(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過性の隔膜によって仕切られた第１室と第２室とを作り、その第１室の隔膜上に生体細胞を形成し、生体細胞が形成された前記第１室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第２室内に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させ、その内の少なくともいずれか一方の培養液を乱流の状態で循環させながら観察を行なうことを特徴とする生体細胞観察方法。
【請求項２】
透過性の隔膜によって仕切られる溶存酸素濃度の異なる培養液の少なくともいずれか一方が乱流の状態で流れる第１室及び第２室とを有する生体細胞観察部と、生体細胞観察部の第１室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第１の培養液貯留装置と、第２室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第２の培養液貯留装置と、所定の溶存酸素濃度に維持された第１の培養液貯留装置の培養液を前記第１室内へ送り出した後、再び第１の培養液貯留装置へ戻す第１循環ポンプと、所定の溶存酸素濃度に維持された第２の培養液貯留装置の培養液を前記第２室内へ送り出した後、再び第２の培養液貯留装置へ戻す第２循環ポンプとから成ることを特徴とする生体細胞観察装置。
【請求項３】
生体細胞観察部の第１室は、隔膜上面に生体細胞が形成されると共に培養液を隔膜へ向けて送り出す供給管と、隔膜に当たった培養液を隔膜に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板とを備えていることを特徴とする請求項２記載の生体細胞観察装置。
【請求項４】
生体細胞観察部の底面に、下方から第１室内を観察する生体細胞観察窓を備えていることを特徴とする請求項２又は３のいずれかに記載の生体細胞観察装置。
【請求項５】
第１循環ポンプと第２循環ポンプは、培養液を吐出する吐出ポンプ部と吐出ポンプ部で吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部とで構成されていることを特徴とする請求項２記載の生体細胞観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、血管細胞に適する生体細胞観察方法とその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、例えば、血管細胞の動脈硬化の発生メカニズムや血管内壁面にコルステロール等が付着する発生メカニズムの究明手段は、単独で培養した血管細胞に対して、例えば、酸素濃度の変化や機械的なストレス等人工的に環境変化を作り出し、複合ストレスを血管細胞に与えることで発生メカニズムの原因を探るようにしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
発生メカニズムの原因究明は、実験室で行なわれるようになるが、実際の人体の血管にあっては、順次枝分かれしながら手、足、脳の末端まで張りめぐらされ、内側と外側では血管細胞内の溶存酸素濃度が異なるようになる点、また、枝分かれした２叉部にあっては、血管細胞のストレス要因となる複雑な血液の乱れが発生している等、生体内の環境条件とは明らかに異なる条件下で行なわれているのが現状である。このために正確な実験データとはなりにくい面があった。
【０００４】
この場合、直接人体の血管細胞を長期間にわたって観察できれば発生メカニズムの正確なデータが得られるようになるが、人体を実験として使用することは現実問題として不可能である。
【０００５】
そこで、この発明は、生体の環境条件に近い状態で生体細胞の観察が実験室において容易に行なえるようにした生体細胞観察方法とその装置を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、この発明の請求項１にあっては、透過性の隔膜によって仕切られた第１室と第２室とを作り、その第１室の隔膜上に生体細胞を形成し、生体細胞が形成された前記第１室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第２室内に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させ、その内の少なくともいずれか一方の培養液を乱流の状態で循環させながら観察を行なうことを特徴とする。
【０００７】
これにより、隔膜上に生体細胞が形成された第１室は、例えば、隔膜を介して生体細胞内側が溶存酸素濃度が高く、以下、外側へ向かうに従い溶存酸素が低くなる、いわゆる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配が確保された環境条件が得られる一方、乱流の状態で流れる培養液は、生体の血液と同じ流れが再現されることで、生体に近づいた条件下での生体細胞の観察が行なえる。この結果、正確な観察データが得られるようになる。
【０００８】
また、この発明の請求項２によれば、透過性の隔膜によって仕切られる溶存酸素濃度の異なる培養液の少なくともいずれか一方が乱流の状態で流れる第１室及び第２室とを有する生体細胞観察部と、生体細胞観察部の第１室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第１の培養液貯留装置と、第２室と接続連通し培養液を所定の溶存酸素濃度に維持する第２の培養液貯留装置と、所定の溶存酸素濃度に維持された第１の培養液貯留装置の培養液を前記第１室内へ送り出した後、再び第１の培養液貯留装置へ戻す第１循環ポンプと、所定の溶存酸素濃度に維持された第２の培養液貯留装置の培養液を前記第２室内へ送り出した後、再び第２の培養液貯留装置へ戻す第２循環ポンプとから成ることを特徴とする。
【０００９】
これにより、生体細胞を形成した隔膜を介して第１室内に溶存酸素濃度の高い培養液を、第２室に溶存酸素濃度の低い培養液をそれぞれ循環させることで、生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配が確保された環境条件が作り出せる。また、乱流の状態で流れる培養液は、生体の血液と同じ流れが再現されることで、生体に近づいた条件下で観察が行なえる観察装置の提供ができる。
【００１０】
また、この発明の請求項３によれば、生体細胞観察部の第１室に、隔膜上面に生体細胞が形成されると共に培養液を隔膜へ向けて送り出す供給管と、隔膜に当たった培養液を隔膜に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板とを備えるようにすることを特徴とする。
【００１１】
これにより、供給管から送り出された培養液は隔膜に当ることで人体の血液と同じように例えば、枝分かれした血管の２叉部に当る同一環境条件の乱流が得られるようになる。一方、隔膜に当たった新鮮な乱流の培養液は、拡散することなく誘導案内板によって隔膜上の生体細胞と長く確実に接触し合い確実にストレスを与えることが可能となる。
【００１２】
また、この発明の請求項４によれば、生体細胞観察部の底面に、下方から第１室内を観察する生体細胞観察窓を備えていることを特徴とする。
【００１３】
これにより、生体細胞観察窓の下から顕微鏡によって生体細胞の動きを２４時間自由に観察することが可能となる。
【００１４】
また、この発明の請求項５によれば、第１循環ポンプと第２循環ポンプを、培養液を吐出する吐出ポンプ部と吐出ポンプ部で吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部とで構成することを特徴とする。
【００１５】
これにより、例えば、第１，第２循環ポンプの作動時において、吐出ポンプ部によって吐出された同一の吐出量だけ吸込ポンプによって吸込むため、培養液が第１室と第２室とを仕切る隔膜上を流れる時に、第１室及び第２室の圧力差がなくなる結果、隔膜上に形成された生体細胞の剥離がなくなり安定した観察が長期間にわたって確実に行なえると共に、隔膜を介して酸素の自然な行き来が行なわれるようになる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、図１乃至図４の図面を参照しながらこの発明の実施の形態について具体的に説明する。
【００１７】
図１はこの発明に係る生体細胞観察装置１を示している。生体細胞観察装置１は、ベース３上に載置セットされた生体細胞観察部５と、第１，第２の培養液貯留装置７，９と、第１，第２循環ポンプ１１，１３とで構成されている。
【００１８】
ベース３はステンレスの材質で帯板状に作られていて、ベース３を持ち上げることで装置全体の持ち運びが可能となっている。
【００１９】
生体細胞観察部５は、上部ケース１５と下部ケース１７と観察室となるチャンバケース１９とを有している。下部ケース１７は、底部が透明板によって閉塞された開口窓２１となっていて、前記ベース３に設けられた生体細胞観察窓２３の窓枠２５に固定支持され、第２取入口２７と第２取出口２９とを有している。
【００２０】
チャンバケース１９は、フランジ部１９ａを有する上方が開放された円筒状に作られていて、底面は薄いフィルム状の透過膜で作られた隔膜３１となっている。
【００２１】
上部ケース１５は、前記下部ケース１７とでチャンバケース１９を固定支持する支持部材として機能し、第１取入口３３と第１取出口３５とを有している。上部ケース１５には下部ケース１７の上端縁に支持されたチャンバケース１９のフランジ部１９ａを上から押えつける押えフランジ３７を有している。押えフランジ３７は、下部ケース１７のケース周面に設けられたねじ部１７ａと螺合し合う締結キャップ３９によって上部ケース１５、下部ケース１７及びチャンバケース１９の三者が一体に固定支持されることで、隔膜３１を介して第１室４１と第２室４３が作られるようになっている。
【００２２】
締結キャップ３９は、図１鎖線で示すように螺合を弛めることで上部ケース１５及びチャンバケース１９の取外しが可能となり、チャンバケース１９の交換が支障なく行なえるようになっている。
【００２３】
第１，第２室４１，４３は、Ｏリング等のシール部材４５によって水密状態に仕切られると共に、隔膜３１で仕切られた上位側となるチャンバケース１９の内側が前記した第１室４１、下位側となる外側が前記した第２室４３となっている。
【００２４】
第１室４１は、前記第１取入口３３及び第１取出口３５と、第２室４３は、前記第２取入口２７及び第２取出口２９とそれぞれ接続連通している。
【００２５】
第１室４１には、第１取入口３３からの培養液４７を隔膜３１へ向けて送り出し隔膜３１へ当てることで乱流を作り出す供給管４９と、隔膜３１に当たった培養液４７を隔膜３１に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板５１とを備えている。
【００２６】
この場合、隔膜３１と対向し合う前記誘導案内板５１の案内面５１ａを中心から外周へ向かって上昇するテーパ面としてもよい。
【００２７】
第１，第２の培養液貯留装置７，９は、図３に示すようにベース３の上面に並列に配置されていて、第１の培養液貯留装置７は生体細胞観察部５の第１室４１用、第２の培養液貯留装置９は生体細胞観察部５の第２室４３用となっている。
【００２８】
第１の培養液貯留装置７は、図１に示すように循環用入口５３及び循環用出口５５とを有する貯留タンク５７内に、培養液４７と溶存酸素検出センサ５９と撹拌子６１とを備え、その外に、フィルタ６３を介して大気中から酸素を取入れる大気取入口６５とを有している。
【００２９】
培養液４７は、溶存酸素濃度が大気と平衡状態にある濃度で、主成分はおもにリポタンパクと白血球とを含んでいる。
【００３０】
溶存酸素検出センサ５９は、培養液４７の溶存酸素濃度を大気と平衡状態となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ５９により溶存酸素濃度を酸素分圧として監視し、その検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口６７から吸引を行ない、大気取入口６５から空気を取入れることで、培養液４７内の酸素分圧が約２０％となるよう制御管理されるようになっている。
【００３１】
撹拌子６１は、貯留タンク５７の底部にセットされた駆動モータ６９によって磁石７１が回転することで、磁石７１の磁力により回転力が与えられ内部の培養液４７を撹拌するよう機能する。
【００３２】
第１循環ポンプ１１は、培養液４７を吐出する吐出ポンプ部７３と吐出ポンプ部７３で吐出された同一吐出量の培養液４７を吸込む吸込ポンプ部７９とで構成され、この実施形態では、一方が吐出ポンプ部７３になると、他方が吸込ポンプ部７９とに交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【００３３】
即ち、左右一対のダイヤフラム８１，８１によって独立した第１ポンプ室８３と第２ポンプ室８４が形成され、第１，第２ポンプ室８３，８４のポンプ取入口８５，８５とポンプ取出口８７，８７には、ポンプ取入口８５からポンプ取出口８７へのみ流れを許す一方向弁８９，８９がそれぞれ設けられている。
【００３４】
ダイヤフラム８１は、駆動モータ９１からの回転動力が偏心カム軸９３によって駆動リンク９５が図１矢印のように往復運動が与えられることで、例えば、第１ポンプ室８３内が圧縮されることで第１ポンプ室８３が吐出ポンプ部７３として機能するようになる。同時に第２ポンプ室８４内が拡大することで第２ポンプ室８４が吸込ポンプ部７９として機能し、第１，第２ポンプ室８３，８４のいずれか一方が吐出ポンプ部になると、他方が吸込ポンプ部となる形状となっている。
【００３５】
一方、第２の培養液貯留装置９は、図２に示すように循環用入口５３ａ及び循環用出口５５ａとを有する貯留タンク５７ａ内に、培養液４７ａと溶存酸素検出センサ５９ａと撹拌子６１ａとを備え、その外に、フィルタ６３ａを介して大気中から酸素を取入れる大気取入口６５ａとを有している。
【００３６】
培養液４７ａは、溶存酸素濃度が大気と平衡状態にある濃度より十分低い濃度で、主成分はおもにリポタンパクを含んでいる。
【００３７】
溶存酸素検出センサ５９ａは、培養液４７ａの溶存酸素濃度を大気と平衡状態にある濃度より十分低い濃度となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ５９ａにより溶存酸素濃度を酸素分圧として監視し、その検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口６７ａから吸引を行ない、ガス取入口６５ａから低い酸素濃度のガスを取入れることで、培養液４７ａ内の酸素分圧が約５％となるよう制御管理されるようになっている。
【００３８】
撹拌子６１ａは、貯留タンク５７ａの底部にセットされた駆動モータ６９ａによって磁石７１ａが回転することで、磁石７１ａの磁力により回転力が与えられ内部の培養液４７ａを撹拌するよう機能する。
【００３９】
第２循環ポンプ１３は、培養液４７ａを吐出する吐出ポンプ部７３ａと吐出ポンプ部７３ａで吐出された同一吐出量の培養液を吸込む吸込ポンプ部７９ａとで構成され、この実施形態では、一方が吐出ポンプ部７３ａになると、他方が吸込ポンプ部７９ａとに交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【００４０】
即ち、左右一対のダイヤフラム８１ａ，８１ａによって独立した第１ポンプ室８３ａと第２ポンプ室８４ａが形成され、第１，第２ポンプ室８３ａ，８４ａのポンプ取入口８５ａ，８５ａとポンプ取出口８７ａ，８７ａには、ポンプ取入口８５ａからポンプ取出口８７ａへのみ流れを許す一方向弁８９ａ，８９ａがそれぞれ設けられている。
【００４１】
ダイヤフラム８１ａは、駆動モータ９１ａからの回転動力が偏心カム軸９３ａによって駆動リンク９５ａが図２矢印のように往復運動が与えられることで、例えば、第１ポンプ室８３ａ内が圧縮されることで第１ポンプ室８３ａが吐出ポンプ部７３ａとして機能するようになる。同時に第２ポンプ室８４内が拡大することで第２ポンプ室８４ａが吸込ポンプ部７９ａとして機能し、第１，第２ポンプ室８３ａ，８４ａのいずれか一方が吐出ポンプ部になると、他方が吸込ポンプ部となる形状となっている。
【００４２】
第１，第２ポンプ室８３ａ，８４ａのポンプ取入口８５ａ，８５ａは、第２の培養液貯留装置９の循環用出口５５ａ及び第２室４３の第２取出口２９と、ポンプ取出口８７ａ，８７ａは前記第２室４３の第２取入口２７及び第２の培養液貯留装置９の循環用入口５３ａとシリコン製のゴムチューブ１０１を介してそれぞれ接続連通している。
【００４３】
シリコン製のゴムチューブ９９，１０１は、チャンバケース１９を交換する際に上部ケース１５を下部ケース１７から取外す際に、自由に屈曲することで、上部ケース１５の取外しに何等支障が起きないようになっている。
【００４４】
なお、シリコン製のゴムチューブ９９，１０１には三方弁１０３が設けられている。この三方弁１０３は、初期作動時に第１，第２循環ポンプ１１，１３を作動しながら弁体１０３ａを開とすることで、チューブ９９，１０１内及び第１，第２室４１，４３内のガスを外へ排出するよう機能する。
【００４５】
次に、装置を使って生体細胞の観察方法について説明する。まず、図４に示すように隔膜３１上面に生体細胞となる血管細胞Ｗを形成したチャンバケース１９をセットする。次に、第１，第２循環ポンプ１１，１３を駆動し、第１，第２の培養液貯留装置７，９の溶存酸素濃度の異なる培養液４７，４７ａを生体細胞観察部５の第１室４１と第２室４３内をそれぞれ通過させる。この時、第１室４１内に乱流が作られると共に、再び第１，第２循環ポンプ１１，１３へ戻るよう循環させながら観察を行なう。
【００４６】
この場合、血管細胞Ｗは内側が内皮細胞、外側となる隔膜３１と接触し合う側が平滑筋細胞となっていて、内皮細胞は乱流によるストレスの要因で機能変化をもたらし血管壁に病変形成に大きく関与する生理活性分子が生れる。例えば、血流中の白血球を減速して内皮細胞表面に接着させる細胞間接着因子を発現させたりあるいは細胞マトリックス内に取り込まれたマクロファージを分化させて異物取り込みの能力亢進や増殖させるマクロフージコロニー刺激因子や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が産生される。
【００４７】
一方、平滑筋細胞は、溶存酸素濃度、特に、低濃度溶存酸素環境によるストレスの要因で機能変化をもたらし、病変形成に大きく関与する多様な生理活性分子が生れる。例えば、低濃度溶存酸素下において、内皮細胞に接着した白血球を平滑筋とコラーゲンとで形成された血管壁細胞マトリックス内へ移動させる因子を発現させたり、あるいは、血管壁内に取り込まれた白血球の遊走を抑制して、その場にとどめる働らきを持つ因子が産生されるようになる。
【００４８】
この観察時において、隔膜３１上面に血管細胞Ｗが形成された第１室４１内には、溶存酸素濃度の高い培養液が、第２室４３内には、溶存酸素濃度の低い培養液がそれぞれ循環する。この培養液の循環時において、吐出ポンプ部７３と吸込ポンプ部７９とにより第１，第２室４１，４３に圧力差が発生することがなくなり、血管細胞Ｗの剥離は起きない。
【００４９】
また、血管細胞Ｗの内側が酸素濃度が高く、外へ行くほど酸素濃度が低くなる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配の環境条件が作り出せる。と同時に、培養液４７が隔膜３１に当ることで乱流が作られ、乱流は、誘導案内板５１によって拡散することなく血管細胞Ｗに確実にストレスを与えることが可能になるため、生体に近づいた血管細胞Ｗの観察が正確に行なえるようになる。
【００５０】
一方、ベース３を持って図外の顕微鏡に生体細胞観察窓２３をセットすることで２４時間顕微鏡による血管細胞Ｗの観察が可能となる。
【００５１】
【発明の効果】
以上のように請求項１の発明あっては、生体内と同じ環境条件下での生体細胞の観察を行なうことができるため、正確な観察データが得られる。
【００５２】
また、請求項２の発明にあっては、生体細胞の内側を溶存酸素濃度が高く、外側へいくにしたがって溶存酸素濃度が低くなる生体内の血管細胞と同じ酸素濃度勾配の環境条件が作り出せる。また、乱流によって人体の血液と同じ流れを再現できる。
【００５３】
また、請求項３の発明にあっては、誘導案内板によって乱流を拡散させることなく確実に作用させ生体細胞に確実にストレスを与えることができる。
【００５４】
また、請求項４の発明にあっては、生体細胞観察窓から顕微鏡によって生体細胞の動きを２４時間自由に観察することができる。
【００５５】
また、請求項５の発明にあっては、第１室と第２室の圧力差をなくすことができるため、生体細胞の剥離がなくなり、安定した観察が長期間にわたって確実に行なえるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明にかかる生体細胞観察装置の第１室側の培養液の流れを示した概要説明図。
【図２】生体細胞観察装置の第２室側の培養液の流れを示した概要説明図。
【図３】生体細胞観察装置の概要平面図。
【図４】生体細胞観察部の拡大説明図。
【符号の説明】
３  ベース
５  生体細胞観察部
７，９  第１，第２の培養液貯留装置
１１，１３  第１，第２循環ポンプ
２３  生体細胞観察窓
３１  隔膜
４１  第１室
４３  第２室
４７，４７ａ  培養液
４９  供給管
５１  誘導案内板
７３  吐出ポンプ部
７９  吸込ポンプ部
【図１】
0003655558.tif 000002
【図２】
0003655558.tif 000003
【図３】
0003655558.tif 000004
【図４】
0003655558.tif 000005