(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Streptomyces avermitilis ａｖｅＣ遺伝子もしくはプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列、または配列番号：１のヌクレオチド位置１７４−１０８５の部分に示されるＳ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列、またはその変異体であって遺伝コードの縮重によってヌクレオチド配列に一つまたはそれ以上のサイレント変化を含むものを含むポリヌクレオチド分子であるが、少なくとも、配列番号：２中のアミノ酸１３８位に該当するＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸残基におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードしている第一突然変異、および配列番号：２中のアミノ酸１３９位に該当するＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸残基におけるアラニンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換をコードしている第二突然変異を更に含むポリヌクレオチド分子であって、そのため、Ｓ．avermitilis 菌株ＡＴＣＣ５３６９２に由来し、野生型ａｖｅＣ遺伝子が失活している細胞であって、少なくとも第一突然変異および第二突然変異を含む前記ポリヌクレオチド分子を発現する細胞が、野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilis 菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して減少する２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
２：１クラスアベルメクチンが、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンである請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比率が０．７５：１またはそれより小さい請求項２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項５】
配列番号：２中のアミノ酸１３８位に該当するＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸残基におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードしている第一突然変異、および配列番号：２中のアミノ酸１３９位に該当するＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸残基におけるアラニンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換をコードしている第二突然変異を導入することによってStreptomyces avermitilisのａｖｅＣ遺伝子を突然変異させることができる組換えベクターであって、このような突然変異をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含む請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子または請求項４若しくは５に記載の組換えベクターを含む宿主Streptomyces細胞。
【請求項８】
野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して減少した２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、（ａ）少なくとも、配列番号：２中のアミノ酸１３８位に該当するアミノ酸残基におけるセリンからトレオニンへの第一アミノ酸置換、および配列番号：２中のアミノ酸１３９位に該当するアミノ酸残基におけるアラニンからフェニルアラニンへの第二アミノ酸置換を含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ遺伝子またはその変異体であって遺伝コードの縮重によってヌクレオチド配列に一つまたはそれ以上のサイレント変化を含むものを有するポリヌクレオチド分子をＳ．avermitilis菌株の細胞に導入し、ここにおいて、前記遺伝子産物の発現は、Ｓ．avermitilis菌株に由来し、第一アミノ酸置換および第二アミノ酸置換を含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする前記突然変異したａｖｅＣ遺伝子またはその変異体を発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率について、野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して減少を引き起こし、そして野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現する菌株の細胞によって生産される２：１クラス比率と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生じる細胞を選択する；または（ｂ）ａｖｅＣ遺伝子中に一つまたはそれ以上の突然変異を導入することができる一つまたはそれ以上のポリヌクレオチド分子をＳ．avermitilis菌株の細胞に導入し、そのためこのような細胞が、少なくとも、配列番号：２中のアミノ酸１３８位に該当するアミノ酸残基におけるセリンからトレオニンへの第一アミノ酸置換、および配列番号：２中のアミノ酸１３９位に該当するアミノ酸残基におけるアラニンからフェニルアラニンへの第二アミノ酸置換を有するＡｖｅＣ遺伝子産物を発現し、ここにおいて、遺伝子産物の発現は、Ｓ．avermitilis菌株に由来し、第一アミノ酸置換および第二アミノ酸置換を含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする前記突然変異したａｖｅＣ遺伝子を発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率について、野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して減少を引き起こし、そして野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに発現する菌株の細胞によって生産される２：１クラス比率と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生じる細胞を選択することを含む方法。
【請求項９】
２：１クラスアベルメクチンが、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比率が０．７５：１またはそれより小さい請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号：２中のアミノ酸１３８位に該当するアミノ酸残基におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードしている第一突然変異、および配列番号：２中のアミノ酸１３９位に該当するアミノ酸残基におけるアラニンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換をコードしている第二突然変異を含む突然変異したａｖｅＣ遺伝子を含むStreptomyces avermitilis細胞。
【請求項１２】
野生型ａｖｅＣ遺伝子だけを代わりに含むStreptomyces avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して減少した２：１クラス比率のアベルメクチンを生じる請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
２：１クラスアベルメクチンが、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンである請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比率が０．７５：１またはそれより小さい請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
アベルメクチンを製造する方法であって、請求項１１に記載の細胞を培地中において、それからのアベルメクチンの生産を可能にするまたは誘導する条件下で培養し、その培養物から該アベルメクチンを回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、アベルメクチンを製造するための組成物および方法に関し、主に、動物の健康の分野である。より詳しくは、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）の培養物の発酵によって生産される２：１クラスアベルメクチンの比率を調節するのに用いることができる、 ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子、およびこのようなポリヌクレオチド分子についてスクリーニングするための組成物および方法に関する。本発明は、更に、生産される２：１クラスアベルメクチンの比率を調節するようにａｖｅＣ遺伝子が突然変異しているベクター、形質転換された宿主細胞、および新規なＳ．avermitils突然変異菌株に関する。
【０００２】
２．発明の背景
２．１．アベルメクチン
ストレプトミセス属（Streptomyces）種は、強力な駆虫および殺虫活性を有する一連の８種類の関連した１６員大環状ラクトンを含む、アベルメクチンを含めた広範囲の二次代謝産物を生産する。これら８種類の異なるが密接に関連した化合物は、Ａ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、Ｂ２ａおよびＢ２ｂと称される。“ａ”系列の化合物は、Ｃ２５位の置換基が（Ｓ）−sec−ブチルである天然のアベルメクチンを意味し、“ｂ”系列は、Ｃ２５位の置換基がイソプロピルであるそれら化合物を意味する。“Ａ”および“Ｂ”という表示は、Ｃ５位の置換基が、それぞれ、メトキシおよびヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。数字“１”は、Ｃ２２，２３位に二重結合が存在するアベルメクチンを意味し、数字“２”は、Ｃ２２位に水素およびＣ２３位にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。関連したアベルメクチンの中で、Ｂ１型アベルメクチンは、最も有効な抗寄生生物および有害生物駆除活性を有すると認識され、したがって、最も商業的に望まれるアベルメクチンである。
【０００３】
アベルメクチンおよびＳ．avermitilis菌株の好気的発酵によるそれらの生産は、米国特許第４，３１０，５１９号および同第４，４２９，０４２号に記載されている。天然のアベルメクチンの生合成は、イソ酪酸およびＳ−（＋）−２−メチル酪酸のＣｏＡチオエステル類似体から内因的に開始されると考えられる。
【０００４】
ランダム突然変異誘発および内因的に供給される脂肪酸の使用による両方の菌株改良の組合せは、アベルメクチン類似体の有効な生産をもたらしている。分岐状鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼを欠いているＳ．avermitilisの突然変異体（ｂｋｄ欠失突然変異体）は、発酵に脂肪酸を補足された場合、アベルメクチンしか生じることができない。分岐状鎖デヒドロゲナーゼ活性を欠く突然変異体（例えば、Ｓ．avermitilis、ＡＴＣＣ５３５６７）のスクリーニングおよび単離は、欧州特許（ＥＰ）第２７６１０３号に記載されている。外因的に供給される脂肪酸の存在下におけるこのような突然変異体の発酵は、用いられる脂肪酸に該当する４種類のアベルメクチンだけの生産を引き起こす。したがって、Ｓ−（＋）−２−メチル酪酸をＳ．avermitilis（ＡＴＣＣ５３５６７）の発酵に補足することは、天然のアベルメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａおよびＢ２ａの生産を引き起こし；イソ酪酸を発酵に補足することは、天然のアベルメクチンＡ１ｂ、Ａ２ｂ、Ｂ１ｂおよびＢ２ｂの生産を引き起こし；そしてシクロペンタンカルボン酸を発酵に補足することは、４種類の新規なシクロペンチルアベルメクチンＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２の生産を引き起こす。
【０００５】
他の脂肪酸を補足した場合、新規なアベルメクチンが生産される。８００種類を越える可能な前駆体をスクリーニングすることにより、６０種類を越える他の新規なアベルメクチンが識別されている。（例えば、Dutton et al., 1991, J.Antibiot. 44:357-365; および Banks et al., 1994, Roy.Soc.Chem. 147:16-26 を参照されたい）。更に、５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．avermitilisの突然変異体は、本質的にＢ類似体アベルメクチンだけを生じる。その結果、分岐状鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ両活性を欠くＳ．avermitilis突然変異体は、発酵に補足するのに用いられる脂肪酸に該当するＢアベルメクチンだけを生じる。したがって、Ｓ−（＋）−２−メチル酪酸をこのような二重突然変異体に補足することは、天然のアベルメクチンＢ１ａおよびＢ２ａだけの生産を引き起こすが、イソ酪酸またはシクロペンタンカルボン酸を補足することは、天然のアベルメクチンＢ１ｂおよびＢ２ｂまたは新規なシクロペンチルＢ１およびＢ２アベルメクチンそれぞれの生産を引き起こす。シクロヘキサンカルボン酸を用いた二重突然変異菌株の補足は、商業的に重要な新規アベルメクチンであるシクロヘキシルアベルメクチンＢ１（ドラメクチン（doramectin））を生産するのに好ましい方法である。このような二重突然変異体、例えば、Ｓ．avermitilis（ＡＴＣＣ５３６９２）の単離および特性は、ＥＰ２７６１０３号に記載されている。
【０００６】
２．２．アベルメクチン生合成に関与する遺伝子
多くの場合、二次代謝産物の生産に関与する遺伝子および特定の抗生物質をコードする遺伝子は、染色体上に一緒に集まった状態で見出される。これは、例えば、Streptomycesポリケチドシンターゼ遺伝子クラスター（ＰＫＳ）の場合である（Hopwood and Sherman, 1990, Ann.Rev.Genet. 24.37-66 を参照されたい）。したがって、生合成経路において遺伝子をクローニングする一つの戦略は、薬物耐性遺伝子を単離後、その特定の抗生物質の生合成に関係する他の遺伝子について染色体の隣接する領域を調べることであった。重要な代謝産物の生合成に関与する遺伝子をクローニングするもう一つの戦略は、突然変異体の相補性であった。例えば、特定の代謝産物を生産することができる微生物からのＤＮＡライブラリーの一部分を、非生産性突然変異体に導入し、そしてその代謝産物の生産について形質転換細胞をスクリーニングする。更に、他の Streptomyces種に由来するプローブを用いたライブラリーのハイブリダイゼーションを用いて、生合成経路において遺伝子を識別し且つクローン化している。
【０００７】
アベルメクチン生合成に関与する遺伝子（ａｖｅ遺伝子）は、他の Streptomyces二次代謝産物の生合成に必要な遺伝子（例えば、ＰＫＳ）と同様、染色体上に集まった状態で見出される。多数のａｖｅ遺伝子は、アベルメクチン生合成を阻止されたＳ．avermitilis突然変異体を相補するベクターを用いてうまくクローン化されている。このような遺伝子のクローニングは、米国特許第５，２５２，４７４号に記載されている。更に、Ikeda et al.,1995, J.Antibiot. 48:532-534 は、Ｓ．avermitilisの４．８２Ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントへのＣ２２，２３脱水工程を含む染色体領域（ａｖｅＣ）の局在化、更には、単一成分Ｂ２ａプロデューサーの生産を引き起こすａｖｅＣ遺伝子の突然変異を記載している。強力な駆虫化合物であるイベルメクチンは、アベルメクチンＢ２ａから化学的に製造することができるので、アベルメクチンＢ２ａのこのような単一成分プロデューサーは、イベルメクチンの商業生産に特に有用であると考えられる。
【０００８】
アベルメクチン生産の複雑さを最小限にするａｖｅＣ遺伝子の突然変異、例えば、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させるような突然変異の識別は、商業的に重要なアベルメクチンの生産および精製を簡単にすると考えられる。
【０００９】
３．発明の要旨
本発明は、Ｓ．avermitilisの完全なａｖｅＣ  ＯＲＦまたはその実質的な部分を含む単離されたポリヌクレオチド分子であって、Ｓ．avermitilis染色体中の原位置のａｖｅＣ  ＯＲＦから下流に位置する次の完全なＯＲＦを欠いている単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、好ましくは、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様である、または図１のａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号：１）と同様であるヌクレオチド配列、またはその実質的な部分を含む。本発明は、更に、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明は、更に、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列に、または図１（配列番号：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列、またはその実質的な部分を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明は、更に、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列、または図１のアミノ酸配列（配列番号：２）に相同であるアミノ酸配列、またはその実質的な部分を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明は、更に、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、単離されたポリヌクレオチド分子は、Ｓ．ハイグロスコピクス（Ｓ．hygroscopicus）からのＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含み、この相同遺伝子産物は、配列番号：４のアミノ酸配列またはその実質的な部分を含む。好ましい態様において、Ｓ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号：３のヌクレオチド配列またはその実質的な部分を含む。
【００１３】
本発明は、更に、配列番号：３のＳ．hygroscopicusヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明は、更に、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＳ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１４】
本発明は、更に、図１（配列番号：１）または配列番号：３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に、または図１（配列番号：１）または配列番号：３のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明は、更に、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦまたはａｖｅＣ相同ＯＲＦを含むポリヌクレオチド分子を含めた本発明のポリヌクレオチドをクローニングするまたは発現する場合に有用である組換えクローニングベクターおよび発現ベクターを提供する。非制限態様において、本発明は、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ遺伝子のＯＲＦ全体を含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を提供する。本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、およびそれに由来する新規な菌株または細胞系を提供する。
【００１６】
本発明は、更に、実質的に精製されたまたは単離された組換え発現されるＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物、またはその実質的な部分、更には、その同族体を提供する。本発明は、更に、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物を製造する方法であって、組換え発現ベクターを用いて形質転換される宿主細胞を培養し、この組換え発現ベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子であって、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物の生産を導く条件下において宿主細胞中のポリヌクレオチド分子の発現を制御する一つまたはそれ以上の調節要素と機能的に結合しているポリヌクレオチド分子を含み、そしてＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物を細胞培養物から回収することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ対立遺伝子、またはプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列またはその縮重変異体、または図１（配列番号：１）に示されるＳ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列またはその縮重変異体とそれ以外は同様であるが、一つまたはそれ以上の突然変異を更に含むので、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞によって生産されるのとは異なった比率または量のアベルメクチンを生産するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本発明によれば、このようなポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株と比較されるアベルメクチン生産の検出可能な変化を示す新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに用いることができる。好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株による場合と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに有用である。更に好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、単一の野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株と比較して増加したレベルのアベルメクチンを生産する新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに有用である。更に好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子が失活した新規なＳ．avermitilis 菌株を生じるのに有用である。
【００１８】
本発明は、生産されるアベルメクチンの比率および／または量を変更することができるＳ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異を識別する方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異を識別する方法であって、（ａ）それに対して天然のａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されていて且つ発現されるＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を決定し；（ｂ）工程（ａ）の場合と同様のＳ．avermitilis 菌株の細胞であるが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子または図１（配列番号：１）のＯＲＦまたはそれに相同であるヌクレオチド配列だけを代わりに発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を決定し；そして（ｃ）工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して；工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率が、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と異なる場合、アベルメクチンの２：１クラス比率を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異が識別されているようにすることを含む方法を提供する。好ましい態様において、アベルメクチンの２：１クラス比率は突然変異によって減少する。
【００１９】
更に好ましい態様において、本発明は、生産されるアベルメクチンの量を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦまたはａｖｅＣ  ＯＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を識別する方法であって、（ａ）それに対して天然のａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むまたはＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されていて且つ発現されるＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量を決定し；（ｂ）工程（ａ）の場合と同様のＳ．avermitilis菌株の細胞であるが、図１（配列番号：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列またはそれに相同であるヌクレオチド配列を有する単一のａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの量を決定し；そして（ｃ）工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量を、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量と比較し；工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量が、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチン量と異なる場合、アベルメクチンの量を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦまたは遺伝子構築物の突然変異が識別されているようにすることを含む方法を提供する。好ましい態様において、アベルメクチンの量は突然変異によって増加する。
【００２０】
本発明は、更に、アベルメクチン生産を変更された新規なＳ．avermitilis菌株を製造するのに有用である組換えベクターを提供する。例えば、本発明は、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子のいずれかをＳ．avermitilis染色体のａｖｅＣ遺伝子の部位に集中させて、ａｖｅＣ対立遺伝子またはＯＲＦまたはその一部分に挿入するかまたは相同的組換えによって置換するのに用いることができるベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、これによって提供される本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子以外の部位でＳ．avermitilis染色体中に挿入された場合、またはＳ．avermitilis細胞中でエピソームによって維持された場合、アベルメクチン生合成を調節するように機能することもありうる。したがって、本発明は、更に、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターであって、ａｖｅＣ遺伝子以外のＳ．avermitilis染色体中の部位にポリヌクレオチド分子を挿入するのに、またはエピソームによって維持されるように用いることができるベクターを提供する。好ましい態様において、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子をＳ．avermitilis染色体中に挿入して、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する細胞の新規菌株を生じるのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。
【００２１】
本発明は、更に、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して変更された比率および／または量のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して変更された２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異した対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更する遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を有するベクターを用いてＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そして野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を代わりに発現する菌株の細胞によって生産される２：１クラス比率と比較して変更された２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。好ましい態様において、生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率は、新規な菌株の細胞中で減少する。
【００２２】
更に好ましい態様において、本発明は、変更された量のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはそのａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物であって、その発現が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異した対立遺伝子または遺伝子構築物を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産される変更された量のアベルメクチンを生じるものを有するベクターを用いてＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そして野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量と比較して変更された量でアベルメクチンを生産する形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。好ましい態様において、生産されるアベルメクチンの量は、新規な菌株の細胞中で増加する。
【００２３】
更に好ましい態様において、本発明は、その細胞が失活したａｖｅＣ対立遺伝子を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、ａｖｅＣ対立遺伝子を失活させるベクターを用いて、任意のａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そしてａｖｅＣ対立遺伝子が失活している形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は、更に、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子またはベクターのいずれかを用いて形質転換された細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を提供する。好ましい態様において、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、またはに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株であって、その細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して変更された２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する新規な菌株を提供する。より好ましい態様において、この新規な菌株の細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する。このような新規な菌株は、ドラメクチンのような商業的に望まれるアベルメクチンの大規模生産に有用である。
【００２５】
更に好ましい態様において、本発明は、それに対して天然のａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、またはに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはそのａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量と比較して変更された量のアベルメクチンの細胞による生産を引き起こす新規な菌株を提供する。好ましい態様において、これら新規な細胞は、増加した量のアベルメクチンを生産する。
【００２６】
更に好ましい態様において、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が失活した細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を提供する。このような菌株は、それらが生産するアベルメクチンの野生型菌株と比較して異なったスペクトルにも、ａｖｅＣ遺伝子の標的またはランダム突然変異誘発がアベルメクチン生産に影響を与えるかどうか確認するための本明細書中に記載の相補性スクリーニング検定においても有用である。
【００２７】
本発明は、更に、アベルメクチンを製造する方法であって、Ｓ．avermitilis菌株の細胞であって、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更する遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞を、それからのアベルメクチン生産を可能にするまたは誘導する条件下の培地中で培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含む方法を提供する。好ましい態様において、突然変異を発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率は減少する。この方法は、ドラメクチンのような商業的に価値のあるアベルメクチンの増加した生産効率を提供する。
【００２８】
本発明は、更に、アベルメクチンを製造する方法であって、Ｓ．avermitilis菌株の細胞であって、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または遺伝子構築物を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または遺伝子構築物を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産される変更された量のアベルメクチンの生産を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現する細胞を、それからのアベルメクチン生産を可能にするまたは誘導する条件下の培地中で培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含む方法を提供する。好ましい態様において、突然変異または遺伝子構築物を発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの量は増加する。
【００２９】
本発明は、更に、本発明の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilisの菌株によって生産されるアベルメクチンの新規な組成物であって、このアベルメクチンが、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して減少した２：１クラス比率で生産される新規な組成物を提供する。新規なアベルメクチン組成物は、発酵培養液中で生産されるように存在しうるし、またはそれから採取することができ、そしてそれから部分的にまたは実質的に精製することができる。
【００３０】
５．発明の詳細な記述
本発明は、Streptomyces avermitilisからのＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの識別および特性決定、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をそれらのアベルメクチン生産への作用についてスクリーニングするのに用いることができる新規なＳ．avermitilis菌株の構築、および若干の突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物が、Ｓ．avermitilisによって生産されるＢ２：Ｂ１比アベルメクチンを減少させることができるという発見に関する。例として、本発明を、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様であるヌクレオチド配列かまたは、図１（配列番号：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子について、およびそれに由来する突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子およびそれらの縮重変異体について、下記の項に記載する。しかしながら、本発明に記載の原理は、例えば、特にＳ．hygroscopicusおよびＳ．griseochromogenesを含めた他の Streptomyces 種からのａｖｅＣ相同遺伝子を含めた他のポリヌクレオチド分子に同様に適用することができる。
【００３１】
５．１．Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｓ．avermitilisの完全なａｖｅＣ  ＯＲＦまたはその実質的な部分を含む単離されたポリヌクレオチド分子であって、Ｓ．avermitilis染色体中の原位置のａｖｅＣ  ＯＲＦから下流に位置する次の完全なＯＲＦを欠く単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００３２】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、好ましくは、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同一の、または図１（配列番号：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列またはその実質的な部分と同様であるヌクレオチド配列を含む。本明細書中で用いられる、Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、図１（配列番号：１）に示される完全なａｖｅＣ  ＯＲＦ配列の少なくとも約７０％を含む単離されたポリヌクレオチド分子を意味し、そしてこれは、機能的に均等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする。これに関して、“機能的に均等な”ＡｖｅＣ遺伝子産物は、天然のａｖｅＣ対立遺伝子が失活したＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２中で発現される場合、Ｓ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２に対して天然の野生型の機能性ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２によって生産されるのと実質的に同様の比率および量のアベルメクチンの生産を引き起こす遺伝子産物として定義される。
【００３３】
ａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列に加えて、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、図１（配列番号：１）に示されるそれらフランキングヌクレオチド配列のような、Ｓ．avermitilisの原位置のａｖｅＣ遺伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列を更に含むことがありうる。
【００３４】
本発明は、更に、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本明細書中で用いられる“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コーディング配列”、“読み取り枠”および“ＯＲＦ”という用語は、一本鎖かまたは二本鎖でありうるＤＮＡおよびＲＮＡ両方の分子を意味するものであり、これは、ＡｖｅＣ遺伝子産物中に、または下記のようにＡｖｅＣ相同遺伝子産物中に、または適当な調節要素の制御下に置かれた場合の適当な宿主細胞発現系におけるＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同であるポリペプチド中に転写し且つ翻訳（ＤＮＡ）することができるしまたは翻訳（ＲＮＡ）することができる。コーディング配列には、原核性配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、および化学合成されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれうるが、これに制限されるわけではない。
【００３５】
図１（配列番号：１）に示されるヌクレオチド配列は、ｂｐ４２位、１７４位、１７７位および１８０位に４個の異なったＧＴＧコドンを含む。下の項目９に記載のように、ａｖｅＣ  ＯＲＦ（図１；配列番号：１）の５’領域の多重欠失を構築して、これらコドンの内のどれが、タンパク質発現の出発部位としてａｖｅＣ  ＯＲＦ中で機能しうるか明確にさせた。ｂｐ４２の最初のＧＴＧ部位の欠失は、ＡｖｅＣ活性を除去しなかった。ｂｐ１７４位、１７７位および１８０位のＧＴＧコドンの全部一緒の追加の欠失は、ＡｖｅＣ活性を除去し、この領域がタンパク質発現に必要であるということが示された。本発明は、したがって、可変長さａｖｅＣ  ＯＲＦを包含する。
【００３６】
本発明は、更に、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列に、または図１（配列番号：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列またはその実質的な部分に相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列に相同であるポリヌクレオチド分子を論及するのに用いられる場合の“相同”という用語は、（ａ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする、または図１（配列番号：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列と同様のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするが、遺伝コードの縮重によってヌクレオチド配列に一つまたはそれ以上のサイレント変化を含む（すなわち、縮重変異体）；または（ｂ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするまたは図１（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、適度なストリンジェント条件、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において４２℃での洗浄（Ausubel et al.(eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Green Publishing Associates,Inc., and John Wiley & Sons,Inc., New York, at p.2.10.3 を参照されたい）の下でハイブリッド形成し、そして上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列の補体にまたは図１（配列番号：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列の補体またはその実質的な部分に、高度なストリンジェント条件、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６８℃での洗浄（Ausubel et al., 1989, 上記）の下でハイブリッド形成し、そして上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする。
【００３７】
ＡｖｅＣ遺伝子産物およびその可能な機能的均等物の活性は、下の実施例に記載のように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって決定することができる。Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物の機能的均等物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子には、他のＳ．avermitilis菌株中に存在する天然に存在するａｖｅＣ遺伝子、Streptomyces の他の種に存在するａｖｅＣ相同遺伝子、および天然に存在するにせよ遺伝子操作されたにせよ、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子が含まれる。
【００３８】
本発明は、更に、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列、または図１（配列番号：２）のアミノ酸配列またはその実質的な部分に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で用いられる、図１（配列番号：２）のアミノ酸配列の“実質的な部分”とは、図１（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含むポリペプチドを意味し、これは、上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ遺伝子産物を構成する。
【００３９】
Ｓ．avermitilisからのＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を論及するのに本明細書中で用いられる“相同”という用語は、それ以外の場合には図１（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するが、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で保存的に置換されたポリペプチドを意味し、ここにおいて、このアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＧＥＮＢＡＮＫ，ＮＣＢＩ）のような任意の標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムによって決定したところ、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるポリペプチドまたは図１（配列番号：２）のアミノ酸配列に少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、そしてこのような保存的置換は、上に定義の機能的に均等な遺伝子産物を生じる。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知である。このような置換を行う規則には、特に、Dayhof,M.D., 1978, Nat.Biomed.Res.Found., Washinton,D.C., Vol.5,Sup.3 によって記載されたものが含まれる。より具体的には、保存的アミノ酸置換は、酸性度または極性において関連しているアミノ酸のファミリー内で一般的に生じるものである。遺伝コードされるアミノ酸は、概して、４群に、すなわち、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸としても共通に分類される。任意の特定のグループ内での、例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、またはアスパラギン酸とグルタミン酸、またはトレオニンとセリン、または任意の他のアミノ酸残基と構造的に関連したアミノ酸残基、例えば、類似した酸性度または極性を有するまたはそれらのいくつかの組合せにおいて類似性を有するアミノ酸残基との一つまたはそれ以上の置換は、概して、ポリペプチドの機能への作用に大差がないであろう。
【００４０】
本発明は、更に、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で用いられる“ＡｖｅＣ相同遺伝子産物”は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＧＥＮＢＡＮＫ，ＮＣＢＩ）のような任意の標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムによって決定したところ、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列または図１（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列を含むＳ．avermitilisのＡｖｅＣ遺伝子産物に少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する遺伝子産物として定義される。非制限態様において、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物は、Ｓ．hygroscopicusに由来し（ＥＰ出願０２９８４２３号に記載される；寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１号）、配列番号：４のアミノ酸配列またはその実質的な部分を含む。配列番号：４のアミノ酸配列の“実質的な部分”とは、配列番号：４のアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含むポリペプチドを意味し、これは、機能的に均等なＡｖｅＣ相同遺伝子産物を構成する。“機能的に均等な”ＡｖｅＣ相同遺伝子産物は、天然のａｖｅＣ相同対立遺伝子が欠失したＳ．hygroscopicus菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１中で発現される場合、Ｓ．hygroscopicus菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１に対して天然の野生型の機能性ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．hygroscopicus菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１によって生産されるのと実質的に同様の比率および量のミルベマイシンの生産を引き起こす遺伝子産物として定義される。非制限態様において、Ｓ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号：３のヌクレオチド配列またはその実質的な部分を含む。これに関して、配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、配列番号：３のヌクレオチド配列の少なくとも約７０％を含む単離されたポリヌクレオチド分子を意味し、これは、直ぐ上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする。
【００４１】
本発明は、更に、配列番号：３のＳ．hygroscopicusヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。配列番号：３のＳ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしている配列に相同であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を論及するのに用いられる場合の“相同”という用語は、（ａ）配列番号：３のヌクレオチド配列と同様の遺伝子産物をコードするが、遺伝コードの縮重によってヌクレオチド配列に一つまたはそれ以上のサイレント変化を含む（すなわち、縮重変異体）；または（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、適度なストリンジェント条件、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において４２℃での洗浄（Ausubel et al. 上記を参照されたい）の下でハイブリッド形成し、そして上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、配列番号：３のＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列の補体に、高度なストリンジェント条件、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６８℃での洗浄（Ausubel et al., 1989, 上記）の下でハイブリッド形成し、そして上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする。
【００４２】
本発明は、更に、Ｓ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．hygroscopicusからの配列番号：４のＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同であるポリペプチドを論及するのに本明細書中で用いられる“相同”という用語は、それ以外の場合には配列番号：４のアミノ酸配列を有するが、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、上に定義の別のアミノ酸残基で保存的に置換されたポリペプチドを意味し、ここにおいて、このアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＧＥＮＢＡＮＫ，ＮＣＢＩ）のような任意の標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムによって決定したところ、配列番号：４のポリペプチドに少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、そしてこのような保存的置換は、上に定義の機能的に均等なＡｖｅＣ相同遺伝子産物を生じる。
【００４３】
本発明は、更に、図１（配列番号：１）または配列番号：３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に、または図１（配列番号：１）または配列番号：３のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長さ、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長さであり、そして前述のポリヌクレオチド分子の一つに、高度なストリンジェント条件、すなわち、６ｘＳＳＣ／０．１％ピロリン酸ナトリウム中において、約１４塩基オリゴについては約３７℃で、約１７塩基オリゴについては約４８℃で、約２０塩基オリゴについては約５５℃で、そして約２３塩基オリゴについては約６０℃での洗浄の下でハイブリッド形成する。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、前述のポリヌクレオチド分子の一つの一部分に相補的である。これらオリゴヌクレオチドは、遺伝子調節において有用なアンチセンス分子をコードするまたはアンチセンス分子として作用することを含めたいろいろな目的に、またはａｖｅＣまたはａｖｅＣ相同体をコードしているポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーとして有用である。
【００４４】
追加のａｖｅＣ相同遺伝子は、既知の技法と一緒にした本明細書中に開示されたポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチドを用いて、Streptomycesの他の種または菌株中で識別することができる。例えば、図１（配列番号：１）のＳ．avermitilisヌクレオチド配列の一部分または配列番号：３のＳ．hygroscopicusヌクレオチド配列の一部分を含むオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識され且つ用いられて、目的の微生物に由来するＤＮＡから構築されたゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、目的の微生物への対照標準微生物、この場合はＳ．avermitilisまたはＳ．hygroscopicusの関係に基づいて選択される。いろいろなストリンジェンシー条件に関する必要条件は、当業者に周知であり、このような条件は、ライブラリーおよび標識配列が由来する具体的な微生物に依って異なるであろうと考えられる。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチド長さであり、例えば、下の実施例に記載のものが含まれる。相同遺伝子の増幅は、これらおよび他のオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的な技法を用いることによって行うことができるが、当該技術分野において知られている他の増幅技術、例えば、リガーゼ連鎖反応を用いることもできる。
【００４５】
ａｖｅＣ相同ヌクレオチド配列を含有するとして識別されるクローンは、機能的ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするそれらの能力について調べることができる。この目的には、適当な読み枠、更には、開始および終結シグナルを識別するために、それらクローンに配列分析を行うことができる。或いは、または更に、クローン化ＤＮＡ配列は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。下記のように、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミド発現ベクターのような細菌系が含まれるがこれらに制限されるわけではない種々の宿主／ベクター系のいずれかを用いることができる。次に、可能なａｖｅＣ相同コーディング配列を含むこのようなベクターを用いて形質転換された適当な宿主細胞を、ＡｖｅＣ型活性について、例えば、下の項目７に記載のように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析のような方法を用いて分析することができる。
【００４６】
本明細書中に開示されたポリヌクレオチド分子の製造および操作は、当該技術の範囲内であり、例えば、本明細書中にいずれも援用される、Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel,et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al.(eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press,Inc., San Diego; および Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New Yorkに記載の組換え技術によって行うことができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物またはＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチドクローンは、下の項目７に記載の方法が含まれるがこれに制限されるわけではない当該技術分野において知られている任意の方法を用いて識別することができる。ゲノムＤＮＡライブラリーは、ａｖｅＣおよびａｖｅＣ相同コーディング配列に関して、バクテリオファージについてはBenton and Davis, 1977, Science 196:180 に、そしてプラスミドライブラリーについてはGrunstein and Hogness, 1975, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 72:3961-3965 に記載の方法などの技法を用いてスクリーニングすることができる。ここでは、例えば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）中またはプラスミドｐＳＥ１１９（下の項目７に記載される）中にａｖｅＣ  ＯＲＦを含むことが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、これらスクリーニング実験においてプローブとして用いることができる。或いは、精製されたＡｖｅＣ相同遺伝子産物の部分的または完全なアミノ酸配列から推定されるヌクレオチドに該当するオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。
【００４７】
５．２．組換え系
５．２．１．クローニングベクターおよび発現ベクター
本発明は、更に、例えば、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦまたは任意のａｖｅＣ相同ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド分子をクローニングするまたは発現する場合に有用である組換えクローニングベクターおよび発現ベクターを提供する。非制限態様において、本発明は、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ遺伝子の完全なＯＲＦを含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を提供する。
【００４８】
Ｓ．avermitilisからのａｖｅＣ  ＯＲＦ、またはＳ．avermitilisからのａｖｅＣ  ＯＲＦまたはその一部分を含むポリヌクレオチド分子、またはＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物に関する次の説明はいずれも、明確にまたは状況によって示されない限り、ａｖｅＣ相同体およびＡｖｅＣ相同遺伝子産物に関する。
【００４９】
種々の異なったベクターは、特に、ファージ、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミドおよび大腸菌（E.coli）−Streptomycesシャトルベクターを含めた、Streptomycesにおいて特異的に用いるために開発されており、これらのいずれかを用いて、本発明を実施することができる。多数の薬物耐性遺伝子も、Streptomycesからクローン化されており、これら遺伝子のいくつかは、選択可能マーカーとしてベクター中に包含されている。Streptomycesにおいて用いるための現在のベクターの例は、特に、Hutchinson, 1980, Applied Biochem.Biotech. 16:169-190 に示されている。
【００５０】
本発明の組換えベクター、特に、発現ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のコーディング配列が、そのコーディング配列を転写および翻訳してポリペプチドを生じるのに必要な一つまたはそれ以上の調節要素と機能的に結合しているように構築される。本明細書中で用いられる“調節要素”という用語には、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびポリヌクレオチドコーディング配列の発現を誘導するおよび／または調節するのに役立つ当該技術分野において知られている他の要素をコードするヌクレオチド配列が含まれるがこれに制限されるわけではない。更に、本明細書中で用いられるように、コーディング配列は、調節要素が、コーディング配列の転写若しくはそのｍＲＮＡの翻訳または両方を有効に調節し且つ可能にする場合、一つまたはそれ以上の調節要素と“機能的に結合”している。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチド分子を含有するように遺伝子操作されうる典型的なプラスミドベクターには、特に、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＣＲ２．１（Invitrogen）、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（Promega）およびシャトルベクターｐＷＨＭ３（Vara et al., 1989, J.Bact. 171:5872-5881）が含まれる。
【００５２】
適当な調節要素と機能的に結合している特定のコーディング配列を含有する組換えベクターを構築するための方法は、当該技術分野において周知であり、これらを用いて本発明を実施することができる。これら方法には、in vitro組換え技術、合成技術、および in vivo 遺伝的組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., 1989, 上記；Ausubel et al., 1989, 上記；Sambrook et al., 1989, 上記；Innis et al., 1995, 上記；および Erlich, 1992, 上記に記載の技法を参照されたい。
【００５３】
これらベクターの調節要素は、強度および特異性が異なることがありうる。用いられる宿主／ベクター系に依って、多数の適当な転写および翻訳要素のいずれかを用いることができる。細菌に関する転写調節領域またはプロモーターの非制限例には、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター、そしてより具体的には、Streptomyces に関して、ｅｒｍＥ、ｍｅｌＣおよびｔｉｐＡのプロモーター等が含まれる。下の項目１１に記載の具体的な態様において、サッカロポリスポラ・エリトレア（Saccharopolyspora erythraea）からの強力な構成性ｅｒｍＥプロモーターに隣接してクローン化されたａｖｅＣ  ＯＲＦを含有した発現ベクターを生じさせた。ベクターをＳ．avermitilisに形質転換したが、引き続きの発酵生成物のＨＰＬＣ分析は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を代わりに発現する同様の菌株による生産と比較して増加した力価のアベルメクチン生産を示した。
【００５４】
融合タンパク質発現ベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物融合タンパク質を発現するのに用いることができる。精製された融合タンパク質は、ＡｖｅＣ遺伝子産物に対する高血清を増加させ、ＡｖｅＣ遺伝子産物の生化学的性状を研究し、異なった生化学的活性を有するＡｖｅＣ融合タンパク質を遺伝子操作し、または発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物の識別または精製を助けるのに用いることができる。可能な融合タンパク質発現ベクターには、β−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合、マルトース結合タンパク質融合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合、およびポリヒスチジン融合（担体領域）をコードする配列を包含するベクターが含まれるが、これに制限されるわけではない。別の態様において、ＡｖｅＣ遺伝子産物またはその一部分は、例えば、Ｓ．hygroscopicusまたはＳ．グリセオクロモジェネス（Ｓ．griseochromogenes）のような Streptomycesの別の種または菌株に由来するＡｖｅＣ相同遺伝子産物またはその一部分に融合することができる。下の項目１２に記載され且つ図７に示される具体的な態様において、Ｓ．hygroscopicus ａｖｅＣ相同ＯＲＦの５６４ｂｐ領域をＳ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦの相同な５６４ｂｐ領域の代わりに含有するキメラプラスミドを構築した。このようなハイブリッドベクターは、Ｓ．avermitilis細胞中に形質転換され且つ調べられて、例えば、生産される２：１クラスアベルメクチンの比率へのそれらの作用を確認することができる。
【００５５】
ＡｖｅＣ融合タンパク質は、精製に有用な領域を含むように遺伝子操作することができる。例えば、ＡｖｅＣ−マルトース結合タンパク質融合は、アミロース樹脂を用いて精製することができ；ＡｖｅＣ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製することができ；そしてＡｖｅＣ−ポリヒスチジン融合は、二価ニッケル樹脂を用いて精製することができる。或いは、担体タンパク質またはペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いることができる。例えば、単クローン性抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を遺伝子操作して、調節要素と機能的に結合した発現ベクターにし、発現されたエピトープがＡｖｅＣポリペプチドに融合するように位置させることができる。例えば、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ標識（International Biotechnologies Inc.）をコードするヌクレオチド配列は、親水性マーカーペプチドであり、標準的な技法によって発現ベクター中に、例えば、ＡｖｅＣポリペプチドのカルボキシル末端に該当する地点に挿入することができる。次に、発現されたＡｖｅＣポリペプチド−ＦＬＡＧ（商標）エピトープ融合生成物を、商業的に入手可能な抗ＦＬＡＧ（商標）抗体を用いて検出し且つアフィニティー精製することができる。
【００５６】
ＡｖｅＣ融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含有するように遺伝子操作することもできるので、発現されたＡｖｅＣポリペプチドは、特定のプロテアーゼを用いた処理によって担体領域または融合パートナーから放出されうる。例えば、融合タンパク質ベクターは、特に、トロンビンまたは因子Ｘａの切断部位をコードしているＤＮＡ配列を含むことができる。
【００５７】
ａｖｅＣ  ＯＲＦから上流のおよびそれを含む読み枠中のシグナル配列は、既知の方法によって発現ベクター中に遺伝子操作されて、発現される遺伝子産物の転送および分泌を支配することができる。シグナル配列の非制限例には、特に、α因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼおよびＴ細胞受容体からのものが含まれる。
【００５８】
本発明のクローニングベクターまたは発現ベクターを用いて形質転換されたまたはトランスフェクションされた宿主細胞の分泌を助けるために、ベクターは、リポーター遺伝子産物または他の選択可能マーカーのコーディング配列を更に含むように遺伝子操作することができる。このようなコーディング配列は、好ましくは、上記のように調節要素コーディング配列と機能的に結合している。本発明において有用なリポーター遺伝子は、当該技術分野において周知であり、特に、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥおよびチロシナーゼをコードしているものが含まれる。選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知であり、これには、抗生物質または代謝拮抗物質への耐性を与える遺伝子産物をコードする、または栄養要求必要条件を与えるものが含まれる。このような配列の例には、特に、エリスロマイシン、チオストレプトンまたはカナマイシンへの耐性をコードするものが含まれる。
【００５９】
５．２．２．宿主細胞の形質転換
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、およびそれに由来する新規な菌株または細胞系を提供する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくは、Streptomyces細胞であるが、他の原核細胞または真核細胞を用いることもできる。このような形質転換された宿主細胞には、典型的には、特に、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡのベクターを用いて形質転換された細菌、または組換えベクターを用いて形質転換された酵母のような微生物が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチド分子は、Streptomyces細胞中で機能するためのものであるが、例えば、クローニングまたは発現の目的のために、他の細菌または真核細胞中に形質転換することもできる。Ｅ．coli 菌株は、典型的には、例えば、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ），Rockville, ＭＤ，ＵＳＡ（受託番号３１３４３）から入手可能な、および市販元（Stratagene）からのＤＨ５α菌株などを用いることができる。好ましい真核宿主細胞には、酵母細胞が含まれるが、哺乳動物細胞または昆虫細胞を有効に利用することもできる。
【００６１】
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、実質的に均一な細胞培養物からの一つまたはそれ以上の宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクションされる。発現ベクターは、概して、既知の技法によって、例えば、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈降、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクロトポレーション、組換えウイルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、接合、またはマイクロプロジェクティルボンバード（microprojectile bombardment）などによって宿主細胞中に導入される。形質転換細胞の選択は、上記のように組換えベクターに関連した標準法によって、例えば、選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を発現する細胞について選択することによって行うことができる。
【００６２】
発現ベクターがいったん宿主細胞中に導入されると、宿主細胞染色体中かまたはエピソームによるａｖｅＣコーディング配列の組込みおよび維持は、標準的な技法によって、例えば、サザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含めたＰＣＲ分析、または予想される遺伝子産物を検出する免疫学的検定によって確認することができる。組換えａｖｅＣコーディング配列を含有するおよび／または発現する宿主細胞は、（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在を検出すること；（iii）宿主細胞中でのａｖｅＣ特異的ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルを評価すること；および（iv）例えば、免疫検定によってまたはＡｖｅＣ生物学的活性（例えば、Ｓ．avermitilis宿主細胞中でＡｖｅＣ活性を示す具体的な比率および量のアベルメクチン生産）の存在によって測定される成熟ポリペプチド生成物の存在を検出することを含めた、当該技術分野において周知である少なくとも４種類の一般的なアプローチのいずれかによって識別することができる。
【００６３】
５．２．３．組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の発現および特性決定
ａｖｅＣコーディング配列が適当な宿主細胞中に安定して導入されたら、その形質転換された宿主細胞をクローン増殖させ、そして得られた細胞を、ＡｖｅＣ遺伝子産物の最大生産を導く条件下で増殖させることができる。このような条件には、典型的には、細胞を高密度まで増殖させることが含まれる。発現ベクターが誘導プロモーターを含む場合、適当な誘導条件、例えば、温度シフト、栄養素の消耗、無償インデューサー（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のような炭水化物類似体）の添加、過剰の代謝副生成物の蓄積等などを、発現を誘導するのに必要とされるように用いる。
【００６４】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、それら細胞を採取し且つ溶解させ、そしてその溶解産物から、タンパク質分解を最小限にする当該技術分野において知られている条件下、例えば、４℃でまたはプロテアーゼインヒビターの存在下で、または両方などで生成物を単離し且つ精製する。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞から分泌される場合、消耗した栄養培地を単純に集めて、それから生成物を単離することができる。
【００６５】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物は、適宜、細胞溶解産物または培地から、次の方法、すなわち、硫酸アンモニウム沈降、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーの任意の組合せが含まれるがこれに制限されるわけではない標準法を用いて単離するまたは実質的に精製することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性を示す場合、その標品の増加純度は、適当な検定の使用によって精製法の各段階で監視することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性を示すにせよ示さないにせよ、それは、例えば、サイズ、またはそれ以外の場合にはＡｖｅＣに特異的な抗体との反応性に基づいて、または融合標識の存在によって検出することができる。本明細書中で用いられるＡｖｅＣ遺伝子産物は、その産物が特定の標品中の約２０重量％を越えるタンパク質を構成する場合に“実質的に精製”されている。更に、本明細書中で用いられるＡｖｅＣ遺伝子産物は、その産物が特定の標品中の少なくとも約８０重量％のタンパク質を構成する場合に“単離”されている。
【００６６】
本発明は、したがって、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列または図１（配列番号：２）のアミノ酸配列またはその実質的な部分およびその同族体を含む、組換え発現されて単離されたまたは実質的に精製されたＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物を提供する。
【００６７】
本発明は、更に、配列番号：４のアミノ酸配列またはその実質的な部分およびその同族体を含む、組換え発現されて単離されたまたは実質的に精製されたＳ．hygroscopicus ＡｖｅＣ相同遺伝子産物を提供する。
【００６８】
本発明は、更に、ＡｖｅＣ遺伝子産物を製造する方法であって、組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の生産を導く条件下で培養し、このベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子であって、宿主細胞中のポリヌクレオチド分子の発現を制御する一つまたはそれ以上の調節要素と機能的に結合しているポリヌクレオチド分子を含み、そして細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む方法を提供する。
【００６９】
組換え発現されたＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ＡｖｅＣ遺伝子産物機能を変化させ、それによってアベルメクチン生合成を調節する化合物をスクリーニングすること、およびＡｖｅＣ遺伝子産物に対して向けられる抗体を増加させることを含めたいろいろな目的に有用である。
【００７０】
充分な純度のＡｖｅＣ遺伝子産物が得られたら、それを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、アベルメクチン生合成経路で適当な生成物を生産する場合の生物学的活性等を含めた標準法によって特性決定することができる。例えば、ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列は、標準的なペプチド配列決定法を用いて決定することができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物は、親水性分析（例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3824 を参照されたい）または類似のソフトウェアアルゴリズムを用いて、ＡｖｅＣ遺伝子産物の疎水性領域および親水性領域を決定するように更に特性決定することができる。構造分析は、具体的な二次構造を推定するＡｖｅＣ遺伝子産物の領域を決定するように行うことができる。Ｘ線結晶学（Engstrom, 1974, Biochem.Exp.Biol. 11:7-13）、計算機モデル製作（Fletterick and Zoller (eds), 1986, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）、および核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような生物物理学的方法は、ＡｖｅＣ遺伝子産物とその基質との間の相互作用部位を地図作製し且つ研究するのに用いることができる。これら研究から得られる情報を用いて、ａｖｅＣ  ＯＲＦ中の突然変異のための新規な部位を選択して、より望ましいアベルメクチン生産特性を有する新規なＳ．avermitilis菌株を開発させることができる。
【００７１】
５．３．ＡｖｅＣ突然変異体の構築および使用
本発明は、Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体、またはプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列またはその縮重変異体、または図１（配列番号：１）に示されるＳ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列またはその縮重変異体とそれ以外は同様であるが、一つまたはそれ以上の突然変異を更に含むので、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したヌクレオチド配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチド分子を発現するＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilis菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞によって生産されるのとは異なった比率または量のアベルメクチンを生産するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７２】
本発明により、このようなポリヌクレオチド分子を用いて、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株と比較されるアベルメクチン生産の検出可能な変化を示す新規なＳ．avermitilis菌株を生じることができる。好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株と比較して減少した２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに有用である。更に好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、単一の野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株と比較して増加したレベルのアベルメクチンを生産する新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに有用である。更に好ましい態様において、このようなポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子が失活した新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに有用である。
【００７３】
ａｖｅＣ対立遺伝子またはコーディング配列の突然変異には、一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、付加または置換をＡｖｅＣ遺伝子産物中に導入する、またはＡｖｅＣ遺伝子産物の切断を引き起こす、またはその任意の組合せ、および所望の結果を生じる任意の突然変異が含まれる。このような突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子配列は、それらの任意の縮重変異体を含むことも意味する。例えば、本発明は、ａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体、またはプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列またはその縮重変異体、または図１（配列番号：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列またはその縮重変異体のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供するが、これは、ＡｖｅＣ遺伝子産物中の選択された位置におけるアミノ酸残基の異なったアミノ酸残基との置換をコードする一つまたはそれ以上の突然変異を更に含む。下に例示されるいくつかの非制限態様において、このような置換は、配列番号：２のアミノ酸３８位、４８位、５５位、８９位、９９位、１１１位、１３６位、１３８位、１３９位、１５４位、１７９位、２２８位、２３０位、２３８位、２６６位、２７５位、２８９位または２９８位、またはそのいくつかの組合せに該当するＡｖｅＣ遺伝子産物の任意のアミノ酸位置で行われうる。
【００７４】
ａｖｅＣコーディング配列への突然変異は、誤りがちのＰＣＲの使用またはカセット突然変異誘発によることを含めたいろいろな既知の方法のいずれかによって行われる。例えば、オリゴヌクレオチドに支配された突然変異誘発を用いて、ａｖｅＣ対立遺伝子またはＯＲＦの配列を一定方法で、例えば、一つまたはそれ以上の制限部位、または終止コドンをａｖｅＣ対立遺伝子またはＯＲＦ内の特定の領域に導入するように変更することができる。米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８３０，７２１号および米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、ランダムフラグメント化、突然変異誘発の反復サイクルおよびヌクレオチドシャッフリング（shuffling）を含む方法は、ａｖｅＣ突然変異をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの大型ライブラリーを生じるのに用いることもできる。
【００７５】
標的突然変異は、特に、それらがＡｖｅＣ遺伝子産物中の一つまたはそれ以上の保存アミノ酸残基を変更するのに役立つ場合に有用でありうる。例えば、図６に示されるように、Ｓ．avermitilis（配列番号：２）、Ｓ．griseochromogenes（配列番号：５）およびＳ．hygroscopicus（配列番号：４）からのＡｖｅＣ遺伝子産物およびＡｖｅＣ相同遺伝子産物の推定のアミノ酸配列の比較は、これら種間のアミノ酸残基の有意の保存部位を示す。これら保存アミノ酸残基の一つまたはそれ以上の変化をもたらす標的突然変異誘発は、アベルメクチン生産の望ましい変更を示す新規な突然変異菌株を生じる場合に特に有効でありうる。
【００７６】
ランダム突然変異誘発も有用でありうるが、Ｓ．avermitilisの細胞を紫外線またはｘ線に、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、スルホン酸エチルメタン、亜硝酸またはナイトロジェンマスタードのような化学的突然変異原に暴露することによって行うことができる。突然変異誘発技術の概説については、例えば、Ausubel, 1989, 上記を参照されたい。
【００７７】
突然変異したポリヌクレオチド分子をいったん生じたら、それらをスクリーニングして、それらがＳ．avermitilis中でアベルメクチン生合成を調節しうるかどうか確認する。好ましい態様において、突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ａｖｅＣ遺伝子が失活してａｖｅＣネガティブ（ａｖｅＣ-）バックグラウンドを与えるＳ．avermitilis菌株を相補することによって調べる。非制限法において、突然変異したポリヌクレオチド分子をスプライシングして、一つまたはそれ以上の調節要素と機能的に結合した発現プラスミドにするが、このプラスミドは、好ましくは、形質転換された細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上の薬物耐性遺伝子も含む。次に、このベクターを、既知の技法を用いてａｖｅＣ-宿主細胞に形質転換し、そして形質転換された細胞を選択し、適当な発酵培地中においてアベルメクチン生産を可能にするまたは誘導する条件下で培養する。次に、発酵生成物をＨＰＬＣによって分析して、突然変異したポリヌクレオチド分子の宿主細胞を相補する能力を確認する。ｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、ｐＳＥ２３１、ｐＳＥ２３９およびｐＳＥ２９０〜ｐＳＥ２９７を含めた、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させることができる突然変異したポリヌクレオチド分子を有するいくつかのベクターを、下の項目８．３に例示する。
【００７８】
本発明は、生産されるアベルメクチンの比率および／または量を変更することができるＳ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異を識別する方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異を識別する方法であって、（ａ）それに対して天然のａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されていて且つ発現されるＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を決定し；（ｂ）工程（ａ）の場合と同様のＳ．avermitilis菌株の細胞であるが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子または図１（配列番号：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列またはそれに相同であるヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を決定し；そして（ｃ）工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して；工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率が、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と異なる場合、アベルメクチンの２：１クラス比率を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦの突然変異が識別されているようにすることを含む方法を提供する。好ましい態様において、アベルメクチンの２：１クラス比率は突然変異によって減少する。
【００７９】
更に好ましい態様において、本発明は、生産されるアベルメクチンの量を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦまたはａｖｅＣ  ＯＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を識別する方法であって、（ａ）それに対して天然のａｖｅＣ対立遺伝子が失活していて、しかも突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むまたはＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されていて且つ発現されるＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量を決定し；（ｂ）工程（ａ）の場合と同様のＳ．avermitilis菌株の細胞であるが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子またはそれに相同であるヌクレオチド配列だけを代わりに発現する細胞によって生産されるアベルメクチンの量を決定し；そして（ｃ）工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量を、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量と比較して；工程（ａ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチンの量が、工程（ｂ）のＳ．avermitilis細胞によって生産されるアベルメクチン量と異なる場合、アベルメクチンの量を変更することができるａｖｅＣ  ＯＲＦまたは遺伝子構築物の突然変異が識別されているようにすることを含む方法を提供する。好ましい態様において、アベルメクチンの量は突然変異によって増加する。
【００８０】
突然変異を識別する前述の方法はいずれも、好ましくは、シクロヘキサンカルボン酸を補足した発酵培地を用いて行われるが、表１に挙げられる脂肪酸前駆体のいずれか一つのような他の適当な脂肪酸前駆体を用いることもできる。
【００８１】
アベルメクチン生産を望ましい方向に調節する突然変異したポリヌクレオチド分子がいったん識別されたら、ヌクレオチド配列中の突然変異の位置を決定することができる。例えば、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、ＰＣＲによって単離され且つ既知の方法を用いてＤＮＡ配列分析を行うことができる。突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列を野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のそれと比較することにより、アベルメクチン生産の変更の原因となる一つまたは複数の突然変異を決定することができる。本発明の具体的であるが非制限の態様において、残基５５（Ｓ５５Ｆ）、１３８（Ｓ１３８Ｔ）、１３９（Ａ１３９Ｔ）または２３０（Ｇ２３０Ｄ）のいずれかにおける単一アミノ酸置換かまたは、１３８位（Ｓ１３８Ｔ）および１３９位（Ａ１３９ＴまたはＡ１３９Ｆ）における二重置換を含むＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物は、生産される２：１クラスアベルメクチンの比率が変更されたようなＡｖｅＣ遺伝子産物機能の変化を生じたが（下の項目８を参照されたい）、ここにおいて、挙げられるアミノ酸位置は、図１（配列番号：２）に示される位置に該当する。更に、次の７種類の突然変異組合せはそれぞれ、アベルメクチンの２：１クラス比率を有効に減少させることが示されている。（１）Ｄ４８Ｅ／Ａ８９Ｔ；（２）Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；（３）Ｑ３８Ｐ／Ｌ１３６Ｐ／Ｅ２３８Ｄ；（４）Ｆ９９Ｓ／Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；（５）Ａ１３９Ｔ／Ｍ２２８Ｔ；（６）Ｇ１１１Ｖ／Ｐ２８９Ｌ；（７）Ａ１３９Ｔ／Ｋ１５４Ｅ／Ｑ２９８Ｈ。本明細書中で用いられるＡ１３９Ｔのような前述の表示は、この場合はポリペプチドの１３９位（配列番号：２に関して）である指示位置にある、この場合はアラニン（Ａ）である一文字表示による元のアミノ酸残基の後に、この場合はトレオニン（Ｔ）である元のアミノ酸残基に置換するアミノ酸残基を示している。したがって、アミノ酸３８位、４８位、５５位、８９位、９９位、１１１位、１３６位、１３８位、１３９位、１５４位、１７９位、２２８位、２３０位、２３８位、２６６位、２７５位、２８９位または２９８位（図１を参照されたい）の一つまたはそれ以上にアミノ酸の置換または欠失、またはその任意の組合せを含む突然変異したＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、本発明によって包含される。
【００８２】
好ましい態様において、このような突然変異は、次から成る群の一つまたはそれ以上より選択されるアミノ酸置換をコードする。
（ａ）ＰまたはＰに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される３８位のアミノ酸残基Ｑ；
（ｂ）ＥまたはＥに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される４８位のアミノ酸残基Ｄ；
（ｃ）ＴまたはＴに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される８９位のアミノ酸残基Ａ；
（ｄ）ＳまたはＳに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される９９位のアミノ酸残基Ｆ；
（ｅ）ＶまたはＶに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１１１位のアミノ酸残基Ｇ；
（ｆ）ＰまたはＰに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１３６位のアミノ酸残基Ｌ；
（ｇ）ＴまたはＴに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１３８位のアミノ酸残基Ｓ；
（ｈ）ＴまたはＦ、またはＴまたはＦに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１３９位のアミノ酸残基Ａ；
（ｉ）ＥまたはＥに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１５４位のアミノ酸残基Ｋ；
（ｊ）ＳまたはＳに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される１７９位のアミノ酸残基Ｇ；
（ｋ）ＴまたはＴに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される２２８位のアミノ酸残基Ｍ；
（ｌ）ＤまたはＤに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される２３８位のアミノ酸残基Ｅ；
（ｍ）ＬまたはＬに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される２８９位のアミノ酸残基Ｐ；および
（ｎ）ＨまたはＨに代わる保存的置換であるアミノ酸で置換される２９８位のアミノ酸残基Ｑ。
ここにおいて、保存的アミノ酸置換は、上の項目５．１に定義の通りである。
【００８３】
更に好ましい態様において、このような突然変異は、置換されるアミノ酸残基の組合せが、次から成る群より選択されるアミノ酸置換の組合せをコードする。
（ａ）アミノ酸残基Ｓ１３８およびＡ１３９；
（ｂ）アミノ酸残基Ｄ４８およびＡ８９；
（ｃ）アミノ酸残基Ｓ１３８、Ａ１３９およびＧ１７９；
（ｄ）アミノ酸残基Ｑ３８、Ｌ１３６およびＥ２３８；
（ｅ）アミノ酸残基Ｆ９９、Ｓ１３８、Ａ１３９およびＧ１７９；
（ｆ）アミノ酸残基Ａ１３９およびＭ２２８；
（ｇ）アミノ酸残基Ｇ１１１およびＰ２８９；および
（ｈ）アミノ酸残基Ａ１３９、Ｋ１５４およびＱ２９８。
【００８４】
更に好ましい態様において、本発明によるアベルメクチンの２：１クラス比率を有効に減少させる場合に有用なａｖｅＣ対立遺伝子中の具体的な突然変異組合せは、次から成る群の一つまたはそれ以上より選択される。
【００８５】
（ａ）Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ；
（ｂ）Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｆ；
（ｃ）Ｄ４８Ｅ／Ａ８９Ｔ；
（ｄ）Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；
（ｅ）Ｑ３８Ｐ／Ｌ１３６Ｐ／Ｅ２３８Ｄ；
（ｆ）Ｆ９９Ｓ／Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；
（ｇ）Ａ１３９Ｔ／Ｍ２２８Ｔ；
（ｈ）Ｇ１１１Ｖ／Ｐ２８９Ｌ；および
（ｉ）Ａ１３９Ｔ／Ｋ１５４Ｅ／Ｑ２９８Ｈ。
本発明は、更に、新規なＳ．avermitilis菌株を製造するための組成物であって、その菌株の細胞が、アベルメクチン生産の変更を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を含有する組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子のいずれかをＳ．avermitilis染色体のａｖｅＣ遺伝子の部位に集中させて、ａｖｅＣ対立遺伝子またはＯＲＦまたはその一部分に挿入するかまたは相同的組換えによって置換するのに用いることができる組換えベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、これによって提供される本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子以外の部位でＳ．avermitilis染色体中に挿入された場合、またはＳ．avermitilis細胞中でエピソームによって維持された場合、アベルメクチン生合成を調節するように機能することもありうる。したがって、本発明は、更に、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターであって、ａｖｅＣ遺伝子以外のＳ．avermitilis染色体中の部位にポリヌクレオチド分子を挿入するのに、またはエピソームによって維持されるように用いることができるベクターを提供する。
【００８６】
好ましい態様において、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体をＳ．avermitilis菌株の細胞中に挿入し、それによって、その細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して変更された２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する新規なＳ．avermitilis菌株を生じるのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。好ましい態様において、それら細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率は減少する。このような遺伝子置換ベクターは、これによって提供される発現ベクター、例えば、ｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９およびｐＳＥ２３１のような下の項目８に例示される発現ベクター中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる。
【００８７】
更に好ましい態様において、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体をＳ．avermitilis菌株の細胞中に挿入して、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して変更された量のアベルメクチンを生産する細胞の新規な菌株を生じるのに用いることができるベクターを提供する。好ましい態様において、それら細胞によって生産されるアベルメクチンの量は増加する。具体的であるが非制限の態様において、このようなベクターは、当該技術分野において知られている強力なプロモーター、例えば、ａｖｅＣ対立遺伝子から上流に位置し且つそれと機能的に結合している Saccharopolyspora erythraeaからの強力な構成性ｅｒｍＥプロモーターなどを更に含む。このようなベクターは、下の実施例１１に記載のプラスミドｐＳＥ１８９でありうるし、またはプラスミドｐＳＥ１８９の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を用いて構築することができる。
【００８８】
更に好ましい態様において、本発明は、Ｓ．avermitilisの野生型菌株中のａｖｅＣ遺伝子を失活させるのに有用である遺伝子置換ベクターを提供する。非制限態様において、このような遺伝子置換ベクターは、下の項目８．１に例示される（図３）プラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる。本発明は、更に、例えば、図１（配列番号：１）に示されるフランキングヌクレオチド配列を含めた、Ｓ．avermitilis染色体中の原位置のａｖｅＣ遺伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列を含むまたはから成るポリヌクレオチド分子を含む遺伝子置換ベクターであって、Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦを欠失するのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。
【００８９】
本発明は、更に、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して変更された比率および／または量のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞と比較して変更された２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較されるその突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更する遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を有するベクターを用いてＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そして野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する菌株の細胞によって生産される２：１クラス比率と比較して変更された２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。より好ましい態様において、本発明は、新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、このような細胞のａｖｅＣ対立遺伝子中に突然変異を導入することができるベクターを用いてＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換することを含み、ここにおいて、ａｖｅＣ対立遺伝子への突然変異は、ａｖｅＣ対立遺伝子がそのように突然変異したＳ．avermitilis菌株の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様のＳ．avermitilis菌株の細胞によって生じる比率とは異なる２：１クラス比率のアベルメクチンを生産するように、コードされたＡｖｅＣ遺伝子産物中において、配列番号：２のアミノ酸残基３８、４８、５５、８９、９９、１１１、１３６、１３８、１３９、１５４、１７９、２２８、２３０、２３８、２６６、２７５、２８９または２９８に該当する一つまたはそれ以上のアミノ酸位置で異なったアミノ酸残基の置換を引き起こす方法を提供する。好ましい態様において、アベルメクチンの変更された２：１クラス比率は減少する。
【００９０】
本明細書中で用いられるように、Ｓ．avermitilis染色体中の、または本発明のベクターまたは単離されたポリヌクレオチド分子中のａｖｅＣ対立遺伝子によってコードされるアミノ酸残基が、配列番号：２の具体的なアミノ酸残基“に該当する”と称される場合、またはアミノ酸置換が、配列番号：２の特定の番号のアミノ酸残基の置換“に該当する”具体的な位置に存在すると称される場合、これは、当業者が、本明細書中において配列番号：２として示されるアミノ酸配列を参照して速やかに決定することができるＡｖｅＣ遺伝子産物中の同様の相対位置にあるアミノ酸残基を意味するものである。
【００９１】
本発明は、更に、具体的な突然変異をコードしているａｖｅＣ対立遺伝子中の特定の突然変異が、配列番号：１に示される具体的なヌクレオチド位置“に該当する”ａｖｅＣ対立遺伝子中の特定のヌクレオチド位置の塩基変化として挙げられる新規な菌株を製造する方法を提供する。該当するアミノ酸位置に関して上記と同様に、ａｖｅＣ対立遺伝子中のヌクレオチド位置が、配列番号：１中の具体的なヌクレオチド位置“に該当する”と称される場合、これは、当業者が、本明細書中において配列番号：１として示されるヌクレオチド配列を参照して速やかに決定することができるａｖｅＣヌクレオチド配列中の同様の相対位置にあるヌクレオチドを意味するものである。
【００９２】
更に好ましい態様において、本発明は、変更された量のアベルメクチンを生産する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物であって、その発現が、単一の野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較される、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または遺伝子構築物を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量の変化を引き起こすものを有するベクターを用いてＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そして単一の野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの量と比較して変更された量でアベルメクチンを生産する形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。好ましい態様において、形質転換された細胞中で生産されるアベルメクチンの量は増加する。
【００９３】
更に好ましい態様において、本発明は、その細胞が失活したａｖｅＣ対立遺伝子を含む新規なＳ．avermitilis菌株を製造する方法であって、ａｖｅＣ対立遺伝子を失活するベクターを用いて、任意のａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞を形質転換し、そしてａｖｅＣ対立遺伝子が失活している形質転換された細胞を選択することを含む方法を提供する。好ましいが非制限の態様において、Ｓ．avermitilis菌株の細胞を、突然変異によってまたはａｖｅＣ対立遺伝子の一部分の相同遺伝子配列との置換によって失活したａｖｅＣ対立遺伝子を有する遺伝子置換ベクターを用いて形質転換し、そしてそれに対してそれ以外は天然のａｖｅＣ対立遺伝子が、失活したａｖｅＣ対立遺伝子で置換されている形質転換された細胞を選択する。ａｖｅＣ対立遺伝子の失活は、下記のように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって確認することができる。下の項目８．１に記載の具体的であるが非制限の態様において、ａｖｅＣ対立遺伝子は、Saccharopolyspora erythraeaからのｅｒｍＥ遺伝子のａｖｅＣ  ＯＲＦ中への挿入によって失活する。
【００９４】
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチド分子またはベクターのいずれかを用いて形質転換された細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を提供する。好ましい態様において、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、またはに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体を発現する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株であって、その細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して変更された２：１クラス比率でアベルメクチンを生産する新規な菌株を提供する。好ましい態様において、その新規な細胞によって生産される変更された２：１クラス比率は減少する。このような新規な菌株は、ドラメクチンのような商業的に望まれるアベルメクチンの大規模生産において有用である。より好ましい態様において、本発明は、本明細書中の上に示されるもの、またはそれ以外はＡｖｅＣ遺伝子産物中の前述のアミノ酸置換のいずれかをコードするものに該当するヌクレオチド位置にａｖｅＣ対立遺伝子中の前述の突然変異または突然変異組合せのいずれかを含むＳ．avermitilis細胞を提供する。このような突然変異は、このような細胞中においてプラスミドのような染色体外要素上に存在しうるが、このような突然変異は、Ｓ．avermitilis染色体上に位置するａｖｅＣ対立遺伝子中に存在することが好ましい。好ましい態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸残基３８、４８、５５、８９、９９、１１１、１３６、１３８、１３９、１５４、１７９、２２８、２３０、２３８、２６６、２７５、２８９または２９８に該当する一つまたはそれ以上のアミノ酸位置に置換を有するＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするａｖｅＣ対立遺伝子中に突然変異を有する細胞であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現する同様のＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産される比率とは異なる２：１クラス比率のアベルメクチンを生産する細胞を含む Streptomyces avermitilis菌株を提供する。
【００９５】
Ｓ．avermitilis細胞中においてその発現が、生産される２：１クラスアベルメクチンの比率を変更する、より詳しくは、減少するａｖｅＣ遺伝子の突然変異した対立遺伝子を識別することは、本明細書中に記載のスクリーニング検定の主な目的である。好ましい態様において、本発明の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体を発現する本発明の新規なＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるＢ２：Ｂ１アベルメクチンの比率は、約１．６：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約１：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．８４：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．８０：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．７５：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．７３：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．６８：１またはそれより小さい。なお一層好ましい態様において、その比率は約０．６７：１またはそれより小さい。より好ましい態様において、その比率は約０．５７：１またはそれより小さい。なお一層好ましい態様において、その比率は約０．５３：１またはそれより小さい。なお一層好ましい態様において、その比率は約０．４２：１またはそれより小さい。なお一層好ましい態様において、その比率は約０．４０：１またはそれより小さい。
【００９６】
下記の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを１．６：１より小さい比率で生産する。下記の別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．９４：１の比率で生産する。下記の更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．８８：１の比率で生産する。下記の更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．８４：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．７５：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．７３：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．６８：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．６７：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．５７：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．５３：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４２：１の比率で生産する。下記のまた更に別の具体的な態様において、本発明の新規な細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１の比率で生産する。
【００９７】
更に好ましい態様において、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、またはに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体、またはａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体を含む遺伝子構築物を発現する細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株であって、その細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較して変更された量のアベルメクチンを生産する新規な菌株を提供する。好ましい態様において、その新規な菌株は、増加した量のアベルメクチンを生産する。非制限態様において、その遺伝子構築物は、ａｖｅＣ  ＯＲＦから上流の且つそれと機能的に結合している、Saccharopolyspora erythraeaからの強力な構成性ｅｒｍＥプロモーターのような強力なプロモーターを更に含む。
【００９８】
更に好ましい態様において、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が失活している細胞を含む新規なＳ．avermitilis菌株を提供する。このような菌株は、それらが生産するアベルメクチンの野生型菌株と比較して異なったスペクトルにも、ａｖｅＣ遺伝子の標的またはランダム突然変異誘発がアベルメクチン生産に影響を与えるかどうか確認するための本明細書中に記載の相補性スクリーニング検定においても有用である。下記の具体的な態様では、Ｓ．avermitilis宿主細胞を遺伝子操作して、失活したａｖｅＣ遺伝子を含有させた。例えば、下の実施例に記載される菌株ＳＥ１８０−１１は、ａｖｅＣコーディング領域中へのｅｒｍＥ耐性遺伝子の挿入によってＳ．avermitilis ａｖｅＣ遺伝子を失活させるように構築された遺伝子置換プラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）（図３）を用いて生じた。
【００９９】
本発明は、更に、本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいずれかによってコードされる組換え発現された突然変異したＳ．avermitilis ＡｖｅＣ遺伝子産物、およびそれを製造する方法を提供する。
【０１００】
本発明は、更に、アベルメクチンを製造する方法であって、Ｓ．avermitilis菌株の細胞であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を変更する遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞を、それからのアベルメクチン生産を可能にするまたは誘導する条件下の培地中で培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含む方法を提供する。好ましい態様において、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞によって培地中で生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率は減少する。この方法は、ドラメクチンのような商業的に価値のあるアベルメクチンの増加した生産効率を提供する。
【０１０１】
本発明は、更に、アベルメクチンを製造する方法であって、Ｓ．avermitilis菌株の細胞であって、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または遺伝子構築物を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または遺伝子構築物を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産される変更された量のアベルメクチンの生産を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現する細胞を、それからのアベルメクチン生産を可能にするまたは誘導する条件下の培地中で培養し、そしてその培養物からアベルメクチンを回収することを含む方法を提供する。好ましい態様において、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子、縮重変異体または遺伝子構築物を発現する細胞によって培地中で生産されるアベルメクチンの量は増加する。
【０１０２】
本発明は、更に、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現する同様の菌株の細胞と比較される突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子または縮重変異体を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率を減少する遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子またはその縮重変異体を発現するＳ．avermitilis菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの新規な組成物であって、この組成物中のアベルメクチンが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．avermitilisの同様の菌株の細胞によって生産されるアベルメクチンの２：１クラス比率と比較して減少した２：１クラス比率で生産される新規な組成物を提供する。新規なアベルメクチン組成物は、消耗した発酵培養液中で生産されるように存在しうるし、またはそれから採取することができる。新規なアベルメクチン組成物は、硫酸アンモニウム沈降、透析、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等のような既知の生化学的精製技術によって培養液から部分的にまたは実質的に精製することができる。
【０１０３】
５．４．アベルメクチンの使用
アベルメクチンは、駆虫薬、外部寄生生物撲滅薬、殺虫薬およびダニ駆除薬として特に有用な極めて活性な抗寄生生物薬である。本発明の方法によって製造されるアベルメクチン化合物は、これら目的のいずれにも有用である。例えば、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、ヒトにおける種々の疾患または状態、特に、当該技術分野において知られている寄生生物感染によって引き起こされる場合の疾患または状態を治療するのに有用である。例えば、Ikeda and Omura, 1997, Chem.Rev. 97(7):2591-2609 を参照されたい。より詳しくは、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、ヒト、家畜、ブタ、ヒツジ、家禽、ウマまたはウシに感染しうる寄生線虫のような内部寄生生物によって引き起こされる種々の疾患または状態を治療する場合に有用である。
【０１０４】
より詳しくは、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、ヒトに感染する線虫、更には、様々な動物種に感染する線虫に対して有効である。このような線虫には、鉤虫属（Ancylostoma）アメリカ鉤虫属（Necator）、回虫属（Ascaris）、ストロンギロイデス属（Strongyloides）、旋毛虫属（Trichinella）、毛頭虫属（Capillaria）、鞭虫属（Trichuris）、蟯虫属（Enterobius）、イヌ糸状虫（Dirofilaria）のような胃腸寄生虫、およびフィラリア蠕虫のように血液または他の組織若しくは器官中で、および Strongyloidesおよび Trichinellaの腸管内状態抽出物中で見出される寄生虫が含まれる。
【０１０５】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、例えば、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、クロバエ類、刺咬性昆虫、または特にウシおよびウマに影響を与えることがありうる移行性双翅類幼虫によって引き起こされる哺乳類および鳥類の節足動物外寄生を含めた外部寄生生物感染を治療する場合にも有用である。
【０１０６】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、例えば、特に、ゴキブリ、イガ、カツオブシムシおよびイエバエなどの家庭害虫、更には、貯蔵穀物および農業用植物の害虫であって、クモダニ、アリマキ、イモムシおよび、特にバッタのような直翅類昆虫を含む害虫に対する殺虫剤としても有用である。
【０１０７】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物を用いて治療することができる動物には、ヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ヤギ、ブタ、家禽を含めた鳥類、およびイヌおよびネコが含まれる。
【０１０８】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、具体的な予定の使用、治療される宿主動物の具体的な種、および関与する寄生生物および昆虫に適した製剤中で投与される。殺寄生生物薬としての使用には、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物を、カプセル剤、大型丸剤、錠剤または液状飲薬の形で経口投与することができるし、または他に、ポアオン（pour-on）として、または注射によって、または植込錠として投与することができる。このような製剤は、標準的な獣医学慣例によって慣用的に製造される。したがって、カプセル剤、大型丸剤または錠剤は、デンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム等のような崩壊剤および／または結合剤を更に含有する適当な微粉希釈剤または担体と一緒に活性成分を混合することによって製造することができる。飲薬製剤は、分散助剤または湿潤剤等と一緒に水溶液中に活性成分を分散させることによって製造することができる。注射用製剤は、滅菌液剤の形で製造することができ、これは、他の物質、例えば、その溶液を血液と等張にするのに充分な塩類および／またはグルコースなどを含有しうる。
【０１０９】
このような製剤は、活性化合物の重量に関して、患者、または治療される宿主動物の種、感染の重症度および種類、および宿主の体重に依って異なるであろう。概して、経口投与には、１回用量としてまたは分割用量で与えられる約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者または動物の体重）の用量の活性化合物が適当であろう。しかしながら、臨床症状に基づいて、例えば、医師または獣医師によって決定されるように、より高いまたはより低い投薬量範囲が指示される場合がありうる。
【０１１０】
他に、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、動物用飼料と組み合わせて投与しうるが、この目的には、普通の動物用試料と混合するための濃厚飼料添加物またはプレミックスを製造することができる。
【０１１１】
殺虫剤としての使用に、および農業病害虫を処理するために、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、標準的な農学慣例によって、噴霧剤、散布剤、乳剤等として適用することができる。
【０１１２】
６．実施例：Streptomyces avermitilisの発酵およびＢ２：Ｂ１アベルメクチン分析
分岐状鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ両方の活性を欠く菌株は、発酵培地に脂肪酸を補足されない場合、アベルメクチンを産生しない。この実施例は、このような突然変異体において、いろいろな脂肪酸の存在下で生合成が開始される場合、広範囲のＢ２：Ｂ１比のアベルメクチンを得ることができるということを示す。
【０１１３】
６．１．材料および方法
Streptomyces avermitilis ＡＴＣＣ５３６９２を、Starch（Nadex, Laing National）−２０ｇ；Pharmamedia（Trader's Protein, Memphis, ＴＮ）−１５ｇ；Ardamine ｐＨ（Yeast Products Inc.）−５ｇ；炭酸カルシウム−１ｇから成る種培地中で調製された全ブイヨンとして−７０℃で貯蔵した。最終容量は、水道水を用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１１４】
上の標品の融解懸濁液２ｍｌを用いて、５０ｍｌの同培地が入っているフラスコに接種した。２８℃においてロータリーシェーカー上、１８０ｒｐｍで４８時間インキュベーション後、２ｍｌのブイヨンを用いて、Starch−８０ｇ；炭酸カルシウム−７ｇ；Pharmamedia−５ｇ；リン酸水素二カリウム−１ｇ；硫酸マグネシウム−１ｇ；グルタミン酸−０．６ｇ；硫酸第一鉄七水和物−０．０１ｇ；硫酸亜鉛−０．００１ｇ；硫酸マンガン−０．００１ｇから成る生産培地５０ｍｌが入っているフラスコに接種した。最終容量は、水道水を用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１１５】
種々のカルボン酸基質（表１を参照されたい）を、メタノール中に溶解させ、接種から２４時間後に発酵ブイヨンに加えて、０．２ｇ／リットルの最終濃度にした。その発酵ブイヨンを２８℃で１４日間インキュベート後、ブイヨンを遠心分離し（２，５００ｒｐｍ，２分間）、上澄みを傾瀉した。菌糸体ペレットを、アセトン（１５ｍｌ）を用いて、次にジクロロメタン（３０ｍｌ）を用いて抽出し、有機相を分離し、濾過した後、蒸発乾固させた。残留物をメタノール（１ｍｌ）中に取り、そして２４０ｎｍで設定された走査型ダイオードアレイ検出器を装備したHewlett-Packard １０９０Ａ液体クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣによって分析した。用いられたカラムは、４０℃で維持されたBeckmann Ultrasphere Ｃ−１８、５μｍ、４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムであった。２５μｌの上のメタノール溶液をカラムに注入した。溶離は、８０：２０〜９５：５のメタノール−水の直線勾配を用いて０．８５ｍｌ／分で４０分間にわたって行った。２種類の標準濃度のシクロヘキシルＢ１を用いて、検出器応答を検量し、Ｂ２およびＢ１のアベルメクチンの曲線下面積を測定した。
【０１１６】
６．２．結果
Ｂ２およびＢ１のアベルメクチンについて認められたＨＰＬＣ保持時間、および２：１比率を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
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表１に示されるデータは、極めて広範囲のＢ２：Ｂ１アベルメクチン生成物比を示し、供給される脂肪酸側鎖スターター単位の性状に依って、クラス２化合物のクラス１化合物への脱水変換の結果に顕著な差が示される。これは、ＡｖｅＣタンパク質への変更によって生じるＢ２：Ｂ１比の変化が、特定の基質に特異的でありうるということを示す。したがって、特定の基質を用いて得られるＢ２：Ｂ１比の変化を示す突然変異体に関するスクリーニングは、その基質の存在下で行われる必要がある。引き続きの下記の実施例は、シクロヘキサンカルボン酸をスクリーニング基質として用いる。しかしながら、この基質は、単に本発明の可能性を示すのに用いられ、発明の適応性を制限するものではない。
【０１１８】
７．実施例：ａｖｅＣ遺伝子の単離
この実施例は、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするStreptomyces avermitilis染色体のある領域の単離および特性決定を記載する。下に示されるように、ａｖｅＣ遺伝子は、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２対シクロヘキシル−Ｂ１（Ｂ２：Ｂ１）アベルメクチンの比率を変更可能と識別された。
【０１１９】
７．１．材料および方法
７．１．１．ＤＮＡ単離用の Streptomycesの成長
次の方法を、Streptomycesを成長させるために行った。Ｓ．avermitilis ＡＴＣＣ３１２７２の単集落（単集落分離物＃２）を、Difco Yeast Extract−５ｇ；Difco Bactoペプトン−５ｇ；デキストロース−２．５ｇ；ＭＯＰＳ−５ｇ；Difco Bacto寒天−１５ｇを含有する１／２強度ＹＰＤ−６上で分離した。最終容量は、ｄＨ2Ｏを用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．０に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１２０】
上の培地中で成長した菌糸体を用いて、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中の１０ｍｌのＴＳＢ培地（Difco Tryptic Soy Broth−３０ｇ，１リットルｄＨ2Ｏ中，１２１℃で２５分間オートクレーブ処理される）に接種し、これを２８℃で振とうしながら（３００ｒｐｍ）４８〜７２時間維持した。
【０１２１】
７．１．２．Streptomycesからの染色体ＤＮＡ単離
上記のように成長した菌糸体のアリコート（０．２５ｍｌまたは０．５ｍｌ）を、１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを棄て、そして細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液（２０ｍｌの１．５Ｍスクロース、２．５ｍｌの１ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、２．５ｍｌの１Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０および７５ｍｌのｄＨ2Ｏ）中に細胞を懸濁させた。それら試料を３７℃で振とうしながら２０分間インキュベートし、AutoGen ５４０（商標）自動核酸単離装置（Integrated Separation Systems, Natick, ＭＡ）中に加え、そして Cycle １５９（装置ソフトウエア）を製造者の指示にしたがって用いてゲノムＤＮＡを単離した。
【０１２２】
或いは、５ｍｌの菌糸体を１７ｍｍｘ１００ｍｍ試験管に入れ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を濃縮し、上澄みを除去した。細胞を、１ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを除去した。細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する１ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３７℃で振とうしながら３０〜６０分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、そして細胞を、溶解が完了するまで３７℃でインキュベートした。その溶解産物を６５℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、２本の１．５ｍｌ Eppendorf試験管に分け、そして０．５ｍｌフェノール／クロロホルム（０．５Ｍトリス，ｐＨ８．０を用いて予め平衡化された５０％フェノール；５０％クロロホルム）を用いて１回抽出した。水性相を取り出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて２〜５回抽出した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８を加えることによってＤＮＡを沈澱させ、その混合物を氷上で１０分間インキュベートし、その混合物を５℃において１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上澄みを清浄な試験管に取り出し、それに１容量のイソプロパノールを加えた。次に、イソプロパノールを加えた上澄み混合物を、氷上で２０分間インキュベートし、５℃において１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを、７０％エタノールを用いて１回洗浄した。ペレットを乾燥させた後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。
【０１２３】
７．１．３．Streptomyces からのプラスミドＤＮＡ単離
菌糸体のアリコート（１．０ｍｌ）を、１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを棄て、細胞を１．０ｍｌの１０．３％スクロース中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを棄てた。次に、細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に懸濁させ、３７℃で振とうしながら２０分間インキュベートし、AutoGen ５４０（商標）自動核酸単離装置中に加えた。プラスミドＤＮＡは、Cycle １０６（装置ソフトウエア）を製造者の指示にしたがって用いて単離した。
【０１２４】
或いは、１．５ｍｌの菌糸体を１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを棄て、細胞を１．０ｍｌの１０．３％スクロース中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを棄てた。細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．５ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。インキュベーション後、０．２５ｍｌのアルカリ性ＳＤＳ（０．３Ｎ  ＮａＯＨ，２％ＳＤＳ）を加え、そして細胞を５５℃で１５〜３０分間または溶液が透明になるまでインキュベートした。酢酸ナトリウム（０．１ｍｌ，３Ｍ，ｐＨ４．８）をそのＤＮＡ溶液に加えた後、これを氷上で１０分間インキュベートした。それらＤＮＡ試料を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを清浄な試験管に取り出し、０．２ｍｌフェノール：クロロホルム（５０％フェノール：５０％クロロホルム）を加え、静かに混合した。そのＤＮＡ溶液を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層を清浄な Eppendorf試験管に取り出した。イソプロパノール（０．７５ｍｌ）を加え、その溶液を静かに混合後、室温で２０分間インキュベートした。そのＤＮＡ溶液を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを、７０％エタノールを用いて洗浄し、乾燥させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
【０１２５】
７．１．４．Ｅ．coliからのプラスミドＤＮＡ単離
形質転換されたＥ．coli単集落を、５ｍｌの Luria-Bertani（ＬＢ）培地（１リットルのｄＨ2Ｏ中に Bacto-Tryptone−１０ｇ、Bacto酵母エキス−５ｇおよびＮａＣｌ−１０ｇ，ｐＨ７．０，１２１℃で２５分間オートクレーブ処理され且つ１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足される）中に接種した。その培養物を一晩インキュベートし、１ｍｌアリコートを１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れた。それら培養試料を、AutoGen ５４０（商標）自動核酸単離装置中に加え、プラスミドＤＮＡを、Cycle ３（装置ソフトウエア）を製造者の指示にしたがって用いて単離した。
【０１２６】
７．１．５．Ｓ．avermitilisプロトプラストの調製および形質転換
Ｓ．avermitilisの単集落を、１／２強度ＹＰＤ−６上で単離した。その菌糸体を用いて、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中の１０ｍｌのＴＳＢ培地に接種後、これを２８℃で振とうしながら（３００ｒｐｍ）４８時間インキュベートした。１ｍｌの菌糸体を用いて、５０ｍｌのＹＥＭＥ培地に接種した。ＹＥＭＥ培地は、１リットルにつき、Difco Yeast Extract−３ｇ；Difco Bactoペプトン−５ｇ；Difco Malt Extract−３ｇ；スクロース−３００ｇを含有する。１２１℃で２５分間オートクレーブ処理後、次を加えた。２．５Ｍ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（別個に、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理される）−２ｍｌ；およびグリシン（２０％）（濾過滅菌される）−２５ｍｌ。
【０１２７】
菌糸体を３０℃で４８〜７２時間成長させ、５０ｍｌ遠心管（Falcon）中において３，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって採取した。上澄みを棄て、菌糸体をＰ緩衝液中に再懸濁させたが、Ｐ緩衝液は、スクロース−２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4−０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ−２．０２ｇ；Ｈ2Ｏ−６００ｍｌ；Ｋ2ＰＯ4（０．５％）−１０ｍｌ；微量元素溶液−２０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（３．６８％）−１００ｍｌ；およびＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）−１０ｍｌを含有する。（*微量元素溶液は、１リットルにつき、ＺｎＣｌ2−４０ｍｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ−２００ｍｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ−１０ｍｇ；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ−１０ｍｇ；Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ−１０ｍｇ；（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ−１０ｍｇを含有する）。ｐＨを６．５に調整し、最終容量を１リットルに調整し、その培地を０．４５ミクロンフィルターを介して熱濾過した。
【０１２８】
菌糸体を３，０００ｒｐｍで２０分間ペレット化し、上澄みを棄て、菌糸体を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２０ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。その菌糸体を３５℃で振とうしながら１５分間インキュベートし、顕微鏡検査して、プロトプラスト形成の程度を確認した。プロトプラスト形成が完了した時点で、プロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、プロトプラストを１０ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。プロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去し、プロトプラストを２ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させ、約１ｘ１０9個のプロトプラストを２．０ｍｌ低温バイアル（Nalgene）に分配した。
【０１２９】
約１ｘ１０9個のプロトプラストが入っているバイアルを、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去し、プロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。２〜５μｇの形質転換用ＤＮＡをプロトプラストに加えた直後に、０．５ｍｌ作業用Ｔ緩衝液を加えた。Ｔ緩衝液基剤は、ＰＥＧ−１０００（Sigma）−２５ｇ；スクロース−２．５ｇ；Ｈ2Ｏ−８３ｍｌを含有する。ｐＨは、１Ｎ  ＮａＯＨ（濾過滅菌される）を用いて８．８に調整し、Ｔ緩衝液基剤を濾過滅菌し且つ４℃で貯蔵した。使用の同日に作られる作業用Ｔ緩衝液は、Ｔ緩衝液基剤−８．３ｍｌ；Ｋ2ＰＯ4（４ｍＭ）−１．０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）−０．２ｍｌ；およびＴＥＳ（１Ｍ，ｐＨ８）−０．５ｍｌであった。作業用Ｔ緩衝液の各成分は、個々に濾過滅菌された。
【０１３０】
Ｔ緩衝液をプロトプラストに加えてから２０秒以内に、１．０ｍｌのＰ緩衝液を更に加え、プロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを棄て、プロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。次に、プロトプラストをＲＭ１４培地上にプレーティングしたが、これは、スクロース−２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4−０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ−１０．１２ｇ；グルコース−１０ｇ；Difco Casamino Acids−０．１ｇ；Difco Yeast Extract−５ｇ；Difco Oatmeal Agar−３ｇ；Difco Bacto Agar−２２ｇ；ｄＨ2Ｏ−８００ｍｌを含有する。その溶液を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、次の滅菌原液を加えた。Ｋ2ＰＯ4（０．５％）−１０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）−５ｍｌ；Ｌ−プロリン（２０％）−１５ｍｌ；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）−１０ｍｌ；微量元素溶液（上記と同様）−２ｍｌ；シクロヘキシルイミド原液（２５ｍｇ／ｍｌ）−４０ｍｌ；および１Ｎ  ＮａＯＨ−２ｍｌ。２５ｍｌのＲＭ１４培地をプレートに分別し、プレートを使用前に２４時間乾燥させた。
【０１３１】
プロトプラストを、９５％湿度において３０℃で２０〜２４時間インキュベートした。チオストレプトン耐性形質転換細胞を選択するために、１２μｇ／ｍｌチオストレプトンを含有する１ｍｌの上層用緩衝液を、ＲＭ１４再生プレート上に一様に塗抹した。上層用緩衝液は、１００ｍｌにつき、スクロース−１０．３ｇ；微量元素溶液（上記と同様）−０．２ｍｌ；およびＭＥＳ緩衝液（１Ｍ，ｐＨ６．５）−１ｍｌを含有する。プロトプラストを、９５％湿度において３０℃で７〜１４日間、チオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏr）集落が目に見えるまでインキュベートした。
【０１３２】
７．１．６．Streptomyces lividans プロトプラストの形質転換
Ｓ．リビダンス（Ｓ．lividans）ＴＫ６４（John Innes Institute, Norwich, Ｕ．Ｋによって提供される）を、若干の場合に形質転換に用いた。Ｓ．lividansを成長させ、プロトプラスト形成させ、そして形質転換するための方法および組成物は、Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces,A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Ｕ．Ｋ．に記載され、そこに記載のように実施される。プラスミドＤＮＡは、上の項目７．１．３に記載のように、Ｓ．lividans形質転換細胞から単離した。
【０１３３】
７．１．７．Ｓ．avermitilis 菌株の発酵分析
１／２強度ＹＰＤ−６上で４〜７日間成長したＳ．avermitilis菌糸体を、８ｍｌのプレフォーム培地および２個の５ｍｍガラスビーズが入っている１ｘ６インチ試験管中に接種した。プレフォーム培地は、可溶性デンプン（薄手ノリデンプンかまたはＫＯＳＯ，Japan Corn Starch Co., Nagoya）−２０ｇ／Ｌ；Pharmamedia−１５ｇ／Ｌ；Ardamine ｐＨ−５ｇ／Ｌ（Champlain Ind., Clifton, ＮＪ）；ＣａＣＯ3−２ｇ／Ｌ；培地中最終濃度５０ｐｐｍの２−（＋／−）−メチル酪酸、６０ｐｐｍのイソ酪酸および２０ｐｐｍのイソ吉草酸を含有する２ｘ  ｂｃｆａ（“ｂｃｆａ”は、分岐状鎖脂肪酸を意味する）を含有する。ｐＨを７．２に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１３４】
その試験管を、１７度の角度で、２９℃において２１５ｒｐｍで３日間振とうした。種培養物の２ｍｌアリコートを用いて、デンプン（薄手ノリデンプンかまたはＫＯＳＯ）−１６０ｇ／Ｌ；Nutrisoy（Archer Daniels Midland, Decatur, ＩＬ）−１０ｇ／Ｌ；Ardamine ｐＨ−１０ｇ／Ｌ；Ｋ2ＰＯ4−２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ−２ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ−０．０２ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ2−０．００２ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ−０．００２ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ3−１４ｇ／Ｌ；２ｘ  ｂｃｆａ（同上）；およびシクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣ）（ｐＨ７．０で２０％溶液として調製される）−８００ｐｐｍを含有する生産用培地２５ｍｌが入っている３００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに接種した。ｐＨを６．９に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１３５】
接種後、フラスコを２９℃において２００ｒｐｍで振とうしながら１２日間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍｌ試料をフラスコから吸引し、８ｍｌのメタノールを用いて希釈し、混合し、その混合物を１，２５０ｘｇで１０分間遠心分離して破片をペレット化した。次に、上澄みを、Beckman Ultrasphere ＯＤＳカラム（２５ｃｍｘ４．６ｍｍ内径）を用いたＨＰＬＣにより、０．７５ｍｌ／分の流速および２４０ｎｍでの吸光度による検出を用いて検定した。移動相は、８６／８．９／５．１のメタノール／水／アセトニトリルであった。
【０１３６】
７．１．８．Ｓ．avermitilis ＰＫＳ遺伝子の単離
Ｓ．avermitilis（ＡＴＣＣ３１２７２，ＳＣ−２）染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを製造し、Saccharopolyspora erythraeaポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグメントから製造されるケトシンターゼ（ＫＳ）プローブとハイブリッド形成させた。コスミドライブラリーの製造の詳細な説明は、Sambrook et al., 1989, 上記に見出されうる。Streptomyces 染色体ＤＮＡライブラリーの製造の詳細な説明は、Hopwood et al., 1985, 上記に示される。ケトシンターゼハイブリッド形成領域を含有するコスミドクローンは、ｐＥＸ２６（Dr.P.Leadlay, Cambridge, ＵＫによって快く供給される）からの２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントへのハイブリダイゼーションによって識別した。約５ｎｇのｐＥＸ２６を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏ４７IIIを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％ SeaPlaque ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ BioProducts, Rockland, ＭＥ）上に加えた。２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、Epicentre Technologies 製のＧＥＬａｓｅ（商標）を用い、Fast Protocol を用いてＤＮＡを回収した。２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントを、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（デオキシシチジン５’−三リン酸，テトラ（トリエチルアンモニウム）塩，［α−32Ｐ］−）（ＮＥＮ−Dupont, Boston, ＭＡ）を用い、ＢＲＬ Nick Translation System（ＢＲＬ Life Technologies, Inc., Gaithersburg, ＭＤ）を供給者の指示にしたがって用いて標識した。典型的な反応は、０．０５ｍｌ容量中で行った。５μｌの停止緩衝液の添加後、標識されたＤＮＡを、包含されていないヌクレオチドから、Ｇ−２５ Sephadex Quick Spin（商標）Column（Boehringer Mannheim）を供給者の指示にしたがって用いて分離した。
【０１３７】
約１，８００種類のコスミドクローンを、コロニーハイブリッド形成によってスクリーニングした。 Sacc.erythraea ＫＳプローブに強くハイブリッド形成した１０種類のクローンを識別した。コスミドＤＮＡを含有するＥ．coli集落をＬＢ液体培地中で成長させ、コスミドＤＮＡを、各培養物から、AutoGen ５４０（商標）自動核酸単離装置中で Cycle ３（装置ソフトウエア）を製造者の指示にしたがって用いて単離した。制限エンドヌクレアーゼ地図およびサザンブロットハイブリダイゼーション分析は、それらクローンの内の５種類が、重複染色体領域を含有したことを示した。５種類のコスミド（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９）のＳ．avermitilisゲノムＢａｍＨＩ制限地図を、重複コスミドの分析およびハイブリダイゼーションによって構築した（図４）。
【０１３８】
７．１．９．アベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節するＤＮＡの識別およびａｖｅＣ  ＯＲＦの識別
次の方法を用いて、ｐＳＥ６６コスミドクローンに由来するサブクローン化フラグメントの、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節する能力について調べた。ｐＳＥ６６（５μｇ）を、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％ SeaPlaque ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ BioProducts）上に加え、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、ＧＥＬａｓｅ（商標）（Epicentre Technologies）を用い、Fast Protocol を用いてＤＮＡを回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３（Vara et al., 1989, J.Bacteriol. 171:5872-5881）を、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。約０．５μｇの２．９Ｋｂインサートおよび約０．５μｇの消化したｐＷＨＭ３を一緒に混合し、１単位のリガーゼ（New England Biolabs, Inc., Beverly, ＭＡ）と一緒に２０μｌの全容量中において、供給者の指示にしたがって１５℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの連結反応混合物を、７０℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、そして用いて、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在は、制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１１９と称した。
【０１３９】
Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８（Pfizer 内菌株）のプロトプラストを、上の項目７．１．５に記載のように、製造し且つｐＳＥ１１９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８は、シクロヘキサンカルボン酸を補足された場合、アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１型と比較して、有意に多いアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２型を生産する突然変異体である（約３０：１のＢ２：Ｂ１）。Ｓ．avermitilisプロトプラストを形質転換するのに用いられるｐＳＥ１１９は、Ｅ．coli 菌株ＧＭ２１６３（Dr.B.J.Bachmann, Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University から入手される）か、Ｅ．coli菌株ＤＭ１（ＢＲＬ）かまたはＳ．lividans菌株ＴＫ６４から単離した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１９を含有するＳ．avermitilis 菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換細胞は、約３．７：１の変更された比率のアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：シクロヘキシル−Ｂ１を生産した（表２）。
【０１４０】
ｐＳＥ１１９が、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節しうるということが確かめられたら、インサートＤＮＡを配列決定した。約１０μｇのｐＳＥ１１９を、プラスミドＤＮＡ単離キット（Qiagen, Valencia, ＣＡ）を製造者の指示にしたがって用いて単離し、そしてＡＢＩ  ３７３Ａ Automated ＤＮＡ Sequencer（Perkin Elmer, Foster City, ＣＡ）を用いて配列決定した。配列データは、Genetic Computer Group プログラム（ＧＣＧ，Madison, ＷＩ）を用いて集め且つ編集した。ＤＮＡ配列およびａｖｅＣ  ＯＲＦを図１（配列番号：１）に示す。
【０１４１】
ｐＳＥ１１８と称される新規なプラスミドは、次のように構築した。約５μｇのｐＳＥ６６を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％ SeaPlaque ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ BioProducts）上に加え、２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、ＧＥＬａｓｅ（商標）（Epicentre Technologies）を用い、Fast Protocol を用いてＤＮＡを回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。約０．５μｇの２．８Ｋｂインサートおよび０．５μｇの消化したｐＷＨＭ３を一緒に混合し、１単位のリガーゼ（New England Biolabs）と一緒に２０μｌの全容量中において、供給者の指示にしたがって１５℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの連結反応混合物を、７０℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、そして用いて、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞を製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在を、制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１１８と称した。ｐＳＥ１１８およびｐＳＥ１１９中のインサートＤＮＡは、約８３８ヌクレオチドによって重複する（図４）。
【０１４２】
Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを、上記のようにｐＳＥ１１８を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１８を含有するＳ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換細胞は、菌株１１００−ＳＣ３８と比較して、アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１の比率を変化させなかった（表２）。
【０１４３】
７．１．１０．Ｓ．avermitilis染色体ＤＮＡからのａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅
ａｖｅＣ  ＯＲＦを含有する約１．２Ｋｂフラグメントを、Ｓ．avermitilis染色体ＤＮＡから、上記で得られたａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって単離した。それらＰＣＲプライマーは、Genosys Biotechnologies,Inc.（Texas）によって供給された。右方向プライマーは、５’−ＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：６）であり；左方向プライマーは、５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：７）であった。ＰＣＲ反応は、Deep Vent（商標）ポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて製造者によって与えられる緩衝液中で、および１００μｌの最終容量中に３００μＭ  ｄＮＴＰ、１０％グリセロール、各２００ｐｍｏｌプライマー、０．１μｇ鋳型および２．５単位の酵素の存在下で、Perkin-Elmer Cetus熱サイクラーを用いて行われた。最初のサイクルの熱プロフィールは、９５℃で５分間（変性工程）、６０℃で２分間（アニーリング工程）および７２℃で２分間（伸長工程）であった。引き続きの２４サイクルは、変性工程を４５秒に短縮し、アニーリング工程を１分に短縮したことを除き、同様の熱プロフィールを有した。
【０１４４】
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中で電気泳動させ、約１．２Ｋｂの単一ＤＮＡバンドを検出した。このＤＮＡをゲルから精製し、２５ｎｇの直鎖状ブラントｐＣＲ−Blunt ベクター（Invitrogen）と、１：１０モルのベクター対インサート比で製造者の指示にしたがって連結した。その連結反応混合物を用いて、One Shot（商標）Competent Ｅ．coli細胞（Invitrogen）を製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．２Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１７９と称した。
【０１４５】
ｐＳＥ１７９からのインサートＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いた消化によって単離し、電気泳動によって分離し、そのゲルから精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いて消化されているシャトルベクターｐＷＨＭ３と、１μｇの全ＤＮＡ濃度において１：５モルのベクター対インサート比で連結した。その連結反応混合物を用いて、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞を製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．２Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８６（図２，ＡＴＣＣ２０９６０４）と称し、これをＥ．coli ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。
【０１４６】
７．２．結果
ｐＳＥ１１９からの２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントは、Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン生産の比率を有意に変化させたということが示された。Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８は、通常は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比を有するが、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むベクターを用いて形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの比率は約３．７：１に減少した。形質転換細胞培養物の発酵後分析は、形質転換用ＤＮＡの存在を示した。
【０１４７】
２．９Ｋｂ  ｐＳＥ１１９フラグメントを配列決定し、約０．９Ｋｂ  ＯＲＦを識別したが（図１）（配列番号：１）、これは、Ｂ２生成物だけを生産するように予めどこか他のところで突然変異しているＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを包含する（Ikeda et al., 1995, 上記）。このＯＲＦまたはその該当する推定ポリペプチドの既知のデータベース（ＧｅｎＥＭＢＬ，ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に対する比較は、既知のＤＮＡまたはタンパク質配列との強い相同性を全く示さなかった。
【０１４８】
表２は、種々のプラスミドを用いて形質転換されたＳ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８の発酵分析を示す。
【０１４９】
【表２】
0003688640.tif 000003
８．実施例：Ｓ．avermitilis ＡｖｅＣ突然変異体の構築
この実施例は、上記の組成物および方法を用いた、いくつか異なったＳ．avermitilis ＡｖｅＣ突然変異体の構築を記載する。Streptomycesの遺伝子中に突然変異を導入する技法の概説は、Kieser and Hopwood, 1991, Meth.Enzym. 204:430-458 によって記載されている。より詳細な説明は、Anzai et al., 1988, J.Antibiot. XLI(2):226-233 および Stutzman-Engwall et al., 1992, J.Bacteriol. 174(1):144-154 によって提供される。これら参考文献は、本明細書中にそのまま援用される。
【０１５０】
８．１．Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ遺伝子の失活
失活したａｖｅＣ遺伝子を含有するＡｖｅＣ突然変異体を、下に詳述されるいくつかの方法を用いて構築した。
【０１５１】
第一の方法では、ｐＳＥ１１９（上の項目７．１．９に記載のプラスミド）中のａｖｅＣ遺伝子に内在する６４０ｂｐ  ＳｈｐＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、Sacc.erythraeaからのｅｒｍＥ遺伝子（エリスロマイシン耐性に関する）と交換した。このｅｒｍＥ遺伝子は、ｐＩＪ４０２６（John Innes Institute, Norwich, U.K. によって提供される；Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368 も参照されたい）から、ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化後、電気泳動によって単離され、そのゲルから精製された。この約１．７Ｋｂフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＧＥＭ７Ｚｆ（Promega）中に連結し、その連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．７Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２７と称した。
【０１５２】
ｐＳＥ１１８（上の項目７．１．９に記載される）を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約１．５Ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩインサートをゲルから精製した。シャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した。ｐＳＥ２７を、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約１．７Ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩインサートをゲルから精製した。４種類全部のフラグメント（すなわち、約２．８Ｋｂ、約１．５Ｋｂ、約７．２Ｋｂ、約１．７Ｋｂ）を、４方連結で互いに連結した。連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８０（図３；ＡＴＣＣ２０９６０５）と称した。
【０１５３】
ｐＳＥ１８０を、Ｓ．lividans ＴＫ６４中に形質転換し、形質転換された集落を、チオストレプトンおよびエリスロマイシンへの耐性によって識別した。ｐＳＥ１８０は、Ｓ．lividansから単離され、Ｓ．avermitilisプロトプラストを形質転換するのに用いられた。４種類のチオストレプトン耐性Ｓ．avermitilis形質転換細胞を識別し、そしてプロトプラストを製造し、ＲＭ１４培地上の非選択的条件下でプレーティングした。プロトプラストを再生した後、単集落を、エリスロマイシン耐性の存在およびチオストレプトン耐性の不存在についてスクリーニングして、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよび遊離レプリコンの損失が示された。一つのＥｒｍrＴｈｉｏs形質転換細胞を識別し、菌株ＳＥ１８０−１１と称した。全染色体ＤＮＡを、菌株ＳＥ１８０−１１から単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩまたはＳｐｈＩを用いて消化し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動によって分割し、ナイロン膜に転移させ、ｅｒｍＥプローブにハイブリッド形成させた。これら分析は、ｅｒｍＥ耐性遺伝子の染色体組込み、および付随する６４０ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントの欠失が、二重交差変化によって起こっていることを示した。菌株ＳＥ１８０−１１の発酵生成物のＨＰＬＣ分析は、普通のアベルメクチンがもはや生産されないことを示した（図５Ａ）。
【０１５４】
ａｖｅＣ遺伝子を失活させる第二の方法では、１．７Ｋｂ  ｅｒｍＥ遺伝子を、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１の染色体から除去し、ａｖｅＣ遺伝子における６４０ｂｐ  ＳｈｐＩ／ＰｓｔＩ欠失をそのままにした。遺伝子置換プラスミドを次のように構築した。ｐＳＥ１８０を、ＸｂａＩを用いて部分消化し、約１１．４Ｋｂフラグメントをゲルから精製した。その約１１．４Ｋｂバンドは、１．７Ｋｂ  ｅｒｍＥ耐性遺伝子を欠いている。次に、そのＤＮＡを連結し且つＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８４と称し、これをＥ．coli ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このプラスミドを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。プロトプラストは、菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞から製造し、ＲＭ１４上の単集落としてプレーティングした。プロトプラストが再生した後、単集落を、エリスロマイシン耐性およびチオストレプトン耐性両方の不存在についてスクリーニングして、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよびｅｒｍＥ遺伝子を含有する遊離レプリコンの損失が示された。一つのＥｒｍsＴｈｉｏs形質転換細胞を識別し、ＳＥ１８４−１−１３と称した。ＳＥ１８４−１−１３の発酵分析は、普通のアベルメクチンが生産されなかったことおよびＳＥ１８４−１−１３がＳＥ１８０−１１と同様の発酵プロフィールを有したことを示した。
【０１５５】
ａｖｅＣ遺伝子を失活させる第三の方法では、ＰＣＲを用いてｎｔ４７１位のＣの後に２個のＧを加えることによってＢｓｐＥ１部位を生じることにより、染色体ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフトを導入した。遺伝子操作されるＢｓｐＥ１の存在は、遺伝子置換変化を検出する場合に有用であった。ＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を導入するように設計され、Genosys Biotechnologies,Inc. によって供給された。右方向プライマーは、５’−ＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：８）であり、左方向プライマーは、５’−ＡＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：９）であった。ＰＣＲ条件は、上の項目７．１．１０に記載されたのと同様であった。６６６ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩを用いて消化して、それぞれ２７８ｂｐおよび３８８ｂｐの二つのフラグメントを生じた。３８８ｂｐフラグメントをゲルから精製した。
【０１５６】
遺伝子置換プラスミドは、次のように構築した。シャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。ｐＳＥ１１９を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約８４０ｂｐフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９を、ＥｃｏＲＩおよびＸｍｎＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動によって分割し、そして約１．７Ｋｂフラグメントをゲルから精製した。４種類全部のフラグメント（すなわち、約７．２Ｋｂ、約８４０ｂｐ、約１．７Ｋｂおよび３８８ｂｐ）を、４方連結で互いに連結した。連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８５と称し、これをＥ．coli ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このプラスミドを用いて、Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｓＰＥ１８５は、Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン比をほとんど変化させなかった（表２）。
【０１５７】
ｓＰＥ１８５を用いてＳ．avermitilisのプロトプラストを形質転換して、染色体ａｖｅＣ遺伝子中でフレームシフト突然変異を生じさせた。プロトプラストを、チオストレプトン耐性形質転換細胞から製造し、ＲＭ１４上で単集落としてプレーティングした。プロトプラストが再生した後、単集落を、チオストレプトン耐性の不存在についてスクリーニングした。チオストレプトン感受性集落からの染色体ＤＮＡを単離し、染色体中に組み込まれたフレームシフト突然変異の存在についてＰＣＲによってスクリーニングした。それらＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計され、Genosys Biotechnologies,Inc.（Texas）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号：１０）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：１１）であり、ＰＣＲ条件は、上の項目７．１．１０に記載されたのと同様であった。得られたＰＣＲ産物は５４３ｂｐであったが、ＢｓｐＥ１を用いて消化された場合、３６８ｂｐ、９６ｂｐおよび７９ｂｐの三つのフラグメントが認められ、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよび遊離レプリコンの損失が示された。
【０１５８】
ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を含有するＳ．avermitilis突然変異体の発酵分析は、普通のアベルメクチンがもはや生産されないこと、およびこれら突然変異体が、菌株ＳＥ１８０−１１およびＳＥ１８４−１−１３と同様の発酵ＨＰＬＣプロフィールを有することを示した。一つのＴｈｉｏs形質転換細胞を識別し、菌株ＳＥ１８５−５ａと称した。
【０１５９】
更に、１１６位のトリプトファン（Ｗ）をコードしているコドンの終止コドンへの変化を引き起こす、ｎｔ５２０位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を生じさせた。この突然変異を含むＳ．avermitilis菌株は、普通のアベルメクチンを生産しなかったし、菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３およびＳＥ１８５−５ａと同様の発酵プロフィールを有した。
【０１６０】
更に、（ｉ）２６６位のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変化させる、ｎｔ９７０位をＧからＡへ、および（ii）２７５位のアミノ酸をチロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）に変化させる、ｎｔ９９６位をＴからＣへと両方とも変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を生じさせた。これら突然変異を含むＳ．avermitilis 菌株（Ｇ２５６Ｄ／Ｙ２７５Ｈ）は、普通のアベルメクチンを生産しなかったし、菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３およびＳＥ１８５−５ａと同様の発酵プロフィールを有した。
【０１６１】
Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ失活突然変異菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、ＳＥ１８５−５ａ、およびこれとともに与えられるその他は、ａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異の影響を評価するスクリーニング手段を提供する。ｐＳＥ１８６は、ａｖｅＣ遺伝子の野生型コピーを含有するが、これをＥ．coli ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このｐＳＥ１８６  ＤＮＡを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。機能性ａｖｅＣ遺伝子のin trans存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に普通のアベルメクチン生産を回復させることができた（図５Ｂ）。
【０１６２】
８．２．Ｂ２：Ｂ１クラス比率を変更するａｖｅＣ遺伝子中の突然変異の分析
上記のように、不活性ａｖｅＣ遺伝子を含有するＳ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１を、機能性ａｖｅＣ遺伝子を含有するプラスミド（ｐＳＥ１８６）を用いた形質転換によって相補した。菌株ＳＥ１８０−１１は、下記のようにａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異を特性決定するための宿主菌株としても利用された。
【０１６３】
染色体ＤＮＡを、菌株１１００−ＳＣ３８から単離し、ａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。１．２Ｋｂ  ＯＲＦを、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって単離した。右方向プライマーは配列番号：６であり、左方向プライマーは配列番号：７であった（上の項目７．１．１０を参照されたい）。ＰＣＲおよびサブクローニングの条件は、項目７．１．１０に記載されたのと同様であった。１．２Ｋｂ  ＯＲＦのＤＮＡ配列分析は、５５位のアミノ酸をセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変化させる、ｎｔ３３７位をＣからＴに変化させるａｖｅＣ遺伝子の突然変異を示す。Ｓ５５Ｆ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子を、ｐＷＨＭ３中にサブクローン化して、ｐＳＥ１８７と称されるプラスミドを生じ、これを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基５５の変化（Ｓ５５Ｆ）をコードしているａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に普通のアベルメクチン生産を回復させることができたが（図５Ｃ）、しかしながら、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比は、ｐＳＥ１８６を用いて形質転換された、約１．６：１のＢ２：Ｂ１比を有した菌株ＳＥ１８０−１１と比較したところ、約２６：１であり（表３）、その一つの突然変異（Ｓ５５Ｆ）が、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して調節するということが示された。
【０１６４】
２３０位のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変化させる、ｎｔ８６２位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中のもう一つの突然変異を識別した。この突然変異（Ｇ２３０Ｄ）を有するＳ．avermitilis菌株は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを生産する。
【０１６５】
８．３．Ｂ２：Ｂ１比を減少させる突然変異
生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少させるいくつかの突然変異を、次のように構築した。
【０１６６】
１３９位のアミノ酸をアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変化させる、ｎｔ５８８位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を識別した。Ａ１３９Ｔ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子を、ｐＷＨＭ３中にサブクローン化して、ｐＳＥ１８８と称されるプラスミドを生じ、これを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３９の変化（Ａ１３９Ｔ）をコードしている突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１にアベルメクチン生産を回復させることができたが（図５Ｄ）、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は約０．９４：１であり、この突然変異は、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少させるということが示された。この結果は、公表された結果も上記の突然変異の結果も、ａｖｅＣ遺伝子の失活かまたはＢ１型に相対して増加したＢ２型アベルメクチンの生産を示しているだけであったので、予想外であった（表３）。
【０１６７】
Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１比をより好ましいＢ１方向に変更したので、アミノ酸１３８位のセリンの代わりにトレオニンをコードした突然変異を構築した。したがって、ｐＳＥ１８６を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＧＥＭ３Ｚｆ（Promega）中にクローン化した。このプラスミドをｐＳＥ１８６ａと称し、これを、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、それらＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で分離し、そして約３．８Ｋｂおよび約０．４Ｋｂの二つのフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いて、ｎｔ５８５位に単一塩基変化を導入した。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位に突然変異を導入するように設計され、Genosys Biotechnologies,Inc.（Texas）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列番号：１２）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡ−３’（配列番号：１３）であった。ＰＣＲ反応は、Advantage ＧＣゲノムＰＣＲキット（Clonetech Laboratories, Palo Alto, ＣＡ）を用いて製造者によって与えられる緩衝液中において、５０μｌの最終容量中に２００μＭ  ｄＮＴＰ、各２００ｐｍｏｌプライマー、５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１．０Ｍ  ＧＣ−Meltおよび１単位の KlenTaq Polymerase Mixの存在下で行われた。最初のサイクルの熱プロフィールは、９４℃で１分間；次に、９４℃で３０秒間および６８℃で２分間を２５サイクル；および６８℃で３分間を１サイクルであった。２９５ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させた。その連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９８と称した。
【０１６８】
ｐＳＥ１９８を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローン化し、そしてＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．coli ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９９と称し、これを用いて、Ｓ．avermitilis 菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３８の変化（Ｓ１３８Ｔ）をコードしている突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に普通のアベルメクチン生産を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．８８：１であり、この突然変異は、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少させるということが示された（表３）。このＢ２：Ｂ１比は、上記のようにｐＳＥ１８８を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換によって生じたＡ１３９Ｔについて認められる０．９４：１の比率よりもなお低い。
【０１６９】
もう一つの突然変異を、アミノ酸１３８位および１３９位両方にトレオニンを導入するように構築した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位および５８８位に突然変異を導入するように設計され、Genosys Biotechnologies,Inc.（Texas）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号：１４）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：１５）であった。ＰＣＲ反応は、この項目の直ぐ上に記載された条件を用いて行われた。４４９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。ｐＳＥ１８６ａを、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、それらＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で分離し、そして約３．８Ｋｂおよび約０．４Ｋｂの二つのフラグメントをゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させ、その連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３０と称した。
【０１７０】
ｐＳＥ２３０を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローン化し、そしてＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．coli ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３１と称し、これを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を発酵によって分析した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔをコードしている二重突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に普通のアベルメクチン生産を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．８４：１であり、この突然変異は、上記のようなｐＳＥ１８８またはｐＳＥ１９９を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換によって与えられる減少よりも更に、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少させるということが示された（表３）。
【０１７１】
もう一つの突然変異を、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して更に減少させるように構築した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１比をより好ましいＢ１方向に変更したので、アミノ酸１３８位にトレオニンおよびアミノ酸１３９位にフェニルアラニンを導入するように突然変異を構築した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位（ＴをＡに変化させる）、５８８位（ＧをＴに変化させる）および５８９位（ＣをＴに変化させる）に突然変異を導入するように設計され、Genosys Biotechnologies,Inc.（Texas）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号：２５）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：１５）であった。ＰＣＲ反応は、Advantage ＧＣゲノムＰＣＲキット（Clonetech Laboratories, Palo Alto, ＣＡ）を用いて製造者によって与えられる緩衝液中において、５０μｌの最終容量中に２００μＭ  ｄＮＴＰ、各２００ｐｍｏｌのプライマー、５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１．１ｍＭ酢酸Ｍｇ、１．０Ｍ  ＧＣ−Melt および１単位の Ｔｔｈ  ＤＮＡ Polymeraseの存在下で行われた。最初のサイクルの熱プロフィールは、９４℃で１分間；次に、９４℃で３０秒間および６８℃で２分間を２５サイクル；および６８℃で３分間を１サイクルであった。４４９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させた。その連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３８と称した。
【０１７２】
ｐＳＥ２３８を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローン化し、そしてＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．coli ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３９と称し、これを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｆをコードしている二重突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に普通のアベルメクチン生産を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．７５：１であり、この突然変異は、上記のようなｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９またはｐＳＥ２３１を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換によって与えられる減少よりも更に、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少させるということが示された（表３）。
【０１７３】
【表３】
0003688640.tif 000004
更に別の突然変異を、Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; および Stemmer, 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751に記載の；および米国特許第５６０５７９３号、同第５８１１２３８号、同第５８３０７２１号および同第５８３７４５８号にも記載のＤＮＡシャッフリング技術を用いて、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量をシクロヘキシル−Ｂ１に相対して更に減少させるように構築した。
【０１７４】
突然変異したａｖｅＣ遺伝子を含有するＤＮＡシャッフリングされたプラスミドを、コンピテントｄａｍ  ｄｃｍ  Ｅ．coli 細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し且つ用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、そして１：１またはそれより小さいシクロヘキシル−Ｂ２：シクロヘキシル−Ｂ１比を有するアベルメクチン生産についてスクリーニングした。１：１またはそれより小さいＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを生産するＳＥ１８０−１１形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列を決定した。
【０１７５】
シクロヘキシル−Ｂ１に相対して減少した量のシクロヘキシル−Ｂ２を生産した８種類の形質転換細胞を識別した。これら形質転換細胞の中で得られる最低のＢ２：Ｂ１比は、０４：１であった（表４）。プラスミドＤＮＡを、８種類の形質転換細胞それぞれから単離し、ＤＮＡ配列を決定して、ａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を決定した。突然変異は次の通りである。
【０１７６】
ｐＳＥ２９０は、ｎｔ３１７位でＴからＡへ、ｎｔ３５３位でＣからＡへ、ｎｔ４３８位でＧからＡへ、そしてｎｔ１１５５位でＴからＡへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ３１７位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ４８位のアミノ酸をＤからＥへ変化させ、ｎｔ４３８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ８９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．４２：１であった（表４）。
【０１７７】
ｐＳＥ２９１は、ｎｔ２７２位でＧからＡへ、ｎｔ５８５位でＴからＡへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、そしてｎｔ７０８位でＧからＡへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３８位のアミノ酸をＳからＴへ変化させ、ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ７０８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１７９位のアミノ酸をＧからＳへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．５７：１であった（表４）。
【０１７８】
ｐＳＥ２９２は、ｐＳＥ２９０と同様の４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．４０：１であった（表４）。
【０１７９】
ｐＳＥ２９３は、ｎｔ２４位でＡからＧへ、ｎｔ２８６位でＡからＣへ、ｎｔ４９７位でＴからＣへ、ｎｔ５５４位でＣからＴへ、ｎｔ５８０位でＴからＣへ、そしてｎｔ８８６位でＡからＴへの６種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ２８６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ３８位のアミノ酸をＱからＰへ変化させ、ｎｔ５８０位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３６位のアミノ酸をＬからＰへ変化させ、そしてｎｔ８８６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２３８位のアミノ酸をＥからＤへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．６８：１であった（表４）。
【０１８０】
ｐＳＥ２９４は、ｎｔ４６９位でＴからＣへ、ｎｔ５８５位でＴからＡへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、ｎｔ７０８位でＧからＡへ、ｎｔ８３３位でＣからＴへ、そしてｎｔ１１８４位でＧからＡへの６種類のヌクレオチド突然変異を含有する。更に、１７３位、１７４位および１７５位でｎｔを欠失している。ｎｔ４６９位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ９９位のアミノ酸をＦからＳへ変化させ、ｎｔ５８５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３８位のアミノ酸をＳからＴへ変化させ、ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ７０８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１７９位のアミノ酸をＧからＳへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．５３：１であった（表４）。
【０１８１】
ｐＳＥ２９５は、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、そしてｎｔ８５６位でＴからＣへの２種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ８５６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２２８位のアミノ酸をＭからＴへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．８０：１であった（表４）。
【０１８２】
ｐＳＥ２９６は、ｎｔ１５５位でＴからＣへ、ｎｔ５０５位でＧからＴへ、ｎｔ１０３９位でＣからＴへ、ｎｔ１２０２位でＣからＴへ、そしてｎｔ１２１０位でＴからＣへの５種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５０５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１１１位のアミノ酸をＧからＶへ変化させ、そしてｎｔ１０３９位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２８９位のアミノ酸をＰからＬへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．７３：１であった（表４）。
【０１８３】
ｐＳＥ２９７は、ｎｔ３７７位でＧからＴへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、ｎｔ６３３位でＡからＧへ、そしてｎｔ１０６７位でＡからＴへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、ｎｔ６３３位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１５４位のアミノ酸をＫからＥへ変化させ、そしてｎｔ１０６７位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２９８位のアミノ酸をＱからＨへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．６７：１であった（表４）。
【０１８４】
【表４】
0003688640.tif 000005
９．実施例：５’欠失突然変異体の構築
上の項目５．１に説明されたように、図１（配列番号：１）に示されるＳ．avermitilisヌクレオチド配列は、可能な出発部位であるｂｐ４２位、１７４位、１７７位および１８０位に４個の異なったＧＴＧコドンを含む。この項は、ａｖｅＣ  ＯＲＦ（図１；配列番号：１）の５’領域の多重欠失を構築して、これらコドンの内のどれが、タンパク質発現に関するａｖｅＣ  ＯＲＦ中の出発部位として機能しうるか決定させることを記載する。
【０１８５】
５’末端で様々に欠失するａｖｅＣ遺伝子のフラグメントを、Ｓ．avermitilis染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅によって単離した。ＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣ  ＤＮＡ配列に基づいて設計され、Genosys Biotechnologies,Inc. によって供給された。右方向プライマーは、５’−ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３’（配列番号：１６）（Ｄ１Ｆ１）；５’−ＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：１７）（Ｄ１Ｆ２）；５’−ＣＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧ−３’（配列番号：１８）（Ｄ１Ｆ３）；および５’−ＴＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号：１９）（Ｄ２Ｆ２）であった。左方向プライマーは、５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡ−３’（配列番号：２０）；５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号：２１）；および５’−ＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号：２２）であった。ＰＣＲ反応は、上の項目８．３に記載のように行われた。
【０１８６】
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中の電気泳動によって分離し、約１．０Ｋｂかまたは約１．１Ｋｂの単一ＤＮＡバンドを検出した。これらＰＣＲ産物をゲルから精製し、２５ｎｇの直鎖状ｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen）と、１：１０モルのベクター対インサート比で製造者の指示にしたがって連結した。その連結反応混合物を用いて、One Shot（商標）Competent Ｅ．coli 細胞（Invitrogen）を製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、インサートの存在を制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。これらプラスミドを、ｐＳＥ１９０（プライマーＤ１Ｆ１を用いて得られる）、ｐＳＥ１９１（プライマーＤ１Ｆ２を用いて得られる）、ｐＳＥ１９２（プライマーＤ１Ｆ３を用いて得られる）およびｐＳＥ１９３（プライマーＤ２Ｆ２を用いて得られる）と称した。
【０１８７】
これらインサートＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いてそれぞれ消化し、電気泳動によって分離し、そのゲルから精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いて消化されているシャトルベクターｐＷＨＭ３と、１μｇの全ＤＮＡ濃度において１：５モルのベクター対インサート比で別個に連結した。その連結反応混合物を用いて、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、インサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ１９４（Ｄ１Ｆ１）、ｐＳＥ１９５（Ｄ１Ｆ２）、ｐＳＥ１９６（Ｄ１Ｆ３）およびｐＳＥ１９７（Ｄ２Ｆ２）と称し、これを、それぞれ別個にＥ．coli 菌株ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このＤＮＡを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析して、どのＧＴＧ部位がａｖｅＣ発現に必要であったか決定した。結果は、４２位のＧＴＧ部位をそれぞれ欠いているが、いずれも、１７４位、１７７位および１８０位に３個のＧＴＧ部位を含有しているｐＳＥ１９４、ｐＳＥ１９５およびｐＳＥ１９６はそれぞれ、ＳＥ１８０−１１中に形質転換された場合に普通のアベルメクチン生産を回復することができたことから、４２位のＧＴＧコドンは、ａｖｅＣ発現に影響を与えることなく削除することができるということを示している。４ヶ所全部のＧＴＧ部位を欠いているｐＳＥ１９７を用いて菌株ＳＥ１８０−１１を形質転換させた場合、普通のアベルメクチン生産は回復されなかった（表５）。
【０１８８】
【表５】
0003688640.tif 000006
１０．実施例：Ｓ．hygroscopicusおよびＳ．griseochromogenesからのａｖｅＣ相同体のクローニング
本発明は、Streptomycesの他のアベルメクチンまたはミルベマイシン生産性種からのａｖｅＣ相同遺伝子を識別し且つクローン化することを可能にする。例えば、Ｓ．hygroscopicus（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１）ゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーを、上記のＳ．avermitilisからの１．２Ｋｂ  ａｖｅＣプローブとハイブリッド形成させた。強くハイブリッド形成するいくつかのコスミドクローンを識別した。これらコスミドから染色体ＤＮＡを単離し、そしてそのａｖｅＣプローブとハイブリッド形成した４．９Ｋｂ  ＫｐｎＩフラグメントを識別した。このＤＮＡを配列決定し、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦへの有意の相同性を有するＯＲＦ（配列番号：３）を識別した。Ｓ．hygroscopicus ａｖｅＣ相同ＯＲＦから推定されるアミノ酸配列（配列番号：４）を、図６に示す。
【０１８９】
更に、Ｓ．griseochromogenesゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーを、上記のＳ．avermitilisからの１．２Ｋｂ  ａｖｅＣプローブとハイブリッド形成させた。強くハイブリッド形成するいくつかのコスミドクローンを識別した。これらコスミドから染色体ＤＮＡを単離し、そしてそのａｖｅＣプローブとハイブリッド形成した５．４Ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントを識別した。このＤＮＡを配列決定し、Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦへの有意の相同性を有するａｖｅＣ相同部分ＯＲＦを識別した。推定のアミノ酸配列（配列番号：５）を、図６に示す。
【０１９０】
Ｓ．hygroscopicusおよびＳ．griseochromogenesからのａｖｅＣ相同体のＤＮＡおよびアミノ酸配列分析は、これら領域が、互いにも、Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦおよびＡｖｅＣ遺伝子産物へも、有意の相同性（アミノ酸レベルで約５０％配列同一性）を有するということを示している（図６）。
【０１９１】
１１．実施例：ｅｒｍＥプロモーターの後にａｖｅＣ遺伝子を含むプラスミドの構築
シャトルベクターｐＷＨＭ３のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位中にＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入された３００ｂｐ  ｅｒｍＥプロモーターを有するｐＷＨＭ３（Ward et al., 1986, Mol.Gen.Genet. 203:468-478 を参照されたい）であるｐＳＥ３４中に、ｐＳＥ１８６からの１．２Ｋｂ  ａｖｅＣ  ＯＲＦをサブクローン化した。ｐＳＥ１８６を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化し、その消化物を電気泳動によって分割し、１．２Ｋｂフラグメントをアガロースゲルから単離し、そしてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化されているｐＳＥ３４と連結した。その連結反応混合物を、コンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に製造者の指示にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、１．２Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８９と称し、これをＥ．coli ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。Ｓ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを、ｐＳＥ１８９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。
【０１９２】
ｓＰＥ１８９を含有するＳ．avermitilis菌株１１００−ＳＣ３８形質転換細胞は、生産されるアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１の比率が、菌株１１００−ＳＣ３８（約３４：１）と比較して変化し（約３：１）、全アベルメクチン生産は、ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された菌株１１００−ＳＣ３８と比較して約２．４倍増加した（表６）。
【０１９３】
ｓＰＥ１８９を、野生型Ｓ．avermitilis菌株のプロトプラスト中にも形質転換させた。チオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｓＰＥ１８９を用いて形質転換されたＳ．avermitilis野生型によって生産される全アベルメクチンは、ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された野生型Ｓ．avermitilisと比較して約２．２倍増加した。（表６）。
【０１９４】
【表６】
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１２．実施例：Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦおよびＳ．hygroscopicus ａｖｅＣ相同体双方からの配列を含有するキメラプラスミド
Ｓ．hygroscopicus ａｖｅＣ相同体の５６４ｂｐ部分を、Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦの５６４ｂｐ相同部分の代わりに含有するｐＳＥ３５０と称されるハイブリッドプラスミド（図７）を次のように構築した。ｐＳＥ３５０は、両方の配列中に保存されるＢｓａＡＩ制限部位（ａｖｅＣ２２５位）、およびＳ．avermitilis ａｖｅＣ遺伝子中に存在するＫｐｎＩ制限部位（ａｖｅＣ８１０位）を用いて構築された。ＫｐｎＩ部位は、Ｓ．hygroscopicus ＤＮＡ中に、ＰＣＲにより、右方向プライマー５’−ＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧ−３’（配列番号：２３）および左方向プライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：２４）（Genosys Biotechnologies によって供給される）を用い、上の項目７．１．１０に記載のＰＣＲ条件を用いて導入された。そのＰＣＲ産物を、ＢｓａＡＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、フラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動によって分離し、そして５６４ｂｐ  ＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントをゲルから単離した。ｐＳＥ１７９（上の項目７．１．１０に記載される）を、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化し、フラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動によって分離し、そして約４．５Ｋｂのフラグメントをゲルから単離した。ｐＳＥ１７９を、ＨｉｎｄIIIおよびＢｓａＡＩを用いて消化し、フラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動によって分離し、そして約０．２Ｋｂ  ＢｓａＡＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントをゲルから単離した。Ｓ．hygroscopicusからの約４．５Ｋｂ  ＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩフラグメント、約０．２Ｋｂ  ＢｓａＡＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントおよび５６４ｂｐ  ＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、３方連結で互いに連結させ、その連結反応混合物をコンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、ＫｐｎＩおよびＡｖａＩを用いる制限分析によって確認した。このプラスミドを、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いて消化して１．２Ｋｂインサートを放出させた後、これを、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３と連結した。その連結反応混合物をコンピテントＥ．coli ＤＨ５α細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いる制限分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．coli ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ３５０と称し、これを用いて、Ｓ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。結果は、Ｓ．avermitilis／Ｓ．hygroscopicusハイブリッドプラスミドを含有する形質転換細胞が、約１０９：１の平均Ｂ２：Ｂ１比を有することを示す（表７）。
【０１９５】
【表７】
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生物材料の寄託
次の生物材料を、１９９８年１月２９日に、１２３０１ Parklawn Drive, Rockville, ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡのAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に寄託し、次の受託番号を付与された。
【０１９６】
プラスミド 受託番号
プラスミドｐＳＥ１８０          ２０９６０５
プラスミドｐＳＥ１８６          ２０９６０４
上に引用される特許、特許出願および公報は全て、本明細書中にそのまま援用される。
【０１９７】
本発明は、本明細書中に記載の、本発明の個々の側面の一つの代表例とされる具体的な態様によって範囲を制限されるべきではなく、機能的に均等な方法および成分は、本発明の範囲内である。実際に、本発明の様々な変更は、本明細書中に示され且つ記載されるものに加えて、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、請求の範囲の範囲内にあるとされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１．Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦを含むＤＮＡ配列（配列番号：１）および推定のアミノ酸配列（配列番号：２）。
【図２】  図２．Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ遺伝子のＯＲＦ全体を含むプラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）。
【図３】  図３．Ｓ．avermitilis のａｖｅＣ  ＯＲＦ中に挿入されたSacc.erythraeaのｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）。
【図４】  図４．識別された５種類の重複コスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６９）を含むＳ．avermitilisからのアベルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図。ｐＳＥ１１８およびｐＳＥ１１９の関係も示す。
【図５】  図５．Ｓ．avermitilis菌株によって生産される発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピーク定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較によって行われた。シクロヘキシルＢ２保持時間は７．４〜７．７分；シクロヘキシルＢ１保持時間は１１．９〜１２．３分であった。図５Ａ．失活したａｖｅＣ  ＯＲＦを含むＳ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１。図５Ｂ．ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を用いて形質転換されたＳ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１。図５Ｃ．ｐＳＥ１８７を用いて形質転換されたＳ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１。図５Ｄ．ｐＳＥ１８８を用いて形質転換されたＳ．avermitilis菌株ＳＥ１８０−１１。
【図６】  図６．Ｓ．avermitilisのａｖｅＣ  ＯＲＦ（配列番号：２）、Ｓ．griseochromogenesからのａｖｅＣ相同部分ＯＲＦ（配列番号：５）、およびＳ．hygroscopicusからのａｖｅＣ相同ＯＲＦ（配列番号：４）によってコードされる推定のアミノ酸配列の比較。肉太活字のバリン残基は、タンパク質の推定出発部位である。保存される残基は、全３種類の配列における相同性について大文字で、３種類の配列の内２種類の相同性について小文字で示される。アミノ酸配列は、約５０％配列同一性を含有する。
【図７】  図７．Ｓ．avermitilis ａｖｅＣ  ＯＲＦ中のＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩ中に挿入されたＳ．hygroscopicus ａｖｅＣ相同遺伝子からの５６４ｂｐ  ＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントを含有するハイブリッドプラスミド構築物。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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