(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、クエン酸合成酵素（ＣＳ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）、ピルビン酸デヒドロゲナーセ（ＰＤＨ）及びアルギニノコハク酸シンターゼからなる群から選ばれる遺伝子のプロモーター配列の−３５領域に、TTGTCA、TTGACA、TTGCTA及びTTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくはTATAAC配列を導入したコリネ型細菌を、培地で培養し、培地中にＬ−グルタミン酸又はＬ−アルギニンを生成蓄積させ、これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸又はＬ−アルギニンの製造方法。
【請求項２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子のプロモーターが、−３５領域に、TTGTCA、TTGACA及びTTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＧＤＨのプロモーターが、−３５領域にTTGACA配列又はTTGCCA配列を有し、及び／又は−１０領域としてTATAATを有するものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＣＳのプロモーターが、−３５領域にTTGACA配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列又はTATAAC配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＩＣＤＨのプロモーターが、−３５領域の第一又は第二のプロモータ−にTTGCCA配列及びTTGACA配列のいずれか及び／又は−１０領域の第一又は第二のプロモータ−にTATAAT配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＨのプロモーターが、−３５領域にTTGCCA配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項７】
アルギニノコハク酸シンターゼのプロモーターが、−３５領域にTTGCCA、TTGCTA及び TTGTCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくはTATAAC配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
アルギニノコハク酸シンターゼのプロモーターが、−３５領域にTTGCTA配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有するものである請求項７記載に方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法及びその変異株を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法は、大別すると２通りあり、１つは化学変異剤をもちいてDNAにランダムに変異を導入する方法であり、もう１つは遺伝子組換えを用いる方法である。遺伝子組換えを用いる方法では、目的物質の生合成に関与する代謝経路上の遺伝子を強化したり、分解に関与する酵素の遺伝子を弱化したりすることにより，目的物質の生産性が向上した菌株を開発出来る。また、その際に、目的遺伝子を強化する方法として、細胞内で，染色体とは独立して自立複製可能なプラスミドが主に用いられてきた。
しかし、プラスミドを用いた目的遺伝子の強化方法には問題点がある。具体的には目的遺伝子の強化の程度はプラスミド自体のコピー数によって決まるため、目的遺伝子の種類によってはコピー数が高過ぎて，発現量が高くなり過ぎることにより、生育が著しく抑制されたり、逆に目的物質の生産能が低下したりする例が多くある。この様な場合、コピー数が低い種類のプラスミドを用いることにより、目的遺伝子の強化の程度を下げることが可能であるが、プラスミドの種類は多くの場合限定的であり、目的遺伝子の発現レベルを自由に調節することは不可能である。
【０００３】
もう一つの問題点は、プラスミドの複製が不安定であることがしばしばであり、プラスミドが脱落してしまうことである。
例えば、特許文献１には、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子）を含むＤＮＡ断片と細胞内での自立複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片(プラスミド)とを含む組換え体ＤＮＡが開示されており、この組換え体ＤＮＡを細胞に導入することによって、ＧＤＨ強化株を育種することができ、微生物による物質（アミノ酸、蛋白質等）生産を改善できることが開示されている。
これに対して、特許文献２には、上記組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウムに移入して該酵素活性が強化された菌株を作成し、この菌株を用いて醗酵法によりＬ−グルタミン酸を製造したが、その生産量や収率はまだまだ満足のいくものではなく、更にＬ−グルタミン酸の生産性を向上させることが望まれているとしている。そして、この要望は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＣＤＨ）の２種の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡをグルタミン酸生産性コリネ型細菌に移入することにより、達成できたとしている。
【０００４】
一方、特許文献３には、コリネバクテリア菌株と、該菌株中の発現のための第一機能性ＤＮＡ配列、アミノ酸、ポリペプチドおよび／または蛋白質をコードする第二ＤＮＡ配列、及び上記第一及び第二ＤＮＡ配列の間に挿入された第三ＤＮＡ配列を含む分泌カセットとを含んでなり、該第三ＤＮＡ配列が該コリネバクテリア菌株によりアミノ酸、ポリペプチドおよび／または蛋白質の分泌を保証するＰＳ１又はＰＳ２から選ばれた蛋白質の要素をコードすることを特徴とするコリネバクテリアの発現及び分泌系が開示されている。具体的には、ポリペプチドの分泌が開示されており、コリネバクテリア菌株にＮＴＧ変異誘発を施し、グルタミン酸アナログである４−フルオログルタミン酸４−fluoroglutamate （４ＦＧ）に対して耐性を与える変異株を選び、これをｐＣＧＬ１４１での形質転換に付しており、上記アナログ耐性菌の中からＧＤＨの発現が強化された株が取得できることが開示されている。ここでは、ＧＤＨプロモーターのヌクレオチド配列２５１〜２６６に変異が生じていることが示されている。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−２６８１８５号公報
【特許文献２】特許第２５２０８９５号公報
【特許文献３】特表平６−５０２５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、プラスミドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な強化および調節を行うことができ、アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供することを目的とする。
本発明は、副生アスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こすことなく、コリネバクテリア菌株にグルタミン酸を高収率で生産する能力を付与することができるＧＤＨ用プロモーターを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記遺伝子を有するＬ−グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株を提供することを目的とする。
本発明は、構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法を提供することを目的とする。
本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる、グルタミン酸の収率を向上させ、より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、染色体上のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターを様々に改変し，目的とする遺伝子の発現量を調節することにより上記課題を効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。特に、プロモーターの特異的領域である−３５領域および／または−１０領域に特定の変異を導入することにより上記課題を効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に、コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか又は遺伝子組換えにより導入して、コリネ型細菌の変異体を調製し、該変異体を培養して目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取することを特徴とするアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌の調製方法を提供する。
【０００８】
本発明は、又、−３５領域に CGGTCA 、TTGTCA、TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくは該配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、プロモーター機能を阻害しない配列を有することを特徴とするグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子用プロモーターを提供する。
本発明は、又、上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を提供する。
本発明は、又、上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を提供する。
【０００９】
本発明は、また、上記の方法で構築したアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌を、培地で培養し、培地中に目的のアミノ酸又は核酸を生成蓄積させ、これを該培地から採取することを特徴とする発酵法による該アミノ酸又は核酸の製造方法を提供する。
本発明は、また、４−フルオログルタミン酸に対して耐性を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を、液体培地で培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明でいうコリネ型グルタミン酸生産菌とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)) 、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。したがって、本発明で使用する変異株は、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属する下記のようなコリネ型グルタミン酸生産菌から誘導することができる。尚、本明細書において、グルタミン酸生産性に言及しない場合は、コリネバクテリウム属細菌及びブレビバクテリウム属細菌を単にコリネ型細菌ということがある。
【００１１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム      ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム        ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ                  ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム              ATCC13032
ブレビバクテリウム・ディバリカタム            ATCC14020
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム      ATCC13869
コリネバクテリウム・リリウム                  ATCC15990
ブレビバクテリウム・フラバム                  ATCC14067
コリネバクテリウム・メラセコーラ              ATCC17965
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム        ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム        ATCC14068
ブレビバクテリウム・ロゼウム                  ATCC13825
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス            ATCC19240
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム        ATCC15354
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス        AJ12310(FERM 9246)
【００１２】
目的物質としてのアミノ酸としては、生合成に関与する遺伝子およびそのプロモーターが明らかになっているものであれば何でもよい。生合成に関与する酵素の例として具体的には，グルタミン酸発酵の場合には、ＧＤＨ、クエン酸合成酵素（ＣＳ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）、ピルビン酸デヒドロゲナーセ（ＰＤＨ）、アコニターゼ（ＡＣＯ）等が有効である。
リジン発酵では、アスパルテートカイネース（AK）、ジヒドロジピコリネートシンターセ、ジヒドロジピコネートレダクターゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーセなどの生合成系酵素に加え、リジンの膜排出に関与するリジン排出蛋白(lysE遺伝子)も同様に有効である。
アルギニン発酵では、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ及びアルギニノサクシナーゼによって触媒される反応で生成する。そして、これらの酵素が有効である。また、これらの酵素は、順にargA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argHの各遺伝子によってコードされている。
【００１３】
セリン発酵では、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホセリントランスアミナーゼ、ホスホセリンホスファターゼ等の酵素が有効である。
フェニルアラニン発酵では、デオキシアラビノヘプツロン酸リン酸合成酵素、３−デヒドロキナ酸合成酵素、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素、コリスミ酸合成酵素、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ等の生合成酵素が有効である。また、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、フォスフォエノールピルビン酸合成酵素等の糖代謝系酵素も有効である。
トリプトファン発酵では、上記フェニルアラニン発酵で有効と考えられる諸酵素、セリン発酵で有効と考えられる諸酵素に加えて、トリプトファンオペロンに属する酵素が有効である。
プロリン発酵では、上記グルタミン酸発酵で有効と考えられる諸酵素に加え、γ−グルタミルキナーゼ、γ−グルタミルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ等が有効である。
グルタミン発酵では上記グルタミン酸発酵で有効と考えられる諸酵素に加え、グルタミンシンテターゼが有効である。
【００１４】
イノシン生産においては５−ホスホリボシル１−二リン酸合成酵素、５−ホスホリボシル１−２リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシアミド  ホルミルトランスフェラーゼなどの酵素の発現強化が有効であると考えられる。
グアノシン生産においては５−ホスホリボシル１−２リン酸合成酵素、５−ホスホリボシル１−２リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシアミド  ホルミルトランスフェラーゼに加えて５′−イノシン酸デヒドロゲナーゼ、５′−キサンチル酸アミナーゼの発現強化が有効であると考えられる。
アデノシン生産においては５−ホスホリボシル１−２リン酸合成酵素、５−ホスホリボシル１−２リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシアミド  ホルミルトランスフェラーゼに加えて、アデニロサクシネートシンテターゼの発現強化が有効であると考えられる。
ヌクレオチド生産においてはフォスフォリボシルトランスフェラーゼやイノシンキナーゼ、グアノシンキナーゼ、アデノシンキナーゼの発現強化が有効であると考えられる。
【００１５】
本発明では、コリネ型アミノ酸生産菌の染色体上の所望のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーター配列、例えば、上記ＧＤＨ用プロモーターなどのプロモーター配列に、コンセンサス配列に近づくような変異を、化学薬品などを用いる変異により起こさせるか又は該変異を遺伝子組換えにより導入して、コリネ型アミノ酸生産菌の変異体を調製する。
ここで、コンセンサス配列は、多くのプロモーター配列を比較して最も高頻度で出現する塩基を並べた配列である。このようなコンセンサス配列としては、大腸菌、バチルス  サブチリスなどのコンセンサス配列があげられる。大腸菌のコンセンサス配列は、Diane K. Hawley and William R. McClure Nuc. Acid. Res. 11:2237-2255(1983)に記載されており、バチルス  サブチリスのコンセンサス配列は、Charles et al. Mol. Gen. Genet 186:339-346(1982)に記載されている。
上記変異は、１つのプロモーター配列、例えば、ＧＤＨ用プロモーターのみに起こさせてもよいが、２つ以上のプロモーター配列、例えば、ＧＤＨ用プロモーター、クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）に起こさせてもよい。
本発明では、このようにして得られた該変異体を培養して目的とするアミノ酸の産生量の多い変異体を採取する。
【００１６】
グルタミン酸発酵の場合に、コリネ型グルタミン酸生産菌のＧＤＨはそれ自身のプロモーター配列をその上流域に持つことが明らかになっている（Sahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6, 317-326)。
例えば、本発明のＧＤＨ用プロモーター、該ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子及び該遺伝子を有するＬ−グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株は、例えば次のようにして得ることができる。
つまり、上記のような菌株に紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等の変異処理を施し、４−フルオログルタミン酸を含有する寒天平板培地上で、４−フルオログルタミン酸に対して耐性を有する菌株を得る。すなわち、親株の生育を抑制する濃度の４−フルオログルタミン酸を含有する寒天平板培地上に変異処理を施した菌株を塗布し、生育してきた変異株を分離すればよい。
又、ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列を、部位特異的変異法を用いて各種変異を導入した配列に置換したものを多数作製し、それぞれの配列とＧＤＨ活性との関係を調べて、Ｌ−グルタミン酸生産性の高いものを選択することができる。
【００１７】
本発明では、特に、ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの−３５領域のＤＮＡ配列がCGGTCA、TTGTCA、TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列となっているか、及び／又は該プロモーターの−１０領域のＤＮＡ配列がTATAATとなっているか、若しくは−１０領域にTATAAT配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、プロモーター機能を阻害しない配列となっているものが好ましい。-10 配列のTATAAT配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、プロモーター機能を阻害しない配列となっているものを選択できるのは、野生型の-10 配列であるCATAATの最初の「C 」を「T 」に代えただけで劇的にＧＤＨ比活性の上昇が観察されたので（表１、p6-4参照）、他の塩基にかえてもかまわないと考えられるからである。
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列は、例えば、前出のSahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6, 317-326に記載されており、又、配列番号１に記載されている。又、ＧＤＨ遺伝子自体の配列は、例えば、同じくSahm et al. Molecular Microbiology(1992), 6, 317-326に記載されており、又、配列番号１に記載されている。
同様にして、クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）のプロモーターについても変異を起こさせることができる。
このようにして、ＧＤＨ用プロモーターとしては、−３５領域に CGGTCA 、TTGTCA、TTGACA及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくは該配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、プロモーター機能を阻害しない配列を有するものがあげられる。又、上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を提供する。
【００１８】
ＣＳ用プロモーターとしては、−３５領域に TTGACA配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有しており、プロモーター機能を阻害しない配列を有するものがあげられる。又、上記プロモーターを有するＣＳ遺伝子を提供する。
ＩＣＤＨ用プロモーターとしては、−３５領域の第一又は第二のプロモタ−にTTGCCA配列及びTTGACA配列のいずれか及び／又は−１０領域の第一又は第二のプロモタ−にTATAAT配列を有しており、プロモーター機能を阻害しない配列を有するものあげられる。又、上記プロモーターを有するicd遺伝子を提供する。
ＰＤＨ用プロモーターとしては、−３５領域にTTGCCA配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列を有しており、プロモーター機能を阻害しない配列をものがあげられる。又、上記プロモーターを有するＰＤＨ遺伝子を提供する。
本発明は、又、上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を提供する。
【００１９】
アルギニノコハク酸シンターゼ用プロモーターとしては、−３５領域にTTGCCA、TTGCTA及び TTGTCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は−１０領域にTATAAT配列若しくは該配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されており、プロモーター機能を阻害しない配列を有するがあげられる。又、上記プロモーターを有するアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は、又、上記遺伝子を有するコリネ型アルギニン生産菌を提供する。
本発明のコリネ型アミノ酸、好ましくはＬ−グルタミン酸生産菌を、液体培地に培養し、培地中に所望のアミノ酸、好ましくはＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを該培地から採取することによりアミノ酸を得ることができる。
本発明において上記菌株の培養に用いられる液体培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノール、グリセロール等のアルコール類、酢酸等の有機酸類が使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー等が使用される。栄養要求性を有する変異株を用いる場合には、それらの要求物質を標品もしくはそれを含有する天然物として添加するのがよい。
【００２０】
コリネ型細菌は一般に、ビオチン制限下でＬ−グルタミン酸を生産する。従って、培地中のビオチン量を制限するか、界面活性剤やペニシリンなどのビオチン作用抑制物質を添加する。
発酵は、振とう培養や通気攪拌培養等による好気条件下にて、培養液のｐＨを５〜９の間に保持しつつ２〜７日間行うのがよい。ｐＨの調節には、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を用いるのがよい。培養温度は２４〜３７℃であるのが好ましい。
培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸の採取は常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよい。
本発明によれば、コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子のプロモーター領域に変異を導入し，目的遺伝子の発現量を調節することにより、目的アミノ酸を高収率で得ることができ、又プラスミドのように脱落がなく、安定して目的アミノ酸を高収率で得ることができるので、工業的に大きな利点がある。
【００２１】
また、本発明によれば、副生アスパラギン酸およびアラニンの増加を引き起こすことなく、コリネバクテリア菌株にアミノ酸、特にグルタミン酸を高収率で生産する能力を付与することができる各種プロモーター、特にＧＤＨ用プロモーターを提供することができる。
また、本発明によれば、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に変異処理を施し、変異がＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に起こった、４−フルオログルタミン酸に対して耐性を有する菌株を採取し、この菌株を培養することによりグルタミン酸を高収率で得ることができるので、工業的に大きな利点がある。
【００２２】
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１：変異型ＧＤＨプロモーターの作製
部位特異変異法を用い：次の方法で変異型ＧＤＨプロモーターを調製した。
(1) 各種変異型のプロモーターを持つＧＤＨ遺伝子の作製
コリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの−３５領域および−１０領域の野生型配列を配列１に示す。但し、野生型のプロモーター配列は既に報告されている（Molecular Microbiolgy (1992), 6, 317-326) 。
変異型プロモーターを持つＧＤＨ遺伝子を運ぶプラスミドの作製方法は、以下の通りである。図１に示すように、“Bacterial Genome DNA purification kit” (Advanced Genetic Technologies Corp.)に基づいて調製したコリネ型細菌野生株ATCC13869 株の染色体遺伝子を鋳型とし、ＧＤＨ遺伝子の上流と下流とでＰＣＲにより遺伝子を増幅し、両端を平滑末端化した後に、それをプラスミドpHSG399 （宝酒造社製）の SmaI 部位に挿入した。次にこのプラスミドの SalＩ部位に、コリネ型細菌で複製可能な複製基点をもつプラスミド pSAK4から取得した複製起点を導入することによりプラスミドｐＧＤＨを作製した。この方法において、ＧＤＨ遺伝子の上流側のプライマーとして配列表１から６に示す配列を持つプライマーを用いることにより、上記のおのおのプロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を作製することが出来る。なお、ここで用いたＰＣＲ増幅断片中には導入したプロモーター配列内の変異以外は変異は導入されていないことを塩基配列の決定により確認した。ｐSAK4を構築するためには、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))由来の複製起点を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号) を制限酵素BamHI 及びKpnIで消化して、複製起点を含むＤＮＡ断片を取得し、得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製、Bluntingkit)を用いて平滑末端化した後 SalＩリンカー（宝酒造社製）を結合し、これをpHSG299 の SalＩサイトに挿入した。得られたプラスミドが pSAK4である。
【００２３】
(2) 各プロモーター配列を有するＧＤＨの発現量の比較
上記の様にして作製したプラスミドをコリネ型細菌野生株 ATCC13869株にそれぞれ導入した。導入の方法はエレクトロポレーション法を用いた（特開平２−２０７７９１号公報参照）。作製したこれらの菌株のＧＤＨの発現量を比較するために、ＧＤＨの比活性を調べた。活性測定方法は上記の Sahm 等の方法に従った。その結果を表１に示す。
【００２４】
表１

菌  株              プロモーター配列      ＧＤＨ比活性      相対値
−35      −10                              
ATCC 13869           TGGTCA     CATAAT         7.7           0.1
/pGDH     TGGTCA     CATAAT        82.7           1.0
/p6-2     CGGTCA     CATAAT        33.1           0.4
/p6-4     TGGTCA     TATAAT       225.9           2.7
/p6-3     TTGACA     TATAAT       327.2           4.0
/p6-7     TTGCCA     TATAAT       407.0           4.9
/p6-8     TTGTCA     TATAAT       401.3           4.9  
【００２５】
上記ATCC 13869／p6-2〜ATCC 13869／p6-8は配列番号２〜６に対応するものであり、これらの配列は配列番号１記載の配列（野生型）を基に下線部を下記の通り変更したものである。
配列番号１    5'-TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT- 3'
配列番号２                  CGGTCA                CATAAT
配列番号３                  TGGTCA                TATAAT
配列番号４                  TTGACA                TATAAT
配列番号５                  TTGCCA                TATAAT
配列番号６                  TTGTCA                TATAAT
尚、これらの配列は、直鎖状、２本鎖の合成ＤＮＡである。
【００２６】
実施例２：変異株の取得
(1) ４−フルオログルタミン酸に対する耐性を有する変異株の誘導
AJ13029 株はWO96/06180に記載されるグルタミン酸生産株で、培養温度が３1.５℃ではグルタミン酸を生産しないが、培養温度を３７℃にシフトするとビオチン作用抑制物質の非存在下でもグルタミン酸を生産する変異株である。本実施例では、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029 株を変異株誘導の親株として用いた。もちろん、AJ13029 株以外のグルタミン酸生産株であっても４−フルオログルタミン酸に対する耐性を有する変異株誘導の親株となりうる。
AJ13029 株をCM2B寒天培地（表２）上にて３1.５℃で２４時間培養して菌体を得た。得られた菌体を２５０μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの水溶液で３０℃で３０分間処理した後、生存率１％の当該菌体の懸濁液を４−フルオログルタミン酸（４ＦＧ）を含む寒天平板培地（表３）に播種し、３1.５℃で２０〜３０時間培養しコロニーを形成させた。この際、初めに１mg/ml の４ＦＧを含む培地を傾斜をつけて作製し、その上に４ＦＧを含まない同培地を水平に重層した。これにより、寒天培地表面は４ＦＧの濃度勾配が作製される。このプレート上に上記変異処理菌体を播種すると、菌株の生育限界の領域を境に境界線が出来る。この境界よりも高濃度の４ＦＧが存在する領域でコロニーを形成した株を採種した。かくして約１0,０００個の変異処理菌株から約５０株の４ＦＧ耐性株を取得した。
【００２７】
表２    ＣＭ２Ｂ寒天培地

成          分                              濃  度        
ポリペプトン（日本製薬社製）                    １．０％
酵母エキス（ディフコ社製）                      １．０％
NaCl                                            ０．５％
ｄ−ビオチン                                  １０μg ／ｌ
寒  天                                          １．５％
（pH  7.２ KOHで調整）                                        
【００２８】
表３    寒天培地

成          分                  水１リットル中の添加量    
グルコース                                  １０  ｇ
MgSO4 ・７H2O                                 １  ｇ
FeSO4 ・７H2O                           ０．０１  ｇ
MnSO4 ・４−６H2O                       ０．０１  ｇ
サイアミン塩酸塩                        ０．２    mg
ｄ−ビオチン                            ０．０５  mg
（NH4) 2SO4                             ５        ｇ
Na2HPO4 ・12H2O                         ７．１    ｇ
KH2PO4                                  １．３６  ｇ
寒天                                  １５        ｇ            
【００２９】
(2) ４ＦＧに対して耐性を示す変異株によるＬ−グルタミン酸の生産能の確認
上記(1) において得られた約５０株の変異株及びその親株であるAJ13029 株について、グルタミン酸の生産能を以下のようにして確認した。
AJ13029 及び各変異株をそれぞれＣＭ２Ｂ寒天培地上にて３1.５℃で２０〜３０時間培養して得た菌体を表４のＡ培地に示す組成の液体培地に接種し、３1.５℃で振とう培養を開始した。約２２時間後、最終濃度が表４のＢ培地に示す濃度になるように新たに培地を添加し、３７℃にシフトさせ、その後約２４時間培養を行った。培養終了後、旭化成社製バイオテックアナライザーを用いてＬ−グルタミン酸の生成の有無を調べた。その結果、この約５０株を培養しグルタミン酸収率が親株より高く、ＧＤＨ活性も高い株を２株分離した（Ａ株およびＢ株）。それぞれのＧＤＨ活性を測定したところ両株ともＧＤＨの比活性が上昇していた（表５）。ＧＤＨ活性の測定は E. R. Bormann等の方法（Molecular Microbiol., 6, 317-326(1996)) に従った。そこでＧＤＨ遺伝子の塩基配列を解析したところＧＤＨのプロモーター領域内にのみ変異点が存在していた（表６）。
【００３０】
表４

成        分          Ａ培地                    Ｂ培地              
グルコース              ３          g/dl        ５          g/dl
KH2PO4                  ０．１４    g/dl        ０．１４    g/dl
MgSO4 ・７H2O           ０．０４    g/dl        ０．０４    g/dl
FeSO4 ・７H2O           ０．００１  g/dl        ０．００１  g/dl
MnSO4 ・４H2O           ０．００１  g/dl        ０．００１  g/dl
(NH4)2SO4               １．５      g/dl        ２．５      g/dl
大豆蛋白加水分解液      １．５     ml/dl        ０．３８   ml/dl
サイアミン塩酸塩        ０．２      mg/l        ０．２      mg/l
ビオチン                ０．３      mg/l        ０．３      mg/l
消泡剤                  ０．０５    ml/l        ０．０５    ml/l
CaCO3                   ５          g/dl        ５          g/dl
pH    ７．０（KOH で調整）                        
【００３１】
表５  変異株のグルタミン酸生成とＧＤＨ活性

菌  株            Glu(g/dl)         ＧＤＨ比活性          相対値    
AJ13029             2.6                 7.7                 1.0
FGR1                2.9                23.1                 3.0
FGR2                3.0                25.9                 3.4   
【００３２】
表６  変異株のＧＤＨプロモーター領域の塩基配列

菌  株              ＧＤＨプロモーター配列
−35                              −10        
AJ13029           TGGTCA    TTCTGTGCGACACTGC            CATAAT
FGR1              TGGTCA    TTCTGTGCGACACTGC            TATAAT
FGR2              TTGTCA    T-CTGTGCGACACTGC            TATAAT    
【００３３】
実施例３  コリネ型グルタミン酸生産菌のＣＳ遺伝子プロモーター領域への変異の導入
本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびクエン酸合成酵素（ＣＳ）をコードする遺伝子のプロモーター強化株を作成した例を示す。
（１）gltA遺伝子のクローニング
コリネ型細菌のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子gltAの塩基配列は既に明らかにされている（Microbiol. 140 1817-1828 (1994)）。この配列をもとに配列番号７および配列番号８に示すプライマーを合成した。一方、Bacterial Genome DNA Purification Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体DNAを調製した。この染色体DNAを0.5μg、前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ10pmol、dNTP mixture(各2.5mM)8μl、10× LA Taq Buffer（宝酒造）5μl、LA Taq（宝酒造）2Uに滅菌水を加えて全量50μlのPCR反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーTP240（宝酒造）を用いて、変性94℃ 30秒、会合55℃ 15秒、伸長反応72℃ 3分の条件で30サイクルのPCRを行ない、gltA遺伝子およびそのプロモーターを含む約３KbpのDNA断片を増幅した。得られた増幅断片は宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。これとpHSG399（宝酒造）をSmaIで完全分解したものを混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）１０μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）４０μg/ml及びクロラムフェニコール40μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエキストラクト5g/l、NaCl5g/l、寒天15g/l、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素地図と同等であるものをpHSG399CSと名付けた。
【００３４】
（2）gltAプロモーターへの変異導入
gltAプロモーター領域への変異導入には宝酒造社製のMutan-Super Express Kmを用いた。具体的な方法を以下に示す。pHSG399CSをEcoRI,SalIで完全分解し、gltA遺伝子を含むEcoRI-SalI断片を調製し、これとpKF19kM（宝酒造）をEcoRI,SalIで完全分解した断片とを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からプラスミドを調製し、gltA遺伝子を含むものをpKF19CSと名づけた。
【００３５】
pKF19CSを鋳型とし、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示す5’末端リン酸化合成DNAとMutan super Express Km付属のselection primerを用いてPCRを行なった。このPCR産物を用いてエシェリヒア・コリMV1184のコンピテントセル（宝酒造）の形質転換を行ない、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、配列番号１２に示す合成DNAを用いてSangerの方法（J.Mol.Biol.,143,161,(1980)）でgltAプロモーター部の塩基配列を決定した。具体的には、塩基配列の決定にはDye terminator sequencing kit(Applied Biosystems)を用いてGenetic Analyzer ABI310（Applied Biosystems）で解析した。gltAプロモーター領域が表７に示す配列に置換されたものを、それぞれpKF19CS1,pKF19CS2,pKF19CS4と名づけた。
【００３６】
表７

-35領域               -10領域     
pKF19CS              ATGGCT                 TATAGC
pKF19CS1             ATGGCT                 TATAAC
pKF19CS2             ATGGCT                 TATAAT
pKF19CS4             TTGACA                 TATAAT     
【００３７】
（3）変異型gltAプラスミドの構築
（2）で構築したpKF19CS,pKF19CS1,pKF19CS2,pKF19CS4をそれぞれSalI、EcoRI(宝酒造)で完全分解した。一方で、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpAM330（特開昭58-67699）由来の複製起点を持つプラスミドpSFK6(特願平11-69896)をEcoRI,SalIで完全分解し、これとgltAを含む約2.5kbの断片を連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセルを用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からプラスミドを調製し、gltA遺伝子を含むプラスミドをそれぞれpSFKC, pSFKC1,pSFKC2,pSFKC4とした。
【００３８】
（４）変異型gltAプラスミドのコリネ型細菌におけるCS発現量の測定
上記（3）で構築したプラスミドをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869に導入した。具体的には、電気パルス法を用い（特開平2-07791）、形質転換体の選択は25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート培地（バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエキストラクト10g/l、NaCl5g/l、ビオチン10μg/L、寒天15g/l、pH7.0）で、31℃にて行った。二晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離しpSFKC, pSFKC1,pSFKC2,pSFKC4を保持する形質転換体をそれぞれBLCS, BLCS1, BLCS2, BLCS4と名づけた。形質転換体を表８に示す培地に接種し、31℃で培養を継続し、完全にグルコースを消費する前に培養を終了した。培養液を遠心し、菌体を分離した。菌体は200mのグルタミン酸ナトリウムを含む50mMのトリス緩衝液（pH7.5）にて洗浄したのち、同緩衝液に懸濁し超音波破砕を行なった。超音波破砕はTOMYのUD-201によった。超音波破砕後、10000gにて20分遠心を行ない、未破砕菌体を取り除いたものを粗酵素液とした。クエン酸合成酵素の活性の測定は（Methods Enzymol. 13,3-11(1969)）にしたがって行なえばよい。具体的にはTisHCl 100mM(pH8), DTNB 0.1mM, グルタミン酸ナトリウム 200mM, アセチルCoA 0.3mMを含む反応液に粗酵素液を添加し、30℃における412nmの吸光度の増大を日立分光光度計U-3210で測定することにより求め、これをバックグラウンドとした。さらにオキサロ酢酸を終濃度0.5mMとなるよう添加し412nmの吸光度の増大を測定し、バックグラウンドの値を差し引いた値をクエン酸合成酵素の活性とした。また、粗酵素液の蛋白質濃度の測定にはProtein Assay（BIO-RAD）を用いた。標準蛋白質には牛血清アルブミンを用いた。測定結果を表９に示す。野生型のgltAプロモーターと比べてgltAプロモーター変異株ではクエン酸合成酵素活性が上昇していることが確認された。
【００３９】
表８
成分                                                  濃度        
グルコース                                            50   g/l  
KH2PO4                                                1    g/l 
MnSO4・7H2O                                           0.4 mg/l
FeSO4・7H2                                            10  mg/l
大豆蛋白加水分解物                                    20  ml/l 
ビオチン                                              0.5 mg/l 
サイアミン塩酸塩                                      2   mg/l    
【００４０】
表９

菌株          dABS/min/mg        相対活性       相対活性     
野生株          6.8                   1.0 
BLCS00         38.8                   5.7           1.0
BLCS01         57.1                   8.4           1.2
BLCSO2         92.5                  13.6           1.9
BLCS04        239.4                  35.2           4.8      
【００４１】
（５）変異型gltA遺伝子の温度感受性プラスミドへの導入
変異型gltAプロモーター配列の染色体への遺伝子組み込み方法としては、コリネ型細菌内で複製が温度感受性であるプラスミドを用いる方法が知られている（特開平5-7491）。ここではコリネ型細菌内でその複製が温度感受性であるプラスミドベクターとしてpSFKT2（特願平11-81693）を用いた。変異型gltAプロモーター配列としてpKFCS1,pKFCS2,pKFCS4をSalIおよびBstPIで完全分解し平滑末端化したもの用い、これとpSFKT2をSmaIで完全分解したものを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミドを調製し、gltA遺伝子を含む温度感受性シャトルベクターをそれぞれpSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4と名づけた。
【００４２】
（６）変異型gltAプロモーターの染色体への導入
pSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4をそれぞれブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムFGR2 株に電気パルス法で導入した。形質転換体の選択は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート培地で、25℃にて行った。導入後、得られた株をCM2B液体培地にて培養した後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプ レートに、プレートあたり103〜105cfuとなるよう希釈した後に塗布し、34℃にて培養した。温度感受性プラスミドを保持した株は、この温度ではプラスミドの複製が阻害されるため、カナマイシン感受性となり、コロニーを形成できないが、染色体にプラスミドDNAを組み込んだ株は、コロニーを形成 するため、選択することができる。出現しコロニーを釣り上げ、単コロニー分離した。この株より染色体DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号８と配列番号１３に示すプライマーを用いPCRを行ない、およそ３ｋｂの増幅断片が確認した。したがってこの株は相同的な組換えにより、宿主染色体のgltA遺伝子の近傍に、温度感受性プラスミド由来の変異型gltA遺伝子が組み込まれていることが示された。pSFKTC1,2,4より誘導された株をそれぞれBLCS11、BLCS12,BLCS14と名づけた。
【００４３】
（７）gltAプロモーター置換株の取得
相同組換えにより、変異型gltA遺伝子を組み込んだBLCS11、BLCS12,BLCS14株より、まず、カナマイシン感受性株を取得した。プラスミド組み込み株をCM2Bプレートに希釈、塗布し、34℃で培養する。コロニー形成後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレートにレプリカし、34℃で培養する。このとき、カナマイシン感受性になった株を取得した。
カナマイシン感受性になった株から、染色体を抽出し、配列番号７および配列番号８に示すプライマーを用いてPCRを行ないgltA遺伝子断片を調製した。得られた増幅断片は宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、配列番号１３に示すプライマーを用いてシーケンス反応を行ない、そのプロモーター領域の配列を決定した。その結果、表７中のpKF19CS1と同じプロモーター配列をもつ株をGB01、pKF19CS2と同じプロモーター配列をもつ株をGB02、pKF19CS4と同じプロモーター配列をもつ株をGB03と名づけた。これらの株では、染色体からプラスミドおよび重複するgltA遺伝子が脱落する際、プラスミドにより導入した変異型のgltA遺伝子は染色体上に残り、元来染色体上にあった野生型のgltA遺伝子が、ベクタープラスミドと共に脱落し、遺伝子置換が起こったことを意味する。
【００４４】
（８）gltAプロモーター変異株のクエン酸合成酵素活性測定
（７）で得られたFGR2, GB01, GB02, GB03株及びFGR2/pSFKC株を（４）に記載した方法と同様にしてクエン酸合成酵素の活性を測定した。測定結果を表１０に示す。gltAプロモーター置換株はその親株に比しクエン酸合成酵素活性が上昇していることが確認された。
【００４５】
表１０

菌株                dABS/min/mg           相対活性     
FGR2                        7.9                1.0 
GB01                        9.5                1.2
GB02                       15.0                1.9
GB03                       31.6                4.0
FGR2/pSFKC                 61.6                7.8    
【００４６】
（９）gltAプロモーター置換株の培養成績
上記(７)で取得した各株を表１１に示す組成の種培養培地に接種し、31.5℃に24時間振とう培養して種培養を得た。表１１に示す組成の本培養培地を500ml容ガラス製ジャーファーメンターに300mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培養を40ml接種した。攪拌速度を800〜1300rpm、通気量を1/2〜1/1vvmとし、培養温度31.5℃で培養を開始した。培溶液のpHはアンモニアガスで7.5に維持した。培養を開始して8時間後に37℃にシフトした。いずれも20〜40時間でグルコースが完全に消費された時点で培養を終了し、培溶液中に生成蓄積されたL-グルタミン酸の量を測定した。
その結果、表１２に示すようにGB01やFGR2/pSFKC株よりは、むしろGB02や GB02株ではL-グルタミン酸の大幅な収率向上が認められた。以上のことより、これらの株のグルタミン酸収率向上において、プロモーターに変異を導入しCS活性を２〜４倍に強めることで好成績となりうることが示された。
【００４７】
表１１

成   分                      濃度              
種培養             本培養       
グルコース            50     g/l        150   g/l
KH2PO4                 1     g/l          2   g/l 
MgSO4・7H2O             0.4  g/l        1.5   g/l 
FeSO4・7H2O            10   mg/l         15  mg/l 
MnSO4・4H2O            10   mg/l         15  mg/l 
大豆蛋白加水分解      20    ml/l         50  ml/l
ビオチン               0.5  mg/l          2  mg/l
サイアミン塩酸塩         2  mg/l          3  mg/l   
【００４８】
表１２

菌株                 L-グルタミン酸(g/l)    
FGR2                        8.9
GB01                        9.1
GB02                        9.4
GB03                        9.4
FGR2/pSFKC                  9.1             
【００４９】
実施例４  コリネ型グルタミン酸生産菌のICDH遺伝子プロモーター領域への変異の導入
本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸合成酵素およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター強化株を作成した例を示す。
（１）icd遺伝子のクローニング
コリネ型細菌のイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子icdの塩基配列は既に明らかにされている（J.Bacteriol. 177 774-782 (1995)）。この配列をもとに配列番号１４および１５に示すプライマーを合成し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行ない、icd遺伝子およびそのプロモーターを含む約３KbpのDNA断片を増幅した。得られた増幅断片はEcoRIにて完全分解し、これとpHSG399（宝酒造）をEcoRIで完全分解したものを混合し連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセルを用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びクロラムフェニコール40μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
icd遺伝子を有するプラスミドをpHSG399icdと名付けた。
【００５０】
（2）icdプロモーターへの変異導入
icd遺伝子の正確なプロモーターの位置は決定されていない。そこで、ICDHをコードする遺伝子の上流配列をプロモーター様の配列に人為的に改変することにより、icd遺伝子のmRNA転写量を増大させうる可能性を検討した。具体的には、ICDH 蛋白質の第一ATGから上流約190bp（第一のプロモーター）及び約70bp（第二のプロモーター）のＤＮＡ配列中に存在する-10様領域に変異を導入した。
icd遺伝子上流域への変異導入には宝酒造社製のMutan-Super Express Kmを用いた。具体的な方法を以下に示す。pHSG399icdをPstIで完全分解し、icd遺伝子のプロモーターを含むPstI断片を調製し、これとpKF18kM（宝酒造）をPstIで完全分解した断片とを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミドを調製し、icd遺伝子のプロモーターを含むものをpKF18icdと名づけた。
【００５１】
pKF18icdを鋳型とし、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１に示す5’末端リン酸化合成DNAとselection primerを用いPCRを行なった。このPCR産物を用いてエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセルの形質転換を行ない、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、配列番号２２に示す合成DNAを用いてSangerの方法（J.Mol.Biol.,143,161,(1980)）でicdプロモーター部の塩基配列を決定した。具体的には、塩基配列の決定にはDye terminator sequencing kit(Applied Biosystems)を用いてGenetic Analyzer ABI310（Applied Biosystems）で解析した。icdプロモーター領域が表7に示す配列に置換されたものを、それぞれpKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6と名づけた。このうち、pKF18ICD2をPstIで完全分解し、icd遺伝子のプロモーターを含むPstI断片を調製し、これとpKF18kM（宝酒造）をPstIで完全分解した断片とを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミドを調製し、icd遺伝子のプロモーターを含むものをpKF18ICDM2と名づけた。pKF18ICDM2を鋳型とし、配列番号２０、配列番号２１に示す5'末端リン酸化合成DNAとselection primerを用いPCRを行なった。このPCR産物を用いてエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセルの形質転換を行ない、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、配列番号２２に示す合成DNAを用いてicdプロモーター部の塩基配列を決定した。icdプロモーター領域が表１３に示す配列に置換されたものを、それぞれpKF18ICD25, pKF18ICD26と名づけた。
【００５２】
表１３
プラスミド           プロモーター１           プロモーター２  
-35       -10            -35        -10      
pKF18ICD         GCGACT    GAAAGT         TTTCCA      CACCAT
pKF18ICD01       GCGACT    TATAAT         TTTCCA      CACCAT
pKF18ICD02       TTGACA    TATAAT         TTTCCA      CACCAT
pKF18ICD03       TTGACT    TAAAGT         TTTCCA      CACCAT
pKF18ICD04       GCGACT    GAAAGT         TTTCCA      TATAAT
pKF18ICD05       GCGACT    GAAAGT         TTGCCA      TATAAT
pKF18ICD06       GCGACT    GAAAGT         TTGACA      TATAAT
pKF18ICD25       TTGACA    TATAAT         TTGCCA      TATAAT
pKF18ICD26       TTGACA    TATAAT         TTGACA      TATAAT   
【００５３】
(３)プロモーター活性測定用プラスミドの構築
プロモーター活性を簡便に測定するためには、レポーター遺伝子を用いて間接的にプロモーター活性を測定する方法が考えられる。レポーター遺伝子として望まれる性質として、活性測定が簡単であること、N末端側にアミノ酸が不可されても活性が著しく低下しないこと、バックグランドの反応がないこと、遺伝子操作をする上で適当な制限酵素切断部位があることが挙げられる。エシェリヒア・コリのβガラクトシダーゼ（LacZ）は広くレポーター遺伝子として用いられており、またコリネバクテリウム属細菌にはラクトース資化能がないことから（J.Gen.Appl.Microbiol.,18,399-416(1972)）、レポーター遺伝子としてLacZを用いるのが最適であると判断した。そこで、LacZをレポーター遺伝子として搭載するプラスミドpNEOLの構築を行なった（図３）。以下その過程を詳細に記す。配列番号２３、配列番号２４に示す合成DNAをプライマーとしてE. coli ME8459(ME8459は、日本の国立遺伝学研究所に寄託されている)から得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行なった。PCR産物はSmaI、BamHIで完全分解した後、pKF3(宝酒造)をHindIIIで分解し平滑末端化したものとを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からプラスミドを調製し、pKF3nptIIとした。次にこれをSalIで分解し、一方でpSAK4を、実施例1の（1）と同様にしてSmaI,SalIで完全分解し平滑末端化したものを連結し、コリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクターpNEOを構築した。このプラスミドは宿主にクロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を付与する。さらにｐNEOをSmaI,Sse8387Iで完全分解し、これとpMC1871（ファルマシア  バイオテク）をPstI,SmaIで完全分解したものを連結し、レポーター遺伝子としてN末端側の8アミノ酸を欠失したLacZを有するコリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクターpNEOLを構築した（図３）。
【００５４】
（４）変異型icdプロモーター活性の測定
（２）で構築した変異型icdプロモーターを有するプラスミドpKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, pKF18ICD26およびpKF18ICDをSacII,PstIで完全分解した後、平滑末端化し、pNEOLをSmaIで切断したものと連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセルを用いて形質転換を行い、IPTG、X-Gal、クロラムフェニコール40μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
形質転換株からプラスミドを調製し、ICDHとLacZの融合たんぱく質が産生されうる構造のものを、pNEOICD1,  pNEOICD2,  pNEOICD3,  pNEOICD4,  pNEOICD5,  pNEOICD6,  pNEOICD25,  pNEOICD26,  pNEOLICDとした。これらのプラスミドおよびpNEOLを電気パルス法にてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869に導入した。形質転換体の選択は25μg/mlのカナマイシンおよびX-Gal ４０μg/mlを含むCM2Bプレート培地（バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエキストラクト10g/l、NaCl5g/l、ビオチン10μg/L、寒天15g/l、pH7.0）で、31℃にて行った。二晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離しpNEOICD1,  pNEOICD2,  pNEOICD3,  pNEOICD4,  pNEOICD5,  pNEOICD6,  pNEOICD25,  pNEOICD26, pNEOLICDを保持する形質転換体をそれぞれBLAC1,BLAC2 BLAC3 BLAC4 BLAC5 BLAC6 BLAC25 BLAC26 BLAC,BNEOLと名づけた。BNEO以外の形質転換体はすべて青色のコロニーを形成していた。これらの形質転換体より実施例３（４）記載の方法で祖酵素液を調製した。ただし、菌体の洗浄および懸濁には緩衝液として、Z-Buffer(KCl 10mM, MgSO4 1mM, 2-ME 270μl/100mM NaPi (pH7.5))を用いた。LacZの活性の測定は以下の手順に従って行なった。Z-Bufferと粗酵素液を混合し、終濃度0.8mg/mlとなるようにZ-Bufferに溶解したONPGを添加し、30℃における420nmの吸光度の増大を日立分光光度計U-3210で測定した値をLacZの活性とした。また、粗酵素液の蛋白質濃度の測定にはProtein Assay(BIO-RAD)を用いた。標準蛋白質には牛血清アルブミンを用いた。測定結果を表１４に示す。icdプロモーターに変異を有するICDH-LacZ融合蛋白を発現している株は、野生型のICDH-LacZ融合蛋白を発現している株に比べてLacZ素活性が上昇していることが確認された。
【００５５】
表１４
菌株                 dABS/min/mg          相対活性   
BNEOL                Not detected           0.0
PNEOLI                   42                 1.0
BNEOLI-1                 84                 2.0 
BNEOLI-2                168                 4.0 
BNEOLI-3                 80                 1.9 
BNEOLI-4                126                 3.0 
BNEOLI-5                139                 3.3 
BNEOLI-6                 84                 2.0 
BNEOLI-25               168                 4.0 
BNEOLI-26               170                 4.0     
【００５６】
（５）変異型icd遺伝子の温度感受性プラスミドへの導入
コリネ型細菌内でその複製が温度感受性であるプラスミドベクターpSFKT2（特願平11-81693）を用いた。変異型icdプロモーター配列として（pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKFICD25,pKFICD26をPstIで完全分解し、これとpSFKT2をPstIで完全分解したものを連結した。連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、IPTG１０μg/ml、X-Gal４０μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 形質転換株からプラスミドを調製し、icdプロモーターを含む温度感受性シャトルベクターをそれぞれpSFKTI1, pSFKTI2, , pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, pSFKTI26と名づけた。
【００５７】
（６）変異型icdプロモーターの染色体への導入
（５）で構築したプラスミドをそれぞれブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムGB02株に電気パルス法で導入した。形質転換体の選択は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート培地（バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエキストラクト10g/l、NaCl5g/l、ビオチン10μg/L、寒天15g/l、pH7.0）で、25℃にて行った。導入後、得られた株をCM2B液体培地にて培養した後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプ レートに、プレートあたり103〜105cfuとなるよう希釈した後に塗布し、34℃にて培養した。温度感受性プラスミドを保持した株は、この温度ではプラスミドの複製が阻害されるため、カナマイシン感受性となり、コロニーを形成できないが、染色体にプラスミドDNAを組み込んだ株は、コロニーを形成 するため、選択することができる。出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離した。この株より染色体DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号１３と配列番号１５に示すプライマーを用いPCRを行ない、およそ３ｋｂの増幅断片を確認した。したがってこの株は相同的な組換えにより、宿主染色体のicd遺伝子の近傍に、温度感受性プラスミド由来の変異型icd遺伝子が組み込まれていることが示された。
【００５８】
（７）icdプロモーター置換株の取得
相同組換えにより、変異型icd遺伝子を組み込んだ（６）記載の株より、まず、カナマイシン感受性株を取得した。プラスミド組み込み株をCM2Bプレートに希釈、塗布し、34℃で培養する。コロニー形成後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレートにレプリカし、34℃で培養する。このとき、カナマイシン感受性になった株を取得した。
カナマイシン感受性になった株から、染色体を抽出し、配列番号１４、配列番号１５にしめすプライマーを用いてPCRを行ないicd遺伝子断片を調製した。得られた増幅断片は宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、配列番号２２に示すプライマーを用いてシーケンス反応を行ない、そのプロモーター領域の配列を決定した。その結果、pSFKTI1, pSFKTI2, , pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, pSFKTI26由来のicdプロモーター配列を有する株をそれぞれGC01, GC02, GC03, GC04, GC05, Gc06, Gc25,及びGC26と名づけた。これらの株では、染色体からプラスミドおよび重複するicd遺伝子が脱落する際に、プラスミドにより導入した変異型のicd遺伝子が染色体上に残り、元来染色体上にあった野生型のicd遺伝子が、ベクタープラスミドと共に脱落している。
【００５９】
（８）icdプロモーター変異株のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性測定
（７）で得られた8株ならびにGB02株を実施例３（7）記載の方法と同様にしてICDH粗酵素液を調製した。ICDHの活性の測定は以下の手順に従って行なった。TisHCl 35mM(pH7.5), MnSO4 1.5mM, NADP 0.1mM,イソクエン酸1.3mMを含む反応液に粗酵素液を添加し、30℃における340nmの吸光度の増大を日立分光光度計U-3210で測定した値をICDHの活性とした。また、粗酵素液の蛋白質濃度の測定にはProtein Assay(BIO-RAD)を用いた。標準蛋白質には牛血清アルブミンを用いた。測定結果を表１５に示す。icdプロモーター置換株はその親株に比しイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が上昇していることが確認された。
【００６０】
表１５
菌株              dABS/min/mg            相対活性   
GB02                 3.9                   1.0
GC01                 8.2                   2.1
GC02                19.1                   4.9
GC03                 7.0                   1.8
GC04                12.5                   3.2
GC05                19.1                   4.9
GC06                10.5                   2.7
GC25                30.4                   7.8
GC26                24.2                   6.2      
【００６１】
（９）icdプロモーター置換株の培養成績
（７）で取得した８株を、実施例３（９）記載の方法と同様にして培養した。その結果、表１６に示すようにGC02, GC04, GC05, GC25及びGC26株ではL-グルタミン酸の収率向上が認められた。icdプロモーターに変異を導入しICDH活性を3倍以上に強めることで好成績となりうることが示された。
【００６２】
表１６

菌株                 L-グルタミン酸(g/l)  
GB02                      9.2
GC01                      9.0
GC02                      9.5
GC03                      9.1
GC04                      9.4
GC05                      9.6
GC06                      9.2
GC25                      9.9
GC26                      9.8             
【００６３】
実施例５  コリネ型グルタミン酸生産菌のＰＤＨ遺伝子プロモーター領域への変異の導入
(1) コリネ型細菌からのpdhA遺伝子のクローニング
大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）のE1サブユニット間で相同性の高い領域を選び、配列番号２５および配列番号２６に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．３キロベースのＤＮＡ断片増幅していることが判明した。得られたＤＮＡは、配列番号２５および配列番号２６の合成DNAを用いて両端の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてSangerの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。決定された塩基配列をアミノ酸に翻訳して、大腸菌、緑膿菌および結核菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットと比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲにより増幅したDNA断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子の一部であると判断し、その遺伝子の上流および下流部分のクローニングを行った。クローニングの方法は、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９染色体を制限酵素EcoRI, BamHI, Hind III, Pst I, Sal I, Xba I（宝酒造社製）で消化したDNA断片から、上流部分をクローニングするために配列表配列番号２７および配列番号２８に示したプライマーを使い、下流部分をクローニングするために配列番号２９および配列番号３０に示したプライマーを使い、LA PCR in vitro cloning Kit（宝酒造製）を用いてクローニングを行った。このキットでPCRを行った結果、上流部分はEcoRI, Hind III, Pst I, Sal I, Xba Iで消化した断片でそれぞれ約0.5, 2.5, 3.0, 1.5, 1.8キロベースのDNA断片が増幅され、また下流部分はBamHI, Hind III, Pst Iで消化した断片でそれぞれ約1.5, 3.5, 1.0キロベースのDNA断片が増幅されたので、このDNA断片を上記と同様の方法で塩基配列の決定を行った。その結果、増幅されたDNA断片にはさらに約920アミノ酸のオープン・リーディング・フレームが含まれており、さらにその上流にはプロモーター領域と推定される領域が存在することも明らかとなった。このオープン・リーディング・フレームの塩基配列から推定される産物のアミノ酸配列は既知の大腸菌などのピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットと相同性が高いことから、このオープン・リーディング・フレームがブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子であることが明らかとなった。このオープン・リーディング・フレームの塩基配列は配列表配列番号３１に示す通りである。配列表配列番号３１の配列には、その塩基配列から推定される産物のアミノ酸配列も示した。なお、タンパク質のＮ末端にあるメチオニン残基は開始コドンであるATGに由来するためタンパク質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られてお���、上記タンパク質の場合にもＮ末端側のメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。ただし、配列表配列番号３１に示したATGの６ベース上流にGTGの配列があり、ここからアミノ酸が翻訳されている可能性もある。また、大腸菌など他の微生物のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、E1, E2およびE3の３つのサブユニットから構成されており、これらをコードする遺伝子はオペロンであることが多いが、ここで明らかとなったpdhA遺伝子の下流約3キロベース中にはピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットと考えられるオープン・リーディング・フレームは存在しなかった。その代わり、このオープンりー・リーディング・フレームの下流にはターミネーターと推定される配列が存在していることが明らかとなっていることから、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９のピルビン酸デヒドロゲナーゼのE2およびE3サブユニットは染色体上の他の部分に存在していると考えられた。
【００６４】
（２）pdhA増幅のためのプラスミドの構築
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９にE.coliのPDHを構成する３つのサブユニットをコードする遺伝子を導入した株はグルタミン酸収率が向上していることが既に明らかとなっている（特願平10-360619）。しかし、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９のPDHはE1サブユニットをコードするpdhA遺伝子しかクローニングされておらず、この遺伝子単独での増幅がグルタミン酸収率に効果があるかは、まだ調べられていなかったので、ここでpdhA遺伝子単独増幅がグルタミン酸収率に効果があるかを調べることにした。
既にクローニングされている塩基配列に基づいて配列番号３３及び３４に示すプライマーを合成し、Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、pdhA遺伝子を増幅した。合成したプライマーの内、配列番号３３は、配列表配列番号３２に記載されているpdhA遺伝子の塩基配列図の1397番目から1416番目の塩基に至る配列に相当しており、配列番号３４は、配列表配列番号３２の5355番目から5374番目の塩基に至る配列に相当する塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。
【００６５】
生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素Sal IとEcoT22Iを反応させ、制限酵素Sal IとPst Iで切断したpSFK（特願平11-69896）とライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、配列表配列番号３２に報告されているpdhA遺伝子の制限酵素地図と比較し、同一制限酵素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpSFKBPDHAと名付けた。
【００６６】
（３）ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869およびＣＧ25へのｐASFKBPDHAの導入と醗酵培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869およびＧＣ25を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によりプラスミドpSFKBPDHAで形質転換して、形質転換株を得た。ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869およびＧＣ25にプラスミドpSFKBPDHAを導入して得られた形質転換株ATCC13869/pSFKBPDHAおよびＧＣ25／pSFKBPDHAを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たATCC13869/pSFKBPDHAおよびGC25／pSFKBPDHA株の菌体を、グルコース  ８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩 ２００μｇ、ビオチン ６０μｇ、カナマイシン２５ｍｇ及びＣａＣＯ3  ５０ｇ を純水 １Ｌ中に含む培地にＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた培養物を、GC25/pSFK6 及びGC25/pSFKBPDHAについては上記と同じ組成の培地に、又ATCC13869/pSFK6及び ATCC13869/pSFKBPDHAについては上記と同じようにビオチンを除いた培池に、５％量接種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869およびＧＣ25に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpSFK6を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表１７に示した。
【００６７】
表１７

菌株                                 Ｌ−グルタミン酸収率（％）
ATCC13869/pSFK                                      3.6
ATCC13869/pSFKBPDHA                                 3.8
GC25/pSFK6                                          5.1
GC25/pSFKBPDHA                                      5.3            
【００６８】
これらの結果から、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869およびＧＣ25においてpdhA遺伝子の単独増幅でもGlu収率向上に効果があることが明らかとなった。
（４）変異したpdhAプロモター活性測定用のプラスミドの構築
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）のプロモーター変異株の作製を行うために、既にクローニングがなされたブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869のpdhA遺伝子のプロモーター領域の決定およびプロモーター領域の改変による発現量の違いの測定をβ-ガラクトシダーぜの活性を測定することによって行った。
クローニングを行って既に明らかとなっている塩基配列からpdhA遺伝子のプロモーター部位を推定したところ、配列表配列番号３２の2252番目から2257番目と2279番目から2284番目がそれぞれ-35領域および-10領域である可能性が高いことが推定された。そこで、配列表配列番号３５及び３６に示すプライマーを合成し、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりpdhA遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を増幅した。合成したプライマーの内、配列番号３５は、配列表配列番号３２の塩基配列の2194番目から2221番目の塩基に至る配列に相当するが、2198番目の塩基をCに、2200番目と2202番目の塩基をGに変更し、制限酵素SmaIの認識配列を挿入している。配列番号３６は、配列表配列番号３２の塩基配列の2372番目から2398番目の塩基に至る配列に相当するが、2393番目と2394番目の塩基をGに変更し、制限酵素SmaIの認識配列を挿入した塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、pdhA遺伝子のプロモーター領域を増幅した。生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素SmaIを反応させ、lacZ遺伝子のプロモーター領域を欠いるコリネ型細菌で複製が可能なpNEOLを制限酵素SmaIで（実施例４の（３））切断したものとライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、定法によりベクターに挿入されたＤＮＡ断片のシーケンスを行いＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpNEOLBPDHApro1と名付けた。
【００６９】
さらにプロモーター部位と推定される領域をコリネ型細菌のプロモーターの共通配列に変えたプラスミドを構築するために、配列表配列番号３７，３８，３９に示すプライマーを合成し、これらのそれぞれのプライマーと配列表配列番号３６に示すプライマーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりpdhA遺伝子のプロモーター領域を共通配列に変えたDNA断片を増幅した。合成したプライマーの内、配列番号３７は、配列表配列番号３２の塩基配列の2244番目から2273番目の塩基に至る配列に相当し、2255番目の塩基をCと2257番目の塩基をAに変更て、-35領域のみをコリネ型細菌の共通配列に変えたものに相当している。また、配列番号３８は、配列表配列番号３２の塩基配列の2249番目から2288番目の塩基に至る配列に相当し、2279番目と2281番目の塩基をTに変更て、-10領域のみをコリネ型細菌の共通配列に変えたものに相当している。また、配列番号３９は、配列表配列番号３２の塩基配列の2249番目から2288番目の塩基に至る配列に相当し、2255番目の塩基をCに、2257番目の塩基をAに、2279番目と2281番目の塩基をTに変更て、-35領域および-10領域の両方をコリネ型細菌の共通配列に変えたものに相当している。Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行い、これらのプライマーを使って、プロモーター領域を共通配列に変えたpdhA遺伝子のプロモーター領域を増幅した。生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、制限酵素SmaIを反応させ、lacZ遺伝子のプロモーター領域を欠いるコリネ型細菌で複製が可能なpNEOLを制限酵素SmaIで切断したものとライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、定法によりベクターに挿入されたＤＮＡ断片のシーケンスを行い、-35領域のみを共通配列に変えたＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpNEOLBPDHApro35と名付け、-10領域のみを共通配列に変えたＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpNEOLBPDHApro35と名付け、-35領域および-10領域を共通配列に変えたＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpNEOLBPDHApro3510と名付けた。
【００７０】
（５）変異したpdhAプロモター活性の評価
ここで構築したpNEOLBPDHApro1、pNEOLBPDHApro10、pNEOLBPDHApro3510と名付けたプラスミドによって、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ATCC13869を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）で形質転換して形質転換株を得た。得られた形質転換体のβ-ガラクトシダーゼ活性を実施例４（４）に記載の方法により測定した。プロモーター領域を共通配列に変えた時のβ-ガラクトシダーゼ活性は、pdhA遺伝子のプロモーター領域を持つβ-ガラクトシダーゼの酵素活性を1として、表１８のような結果であった。
【００７１】
表１８
菌株            β-ガラクトシダーゼ活性（相対値）
ATCC13869/pNEOLBPDHApro1                     1
ATCC13869/pNEOLBPDHApro10                    6
ATCC13869/pNEOLBPDHApro3510                 7.5        
【００７２】
この結果は、推定したプロモーター部位がpdhA遺伝子のプロモーターであることを意味しており、この領域を共通配列に変えることで、PdhAの発現量を変えること（増幅すること）ができることを示している。これは、pdhA遺伝子のプロモーター領域を変えることで、プラスミドを使わずに発現量を変えることができることを示している。
（６）プロモーター変異株作製用プラスミドの構築
プロモーターに変異を起こさせることによりPdhAの発現量を変えられることが明らかとなったので、pdhA遺伝子のプロモーター変異株を作製するためのプラスミドの構築を行った。プロモーター変異株構築用のプラスミドは、-35領域および-10領域をそれぞれ共通配列に変えたものとその両方を共通配列に変えたもの３種類の構築を行った。
【００７３】
４−１）プロモーター変異株作製用プラスミドの構築
既にクローニングされている塩基配列に基づいて配列番号４０、４１に示すプライマーを新たに合成した。合成したプライマーの内、配列番号４０は、配列表配列番号３２の2491番目から2521番目の塩基に至る配列に相当する塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものの５’末端にAが3個連なった後にTが4個連なった配列を付与したものである。また、配列番号３３は配列表配列番号３２に記載されているpdhA遺伝子の塩基配列図の5020番目から5039番目の塩基に至る塩基配列の逆ストランドを５′側から表記したものである。Advanced Genetic Technologies Corp.製Bacterial Genomic DNA Purification Kitによって調整したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、プライマーとして配列表配列番号３３および４０を用いてＰＣＲテクノロジー（ヘンリーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行った。また、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を鋳型とし、配列表配列番号15および17を用いてもＰＣＲを行った。生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、プライマーとして配列表配列番号9および16を用いたときのPCR産物と配列表配列番号３９および４１を用いたときのPCR産物および配列表配列番号３３と４１を用いてPCRを行った。このときの条件は、これら４つのDNAの濃度が10マイクロMとなるように反応液中に加えて、鋳型を入れずにLA taq（宝酒造社製）を用いてPCRを行った。生成したＰＣＲ産物は常法により精製後、制限酵素Sal IとXhoIを反応させ、コリネ型細菌で複製可能な温度感受性プラスミドpSFKT2を制限酵素Sal Iで切断したものとライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。 形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のシーケンスを行い、配列表配列番号３２に報告されているpdhA遺伝子の塩基配列と比較し、プロモーターの-35領域と-10領域だけがコリネ型細菌の共通配列に変わっているＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドをpSFKTPDHApro3510と名付けた。
【００７４】
上記の方法の配列表配列番号３９を配列表配列番号３７および３８にそれぞれ変えて、全く同様の方法で、pdhA遺伝子のプロモーターの-35領域をコリネ型細菌の共通配列に変えたプラスミドおよびpdhA遺伝子のプロモーターの-10領域をコリネ型細菌の共通配列に変えたプラスミドを構築した。これらのプラスミドはそれぞれpSFKTDHApro35およびpSFKTPDHApro10と名付けた。
（７）プロモーター変異株の作製
（６）で構築したプロモーター変異株作製用のプラスミドを用いて、相同組み換えによりpdhA遺伝子のプロモーター変異株の作製を行った。
まず、プロモーター変異株作製用プラスミドpSFKTPDHApro3510を用いてＧＣ25を電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）で形質転換を行い、CM2Bプレート培地（ポリペプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ビオチン10マイクロｇ／ｍｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）に湿布して培養温度２５℃で形質転換株を得た。得られた形質転換株は、CM2B液体培地で一晩試験管培養した後に、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むCM2Bプレート培地に湿布して、培養温度３４℃で培養して、相同組み換えで染色体上にプラスミドpSFKTPDHpro3510が挿入された１回組み換え株を得た。得られた１回組み換え株を単コロニー分離した後に、CM2B液体培地に湿布して、培養温度３１．５℃で培養し、コロニーが出現してきたら、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むCM2Bプレート培地にレプリカすることで、カナマイシン感受性株を取得した。取得された株のpdhA遺伝子のプロモーター部位は野生株の配列の株と変異が導入されている株の２種類が得られるので、この部分のシーケンスを行うことで、pdhA遺伝子のプロモーター部位に変異が導入されたプロモーター変異株を取得した。この株は、pdhA遺伝子のプロモーターの-35領域および-10領域がコリネ型細菌の共通配列に変えた株であり、この株をGD3510と名付けた。
【００７５】
また、上記のプロモーター変異株作製用プラスミドpSFKTPDHApro3510をプロモーター変異株作製用プラスミドpSFKTPDHApro35およびpSFKTPDHApro10に代えて、上記と全く同様の方法により、それぞれpdhA遺伝子プロモーターの-35領域および-10領域がコリネ型細菌の共通配列に変えた株を取得し、それぞれGD35およびGD10と名付けた。
（８）pdhA遺伝子プロモーター変異株のフラスコ培養評価
取得した３種類のpdhA遺伝子プロモーター変異株ＧＤ3510、ＧＤ35、ＧＤ10及びＧＣ25を用いてＬ−グルタミン酸生産のためのフラスコ培養を以下のように行った。ＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たプロモーター変異株ＧＤ3510、ＧＤ３５、ＧＤ１０及びＧＣ２５の菌体を、グルコース  ３０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩 ２００μｇ、ビオチン ６０μｇ及びＣａＣＯ3  ５０ｇ を純水 １Ｌ中に含む培地にＫＯＨを用いてｐＨ８．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。得られた生成物を、上記と同様の組成の倍地に5％の濃度で接種し、倍地中の糖が消費されるまで37℃で振とう培養した。培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表１９に示した。
【００７６】
表１９

菌株                              Ｌ−グルタミン酸（g/dl）  
ＧＣ２５                                          1.9
ＧＤ３５                                          2.0
ＧＤ１０                                          2.0
ＧＤ３５１０                                      2.1              
これらの結果から、取得したプロモーター変異株はGlu収率が向上していることが明らかとなった。
【００７７】
実施例６  コリネ型アルギニン生産菌へのアルギノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域への変異の導入
1) argG遺伝子の上流域の塩基配列決定
ブレビバクテリウム・フラバムのargG遺伝子をPCR により増幅するために、同ORF の上流及び下流の領域の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、公知のコリネバクテリウム・グルタミカムのargG遺伝子のORF の塩基配列（GenBank accession AF030520）に基づいてプライマーを合成し、In vitro LA PCR cloning kit （宝酒造（株）製）を用いて、キットに添付の説明書に従って行った。前記プライマーとして具体的には、ORF の上流領域用には配列番号42及び43に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１、２）を、下流領域用には配列番号44及び45に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー３、４）をそれぞれ用いた。ブレビバクテリウム・フラバムの野生株である2247株（ATCC14067）の染色体ＤＮＡを制限酵素EcoRI で完全消化し、一次PCR をプライマー２または３で行い、二次PCR をプライマー１または４を用いて行うことにより、argGの上流、下流の塩基配列を決定した。
【００７８】
2)promoter部位の予測
上記配列より、市販のソフト（GENETYX）を用いて、argG遺伝子のORFの上流にあるpromoter様配列を検索した。最もスコアの高かった部位(最初のATGから約120bp上流)に変異を導入し、次いでプロモーターの活性を評価した。
3)promoter配列への変異導入と変異型promoterの活性測定
最もスコアの高かった部位に、変異導入用プライマーprimer9またはprimer10またはprimer11またはprimer12またはprimer13とprimer7（それぞれ配列番号５０、５１、５２、５３、５４、４８）を用いてAJ12092株の染色体DNAを鋳型として1回目のPCRを行い、このPCR産物を3'側のprimerとし，primer8（配列番号４９）を5'側のprimerとして再度同染色体DNAを鋳型としてPCRを行うことにより、目的のpromoter部分に変異が導入されたDNA断片を得た。次にこの変異型promoterの活性を測定する為に、これらのDNA断片を  promoter probe vector pNEOLのSmaIサイトにリポーター遺伝子のlacZと順向きになるように挿入したplasmid pNEOL-1,pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL-４、pNEOL-7 を得た。また活性の対照としてprimer7とprimer8を用いてAJ12092株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行って得たDNA断片を同様にpNEOLのlacZ遺伝子の上流に挿入したplasmid  pNEOL-0を構築した。
【００７９】
pNEOL-0、pNEOL-1、pNEOL-2、 pNEOL-3、 pNEOL-４、pNEOL-7 をAJ12092株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１）を用いた。形質転換体は4μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にてクロラムフェニコール耐性株として選択した。
これらの菌株をグルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、 酵母エキス 1g/dl、 NaCl 0.5g/dl、クロラムフェニコール 5μg/lを含む寒天培地にぬりつけ31.5度で20時間培養して得た菌体１エーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム1.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、 MgSO4 0.04g/dl、 FeSO4 0.001g/dl、 MnSO4 0.01g/dl、 VB1 5μg/dl、 biotin 5μg/dl, 大豆加水分解物 N量として45mg/dlを含む培地に植菌し、31.5度で18時間培養して得た菌体を用い、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
表２０に示す様にAJ12092/pNEOL-0でβ-ガラクトシダーゼ活性が検出されたことから、lacZ構造遺伝子の上流に挿入したDNA断片がpromtoerとして機能していることがわかった。また、AJ12092/pNEOL-0に比して各plasmid導入株ではβ-ガラクトシダーゼ活性が高くなっており、このpromoter様配列への変異導入により、転写活性が表２０の様に上昇することが判った。
【００８０】
表２０
0003651002.tif 000002
【００８１】
4)変異導入用plasmidの構築
primer14、15（配列番号５５と５６）を用いてAJ12092株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行って得たDNA断片をクローニングベクターpHSG398(TaKaRa製のマルチクローニングサイトのSmalI部位に挿入しplasmid p0を構築した。次にp0を制限酵素EcoRV及びBspHIで消化し、同様にpNEOL-3及びpNEOL-7を制限酵素EcoRV及びBspHIで消化することによってえられるＤＮＡ断片をライゲーションすることにより変異導入用plasmid p3(変異導入用primer11由来の変異)及びp7(変異導入用primer13由来の変異)を得た。
5)変異導入用plasmidのArg生産菌への導入
上記plasmidをArg生産菌 Bevribacterium lactofermentum AJ12092株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１）を用いた。Bevribacterium 中でこれらのプラスミドの自律複製不可能な為、本plasmidが相同組換えによって染色体に組み込まれた株のみがCm耐性株として選択できる。変異導入用plasmidが染色体に組み込まれた株は5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にてクロラムフェニコール耐性株として選択した。
次に再度相同組換えをおこしてCm感受性になった株の中から、argG遺伝子のpromoter部分が目的の変異配列に置換された株を選択した。
その結果、P3の配列に置換されたもの(AJ12092-P3)及びP7の配列に置換されたもの(AJ12092-P7)を得た。
【００８２】
6) argG遺伝子のクローニング
１）のようにして決定した塩基配列をもとに、配列番号46及び47に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー５、６）を合成し、ブレビバクテリウム・フラバム2247の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCR を行った。PCR 反応は、94℃：30秒、55℃：１秒、72℃：２分30秒からなるサイクルを25サイクル行った。得られたDNA 断片をクローニングベクターpSTV29（宝酒造（株）製）のマルチクローニングサイト内のSmaI部位にクローニングし、pSTVarG を作製した。さらに、pSTVargGのSalI部位に、実施例１(1) 記載のpSAK4 をSalI処理して得られた複製起点を含む断片を挿入したpargG を作製した。
７）pargGのBrev.への導入
pargGを Bevribacterium lactofermentum AJ12092株に導入した．プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２−２０７７９１）を用いた。形質転換体は4μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にてクロラムフェニコール耐性株として選択した。
【００８３】
８) promoter変異株のArgG活性
上記2種類のArgG promoter変異株及びplasmidにてargGを増幅した株(AJ12092/pargG)のArgG活性を測定した。これらの菌株をグルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、 酵母エキス 1g/dl、 NaCl 0.5g/dl、クロラムフェニコール 5μg/lを含む寒天培地にぬりつけ31.5度で20時間培養して得た菌体１エーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム1.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、 MgSO4 0.04g/dl、 FeSO4 0.001g/dl、 MnSO4 0.01g/dl、 VB1 5μg/dl、 biotin 5μg/dl、大豆加水分解物 N量として45mg/dlを含む培地に植菌し、31.5度で18時間培養して得た菌体を用い、既報(Journal of General Microbiology(1990),136,1177-1183)に従ってArgG活性の測定をした。上記2種類のArgG promoter変異株及びplasmidにてargGを増幅した株(AJ12092/pargG)のArgG活性を表２１に示す．表２１に示すように、promoterに変異を導入することにより、AJ１２０９２-P3では親株の約2倍に、AJ12092-P7では約3倍にArgG活性が上がっていた。また、AJ12092/pargGではArgG活性は親株の約4.5倍であった。
【００８４】
表２１      
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【００８５】
９)promoter変異株によるArg生産
ArgG promoter変異株のフラスコ培養を行った。対照として親株AJ12092及びAJ12092/pargGも同様に培養した。KH2PO4 0.1g/dl、 MgSO4 0.04g/dl、 FeSO4 0.001g/dl、 MnSO4 0.01g/dl、 VB1 5μg/dl、 biotin 5μg/dl、 大豆加水分解物 N量として45mg/dlを含む培地に植菌し、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、 酵母エキス 1g/dl、 NaCl 0.5g/dl、クロラムフェニコール 5μg/lを含む寒天培地にぬりつけ31.5度で20時間培養して得た菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、フラスコにて31.5度でグルコースを完全に消費するまで培養した。
培養液を0.2N HClで５１倍希釈した液の６２０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６２０）、アルギニン生成量（濃度（ｇ／ｄｌ）及び培養時間を示した。
表２２に示す様に、argG promoter変異株ではArg収率が向上し、plasmidでのargG増幅株と同等の収率であった。また、plasmid増幅株では培養時間が遅延したのに対し、promoter変異株ではAJ12092-P3,AJ12092-P7ともに培養時間は親株と同等であり、Arg生産性がplasmid増幅株よりも向上することが判った。
【００８６】
表２２
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【００８７】
実施例７：コリネ型グルタミン酸生産菌のGDH遺伝子プロモーター領域への変異の導入
（１）変異型gdhプラスミドの構築
上記実施例２に示したFGR1株およびFGR2株がもつGDHプロモーター配列を有するプラスミドを部位特異的変異手法により構築した。FGR1株のGDHプロモーター配列を得るためには、配列番号57に示す合成DNAと配列番号60に示す合成DNAをプライマーに用いATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行ない、一方で配列番号58に示す合成DNAと配列番号59に示す合成DNAをプライマーとして用いATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行なった。さらにこのPCR産物を混合したものを鋳型として配列番号57および58に示す合成DNAをプライマーに用いPCRを行なった。こうして得られたPCR産物をpSFKT2（特願平11−69896）のSmal部位に挿入したpSFKTG11を構築した。FGR2株のGDHプロモーター配列を得るためには、配列番号57に示す合成DNAと配列番号62に示す合成DNAをプライマーに用いATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行ない、一方で配列番号58に示す合成DNAと配列番号61に示す合成DNAをプライマーとして用いATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行なった。さらにこのPCR産物を混合したものを鋳型として配列番号57および58に示す合成DNAをプライマーに用いPCRを行なった。こうして得られたPCR産物をpSFKT2（特願平11−69896）のSmal部位に挿入したpSFKTG07を構築した。なお、pSFKTG11およびpSFKTG07のSmal部位に挿入したDNA断片の塩基配列決定を行ない、GDHのプロモーター領域以外に変異が導入されていないことを確認している。
【００８８】
（２）gdhプロモーター変異株の構築
次にpSFKTG11およびpSFKTG07を電気パルス法によりAJ13029株に導入し、25℃で25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート上に生育する形質転換体を選択した。この形質転換体を34℃で培養し、34℃でカナマイシン耐性を示す株を選択した。34℃でカナマイシン耐性を示すことはpSFKTG11あるいはpSFKTG07がAJ13029株の染色体上に組み込まれたことを意味する。このような染色体上にプラスミドが組み込まれた株よりカナマイシン感受性株を取得した。これらの株のGDHプロモーター配列を決定し、pSFKTG11およびpSFKTG07と同じgdhプロモーター配列を持つ株をそれぞれGA01,GA02とした。
（３）gdhプロモーター変異株のL−グルタミン酸生産能の確認
GA01株、GA02株およびその親株AJ13029株についてグルタミン酸の生産能を上記実施例２（２）と同じ方法で確認した。その結果、GA01およびGA02では顕著なグルタミン酸の蓄積向上が認められた（表２３）。
【００８９】
表２３
菌株             Glu (g/dl)      GDH比活性      相対値  
AJ13029            2.6              7.7          1.0
GA01             3.0             22.3          2.9
GA02             2.9             27.0          3.5    
【００９０】
（４）セルフクローニング型gdhプラスミドの構築
まず、セルフクローニングベクターpAJ220を構築した。pAJ226（特開昭61-152289）をEcoRV,Pstlで処理し、コリネ型細菌内で自律複製可能な領域を含む断片を調製し、これとpAJ224（特開昭61-152289）をEcoRV,Pstlで処理して生じるおよそ0.7kbのDNA断片とを連結したプラスミドがpAJ220である。本プラスミドはコリネ型菌類内で自律複製可能であり、宿主にトリメトプリム耐性を付与する。
コリネ型細菌野生型のATCC13869株の染色体DNAを鋳型として配列番号63および配列番号64に示す合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行ないgdh遺伝子断片を調製し、これをpAJ220のBall部位に挿入したpAJ220Gを構築した。pAJ220のBall部位近傍にはプロモーターが存在しており、Ball部位に挿入された遺伝子はその挿入された向きによっては発現量が増強されることとなる。pAJ220GおよびpGDHをATCC13869株に電気パルス法で導入した株を構築し、上記（１）記載の方法でGDH活性を測定した。その結果、pAJ220G導入株ではpGDH導入株に比しおよそ1.5倍のGDH活性が認められた。（表２４）
【００９１】
表２４
菌株                      GDH比活性            相対値    
ATCC13869                    7.7                 1.0
ATCC13869/pGDH              82.7                10.7
ATCC13869/pAJ220G          120.l                15.6     
【００９２】
(5) gdh 活性が収率および副生Asp に与える影響の検討
pGDHおよびpAJ220G をAJ13029 に電気パルス法にて導入した。これらの株と上記（２）で取得した各株を表25に示す組成の種培養培地に接種し、31.5℃に24時間振とう培養して種培養を得た。表25に示す組成の本培養培地を500ml 容ガラス製ジャーファーメンターに300ml ずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培養を40ml接種した。攪拌速度を800 〜1300rpm 、通気量を1/2 〜1/1vvmとし、培養温度31.5℃で培養を開始した。培溶液のpHはアンモニアガスで7.5 に維持した。培養を開始して８時間後に37℃にシフトした。いずれも20〜40時間でグルコースが完全に消費された時点で培養を終了し、培溶液中に生成蓄積されたL-グルタミン酸の量を測定した（表26）。収率を最高にするGDH 活性は３倍程度であり、それよりもGDH 活性が上昇すると収率向上幅は減少し、およそ16倍に強化したところではむしろ収率は低下していた。副生アミノ酸を日立のアミノ酸アナライザーL-8500にて分析したところ、GDH 活性の上昇に伴いアスパラギン酸およびアラニンの蓄積が上昇していることが明らかとなった。これらの結果から、グルタミン酸収率を向上させるためにはアスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こさないようにGDH 活性を適度に強化する必要があり、その方法の一つしてgdh プロモーターに各種の変異を導入することでGDH 活性を親株の３倍前後に調節することが有効な手段であることが示された。
【００９３】
表２５
濃度                     
成分
種培養             本培養           
グルコース                  50    g/l     150   g/l
KH2PO4                       1    g/l       2   g/l 
MgSO4・7H2O                 0.4   g/l      1.5  g/l 
FeSO4・7H2O                 10   mg/l      15  mg/l 
MnSO4・4H2O                 10   mg/l      15  mg/l 
大豆蛋白加水分解            20   ml/l      50  ml/l
ビオチン                    0.5  mg/l       2  mg/l
サイアミン塩酸塩              2  mg/l       3  mg/l    
【００９４】
表２６
菌株       Glu(g/dl)  Asp(mg/dl)  Ala(mg/dl)  GDH比活性   相対値  
AJ 13029         8.3        49         60         7.7       1.0
GA01             9.0       145        152        22.3       2.9
GA02             8.9       153        155        27.0       3.5
AJ13029/pGDH     8.6       201        190        82.7      10.7 
AJ13029/pAJ220G  7.5       290        590       120.12     15.6   
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】変異プロモーターを有するＧＤＨ遺伝子の構築フローを示す。
【図２】変異プロモーターを有するＣＳ遺伝子の構築フローを示す。
【図３】レポーター遺伝子としてlacZを有するシャトルベクターの構築フローを示す。
【図１】
0003651002.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【配列表】
0003651002000001.app