(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の配列を有する対象ポリヌクレオチドにおける変異領域の存在を確認するための、下記のステップを含む該対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。
ａ）各々が同一数の塩基を有すると共に、既知の配列を有する任意の数のオリゴヌクレオチドプライマーを含む組であって、１番目のオリゴヌクレオチドプライマーが第１〜第Ｎ塩基を有し、２番目のオリゴヌクレオチドプライマーが、第１オリゴヌクレオチドプライマーの第２〜第Ｎ塩基および第Ｎ＋１塩基を有し、以下ｎ番目（ｎ＜Ｎ）のオリゴヌクレオチドプライマーが、ｎ−１番目のオリゴヌクレオチドプライマーの第２塩基以降の全ての塩基および第Ｎ＋（ｎ−１）塩基を有するように、ｎ番目のオリゴヌクレオチドプライマーとｎ−１番目のオリゴヌクレオチドプライマーとを成長端において互いに一塩基だけ異ならした前記組の1つ以上を持つアレイに、ハイブリッド形成条件で対象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、
ｂ）四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドをアニールプライマーに与える単一塩基拡張反応にアニールプライマーを付して、終止ヌクレオチドを付加することによりアニールプライマーを拡張し、
ｃ）アニールプライマーに付加した各終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見る、各ステップを備え、
ステップａ）における各オリゴヌクレオチドプライマーは、前記対象ポリヌクレオチドにおける前記変異領域の直近にアニール可能である分析法。
【請求項２】
下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。
ａ）連続する複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含む組であって、各組のオリゴヌクレオチドプライマーが長さＮヌクレオチドの既知の配列を有し、かつ各組内で成長端において互いに一塩基だけ異なっている組の１つ以上を持つアレイを固体担体の所定位置に取り付け、
ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーのアレイに対象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、
ｃ）アニールプライマーを単一塩基拡張反応に付して、終止ヌクレオチドを付加することによりアニールプライマーを拡張し、
ｄ）開始アニールプライマーを選定し、
ｅ）開始アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見て、順序が次のヌクレオチドを決定し、
ｆ）開始アニールプライマーのヌクレオチド２ないしＮとステップ（ｅ）で決まる順序が次のヌクレオチドを加えたものと同じヌクレオチド配列の第２アニールプライマー選定し、
ｇ）各反復について第２アニールプライマーを開始アニールプライマーとして用いてステップ（ｅ）、（ｆ）を反復し、対象ポリヌクレオチドの配列を決定する。
【請求項３】
下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。
ａ）連続する複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含む組であって、各組のオリゴヌクレオチドプライマーが長さＮヌクレオチドの既知の配列を有し、かつ各組内で成長端において互いに一塩基だけ異なっている組の１つ以上を持つアレイを固体担体の所定位置に取り付け、
ｂ）ハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイに対象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、
ｃ）四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドをアニールプライマーに与える単一塩基拡張反応にアニールプライマーに付して、終止ヌクレオチドを付加することによりアニールプライマーを拡張し、
ｄ）開始アニールプライマーを選定し、
ｅ）開始アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見て順序が次のヌクレオチドを決定し、
ｆ）開始アニールプライマーのヌクレオチド２ないしＮとステップ（ｅ）で決まる順序が次のヌクレオチドを加えたものと同じヌクレオチド配列の第２アニールプライマーを選定し、
ｇ）各反復について第２アニールプライマーを開始アニールプライマーとして用いてステップ（ｅ）、（ｆ）を反復し、対象ポリヌクレオチドの配列を決定する。
【請求項４】
単一塩基拡張反応が、ポリメラーゼと四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドとから成る反応混合物にアニールプライマーを反応させるものである請求項１ないし３のいずれかに記載の分析法。
【請求項５】
四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドが相互に区別できるものである請求項３または４のいずれかに記載の分析法。
【請求項６】
四つのヌクレオチドのうちの三つが標識の異なったものである請求項５に記載の分析法。
【請求項７】
三つの異なった標識のヌクレオチドが蛍光標識したものである請求項６に記載の分析法。
【請求項８】
さらに、相補対象ポリヌクレオチドの配列を分析することを含む請求項１ないし７のいずれかに記載の分析法。
【請求項９】
終止ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドである請求項１ないし８のいずれかに記載の分析法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さＮが７ないし30（両端を含む）である請求項１ないし９のいずれかに記載の分析法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さＮが20ないし24（両端を含む）である請求項１ないし１０のいずれかに記載の分析法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドプライマーが異なった長さのオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項１、１０または１１のいずれかに記載の分析法。
【請求項１３】
終止ヌクレオチドを同定し位置を見るのを、荷電結合素子または光電子増倍管を用いて行う請求項１ないし１２のいずれかに記載の分析法。
【請求項１４】
分析終了後、終了ヌクレオチドをアニールプライマーから除去して固体担体を再使用できるように用意する請求項２ないし１１、または１３のいずれかに記載の分析法。
【請求項１５】
終止ヌクレオチドがジヌクレオチドである請求項１ないし１４のいずれかに記載の分析法。
【請求項１６】
連続する複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含む組であって、各組のオリゴヌクレオチドプライマーが長さＮヌクレオチドの既知の配列を有し、かつ各組内で成長端において互いに一塩基だけ異なっている組の１つ以上を持つアレイが所定位置に取り付けられた固体担体を有する、請求項１ないし３のいずれかに記載の分析法を実施するための、対象ポリヌクレオチドの配列を分析する分析装置。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドプライマーが特定結合対によって固体担体に取り付けられている請求項１６に記載の分析装置。
【請求項１８】
特定結合対が、ビオチンと、アビジンとストレパビヂンを含む群から選ばれた分子との対である請求項１７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
今日DNA配列決定には化学分解法(chemical degradation)(Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:560-564[1997])とジデオキシ連鎖終止法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467[1977])の二つの主な方法がある。大抵の自動配列決定方法は生成物組成の蛍光検知を利用する連鎖終止法に基づくものである。これらの方法には、(1)染料標識プライマーにデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドを加えたものと(2)プライマーにデオキシヌクレオチドと蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを加えたものの二つの一般的な変形がある。さらに、標識デオキシヌクレオチドは非標識ジデオキシヌクレオチドとともに用いることができる。この方法は酵素が特定のヌクレオチドを鋳型にアニール（焼還）されたプライマーの3'ヒドロキシル端に付加できることに基づいている。核酸の塩基対合性によってヌクレオチド付加の特異性が決まる。拡張生成物はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離され、レーザ励起を利用する光学系によって検出される。
化学分解法とジデオキシ連鎖終止法はともに広く用いられているが、多くの関連した欠点がある。例えばこれらの方法ではゲル電気泳動分離が必要である。一般に、単一クローンから400〜800の塩基対しか配列できないので、この系は時間、労働ともに集約的である。配列処理能力を増そうとしてゲル分離をしない方法が開発されている。
Crkvenjakov(Drmanac, et al, Genomics 4:114[1989]);Strezoska et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10089[1991]);Drmanac, et al.(Science 260:1649[1991])およびBainsとSmith(Bains and Smith, J. Theoretical Biol. 135:303[1988])によって方法が提案されている。ハイブリッド形成(SBH)法によるこれらの配列(sequencing)は、多重ハイブリッド形成反応が同時に行われるので、配列処理能力を潜在的に増すことができる。この種の系では核酸配列を決定するのに短いオリゴヌクレオチドを用いて３対象ポリヌクレオチドの多重ハイブリッド形成から得られる情報が用いられる（Drmanac, 米国特許No.5,202,231）。配列を再構成するには多重ハイブリッド形成によって得られたすべてのフラグメントの最適順位を決定するための広範なコンピュータ探索アルゴリズムが必要である。
これらの方法は種々の点で問題がある。例えば、ハイブリッド形成は、GCに富んだ領域がATに富んだ領域よりも安定になるように、オリゴヌクレオチドと対象ポリヌクレオチドの二重型の配列組成に依存しているので、ハイブリッド形成検出中に疑似陽性と疑似陰性が存在することが多く、配列決定が複雑になる。さらに、ポリヌクレオチドの配列は直接決定されず、既知のプローブの配列から推測され、これが誤差の可能性を増している。核酸配列決定の能率的で正確な方法を開発することがなお求められている。
発明の概要
本発明は対象ポリヌクレオチドの分析、特に配列に関する方法と対象ポリヌクレオチドの分析に有用な装置に係るものである。本発明の一実施例においては、対象ヌクレオチド配列に変異(mutations)または変化(alterations)があるか分析している。本発明の第２の実施例においては、ヌクレオチド配列が既知でない対象ポリペプチドのヌクレオチド配列を決定している。この方法は各々別の拡張事象(extension event)の標識と位置で対象ポリヌクレオチドの塩基(base)が決まるように、一組の特定オリゴヌクレオチドプライマーの単一塩基拡張事象を検出するものである。
本発明の一方法では固体担体を設ける。既知の配列で特定の大きさの連続オリゴヌクレオチドプライマーの一組または数組のアレイを所定位置で固体担体に取り付ける。オリゴヌクレオチドプライマーは各組内で一塩基対だけ違う。オリゴヌクレオチドプライマーは配列が既知の場合、対象ポリヌクレオチドの一ストランドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相応しているか、配列が未知の場合、特定の大きさのオリゴヌクレオチドプライマーのすべての可能なヌクレオチド配列の一組を代表しているか、いずれかである。DNAかRNAである対象ポリヌクレオチドまたは対象ポリヌクレオチドの断片(fragment)をハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイにアニールして、「アニールプライマー」を発生させる。アニールプライマーは単塩基拡張反応条件に付し、この条件で、四つの既知の塩基(A，GおよびC)に相当するジデオキシヌクレオチド(ddNTPs)のような核酸ポリメラーゼと終止ヌクレオチドを、アニールプライマーに与える。終止ヌクレオチドはジヌクレオチドのような既知のポリヌクレオチドの終止ストリングより成るものであってもよい。単塩基拡張反応の結果として、アニールプライマーの各々に終止ヌクレオチドが付加された拡張プライマーが発生する。終止ヌクレオチドは同時か順次のいずれかでアニールプライマープライマーに与えることができる。終止ヌクレオチドは相互に区別できる。すなわち、ヌクレオチドの少なくとも一つに標識して検出を容易にする。終止ヌクレオチドを付加して後、オリゴヌクレオチドアレイを「読む」、すなわち、固体担体上のアレイ内の各終止ヌクレオチドの標識と位置を見ることによって、対象ヌクレオチドの配列を分析する。固体担体上の各終止ヌクレオチドの標識と位置によって、分析している対象ポリヌクレオチドの配列が直接決まる。
本発明の第２の方法においては、固体担体に取り付けられていないオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、対象ポリヌクレオチドに特定の変異がないか分析する。オリゴヌクレオチドプライマーは、変異点のすぐ前の点で対象ポリヌクレオチドにアニールするように調整する。二つ以上の変異点を調べる場合には、オリゴヌクレオチドプライマーを相互に区別できるように設計する。好適な一実施例においては、オリゴヌクレオチドプライマーはゲル電気泳動中に異なる移動度を持つ。例えば長さの異なったオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドプライマーを対象ポリヌクレオチドにアニールして後、アニールしたプライマーを単塩基拡張反応条件に付すと、拡張プライマーとなり、アニールされたプライマーの各々に終止ヌクレオチドが付加される。本発明の第１の方法におけるように、終止ヌクレオチドは相互に区別できる。終止ヌクレオチドを付加して後、拡張プライマーを溶出し、ゲル電気泳動を行い、ゲルを「読む」、すなわち、自動DNA配列決定装置でするように、標準法でゲル上の各終止ヌクレオチドの標識と位置を観察する。ゲル上の各終止ヌクレオチドの標識と位置によって、分析している対象ポリヌクレオチドの配列が直接決まり、変異があるかとうかが示される。
本発明の装置は、各々が各組内で一塩基対だけ違う既知の配列の連接したオリゴヌクレオチドプライマーの一組以上を持つアレイを取り付けた固体担体より成るものである。オリゴヌクレオチドプライマーの組は、配列が既知の場合に対象ポリヌクレオチドの一ストランドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相応するか、配列が未知の場合に特定大きさのオリゴヌクレオチドプライマーについて可能なヌクレオチド配列の全部であるか、いずれかである。
本発明は、対象ポリヌクレオチドについて特定ヌクレオチド付加の検出による直接情報と、特定塩基付加がなされたアニールプライマーの既知の配列による間接情報の両方とも与えるものである。核酸配列を決定できることは遺伝子発現と制御(regulation)を知るのに不可欠な要素である。さらに、分子医学が進歩し続けると、配列決定は疾病と診断と処置により重要な要素となる。
【図面の簡単な説明】
図１は成長端において一塩基対だけ違い対象ポリヌクレオチドの関連部または全体沿いに順次ハイブリッド形成できる連接プライマー(consecutive primer)より成るオリゴヌクレオチドプライマーの一組の例を示す図である。
図２は固体担体に取り付けられたプライマーに結合された単一ストランド鋳型を例示する模式図である。
図３は図２に例示したプライマーのすぐ後に続く対象ポリヌクレオチドの一部に対する連接オリゴヌクレオチドの一組を例示する図である。
図４は図３に例示したすべてのプライマーへの単一塩基対付加物ならびに対象ポリヌクレオチドの相補ストランドに関係した相応するプライマーに対する相応する付加物を例示する図である。
図５は対象ポリヌクレオチドにアニールした遊離オリゴヌクレオチドプライマーを用いて形成された拡張プライマーの長さをグラフ表示した図である。
図６Ａ，６Ｂ，６Ｃは対象ポリヌクレオチドの変異の検出を実証するエレクトロフォレトグラム(electrophoretogram)をグラフ表示した図である。
図７Ａ，６Ｂ，６ＣはHPRT遺伝子の第３エキソン内の５塩基領域についてのDNAチップベースの分析(DNA chip-based analysis)の結果を示す図である。
発明の詳細な説明
本発明は、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の分析法に関するものである。この方法は対象ポリヌクレオチドのすべてまたはフラグメントをハイブリッド形成し単一塩基拡張反応を行い、単一塩基拡張事象を検出するものである。この方法はヌクレオチド配列に変異（変化）がないか配列を調べることによって、すなわち対象ポリペプチドの配列を決定することによって対象ポリペプチドの配列を分析するに用いることができる。
「対象ポリヌクレオチド」という語は、ここで用いた意味では、配列情報が欲しい特定のポリヌクレオチドのことである。代表的な対象ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、DNAあるいはDNAフラグメント、RNAまたはRNAフラグメント、ならびに遺伝子または遺伝子の部分がある。対象ポリヌクレオチドは一重ストランドでも二重ストランドのものでもよい。「対象鋳型ポリヌクレオチド(template polynucleotide of interest)」という語は、ここでは、二重ストランドのポリヌクレオチドの一ストランドだけ分析する場合、分析するストランド、あるいは二重ストランドのポリヌクレオチドの両ストランドを分析する場合、第１ストランドと識別されるストランドのことを言う。「相補対象ポリヌクレオチド」という語は、ここでは、二重ストランドのポリヌクレオチドの一つのストランドだけを分析する場合、分析しないストランド、あるいは二重ストランドのポリヌクレオチドの両方のストランドを分析する場合、第２のストランド(すなわち第１［鋳型］ストランドに相補的なストランド)と識別されるストランドのことを言う。二つのストランドのいずれも分析できる。好適な一実施形態では、相補（第２）ストランドと比較することによって鋳型（第１）ストランドから得られた配列情報を確認するために、対象二重ストランドのポリペプチドの両ストランドとも分析している。それでも両ストランドを分析するのは常に必要ではない。例えば、対象ポリヌクレオチドに単一塩基変異がないかを分析しようとしており、変異領域における完全な塩基配列を分析しようとするのでなければ、対象ポリヌクレオチドの単一ストランドを分析すれば十分である。
本発明の方法は対象ポリペプチドのヌクレオチド配列における変異（変化）があるかないかを確認するのに用いることができる。変異（変化）を確認するには対象ポリヌクレオチドの配列を未変性の、すなわち正常なポリヌクレオチドの配列と比較する。ここで用いた対象ポリヌクレオチドの「変化」とは、欠失、挿入、点変異、フレームシフト、拡張オリゴヌクレオチド反復、などの変化を含む予期される配列（未変性の正常なポリヌクレオチドの配列）からの逸脱のことである。変化部のある対象ポリヌクレオチドの部分は「変化」領域と言われる。この方法はこれまで未知のヌクレオチド配列のある対象ポリペプチドの配列を決定するのにも用いることもできる。
本発明の一実施形態においては、対象ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーの組より成るアレイにアニールすることによって分析する。アレイのオリゴヌクレオチドプライマーの長さはNで、このＮは約7ないし30（両端を含む）のヌクレオチドで、なるべく、20ないし24（両端を含む）のヌクレオチドであるとよい。各組内の各オリゴヌクレオチドプライマーは一塩基対だけ違う。オリゴヌクレオチドプライマーは従来法(Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual[第2版、1989]を参照)によって調製できる。アレイ上の各オリゴヌクレオチドプライマーの位置とヌクレオチド内容がわかるように、オリゴヌクレオチドプライマーの組をアレイに配置する。
アレイのオリゴヌクレオチドプライマーの大きさとヌクレオチド内容は、対象ポリヌクレオチドと配列情報の望まれる対象ポリヌクレオチドの領域による。対象ポリヌクレオチドに変化がないか分析するには、成長端で一塩基対だけ違いポリヌクレオチドの関連部分あるいは全体沿いに順次ハイブリッド形成できる連接プライマーを用いる。このようなプライマー組の一例を図１に示す。ポリヌクレオチド配列の一つまたは数個の特定位置だけに変化がないか調べるのであれば、オリゴヌクレオチドプライマーの必要はアレイは、変異領域だけに渡るものであって小さい。対象ポリヌクレオチドの全体あるいは大部分を種々の位置に変異がないか分析するのであれば、必要なアレイはもっと大きくなる。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子は30 X 30アレイに配置した900のプライマーによって処理でき、全p53遺伝子には700のプライマーが必要である。二重ストランドの対象ポリヌクレオチドの両ストランドに変化がないか分析する場合は、アレイは鋳型対象ポリヌクレオチドと相補対象ポリヌクレオチドの両方の疑われる変異領域に対する連接オリゴヌクレオチドプライマーより成るものとする。対象ポリヌクレオチドを以前に配列させていない場合には、アレイはすべての可能なNマーより成るオリゴヌクレオチドプライマーを含むものとする。
オリゴヌクレオチドプライマーの組のアレイを所定位置（すなわち、既知の位置）で固体担体に固定する。固定したアレイを「DNAチップ」と言うが、これは本発明の装置(apparatus)である。固体担体は硝子、珪素、あるいは他の材料の板または削り屑(chip)でもよい。固体担体は金や銀のようなもので被覆してもよい。被覆するとオリゴヌクレオチドプライマーを固体担体の表面に取り付けやすくなる。オリゴヌクレオチドプライマーはビオチンとアビジン、あるいはビオチンとストレプタビジンのような特定結合対によって固体担体に結合できる。例えば、プライマーにはその調製関連でビオチンハンドルを設けることができ、次いでビオチン標識したプライマーをストレプタビジン被覆担体に取り付けることができる。別法として、C10-20鎖のような共有結合炭化水素のようなリンカーアームによって結合できる。プライマーはエポキシド／アミン結合化学作用によるなどして固体担体に直接結合することができる（Eggers, M.D. et al., Advances in DNA Sequencing Technology, SPIE Conference Proceedings, 1993年1月21日）。次に詳細に述べるように、固体担体は再使用できる。
本発明のもう一つの実施形態においては、対象ポリヌクレオチドを固体担体に取り付けられていない一つ以上の特定オリゴヌクレオチドにアニールすることによって、そのポリヌクレオチドを分析する。このようなオリゴヌクレオチドプライマーを、ここでは「遊離オリゴヌクレオチドプライマー」という。遊離オリゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、対象ポリヌクレオチドを磁性ビードのような固体担体に取り付けることができる。遊離オリゴヌクレオチドプライマーの長さは上述のようにＮで、通常の方法（Sambrook et al., Molecular cloning:A Laboratory Manual［第2版、1989年］を参照）で調製する。遊離オリゴヌクレオチドプライマーの大きさとヌクレオチド内容は対象ポリヌクレオチドと、配列情報を求めている対象ポリヌクレオチドの領域とによる。対象ポリヌクレオチドに変化がないかを分析するには、ポリヌクレオチドの関連部分にすぐ隣接してハイブリッド形成できるプライマーを用いる。ポリヌクレオチド配列の二つ以上の位置に変化がないかを調べるに場合は、遊離オリゴヌクレオチドプライマーは相互に区別できるものとする、すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーはゲル電気泳動中に移動度の異なるものとする。好適な一実施形態においては、長さの異なったオリゴヌクレオチドを用いている。例えば、長さ10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーを一つの推定変異部にすぐ隣接してハイブリッド形成するようにし、長さ12ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーを第２の推定変異部にすぐ隣接してハイブリッドを形成するようにする。オリゴヌクレオチドプライマーは長さが異なるものであるので、ゲルの異なった位置へ移行する。このようにして、各オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド内容がゲル上のオリゴヌクレオチドの位置によって同定できる。
極めて厳密な条件で、対象ポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドプライマーのアレイ、または遊離ヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成し、塩基対の不同(mismatch)なしに、対象ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプライマーを正確に合わせるようにする（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual［第2版、1989年］を参照）。例えば、固体担体に取り付けたオリゴヌクレオチドプライマーにアニールした仮想の対象ポリヌクレオチドを、図２に略図で例示している。図２において、アレイ上のオリゴヌクレオチドに結合されたポリヌクレオチドの部分のすぐ後に続く対象ポリヌクレオチドの配列の一部をTGCAACTAと示す。六つの相応する連接プライマー、すなわち対合塩基A、AC、ACG、などで終止するプライマーを図３に示す。対象ポリヌクレオチドが二重ストランドのものであれば、それは対象ポリヌクレオチドのアレイオリゴヌクレオチドプライマーへの結合の前か後のいずれかの時に二つの単一ストランドに分離することができる。鋳型と相補の対象ポリヌクレオチドはともに単一アレイを用いて分析できる。すなわち、図２には示していないが、相補対象ポリヌクレオチドに相応する適切なプライマーも、既知の位置で固体担体に取り付けることができる。
対象ポリヌクレオチドをハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーの組のアレイまたは遊離のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成すると、アニールプライマーができる。ここで用いた用語「アニールプライマー」とは、対象ポリヌクレオチドをハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドプライマー（遊離か又は固体担体に取り付けられたもの）を言う。アニールプライマーは単一塩基拡張反応に付する。ここで用いた「単一塩基拡張反応」とは、単一終止ヌクレオチドがアニールプライマーの各々に付加される条件で、T7ポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼと終止ヌクレオチドの反応混合物を、アニールプライマーに与える反応のことである。ここで用いた「終止ヌクレオチド」という語は、単一終止ヌクレオチド又はヌクレオチドの単位（この単位はなるべくジヌクレオチドであるとよい）のことである。好適な一実施形態では終止ヌクレオチドは単一ジデオキシヌクレオチドとしている。終止ヌクレオチドは、標準ヌクレオチドとヌクレオチド類似物またはそのいずれかを含むものとすることができる。それで、各アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドは対象ポリヌクレオチドの鋳型塩基と対合する塩基であり、それぞれのプライマ-の成長端にすぐ隣接して付加される。単一塩基拡張反応によって終止ヌクレオチドを付加したオリゴヌクレオチドプライマーを「拡張プライマー」と言う。すなわち、仮想対象ポリヌクレオチドの両ストランドについて、図４に模式的に示すように、単一ヌクレオチドをアレイの各プライマーに付加する。図２に例示したストランドに関連するプライマー組は、図４の左側に示し、他の（相補）ストランドは右に示す。付加したヌクレオチドは太字で示す。
終止ヌクレオチドはなるべくdNTPsを有するもの、ことにジデオキシヌクレオチド(ddNTPs)を有するものであるとよいが、当業者には自明な他の終止ヌクレオチドも用いることができる。終止ヌクレオチドが単一ヌクレオチドであれば、四つの塩基（A、T、GおよびC）の各々に相応するヌクレオチドを単一塩基拡張反応に用いる。終止ヌクレオチドは例えばジヌクレオチド単位であれば、16の可能なジヌクレオチドの各々に相応するヌクレオチドを用いる。
ヌクレオチドは相互に区別できる。例えば、固体担体を金や銀でのように自由電子金属で被覆すると、表面プラスモン共鳴(SPR)顕微鏡で、各塩基拡張によって起こる表面における屈折率の変化により、各ヌクレオチドを同定できる。別法として、終止ヌクレオチドの少なくとも一つを標準法で標識して検出を用意にする。適当な標識には蛍光染料、化学発光、および放射性核種がある。標識するヌクレオチドの数は変えることができる。標識した終止ヌクレオチドを三つ用いれば十分で、塩基拡張反応で単一ヌクレオチドを付加する場合、第４の終止ヌクレオチドはそれの「無標識」によって識別する。例えば、変化した領域における完全な塩基配列についてでなく、対象ポリヌクレオチドに特定の変化がないかどうかを調べるのであれば、標識した終止ヌクレオチド三つで十分である。適切な状況では標識は三つより少なくすることもできる。二つを標識し二つを標識しないdNTPsを用いる例を次に挙げる。点変異のような特定の変化を調査するのであれば、変異が「無標識」のあることによって示されることになるので、無変化すなわち正常なヌクレオチドだけ標識すればよい。別法として、予期される変異体ヌクレオチドも標識できる。
単一塩基拡張反応を行った後、各終止ヌクレオチドの標識と位置を見る。遊離オリゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、ゲル電気泳動法で拡張プライマーを溶出して分離してからゲルを分析する。アレイに取り付けたオリゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、アレイ自体を分析する。ゲルあるいはアレイはオリゴヌクレオチドプライマーに結合された標識した終止ヌクレオチドを検出して分析する。標識した終止ヌクレオチドは光学系のような通常の方法によって検出する。例えば、特定の型の終止ヌクレオチドの蛍光発光を分離するために、フィルタセットと一緒にレーザ励起源を用いることができる。光電子増倍管、荷電結合素子(CCD)、または他の適当な蛍光検知法のいずれかを用いて、蛍光終止ヌクレオチドの発光を検出することができる。
アレイまたはゲル上の相異なるプライマーの位置が既知であり、かつ、各終止ヌクレオチドがそれに特定の標識によって識別できるので、対象ポリヌクレオチドの配列をアレイ上またはゲル上で見られる標識パタンから分析できる。アレイ内かゲル上のいずれかの各終止ヌクレオチドの標識と位置によって、分析している対象ポリヌクレオチドの配列が決まる。対象ポリヌクレオチドの配列の変異（変化）は予期される標識のパタンの変化によって示される。例えば、図２に示すヌクレオチド配列に一つの変異があるとする。左から三番目の塩基Ｃが、対象ポリヌクレオチドではＧによって置き換えられている。図３の最上プライマーは図４に示すように、なおＣによって拡張されるが、次のプライマーもＧでなくＣによって拡張される。この新しい予期されない塩基Ｃはそれの特定標識によって識別することができ、またそれぞれのプライマー位置がわかっているので、相応する塩基変異をＧとして識別する。
下記の簡単な例は、完全な配列情報を得て対象の代表的なポリヌクレオチドにおける変異を識別できることを例示するものである。この例は完全な配列情報を与える二つの識別した終止ヌクレオチドを用いている。下記の塩基対組成を持つ正常ポリヌクレオチド
＋  ＡＣＴＧＣＴＴＡＧ
−  ＴＧＡＣＧＡＡＴＣ
および第３塩基対に単一塩基変異のある下記の塩基対組成を持つ相応する変異体ポリヌクレオチドを想定する。
＋  ＡＣＣＧＣＴＴＡＧ
−  ＴＧＧＣＧＡＡＴＣ
例えば終止Ａに赤標識（“Ｒ”）、終止Ｇに緑標識（“Ｇ”）、残りの塩基Ｔ、Ｃに無意識すなわち、無し（“Ｎ”）とする蛍光標識法を用いると、それぞれ正常、変異体および異型接合体(heterozygote)の配列に対して配列判定が可能な下記の「二進」記号が得られる。
0003722833.tif 000002
このような点変異があると次の二三のオリゴヌクレオチドプライマーの対象ポリヌクレオチドとの塩基対合、それにより得られるプライマー拡張に影響があって、変異部の付近の（すなわち、変化領域の）塩基が正確に同定できなくなる。この変化領域の塩基の同定を最適にするには、なるべく対象二重ストランドポリヌクレオチドの両ストランドを分析するとよい。対象の鋳型ポリヌクレオチド上で同定しにくい二三の塩基ならびに変化塩基は、相補対象ポリヌクレオチドの分析を反対方向から変異点に近付いて行うようにすると、対象ポリヌクレオチドについてプライマーの塩基拡張によって同定される。変化部の両側の最も近い領域では、これで二つのストランドの一つについてオリゴヌクレオチドプライマーによって配列決定がなされる。
配列が既知の対象ポリヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチドプライマーのアレイを用いる変異の同定について上に述べた方法と同様な方法で決定できる。前述のように、アレイ内の終止ヌクレオチドの位置によって対象ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドの配列位置が決まる。
オリゴヌクレオチド配列を決定するには、一つのアニールしたプライマーを「開始」アニールプライマーに選ぶ。分析を行うために、対象ポリヌクレオチドの配列がこのプライマーで「開始する」と想定している。開始アニールプライマーに付加されたヌクレオチドは標準法で検出する。次いで、開始アニールプライマーから5'ヌクレオチドを取り、付加ヌクレオチドを付加したものと同じヌクレオチド配列の第２アニールプライマーを選ぶ。この第２アニールプライマーに付加された終止ヌクレオチドを検出する。第２アニールプライマーを「開始」アニールプライマーとして用いて、対象ポリヌクレオチドの配列が決定されるまで、これらのステップを反復する。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが長さ10ヌクレオチドであれば(N=10)、開始アニールプライマーを配列の最初の十塩基に相当するように選ぶ。次いで開始アニールプライマーの終止ヌクレオチドを決定する。次に、塩基2〜11（すなわち開始アニールプライマーの塩基2〜10プラス終止ヌクレオチド拡張部）をもう一つのアニールプライマーに合わせる。このプライマーが第２アニールプライマーである。次いでこの第２アニールプライマーの終止ヌクレオチドを決定する。これらのステップを繰り返して完全な配列を決定する。このようにして単一塩基拡張反応によってアニールプライマーの組が自動的につなぎ合わされる。
対象ポリペプチドの分析の後、チップを再使用することができるように、対象ポリヌクレオチドと終止ヌクレオチドをDNAチップから除去する。好適な実施形態においては、対象ポリヌクレオチドの分析の後、付加された終止ヌクレオチドは固体担体から除去することができる。ヌクレオチドを除去すると、固定オリゴヌクレオチドプライマーの付いた固体担体は新しい分析に用いることができる。ヌクレオチドは酵素開裂あるいは化学分解のような標準法で除去できる。酵素開裂には例えば酵素によって除去できる終止ヌクレオチドを用いる。単一塩基拡張反応では、逆トランスクリプターゼか他のポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドプライマーに、RNAジデオキシTTPまたはRNAジデオキシCTPが付加されることになる。すると、RNアーゼAのようなC/T開裂酵素を用いてRNAジデオキシヌクレオチドを「剥離」することができる。別法として、単一拡張反応中に含硫黄ジデオキシAあるいはデオキシGを用いることができる。次いで、燐酸塩を開裂させない硫黄専用エステラーゼを用いてジデオキシヌクレオチドを開裂して除くことができる。化学分解には、化学的に分解できる終止ヌクレオチドを用いることができる。例えば、アセチル基によって2'-ヒドロキシル基と3'-ヒドロキシル基をエステル化した修飾リボヌクレオチドを用いることができる。アニールプライマーに終止ヌクレオチドを結合させて後、塩基で処理してアセチル基を除去して2'-ヒドロキシル基と3'-ヒドロキシル基を露出させる。すると、リボース残基は過ヨウ素酸酸化によって分解でき、塩基とアルカリ性ホスファターゼで処理して燐酸残基をアニールプライマーから除去できる。
本発明の方法と装置は変異、欠失、拡張オリゴヌクレオチド反復、その他の遺伝的異状を検出するのに用いられる。例えば、本発明は挿入あるいは欠失により起こるフレームシフト変異を識別するのに用いることができる。正常信号と変化信号ともに検出されるので、本発明を用いてさらに?胞性繊維症、β−サラセミア、α−１、ゴーシェ病、テイ・サックス病、あるいはレッシュ・ナイハン病のような遺伝病の担体状態(carrier status)を容易に決定することができる。さらに薬剤抵抗のあるHIV感染患者に起こるようなDNA分子の混合物が判定できる。HIVウイルスには、逆トランスクリプターゼ(RT)遺伝子における点変異によって、AZTのような薬剤に対する抵抗ができる。ウイルス固体群に変異ウイルスが出現し始めると、変異遺伝子と正常（野生型）遺伝子がともに検出できる。変異体の割合が多いほど、相応する変異体終止ヌクレオチドからの信号の多い。
本発明を下記の実施例によってさらに例証する。
実施例１：遊離オリゴヌクレオチドプライマーを用いる対象ポリヌクレオチドの配列の分析
ヒポキサンチグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（対象ポリペプチド）の分析を三個体（患者A、B、およびC）について行った。
A.  対象ポリヌクレオチドを得ること
対象ポリヌクレオチドを増殖するのに、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual〔第２版、1989年〕特に第14章）を用いた。反応中、二つのPCRプライマーの一つをビオチン基で標識した。増殖の後、単一ストラント鋳型をストレプタビジン被覆磁気ビードで捕集した。50μlのPCR反応に、25μlのDynal M-280常磁性ビード(Dynal A/S, Oslo, Norway)を用いた。ビードの上澄液を除去し、50μlの結合・洗浄緩衝液（10mM トリス-HCl［pH 7.5］;1mM EDTA;2M NaCl）と取り替えた。ビードにPCR生成物を加え室温で30分間温置して生成物をビード捕集した。５分間にわたって、150μlの0.15M NaOHを加えて対象の単一ストランドポリヌクレオチドを分離した。ビードを捕集し、上澄液を除去し、0.15M NaOH 150μlを５分間再び加えた。変性の後、ビードを0.15M NaOH 150μlで一回、1X T7アニール用緩衝液（40mM  トリスHCl［pH7.5］;20mM MgCl2;50mM NaCl）で二回洗浄した。ビードは最期に水70μl中に懸濁させた。このプロセスで単一ストランドの対象ポリヌクレオチドが分離されるとともに、PCR後に残留している組み込まれていないdNTPsが除去される。
B.  対象ポリヌクレオチドの配列の分析
単一ストランド分離の後、約２分間65℃に加熱し、約20分間で室温まで冷却してオリゴヌクレオチドプライマーをポリヌクレオチドにアニールした。10μl反応容(reaction volume)は、対象ポリヌクレオチド７μl（0.5〜1pmol）、5X T7アニール用緩衝液2μlと拡張プライマー1μl（3〜9pmol）より成るものであった。次いで拡張反応を行った。この反応にはDTT1μl、T7ポリメラーゼ2μl(1:8希釈)およびddNTPs(最終濃度0.5uM)を添加した。反応は37℃で2分間進めてから、洗浄緩衝液（1XSSPE、0.1%SDS、30%エタノール）を加えて停止した。ビードは洗浄緩衝液150μlで二回洗浄した。拡張生成物をホルマミド5μlを加えて溶出し、70℃で２分加熱した。ビードを磁石で捕集し、拡張生成物を含む上澄液を収集し、ABI373(Applied Biosystems, Inc.)で分析した。長さ10〜17と異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。図５に示すように拡張生成物は効率的に生成された。
1.  デオキシヌクレオチド標識‐四つの蛍光体
各ddNTPは異なった蛍光体によって標識した。
標識ポリメラーゼ用に造られたABI染料ターミネータを用いた。
ddGは青、ddAは緑、ddTは黄、ddCは赤である。各反応管に四つの蛍光ddNTPsを加えた。拡張生成物を精製し、ゲル分離してABI373で分析した。HPRT遺伝子のエキソン3の二つの異なった塩基、塩基16534（野生型(wild type)はA）と塩基16620（野生型はC）を分析した。
４蛍光体、１レーンの結果、変異のあることが容易に識別できることが示された。３人の患者はすべて塩基16534がAの野生型である(データは図示せず)。図６Ａ，６Ｂおよび６Ｃに示すエレクトロホレトグラムによって、患者Aは塩基16620が野生型(C)(図6A)、患者Bは塩基16620が変異固体(C-->T)(図6B)、患者Cは塩基16620が保因者(C、Tとも)(図6C)であることが示されている。
2.  デオキシヌクレオチド標識‐単一蛍光体
各ddNTPを同じ蛍光体で標識した。デュポンNENフルオロセイン染料(NEL400〜404)を用いた。各ddNTPはABI373で青く見える。各反応管に一つの蛍光ddNTPのみを加える。拡張生成物を精製し、ゲル分離して、ABI373で分析した。各塩基を分析するのにゲル上の４レーンを用いねばならない。HPRT遺伝子のエキソン3の異なった二つの塩基である、塩基16534（野生型はAである）と塩基16620（野生型はCである）を分析した。
１蛍光体、４レーンの結果、上の(1)に述べた４蛍光体、１レーン法で得られた結果と同じものであることが実証された。この種の検定では、拡張生成物生成中およびゲル分離中における蛍光体の違いの影響を最小にする。
3.  デオキシヌクレオチド標識‐ビオチニル化ジデオキシヌクレオチド
ddNTPsをビオチン基で標識する。四つの別の反応を行うが、四つのddNTPsのうちの一つしかビオチニル化しない。拡張反応の後、ストレパビジン（またはアビジン）結合蛍光基がビオチン化ddNTPsに付く。ビオチン基は小さいので、ddNTPsが均等に組み込まれると予期され、拡張における塩基特定の差異が少なくなる。さらに、ビオチン基は多重蛍光体に結合されたストレプタビジンの部分を拘束できるので、蛍光信号を増幅できる。
実施例２：標識したデオキシヌクレオチドを用いる対象ポリヌクレオチドの配列の分析
３個体（患者Ａ、Ｂ、Ｃ）について、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子（対象ポリペプチド）の分析を行った。HPRT遺伝子の第３エキソンを調べた。
Southern(Nucl. Acids Res. 20:1679［1992］とGenomics 13:1008[1992])に従って、乾燥キシレン(Aldrich Chemical)中でジイソプロピルエチラミン(Aldrich Chemical)の触媒量とともに、25% 3' グリシドオキシプロピルトリエトキシシラン(Aldrich Chemical)を用い、80℃で８時間顕微鏡ガラススライドをエポキシシラン化した。5'-アミノ結合オリゴヌクレオチド(50μM、0.1M NaOH)0.5μlを37℃の湿潤環境に６時間置いて、DNAチップを造った。チップは50℃の水中で15分間洗い、乾燥して用いた。アニール反応は、単一ストランドDNA2.2μl(T7反応緩衝液中で0.1M)を各グリッド位置に付加し、湿潤環境にあるチップ70℃に加熱してから、ゆっくり室温に冷却することからなる。0.1M DTTの液滴１μl、Sequenase Version 2.0（USB）３ユニット、α−32P dNTP（3000Ci/mmol）(DuPont NEN)５μCiおよび競合しない無標識のddNTPs(Pharmacia)18.5μMを、３分間に各グリッド位置に付加した。この反応は、75℃の水中で洗って停止させ、PhosphorImager（Molecular Dynamics）で分析した。
図７Ａ，７Ｂ，７ＣはHPRT遺伝子の第３エキソン内の５塩基領域についてのDNAチップベースの分析結果を示している。行(rows)は検討している特定塩基に相応し、列(columns)は標識塩基に相応している。図７Ａは野生型配列(TCGAG)を示し、図７ＢはC-->T変異を示し、図７ＣはC-->T変異を示している。
均等物
当業者はここに説明した特定の実施例の均等物を認識する、すなわち平常の実験以上をすることなく確認できるであろう。そのような均等物も下記の請求の範囲に入るものとする。
【図１】
0003722833.tif 000003
【図２】
0003722833.tif 000004
【図３】
0003722833.tif 000005
【図４】
0003722833.tif 000006
【図５】
0003722833.tif 000007
【図６Ａ】
0003722833.tif 000008
【図６Ｂ】
0003722833.tif 000009
【図６Ｃ】
0003722833.tif 000010
【図７Ａ】
0003722833.tif 000011
【図７Ｂ】
0003722833.tif 000012
【図７Ｃ】
0003722833.tif 000013