(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド化合物であって、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２単離体のヌクレオチド５８４９のＧＵＡターゲット部位をターゲットするリボザイムを含み、
ａ）前記リボザイムは以下の構造を有するか：
0003691849.tif 000028
上記式において、Ｘは、その糖、リン酸もしくは塩基部分において修飾もしくは置換されてもよい同一もしくは異なるヌクレオチドであり；
Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々は、その糖、リン酸もしくは塩基部分において修飾もしくは非修飾または置換されてもよいリボヌクレオチドを表し、３′−ＡＡＧ......ＡＧＵＣＸ−５′は、保存された触媒領域を定義し；
（Ｘ）nＡおよび（Ｘ）n′の夫々は、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２単離体内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズできる配列を有するヌクレオチを定義し；
夫々の★は、その両側に位置するヌクレオチドの間の塩基対形成を表し；夫々の実線は、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を与える化学的結合を表し；
ａは、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し（但し、ａは０または１であってもよく、もし０であれば、（Ｘ）aの５′に位置するＡは（Ｘ）aの３′に位置するＸに結合される）；
ｍおよびｍ′の夫々は、１以上の整数を表し；（Ｘ）bはオリゴヌクレオチドを表し、ｂは２以上の整数を表し、または、
ｂ）前記リボザイムは以下の構造を有するか、
0003691849.tif 000029
上記式において、Ｘは、その糖、リン酸もしくは塩基部分において修飾もしくは置換されてもよい同一もしくは異なるヌクレオチドを表し；
Ａ，Ｃ，ＵおよびＧの夫々は、その糖、リン酸もしくは塩基部分において修飾もしくは非修飾または置換されてもよいリボヌクレオチドを表し；３′−ＡＡＧ......ＡＧＵＣＸ−５′は、保存された触媒領域を定義し；
（Ｘ）nＡおよび（Ｘ）n′の夫々は、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２単離体内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズできる配列を有するヌクレオチを定義し；
ｍは、２〜２０の整数を表し；
ヌクレオチド（Ｘ）mは何れも、当該化合物内の何れのヌクレオチドともワトソン-クリックの塩基対形成をしておらず、および、
夫々の実線は、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を与える化学的結合を表し、または、
ｃ）前記リボザイムは、以下の構造を有する化合物：
0003691849.tif 000030
上記式において、３′（Ｘ）p4...（Ｘ）p1−５′は、保存された触媒領域を定義し；（Ｘ）F4および（Ｘ）F3の夫々は、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２単離体内の前もって決定された配列とハイブリダイズできる配列を有するヌクレオチを定義し；
夫々の実線は、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を与える化学的結合を表し；
Ｆ3は、当該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を定義する整数を表し（但し、Ｆ3は３以上である）；
Ｆ4は、当該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を定義する整数を表し（但し、Ｆ4は３〜５である）；
（Ｘ）P1および（Ｘ）P4の夫々は、（Ｘ）P4が（Ｘ）P1の３〜６の塩基と塩基対を形成するような前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、Ｐ１は、当該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を定義する整数を表し（但し、Ｐ１は３〜６であり、Ｐ１およびＦ４の合計は９である）；
（Ｘ）P2および（Ｘ）P3の夫々は、（Ｘ）P2が（Ｘ）P3の少なくとも３塩基と塩基対を形成するような前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、夫々の破線は、独立に、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を与える化学的結合または斯かる化学的結合の不存在を表し；および、
（Ｘ）L2は、存在しても存在しなくてもよいヌクレオチドを表す（但し、存在するときには、Ｌ２は３以上の整数を表す）。
【請求項２】
前記リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
単一リボザイムである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ｔａｔ内の異なる部位をターゲットする複数のリボザイムである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
以下の配列を含むか、または該配列を含む構築物によってコードされる、請求項２に記載の化合物：
ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項６】
以下の配列を含むか、または該配列を含む構築物によってコードされる、請求項２に記載の化合物：
ＣＣＴＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項７】
さらに以下の配列を含むか、または該配列を含む構築物によってコードされる、請求項２に記載の化合物：
ＧＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項８】
ｔａｔ内の複数のターゲット部位が、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２単離体のヌクレオチド５７９２、５８８６、もしくは６０４２のヌクレオチドである、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせから構成されるトランスファーベクターであって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を生じさせるトランスファーベクター。
【請求項１０】
ＨＩＶにより感染され得る真核細胞タイプにおける前記化合物の発現のための真核生物プロモーターを含む、請求項９に記載のトランスファーベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物であるか、または転写によって該化合物を生じさせる配列を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む生体外の細胞。
【請求項１２】
前記リボザイムが、ヒト初代造血細胞におけるＨＩＶ−１の複製を阻害することができる、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、トランスファーベクター構築物の一部である、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記トランスファーベクターが、アデノウイルス関連トランスファーベクター、Ｍｏ−ＭＬＶ、または両種指向性ウイルスベクターである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記トランスファーベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列が、前記レトロウイルスベクターのネオマイシン耐性遺伝子の３'非翻訳領域である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記トランスファーベクターが、ＬＮＬ６ベクターに由来する請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が以下の配列を含む、請求項１１に記載の細胞：
ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列が以下の配列を含む、請求項１１に記載の細胞：
ＣＣＴＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列がさらに以下の配列を含む、請求項１１に記載の細胞：
ＧＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧ
ここで、Ｔ、Ｇ、Ａ、およびＣのそれぞれは、ヌクレオチドを表す。
【請求項２１】
請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞は、造血幹細胞、前駆体細胞、コミットされた前駆体細胞、Ｔリンパ球前駆体細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Tリンパ球、骨髄前駆体細胞、または単球／マクロファージ細胞である細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の真核細胞であって、前記細胞は前駆体細胞である真核細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載の真核細胞であって、前記細胞はＴリンパ球である真核細胞。
【請求項２４】
請求項２１に記載の真核細胞であって、前記細胞はヒト初代造血細胞である真核細胞。
【請求項２５】
薬学的に許容されるキャリアーに、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物または請求項９もしくは１０に記載のトランスファーベクターを含む、HIV感染に耐性のヒト細胞を作製するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９４年１月５日出願の米国特許出願第08/178,082号の一部継続出願である。本出願では、種々の刊行物がかっこ内の著者名と発行年により参照される。完全な参照文献情報は、実験の項の後にアルファベット順にリストされる。本発明が属する技術の現状をより充分に記載するための参照として、これらの刊行物の開示は全体として本出願の一部をなす。
〔発明の背景〕
レトロウイルス
レトロウイルスは、ＲＮＡをゲノム物質として有するウイルスである。これらは、自身のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡコピーを宿主細胞ゲノム中に安定に組み込むことにより、自身の複製のために宿主細胞を利用する（Miller,1992;およびBrown,1987）。このウイルスゲノムは、ウイルスのプロウイルスｃＤＮＡ型の各末端（５’および３’）の長末端反復配列（Long Terminal Repeat）（ＬＴＲ）よりなる。５’から３’方向に進むと、このＬＴＲは、Ｒと呼ばれる短い配列で結合されたＵ３およびＵ５配列よりなる。転写は、５’ＬＴＲ内で開始し、３’ＬＴＲ内のポリアデニル化部位で停止する。ＬＴＲに隣接して、逆転写酵素による正のＤＮＡ鎖と負のＤＮＡ鎖合成の開始誘導（priming）に必要な短い配列がある。ゲノムにはスプライス供与配列および受容配列も存在し、これらは、サブゲノムＲＮＡ種の産生に関与している。５’ＬＴＲに直接隣り合っているのは、ウイルスＲＮＡをキャプシドで包みこんでウイルス粒子にするのに必要な配列である。これは、Ｐｓｉパッケージング配列と呼ばれる。これは、ウイルスＲＮＡのパッケージングを保証する必須で特異的なシグナルである。ウイルスＲＮＡの大部分は、各々、コア蛋白（ｇａｇ）、インテグラーゼ、プロテアーゼおよび逆転写酵素の酵素類（ｐｏｌ）、およびエンベロープ蛋白（ｅｎｖ）をコードする、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ複製遺伝子よりなる。
細胞のレトロウイルス感染は、ウイルス糖蛋白と細胞受容体との相互作用により開始する（Ａ）（図１参照）。吸着と脱外被（uncoating）後、ウイルスＲＮＡは標的細胞に入って、ウイルス粒子に運ばれる酵素である逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡに変換される（Ｂ）。このｃＤＮＡは環状であり（Ｃ）、二重鎖ｃＤＮＡに変換され、次いでインテグラーゼの作用により宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる（Ｄ）。いったん組み込まれると、プロウイルスｃＤＮＡが５’ＬＴＲ内のプロモーターから転写される（Ｅ）。転写されたＲＮＡは、ｍＲＮＡとして作用して翻訳されてウイルス蛋白を産生する（Ｆ）か、または新生ＲＮＡとして残る。このウイルスＲＮＡは、ウイルス粒子へのパッケージングに必須のＰｓｉパッケージング配列を含有する（Ｇ）。いったんウイルス粒子が産生されると、これは原形質膜からの出芽により細胞から放出される（Ｈ）。一般にレトロウイルスは、宿主細胞の溶解を起こさないが、ＨＩＶはこの例外である。プロウイルスｃＤＮＡは、宿主ゲノムに安定に組み込まれて残り、宿主ＤＮＡと共に複製されるため子孫細胞もこのプロウイルスを受け継ぐ。これらの複製調節点のいずれかを標的にすることにより、抗ウイルス剤を見い出す可能性がある。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶは、レトロウイルスの分類に属し、その複製は上に略述したとおりである。Ｔリンパ球、単球およびマクロファージを含む細胞中へのＨＩＶの侵入は一般に、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープ蛋白と標的細胞表面上のＣＤ４受容体との相互作用により行われる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、異なる患者間（または同じ患者でさえ）で大いに変化しやすく、このためワクチン製造は非常に困難である（Brown,1987；およびPeterlinら,1988）。この可変性は、疾患の進行と関連しているものと考えられる。ＨＩＶの主な特色は、ｉ）（レンチウイルス群の他のものと同様に）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた後プロウイルスが潜伏している潜伏期間があり、そしてii）Ｔリンパ球標的細胞に対して細胞変性作用を持つことである。ＨＩＶは、プロウイルスが入った細胞が活性化された後に複製を開始する。細胞活性化とこれに伴うウイルス複製の刺激は未だ明確には同定されていない（Brown,1987；およびPeterlinら,1988）。全てのレトロウイルスのように、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物は構造蛋白および酵素蛋白に翻訳される。ＨＩＶの場合には、さらに調節遺伝子が存在する。具体的には、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子産物が調節蛋白に翻訳されて、転写増強物質として作用し、高レベルの遺伝子発現を誘導する。ｎｅｆは、ウイルス複製レベルを調節するための別の調節遺伝子である（Jones,1989；Greene,1990；およびEpstein,1991）。
ＨＩＶの複製は、活性化し増殖している細胞で最高に達する；細胞の活性化が、核内転写因子および細胞内エンハンサー因子（cellular enhancer factors）と、ＨＩＶ ＬＴＲとの結合を引き起こし、転写レベルの上昇が起こる。全てのレトロウイルスのようにパッケージング領域（Ｐｓｉ）は、ゲノムＲＮＡのキャプシド包み込みに必要なＨＩＶゲノム上に存在するシス作用性ＲＮＡ配列である。ｇａｇ蛋白、ｐｏｌ酵素およびウイルスＲＮＡを組み込むコアの形成は、ＨＩＶ複製サイクルの最後の段階である。このコアは、膜を獲得し、細胞膜を通り抜ける出芽により細胞から出る（Peterlinら,1988；Jones,K.A.,1989；Greene,1990；およびEpstein,1991）。
現在まで、ＨＩＶの抑制のための多くの物質が検討されてきた。図１に示す複製段階を標的とした幾つかの物質を以下に説明する。
（Ａ）標的細胞へのウイルス吸着
可溶性ＣＤ４は、ウイルス受容体の大部分を占有して、このためウイルスが細胞膜に結合できないようにすることを目指して使用されてきた。しかし現在までこの治療方針は成功したことがない（Stevensonら,1992）。硫酸化多糖類は、恐らく細胞−ウイルス融合を妨害することにより、ＨＩＶ感染を阻害する能力を示した（McClureら,1992）。ＣＤ４結合外毒素（Stevensonら,1992）と同様に、ＨＩＶ自体、宿主細胞受容体またはＨＩＶエンベロープ抗原決定基に対する抗体は、ウイルスの細胞への侵入を妨害する他の可能な方法である。
（Ｂ）逆転写酵素によるｃＤＮＡの産生
アジドチミジン三リン酸（ＡＺＴ）のような化学物質がインビトロで逆転写酵素を阻害することが見い出された。現在ＡＺＴは、日常的にＡＩＤＳ患者に、および骨髄移植を受ける時に投与されているが、後者の場合は残存ＨＩＶから骨髄を保護することを目指して行われている（Miller,1992）。
（Ｃ）細胞質から核へのｃＤＮＡのトランスロケーション
核膜孔を通るｃＤＮＡのトランスロケーションまたは核内輸送（nuclear transport）自体を妨害することは可能であるかもしれないが、この試みは未だ成功していない。
（Ｄ）宿主ゲノムへのｃＤＮＡの組み込み
宿主細胞ゲノムへのプロウイルスｃＤＮＡの組み込みを防止することも可能であるかもしれない（Stevensonら,1992）。現在までに、有効であることが判った候補化合物はない。
（Ｅ）プロウイルス転写
５，６−ジクロロ−１−ベータ−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールは、転写の伸長を妨害することが知られている（Stevensonら,1992）。センスＴＡＲ類似体もｔａｔ蛋白に結合して、ＨＩＶを活性化するこの蛋白の能力を阻害することにより、転写に影響を及ぼし得る（Miller,1992；およびSullengerら,1990）。
（Ｆ）ＨＩＶ ｍＲＮＡの翻訳
アンチセンスＲＮＡは、ウイルスＲＮＡに結合することにより、ウイルスの複製を阻害するかもしれない（Sczakielら,1992）。ｍＲＮＡへの結合により、翻訳は阻害され；また新生ウイルスＲＮＡへの結合は、ウイルス粒子へのＲＮＡの生産的パッケージングを阻害するように作用するであろう。
（Ｇ）ウイルスパッケージングと成熟ウイルス粒子の産生
プロテアーゼは、ＨＩＶポリ蛋白の特異的な切断を誘導する。この活性は、成熟した、感染性ウイルス粒子の産生には必須である。α，α−ジフルオロケトン類のような数種の化合物が、ＨＩＶプロテアーゼを阻害することが見い出され、組織培養物においてある程度の抗ウイルス活性が証明されている。しかし、多くのプロテアーゼ阻害剤は、短い血清半減期、迅速な胆汁クリアランスおよび経口利用性の低さを示している（Debouck,1992）。
リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡを切断し代謝回転を示す酵素的ＲＮＡである。ある分類のリボザイムにおいては、相補配列アームの添加により、これらは特異的標的ＲＮＡと対を形成して、ＲＮＡのホスホジエステル基本骨格に沿った特異的部位での切断を誘導することが可能になる（Haseloffら,1988；Rossiら,1992；Hampel,1990；Ojwang,1992）。ハンマーヘッドリボザイムは、小さく、単純で、種々の隣接する配列モチーフに組み込まれる時に部位特異的切断を維持する能力を有する（Haseloffら,1988；Rossiら,1992）。これらの特徴により、遺伝子の抑制に特に適したものになっている。
〔発明の概要〕
本発明は、その配列が、保存された触媒領域を規定するヌクレオチドと、その配列が、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含む、合成の非天然オリゴヌクレオチド化合物に関する。好適には、このウイルスパッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列であり、１つの実施態様においてＨＩＶ−１ Ｐｓｉパッケージング配列である。このＲＮＡウイルスは、ＨＩＶ−１、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルスまたは表６にリストしたウイルスの１つであってよい。保存された触媒領域は、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎デルタリボザイム、ＲＮＡａｓｅＰリボザイム、グループＩイントロン、グループIIイントロンから誘導することができる。本発明はまた、多重リボザイム、およびリボザイムと、ＲＮＡウイルスを標的とするアンチセンスの組合せ（このような組合せは、さらにポリＴＡＲ、ＲＲＥまたはＴＡＲデコイ（decoy）を含む）に関する。アンチセンスおよびポリＴＡＲ、ＲＲＥまたはＴＡＲデコイと一緒の、またはこれらを含まないベクターまたはリボザイムも記載される。さらに、インビボおよびエクスビボの治療方法と使用方法が記載される。
【図面の簡単な説明】
図  １．典型的なレトロウイルスの複製サイクル。
（Ａ）ウイルスは標的細胞上の細胞表面受容体に結合して、融合とウイルスの脱外被後、ゲノムＲＮＡが標的細胞に侵入する。
（Ｂ）逆転写により、ｃＤＮＡへのウイルスＲＮＡの変換が起こる。
（Ｃ）ｃＤＮＡが核内に入り、環状に変換される。
（Ｄ）次にｃＤＮＡが宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。
（Ｅ）プロウイルスの転写により、ウイルスＲＮＡとｍＲＮＡが産生される。
（Ｆ）翻訳により、ウイルス蛋白が産生される。
（Ｇ）ウイルスがコードする蛋白からウイルスコアが形成されて、ウイルスＲＮＡがパッケージングされる。
（Ｈ）このコアが膜を獲得し、細胞膜を通り抜ける出芽により細胞を出る。
図  ２．Ｍｏ−ＭＬＶ Ｐｓｉパッケージング領域内のリボザイム標的部位。
Ｍｏ−ＭＬＶ５’領域は、ｐＭＬＶ−１（本文に定義される）のＢａｌＩ／ＢａｌＩ断片（ｎｔ２１２〜ｎｔ７４７）である。矢印は、全部がＧＵＣ残基であるリボザイム標的部位を示す。
図  ３．モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus）のゲノム。
ＭｏＭＬＶのゲノムは、複製遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと、５’および３’の長い末端反復配列（long terminal repeats）（ＬＴＲ）よりなる。Ｐｓｉパッケージング部位は、ウイルス粒子へのウイルスＲＮＡのパッケージングに必要である。
図  ４．アンチ−Ｍｏ−ＭＬＶおよびアンチ−ＨＩＶパッケージング部位構築物。
標準的な発現構築物はｐＳＶ２ｎｅｏに基づき、設計されたリボザイムの１つまたはｎｅｏrのＳｍａＩ部位に挿入されたＰｓｉパッケージング配列に相補的なアンチセンス配列（アンチ−Ｐｓｉ）と一緒の、ｎｅｏr遺伝子の上流のＳＶ４０プロモーターよりなる。
図  ５．標的にしたＨＩＶパッケージング部位。
この図は、リボザイム９がそのＰｓｉパッケージング部位内の配列を標的とした、ＨＩＶゲノムの簡略化した見取り図を示す。
図  ６．インビトロで作成したＭｏ−ＭＬＶパッケージング領域ＲＮＡのリボザイムによるインビトロ切断。
レーン１は、ＨｉｎｆＩで消化したｐＢＲ３２２マーカーＤＮＡである。レーン２は、約５５０kbの基質である。レーン３、５、７および９は夫々、インビトロで作成した単独のＲｚ２４３、Ｒｚ２７４、Ｒｚ３６６およびＲｚ−Ｍ７単独である。下記のリボザイムが標的基質ＲＮＡに添加された：レーン４、Ｒｚ２４３；レーン６、Ｒｚ２７４；レーン８、Ｒｚ３６６；レーン１０、Ｒｚ−Ｍ７。切断反応は、試料を１０mMトリス．Ｃｌ、ｐＨ７．５中で８０℃で２分間加熱後、１０mM ＭｇＣｌ2、５０mMトリス．Ｃｌ、ｐＨ７．５中で３７℃で３０分間行った。
図  ７．リボザイムまたはアンチセンス構築物でトランスフェクションした細胞株からのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション。
種々の構築物（レーン１、ｐＳＶ２４３；レーン２、ｐＳＶ２７４；レーン３、ｐＳＶ３６６；レーン４、ｐＳＶ−Ｍ７；レーン５、ｐＳＶＡｓ−Ｐｓｉ；およびレーン６、ｐＳＶｎｅｏベクター単独）でトランスフェクションした３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞からのゲノムＤＮＡ（１０μg）をＨｉｎｄIII／ＮｒｕＩで消化し、０．６％アガロースゲルで分離して、ニトロセルロースフィルターにブロットし、32Ｐ標識ｎｅｏr遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。矢印は、ｎｅｏr遺伝子単独（１．３４kb）、ｎｅｏr遺伝子＋単一リボザイム（１．３８kb）、＋多重Ｒｚ（１．９８kb）、または＋アンチセンス（１．８９kb）の予測サイズを示す。
図  ８．リボザイム／アンチセンス構築物の発現を試験するためのＲＮａｓｅ保護分析。
32Ｐ標識リボプローブ（riboprobes）を使用して、一連のトランスフェクションした細胞からの全ＲＮＡ２０μgを、リボザイムまたはアンチセンス構築物の発現に関して分析した。レーン１、サイズマーカーであるＨｉｈｆＩで消化したｐＢＲ３２２の末端標識ＤＮＡ断片；レーン２、酵母ＲＮＡとハイブリダイズさせＲＮａｓｅで消化したＲｚＭ７のリボプローブ；レーン３、酵母ＲＮＡとハイブリダイズさせ、次にＲＮａｓｅ消化を行わなかったＲｚＭ７のリボプローブ；レーン４〜８、各々ｐＳＶ２４３、ｐＳＶ２７４、ｐＳＶ３６６、ｐＳＶ−Ｍ７およびｐＳＶＡｓ−Ｐｓｉでトランスフェクションした細胞からのＲＮＡとハイブリダイズさせＲＮａｓｅで消化した、Ｒｚ２４３、Ｒｚ２７４、Ｒｚ３６６、ＲｚＭ７およびＡｓ−Ｐｓｉのリボプローブ；レーン９〜１３、夫々単独のＲｚＭ７、Ｒｚ２４３、Ｒｚ２７４、Ｒｚ３６６およびＡｓ−Ｐｓｉのリボプローブのみ。Ｍｏ−ＭＬＶ複製を最も抑制した各構築物につき１つのクローンを測定に使用した。
図  ９．異なるＭｏ−ＭＬＶ産生３Ｔ３細胞から誘導したウイルスＲＮＡのドットブロットのオートラジオグラフ。
１：１、１：５および１：１０希釈のウイルスＲＮＡ調製物を、前述のようにＭｏ−ＭＬＶ Ｐｓｉパッケージング領域に相補的な32Ｐ標識リボプローブでプローブ結合させた。レーン１、酵母ＲＮＡ；レーン２〜７、ｐＳＶ２４３、ｐＳＶ２７４、ｐＳＶ３６６、ｐＳＶ−Ｍ７、ｐＳＶＡｓＰｓｉおよびｐＳＶ２ｎｅｏでトランスフェクションした３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞の上澄液からのＲＮＡ。ウイルスＲＮＡレベルは、インビトロでＲＮＡ標的分子を切断するのに有効なリボザイムおよびアンチセンスにより低下がみられる。
図１０．長期測定におけるｐ２４レベル。
このヒストグラムは、ＨＩＶパッケージング部位を標的とするリボザイム構築物であるリボザイム９（Ｒｚ−９）について８、１３および２２日後のｐ２４レベルにより測定したＨＩＶ複製に関するデータを示す。ベクターは対照構築物である。Ｒｚ−２とＲｚ−Ｍは、ＨＩＶのｔａｔ遺伝子を標的とする２つのリボザイム構築物である。Ｒｚ−Ｍは、ｔａｔ内の異なる部位を標的とする幾つかのリボザイムを含有する多重リボザイムである。これは、Ｒｚ−２に標的とされる部位を含む。
図１１．ジーンバンク（Genebank）（所在：ＨＩＶＳＦ２ＣＧ）からのＨＩＶ−１ ＳＦ２単離体の配列データにより、抗−ＨＩＶ−１ ｔａｔリボザイムが設計された。標的部位は、ＧＵＣ（Ｒｚ１）、ＧＵＡ（Ｒｚ２）、ＧＵＣ（Ｒｚ３）およびＣＵＣ（Ｒｚ４）である。
図１２．ｔａｔが保存された配列。
図１３．種々のｔａｔ標的配列の比較。
図１４．Ｒｚ２（ａ、ｄ、ｆ）で保護を示すトランスフェクションしたクローン化Ｔ細胞株（Ｓｕｐ Ｔ１）。ベクター（ｐＳＶ２ ｎｅｏ、ｎｅｏ−ａ）およびランダム対照（Ｒａｎ ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を含有するクローン性細胞株。
図１５Ａ〜１５Ｃ．レトロウイルスベクター構築物とこれらの結果としての発現の概略図（一定の比率では描かれていない）。１５Ａ、リボザイム構築物ＲＲｚ２；１５Ｂ、アンチセンス構築物ＲＡＳＨ５；１５Ｃ、ポリマー性ＴＡＲ構築物Ｒ２０ＴＡＲ。親のレトロウイルスベクターはカッコ内に注記される。詳細は本文を参照のこと。
図１６Ａ〜１６Ｃ．形質導入したＰＢＬにおけるレトロウイルス構築物の発現。リボザイム（図１６Ａ）、アンチセンス（図１６Ｂ）および２０ＴＡＲ ＲＮＡ（図１６Ｃ）の発現を、対応する32Ｐ標識プローブを使用してノーザン解析により試験した。詳細は本文を参照のこと。
図１７Ａ〜１７Ｃ．形質導入したＰＢＬにおけるＨＩＶ−１ III Ｂ複製の阻害。形質導入し選択したＰＢＬは、材料と方法に記載したように投与して測定した。プロットしたデータは、５名のドナー（図１７Ａ、リボザイム構築物および図１７Ｂ、アンチセンス構築物）と２名のドナー（図１７Ｃ、ポリマー性ＴＡＲ構築物）の平均である。
図１８Ａ〜１８Ｃ．臨床的な単離体８２Ｈによる感染に対する形質導入したＰＢＬの耐性。材料と方法に記載したように、ＰＢＬをリボザイム構築物（図１８Ａ）、アンチセンス構築物（図１８Ｂ）およびポリマー性ＴＡＲ構築物（図１８Ｃ）で形質導入して、８２Ｈで感染させた。プロットしたデータは、２名のドナーの平均である。
図１９．形質導入したＰＢＬの増殖測定。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。形質導入していないＰＢＬであるＰＢＬのみ；対応するレトロウイルスで形質導入した、ＬＸＳＮ、Ｒ−２０ＴＡＲ、ＬＮＨＬ、ＲＡＳＨ−５、ＬＮＬ６およびＲＲｚ２。
図２０．ＣＥＭ Ｔ４ Ｔリンパ球細胞株をウイルスで形質導入してＧ４１８選択を行った。プールした細胞集団は、ランダム組み込み体と種々の構築物発現レベルを有する細胞を含有しており、次にこれらにＨＩＶ−１を投与する。
図２１Ａ〜２１Ｂ．ＲｚＭは、ｔａｔに対する多重リボザイムであり、そしてＲＲｚｐｓｉ／Ｍは、パッケージングに対するリボザイム／ｔａｔに対する多重リボザイムが一緒になっている。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、その配列が、保存された触媒領域を規定するヌクレオチドと、その配列が、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含む、合成の非天然オリゴヌクレオチド化合物に関する。好適には、このウイルスパッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列であり、１つの実施態様においてＨＩＶ−１ Ｐｓｉパッケージング配列である。このＲＮＡウイルスは、ＨＩＶ−１、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルスまたは表６〜７にリストしたウイルスの１つであってよい。保存された触媒領域は、ハンマーヘッドリボザイム（Haseloffら、米国特許第5,245,678号；Rossiら、米国特許第5,249,796号参照）、ヘアピンリボザイム（Hampelら、１９８９年９月２０日出願のヨーロッパ特許出願第89 177 424号参照）、肝炎デルタリボザイム（Goldbergら、１９９１年４月４日発行の、ＰＣＴ国際出願WO 91/04319およびWO 91/04324参照）、ＲＮＡａｓｅＰリボザイム（Altmanら、米国特許第5,168,053号参照）、グループＩイントロン（Cechら、米国特許第4,987,071号参照）、またはグループIIイントロン（Pyle,1993参照）から誘導することができる。
１つの実施態様において本化合物は、下記構造（配列番号１）：
0003691849.tif 000002
（式中、各Ｘは、同一かまたは異なるヌクレオチドを表し、その糖、リン酸または塩基が修飾または置換されていてもよく；各Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧは、リボヌクレオチドを表し、その糖、リン酸または塩基が修飾されていないか、または修飾または置換されていてもよく；３’−ＡＡＧ．．．．ＡＧＵＣＸ−５’は、保存された触媒領域を表し；各（Ｘ）nＡおよび（Ｘ）n′は、その配列がＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを表し；各＊は、その両側に位置するヌクレオチド間の塩基対を表し；各実線は、これの両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を提供する化学結合を表し；各点線は、独立に、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を提供する化学結合を表すか、またはこのような化学結合が存在しないことを表し；ａは、０または１であり、もしａが０であるならば、（Ｘ）aの５’に位置するＡは、（Ｘ）aの３’に位置するＸに結合する、ヌクレオチドの数を表す整数を表し；各ｍおよびｍ’は、１またはそれ以上の整数を表し；（Ｘ）bは、オリゴヌクレオチドを表し；そしてｂは、２またはそれ以上の整数を表す）を有する。
あるいは、本化合物は、下記構造（配列番号２）：
0003691849.tif 000003
（式中、３’−ＡＡＧ．．．．ＡＧＵＣＸ−５’は、保存された触媒領域を表し；ｍは、２〜２０の整数を表し；そしてヌクレオチド（Ｘ）mのいずれも、本化合物内の他のどのヌクレオチドともワトソン・クリック塩基対を形成しない）を有する。
別の実施態様において請求の範囲第１項記載の化合物は、下記構造（配列番号３）：
0003691849.tif 000004
（式中、３’（Ｘ）P4．．．．（Ｘ）P1−５’は、保存された触媒領域を表し；各（Ｘ）F4および（Ｘ）F3は、その配列がＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の前もって決定された標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを表し；各実線は、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を提供する化学結合を表し；Ｆ３は、Ｆ３が３またはそれ以上である、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数を表し；Ｆ４は、Ｆ４が３〜５である、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数を表し；各（Ｘ）P1および（Ｘ）P4は、（Ｘ）P4が（Ｘ）P1の３〜６塩基と塩基対を形成する、前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；Ｐ１は、Ｐ１が３〜６であり、かつＰ１とＦ４の和が９であるオリゴヌクレオチド中のオリゴの数を表し；各（Ｘ）P2および（Ｘ）P3は、（Ｘ）P2が（Ｘ）P3の少なくとも３塩基と塩基対を形成する、前もって決定された配列を有するオリゴヌクレオチドを表し；各点線は、独立に、その両側に位置するヌクレオチド間の共有結合を提供する化学結合を表すか、またはこのような化学結合が存在しないことを表し；そして（Ｘ）L2は、存在するかまたは存在しないオリゴヌクレオチドを表し、もし（Ｘ）L2が存在するならば、Ｌ２は３またはそれ以上の整数を表す）を有する。
別の実施態様において、配列が保存された触媒領域を定義するヌクレオチドは、肝炎デルタウイルスの保存された領域由来である。あるいは、配列が保存された触媒領域を規定するヌクレオチドは、その３’末端に配列ＮＣＣＡを含有する。
本発明はまた、同一かまたは異なる前もって決定された標的配列を標的とする、同一かまたは異なる保存された触媒領域を有する多重化合物またはリボザイムに関する。この実施態様において、天然に存在しない合成オリゴヌクレオチド化合物は、同一もしくは異なる２以上のドメインを含み、夫々のドメインは、保存された触媒領域を定義する配列を有するヌクレオチドと、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の所定の標的配列とハイブリダイズできる配列を有するヌクレオチドとを含む合成オリゴヌクレオチド化合物。この化合物はまた、ＲＮＡウイルスのパッケージング配列内の、このオリゴヌクレオチド化合物と同一かまたは異なってもよい、所定の配列とハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸化合物に対して共有結合していてもよい。
１つの好適な実施態様において、ヌクレオチドは、ＭｏＭＬＶの２４３、２７４、３６６または５５３標的配列、およびＨＩＶ Ｐｓｉパッケージング部位中の部位７４９とハイブリダイズすることができる。このオリゴヌクレオチド化合物はさらに、ＲＮＡウイルスゲノムの異なる遺伝子に共有結合され、これを標的とする、少なくとも１つのさらなる合成の非天然オリゴ化合物またはアンチセンス分子を含んでもよい。ＲＮＡウイルスがＨＩＶである場合に、ＨＩＶゲノムの異なる領域は、長末端反復配列（long terminal repeats）、５’非翻訳領域、スプライス供与−受容部位、プライマー結合部位、３’非翻訳領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはｔｅｖ領域よりなる群から選択されてよい。
好適には、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、ＭｏＭＬＶの２４３、２７４、３６６または５５３標的部位またはこれらの組合せ、およびＨＩＶ Ｐｓｉパッケージング部位の部位７４９とハイブリダイズすることができ、そして第２の追加化合物のヌクレオチドは、ＨＩＶ ｔａｔ領域の５７９２、５８４９、５８８６、または６０４２標的部位またはこれらの組合せとハイブリダイズすることができる。追加の標的は、ＨＩＶゲノム内（表III）（配列番号４〜７）、特にｔａｔ配列内およびｐｓｉパッケージング領域（ＨＩＶ−１ ＳＦ２）636 GUGGC GCCCG AACAG GGACG CGAAA GCGAA AGUAA AACCA GAGGA GCUCU CUCGA CGCAG GACUC GGCUU GCUGA AGCGC GCACA GCAAG AGGCG AGGGG CGGCG ACUGG UGAGU ACGCC AAUUU UUGAC UAGCG GAGGC UAGAA GGAGA GAGAG AUGGG UGCGA GAGCG 805（すなわち表III）に存在してよい。本明細書で使用された具体的なリボザイム配列は、Ｒｚ−２、Ｒｚ−ＭおよびＲｚ−ψである。抗ＨＩＶリボザイム配列：
Ｒｚ−２（単一抗ｔａｔ）
TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC；
Ｒｚ−Ｍ（多重抗ｔａｔ）
CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAA；
Ｒｚ−ψ（単一抗ＨＩＶψ）
GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG。
リボザイムによるＨＩＶ ＲＮＡの切断は、有用な方法になりうる。治療上、これは幾つかの重要な性質を有する：
ｉ）特異性、
ii）比較的多数の可能性ある部位を標的とする能力、
iii）細胞に対する毒性の欠如、
iv）リボザイム分子の代謝回転、
ｖ）適用可能な導入方法の多様性および
vi）種々の製造方法の可能性：ａ）化学合成（短い分子であるため）、ｂ）インビトロ転写による生化学的産生、およびｃ）組み込んだ構築物からのプロモーターに推進されるインビボ産生。
本発明は、ＨＩＶ複製を阻害する抗パッケージング部位（Ｐｓｉ）リボザイムを利用する。この活性は、レベルＡ、Ｅ、ＦおよびＧで作用するであろう。この部位の切断は、以下の阻害効果を及ぼしうる：ｉ）標的細胞へのウイルスの侵入；ii）ウイルスＲＮＡの産生；iii）ウイルス蛋白へのウイルスｍＲＮＡの翻訳；およびiv）ウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージング。
ＰＳＩパッケージング配列
Ｐｓｉパッケージング配列は、ウイルス粒子へのウイルスＲＮＡの特異的なキャプシド包み込みに必要なシス作用性ウイルスゲノム配列である（Aronoffら,1991）。ウイルス粒子へのＲＮＡのパッケージングは高い特異性を示し、これはＰｓｉ部位によるものであるらしいことが示された。Ｍｏ−ＭＬＶとＨＩＶ−１の両方に関してＰｓｉパッケージング部位の位置は、機能欠失（すなわち、ある配列を除去してウイルスＲＮＡのパッケージング過程が継続するかどうかの観察）により同定された。この配列は、レトロウイルスの５’非翻訳領域内に存在し、パッケージングされないＲＮＡには存在しないことが示された。本発明に関して、ＲＮＡがパッケージングされるものとして容易に認識されるようにするには、パッケージング配列は露出しており利用しやすくかつ認識することができなければならないと我々は推論した。Ｍｏ−ＭＬＶとＨＩＶ−１パッケージングシグナル両方の検討により、各場合に保存された安定な２次構造が存在することが判った（Alfordら,1992およびHarrisonら,1992）。我々の考えでは、これらの特徴によりＰｓｉパッケージング部位はリボザイム作用の有力な標的になっている。レトロウイルスパッケージング配列に対するアンチセンスを使用する以前の検討により、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）の複製はトランスジェニック動物ではＰｓｉ配列による妨害のため阻害されうることが判った（Hanら,1991）。
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）
Ｍｏ−ＭＬＶは、癌遺伝子を含まないマウスの野生型レトロウイルスである（図３）（Teichら,1985）。これは、挿入突然変異のため長い潜伏期でマウスに白血病を引き起こす。我々は抗ウイルスリボザイムの有効性の原理を立証するための第１段階としてＭｏ−ＭＬＶを使用した。Ｍｏ−ＭＬＶは、その複製が図１に略述した線にそって進行し、パッケージングがＰｓｉパッケージング部位により行われる典型的なレトロウイルスである。本発明の１つの実施態様において、Ｐｓｉパッケージング部位を標的とし、発現ベクター内でクローン化された抗Ｍｏ−ＭＬＶリボザイムを、組織培養でウイルス産生を低下させるその能力に関して試験した。
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の活性成分であるＨＩＶ−１は、Ｔリンパ球の細胞死を誘導する（McCune,1991；Levy,1993）。これらの細胞は免疫応答に極めて重大に寄与している。抗ＨＩＶ法が有効であるためには、これらの細胞の喪失のため免疫系が機能しなくなる前にウイルスの複製を実質的に低下させるかまたは阻害することが必須である。現在ＡＩＤＳの有効な治療法はない。しかし、ウイルス力価を低下させることにより疾患の進行が遅延しさらに停止しうることが期待される。抗ＨＩＶパッケージング配列リボザイムの開発は、ウイルス産生を実質的に阻害し、さらには停止させる実行可能な方法であると考えられる。
リボザイムを発現する細胞においてｇａｇ−ＲＮＡとｐ２４のレベルを低下させることができることが証明された抗ＨＩＶ−ｇａｇリボザイムが既に開発されている（Sarverら,1990）。インテグラーゼ蛋白の翻訳を防止するため大腸菌においてＨＩＶ−１インテグラーゼＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムが開発されている（Sioudら,1991）。ＨＩＶの５’非翻訳領域であるＵ５またはｔａｔにおいてＨＩＶ−１ ＲＮＡも切断するリボザイムが、Ｔ細胞をＨＩＶ−１から保護することができることを示した研究もある（Dropulicら,1992；Ojwangら,1992；Loら,1992；およびWeerasingheら,1991）。
本発明の別の好適な実施態様において、Ｐｓｉパッケージング部位を標的とする抗ＨＩＶリボザイムが、抗Ｍｏ−ＭＬＶ構築物と同じ発現ベクター内でクローン化された。これらの構築物も、組織培養でウイルス産生を低下させる能力に関して試験した。
発現構築物の導入
標的細胞中に発現構築物を導入する主な手段は、電気穿孔法、リポゾーム介在およびレトロウイルス媒介性遺伝子導入を含むトランスフェクションである。
定義
本明細書で使用される「Ｐｓｉパッケージング部位」とは、ウイルス粒子へのウイルスＲＮＡのキャプシド包み込みに関与する５’ＬＴＲに直接隣り合う領域を意味する。
本明細書で使用される「相補的アーム」は、標的ＲＮＡの特異的な領域に結合させることのできるコアハンマーヘッドリボザイムに付加された配列である。
本明細書で使用される「リボザイム」は、標的ＲＮＡを切断することができる、ハンマーヘッドヘアピン、肝炎デルタ、ＲＮＡａｓｅＰ、グループＩイントロンまたはグループIIイントロンのリボザイムであってよい。ハンマーヘッドリボザイムは、HaseloffとGerlach（Haseloffら,1988）の論文の主題であり、多くの研究室により続いて論文が出た。
説明
本発明は、病原物質が、そのゲノム物質としてＲＮＡを有し、このＲＮＡがウイルス粒子にパッケージングされる、ウイルス疾患、特にＡＩＤＳの治療に関する。本方法は、ウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに必要な認識配列であるＰｓｉパッケージング部位でウイルスＲＮＡを破壊することにより、ウイルスの複製を阻害するものである。この部位の切断は、ｉ）標的細胞へのウイルスの侵入、および続いての宿主ゲノム中へのプロウイルスの組み込み、ii）ウイルスＲＮＡの産生、iii）ウイルス蛋白へのウイルスｍＲＮＡの翻訳、およびiv）ウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングに阻害効果を有する。
本発明の１つの実施態様において、目的のヌクレオチド配列を含む幾つかの発現構築物が提供される。好適な発現構築物において、リボザイム発現構築物は、Ｍｏ−ＭＬＶまたはＨＩＶ−１感染細胞である細胞に導入されると、リボザイムを取り巻く相補的アームのためＭｏ−ＭＬＶまたはＨＩＶ−１ ＲＮＡに結合することができるＲＮＡの転写を指令することができるリボザイム発現構築物が提供される。これらの相補的アームは短く、ＲＮＡを切断してＲＮＡ分子の作用を妨害するのはリボザイム配列の存在である。
本発明は幾つかの方法で試験された。１セットの実験は、インビトロのＭｏ−ＭＬＶウイルスＰｓｉパッケージング配列のリボザイム介在切断と、Ｍｏ−ＭＬＶ複製のインビボの抑制の間の正の相関を証明した。この結論に到達するには下記３つの主要な段階があった：
ｉ）リボザイム介在インビトロ切断の証明。ii）Ｍｏ−ＭＬＶ感染細胞へのリボザイム含有構築物のトランスフェクション。iii）ａ）構築物の組み込み、ｂ）リボザイム構築物の発現、ｃ）ウイルス複製のレベルに及ぼすリボザイム構築物発現の影響を証明するための種々の測定。
ＨＩＶに関して、同様な段階は以下のとおりであった：
ｉ）リボザイム構築物の設計と作成、ii）ヒトＴリンパ球細胞株へのリボザイム含有構築物のトランスフェクション、iii）ａ）構築物の組み込み、ｂ）リボザイム構築物の発現、ｃ）ウイルス複製のレベルに及ぼすリボザイム構築物発現の影響を証明するための種々の測定。
本発明は、以下の両方にウイルス抑制剤として作用する：ｉ）ウイルスが標的細胞に侵入する際にウイルスＲＮＡを捕捉することにより、非感染細胞へのウイルスの侵入を阻害する；およびii）感染細胞を出る機能性ウイルスのレベルを低下させる。両方の場合に、これはウイルスＲＮＡを切断する（第１の場合には侵入時点で、そして第２の場合には細胞を出る時点で）。後者の場合に、切断は、ウイルスおよびｍＲＮＡの両方を切断することによりＲＮＡレベルを低下させる。Ｐｓｉパッケージング部位の特異的な切断もウイルスＲＮＡのパッケージングを阻害する作用を有する。
抗ウイルスリボザイム作用の標的を選択するために幾つか考慮したことがある。本発明のために使用した評価基準は、以下のとおりであった：
ｉ）この標的は機能的に重要なものである必要がある。ii）標的領域内で異なるＨＩＶ−１単離体間の配列の保存の程度が高くなければならない。iii）ハンマーヘッドリボザイムの場合には、ＧＵＣまたはＧＵＡのようなリボザイム標的配列が、好適にはその配列または関連するトリプレットＧＵＵ、ＣＵＣなどの中に存在する（Perrimanら,1992）。iv）標的配列は容易に利用可能であるべきであり、例えば、広範囲の２次構造を欠いている（Rossiら,1992）。
Ｐｓｉパッケージング部位は、上記評価基準に合致しており、リボザイムによる切断の標的として選択された。この部位は、ｉ）レトロウイルス複製サイクルにおける必須の機能を有し、ii）比較的利用しやすく、パッケージングが起こるために他の成分に対して認識され利用しやすくなければならないＲＮＡ上の部位であり、そしてiii）同じウイルスの異なる株間で保存された性質を有する。
Ｍｏ−ＭＬＶとＨＩＶの両方の異なる株で各ウイルスのＰｓｉパッケージング領域における配列と構造に強い保存性があることが観察された。ＨＩＶとＭｏ−ＭＬＶのパッケージング部位間に構造または配列の明らかな保存性はないが、各ウイルスのＰｓｉ部位の同一の機能のため、これらに類似性があると推測することは合理的である。ウイルスＲＮＡの２次構造が検討され、リボザイム作用に利用可能であると考えられたＰｓｉ配列の部位が選択された。これらはループ領域、すなわちＲＮＡの一本鎖の塩基対非形成領域にある。Ｐｓｉパッケージング配列の塩基対非形成領域の位置を見つけるために、ズーカー（Zuker's）のFOLDRNAプログラムを使用した。このリボザイムにはこれらの部位を標的とするよう設計された。選択された部位には、ＧＵＣ塩基配列も存在した。
本発明に使用された構築物は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏr）の３’非翻訳領域中に挿入したリボザイムを利用した。この基本的な構築物を図４に示す。このような構築物により、組み込みと発現を評価することができた。前者はサザン解析により測定され、後者はＧ４１８毒性に対する細胞耐性とＲＮＡｓｅ保護測定法により測定された。利用した設計物のさらなる利点は、より大きなｎｅｏr遺伝子メッセンジャーの３’末端にある小さなリボザイム配列とのキメラＲＮＡが、細胞中でリボザイムを安定に維持する作用を有するらしいことである。安定性なしにはリボザイムの効果は非常に小さいため、後者は極めて重要な点である。
考察
本発明は、ヒトを含む動物をレトロウイルスにより引き起こされる疾患から保護するためにリボザイムを使用する方法の根拠を提供する。本発明の基本原理は、より大きな遺伝子に標的レトロウイルスのパッケージング部位に対するリボザイムを組み込むことである。この担体遺伝子は、選択性（本出願のように）または非選択性であってよい。この大きな担体遺伝子の発現は、より安定なキメラリボザイムＲＮＡ分子を提供する。このＤＮＡ構築物を、感染していない細胞集団にトランスフェクションして細胞を保護するか、またはウイルスに感染した細胞集団に導入してウイルス力価を低下させることができる。さらなる実施態様において、このリボザイム発現構築物は、レトロウイルス媒介性遺伝子導入により導入効率を上昇させることもできる。本発明の第３の実施態様は、抗パッケージング部位リボザイムを含むレトロウイルスである。このレトロウイルスベクターがＭｏＭＬＶに基づくならば、ＨＩＶのパッケージング部位を標的とするリボザイムは、２つのレトロウイルスの配列の相違のためＭｏＭＬＶパッケージング部位を切断しないであろう。
治療的には本出願は、この構築物のエクスビボでのＴリンパ球への導入、またはエクスビボでの造血幹細胞への導入に関する。１つの好適な研究法は、両種向性（amphotropic）Ｍｏ−ＭＬＶのようなレトロウイルスベクターによりリンパ球または幹細胞中にリボザイム構築物を組み込むことであろう。造血前駆細胞と真の幹細胞は、これらが骨髄に存在するかまたは末梢血に移動することができるため、遺伝子治療の有力な標的である。前駆細胞は、骨髄系細胞およびリンパ系細胞の両方に分化し、真の幹細胞は、全ての細胞系統の細胞に分化する。治療は、リボザイムを含有するＨＩＶ感染造血系と幹細胞を破壊する放射線照射を行い、次に患者に注入することを伴う。その結果、患者の細胞はＨＩＶに抵抗性になる。
本発明はまた、転写により上述の化合物になるヌクレオチド配列を含有するＲＮＡまたはＤＮＡまたはこれらの組合せを含むトランスファーベクターに関する。このトランスファーベクターは、ＨＩＶの長末端反復配列（ＬＴＲ）、アデノウイルス関連トランスファーベクター、ＳＶ４０プロモーター、Ｍｏ−ＭＬＶ、または両種向性を示すレトロウイルスベクターであってよい。このトランスファーベクターは、このオリゴヌクレオチド化合物をインビボで特定の臓器または細胞、あるいは細胞内の特定の領域に指向させる配列をさらに含んでよい。細胞の特定の領域に局在する例は、パッケージングシグナルの使用がある（Sullengerら,1993）。本発明はまた、適切な担体中に上述の化合物またはトランスファーベクターを含有する組成物に関する。担体は、薬剤学的に、獣医学的に、または農学的に許容しうる担体または賦形剤であってよい。この組成物はさらにＴＡＲデコイ（decoy）、ポリＴＡＲまたはＲＲＥデコイを含んでもよい。
本発明のＤＮＡ配列の原核生物または真核生物宿主中での産生のため、本発明のプロモーター配列は原核生物、真核生物またはウイルス由来であってよい。適切なプロモーターは、誘導可能、抑制可能、またはより好適には、構成的なものである。適切な原核生物プロモーターは、Ｔ４ポリメラーゼを認識することができるプロモーター（Malik,S.ら,J.Molec.Biol.195:471-480(1987)；Hu,M.ら,Gene 42:21-30(1986)）、Ｔ３、Ｓｐ６、およびＴ７（Chamberlin,Mら,Nature 228:227-231(1970);Bailey,J.N.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80:2814-2818(1983);Davanloo,P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:2035-2039(1984)）；バクテリオファージラムダのＰRおよびＰLプロモーター（バクテリオファージラムダ（The Bacteriophage Lambda）,Hershey,A.D.編,Cold Spring Harbor Press,コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1973)；ラムダII（Lambda II）,Hendrix,R.W.編,Cold Spring Harbor Press,コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1980)）；大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、およびｌａｃＺプロモーター；バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター；ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどを含む。原核生物プロモーターは、Glick,B.R.（J.Ind.Microbiol. 1:277-282(1987)）；Cenatiempo,Y.（Biochimie 68:505-516(1986)）；Watson,J.D.ら（J.Mol.Appl.Gen. 1:273-288(1982)）による総説がある；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight,S.,Cell 31:355-365(1982)）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist,C.ら,Nature(London)290:304-310(1981)）および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Johnston,S.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:6971-6975(1982);Silver,P.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:5951-5955(1984)）。
感受性のある真核細胞または完全な動物のレトロウイルス感染を阻害するのに使用するベクターの調製のため、上述のように真核生物プロモーターを利用しなければならない。好適なプロモーターと、ポリアデニル化シグナルのような追加の制御要素は、レトロウイルスの感染を阻害すべき細胞の型において最大の発現が得られるようなものである。すなわち、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスだけでなく、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２は全てリンパ球に感染し、そしてリボザイム構築物単独、またはこれらのウイルスの１つ（またはそれ以上）のパッケージング配列に相補的なアンチセンスＲＮＡとの組合せで充分に発現させるために、転写調節単位（プロモーターとポリアデニル化シグナル）が造血細胞、特にリンパ球（またはリンパ組織）で充分な発現を可能にするように選択される。以下に例示されるように、好適なプロモーターは、場合により成長ホルモンポリアデニル化シグナル（３３）と連結して使用される、サイトメガロウイルス極初期プロモーター（３２）、およびリンパ親和性レトロウイルスでの使用のための、モロニー−ＭｕＬＶ ＬＴＲのプロモーターである。モロニー−ＭｕＬＶ ＬＴＲプロモーターの望ましい特徴は、レトロウイルスと同じ組織指向性を有することである。ＣＭＶプロモーターは、リンパ球で発現される。他のプロモーターは、ＶＡ１およびｔＲＮＡプロモーターを含む。メタロチオネインプロモーターは、誘導性で利点を有する。ＳＶ４０初期プロモーターは、骨髄細胞でインビトロで高レベル発現を示す。
本発明はまた、（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組合せを含むトランスファーベクター中に化合物に対応するヌクレオチド配列を連結し；（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼにより工程（ａ）のヌクレオチド配列を転写し；そして（ｃ）化合物を回収する工程を含む、化合物を製造する方法に関する。
本発明はまた、上述の化合物であるか、または転写によりこれを与えるヌクレオチド配列を含む、原核生物または真核生物宿主細胞に関する。この細胞は、動物細胞、前駆細胞に分化する造血幹細胞、全造血細胞系統のさらに成熟した細胞、および完全に成熟した細胞、全造血細胞系統の成熟した細胞に分化する前駆細胞、特定の造血細胞系統に分化することが決まっている前駆細胞、Ｔリンパ球前駆細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、骨髄系前駆細胞、または単球／マクロファージ細胞であってよい。
本発明はまた、造血幹細胞、前駆細胞、分化の決まった前駆細胞、Ｔリンパ球前駆細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、骨髄系前駆細胞、または単球／マクロファージ細胞を保護するための上記化合物の使用に関する。さらに、上記トランスファーベクターを造血細胞に導入し、細胞をＨＩＶに抵抗性にして、これによりＨＩＶを抑制／治療またはこれに対して保護することを含む、患者においてＨＩＶを抑制／治療またはこれに対して保護する方法に関する。導入はエクスビボで行い、細胞は、骨髄切除（myeloablation）をしたか、またはしない自己由来、または異種由来の細胞である。本発明の１つの実施態様において、Ｍｏ−ＭＬＶ Ｐｓｉパッケージング部位内の異なる部位を標的として３つの単一のハンマーヘッドリボザイムと１つの多重ハンマーヘッドリボザイムを設計し、ＨＩＶ Ｐｓｉパッケージング部位内の部位を標的として１つのリボザイムを設計した（図２参照）。作用の原理を決定するレトロウイルスの例としてＭｏ−ＭＬＶを選択した。これらの原理は、ＨＩＶを含む他のレトロウイルスにも適用されるであろう。試験はＨＩＶ−１についても行った。
本発明において、非ヒト動物とその子孫は、非天然オリゴヌクレオチド化合物を発現するかまたは保持する少なくとも幾つかの細胞を含有する。トランスジェニック非ヒト動物は、その生殖細胞と体細胞の全てが、その動物、またはその祖先に対して、米国特許第4,736,866号、5,175,383号、5,175,384号、または5,175,385号に記載されたように胚形成期に導入された、発現可能な非天然オリゴヌクレオチド化合物を含有している。以下も参照のこと（Van Brunt,1988；Hammer,1985；Gordonら,1987；Pittiusら,1988；Simonsら,1987；Simonsら,1988）。
本発明はまた、上述の非天然オリゴヌクレオチド化合物で細胞を処理することを含む、ウイルス感染に対して細胞を抵抗性にする方法を含む。好適には、この処理はエクスビボで行われる。さらに、本明細書で使用されるアンチセンスとリボザイムという用語は、ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ペプチド、核酸などで修飾した化合物も含む。これらはエクスビボの処理または局所処理に使用される。
本発明の非天然オリゴヌクレオチド化合物の有効量は、局所適用用のクリーム、無菌注射用組成物、または他の非経口投与用組成物などの投薬形中に、一般に約１nM〜約１mM濃度を含む。局所用処方に関しては、約５０μM〜約５００μMの非天然オリゴヌクレオチド化合物を使用することが一般に好適である。ホスホロチオ酸塩またはメチルホスホン酸誘導体のような化学修飾した基を含む誘導体である、ヌクレオチド誘導体を含む化合物は、ナノモル濃度で活性であろう。このような濃度は、毒性を回避するためにも使用することができる。
本発明の化合物を利用する疾患の治療に関する治療方針は、一般に（Chrisley,1991）のアンチセンス出版目録に記載されたようなアンチセンス法に関するものと同じである。特に、使用される化合物の濃度、投与方法および投与様式、および関係する処方は、アンチセンス適用に使用されるものと同じであってよい。
本明細書に使用される「有効量」とは、ある病状の哺乳動物に目的の効果と、投与方法を提供する量を意味する。適切な希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体と一緒に有効量を含む組成物は治療に有用である。このような組成物は、液体か、または凍結乾燥か他の方法で乾燥した処方であり、種々の緩衝化剤含量（例えば、トリス−ＨＣＬ、酢酸塩リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、アルブミンまたはゼラチンのような表面への吸収を防止する添加剤、界面活性剤（例えば、ツイン２０、ツイン８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、増量剤（bulking substances）または張度調節剤（tonicity modifiers）（例えば、ラクトース、マニトール）、非天然オリゴヌクレオチド化合物へのポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）の共有結合、金属イオンとの錯体化、またはポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドンなど）の粒状調製物中または表面上への本物質の組み込み、またはリポゾーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラストへの組み込みを含む。このような組成物は、オリゴヌクレオチドの物理的状態、溶解性、安定性、インビボの放出速度、インビボのクリアランス速度に影響する。抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（すなわち、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；蛋白（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；および糖アルコール（例えば、マニトール、ソルビトール）のような他の成分も場合により添加してもよい。可能な徐放性組成物は、親油性貯蔵物（例えば、脂肪酸、ロウ、油）を含む。ポリマー（例えば、ポリオキサマー（polyoxamers）、またはポリオキサミン）でコートした粒状組成物や、組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対する抗体に結合した、または組織特異的受容体のリガンドに結合した非天然オリゴヌクレオチド化合物も本発明に包含される。
さらに、特異的ヌクレオチド配列を、本発明の非天然オリゴヌクレオチド化合物を標的とするため、核、プラスチド、細胞質または特定の型の細胞に添加してもよい。本発明の組成物の他の実施態様は、粒子型保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または非経口、肺内、鼻内および経口を含む種々の投与経路の浸透増強剤を組み込む。
適切な局所用処方は、ゲル剤、クリーム剤、液剤、乳剤、炭水化物ポリマー、その生物分解性マトリックス；蒸気、ミスト、エーロゾル、または他の吸入剤を含む。非天然オリゴヌクレオチド化合物は、ウエハース（wafer）、ロウ、フィルムまたはチューイングガムを含む固体担体中にカプセル化してもよい。表皮層の通過を助ける浸透増強剤も当該分野で公知であり、ジメチルスルホキシドおよびグリコールを含むが、これらに限定されない。
リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド誘導体または修飾体は、当該分野で周知であり、市販のＤＮＡ合成機に適合可能である（Saenger,1984参照、特に159-200ページ）。ヌクレオチドは、塩基、糖および一リン酸基を含む。従って、ヌクレオチド誘導体、置換体、または修飾体は、塩基、糖、または一リン酸のレベルで製造することができる。
多数の修飾塩基が天然に見い出され、広い範囲の修飾塩基が合成的に製造されている（Saenger,1984；および生化学のＣＲＣハンドブック（CRC Handbool of Biochemistry））。適切な塩基は、イノシン、５’−メチルシトシン、５’−ブロモウラシル、キサンチン、ヒポキサンチンおよび他のこのような塩基を含む。例えば、アミノ基と環窒素がアルキル化（例えば、環窒素または炭素原子のアルキル化（例えば、グアニンのＮ1およびＮ7、およびシトシンのＣ5））されてもよく；チオケト基によるケトの置換；炭素−炭素二重結合の飽和、およびシュードウリジンのＣ−グリコシル結合の導入がある。チオケト誘導体の例は、６−メルカプトプリンおよび６−メルカプトグアニンである。
塩基は、ハロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニトロ、フェニルなどのような種々の基で置換されてよい。塩基は、他の化学物質（例えば、酸性または塩基性基）を組み込むかまたは組み込まない、アミノ酸側鎖またはリンカーのような他の化学種で置換されていてもよい。例えば、グアニン（Ｇ3）は、チロシン、および同様にヒスチジンで置換されたシトシン（Ｃ１）またはアデニン（ａ１）で置換されていてもよい。
ヌクレオチドの糖残基も、当該分野で公知の方法により修飾されてよい（Saenger,1984）。本発明は、このような修飾が化合物の切断活性を破壊しない限り、ヌクレオチドの糖残基への種々の修飾を包含する。修飾糖の例は、第二級ヒドロキシル基のハロゲン、アミノまたはアジド基による置換；２'−メチル化；Ｏ2'−ヒドロキシルがグリコシルＣ1に対してｃｉｓ配向したような配座変異体、アラビノヌクレオシドを与えるような−Ｎ結合、およびα−ヌクレオシドを与えるＣ1炭素の配座異性体などを含む。さらに、ヘキソース（例えば、グルコース）、ペントース（例えば、アラビノース）のような非リボース糖を使用することができる。
ヌクレオシドのリン酸残基も、当該分野で公知のとおり誘導体化または修飾することができる。例えば、窒素、硫黄または炭素誘導体により酸素を置換して、各々ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホジチオール酸、およびホスホン酸を与える。窒素、硫黄または炭素誘導体による酸素の置換は、架橋または非架橋位置で行われてよい。アンチセンスオリゴヌクレオシドに関する研究から、恐らく細胞受容体との会合のため、ホスホジエステルとホスホロチオ酸誘導体が効率的に細胞に導入される（特に長さが短い時に）ことは充分に確立されている。メチルホスホン酸は、これらが電気的に中性であるため、細胞に恐らく容易に取り込まれる。
リン酸残基は、ペプチド核酸により完全に置換されていてもよい（Hanveyら,1992；Nielson,1991；およびEgholm,1992を参照）。他の置換も当業者には公知であり、例えば、シロキサン架橋、炭酸架橋、アセトアミド酸（acetamidate）架橋、カルバミン酸架橋、チオエーテル架橋などがある（UhlmannとPeymann,1990）。
以下の実施例は、特許請求した発明の説明のために与えられる。本発明は、以下の詳細な実験の項で説明される。これらの項は、本発明の理解を助けるために与えられるものであり、その後に続く請求の範囲に述べる本発明をなんら制限する意図はなく、制限すると解釈されてはならない。
実施例１
Ｍｏ−ＭＬＶ Ｐｓｉパッケージ配列のリボザイムに触媒されるインビトロ開裂
ターゲット部位が実際に開裂可能であることを示すために、細胞培養中でリボザイムテストを行う前にインビトロで開裂反応を実施した。
Ｍｏ−ＭＬＶパッケージ領域で、ＧＵＣ塩基の存在およびズッカーのＦＯＬＤＲＮＡプログラム(Zuker et al.,1981)から提案されるＲＮＡ二次構造内にある部位のアクセス可能性によって、４つの部位を選択した。該部位は、ウイルスの転写物の５’末端からのヌクレオチドの距離を基に、２４３、２７４、３６６、および５５３と命名された（図２）。これらヌクレオチドの位置は、ＲＮＡ腫瘍ウイルスに記載されている通りである（Coffin,1985）。２種類のリボザイムがデザインされた。その内の一つは、三つの部位２４３、２７３、３６６の個々にターゲットされた、１２ヌクレオチドの長さの腕をもった３つの単一リボザイムであり、他の一つは、４つの部位の全てにターゲットされ、各ターゲット部位間に挟まれた配列の長さの腕を持つ多重リボザイムである。該部位および全体のデザインは、図２に示されている。
単一リボザイムは、張り出したＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ末端を持つ人工の二本鎖挿入物を、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中にクローニングすることによって構築された。得られたプラスミドは、ｐＧＥＭ２４３，ｐＧＥＭ２７４、ｐＧＥＭ３６６であった。多重リボザイムは、標準インビトロ突然変異プロトコールの変法によって構築された（Warrilow et al.,1992）。このプラスミドは、ｐＧＥＭ−Ｍ７と命名された。クローニングの成功および配列の完璧さは、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
ｐＭＬＶ−１（Coffin,1985）から得られるＭｏ−ＭＬＶのＢａｌＩーＢａｌＩ断片中に存在するＰｓｉパッケージ配列が、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター中にクローン化され、インビトロリボザイム開裂用の基質として転写された。リボザイムまたは基質を生成させるためのランオフ転写用混合物(run-off transcription mixture)（５０μｌ）は、１μｌの直線化されたプロテナーゼＫで処理したＤＮＡテンプレート、３０ｍＭのジチオトレイトール、４００μＭの各ｒＮＴＰｓ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭスペルミジン、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１μｌの[a-32Ｐ]-ＵＴＰ(400-800Ci/m mole,10m Ci/ml)，１ユニット  ＲＮａｓｉｎ、および１０ユニットのＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を含んでいた。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＲＮａｓｅを含まない１０ユニットのＤＮａｓｅ（Promega）を加え、該混合物を３７℃で１５分インキュベートした。フェノール・クロロホルムで抽出した後、ＲＮＡ転写物を０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５体積のエタノールを加えることによって沈澱させた。開裂反応用に、リボザイムおよび基質（１：１モル比率）を８０℃で２分間予備インキュベーションし、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在下において、３７℃で３０分インキュベーションした。反応を、同量の停止混合物（８Ｍ尿素、５０ｍＭ ＥＤＴＡ,０．０５％ブロムフェノール・ブルー、および０．０５％キシレンシアノール）を加えて停止させ、８Ｍ尿素を含む変性６％のポリアクリルアミド・ゲル上で分析し、オートラジオグラフィーにかけた。
Ｍｏ−ＭＬＶプロウイルス・パケージング配列の別の部位をターゲットする加工リボザイム(engineering ribozymes)は、目的のＲＮＡを選択された部位でインビトロ開裂することがわかった
リボザイム構築物の大半は、32Ｐで標識されたプサイ（Ｐｓｉ）転写物を32Ｐで標識されたリボザイムＲＮＡと共に、約等モル量でインキュベーションすると、温和な物理的状態（３７℃、１０ｍＭ Ｍｇｃｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-Ｃｌ，ｐＨ７．５）下で基質の有効な開裂を導いた。これらの消化物の代表的な例を図６に示す。Ｒｚ２７４およびＲｚ３６６によって産生された開裂プサイ断片のサイズは、開裂予想部位の位置と一致しており、夫々、６２ｎｔ＋４７３ｎｔおよび１５４ｎｔ＋３８１ｎｔのバンドとなって得られた。多重リボザイム（Ｒｚ−Ｍ７）は、いくつかの部分開裂断片と同様に予想通り４断片（５０ｎｔ，９２ｎｔ，１８７ｎｔ、および２４０ｎｔ）を産生した（図３）。Ｒｚ２４３については、３７℃では、視認可能な開裂はなく、５０℃では弱い開裂があり、適合サイズの断片が産生した（データ表示せず）。リボザイム２４３を除いて、これらの結果によって、部位特異的リボザイムに媒介された開裂が有効に行われることがわかった。
実施例２
抗Ｍｏ−ＭＬＶパッケージング部位プサイ（Ｐｓｉ）構築物
有効なインビトロ開裂を実証した後、加工リボザイムおよびＰｓｉパッケージング領域と相補的な長いアンチセンス配列を、サル・ウイルス（ＳＶ４０）初期プロモータと繋がったｎｅｏr遺伝子の３'の未翻訳領域にクローン化した（図４）。ｎｅｏr遺伝子は、燐酸化酵素をコードする原核生物の遺伝子であり、燐酸化によってネオマイシンまたはネオマイシン類似物Ｇ４１８を不活性化する。後者は、哺乳類細胞にとって有毒であり、外因性ｎｅｏr遺伝子が発現すると、細胞が生存できる。ｎｅｏr遺伝子と繋がったＳＶ４０プロモータを持つこの構築物は、哺乳類発現ベクターｐＳＶ２ｎｅｏ内にあり、図４に図式的に示される。
リボザイム挿入物およびアンチセンス対照(antisense control)を、平滑末端連結によってｎｅｏrの３’未翻訳領域のＳｍａＩ部位にクローン化した。得られたベクターは、それぞれｐＳＶ２４３，ｐＳＶ２７４，ｐＳＶ３６６，ｐＳＶＭ７およびｐＳＶａｓ  Ｐｓｉ（アンチセンス構築物）と命名された。
実施例３
構築物類の３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ産生細胞系へのトランスフェクション
種々のｐＳＶ２ｎｅｏ系構築物を、燐酸カルシウム・トランスフェクション・プロトコールを使用して、３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞中にトランスフェクトした（Chen et al.,1987）。陽性コロニーは、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下において、９〜１２日後に形成された。各構築物について、４〜７コロニーをクローニング・シリンダーを使用して単離した。これらのコロニーを成長させ、液体窒素中に貯蔵して、その後の分析に使用した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で１０〜１４日、選別した後、各構築物について、いくつかの安定したクローン細胞系が確立された。トランスフェクトされたＤＮＡ発現構築物の統合を確認するため、ゲノムＤＮＡをトランスフェクトされたいくつかの細胞系から調整し、サザン分析を行なった。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩを使用して、ゲノムＤＮＡを消化し、ｎｅｏr遺伝子プラス挿入物（リボザイムまたはアンチセンス）を含む断片を産生した。次に、構築物の存在を、ｎｅｏr特異的プローブを使用することで決定された。図７に示されたサザン分析からは、リボザイムおよびアンチセンス両構築物によってトランスフェクトされ、Ｇ４１８中で選択された細胞が、ｎｅｏr遺伝子プラス適宜なリボザイムまたはアンチセンス配列を含んでいることが明らかである。ｎｅｏrプローブによってハイブリダイズされたＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片のサイズは、各ケースにおいて予想されたサイズ、つまりｎｅｏr遺伝子単独では、１．３ｋｂ；ｎｅｏr＋単独リボザイムは、１．３８ｋｂ；ｎｅｏr＋多重リボザイムは、１．９８ｋｂ；ｎｅｏr＋アンチセンス配列は、１．８９ｋｂであることがわかった。
リボザイムまたはアンチセンス構築物の発現は、陽性トランスフェクト物中のＧ４１８耐性によって推定された。これは更に、トランスフェクトされた細胞中において、ＲＮａｓｅプロテクション分析を使用して調べられた。全ＲＮＡは、グアジニウム・チオシアネート法を使用していくつかの細胞系から抽出され、全ＲＮＡ２０μｇが32Ｐで標識された対応するリボプローブ（５ｘ１０4ｃｐｍ）によって、８０％のイオン除去されたホルムアミド、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．４、３００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液中でハイブリダイズされ、続いてハイブリダイズされたＲＮＡｓのＲＮａｓｅ消化を行った（５μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡおよび１０ユニット／ｍｌＲＮａｓｅＴ１）。リボザイムが発現されなければ、その時は相補的なリボプローブが結合することができない。ＲＮＡは、単一鎖のまま残り、ＲＮａｓｅで全部消化される。次に、反応混合物を、電気泳動により分離した。図８に示すように、全リボザイムおよびアンチセンス構築物が予想されたように発現されたことが分析によって明かとなった。プロテクトされた断片は、６５ｂｐ（単一リボザイム）；５８８ｂｐ多重リボザイム、５２４ｂｐ（アンチセンス）である。
実施例４
Ｍｏ−ＭＬＶ複製を抑制する構築物の能力
異なる構築物によってトランスフェクトされた安定な３Ｔ３ Ｍｏ−ＭＬＶクローン細胞系が確立された後、ＸＣプラーク分析を採用してＭｏ−ＭＬＶ複製のレベルを評価した。ＸＣ分析は、Ｍｏ−ＭＬＶのシンシチウム・プラーク分析法であり、これは、Ｍｏ−ＭＬＶ産生細胞がＸＣ細胞融合を引き起こすことができるかの観測に立脚して行われ、ターゲット細胞へのウイルスの結合を高めるために、感染の際に８μｇ／ｍｌのポリブレン（Sigma）を存在させ、それ以外は（gautsche et al.,1976）に記載されるようにＭｏ−ＭＬＶを適定した。異なるＭｏ−ＭＬＶ産生細胞系の培養物から得られた上澄み液を、感染前に一時間、８μｇ／ｍｌのポリブレンで予備処理した未感染マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に加えた。成長培地で２０時間インキュベーションを行った後、感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞をＸＣ細胞と共に、２ｘ２ｍｍ2の格子目を付けたプレート中で３〜４日間共培養した。該プレートを、次にメタノールで固定し、１％メチレンブルー  ＋  ０．１％ゲンチアン・バイオレットで染色し、顕微鏡でシンチニウム・プラークをスキャンした。分析が用量−反応曲線の直線部分内で確実に行われる様に、１プレート当たり３．５ｘ１０5細胞に、２倍に連続希釈したウイルスを感染させ、２４時間後にＸＣ細胞を混合させた培養基に移した。表１の結果は、３つの別々の実験から得られた。シンシチウム・プラーク形成を７４％から７７％阻害することが、ｐＳＶ２ｎｅｏベクター含有細胞に関連したＲｚ２７４，Ｒｚ３６６，Ｒｚ−Ｍ７およびＡｓ−Ｐｓｉを含む細胞から観察されたが、Ｒｚ−２４３含有細胞については、はっきりした阻害がみられなかった。これらのデータは、Ｒｚ２４３は、使用された条件下で有効に基質を開裂したようにはみえないというインビトロの開裂結果（図６）と一致する。
これらの抑制効果は、ウイルスＲＮＡドット・ブロテイングを使用して確認され、ＮＩＨ３Ｔ３ウイルス産生細胞の１６時間培養物から１ｍｌの上澄み液をマイクロ遠心分離機で遠心分離（12,000rpm,10分,4℃）することによって解明された。ウイルスＲＮＡは、８％ＰＥＧ8,000および０．５Ｍ ＮａＣｌ中で沈澱させた。フェノール・クロロホルム抽出後、アルカリ・トランスファー溶液中（Reed et al.,1985）で、ＲＮＡを陽電気荷電したナイロン膜上（ゼータ・プローブ、Bio-Rad）にブロットした。
ハイブリダイゼーションを、４２℃で一晩、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよびｐＧＥＭ−ＰｓｉのＴ７プロモータから転写された32Ｐで標識のリボプローブの中で行った。ウイルスＲＮＡは、ドット・シンチレーション計測によって定量された。リボザイムまたはアンチセンスでトランスフェクトされた３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞から得られた上澄み液中のウイルスＲＮＡが測定され、ｐＳＶ２ｎｅｏでトランスフェクトされた３Ｔ３−Ｍｏ−ＭＬＶ細胞から得られる上澄み液中のウイルスＲＮＡと比較された。図９および表２（Ｒｚ２４３発現細胞を除く）からもわかるように、リボザイムまたはアンチセンスを発現する全ての細胞系から産生されるウイルスＲＮＡの量は、シンシチア分析によって観測される量と同じ量だけ実質的に減少した。
これらのリボザイム構築物をＭｏ−ＭＬＶ感染細胞中にトランスフェクトした後、有効なインビトロ開裂を示すリボザイムのみが、インビトロのＭｏ−ＭＬＶ複製を抑制（約７０〜８０％）する能力を示した。これらの結果から、インビトロ開裂と、インビトロでのリボザイム媒介性ウイルス抑制との間に直接の相関関係があることが実証された。
先の実験は、ウイルス適定を減少させるために、ＨＩＶ・Ｐｓｉパッケージ配列上の部位にターゲットとするようにデザインされたリボザイムをさらに研究する基礎となった。
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実施例５
抗ＨＩＶパケジング部位構築物
ＧＵＡ部位が、リボザイム・ターゲテング用のＨＩＶ−１（ＨＩＶＳＦ２,Levy,1984）Ｐｓｉパケージング領域（ＨＩＶゲノムの５’末端よりｎｕｃ７３５からｎｕｃ７６５）の中からひとつ選ばれた。先の構築物について、合成リボザイム挿入物が、ｐＳＶｎｅｏベクターのｎｅｏr遺伝子の３’未翻訳部分におけるＳｍａ１部位に平滑末端連結によりクローンされた。クローニングの成功および配列の完全性は、ＤＮＡ配列決定により確認された。この構築物は、ｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉと命名された。図４は、該構築物の図を示している。
実施例６
ｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉ構築物のＴ−リンパ球へのトランスフェクション
抗ＨＩＶパケージング部位構築物ｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−Ｐｓｉを電気穿孔してＳｕｐＴ−１細胞、ヒトＴ−リンパ腫細胞系に導入した。指数関数的に成長する細胞を採収して、生存細胞の数を色素排除によって計測した。細胞をＰＢＳで洗浄し、生存細胞密度１ｘ１０7／ｍｌで、ＦＣＳは含まないが１０ｍＭデキストローゼおよび０．１ｍＭジチオスレイトールを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁した。０．４ｃｍキュベット（Bio-Rad）での電気穿孔につき、０．４ｍｌの細胞懸濁物および１０μｇのｐＳＶ−Ｒｚ−ＨＩＶ−ＰｓｉプラスミドＤＮＡを使用した。細胞およびＤＮＡ混合物を遺伝子パルサー（Bio Rad）からの単独パルス９６０μＦ、２００Ｖに供した。ショックを与えた後、キュベットを１０分間室温でインキュベーションして、細胞を１０％ＦＣＳを含む１０ｍｌのＲＰＭＩ培地に移し、インキュベータ中（５％ＣＯ2，３７℃）に載置した。電気穿孔後４８時間目に細胞が８００μｇ／ｍｌＧ４１８を補給した培地中で選別された。９〜１２日後、陽性コロニーを単離し、ＨＩＶプロテクション分析に使用されるクローン単離物として生育させた。
実施例７
リボザイム発現構築物のＨＩＶ感作に対する防御を与える能力の評価
ｐ２４抗原およびシンチウム形成の二つの分析が行なわれ、細胞培養中における抗ＨＩＶ−Ｐｓｉリボザイム構築物の有効性を評価した。ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原分析は、酵素免疫分析であり、これはマイクロウエル・ストリップ上に被覆されたＨＩＶ−核抗原に対するネズミモノクローナル抗体を使用している。ＨＩＶ−１シンチウム分析は、ＨＩＶ−１が融合を起こすことによってターゲットＴリンパ球と相互作用してシンシチア、つまり多くの核を含む大細胞、の形成に至るという観測に基づいている。クローナル・リボソーム構成物を発現する細胞＋コントロールにＨＩＶー１（ＳＦ２）を０．１から１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。２時間後、細胞を洗浄し、１０ｍｌの新しい培地を加えた。３〜４日毎にシンシチアおよび生存細胞両方の数を計測した。シンシチア形成に付いては、おおよそ２対数高い投与量が、リボザイムを含まないコントロールと同等の結果を得るために必要であった（表３）。加えて、リボザイムの存在はシンシチア形成を遅らせた（表４）。
別の実験プロトコールでは、細胞をペレットにし、ｐ２４分析用にその上澄み液のアリコットを採取した。代表的な結果を図１０に示す。この実験では、感作後２２日目までｐ２４レベルの阻害があった。ベクターのみを含む細胞と比較すると、感作後８〜１３日でｐ２４生産の８０％を超える阻害が、リボザイムを発現している細胞に見られたが、２２日目には、約６０％の阻害が観察された。
これらの結果は、ＨＩＶ複製が、Ｐｓｉパケージング部位に対するリボザイムをＴリンパ球に添加することによって阻害できるという証拠となった。
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実施例８
我々は、（ψターゲットに加えて）他のリボザイム構築物の有効性に付いても評価した。予期しなかったことだが、我々はＨＩＶ−１（Ｒｚ２）のｔａｔ遺伝子内の配列をターゲットにした単一リボザイムが、ＨＩＶ−１の複製を阻害するのに有効であることを発見した。我々はこのｔａｔ領域の配列保存性を調べ、この領域が異なるＨＩＶ−１単離物の中で高度に保存されていることを発見した（図１２）。これらは、ＨＩＶ−１リボザイム・ターゲット部位であるｔａｔ配列による最初の実験である。該文献での報告は図１３に示されるが、そこに記載されたｔａｔターゲット部位は、他の研究者の部位１（Crisell et al.,1993）および部位３（Lo et al.,1992  Zhou et al.,1992）によってターゲットされた。
要  約
ヒト抹消血液リンパ球（ＰＢＬｓ）は、多数の組替レトロウイルスによって形質導入された。このような組替レトロウイルスには、ＲＲｚ２、すなわちネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏr）の３’領域内に挿入されたＨＩＶ ｔａｔ遺伝子転写物をターゲットするリボザイムをもったＬＮＬ６系のウイルス；ＲＡＳＨ−５、すなわちヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモータの下流のＨＩＶ−１の５’リーダー領域に対するアンチセンス配列を含むＬＮＨＬ系ウイルス；Ｒ２０ＴＡＲ、すなわち、モロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）によって駆動されるＨＩＶ−１ ＴＡＲ配列の２０タンデム・リピートを持つＬＸＳＮ系ウイルスが含まれる。Ｇ４１８選別後、形質導入されたＰＢＬｓを、ＨＩＶ−１実験室株IIIBおよび一次臨床単離物で感作させた。結果は、異なるドナーから得られるＰＢＬｓが形質導入され得ることで、これがＨＩＶ−１感染に対する耐性を与えることを示した。構築物の各々については、対応する対照ベクターが形質導入されたＰＢＬｓに関連して、ｐ２４の抗原のレベルに約７０％減少が見られた。分子的分析では、レトロウイルスＬＴＲから得られる形質導入された全遺伝子が構成的に発現したが、アンチセンス構築物に対する内部ＨＣＭＶプロモータからの検出可能な転写物はみられなかった。ＰＢＬｓの形質導入および続くＰＢＬｓ中における導入遺伝子の発現は、（フローサイトメトリーで測定される）ＣＤ+／ＣＤ８+の表面の発現にも（［3Ｈ］チミジンの取込分析によって調べられる）細胞増殖にも影響を与えなかった。これらの結果は、これらの抗ＨＩＶ−１遺伝子の治療剤の使用可能性を示し、このＰＢＬ分析システムの予備臨床的価値を示す。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびその関連疾患の病原物体として確認されている（Barre-Sinoussi,F.et al.,1983;Gallo,R.C.et al.1984）。現在のところ、この疾患には適切な治療法がなく、ＨＩＶの複製を阻止する遺伝子学的操作を利用することが、ＡＩＤＳ治療の新規かつ有望なアプローチであるようだ。ＨＩＶ−１の複製という側面に介在する有望な遺伝子治療的アプローチには、リボザイム発現を利用して触媒作用で開裂を行ない、ＨＩＶ−１ＲＮＡを不活性化させること;アンチセンスＲＮＡ発現により、ＨＩＶ ＲＮＡの逆転写、プロセッシング、および翻訳を阻害すること；突然変異ＨＩＶ構造、または優性抑制遺伝子活性を持つ調節遺伝子を発現させること;およびＲＮＡデコイを発現させ、ＨＩＶ−１転写、プロセッシング、パッケージングを阻害すること；があげられる。
今までに公開された報告においては、レトロウイルス・ベクターが、導入遺伝子、遺伝子治療の抗ＨＩＶ−１薬剤を導入するための選ばれたデリバリー法であった。これらのベクターは、ＣＥＭ，ＳｕｐＴ１およびＭＯＬＴー４（Surver,N et al.,1990;Weerashingee,M et al.,1991;Yu,M.et al.1993;Yamanda,O.et al.,1994;Rhodes,A.and James W.1991;Sczakiel,G.et al.1992;Lisziewicz,J.et al.1991,1993;Trono,D.et al.1989;Malim,M.H.et al.1992）等の、ヒト造血Ｔリンパ球細胞系でテストされている。これらは、インビトロ分析用に無限の成長可能性を持つことをはじめとして、好ましい特徴をいくつか備えてはいるが、形質転換された細胞であるという欠点を有している。それ故、抗ＨＩＶ遺伝子治療剤の有効性を、抹消血液リンパ球（ＰＢＬｓ）等のヒト初代細胞(human primary cells)でテストする必要がある。これらの細胞にとって、ＨＩＶ感染の鍵となるターゲット細胞はＣＤ４+のサブ細胞集団であり、ＡＩＤＳ患者に主に欠けているは、この細胞集団である。しかしながら今の処、初代ＰＢＬ分析が抗ＨＩＶ遺伝子治療アプローチ用に使用されてきたという報告はない。
我々は、ｉ）リボザイム、アンチセンスおよびＲＮＡ・ＴＡＲデコイをはじめとする抗ＨＩＶ薬剤をテストし、ｉｉ）実験室および臨床的ＨＩＶ−１の単離物の両者を使用したＰＢＬ形質導入、Ｇ４１８選別、ＨＩＶ−１感作の条件を確立するために、ヒトＰＢＬｓについての包括的な研究を行なってきた。これらの実験で、ＨＩＶ−１ ｔａｔ遺伝子をターゲットするリボザイムを発現するレトロウイルス構築物；ＨＩＶ−１の５’リーダー配列に対して相補的なアンチセンス配列；または２０ＴＡＲ ＲＮＡデコイ；を初代ＰＢＬｓへ形質導入することにより、ＨＩＶ−１感染に対して実質的耐性が与えられることを実証した。この分析システムは、抗ＨＩＶレトロウイルス構築物の先の分析を基に改良したものであり、現在のＴ細胞系分析を補足する役割を果たす。このシステムを利用することにより、我々は、ＨＩＶ遺伝子治療の臨床に関わる重要なデータを産みだした。
材料および方法
細胞系：パケージング細胞系  ψ２（Mann,R.et al.1983）およびＰＡ３１７（ATCC CRL 9078）を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥ）中で培養した。６週間毎に、ＰＡ３１７細胞をＨＡＴ培地における５〜７日の選別に供した。ψＣＲＥおよびψＣＲＩＰ（Danos,O.Mulligan,R.C.1988）は、ＤＭＥ＋１０％子牛血清（ＢＣＳ）中で生育させた。
レトロウイルス・ベクター構築：ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子転写物（ＨＩＶ−１ IIIB、のnt 5865からnt5882、GGAGCCAGTAGATCCTA）をターゲットする化学的に合成されたハンマーヘッドリボザイムを、ネオマイシン耐性遺伝子（図１５Ａ）の３’未翻訳部位内にあるＬＮＬ６ベクター（Bender,M.A.et al.1987）のＳａｌＩ部位にクローン化した。この構築物はＲＲｚ２と命名された。アンチセンス構築物として、ｇａｇ遺伝子（ｎｔ７８からｎｔ６２８）のＲ、Ｕ５および５’部の一部を含むＨＸＢ２のクローン５５０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ部位（Yee J.K.et al.1987））でＨＰＲＴ ｃＤＮＡを除去することによって、ｐＮＨＰ−１ベクターから得られるＬＮＨＬベクター（図１５Ｂ）のＢａｍＨＩ部位にアンチセンスの方向でクローン化した。その結果得られる構築物を、ＲＡＳＨ５と呼称した。重合体ＴＡＲ構築物は、２０ＴＡＲ断片を、ＬＸＳＮベクター（Miller,A.D.et al,1989）内のＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入することによって作成し、Ｒ２０ＴＡＲと名付けた（図１５Ｃ）。配列の統合およ該構築物の配向をＤＮＡ配列決定または制限酵素マッピングによって確認した。
両栄養性レトロウイルスの産生：レトロウイルスＬＮＬ６およびＲＲｚ２をパケージング細胞系ψ２およびＰＡ３１７を包含するトランス感染によって産生した。約８０％の集密なψ細胞に、１０μｇの構築物ＤＮＡをカルシウム沈澱を使用し、１０％のＦＢＳ（ＤＭＥ成長培地）を含むＤＭＥ培地で１４時間インキュベーションすることによってトランスフェクトした。次に培地を除去して、新しいＤＭＥ成長培地で置換して、一晩３７℃５％のＣＯ2でインキュベーションした。次に環境栄養性ウイルスの上澄液をトランスフェクトされたψ２細胞から採集して使用し、ＤＭＥ成長培地中で４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下、やや集密（６０〜８０％）なＰＡ３１７細胞に感染させた。３７℃、５％ＣＯ2２４時間インキュベーションした後、被感染ＰＡ３１７は、トリプシン処理し、７５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＤＭＥ成長培地により１：２０に分割された。培地は、コロニーが形成されるまで３〜４日毎に取り変えられた。構築物の各々から１０〜２９のコロニーを摘みとり、ウイルス力価（ネオマイシン耐性コロニー分析）および複製コンピテント・レトロウイルス（ＰＣＲ）分析（Miller,A.D.Rosma,G.J.1989）用に増殖させた。レトロウイルスＬＮＨＬ，ＲＡＳＨ５、ＬＸＳＮ、およびＲ２０ＴＡＲは、ψＣＲＥをトランスフェクトし、ψＣＲＩＰ細胞を感染させることにより生成された。
ヒトＰＢＬｓの形質導入：抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を健康なドナーの白血球パックからフィコール・ハイパクー勾配遠心によって調整した。ＣＤ４+細胞が、ＣＤ８+細胞をマイクロセレクター（microCELLector）フラスコ（Applied Immune Science）を使用してメーカーの指示に従って除去することにより濃縮された。ＣＤ４+に富むＰＢＬｓ（５ｘ１０5細胞／ｍｌ）は、５μｇ／ｍｌの植物凝集素（ＰＨＡ、Sigma）またはＯＫＴ３モノクローナル抗体（Janssen-Cilag）１０ｎｇ／ｍｌを使用して、１０％のＦＢＳおよび２０ユニット／ｍｌのヒト組替インターロイキン２（ＲＰＭＩ成長培地）を補給したＲＰＭＩ １６４０培地中で４８時間から７２時間、刺激された。刺激されたＰＢＬｓは、産生細胞を含まないレトロウイルスストックに、４μｇ／ポリブレン（ｍ．ｏ．ｉ０．５を使用）の存在下で細胞を１８時間曝すことによって形質導入された。形質導入後４８時間して、ＰＢＬｓが、３００から５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ成長培地で１０〜１４日間かけて選別された。その後、これを新ＲＰＭＩ成長培地において１週間の期間で回収し、ＰＢＬｓにＨＩＶ−１を感作させた。
ＨＩＶ感染：ＨＩＶ−１実験株IIIBおよび臨床的な単離物８２Ｈの感染力価（TCID50）を、（Johnson,V.A.et al.1990）に記載のようにヒトＰＢＬｓ上で測定した。５／１０5形質導入されたＰＢＬｓに１００ ＴＣＩＤ ５０ ＨＩＶウイルスを２時間３７℃で感染させて、その後、細胞を二回ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、５ｍｌのＲＰＭＩ成長培地に再懸濁させた。３〜４日毎に、上澄み液のアリコットをｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（Coulter）用のサンプルとした。
ＲＮＡ分析：全細胞質ＲＮＡを、形質転換したＰＢＬｓからグアニヂウム・イソチオシアネート法（Chirgwin,J.J.et al.1979）を使用して抽出した。１５μｇのＲＮＡを１％のアガロース・ホルムアルデヒド・ゲル上で分画してナイロン膜（Hybond-N）に移し、夫々ｎｅｏrリボザイム、アンチセンスおよびＴＡＲの発現を検出するために、32Ｐ標識したｎｅｏr特異的プローブ、ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２の５５０ｂｐ ＢａｍＨＩ断片または２０ＴＡＲ断片でハイブリダイズした。
形質導入されたＰＢＬｓのＦＡＣＳ分析：１ｘ１０5の形質導入されたＰＢＬｓを２０分４℃で、ＣＤ４またはＣＤ８特異的なフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が抱合したモノクローナル抗体（Becton Dickinson）またはコントロール抗体（ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１、Becton Dickinson）と共にインキュベーションした。ＰＢＳ中で二回洗浄した後、細胞をBecton Dickinson FACScan上で分析した。
増殖分析：ＰＢＬｓは上記に記載の様に形質導入された。Ｇ４１８中での選別に続いて、新ＲＰＭＩ成長培地中で回収し、生存率をトリパンブルー排除によって評価し、細胞数を１ｘ１０6生存細胞／ｍｌに調整した。３重ウエル（Corning，２４ウエル・プレート）中に、１ｘ１０6細胞を植え付け、１μＣｉ６−［3Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Amersham）を各ウエルに添加した。培養４８時間後、真空下で細胞をグラスファイバー・フィルターに移し、氷冷燐酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、３ｘ５ｍｌの氷冷１０％トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）で沈澱させた。フィルターをエタノールですすぎ、ベータ・シンチレーション計測に供した。統計学的分析をスチューデント式テストを使用して行なった。
結  果
種々のトランス遺伝子を含有する高力価の両栄養性レトロウイルスの生成：トランス遺伝子（リボザイム、アンチセンスまたは重合性ＴＡＲ）を発現する３種類のレトロウイルスを、異なるベクターのバックボーン上に構築した。ＲＲｚ２は、抗ＨＩＶｔａｔリボザイム遺伝子を、ＬＮＬ６ベクター（図１５Ａ）におけるＭｏＭＬＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）によって駆動されるｎｅｏr遺伝子の３’未翻訳領域に挿入することによって構築した。ｎｅｏrおよびリボザイム遺伝子の両方を含むキメラＲＮＡ転写物は、このレトロウイルスから得られる。ＲＡＳＨ５レトロウイルス（図１５Ｂ）において、アンチセンス配列は、ウイルスＬＴＲまたは内臓のヒトＣＭＶプロモーターから転写することが可能であった。Ｒ２０ＴＡＲ構築物においては、重合系ＴＡＲは、ウイルスＬＴＲ（図１５Ｃ）から発現される。３つのレトロウイルス構築物および対応するコントロールベクターを使用して両栄養性の産生細胞系を生成した。ウイルスの力価は、標準プロトコール（Miller,A.D.and Rosma,G.J.et al.1989）で測定したところ、１０5から５ｘ１０6ｃｆｕ／ｍｌ範囲内であった。一般に、形質導入の試験では、＞１０6ｃｆｕ／ｍｌのレトロウイルスの力価が使用された。全てのウイルスのストックがテストされ、ＲＣＲのないことが確認され、−８０℃で貯蔵された。
ＰＢＬｓのレトロウイルス形質導入：レトロウイルスの形質導入用にＰＢＬｓ刺激を至適化するために、ＣＤ４+が豊富なＰＢＬｓのＰＨＡに対する反応またはＯＫＴ３抗体に対する反応が比較された。ＰＨＡまたはＯＫＴ３のどちらを用いても培養基内では、細胞世代時間、生存率および形質導入能力について何の変化も観察されなかった。この実験では、ヒトでの使用を認可されているという理由によってＯＫＴ３抗体を使用した。刺激されたＰＢＬｓは、次に、ｍ．ｏ．ｉ．０．５を使用して両栄養性レトロウイルによって形質導入された。相対的形質転換効率は、Ｇ４１８選別を生き抜いた細胞数に基づいて決定された。全体の形質導入効率は、ドナーの血液パックに依存して、２〜７％変化することがわかった。
形質導入されたＰＢＬｓのＧ４１８選別は、ＰＢＬ分析の内の重要な段階であることがわかった。完璧な選別を行うために、二段階法が採用された。ＰＢＬｓの各バッチについて、Ｇ４１８有毒投与量法がセットアップされ、同時に３００μｇ／ｍｌのベースラインＧ４１８濃度を、初めの７〜９日間、形質導入したＰＢＬｓに与えた。この初期期間の後、Ｇ４１８の濃度を有毒投与量分析において決められた濃度に調整した。テストした１０ドナーについて、初期細胞濃度１０5細胞／ｍｌを使用した場合、Ｇ４１８有毒投与量が、３００から５００μｇ／ｍｌにわたることがわかった。形質導入および選別後、ＰＢＬｓはＧ４１８無しで１週間、新培地にて培養された。この回収段階は、引き続きＨＩＶ−１感作分析用に細胞の生存率を高めて細胞数を増加させる為に重要である（Ｇ４１８で見られた増加に対して３から５倍の増加が見られた）。
形質導入されたＰＢＬｓ中でのトランス遺伝子の発現：形質導入されたＰＢＬｓ中でのリボザイム、アンチセンスまたはＴＡＲ配列の発現を評価した。図１６Ａ−１６Ｃは、ノーザン分析の代表的パターンを示す。ＲＲｚ２およびＬＮＬ６形質導入細胞（図１６Ａ）において、ｎｅｏrリボザイムまたはｎｅｏrの情報を含むスプライスされた転写物および未スプライスの転写物の両者をｎｅｏr特異的プローブ（３．２ｋｂおよび２．４ｋｂ）を使用して検出した。優勢なＲＮＡ種は、未スプライス転写物であった。ブロットがリボザイム特異的プローブによってハイブリダイズされると、ＲＲｚ２についてのみ同じパターンが観察された。ＲＡＳＨ５形質導入ＰＢＬｓにおいて、５’ＬＴＲから得られる２つの転写物（スプライスおよび未スプライス）が、５５０ｂｐプローブを使用して検出され、予想されたサイズ（４．８ｋｂおよび４．０ｋｂ）（図１６Ｂ）であることが確認された。しかしながら、内臓ＣＭＶプロモーターから得られると期待される、より短い転写物は発現されなかった。これは、ＣＭＶプロモーターが、この構築物中で停止していることがわかる。Ｒ２０ＴＡＲベクターは、予想通り、ＬＸＳＮにおいてスプライス・ドナーを不活性化することによって、未スプライスの４．６ｋｂの転写物をＴＡＲプローブとハイブリダイズしている５’ＬＴＲから生成した（図１６Ｃ）。
ヒトＰＢＬｓにおけるＨＩＶ−１の阻害：ＨＩＶ−１遺伝子治療の研究に対するＰＢＶＬ分析システム関連を分析するために、ＨＩＶ感作実験が実験室株（IIIB）および第一次臨床単離物（８２Ｈ）の両方を使用して、形質導入されたＰＢＬｓについて行なわれた。感染は重複して行なわれ、３から５個の別々のＰＢＬｓバッチで、繰り返された。ＨＩＶ−１の複製は、ｐ２４抗原レベルを培養上澄み液中で測定することにより、様々な時点でモニターされた。ＨＩＶ−１ IIIB株を使用した感作実験では、ｐ２４産生が、ＰＢＬｓ発現するリボザイム中（図１７Ａ）、アンチセンス（図１７Ｂ）、ＴＡＲデコイ（図１７Ｃ）において、対応するコントロール・ベクターによって形質導入されたＰＢＬｓに関連して、著しく減少した（７０％）。形質導入されたＰＢＬｓでは、阻害も、より低い度合い（７０％に比べて４０％）まで観察されたが、選別されたＰＢＬｓでは、観察されなかった。形質導入され、選別されたＰＢＬｓは、その一次ＨＩＶ−１単離物の感染に対する耐性についても評価された。該一次臨床単離物８２Ｈは、患者のＰＢＭＣｓから直接得られ、Ｔ細胞栄養性およびシンシチアを誘導する単離物として特徴づけられている。IIIBについては、（ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡによって分析された）８２Ｈの複製が、ＨＩＶ−１ IIIBに感染したＰＢＬｓ（図１８Ａ〜１８Ｃ）に見られると同じレベルにまで阻害された。これらの結果は、レトロウイルス・ベクターを通してヒトＰＢＬｓに運ばれたこれらのトランス遺伝子が、ＨＩＶ−１の複製を、初代造血細胞中で阻害できることを提示している。
形質導入されたＰＢＬｓの分析：形質導入およびＰＢＬ増殖における構築物発現の起こり得る影響を調査するために、［3Ｈ］チミジン取り込み分析が、形質転換され、選別された全ＰＢＬｓについて行われた。形質転換されていない通常のＰＢＬｓに比べた場合、トランス遺伝子構築物およびベクター形質導入されたＰＢＬｓ（Ｐ＜０．０２）；（図１９）には明らかに有害な影響は何もなかった。加えて、ＦＡＣＳ分析では、ＣＤ４表面マーカーが、形質導入後も変わらずに残ったことがわかった（表５）。これによって、ＨＩＶ−１感作分析によって観察された阻害効果が、形質導入ＰＢＬｓ上のＣＤ４受容体の数の減少によるものではないことが実証された。
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図２０は、ウイルスにより形質導入され、Ｇ４１８の選別に供されたＣＥＭ Ｔ４ Ｔリンパ球細胞系の結果を示す。プールされた細胞集団は、ランダムな構成要素を持つ細胞、構築物発現レベルが変わりやすい細胞を含み、これらは、つぎにＨＩＶ−１によって感作される。
図２１Ａ−２１Ｂは、ｔａｔに対向する多重リボザイムであるＲｚＭ；パケージング部位およｔａｔ両者に対向するリボザイムであるＲＲｚｐｓｉ／Ｍの結果を示す。
考  察
遺伝子治療が、インビボでＨＩＶ−１複製を阻害することに最終的に使用されるようにするためには、このような遺伝子治療的アプローチを、まず実験的システムで調べる必要がある。今日までは、これらの実験的システムには、主にヒトＴリンパ球細胞系が関わってきた。初代ＰＢＬｓ（Yu,M.et al.1994）においては、利用可能な公開データはない。予備臨床データを作成するために、初代造血細胞中で抗ＨＩＶ−１遺伝子治療剤をテストすることが重要である。これらの細胞はＨＩＶ−１感染、複製の主なターゲットであり、細胞系とＰＢＬｓ間には、成長特性、インビトロ操作に対する応答性，ＨＩＶ−１感染の反応性に著しい差異がある。それはＨＩＶ−１遺伝子治療のＣＤ４+ＰＢＬ集団である。これらの理由により、我々は、ＰＢｌ分析システムを確立するために本研究を行った。
本研究では、リボザイム、アンチセンスまたはＴＡＲデコイ遺伝子を発現する３つの異なるレトロウイルス・ベクターのヒトＰＢＬｓ中での抗ウイルス効能についてテストした。それらは異なるレトロウイルス・ベクター中で構築されたけれども、3Ｈチミジンの取り込み分析およびＦＡＣＳ分析で測定したところ、それらは全てＨＩＶー１プロテクション分析において、はっきりした細胞毒性をもたず、同レベルの有効性を示した。これらの所見は、ＨＩＶ−１遺伝子治療のターゲットとしてのＰＢＬｓの可能性を示す。
ＰＢＬｓを分析システムとしてまたは治療ターゲット細胞のいずれかに利用するためには、いくつかのポイントを指摘される。まず、高ウイルス力価がＰＢＬｓの有効な形質導入を達成するために決定的な因子となる。これは特に、臨床学的な目的の場合であって、形質導入されたＰＢＬｓをＧ４１８で選別するには望ましくない。我々は、高力価治療用レトロウイルス（＞１０6ｃｆｕ／ｍｌ）によって形質導入された選別ＰＢＬｓおよび未選別ＰＢＬｓの両方をテストした。未選別のＰＢＬｓもまた、阻害の程度は選別ＰＢＬｓに見られるよりも低いけれども、ＨＩＶ−１感染に対して抵抗性があることがわかった。これは、ビボ外（ex vivo）で形質導入されたＰＢＬｓを４１８Ｇの選別なしで臨床的に使用できる可能性のあることを示唆している。Ｇ４１８選別は、しかしながら、力価の低いウイルスを遺伝子治療のインビトロテストに使用されるようにすることが可能だ。我々は、２段階Ｇ４１８手法を開発し、これによって完璧な選別が容易に達成できる。これらの手法は、インビトロ培養の時間を最小化でき、それによってＴ細胞集団に対するいかなる修飾をも削減することに役立つ。我々の実験では、ＰＢＬｓをインビトロでの連続培養を２週間行っても、表面抗原（ＣＤ４+およびＣＤ８+）に重篤な衝撃を与えることはなかった。この期間（２週間）の長さは、治療目的のＰＢＬｓのex vivo操作にとって充分であろう。
レトロウイルスのベクターのデザインは、有効な遺伝子転換および発現に取っての、もうひとつの重要な側面となる。本研究に使用される３つのベクターデザインの間で直接的な比較はできないが、２つの所見は注目される。まず、ウイルスのＬＴＲ（ひとつの構築物については、ＣＭＶ内臓プロモータからは得られない）によって調整される全てのトランス遺伝子は、ヒト初代造血細胞において構成的に、有効に発現される。第２に、リボザイム遺伝子を、レトロウイルス・ベクターにおいてｎｅｏr等の遺伝子の３’未翻訳領域に挿入するという戦略は、ＰＢＬｓにおいてもＴ細胞系におけると同様に有効であると思われる。これらの所見は、遺伝子治療デザインをこれから改良していくに有効であろう。結論として、ヒト初代ＰＢＬｓの形質導入およびそのＨＩＶ−１のex vivo感染から、それらを防御することは、この開示中に提示されているプロトコールを使用して、完遂することができる。これは、インビトロ遺伝子治療剤の評価の為の有効なシステムを提供するばかりでなく、ＣＤ４+リンパ球にターゲットするＨＩＶ−１遺伝子治療の基盤を形成することにもなる。
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参照文献
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配  列  表
（１）一般的情報
（i）出願人：Symonds,Geoffrey P.
Sun,Lun-Quan
（ii）発明の名称：レトロウイルスパッケージング配列を標的とするリボザイム、その発現構築物、および斯かる構築物を含む組換えレトロウイルス
（iii）配列の数：１１
（iv）通信宛先：
(A)名宛人：クーパー  ＆  ダンハム  ＬＬＰ
(B)通り：アメリカズ通り1185
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10036
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
(A)媒体タイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．２４
（vi）現在の出願データ：
(A)出願番号：未知
(B)出願日：１９９５年１月５日
(C)分類：
（vii）先の出願データ：
(A)出願番号：ＵＳ  08／310,259
(B)出願日：１９９４年９月２１日
（viii）アトニー／エージェント情報
(A)氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
(B)登録番号：２８，６７８
(C)参照／ドケット番号：４３８４６−Ａ−ＰＣＴ
（ix）電信情報：
(A)電話：（２１２）２７８−０４００
(B)テレファックス：（２１２）３９１−０５２５
（２）配列認識番号１のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号１
0003691849.tif 000021
（２）配列認識番号２のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号２
0003691849.tif 000022
（２）配列認識番号３のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：２１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号３
0003691849.tif 000023
（２）配列認識番号４のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：３８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号４
0003691849.tif 000024
（２）配列認識番号５のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１１４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号５
0003691849.tif 000025
（２）配列認識番号６のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：５１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号６
0003691849.tif 000026
（２）配列認識番号７のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１７０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線形
（xi）配列の記載：配列認識番号７
0003691849.tif 000027
【図１】
0003691849.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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