(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉに対応するホスホトリエステル化合物：
0003628324.tif 000005
（上記式中：
−Ｒは基−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｘであり、
上記において：−Ｘは基−Ｃ（＝Ｚ）−Ｙまたは−Ｓ−Ｕを表し、
−ＺはＯまたはＳであり、
−ＹおよびＵは、OH、SHまたはNH2基で場合により置換されていてもよいアルキル、アリールまたは糖基を表し、
−ｎは１〜４であり、
−Nuは、生物学的に活性な化合物の残基、またはホスフェートもしくはホスホネート基を有したときに生物学的に活性である化合物の脱ホスホリル化残基からなる基である）。
【請求項２】
ｎが１または２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘが−Ｓ−Ｕを表し、Ｕが基（CH2）n1−X1（X1はＨ、OH、SHまたはNH2を表し、n1は１〜４である）を表す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
n1が１または２である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒが−（CH2）２−Ｓ−Ｓ−（CH2）2OHを表す、請求項３または４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘが−Ｃ（＝Ｚ）−Ｙを表し、ＹがCH3またはtBuを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒが−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−CH3または−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−tBu（ｎ＝１または２）を表す、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Nuが、治療上活性であるか、またはその5'−（Ｏ）−モノホスフェートまたは5'−（Ｃ）−モノホスホネート誘導体が治療上活性である天然ヌクレオシドまたは天然ヌクレオシドの誘導体の5'残基を表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Nuが2',3'−ジデオキシヌクレオシドタイプまたは2',3'−ジデヒドロヌクレオシドタイプの天然ヌクレオシドの誘導体の5'残基を表す、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
NuがddU、ddT、ddC、AZT、またはピリミジン塩基上で、もしくは糖環の2'および3'で置換されたそれらの誘導体の5'残基を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
誘導体がピリミジン塩基上の５位で置換された、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
Nuがヌクレオシドアナログ残基を表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
ヌクレオシドアナログ残基がカルボヌクレオシド、ホスホノヌクレオシドまたはアシクロヌクレオシドである、請求項12に記載の化合物。
【請求項１４】
Nuが式−CH2−Ｏ−アルキルプリンまたは−ピリミジンのメトキシアルキルプリンまたは−ピリミジンタイプの基である、請求項13に記載の化合物。
【請求項１５】
Nuが、式−CH2−Ｏ−CH（CH2OH）−CH2−プリンもしくは−ピリミジンで表される３−ヒドロキシ−２−メトキシプロピルプリンもしくは−ピリミジン基、または式−CH2−Ｏ−C2H4−プリンもしくは−ピリミジンで表される２−メトキシエチルプリンまたは−ピリミジン基である、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜15のいずれか一項に記載の化合物の製造法であって、
その化合物において、Ｒおよび場合によってはNuの官能基が適切な保護基で保護され、その後式（Ｉ）の化合物を得るためにＲおよび場合によってはNuの上記官能基が脱保護されて、式（Ｉ）の化合物が製造されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
下記式（II）の化合物：
0003628324.tif 000006
（上記式中Nuは場合によっては保護されていてもよい）を式（III）の化合物：
Ｘ−Ｓ−（CH2）ｎ−OH
（Ｘは保護されている）
と反応させ式（Ｉ）の保護化合物を得、その後脱保護される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
式（II）および（III）の化合物間の反応がピリジン中、縮合剤の存在下で行われる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
縮合剤がMSNTである、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物学的に活性な化合物のホスフェートまたはホスホネート基の生物学的に可逆的な官能化に関する。
更に具体的には、本発明は、細胞内媒体中で生物学的に可逆的な保護基により保護されたホスフェートまたはホスホネート基を有したホスホトリエステルタイプ生物学的に活性な化合物に関する。
ホスフェートまたはホスホネート基を有した化合物は、生理的pHで負のイオン荷電を帯びる性質を有する。その結果、このような化合物の治療活性は、負に荷電した化合物が生体脂質膜を横切るにあたり低拡散性であることにより制限される。しかも、ホスフェート基を保有した化合物は血中または細胞膜で、基質化合物を脱ホスホリル化するホスファターゼ酵素の作用により容易に脱ホスホリル化される。一般的に、荷電したホスフェートまたはホスホネート化合物は経口投与でほとんど吸収されず、性質上脂質である細胞膜または脳関門からでさえも効率的に拡散しない。
ある化合物、例えばヌクレオシド誘導体またはアナログは非ホスホリル化形で投与される活性剤であるが、代謝モノホスフェートまたはトリホスフェートの形でインビボでホスホリル化されて活性になる。
このため、抗腫瘍活性を有するヌクレオシド誘導体、例えば５−フルオロウリジン、５−フルオロ−2'−デオキシウリジンまたは１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンは、ホスホリル化された形でそれらの活性を発揮する。
同様に、それらの抗増殖活性を発揮するためには、あるヌクレオシドまたはホスホノヌクレオシドアナログは細胞またはウイルス酵素によってその対応トリホスフェートにホスホリル化される必要がある。それにより、このトリホスフェートはウイルスおよび／または細胞ポリメラーゼを阻害することができる。
抗ウイルス剤の様々な構造のものの中で、2',3'−ジデオキシヌクレオシドはエイズの治療上最も有効な化合物に入る。しかしながら、これらのヌクレオシドアナログが、エイズの病原体HIVの複製においてそれらの活性を発揮するためには、細胞キナーゼによる生物変換をうけなければならない。この代謝ではジデオキシヌクレオシド5'−モノホスフェート、次いで5'−ジホスフェートを経て5'−トリホスフェートに至り、これはHIV逆転写酵素の阻害剤であり、それによりウイルスDNAの生合成が阻害される。
それらの治療薬としての大きな可能性にもかかわらず、2',3'−ジデオキシヌクレオシドには制限がある。具体的には、それらの一部はキナーゼによるトリホスフェートへの代謝性が低い。例えば、2',3'−ジデオキシウリジン5'−トリホスフェートは逆転写酵素の優れた阻害剤である（Z.Hao et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.,1988,29,348;E.Matthess et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,148,78−85）。しかしながら、このヌクレオシドはインビトロでHIVの複製を阻害することができない。研究によれば、この結果は、細胞キナーゼによるヌクレオシドからそのモノホスフェートへの代謝性が低いことと関連していることが示された（Z.Hao et al.,Mol.Pharmacol.,1990,37,157−153）。
このため、AZTはそのトリホスフェート（AZTP）に連続的に代謝され、これはHIV逆転写酵素の強力な阻害剤である。同様に、アシクロビア（ACV）はそのトリホスフェート（ACVTP）に変換され、ヘルペスウイルスDNAポリメラーゼを選択的に阻害する。ヌクレオシド（Nu）の活性化の第一ステップはモノホスホリル化からなり、対応モノホスフェート（NuMP）に至る。最も選択的なのがこの第一ステップである。
酵素モノホスホリル化のこの主要工程を迂回するために、NuMPを直接投与することが既に提案されているが、治療を目的とするそれらの使用は前記制限および欠点により限定的である。
ホスフェートまたはホスホネート基を有した化合物は、生理的pHで負のイオン荷電を帯びる性質を有する。その結果、このような化合物の治療活性は、負に荷電した化合物の生体脂質膜を横切る拡散性が低いために制限される。特に、荷電化合物は性質上脂質である細胞膜または更に脳関門からも効率的に拡散しない。更に、このような化合物は血中または細胞膜でその基質化合物を脱ホスホリル化するホスファターゼ酵素の作用により容易に脱ホスホリル化される。一般的に、荷電ホスフェートまたはホスホネート化合物は経口投与でほとんど吸収されない。
細胞膜の通過と対応モノヌクレオチドホスホトリエステル（NuMP）の細胞内送達ができる中性ホスホトリエステルにモノヌクレオチドを交換することが求められてきた。このようなアプローチは何年にもわたり様々な著者により続けられたが、期待はずれとわかった。得られた誘導体は一般的に過度に毒性であるか、もまたは不十分な細胞外安定性であり、最終的に生物学的活性の向上を何ら示さなかった。
このため、アシルオキシメチルまたはアシルオキシベンジルタイプの生物学的に可逆性である保護基を含んだホスホリル化ヌクレオシド構造の使用が、WO第9,008,155号および第9,119,721号明細書で、抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、例えば５−フルオロウラシルについて提案された。しかしながら、これらの化合物の化学的安定性は限定されたものであり、インビボで毒性ホルムアルデヒド代謝産物を生じる。更に、それらは難溶性であり、それら化学的製造の収率は低い。
従って、本発明の目的は、特に抗ウイルス活性を有するヌクレオシドに由来するか、またはそれと類似した化合物に関し、その生物学的活性が高まるように、特にモノヌクレオチドまたは他の構造と組み合わされ、かつ、前記欠点を有しない、他のタイプの生物学的に可逆性な基を提供することである。
本発明は、選択的に対応モノホスフェートまたはモノホスホネートを放出する不安定中間体を酵素活性化の後に形成する
0003628324.tif 000002
酵素不安定結合の存在により特徴付けられる、新規基の使用を提案している。
更に正確には、本発明の主題は下記一般式Ｉに対応する化合物である：
0003628324.tif 000003
上記式中：
−Ｒは基−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｘであり、
上記において：−Ｘは基−Ｃ（＝Ｚ）−Ｙまたは−Ｓ−Ｕを表し、
−ＺはＯまたはＳであり、
−ＹおよびＵは、特にOH、SHまたはNH基で場合により置換されていてもよいアルキル、アリールまたは糖基を表し、
−ｎは１〜４、好ましくは１または２であり、
−Nuは、生物学的に活性な化合物の残基、またホスフェートもしくはホスホネート基を有したときに生物学的に活性である化合物の脱ホスホリル化残基からなる基である。
式（Ｉ）においてNuがＰ−Ｏ結合でリンに結合されているとき、本発明による式（Ｉ）の化合物はホスフェート基を有し、このためホスホトリエステル化合物を形成する。
NuがＰ−Ｃ結合でリンに結合されているとき、本発明による式（Ｉ）の化合物はホスホネート基を有している。
基Ｒの生物学的に可逆性である機構は、図１で表された例により示されるメカニズムのように、Ｓ−Ｘ結合の酵素的開裂と（CH2）ｎ−Ｓ残基の放出による。
ＹおよびＵでは、特にアルキル基としてC1−C7アルキル、アリール基としてフェニルおよびベンジル基、糖基としてグルコース、マンノースまたはラムノースが挙げられる。
１つの態様において、ＸがSUを表すとき、Ｕは好ましくは基−（CH2）n1−X1を表し、ここでX1はＨ、OH、SHまたはNH2を表し、n1は１〜４、好ましくは１または２である。
Ｒが−（CH2）２−Ｓ−Ｓ−（CH2）２−OHを表す化合物（Ｉ）が特に挙げられる。
もう１つの態様において、Ｘが−Ｃ（＝Ｚ）−Ｙを表すとき、Ｙは好ましくはCH3またはtBuを表す。
Ｒが−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−CH3または−（CH2）ｎ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−tBu（ｎ＝１または２）を表す化合物（Ｉ）が特に挙げられる。
化合物（Ｉ）に関する本発明の有利な態様において、Nuが、治療上活性であるか、またはその5'−（Ｏ）−モノホスフェートまたは5'−（Ｃ）−一ホスホネートが治療上活性である天然ヌクレオシドまたは天然ヌクレオシドの誘導体の5'残基を表す化合物が特に挙げられる。
式（Ｉ）のこれら化合物は抗ウイルスまたは抗腫瘍活性を通常有している。
Nuが2',3'−ジデオキシヌクレオシドまたは2',3'−ジデヒドロヌクレオシドの5'残基を表す式（Ｉ）の化合物が更に具体的に挙げられる。
NuがddU（ジデオキシウリジン）、ddT（ジデオキシチミジン）、ddC（ジデオキシシチジン）、AZT（3'−アジド−2',3'−ジデオキシチミジン）およびそれら誘導体の5'残基である化合物（Ｉ）、特にピリミジン塩基または糖環の2'および3'で置換された化合物が、抗ウイルス活性を有するジデオキシヌクレオシドに由来する化合物（Ｉ）の中で更に具体的に挙げられる。
ddT、ddCまたはAZTは、治療上活性な天然ヌクレオシド誘導体の5'残基を表す基Nuの例である。
ddUは、ホスホリル化形のみで活性であるヌクレオシド誘導体の5'残基を表す基Nuの例である。ddU（ジデオキシウリジン）はインビボで酵素的にモノホスホリル化されない。そのトリホスフェートのみがポリメラーゼ阻害剤であり、それに抗ウイルス活性を付与する。
Nuが誘導体５−フルオロウリジン、５−フルオロ−2'−デオキシウリジンまたは１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンの5'残基を表す化合物が、抗腫瘍活性を有する化合物（Ｉ）の中で特に挙げられる。これらの化合物は、抗腫瘍化学療法でよく見られる、耐性がモノホスホリル化されるそれら能力の喪失によるものである場合に、あるヌクレオシド薬物に対して獲得される耐性を回避する上で本発明による官能化が利点であることを示す。
本発明のもう１つの態様によれば、化合物（Ｉ）において、基Nuはヌクレオシドアナログ残基、例えばカルボヌクレオシド（糖環の酵素が炭素で置き換えられたヌクレオシド）、ホスホノヌクレオシド（5'の酸素が炭素で置き換えられたヌクレオシド）あるいはアシクロヌクレオシドタイプのプリンまたはピリミジンベース誘導体、即ち糖環を含まないもの、例えばACV（アシクロビア）または式CH2−Ｏ−アルキルプリンもしくは−ピリミジンのメトキシアルキルプリンもしくは−ピリミジン基を表す。
Nuがメトキシアルキルプリンまたは−ピリミジン基を表す化合物（Ｉ）が、ホスホネート化合物の例である。ホスホニルメトキシアルキルプリンまたは−ピリミジン抗ウイルス化合物の具体例としては、PMEA、HPMPAまたはHPMPCが特に挙げられ、その式は図３および４で示されている。
このため、本発明は特にNuが式−CH2−Ｏ−CH（CH2OH）−CH2−プリンまたは−ピリミジンで表される３−ヒドロキシ−２−メトキシプロピルプリンまたは−ピリミジン基、あるいは式−CH2−Ｏ−C2H4−プリンまたは−ピリミジンで表される２−メトキシエチルプリンまたは−ピリミジン基である化合物、例えばNuがメトキシエチルアデニンまたは３−ヒドロキシ−２−メトキシプロピルシトシン基である化合物（Ｉ）に関する。
分子がホスフェートまたはホスホネート形であるときに生物学的に活性である分子の脱ホスホニル化（脱ホスフェート化または脱ホスホネート化）された残基をNuが表す場合に、本発明による官能化で、ホスフェートまたはホスホネート基を含む上記分子の物理化学的および生物物理学的パラメーターを一般的に修正することができる。そのとき、化合物（Ｉ）は、例えばリンペプチドでもまたはリン脂質化合物からなっていてもよい。
Nuがヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体またはヌクレオシドアナログの残基を表すとき、後者はＤでもまたはＬエナンチオマーであってもよい。
本発明による化合物は当業者に知られる方法で製造してよい。
特に、本発明の主題は、式（Ｉ）の化合物が製造されることを特徴とする本発明による化合物の製造方法であり、その場合にその化合物ではＲおよび場合によってはNuの官能基が適切な保護基で保護され、その後式（Ｉ）の化合物を得るためにＲおよび場合によってはNuの上記官能基が脱保護される。
特に、下記式（II）の化合物：
0003628324.tif 000004
（上記式中Nuは場合によっては保護されていてもよい）を式（III）の化合物Ｘ−Ｓ−（CH2）ｎ−OH（Ｘは保護されている）と適切な方法で反応させ前記式（Ｉ）の保護化合物を得、その後脱保護される。
具体的な態様において、式（II）および（III）の化合物間の反応はピリジン中、縮合剤、例えばMSNTの存在下で行う。
他の製造方法は下記例で示されているが、これらから本発明の他の特徴および利点もまた明らかとなろう。
図１〜６に関する説明：
−図１は酵素活性下で生物学的に可逆性である基の分解メカニズムを表す。同様のメカニズムが双方の基Ｒで生じる。
−図２は例２の化合物の生物学的に可逆性な基の分解メカニズムを表す。
−図３は本発明によるある化合物の式を表す。
−図４は例１で製造された化合物の製造スキームと化合物HPMPAおよびHPMPCの式を表す。
−図５は例２および３で製造された化合物の製造スキームを表す。
−図６は例４で製造された化合物の製造スキームを表す。
本発明の利点は、細胞外と細胞内媒体との間におけるモノヌクレオチドホスホトリエステルの安定性に関する差異にある；本発明（例２）で記載された化合物の１つの分解は前記基準に十分に対応しており、図２で示されたメカニズムに従い起きることが、まず明らかにされている。
“ISRPオンライン"HPLC技術（"On−line Internal Surface Reversed−Phase Cleaning:The Direct HPLC Analysis of Crude Biological Samples",A.POMPON,I.LEFEBVRE and J.L.IMBACH,Biochemical Pharmacology,43,1769−1775（1992））がこの研究で用いられ、研究された化合物は培地（RPMI/10％不活性化血清）および全細胞抽出物（CEM）で各々インキュベートされた。
例２の化合物は培地中で９時間および細胞抽出物中で５分間以下の半減期を有する。NuMPの対応細胞内放出は生物活性の証明により確認されるが、構成ヌクレオシドは不活性である。
更に、モノヌクレオチドへのホスホトリエステルの活性化に関する律速工程が酵素加水分解の初期動力学的に高度に依存しているかぎり酵素不安定基の性質の変化が薬物の薬物動力学的パラメーターの調節を導いて、遅延作用を起こす。
これらのデータは明らかに本発明の利点を追認している。
薄層クロマトグラフィーはメルク60F 254シリカプレート（Art.5554）で行った。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーはメルク60Hシリカ（Art.7736）またはRP2メルクシラン処理シリカ（Art.7719）で行った。分析または凍結乾燥前に、溶液はMillex HV−４フィルター（Millipore）で濾過した。
UVスペクトルはUVIKON 810分光光度計で記録した。
質量スペクトルは、グリセロール（Ｇ）、グリセロール／チオグリセロール（GT）または３−ニトロベンジルアルコール（NBA）のマトリックス中ポジティブまたはネガティブモードでFABイオン化法によりJEOL JMS DX 300装置で測定した。
プロトンNMRスペクトルはVarian EM 360装置またはBruker AC 250装置で記録した。化学シフトはテトラメチルシラン（TMS）シグナルに対してppmで表される。NMRで観察されるシグナルの多重度および出現は１つ（またはそれ以上）の文字:s（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｍ（マルチプレット）、ｂ（ブロード）で示される。
リンNMRスペクトルは、プロトンデカップリングによりBruker WP 200 SY装置で記録した。化学シフトは内部参照とされるH3PO4シグナルに対してppmで表される。
例1:
Ｏ−（2',3'−ジデオキシウリジン−5'−イル）−O,O'−ビス（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート（１）
（図４のスキーム）
２−ヒドロキシエチルアセチルスルフィド（５）
トルエン5ml中チオ酢酸1.0ml（14mmol）の溶液を1,8−ジアザビシクロ−（5.4.0）−７−ウンデセン（DBU）1.7ml（12mmol）の存在下で２時間にわたりヨードエタノール0.90ml（12mmol）で処理する。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水洗する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させる。得られた粗製生成物をシリカゲルのカラムで精製し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜４％））、油状物の形で1.2gの５を得る。
５:1H  NMR（DMSO−d6）:d＝2.32（s,3H,CH3）;2.91（t,2H,CH2S,J＝6.6Hz）;3.45（Pseudo  q,2H,CH2OH,J＝6Hz）;4.97（t,1H,OH）ppm.
Ｏ−（2',3'−ジデオキシウリジン−5'−イル）ヒドロゲノホスホネート（６）
無水ピリジン中亜ホスフェートの1.5M溶液（165ml、247mmol）を2',3'−ジデオキシウリジン（24.7mmol）5.25gに加え、塩化ピバロイル16.8ml（136mmol）で処理する。３時間の反応後、1M炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液を加えて混合液を中和させ、溶媒を減圧下で留去する。得られた油状物をシリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜35％））、６を得る。生成物をメタノールに溶解し、Milliporeフィルターで濾過する。溶媒の蒸発により7.10g（76％）の６を（トリエチルアンモニウム形で）得たが、これは次の合成工程で使用上十分に純粋である。より高純度のサンプルは、溶出液としてイソプロパノール、アンモニア溶液および水（8:1:1）の混合液を用いたシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーによる更なる精製後に得る。アンモニウム形の生成物をシリカからメタノールで抽出し、溶媒を蒸発により除去し、残渣を水に溶解し、Milliporeフィルターで濾過し、凍結乾燥する。
６:UV（H2O）:1max＝262nm（e9940）;1min＝230nm（e2080）MS（negative  FAB,GT）;275（Ｍ）−
1H  NMR（DMSO−d6）:d＝1.78−2.05（m,3H,H−２′,3′,3″）;2.18−2.45（m,1H,H−２″）;3.65−3.95（m,2H,H−５′,5″）;4.11（m,1H,H−４′）;5.55（d,1H,H−5,J＝8.1Hz）;5.95（dd,1H,H−１′,J＝6.8and3.8Hz）;6.63（d,1H,HP,J＝592Hz）;7.87（d,1H,H−6,J＝8.1Hz）ppm
31P  NMR（DMSO−d6）:d＝1.60ppm.
Ｏ−（2',3'−ジデオキシウリジン−5'−イル）−O,O'−ビス（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート（１）
ピリジン5ml中2',3'−ジデオキシウリジンのヒドロゲノホスホネート６  200mg（0.530mmol）の溶液を塩化ピバロイル196μｌで30分間処理する。２−ヒドロキシエチルアセチルスルフィド（５）159mg（1.33mmol）を加え、反応液を２時間攪拌する。形成された亜ホスフェートエステルは、持続的な色が得られるまで、ピリジン−水混合液（98:2）中２％ヨウ素溶液（７〜8ml）を用いて酸化する。溶媒を減圧下で留去する。得られた粗生成物をトルエンで共蒸発させ、シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜６％））、油状物の形で化合物１  65mg（25％）を得る。
１:UV（EtOH）:1max＝262nm（e9400）;1min＝230nm（e2500）
MS（positive  FAB）:497（Ｍ＋Ｈ）＋
1H  NMR（DMSO−d6）:d＝1.73−2.13（m,3H,H−２′,3′,3″）;2.20−2.4（m,1H,H−２″）;2.356and2.360（ｓ  and  s,3H  and  3H,2CH3）;3.13（t,4H,2CH2S,J＝6.4Hz）;4.00−4.26（m,7H,H−４′,5′,5″and2CH2CＨ2OP）;5.60（d,1H,H−5,J＝8.1Hz）;6.01（dd,1H,H−１′,J＝4.2and7.0Hz）;7.64（d,1H,H−6,J＝8.1Hz）;11.3（bs,1H,NHCO）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）:d＝1.21ppm.
例2:
O,O'−ビス〔Ｓ−（２−ヒドロキシエチルスルフィジル）−２−チオエチル〕−Ｏ−（2',3'−ジデオキシウリジン−5'−イル）ホスフェート（２）
（図５のスキーム）
O,O'−ビス〔Ｓ−〔Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２−オキシエチルスルフィジル〕−２−チオエチル〕ホスフェート（８）
ピリジン18ml中イミダゾール0.910g（13.4mmol）の溶液に０℃でオキシ塩化リン0.406ml（4.45mmol）を加える。混合液を室温で30分間攪拌し、その後モノ−Ｏ−（４−メトキシトリチル）ジチオジエタノール（７）3.80g（8.91mmol）に加える。18時間後、反応混合液を1M酢酸トリエチルアンモニウム溶液で処理する。反応生成物をジクロロメタンで抽出し、有機相を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、トルエンで共蒸発させる。シリカゲルのカラムで精製し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜10％））、トリエチルアンモニウム塩の形で2.2g（48％）の８を得る。
８:MS（negative  FAB,NBA）:913（M-）
1H  NMR（DMSO−d6）:1.14（t,9H,（ＣＨ3CH2）3NH+,J＝7.3Hz）;2.78（t,4H,2SCＨ2CH2OP,J＝6.4Hz）;2.86（t,4H,2SCＨ2CH2OMTr,J＝6Hz）;2.99（q,6H,（CH3CＨ２）3NH+,J＝7.3Hz）;3.21（t,4H,2CＨ2OMTr,J＝5.9Hz）;3.71（s,6H,2CH3O）;3.87（m,4H,2CＨ2OP）;6.82−7.45（m,28H,2Tr）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）：−2.70ppm.
O,O'−ビス〔Ｓ−（２−ヒドロキシエチルスルフィジル）−２−チオエチル〕−Ｏ−（2',3'−ジデオキシウリジン−5'−イル）ホスフェート（２）
ピリジン5ml中８  666mg（0.655mmol）および2',3'−ジデオキシウリジン139mg（0.656mmol）の混合液を１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール486mg（1.64mmol）で処理する。30時間後、反応混合液をジクロロメタンで希釈し、1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液、その後水で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、トルエンで共蒸発させ、シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付す（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜４％））。部分的に精製された保護ホスホトリエステルを酢酸／水／メタノール混合液（8:1:1）5mlで24時間処理する。溶媒を減圧下で留去し、得られた油状物をトルエンで共蒸発させる。シリカゲルのカラムで精製し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜６％））、その後シラン処理シリカのカラムで精製し（溶出液：水中エタノール（０〜40％））、ジオキサンで凍結乾燥後に化合物２  52mg（14％）を得る。
２:UV（EtOH）：λmax261nm（ε9900）
λmin231nm（ε3100）
MS（positive  FAB,GT）;565（Ｍ＋Ｈ）+:489（Ｍ−SCH2CH2OH＋2H）+;429（Ｍ−HOCH2CH2SSCH2CH2＋2H）+.
1H  NMR（DMSO−d6）:1.63−1.9（m,1H,H−３′）;1.9−2.10（m,2H,H−２′,3″）;2.33−2.40（m,1H,H−２″）;2.80（t,2H,HOCH2CＨ2S,J＝6.4Hz）;2.81（t,2H,HOCH2CＨ2S,J＝6.4Hz）;3.00（t,4H,2SCＨ2CH2OP,J＝6.3Hz）;3.61（Pseudo  q,4H,2,HOCＨ2,J＝6Hz）;4.07−4.32（m,7H,H−４′,5′,5″and2CH2CＨ2OP）;4.89（t,2H,2HO,J＝4.9Hz）;5.598（d,1H,H−5,J＝8.1Hz）;5.604（d,1H,H−5,J＝8.1Hz）;6.00（dd,2H,2H−１′,J＝4.1and7.9Hz）;7.65（d,2H,2H−6,J＝8.0Hz）;11.31（bs,1H,NHCO）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）：−0.880ppm
例3:
O,O'−ビス〔Ｓ−（２−ヒドロキシエチルスルフィジル）−２−チオエチル〕−Ｏ−（3'−アジド−3'−デオキシチミジン−5'−イル）ホスフェート（３）
（図５のスキーム）
ピリジン5ml中８  666mg（0.655mmol）および3'−アジド−3'−デオキシチミジン193mg（0.722mmol）の混合液を１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール486mg（1.64mmol）で処理する。24時間後、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール194mg（0.656mmol）を加え、反応を更に24時間続ける。次いで反応混合液をジクロロメタンで希釈し、1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液およびその後水で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、トルエンで共蒸発させ、シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付す（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜２％））。部分的に精製された保護ホスホトリエステルを酢酸／水／メタノール混合液（8:1:1）5mlで24時間処理する。溶媒を減圧下で留去し、得られた油状物をトルエンで共蒸発させる。シリカゲルのカラムで精製し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜６％））、ジオキサンで凍結乾燥後に化合物３  130mg（29％）を得る。
３:UV（EtOH）：λmax264nm（ε9600）
λmin234nm（ε2100）
MS（positive  FAB,GT）:620（Ｍ＋Ｈ）+:544（Ｍ−SCH2CH2OH＋2H）+.
1H  NMR（DMSO−d6）:1.80（s,3H,CH3）;2.26−2.5（m,2H,H−２′,2″）;2.796（t,2H,HOCH2CＨ2S,J＝6.4Hz）;2.802（t,2H,HOCH2CＨ2S,J＝6.4Hz）;2.99（t,4H,2SCＨ2CH2OP,J＝6.3Hz）;3.61（Pseudo  q,4H,2,HOCＨ2,J＝6Hz）;4.02（m,1H,H−４′）;4.09−4.44（m,6H,H−５′,5″and2CH2CＨ2OP）;4.48（m,1H,H−３′）;4.90（t,2H,2HO,J＝5.3Hz）;6.14（t,1H,H−１′Ｊ＝6.6Hz）;7.49（s,1H,H−６）;11.37（bs,1H,NHCO）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）：−0.954ppm
例4:
９−〔２−〔O,O'−ビス〔Ｓ−（２−ヒドロキシエチルスルフィジル）−２−チオエチル〕ホスホニルメトキシエチル〕アデニン（４）
（図５のスキーム）
N6−（４−メトキシトリチル）−９−（２−ジエトキシホスホニルメトキシエチル）アデニン（10）
ジクロロメタン50ml中９−（ジエトキシホスホニルメトキシエチル）アデニン（９）（A.Holy et al.,Collection Czechoslovak Chem.Commun.,52,2792,1987）3.93g（11.9mmol）および４−ジメチルアミノピリジン146mg（1.19mmol）の溶液をトリエチルアミン3.31ml（23.8mmol）および４−メトキシトリチルクロリド7.35g（23.8mmol）で４時間処理する。次いで反応混合液をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液およびその後水で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜３％））、化合物10  5.43g（84％）を単離する。
10:UV（EtOH）：
λmax275nm（ε27200）
λmin246nm（ε11200）
MS（negative  FAB,GT）;601（Ｍ−Ｈ）-;406（AMTr）-;328（Ｍ−MTr）−
1H  NMR（DMSO−d6）:1.10（t,6H,2CＨ3CH2,J＝7.0Hz）;3.71（s,3H,CH3O）,3.80−3.98（m,4H,PCＨ2and  ＣＨ2CH2）;3.88（q,4H,2CH3CＨ2,J＝8Hz）;4.33（t,CH2CＨ2,J＝4.8Hz）;6.80−7.37（m,14H,Tr）;7.91（s,1H,H−８）;8.18（s,H−２）ppm
31P  NMR（DMSO−d6）:21.35ppm
N6−（４−メトキシトリチル）−９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（11）
アセトニトリル29ml中10  5.00g（8.31mmol）の溶液をトリメチルシリルブロミド3.29ml（24.9mmol）で14時間処理する。過剰の試薬および溶媒を減圧下で留去する。得られた油状物を炭酸水素トリエチルアンモニウムに溶解し、減圧下で濃縮する。精製をシリカゲルのカラムでクロマトグラフィーにより行う（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜50％））。ジクロロメタンで溶液の濾過後に、3.4g（63％）の11を酸およびトリエチルアンモニウムの混合塩（1:1）の形で単離する。
11:MS（negative  FAB,GT）:544（Ｍ−Ｈ）-:272（Ｍ−MTr）-.
1H  NMR（DMSO−d6）:1.11（t,9H,（ＣＨ3CH2）NH+,J＝7.3Hz）;2.96（q,6H,（ＣＨ3CH2）NH+,J＝7.3Hz）;3.34（d,2H,PCH2,J＝8.4Hz）;3.68（s,3H,CH3O）;3.8（m,2H,CＨ2CH2）;4.27（t,CH2CＨ2,J＝4.5Hz）;6.65−7.35（m,14H,Tr）;7.83（s,1H,H−８）;8.31（s,1H,H−２）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）:11.40ppm.
N6−（４−メトキシトリチル）−９−〔２−〔O,O'−ビス〔Ｓ−〔Ｏ−（４−メトキシトリチル）−２−オキシエチルスルフィジル〕−２−チオエチル〕〕ホスホニルメトキシエチル〕アデニン（12）
ピリジン5ml中11  296mg（0.458mmol）とモノ−Ｏ−（４−メトキシトリチル）ジチオジエタノール（７）977mg（2.29mmol）の混合液を１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール341mg（1.15mmol）で処理する。３日後、反応混合液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液およびその後水で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、トルエンで共蒸発させ、シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーに付し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜５％））、330mg（53％）の12を得る。
12:UV（EtOH）：
λmax275nm（ε28200）
λmin253nm（ε18300）
MS（negative  FAB,NBA）:1360（Ｍ−Ｈ）-:952（Ｍ−MTrOCH2CH2SSCH2CH2）-.
1H  NMR（DMSO−d6）:2.75（t,4H,2SCＨ2CH2OP,J＝6.3Hz）,2.86（t,4H,2SCＨ2CH2OMTr,J＝5.9Hz）;3.19（t,4H,2CＨ2OMTr,J＝6.0Hz）;3.68（s,3H,CH3O）;3.69（s,6H,2CH3O）;3.83（m,4H,PCH2,and  ＣＨ2CH2）;4.05（m,4H,2CＨ2OP）;4.28（t,2H,CH2CＨ2,J＝4.6Hz）;6.87−7.45（m,42H,3Tr）;7.88（s,1H,H−８）;8.12（s,1H,H−２）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）:22.09ppm.
９−〔２−〔O,O'−ビス〔Ｓ−（２−ヒドロキシエチルスルフィジル）−２−チオエチル〕ホスホニルメトキシエチル〕アデニン（４）
ホスホトリエステル12（290mg、0.213mmol）を酢酸／水／メタノール混合液（8:1:1）15mlで15時間処理する。溶媒を減圧下で留去し、得られた油状物をトルエンで共蒸発させる。シリカゲルのカラムで精製し（溶出液：ジクロロメタン中メタノール（０〜８％））、水／ジオキサン混合液で凍結乾燥後に化合物４  116mg（90％）を得る。
４:UV（EtOH）：
λmax260nm（ε14700）
λmin228nm（ε3600）
MS（positive  FAB,GT）:545（Ｍ＋Ｈ）＋
1H  NMR（DMSO−d6）:2.80（t,4H,2SCＨ2CH2OP,J＝6.4Hz）;2.91（t,4H,2SCＨ2CH2OH,J＝6.4Hz）;3.61（Pseudo  q,4H,2CＨ2OH,J＝6Hz）;3.91（t,2H,CＨ2CH2,J＝5.1Hz）;3.95（d,2H,PCH2,J＝8.2Hz）;4.15（m,4H,2CＨ2OP）;4.32（t,2H,CH2CＨ2,J＝5.0Hz）;7.20（bs,2H,NH2）;8.08（s,1H,H−８）;8.14（s,1H,H−２）ppm.
31P  NMR（DMSO−d6）:22.24ppm.
例5:
CEM細胞およびMT−４細胞での抗HIV−１活性の評価
HIV＝ヒト免疫不全ウイルス
MT−４＝ヒト白血病Ｔ細胞
CEM＝ヒトリンパ芽球様Ｔ細胞
CEM細胞におけるHIV−１複製（LAI単離物）は、５日間感染後に培養上澄で逆転写酵素（RTアーゼ）を調べることにより測定する。この活性は細胞により放出されたウイルスの存在を反映する。ウイルスの吸着後に、試験化合物を様々な濃度で培地に加える。
抗ウイルス活性は、RTアーゼの産生を少くとも50％減少させる化合物の最少濃度（ED50）として表される。
非感染CEMの毒性効果は、様々な濃度の化合物の存在下で５日間のインキュベート後に、３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドをホルマザンに還元する生細胞の能力に基づく比色測定反応により評価する。結果は、ホルマザンの形成を少くとも50％阻害する化合物の最少濃度（CD50）として表される。
本発明で例として用いられた化合物は下記抗HIV活性を有する：
・化合物1:
ED50−CEM−TK-,4.10-6M（CD507.10-5M）
CEM−SS,5.10-6M（CD509.10-5M）
MT4,2.10-6M（CD509.10-5M）
・化合物2:
ED50−CEM−TK-,8.10-6M（CD508.10-5M）
CEM−SS,6.10-5M（CD5010-4M）
・化合物3:
ED50−CEM−TK-,7.10-6M（CD508.10-5M）
CEM−SS,7.10-10M（CD508.10-5M）
MT4,10-9M（CD508.10-5M）
・化合物4:
ED50−CEM−TK-,8.10-8M（CD504.10-5M）
CEM−SS,3.10-6M（CD50＞10-4M）
MT4,8.10-7M（CD502.10-5M）
この一連のデータは、ヌクレオシドモノホスフェートの細胞内放出が実際にあったことを示している。
【図１】
0003628324.tif 000007
【図２】
0003628324.tif 000008
【図３】
0003628324.tif 000009
【図４】
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【図５】
0003628324.tif 000011
【図６】
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