(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの標的非タンパク質成分の分析方法であって、下記アミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１に示すサブチリシン147のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列の部分であって、少なくとも配列番号：２に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持しているもの；及び
（ｄ）前記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されており、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持している修飾されたアミノ酸配列；
のいずれか一つを有するプロテアーゼとともに上記混合物をインキュベートするステップを含む上記方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清又は尿であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーション・ステップの後、前記標的非タンパク質成分が、それに親和性をもつ物質に結合されることを特徴とする、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合の後、結合物が洗浄される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記洗浄の後、前記非タンパク質成分が前記親和性を有する物質から遊離される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非タンパク質成分とタンパク質成分の前記混合物が、核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸を含む非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの標的核酸成分の分析方法であって、以下のステップ；
（１）下記アミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１に示すサブチリシン147のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列の部分であって、少なくとも配列番号：２に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持しているもの；及び
（ｄ）前記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されており、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持している修飾されたアミノ酸配列；
のいずれか一つを有するプロテアーゼとともに上記混合物をインキュベートし、そして
（２）上記標的核酸成分を測定又は検出する、
を含む上記方法。
【請求項８】
前記標的核酸成分の測定又は検出の前に、当該核酸成分の増幅を行なう、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清又は尿であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、ウイルス又は微生物に由来することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（１）の後、前記核酸及び前記標的核酸成分が、核酸に親和性をもつ物質に結合されることを特徴とする、請求項７〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合の後、結合物が洗浄される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄の後、前記非タンパク質成分が前記親和性を有する物質から遊離される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
核酸及び前記標的核酸成分に親和性をもつ前記物質が、シリカ表面をもつ物質を含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト以外の動物の診断に用いる分析ための、請求項１〜14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ヒト以外の動物の診断における、請求項７に記載のプロテアーゼの使用。
【請求項１７】
非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの標的非タンパク質成分の分析のための、請求項７に記載のプロテアーゼの使用。
【請求項１８】
非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの標的非タンパク質成分の精製又は単離のための、請求項７に記載のプロテアーゼの使用。
【請求項１９】
前記標的非タンパク質成分が、核酸であることを特徴とする、請求項17又は18に記載の使用。
【請求項２０】
下記アミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１に示すサブチリシン147のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列の部分であって、少なくとも配列番号：２に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持しているもの；及び
（ｄ）前記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されており、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持している修飾されたアミノ酸配列；
のいずれか一つを有するプロテアーゼを含むことを特徴とする、請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法において使用するための又は請求項16〜19のいずれか１項に記載の使用のためのキット。
【請求項２１】
核酸に親和性をもつ物質を付加的に含むことを特徴とする、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
前記キットが、付加的に消化緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶離緩衝液を付加的に含むことを特徴とする、請求項20又は21に記載のキット。
【請求項２３】
下記アミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１に示すサブチリシン147のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列の部分であって、少なくとも配列番号：２に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持しているもの；及び
（ｄ）前記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されており、そしてサブチリシン147のタンパク質分解活性を維持している修飾されたアミノ酸配列；
のいずれか一つを有するプロテアーゼの水性組成物であって、ここで10mMトリス酢酸、5mM塩化カルシウム、5mM酢酸カルシウム、1mM EDTA、50％（V/V）グリセロールを含み、pH5.5であることを特徴とする、請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法において使用するための又は請求項16〜19のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、バチルス株からのプロテアーゼを用いた非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析方法に関する。さらに本発明は、核酸を含む非タンパク質成分及びタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとの１つの）標的核酸成分の分析方法であって、上記混合物をバチルス株からの（少なくとも１つの）プロテアーゼとともにインキュベートし、場合によりは（少なくとも１つの）標的核酸成分を増幅し、そして（少なくとも１つの）標的核酸成分を測定又は検出するステップを含む上記方法に関する。
【０００２】
本技術分野の背景
現在多くの生物学的な物質、特に核酸を自然環境から分離することに関して特に力が注がれている。一方でそれらは、しばしば非常に低濃度で存在し、そしてもう一方でそれらは、しばしば他の多くの固体と溶解された物質の中、例えば細胞の消化後に発見される。このことは、特に特定の分析物、例えば核酸又は特定の分析物の特性を検出でき、かつ、診断、研究での生物分析論、及び発生の分野において主要な役割を演じる生物特有のアッセイにおいて、それらを単離又は計測することを困難にしている。生物特有のアッセイの例は、ハイブリダイゼーション・アッセイ、イムノ・アッセイ、及びレセプター−リガンド・アッセイである。ハイブリダイゼーション・アッセイは、核酸分析物、例えばＲＮＡ及びＤＮＡ分子検出のためのに特異的な塩基対形成を利用する。したがって、１８〜２０ヌクレオチドの長さをもつオリゴヌクレオチド・プローブは、選択した相補的な配列、例えばヒト・ゲノムにおいて特異的な認識を可能にしうる。２つのポリヌクレオチド・プライマーが選択的な結合を引き起こす他のアッセイは、ＵＳ  ４，６８３，１９５に記載されるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。この方法は、数サイクルのうちにデオキシ核酸三リン酸の存在中で耐熱性ポリメラーゼにより特定の核酸領域を検出可能なレベルまで選択的に増幅させる。
【０００３】
先に記載したように、生物学的な物質は、先に挙げたアッセイの１つにより分析されるか又は他の工程に使用されるであろう前に、例えばタンパク性及び非タンパク質成分といった異なる成分の複雑な混合物を含む生物学的サンプルから分離又は精製されなくてはならない。大抵、最初のステップとして、対象となる成分、例えば核酸のような非タンパク質成分を濃縮させる工程が用いられる。しばしば、それらは、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子又はより複雑な生物の細胞、例えばヒト血液細胞若しくは植物細胞に含まれている。前記対象となる成分を、「標的成分」と呼ぶこともできる。
【０００４】
上述の細胞又は粒子の内容物を遊離するために、それらは、それら生物の細胞壁を溶解、分解、変性すべく酵素又は薬品により処理されうる。この工程は一般的に消化と言う。前記溶解された物質を含有する得られる溶液を、ライセートと言う。消化の間にたびたび遭遇する問題は、対象の非タンパク質成分を分解する他の酵素、例えば核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼが、消化の間に対象成分と接触することである。それらの分解酵素は、細胞外にも存在するかもしれないし又は消化前には空間的に離れた細胞区画にありそして現状で対象成分に接触するようになったのかもしれない。この工程の間に遊離される他の成分は、例えばリポポリサッカライド・ファミリーに属し、細胞毒でありそしてヒトまたは動物の治療に使用されることを意図した製品にとって問題となりうるエンドトキシンであろう。
【０００５】
先に挙げた問題に取り組むためのさまざまな手段がある。カオトロピック物質、例えば核酸を単離させたい場合、グアニジニウム・チオシアネート又は陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性若しくは非イオン性界面活性剤の使用が一般的である。それらの酵素又は不要なたんぱく質を素早く分解するプロテアーゼの使用もまた有効である。しかしながらこれは、前述の物質又は酵素が次のステップにおいて試薬又は成分を妨げうるといった他の問題を生み出す。
【０００６】
前記消化又は先に挙げたサンプル調製の工程において使用した有効でありうる酵素は、タンパク質基質のアミノ結合を切断する、プロテアーゼ又は（互換性）ペプチダーゼに分類される酵素である（Ｗａｌｓｈ，  １９７９，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃｈａｐｔｅｒ３を参照のこと）。先行技術において使用されているプロテアーゼは、例えば、アルカリ性プロテアーゼ（ＷＯ９８／０４７３０）又は酸性プロテアーゼ（ＵＳ  ５，３８６，０２４）である。核酸分離のためのサンプル調製として先行技術において広く使用されているプロテアーゼは、ｐＨ中性付近で活性であり、そして当業者にサブチリシンとして知られるプロテアーゼのファミリーに属する、トリティラチウム・アルバム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）からのプロテイナーゼＫである（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９を参照のこと）。サブチリシンは、グラム陽性菌又はカビにより産生されるセリン・プロテアーゼである。
【０００７】
バチルス種の細菌は、中性又はメタロプロテアーゼ及びサブチリシンと呼ばれる、機能的にはセリン・エンドペプチダーゼであるアルカリ性プロテアーゼの２種類の細胞外プロテアーゼを分泌する。セリン・プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解に触媒作用を及ぼし、活性部位に必須なセリン残基がある酵素である（Ｗｈｉｔｅ，  Ｈａｎｄｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  １９７３「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，」Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．２７１−２７２）。前記セリン・プロテアーゼは、２５，０００〜３０，０００Ｄａ（ダルトン）の範囲の中に分子量をもつ。それらは単純にエステル末端を加水分解し、そして活性において、同様にセリン・プロテアーゼである真核生物のキモトリプシンに似ている。前記もう一つの用語、アルカリ性プロテアーゼは、ｐＨ９．０〜１１．０のセリン・プロテアーゼの高い至適ｐＨを反映している（説明として、Ｐｒｉｅｓｔ，  １９７７，  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．４１：７１１−７５３を参照のこと）。
【０００８】
トリティラチウム・アルバムからのプロテイナーゼＫ（Ｊａｎｙ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，  １９８５，  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３６６：４８５−４９２を参照のこと）を含む、多種多様なサブチリシンが、確認されている（例えばＫｕｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：５６２９−５６３１；  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒｉ，  １９８４，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８；  Ｖａｓａｎｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８１１−８１９，  Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８９１３−８９２６；  Ｎｅｄｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３６６：４２１−４３０；  Ｓｅｖｅｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．  １９６：２２８−２３２；  Ｍｅｌｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．１８３：１９５−２００を参照のこと）。サブチリシンは、三次構造によってだけでなく一次構造によっても明確に特徴づけられている（例えばＫｒａｕｔ，  １９７７，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３３１−３５８；  Ｋｕｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：５６２９−５６３１；  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒｉ，  １９８４，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８；  Ｖａｓａｎｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８１１−８１９；  Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８９１３−８９２６；  Ｎｅｄｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３６６：４２１−４３０；  Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．  １９６：２２８−２３２；  Ｍｅｌｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．１８３：１９５−２００；  Ｊａｎｙ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，  １９８５，  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３６６：４８５−４９２を参照のこと）。
【０００９】
この発明との関連において２つのさらなるセリン・プロテアーゼのアミノ酸及びＤＮＡ配列は、きわめて重要である。これらのプロテアーゼは、ＮＣＩＢに寄託され、そしてそれぞれ登録番号ＮＣＩＢ  １０１４７とＮＣＩＢ  １０３０９で示される、２種類のバチルス・レントゥスの変異体１４７と３０９から抽出された（ＷＯ８９／０６２７９及びＵＳ  ３，７２３，２５０を参照のこと）。便宜上これらの株により産生されたプロテアーゼは、それぞれサブチリシン１４７とサブチリシン３０９と示され、そしてこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、サブチリシン１４７遺伝子と３０９遺伝子と呼ばれる。これらの配列の開示を、ＷＯ８９／０６２７９にて入手できる。それに対応するものが、ＥＰ３９６６０８とＵＳ  ５，７４１，６９４である。サブチリシンは、工業、特に衣服の洗浄に用いる洗剤として多くの有用性を見出された。
【００１０】
前記消化ステップに続くサンプル調製の次のステップにおいて、対象成分は、さらに濃縮される。対象の非タンパク質成分が、例えば核酸の場合、通常それらはプローブに基づくアッセイに使用される前に複雑な消化混合物から抽出される。
【００１１】
核酸の抽出にはいくつかの方法がある：
−配列依存すなわち生物特有の方法として、例えば：
・アフィニティー・クロマトグラフィー
・固定化プローブへのハイブリッド形成
−配列非依存すなわち物理化学的方法として、例えば：
・例えばフェノール−クロロホルムによる液液体体抽出
・例えばエタノールによる沈澱
・ろ紙による抽出
・セチル−トリメチル−アンモニウム−ブロミドのようなミセル形成物質による抽出
・固定化インターカレート色素、例えばアクリジン誘導体への結合
・シリカ・ゲルすなわちけいそう土への吸着
・カオトロピック条件下、磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）すなわち有機シラン粒子への吸着
抽出目的として特に興味深いものは、他の表面でも可能ではあるが、ガラス表面への核酸の吸着である。近年、それらのガラス表面に結合する性質の利用により、それらの自然環境からの核酸の分離のための多くの手段が提案されている。
【００１２】
先に挙げたように、核酸分離のサンプル調製のための先行技術において広く用いられるプロテアーゼは、トリティラチウム・アルバムからのプロテイナーゼＫである。しかしながら、このプロテアーゼは、製品が比較的に高価であるといった不都合な点をもつ。さらにプロテイナーゼＫは、磁性ガラス粒子を用いるＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸処理した血液の血漿からの核酸分離の方法において、上記粒子が互いに接着することがよくあり不都合である。これは、非常に多数のサンプルの分析に使用される自動化された工程にとって非常に不都合である。
【００１３】
それゆえに、比較的安価で、均一の品質を持ち、そしてさまざまな工程に使用されうるプロテアーゼを用いる、標的非タンパク質成分、特に核酸の新しい分析方法を提供することが、本発明の目的である。好ましくはそれがさまざまに異なった物質、例えばＥＤＴＡ、クエン酸又はヘパリン処理した血液の血漿又は血清からの（少なくとも１つの）標的核酸成分の分析に対して使用することが可能であることが望ましい。この方法は、自動化された工程に特に好適であることが望ましい。理想的なプロテアーゼは、核酸の精製にたびたび用いられるカオトロピック作用物質の存在下でも非常に活性であろう。
【００１４】
この問題は、非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析方法であって、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をもつ（少なくとも１つの）プロテアーゼとともに上記混合物をインキュベートするステップを含む上記方法に関するところの本発明の発見により解決された。本実施例から理解されうるように、前記プロテアーゼは、カオトロピック作用物質の存在下で非常に活性であり又はクエン酸若しくはＥＤＴＡ処理した血液の血漿の分解においても同様に活性である。これは、先行技術から予見されることができなかった。
【００１５】
要するに、この発明は、バチルス株からのプロテアーゼを用いた、非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析方法に関する。さらには本発明は、核酸を含む非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的核酸成分の分析方法であって、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をもつ（少なくとも１つの）プロテアーゼとともに上記混合物をインキュベートするステップを含み、場合により、（少なくとも１つの）標的核酸成分を増幅し、そして（少なくとも１つの）標的核酸物質を測定又は検出する上記方法にさらに関する。場合により、前記核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分が、それに親和性をもつ物質に結合され、場合により洗浄され、さらに場合によりそれに親和性をもつ物質から遊離される。ここで核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分に親和性をもつ前記物質は、シリカ表面をもつ物質、特に磁性ガラス粒子を含む。本発明は、診断、研究及び生物分析論において、例えば核酸の精製への、非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析への、非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の濃縮への又は非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の精製若しくは単離への本発明によるプロテアーゼの使用にさらに関する。本発明は、本発明によるプロテアーゼを含むキット並びに診断及び／又は核酸の精製への本発明によるキットの使用にも関する。本発明を、以下により詳細に記載する。
【００１６】
本発明の説明
非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析方法であって、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をもつ（少なくとも１つの）プロテアーゼとともに上記混合物をインキュベートするステップを含む上記方法を提供することは本発明の１つの態様である。前記用語「由来する」は、本来生物学的サンプル中に含まれる非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物を生み出すために生物学的サンプルが操作又は処理されることを意味する。この混合物から特定の非タンパク質成分を分析、分離、濃縮又は精製することが可能であることが望ましい。前記用語「分析」は、標的非タンパク質成分の存在又は総量を調べる、すなわち標的非タンパク質成分が検出又は測定されるすなわちその量が決定されることを意味することが望ましい。操作又は処理ステップは、当業者に知られる化学的又は物理的操作を含む。より特に、これは生物学的サンプルを消化することによりおこなわれることができる。生物学的サンプルは、植物又は（ヒトを含む）動物から採取されるサンプルであって、そして固体又は液体である。具体的な例を、以下により詳細に記載する。
【００１７】
本発明のさらなる態様において、本方法には、インキュベーションの後に前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質に結合し、場合により洗浄し、そして場合により前記標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質から遊離するようなさらなるステップをもつ。その後、前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分は、当業者に知られる及び、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ又は「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」，  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ  （ｅｄｓ．），  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９８，  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙによる分析方法により測定又は検出されうる。好ましくは、前記標的非タンパク質成分の量は、本明細書に記載の方法により測定される。本明細書に記載の方法は、好ましくは研究、生物分析論、特に診断又は医学における診断上の検査、すなわちヒト又は動物における病気又は機能障害の原因特定のために用いられる方法に使用される。
【００１８】
したがって、本発明の好ましい態様は、得られる非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記混合物を（少なくとも１つの）本発明によるプロテアーゼとともにインキュベートし、
（ｂ）上記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質に結合し、
（ｃ）場合により洗浄し、さらに場合により上記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質から遊離し、そして
（ｄ）上記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分を測定又は検出する、
を含む上記方法である。
【００１９】
最も好ましい態様において、前記ステップ（ｃ）は任意ではない、すなわち結合した（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分は洗浄され、そしてそれに親和性をもつ物質から遊離される。好ましくは前記標的非タンパク質成分の総量が測定される。
【００２０】
本発明によるプロテアーゼは、前記タンパク質成分、すなわち生物学的サンプルの前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分を濃縮し、分離し又は精製することが重要性をもつ場合、加水分解されるであろうペプチド結合を含む成分を分解する。本発明によるプロテアーゼは、固形、例えば錠剤又は粉末又はプロテイナーゼＫについての記載と類似したやり方で緩衝化緩衝化した又は緩衝化していない溶液に溶解した形で添加されうる。
【００２１】
この発明の目的について、前記用語「エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）」は、本発明によるプロテアーゼを意味する、すなわち登録番号ＮＣＩＢ  １０１４７としてＮＣＩＢに寄託されているバチルス・レントゥス変異株１４７由来サブチリシン１４７プロテアーゼである。アミノ酸配列配列番号１は、分泌後にプロテアーゼの働きにより除去されるシグナル配列を含むサブチリシン１４７プロテアーゼ（又はエスペラーゼ）の完全長アミノ酸配列である。シグナル配列は、発現したタンパク質の宿主細胞からの分泌を導き、そして分泌後タンパク分解的に除去される配列である。配列番号２は、シグナル配列をもたないエスペラーゼの配列である。前記用語「エスペラーゼ」は、シグナル配列の不完全な又は不正確なプロセッシングにより産生されるかもしれない、そして低いがいまだ十分に高い活性を持つものと同じタンパク分解活性をもつ配列番号１のタンパク分解性の誘導体をも含む。前記アミノ酸配列は、サブチリシン１４７遺伝子、すなわちヌクレオチド配列配列番号３、その一部又はその縮重のバージョンによりコードされうる。縮重配列は、結果として本来コードされているアミノ酸の変化を伴わず無数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置き換えられる遺伝子コードの意味の範囲内で縮重されている。
【００２２】
本発明による前記用語「タンパク性物質」は、（少なくとも１つの）ペプチド結合を含む物質を表すことを意図する、したがって「タンパク性物質」は好ましくは天然のアミノ酸による（少なくとも１つの）タンパク質を含む物質の組成物である。それらのペプチド結合のほとんどは、隣接する化学基（又はアミノ酸）の化学的性質及びペプチド結合の接触性に依存して本発明によるプロテアーゼにより加水分解されうる、すなわち前記タンパク性物質は、本発明によるプロテアーゼの基質である。したがって、前記用語「非タンパク性物質」は、ペプチド結合を含まず、そして本発明によるプロテアーゼの基質でない物質を表すことを意図する。
【００２３】
バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼは、当業者により使用でき、例えばＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ又はＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，  Ｄｅｎｍａｒｋからのものである。このプロテアーゼを入手するために実行可能な他の手段は、寄託された微生物からの前記遺伝子の分離又は標準的手順によるプロテアーゼをコードする遺伝子の合成である、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡを参照のこと。シグナル配列を含む前記プロ−タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）、前記分泌したプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号２）及びこのタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号３を参照のこと）は、ＷＯ８９／０６２７９、ＥＰ  ３９６  ６０８及びＷＯ９８／２０１１５から得られる。前記分泌したタンパク質の主な形態は、配列番号３のヌクレオチド２８０〜１０８３によりコードされる、すなわち前記シグナルペプチドは配列番号３のヌクレオチド１〜２７９によりコードされる。前記微生物の単離は、ＵＳ  ３，７２３，２５０に記載される。前記単離された菌株は、ＮＣＩＢ  １０１４７として寄託される。慣用の遺伝子合成は、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ａｌａｍｅｄａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ，そして新しく得たＱｉａｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙによる前例に従っておこなわれうる。当業者の標準的手順の使用は、発現ベクターの構築、遺伝子産物の発現及び本明細書中に援用されるであろうところのＷＯ８９／０６２７９又はＷＯ９８／２０１１５に基本的に記載されるタンパク質の分離を可能にする。
【００２４】
所有しているこの情報により、当業者は、異なるアミノ酸で置換することによりサブチリシン１４７のアミノ酸配列に対し８０％同一のアミノ酸配列をもつプロテアーゼをコードする遺伝子の構築及び発現をも可能にする。したがって、当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡに記載の標準的手順又はＷＯ８９／０６２７９若しくはＷＯ９８／２０１１５に記載の方法論を使用する。前記タンパク分解活性についての試験は、それら２つの国際出願又はこの発明に記載される。
【００２５】
さらなる態様において、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と同一（１００％同一）であるアミノ酸配列をもつプロテアーゼが使用される本発明による方法が、開示される。さらなる態様において、プロテアーゼのアミノ酸配列がアミノ酸配列配列番号１、プロテアーゼ活性をもつ配列番号Ｉのタンパク分解性誘導体又はアミノ酸配列配列番号２であることを特徴とする本発明による方法が、開示される。本発明のもっと他の態様において、本発明によるプロテアーゼのアミノ酸配列が核酸配列配列番号３、本発明の活性なプロテアーゼをコードする配列番号３の一部又は核酸配列配列番号３の縮重のバージョンによりコードされることを特徴とする本発明による方法が、開示される。本発明は、置換、欠失及び付加により修飾された、機能的に同等な分子を提供するＤＮＡ配列配列番号３の誘導体を企図する。例えば、配列をコードするヌクレオチドの縮重により配列番号１又は２で表されるものと同一のアミノ酸配列を大体においてコードする他のＤＮＡ配列を、この発明の操作において使用することができる。さらには、同じグループ、例えば極性又は疎水性のアミノ酸がお互いに交換されるところのアミノ酸の置換をもつアミノ酸配列が使用されうる。
【００２６】
本発明の態様において、前記生物学的サンプルは、ウイルス又は細菌細胞と同様に多細胞生物から分離された細胞、例えばヒト及び動物細胞の白血球、そして免疫学的に活性な低分子及び高分子の化学物質、例えばハプテン、抗原、抗体及び核酸、血漿、大脳液、痰、便、生検検体、骨髄、うがい水、血清、組織、尿又はそれらの混合物を含むことを意図する。本発明の好ましい態様において生物学的サンプルは、人体又は動物体からの液体であり、好ましくは生物学的サンプルは、血液、血漿、血清又は尿である。血漿は、好ましくはＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸処理した血液の血漿である。本発明の１つの態様において生物学的サンプルは、細菌細胞、真核生物細胞、ウイルス又はそれらの混合物を含む。
【００２７】
生物学的サンプルは、例えば細菌培養、ファージ・ライセートからの環境分析、食品分析又は分子生物学研究に用いられるタイプであることもできる。ある場合において生物学的サンプルは、本発明による方法の前処理なしに使用されうる。しかしながら、多くの場合において、前記サンプルを、適切な方法を用いて溶解され、前記サンプル中に含まれる生物学的物質を遊離し、それにより前記タンパク質成分及び非タンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものが作られるべきである。サンプルの溶解の方法は、当業者により知られ、そして事実上化学的、酵素的又は物理的でありうる。それらの方法の組合せが、同様に適用できる。例えば、溶解は、超音波、高圧、剪断力により、アルカリを用いて、洗剤若しくはカオトロピック生理的食塩溶液又はプロテアーゼ若しくはリパーゼを用いておこなわれうる。核酸を得るための溶解方法を考慮して、専門の文献、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｗ  ａｌ，：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８７，  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＵＳＡを参照のこと。
【００２８】
本発明のさらなる他の態様において、生物学的サンプルは、本発明によるプロテアーゼにより部分的に又は完全に分解される（少なくとも１つの）グリコシル化タンパク質を含む。したがって、本発明は、グリコシル化タンパク質、すなわち糖の一部を共有結合的に結合した炭水化物部分の部分的な又は完全な分解のために本発明によるプロテアーゼの使用をも意図する。
【００２９】
本発明による方法は、前記インキュベーションの後に前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分のそれに親和性をもつ物質への結合、場合により洗浄さらに場合により前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分のそれに親和性をもつ物質からの遊離といったさらなるステップももちうる。その後、前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分は、当業者に知られた及び例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ又は「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」，  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ  （ｅｄｓ．），  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９８，  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙに記載された標準的な分析方法により測定又は検出されうる。
【００３０】
前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質に結合するために、非タンパク質成分とタンパク質成分の混合物を、前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分が前記物質の表面に結合する条件下、前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分に親和性をもつ物質と接触させる。この条件は、含まれる前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分のタイプに依存するが、当業者により基本的に知られている。それらは、前記（少なくとも１つの）非タンパク質成分を前記表面に接着させる方法にも依存する。例えば、修飾した核酸が標的非タンパク質成分の場合、その結合は、その修飾を提示する核酸の基を介しておこなわれ、例えばビオチンはストレプトアビジンでコートした表面との結合を介しておこなわれる。
【００３１】
非修飾核酸が標的非タンパク質成分の場合、前記核酸のシリカ表面をもつ物質への直接結合が、おこなわれる、なぜならとりわけ非修飾核酸、そして天然の核酸でさえ結合されることができるからである。これらの工程は、さまざまな文書に詳細に記載される。例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ  ７６，  ６１５−６９１（１９７９）において、ヨウ化ナトリウムが存在するアガロース・ゲルからフリントすりガラスに核酸を結合する方法が述べられている。過塩素酸ナトリウムの存在するガラス・ディッシュ上の細菌からのプラスミドＤＮＡの精製は、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２１，  ３８２−３８７（１９８２）に記載されている。ＤＥ−Ａ  ３７  ３４  ４４２において、酢酸を用いたファージ粒子の沈澱によりグラス・ファイバー・フィルター上の一本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡの分離及び過塩素酸塩によるファージ粒子の溶解が記載されている。グラス・ファイバー・フィルターに結合した核酸は、洗浄され、そしてその後メタノール含有トリス／ＥＤＴＡ緩衝液により溶出される。ラムダ・ファージからのＤＮＡの精製のための類似の方法が、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７５，  １９６−２０１（１９８８）に記載されている。前記方法は、カオトロピック塩溶液中において核酸のガラス表面への選択的な結合、そして夾雑物、例えばアガロース、タンパク質又は細胞残渣からの分離を伴う。夾雑物からガラス粒子を分離するために、前記粒子が、遠心分離されるか又は液体がグラス・ファイバー・フィルターを通されるかのどちらかでありうる。しかしながら、これは、多量のサンプルの処理に前記方法を使用させない制限的なステップである。塩及びエタノールの添加による析出後、核酸を固定するための磁性粒子の使用は、より有利であり、そしてＡｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０１，  １６６−１６９（１９９２）及びＰＣＴ  ＧＢ  ９１／００２１２に記載される。この方法において、核酸は、前記磁性粒子に吸着される。前記吸着物は、磁場の利用し、そして洗浄ステップをおこなうことによりもとの溶媒から分離される。１回の洗浄ステップの後、核酸は、トリス緩衝液中に溶解される。しかしながら、この方法は、前記析出が核酸について選択的でないという不利な点をもつ。それどころか、さまざまな固体及び不溶性物質が同様に接着される。結果として、この方法に存在するかもしれない特異的な酵素反応の有意な量の全ての阻害物質の除去に使用することはできない。磁性の多孔質ガラスは、多孔質の特定のガラス基質中に磁性粒子を含み、そしてストレプトアビジンを含む層に覆われている市販品が利用できる。ビオチンに共有結合的に結合するように生物学的物質が複合体調製ステップにおいて修飾されるならば、この製品は、生物学的物質、例えばタンパク質又は核酸の分離のために利用されうる。磁化できる特定の吸着剤が、自動サンプル調製において能率的であり、そして好適であることを示した。超常磁性色素と同様にフェリ磁性及び強磁性色素が、この目的のために使用されうる。最も好ましいＭＧＰｓは、ＷＯ０１／３７２９１に記載のものである。
【００３２】
詳細には、ガラス粒子への（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の結合方法は、以下のとおり記載されうる。それは好ましくは濃度が１〜８ｍｏｌ／ｌの間、さらに好ましくは２〜６ｍｏｌ／ｌの間のカオトロピック塩の存在中でおこなわれる。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又はグアニジニウム塩酸塩でありうる。他の物質でも可能である。精製の効果は、これらの条件下、すなわち一定の濃度のカオトロピック作用物質の存在中、より高い有機溶媒濃度又は酸性条件下、ガラス表面をもつ物質に結合するというＤＮＡ又はＲＮＡの性質に起因する。（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分に親和性をもつ物質との接触においてサンプルを引き寄せるために、前記サンプルを、上記物質と混合し、そして結合が起こるのに十分な時間インキュベートする。当業者は普通非磁性粒子の処理をおこなう方法からインキュベーション・ステップの継続時間を熟知している。このステップは、さまざまな時点における表面に固定化された生物学的物質の量を測定することにより最適化されうる。１０秒〜３０分の間のインキュベーション時間が、核酸に使用される。インキュベーションの後、結合した（少なくとも１つの）標的タンパク質成分を、液体から分離する。これは、一般的に重力によるか又は核酸が磁性ガラス粒子に結合した適当な場合に磁場を利用することにより磁性粒子に結合した物質を分離することにより実現される。例えば、前記磁性粒子を、インキュベーションがおこなわれた試験管壁に引き寄せることができる。その後前記磁性粒子に結合されなかったサンプル内容物を含む液体を、除去しうる。用いた除去方法は、インキュベーションがおこなわれた試験管の種類により決定する。好適なステップは、ピペッティング又は吸引を介した前記液体の除去を含む。次に結合したＤＮＡ又はＲＮＡをもつ前記物質を、少なくとも１度、好ましくは７０容のエタノールと３０容の水の割合の混合物（「７０％エタノール」）において洗浄しうる。（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分を前記物質表面から遊離をさせてしまうことがなく、できるだけ徹底的に望ましくない夾雑物を洗い流す洗浄液を使用する。好ましくはこの洗浄ステップは、（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分を結合した物質を前記洗浄液とともにインキュベートすることによりおこなわれる。好ましくは前記物質を、このステップの間に再懸濁させる。好ましくは汚染した洗浄液を、生物学的物質を結合するために先に記載したステップと同様に除去する。最後の洗浄ステップの後、前記物質を減圧にて短時間に乾燥しうるか又は流体を蒸発させうる。アセトンを用いる前処理ステップもまたおこなわれうる。その後、条件は戻されうる、例えばカオトロピック作用物質又は有機溶媒の濃度を、前記物質に結合したＤＮＡ又はＲＮＡの溶離のために低くする。好ましくは、前記磁性ガラス粒子をサンプルの残りから分離する工程を、固定した生物学的物質のペレット化、例えば重力により又は磁性ガラス粒子の場合には磁石の使用によりおこない、そして上清の除去をおこなう。次に固定した生物学的物質をもつ前記磁性ガラス粒子を、全くないか又は少量のみのカオトロピック作用物質及び／又は有機溶媒を含む溶液に再懸濁させる。あるいは、前記懸濁液は、全くないか又は少量のみのカオトロピック作用物質及び／又は有機溶媒を含む溶液に希釈されうる。この種類の緩衝液は、ＤＥ  ３７２４４４２及びＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７５，  １９６−２０１（１９８８）から知られる。低い塩含有量をもつ溶離緩衝液は、特に０．２ｍｏｌ／ｌ未満の含有量をもつ緩衝液である。特に好ましい態様において、溶離緩衝液は、緩衝化の目的でトリス物質を含む。特殊な他の態様において、溶離緩衝液は、脱塩した水である。精製したＤＮＡ及びＲＮＡを含む溶液は、すぐに他の反応に使用されることができる。
【００３３】
洗浄及び結合ステップについて、好ましくは分子生物学における工程、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の精製工程であって、特定の条件下、それらの物質のガラス粒子に対する結合を利用する上記工程に好適である液体が使用される。好ましい液体は、アルコール及び／又はケトン又はそれらのいくつかと水との混合物を含む。アルコールは、本発明による好ましくはＲがｎ＞＝０をもつ一般式−（−ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３を意味する一般式Ｒ−ＯＨの一級、二級又は三級アルコールを含むであろう。しかしながら、他のアルコールもそれらが、例えばグリセロールのように分子生物学用途に好適であれば使用されうる。特に好適には、前記アルコール、すなわちイソプロパノール、エタノール又はそれらと水の混合物、好ましくは８０容のイソプロパノールと２０容の水の混合物である。本発明の他の態様において前記液体には、例えばアセトンといったケトンが含まれる。
【００３４】
本発明に用いた磁性ガラス粒子は、異なった剤形において提供されうる。それらを錠剤、粉末として又は好ましくは懸濁液の形状にて提供することが可能である。本発明の好ましい態様においてそれらの懸濁液は、５〜６０ｍｇ／ｍｌの磁性ガラス粒子（ＭＧＰｓ）を含む。本発明の他の態様においてシリカ含有物質は、場合により２〜８ｍｏｌ／ｌ、そして好ましくは４〜６ｍｏｌ／ｌの濃度においてカオトロピック作用物質を含みうる水性緩衝化溶液中に懸濁される。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又はグアニジニウム塩酸塩である。当業者により知られる他の化合物であってもよい。本発明によるカオトロピック作用物質は、液状に水の構造を乱し、そしてＤＮＡ又はＲＮＡを含む溶液中にこの作用物質が存在した場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが磁性ガラス粒子に結合することに対して効果をもつあらゆる化学物質である。好適な水性緩衝化溶液を作り出すことは、当業者にとって自明のことである。分子生物学目的において好適な緩衝液系は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ中に見出されうる。好ましい緩衝液物質は、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）、リン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、それらの塩又は他の好適な物質である。さらに、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム若しくは塩化カルシウムのような溶液のイオン強度を変える物質又は、例えばエチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはそれらの塩のような金属陽イオン錯化剤である物質が、提供されうる。当業者に知られる他の生物学的物質もまた提供されうる。本発明による方法は、核酸、すなわちＲＮＡ又はＤＮＡのそれらを含む他の生物学的物質を伴う複雑な混合物からの精製に好適である。したがって、たとえ混合物が対象の核酸を少量含んでいたとしても、異なる核酸の混合物は精製されうる。本発明の１つの態様において、前記標的核酸が濃度の点から見て微量成分でありうる（又は少量において存在しうる）特定の核酸の混合物は精製される。
【００３５】
記載した方法は、天然の又は修飾された生物学的物質の単離のために使用されうる。天然の生物学的物質は、その構造が天然の生物学的物質と比較して不可逆的に修飾されることのなかった物質であると理解される。これはどんな方法であっても修飾することができないサンプルの他の成分を意味するものではない。修飾した生物学的物質は、天然に存在しない物質、例えば反応性の、検出が可能な、固定化の可能なそれらのグループに接着することにより修飾される核酸を含む。この１つの例は、ビオチン化核酸である。
【００３６】
上記ステップの後、本発明による方法を用いて単離した非タンパク質成分は、さらに必要な場合に用いられうる。例えば、それらはさまざまな酵素反応の基質として用いられうる。核酸が含まれる場合、それらは、シークエンス、放射性若しくは非放射性標識、それらが含む配列の１つ以上の増幅、転写、標識された核酸プローブによるハイブリッド形成、翻訳又は連結に用いられうる。したがって、本発明のより好ましい態様において前記方法は、結合した（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質から遊離するステップを含む。適宜、前記（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分は、先に記載した物質から単離されうるこのやり方にて精製した。
【００３７】
本発明の好ましい態様において前記方法は、（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の検出又は測定のステップを含む。したがって本発明の好ましい態様は、測定若しくは検出ステップが続く先に記載した精製方法又は増幅そして測定若しくは検出ステップが続く精製方法である。核酸の場合、標的核酸又は対象の核酸は、非標的核酸の混合物中に含まれうる、さらに上述の特定の核酸の混合物中の微量成分でさえありうる。好適なＤＮＡ検出方法は、当業者に知られている、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  ＮＹ及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８７，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹといった標準的な教科書に記載されている。ＤＮＡ検出ステップの前にもありうるさらなる精製ステップは、例えば沈澱ステップとしておこなわれる。前記検出方法は、二重鎖ＤＮＡの中に挿入され、そしてその吸光度を変化させる臭化エチジウムのような特定の染料の結合又は挿入を含みうるがそれに限定されない。精製されたＤＮＡは、場合により制限消化の後に電気泳動法により分離され、そしてその後可視化される。特異的な配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を利用し、そしてその後に上記ハイブリッドを検出するプローブに基づくアッセイもある。当業者に知られているさらなるステップの後にＤＮＡの配列決定することも可能である。他の方法には、特異的プローブがそれに結合されるところのシリコン・チップに多様なＤＮＡ配列を適用し、そして相補的な配列が結合するときにシグナルを発生する。
【００３８】
本発明の好ましい態様において核酸を含む非タンパク性及びタンパク質成分の混合物は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその両方を含むところの核酸を含む。
【００３９】
本発明の好ましい態様は、核酸を含む非タンパク質成分及びタンパク性物質の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的核酸成分の分析方法であって、以下のステップ；
（ａ）前記混合物とともにバチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をもつ（少なくとも１つの）プロテアーゼをインキュベートし、
（ｂ）場合により上記（少なくとも１つの）標的核酸成分を増幅し、そして
（ｃ）上記（少なくとも１つの）標的核酸成分を測定又は検出する、
を含む上記方法に関する。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、前記標的核酸成分の量は、測定される。
【００４１】
本発明の態様において前記プロテアーゼのアミノ酸配列は、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と同一である。本発明の好ましい態様においてプロテアーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸配列配列番号１、プロテアーゼ活性をもつ配列番号１のタンパク分解性誘導体又はアミノ酸配列配列番号２である。本発明のさらに他の好ましい態様において本発明によるプロテアーゼのアミノ酸配列は、核酸配列配列番号３、配列番号３の一部又は核酸配列配列番号３の縮重のバージョンによりコードされる。本発明のさらに他の態様において前記生物学的サンプルは、例えばヒト及び動物の細胞、例えば白血球のような多細胞生物から分離された細胞と同様にウイルス又は細菌、さらに免疫学的に活性な低分子及び高分子の化学物質、例えばハプテン、抗原、抗体及び核酸、血漿、大脳液、痰、便、生検検体、骨髄、うがい水、血清、組織、尿又はそれらの混合物を含むことを意図する。本発明の好ましい態様において生物学的サンプルは、人体又は動物体からの液体であり、好ましくは上記生物学的サンプルは、血液、血漿、血清又は尿である。前記血漿は、好ましくはＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸処理した血液の血漿である。本発明の１つの態様において生物学的サンプルは、細菌細胞、真核生物細胞、ウイルス又はそれらの混合物を含む。
【００４２】
本発明の好ましい態様において核酸及びタンパク性物質の混合物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）又はその両方を含み、好ましくは前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその両方は、（少なくとも１つの）ウイルス又は（少なくとも１つの）微生物から抽出される。前記ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）又はパルボウイルスＢ１９でありうる。
【００４３】
本発明の好ましい態様において（少なくとも１つの）標的核酸成分及び他の核酸は、基本的には先に記載したとおり精製される。その後前記（少なくとも１つの）標的核酸成分は、さらに処理され、すなわち標的核酸成分は標的配列を検出可能な量まで特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応法により増幅され、そして検出される。他の可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ，  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  １９８９，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９及びＢａｒａｎｙ，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）；ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応法（Ｂａｒａｎｙ，  １９９１，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．  １：５−１６）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９０／０１０６９）；修復連鎖反応法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ４３９，１８２  Ａ２）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７；  Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８；  ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９２／０８８０Ａ）、並びにＮＡＳＢＡ（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，１３０，２３８）である。さらに、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、転写を介した増幅法（ＴＭＡ）、及びＱβ−増幅法（総説として、例えばＷｈｅｌｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｉｎｇ  （１９９６），  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５０，  ３４９−３７３；  Ａｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，  １９９３，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７を参照のこと）がある。
【００４４】
特に好ましい検出方法は、ＷＯ９２／０２６３８及びそれに対応する米国特許ＵＳ  ５，２１０，０１５、ＵＳ  ５，８０４，３７５、ＵＳ  ５，４８７，９７２に記載のＴａｑＭａｎ（商標）法である。この方法は、シグナルを発生させるためにポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用する。詳細には、（少なくとも１つの）標的核酸成分は、サンプルと標的核酸成分の１つの領域に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド及び同じ標的核酸成分の配列鎖の、しかし上記第一のオリゴヌクレオチドにより定義される核酸配列を含まない第二の領域に対し相補的な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成条件の間に、上記第一のオリゴヌクレオチドの３’末端が上記標識されたオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接するような、第一のオリゴヌクレオチド及び標識されたオリゴヌクレオチドにアニールした標的核酸を含む二重鎖の混合物を作り出すために接触することを含む工程により検出される。次に５’から３’へのヌクレアーゼ活性をもつ鋳型依存性核酸ポリメラーゼによりアニールした標識オリゴヌクレオチドを切断するために上記ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性をもたせ、そして標識された断片が遊離するのに十分な条件下、この混合物を処理する。前記標識されたオリゴヌクレオチドの加水分解により発生したシグナルは、検出及び／又は計測される。ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、固層結合された反応複合体を形成し、そして検出できるようにする必要性を取除く。より一般的な用語では、（少なくとも１つの）標的核酸成分の精製の後の検出ステップであって増幅及び／又は検出反応が、均質な溶液層であるやり方を開示する。
【００４５】
本発明の他の好ましい態様において（少なくとも１つの）標的核酸成分を含む核酸は、場合によりそれらが増幅される又は測定される若しくは検出される前にそれらに親和性をもつ物質に結合される。結合の後それらは、基本的には先に記載したように場合により洗浄され、そして場合によりそれらに親和性をもつ物質から遊離される。したがって、本発明の好ましい態様は、核酸を含む非タンパク質成分及びタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的核酸成分の分析方法であって、以下のステップ；
（ａ）前記混合物とともに（少なくとも１つの）本発明によるプロテアーゼをインキュベートし、
（ｂ）（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分をそれに親和性をもつ物質に結合し、
（ｃ）場合により洗浄し、さらに場合により（少なくとも１つの）標的核酸成分をそれに親和性をもつ物質から遊離し、
（ｄ）場合により（少なくとも１つの）標的核酸成分を増幅し、そして
（ｅ）（少なくとも１つの）標的核酸成分を測定又は検出する、
を含む上記方法に関する。
【００４６】
最も好ましい態様において、前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は任意でない、すなわち結合した（少なくとも１つの）標的核酸成分は、洗浄され、そしてそれに親和性をもつ物質から遊離される、さらに（少なくとも１つの）標的核酸成分は、それが測定又は検出される前に増幅される。好ましくは標的核酸成分の量は、測定される。
【００４７】
核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分に親和性をもつ物質は、シリカ表面をもつ物質を含み、好ましくはシリカ表面をもつ物質がガラスであり、最も好ましくは核酸に親和性をもつ物質が磁性ガラス粒子を含む組成物である。前記ステップは、基本的にはすでに先に記載したとおりにおこなわれる。要するに、磁性ガラス粒子は、（少なくとも１つの）標的核酸成分を包含する核酸を含む溶解混合物に添加される。−機械的な撹拌により最適化されることができる−吸着がおこなわれるのに好適な時間の後、前記粒子は、検出されることのない余分な成分を含んだ周囲にある液体から分離される。好ましくはこれは、磁場を用いることにより、磁石を容器の壁に置き、そして残留している液体を試験管から除去することによりおこなわれる。なおも存在しうるさらなる夾雑物を除去するために、好ましくは洗浄ステップが、核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分がガラス表面から遊離される原因とならない液体によりおこなわれる。核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分がガラス表面に結合されなくなり、そして溶離される試薬条件をもつ溶離緩衝液は、（少なくとも１つの）標的核酸成分を含む核酸をガラス表面から外すために添加される。それらの条件は、特に低濃度塩の条件である。上記核酸及び（少なくとも１つの）標的核酸成分の意図されるさらなる用途により、前記液体は、前記粒子からすぐに分離され、そしてさらにすぐに処理されうる。この分離ステップは、好ましくは溶離物から前記粒子を分離するために磁場の利用を介しておこなわれる。この方法のための最も好ましい磁性ガラス粒子は、ＷＯ０１／３７２９１に記載されている。
【００４８】
好ましくは本発明による方法は、診断上の分析又は生物分析論に用いられる。
【００４９】
本発明の好ましい態様において本発明によるプロテアーゼは、研究、生物分析論又は診断に使用されうる。さらに好ましい態様において本発明によるプロテアーゼは、非タンパク性及びタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の分析に、非タンパク性及びタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の濃縮に又は非タンパク性及びタンパク質成分の混合物であって生物学的サンプル由来のものの（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分の精製若しくは単離に使用される。好ましい（少なくとも１つの）標的非タンパク質成分は、核酸であり、好ましくはウイルス若しくは微生物又は核酸を含む非タンパク性及びタンパク質成分の混合物からである。好まれるウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス若しくはヒト免疫不全ウイルス又は先に記載したその他のウイルスである。
【００５０】
本発明は、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をもつ（少なくとも１つの）プロテアーゼを含むことを特徴とするパーツから成るキットをさらに企図する。本発明の他の態様において前記プロテアーゼのアミノ酸配列は、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と同一である。本発明の好ましい態様においてプロテアーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸配列配列番号１、プロテアーゼ活性をもつ配列番号１のタンパク分解性誘導体又はアミノ酸配列配列番号２であり、本発明によるプロテアーゼの好ましいアミノ酸配列は、核酸配列配列番号３、活性なプロテアーゼをコードする配列番号３の一部又は核酸配列配列番号３の縮重のバージョンによりコードされる。本技術分野において知られている前記キットは、例えば９６若しくは３８４穴型のマイクロタイター・プレートのようなサンプル調製手順の間に使用されうる又は、例えばエッペンドルフ、ハンブルク、ドイツにより製造されたまさに普通の反応試験管として使用されうるプラスチック製品及び本発明による方法を実行するための他の試薬をさらに含む。したがって、前記キットは、核酸（及び（少なくとも１つの）標的核酸成分）に親和性をもつ物質を補足的に含むことができ、好ましくは前記核酸（及び（少なくとも１つの）標的核酸成分）に親和性をもつ物質が、シリカ表面をもつ物質を含む。好ましくは、前記シリカ表面をもつ物質は、ガラスである。最も好ましくは、核酸に親和性をもつ物質は、磁性ガラス粒子を含む組成物である。前記キットは、例えば細胞の溶解をもたらすカオトロピック作用物質、界面活性剤若しくはアルコール又はそれらの混合物を含む溶解緩衝液をさらに又は補足的に含むことができる。本発明によるキットのそれらの成分は、試験管又は保存容器に別個に提供されうる。前記成分の性質により、それらは、１つの試験管又は保存容器の中にさえ提供されうる。前記キットは、ＤＮＡ又はＲＮＡがそれに結合されている場合の磁性ガラス粒子の洗浄ステップのために好適な洗浄溶液をさらに含みうる。この洗浄溶液は、エタノール及び／又は緩衝化溶液若しくはエタノールを含まない酸性ｐＨの溶液中のカオトロピック作用物質及び／又は先に記載したカオトロピック作用物質を含みうる。しばしば洗浄溶液又は他の溶液は、使用前に希釈されなくてはならない原液として提供される。前記キットは、溶離剤又は溶離緩衝液、すなわち磁性ガラス粒子に結合したＤＮＡ又はＲＮＡを溶離するための溶液若しくは緩衝液（例えば１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）又は純水をさらに又は補足的に含みうる。さらには、核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡの精製プロセスに使用されることができる補足的な試薬又は緩衝化溶液が、与えられうる。
【００５１】
本発明の好ましい態様は、例えばＷＯ  ９９／１６７８１に記載されているような自動化しうる方法に本発明の方法又はキットを用いることである。自動化できる方法とは、上記方法のステップが外部からの制御又は人間の力をわずかに伴うか又は全く伴わない操作を可能にする装置又は機械により実行されるのに好適であることを意味する。自動化された方法とは、自動化できる方法のステップが外部からの制御又は人間の力をわずかに伴うか又は全く伴わない操作を可能にする装置又は機械により実行されるのに好適であることを意味する。前記方法の調製ステップ、例えば保存容器は満たされ、そしてセットされなくてはならず、サンプルの選択は人間により成されなくてはならず、そして当業者が知るさらなるステップ、例えば制御コンピュータの操作だけは、手作業でおこなわれなくてはならないであろう。前記装置又は機械は、例えば自動的に液体を添加し、サンプルを混合し又は一定の温度によりインキュベーション・ステップを実行しうる。典型的には、前記機械又は装置は、１つのステップ及び命令が指定されているプログラムを実行するところのコンピュータにより制御されるロボットである。好ましい自動化された方法は、前記方法及び用いた機械又は装置が短時間でのサンプルの高処理量のために最適化されることを意味する高処理量形式で実行されるものである。本発明の他の態様において本発明による方法又はキットは、いくつかの反応ステップが手を使っておこなわれなくてはならないことを意味する半自動化された工程に使用される。本発明の好ましい態様において、本発明によるＭＧＰｓを含む懸濁液は保存容器から取り出され、そして一部が別の反応容器に加えられる。反応容器は、プラスチックでできた反応試験管、結局は反応がおこなわれうる９６若しくは３８４又はそれ以上のウエルを含むマイクロタイタープレート形式でありうる。しかしながら、それらの容器は、他の材料、例えばスチールから作られうる。
【００５２】
本発明の好ましい態様において本発明によるキットは、研究、生物分析論又は診断における核酸の精製に使用される。本発明による好ましい態様において本発明によるキット又は本発明による方法は、高処理量形式すなわち非常に短時間うちに多数の異なるサンプルの分析を可能にする自動化された方法において使用される。
【００５３】
当業者は、本発明の教示及び実施例から、本発明によるプロテアーゼ、すなわちエスペラーゼ・プロテアーゼと等価なやり方で機能する他のプロテアーゼの同定の仕方を知る。それにより、エスペラーゼと同等の方法をおこなうエスペラーゼの変異体又は突然変異体の同定も可能になる。「突然変異（ｍｕｔａｎｔ）アミノ酸配列」、「突然変異タンパク質」又は「突然変異ポリペプチド」は、天然の配列と異なるアミノ酸配列をもつポリペプチド又は天然の配列から意図的に変えられた核酸配列によりコードされるポリペプチドを指す。「突然変異タンパク質」、「変異（ｖａｒｉａｎｔ）タンパク質」又は「突然変異」は、突然変異アミノ酸配列を含むタンパク質及びアミノ酸の欠失、置換又はその両方により天然のエスペラーゼのアミノ酸配列と異なるポリペプチドを含むタンパク質を意味する。「天然の配列（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、野生型又は天然型の遺伝子若しくはタンパク質と同一であるアミノ酸又は核酸配列を指す。
【００５４】
それらの変異又は突然変異タンパク質を発見するために、当業者はエスペラーゼがプロテアーゼの活性測定の基準として用いられる実施例１の試薬及び緩衝液と同一の溶液を調製するであろう。最初に、当業者は、対象のプロテアーゼを血漿タンパク質消化のクロマトグラフ的分析プロトコール（実施例３を参照のこと）に記載のとおり分析するであろう。当該プロテアーゼは、サンプル調製におけるその特性によりそしてその後のＰＣＲ増幅及び増幅した産物の検出によりさらに分析されるであろう（実施例２を参照のこと）。保存安定性の検討（実施例６を参照のこと）又はカオトロピック作用物質中における酵素活性の評価（実施例５参照のこと）は、開示した酵素エスペラーゼとの比較にさらに重要である。これらの検討の結果を考慮することで、当業者は、対象のプロテアーゼが本発明により開示されたエスペラーゼ・プロテアーゼと等価のやり方で機能するかどうか決定できる。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、本発明によるプロテアーゼの水性組成物である、すなわちプロテアーゼはバチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であって、前記組成物は１０ｍＭトリス酢酸、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ酢酸カルシウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％（Ｖ／Ｖ＝体積／体積）グリセリンを含み、ｐＨ５．５である。この組成物は、エスペラーゼの理想的な保存緩衝液である（実施例６を参照のこと）。当業者は、本発明によるプロテアーゼが、修飾された緩衝液組成物中で等しく安定である限り、実施例５の教示を考慮して上記緩衝液の組成を修飾することができる。さらなる態様において、先に記載した組成物中のプロテアーゼのアミノ酸配列は、バチルス・レントゥスからのサブチリシン１４７プロテアーゼのアミノ酸配列と同一であるか又はプロテアーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸配列配列番号１、プロテアーゼ活性をもつ配列番号１のタンパク分解性誘導体若しくはアミノ酸配列配列番号２である。他の態様において、先に記載した組成物中の本発明によるプロテアーゼのアミノ酸配列は、核酸配列配列番号３、配列番号３の一部又は核酸配列配列番号３の縮重のバージョンによりコードされる。本発明による組成物は、核酸の精製のため又は診断若しくは診断上の分析におけるサンプル調製又はサンプル調製方法、特に本発明による上記方法に用いられることができる。
【００５６】
以下の実施例、参考文献、配列表及び図は、本発明の理解を助けるために提供されるもので、真の範囲は添付した請求項において説明される。本発明の本質を逸脱せずに上記手順において変更がされるうることは理解される。
【００５７】
実施例１：試薬及び緩衝液
１．１  プロテアーゼ
以下のプロテアーゼについて、サンプル調製工程におけるそれらの適合性について試験した：
0003621673.tif 000002
１．２  緩衝液：
１．２．１  溶解−及び結合緩衝液：
溶解−及び結合緩衝液を以下のように調整された：
５Ｍグアニジウムチオシアネート
１５％ポリドカノール（Ｐｏｌｙｄｏｃａｎｏｌ）
１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
１５ｍＭビス−トリス、ｐＨ６．０
１．２．２  洗浄緩衝液：
洗浄緩衝液は以下の組成を用いた：
５０％エタノール
５０ｍＭ塩化ナトリウム
１０ｍＭビス−トリス、ｐＨ６．０
１．２．３  溶離緩衝液：
溶離緩衝液はＲＮａｓｅを含まない滅菌水を用いた。
【００５８】
１．３  磁性ガラス粒子：
ＷＯ０１／３７２９１に記載されているような磁性ガラス粒子を、６ｍｇ／ｍｌの濃度でイソプロパノールに懸濁させた。前述の磁性ガラス粒子は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔＩ（ロシュ、マンハイム、ドイツ）から得ることもできる。
【００５９】
0003621673.tif 000003
実施例２  サンプル調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応法
２．１  ポリメラーゼ消化及び溶解：
８０μｌのプロテアーゼ溶液を４２０μｌのサンプル物質（例えば一定のウイルス濃度をもつ血漿）と混ぜ、そしてかき混ぜる。５００μｌの溶解−及び結合緩衝液を添加し、そして上記溶液を室温にて１０分間かき混ぜる。
【００６０】
２．２  結合：
５００μｌのイソプロパノール中への磁性ガラス粒子の懸濁液を添加し、そして上記溶液を室温で２０分間かき混ぜる。
【００６１】
２．３  洗浄：
結合ステップの後に前記磁性ガラス粒子を磁石により前記溶液から分離し、洗浄サイクルごとに７５０μｌの洗浄緩衝液により洗浄する。
【００６２】
２．４  溶離：
最後の洗浄サイクルの後に前記磁性ガラス粒子を磁石により前記懸濁液から分離し、そして前記洗浄緩衝液を磁性ガラス粒子から吸い出し、そして１００μｌの溶離緩衝液を加える。前記懸濁液をかき混ぜ、そして８０℃にて１５分間インキュベートする。溶離ステップの後に前記磁性ガラス粒子を磁石により再び分離し、そしてウイルスの核酸を含む上清を回収する。
【００６３】
２．５  増幅／検出プロトコール：
プライマーを除いて全ての試薬をロシュ・モレキュラー・バイオケミカルス社から入手した。
【００６４】
0003621673.tif 000004
サンプル調製工程からの標的核酸、例えばウイルスのＲＮＡ（ＨＣＶ、ＨＩＶ）又はウイルスのＤＮＡ（ＨＢＶ）を含む溶離液２０μｌを１００μｌのマスター・ミックスと混合する。増幅を以下のサーモサイクラーのプログラムによりパーキン−エルマー・サーモサイクラー９６００においておこなう。
【００６５】
0003621673.tif 000005
増幅した物質の検出のために、電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく非常に感度の高い非同位体的方法を用いた。ルテニウム−トリス（ビピリジル）標識したオリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）を変性したビオチン標識増幅物質に対して特異的にハイブリダイズした。続いて、このハイブリッド物質をストレプトアビジン・コートした磁性ビーズに結合した。その後前記ビーズを永久磁石を用いて電極上に捕獲し、ルテニウム標識のＥＣＬ反応を、電位の利用により誘発した。ＥＣＬ検出工程の詳細については、Ｈｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１３）を参照のこと。完全に自動化されたＥＣＬ検出を機器プラットホームでおこなった（Ｅｌｅｃｓｙｓ１０１０の前の原型；ベーリンガー・マンハイム社）。
【００６６】
ＨＣＶ：
ＫＹ８０：          配列番号４
ＫＹ７８：          配列番号５
プローブ：      配列番号６
ＨＩＶ：
ＳＫ４６２：          配列番号７
ＳＫ４３１：          配列番号８
プローブ：      配列番号９
ＨＢＶ：
プライマー１：    配列番号１０
プライマー２：    配列番号１１
プローブ：      配列番号１２
結果
【００６７】
【表１】
0003621673.tif 000006
【００６８】
サンプル調製工程における血漿タンパク質の分解へのエスペラーゼ及びチラザイムの使用に限って得られたＥＣＬシグナルは、サンプル調製工程におけるプロテイナーゼＫの使用により発生したシグナルに匹敵する。
【００６９】
実施例３  血漿タンパク質消化のクロマトグラフ的分析プロトコール：
タンパク質の消化及び溶解を記載のとおりおこなった。それぞれ１００μｌのライセート溶液を、高圧液体クロマトグラフィー機器（ＨＰＬＣ）（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｇｙｎｋｏｔｈｅｋ）に注入し、そして逆相カラム（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）において０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の０〜８０％アセトニトリルの線形勾配にて分離した。ピークを２２０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長において検出した。
【００７０】
【表２】
0003621673.tif 000007
【００７１】
図１において、エスペラーゼ（図１ａを参照のこと）及びプロテイナーゼＫ（図１ｂを参照のこと）によるＥＤＴＡ血漿とクエン酸血漿の消化の比較を示す。
【００７２】
実施例４  至適ｐＨの評価
エスペラーゼの至適ｐＨを、さまざまなｐＨをもつ基本的には１．１．４に記載の緩衝液を用いてプロテイナーゼＫの至適ｐＨと比較した。前記至適ｐＨは、プロテイナーゼＫと比較においてより中性ｐＨ領域よりであった（図２を参照のこと）。
【００７３】
サンプル：タンパク質量１０ｍｇを１ｍｌの滅菌水中に溶解する。測定の前に、前記サンプルを、前記試験における吸光度の増加が０．０２〜０．０５Ｅの間になるように滅菌水にて希釈する。
【００７４】
サンプル緩衝液：
・ｐＨ範囲：５．５と７．５の２つ：５０ｍＭビス−トリス＋１０ｍＭ塩化カルシウムを、２Ｎ塩酸又は２Ｎ水酸化ナトリウムにて個々のｐＨに調整する。
【００７５】
・ｐＨ範囲：７．５と９．５の２つ：５０ｍＭトリス−塩基＋１０ｍＭ塩化カルシウムを、２Ｎ塩酸又は２Ｎ水酸化ナトリウムにて個々のｐＨに調整する。
【００７６】
0003621673.tif 000008
【００７７】
・層の厚さ：１ｃｍ
【００７８】
【数１】
0003621673.tif 000009
【００７９】
比活性：それぞれのサンプルについて、最も高い測定した活性を１００％の値とみなし、そして他のｐＨ値における活性をこの値に対する百分率に換算することにより評価する。
【００８０】
実施例５  カオトロピック作用物質の存在中における酵素活性の評価
エスペラーゼの酵素活性を、カオトロピック作用物質の量を増加した基本的には１．１．４に記載の緩衝液を用いてカオトロピック作用物質の存在中においてプロテイナーゼＫの酵素活性と比較した。エスペラーゼは、カオトロピック作用物質存在中においてより高い活性を保持した（図３及び図４を参照のこと）。このより低い残留活性は、エスペラーゼによるタンパク質の消化がカオトロピック作用物質存在中においてとても速いこと（≦１分間）及びエスペラーゼが低い残留活性をもつことにおいて有利である。これは、活性のより低いエスペラーゼがそれが増幅反応を妨げうる増幅反応へ移される限りでは有利である。
【００８１】
0003621673.tif 000010
【００８２】
活性の測定：
・試験緩衝液：５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ＝８．２；１０ｍＭ塩化カルシウム
・基質：２００ｍＭ  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドをＤＭＳＯ中に溶解
・計測温度：２５℃
・計測波長：４０５ｎｍ
評価：至適ｐＨの評価を参照のこと
実施例６  保存安定性：
前記プロテアーゼの安定性を、保存緩衝液（組成：１０ｍＭトリス酢酸、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ酢酸カルシウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％（Ｖ／Ｖ）グリセリド、ｐＨ５．５）中にて熱ストレス下、タンパク分解活性を以下の方法により測定した。基質としてＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを使用した動力学的アッセイを用いた。使用直前にプロテアーゼ・サンプルを滅菌水にて１〜３μｇ／ｍｌの濃度に希釈しなくてはならない。２ｍｌの緩衝液を０．０２ｍｌの基質及び０．０５ｍｌの希釈したサンプルと混合した。２５℃にて基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離を、４０５ｎｍにて分光光学的に計測した。エスペラーゼの安定性の経時曲線をプロテイナーゼＫと比較して図５に示す。この実験の結果は、エスペラーゼが保存緩衝液中で長期間の後でさえ非常に安定であることを示すことができたことである。
【００８３】
【表３】
0003621673.tif 000011
【００８４】
【化１】
0003621673.tif 000012
【００８５】
【化２】
0003621673.tif 000013
【００８６】
【配列表】
0003621673.tif 000014
0003621673.tif 000015
0003621673.tif 000016
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0003621673.tif 000018
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0003621673.tif 000020
0003621673.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】ａは、高圧液体クロマトグラフィーにより分析したエスペラーゼによるＥＤＴＡ血漿とクエン酸血漿の消化の比較
ｂは、高圧液体クロマトグラフィーにより分析したプロテイナーゼＫによるＥＤＴＡ血漿とクエン酸血漿の消化の比較。
【図２】エスペラーゼの至適ｐＨの測定。
【図３】カオトロピック作用物質濃度依存性のエスペラーゼとプロテイナーゼＫの残留活性の測定。最も高い活性を１００％の値に合わせ、そして他の濃度を最も高い値に相対して算定する。
【図４】グアニジニウム・チオシアネートの濃度依存性のエスペラーゼとプロテイナーゼＫの安定性の測定。前記プロテアーゼの活性を、グアニジウム・チオシアネートの添加後、及びグアニジウム・チオシアネートの存在する中で２５℃にて１５分間の後に直ちに計測する。さまざまなグアニジウム・チオシアネート濃度における残留活性の割合を、この図に示す。
【図５】エスペラーゼとプロテイナーゼＫの保存緩衝液（組成：１０ｍＭトリス酢酸、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ酢酸カルシウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、ｐＨ５．５）中での安定性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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