(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と、（ＩＩ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、構成アミノ酸数が１〜３個であるアミノ酸又はペプチド成分とからなる、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、フゾバクテリウム・ヌクレエータムから選ばれる歯周病細菌内毒素中和剤。
【請求項２】
（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と、（ＩＩ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、構成アミノ酸数が１〜３個であるアミノ酸又はペプチド成分とからなる、アクチノマイセス・ナエスランデイの歯周病原因菌付着抑制剤。
【請求項３】
（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜３％と、（ＩＩ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、構成アミノ酸数が１〜３個であるアミノ酸又はペプチド成分を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜５％とを、前記（Ｉ）／（ＩＩ）の配合比率（モル比）が０．０００１〜１０の範囲で、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、フゾバクテリウム・ヌクレエータムから選ばれる歯周病細菌内毒素中和および／またはアクチノマイセス・ナエスランデイの歯周病原因菌付着抑制有効成分として含有してなることを特徴とする口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病細菌内毒素中和剤、歯周病原因菌付着抑制剤、更には、歯周病細菌内毒素を中和し、また歯周病原因菌の付着を抑制することにより歯周疾患の予防や治療用に有効な口腔組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
歯周疾患の病原性因子として、付着因子（線毛、レクチン様リガンド）、内毒素、組織破壊性酵素（コラゲナーゼ、トリプシン様酵素）、白血球抵抗因子（莢膜、スーパーオキサイドデスムターゼ、ロイコトリエン）及び細胞毒性代謝物（硫化水素、脂肪酸）などがある。なかでも細菌内毒素は、直接あるいは間接的に歯周組織に対して炎症を惹起したり、歯槽骨吸収を促進したりすることが確認されている。
【０００３】
そこで内毒素の関与する歯周疾患の予防、治療の従来技術として、マクロライド系抗生物質による歯周組織再生の前処置剤（特開平７−２６７８６７号公報）、オクタデシルプロピルジメチルアンモニウム固定の水不溶性固体による内毒素吸着除去剤（特開平８−２６９５４号公報）が提案されている。
【０００４】
しかしながら、これらの技術を歯周疾患の予防、治療に応用するには、耐性菌の出現、副作用および歯牙へのステイン付着等の問題があった。従って、細菌内毒素を中和し得るより有効な技術の開発が望まれていた。
【０００５】
一方、歯周病原因菌の付着を抑制、防止する代表薬剤としてクロルヘキシジンがあるが、歯牙への着色問題や味覚への影響があった（縁下プラークの抑制法、クインテッセンス出版株式会社発行、１９９１年９月３０日）。
【０００６】
このように本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、優れた細菌内毒素活性抑制作用を有し、また、細菌の歯牙、粘膜に対する付着抑制効果も期待でき、しかも長期間使用しても安全な歯周病細菌内毒素中和剤、歯周病原因菌付着抑制剤及び口腔用組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明者は上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせた場合、後述する実験例から認められるように、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フゾバクテリウム・ヌクレエータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）等の歯周病細菌の内毒素を効果的に中和し得ること、また、アクチノマイセス・ナエスランデイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）等の歯周病原因菌の付着を抑制し得ることから、歯周疾患の予防及び治療に応用できる口腔用組成物が得られることを知見し、本発明をなすに至った。
【０００８】
従って、本発明は、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と、（ＩＩ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、構成アミノ酸数が１〜３個であるアミノ酸又はペプチド成分とからなる、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フゾバクテリウム・ヌクレエータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）から選ばれる歯周病細菌内毒素中和剤およびアクチノマイセス・ナエスランデイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）の歯周病原因菌付着抑制剤、上記（Ｉ）成分を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜３％と（ＩＩ）成分を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜５％とを、前記（Ｉ）／（ＩＩ）の配合比率（モル比）が０．０００１〜１０の範囲で、上記特定菌の歯周病細菌内毒素中和および／または歯周病原因菌付着抑制有効成分として含有してなることを特徴とする口腔用組成物を提供する。
【０００９】
以下、本発明を具体的に説明する。本発明で用いられるラクトフェリンは動物の体内に広く分布しているものであり、ラクトフェリンの生物学的機能としては、抗菌作用、抗ウイルス作用、生体防御作用および内毒素中和作用を有し、ムチン産生促進剤（特開平９−１２４７３号公報）、新規医薬組成物（特開平８−２１７６９３号公報）等が特許出願されている。
【００１０】
本発明に提供されるラクトフェリン関連成分の資源としては、哺乳動物の乳牛からの生産物、植物（トマト、イネ、タバコ）からの生産物、麹カビからの生産物、牛乳中で産生したヒト型ラクトフェリンおよび合成品のいずれであっても良い。本発明に提供するラクトフェリンは、特にウシ由来のものが好ましい。
【００１１】
本発明に提供するラクトフェリン分解物とは、酸分解物、ペプシン分解物を指し、ラクトフェリンと同様の生物学的機能を有している。ラクトフェリン酸加水分解物を有効成分とする抗菌剤およびそれを配合した化粧料（特開平６−２７９３１０号公報）、抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法（特開平５−３２００６７号公報）等が特許出願されている。本発明に用いるラクトフェリン分解物は、特に酸分解物が好ましい。
【００１２】
本発明に提供されるラクトフェリン関連ペプチドとは、１５個から５０個のアミノ酸で構成されたラクトフェリンおよびその分解物由来のペプチドを指す。これらペプチドの生物学的機能としては、強い抗菌作用、生体防御作用および内毒素中和作用があげられ、抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法（特開平５−３２００６７）が特許出願されている。ラクトフェリン関連ペプチドは、特に２５個のアミノ酸からなるウシ・ラクトフェリンのＮ−末端から調製したラクトフェリシンＢが良い。
【００１３】
ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチド（Ｉ）の配合量は、口腔用組成物全体の０．００１〜３％（固形分重量、以下同様）、特に０．０１〜１．５％とすることが好ましい。０．００１％未満であると、アミノ酸、又は２〜３個のアミノ酸からなるペプチドと組み合わせた場合、口腔唾液中および歯肉溝滲出液中の内毒素を十分に抑制できないし、又、歯周病原因菌の歯牙、粘膜への付着抑制も十分でない。３％を超えると、効果が定常に達し、又、製剤中での溶解性、安定性に問題が生ずる。
【００１４】
本発明で提供される（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分はグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−アラニン、グリシル−Ｌ−ロイシン、グリシル−Ｌ−プロリン、グリシル−グリシン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−ノルバリン、Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシン、グリシル−グリシル−Ｌ−ヒスチジン、グリシル−グリシル−グリシン等があり、特にＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−アラニンおよびＬ−ロイシル−グリシル−グリシンが配合成分として好ましい。
【００１５】
これらの成分の配合量（ＩＩ）は、口腔用組成物全体の０．００１〜５％、特に０．０１〜３％とすることが好ましい。０．００１％未満であると、ラクトフェリン類と組み合わせた場合、口腔唾液中および歯肉溝滲出液中の内毒素を十分に抑制できず、又、歯周病原因菌の歯牙、粘膜への付着抑制も期待できない。５％を超えると、効果が定常に達し、又、製剤中での溶解性、安定性に問題が生ずる。
【００１６】
（Ｉ）／（ＩＩ）の配合比率（モル比）は０．０００１〜１０とすることが好ましい。１０-5未満であると、期待以上の相乗効果が出にくく、１０００を超えると相乗効果が定常に達する。
【００１７】
本発明の口腔用組成物には、上記以外の成分とし通常の口腔用組成物に使用されている成分を用いることができ、これらの成分の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００１８】
歯磨類の場合は、例えば、研磨剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、着色剤、上記以外の各種有効成分などを常用量配合し得、これら成分を水と混合して製造することができる。
【００１９】
本発明の口腔用組成物は、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせたものを有効成分として含有するもので、練歯磨、液状歯磨などの歯磨剤、口腔用軟膏、洗口剤、うがい用錠剤、トローチ、チュウインガムなどとして調製される。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、優れた細菌内毒素活性抑制、細菌付着抑制効果を有し、しかも長期間使用しても安全であり、歯周疾患の予防や治療に好適に利用することができる。
【００２１】
【実験例】
以下、調製例、実験例、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に制限されるものではない。
【００２２】
［調製例１］  ウシ・ラクトフェリンの調製
新鮮なウシ・ホエーの硫安沈殿物を水に溶解して、セファデックスＧ−２５のカラムを通し脱塩を行った。脱塩蛋白をｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、抗ウシ・ラクトフェリンモノクローナル抗体アフィニテイカラムに通し、さらにリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。その後、０．１５Ｍの食塩を含むｐＨ３．７の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液でカラムよりウシ・ラクトフェリンを溶出し、凍結乾燥により目的物を得た。
【００２３】
［調製例２］  ウシ・ラクトフェリン酸分解物の調製
ラクトフェリン酸分解物は、凍結乾燥前のカラム溶出物を５０％クエン酸にてｐＨを３以下に調製後、加水分解処理を行った（９５℃まで加熱後、１時間放置）。分解物を冷却後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨを中性付近に調整し、精製水で３日間透析し、透析物を凍結乾燥してラクトフェリン酸加水分解物を得た。
【００２４】
［調製例３］  ラクトフェリンペプチドの調製
目的のラクトフェリンペプチドは、上記の調製例１、２で得られたラクトフェリン加水分解物を通常の液体クロマトグラフィー法を用いて単離することができる。例えば、ＴＳＫゲルＯＤＳ１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー法で、アセトニトリルのグラジエントで分画溶出させて単離することができる（特開平５−３２００６７号公報参考）。
その他の方法としては、上記のようにして得たペプチドのアミノ酸配列を公知の方法（気相シークエンサーを用いる方法など）によって決定し、それらのアミノ酸配列を有するペプチドを公知の方法（ペプチド自動合成装置など）で合成して目的のペプチドを調製することができる（例：配列番号１、２）。
【００２５】
〔実験例１〕  インビトロ内毒素活性抑制試験
エンドスペーシー法（生化学工業（株）製）を変法して、下記方法でインビトロ内毒素活性抑制試験を行った。
歯周病の原因菌であるアクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス  Ｙ４、ポルフィロモナス・ジンジバリス  ３８１及びフゾバクテリウム・ヌクレエータムの内毒素（以下、それぞれＡａ  ＬＰＳ、Ｐｇ  ＬＰＳ、Ｆｎ  ＬＰＳと略す）各１μｇ／ｍｌと表１〜４に示すような各種薬剤（１×１０−４Ｍ）１ｍｌとを３７℃、３０分インキュベーション後、各ＬＰＳが１００ｐｇ／ｍｌになるように希釈して、エンドスペシー法による内毒素活性抑制率を測定した。結果を表１〜４に示す。なお、表中の内毒素活性抑制率は下記式により算出した。
内毒素活性抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×  １００
Ａ＝（内毒素単独のＡＢＳ）−（注射用蒸留水のＡＢＳ）
Ｂ＝（（薬剤＋内毒素）のＡＢＳ）−（注射用蒸留水のＡＢＳ）
ＡＢＳ：５４５ｎｍの吸光度
【００２６】
表１〜表４の結果より、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせたものが、インビトロ内毒素活性抑制効果に優れていることが確認された。
【００２７】
【表１】
0003726875.tif 000002
【００２８】
【表２】
0003726875.tif 000003
【００２９】
【表３】
0003726875.tif 000004
【００３０】
【表４】
0003726875.tif 000005
【００３１】
〔実験例２〕家兎皮内毒性試験による細菌内毒素活性抑制試験
内毒素活性抑制（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｋｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）試験
家兎腹部をバリカンで除毛後、皮内に表５に示すように内毒素又は内毒素と薬剤の混合液（注射前に３７℃、３０分間反応）をそれぞれ家兎腹部に０．１ｍｌ注射した。４８時間後に注射部位の発赤、腫脹の大きさ（縦×横）を測定して内毒素活性抑制を評価した。なお、抑制率は下記式により算出した。
抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×  １００
Ａ＝内毒素注射部位の面積
Ｂ＝（内毒素＋検体）注射部位の面積
【００３２】
【表５】
0003726875.tif 000006
【００３３】
〔実験例３〕局所シュワルツマン反応（Ｌｏｃａｌ Ｓｃｈｗａｒｚｍａｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｋｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ判定後、家兎耳静脈に表６に示すように細菌内毒素を１００μｇ／ｋｇ（体重）注射し、２４時間後に皮内注射部位の紅斑、出血性壊死の大きさ（縦×横）や程度を測定して内毒素活性抑制を評価した。結果を表６に示す。なお、抑制率は下記式により算出した。
抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ＝内毒素注射部位の面積
Ｂ＝（内毒素＋検体）注射部位の面積
【００３４】
【表６】
0003726875.tif 000007
【００３５】
〔実験例４〕アクチノマイセス・ナエスランディ付着阻止実験
ハイドロオキシアパタイト粉末（ＢＨＤケミカル社製）（以下、ＨＡと略す）５ｍｇをポリスチレン製マルチプレート（住友ベークライト社製）の各ウエルに入れ、ＫＣｌ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ  ６．０）で洗浄後、ヒト全唾液の遠心上清（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）１２５μｌを加えて、室温で６０分間反応させた。次に、ＨＡをＫＣｌ緩衝液で洗浄し、表７、８に示す０．１％の各薬剤１２５μｌを加えて３０分間反応させた。
【００３６】
ＨＡを緩衝液で洗浄した後、3Ｈ−チミジンを含む培地で培養して放射ラベルしたアクチノマイセス・ナエスランディＴ１４Ｖ（１×１０8／ｍｌ）１２５μｌを加えて、室温で６０分間反応させた。ＨＡをＫＣｌ緩衝液で洗浄し、ＨＡに付着した細菌の放射活性を液体シンチュレーションカウンターで測定した。結果を表７、８に示す。なお、付着抑制率は下記式より算出した。
付着抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ：検体無添加時の細菌付着数
Ｂ：検体添加時の細菌付着数
【００３７】
【表７】
0003726875.tif 000008
【００３８】
【表８】
0003726875.tif 000009
【００３９】
以下、実施例を示す。
0003726875.tif 000010
【００４０】
0003726875.tif 000011
【００４１】
0003726875.tif 000012
【００４２】
0003726875.tif 000013
【００４３】
0003726875.tif 000014
【００４４】
0003726875.tif 000015
【００４５】
0003726875.tif 000016
【００４６】
0003726875.tif 000017
【００４７】
0003726875.tif 000018
【００４８】
0003726875.tif 000019
【００４９】
0003726875.tif 000020
【００５０】
【配列表】
0003726875.tif 000021