(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト核グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列のヘリックスH11およびH12の間に位置したイソロイシン→トレオニン突然変異を有する野生型の核グルココルチコイドレセプターをコードするDNA断片であって、レセプターの活性が、天然のグルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドによって一層強力に誘導される、DNA断片。
【請求項２】
配列として、アミノ酸配列が配列番号１に表されるヒトの核グルココルチコイドレセプターをコードする配列を有する、請求項１に記載のDNA断片。
【請求項３】
配列として、配列番号１に表されるヒト核グルココルチコイドレセプターのcDNA配列を有する、請求項２に記載のDNA断片。
【請求項４】
完全なレセプターのアミノ酸配列の位置747に相当する位置にイソロイシン→トレオニンの突然変異を有する天然のヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードするDNA断片。
【請求項５】
配列として、アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸532〜アミノ酸777に表されるヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸をコードする配列を有する、請求項４に記載のヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインをコードするDNA断片。
【請求項６】
配列として、配列番号１のコドン532〜コドン777に表されたヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードする配列を有する、請求項５に記載のDNA断片。
【請求項７】
配列として、ヘリックスH11およびH12の間に位置したイソロイシン→トレオニン突然変異を有する野生型のヒト核グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列を有する、レセプターであって、レセプターの活性が天然グルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドによって一層強力に誘導される、レセプター。
【請求項８】
アミノ酸配列として、配列番号１に表される配列を有する、請求項７に記載のヒト核グルココルチコイドレセプター。
【請求項９】
請求項７または８に記載の核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン。
【請求項１０】
ヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインLBD［GR（I747/T）］であって、配列として、配列番号１のアミノ酸532〜アミノ酸777に表されるヒトグルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を有することを特徴とする、リガンド結合ドメイン。
【請求項１１】
核グルココルチコイドレセプターとリガンドとによって形成された複合体によって誘導可能な転写の制御のための要素を含んでなる宿主細胞において、タンパク質、特に異種タンパク質を、条件的に発現するためのベクター系であって、
上記宿主細胞で確実に発現させる要素の制御下で上記タンパク質をコードするDNA断片からなる第一のDNA断片であって、確実に発現させる上記要素が、合成グルココルチコイドリガンドと複合体形成した請求項７または８に記載のレセプターによって誘導可能な転写の制御のための配列（RE）を含んでなるものと、
請求項４〜６のいずれか一項に記載のリガンドを認識する領域（LBD）を含んでなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の上記レセプターをコードする機能的DNA断片またはその断片の一部だけと、転写の制御のための上記配列（RE）に結合しているDNA結合領域（DBD）からなる第二のDNA断片
とを含んでなり、
上記第一および第二のDNA断片が同一ベクターまたは２個のベクターによって別個に担持されうることを特徴とするベクター系。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸番号532〜777をコードするコドンによって表されるLBD領域と、配列番号１のアミノ酸番号421〜487をコードするコドンによって表されるDBD領域とをコードするcDNAを含んでなる、請求項11に記載のベクター系。
【請求項１３】
グルココルチコイドレセプターのDNA結合ドメイン（DBD）が別のトランス活性化物質のドメイン、特に酵母タンパク質Gal4のドメイン、によって置換され、グルココルチコイドレセプターの転写（RE）を制御するための配列を上記の他のトランス活性化物質によって認識される配列、特にGal4トランス活性化物質によって認識された17m配列、によって置換する、請求項11に記載のベクター系。
【請求項１４】
ヒトまたは動物、特に哺乳類、の細胞で異種タンパク質を発現する方法であって、請求項11〜13のいずれか一項に記載のベクター系を含む細胞を培養し、上記合成リガンドを培地に加えた後、合成されたタンパク質を回収することを特徴とする方法。
【請求項１５】
上記合成リガンドが、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、RU2836、ビメトラゾール、デアシルコルチバゾールおよびフルオシノロンアセトニドから選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のDNA断片と、活性を調節することが求められるタンパク質をコードするDNA断片とを含んでなる融合遺伝子であって、上記タンパク質が上記レセプターまたは上記レセプターのリガンド結合ドメインに融合するとき、上記レセプターまたはこのレセプターの上記リガンド結合ドメインを天然グルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドと結合させることによって、活性が一層強力に誘導される、融合遺伝子。
【請求項１７】
上記タンパク質がリコンビナーゼタンパク質である、請求項16に記載の融合遺伝子。
【請求項１８】
上記タンパク質が、λインテグラーゼのファミリーのリコンビナーゼである、請求項17に記載の融合遺伝子。
【請求項１９】
リコンビナーゼタンパク質が、バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼである、請求項18に記載の融合遺伝子。
【請求項２０】
バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼタンパク質をコードするDNA断片と、請求項６に記載のDNA断片とを含んでなる、請求項19に記載の融合遺伝子。
【請求項２１】
５′→３′方向において、バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼをコードするDNA断片と、DBDドメインとLBDドメインとの間に位置した領域である核グルココルチコイドレセプターのヒンジ領域Ｄの総てまたは一部をコードするDNA断片と、請求項６に記載のDNA断片とを含んでなる、請求項20に記載の融合遺伝子。
【請求項２２】
Creリコンビナーゼに相当するアミノ酸１〜343と、ヒトグルココルチコイドレセプターのＤ領域のＣ−末端領域に相当するアミノ酸346〜377と、ＬBD［GR（I747/T）］に相当するアミノ酸378〜623とを含んでなる配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列を配列として有することを特徴とする、請求項21に記載の融合遺伝子。
【請求項２３】
アミノ酸626〜667がヒトエストロゲンレセプターのＦ領域に相当する配列番号２に示されるCre−LBD［GR（I747/T）］配列を有する、請求項22に記載の融合遺伝子。
【請求項２４】
動物、特に哺乳類、の宿主細胞における請求項16〜23のいずれか一項に記載の融合遺伝子によってコードされた融合タンパク質を発現するためのベクターであって、発現の要素を制御して上記宿主細胞で確実に発現させる請求項16〜23のいずれか一項に記載の融合遺伝子を含んでなる、ベクター。
【請求項２５】
請求項７または８に記載のレセプターまたは請求項９または10に記載のリガンド結合ドメインと、その活性が、上記レセプターまたはこのリガンド結合ドメイン（LBD）を天然グルココルチコイドリガンドよりも上記合成グルココルチコイドリガンドと結合させることによって一層強力に誘導されるタンパク質とを含んでなる融合タンパク質。
【請求項２６】
タンパク質がリコンビナーゼタンパク質である、請求項25に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
タンパク質が、λインテグラーゼのファミリーのリコンビナーゼタンパク質である、請求項25に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
リコンビナーゼが、バクテリオファージP1のCreタンパク質である、請求項27に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
Creタンパク質と、請求項９または10に記載のリガンド結合ドメインとの間にインターカレーションされたヒトの核グルココルチコイドレセプターのヒンジ領域ＤのＣ−末端領域を更に含んでなる、請求項28に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
動物の宿主細胞においてリコンビナーゼタンパク質の特異的認識のための１または２個の部位を含むDNA断片の水準における、組換え、特に条件的切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションの方法であって、
１）  請求項26〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項24に記載のこの融合タンパク質を発現するためのベクターを、請求項26〜29のいずれか一項に記載のこの融合タンパク質を発現させる条件下で上記宿主細胞に導入し、
２）  上記融合タンパク質を、上記リガンドをを上記宿主細胞に暴露することによって上記合成グルココルチコイドリガンドと複合体形成する
段階を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項３１】
遺伝子におけるDNA断片の条件的欠失の方法であって、請求項30に記載の切出しの方法を用い、切出されるDNA断片をダイレクトリピートとして方向付けられた２個のリコンビナーゼタンパク質認識部位の間に組み込むことを特徴とする、方法。
【請求項３２】
リコンビナーゼタンパク質特異的認識部位がloxP部位であり、リコンビナーゼタンパク質がバクテリオファージP1のCreタンパク質である、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３３】
切出しが求められる上記DNA断片と、およびリコンビナーゼタンパク質に特異的な上記認識部位とが、プラスミドまたはウイルスベクターに担持され、または宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項30〜32のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
リコンビナーゼタンパク質に特異的な認識部位、特に（複数の）loxP部位、の組み込みが、（複数の）上記リコンビナーゼ認識部位、特に（複数の）loxP部位、によって５′および／または３′に隣接されたDNA断片を含んでなる遺伝子で、挿入またはトランスロケーションされまたはそれぞれ切出しまたは反転されるDNA断片を含んでなる遺伝子を相同組換えすることによって行なう、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ヒトまたは動物、特に哺乳類、の宿主細胞にDNA断片を伝達するベクターであって、ダイレクトリピートとして方向付けられたリコンビナーゼに特異的な認識部位、特に２個のloxP部位、と、請求項16〜23のいずれか一項に記載の融合遺伝子の発現のためのカセットとを含んでなる伝達される上記DNA断片を含んでなることを特徴とするベクター。
【請求項３６】
融合遺伝子を宿主細胞に特異的な発現要素の制御下に配置する、請求項35に記載のベクター。
【請求項３７】
配列番号３のプラスミドpCre−LBD［GR（I747/T）］の配列を含んでなる、請求項36に記載のベクター。
【請求項３８】
切り出される上記DNA断片が、請求項35に記載の伝達ベクターによって上記細胞の染色体に伝達され、特に組み込まれる、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項24に記載の融合タンパク質を発現するベクターでトランスフェクションしたヒト細胞または動物細胞、特に哺乳類細胞。
【請求項４０】
DNA断片が、請求項35または36に記載のベクターによって伝達された、ヒト細胞または動物細胞。
【請求項４１】
請求項25〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質を構成的に発現する動物、特に哺乳類、細胞。
【請求項４２】
請求項25〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質に対する機能遺伝子を含み、特にその染色体の一つに組み込んでなる、トランスジェニック非ヒト動物、特にトランスジェニックマウス。
【請求項４３】
１個以上のloxP部位が目的の遺伝子に挿入され、特にその染色体の１個以上に組み込まれた、請求項42に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
請求項35〜37のいずれか一項に記載のベクター、請求項39〜41のいずれか一項に記載の細胞、または請求項42または43に記載の非ヒト動物の、宿主細胞の所定の遺伝子の機能を分析しまたは検討するための手段としての使用。
【請求項４５】
請求項30〜34または38のいずれか一項に記載の方法の使用を含む、エクス・ビボまたはイン・ビトロでの細胞の処理法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、修飾された核グルココルチコイドレセプター（GR）をコードするDNA断片、および上記レセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードするDNA断片、並びにグルココルチコイドリガンドの存在下で活性が誘導されるタンパク質に融合した上記レセプターの上記リガンド結合ドメインの上記レセプターを含んでなる融合タンパク質をコードするDNA断片に関する。
本発明は、修飾核グルココルチコイドレセプター、特にヒトレセプター、およびその修飾されたリガンド結合ドメイン、並びに上記レセプターまたは上記リガンド結合ドメインを含んでなる融合タンパク質にも関する。
本発明は、ヒトまたは動物宿主細胞、特に哺乳類細胞、におけるタンパク質、特に異種タンパク質を条件的に発現するためのベクターにも関する。本発明は、上記細胞中のタンパク質を発現する方法にも関する。更に、本発明は、ヒトまたは動物、特に哺乳類の宿主細胞におけるDNA断片の条件的切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションの方法に関する。
本発明は、更に、上記ヒトまたは動物、特に哺乳類、の宿主細胞にDNA断片を転移するベクター、および医薬品としておよび遺伝子の機能を分析しかつ研究するための手段としてのその使用、並びにエクス・ビボまたはイン・ビトロで細胞を処理する方法にも関する。
最後に、本発明は、本発明による発現および／またはトランスファーベクターでトランスフェクションしたヒトまたは動物細胞、並びにそれから誘導されるトランスジェニック動物に関する。
グルココルチコイドレセプター（GR）は、標的細胞中のグルココルチコイド作用を伝達する遺伝子の転写を制御するタンパク質である。GRおよび核レセプターのスーパーファミリーの他の構成員（リガンドによって活性化された転写因子）は、通常のモジュレーター構造を示す。可変Ｎ−末端領域は、構成的トランス活性化活性AF−１を含んでいる。コアDNA結合ドメイン（DBD）は、各種の種の間で高度に保存されており、レセプターをその関連したDNA応答要素（GRの場合にはGRE）に結合させることができる。GRのＣ−末端領域に位置するリガンド結合ドメイン（LBD）は、リガンドと結合するだけでなく、複数の異常活性、すなわちhsp90との相互作用の表面、ホモ二量体化、核局在化シグナルおよびリガンド依存性のトランス活性化機能AF−２のための異常表面（総説および文献については、（１〜５）を参照されたい）。LBDは、様々な種の間で高度に保存されている。トランス活性化機能AF−２は、各種のLBDのＣ−末端部分で同定されている（６−10）。相当する核レセプターによるリガンド依存性転写活性化、およびAF−２を含む領域と関連した転写中間体因子（TIF、コアクティベーターまたはメディエーターとも呼ばれる）との相互作用には、この領域のコア部分の完全性が必要である（11〜19）。リガンドの結合が、特にAF−２のコア部分を有するＣ−末端領域を利用することによってリガンド結合ドメインに立体配座変化を誘導し、これによってTIFと有効に相互作用する表面を生成する一般的モデルが提案されている（19）。核レセプターのLBDは、らせん状の基準構造を有する保存された領域を含む。これらの構造データにより、総ての核レセプターのLBDについて通常の整列を行なうことができた。H12ヘリックスは、トランス活性化機能AF−２を含む（19）。ヘリックスH11およびH12、特にヒト、ラット、マウスおよびツメガエルのような様々な種からのグルココルチコイドのアミノ酸は、保存される。
GRのLBDにおける幾つかの突然変異が、以前に報告されている。下記の突然変異の２つの主要な種類を識別することができる。
第一の群は、リガンドに対する親和性に正または負の影響を及ぼす突然変異にある。例えば、ラットGR（20）におけるシステイン残基656をグリシンによる置換、およびヒトGR（hGR）（21）におけるメチオニン残基565をアルギニンによるまたはアラニン残基573をグルタミンによる置換では、リガンドに対する結合の親和性が増加し、最低リガンド濃度の方向でのトランス活性化について用量−応答曲線がシフトする。従って、これらの突然変異体は、「スーパーGR」と呼ばれている。同様に、リガンドに対する結合の親和性が低い突然変異体も、報告されている（21〜24）。最高リガンド濃度の方向にリガンド用量−応答曲線をシフトするLBD突然変異は、ホルモン結合親和性の変化から生じる（25〜26）。
LBD突然変異体の第二の群は、リガンドに対する結合を変化することなく転写活性化機能（AF−２）に影響を与えるものを含んでなる。例えば、トランス活性化ポテンシャルの損失または減少分に連結しているが、リガンドへの結合の親和性に影響しないAF−２を含む領域における突然変異を挙げることができる。
核レセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）の異種タンパク質への融合により、多くの場合にその活性を制御することができる。
Myc、ｃ−Abl、Src、erbB1、Raf、E1A  CreおよびFLPは、核レセプターのLBDとの融合タンパク質を生成することによって調節することができる（27〜29）。しかしながら、これらのレセプターのリガンドは多数の生物学的系に存在しているので、基本活性水準を誘導することができる。このような問題を回避するため、エストロゲンレセプター（ER）の突然変異したLBDは、ｃ−Mycタンパク質（30）またはCreおよびFLPリコンビナーゼ（28および29）に融合されている。
λインテグラーゼのファミリーのリコンビナーゼは、このリコンビナーゼの認識の特異的部位の水準でDNA断片の切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションを触媒する（31〜36）。リコンビナーゼは、動物細胞で活性である（35）。
バクテリオファージP1由来の38kDaのインテグラーゼであるCreリコンビナーゼは、補因子の非存在下でloxPと呼ばれる34塩基対の２個のDNA配列の間の組換えを触媒する（32、第１図）。
互いに相対的なloxP部位の１個以上のDNA分子上の位置および方向により、リコンビナーゼ、特にCreリコンビナーゼの機能の種類、切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションが決まる（第１図）。例えば、Creのリコンビナーゼ活性は、２個のLoxP部位が同一DNA断片上でヘッド−テイルであるときには、逆位であり、LoxP部位が同一DNA断片上のダイレクトリピートであるときには、切出しである。loxP部位がDNA断片上に存在し、loxP部位を含むプラスミドのようなDNA分子をこのloxP部位の水準で挿入可能であるときには、リコンビナーゼ活性は挿入である（第１図）。loxP部位が２個の染色体のそれぞれの上に存在する場合には、Creリコンビナーゼはこれらの染色体の間でトランスロケーションを誘発することもできる（37）（第１図）。従って、更に一般的には、１個以上の異なるDNA分子がloxP部位を有するときには、Creリコンビナーゼは、それらの分子の間で組換えを誘導することができる。
同様に、Saccharomyces cerevisiae由来の43kDaのリコンビナーゼであるFLPリコンビナーゼは、認識部位FRTを含むDNA断片上で同じ型の作用が可能である（34）。
Creリコンビナーゼと位置400にバリンを含むエストロゲンに対するヒトレセプターのＣ−末端領域との間で融合タンパク質（キメラ）を生成することによって、loxP部位が直接反復であるときには、２個のloxP部位の間並びにloxP部位の一方にあるDNA配列を、レセプターリガンドであるエストラジオールの存在下で切出しが可能な分子が得られるが、リガンドの非存在下では、切出しは起こらない（28）。
FLPリコンビナーゼの活性は、FLPと核レセプターの結合ドメインとの間にキメラを生成することによって調節することもできる。リガンドの非存在下において、FLPをエストロゲンレセプターまたはグルココルチコイドレセプターのLBDと融合すると、リコンビナーゼ活性は極めて低いが、これはLBDに対するそれぞれのリガンドによって速やかに誘導される（29）。
しかしながら、動物または細胞培地に含まれるリガンド濃度がリコンビナーゼ活性を少なくとも部分的に誘導するのに十分であるならば、リコンビナーゼの認識の部位間に位置したDNA断片を制御した方法で切出す目的で、リコンビナーゼと核レセプターのLBDとの間の融合タンパク質を用いると、問題が生じることがある。
本発明は、リコンビナーゼと、活性が、合成グルココルチコイドによって誘導可能であるが、天然グルココルチコイドによっては、特に10-6M未満の濃度、すなわち生理学的濃度では誘導されないグルココルチコイドレセプター由来のリガンド結合ドメインとの間で生成される融合タンパク質を使用することによる動物、特に哺乳類、で誘導可能なリコンビナーゼ系を提供する。
内在性リガンドによるキメラタンパク質のリコンビナーゼ活性の誘導を回避するため、本発明は、実際には、グルココルチコイドレセプターのLBDで突然変異を生じさせ、生理学的濃度で天然グルココルチコイドリガンドの存在下よりは合成グルココルチコイドリガンドの存在下で一層強力に活性化させることを提案している。
本発明の課題は、実際には、修飾された核グルココルチコイドレセプター、特にリガンド結合ドメインの領域で突然変異を行ない、このレセプターの活性が天然グルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドによって一層強力に誘導可能とするものである。
本発明によれば、「天然グルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドによって一層強力に誘導可能な（突然変異した）グルココルチコイドレセプター」とは、本発明による突然変異したレセプターの活性が所定濃度では天然グルココルチコイドリガンドよりも合成グルココルチコイドリガンドによって一層強力に誘導され、本発明による突然変異したグルコースレセプターは、野生型レセプターよりも天然グルココルチコイドに対して感受性が著しく低いことを意味するものと理解される。
「レセプターの活性」とは、本明細書では、レセプターの転写活性および／または、適当な場合には、グルココルチコイドの存在下で誘導される、レセプターまたは上記リガンド結合ドメインに融合したタンパク質の活性を調節する活性を意味するものと理解される。更に具体的には、上記レセプターまたはこのレセプターのリガンド結合ドメインに融合したリコンビナーゼタンパク質の活性を挙げることができる。
「天然グルココルチコイド」とは、本明細書では、コルチゾール、コルチコステロン、またはアルドステロンのような副腎皮質によって分泌されるステロイドホルモンを意味するものと理解される。「合成グルココルチコイド」とは、関連活性に対する上記レセプターの化学的に合成された作動薬を意味するものと理解される。後者の中では、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニドRU486、RU28362、ビメドラゾール、フルオシノロンアセトニドを挙げることができる。
幾つかの合成リガンドは、レセプターの上記の特定の活性を誘導する作動薬、およびレセプターのもう一つの活性に対する拮抗薬となる。例えば、化合物RU486は、上記レセプターまたはこのレセプターのリガンド結合ドメインに融合したリコンビナーゼタンパク質の活性を誘導するが、このレセプターの転写活性は誘導しない。
合成グルココルチコイドリガンドは、（突然変異していない）野生型の核レセプターに結合することができるが、この合成リガンドは突然変異したレセプターに結合し、天然レセプターには結合しない可能性がある。この合成リガンドが野生型レセプターに結合しても、後者の活性が合成リガンドへの結合によって誘導されないことも考えられる。
突然変異は、特にヘリックスH11およびH12の間に位置した核グルココルチコイドレセプターのLBDドメインで同定されている（イソロイシン→トレオニン）（19）。この突然変異は、天然グルココルチコイドの存在下においてレセプターに対する活性の損失を生じる。更に精確には、H11とH12との間で突然変異したこのグルココルチコイドレセプターは、天然の生理学的濃度、特に10-6M未満の濃度の天然グルココルチコイドの存在下では、転写活性を全くまたはほとんど持たない。しかしながら、その活性は、合成グルココルチコイドリガンド、特にデキサメタゾン（dex）によって誘導することができる。
本発明の課題は、更に具体的には、hGR（I747/T）と呼ばれる突然変異したヒトレセプターであって、配列として、位置747にイソロイシン→トレオニン突然変異を有するヒト野生型核グルココルチコイドレセプター、更に一層具体的には、アミノ酸配列としてSEQ  ID  NO.1に実質的に表されている配列を有する修飾されたヒト核レセプターのアミノ酸配列を有することを特徴とするものである。
グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）のＣ−末端部分におけるイソロイシン747のトレオニンへの突然変異は、天然リガンドのトランス活性化活性を誘導する能力を変化させる。コルチゾール、アルドステロンまたはコルチコステロンのような天然グルココルチコイドは、GR突然変異体（I747/T）では活性が極めて弱いかまたは完全に不活性であるが、デキサメタゾン（Dex）のような合成グルココルチコイドは、GR介在性トランス活性化（I747/T）を効率的に刺激する。しかしながら、Dexによって誘導されたトランス活性化についての相当するリガンド用量−応答曲線は、野生型（WT）GRで得られたものと比較して、最高濃度へとシフトする。このシフトもコルチゾールが効率的にGR（I747/T）を活性化することができないことも、イン・ビトロでのリガンドへの結合の親和性の変化によるものではない。
実際に、GR（I747/T）のLBDにおける突然変異は、イン・ビトロでのリガンドへの結合の親和性を変化させない。しかしながら、この突然変異体は、活性曲線についてのWT  GRと比較して高リガンド濃度への実質的なシフトを示す。更に、WT  GRを活性化するのに十分な天然グルココルチコイドリガンドのいわゆる生理学的濃度は、突然変異体GRにおいて残留またはゼロ活性しか生じない。
この突然変異体は、変化した活性化機能がイン・ビトロでのリガンドへの結合についての特性において修飾体と緊密に相関している以前に報告された他のGR  LBD突然変異体（22,38）とは異なっている。
本発明の課題は、本発明による核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン、特にLBDドメイン［GR（I747/T）］であって、ヘリックスH11およびH12の間のイソロイシン→トレオニンの突然変異体を有することを特徴とするものでもある。更に具体的には、配列として、SEQ  ID  NO.1のアミノ酸532〜アミノ酸777に実質的に表され、位置747にイソロイシン→トレオニンの突然変異を有するヒトグルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を有する。
本発明は、特に本発明によるリガンド結合ドメイン（LBD）の領域において突然変異した修飾された核グルココルチコイドレセプターをコードするDNA断片、並びに本発明による修飾されたレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードするDNA断片も提供する。
従って、本発明の課題は、更に精確には上記レセプターのアミノ酸配列のヘリックスH11およびH12の間に位置したイソロイシンからトレオニンへの突然変異を有する野生型の核グルココルチコイドレセプターをコードするDNA断片であり、更に一層精確には、アミノ酸配列が実質的に配列番号１に表されるものであるヒト核グルココルチコイドレセプターのコード配列を配列として有することを特徴とするDNA断片である。
一つの態様では、本発明の課題は、実質的に配列番号１に表されるものであるヒト核グルココルチコイドレセプターのcDNA配列を配列として有することを特徴とし、上記レセプターのアミノ酸配列の位置747においてトレオニンをコードするACCコドンを含んでなるDNA断片である。
同様に、本発明の課題は、ヘリックスH11とH12との間に、特にヒト核グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の位置747に相当する位置にイソロイシン→トレオニンの突然変異が位置した修飾された核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードするDNA断片である。
更に具体的には、本発明は、修飾されたヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインをコードするDNA断片であって、アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸532からアミノ酸777に実質的に表されているヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸をコードする配列を配列として有することを特徴とするDNA断片を提供する。
更に一層具体的には、本発明は、位置747にACCコドンを有する配列番号１のコドン532からコドン777に実質的に表されているヒト核グルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）をコードするcDNA配列を配列として有することを特徴とするDNA断片を提供する。
本発明の課題は、更に、核グルココルチコイドレセプターとリガンドとによって形成された複合体によって誘導可能な転写の制御のための要素を含んでなる宿主細胞において、タンパク質、特に異種タンパク質を条件的に発現するためのベクター系であって、
上記宿主細胞で確実に発現させる要素の制御下で上記タンパク質をコードするDNA断片からなる第一のDNA断片であって、確実に発現させる上記要素が、合成グルココルチコイドリガンドと複合体形成した本発明によるレセプターによって誘導可能な転写の制御のための配列（RE）を含んでなるものと、
本発明によるリガンドを認識する領域（LBD）を含んでなる本発明による上記レセプターをコードする機能的DNA断片またはその断片の一部だけと、転写の制御のための上記配列（RE）に結合しているDNA結合領域（DBD）からなる第二のDNA断片
とを含んでなり、
上記第一および第二のDNA断片が同一ベクターまたは２個のベクターによって別個に担持されることが可能であることを特徴とするものである。
一つの態様では、このベクター系は、配列番号１のアミノ酸番号532〜777をコードするコドンによって表されるLBD領域と、配列番号１のアミノ酸番号421〜487をコードするコドンによって表されるDBD領域とをコードするcDNAを含んでなる。
幾つかの細胞は、天然リガンドおよび合成リガンドによって活性化することができる内在性GRを有する。内在性リガンドまたは内在性レセプターによって活性化することを可能とすることなく所定の細胞をそのような細胞で自由に活性化することが所望な場合には、この遺伝子がGREとは異なるREを含み、相当するDBDと本発明による突然変異したLBDとを含む含んでなるキメラ活性化物質を用いる必要がある。従って、この遺伝子は、合成リガンドによって活性化することができるが、天然リガンドによって活性化することはできない。
従って、一つの態様では、グルココルチコイドレセプターのDNA結合ドメイン（DBD）は、別のトランス活性化物質のドメイン、特に酵母タンパク質Gal4のドメインによって置換され、グルココルチコイドレセプターの転写（RE）の制御のための配列は、別のトランス活性化物質の配列、特にGal4タンパク質によって認識される17マー（17m）配列によって置換される。
従って、本発明の課題は、ヒトまたは動物、特に哺乳類の細胞で異種タンパク質を発現する方法であって、本発明による発現ベクター系を含む細胞を培養し、上記合成リガンドを培地に加えた後、合成されたタンパク質を回収することを特徴とする方法でもある。
合成グルココルチコイドリガンドを培地に加えまたは動物に注射すると、それらは細胞中で自由に拡散する。
この方法において、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、RU2836、ビメトラゾール、デアシルコルチバゾールおよびフルオシノロンアセトニドから選択される合成リガンドが、特に用いられる。
更に、本発明の課題は、本発明によるレセプターまたは本発明によるリガンド結合ドメインと、活性が上記レセプターまたはこのレセプターのリガンド結合ドメイン（LBD）を天然のグルココルチコイドリガンドとよりは上記の合成グルココルチコイドリガンドと結合することによって一層強力に誘導可能なタンパク質とを含んでなる融合タンパク質である。
特に、本発明の課題は、リコンビナーゼタンパク質、更に具体的にはλインテグラーゼのファミリーのタンパク質、更に一層具体的にはバクテリオファージP1のCreタンパク質を含んでなる融合タンパク質である。
一つの態様では、この融合タンパク質は、Creタンパク質と本発明による修飾されたレセプターの上記リガンド結合ドメインとの間にインターカレートされたヒトの核グルココルチコイドレセプターのヒンジ領域ＤのＣ−末端部分を含んでなる。
融合タンパク質の実際のリコンビナーゼ活性は、Creの活性と同じ程度である。従って、Creと同様に、loxP部位の間に配置されたDNA配列を切出しまたは反転し、ゲノムに配置されたloxP部位の水準においてloxP部位を含むプラスミドを挿入し、またはそれぞれloxP部位を含む２個の染色体の間でトランスロケーションを行なうことができる。
本発明の課題は、本発明による融合タンパク質をコードする融合遺伝子であって、修飾された核グルココルチコイドレセプターまたは本発明によるこのレセプターのリガンド結合ドメインをコードするDNA断片、並びに活性を調節することが所望なタンパク質をコードするDNA断片を含んでなり、上記活性が上記レセプターまたは上記リガンド結合ドメインを合成グルココルチコイドと結合することによって誘導可能であるが、上記タンパク質が上記レセプターまたはこのレセプターのリガンド結合ドメインに融合しているときには天然のグルココルチコイドリガンドと結合することによっては誘導されないものでもある。
更に具体的には、本発明の課題は、５′→３′方向において、
バクテリオファージＰのCreリコンビナーゼをコードするDNA断片、DBDドメインとLBDドメインとの間に位置した領域である核グルココルチコイドレセプターのヒンジ領域Ｄの総てまたは一部をコードするDNA断片と、
本発明による核グルココルチコイドレセプターの修飾された、特に突然変異した、リガンド結合ドメイン（LBD）をコードするDNA断片と
を含んでなる融合遺伝子である。
更に一層具体的には、本発明の課題は、
Cre組換えに相当するアミノ酸１〜343と、
ヒトグルココルチコイドレセプターのＤ領域のＣ−末端領域に相当するアミノ酸346〜377と、
LBD［GR（I747/T）］に相当するアミノ酸378〜623と
を含んでなる配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列を配列として有することを特徴とする融合遺伝子である。
具体的態様では、この融合遺伝子は、配列として、アミノ酸626〜667がヒトエストロゲンレセプターのＦ領域に相当する配列番号２に示されるCre−LBD［GR（I747/T）］配列を実質的に有する。
本発明の課題は、動物、特に哺乳類の宿主細胞における本発明による誘導遺伝子によってコードされた融合タンパク質を発現するためのベクターであって、発現の要素を制御して上記宿主細胞で確実に発現させる本発明による融合遺伝子を含んでなることを特徴とするベクターでもある。この融合タンパク質を発現するためのベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むためのベクターであることもある。
本発明によるベクターでは、レセプター、LBDまたは本発明による融合タンパク質を発現するには、これらの分子をコードするDNA断片を制御配列、特にプロモーター／エンハンサー配列の制御下に置く必要がある。特に、SV40ウイルスのプロモーター／エンハンサー配列を用いることができる。
更に、本発明の課題は、ヒトまたは動物、特に哺乳類、の宿主細胞においてリコンビナーゼタンパク質の特異的認識のための１または２個の部位を含むDNA断片のレベルにおける、組換え、特に条件的切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションの方法であって、
１）  本発明による融合タンパク質または本発明によるこの融合タンパク質を発現するためのベクターを、本発明によるこの融合タンパク質を発現させる条件下で上記宿主細胞に導入し、
２）  上記融合タンパク質を、上記リガンドを上記宿主細胞に暴露することによって上記合成グルココルチコイドリガンドと複合体形成する
段階を含んでなることを特徴とする方法である。
従って、本発明は、DNA断片の条件的欠失の方法であって、本発明による切出しの方法を用い、切出されるDNA断片をダイレクトリピートとして設けられた２個のリコンビナーゼタンパク質認識部位の間に組み込む方法を提供する。特に、上記DNA断片は、このDNA断片の切出しが結果として上記遺伝子が不活性化されるように選択することができる。このDNA断片の切出しにより、この断片が停止コドンまたはポリアデニル化シグナルなどを含む場合には、機能タンパク質の合成を行なうこともできる。
本発明による好ましい態様では、上記リコンビナーゼタンパク質特異的認識部位はloxP部位であり、上記リコンビナーゼタンパク質はバクテリオファージＰのCreタンパク質である。
組換え、特に切出しが所望な上記DNA断片、およびリコンビナーゼタンパク質に特異的な（複数の）上記認識部位は、プラスミドまたはウイルスベクターによって担持することができ、または宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。
ゲノムにおけるloxP部位を有する遺伝子の組み込みは、ランダムであっても、または標的設定されてもよい。特に、リコンビナーゼタンパク質に特異的な認識部位、特にCreリコンビナーゼに対する（複数の）loxPの組み込みは、切出しまたは反転（２個のloxP部位）、または所望な用途によって変化する上記の（複数の）リコンビナーゼ認識部位、特にloxP部位によって５′および／または３′に隣接した切り出される上記DNA断片を含んでなる上記の修飾された遺伝子でそれぞれ挿入またはトランスロケーション（１個のloxP部位）される上記DNA断片を含んでなる遺伝子の相同組換えによって行なうことができる。
GR（I747/T）のLBDに融合したCreリコンビナーゼからなるSEQ  ID  NO.2のCre−LBD［GR（I747/T）］であるキメラタンパク質を構築した。この融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］は、合成グルココルチコイドで処理した後、哺乳類細胞において、loxP部位の間で組換えを行なうことができる。処理を行なわない場合、または10-6までの濃度の天然グルココルチコイドの存在下では、切出しは観測されない。このキメラは、F9細胞（マウス胎児癌）のゲノムに予め組み込まれたloxP部位の間に位置した、または10-6Mまたは10-7MのDexで処理した後にCre−LBD［GR（I747/T）］を発現するベクターでこれらの細胞をトランスフェクションした後にプラスミド上に存在するDNA配列を切出すことができるが、このような濃度では、コルチゾールはリコンビナーゼ活性を誘導しない。既述のように、Cre−LBD［GR（I747/T）］発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むためのベクターであることもある。
従って、この系は、所定の選択された時間にキメラタンパク質のリコンビナーゼ活性を放出することができる。この融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］は、loxP部位を含む座を修飾することなく、loxP部位を含む細胞で発現することができる。loxP部位のレベルでの組換えは、合成グルココルチコイドで処理した後だけに起こる。更に、細胞特異性を示すプロモーターの制御下において、動物で融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］を発現することによって、loxP部位の間で、具体的にはこれらの細胞で組換えを行なうことが可能である。
本発明の課題は、ヒトまたは動物、特に哺乳類、の宿主細胞にDNA断片を伝達するベクターであって、ダイレクトリピートとして配置されたリコンビナーゼに特異的な認識部位、特に２個のloxP部位と、本発明による融合遺伝子の発現のためのカセットとを含んでなる伝達される上記DNA断片を含んでなることを特徴とするベクターでもある。２個の部位を上記DNA断片のそれぞれの末端に配置するのが好ましい。
融合遺伝子は、宿主細胞に特異的な発現要素によって制御するのが好ましく、特に、配列番号３のプラスミドpCre−LBD［GR（I747/T）］の配列を含んでなる。
本発明による切出し法において、切出される上記DNA断片は、融合タンパク質またはトランスファーベクターを導入する段階の前、と同時に、またはの後に宿主細胞を伝達することができる。
本発明によるトランスファーベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであることができる。伝達の様式は、標的細胞の種類および所望な効率によって変化する。
物質を胚細胞に伝達するときには、受精した卵母細胞の雄生殖核のマイクロインジェクションを用いるのが好ましい。DNAを多分化能胎児細胞（ES細胞）に導入するには、代わりの適当な手法は、電気穿孔またはレトロウイルスベクターの使用である。
体細胞で実験するには、最大効率を得ること求められ、従ってウイルスベクター、主としてレトロウイルスおよびアデノウイルスが優先的に使用される。これらのウイルスは防御的なものであり、特にヒトの健康において増殖や復帰の危険性を防止する目的で適用されるものである。
この種のベクターのゲノムへの組み込みなどを行なうと、Cre−lox系は、ウイルスの引き続く増殖に対する危険性を生じる可能性があるある種のウイルス配列を切出すことができる。これは、遺伝子療法においてこのようなベクターを使用する上で極めて有利である。Cre−LBD［GR（I747/T）］遺伝子および潜在的に「危険性」のある遺伝子の限界を定めるlox部位の発現のためのカセットを含むベクター、およびこのカセットにより、適当な場合には組換えウイルスのゲノムに組み込んだ後に、これらの要素を除去することが可能である。逆に、不活性形態で組み込まれた遺伝子を活性化することも可能である。この活性化は、上記遺伝子から断片、例えば停止コドンまたはloxP部位によって限界を定めたポリアデニル化シグナルを欠失することによって生じる。
遺伝子物質を細胞に伝達することが所望な場合には、伝達される遺伝子を含み、ヘルパー遺伝子を場合によっては添加して、選択的な利点（例えば、抗生物質G418に対する耐性を付与するneo遺伝子）を付与する構築物が一般に用いられる。
選択的なマーカーは、本発明による切出し法によって切出すこともできる。
通常の手法を用いることによって、相同組換えによって哺乳類、特にマウスの遺伝子を修飾することが可能である。loxP部位を、修飾しようとする遺伝子に導入することができ、または２個のloxP部位によって修飾しようとする配列の限界を設けることができる。特に、相同組換え現象を同定することができるようにする目的で用いられる選択可能なマーカーは問題であることがあり、必要ならば、loxPのようなリコンビナーゼ認識部位またはFRT部位によって限界を定められている場合には、相当するリコンビナーゼタンパク質のマイクロインジェクションにより、細胞、特にES細胞のリコンビナーゼタンパク質に対する発現ベクターによるトランスフェクションにより、または選択可能なマーカーを有するマウスを所望なリコンビナーゼ、特にCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配することによって最初に除去することができる。これにより、修飾された座における唯一の修飾がloxPのような認識部位の挿入であるマウスを得ることが可能である。これらのマウスを、次にCre−LBD［GR（I747/T）］およびDexのようなリガンドで処理することによって得られる座の修飾を発現するマウスと交配することができる。これにより、遺伝子を所定時間に不活性化または修飾することにより、発生の様々な時点におけるこれらの遺伝子の機能を検討することが可能である。これは、胎児発生の良好な進展に本質的な遺伝子を検討する上で特に有利である。実際に、幾つか場合には、従来の相同組換え法では、胎児の死亡を引き起こし、遺伝子の機能を以後の段階で検討することはできないのである。
遺伝子を所定細胞に伝達することにより、遺伝子療法の基礎が形成される。これに関して最も効率的なベクターは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターである（39）。従って、本発明の課題は、本発明によるトランスファーベクターであって、上記合成グルココルチコイドリガンド、例えばデキサメタゾンと組み合わせて投与するときに、遺伝子療法における医薬として用いるための直接反復として配置された２個のloxP部位を含んでなる伝達される上記DNA断片を含んでなるものである。
この種のベクターは、２個のリコンビナーゼに特異的な認識部位を含んでなる所望なDNA断片を遺伝子に伝達して、２個のloxP部位の間に配置されたDNA配列を、上記の合成グルココルチコイドリガンドを投与した後に条件的に切出すことができるようにすることができる。
本発明は、更に、本発明による融合タンパク質の発現または伝達のためのベクターでトランスフェクションしたヒトまたは動物、特に哺乳類の細胞、またはヒトまたは動物、特に哺乳類の細胞であって、本発明によるトランスファーベクターによってDNA断片が転移されたもの、あるいは本発明による融合タンパク質を構成的に発現するヒトまたは動物、特に哺乳類の細胞を提供する。
本発明のもう一つの課題は、最後に、トランスジェニック動物、特にマウスであって、本発明による融合タンパク質についての機能遺伝子であって、特にその染色体の一つに組み込まれている遺伝子を含んでなるマウスである。
あるいは、本発明による融合タンパク質についての機能遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物であって、重要な遺伝子を（複数の）loxP部位の挿入によって修飾され、特に１個以上の染色体に組み込まれている動物である。
本発明の課題は、最終的には、本発明による細胞または動物の発現またはトランスファーベクターの、宿主細胞の所定の遺伝子の機能を分析しまたは検討するための手段としての使用、および本発明による切出し、挿入、逆位またはトランスロケーションの方法の使用および本発明による発現またはトランスファーベクターの使用を伴うエクス・ビボまたはイン・ビトロでの細胞の処理法である。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を考慮すれば、明らかになるであろう。
配列番号１は、aa421〜487に相当するDBDおよびaa532〜777に相当するLBDを有するGR（I747/T）のヌクレオチドおよびペプチド配列を表す。
配列番号２は、Cre−LBD［GR（I747/T）］のヌクレオチドおよびペプチド配列を表す。
ヌクレオチド１〜1029は、Creリコンビナーゼ（aa1〜343）をコードし、
ヌクレオチド1036〜1131は、ヒトグルココルチコイドレセプターのＤ領域のＣ−末端領域をコードし［GR（I747/T）のaa500〜531、Cre−LBD［GR（I747/T）］のaa346〜377］、
ヌクレオチド1132〜1869は、GR（I747/T）のLBDをコードし［GR（I747/T）のaa532〜777、Cre−LBD［GR（I747/T）］のaa378〜3623］、
ヌクレオチド1876〜2001は、ヒトエストロゲンレセプターのＦ領域をコードし［HEGOのaa554〜595、Cre−LBDのaa626〜667］、
ヌクレオチド1777〜1779は、イソロイシンをトレオニンで置換する突然変異に相当する。
配列番号３は、プラスミドpCre−LBD［GR（I747/T）］のヌクレオチド配列を表す。
配列番号４〜17は、本発明による各種のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す。
第１図は、Creリコンビナーゼ活性の概略図である。
第２図は、デキサメタゾンに応答する突然変異体および野生型GRレセプターの転写活性、および２個のレセプターへのデキサメタゾンの結合の容量を表す。
第３図は、［3H］−デキサメタゾンの野生型およびI747/T突然変異体レセプターへの結合のスキャチャード分析を表す。
第４図は、野生型（WT）およびGR（I747/T）レセプターのDex結合トランス活性化活性に対するRU486による競合を表す。
第５図は、Cre、hER、Cre−ER、hGRおよびCre−LBD［GR（I747/T）］タンパク質を模式的に表した図である。
第６図は、プラスミドpCre−LBD［GR（I747/T）］を模式的に表した図である。
第７図は、pCre−LBD［GR（I747/T）］のヌクレオチド配列、およびCre−LBD［GR（I747/T）］のペプチド配列を表す。
第８図は、Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性の試験における野生型、突然変異および組換え対立遺伝子を検出するのに用いるPCR法を表す。
第９図は、リガンドを添加しない、またはコルチゾール（10-6M）またはデキサメタゾン（10-6M）で処理したネズミ細胞RXRα＋／−（LNL）におけるpCre−LBD［GR（I747/T）］の一過性のトランスフェクションの後のloxP部位の間に配置された配列の切出しのPCR分析を表す。
第10図は、10-6Mのコルチゾールまたはデキサメタゾンで処理しないまたは処理した細胞RXRα＋／−（LNL）:Cre−LBD［GR（I747/T）］におけるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性のPCR分析を表す。
第11図は、各種のリガンドの増加濃度の存在下でのリコンビナーゼを構成的に発現するRXRα＋／−（LNL）系におけるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性を要約した図である。
第12図は、天然リガンドの存在下でも合成リガンドによって誘導されるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性のPCR分析を表す。
第13図は、ヒトHeLa細胞におけるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性についての試験を表す。
第14図は、導入遺伝子（trangene）Cre−LBD［GR（I747/T）］の模式的表現であり、（ａ）はトランスジェニックマウスを得るのに用いたCre−LBD［GR（I747/T）］遺伝子をコードする配列を含むDNA断片を表し、（ｂ）は野生型対立遺伝子RXRα、標的対立遺伝子RXRαΔAF2（LNL）、および切出した対立遺伝子RXRαΔAF2（Ｌ）のゲノム構造、並びにマーカーの切出しを分析するためのPCR法を表す。
第15図は、デキサメタゾンで処理したマウスにおけるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性のPCR分析を表す。
実施例1:ヒト核グルココルチコイドレセプターにおけるイソロイシン747のトレオニンによる置換
リガンド結合ドメインのＣ−末端部におけるヘリックスH11とH12との間に配置されたイソロイシン747残基のトレオニン残基による置換である単一アミノ酸置換を含んでなるヒトGR突然変異体を得た。この突然変異は、HG1から誘導されるベクターでは自発的であると思われた（40）。この突然変異体は、以前に記載された他のGR  LBD突然変異体（22,38）とは異なり、変化した活性化機能はイン・ビトロでのそれらのリガンド結合特性における修飾と緊密に相関している。
1.ヒトGRにおける突然変異
野生型のヒトGR（pSG5HGO）の発現のためのベクターを、以前に報告されたHGOベクター（40）から単離した約2.9kbのBamH I断片（野生型hGRのオープン・リーディング・フレームを含む）を発現ベクターpSG5（41）のBamH I部位にクローニングすることによって得た。
総てのDNA構築は、従来の手法（42）によって行なった。I747→Ｔ突然変異を有する突然変異体をコードする発現ベクターGR（I747/T）hGRを、pSG5HG0の相当するPst IおよびPflM I部位に連結した突然変異した発現ベクターHG1（40）のPst I−PflM I消化の断片から得た。
HG1に含まれるイソロイシン747残基からトレオニン残基の突然変異に加えて、この突然変異体は、ペプチド配列には全く変化を生じないEcoR I部位の突然変異も含んでいる。
この突然変異の存在は、配列分析によって確認した（Sequenase 2.0 protocol,U.S.Biochemical Corp.,クリーブランド，オハイオ）。
2.結果
2.1  イソロイシン747をトレオニンによって置換すると、トランス活性化のためのデキサメタゾン用量−応答曲線がシフトするが、リガンド結合親和性にはほとんど影響しない。
野生型（WT）hGRと、イソロイシン747がトレオニンによって置換された突然変異体［以後、GR（I747/T）と呼ぶ］の転写特性を比較した。レセプターを、チロシンアミノトランスフェラーゼプロモーター（pTAT−tk−Luc）の制御下でルシフェラーゼリポーター遺伝子と共同して無GRのCV−１細胞で一過的に発現した。第２図は、用いたリガンド用量の関数としての応答の相当する曲線を示し、EC50（最大転写応答が50％となるリガンド濃度）値を測定することができる。WT  hGRについての用量−応答曲線は、10-8Mで最大応答を、４×10-10Mで最大応答の半分に等しい応答を示すが、GR（I747/T）突然変異体についての転写応答曲線は、最高リガンド濃度方向へ著しくシフトし、DexについてのEC50の100倍の値（４×10-8M）を生じる（下記の第Ｉ表を参照）。GR（I747/T）によって伝達される最大刺激は、約10-6M  Dexで到達した。しかしながら、GR（I747/T）レセプターは、WT  GRと同程度までpTAT−tk−Lucの転写を活性化することができることに留意するのが重要である。従って、位置747でイソロイシン残基をトレオニンで置換しても、GRが転写を活性化する能力を減少しないが、応答のリガンド感受性を特異的に改変した。
この突然変異体の効果は、Ｎ−末端A/B領域およびその関連したトランス活性化機能AF−１から独立している。AF−１を欠いているがI747/T［ΔA/B−GR（I747/T）］突然変異を含む欠失突然変異体は、最大刺激の半分を表す刺激には３×10-8MのDexを必要とするが、WTから誘導されたΔA/B−GRには６×10-11Mだけで十分である（データ示さず。相当するGALキメラについては第II表を参照）。例えば、I747/T突然変異は、完全なGRおよびＮ−末端に欠失を有するGRに同様な効果を示す。これから、リガンド用量の関数としての応答で観察されるシフトは、AF−１とAF−２との間の修飾された相互作用の結果ではないと結論することができる。
リガンドの結合に対するI747/T突然変異の効果を測定するため、Dexの結合を突然変異体hGRおよび野生型hGRを一過性で発現するCos−７細胞のサイトゾルで測定した。I747/T突然変異体は、Dexに対してWT  GRの1/2程度の親和性しか示さないので、スキャッチャード分析から得られたKd値は、極めて類似している。従って、hGR（I747/T）の高濃度への用量−応答曲線のシフトの大きさの程度は、WT  hGRと比較すると（約100倍）、突然変異したhGRについてのリガンドに対する親和性の減少から生じるとは思われない（係数は２に過ぎない、第２図および第３図を参照）。
2.2  hGR（I747/T）は天然リガンドには応答しない。
I747/T突然変異体の結合特性を更に特性決定するため、WT  GRについての各種の既知の合成作動薬（トリアムシノロンアセトニド、RU28362、ビメドラゾール）、部分的作動薬（フルシノロンアセトニド）、および天然グルココルチコイド（コルチゾール、コルチコステロン）による活性化を比較した。突然変異体レセプターでは、トリアムシノロンアセトニドおよびRU28362は、野生型レセプターを用いたのと同一のトランス活性化を生じるが、ビメドラゾールおよびフルオシノロンアセトニドは一層高い活性を示した（第Ｉ表）。これら総ての類似体に対して、I747/T突然変異体は高リガンド濃度の方向での用量−応答曲線のシフトを示すが、このシフトは高親和性リガンドについては余り顕著ではない（第Ｉ表）。
コルチゾールまたはコルチコステロンのような天然リガンド、またはミネラルコルチコイドレセプターに対する天然リガンドであるまたはアルドステロンは、Dexより低い親和性でGRに結合する。野生型GRでは、これらのリガンドは、ルシフェラーゼリポーターの刺激についてのDexと同様に効果的である（第Ｉ表）。しかしながら、これらの天然リガンドの存在下において、およびDexで観察された効果とは極めて対照的に、I747/T突然変異体によるトランス活性化は著しく減少し（コルチゾール）または抑制される（コルチコステロン、アルドステロン）。
2.3  野生型hGRおよび突然変異体hGRを有するRU486の同様な作動薬および拮抗薬活性
RU486は、グルココルチコイドによって変化する遺伝子の発現の強力な阻害剤である。この拮抗薬の存在下では、GRのAF−２機能は遮断されるが、幾らかのAF−１に依存する作動薬活性を観察することは可能であった［（43）およびそれに含まれる文献］。LBDのＣ−末端部分の突然変異または欠失は作動薬／拮抗薬リガンドに対する応答を変化させることができるが、AF−１およびAF−２の役割は、報告された研究では明確に定義されてはいない（44〜46）。
I747/T突然変異体と野生型についてのRU486の相対的結合親和性を試験するため、RU486がDexと競合してレセプターに結合する能力を検討した。突然変異体またはWT  hGRでトランスフェクションした細胞を、Dexと複合体形成した突然変異体およびWTレセプターを本質的に生成するのに十分なイン・ビトロでのリガンド結合試験（上記参照）と一致した濃度である10nM［3H］−Dex、および増加濃度のRU486で処理した（第４図）。２このレセプターについて、極めて類似したIC50（最大トランス活性化の50％を遮断する拮抗薬濃度）値を得た（WT  hGRについては10-8M、および突然変異体hGRについては６×10-9M）。これらの結果は、Dexへの結合の試験と一致しており、DexおよびRU486への結合の親和性はI747/Tの突然変異によっては改変されないことを示している。
2.4  突然変異体レセプターの転写活性のシフトは、プロモーターから独立している。
上記の結果は、２個のグルココルチコイド応答要素（GRE）を有するTAT遺伝子のプロモーター断片を含むレセプター遺伝子を用いてトランスフェクションした細胞で得られた。レセプターの固有のトランス活性化特性の修飾と数個のレセプター分子の結合から生じる協同活性の修飾とを識別するため、突然変異体レセプターGR（I747/T）および野生型レセプターの転写活性を、パリンドローム的かつ完全な単一GREを含む合成プロモーターを用いて比較した。相当する用量−応答曲線は、TATプロモーターで得られたものと同じ形状を有する。最大応答の半分に相当する応答は、WT  GRについては10-10Mで得られ、GR（I747/T）については２×10-8Mで得られる（第II表）。これは、突然変異体レセプターで得られたシフトは突然変異体GR（I747/T）の固有のトランス活性化特性を反映しており、レセプター間の協同の変更の結果ではないことを示している。
GRのDNA結合ドメインを酵母Gal4トランス活性化因子の最初の147アミノ酸によって置換すると、新規なプロモーター特異性を有するハイブリッド活性化因子タンパク質を生じる。Gal4−GRハイブリッドは、WTまたは突然変異体hGRのLBDと融合したGal4のDNA結合ドメイン（DBD）（１〜147）からなっている。転写を活性化するためのそれらの能力を、HeLa細胞での一過性トランスフェクションで試験した。完全なGR（I747/T）突然変異体を用いたのと同じシフトを観察した（第II表）。これらの結果は、リガンド用量の関数としての転写応答におけるシフトは、プロモーターからも、応答要素（RE）からも独立していることを示している。更に、この効果は、ヒトHeLa細胞およびサルCos細胞の両方で観察されているように、用いた細胞の品種に特異的ではないことは明かである。リポーター遺伝子のtkまたはβ−グロブリンプロモーターに結合している因子の関与の可能性を更に排除するため（47）、最小プロモーターに先行するGal4応答要素を含むリポーター遺伝子を用いた。この最小リポーター遺伝子では、Gal4キメラタンパク質によるトランス活性化は減少したが、突然変異体キメラタンパク質Gal4−GR（I747/T）に対する増加用量への応答曲線のシフトを観察することが可能であった（第II表）。
2.5  デキサメタゾンに応答する突然変異体および野生型GRレセプターの転写活性（第２図）
CV−１細胞を、野生型GR（□）またはGR（I747/T）（○）の発現のためのベクター0.5μｇ、リポータープラスミドとしてのpTAT−tk−Luc2.5μｇ、および内部コントロールとしてのpCMV−βGal10.5μｇで一過性トランスフェクションを行なった。トランスフェクションの後、細胞を増加濃度のDexを用いて24時間インキュベーションした後、「材料および方法」に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ活性の分析を行なった。ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼ活性で規格化し、リガンドの非存在下で得られた値をそれぞれの点について差し引いた。結果を、それぞれのレセプターについて得られた最大ルシフェラーゼ活性の百分率として表した。それぞれの点は、２回ずつ行なった別個の測定値の平均の平均値＋標準偏差である。飽和時の結合の分析は、野生型hGR（□）またはhGR（I747/T）（●）の発現のためのベクター40μｇ、増加濃度の［3H］−デキサメタゾン±100倍過剰量の非放射性Dexの存在下で４℃で一晩インキュベーションしたpCMV−βGal  20μｇでトランスフェクションしたCos−７細胞から得たサイトゾル上で行なった。デキストランをコーティングした木炭で処理した後、結合した［3H］ステロイドを測定した。得られた結果は、２回ずつ測定した１回の分析についての結果と３回の別個の分析の代表値である。［3H］−デキサメタゾンの結合についての飽和曲線は、それぞれのレセプターについて得られた最大結合容量の百分率として表している。GR（I747/T）の結合容量は減少して、野生型hGRの結合容量の約40〜60％に達している（タンパク質623±65fmol/mg、タンパク質1340±285fmol/mgと比較）。
2.6  野生型およびI747/T突然変異体レセプターに対する［3H］−デキサメタゾンの結合のスキャッチャード分析（第３図）
スキャッチャード分析を、第２図に記載の方法で行なった結合に適用した。GR（I747/T）突然変異体（○）についての見掛けの解離定数は、野生型hGR（□）についての解離定数の２倍に過ぎない（Kd＝2.7±1.3nMと比較して5.1±1.9）。
0003618356.tif 000002
同時トランスフェクションを行ない、容量−応答曲線を第２図に記載の方法で構築した。６個のトリアムシノロンアセトニド（TA）、RU28362、フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン）、コルチゾール、コルチコステロンおよびアルドステロンの増加濃度を、２回ずつ試験した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の分析は、「材料および方法」に記載の方法で行なった。３個の独立した分析の平均値を、この表に示す。
2.8  RU486によるDex結合およびトランス活性化の競合（第４図）野生型hGR（□）またはI747T突然変異体（●）でトランスフェクションしたCos−７細胞を、「材料および方法」に記載の通りに、10nMの［3H］−デキサメタゾンのみとまたは所定濃度の非標識RU486の存在下で、37℃で１時間インキュベーションした。データは、競合を行なわなかったコントロールで観察された特異的結合の百分率として表している。これらのデータは、それぞれの拮抗薬濃度について２回ずつ行なった測定の平均値を表している。
拮抗薬活性は、第４図に記載した通りにトランスフェクションし、同時に10-7M  Dexで処理したCV−１細胞で測定し、24時間後に回収して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の分析を行なった。100％活性は、それぞれのレセプターについてDexのみで処理した細胞のルシフェラーゼ活性として定義される。それぞれの点は、２回ずつ行なった少なくとも２個の独立した試験の平均値を表す。（□）：野生型hGR、（○）:I747T突然変異体。
0003618356.tif 000003
HeLa細胞（Gal4キメラについて）またはCV−１細胞を、各種の発現ベクターおよびリポーター遺伝子で一過性に同時トランスフェクションした。トランスフェクション効率を、ベクターpCMV−βgal  0.5μｇで同時トランスフェクションすることによって標準化した。細胞を、増加濃度のデキサメタゾンで24時間処理した。「材料および方法」に記載の通りにルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ分析を行なった。ルシフェラーゼ活性は、それぞれのレセプターおよびそれぞれのリポーター遺伝子について得られた最大活性の百分率として表される。EC50値を、グラフから測定した。
2.10  概略
ヒトグルココルチコイドレセプターのイソロイシン747のトレオニンへの突然変異の結果、天然グルココルチコイドの存在下では、レセプターのトランス活性化活性が著しく減少し、または全くなくなるが、同様な濃度で合成グルココルチコイドは、この突然変異したレセプターのトランス活性化活性を効率的に刺激する。
hGR（I747/T）は、高濃度のDexに完全に応答し、これは、原則的には、その対応する野生型と同程度の効率でトランス活性化することができることを示していることを強調することが重要である。従って、AF−２自身の転写活性化機能は、AF−２のコア部分における突然変異を含んでなるレセプターについての場合と同様に、突然変異によって変化しないことは明かである（文献の導入部を参照）。
3.材料および方法
3.1.細胞培養およびトランスフェクション
CV−１およびCoS−７細胞を、５％CO2を含む加湿雰囲気中で、ウシ胎児血清（FCS）10％（v/v）を含むダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）（Gibco、グランド・アイランド、ニューヨーク）で培養した。HeLa細胞は、同じ条件下で培養した。既述のリン酸カルシウム法（42）により、一過性トランスフェクションを６−ウェルのマルチプレートで行なった。細菌性のβ−ガラクトシダーゼを発現する対照組換えプラスミドpCMV−βGalを、レセプター発現ベクターおよび相当するリポーター遺伝子と共同でトランスフェクションして、トランスフェクション効率における起こり得る変動を補正した。24時間後に、沈澱を洗浄によって除去し、細胞をFCSを含まないがホルモンを含むDMEMに保持した。更に24時間後、細胞を濯ぎを行ない、リーシス緩衝液［25mM  Tris−リン酸、pH7.8、8mM  MgCl2、１％  Triton X100、10％グリセロール（48）］0.3mlで15分間リーシスを行なった。相当するルシフェラーゼ活性を、小画分について、1mMルシフェリン0.1mlを注射した後LKBルミノメーターで発光ピークを評価することによって（積算時間15秒間）測定した。β−ガラクトシダーゼを、それぞれのトランスフェクションの効率を制御するため、Bocquel et al.によって改良された方法（49）によって測定した。
3.2  使用プラスミド
アミノ酸368〜777だけを発現したＮ−末端欠失GRs、ΔA/B−GRまたはΔA/B−GR5I747/T）は、HG8の相当する部位にそれぞれの連結した発現ベクターHG0またはpGR（I747/T）のPst I−PflM I消化の断片から得た（49）。プラスミドpGAL−GR（T.Lerougeから贈与）は、酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメイン（aa1〜147）とGRのホルモン結合ドメインとからなり、pGal−GR（I747/T）は、突然変異のpGal−GRへの挿入によって構築した。
リポーター遺伝子pTAT−tk−Lucは、D.Gagneによって提供され、下記のようにして構築した。すなわち、中間体プラスミドpTATを、最初にpKT531［T.Grande（50）の好意により提供された］から得た966bpのEcoR I−BamH IセグメントをベクターpUC19（Pharmacia）の相当する部位に挿入することによって得た。ホタルルシフェラーゼをコードする配列と単純ヘルペスウイルスから得られたチミジンキナーゼ（tk）最小プロモーターとを含む断片をpvit−tk−Luc（51）からのBamH I断片の形態で単離し、TATプロモーターの下流のpTATの相当する部位に挿入した。リポータープラスミドpGRE−tk−Lucは、tk最小プロモーターの上流に合成GRE（AGAACAcagTGTTCT）を含むpGRE−tk−CAT（52）のHind III−Bgl II消化の断片をpLucのHind III−Bgl II部位に連結することによって構築した。リポーター遺伝子（17M）６−βGlob−Lucは、以前に報告されている（54）。リポータープラスミド（17M）６−tata−Lucは、プラスミド（17M）６−tata−CAT（55）からXho I−BamH Iで消化し、（17M）６−tataを含む断片を単離することによって構築した。次に、この断片を、同じ制限酵素で消化したベクターpGL2（Promega）に挿入した。
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターpCMV−βGalは、強力な構成的サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下で、β−ガラクトシダーゼをコードする配列を含んでいる。
3.3  ホルモンへの結合の試験
pCMV−βGalおよび野生型hGRまたはI747/T突然変異体でトランスフェクションしたCos−７細胞を、トランスフェクションの48時間後にリン酸緩衝溶液（STP）中で、ゴムへらで掻取ることによって回収した。細胞を、氷冷STPで２回洗浄した。サイトゾルの調製のための総ての段階は、４℃で行なった。細胞を、結合緩衝液［20mM  Na−HEPES,pH7.3、20mMモリブデン酸ナトリウム、および5mM  EDTA（22）］の３倍容およびプロテアーゼ阻害剤［ロイコペプチン（leucopeptin）（５μg/ml）、アプロチニン（５μg/ml）、PMSF（40μg/ml）、およびペプスタチンＡ（５μg/ml）］に再懸濁し、それらを15分間氷上に置いた。次に、細胞を、ダウンス（Dounce）ガラスホモジナイザー中で30〜40回ピストンを往復運動させることによってリーシスを行なった後、生成したホモジネートを110,000gで30分間遠心分離した。サイトゾルと呼ばれる上清を用いて、直ちにホルモンへの結合の試験を行なった。タンパク質濃度を、Bio−Radタンパク質分析法（Bio−Rad Laboratories,Herecules、カリフォルニア、米国）によって測定した。ホルモンへの結合の試験のために、タンパク質１〜3mg/mlを含むサイトゾルを、非放射性化合物（10-5M、Sigma Chemical Co.,セント・ルイス、ミズーリ、米国）の100倍過剰量を含まない（総結合）または含む（非特異的結合）［3H］−Dex（49CI/ミリモル、Radiochemical Center,Amersham、英国）またはコルチゾール（67Ci/ミリモル、Radiochemical Center,Amersham、英国）と共に４℃で一晩インキュベーションした。次いで、試料を、デキストラン−木炭（５％木炭、0.5％デキストラン／結合溶液）１容で氷上で一定攪拌を行ないながら15分間処理した後、それらを12,000gで10分間遠心分離した。結合した［3H］リガンドを、上清の一部でシンチレーション計数法によって測定した。デキサメタゾンまたはコルチゾールについてのレセプターの平衡解離定数（Kd）は、スキャッチャード分析によって決定した。
競合的結合分析のため、サイトゾルを10nM［3H］−Dexおよび各種濃度の非放射性競合ステロイドと共に上記と同一条件下でインキュベーションした。デキストラン−木炭で処理し、シンチレーション計数の後、特異的結合を、競合を行なわなかったコントロールの百分率として表し、競合におけるステロイドの濃度の関数としてプロットした。全細胞での競合結合試験は、10nM［3H］−Dexおよび各種濃度の競合ステロイドと共に37℃で１時間インキュベーションした106細胞で行なった。KCl緩衝液（1.5mM  EDTA、20mM  Tris・HCl,pH7.4、0.5M  KCl）1ml中で超音波処理を行なった後、ゼラチン（0.05％デキストラン、0.5％木炭、0.1％ゼラチン）を含むKCl緩衝液中で、未結合ステロイドをデキストランをコーティングした木炭２容を加えて除去した。混合物を４℃で30分間インキュベーションし、3000gで５分間遠心分離した。放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、特異的結合を上記のように曲線上にプロットした。
実施例2:活性が合成グルココルチコイドによって誘導可能であるが、天然グルココルチコイドによっては誘導されないキメラCreリコンビナーゼ
1.材料および方法
1.1.ベクターpCre−LBD［GR（I747/T）］の構築
ヒトグルココルチコイドレセプターのリガンド結合ドメインをコードする配列を含む約1300塩基対（bp）のCla I−Xba I DNA断片を、プラスミドHG1（実施例１を参照（40））から単離して、その両端をT4ポリメラーゼによって充填した。この断片を突然変異処理し、野生型レセプター（56）の位置747のイソロイシンがコードするヌクレオチドATTをトレオニンをコードするヌクレオチドACCによって置換されるようにした。この突然変異断片を、Xho IおよびPst Iで消化してその両端を更にT4ポリメラーゼによって充填したベクターpCre−ER（28）にクローニングした［プラスミドpCre▲＋▼GR（I747/T）＋Ｆ、Creと同じ配向でhGR（I747/T）のLBDの配列をコードする］。pCre−LBD［GR（I747/T）］は、プラスミドpCre＋GR（I747/T）＋Ｆから、合成オリゴヌクレオチド
SG52（５′−CTGGAAGATGGCGATCTCGAGATTCAGCAGGCCACT−３′）
SG53（５′−CTGTTTCATCAAAAGGGTACCAGCCGTGGAGGGGCAT−３′）
を用いて調製した一本鎖DNA上で行なわれる部位指定突然変異誘発によって得て、一方では、Cre［アミノ酸（aa）１〜343（orf2（cre）、（31）］をコードするDNA配列とHG1の突然変異LBD［aa500〜777］を含む領域をコードするものとを融合させ、他方では、以前に修飾したDNA配列とヒトエストロゲンレセプター（ER）［aa553〜595（57）］のＦ領域をコードするものとを融合させることができる（第５図）。この操作により、pCre−ERのCre配列の末端に位置するXho I制限部位が修復され、GRをコードする配列とERのＦ領域との間にKpn I制限部位が導入される（第６表および第７表）。
1.2.RXRα遺伝子の突然変異
F9細胞で相同組換えによってRXRα遺伝子（58）を突然変異するのに用いたベクター（pRXRα(LNL)）を、下記の方法で構築した。
RXRαのエキソン２、３および４を含んでなる11.8kbのゲノム断片を含むλファージを、EMBL3λベクターにクローニングしたP19ネズミ胎児癌ゲノムDNAで調製したゲノムライブラリーから単離した。このファージから単離したSal I断片（両端をT4ポリメラーゼで充填したもの）を、ベクターpBluescript II SK＋（Stratagene）の誘導体のSamH I部位に（T4ポリメラーゼで処理した後）サブクローニングした。この誘導体では、Xho I部位は除去されている。Xho I部位を、下記の合成オリゴヌクレオチドをAcc I部位にクローニングすることによって、RXRαについてのcDNAのヌクレオチド535に相当するAcc I部位の水準でRXRαのエキソン４に導入した（RXRαについてのcDNA配列は、Genbank文献:M84817に示されている）。
５′−ATTATTATTACTCGAGTGATGATG−３′、および
５′−ATCATCATCATCCGAGTAATAATA−３′。
最後に、ベクターpHR56（28）から単離したloxP部位によって囲まれたネオマイシン耐性遺伝子の発現のためのカセットを含むXho I断片を、上記ベクターのXho I部位にクローニングした。
F9細胞でのRXRα遺伝子の対立遺伝子の突然変異は、ベクターpRXRα(LNL)（28）による相同組換えによって行なった。この細胞系を、RXRα＋／−（LNL）と呼んだ。
1.3.修飾断片RXRα(LNL)を含んでなるCre−LBD［GR（I747/T）］の発現
一過性トランスフェクション:PBS500μｌに再懸濁した５×106個のRXRα＋／−（LNL）細胞またはHeLa細胞を、200Vおよび960μＦに設定した電気穿孔装置（Bio−Rad遺伝子パルサー）によって、プラスミドpCre−LBD［GR（I747/T）］５μｇで電気穿孔した［場合によっては、HeLa細胞についてベクターpRXRα(LNL)5μｇで同時トランスフェクションした］。次に、細胞を、106個の細胞/100mm皿でインキュベーションし、必要ならば、リガンドで処理した。
安定なトランスフェクション:PBS500μｌに再懸濁した５×106個のRXRα＋／−（LNL）細胞を、200Vおよび960μＦに設定した電気穿孔装置（Bio−Rad遺伝子パルサー）によって、それぞれのSal IおよびPvu IIで消化したCre−LBD［GR（I747/T）］５μｇおよびpPGK−Hyg  １μｇで電気穿孔した。耐性クローンは、Metzger et al.（28）によって記載された手続きに従って得た。
1.4.RXRαのエキソン４に配置されたゲノムDNA領域の「PCR」増幅
DNA増幅は、Chen and Evans（60）によって記載されたプロトコールに従って「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）法を用いて行なった。用いたプライマーは、それぞれのヌクレオチド配列として５′−GGCAAACACTATGG−３′、および５′−TTGCGTACTGTCCTCTT−３′を有するSB211およびPZ105である。94℃で８分間変性した後、Taqポリメラーゼ2.5単位を加える。増幅は、35サイクル（94℃で30秒、50℃で30秒）の後に１サイクル（94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で５秒）行ない、その生成物を４℃で保管する。
反応の生成物を、ポリアクリルアミド（10％）またはアガロース（2.5％）ゲル上で分離した。DNAを、UVの後、臭化エチジウム染色またはサザンブロット法によって検出した。
1.5.LoxP部位の間に位置する配置の切出しの試験
pCre−LBD［GR（I747/T）］またはコルチゾール（10-6M）またはデキサメタゾン（10-6M）で処理しなかったまたは72時間処理した親ベクターpSG5でトランスフェクションしたRXRα＋／−（LNL）細胞のDNAに、第８図で記載した方法に従ってPCR反応を施した。反応の生成物をアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。第９図のレーンＭは、Hinf Iで消化したpBR322サイズマーカーの装填に相当する。野生型および組換え対立遺伝子の位置が示されている。
1.6.キメラタンパク質を構成的に発現するRXRα＋／−（LNL）細胞系におけるCre−LBD「GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性のPCR分析
第10図について、コルチゾール（10-6M）またはデキサメタゾン（10-6M）で処理しなかったまたは処理したRXRα＋／−（LNL）:Cre−GR（I747/T）細胞から調製したDNAは、第８図に記載の手続きに従ってPCR増幅を行なうための鋳型として用いた。増幅したDNAをアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。レーン１、２、３および４は、それぞれ野生型（WT）F9細胞、RXRα＋／−（LNL）、RXRα＋／−（Ｌ）細胞、およびC2RXRα−（Ｌ）／−（Ｌ）細胞（73）から抽出したDNAで生成したPCR生成物を含んでいる。レーン８は、サイズマーカー（1kbラダー（ladder）、GibcoBRL）を含む。
第11図において、10-9〜10-6Mの範囲の濃度のアルドステロン、コルチコゾール、コルチステロン、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニドまたはRU486で処理しなかったまたは処理したRXRα＋／−（LNL）:Cre−GR（I747/T）細胞から調製したDNAは、第８図に記載の手続きに従ってPCR増幅を行なうための鋳型として用いた。増幅したDNAをアガロースゲル上で分離し、サザン法に従って分析した。野生型および組換え対立遺伝子に相当する増幅した断片を、５′末端でT4ポリヌクレオチドキナーゼで放射性標識した合成オリゴヌクレオチド（５′−AAGAAGCCCTTGCAGCCCTC−３′）によるハイブリダイゼーションによって検出した。シグナルを、「ホスホイメージャー（phosphoimager）」（Fujix bas2000）によって視覚化して、定量した。
第12図において、RXRα＋／−（LNL）:Cre−GR（I747/T）細胞を、３種類の天然リガンド（アルドステロン、コルチゾールおよびコルチコステロン）を10-9Mまたは10-8Mの濃度で、およびデキサメタゾン（10-7または10-6M）を上記のようにして加えた培地で72時間培養した。組換え対立遺伝子を、第８図に記載の手続きに従って検出した。増幅したDNAをアガロースゲル上で分離し、サザン法に従って分析した。組換え対立遺伝子に相当する増幅した断片を、５′末端でT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン32で放射性標識した合成オリゴヌクレオチド（loxP部位を含む）
５′−AATTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTC−３′
でハイブリダイゼーションした後、オートラジオグラフィによって検出した。
第13図については、HeLa細胞を、プラスミドpRXRα(LNL)およびpCre−LBD［GR（I747/T）］を用いて同時トランスフェクションした後、適当なリガンドを10-7Mの濃度で添加してまたは添加することなく、72時間培養した。次に、これらの細胞のDNAに、記載した方法に従ってPCR増幅を施した。反応の生成物を、アクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。レーン１は、1kbラダーサイズマーカー（GibcoBRL）の装填に相当する。
2.結果
Creリコンビナーゼであって、その活性がグルココルチコイドレセプターについての合成リガンドによって誘導することができるが、「生理学的」濃度の天然グルココルチコイドリガンドによっては誘導されないものを発現するため、ベクターpCre−ER（28）から、エストロゲンレセプター（ER）のLBDを含むアミノ酸344〜618をコードするDNA配列をGR（I747/T）の突然変異結合ドメイン（LBD）を含む突然変異グルココルチコイドレセプター（GR）のアミノ酸500〜777をコードするDNA配列によって置換することによって誘導した発現ベクターpCre−LBD［GR（I747/T）］を構築した。このプラスミドの構築によって、Cre−LBD［GR（I747/T）］の位置624〜625にaaGly−Thrをコードする配列GGTACCが挿入された（第７図）。
Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性を、ネズミ細胞系RXRα＋／−（LNL）で試験した。この細胞系は、loxP部位（ダイレクトリピートとして）（LNL）によって限界設定したTK−neo遺伝子を相同組換えによってRXRα遺伝子（28）の対立遺伝子のエキソン４に組み込むことによって得た。TK−neo遺伝子は、チミジンキナーゼ／ネオマイシン耐性遺伝子融合タンパク質を発現させるキメラ遺伝子である。この細胞系のベクターpCre−LBD［GR（I747/T）］を用いる電気穿孔によって、リガンドの添加なしに、またはコルチゾール（天然リガンド）またはデキサメタゾンを添加した後に、そのリコンビナーゼ活性を評価することができた（第９図）（Dex:合成リガンド）。このようにして処理した細胞のDNAに、実際にエキソン４の一つはAcc I部位の上流に、他方はこの部位の下流に配置された合成オリゴヌクレオチドでPCRを施した。この対のオリゴヌクレオチドで得たPCR断片のサイズは、野生型対立遺伝子については65bpであり、突然変異した対立遺伝子（LNLの組み込みの後）については3345bpであり、組換え対立遺伝子（２個のlox部位の間に位置した配列およびこれらのlox部位の一方の切出しの後、第８図を参照）については191bpである。デキサメタゾン（10-6M）でトランスフェクションした細胞を処理した後、191bpの断片が観察され、組換え対立遺伝子に相当する配列の存在を反映しているが、処理なしまたはコルチゾール（10-6M）で処理した後には、このサイズの断片は観察されない。従って、これらの結果は、検討を行なった融合タンパク質のリコンビナーゼ活性は、このタンパク質を発現する細胞をデキサメタゾンのような合成GRリガンドで処理することによって誘導することができるが、コルチゾールのような天然リガンドを10-6Mの濃度で処理することによっては誘導されないことを示している。
Cre−LBD［GR（I747/T）］を構成的に発現するRXRα＋／−（LNL）細胞系も、ヒグロマイシン耐性遺伝子を発現するベクターを用いてCre−LBD［GR（I747/T）］遺伝子の発現のためのカセットを同時組み込みを行なうことによって確立した（RXRα＋／−（LNL）:Cre−LBD［GR（I747/T）；「材料および方法」を参照されたい；データは示されていない）。リコンビナーゼ活性を、これらの細胞をDex（10-6M）で72時間処理した後に試験した。これらの細胞のDNA上で行なったPCRの生成物の分析の結果、191bpの断片は、Dexで処理した後には組換え対立遺伝子だけに相当することが示される（第10図）。
従って、Cre−LBD［GR（I747/T）］は、その発現カセットがゲノムに組み込まれる場合には、リガンドを添加しなければ、または10-6Mのコルチゾールの存在下では不活性であるが、Dexの存在下では活性であることが示されている。
リコンビナーゼ作用の速度論も評価した。すなわち、その活性は10-6Mのデキサメタゾンで処理した12時間後から検出可能であるが、これは処理の72時間後にはかなり強くなる（結果は示さず）。
Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性も、各種の濃度のリガンドを添加した後に試験した。アルドステロン、コルチゾールまたはコルチコステロン（リガンド濃度範囲10-9〜10-6M）で処理したRXRα＋／−（LNL）:Cre−GR（I747/T）細胞では観察されなかったが、dex、トリアムコシノロンアセトニドまたはRU486の存在下では、リコンビナーゼ活性は10−9Mから観察される（第11図）。
この細胞系により、Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性は、これらの細胞を10-9または10-8Mの天然リガンド（アルドステロン、コルチゾールおよびコルチコステロン）の存在下で培養するときにでも、合成リガンドによって誘導することができることも示される。loxP部位の間に位置した配列の切出しは、10-7または10-6Mのデキサメタゾンで72時間処理した後に得られた（第12図）。
最後に、Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性を、ヒト細胞で試験した。すなわち、HeLa細胞をベクターpCre−LBD［GR（I747/T）］およびpRXRα＋／−（LNL）を用いて一過性の同時トランスフェクションを行なった後、リガンドを添加することなく、または第13図に示したリガンドの存在下で培養を行なった。F9細胞におけるのと同時に、組換え断片に相当する191bpのバンドを、合成リガンド（デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニドまたはRU486、10-7M）で処理した細胞から単離したDNAから増幅し、リガンドを添加せずにまたは同濃度でのアルドステロン、コルチコステロンまたはコルチゾールのような天然リガンドの存在下では、野生型対立遺伝子に相当する断片だけを検出することができる。
従って、これらの結果は、融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性は、グルココルチコイドレセプターに対する合成リガンドによって誘導されるが、これは、コルチゾール、コルチコステロンまたはアルドステロンのような天然リガンドには10-6M程度の濃度でも不感受性であることを示している。更に、天然リガンドが含まれていても、合成リガンドによるCre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性の誘導は防止されない。
実施例3:マウスにおけるキメラCreリコンビナーゼの活性の誘導
1.材料および方法
1.1.プラスミドの構築およびトランスジェニックマウスの確立
ベクターpCMVCre−LBD［GR（I747/T）］を、pCre−LBD［GR（I747/T）］から単離した2kbのEcoR I断片をpMGSV1のEcoR I部位にクローニングすることによって構築した。pCMVCre−LBD［GR（I747/T）］から単離した4.64kbのPvu II断片を、4ng/μｌの濃度でF1接合子（C57BL/6  XSJL）に注射して、常法によるトランスジェニックマウスを産生させた（61）。
1.2.PCR条件
PCR増幅は、10mM  Tris−HCl（pH＝8.8）、50mM  KCl、1.5mM  MgCl2、0.2mM  dNTPs、0.25μＭのそれぞれのプライマー、２単位のTaqポリメラーゼ、および１μｇのゲノムDNAを鋳型として含む緩衝液中で行なった。30サイクル（94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分）、次いで１サイクル（90℃で30秒、55℃で30秒、72℃で５分）の後、増幅生成物を、臭化エチジウム上で染色した2.2％アガロースゲル上で分離した。
1.3.マウスの遺伝子型の分析
導入遺伝子Cre−LBD［GR（I747/T）］および野生型対立遺伝子および切出されたRXRαΔAF2（LNL）を、PCRによって検出した。導入遺伝子Cre−LBD［GR（I747/T）］の検出は、ヌクレオチドプライマー５′−ATCCGAAAAGAAAACGTTGA−３′および５′−ATCCAGGTTACGGATATAGT−３′を用いて行ない、RXRα遺伝子の対立遺伝子の検出は、プライマー５′−GGTTCTCCGGCCGCTTGGGT−３′および５′−GAAGGCGATGCGCTGCGAAT−３′を用いて行なった。同様にして、loxP部位によって限界設定されたtk−neoマーカーの切出しは、プライマーＡ（５′−CAAGGAGCCTCCTTTCTCTA−３′）およびＢ（５′−CCTGCTCTACCTGGTGACTT−３′）を用いてPCRによって行なった。これらのプライマーは、野生型対立遺伝子からの156塩基対のDNA断片および切出された対立遺伝子RXRαΔAF2（Ｌ）からの190塩基対の断片を増幅する。
2.結果
Cre−LBD［GR（I747/T）］のリコンビナーゼ活性も、マウスで試験した。このようにして、ヒトサイトメガロウイルス「major IE」遺伝子のプロモーターの制御下で融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］を発現するトランスジェニックマウスを確立した。導入遺伝子の構造を、第14a図に表す。これは、ヒトサイトメガロウイルス「major IE」遺伝子の活性化／プロモーター配列、ウサギβ−グロブリン遺伝子のイントロン、Cre−LBD［GR（I747/T）］のコード配列、およびネズミウイルスSV40ポリアデニル化シグナルを含んでいる。転写の開始部位を、矢印で示す。次に、これらのマウスを「リポーター」マウスと交配して、そこに誘導したリコンビナーゼ活性の存在を示すようにした。この「リポーター」系は、その２個の対立遺伝子［RXRαΔAF2（LNL）］の一方に、RXRα遺伝子のエキソン８および９の間に位置したイントロンに、loxPブイによって限界設定されたtk−neo選択性マーカーの挿入を含む。tkneoマーカーの組換えの後、loxP部位は所定場所に止まり、切出された対立遺伝子RXRαΔAF2（Ｌ）を構築する。野生型RXRα対立遺伝子および切出された対立遺伝子は、適当なプライマー対ＡおよびＢを用いて、PCR増幅によって同時に検出することができる。第14b図は、ＡおよびＢプライマー並びにある種の制限部位を示すことによってこのPCR法を模式的に表している。
Cre−LBD［GR（I747/T）］マウスと、上記の「リポーター」マウスとから誘導され、導入遺伝子Cre−LBD［GR（I747/T）］と対立遺伝子RXRαΔAF2（LNL）とを両方とも含む子孫を、尾の生験からそれらの遺伝子型を確立することによって同定した。４週令のこれらのマウスの一匹に、デキサメタゾン0.3mgを植物油100μｌで希釈したものを腹腔内に毎日５日間注射した。尾の生験は、最初に注射を行なう前日並びに５界面活性剤の注射の翌日に行なった。これらの試料から単離したDNAを、オリゴヌクレオチドＡおよびＢを用いてPCRによって分析し（第15図、レーン２および３）、この処理によってtk−neoマーカーの欠失を誘導するかどうかを測定した。レーン１は、DNAなしで行なったコントロール反応に相当する。野生型RXRα対立遺伝子および切出された対立遺伝子RXRαΔAF2（Ｌ）を用いて増幅したPCR生成物の位置を示す。サイズマーカー（レーン４）は、1kbのラダー（GibcoBRL）に相当する。断片のサイズを、塩基対として示す。第15図によれば、誘導された切出しは、実際には、デキサメタゾンで試験したマウスの処理の後に起きた。実際に、処理前に尾から増幅したDNA断片の分析では、野生型RXRα対立遺伝子の存在だけを示し、処理後の同一マウスの尾の分析では、切出された対立遺伝子RXRαΔAF2（LNL）の存在を示している（第15図）。従って、キメラリコンビナーゼCre−LBD［GR（I747/T）］は、内因性リガンドの存在下では基本的な構成的活性を示さないものと思われる。しかしながら、これは、デキサメタゾンで処理すると、マウスで誘導され、活性である。
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配列表
配列番号１
配列の長さ:2334塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:GR（I747/T）（747位が突然変異されたヒトグルココルチコイドレセプター）
存在位置:1..2331
配列の長さ:777アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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0003618356.tif 000013
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配列番号:2
配列の長さ:2004塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CRE−LBD（GR（I747/T）（747位が突然変異されたヒトグルココルチコイドレセプターのLBD領域およびCreリコンビナーゼタンパク質の融合タンパク質）
存在位置:1..2001
配列の長さ:667アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号:3
配列の長さ:6094塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：環状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:pCRE−LBD［GR（I747/T］（融合タンパク質Cre−LBD［GR（I747/T）］発現用プラスミド）
存在位置:1..6091
配列
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0003618356.tif 000026
0003618356.tif 000027
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配列番号:4
配列の長さ:36塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:SG52
配列
0003618356.tif 000030
配列番号:5
配列の長さ:37塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:SG53
配列
0003618356.tif 000031
配列番号:6
配列の長さ:24塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：合成オリゴヌクレオチド
配列
0003618356.tif 000032
配列番号:7
配列の長さ:24塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：合成オリゴヌクレオチド
配列
0003618356.tif 000033
配列番号:8
配列の長さ:14塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:SB211
配列
0003618356.tif 000034
配列番号:9
配列の長さ:17塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:PZ105
配列
0003618356.tif 000035
配列番号:10
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：合成オリゴヌクレオチド
配列
0003618356.tif 000036
配列番号:11
配列の長さ:40塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成オリゴヌクレオチド
配列の特徴
特徴を表す記号:SG52
配列
0003618356.tif 000037
配列番号:12
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:primer
配列
0003618356.tif 000038
配列番号:13
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:primer
配列
0003618356.tif 000039
配列番号:14
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:primer
配列
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配列番号:15
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:primer
配列
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配列番号:16
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：プライマーＡ
配列
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配列番号:17
配列の長さ:20塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：プライマーＢ
配列
0003618356.tif 000043
【図１２】
0003618356.tif 000044
【図１】
0003618356.tif 000045
【図２】
0003618356.tif 000046
【図３】
0003618356.tif 000047
【図４】
0003618356.tif 000048
【図５】
0003618356.tif 000049
【図６】
0003618356.tif 000050
【図７Ａ】
0003618356.tif 000051
【図７Ｂ】
0003618356.tif 000052
【図７Ｃ】
0003618356.tif 000053
【図７Ｄ】
0003618356.tif 000054
【図８】
0003618356.tif 000055
【図９】
0003618356.tif 000056
【図１０】
0003618356.tif 000057
【図１１】
0003618356.tif 000058
【図１３】
0003618356.tif 000059
【図１４】
0003618356.tif 000060
【図１５】
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