(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の組み合わせが、[B(+)X(+)3(+)]または[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、[B(-)X(-)3(+)]または[B(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、[B(-)X(+)3(+)]、[B(-)X(+)3(-)]または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法（ここで、Ｂは第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm Iにより切断されないビタミンＤ受容体対立遺伝子を、Ｘは第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内でXba Iにより切断されないエストロゲン受容体対立遺伝子をそれぞれ表し、Ｂ（＋）またはＸ（＋）およびＢ（−）またはＸ（−）はその対立遺伝子を有するおよび有しないことをそれぞれ表し、３（＋）はアポリポ蛋白Ｅ遺伝子３／３型を、３（−）はアポリポ蛋白Ｅ遺伝子３／３型以外の多型を表している）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨粗鬆症の治療において有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分析方法に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症治療薬、特にビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2のうち、いずれの薬剤を使用することが最も有効な治療効果を示すかを予測するための、ヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の分析方法に関する。また、本発明はヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み合わせから、該試料が前記薬剤に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測する方法に関する。さらに、本発明は上記の方法において使用し得る遺伝子多型分析用キットに関する。また、該遺伝子多型分析用試薬キットを用いて分析された遺伝子多型の組み合わせから、適当な骨粗鬆症治療薬を選択する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ、骨組織の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやすくなった病態であり。閉経後の女性や高齢の男性に多く、我が国の患者数は推定１０００万人といわれてい。人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増加するものと予測される。
【０００３】
現在、骨粗鬆症の治療薬として、カルシウム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によってまちまちであり、それらをどのように使い分けるかについての検討はほとんどなされていない。これらの治療薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかないのが現状であり、極めて非効率的である。
【０００４】
一方、近年の遺伝子研究から、いくつかの遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性との関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でApa Iにより切断されない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝子型ａに比べて、ビタミンＤに対して高感受性であるとの報告がある［例えば、特開平8-126497号公報および特開平8-126500号公報参照］。
【０００５】
また、白木ら［１９９７年骨代謝学会要旨集第５２頁］には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感受性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子の多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以下、ＡｐｏＥという）遺伝子の多型とビタミンＫ２感受性について調べた結果、ＶＤＲ遺伝子多型ＡＡＢ（Ｂは第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm Iにより切断されない遺伝子型）は、ａａｂｂに比べてビタミンＤ３に対する感受性が有意に低く、またＥＲ遺伝子多型ＰｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu IおよびXba Iで切断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群に比べて、エストロゲンに対する感受性が有意に高く、さらに、ＡｐｏＥ４（＋）群はＡｐｏＥ４（−）群に比べてビタミンＫ２に対する感受性が有意に低かったと記載されている。
【０００６】
さらに、ビタミンＤ結合蛋白（以下、ＤＢＰという）遺伝子をHae IIIおよびSty Iで切断して得られるＲＦＬＰパターンがＧＣ−２型のものは、他の群に比べてビタミンＤ類に対する感受性が高いと記載されている［特開平8-201373号公報］。
【０００７】
しかしながら、これらのいずれも１遺伝子の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するものであり、１つの薬剤について他の遺伝子型よりも感受性が高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、ＶＤＲ遺伝子型がａａｂｂであり、かつＡｐｏＥ遺伝子型がＡｐｏＥ４（−）である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およびＡｐｏＥ遺伝子型を有する人に比べてビタミンＤおよびビタミンＫ２に対する感受性が高いと予測されるが、それでは、このような遺伝子型を有する患者に対してビタミンＤを投与するのと、ビタミンＫ２を投与するのとでは、どちらがより高い治療効果が得られるかについては、依然として予測することができない。したがって、結局のところ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより感受性が高いかを知るには、上述のように、実際に各薬剤を、１つの薬剤について数年間のスパンで順次患者に投与して結果を見るしかなかった。特に、エストロゲンは、治療効果は大きいが副作用も大きいため、感受性の低い患者への長期投与は患者のＱＯＬ（Quality of Life）を著しく損なうおそれがあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症する可能性のある人が、複数の骨粗鬆症治療薬のいずれかに対してより高い感受性を有するかを予測する手段を提供することであり、それによって治療効果の低い薬剤の長期投与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬを向上させることである。
【０００９】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡを含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型について分析することにより、得られる多型の組み合わせに基づいて、ビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ２のうちのいずれかの薬剤に対する感受性が、他の２つの薬剤に対する感受性に比べて高いことが予測可能であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明者らは、ＡｐｏＥ遺伝子型として、対立遺伝子３を有する遺伝子型３（＋）（＝3/3）はそれ以外に比べて、ビタミンＫ２に関する薬剤感受性が高くなることを見出した。また、２／３、３／４型が２／２、２／４または４／４型に比べて有意にビタミンＫ２感受性が高いことも同時に見出した。
すなわち、他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型｛ここで、ビタミン感受性Ｋ２に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型とは、対立遺伝子３を有する遺伝子型３（＋）（すなわち、3/3）と該対立遺伝子３を有しない遺伝子型３（−）（すなわち、2/2、2/3、2/4、3/4または4/4）と類別される遺伝子型のうち、前者をいう。｝を有する場合、エストロゲンよりもビタミンＫ２に対してより感受性が高く、他の遺伝子型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＫ２よりもビタミンＤに対してより感受性が高い傾向にあることを見出した。
【００１１】
本発明は、ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法である。
【００１２】
また、本発明はビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲ）遺伝子、アポリポタンパク（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）遺伝子のそれぞれの遺伝子に対して、特異的な増幅プライマー、およびＶＤＲ遺伝子多型、アポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）多型およびＥＲ遺伝子多型をそれぞれ検出するための検出プローブを含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用試薬キットである。
【００１３】
さらに、本発明は、上記したＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用キットを用いて分析されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせと骨関連疾患の治療薬を結びつけることを特徴とする骨関連疾患治療薬の選択方法である。
【００１４】
【発明の実施態様】
本発明の分析に供され得るヒト由来試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば、特に限定されない。好ましくは、各種ヒト細胞から単離されたゲノムが例示される。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＳＤＳ／フェノール法、グアニジンチオシナネート法、ＣＴＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。また、全血、分画された血球細胞、擦過材料として使用される表皮細胞や粘膜細胞、あるいは毛髪などの、入手が容易で且つＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡ試料として従来から使用されている細胞・組織も好ましくは用いられる。この場合、例えば細胞・組織を水中で煮沸したり、あるいはアルカリ溶液中で加熱することにより、細胞を破砕してゲノムＤＮＡ試料とする。
【００１５】
本発明の分析方法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子型を調べることを特徴とする。
ＶＤＲ遺伝子は第１２染色体上にある。ＶＤＲ遺伝子多型の１つは、第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Bsm Iによる切断の可否によって検出される。Bsm Iで切断されない対立遺伝子をＢ、同酵素により切断される対立遺伝子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂの３つの遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＶＤＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子B(+)（すなわち、ＢＢおよびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを有しない遺伝子型B(-)（すなわち、ｂｂ）とに類別される。また、ＶＤＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｂの第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内のBsm I制限部位（ＧＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂのそれに対応する部位（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとする。
【００１６】
ＥＲ遺伝子は第６番染色体上にある。ＥＲ遺伝子の多型の１つは、第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Xba Iによる切断の可否によって検出される。Xba Iで切断されない対立遺伝子をＸ、同酵素で切断される対立遺伝子をｘで表すと、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３つの遺伝子型を取り得るが、本発明においては、ＥＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｘを有する遺伝子型X(+)（すなわち、ＸＸおよびＸｘ）と対立遺伝子Ｘを有しない遺伝子型X(-)（すなわち、ｘｘ）とに類別される。また、ＥＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｘの第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内のXba I制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）および対立遺伝子Ｘのそれに対応する部位（ＴＣＣＡＧＡ）をいうものとする。
【００１７】
ＡｐｏＥ遺伝子は第１９染色体上にあり、４つのエクソンと３つのイントロンからなり、２９９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする。ＡｐｏＥ蛋白はリポ蛋白によるトリグリセリドやコレステロールの輸送に関与し、ビタミンＫ２の転送蛋白でもある。ＡｐｏＥ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）が知られており、このうち、Ｅ３が野生型（第１１２番目がシステイン、第１５８番目がアルギニン）であると考えられている。Ｅ４は第１１２番目のシステイン（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）に置換されたものである。また、Ｅ２は第１５８番目のアルギニンがシステインに置換されたものである。したがって、ＡｐｏＥ４対立遺伝子は変異部位において制限酵素Hha Iにより切断されるが、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３対立遺伝子は同部位において同酵素により切断されない。これらを要約すると下記の通りである。
0003682688.tif 000002
【００１８】
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2/2、2/3、2/4、3/3、3/4および4/4の遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型を、3/3を有する遺伝子型3(+)（すなわち、3/3）と、これを有しない遺伝子型3(-)（すなわち、2/2、2/3、2/4、3/4および4/4）とに類別する。
【００１９】
本発明の遺伝子多型の測定方法は、ＶＤＲ遺伝子の多型B(+)とB(-)、ＥＲ遺伝子の多型X(+)とX(-)およびＡｐｏＥ遺伝子の多型3(+)と3(-)をそれぞれ区別し得る方法であれば、特に制限されず、サザンハイブリダイゼーション法、シーケンス法、ＰＣＲ法等の通常のゲノムＤＮＡの検出・分析法を適宜組み合わせた種々の方法が利用できる。
【００２０】
これらの遺伝子多型の測定方法は、その原理に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型部位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を決定するか、あるいは特異的なプローブまたはプライマーを用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部位を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法および（３）多型部位での制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法として、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプローブ（sequence-specific pligonucleotide probes; ＳＳＯＰ）法、アレル特異的増幅（mutant allele specific amplification; ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。
【００２１】
シーケンス法では、まず、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は約１５〜約４０塩基であり、通常のＰＣＲプライマーに要求される好適な条件を満たすものであれば、特に制限されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適宜選択することができる。各遺伝子断片を適当なベクターにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより各多型部位の塩基配列を決定することができる。また、サブクローニングすることなく直接サイクリングシーケンス法により配列決定することもできる。
【００２２】
ＳＳＯＰ法は、多型部位を吹くむ約１５〜約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハイブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行っても、あるいは同時に行ってもよい。但し、本発明において測定される３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換であるので、ミスマッチによる不安定効果を最大限にするために、プローブの中央付近に多型部位が存在するようにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共存下にハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別することができる。
【００２３】
ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜約４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（または完全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとして合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながら、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中で反応を行えば、比較的容易に正確な判別が可能である。
【００２４】
上記（２）の方法としては、以下のＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis）法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fragment length polymorphism）法等が挙げられる。これらの方法は、いずれの方法は、いずれも（１）のシーケンス法と同様にして、多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅することを第一の工程とし含む。
【００２５】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性する。一本鎖に解離したＤＮＡ断片はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成するので、これをポリアクリルアミド等の非変性ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換の多型を移動度の差として検出することができる。
【００２６】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法では、増幅産物を変性・再会合させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムアミドなど）の濃度勾配をつけた変性ゲル上で電気泳動する。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温度（Ｔｍ）を変化させるので、異なる変性剤濃度の位置で部分解離し、その結果異なる移動度を示す。特に、へテロ接合体のＤＮＡの場合、変性・再会合により、野生型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるので、４本のバンドが検出される。但し、最もＴｍの高いドメイン中に変異を有する場合は移動度に差が生じない。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その部分が最もＴｍの高いドメインになるので、多型を移動度の差として検出することができる。
【００２７】
ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法は、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性し、さらにcleavageと呼ばれるヘアピン構造を認識して切断する酵素で処理した後、ゲル電気泳動を行う方法であり、多型によるヘアピン構造の有無またはヘアピン形成部位の相違をバンドの数および／または移動度の差として検出することができる。
【００２８】
上記（３）の方法も、迅速且つ簡便に遺伝子多型を測定できるので好ましい。このような方法としては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【００２９】
ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離したゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し得る酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流および下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方法である。本発明においては、ＶＤＲ遺伝子の分析にはBsm Iが、ＥＲ遺伝子の分析にはXba Iが、ＡｐｏＥ遺伝子の分析には、Hha Iがそれぞれ使用される。
【００３０】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動してバンドの長さおよび数から多型を判別する方法である。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、バンドの有無により多型を判別することができる。
【００３１】
上記のような本発明の多型分析により、ヒト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、３型遺伝子については、[B(-)X(-)3(-)], [B(-)X(-)3(+)], [B(-)X(+)3(-)], [B(-)X(+)3(+)], [B(+)X(-)3(+)], [B(+)X(+)3(+)]に類別される。
【００３２】
本発明は、上記の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該ヒト由来試料が、複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする。本発明において、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ２である。また、ここで骨粗鬆症治療薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗鬆症治療効果の度合いの大きさ意味する。すなわち、ある患者において薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場合には、「その患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに対する感受性に比べて高い」。本発明においては、薬剤投与前後での骨塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨塩量変化率］−［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、その薬剤に対する感受性が高いと定義する。
【００３３】
本発明では、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B(+)X(+)3(+)]および[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X(-)3(+)]および [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビミタンＤに対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X(+)3(+)], [B(-)X(+)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする。
【００３４】
【表１】
0003682688.tif 000003
[B(+)X(-)3(-)]については、３つの治療薬のいずれにも感受性がないと推定される。
【００３５】
本発明はまた、上記の分析方法を実施するのに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、ＶＤＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、ＥＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、およびＡｐｏＥ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはＶＤＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、ＥＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブおよびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む。
【００３６】
多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多型部位を含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、一方のプライマーは、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセンス）な塩基配列を有するものである。
【００３７】
また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を含むものであれば、特に制限されず、多型部位の配列を必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブは、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的な塩基配列を有するものである。
【００３８】
本発明において使用するＶＤＲ遺伝子に特的なプライマーとは、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法によって、本発明の検出目標部位であるＶＤＲのイントロン８のBsm I制限酵素多型を含むようなＶＤＲ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プライマーと似通ってＴｍを有するものである。具体的には、ＰＣＲ時のアニーリング温度が５０℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することができる。
gtgcaggcga ttcggtaggg   20      (1)    （配列番号１）および
ccagcggaag aggtcaaggg   20      (2)    （配列番号２）
【００３９】
本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出目標部位であるＡｐｏＥの多型領域を含むようなＡｐｏＥ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プライマーと似通ったＴｍを有するものである。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することができる。
ctgggcgcgg acatgg       16      (3)      （配列番号３）および
cccggcctgg tacact       16      (4)      （配列番号４）、
または
ctgggcgcc acatggagga    20      (5)       （配列番号５）および
cccggcctgg tacactgcca   20      (6)       （配列番号６）
【００４０】
本発明において使用するＥＲ遺伝子に特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出目標部位であるＥＲのイントロン１のXba I制限酵素多型を含むようなＥＲ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の増幅プライマーと似通ったＴｍを有するものである。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することができる。
gttccaaatg tcccagccgt     20   (7)      （配列番号７）および
cctgcaccag aatatgtacc     20   (8)      （配列番号８）、
または
gttccaaatg tcccagccgt     20   (7)       (配列番号７)  および
cctgcaccag aatatgttacc    21   (9)      （配列番号９）
【００４１】
本発明において使用するＶＤＲ遺伝子を検出するためのプローブとは、ＶＤＲ遺伝子のBsam I多型部分において、Ｂ型またはｂ型と結合するオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にはハイブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものとして、下記検出用プローブを例示することができる。
caggcctgcg cattcc         16  (10)      （配列番号１０）および
caggcctgca cattcc         16  (11)      （配列番号１１）
【００４２】
本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子を検出するためのプローブとは、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部分において３（＋）型または３（−）型と結合するオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものとして、下記検出用プローブを例示することができる。
aggacgtgcg cggc            14  (12)      （配列番号１２）
aggacgtgtg cggcc           15  (13)      （配列番号１３）
cagaagcgcc tggcag          16  (18)      （配列番号１８）および
cagaagtgcc tggcag          16  (19)      （配列番号１９）
【００４３】
本発明において使用するＥＲ遺伝子を検出するためのプローブとは、ＥＲ遺伝子のXba I多型部分においてＸ型またはｘ型と結合するオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の検出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合として、下記検出用プローブを例示することができる。
gtgtggtcta gagttg       16   (14)  （配列番号１４）および
gtgtggtctg gagtta       16   (15)  （配列番号１５）、
または
tctggagttg ggatga       16   (16)  （配列番号１６）および
gtggtctaga gttggg       16   (17)  （配列番号１７）
【００４４】
本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子増幅用試薬とは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),(6),(7),および(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および(9)、または(1),(2),(5),(6),(7)および(9)を含む。
【００４５】
該増幅試薬は、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液を含む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Tth ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。ｄＮＴＰｓとはdATP, dCTP, dGTP, dTTPの混合物をいう。さらに緩衝液としては、使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれる。例えば、Taq ＤＮＡポリメラーゼで、Ｍｇイオン、グルセロールを含むトリス緩衝液などを使用する。
【００４６】
本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用試薬キットは、上記検出用プローブ (10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)および(15)、または(10),(11),(12),(13),(18),(19)(16)および(17)を含む。
増幅用プライマーまたは検出プローブは直接または間接に標識物質を結合してもよい。標準物質としては、放射性物質、酵素、蛍光性物質またはビオチンなどが例示される。
標識物質が放射性物質であれば、その放射線量を計測する。また、標準物質が酵素、例えばアルカリホスファターゼであれば、その基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリールリン酸−ｐ−トルイジン塩(BCIP)およびニトロ・ブルー・テトラゾリウム(NBT)を作用させ、その生成物を発色強度を測定する。また、アルカリホスファターゼには、１，２−ジオキセタン化合物などの発光性物質を作用させ、該化合物が分解する際に生じる発光量を測定することも可能である。標識物質がビオチンであれば、ＰＣＲ後、例えばアルカリホスファターゼ結合ビオチンを反応させ、反応後のアルカリホスファターゼを常法に従い、測定する。
【００４７】
本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出用試薬キットは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),(6),(7),および(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および(9)、または(1),(2),(5),(6),(7)および(9)、さらに上記検出用プローブ(10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)および(15)、または(10),(11),(12),(13),(18),(19),(16)および(17)を含んでいてもよい。
上記増幅試薬において、プライマーはＰＣＲ最終組成物中、０．１〜１．０μＭであることが好ましい。また、上記検出試薬において、プローブは、０．１〜１．０pmol／μＬであることが好ましい。
【００４８】
本発明において、上記遺伝子多型を検出する生体試料としては、上記タンパク（ＶＤＲ、ＡｐｏＥ、ＥＲ）を産生する生体から採取されるゲノムであれば、特に制限されないが、例えば、ヒト血球成分からフェノールなどにより抽出し、必要により精製したゲノム（ＤＮＡ）がある。
本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型分析方法とは、通常の遺伝子分析法に従う。すなわち、試料中のＤＮＡをＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子に特異的に増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、次いでＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検出するための検出プローブを含む検出用試薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型を分析する方法である。
具体的には、試料中のＤＮＡ、例えばヒト血液から精製したＤＮＡを上記増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、増幅された試料を上記検出用プローブを含む検出用試薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を分析する方法である。
【００４９】
増幅方法の１つは、一般的にポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法と呼ばれる方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼにより該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸長させる。得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返すことにより、効率的に目標領域を有するＤＮＡを増幅することができる。一般に反応条件は９２〜９５℃で３０秒間〜１分間、５０〜６５℃を２０秒〜１分間、７０〜７５℃を２０秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。５０〜６０℃を部分で上記アニールがおこり、反応を成功させるためのアニール温度は、主にプライマー組成によって規定される。７０〜７５℃の部分で伸長がおこり、反応を成功させるための伸長時間は増幅する目標領域の長さによって規定される。
【００５０】
検出方法とは、上記増幅方法により増幅したＤＮＡを検出プローブによって検出する方法である。増幅プライマーには何らかの標識物質が結合してあることが好ましい。標識物質はプライマーに複数結合していてもよい。
【００５１】
本発明では、例えば１つの固相担体に３種の検出プローブを固定化し、該検出プローブに増幅した試料ＤＮＡを結合させることにより、固相担体上でＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検出することが可能である。固相担体としては、ナイロン膜、マイクロタイター・プレートなどが使用できる。検出プローブを固相担体へ固定化するには、例えば、該検出プローブの末端に、ターミナル・デオキシヌクレオジル・トランスフェラーゼ(TdT)によってｄＴＴＰを鎖状に付加（polyT付加）し、上記担体へ物理的吸着させる方法がある。１つの担体、例えばナイロン膜の別々な場所、あるいはマイクロタイター・プレートの個々のウェルにＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の検出プローブを固定化することにより、１つの増幅試料中の３種の遺伝子多型を同時に判定することができる。
【００５２】
固相担体上で検出プローブにハイブリダイズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定することにより検出できる。
例えば、検出プローブ（１）に対して反応し、（２）に反応しない試料はＶＤＲ遺伝子ＢＢ型、検出プローブ（１）に対して反応せず、（２）に反応する試料をｂｂ型、検出プローブ（１）および（２）に反応する試料はＢｂ型である。ＢＢ型、およびＢｂ型をＶＤＲ遺伝子Ｂ（＋）型、ｂｂ型をＢ（−）型と判定する。
同様に、検出プローブ（３）に対して反応する試料は、ＡｐｏＥ遺伝子４型、検出プローブ（４）に反応する試料は２または３型、検出プローブ（５）に反応する試料はＡｐｏＥ遺伝子３または４型、検出プローブ（６）に対して反応する試料は、ＡｐｏＥ遺伝子２型である。ＡｐｏＥ遺伝子３／３型（つまり、ＡｐｏＥ３（＋）型）の場合、検出プローブ（４）および（５）が反応し、検出プローブ（３）および（６）が反応しないことになる。ＡｐｏＥ３（−）型の場合（つまり３／３型以外）、検出プローブ（３）、（４）、（５）および（６）が上記反応を示すこととなる。
検出プローブ（７）または（９）に対して反応し、（８）および（１０）に反応する試料をＥＲ遺伝子ＸＸ型、検出プローブ（８）および（１０）に対して反応して、検出プローブ（７）または（９）に対して反応しない試料は、Ｘｘ型である。ＥＲ遺伝子ＸＸおよびＸｘ型の場合をＸ（＋）型、ｘｘ型の場合をＸ（−）型とする。
これらの組み合わせにより、試料中の３つの遺伝子多型を分析することができる。
【００５３】
本発明の試薬キットは、本発明の分析方法を実施するのに好適な各種試薬および／または器具等をさらに含んでいてもよい。
【００５４】
【実施例】
以下、参考例および実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。
【００５５】
参考例１
無作為に選んだ閉経後の１６７人の日本人女性から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片、ＥＲ遺伝子断片およびＡｐｏＥ遺伝子断片をそれぞれ別個に増幅した。
ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス：       5'-caaccaagac tacaagtacc gcgtcagtga-3' （配列番号２０）
アンチセンス： 5'-aaccagcggg aagaggtcaa ggg-3'        （配列番号２１）
ＥＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス：     5'-ctgccaccct atctgtatct tttcctattc tcc-3'（配列番号２２）
アンチセンス：5-tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga-3' (配列番号２３）
ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス：       5'-cgggcacggc tgtccaagga g-3'       (配列番号２４)
アンチセンス： 5'-cacgcggccc tgttccacga g-3'      （配列番号２５）
【００５６】
ＰＣＲ条件は、ＶＤＲ遺伝子については、変性：９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０秒；伸長７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＥＲ遺伝子については、変性９４℃、３０秒：アニーリング：６５℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒（３０サイクル）；ＡｐｏＥ遺伝子については、変性９４℃、３０秒；アニーリング：６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３０サイクル）であった。このＰＣＲ増幅を含む７．２ｋｂｐのＶＤＲ遺伝子断片、１．３ｋｂｐのＥＲ遺伝子断片および２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得られる。ＶＤＲ遺伝子増幅反応液はBsm Iで、ＥＲ遺伝子増幅反応液をXba Iで、ＡｐｏＥ遺伝子増幅反応液をHha Iでそれぞれ処理した後、アガロースゲル電気泳動にかけた。各増幅産物が多型部位において制限酵素で切断される場合、ＶＤＲ増幅産物では４．６ｋｂｐと２．６ｋｂｐ、ＥＲ増幅産物では９００ｂｐと４００ｂｐ、ＡｐｏＥ増幅産物では７２、４８、３８、３５、１９、１７、および１５ｂｐのバンドが検出される。
【００５７】
ＡｐｏＥ３型遺伝子の検出には増幅産物を制限酵素Hha Iで処理した後、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にかけ、電気泳動終了後にエチジウムプロマイドでゲルを染色し、バンド・パターンよりＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を判別した。
2/2 型  16, 18, 38, 81, 91bp
2/3 型  16, 18, 33, 38, 48, 81, 91bp
2/4 型  16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 81, 91bp
3/3 型  16, 18, 33, 38, 48, 91bp
3/4 型  16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 91bp
4/4 型  16, 18, 19, 33, 38, 48, 72bp
泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、バンドバターンからＶＤＲ、ＥＲおよびＡｐｏＥ遺伝子多型を判別し、８つの多型群に類別した（表２）。
【００５８】
【表２】
遺伝子型別平均治療効果（％）−期待治療効果（％）
0003682688.tif 000004
【００５９】
表２から明らかなように、遺伝子型が[B(+)X(+)3(+)]または[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(-)3(+)]または [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(+)3(+)], [B(-)X(+)3(-)]または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高かった。
【００６０】
実施例１
ある日本人の骨粗鬆症患者から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例２と同様の方法でＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得られた遺伝子型が[B(+)X(+)3(+)]および[B(+)X(-)3(+)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定し、遺伝子型が[B(-)X(-)3(+)]または[B(-)X(-)3(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。さらに、遺伝子型が[B(-)X(-)3(+)]、[B(-)X(-)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。
【００６１】
本発明の分析方法によれば、投薬前に対象となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性が高いかを高い確率で予測することできるので、適切な薬剤の選択が可能となる。したがって、治療効果の乏しい薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避することができ、患者のＱＯＬを向上することができる点が極めて有用である。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の分析試薬を使用して、ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の３つの遺伝子を増幅し、その増幅物を用いて１回の操作で３つの遺伝子多型を分析することができる。また、これらの遺伝子が骨粗鬆症に関わっていることから、該分析試薬を使用して、ヒト検体中のこれらの遺伝子の遺伝子多型を分析した結果から、その組みあわせにより、有効な骨粗鬆症治療薬を選択することが可能となる。
【００６３】
配列番号１、２、２０および２１：多型部位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３、４、５、６、２４および２５：多型部位を含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７、８、９、２２および２３：多型部位を含むＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０および１１：ＶＤＲ遺伝子の断片を検出するためのプローブとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２、１３、１８および１９：ＡｐｏＥ遺伝子の断片を検出するためのプローブとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４、１５、１６および１７：ＥＲ遺伝子の断片を検出するためのプローブとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【００６４】
【配列表】
SEQUENCING LIST
<110>  NISSHO CORPORATION
<120>  Method for Anticipating Sensitivity to Medicine for Osteoporosis and a Reagent Kit therefor
<130>  12-040
<160>  25
【００６５】
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of vitamin D receptor gene
<400>  1
gtgcaggcga ttcggtaggg    20
【００６６】
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of vitamin D receptor gen
<400> 2
ccagcggaag aggtcaaggg    20
【００６７】
<210>  3
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400>  3
ctgggcgcgg acatgg        16
【００６８】
<210>  4
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400> 4
cccggcctgg tacact        16
【００６９】
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400> 5
ctgggcgcc acatggagga    20
【００７０】
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<222>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400>  6
cccggcctgg tacactgcca    20
【００７１】
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400> 7
gttccaaatg tcccagccgt    20
【００７２】
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400> 8
cctgcaccag aatatgtacc    20
【００７３】
<210>  9
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400> 9
cctgcaccag aatatgttac c    21
【００７４】
<210>  10
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of vitamin D receptor gene
<400> 10
caggcctgcg cattcc        16
【００７５】
<210>  11
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of vitamin D receptor gene
<400> 11
caggcctgca cattcc        16
【００７６】
<210>  12
<211>  14
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400>  12
aggacgtgcg cggc          14
【００７７】
<210>  13
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400> 13
aggacgtgtg cggcc         15
【００７８】
<210>  14
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400>  14
gtgtggtcta gagttg        16
【００７９】
<210>  15
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400> 15
gtgtggtctg gagttg        16
【００８０】
<210>  16
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400>  16
tctggagttg ggatga       16
【００８１】
<210>  17
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of estrogen receptor gene
<400> 17
gtggtctaga gttggg       16
【００８２】
<210>  18
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400> 18
cagaagcgcc tggcag          16
【００８３】
<210>  19
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  A part of the base sequence of apolipoprotein E gene
<400> 19
cagaagtgcc tggcag          16
【００８４】
<210>  20
<211>  30
<212>  Nuleic acid
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying VDR gene fragment containing polymorphic site
<400>  20
caaccaagac tacaagtacc gctgtcagtga          30
【００８５】
<210>  21
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying VDR gene fragment containing polymorphic site
<400>  21
aaccagcggg aagaggtcaa ggg          23
【００８６】
<210>  22
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying ER gene fragment containing polymorphic site
<400> 22
ctgccaccct atctgtatc tttcctattc tcc          33
【００８７】
<210>  23
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying ER gene fragment containing polymorphic site
<400> 23
tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga          33
【００８８】
<210>  24
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying ApoE gene fragment containing polymorphic site
<400> 24
cgggcacggc tgtccaagga g          21
【００８９】
<210>  25
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Human
<223>  Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying ApoE gene fragment containing polymorphic site
<400> 25
cacgcggccc tgttccacga g           21