(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）：
0003706906.tif 000007
（式中、R1、R2及びR3は水素、C1〜C5アルキル基、又は-CO-R4（R4はC1〜C5アルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物又はその塩。
【請求項２】
R1、R2及びR3が水素である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含有するラジカル消去剤。
【請求項４】
クサソテツ属(Matteuccia)植物からの式（II）：
0003706906.tif 000008
の化合物又はその塩を含む水溶性抽出物を含有するラジカル消去剤。
【請求項５】
クサソテツ属(Matteuccia)植物から抽出することを特徴とする下記式（I）：
0003706906.tif 000009
（式中、R1、R2及びR3は水素、C1〜C5アルキル基、又は-CO-R4（R4はC1〜C5アルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物又はその塩の製造方法。
【請求項６】
R1、R2及びR3が水素である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品産業分野、化学産業分野等において有用な新規Ｌ-O-カフェオイルホモセリン及びラジカル消去剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クロロゲン酸等、コーヒー酸等を骨格にもつフェノール酸化合物は天然抗酸化剤、ラジカル消去剤として知られており、食品の酸化防止の他、生体のラジカル消去剤としての報告がある。しかしながら、これらは疎水的性質が強く、水にはほとんど溶解しない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、親水性で、食品用の抗酸化剤などとして有用な化合物、及びその製造方法、並びに該化合物を有効成分として含有するラジカル消去剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、東北地域の４００種類以上にものぼる農産物を対象に広くラジカル消去活性をスクリーニングしてきた。その結果、東北地域の代表的な山菜であるクサソテツに強い活性があることを見出し、強力なラジカル消去活性を有する化合物の単離に成功した。
【０００５】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（I）：
【０００６】
【化３】
0003706906.tif 000002
（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素、C1〜C5アルキル基、又は-CO-R4（R4はC1〜C5アルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物又はその塩。
（２）前記（１）に記載の化合物を有効成分として含有するラジカル消去剤。
（３）クサソテツ属(Matteuccia)植物の水溶性抽出物を含有するラジカル消去剤。
（４）クサソテツ属(Matteuccia)植物から抽出することを特徴とする下記式（I）：
【０００７】
【化４】
0003706906.tif 000003
（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素、C1〜C5アルキル基、又は-CO-R4（R4はC1〜C5アルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物又はその塩の製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について詳しく説明する。
クサソテツ（別名：コゴミ）はオシダ科の多年草のシダで、北半球の温帯地域に広く分布しており、日本では北海道、本州、四国、九州の日当たりのよい原野の湿った場所に群生する。また、早春の融雪後まもなく芽を出した葉先がまいた状態の若い葉は食用となる。
【０００９】
クサソテツの健康機能についてはこれまで報告されていなかったが、本発明者らはクサソテツが強いラジカル消去活性を有することを見出した。クサソテツの抽出液は非常に強いラジカル消去活性を示すことから、この活性成分を明らかにすべく、鋭意検討を重ね、クサソテツに含まれる活性成分を単離し、その化学構造を明らかにすることに成功した。その結果クロロゲン酸、及び、Ｌ-O-カフェオイルホモセリンが活性の主成分であると同定した。その一つのＬ-O-カフェオイルホモセリンは文献未記載の新規な化合物であり、本発明者らが新たに見出したものである。
【００１０】
請求項１に係る本発明は、上記一般式（ I ）で表される化合物である。上記一般式（ I ）で表される化合物は、アミノ酸の一種であるホモセリンのγ-水酸基とカフェ酸とがエステル結合した化合物であって、文献未記載の新規化合物である。
【００１１】
一般式（Ｉ）において、R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素、C1〜C5アルキル基、又は-CO-R4（R4はC1〜C5アルキル基を表す。）を表す。C1〜C5アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。また、R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ルチノース等の糖類、グルタミン酸、リジン等のアミノ酸であってもよい。本発明では、R1、R2及びR3のうち、少なくとも1つは水素であることが好ましく、少なくとも2つが水素であることが更に好ましく、3つとも水素であることが最も好ましい。
【００１２】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、化学的合成法によっても製造することができるが、例えば以下のようにして、一般式（ I ）で表される化合物を産生する植物から抽出、分離精製して得ることもできる。
本発明の化合物を生産する植物としては、オシダ科（イワデンダ科）植物、好ましくはクサソテツ属(Matteuccia)に属する植物、例えばクサソテツ（Matteuccia struthiopteris (L.)Todaro）、イヌガンソク（Matteuccia orientalis）等が挙げられる。なお、クサソテツからは、下記式(II)で表される化合物が得られる。
【００１３】
【化５】
0003706906.tif 000004
上記式(II)で表される化合物に、慣用の化学合成手法を利用してアミノ酸部分のアミノ基及び／又はカルボキシル基を化学修飾することにより、上記一般式(I)で表される種々の誘導体を得ることができる。
以下に、クサソテツから本発明の化合物を抽出する方法について説明する。
【００１４】
上記植物を、必要に応じて裁断、破砕、圧搾及び／又はホモジナイズして、植物が十分浸る量の溶媒に浸漬する。また、この抽出工程を、必要に応じて加温しながら行なってもよく、抽出時間は抽出温度に応じて適宜変更してよい。抽出溶媒としては、本化合物は水溶性が高いことから水、又は水溶性・極性の有機溶媒、若しくはこれらの混合溶媒を用いることが好ましい。水溶性又は極性の有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等の水溶性アルコール、アセトン等が挙げられる。
【００１５】
上述のようにして抽出した後に、濾過、分液、遠心分離、減圧濃縮等の慣用の方法を用いて、本発明の化合物等の水溶性抽出物を含む抽出液を得る。この水溶性抽出物を含む抽出液は、これ以上精製することなくそのままラジカル消去剤として用いることもできる。
【００１６】
また、さらに精製する場合には、カラムクロマトグラフィー等の通常の分離精製手段を適宜組み合わせて、上述の抽出液から一般式（Ｉ）で表される化合物を単離することができる。例えば、得られた抽出液をODSのカラムに通し、メタノールの濃度勾配をかけて溶出させて紫外部吸収を指標にポリフェノールの画分を得る。この画分に含まれる成分を分取高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分離後、再結晶して単一の純粋な一般式（Ｉ）で表される化合物を得る。
【００１７】
本発明の化合物は、強いラジカル消去活性を有する。また、本発明の化合物は、古くから山菜として食用とされているクサソテツより得られるため、安全性の上でも問題がない。また、アミノ酸のアミノ基、カルボキシル基の親水基を有していることから水溶性である特徴を有する。クサソテツから得られる一般式(II)で表される化合物だけでなく、その誘導体、光学異性体、及びその塩も同様にラジカル消去活性を有する。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば食品分野、化粧品分野及び農薬・医薬品分野等のラジカル消去剤（ラジカル補足剤）として有用である。食品分野又は化粧品分野で用いる場合には、食品又は化粧品中に本発明の化合物を0.001〜50重量％含有させることが好ましく、また、医薬品として人体に投与する場合には、成人一日当たり0.01〜10000mgを投与することが好ましい。
【００１９】
本発明の化合物は、単独で用いてもよいし、又は食品分野、化粧品分野及び農薬・医薬品分野等で通常用いられる他の成分と組み合わせて組成物として用いてもよい。そのような他の成分としては、例えば、食品分野では、保存料、乳化剤、安定剤、増粘剤、矯味矯臭剤、呈味剤、甘味剤、酸味剤、着色料等が挙げられ、化粧品分野では、ワセリンやマイクロクリスタリンワックス等のような炭化水素類、ホホバ油やゲイロウ等のエステル類、牛脂、オリーブ油等のトリグリセライド類、セタノール、オレイルアルコール等の高級アルコール類、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸、グリセリンや１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、エタノール、カーボポール等の増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、粉体類等が挙げられ、医薬品分野では、賦形剤、結合剤、被覆剤、滑沢剤、糖衣剤、崩壊剤、増量剤、矯味矯臭剤、乳化・可溶化・分散剤、安定剤、ｐＨ調整剤、等張剤等が挙げられる。
【００２０】
従来の抗酸化剤、ラジカル消去剤が疎水性のであるのに対し、本発明の新規化合物(I)は水溶性であり、現在、水溶性の抗酸化剤、ラジカル消去剤が強く望まれる中、本発明の化合物は非常に有用性が高い。これを例えば食品に添加することにより、食品の酸化を抑制することができる。また、親油性ラジカル消去剤、例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡとの相乗作用も期待でき、効率的に食品の酸化が抑制される。この他、本発明の化合物を摂取、又は投与することにより、体内で老化、生活習慣病を引き起こすといわれている活性酸素種を消去することが期待される。
【００２１】
【実施例】
次に本発明を実施例によって詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）クサソテツからの本発明の化合物の単離
クサソテツのラジカル消去活性を指標にして分離精製を進めた。
クサソテツ2kgにメタノールを加えてホモジナイズした。濾紙で吸引濾過し、濾液を遠心分離（5000rpm×10min）し、約10Ｌの上清を得た。これを減圧濃縮しメタノールを除去した。得られた濃縮液を更に遠心分離し、上清をフィルター濾過し、濾液をODS（INERTSIL PREP-ODS, 20×250mm, GLサイエンス社）カラムクロマトグラフィー（流速7ml/min、水／メタノール  10/90〜0/100の直線濃度勾配、40min）で溶出をおこなった。分画は14mlずつ行い、各々の画分についてラジカル消去試験を行った。活性が見られた２つの画分のうち、後半に溶出されるピークはクサソテツのもう一つのラジカル消去活性の主体成分であるクロロゲン酸であった。前半に溶出される活性ピークを更にカラムに通し、280nmにおける紫外線吸収で単独ピークになったことを確認し、これを再結晶し白色の結晶を得ることができた。
【００２２】
（実施例２）クサソテツから単離した本発明の化合物の構造解析
得られた化合物が、上記一般式（ I ）で表される化学構造であることを下記のようにして確認した。
上記実施例１で得られた化合物について、NMR（核磁気共鳴）及びMS（質量分析法）により、構造解析を行った。以下に、各データを示す。
【００２３】
【表１】
0003706906.tif 000005
ネガティブ高分解能質量分析（HRESIMS）：
m/z 280.0835 ([M-H]-)（C13H14O6, 計算値280.08156）
同様にネガティブHRESIMSでインソースCID(Collision Induced Dissociation)によるフラグメンテーションによって得られたピーク：
m/z 179.0376 (C9H7O4, 計算値179.03389), 135.0484 (C8H7O2, 計算値135.04406)
【００２４】
【化６】
0003706906.tif 000006
この結果、上記実施例１で得られた化合物は、前記式（II）で表される化合物であることが同定された。
【００２５】
（実施例３）クサソテツから単離した本発明の化合物のラジカル消去活性試験
上記実施例１で得られた化合物について、DPPH（ジフェニルピクリルヒドラジル）ラジカル消去法、及び、化学発光法によるラジカル消去活性試験を行った。2つの原理の異なる方法を組み合わせることにより、より正確なラジカル消去活性を知ることができるが、他の測定法を用いることもできる。
▲１▼  DPPHラジカル消去法
クサソテツより単離した本発明の化合物の10mM/DMSO 溶液を調製し、これを更に1.78倍ずつ0.01mMまでDMSOを用いて希釈していく。この希釈したサンプルを96穴プレートに15μlづつ分注し、その後200μMのDPPH／50％エタノール水溶液を175μl分注し、5分間室温で撹拌し、その後550nmにおける吸光度を測定する。
活性は、サンプルがDPPHの550nmの吸光度を、無添加の時に対し50%にまで減少させるときのサンプルの濃度を没食子酸の時に相当する濃度で示す。
【００２６】
▲２▼  化学発光法
DPPHラジカル消去法と同じく、クサソテツより単離した本発明の化合物の10mM/DMSO 溶液を調製し、これを更に1.78倍ずつ0.01mMまでDMSOを用いて希釈していく。この希釈したサンプルを96穴プレートに10μlづつ分注し、その後、100μlのキサンチン、MCLA（2-メチル-6-[4-メトキシフェニル]-3,7-ジハイドロイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン）溶液と、100μlのキサンチンオキシダーゼ溶液を添加する。キサンチンとキサンチンオキシダーゼにより、生体内で発生する活性酸素のひとつのスーパーオキサイドアニオンを産生させ、これに特異的な発色試薬であるMCLAにより発色させ、この発光強度を測定する。活性はサンプルが無添加の時の発光強度に対し、50%にまで減少させるときのサンプルの濃度をスーパーオキサイドアニオンジスムターゼ（SOD）の時に相当する活性で示す。
【００２７】
これらの結果、上記実施例１で得られた化合物、つまり一般式（ I ）で表される本発明のＬ-O-カフェオイルホモセリンは、天然型ラジカル消去剤として知られるクロロゲン酸、ルチン、カフェ酸と同等以上の強力なラジカル消去活性を持つことが分かった。
【００２８】
【発明の効果】
請求項１に係る本発明により、新規カフェオイルホモセリンが提供される。この新規カフェオイルホモセリンは、アミノ酸のひとつであるホモセリンのγ水酸基とカフェ酸のカルボキシル基がエステル結合した化合物である。この新規カフェオイルホモセリンはその構造から非常に親水性が高い。これまで知られているポリフェノール系の抗酸化剤は疎水性が高いものが多く、そのため親水性の高い水溶性抗酸化剤が望まれており、本発明の新規カフェオイルホモセリンはその点で注目される。
【００２９】
請求項１記載のカフェオイルホモセリンは、請求項２に係る本発明のように、抗酸化剤として有用であり、特に古くから食用とされているクサソテツ（コゴミ）に比較的多量に含まれる成分であるため、食品用の抗酸化剤として用いたときにも安全性の上で問題がない。
【００３０】
また、本発明により、水溶性で強力なラジカル消去活性を有する一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有するラジカル消去剤を提供できる。クサソテツの水溶性抽出液又は請求項１記載のカフェオイルホモセリンを食品に添加することにより、食品中の油脂エマルジョンなどの酸化が抑制される。すなわち、食品中の油脂エマルジョンにおいて不飽和脂肪酸の酸化などが抑制される。また、その食品摂取後は、体内で抗酸化性を発揮することが期待される。
【００３１】
さらに、本発明によりクサソテツから一般式（Ｉ）で表される化合物を容易に製造する方法を提供できる。クサソテツ（コゴミ）は、主に東北地方を代表する山菜として食されており、今までは特にその食品としての機能は知られていなかったが、本発明により、抗酸化性を有するカフェオイルホモセリンの原料としての利用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各化合物のラジカル消去活性を比較した図である。
【図１】
0003706906.tif 000010