(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３グルコシル化合物に、ストレプトマイセス属に属する微生物から得られるβ−１，３グルカナーゼを作用させラミナリペンタオースを製造する方法であって、反応系に金属塩を添加することを特徴とするラミナリペンタオースの製造方法。
【請求項２】
β−１，３グルコシル化合物が精製したβ−１，３グルコシル化合物である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
β−１，３グルコシル化合物がカードランあるいはパキマンである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
金属塩の添加量が０．５〜５００ｍＭである請求項１から３のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項５】
金属塩が１価または２価の金属塩であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項６】
金属塩がナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンの塩から選ばれる請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
金属塩が塩化物である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
金属塩の添加量が５〜１００ｍＭである請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
ストレプトマイセス属に属する微生物がストレプトマイセスマテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）である請求項１〜８のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は食品添加物、化粧品・医薬基剤、医薬品原料等に有用なラミナリペンタオースの酵素的生産法に関し、特にその高純度品を高収率かつ容易に取得する方法に係る。
【０００２】
【従来の技術】
ラミナリペンタオース（以下ＬＰと略記する）は、グルコースがβ−１，３グルコシド結合からなる５糖のオリゴ糖であり、近年医薬品原料などへの利用が研究されており、大量かつ高純度の生産が切望されている。ＬＰを得る手段としては、本出願人による特公平４−３７７１９号に、ストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８（Streptomyces Matensis DIC-108）に由来するβ−１，３グルカナーゼＦｉＩを用いて粗精製品のβ−１，３グルコシル化合物を分解し、ＬＰを特異的に生産し得ることが開示されている。しかし、医薬品原料として使用する場合高純度のＬＰが必要とされるが、粗精製品のβ−１，３グルコシル化合物をそのまま酵素反応に使用すると、粗精製ゆえに不純物を多く含んでおり、これが生成ＬＰ中に混入し、しかも除くのが困難であるため満足のいく純度が得られなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ＬＰを高純度でしかも収率良く製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は高純度でしかも収率良くＬＰを製造する方法について鋭意研究をした結果、酵素反応系に金属塩を添加することにより、精製したβ−１，３グルコシル化合物からの分解であっても、高収率でＬＰを得られることを見いだし本発明を完成するに至った。即ち本発明は、β−１，３グルコシル化合物に、ストレプトマイセス属に属する微生物から得られるβ−１，３グルカナーゼを作用させＬＰを製造する方法であって、反応系に金属塩を添加することを特徴とするＬＰの製造方法に関する。
【０００５】
本発明において用いられるβ−１，３グルコシル化合物としては、グルコースがβ−１，３グリコシド結合している多糖であればいかなるものでも良く、側鎖の有無や種類によって限定されるものではない。例えば、側鎖を持たない直鎖状のものとしてはカードランやパラミロン等が、側鎖を持つものとしてはパキマンやラミナラン、シゾフィラン等が、また酵母細胞壁またはその部分分解物等が挙げられる。好ましくは、カードランやパキマンが挙げられる。
【０００６】
本発明で用いるβ−１，３グルカナーゼとは、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物から得られる酵素であり、β−１，３グルコシル化合物に作用させると、これを加水分解し、ＬＰを主成分とする分解生成物を生産する能力を有する酵素であればどのような酵素でも良いが、ストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８（Streptomyces Matensis DIC-108）菌株を培養して得られるラミナリペンタオース生産酵素（以下ＬＰＨａｓｅと称する）が、ＬＰを高収量で生産するのでより好ましい。ここでいうストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株とは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第２５３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５３）として国際寄託されているストレプトマイセス  エスピ−ＤＩＣ−１０８（Streptomyces sp DIC-108）と同一であり、ＬＰＨａｓｅは本出願人による特公平４−３７７１９号記載のβ−１，３グルカナーゼＦｉＩと同一である。
【０００７】
ＬＰＨａｓｅの製造方法、精製方法、特徴等の詳細は、特公平４−３７７１９号に記載されているとおりであるが、ＬＰＨａｓｅの特徴の概略を説明すると、作用ｐＨは３．０〜９．０、至適ｐＨは５．０〜６．０、作用温度は４０〜７５℃、至適温度は５０〜６０℃、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求められる分子量は約４万である。単一酵素を得るためではなくＬＰ生成反応に供する目的でのＬＰＨａｓｅの精製方法としては、ＤＩＣ−１０８菌株の培養液遠心上清を緩衝液、例えば１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で交換し、同緩衝液で平衡化したイオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ  ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  Ａ−２００を詰めたカラムに通す。その素通り画分をもってＬＰＨａｓｅ画分とする。
【０００８】
また本発明で製造されるラミナリペンタオース（ＬＰ）とはグルコースがβ−１，３グリコシド結合でつながっている重合度が５の直鎖状オリゴ糖であり、Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドで表される化合物である。
【０００９】
本発明で使用する金属塩としては一価、二価または三価の塩、例えばナトリウム、カリウム等の一価の塩、カルシウム、マグネシウム、マンガン等の二価の塩、アルミニウム等の三価の塩が挙げられる。ＬＰ収率向上の程度が高いことから、好ましくは一価または二価の塩であり、特に好ましくは二価の塩が用いられる。相手アニオンには特に制限はなく、塩酸化物、硫酸化物、リン酸化物、硝酸化物等が挙げられ、好ましくは塩酸化物が挙げられる。従って本発明においては、特に二価の金属の塩化物が好ましく用いられる。
【００１０】
以下具体的に本発明によりＬＰを製造する方法について説明する。
本発明においてＬＰを製造するには、高純度のＬＰを得るためにまず粗精製β−１，３グルコシル化合物から洗浄処理等により不純物を除き、精製β−１，３グルコシル化合物を調製する。洗浄方法としては例えば、β−１，３グルコシル化合物を１０倍重量以上、好ましくは２０〜８０倍の水あるいは水／水溶性有機溶媒の混合液に懸濁し、用いる溶媒量によっても異なるが、５分〜１時間程度、好ましくは１０分〜３０分程度攪拌した後、遠心分離又は濾過により水分を除く方法が挙げられる。ここでいう水溶性有機溶媒としてはメタノール、エタノール、アセトン、プロパノール等が挙げられ、好ましくは、メタノール、エタノールが挙げられる。以上の操作を必要とするＬＰの純度に応じて数回繰り返し精製品とする。精製品としては乾燥させたものでもよいし、未乾燥のまま使用してもよい。
【００１１】
次に上記のようにして得られた精製β−１，３グルコシル化合物に反応緩衝液、β−１，３グルカナーゼを加え、これを反応系とする。反応緩衝液は１０ｍＭ程度が好ましく、緩衝液のｐＨはｐＨ３．０〜９．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．０である。緩衝液の種類は特に限定されるものではないが、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液等を用いることができ、好ましくは酢酸緩衝液である。またβ−１，３グルカナーゼはβ−１，３グルコシル化合物１ｇに対して５〜４０μｇ、好ましくは１０〜２０μｇ加えることが良い。
【００１２】
本発明は上記の反応系に更に金属塩を添加し、反応液とする。金属塩の添加は特に順序は問わず、β−１，３グルカナーゼを添加する前に添加しても構わない。金属塩の添加濃度は用いる金属塩の種類によっても異なるが、通常０．５〜５００ｍＭであれば良く、添加量が多いほどＬＰの収率が向上するというわけではない。従って好ましくは０．５〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭ、特に好ましくは１０〜５０ｍＭである。金属塩を添加した反応系中のβ−１，３グルコシル化合物の濃度は、粘度や凝固性などを考慮して決定し、例えばカードランにおいては１０％以下、好ましくは１〜１０％である。
【００１３】
次に上記反応液を通常４０〜７５℃、好ましくは５０〜６０℃の温度条件下で適当時間、一般に１０時間〜３日間攪拌しながら反応させる。反応時間はＬＰ生成量を経時的に測定しながら判断することがより好ましく、反応条件等により異なるが、例えば反応液中のＬＰ収率が約５０〜７０％となった時点で反応を終了させることが好ましい。次いで反応終了後、遠心分離あるいは濾過により未分解グルカンなどの固形分を除く。得られた上清、即ちＬＰ溶液を乾燥して、粉末状のＬＰを得る。
【００１４】
このようにすることで、ＬＰ収率は、金属塩を添加しない場合５％程度であったのに対し、６０〜７０％にまで上昇し、更にＬＰ粉末の着色も認められず、高純度のＬＰを得ることができる。本発明の作用機構については明らかではないが、金属塩による、ＬＰＨａｓｅの活性化及び／またはβ−１，３グルコシル化合物への何らかの影響に起因するものと推定される。特に後述する実施例及び比較例で示すように、精製したβ−１，３グルコシル化合物を原料として使用した場合、金属塩を添加しないと著しく収率が低下するが、金属塩の添加により、粗精製ＬＰを用いた場合と同程度またはそれ以上の収率で高純度のＬＰを得る事ができ、粗精製ＬＰを用いた場合と異なり、後の精製工程が不要となる。
【００１５】
【実施例】
以下、比較例および実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。尚、例中の％は重量基準である。
（実施例１）  一価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
粗精製カードラン（武田薬品製カードラン）を５０倍重量の蒸留水中で１０分間攪拌し、遠心分離又は濾過により脱水した。これに再び蒸留水を加え、同様の操作を２回繰り返すことにより、精製カードランを得た。
【００１６】
得られた精製カードランに、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５％懸濁液とした。該懸濁液に、塩化ナトリウムを５、１０、２０、４０、６０、８０、１２０ｍＭ添加した。更に特公平４−３７７１９号に記載した方法により、ストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８を培養して得られたＬＰＨａｓｅを１２μｇ／ｇカードランとなるように添加し、５５℃にて振盪しながら２０時間反応させた。反応後、遠心分離により未分解カードランを除去し、清澄なＬＰ溶液を採取、これを乾燥させることによりＬＰの粉末を得た。ＬＰの検出はＨＰＬＣ（カラム：東ソーＡｍｉｄｅ８０、溶離液：６０％アセトニトリル水溶液）にて行った。
結果を図１に示した。ＬＰの収率は最大で約４５％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００１７】
（実施例２）  一価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウムを添加したこと以外は、実施例１と同様にＬＰを製造した。結果を図１に示した。ＬＰの収率は最大で約５０％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００１８】
（実施例３）  二価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを０．５、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ添加したこと以外は、実施例１と同様にＬＰを製造した。結果を図２に示した。ＬＰの収率は最大約７０％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００１９】
（実施例４）  二価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
塩化カルシウムの代わりに塩化マグネシウムを添加したこと以外は、実施例３と同様にＬＰを製造した。結果を図２に示した。ＬＰの収率は最大約５５％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００２０】
（実施例５）  二価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
塩化カルシウムの代わりに塩化マンガンを添加したこと以外は、実施例３と同様にＬＰを製造した。結果を図２に示した。ＬＰの収率は最大約５５％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００２１】
（実施例６）  三価の金属塩添加による精製カードランからのＬＰの製造
塩化ナトリウムの代わりに塩化アルミニウムを５、１０、２０ｍＭ添加したこと以外は、実施例１と同様にＬＰを製造した。結果を図３に示した。ＬＰの収率は最大約２０％であり、得られたＬＰに着色は認められず、純度の向上も確認できた。
【００２２】
（比較例１）  粗精製カードランからのＬＰの製造
粗精製カードラン（武田薬品製カードラン）に実施例１と同様の酢酸緩衝液を加え、５％懸濁液とした。更に実施例１と同様のＬＰＨａｓｅを１２μｇ／ｇカードランとなるように添加し、５５℃にて振盪しながら２０時間反応させた。反応後、遠心分離により未分解カードランを除去し、清澄なＬＰ溶液を採取、これを乾燥させることによりＬＰ粉末を得た。ＬＰの収率は６２％であったが、得られたＬＰには褐色物質をはじめとする不純物の混入が認められた（図４参照）。ＬＰの検出はＨＰＬＣ（カラム：東ソーＡｍｉｄｅ８０、溶離液：６０％アセトニトリル水溶液）にて行った。
【００２３】
（比較例２）  精製カードランからのＬＰの製造
粗精製カートランの代わりに、実施例１と同様にして得られた精製カードランを用いたこと以外は比較例１と同様にＬＰを製造した。得られたＬＰに着色は認められなかったが、収率は５％であった（図４参照）。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度のＬＰを効率よく生産することが可能であり、工業的に有利な方法で、医薬品開発などへの大量・安価な供給を可能にするものである。特に後述する実施例及び比較例で示すように、精製したＬＰを原料として使用した場合、金属塩を添加しないと著しく収率が低下するが、金属塩の添加により、粗精製ＬＰを用いた場合と同程度またはそれ以上の収率で高純度のＬＰを得る事ができ、粗精製ＬＰを用いた場合と異なり、後の精製工程が不要となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法のうち、反応系に一価の金属塩を種々の濃度で添加した際のＬＰ製造結果を示した。
【図２】本発明の方法のうち、反応系に二価の金属塩を種々の濃度で添加した際のＬＰ製造結果を示した。
【図３】本発明の方法のうち、反応系に三価の金属塩を種々の濃度で添加した際のＬＰ製造結果を示した。
【図４】従来の方法、即ち塩無添加による、粗精製カードラン及び精製カードランからのＬＰ製造反応の結果を示した。
【図５】図１から図４をまとめ、比較したグラフ。精製は金属塩無添加、その他は各金属塩を最適濃度で加えたときのＬＰ収率である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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