(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グループＩのシュードモナスのリパーゼのアミノ酸配列において、野生型シュードモナス・シュードアルカリゲネスリパーゼの部位21に対応する部位のメチオニンをロイシンまたはアラニンで置換したアミノ酸配列を含む、脂質分解性の向上した改変リパーゼ。
【請求項２】
グループＩのシュードモナスが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスまたはシュードモナス・アエルギノサである、請求項１記載の改変リパーゼ。
【請求項３】
脂質分解性能の向上がSLMテストによって決定される、請求項１または２記載の改変リパーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の改変リパーゼを含む洗剤組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の改変リパーゼをコードする組換えDNA分子。
【請求項６】
請求項５記載の組換えDNA分子を含む組換えDNAベクターであって、改変リパーゼの発現に有用なベクター。
【請求項７】
請求項５記載の組換えDNA分子または請求項６記載の組換えDNAベクターを含む形質転換宿主微生物。
【請求項８】
シュードモナスであることを特徴とする請求項７記載の形質転換宿主微生物。
【請求項９】
グループＩのシュードモナスのリパーゼをコードするDNA中、シュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼ中のMet21に対応する部位に突然変異を起こし、該突然変異に由来する酵素の脂質分解性能の変化を試験することを含む、脂質分解性の向上した改変リパーゼを作製する方法であって、該突然変異がロイシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれるアミノ酸による置換である、前記方法。
【請求項１０】
突然変異が、ロイシンおよびアラニンからなる群より選ばれるアミノ酸による置換である請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は改良型リパーゼ、および、これを使用した洗剤またはクリーニング剤に関する。
発明の背景
リパーゼは脂質を加水分解することが可能な酵素であり、脂肪および油処理、洗剤、診断薬等幅広い応用範囲で利用されている。
細胞外リパーゼ（トリアシルグリセロール・アシルヒドロラーゼ、E.C.3.1.1.3）は種々の微生物で生産されている。例えば、適当な微生物のリパーゼは米国特許No.3,950,277に記されている。これらのリパーゼはシュードモナス（Pseudomonas）、アスペルギラス（Aspergillus）、ニューモコッカス（Pneumococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコトルラ・リポリチカ（Mycotorula lipolytica）およびスクレロチニア（Sclerotinia）等、多様な微生物から入手できる。
洗剤にリパーゼを使用した例は、例えばEP 463100（シュードモナス・アルカリゲルス（Pseudomonas alcaligenes）、EP 0218272（シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、EP 0214761（シュードモナス・セパシア（Pseudomona cepacia）、EP 0258068（サーモミセス（Thermomyces）、EP 206390（シュードモナス・クロモバクター（Pseudomonas chromobacter）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・ニトロレジュセンス（Pseudomonas nitroreducens）、シュードモナス・グラジオリ（Pseudomonas gladioli）およびクロモバクター・ビスコサム（Chromobacter viscosum）に示されている。
特にシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼは目的に適った特性を有していると考えられる。従って、シュードモナス（Pseudomonas）種はリパーゼを採るのに盛んに使用されている。発酵によるリパーゼの収率を上げるために幾つかのリパーゼ遺伝子がクローニングされ、同一種または異種において発現されている。リパーゼ遺伝子のクローニングが報告されているシュードモナス（Pseudomonas）種の例には、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）（EP 331376））、シュードモナス・グルメ（Pseudomonas glumae）（EP 464922））、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（EP 334462））、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）（EP 318775））がある。
シュードモナス（Pseudomonas）種の分類はパレロニ（Palleroni）等、Int.J.Syst.Bacteriol.23:333（1973）に報告されているようにDNA−rRNAおよびNDA−DNAのハイブリダイゼーション実験に基づいている。より詳細な概説にはBergey's Manual of Systematic Bacteriology（Vol.1,Section 4,pp.160−161（1984）,N.R.クリーグ（Krieg）およびJ.G.ホルト（Holt）編、ウィリアムス・アンド・ウィルキンス版、バルチモア、ロンドン）がある。また、この概説はその分類が形態学的データおよび16SリボゾーマルRNAホモロジーに支持されていることを記している。
望ましい応用特性を有するシュードモナス（Pseudomonas）は２つのDNAホモロジーグループに分類される。シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・アルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）（例えばEP 334462参照）、シュードモナス・スツツェリ（Pseudomonas stutzeri）およびシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）は密接に関係しており、グループＩに属する。例えば、シュードモナス・アルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のリパーゼはシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼと81％のホモロジーを有する。シュードモナス・グルメ（Pseudomonas glumae）とシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）はグループIIに属する。表１に種々の株に由来するリパーゼ遺伝子のホモロジー比較を示した。このホモロジー比較からシュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）はグループＩとグループIIの中間に位置することが読み取れる。
グループＩとグループＩのリパーゼには差がある。シュードモナス（Pseudomonas）のグループＩに属するリパーゼはグループIIに属するものに比べて疎水性が高く、より親油的である。この性質は洗剤に応用する際に大変有利である。シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼの疎水的性質は表面ーの容易な付着を起こす。他のグループまたは例えば、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）等、他の生物由来のリパーゼは往々にして親水的である。洗剤に使用した際に高い疎水性のグループＩのリパーゼのみがうまく作用しうる。
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表の下部は核酸配列の比較を示している。上部はアミノ酸配列の比較を示している。
すでに記してきたようにリパーゼは洗剤組成物の成分として使用しうる。洗剤組成物にはリパーゼ以外にその形状に依存して多くの既知成分が含まれている。
一般に粉末洗剤にはビルダー（例えばゼオライト、リン酸塩）、界面活性剤（例えばアニオン性、非イオン性）、ポリマー（例えばアクリル）、漂白剤前駆体（例えば硼酸塩）、漂白活性剤、ストラクチュラント（例えばシリケート）、pH調整剤（例えばアルカリ）を含んでいる。
一般に液体洗剤は界面活性剤（例えばアニオン性および非イオン性）、漂白剤前駆体（例えば硼酸塩）、漂白活性剤、pH調整剤（例えばアルカリ）を含んでいる。
これらの組成物のなかには酵素（例えばプロテアーゼ、アミラーゼ）、有機酸、無機酸、繊維柔軟剤のような成分も含めることがある。
リパーゼを洗剤の成分として使用するためには洗浄性能のほかにこのような組成物中に存在する成分に対する耐性を持たなくてはならない。
洗剤に使用するために選択される酵素は、例えば古典的スクリーニング法または最近の遺伝的およびタンパク質工学的手法等、いくつかの方法で開発しうる。
望ましい酵素活性を示す生物または微生物のスクリーニングは、例えば、微生物または微生物の培養上清から酵素を単離精製し、その生物学的性質を決定し、その生物学的性質が特定の用途に対する要求を満足するかどうかを判定することによって行われる。もし、同定された酵素が天然の生物から得られない場合は、組み換えDNA技術を用いてその酵素をコードする遺伝子を単離し、他の生物内でその遺伝子を発現させ、発現された酵素を単離精製後、目的に適しているかどうかを判定する。
特定の目的に適した新しい酵素を得るための別の方法には既存の酵素の改変がある。とりわけこれは化学修飾法によって行われる（WO 91/16423）。一般に、これらの方法は共通した側鎖を有する全ての受容残基を修飾する点で特異性を欠いているか、さもなくば修飾すべき適当なアミノ酸の存在に依存しており、さらに、この方法ではその酵素の構造が壊れていないかぎり到達するのが困難なアミノ酸を修飾することが出来ないこともしばしばある。
これとは別に、コードされている遺伝子の突然変異誘発により酵素を改変する方法は上述の非特異性の心配が無く、優れた方法であると考えられている。突然変異誘発はランダム突然変異誘発または部位指定突然変異誘発により行いうる。
微生物全体を化学変異原または変異性照射で処理することによるランダム突然変異誘発ももちろん酵素の改変を起こす。この場合、特定の変異体を探索する強力な選択法が必要となる。ランダム突然変異誘発による変異酵素を高い確率で単離するには、コード遺伝子をクローニング後、インビトロまたはインビボでこれを変異させ、その変異遺伝子を再クローニングすることにより適当な宿主細胞中でコードされている酵素を発現する事で行いうる。改変酵素の生産に適した宿主には、例えば、細菌（大腸菌、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas））、イーストまたは菌類（アスペルギラス（Aspergillus））がある。また、この場合、望ましい変異酵素を選択するための適当な生物学的選択方法が無ければならない。これらの生物学的選択方法は必ずしも工業的用途に最も適した酵素を直接選択するものではない。例えば、EP 0407225はプロテアーゼまたは酸化剤による攻撃に対して安定なリパーゼを報告している。これらの改良が特定の問題を解決することは正しいが、必ずしもより良い洗浄性能を示すものではない（例えば、EP 0328229）。
さらに、EP 0407225はシュードモナス・グルメ（Pseudomonas glumae）由来のリパーゼの配列の変異を示している。この出願は他の微生物に由来するリパーゼをコードする遺伝子の場合に置換すべき残基を示してはいない。一般に特定の酵素に関する変異の最良の選択は他の相同的の酵素に対する最良の選択とは限らず、関連性の低い酵素の対しては確実なものとはならない。
WO 92/05249は洗浄性能、安定性、保存性および特異性の改良を起こしうる脂質接触領域の疎水性又は静電的性質の異なるリパーゼ変異体を報告している。しかし、本出願に記載されているリパーゼがシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼとほとんどホモロジーを示さず、かつ、実際に全く異なる性質を示すことから、WO 92/05249は望ましい性質を有するシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼを得るためにどの部位を変異すべきかを判定するのに使用する事は出来ない。
発明の概要
本発明は野生型のシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼの少なくとも部位21に対応するメチオニンを他のアミノ酸に置換し、望ましい性質の改変を起こした新しい改変リパーゼを提供している。本発明の望ましい態様において、これらのリパーゼ変異体は使用条件において洗浄性能の向上を示した。M21残基をロイシン、セリンまたはアラニンで置換した特異体が特に望ましい。
【図面の簡単な説明】
図1:PCRを用いた部位指定突然変異誘発
図2:染色体へのプラスミドpBRの組み込み
図3:染色体からリパーゼ遺伝子およびプラスミドを欠失させる組み換え
図4:染色体およびプラスミドへの変異リパーゼDNAの導入
図5:3'側隣接領域での組み換え
発明の詳細な説明および好ましい態様
本明細書で使用されている「改良された洗浄性能」という言葉は、使用条件下、即ち十分に確立された洗剤成分の存在下で、かつ確立された条件下で改良された洗浄結果を示す場合に使用される。
アミノ酸配列を比較してみるとシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosａ）由来のリパーゼの部位16のメチオニンは（ウォールファース（Wohlfarth）等、（1992）J.of General Microbiology 138（７）:1325−1335）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）由来の対応する酵素の部位21のメチオニンと等価である。
野生型のリパーゼがシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼと70％以上のホモロジーを有することから、おそらく野生型のリパーゼはシュードモナス（Pseudomonas）グループＩの微生物で生産しうるリパーゼである。ホモロジーとは、異なるアミノ酸（またはタンパク質）配列を整列および比較したときに同一と見なせるアミノ酸の数と定義される。我々は工業的プロセス条件下で改良された洗浄性能を示す変異体または改良酵素を得るのに始めて成功した。
１つ以上のアミノ酸を他の望ましいアミノ酸に特異的に置換できる部位指定突然変異誘発を使用して改良型の酵素を構築し、選択することが出来た。
詳細に記すと、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼの少なくとも部位21に対応する特異的突然変異、即ち、本来のメチオニンの別のアミノ酸による置換は、以外にも漂白剤の存在下、または非存在下で洗浄性能の向上を示し、このことは洗浄性能におけるこの部位の重要性を示している。従って部位21のメチオニンの置換は酸化安定性のみならず、洗浄性能の改良をも引き起こす。
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼは高いアミノ酸ホモロジーに基づくシュードモナス（Pseudomonas）株のグループＩに属する他のシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼと近い関係にある。このことは、これらのリパーゼの全体的な三次元構造が良く似ていることを示している。従って、シュードモナス（Pseudomonas）株のグループ１に属する他のリパーゼにおけるこの構造部位の修正も洗浄性能に影響するであろう。
上述のメチオニンの置換に適したアミノ酸には、Ala、Ser、Leu、Val、Phe、AsnおよびAspがある。
本発明の望ましい態様において、野生型のシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼに対応する部位21の本来のメチオニンをロイシンで置換すると、以外にもこの変異体の疎水性又は静電的性質の実質的変化は見られないにもかかわらず洗浄性能の向上が示された。
また、本発明は少なくともシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼ中のMet＋21に対応する部位でシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼをコードするDNAを変異させ、この変異で生じた酵素における望ましい性質の変化を評価する方法を提供している。このような性質の変化には洗浄性能の向上、特異性の変化、pH依存性の変化、基質依存性の変化、または酸化安定性の向上、またはこれらの性質の組み合わせが含まれる。
本発明のその他の特徴としては、洗浄性能が向上した変異体の選択を可能にする選択法の提供がある。
洗浄条件下におけるリパーゼの性能の測定法（SLMテスト）
本発明では洗浄工程におけるアルカリリパーゼ変異体の評価には所謂SLMテストを使用した。SLMテストは、T.ハシモト（Hashimoto）等（Yukagaku 34（1985）606−612）が開発した方法と同様の原理を使用しているが、分析に要する時間は著しく削減されている。この方法は、試験シミとして繊維に固定化した非エマルジョン性脂質または脂肪酸を使用し、洗浄工程後、そのスワッチを抽出し、その抽出物中の脂肪および脂肪酸を分析するステップを含んでいる。使用した条件に依存してリパーゼ活性の結果生成する脂肪酸は、洗浄工程の間、残存するトリグリセライドと共に布地上に留まりうる。従って、スワッチ上に残った生成物の量が洗浄工程におけるリパーゼの性能の良い尺度となる。
以下に示すものはSLMテストがいかに旨く行われたかを示す典型的な例である。繊維としてポリエステルのスワッチを使用し、基質としてはトリオレインまたは精製したオリーブ油（いずれもシグマの製品、USA）を用いた。トリオレインの加水分解は繊維抽出後のクロマトグラフィー法で追跡した。
SLMテストの目的で使用した洗浄工程を以下に示す。ｎ−ヘキサンに溶かした10mgのオリーブ油（12.5％）80μｌをポリエステルのスワッチ（３×3cm）にスポッティングした。このスワッチを室温で空気乾燥した。STW（標準タップ水:2mM塩化カルシウムおよび0.7mM塩化マグネシウム／蒸留水）または洗剤を溶かしたSTWを10ml含む洗浄溶液を栓付きの三角フラスコ（50ml）に入れ、40℃の振盪水浴で保温する。洗浄工程は三角フラスコにリパーゼM1（40ILU、以下参照）およびスワッチを入れた直後から開始され、40分間振盪する。ブランク実験にはリパーゼを含めない。洗浄後、スワッチをSTWで濯ぎ55℃で１時間乾燥してから第２の洗浄サイクルを行う。乾燥したスワッチは基質および生成物のクロマトグラフィー分離に用いる溶出液と同様の組成を有する溶剤5mlを含むガラス管中で回転することにより抽出操作を行う。
抽出液中のトリグリセライドの残量は、生成した遊離の脂肪酸および1,2−および1,3−ジアシルグリセライドの量とともにHPLCで測定する。
装置および条件
ポンプ:LKB（モデル2150）
検出器：屈折率計（ジョビン・イボン）
インジェクション・システム：パーキン・エルマーISS−101;10μｌ
インテグレーター：スペクトラ・フィジックス、クロムシジェット
カラム:CP Microspher−Si（クロムパック）、100×4.6mm
溶出液:n−ヘキサン／イソプロピルアルコール／蟻酸:975:25:2.5（V/V）,1ml/min
温度：室温
これらの条件下、トリオレイン、オレイン酸、1,3−および1,2−ジアシルグリセライドの保持時間は各々1.2、1.6、2.4および3.4分であった。ピークの面積または高さを測定した。これらはスワッチからの抽出のトリグリセライド、遊離脂肪酸およびジアシルグリセライドの回収の尺度となる。非洗浄スワッチの抽出によるトリグリセライドの回収を100％とした。先に述べた条件下でのオリーブ油、オレイン酸、1,2−および、1,3−ジアシルグリセライド間の屈折率の比はピークの高さにより各々1.00、0.98、2.10および1.30であることが分かった。
リパーゼ活性の測定法
ILUで表される本発明のリパーゼおよび変異体の活性はオリーブ油の加水分解に基づいて測定した。加水分解は20mM塩化ナトリウムおよび10mM塩化カルシウムを含む0.4mMトリス・バッファ（pH9）に10％のオリーブ油を添加したpHスタット中、30℃で測定した。1ILUはテスト条件下において１分間に１μモルの脂肪酸を遊離するのに必要な酵素量であると定義される。
以下の実施例は本発明の説明を目的としたものであり、これを制限するものではない。
実施例１
リパーゼ遺伝子の突然変異システムの開発
現在の部位指定突然変異誘発の戦略は２つに分類できる。
１）ギャップを有する二本鎖DNAの変異プライマーに基づくフィル・インで一方が変異した鎖を含むヘテロ二本鎖が出来る。
２）目的遺伝子内のカセットを交換することにより適当な変異配列を導入する。発現カセット中の一部を望ましい変異を含むPCR断片と交換する。
PCRを用いた部位指定突然変異誘発
この方法は第三回シュードモナス（Pseudomonas）会議（1991）において本方法の一般的説明を行ったジョン（Xiong）の方法に基づくものである。本方法を図１に模式的に示した。
一本鎖DNAを単離するために、EP 0334462に報告されているプラスミドpTMPv18Aを使用した。増幅反応にはベント・ポリメラーゼ（バイオラド）を使用した。このポリメラーゼは3'プルーフリーディング活性を有しており、PCR反応における取り込みミスは少ない。
PCR反応は以下に示すバッファ中で行った:10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、20mMトリス−HCl（pH8.8）、2mM MgSO4および0.1％Triton X−100、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dTTPおよび１ユニットのベント・ポリメラーゼ。
ステップ１において、0.5μＭの変異を含むプライマーＡ、0.05μＭのプライマーＢおよび１−10ngの一本鎖pTMPv18Aを50μｌの反応混合物に添加し、98℃:2分、55℃:2分、72℃:2分のサイクルを25サイクル行った。
その後、クレノーポリメラーゼおよびリガーゼを添加し、プライマーとして変異を含む断片を用いて一本鎖DNAをフィルインした。これで一方が変異を有するヘテロ二本鎖ができる。この混合物にエクソヌクレアーゼを添加し、一本鎖DNAおよびプライマーＡおよびＢを除去した。DNAは沈殿後、PCRバッファに溶解した。変異を含む新たに合成されたDNAをステップ２のテンプレートとして使用した。
ステップ２では、0.05μＭのプライマーＣをこの混合物に添加し、先と同様の第２のPCRを行った。
PCRフラグメントを適当な制限酵素で消化し、組み込みベクターにサブクローニングした。
実施例２
活性化部位付近への変異導入：部位M21の交換
先に述べたように変異を導入した。適当な制限酵素としてはXho IおよびBcl Iを選択した。使用したオリゴヌクレオチドを表２に示す。
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実施例３
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）M1（CBS 473.85）のリパーゼ遺伝子の染色体不活性化
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）中では複製できないが、他の微生物では複製できる自殺型組み込みプラスミドを用いてシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）の染色体中のリパーゼ遺伝子を不活性化した。
リパーゼを含む遺伝子フラグメントをプラスミドpTMPv18から、大腸菌では複製できるがシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）では複製できないプラスミドpBR322（ボリバー（Bolivar）等、Gene2（1977）95−113）にサブクローニングした。さらに、このプラスミドから内部のフラグメントの欠失を行った。このプラスミドをpBRflankと命名した。
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）M1（CBS 473.85）をpBRflankにトランスホーメーションした。このプラスミドはシュードモナス（Pseudomonas）中で複製できないため、組み込みによりテトラサイクリン耐性のコロニーのみ得ることが出来る。いくつかのテトラサイクリン耐性のコロニー（5mg/l）を選択した。この株では、プラスミドpBRflankが5'または3'側隣接領域における単一の組み換えにより細菌の染色体への組み込まれている（図２）。これらの株が機能的リパーゼ遺伝子を含んでいることから、これらはリパーゼ陽性であり、かつ、テトラサイクリン耐性であるという表現型を有する。次の実験のためにいくつかの株を選択した。染色体がリパーゼ遺伝子およびプラスミドを欠失させるために、第２の組み換え（切りだし）を行った。この事は株を数日間、抗生物質を含まないBHI（ブレイン・ハート・インフュージョン）培地中で生育させることにより達成しうる。
さらに、この細胞をトリブチリンを含む寒天培地にプレーティングした。リパーゼ陰性の表現型を持つコロニーについても選択寒天培地で生育できるかどうかを試した。このリパーゼ陰性の株をPs600と命名した。
組み込み、および第２の組み換えの模式図を図２および図３に示した。
リパーゼ陰性株シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）Ps600における変異リパーゼ遺伝子の導入
多量の変異酵素を生産するために、変異遺伝子を染色体中ならびにプラスミドとして同株に導入した。染色体への変異リパーゼ遺伝子の組み込みは、先の実施例において説明した方法で行った。
この方法の模式図を図４および図５に示した。
変異リパーゼの生産
この株をEP 03334462に示した方法で生育させた。この培養培地からリパーゼタンパク質を精製した。この操作もEP 0334462に示してある。
実施例４
M21L変異体リパーゼの比活性の測定
先に述べた活性検定法およびタンパク質含量の定量を行うためのアミノ酸定量分析を行うことによって、野生型および変異体の比活性を測定した。変異体の比活性は野生型よりも1.4倍小さかった:8000対6390ILU/mgタンパク質。
実施例５
使用条件下（SLMテスト）における野生型リパーゼM1（CBS 473.85）、およびM21変異体のリパーゼ活性
先に述べた方法に従ってSLMテストを行った。以下の条件下で野生型および変異体について単一および２サイクルの洗浄テストを行った。
−標準タップ水（STW）
−洗剤アリール・ウルトラTM（2g/l）
−指示されたリパーゼ投入量
アリール・ウルトラはプロクター・アンド・ギャンブル社の製品であり、市販されている。この洗剤にはプロテアーゼもリパーゼも含まれていない。
これらの条件は基本的にヨーロッパの洗浄条件を示している。
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この表から使用したリパーゼが布地に対して脂質分解的性質を示していると考えられる。これらの結果はここでの使用条件下においては同重量添加したときにM21LおよびM21A変異体が野生型よりも活性が高いことを明確に示している。M21S変異体リパーゼの脂質分解的性質は野生型のリパーゼに匹敵する。
実施例６
SLMテストに従った洗浄工程における野生型リパーゼ（M1）および変異体M21Lの性能。
これらの酵素の粉末洗剤および漂白システムとの適合性を以下の条件下でチェックした。
−標準硬水（0.75mMカルシウムおよび0.25mMマグネシウム）
−洗剤タイドTM（1g/l）
−指示されたリパーゼ投入量
−２サイクル洗浄テスト
タイドTMはプロクター・アンド・キャンブル社の製品であり、市販されている。
この洗剤にはプロテアーゼは含まれているがリパーゼは含まれていない。
これらの条件は基本的にアメリカにおける洗浄条件を示している。
表４からこの実施例で使用したリパーゼは布地に対する脂質分解的性質を有し、特に粉末洗剤において洗浄性能を示すことが明確に読み取れる。この変異酵素の洗浄性能は洗剤中の漂白剤の有無を問わず野生型よりも優れている。
0003618748.tif 000005
実施例７
SLMテストに従った洗浄工程における野生型M1（CGS473.85）およびM21SおよびM21A変異体の性能
これらの酵素の洗浄性能および粉末洗剤および漂白システムに対する適合性を以下の条件下でチェックした。
−標準硬水（0.75mMカルシウムおよび0.25mMマグネシウム）
−洗剤タイドTM（1g/l）
−指示されたリパーゼ投入量
−２サイクル洗浄テスト
タイドTMはプロクター・アンド・ギャンブル社の製品であり、市販されている。この洗剤にはプロテアーゼは含まれているがリパーゼは含まれていない。この洗浄テストに使用したスワッチは洗浄において種々の処理を施した布地に由来するものである。
これらの条件は基本的にアメリカにおける洗浄条件を示している。
表５からこの実施例で使用したリパーゼは布地に対する脂質分解的性質を有し、洗剤中の漂白剤の有無を問わず洗浄性能を示すことが明確に読み取れる。M21Sの洗浄性能は野生型と同等である一方、M21Aの洗浄性能は野生型を上回っている。
0003618748.tif 000006
実施例８
種々の温度における使用条件下での（SLMテスト）野生型M1リパーゼおよびM21L変異体のリパーゼ活性
先に示したようにSLMテストを行った。野生型および変異体について以下の条件下で１回洗浄テストを行った。
−標準タップ水（STW）
−洗剤アリール・ウルトラTM（2g/l）
−指示されたリパーゼ量
アリール・ウルトラTMはプロクター・アンド・ギャンブル社の製品であり、市販されている。これには酵素は含まれていない。
0003618748.tif 000007
本実施例はテストの使用条件下、全ての温度において変異体の脂質分解能力が野生型の能力を上回ることを明確に示している。本テストにおける使用条件下でのリパーゼM1の至適温度（最高のトリグリセライド加水分解能を示す）は40℃であり、一方変異体の至適温度はより高い温度50℃にシフトしていることが分かった。
実施例９
成形したリパーゼM1およびM21変異体のシェルフ安定性
リパーゼM1および変異体M21L、M21SおよびM21AをPEG−プリルで成形した。これらの顆粒を密閉したガラス管中以下に示す表７に記した温度で保存した。８週間の保存後、pHスタットでリパーゼの残存活性を測定した。
以下の表に見られるように、37℃までの温度における８週間の保存では、全てのリパーゼが本来の活性の90％以上を保持していた。
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特に本発明の新しい変異体は洗濯および食器洗浄等の洗剤に使用するのに有用であるが、当分野で知られているその他の用途に使用することも可能である。リパーゼは、通常安定化剤と共に粒子（例えばプリル等）または液体の形で洗剤添加物として使用されるのが望ましい。Met＋21の置換は洗剤安定性を高くする効果を持っているが、その程度は使用するアミノ酸に依存する。また、漂白システム（例えばパーボレート/TAED）の有無に係わらず液体中でのMet＋21変異体の安定性は驚くほど高い。リパーゼはアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼおよび種々の細胞壁分解酵素等の酵素とともに使用しうる。
本明細書に記した全ての出版物（特許および特許出願を含む）は本発明が属する分野の関係者の技術レベルに適ったものである。また、全ての出版物は各出版物が個々に特定されて参考として引用されることが示されていると同様に本明細書に参考として引用されている。
以上明確な理解を目的として実例を基にしてある程度詳細に本発明を説明してきたが、本発明の請求の意図または範囲を逸脱すること無しに本発明に変化、修正を施すことが可能であることは明白である。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願者：
（Ａ）氏名：ギスト・ブロケーズ（Gist−Brocades）N.V.
（Ｂ）番地:P.O.Box1
（Ｃ）市：デルフト
（Ｅ）国：オランダ
（Ｆ）郵便番号:ML−2600MA
（Ｇ）電話番号:31.15.791111
（Ｈ）ファックス番号:31.15.793957
（ii）発明の名称：洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体
（iii）配列の数:3
（iv）コンピュータ・リーダブル・フォーム：
（Ａ）メディア・タイプ：フロッピィディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM PCコンパチ
（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.0、バージョン＃1.25（EPO）
（vi）先願出願データ：
（Ａ）出願番号:EP 93201212.3
（Ｂ）登録期日:27−APR−1993
（２）SEQ.ID No.1の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型:DNA（合成）
（iii）仮定：無し
（iv）由来：
（Ｃ）インディビジュアル・アイソレート：プライマーＡ
（xi）配列:SEQ.ID No.1:
0003618748.tif 000009
（２）SEQ.ID No.2の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型:DNA（合成）
（iii）仮定：無し
（iv）由来：
（Ｃ）インディビジュアル・アイソレート：プライマーＢ
（xi）配列:SEQ.ID No.2:
0003618748.tif 000010
（２）SEQ.ID No.3の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型:DNA（合成）
（iii）仮定：無し
（iv）由来：
（Ｃ）インディビジュアル・アイソレート：プライマーＣ
（xi）配列:SEQ.ID No.3:
0003618748.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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