(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＤＮＡ断片試料を得る工程と、
（２）既知配列と前記既知配列の３’末端に続く２塩基の任意配列とを有し、前記任意
配列の３’末端から３塩基目の塩基が相補鎖結合能の弱い塩基又は前記ＤＮＡ断片試料に対し相補鎖を形成しない塩基であるオリゴマーを、前記ＤＮＡ断片試料にハイブリダイズさせる工程と、
（３）ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成により、前記ＤＮＡ断片試料にハイブリダイズした前記オリゴマーを伸長させる工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ断片分取法。
【請求項２】
前記（３）工程の後、加熱処理を施して前記オリゴマーにハイブリダイズしたＤＮＡ断片試料を選別分取する工程を更に有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ断片分取法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡ塩基配列決定あるいはＤＮＡ解析などに用いるＤＮＡの分離・分取、更には試料調製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来長いＤＮＡの塩基配列を決定する場合、目的とするＤＮＡをプラスミドなどのベクタ−中にクロ−ニングし、培養によりＤＮＡのコピ−数を増やし用いている。このＤＮＡ（ここでは数十Ｋｂ）の塩基配列を決定するにはＤＮＡを制限酵素で切断し、小さな断片とした後、再度クロ−ニング（サブクロ−ニング）した後、大腸菌等に感染させ、この大腸菌をコロニ−培養してコピ−数を再度増やすと同時にコロニ−選別によりＤＮＡ断片の分別を行う。すなわち、ＤＮＡを制限酵素切断し、サブクロ−ニングとそれに続くコロニ−培養により、ＤＮＡ断片の精製分取と増幅を行う。寒天上で培養された大腸菌は前述したようにコロニ−を形成する。各コロニ−中には単一種のＤＮＡ断片を含んだプラスミドを持った大腸菌が含まれている。各コロニ−から大腸菌をピックアップして試験管培養してコピ−数を更に増やした後、ＤＮＡを抽出して塩基配列決定用試料として用いる。種々ＤＮＡ断片を解析するには種々コロニ−から得たＤＮＡを解析するが、同じＤＮＡ断片のクロ−ンを含んだコロニ−を重複して解析する場合が生ずるためＤＮＡ断片種の数の平均４倍位の数のコロニ−を解析することが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このようなサブクロ−ニングを用いたＤＮＡ調製は、ＤＮＡ断片の分離と増幅を１つのプロセスでできる反面、手間がかかり、自動化に適さない難点があった。また、各コロニ−中にはどのＤＮＡ断片種を含んだ大腸菌が含まれているかをあらかじめ知ることができないため、同じＤＮＡ断片を何度も解析する無駄をしてしまう難点があった。そこで、サブクロ−ニング、培養といった手間がかかり、自動化に不向きなプロセスに代わるＤＮＡ断片の分取・増殖法およびこれを用いたＤＮＡ解析システムを提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記目標を達成するために本発明者らはＤＮＡ断片をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増殖することと、ゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の長さ分離および分取、更にＤＮＡ断片と固体表面に固定されたＤＮＡプロ−ブをハイブリダイズさせ、プロ−ブＤＮＡ鎖の伸長反応がおきるか否かによりＤＮＡを分別・分取する方法を開発し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、少なくとも、複数のＤＮＡ断片に既知配列を持つオリゴマ−を結合するプロセス、得られるＤＮＡ断片を、既知配列部を含み３’末端側１〜３塩基が任意であるオリゴマ−を当該任意配列の種類毎に固体表面に固定したチップを用いて当該チップ上のオリゴマ−にハイブリダイズさせるプロセス、ＤＮＡポリメラ−ゼによる相補鎖合成で上記のハイブリダイズしたチップ上のオリゴマ−のうち特定のものだけを伸長させてＤＮＡ断片とのハイブリダイゼ−ション力を増強させるプロセス、次いで加温処理して特定のＤＮＡ断片を選別分取するプロセスを含むＤＮＡ断片の分離・分取方法にある。
【０００６】
さらに、本発明は、上記方法により分離・分取られたＤＮＡ断片のコピ−数を増幅し又は増幅することなくそのＤＮＡ配列を解析するＤＮＡ解析方法にある。上記ＤＮＡ断片の分離・分取方法或いは該ＤＮＡ断片の配列を解析するＤＮＡ解析方法における出発物質としてのＤＮＡ断片は、いずれの処理方法により調製したものでもよいが、例えば、ＤＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡ断片が用いられる。この制限酵素としては、対象とするＤＮＡ配列により適宜選択されるが、例えば  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｓａｕ３Ａｌ、ＮｏｔＩ、ＥＣＯＲＩ  等が挙げられる。
【０００７】
さらに、本発明は、少なくとも、複数のＤＮＡ断片に既知配列を持つオリゴマ−を結合するプロセス、既知配列部を含み３’末端側１〜３塩基が任意であるオリゴマ−を当該任意配列の種類毎に固体表面に固定したチップと、ＤＮＡ断片の末端に結合した共通配列を持つ固定されていないプライマーとを用いて当該ＤＮＡ断片のコピー数を酵素を用いた相補鎖合成反応を用いて増幅すると共にＤＮＡ断片を種類毎に分離して固体表面上に分取する方法にある。
【０００８】
上記方法に用いるオリゴマ−において、その既知配列部の塩基長はハイブリダイゼーションにより安定な二本鎖形成の要件を満たすものであり、１０〜３０  ｍｅｒ好ましくは１６〜２０  ｍｅｒである。このオリゴマーには標識を付した方がその後の分離操作のために都合がよい。そして、この標識物としては、蛍光体、化学発光を誘起する物質、放射性物質などが用いられる。
【０００９】
ゲル電気泳動による分離・分取方法ははポリアクリルアミドゲル（６％）板を用いＤＮＡバンドを切り出す方法、チューブゲル末端から溶液中にＤＮＡを溶出させ分取する方法等が用いられている。
本発明のオリゴマーチップは次のように調製する。固定表面へオリゴマ−を固定する手法は文献Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｍ．３９，７１８−７２２（１９９３）によるか、あるいはＮａｔｕｒｅ  ３５７，５１９（１９９２）と同様ポリＴを保持するプラスチック表面を用いポリＡと目的とするオリゴマ−配列に相補な配列を持つオリゴマ−をポリＴにハイブリダイズさせた後相補鎖合成により目的とするオリゴマ−をポリＴの３’端側に作製する。このオリゴマーチップの固体基盤としては、石英板、シリコンウェハー等が用いられる。
【００１０】
ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成は、Ｔａｑ  ポリメラーゼ２ユニットに基質ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチドトリフォスフェート）  をチップを保持した容器に加え、反応温度７５℃の条件で行う。ＤＮＡ断片のコピー数を酵素を用いて増幅する方法は、通常行われている  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（  ＰＣＲ）条件のとおり行う。ＤＮＡ配列を解析は蛍光式自動ＤＮＡシーケンサーを用い、その標準プロトコールのとおり行う。
【００１１】
【作用】
ＰＣＲはＤＮＡ断片のコピ−数をふやすのに有効であり、ゲル電気泳動はＤＮＡ断片を長さにより分離し、グル−プ化するのに有効である。ゲル電気泳動分離を用いて分取したＤＮＡ断片は両端には既知配列のオリゴマ−をライゲ−ションにより付加する。この配列を含み３’末端に任意の２つの塩基を持つオリゴマ−を末端配列毎に区分して、５’末端側を底面に固定した容器を用意する。ＤＮＡ断片を含む溶液を容器に入れ、固定されたオリゴマ−とハイブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラ−ゼを用いてオリゴマ−の鎖を伸ばすが、３’末端配列が相補的な場合だけ鎖伸長がおこり、結合力が増す。そこで温度を上げ（７０〜８５℃）相補鎖伸長しなかったオリゴマ−とＤＮＡ断片の結合を分断し、相補鎖伸長したハイブリドマ−だけが固体表面にのこるようにして分取する。相補鎖合成は３’末端２塩基が一致する場合は伸長するが一致しない時は伸長しないか、伸長反応はおそいので末端塩基種の違いで分離・分取できる。２塩基の組合せ数は１６通りであり多くのＤＮＡ断片を一度に分離・分取できないが、ゲル電気泳動による長さ分離を組み合わせると非常に多くのＤＮＡ断片種を分離・分取できる。このように分取されたＤＮＡ断片はＰＣＲ増幅され、ＤＮＡ塩基配列決定用反応に用いられる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕
図１は本発明によるＤＮＡ解析のフロ−チャ−トである。試料としてλファ−ジＤＮＡを選んだ。λＤＮＡを６塩基認識制限酵素たとえばＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断する。この酵素は図２に示した配列１０を認識して、図示した所でＤＮＡを切断する。切断されたＤＮＡ断片１２に既知配列を持つＤＮＡオリゴマー１３（図２に表示）をライゲーションにより結合させる。オリゴマーとして蛍光標識１４されたものを用いると以下の分取操作に都合が良く、ここではスルホローダミン  １０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；発光波長６２０ｎｍ）で標識されたオリゴマーを用いた。ライゲーション産物はアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、分取される。各フラクション中のＤＮＡ断片種の数はゲル電気泳動の分離能によるが、数ｋｂ以下のＤＮＡ断片を分離する場合、長さの１％程度の精度で分取できる。そのため各フラクション中には図１の１６のように２〜６種以下のＤＮＡ断片種が含まれるようにできる。これらＤＮＡ断片を図１の２のようにフラクション毎に再度別の制限酵素で再度切断する。制限酵素としてＳａｕ  ３ＡＩなどの４塩基認識切断酵素を用いた。切断部には前述既知配列を持ったオリゴマーをライゲーションにより結合する。切断部や概知オリゴマ−配列図３に示した。前述の既知配列と異なる配列を選択しても良い。オリゴマーには蛍光標識１４を付加しておき、検出が容易にできるようにする。
【００１３】
得られたＤＮＡ断片を分離・分取するために図１に示したようなオリゴマーを保持したチップ３０を用意する。チップ上にあるオリゴマーは図４に示したようにリンカー１８１を介して５’末端側を固体表面１８０に固定されたもので、ライゲーションによりＤＮＡ断片試料に付加されたオリゴマー配列３２とその３’側に制限酵素認識配列の一部３３を含むものである。このオリゴマーはすべてのＤＮＡ断片とハイブリドマーを形成するがＤＮＡ断片種を区別をするために更に３’端に２つ（１〜３塩基でよい）の任意塩基３４を持つものを用いる。任意の２塩基の選び方は１６通りあるのでチップ表面を図５に示したように隔壁２０２で１６分割し、それぞれの区画２０１に単一種のオリゴマ−を固定する。このチップを用いてＤＮＡ断片試料を分離・分取するが、ＤＮＡ断片の制限酵素認識配列に続く２塩基の配列の違いにより相補鎖合成が伸長するか否かでハイブリダイゼーションの安定度が大きく変化することを利用して分離分取する。ＤＮＡ断片はチップ上のオリゴマ−の３’末端の２塩基以外は完全に相補的であり、ハイブリダイゼ−ションの強弱で末端２塩基が相補的か否かを見分けることは難しい。しかし、ＤＮＡポリメレ−スを用いた相補鎖伸長反応はプライマ−として用いるオリゴマ−の３’末端２塩基に大きく依存する。また、相補鎖伸長したオリゴマ−とＤＮＡ断片の結合力は非常に強くなる。そこで図１の３０の表面に固定したオリゴマ−３１とＤＮＡ断片３７，３８とをハイブリダイズさせた後ＤＮＡ相補鎖伸長反応を行い、鎖伸長したオリゴマ−３９に結合したＤＮＡ断片だけを得ることで分離・分取する。チップを底面とする容器中に（容器の底面にチップを置いてもよい）ＤＮＡ断片試料を入れ、オリゴマ−とハイブリドマ−を形成させる。これにＴａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼおよび相補鎖合成基質ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチドトリフォスフェ−ト）を加えて相補鎖合成する。ハイブリドマ−のうちオリゴマ−の３’末端の２塩基が完全にＤＮＡ試料と相補的なもの３７については相補鎖合成が進行し、表面に固定されたオリゴマ−の鎖が伸長する。末端２塩基が完全には相補的でないもの３８について相補鎖伸長はおこらないかおこっても非常におそい。末端２塩基が相補的でなくても相補鎖合成がおきる事がある。特にこの２塩基がＧあるいはＣの組み合わせで、１つが他の塩基におき代わった場合などである。この場合、末端から３塩基目をイノシンなど相補鎖結合能の弱い塩基か相補的でない塩基を持つオリゴマーを固体表面に固定し用いると良い。この場合、３塩基目の結合が弱いので末端２塩基が相補的でないとより一層相補鎖合成がおこりにくくなり、実質的に末端２塩基が一致するものだけに相補鎖合成がおきるようにできる。反応はＴａｑポリメレ−スの反応に都合の良い７５℃で行った。反応後、溶液の温度を８０〜８５℃にまで高めて相補鎖伸長しなかったハイブリドマ−の結合を切り、末端２塩基が完全に相補的でないものは４０のように遊離される。一方、４１のように相補鎖伸長したハイブリドマ−はそのままオリゴマ−と共に固定表面に保持される。この反応と昇温をくりかえす事により、ＤＮＡ断片の分離率を上げることができる。たとえば１回の反応で���定のＤＮＡ断片が１６種あるＤＮＡオリゴマ−と完全にハイブリダイズし、相補鎖伸長できる確立は１／１６である。昇温して未反応ＤＮＡ（全体の１５／１６）を剥がし、再度ハイブリダイズさせると更にこの１／１６（すなわち、１５／１６  ×  １／１６  ）  が所定の所にハイブリダイズして相補鎖伸長されたオリゴマーにトラップされる。この結果が約１／８  が所定位置にトラップされる。１０回くりかえすとこの断片の約半分が相補鎖伸長して所定の区画に捕獲されることになる。このように分画されたＤＮＡだけを分取するには溶液温度を８５℃近傍にし相補鎖伸長してないハイブリドマ−を解離させ洗浄する。各区画に保持されたＤＮＡ断片を９５℃で溶出させ区画毎にキャピラリ−等を用い分取する。この時ゲル充填キャピラリーを用い分離も同時に行うことにより詳細な分離・分取ができる。ここでゲル電気泳動を用いるのは、４２，４３のように３’末端の２塩基が同一で異なるＤＮＡ断片が存在し得るからである。また、ＤＮＡ断片の長さを知ることにより、１回で塩基配列決定（ＤＮＡシ−ケンシング）できる断片か否か知り、シ−ケンシングする上での情報とするためである。ＤＮＡ断片の長さが１Ｋｂ（１０００塩基）以下の場合には長いゲル（５０〜６０ｃｍ）を用いた電気泳動（１０００塩基長近くまで分離可能である）を用いるか、または、５００  〜  ６００  塩基長まで配列を読み取っては新しいプライマーを用いて次の配列決定をしてゆく方法（  ウォーキング法）  が適している。一方、１Ｋｂを越える場合には別の制限酵素で切断して短小化するか、プラスミドなどにクローニングした後に末端から削ってゆくデリーション法により種々長さのＤＮＡを生成してこれを解析する方法が適している。このようにＤＮＡ塩基配列決定は対象とするＤＮＡ断片の長さによりその解析戦略が異なるのでＤＮＡ断片長をゲル電気泳動分離の際に知ることは重要である。ゲル電気泳動分離・分取には内径０．３ｍｍ、長さ２０ｃｍのガラスキャピラリー内に作製した柱状ゲル（キャピラリーゲル、４％）を用い、キャピラリー下端から溶出してくるＤＮＡを蛍光検出器でモニターしながら分取した。各フラクション中に含まれるＤＮＡ断片の３’末端側の制限酵素認識部へ続く２塩基は既にわかっているので、共通部分に加えてこの２塩基と相補的な配列を３’末端に持つプライマーと概知の共通部配列（  ライゲーションで付加したオリゴマーの一部）  だけを持つプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行いＤＮＡ断片のコピー数を増やして塩基配列決定の鋳型とし、解析を行った。
【００１４】
本実施例ではオリゴマーを保持したチップを用い、種々ＤＮＡ断片を末端配列毎に分画した後に電気泳動分離したが、逆を行っても良い。
すなわちゲル電気泳動によりＤＮＡ断片群を長さ分離する。ＤＮＡ断片の長さが１Ｋｂ以下の場合には長さ分離の精度は１〜２ｂあり、ＤＮＡ断片混合物を１つのフラクション当り２〜６種とすることは容易である。（ＤＮＡ断片は２本鎖のまま扱うので２種のＤＮＡ分取が最小である。）各フラクション中のＤＮＡ断片の末端２塩基（制限酵素切断配列に続く２塩基）を１６種類のオリゴマーを保持したチップを用いたＤＮＡ相補鎖合成を行い相補鎖伸長の有無により末端塩基を識別して分画し、ＰＣＲ増幅してＤＮＡ塩基配列決定試料とする。
【００１５】
〔実施例２〕
図６は塩基配列決定の一例でＭ１３ファ−ジＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳａｕ３Ａ１で分解したフラグメントを分析したものである。塩基配列決定プライマーには図７に示したように分画の時用いた共通配列の一部３００と３’末端に２つの任意配列３０１を持つものを用いた。末端２塩基の異なるプライマ−を用いると全く相補鎖合成は行われず、配列情報は得られない（  図６−（５）  。フラクション中に一種のＤＮＡ断片があると塩基配列決定反応とゲル電気泳動に基づくＤＮＡシ−ケンサ−により図６−（１）に示すスペクトルが得られ配列決定ができる。一方、電気泳動分離をしなかったり、フラクション中に多くの断片が含まれる場合には１つのフラクション中に同じ末端２塩基配列を持つＤＮＡ断片が２種以上含まれている確立が高い。たとえば２種のＤＮＡ断片が含まれているときには（図６−（２））のように得られるシ−ケンシングスペクトル中には２種のＤＮＡ断片に起因するピ−クが重なるため複雑になるが、３’末端に３塩基選択配列を持つプライマ−３１１を使用し配列決定してＤＮＡシーケンシング反応することでそれぞれの塩基配列情報を得ることができる（図６−（３），（４））。長いＤＮＡを細かく切断すると多くの断片種ができ手間がかかるので、一度に多くの断片種を多く作らず、まずＤＮＡを６塩基認識酵素で切断して電気泳動ついでオリゴチップで分取し、次いで各断片毎に４塩基認識酵素で切断して解析可能なサイズにしてからゲルおよびオリゴチップを用いて分画するのが良い。
【００１６】
〔実施例３〕
本実施例は元のＤＮＡ断片コピー数が少ない場合の例である。ＤＮＡを酵素などで断片化して、オリゴマーをライゲーションにより結合させる。ゲル電気泳動により長さ分取るする。１つのフラクション中には数種のＤＮＡ断片が含まれているが、これを底面に分画用オリゴマーを固定した容器に移し、ハイブリダイズさせた後相補鎖合成をする。次いで８０℃に昇温し、相補鎖伸長しなかったハイブリドマーを解離させ、降温後再度相補鎖合成をする。この操作を数回くり返した後、ライゲーションに用いたオリゴマーと同じ配列のプライマーを添加し、ＰＣＲ増幅を行う。増幅は溶液中及び固体表面で起こるが添加プライマーを量を少なくすると固体表面で相補鎖合成の割合が増える。また、ＤＮＡ断片の両端にそれぞれ異なる配列のオリゴマーを連結させると固体表面でのＰＣＲ増幅だけを起こすことができる。すなわち、片方のオリゴマー配列を持ったプライマーを固体表面に固定し、もう一方のＤＮＡ末端に結合したオリゴマー配列と同じ配列のオリゴマーを溶液中に入れる。両プライマーが揃って初めてＰＣＲ増幅が起こるのでＤＮＡ断片の増幅は固体表面だけで起こる。
なお、ここでは平板状の固体表面を用いたがビーズ、キャピラリーあるいは多孔質の固体を用い、表面積をふやして保持するオリゴマーの数を多くして効率を上げることもできる。
【００１７】
【発明の効果】
ＤＮＡ断片の長さによる分離およびＤＮＡ末端配列による選別を合わせる事で単一のＤＮＡ断片をクロ−ニングせずに得ることができ、ＰＣＲを組み合わせることでクロ−ニングプロセスなしに長いＤＮＡを断片化し、各断片を分離してコピ−数をふやして塩基配列の決定などの解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を示すフロ−チャ−ト。
【図２】試料ＤＮＡを制限酵素切断し末端に概知配列を導入する方法を示す図。
【図３】試料ＤＮＡを他の制限酵素で切断し末端に概知配列を導入する方法を示す図。
【図４】チップ上に固定されたプロ−ブの構造を示す図。
【図５】プロ−ブチップ表面の構造を示す図。
【図６】配列決定例を示す図。
【図７】配列決定に用いたプロ−ブを示す図。
【符号の説明】
１…第１の制限酵素による試料ＤＮＡの断片化とおおまかの分離の行程，  ２…第２の制限酵素による再断片化の行程，  ３…オリゴマ−固定チップによるＤＮＡ断片の分離の行程，  １０，１１０…制限酵素認識部位，  １１…試料ＤＮＡ，  １２，１２２…ＤＮＡ断片，  １３…概知配列ＤＮＡオリゴマ−，  １４…蛍光標識，  １５，１１５…蛍光標識された概知配列ＤＮＡオリゴマ−を導入したＤＮＡ断片，  １６…電気泳動で分離したＤＮＡ断片のフラクション，  ３０…オリゴマ−固定チップ，  ３１…固定されているオリゴマ−，  ３２…共通配列部分，３３…制限酵素切断認識配列の一部，  ３４…任意塩基部分，  ３７，３８…概知配列を導入したＤＮＡ断片，  ３９…鎖伸長したオリゴマ−，  ４０…洗浄除去されたＤＮＡ断片，  ４１…鎖伸長したオリゴマ−に保持されたＤＮＡ断片を持つチップ，  ４２，４３…回収されたＤＮＡ断片，  ５０，５１，５２＊＊＊異なるオリゴマーを固定したチップ上のオリゴマー固定区画，  １８０  …固体表面，  １８１…リンカ，  ２０１…オリゴマ−固定区画，  ２０２…隔壁，  ３００…共通配列部分，  ３０１…任意配列部分，  ３１０…任意配列部分の配列（２塩基の例），  ３１１…任意配列部分の配列（３塩基の例）
【図１】
0003612092.tif 000002
【図２】
0003612092.tif 000003
【図３】
0003612092.tif 000004
【図４】
0003612092.tif 000005
【図５】
0003612092.tif 000006
【図６】
0003612092.tif 000007
【図７】
0003612092.tif 000008