(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列１から３０２７までの配列で示される塩基配列を備えるＤＮＡ断片。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の発現ベクターを含む形質転換植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は植物の遺伝子工学の分野に属し、特にＡＤＰリボシル化因子遺伝子の植物における発現調節領域を用いた遺伝子発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日における遺伝子工学的技術の進歩によって、植物の遺伝子レベルからの育種（いわゆる分子育種）が盛んに研究されつつある。しかしながら、遺伝子工学手法を用いて植物の品種改良等を達成するためには、対象植物においてその有用遺伝子を合目的かつ効率的に発現機能させる必要がある。そして、遺伝子の発現を合目的的に調節するためには、植物の持つ遺伝子発現調節領域を分離利用するのが一般的である。
【０００３】
現在まで利用されている代表的な遺伝子発現調節領域としては、例えば、タバコモザイクウイルスの 35sプロモーター（Guilley, H., et al (1982).Cell 30, 763-773. ）、あるいはイネ由来アクチン遺伝子プロモーター（McElroy, D., et al. (1990). The Plant Cell, 2, 163-171. ）等がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、植物においては、汎用性のあるプロモーターの数が依然として少ないという問題がある。実際に、対象植物において発現の時期、場所、程度が重要であるということを考えると、現実に利用できる植物の遺伝子発現調節領域の例は余りにも少ない。これは、植物の品種改良のために分離もしくは作製された有用遺伝子を、対象植物において自由に発現機能させる技術はそれほど進歩していないことに基づく。
【０００５】
このため、現在では、植物において有用遺伝子を合目的かつ効率的に機能させるための遺伝子発現調節技術の確立と蓄積が期待されている。
【０００６】
本発明は以上のような課題に鑑みなされたものであり、その目的は、植物において組織特異的かつ効率的に発現させることが可能な遺伝子発現ベクターを構築することであり、より具体的には、遺伝子工学的手法を用いた植物品種改良、植物組織あるいは細胞を用いた物質生産において有用な遺伝子を合目的かつ効率的に発現させることができる遺伝子発現ベクターを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段および作用】
以上のような目的を達成するために、本発明においては、植物用のプロモーターとして、ＡＤＰリボシル化因子のプロモーターを用いることを特徴とする。
【０００８】
具体的には、本願の請求項１に係る発明は、配列番号１の配列１から３０２７までの配列で示される塩基配列を備えるＤＮＡ断片もしくはプロモータ活性を有するその一部を有するＤＮＡ断片である。
【０００９】
請求項２に係る発明は請求項１記載のＤＮＡ断片を含む発現ベクターであり、請求項３に係る発明は請求項２記載の発現ベクターを含む形質転換植物細胞である。
【００１０】
このＡＤＰリボシル化因子（ADP Riboslyation Fator；以下、ＡＲＦという）遺伝子の発現調節領域（以下、単にプロモーターと呼ぶ場合がある）を遺伝子発現に利用することにより、目的遺伝子を対象植物において合目的かつ効率的に発現機能させることが可能となり、植物品種改良、植物培養細胞を用いた有用物質生産等に利用することができる。
【００１１】
［ＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）］
（先行文献）
ＡＲＦは、最初はコレラ毒素の促進因子として発見された。哺乳類では、特に脳に多く蓄積され、その量は全蛋白の１％を占める（Kahn, R., and Gilman, A. G. (1984) The Journal of Biological Chemistry, 259, 6228-6234）。最近の研究から、ＡＲＦは真核生物に一般に存在する分子量約20kDのタンパク質であり、細胞内輸送に関与する低分子量G タンパク質の一種であることが分かっている（Serafini, T., et al. (1991) Cell, 67, 239-253.）。また、その遺伝子構造についても酵母、哺乳類、双子葉植物などで報告されている（Sewell, J. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85, 4620-4624.）。
【００１２】
（本発明者らの研究）
本発明者らは、オオムギにおける組織特異的遺伝子発現系の構築を目指す研究において、ＡＲＦ遺伝子が、オオムギ種子、根、カルスで活発に発現するが、葉においては発現が非常に抑えらているか、ほとんど発現しないという特徴を有する遺伝子であるということを発見した。
【００１３】
本発明者らの研究は、ＡＲＦ遺伝子についてその機能からではなく、それを遺伝子発現の観点から研究した最初のものであり、本発明は、ＡＲＦ遺伝子の発現調節領域が、産業上有用である遺伝子発現ベクターに利用できるということを明らかにしたものである。即ち、本発明に係るＡＲＦ遺伝子発現領域を利用して構築された遺伝子発現ベクターは、遺伝子工学的手法を用いた植物品種改良、植物組織あるいは細胞を用いた物質生産において、特徴ある遺伝子発現系として広く利用されることが期待される。
【００１４】
［ＡＲＦのcDNAの単離］
本発明者らは、ディファレンシャルスクリーニングの技法により、組織特異的にかつ高レベルで発現されるＡＲＦ遺伝子のcDNAのクローニングに成功し、完全長のcDNAを単離した。次に、ＡＲＦ遺伝子の上流領域をクローニングし、そのプロモーター活性を確認すると共に、本遺伝子発現調節領域を利用した遺伝子発現ベクターを作出した。
【００１５】
［発現ベクターの取得］
本発明者らは、オオムギの遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、この遺伝子の上流領域のＤＮＡ断片を単離し、この断片とレポーター遺伝子とを結合して遺伝子発現ベクターを構築した。
【００１６】
具体的には、本発明のＡＲＦ遺伝子のプロモーターを利用した遺伝子発現ベクターは、以下のような方法により得られる。
【００１７】
（ディファレンシャルスクリーニング）
一般的な方法としては、高橋らの方法などにより（Takahashi, Y.,Kuroda, H., et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9279-9283 ）、異なる遺伝子発現を行っている細胞、組織から発現特異的な遺伝子をクロニングすることができる。例えば、根の polyA+ RNA を抽出後、これからcDNAを合成し、cDNA断片をラムダファージベクターまたはプラスミドベクターに組み込み、cDNAライブラリーを作製する。ライブラリーの一部をプレーティングし、ナイロンフィルターに転写後、葉または根の放射性プローブとハイブリダイズさせ、根で特異的に発現するクローンをスクリーニングする。クローンの塩基配列は、常法により決定することができる。
【００１８】
（プロモーターのクローニング）
遺伝子の上流領域の断片のクローニングの一般的な方法については、 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A laboratory Manual (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Pressなどに詳細に記載されている。例えば、本発明ではcDNAの塩基配列が明らかであるので、いくつか適当な制限酵素を用い、染色体ＤＮＡを切断しゲノムサザン法を行って、どれくらいの大きさの上流領域断片が得られるかが分かる。次にオオムギ染色体ＤＮＡを分離し、この酵素で切断後、このＤＮＡを用いて染色体ライブラリーを作製する。放射性cDNAプローブを作製し、このライブラリーをスクリーニングすれば、目的の上流領域をクローニングすることができる。
【００１９】
（遺伝子発現ベクターの機能の確認）
得られた上流領域がプロモーターとして機能するかは、一般的には、上流領域にレポーター遺伝子を連結後、適当な細胞や組織に導入し、レポーター遺伝子の発現を酵素化学的に確認することにより行う。詳細な方法は、Draper, J., et al. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A laboratory manual. (1988) Blackwell Scientific Publicationsなどに記載されている。
【００２０】
本発明に係るベクターは、オオムギ培養細胞のプロトプラストに導入して遺伝子の発現を解析することにより、その機能が確認された。
【００２１】
即ち、本発明では、まず分離された上流領域ＤＮＡ断片にβ-glucronidase 遺伝子を連結し、オオムギ培養細胞プロトプラストに導入した。数日培養後、全蛋白質を抽出し、基質4-methyl umbelliferyl glucuronide(4-MUG)を用いてその全蛋白質中の酵素活性を測定することによりプロモーターの機能が確認され、その結果、遺伝子発現ベクターとして採用可能であることが明らかになった。
【００２２】
（ＡＲＦプロモーターをコードするＤＮＡ断片の単離法）
配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片は以下の方法で得られる。まず、配列番号１の１〜５０の塩基配列を有するＰＣＲプライマーと、２９７６〜３０２７の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＰＣＲプライマーと、をＤＮＡ合成装置（例えば、DNA Synthesizer( ABI製) またはGene Assembler（ファルマシア製））で合成する。オオムギゲノムＤＮＡをＣＴＡＢ法、ＳＤＳ−フェノール法で精製する（これについては、Draper著、Plant Genetic Transformation and Gene expressionなどに詳細に記載されている）。最終的にＡＲＦプロモーターの配列を有するＤＮＡ断片は、例えばＬＡ  ＰＣＲキット（宝酒造製）やＸＬ−Ｗａｘ１００（パーキン  エルマー製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応により合成することができる。
【００２３】
また、ＡＲＦプロモーターの配列を有するＤＮＡ断片は、直接的に合成することもできる。例えば、配列番号１の１〜１１０の塩基配列を有するＤＮＡ断片と、１〜１６の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片と、を合成する。１〜１１０の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡは、これらのプライマーを用い、Klenow filling反応を利用して得られる。同様にして、１００〜１９０の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得ることができる。次に、一般的な遺伝子クローニング法により、配列番号１の１０４に認識部位を持つ制限酵素ＡｐａＩを利用して、この２つのＤＮＡを連結する。この手順を繰り返して、最終的に、配列番号１の１〜３０２７の塩基配列を有する完全長のＤＮＡ断片が得られる。
【００２４】
【実施例】
以上説明したように、本発明においては、ディファレンシャルスクリーニングの技法により完全長のcDNAを単離し、オオムギの遺伝子ライブラリーをスクリーニングしてこの遺伝子の上流領域のＤＮＡ断片を単離し、この断片とレポーター遺伝子とを結合することによって遺伝子発現ベクターを構築した。そして、このベクターは、オオムギ培養細胞のプロトプラストに導入して遺伝子の発現を解析することにより、その機能が確認された。以下に、実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。しかしながら、本発明はこの実施例に限定されるべきものではない。
【００２５】
［実施例１］  根で発現するcDNAライブラリーの作製
第１、２葉が展開したオオムギ幼植物（はるな二条由来）の根10g を分離し、液体窒素で凍結後、液体窒素中で粉末状になるまでブレンダーで磨砕した。液体窒素を蒸発させた後、100ml の4Mグアニジンイソシアネート  0.1Mトリス-HCl(pH7.0) 溶液と100ml のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1混合溶液) を加え、数分ブレンダーで混合した。この懸濁液を遠心チューブに移し、 4000Gで20分間遠心し、水層を回収した。これにフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1混合溶液) を等量加えて遠心し、水層を回収した。フェノール層と水層の間の中間層がなくなるまでこれを繰り返した後、1/10容量の3M酢酸ナトリウムと 2.5容量のエタノールを加え、全核酸を沈澱させた。沈澱を10mlの0.5M KCl 10mM トリス-HCl (pH 8.0）に溶解後、オリゴdTセルロース（ベーリンガー社製）カラムを用いて、 polyA+ RNA を精製した。
【００２６】
この polyA+ RNA  2μg とcDNA合成キット（アマシャム社、cDNA synthesis system plus）を用いてcDNAを合成した。このcDNAとcDNAクローニングシステムλgt10（アマシャム社製）を用いて、λgt10ライブラリーを作製した。
【００２７】
［実施例２］  ディファレンシャルスクリーニング
実施例１の方法を用いて、第１、２葉が展開したオオムギ幼植物の葉の polyA+ RNA を精製した。実施例１で作製したλgt10ライブラリーを103 pfu/plate となるようにプレーティング後、ハイボンドN+フィルター（アマシャム社製）に転写し、アルカリ固定した。これを２回繰り返し、フィルターを２枚用意した。このフィルターをそれぞれ根と葉の polyA+ RNA 2 μg を鋳型として合成した放射性cDNAプローブ（105 cpm/μg  polyA+ RNA ）をハイブリダイゼーション溶液（ 6×SSC, 1%SDS）20ml中で65℃の条件で24時間ハイブリダイズし、洗浄液（ 2×SSC, 1%SDS）を用いて65℃の条件で4 回洗浄した。フィルターを乾燥後オートラジオグラフを行い、各ファージクローンの示すシグナル強度を比べ、根で強くシグナルを示すクローンを元のプレートから回収した。
【００２８】
［実施例３］  cDNAクローンの構造解析
各ファージクローンを増殖し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡからcDNAインサートを分離し、pUC118またはpUC119（宝酒造社製）にクローニングした。塩基配列の決定は、 ABI社製373ADNA シーケンサーを用いて、ジデオキシ法により行った。
【００２９】
［実施例４］  cDNAクローンR151の解析
いくつかのcDNAの塩基配列を決定し、それをコンピュータ検索した結果、そのうちの一つ、cDNAクローンR151は、ヒト、ウシ、酵母のＡＲＦ遺伝子とアミノ酸レベルで約90% の相同性を示すことが分かった（図１）。またこのcDNAクローンR151をプローブとして用い、ノーザンブロット解析を行ったところ、この遺伝子はオオムギ種子、根、培養細胞で非常に強く発現し、葉ではほとんど発現しないことが分かった。
【００３０】
［実施例５］  上流領域ＤＮＡ断片のクローニング
このcDNAクローンR151をHindIII 切断して得られる、ARF タンパク質N 末端領域を含む上流側のＤＮＡ断片をプローブとして、オオムギ染色体ＤＮＡを制限酵素HindIII 切断した材料に対し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、クローニング可能で、かつプロモーター領域を含むと考えられる5kb のバンドが検出された。そこでオオムギ染色体ＤＮＡをHindIII 切断後、5kb 付近のＤＮＡ断片を電気泳動により分離し Lambda Blue MidTM（Clontech社製）のHindIII 部位に連結し、ライブラリーを作製した。このライブラリーを上記プローブでスクリーニングし、クローンλR15 を得た。即ち、本実施例では、R151のHindIII 上流プローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングしてλＤＮＡを単離したのである。
【００３１】
［実施例６］  上流領域ＤＮＡ断片の構造解析
上記断片をpUC118のHindIII 部位にクローニング後、制限酵素地図を作製した（図２）。因みに、λR15 を切断しない酵素は、EcoRI,ClaI,SalI,KpnI,NaeI,SacII,SmaIである。この結果から、ＡＲＦ蛋白のＮ末端は、ほぼ中央に位置すると考えられ、また方向性は図２の通りと考えられた。そこで、正確なN 末端の位置を確定するため、配列番号２で示したＮ末端をコードする塩基配列を認識する合成プライマー 5'- ACGAATTCATGGGGCTCACGTTTACCAAGCTG-3'と M13プライマー（宝酒造社製）を用いて、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行い、反応後検出されるＤＮＡ断片の大きさを測定した。その結果、Ｎ末端は下流から約2.3kbpに位置することが分かった。そこで、Ｎ末端付近から、上流部分に相当するHindIII(1)-BamHI(3070)断片をpUC118にクローニングし、実施例に示した方法で、塩基配列を決定し、配列番号１に示す結果を得た。
【００３２】
［実施例７］  遺伝子発現ベクターの構築と発現解析
（遺伝子発現ベクターの構築）
レポーター遺伝子であるβ -グルクロニダーゼ遺伝子とＡＲＦプロモーター断片とを連結し、プロモーター活性を測定した。図３（ａ）に示されるpBI101（東洋紡社製）を制限酵素HindIII とEcoRI で切断し、2280bps の断片を電気泳動を用いて回収し、pUC118のHindIII とEcoRI 部位にクローニングし、pSBG419 を構築した（図３（ｂ））。次に、 pSBG419を制限酵素PstIで切断し、宝酒造社製DNA blunting kitを用いて、平滑末端化後、連結し、pSBG420 を構築した（図３（ｃ））。同様な方法で、 pSBG420のHindIII に、実施例５で示した上流領域ＤＮＡ断片をクローニングし pSBG421を構築した（図３（ｄ））。このpSBG421 を制限酵素XhoIとSphI切断し、配列番号１に示したXhoI(2700)- NlaIII(3010)断片をクローニングしpSBG418 を構築した（図３（ｅ））。pSBG418 は、ＡＲＦプロモーター下流にアミノ酸、メチオニン、プロリン、バリン、アスパラギン、セリン、アルギニン、グリシン、セリン、プロリン、グリシン、グリシン、グルタミン、セリン、ロイシンがＮ末端に付加したβ -グルクロニダーゼ融合遺伝子が連結した構築となり、ＡＲＦプロモーターの駆動で、β -グルクロニダーゼ融合遺伝子の転写が誘導される。
【００３３】
（発現解析）
次に、オオムギ野生種完熟胚(Hordeum bulbosum 由来) から誘導した懸濁細胞B53 のプロトプラストを用い、トランジェント発現実験を行い、プロモーター活性を調べた（図４）。継代５日目、または７日目の懸濁細胞から酵素液を使って、約108 のプロトプラストを単離した。次にプロトプラストをに懸濁して、2x106 のプロトプラストと 2nmolのpSBG418 、pBI221（東洋紡社製）と、キャリアＤＮＡとして牛胸腺ＤＮＡを合わせて60μg となるよう加え、バイオラッド社製ジーンパルサーを用いて900V/cm, 125μF の条件でエレクトロポレーションを行った。プロトプラストを回収後、15mlのMSD4, 0.6Mマンニトールに懸濁し、9cm シャーレで、25℃の条件で3 日間静置培養した。培養後、細胞を回収後、Gus 抽出バッファー（50mMリン酸バッファー(pH 7.0), 10mM EDTA(pH 7.0), 0.1% トライトンX-100, 0.1% ラウリルサコルシンナトリウム, 10mMメルカプトエタノール）で可溶化し、 100μg の可溶性タンパク質を用いて、基質4MUGを用いてガスアッセイを行った。
【００３４】
その結果、それぞれ比活性 8.9nmol 4-MU mg-1hr-1（可溶性蛋白）または、 0.3nmol 4-MU mg-1hr-1（可溶性蛋白）を示し、本発明に係るプロモーター（R15 プロモーター（pSBG418 ））は、継代５日目も７日目も、従来用いられている35s プロモーター（pBI221）よりも高い活性を示し、特に継代７日目では35s プロモーターの約30倍の活性を示すことが明らかになった。
【００３５】
なお、他の有用遺伝子を発現させる場合には、β -グルクロニダーゼ融合遺伝子と有用遺伝子を交換挿入させればよく、当業者であれば、周知・慣用技術を用いて容易に実現することができる。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るＡＲＦ遺伝子発現領域を利用して構築された遺伝子発現ベクターは、遺伝子工学的手法を用いた植物品種改良、植物組織あるいは細胞を用いた物質生産において、特徴ある遺伝子発現系として広く利用できる。即ち、本発明のＡＲＦ遺伝子の発現調節領域を利用した遺伝子発現ベクターを用いることにより、目的遺伝子を対象植物において合目的かつ効率的に発現機能させることが可能となり、植物品種改良、植物培養細胞を用いた有用物質生産等に大きく貢献することができる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  cDNAクローンR151と、ヒト、ウシ、酵母のＡＲＦ遺伝子とのアミノ酸レベルでの相同性をコンピュータ検索した結果を示す図である。図中、 -は共通するアミノ酸配列を示し、網かけはＧＴＰ結合部位と考えられるアミノ酸を示す。
【図２】  クローンλR15 の制限酵素地図を示す図である。
【図３】  遺伝子発現ベクターの構築の工程を示す図である。
【図４】  本発明に係るプロモーター（R15 プロモーター（pSBG418 ））のプロモーター活性の調査結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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