(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）
で表わされ、かつ昆虫類（Insecta)由来のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素によってＸ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖を、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素と接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性を測定することを特徴とするプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性測定法。
【請求項２】
Ｘが、一般式：
Ｘ'−Ａｓｎ
〔Ｘ'は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される基である請求項１記載のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性測定法。
【請求項３】
Ｙが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個少ない。）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕
で示される基である請求項１又は２記載のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性測定法。
【請求項４】
計測手段が比色、発光、蛍光、放射能、磁気のいずれかの手段であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性測定法。
【請求項５】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）
で表わされ、かつ昆虫類（Insecta)由来のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素によって、Ｘ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖を、プロフェノールオキシダーゼ活性化系及び、β−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンを含有する可能性のある検体と接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、検体中のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定を行うことを特徴とするβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定方法。
【請求項６】
Ｘが、一般式：
Ｘ'−Ａｓｎ
〔Ｘ'は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される請求項５記載のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定方法。
【請求項７】
Ｙが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個少ない。）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕
で示される請求項５又は６記載のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定方法。
【請求項８】
計測手段が比色、発光、蛍光、放射能、磁気のいずれかの方法であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定方法。
【請求項９】
ペプチドグリカンに特異的に反応する成分を取り除いたプロフェノールオキシダーゼ活性化系を用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカンの測定方法。
【請求項１０】
β−１，３−グルカンに特異的に反応する成分を取り除いたプロフェノールオキシダーゼ活性化系を用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のペプチドグリカンの測定方法。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）
で表わされ、かつ昆虫類（Insecta）由来のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素によってＸ−ＡｒｇとＹに分解され得るペプチドを含んでなるプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性測定用試薬。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）
で表わされ、かつ昆虫類（Insecta）由来のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素によってＸ−ＡｒｇとＹに分解され得るペプチドと、プロフェノールオキシダーゼ活性化系とを含んでなるβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカン測定用試薬。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）
で表わされ、かつ昆虫類（Insecta）由来のプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素によってＸ−ＡｒｇとＹに分解され得るペプチドと、プロフェノールオキシダーゼ活性化系とを含んでなるβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（以下、ＰＰＡＥという。）の活性測定法、および該測定法を利用するβ−１，３−グルカン及び／またはペプチドグリカンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】
昆虫体液には、体液のメラニン化に関与するプロフェノールオキシダーゼ活性化系（以下、ｐｒｏＰＯ活性化系という）と呼ばれる一連の酵素群からなるカスケード系が存在しており、真菌細胞壁構成成分であるβ−１，３−グルカン、または／および細菌細胞壁構成成分であるペプチドグリカンがこのカスケードの引き金となることが知られている〔Onishi, Annot. Zool. Jpn., 27, 33-39 (1954), Ashida and Onishi, Arch. Biochem. Biophys., 122, 411-416 (1967)；  Brunet, Insect Biochem., 10, 467-500 (1980) ；  Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis, 239-265, Japan Sci. Soc. Press (1990) 〕。これは、当該ｐｒｏＰＯ活性化系にβ−１，３−グルカンに特異的親和性をもつβ−１，３−グルカン認識タンパク（βＧＲＰ；分子量６２ｋＤａ）、およびぺプチドグリカンに特異的親和性をもつペプチドグリカン認識タンパク（ＰＧＲＰ；分子量１９ｋＤａ）が存在することによるもので、これらのタンパクによりβ−１，３−グルカンまたはペプチドグリカンの存在が認識された時、カスケード系の一連反応が開始する。カスケード系はその後、Ｃａ2+を要求する酵素による反応を含む未解明の幾つかの反応を経て、プロフェノールオキシダーゼ（フェノールオキシダーゼの前駆体：以下、ｐｒｏＰＯという。）をフェノールオキシダーゼ（以下、ＰＯという。）に変換するＰＰＡＥが生成される〔Ashida and Dohke, Insect Biochem., 10, 37-47 (1980) 〕。
【０００３】
このような現象をもとに、治療薬などの安全性試験、或いは細菌性感染や真菌性感染を検出するための手段として、上記のカスケード反応を利用したβ−１，３−グルカン，ペプチドグリカンなどの測定方法が種々検討されている。
【０００４】
現在、治療薬などの安全性試験用試薬、或いは細菌性感染などの検出用試薬として、昆虫と同様な生体内カスケード系を有するカブトガニ血球抽出物を用いたリムルステスト試薬がある。しかし、カブトガニはペプチドグリカンに反応する系を持たないため、β−１，３−グルカン及びリポ多糖類しか検出できず、この結果リポ多糖類を持たないグラム陽性細菌は検出できないといった欠点がある。また、試薬の供給源としてのカブトガニ自身が日本国内では稀少動物であり、その将来的供給の不安定性が常に問題となっている。
【０００５】
それに対して、昆虫のカスケード系（ｐｒｏＰＯ活性化系）を利用する場合、試薬の安定した供給が望めるばかりか、真菌類はもとよりペプチドグリカンに反応する系をもつため細菌類についてもグラム陽性・陰性の区別をしないで全体を捕らえることができる。さらには、体液中からペプチドグリカンと特異的に反応する成分またはβ−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を取り除くことによって、それぞれβ−１，３−グルカン（真菌類）またはペプチドグリカン（細菌類）を別個に測定することも可能である（特開昭６３−１４１５９８号公報、特開昭６３−１４１５９９号公報）等の利点がある。
【０００６】
昆虫のカスケード系を利用した測定方法としては、従来ＰＰＡＥによりｐｒｏＰＯがＰＯに変換されて生じるＰＯ活性を計測することによってβ−１，３−グルカンやペプチドグリカンを測定する方法がある。しかし、この測定方法では不安定な酵素であるＰＯの自己酸化などの問題と検出感度の飛躍的な上昇が望めない点で問題があった。
また、この問題を解消する測定法として、ゼーダールヘール・トルド・ケネスにより、フェノールオキシダーゼを活性化する何らかのセリンプロテアーゼ活性を、合成ペプチドを基質として計測することによって、β−１，３−グルカンや内毒素（リポ多糖類）を測定する方法が提案されている（特表昭５８−５０２０８２号公報）。
しかし、ここで使用されている基質は、ｐｒｏＰＯからＰＯへの変換を触媒するＰＰＡＥの基質特異性を考慮することなく、単にＰＰＡＥがセリンプロテアーゼであるという事実に基づいて構築されたものであることから、ＰＰＡＥ活性、ひいてはβ−１，３−グルカンや内毒素の量を正確に測定できないというおそれがある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ＰＰＡＥ本来の基質特異性を利用することにより、反応特異性に富み、正確にＰＰＡＥ活性を測定する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は当該ＰＰＡＥ活性測定法を利用して、β−１，３−グルカン及び／またはペプチドグリカンの正確な測定方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するため種々研究を重ねた結果、ＰＰＡＥ本来の基質であるｐｒｏＰＯの一次構造の解析により、ＰＰＡＥが認識，切断する領域のアミノ配列を解明することに成功した。
本発明は、かかる研究で得られた情報をもとに、ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位を含むペプチド鎖を基質として用いることを特徴とするＰＰＡＥ活性測定法、およびこの方法で測定されるＰＰＡＥ活性を指標とするβ−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの測定方法に関する。
【０００９】
すなわち、本発明は一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）で表わされ、かつ昆虫類由来のＰＰＡＥによってＸ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖をＰＰＡＥと接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性を測定することを特徴とするＰＰＡＥ活性の測定法〔以下、これを測定法（１）ともいう。〕であり、特に、このＸが一般式：
Ｘ’−Ａｓｎ
〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個より少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される基、又は／及びＹが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個より少ない。）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕で示される基である測定法に関する。さらに、本発明は、比色、発光、蛍光、放射能、磁気を用いるいずれかの測定手段によって測定されるＰＰＡＥ活性の測定方法に関する。
【００１０】
また、本発明は一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）で表わされ、かつ昆虫類由来のＰＰＡＥによって、Ｘ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖を、ｐｒｏＰＯ活性化系及び、β−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンを含有する可能性のある検体と接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、検体中のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定を行うことを特徴とするβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定法〔以下、測定法（２）ともいう。〕であり、特にＸが、一般式：
Ｘ’−Ａｓｎ
〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個より少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される基、又は／及びＹが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
（Ｚは、標識されても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個より少ない）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。）で示される基を利用する測定法に関する。さらに、本発明は比色、発光、蛍光、放射能、磁気を用いるいずれかの測定手段によって測定されるβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定法に関する。
【００１１】
またさらに、本発明は測定法（２）において、ペプチドグリカンに特異的に反応する成分を取り除いたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることを特徴とするβ−１，３−グルカンの測定法〔以下、測定法（３）ともいう。〕、および測定法（２）において、β−１，３−グルカンに特異的に反応する成分を取り除いたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることを特徴とするペプチドグリカンの測定法〔以下、測定法（４）ともいう。〕に関する。
【００１２】
本発明のＰＰＡＥ活性測定法（１）は、基質であるペプチド鎖：Ｘ−Ａｒｇ−ＹにＰＰＡＥが接触することにより生じる反応生成物Ｘ−ＡｒｇおよびＹのいずれか少なくとも一方を計測することによって、ＰＰＡＥ活性を測定する方法である。
基質であるＸ−Ａｒｇ−Ｙは、２以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖であり、以下の条件を満たすものであれば特に限定されない。
▲１▼昆虫由来のＰＰＡＥによってＸ−ＡｒｇとＹとに分解される。
▲２▼ＰＰＡＥにより分解され生成するＸ−ＡｒｇおよびＹのうち、少なくともいずれか一方がその化学的性質あるいは物理的性質に基づいて測定できる。
▲３▼Ａｒｇのαアミノ基はアミノ酸残基と結合しており、そのアミノ酸残基はＧｌ
ｙおよびＡｌａでない。
【００１３】
なおペプチド鎖とは、ペプチド及びペプチド誘導体をも包含する意味で使用される。ペプチド誘導体としてはペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に保護基を有するもの、ペプチド中のアミノ酸残基が標識されているものなどが例示される。
【００１４】
Ａｒｇに結合するＸおよびＹは、上記の条件を満たすものであれば、特に限定されない。
【００１５】
Ｘとしては、ＧｌｙおよびＡｌａ以外のアミノ酸残基、Ｃ末端側のアミノ酸残基がＧｌｙおよびＡｌａでないペプチド残基が挙げられる。また、アミノ酸残基は、標識されていても、そのαアミノ基が保護されていてもよく、同様にペプチド残基は、標識されていても、そのＮ末端が保護されていてもよい。
好ましくは、ＸがＸ’−Ａｓｎ〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個少ない。）、またはＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で表わされる基である。
より好ましくは、Ｘが、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を表す下式
Ｘ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ
または、下式
Ｘ＝Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
で表わされる配列のうちＣ末端側の少なくとも２個のアミノ酸残基を有する基である。含有するアミノ酸残基数としては、２〜２０個が好ましい。
【００１６】
ここで、ペプチド残基のＮ末端の保護基、アミノ酸残基のαアミノ基の保護基およびＡｓｎのαアミノ基の保護基とは、アミノ酸残基のαアミノ基を保護しうる基一般を意味し、例えばカルボベンゾキシ基、サクシニル基、炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基などが挙げられる。
【００１７】
Ｘ−Ａｒｇ−ＹのＹとしては、酸アミド結合またはエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合しえる有機残基、またはアミノ酸残基もしくはペプチド残基が挙げられる。また、アミノ酸残基は標識されていても、そのαカルボキシル基が保護されていてもよく、同様にペプチド残基は標識されていても、そのＣ末端が保護されていてもよい。
【００１８】
ここで「有機残基」としては、Ａｒｇのカルボキシル基に酸アミド結合またはエステル結合により結合し、ＰＰＡＥの存在によってＸ−Ａｒｇから遊離するものであり、かつ有機残基（Ｙ）それ自身が物理的あるいは化学的に検出可能なもの、またはＸ−Ａｒｇ−Ｙから切断され、Ｘ−ＡｒｇおよびＹとなることにより測定系の特性が変化し、その変化が物理的もしくは化学的に測定可能なものであれば特に限定されない。
代表的なものとしては、例えばｐ−ニトロアニリノ基，２−クロロ−４−ニトロアニリノ基等の発色基、例えば２−ピリジルアミノ基，３−ピリジルアミノ基，β−ナフチルアミノ基，７−アミノ−４−メチルクマリノ基，７−ヒドロキシ−４−メチルクマリノ基等の蛍光性を有する基、例えば125 Ｉや14Ｃ， 3Ｈ等の同位元素で標識された有機残基、磁気性を有する基などが例示されるが、これらの有機残基に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００１９】
また、Ｙに関して「ペプチド残基」としては、好ましくはＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個少ない。）、またはＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕で表わせるものである。
より好ましくは、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を表す下式
Ｙ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
または、下式
Ｙ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
で表わされる配列のうち、Ｎ末端側の少なくとも２個のアミノ酸残基を有する基である。含有するアミノ酸残基数としては２〜２０個が好ましい。
「アミノ酸残基」としては特に限定されないが、好適にはＰｈｅが例示される。
【００２０】
ここでペプチド残基のＣ末端の保護基、アミノ酸残基のαカルボキシル基の保護基およびＧｌｙのカルボキシル基の保護基とは、アミノ酸残基のαカルボキシル基を保護しうる基一般を意味し、例えばベンジルオキシ基，フェネチルオキシ基などのアラルキルオキシ基などが代表的なものとして挙げられる。
【００２１】
本発明で「標識」とは、ペプチド残基またはアミノ酸残基の一部を修飾もしくは置換して、その結果、かかるペプチド残基またはアミノ酸残基を有する化合物が同定され得るものであれば特に限定されない。
このような標識に係わる標識物質としては、例えばＥＩＡ（enzyme immunoassay）に於いて用いられるアルカリフォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡ（radioimmunoassay) で用いられる99m Ｔｃ，131 Ｉ，125 Ｉ，14Ｃ，3 Ｈ等の放射性同位元素、２−アミノピリジン，３−アミノピリジン或いはＦＩＡ（fluoroimmunoassay)で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或いはこれら誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−2,2,6,6 −テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−2,2,5,5 −テトラメチルピロリジン−１−オキシル、2,6 −ジ−t −ブチル−α−（3,5-ジ-t- ブチル−4-オキソ-2,5- シクロヘキサジエン-1- イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２２】
ＰＰＡＥの由来となる昆虫類（Insecta)は、特に限定されないが、飼育方法の確立しているものが好ましい。例えば、カイコガ，タバコスズメガなどの鱗翅目、イエバエ，センチニクバエなどの双翅目、トノサマバッタ，エンマコウロギなどの直翅目、センノキカミキリなどの鞘翅目などが挙げられる。
なお、昆虫類には、幼生、成体等を問わず、全ての態様のものが包含される。鱗翅目、双翅目及び鞘翅目などの完全変態類に属する昆虫については、取得の容易性から、成虫よりも幼虫であるほうが好ましい。
【００２３】
本発明のＰＰＡＥ活性測定方法において、Ｘ−Ａｒｇ−Ｙに接触させるＰＰＡＥは、昆虫に由来するＰＰＡＥそのもの、またはそれを含有するものであれば特に限定されない。ＰＰＡＥを含有するものとしては、好ましくは昆虫の体液である。体液としては、取得の容易性から一般に昆虫の体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。
ヘモリンパの取得法については特に限定されない。好ましくは、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース、アミノ酸等からなる高分子物質）を不純物として含む庶糖、またはトウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射し、その後しばらく放置してから体腔から集める方法が挙げられる。
さらに、上記のような方法で集めたヘモリンパを遠心分離にかけ、血球を除去した後、透析により得られる血漿を用いることもできる。
【００２４】
本発明のＰＰＡＥ活性測定方法は、前述のペプチド鎖Ｘ−Ａｒｇ−Ｙに昆虫体液等に存するＰＰＡＥが接触することによって生じる反応生成物を測定することによって行われる。
反応生成物の検出には、反応生成物であるＸ−ＡｒｇおよびＹの少なくともいずれか一方の化学的または物理的性質に基づくいずれの方法をも使用できる。
例えば吸光度測定法，比色法，蛍光法〔参考「図説蛍光抗体」（株）ソフトサイエンス社〕，発光法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31, 第251 〜263 頁, 共立出版（株）〕，ＲＩＡ法（参考「医化学実験講座」第８巻，中山書店），ＥＩＡ法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31，51〜63頁, 共立出版（株）〕、核磁気共鳴スペクトル法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31，264 〜271 頁, 共立出版（株）〕などが例示される。
【００２５】
具体的には、以下の方法が例示される。
Ｙがｐ−ニトロアニリノ基などの発色基である場合は、反応の前後における系の吸光度（吸収曲線）の変化を常法に従って測定することができ、またＹがβ−ナフチルアミノ基などの蛍光性を有する基である場合は、反応前後の系の蛍光強度の変化を常法に従って測定することができる。また、Ｙが14Ｃや 3Ｈ等の同位元素で標識された有機残基である場合は、Ｘ−ＡｒｇとＹとをそれらの分子量，疎水性または親水性などの特性の違いを利用して液体クロマトグラフィーや電気泳動法などで分離後、同位元素の線種に応じた検出法によりＹの生成を測定することができる。Ｙが磁気性を有する有機残基の場合は、固相担体に磁力を利用して固定し得るＸ−Ａｒｇ−ＹからＸ−Ａｒｇが遊離することを利用して測定できる。
【００２６】
また、特にＹがそれ自身が蛍光等の検出特性を有しないものであっても、分子量，疎水性などの特性の違いを利用して液体クロマトグラフィーや電気泳動法などでＸ−ＡｒｇとＹとを分離後、吸光度を検出することによって測定することもできる。またこの場合、Ｘ−Ａｒｇが発色性，蛍光性，発光性，放射性などの特性を有していれば、それぞれに対応した検出手段によってＸ−Ａｒｇの生成量もしくはＸ−Ａｒｇ−Ｙの残量を測定することも可能である。
【００２７】
また、Ｘが酵素で標識されている場合、Ｘ−ＡｒｇまたはＸ−Ａｒｇ−Ｙを当該酵素の基質となりえる物質と接触させ、基質の変化を測定することによって、ＰＰＡＥの活性を測定することができる。例えば、Ｘがペルオキシダーゼで標識されている場合、基質として５−アミノサリチル酸，ｏ−フェニレンジアミン等を使用するなら吸光度の変化（比色法）で、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等を使用するなら蛍光法で、ルミノール等を使用するなら発光法で検出できる。また、Ｘがアルカリホスファターゼで標識されている場合、基質としてｐ−ニトロフェニル・リン酸を使用するなら比色法で、４−メチルウンベリフェリル・リン酸を使用するなら蛍光法、４−メトキシ−４−（３−ホスフェートフェニル）スピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン〕ジソデュウム塩（ＡＭＰＰＤ）を使用するなら発光法で検出することができる。
【００２８】
本発明のβ−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの測定法（２）は、前述の一般式（Ｉ）で示されるペプチド鎖，ｐｒｏＰＯ活性化系およびβ−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンをともに接触させることによって生じるＸ−ＡｒｇおよびＹのいずれか少なくとも一方を計測することによって測定されるＰＰＡＥの活性を指標として、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンを検出、定量する方法である。
すなわち当該測定法（２）は、β−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの存在によってｐｒｏＰＯ活性化系が活性化され、その結果生じるＰＰＡＥ活性を指標として、β−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの量を測定する方法であり、指標となるＰＰＡＥ活性の検出に前述のＰＰＡＥ活性測定法（１）を利用するものである。
【００２９】
ｐｒｏＰＯ活性化系とは、β−１，３−グルカンを特異的に認識する成分あるいは／及びペプチドグリカンを特異的に認識する成分を含有しており、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの存在によって引き金が引かれ、その結果ｐｒｏＢＡＥＥａｓｅ（ベンゾイルアルギニンエチルエステルを加水分解する活性を有する酵素の前駆体）、ｐｒｏＰＰＡＥ（ｐｒｏＰＯを活性化するセリンプロテアーゼの前駆体）、ｐｒｏＰＯの少なくとも３つの前駆体を活性化する一連の酵素群からなるカスケード系をいう。
【００３０】
本発明の測定法（２）で使用されるｐｒｏＰＯ活性化系は、ｐｒｏＰＯ活性化系そのものもしくは当該系を含有するものであってもよい。ｐｒｏＰＯ活性化系を含有するものとして、好適には昆虫の体液が挙げられる。
使用される昆虫の体液としては、前述と同様に昆虫体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。ヘモリンパの取得方法については前述と同様の方法が例示され、また使用できる昆虫の種類についても前述と同様である。
【００３１】
本発明の測定の対象となるβ−１，３−グルカンとしては、β−１，３−結合を有するグルコースポリマーやその誘導体、例えばザイモサン、カードラン、パキマン、スクレロタン、レンチナン、シゾフィラン、コリオラン、ラミナラン、リケナン及びその誘導体等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の測定の対象となるペプチドグリカンとしては、特に限定されないが、例えば、各種細菌類（例えば、Micrococcus 属、Streptococcus 属、Aureobacterium属、Bacillus属、Agrobacterium 属など) の細胞壁構成成分が挙げられる。
【００３３】
本発明の測定法（２）は、β−１，３−グルカンあるいは／およびペプチドグリカンを特異的に検出・定量する方法であり、かかる方法によれば、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンを含む検体を識別すること、また検体中のβ−１，３−グルカンあるいは／およびペプチドグリカンを定量的に測定することも可能である。
【００３４】
測定法（２）は、β−１，３−グルカンまたは／及びペプチドグリカンを含有する可能性のある測定対象の検体、一般式（Ｉ）で規定されるペプチド鎖を含有する溶液およびｐｒｏＰＯ活性化系を含有する溶液、好ましくは昆虫の体液をよく混合して反応液とし、一定時間後の反応液中のＰＰＡＥ活性を、生成するＸ−ＡｒｇもしくはＹを前述の測定方法（１）で測定することによって行われる。
【００３５】
使用されるペプチド鎖の濃度は検出される程度の濃度であればよく、測定系に応じて適宜調製される。ｐｒｏＰＯ活性化系の量もｐｒｏＰＯカスケード系が働き得る量であればよく、測定系に応じて適宜調製される。
反応ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜９である。また、かかるｐＨ値を維持するため緩衝液を使用してもよく、緩衝液としては反応に影響を与えないものであれば、種類，使用濃度とも特に制限されない。例えばリン酸塩緩衝液，ホウ酸塩緩衝液，酢酸塩緩衝液，トリス緩衝液，グッド緩衝液等が例示される。
また、反応温度および反応時間については、反応が進む温度，時間であれば特に制限されない。反応温度としては通常０〜５０℃、好ましくは４〜３０℃が挙げられる。反応時間としては通常１秒〜２０時間、好ましくは１０秒〜２時間である。
また本測定系には、０．００１〜１０００ｍＭ，好ましくは５〜１００ｍＭの範囲内の２価の金属イオン、例えばＣａ2+，Ｍｇ2+等が存在していることが好ましい。
【００３６】
このβ−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの測定法（２）においては、検体中にβ−１，３−グルカンとペプチドグリカンとの両者が存在する場合、得られるＰＰＡＥ活性はβ−１，３−グルカンとペプチドグリカンの総和として示される。
【００３７】
一方、本発明の測定法（３）はβ−１，３−グルカンを特異的に検出、定量する方法であり、また本発明の測定法（４）はペプチドグリカンを特異的に検出、定量する方法である。
β−１，３−グルカンの測定方法（３）は、前述の測定法（２）においてあらかじめペプチドグリカンに特異的に反応する成分を除去しておいたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることによって行われる。ペプチドグリカンに特異的に反応する成分としては、例えばペプチドグリカン認識タンパク等が挙げられる。
【００３８】
また、ペプチドグリカンの測定方法（４）は、前述の測定法（２）の方法においてあらかじめβ−１，３−グルカンに特異的に反応する成分を除去しておいたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることによって行われる。β−１，３−グルカンに特異的に反応する成分としては、例えばβ−１，３−グルカン認識タンパク等が挙げられる。
【００３９】
ｐｒｏＰＯ活性化系から、ペプチドグリカンまたはβ−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を除去する方法としては、ゲル濾過法、電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、遠心分離法など、一般に生化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも使用できる。好適には、ペプチドグリカンと特異的に反応する成分を除去する方法として、ペプチドグリカンを結合させた担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが例示され（特開昭６３−１４１５９９号公報）、β−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を除去する方法として、β−１，３−グルカンを結合させた担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが例示される（特開昭６３−１４１９８号公報）。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＰＡＥ活性の正確な定量測定が可能となる結果、このＰＰＡＥ活性を指標にしたβ−１，３−グルカンおよび／またはペプチドグリカンの正確な測定法を提供することができる。
さらに本発明は、培養法等によって増殖させることなく真菌類や細菌類の検出を可能とし、そのためこれらの微生物感染症の早期診断を可能とする。また、水、食物等への微生物混入試験や治療薬（抗生物質、注射用製剤）などの安全性試験へも広く利用可能である。
【００４１】
【実施例・参考例】
本発明をより詳細に説明するために、実施例および参考例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００４２】
参考例１  家蚕型ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位のアミノ酸配列の決定
(1) 家蚕型ｐｒｏＰＯの精製
家蚕５令幼虫より得られたヘモリンパ約２００ｍｌに飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて７０％硫安溶液とし、４℃、一晩静置した。そこへ０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて４０％硫安溶液とした。２時間ゆっくり攪拌した後静置して、８０００rpm ，２０分間遠心し（日立ＲＰＲ９−２ロータ、以下同じ）上清を得た。この上清に飽和硫安（ｐＨ６．５）を加え、５０％硫安溶液とし、一晩静置した。これをさらに８０００rpm ，２０分間遠心し、沈澱を得た。この沈澱を０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）−２０％硫安溶液（ｐＨ６．５）で溶かして、さらに飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて３８％硫安溶液とした。１時間攪拌して２．５時間静置した後、１００００rpm , ２０分間遠心して上清を得た。この上清に飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて４８％硫安溶液とした。これを３０分間攪拌した後、一晩静置し、８０００rpm ，２０分間遠心して沈澱を得た。この沈澱を０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液に溶かして、同緩衝液中で透析した。
【００４３】
透析を終えた試料を１２０００rpm ，２０分間遠心後、得られた上清を６５℃水浴中で攪拌しながら５４．５℃に上がるまで加温し、５５℃水浴中で５分間さらに加温した。氷で急冷後、１８０００rpm ，２０分間遠心し、上清を得た。
この上清をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー〔和光純薬工業（株）製、φ１．５×１９ｃｍ〕に付し、ＫＣｌのグラジエントで溶出させて分画を行った。粗ＰＰＡＥを使って活性化後現れるＰＯ活性の有無を調べることにより、ｐｒｏＰＯ画分を集めた。この集めたｐｒｏＰＯ画分は、０．０４Ｍ  ＫＣｌ−０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析を行った。
さらにこの試料は、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー〔和光純薬工業（株）製、φ１．５×９．３ｃｍ〕にかけ、５０ｍＭ，７５ｍＭ，９５ｍＭの各リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させて得られた各分画中のＰＯ活性を先述の方法に従って測定した。その結果、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でｐｒｏＰＯの溶出を確認したためこの画分を集めた。
この画分をザルトリウス社の Collodion Bag (SM13200)で濃縮し、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７５）中で透析し、精製ｐｒｏＰＯ溶液とした。
【００４４】
(2) ＰＰＥＡの精製
家蚕５令幼虫の表皮より得たホモジネートを硫安分画し、うち０．２〜０．４％硫安画分を集め、０．０１Ｍ  トリス−塩酸−０．０１Ｍ  ＣａＣｌ2 （ｐＨ８．５）中で透析した後、さらに０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でさらに透析した。これをＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で溶出した。このうちＰＰＡＥ活性を示す分画を集め、これをさらにヒドロキシアパタイトカラムにかけて０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、０．０１〜０．５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントで溶出した。このうち、ＰＰＡＥ活性を示す分画を集めて、精製ＰＰＡＥ溶液とした。
【００４５】
(3) ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断されて得られるペプチド断片のアミノ酸配列分析
上記精製ｐｒｏＰＯを精製ＰＰＡＥと共にインキュベーションして、その反応溶液をセファデックスＧ−５０カラムにかけ、０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、ｐｒｏＰＯから切断され遊離してくるペプチド鎖を集めた。ついで、このペプチド鎖をＯＤＳカラムにより３種類のフラグメント（ｆＩ，ｆII，ｆIII ）に分けた。これらをそれぞれリジルエンドペプチダーゼ処理して断片化した後、エドマン分解法により、各断片のアミノ酸配列を調べた。その結果、ｆＩ，ｆIIが多少修飾に違いはあるものの同じ配列を有する断片（配列表、配列番号２）であり、ｆIII がそれとは異なるアミノ酸配列であることがわかった（配列表、配列番号１）。
【００４６】
(4) ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯから上記ペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端のアミノ酸配列分析
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中のｐｒｏＰＯをチオウレアと７５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中のＰＰＡＥと共に０℃で３時間インキュベーションし、全てのｐｒｏＰＯをＰＯに変換した。この反応液をＯＤＳカラムによって２つの主要分画に分け、それぞれのＮ末端のアミノ酸配列をエドマン分解法によって決定した（配列表、配列番号３，４）。
【００４７】
参考例２  蚕型ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位のＤＮＡ塩基配列の決定
(1) 家蚕ｃＤＮＡライブラリーの作製
家蚕５令幼虫５００頭より体液を２５ｍｌ採取し、これを遠心分離（４０Ｇ，１５分，４℃）して血球細胞を沈澱させた。この血球細胞よりＲＮＡ抽出キットＩＳＯＧＥＮ〔和光純薬工業（株）製〕を用いて約８００μｇの全ＲＮＡを調製した。
この全ＲＮＡより mRNA Purification Kit（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを精製し、cDNA Synthesis Kit（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。合成したｃＤＮＡはλＺＡＰIIファージベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、Gigapack Gold packaging extract （ストラタジーン社製）を用いて in vitro パッケージングを行った。その結果４．２×１０5 プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）のファージライブラリーを得た。
【００４８】
(2) ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニング
ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニングには PicoBlue TM Immunoscreening Kit（ストラタジーン社製）を用いて行った。
１．５×１０4 ＰＦＵの家蚕ｃＤＮＡファージライブラリーと２００μｌのE. coli XL-1 Blue(OD600 ＝約 0.5）を混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＮＺＹプレート（１．５％アガー，１％ＮＺアミン，０．２％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．５％バクトイーストエキストラクト，０．５％ＮａＣｌ，１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン：ｐＨ７．５）にまき、４２℃で３．５時間程培養した。プラークが現れた段階で１０ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を染み込ませたニトロセルロースフィルター（アマシャム社製）をかぶせ、更に３７℃で３．５時間培養した後、ピンセットで注意深くニトロセルロースフィルターを取りＴＢＳＴ〔２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％(V/V) Ｔｗｅｅｎ２０〕で１５分間、３〜５回洗浄した。
また、同一プレートに２枚のスクリーニング用レプリカフィルターを作製するため１枚目のフィルターを剥がした後、１０ｍＭ  ＩＰＴＧを染み込ませた別のニトロセルロースフィルターをプレートに被せ、３７℃、４時間培養した。この２枚目のフィルターも１枚目のフィルターと同様に洗浄した。
この操作を２０プレート行い、合計約３．０×１０5 個のプラークを持つレプリカフィルターを作製した。
これらのフィルターは、ブロッキング溶液〔１％ＢＳＡ，２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ〕中で１時間ゆっくりと振盪後、ブロッキング溶液で適当に希釈した抗ｐｒｏＰＯウサギ抗体溶液中に移替え１時間ゆっくりと室温で振盪した。一次反応を終えたレプリカフィルターは１回につき５分間，ＴＢＳＴで３〜５回洗浄後、ブロッキング溶液で適当に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体溶液中で１時間ゆっくり室温で振盪し二次反応を行った。終了後、ＴＢＳＴで５分間、３〜５回洗浄し、さらにＴＢＳ〔２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＢＳＡ〕で５分間洗浄した。レプリカフィルターの水滴を濾紙で吸い取った後、発色液〔０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム，０．１５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート，１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ９．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 〕中で発色させた。
ニトロセルロースフィルター上で青く発色した位置に対応するプラークをプレート上より拾い上げ、２次スクリーニング、３次スクリーニングを行うことによってファージの純化を行い、最終的に８つのクローンを得た。
【００４９】
(3) サブクローニング
λＺＡＰIIにクローニングされたＤＮＡ断片はヘルパーファージの働きにより自動的に切り離されて再閉環する。よって、pBluescript SK(-) ファージミドベクターにサブクローニングするため以下の操作を行った。
λＺＡＰII組換え体ファージ１００μｌ（＞１×１０5 ＰＦＵ）と２００μｌＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ＯＤ600 ＝約１．０），１μｌ ExAssist helper Phage（＞１×１０6 ＰＦＵ）を混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした後、３ｍｌの２×ＹＴ培地（１％  ＮａＣｌ，１％イーストエキストラクト，１．６％バクトトリプトン）を加え、更に２．５時間振盪培養した。その後、７０℃で２０分間インキュベーションし、遠心分離（4000×g, 15 分間, 室温) して上清を回収した。このうち、１μｌを２００μｌの E. coli SOLR TM (OD600 ＝約１．０）と混合し３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＬＢ／Ａｍｐプレート（１．５％アガー，１％ＮａＣｌ，１％バクトトリプトン，０．５％イーストエキストラクト，５０μｇ／ｍｌアンピシリン）にプレーティングし培養後、単一コロニー（ｐＰＯ２，ｐＰＯ３，ｐＰＯ４，ｐＰＯ５，ｐＰＯ６，ｐＰＯ８，ｐＰＯ１７，ｐＰＯ２０）を選び出した。
【００５０】
(4) ｐｒｏＰＯクローンの塩基配列の決定
サブクローニングしたクローンについて制限酵素切断地図を作製したところ、ｐＰＯ２，ｐＰＯ３，ｐＰＯ４，ｐＰＯ８，ｐＰＯ１７，ｐＰＯ２０はその制限酵素部位が類似していることから同一のタンパク質をコードしているクローンであると考えられ、ｐＰＯ１７をその代表として選んだ。さらにｐＰＯ５，ｐＰＯ６はそれぞれ異なったタンパク質をコードし、またｐＰＯ６についてはｐＰＯ２などの一部分のクローンであると考えられる為、ｐＰＯ５をもう一つの候補として選んだ。
そこでｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥによる切断部位の検索のため、ｐＰＯ５，ｐＰＯ１７について切断部位の含まれているであろうと思われるｃＤＮＡ挿入断片５’側の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし AmpliTaq R ＤＮＡポリメラーゼを用いたTaq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing kit（アプライドバイオシステムズ社製）によって行った後、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーで解析を行った。その結果（配列表、配列番号５，６）と参考例１にて決定されたアミノ酸配列と照らし合わせ、参考例１で得られたペプチドの組み合わせを決めＰＰＡＥによって認識、切断されるｐｒｏＰＯ上の領域のアミノ酸配列を確定した。該アミノ酸配列とそれに対応するコドンを後記配列表の配列番号５および配列番号６に示す。
これらの配列表から明らかにｐＰＯ５，ｐＰＯ１７の二つのクローンでは異なる配列を示し、ＰＰＡＥによって認識切断されるｐｒｏＰＯタンパクが２種類あることが示された。
【００５１】
実施例１  ＰＰＡＥ活性測定
(1) ペプチド合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ樹脂〔渡辺化学工業（株）製〕を用いて、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８型、島津製作所）により下記の配列のペプチドを合成した。
２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ
（配列中、２−Ｐｙｒは２−ピリジル基を示す。）
ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ樹脂上のＦｍｏｃ基（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）をＤＭＦ中、３０％ピペリジンで処理し末端アミノ基を遊離させ、この遊離アミノ基にＦｍｏｃ−Ｐｈｅを縮合させ、順次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕおよび２−ピリジルアミノ基導入のための２−Ｐｙｒ−Ａｌａを、この順でＢＯＰ試薬存在下に縮合させる反応を繰り返すことにより行った。
このようにして得られたペプチド鎖が結合する樹脂をメタノールで洗浄後乾燥させ、トリフルオロ酢酸９５０μｌ，チオアニソール５０μｌの溶液中に１時間浸しペプチドを遊離させた。それをトリフルオロ酢酸で洗い、濾液を回収後、無水エチルエーテルを加えて析出した白色沈澱を遠心（2000rpm,６分間，４℃）で集め、減圧乾燥した。更にこれを精製するため、この白色沈澱を３０％酢酸に溶かし、５Ｃ１８逆相クロマトカラム〔和光純薬工業（株）製〕を用いて主要分画を採取して凍結乾燥した。使用直前に０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、合成ペプチド溶液とした。
【００５２】
(2) ＰＰＡＥの精製
家蚕５令幼虫約５００頭より約１００ｇの表皮を切り出し、冷蒸留水で洗浄した後ホモジナイズした。得られたホモジネートは図１に記載のスキームに従い硫安分画をした。
各硫安分画中のＰＰＡＥ活性の検出は、ｐｒｏＰＯを基質として用いてＰＯ活性の出現を観察することにより行った。更に、そのＰＯ活性が添加したｐｒｏＰＯに由来するものであることを確認するため、ｐｒｏＰＯを添加しない同じ分画のＰＯ活性も調べた。これらのＰＯ活性の測定は、基質としてドーパを用い、生成されるドーパクロムの発色によるＯＤ４９０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。
その結果、上清１，沈澱２，上清３および沈澱４（図１参照）にＰＰＡＥ活性（ＰＯ活性の出現）を認めたが、上清１および沈澱２にはかなりの、上清３には若干の、元々あるＰＯ活性の存在も認めたため、沈澱４をＰＰＡＥ画分と決定した。その画分を０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で透析し、ＰＰＡＥ溶液とした。
【００５３】
(3) 液体クロマトグラフィーによるＰＰＡＥ活性測定
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した合成ペプチド溶液５０μｌと０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に０．３６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＰＰＡＥ溶液５０μｌを混合し、３０℃、１０分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した〔カラム：Wakosil-5C18〔和光純薬工業（株）製〕 (4.6 i.d.×250 mm）；カラム温度：４０℃；移動相：Ａ緩衝液（50 mM  AcONH4 (pH 6.0)-10 % アセトニトリル）；Ｂ緩衝液（50 mM  AcONH4 (pH 6.0)- 50 %アセトニトリル）；グラジエント: Ｂ緩衝液０→５０％（０→１５分）；流速：１．５ ml/min ；検出：Ｅｘ３０５ｎｍ，Ｅｍ３７６ｎｍ〕（図２−▲１▼）。対照として、上記合成ペプチド溶液５０μｌに０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５０μｌを加えたもの（図２−▲２▼）と、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌに上記ＰＰＡＥ溶液５０μｌを加えたもの（図２−▲３▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、合成ペプチドの切断断片を確認した。すなわち、図２−▲１▼の液体クロマトグラフィー分析図中の保持時間７．２２５分に合成ペプチドの切断断片を表すピークが出現し、ＰＰＡＥ活性を検出測定することができた。
【００５４】
(4) ＰＰＡＥ濃度と活性の相関関係
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した合成ペプチド溶液５０μｌと０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に０、０．１８、０．３６、０．７２ｍｇ／ｍｌの各濃度で溶解したＰＰＡＥ溶液５０μｌをそれぞれ混合し、３０℃で５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。その結果現れる合成ペプチドの切断断片のピーク面積をＰＰＡＥ活性値としてＰＰＡＥの濃度との相関関係を調べた。その結果、互いに明らかな相関関係があることが示され（図３）、このペプチドを使ったＰＰＡＥ活性の定量測定が可能であることが判明した。
【００５５】
参考例３  ＳＬＰ溶液の調製
家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）５令幼虫を氷上に１０分間置いて動きを止めた後、サトウキビから精製されたショ糖の２０ｍＭ溶液を家蚕の体重の半分量、第５腹部節と第６腹部節の間に注射した。注射した液が漏れないように縫い糸で第５腹部節の前を縛り、２０分間室温で放置した後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパを集めた。
集めたヘモリンパを１５００Ｇで５分間、低温で遠心して血球を除いた。その上清約１００ｍｌを、０．１ｍＭ  ＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１％キシリトールからなる溶液３リットルに対して２日間低温下で透析して、目的のＳＬＰ溶液とした。
【００５６】
実施例２  β−１，３−グルカンの測定
(1) 家蚕の体液（ＳＬＰ）を用いたβ−１，３−グルカンの測定
β−１，３−グルカンの代表として、カルボキシメチル−カードラン（ＣＭ−カードラン）を用いた。０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度に溶解した実施例１（１）で調製の合成ペプチド溶液１０μｌ、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液５μｌ、１０ｍＭフェニルチオ尿素１０μｌ、８０ｍＭ  ＣａＣｌ2 １５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭ−カードラン５μｌ、０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌ、蒸留水５５μｌを混合し、２５℃で２５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した〔カラム：Wakosil-5C18（和光純薬工業（株）製），4.6 i.d.×250 mm；カラム温度：４０℃; 移動相：Ａ緩衝液（50 mM  AcONH4 (pH 6.0)-10 % アセトニトリル）；Ｂ緩衝液（50 mM  AcONH4 (pH 6.0)- 50 %アセトニトリル）；グラジエント: Ｂ緩衝液０→５０％（０→１５分）；流速：１．５ ml/min ；検出：Ｅｘ３０５ｎｍ，Ｅｍ３７６ｎｍ〕（図４−▲１▼）。対照として、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭ−カードランのかわりに蒸留水を５μｌ余分に加えたもの（図４−▲２▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、保持時間６．２７９分に合成ペプチドの切断断片を示すピークが現れ、β−１，３−グルカンを検出することができた。
なお、使用したＳＬＰ溶液は参考例３に記載の方法により調製した。
【００５７】
(2) β−１，３−グルカン濃度と活性の相関関係
β−１，３−グルカンの代表としてＣＭ−カードランを用いた。
０．０１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した実施例１（１）で調製の合成ペプチド溶液１０μｌ、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液５μｌ、１０ｍＭ  フェニルチオ尿素１０μｌ、８０ｍＭ  ＣａＣｌ2 １５μｌ、０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌ、蒸留水５５μｌに０、０．１、０．２５、０．５、１．０ｍｇ／ｍｌの各濃度のＣＭ−カードラン５μｌをそれぞれ混合し、２５℃，２５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。その結果現れる合成ペプチドの切断断片のピーク面積をＰＰＡＥ活性値としてＣＭ−カードランの濃度との相関関係を調べた。その結果、互いに明らかな相関関係があることが示され（図５）、このペプチドを使ったβ−１，３−グルカンの定量測定が可能であることが判明した。
【００５８】
実施例３  家蚕の体液（ＳＬＰ）を用いたペプチドグリカンの測定
以下、Micrococcus lysodeikticus （ＩＦＯ３３３３）から超音波破砕で調製したペプチドグリカンを代表として用いて実験を行った。
０．１Ｍ  ＭＯＰＳ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液８０μｌ、８０ｍＭ  ＣａＣｌ2 ７．５μｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ  ペプチドグリカン溶液１０μｌ、蒸留水２．５μｌを混合し、３０℃で１０分間加温後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ５μｌ、１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５μｌ、適当な濃度に調製した実施例１（１）で作成の合成ペプチド溶液１０μｌをこの順に加えて混合後、再び３０℃で３０分間加温した。反応終了後、そのうちの５０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した（なお、分析条件は実施例２で行ったβ−１，３−グルカンと同じである。）（図６−▲１▼）。対照として、０．３ｍｇ／ｍｌ  ペプチドグリカン溶液の代わりに蒸留水を１０μｌ余分に加えたもの（図６−▲２▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、ペプチドグリカンを加えた場合（図６−▲１▼）のみ、保持時間４．３６分に合成ペプチドの切断断片を示すピークが現れた。すなわち、合成ペプチドを使ってペプチドグリカンを測定することが可能であることが判明した。
なお、使用したＳＬＰ溶液は参考例３に記載の方法により調製した。
【００５９】
参考例４  ＰＰＡＥの基質特異性
Ｎ末端に２−ピリジル基（２−Ｐｙｒ）を導入した４種類の配列のペプチド鎖２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−＊−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（なお、＊印はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙである）を合成し、蒸留水でそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解した。これらの溶液１２５μｌに、１０μｇ／ｍｌ  ＰＰＡＥ２５μｌ、１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２５μｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ２５μｌ、蒸留水５０μｌを加え、２５℃で０、１５、３０分間反応させ、反応毎にその反応液８０μｌずつ取り出し、５０％酢酸２０μｌを加えて反応を止め、さらに蒸留水１００μｌを添加して混合した後、うち１００μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。合成ペプチド２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−＊−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを表すピークの面積の１５分間あたりの減少率を基質減少率として算出し、上記４種のペプチド間の比較を行った。
その結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
0003658782.tif 000002
【００６１】
表１の結果から明らかな如く、＊で示されるアミノ酸残基がＧｌｙである場合には基質減少率が減り、ＰＰＡＥ反応速度が著しく低下することが判る。即ち、この＊で示されるアミノ酸残基がＧｌｙであるペプチドは、ＰＰＡＥ活性測定の基質として適していないことが判る。
【００６２】
【配列表】
0003658782.tif 000003
【００６３】
0003658782.tif 000004
【００６４】
0003658782.tif 000005
20
【００６５】
0003658782.tif 000006
【００６６】
0003658782.tif 000007
【００６７】
0003658782.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＰＡＥ精製に至る硫安分画の手順を示すスキームを示す図である。
【図２】合成ペプチドを基質としたＰＰＡＥ活性の液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図３】ＰＰＡＥ濃度とＰＰＡＥ活性の相関性を示すグラフである。
【図４】合成ペプチドを基質としＣＭ−カードランの検出結果を示す液体クロマトグラムである。
【図５】ＣＭ−カードラン濃度とＰＰＡＥ活性の相関性を示すグラフである。
【図６】合成ペプチドを基質としてペプチドグリカンの検出結果を示す液体クロマトグラムである。
【符号の説明】
１  反応生成物 (2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH) のピーク
２  合成ペプチド（2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH) のピーク
【図１】
0003658782.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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