(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクター粒子を濃縮する方法において、
エンベロープを有するベクター粒子を生育させ、前記エンベロープを有するベクター粒子は、レトロウイルス由来の起源を有するヌクレオキャプシド蛋白質を含むヌクレオキャプシドと、前記ヌクレオキャプシド蛋白質によってキャプシド封入される核酸配列と、膜会合蛋白質とを含むものとし、前記膜会合蛋白質は、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質とし、
前記ベクター粒子を回収し、
前記ベクター粒子を濃縮して前記ウイルス粒子を含むペレットを形成する
ことを特徴とするベクター粒子の濃縮方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ペレットを液体に再懸濁し、前記液体を第２のサイクルの濃縮に供することを更に含む方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記液体を、TNEおよび0.1％ハンクス平衡塩溶液よりなる群から選択する方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記ベクター粒子を、少なくとも108cfu/mlの力価まで濃縮する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記ベクター粒子を、少なくとも109cfu/mlの力価まで濃縮する方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記ペレットが、濃縮前に存在したコロニー形成単位の50％以上を保持する方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記ペレットが、濃縮前に存在したコロニー形成単位の90％以上を保持する方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、濃縮工程が超遠心分離を含む方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、濃縮工程が、ろ過およびクロマトグラフィよりなる群から選択される方法を含む方法。
【請求項１０】
エンベロープを有するベクター粒子の溶液であって、前記エンベロープを有するベクター粒子が、レトロウイルス由来の起源を有するヌクレオキャプシド蛋白質を含むヌクレオキャプシドと、前記ヌクレオキャプシド蛋白質によってキャプシド封入される核酸配列と、膜会合蛋白質とを含むものとし、前記膜会合蛋白質が、水泡性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質とし、前記溶液が、少なくとも108cfu/mlの力価を含むことを特徴とするエンベロープを有するベクター粒子の溶液。
【請求項１１】
請求項10記載の溶液において、少なくとも109cfu/mlの力価を含む溶液。
【請求項１２】
請求項10記載の溶液において、前記ベクター粒子が、VSV−Ｇ蛋白質である膜会合蛋白質を含む溶液。
【請求項１３】
請求項10記載の溶液において、前記ベクター粒子が、MoMLVヌクレオキャプシド蛋白質を含む溶液。
【請求項１４】
哺乳動物以外の種の細胞に外来核酸を導入するための組成物の調製の際にベクター粒子を使用する方法において、前記ベクター粒子が、
前記外来核酸と、
前記核酸をキャプシド封入するヌクレオキャプシドであって、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質を含む前記ヌクレオキャプシドと、
前記ヌクレオキャプシドを囲繞する膜であって、これに会合した水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質を有する前記膜と
を含むことを特徴とするベクター粒子の使用方法。
【請求項１５】
請求項14記載の使用方法において、前記レトロウイルスをMoMLVとする使用方法。
【請求項１６】
請求項14記載の使用方法において、前記核酸配列がプロモーターに機能的に連結され、ポリペプチドへと発現可能な遺伝子をコードする使用方法。
【請求項１７】
請求項16記載の使用方法において、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターを含む使用方法。
【請求項１８】
請求項14記載の使用方法において、前記核酸配列が、前記細胞のゲノムに組み込まれるに至る使用方法。
【請求項１９】
請求項14記載の使用方法において、前記核酸が選択可能マーカーを含む使用方法。
【請求項２０】
請求項19記載の使用方法において、前記選択可能マーカーがネオマイシン耐性遺伝子である使用方法。
【請求項２１】
請求項14記載の使用方法において、前記哺乳動物以外の種が魚類である使用方法。
【請求項２２】
請求項14記載の使用方法において、前記哺乳動物以外の種が昆虫である使用方法。
【請求項２３】
請求項22記載の使用方法において、前記昆虫がカである使用方法。
【請求項２４】
請求項14記載の使用方法において、前記哺乳動物以外の種が両生類である使用方法。
【請求項２５】
請求項24記載の使用方法において、前記両生類がカエルである使用方法。
【請求項２６】
請求項14記載の使用方法において、前記細胞が生殖細胞である使用方法。
【請求項２７】
哺乳動物以外の種の細胞に外来核酸を導入する方法において、ベクター粒子を前記細胞に感染させることを含み、前記ベクター粒子が、
前記外来核酸と、
前記核酸をキャプシド封入するヌクレオキャプシドであって、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質を含む前記ヌクレオキャプシドと、
前記ヌクレオキャプシドを囲繞する膜であって、これに会合した水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質を有する前記膜と
を含むことを特徴とする外来核酸の導入方法。
【請求項２８】
請求項27記載の方法において、前記レトロウイルスをMoMLVとする方法。
【請求項２９】
請求項27記載の方法において、前記核酸配列がプロモーターに機能的に連結され、ポリペプチドへと発現可能な遺伝子をコードする方法。
【請求項３０】
請求項29記載の方法において、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターを含む方法。
【請求項３１】
請求項27記載の方法において、前記核酸配列を相補的RNAへと転写することを更に含む方法。
【請求項３２】
請求項28記載の方法において、前記RNAの翻訳を介して前記ポリペプチドを発現させることを更に含む方法。
【請求項３３】
請求項27記載の方法において、前記核酸配列が、前記細胞のゲノムに組み込まれるに至る方法。
【請求項３４】
請求項27記載の方法において、前記核酸が選択可能マーカーを含む方法。
【請求項３５】
請求項34記載の方法において、前記選択可能マーカーがネオマイシン耐性遺伝子である方法。
【請求項３６】
請求項27記載の方法において、前記哺乳動物以外の種が魚類である方法。
【請求項３７】
請求項27記載の方法において、前記哺乳動物以外の種が昆虫である方法。
【請求項３８】
請求項37記載の方法において、前記昆虫がカである方法。
【請求項３９】
請求項27記載の方法において、前記哺乳動物以外の種が両生類である方法。
【請求項４０】
請求項39記載の方法において、前記両生類がカエルである方法。
【請求項４１】
哺乳動物以外の種の生殖細胞に外来核酸を導入する方法において、
請求項27記載の方法により前記生殖細胞に前記外来核酸を導入し、
前記胚を成体へと生育させ、
前記成体を繁殖させF2世代を生成し、
前記外来核酸を担持するF2世代を生産する成体を同定することを含み、前記成体が前記外来核酸をその生殖系列に含む
ことを特徴とする外来核酸の導入方法。
【請求項４２】
請求項41記載の方法において、前記レトロウイルスをMoMLVとする方法。
【請求項４３】
請求項41記載の方法において、前記外来核酸がプロモーターに機能的に連結され、ポリペプチドへと発現可能な遺伝子をコードする方法。
【請求項４４】
請求項43記載の方法において、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターを含む方法。
【請求項４５】
請求項43記載の方法において、前記核酸配列を相補的RNAへと転写することを更に含む方法。
【請求項４６】
請求項43記載の方法において、前記RNAの翻訳を介して前記ポリペプチドを発現させることを更に含む方法。
【請求項４７】
請求項41記載の方法において、前記核酸配列を前記生殖細胞のゲノムに組み込むことを更に含む方法。
【請求項４８】
哺乳動物以外の種の生殖細胞に外来核酸を導入する方法において、
請求項27記載の方法により前記生殖細胞に前記外来核酸を導入し、
前記哺乳動物以外の種の胚に前記生殖細胞を移植して、前記胚を成体へと生育させ、
前記成体を繁殖してF2世代を生成し、
前記外来核酸を担持するF2世代を生産する成体を同定することを含み、前記成体が前記外来核酸をその生殖系列に含む
ことを特徴とする外来核酸の導入方法。
【請求項４９】
請求項48記載の方法において、前記哺乳動物以外の種の生殖細胞についての抗体を使用して前記生殖細胞を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般に、改変した宿主範囲を有するウイルスベクターの分野に関する。更に詳しくは、本発明は、高い力価の偽型（pseudotyped）レトロウイルスベクターの生成に関する。
発明に関する政府の権益
ここに開示する発明の所定の観点は、国立衛生研究所からの米国公衆衛生制度助成金HD20034およびAl28945の下で米国政府の支援により行われたものである。米国政府は、米国において、この発明のこれらの観点について所定の権利を有する。
発明の背景
エンベロープを有する動物ウイルスの組立は、ウイルスゲノムとアクセサリーウイルス蛋白質とが、出芽ウイルス粒子内に選択的に封入されることを特徴とする。選択的なキャプシド封入（encapsidation）またはパッケージングの機構は十分に特徴付けられていないが、ウイルスのヌクレオキャプシドによる細胞膜内におけるウイルスエンベロープ蛋白質の認識が、パッケージングの特異性についての１つの可能性のある調節点に相当すると予測されている。
内部イメージ抗イディオタイプ抗原を使用し、Vauxら（Nature（London）336:36−42（1988））は、セムリキ・フォーレスト（Semliki Forest）ウイルス（SFV）のヌクレオキャプシドが、ウイルス粒子E2のスパイク糖蛋白質の細胞質尾部のための特異的な受容体を含むことを示した。Vauxらは、二者の間の特異的な受容体−リガンド様相互作用が、SFVおよび関連するウイルスの感染細胞からの出芽の機構に非常に重要である可能性があることを示唆した。
E2蛋白質に対するSFVの高度の特異性に対して明らかに対照をなすのは、「偽型（pseudotype）」形成の周知の現象であり、この場合、１つのウイルスと複数のレトロウイルスによる細胞の混合感染の結果、他のもののエンベロープ蛋白質によってキャプシド封入された１つのウイルスのゲノムを担持する子孫ウイルスが生成する。このような表現型が混合したウイルスは、適当な指示体細胞上でプラークを形成し、特異的なエンベロープ蛋白質に対して増強した血清によって中和することができる。偽型の形成に関与することが知られているウイルスの１つは、ラブドウイルス科（rhabdovirus family）の一員である水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus,VSV）である。
関連しないウイルスのウイルス粒子に１つのウイルスのエンベロープ蛋白質が封入される機構は不明確である。VSV G蛋白質とレトロウイルスのエンベロープ蛋白質との配列比較によっては、これらの蛋白質の間の有意な配列の類似性は明らかとならない。また、従来は、他のVSVコード蛋白質の非存在下で、Ｇ蛋白質が単独で偽型の形成に関与し得るか否かを決定することも困難であった。２つのアルファウイルスの間で、またはアルファウイルスと日本脳炎ウイルスのような関連するフラビウイルスとの間で偽型が形成され得るにも拘わらず、VSVとSFVのようなアルファウイルスとの間では偽型は形成されない。
幾つかの場合においては、VSVと家禽ペストウイルス（fowl plaque virus,FPV）との場合、またはVSVとシンドビス（Sindbis）ウイルスとの場合のように、表現型の混合は一方的となる。FPVのエンベロープ蛋白質によってキャプシド封入されたVSVゲノムを含む偽型ウイルス粒子VSV（FPV）、および偽型ウイルス粒子VSV（Sindbis）が示されているが、VSV G蛋白質を用いてFPVまたはSindbisウイルスゲノムを含む逆の偽型、FPV（VSV）またはSindbis（VSV）は検出されていない。
レトロウイルスおよびVSVによる混合感染の結果、通常は同じ細胞から生成されたVSVの場合より遥かに低い力価を有する偽型が形成される。これは、レトロウイルスのヌクレオキャプシドとＧ蛋白質との間の相互作用の特異性によるのか、または他の要因によるのかは明らかではない。
ウイルスの感染過程を利用することにより、レトロウイルスベクターは、遺伝子を効率的に転移（transfer）させるのに使用されている。レトロウイルスのゲノムにクローン化された外来遺伝子は、レトロウイルスによる感染に対して感受性の細胞に効率的に伝達することができる。他の遺伝子操作を介して、レトロウイルスゲノムの複製能力を破壊することができる。ベクターは、新しい遺伝材料を細胞に導入するが、複製することはできない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング系を使用して、ベクター粒子の組立および放出を可能とすることができる。ここで使用するように、「ベクター粒子」という用語は、ウイルス様の侵入機構を介して核酸を細胞に導入し得るウイルス様の粒子を指す。このようなベクター粒子は、所定の状況下で、感染した細胞への遺伝子の転移を媒介することができる。
他の近縁のウイルス由来のエンベロープ遺伝子を含ませることにより、このようなベクターが感染し得る細胞の範囲を改変することができる。Millerら（Mol.Cell.Biol.5:431−437（1985））は、選択可能マーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素を感受性の細胞に導入するためにMoMLVから誘導されたベクターを構築し、関連する両栄養性（amphotropic）レトロウイルス4070A由来のエンベロープ領域を含ませ、ベクターの宿主範囲を広げた。異なるウイルス由来のエンベロープ蛋白質の置換により宿主細胞範囲を改変したレトロウイルスベクターの偽型が、他の研究者によって記載されている。テナガザル系サルの白血病ウイルスのエンベロープ蛋白質を両栄養性レトロウイルスエンベロープにより置換した結果、MoMLVエンベロープ蛋白質を含むレトロウイルスベクターを用いた感染には感受性ではない種であるウシおよびハムスター細胞に感染可能なベクターが得られた（Millerら、J.Virol.,65:2220−2224（1991））。同様に、HTLV1エンベロープ蛋白質の置換により、MoMLVに基づくベクターの宿主細胞範囲がHTLV1により感染可能な細胞に制限されることが示されている（Wilsonら、J.Virol.,63:2374−2378（1989））。
モロニーのネズミ白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus,MoMLV）から誘導されたレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞への安定な遺伝子転移のための重要な道具である。これらは、遺伝子の制御および発現を研究し、ヒト遺伝子治療の研究のために遺伝子転移を促進させるべく使用されている。これらのレトロウイルスベクターの使用に対する２つの重要な制限は、宿主細胞の範囲が限定されていることと、高い力価のウイルスを生産することができないことである。レトロウイルスベクターによる感染は、宿主範囲を特定し感染の効率を決定する、ウイルスエンベロープ糖蛋白質と細胞受容体との特異的な相互作用の結果である。遠心分離または他の物理的手段によってレトロウイルスベクターを濃縮する試みは、一般に力価が最小限増加するのみで、感染性のウイルスの喪失に帰着する。レトロウイルス粒子の不安定性は、エンベロープ蛋白質の構造的特徴に関連すると考えられ、したがってエンベロープ成分の改変により、結果的により安定な粒子が得られる可能性がある。
前記したように、ベクター粒子の機能的な組立を指向するのにどのようなシグナルが必要とされるかは明らかではなく、どのような因子により、ヌクレオキャプシドと膜会合蛋白質（membrane−associated protein）とが相互作用してパッケージングを完結させるのかも知られていない。よって、従来は、異種膜会合蛋白質をベクター粒子内に含ませることによる宿主範囲の変更は行われていなかった。「異種膜会合蛋白質」は、ベクター粒子のヌクレオキャプシド蛋白質の起源として、同じウイルスの科（family）のウイルス以外の少なくとも１つの起源を有する膜会合蛋白質を意味する。ここで使用するように、ウイルスの「科」は、ウイルスの分類に関する国際会議によって指定されたように、科の分類順位に言及するよう使用される。
発明の要旨
この発明の１つの態様によれば、外来核酸を哺乳動物以外の種の細胞に導入する方法が提供される。この方法は、ベクター粒子を細胞に感染させることを含む。ベクター粒子は次の成分：外来核酸、核酸をキャプシド封入するヌクレオキャプシド（ヌクレオキャプシドは、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質を含む）、およびヌクレオキャプシドを囲繞する膜を含む。膜は、これに会合した水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質を有する。好適な実施形態では、レトロウイルスはMoMLVとする。他の好適な実施形態では、核酸配列は、プロモーターと機能的に連結させ、ポリペプチドへと発現可能な遺伝子をコードするものとする。１つの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターを含む。他の実施形態は、核酸配列を相補的RNAへと転写させることを含む。更なる実施形態は、RNAの翻訳を介してポリペプチドを発現させることを含む。好ましくは、核酸配列は、細胞のゲノムに組み込まれるに至るものとする。他の好適な実施形態では、核酸は選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子とすることができる。他の実施形態では、哺乳動物以外の種は、ゼブラダニオ（zebra fish）のような魚類、カ（mosquito）のような昆虫、またはカエル（frog）のような両生類とする。
この発明の他の態様によれば、ベクター粒子を濃縮する方法が提供される。この発明のこの態様は、エンベロープを有するベクター粒子を生育させることを伴う。粒子は、レトロウイルス由来の起源を有するヌクレオキャプシド蛋白質を含むヌクレオキャプシドと、ヌクレオキャプシド蛋白質によりキャプシド封入された核酸配列と、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質とする膜会合蛋白質とを含む。またこの方法は、ベクター粒子を回収し、ベクター粒子を濃縮してウイルス粒子を含むペレットを形成することを含む。好適な実施形態では、濃縮工程は、超遠心分離、ろ過、またはクロマトグラフィとする。好適な実施形態は、ペレットを液体に再懸濁し、これを第２のサイクルの超遠心分離に供することを更に含む。更に好適な実施形態では、液体は、TNEまたは0.1％ハンクス（Hank's）平衡塩溶液とする。この方法の好適な実施形態では、ベクター粒子は少なくとも108cfu/mlの力価、特に好ましい実施形態では、少なくとも109cfu/mlの力価に濃縮する。他の実施形態では、ペレットは、超遠心分離の前に存在したものの50％を越えるコロニー形成単位を保持する。更に他の実施形態では、ペレットは、超遠心分離の前に存在したものの90％を越えるコロニー形成単位を保持する。
この発明の他の態様によれば、少なくとも108cfu/mlの力価を含むレトロウイルス粒子の溶液が提供される。好適な実施形態では、溶液は少なくとも109cfu/mlの力価を含む。この溶液の１つの実施形態では、レトロウイルス粒子は、膜会合蛋白質、すなわちVSV−Ｇ蛋白質を含む。この溶液の他の実施形態では、レトロウイルス粒子は、MoMLVヌクレオキャプシド蛋白質を含む。
この発明の更に他の態様によれは、哺乳動物以外の種の生殖細胞に外来核酸を導入する方法が提供される。この発明のこの態様では、この方法は、哺乳動物以外の種の個々の一員の胚をベクター粒子に晒すことを含む。ベクター粒子は、外来核酸と、核酸をキャプシド封入するヌクレオキャプシドと、ヌクレオキャプシドを囲繞する膜とを含む。ヌクレオキャプシドは、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質を含み、膜は、これに会合したVSV G蛋白質を有する。この方法は、胚を成体へと生育させ、成体を繁殖（ブリード）させF2世代を生成し、外来核酸を担持するF2世代を生産する成体を同定することを更に含む。成体は、その生殖系列に外来核酸を含む。この発明の１つの実施形態では、レトロウイルスはMoMLVとする。他の実施形態では、外来核酸はプロモーターに機能的に連結し、ポリペプチドへと発現可能な遺伝子をコードするものとする。プロモーターは、組織特異的プロモーターとすることができる。好適な実施形態では、外来核酸配列はプロモーターに機能的に連結し、相補的RNAへと転写され、必要に応じて更にポリペプチドへと翻訳され得る遺伝子をコードするものとする。１つの実施形態では、核酸配列は、生殖細胞のゲノムに組み込まれる。
この発明の他の態様によれば、哺乳動物以外の種の生殖細胞に外来核酸を導入する方法が提供される。この方法は、哺乳動物以外の種の生殖細胞をベクター粒子に晒すことを含む。ベクター粒子は、外来核酸と、核酸をキャプシド封入するヌクレオキャプシドと、ヌクレオキャプシドを囲繞する膜とを含む。ヌクレオキャプシドは、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質を含み、膜は、これに会合するVSV G蛋白質を有する。この方法は、哺乳動物以外の種の胚に生殖細胞を移植し、胚を成体へと生育させ、成体を繁殖させてF2世代を生成し、外来核酸を担持するF2世代を生産する成体を同定することを更に含む。成体は、その生殖系列に外来核酸を含む。好適な実施形態では、哺乳動物以外の種の生殖細胞に対する抗体を使用して生殖細胞を同定する。
本発明の更に他の態様によれば、高い力価のレトロウイルスベクターを生成する方法が提供される。この方法は、レトロウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の生産をコードする第１の核酸配列を含む宿主細胞を取得し、レトロウイルスの長末端反復配列（LTRs）と所望の外生遺伝子とを含む第２の核酸配列を宿主細胞に導入し、これにより組み換え宿主細胞を造成することを含む。その後、プロモーターに機能的に連結した第３の核酸配列を、組み換え宿主細胞に導入する。第３の核酸配列は、細胞質、膜横断および細胞外ドメインを有する膜会合蛋白質をコードする。この結果得られるレトロウイルス粒子は、内部に膜会合蛋白質を有するエンベロープと、外生遺伝子を含むゲノムとを含む。好適な実施形態では、第１の核酸配列は、レトロウイルスのgagおよびpol遺伝子を含む。他の実施形態では、レトロウイルスはMoMLVとする。更に他の好適な実施形態では、第２の核酸配列は、選択可能マーカーをコードするものとする。選択可能マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子とすることができる。更に他の実施形態では、所望の外生遺伝子は、ポリペプチドへと発現可能なものとする。この発明のこの態様によれば、第２の核酸配列を含むゲノムを有するウイルスを宿主細胞に感染させるか、または第２の核酸配列を含むプラスミドを用いて細胞の形質移入（transfect）を行うことにより、第２の核酸配列を宿主細胞に導入することができる。第３の核酸配列を含むゲノムを有するウイルスを宿主細胞に感染させるか、または第３の核酸配列を含むプラスミドを用いて細胞の形質移入を行うことにより、第３の核酸配列を宿主細胞に導入することができる。この発明の好適な実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスから誘導する。他の実施形態では、蛋白質は、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質とする。更に他の実施形態では、蛋白質は、CD4蛋白質のような非ウイルス蛋白質とする。本発明のこの態様の特に好適な形態は、レトロウイルス粒子を濃縮することを更に含む。好適な実施形態では、濃縮工程は超遠心分離を含む。この発明のこの態様の他の好適な実施形態は、レトロウイルス粒子を細胞に感染させることを含む。１つの実施形態では、細胞は、生体内で（in vino）生きた生物中に配置する。他の実施形態では、細胞は試験管内で（in vitro）生育させる。
本発明の更に他の態様によれば、レトロウイルスヌクレオキャプシド蛋白質の生産をコードする第１の核酸配列と、レトロウイルスの長末端反復配列および所望の外生遺伝子を含む第２の核酸配列とを含む組み換え宿主細胞が提供される。１つの実施形態では、宿主細胞は293GP細胞とする。他の実施形態では、第２の核酸配列は、選択可能マーカーをコードするものとする。選択可能マーカーはネオマイシン耐性遺伝子とすることができる。更に他の実施形態では、所望の外生遺伝子は、ポリペプチドへと発現可能なものとする。
本発明の更に他の態様によれば、所望の遺伝子を細胞に導入する方法が提供される。この方法は、レトロウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質の生産をコードする第１の核酸配列と、レトロウイルスの長末端反復配列および所望の外生遺伝子を含む第２の核酸配列とを含む組み換え宿主細胞を取得することを含む。膜会合蛋白質をコードする遺伝子を担持するベクターを宿主細胞に導入し、組み換え宿主細胞中でレトロウイルス粒子を生産する。これらのレトロウイルス粒子は、内部に膜会合蛋白質を有するエンベロープと、外生遺伝子を含むゲノムとを含む。これらのレトロウイルス粒子を使用して細胞に感染させる。細胞は生体内に配置することができ、または代替的に、試験管内に配置することができる。１つの実施形態では、第１の核酸配列は、レトロウイルスのgagおよびpol蛋白質をコードする。他の実施形態では、レトロウイルスはMoMLVとする。更に他の実施形態では、第２の核酸配列は、選択可能マーカーをコードするものとする。この選択可能マーカーはネオマイシン耐性遺伝子とすることができる。好適な実施形態では、所望の外生遺伝子は、ポリペプチドへと発現可能なものとする。この発明のこの態様の好適な形態では、導入工程は、組み換え宿主細胞にウイルスを感染させるか、またはプラスミドを用いて組み換え宿主細胞の形質移入を行うことを含む。好適な実施形態では、膜会合蛋白質は、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇ蛋白質とする。他の実施形態では、膜会合蛋白質は、CD4蛋白質のような非ウイルス蛋白質とする。本発明のこの態様の特に好適な形態は、細胞に感染させる前にレトロウイルス粒子を濃縮することを含む。好適な実施形態では、濃縮工程は超遠心分離を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、レトロウイルスベクター粒子の造成のためのレトロウイルスベクターおよびパッケージング構成体pLRNL、pLARNL、pLGRNL、pSVGPおよびpSAMの概略説明図である（スケールに準じて示していない）。
図２は、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとして使用した、LGRNL感染細胞のサザンブロット分析を示す図である。
図３はSDS−PAGEにより分離し、フルオログラフィにより目視可能とした免疫沈降物を示す図である。レーン１および２は、抗VSV Gおよび通常のウサギ血清を用いて免疫沈降させたポリクローナルセルラインをそれぞれ示す。レーン３は、抗VSV G抗体を用いて免疫沈降させた模擬（mock）感染MDCK細胞である。
図４は、プールし、１週間生育させた後、FACS選別（sorting）により再単離した、選択した細胞の免疫沈降物を示す図である。レーン１は、抗VSV−Ｇ抗体を用いて免疫沈降させた２回選別細胞の抽出物を示し、レーン２、３および４は、それぞれ図３のレーン３、２および１に対応する。
図５は、MoMLV gagおよびpol遺伝子を用いて安定に形質移入した293生産体細胞の表面上でのVSV−Ｇ蛋白質の発現のフローサイトメトリーによる分析を示す図である。マウス免疫グロプリンを用いて染色した陰性対照細胞（Ａ）、および抗VSV−Ｇモノクローナル抗体を用いて染色した細胞（Ｂ）の両者についての結果を示す。
図６は、40の野生型胚（レーン１〜２）、40のLSRNLに晒した胚（レーン３〜６）、50のLGRNL（VSV−Ｇ）に晒した胚（レーン７〜11）、DNAのない陰性対照（レーン12）、100pgのpLGRNL（レーン13）および0.1pgのpLSRNL（レーン14）から抽出した増幅DNAのハイブリダイゼーションを示す図である（32P標識したneo PCR生成物プローブを使用した）。
図７は、LGRLN（VSV−Ｇ）を感染させた、および対照（感染させていない）アフリカツメカエル（Xenopus）A6細胞から抽出したゲノムDNAのPCRの結果を示す図である。レーン１は、感染させていないA6細胞のSac I消化からの断片を示す。レーン２および３は、プラスミドpLGRNL感染細胞のSac I消化からの断片を示す。レーン５および６は、A6クローンのBamH I消化物を示す。レーン７は、感染させていないA6細胞のBamH I消化物からの断片を示し、レーン８は、プラスミドpLGRNL感染細胞のBamH I消化からの断片を示す。
図８は、pLSPONLレトロウイルスベクターの構造を示す図である。
図９は、pHCMV−Ｇプラスミドの制限地図である。
図10は、ラット208F繊維芽細胞ラインおよび種々のヒトセルラインにおける両栄養性対応物LSPONL（Ａ）に対する偽型ウイルスLSPONL（Ｇ）のG418耐性を示す図である。
図11は、異なる感染多重度（MOI）のLSPONL（Ｇ）またはLSPONL（Ａ）に晒した後の初期（primary）肝細胞により分泌されたHBsAgのレベルを示す図である。
発明の詳細な説明
関連しないウイルス由来の特定の膜会合蛋白質をレトロウイルスのベクター粒子に組み込み、広範なスペクトルの細胞に渡る改変された宿主範囲を提供することができることをこの度突き止めた。
モデル系として、モロニーのネズミ白血病ウイルス（MoMLV）に基づくベクター粒子にVSV G膜会合蛋白質を組み込み、そのエンベロープ内に、MLVから誘導されたヌクレオキャプシドと膜会合蛋白質VSV Gとを有するレトロウイルスベクター粒子を生成した。このようなベクター粒子は、ここではMLV［VSV G］という命名により言及するものとする。この命名は、ここでは一般に１つのウイルス起源由来のヌクレオキャプシドと他の起源由来の膜会合蛋白質とを有するベクター粒子に言及すべく使用するものであり、この命名において括弧を付けいてない部分はキャプシドの起源を指し、括弧を付けた部分はベクター粒子のエンベロープ内の膜会合蛋白質を指す。
ベクター粒子の生成のために、本発明のベクター粒子の核酸を使用し、適切なセルラインに形質移入することができる。ベクター粒子は、形質移入された細胞から上澄へと放出され、これを所望の細胞型に感染させるのに使用する。形質移入（transfection）のために使用する核酸は、単離された形態とすることができ、または既にベクター粒子にパッケージされたものとすることができる。場合により、ウイルス粒子の組立を促進するためにヘルパー粒子を必要とする。よって、例えばgapおよびpol遺伝子をコードする遺伝子をヘルパーウイルスの核酸に組み込むことができ、他のウイルス由来の機能性配列を核酸に組み込み、これをベクター粒子にパッケージすることができる。
膜会合エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子は、ベクター粒子またはヘルパーウイルスの核酸に組み込むことができる。代替的に、このエンベロープ蛋白質のための遺伝子は、核酸の第３の断片から、または生産体の細胞のゲノムから発現させ得る。本発明の好適な形態では、ベクター粒子により感染された細胞の細胞ゲノムにベクター粒子内の核酸を組み込み、ベクター粒子ゲノムである核酸とは異なる核酸の断片上にエンベロープ遺伝子を位置させる。よって、この好適な実施形態では、ベクター粒子由来の組み込まれた核酸を含むベクター粒子感染細胞によっては、膜会合蛋白質は生産され得ない。
以下に説明するように、VSV G蛋白質は単独で、MLV［VSV G］ベクター粒子の形成の際に、MoMLVのヌクレオキャプシドと相互作用するのに十分であることを見出した。VSV G蛋白質をベクター粒子に組み込む過程は効率的なものであり、その結果、レトロウイルス全体のものと対比し得る力価を有する感染性のベクター粒子が生産される。よって、他の異種膜会合蛋白質も、エンベロープを有するウイルスのエンベロープに効率的に組み込むことができると考えられる。
MoMLVは、マウス細胞の外では感染性が貧弱なネズミのレトロウイルスである。このエコトロピック（ecotropic）ウイルスを、例えばN2ベクターゲノムを担持するレトロウイルスベクター粒子の生産に適用する場合、このベクターは、相当な効率でマウス細胞のみに感染することとなろう。関連する両栄養性（アンフォトロピック）N2ウイルスは、ヒト、マウスおよび他の生物由来の細胞に感染することとなろう。この差は、両栄養性エンベロープ蛋白質をエコトロピックエンベロープ蛋白質により置換したことに帰し得る。両者の型のウイルスベクター粒子は、MoMLVから誘導された本質的に同一のヌクレオキャプシドを有する。しかしながら、エコトロピックN2および両栄養性N2共にハムスター細胞には感染し得ない。以下に説明する実施例で示すように、ハムスター細胞はMLV［VSV G］ベクター粒子によって感染させることができ、このようなウイルス粒子の調製物に抗VSV血清を添加すると、その感染性が完全に排除されることを見出した。よって、ベクター粒子におけるVSV G蛋白質の存在は、結果的に、エンベロープに組み込まれた膜会合蛋白質の起源であるVSVから誘導された宿主範囲を有するベクターを与えることが示された。
異種膜会合蛋白質を含むベクター粒子が効率的に組み立てられるか否かを決定するために、VSV G蛋白質が、MoMLVのヌクレオキャプシドを用いて組み立てられるか得るか否かを試験した。最初に、ベクター粒子のための選択可能マーカーとして、ネオマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Neo）を両栄養性パッケージングセルラインPA317に導入した。この結果得られたベクター粒子を、両栄養性MLVの感染を支持し得ない細胞に添加した。ベビーハムスター腎臓（Baby Hamster Kidney,BHK）細胞は、両栄養性細胞表面受容体を欠如し、従って実施例１の実験において以下に示すように、両栄養性MLVに基づくレトロウイルスによる感染に感受性ではない。
最初の実験で、このセルラインは、両栄養性のMLVレトロウイルスによる感染に対して実際に無反応性であることを確認した。最初の実験の次の設定を実施例１に示す。これらの実験では、Neo遺伝子を含む両栄養性のN2ウイルスは、ラット208F繊維芽細胞においては生育し得るが、BHK細胞においては生育し得ないことを確認した。
実施例１
ラット208F繊維芽細胞におけるN2ウイルスの生育
MoMLVの長末端反復配列（LTRs）の間に挿入されたNeo遺伝子を含む両栄養性のN2ウイルスを生産体セルラインPA317/N2から調製し、MoMLVレトロウイルス感染に感受性のセルラインであるラット208F繊維芽細胞およびBHK細胞の両者に対する力価を測定した。ラット208F細胞と比較して、BHK細胞においては、Neo耐性（Neor）コロニー形成単位（CFU）の105倍の減少が観察され、よって使用したBHK細胞は、両栄養性レトロウイルスエンベロープ蛋白質を含むN2ウイルスによる感染を支持することはできなかった。
最初の検討が完了したところで、異種膜会合蛋白質を含むエンベロープを有するベクター粒子を生成させた。このような生成の例として、実施例２を設けて、VSV G蛋白質をコードするMLVに基づくレトロウイルスベクターを使用する両栄養性N2 MLV［VSV G］ベクター粒子の生成を示す。MLV［VSV G］ベクター粒子をBHK細胞上で検定し、両栄養性のMLVに対してこれらのベクター粒子の宿主範囲が変化したか否かを決定した。
実施例２
MLV［VSV G］ベクター粒子の生成
MLV［VSV G］ベクター粒子を製造するために、図１に示すようなMoMLVに基づくベクターを使用した（スケールに準じて示したものではない）。pLRNLにおいて、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus,RSV）プロモーターから発現されるNeor遺伝子は、MoMLVのLTRsの間に挿入されている。MoMLVに基づくレトロウイルスベクターpLRNLは、RSVのプロモーターの調節下のNeo耐性（Neor）遺伝子を含む。このベクターは、Liら、Virology,171:331−341（1989）に記載されている。単一のBamH1部位が、RSVプロモーターの直ぐ下流にある。このBamH1部位に、VSV G遺伝子の全コード領域を含む1.7キロベース対（kb）のBamH1断片を挿入し、構成体pLGRNL（ATCC番号75473）を生成した。このVSV G遺伝子は、Roseら、Cell 30:753−762（1982）およびRoseら、J.Virol.,39:519−528（1981）に記載されている。MoMLVのgag領域、MoMLVと両栄養性ウイルス4070Aとの間のハイブリッドpol領域、および4070Aのenv領域を含む、同様に図１に示すプラスミドpSAMは、Millerら、Science,225:630−632に記載されている。
HPRT欠損208F細胞は、Quade,K.Virology,98:461−465（1979）に記載されたように、６−チオグアニンによる選択によってFischerラット細胞から誘導した。チミジンキナーゼ（Tk）欠損BHK細胞は、Littlefieldら、Nature 211:250−252（1966）に記載されたように、５−ブロモデオキシウリジンを用いた選択によってBHK21細胞から誘導されたものである。これらのBHK細胞および208F繊維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）を補填した高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DME）中で生育させた。
感染性のベクター粒子を生成するために、MoMLV gag蛋白質、ポリメラーゼ遺伝子、およびSV40初期プロモーター由来の両栄養性エンベロープ蛋白質を発現するヘルパーベクターpSAMを用いて、pLGRNLまたはpLRNLをBHK細胞に同時形質移入（cotransfect）させた。形質移入の48時間後に形質移入したBHK細胞から上澄を集め、感受性の208F細胞および耐性のBHK細胞に感染させるのに使用した。ウイルスの力価を測定するために、4mg/mlポリブレン（polybrene）の存在下でろ過した上澄を用いて細胞に一夜感染させた。感染細胞は、400mg/mlのG418を含む培地中で選択し、感染後約14日間コロニーを評価した。この実施例の実験の結果を表１に示す。
0003655307.tif 000002
表１から、VSV G蛋白質を欠如するpLRNLから誘導したベクター粒子は、208F細胞に感染できたが、BHK細胞には感染できなかったことが分かる。これに対して、VSV G蛋白質を含むpLGRNLから誘導したベクター粒子は、Neorコロニーの出現によって示されるように、208F細胞のみならず、BHK細胞にも感染することができた。よって、MLV［VSV G］ベクター粒子の宿主範囲が、両栄養性MLVに対して改変された。
よって、実施例２のpLGRNL形質移入したBHK細胞により生産されたVSV G蛋白質は、少なくとも幾つかのレトロウイルスベクター粒子に組み込まれ、ハムスター細胞に感染し得るMLV［VSV G］ベクター粒子を生成すると考えられる。pLGRNLによりコードされる唯一のVSV蛋白質はVSV G蛋白質であるため、表１に示す実施例２の結果は、他のVSVコード蛋白質の複製がなくても、Ｇ蛋白質単独で、MLV［VSV G］ベクター粒子の形成に十分であることも示す。よって、実施例２は、１つのウイルス由来のヌクレオキャプシドと異種膜会合蛋白質とを有する感染性のベクター粒子を組み立て得たことを示す。
発明の背景において前記銘記したように、VSVとレトロウイルスとの混合感染は、結果的にVSV感染単独で得られるものより低いベクター粒子の力価を与えるものであった。Ｇ蛋白質とレトロウイルスヌクレオキャプシドとの間の貧弱な特異性により生ずるウイルス粒子への効率の低い組み込みの結果であるより寧ろ、この低い力価は、VSV G蛋白質の毒性の結果として、レトロウイルスによりコードされるような蛋白質を含む細胞蛋白質の合成の連続的な阻害によるものと考えられる。
よって、ヌクレオキャプシドの起源として同一の科に由来する膜会合蛋白質の存在が、ベクター粒子の形成に必要であるか否かを決定するために、MLVと同一の科に由来する起源を有するエンベロープ蛋白質を何ら用いることなく、MLV［VSV G］ベクター粒子を形成する実験を行った。このような実験の例を実施例３に示す。
実施例３
Env遺伝子産物を伴わないMLV［VSV G］ベクター粒子の形成
この実験のために、図１に示す２つの更なるベクター、pLARNLおよびpSVGPを作製した。pLARNLは、pLGRNLの作製と同様にしてpLRNLから作製したが、両栄養性レトロウイルス4070Aのエンベロープ（env）遺伝子を含む2.7kbのXbal断片をpLRNLのBamH1部位に挿入した。pSVGPは、SV40初期プロモーター並びにpSAM由来のgagおよびpol領域を含む5.8kbのHind III−Sca I断片を、Okayamaら、Mol.Cell.Biol.,3:280−289（1983）に記載された哺乳動物発現ベクターpcDに挿入することにより構築した。図１の「Poly A」は、SV40から誘導されたポリアデニル化シグナルを示す。
この例では、pSVGPを用いてpLRNL、pLARNLまたはpLGRNLをBHK細胞へ同時形質移入した。ベクター粒子を生成するために、Grahamら、Virology 52:456−457のリン酸カルシウム沈殿手順を使用し、10μｇのpSVGPと共に10μｇのベクターDNAを細胞へ同時形質移入した。形質移入の36時間後に培養培地を集め、0.45mmのフィルターによりろ過した。
構成体pSVGPは、SV40初期プロモーターから発現されたgagおよびpol遺伝子を含むが、MoMLV Env遺伝子は存在しない。前記したように、Neorマーカー（pLARNLまたはpLGRNL）を発現するベクター粒子を、208FおよびBHK細胞上で別々に力価測定した。得られた力価を表２に示す。
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表２の結果から、pLRNLおよびpSVGPにより同時形質移入した細胞からは、感染性のベクター粒子は検出されなかったことが分かる。両者のプラスミド中には、MoMLV env遺伝子が存在しないからである。両栄養性のMLV Env遺伝子を含むpLARNLおよびpSVGPを用いて同時形質移入した208F細胞は、200〜300CFU/mlのNeor力価を生成したが、この調製物はBHK細胞に感染することはできなかった。しかしながら、208FおよびBHK細胞の両者は、pSVGPを用いて構築したVSV G遺伝子を含むベクター粒子から誘導したpLGRNLによって類似する効率で感染を受けた。LGRNLベクター粒子は、MoMLV env蛋白質の完全な非存在下で生成されたため、表２に示す実施例３の結果は、ヌクレオキャプシドの起源として同一の科のウイルスに由来する起源を有するエンベロープ蛋白質関与を何ら伴うことなく、異種膜会合蛋白質をベクター粒子へと組み立てることができるという結論を導くものである。Ｇ蛋白質は、この実施例で使用したVSVコード蛋白質の全てでもあるため、これによりMLV［VSV G］ベクター粒子の形成には、Ｇ蛋白質以外のVSV遺伝子産物は必要ないことが確認される。よって、一般に、外来の膜会合蛋白質をベクター粒子に導入するためには、追加的な遺伝子産物は必要ないと考えられる。
一次的に（transiently）生成したLGRNLおよびLARNLベクター粒子を208F細胞上で検定した場合、類似する力価のNeo耐性が得られた。レトロウイルスenv遺伝子およびVSV G遺伝子の両者の発現は、これらの構成体では、同一のMoMLV LTRによって制御されているため、形質移入したBHK細胞における一次的に生産された蛋白質の量は類似するものと考えられる。しかしながら、２つの蛋白質の安定性が異なり得る可能性を排除できない。いずれにしろ、これらの構成体および類似する構成体を使用して、他の膜会合蛋白質を同様に発現させることができると考えられる。
よって、ヌクレオキャプシドと異種膜会合蛋白質との間の相互作用は、異種膜会合蛋白質に対して少なくとも同程度に効率的であるか、またはより以上に効率的たり得ると考えられる。MLV［VSV G］ベクター粒子の場合、MLVから誘導されたヌクレオキャプシドおよび膜会合蛋白質の両者を有するベクター粒子を用いるよりも、低い力価のMLV［VSV G］ベクター粒子による方が208F細胞の感染の効率が大きいことが観察された。ネズミレトロウイルス、例えばMLVの受容体は、細胞表面蛋白質であることが示されているが、膜のリン脂質がVSVの受容体であるという幾つかの証拠があり、VSVの広い宿主範囲を可能性として説明している。したがって、MLV［VSV G］ベクター粒子のここで観察されたNeor力価は、envを含むMoMLVベクター粒子を用いた場合よりも、MLV［VSV G］ベクター粒子を用いた場合に増加した感染に対する細胞の感受性を反映するものである。
MLV［VSV G］のようなベクター粒子を用いた感染の特異性が、膜会合蛋白質によって決定されるか否かを確認するために、膜会合蛋白質に対して特異性を有する中和抗血清を用いてベクター粒子を処理することができる。特異性が膜会合蛋白質によって決定されるならば、この種の中和抗血清によって、中和された粒子による感染が阻止されよう。よって、異種膜会合蛋白質を有するベクター粒子が、膜会合蛋白質によって決定される感染の特異性を与えるか否かを決定するために、実施例４の実験を行った。実施例４では、抗VSV血清を使用して、MLV［VSV G］ベクター粒子の感染性を中和した。
実施例４
MLV［VSV G］ベクター粒子の中和
pSVGPを用いてpLARNLまたはpLGRNLの同時形質移入により一次的に生成したベクター粒子を、通常のウサギ血清を用いて、またはLee Biomolecular Research Laboratories社から購入したウサギ抗VSV血清の種々の希釈物（1:500、1:100および1:20）を用いて37℃で45分間インキュベートした。pLARNLまたはpLGRNLを用いたpSVGPのBHK細胞への同時形質移入の48時間後に上澄を回収した。前記したように、208F細胞およびBHK細胞上でのNeorコロニーの形成について検定することにより、ベクター粒子を定量した。結果を表３に示す。
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表３の結果から、1:100希釈の抗VSV血清は、両者の細胞型に対してLGRNLベクター粒子の感染性を顕著に低減させたが、208F細胞に対するLARNLの力価は、VSV抗血清に晒すことによっては影響を受けなかった。この観察は、VSV G蛋白質は、LGRNLのベクター粒子へと組み立てられるという我々の考えを更に支持する。
表２に詳述した実施例３の結果により示されたように、VSV G蛋白質のベクター粒子への組み込みは効率的なものであった。pSVGPを用いてpLGRNLまたはpLARNLの同時形質移入により一次的に生成したベクター粒子は、208F細胞上で類似するNeor力価を与えたためである。次に、VSV G蛋白質のような膜会合蛋白質を粒子エンベロープに組み込むプロセスが、本来の粒子エンベロープ蛋白質の存在下で同等に効率的か否かを測定した。この測定は、pSAMと共にpLGRNLをBHK細胞中へ同時形質移入し、抗VSV抗体が直接作用する補体媒介溶解により純粋なベクター粒子と表現型的に混合した粒子との割合を分析することにより行った。これらの実験を実施例５に示す。
実施例５
MLV［VSV G］ベクター粒子の補体媒介溶解
種々の量の特異的な抗血清、補体または等容量の通常の血清を含む最終容量200μｌのDMD−10％FCS中の細胞上澄を含むベクター粒子を、37℃で45分間加熱した。その後、４μg/mlポリブレンの存在下で、混合物を培養培地に添加した。感染細胞は、前記したように、G418含有培地中で選択した。pLARNLまたはpLGRNLを用いたpSAMのBHK細胞への同時形質移入の48時間後にウイルス上澄を回収した。10μｌのウサギ補体を用いるか用いることなく、10μｌのウサギ血清または10μｌの抗VSV血清を用いて（1:20希釈）上澄を処理した。全ての反応は200μｌの最終容量で行い、37℃で45分間加熱した。結果を表４に示す。
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表４から、何ら処理しなくても、一次的に生成したLGRNLベクター粒子は、208F細胞上で380CFU/ml、BHK細胞上で260CFU/mlのNeor力価を与えることが分かる。同じベクター粒子調製物に対する通常のウサギ血清の添加は、力価に何ら影響を与えなかった。これに対して、抗VSV抗体の1:20希釈物を用いてベクター粒子を予備処理すると、力価は、208F細胞上で270CFU/mlへと、BHK細胞上ではバックグラウンドレベルへと低下した。この結果は、この調製物におけるVSV G蛋白質のみを含むLGRNLベクター粒子の力価は、208F細胞上で約110CFU/mLであることを示す。レトロウイルスエンベロープ蛋白質のみを含むベクター粒子の画分、およびこの調製物におけるレトロウイルスエンベロープ蛋白質とVSV G蛋白質との両者を含むベクター粒子の画分を測定するために、ウサギ補体と抗VSV抗血清との組合せを用いてベクター粒子調製物を処理した。
補体媒介溶解の増強効果は、MLV［VSV G］ベクター粒子を効率的に除去するために、他によって先に示されている。ベクター粒子調製物へのウサギ補体単独の添加により、Neor力価が、208F細胞上で320CFU/mlへと、BHK細胞上で230CFU/mlへと僅かに低減するのは（表４参照）、恐らく培地中のウシ胎児血清とウサギ補体との非特異的な相互作用によるものである。ウサギ補体と共に1:20希釈の抗VSV抗体を用いて前処理したベクター粒子は、208F細胞上で90CFU/mlのNeorを与えた。よって、このNeorベクター粒子の中和されていない集団は、レトロウイルスのエンベロープ蛋白質のみを含むものと考えられる。この解釈は表４にも示した結果と一貫するものであり、この場合はレトロウイルスエンベロープ蛋白質のみを含むLARNLベクター粒子は、208F細胞上で測定した場合、そのNeor力価に対する効果は殆ど有していない。よって、元のエンベロープ蛋白質の存在下であっても、VSV G蛋白質および他の膜会合蛋白質が、ベクター粒子に効率的に組み込まれ得る可能性がある。
レトロウイルスのDNAは、プロウイルス配列と呼ばれる配列中でウイルスゲノムの直鎖状の構造を維持する様式で宿主染色体に組み込まれる。異種膜会合蛋白質を有するエンベロープを有するベクター粒子による感染に起因する細胞クローンが、ベクター粒子の核酸の直鎖状の構造を維持するプロウイルス配列を含むことを確定するために、LGRNL感染クローンのサザンブロット分析を行った。これらの実験を実施例６に示す。
実施例６
LGRNL感染細胞のサザンブロット分析
Maniatisら、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY（1982）により記載されたように、ゲノムDNAを調製した。適切な制限酵素を用いてDNAサンプルを消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロンメンブレンに移した。ランダムデオキシヘキサヌクレオチド（Amersham）を用いて開始（priming）することにより調製した完全なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む32P標識DNAプローブを、フィルターを用いるハイブリダイゼーションプローブとして使用した。0.1×SSC−0.5％SDSを用いてフィルターを53℃で数回洗浄し、オートラジオグラフィに供した。
２つの異なるNeorクローン（レーンＢおよびＣ）、およびLGRNLベクター粒子により感染させた２つの異なるNeor BHKクローン（レーンＤおよびＥ）からゲノムDNAを単離した。Sst1を用いてDNA（10μｇ）を切断し、１％アガロースゲル上で流し、ナイロン型フィルターに移し、Neo遺伝子特異的プローブを用いてプローブ処理した。Sst1により消化した５ナノグラムのpLGRNLプラスミドDNAをレーンＡに装填し、マーカーとして使用した。この結果得られたサザンブロットを図２に示す。
Sst1は、LTRおよびLGRNLをそれぞれ１回のみ開裂させるため、5kbの断片を生成すると予期される（図１参照）。図２のレーンＢ〜Ｅから分かるように、２つのBHKクローンおよび２つの208Fクローンからの染色体DNAを、Sst1により開裂し、Neo遺伝子を含むプローブとハイブリダイズさせたところ、約5kbの断片が検出された。この断片の大きさは、レーンＡで認められるSst1開裂したpLGRNLプラスミドDNAのものと同一であった。よって、実施例６の結果は、LGRNLプロウイルスDNAは、感染した細胞中で中断されず再配置されていない構造を有すると認められることを示す。この結果は、野生型のレトロウイルス感染について見られるものと同一である。よって、他の組み換えベクター粒子も、中断されず再配置されていないプロウイルスDNA配列を同様に形成すると考えられる。
このような組み換えベクター粒子は、そのエンベロープ内に存在する膜会合蛋白質の宿主範囲を獲得することを示すために、pLGRNLおよびpLARNLから誘導されたベクター粒子を用いて種々のセルラインに感染させた。これらの検討を実施例７に示す。
実施例７
MLV［VSV G］の宿主範囲の決定
HeLa細胞は、American Type Culture Collectionから取得した。LNSV細胞は、SV40で形質転換したHPRT欠損Lesch−Nyhan細胞（Jollyら、Mol.Cell.Biol.,6:1141−1147（1986）に記載されている）から誘導した。ラット208F細胞およびBHK細胞は前記した通りである。pLARNLまたはpLGRNLを用いたpSVGPのBHK細胞への同時形質移入の48時間後に上澄を回収した。その後、等容量の各上澄を４つの異なる細胞型に施し、Neor力価をG418選択の２週間後に測定した。実験は３回繰り返した。このような実験の１つの結果を表５に示す。
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前記したように、この検討で使用したLARNLのenv遺伝子は、両栄養性ウイルス4070Aのenv領域から誘導したものである。この遺伝子によってコードされるエンベロープ糖蛋白質は、ヒト細胞を含む広い範囲の哺乳動物種由来の細胞上に存在する細胞表面受容体に結合することができる。しかしながら、幾つかのヒトラインは、ネズミ細胞と比較して両栄養性ウイルスの感染に対しては相対的に無反応性である。表５に示すように、HeLa細胞またはLNSV繊維芽細胞のようなヒトラインにおけるLARNLのNeor力価は、ラット208F細胞における場合と比較して約20倍低い。表５にも示すように、LGRNLベクター粒子は、LARNLベクター粒子より僅かに大きい効率でHeLa細胞に感染したが、これらはLARNLベクター粒子と比較して遥かに大きい効率でLNSV繊維芽細胞に感染した。
pLGRNLから誘導されたMLV［VSV G］ベクター粒子のLNSV細胞上での感染の効率が優れているため、レトロウイルスによるLNSV細胞の感染に対する主要な障害は、細胞表面受容体とレトロウイルスエンベロープ蛋白質との効率の悪い相互作用によるものと考えられる。細胞表面受容体と相互作用することが知られている膜会合蛋白質をレトロウイルス内に封入すれば、この障害が克服されると考えられる。よって、誘導されたベクター粒子のエンベロープ内に異種膜会合蛋白質を含ませることにより、エンベロープを有するベクター粒子の宿主範囲を改変する一般的な方法が見出されたと考えられる。
LGRNLのMLV［VSV G］ベクター粒子によるHeLa細胞の感染において見られた比較的効率の低い結果は、HeLa細胞表面受容体との貧弱な相互作用によるものとは思われない。寧ろ、VSVはHeLa細胞に効率的に感染するため、前記観察された効率の低い結果は、恐らく侵入後の問題によるものと思われる。
現在のところ、レトロウイルスベクターは、新しい遺伝情報を哺乳動物細胞に導入するための最も効率的な方法を提供するものである。両栄養性のエンベロープ蛋白質を含むベクター粒子は、ヒト細胞に感染し得るため、これらは、ヒトにおける遺伝的障害の処置のための潜在的に有用な道具を代表する。しかしながら、表５に示すように、幾つかのヒト細胞は、両栄養性のレトロウイルス感染に対して比較的抵抗性である。両栄養性のレトロウイルス受容体が比較的少数しか存在しないこと、細胞質中で逆転写が不十分であること、またはヒト細胞に組み込まれていないウイルスDNAの分解が加速されることは、それぞれレトロウイルスベクターによるヒト細胞の非効率的な感染の原因となり得る。
我々の発見は、同一の科のウイルスから誘導された膜会合蛋白質により与えられる限定された範囲を超えて、ヒトおよび他の細胞のレトロウイルス感染の効率を増加させる方法を提供するものである。この発見は、膜会合蛋白質をレトロウイルスに組み込むことにより、レトロウイルスベクターの宿主範囲を改変することによって、少なくとも幾つかの感染に対する潜在的な障害を克服することができ、これにより外来遺伝子のこれらの細胞へのより効率的な転移を促進するというものである。この系は、感染単位を造成するためにヘルパーウイルスを使用する。この単位は、宿主ゲノムへの組み込みを可能とするレトロウイルスの要素、外来遺伝子の発現を調節するための制御要素、選択可能細胞マーカー、および／または他の外来遺伝子を含む。この単位は、与えられた群の細胞を標的とするよう設計される。感染性の幅は、所定の範囲の細胞型に結合するよう操作される蛋白質の能力によって特定される。これらの成分遺伝子は、当業者に公知のいずれかの様式によって、結果的に得られたベクターへと導入することができる。
他のウイルスをこの系で使用し得ることが想定される。他のレトロウイルス由来の長末端反復配列を、限定されるものではないが、RSV、HIV、トリ白血病ウイルス（Avian Leukemia Virus）および他のネズミ白血病ウイルスよりなる群から使用することができる。キャプシド蛋白質は、これらのウイルスまたは他のウイルスから誘導することもできる。
発明者らは、そのモデルにおいて、ネオマイシン耐性の発現を調節するためにRSVプロモーターを使用した。他のマーカーには、ハイグロマイシン耐性、およびジヒドロ葉酸還元酵素（メトトレキセート耐性）が含まれる。同様に、他のプロモーターも使用することができ、必ずしも限定されるものではないが、サイトメガロウイルス前初期（immediate early）プロモーター、SV40が含まれる。プロモーターは、所望に応じて発現を有効に駆動するように、または比較的弱い発現を与えるように選択することができる。
加えて、以下により詳細に記載するように、標的とする細胞集団内での発現のための外来遺伝子をベクターに付加することができる。この種の外来遺伝子の発現を与えられた細胞型に限定するために、与えられた組織特異性を備えたプロモーターを使用することもできる。例えば、膵臓エラスターゼプロモーターは、膵臓組織の発現に特異的である。他の例は、肝臓に特異的な様式で遺伝子発現を制御するヒト肝炎Ｂコア遺伝子の内部プロモーターであろう。脳および他の組織についても他の組織特異的プロモーターが存在する。
VSV G蛋白質についての例で記載したような、本発明に従って使用した場合に改変された宿主範囲を与える良好な候補者である、VSV G蛋白質以外の膜会合蛋白質は、宿主受容体に結合し感染を促進する他のエンベロープを有するウイルス由来の蛋白質を含む。我々の発見により、あらゆる膜会合蛋白質の選択的な除去、および改変された範囲の細胞を標的とする核酸伝達系を造成するためにこの蛋白質を使用することが可能となる。１つの例として、HSV（ヘルペスシンプレックスウイルス）由来のgD遺伝子を使用し、ヒト組織の神経節を含む宿主範囲の取得を図ることができる。多数のこの種のウイルス性および非ウイルス性のものの例は、当業者に容易に明らかであろう。
非ウイルス性の膜会合蛋白質を使用してベクター粒子の宿主範囲を改変することもできる。与えられた細胞受容体または細胞表面部分に対してリガンドとして相互作用する蛋白質は、与えられた細胞受容体または細胞表面部分を有する所定の宿主範囲の細胞をベクター粒子が標的とするための候補者であると考えられる。適切な蛋白質は、ベクター粒子のために宿主範囲を特定するよう働き得る結合領域を含み得る。問題となる蛋白質についての受容体の偏在に応じて、ウイルスベクターは、広範な範囲のヒト細胞、細胞の部分集団、または単一の細胞型を標的とするものとし得る。よって、例えば、潜在的には全てのヒト細胞、白血球細胞、またはＴヘルパー細胞のみを標的とすることができる。
この発明の１つの実施形態では、この種の蛋白質は、特定の細胞型に感染することが知られているウイルスから誘導する。しかしながら、本発明は、ウイルスより誘導された蛋白質に限定されるものではない。あらゆるリガンド／受容体の組合せをこの系で利用し得ることを企図する。機能性の系のための要件は、リガンド／受容体の組合せの特定、または治療法のためには、少なくともリガンドと相互作用し得る細胞型の幅を理解することである。この系の有用性は、リガンドのための受容体の利用可能性、およびそのリガンドのために与えられた受容体の親和力に依存し得る。
この発明の好適な形態では、膜会合蛋白質は、VSV G蛋白質のような宿主範囲を決定するウイルス蛋白質とする。しかしながら、事実上は細胞質、膜横断および細胞外ドメインを有するあらゆる蛋白質を、膜会合蛋白質として使用することができる。よって、例えば、HIV感染細胞の表面上でHIV gp120と相互作用することが知られているCD4は、このような細胞へ外来遺伝子を伝達するための組み換えベクター粒子において使用されるべき候補者である。Youngらは、他の技術を使用し、ヒトCD4細胞表面蛋白質をレトロウイルス粒子へと組み立てることができることを示した。トリ白血病ウイルス中へのCD4蛋白質の組み込みは、予め複製コンピテントALVベクターを感染させたウズラ細胞中でSV40に基づく発現ベクターによってこの蛋白質を一次的に発現させることにより試験された。CD4は、形質移入された細胞により生産されたALV粒子に組み込まれることが見出された。（Youngら、Science,250:1421−1423（1990）を参照することができる）。免疫細胞の他の膜蛋白質も導入することができる。種々の膜会合蛋白質の公知の親和力を使用し、結果的に得られるレトロウイルス粒子の宿主範囲を特定することができる。
HIVが感染した細胞を標的とし得るベクターの作製を説明するために、実施例８を設ける。Ｔヘルパー細胞膜会合表面抗原、CD4は、主要なHIV細胞表面受容体であることが知られている。CD4抗原は、HIV産生蛋白質、gp120とのリガンド−受容体相互作用を有する。よって、そのウイルスエンベロープと会合したCD4を有するベクター粒子は、HIVが感染した細胞を標的とする筈である。
実施例８
標的HIV治療法のためのベクター粒子
CD4をコードする配列をＴ細胞ラインから最初に取得する。簡略には、細胞を培養により生育させ、溶解させる。塩化セシウム勾配を使用し、これらの細胞から全RNAを精製する。全RNAを洗浄して沈殿させ、逆転写酵素およびオリゴdTプライマーを使用してこれからcDNAを合成する。CD4配列の5'および3'末端と相補的で、BamH1制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする尾部を含む適切なプライマー対を使用し、結果的に得られるcDNA/RNAハイブリッドをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のための鋳型として使用する。PCR生成物をアガロースゲル上で流し、予期される大きさ（約1.2kb）の断片を切断し、ゲルから溶出させる。溶出したDNAをBamH1を用いて消化し、このCD4コード配列の5'末端にプロモーターを付加する。この結果得られる配列をpLRNL中のBamH1部位にクローン化する。
よって、実施例８は、天然に存在する膜会合蛋白質により特定される宿主範囲を有するベクター粒子の生産を示す。ウイルスエンベロープ内に含ませるリガンドが天然に存在する膜会合蛋白質ではない場合は、リガンドと膜とを会合させる必要がある。これを達成するために、リガンドをコードする遺伝子を、膜会合ドメインをコードする配列と組み合わせることができる。「天然に存在する膜会合蛋白質」とは、細胞膜と会合して、またはウイルスのエンベロープ上に見出されるような、その本来の状態で生体内で脂質膜と会合して存在するような蛋白質を意味する。
本発明の好適な形態では、これは、与えられたキャプシド蛋白質を用いて安定に組み立てられるVSV G蛋白質または他のウイルスにより誘導されたエンベロープ蛋白質について、膜結合ドメインの近位リガンドをコードする遺伝子を組み換えることによって達成することができる。よって、筋肉および脂肪細胞上の受容体と相互作用することが知られているインシュリンのような蛋白質は、その膜会合ドメインをコードするVSV G配列、または安定なベクター粒子を形成する他の膜会合蛋白質由来の膜会合配列を備えたインシュリン遺伝子を含むことにより、適切なインシュリン受容体を有する細胞の感染性を取得するための運搬体を提供するものである。
前記銘記したように、エンベロープを有するベクター粒子による細胞の感染に対する主要な障害は、細胞表面受容体とウイルスエンベロープ蛋白質との効率の悪い相互作用によるものと考えられる。よって、これらの蛋白質の外部ドメインを膜または内部ドメインに連結して、機能性のベクター粒子を造成することができる。リガンド−受容体相互作用は、蛋白質とヌクレオキャプシドとの間の相互作用を伴うとは思われない。
セムリキフォーレストウイルスのヌクレオキャプシドは、ウイルスE2スパイク糖蛋白質の細胞質尾部のための特異的な受容体を含むが、この機構は、他のエンベロープを有するウイルスに対して必ずしも直接適用可能ではない。よって、SFVおよび他のアルファウイルスについては、E2スパイク糖蛋白質、または類似する蛋白質が効率的な感染のために必要である可能性がある。よって、SFVまたは他のアルファウイルス誘導ベクター粒子を本発明の文脈において使用すべき場合、ヌクレオキャプシドとの効率的な相互作用のために重要なE2スパイク糖蛋白質のこのような部分を含ませることが必要である。
ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルスは、細胞質尾部を欠如したエンベロープ蛋白質の変異形態を使用して、ベクター粒子を作製することができる。よって、レトロウイルスのエンベロープ蛋白質とそのヌクレオキャプシドとの間の相互作用が、出芽ウイルス粒子のエンベロープに糖蛋白質を組み込むのを媒介するために必要であるならば、この種の相互作用は、脂質二重層内またはその近傍で生起するものである。恐らく、この相互作用は、エンベロープ蛋白質の疎水性膜会合ドメイン内で生起する。よって、多くの系について、膜会合蛋白質の何らかの部分がベクター粒子の組立に重要である場合は、この部分は、膜会合ドメイン内またはそのドメインの近傍に存在すると考えられる。
よって、VSV G蛋白質のようなパッケージングに向かう能力を有する蛋白質由来の膜会合ドメインと、膜会合性であるか否かを問わず他のリガンドの少なくとも受容体結合部分とを有する組み換え蛋白質を形成することにより、ベクター粒子が所望の細胞型を標的とすることが可能となると考えられる。
よって、本発明の１つの実施形態として、カセット型の系が提供され、この場合、VSV G蛋白質または他の膜会合蛋白質由来の膜会合ドメインをコードする遺伝子の部分は、カセットベクターの不変部分として残るものとする。この不変領域に対して、所望のリガンド由来の部分を挿入する。これらの２つのドメインは組み換え蛋白質を形成し、これはヌクレオキャプシドと相互作用し、所望の１または複数の型について効率的な標的能力を有する構造的に無傷のベクター粒子を提供し得る。リガンドをこのカセットに挿入する場合は、翻訳の読取枠を維持し、全長の２機能性組み換え蛋白質のキメラの取得を図ることが重要である。「蛋白質のキメラ」は、２以上の蛋白質由来の核酸配列の領域を遺伝子的に連結することにより組み換えによって生成した生成物を記載するために使用するものであり、この場合、コードされる生成物は、１つの連続した蛋白質ではあるが、これらの蛋白質に由来するアミノ酸の配列を二重にしたドメインを含む。結局、十分なリガンド受容体相互作用が残留する限り、全長のエンベロープ蛋白質または膜結合以外の蛋白質を使用する必要性はない。
よって、本発明は、第１のウイルスと、更に核酸を含むベクター粒子の宿主範囲を特定するリガンドをコードする配列とに由来する機能性の配列を有する核酸を提供する。「機能性」とは、当該ウイルスによる典型的な野生型の複製または感染を伴うあらゆる配列を意味する。典型的な野生型の複製または感染に随伴するもの以外の配列も、ここに提供する機能性の核酸の内に含まれるものとすることができる。
核酸は、それ自体でベクター粒子の生産に向けることができ、またはpSVGPを用いたLGRNLの使用に関連して前記したように、ヘルパーウイルスを用いた同時形質移入を必要とし得る。このような核酸配列を用いた場合、遺伝子の伝達のために、与えられた細胞を与えられた粒子の標的とすべく、ハイブリッド組み換え蛋白質として、または全長遺伝子の発現産物として、このような宿主改変膜会合蛋白質を含むベクター粒子を組み立てることができる。
MoMLVのような典型的なレトロウイルス由来のエンベロープ蛋白質は、３つのドメインを含む。すなわち外部受容体結合ドメイン、膜会合ドメイン、および内部（細胞質）ドメインである。従来、効率的な粒子のパッケージングのためには、ヌクレオキャプシド蛋白質と相互作用するために細胞質ドメインが必要であると考えられていた。実施例９は、レトロウイルスのエンベロープ蛋白質ドメインは、レトロウイルスにより誘導されたヌクレオキャプシドを有するベクター粒子の効率的なパッケージングには必要ではないことを確認する実験の結果を示す。実施例９の実験においては、種々のレトロウイルスのドメインを有する組み換えキメラ蛋白質を構築し、この結果得られたベクター粒子のパッケージング効率を、VSV免疫反応性をCOS細胞に導入する構成体の能力によって検定した。
実施例９
レトロウイルス/VSV Gキメラ膜会合蛋白質を有するベクター粒子のパッケージング効率
２つのキメラ膜会合蛋白質遺伝子構成体を調製した。M2構成体は、MLVエンベロープ蛋白質の膜会合および細胞質ドメインに融合したVSV G外部受容体結合ドメインを含むものとした。M9構成体は、MLVエンベロープ蛋白質の細胞質ドメインをコードする配列に融合した、VSV G蛋白質の外部受容体結合ドメインおよび膜会合ドメインを含むものとした。
M2およびM9構成体を２つの発現ベクターのそれぞれに導入した。第１のベクター、pSLVは、SV40後期プロモーターおよび後期蛋白質ポリアデニル化シグナルを含むものとした。第２のベクター、pFR400は、SV40初期プロモーターおよびHBVポリアデニル化シグナルを含むものとした。よって、４つの発現構成体:pSVLM2、pSVLM9、pFR4M2、およびpFR4M9を作製した。これらの発現ベクターをCOS細胞に導入した。全長のVSV G膜会合蛋白質（pJM）および全長のMLVエンベロープ蛋白質（pSVLENV）を含むプラスミドも導入した。ウサギ抗VSV G蛋白質を使用する間接免疫蛍光を使用し、これらの細胞におけるVSV G蛋白質の免疫反応性を分析した。表６は、これらの実験の結果を示す。
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pJM由来の全長のVSV G蛋白質は、細胞内で、および細胞表面上で可視化可能であった。ハイブリッドM9蛋白質は、核周囲領域でのみ可視化可能であった。蛍光活性化細胞選別（fluorescent activated cell sorting,FACS）により、これらの細胞の10％のみがその細胞表面上でハイブリッドM9蛋白質を発現していると決定した。ウサギ抗VSV Gを使用する免疫沈降により、ハイブリッド蛋白質の分子量を確認した。移動度は、塩基配列から予測される蛋白質の大きさと一貫するものであった。
実施例９の実験の結果は、最も効率的なパッケージングは、全長のVSV G蛋白質の結果から得られ、MLV細胞質ドメインを有するいずれかのハイブリッド蛋白質は、細胞表面上でより低い効率で発現されることを示す。前記したように、レトロウイルスより誘導されたヌクレオキャプシドを有するベクター粒子の効率的なベクター粒子パッケージングのためには、レトロウイルスの細胞質ドメインが必要であるという一般的な考えがあったために、これを見出したのは予期しないことであった。よって、実施例９は、特定のウイルスから誘導されたヌクレオキャプシドを有するエンベロープを有するベクター粒子が、異種膜会合蛋白質によって効率的にパッケージされ得るという我々の驚くべき発見を確認するものである。
実施例９は、VSV G蛋白質細胞質および膜ドメインは、蛋白質を細胞表面に指向させるのにも有効であることを示す。よって、実施例９と同様の様式でハイブリッド蛋白質を造成し得ると考えられ、その場合は、VSV G蛋白質の細胞質および膜ドメインを組み合わせてベクター粒子のためのカセットを造成し、これにより種々の関連しない蛋白質由来の外部受容体ドメインが、カセットと共に使用し得るものとなる。
前記銘記したように、ベクター粒子の形成に関与する膜会合蛋白質の領域は、主として蛋白質の膜会合ドメイン内に存すると考えられる。よって、本発明のベクター粒子において有用な組み換えキメラ膜会合蛋白質は、ベクター粒子へと効率的にパッケージされることが示された、膜会合蛋白質由来の膜会合ドメインを含む。このようなキメラ蛋白質の外部受容体ドメインは、前記したように宿主範囲を決定するために、あらゆるリガンド／受容体から選択することができる。組み換えキメラ膜会合蛋白質を有するベクター粒子の生産の一例として実施例10を設ける。
実施例10
キメラ膜会合蛋白質を有するベクター粒子生産のためのカセット
実施例９に記載した指針に従い、ハイブリッド膜会合糖蛋白質を構築した。この例のモデルとして、VSV G細胞質および膜ドメインを、エリスロポイエチン（EPO）をコードする遺伝子と遺伝子的に組み換える。この組み換えキメラを、実施例９からの発現ベクターpSVLに挿入する。更に、ベクターpLRNLおよびベクターpSVGPを生産体細胞に形質移入する。この結果得られる上澄を集め、ベクター粒子を使用してB6SutA細胞に感染させる。B6SutA細胞はEPO受容体を含み、ネオマイシン選択下では、EPOハイブリッド蛋白質およびpLRNLベクター粒子ゲノムを含むベクター粒子を受容するような細胞のみが生存し得る。
実施例10に記載した方法論を使用し、VSV G蛋白質由来の膜会合ドメインまたは他の膜会合ドメインを用いて、あらゆる所望の受容体結合ドメインのための遺伝子を組み換えることができるカセット系を造成することができる。よって、実施例10は、カセットに挿入された受容体結合ドメインによって特定される宿主範囲を有する多様なベクター粒子の迅速な生産のための方法論を提供するものである。
ここに記載したように本来のものではない膜会合リガンドを有するベクター粒子は、有利には、膜会合蛋白質のリガンド−受容体相互作用により決定される宿主範囲を有し得る。例えば、膜会合蛋白質が、ヒト細胞に感染し得るエンベロープを有するウイルスから誘導される場合、そのベクターは、大きく増加した効率で外来遺伝子をヒト細胞に導入し得るものとなろう。先の例で使用したネオマイシン遺伝子は、同様にRSVプロモーターの調節下とし得る治療用遺伝子と置換することができる。同様に治療用遺伝子を、ネオマイシン遺伝子に加えて導入することができる。記載したように、この系で使用し得る多数のプロモーターおよびマーカー遺伝子がある。治療用遺伝子は、蛋白質をコードする核酸配列または固有の制御価値を有する核酸配列の形態をとることができる。
蛋白質をコードする治療用遺伝子は、与えられた蛋白質の欠陥を補填するポリペプチドの形態をとることができ、免疫機能または特定の蛋白質または蛋白質の群を不活性とするものを改良または改変することができる。治療用蛋白質は、潜在的には蛋白質または蛋白質の群を刺激または阻害する制御活性を有し得る。治療用蛋白質は、与えられた細胞機能を刺激または阻害することもできる。換言すれば、治療用遺伝子は、必ずしも本記載に限定されず、当業者が選択可能な所定範囲の活性を有するポリペプチドをコードし得る。
核酸は、核酸としての活性を有する生成物もコードし得る。例えば、この核酸は、与えられた蛋白質の翻訳を阻止するアンチセンス活性を有するものとすることができ、またはこれは、蛋白質または蛋白質の群の発現を促進または阻害するか、与えられた細胞機能を促進または阻害するDNA結合能力を有するものとすることもできる。換言すれば、選択の順序は、当業者に明らかであろう。
よって、標的遺伝子治療のために、本発明の方法を使用して、改変された宿主範囲を有するベクター粒子を生産することができる。リガンドを選択し、標的とする細胞型を含む宿主範囲を提供し得る。よって、ポリペプチドが十分な量で、または十分な量の活性な形態で発現されていない遺伝的欠陥のための治療法を提供するために、正常な状態ではそのポリペプチドを生産する細胞型を標的とするようリガンドを選択し得る。ポリペプチドのための遺伝子は、同様に適切なウイルスプロモーターの調節下に導入すべきである。
或いは、例えば、望ましくないポリペプチドをコードするmRNAの翻訳を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの生産を介して、望ましくないポリペプチドの発現を阻害することにより、治療法を提供することができる。HIV感染のために治療用オリゴヌクレオチドを伝達するための標的化ベクター粒子の生産を説明するために実施例11を設ける。
実施例11
抗HIV治療剤のための伝達運搬体
主要HIVプロテアーゼのmRNAに相補的な領域についてアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列を用いてNeo遺伝子を置換することにより、実施例８からのベクター粒子を改変する。この結果得られるベクター粒子は、膜会合蛋白質としてCD4を含み、HIVの複製を制限するためにHIVのmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAの翻訳に向けられている。
よって、実施例10は、ベクター粒子ゲノムを修飾し、特定の細胞型に対する特定の治療法に向ける技術を示すものである。また、本発明は、前駆細胞を標的とすることを含むことも企図する。例えば、多数の前駆細胞型が骨髄に見出され、これらは血液細胞へと分化する。多くの血液細胞の寿命期間は比較的短く、したがって前駆細胞は継続的に分裂して分化し、失われた細胞を置き換えている。血液細胞に向けられた治療法は、前駆細胞を標的とした場合に最も有用となろう。これらの細胞は、組織学的同定を可能とする独特の細胞決定基を有することが知られており、本発明のベクター粒子の膜会合蛋白質のための細胞受容体として使用することができる。ベクターは、この種の前駆細胞型の独特の細胞決定基に結合する膜会合蛋白質をコードする発現可能な遺伝子を含ませることにより、遺伝子の伝達のためにこれらの細胞型を標的とするよう構築することができる。本発明のベクター粒子を使用して標的化し得るこの種の前駆細胞型の例には、多能性幹細胞、赤芽球、リンパ芽球、骨髄芽球、および巨大核細胞が含まれる。
本発明の治療法は、生体内または試験管内のいずれかで行うことを更に企図する。生体の試験管内治療のために、細胞を取り出して、試験管内でベクター粒子を感染させることができる。適切な宿主範囲を決定する膜会合蛋白質を有するベクター粒子については、試験管内で標的化するために細胞を精製する必要はないであろう。ウイルスベクターは、適切な細胞に特異的に感染し得るためである。よって、骨髄サンプルを対象体から取り出し、所望の細胞型の形質移入を行い得る。その後、このような形質移入した細胞を細胞の起源の生体に戻すが、その際には、他の生体にとっては問題となる細胞の拒絶は考えられない。形質移入の前または後に試験管内で成長因子を用いてサンプルを処理し、細胞の数を増加させ、対象生体を標的とするか、またはこれに戻すことができる。
このようなウイルスベクターの宿主範囲を改変する更なる到達点を目指して、膜会合蛋白質を構成的に発現する安定なパッケージングセルラインの確立により、更に広い宿主範囲を有し、ヒトおよび他の細胞において増加した感染の効率を有するレトロウイルスベクターの更なる生成を促進し得ることを突き止めた。VSV Gエンベロープ蛋白質を含むこのような膜会合蛋白質の多くは、細胞に対して毒性である。これは、生産体ラインの安定性の問題に帰着する。発現体細胞が速やかに死滅する結果、それ以上の一次的な生産を造成するのが困難となるためである。幾つかの細胞型（例えば、ヒト293、MLVからgagおよびpol蛋白質を生産するその誘導体２−３、またはハムスターBHK細胞）は、ベクター粒子LGRNLによる形質導入（transduction）およびneo選択の後に生育し得るが、この生育が続くのは４週間のみで、その後細胞は死滅する。他の細胞型は、更に早く死滅する。よって、安定なパッケージングセルラインの確立は非常に望ましい。
安定なパッケージングセルラインを作製する１つの方法は、エンベロープ蛋白質が、特定の化合物の存在または非存在を介して、または温度のような条件の変化を介して、エンベロープ蛋白質の発現をオンまたはオフとすることができる誘導性プロモーターの支配下にあるパッケージング構成体を開発することである。この種の誘導性プロモーターの一例は、マウス乳腺ガンウイルス（mouse mammary tumor virus,MMTV）プロモーターである。MMTVプロモーターは、十分な量でグルココルチコイド受容体蛋白質を合成する細胞中のコルチコステロイドおよびそのアナログによって高度に誘導性である。
MMTVプロモーターのような誘導性プロモーター由来のベクター粒子遺伝子を発現する能力を有するセルラインは、適切な誘導条件、例えばMMTVプロモーターのためのコルチコステロイドの存在による誘導がなければ、ベクター粒子を生産し得ない。よって、ベクター粒子を生産する能力を有するセルラインを、ベクター粒子の生産を伴うことなく安定に維持することができる。所望する場合は、その後に適切な条件によってこのセルラインからの部分集団を誘導し、ベクター粒子を生産させることができる。誘導性のプロモーターの調節下でベクター粒子遺伝子を発現する能力を有する安定なパッケージングセルラインの作製の例を実施例12に示す。
実施例12
誘導性のプロモーターを有する安定なパッケージング構成体の作製
グルココルチコイド受容体蛋白質を十分な量で合成し、コルチコステロイドの存在下でMMTVプロモーターの誘導を与えるセルラインを同定するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子のようなマーカー遺伝子の翻訳に向けられたMMTVプロモーターを有する構成体を作製する。この構成体を、デキサメタゾン処理を伴うか、伴うことなく、種々のセルラインに導入する。
デキサメタゾン処理細胞において、未処理の細胞の場合に対して25:1より大きいCAT活性の比率を示すようなセルラインは、誘導性のMMTVプロモーターの調節下で安定なパッケージングセルラインとして使用するのに好適である。このような比率を示すセルラインは、BHKセルラインである。
MLV［VSV G］のための安定なパッケージングセルラインを作製するために、パッケージング構成体、pSVGPを用いてBHK細胞を永久的に形質移入した後、構成体を用い、MMTVプロモーターに対して、VSV G遺伝子および選択可能マーカーとしてハイグロマイシン耐性を駆動するRSV LTRを連結する。ハイグロマイシン耐性細胞を選択し、抗MLV30をプローブとして使用し、ウエスタンブロットによりGagおよびPolの生産についてチェックする。これらの細胞は、サザンブロット分析により、MMTV−VSV G遺伝子の存在についてもチェックする。
デキサメタゾンを用いて処理するか、処理することなく、LRNLのようなベクターを用いた一次的な形質移入により、生育を継続する（したがって致死的ではないレベルのVSV−Ｇを生産する）細胞を試験し、neo耐性コロニー形成単位の比率を測定する。最高の性能を有する細胞クローンに対して、核酸を生産するMLV［VSV G］ベクター粒子を用いて永久的な形質移入を行う。デキサメタゾン処理により短い時間期間の間（１〜３日）、感染性の粒子の生産を誘導する。
よって、実施例12は、誘導性のプロモーターの調節下における安定なパッケージング構成体の作製の一例を示す。同様の技術を使用し、MMTVプロモーターまたは他の誘導性プロモーターの調節下に、本発明の多様なベクター粒子を生産することができる。
安定なパッケージング構成体の作製の他の例は、膜会合蛋白質の生産に耐え得る細胞の開発を伴うものである。１つのセルライン、MDCK（ATCC No.CCL34）は、VSVの毒性効果に対して耐性であり、VSV−Ｇの長期間の生産を支持し得ることが報告されている。他のこの種のセルラインも存在すると考えられる。しかしながら、このようなセルラインにより生産された全てのVSV G蛋白質が機能性であるとは限らない。よって、機能性の蛋白質を生産するクローンを選択する必要がある。機能性の膜会合蛋白質を生産する安定なパッケージングセルラインの作製の例を実施例13に示す。
実施例13
許容性のセルラインにおける安定なパッケージング構成体の作製
VSV G膜会合蛋白質の安定な発現に対する寛容について、およびベクター粒子を生産する能力について、MDCK細胞を試験した。VSV G耐性は、MLV［VSV G］ベクター粒子によりMDCK細胞を感染させ、G418耐性クローンを選択することにより試験した。レトロウイルスのgagおよびpol蛋白質を安定に発現するヒト293細胞中へのpLGRNLの一次的な形質移入によりベクター粒子を生産した。ベクター粒子を含む、このような形質移入を行った細胞の上澄を使用し、MDCK細胞に感染させた。これらのベクター粒子は、そのベクターゲノムとしてpLGRNLを含み、その膜会合蛋白質としてVSV Gを含む。
MDCK細胞を感染させ、G418中での選択の前に細胞を24時間培養した。感染の後24時間で、400μg/mlのネオマイシンアナログG418を用いて細胞を処理した。選択の約７〜10日後に、G418に耐性のコロニーが出現し始めた。コロニーが明確に目視でき、耐性でない細胞から分離された時点で、これらをプールし、更なる分析のためにG418の存在下で継代培養した。
pLGRNLベクターゲノムからのVSV Gの発現について、前記したポリクローナルセルラインを試験した。簡略には、60〜70％の集密度へと細胞を生育させ、ウシ胎児血清非含有でメチオニンを含まない培地（Met- DME）中で37℃で30分間インキュベートした。300μCiの35S−メチオニンを含有する2mlのMet- DMEを用いて培地を交換し、更に４時間インキュベートした。氷で冷却したPBSにより細胞を洗浄し、1mMの濃度で10μｌのプロテアーゼ阻害剤、PMSFを含有する1mlのRIPA溶解緩衝液（150mM NaCl、１％NP−40、0.5％デオキシコール酸、0.19％SDS、50mM Tris pH8.0）を各プレートに添加した。プレートを氷上で15〜30分間インキュベートした後、溶解した細胞材料をミクロ遠心チューブに移した後に10分間遠心分離を行った。上澄を除去し、−70℃で保存するか、免疫沈降のために直接使用した。非特異的な結合活性を予め浄化するために、免疫していないウサギ血清を用いて最初に処理することにより、免疫沈降のためのこのような溶解物を調製した。
約５μｌのウサギ抗VSV G抗体を用いて１×107カウントのプレクリア済み溶解物を含有する所定容量を４℃で一夜インキュベートすることにより、免疫沈降を行った。その後、プロテインＡ−セファロース（RIPA緩衝液中の100μｌの10％溶液）を添加した後、４℃で１〜２時間インキュベートを行った。RIPA緩衝液中で接合体を３回洗浄し、最終ペレットを30μｌのLaemmliサンプル緩衝液に再懸濁した。免疫沈降物をSDS−PAGEにより分離し、フルオログラフィにより可視化可能とした。結果を図３に示す。レーン１および２は、抗VSV Gおよび通常のウサギ血清を用いて免疫沈降させたポリクローナルセルラインをそれぞれ示す。レーン３は、抗VSV G抗体を用いて免疫沈降させた模擬感染（mock infected）MDCK細胞である。約68kDのMrで移動するバンドは、VSV G蛋白質に対応し、これらのMDCK細胞がVSV Gの長期間の発現を支持することを示す。
VSV G含有ベクター粒子を生成する能力についても、MDCK/VSV Gポリクローナルセルラインを試験した。これを行うために、選択可能マーカーとしてのpTKhygroおよびgag/pol機能を与えるためのpSVGPを用いて細胞に対して同時形質移入を行った。
MDCK/VSV G細胞の同時形質移入のために、ポリ陽イオンポリブレン（Polybrene,Aldrich,Milwaukee,WI）を使用した。簡略には、対数期の生育細胞をトリプシン処理により回収し、10％FCSを含有する10mlの培地中で、100mmのディッシュ当たり５×105細胞で再度プレート処理した。10％CO2の雰囲気中で、培養物を37℃で18〜20時間インキュベートした。形質移入DNA（２μｇのpTKhygroおよび18μｇのpSVGp）を3mlの血清含有培地と混合した後、30μｇのポリブレンを添加した。培地を除去した後に、この形質移入溶液を細胞に施した。細胞を10時間インキュベートした。DNA培地混合物を吸引し、2mlのDMSO溶液（３部のDMSO:1部の培地）と混合した。細胞を室温で５分間インキュベートした。培地を用いて３回洗浄した後、完全培地中で細胞を更に48時間インキュベートした。この時、ハイグロマイシン（400μg/ml）およびG418を含有する選択培地中で細胞をインキュベートし、二重耐性細胞の選択を可能とした。ハイグロマイシン耐性およびG418耐性コロニーを先に記載したようにプールし、VSV G含有ベクター粒子の生産をBHK細胞上で力価検定した。
耐性細胞から誘導したベクター粒子によるBHK細胞の感染により、10mlの培地当たり約100〜200のG418耐性コロニーが生成された。この結果は、MDCKポリクローナルセルラインは、VSV−Ｇエンベロープ糖蛋白質およびpLGRNLベクターゲノムを含む機能性のベクター粒子を生成し得ることを示したものである。
その後、パッケージング成分ベクター粒子ゲノムを含まないが、実際にVSV−Ｇ、gapおよびpolを安定に発現する安定なパッケージングセルラインを２工程の形質移入手順で構築した。第１の工程では、pTKhygroおよびpSVG（SV40初期プロモーターの調節下のVSV G）を、ポリブレンを使用してMDCK細胞に同時形質移入し、先に記載したようにハイグロマイシン耐性について選択した。耐性の細胞をプールし、蛍光活性化細胞選抜（FACS）によってVSV Gを同時発現する細胞を単離した。簡略には、準集密（subconfluent）プレートをPBS中で１回洗浄した後、10mM EDTAを用いて37℃で15分間処理してディッシュから細胞を取り除いた。細胞を15mlの遠心分離チューブに移し、低速遠心分離によりペレット化し、DMEプラス２％FCSに再懸濁し、再度遠心分離した。培地を除去し、0.5mlの1:200希釈の通常のウサギ血清または1:200希釈のウサギ抗VSV G抗体にペレットを再懸濁した。抗体を用いて氷上で30分間細胞をインキュベートした後、5.0mlのDMEプラス２％FCSを用いて希釈し、その後に低速遠心分離を行った。5mlのDMEプラス２％FCSを用いて、得られたペレットを更に２回洗浄した。二次抗体を含む500μｌのPBS溶液に細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベート期間の後、前記したように細胞を洗浄し、Pen/Strepおよびファンギゾンを用いた0.5mlのDMEプラス２％FCSに最終ペレットを再懸濁し、セルソーターに注入した。選択した細胞をプールし、１週間生育させた後、FACS選別によって再度単離した。先に記載したように抗VSV G抗体を用いた免疫沈降により、VSV G発現についてこれらの２回選別した細胞を分析した。結果を図４に示すが、ここでレーン１は、抗VSV−Ｇ抗体を用いて免疫沈降させた２回選別した細胞の抽出物を示し、レーン２、３および４は、それぞれ図３のレーン３、２および１に対応する。これらの結果は、pSVG形質移入細胞は、実質的なレベルのVSV Gを安定に発現することを示す。
安定なパッケージングラインを作製する際の第２の工程は、pSVGPと、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を発現するプラスミドとの同時形質移入を行い、gagおよびpol遺伝子の安定な発現を達成したものである。DHFRは、メトトレキセート（MTX）の存在下で生育させた場合に安定な形質移入体を選択するために使用した。先に記載したようにポリブレンを使用してプラスミドを同時形質移入し、５μM MTXの存在下で形質移入の48時間後に再度プレート処理した。MTX耐性コロニーをプールし、パッケージングコンピテントベクターゲノムを用いたこれらの細胞の一次的な形質移入により、ベクター粒子の生成について試験した。48時間で上澄を集め、先に記載したように標的BHK細胞上で感染性のベクターを力価検定した。
実施例13は、VSV G蛋白質の毒性効果に抵抗性のセルラインにおける機能性のVSV G蛋白質の選択的検索による永久的なVSV Gパッケージングラインの作製を示す。当業者に容易に理解されるように、同様の方法を使用し、種々の起源から機能性の膜会合蛋白質を生産するセルラインを造成することができる。
VSV−Ｇ蛋白質は、レトロウイルス粒子中のMoMLVエンベロープ蛋白質を完全に置換することができ、その感染性は、抗VSV−Ｇ中和抗体に晒すことにより破壊されることを示した。VSV−Ｇ蛋白質は、MoMLVエンベロープ蛋白質を完全に置換し得ることを明確に示したが、前記した方法は、極めて低い力価（103cfu/ml）のLGRNL（VSV−Ｇ）ウイルスを一次的に生産したのみである。
ベクター生産を改良するために、レトロウイルスgagおよびpol並びにVSV−Ｇ蛋白質を構成的に発現する安定なパッケージングセルラインの構築を試みたが、従来はこの種の試みは、VSV−Ｇの毒性により妨害されていた。実施例13は、VSV G蛋白質の毒性効果に抵抗性のセルラインにおけるVSV Gパッケージングラインの生成を記載するものである。安定なパッケージングセルラインの生成の更なる例は、細胞が十分なVSV−Ｇを発現し、細胞表面における予想されるVSV−Ｇの蓄積によりシンシチウム形成および細胞の死滅に至る前に、ウイルス生産を支持する（105〜106の力価）期間があるという利益を伴うものである。改良されたベクター生産の例を実施例14に示す。
実施例14
偽型レトロウイルスベクターの生成
偽型レトロウイルスベクターを生成するために、プラスミドpLSRNLおよびpLGRNLを使用した。VSV−Ｇ遺伝子（Ｇ）または肝炎Ｂ表面抗原遺伝子（Ｓ）を、ネズミ肉腫ウイルス（MSV）LTR（5'L）から発現させる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子（Ｎ）は、RSVプロモーター（Ｒ）から発現させる。
生産体細胞を生成するために、CMVプロモーターの調節下にMoMLV gagおよびpol遺伝子をコードするpCMV gag−pol、およびメトトレキセートに対する低減した親和力を有する改変したジヒドロ葉酸還元酵素をコードするpFR400を用いて、10:1の比率で、ヒトAd−５により形質転換した胚腎臓セルライン293（ATCC CRL ＃1573）を同時形質移入した（Simonsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,80:2495−2499（1983））。形質移入した細胞をメトトレキセート（５×10-7M）およびジピリジモル（dipyridimole,5×10-6M）中で選択した。細胞外逆転写酵素活性（Goffら、J.Virol.,38:239−248（1981））およびヤギ抗p30抗体（NCL抗血清＃77S000087）を用いたウエスタンブロットにより細胞内p30gag発現についてコロニーを検索した。継続したメトトレキセート選択を必要とすることなく、レトロウイルス遺伝子を安定に発現するクローンを選択した。
LGRNL（VSV−Ｇ）およびLSRNLウイルスを生成するために、gagおよびpol遺伝子を含有するがエンベロープ遺伝子を欠如する293細胞、またはMoMLV遺伝子、gag、polおよびレトロウイルスenv遺伝子を含有するPA317細胞（ATCC ＃CRL 9078）に20μｇのプラスミドDNAを形質移入した。形質移入の48時間後、G418（400μg/ml,ゲネチシン（Geneticin）、Sigma,St.Louis,MO）に細胞を晒した。G418耐性生産体細胞の集密培養物からの上澄をろ過し（0.45μｍ）、ウイルス力価を測定した。
ウイルス力価は、４〜８μg/mlのポリブレン（Sigma）の存在下で、Madin−Darbyイヌ腎臓細胞（MDCK）（ATCC ＃CCL−34）の感染により測定した。MDCK細胞を選択したのは、このような分極した上皮細胞は、細胞表面上で発現したVSV−Ｇ蛋白質の融合性の性質に対して相対的に耐性であり、したがってVSV−Ｇ含有ベクターによる感染の後も安定なコロニーを形成し得るためである。ウイルス力価を測定するために、感染の12〜24時間後にMDCK細胞をG418に晒し、選択の際に10〜12日後に耐性のコロニーを計数した。
pLGRNL形質移入した293−gag−pol細胞の表面上の免疫反応性のVSV−Ｇの存在を示すために、VSV−Ｇに対するモノクローナル抗体を用いて染色した生細胞のFACS分析を行った。抗VSV−Ｇ抗体は、IgG2a抗体l1とした。当業界で周知のモノクローナル抗体生成技術を使用し、他の適切な抗VSV−Ｇ抗体を生成することができる。簡略には、集密単層（monolayers）の293−LGRNL細胞を10mM DETAを用いて37℃でインキュベートし、プレートから生きた細胞を取り外した。２％FCSを用いたDMEM中に細胞を懸濁し、500×ｇで室温で遠心分離し、次の試薬を用いて順次再懸濁しインキュベートした：（ａ）リン酸緩衝塩類溶液（pH7.4）中の３％通常ヤギ血清×20分、室温；（ｂ）抗VSV−Ｇモノクローナル抗体（l1ハイブリドーマ上澄、未希釈）または精製したマウス免疫グロプリン（１μg/ml,Cappel,Durham,NC）×30分、４℃；および（ｃ）２％FCSによりDMEM中で1:40に希釈したマウス免疫グロプリン（Cappel）に対するFITC接合ヤギＦ（Ab'）２断片×30分、４℃。２％FCSを用いたDMEMを用いて、それぞれのインキュベートの間に細胞を１回洗浄した。ヨウ化プロピジウムを用いて細胞を対比染色し、オルソサイトフルオログラフ（Ortho Cytofluorograph）50−Ｈ上でフローサイトメトリーにより5,000の生細胞を分析した。モノクローナル抗体で染色された細胞を、対照マウス免疫グロプリンで染色した陰性対照細胞と比較した。
G418中での選択後の９日目に、90.9％の細胞が、その表面上にVSV−Ｇを発現した（図５）。ウイルス上澄の逐次の捕集および力価検定により、ウイルスの生産は、G418選択後第２週の間に最大となることが示された（データは示さない）。シンシチウム形成およびその後の細胞死は、選択後第３週目に最初に観察され、全単層に渡って進行した。前記したようにMDCK細胞上で測定したウイルスの力価は、５×105〜４×106cfu/mlの範囲であった。
マウスC127細胞（Florikiewiczら、J.Cell Biol.97:1381−1388（1983））およびMDCK細胞（Romanら、Exp.Cell Res.,175:376−387（1988））のような候補生産体セルラインにおいて、低レベルのVSV−Ｇの安定な発現が報告されているが、VSV−Ｇの細胞表面発現は、効率的なレトロウイルスベクターの生産を支持するには不十分であった。
実施例14の方法を用いることにより、細胞が十分なVSV−Ｇを発現することができ、細胞表面におけるVSV−Ｇの蓄積によりシンシチウム形成および細胞死に至る得る前に、105〜106cfu/mlの力価のウイルス生産を支持する期間があるという利益を得た。
細胞表面における静電的相互作用は、ウイルスの付着および細胞侵入に重要な役割を果たしている（Contiら、Res.Virol.,142:17−24（1991）;Toyoshimaら、Virology,38:414−426（1969））。ベクターと宿主との間の静電的反発を克服し、これによりベクター生成のレベルを更に増加させるために、MDCK細胞の感染の効率に対する異なる濃度のポリ陽イオンの効果を検討した。次のポリ陽イオン：ポリブレン、硫酸プロタミン、およびポリ−Ｌ−リジンを試験した。これらの実験を以下の実施例15に示す。
実施例15
ウイルス力価に対するポリ陽イオンの効果
異なる濃度のポリ陽イオンのウイルス力価に対する効果を測定するために、ウイルスによるMDCK細胞の感染の直前に培地に添加したポリ−Ｌ−リジン（0.25〜25μg/ml,Sigma）、硫酸プロタミン（1.25〜250μg/ml,Sigma）およびポリブレン（2.5〜80μg/ml,Sigma）を比較した。
両者のベクターについて、G418耐性細胞の数により測定した感染の最適効率は、８μg/mlのポリブレンの存在下で生じた。ヒトのための使用およびヒトの遺伝子治療法モデル検討のために認められている薬剤である硫酸プロタミン（1.25〜5.0μg/ml）で置き換えた結果、LSRNLおよびLGRNL（VSV−Ｇ）についてそれぞれ感染効率が２または４倍減少した。同様に、ポリ−Ｌ−リジン（2.5〜10.0μg/ml）の存在下での感染の結果、両者のベクターについて感染効率が２倍減少した。ポリ陽イオンを完全に省略した結果、感染細胞の数が100倍低下した。よって、実施例15は、ポリ陽イオンは、ウイルス生産のレベルを有意に増加させることを示す。
LGRNLがそれ自体複製コンピテントであることを確認するために、我々のLGRNL（VSV−Ｇ）ウイルスストックに混在する複製コンピテントなヘルパーウイルスを探索した。組み込まれたプロウイルスを含む細胞からLSRNLを開放する能力について、ウイルス上澄を調べた。以下の実施例16に試験を示す。
実施例16
ベルパーウイルスについてのウイルスストックの検討
複製コンピテントなヘルパーウイルスの存在について我々のウイルスストックを検査するために、LGRNL（VSV−Ｇ）または複製コンピテントMAウイルス（Millerら、Mol.Cell Biol.5:431−437（1985））を１コピーのLSRNLプロウイルスを含む293細胞（293−LSRNL細胞）に感染させた。簡略には、安定に感染させたMDCK−LSRNL細胞に対し、ポリブレン（４μg/ml）の存在下に、２×105cfu/mlのLGRNLウイルスストック、または2mlの複製コンピテントなMoMLV誘導MAウイルス培養上澄を感染させた。１週間後に培養上澄を回収し、培養上澄に208F細胞を晒した後にG418選択により感染細胞を単離することにより、レスキューされたLSRNLの存在を測定した。重複感染の後１週間の間、培養物をG418中で維持した。培養上澄をDMEMで取り替え、一夜インキュベートし、フィルタ（0.45μｍ）を通過させ、１および10mlの画分を使用してマウス208F細胞に感染させ、ウイルス力価を測定した。
LGRNL（VSV−Ｇ）ウイルスストックでは、LSRNLのレスキューの証拠は観察されなかった。これに対して、LSRNLは、293−LSRNL細胞由来のMAウイルスによって効率よくレスキューされた（データは示さない）。よって、実施例16は、LGRNLの生育は、トランス作用性ヘルパーウイルスによる結果ではないと考えられる。
レトロウイルスの感染は、通常はウイルスエンベロープ蛋白質と特異的な細胞表面受容体蛋白質との間の相互作用を必要とするが、VSV−Ｇは、細胞膜のリン脂質成分と相互作用し、膜融合によってウイルスの侵入を媒介する。ウイルスの侵入は、特異的な蛋白質受容体の存在に依存するとは認められないため、VSVは、極めて広範な宿主細胞範囲を有する。更に、MoMLVエンベロープ蛋白質によってVSV−Ｇが置換され偽型粒子に対して増加した宿主細胞範囲の望ましい性質を与える能力を試験した。本発明の修飾したレトロウイルスベクターの宿主細胞範囲の測定を実施例17に記載する。
実施例17
宿主細胞範囲の測定
修飾したレトロウイルスベクターの宿主細胞範囲を検討するために、PA317細胞（MoMLV、gag、polおよびenv蛋白質を発現するマウス繊維芽細胞セルライン）から生成した２つのレトロウイルスベクター、LGRNL（VSV−Ｇ）およびLSRNLを用いて、BHK、ゼブラダニオ、サケ（chum salmon）およびニジマス（rainbow trous）のセルラインに感染させた。
ZF4細胞は、分離させた全ゼブラダニオ胚から誘導された安定な倍数体セルラインである（Drieverら、In vitro Cell Develop.（印刷中））。ZF4細胞は、DMEM/F12（50/50）を含み、2mMグルタミン、10％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含む培地中で、室温で25cm2のフラスコ中、５％CO2を用いて維持されたものである。ニジマス生殖腺から誘導されたRTG−２細胞（ATCC ＃CC1−55）、およびサケ胚から誘導されたCHSE−214（ATCC ＃CRL 1681）は、ZF4細胞と同様にフラスコ中で、Eagle's MEM中で、ZF4細胞と同様にEagle's基礎塩類溶液および添加物を補填した非必須アミノ酸を用いて維持されたものである。
異なる細胞に対するLGRNL（VSV−Ｇ）およびLSRNL感染の効率を以下の表７に示す。
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G418耐性コロニーは、MoMLVエンベロープ蛋白質を含むLSRNLウイルスを感染させた魚類セルラインにおいては、複数の実験で検出されなかった。これに対して、LGRNL（VSV−Ｇ）の感染により、G418耐性コロニーが再現性良く生成した。同じウイルスを用いた場合、感染の効率は、MDCK細胞の感染と比較して10〜460倍低下した。予期しないことに、LGRNL（VSV−Ｇ）を用いて感染させた全ての魚類セルラインが、明らかな細胞毒性を示すことなく、800μg/mlのG418の存在下で増殖した。LGRNLが感染した多くの哺乳動物セルラインでは、VSV Gの細胞毒性によるシンシチウム形成および細胞死が観察された。
FACS分析を行うことにより、魚類セルラインにおける予期しない細胞毒性の欠如についての１つの説明を評価した。前記したVACS分析により、感染魚類細胞が、細胞表面上に免疫反応性のVSV−Ｇを有するか否かを評価した。予期しないことに、この分析では、免疫反応性のVSV−Ｇ蛋白質は検出されないことを見出した。毒性効果を伴うことなく全ての魚類セルラインに感染するVSV−Ｇ含有ベクターの予期しない能力についての如何なる特定の説明にも拘束されるものではないが、魚類細胞におけるVSV−Ｇ蛋白質の細胞毒性の欠如は、魚類細胞がVSV−Ｇを細胞表面上に発現する能力がないことによるものと考えられる。この結果は、成熟VSV−Ｇ蛋白質の忠実な細胞内プロセシングができないことにより説明することができる。カのVSV感染（Schloemerら、J.Virol.,15:1029−1032（1975））、およびカモ胚細胞（Levinsonら、Virology,85:621−616（1978））に従ってこの機構が良く説明されている。ただし、ここでは細胞内VSV−Ｇの存在または分布は確定していない。代替的な説明は、レトロウイルスの長末端反復配列（LTR）は、このような細胞中では機能性ではないというものである。正確な機構に拘わらず、VSV−Ｇ細胞表面蛋白質の欠如により、シンシチウム形成および細胞の死滅を伴うことなく、これらの魚類セルラインの継続した生育が可能となった。更に、感染細胞のG418耐性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が、プロウイルスから安定に発現されることを示すものである。
よって、本発明の修飾したベクターは、MoMLVエンベロープ蛋白質を含有するものを含む、他のレトロウイルスベクターによっては感染できない魚類のような哺乳動物以外の種における安定な遺伝子転移を媒介することができることが示された。レトロウイルスのエンベロープ蛋白質を含むベクターが魚類セルラインに感染できないのは、恐らくこれらの細胞が適切なウイルス受容体を発現し得ないためである。
本発明の修飾したベクター粒子を使用し、魚類セルラインへの安定な遺伝子の転移を行うことができる。通常、レトロウイルスベクターを使用しての安定な遺伝子の転移は、細胞ゲノムへのプロウイルスの組み込みがなければ生起しない。よって、ウイルス／細胞膜融合、ウイルス包被除去、逆転写およびプロウイルスの組み込みを支持する魚類細胞の能力は、これらのセルラインに安定なG418耐性を与えるLGRNL（VSV−Ｇ）の能力に由来すると推論することができる。
従来、生殖系列の伝達および組み込まれた外来遺伝子の安定な発現は、魚類において達成するのが困難であった。外来DNAの胚へのマイクロインジェクションおよびエレクトロポーレーションを含む、トランスジェニックな魚類の造成のための現在の方法により生殖系列の伝達が達成されているが、組み込まれたDNAは、しばしば転写的に不活性であり、多くの場合に高度に再配置されていることが見出されている。よって、このような従来の努力は、結果的に高レベルの遺伝的不安定性をもたらした。このような不安定性についての１つの説明は、注入されたプラスミドDNAが染色体外要素として維持され、長期間に渡って魚類中で過剰複製されるというものである。本発明におけるように、レトロウイルスベクターを使用することにより、細胞ゲノムへのプロウイルスの組み込みを介して、これらの問題が回避される。
本発明のベクターを使用し、広範な種類の哺乳動物以外の種を安定に形質転換できることを突き止めた。広範な種類の哺乳動物以外の種を安定に形質移入する本発明のレトロウイルスベクターの能力を更に示すために、実施例18〜19に記載するように、カおよびアフリカツメカエルにおける感染実験を行った。
カのセルラインに由来する細胞を形質転換する本発明のレトロウイルスベクター構成体の能力を示すために、以下の実施例18に記載する実験を行った。
実施例18
カのセルラインへのベクターDNAの組み込み
10％ウシ胎児血清および抗生物質を補填した市販のリーボビッツ培地中で、アデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）セルラインC6/36由来のカの細胞を生育させた。125mlまたは250mlのＴフラスコ中で27℃で細胞を生育させた。未処理の対照細胞は、27時間の平均倍加時間を有していた。
処理の前に、30％の集密度まで細胞を生育させた。それぞれのフラスコに、４μg/mlの最終濃度でポリブレンを添加した。LGRNLウイルスを培地に添加し、混合物を24時間インキュベートした。対照フラスコは、未処理および模擬感染細胞より構成されるものとした。ネオマイシンアナログ、G418を1mg/mlの最終濃度まで添加し、細胞死の進行をモニターした。４週間後、ウイルス感染細胞はフォーカスを形成していたのに対し、対照培養では細胞が失われていた。よって、外生のneo遺伝子が、LGRNL感染細胞中で発現されたと認められた。
更に、感染細胞が実際にneo遺伝子を含むことを示すために、neoプライマー対を使用してPCRを行った。残存する細胞の約半分をそれぞれの細胞培養物から取り出した（感染させた細胞培養物、および２つの対照培養物）。neoプライマー対を使用し、それぞれの培養物からのDNAをPCR検出および増幅に供した。ウイルス感染細胞においてベクターDNAが検出された（陽性PCR）。両者の対照培養物からの細胞を用いて、陰性のPCRの結果が得られた。よって、LGRNLにより感染されたカの細胞は、LGRNL由来のneo遺伝子を安定に含んでいた。
実施例19に示すように、アフリカツメカエル細胞のゲノムに安定に感染させて組み込んだVSV−Ｇを含む本発明のレトロウイルス構成体の能力も試験した。
実施例19
Xenopus A6セルラインへのベクターDNAの組み込み
LGRNL（VSV−Ｇ）を用いてアフリカツメカエルA6セルライン由来の細胞に感染させた。このベクターに晒した細胞におけるベクターDNAの存在を検出するために、サザンブロットを行った。結果を図７に示す。LGRNL（VSV−Ｇ）感染、および対照（非感染）アフリカツメカエルA6細胞から抽出したゲノムDNAをneoプローブとハイブリダイズさせた。レーン１は、感染させていないA6細胞のSac I消化からの断片を示す。レーン２および３は、プラスミドpLGRNL感染細胞のSac I消化からの断片を示す。レーン５および６は、A6クローンのBamH I消化を示す。レーン７は、感染させていないA6細胞のBamH I消化からの断片を示し、レーン８は、プラスミドpLGRNL感染細胞のBamH I消化からの断片を示す。LGRNL感染体におけるゲノムDNAは、LGRNL由来のneo遺伝子にハイブリダイズするバンドを含み、対照細胞はこのようなバンドを欠如することが分かる。よって、本発明のベクター粒子からのDNAが、細胞当たり１個の組み込みの様式で、アフリカツメカエル由来の細胞のゲノムDNAに含まれることが示された。
魚類、カおよびカエルのような、このように広範に異なる哺乳動物以外の種に感染する本発明のレトロウイルス粒子を含むVSV−Ｇの能力に基づいて、本発明の広範な適用性が示された。当業者であれば、他の両生類、昆虫または魚類、トカゲ、トリおよび甲殻類を含む他の哺乳動物以外の動物種に感染させるために、前記した技術を容易に適用することができる。
哺乳動物以外の動物を生体内で形質転換する本発明のベクターの能力を試験した。ゼブラダニオ胚における、このような生体内形質転換の例を実施例20に示す。
実施例20
ゼブラダニオ胚におけるベクターDNAの検出
８〜64細胞期（cell stage）のゼブラダニオ胚を穏和なペプシン消化に晒して外皮を除去した後、４μg/mlのポリブレンの存在下に28℃で７時間、LSRNLまたはLGRNL（VSV−Ｇ）を含む上澄に晒した。中期包胚遷移（midblastula transition）の後のウイルス上澄に晒した胚の内、模擬感染胚における70〜90％の生存率と比較して、感染後30時間での生存率は60〜70％であった。中期包胚遷移と比較して、初期ステージでは、ウイルス上澄に晒した胚の１〜10％のみが生存していた。その後感染した胚を回収し、10の胚のバッチからの全胚核酸抽出物をPCR分析のために調製した。100μｌの溶解緩衝液（10mM Tris pH8.4,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.3％Tween 20,0.4％NP40）中で98℃で10分間抽出物をインキュベートした後、1mg/mlのプロテイナーゼＫの存在下で55℃で一夜インキュベートした。胚溶解物をフェノール抽出し、水性画分をエタノール沈殿させ、この結果得られたペレットを風乾し、60μl H2Oに再懸濁した。
１つの胚の等量、すなわち10の胚からの抽出物の1/10を、組み込まれたウイルスDNAのPCR分析のための鋳型として使用した。0.2〜0.5μＭオリゴヌクレオチドプライマー、200μＭ各dNTP、および１〜2UTaq DNAポリメラーゼ（Perkin−Elmer,Norwalk,CT）を含む抽出緩衝液中で、20μｌの容量で遺伝子増幅を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りである:neo遺伝子プライマー（配列番号:1、配列番号:2）、肝炎Ｂ表面抗原プライマー、およびVSV−Ｇプライマー（配列番号:3、配列番号:4）。加熱サイクル条件は、94℃×１分、62℃（HBsAgについては58℃）×１分、72℃×１分とし、これを40サイクル行い、最終の伸長工程は72℃×５分とした。PCR生成物の半分を２％アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレンに移し、32Pランダムプライマ−標識したpLGRNLからの349pb neo PCR生成物、または1.665kbゲル精製したpLGRNLのBamH1消化物、またはpLSRNLからの472bp HBsAg PCR生成物とハイブリダイズさせ、10時間フィルムに露光した。
図６は、40の野生型胚（レーン１〜２）、40のLSRNLに晒した胚（レーン３〜６）、50のLGRNL（VSV−Ｇ）に晒した胚（レーン７〜11）、DNAのない陰性対照（レーン12）、100pgのpLGRNL（レーン13）および0.1pgのpLSRNL（レーン14）から抽出した増幅DNAのハイブリダイゼーション（32P標識neo PCR生成物プローブを使用）を示す。LGRNL感染胚は、ベクター由来のneo遺伝子を信頼性良く含有し、対照胚はこの遺伝子を欠如することが分かる。よって、外生遺伝子材料のゼブラダニオ胚への安定な導入が示された。
実施例20の様式で処理されるゼブラダニオ胚の相当の割合が、その生殖系列に外生の遺伝子材料を含むことが予期される。この種の胚を成体魚へと生育させて繁殖させ、外生遺伝子材料により発現される表現型の伝達を図ることができる。多様な特性のいずれかをコードする遺伝子を、本発明によるベクター中に含ませることができる。例えば、ニジマス成長ホルモンの遺伝子をコードする遺伝子をneo遺伝子を有するジシストロン性構成体としてラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターから発現させることができる。ニジマス成長ホルモン遺伝子は先にクローン化されており、この目的のために容易に利用可能である。特定の組織のみにおいて遺伝子を発現させるために、組織特異的プロモーターを使用することもできる。
他の魚類種へと転移させ得る、既にクローン化された他の魚類遺伝子には、凍結防止蛋白質（antifreeze protein）をコードするものがある。世界の幾つかの地域のサケは、摂氏数度の変化に特に敏感なものがあり、温度の低下によりその集団が死滅し得る。よって、サケ集団のこのような急激な減少を防止するために、本発明のベクターを使用し、魚類凍結防止蛋白質遺伝子をサケに転移させることができる。
魚類における更に他の可能性のある望ましい遺伝子転移には、ウイルスのような病原性生物に対するアンチセンスメッセージをコードする遺伝子を転移させるものがある。代替的に、病原性生物に対して魚類をワクチン処理するために、病原性生物由来の抗原をコードする遺伝子を転移させることができる。
従来技術においては、信頼性が良く安定したカの形質転換は可能ではなかった。種々の手順を使用して従来技術において、遺伝子が首尾よくカに転移されているが、これらの手順は、信頼し得るに十分な頻度を与えるものではなかった。更に、転移された遺伝子は、経時的に不安定であるか、または組み込みの際に遺伝子の再編成を受けるものであった。
有利には、本発明のベクターを使用し、高い頻度でカを安定に形質転換することができる。安定なカの系列をもたらすために、このベクターを使用し、カの生殖系列に外生核酸を転移させることができる。外来DNAがカの生殖系列に組み込まれ得ることを確認するために、実施例21の実験を行う。
実施例21
後続するカの世代における外来DNAの検出
受精させたカの卵を包胚段階まで生育させる。マイクロマニュピレーターを使用し、少量のLGRNLを包胚にマイクロインジェクションする。模擬注入した群も調製する。ショウジョウバエ胚について十分に記載されているものと同様の手順をマイクロインジェクションに使用する。卵を成体へと発生させる。これらの成体を繁殖させ、それぞれの対からの卵を保存する。その後成体を犠牲にして死亡させ、実施例20のゼブラダニオの形質転換に関連して前記したneoプライマーを使用してPCRを行う。PCR分析に基づいてneo遺伝子を含むものとした成体からの卵を成体へと発生させ、再度繁殖させる。その後、これらのF2成体を、PCR手順を使用してneo遺伝子についてチェックする。陽性のneo PCRを有するこのような成体からの卵は、生殖系列にneo遺伝子を含むものである。
よって、実施例21の手順に従い、その生殖系列に外生遺伝子を担持する安定なカの系列を取得することができる。カにおける発現を与える適切なプロモーターに機能的に連結させれば、neoに加えてneo以外の遺伝子で置換するか、これを使用することができる。カにおける発現のための技術は周知であり、過去において一次的な発現のためには首尾よく使用されてきた。しかしながら、カの生殖系列を形質転換する本発明のベクターを使用することにより、有利にはこの種の発現が多数の世代に渡って安定に生起することが可能となる。
カへの可能な遺伝子転移の多くの例を有利に実施することができる。１つの例として、マラリアまたはリーシュマニア、またはデング熱ウイルスおよびアルボウイルスを含む他のヒト病原体のような、カによって広がる重要な寄生体の正常なライフサイクルを妨害する遺伝子を導入することができる。
前記論じたように、生殖系列の伝達および組み込まれた外来遺伝子の安定な発現は、従来は達成するのが困難であった。この度、ゼブラダニオの生殖細胞に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を同定した。この抗体は、ウイルスベクターを用いた単離および感染のために生殖細胞を同定するのに有用であり、この結果改良された生殖細胞および生殖系列の伝達がもたらされる。このモノクローナル抗体の使用を実施例22に記載する。
実施例22
モノクローナル抗体を使用するゼブラダニオ生殖細胞の同定
８〜64細胞期のゼブラダニオ胚を穏和なペプシン消化に供し、ゼブラダニオ生殖細胞に対するモノクローナル抗体を用いて染色する。オルソサイトフルオログラフ50−Ｈ上で細胞のFACS分析を行う。モノクローナル抗体により染色される細胞を単離し、ウイルス上澄に細胞を浸すことによりLGRNLを感染させる。その後、生殖細胞を再度ゼブラダニオ胚に移植する。
その後、実施例22の胚を成体へと生育させ、繁殖させ、実施例21におけるカに関して記載したように試験する。その生殖系列に転移した遺伝子を担持する魚は、多数の世代に渡って外生遺伝子を安定に発現する。カまたは他の生物の生殖細胞のための抗体を使用する同様の技術を展開し、本発明のベクターを使用し、他の生物の生殖系列への遺伝子転移の促進を図ることができる。
拡大された宿主細胞範囲に加えて、VSV−Ｇ偽型粒子の他の重要な特質は、超遠心分離の際に遭遇する剪断力に耐えるその能力である。MoMLVレトロウイルス粒子および他のレトロウイルスは、超遠心分離によりある程度濃縮することができるが、感染性の重篤な喪失によりこの方法の有用性は明確に制限される。PA317のようなパッケージングセルラインにより生産されたヘルパーを含有しない大半のレトロウイルスベクターは、105〜107cfu/mlの力価に限定されている（Millerら、Mol.and Cellular Biol.,6:2895−2902（1986））。このような力価は、多くの生体外の遺伝子転移の用途には一般に適切である。しかしながら、形質導入した細胞の後続する選択および長期間の培養が必要な場合はには不利であるが、これは標準的な技術を使用しては得ることができない高いベクターの力価により回避し得るものである。更に、幾つかのレトロウイルスベクターにより媒介された遺伝子転移の応用においては、特に多数の細胞の感染が必要な生体内遺伝子治療の検討においては、調製物における過度の負担を防止するために、高い力価のウイルス調製物が必要である。
本発明の他の態様は、レトロウイルスの高い力価の溶液を取得する能力に関する。極めて高い力価のレトロウイルスを調製することについて、２種類の制限がこれまで示唆されている。１つの制限は、超遠心分離、ろ過、クロマトグラフィ等のような濃縮方法の際の剪断に対するレトロウイルスの感受性に関する。他の制限は、高度に濃縮されたウイルスは隣接する粒子と凝集または融合する傾向があることに関する。予期しないことに、VSV−Ｇ膜会合蛋白質を含む本発明のレトロウイルスベクターは、高い力価まで濃縮することができることを突き止めた。実施例23の実験は、このように偽型としたベクターが、超遠心分離によるベクター粒子の濃縮を可能とし得ることを確認するために行ったものである。
実施例23
ウイルスの濃縮
前記した添加物を含む6mlのDMEM高グルコース中での一夜インキュベートの後に、10cmの組織培養ディッシュから、集密単層の293−LGRNLおよびPA137−LSRNL生産体細胞から上澄を回収した。上澄をろ過し（0.45μ）、ベックマン  モデルL3−50遠心分離機によりSW41ローターを用いて40,000×ｇ（25k rpm）にて４℃で90分間超遠心分離に供した。30μｌのTNE（50mM Tris pH7.8,130mM NaCl,1mM EDTA）または0.1％ハンクス平衡塩溶液中で４℃で一夜このペレットを再懸濁した。ウイルスを更に濃縮するために、２回目のサイクルの超遠心分離を行った。６つのチューブからのペレットを全量360μｌに再懸濁し、超遠心分離により再度濃縮した。濃縮前後のウイルスの力価は、前記したようにMDCK細胞上で測定した。
超遠心分離によるベクター粒子の濃縮の結果を表８に示す。
0003655307.tif 000009
前記した結果は、50,000×ｇで濃縮した１×106cfu/mlの力価における82mlの培養上澄についてのものである。全容量360μｌの0.1×ハンクス平衡塩溶液中に再懸濁したペレット化したウイルスは、ウイルス力価の220倍の増加を示し、感染性の粒子の回収率は96％であった。更なるサイクルの超遠心分離の後に、ウイルスストックを２×109cfu/mlまで濃縮した。これに対して、同一の手順によるLSRNLの濃縮は、LSRNL力価の４倍の増加を与えたのみであり、感染性の粒子の回収率は１％未満であった。
よって、単一サイクルの超遠心分離により、感染性の粒子の94〜100％の回収率で、ウイルスの100〜300倍の濃縮が再現性良く達成された。好ましくは、この方法により、ここで示したように、遠心分離の前に存在したcfuの少なくとも50％の回収率、更に好ましくは90％を越える回収率が得られる。
LGRNL（VSV−Ｇ）ベクターとLSRNLとの間の更なる差異を探索するために、異なる環境条件下でレトロウイルスベクターの安定性を検討した。この試験を実施例24に示す。
実施例24
レトロウイルスベクターの温度安定性
37℃および４℃での、および多数回の凍結融解サイクルの後の10％FCSを用いたDMEM中での感染性の粒子の安定性を測定した。結果を表９に示す。
0003655307.tif 000010
両者のベクターを37℃でインキュベートした結果、感染性の粒子の数が連続的に減少し、その結果８時間の間に力価が約10倍低下した。ウイルスストックを培地中で一夜４℃でインキュベートした結果、力価が約100倍低下した。更に、ベクターは、繰り返した凍結融解のサイクルに対して同等に感受性であり、６サイクルの後に約60％の感染性が残っていた。よって、２つのベクターのエンベロープ蛋白質の間の差は、粒子の温度安定性には有意に影響を与えなかった。
結論として、広範な範囲の宿主細胞の感染を可能とし、109cfu/mlを越える力価へとウイルスの濃縮を可能とするVSV−Ｇを有するレトロウイルスベクターの偽型が調製された。この種類のレトロウイルスベクターの偽型は、従来は接近不能であった種における安定な遺伝子転移および遺伝的検討のためのレトロウイルスベクターの用途を拡大するものである。更に、高い力価のウイルス調製物を生産する能力は、生体内遺伝子治療の検討に応用することができる。
先の実施例により、VSV Gエンベロープ蛋白質を用いて偽型としたレトロウイルスベクターは、広範な宿主範囲および増加した感染の効率を有し、超遠心分離のような手段により高い力価へと濃縮できることが示された。しかしながら、先に銘記したように、VSV G蛋白質を発現する哺乳動物細胞によるレトロウイルスの生産は制限されている。VSV G蛋白質の一次的なまたは本来的な発現が、大半の哺乳動物細胞において、シンシチウム形成および細胞死を生起し得るためである。
高い力価のレトロウイルスの生産は、多くの応用において望ましい。しかしながら、高い力価の生成は、生体内での直接的な遺伝子転移が望ましいヒトの遺伝子治療において特に重要である。よって、比較的高い力価でレトロウイルスベクターを生産し得る安定なパッケージングセルラインを生成する更に改良された方法が開発された。
ここでは、エンベロープ蛋白質を伴うことなく意図するレトロウイルスベクターを宿す安定なセルラインを作製した。これらのセルラインは、エンベロープ蛋白質以外のレトロウイルスのパッケージングに必要な成分の全てを生産するものである。よって、このセルラインは、レトロウイルスの長末端反復配列（LTR's）に対応する核酸と、レトロウイルスのgagおよびpolとを含み、更に所望の外生ポリヌクレオチド配列も含み得るものである。この細胞は毒性のエンベロープ蛋白質を発現しないため、このセルラインは無期限に維持することができる。このセルラインでは、機能性の膜会合蛋白質をコードする核酸を細胞の部分集団に導入することによって、高い力価のレトロウイルスの生産が開始される。
この発明の１つの好適な形態では、gagおよびpol遺伝子を含むが、あらゆるエンベロープ遺伝子を欠如する293GP細胞を初発の宿主細胞として使用し、これに対して、所望の外生遺伝子を含むレトロウイルスLTRsを導入し、前記したセルラインを生成することができる。他の適切な初発セルラインは当業者に公知であり、これらを使用することができる。好ましくは、宿主細胞は、レトロウイルスgapおよびpol遺伝子の高レベルの発現を与え得るものとする。
他の実施形態では、セルラインは、蛋白質が発現されない条件で機能性の膜会合蛋白質をコードする核酸を宿すものとする。この実施形態では、レトロウイルスの生産は、膜会合蛋白質を発現するよう条件を変化させることにより開始される。例えば、膜会合蛋白質は、与えられた温度以下では蛋白質の生産が本質的に生起しない温度感受性プロモーターに機能的に連結することができる。この種の温度感受性プロモーターの例は、当業者に周知である。蛋白質の生産は、蛋白質の発現が生起し得る点に温度を上昇させることにより、この実施形態の細胞において開始させることができる。広範な種類の異なる条件下で誘導される多数のプロモーターも知られている。当業者には明らかなように、これらの他のプロモーターも、この発明のこの実施形態に関連して使用することができる。
レトロウイルスのgagおよびpolを含む初発宿主セルラインが一旦形成されたならば、適切なベクターを使用して意図する所望の外生遺伝子を導入する。好ましくは、レトロウイルスのLTR'sおよび意図する遺伝子を担持するウイルスベクターを使用して遺伝子を導入する。ただし、同様にLTR'sおよび所望の遺伝子を担持する適切なプラスミドを用いた形質移入によって、意図する遺伝子を宿主細胞に導入することができる。
外生遺伝子と共にレトロウイルスベクターを宿すが、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠如する安定なセルラインの作製の例を実施例25に示す。
実施例25
レトロウイルスベクターを宿す安定なセルラインの作製
外生のネオマイシン耐性遺伝子を担持するレトロウイルスベクターpLSPONLを構築した。pLSPONLの構造を図８に示す。
pLSPONLレトロウイルス構成体は、5'長末端反復配列（5'LTR）により調節される肝炎Ｂウイルス（HBV）の表面抗原（Ｓ）をコードする遺伝子を含む。細菌のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Neo）をコードする遺伝子が後続するポリオウイルスDNAから誘導された内部リボソーム侵入配列を含む断片を、HBV S遺伝子の直ぐ下流に挿入した。
感染性のLSPONLウイルスを生成するために、MoMLV gag、polおよびレトロウイルスenv遺伝子を含むPA317細胞（ATCC ＃CRL−9078）に20μｇのpLSPONLを一次的に形質移入した。この結果得られたLSPONLウイルスを、形質移入の48時間後に捕集した。その後、LSPONLウイルスを使用し、293GP初発宿主細胞に感染させた。前記したように、これらの初発宿主細胞は、レトロウイルスgagおよびpolの実質的な発現を行うことができる。
LSPONLウイルスによる感染の後、400μg/mlのG418を含む培地に293GP細胞を晒し、ネオマイシン耐性の遺伝子を発現する細胞を選択した。G418耐性コロニーは、２週間後に採取した。HBsAgの存在をELISAにより測定し、最も多い量のHBsAgを培養培地に分泌したクローンを採取し、LSPONLウイルスの後続する生産のために使用した。
毒性の膜会合蛋白質をコードする遺伝子は存在しないことから、実施例25に記載したLSPONLレトロウイルスベクターを宿す細胞は、無期限の期間に渡って安定に維持することができる。
膜会合蛋白質をコードする核酸をこのセルラインの部分集団に導入することにより、感染性のレトロウイルス粒子の生産を開始した。残りの細胞は、レトロウイルス粒子の生産を開始することなく、将来の生産のために保存する。膜会合蛋白質をコードする核酸は、宿主細胞中で発現を駆動し得るプロモーターに機能的に連結された遺伝子を担持するプラスミドの形質移入によって導入することができる。好ましくは、大量のレトロウイルス粒子を迅速に生産するために、プロモーターは、相対的に高いレベルで発現を駆動するものとする。膜会合蛋白質の遺伝子は、遺伝子を担持するウイルスベクターによる感染のような当業者に公知の他の方法を使用しても導入することもできる。
膜会合蛋白質としてVSV G蛋白質を使用するレトロウイルス粒子の生産の例を実施例26に示す。
実施例26
感染性のレトロウイルスベクターの生産
偽型LSPONLウイルスを生成するために、30μｇのpHCMV−Ｇプラスミド（ATCC受託番号75497）を、実施例25からのLSPONLプロウイルスを宿すクローンに一次的に形質移入した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスから誘導された強力な直接初期プロモーターにより調節されるVSV−Ｇ遺伝子を含む。このプラスミドは、ウサギβグロブリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよびpBR322のアンピシリン耐性遺伝子も含む。このプラスミドの制限地図を図９に示す。
pHCMV−Ｇにより感染させた宿主細胞により生成したLSPONLウイルスを、形質移入の後48〜96時間の間に集めてプールした。両栄養性の対応体LSPONL（Ａ）と比較した偽型ウイルスLSPONL（Ｇ）のG418耐性の力価を、ラット208F繊維芽細胞中で、並びにヒト子宮頚ガン系列（HeLa）、ヒト気管上皮系列（9HTEO）、ヒト包皮繊維芽細胞系列（Basinger）、ヒト皮膚繊維芽細胞系列（TO−119）、およびヒトグリオブラストーマ系列U251、Ｕ−138、Hs683、U373MGおよびLNA−E8を含む種々のヒトセルライン中で測定した。両栄養性ベクターLSPONL（Ａ）は、PA317生産体細胞の使用を介するレトロウイルス生産の従来の方法によって作製した。レトロウイルス生産のこれらの従来の方法は、当業者に周知である。
結果を図10に示す。G418耐性力価は、試験した10のセルラインの内８つで、LSPONL（Ｇ）ウイルス感染細胞について高かったことが分かる。
よって、実施例26の実験の結果は、VSV−Ｇ偽型ウイルスは、その両栄養性対応体より効率的にヒト細胞に感染できることを示す。これらの結果を確認するために、実施例27に記載するように、LSPONL（Ｇ）の感染効率を測定した。
実施例27
LSPONL（Ｇ）ウイルスの感染効率
初期ネズミ肝細胞（primary murine hepatocytes）は、遺伝子治療のための重要な標的細胞を代表するものであり、したがって、これらの肝細胞を使用し、LSPONL（Ｇ）ウイルスの感染効率を測定した。感染多重度（MOI）を変化させたLSPONL（Ｇ）またはLSPONL（Ａ）ウイルスに初期肝細胞培養物を晒した。ウイルスによる感染の３日後に、培養培地に分泌されたHBsAgのレベルを、ELISAにより測定した。図11に示すように、LSPONL（Ａ）感染細胞におけるHBV S抗原の発現は、１に等しいMOIにおいて最高レベルに達した。これに対して、LSPONL（Ｇ）感染細胞におけるHBV S抗原の発現は、MOIの上昇につれて増加を続け、初期肝細胞は、両栄養性対応体LSPONL（Ａ）より、偽型LSPONL（Ｇ）によってより効率的に感染され得ることが示された。
実施例23に関連して前記したように、VSV−Ｇ膜会合蛋白質を含む本発明のレトロウイルスベクターは、高い力価へと濃縮することができる。このような高い力価は、遺伝子治療において特に重要である。有利には、本発明のレトロウイルスベクターは、相対的に高い力価で生産することができる。これらを濃縮し、更に高い力価を得ることもできる。よって、好適な実施形態では、実施例26に記載したこの方法により生産されるウイルスは、実施例23に関連して記載した方法に従って濃縮するものとする。超遠心分離による濃縮の例は、実施例28に記載されている。
実施例28
SLPONL（Ｇ）ウイルスの定量と濃縮
pHCMV−Ｇプラスミドにより感染させた宿主細胞の培養物からの上澄を回収し、ろ過し（0.45μ）、ベックマン  モデルL3−50遠心分離機によりSW41ローターを用いて40,000×ｇ（25k rpm）にて４℃で90分間超遠心分離に供した。前記したようにラット208F繊維芽細胞を使用し、濃縮前後の力価を測定した。
超遠心分離によるベクター粒子の濃縮の結果を表10に示す。
0003655307.tif 000011
表10から分かるように、LSPONL（Ｇ）ウイルスの濃縮前の力価は、既に相対的に高かった。超遠心の結果、感染性のウイルスの回収率95％で、ウイルス力価は125倍増加した。
よって、意図するレトロウイルスベクターを宿す安定なセルラインを作製できることが示された。このセルラインを使用し、高い力価のレトロウイルスベクターを生成することができる。このセルラインは、毒性の膜会合蛋白質をコードする遺伝子を欠如しているため、無期限に維持することができる。実施例12に関連して前記説明したように、生産体セルラインの安定性の問題は、従来は極めて普通のものであった。多くの発現体細胞が、毒性の膜会合蛋白質の発現のために急速に死滅するというものである。本発明は、細胞死を生起する毒性の膜会合蛋白質を発現させることなくレトロウイルスベクターを宿すことのできる安定なセルラインを生成することによって、この困難を克服するものである。
意図する遺伝子を有するレトロウイルスベクターを所望する場合は、膜会合蛋白質をコードする核酸をセルラインからの部分集団に導入し、これによりベクター粒子の生産を開始する。このようなベクターは、有利には膜会合蛋白質により決定される拡張された宿主範囲を有する。本発明により生産されるベクターの更なる利点は、ヒトおよび他の細胞における感染の効率が増加することである。よって、本発明の修飾したレトロウイルスベクター粒子は、哺乳動物細胞および哺乳動物以外の細胞の両者への安定な遺伝子転移のために効果的に使用することができる。
【図１（Ａ）】
0003655307.tif 000012
【図３】
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【図１（Ｂ）】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0003655307.tif 000021
【図１０】
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【図１１】
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