(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口投与した場合に免疫賦活作用を有する、プロバイオティクスとして有効なラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）Ｇ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫賦活に有用なラクトコッカス属乳酸菌に関し、詳しくは免疫賦活作用を有するラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は、チーズや漬物等の製造において重要な役割を果たしている以外に、発酵乳等の形で体内に摂取されることにより、整腸作用や血清コレステロール低下作用等、乳酸菌の機能性に基づく様々な生理的効用を発揮することが知られている。
【０００３】
このような乳酸菌の効用については、近年「プロバイオティクス」（宿主の健康維持に有益に働く生きた微生物）という概念が導入され、消費者の健康志向を反映して広く関心を集めており、多くの研究が行われている。
この「プロバイオティクス」という言葉は当初、「腸内フローラのバランスを改善することによって宿主動物に有益に働く微生物添加物」（Fuller, R. 1989:J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378 ）と定義されてきたが、現在は上記のように、広義の意味で用いられることが多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在、プロバイオティクスとして世界的に広く利用されている微生物は、ヒト由来のラクトバチルス属乳酸菌やビフィズス菌に限られている。
一方、ラクトコッカス属の乳酸菌については、これまで消化管を生きたまま通過できないとされていた（Teuber, M., Geis, A. and Neve, H. :1992 、The genus Lactococcus. In: Balows, A., Truber, H.G., Dworkin, M., Harder, W. and Schleifer, K.H. (eds.)The Prokaryotes, Vol II, 2 nd edn. Springer Verlag, New York, pp.1482-1501 ）。このため、プロバイオティクスとしての研究が、上記ラクトバチルス属乳酸菌やビフィズス菌等の微生物に比べて少ないのが実情である。
【０００５】
しかし、最近では、ラクトコッカス属乳酸菌の中にも生菌として消化管を通過できるものが存在することが明らかになってきており（Grahn, E., Holm, S. E., Lilja, H. and Sellgren K.:1994、Scandinavian Journal of Nutrition 38, 2-4.）、ラクトコッカス属乳酸菌のプロバイオティクスへの応用が考えられるようになってきた。
ラクトコッカス属の乳酸菌は、乳中での生育が良いために、乳製品製造のスターターとして用いられており、乳業利用上重要な役割を果たしている。
従って、ラクトコッカス属乳酸菌の中からプロバイオティクスとして有効な性質を有する菌株が見出されれば、それを用いた乳製品製造へ応用できる可能性が高い。
【０００６】
乳酸菌による免疫賦活作用は、プロバイオティク機能の一つとして注目されており、がんを始めとした各種疾病に大きく貢献するとされている。これまでにも、乳酸菌体や菌体成分について、免疫賦活作用が報告されている（Tejada-Simon, M.V. and Pestka, J.J.(1999),J. Food Prot., 12, 1435-1444、Perdigon, G.et al. (1999),J. Dairy Sci., 82, 1108-1114) 。これらの報告においては、免疫賦活の指標として、Ｔ細胞の増殖能の上昇、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡと略記することがある。）の産生量の増加、細胞が生産する様々な働きを持つペプチドであるサイトカイン量の増加等が用いられている。
しかし、これらの多くはラクトバチルス属乳酸菌やビフィズス菌についての報告である。
【０００７】
また、ある種の生理的効用を有する物質を体内に供給する方法としては、食品という形で摂取する方法と医薬品という形で投与する方法がある。このうち、食品の形で摂取する方法は、医薬品を用いるよりも身体に良い印象があり、さらに疾病予防として毎日摂取することについても、食品としてならば抵抗が少ないと考えられる。
従って、食品として摂取される乳製品の製造において重要な役割を果たし、かつ乳酸菌の中でもラクトバチルス属と並んで安全性の高いラクトコッカス属乳酸菌の中から、免疫賦活に有用な菌株を見出すことが望まれていた。
【０００８】
本発明の目的は、乳酸菌の中でも安全性が高く、しかも乳製品製造に適しているラクトコッカス属乳酸菌について探索し、該乳酸菌の中から免疫賦活に有用な菌株を選抜し、プロバイオティクスとして応用することである。
そこで本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、乳製品製造に適しているラクトコッカス属乳酸菌の中から、免疫賦活に有用な菌株を選抜することに成功した。すなわち、ラクトコッカス属乳酸菌の中に、免疫担当細胞の一つであるマクロファージからある種のサイトカイン産生を誘導する菌株があることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の本発明は、経口投与した場合に免疫賦活作用を有する、プロバイオティクスとして有効なラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５）である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫賦活作用を有する新規なラクトコッカス属乳酸菌であるラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５）は、以下の方法によってラクトコッカス属乳酸菌の中から選抜することができる。
すなわち、本発明の免疫賦活機能を有するラクトコッカス属乳酸菌は、供試乳酸菌と免疫担当細胞の一つであるマクロファージ（大食細胞）株とを共培養したときのマクロファージ株のサイトカイン産生量を指標として選抜することができる。本発明に用いるマクロファージ株としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来のＪ７７４．１（ATCC TIB-67 ）株などがある。
【００１１】
乳酸菌と共培養するマクロファージ株としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来のＪ７７４．１株やＲＡＷ２６４．７などが挙げられるが、特にＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来のＪ７７４．１株が好ましい。
このマクロファージ株を、２４ウェルプレートに、４．６×１０5 〜５．１×１０5 cells ／ウェル、好ましくは５．０×１０5 cells ／ウェルとなるように播種する。詳しくは、１ｍｌあたり５．０×１０5 cells となるように調製したマクロファージを１ウェルに播種する。
マクロファージを播種したプレートは、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で２〜３日間、好ましくは２日間培養する。
マクロファージを播種する培地としては、血清を添加したＲＰＭＩ培地（ローズウエル・パーク・メモリアル・インスチチュート培地）やＤＭＥＭ培地（ダルベッコ・モディファイド・イーグル培地、シグマ社製）を用いることができる。
【００１２】
培養終了後、プレートから培地をピペットで吸引する等の方法によって取り除き、新たに血清成分を添加したＲＰＭＩ培地を加える。
このとき培地に添加する血清成分としては、ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略記することもある。）等が挙げられるが、特にＦＣＳが好ましい。血清成分としてＦＣＳを用いる場合の添加濃度は、１０％が適当である。なお、ＲＰＭＩ培地の他にＤＭＥＭ培地なども用いられる。
【００１３】
マクロファージ株と共培養する乳酸菌は、本発明者らが選抜したＧ５０株の他に、独立行政法人  農業技術研究機構  畜産草地研究所（茨城県稲敷郡茎崎町）に保存されているもの及び理化学研究所（埼玉県和光市）から入手したものも使用することができる。乳酸菌は、予め常法に従い一昼夜培養しておく。
次に、上記培養乳酸菌株を０．８５％食塩水で１〜２回、好ましくは２回洗浄し、血清を添加したＲＰＭＩ培地に懸濁した後、１×１０7 〜１×１０9 cells ／ウェル、好ましくは１×１０9 cells ／ウェルになるようにプレートに接種し、マクロファージ株と共培養する。
共培養の条件は、５％ＣＯ2 存在下、３７℃、８〜４８時間、好ましくは２４時間が適当である。
【００１４】
共培養終了後、培養上清を遠心分離等の常法によって分離し、上清中に含まれるサイトカイン量をＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法、エライザ）によって測定する。ＥＬＩＳＡはインターロイキン−１２（以下、ＩＬ−１２と略記することがある。）の場合は、optEIAマウスIL-12 測定キット（ファーミンジエン社製）を、ＴＮＦ−αの場合は、optEIAマウスTNF-α測定キット（ファーミンジエン社製）を用い、これらキットのプロトコールに従って行う。また、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と略記することがある。）の場合は、抗マウスＩＬ−６（ファーミンジエン社製）とビオチン標識抗マウスＩＬ−６（ファーミンジエン社製）の組み合わせを使用するとよい。
【００１５】
上記の共培養によって産生されるサイトカインとしては、がん予防に寄与するとされる細胞性免疫の賦活化を誘導するＩＬ−１２、消化管におけるＩｇＡ産生等の液性免疫賦活に関わるＩＬ−６又は腫瘍細胞に対して障害活性を有する因子であるＴＮＦ−α等が挙げられる。
【００１６】
後述する実施例に示すとおり、乳酸菌とマクロファージ株とを共培養することにより、サイトカインの産生が促進されることが認められた。すなわち、乳酸菌供試株１６株中６株について、マクロファージ株のサイトカイン産生を促進することが見出された。この６株のうち、ＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αすべてのサイトカイン産生を最も促進した菌株は１株のみであった。この乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）Ｇ５０株である。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５である。
【００１７】
このラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株を、マウスに経口投与した場合には、本菌株を投与しなかった非投与群よりもサイトカインの産生が促進される。なお、経口投与する際は、マウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ程度を目安とすればよい。また、該菌株はラクトコッカス属の特長を有し、牛乳中でもよく生育するため、スターター等として乳製品製造へ応用することができる。  さらに、本菌株は加熱処理等を行った死菌体であっても、マクロファージ株のサイトカイン産生を促進する作用を有している。
【００１８】
【実施例】
以下において、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
本実施例においては前記畜産草地研究所保有株や理化学研究所から入手した乳酸菌１６株について、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来マクロファージＪ７７４．１株との共培養を行い、サイトカイン産生促進能を有する乳酸菌を選抜した。
なお、対照として、乳酸菌を接種しないコントロールとポジティブコントロールとしてリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳと略記することがある。）を用いたものについても同様に培養を行った。ＬＰＳは、マクロファージ活性化物質であり、本実験では、大腸菌由来ＬＰＳ（シグマ社製）を１μｇ／ウエルになるように添加した。
【００１９】
まず、マクロファージＪ７７４．１株を、２４ウェルプレート（ファルコン社製）に５×１０5 cells ／ウェルとなるように播種し、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で２日間培養した。マクロファージを播種する培地としては、ＦＣＳを１０％添加したＲＰＭＩ培地を用いた。
培養終了後、プレートから培地をピペットを用いて吸引することによって取り除き、新たに血清成分として１０％ＦＣＳ（シグマ社製）を添加したＲＰＭＩ培地（シグマ社製）０．９ｍｌを加えた。
【００２０】
また、マクロファージ株と共培養する供試乳酸菌は、予め常法に従って一昼夜培養した。
次に、上記の培養した乳酸菌株を０．８５％食塩水で２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地に１×１０10cells ／ウェルになるように懸濁した後、１ウエルあたり０．１ｍｌ（乳酸菌は１×１０9cells) を添加し、マクロファージ株と共培養した。共培養の条件は、５％ＣＯ2 条件下で３７℃で２４時間とした。
共培養終了後、培養上清を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって分離した。この上清中に含まれるサイトカイン量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡにはＩＬ−１２の場合は、optEIAマウスIL-12 測定キット（ファーミンジエン社製）を用い、ＴＮＦ−αの場合は、optEIAマウスTNF-α測定キット（ファーミンジエン社製）を用いた。また、ＩＬ−６の場合は、抗マウスＩＬ−６（ファーミンジエン社製）とビオチン標識抗マウスＩＬ−６（ファーミンジエン社製）の組み合わせを用いて測定を行った。測定は、それぞれのプロトコールに従って実施した。
【００２１】
図１は、マクロファージ株と乳酸菌の共培養によって産生したサイトカイン量をＥＬＩＳＡ法によって測定した値を示したものである。
図１から明らかなように、サイトカインの産生量は、共培養に用いる供試乳酸菌の種類によって差があることが分かる。供試乳酸菌のうちＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのすべてのサイトカインの産生を促進する効果が大きく、ポジティブコントロールであるＬＰＳと比べても同程度かそれ以上である乳酸菌は１株のみであった。本菌株がＧ５０株である。
【００２２】
実施例２
本実施例では、実施例１において選抜したラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株について、死菌体とした場合におけるマクロファージ株のサイトカイン産生促進能について検討した。
ラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株の死菌体は、生菌体を１００℃で５０分間の熱処理をすることによって調製した。共培養の条件、培養後の培養上清に含まれるサイトカインの量の測定等は実施例１と同様に行った。なお、対照として乳酸菌を接種しないものについても、同様に培養を行った。
【００２３】
結果を図２に示す。図は、乳酸菌として生菌体又は死菌体を共培養に用いた場合のサイトカイン産生量の相対変化を表したものである。すなわち、各々の測定値を対照の測定値で除すことによって算出したものである。
この結果、Ｇ５０株は死菌体であっても、生菌体の場合と同様に、マクロファージ株のＩＬ−１２及びＩＬ−６産生を促進することが明らかとなった。
【００２４】
実施例３
本実施例では、ラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株を生体に経口投与した場合における免疫系に対する影響について検討した。
Ｇ５０株は、予め常法に従って一昼夜培養した。次に、上記の乳酸菌株を０．８５％食塩水で２回洗浄し、２００μｌあたり１×１０9cellsとなるように１０％脱脂乳（雪印スキムミルク、雪印乳業製）に懸濁した。
【００２５】
Ｇ５０株生菌体の１０％脱脂乳懸濁液を、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス３匹（体重平均２０ｇ）に７日間又は１４日間強制的に連続して経口投与した。なお、対照群には、１０％脱脂乳のみを同様に経口投与した。また、Ｇ５０株の投与量は、マウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇを目安とした。
【００２６】
投与後８日目又は１５日目に、供試マウスからパイエル板細胞と脾臓細胞を採取した。採取したパイエル板細胞と脾臓細胞は、単一細胞にして２４ウエルプレートに播種し、ＦＣＳを１０％添加したＲＰＭＩ培地を用いて、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で７２時間培養した。
培養終了後、培養上清を採取し、遠心分離を行って細胞を取り除いた上清中に含まれるサイトカイン量を実施例１と同様にＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図３に示す。
【００２７】
パイエル板細胞は、消化管免疫系で重要な役割を果たしている組織である。この細胞は、局所性の免疫能を表す指標と考えられる。また、脾臓細胞は、血中に生じた抗原に対する免疫防御等の役割を果たしていることから、全身性の免疫能を表す指標と考えられる。
【００２８】
図から明らかなように、パイエル板細胞においては、Ｇ５０株を７日間投与群では、ＩＬ−１２産生量が対照群に比べて約４倍の高値を示した。また、ＩＬ−６については、該菌株の７日間投与群で対照群よりも高い産生量を示した。
一方、脾臓細胞については、該菌株の１４日間投与群では、ＩＬ−１２産生量が対照群よりも高値となった。しかし、ＩＬ−６に関しては、投与期間にかかわらず、該菌株を投与した群は対照群よりも産生量がやや低下していた。
これらのことから、Ｇ５０株は生体内において免疫担当細胞のＩＬ−１２産生を強く誘導することが明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、乳酸菌の中でもラクトバチルス属と並んで安全性が高く、しかも乳製品製造に適しているラクトコッカス属乳酸菌の中から選抜した、免疫賦活に有用な菌株が提供される。したがって、該菌株をスターター等として用いることにより乳製品製造に応用し、そのプロバイオティク機能を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡとＢは、実施例１におけるマクロファージ株と各種乳酸菌を共培養した場合におけるサイトカイン産生量を示した図である。
図中、５２７，７１２，Ｈ４８，Ｇ５０及びＪ５３はラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス；ＨＰ，Ｈ６１，ＭＬ及びＣＨ２−１はラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）；Ｎ７，ＤＲＣ１，８Ｗ，ＣＶＴ３，Ｂ７５−１Ｗ及びＢ７５−２Ｙはラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティ  ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）；１１１２はラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri)に属する乳酸菌をそれぞれ表している。
【図２】  実施例２のラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株の生菌体及び死菌体を用いた場合のサイトカイン産生量の相対変化を示した図である。図中のＡはＩＬ−１２、ＢはＩＬ−６の結果を示す。
【図３】  実施例３におけるラクトコッカス・ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスＧ５０株を経口投与した場合のサイトカイン産生量を示した図である。
図中、Ａはパイエル板細胞におけるＩＬ−１２の産生、Ｂはパイエル板細胞におけるＩＬ−６の産生、Ｃは脾臓細胞におけるＩＬ−１２の産生を示す。
【図１】
0003671212.tif 000002
【図２】
0003671212.tif 000003
【図３】
0003671212.tif 000004