(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９２番目のアミノ酸がグルタミンまたはグルタミン酸に置換され、４９３番目のアミノ酸がグリシンに置換された肝実質細胞増殖因子誘導体。
【請求項２】
肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９２番目のアミノ酸がグルタミンまたはグルタミン酸に置換され、４９３番目のアミノ酸がグリシンに、４９４番目のアミノ酸がアルギニンに置換された肝実質細胞増殖因子誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規肝実質細胞増殖因子誘導体、該誘導体をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入された形質転換細胞、及び該誘導体の製造方法に関わる。さらに、本発明の肝実質細胞増殖因子誘導体のＰＴＣＡ処置等による血管損傷を伴う疾患の治療薬としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ    ｇｒｏｗｔｈ    ｆａｃｔｏｒ、以下ＨＧＦという）は、初代培養ラット肝細胞のＤＮＡ合成促進物質として、ラット血液中［Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．  Ｎａｗａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｃｈｉｈａｒａ，  Ａ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １２２，  １４５０  （１９８４）．］で初めて見いだされ、部分精製により既知の細胞増殖因子とは異なる因子であることが明かとなった。その後、ヒトｃＤＮＡがクローニングされ、全一次構造が決定された［Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ４４０  （１９８９）．Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６３，９６７（１９８９）．］。
【０００３】
ＨＧＦは、４６３アミノ酸残基のα鎖と２３４アミノ酸残基のβ鎖から成るヘテロダイマーである。ＨＧＦは、Ｎ末端に３１アミノ酸残基のシグナルペプチドを有する７２８アミノ酸残基からなる１本鎖の前駆体として合成される。ＨＧＦの活性化はセリン系プロテアーゼ［Ｍｉｙａｚａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  １００２４  （１９９３）］によるプロセッシングであり、Ｎ末端から４９４番目のアルギニンと４９５番目のバリンのペプチド結合が切断され、２本鎖構造［Ｎａｋａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７  ２０１１４  （１９９２）  ］をとることである。
【０００４】
当初、ＨＧＦは肝実質細胞に対する特異的な増殖因子であると考えられていたがその後、内皮細胞、上皮細胞の増殖活性［Ｒｕｂｉｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８，  ４１５  （１９９１）．］、上皮細胞の分散活性［Ｍａｔｕｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  １９６，  １４４  （１９９１）．］を有することが明かとなった。また、血管内皮細胞の増殖活性促進によるｉｎ ｖｉｖｏでの血管管腔形成能［Ｄｅｒｒｉｃｋ，  Ｓ．  Ｇｒａｎｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９０  ，１９３７  （１９９３）］を有することが明かとなった。
【０００５】
ＨＧＦは、細胞増殖活性の他、細胞運動性促進活性、形態形成誘導活性、巨核球刺激活性等を有する多機能な因子であるため、標的部位以外での活性型ＨＧＦの作用は副作用が懸念される。従って、血管損傷部位で特異的、且つ速やかに活性化するＨＧＦが得られれば、損傷を受けた内皮細胞に特異的な作用が可能となり、上記問題点が解決、または、軽減する事が期待され、その開発の意義は極めて大きい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子工学的手法により新規ＨＧＦ誘導体を作製し、正常状態ではＨＧＦを不活性型として存在させ、血管内皮細胞損傷部位で特異的に活性化する事で、血管損傷部位の内皮細胞を標的とした治療を可能とするＨＧＦ誘導体を、提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９２番目から４９４番目のアミノ酸配列が、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグリシン、セリン、スレオニン、のうちいずれか一つ）に置換された肝実質細胞増殖因子誘導体によって解決される。また、肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９３番目のアミノ酸がグリシンに置換された肝実質細胞増殖因子誘導体によっても解決される。さらに上記課題は、これらの肝実質細胞増殖因子誘導体を有効成分として含有する医薬品組成物によっても解決される。
【０００８】
血管損傷部位では、損傷内皮細胞上で、血小板の活性化した組織因子が血液凝固因子と複合体を形成し、血液凝固反応系の活性化が起こる。血液凝固因子である活性型第Ｘ因子は、基質特異性が高く、プロトロンビンを特異的に活性化する。
第Ｘ因子の認識アミノ酸配列はＧｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグリシン、セリン、スレオニン、のうちいずれか一つ）である。
【０００９】
ＨＧＦは、不活性型の１本鎖を、Ｎ末端から４９４番目のアルギニンのＣ末端側で切断され、ヘテロダイマーを形成することで活性型となる［Ｍｉｚｕｎｏ，  Ｋ．  Ｔａｋｅｈａｒａ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １８９，  １６３１  （１９９２）］。本発明者らは、その切断領域を改変することにより、活性を制御可能となる事を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、ＨＧＦのＮ末端より、４９１番目から４９５番目のアミノ酸配列を血液凝固第Ｘ因子の認識可能なアミノ酸配列に改変することにより、血管損傷部位で特異的に活性化する新規ＨＧＦ誘導体を作製した。
【００１１】
投与方法としては、静注投与、または筋肉注射、またはコラーゲンゲルと調合して局所へ注入することが望ましい。
投与量は、投与方法により異なるが、静注投与の場合、新規ＨＧＦ誘導体を、体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１００μｇを数日に渡り、４回以上投与する。
【００１２】
本発明のＨＧＦ誘導体は、主に、遺伝子工学的手法、または、タンパク質工学的手法によって達成されるものである。以下に、本発明の新規ＨＧＦ誘導体の作製方法について詳細に説明するが、目的のＨＧＦ誘導体が得られれば、作製方法はこれに限定しない。
【００１３】
ＨＧＦ、またはその一部、或いはその改変体、誘導体をコードするＤＮＡをほ乳類動物細胞用発現プラスミドベクターに組み込む。この時用いるプラスミドは、宿主中でＨＧＦ誘導体を産生できるものであれば良いが、ｐＧＭ、ｐＫＣＲ、ｐＳＶＬ等が好ましく、特にｐＧＭが好ましいい。プラスミドに組み込まれたＨＧＦｃＤＮＡの目的の領域に変異を導入する。変異の導入は、インビトロミュータゲネシスシステム  Ｖｅｒ２．１（アマシャム社製）を用いると便利であるが、他の方法でも良い。又、予めＨＧＦｃＤＮＡに、変異を導入させた後に、ほ乳類動物細胞用発現ベクターに組み込んでも良い。
【００１４】
変異を導入したＨＧＦｃＤＮＡを組み込んだプラスミド、または、変異を導入したＨＧＦｃＤＮＡをほ乳類動物細胞にトランスフェクションする。この時の宿主としては、ＣＯＳ１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等のほ乳類動物細胞を用いるのが望ましいが、この限りではない。トランスフェクションの方法としては、リポフェクチン（ギブコ社製）等のリポソームを用いる方法や、燐酸カルシウム法［Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７，  ２７４５  （１９８７）．］、ＤＥＡＥデキストラン法［Ｍａｅｓ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｉｓ．  Ａｃｔａ  １３４，２６９  （１９６７）］、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、その他の方法でも良い。
【００１５】
得られた形質転換細胞を、数日間適切な培地中で培養する。培地はイーグルＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等を例として挙げる事ができ、必要に応じて添加物を加える。培養は、通常３７℃で、５％二酸化炭素存在下で行われるが、細胞が生育すればこれに限定はしない。数日間の培養を行った後、培養上清を回収する。得られた培養上清を抗体、またはヘパリン等のアフィニティカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。精製品は更に、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）等にたいし透析、または、セントリコン１０（グレースジャパン社製）にかけることにより、適当な塩濃度に調製する事ができる。
【００１６】
【実施例】
次に、本発明のＨＧＦ誘導体の調整法、およびその薬理作用について具体的に述べる。
【００１７】
［ＨＧＦ誘導体の作製］
発現ベクターに使用するプラスミドｐＣＤＬ−ＳＲα２９６［Ｔａｋｅｂｅ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８，４６６（１９８８）．］のプロモーター領域の下流にＢｇ１２認識部位を設けた後、Ｓａｌ１で消化した。このプロモーター領域を含むＳａｌ１消化断片とｐＳＧ５（フナコシ社製）のｆ１  ｏｒｉを含むＳａｌ１消化断片とを結合させてｐＧＭベクターを構築した。このｐＧＭベクターをＢｇ１２で消化し、ＨＧＦｃＤＮＡのＢａｍＨ１断片を結合することによりｐＧＭ／ＨＧＦを作製した。構築した発現プラスミドを図１に示す。
【００１８】
このＨＧＦｃＤＮＡを組み込んだほ乳類動物細胞発現ベクターｐＧＭ／ＨＧＦを用いて、ＨＧＦｃＤＮＡに対してＨＧＦのアミノ酸配列のＮ末端より４９１番目から４９５番目のアミノ酸配列が配列番号１〜４に記載したアミノ酸配列と置換されるように点突然変異を導入した。点突然変異の導入については、インビトロミュータゲネシスシステム    Ｖｅｒ２．１（アマシャム社製）を用いて行った。突然変異の導入で使用したＤＮＡプライマーは、自動ＤＮＡ合成機ＭＯＤＥＬ３９２（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてホスフェイト法により化学合成し、それぞれの配列は配列番号５〜８に記載した。
【００１９】
配列番号１〜４で置換して得られたＨＧＦ誘導体（ＦＸ１〜４）の突然変異を導入した箇所を以下に示す。
ＦＸ１：４９１番目のリジンをイソロイシンに置換、且つ、４９２番目のグルタミンをグルタミン酸に置換、且つ、４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且つ、４９５番目のバリンをスレオニンに置換。
ＦＸ２：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且つ、４９５番目のバリンをイソロイシンに置換。
ＦＸ３：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且つ、４９５番目のバリンをスレオニンに置換。
ＦＸ４：４９３番目のロイシンをグリシンに置換。
【００２０】
［ＨＧＦ誘導体の精製］
配列番号１〜４のアミノ酸配列に置換されるように突然変異を導入したプラスミドベクターをそれぞれＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした。即ち、直径１００ｍｍの組織培養用デイッシュに、６ｘ１０５個のＣＯＳ１細胞をまき、一晩、３７℃で、５％二酸化炭素存在下で培養した。細胞を燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、５μｇのｐＧＭ／ＨＧＦを含む４ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン培地（５０ｍＭ    トリス    ｐＨ７．４／ＤＭＥ培地／０．４ｍｇ／ｍｌ    ＤＥＡＥ−デキストラン溶液）を加え、４時間培養した後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、クロロキン−ＤＭＥ培地（１００μＭ    クロロキン／２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地）を加えた。２．５時間、３７℃で、５％二酸化炭素存在下で培養する事により、ｐＧＭ／ＨＧＦをＣＯＳ１細胞に取り込ませた。トランスフェクション後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、ＤＭＥ培地を１０ｍｌ加え、３７℃で、５％二酸化炭素存在下で３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【００２１】
培養上清中に含まれているＨＧＦ誘導体をヘパリンアフィニティクロマトクロマトグラフィーにより精製した。システムは島津製作所製のＬＣ７Ａ型高速液体クロマトグラフを用い、カラムはＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ    ５ＰＷカラム（東ソー社製）を使用した。まず、カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラムを平衡化し、培養上清をカラムにかけ、ＨＧＦ誘導体を吸着させた。０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラムを洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸緩衝液存在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直線濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体を溶出した。溶出塩濃度０．９Ｍから１．２Ｍの画分をＨＧＦ溶出画分とした。得られた溶出画分を燐酸緩衝液に透析する事により、ＨＧＦ誘導体の精製品を得た。
【００２２】
［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］
得られたＨＧＦ誘導体（ＦＸ４）精製品を５０ｍＭトリス／塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール／０．１％ｖ／ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）の緩衝液中に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理を行い、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７，  ６８０  （１９７０）  ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとしては、０．１２５Ｍ    トリス（ｐＨ６．８）／０．１％ＳＤＳ／０．０２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリルアミドゲルを用いた。分離ゲルのアクリルアミド濃度は９％に調製した。電気泳動終了後、シルベストステインキット（ナカライテスク社製）を用いて、ゲルの銀染色を行い、ゲル上のバンドとしてＨＧＦ誘導体を検出した。
【００２３】
結果、ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地から精製して得られたＨＧＦは約３２ＫＤａと５７ＫＤａのヘテロダイマー構造であるのに対し、ＨＧＦ誘導体いずれもは約９０ＫＤａの一本鎖構造であった。つまり、ＨＧＦ誘導体は、血清中のＨＧＦ活性化酵素による修飾を受けず、不活性型の構造を維持していることが明らかとなった。
【００２４】
［ＨＧＦ誘導体のＦａＸａ反応性］
得られた１本鎖のＨＧＦ誘導体（ＦＸ１〜４）精製品各３０ｎｇ及び無血清培地（ＤＭＥ培地）で培養して得られた１本鎖のＨＧＦ３０ｎｇに、活性型血液凝固第Ｘ因子（ＦａＸａ、シグマ社製）をそれぞれ６００ｎｇ加えて、トリス緩衝液中で３７℃で、５分、１０分、３０分、６０分間インキュベートした。
【００２５】
反応後のＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦは、５０ｍＭトリス／塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール／０．１％ｖ／ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）の緩衝液中に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理を行い、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［Ｕ．  Ｋ．  Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７，  ６８０  （１９７０）  ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとしては、０．１２５Ｍ    トリス／塩酸（ｐＨ６．８）／０．１％ＳＤＳ／０．０２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリルアミドゲルを用いた。分離ゲルのアクリルアミド濃度は９％に調製した。電気泳動終了後、ゲルを１０％メタノール／１０ｍＭＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、ナカライテスク社製）緩衝液に３０分間浸し、平衡化した。同時に、タンパク質を転写するポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜は、１００％メタノールに１０秒間浸した後、１０％メタノール／ＣＡＰＳ緩衝液に浸して平衡化した。平衡化されたＰＶＤＦ膜をゲルに対して陽極側に密着させ、その両側をろ紙、スポンジパッドの順にゲルホルダーではさみ、ブロッティング装置（Ｂｉｏ    Ｒａｄ社製）にセットして緩衝液で満たした。電気泳動槽には１００Ｖの電圧を１．３時間かけて、電気泳動によるタンパク質の転写を行った。
【００２６】
転写終了後に、ＰＶＤＦ膜を取り出し、分子量マーカー（Ｂｉｏ    Ｒａｄ社製）の転写部分をカッターナイフで切り出して、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）による染色を行った。残りのＰＶＤＦ膜は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／トリス緩衝液（２０ｍＭトリス／０．１５塩化ナトリウム
ｐＨ７．５）に室温で２時間浸して、ブロッキングをした。
【００２７】
ブロッキング終了後、ＰＶＤＦ膜を、５μｇ／ｍｌ抗ＨＧＦα鎖マウスモノクローナル抗体／３％ＢＳＡ−トリス緩衝液に浸して、室温で、２時間反応させた後、０．１％    Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ    Ｒａｄ社製）／トリス緩衝液で、６分間の洗浄を３回行った。洗浄後、ＰＶＤＦ膜を、２００ｎｇ／ｍｌ    ＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ    ａｎｔｉ    ｍｏｕｓｅ    ＩｇＧ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）／３％ＢＳＡ−トリス緩衝液に浸し、室温で、１．５時間反応させた後、０．１％    Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ    Ｒａｄ社製）／トリス緩衝液で、６分間の洗浄を４回行った。
【００２８】
ＰＶＤＦ膜を、二次抗体の標識酵素（ＡＰ）基質溶液（１ｍｌＮＢＴ／１ｍｌＢＣＩＰ／２０ｍｌ    ０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５））に浸し、酵素反応をさせて、膜上のバンドとして、新規ＨＧＦ誘導体のα鎖を検出した。
バンド検出後のＰＶＤＦ膜を、バイオイメージシステムＶｅｒ２．１（ミリポア社製）によりデンシトグラムとして処理し、各反応時間でのα鎖量を膜上の濃度として数値化した。
【００２９】
結果（表１）より、ＨＧＦ誘導体はＦａＸａ反応開始から５分以内に、α鎖の１００％が修飾を受け、約５７ＫＤａのバンドとして検出された。天然型ＨＧＦでは、反応開始から５分後、１０分後、３０分後、６０分後で、それぞれ約２０％、２４％、８２％、８３％の修飾率であった。つまり、ＦａＸａ存在下において、ＨＧＦ誘導体は速やかに活性型二本鎖構造となることが明かとなった。
【００３０】
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【００３１】
［内皮細胞増殖活性の測定］
ＢＡＥＣ（ウシ大動脈血管内皮細胞、Ｆｌｏｗ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を２４穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各穴に、５ｘ１０３個細胞ずつ加え、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地（Ｎｉｓｓｕｉ社製）中で、３７℃で、５％二酸化炭素存在下で培養を開始した。一晩培養後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地に交換し、同時にＨＧＦ及び、各ＨＧＦ誘導体（ＦＸ１，３，４）をそれぞれ３ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。陽性対照はｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）１ｎｇ／ｍｌとした。培養開始から５日目に、各穴に０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを加えて、細胞を剥し、懸濁した。細胞懸濁液にアイソトンＩＩＩ（日科機社製）を加えた後、コールターカウンター（コールター  エレクトロニクス社製）を用いて細胞数を計測した。
【００３２】
結果（図２）より、ＨＧＦ誘導体の内皮細胞増殖促進活性とＨＧＦの活性は、同程度であることが明かとなった。
【００３３】
［ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＧＦ誘導体構造の検出］
体重１６０ｇのラット（ＳＤ／ｗｉｓｔａｒ、雄）の尾静脈より、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦをそれぞれ別々のラットに、２０μｇ注射投与し、１分後に断頭して血液を回収した。回収時にはＥＤＴＡ・２Ｎａを加えて、血液凝固反応を阻止し、１０℃で、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心の後、上清をプラズマとして回収した。プラズマ５ｍｌに、０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液を２５ｍｌ加えて希釈した後、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。カラムはＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ    ５ＰＷカラム（東ソー社製）を使用した。カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラムを平衡化し、プラズマ希釈液をカラムにかけ、０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラムを洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸緩衝液存在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直線濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦを溶出し、精製品を得た。
【００３４】
精製されたＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦを、［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］の項と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色または、［ＨＧＦ誘導体のＦａＸａ反応性］の項と同様に電気泳動ブロッティング後の酵素抗体法によりバンドとして検出した。
【００３５】
結果より、ＨＧＦはラット生体内を循環する間に、一本鎖構造（不活性型）から二本鎖構造（活性型）への修飾を受けるが、ＨＧＦ誘導体は、ラットの生体内循環後においても、一本鎖構造（不活性型）が保持されていることが明かとなった。
【００３６】
［肝実質細胞に対するＤＮＡ合成促進活性の測定］
肝実質細胞を、高橋らの方法［組織培養    １２（８），３０８（１９８６）］に従って調製した。この肝実質細胞をＷＥ播種用培地（５％ウシ胎児血清、１０−８Ｍデキサメタゾンを含むＷＥ基礎培地に懸濁して、コラーゲンコートした２４穴組織培養用プレートに、５．０ｘ１０４個細胞／０．４ｍｌ／穴となるように播いて培養した。培養開始から４時間後にＷＥ基礎培地に交換し、この際に、ＨＧＦ誘導体を添加して培養を継続した。培養開始２４時間後に、３Ｈ−チミジンを添加し培養を継続して、２０時間のパルスラベリングを行った。ラベリング後に、培養上清を除き、冷燐酸緩衝液（ＰＢＳ）、冷２％過塩素酸／ＰＢＳ、冷９５％エタノールの順にそれぞれ３回洗浄した後、室温で乾燥させた。乾燥後、１％ＳＤＳ／０．１Ｎ水酸化ナトリウムを０．５ｍｌずつ添加し、室温で１時間以上静置して細胞を溶解させた。各穴から細胞溶解液０．２５ｍｌをミニシンチレーションバイアルにとり、シンチレーター（オプティフロー、パッカード社製）を３ｍｌ加えて混合後、シンチレーションカウンターで放射活性を測定して、３Ｈ−チミジンの取り込みを調べた。ＤＮＡ合成促進活性値は、各穴における１分間あたりの放射壊変数（ＤＰＭ／穴）で示した。
【００３７】
結果（図３）より、ＨＧＦ誘導体ＦＸ２及び、ＦＸ４の肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性はＨＧＦの活性と同程度であり、ＦＸ１とＦＸ３は共に、ＨＧＦと比較して、低い活性であった。ＦａＸａ存在下での肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性を測定したところ、ＨＧＦとＦＸ３の活性にはＦａＸａの効果がみられなっかったが、ＦＸ１、ＦＸ２、ＦＸ４は、より高い活性値を示すことが明らかとなった。
【００３８】
また、上記［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］より、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＧＦ誘導体の活性化が、天然型ＨＧＦに比べ、速やかに行われることから、ｉｎ ｖｉｖｏでは、血管損傷部位など、血液凝固反応系の促進している局所において、ＨＧＦ誘導体がＦａＸａにより速やかに活性化されると推測される。このことは同時に、多くの標的細胞と多機能な活性を持つ活性型ＨＧＦの副作用が懸念される中で、ＨＧＦ誘導体は不活性型一本鎖構造で体内を循環する為、副作用の問題についても軽減されることが期待される。また、上記［内皮細胞増殖活性の測定］より、血管内皮細胞に対する増殖促進活性も同程度であることから、速やかに活性化したＨＧＦ誘導体により血管の再構築が可能であると推定される。
【００３９】
図３よりＦＸ１及びＦＸ３については肝細胞に対するＤＮＡ合成促進活性は、天然型ＨＧＦに比べ有意に低い値であるが、図２より血管内皮細胞に対する細胞増殖活性は天然型ＨＧＦと同程度であった。つまり、４９５番目のアミノ酸がバリンからスレオニンに置換されているＦＸ３、さらに４９１番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されているＦＸ１は、細胞選択性を有するＨＧＦ誘導体であると考えられる。このように、４９２〜４９４番目の前後の４９１、４９５番目のアミノ酸を含めた配列を変えることで各種活性にみられることより、４９１〜４９５番目のアミノ酸配列を置換することによって、シャープな細胞特異性を有するＨＧＦ誘導体の作製が可能である。
【００４０】
［急性毒性］
非臨床試験での毒性ＬＤ５０は１ｍｇ／ｋｇ（ラット）以上であった。
【００４１】
【配列表】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】発現プラスミドｐＧＭ／ＨＧＦを示した図である。
【図２】ＨＧＦ誘導体とＨＧＦの内皮細胞増殖促進活性を比較したものである。
【図３】ＨＧＦ誘導体とＨＧＦの肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性を比較したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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