(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、多糖類から次の式(1)で表される光学的に純粋な(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルを製造する方法。
(i) アミロペクチンとα−アミラーゼとを反応させて分解生成物を製造する工程；
(ii) 前記α−アミラーゼを不活性化する工程；
(iii) 前記分解生成物とプルラナーゼを反応させて式(2)で表されるα-(1,4)結合したオリゴサッカライドを製造する工程；及び
(iv) 前記オリゴサッカリドを塩基の存在下で酸化剤により酸化させた後に、酸触媒の存在下で式：ROHのアルコールによるエステル化を行う工程。
【化１】
0003614366.tif 000007
式中、RはC1-5の線状又は分岐のアルキル基を示す。
【請求項２】
前記オリゴサッカリドが、3-50のグルコース単位を有することを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項３】
前記酸化が、30-65℃の条件下でを行われることを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項４】
前記酸化に使用される塩基が、アルカリ金属水酸化物及びアルカリ土類金属水酸化物の中から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項５】
前記塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項４記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項６】
前記塩基が、アミロペクチンのグルコース単位１モルに対して2-4当量の範囲で使用されることを特徴とする請求項１或いは４記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項７】
前記酸化に使用される酸化剤が、過酸化水素、過酸化アルカリ金属、過酸化アルカリ土類金属及びアルキルヒドロペルオキシドの中から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項８】
前記酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする請求項７記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項９】
前記酸化剤がt-ブチルヒドロペルオキシドであることを特徴とする請求項７記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が、アミロペクチンのグルコース単位１モルに対して1-3当量の範囲で使用されることを特徴とする請求項１或いは７記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１１】
前記エステル化が、30-80℃の条件下で行われることを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１２】
前記エステル化に使用される酸触媒が、塩酸、硫酸、リン酸及び硝酸の中から選ばれた無機酸であることを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１３】
前記エステル化に使用される酸触媒が、フルオロアルキルスルホン酸、アラルキルスルホン酸、アラルキルスルホン酸の水和物及びトリフルオロ酢酸の中から選ばれた有機酸であることを特徴とする請求項１記載の(S)-3,4-ジヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、以下の工程を含む、次の化学式１で表される光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体の製造方法に関するもので、より詳細には次の方法により光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を経済的に大量生産が可能である製造方法に関するものである。
（ａ） 天然物から容易に得られるアミロペクチンを特定の条件下で酵素と反応させて目的化合物の製造に適合する糖の分布を有する、α−（１，４）結合したオリゴサッカリドを製造する工程、及び
（ｂ） これを連続的に特定の条件下で酸化及びエステル化する工程。
【０００２】
【化２】
0003614366.tif 000002
式中、Ｒは Ｃ１−５の線状又は分岐のアルキル基を示す。
【０００３】
【従来の技術】
（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、多様なキラル化合物を製造するために中間体の合成用原料として使用されている。上記の化合物は例えば、神経調節剤としての（Ｒ）−ＧＡＢＯＢ ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ４６， ４２７７（１９９０）］、高脂血症薬剤（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ； ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ阻害剤） ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３３， ２２７９（１９９２）］、抗ＡＩＤＳ薬剤 （Ａｇｅｎｅｒａｓｅ； ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の核心中間体である（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７， １１８１（１９９５）； 国際特許公開 ＷＯ９４／０５，６３９号］、脳代謝改善剤としての（Ｓ）−オキシラセタム［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９３／０６，８２６］、健康補助剤としての ｌ−カルニチン［国際特許公開 ＷＯ９９／０５，０９２号］、（Ｓ）−ｍｏｎｏ−ベータラクタム［日本特許公開昭６４−１３，０６９号（１９８９）］、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ブロモ酪酸のエステル ［日本特許公開平 ４−１４９，１５１号（１９９２）； 日本特許公開平 ６−１７２，２５６号（１９９４）］、飽満剤の潜在的中間体原料［Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， ６１， ２０２５（１９８８）］、神経弛緩剤の中間体原料［ＵＳＰ ４，１３８，４８４］、天然物を合成するために有用な中間体［Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５０， １１４４ （１９８５）； Ｃａｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ．， ６５， １９５ （１９８７）， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ５０７ （１９９２）］等の製造に重要な中間体として機能することが良く知られている。
このように、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、各種のキラル化合物を製造する時に広く使用されている重要な化合物であるので、多くの研究がなされて来た。これらの化合物の製造に最も重要なことは、光学純度である。
【０００４】
これらのキラル化合物を製造する時に中間体として有用な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造に関連する従来の技術を説明すれば次のようである。
β−ケトエステルを酵素或いは触媒を利用した還元反応により（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸の誘導体を得る方法が報告されている［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０５， ５９２５−５９２６（１９８３）； Ｔｅｔｅｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３１， ２６７−２７０（１９９０）； ヨロッパー公開特許第４５２，１４３Ａ２号］。上記の方法によると、プロキラル中心炭素を一方向に還元してキラル中心を形成しなければならない難しさがあり、高価な金属触媒を使用しなければならない短所もある。
また、（ｌ）−リンゴ酸をエステル化させた後に、選択的な還元反応により（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸エステル及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを合成する方法が報告されている［Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １３８９−１３９２（１９８４）； ＵＳＰ ５，８０８，１０７］。この技術も２つのエステル官能基の中で１つの官能基だけを還元させる難しさがある。
他の方法としては、炭水化物から化学的な方法により（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを合成する多くの方法が報告されている。
【０００５】
反応式１
【化３】
0003614366.tif 000003
既存に報告された文献によると、Ｃ−４の位置にグルコース置換基を持つ炭水化物、例えば４−Ｏ−メチル−（ｄ）−グルコース、麦芽糖、アミロース及びセルロースを塩基の存在下で反応させ、Ｃ−４の位置に存在するグルコース置換基を離脱基として除去して上記の反応式１に示すジカルボニル化合物（Ａ）（４−デオキシ−２，３−ヘキソジウロース）を生成させ、これを塩基と反応させてイソサカリン酸（Ｂ）、或いは（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸（Ｃ）を製造する技術が報告されている［Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９２４−１９３１（１９６０）］。しかし、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸（Ｃ）の収率は低い。
また、上記したようなグルコース置換基を持つ炭水化物を塩基の存在下で反応させてジカルボニル化合物（Ａ；４−ｄｅｏｘｙ−２，３−ｈｅｘｄｉｕｌｏｓｅ）を生成し、ジカルボニル化合物を分離して過酸化水素と反応させて（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸（Ｃ）とグリコール酸（Ｄ）を主生成物として得ている［Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９３２−１９３８（１９６０）］。この方法によると、反応混合物からジカルボニル化合物（Ａ）を分離する時に互変（ｔａｕｔｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によりジカルボニル化合物（Ａ）の異性体（ｉｓｏｍｅｒ）が存在し、又は環式化合物の水和物の生成により多量のジカルボニル化合物（Ａ）を分離することができない問題がある。さらに、生成された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸が過度の酸化によりギ酸及びグリコール酸に分解されるという問題もある。
【０００６】
上記と類似な技術としては、炭水化物から塩基単独、又は塩基の存在下で酸素を利用して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸を合成している。上記の反応式１に示したように、ジカルボニル化合物（Ａ）を中間体として約３０％の低い収率である（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸が生成されたと報告している［Ｊ． Ｒｅｓ． Ｎａｔｌ． Ｂｕｒ． Ｓｔａｎｄ．， ３２， ４５（１９４４）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２２４５−２２４７（１９５３）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １４３１−１４３５（１９５５）； Ｃａｒｂｏｈｙｄ． Ｒｅｓ．， １１， １７−２５（１９６９）； Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ５４９， １１３−１２５（１９９１）］。この方法によると、グリコール酸（Ｄ）、イソサカリン酸（Ｂ）、ギ酸、ケトン、ジケトン、グリセリン酸等のように各種の酸混合物が主に生成され、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸も生成される。しかし、上記の方法による（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸の収率が極めて低いので、産業的な技術価値はないと判断される。（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸を製造する他の方法としては、二糖（乳糖）から塩基と酸化剤を使用して製造された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸を（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンで環化させ、これを再び開環反応によりメチル（Ｓ）−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−３，４−ジヒドロキシ酪酸エステルに分離したと報告している［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９８／０４５４３］。この方法により反応混合物の中で存在する（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを生成することにおいて、開環反応の後に２つのヒドロキシ官能基により保護されたアセトニドエステルに転換させ、これを酸触媒の存在下で環化させて（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得る追加的な精製工程を経る。
【０００７】
一方、Ｃ−４の位置にグルコース置換基を持つ炭水化物を塩基の存在下で酸化剤による酸化させる工程が含まれる（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸及びその誘導体の製造方法が報告されている［米国特許第５，２９２，９３９、第５，３１９，１１０及び第５，３７４，７７３ （１９９４）］。しかし、中間体であるジカルボニル化合物（Ａ）を形成した後に、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸（Ｃ）とグリコール酸（Ｄ）を合成したと報告しているが、キラル化合物の中で最も重要な物性である光学純度に対して何の言及もしていない。その上、反応メカニズムの面において、出発物質として麦芽糖、或いは乳糖のように二糖を使用する時に、二糖の中で１つのグルコースだけが（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸及びその塩を生成させ、他の１つのグルコースは離脱基として作用するので、目的化合物と離脱基が１：１の比率で混合されている。この反応混合物から（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸と（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンとを分離・精製することは極めて難しい。上記した方法によると、使用した原料重量に対して生成される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの理論的な最大収率が２８．３重量％であり、相対的な収率が低い限界点がある。詳しく述べると、１００ｇの二糖（麦芽糖或いは乳糖）から生成される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの理論的な最大収率が２８．３ｇである。しかし、マルトデキストリン、澱粉及びセルロースのような多糖の場合には、グルコースの連結単位として（１，４）結合及び／或いは（１，６）結合が網のように連結されており、（１，４）結合からなる糖還元基（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄ ｕｎｉｔｓ）から段階的な（ｓｔｅｐ−ｂｙ−ｓｔｅｐ）酸化が進行しているが、（１，６）結合からなる部分で酸化が終結されて所望量の目的化合物を製造することができない問題がある。また、上記した多糖の高分子においては、塩基の存在下で酸化剤（過酸化水素）を使用して酸化を進行させれば糖還元基の過度酸化によりギ酸、シュウ酸、グリコール酸、エリトロン酸等のような酸混合物に分解されたと報告している［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８１， ３１３６（１９５９）； Ｓｔａｒｃｈ ４１ Ｎｒ． ８， Ｓ． ３０３−３０９（１９８９）； Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ５９７−６１３（１９９７）］。
【０００８】
一方、多糖の反応収率を高めるために、高分子のグルコースを酸、或いは塩基を利用した加水分解により相対的な低分子のグルコースに分解させたと報告している［Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ． ４９２−５０７］。この方法の反応性はある程度増大するが、（１，４）結合と（１，６）結合との選択的な加水分解が起こらないので、不規則的に分解される多糖の生成により（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸及びその誘導体を高い収率で製造することは根本的に難しい問題がある。
一般的に、（１，４）結合の多糖を使用して（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する場合には、糖還元末端から非還元末端に向かって段階的な酸化が、最後の糖鎖単位（離脱基）が残存するまで連続的に進み、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸が生成される。即ち、（１，４）結合の多糖を使用して（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを合成する場合には、使用した原料重量に対して理論的な最大収率が６３重量％であるので、二糖の使用に比べて約２倍ほど高い。詳しく述べると、（１，４）結合である１００ｇの多糖から生成される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの理論的な最大量は６３ｇである。また、二糖の使用に比べて離脱基の残存率が小さいので、目的化合物を容易に精製することができる長所がある。従って、原料物質として（１，４）結合の多糖を使用することが二糖より生産性が高い。しかし、一般的な多糖を使用する場合には、段階的な酸化により目的化合物と副産物（ギ酸、シュウ酸、グリコール酸、エリトロン酸等のような酸類）が競争的に生成されるので、（１，４）結合した適切な分布範囲のグルコースに分解する技術が追加的に要求される。
【０００９】
一方、高分子のグルコースを低分子のグルコースに転換させて産業的に有用な物質として製造するために、生物学的酵素処理を報告する文献が多い。
上記の文献による技術の例としては、澱粉を酵素処理してグルコース或いは麦芽糖を製造する技術とアルコールを発酵原料として使用する技術 ［米国特第３，７９１，８６５号（１９７４）；米国特許第 ３，９２２，２００号（１９７５）；米国特許第４，８５５，２３２号（１９８９）；日本特許公開平４−１５８，７９５号（１９９２）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ．， １０， ２３１−２３９（１９９４）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ．， １０， ２４５−２４８（１９９４）］、適切なグルコース当量（ＤＥ）を有するマルトデキストリンを製造する技術 ［米国特許第３，９８６，８９０号（１９７６）； 米国特許第４，４４７，５３２号（１９８４）； 米国特許第 ４，６１２，２８４号（１９８６）； 米国特許第５，５０６，３５３号（１９９６）］等が挙げられる。これらの文献では、高分子多糖を分解及び転換させて、医薬品、食品添加剤、診断試薬の原料物質を得ている。
しかし、光学的に純粋な（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造することにおいて、本発明により多糖の生物学的酵素処理により（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造に適合する、（１，４）結合を有するオリゴサッカリドを製造しようとする例は未だにない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような研究の一環として、本発明者らは、商業的に獲得が容易なアミロペクチンを使用して光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を経済的に製造することができる方法を開発しようと努力して来た。その結果、アミロペクチンを特定の条件下で順次的に酵素反応させてα−（１，４）結合したオリゴサッカリドを製造して酸化させることにより、上記のオリゴサッカリドの構造的特異性により酸化により生じる副産物の生成を抑制し、またオリゴサッカリドに対する別の分離・精製工程を経ないで１つの反応器内で連続的に酸化を行うことを見出して本発明を完成した。
従って、本発明は、中間生成物に対する別の精製工程なく、経済的に進歩された技術により高い収率で簡便に光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を大量生産する方法を提供することにその目的がある。
【００１１】
【発明の構成及び作用】
本発明は、以下の工程を含む。
（ａ） アミロペクチンを酵素反応させて次の化学式２で表されるα−（１，４）結合したオリゴサッカリドを製造する工程、及び
（ｂ） 上記のオリゴサッカリドを塩基の存在下で酸化剤により酸化させた後に、酸触媒の存在下でアルコールによるエステル化を行って次の化学式１で表される（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造する工程。
【００１２】
【化４】
0003614366.tif 000004
式中、ＲはＣ１−５の線状又は分岐のアルキル基を示す。
【００１３】
このような本発明をさらに詳細に説明すれば次のとおりである。
本発明は、アミロペクチンを原料物質として（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造する方法において、より効率的に酸化を行うために特定の酵素を使用してアミロペクチンの中でα−（１，４）結合とα−（１，６）結合を選択的に分解させて目的化合物の製造に適合するグルコースの分布を持つ、α−（１，４）結合したオリゴサッカリドに転換させた後に、段階的に酸化、エステル化及び環化させることを基本的な発明思想とするものである。
即ち、本発明は、使用された各酵素の特異性に基づいたものであり、特定の酵素を順次的使用によりアミロペクチンを分解させてα−（１，４）結合したオリゴサッカリドに転換し、転換されたオリゴサッカリドを利用して 高い収率で光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造する方法に関するものである。
本発明により原料物質として使用されるオリゴサッカリドは、アミロペクチンの生物学的酵素処理により調製される。特に、オリゴサッカリドを製造するために使用されるアミロペクチンは商業的に購入が容易である。特に、アミロペクチンは、澱粉やセルロースのように他の多糖に比べて本発明により酵素反応での反応溶媒として使用している水、或いはｐＨ ４．０−８．０の緩衝溶液に対する溶解度が高い。従って、アミロペクチンにより酵素反応に対する相対的活性が増加し、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体の製造に適合するグルコースの分布を持つオリゴサッカリドの製造に非常に効果的である。
【００１４】
本発明による製造方法を設計する工程の中、上記のアミロペクチンを適切なグルコースの分布を持つオリゴサッカリドに転換させるために、アミロペクチンのα−（１，６）結合を選択的に分解する酵素としてプルラナーゼを試みたが、低下されるアミロペクチンの溶解度とプルラナーゼの活性減少が問題として提起された。従って、１つのプルラナーゼだけを適用する代わりにα−アミラーゼを反応させて適切なグルコースの分布によりアミロペクチンを低分子化させて反応性を増加した後に、プルラナーゼを順次的に処理する方法を選択した。しかし、このような酵素反応の場合には、プルラナーゼにより酵素反応の中に残存するα−アミラーゼの活性が継続的に発揮され、α−アミラーゼの特性により長時間にわたって酵素反応が進行すればアミロペクチンが過度に低糖に転換されて目的とするオリゴサッカリドを製造することができない。従って、本発明ではプルラナーゼによる酵素反応に前もってα−アミラーゼによる酵素反応が終ってから残存するα−アミラーゼを不活性化する技術を導入した。
【００１５】
このような本発明の製造方法を細分化すれば次のとおりである。
１） 特定の酵素を利用した生物学的処理方法によりアミロペクチンを選択的に分解させて上記の化学式２で表される特性的なα−（１，４）結合のオリゴサッカリドを利用して化学的な酸化を行う工程と、また２） 生成された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸塩をエステル化させて上記の化学式１で表される（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造する工程からなる。特に、本発明による製造方法は、上記した反応中に生成される（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸エステルの精製工程がなく、１つの反応器内で連続的に反応を行って目的化合物である（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を得ることにその長所がある。
本発明の酵素反応によると、アミラーゼの酵素反応が終った後に順次的にプルラナーゼを使用する。α−アミラーゼはα−（１，４）結合を選択的に分解し、プルラナーゼはα−（１，６）結合を選択的に分解することを特徴とする酵素である。
一般的な加水分解の場合には、α−（１，４）結合或いはα−（１，６）結合の分解に対する選択性を持たずに、アミロペクチンを不規則的に分解させる。これに対して、本発明の加水分解ではα−（１，４）結合或いはα−（１，６）結合に選択的に作用する酵素を選んで使用することにより、温和な条件下でアミロペクチンを目的化合物の製造に適合する、グルコースの分布を持つオリゴサッカリドに転換させて光学的に純粋な（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸エステルを製造することにその長所がある。
【００１６】
本発明のアミラーゼによる酵素反応は、水の単独溶媒、又はｐＨ４．０−８．０の緩衝溶液を利用して４０−１２０℃の条件下で行う。アミラーゼはアミロペクチンに対して０．００１−１０重量％の範囲で使用し、アミラーゼによる酵素反応を３０分−４時間にわたって処理した後に、残存するアミラーゼを不活性化させる。この時、上記の不活性化は酸性（ｐＨ ２．０−４．５）及び高温（６０−１５０℃）の条件下で１０分−４時間にわたって行う。
上記したアミラーゼによる酵素反応が終った後に、プルラナーゼをアミロペクチンの重量に対して０．００１−１０重量％の範囲で使用し、アミラーゼによる酵素反応を１０−４０時間にわたって処理して得た大部分のオリゴサッカリドは３−５０のグルコース単位を有する範囲で分布される。生成されたオリゴサッカリドは光学分析器により糖還元基（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄ ｕｎｉｔｓ及びｄｅｘｔｒｏｓｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）分析、ＨＰＬＣ分析及びゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）分析を通じて相対的な糖還元基と分子量の分布を分析した。
【００１７】
本発明のオリゴサッカリドはアミロペクチンを選択的に酵素分解することにより得たものであり、その大部分が３−５０のグルコース単位、望ましくは５−５０のグルコース単位を有する範囲で分布する。また、グルコースとグルコースの間はその大部分がα−（１，４）結合により連結されているので、次に行われる酸化での副産物（例えば、ギ酸、シュウ酸、グリコール酸、エリトロン酸等のような酸混合物）の生成を最小化させ、段階的な反応を連続的に行うことにより高収率で（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体が得られる長所がある。また、得られた（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体は光学的に極めて純粋であることが認められた。
一方、オリゴサッカリドの酸化は、３０−６５℃の条件下で６−３６時間にわたって塩基及び酸化剤を滴下して行われる。この時、酸化剤の例としては、過酸化水素、過酸化アルカリ金属、過酸化アルカリ土類金属及びアルキルヒドロペルオキシドが挙げられ、望ましくは過酸化水素を使用する。上記の酸化剤は、アミロペクチンのグルコース単位１モルに対して１−３当量の範囲で使用する。また、塩基の例としては、アルカリ金属或いはアルカリ土類金属が挙げられ、望ましくは水酸化ナトリウム或いは水酸化カリウムを使用する。上記の塩基は、アミロペクチンのグルコース単位１モルに対して２−４当量の範囲で使用する。
【００１８】
また、 本発明のエステル化は、酸触媒の存在下で反応溶媒とエステル化剤としてアルコールを使用して３０−８０℃の条件下で行う。この時、酸触媒の例としては、塩酸、硫酸、リン酸及び硝酸などの有機酸、或いはフルオロアルキルスルホン酸、アラルキルスルホン酸、アラルキルスルホン酸の水和物及びトリフルオロ酢酸等の有機酸を使用する。アルコールの例としては、Ｃ１−５の線状又は分岐アルコールを使用する。
一方、酸化において、使用される原料物質の選択による収率を比較すれば次のとおりである［実験例１を参照］。即ち、上記の化学式１で表される（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を、酸触媒の存在下で３０−８０℃で２−５時間にわたって攪拌させ、環化を進めることにより（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが得られる。その時、酸触媒の例としては、塩酸、硫酸、リン酸及び硝酸等の無機酸、或いはフルオロアルキルスルホン酸、アラルキルスルホン酸の水和物及びトリフルオロ酢酸等の有機酸が挙げられる。その結果、麦芽糖（二糖）或いはチーズの副産物から得られた乳糖（二糖）を原料物質として（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する場合には、使用された原料重量に対して（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの最高収率が２８．３重量％を超えない。これに対して、５０以上のグルコース単位を有する多糖の中、α−（１，４）結合により連結された純粋なアミロースを原料物質として（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する場合には、その理論収率はアミロペクチンと同じである。しかし、極端に強い分子内の水素結合によりダブルヘリックス（ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｌｉｘ）を形成しているので、段階的な酸化が制約を受けて理論収率に達しない極めて低い結果が認められた。これに対して、本発明のオリゴサッカリドを原料物質として（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する場合には、使用された原料重量に対する収率が５７．２重量％と非常に高い。
上に述べたように、本発明では特異的な酵素を適用してアミロペクチンをオリゴサッカリドに転換させることにより酸化に対するアミロペクチンの低い反応性を克服し、副産物の生成を最小化すると共に精製工程が非常に単純な製造方法として光学的に純粋な高収率の（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造することにより生産性を極大化させうることにその長所がある。
このような本発明を次の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、 本発明は、これらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１：（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルの製造
５０ Ｌの反応器に１０ Ｌの水及び乾燥された５ ｋｇのアミロペクチンを入れ、温度を５５℃まで上昇させた後に、１２ ｇのα−アミラーゼ （ＢＡＮ； ＥＣ ３．２．１．１ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ， Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を加えた。つづいて、上記の反応液の温度を７５℃まで上昇させ、同じ温度で２時間にわたって攪拌させた。５ ｍＬの０．１Ｎ塩酸水溶液を使用してｐＨを３．０−３．５の範囲に調節した後に、９０℃で１時間にわたって攪拌して残っているα−アミラーゼを不活性化させた。上記の反応混合液を３０℃に徐々に冷却させた後に， ３．７Ｌの４Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ ５）及び１．３Ｌの水を入れてｐＨを５に調節した。その後、上記の反応液の温度を６０℃まで上昇させ、同じ温度で６２．５ｇのプルラナーゼ（Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ； ＥＣ ３．２．１．４ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ， Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を入れて２２時間にわたって攪拌させた。上記の反応液に０．５４ｋｇの４０％ ＮａＯＨを入れて酢酸を中和させた後に、温度を６０℃まで上昇させた。また、上記の反応液に８．６４ ｋｇの４０％ ＮａＯＨ溶液と５．２５ ｋｇの３０％ Ｈ２Ｏ２溶液を２４時間にわたって滴下した後に、同じ温度で１時間にわたって攪拌させた。この時、生成された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸ナトリウム塩の存在は核磁気共鳴分析法により認められた。
１Ｈ−ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ， ｐｐｍ） ： δ２．２７ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．４１ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．５１ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．８−３．９ （ｍ， １Ｈ）
【００２０】
上記の反応液を濃縮させた後に、１０Ｌのメタノールを添加した。濃硫酸を加えてｐＨを４−５の範囲に調節して５０℃で３時間にわたって攪拌させた。上記の溶液に炭酸ナトリウムを入れて酸を中和させた後に、ろ過して生成された塩等の副産物を除去し、メタノールで濃縮して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルを得た。これを核磁気共鳴分析法により内部標準物質に比較して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステル（転換率：９２％）の生成が認められた。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ｐｐｍ） ： δ２．５ （ｄｄ， ２Ｈ）， ３．５ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．６ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１ （ｍ， １Ｈ）
【００２１】
実施例２：（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
５０ Ｌの反応器に１０ Ｌの水及び乾燥された５ ｋｇのアミロペクチンを入れ、温度を５５℃まで上昇させた後に、１２ ｇのα−アミラーゼ（Ｔｅｒａｍｙｌ； ＥＣ ３．２．１．１ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ， Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を加えた。つづいて、上記の反応液の温度を８５℃まで上昇させ、同じ温度で２時間にわたって攪拌させた。５ ｍＬ ｏｆ ０．１Ｎ塩酸水溶液を使用してｐＨを３．０−３．５の範囲に調節した後に、９０℃で１時間にわたって攪拌して残っているα−アミラーゼを不活性化させた。上記の反応混合液を３０℃に徐々に冷却させた後に， ３．７Ｌの４Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ ５）及び１．３Ｌの水を入れてｐＨを５に調節した。その後、上記の反応液の温度を６０℃まで上昇させ、同じ温度で６２．５ｇのプルラナーゼ（Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ； ＥＣ ３．２．１．４ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ， Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を入れて２２時間にわたって攪拌させた。 上記の反応液に０．５４ｋｇの４０％ ＮａＯＨを入れて酢酸を中和させた後に、温度を６０℃まで上昇させた。また、上記の反応液に８．６４ ｋｇの４０％ ＮａＯＨ溶液と５．２５ ｋｇの３０％ Ｈ２Ｏ２溶液を２４時間にわたって滴下した後に、同じ温度で１時間にわたって攪拌させた。この時、生成された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸ナトリウム塩の存在は核磁気共鳴分析法により認められた。
１Ｈ−ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ， ｐｐｍ） ： δ２．２７ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．３９ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．４１ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．５１ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．８−３．９ （ｍ， １Ｈ）
【００２２】
上記の反応液を濃縮させた後に、１０Ｌのメタノールを添加した。メタンスルホン酸を加えてｐＨを４−５の範囲に調節して５０℃で３時間にわたって攪拌させた。上記の溶液に炭酸ナトリウムを入れて酸を中和させた後に、ろ過して生成された塩等の副産物を除去し、メタノールを濃縮して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルを得た。これを核磁気共鳴分析法により内部標準物質に比較して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステル（転換率：９３％）の生成が認められた。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ｐｐｍ） ： δ２．５ （ｄｄ， ２Ｈ）， ３．５ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．６ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１ （ｍ， １Ｈ）
上記から生成された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルを、別に分離しない状態で０．５重量％の濃い塩酸を入れて６５℃と減圧の条件下で環化させた。 上記の生成物を酢酸エチルに溶解させて炭酸ナトリウムで中和し、ろ過・濃縮して（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（２．８６ｋｇ、使用したアミロペクチンの重量に対して５７．２ 重量％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ｐｐｍ） ： δ２．２８ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．７４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．３２ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．４−４．５ （ｍ， １Ｈ）
【００２３】
実施例３：（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
上記の実施例２と同様の方法により製造された（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルの環化において、濃塩酸の代わりに１重量％のメタンスルホン酸を入れて６５℃と減圧の条件下で環化させた。上記の生成物を酢酸エチルに溶解させて炭酸ナトリウムで中和し、ろ過・濃縮して（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（２．８５ｋｇ、使用したアミロペクチンの重量に対して５７重量％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ｐｐｍ）：δ２．２８ （ｄｄ， １Ｈ）， ２．７４ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１３ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．３２ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．４−４．５ （ｍ， １Ｈ）
【００２４】
実施例４：（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルの製造
上記の実施例１の製造方法において酸化剤として過酸化水素の代わりにｔ−ブチルヒドロペルオキシド（４．１６ ｋｇ）を入れ、同様の製造工程により（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステルを得た。これを核磁気共鳴分析法により内部標準物質に比較して（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸メチルエステル（転換率：９１％）の生成が認められた。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ｐｐｍ）：δ２．５ （ｄｄ， ２Ｈ）， ３．５ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．６ （ｄｄ， １Ｈ）， ３．７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１ （ｍ， １Ｈ）
【００２５】
比較例１：澱粉から（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
５０ Ｌの反応器に２０ Ｌの水及び乾燥された５ ｋｇの澱粉を入れて温度を７０℃まで上昇させた。この反応液に４０％ ＮａＯＨ溶液（８．６４ｋｇ）と３０％ Ｈ２Ｏ２溶液（５．２５ｋｇ）を４８時間にわたって滴下した後に、同じ温度で１時間にわたって攪拌させた。つづいて、上記の実施例２と同様の方法によりエステル化及び環化させて（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（１．１ｋｇ、使用した澱粉に対して２２．０重量％）を得た。
【００２６】
比較例２：澱粉から（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
５０ Ｌの反応器に乾燥された５ ｋｇの澱粉と１０Ｌの０．５Ｎ 塩酸溶液を入れて１００℃で２０分にわたって澱粉を加水分解させた後に、２０℃に冷却させて１００ｍＬの４０％ ＮａＯＨ溶液で中和してから温度を７０℃まで上昇させた。この反応液に４０％ ＮａＯＨ溶液（８．６４ｋｇ）と３０％ Ｈ２Ｏ２溶液（５．２５ｋｇ）を４８時間にわたって滴下した後に、同じ温度で１時間にわたって攪拌させた。つづいて、上記の実施例２と同様の方法によりエステル化及び環化させて（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γブチロラクトン（１．２２ｋｇ、使用した澱粉に対して２４．４重量％）を得た。
【００２７】
比較例３：アミロースから（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
５０ Ｌの反応器に２０ Ｌの水及び乾燥された５ ｋｇのアミロースを入れて温度を７０℃まで上昇させた。この反応液に４０％ ＮａＯＨ溶液（８．６４ｋｇ）と３０％ Ｈ２Ｏ２溶液（５．２５ｋｇ）を４８時間にわたって滴下した後に、同じ温度で１時間にわたって攪拌させた。つづいて、上記の実施例２と同様の方法によりエステル化及び環化させて（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（１．３５ｋｇ、使用したアミロースに対して２７．０重量％）を得た。
【００２８】
実験例１：原料物質による（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生成量の比較次の表１に示したように、それぞれの炭水化物が含まれている反応液を実施例２と同様の方法により酸化及びエステルを行って（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を製造した。つづいて、環化を行って（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得た。炭水化物の使用量に対する（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生成量を次の表１に示す。
【００２９】
【表１】
0003614366.tif 000005
【００３０】
上記の表１によると、二糖を使用した時に用いられた原料の重量に対する相対的な収率は２３．７重量％と低かった。これに対して、本発明によりアミロペクチンを適切に酵素処理してオリゴサッカリドに転換させた場合には、二糖を使用した場合と比べて原料物質の重量に対する相対的な収率は５７．２重量％と約２倍程度に上昇する優れた結果が認められた。酵素処理しなかったアミロペクチンの場合には、原料物質の重量に対する相対的な収率は約２０．２ 重量％と比較的に低かった。
【００３１】
実験例２：（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度の分析
本発明及び従来の方法により製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度を分析するために、次のような方法により（Ｓ）−３−アセトキシ−γ−ブチロラクトンを合成した。
それぞれの方法により合成された１０２ｍｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（１ｍｍｏｌ）を３ｍＬの塩化メチレンに溶解させた後に、０．４ｍＬのピリジン（５ ｍｍｏｌ）及び０．４７ｍＬの無水酢酸（５ｍｍｏｌ）を入れて常温で３時間にわたって反応させてから１Ｎ塩酸で反応を終結した。生成された（Ｓ）−３−アセトキシ−γ−ブチロラクトンを有機層から抽出して得た後に、これを濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィで分離させた。得られた（Ｓ）−３−アセトキシ−γ−ブチロラクトンを塩化メチレンに溶解させた後に、注射器で０．５μｌを取ってＧＣで分析した結果を次の表２及び図１ａ〜１ｃに示す。
【００３２】
【表２】
0003614366.tif 000006
【００３３】
キラル化合物の場合、薬効の向上及び副作用を最小化するためには、９９．５％ｅｅ以上の高い光学純度が要求される。上記の表２によると、従来の製造方法に比べて本発明の製造方法により合成された（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、その光学純度が９９．９％ｅｅとして非常に純粋であるので、ほかのキラル化合物を合成する時に中間体として有用である。
【００３４】
【発明の効果】
本発明による製造方法は、アミロペクチンを特定の条件下で酵素と反応させてα−（１，４）結合したオリゴサッカリドを製造し、これを酸化及びエステル化させて従来の製造技術に比べて副産物の生成が最小化されると同時に、精製工程が極めて単純な工程により光学的に純粋な大量の（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ酪酸誘導体を得ることができるので、産業的な価値が非常に有用である。
また、高価な金属触媒を使用した選択的還元反応のような従来の短所を克服し、光学活性を有している低価の天然物から容易に製造することができるので、あらゆる医薬品のキラル中間体として産業的な有用性を最も極大化させることが可能である。
さらに、本発明で原料物質として利用されているアミロペクチンは乳糖、或いは麦芽糖に比べて天然物から容易に得られるので、低価の原料を円滑に確保することができると共に光学的に純粋な目的物が得られる長所がある。さらに、使用した原料の重量に対する相対的な収率が二糖の使用に比べて約２倍ほど高いので、生産性が極大化される効果を持つ。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】ラセミ３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度をガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により分析した結果を示す。
【図１ｂ】従来方法の原料物質（二糖）により製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度をガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により分析した結果を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、本発明の原料物質（オリゴサッカリド）により製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度をガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により分析した結果を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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