(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４いずれかのアミノ酸残基１から391、配列番号６または８いずれかのアミノ酸残基１から369、配列番号10のアミノ酸残基１から418、または配列番号12のアミノ酸残基１から428を含むソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を持つDNAセグメントを含有する組換えベクター。
【請求項２】
該ソマトスタチン受容体ポリペプチドが、配列番号２または４いずれかのアミノ酸残基１から391、配列番号６または８いずれかのアミノ酸残基１から369、配列番号10のアミノ酸残基１から418、または配列番号12のアミノ酸残基１から428、からなるものである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
該ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列が有効なプロモーターに隣接し、かつその制御下に位置する請求項１記載のベクター。
【請求項４】
プロモーターが原核性プロモーターを含み、ベクターが原核宿主内での発現に適応している請求項３記載のベクター。
【請求項５】
プロモーターが真核性プロモーターを含み、ベクターが真核宿主内での発現に適応しており、且つ、該ベクターがカルボキシ末端−アミノ酸残基の3'位で、そしてコードされたポリペプチドの転写ユニット内にポリアデニル化シグナルをさらに含有している請求項３記載のベクター。
【請求項６】
配列番号２または４いずれかのアミノ酸残基１から391、配列番号６または８いずれかのアミノ酸残基１から369、配列番号10のアミノ酸残基１から418、または配列番号12のアミノ酸残基１から428に対応するソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を持つ単離されたDNAセグメント。
【請求項７】
該ソマトスタチン受容体ポリペプチドが、配列番号２または４いずれかのアミノ酸残基１から391、配列番号６または８いずれかのアミノ酸残基１から369、配列番号10のアミノ酸残基１から418、または配列番号12のアミノ酸残基１から428からなるものである、請求項６記載の単離されたDNAセグメント。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９または11のいずれかのDNA配列の、連続した少なくとも20塩基からなる配列部分を含む、単離されたDNAセグメント。
【請求項９】
配列が配列番号１、３、５、７、９または11のDNA配列の少なくとも30塩基配列を含む、請求項８記載の単離されたDNAセグメント。
【請求項１０】
配列が配列番号１、３、５、７、９または11のDNA配列の少なくとも40塩基配列を含む、請求項８記載の単離されたDNAセグメント。
【請求項１１】
さらに、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするものとして定義される、請求項８記載の単離されたDNAセグメント。
【請求項１２】
請求項６〜９のいずれかに記載のDNAセグメントを含有する組換えベクター。
【請求項１３】
配列番号２または４いずれかのアミノ酸残基１から391、配列番号６または８いずれかのアミノ酸残基１から369、配列番号10のアミノ酸残基１から418、または配列番号12のアミノ酸残基１から428を含む、ソマトスタチン受容体ポリペプチド。
【請求項１４】
組換えポリペプチドとしてさらに定義される請求項13記載のソマトスタチン受容体ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項６または８に記載の単離されたDNAセグメントを含有する組換え宿主細胞。
【請求項１６】
真核宿主細胞としてさらに定義される請求項15記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
原核宿主細胞としてさらに定義される請求項15記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
酵母細胞としてさらに定義される請求項15記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメントが、組換え宿主細胞内において機能する調製シグナルの転写制御の下にあり、その調節シグナルは全ての必要な転写および転写後修飾がなされるようにソマトスタチン受容体ポリペプチドの発現を適切に制御するものである請求項15〜18のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
ソマトスタチン受容体ポリペプチドと反応性がある抗体の製法であって、請求項15〜19のいずれかに記載の組換え宿主細胞であり、該ポリペプチドを発現することができる細胞を生産すること、該ポリペプチドを発現するために適当な条件下に該宿主細胞を培養すること、該ポリペプチドを回収すること、および該ポリペプチドに対する抗体を製造することからなる方法。
【請求項２１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ソマトスタチン受容体ポリペプチドの製法であって、請求項15〜19のいずれかに記載の組換え宿主細胞であり、該ポリペプチドを発現することができる細胞を生産すること、該ポリペプチドを発現するために適当な条件下に宿主細胞を培養すること、および該ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２３】
宿主細胞がさらに真核宿主細胞を包含する請求項22記載の方法。
【請求項２４】
真核細胞がさらにCOS−１細胞を包含する請求項23記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞がさらに原核細胞を包含する請求項22記載の方法。
【請求項２６】
原核細胞がさらに大腸菌DH5α株の細菌細胞を包含する請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する能力のある候補物質を検定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項15記載の宿主中で請求項13または14に記載のソマトスタチン受容体ポリペプチドを発現させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドを該候補物質に暴露させる工程、および
（ｃ）該ポリペプチドと該候補物質との反応を評価する工程、を含む方法。
【請求項２８】
評価工程（ｃ）において、ソマトスタチン様相互作用について候補物質を試験する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
該ソマトスタチン様相互作用がインシュリン代謝の阻害またはグルカゴン代謝の阻害である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
評価工程（ｃ）がさらに１またはそれ以上の単離された組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する選択的能力を持つ候補物質を特定できる評価を含む、請求項27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.発明の技術分野
本発明は、一般的に、ソマトスタチン受容体（SSTR）群の組成物およびそれらを得る方法に関する。本発明はまた、ソマトスタチン受容体群をコードするDNA配列、それら配列を担持する組換えベクター、該配列またはベクターのいずれかを含有する組換え宿主細胞、および組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドに関する。特定の具体的な態様において、本発明は、少なくとも３種類の異なるソマトスタチン受容体、即ちSSTR1、SSTR2およびSSTR3を、ヒトDNAを含む様々な起源からクローニングし、機能的に発現させることに関する。本発明はまた、診断、医薬デザインおよび治療適用に用いるために、候補物質の中からソマトスタチン受容体ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストなどを選択し、改良するために設計されたアッセイに、単離した組換え受容体ポリペプチドを用いる方法に関する。
2.従来技術の説明
ソマトスタチン
ソマトスタチンは最初、視床下部抽出物から単離された、脳下垂体前葉から分泌される強力な成長ホルモン阻害作用を有するテトラデカペプチドであることが示された［ブラゾウら（Brazeau et al.）1973］。その後の研究で、このホルモンが広範囲に分布しており、中枢神経系、および胃、腸、および膵臓などの身体の末梢組織に存在することが明らかになった［ライヒリンら（Reichlin et al.）1983］。ソマトスタチンは、組織特異的な様々な生理学的効果を表すことが知られている（Reichlin 1983）。それは、例えば、神経伝達物質としての機能と、ホルモンとしての機能である。そのホルモン作用には多くの脳下垂体、膵臓、および胃腸ホルモン、およびその他の分泌性タンパク質（蛋白質）の放出制御が含まれる。これらの理由により、天然ソマトスタチンによる患者の治療には、多くの、そして望ましくない作用があり得る。今日、そのような薬物を完成する唯一の方法は、全動物研究を行うか、これら受容体の粗単離物を用いることである。
ソマトスタチンはソマトスタチン様ペプチドファミリーのメンバーである［プラディロールら（Pradyrol et al.）1980;エッシェら（Esch et al.）1980］。ソマトスタチンの２つの基本的な生物活性形であるソマトスタチン−14とソマトスタチン−28は、92アミノ酸からなる前駆体であるプロソマトスタチン［シェンら（Shen et al.）1982］の組織特異的タンパク質加水分解法によって得られた。同様に、ソマトスタチン−14およびソマトスタチン−28は様々な組織で、様々な濃度で見い出されることが知られている。
ソマトスタチン−14およびソマトスタチン−28は標的組織に対して共通の効果を有し得るが、それらは異なる能力を有し、そのことは、それらの作用が異なる受容体を介することを示している（Reichlin、1983）。例えば、ソマトスタチン−14は、比較的、グルカゴンおよび胃酸分泌に選択的であると思われるが、ソマトスタチン−28はむしろ成長ホルモン、インシュリンおよび膵臓外分泌の特異的な阻害物質であると思われる［ワス（Wass）1989］。
ソマトスタチン受容体
ソマトスタチン−14およびソマトスタチン−28は、多くの場合GTP−結合（Ｇ）タンパク質と結合（カップリング）していると考えられる高親和性受容体との結合を介して、その生物活性を発揮する［ライシンら（Reisine et al.）1985;ルイスら（Lewise et al.）1985］。薬理学的研究で、ソマトスタチン受容体には少なくとも２つのサブタイプがあることが示された［スリカント（Srikant）およびパタル（Patel）1981;トランら（Tran et al.）1985］。このソマトスタチン受容体の２つのサブタイプはソマトスタチン−14およびソマトスタチン−28のいずれかに選択的な受容体を反映していると推測される。ソマトスタチン受容体は他の膜貫通型シグナル受容体に類似すると予測される。
そのような膜貫通型シグナル系の多くは、少なくとも３個の膜結合タンパク質成分：（ａ）細胞表面受容体；（ｂ）イオンチャンネルまたは酵素アデニル酸シクラーゼのようなエフェクター；および（ｃ）受容体およびそのエフェクターの両方と結合している、グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（またはＧタンパク質）、からなる。
Ｇタンパク質と結合した受容体は、光、匂い、ペプチドホルモンおよび神経伝達物質などの様々な細胞外シグナルの作用を媒介する。そのような受容体は、種々の生物で、酵母やヒトなどの様々な進化状態の動物で同定される。ほぼ全てのＧタンパク質−カップリング受容体は、相互に配列類似性を有し、全て脂質２重層を貫通する、７個の疎水性（および潜在的にα−ヘリックス）セグメントからなる、類似のトポロジーモチーフを共有すると考えられている［ドールマンら（Dohlman et al.）1987;Dohlman et al.,1991］。
７回膜貫通セグメント受容体と結合したＧタンパク質はすべて、かさを低くするために３個のしっかりと会合したサブユニット、α、βおよびγ（1:1:1）からなる。アゴニストが受容体に結合した後、Ｇタンパク質に立体配座の変化が伝達され、その結果α−サブユニット結合のGDPとGTPとの交換、およびβγ−サブユニットから解離が起きる。GTP結合形のα−サブユニットは、通常、エフェクター変調部分（Effector−modulating moiety）である。シグナル増幅は、単一の受容体が多くのＧタンパク質分子活性化能力を有することに起因しており、Ｇα−GTPが幾つかのエフェクターの触媒サイクルを刺激することに起因している。
調節Ｇタンパク質ファミリーは、多くの異なるα−サブユニット（ヒトで20以上）からなり、それは、より小さいプールであるβ−およびγ−サブユニット（それぞれ４個以上）と会合している［ストロスマン（Strothman）およびシモン（Simon）1991］。即ち、様々なα−サブユニットの標的化または機能は、それらが会合しているβγ−サブユニットに依存しているかもしれないが、おそらく、α−サブユニットにおける相違によって様々なＧタンパク質オリゴマーを識別している考えられる（Strothman and Simon,1991）。
幾つかのソマトスタチン受容体が、少なくとも部分的に精製された（Patel et al.,1990）。これらの研究では、天然に存在するソマトスタチン受容体のリガンドの類似体（即ち、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体）を用いて、様々な化学的および光学親和性クロスリンカー類を用いる、ラットの脳、脳下垂体、外分泌膵臓および副腎皮質の膜ソマトスタチン受容体とのクロスリンク（交差結合）を行った。２つの主要な58−kDaおよび27−kDaのソマトスタチン受容体タンパク質が同定された。これらのタンパク質は、組織特異的な分布を示した。58−kDaタンパク質は脳下垂体、副腎、および外分泌膵臓における優勢形（全標識タンパク質の約90％）であり、27−kDaタンパク質は脳の基本的なソマトスタチン受容体（全標識タンパク質の約80％）であった。32−kDaおよび42−kDaの２つのマイナーな、特異的に標識されたソマトスタチン受容体タンパク質が、それぞれ、脳および膵臓のみに、見い出された。
同じ２つのリガンドを用い、これらの研究者は、ソマトスタチン−28およびソマトスタチン−14と比較的優先的な結合を示す細胞系からソマトスタチン受容体を特性化した。58−kDa、42−kDaおよび27−kDaの３つの特異的ソマトスタチン受容体タンパク質がそのような細胞系の１つ（AtT−20細胞）で同定された。対照的に、GH3細胞内では、58−kDa種でなく、27−kDaタンパク質が優勢な成分であった。これらの主要およびマイナーなタンパク質のラベル化はGTPおよびソマトスタチン−14による阻害に敏感であり、それらの推定のソマトスタチン受容体タンパク質としての特異性を証明していた。
最近、ヒーら（He et al.,1989）は、Ｄ−Trp8SS−14アフィニティーカラムを用い、ラットの脳およびAtT−20細胞から、界面活性剤で可溶化した60kDaソマトスタチン受容体タンパク質を精製した。このタンパク質のサイズはパテルら（Patel et al.）、彼らも、ラットの脳およびAtT−20細胞から、58−kDa受容体をクロスリンクし、精製することに成功したが、のそれと一致している。即ち、ソマトスタチン−14およびソマトスタチン−28と高親和性および高特異性で結合し、薬理学的受容体としての資格を有する、58−60kDaの同じようなサイズのタンパク質が、２つの異なる研究グループにより、２つの異なる組織から、２つの異なる方法で精製された。しかもそのサイズは他のクローンされたＧ−タンパク質−結合膜受容体のそれと一致した。
レイル−デスマーら（Reyl−Desmars et al.,1989）は、抗受容体モノクローナル抗体を用い、ヒト胃細胞系HGT1から90kDaの異なるサイズのソマトスタチン受容体タンパク質を均一にまで精製した。AtT−20細胞から単離した無傷の58−kDaタンパク質の配列決定の試みは、最初、Ｎ−末端のブロックによって失敗に終わった。従って、これらの研究者らは、脳58−kDaタンパク質をトリプシン処理した。消化物を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。消化物対照には存在しない多くのペプチドピークが同定された。これらピークの内、タンパク質20−40ピコモルを含有する最大の４ピークの各々を配列決定した。従来知られていなかった、16−23アミノ酸残基のペプチド配列が得られた。これらフラグメントの最大のものはGiタンパク質ファミリーと相同な部分配列を示した。しかし、配列はどの既知のＧタンパク質にも相当せず、残りのトリプシン処理断片（トリプチックフラグメント）はＧタンパク質となんらの類似性も示さなかった。
従って、トリプチックフラグメントの１つがGiタンパク質と部分配列において相同であることは、偶然の一致である、あるいは、多分、最近特性化されたシグナル認識粒子受容体などの他のGTP−結合受容体［コノリー（Connolly）およびギルモア（Gilmore）1989］に相当する58−kDaソマトスタチン受容体のＧタンパク質関連構造を示していると考えることができる。パテルらが単離した32−kDaタンパク質は配列決定できなかった（Dohlman,1991）。
７−トランスメンブランセグメント（７回膜貫通型セグメント）受容体のクローニング
細胞培養および薬理学的手法の改良により、さらに、近年では、分子クローニングおよび遺伝子発現技術の発展により、既に同定されていた受容体の新規なサブタイプ、サブサブタイプなど、多くの新しい７回膜貫通型セグメント受容体が特性化された。アドレナリン性α１−およびα２−受容体は、かつて、各々単一の受容体種からなると考えられていたが、現在では各々が少なくとも３つの別個の遺伝子によってコードされていることが分かっている［コビルカら（Kobilka et al.）1987;レーガンら（Regan et al.）1988;コッチアら（Cotecchia et al.）1988;ロマスネー（Lomasney）1990］。薄暗い所での視覚を伝える網膜杆細胞内のロドプシンのほか、色を伝える非常に似通った３つの錐体色素がクローンされた［ナサンスら（Nathans et al.）1986a;Nathans et al.,1986b］。Ｇ−タンパク質−カップリング受容体ファミリーの全メンバーは、Ｇ−タンパク質−カップリング受容体ファミリーの他のメンバーと相同であるように思われ（例、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、タキキニンなど）、各々は、７回膜貫通型セグメントトポロジーを共有するように見える。
７回膜貫通型セグメント受容体を相互に比較すると、アミノ酸配列の保存に関して認識できるパターンが認められる。膜貫通型ドメインは、しばしば、最も似通っているが、Ｎ−Ｃ末端領域および膜貫通型セグメントＶおよびVIを連結している細胞質内ループは全く異なっている（Dohlman et al.,1987）。
例えば、キナーゼ類およびＧタンパク質類などの細胞質内タンパク質との相互作用には、受容体の膜貫通型ドメインを連結している疎水性ループが関与していると予測される。しかしながら、機能保全の故に７つの膜貫通型セグメント受容体の中で、どの性質が保存されているか、そして、どの異なる性質が新しい機能への構造的適応を表しているかを決定することが挑戦の対象であった。これらの考えを試験するために、組換えDNA、および置換および欠失突然変異体の構築のための遺伝子発現法の使用、並びにハイブリッドまたはキメラ受容体の使用などの様々な戦略が用いられた（Dholman et al.,1991）。
受容体サブタイプ、Ｇタンパク質類、およびエフェクターの数が増えるに伴って、これらの受容体のリガンド結合およびＧタンパク質認識特性の特性化が重要な研究分野となってきた。長い間、複数の受容体が単一のＧタンパク質と結合でき、アドレナリン性β２−およびα２−受容体と結合するエピネフィリンの場合のように、単一のリガンドが複数の機能的に異なる受容体サブタイプと結合することが分かった。さらに、同様の、受容体およびエフェクター結合特異性を有するＧタンパク質も同定された。例えば、ヒトGiの３つの種がクローンされ［イトウら（Itoh et al.）1988］、交互の（１つおきの）mRNAスプライシングによりGsの多くの変異体が得られることが分かった［コザサら（Kozasa et al.）1988］。ムスカリン様およびアドレナリン性α２−受容体のクローニングおよび過剰生産は単一の受容体サブタイプが、細胞内で高レベルに発現されると、１以上のタイプのＧタンパク質とカップリングすることが示された。
この複雑さおよび見かけ上の機能の退化から、基本的に重要な疑問は、いかにして、そしてどのような条件下で、Ｇタンパク質が複数の受容体からのシグナルを系統づけ、それらを適当なエフェクターに指令するか、ということである。伝統的な方法は、精製受容体とＧタンパク質成分をインビトロで再構成することである。残念ながら、精製法は、極く限られた数の受容体サブタイプおよびその同族のＧタンパク質の精製でしか成功しない。別法として、クローンした受容体の特性化および受容体Ｇタンパク質のカップリング特異性の解明に、ヘテロローガス発現系が、より一般的な有用性を持ち得る［マルレロら（Marullo et al.）1988;ペイエットら（Payette et al.）1990;キングら（King et al.）1990］。このタイプの研究は、ソマトスタチン−関連疾患における治療法の設計に成功するために必要である。
最近、酵母細胞内で哺乳類のアドレナリン性β２−受容体およびGsα−サブユニットが同時に発現され（co−expression）るような、酵母細胞発現系が開発された（King et al.,1990）。いかなるヒト組織よりも数百倍高いレベルのアドレナリン性β２−受容体の発現が達成され、適切な親和性、特異性および立体選択性のリガンド結合が示された。さらに、成長阻害の負荷、形態学的変化、およびEscherichia coli lacz遺伝子（β−ガラクトシダーゼをコードする）と融合したフェロモン反応性プロモーター（FUS1）の誘導などの幾つかの基準に基づいて、フェロモンシグナル伝達経路のアドレナリン性β２−受容体を介する活性化が証明された。（King et al.1990）。
最後に、他の関連サブタイプなしに、単一受容体のみを発現させることは、たとえ単離した、非組換え哺乳類細胞内でも、しばしば達成不可能である。即ち、そのような内因性受容体が存在しない微生物内（例、酵母細胞または突然変異哺乳類細胞）での発現は、サブタイプ選択性薬物のスクリーニングおよび評価のために有用である（Marullo et al.,1988;Payette et al.,1990;King et al.,1990）。
即ち、ソマトスタチン受容体の研究に古典的な遺伝子学の標準的な方法を適用することは相当困難であり、たとえ分子生物学の強力な技術でさえも適用は困難である。とりわけ、個々のソマトスタチン受容体をコードするDNA配列を同定する方法が必要である。そのような、単離された組換え配列が得られれば、従来困難であった、イソフォーム特異性ソマトスタチン受容体アゴニストおよびアンタゴニストを設計し、試験することに伴う困難な問題の解決が可能になるかもしれない。
発明の要約
本発明は、組換えソマトスタチン受容体を得、用いるために必要な、DNAセグメント、純化ポリペプチド、抗体を得る方法、クローニング法および組換え宿主細胞を用いる方法を、初めて提供する。即ち、従来技術から明らかに、分子生物学における古典的な遺伝学および技術による標準的な方法の適用が直面する問題点、例えば、ソマトスタチン受容体の分子量が様々であることなどが克服された。従って、本発明は、一般的に、ヒトおよびマウス両起源のソマトスタチン受容体を含む受容体の製造のための組成物（成分）および方法に関する。
本発明の実質的な利益を達成するために、種々の、新規な物質の組成物および方法を提供する。本発明が提供する組成物には、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAを含有する（組み込まれた）組換えベクター、ソマトスタチン受容体をコードする単離されたDNAセグメント、ソマトスタチン受容体ポリペプチドそのもの、およびソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAを含有する（組み込まれた）組換え宿主細胞が含まれる。本発明の方法は、ソマトスタチン受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体の製造、ソマトスタチン受容体ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストのような試験候補物のスクリーニングアッセイであって、候補物質の中から、望ましくない性質に対し、望ましい性質を有する候補物質を識別できるアッセイ、候補物質から１つまたは他のソマトスタチン受容体ポリペプチドに特異的な物質を選択できるアッセイ、およびソマトスタチン受容体ポリペプチドの構造と機能の相互関係を調査する方法を含む。
本発明の意味から、ソマトスタチン受容体ポリペプチドという語句は、本発明によって可能になったソマトスタチン受容体ポリペプチドと生物学的および免疫学的同一性を有するペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、そのような受容体ポリペプチドは、本発明でヒトおよびマウス起源から誘導されたものを包含する。本発明のアミノ酸配列が、現時点で配列決定されている既知のソマトスタチン受容体ポリペプチドに関する唯一の、正確な長さおよび正確な性質を示すことから、本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは一般に本発明が提供するアミノ酸配列の任意のものを指すものとする。しかしながら、本発明はより短いまたは長いペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を排除するものでなく、実際、それらペプチドまたはタンパク質が、例えば、本明細書で同定したソマトスタチン受容体ポリペプチドのいずれかに対するポリクローナル抗血清によって定義される、生物学的活性および／または交差免疫学的反応性を有する限り、それらの製造または使用をも可能ならしめるものである。例えば、当業者ならば理解するように、他の哺乳類起源と同様、特定の種の異なる組織起源などの、種々の真核性供給源から、本発明の方法を用いて組み換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを得ることができる。
DNAセグメント
本明細書で開示する組換えベクターは、本発明の方法および組成物を用い、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメントを含有する。そのようなDNAセグメントという語句は、該セグメントを非−ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメントから区別するに十分な長さの、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメントを包含するものである。本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは、任意の形のソマトスタチンまたはその類似体と結合し得る、任意のソマトスタチン受容体ポリペプチドと理解され得る。さらに、本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドは特定の供給源に限定されない。本明細書に開示したように、本発明の方法および組成物は、例えば、ヒトおよびマウス起源からのSSTR1−３の同定および単離を可能にする。このように、本発明は、様々な供給源からのソマトスタチン受容体ポリペプチド群を一般的に検出および単離すると同時に、２つの別個の供給源からの３つの種を個々に同定する方法を提供する。本発明の組成物および方法を用いて、ソマトスタチン受容体ポリペプチドファミリーの多数の種が検出および単離できると考えられる。現在、この受容体ポリペプチドファミリーの少なくとも４つのメンバーを、本発明の組成物および方法を用いて得ることができると考えられている。本発明のDNAセグメントは、アミノ酸の相対的ヒドロパシースコアの変換などを考慮して選択される変化を有するアミノ酸配列変異のような、様々なアミノ酸配列変異を有する、生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドをコードしていてもよい。これらの変異配列は天然起源から単離されるか、本明細書開示の配列から、部位−特異的突然変異誘発などの突然変異誘発法を用いて誘導したもので良い。
ある一般的な観点から、本発明は、ベクターおよびDNA断片を含む、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を有する、DNAセグメントの製造および使用に関する。本発明のDNAセグメントは、勿論、本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドの発現に用いることができる。
ある態様では、ベクターは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを表す配列を示す任意の配列番号のアミノ酸を含有するソマトスタチン受容体ポリペプチドの、少なくとも有用な部分をコードする、実質上、精製されたDNA断片を含有する。SSTR1のためのソマトスタチン受容体ポリペプチドの場合、本発明により、ヒト（配列番号２）およびマウス（配列番号４）ポリペプチドの両者が得られた。同様に、ヒトSSTR2およびマウスSSTR2も本発明によって得られ、それぞれ、配列番号６および８に記載されている。さらに、ヒトSSTR3ポリペプチドは配列番号10に、マウスSSTR3は配列番号12に記載されている。
本発明のある態様では、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAを示した様々な配列番号の任意のものの配列を含有する、短いおよび長いDNA断片には、例えば、真核性および原核性組換えクローンバンクのスクリーニングのための短いDNA断片ハイブリダイゼーションプローブとしての使用など、別の用途が見いだされる。どのような事象でも、約14ヌクレオチドの短いストレッチの、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNA配列を示す任意の配列番号の配列に対応する断片は、これらまたは他の態様における用途を有することが見い出されるであろう。SSTR1−３のための配列番号の、任意のソマトスタチン受容体DNA配列と共通の、またはそのいずれかと相補的な、少なくとも約14ヌクレオチドのストレッチを有すれば、１つのDNAセグメントは、通常、ソマトスタチン受容体種のDNAと優先的にハイブリダイズ（ハイブリド化）する能力、特に、0.15M塩化ナトリウムおよび0.02Mクエン酸ナトリウム、pH7.4（約50℃）のやや強いストリンジェンシーの下で、ハイブリダイズする能力を有する。
通常、そのような相補的あるいは共通なストレッチは、安定なハイブリッドを形成する能力を確実に持つが、ある態様では、より長いストレッチの相補DNAが望ましいと判明するかもしれない。即ち、例えば、20、30または40塩基長さの、より長いストレッチの相補配列を有するDNAセグメントの使用が望まれることもある。勿論、用いる相補配列が長ければ長いほど、ハイブリダイゼーションの可能性が大きく、ハイブリダイゼーション（ハイブリド化）プロコトルはより強度（ストリンジェント）である。
即ち、本発明のDNA配列を、オリゴヌクレオチドプローブとして用い、ソマトスタチン受容体ポリペプチドまたは遺伝子を有すると考えられるDNA供給源にハイブリダイズさせることができる。通常、オリゴヌクレオチドをそのような受容体遺伝子を有することが疑われるDNA供給源にハイブリダイズさせることで、プローブを行う。ある場合には、プローブは単一のプローブのみからなり、他の場合には、プローブは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドのあるアミノ酸配列または配列群に基くプローブの集まりで構成されているかもしれず、その多様性によって遺伝子コード特有の重複性を満たすであろう。
このような方法でプローブするためのDNAの適当な供給源は、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを発現することができる、目的の細胞系のゲノムライブラリーであろう（例、ヒト膵臓島細胞）。または、DNAの供給源は、目的の細胞系からの全DNAを含有するであろう。本発明のハイブリダイゼーション法によって候補DNAセグメントが同定されれば、陽性クローンが得られたかどうかを、例えば、さらにハイブリダイゼーションし、配列決定し、かつ／または発現させ、試験することで確認することが望まれるかもしれない。
または、これらのセグメントを、あるDNA配列群と本明細書に開示したソマトスタチン受容体セグメントDNA配列との類似性に依存する他の方法と同様、下記の種々の方法で、以下のようにして用いることができる：（１）患者の細胞から得たDNA内の正常および異常なDNA配列の検出のための診断道具として；（２）ソマトスタチン受容体ファミリーの他のメンバーおよび近縁タンパク質の配列を含有する可能性のあるDNAライブラリーから、そのような配列を検出し、単離するための手段として；（３）近縁の配列を増幅するために近縁配列とハイブリダイズさせるためのプライマーとして；（４）天然のソマトスタチン受容体DNA配列を変化させるためのプライマーとして。
ベクター
本発明は、１つの実施態様として、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列を有するDNAセグメントを含有する組換えベクターを提供する。そのようなベクターは当該術分野の当業者に周知の、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードしており、宿主細胞を安定に形質転換することができる適当なDNAセグメントを含有する、任意のベクターであってよい。そのようなベクターは、pCMV6bおよびpCMV6CなどのpCMVファミリーの哺乳類発現ベクター（Chiron Corp.,Emeryville CA）を含む。ある場合には、そして特異的に、これらの個々の哺乳類発現ベクターの場合には、得られた構築物を、pSV2neoのような選択可能マーカーを含有するベクターと一緒にコトランスフェクション（同時トランスフェクション）する必要がある。DG44のような、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系へのコトランスフェクションで、そのような発現ベクターに組み込んだDNAにより、ソマトスタチンポリペプチドを発現するクローンを検出することができるであろう。
本発明は、１つの実施態様として、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列であって、それぞれ、ヒトおよびマウスSSTR1ポリペプチドに相当する、配列表の配列番号２または４のいずれかに記載の配列のアミノ酸番号１−391のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする配列を有するDNAセグメントを含有するベクターを提供する。該組換えベクターはまた、ソマトスタチン受容体ポリペプチドであって、それぞれ、ヒトおよびマウスSSTR2ポリペプチドに相当する、配列表の配列番号６または８のいずれかに記載の配列のアミノ酸番号１−369のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする配列を有するDNAセグメントを含有していてもよい。さらに、該組換えベクターは、その配列に、ソマトスタチン受容体ポリペプチドであって、それぞれ、ヒトおよびマウスSSTR3ポリペプチドに相当する、配列表の配列番号10のアミノ酸番号１−418のアミノ酸を含むポリペプチド、または配列表の配列番号12のアミノ酸番号１−428のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするDNAセグメントを含有していてもよい。加えて、当該技術分野の当業者ならば理解することであるが、本発明によって同定、クローニング並びに配列決定が可能になった、他のソマトスタチン受容体ポリペプチドもベクターに組み込むことができ、従って、それらも本発明の範囲に包含される。
ベクターに関しては、本発明のDNA配列を組み込むことができる多くのベクターが知られている。例えば、ベクターpUC18は特に価値あることが証明された。同様に、近縁のベクターM13mp18およびM13mp19は、本発明のある実施態様、特に、ジデオキシ配列決定において有用である。
従って、組換えベクターおよび単離したセグメントは、上記のソマトスタチン受容体ポリペプチドの任意のものの、基本的なソマトスタチン受容体ポリペプチド暗号領域自身を様々に含有するか、そのようなソマトスタチン受容体ポリペプチドの基本的な暗号領域における選択された変更または修飾を有する暗号領域を含有していてもよい。あるいは、そのようなベクターまたは断片は、基本的な暗号領域を含有しつつ、より大きいタンパク質またはポリペプチドをコードしていてもよい。いずれの場合でも、生物学的な機能の等価性と同様、コドンの重複性の故に、本発明は、この点に関して、上記のポリペプチド配列に対応する特定のDNA配列に限定されるものではないことが理解されるであろう。
上記の組換えベクターは、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNA自身を量産する手段、並びにコードされたタンパク質およびペプチドを生産する手段として有用である。本発明のソマトスタチン受容体ポリペプチドを組換え法で製造する場合、シャトルシステムとして、原核性または真核性発現を用いることができる。しかしながら、原核性システムでは、通常、前駆体タンパク質が正しくプロセッシングされず、特に、そのようなシステムは膜結合真核性タンパク質を正しくプロセッシングしないので、さらに開示した発明による教示から真核性ソマトスタチン受容体ポリペプチドが理解されるので、そのような配列を真核性宿主内で発現させることが望まれるかもしれない。しかしながら、DNAセグメントが真核性のソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードしている場合でも、原核性発現の適用の可能性も幾らかあることは理解される。従って、本発明は、真核性および原核性細胞間のシャトルベクターと組み合わせて用いることができる。細菌性および真核性宿主細胞を用いることができるそのようなシステムは本明細書に開示されている。
組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドの発現が望まれ、真核性宿主が想定されているとき、真核性複製起点を有するプラスミドのようなベクターを用いることが最も望ましい。加えて、真核性システムでの発現を目的とする場合、ソマトスタチン受容体をコードする配列を、チャイニーズハムスターの卵巣細胞と一緒に用いられるプロモーターのような、有効な真核性プロモーターに接近し、そのコントロール下に位置させることが望まれる。それが真核性、原核性のいずれであれ、コード化配列をプロモーターの制御下に置くには、通常、タンパク質の適切な翻訳読み砕くの5'末端を、選択したプロモーターの3'側または下流、約１−約50ヌクレオチドの範囲に位置させることが望ましい。さらに、真核性発現が想定されるとき、通常、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを含有する転写ユニット内に、適切なポリアデニル化部位を組み込むことが望ましい。通常、ポリアデニル化部位はタンパク質の約30−2,000ヌクレオチド下流で転写終止側の前に位置させる。
従って、ある好ましい態様では、本発明のベクター内で、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードする配列は、有効なプロモーターに隣接し、その制御下に位置する。ベクターは当業者に周知の原核性プロモーターを含有する、原核性宿主細胞内での発現に適合させたベクター類であってよい。あるいは、ベクターは当業者に良く知られた、真核性プロモーターを含有し、さらにカルボキシ末端アミノ酸の3'に位置し、コードされているタンパク質の転写単位内にポリアデニル化シグナルを有するベクターであってよい。
宿主細胞
本発明はまた、配列表の配列番号１、３、５、７、９または11に記載のDNA配列を含有する様々な組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞の本質は、原核性または真核性のいずれであってもよい。いずれの場合でも、ソマトスタチン受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメントは特定の宿主細胞内で機能的な制御シグナルをも有することが理解される。
好ましい実施態様には、組換え真核性細胞が含まれる。ヒトソマトスタチン受容体ポリペプチドの生産が目的の場合、とりわけヒト組織から導かれた真核細胞系が望ましい。
ソマトスタチン遺伝子およびポリペプチドの単離
本発明はまた、組換えおよび非組換え、両供給源からのソマトスタチン受容体ポリペプチドの単離法を提供する。そのようなタンパク質は通常、配列番号２または４のいずれかの、アミノ酸番号１−391に対応するアミノ酸配列、または配列番号６または８のいずれかの、アミノ酸番号１−369に対応するアミノ酸配列を含有する。
しかしながら、本発明方法は、少なくとも配列番号10のアミノ酸１−418を含有するソマトスタチン受容体ポリペプチドのヒト膵臓島細胞からの単離に奏功することが証明された。同様に、本発明の方法を用いて、少なくとも、配列番号12のアミノ酸１−428を含有する、マウスDNAからのソマトスタチン受容体ポリペプチドが単離された。当業者には明らかなことであるが、これらのソマトスタチン受容体ポリペプチド群は、本明細書に詳細に記載したソマトスタチン受容体１または２のいずれかとアミノ酸配列において異なるポリペプチドに対応する。当業者にとって、同じく明らかであり、本発明の技術背景において特に指摘したように、少なくとも部分的に精製された様々なソマトスタチン受容体がある。既述のごとく、58kDaおよび27kDaの、少なくとも２つの主要なソマトスタチン受容体タンパク質が同定された。さらに、32kDaおよび42kDaの特異的にラベルされたソマトスタチン受容体タンパク質も同定された。同様に、既述のごとく、ヒト胃細胞系から、90kDaソマトスタチン受容体タンパク質が、均質にまで、精製された。
このように、ソマトスタチン受容体活性を有する異なる分子量のポリペプチドが本発明によって示された。さらに、本発明により入手可能となった様々なソマトスタチン受容体における分子量の相違は、グルコシル化が様々であることに関連するかもしれず、あるいはそのような相違は、おそらくヒト、腸または特定の組織に特有の、全体として異なるソマトスタチン受容体形を表しているのかもしれない。即ち、先行文献に記載の様々な分子量の異なるソマトスタチン受容体ポリペプチドは、ソマトスタチン受容体活性を有すると予測され、しかも実質上同様のDNAまたはアミノ酸配列を有し得る。活性の相違は、実際、アミノ酸鎖自身の一次構造の相違に起因するかもしれず、あるいは、任意の数の翻訳後修飾に起因するかもしれない。しかしながら、分子量の相違をもたらすような翻訳後または修飾に関係なく、本発明で得た配列を表している場合、そのようなタンパク質は、本発明に従って得ることができることを、当業者ならば理解するであろう。当業者はそのようなタンパク質が組換えDNA分子中によりコードされている場合、適当な宿主細胞および遺伝子的アプローチが得られれば、それを用いて直接、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを合成することができることを理解するであろう。
さらに、そのようなポリペプチドはある実施態様で用いる抗体を調製するために用い得る。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれであっても良く、いずれの場合でも、本発明のポリペプチドのいずれかと免疫学的に反応し得る抗体を表す。そのような抗体が一度調製されれば、その抗体を、発現ライブラリーと一緒に用い、ソマトスタチン受容体様ファミリーポリペプチドの他のメンバーのスクリーニングを行うことができる。
ソマトスタチンポリペプチドの発現
従って、本発明は、組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを製造する方法を提供する。この方法は、組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを発現することができる組換え宿主細胞の使用を含む。さらに、本発明の組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養することを含む。最後に、特許請求にかかる製造法は、このようにして発現されたポリペプチドを収集することをも含む。
本発明方法は、特に、配列番号２、４、６、８、10、または12のいずれかに明示されたポリペプチドのいずれかに対応するポリペプチドを得る場合に適用することができる。しかしながら、本発明方法は、上記のいずれかに記載のポリペプチドと実質上類似のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする遺伝子の単離をも意図する。特定の態様において、該方法は、通常、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを発現し得る細胞の選択、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるそのような細胞の選択を含む。しかしながら、本発明方法には、酵母細胞、ヒト細胞系、および当業者に既知の他の細胞系などの様々な細胞を用いることができる。勿論、本発明方法は、通常、そのような細胞を、ソマトスタチン受容体ポリペプチドが実質的な量、産生されるよう、培養することを含む。
次いで、ある種の一般的な態様として、本発明は、組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドの製造方法を提供する。まず、本発明の方法および組成物を用いてポリペプチドを発現することができる、組換え宿主細胞細胞を製造する。次いで、宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する。最後に、本発明の方法および組成物を用いて組換えポリペプチドを回収する。
組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドを用いるアッセイ
これらの方法によって発現された組換えソマトスタチン受容体ポリペプチドは様々なスクリーニングアッセイに用いられる。例えば、本発明の方法および組成物を用い、ソマトスタチン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの候補物質を試験するためのスクリーニングアッセイが導かれる。候補物質は、ソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用するか、あるいは、結合または他の分子内相互作用により、ソマトスタチン受容体ポリペプチドを調節する物質である。ある場合には、そのような候補物質は、受容体のアゴニストであり、他の場合には、受容体ポリペプチドと相互作用してアゴニスト的に寄与する。他の場合には、そのような物質は、アゴニスト的およびアンタゴニスト的な性質を併有しているか、他の方法でソマトスタチン受容体を調節し得る。
本発明のスクリーニングアッセイには、通常、受容体の機能を阻害するか、さもなくば修飾する候補物質のスクリーニングのような、受容体の活性に影響する候補物質の能力の測定が含まれる。一般に、この方法は、受容体ポリペプチドを組換え的に製造し、候補物質の酵素機能に影響する能力を測定するために、該組換えポリペプチドを該物質を用いて試験することを含む。本発明の好ましい実施態様は、ヒト受容体の酵素活性に影響する物質であり、ヒト内で用いるために適した物質を同定するために、候補物質をスクリーニングすることに関する。
候補物質を同定するための典型的なスクリーニングアッセイでは、受容体ポリペプチドを得るための出発起源として、通常粗ホモジネートの形に調製された、同じ組換え発現宿主を用いることが望ましいであろう。受容体を発現している組換え細胞を、例えば本明細書に記載された、望ましいバッファーで洗浄し、ホモジナイズする。典型的なアッセイでは、細胞ホモジネートから得たある量のタンパク質を、少量の適当なpHの適当なバッファー中に入れる。アゴニストまたはアンタゴニストのような候補物質を、その混合物に好都合な濃度、加え、候補物質と受容体ポリペプチドとの相互反応を監視する。
受容体のための基質として適当な既知物質を用いる場合、前記の方法で、組換え的に製造された受容体の基準活性を得る。次いで、受容体機能の抑制物質または改変物質を試験するために、受容体に対する作用を試験すべき候補物質を混合物に加える。次いで、候補物質の存在又は非存在下で行った反応を比較することにより、受容体の正常な機能に対する候補物質の効果に関する情報を得ることができる。
従って、本発明はまた、当業者に、ソマトスタチン受容体ポリペプチドの作用を改変する能力を有する候補物質を同定するための、１またはそれ以上の方法からなる方法論を提供する。
１つの態様では、そのようなアッセイはソマトスタチンの望ましい性質を有するが、インシュリンまたはグルカゴン放出阻害作用のようなソマトスタチンの望ましくない性質を持たない、あるいはその逆の性質を有する候補物質を区別することができるように設計されていてよい。他の態様では、ソマトスタチン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのような被験候補物質のスクリーニングアッセイは、１またはそれ以上のソマトスタチン受容体ポリペプチドと相互作用する選択的な能力を有するが、該ポリペプチドは、本発明で同定された他のソマトスタチン受容体ポリペプチドと、実質上、重なる（オーバーラップする）活性を持たない候補物質の同定に用いられる。
さらに、候補物質の試験のためのスクリーニングアッセイは、ソマトスタチンと受容体との構造活性相関関係の調査を可能にするものであり得る。それは、例えば、受容体と相互作用し得るかそれを調節し得る、天然に存在するホルモンまたは他の物質の結合の研究対そのような分子の受容体への結合によって引き起こされる活性の研究である。ある態様では、候補物質または他の分子とソマトスタチン受容体ポリペプチドとの相互作用を評価する手段として、Ｘ−線結晶学的研究を行うために、本発明のポリペプチドを結晶化することができる。例えば、本発明の精製組換えポリペプチドを適当な形で結晶化すると、Ｘ−線結晶学による分子内相互作用の検出が可能になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトSSTR1および２のアミノ酸配列の比較である。アミノ酸はそれらの１文字省略形で示されている。アステリスク（※）は、同一アミノ酸であることを、棒（−）は、化学的に類似残基であることを表す。このアラインメントをクローンで表わすために、ギャップを導入した。７つの推定の膜貫通領域（M1−M7）が示されている。Ｇ−タンパク質−結合受容体スーパーファミリーに保存されているアミノ酸残基をボールド文字で示した。
図２は［［I125］ヨード−Tyr11］−ソマトスタチン−14の、SSTR1およびSSTR2を発現しているCHO細胞への結合を示す。A:ヒトSSTR1によってトランスフェクトされた細胞;B:マウスSSTR2によってトランスフェクトされた細胞。データ（２回の測定の平均値）は、阻害物質の不在下で結合した放射性標識リガンドに関する計算値（対照結合、パネルＡについては1425cpm、パネルＢについては2080cpm）に関して規格化され、非特異的結合（１μＭソマトスタチン−14の存在下、結合した放射性標識、両方の場合に225cpm）に関して補正した。それぞれ、１μＭソマトスタチン−14の存在下での結合阻害。曲線は結合部位の単一集団とのリガンド相互作用に関してモデル化されている。
図３はヒトおよびマウスのゲノムDNAのサザーンブロット分析の結果を示す。材料および方法の項に記載のごとく、ヒトおよびマウスのゲノムDNA10μｇをEcoR Iで消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターにブロットし、32P−標識ヒトSSTR1プローブとハイブリダイズさせた。ヒトおよびマウスのSSTR1および２遺伝子を含有するEcoR I断片は矢印で示されている。
図４はヒト組織内のSSTR1およびSSTR2mRNAのノーザンブロット分析の結果を示す。全RNA20μｇをグリオキサールで変性し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブランにブロットし、32P−標識ヒトSSTR1（Ａ）またはヒトSSTR2（Ｂ）プローブとハイブリダイズさせた。
好ましい実施態様の説明
以下に詳細に説明するように、本発明の組成物および方法は、受容体分子の正確な配列の起源に無関係に、一般的にソマトスタチン受容体に適用可能である。従って、以下に使用し説明する多くの一般的に適用可能な技術がある。さらに、ヒトおよびマウス起源の、幾つかの特殊なソマトスタチン受容体ポリペプチドへの、該一般的方法の適用可能性を例示する。
宿主細胞培養およびベクター類
勿論、まず、DNA配列のクローニングおよび本発明に有用なベクターの構築には、一般に、原核性宿主が好ましい。例えば、E.coliK12株は特に有用である。使用可能な他の微生物株には、例えば、E.coliBおよびE.coliX1776（ATCC No.31537）がある。勿論、これらの例は、制限を意図するものでなく、例示に過ぎない。
発現にも原核性細胞が使用できる。上記の株、並びにE.coliW3110（Ｆ−，ラムダ、栄養要求性、ATCC No.273325）、例えば、Bacillus subtilusのようなバシラス、またはSalmonella typhimuriumまたはSerratus marcesansのような他の腸内細菌、あるいは様々なPseudomonasが使用できる。
通常、宿主細胞に適合する種から導かれたレプリコンおよび制御配列を有するプラスミドベクターを、これらの宿主細胞と一緒に用いることが好ましい。ベクターは普通、複製部位、並びに形質転換された細胞内で表現型選択を可能にするマーキング配列を与える。例えば、E.coliは、一般に、E.coli種から導かれたpBR322［ボリバーら（Boliver et al.）1977］を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を有し、従って、形質転換された細胞を容易に同定する方法を提供する。pBRプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージは、それ自身のタンパク質の発現のために微生物機構が用いるプロモーターを有するか、有するように改変されねばならない。
組換えDNA構築に最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム［チャンら（Chang et al.）1978;イタクラら（Itakura et al.）1977;ゲッデルら（Goeddel et al.）1979;Goeddel et al.,1980］およびトリプトファン（TRP）プロモーターシステム［EPO  APPl.Publ.No.0036776;シーベンリスト（Siebwenlist et al.）1980］が含まれる。これらは最も普通に用いられるが、他の微生物プロモーターも発見され、用いられ、その詳細なヌクレオチド配列は公開されており、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に連結（ligate）することができる（Siebwenlist et al.,1980）。
原核性微生物に加えて、酵母培養のような真核性微生物も用いることができる。真核性微生物のうち、Saccharomyces cerevisiaseまたは普通のパン酵母が最も一般的に用いられるが、多くの他の株も普通に用いることができる。Saccharomyces内での発現のためには、例えば、プラスミドYRp7が一般に用いられる［シンコムら（Stinchcomb et al.）1979;キングスマンら（Kingsman et al.）1979;チェンバーら（Tschemper et al.）1980］。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異体株、例えば、ATCC No.44076またはREP4−１、に選択マーカーを与えるtrp1遺伝子を既に含有している（Jones,1977）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1損傷の存在は、トリプトファンの不在下に増殖することによって形質転換体を検出する有効な環境を提供する。
酵母ベクター内の適当な促進配列（promoting sequence）には、３−ホスホグリセラートキナーゼ［ヒッツマンら（Hitzman et al.）1980］、または例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類［ヘスら（Hess et al.）1968;ホランドら（Holland et al.）1978］のためのプロモーターが含まれる。適当な発現ベクターの構築には、mRNAのポリアデニル化と停止のために、発現ベクター内の、発現が望まれる配列の3'側にこれらの遺伝子を伴う終止配列を連結する。増殖条件によって転写がコントロールされるという利点を有する他のプロモーター類は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、および上記の、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関連する酵素類のプロモーター領域である。酵母に適用可能なプロモーター、複製起点、および終止配列を含有する任意のプラスミドが好ましい。
微生物に加えて、多細胞生物からの細胞の培養物も宿主として用いられる。基本的には、脊椎動物または無脊椎動物のいずれでも、そのような細胞培養は有用である。しかしながら、脊椎動物細胞に興味があり、培養（組織培養）による脊椎動物細胞の増殖は、最近では日常的な工程となっている［クルス（Kruse）およびペーターソン（Peterson）1973］。そのような有用な宿主細胞系の例として、AtT−20、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、およびW138、BHK、COSM6、COS−７、293、およびMDCK細胞系を挙げることができる。そのような細胞のための発現ベクターは通常、任意の必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列と共に、（所望により）複製起点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーターを含有する。
哺乳類細胞内での使用のための発現ベクターのコントロール機能は、しばしばウイルス性物質によって提供される。例えば、通常用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、そして最も頻繁には、シミアンウイルス40（SV40）から導かれる。SV40ウイルスの早期および後期プロモーター類は、SV40ウイルス複製起点をも含有する断片としてウイルスから容易に手に入るので、特に有用である［ファイヤースら（Fiers et al.）1978］。SV40のHind III部位からウイルス複製起点のBgl I部位に至る約250bpの配列を含有する限り、より小さいか大きい、SV40断片も用いられる。さらに、通常、所望の遺伝子配列を伴っているプロモーターまたはコントロール配列も、該コントロール配列が宿主細胞系に適合する限り、その使用は可能であり、しばしば望ましい。
複製起点はSV40または他のウイルス起源（例、ポリオーマ、アデノ、VSV、BPV、CMV）から導かれる外因性起点をベクターの構築により提供するか、または宿主細胞染色体複製機構から提供される。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、しばしば後者で十分である。
pCMV真核発現ベクター
pCMVプラスミドは本発明における特殊な用途を持つ一連の哺乳類発現ベクターである。このベクターは実質的に全ての培養細胞における使用のために設計されたものであり、SV40で形質転換されたサルCOS細胞系では極めてよく作用する。pCMV1、２、３および５ベクターは各プラスミド中で前記ポリリンカー領域におけるある種の独特な制限部位について互いに相違する。pCMV4ベクターはこれら４種のプラスミドとはポリリンカーより前の配列中に翻訳エンハンサーを含む点で相違する。これらは一連のpCMV1〜５のベクターから直接誘導されたものではないが、機能的に類似なpCMV6bおよびｃベクターはカリフォルニア州エマリービルのチロン社から購入でき、ポリリンカー領域の向きが互いに逆である点を除いて同一である。
pCMVプラスミドの共通な成分は次の通りである。ベクターのバックボーンはpTZ18R（ファルマシア社）であり、単一鎖DNA産生のためのバクテリオファージf1複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。CMV領域は強力な促進制御領域であるヒトのサイトメガロウイルス（Towne株）のメジャー即時型初期遺伝子（Thomsenなど、1984;Boshartなど、1985）の−760から＋３までのヌクレオチドからなる。ポリリンカー領域はアプライド・ビオシステム社の機器でも合成しうる。ヒト生長ホルモン断片（hGH）はこの遺伝子（Seeburg、1982）の配列1533から2157までが示す転写停止およびポリアデニル化シグナルを含む。この断片にはAlu中間反復DNA配列がある。最後に、SV40複製起点およびpcD−Ｘプラスミド（Hind IIからPst Iまでの断片）から誘導される早期型領域プロモーター−エンハンサーは（Okayamaなど、1983）に記載がある。この断片におけるプロモーターは転写がCMV/hGH発現カセットから遠ざかる向きに進行するような方向に向いている。
pCMVプラスミドは制限酵素部位がポリリンカー内で独特であることおよび翻訳エンハンサーの存在または不在により互いに区別される。出発pCMV1プラスミドは進行的に修飾されてポリリンカー中の部位数の増加で独特となった。pCMV2を創るために、pCMV1の２個のEcoR I部位の１個を破壊した。pCMV3を創るために、pCMV1をSV40領域から短いセグメント（Stu IからEcoR I）を除去してポリリンカー中のPst I、Sal IおよびBamH I部位が独特になった。pCMV4を創るため、mRNAの5'−非翻訳領域に対応するDNAの合成断片をVMVプロモーターから転写した。配列は蛋白質合成における開始因子のための要件を減少させることによって翻訳エンハンサーとしての役をする（Joblingなど、1987;Browningなど、1988）。pCMV5を創るため、pCMV1のSV40起源領域からDNAのセグメント（Hpa IからEcoR I）を除去して出発ポリリンカー中のすべての部位を独特にした。
pCMVベクターはサルのCOS細胞、マウスのＬ細胞、CHO細胞およびHeLa細胞で用いられた。数種の互いの比較において、それらはCOS細胞ではSV40を背景とするベクターよりも５倍から10倍高い発現水準を与えた。pCMVベクターはLDL受容体、核因子１、Gsα蛋白質、蛋白質ホスファターゼ、シナプトフィシン、シナプシン、インシュリン受容体、流感ヘマグルチニン、アンドロゲン受容体、ステロール26−ヒドロキシレース、ステロイド17−および21−ヒドロキシレース、チトクロームＰ−450オキシドレダクテース、ベータ−交感神経作用性受容体、葉酸受容体、コレステロール側鎖分解酵素、および他のcDNA類の宿主を発現するために用いられた。これらのプラスミド内のSV40プロモーターは優性に選択可能なマーカーのような他の遺伝子を発現するためにも用いることができることは注目すべきである。最後に、Hind IIとPst Iの部位の間にあるポリリンカー内には偽翻訳開始を起こすATG配列がある。このコドンは発現プラスミドでは可能であれば避けるべきである。親のpCMV1およびpCMV4ベクターの構造および使用を記載した報告が出版されている（Anderssonなど、1989b）。
核酸ハイブリド化の態様
前記のように、ある側面では、本発明が提供するDNA配列情報は選ばれたソマトスタチン受容体遺伝子の遺伝子配列と特異的にハイブリド化する能力を持つ相対的に短いDNA（またはRNA）配列を産生させる。これらの側面で、たとえば配列番号１、３、５、７、９または11に示す配列のような、適当な長さの核酸プローブは選択されたソマトスタチン受容体配列の考慮に基づいて製造される。そのような核酸プローブをソマトスタチン受容体遺伝子配列に特異的にハイブリド化する能力は種々の態様において特定的な用途を与える。最重要には、与えられた標品内の相補的配列の存在を検出するための種々の検定法にプローブを用いることができる。しかし、突然変異体種プライマーの製造のための配列情報の使用または他の遺伝子的構築物生産における使用のためのプライマーを含む、どちらの使用も想到できる。
本発明によるある利益を得るために、ハイブリド化研究または検定のために用いる好適な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９または11のようなソマトスタチン受容体配列の少なくとも14から40位のヌクレオチド鎖に相補的である配列を含む。長さが少なくとも14ヌクレオチドというサイズは断片が安定で選択的な二重らせん分子を形成するに十分な長さであろうことを確実にするのに役立つ。長さが14塩基より大きい鎖への相補的配列を持つ分子は一般に好適であり、ハイブリッドの安定性および選択性を増すために、および得られるハイブリッド分子の品質と程度を改善するために、より長いハイブリド化分子を用いうる。所望の場合、14から20ヌクレオチドまたはさらに長い遺伝子−相補的鎖を持つ核酸分子を設計するのが一般に好まれる。そのような断片は、例えば、直接化学的手段により、ここに参考として引用する米国特許第4603102号のPCR技術のような核酸再生産技術の応用により、または組換え生産のために選択した配列を組換えベクターへの導入により容易に製造しうる。
それ故、本発明のヌクレオチド配列は遺伝子の相補的鎖と二重らせん分子を選択的に形成するその能力のために用いうる。想到した応用に従い、標的配列のためのプローブの種々の程度の選択性を達成するため、種々のハイブリッド化条件の採用が望ましい。高度の選択性を要する応用のためには、ハイブリッドを形成するために、一般に相対的に厳密な条件を採用することが望ましい。例えば、50℃〜70℃で0.02M〜0.15M−NaClによって得られるような相対的に低塩および／または高温度条件、を選択するであろう。これらの条件は殊に選択的であり、プローブと鋳型または目的鎖との間のミスマッチは、あっても僅かしか許さない。
勿論、ある種の応用のためには、例えば、背景となる鋳型にハイブリド化した突然変異体プライマー鎖を用いて突然変異体を生産することを望む時、または関連物、官能均等物のようなものの配列をコードするソマトスタチン受容体を分離しようとする時には、ヘテロ二重らせんの形成を許すために厳密さがより少ないハイブリド化条件が典型的に必要とされるであろう。この場合には、20℃から55℃の範囲の温度で0.15M〜0.9M塩のような条件を採用することを望みうる。その際、交差−ハイブリド化物は対照ハイブリド化に対して陽性にハイブリド化したシグナルとして容易に特定することができる。どの場合も、高温と同様にしてハイブリッド二重らせんを不安定化するために役立つホルムアミドの量を増加して添加することにより、条件はさらに厳密にすることができることは一般的に認識されている。かくして、ハイブリド化条件は容易に再現され、一般には所望する結果に依存して調べる方法になるであろう。
ある種の態様において、本発明の核酸配列をハイブリド化を測定する標識のような適当な手段と組合わせて採用することが有利であろう。検出しうるシグナルを与えることのできる放射性、酵素的またはアビジン／ビオチンのような他のリガンドを含む広範な種類の適当な標識手段が当業界で知られている。好適な態様においては、放射能または他の環境的に望ましくない試薬の代わりにウレアーゼ、アルカリホスファダーゼまたはパーオキシダーゼのような酵素タグを採用することを望むようである。酵素タグの場合、相補的核酸含有標品との特定のハイブリッド化を特定するヒトの眼または分光光学的に可視である方法を与えるために採用できる熱量測定されるインディケーター基質が公知である。
一般に、ここに記載するハイブリッド化プローブは液相および固相を用いるハイブリッド化の両態様における試薬として有用であることが想到される。固相を含む態様では、被検DNA（またはRNA）は選択されたマトリックスまたは表面に吸着か、でなければ結合される。この結合した単一鎖核酸に次に選択したプローブで所望の条件下に特定のハイブリッド化を行う。選択した条件は必要な特定の限定（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の起源、ハイブリド化プローブのサイズなどに依存する）に基づく特定の環境に依存するであろう。非特異的に結合したプローブ分子を除くためにハイブリッド化表面を洗浄後、ラベルを用いて特異的ハイブリッド化を検出するか、または定量する。
生物学的機能が均等なアミノ酸残基
前記の通り、所望の場合にはソマトスタチン受容体ポリペプチドの構造に修飾および変化を加えて、同様なまたはそうでなくてもさらに望ましい性質を持つ分子を得ることができる。そのような変化は野生型分離体に存在しうるかまたは以下に記載するような部位特異的突然変異誘発を用いて合成的に導入しうる。
例えば、蛋白質構造におけるある種のアミノ酸残基を、抗体の抗原結合領域のような構造（または、たとえば、基質分子の結合部位）の反応性結合能に認めうる減少なしに他のアミノ酸残基に置換しうる。蛋白質の生物学的機能の活性を決定するのは反応性結合能および蛋白質の性質であるから、蛋白質配列（または、もちろん、その背景となるDNAコード配列）にある種のアミノ酸配列置換をしても、同様なまたは対抗する性質（たとえば、アンタゴニスト対アゴニスト）を持つ蛋白質を得ることさえできる。発明者は種々の変化をペプチドの配列（または背景となるDNA）にもたらしうると考えている。
蛋白質における生物学的反応性機能を与えることについてのアミノ酸残基の親水性係数の重要性は、ここに参考のために引用するKyteなど（1982）またはHoppの米国特許第4554101に、ある種のアミノ酸残基は同様な親水性係数またはスコアを持つ他種アミノ酸残基と同様な生物学的活性を保持しつつ置換しうることを発見したと一般的に論述されている。次表に示すのは、アミノ酸残基に与えられた親水性と電荷の性質に基づくアミノ酸残基の親水性係数である。アミノ酸残基の相対的な親水性の性質が、得られる蛋白質の第二次構造を決定し、それによって蛋白質と基質分子との相互作用を決定すると信じられている。
表Ｉ
アミノ酸残基 親水性係数 アミノ酸残基 親水性係数
イソロイシン            4.5       セリン          −0.8
バリン                  4.2       チロシン        −1.3
ロイシン                3.8       プロリン        −1.6
フェニルアラン          2.8       ヒスチジン      −3.2
システイン／シスチン    2.5       グルタミン酸    −3.5
メチオニン              1.9       グルタミン      −3.5
アラニン                1.8       アスパラギン酸  −3.5
グリシン              −0.4       アスパラギン    −3.5
スレオニン            −0.7       リジン          −3.9
トリプトファン        −0.9       アルギニン      −4.5
アミノ酸残基の親水性係数が基礎となるアミノ酸残基の値と±２、より好ましくは±１以内にある時には、この変化は同様な、また多分改良された機能的活性を持つ蛋白質を与えることが提案されている。それで、例えば、親水性係数＋4.5を持つイソロイシン残基はバリン残基（＋4.2）またはロイシン残基（＋3.8）に置き換えても、同様な生物学的活性を持つ蛋白質を得ることができると提案されている。また、このスケールの逆の末端ではリジン残基（−3.9）はアルギニン残基（−4.5）などに置き換えることができると提案されている。
従って、これらのアミノ酸残基置換は一般にはＲ基置換基の相対的な近似性、例えば大きさ、親電子的性質、電荷などの側面に基づいている。一般に、前記種々の性質を考慮に入れた置換例は次のものを含む：
表II
元の残基 置換例 元の残基 置換例
Ala       Gly;Ser   Ile       Leu;Val
Arg       Lys       Leu       Ile;Val
Asn       Gln;His   Lys       Arg
Asp       Glu       Met       Met;Leu;Try
Cys       Ser       Ser       Thr
Gln       Asn       Thr       Ser
Glu       Asp       Trp       Tyr
Gly       Ala       Tyr       Trp;Phe
His       Asn;Gln   Val       Ile;Leu
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は背景であるDNAの特異的な突然変異誘発によってその配列から誘導された第二世代蛋白質または生物学的機能的に均等な蛋白質またはペプチドの製造に有用な技術である。前記のように、この変化はアミノ酸残基置換を望む時には好ましいであろう。この技術はさらに、例えば、前記考慮の１つまたはそれ以上を導入してDNAにヌクレオチド１個またはそれ以上の配列変化を導入することによって、配列変種を製造し、試験する容易な能力を提供する。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドのDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列を用いることにより、欠失連結部の両側を横断する安定な二重らせんを形成するために十分な大きさと配列のプライマー配列を与え、突然変異体の製造を可能にする。典型的には、長さ約17から25ヌクレオチドであって、変えるべき配列の連結部の両側約５から10残基を有するプライマーが好適である。
一般に、部位特異的突然変異誘発は当業者によく公知であり、例として、Adelmanなど（1983）を挙げられる。認識されるように、この技術は典型的には一重鎖および二重鎖型の両方で存在するファージベクターを採用する。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターはM13ファージ（Messingなど、1981）のようなベクターを含む。これらのファージは商業的に容易に入手可能で、使用法は当業者には一般的に公知である。
一般に、本文の部位的特異的突然変異誘発で、第一にその配列内に選択したソマトスタチン受容体ポリペプチド配列の全部または一部をコードするDNA配列を含む一重鎖ベクターを製造する。所望の突然変異配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを一般的には合成的、例えば、Creaなど（1978）の方法、により製造する。このプライマーを次に一重鎖ベクターにアニールして大腸菌ポリメラーゼＩのKlenow断片のようなDNA重合酵素を作用させて突然変異を保持した鎖の合成を完了する。それで、一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第二の鎖が所期の突然変異を持つヘテロ二重鎖を形成する。このヘテロ二重鎖ベクターを用いて次に大腸菌細胞のような適当な細胞を形質転換し、突然変異が誘発された配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。
スクリーニング検定法
本発明の重要な側面の一つは受容体の機能を阻害またはそうでなければ修飾または変更しうる物質を特定するためのスクリーニング検定法における組換え的に製造したソマトスタチン受容体ポリペプチドの使用である。組換え的に製造した受容体の使用は天然起源の受容体は極少量しか存在せず、精製が困難であることが証明されているので殊にに有益である。さらに、これはヒトの受容体、殊に今までにはなかったヒト膵臓の小島受容体、の入手を容易にした。本発明者はヒト受容体ポリペプチド配列はマウスのような他種から得た受容体とは僅かに異なり、その上、種々のソマトスタチン受容体ポリペプチド（SSTR1〜３）が互いに相違することを発見した。この重要性は極めて明瞭である。それが、たとえば、ヒトの酵素を阻害を機能する、化合物を求めて探す時、スクリーニング検定法にはヒトの受容体ポリペプチドを用いるべきであり、殊に、問題のヒトに特異的なSSTRを用いることが望まれるからである。
本発明のスクリーニング検定法は、好適な態様では、それが生産された組換え宿主から直接に得た受容体ポリペプチドを採用することが有利である。これは最も好ましくは単に選択したポリペプチドを組換え宿主、典型的には真核宿主、内に発現させ、続いて酵素を含む粗製ホモジェネートを製造して達成される。粗製ホモジェネートの一部を次に受容体の適当なエフェクター、たとえば、ソマトスタチン、オクトレオチド、など（たとえば、ここに参考のために特に引用するLambertsなど、ソマトスタチンおよびその類似体の癌の診断および処置における役割、Endocrine・Reviews、12（４）:450〜482、参照）を検定すべき候補物質と共に混合する。候補物質の存在下または不在下での選択したエフェクターの結合を比較して、候補物質の結合性能に関する情報を得ることができる。
本発明のスクリーニング検定法は殆どソマトスタチンの望ましい側面を模倣しつつ、このホルモンの望ましくない側面を排除しながら有用な試薬を特定するために設計されるであろうから、好適な検定は通常のエフェクターとしてソマトスタチンを採用するであろう。
本発明の受容体ポリペプチドへの候補物質の効果を測定するために採用される広範な態様があり、本発明は、その方法のどの一つにも限定されないと信じる。しかし、結合されるべき受容体ポリペプチドの性能を測定できる系を採用し、また、特定物質に採用するエフェクターにより修飾することは、一般に好ましいであろう。採用し得る一方法では、得られるエフェクター／受容体錯体において定量的に保持されるように標識された標識エフェクターを用いる。有利な方策には125I、14C、3Hのような放射能標識であって、エフェクターおよび得られる錯体の双方で直接定量しうる。
好適な検定において、蛋白質、エフェクターおよび候補物質を含む混合物を所定の時間インキュベートし、得られたインキュベート混合物を混合物中に残存する非結合エフェクターを生成したエフェクター／受容体錯体から分離するための分離法にかける。次に、各々、たとえば候補化合物を添加しなかった対照に対して、各々の量を単純に測定する。速度データを求める時はこの測定を種々な時点で行う。これから、受容体の機能を変化または修飾する候補物質の性能を測定しうる。
エフェクター／受容体錯体からエフェクターを分離するために採用することのできる多数の技術が公知であり、そのような方法は、すべて本発明の範囲内に含まれるものである。薄層クロマトグラフィー法（TLC）、HPLC、分光光学術、ガスクロマトグラフィー／質量分析術またはNMR分析の使用。この技術はどれもエフェクターと錯体とを分別できる限り、そして基質および生成物を特定または定量することによるような酵素機能の測定に用いることができる限り、採用できると認識される。
エフェクター／受容錯体それ自身も、Ｘ線結晶解析のような技術の対象である。候補物質が医薬の作用機序としてエフェクター分子と置き替わるとき、置き替えおよびその受容体への効果を観察するために設計された研究は殊に有益となろう。
実施例
実施例は本発明の好適な態様を例示するために記載する。下記実施例のある種の側面は本発明の実施においてよく作動するように本発明者によって発見または意図された技術および操作について記載される。これらの実施例は発明者の標準的な実験室的慣例を使用して例示する。本開示および当業者の一般的水準に照らし、以下の実施例が説明のみを意図したものであり、本発明の本質と範囲から逸脱することなしに無数の変化、修飾および改変を採用できることを当業者は認識するであろう。
実施例I:SSTR1のクローニングおよび発現
クローニング技術
方法をSambrookなど（1989）に記載され、および前に報告された（Fukumotoなど、1988）ように実施した。ヒト膵臓小島をASM消化およびFicoll精製により、無菌的製造法を用い、一管当り20000小島づつを凍結し、−70℃（この物質はIslet・Transplantation・Laboratory、ワシントン大学医学部、セントルイス、MO63110から最も容易に入手しうる）に維持した。チオシアン酸グアニジニウム/CsCl法（Sambrookなど、1989）を用いてRNAを分離した。DNA配列決定は適当なDNA断片をM13mp18または19にサブクローニング後にジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Sangerなど、1980）により、行った。両鎖とも配列決定した。
全ヒト膵臓小島RNA10μｇをオリゴ（dT）プライマーおよびAMV−逆転写酵素（Molecular・Biological・Resources社、タンパ、FL）とを用いて逆転写した。Ｇ蛋白質と共役する受容体に関する配列をPCRとLibertなど、1989に記載の変性オリゴヌクレオチドプライマーとを用いて増幅した。PCR生成物を１％低融解温度アガロースゲル上で分離し、400塩基対と500塩基対の間のDNA断片をアガロースから溶出し、M13mp18に連結し、配列決定した。hGPR81と命名した新規Ｇ蛋白質共役受容体をコードするPCR生成物をニックトランスレーションにより32Pで標識し、これをヒトゲノムライブラリー（Lawnなど、1978）を検索するために用いてこの新種の７−貫膜ファミリーの受容体をコードする遺伝子を分離した。標準的ハイブリド化条件［42℃;16時間;50％ホルムアミド、５×SSC、２×デンハート溶液、20mM−燐酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、100μg/ml超音波照射および変性鮭精巣DNAおよび10％硫酸デキストラン（Kayanoなど、1988）］を用い、濾過体をオートラジオグラフィーの前に50℃で0.1×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄した。マウスのSSTR1およびヒトおよびマウスのSSTR2遺伝子をヒトおよびマウスのゲノムライブラリー（Stratagene社、ラホヤ、CA）から前記のハイブリッド化によって分離した。
発現技術
ヒトSSTR1遺伝子の1.5Pst I/Xmn I断片およびマウスSSTR2遺伝子の1.2kb・Xba I断片をそれぞれ哺乳類発現ベクターpCMV6bおよび6c（Chiron社、エマエリービル、CA、のB.Chapman博士の提供）に導入した。得られた構築物をpSV2neoとともにジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、DG44にリポフェクチン試薬（GIBCO・BRL、ガイザースバーグ、MD）を用いて共（コ）トランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを選び、G418400μg/mlを含むα−MEM（GIBCO・BRL）中に保持した。各細胞系を６穴の直径35mm板に37℃で密集成長させた。細胞を10mM−HEPES、5mM−KH2PO4、5mM−MgCl2、150mM−NaClおよび１％（w/v）ウシ血清アルブミン（全てpH7.4）を含む緩衝液で洗浄し、同じ緩衝液中、22℃に30分間22℃で安定化した。細胞をバチトラシン（1mg/ml）および［［I125］−ヨード−Try11］−ソマトスタチン−14（50000cpm、Amersham社、アーリントンハイツ、IL）単独、またはソマトスタチン−14またはソマトスタチン−28（Bachem、フィラデルフィア、PA）とともに含む緩衝液1ml中で図２に示す濃度で30分間22℃で二種のインキュベートをした。インキュベートした細胞を氷冷緩衝液2mlで２回洗浄し、3M−酢酸中の8M−尿素1mlで溶解した。懸濁した細胞を管に移し、穴を同一溶液1mlで洗浄し、集めた抽出物の放射能をガンマ・カウンターを用いて測定した。
クローニングの結果
Ｇ蛋白質−共役受容体をコードするヒト膵臓小島RNA中のメッセンジャーRNA配列を前記のようにPCR法を用いて増幅した。PCR生成物をクローンして、配列を決定し、二つの推定上の新規受容体をコードするクローンを得、hGPR81およびi5と命名した。配列決定した24個の異なるクローンのうち、19個はhGPR81を、および３個はhGPRi5をコードしており、残りのクローン２個の配列はＧ蛋白質共役受容体スーパーファミリー（Dohlmanなど、1991）のメンバーのものとは無関係であった。Ｇ蛋白質共役受容体をコードする遺伝子はイントロンを欠損することが多い（Kobikaなど、1987）ので、これらの２個の新受容体をコードする遺伝子を分離して配列決定した。hGPR81をコードするゲノム断片の配列は391アミノ酸残基をコードする1173bpの開いた読み枠（配列番号１および２参照）を示した、Mr＝42657。
この蛋白質は７個の推定上の膜貫通ドメインおよび第一の膜スパニングセグメントの前にある細胞外NH2−末端セグメントを持ち、３個のＮに結合するグリコシル化のための共通部位を持つ（Asn4、Asn44およびAsn48）。細胞内にあると予言されている領域には２個の環状AMP−依存性蛋白質カイネース（Kempなど、1990）（Thr172およびSer265）のための推定上の燐酸化部位がある。細胞内COOH末端ドメインもセリンおよびスレオニンが豊富であってセリン／スレオニン蛋白質カイネース（Sibleyなど、1987）のための基質として役立っているかもしれない。加えるに、Ｇ蛋白質共役受容体スーパーファミリー内に保存されている数個のアミノ酸残基（Dohlmanなど、1991;Findlayなど、1990）もhGPR81に保存されている（図１）。
hGPR81がイントロンを欠く遺伝子によってコードされていることを確認するため、マウス同族体のための遺伝子を分離し、配列決定した。ヒトおよびマウス蛋白質のアミノ酸残基配列の間には99％の同一性があった。この高度の配列同一性はこの蛋白質の全ドメインが機能的に重要であることを示唆する。
発現結果
膜貫通セグメントM5−M6を結合する短い細胞質ループの存在はペプチドホルモンとニューロペプチドを結合するＧ蛋白質共役受容体の特徴（E.M.Ross、1990）なので、膵臓小島からのホルモン分泌を調節することが知られているペプチドをhGPR81のためのリガンドとして試験した。Xenopus・laevisのオオサイト（Kayanoなど、1990）に試験管内で転写したRNAを注入し、ウイルスペプチド［カルシトニン遺伝子関連ペプチド、胃抑制ポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１−（７〜36アミド）および血管作動性小腸ペプチド］に反応する基礎または促進cAMP濃度の変化またはCa2+流出（Williamsなど、1988）（アンジオテンシンII、ボンベシン、コレシストキニンおよびバソプレシン）を検定することによりhGPR81のためのリガンドを特定する最初の試みは不成功であった。放射能標識ペプチド（ガラニン、グルカゴンおよびソマトスタチン）の一過性にhGPR81を発現するCOS−７細胞への結合も試みた。
トランスフェクトした細胞を［［I125］−ヨード−Tyr］−ソマトスタチン−14とインキュベートし、板をオートラジオグラフィーにかけた時、過剰の非標識化ソマトスタチン−14の添加で競合される陽性のシグナルが検出され、hGPR81がソマトスタチン受容体であることが示唆され、SSTR1と命名された。
SSTR1の薬理学的性質を、この受容体を安定に発現するCHO細胞で検討した。これらの細胞は［［I125］−ヨード−Tyr］−ソマトスタチン−14（図2a）がソマトスタチン−28よりもソマトスタチン−14について高い親和性で特異的に結合し、半−最高反応の阻害濃度（IC50）値おのおの1.5および4.7nMを持つことを示した。これらの値はソマトスタチン−14および−28の親和性として野生型受容体について以前に報告された値（Srikantなど、1981;Tranなど、1985;Schonbrunnなど、1983）に近似している。
実施例II:SSTR2のクローニングおよび発現
クローニング技術および結果
ヒトSSTR1プローブのEcoR I消化ヒトDNAのサウザーンブロトへのハイブリッド化は14kbに強いシグナルを示し、この値はこの遺伝子を含むEcoR I断片に期待される大きさであり、また、＞23、18、8.4および7.8kbの断片には弱いハイブリッド化を示した（図３）。このプローブはまた＞23、13.5、8.6および8.2kbのマウスDNAのEcoR I消化における多重断片にもハイブリド化する。期待されるものに加えてハイブリダイズ化断片の存在はアドレナリン作動性およびドパニン作動性受容体について以前に記載された（Kobilkaなど、1987;Bunzowなど、1988）ように一群のソマトスタチン受容体があることを示唆する。
われわれはヒトおよびマウスのゲノムライブラリーをヒトSSTR1プローブで検索し、第二の推測上のソマトスタチン受容体をコードする遺伝子を分離し、SSTR2と命名した；ヒトおよびマウスのSSTR2を含むEcoR I断片はそれぞれ18および8.2kbであり、図３に示した。ヒトSSTR2遺伝子のヌクレオチド配列は1107bpのオープンリーディングフレームを示し、369−アミノ酸残基蛋白質をコードする（Mr＝41305）（配列番号５および６参照）、７個の膜貫通セグメント、細胞外NH2末端セグメントに４個の推測上のＮ−グリコシル化部位（Asn9、Asn22、Asn29およびAsn32）およびcAMP依存性蛋白質カイネースにより燐酸化され得るもの（Kobilkaなど、1987）（Ser250）１個を持つ。ヒトとマウスとのSSTR2のアミノ酸残基配列の間には94％の同一性がある。
ヒトSSTR1および２のアミノ酸残基配列の比較はこれら２種の受容体の間に46％の同一性と70％の近似性を示した（図１）。同一性最高領域は膜貫通ドメイン、特にM1、M2およびM7にあり、多分、これらの領域はリガンド結合に関与していることを暗示する。SSTR2の薬理学的性質は、SSTR1とソマトスタチン−14および−28に対する高い親和性については類似している。IC50値はそれぞれ1.6および5.2nMである（図2b）。
発現技術および結果
SSTR1および２の組織分布をRNAブロッティング法により検査した。ヒトSSTR1のmRNAは大きさ4.8kbであり、空腸および胃で最高濃度を示し（図4a）、ヒト小島RNAにも容易に検出された（資料提示せず）。低濃度のSSTR1mRNAは結腸、結腸癌および腎臓にある。SSTR1mRNAは側頭葉の一部から調製したヒト大脳RNAのノーザンブロットには検出されなかったが、マウス全脳から調製したRNAのブロットには容易に見出すことができ、このサブタイプの受容体は脳で発現されることを示した（資料提示せず）。SSTR2の組織分布はSSTR1のそれとは極めて相違した。ヒトSSTR2mRNAは大脳および腎臓で最高濃度に発現され、両組織において、8.5および2.5kbの転写物がSSTR2プローブとハイブリド化した（図4b）。低濃度のSSTR2mRNAは空腸、肝癌、結腸、結腸癌および肝臓にも検出された。SSTR2mRNAもラットの膵臓小島にも存在し（資料提示せず）、膵臓小島はSSTR1および２の両方を発現することを暗示している。
この結果はソマトスタチンの生物学的効果がソマトスタチン受容体ファミリーの組織特異的発現により媒介されることを示す。クローニングおよびサザンブロトット研究はこの遺伝子群は多分４メンバーからなることを示す。これらの受容体のうちの２個、SSTR1および２の配列およびリガンド結合性能が測定された。両方ともソマトスタチン−14および−28に類似の親和性を持つが、それらの配列は驚くほど相違している。この配列の多様性はその受容体を異なる細胞内エフェクター系に結合することによる（Dorflingerなど、1983;Wangなど、1989）ソマトスタチンの多様な生物学的効果（S.Reichlin、1983）に基づくものであろう。SSTR1およびSSTR2のクローニングは交差結合分析（Susiniなど、1986;Sakamotoなど、1988;Kimuraなど、1989;Thermosなど、1990）により決定されるソマトスタチン受容体の不均質性およびソマトスタチン機能の機構と調節について分子的根拠のよりよい理解をもたらすであろう。加えるに、これらは特異的な診断および治療的応用（A.V.Schally、1988;Lambertsなど、1990）のための選択的な類似体の開発を加速するに違いない。
実施例III:SSTR3のクローニングおよび発現
SSTR2のクローニング発現と同様な方法で、EcoR I消化ヒトDNAのサザンブロットへのヒトSSTR1プローブのハイブリッド化は強いシグナルを、この遺伝子を含むEcoR I断片に期待されうる大きさである14kbに示し、また、＞23、18、8.4および7.8kbの断片には弱いハイブリッド化を示した。このプローブは＞23、13.5、8.6および8.2kbのマウスDNAのEcoR I消化物中の多重断片にもハイブリド化した。予期されるものに加えて、ハイブリッド化断片の存在は、アドレナリン作動性およびドパミン作動性受容体について以前に記載された（Kobilkaなど、1987;Bunzowなど、1988）ようにソマトスタチン受容体のファミリーがあることを示唆する。
ヒトおよびマウスのライブラリーを前記のSSTR1プローブで検索して、第三の推測上のソマトスタチン受容体をコードする遺伝子を分離し、SSTR3と命名し、ヒトSSTR3遺伝子を含むEcoR I断片は8.4kb、マウス遺伝子のそれは23kbである。ヒトSSTR3遺伝子のヌクレオチド配列は418−アミノ酸残基蛋白質配列をコードする少なくとも1254bpで、オープンリーディングフレーム（配列番号９および10）であることが判明した。マウスSSTR3配列の全1794bp配列（配列番号11および12）も同様に得られた。
実施例IV:診断的／治療的応用
異なるソマトスタチン受容体蛋白質の分離および精製が可能となったので、与えられて、診断的または治療的な応用に使用するために可能性のある好適な性質を持つ候補作動薬（アゴニスト）および拮抗薬（アンタゴニスト）のような候補物質を検索するために設計された方法にこれらの蛋白質を用いることが可能になる。
例えば、最近（Dohlmanなど、1991）により記載されたように、受容体サブタイプ、Ｇ蛋白質およびエフェクター数の増加につれて、受容体のリガンド結合およびＧ蛋白質認識の性質解明が診断的および治療的企業にとって重要な課題となっている。ここに記載する通り、再構成実験は受容体が様々な程度の特異性で多重（およびある場合には機能的に異なる）Ｇ蛋白質に結合できること（Kanahoなど、1984）を初めて示した。
例えば、ムスカリン性およびα２−ARのクローニングおよび過剰生産が一個の受容体サブタイプが細胞内で高濃度に発現した時、一つ以上の型のＧ蛋白質と結合するであろうことを示すに到った。これら受容体の各々について、作動薬処理はアデニルサイクレースの阻害およびホスホイノシチド代謝の刺激の両方を導いた。最後に、各Ｇ蛋白質は１個以上のエフェクター、Gs、を刺激することが示され、例えば、アデニルサイクレースに加え、カルシウムチャネルを調節していることが報告されている。これらの著者はこの複雑さおよび表面的な機能の縮重があると、基本的に重要な問題は如何にして、そして如何なる条件下に、Ｇ蛋白質が多重受容体からの信号を組織化しそれらを適当なエフェクターに向けることができるのかであると指摘している。
通常の方法は精製した受容体とＧ蛋白質成分を試験管内でを再構成することであった。不幸にも、これらの著者が指摘したように、精製法は非常に限られた数の受容体サブタイプについてのみ成功しており、Ｇ蛋白質も同様である。一方、今までに特定されたソマトスタチンの受容体のクローニングおよび配列決定が本発明により可能になったので、異型の発現系が、クローンした受容体の特徴付けおよび受容体−Ｇ蛋白質結合特異性の解明においてより一般的な有用性を有すであろう。
最近、この系が酵母細胞内に導入され、ここでは哺乳類のβ２−ARおよびGsα−サブユニットの遺伝子を共発現する（Kingなど、1990）。ヒトの組織が達する濃度のどれよりも数百倍高い濃度に達するβ２−ARの発現およびリガンド結合は適切な親和性、特異性および立体選択性があることが証明された。さらに、β２−ARを介するフェロモン信号トランスダクション経路の活性化は成育速度の変化、形態学的変化および大腸菌lacZ遺伝子（β−ガラクトシデースをコードする）に融合したフェロモン反応性プロモーター（FUS1）を含む数種の判断基準により証明された。
β２−AR及びGsαの発現による酵母フェロモン反応の経路を調節する能力には、このような受容体の構造的および機能的特徴付けを大きく加速する潜在力を持つ。成長速度またはβ−ガラクトシデース誘導を記録することにより、突然変異体受容体の性質を速やかに試験できる。加えるに、ここに可能となった分離した組換えソマトスタチン受容体はソマトスタチンの好ましい性質を持つが、インシュリンの阻害またはグルカゴンの放出およびこの逆のようなソマトスタチンの望ましくない性質を欠いている候補物質を判別できる。さらに、同じソマトスタチン受容体ファミリーの他のものよりソマトスタチン受容体蛋白質１種またはそれ以上と相互作用する選択的能力を持つ候補物質を特定するために前記のような系を用いることが本出願により可能になった。
そこで、例えば、特定の共通の細胞系にクローンされ、発現された一群のソマトスタチン受容体を用い、そのような一群の受容体蛋白質を様々な候補物質に接触させることができる。このような検索検定の結果は、例えば、SSTR1とは相互作用をすることができるが、SSTR2またはSSTR3とは相互作用をしない候補物質を見つけることを可能にする。
さらに、本出願により可能となった、単離された組換えソマトスタチン受容体と比較した時、ソマトスタチンの構造−活性相関を研究することが可能になる。このような研究は個々のソマトスタチン受容体と結合する作動薬および拮抗薬のような候補物質を特定するめの結合研究を含むばかりでなく、それの受容体への結合とは別に、ソマトスタチン受容体における活性を刺激する候補物質を見出すための研究をも含む。
その上、Dohlmanなど、1991が指摘したように、推測上のＧ蛋白質のための他の遺伝子として、本出願により得られる結合受容体が単離され、未確認遺伝子産物への活性を持つリガンドを確認するための一連のリガンドの検索が容易にできる。これらの著者が指摘するように、他の関連サブタイプの不在下の単一受容体の発現はしばしば野生型哺乳類細胞では達成不能である。そこで、微生物中または内在受容体を欠く分離真核細胞中での発現はサブタイプ選択的薬物（Marulloなど、1988;Payetteなど、1990;Kingなど、1990）の探索または評価のために有用である。
本発明の組成物および方法を用いる療法も可能である。ここに、参考のために引用するLambertsなど、ソマトスタチンおよびその同族体の癌の診断および処置における役割、Endocrine・Reviews、12（４）:450〜482は用いうる少なくともいくつかの潜在的な診断および治療操作法を概説している。そして、そこに見られるように、ヒトのソマトスタチン受容体を持つ人腫瘍が多数検出されている。このような腫瘍は下垂体癌；内分泌腺性膵臓癌；カルシノイド；傍神経節腫、褐色細胞腫、髄質甲状腺癌、および小細胞肺癌を含む他の「APUDオマ」；神経芽腫；髄膜腫およびグリア由来脳腫瘍を含む脳腫瘍；メルケル細胞腫瘍；乳癌；腺癌；ならびにリンパ腫および「活性」白血球を含む。
文献リスト
以下に列挙する文献は、本明細書に用いた方法論、技術および／または組成物のための背景を補充し、説明し提供するかそれらを教示するために、本明細書に引用して組み込まれたものである。
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配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）特許出願人：ベル，グリーム・アイ
ヤマダ，ユウイチロウ
セイノ，ススム
（ii）発明の名称：ソマトスタチン受容体
（iii）配列の数:12
（iv）連絡先：
（Ａ）住所：アーノルド，ホワイト・アンド・ダーキー
（Ｂ）通り：ピーオー・ボックス4433番
（Ｃ）市：ヒューストン
（Ｄ）国：アメリカ合衆国
（Ｅ）ZIP:77210
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：プロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC適合
（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号:US 07/816,283
（Ｂ）出願日:1991年12月31日
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：パーカー，デイビッド・エル
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号:512−320−7200
（Ｂ）ファックス番号:512−474−7577
（Ｃ）テレックス番号:79−0924
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1634塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号1:
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（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:391アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号2:
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（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1265塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号3:
0003657602.tif 000006
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:391アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号4:
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（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1351塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号5:
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（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:369アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号6:
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（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1244塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号7:
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（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:369アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号8:
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（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1296塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号9:
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（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:418アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号10:
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（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1796塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号11:
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（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:428アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号12:
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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