(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）、
【化１】
0003683433.tif 000005
（式中、ＤＮＡはＤＮＡオリゴマーを示す。）
で示されるビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー。
【請求項２】
請求項１に記載のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いて四酸化オスミウムの存在下にＤＮＡ中のひとつのチミン塩基を選択的にジヒドロキシル化する方法。
【請求項３】
請求項１に記載のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いて四酸化オスミウムの存在下にＤＮＡ中の特定のひとつのチミン塩基の位置でＤＮＡを切断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡオリゴマーの３’又は５’末端に２，２’−ビピリジル基を含有する基が結合したビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー、当該ビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いてＤＮＡ中のひとつのチミン塩基をジヒドロキシル化し、その位置でＤＮＡを切断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
四酸化オスミウムとビピリジンを用いるチミンのジヒドロキシル化は良く知られた反応であるが、複数のチミン塩基が存在する場合にはそれらを区別することは出来ない。したがって、この方法ではＤＮＡ中の全てのチミン塩基の位置でＤＮＡが切断されてしまい、特定のチミンの位置で選択的にＤＮＡを切断することはできなかった。
従来、特定のチミンの位置でＤＮＡを切断する方法としては、チミン塩基を一つしか含まないオリゴマーを用いて、チミンをジヒドロキシル化した後、別のオリゴマーと結合させて結果として複数のチミンと一つのジヒドロキシル化されたチミンを持つオリゴマーを合成する方法が知られているが、その合成効率は極めて低いものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ鎖中に存在する複数のチミン塩基の内、ひとつのチミン塩基だけをジヒドロキシル化し、その位置でＤＮＡを切断する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、四酸化オスミウムの配位子であるビピリジンをＤＮＡオリゴマーの末端に結合させたビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを創出した。
即ち、本発明は、ＤＮＡオリゴマーの３’又は５’末端に２，２’−ビピリジル基を含有する基が結合したビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー又はその塩に関する。
また、本発明は、前記したビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー又はその塩を用いてＤＮＡ中のひとつのチミン塩基を選択的にジヒドロキシル化する方法に関する。さらに本発明は、前記したビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー又はその塩を用いてＤＮＡ中の特定のチミン塩基の位置でＤＮＡを切断する方法に関する。
【０００５】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーのＤＮＡオリゴマーの長さには特に制限はないが、ジヒドロキシル化又は切断されるＤＮＡ鎖にハイブリダイズできるに充分な長さがあればよい。ＤＮＡオリゴマーは長いものでもあってもよいが、ビピリジン部分を結合させる処理を行うために、位置選択的に目的のＤＮＡ鎖とハイブリダイズするに充分な長さを有する比較的短いものが好ましい。
好ましいＤＮＡオリゴマーとしては、６塩基以上のものであり、３０塩基以上の長さであってもよいが、６〜３０塩基、好ましくは６〜２０塩基のものが挙げられる。
【０００６】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーにおける２，２’−ビピリジル基を含有する基としては、ＤＮＡオリゴマーの３’又は５’末端から適当な距離を隔てられるリンカー部分を有する２，２’−ビピリジル基が好ましい。リンカー部分としては３〜２０原子、好ましくは５〜１５原子の鎖状の基からなるものであり、直鎖又は分枝状の炭素原子であってもよいが、製造の容易さからリンカー部分中にエステル基、アミド基、炭酸基やウレタン基などの官能基が存在するものが好ましい。
【０００７】
２，２’−ビピリジル基を含有する基は前記したＤＮＡオリゴマーの３’末端又は５’末端のいずれに結合していてもよい。
本発明の好ましいビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー又はその塩を例示すれば、次式（Ｉ）、
【化２】
0003683433.tif 000002
（式中、ＤＮＡはＤＮＡオリゴマーを示す。）
で示されるビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーが挙げられる。
【０００８】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーの製造方法としては、２，２’−ビピリジル基にリンカー部分を反応させて２，２’−ビピリジル基を含有する基の部分を製造し、次いでＤＮＡオリゴマーに結合させて製造することもできるが、後述する実施例に記載のように、２，２’−ビピリジル基とリンカー部分の一部を製造し、これに３’末端又は５’末端が修飾されたＤＮＡオリゴマーとを反応させて製造することもできる。
【０００９】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーは、ＤＮＡオリゴマーと相補的なＤＮＡの配列を認識し、その部分にハイブリダイズし、２本鎖になったＤＮＡの外側の最も近傍のチミン塩基を選択に処理可能にする。
例えば、図１に示されるように、本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーとして、次式
３’−ＴＣＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧ−Ｂｐｙ
（式中、Ｂｐｙは２，２’−ビピリジル基を含有する基を示す。）
を用いた場合には、その相補鎖を認識し、ハイブリダイズした後に本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマー中の２，２’−ビピリジル基を含有する基の中の２，２’−ビピリジル基は、その最も近傍のチミン塩基を認識する。例えば、図１の場合には、図１中でＴ１６と記載されているチミン塩基が認識される。
【００１０】
図２は、５’末端を３２Ｐでラベル化したＤＮＡ
５’−３２Ｐ−ＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴ
を前記した本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いて特定の位置のチミン塩基をジヒドロキシル化した結果をポリアクリルアミドゲル電気泳動によりその配列選択性を解析したものである。
図２のレーン１は四酸化オスミウムとビリジンによるＴ切断を示し、レーン２はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によるＡ＋Ｇを示し、レーン３はビビリジン結合ＤＮＡオリゴマーと四酸化オスミウム処理したものを示し、レーン４はビペリジン処理が無かった場合を示し、レーン５は四酸化オスミウムによる処理が無かった場合を示す。
図２の矢印（→）は、１６番目のチミンだけがジヒドロキシル化されていることを示している。
【００１１】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーは四酸化オスミウムの共存下、オリゴマーの配列に相補的な塩基配列を認識し、かつその近傍のチミン塩基を選択的にジヒドロキシル化する。そして、常法によりこの位置で目的のＤＮＡを切断することが可能となる。
四酸化オスミウムによるジヒドロキシル化、及び、その後の切断の方法は公知の任意の方法により行うことができる。
【００１２】
このように、本発明はＤＮＡ中の特定のチミン塩基のみを選択的にジヒドロキシル化するための方法及びそのためのビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを提供するものであり、本発明は特定のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーに限定されるものではない。
本発明の方法によれば、任意の塩基配列内にある特定のチミン塩基をひとつだけジヒドロキシル化することも可能となり、１）ＤＮＡ損傷研究、２）アンチセンスＤＮＡ、３）ＤＮＡ切断反応の解析、４）損傷ＤＮＡ−修復タンパクとの相互作用解析等への利用が期待される。
【００１３】
【実施例】
次に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１４】
以下の実施例に記載する本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーの製造例を次の化学反応式で示す。
【化３】
0003683433.tif 000003
【００１５】
実施例１（ステップ１）
２’−ヒドロキシメチルビピリジン（３０６ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、ジスクシンイミジルカーボネート（１．１８ｇ、４．６２ｍｍｏｌ）とルチジン（５２５ｍｇ、４．９０ｍｍｏｌ）を加え室温５時間反応させた。反応溶液を抽出操作により精製し、活性化ビピリジン誘導体を得た（３５２ｍｇ、６５％）。
【００１６】
0003683433.tif 000004
【００１７】
実施例２（ステップ２）
活性化ビピリジン（４２μｇ、１００ｎｍｏｌ）をアセトニトリル（２０μＬ）に溶解し、市販の５’末端がアミノ化されたＤＮＡオリゴマー（０．４２ｍＭ、１０μＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０μＬ）を加えて室温−時間反応させた。生成物は直接高速液体クロマトにより精製した。
【００１８】
実施例３（ビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーによる配列選択的チミン塩基のジヒドロキシル化）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による配列選択性の解析を行った。
５’末端を３２Ｐでラベル化したオリゴマーを、１００  ｍＭ  ＮａＣｌを含んだＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で３０μＭのピピリジン結合ＤＮＡオリゴマーと室温で１２時間放置し、二本鎖を形成させ、３ｍＭの四酸化オスミウムを加えて室温で３０分間反応させチミン塩基のジヒドロキシル化を行った。
ジヒドロキシル化されたチミン塩基は、１０％のピペリジンで９０℃で３０分間加熱処理し、７Ｍの尿素を含んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により切断バンドとして確認した。
【００１９】
結果を図２に図面に代わる写真により示す。図２のレーン１は四酸化オスミウムとビリジンによるＴ切断を示し、レーン２はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によるＡ＋Ｇを示し、レーン３はビビリジン結合ＤＮＡオリゴマーと四酸化オスミウムを示し、レーン４はビベリジン処理が無しの場合を示し、レーン５は四酸化オスミウム処理が無しの場合を示す。
図２の矢印（→）は、１６番目のチミンだけがジヒドロキシル化されていることを示す。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いることにより、任意の塩基配列内にあるチミン塩基をジヒドロキシル化することが可能となり、従来の方法では供給できない同一オリゴマー上の複数のチミン塩基の中から選択的にーつだけがジヒドロキシル化されたオリゴマーの合成を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーと標的のＤＮＡとがハイブリダイズしている様子を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明のビピリジン結合ＤＮＡオリゴマーを用いたＤＮＡのジヒドロキシル化および切断の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１】
0003683433.tif 000006
【図２】
0003683433.tif 000007