(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の血漿と血球溶解物との混合物の試料を得、
得られた試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得た後、
得られた分画の中からカルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を包含する方法により製造されることを特徴とする、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示すβ−1、3−グルカン検出用組成物。
【請求項２】
昆虫の血漿と血球溶解物との混合物の試料を得、
得られた試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得た後、
得られた分画の中からカルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を特徴とする、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンにより活性化されるフェノールオキシダーゼ組成物の製造方法。
【請求項３】
前記昆虫は、甲虫目（Coleoptera）の昆虫であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記甲虫目の昆虫は、ゴミムシダマシ科（Tenebrionidae）またはコガネムシ科（Scarabaeidae）の昆虫であることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記分画は、カラムクロマトグラフィーにより得られることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
前記カラムクロマトグラフィーに使用されたカラムは、デキストランを含んで成るレジンにより充填されたことを特徴とする請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画に、血球溶解物を追加添加することを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項８】
昆虫の血漿を、該血漿及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得、
得られた分画に血球溶解物または部分精製された血球溶解物を添加した後、
カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を特徴とする、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンにより活性化されるフェノールオキシダーゼ組成物の製造方法。
【請求項９】
前記昆虫は、甲虫目の昆虫であることを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記甲虫目の昆虫は、ゴミムシダマシ科またはコガネムシ科の昆虫であることを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
前記分画は、カラムクロマトグラフィーにより得られることを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１２】
前記カラムクロマトグラフィーに使用されたコラムは、デキストランを含んで成るレジンにより充填されたことを特徴とする請求項11記載の製造方法。
【請求項１３】
前記カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画に、全又は部分精製された血球溶解物を追加添加することを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１４】
検体から試料を採取し、
請求項1の組成物及びカルシウムイオンを前記採取した試料に添加して、
前記試料におけるフェノールオキシダーゼ活性を測定する段階
を含んで成る、β−1、3−グルカンの検出方法。
【請求項１５】
昆虫の血漿と血球溶解物との混合物の試料を得、
得られた試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得た後、
得られた分画の中からカルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を含んで成る方法により製造されるβ−1、3−グルカン検出用キット。
【請求項１６】
前記昆虫は、甲虫目の昆虫であることを特徴とする請求項15記載のβ−1、3−グルカン検出用キット。
【請求項１７】
昆虫の血漿を、該血漿及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得、
得られた分画に血球溶解物または部分精製された血球溶解物を添加した後、
カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を含んで成る方法により製造されるβ−1、3−グルカン検出用キット。
【請求項１８】
前記昆虫は、甲虫目の昆虫であることを特徴とする請求項17記載のβ−1、3−グルカン検出用キット。
【請求項１９】
昆虫の血漿を、該血漿及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得、
得られた分画に血球溶解物または部分精製された血球溶解物を添加した後、
カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択すること
を含んで成る方法により製造される、カルシウムイオンの存在化でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示すβ−1、3−グルカン検出用組成物。
【請求項２０】
検体から試料を採取し、
請求項19の組成物及びカルシウムイオンを前記採取した試料に添加して、
試料におけるフェノールオキシダーゼ活性を測定する段階
を含んで成る、β−1、3−グルカンの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、β−1、3−グルカン検出用組成物、その製造方法及びβ−1、3−グルカン検出用キットに関するものである。
背景技術
ガン患者または臓器移植手術患者若しくはエイズ（AIDS）患者など免疫機能の低下された患者に、真菌感染症または原生動物による感染が増加しているということは、医療系における深刻な問題となってあり、それによる死亡率も漸次増加している。このような免疫機能の低下された患者達に対する真菌感染の可否を早期に判断して適切な抗真菌剤を投与することは非常に必要なことであるが、現在は真菌感染可否を早期に判断するということが困難である。また、数多くのエイズ患者がニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis  carinii)による肺炎により死亡しており、最近、ニューモシスティス・カリニの細胞壁成分としてβ−1、3−グルカンが存在するということが報告されている(Kottom  et  al.、J.Biol.Chem.(2000)、275(51)、pp.40628-34)。
【０００２】
即ち、患者を診断する場合、免疫機能の低下された患者の真菌感染可否を診断する方法として、今までは真菌学的方法を用いて、患者の血液を採取して培養することで真菌の感染可否を判断していたが、この方法は、培養期間が2〜5日も掛るので、治療時期に間に合わないという短所があった。最近には、真菌の抗原を利用する方法または真菌の代謝産物を利用して診断する方法が提示されているが、後者の場合は、多様な代謝産物を全て分析すべきであるだけでなく、真菌代謝産物の頻繁な変異誘導によってその感度や正確度が低下するという問題点があった。従って、このような問題点を解決するため、真菌感染の初期段階で感染患者の血液中に微量存在するβ−1、3−グルカンを正確に認識するシステムを探索する多様な研究が進行されている。
【０００３】
例えば、ザリガニや魚介類を人工養殖する場合、かびが養殖槽に感染されると、ザリガニや魚介類の多量が怪死するため、養殖業者の経済的被害が深刻である。従って、このような場合、真菌の感染を初期診断することができるようになれば、適切な措置を行うことで水産養殖の効率を向上することができる。
【０００４】
昆虫に対するメラニンの形成は、体内に存在するフェノール性物質の酸化から開始され、この過程で作用する酵素のフェノールオキシダーゼは、昆虫の体内で平素は不活性形態のプロフェノールオキシダーゼの形態に存在するが、外部異質物により活性化されるプロフェノールオキシダーゼ連鎖反応の最終産物の刺激によって最終活性形態のフェノールオキシダーゼに転換されるものと知られている。このようなプロフェノールオキシダーゼの活性化は、微生物の細胞壁成分のβ−1、3−グルカン、リポ多糖体及びペプチドグリカンなどにより開始されると報告されている。
【０００５】
且つ、完全変態昆虫の生体内にはプロフェノールオキシダーゼが存在され、β−1、3−グルカンまたはリポ多糖体により活性化されるカスケード反応によってフェノールオキシダーゼに活性化される。一連のカスケード段階からなる前記反応システムは、外部から侵入した病院菌や異質物、若しくは自分の血球細胞の脱顆粒化反応により誘導される内部因子などによって容易に活性化されてフェノールオキシダーゼに変化されて、カテコールアミン類を利用してメラニンを形成してしまうため、前記反応システムを生体外に分離することは困難である。
【０００６】
また、アシダ（Ashida）氏は、米国特許4、970、152号に、エンドトクシンとは反応せず、ペプチドグリカン及びβ−1、3−グルカンと反応する蚕の血漿から得た組成物を利用して、ペプチドグリカンまたはβ−1、3−グルカンを検出する方法を提示した。且つ、この特許には、親和クロマトグラフィーによりペプチドグリカンと反応する蛋白質を除去することで、β−1、3−グルカンを特異的に認識する組成物が提供されている。
【０００７】
前記アシダ（Ashida）氏は、Eur.J.Biochem、188、507-515(1990)に、蚊の幼虫から分離した、β−1、3−グルカンを認識する組成物を提示しながら、プロフェノールオキシダーゼの活性に2価イオンが重要な役割を果たすことを明らかにした。
【０００８】
また、米国特許5、266、461号には、リムルス(Limulus)の血球混合物から分離した、β−1、3−グルカンを認識する組成物が提示されているが、このとき、リムルスは稀貴動物であって、殆どの国家で自然保護動物として指定されているという問題点がある。
発明の要約
本発明は、β−1、3−グルカン検出用組成物に関するものである。
【０００９】
本発明は、β−1、3−グルカン検出用組成物の製造方法に関するものである。
【００１０】
本発明は、β−1、3−グルカンの検出方法に関するものである。
【００１１】
本発明は、β−1、3−グルカン検出用キットに関するものである。
発明の詳細な説明
本発明は、試料内のβ−1、3−グルカンを検出し得る組成物、その製造方法及びそれを利用したβ−1、3−グルカン検出用キットに関するものである。
【００１２】
本発明において、フェノールオキシダーゼシステムとは、昆虫内に存在する、β−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼに活性化されるシステムを示したものである。
【００１３】
本発明において、フェノールオキシダーゼ組成物とは、フェノールオキシダーゼシステム成分の全部または一部を包含し、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物を示す。
【００１４】
本発明は、カルシウムの存在下で、β−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物に関するものである。本発明の組成物は、昆虫のフェノールオキシダーゼシステム全部または一部を包含し、その一例として、プロフェノールオキシダーゼを包含する。
また、本発明は、β−1、3−グルカンを好ましくは20pg／mlまで検出し得る組成物に関するものである。
【００１５】
このようにβ−1、3−グルカンを検出し得る本発明に係る組成物は、個体にカンジダのような真菌の感染可否及びニューモシスティス・カリニのような原生動物の感染可否の確認に利用することができる。
【００１６】
本発明において、昆虫とは、体内にフェノールオキシダーゼシステムを有する昆虫を示し、完全変態昆虫が好ましい。例えば、ザリガニや海老のような甲殻類や甲虫目(Coleoptesra)などが挙げられ、好ましくは、甲虫目としてゴミムシダマシ科及びコガネムシ科などを使用することができる。
【００１７】
また、本発明は、カルシウムの存在下で、β−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物を製造する方法に関するものである。本発明に係る方法は、血漿と血球溶解物との混合物を試料として使用し、分離工程中のカルシウムイオンの生理的作用を遮断することで、β−1、3−グルカンにより活性化されるフェノールオキシダーゼ組成物を分離することができる。
【００１８】
従って、本発明に係る方法は、昆虫の血漿と血球溶解物との混合物である試料を得、その得られた試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得た後、得られた分画中カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択することを包含して構成される。
【００１９】
本発明に係る方法の他の例は、昆虫の血漿を、該血漿及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得、得られた分画に血球溶解物または部分精製された血球溶解物を添加した後、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択することを包含して構成される。
【００２０】
本発明に係る方法では、必要に応じて、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画に血球溶解物を追加添加することができる。
【００２１】
本発明では、昆虫に存在するフェノールオキシダーゼシステムがβ−1、3−グルカンにより活性化されるだけでなく、カルシウムイオンによっても活性化されることを明らかにした。従って、昆虫からフェノールオキシダーゼシステムを分離するためには、β−1、3−グルカンだけでなく、カルシウムイオンによる活性化も抑制することが必要である。この発見に基づいて、本発明は、昆虫体液、または、血漿と血球溶解物から、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物を製造する方法を提供する。
【００２２】
本発明に係る方法は、試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤の存在下で昆虫から体液、または、血漿と血球溶解物との混合物の試料を得、得られた試料を前記試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理して分画を得た後、得られた分画の中からカルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す分画を選択することを包含して構成される。
【００２３】
本発明の方法において、好ましくは、昆虫から試料を採取する時、体液凝固を抑制し得る抗凝固緩衝液を使用する。抗凝固緩衝液は、昆虫の体液凝固を抑制し得る緩衝液であれば何れのものでも使用することが可能で、特に、クエン酸緩衝液が好ましい。
【００２４】
また、本発明者等は、昆虫の血漿と血球溶解物との混合物を試料として使用することで、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンにより特異的にフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物が得られることを明らかにした。本発明の組成物は、血漿と血球溶解物との混合物からβ−1、3−グルカンを20pg／mlまで検出することができる。血漿と血球溶解物との混合物は、昆虫の体液を採取して血漿と血球とを分離させた後、分離された血球を溶血させて血漿に混合させるか、血球溶解物または部分精製された血球溶解物を部分精製された血漿に添加することで得ることができる。他の方法として、体液内の血球を分離せず、そのまま一部または全部の血球を溶血させて得ることもできる。例えば、体液または分離した血球を超音波粉砕(sonication)するか、または、高速遠心分離することで血球を溶血させることができる。
【００２５】
本発明に係る方法において、キレート剤を含有する溶媒または緩衝液により試料を処理して分画を得る工程は、例えば、カラムクロマトグラフィーにより行うことができる。
【００２６】
本発明に係る方法において、試料採取及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤として、公知のキレート剤を特に限定せずに使用することが可能で、例えば、EDTA、EGTA及びクエン酸などを使用することができる。キレーティング剤の量は、対象昆虫試料やカラムの種類、使用溶媒など分離工程条件によって可変されるが、昆虫試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得る量であれば良い。従って、この分野における通常の専門家は、過剰な実験を行わずにキレーティング剤の量を決定することができる。
【００２７】
本発明に係る製造方法において、使用可能な溶媒または緩衝液の種類は特に限定されないが、pHが6.5以下であるものが好ましい。pHが6.5よりも高いと、フェノールオキシダーゼカスケード反応の一つの成分であるセリンプロテアゼが活性化されて、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに活性化させてしまうので、本発明に係る組成物を得ることが困難になる。
【００２８】
本発明において、昆虫試料をキレート剤を含有する溶媒または緩衝液により処理する方法の一例としてはカラムクロマトグラフィーが挙げられ、即ち、レジンを充填させたカラムに昆虫試料をローディングした後、キレート剤を含有する溶媒または緩衝液により溶出させることで分画を得ることができる。本発明においては、アフィニティークロマトグラフィーのような別途のややこしい精製過程を施すことなく、カラムクロマトグラフィーを行うことによってβ−1、3−グルカンを20pg／mlまで特異的に検出し得る組成物を精製することができる。
【００２９】
本発明において、カラムクロマトグラフィーに使用し得るレジンとしては、デキストランまたはビニールを原料とするレジンが好ましい。一例として、セファデックスまたはトヨパール(Toyopearl）を使用することができる。
【００３０】
本発明に係る組成物は、β−1、3−グルカンを特異的に検出することができるため、β−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物の感染診断に有用である。
【００３１】
従って、本発明は、検体にβ−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物感染を診断する方法に関するもので、本発明の方法は、検体から試料を採取し、該試料にカルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物及びカルシウムイオンを添加して、前記試料におけるフェノールオキシダーゼ活性を測定することで構成される。一例として、本発明に係る方法において、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物は、試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤の存在下で、準備された昆虫の血漿と血球溶解物の試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を包含する溶媒により処理して得られた分画中、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼを活性化させる分画を選択して製造される組成物である。
【００３２】
本発明に係るβ−1、3−グルカンの検出方法において、検体は、人間を包含する動物であるか、生物が棲息する環境である。一例として、検体から血液を採取して真菌感染を診断することができる。他の一例として、養殖業の場合は、養殖場の水を採取して、真菌のようにβ−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物感染を診断することができる。
【００３３】
β−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物感染診断の特異性を向上させるために、必要な場合、検体試料に存在するリポ多糖体を除去する前処理を行うことができる。例えば、検体試料を、ポリミキシン(polymyxin)のようにリポ多糖体と特異的に結合するか、リポ多糖体を沈殿させる物質により処理することで、リポ多糖体の影響を除去することができる。
【００３４】
本発明において、真菌感染の診断方法に利用されるフェノールオキシダーゼの活性測定方法は、公知のフェノールオキシダーゼ測定方法をそのまま、または、変形させて利用することができる。一例として、後述する4−メチルカテコル／4−ヒドロキシプロリンエチルエステル(4−MC／4−HP)を利用した発色反応や、ドーパミンを利用したメラニン形成反応を利用して吸光度を測定することで、フェノールオキシダーゼ活性を測定することが可能で、それに基づいて初期段階の真菌感染を容易に診断することができる。
【００３５】
また、本発明は、β−1、3−グルカン検出用キットに関するものである。本発明に係るβ−1、3−グルカン検出用キットは、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物を含有する。一例として、本発明において、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性を示す組成物は、試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤の存在下で、準備された昆虫の血漿と血球溶解物との混合物である試料を、該試料及び分離工程中に存在するカルシウムイオンを充分にキレーティングし得るキレート剤を包含する溶媒により処理して得られた分画中、カルシウムイオンの存在下でβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼを活性化させる分画を選択して製造される組成物である。
【００３６】
本発明において、使用される緩衝液及びフェノールオキシダーゼ活性測定方法は次のようである。
【００３７】
抗凝固緩衝液(pH5.5)：NaCl  15mM、クエン酸トリナトリウム136mM、クエン酸26mM、EDTA  20mM
β−1、3−グルカン溶液：β−1、3−グルカン(curdlan、Wako  Pure  Chemical  Industries、Ltd.  Japan)10mgを0.1NのNaOH  1mlに溶かした溶液10μlと20mMのトリス緩衝液(pH8.0)990μlとを混合して形成した溶液
4−MC／4−HP発色反応
濃度別に希釈したβ−1、3−グルカン溶液10μlにフェノールオキシダーゼ組成物30μlを混合して30℃で5分間前反応させ、20mMのトリス緩衝液(pH7.5)437.5μl、1MのCaCl2  5μl、250mMの4−メチルカテコル(MC)2μl及び62.5mMの4−ヒドロキシプロリンエチルエステル(HP)16μlをそれぞれ入れて総量が500μlになるようした後、30℃で30分間反応させる。更に、20％の酢酸500μlを入れて反応を中止させた後、520nmにおける吸光度を測定する。
【００３８】
メラニン生成反応
希釈したβ−1、3−グルカン溶液10μlにフェノールオキシダーゼ組成物30μlを混合して30℃で10分間前反応させた後、0.02Mのトリス緩衝液(pH8.0)405μl、1MのCaCl2  5μl及び10mMのドーパミン溶液50μlをそれぞれ加えて30℃で60分間反応させ、400nmにおける吸光度を測定して標準曲線を得る。検体から採血した血液を遠心分離して得た血漿を試料として使用し、前記と同様な方法によって400nmにおける吸光度を測定する。標準曲線から試料内に存在するβ−1、3−グルカンの量を決定する。
実施例
以下、実施例を示して本発明をより詳しく説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲を外れない限りそれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
甲虫目褐色ゴミムシダマシ(Tenebrio  molitor）の幼虫を氷上で麻酔させ、25Gの注射針が連結された5mlの滅菌注射器に抗凝固緩衝液を満たした後、頭部側の一番目の節に刺して流出される体液を一匹当り3滴ずつ集めた。採取した体液60mlを203、006gの速度で4℃で4時間の間遠心分離した後、上澄み液を濾過(0.45um)して不純物を除去して55mlを集めた。それを限外ろ過(cut  off：10、000)して3mlまで濃縮した。トヨパール(Toyopearl)HW−55Sレジンを1×50cmカラムに充填させ、充分な量の抗凝固緩衝液によりコラムを洗浄した。濃縮された試料をローディングし、0.18ml／分の速度で抗凝固緩衝液を流しながら溶出液を3.8mlずつ集めた後、280nmにおける吸光度を測定して蛋白質濃度を調査し、β−1、3−グルカン溶液を使用した4−MC／4−HP発色反応を施して、β−1、3−グルカンが存在するときに発色する分画だけを集めて、1次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物を3.8ml得た。得られた前記1次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物を使用して、Ca2+の存在または不存在下におけるβ−1、3−グルカン検出能力を確認した。
【００４０】
前記1次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物3.8mlを再び前記と同様なカラムにローディングし、抗凝固緩衝液を0.16ml／分の速度で流しながら溶出液を3mlずつ集めた後、280nmにおける吸光度を測定して蛋白質濃度を調査し、β−1、3−グルカン溶液を使用した4−MC／4−HP発色反応を施して、β−1、3−グルカンが存在するときに発色する分画だけを集めて、２次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物を得、それを最終的にフェノールオキシダーゼ組成物とした。最終Ca2+濃度がそれぞれ0mM又は5mMとなるようにし、β−1、3−グルカン溶液100ng／mlを含有する溶液10ulを使用してフェノールオキシダーゼ組成物により4−MC／4−MP発色反応を行った後、反応時間による結果を確認した。その結果を図1に示した(図中、黒ひし形：緩衝液、黒四角：フェノールオキシダーゼ組成物、黒三角：フェノールオキシダーゼ組成物＋Ca2+、−×−：フェノールオキシダーゼ組成物＋Ca2+＋β−1、3−グルカン、をそれぞれ示す)。図示されたように、β−1、3−グルカンが存在する場合、フェノールオキシダーゼ組成物がフェノールオキシダーゼ活性を示すことが分かる。
【００４１】
フェノールオキシダーゼ組成物のβ−1、3−グルカンの濃度によるフェノールオキシダーゼ活性を測定して標準曲線とした。0〜200pg／mlのβ−1、3−グルカンの濃度に対し、30℃で1時間の間前記発色反応を施して、520nmにおける吸光度を測定し、その結果を図2に示した。濃度と活性との相関係数は0.9862となって、極微量のβ−1、3−グルカンを検出し得ることが確認された。
【００４２】
実施例２
実施例1のフェノールオキシダーゼ組成物がβ−1、3−グルカンに対する特異性を有するかを確認するために、リポ多糖体及びペプチドグリカンに対してフェノールオキシダーゼ活性を測定した。50mMのトリス緩衝液(pH7.0)にリポ多糖体(シグマケミカル社製)及びペプチドグリカン(シグマケミカル社製）をそれぞれ懸濁させて、ペプチドグリカンはそのまま、リポ多糖体は2〜3分間超音波破砕して、基質として使用した。リポ多糖体は、200pg／ml、20ng／ml及び20ug／mlの濃度のものを基質として使用して、最終Ca2+濃度5mM及びフェノールオキシダーゼ組成物に対する4−MC／4−MP発色反応を行い、β−1、3−グルカン20ng／mlを基質として使用した時と比較して、その結果を図3に示した(図中、□：フェノールオキシダーゼ組成物＋Ca2+を添加した陰性対照区(以下、Aと称す)、□：A＋リポ多糖体200pg／ml、□：A＋リポ多糖体20ng／ml、□：A＋リポ多糖体20ug／ml、黒四角：A＋β−1、3−グルカン20ng／ml(陽性対照区)、をそれぞれ示したものである)。
【００４３】
また、ペプチドグリカンに対しても前記と同一条件下でフェノールオキシダーゼ活性を測定して、その結果を図4に示した(図中、□：フェノールオキシダーゼ組成物＋Ca2+を添加した陰性対照区(以下、Aと称す)、□：A＋ペプチドグリカン200pg／ml、□：A＋ペプチドグリカン20ng／ml、□：A＋ペプチドグリカン20ug／ml、黒四角：A＋β−1、3−グルカン20ng／ml(陽性対照区)、をそれぞれ示したものである)。
【００４４】
その結果、リポ多糖体及びペプチドグリカンが高濃度、即ち、20ug／mlであるときも、その反応時間を増加させたがフェノールオキシダーゼ活性を示さないので、本発明に係るフェノールオキシダーゼ組成物は、β−1、3−グルカンを特異的に検出し得ることが分かる。
【００４５】
比較例１
甲虫目褐色ゴミムシダマシ(Tenebrio  molitor）の幼虫を氷上で麻酔させ、25Gの注射針が連結された5mlの滅菌注射器に抗凝固緩衝液を満たした後、頭部側の一番目の節に刺して流出される体液を一匹当り3滴ずつ集めた。採取した体液85mlを372gで4℃で5分間遠心分離した後、上澄み液を血漿として、沈殿物を血球細胞として得た。血漿60mlを203,006gの速度で4℃で4時間の間遠心分離した後、上澄み液を濾過(0.45um)して不純物を除去して58mlを集め、限外ろ過(cut  off：10、000)により3mlまで濃縮した。トヨパール(Toyopearl)HW-55Sレジンを1×50cmコラムに充填させ、充分な量の抗凝固緩衝液によりカラムを洗浄した。濃縮された試料をローディングし、0.18ml／分の速度で抗凝固緩衝液を流しながら溶出液を3.8mlずつ集めた後、280nmにおける吸光度を測定して蛋白質濃度を調査し、β−1、3−グルカン溶液を使用した4−MC／4−HP発色反応を施して、β−1、3−グルカンが存在するときに発色する分画だけを集めて、1次精製された血漿由来のフェノールオキシダーゼ組成物を3.8ml得た。
【００４６】
一方、沈殿物の血球細胞に対し、抗凝固緩衝液により洗浄した後遠心分離して血漿部分を除去した。この過程を3回ほど反復して行い、血球細胞を完全に破壊するために超音波粉砕を施した後、372gの速度で4℃で5分間遠心分離して3mlの上澄み液を血球細胞溶解物として得た。
【００４７】
部分精製された血漿のフェノールオキシダーゼ組成物、血球細胞溶解物及び実施例1の体液から1次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物の同一蛋白質含有量(400ug)に対し、Ca2+の存在下における各β−1、3−グルカン(濃度2ng／ml)検出能力を比較し、その結果を図5に示した。図示されたように、体液から得たフェノールオキシダーゼ組成物は、β−1、3−グルカンに対して検出能があることが分かる。
【００４８】
一方、前記血漿由来のフェノールオキシダーゼ組成物を使用してβ−1、3−グルカンの濃度によるβ−1、3−グルカン検出能力を確認し、その結果を図6に示した。図示されたように、血漿だけで得たフェノールオキシダーゼ組成物に対しては、β−1、3−グルカンとフェノールオキシダーゼの活性間には相関関係がないことが分かる。
【００４９】
実施例３
フェノールオキシダーゼ組成物がβ−1、3−グルカンを特異的に検出するかを確認するために、多様な糖を試料に使用して、上述された方法によりメラニン生成反応を行った。400nmにおける吸光度を測定して生成されたメラニン量を測定した結果、フェノールオキシダーゼ組成物は、β−1、3−グルカンの存在下でのみ有意性のあるメラニンを生成した。その結果を表1に示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例４
韓国産の韓国産コガネムシ（Holotrichia  diomphalia）幼虫から分離した体液50mlを420g速度で4℃で20分間遠心分離して、上澄み液及び沈殿物をそれぞれ血漿及び血球細胞として得た。先ず、沈殿された血球細胞5mlに50mMのトリス緩衝液／1mMのEDTA(pH6.5)5mlを加えて超音波粉砕を施した後、22、000gの速度で4℃で20分間遠心分離してその上澄み液を血球細胞溶解物として使用する。
【００５２】
一方、上澄み液の血漿50mlを203,006gの速度で4℃で4時間遠心分離した後、上澄み液を限外ろ過(cut  off：10、000)して3mlまで濃縮した。トヨパールHW55Sレジンを1×50cmのカラムに充填させ、50mMのトリス緩衝液／20mMのEDTA(pH6.5)に平衡化させた後、濃縮された血漿3mlをローディングした。50mMのトリス緩衝液／20mMのEDTA(pH6.5)を0.16mL／分の速度で流しながら溶出液を約3.2mLずつ集めた後、280nmにおける吸光度を測定して蛋白質濃度を調査し、4−MC／4−HP発色反応を施して5mMのCa2+が存在するときに発色する分画をそれぞれ集めた。それら分画から血球溶解物及びβ−1、3−グルカンの存在下でフェノールオキシダーゼ活性を示す分画だけを集めて、部分精製された血漿液(3.2ml)とした。
【００５３】
部分精製された血漿液(蛋白質含有量：25ug)、前記血球溶解物(蛋白質含有量175ug)及びそれらの混合物のフェノールオキシダーゼ組成物(蛋白質含有量比25ug：175ug)のそれぞれに対し、β−1、3−グルカンに対する検出能を測定して図7に示した。反応条件は、最終Ca2+濃度を5mMにし、β−1、3−グルカンを0.1ug／ml濃度含有する溶液10ulを使用して、30分間4−MC／4−HP発色反応を行った。部分精製された血漿液と血球溶解物との混合物は、β−1、3−グルカンが存在する場合にフェノールオキシダーゼ活性を示すことが分かる。
【００５４】
また、前記フェノールオキシダーゼ組成物を使用して、前記と同一条件下で反応時間によるβ−1、3−グルカンの検出能を確認して図8に示した(図中、黒丸：カルシウムの最終濃度5mM＋β−1、3−グルカン2μg／ml、□―□：カルシウムの最終濃度5mM、○―○：20mMのトリス緩衝液、黒三角：β−1、3−グルカン2μg／ml、をそれぞれ示したものである)。図示されたように、カルシウムイオン及びカルシウムイオンの存在下でのβ−1、3−グルカンによりフェノールオキシダーゼ活性が観察された。
【００５５】
実施例５
健康な成人男女11人及び入院中のガン患者50人から採血した。血液にヘパリン（heparin）を処理した後、遠心分離して得た血漿をβ−1、3−グルカン検出用試料として使用した。
【００５６】
患者から得た血漿10μlに、実施例1の1次精製されたフェノールオキシダーゼ組成物10μlを混合して4−MC／4−HP発色反応を行った。520nmにおける吸光度を測定して、標準曲線から試料に存在するβ−1、3−グルカンの量を求めた。健康な成人男女(11人)から採血した血漿からはβ−1、3−グルカンが殆ど検出されなかった。抗ガン治療により免疫性が低下された固形腫よう(solid  tumor)及び血液腫よう(hematogenic  tumor）を有する患者は、炎症性疾患患者等と比較して著しく高いβ−1、3−グルカン濃度を示した(図9参照、括弧内の数字は、実行された実験の回数を意味し、β−1、3−グルカンの濃度はug／血清mlで表示し、平均値±SEMである）。図9中の、その他に表示された患者は、炎症性疾患だけを有して腫ようはない患者である。図10に示したように、炎症性疾患患者の場合は、β−1、3−グルカンが殆ど検出されず、腫よう及び炎症性疾患を同時に有する患者の場合は、その値が一層高く現れた(括弧内の数字は、実行された実験の回数を意味し、β−1、3−グルカンの濃度は平均値±SEMである）。後者の場合は、腫ようだけを有する患者に比べて腫よう及び炎症性疾患を同時に有する患者の場合は、免疫性が一層低下して真菌感染程度が高いためであると推測される。
【００５７】
カンジダ症(Candidiasis）があると確診された患者の場合はβ−1、3−グルカンの濃度がより高く、カンジダ症患者中、抗真菌治療を受けている患者の場合は有意性を有してβ−1、3−グルカンの濃度が低かった(図11参照、図中、括弧内の数字は実行された実験の回数を意味し、β−1、3−グルカンの濃度は平均値±SEMである）。本発明の組成物を使用して試料内のβ−1、3−グルカン濃度を測定することによって、有効性のある真菌感染可否を診断し得ることが分かった。
産業上の利用可能性
本発明により、β−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物の感染可否を初期診断することができる。免疫機能の低下された患者に、β−1、3−グルカンを細胞壁成分として有する微生物の感染可否を早期判断して適切な抗菌剤を投与することで、微生物感染による死亡を低減させることが可能である。また、水産養殖業などの場合、かびの感染に対する措置を早期に取ることができるため、被害を低減し得るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  カルシウムイオン及びβ−1、3−グルカンの存在下で、反応時間による褐色ゴミムシダマシの体液から分離したフェノールオキシダーゼ組成物のフェノールオキシダーゼ活性を示したグラフである。
【図２】  β−1、3−グルカン濃度による褐色ゴミムシダマシの体液から分離したフェノールオキシダーゼ組成物のフェノールオキシダーゼ活性を示した標準曲線である。
【図３】  褐色ゴミムシダマシの体液から分離したフェノールオキシダーゼ組成物のリポ多糖体に対する検出の特異性を調べたグラフである。
【図４】  褐色ゴミムシダマシの体液から分離したフェノールオキシダーゼ組成物のペプチドグリカンに対する検出の特異性を調べたグラフである。
【図５】  褐色ゴミムシダマシの血漿、血球溶解物及び体液からそれぞれ得た組成物がβ−1、3−グルカンにより誘導されてフェノールオキシダーゼ活性を示す程度を比較したグラフである。
【図６】  β−1、3−グルカンの濃度に依存する褐色ゴミムシダマシの血漿から得たフェノールオキシダーゼ組成物のフェノールオキシダーゼ活性を観察したグラフである。
【図７】  韓国産コガネムシ（Holotrichia  diomphalia）幼虫の血漿から分離したフェノールオキシダーゼ組成物、血球溶解物及びそれらの混合物のβ−1、3−グルカンに対するフェノールオキシダーゼ活性をそれぞれ比較したグラフである。
【図８】  カルシウムイオン及びβ−1、3−グルカン存在下で、韓国産コガネムシ（Holotrichia  diomphalia）幼虫の血漿から分離したフェノールオキシダーゼ組成物と血球溶解物との混合物の時間経過に対するフェノールオキシダーゼ活性を示したグラフである。
【図９】  ガン患者の血液を対象に、フェノールオキシダーゼ組成物を利用したβ−1、3−グルカン検出結果を示したグラフである。
【図１０】  腫よう及び炎症性疾患を有する患者の血液を対象に、フェノールオキシダーゼ組成物を利用したβ−1、3−グルカン検出結果を示したグラフである。
【図１１】  カンジダ症患者を対象に、フェノールオキシダーゼ組成物を利用したβ−1、3−グルカン検出結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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