞性免疫応答（好ましくは抗HMFG応答）の誘導、ならびにHMFG関連疾患の改善または緩和が挙げられるが、これらに限定されない。
別の抗体に対して同一である「同定的特徴」を有する抗体は、抗体が別の抗体と同一である構造的（即ち、物理的）および／または機能的（即ち、化学的）特性を有することを意味する。同様に、ハイブリドーマ細胞株の細胞の「同定的特徴」を有するハイブリドーマは、比較されるハイブリドーマ細胞株と同一である構造的および／または機能的特性を有するハイブリドーマである。本発明の目的のために、抗体の同定的特徴は、上記のように11D10に関連する特徴であるがそれらに限定されない；ハイブリドーマの同定的特徴は、11D10を産生するハイブリドーマに関連する特徴である。
11D10の「可変領域」は、11D10の軽鎖の可変領域もしくは11D10の重鎖の可変領域の、いずれか一方または組み合わせをいう。
本明細書中でいう、GM-GSF、IL-2、および他の生物学的に活性な分子は、同一の生物学的機能または生理学的機能を有するそれぞれの親分子に基づくフラグメントおよび誘導体を含むことを意味する。
本明細書中で使用されるハイブリドーマの「子孫（progeny）」とは、ハイブリドーマ派生物（descendant）であり、これは変異または他の順応のために元の（親）細胞と完全に同一であっても同一でなくてもよいが、免疫寛容を回避する（即ち、HMFGに対する免疫応答を引き起こす）能力を維持するモノクローナル抗体を産生する。
「HMFG」は、ヒト乳脂肪球の略語である。HMFGは、いくつかのタンパク質様の（従って、抗原性の）成分である。本明細書で使用するように、それは、抗原的に関連する物質と共に、Cerianiら((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:582-586)の方法により調製されるようなHMFG発現乳癌細胞株の半精製された抽出物をいい、これは、乳癌細胞で発現されたHMFGおよびより高度に精製された精製物を含む。HMFGには、高分子量ムチンの既知アミノ酸配列（そのエピトープは、11D10の惹起の際にAb1として使用されるモノクローナル抗体MC-10により認識される）が含まれる。従って、11D10を用いて動物を免疫することにより誘導した抗HMFGの免疫学的反応性は、好ましくは、MC-10により認識されるエピトープに関連するポリペプチドエピトープに結合する。
本発明の目的については、「HMFG関連疾患」または「HMFG関連腫瘍」は、MC-10（Ab1）に結合するHMFG抗原（特に細胞の表面上に発現された）に関連する疾患の状態または腫瘍である。
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であり、これはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを包含する。本明細書中で用いる用語「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド」は、互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして既知または未知の任意の機能を行い得る。用語「ポリヌクレオチド」には」、二本鎖、一本鎖、および三重らせん分子が含まれる。他に特定されたりまたは要求されたりしない限り、ポリヌクレオチドである本明細書中に記載する本発明のいずれの実施態様も、二本鎖形態、および二本鎖形態を形成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々を包含する。
以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾されたヌクレオチドを含み得る。プリンおよびピリミジンのアナログは当該分野で公知であり、そしてアジリジニルシトシン、４-アセチルシトシン、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウラシル、５-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン１-メチルアデニン、１-メチルシュードウラシル、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、シュードウラシル（pseudouracil）、５-ペンチニルウラシル、および2,6-ジアミノプリンを含むが、これに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの置換基としてのウラシルの使用もまたピリミジンの類似形態と考えられる。
存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組立ての前または後に加えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾され得る。この定義に含まれる他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合での修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメートなど）、および荷電結合での修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど））、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン(ply-L-lysine)など）のようなペンダント部分を含む修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での修飾、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む修飾、アルキレーターを含む修飾、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）での修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態である。
さらに、通常糖に存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホネート基、ホスフェート基で置換し、標準的な保護基で保護するか、または活性化してさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製し得るか、あるいは固体支持体に結合させ得る。５’および３’末端OH基をリン酸化するか、あるいは１〜20個の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分で置換し得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。
ポリヌクレオチドはまた、２’-Ｏ-メチル−、２’-Ｏ-アリル、２’-フルオロ-もしくは２’-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および無塩基ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）を含むがこれらに限定されない、一般に当該分野で公知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有し得る。
上記のように、１つ以上のホスホジエステル結合が、別の結合基によって置換され得る。これらの別の結合基は、ホスフェートがP(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）によって置換された実施態様を含むが、これに限定されない。ここで、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、あるいは必要に応じてエーテル(-O-)結合を含む置換もしくは無置換アルキル（１〜20Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル(cycloalky)、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチドの全ての結合が同一である必要はない。
従来の糖および塩基を本発明の方法を適用するのに使用するが、糖、プリンおよびピリミジンの類似形態の置換は、ポリアミド骨格に似た別の骨格構造が有利であり得るように、最終産物を設計するのに有利であり得る。
11D10ポリヌクレオチド（すなわち、11D10をコードするポリヌクレオチド）の「フラグメント」（「領域」とも呼ばれる）は、11D10の可変領域の少なくとも９つの連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである（即ち、少なくとも11D10の可変領域の一部分をコードする）。好ましいフラグメントは、11D10の可変領域の少なくとも５つの連続するアミノ酸をコードする領域を含む。より好ましくは、可変領域の少なくとも10の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは可変領域の少なくとも15の連続するアミノ酸を含む。
本明細書で使用される用語「組換え」ポリヌクレオチドは、その起源または操作により（１）それが天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部とは会合しないか、（２）それが天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されるか、または（３）天然に生じない、ゲノム、cDNA、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意図する。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、線状または分岐状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、そして非アミノ酸により妨げられ得る。また、この用語は、天然に、あるいは介在（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化(lipidation)、アセチル化、リン酸化、あるいは標識成分との結合のような任意の他の操作または修飾）によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義には、例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当該分野で公知の他の修飾含有するポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、このポリペプチドは単鎖または会合した鎖として生じ得ることが理解される。
11D10のポリペプチド「フラグメント」（「領域」とも呼ばれる）は、11D10の配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも８つの連続したアミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも約10の連続したアミノ酸を有する11D10のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ここで少なくとも３つのアミノ酸は11D10の可変領域由来である。本発明の目的では、11D10のフラグメントは以下の機能のうちのいずれかにより同定され、そして特徴付けられ得る：（ａ）HMFGとの相同性；（ｂ）Ab1またはAb3に結合する能力；（ｃ）免疫応答（即ち、体液性および／または細胞性応答）、好ましくは抗HMFGである免疫応答を誘発する能力；（ｄ）HMFG関連腫瘍の改善、遅延、または遅延化および／またはHMFG関連疾患状態の改善または緩和をもたらす能力。（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）項は用語「免疫学的に反応性」の範囲内に入る。11D10フラグメントは任意の、１つより多い、または全ての上記で同定される機能を有し得る。これらの機能（ａ）〜（ｄ）を決定するための方法を下に記載する。
HMFGに「相同である」またはHMFGと「相同性を共有する」11D10ポリペプチドは、HMFGおよび11D10ポリペプチドのアミノ酸配列を任意の方法（相互に対して同じ方向または逆方向を含む）で並べた場合に、ポリペプチド内の少なくとも２、好ましくは３、より好ましくは４つの連続するアミノ酸がHMFGに一致することを意味する。機能的ペプチドフラグメントは本発明の目的のためには非常に小さい可能性があるので、ほんの数個のアミノ酸のみが一致し得る（例えば、結合部位および／または抗原提示に必要な連続するアミノ酸の所要数は、２〜５個と少ないアミノ酸であり得る）。HMFGに対して「相同性の領域を含有する」11D10ポリペプチドは、上記で定義されたように、そのアミノ酸配列内にHMFGに対する相同性を共有する。
「融合ポリペプチド」は、天然に存在する位置とは配列中の異なる位置における領域を含むポリペプチドである。この領域は、通常異なるタンパク質中に存在し得、そして融合ポリペプチドにおいて結合される；あるいは、これらは、通常同じタンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド中の新しい配置に置かれる。
本明細書で用いる「免疫応答」は、体液性応答、細胞性応答、または両方をいう。
11D10ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「機能的に等価なフラグメント」は、11D10ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性および／または機能を維持する。例えば、免疫性を誘導する配列の機能性が改変されないように、当該分野で公知のような、さらなるヌクレオチドまたはペプチドを付加することによって配列を変化させ得る。他の例は、配列の欠失および／または置換である。あるいは、ヌクレオチドまたはアミノ酸を置換するか、あるいは付加、欠失または置換を組み合わせることによって配列を変化させ得る。当業者に明らかなように、免疫性を誘導するポリペプチド配列の機能性は、Ab1および／またはAb3への結合のような配列の他の特徴および／または活性を含む。さらに、「免疫性を誘導すること」は、体液性応答または細胞性応答のようないずれの局面の免疫応答をも含むことは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド配列の機能性は、部分的にはその意図される使用に依存し、そしてポリヌクレオチドのフラグメントに維持されたいずれの機能性もこの定義を満たすこともまた明らかである。例えば、11D10ポリヌクレオチドの「機能的に等価なフラグメント」は、所望のポリヌクレオチドをプローブとして使用し得るように、ハイブリダイズする能力が維持されたフラグメントであり得る。あるいは、11D10ポリヌクレオチドの「機能的に等価なフラグメント」は、ポリヌクレオチドが、インタクトな11D10に関連した機能、そして好ましくは抗HMFG免疫性の誘導に関連した機能を有する11D10のフラグメント（可変領域の一部を含む）をコードすることを意味し得る。11D10ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能的に等価なフラグメントは、11D10ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較した場合に、同一、増強された、または減少した機能を有し得る。11D10の他の機能を上記に列挙した。機能的に等価なフラグメントは、少なくとも９ヌクレオチドまたは少なくとも５アミノ酸を有し、好ましくは少なくとも15ヌクレオチドまたは少なくとも10アミノ酸を有し、なおより好ましくは少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも20アミノ酸を有する。
「細胞系」または「細胞培養」は、インビトロで増殖または維持された高等真核生物細胞を示す。細胞の派生物は親細胞と（形態学的、遺伝子型的、または表現型的のいずれかで）完全には同一でない場合があることは理解される。
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞中におよび／またはその間で移行させる自己複製核酸分子である。この用語は、主として核酸分子の細胞への挿入のために機能するベクター、主として核酸の複製のために機能するベクターの複製、およびDNAまたはRNAの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記機能の２つ以上を提供するベクターもまた含まれる。
「宿主細胞」は、ベクターのレシピエント、あるいは核酸分子および／またはタンパク質の取り込みのレシピエントとなり得るか、またはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は自然の、偶然の、または意図的な変異のために元の親細胞とは（形態または全DNA相補性のゲノムにおいて）必ずしも完全には同一でない場合がある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドでインビボにおいてトランスフェクトされた細胞を含む。
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチドに転写および翻訳され得るポリヌクレオチドと定義される。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能し得る発現ベクターを含む適切な宿主細胞を意味する。
「シグナル配列」は、小胞体のような細胞性の膜におよびそれを通して新しく合成された分泌タンパク質または膜タンパク質を指向する短いアミノ酸配列である。シグナル配列は、代表的には、ポリペプチドのＮ末端部分にあり、そしてポリペプチドが膜を横切った後に切断される。
「異種」は、比較されているものの残りとは遺伝子型的に異なるものに由来する（即ち、得られる）ことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子操作技術により異なる供給源由来のプラスミドまたはベクター内に位置され、それにより異種のポリヌクレオチドになり得る。天然では連結しないコード配列と連結するプロモーターは、異種のプロモーターである。
「単離された」または「精製された」抗体、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが天然で会合する物質が実質的にないものである。実質的にないとは、それが天然で会合する物質が少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、そしてなおより好ましくは少なくとも90％ないことを意味する。
「ワクチン」は、ヒトまたは動物用途の薬学的組成物であり、これは特定の標的または標的群に対する一定の程度の特異的免疫学的反応性をレシピエントに付与する意図で投与される。免疫学的反応性は、標的に対して免疫学的に反応性である抗体または細胞（特に、Ｂ細胞、形質細胞、ヘルパーＴ細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球、およびそれらの前駆体）、またはそのいずれかの組合せであり得る。本発明の目的は、この標的は、腫瘍関連抗原HMFG、または11D10によって結合される任意の腫瘍関連抗原である。免疫学的反応性は、実験目的のため、特定の状態の処置のため、または特定の物質の排除のために望まれ得る。
「安定な二本鎖」のポリヌクレオチド（または、生化学反応において任意の２つ以上の成分の間で形成される「安定な複合体」）は、二本鎖または複合体の形成と次の検出（その間に起こり得る任意の付加的な洗浄工程または他の操作を含む）との間で十分に長く持続する二本鎖または混合物をいう。
生物学的「サンプル」は、個体から得られ、そして代表的には診断手順またはアッセイで使用される種々のサンプルタイプを包含する。この定義は血液および生物学的起源の他の液体サンプル、生検標本または組織培養物、あるいはそれらから得られる細胞およびその子孫のような固体組織サンプルを包含する。この定義はまた、それらの獲得後に任意の方法（例えば、試薬での処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドのようなある成分の富化による）により操作されたサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」は臨床サンプルを包含し、そしてまた、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的体液、および組織サンプルを包含する。
本明細書で用いる「処置」は、有利なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有利なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能を問わず、徴候の改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡大（すなわち、転移）の防止、疾患進行の遅延または延長、疾患状態の改善または緩和、および（部分的または全体的を問わず）軽減を含むが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較して延長した生存も意味し得る。
疾患の「緩解」は、11D10、11D10ポリヌクレオチド、および／または11D10ポリペプチドを投与しない場合と比較して、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床症状が軽減されること、ならびに／または進行の時間経過が遅くなるかもしくは延ばされることを意味する。
「有効量」は、有利なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与され得る。本発明の目的では、有効量の11D10、11D10ポリヌクレオチド、および／または11D10ポリペプチドは、免疫応答、特に抗HMFG応答を誘導するのに十分な量である。処置に関して、11D10、11D10ポリヌクレオチド、および／または11D10ポリペプチドの「有効量」は、HMFG関連疾患の状態の進行を緩和、改善、安定化、逆行、延長、または遅延させるのに十分な量である。効能のこれらのインジケーターの検出および測定を下記で議論する。
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、競技動物およびペットを含むが、これらに限定されない。
一般的技術
本発明の実施では、特に示さない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第２版（Sambrookら、1989）；「Oligonucleotides Synthesis」（M.J.Gait編，1984）；「Animal Cell Culture」（R.I.Freshney編、1987）；「Methods in Enzymology」（Academic Press,Inc.）；「Handbook of Experimental Immunology」（D.M.WeiおよびC.C.Blackwell編）；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（J.M.MillerおよびM.P.Calos編，1987）；「Current Protocols in Molcecular Biology」（F.M.Ausubelら編，1987）；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」（Mullisら編，1994）；「Current Protocols in Immunology」（J.E.Coliganら編，1991）のような文献に十分に説明されている。
これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に応用可能であり、それゆえ、これらの発明の局面を熟慮する場合に考慮すべきである。個々の局面に特に有用な系を以下で議論する。
11D10
１つの実施態様では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ATCC番号12020またはその子孫により産生されるモノクローナル抗イディオタイプ抗体（本明細書では、「抗Id」と呼ぶ）を包含する。本発明はまた、ATCC番号12020によって示されるハイブリドーマ細胞株を包含する。産生および特徴付けは、実施例１および以下に記載される。
他の実施態様では、本発明は、ATCC番号12020で示されるハイブリドーマ細胞株により産生される抗体と同一である同定的特徴を有する精製された抗体を包含する。本発明はまた、ATCC番号12020で示されるハイブリドーマ細胞株の細胞の特徴の全てを同定するハイブリドーマを包含する。
本発明はまた、検出可能なシグナルを生じ得る標識と結合した11D10を包含する。これらの結合した抗体は、例えば、Ab1（および／またはAb3）の定量または画像化に有用である。このような標識は、当該分野で公知であり、そして放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、および他の抗体を含むが、これらに限定されない。標識は、11D10と共有結合するか、または第二の試薬（例えば、二次抗体、プロテインA、またはビオチン−アビジン複合体）を介して11D10に結合し得る。抗体を標識する方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中で詳細に記載する必要はない。
11D10の生成および選択
抗Id（Ad2）を惹起するAb1の選択。乳癌に関連するが大部分の正常の組織には関連しないヒト乳脂肪球（HMFG）皮膜の成分を認識する細胞型特異的マウスモノクローナル（「mAb」）の系列を産生した。Cerianiら、(1983);Taylor-Papadimitriouら、(1981)Int.J.Cancer 28:17-21。これらのmAbにおいて、MC-10（BrE1とも呼ばれる）は、非常に制限され、そしてそれがヒトの乳房上皮細胞においてはごくわずかな量で存在し、そして乳癌細胞においては少なくとも10倍増加している高分子量（分子量400,000）のムチンと反応するという意味で、特異的である。WO 8907268;EP 401247。この抗体は、インビトロでの研究において乳癌細胞に細胞傷害性である。Cerianiら(1983);Petersonら、(1990)。
mAb MC-10は、正常組織では組織病理学的分布が非常に制限されている。MC-10は、肺、および腎臓の散在する遠位曲尿細管（scattered distal convoluted tubules）の上皮内層のいくつかの領域に結合するのみで、正常な乳房および多くの他の正常な上皮（大腸、膵臓、胃、甲状腺、膀胱、肝臓）ならびに他の正常な組織（副腎、脳、リンパ節、心筋、卵巣、膵臓、精巣）とは明らかな組織病理学的な結合をしない。一方、高い割合の種々のヒトの腫瘍（乳房、子宮内膜、肺、卵巣、および膵臓を含む）が、激烈にmAb MC-10と結合する。MC-10結合について研究したホルマリン固定した腫瘍（ポジティブ数／総数）は、次のものを含む：乳癌(carcinoma(CA))(144/182)、大腸CA(3/27)、十二指腸CA(0/1)、子宮内膜CA(7/14)、腎臓CA(0/11)、肺CA(41/47)、卵巣CA(20/26)、膵臓CA(9/15)、前立腺CA(0/2)、唾液腺CA(0/3)、胃CA(2/7)、甲状腺CA(0/7)、肝胆管(hepatocholangio)CA(8/33)、島細胞CA(0/2)、リンパ腫(0/20)、黒色腫(0/23)、髄膜腫(0/5)、Merkel細胞CA(4/9)、中皮腫(1/11)、神経芽細胞腫(0/2)、好酸性顆粒細胞腫(1/1)、傍神経節腫(0/10)、プレオアデノーマ（plleoadenoma）(0/7)。肉腫では：未区分(0/1)、肺胞(0/1)、血管肉腫(0/1)、明細胞(0/2)、嚢腫状肉腫(0/1)、類上皮細胞(5/12)、Ewing(0/1)、線維肉腫(0/1)、平滑筋腫(0/2)、脂肪肉腫(0/1)、悪性線維組織球種(fibrohistiocytoma)(0/2)、滑膜中皮腫(0/7)、紡錘細胞CA(5/16)、未分化(1/9)；シュワン細胞腫(0/3)、精上皮腫(0/4)、奇形腫(0/3)、胸腺腫(0/8)、移行上皮細胞CA(5/10)、未分化のCA(7/29)、Warthin's腫瘍（0/1)。Cerianiら(1990)。本発明者らはまた、本発明者らの研究室においてFACS分析によりMC-10 Agの存在について造血細胞を研究し、そしてそれらの細胞（顆粒球および血小板を含む）が抗原に対してネガティブであることを見出した。ポジティブコントロールのMCF-7細胞は、mAb MC-10で十分に染色された。従って、11D10は、HMFGが検出される広範な種々の癌において使用される可能性を有する。
従って、mAb MC-10は抗Idの産生のために選択される。なぜなら、それが、ヒトの乳癌およびいくつかの他の腫瘍細胞によって高密度で初期に発現されるが、正常な成人組織では免疫ペルオキシダーゼ染色によって、または顆粒球を含む造血細胞ではフローサイトメトリー分析によっては見出すことができないヒト乳脂肪球（HMFG）の高分子量ムチンの独特かつ特異的なエピトープを規定するからである。
モノクローナル抗体MC-10により規定される乳癌関連エピトープは、これらの腫瘍に対する活性な免疫療法に適切な標的である。このAgは、乳癌の場合では80％より多く発現され、そしてこのAgを微量に含む少数の正常組織と比較して腫瘍組織で高密度に存在する。Cerianiら(1983);Taylor-Papadimitriouら(1991)。Agはごく微量で循環中を流れる。Petersonら(1990)Hybridoma 9:221-235。循環する低レベルのAgは、進行性の乳癌患者のインビボ研究において腫瘍標的への放射性標識した抗HMFGmAbの結合を妨害しないようである。代表的な乳癌細胞株MCF-7およびSKBR3へのMC-10の高い結合能力と共にMC-10の限定された特異性は、それをAb2ハイブリドーマ産生のための優れた標的とする。本発明者らは、抗イディオタイプ産生のために精製MC-10(IgG2bκ)（ロット番号5319001）を得た。
モノクローナル抗イディオタイプハイブリドーマの生成および11D10の選択。MC-10抗HMFG抗体で未処置のマウスを免疫化することにより、11D10を得て抗イディオタイプ応答を得た。同質遺伝的なBALB/cマウスを、MC-10(Ab1)で４回免疫化し、そしてそれらの脾臓細胞を非分泌マウスメラノーマP3-653細胞と融合させた。所望される全ての特徴を有する抗イディオタイプを得るために、次の４つの重要な工程を包含する大規模なスクリーニングプロセスを用いた：(1)MC-10に結合している抗体のポジティブ選択；(2)アイソタイプのまたはアロタイプの決定基を認識する抗体に対するネガティブ選択；(3)HMFGに対するMC-10の結合を阻害する能力のポジティブ選択；(4)マウスおよびウサギ両方における元の腫瘍関連抗原(HMFG)に対する体液性免疫応答を誘導する能力のポジティブ選択。
免疫化したMC-10のIdに特異的であるいくつかのAb2ハイブリドーマが得られ、そしてそれはアイソタイプまたはアロタイプの決定基のいずれとも反応しなかった。これらのAb2がMC-10のパラトープに対するものか否かを決定するために、乳房腫瘍細菌株MCF-7およびSKBr3への放射性標識MC-10の結合が、種々の量のAb2ハイブリドーマの培養上清の存在下で研究された。これらの細胞へのMC-10結合を阻害し得るAb2を増殖させ、そしてさらなる研究のために腹水から精製した。異なる精製されたAb2をワクチンとして調製し、そして未処置のマウスおよびウサギに２週間毎のスケジュールで注射した。４回の注射の後に、血清サンプルを、免疫化するAb2にだけでなく、HMFGにも結合するAb3の存在について力価決定した。所望の特異性を有する高力価のAb3を再現的に誘導するAb2は、11D10と命名された。11D10を得るために使用した方法のさらなる詳細は、実施例１に提供される。
11D10で免疫化された動物における免疫応答を、さらに特徴付けた。11D10で免疫化されたマウスおよびウサギの両方由来の免疫血清は、乳癌細胞株MCF-7またはSKBr3への結合についてMC-10と競合し、そして11D10への放射性ヨウ素標識MC-10の結合を阻害した（図７）。これは、マウスおよびウサギのAb3はAb1(MC-10)とイディオタイプを共有し得、そしておそらくAb1と同じエピトープに結合することを示す。
MC-10ポジティブ抗原に結合するモノクローナルAb3はまた、11D10で免疫化したマウスから得られる。Ab3（ポリクローン性ならびにモノクローン性の両方）は、ドットブロット分析により半精製されたHMFG Agと反応し、そして免疫ペルオキシダーゼ法によりMCF-7細胞を染色する。さらに、ウサギAb3血清は、補体媒介性細胞傷害(CMC)アッセイにおいて、腫瘍細胞株MCF-7およびSKBr3をオプソニン化した。
本発明者らはまた、ヒト以外の霊長類（カニクイザル）へ11D10を投与することにより免疫応答（体液性および細胞性の両方）が生じることを発見した（実施例３；Cancer Res.(1995)55:1525-1530）。11D10に応答して産生されたAb3は、HMFGに特異的であった（図12〜17）。抗体(Ab3)濃度は極めて高く、30mlの血清から1.32mgの精製Ab3が回収された（44μg/ml血清）。この精製Ab3はわずか100ngの量で、HMFGポジティブ乳癌細胞株MCF-7への放射標識Ab1の結合を60％より多く阻害し得た。
体液性免疫に加えて、サルにおける細胞性免疫応答が、T細胞増殖アッセイにより研究された。11D10を受けたサル由来の末梢血免疫リンパ球（PBL）を、インビトロで11D10を用いて攻撃誘発したが、無関連のコントロールAb2、3H1を用いては攻撃誘発しなかった場合、実質的な増殖が記載された（図19）。これは、Id特異的な細胞性増殖を示唆する。
免疫療法のための抗イディオタイプ抗体の臨床応用に関しては、動物の異なる種における特異的な抗TAA抗体の誘導を証明することが、本質的な条件である。
さらに重要なことには、HMFG関連腫瘍を有するヒトは、HMFG抗原に対して寛容であるが、本発明者らはまた、11D10が免疫寛容を回避し、そして進行性のヒト乳脂肪球関連疾患（特に、乳癌）を有する個体において免疫応答を誘発することを見出した。HMFGポジティブの進行性の乳癌を有する３人の患者（彼らは標準的な治療に失敗していた）に、11D10が投与された（実施例５）。初期データは、これらの患者の３人全てが抗HMFGである抗体を発達させたことを示した（図20〜21）；患者＃２は非特異的結合であったが、いくらかのAb3活性を有した。さらに、患者の１人は、T細胞増殖アッセイにより証明されるように細胞性免疫応答を示した（図22）。さらなる分析（アフィニティー精製されたAb3を使用する）に際して、これらの３人の患者の１人のみが抗HMFGである抗体を発達させたことが見出された（図27および28；実施例10）。この研究（実施例10）に集まった追加の患者（総数12）を評価する際に、本発明者らは、試験した10人の患者の中の５人が、11D10への放射標識MC-10(Ab1)の結合の阻害により評価されるように、抗HMFG抗体を発達させたことを見出した。全部で４人の患者（＃１、５、６、および12）が、細胞性免疫応答を示した（図29）。この研究のより詳細な記述は、実施例５および10において見出される。
11D10の調製
本発明の抗体は、いくつかの方法で得ることができる。11D10は、本明細書中に記載のハイブリドーマATCC番号HB12020から産生され得る。抗体を単離する方法は、当該分野で周知である。例えば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、およびSambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと。抗体は、組織培養を介して、またはマウスの腹水由来のハイブリドーマから得られ得、そして抗体精製のための従来の技術を使用して精製し得る。これらの技術は当該分野において公知である。例えば、細胞は適切な培地で培養され得、そして、消費された培地は、抗体の供給源として使用され得る。必要に応じて、マトリックスでコートしたチャンネルまたはビーズおよび細胞共培養が、抗体産生細胞の増殖を促進するために含有され得る。大量の抗体を産生するためには、通常は腹水を得るのがより便利である。このような方法は当該分野で公知であり、そして、一般的には、ハイブリドーマ細胞を未処理の免疫学的に組織適合性でも免疫寛容でもない哺乳動物（特にマウス）に注射する工程を包含する。哺乳動物は必要に応じて、腹水の産生のために、適切な組成物（例えば、プリスタン）を予め投与することにより処理される。好ましくは、11D10は、組換えプロテインG-アガロースクロマトグラフィーおよびそれに続くプロテイン-A-CL-セファロース4Bクロマトグラフィーを用いて、BALB/cの腹水から精製される。
あるいは、11D10は、本明細書中に提供される配列および情報ならびに当該分野で公知の技術（例えば、Applied Biosystems,Inc (Foster City、CA)により製造されるような、市販の自動ペプチド合成装置）を使用して化学的に合成され得る。
11D10抗体は、IgG1マウスサブクラスであり、そしてこのアイソタイプの免疫グロブリンに適切な任意の技術によって単離され得る。精製方法には、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを使用して）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン性またはアニオン性の交換カラム上で中性pHにおいて行われ、そして段階的にイオン強度のグラジエントを増加させながら溶出される）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過HPLCを含む）、およびアフィニティー樹脂（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ハイドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリン）上のクロマトグラフィーが挙げられ得る。11D10はまた、MC-10パラトープを含有するアフィニティーカラム上で、例えば精製Ab1またはAb3の形態で精製され得る。
11D10はまた、Sambrookら(1989)に記載のような、慣習的な組換え法の使用によっても得ることができる。例えば、本明細書中に提供される配列および情報を使用して、11D10の重鎖または軽鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター（それは転写のための制御配列（例えばプロモーター）を含有する）にクローン化され得る。発現ベクターは、順番に宿主細胞に導入される。宿主細胞を、ポリヌクレオチドがタンパク質に転写および翻訳されるような適切な条件下で増殖させる。11D10の重鎖および軽鎖は別々に産生され得、次いでジスルフィド結合の再配列により結合し得る。あるいは、11D10の各鎖をコードする別々のポリヌクレオチドを有するベクター、または別々の転写物として両方の鎖をコードする単一のポリペプチドを有するベクターは、単一の宿主細胞にトランスフェクトされ得、それは次いで、分子全体を産生し得、そして組み立て得る（assemble）。好ましくは、宿主細胞は、分子の正常な炭水化物補足物を提供し得る高等真核生物細胞である。従って宿主細胞中で産生された11D10は、当該分野の標準的な技術を使用して精製され得る。これらの方法のいずれかによる11D10の産生に使用するための、次に11D10をコードするポリヌクレオチドは、11D10を産生するハイブリドーマから順番に得ることができるか、あるいは、本明細書中に提供されたDNA配列から、合成的にまたは組換え的に産生され得る。
11D10が個体に投与される場合、11D10は好ましくは少なくとも80％の純度であり、より好ましくは少なくとも90％の純度であり、さらにより好ましくは、なおより好ましくは少なくとも95％の純度であり、さらにより好ましくは約97％の純度、なおより好ましくは約99％の純度、なおより好ましくは少なくとも約99.5％の純度であり、ならびに発熱物質および他の混入物がない。この場合は、純度パーセントは、調製物の全タンパク質含量の重量パーセントで算出される。
11D10の用途および11D10の使用方法。
11D10は、いくつかの用途を有する。11D10は、進行性のHMFG関連腫瘍を有する個体の免疫応答を誘発して、それにより、個体のHMFG関連腫瘍を処置するのに使用され得る。好ましくは、免疫応答は抗HMFGである。さらに、11D10は、HMFGまたは11D10に結合する抗体を検出するのに使用され得る。11D10はまた、標識モノクローナル抗HMFG抗体で予め処置された患者の循環から、望ましくない過剰な標識Ab1を除去するのに使用され得る。標識は、その意図する用途に適切な抗体に結合した任意の標識であり得、例えば、放射性同位体、トキシンのような毒性部位、および薬物が挙げられる。11D10はまた、画像化において、腫瘍の検出を増強させるのに有用である。
免疫応答を誘発するためまたは処置における11D10の使用。本発明は、有効量の11D10を個体に投与することを内包する、進行性のHMFG関連疾患（例えば、HMFG関連腫瘍）を有する個体において免疫応答を誘発する方法を包含する。この意味では、「有効量」は、体液性および/または細胞性の、免疫応答を誘発するのに十分な量である。好ましくは、免疫応答は、抗HMFGの産物を含む。
11D10抗体の投与に適切な被験体は、多数の異なる基準により同定され得る。例えば、免疫応答に対する11D10の効果を研究するために、あるいは抗HMFGに特異的な抗体または細胞株のような有用な試薬を得るために、実験動物に11D10が投与され得る。
好ましい実施態様において、11D10は、免疫応答を誘発するためならびに／または進行性のHMFG関連疾患（例えば、HMFG関連腫瘍）を処置および／もしくは緩和するために使用され得る。「HMFG関連腫瘍」は、腫瘍細胞（例えば、乳房、子宮内膜癌、卵巣、移行上皮癌および未分化の癌（他の例は上記される））の表面上で特に発現されるHMFG抗原（すなわち、HMFG関連抗原）を含む腫瘍である。本明細書中で使用される「進行性の」HMFG関連腫瘍は、検出可能な転移（すなわち、腫瘍の原発部位以外の部位にある検出可能な腫瘍塊）が存在することを意味する。塊は、好ましくは当該分野で公知の画像化技術（例えば、Ｘ線またはCTスキャン）により検出される。免疫応答の誘発、緩和、または処置のために、11D10の有効量が、進行性のHMFG関連腫瘍を有する個体に投与される。進行性のHMFG関連腫瘍を有する個体への11D10の有効量の投与は、そのように処置されない他の個体と比較して、疾患の進行速度を遅らせるかまたは遅くするか、あるいは疾患を改善し得る。
進行性のHMFG関連腫瘍（特に、進行性の乳癌）が関与するいくつかの状況では、11D10を受けている個体は、以前の処置、疾患それ自体、またはその両方の性質のいずれかが原因で、免疫無防備状態が中程度から重篤になり得ることが理解される。従って、免疫応答を開始する（mount）ために必要な時間および／または11D10の注射の回数および／または１回の投与あたりの11D10の量が変化し得る。例えば、個体は、一旦11D10が投与されていれば、免疫応答を誘発するためにより長い時間を必要とし得る。この場合、たとえ初回（すなわち、１カ月以内）の免疫反応が検出されないとしても、個体は免疫応答についてモニターされることを継続することが勧められる。別の例では、個体は、免疫応答を誘発するために平均より多い数の注射を必要とし得る。
11D10の投与の有効性の一つの可能な指標（免疫応答および／もしくは処置を誘導したか否か、または11D10の投与が示されるか否か）は、腫瘍細胞上のHMFGの密度である。この密度は個体ごとに広く変化し得、そして11D10の投与過程にわたり、および／または疾患の過程にわたり変化し得る。本明細書中で使用するように、HMFGの「密度」は、以下のどちらかまたは両方をいい得る：(a)所定の生物学的サンプルにおける全細胞あたりのその表面上にHMFGを有する細胞の数；(b)各細胞表面上のHMFGの量。密度(a)は、染色されたサンプル中の細胞数に注目して計算されるか、またはさもなければ細胞の総数で除したHMFGの存在を示す。この密度は、好ましくは約20％を超え、より好ましくは約30％を超え、より好ましくは約50％を超え、なおより好ましくは約70％を超え、なおより好ましくは約80％を超え、最も好ましくは約90％を超える。従って、本発明は、約20％を超える、好ましくは約30％を超える、より好ましくは70％を超える、なおより好ましくは約80％を超える、最も好ましくは約90％を超えるHMFG密度を有する、個体への11D10の投与を含む。
密度(b)は、例えば、別の個体由来のサンプルに対するある個体由来のサンプルにおける、細胞の染色の相対強度（または、HMFGの存在を示す任意の測定値の強度）により示される。この密度について、当業者は、密度の経験的に決定し得る。密度(b)は、正常組織（すなわち、HMFGを欠く細胞、または無影響の細胞）に対するものであり、それ故、免疫組織化学的染色密度により検出される場合、好ましい範囲は無影響の細胞よりも約1.5倍、好ましくは約３倍、より好ましくは約10倍高い発現である。無影響の細胞もまた、同じ個体由来であり得る。
これは、低い密度（例えば、約50％未満）の個体は、11D10の投与について示されないことを言うのではない。単一の理論により束縛されることを望まないが、11D10の投与は、HMFG関連腫瘍に対して有効であるより一般的な応答を生じる一連の免疫反応（例えば、細胞傷害性T細胞応答）を誘発し得ることが可能である。しかし、密度がより低ければ、さらなる治療が望ましいことを示し得る。
密度はまた、疾患および11D10の投与に対する応答の程度の指標として使用され得ることが理解される。例えば、11D10の投与の開始時に個体から採取したサンプルは、約80％密度を示し得る（すなわち、約80％の細胞がHMFGを示す）。11D10を受けた後に、同じ部位から採取したサンプルは、約50％のみの密度を示し得る。これは、HMFG発現細胞が破壊されていることを示す。同様に、11D10を受けた個体由来のサンプルの染色強度が11D10を受ける際に消失する場合、これは、HMFG保有腫瘍細胞が破壊されていることを示す。
進行性のHMFG関連腫瘍を有する個体に対する免疫応答を惹起し、または処置する目的のために、11D10は非経口的に投与され、好ましくは、皮内に（intracutaneously）投与される。他の投与経路として、筋肉内、皮下、および皮内（intradermal）が挙げられるが、これらに限定されない。11D10はまた、培養細胞の処理、それに続くこれら培養細胞の個体への導入によって、間接的に投与され得る。
投与される11D10の量は、個体の症状および投与の経路のようないくつかの要因に依存する。好ましくは、投与あたりの用量は、約0.1mg〜約20mgの範囲である。より好ましくは、用量は約0.5mgの範囲であり、より好ましくは、約１mg〜約８mgの範囲である。好ましくは、用量は約２mg〜約８mgである。11D10は代表的には、２週間毎に４回注射で投与され、続いて必要ならば１ヶ月毎に投与される。次回以降の注射の時期（すなわち、維持用量）は、特に、処置される個体の症状および応答に依存する。維持（追加）投与がいつ与えられるべきか（代表的には、約３ヶ月毎）を決定するために、例えば、好ましくは本明細書に記載の診断方法によってAb3のレベルがモニターされ得る。
好ましくは、11D10は薬学的に受容可能な賦形剤と共に投与される。薬学的に受容可能な賦形剤は、薬学的に有効な物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤には、ワクチン組成物に形態または粘調度を与えることができ、あるいは希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、種々の浸透圧に対する塩、カプセル化剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な賦形剤の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Alfonso R.Gennaro編、第18版、1990)に記載される。
好ましくは、11D10は、11D10の提示を増強するか、または11D10に対する免疫応答を増強するアジュバントと共に使用される。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、ミョウバン、QS-21（米国特許第5,057,540号）、その前駆体および改変形態（例えば、DHEA-S、DHEAのスルホン酸化形態）を含むDHEA（米国特許第5,407,684号および同第5,077,284号）、β-2ミクログロブリン（WO 91/16924）、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド（米国特許第5,171,568号）、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（米国特許第4,436,728；WO 92/16231）およびその誘導体（例えば、DetoxTM）、ならびにBCG（米国特許第4,726,947号）が挙げられる。他の適切なアジュバントとしては、アルミニウム塩、スクアレン混合物（SAF-1）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラトキシンＢサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashiら(1990)Nature 344:873-875に記載されるような免疫刺激性複合体（ISCOM）が挙げられるが、これらに限定されない。獣医科での使用および動物中での抗体の産生のためには、フロイントアジュバントのマイトジェン組成物が使用され得る。
アジュバントの選択は、特に、ヒトへの用途を意図した場合、アジュバント存在下でのワクチンの安定性、投与経路、およびアジュバントの規定の受容可能性に部分的に依存する。例えば、ミョウバンは米国食品医薬品局(FDA)によって、アジュバントとしての人体への使用に承認され、そして本発明者らの臨床治験において使用される。11D10は、沈降形態で投与され得る；例えば、ミョウバン沈殿11D10が使用され得る。水酸化アルミニウム沈殿11D10の調製は、実施例３および４において記載される。QS-21が使用される場合、好ましくは100μgが各用量として使用され、これは好ましくは11D10との混合（混合はおだやかに行うように注意する）後約30分以内に皮下投与される。DetoxTMが使用される場合、好ましくは0.12mlが各用量として使用され、これは好ましくは11D10との混合後約30分以内に皮下投与される。製造者は、一般的に、量、容積、調製、および投与経路に関する推奨を提供し得る。
あるいは、11D10は、例えば、リポソームにカプセル化され得る。細胞への送達のために、ポリペプチドをパッケージングするのに適切なリポソームは、当該分野で公知である。
11D10は、投与の前に加熱処理され得、そして加熱処理は、アジュバント（例えば、ミョウバン）の存在下で行われ得る。例えば、11D10は、約40℃〜60℃、好ましくは45℃〜55℃で、約５分〜２時間、好ましくは15分〜１時間加熱され得る。加熱処理は、より好ましくは45℃で30分、水浴中の無菌バイアル中で行われる。加熱処理は投与の前のいつでも行われ得る。好ましくは、加熱処理は投与後７日以内に行われる。11D10の所望の活性が顕著に失われない限り、他の加熱処理法も使用され得る。
免疫応答を惹起する目的のために、11D10は非改変の形態で投与され得る。免疫原性を改善するために11D10を改変させるのが好ましい場合もある。免疫原性を改善するための方法には、特に、グルタルアルデヒドまたは二官能性結合剤のような試薬での架橋、あるいは多価プラットホーム分子への結合が挙げられる。免疫原性はまた、タンパク質キャリア（特に、Ｔ細胞エピトープを含むもの）への結合によって改善され得る。
11D10は、単独または所望の活性／目的を促進する他の因子と併用して使用され得る。この意味では、「因子」は、任意の種々の物質であり得る。さらに、「と併用して」は、因子が11D10と同時に、前に、または後で使用され得ることを意味する。所望の活性は、11D10を使用した場合に所望の目的を容易にし、増強し、促進し、または調節する任意の活性である。使用され得る因子は、サイトカイン、リンホカイン、アジュバント、および薬物を含むがこれらに限定されない。因子はまた、11D10の送達を容易にする物質（例えば、リポソーム）または特定の標的（例えば、細胞レセプター）への11D10の送達を促進する物質を含む。例えば、11D10はGM-CSFのようなサイトカインと共に投与され得る。
11D10の投与の効果を決定するために、個体は、HMFGに対する抗体（体液性）または細胞性免疫応答、あるいはそれらの組合わせのいずれかについてモニターされ得る。
生物学的サンプル中のHMFG抗体（Ab3）のレベルを決定するために、例えば、血清または血漿を個体から得る。サンプルは必要に応じて、アッセイが行われる前に免疫グロブリンを富化される（これは、通常は必要とされない）。マウス免疫グロブリン（例えば11D10）をアッセイ試薬として使用する場合、サンプルは好ましくは、抗マウス免疫グロブリン活性を除去するために前処理される。これは例えば、マウス免疫グロブリンカラム上での涸渇、または非特異的マウス免疫グロブリンをサンプルに混合しそして形成した任意の免疫沈降物を除去することにより行われ得る。
このアッセイを行うために、サンプル中に存在し得る抗HMFGを、非制限量のHMFGの抗原的等価物と接触させる。これは、単離されたHMFG、直接ブロッティングまたはポリアクリルアミドゲルからの転写により付着したHMFGを伴うニトロセルロース、HMFGを発現する細胞（例えば、MCF-7またはSKBR3細胞）、そのような細胞からの膜調製物、あるいはHMFGを含む固定化組織切片であり得る。あるいは、抗イディオタイプ、特に11D10が使用され得る。
一旦免疫複合体が形成されると、それは通常複合化しなかったHMFGアナログから分離され、そして存在する複合体の量が決定される。複合体は、例えば、回収した細胞の遠心分離、または免疫沈降、または固相による捕獲により、分離され得る。存在する複合体の量は、標識を有するHMFGアナログを直接供給することによって、または第２の試薬と共にインキュベートすることによって測定することができる。あるいは、競合アッセイが行われ得、ここでサンプルは最初にHMFGアナログでインキュベートされ、次いで、サンプル中に存在し得る抗HMFGと競合する、標識抗HMFG試薬の非制限量が添加される。適切な標識には、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、および化学発光標識が挙げられる。抗HMFGを含まないことが既知の溶液を使用して、標準曲線が構成され、そして種々の相対濃度の抗HMFGを有する溶液を、サンプルの代わりに用いる。未知の量の抗HMFGを含有するサンプルは、通常並行してアッセイされ、そしてそこに含まれる抗HMFGの相対量は、標準曲線との比較により決定される。11D10抗体を用いて抗HMFGのレベルを決定するのに好ましいアッセイは、以下のセクションでさらに詳細に記載される。
抗HMFG抗体のアイソタイプは、イムノアッセイに分離段階または標識段階のいずれかでアイソタイプ特異性試薬を含めることによって決定され得る。例えば、抗ヒトIgGは、ヒト起源の臨床サンプルに存在するIgGクラスの抗体を、分離または検出するのに使用され得る。IgGクラスの特異的抗HMFGの存在は、通常、記憶応答を示す。IgMクラスの抗HMFGの存在は、通常、行っている免疫刺激（例えば、HMFG発現性腫瘍の存在に起因し得る）、または行っている11D10での処置を示す。
所望であれば、生物学的サンプル中で検出される抗HMFG抗体は、さらに特徴付けられ得る；例えば、抗MC10(Ab1)と競合させることにより、それらがHMFG上の関連するエピトープに特異的であるかどうかが決定される。Ab1とAb3との間の競合アッセイは、実施例のセクションで詳細を記載される。
抗HMFG抗体はまた、それが細胞傷害性であるかどうか決定するために試験され得る。補体媒介性細胞傷害性（CMC）が、例えば51Crで標識されたHMFG発現標的細胞（例えば、MCF-7またはSKBR3）を使用して決定される。標識は、約106個の細胞を約200μCi Na251CrO4を用いて60分の間、37℃でインキュベートし、続いて洗浄することにより達成され得る。このアッセイは、抗体（または抗体を含む臨床サンプル）を標的細胞と共にインキュベートすることにより行う。次いで、オプソニン化された細胞を洗浄し、そして補体供給源と共にインキュベートする；例えば、モルモット血清を、固有の抗体活性を除去するために予備吸着する。37℃における適切なインキュベーション期間の後、51Crの培地への放出が決定され、そしてオプソニン化されていないコントロール細胞由来のそれと比較される。51Crの培地への放出を測定し、そしてオプソニン化されていないコントロール細胞由来のそれと比較する。51Crの放出は、CMCの活性と相関する。
抗HMFG抗体を特徴付ける別の方法は、ADCC応答に関与する能力を試験することによるものである（Chereshら（1986）、Cancer Res.46:5112）。放射性標識HMFG発現標的細胞を、抗HMFG（熱失活血清の形態で）、およびエフェクター細胞と共にインキュベートする。正常なヒト末梢血単核細胞（PBMC）は適切なエフェクター細胞であり、そして好ましくは、エフェクター：標的比が約100で使用される。37℃で約４時間後、放出された51Crの割合は、ADCC活性の測定値として決定される。
11D10を投与される被験体中の細胞性免疫応答は、特定のＴ細胞活性について標準的な機能アッセイを行うことで定量され得る。
アッセイの１つのタイプは、Ｔ細胞の増殖を測定する。この試験において、末梢血単核細胞（PBMC）は、処置された被験体から回収された全血サンプルから得られる。実験動物については、脾臓細胞もまた使用され得る。Ｔ細胞は、例えば、Ficoll(TM)のような勾配で遠心分離することで豊化され得る。次いで、細胞を種々の濃度のHMFGまたは（より一般的には）放射線照射されたHMFG発現細胞の存在下で培養する。好ましくは、刺激細胞は、特に組織適合性クラスII抗原に関して応答細胞と自己由来である。
アッセイの別のタイプは、Ｔ細胞の細胞傷害性を測定する。この試験において、富化されたＴ細胞の集団を、51Crで標識したHMFG発現標的細胞（上記のように調製された）を分解させるために使用する。好ましくは、エフェクター細胞は、特に組織適合性クラスＩ抗原に関して標的細胞と自己由来である。Ｔ細胞の集団は、必要に応じて、HMFGまたは適切な細胞株で予備刺激され得る。次いで、Ｔ細胞を、約104個の標識標的細胞と種々の比で合わせる（例えば、マイクロタイタープレートのウェル中で）。プレートは必要に応じて、細胞接触を開始させるために遠心分離され、そして細胞を37℃で４〜16時間の間共に培養する。51Crの培地への特異的放出のパーセントは、単独で培養した標識標的（ネガティブコントロール）および0.1％Triton(TX)X-100のような界面活性剤で分解した標的（ポジティブコントロール）との比較により、測定される。
11D10投与の効果を測定する他の適切な測定には、疑わしいタイプのガンの進行を決定するのに適切であり得るような臨床試験が含まれる。このような試験には、炎症指標、マンモグラフィー、およびラジオシンチグラフィー（本開示の他の部分に記載される）が挙げられ得る。
イムノアッセイを行うための11D10の使用。11D10が使用され得る別の様式は、11D10またはHMFGに結合する抗体または他の免疫組成分の存在をアッセイすることである。このような化合物は、11D10の治療的投与後に存在し得るか、あるいは、免疫能力のある宿主中のHMFG発現腫瘍の存在に起因して自然に生じ得る。アッセイは、生物学的サンプル、通常は臨床サンプルにおいて行われ得る。
本発明の１つの実施態様において、11D10は、生物学的サンプル中に存在し得る抗HMFG（特に抗11D10イディオタイプ）の存在を検出するのに用いられる。サンプルは、アッセイを行う前に、必要に応じて抗体活性を富化することによって、適切に調製される。生物学的サンプルが11D10の非イディオタイプ領域（特に、抗マウス免疫グロブリン）に対して活性な抗体を含有する疑いがある場合、それらを除去するか、またはそれらの検出を回避するようにアッセイを行うことが好ましい。抗マウス免疫グロブリン抗体は、例えば、正常マウスIgGで沈澱させるか、またはマウスIg吸着による吸着によってサンプルから除去され得る。抗マウス免疫グロブリン抗体（特に、Fc領域に特異的な抗体）の結合は、アッセイ試薬を慎重に選択することによって、最小化し得る。11D10のF(ab')2またはFabフラグメントおよび他のマウス免疫グロブリン試薬が、特に適切である。
サンプルを適切に調製した後、これを、11D10と存在し得る任意の抗HMFGとの間で複合体を形成させる条件下で、サンプルと過剰な機能的に等価な11D10と混合する。次いで複合体の量を決定し、そして予想される範囲内で、既知の量の抗HMFGを含有する標準サンプルと形成された複合体と比較した。複合体形成は、免疫沈降またはネフロメトリーにより観察され得るが、標識（例えば、125Iのような放射性同位体）、ペルオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼのような酵素、あるいはフルオロセインのような蛍光色素で標識した試薬を使用することが、一般により好感度である。
抗体アッセイは、液相において行われ得る。例えば、抗HMFGは、標識11D10と混合され得る。あるいは、サンプル中の抗HMFGは、11D10上の結合部位に対して標識抗HMFGと競合させるのに使用され得る。一般的には、結合した標識と結合しなかった標識とは、結合パーセントを定量するために分離される。適切な分離の方法には、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびサンプルを得た種に由来する免疫グロブリンに対する抗体での沈降（必要に応じて、ポリエチレングリコール存在下で）が挙げられる。あるいは、結合した標識と結合しなかった標識との割合は、例えば、蛍光/クエンチ標識のペア、または酵素/インヒビター標識のペアを使用して、インサイチュにおいて決定され得る。例えば、米国特許第3,996,345号Ullmaら)を参照のこと。
固相（例えば、ポリエチレン試験管、マイクロタイタープレートウェル、または磁気ビーズ）に結合した試薬を使用して捕獲アッセイを行うことは、通常、より便利である。競合型捕獲アッセイにおいて、サンプル中の非標識抗HMFGは、11D10への結合について、標識抗HMFGと競合する。11D10は、固相支持体に直接結合し得るか、または、例えば、抗11D10を使用して後に捕獲され得る。このアッセイにおいて、固相に関連する標識の量は、サンプル中の抗HMFGの量に対し逆に相関する。
サンドイッチ型捕獲アッセイにおいて、抗HMFGは、直接または第２の試薬を通して固相に結合した11D10により捕獲される。洗浄の後、抗HMFGは、適切な種の抗免疫グロブリン、あるいは標識が直接的または間接的に結合する第２の11D10抗体を使用して検出される。あるいは、抗免疫グロブリンを固相に結合し得、そして標識11D10はサンドイッチ型アッセイを簡潔させるのに使用される。使用される抗免疫グロブリンがアイソタイプ特異的である場合、次いで抗体のクラスもまた決定され得る。このアッセイのタイプにおいて、固相に結合した標識の量は、サンプル中の抗HMFGの量と正に相関する。
特異的抗体を測定する他の方法は、当該分野で公知であり、そして11D10を標的抗原として使用することにより抗HMFGを測定するのに適用され得る。このような適用された方法の全ては、本発明において想定される。特定の実施態様のさらなる記載は、実施例のセクションにおいて提供される。
11D10はまた、細胞の抗HMFG活性（特に抗11D10イディオタイプ）のレベルを測定するのに使用され得る。好ましい実施例において、11D10は抗HMFGＴ細胞を同定するのに使用される。Ｔ細胞は、11D10イディオタイプに結合するＴ細胞レセプターを発現するリンパ球としてのこの目的のために定義される。11D10は標識され、そして、抗HMFGＴ細胞を含有する疑いのある細胞の集団と接触させられ得る。あるいは、非標識11D10は細胞と混合され得、続いて標識抗マウス免疫グロブリンまたはプロテインＡのような標識２次試薬と一緒にされる。この目的に適切な標識には、放射性標識および蛍光標識が挙げられる。蛍光標識の使用はまた、蛍光活性化セルソーター中で抗HMFG細胞を非特異的細胞から分離させる。
標識Ab1を除去するための11D10の使用。本発明はまた、例えば、ラジオシンチグラフィーまたは放射線治療のための、標識抗HMFG抗体(Ab1)を受容した個体からの標識（例えば放射性物質）の除去のために11D10を使用する方法を包含する。抗体標的放射性核種の使用（すなわち、放射性免疫治療）における共通の問題の１つは、治療のための放射性標識抗体の用量を制限する系における、過剰のAb1の存在である。さらに、放射性標識抗体を使用する効果的な画像化は、過剰の循環している放射性標識抗体（それはしばしば、循環系および組織から除去するのに数日かかる）により妨げられる。本発明のこれらの方法において、標識抗HMFGの投与の後の特定の時間に、11D10が個体に投与される。その意図は、腫瘍以外の部位（例えば、循環系および間隙）において、11D10を抗HMFGと複合体化させ、それによりそのクリアランスを促進することである。結果として、冒されていない組織における標識部分（例えば、放射性同位体）のレベルは減少し、そして、腫瘍の画像（隣接する組織と比較して）は増強された。同様に、腫瘍部位の照射のために放射性核種を被験体に与えた場合、冒されていない組織の付帯的な曝露を低減するのが望ましい。従って、本発明は、放射性標識抗HMFG抗体が治療用量で投与され、続いて過剰モル量の11D10が投与される処置方法を包含する。
これらの適用のいずれかにおいて、腫瘍部位に局在していない任意の抗HMFGに配置および結合させるために、11D10の量は、標識抗HMFGの量を過剰に越えるのに十分なモル量になるよう選択される。投与の時期および11D10の量は、放射性標識抗体の性質、使用される放射性同位体の型、および個体の容態に依存する。好ましくは、抗HMFG抗体に対する11D10のモル比は少なくとも約５：１であり、より好ましくは約25:1〜200:1である。好ましくは、11D10は、個体が抗HMFG抗体を受容した後、５〜24時間以内に投与される。
腫瘍細胞に結合した抗HMFG抗体を検出するための11D10の使用。本発明はまた、腫瘍細胞に結合する抗HMFG抗体の存在を検出する方法を包含し、この方法は、腫瘍細胞を11D10で十分な時間処理して抗HMFG抗体に結合させる工程、および形成される複合体の存在を全て検出する工程を含む。この意図は、11D10を、腫瘍細胞に予め結合させた抗HMFGの検出に使用させること；あるいは、多価抗HMFG/11D10免疫複合体を形成することにより、抗HMFGの腫瘍細胞への結合を促進することである。前者の例では、11D10は、検出可能な標識と共に、または標識が結合し得る手段により提供される。後者の例では、抗HMFGまたは11D10のいずれかは、標識と共に提供される。
このストラテジーはまた、例えば、単離細胞懸濁液中のHMFG抗原保有細胞を同定するために使用され得る。細胞を抗HMFGおよび11D10と共に連続的にまたは同時にインキュベートし、洗浄し、次いで標識細胞を検出する。本実施態様に好ましい標識には、例えばフルオロセイン、ローダミン、およびテキサスレッドのような蛍光標識が挙げられる。必要に応じて、標識細胞は、例えば、蛍光活性セルソーターでの分離によってまたはアフィニティー分離によって、当該分野で公知の任意の固相ポジティブまたはネガティブ免疫選択の技術を使用して、非標識細胞から分離され得る。
このストラテジーは、例えば、罹患した被験体における腫瘍の検出または画像化のために使用され得る。抗HMFGおよび11D10は被験体に投与（通常は連続的に）され、そして腫瘍部位に蓄積させられる。適切な標識には、放射線標識（例えば、111In、131Iおよび99mTc）が挙げられる。次いで、腫瘍をラジオシンチグラフィーの標準的な方法を使用して、検出または視覚化する。
11D10ポリヌクレオチド
本発明は、図１および図２に示されるポリヌクレオチド配列に基づく抗イディオタイプ抗体11D10または11D10のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、化学的方法および／または組換え方法、またはこれらの方法の組合せによって単離および／または産生される。特に言及のない限り、用語「ポリヌクレオチド」または「11D10ポリヌクレオチド」は、本発明のポリヌクレオチドの全実施態様を含むべきである。
本発明の11D10ポリヌクレオチドは、発現系においてプローブ、プライマーとして、およびワクチンを含む薬学的調製物において有用である。このポリペプチドの特に有用な適用を以下で議論する。
従って、本発明は、11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでポリペプチドは、11D10可変領域の少なくとも５つの連続するアミノ酸を含む。１つの実施態様において、コードポリヌクレオチド配列は、軽鎖由来の可変領域をコードする。別の実施態様において、コードポリヌクレオチド配列は、重鎖由来の可変領域をコードする。
本発明はまた、図１および図２に示す11D10ポリヌクレオチドを提供する。１つの実施態様において、11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、該ポリヌクレオチドは配列番号２（図１）の中に示される11D10の可変軽鎖の少なくとも５の連続するアミノ酸を含む。別の実施態様において、11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、該ペプチドは配列番号４（図２）の中に示される11D10の可変重鎖の少なくとも５の連続するアミノ酸を含む。別の実施態様において、（可変領域）コードポリペプチド配列は、配列番号１（図１）の中に示される。別の実施態様において、（可変領域）コードポリヌクレオチド配列は、配列番号３（図２）の中に示される。ポリヌクレオチド配列は、コドンの使用法または安定性を最適化するように設計した微小な変化を伴い、配列番号１（図１）または配列番号３（図２）に示される配列と類似であり得るか、または有意に変化し得る。配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を考慮すれば、このようなポリヌクレオチドを設計することは当業者の能力の範囲内である。図１は、11D10の軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１）および導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図２は、11D10の重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３）および導かれるアミノ酸配列（配列番号１）を示す。配列番号１のヌクレオチド配列は、435塩基対であり、実施例２に記載のクローンから得られた。配列番号３のポリヌクレオチド配列は467塩基対であり、実施例２に記載のように得られた。
別の実施態様において、本発明は、配列番号１の少なくとも約60の連続するヌクレオチド、好ましくは70の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約80の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約100の連続するヌクレオチド、なおさらに好ましくは少なくとも約150の連続するヌクレオチドを含む、11D10軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、11D10軽鎖可変領域の配列をコードするCDR1の少なくとも約15の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約30の連続するヌクレオチドを含む、11D10軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、11D10軽鎖可変領域の配列をコードするCDR2またはCDR3の少なくとも約10の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15の連続するヌクレオチド、なおさらに好ましくは少なくとも約20の連続するヌクレオチドを含む、11D10軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。
別の実施態様において、本発明は、配列番号３の少なくとも約60の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約70の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約80の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約100の連続するヌクレオチド、なおさらに好ましくは少なくとも約150の連続するヌクレオチドを含む、11D10重鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、11D10重鎖可変領域の配列をコードするCDR1の少なくとも10の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15の連続するヌクレオチドを含む、11D10重鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、11D10重鎖可変領域の配列をコードするCDR2またはCDR3の少なくとも約15の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約20の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約35の連続するヌクレオチド、なおさらに好ましくは少なくとも約50の連続するヌクレオチドを含む、11D10重鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを含む。
別の実施態様において、本発明は、任意の上述の11D10ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは相補性決定領域（CDR）の少なくとも５アミノ酸をコードする。CDRは以下に記載される。
本発明は、欠失、置換、付加、または任意の核酸部分における性質の変化のような、上記の11D10ポリヌクレオチドに対する修飾を含む。「修飾」とは、11D10ポリペプチドフラグメントをコードする本明細書中に示したポリヌクレオチドと比較したヌクレオチド配列の任意の相違、および／またはポリヌクレオチドの核酸部分の任意の相違である。このような変化は、11D10ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現改変を容易にするために有用であり得る。このような変化はまた、安定性のような所望の特性をポリヌクレオチドに付与するのに有用であり得る。本明細書中に提供するポリヌクレオチドの定義は、これらの修飾の例を与える。
本発明は、11D10ポリヌクレオチドのその完全長（プロセスされていない）、プロセスされたポリヌクレオチド、コードポリヌクレオチド、非コードポリヌクレオチド、またはそれらの部分を含む11D10ポリヌクレオチドを含む。但し、これらのポリヌクレオチドは11D10の可変領域の少なくとも一部をコードする領域を含む。可変領域コードセグメントの一部を含むmRNA配列およびcDNA配列およびそのフラグメントもまた包含する。
本発明はまた、それによりコードされるポリペプチドの特性を増強し得るか、減少し得るか、または有意には影響しなくてもよい11D10の機能的に等価な変異体および誘導体ならびにその機能的に等価なフラグメントについてコードするポリヌクレオチドを包含する。これらの機能的に等価な変異体、誘導体およびフラグメントは、免疫応答、好ましくは抗HMFG免疫応答を誘導する能力を示す。例えば、コードされたアミノ酸配列を変化させないDNA配列の変化、ならびにアミノ酸残基の保存的置換を生じる変化、１または数個のアミノ酸欠失または付加を生じる変化、およびアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換を生じる変化は、コードされたポリペプチドの特性に有意に影響しない変化である。コードされたアミノ酸残基を変更しないヌクレオチド置換は、異なる系における遺伝子発現を最適化するために有用であり得る。適切な置換は当業者に公知であり、例えば、特定の発現系において好ましいコドン使用を反映させるためになされる。別の例において、オルタナティブにスプライスされたポリヌクレオチドは、11D10の機能的に等価なフラグメントまたは変異体を生じさせ得る。オルタナティブにプロセスされたポリヌクレオチド配列変異体は、相互に配列が異なるが、同じゲノム領域に由来するmRNA、例えば、１）オルタナティブなプロモーターの使用；２）オルタナティブなポリアデニル化部位の使用；または３）オルタナティブなスプライス部位の使用により生じるmRNAに対応するポリヌクレオチド配列として規定される。
本発明の11D10ポリヌクレオチドはまた、他の11D10フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。11D10フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、例えば、プローブ、治療剤として、および11D10の種々の機能ドメインおよび／または結合ドメインをコードするテンプレートとして有用である。従って、本発明は、11D10の軽鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成するが、本出願の出願時に公知の領域をコードする他の免疫グロブリンとハイブリッドを形成しない、少なくとも15の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約35の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約50の連続するヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約75の連続するヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約100の連続するヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約200の連続するヌクレオチド、なお好ましくは少なくとも約300の連続するヌクレオチドの領域を含むポリヌクレオチドを含む。一つの実施態様において、領域は、領域が配列番号５から配列番号14と安定なハイブリッドを形成しない場合の条件下で、配列番号１の配列をコードする可変軽鎖からなるポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し得る。別の実施態様において、領域は、領域が配列番号５から配列番号32と安定なハイブリッドを形成しない場合の条件下で、配列番号３の配列をコードする可変重鎖からなるポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し得る。
別の実施態様において、11D10ポリヌクレオチドフラグメントは、図１（配列番号１）または図２（配列番号３）に示した配列の約15、好ましくは20、なおさらに好ましくは30塩基を含む。これに近いサイズのフラグメントは、Ab1またはAb3抗体の結合部位をコードし得る。適切なフラグメントは、それらがプライマーまたはプローブとして効果的であるように、11D10 DNAまたはRNAに特異的にハイブリダイズするフラグメントである。プライマーはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で特に有用である。
ハイブリダイゼーション反応は異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。この条件は、当該分野で広く知られたおよび刊行されたハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件である。例えば、SambrookおよびManiatisを参照のこと。関連条件の例としては、（ストリンジェンシーを増加する順に）：25℃、37℃、50℃および68℃のインキュベーション温度；10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC（ここで、SSCは0.15Ｍ NaClおよび15mMクエン酸緩衝液）および他の緩衝液系を用いるそれらの等価な濃度；０％、25％、50％および75％のホルムアミド濃度；５分間〜24時間までのインキュベーション条件；１回、２回またはそれを越える洗浄工程；１、２または15分の洗浄インキュベーション時間；および6×SSC、1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。
「Tm」は、ワトソン−クリック塩基対合によって逆平行向きに水素結合した相補鎖より作製されたポリヌクレオチド二重鎖の50％が実験条件下で一本鎖に解離する摂氏度での温度である。Tmは以下の標準式に従って予測され得る：
Tm＝81.5+16.6log[Na+]+0.41(%G/C)-0.61(%F)-600/L
ここで、［Na+］はモル／Ｌで表したカチオン（通常ナトリウムイオン）濃度である；（％G/C）は二重鎖における全残基のパーセントとしてのＧおよびＣ残基の数である；（％Ｆ）は溶液中のホルムアミドパーセント（wt/vol）であり；そしてＬは二本鎖の各鎖におけるヌクレオチドの数である。
11D10のフラグメントをコードする有用な11D10ポリヌクレオチドは（例えば、図１中の配列番号１または図２中の配列番号３に基づいて）ポリヌクレオチドフラグメントを生じさせ、そして目的の機能について、それによりコードされるポリペプチドを試験することによって得ることができる。あるいは、所望の11D10ポリペプチドがあれば、ポリヌクレオチド配列は、11D10ポリペプチドのアミノ酸配列から導かれ得る。例えば、11D10ポリペプチドをAb1および／またはAb3に結合する。または免疫応答を誘発するそれらの能力について試験し得る。これらの種々の機能についてのアッセイは、以下で述べる。
本発明はまた、scFv、ポリマー、融合タンパク質、およびキメラをコードするポリヌクレオチドのような、１以上の11D10ポリペプチドを含む11D10誘導体または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。11D10のこれらの形態を以下に記載。
本発明はまた、検出可能な標識と共有結合したポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、例えば、関連のヌクレオチド配列の検出用プローブとして有用である。
11D10ポリヌクレオチドの調製
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはPCRを用いて得ることができる。
ポリヌクレオチドの化学的合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書中に提供した配列および市販のDNA合成器を用いて所望のDNA配列を生成し得る。
組換え法を用いて11D10ポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し得、次いで、該ベクターを、複製および増幅のための適切な宿主細胞に導入し得る。ポリヌクレオチドは当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞に挿入し得る。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、接合またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、細胞を形質転換する。一旦導入すれば、外因性ポリヌクレオチドは非組込みベクター（例えば、プラスミドのような）として細胞内に維持され得るか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法によって宿主脂肪から単離され得る。例えば、Sambrookら(1989)を参照のこと。
あるいは、PCRはDNA配列の再生を可能にする。PCR技術は当該分野で周知であり、米国特許第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,754,065号および同第4,683,202号、ならびにPCR:The Polymerase Chain Reaction,Mullisら編，Birkauswer Press,Boston(1994)に記載されている。
RNAは、適切なベクター中の単離DNAを用い、適切な宿主細胞にそれを挿入することによって得ることができる。細胞が複製され、そしてDNAがRNAに転写される場合、次いで、該RNAは、例えばSambrookら(1989)に記載されているような当業者に周知の方法を用いて単離され得る。
ワクチンとして使用する場合、Hornら（(1995)Human Gene Therapy 6:565-573）（これは、投与に適した医薬用のプラスミドDNAを生産する）によって記載されるように、11D10ポリヌクレオチドを含むプラスミドが調製される。
11D10ポリヌクレオチドを含むクローニングベクターおよび発現ベクター
本発明は、さらに、クローン化された11D10ポリヌクレオチドを有する様々なベクターを含む。これらのベクターは組換えポリペプチドの発現のためにならびに11D10ポリヌクレオチドの供給源として使用され得る。クローニングベクターは、それらが含有する11D10ポリヌクレオチドの複製コピーを得るために、または将来の回収のために、寄託機関にポリヌクレオチドを保存する手段として使用され得る。発現ベクター（およびこれらの発現ベクターを含む宿主細胞）を用いて、それらが含有するポリヌクレオチドから生産されたポリペプチドを得ることができる。ベクターはまた、遺伝子治療におけるように、個体において11D10ポリペプチドを発現し、従ってポリペプチドを合成し得るインタクトな細胞を有することが望ましい場合に使用され得る。適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは当該分野で公知の任意のベクター、例えば、細菌発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系および昆虫発現系で使用されるベクターを含む。特異的ベクターおよび適切な宿主細胞は当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。例えば、GacesaおよびRamji,Vectors,John Wiley & Sons（1994）を参照のこと。
クローニングベクターおよび発現ベクターは、典型的には、選択マーカー（例えば、該ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含むが、このようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時導入された別のポリヌクレオチド配列に担持され得る。選択遺伝子が導入されたそれらの宿主細胞のみが、選択的条件下で生存および／または増殖する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート等）に対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）栄養要求性欠陥を相補するタンパク質；または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、異なる宿主用の適切な遺伝子は、当該分野で公知である。クローニングベクターおよび発現ベクターはまた、典型的には、宿主によって認識される複製系を含有する。
適切なクローニングベクターは標準的な技術に従って構築され得るか、または当該分野で入手可能な非常に多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されたクローニングベクターは、使用することを意図される宿主細胞に従って変化し得、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を保有し得、および／または該ベクターを含有するクローンを選択するにおいて使用され得るマーカー用の遺伝子を担持し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス（例えば、pUC18、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、およびpSA3およびpAT28のようなシャトルベクター）が挙げられる。これらのクローニングベクターおよび多くの他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene、およびInvitrogenのような供給業者から入手可能である。
発現ベクターは、一般に、目的の11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターのような適切な転写制御エレメントに作動可能に連結される。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンのような１以上の翻訳制御エレメントがまた、通常必要とされる。これらの制御エレメント（転写エレメントおよび翻訳エレメント）は、11D10ヌクレオチド（すなわち、11D10遺伝子）に由来し得るか、またはそれらは異種であり得る（すなわち、他の遺伝子および／または他の生物に由来し得る）。また、11D10ポリペプチドが細胞膜を通過すること、および／またはそこに止まることを可能にするために、または細胞から分泌させるために、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列もまた含まれ得る。酵母、トリおよび哺乳動物細胞を含む真核生物細胞での発現に適切な多数の発現ベクターが当該分野で知られている。発現ベクターの一つの例は、pcDNA3（Invitrogen,San Diego CA）であり、ここでは、転写はサイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター／エンハンサーによって駆動される。このベクターはまた、目的の11D10ポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限酵素の認識部位を含む。発現ベクター（系）の別の例は、バキュロウイルス／昆虫系である。
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)；リポフェクション；および感染（ここでベクターは以下に記するワクシニアウイルスのような感染性因子である）を含む任意の多くの適切な手段によって宿主細胞に導入され得る。ベクターまたは11D10ポリヌクレオチドを導入する手段の選択は、しばしば、宿主細胞に依存する。
一旦適切な宿主細胞、例えば大腸菌（E.coli）またはCOS-7に導入されると、本明細書中に記載される任意のアッセイを用いて11D10ポリペプチドの発現は測定され得る。例えば、11D10ポリペプチドの存在は、（11D10ポリペプチドが分泌される場合）培養上清または細胞溶解物のRIAまたはELISAによって検出され得る。
11D10ポリヌクレオチドに特に有用な発現ベクターは、11D10ポリヌクレオチド配列を含むワクシニアウイルスであり、これはまたワクチン調製において使用され得る。Moss(1991)Science 252:1662-1667。11D10ポリペプチドフラグメントを含む11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をワクシニアに導入するために、目的のポリヌクレオチド配列を、まず、複製に必須でないワクシニアDNAに相同な隣接配列と共にワクシニアウイルスプロモーターを含むプラスミドに挿入する。次いで、プラスミド含有細胞をワクシニアで感染させ、これにより、プラスミドとウイルスとの間の低レベルの相同組換えが導かれ、ワクシニアプロモーターおよび11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がワクシニアウイルスのゲノムに移入される。典型的には、11D10ポリヌクレオチドはウイルスtk（チミジンキナーゼ）遺伝子に挿入される。tk部位への挿入により、野生型と比較してウイルスは10,000倍を越えて減弱される（Flexnerら(1989)Vaccine 88(Cold Spring Harbor Laboratory),179-184）。組換えウイルスは、tk-表現型によって同定される。好ましくは、11D10ポリヌクレオチドの発現は、ワクシニア初期／後期プロモーター（7.5K）の制御下であり、それにより、得られる11D10ポリペプチドはウイルスのライフサイクルを通じて感染細胞において発現され得る。しかし、pH6、合成プロモーター、SV40プロモーター、またはアデノウイルス由来のプロモーターのような当該分野で知られている他のプロモーターが使用され得る。11D10ポリペプチドの発現は、組換えワクシニアで感染させた細胞または組換えワクシニア生ウイルスで免疫化された個体で生じる。11D10ポリペプチドの発現のためのワクシニアベクターの構築は、実施例４に提供される。限定されないが、WR、ALVACおよびNYVACを含むワクシニアのいくつかの株のうちのいずれか１つが使用され得る。トリ細胞を感染するためには、ALVACおよびNYVAC株を用いる。
本発明のワクシニアベクターは、11D10ポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを含有し得る。ワクシニアベクターはまた、所望の結果を増強し、容易にし、または調節する他のポリペプチド（例えば、限定されないが、IL-2、IL-4およびGM-CSFを含むリンホカイン）をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。好ましいリンホカインは、GM-CSFである。GM-CSFを使用する場合、組換え法によって、RNA転写産物の３’非翻訳領域からAU-リッチエレメントを排除しおよび／またはヘアピンループを形成し得る５’非翻訳領域における配列を排除することもまた好ましい。また、scFvs、キメラ、およびポリマー（以下に記載）のような、11D10ポリペプチドを含む組換え11D10変異体をコードするワクシニアベクターが本発明に包含される。
11D10ポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞
本発明の別の実施態様は、上述のような、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリヌクレオチド配列を有するベクターで形質転換された（すなわち、含む）宿主細胞である。原核生物および真核生物の両方の宿主細胞が使用され得る。原核生物宿主は、細菌細胞（例えば、E.coliおよびマイコバクテリア）を包含する。真核生物宿主の中には、酵母、昆虫、トリ、植物および哺乳動物細胞がある。宿主系は当該分野で知られており、本明細書中に詳細に記載する必要はない。哺乳動物宿主細胞の１つの例は、European Collection of Cell Cultures(英国)から得ることができるNSOである。例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって駆動される、プラスミドでのNSO細胞のトランスフェクション、その後のグルタミンシンテターゼを用いるこのプラスミドの増幅により、タンパク質産生のための有用な系が提供される。Cockettら(1990)Bio/Technology 8:662-667。
本発明の宿主細胞は、とりわけ、11D10ポリヌクレオチドの貯蔵場所および／または11D10ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生のためのビヒクルとして使用され得る。これらはまた、11D10ポリペプチドのインビボでの送達のためのビヒクルとして使用され得る。
11D10ポリヌクレオチドの用途および使用方法
本発明のポリヌクレオチドはいくつかの用途を有する。11D10ポリヌクレオチドは、例えば、11D10または11D10フラグメントの組換え産生のための発現系において有用である。それらはまた、当業者に周知の方法を用いてサンプル中の11D10ポリヌクレオチド（または関連の）配列の存在についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。さらに、11D10ポリヌクレオチドはまた、所望のポリヌクレオチドの増幅を達成するためのプライマーとしても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ワクチンとしておよび遺伝子治療のために有用である。
本発明の11D10ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるように、11D10またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの増幅用プライマーとして使用され得る。PCRは上述した。PCR反応を行うための条件は、所望の特異性に依存し、これは使用されるプライマーおよび反応条件によって調整され得る。このような調整は、当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。
11D10ポリヌクレオチドはまた、例えば、細胞における11D10ポリヌクレオチドの存在の検出用のハイブリダイゼーションプローブとしても使用され得る。例えば、11D10ポリヌクレオチドは、遺伝子治療で使用する細胞における11D10ポリヌクレオチド配列の存在を決定するためのプローブとして使用され得る。これらの方法について、適切な細胞サンプルまたは細胞由来のサンプル（いずれも、11D10ポリヌクレオチド配列を含むと考えられるサンプル）を得、サンプル由来のポリヌクレオチドと11D10ポリヌクレオチドプローブとを接触させることによって11D10ポリヌクレオチドの存在について試験する。この方法を行って、11D10プローブと目的の11D10ポリヌクレオチドとの間にハイブリダイゼーションが生じることを可能にし、得られた（もしあれば）ハイブリダイズした複合体が検出される。このような方法は、細胞培養、ポリヌクレオチド調製、ハイブリダイゼーション、およびもしあれば形成されたハイブリッド複合体の検出のような当該分野で周知の手順を必要とする。同様の方法を用い、プローブはまた、次に11D10ポリペプチド、インタクトな11D10、または11D10の組換え変異体形態を産生するために用いられるベクターを検出するために使用され得る。
本発明の11D10ポリペプチドは、11D10ポリペプチド、インタクトな11D10、または増強された特性、等価な特性、もしくは異なる、所望の特性を有する、インタクトな11D10を含む、11D10の組換え形態を産生するための発現系において使用され得る。これらの組換え形態は、当該分野における日常的方法を用いることにより作製される。11D10の組換え形態および11D10ポリペプチドの例は、限定されないが、サイトカインのような他の成分を含む、ハイブリッド、キメラ、一本鎖変異体、および融合タンパク質を包含する。これらの11D10の組換え形態および11D10ポリペプチドおよびその作製のより詳細な記載を、以下に提供する。
11D10ポリヌクレオチドの別の用途は、ワクチンおよび遺伝子治療にある。一般的な原理は、そこにコードされたポリペプチドの発現を促進または減弱のいずれかをするようにポリヌクレオチドを投与することである。従って、本発明は、免疫応答を誘導する方法、および有効量の11D10ポリヌクレオチドを個体に投与する工程を含む処置方法を包含する。これらの方法において、11D10ポリペプチドをコードする11D10ポリヌクレオチドを、直接または11D10ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞を介するかのいずれかで個体に投与する。好ましくは、11D10ポリヌクレオチドを細胞内で複製させる。従って、11D10ポリヌクレオチドを、標的組織型の細胞において内在的に活性である異種プロモーターのような適切なプロモーターに作動可能に連結させる。ポリヌクレオチドの細胞への侵入は、ワクシニアまたはアデノウイルスベクターのようなウイルス発現ベクターを介するような当該分野で公知の技術により、またはポリヌクレオチドをカチオン性リポソームと結合させることにより達成される。好ましくは、11D10ポリヌクレオチドは、環状プラスミドの形態であり、好ましくは超らせん配置である。好ましくは、一旦細胞核に入れると、プラスミドは環状の非複製エピトープ分子として存続する。次いで、例えば、所望のHLAモチーフを有するより免疫原性分子またはＴ細胞エピソームをコードするように、プラスミド構築物を用いてインビトロ変異誘発を行い得る。
11D10ポリヌクレオチドを含むプラスミドが真核生物細胞において発現され得るか否かを決定するために、例えばCOS-7細胞、CHO（トリ起源）細胞、またはHeLa（ヒト起源）細胞のような真核生物細胞が、プラスミドでトランスフェクトされ得る。次いで、11D10ポリペプチドが得られる発現を、RIAまたはELISAによって測定する。プローブとしてMC-10(Ab1)を用いる細胞溶解物を用いてウェスタンブロットを行って、細胞に会合した11D10ポリペプチドを確認し得る。あるいは、より小さい11D10ポリペプチドについては、得られた11D10ポリペプチドが、例えば酵素標識を用いて組換えにより標識されるように、プラスミドを構築することにより、発現が検出され得る。さらに、11D10ポリペプチドの精製、その後の本明細書中に記載する機能アッセイ（例えば、細胞結合阻害アッセイ）を行うことにより、発現された11D10ポリペプチドの特徴付けが達成される。
本発明はまた、11D10ポリヌクレオチドのエクスビボトランスフェクションを含み、ここでは、個体から取り出した細胞を11D10ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、個体に再導入する。適切なトランスフェクト細胞は限定されないが、末梢血単核細胞を包含する。
11D10ポリヌクレオチドの治療的投与を、以下により詳細に記載する。
11D10ポリペプチド
本発明は、11D10の可変領域の少なくとも一部を含有する11D10のポリペプチドフラグメント、および11D10フラグメントを含むタンパク質を含む。配列番号２（図１）または配列番号４（図２）の任意の領域またはサブ領域を含み得る11D10のポリペプチドフラグメント（但し、フラグメントは可変領域の少なくとも一部を含む）は、以下の基準：（ａ）Ab1および／またはAb3に結合する能力；（ｂ）HMFGに対する免疫応答を誘導する能力；（ｃ）HMFGの任意の部分に対する相同性（すなわち、実質的な配列の同一性）；（ｄ）HMFG関連疾患、特にHMFG関連腫瘍を緩和、改善、減少、または遅延する能力のいずれか（１以上）によって同定され、そして特徴付けられる。
11D10のポリペプチドフラグメントは、薬学的組成物およびワクチンにおける、Ab1および／またはAb3レベルをモニターするための診断ツールとしてのそれらの使用、HMFGに結合する抗体を作製する際のそれらの使用、および標識抗HMFG抗体を受容した個体からの標識Ab1を除去する際のそれらの使用を包含する種々の使用を有する。
特に断りのない限り、用語「11D10ポリペプチド」は、本発明のポリペプチドの全ての実施態様を包含する。
本発明は、11D10の免疫学的活性を有するポリペプチドを含み、ここでポリペプチドは、11D10の可変領域由来の少なくとも５つの連続するアミノ酸の配列で構成される。一つの実施態様において、可変領域は、軽鎖由来であり、より特定すると、配列番号２（図１）の中に示される。別の実施態様において、可変領域は、重鎖由来であり、より特定すると、配列番号４（図２）の中に示される。別の実施態様において、５つの連続するアミノ酸配列は、相補性決定領域（CDR）由来である。
配列番号２（図１）および配列番号４（図２）のアミノ酸配列を図３を示し、これは、各々、11D10の軽鎖および重鎖の可変領域のフレームワークおよびCDR配列を示す。フレームワーク配列は、ＶＬおよびＶＨドメインの正しいβシート折り畳みおよびドメインを一緒にする鎖間相互反応を担う。相補性決定領域（CDR）とは、一緒になって抗原結合部位を形成すると考えられる可変領域の６つの超可変配列（ＶＬから３つおよびＶＨから３つ）をいう。これらの領域の脱線状化ならびに11D10のリーダー配列の同定は、BLASTプログラムによるKabatの免疫学データベースのサーチおよび分析に基づくものであった。
本発明の別の実施態様は、図３に示すアミノ酸配列（フラグメント）からなる群より選択される配列を含む11D10のポリペプチドフラグメントである。これらのポリペプチドは、軽鎖および重鎖可変領域の機能的サブ領域（すなわち、フレームワークおよびCDR）を表わす。好ましくは、これらの11D10ポリペプチドはCDRを含む。
本発明はまた、配列番号２（図２）の中に示される可変領域の少なくとも25の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも28、より好ましくは少なくとも30の連続するアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも約35の連続するアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも約50の連続するアミノ酸、またはそのCDR1もしくはCDR2の少なくとも５の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも７の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも８の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約10の連続するアミノ酸、またはそのCDR3の少なくとも７の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも８の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも９の連続するアミノ酸を含む、11D10軽鎖可変領域のポリペプチドフラグメントを含む。
別の実施態様において、本発明は、配列番号４（図１）の中に示される可変領域の少なくとも17の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも20の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも約25の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約35の連続するアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも約50の連続するアミノ酸、またはそのCDR1の５つの連続するアミノ酸、またはそのCDR2もしくはCDR3の少なくとも６つの連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも７つの連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約10の連続するアミノ酸を含む、11D10重鎖可変領域のポリペプチドフラグメントを含む。
11D10ポリペプチドフラグメントのサイズは、活性を生じるのに要する長さは非常に小さくてよいので、広範囲に変化させることができるが、最大長さは典型的に、活性を生じるのに有害ではない。最小サイズは所望の機能を提供するのに十分なものでなければならない。例えば、ポリペプチド上の結合部位はわずか約５アミノ酸長の短さであり得、その一方で他の結合部位は、空間的に近位であるが隣接配列にはないアミノ酸の集合によって形成される。このように、本発明は、配列番号２（図１）または配列番号４（図２）に示すアミノ酸配列の一部を含む11D10のポリペプチドフラグメントを含み、ここで、11D10ポリヌクレオチドは約５アミノ酸長である。また、本発明は、配列番号２（図１）または配列番号４（図２）に示すアミノ酸配列の一部を含む11D10のポリペプチドフラグメントを提供し、ここで、11D10ポリヌクレオチドは約10、15、25、30、50、100、または150アミノ酸長である。また、本発明は、少なくとも約５アミノ酸、多くても約100アミノ酸を有する、配列番号２（図１）または配列番号４（図２）に示すアミノ酸配列の一部を含む11D10ポリペプチドフラグメントを提供する。当業者に明らかなように、それらのサイズに係わらず、これらの11D10ポリペプチドはまた、他の物質または因子と会合させ、または結合させて、11D10ポリペプチドの機能および／または特異性を容易にし、増強し、または調節し得る。このような改変の例は後記する。
別の実施態様において、HMFG、特にHMFG内の20のアミノ酸の縦列反復（tandemrepeat）に対して相同性の領域を含有する11D10ポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、Laroccaら（1992）Hybridoma 11:191-201を参照のこと。このような相同フラグメントは、少なくとも部分的には、名目的にHMFGの高分子量ムチン抗原に類似し、それゆえ、HMFG（最終標的抗原）を模倣することによって抗原提示に参加し得る。また、これらの11D10ポリペプチドはクラスＩ主要組織適合性複合体（MHC）抗原と協同して抗原提示に参加し、それゆえ、細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷を引き起こす。図23は、アミノ酸配列を両方向に並べた場合に（すなわち、同方向および逆方向に並べた場合に）、11D10およびHMFGの類似の配列間のアラインメントを示す。本発明に含まれるHMFGに対する相同性の領域の例は、以下の通りである（配列番号２；図３のアミノ酸１〜107に基づくアミノ酸ナンバリング）：（ａ）軽鎖のアミノ酸51〜アミノ酸52；アミノ酸54〜アミノ酸56；アミノ酸92〜アミノ酸93；および（ｂ）重鎖のアミノ酸57〜アミノ酸58。従って、本発明はまた、図３−Ａ（配列番号２のアミノ酸１〜107）に示す配列の、約アミノ酸50〜約アミノ酸53、約アミノ酸50〜約アミノ酸56、約アミノ酸92〜約アミノ酸93、または約アミノ酸90〜約アミノ酸94のアミノ酸配列を含む11D10ポリペプチド、ならびに図３−Ｂ（配列番号４のアミノ酸１〜118）に示す配列の、約アミノ酸57〜約アミノ酸58、約アミノ酸56〜約アミノ酸58、または約アミノ酸53〜約アミノ酸58を含むポリペプチドを含む。
本発明は、11D10ポリペプチドに対する修飾を包含し、それらの特性に有意には影響しない11D10ポリペプチドの機能的に等価なフラグメント、および増強されたまたは低下した活性を有する変異体を含む。ポリペプチドの修飾は当該分野においては日常的な実施であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。修飾されたポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を顕著に有害に変化させないアミノ酸の１以上の欠失または付加、または化学的アナログの使用を伴うポリペプチドが挙げられる。相互に保存的に置換され得るアミノ酸残基は、限定されるものではないが、以下を含む：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン。これらのポリペプチドはまた、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびに例えば異なる糖でのグリコシル化、アセチル化およびリン酸化のような他の翻訳後修飾を伴うポリペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸置換は保存的である、すなわち、置換されたアミノ酸は本来のアミノ酸のものと同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該分野で公知であり、例は上述で提供した。アミノ酸修飾は１以上のアミノ酸の変化または修飾から可変領域のような領域の完全な再設計までの範囲であり得る。可変領域の変化は、結合アフィニティーおよび／または特異性を改変し得る。修飾の他の方法は、限定されるものではないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を包含する、当該分野で公知のカップリング技術の使用を包含する。修飾は、例えば、ラジオイムノアッセイのための放射性部分の結合のような、免疫アッセイのための標識の結合のために用いられ得る。修飾された11D10ポリペプチドは当該分野で確立された手順を用いて作製され、そして当該分野で公知の標準的アッセイを用いてスクリーニングされ得、そのうちいくつかについては実施例にて後記する。
また、本発明は、１以上の11D10ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。１つの実施態様において、配列番号２（図１）の中に示される可変軽鎖領域の少なくとも10の連続するアミノ酸および配列番号４（図２）の中に示される可変重鎖領域の少なくとも10アミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施態様において、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施態様において、融合ポリペプチドは、11D10の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本発明の目的のために、11D10融合タンパク質は、１以上の11D10ポリペプチド、およびネイティブの分子ではそれに結合していない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域由来の相同配列を含有する。有用な異種配列は、限定されるものではないが、宿主細胞からの分泌を提供する配列、免疫学的反応性を増強させる配列、あるいは当該ポリペプチドのイムノアッセイ支持体またはワクチンキャリアへのカップリングを容易とする配列を含む。他の例は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（SEA）のようないわゆる細菌「スーパー抗原」である。Dohlsitenら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8945-8949。例えば、11D10ポリペプチドは、生物学的反応修飾物質と融合され得る。生物学的反応修飾物質の例は、限定されるものではないが、GM-CSF、インターロイキン−２（IL-2）、インターロイキン−４（IL-4）、およびγ−インターフェロンのようなサイトカインまたはリンホカインを含む。従って、本発明は、GM-CSFまたはIL-2を含む11D10融合ポリペプチドを含む。図25は、11D10ポリペプチドと好ましいリンホカインGM-CSFまたはIL-2との融合のためのプラスミド構築物の例を示す。このプラスミド（示されるように、11D10重鎖をコードする）の、11D10軽鎖をコードするプラスミドとの同時トランスフェクションもまた、11D10融合ポリペプチドを産生する。好ましくは、11D10軽鎖をコードするプラスミドを、プロトプラスト融合（Shinら(1989)Meth.Enzym.178:459-476）により、Sp2/0またはNSO細胞にまずトランスフェクトし、続いてエレクトロポレーションにより、11D10重鎖のコード配列を含むプラスミドを１回目のトランスフェクションからの高産生クローンにトランスフェクトする。Shinら(1989)。これらの手順は、実施例７により詳細に記載する。
上記プラスミドのトランスフェクション（同時トランスフェクションまたは連続するトランスフェクションのいずれかにより）の結果として産生された抗体（すなわち、重鎖および軽鎖を含む抗体）は、重鎖に結合した軽鎖の形成を検出する任意のアッセイにより検出され得る。このようなアッセイは、当該分野では日常的である。例えば、非還元SDSゲル電気泳動は、軽鎖および重鎖の両方を含む抗体分子の存在（分子量で示される）を検出するために使用し得る。重鎖に結合した軽鎖を検出するアッセイの別の例は、以下のようなELISAである。マイクロタイタープレートを、標準濃度のヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体で被覆し、BSAでブロックし、そして洗浄する。被覆したプレートを、種々の試験構築物を発現する細胞の培養上清と反応させる。洗浄の後、次いでプレートを、アルカリホスファターゼ結合体とともにヤギ抗ヒトγ-1抗体で処理し、そして通常の様式で発色させる。吸光度を、405nmで測定する。融合抗体が、サイトカインのような生物学的反応分子を含む場合、抗体はまた、例えば、サイトカインの反応性を測定するアッセイを使用することにより検出され得る。このようなアッセイは当該分野で公知であり、そして本明細書中に詳細に記載する必要はない。例えば、GM-CSF融合11D10抗体および／または11D10ポリペプチドは、以下のように検出され得る。プレートを、ヤギ抗ヒトκ抗体で被覆し、そして被覆したプレートを、培養上清（融合物が分泌される場合）と反応させる。次いで、反応したプレートを、マウスのGM-CSF/ビオチン結合体に対するラットの抗体で処理し、そして得られた複合体を、490nmで吸光度を測定することにより検出する。これらのアッセイは、実施例７により詳細に記載する。
あるいは、図25のプラスミドは、重鎖消失変異体にトランスフェクトし得る。例えば、重鎖消失変異体は、2×10７個の11D10細胞を、供給者の指示に従ってフルオレセイン標識ウサギ抗マウスIgG（Ｈ鎖特異的、DAKO Corporation,Carpinteria,CA）で処理することによって得ることができる。染色されたおよび染色されていない細胞集団を蛍光活性化セルソーターで分析する。未染色細胞を滅菌チューブに回収し、限界希釈によって１細胞／ウェルにて96ウェルプレートに入れる。次いで、培養上清を、ヤギ抗マウスIgG（重鎖特異的）およびヤギ抗マウスκを用いるELISAによってアッセイする。κポジティブおよびIgGネガティブ表現型を有するクローンを少なくとも３回サブクローンして、安定な11D10(-H)変異体を得る。推定重鎖消失変異体(11D10(-H))クローンが単離され得、そして軽鎖可変領域cDNAの配列を決定して、残りの軽鎖が11D10の軽鎖であることを確証する。11D10 ＶＨについてのmRNAの逆方向PCRを、11D10(-H)cDNAのクローニングに用いた、２セットの5'-および3'-プライマーで行う（実施例２）。重鎖消失変異体は、検出可能なDNAバンドを生じていないはずである。次いで、重鎖構築物によるこれらの細胞のトランスフェクションが、エレクトロポレーションのような当該分野において標準的な方法を用いて達成され得る。
11D10融合ポリペプチドは、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出し翻訳することによって、作出され得る。これらの融合タンパク質は、11D10ポリペプチドの活性を増強し、修飾し、および／または容易とするために有用であり得る。
また、本発明は、11D10ポリペプチドを含む11D10の改変された組換え形態、すなわち、図１および２に示す11D10の可変領域の少なくとも一部を含有する11D10ポリペプチドを含む。本明細書で用いる11D10の「改変された」または「組換え」形態とは、インタクトな11D10とは異なる配列および／または立体配置の11D10ポリペプチドを含有する。本発明に含まれる11D10抗体の組換え形態は、ハイブリッド抗体であり、ここで、重鎖と軽鎖との一方の対は、第１抗体のそれらと相同であり、重鎖と軽鎖との他方の対は、異なる第２抗体と相同である。本発明の目的のために、軽鎖と重鎖との１対は、11D10由来である。典型的には、これらの２対の各々は、HMFGの異なるエピトープに結合する。このようなハイブリッドはまた、後述するように、キメラ鎖を用いて形成され得る。
別の実施態様において、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質である11D10キメラが提供される。典型的には、鎖の定常ドメインは、１つの特定の種および／またはクラスに由来し、可変ドメインは、異なる種および／またはクラスに由来する。例えば、「ヒト化」11D10抗体は、定常領域がヒト起源であって、そして可変領域が11D10由来（すなわち、マウス）の抗体である。また、フレームワーク領域はヒト配列に由来するが、CDR領域が11D10アミノ酸配列を含むヒト化可変領域を有する抗体が本発明において例証される。例えば、EP0329400を参照のこと。また、キメラの機能的フラグメントが例証される。一例は、ヒト化Fabフラグメントであり、これは、ヒトのヒンジ領域、ヒトの第１定常領域、ヒトκ軽鎖または重鎖定常領域、および11D10由来の可変領域を含有する。ヒト化11D10 Fabフラグメントは、Fabダイマーを形成するように順に作製される。典型的には、本発明の11D10融合タンパク質および11D10キメラは、本明細書に記載の組換え方法を用いて、それらをコードするポリヌクレオチドを調製し、そして発現させることによって作製されるが、それらはまた、例えば化学合成を含む当該分野で公知の他の手段によっても調製され得る。
本発明に含まれる11D10の改変された組換え形態の別の例は、改変された抗体であり、これは、11D10のアミノ酸配列を変更した抗体をいう。標準的な組換え技術を用いて、11D10抗体は、所望の特性を得るように設計され得る。例えば、アミノ酸配列における変化の結果、得られる11D10ポリペプチドの免疫原性がより大きくなり得る。変化は、１以上のアミノ酸の変化から領域、例えば、定常領域の完全な再設計までの範囲にわたる。一般に、定常領域における変化は、所望の細胞プロセス特徴、例えば、補体固定、膜との相互作用、および他のエフェクター機能の変化を達成し得る。可変領域における変化は、結合特性を改変するようになされ得る。改変された／組換え11D10抗体はまた、エフェクター細胞への（リンホカインのような）物質の特異的送達を助けるようにも設計され得る。他のアミノ酸配列修飾は上述した。
また、本発明は、11D10の単鎖可変領域フラグメント（「scFv」）を含む。単鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いることによって、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって作製される。Birdら(1988)Science 242:423-426。連結ペプチドの例は、(GGGGS)３（配列番号35）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間の約3.5nmを架橋する。他の配列のリンカーは設計され使用されている。Birdら(1988)。リンカーは、順に、薬物の結合または固体支持体への結合のような、さらなる機能のために修飾され得る。
従って、本発明の１つの実施態様は、配列番号２（図１）の中に示される軽鎖可変領域の少なくとも10の連続するアミノ酸および配列番号４（図２）の中に示される重鎖可変領域の少なくとも10の連続するアミノ酸を含む融合ポリペプチドであり、ここで、アミノ酸セグメントは約５〜20アミノ酸のリンカーポリペプチドによって連結される。別の実施態様において、融合ポリペプチド（scFv）は、配列番号２（図１）に示すアミノ酸配列の軽鎖可変領域および配列番号４（図２）に示すアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む。
十分な可動性および長さを有するいずれのペプチドもscFvにおけるリンカーとして使用し得る。通常、リンカーは、免疫原性をほとんどから全く有さないように選択される。scFvの11D10成分に関して、重鎖および／または軽鎖の全てまたは一部が使用され得る。典型的には、全可変領域がscFvに含まれる。例えば、軽鎖可変領域が重鎖可変領域に連結され得る。あるいは、軽鎖可変領域の一部が重鎖可変領域の全部または一部に連結され得る。(GGGGS)３（配列番号35）のような非対称リンカーについては、scFvは、いずれかの順序、例えば、ＶＨ--(リンカー)--ＶＬまたはＶＬ--(リンカー)--ＶＨのように組み立てられ得る。しかし、E.coliで発現させる場合、これらの２つの立体配置の発現レベルには、差異があり得る。また、ハイブリッドの（または２つの相を持つ）scFv（ここで、１つの成分が11D10ポリペプチドであって、もう１つの成分がＴ細胞エピトープのような異なるポリペプチドである）を構築することも可能である。(Ｘ)--(リンカー)--(Ｘ)--(リンカー)--(Ｘ)（ここで、Ｘは11D10ポリペプチド、または11D10ポリペプチドと他のポリペプチドとの組合せである）のようなタンデムscFvもまた作製され得る。
単鎖変異体は、組換えまたは合成のいずれかで産生され得る。scFvの合成的産生では、自動合成装置を使用し得る。scFvの組換え生産では、scFvをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞のような真核細胞、あるいはE.coli.のような原核細胞のいずれかの適切な宿主細胞に導入し得る。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結のような日常的操作によって作製し得る。得られるscFvを、当該分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離し得る。
11D10 scFvの産生に特に有用な系は、E.coli.におけるプラスミドベクターpET-22b(+)(Novagen,Madison,WI)である。pET-22b(+)は、scFv精製の基礎として働く、６つの連続するヒスチジン残基からなるニッケルイオン結合ドメインを含有する。（実施例７に示す）この例は、単に例示を目的としており、限定しているわけではない。使用し得るベクターの別の例は、上記のpcDNA3（Invitrogen,San Diego,CA)である。
E.coli.をscFv産生に使用する場合、条件は、scFvポリペプチドが最適な三次構造および四次構造を保証し得るような条件とすべきである。使用するプラスミド（特に、プロモーターの活性）および宿主細胞に応じて、scFvの産生を調節する必要があり得る。例えば、より弱いプロモーターの使用またはより低温での発現がscFvの産生を最適化するのに必要であり得る。あるいは、酵母、昆虫、植物または哺乳動物のような真核生物細胞におけるscFv発現が適切であり得る。
種々のscFvは、例えば、Ab1への直接結合を試験することによって、あるいは本明細書に記載の競合実験においてそれらを使用することによって、結合活性について試験され得る。11D10活性についてフラグメントを試験する後記のアッセイのいずれかが、scFvを試験するのに使用され得る。例えば、試験すべきscFvの非存在下または存在下（量を増大させる）で、放射性標識Ab1(MC-10)をMCF-7細胞のようなHMFG+細胞と反応させる。観察された阻害パーセントを11D10または別のAb2と比較する。11D10 scFvは、非関連の抗イディオタイプ抗体のようなネガティブコントロールと比較する場合、scFvがHMFGポジティブ細胞へのAb1の結合を阻害すれば、結合可能と特徴付けられる。あるいは、scFvは、免疫応答を誘発する能力のような、本明細書に記載の他の免疫学的アッセイを用いて特徴付けられ得る。さらに、scFvは、scFvの分泌形態または細胞会合形態が所望されるか否かに依存して、免疫グロブリンリーダー配列（分泌のために）を伴ってまたは伴わず構築され得る。
別の実施態様において、リンカーを含まないか、または非常に短いフレキシビリティのないリンカーを含む、単鎖11D10抗体ポリペプチドが提供される。これらのいわゆる「二価」抗体は、リンカーが存在しないために（または非常に短いリンカーが存在するために）、鎖内相互作用に関与し得ず、それゆえ、他の単鎖と相互作用し、「二価抗体(diabodies)」を形成する。例えば、二価11D10抗体ポリペプチドは、以下の立体配置：ＶＬ--ＶＨまたはＶＨ--ＶＬのいずれかにおいて、組換え方法を用いて作製され得る。
また、本発明は、11D10ポリペプチドのポリマー性形態を包含する。本明細書で用いる11D10ポリペプチドのポリマー性形態は、複数の（すなわち、１を越える）11D10ポリペプチドを含有する。１つの実施態様において、11D10ポリペプチドの線状ポリマーが提供される。これらの11D10線状ポリマーは、キャリアに結合され得る。これらの線状ポリマーは、単一11D10ポリペプチドの多重コピー、または異なる11D10ポリペプチドの組合せを含み得、そしてタンデム11D10ポリペプチド、または他のアミノ酸配列で分けられた11D10ポリペプチドを有し得る。これらの線状ポリマーは、当該分野で周知の標準的な組換え方法を用いて作製され得る。別の実施態様において、11D10多重抗原ペプチド（MAP）が提供される。MAPは、放射状に分岐するリジン樹状突起を有する小さな免疫学的不活性コアを有し、そのリジン樹状突起上に多数の11D10ポリペプチドがつなぎ止められ得る（すなわち、共有結合され得る）。Posnettら(1988)J.Biol.Chem.263:1719-1725;Tam(1989)Meth.Enz.168:7-15。その結果は、コアに対する11D10ポリペプチドの高いモル比を有する大きなマクロ分子である。MAPは、有用で効果的な免疫原であり、そしてELISAのようなアッセイに有用な抗原である。11D10 MAPは合成により作製され得、市販により得られ得る（Quality Controlled Biochemicals,Inc.,Hopkinton,MA）。典型的なMAP系において、コアマトリックスは３つのレベルのリジンおよび11D10ポリペプチドをつなぎ止めるための８個のアミノ酸からなる。MAPは、当該分野で公知の任意の方法、例えば、固相方法によって合成し得る。例えば、R.B.Merrifield（1963）J.Am.Chem.Soc.85:2149。
本発明の別の実施態様において、11D10ポリペプチドの免疫原性は、例えば、11D10ポリペプチドがＢ型肝炎表面抗原と会合するように、粒子形成タンパク質と融合または組み立てられる発現系でそれらを調製することによって、増強され得る。例えば、米国特許第4,722,840号を参照のこと。11D10ポリペプチドが粒子形成タンパク質コード配列に直接連結する構築物は、11D10ポリペプチドに関して免疫原性であるハイブリッドを生じる。さらに、調製した全てのベクターは、例えば、プレＳペプチドのような種々の程度の免疫原性を有するHBVに特異的なエピトープを含む。それゆえ、11D10配列を含む粒子形成タンパク質から構築した粒子は、11D10およびHBVに関して免疫原性である。11D10ポリペプチドのこれらの形態は、酵母または哺乳動物細胞のような真核細胞内で作製され得る。
別の実施態様において、11D10ポリペプチドはキャリアに結合され得る。11D10ポリペプチドが結合部位を供するように正しい立体配置をとるが、免疫原性となるには非常に小さい場合、ポリペプチドは適切なキャリアに連結され得る。このような連結を得るための多数の技術が当該分野で公知であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。それ自体は宿主に有害な抗体の産生を誘導しないいずれのキャリアも使用し得る。適切なキャリアは、タンパク質；ラテックス機能化セルファロース(latex functionalized sepharose)、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのようなポリサッカライド；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのようなポリマー性アミノ酸：アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子、またはサルモネラのような、弱毒化細菌のような典型的に大きくかつゆっくりと代謝されるマクロ分子である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。当業者に明らかなように、融合タンパク質のような11D10ポリペプチドおよび11D10の上記組換え形態は、他のアミノ酸配列と順に融合され得る。例えば、11D10 scFvを、IL-2のようなサイトカインに融合させ得る。図25は、このような融合タンパク質を産生するプラスミド構築物の例を提供する。
本発明の11D10ポリペプチドは、多くの方法で同定され得る。例えば、軽鎖および重鎖の可変領域は、一緒になって可変領域アミノ酸配列全体にわたる一連の短いポリペプチドを調製することによって、スクリーニングし得る。例えば、50マーまたは20マーのポリペプチドで出発することによって、所望の特性の存在について各ポリペプチドを試験するのは日常的である。このようなポリペプチドのスクリーニングは十分に当業者の技量内である。また、可能性として興味深いポリペプチドを同定するためのタンパク質配列、例えば、HMFGに対する相同性のコンピューター解析、またはイディオタイプ-抗イディオタイプ接触に関連した推定領域を同定し、次いで試験するためにこれらの領域を含むこれらのポリペプチドを調製するための分子認識理論に基づくコンピューターアルゴリズムを実行するのも公知である。
当業者は、望ましい特性を有する他の11D10ポリペプチドを産生するために、この節に記載されている11D10の種々の形態および誘導体が、種々の方法で組み合わされ得ることを容易に理解する。例えば、修飾された残基を有する11D10ポリペプチドが、MAPに含まれ得る。別の例において、11D10 scFvは、IL-2のようなサイトカインと融合される。
ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは当該分野で公知の手順によって作製され得る。ポリペプチドは、11D10のタンパク分解または他の分解によって、上記の組換え法（すなわち、単一または融合ポリペプチド）によって、あるいは化学合成によって産生され得る。11D10ポリペプチド、特に約50までのアミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成によって好都合に作製され得る。化学合成の方法は当該分野で公知であり、市販されている。例えば、11D10ポリペプチドは、固相法を使用して、自動ポリペプチド合成装置によって生産し得る。
好ましくは、ポリペプチドは、他の細胞成分から少なくとも部分的に精製される。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも50％の純度である。この意味では、純度は、調製物の全タンパク質含量の重量パーセントとして算出される。より好ましくは、タンパク質は50-70％の純度である。より高度に精製されたポリペプチドもまた得られ得、そして本発明に含まれる。臨床的用途では、ポリペプチドは、好ましくは、高度に精製され、少なくとも約80％純度、好ましくは少なくとも約90％純度、より好ましくは少なくとも約95％純度、なおより好ましくは少なくとも約99％純度であり、発熱物質および他の汚染物は認められない。タンパク質精製の方法は当該分野で公知であり、本明細書においては詳細に記載していない。あるいは、11D10ポリペプチドが植物種子のような適切な貯蔵媒体で発現される場合、11D10ポリペプチドは精製する必要がなく、精製することなく投与してもよい。Fiedlerら(1995)Biotechnology 13:1090-1093。
11D10ポリペプチドはインタクトな11D10から得ることができ、インタクトな11D10は11D10を産生するハイブリドーマ（ATCC HB 12020）から順に単離し得、これは共同所有の米国特許出願第08/575,762号（仮の番号第＿＿＿＿＿＿号；代理人事件番号30414-20003.00）に記載されている。ハイブリドーマから抗体を単離する技術は当該分野で周知である。例えば、HarlowおよびLane(1988)を参照のこと。一旦インタクトな11D10が得られたならば、11D10ポリペプチドを、例えば、タンパク分解酵素（プロテイナーゼ）を用いることにより、インタクトな11D10の分解によって得ることができる。タンパク分解酵素の例は、限定されるものではないが、トリプシン、プラスミンおよびトロンビンを含む。インタクトな11D10は、１以上のプロテイナーゼと共にインキュベートし得、あるいは消化を順次行い得る。タンパク分解切断の性質および程度は、所望のポリペプチド長ならびに使用する酵素に依存する。これらの技術は当該分野で周知である。あるいは、またはさらに、インタクトな11D10は、ジスルフィド還元剤で処理して、分子を解離させ得る。
11D10ポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成によって作製され得る。
11D10ポリペプチドはまた、組換え法を用い、発現系によって作製され得る。11D10ポリペプチドをコードする11D10ポリヌクレオチドを利用することができれば、インタクトな11D10、その機能的に等価なフラグメント、または11D10の組換え形態をコードする発現ベクターの構築が可能である。所望の11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、融合形態または成熟形態にかかわらず、分泌を可能にするシグナル配列を含有するか否かにかかわらず、任意の都合のよい宿主に適した発現ベクターに連結し得る。真核生物宿主系および原核生物宿主系の両方を用い得る。次いで、ポリペプチドを溶解細胞または培養培地から単離し、そしてその意図する用途に必要な程度まで精製する。宿主系で発現されるポリペプチドの精製または単離は、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。例えば、インタクトな11D10またはそのフラグメントをコードするcDNAを適切なプロモーターに作動可能に連結させ、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞にトランスフェクトし得る。次いで、宿主細胞を、転写および翻訳が起こり得る条件下で培養し、所望のポリペプチドを回収する。ポリペプチドを（すなわち分泌のために）特異的細胞区画に指向させるシグナル配列のような、転写または翻訳を制御する他のセグメントも用い得る。原核宿主細胞の例は当該分野で公知であり、例えば、E.coli.を含む。真核宿主細胞の例は当該分野で公知であり、酵母、トリ、昆虫、植物、ならびにCOS7、HeLa、CHOおよび他の哺乳動物細胞のような動物細胞を含む。
本発明のポリペプチドはまた、ベクターとして組換えワクシニアウイルスを用いて発現され得る。異種抗原決定基を含有するワクシニアウイルスキャリアは、首尾よい免疫原であることが明らかにされているので、本出願はワクチン製剤において特に有用である。ワクシニアベクターにおける11D10ポリペプチドの発現およびそれらの使用は、上記および下記に記載されている。
11D10ポリペプチドの特徴付け
本発明の11D10ポリペプチドはいくつかの方法で特徴付けできる。例えば、11D10ポリペプチドはAb1および／またはAb3に結合する能力について試験され得る。あるいは、11D10ポリペプチドは免疫応答、好ましくは抗HMFG応答を誘発するそれらの能力について試験され得る。11D10ポリペプチドはまた、HMFG関連腫瘍のようなHMFG関連疾患を緩和または改善するそれらの能力について試験され得る。これらの特性のうち１つのみが、ポリペプチドが本発明に適合するように存在させるのに必要であるが、これらの特性のうち１を越えて存在し得ることは理解される。
11D10ポリペプチドがAb1および／またはAb3に結合する能力はいくつかの方法で評価され得る。１つの試験において、11D10ポリペプチドのAb1への結合は、実施例１（図１）に記載のように、直接的に、例えば、放射性標識11D10ポリペプチドをマイクロタイタープレートに被覆させたAb1またはAb3と反応させることにより、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）によって試験され得る。
別の手順において、Ab1またはAb3への結合は競合イムノアッセイによって測定される。この手順の１つの改変において、標識11D10ポリペプチドまたは機能的に等価なフラグメントのAb1(MC-10)への結合は、異なるAb1、他のAb2、11D10またはそのアナログ、他の11D10ポリペプチド、HMFGまたはHMFGを含有する抽出物、または他のタンパク質の存在下で測定される。阻害パーセントは以下の式によって計算される：
0003683278.tif 000002
別の改変において、推定11D10活性を有する試験フラグメントを、Ab1とAb2との間、またはAb1とHMFGとの間の結合を妨げる能力について試験する。この試験はいくつかの適用においてより感受性であり得る。何故ならば、11D10とAb1との間のより低いアフィニティー相互作用は非常に弱くて安定な結合を形成できないが、十分な濃度で存在させた場合は、別のリガンド−レセプター対の結合を妨げるのに十分であるからである。HMFGは精製された抗原またはHMFG発現細胞として提供され得る。アッセイは、Ab1またはHMFGまたはAb2いずれかを標識し、分離を容易にするために必要に応じてリガンド−レセプター対の他のメンバーを固体支持体に固定化させることによって行われ得る。試験フラグメントを標識試薬と共にインキュベートし、次いで、混合物を固定化標的または試験細胞に提示して、試験フラグメントが結合を阻害し得るかを測定する。阻害の程度は11D10活性に相関する。
競合アッセイの種々の例は実施例のセクションで後記する。11D10ポリペプチド活性を示す１つの試験は、種々の量の11D10ポリペプチドの存在下で、放射性標識Ab1(MC-10)の半精製もしくは精製HMFGへの結合を測定することである。例えば、実施例１を参照のこと。次いで、Ab1-HMFG混合物を11D10ポリペプチドで被覆したプレートに添加し、そして結合を標識Ab1単独の結合と比較する。好ましくは、この試験は標識Ab1の非飽和量で行って、少量の競合HMFGでの結合の変化を検出する。インタクトな11D10で行ったこの試験の例を実施例１に示す。別の競合アッセイにおいて、（MCF-7またはSKBR3のような）HMFGポジティブ標的細胞をコンフルエントな単層として96ウェル組織培養プレート中で増殖させる。11D10ポリペプチドの非存在下および存在下での放射性標識Ab1(MC-10)の結合を測定する。阻害の程度は、インタクトな11D10または他の11D10ポリペプチドの阻害と比較され得る。インタクトな11D10を用いるこの競合アッセイの例を実施例１に示す。11D10 scFvとインタクトな11D10との間の阻害の程度を比較するこのアッセイの別の例を実施例８に示す。
Ab1に結合しない非関連の抗イディオタイプ抗体のようなネガティブコントロールと比較する場合に阻害があれば、11D10ポリペプチドはAb1に結合すると考えられる。
上記の全てのアッセイを用いれば、標識分子を、放射性同位体（すなわち、125I）を用いる、ならびにビチオン化分子、および酵素検出のための分子、蛍光標識および化学発光標識のような非放射性標識を用いるような種々の方法で標識し得ることが当業者に明らかである。
また、上記試験を用いて、種々の11D10ポリペプチドフラグメントの特徴を比較し得る。例えば、競合アッセイを行うことができ、ここで、第１の11D10ポリペプチドが、種々の量の第２の11D10ポリペプチドの存在下で、Ab1(MC-10)への結合に対して競合する。このような試験は、結合アフィニティーまたは他の特徴の相対的程度を示し得る。
11D10ポリペプチドを特徴付ける別の方法は、免疫応答を生じるそれらの能力を試験することである。本明細書で用いる「免疫応答」とは体液性応答、細胞性応答、またはその両方のいずれかを示す。本明細書で用いる「免疫応答を誘発する能力」は、ヒトを含むいずれかの個体に関する。
11D10ポリペプチドが体液性応答を生じる能力は、11D10ポリペプチドの投与後に11D10ポリペプチドに結合する抗体の存在を試験することによって測定し得る。この抗体（Ab3）は、11D10ポリペプチドの投与前には存在しないか、あるいは低量で存在したことが理解される。免疫原性は、好ましくは、先の抗11D10応答を伴わない個体で試験される。適切な個体の例は限定されるものではないがマウス、ウサギ、サルおよびヒトを含む。この試験のために、個体に11D10ポリペプチドを投与する。投与当たりの量および投与回数は、個体に応じて変化する。インタクトな11D10を用いる本発明者らの先の実験に基づくと、マウスでは、用量および３回の投与当たりCFAおよびIFAの存在下で、KLHにカップリングした11D10ポリペプチドの約100μgを要した。サルはほぼ２mgを要する。本発明の目的のために、ヒトに投与され得る11D10ポリペプチドの範囲は、約10μg〜10mg、好ましくは100μg〜10mg、好ましくは500μg〜８mg、より好ましくは１mg〜４mg、なおより好ましくは約２mgである。
Ab3の存在は、まず、血清をオートロガスな免疫グロブリンと共にプレインキュベートしてイソタイプおよびアロタイプ抗原決定基に対する抗体をブロックし、次いで、例えば、ELISAまたはRIAを用いて、HMFGおよび／または11D10ポリペプチドに対する結合について血清を試験することによって決定され得る。例えば、予め反応させた血清の異なる希釈をマイクロタイタープレート上に被覆した11D10（または11D10ポリペプチド）と反応させる。非関連Ab2をコントロールとして供する。洗浄の後、例えば、同種サンドイッチアッセイにおいて125I−標識11D10を用いて、Ab3−11D10複合体を標識する。このアッセイからの結果を11D10ポリペプチドの投与前に得られた結果と比較する。マウスにおいてインタクトな11D10によって誘発されたAb3のこのような検出用アッセイのより詳細な記載を実施例１に記載する。あるいは、ヒト大腸癌腫LS174-T細胞のようなHMFGポジティブ細胞への結合が免疫フローサイトメトリーを用いて試験され得る。
HMFGに対するAb3の結合はまた、HMFGポジティブ組織サンプルでの免疫沈降もしくはそれとの免疫反応性、またはドットブロット分析によって決定され得る。ドットブロット分析の一つの方法において、HMFGの半精製抽出物をニトロセルロースフィルターに直接ブロットする。次いで、フィルターを、Ab3を含有する血清と共にインキュベートし、酵素結合抗免疫グロブリンによって反応を発現させる（実施例１）。もしAb3がHMFGに結合すれば、ポジティブなブロットが出現するはずである。組織サンプルでの試験には、イムノペルオキシダーゼアッセイが使用され得る（実施例１）。
所望ならば、11D10ポリペプチドによって誘発されたAb3はさらに特徴付けされ得る。例えば、競合アッセイが、Ab3がAb1イディオトープを共有するか否かを決定するために行われ得る。この試験では、11D10ポリペプチドで免疫化した個体由来の血清を、標識11D10ポリペプチド（またはインタクトな11D10）のAb1への結合の阻害について試験する。阻害はAb3およびAb1が少なくとも類似の結合決定基を含有することを示す。同様に、（部分的に精製した、精製した、またはHMFGポジティブ細胞の表面上にあるを問わず）HMFGに対する結合についてのAb3とAb1との競合は、固定量の標識Ab1(MC-10)を、Ab3含有血清またはAb1調製物およびHMFG（または、MCF-7またはSKBR3のようなHMFG関連細胞）の種々の希釈物と共に同時インキュベートすることによって試験され得る。これらの試験を実施例１においてインタクトな11D10について説明する。
当業者に明らかにように、上記したアッセイを使用し、Ab3は、順に11D10ポリペプチドを特徴付けるために用いられ得る。
11D10ポリペプチドを特徴付ける別の方法は、細胞傷害性である抗体を誘発するその能力を試験することによる。補体が媒介する細胞傷害性（CMC）の決定のために、SKBR3（標的）細胞（すなわち、HMFGを発現する細胞）を51Crで標識する。標識は、約106細胞をほぼ200μCiのNa2SO4と共に37℃で60分間インキュベートし、続いて洗浄することによって達成され得る。このアッセイは、抗体を含有すると考えられる血清を添加し、そしてインキュベートすることによって行なわれる。次いで、LS174-T細胞で予め吸着されたモルモット血清（または他の補体源）を添加する。37℃における適切なインキュベーション時間の後、次いで、51Cr放出の程度を測定し、そして未オプソニン化コントロール細胞の51Cr放出の程度と比較する。51Crの放出はCMC活性と相関する。Herlynら(1981)Int.J.Cancer 27:769。
11D10ポリペプチドを特徴付ける別の方法は、ADCC応答に関与する抗HMFG抗体を誘発するその能力を試験することによる。Chereshら(1986)Cancer Research 46:5112-5118。このアッセイでは、培養ヒトMCF-7またはSKBR3細胞（すなわち、それらの表面でHMFGを発現する細胞）が51Crで標識され、標的細胞として使用される。正常ヒト末梢血単核細胞（PBMC）がエフェクター細胞として使用される。好ましくは、ADCCアッセイは、100：１のエフェクター：標的細胞比にて、熱不活化血清の存在下で４時間行われるが、他の適切な条件が用いられ得る。次いで、51Cr放出の量を測定する。
本発明の11D10ポリペプチドはまた、細胞性応答を誘発するそれらの能力によって特徴付けられ得る。本明細書で用いる「細胞性応答」とは、Ｔ細胞が関与する応答であり、そしてインビトロまたはインビボで観察され得る。
細胞性免疫応答を検出する１つの方法は、Ｔ細胞増殖活性についてアッセイすることによる。この試験では、細胞性免疫応答を、11D10ポリペプチドと共にインキュベートした末梢血単核細胞（PBM）の増殖によって測定する。11D10ポリペプチドの所要数の投与後に末梢血単核細胞を血液から単離し、そして種々の濃度の11D10ポリペプチドと共にインキュベートする。マウスを用いる場合、Ｔ細胞は脾臓から得られる。Ｔ細胞は、例えば、FicollTMのようなグラジエント上の遠心分離によって富化され得る。PHAのような非特異的マイトジェンをポジティブコントロールとして供する：非関連抗イディオタイプ抗体とのインキュベーションをネガティブコントロールとして供する。好ましくは、刺激細胞は、特に組織適合性Call II抗原に関して、応答細胞とオートロガスである。PBMを適切な日数の間インキュベートさせることにより増殖させた後、［3Ｈ］チミジン取込みを測定する。多くの場合、適切な時間は５日間である。所望ならば、いずれのＴ細胞サブセットが増殖するかの決定がフローサイトメトリーを用いて行われ得る。必要に応じて、脾臓Ｔ細胞は、モノクローナル抗体RL.172（抗CD4+）またはmAb.168（抗CD8+）および補体とのインキュベーションによって、増殖アッセイ前にCD4+またはCD8+細胞いずれかを予め枯渇され得る。
細胞性免疫応答を検出する別の方法は、Ｔ細胞の細胞傷害性（CTL）活性について試験することである。この試験では、Ｔリンパ球（すなわち、富化Ｔ細胞集団）を、標準的51Cr放出アッセイにおいて標的として用いるために、（典型的には、脾臓細胞から）単離する。Kantorら(1992)J.Natl.Cancer Inst.84:1084-1091。51Cr放出アッセイの例は以下の通りである。略言すると、HMFGポジティブ腫瘍細胞（典型的には、１〜２×106細胞）を標的細胞として約200μCiのNa251CrO4(Amersham Corp.,Arlington Heights,Ill)で37℃で60分間放射性標識し、続いて、徹底的に洗浄して取り込まれなかった同位体を除去する。次いで、共に培地に再懸濁したＴ細胞および標的（１×104／ウェル）を、96ウェルＵ底プレート(Costar Corp.)中、種々のエフェクター：標的比にて組み合わせる。プレートを100×ｇで５分間遠心して細胞接触を開始させ、そして５％CO2にて37℃で４または16時間インキュベートする。インキュベーション後、上清をSupernatant Collection System(Skatron,Inc.,Sterling,VA)を用いて収集し、そして放射能をガンマカウンター(Beckman Instruments)で定量する。51Crの自然放出をエフェクターの非存在下における標的のインキュベーションによって決定し、他方、51Crの最大または全放出を0.1％Triton X-100中における標的のインキュベーションによって決定する。51Crの特異的放出パーセントは以下の式によって決定する。
特異的放出パーセント＝［（実験−自然）/（最大−自然）］×100
11D10ポリペプチドを特徴付ける別の方法は、HMFG関連腫瘍の進行を改善し、遅延させ、および／またはその程度を減少させるそれらの能力を試験することである。このような試験は炎症インジケーター、ラジオシンチグラフィー、または循環HMFGレベルの測定を含み得る（このようなアッセイは商業的に入手できる）。
11D10ポリペプチドの使用および使用する方法
11D10ポリペプチドは多数の用途を有する。11D10ポリペプチドは、個体における免疫応答、好ましくは抗HMFG応答を誘導するために用いられ得る。それらはまた、Ab3のレベルを検出およびモニターするため、またはAb3を精製するために用いられ得る。11D10ポリペプチドはまた、例えば、結腸直腸ガン、ある種の肺ガン（腺ガン）、胃ガン、膵ガン、およびある種の乳ガンのようなHMFG関連疾患の処置に有用である。
このように、本発明は、免疫応答を誘導するのに有効な量で11D10ポリペプチドを投与する工程を包含する、個体において免疫応答を誘導する方法を含む。好ましくは、個体はHMFG関連腫瘍を有する。この意味では、「有効量」とは、体液性および／または細胞性を問わず、測定可能な免疫応答を誘発するのに十分な量である。有効量は１回またはそれ以上の投与で投与され得る。
本発明はまた、生物学的サンプル中の11D10と結合する抗体（すなわち、Ab3および／またはAb1）を検出する方法を含む。これらの方法は、例えば、個体中のAb1またはAb3レベルをモニターするための臨床状況において、ならびにAb3の市販生産が望まれる産業状況において適用可能である。これらの方法は、サンプル中のAb3および／またはAb1を11D10ポリペプチドと、Ab3および／またはAb1と11D10ポリペプチドとの間の安定な複合体の形成を可能とするのに適切な条件下で接触させ、もしあれば形成された安定な複合体を検出することを要する。多数の免疫アッセイ方法が当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載されている。さらなる例示のために、潜在的にAb3および／またはAb1を含有する試験サンプルが、典型的には（例えば、放射性同位体または酵素で）検出可能に標識した11D10ポリペプチドの所定の非限定量と混合され得る。液相アッセイにおいては、未反応試薬は、濾過またはクロマトグラフィーのような分離技術によって除去される。これらの免疫アッセイ技術において、複合体と会合した標識の量は、サンプル中に存在するAb3および／またはAb1の量と正に相関する。同様のアッセイが設計され得る。そこでは、試験サンプル中のAb3および／またはAb1が、限定量の11D10ポリペプチドへの結合について標識抗体と競合する。ここでは、標識の量は、サンプル中のAb3および／またはAb1の量と負に相関する。Ab3および／またはAb1レベルを測定するための適切なサンプルは生物学的サンプルであり、血清または血漿を含み、好ましくは血清である。他のサンプルは組織サンプルを含む。
さらに、本発明はまた、Ab3（および／またはAb1）を含有する生物学的サンプルを11D10ポリペプチドと接触させる工程、およびもしあればそれにより形成された複合体を得る工程を包含する、Ab3（またはAb1）を精製する方法を含む。典型的には、11D10ポリペプチドを、アフィニティーカラム精製のためにアフィニティーマトリックスにカップリングさせる。このような方法は当該分野では日常的であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。
また、本発明には、有効量の11D10ポリペプチドを投与する工程を包含する、HMFG関連腫瘍のようなHMFG関連疾患を処置する方法が含まれる。「HMFG関連腫瘍」は、HMFG、特に腫瘍細胞の表面で発現されたHMFGを含有する腫瘍であり、その例は上記されている。この意味では、処置のための有効量は、疾患状態を緩和するのに十分な量である。有効量は、１回または１回より多い投与にて与えられ得る。有効量の11D10ポリペプチドでの個体の処置は、例えば、そのように処置されない個体と比較して、疾患の進行の速度を減少させ得る。
別の実施態様において、HMFG関連疾患を有する個体においてＴ細胞応答を刺激する方法が提供される。このＴ細胞応答は、11D10ポリペプチド、特にHMFGに対して相同である11D10ポリペプチドを用いる、Ｔ細胞の増殖および／または細胞傷害性Ｔ細胞活性の促進として現れ得る。11D10ポリペプチドは、（ポリペプチドまたは11D10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドのいずれかとして）直接に投与され得るか、あるいは適切な細胞のエクスビボ培養に添加され得る。11D10ポリペプチドは、例えば、所望のＴ細胞活性を刺激するのに有効な量で、単離された末梢血単核細胞に添加される。次いで、刺激されたＴ細胞が個体に再導入される。添加される11D10ポリペプチドの量は、個体の状態、従前および／または併用の処置手順、および使用される他の物質のようないくつかの要因に依存する。
本発明のポリペプチドは単独でまたは所望の活性／目的を促進する他の因子と併用して使用され得る。11D10ポリペプチドはまた、相互に種々に組み合わせて使用され得る。この意味では、「因子」とは種々の物質のいずれでもあり得る。さらに、「併用して」とは、因子がポリペプチドと同時に、その前に、またはその後に使用され得ることを意味する。因子はまた、融合タンパク質のようなポリペプチドに共有結合され得るか、またはポリペプチドに物理的に近接し得る。所望の活性は、11D10ポリペプチドの使用における所望の目的を容易にし、増強し、促進し、または調節するいずれの活性でもある。
使用され得る因子は、サイトカイン、リンホカイン、アジュバント、および薬物を含むが、これらに限定されない。因子はまた、リポソームのようなポリペプチドの送達を容易とする物質、またはポリペプチドの、特定の標的、例えば、細胞レセプターへの送達を促進する物質を含む。例えば、１つ以上の11D10ポリペプチドが、GM-CSFのようなサイトカインもまた含有する融合タンパク質として生産され得る。あるいは、１つ以上の11D10ポリペプチドは、GM-CSFのようなサイトカインと共に投与され得る。
本発明はまた、例えば、ラジオシンチグラフィーまたは放射線療法のために、標識抗HMFG抗体（Ab1）を受容した個体から標識（例えば、放射能）を除去するために11D10ポリペプチドを使用する方法を含む。本発明はまた、放射性標識抗HMFG抗体を治療用量で投与し、続いてモル過剰の11D10ポリペプチドを投与する方法を包含する。
本発明の目的のための11D10の使用は、上記で議論され、そして同様にそれらの原理が11D10ポリヌクレオチドに適用される。腫瘍部位に局在化されないいずれの抗HMFGをも位置決定し結合させるために、標識抗HMFGよりも十分にモル過剰である11D10ポリペプチドの量が選択される。投与のタイミングおよび11D10ポリペプチドの量は、放射性標識抗体の性質、使用される放射性同位体のタイプ、および個体の状態に依存する。好ましくは、11D10ポリペプチドと抗HMFG抗体とのモル比は、少なくとも約５：１、より好ましくは約25：１〜200：1である。好ましくは、11D10ポリペプチドは、個体が抗HMFG抗体を受容した５〜24時間後に投与される。
抗HMFG抗体に結合した11D10ポリペプチド（特に、MC-10）について、腫瘍細胞表面上の抗HMFGの検出は、腫瘍細胞と11D10ポリペプチドとを抗HMFG抗体への結合を可能にするのに十分な時間接触させ、そして抗HMFG抗体に結合したいずれかの11D10の存在を検出することにより達成され得る。実験的なパラメータの開発（例えば、11D10のポリペプチドの量または反応時間）は、十分に当該分野の技術内である経験的な決定である。
11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチン
本発明は、11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリペプチドを含有する薬学的組成物およびワクチンを含む。このような薬学的組成物／ワクチンは、免疫応答を誘発するのに、および／または乳ガンのようなHMFG関連疾患の処置に有用である。薬学的組成物／ワクチンは、単独で、または化学療法または放射線治療のような他の形態の治療と併用してのいずれかで、HMFG関連疾患を緩和または改善し得る。薬学的に受容可能な賦形剤において有効量の11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリペプチドから成るこれらの薬学的組成物は、単位投与量形態、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌の非経口以外の溶液または経口溶液または懸濁液、水中油型または油中水型エマルジョンなどでのヒトおよび動物への全身投与に適する。処方または非経口および非経口でない薬物送達は当該分野で公知であり、そしてRemingtons' Pharmaceutical Sciences第18版，Mack Publishing(1990)に記載されている。
薬学的に受容可能な賦形剤は、薬理学上有効な物質の投与を容易とする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、ワクチン組成物に形態および粘稠度を与え得、あるいは希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤は、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤を含むが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な賦形剤の例はRemingtons' Pharmaceutical Sciences(1990)、前掲に記載されている。
１つの実施態様において、11D10ポリペプチドを含有する薬学的組成物は、例えば、個体由来の末梢血単球（PBM）のエクスビボ培養を刺激するために用いられる。次いで、PBMを個体に再導入する。薬学的組成物は、単独でまたはリンホカインのような他の生体応答改変因子と組み合わせて用いられる。
１つのタイプの薬学的組成物はワクチンである。従って、本発明はまた、有効量の11D10、11D10ポリヌクレオチド、11D10ポリペプチド、またはそれらの組合せおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含むワクチンを含む。これらのワクチンは、特に、個体（特に、HMFG関連腫瘍のような進行性のHMFG関連疾患を有する個体）の免疫応答を誘発するために使用され得る。好ましくは、免疫応答は、ヒト乳脂肪球抗体の産生を含む。これらのワクチンはHMFG関連疾患の処置、調節、および／または緩和に特に有用である。
11D10を含むワクチンの投与は上記で議論した。
上述した11D10ポリヌクレオチドを含有するワクチンは、いわゆる「遺伝子免疫化」またはDNAワクチンのために使用され得、ここでは、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、保護的免疫応答を誘発するために、宿主細胞に導入される。Tangら(1992)Nature 356:152-154。一旦細胞核に入ったら、プラスミドは環状の非複製エピソームとして持続し得、これは用量依存的かつ長期の発現に導く。Spoonerら(1995)Gene Therapy 2:173-180。ポリヌクレオチドを用いる免疫化が細胞性応答ならびに体液性応答を生じることが示されている。Spoonerら(1995);Wangら(1995)Human Gene Therapy 6:407-418。遺伝子免疫化は、感染の危険がなく免疫応答を誘発するビヒクルとしての生微生物または弱毒微生物の多くの利点を有する。
好ましくは、11D10ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサーおよびシグナル配列のような転写および翻訳のための適切な制御配列を含有するプラスミドベクターとして導入される。１またはそれ以上の11D10ポリヌクレオチドが単一クローニングベクター内で使用され得、および／または複数のベクターが使用され得る。複数の11D10ポリヌクレオチドが使用される場合、それらはベクター内にインフレームで挿入されるか、または別々のプロモーターの制御下に置かれるべきである。使用される11D10ポリヌクレオチドの長さおよび／またはタイプは変化し得、そしてワクチン投与の臨床目的、個体の状態、および個体の免疫学的プロフィールのようないくつかの要因に依存する。さらに、免疫応答を増強し、容易とし、および／または増加させる他の物質をコードするポリヌクレオチドもまた、ベクターに挿入され得る。GM-CSFのようなこのような物質の例は上述した。
例えば、１つの実施態様においては、11D10のscFvをコードするポリヌクレオチドが上記発現ベクター（プラスミド）の１つに挿入される。別の例においては、図19に示される11D10フラグメントをコードするポリヌクレオチドが、ワクチンとして投与するために発現ベクターに挿入される。別の例においては、11D10の免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入される。
11D10ポリヌクレオチドを使用する別のタイプのワクチンは、いわゆる発現ライブラリー免疫化であり、ここでは、（11D10の種々の部分をコードする）11D10ポリヌクレオチドの発現ライブラリーを用いて宿主を免疫化する。Barryら(1995)Nature 377:632-635。得られた複数部分に分かれた非感染性ワクチンは、可能な免疫原として複数のペプチドを提示するので、特に有用であることが判明し得る。複数の免疫原の提示は、それを投与する各特定の宿主（すなわち、個体）が免疫学的に有効なポリペプチドを選択し得るというさらなる利点を有し、それは個体間で変化し得る。11D10ポリペプチドの発現で用いる発現ライブラリーは包括的（すなわち、全11D10分子を集合的にコードする）であり得るか、あるいは部分的であり得る。免疫化用の発現ライブラリーは、適切なベクター系を用い、上述した一般的組換え方法によって作製される。典型的には、11D10ポリヌクレオチドは分泌を媒介するシグナル配列とインフレームに融合される。
投与すべき11D10ポリヌクレオチドの量は、投与の様式および経路（すなわち、直接的注射−対−エクスビボ培養およびトランスフェクション）、11D10ポリヌクレオチドによりコードされる11D10ポリペプチド、（免疫学的および／または疾患状態のような）個体の状態、および所望の目的のようないくつかの要因に依存する。典型的には、直接的に投与する場合、投与当たりの量は約10μg〜１mg、好ましくは25μg〜500μg、より好ましくは30μg〜250μg、さらにより好ましくは50〜100μgである。
別の実施態様において、11D10ポリヌクレオチドは、ワクチン処方のためのコードされた11D10ポリペプチドを発現できる生ウイルスまたは弱毒化ウイルスまたはウイルスベクターにおいて用いられる。例として、アデノウイルス、アデノ随伴レトロウイルス（AAV）、およびSV40が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ウイルスはワクシニアである。組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ウイルス粒子と共に11D10ポリヌクレオチドによってコードされる11D10ポリペプチドを有効に共提示するための強力な因子を提供し得る。ワクシニアウイルスベクターの構築は上述された。一般に、組換えウイルスベクターを宿主細胞のインビボ感染を行うのに十分な量で添加する。この量は使用するウイルスのタイプ、コードされる11D10ポリペプチドの性質、個体の状態、および所望の結果に依存する。（11D10ポリペプチドまたはscFvのような11D10ポリペプチドを含有する11D10変異体をコードし得る）組換えワクシニアは、用量当たり約107〜108プラーク形成単位でワクチン接種のために直接使用され得る。ワクシニアは、非経口的に(例えば、皮下または筋肉内注射によって)、ならびに粘膜を介して（例えば、鼻的に）、経口的に、または吸入によって投与され得る。あるいは、ワクシニアは、ワクシニア感染細胞を介して投与され得る。この技術において、腫瘍細胞のような適切な細胞を培養中のワクシニアで感染させる。次いで、感染細胞を個体に再導入する。ワクシニアで細胞を感染させる方法およびそれらの感染細胞を再導入する方法は記載されている。例えば、Moss(1990)参照のこと。
ワクチンはまた、１以上の11D10ポリペプチドから調製され得る。11D10ポリペプチドは、上述の方法のうちのいずれかによって、特に適切な発現ベクターからの精製によって調製され得る。１つの実施態様において、ワクチンは、１以上の11D10ポリペプチドを含む。11D10ポリペプチドは、中性もしくは塩形態としてワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、（11D10ポリペプチドの遊離アミノ酸で形成された）酸付加塩を含み、これは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機塩、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などのような有機酸で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
別の実施態様において、ｂ型肝炎表面抗原のようなウイルス粒子に融合させた11D10ポリペプチドを含有するワクチンが提供される。
活性成分として11D10ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当該分野における標準的な実施を含む。典型的には、このようなワクチンは注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される；注射に先立って液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。ワクチンはまた乳化され得るか、あるいは11D10ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはリポソームと会合され得る。
ワクチン中の11D10、11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドはそのまま使用され得るが、しばしば、薬学的に受容可能な賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、生理学的緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せである。所望ならば、ワクチンはまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤、および／またはアジュバントのような少量の補助物質を含有し得る。アジュバントの例は、上述した。獣医学的用途および動物における抗体の生産のために、フロイントのアジュバントの分裂促進成分が使用され得る。アジュバントの選択は、特にヒトに使用することを意図する場合は、部分的に、アジュバントの存在下におけるワクチンの安定性、投与経路、およびアジュバントの調節受容性に依存する。例えば、ミョウバンは、ヒトにおけるアジュバントとしての使用について米国食品医薬品局（FDA）によって認可されている。11D10ポリヌクレオチドを含有するワクチンを用いて免疫応答を増強させるために、カチオン性脂質中のカプセル化が使用され得る。11D10ポリペプチドの送達のために、リポソーム中へのカプセル化もまた適し得る。細胞への送達のために、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドをパッケージングするのに適したリポソームは、当該分野で公知である。
11D10ポリペプチドは、特に11D10ポリペプチドが100アミノ酸またはそれ未満のアミノ酸を含む場合、その免疫原性を増強させるために、必要に応じて化学的に処理され得る。このような処理は、例えば、グルタルアルデヒドでの架橋；キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイドのようなタンパク質キャリアへの連結を含み得る。
最適下の免疫応答が本発明のワクチンによって誘導されたサプレッサーＴ細胞に起因すると推定される場合、シクロホスファミド（100mg/kg体重）もまた腹腔内投与され得る。
本発明のワクチンは、典型的には、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、または皮内のいずれかで、注射によって非経口的に投与される。投与はまた、鼻孔内、肺内（例えば、エアロゾルによる）、経口、および静脈内であり得る。他の投与様式に適したさらなる処方は、坐薬、およびある場合には経口処方を含む。投与経路は、処置すべき個体の状態および所望の臨床的効果に依存する。
投与は、免疫応答（体液性および／または細胞性）の誘発のような、所望の測定可能なパラメーターが検出されるまで一週間毎または二週間毎のベースで開始し得る。投与は、次いで、二週間毎または一カ月毎のようなより少い頻度ベースで継続され得る。11D10を含むワクチンについて、好ましくは、投与は、最初の４回の投与は２週間毎に与えられ、続いて１カ月毎に与えれる。
ワクチンは、投与処方に適合する様式で、予防的および／または治療的に有効となるような量で投与される。投与すべき量は、処置すべき個体、抗体を合成する個体の免疫系の能力、投与経路、および所望の保護の程度に依存する。投与するために必要な活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し得、そして個体に特有であり得る。11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび11D10ポリペプチドについての一般投与量範囲は上述に示した。
典型的には、ワクチンは一連の用量にて投与され、免疫応答を初回刺激するための一群の用量で開始し、続いてより間隔をあけた「維持」用量で行う。例えば、ワクチンは免疫応答を確立させるために一週間毎ベースで、続いて応答を維持するために二週間毎または一月毎の注射で投与され得る。
ワクチン中の11D10ポリペプチドおよび／または11D10ポリヌクレオチドは、単独で、他の11D10ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと組み合わせて、インタクトな11D10と組み合わせて、ならびに／あるいは所望の効果を増強し、容易とし、または調節する、リンホカインおよび薬物のような他の物質と組み合わせて与えられ得る。このような物質の例は上述した。11D10ポリペプチドは溶液中の11D10ポリペプチドの混合物を調製するか、または融合タンパク質を合成することによって組み合わせられ得る。
本発明のワクチンはまた、HMFGをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含有する組換えワクシニアおよび／あるいはGM-CSFのようなリンホカインをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えワクチンと併用して投与され得る。さらに、本発明のワクチンは、確立されているかまたは実験的であるかを問わず、他の治療様式と併用して使用され得る。このような使用は、例えば、化学療法または放射線療法のような、他の治療様式の投与のみと比較して、ワクチンの投与が臨床的結果を改善する場合に示される。
11D10ワクチンの免疫原性は、Ab3のレベルを測定しおよび／または疾患状態をモニターすることによってモニターされ得る。RIAまたはELISAを用いるAb3の検出および測定ならびにＴ細胞活性（すなわち、増殖および／または細胞傷害活性）の測定は上述した。一例として、Ab3は以下のように定量され得る。マイクロタイタープレートをMC-10（Ab1）で被覆し、そして固定量の125Ｉ−標識11D10ポリペプチドと反応させる。阻害剤として精製MC-10を用いて標準阻害曲線を作成する。異なる希釈の血清を、Ab1-Ab2反応を阻害する能力について試験し、そして血清中のAb3の量を標準阻害曲線から見積もる。あるいは、Ｔ細胞応答は、上述したアッセイのうちのいずれかを用いてモニターされ得る。疾患状態は、腫瘍関連マーカー、Ｘ線、CTスキャン、および他の測定可能な臨床的発現の測定のような当該分野における標準的技術を用いてモニターされ得る。
本明細書中に記載したものに限定されない多数の代替的なワクチン組成物が免疫反応を誘導するのに効果的であり得ることが認識される。全てのこのような組成物は、それらが11D10ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを活性成分として含むのであれば、本発明の範囲内で具体化される。
11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含むキット
本発明はまた、11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含有するキット（好ましくは、診断キット）を含む。本発明の11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／または11D10ポリペプチドを用いる診断手順は、診断研究所、実験研究所、実施者、または私的な個人によって行われ得る。本発明により具体化されるキットは、本明細書中に開示したもののいずれかのような抗HMFGまたは抗11D10活性についてのアッセイを行うことを可能とするものを含み、それにより、それらの活性を検出および／または定量する。本発明によって具体化されるキットはまた、例えば、エクスビボまたはインビボでトランスフェクトされた細胞における11D10ポリヌクレオチドの検出を可能とするキットを含む。これらのキットは、11D10の可変領域またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの検出または定量のために使用され得る。11D10可変領域とハイブリダイズするが（すなわち、安定なハイブリッドを形成する）、（本出願の出願時には公知の）他の可変領域のポリヌクレオチドとはハイブリダイズし得ない11D10ポリヌクレオチド（本明細書中に記載される）が、特に適切である。
例えば、生物学的サンプル中のAb3の存在が、11D10ポリペプチドを用いて試験され得る。このサンプルは、Ab3の富化のために、必要に応じて前処理され得る。
本発明のキットは、適切なパッケージングにおける11D10、11D10ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む。キットは、必要に応じて、手順において有用なさらなる成分を提供し得る。これらの必要に応じた成分は、以下を包含するが、これらに限定されない：緩衝液、捕獲試薬（capture reagent）、発現試薬（developing reagent）、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、使用説明書、および説明的資料。
以下の実施例を例示のために提供するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例
実施例１．11D10抗イディオタイプ抗体の産生および特徴づけ
モノクローナル抗イディオタイプ抗体11D10を産生するハイブリドーマ細胞株を作製し、そして、以下の記載に従って同定した。所望の特異性と機能性を有する抗体を得るためには、免疫化手順およびスクリーニング手順の両方の局面が重要であった。11D10は初期に産生された多くのAb2の１つであり、そして最も望ましい特性を備えた候補として同定された。
この免疫化抗体(Ab1)は、マウス抗HMFGモノクローナル抗体MC-10（この節ではBrE-1）と言う）であった。応答動物もまたマウスであったため、生成したAb2はBrE-1のイディオタイプの特性に対するものと予想された。しかし、その中の一画分のみがBrE-1パラトープに対するものであり、さらにより小さい集団が、免疫原性でありそしてAb3を誘発し得、そしてさらにより小さな集団が腫瘍関連抗原と交差反応するAb3を誘発する。
BrE-1をオートロガスな種において十分に免疫原性とするために、キャリアKLHに結合させ、フロイントアジュバントで乳化した。これを用量の間が２週間のみの通常でないスケジュールでレシピエント動物に反復投与した。このスケジュールに従って５匹のマウスを免疫化した。約３匹のマウスで、４回目の免疫化後にのみ実質的な応答が起きた。応答動物に、５回目のBrE-1静注投与量によって追加抗原刺激を行い、脾臓細胞を単離し、そして各動物から個別にハイブリドーマを調製した。クローニングは標準的な技術に従って行った。
スクリーニング手順は、以下の四つの重要な工程を包含する：(1)BrE-1に結合する抗体についてのポジティブ選択、(2)アイソタイプまたはアロタイプ決定基を認識する抗体についてのネガティブ選択、(3)HMFGに対するBrE-1の結合を阻害する能力ついてのポジティブ選択、および(4)マウスおよびウサギの両方において、最初の腫瘍関連抗原（HMFG）に対する体液性免疫応答を誘導する能力ついてのポジティブ選択。この節の残り部分（rest）は、スクリーニング手順の概要を提供し、この手順は続く節でより詳細に示される。
BrE-1と反応するが、同じアロタイプ決定基またはアイソタイプ決定基を共有する他の標的モノクローナル抗体とは反応しないクローンを同定するための初期スクリーニングを、イムノアッセイによって行った。重要なアッセイは、BrE-1を固相に付着させ、培養上清で重層し、そして放射性ヨウ素標識BrE-1で発現させるサンドイッチRIAであった。このアッセイでは、ハイブリドーマ上清中の抗体が、機能的に二価であって、かつ捕獲BrE-1と発現するBrE-1との間をつなぎ得ることが要求される。イディオタイプ特異的であり、かつこのアッセイで強いシグナルを発した数個のクローンをさらなる研究用に選択した。
BrE-1のHMFGへの結合をブロックするためにAb2を必要とする競合アッセイにより次のスクリーニングを行った。これによると、Ab2がBrE-1のパラトープを認識したことが立証された。HMFGは、細胞表面でHMFGを発現するヒト乳房細胞腫瘍株である、MCF-7細胞の形態で提供された。このアッセイの性質上、Ab2が腫瘍細胞上でその特異的な提示様式でBrE-1と腫瘍抗原との間の相互作用をブロックすることが必要である。最低限、それ以前のスクリーニング試験を通過した候補Ab2は、BrE-1の細胞への結合を少なくとも85％阻害することが必要とされた。この最低限を実質的に超えたAb2は約３個あり、11D10がほぼ最高レベルの阻害を提供した。
最終的なスクリーニング試験は、候補Ab2をレシピエントに注入したときに、所望の特異性のAb3を誘発し得るか否かの決定であった。マウス腹水から十分な量のAb2を調製し、そしてマウスとウサギで試験した。これらの試験動物由来の血清を、最初に、免疫化に使用した同じ標識Ab2を用いるサンドイッチイムノアッセイにおいてAb3の存在についてアッセイした。次いで、ポジティブの試験結果を示す血清を、腫瘍関連抗原、すなわちHMFGに対して反応するAb3の能力についてアッセイした。HMFGの半純粋な調製物を用いてマイクロタイタープレートを被覆し、系列希釈した試検血清を重層し、そして標識抗免疫グロブリンを用いて、結合したAb3を検出した。HMFGに結合するAb3の力価により、抗HMFG誘導物質としてのその能力の反映としてAb2の「質」を規定した。
モノクローナル抗体11D10は、最高の質を有する抗イディオタイプとして出現し、そして本発明で具体化される種々の成分、組成物、および手順の基礎となる。
材料および方法
細胞：ハイブリドーマ株の生成に用いた融合パートナーは、ATCCからNo.CRL-1580として入手でき、P3X63Ag8.653と祖先が関係するマウス非分泌性ミエローマ細胞株P3-653であった。樹立ヒト細胞株を、他の箇所で記載されたように(Seonら(1984)J.Immunol.132:2089)、５％ウシ胎児血清を補充したRPMI1640中で培養した。
HMFG：脱脂HMFGを、Roberto L.Cerianiから供給を受け、そして彼のプロトコルに従って調製した（Ceraniら(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:582-586）。簡単には、人乳の洗浄された乳脂画分を、２容量のクロロホルムで２回抽出し、そして１容量のエーテルで２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。タンパク質の濃度を、Lowry法により決定した。
BrE-1抗体：マウスモノクローナル抗体BrE-1（MC-10）を、Dr.R.L.Cerianiより豊富に提供を受け、そしてそれはWO 89/07268に記載されている。プリスタンで初回刺激した個々のマウスに、２〜10×106個の生存細胞を腹腔内注入することによって、BrE-1ハイブリドーマの腹水を調製した。この腹水から45％飽和硫酸アンモニウム沈殿およびその後のProtein Ａ SepharoseTM CL-4B（Eyら（1978）Immunochemistry 15:429）上のクロマトグラフィーによってIgG画分を単離した。単離されたIgGの純度を、免疫拡散法、免疫電気泳動、および高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分画によってチェックした。異なるアイソタイプの他の非関連のAb1およびAb2を、コントロールとして使用した。
BrE-1のF(ab')2フラグメントの調製：標準的なペプシン消化（Parham（1983年）J.Immunol 131:2895）によりF(ab')2フラグメントを調製した。要約すれば、BrE-1腹水由来のIgG画分を0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.5）に対して透析し、そしてペプシン（25Tg/mg IgG）を用いて370Cで８時間消化した。切断後、3.0Mトリス緩衝液（pH8.6）でpHを7.0に調整し、そして低温で溶液をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析した。消化物をSepharoseTM６カラムを用いるHPLCによって分離した。単離されたF(ab')2の純度は免疫拡拡散法により、および標準的なELISAでの抗アイソタイプ試薬との反応により決定した。
抗体のKLHとのカップリング：Maloneyら(1985)、Hybridoma 4:191によって記載された方法に従って、BrE-1をキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)とカップリングした。抗体ストック溶液(1mg/ml)を新たに希釈したグルタルアルデヒド溶液の存在下（最終濃度0.05％）でPBS中のKLH(1mg/ml)と混合した。混合物を室温で１時間くるくると回転させ、次いで、PBSに対して40Cで完全に透析した。
同系BALB/cマウスの免疫化：BALB/cの雌を、２ヶ月の期間にわたって４回免疫化した。最初の注入は、完全フロイントアジュバントで乳化した100TgのBrE-1を用いて腹腔内に与えた。次の２回の注入は、不完全フロイントアジュバント中のKLHとカップリングした100TgのBrE-1を皮下注入または腹腔内注入のいずれかで与えた。マウスは時々採血を行い、そしてBrE-1のF(ab')2フラグメントおよびコントロールとして正常プールBALB/cマウス血清IgGを用いることにより、結合アッセイ中のELISAによって抗イディオタイプ活性をチェックした。融合の３日前に、PBS中のBrE-1を静脈内に注入してマウスを追加免疫した。
抗イディオタイプハイブリドーマの生成
ハイブリドーマ株の生成に用いた融合パートナーは、ATCCからNo.CRL-1580として入手でき、P3X63Ag8.653と祖先が関係するマウス非分泌性ミエローマ細胞株P3-653であった。樹立ヒト細胞株を他の箇所で記載されたように(Seonら(1984)J.Immunol.132:2089)、５％ウシ胎児血清を補充したRPMI1640中で培養した。
ハイブリドーマは、本質的に、OiおよびHerzenberg（（1980）Selected Methods of Cellular Immunology、MishellおよびShiigi編、Freeman Publs.351〜372）の方法に従って生成した。50％ポリエチレングリコール（PEG、分子量約4500）の存在下、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、P3-653細胞と1:1から10:1の割合で混合した。次に、融合細胞を洗浄し、そして培養した。ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地を用いてハイブリッドを選択した。
ハイブリドーマクローンを分泌する抗イディオタイプ抗体(Ab2)の初期選択
RIAによってハイブリドーマクローンの初期スクリーニングを行った。精製したBrE-1を、クロラミンT法（Hunter(1970)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.133:989）により放射性ヨウ素標識した。BrE-1またはコントロール抗体（種々のアイソタイプおよび非関連の特異性のモノクローナル抗体、ならびにBALB/cの正常IgG）を、PVCプレート上に500ng/ウェルで被覆した。40Cで一晩インキュベートした後に、プレートを、PBS中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックした。被覆したプレートを、ハイブリドーマ上清の系列希釈と共に４時間インキュベートし、そして約50,000cpmの125I-BrE-1を用いて発現させた。RIAアッセイは、抗体に対するストリンジェントな特異性試験であり、そしてまた、抗体が２つのBrE-1分子の間をつなぎ得ることを必要とする。
加えて、ELISAアッセイを行い、各クローンのクラスおよびサブクラスを決定する。ELISAを、BrE-1抗体（または、コントロール）を用いて500ng/ウェルでマイクロタイタープレートを被覆することにより行った。40Cで一晩インキュベートした後に、プレートを、PBS中の１％BSAでブロックした。100TIのハイブリドーマ培養上清または20×濃縮物を、室温で４時間、ウェル中でインキュベートする。PBSで洗浄した後に、プレートを、アルカリホスファターゼ標識抗アイソタイプ試薬と共に室温で４時間または40Cで一晩さらにインキュベートし、そして基質を用いて発色させた。特定のIgGサブクラスの抗体を、プロテインAクロマトグラフィーにより容易に精製し、そしてそれは有用なエフェクター機能を有し得る。
1300の初期融合物のウェル由来の培養上清を、初めにスクリーニングした。RIAにおいてBrE-10と反応するが、コントロールの免疫グロブリンに一致するアイソタイプまたはアロタイプとは反応しない、42のAb2ハイブリドーマを得た。
所望の特性を備えるこれらのスクリーニングアッセイから多くのモノクローナルAb2分泌細胞株が出現した。その中にモノクローナル抗体11D10が存在した。
モノクローナルAb2がBrE-1イディオタイプに特異的であることの確認
Ab2のイディオタイプ特異性はAb1への直接結合により確認された。種々の精製Ab2を125Iで標識し、そしてモノクローナル抗TAA Ab1のパネルで被覆したプレートへの結合について試験した。125I-11D10を用いた実験の結果を図６に示す。結果は平均cpmで示される（n=3、標準偏差10％未満）。11D10は、BrE-1とほぼ独占的に結合し；試験された他のAb1のいずれとも交差反応性は実質的に無かった。
Ab2のイディオタイプ特異性をまた、Ab1およびAb2の位置を逆転することにより確認した。100ng、300ng、および1000ngの精製したAb2でプレートを被覆し、種々の標識Ab1と反応させた。125I-BrE-1および125I-BrE-3が含まれる。BrE-3は、別の腫瘍関連HMFGエピトープに特異的なIgG1であり、そしてコントロールとして作用する。11D10をこの方法により試験した実験の結果を表１に示し、そしてBrE-1についての特異性を確認した。
0003683278.tif 000003
BrE-1イディオタイプに対する特異性を、競合実験においてさらに確立する。種々の標識Ab2を、Ab2s、Ab1、および他のマウスの免疫グロブリンを含む非標識競合物のパネルの異なるメンバーと混合した。次いで、Ab2を、BrE-1被膜プレートに対する結合について試験した。最も良好なAb2では、250ngの非標識のAb2またはBrE-1を競合物として使用して90％を超える阻害を観察した。実際に、他の免疫グロブリンを潜在的な競合物として使用して、10Tgまでの濃度で阻害は得られなかった。11D10が試験されたAb2であった代表的な結果を、表２に示す（平均cpm、n=3、標準偏差10％未満）。
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BrE-1パラトープに対する抗イディオタイプについてのスクリーニング
Ab2がBrE-1のパラトープに対するものか否かを決定するため、Ab2を使用して放射性標識BrE-1の、ヒト乳癌腫細胞株MCF-7またはSKBR3上に発現されたHMFGへの結合について競合させた。
アッセイを行うために、標的細胞を96ウェル組織培養プレート中でコンフルエントな単層として増殖させた。試験Ab2の種々の希釈物（培養上清または精製抗体のいずれか）を標識BrE-1と混合し、次いで、マイクロタイタープレート中のコンフルエントな細胞培養物に加えた。アッセイの阻害パーセントを次式に従って計算した。
0003683278.tif 000005
ここでRTはインヒビターを有する実験ウェルの平均cpmであり；Rcは平均バックグラウンドcpmであり；そしてRMAXはいずれのインヒビターも有さない平均最大結合である。
図７は、11D10を競合抗体として用いて行った、このタイプの実験の結果を示す。250ngのAb2 11D10は、HMFG発現細胞に対する標識BrE-1の結合を90％以上阻害した（図７）。
このステージで試験された42個のモノクローナル抗体（11D10を含む）のうちの約24個は、HMFG発現細胞またはHMFG抽出物に対する標識BrE-1の結合を、プレート結合アッセイにおいて約25ngという少量で阻害した。精製された3H1（無関係の特異性のマウスモノクローナル抗体）を、コントロール競合物として使用し、そしてそれは細胞に対するBrE-1の結合を阻害しなかった。一般的に、少なくとも85％の阻害を生じるAb2は、スクリーニング工程においてこの段階を通過したと考えられた。
結合特異性の確認
最も有望なAb2について、BrE-1への結合の特異性を確認するため、HMFGを用いる確認実験を行った。
約40,000cpmの125I-BrE-1を、HMFGの半精製調製物と、同時にインキュベートした。この抗体Ag混合物をAb2被覆プレートに添加し（500ng/ウェル）、そしてHMFGの結合阻害能力を測定した。Ab2の量は、結合し得たBrE-1の量に関して限定されず、そしてそれ故、少量の競合HMFGに対する鋭敏なインジケーターであった。
これまでに記載したスクリーニング試験において、ポジティブと判断された24個の抗体産生クローンのうち６個を使用して、Ab2の供給源としてマウスの腹水を調製した。このAb2を、標準的な技術によりProtein Aアフィニティー樹脂を用いるクロマトグラフィーによって精製した。
11D10に対するBrE-1の結合は、HMFGにより阻害される。
腫瘍特異的免疫応答を誘発し得る抗イディオタイプのスクリーニング
これらの実験の主な目的は抗HMFG免疫応答を誘発し得る抗イディオタイプを見出すことであるので、次のスクリーニング工程は、動物モデルにおいてその免疫原性を試験することであった。Ab2は免疫原性であるだけでなく、腫瘍抗原HMFGと交差反応するAb3を惹起し得る。
従って、HMFG発現細胞との競合実験で最も強い結果をもたらしたAb2を、免疫化実験で試験するために取り上げた。
試験されるべき各Ab2について、５匹のBALB/cマウスおよび２匹のニュージーランドシロウサギを免疫化した。マウスについては、Ab2をKLHに結合させた。２週間のスケジュールで、マウス一匹あたり50μgを注射し、そしてウサギ一匹あたり200μgを注射した。最初の注射液は、フロイントの完全アジュバント中で調製し、次の注射液はフロイントの不完全アジュバント中で調製した。血清を、分析のために規則正しく回収した。最初に、Ab3の力価を、抗体の捕獲および検出の際にAb2の両方を用いて標準的なサンドイッチラジオイムノアッセイで測定した。Ab2に対する抗体応答は、５回目の免疫後に実質的なレベルに達した。
次に、アッセイを、HMFG調製物でコートしたプレートで行った。血清をウェル中でインキュベートし、そして結合した抗体を酵素結合抗免疫グロブリンで検出した。このアッセイには、抗体が元の腫瘍関連抗原に結合することが必要であり、そして抗イディオタイプで免疫化することによって誘導されたAb3の少なくとも一部が腫瘍抗原特異的であることを確立する。HMFG特異的Ab3のレベルを連続希釈によって力価測定し、そして免疫化Ab2の「質」を規定した。
11D10モノクローナル抗体は、試験される候補の中で、最も高い質を有することが明らかになった。
11D10により誘発されたAb3が所望の特異性を有することの確認
11D10の治療目的が腫瘍関連抗原にタンパク質に対する免疫反応を誘発するその能力に依存するので、得られたAb3の特異性を続く多数の実験で確認した。
Ab3含有血清(抗アイソタイプおよび抗アロタイプ活性を欠く)は、標識BrE-1の11D10への結合またはその逆をほぼ完全に阻害した。このことは、Ab3抗体がAb1とイディオタイプを共有することを示す。Ab3産生動物がKLHに結合した11D10またはフロイントのアジュバント中で乳化した11D10のどちらで免疫された場合でも、類似の結果が得られた。
11D10で免疫化したマウス由来の脾細胞を、モノクローナルAb3産生細胞株を作製するために用いた。前節で記載したものと同様の競合実験により、モノクローナルAb3がBrE-1と同じ様式でHMFGに結合することが示された。
結合実験を、11D10によって誘導されたAb3が腫瘍細胞株で発現したときにHMFGに結合し得るか否かを決定するために行った。図８は、種々のAb3調製物の乳ガン細胞株SKBR3への直接結合の結果を示す。ポリクローナルマウスAb3、ポリクローナルウサギAb3、およびモノクローナルマウスAb3を、マウス免疫グロブリンでの吸着によって調製し、そしていくつかの希釈液での結合について試験した。11D10で免疫化した動物由来のポリクローナルおよびモノクローナルAb3血清の両方は、HMFGポジティブ細胞株MCF-7およびSKBr3に結合したが、抗原陰性メラノーマ細胞株M21/P6には結合しなかった。
種々の競合実験を行って、11D10によって誘導されたAb3が所望の特異性を有することを確認した。マイクロタイターウェル中のSKBR3細胞のコンフルエントな単層培養物を、競合因子としての50,000cpmの125I-BrE-1および種々のAb3希釈物と反応させた。特異性に関連のないモノクローナル抗体(1E3)を、ネガティブコントロールとして用いた。結果を図９に示す。20μgのモノクローナルAb3は、結合を25％阻害した。1/50希釈に希釈したポリクローナルAb3血清を含むマウスまたはウサギの血清は、それぞれ38％および30％阻害した。このことは、Ab3がAb1と同一のHMFGエピトープに結合することを示した。これらの条件下で完全に結合しなかったことにより、Ab3のいくつかはAb1よりもHMFGに対してより低い親和性および親和力を有しうることが示唆される。
11D10で免疫化したマウス由来の脾細胞をＴ細胞増殖アッセイに用いた。脾細胞を半精製したHMFGの存在下で５日間培養し、次いで[3H]チミジンをパルスした。コントロールよりも11D10で免疫化した動物由来の細胞での取り込みが大きいことは、Id特異的細胞性免疫応答の存在と一致する。11D10-Alugel免疫化ウサギは、半精製したHMFG調製物に対してDTH皮膚反応をいくらか示したが、純粋CEA(ネガティブ特異性コントロール)に対しては示さなかった。HMFGはいくつかのエピトープを含みそして精製形態では入手できないので、本発明者らは、反応の特異性について確認できない。
mAb1およびmAb3のドットブロット分析
種々の希釈のHMFG抗原を、ニトロセルロースフィルターにトランスブロットし、そしてBrE-1(Ab1)およびmAb3と反応させた(図10)。レーン１〜３は、HMGFでトランスブロットし、そしてそれぞれ、BrE-1(10μg/ml)、コントロール1E3 IgG1(50μg/ml)、およびmAb3 IgG1(50μg/ml)と共にインキュベートした。反応をヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ試薬および基質を用いることによって進行させた。染色は同じであったが、Ab1でより強力であった一方でコントロール抗体はネガティブであった。
乳ガン患者での交差反応イディオタイプについての適合実験
本発明者らは、50人の無作為に選出した乳ガン患者由来の血清を研究して、そのいずれかがAb2 11D10によって認識される予め存在する適合イディオタイプを有するか否かを決定した。マイクロタイタープレートを、250ng/ウェルの11D10(Ab2)の精製F(ab')2フラグメントでコートし、そして1:100希釈の患者の血清と共にインキュベートし、そしてヤギ抗ヒトIgG酵素標識抗体を用いて発現させた。Ab2への血清の結合を、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトIgG(γ鎖特異性)抗体および基質を用いて検出した。
図11に示すように、これらの乳ガン患者の血清のうち少数(8/50)が、11D10と反応する抗体のレベルが上昇した。抗Id治療での選択基準は、疾患それ自身が宿主でのＢ細胞およびＴ細胞のプライミング状態を誘導するという仮定に基づいている。対応する適合しているIdを発現している患者において、Ab2刺激によって既にプライムされているこのようなＢ細胞およびＴ細胞が効果的に刺激され得るという仮説がたてられる。乳ガン患者由来の血清に適合するIdの発見により、これらがAb2 11D10での抗Id免疫治療活性化のための潜在的な候補として特に適切であり得ることが示唆される。
MX-1腫瘍保持BALB/cヌードマウスでの111In-BrE-1のクリアランス研究
11D10が放射線免疫治療において過剰の放射標識した抗体に結合させるための第２の試薬として適切であるか否かを決定するために、本発明者らはクリアランス研究を行った。各BALB/cヌードマウスに、20μCiの2.9μgの111In-BrE-1を注射した。24時間後、20μgの抗Id 11D10を６匹のマウスの一群に注射して、30分後に屠殺しそして別の群を40時間後に屠殺した。マウスのコントロール群は、抗Id-11D10を30分後および40時間後に注射しなかった。マウスを屠殺した後、血液および器官を取り出して放射活性レベルを測定した。結果を表３に示し、そして１gmの111In-BrE-1±SEMあたりのパーセント用量で表した。値は、平均％SEMで表した。30分および40時間の両方で、コントロールと比較して、実験群で肝臓を除くほとんど全ての器官(特に血液、腎臓、筋肉、および肺)で放射活性の顕著なクリアランスが存在した。腫瘍の保持については30分では影がなかった；しかし、40時間後、処置群でいくらかのクリアランスが存在した。
0003683278.tif 000006
実施例２：11D10 cDNAのクローニングおよび配列決定
他に特定しなければ、全てのクローニング技術は、本質的に、Sambrookら(1989)に記載されたものであり、そして使用した全ての試薬は製造者の指示に従った。
ポリヌクレオチド配列を、11D10産生細胞株由来のメッセンジャーRNAを単離することによって、11D10抗体について得た。各配列決定のために、総RNAを１×107の11D10ハイブリドーマ細胞から単離した。メッセンジャーRNAを、オリゴチミジレート-セルロースカラムのクロマトグラフィーを２サイクル通過させることによって調製した。mRNAの収量は約100μgであった。一本鎖cDNAを、SuperScript Preamplification kit(GIBCO/BRL)を用いて合成した。
重鎖可変領域を配列決定するために、PCRを、以下のマウスγ１定常領域のアミノ酸126〜119に対応する逆方向(3')プライマー
0003683278.tif 000007
および正方向プライマーの種々の混合物(マウス可変領域サブグループのＮ末端リーダー配列に対応する)を用いて、cDNAで行った。陽性反応をもたらした(5')正方向プライマーは：
0003683278.tif 000008
であり、これはアミノ酸-20〜-13に対応する(Ｉ＝イノシン、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ)。
増幅したcDNAのフラグメントを、pT7プラスミドにサブクローニングし、そしてNovaBlueコンピテント細胞を供給者(Novagen)によって提供されたプロトコルを用いて形質転換した。組換えコロニーを色選択によって拾い、そしてプラスミドDNAをミニプレップ手順によって調製した。二本鎖プラスミドのDNA配列を、Sequenase Version 2.0キット(USB,Cleveland,Ohio)を用いて決定した。プラスミド中のDNA挿入片の配列を、プラスミドに特異的なプライマーを用いて両方向から決定した；すなわちT7プロモータープライマー(TAATACGACTCACTATAGGGG-配列番号38)およびU-19プライマー(GTTTTCCCAGTCACGACGT-配列番号39)。少なくとも８個のクローンを、配列決定のために拾った。
11D10軽鎖可変領域の配列を、同様の様式で決定した。PCRでポジティブな結果を生じた正方向および逆方向のプライマーは：
0003683278.tif 000009
これは、それぞれリーダー配列のアミノ酸-20〜-10、およびマウスκ鎖定常領域の122〜116に対応する。
PCR増幅でのエラー率を最小にするために、pfuDNAポリメラーゼ(Stratagene,an Diego)を、全ての次の実験での増幅に用いた。この熱安定性DNAポリメラーゼでの変異頻度は、Taqポリメラーゼと比較して1/10である。
単離されたcDNAが11D10重鎖および軽鎖に対応することの確認を、単離された抗体のＮ末端のアミノ酸配列決定によって得た。50μgの精製11D10抗体をサンプルローディング緩衝液(50mM Tris-HCl(pH6.8)、１％SDS、１％グリセロール、0.1％βメルカプトエタノール)で希釈して、100℃で３分間加熱する。変性させたタンパク質を、SDS含有7.5％ポリアクリルアミドゲル(BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell)にロードし、そして200Ｖで１時間電気泳動に供した。ゲル中のタンパク質を、Towbinら((1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:4350-4354)に記載された手順によって、150mAで一晩、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)メンブレンに移した。転移緩衝液は、25mM Tris、192mMグリシン、20％(v/v)メタノールを含む。メンブレンを、50％メタノール−50％酢酸中の0.1％Coomasie Brilliant Blueに素早く浸して染色し、その後40％メタノールおよび10％酢酸を含む溶液で洗浄した。室温でメンブレンを乾燥させた後、染色された重鎖および軽鎖のバンドを、清潔なカミソリ刃で切り出した。メンブレン片上のタンパク質を、パルス標識した液体化学およびオンラインフェニル−エチオノハイダンション(ethiohydantion)アミノ酸同定を用いて、Applied Biosystem Model 477Aタンパク質シーケンサーを使用して、自動Edman分解によるＮ末端ミクロ配列決定に供した。各タンパク質を、10〜15の分解サイクルに供し、そして各サイクルからの変換された切断産物を、逆相HPLCによって分析した。
モノクローナル抗体11D10の重鎖および軽鎖可変領域の核酸配列および対応するアミノ酸配列を、それぞれ図１および図２に示す。
図１では、リーダー配列の３番目のアミノ酸(アミノ酸-18)およびフレームワーク３の25番目のアミノ酸(アミノ酸81)はエラーであることが明らかである。当業者に明らかであるように、ヌクレオチドトリプレット「GCC」によってコードされるアミノ酸はＡ、すなわちアラニン(アミノ酸-18)であり、そしてヌクレオチドトリプレット「GAA」によってコードされるアミノ酸はＥ、すなわちグルタミン酸(アミノ酸81)である。同様に、図３Ａにおいて、アミノ酸81(フレームワーク３内)は、Ｅまたはグルタミン酸である。配列番号58は、本開示と共に提出された「図１」を読むタイプされたシート上の誤植で示されるように、間違ったアミノ酸翻訳を示す。配列番号２は、正しいアミノ酸翻訳を示す。
核酸配列を、本実施例で先に記載したように、抗体産生細胞株由来のmRNAのPCR増幅によって得た。アミノ酸配列を、続いて、遺伝コードを用いてポリヌクレオチド配列を翻訳することによって得た。正確なアミノ酸は、遺伝コードのために自明である。正確なアミノ酸配列はまた、本開示の支持においてアクセス番号HB-12020でATCCに寄託された抗体産生細胞株に固有のものである。
重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドならびにアミノ酸配列を、National Center for Biotechnology InformationでBLASTアルゴリズムを用いて、PDB,SwissProt,PIR,SPUpdate、GwnPept、およびGPUpdateデータベースから入手可能な配列と比較した。比較は、1996年１月19日に行った。
11D10軽鎖可変領域のDNA配列に最も密接に適合した10のデータベースDNA配列のなかでは、同一のものはなかった。11D10 DNA配列と約８〜27の差異が存在した(これは約６〜17アミノ酸の差異に相当する)。６番目の適合した配列(名称＞gb/M59920/MUSIQKAA3)は、マウスκVJ生殖様配列であり、そしておそらく11D10軽鎖が由来するプロトタイプ遺伝子を表す。11D10 DNA配列は、14個の位置で生殖系配列と異なるが、これは約７アミノ酸の位置の差異に相当する。
11D10重鎖可変領域のDNA配列に最も密接に適合した10のデータベースのDNA配列の中では、同一のものはなかった。10の配列のうち９が、３〜12塩基対長く、これはVDJ接合部内のスプライシングの差異に依存した。さらに、接合部の外側の11D10 DNA配列と比較して、約15〜43点の差異が存在し、これは11〜23アミノ酸の差異に相当した。
従って、11D10 DNAによってコードされるアミノ酸配列と最も密接に適合したデータベースのDNAによってコードされるアミノ酸配列との間には、少なくとも約18アミノ酸の差異が存在する。点の差異は、おそらく、抗体産生細胞株を作製するために用いる動物でのこの細胞株の発達の間に、生殖系配列の体細胞変異によって生じる。
図４は、11D10軽鎖可変領域コード配列に最も密接に適合した10のポリヌクレオチド配列を示す。図５は、11D10重鎖可変領域コード配列に最も密接に適合した10のポリヌクレオチド配列を示す。
軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を、他の既知の配列とNational Center for Biotechnology Informationで、BLASTアルゴリズムを用いて、PDB,SwissProt,PIR,SPUpdate,GenPept、およびGPUpdateデータベースから入手可能な配列と比較した。比較は、1996年１月19日に行った。
BLAST検索で見出された15の最も密接したアミノ酸配列は、表６に示す識別名を有する。
0003683278.tif 000010
図26(A)および(B)は、BLASTサーチに見出される15の最も近い配列との11D10軽および重鎖アミノ酸配列の比較描写である。パネル(A)は、軽鎖の比較を示す。パネル(B)は、重鎖の比較を示す。11D10配列と同一の残基は、点（．）で示す。重鎖VDJ接合点の近くの整列を改善するために導入したギャップは、二重線（＝）で示す。
11D10軽鎖可変領域のものに最も密接に適合した50のデータベースのアミノ酸配列のうちで、同一のものはなかった。11D10は、15の最も近い配列とは最小７および平均約12の置換の相違で異なった。相違の集まりが、CDR1の末端の近くに起こった。他の相違は、CDR3およびフレームワークに起こった。
11D10重鎖可変領域のものに最も密接に適合した50のデータベースのアミノ酸配列のうちで、同一のものはなかった。以下は、比較から推定された主要点を要約する。
最も近い適合は、別の抗イディオタイプ（命名gp|X64805|MMAIDHCH_1）としてそのGen Bankの命名によって示される重鎖可変領域とであった。残基１と98との間（VDJ接合の前）に11の置換があり、残基98の後は７置換の相違があった。
11D10は、長さが40の重鎖配列と異なっていた。他の配列は、VDJ接合点の近くで、５残基までとより長いか、または２残基ほどより短かった。
２つの最も密接に適合した配列を除いて、残基１と98との間には、少なくとも18そして平均では約22の置換の相違があった。
種々のDおよびJ領域遺伝子は、プロトタイプV遺伝子とともに用いられるようである。50の配列のうちの１つのみが、同じD領域を用いているようであった。D領域内に点相違が存在し、そして３残基のスプライシング相違が存在した。
最も密接に適合した50の配列にとって、全部で18の挿入、欠失、および置換の相違が存在した。他の49の配列は、全部で少なくとも25および平均で約30の挿入、欠失、および置換の相違を有した。
相違は、可変領域全体に現れる。
図26(C)は、15の最も最も近い適合した配列の軽および重鎖可変領域のアミノ酸コンセンサス配列を示す（配列番号47および配列番号48）。これらは、組み立てられた軽鎖VJ遺伝子および重鎖VDJ遺伝子のプロトタイプを表す。コンセンサス配列と同一である11D10配列中の残基は、点（．）で示す。CDRは、アスタリスク（￥）で示す。また、N→C（大文字）またはC→N（小文字）の方向で、ヒト乳脂肪グロブリン（HMFG）由来のフラグメントを示す。
以下のポイントを推論し得る：
・11D10は、コンセンサス配列から少なくとも18残基離れている。これらのうちの７個は軽鎖に生じ、そして11個は重鎖に生じる。
・点相違は、11D10軽および重鎖可変領域配列全体に起こる。８個はCDR内に生じ、10個はCDR外に生じる。
・HMFGフラグメントとの11D10配列の整列は、点変異に依存しない。
可変領域フラグメント配列、特に重鎖VDJ接合点を包囲する配列または図26(C)に示される任意の点相違は、11D10の免疫学的活性を有する本発明のポリペプチドの開発において興味深い。VDJ接合点または任意の点相違の近くのコード配列は、本発明のポリヌクレオチドの開発において興味深い。
実施例３：サルにおける11D10による乳ガン特異的応答の誘導
細胞株
HMFG抗原を発現するヒト乳ガン細胞株MCF-7を、10％FCS、1％L-グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地中で増殖させ、そして抗腫瘍応答の検出に用いた。ヒト黒色腫細胞株M21/P6（Scripps Research Institute,La Jolla,CAのRalph Reisfeid博士の好意により提供された）およびＴ細胞株MOLT-4（両方ともHMFGネガティブである）を同じ培地で増殖させ、そしてネガティブコントロールとして用いた。
抗体
分子量400,000のHMFG分子で別個のそして特異的なエピトープを識別するAb1 mAb MC-10(IgG2b、κ)を、実施例１に記載のように、抗Id mAb 11D10(IgG1-κ)の産生のために、同系のBALB/cマウスを免疫するために用いた。mAb2 3H1(IgG1-κ)は、ヒトCEA（Bhattacharya-Chatterjeeら、（1990）J.Immunol.14S:Z758-2765）に関連するマウス抗Id mAbであり、そしてコントロールとして用いた。
アジュバント
抗Idワクチンの免疫原生を増強するためには、アジュバントが必要である。水酸化アルミニウムは、米国食品医薬品局により、ヒトでのアジュバントとしての使用が認められている。それゆえ、本発明者らは、この前臨床研究において、以下に記載のように、水酸化アルミニウムで沈降させたAb2 11D10でサルを免疫化した。
抗体の調製
11D10を、実施例１に記載のように得た。mAb2 3H1(IgG1-κ)は、ヒトCEA（Bhattacharya-Chatterjeeら、（1990）J.Immunol.14S:Z758-2765)に関連するマウス抗Id mAbであり、コントロールとして用いた。
水酸化アルミニウム沈降
アジュバントを、抗Idワクチンの免疫原性を増強するために用いた。水酸化アルミニウムは、米国食品医薬品局により、ヒトでのアジュバントとしての使用が認められている。それゆえ、本発明者らは、この前臨床研究において、Ab2 11D10でサルを免疫化した。簡単に述べれば、精製したmAb抗Id(Ab2)の５mgのアリコートに、１mlの2％ Alu-Gel S(Serva Fine Biochem,Inc.,Garden City,Long Island,NY)を添加した。次いで、Dulbecco's-PBSを用いて容量を10.0mlに調整し、そして混合物をボルテックス上で室温で１時間インキュベートした。次いで混合物を、24℃にて2000rpmで10分間遠心分離した。ゲル層に結合したmAbの量は、上清中の結合していない抗体の量の分光光度測定により決定した。Alu-Gelで沈降させた抗体を、使用するまで４℃で保存した。これらの手順は、層流フード内で無菌的に行い、そして最終産物を滅菌して、抗Id 11D10 Alu-Gelとして鮮明にラベルし、そして発熱物質を含まない、滅菌ガラスバイアルに等分した。
サルの免疫化
カニクイザルを、11D10または3H1コントロールを用いて免疫化した。サルを、White Stands Research Institutes（Alamogordo,NM）に収容した。体重が３〜４kgの雄ザルと雌ザルとの対を、２mgの11D10または3H1のいずれかを用いて、４つの異なる部位で０日、14日、28日、および42日に、それぞれ皮内に免疫化した。２匹のサルだけを、経済的理由のために単回投与量で各抗Id(Ad2)について使用した。２mgの投与量を、異なる抗Idワクチンを用いた事前の前臨床試験および臨床試験に基づいて選択した。血液サンプルを、免疫前および各免疫の10日後に採取した。
毒性
サルにおけるAb3応答の誘導は、動物において明白な副作用を全く引き起こさなかった。複数回の免疫の結果として、接種部位における穏やかな局部的膨張、および炎症しか観察されなかった。サルを、物理的検察および体重測定により日常的にチェックした。異常の徴候は全く示さなかった。
水酸化アルミニウム沈降させたAb2での免疫化によって誘導された体液免疫性の発達
Ab2への特異的Ab3応答。免疫化したサル由来の血清を、抗-抗Id抗体の存在について試験した。血清を、正常マウス免疫グロブリンで予備インキュベートして、アイソタイプおよびアロタイプの決定基に対するサル抗体をブロックし、次いで、マイクロタイタープレートにコートした免疫化抗Id(11D10)との反応によって抗-抗Id(Ab3)の存在をRIAによってチェックした。無関係のAb2を、コントロールとして用いた。洗浄した後、抗原-抗体反応を、均一サンドイッチRIA中で125I標識抗Id試薬を用いてタグした。前免疫性血清およびコントロールAb2 3H1で免疫化したサル由来の血清もまた、これらのアッセイに用いた。さらに、125I標識モノクローナルAb2 3H1を、コントロールとして用いた。
Ab3のイディオトープ分析。ポジティブ反応を上記の方法で得る場合、これらのサル由来のAb3血清を、マイクロタイタープレートに結合させたBrE-1(Ab1)への125I標識11D10の結合を阻害する能力またはその反対（プレートの11D10への放射標識したBrE-1の結合を阻害）についてチェックした。無関係のAb1-Ab2系を、コントロールとして用いた（Bhattacharya-Chatterjeeら、(1990);Bhattacharya-Chatterjeeら、(1987)J.Immunol.139:1354-13605）。これは、サル血清中のAb3が、BrE-1(Ab1)を有するイディオトープを共有するかどうかを示した。Ab3血清によるAb1-Ab2結合の阻害アッセイもまた、Ab3が真の抗-抗Idであるかどうかを示している。
腫瘍抗原へのAb3の結合。天然の標的抗原への直接の体液免疫応答を評価するために、サルAb3血清を、RIAにおいてHMFGを発現することが知られている細胞株との反応性について試験した。さらに、血清を、マイクロタイタープレートにコートしたHMFG抗原の可溶化半精製調製物への反応性をチェックした。抗原-抗体反応を、ELISAにおいて、125I標識抗ヒト免疫グロブリン試薬またはアルカリホスファターゼで標識した抗ヒト免疫グロブリンを用いることにより検出した。予備免疫性血清を、コントロールとして用いた。無関係のCEAもまた、このアッセイのコントロールとして用いた。HMFG抗原に結合しているサルAb3血清のアイソタイプを、抗ヒトアイソタイプ特異的試薬を用いるELISAによって決定した。
腫瘍細胞株へのAb3の結合もまた、免疫フローサイトメトリーによってチェックした。抗原ポジティブMCF-7細胞（１×106／ウェル）を、100μlのAb1(MC-10)およびAb3とともに、４℃で60分間反応させた。洗浄の後、細胞を、ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒトF(ab')2 IgG-FITC標識抗体（Tago,Burlingame,CA）のいずれかとともに、４℃で30分間インキュベートした。次いで、これを２回洗浄し、２％のパラホルムアルデヒドで固定し、そして免疫フローサイトメトリー（FACStar,Becton,Dickinson,San Jose,CA）によって分析した。抗原ネガティブMOLT-4細胞を、このアッセイのコントロールとして用いた。
過免疫化サル血清由来の抗-抗Id抗体（Ab3）の精製。20mlの過免疫血清を、Sepharose4Bに結合させた免疫化抗Id免疫グロブリン（11D10-IgG1）からなる免疫吸着カラムに通した。抗-抗Id抗体（Ab3）を、0.1Mグリシン-塩酸緩衝液（pH2.4）で溶出し、そして３MトリスでpH7.0に中和した。次いで、溶出した抗体を、Sepharose4Bに結合させた無関係のアイソタイプ-アロタイプ適合抗Id mAbからなる免疫吸着カラムに通して抗アイソタイプ反応性および抗アロタイプ反応性を除去した。通した抗体を濃縮し、そして精製Ab3として用いた。Ab3のアイソタイプを、ヒト抗アイソタイプ特異的抗原（Tago）を用いるELISAによって決定した。
Ab3のエピトープ分析。サルに生じるAb3、およびAb1(BrE-1)が、同一の抗原決定基に結合することを示すために、精製Ab3によって抗原ポジティブ腫瘍細胞株MCF-7またはHMFG抗原へのBrE-1の結合の阻害を、RIAによってチェックした（Bhattacharya-Chatterjeeらに記載される）（1990）。
HMFGを用いる精製Ab3のスロットブロット分析。ポリビニリデン二フッ化物の膜を、メタノールで５分間活性化し、0.02MPBS（pH7.0）に移した。種々の濃度のタンパク質（５μg、２μg、１μg）を、Hybrislot機器（BRL Life Technologies,Gaithersburg,MD）を用いて膜に吸着させた。次いで、膜をPBS中の２％BSAで２時間振盪しながらブロックし、続いて、20μg/mlのAb1またはAb3の溶液の５mlとともに、３時間振盪しながらインキュベーションした。次いで、膜をPBS中の１％BSAで５回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンまたはヤギ抗マウス免疫グロブリン（１：100希釈）とともに90分間インキュベートし、洗浄し、ならびにBio-Radキットに供給された基質を用いて発色させた。
Id特異的増殖応答のためのアッセイ
新鮮な末梢血単核細胞を、標準Ficoll-Hypaque密度勾配遠心法によって単離し、そして５×103細胞／ウェルを、種々の濃度の11D10およびコントロール3H1（10ng〜２μg）とともに、５％の熱失活化FCS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するRPMI1640培地中でインキュベートした。非特異的マイトジェンフィトヘマグルチニン-Pを、２μg/ウェルおよび１μg/ウェルでポジティブコントロールとして用いた。細胞を５％の二酸化炭素を含む空気中で37℃で５日間インキュベートした後、[3H]チミジン（１μCi／ウェル）で20時間パルスした。データを、[3H]チミジン取り込みの平均計測値（３連のウェル）／分として表した。SDのデータは、各決定値の10％未満であった。
結果
サルにおける抗-抗Id(Ab3)応答の誘導。サル由来の血清を、４回目の免疫化の後に10日得て、サンドイッチRIAによるAb3応答およびAb1にへのAb2の結合の阻害について分析した（表４）。これらのアッセイのために、血清を、正常マウス免疫グロブリン（500μg/ml）で前処理して、抗アイソタイプ反応性および抗アロタイプ反応性をブロックした。サンドイッチRIAのために、４回目の免疫化の後に得られたAB3血清を、正常マウス免疫グロブリン（500μg/ml）を含むPBSで希釈した。血清を、アッセイの前に正常マウスIgGとともに予備インキュベートした。１：40希釈のAb3を、抗Id mAb 11D10または3H1とともにインキュベートし、マイクロタイタープレートにコートし、次いでサンドイッチアッセイにおいて125I標識11D10または3H1（-50,000cpm）と反応させた。結果は、サンドイッチアッセイにおける結合したcpmとして表している。結果は、平均のcpm（n＝３）として示してある。データのSDは、10％未満だった、次いで、本発明者らは、サルAb3血清の半精製したHMFGへの結合を試験した。11D10で免疫化したサル由来のAb3血清（PRO723およびPRO872）は、免疫化Ab2（11D10）に特異的に結合したが、無関係のAb2（3H1）との反応性は最小であった。サルAb3はまた、Ab1への放射線標識したAb2の結合を、１：40の希釈時でさえ、それぞれ91および95％阻害した（表４）。前免疫化血清または無関係のAb2 3H1で免疫化したサルから得られた血清（PRO541およびPRO667）では、阻害はなかった。精製11D10を、プレートをコートするために用い（250ng/ウェル）、そして11D10への放射線標識したBrE-1（約50,000cpm）の結合を、種々の希釈のAb3血清の存在下での阻害について試験した。平行して行ったコントロール実験において、無関係のAb1-Ab2系（mAb 5019-3H1）をコントロールとして用いた。Ab3応答の速度論は、サルPRO723由来の血清を用いて図12に示し、これは、Ab2への放射線標識したAb1の結合の阻害を示す。同様の反応性が、サルPRO872由来の血清で見られた。これらの結果は、サルAb3血清はAb1とイディオタイプを共有していることを示している。
0003683278.tif 000011
抗腫瘍細胞抗体応答の誘導。11D10免疫化サル血清がHMFGポジティブ乳ガン細胞に特異的に結合するかどうか決定するために、サルAb3血清の乳ガン細胞株MCF-7への結合をELISAによって試験した。種々の希釈のAb3血清を、96ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた細胞のコンフルエントな単層に加え、そしてヤギ抗ヒトIgG（重鎖および軽鎖特異的）酵素標識抗体を用いて発達させた。吸光度（OD）を、１時間後に読みとった。サルPRO872を、Ab2 11D10で免疫化した。サルPRP667を、コントロール無関係のAb2(3H1)で免疫化した。前免疫サル血清をまた、コントロールとして用いた。サルAb3血清（.....）の黒色腫細胞株M21/P6への結合を、ELAISAによって同じプロトコルに従って試験した。結果を、405nmでの平均吸光度（n＝３）として示す。データのSDは、各アッセイについて10％未満であった。図13で示されるように、血清（種々の希釈での４回目の免疫化の後に得られる）は、MCF-7細胞と反応したが、抗原ネガティブ黒色腫細胞株M21/P6とは反応しなかった。次いで、本発明発明者らは、サルAb3血清の半精製したHMFGへの結合を試験した。プレートを、HMFG（２mg/ウェル）でコートし、そしてAb2 11D10で免疫化したサル（PRO723）ならびに同じアイソタイプおよびアロタイプの無関係のAb2 3H1で免疫化したサル（PRO667）由来のAb3血清（１：100希釈）と反応させた。前免疫性血清およびPBS-BSAをまた、コントロールとして用いた。結果は図９であり、そして、405nmでの平均吸光度（OD）として表した。平行したコントロール実験において、同一の血清を、精製CEAでコートしたプレート上でチェックした。11D10免疫化サル血清との反応性は見られなかった；得られた吸光度は、FBS-BSAコントロールで得られた物に匹敵した。結果を、405nmでの平均吸光度（n＝３）として表す。データのSDは10%未満であった。実験値とコントロール値との間の差違は、統計学的に有意であった。Ab3血清はまた、ELISAによって、マイクロタイタープレートにコートされた半精製したHMFGに特異的に結合した（図14）。前免疫サルまたは無関係のAb2(3H1)で免疫化したサル由来のコントロール血清は、感知できるほどのHMFGへの結合は示さなかった。平行した実験において、サルPRO723由来の同一のAb3を、CEAでコートしたプレートに上で比較したところ、ネガティブであった。
細胞表面HMFGとの反応性を決定するために、MCF-7細胞を、免疫フローサイトメトリーによって試験した。図10に示しているように、Ab2免疫化サル由来のAb3は、Ab1で得られる結合パターン（示していない）に類似した別個の結合（図15-A）を示した。有意な結合は、HMFGを発現しないMOLT-4細胞では得られなかった（図15-B）。
次いで、Ab3抗体を上記のように血清から精製した。精製したAb3の反応性を、ELISAによってチェックした。プレートを、HMFG（２mg/ml、100ng/ウェル）でコートし、そして室温で一晩インキュベートした。プレートを、PBS中の１％BSAでブロックし、そして11D10またはコントロールAb2(3H1)のいずれかで免疫化したサル由来の精製したAb3（20mg/ml）と反応させた。PBS-BSAをネガティブコントロールとして用いた。CEAでコートしたプレートにおいて、mAb 8019（抗CEA）をポジティブコントロールとして用いた。結果は図16であり、そして405nmでの平均吸光度（OD）（n＝３）として表す。データのSDは、10％未満であった。サルAb3は、マイクロタイタープレートにコートしたHMFGと特異的に反応したが、一方、反応性はコントロールCEAでコートしたプレートでは得られなかった。
精製したAb3のHMFGへの特異性を、スロットブロット分析によって、さらに確認した（図17）。図６において、レーン１および２を半精製したHMFGでコートし、そしてレーン３および４を精製したCEAでコートした。膜を、Ab1（レーン１）、精製したAb3（レーン２および３）、およびmAb8019中の抗CEA（レーン４）とともにインキュベートした。HMFGとの反応性は示されたが、CEAとの反応性は示されなかった。
MCF-7細胞結合へのマウスAb1およびサルAb3の競合。Ab3がAb1と同様の結合部位を有する場合、Ab3は、MCF-7細胞上でのHMFGへの結合についてAb1を競合するはずである。マイクロタイタープレート中のMCF-7細胞のコンフルエントな単層を、種々の濃度の精製したAb3および固定量の125I標識したAb1（約50,000cpm）と反応させた。阻害の割合を算出し、そしてインヒビターに対して（mg Ab3）プロットした。固定した量の放射性標識したAb1を、種々の量の精製したAb3またはコントロールAb3調製物およびMCF-7細胞とともに同時インキュベートした（図18）。100ngの精製したAb3は、結合を60％阻害し、そして１mgの精製したAb3は80％をこえる阻害を与えたが、一方、５mgの濃度で用いられたコントロールAb3は、何らかの阻害も産生しなかった。これらの結果は、Ab2免疫サル抗体はAb1のような同一の抗原に結合することを示している；従って、Ab3調製物はAb1'特性を有する抗体分子を含む。
抗Idへの細胞応答。細胞性免疫応答を、水酸化アルミニウム沈降した抗Id抗体（11D10）および水酸化アルミニウム沈降した抗iD抗体（3H1）とともにインキュベートした抹消血単核細胞の増殖によって測定した。免疫化サル由来の末梢血リンパ球（PBL）を、インビトロでの11d10-Alugelまたは3H1-Alugelでの刺激への応答性についてアッセイした。PBLを、11D10 AlugelTM（２μg〜100ng）および3H1-Alugel（２μg〜100ng）とともに５日間培養し、そして増殖を、[3H]チミジンの取り込みにより測定した。サルPRO723から得た末梢血単核細胞をインビトロで11D10（１mg/ml）；コントロールの無関係のAb2 3H1（１mg/ml）で刺激した。同様に、サルPRO872から得られた末梢血単核細胞を、インビトロで11D10（１mg/ml）；無関係のAb2 3H1（１mg/ml）で刺激した。刺激を、[3H]チミジンパルスの取り込みの程度によって測定した。抗原を全く含まない培養培地をまた、コントロールとして用いた。免疫化後の末梢血単核細胞を、３回目の免疫化後10日目に回収した。結果を、図19に示し、そして３連のウェルの平均cpmとして表す。データのSDは、各決定値について10%未満であった。実験値とコントロール値との間の相違は、統計学的に有意なものであった。ポジティブ増殖応答は、サルPRO872およびPRO723の両方において見られ、これはマイトジェンフィトヘマグルチン-Pへの応答にほぼ匹敵した。前免疫細胞は、抗Id抗体に対して増殖応答を示さなかったが、免疫後の細胞は、有意に応答した。また、アイソタイプ適合3H1抗Id抗体への、わずかではあるが重要な応答が存在し、これは11D10応答よりも有意に小さかった；これは、免疫グロブリン分子の非Id成分への応答を表しているようである。増殖応答を、最初３回目の注射後に記録し、そして同様の反応性を、４回目の免疫化後に得た。血液の供給が制限されていたので、本発明者らは、半精製したHMFG抗原の存在下でのＴ細胞増殖を試験できなかった。従って、リンパ球において誘導される細胞性免疫応答の抗原特異性、ならびにこれらのリンパ球の表現型を確立できなかった。
実施例４：11D10のヒトへの投与
注入あたり1、2、4、または8mgのいずれかの11D10でアルミニウム沈降された抗Id 11D10を用いる免疫
患者を、0、14、28、および42日に、皮内注入によって、11D10の４用量のうちの１つを受けるように無作為に選択した。各用量群は、３人から８人の患者を含む。水酸化アルミニウム沈降を、Herlynら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84.805Sの方法に従って実施する。簡潔には、ワクチンは、0.2% Alu-Gel Sを含有する水酸化アルミニウム沈降後の抗Id 11D10からなる。精製モノクローナル抗Id(Ab2)の５mgのアリコートに、２% Alu-Gel S（Serva Fine Biochem,Inc.,Garden City,Long Island,NY）の1mlを添加する。次に、容量をD-PBSで10.0mlに調整し、そして混合物を撹拌しながら、室温で１時間インキュベートする。次に、混合物を24℃にて10分間、2000rpmで遠心分離する。ゲル層に結合された抗体の量を、分光分析によって、上清中の非結合抗体量を測定することにより、決定する。Alu-Gel沈降されたAbを、使用するまで４℃にて保存する。全ての操作は、層流フード(hood)下で実施される。最終産物を滅菌し、抗Id 11D10-Alu-Gelとして明らかに標識され、発熱物質を含まない滅菌ガラスバイアルに分配する。水酸化アルミニウム沈降されたイディオトープの活性を、ELISAでのAb1 F(ab')2への結合を試験することによってモニターする。最終的に、そのロットの生物学的活性を、記載されているように（Bhattacharya-Chatterjeeら(1987)J.Immunol.139:1354;Bhattacharya-Chatterjeeら(1988)J.Immunol.141=1398）、イディオトープキャリアでの免疫後に、小動物の血清で確かめる。最終充満産物を、モルモットにおいてエンドトキシン、不妊症、および一般的な安全性について、試験する。次いで、水酸化アルミニウム沈降された11D10を、投与前に、水浴中で45℃にて30分間加熱処理する。
体液性免疫
抗抗Id抗体（Ab3）を生じる患者の体液性免疫応答を特徴づける。抗体を、以下の(a)から(e)について評価する：(a)Ab3が実際にAb1抗体を含有するかどうかを決定するための、腫瘍細胞または単離された半精製抗原への結合；(b)細胞傷害性効果のメディエーターとしてのエフェクター細胞または補体による、乳ガン細胞に対する細胞傷害性活性；(c)抗ヒトイソタイプ特異的試薬によるイソタイプの特徴づけ；(d)Ab3のイディオトープ分析（すなわち、Ab1とのイディオトープの共有）；および、(e)Ab3のエピトープ分析（すなわち、Ab1と同じエピトープへの結合）。
アルミニウム沈降されたAb2による免疫によって誘導された、体液性免疫の出現を、プロトコールに示されている種々の時点で、患者から得られた血清を試験することによって評価する。血清を、まず、全ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答（抗イソ／アロ／および抗抗イディオタイプ抗体）について、サンドイッチRIAによって試験する。簡潔には、マイクロタイタープレートを11D10でコートし、そして患者血清の種々の希釈物とともにインキュベートする。洗浄後に、抗原-抗体反応は、均一系サンドイッチRIAにおいて、125I-標識された抗Id 11D10を用いて標識される。11D10は、無傷の(intact)IgG1として注入されるので、患者はHAMA応答をマウントすることが期待される。
(a)Ab2に応答する特異的Ab3応答：ポジティブHAMA応答を有する、免疫された患者からの血清を、抗抗イディオタイプ抗体の存在について試験する。血清を、イソタイプおよびアロタイプ決定基に対するヒト抗体をブロックするために、正常マウス免疫グロブリンとともにプレイキュベートし、次いで、抗抗Id(Ad3)の存在について、マイクロタイタープレートにコートされた免疫抗Id(11D10)との反応を、RIAによって確認する。無関係のAb2をコントロールとして使用する。洗浄後に、抗原-抗体反応を、上記のように、均一系サンドイッチRIAにおいて125I-標識抗Id試薬を用いて標識する。前処理、非免疫血清、および正常ドマーからの血清を、これらのアッセイにおけるコントロールとして使用する。
(b)Ab3のイディオトープ分析：ポジティブ反応が上記(a)で得られる場合、それらの処置患者からのAb3血清を、マイクロタイタープレートに結合されたMC-10(Ab1)への125I-標識11D10結合を阻害する能力、またはその逆（プレート上の11D10への放射標識MC-10の結合の阻害）について確かめる。非関連Ab1-Ab2システムを、コントロールとして使用する。この試験は、患者血清中のAb3が、MC-10(Ab1)と、イディオトープを共有するか否かを実証する。Ab3によるAb1-Ab2結合の阻害アッセイはまた、Ab3が真の抗抗イディオタイプであるか否かを実証する。
(c)Ab3の腫瘍抗原への結合：ネガティブ標的抗原に対して指向される体液性免疫応答を評価するために、患者Ab3血清を、HMFGを発現することが知られている細胞株との反応性について、RIAにおいて試験する。さらに、血清を、マイクロタイタープレート上にコートされた、HMFG抗原の可溶化半精製調製物に対する反応性について確かめる。抗原-抗体反応を、ELISAにおいて125I-標識抗ヒトIg試薬またはアルカリホスファターゼ標識抗ヒト-Igを使用することにより検出する。免疫前血清および非関連抗原をコントロールとして使用する。HMFG抗原へ結合するヒトAb3血清のイソタイプを、抗ヒトイソタイプ特異的試薬を使用して、ELISAにより決定する。これらの実験について、HMFGを、Laroccaら（1992）Hybridoma 11(2):191-201の方法によって、E.coliから融合タンパク質として得る。
(d)Ab3のエピトープ分析：処置患者において生成されたAb3およびAb1(MC-10)が、同じ抗原決定基に結合することを実証するために、Ab3血清による、Agポジティブ腫瘍細胞株MCF-7またはHMFG抗原に対するMC-10結合の阻害を、RIAによって確かめる。
(e)Ab3の細胞傷害性活性：患者血清中のAb3が、腫瘍細胞に特異的に結合する場合、エフェクター細胞および／または補体と共合して、これらの細胞を溶解するAb3の能力を、標準ADCC（Chereshら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:515）、またはCMCアッセイ（Herlynら(1981)Int.J.Cancer 27:769）によって試験する。しかし、Ab3の細胞傷害性活性はそのイソタイプに依存し得、IgG1は、ADCCにおいて有効であり、およびIgG1、IgG2、IgG3、およびIgMは、CMCにおいて有効である。
患者の細胞性免疫応答に対する11D10免疫の効果の測定
進行性の乳ガンを有する患者の11D10-Alugelでの免疫が、T細胞（そのうちのいくつかが、その腫瘍細胞に対して細胞溶解活性を示し得る）の活性に導くかどうかを試験するために、患者のT細胞は、Ab2βによってインビボで活性化される場合、インビトロでのAb2β、抗原、または増殖を伴う自己腫瘍細胞での刺激、および潜在的なCTL誘導に応答するはずである。
(a)患者の末梢血単核細胞（PBMC）の増殖応答を、免疫抗Id 11D10、コントロールAb2、または半精製HMFG抗原の存在下で試験する。あるいは、PBMCを、照射自己腫瘍細胞（可能な場合、手術中低温保存されるか、または短時間培養で維持される）で刺激する。細胞が増殖する場合、それらは、増殖に関与する細胞のサブタイプを決定するために、フローサイトメトリーによって表現型を分類する。増殖応答は、3H-チミジンの取り込みによって測定され、そして前治療PBMC Stimulation指標に比較される。このアッセイに対して、血液サンプルを、３回および４回の免疫後、および最終治療の１ヶ月後に回収する。
(b)インビトロ細胞傷害性活性：細胞性免疫プロフィールを、自己ガン細胞（可能な場合）、または同種異系MC-10Agポジティブ腫瘍細胞に対する、T細胞の細胞傷害性活性を、51Cr放出アッセイにおいて、インビトロで試験することによって評価する。Ertleら(22)によって示唆されるように、抗Id抗体の、エフェクター相レベルに限定されたMHCではない、細胞傷害性T細胞を誘導する能力は、標的として自己腫瘍細胞を使用する困難を克服し得、さらに自己腫瘍細胞の使用を促進し得る。乳ガン患者および健常ドナーからの末梢血リンパ球調製物を、バイオビーズに不溶化するか、またはプラスチックプレート上にコートした、抗Id（10ng〜100μgの範囲）の種々の用量とともにインキュベートする。最適数のリンパ球を、Mishell-Dutton培養培地で２ml中の最適濃度のイディオトープワクチンとともに、135mmペトリ皿中で培養する。細胞を５〜６日後に採集し、記載(84)されるように、51Cr標識標的に対する、４時間または18時間の51Cr放出細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞として使用する。可能な場合はいつでも、自己腫瘍細胞（診断中または治療前に低温保存される）を、標的細胞として使用する。新鮮腫瘍細胞株を、ヌードマウスまたは細胞培養において、増殖および維持することにより、少なくとも選択された何人かの患者において、自己細胞の供給を有するこのは可能であり得る。同種異系MC-10 Agポジティブ腫瘍細胞株はまた、標的として同時に試験される。腫瘍細胞殺傷が存在する場合、特異性を特徴づけるために以下の実験を行う：
(i)リンパ球が、乳腫瘍細胞に対して細胞傷害性になる場合、それらを、抗原を発現しない多数の標的（すなわち、リンパ球、その他のガン腫細胞株）を用いる細胞傷害アッセイにおいて試験する。細胞傷害性の欠損は、標的が、おそらく乳ガン関連Agであることを示唆する。
(ii)リンパ球を、51Cr-標識腫瘍細胞を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用および試験される、Ab2βと同じイソタイプの非関連抗イディオタイプハイブリドーマとともにインキュベートする。細胞傷害性の欠損は、抗Idの効果が特異的であることを示す。
別の実験において、患者のリンパ球を、照射自己腫瘍細胞（可能な場合）とともにインキュベートする。細胞を５〜６日後に採集し、そして生細胞を、リンパ球分離培地で精製する。細胞傷害性を、51Cr-標識自己標的腫瘍細胞に対して測定する。
このインビトロ細胞傷害性アッセイは、前治療後に、すなわち、４回の免疫および最後の免疫の１ヶ月後に得られた血液から単離されたPBMCを利用する。
11D10の最適用量の決定
さらなる臨床試験用の最適用量を、２つの基準に従って選択する：
(a)最大Ab3応答を誘導するAb2用量を決定する。これは、阻害アッセイによって決定され得る。
(b)最大Ab3結合を誘導するAb2用量は、腫瘍に応答する（Ab1'応答）。
Ab3およびAb1'応答の定量
患者血清中の抗抗Id抗体（Ab3）の発現を、RIA阻害研究によって、以下のように定量する。簡潔には、マイクロタイタープレートをMC-10-IgG1（Ab1）でコートし、そして125I-標識Ab2の固定化量と反応させる。標準阻害曲線を、インヒビターとして精製MC-10 IgG1を使用して作成する。次に、抗イソアロタイプ活性を涸渇された患者血清を、異なる希釈でのAb1-Ab2反応を阻害する能力について確認し、そして血清中のAb1様抗体の量を、標準阻害曲線から評価する。Ab3応答の誘導および持続期間を、種々の用量レベル間で比較し得る。多数の用量で、Ab3応答または持続期間の間に実質的な差異が存在しない場合、半精製HMFG抗原でコートされたプレートに対するELISAアッセイにより、血清中の特異的抗腫瘍応答(Ab1')の力価を比較する。
インビトロ研究。Ab1'またはAb3ポジティブな患者血清が循環する場合、それは、患者の腫瘍細胞もしくは循環腫瘍抗原に（Agが血液中に微少量分泌されたとしても）結合し得るか、またはそれらが低親和性であるかを示し得る。患者のPBMCを、腫瘍特異的抗体の誘導のために、抗原またはAb2を用いてインビトロで刺激する。これには、治療前および次いで４回免疫の１ヶ月後に回収される血液から得た末梢血単核細胞（PBMC）を、改変Mishell-Dutton培養（DeFreitasら(1985)Curr.Top Microbiol.Immunol.119:75）において、種々の濃度の11D10、または非関連Ab2、またはHMFG抗原（10μg〜110ng）とともに培養する。培養上清を採集し、そしてまず最初に、特異的ヒト免疫グロブリン産生についてELISAアッセイにより確認し、そしてラジオイムノアッセイによりAb2の不溶化調製物への結合について確認する。さらに、上清を、125I-標識MC-10（Ab1）とAb2βとの間の反応を阻害する能力によって、イディオトープ保有分子の含有量について試験する。上清を、MC-10 Ag-ポジティブヒト乳ガン腫細胞、およびAg-ネガティブリンパ球とのそれらの反応性について、Ab1'抗体評価用のRIAまたはELISAアッセイ（感度＞1ng）によって、125I-標識抗ヒトIg試薬を用いる結合アッセイにおいてもまた、確認する。
Ab2βの効果の特異性は、同じイソタイプの非関連Ab2とともに、PBMCをインキュベートすることによってモニターする。Ab3ポイジティブ患者のみがこのインビトロ研究に包含されるので、Ab2βで刺激されたPBMCは、Ab2β（11D10）に結合する抗体を分泌し、そしてポジティブコントロールとして作用するはずである。
Ab4応答の潜在的な誘導
ネットワーク仮説(network hypothesis)に従って、Ab2で免疫された患者はまた、Ab2の特異性を模擬し得る、Ab4応答（抗抗抗Id）を最終的に誘導し得る。この可能性を研究するために、Ab3ポジティブ患者の（抗イソおよび抗アロタイプ抗体の涸渇された）血清を、記載されてるように、ELISAまたはRIAによって、MC-10（Ab1）と反応させる。ポジティブおよびネガティブコントロールを、記載のように、Ab3アッセイに対して包含させる。このアッセイのための血清を、最終治療の３ヶ月後に得る。
実施例５：進行性HMFG関連疾患を伴う患者への11D10の投与によって誘発された免疫応答の分析
INDを、アルミニウムで沈降された抗Id 11D10を有する乳ガン患者の臨床治験用に、米国食品医薬品局から得た（BB-IND番号5745）。５人の患者を、フェーズIb試験に登録した。全患者は、以前に標準的な治療法によって治療された進行性の乳ガンを有し、彼らの腫瘍細胞は、モノクローナル抗体MC-10（BrE1）によって同定すると、乳ガン抗原HMFGに対してポジティブであった。患者を注射あたり、１mg、２mg、４mg、または８mg用量の11D10-Alugel（アルミニウム）のいずれかに無作為化した。彼らを、最低４回の注射に対して隔週に皮内注入により免疫した。治療は、患者の疾患が快方に向かうまで、月基準で継続した。
第１の患者は、これまでのところ、８mgの８回免疫を受け；第２の患者は、4mgの４回の免疫を受け；第３の患者は、２mgの４回免疫を受けた。第４および第５の患者は、それぞれ、１mgおよび４mgの用量を受け、最近研究に加えられた。
毒  性
毒性は、注入部位で軽度の紅斑(erytherma)および硬化を伴った局所反応のみを有し、最小であった。抗Id処置は、造血細胞、腎機能、または肝機能に対して、有害な影響を何も有さなかった。
抗イディオタイプに対する体液性応答
アルミニウム沈降された抗Id 11D10（実施例４に記載されたように調製された）での免疫によって誘導された体液性免疫の出現を、治療前およびワクチンでの各治療後の患者からの血清を試験することにより評価した。第１の患者３人からの超免疫血清（４回免疫後）は、免疫Ab2 11D10に対する抗イソ／アロ／抗抗イディオタイプ応答を含む、全ヒト抗マウス抗体応答の有意なレベルを示した。第１の患者からの典型的なデーターを図20に示す。次に、これらの患者からの血清を、ラジオイムノアッセイによって、プレート上で、125I-MC-10（Ab1）のAb2 11D10への結合またはその逆（プレート上での放射標識Ab2のAb1への結合）を阻害する能力について確認した。これらの反応を、イソタイプおよびアロタイプ決定基に対するヒト抗体をブロックするために、過剰の正常マウスIgの存在下で行った。図21は、第一患者についてのデーターを示す。約40%の阻害が、血清の1:40希釈にて得られたが、一方、９%および22%のみの阻害が、同じ希釈にて、第２および第３の患者血清によって得られた。７回の免疫後に、第１の患者は、血清の1:40希釈で83%の阻害を示した。全患者３人からの免疫前血清は、阻害を示さなかった。これらの結果は、患者１が、抗抗イディオタイプ抗体（Ab3）を有意にマウントし、そして他の２人の患者は、ある程度のAb3反応性を有したことを示す。
次に、抗Id 11D10が、抗腫瘍抗原（HMFG）の特異的抗体応答を、免疫された患者において誘導し得るか否かを、調査した。これについては、４回の免疫後に得られた血清を、マイクロタイタープレート上にコートされたHMFG抗原（Dr.Cerianiから得た融合タンパク質;Laroccaら(1992)）に対して、ELISAアッセイによって試験した。結果を表５に示し、そして３連のウエルの平均として表す（S.D.＜10%）。
0003683278.tif 000012
患者１および３からのAb3血清は、免疫前血清と比較すると、HMFG抗原への特異的結合を示した。患者２からの免疫前および免疫後血清は両方とも、HMFGへの非特異的結合を示し、これは、免疫によって増大しなかった。
抗イディオタイプに対する細胞性免疫応答
細胞性免疫応答を、アルミニウム沈降させた抗Id 11D10、およびイソ、アロタイプ適合性コントロール抗Id 3H1とともにインキュベートした、末梢血単核細胞の増殖によって測定した。ポジティブ増殖応答は、患者１のみにおいて認められたが（図22）、他の２人の患者においては認められなかった。患者１からの免疫前細胞は増殖応答を有さなかったが、一方、超免疫細胞は、抗Id 11D10に対して有意な応答を有した。コントロール抗Id 3H1に対する応答もまた存在した；この応答は、11D10応答よりも有意に弱く、マウス免疫グロブリン分子の非イディオタイプ成分に対する応答を示すようである。
結果は、抗Id 11D10が、進行性乳ガン患者において、体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導し得ることを示唆する。
実施例６：11D10ポリペプチドフラグメントをコードする組換えワクシニアベクターの構築
プラスミド構築および組換えワクシニアウイルスの産生
一般ワクシニアベクター（rvv）の構築スキームを図18に示す。本発明者らは、ワクシニアウイルス野生型WR株のTK遺伝子の全配列（GenBank,受託番号J02425）を、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）よりBLASTプログラムを用いて取得した。Aitschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。配列データから、順方向および逆方向PCRプライマー5'-CAGATGGAAGGGCCCAAC(配列番号42)および5'-GATTGATGCATATCATTACC(配列番号43)を合成した。これらはそれぞれTK配列のヌクレオチド22〜39および727〜708に相当する（Hrubyら(1983)Pro.Natl.Acad.Sci.USA 80:3411-3415)。プラスミドpGEM-7Zf(+)（Promega）へ挿入するため、Apa I部位（下線）を順方向プライマーに導入し、Nsi I部位（下線）を逆方向プライマーに導入した。ワクシニアの野生型WR株由来のDNAを単離し、TK遺伝子をPCRで増幅した。予想通りのサイズ（約700bp）のDNAフラグメントがPCRで得られた。このDNAを、低融点アガロースにおける電気泳動で分離し、GELase(Epicentre Tech.)で消化することにより精製した。Apa IおよびNsi Iでの消化後、TK DNAフラグメントをpGEM-7Zf(+)に連結した。得られたプラスミド（pGEM-TK）を標準的な形質転換法で増幅した。挿入を制限マッピングにより確認した。
プロモーター7.5Kを野生型ワクシニアウイルスから、7.5Kプロモーター配列のヌクレオチド69〜88および335〜312に相当する、順方向プライマー5'-GTTATCGATGTCGAATAGCC(配列番号44)および逆方向プライマー5'-TTGCTGCAGATTGAGTACTGTTCT（配列番号45）を使用してPCRにより増幅した。Cochranら(1985)J.Virol.54:30-37。Cla I部位（順方向）とPst I部位（逆方向）をプライマーに含ませた。増幅したDNAフラグメントをPst Iで消化した。5'末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化したより小さいオリゴヌクレオチドを有するポリヌクレオチドアダプターを合成した。半リン酸化したアダプターをPst Iで消化したPCR増幅7.5KプロモーターDNAフラグメントに連結した。産物をCla I/Eco RI消化pGEM-TKで消化した。
11D10ポリペプチドをコードするcDNA挿入物を、pVVのNco I部位とXmaI(Sma I)部位との間に挿入する。このプラスミドはまた、scFv cDNAの5'末端にVHのリーダー配列を含む。所望であれば、E.coliβガラクトシダーゼのcDNAを含むワクシニアコントロールプラスミドが構築され得る。
rvvの構築
rvvを、Mackettら（DNA Cloning，第２巻、D.M.Glover編、IRL Press 1985）の手順に従って、CV-1細胞を用い、ワクシニアプラスミドとワクシニアウイルスの野生型WR株との相同組換えによって構築する。βガラクトシダーゼ（コントロール）を発現する組換えウイルスクローンを、5'-ブロモデオキシウリジンと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシダーゼ(X-Gal)の存在下でTK 143B細胞上での増殖により選択する。青色の組換えウイルスを、パスツールピペットで拾いプラークを精製する。クローン選択の第二工程として、11D10cDNAをプローブとして使用し、抽出したDNAのサザンブロットを行う。rvvの更なる選択を、ウイルス感染したCV-1または他の任意の真核細胞の培養上清をELISAによりアッセイすることにより行う。細胞に結合した11D10ポリペプチドがrvvに存在する場合（すなわち、リーダー配列が欠失されている場合）、細胞溶解物をアッセイする。MC-10(Ab1)をプローブとして用いるウェスタンブロットもまた行う。ワクシニアウイルスによって合成された11D10ポリペプチドの生物学的活性を、上記のように細胞結合阻害によって決定する。11D10ポリヌクレオチドを含むrvvクローンを、0.1%のニュートラルレッドで染色することによって選択し、上記のようにプラークを精製する。ウイルスクローンを、標準技術を用い、高力価溶解物中に増殖させる。Mackettら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415-7419。典型的には、最高量の11D10ポリペプチドを産生するクローンを、さらなる研究のために選択する。
組換えワクシニアウイルスによって発現された11D10ポリペプチド（外来タンパク質）のアッセイ
CV-1細胞を、10％ウシ胎児血清ならびに1ml当たり100単位のペニシリンおよび100μgのストレプトマイシンを補充したDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)で、25cm2フラスコあるいは６ウェルのクラスターフラスコにおいて培養する。細胞にrvvを30のMOIで接種する。ウイルスを2時間、37℃で組織培養インキュベーターにおいて吸収させ、その後、接種物を培養培地で置換し、そしてインキュベーションを継続する。示された時間のインキュベーション後、上清を取り出し、分泌された11D10ポリペプチドをアッセイする。コントロールとして、模擬感染させた細胞からの上清を使用する。11D10ポリペプチドのアッセイを、例えば実施例１および５に記載されたように、MC-10(Ab1)との結合について試験することによって、実行し得る。rvv-lacZによって産生されたβ-D-ガラクトピラノシドを、Miller（Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Pines 1972）に従って、p-ニトロ-β-D-ガラクトピラノシドを基質として用いてアッセイする。ウイルス感染細胞の培養上清を、アッセイの前にウイルスを不活化するためにβ-プロピオネートで処理する。Corcoranら(1988)J.Parasit.74:763。3HチミジンのNFS60細胞による取り込みを、細胞増殖の尺度として使用した。Jaffeeら(1993)Cancer Res.53:2221-2226。模擬感染CV-1細胞由来の上清の存在下での、3Hチミジン取り込みによる放射能をバックグラウンドとして差し引いた。ポジティブコントロールとしておよび生物学的活性の標準として、インタクトな11D10を使用する。あるいは、GM-CSFの標準溶液を使用し得る。
ワクシニア11D10ワクチンの試験
ワクシニア投与については、104〜107pfuのウイルス価をマウスに注射する。注射は皮下、筋肉内、皮内または腹腔内であり得る。免疫は毎週行う。マウスはAb3（Ab1'を含む）の測定のため各免疫の７日後に採血する。Ｔ細胞免疫性の発展についての試験を追加免疫の10日後に行う。マウスをまた、腫瘍チャレンジによって試験し得、そこで腫瘍細胞注射後の生存をモニターする。
ウイルス感染腫瘍細胞を介するワクシニア投与については、自己腫瘍細胞を、10％（vol/vol）のウシ胎児血清、２mMグルタミンおよびゲンタマイシンを含むEagle培地中で維持する。75cm2フラスコ中のコンフルエント細胞の単層に、（3×108）プラーク形成単位（pfu）のrvvを接種する。37℃で２時間後、接種物をDMEMに置換し、インキュベーションをさらに24時間継続した。顕微鏡下での検査の後、細胞をスクレーパーで回収し、PBSで２回洗浄し、所望の濃度（103〜105/200μl）でPBSに再懸濁する。６〜８週齢の雌性C57BL/6マウスをHarlan Bioproducts for Science Inc.（IN）から購入する。動物の左後脇腹に細胞性ワクチンを皮下注射し、２週間後、右後脇腹にチャレンジ用に腫瘍細胞を注射する。腫瘍チャレンジ後、マウスの生存および腫瘍の存在を毎日モニターする。腫瘍が測定可能であれば、腫瘍を週毎にカリパスで二次元に測定し、体積を式（幅2×長さ）／２を使用して計算する。明白であるが、体積を正確に測定するには小さすぎる腫瘍は０体積として記録されるが、腫瘍発現はポジティブとして記録される。腫瘍体積は、120日の観察期間にわたって実際に腫瘍を発生したマウスについてのみ平均する。０値は、最終的には腫瘍を発生するが所定の時点では腫瘍がなかったマウスについて含める。
統計学的評価
統計学的評価はSigmaStatソフトウェア（Jandel,Inc.San Rafael CA USA）を用いて行う。0.05未満のP値を統計学的に有意とみなす。
実施例７：11D10融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築
11D10の重鎖のVDJ可変領域をコードするcDNAを、プラスミドpUC911D10Vから単離し、図25に示したベクターに連結した。このベクターではマウスGM-CSFあるいはIL-2の成熟ペプチドをコードするDNAフラグメントを、CH3エキソンの3'側に連結した。これはCH3エキソンの最終コドンと停止コドンとの間にCla I部位、そしてその停止コドンの3'側にNotI部位を生成することによって実現された。11D10の軽鎖をコードするcDNAを、図25に示した発現プラスミドpSV184-ΔHneoに組み込んだ。pSV184ΔHneoプラスミドはShinら((1989)Meth.Enzymol.178:459-476)によって以前に記載された。
最初のトランスフェクション後、11D10の軽鎖を含むプラスミドを、Shinら(1989)の変法に従い、エレクトロポレーションにより以下のように上記細胞にトランスフェクトした。細胞を遠心分離によって増殖培地から取り出し、Iscoveの改変Dulbecco培地（IMDM,GIBCO）で２回洗浄した。細胞を4.5ｘ106/mlの濃度で冷IMDM（血清なし）に再懸濁した。この懸濁液から0.9ml（4×106細胞）を0.4cm BioRadキュベットに加えた。約20μgのpSV211D10VH-サイトカインDNAを、pSV211D10VH-サイトカインのEco RI部位の間に存在しない制限酵素（例えばPvuII）で線状化した。フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈澱の後、DNAを50μl未満のIMDMに懸濁し、細胞懸濁液に加えた。細胞懸濁液-DNA混合物を氷中で10分間冷却した後、Bio-Rad Gene Pulser Transfection Apparatusにより200V、960μFの電気容量で電気パルスを印加した。10分間の氷中でのインキュベーション後、細胞を、10％ウシ胎児血清を含む96mlのIMDMに懸濁し、８つの96ウェルのプレートに、マルチチャンネルピペットにより125μl／ウェル（5×103細胞／ウェル）で分配した。２日後、１ウェル当たり10％ウシ胎児血清および25μg／mlのマイコフェノール酸を含む125μlのIMDMを加えた。４日後、培地を各ウェルから半分除去し、125μlの1×IMDM-マイコフェノール酸培地を加えた。クローンが可視化した後（約10〜15日後）、トランスフェクトーマの検出のためのMC-10でのアッセイのために培養上清を取り出した。
表６は、構築した種々の発現プラスミドを示す。mIL-2およびmGM-CSFは、マウスのIL-2およびGM-CSFをそれぞれ意味する。VHおよびVLはシグナルペプチドを含んでいた。
0003683278.tif 000013
高産生トランスフェクトーマの検出には、細胞を限界希釈（１細胞／ウェル）後、96ウェルのプレートにプレートする。マイクロウェル中のクローンが可視化したが、まだ小さなままである場合、培養上清を、機能的な抗体の検出について、サンドイッチラジオイムノアッセイによりアッセイする。96ウェルプレートをMC-10でコートし、トランスフェクトーマからの50μlの培養上清を、コートした抗体と反応させる。各トランスフェクトーマにより産生される機能的な抗体の量は125I-標識MC-10によるラジオイムノアッセイによって決定される。高抗体産生トランスフェクタントのさらなる評価については、選択したクローン由来の培養上清の種々の希釈物を同様にアッセイする。
重鎖GM-CSF融合物を含むプラスミドを、Oiら（1986）BioTechniques 4:214-221の技法を使用し、原形質融合によりSp2/0細胞にトランスフェクトした。高産生クローンを融合タンパク質の最初の生化学的特徴付けのために選択した。
２回のELISAを以下のように実施した。アッセイ１では、マイクロタイタープレートを標準濃度のヤギ抗ヒトκ軽鎖（Orgomon Teknika Corp.West Chester,PA）でコートし、BSAでブロックし、そして洗浄した。種々の試験構築物を発現する細胞の培養物由来の上清を、次にウェルでインキュベートした。洗浄後、ウェルにアルカリホスファターゼ結合重鎖特異的ヤギ抗ヒトIgG1（Sigma）を重層し、通常の方法で発色させた。陽性反応は、上清が、予測したタイプのヒト重鎖および軽鎖の定常領域の両方を有する免疫グロブリンを含んでいることを示した。アッセイ２を、ビオチン結合ラット抗マウスGM-CSF（Pharmingen）、続いてアビジンペルオキシダーゼ結合物（Sigma）を使用して発色させた以外は類似の様式で行った。陽性反応は、上清が、ヒト軽鎖およびGM-CSF成分（重鎖Ｃ末端に期待される）を有する免疫グロブリンを含んでいることを示した。
表７は、９クローンの上清を重鎖にカップリングした軽鎖の存在（アッセイ１）およびGM-GSF活性（アッセイ２）についてアッセイした結果を示す。結果は、軽鎖、重鎖、およびGM-CSFについて決定基を同じ分子上に含む、多くの結合タンパク質が得られたことを示す。
融合タンパク質を、Sepharose-protein Aカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、下記のように以下の抗体および標準を用い特徴づける：モノクローナルマウス抗ヒトIL-2（Genzyme,code,DNA-1）、標準天然ヒトIL-2（BRL cat.#13288-014）；モノクローナル抗マウスIL-2（UBI,cat.#05-115）、標準マウス組換えIL-2（Sigma,cat,#I 4517）；ヒトGM-CSF標準を用いたヒトGM-CSFアッセイキット（R&D System cat.DGM00）、ラット抗マウスGM-CSF（BRL,cat.#13306-014）、標準マウス組換えGM-CSF（UBI,cat.#01-167）。
0003683278.tif 000014
精製したキメラ（すなわち融合）タンパク質を、還元条件下および非還元条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。分子量標準および精製した11D10をこの実験に含めた。タンパク質のバンドをクーマシーブリリアントブルー染色により染色した。MC-10（Ab1）と11D10（元のAb2）およびHMFG（名目上の抗原）との結合に対する精製融合タンパク質の効果を、阻害RIAにより、この融合タンパク質のAb1結合特異性を確立するためのAb2の特徴付けのために、予め行ったように研究した。標識Ab1とSKBR3（HMFG発現乳ガン細胞株）細胞との結合の融合タンパク質による阻害は、抗原抗体結合の特異性についてのさらなる支持を提供する。マウスIL-2の生物学的活性を、CTLL-2Ｔ細胞の懸濁液を用いる細胞増殖アッセイにより決定する。サンプルおよび標準を、完全RPMI-10培地に系列希釈し、50μlのアリコートを96ウェルプレートのウェルに分注した。CTLL-2細胞を活動対数期まで増殖させ、完全RPMI-10で洗浄して、残りのIL-2を除去する。細胞を完全RPMI-10中に1×105細胞／mlで懸濁する。細胞を３群に分割し、１セットにモノクローナル抗マウスIL-2を投与し、１セットに抗ヒトIgGγ鎖を投与し、そして残りの１セットにこれらの抗体の希釈に使用する溶液を投与する。細胞懸濁液（50μl、5×103細胞）を各ウェルに加える。細胞をCO2インキュベーターで37℃にて24時間インキュベートする。3H-チミジンを加え、インキュベーションをさらに24時間継続し、その後細胞を回収し、そして取り込まれた放射能を測定する。抗体の有無によるウェル中のカウントの差分を、サンプルあるいは標準の正味の生物学的活性とみなす。11D10もまたこれらアッセイに含め、抗体自体がCTLL-2の細胞増殖を誘導し得るかどうかを決定する。ヒトIL-2の生物学的活性を、特異的な抗体の存在下および非存在下で、CTLL-2細胞を用いて同様に評価した。GM-CSFの生物学的活性については、類似の細胞増殖アッセイを行う。マウスおよびヒトのGM-CSFについては、NFS-60細胞（Holmesら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)82:6687-6691）およびM-07e細胞（Genetics Institute）をそれぞれ使用する。
データ解釈、予想される結果、起こり得る問題および代替のストラテジー。還元条件下でのSDS-PAGEは、11D10および融合タンパク質の両方について25Kd付近のタンパク質バンドを示すと予測される；より高分子量のバンドは、トランスフェクトーマが重鎖と融合したサイトカイン−抗体融合タンパク質を産生したことを示す。非還元条件下の電気泳動により、テトラマーの免疫グロブリンが形成されたかどうかを決定することは可能である。その場合、融合タンパク質は一本のバンドを形成し、その分子量はサイトカイン分子の２倍に相当する量だけ高いはずである、すなわち、融合タンパク質は、サイトカインに関してはダイマーである。サイトカインに対するELISAおよび生物学的アッセイは、サイトカイン分子が発現されているかどうか、そして生物学的に活性であるかどうかを示す。標準組換えサイトカインを用いる定量アッセイは、融合タンパク質として存在するサイトカインの生物学的活性が、遊離のサイトカインと比較して、匹敵するかあるいは増強されているかどうかを示す。コントロールの抗体と比較して対応する抗体による、サイトカインの生物学的活性の阻害は、サイトカインの作用が特異的であることを示す。抗ヒトIgGγ鎖による、サイトカインの生物学的活性の阻害は、サイトカイン部分がIgとの融合分子として存在していることを示す。
実施例８：11D10scFの発現および特徴付け
11D10のためのVH-(GGGS)3-VL（配列番号46）をコードするcDNA構築物を調製する。この11D10フラグメントに対するcDNAを、pET-22b(+)プラスミドベクター（Novagen,Madison,WI）に組み込み、E.coli中で発現させる。配列分析を行い、VLのフレームワークに結合したVHのカルボキシ末端を含みリーダー領域を含まないプラスミド構築物を確認する。pET-22b(+)は、６つの連続したヒスチジン残基（His6）からなるニッケルイオン結合ドメインを含む。His6ドメインは、ニッケルに対して高親和性を有し、これを組換え11D10scFvの精製に使用する。
細胞結合競合アッセイを、11D10scFvが、インタクトな11D10によって示される抗原模倣物を保持しているかどうかを調べるために行う。HMFGポジティブMCF-7あるいはSKBR3（50μl容量で1×105細胞／ウェル）を96ウェルプレートに播く。細胞を、[125I]MC-10（Ab1）（100,000cpm）とともに室温で2時間、漸増濃度の11D10あるいは11D10scFvフラグメントの非存在下あるいは存在下でインキュベートする。％阻害を以下の式に従い計算する。
0003683278.tif 000015
ここで、R7は実験ウェルの平均放射能であり、RMAXはタンパク質が全く存在しないときの放射能であり、そしてRCはバックグラウンドの放射能である。
実施例９：マウスにおける組換え11D10ポリヌクレオチドワクチンの試験
組換え候補11D10ポリヌクレオチドワクチンを本明細書中に記載のように調製する。10〜15匹の雌性C57BL/6マウス（６〜８週齢）からなる２群を、Bhattacharya-Chatterjeeら(1988)により記述されるグルタルアルデヒドを使用してKLHとカップリングした50〜100μg用量の精製プラスミドで筋肉内に免疫した。
さらに、種々の投与経路（例えば、筋肉内、皮内、皮下、および腹腔内）を比較する。
Ab3（Ab1'を含む）産生を確認するために、各免疫の７日後に、上記のようにマウスから採血する。追加免疫の10日後に、Ｔ細胞増殖アッセイ用の脾臓を単離するために、各群３匹のマウスを屠殺する。
観察された任意の効果が特異的であるか否かを決定するため、非特異的な体液性あるいは細胞性免疫（注射されたポリヌクレオチドによって誘導されるサイトカイン産生のような間接メカニズムによる）との対比として、以下のコントロールを使用する：(a)11D10ポリヌクレオチドインサートを有さないプラスミド；(b)11D10ポリヌクレオチドインサートを逆（すなわちアンチセンス）方向に有するプラスミド；および(c)無関係のAb2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド。
実施例１０：HMFG関連疾患が進行性の患者への11D10の投与により誘発される免疫応答のさらなる解析
実施例５に記載のようなミョウバン（BB-IND#5745）で沈澱させた抗Id 11D10を用いた乳ガン患者の臨床試験のための米国FDA第Ib相を、12人の患者を含むように拡張した。全ての患者が進行性の乳ガンに罹患しており、以前に標準的な治療法で処理されており、そして彼らの腫瘍細胞は、モノクローナル抗体MC-10（BrE1）によって規定されるように乳ガン抗原HMFGについてポジティブであった。患者を、ランダムに１回の注射につき1mg，2mg，4mg，または8mgの用量の11D10アルゲル（ミョウバン）に割り当てた。この患者を、皮内注射で１週間おきに最低４回免疫した。患者の疾患が進展するまで、治療を月単位で継続した。患者は疾患の活動について非常に綿密に監視され、そして疾患の進展あるいは死亡のために全員がこの研究からはずされた。12人の患者のこの研究の詳細を表８に示す。
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毒性
毒性は、軽い紅斑および硬化を伴う、注射部位での局所的な反応のみとわずかであった。抗Id処置は、造血細胞、腎機能あるいは肝機能に対してにいかなる有害効果も有さなかった。
抗イディオタイプに対する体液性応答
ミョウバン沈澱させた抗Id 11D10（実施例４に記載されたように調製）を用いた免疫によって誘導された体液性免疫の発達を、治療前およびワクチンでの各処置後の患者の血清を試験することにより評価した。10人の患者の内の５人から得た超免疫血清（4回目の免疫後）は、Ab2 11D10での免疫に対して、抗イソ／アロ／抗抗イディオタイプ応答を含む、顕著なレベルの全ヒト抗マウス抗体応答を示した。次に、これらの患者の血清を、ラジオイムノアッセイにより125I-MC-10(Ab1)とプレート上のAb2 11D10との結合を阻害する能力あるいはその逆（プレート上のAb1に対する放射標識Ab2の結合の阻害）について、チェックをした。これらの反応を、イソタイプおよびアロタイプの決定基に対してヒト抗体をブロックするために、過剰な正常マウスIgの存在下で行った。
図27AおよびBは、患者１（患者１のデータは実施例５でも議論されている）を含む１０人の患者のデータを示す。患者１、５、６、７および12由来の血清は、希釈率１：100でさえも有意な阻害を示した。患者１、５、６、７および12由来の免疫前血清はいかなる阻害も示さなかった。まとめると、これらの結果は、患者１、５、６、７および12は、有意な抗抗イディオタイプ抗体（Ab3）を生じたが、他の患者（２、３、８、９、および10）は、有意なAb3反応性を生じなかったことを示す。
次に、本発明者らは、免疫患者において抗Id 11D10が抗腫瘍抗原（HMFG）特異的抗体応答を誘導し得るかどうかを調べた。このためには、４回目の免疫後に血清の患者１、６および12から得た血清を、抗Id 11D10カラムでアフィニティー精製し、精製したAb3を、マイクロタイタープレート上にコートしたHMFG抗原（Ceriani博士から得た融合タンパク質；Laroccaら(1992)）に対してELISAアッセイにより試験した。
結果を図28に示す。患者#1、６、および12からの精製したAb3血清は、コントロール抗Id 3H1で処置した大腸ガン患者から得た精製したAb3と比較して、HMFG抗原に特異的な結合を示した。11D10で免疫した患者の血清における抗体（Ab1'）のアイソタイプは、ほとんどがIgGであった。
抗イディオタイプに対する細胞性免疫応答
細胞性免疫応答を、ミョウバンで沈澱させた抗Id 11D10およびイソ、アロタイプがマッチしたコントロールの抗Id 3H1とともにインキュベートした末梢血単核細胞の増殖により測定した。ポジティブの増殖応答は、患者#1、５、６、および12において見られたが、試験した他の患者では見られなかった。図29Aおよび29Bは、それぞれ患者#1および５のデータを示す。患者の免疫前細胞は増殖応答は有さないが、超免疫細胞は、抗Id 11D10に対する有意な応答を有した。コントロールの抗Id 3H1に対する応答も存在した；この応答は11D10に対する反応より弱く、マウス免疫グロブリン分子の非イディオタイプ成分に対する応答を表しているようである。
この結果は、実施例５の知見は、抗Id 11D10が、進行性の乳ガン患者（他の多くの処置も受けていた）において、体液性および細胞性の両方の免疫応答を誘導し得ることを支持することを確証する。
前述の発明は、明瞭な理解のために例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、特定の変更および改変を実行することは当業者に明らかである。したがって、記載および実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって正確に記載される。
部分配列表
(xi)配列：配列番号１
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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