(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
0003658621.tif 000009
（ここで、Ｒ１は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基を表し、Ｒ２は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、Ｒ１とＲ２が同時に水素であることはない。）で示されるｐ−アミノフェノール誘導体の検出方法であって、
（ａ）試料溶液中のｐ−アミノフェノール誘導体を分解してｐ−ヒドロキシアニリンを生成させるために試料溶液を酸性条件下に置く工程、
（ｂ）前記工程（ａ）からの溶液に式（II）
【化２】
0003658621.tif 000010
（ここで、Ｘはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、ｎは１〜４の整数を表す。ただし、ｎ＝１のときＸがメチル基であることはない。）で示されるフェノール化合物、および式（III）
【化３】
0003658621.tif 000011
（ここで、ＸおよびＹはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、ａは１〜３の整数を、ｂは１〜４の整数をそれぞれ表す。）で示されるα−ナフトール化合物からなる群の中から選択される発色剤を添加する工程、
（ｃ）前記ｐ−ヒドロキシアニリンと発色剤を反応させて発色させるために前記工程（ｂ）からの溶液をアルカリ条件下に置く工程、および
（ｄ）前記発色に基づいて前記試料溶液中のｐ−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する工程
を含むことを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記試料溶液が生体由来のものであり、前記工程（ａ）の前に、該試料溶液に除タンパク剤を添加することによりタンパク質を含む不純物を分離する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において、マイクロウェーブオーブンを用いて前記反応溶液を加熱することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）において、室温（２０℃）で固体の無機塩基および式Ｒａ−ＮＨ（３−ａ）（ここで、ａは１〜３の整数を表す）で示される有機アミン類からなる群の中から選択されるアルカリ化剤を添加することにより前記工程（ｂ）からの溶液をアルカリ性にすることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記発色剤が２，６−キシレノールである請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
式（I）
【化４】
0003658621.tif 000012
（ここで、Ｒ１は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基を表し、Ｒ２は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、Ｒ１とＲ２が同時に水素であることはない。）で示されるｐ−アミノフェノール誘導体の検出キットであって、
前記ｐ−アミノフェノール誘導体を分解させるための無機酸または有機酸を含む分解試薬、
式（II）
【化５】
0003658621.tif 000013
（ここで、Ｘはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、ｎは１〜４の整数を表す。ただし、ｎ＝１のときＸがメチル基であることはない。）で示されるフェノール化合物、および式（III）
【化６】
0003658621.tif 000014
（ここで、ＸおよびＹはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、ａは１〜３の整数を、ｂは１〜４の整数をそれぞれ表す。）で示されるα−ナフトール化合物からなる群の中から選ばれる発色剤を含む発色試薬、および
アルカリ化剤を含むアルカリ化試薬
を備えるキット。
【請求項７】
前記キットがさらに除タンパク剤を含む除タンパク試薬を備える請求項６記載のキット。
【請求項８】
前記アルカリ化剤が室温（２０℃）で固体の無機塩基および式Ｒａ−ＮＨ（３−ａ）（ここで、ａは１〜３の整数を表す）で示される有機アミン類からなる群の中から選択されることを特徴とする請求項６または７記載のキット。
【請求項９】
前記発色剤が２，６−キシレノールである請求項６ないし８のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｐ−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｐ−アミノフェノール誘導体は、多くの医薬品およびその原料に使用されているとともに化学工業原料としても使用されている。これらの大量服用あるいは暴露によって、通常の解毒機能では対処できないｐ−アミノフェノール誘導体が体内に蓄積して、肝細胞に障害を与え、重篤な肝障害を引き起こして死に至る危険性があることが知られている。特にｐ−アミノフェノール誘導体の一種であるアセトアミドフェノール（アセトアミノフェン）については、その血清中の濃度と肝障害の危険性には相関関係のあることも知られている。したがって、血清中のｐ−アミノフェノール誘導体の濃度を知ることができれば、その危険性を予知し、治療を施すことが可能となる。
【０００３】
現在、試料中のｐ−アミノフェノール誘導体を検査する方法はいくつか知られている。例えば、分析機器を用いる方法が知られているが、これは結果が出るまでに数時間を要するため、緊急時に対処することは困難である。また、ｏ−クレゾールとアンモニアを使用するインドフェノール法が知られているが、ｏ−クレゾールは危険物であると同時に、この方法は反応時に不快な臭いを発するため、安全装置のある施設内での使用に限られている。また、これらの試薬は揮発性であるため、調製後に試薬の濃度が変化する危険性がある。さらに、気散した薬品が他の検査に悪影響を及ぼしたり、検査者の健康を害するなど安全性の面でも問題がある。また、アセトアミノフェンの検出キットとして既にＳｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓがＳＩＧＭＡ社から製品化されているが、インドフェノール法とは異なった発色法であるニトロ化法を使用しており、最終生成物が黄色に発色する。しかしながら、検体が血清等の血液成分である場合には、もとの試料と発色した生成物との色が類似しているために陽性判定が困難であるとともに低濃度の検出が困難である。このように、これらの方法においては、迅速性、操作性および安全性の面で不十分である。よって、緊急を要する医療の現場において、その検査結果を治療行為に有効に反映させるには、迅速かつ簡便に検査試料そのものを発色させられる方法が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているｐ−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で迅速かつ確実に検出する方法およびキットを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料中のｐ−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるｐ−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤で発色させることにより、既存の方法と比較しても迅速にかつ高感度に検出することができることを見出した。本発明はこの知見に基づく。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、式（I）
【化７】
0003658621.tif 000002
（ここで、Ｒ１は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基を表し、Ｒ２は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、Ｒ１とＲ２が同時に水素であることはない。）で示されるｐ−アミノフェノール誘導体の検出方法であって、
（ａ）試料溶液中のｐ−アミノフェノール誘導体を分解して、ｐ−ヒドロキシアニリンを生成させるために試料溶液を酸性条件下に置く工程、
（ｂ）工程（ａ）からの溶液に式（II）
【化８】
0003658621.tif 000003
（ここで、Ｘはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、ｎは１〜４の整数を表す。ただし、ｎ＝１のときＸがメチル基であることはない。）で示されるフェノール化合物、および式（III）
【化９】
0003658621.tif 000004
（ここで、ＸおよびＹはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、ａは１〜３の整数を、ｂは１〜４の整数をそれぞれ表す。）で示されるα−ナフトール化合物からなる群の中から選択される発色剤を添加する工程、
（ｃ）ｐ−ヒドロキシアニリンと発色剤を反応させて発色させるために工程（ｂ）からの溶液をアルカリ条件下に置く工程、および
（ｄ）発色に基づいて試料溶液中のｐ−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する工程を含むことを特徴とする検出方法が提供される。
【０００７】
本発明の方法は、試料溶液が生体由来のものである場合には、工程（ａ）の前に、試料溶液に除タンパク剤を添加することによりタンパク質を含む不純物を分離する工程を含むことができる。
【０００８】
本発明の方法は、好ましくは工程（ａ）において、マイクロウェーブオーブンを用いて試料溶液を加熱することができる。
【０００９】
本発明の方法は、工程（ｃ）において、室温（２０℃）で固体の無機塩基および式Ｒａ−ＮＨ（３−ａ）（ここで、ａは１〜３の整数を表す）で示される有機アミン類からなる群の中から選択されるアルカリ化剤を添加することにより工程（ｂ）からの溶液をアルカリ性にすることが好ましい。
【００１０】
本発明はまた、本発明のｐ−アミノフェノール誘導体の検出方法において検出対象とされるｐ−アミノフェノール誘導体の検出キットであって、ｐ−アミノフェノール誘導体を分解させるための無機酸または有機酸を含む分解試薬、本発明の発色剤を含む発色試薬、およびアルカリ化剤を含むアルカリ化試薬を備えるキットが提供される。
【００１１】
本発明のキットは、さらに除タンパク剤を含む除タンパク試薬を備えることができる。
【００１２】
本発明のキットにおいて、アルカリ化剤は好ましくは室温（２０℃）で固体の無機塩基および式Ｒａ−ＮＨ（３−ａ）（ここで、ａは１〜３の整数を表す）で示される有機アミン類からなる群の中から選択される。
【００１３】
本発明において、発色剤は２，６−キシレノールであることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１５】
本発明は、試料中に存在するｐ−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるｐ−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤とアルカリ性条件下で反応させて発色させることにより検出するものである。
【００１６】
本発明で検出し得るｐ−アミノフェノール誘導体は、式（I）
【化１０】
0003658621.tif 000005
で示すことができる。式（I）においてＲ１は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基である。低級アルキル基（カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む）としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のＣ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、Ｒ２は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、Ｒ１とＲ２が同時に水素であることはない。
【００１７】
本発明において用いられる検体試料は、血液やその成分（血清、血漿等）、胃液等の体内分泌物、尿等の排泄物、および吐瀉物などの生体由来の試料、並びに飲料水および河川水などの環境由来の試料を含む。
【００１８】
本発明に係るｐ−アミノフェノール誘導体の検出方法においては、試料を酸性条件下に置いて試料中のｐ−アミノフェノール誘導体を分解させる分解剤、ｐ−アミノフェノール誘導体が分解して生じるｐ−ヒドロキシアニリンと反応させる発色剤、および発色反応液をアルカリ条件下に置くためのアルカリ化剤を用いる。これらの試薬は好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができる。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【００１９】
分解剤としては無機酸および／または有機酸を用いることができる。好ましくは塩酸、硫酸、または硝酸を用い、１〜１０重量％の濃度で使用することが望ましい。
【００２０】
発色剤には、式（II）
【化１１】
0003658621.tif 000006
で示されるフェノール化合物が含まれる。式（II）において、Ｘはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、ｎは１〜４の整数を表す。ただし、ｎ＝１のときＸがメチル基であることはない。低級アルキル基（カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む）としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のＣ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、発色剤には式（III）
【化１２】
0003658621.tif 000007
で示されるα−ナフトール化合物も含まれる。式（III）において、ＸおよびＹはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、ａは１〜３の整数を、ｂは１〜４の整数をそれぞれ表す。低級アルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のＣ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。発色剤としては、好ましくは悪臭が無く、危険物に指定されていない２，６−キシレノールを用いる。これらの発色剤は、試料１ｍｌあたり０．１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲で使用されることが好ましい。ｐ−アミノフェノールはこれら発色剤と反応してインドフェノール類（青色）を生成する。
【００２１】
アルカリ化剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどの室温（２０℃）で固体の無機塩基、または式Ｒａ−ＮＨ（３−ａ）（ここで、ａは１〜３の整数を表す）で示される有機アミン類を使用し、好ましくは１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いる。
【００２２】
また、検体試料が生体由来のものである場合には、前述した試薬に加えてさらに、試料中のタンパク質を予め分離・除去するための除タンパク剤を用いる。除タンパク剤には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、およびジメチルスルホキシドのような有機溶剤、塩酸、硫酸、過塩素酸、タングステン酸、メタリン酸、およびモリブデン酸のような無機酸、スルホサリチル酸、トリクロロ酢酸、およびピクリン酸のような有機酸、並びに硫酸アンモニウム、スルホン酸銅、タングステン酸ナトリウム、および水酸化亜鉛などの塩類が含まれ、好ましくはトリクロロ酢酸を用いる。これらの除タンパク剤は、好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができ、１〜１０重量％の濃度で使用することが好ましい。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【００２３】
より具体的には、本発明に係る検出方法は、次のように行うことができる。まず、検体試料が生体由来のものである場合には、ガラスおよびポリプロピレンなどの試験管に検体試料を入れ、除タンパク剤を加えて充分に撹拌し、好ましくは遠心分離器を用いて（３，０００ｒｐｍ，５分間）タンパク質などの不純物を除去する。不純物を分離後、上清を別の試験管に移し、これを検査試料として用いる。試料溶液に分解剤を添加して溶液を酸性にし、ｐ−アミノフェノール誘導体を分解させる。反応は室温から１００℃の温度で５〜３０分間で行うことができ、１００℃で２０分間加熱することが好ましい。反応時間を短縮するためにはマイクロウェーブオーブンを用いて加熱することが好ましい。この場合出力３５０〜５００Ｗにて３０秒〜２分間加熱することで充分である。マイクロウェーブオーブンに関しては、市販の電子レンジで代用することも可能である。放冷後、発色剤とアルカリ化剤を順次加えて撹拌する。このとき得られる反応溶液はｐＨ８〜１４であることが好ましく、ｐＨ１０以上であることがより好ましい。反応は室温から１００℃の温度で行うことができるが、室温でも十分に反応は進行するため、室温で行うことが望ましい。この反応後、発色に基づいて試料中のｐ−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する。ｐ−アミノフェノール誘導体の存在の有無は目視による着色（青色）の有無で判定できる（定性的検出）。ｐ−アミノフェノール誘導体を定量的に検出するためには、分光光度計を用いて波長６００〜６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線と比較することによって濃度を決定する。また、色彩表を用いた目視検査により判定することもできる。
【００２４】
本発明に係るｐ−アミノフェノール誘導体の検出キットには、上述した検出方法において用いられる各試薬が備えられる。各試薬は、通常、個別にパッケージされている。
【００２５】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
血清０．５ｍｌに５重量％のトリクロロ酢酸０．５ｍｌを加えて良く撹拌した。この混合液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清０．６５ｍｌをネジ口付の試験管に移し、塩酸２０μｌを加えて蓋をした。試験管を１００℃で２０分間加温した（あるいは、３５０Ｗ出力のマイクロウェーブオーブンで２分間、マイクロウェーブを照射した）。放冷後、１重量％の２，６−キシレノール０．５ｍｌと１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加えて撹拌した。５分後に分光光度計を使用して６２０ｎｍでの吸収を測定した。種々の濃度のｐ−アミノフェノール誘導体を含む血清試料について同検査を行った結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
0003658621.tif 000008
【００２８】
本方法での血清中ｐ−アミノフェノール誘導体の検出下限は１０μｇ／ｍｌであり、２００μｇ／ｍｌまで定量性が確認された。また、この方法によれば、肝障害の治療域（１０〜２０μｇ／ｍｌ）においても十分に目視的に着色を確認することができた。よって、本方法は、救急の場において利用可能であるといえる。
【００２９】
実施例２
ｐ−アセトアミドフェノールを大量に服用して急性中毒を起こした患者より得られた血清を使用して、実施例１と同じ方法で試料を調製し、吸光度を測定した。測定値をあらかじめ作成しておいた検量線と比較することによって血清中のｐ−アミノフェノール誘導体の濃度を決定した。なお、定量精度を高めるために、比較対照として、事前にｐ−アセトアミドフェノールが２００μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した血清試料も同時に検査し、その吸収度を基に検量線を補正した。この補正した検量線に基づいて、患者由来の血清中のｐ−アセトアミドフェノールの濃度は１３．０μｇ／ｍｌと決定された。なお本発明の方法ではｐ−アセトアミドフェノールとその代謝物を含めてそれらの濃度が測定される。参考として、ｐ−アミノフェノール誘導体自体の濃度のみが測定される機器分析法により同じ試料を測定したところ、９．６μｇ／ｍｌであった。本発明の方法は簡便で精度の高い検査法であることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているｐ−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で、迅速かつ確実に検出することができる。