(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の肝細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られるインビトロ哺乳類不死化肝細胞および哺乳類の星状細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られるインビトロ哺乳類不死化星状細胞からなるインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項２】
哺乳類がヒトである請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項３】
ヒトが成人である請求項２記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項４】
細胞増殖因子遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子である請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項５】
細胞増殖因子遺伝子がレトロウイルスベクターを用いて導入される請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項６】
一対の部位特異的組換え配列がＬｏｘＰ配列である請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項７】
一対の部位特異的組換え配列の間にＧＦＰ遺伝子が存在する請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項８】
無血清培地で増殖される請求項１記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項９】
ヒト不死化肝細胞株TTNT-1（寄託番号FERM BP-7498）およびヒト不死化星状細胞株TWNT-1（寄託番号FERM BP-7843）からなるインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞。
【請求項１０】
請求項１または９記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞を含有する、人工肝臓を製造するための材料。 
【請求項１１】
請求項１または９記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞からなる薬物代謝検定モデル。
【請求項１２】
請求項１または９記載のインビトロ哺乳類不死化肝臓細胞からなるヒト肝炎ウイルスの感染モデル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、哺乳類の不死化肝臓細胞に関する。さらに詳細には、本発明は、遺伝子工学的手法を用いて得られる哺乳類の不死化肝臓細胞に関する。
【０００２】
［本発明の背景］
肝移植は、代謝性肝疾患や肝不全の患者に利用できる唯一の治療法である。しかしながら、その治療は、ドナー肝の不足、手術リスクに伴う無視できぬ術後死亡率、高費用、および長期に及ぶ免疫抑制剤の使用などの問題を抱えている。近年、分離肝臓細胞の移植や生きた肝臓細胞を使用したバイオ人工肝臓が、肝移植または肝臓再生までのつなぎとして期待されている。分離肝臓細胞移植やバイオ人工肝臓の利点としては、肝移植手術に比べ経済的であること、リスクが少ない点などが挙げられる。しかしながら、分離肝臓細胞の移植やバイオ人工肝臓においても、やはりドナー肝の不足のため、臨床使用が制限されている。
【０００３】
分離肝臓細胞の代用として、インビトロで大量に増殖でき、分離肝臓細胞の性質を保持し、さらに移植後に代謝補助を提供できる肝臓細胞株が含まれる。大量増殖可能でかつ高度な肝機能を有する肝臓細胞株の樹立および細胞株バンクの発達は、必要時に必要量の肝臓細胞の移植を可能としドナー肝の不足を解消し得るものと期待されている。
【０００４】
癌遺伝子を導入する細胞の不死化により、適度な分化機能を保持した細胞株を産出できることが知られている（ケイ  エイ  ウェスタマン（Ｋ． Ａ． Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．第９３巻、８９７１頁、１９９６年）。しかしながら、不死化細胞株を、生体内に注入することにより、またはバイオ人工肝臓などの体外循環補助装置に使用することにより、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性がある。異種動物の細胞や非適合の同種のヒトの細胞を用いたとしても移植細胞が最終的に拒絶される保証はない。異種動物細胞との安定なキメラ状態やＨＬＡ非適合の同種腫瘍の偶発的な生着がヒトにおいて報告されている（ガートナー（Ｇａｒｔｎｅｒ）ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３３５巻、１４９４頁、１９９６年；ケイ  パラディス（Ｋ． Ｐａｒａｄｉｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８５巻、１２３６頁、１９９９年）。したがって、安全性の高い肝臓細胞を容易にかつ大量に入手できることが望まれている。
【０００５】
しかしながら、従来の培養技術では、安全性の高い肝臓細胞を大量に増殖させることは困難であった。
【０００６】
本発明の目的は、前記のような点に鑑みて、最終的に多数の安全性の高い肝臓細胞が得られるように特に設計された、無限に増殖可能な哺乳類の不死化肝臓細胞を提供することにある。
【０００７】
［発明の開示］
本発明者らは、前記問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、細胞増殖因子（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入することにより、大量増殖が可能な哺乳類の不死化肝臓細胞（または不死化肝臓細胞株）を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、インビトロにて、哺乳類の肝臓細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られる不死化肝臓細胞を提供する。
【０００９】
前記不死化肝臓細胞において、哺乳類の肝臓細胞がヒトの肝臓細胞であることが好ましく、さらに該ヒトの肝臓細胞がヒトの成人の肝臓細胞であることが好ましい。
【００１０】
前記不死化肝臓細胞において、細胞増殖因子遺伝子がｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子であることが好ましく、さらに該細胞増殖因子遺伝子がレトロウイルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
【００１１】
また、前記不死化肝臓細胞において、一対の部位特異的組換え配列がＬｏｘＰ配列であることが好ましく、また、一対の部位特異的組換え配列の間にさらにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子がコードされていることが好ましい。
【００１２】
また、前記不死化肝臓細胞が無血清培地で培養されることが好ましい。
【００１３】
さらに、本発明は、前記インビトロ不死化肝臓細胞を含有する人工肝臓を提供する。
【００１４】
本発明は、前記インビトロ不死化肝臓細胞を含有する肝疾患治療剤を提供する。
【００１５】
本発明は、前記インビトロ不死化肝臓細胞を含有する薬物代謝検定モデル、および肝炎ウイルスの感染モデルを提供する。
【００１６】
そのうえ、本発明は、哺乳類の肝臓細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られるインビトロ不死化肝臓細胞であって、凝固因子を産生するインビトロ不死化肝臓細胞を提供する。
【００１７】
本発明はまた、哺乳類の肝臓細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られるインビトロ不死化肝臓細胞であって、アルブミンを産生するインビトロ不死化肝臓細胞を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、薬剤誘導性プロモーターの下流に部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列が染色体に組み込まれた前記インビトロ不死化肝臓細胞を提供する。
【００１９】
［発明を実施するための最良の形態］
本発明で用いられる哺乳類の肝臓細胞としては、たとえば豚、猿、類人猿、ヒトの肝臓細胞などである。その中でもヒトの肝臓細胞が好ましく、ヒトの成人肝臓細胞が最も好ましい。ヒトの胎児肝臓細胞もまた応用可能である。本明細書に記載される用語「肝臓細胞」とは、たとえば肝機能の指標であるアルブミンや様々な血液凝固因子などのタンパク質の産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解毒および浄化能、ならびに、アミノ酸、糖質、および脂質代謝能を有する細胞を意味する。具体的には、肝細胞、肝類洞内皮細胞、肝星状細胞、肝ピット細胞およびクッパー細胞などがあげられる。
【００２０】
本発明に使用される細胞増殖因子遺伝子は正常細胞から提供され、導入されることにより哺乳類の肝臓細胞を不死化できるものである。該細胞増殖因子遺伝子の産物は、正常細胞の細胞増殖およびシグナル伝達に基本的に関与するものである。その具体例としては、増殖因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキナーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと結合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナーゼ活性を有するもの、核内に存在しＤＮＡに結合能を有するものが含まれる。該細胞増殖因子遺伝子としては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子などがある。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球において自然と発現増強しているため、ｈＴＥＲＴ遺伝子が好ましい。
【００２１】
本発明において、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入するためにレトロウイルスベクターが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞に対する外来遺伝子導入手段として利用され、導入された遺伝子は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるために遺伝子は確実に嬢細胞に受け継がれ、組み込まれた遺伝子は長期の安定した発現が可能である。
【００２２】
レトロウイルスベクターの導入方法としては、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、門脈内投与および直接穿刺による投与、インビトロでは培養細胞へのレトロウイルスベクターの直接播種による方法などが知られている。門脈内投与および直接穿刺による投与ならびに培養細胞への直接播種による方法が好ましい。
【００２３】
レトロウイルスベクターを培養細胞に直接播種することによって培養細胞にレトロウイルスベクターを導入する方法としては、本発明の目的を達成するものであればどのような方法でも用いることができる。たとえば、レトロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清を、別途培養中の肝臓細胞に播種することにより導入を達成することもできる。各細胞の培養条件および播種濃度など種々の条件は、当該技術分野で周知の方法で決定することができる。
【００２４】
また、培養細胞への播種回数は、細胞への影響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらのことから、本発明では、４時間感染を１日に２回、計３日間実施することが最も好ましい。
【００２５】
さらに本発明で用いられる細胞増殖因子遺伝子は、肝臓細胞に導入されたプロウイルスからのちに該遺伝子を切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配列に挟まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であり、この配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結合が起こる。
【００２６】
部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列およびＦＲＴ配列などがある。それらの中でも、ＬｏｘＰ配列が好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素により相同組換えを単独に行うための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４塩基から成る配列である。同一のＤＮＡ分子上に同方向の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列が切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。異なるＤＮＡ分子上にそれぞれ一対のＬｏｘＰ配列が存在し、ＤＮＡ分子のそれぞれおよびその一方が環状ＤＮＡである場合はＬｏｘＰ配列を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される（挿入反応）。
【００２７】
さらに本発明において、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝細胞に導入する際には、常に同時にＧＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位特異的組換え配列間に存在する必要がある。「一対の部位特異的組換え配列間」とは、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた位置を意味する。該ＧＦＰ遺伝子は、レトロウイルスベクターが感染し、プロウイルスがゲノムに組み込まれた肝臓細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）にて選択的に同定するために用いられる。よって、プロウイルスがゲノムに組み込まれた肝臓細胞が同定されれば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子を用いてもよい。
【００２８】
該薬剤耐性遺伝子の例としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、とくにそれらに限定されない。
【００２９】
本明細書に記載される「不死化肝臓細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常肝臓細胞に近い形態を呈し、肝特異的機能を比較的保持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴を有する細胞を意味する。
【００３０】
該不死化細胞の培養は、増殖速度が速いことが好ましい。しかし、容器の取り扱いが容易であるという点から、コラーゲンなどによる培養容器表面の特別なコーティングを必要としないことがさらに好ましい。該不死化細胞の倍化時間は２４〜７２時間であり、好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４〜３６時間である。培養培地としては、人畜共通感染症を回避するために、ウシなどの動物由来の血清が添加されていない無血清培地が好ましい。不死化細胞が機能的にもアルブミンの産生量を増加させることから無血清培地が好ましい。ＣＳ−Ｃ培地がより好ましく、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２ないし３倍に希釈されたＣＳ−Ｃ培地を用いてもよい。
【００３１】
本発明の不死化細胞は、導入された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え酵素により除去できる可逆的な不死化細胞である。部位特異的組換え酵素は、部位特異的組換え配列を特異的に認識し、切断、結合からなる相同組換えを単独で行う酵素である。部位特異的組換え酵素としては、Ｃｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素などがある。それらの中でも、Ｃｒｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換え酵素はＬｏｘＰ配列を特異的に認識する酵素である。
【００３２】
部位特異的組換え酵素は、アデノウイルスおよびプラスミドベクターなどの発現ベクターによってコードされることができる。あるいは、部位特異的組換え酵素は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型由来のＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ｐ． Ｍ．， Ｃｅｌｌ ５５， ｐ１７９−１１８８， １９８８： Ｆｒａｎｋｅｌ， Ａ． Ｄ． ａｎｄ Ｐａｂｏ， Ｃ． Ｏ．， Ｃｅｌｌ ５５， ｐ１１８９−１１９３， １９８８： Ｎａｇａｈａｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １９８８， ４， １４４９−１４５２）に融合されてもよい。ＴＡＴタンパク質はタンパク質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｕｄａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を有しているため、融合タンパク質を培養培地に添加することにより、本発明の不死化細胞内で部位特異的組換え反応が起こる。アデノウイルスは細胞傷害性である。そのようなリスクを回避するための目的において、部位特異的組換え酵素はアデノウイルスベクター以外の発現ベクターにコードされるか、またはＴＡＴタンパク質に融合されることが好ましい。
【００３３】
本発明で用いられる発現ベクターは、部位特異的組換え酵素をコードする配列を含有するものである限り、とくに限定されない。部位特異的組換え酵素に対するプロモーターとしては、薬剤誘導性プロモーターが好ましい。本明細書において「薬剤誘導性プロモーター」は、薬剤を添加することにより遺伝子発現を誘導するプロモーターを意味する。薬剤誘導性プロモーターと部位特異的組換え酵素の両方を含有する発現ベクターが染色体に組み込まれた不死化肝臓細胞株を樹立すれば、ウイルスの感染効率を考慮する必要がない。そのような細胞株を用いた場合、部位特異的組換え酵素の発現時期は任意に設定できる。
【００３４】
前記薬剤誘導性プロモーターはとくに限定されるものではなく、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびタモキシフェン誘導性プロモーターなど、公知のプロモーターを使用することができる。これらの薬剤誘導性プロモーターは、当業者により適宜選択され得る。
【００３５】
したがって、本発明の不死化細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子配列に加え、薬剤誘導性プロモーターの下流に部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列が染色体に組み込まれた不死化細胞であることが好ましい。
【００３６】
本発明の不死化肝臓細胞は、ヒトの肝臓の薬物代謝検定モデルとして利用可能である。環境汚染または薬剤使用時に人体への影響が問題となる毒性物質および発癌性物質の代謝経路は、ヒトと動物では異なる。これまで、薬剤を含む化学物質の毒性および発癌性ならびに体内での代謝経路の検定はラット、イヌまたはブタなどの実験動物を用いて検討されてきた。しかしながら、ヒトと実験動物との化学物質の代謝経路の違いは明らかであるので、動物実験でのデータをヒトに当てはめるには慎重でなけらばならない。また、近年の動物愛護の立場より、できるだけ動物を用いた研究は控え、ヒトの病態変化はヒトで研究されるという研究手段の開発が重要な課題となっている。本発明の不死化肝臓細胞は、高度に肝機能を発現しており、実験動物の代わりでなくよりヒト肝機能に近づいた新しい薬物代謝検定モデルとして大きな意義を有する。具体的には、１）肝臓での薬物の代謝系の解析、２）薬物の相互作用の検討、３）肝臓における薬物からの変異原性物質産生の検定などに利用される。
【００３７】
また、本発明の不死化肝臓細胞は創薬にも利用できる。ヒト由来不死化肝臓細胞株の大量培養により、生理活性物質の大量産生が可能となる。これらの産生物は、遺伝子操作による酵母、大腸菌、またはクローン動物により産生される生理活性物質より除去しにくい夾雑物をあまり含まず、容易に単離される。創薬の応用例としては、各種の血液凝固因子、アルブミンなどの産生を含む。
【００３８】
さらに、本発明の不死化肝臓細胞はヒト肝炎ウイルスの感染モデルとしても利用できる。ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の全容はいずれも明らかに成りつつあるが、未だにウイルス本体は確認されていない。これは、インビトロの培養系が未だに確立されていないためであり、たとえばウイルスの複製、粒子形成、変異といった生物学及び発癌機構の解明などの基礎的研究の大きな障害となっている。本発明の不死化肝臓細胞を用いてＨＢＶおよびＨＣＶの感染実験系を確立し、ついで感染の機構および予防ならびに治療の方策をたてる基礎実験の系を確立することも可能である。
【００３９】
本発明の肝疾患用の治療剤は、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入して得られる肝臓細胞を含有する。肝疾患用の治療剤は、他に肝臓細胞を保護するために、電解質、アミノ酸および糖質を含んでもよい。本発明における「肝疾患」としては、たとえばウイルス、薬剤、そして中毒（キノコ等）による急性肝不全などの肝不全、血友病、α１−抗トリプシン欠損症、ガラクトース血症、肝腎性チロシン血症、カエデシロップ尿症、糖原病１ａ型、肝性ポルフィリン症、低ベータリポ蛋白血症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症１型、クリグラー−ナジャー症候群１型、高フェニルアラニン血症などの代謝性肝疾患、慢性肝疾患の急性増悪などが含まれる。本発明の治療剤は、肝不全および代謝性肝疾患の治療に用いられることが好ましい。
【００４０】
本発明の治療剤の投与経路としては、門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続点滴投与または腹腔内移植が好ましく、門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続点滴投与がさらに好ましく、門脈内持続点滴投与がもっとも好ましい。治療剤の投与量は少なくとも１×１０１０細胞であり、１．５×１０１０細胞が好ましく、２．０×１０１０細胞がさらに好ましい。
【００４１】
本発明の人工肝臓は、哺乳類の肝臓細胞に細胞増殖因子遺伝子を導入し、得られた不死化細胞を増加させることにより得られる不死化肝臓細胞からなる。本明細書における「人工肝臓」とは、マイクロ孔質糖マイクロキャリヤーまたは毛管やセラミックのような他の生体適合性支持マトリックス系を基盤とした機能的不死化肝臓細胞の集合体がグルコースや尿素を新生し、肝性脳症の原因物質であるアンモニア等を速やかに解毒すると共に患者のアミノ酸異常を是正するといった適確な肝機能の再現が行える体外循環肝補助装置として定義される。
【００４２】
前記人工肝臓においては、少なくとも、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９を発現する不死化肝細胞を用いることが好ましい。ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９は、薬物の代謝酵素でありチトクロームＰ４５０関連酵素である。また、本発明により、不死化肝細胞のＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９発現が、不死化肝星状細胞との共培養により増強されることが初めて示された。したがって、人工肝臓を製造する際には、不死化肝細胞とともに不死化肝星状細胞を用いることが好ましい。使用する肝細胞の不死化細胞株としては、ＴＴＮＴ−１（産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９８）がとくに好ましい。使用する不死化肝星状細胞としては、ＴＷＮＴ−１（産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４３）がとくに好ましい。不死化肝星状細胞株ＴＷＮＴ−１はＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９を発現しない。しかしながら、ＴＷＮＴ−１は不死化肝細胞とともに培養されると、不死化肝細胞により発現されるＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９を増加させることができる。不死化肝細胞と不死化肝星状細胞の割合としては、１０：１〜１：１が好ましく、１０：１〜５：１がさらに好ましい。とくに、生体内における肝細胞と不死化肝星状細胞の割合が９：１であることから、不死化肝細胞と不死化肝星状細胞の使用割合を９：１とすることが最も好ましい。
【００４３】
本発明の人工肝臓においてはマイクロキャリアーを含有してもよい。マイクロキャリアーは、不死化肝臓細胞の基質として単位面積当たりの培養不死化肝臓細胞総数を増加させるのに有用である。マイクロキャリアーは、球型のデキストラン、多孔質樹脂またはコラーゲンミクロスフィアが好ましい。
【００４４】
くわえて、生体適合性に優れたセルロースビーズが好ましく、細胞接着性ペプチドを付着させたセルロースビーズがより好ましい。細胞接着性ペプチドとしては、ＧＲＧＤＳおよびＲＧＤＳ（Ｇ：グリシン、Ｒ：アルギニン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｓ：セリン）などのアミノ酸配列が挙げられ、ＲＧＤのアミノ酸配列が含まれる限り特に限定されない。
【００４５】
コラーゲンミクロスフィアのなかでもコラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアが、生体内に類似した培養環境を作ることができるため、最も好ましい。
【００４６】
本発明においては、不死化肝臓細胞の付着占拠率を考えると、細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロースビーズ、およびコラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアが好ましい。コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアは、ウシ真皮をペプシンで処理し、可溶化し、精製し、ついでビーズ状に成形することにより製造することができる。細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロースビーズでは、不死化肝臓細胞の付着占拠率は８０〜９０％であり、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアでは、不死化肝臓細胞の付着占拠率はほぼ１００％である。したがって、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアが最も好ましい（図４（ａ）および図４（ｂ）参照）。
【００４７】
本発明の人工肝臓は、前記不死化肝臓細胞を内蔵するための容器を含んでもよい。容器としては、ホローファイバー型、平板状に培養不死化肝臓細胞をモジュール内に積み上げた積層型、不織布充填型などが挙げられ、細胞密度が高く、機能的に長期間の培養維持が可能であれば、特に限定されない。
【００４８】
本発明の人工肝臓は、さらに導管を有してもよい。患者の血液から有害物質を含む血漿の一部が血漿分離装置によって分離さる。分離された血漿は導管をとおしてバイオ人工肝臓モジュール側回路へ移動し、バイオ人工肝臓モジュールで有害物質が解毒され、グルコースやその他の物質の新生が行われる。処理された血漿を患者体内へと導くために導管を使用してもよい。導管はバイオ人工肝臓モジュール内の培養不死化肝臓細胞への酸素供給のためにガス交換装置や活性炭カラム等を直列に連結するために用いる。バイオ人工肝臓モジュールとは、患者側からの血漿流入部路と処理された血漿が患者側に導かれる流出路を有するものであれば、特に限定されない。
【００４９】
以下、実施例および比較例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
製造例１
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７の製造
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７（図１参照）は、従来の方法（ケイ  エイ  ウェスタマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、８９７１頁、１９９６年）にしたがい、具体的には以下の方法にて製造した。
【００５１】
１．  ＬＸＳＮレトロウイルスをＥｃｏＲＩとＲｓｒ２で消化した。バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏｔ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ１、Ｓａｌ１、Ｓｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列を、得られたベクターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に挿入した。ｈＴＥＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位に挿入した。
【００５２】
２．  ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰ配列およびＢ型肝炎転写後調節因子（ティー  エス  エン（Ｔ． Ｓ． Ｙｅｎ）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９５年）を含有するカセットベクターを、以下のようにして製造した。
【００５３】
ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ３で消化した。バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲＶ、Ｎｏｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列を、得られたベクターのＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。ついで、ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ）製）とがＮｃｏ１部位で連結され、一方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑にしたＣｌａ１部位である断片を製造した。この断片をバックボーンベクターのＳａｌ１および平滑にしたＢｇｌ２部位に挿入した。
【００５４】
３．  前記工程１で製造したベクターのＳａｌ１およびＣｌａ１部位に、前記工程２で製造したカセットベクター由来のＸｈｏ１およびＣｌａ１断片を挿入し、ＳＳＲ＃１９７ベクターを完成させた。
【００５５】
実施例１
不死化ヒト成人肝細胞株ＴＴＮＴ−１の樹立
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生細胞であるＣｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち力価は、１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５フラスコに１×１０５細胞／ｃｍ２で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約９０％となった時点で、培養液をＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ培養液１０ｍｌに交換した。
【００５６】
培養液交換２４時間後に、レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７を含有するＣｒｉｐ細胞上清２ｍｌを０．４５μｍのフィルターで濾過することにより得た液に１２μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を加えた。得られた液を、継代数１の成人ヒト肝細胞（大日本製薬株式会社製、カタログ番号ＣＳ−ＡＢＩ−３７１６）１×１０６個が培養された培養液と交換し、４時間感染させた。同様な感染処置を１日に２回、計３日間施行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮なＣＳ−Ｃ培養液に交換して肝細胞を培養した。
【００５７】
最終感染後２日後に細胞をトリプシンにて処理し、回収した。ＦＡＣＳカリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を回収した（図２（ａ）および図２（ｂ）参照）。ＣＳ−Ｃ無血清培地キット（大日本製薬株式会社、カタログ番号ＣＳ−ＳＦ−４ＺＯ−５００）を用いて、限界希釈法（１／２細胞／穴で播種）にてＴＴＮＴ−１を樹立した。ＴＴＮＴ−１細胞は寄託された（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９８）。ＴＴＮＴ−１細胞は、増殖が停止する危機もなく不死化し、ＣＳ−Ｃ培地において単層に増殖し、約２４時間でその数が倍加した。ＴＴＮＴ−１細胞は、数個の核小体を有する大きな核をもち細胞内顆粒に富んだ、肝臓の実質細胞の形態学的な特徴を示した。
【００５８】
実施例２
不死化ヒト成人肝細胞株における遺伝子発現
ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＴＴＮＴ−１細胞において肝臓代謝に重要な遺伝子、すなわち、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子、ＧＫ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ−π遺伝子およびヒトβ−アクチン遺伝子、ならびにｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を調べた。
【００５９】
ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バイオテックス社（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏ Ｔｅｃｘ）製、フレンズウッド、テキサス州、アメリカ合衆国）を用いてＴＴＮＴ−１細胞からＲＮＡを抽出し、２μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
【００６０】
得られた２μｇの逆転写産物を、各プライマー２０ｐｍｏｌ／ｍｌおよびＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄキット（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製、ＣＡ、アメリカ合衆国）を用い、そのプロトコールにしたがってＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲは、９５℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒のインキュベーションを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間インキュベーションして実施した。各遺伝子に対するプライマーには下記のものを使用した。
【００６１】
ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣ
３′プライマー：ＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＣ
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子
５′プライマー：ＣＣＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＣＧ
３′プライマー：ＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧＴＧＣ
ＧＫ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴ
３′プライマー：ＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡ
ＧＳ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＧ
３′プライマー：ＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧ
ＧＳＴ−π遺伝子
５′プライマー：ＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＡＴＴ
３′プライマー：ＧＧＣＴＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡ
ｈＴＥＲＴ遺伝子
５′プライマー：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ
３′プライマー：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧ
ヒトβ−アクチン遺伝子
５′プライマー：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ
３′プライマー：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ
ＴＴＮＴ−１細胞では、上記いずれの遺伝子の発現も認められた（図３参照）。
【００６２】
実施例３
不死化ヒト成人肝星状細胞ＴＷＮＴ−１の樹立
継代数１の成人ヒト肝細胞（カタログ番号ＣＳ−ＡＢＩ−３７１６、大日本製薬株式会社製）１×１０６個の代わりに１×１０６個のヒト肝星状細胞株ＬＩ９０を用いたほかは実施例１と同様にして、ＴＷＮＴ−１を樹立した。ＬＩ９０は、日本国東京都港区西新橋３−１９−１８の松浦先生より万人に提供され得る。ＴＷＮＴ−１細胞を寄託した（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４３）。ＴＷＮＴ−１細胞は、紡錘形で細胞内に脂肪滴を含んだ、肝臓の星状細胞の形態学的な特徴を示した。
【００６３】
実施例４
マイクロキャリアーへのＴＴＮＴ−１細胞の付着
１×１０７細胞個のＴＴＮＴ−１細胞を５０ｍｌ容積のスピンナーフラスコ（カタログ番号１９６７−０００５０、ベルコガラス社（ＢＥＬＬＣＯ ＧＬＡＳＳ， Ｉｎｃ．）製）に播種し、２５ｍｌのＣＳ−Ｃ培地にて培養した。培養は、４ポジションマグネチックスターラー（４ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｔｉｒｒｅｒ）（モデル１１０４Ｓ、和研薬株式会社）を用いて、９５％酸素、５％二酸化炭素および３７℃に設定したＣＯ２ガスインキュベータ（シリーズ５３００、和研薬株式会社）の中で２４時間旋回培養した。
【００６４】
図４（ａ）は、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィア（商品番号ＫＯ−００００−０１、フナコシ社製）に付着した不死化肝臓細胞の顕微鏡像である。図４（ａ）中、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィア１は不死化肝臓細胞２に完全に覆われているのが認められる。図４（ｂ）は、細胞接着性ペプチドを付着させたセルロースビーズ（株式会社クラレ製）に付着した不死化肝臓細胞の顕微鏡像である。図４（ｂ）中、細胞接着性ペプチドを付着させたセルロースビーズ３は、（ａ）より低い占拠率で不死化肝臓細胞２により覆われており、かつ、細胞の付着していないビーズ表面４が観察される。
【００６５】
実施例５
腫瘍形成試験
１．０×１０７個のＴＴＮＴ−１を重症複合型免疫（ＳＣＩＤ）マウスの皮下に移植した。また、ポジティブコントロールとして、１．０×１０６個のヒト肝臓癌由来のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を、同じマウスの皮下に移植した。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は、東北大学医学加齢研究所（日本国宮城県仙台市青葉区星陵町４−１）により万人に提供され得る細胞である。その結果、ＴＴＮＴ−１は、移植の１ヵ月後において、腫瘍を形成しなかった（図５の矢印５）。一方、移植の１週間後に腫瘍が肉眼で観察され、移植の１ヵ月後には約３ｃｍの大きさの腫瘍が観察された（図５の矢印６）。したがって、ＴＴＮＴ−１は極めて安全であることが示された。
【００６６】
実施例６
ＴＴＮＴ−１とＴＷＮＴ−１との共培養
１．８×１０６個のＴＴＮＴ−１と０．２×１０６個のＴＷＮＴ−１とを混合し、その混合物を直径１０ｃｍのシャーレに播種して、１０ｍｌのＣＳ−Ｃ培地で培養した。培養は、９５％酸素、５％二酸化炭素および３７℃に設定したＣＯ２インキュベータ（シリーズ５３００、和研薬株式会社）の中で１週間実施した。コントロールとして、１．８×１０６個のＴＴＮＴ−１のみを同様の方法で培養した。
【００６７】
共培養の結果、肝小葉様の構造が観察された。ＴＴＮＴ−１およびＴＷＮＴ−１細胞を１週間共培養したのち細胞の位相差顕微鏡像を観察した。図６において、矢印７はＴＴＮＴ−１を示し、矢印８はＴＷＮＴ−１を示す。
【００６８】
次に、培養した細胞を氷上でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ですすぎ、スクレイパーを用いて回収し、ついで遠心（３０００ｒｐｍ、３分間）して沈殿させた。上清を除いた。得られたペレットに約３倍量の細胞溶解液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、２００μｇ／ｍｌ  フェニルメタンスルホニルフルオリド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３）を添加した。得られた混合物液をピペッティングにより混ぜ、得られた懸濁液を氷上で１０分間放置した。懸濁液を遠心（１５０００ｒｐｍ、２０分間）し、不溶性タンパク質を沈殿させることにより、上清を回収した。ついで、上清に含まれるタンパク質３０μｇを用い、通常の方法でウェスタンブロットを実施した。ついで、ウェスタンブロットにおいて検出されたアクチンに対するＣＹＰ３Ａ４の比を、ＮＩＨ画像ソフトを用いて得た。ＮＩＨ画像ソフトは、ＮＩＨのホームページで無料で配布されている。また、ウェスタンブロットにおいて検出されたアクチンに対するＣＹＰ２Ｃ９の比についても同様にして得た。アクチンは、内因性のコントロールとして用いた。その結果を図７（ａ）および図７（ｂ）に示す。図７（ａ）は、ＴＴＮＴ−１とＴＷＮＴ−１との共培養では、ＣＹＰ３Ａ４の発現量がコントロールに対して１．９倍増加したことを示す。図７（ｂ）は、共培養ではＣＹＰ２Ｃ９の発現量がコントロールに対して１．５倍増加したことを示す。
【００６９】
［産業上の利用可能性］
インビトロにて哺乳類の肝臓細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより、インビトロ不死化肝臓細胞を得ることができる。本願発明のインビトロ不死化肝臓細胞は、人工肝臓に有用である。さらに、本願発明のインビトロ不死化肝臓細胞は、肝疾患治療剤、薬物代謝検定モデル、ヒト肝炎ウイルスの感染モデルとしても有用である。そのうえ、本願発明のインビトロ不死化肝臓細胞は、凝固因子および／またはアルブミンの製造に用いることができる。
【００７０】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：ＬｏｘＰ配列
配列番号２：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号３：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号４：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号５：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号６：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号７：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号８：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号９：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１０：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１１：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１２：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１３：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１４：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号１５：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号１６：細胞接着性ペプチド
配列番号１７：細胞接着性ペプチド
【配列表】
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0003609395.tif 000004
0003609395.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はレトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７を示す図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケージングシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴはｈＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位をそれぞれ示す。
【図２ａ】図２（ａ）はレトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７に感染した肝細胞の位相差顕微鏡像である。
【図２ｂ】図２（ｂ）は図２（ａ）に示した細胞の蛍光顕微鏡像である。
【図３】図３は、ＴＴＮＴ−１細胞における肝特異的遺伝子およびｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示す。レーン１から７は、それぞれ肝臓性ビリルビン−ウリジンジフォスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ（以下、ビリルビン−ＵＧＴという）遺伝子、チトクローム  Ｐ  ４５０  ３Ａ４（以下、ＣＹＰ３Ａ４という）遺伝子、グルコキナーゼ（以下、ＧＫという）遺伝子、グルタミンシンセターゼ（以下、ＧＳという）遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ（以下、ＧＳＴ−πという）遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびヒトβ−アクチン遺伝子の発現を示す。Ｍはマーカーを示す。
【図４ａ】図４（ａ）は、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィアに付着した不死化肝臓細胞の顕微鏡像である。
【図４ｂ】図４（ｂ）は、細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロースビーズに付着した不死化肝臓細胞の顕微鏡像である。
【図５】図５は、ＴＴＮＴ−１細胞およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の移植１ヵ月後のマウスを示す図である。
【図６】図６は、ＴＴＮＴ−１細胞とＴＷＮＴ−１細胞とを１週間共培養した後に観察された肝小葉様の構造を示す位相査顕微鏡像である。
【図７ａ】図７（ａ）は、ウェスタンブロッティングにより検出されたアクチンに対するＣＹＰ３Ａ４の比を示すグラフである。
【図７ｂ】図７（ｂ）は、ウェスタンブロッティングにより検出されたアクチンに対するＣＹＰ２Ｃ９の比を示すグラフである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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