(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、セマフォリン類に結合可能なポリペプチド。
【請求項２】
以下の：
（ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である；および
（ｂ）（ａ）の配列の断片；
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドはセマフォリン類に結合することが可能である、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列からなるセマフォリン類に結合可能なポリペプチド。
【請求項４】
セマフォリン類に結合可能なポリペプチドをコードするＤＮＡであって、以下の
（ａ）配列番号１の核酸配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡに完全に相補的なＤＮＡ；
（ｅ）遺伝暗号の縮重によって（ａ）−（ｄ）のＤＮＡに縮重するＤＮＡ；及び、
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のＤＮＡに完全に相補的なＤＮＡ；
からなる群より選択される、前記ＤＮＡ。
【請求項５】
セマフォリン類に結合可能なポリペプチドをコードするＤＮＡであって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）遺伝暗号の縮重によって（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに縮重するＤＮＡ；及び
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のＤＮＡに完全に相補的なＤＮＡ
からなる群より選択される、前記ＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列からなるセマフォリン類に結合可能なポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡであって、ここで、前記断片はセマフォリン類に結合可能である、前記ＤＮＡ。
【請求項９】
セマフォリン類に結合することができる融合タンパク質であって、
配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４、ここでｘ1は１または３５である、のアミノ酸配列；および、
当該融合タンパク質の精製を容易にするペプチド、シグナルもしくはリーダーペプチド、および／または当該融合タンパク質をオリゴマー化するペプチド、のアミノ酸配列；
からなる、前記融合タンパク質。
【請求項１０】
ペプチドが、抗体のＦｃ領域、α−因子リーダー、ポリＨｉｓタグ、抗原性同定ペプチド、およびＦＬＡＧ（登録商標）タグからなる群から選択される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
セマフォリン類に結合することができる融合タンパク質であって、
配列番号２のアミノ酸ｘ1ないし９４４のアミノ酸配列またはその断片のアミノ酸配列、ここでｘ1は１または３５であり、そしてここで該断片はセマフォリン類に結合可能である；および
当該融合タンパク質の精製を容易にするペプチド、シグナルもしくはリーダーペプチド、および／または当該融合タンパク質をオリゴマー化するペプチド、のアミノ酸配列；
からなる、前記融合タンパク質。
【請求項１２】
ペプチドが、抗体のＦｃ領域、α−因子リーダー、ポリＨｉｓタグ、抗原性同定ペプチド、およびＦＬＡＧ（登録商標）タグからなる群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項９−１２いずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項４−８又は１３のいずれか１項のＤＮＡを含む、組み換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
ポリペプチドを調製するための方法であって、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項１５の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項１−３のいずれか１項のポリペプチドに免疫反応性である抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）受容体ポリペプチド、こうしたセマフォリン受容体ポリペプチドをコードする核酸、組換えセマフォリン受容体ポリペプチドを産生するための方法、およびこうしたポリペプチドを含む薬剤組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
セマフォリン遺伝子ファミリーは、神経学的制御因子であることが知られる、関連する膜貫通および分泌糖タンパク質をコードする、多数の分子を含む。セマフォリンは、一般的に、典型的には長さ約５００アミノ酸であるその細胞外ドメインにおいて、よく保存されている。セマフォリンファミリータンパク質は、ニューロン性および非ニューロン性組織で観察されてきており、そしてその神経成長円錐ガイダンスにおける役割に関し広く研究されてきている。例えば、コラプシン−１およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ）セマフォリンＩＩとして知られる分泌セマフォリンは、発生中の反発性成長円錐ガイダンスに選択的に関与している。機能が減少するように突然変異しているセマフォリンＩＩを有するハエは、異常な行動特性を示す。
【０００３】
別のセマフォリン遺伝子が、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）のいくつかの株で同定されてきている。このセマフォリンは、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）ウイルス（コペンハーゲン株）に見られ、そしてＡ３９Ｒとして知られる読み枠（ＯＲＦ）にコードされている。Ａ３９Ｒコードタンパク質は、膜貫通ドメインおよび潜在的な膜結合を持たず、そして分泌タンパク質として知られている。痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ）ウイルスＯＲＦもまた、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで、ワクシニアウイルスＯＲＦ  Ａ３９Ｒと相同性を共有する配列を含む。別のウイルスセマフォリン、ＡＨＶ−セマが、アルセラフィン・ヘルペスウイルス（Ａｌｃｅｌａｐｈｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）（ＡＨＶ）で見られてきている。
【０００４】
昆虫セマフォリンに対する類似性に基づき、哺乳動物（ヒト、ラット、およびマウス）セマフォリンをコードする遺伝子が同定されてきている。これらのセマフォリンの機能研究により、胚および成体ニューロンは、作動可能な連結を確立するため、セマフォリンを必要とすることが示唆される。重要なことに、適切なセマフォリンに対する成長円錐培養の、速い反応時間により、セマフォリン情報伝達は、受容体仲介情報伝達機構を含むことが示唆される。今日まで、ラット脊髄由来のｍＲＮＡを用い、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）と称される、１つのセマフォリン受容体が単離されてきている。ニューロピリン−２と称される、別の受容体が示唆されてきている（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら，  Ｃｅｌｌ  ９０：７５３−７６２，  １９９７）。
【０００５】
細胞外環境に分泌されるセマフォリンリガンドは、局所および全身性方式で、受容体産生細胞を通じ情報を伝達する。こうした局所および全身性情報伝達により制御される細胞過程の性質をさらに研究するため、さらなるセマフォリン受容体およびリガンドを同定することが有益であろう。さらに、ウイルスがコードするセマフォリンは、感染細胞により産生され、そして溶解性であるウイルス（ポックスウイルス類）および向神経性であることが知られていないウイルス（ＡＨＶ）に存在するため、その主要な機能が神経学的反応を修飾することであるとは考えにくい。ウイルスがコードするセマフォリン類は、感染宿主の免疫学的反応を修飾するよう機能する可能性がより高く、そしてウイルスがコードするセマフォリンに対する哺乳動物相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）は、免疫学的反応を修飾するよう機能する可能性が高い。ウイルスセマフォリンが天然免疫制御因子として免疫系において機能する可能性があるという示唆を考慮し、セマフォリン受容体を、免疫反応を亢進するまたは下方制御するための治療剤として同定することは有益であろう。
【０００６】
発明の概要
本発明は、単離されているまたは均質なタンパク質としてのセマフォリン受容体に関する。特に、本発明は、限定されるわけではないが、Ａ３９ＲワクシニアセマフォリンおよびＡＨＶセマフォリンを含むセマフォリンに結合する、ＶＥＳＰＲ（ウイルスがコードするセマフォリンタンパク質受容体）と称されるセマフォリン受容体ポリペプチドを提供する。また、本発明の範囲内には、ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターがある。本発明はまた、ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞、およびこうした宿主細胞を、発現を導く条件下で培養することにより、ＶＥＳＰＲポリペプチドを産生するための方法も含む。本発明はさらに、ＶＥＳＰＲポリペプチドに対して向けられる抗体を含む。
【０００７】
さらに本発明の範囲内には、本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドが結合する、セマフォリンまたはセマフォリンを発現する細胞を精製するまたは分離するための方法がある。こうした方法には、少なくとも１つのＶＥＳＰＲポリペプチドを固相マトリックスに結合させ、そしてＶＥＳＰＲポリペプチドが結合するセマフォリンポリペプチドを含む混合物、またはセマフォリン発現細胞の混合物を、結合しているＶＥＰＳＲポリペプチドと接触させ、そしてその後、接触表面および溶液を分離することが含まれる。
【０００８】
さらに、本発明は、炎症および炎症性疾患を治療するための方法を提供する。こうした方法には、可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドの治療的に有効な量を、セマフォリンリガンドの炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性に関連する疾患を患うヒトまたは他の哺乳動物に投与することが含まれる。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ウイルスがコードするセマフォリンタンパク質受容体（ＶＥＳＰＲ）と称される新規セマフォリン受容体ポリペプチド、ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明はさらに、ＶＥＳＰＲポリペプチドを単離するための方法、並びに組換え発現ベクターでトランスフェクションされている宿主細胞を、セマフォリン受容体を発現するのに適した条件下で培養し、そして発現された受容体ポリペプチドを回収することによる、組換えＶＥＳＰＲポリペプチドを産生するための方法を提供する。
【００１０】
特に、本発明は、限定されるわけではないが、ワクシニアウイルスＡ３９ＲセマフォリンおよびＡＨＶセマフォリンを含むセマフォリンに結合するＶＥＳＰＲポリペプチドを提供する。本明細書に記載される天然ＶＥＳＰＲポリペプチドは、該受容体を発現するヒト細胞の膜からＶＥＳＰＲを回収するため、エクトロメリア（Ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ）ウイルスＡ３９Ｒセマフォリン／Ｆｃ融合タンパク質（Ａ３９Ｒ／Ｆｃ）を用い、単離した。以下の実施例に記載されるように、フローサイトメトリー実験により、本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドはＢ細胞株、単球型細胞株、Ｔ細胞株、樹状細胞、ＮＫ細胞、肺上皮細胞、ストローマ、腸上皮細胞およびリンパ腫細胞に発現されることが証明される。
【００１１】
さらに、以下の実施例に立証されるように、本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドは、そのリガンドと結合し、樹状細胞上のＣＤ６９活性化抗原の上方制御に関与する。やはり本明細書に記載されるセマフォリン受容体の特性は、そのリガンドと相互作用し、インターフェロンおよびＳＡＣと相乗作用し、マウス樹状細胞に対し、ＩＬ−１２産生を上方制御し、そしてＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８６発現を下方制御する能力である。本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドはまた、単球上のＣＤ５４の発現増加にも関与し、これはセマフォリンおよびその受容体の間の相互作用の結果としての細胞活性化を示唆する。受容体−リガンド相互作用の前述の生物学的特性から生じるＶＥＳＰＲポリペプチドの使用の中に、ＩＬ−１２産生および続いて起こるナチュラルキラー細胞活性化を誘導することがある。ＶＥＳＰＲポリペプチドは、炎症に関連する疾患および不利な状態を治療するのに、さらなる使用を見出す。特に、可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドを用い、セマフォリンリガンドおよびその受容体の相互作用に関連する炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性に拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）させてもよい。滑膜組織の慢性炎症に関連する疾患である慢性関節リウマチは、ヒトセマフォリンＥ遺伝子の上方制御と結び付けられてきている（Ｍａｎｇａｓｓｅｒ−Ｓｔｅｐｈａｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ，  ２３４：１５３−１５６，  １９９７）。したがって、本発明の可溶性型ＶＥＳＰＲポリペプチドは、本炎症性疾患を仲介するセマフォリン活性を下方制御するのに有用である可能性がある。
【００１２】
本発明の天然セマフォリン受容体である、ＶＥＳＰＲは、エクトロメリアＡ３９Ｒとして知られるウイルスセマフォリンリガンドを用い、単離した。以下の実施例１は、Ａ３９Ｒセマフォリンリガンドを単離すること、並びにリガンドに結合する細胞株を同定するため、およびＡ３９Ｒおよびその細胞結合受容体の間の相互作用の影響を決定するため用いたＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を調製することを記載する。
【００１３】
実施例４および５は、本発明の天然ＶＥＳＰＲポリペプチドを同定すること、およびヒトＶＥＳＰＲポリペプチドを単離しそして精製することを記載する。実施例５に記載されるように単離されたヒトＶＥＳＰＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に開示されている。配列番号２のアミノ酸配列は、トリプシン消化で産生されたペプチドの直列（ｔａｎｄｅｍ）質量分析を、隣接しているＥＳＴ配列および同定されているｃＤＮＡと組み合わせて用い、単離されそして精製されている受容体を配列決定することにより得た。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、アミノ酸３４に予測される切断部位を持つシグナルペプチドを含む、アミノ酸１−９４４の予測される細胞外ドメインを有する。配列番号２の予測される膜貫通ドメインは、アミノ酸９４５−９６５を含み、そして配列番号２の細胞質ドメインは、アミノ酸９６６−１５６８に渡る。
【００１４】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ中のヒトＶＥＳＰＲのアミノ酸１９−１１００をコードするＤＮＡを、＿＿＿にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、米国メリーランド州ロックビルに寄託し、そして寄託番号＿＿＿を得た。該寄託は、ブダペスト条約の条件下で行われた。寄託物のＤＮＡ構築物は、ヌクレオチド１７２がＣである点で、配列番号１のものと異なる。生じるコードされるアミノ酸５８はｌｅｕである。
【００１５】
利用可能なデータベースで、全長ＶＥＳＰＲまたはそのドメインと相同性を共有するタンパク質およびポリペプチドに関し、アミノ酸配列検索を行った。ＶＥＳＰＲと相同性を共有するポリペプチドに関する検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い、行った。本プログラムを用い、ＶＥＳＰＲアミノ酸配列を、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から得られるデータベースに見られるタンパク質およびＤＮＡ配列と比較した。これらの検索の結果として得た類似性スコアにより、ＶＥＳＰＲと多様な度合いの相同性を有するポリペプチド群が同定された。最も高い度合いの類似性は、ＶＥＳＰＲおよび「プレクシン（ｐｌｅｘｉｎ）遺伝子ファミリー」として知られるタンパク質群の間に見られた（Ｍａｅｓｔｒｉｎｉら，  １９９６およびＫａｍｅｙａｍａら，  １９９６）。遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ）プログラム「ＢＥＳＴＦＩＴ」および「ＰＩＬＥＵＰ」（ウィスコンシン・パッケージ、９．０）で実行されるような、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用い、ＶＥＳＰＲ並びにヒトおよびネズミのプレクシンファミリーのメンバーの間の対および多数配列整列を行った。ＧＣＧプログラム「ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ」を用い、整列タンパク質配列の平均対同一性パーセントを計算した。
【００１６】
ＶＥＳＰＲポリペプチドおよびプレクシン遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーの各々の間の対配列整列により、その細胞質ドメイン（アミノ酸９６６−１５６８）の３９％から４０％の平均同一性および全タンパク質の各々に関する２４％−２５％の平均同一性が明らかになった。細胞質ドメインの相同性がより高い程度であることにより、細胞質ドメインに同様のシグナル伝達機構があることが示唆される。
【００１７】
ある程度の全体的な相同性を有することが見出されたタンパク質配列間の類似性領域を同定するため、ＢＬＩＸＥＭおよびＭＳＰＣＲＵＮＣＨプログラム（ＳｏｎｎｈａｍｍｅｒおよびＤｕｒｂｉｎ（１９４４ａ，ｂ））を用い、タンパク質データベース検索の結果の相同性解析を行った。相同性解析により、Ｋｏｌｏｄｋｉｎら（１９９３）に記載されるセマフォリン遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーのセマフォリンドメインの領域に対し、類似性を持つ新規のサブドメインが明らかになった。新規サブドメインは本発明のＶＥＳＰＲ配列のアミノ酸３８０−４８２を含む。本サブドメインは２つの別個の、より小さい領域にさらに分割することが可能であり、それぞれ残基３８８−４０２および４５４−４８２を含む。Ｃ近位半サブドメインは、いくつかの非常に保存されているシステインおよびトリプトファン残基を含み、コンセンサス配列Ｃ−ｘ（５）−Ｃ−ｘ（２）−Ｃ−ｘ（７）−Ｃ−ｘ−Ｗ−Ｃ−ｘ（５）−Ｃ、ここでｘはいかなるアミノ酸でもよい、を形成する。この全サブドメインは、セマフォリン遺伝子ファミリーに関し記載されている標準的セマフォリンドメインとは、（ａ）該サブドメインがより小さく（該サブドメインが１００アミノ酸残基に対し全セマフォリンドメインは５００残基）、（ｂ）該サブドメインが、どちらも標準的セマフォリン遺伝子ファミリーメンバーではない、プレクシン遺伝子ファミリーおよびＭＥＴ−肝細胞増殖因子受容体ファミリーにも存在し、そして（ｃ）該サブドメインが、それ自体セマフォリン遺伝子ファミリーのメンバーではないが、セマフォリンファミリーのメンバー（Ａ３９Ｒ）と相互作用する遺伝子に存在する点で、異なる。これらのサブドメイン配列は、したがって、セマフォリンと相互作用する他の受容体をさらに同定することが潜在的に可能であるペプチドを代表する。
【００１８】
配列番号２のＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、隣接するＥＳＴおよびクローンされたｃＤＮＡヌクレオチド配列の複合物として組み立てられ、そして配列番号１に開示されている。実施例５に記載されるように、配列番号２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを同定することにより、コードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築することが可能になる。その後ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターでトランスフェクションされている宿主細胞を、ＶＥＳＰＲポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養し、そして発現されたＶＥＳＰＲポリペプチドを回収することが、本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドを産生するための方法を提供する。
【００１９】
ＶＥＳＰＲポリペプチドはＢ細胞株、Ｔ細胞株および樹状細胞で見られるため、過敏性または低作用性免疫制御に関連する多様な状態を治療することが可能である。さらに、リガンドおよび受容体複合体は、神経成長、発生、および／または維持に関与している可能性がある。こうしたものに限定されないが、ＶＥＳＰＲの特定の使用が以下に記載される。
【００２０】
本発明の「ＶＥＳＰＲ」および「ＶＥＳＰＲポリペプチド」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号１の核酸配列を含む核酸がコードするタンパク質を含む。さらに、該用語は、配列番号２のアミノ酸配列と高い度合いの類似性または高い度合いの同一性を有するポリペプチドであって、生物学的に活性があり、そしてセマフォリンファミリーのメンバーである分子または分子の断片の少なくとも１つに結合する、前記ポリペプチドを含む。さらにＶＥＳＰＲという用語は、配列番号１のＤＮＡの生物学的に活性がある遺伝子産物を指す。さらにＶＥＳＰＲという用語に含まれるのは、主にタンパク質の結合部分を含み、生物学的活性を保持し、そして分泌されることが可能である、可溶性または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質である。こうした可溶性タンパク質の特定の例は、配列番号２のアミノ酸１−９４４の配列を含むものである。
【００２１】
ＶＥＳＰＲまたはセマフォリン受容体ポリペプチドを指す場合、「生物学的に活性がある」という用語は、ＶＥＳＰＲまたはセマフォリン受容体ポリペプチドが少なくとも１つのセマフォリンに結合することが可能であることを意味する。ＶＥＳＰＲ結合を測定するのに適したアッセイが本明細書に記載され、そして該アッセイは標準的フローサイトメトリー試験およびスライド結合試験を含んでもよい。
【００２２】
「単離されている」は、ＶＥＳＰＲが、例えば、組換え宿主細胞培養の精製産物として、または精製抽出物として、実質的に発現過程の残渣である他のタンパク質またはポリペプチドを含まないことを意味する。
【００２３】
本明細書で論及されるＶＥＳＰＲ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）は、天然ＶＥＳＰＲに実質的に相同であるが、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＶＥＳＰＲのものと異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを意味する。変異体アミノ酸配列は、好ましくは、天然ＶＥＳＰＲアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９０％同一である。パーセント同一性は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７，  １９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン８．１を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，  １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。変異体は保存的置換配列を含んでもよく、これは既定のアミノ酸残基が同様の物理化学的特性を有する残基により置換されていることを意味する。保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの、またはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換が含まれる。他のこうした保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。天然発生ＶＥＳＰＲ変異体または対立遺伝子もまた、本発明に含まれる。こうした変異体の例は、選択的ｍＲＮＡ事象から、またはＶＥＳＰＲタンパク質のタンパク質分解的切断から生じる、結合特性が保持されているタンパク質である。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、一部切除されているが生物学的に活性があるＶＥＳＰＲポリペプチドを生じる可能性があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型などがある。タンパク質分解に起因すると考えられる変異体には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現に際しての、ＶＥＳＰＲポリペプチドからの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去によるＮ末端の相違が含まれる。
【００２４】
上述のように実施例１は、ＶＥＳＰＲ結合を研究するのに有用な、新規ウイルスＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質の構築を記載する。本実施例に記載されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に対し、他の抗体Ｆｃ領域を置換してもよい。適切なＦｃ領域は、プロテインＡまたはプロテインＧに高い親和性で結合することが可能なものであり、そしてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域あるいはヒトまたはネズミＩｇＧ１  Ｆｃ領域の断片、例えば鎖間ジスルフィド結合が形成されるであろうように、少なくともヒンジ領域を含む断片を含む。ウイルスＡ３９Ｒ：Ｆｃ融合タンパク質は、容易に精製されるという利点を提供する。さらに、ジスルフィド結合は２つの別個の融合タンパク質鎖のＦｃ領域の間に形成され、二量体を生成する。
【００２５】
上述のように、１つの側面において、本発明は、可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドを含む。可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドは、天然ＶＥＳＰＲの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むが、細胞膜上へのポリペプチドの保持を生じるであろう膜貫通領域を欠く。可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドは、都合のよいことに、最初に合成される際、分泌を促進するように天然（または異種性）シグナルペプチドを含むが、ＶＥＳＰＲポリペプチドが細胞から分泌される際、該シグナルペプチドは切断される。本発明に含まれる可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドは、セマフォリンリガンドに結合する能力を保持する。実際、可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドは、該可溶性ＶＥＳＰＲタンパク質が分泌されることが可能であるならば、シグナルの一部または細胞質ドメインの一部あるいは他の配列もまた含んでもよい。
【００２６】
可溶性ＶＥＳＰＲは、望ましいタンパク質を発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を、培地から、例えば遠心分離により分離し、そして望ましいタンパク質の存在に関し培地（上清）をアッセイすることにより、同定し（そしてその非可溶性膜結合対応物と区別し）てもよい。培地中のＶＥＳＰＲの存在は、該タンパク質が細胞から分泌され、そしてしたがって望ましいタンパク質の可溶性型であることを示す。
【００２７】
ＶＥＳＰＲポリペプチドの可溶性型は、天然膜結合ＶＥＳＰＲタンパク質に比べ多くの利点を有する。可溶性タンパク質は細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのタンパク質の精製に適している。さらに、可溶性タンパク質は、一般的に、静脈内投与に、より適している。
【００２８】
可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドの例には、天然ＶＥＳＰＲポリペプチドの細胞外ドメインのかなりの部分を含むものが含まれる。可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸１−９４４である。さらに、全細胞外ドメインより少ない部分を含む一部切除可溶性ＶＥＳＰＲが、本発明に含まれ、例えばアミノ酸３５−９４４である。最初に宿主細胞内で発現されるとき、可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドはさらに、使用される宿主細胞内で機能する、以下に記載される異種性シグナルペプチドの１つを含んでもよい。あるいは、該タンパク質は天然シグナルペプチドを含んでもよい。本発明の１つの態様において、可溶性ＶＥＳＰＲは、（Ｎ末端からＣ末端に）酵母α−因子シグナルペプチド、以下にそして米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、および配列番号２のアミノ酸１−９４４または３５−９４４からなる可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されてもよい。本組換え融合タンパク質は、酵母細胞において発現され、そして該細胞から分泌される。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドはタンパク質の精製を容易にし、そして続いてウシ粘膜エンテロキナーゼを用い、可溶性ＶＥＳＰＲから切断することが可能である。可溶性ＶＥＳＰＲタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。
【００２９】
可溶性ポリペプチドを含む、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＶＥＳＰＲポリペプチドは、いくつかの慣用的技術のいずれにより調製してもよい。望ましいＤＮＡ配列を、それ自体知られる技術を用い、化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローンＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離してもよい。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカーを使用し、望ましいＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入してもよく、または該断片を、その中に天然に存在する切断部位で消化してもよい。周知のポリメラーゼ連鎖反応法もまた、望ましいタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を増幅するのに使用してもよい。さらなる代替物として、既知の突然変異誘発技術を使用し、望ましい点、例えば結合ドメインの最後のアミノ酸に対するコドンのすぐ下流に、終止コドンを挿入してもよい。
【００３０】
上述のように、本発明は、組換えおよび非組換え体両方の、単離されているまたは均質なＶＥＳＰＲポリペプチドを提供する。望ましい生物学的活性（例えばセマフォリンに結合する能力）を保持する天然ＶＥＳＰＲタンパク質の変異体および誘導体は、天然ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により、得てもよい。天然アミノ酸配列の改変は、いくつかの慣用法のいずれにより達成してもよい。突然変異は、天然配列の断片への連結を可能にする制限部位が隣接している、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入してもよい。連結後、生じた再構築配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体（ａｎａｌｏｇ）をコードする。
【００３１】
あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発法を使用し、あらかじめ決定されたコドンが置換、欠失または挿入により改変されている可能性がある、改変遺伝子を提供してもよい。上述の改変を作成する典型的な例は、すべて本明細書に援用される、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，  １９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，  １９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，  １２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８，  １９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７，  １９８７）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されている。
【００３２】
他の化学部分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体を形成することにより、天然ＶＥＳＰＲポリペプチドを修飾し、ＶＥＳＰＲ誘導体を生成してもよい。ＶＥＳＰＲポリペプチドの共有誘導体は、ＶＥＳＰＲアミノ酸側鎖上の、あるいはＶＥＳＰＲポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、またはその細胞外ドメインの、官能基上に、化学部分を連結することにより、調製してもよい。本発明の範囲内の他のＶＥＳＰＲ誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体としての組換え培養中の合成によるなど、ＶＥＳＰＲポリペプチドまたはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体が含まれる。例えば、結合体は、ＶＥＳＰＲポリペプチドのＮ末端にシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα−因子リーダー）を含んでもよい。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の部位への、結合体の運搬を指示する。
【００３３】
ＶＥＳＰＲポリペプチド融合体は、ＶＥＳＰＲの精製および同定を容易にするため添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリＨｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。
【００３４】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないＶＥＳＰＲを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−７細胞）で発現されたＶＥＳＰＲポリペプチドは、発現系の選択に基づき、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然ＶＥＳＰＲポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）でのＶＥＳＰＲポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。
【００３５】
アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは生物学的活性または結合に必要とされない末端または内部残基または配列の欠失をコードする同等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）ＤＮＡ構築物が、本発明に含まれる。例えば、ＶＥＳＰＲ細胞外ドメインのＮ糖鎖付加部位を修飾し、糖鎖付加を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。天然ヒトＶＥＳＰＲタンパク質は、配列番号２のアミノ酸８６−８８、１４１−１４３、１４９−１５１、２４１−２４３、２５２−２５４、３８６−３８８、４０７−４０９、５４８−５５０、５５３−５５５、５８２−５８４、５８８−５９０、５９１−５９３、６５３−６５５、６８６−６８８、６９２−６９４、７１５−７１７、７４１−７４３、７７１−７７３、７９６−７９８、８２１−８２３、８７１−８７３、８９０−８９２、８９５−８９７および９２０−９２２にこうしたトリプレットを２４含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。タンパク質のＮ糖鎖付加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【００３６】
別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるようにし、再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを妨げてもよい。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢進させるため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の発生を除去するため、残基を欠失、付加、または置換することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的なそして好ましいアプローチを代表する。ヒトＶＥＳＰＲは、１１のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を含む。
【００３７】
本発明の範囲内にある核酸配列には、中程度のまたは非常にストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件下で、本明細書に開示されるＶＥＳＰＲヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして生物学的に活性があるＶＥＳＰＲをコードする、単離ＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。中程度にストリンジェントな条件には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ  １０１−１０４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に定義されるように、５  Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の前洗浄溶液の使用および約５５℃、５  Ｘ  ＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件が含まれる。非常にストリンジェントな条件には、より高温度のハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれる。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、核酸分子の長さおよびＡ、Ｔ／Ｕ、ＣおよびＧヌクレオチドの相対量などの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００３８】
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号１に示されるものと異なり、そしてなお配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＥＳＰＲポリペプチドをコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３９】
本発明は、生物学的に活性があるＶＥＳＰＲをコードする同等の単離ＤＮＡ配列であって：（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズすることが可能であり、そして生物学的に活性があるＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の結果として（ａ）または（ｂ）に定義されるＤＮＡに対し縮重しており、そして生物学的に活性があるＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、より選択される、前記ＤＮＡ配列を提供する。こうしたＤＮＡ同等配列がコードするＶＥＳＰＲポリペプチドが、本発明に含まれる。
【００４０】
配列番号１のＤＮＡ配列に同等であるＤＮＡは、配列番号２の配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に，中程度および非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするであろう。こうしたＤＮＡがコードするＶＥＳＰＲタンパク質の例には、限定されるわけではないが、ＶＥＳＰＲ断片および上述のような、不活性化Ｎ糖鎖付加部位、不活性化ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミノ酸置換を含むＶＥＳＰＲタンパク質が含まれる。他の種由来のＤＮＡにコードされるＶＥＳＰＲポリペプチドであって、そして該ＤＮＡが配列番号１のｃＤＮＡにハイブリダイズするであろう前記タンパク質もまた、含まれる。
【００４１】
セマフォリン類に結合する、必須の能力を有する変異体は、いかなる適切なアッセイにより同定してもよい。ＶＥＳＰＲポリペプチドの生物学的活性は、例えば、セマフォリン類の受容体結合ドメインへの結合に関する競合（すなわち競合的結合アッセイ）により、測定してもよい。
【００４２】
ＶＥＳＰＲポリペプチドに関する競合的結合アッセイの１つの種類は、放射標識可溶性ＶＥＳＰＲおよび損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）セマフォリン発現細胞を用いる。損なわれていない細胞の代わりに、可溶性セマフォリン：Ｆｃ融合タンパク質であって、プロテインＡ、プロテインＧあるいは該分子のセマフォリンまたはＦｃ部分に対する抗体と、該融合タンパク質のＦｃ部分との相互作用を通して、固相に結合している該融合タンパク質を代用してもよい。競合的結合アッセイの別の種類は、融合タンパク質などの放射標識可溶性セマフォリン、およびＶＥＳＰＲを発現している損なわれていない細胞を利用する。
【００４３】
競合的結合アッセイは、慣用的方法論にしたがい、行うこともできる。１つの態様において可溶性ＶＥＳＰＲポリペプチドを作成し、固定受容体と競合させてもよい。例えば、表面結合セマフォリン受容体に対する結合活性に関するアッセイにおいて、放射標識可溶性セマフォリンリガンドを、可溶性ＶＥＳＰＲにより拮抗させてもよい。定性的結果は、競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより得てもよく、またはスキャッチャードプロットを利用して定量的結果を生成してもよい。
【００４４】
あるいは、ＶＥＳＰＲまたは抗セマフォリン抗体などのセマフォリン結合タンパク質を、表面上にセマフォリンを発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の支持体などの固相に結合させてもよい。セマフォリン結合タンパク質の、固相接触表面への結合は、いかなる手段により達成してもよく、例えば、ＶＥＳＰＲ：Ｆｃ融合タンパク質を構築し、そしてこうしたものをプロテインＡまたはプロテインＧの相互作用を通じ固相に結合させることによってもよい。タンパク質を固相に固定するための多様な他の手段が当業に周知であり、そして本発明での使用に適している。例えば、磁気微小球体をＶＥＳＰＲで被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。セマフォリン発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、その上にＶＥＳＰＲポリペプチドを有する固相と接触させる。その表面上にセマフォリンを有する細胞は、固定されたＶＥＳＰＲに結合し、そして非結合細胞をその後洗い流す。このアフィニティー結合法は、こうしたセマフォリン発現細胞を溶液から精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から遊離させる方法は当該分野に知られ、そして例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは、細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは、細胞表面結合パートナーを切断することに向けられる。セマフォリン−ＶＥＳＰＲ相互作用の場合、酵素は、好ましくは、セマフォリンを切断し、それにより生じた細胞懸濁物を「異質な（ｆｏｒｅｉｇｎ）」セマフォリン受容体成分から遊離させる。精製細胞集団は、その後、成熟（成体）組織に再定着させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）のに用いてもよい。
【００４５】
あるいは、セマフォリン陽性細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず、ビオチン化ＶＥＳＰＲとインキュベーションしてもよい。インキュベーション期間は、典型的には、セマフォリンへの結合を確実にするため、少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高親和性が、ビーズへの細胞の結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用は当業に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用的方法を用いて行う。
【００４６】
上述のように、ＶＥＳＰＲはセマフォリンを発現する細胞を分離するのに用いてもよい。代替法において、ＶＥＳＰＲあるいはその細胞外ドメインまたは断片を、セマフォリン発現細胞を検出するため、１２５Ｉなどの検出可能部分と結合させてもよい。１２５Ｉでの放射標識は、高比放射能に標識されている機能する１２５Ｉ−ＶＥＳＰＲ分子を生じるいくつかの標準的方法論のいずれにより行ってもよい。あるいはセマフォリン受容体に対するヨウ素化またはビオチン化抗体を用いてもよい。比色または蛍光分光反応を触媒することが可能な酵素、ビオチン、あるいはアビジンなどの別の検出可能部分を用いてもよい。セマフォリン発現に関し試験すべき細胞を標識ＶＥＳＰＲポリペプチドと接触させてもよい。インキュベーション後、非結合標識ＶＥＳＰＲを除去し、そして検出可能部分を用い、結合を測定する。
【００４７】
ＶＥＳＰＲ（変異体を含む）の結合特性はまた、上述のものと類似の競合アッセイにおいて、結合体化セマフォリン（例えば、１２５Ｉ−セマフォリン：Ｆｃ）を用い、決定してもよい。しかしこの場合、固体支持体に結合している、セマフォリンを発現している損なわれていない細胞を用い、推定上のＶＥＳＰＲ変異体を含む試料が、結合体化セマフォリンとの結合に関し競合する度合いを測定する。
【００４８】
ＶＥＳＰＲに関しアッセイする他の手段には、抗ＶＥＳＰＲ抗体、ＶＥＳＰＲに反応し増殖する細胞株、またはセマフォリンを発現し、そしてＶＥＳＰＲの存在下に増殖する組換え細胞株の使用が含まれる。
【００４９】
本明細書に開示されるＶＥＳＰＲタンパク質はまた、ＶＥＳＰＲに対する結合親和性という点で、セマフォリンタンパク質の生物学的活性を測定するのに、使用してもよい。１つの例として、セマフォリンタンパク質の修飾（例えば化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活性が保持されているかを測定するのに本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドを用いてもよい。このように、セマフォリンタンパク質の生物学的活性を、例えば、調査研究、または臨床に用いる前に、確定することが可能である。
【００５０】
本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドは、例えば異なる条件下でのセマフォリンタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものにより、使用されてもよい試薬としての使用を見出す。例えば、ＶＥＳＰＲポリペプチドを結合親和性研究に使用し、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生されたセマフォリンタンパク質の生物学的活性を測定してもよい。修飾セマフォリンタンパク質のＶＥＳＰＲに対する結合親和性を、非修飾セマフォリンタンパク質のものと比較し、セマフォリンの生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。
【００５１】
ＶＥＳＰＲポリペプチドはまた、結合する剤を、セマフォリンを発現している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。以下の実施例７に記載されるように、推定上のヒトセマフォリンは、胎盤、精巣、卵巣および脾臓に見られる細胞に発現される。したがって、ＶＥＳＰＲポリペプチドを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断または治療剤をこれらの細胞に（または細胞表面上にセマフォリンを発現することが見出されている他の細胞種に）搬送してもよい。
【００５２】
ＶＥＳＰＲポリペプチドに結合させてもよい診断および治療剤には、限定されるわけではないが、薬剤（ｄｒｕｇｓ）、毒素、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素、およびそれらに匹敵するものが、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。薬剤の例には、多様な型の癌を治療するのに用いられるもの、例えばＬ−フェニルアラニンナイトロジェンマスタードなどのナイトロジェンマスタードまたはシクロホスファミド、シス−ジアミノジクロロ白金などの挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗物質、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、およびブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの抗生物質、並びにそれらの誘導体が含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒがある。治療使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕがある。
【００５３】
こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、セマフォリン受容体に結合させてもよい。ＶＥＳＰＲはタンパク質であり、例えば、望ましい剤の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成し、または結合してもよい。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に結合させるのに入手可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴ってもよい。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を、例えば適切な二官能性キレート剤を用いることにより、受容体に結合させてもよい。
【００５４】
ＶＥＳＰＲおよび適切な診断または治療剤を含む（好ましくは共有結合している）結合体をこのように調製する。該結合体を投与し、またはそうでなければ特定の適用に適した量で使用してもよい。
【００５５】
本発明のＶＥＳＰＲの別の使用は、受容体が、セマフォリンと共同で、免疫制御およびウイルス感染に果たす可能性がある役割を研究するための研究手段としてのものである。本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドはまた、該ポリペプチドが結合するセマフォリンまたはＶＥＳＰＲ、あるいはそれらの相互作用の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにも使用してもよい。
【００５６】
実施例１６に記載されるように、セマフォリンは本発明の膜結合受容体と相互作用し、樹状細胞からのＩＬ−１２産生においてインターフェロンおよび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｃ型）（ＳＡＣ）と相乗作用する。ＩＬ−１２産生を誘導するためのＶＥＳＰＲおよびそのセマフォリンリガンドの使用は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞産生を促進し、そしてサイトカイン産生（主にγ−インターフェロン）を誘導する。ＩＬ−１２およびＩＬ−１２誘導γインターフェロン産生は、Ｔｈ１細胞分化を支持し、そしてＴｈ２細胞分化に関連するサイトカインの産生を下方制御する。ＩＬ−１２は、炎症誘発性サイトカインおよび免疫調節因子の両方として作用することが知られる。したがって、可溶性ＶＥＰＳＲを用い、ＩＬ−１２産生を拮抗し、そして生物のＴｈ１細胞分化を下方制御してもよい。同様に、可溶性ＶＥＳＰＲを用い、Ｔｈ２細胞分化に関連するサイトカインの産生を促進し、こうして炎症誘発性活性を阻害してもよい。また、ＶＥＳＰＲをそのセマフォリンリガンドと組み合わせて用い、細胞免疫が有効である病原体に対するワクチン投与と組み合わせ，ＩＬ−１２産生を高めてもよい。この方式で亢進された量のＩＬ−１２は、ワクチン投与におけるアジュバントとして作用し、より持続するＴｈ１型免疫学的記憶を誘導する。
【００５７】
さらに、腫瘍を持つ動物に対するＩＬ−１２の投与は、腫瘍退化および腫瘍特異的免疫反応の確立を生じることが知られる。したがって、ＩＬ−１２を亢進するまたは促進するために、ＶＥＳＰＲに結合するセマフォリンリガンドを使用することは、侵略性微小転移巣腫瘍に対する治療的免疫反応を誘導することが可能である。
【００５８】
さらに、実施例１８に記載されるように、本発明の受容体は、そのセマフォリンリガンドに結合し、単球上のＣＤ５４発現を増加させる。この観察は、セマフォリン／セマフォリン受容体相互作用は、典型的には単球活性化に関与する炎症誘発性活性に寄与する細胞活性化を仲介することを示唆する。こうした活性には、食作用、飲作用、一酸化窒素産生およびサイトカイン産生の増加が含まれる。セマフォリンリガンドおよびその膜結合受容体の間の相互作用から生じる炎症誘発性活性に拮抗するまたは該活性を逆転させるため、治療的に有効な量の本発明の可溶性ＶＥＳＰＲを含む薬剤組成物を、生物に非経口的に（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）投与してもよい。可溶性ＶＥＳＰＲはセマフォリンリガンドに結合し、したがってリガンドが膜結合受容体に結合し、そして炎症誘発性活性に寄与するのを妨げる。ＶＥＳＰＲの治療的に有効な量は、炎症誘発性活性に拮抗するのに十分な量である。
【００５９】
単球上のＣＤ５４の増加した発現にもかかわらず、微小生理機能測定装置（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）データにより、ＶＥＳＰＲを通じた細胞情報伝達は、古典的な免疫学的な意味で、細胞を活性化しないことが示される。より詳細には、微小生理機能測定装置データにより、ＶＥＳＰＲがそのリガンドに結合する際、培地のｐＨ変化の速度の減少が生じることが示唆される。これは細胞活性化中に起こることと反対である。こうした減少は、細胞内でプロテインキナーゼを阻害する薬剤、または細胞を代謝的に麻痺させることが可能なウイルス感染で経験される。ＶＥＳＰＲを通じて搬送される抑制性シグナルは、ＶＥＳＰＲの可溶性型の投与により、拮抗させることが可能である。こうした可溶性型は、ＶＥＳＰＲ結合パートナーに効果的に結合し、そして抑制性情報伝達に拮抗し、したがって細胞の不活性化状態を妨げる。あるいは、そして本発明にしたがい、情報伝達する抗ＶＥＳＰＲ抗体を治療剤として用い、炎症がＴ細胞に対する自己抗原の提示の結果である自己免疫疾患を治療してもよい。より詳細には、こうした抗ＶＥＳＰＲ抗体は、抗原提示細胞により取り込まれるように標的化し、そしてプロテインキナーゼ阻害剤と同様、抗原提示細胞を不活性化してもよい。炎症に責任を負う抗原提示細胞の抗原提示が劣ってくるため、自己免疫が治る。
【００６０】
セマフォリンリガンドがＶＥＳＰＲに結合し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と培養している樹状細胞上の、ＭＨＣクラスＩＩ分子および共刺激性分子であるＣＤ８６の発現を下方制御すること（実施例１７）により、セマフォリンリガンドおよび本発明の受容体の間の相互作用は、成熟樹状細胞の免疫抑制に関与することが示唆される。セマフォリンリガンドおよびその膜結合受容体の間の相互作用から生じる免疫抑制活性に拮抗するまたは該活性を逆転させるため、本発明の可溶性ＶＥＳＰＲの治療的に有効な量を含む薬剤組成物を、生物に非経口的に投与してもよい。可溶性ＶＥＳＰＲは、セマフォリンリガンドに結合し、したがってリガンドが膜結合受容体と結合し、そして免疫抑制活性に寄与するのを妨げる。あるいは、慢性炎症の影響で損傷を受ける患者または生物に、適切なセマフォリンリガンドを投与することは、分化マクロファージの炎症誘発性活性を抑制するのに寄与するであろう。
【００６１】
データにより、ＶＥＳＰＲリガンドがＴ細胞上に見られ，そしてＶＥＳＰＲがリンパ節のＴ細胞地帯からの樹状細胞の移動に関与することが示される。さらに、データにより、ＶＥＳＰＲは、病原体が除去されると直ちにＴ細胞免疫反応を遮断するのに関与することが示唆される。
【００６２】
本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドを、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい処方してもよい。ＶＥＳＰＲは、単一の活性成分として、または他の既知の活性成分と共に、薬学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。適切なキャリアーおよびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化している、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物に取り込まれている、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれているＶＥＳＰＲポリペプチドを含んでもよい。こうした組成物は、ＶＥＳＰＲの物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響するであろう。ＶＥＳＰＲポリペプチドはまた、組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対する抗体に結合していてもよいし、または組織特異的受容体のリガンドにカップリングしていてもよい。
【００６３】
ＶＥＳＰＲポリペプチドは、局所、非経口、または吸入によるなどで、投与してもよい。「非経口」という用語には、皮下注射、静脈内、筋内、槽内注射、または注入技術が含まれる。これらの組成物は、典型的には、ＶＥＳＰＲの有効量を、単独でまたは他のいかなる活性成分であってもよいものの有効量と組み合わせ、含むであろう。組成物に含まれるこうした投薬量および望ましい薬剤濃度は、意図される使用、患者の体重および年齢、並びに投与経路を含む、多くの要因に依存し変化する可能性がある。予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そしてヒト投与のための投薬量の見積もりを、当業に認められる実施にしたがい、行ってもよい。
【００６４】
ＶＥＳＰＲポリペプチドは、共有結合もしくは非共有結合している二量体または三量体などの、オリゴマーとして存在してもよい。オリゴマーは、異なるＶＥＳＰＲ分子上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により連結されていてもよい。本発明の１つの態様において、ＶＥＳＰＲ二量体は、ＶＥＳＰＲを抗体（例えばＩｇＧ１）のＦｃ領域に、ＶＥＳＰＲのセマフォリンリガンド結合ドメインへの結合に干渉しない方式で、融合させることにより、生成される。Ｆｃポリペプチドは、好ましくは、可溶性ＶＥＳＰＲ（リガンド結合部分のみを含む）のＣ末端に融合される。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えば、本明細書に援用される、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，  １９９０）に記載されている。ＶＥＳＰＲ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。ＶＥＳＰＲ：Ｆｃ融合タンパク質を、抗体分子によく似た形で集合するのを可能にし、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、二価物を生じる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＶＥＳＰＲ細胞外領域を含むＶＥＳＰＲオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、２つの可溶性ＶＥＳＰＲドメインをペプチドリンカーで連結してもよい。
【００６５】
ＶＥＳＰＲポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現用ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク州エルセビア（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、ＶＥＳＰＲポリペプチドを産生するのに使用してもよい。
【００６６】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ＶＥＳＰＲポリペプチドがＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ末端メチオニンは、発現された組換えＶＥＳＰＲポリペプチドから切断されてもよい。
【００６７】
ＶＥＳＰＲポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の、酵母宿主細胞において発現されてもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）あるいは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ，  ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌｅｅｒら，  Ｇｅｎｅ，  １０７：２８５−１９５（１９９１）；およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５−１３９（１９９０）にさらに記載されている。他の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２）に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターは、大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、構築してもよい。
【００６８】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、ＶＥＳＰＲポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２；Ｂｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４；米国特許第４，５４６，０８２号；およびＥＰ  ３２４，２７４を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたはそれ以上の制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列の構造遺伝子への融合を容易にするであろう。
【００６９】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ＋形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸，２％グルコース，１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００７０】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換されている酵母宿主細胞は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００７１】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＶＥＳＰＲポリペプチドを発現するのに使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７  （１９８８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株が含まれる。
【００７２】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列を、ウイルスゲノムより切り出してもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡るおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いてもよい。
【００７３】
哺乳動物宿主細胞において用いるのに典型的な発現ベクターを、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、および１９９１年５月１６日に提出された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている。ベクターはレトロウイルス由来であってもよい。天然シグナル配列の代わりに、そしてイニシエーターメチオニンに加え、異種性シグナル配列、例えば、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるＩＬ−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチドを添加してもよい。
【００７４】
本発明にしたがった、単離され、精製されているまたは均質なタンパク質としてのＶＥＳＰＲポリペプチドは、上述のように組換え発現系により産生してもよいし、または天然発生細胞から精製してもよい。ＶＥＳＰＲは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質に精製することが可能である。
【００７５】
ＶＥＳＰＲを産生するための１つの方法は、ＶＥＳＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換されている宿主細胞を、ＶＥＳＰＲポリペプチドの発現を促進するのに十分な条件下で培養することを含む。該受容体をその後、使用される発現系に応じ、培地または細胞抽出物から回収する。当業者に知られるように、組換えタンパク質を精製するための方法は、使用される宿主細胞および組換えタンパク質が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、変化するであろう。
【００７６】
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を使用する場合、培地をまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側鎖を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、側鎖メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、ＶＥＳＰＲポリペプチドをさらに精製してもよい。前記の精製段階のいくつかまたはすべてを多様な組み合わせで用いる方法が周知であり、そして実質的に均質な組換えタンパク質を提供するのに使用されうる。
【００７７】
発現されたＶＥＳＰＲポリペプチドをアフィニティー精製するのに、ＶＥＳＰＲに結合するセマフォリンの受容体結合ドメインを含むアフィニティーカラムを利用することが可能である。ＶＥＳＰＲポリペプチドは、慣用的技術を用いて、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に透析することによって、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムから除去してもよい。あるいは、アフィニティーカラムはＶＥＳＰＲに結合する抗体を含んでもよい。実施例２０は、本発明のＶＥＳＰＲを、ＶＥＳＰＲに対して向けられるモノクローナル抗体を生成するのに使用するための方法を記載する。
【００７８】
細菌培養において産生される組換えタンパク質を、最初に宿主細胞を破壊し、遠心分離し、不溶性ポリペプチドであれば細胞沈澱から、または可溶性ポリペプチドであれば上清流体から抽出し、その後１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことにより単離してもよい。最後に、最終精製段階に、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してもよい。微生物細胞を、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いかなる簡便な方法により破壊してもよい。
【００７９】
形質転換酵母宿主細胞は、好ましくは、精製を単純にするため、分泌ポリペプチドとしてＶＥＳＰＲを発現するよう使用される。酵母宿主細胞発酵から分泌される組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  ２９６：１７１，  １９８４）に開示されるものと類似の方法により精製してもよい。Ｕｒｄａｌらは、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２精製のための、２つの連続する逆相ＨＰＬＣ段階を記載する。
【００８０】
ＶＥＳＰＲ核酸の有用な断片には、標的ＶＥＳＰＲ  ｍＲＮＡ（センス）またはＶＥＳＰＲ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがい、ＶＥＳＰＲ  ｃＤＮＡのコード領域の断片を含む。こうした断片は一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオチドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９，  １９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，  １９８８）に記載されている。
【００８１】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、二重鎖の亢進した分解、転写または翻訳の未成熟な終結、または他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つにより、標的配列の転写または翻訳を遮断する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、ＶＥＳＰＲタンパク質の発現を遮断してもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ  ９１／０６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてこのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。こうした耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ（Ｌ−リジン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【００８２】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、いかなる遺伝子トランスファー法により、またはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入されてもよい。好ましくは、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに該アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを挿入し、その後、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで該挿入配列を含む該レトロウイルスベクターと接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるわけではないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）由来のもの、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称される二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ  ９０／０２６５６を参照されたい）が含まれる。
【００８３】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ  ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入されてもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。
【００８４】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞に導入されてもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離される。
【００８５】
上記に加え、以下の例は、特定の態様を例示するため提供され、そして本発明の範囲を限定するためではない。
【００８６】
【実施例】
実施例１
エクトロメリアセマフォリン／Ｆｃ融合タンパク質の調製
以下は、エクトロメリアセマフォリンＡ３９Ｒ／免疫グロブリン融合タンパク質（Ａ３９Ｒ／Ｆｃ）の調製を記載する。該方法は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を調製し、該ＤＮＡ構築物で細胞株をトランスフェクションし、そしてトランスフェクションされた細胞から上清を採取することを含んだ。Ａ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質は、ＶＥＳＰＲ結合特性を研究し、そしてＶＥＳＰＲを単離するため、実施例３、４、５および６に記載されるように用いた。
【００８７】
Ａ３９ＲセマフォリンをコードするＤＮＡを、ＰＣＲ技術、および配列がワクシニアウイルスのコペンハーゲン株中の公表されているＡ３９Ｒ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、エクトロメリアウイルスゲノムＤＮＡから単離し、そして増幅した。コペンハーゲン株Ａ３９Ｒ  ＤＮＡ配列は、Ｇｏｅｂｅｌ，  Ｓ．Ｊ．ら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９：２４７，  １９９０に記載されている。単離エクトロメリアＡ３９Ｒ  ＤＮＡは配列番号７に提示され、そして該ＤＮＡがコードするタンパク質は、配列番号８に提示される。上流オリゴヌクレオチドプライマーにより、Ａ３９Ｒポリペプチドのアミノ酸１５の上流にＳｐｅ１部位を導入した。下流オリゴヌクレオチドプライマーにより、エクトロメリアＡ３９Ｒの終止コドンの下流、アミノ酸３９９の後にＮｏｔ１部位を導入した。プライマー配列は以下の通りであった：
上流Ｓｐｅ１プライマー：
【００８８】
【化１】
0003621883.tif 000002
下流Ｎｏｔ１プライマー：
【００８９】
【化２】
0003621883.tif 000003
Ｂａｕｍら，  Ｃｉｒ．  Ｓｈ．  ４４：３０（１９９４）に記載されるような、免疫グロブリンの突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）ヒトＦｃ領域を含むＢｇｌ  ＩＩからＮｓｌ  Ｉの制限断片を、ネズミＩＬ−７シグナルペプチドおよび米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるようなＦＬＡＧＴＭオクタペプチドを含む発現ベクター（ｐＤＣ３０４）内に連結した。その後、エクトロメリアＡ３９Ｒのアミノ酸１５−３９９をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡを、突然変異タンパク質ヒトＦｃ領域、ネズミＩＬ−７シグナルペプチドおよびＦＬＡＧＴＭペプチドを含む発現ベクター内に二方向連結で連結した。生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡに（ｐｓｖ３ｎｅｏの共トランスフェクションと共に）トランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地で７日間培養した後、０．２％アジ化物溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通し上清を濾過した。その後、およそ１ｌの培養上清を、１０  ｍｌ／分で、４．６  ｘ  １００  ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用い、ＢｉｏＣａｄ  プロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系を通過させた。プロテインＡカラムは、上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清中の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。カラムを３０  ｍｌのＰＢＳ溶液で洗浄し、そして結合している融合タンパク質をｐＨ  ３．０に調整したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出させた。溶出した精製融合タンパク質は、溶出の際、ｐＨ  ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用い、中和した。
実施例２
エクトロメリアセマフォリン／ポリＨｉｓ融合タンパク質の調製
以下は、エクトロメリアＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質（Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ）の調製を記載する。該方法は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を調製し、該ＤＮＡ構築物で細胞株をトランスフェクションし、そしてトランスフェクションされた細胞から上清を採取することを含んだ。
【００９０】
エクトロメリアＡ３９Ｒ（Ａ３９Ｒ  ＯＲＦ、配列番号８のアミノ酸１−３９９）をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ技術および合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、エクトロメリアウイルスゲノムＤＮＡから単離し、そして増幅した。該プライマーは、５’端にＮｏｔ  １部位および３’端に精製過程に用いるモチーフＧｌｙ−Ｓｅｒ−６ｘＨｉｓを添加した。該プライマーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−６ｘＨｉｓモチーフの後に、インフレーム終止コドンおよびＢｇｌ  ２部位を添加した。ＰＣＲ産物を切断し、ｐＤＣ４０９発現ベクター（ＭｃＭａｈｏｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）にクローンした。
【００９１】
生じたＤＮＡ構築物を、サル細胞株ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）に一過性にトランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地で７日間培養した後、細胞上清を採取し、そして０．２％アジ化ナトリウム溶液を上清に添加した。０．２２μｍフィルターを通し上清を濾過し、調製スケール濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；マサチューセッツ州ベッドフォード）で１０倍に濃縮し、そして、ニッケルＮＴＡスーパーフローセルフパック樹脂カラム（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州サンタクラリタ）を備えたＢｉｏＣａｄ  ＨＰＬＣタンパク質精製上で精製した。上清がカラムを通過した後、カラムを緩衝液Ａ（２０  ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ  ７．４；３００  ｍＭ  ＮａＣｌ；５０  ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。その後、勾配溶出技術を用い、結合しているタンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質を含む分画を集め、４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上で解析した。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質を含むピークをプールし、２倍に濃縮し、そしてその後ＰＢＳ中で透析した。生じたＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質をその後、０．２２μｍ無菌フィルターを通し濾過した。
実施例３
Ａ３９Ｒに対する結合に関する細胞株のスクリーニング
実施例１に記載されるように調製されたＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を用い、標準的フローサイトメトリー方法論にしたがい、定量的結合研究を用い、結合に関し細胞株をスクリーニングした。スクリーニングされる各細胞株に関し、該方法は、およそ１００，０００の細胞をインキュベーションし、ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５％正常ヤギ血清および５％ウサギ血清で１時間ブロッキングすることを含んだ。その後、ブロッキングされた細胞をＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質５μｇ／ｍｌと、ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ、５％ヤギ血清および５％ウサギ血清中でインキュベーションした。インキュベーション後、試料をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ）で２回洗浄し、そしてその後、マウス抗ヒトＦｃ／ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入）およびＳＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入したストレプトアビジン−フィコエリトリン）で処理した。この処理は、抗ヒトＦｃ／ビオチンをすべての結合しているＡ３９Ｒ／Ｆｃに結合させ、そしてＳＡＰＥを抗ヒトＦｃ／ビオチンに結合させ、細胞に結合しているＡ３９Ｒ／Ｆｃ上に蛍光同定標識を生じさせる。蛍光検出フローサイトメトリーを用い、すべての結合しているタンパク質に関し細胞を解析した。結果により、Ａ３９Ｒセマフォリンは、ヒトＮＫ細胞、ネズミ脾臓Ｂ細胞、ヒトＰＢ  Ｔ細胞、ヒトＴ、Ｂ、赤芽球、リンパ芽球および骨髄前駆細胞、繊維芽細胞および上皮細胞系譜によく結合することが示された。表１は、フローサイトメトリー研究の結果を列挙する。「＋」は細胞表面およびＡ３９Ｒの間に結合が検出されたことを示す。「−」は細胞表面およびＡ３９Ｒの間に結合が検出されなかったことを示す。
【００９２】
【表１】
0003621883.tif 000004
【００９３】
実施例４
推定上のセマフォリン受容体の同定
Ａ３９Ｒに対する結合に関し陽性に試験されたＣＢ２３細胞（ヒト臍帯血Ｂ細胞株）およびヒトＰＢ  Ｔ細胞を、推定上の受容体の発現に関し、そしていくらかの受容体が膜結合分子、可溶性分子または両方として発現しているか決定するため、試験した。概して、該解析は、ＣＢ２３およびヒトＰＢ  Ｔ細胞表面を放射標識し、採取し、そして細胞上清および溶解物をＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質で処理し、すべての推定上の受容体を沈澱させ、そしてその後、電気泳動ゲル上で免疫沈降物を視覚化することを含んだ。
【００９４】
特に、該方法は、Ｂｅｎｊａｍｉｎら，  Ｂｌｏｏｄ  ７５：２０１７−２０２３（１９９０）に記載されるように、まず、［１２５Ｉ］で、およそ１  ｘ  １０７のＣＢ２３またはＰＢ  Ｔ細胞を放射標識することを含んだ。培養細胞上清を採取し、そして１４，０００  ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により、清澄にした。細胞溶解物は、プロテアーゼ阻害剤、フェニルメチルスルホニルフロリド、ペプスタチン−Ａ、およびロイペプチンを含む１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含む１  ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中で、細胞を氷上で３０分間インキュベーションすることにより生成した。溶解物を１４，０００  ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により清澄にした。溶解物および／または上清に存在するすべての受容体を沈澱させるため，細胞上清または溶解物２００μｌを実施例１に記載されるように調製したＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質２μｇとインキュベーションした。インキュベーションは４℃で穏やかに揺らしながら１時間行った。同様にＦｃタンパク質コントロール試料を調製し、そしてインキュベーションした。インキュベーション後、プロテインＡセファロースビーズ（＃１７−０７８０−０１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を溶解物および上清に添加し、そして混合物を４℃で穏やかに揺らしながら１時間インキュベーションした。ＰＢＳ  １％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００溶液で、ビーズをよく洗浄した。結合しているタンパク質を溶出させ、そしてＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析した。タンパク質バンドをオートラジオグラフィーで視覚化し、そして単一のおよそ２００  ｋＤａのバンドが、Ａ３９Ｒ／Ｆｃに結合するが、コントロールＦｃタンパク質には結合しないことを見出した。セマフォリン受容体は細胞溶解物および細胞上清に存在し、膜結合タンパク質としての、そして分泌される可溶性タンパク質としてのその発現が確認された。
実施例５
セマフォリン受容体の単離および配列決定
実施例１に記載されるように調製されたＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を用い、ヒトセマフォリン受容体ポリペプチドを単離し、そして単離ポリペプチド精製のための方法を確認した。ＣＢ２３細胞ペレットを、ホモジェナイズ緩衝液（１０  ｍＭリン酸、３０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）中にＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンＡを各々１  ｍＭ、１０μｇ／ｍｌ  ＡＰＭＳＦ、および１  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むプロテアーゼ阻害剤溶液に懸濁することにより、セマフォリン受容体を単離した。細胞をダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジェナイズし、そしてホモジェナイズ緩衝液中の４１％ショ糖溶液に上層し、そして２５，０００  ｒｐｍ、４℃で４５分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ−２８ローターで回転させ落とした。中間相を集め、そして冷たいホモジェナイズ緩衝液で希釈し、ダウンスし、そして回転させた。生じた透明な膜ペレットを−８０℃で貯蔵した。
【００９５】
充填細胞２４０  ｍｌから調製した膜ペレットを、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、上記に同定されるプロテアーゼ阻害剤、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、およびＭｃＣｌ２塩０．１  ｍＭの水性溶液（緩衝液Ａ）１００  ｍｌと合わせた。懸濁ペレットをダウンスし、そしてＳＷ−２８ローターで、２５，０００  ｒｐｍ、４℃で３０分間回転させた。上清を１００  ｍｌコムギ胚（ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ）凝集素カラムに入れ、そして１０カラム体積の緩衝液Ａを用い１  ｍｌ／分の速度で溶出させた。カラムに特異的に結合しているタンパク質をその後、０．２Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液Ａで溶出させた。
【００９６】
タンパク質に関し陽性に試験された分画をプールし、そしてＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質１００μｇと４℃で１時間インキュベーションした。インキュベーションした混合物をセファロースカラムに通し、特異的に結合しない成分を除去し、そしてその後、プロテインＡ／セファロース固体支持体の０．５  ｍｌカラムに通過させた。プロテインＡ／セファロース固体支持体を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ  ２０カラム体積で洗浄し、その後、ＰＢＳで洗浄し、いかなる非結合成分も洗い落とした。その後、ｐＨ  ３．０の５０  ｍＭクエン酸の０．３５  ｍｌ分画で、段階的方式で、プロテインＡ／セファロースカラム上に保持されているタンパク質を溶出した。タンパク質に関し陽性に試験された分画を合わせ、そして１０  ｋＤ  ＭＷＣＯ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置を用い、５０μｌに濃縮した。生じた濃縮試料中のタンパク質を還元し、そしてその後、標準的ＤＴＴおよびヨード酢酸法を用い、アルキル化した。アルキル化タンパク質をその後、８％ゲル上で電気泳動した。ゲル上のタンパク質を、５％酢酸を含む５０％  ＭｅＯＨ中のクーマシーＧで視覚化し、そしてその後、５０％  ＭｅＯＨ中で脱染した。
【００９７】
タンパク質標準に比較することにより位置決定された、およそ２００  ｋＤバンドを、かみそりで切り出し、そして１００  ｍＭ炭酸アンモニウム中で一晩洗浄した。ゲル切片を乾燥するまで高速蒸発させ、そして１００  ｍＭ炭酸アンモニウム中のトリプシンの１：１０溶液を乾燥スライドに添加した。スライドを３７℃で１６時間インキュベーションし、そしてその後切片中のタンパク質を、各抽出と共に３０分間インキュベーションしながら、５％ギ酸を含む５０％アセトニトリルで３回抽出した。
【００９８】
トリプシン消化ペプチド断片を凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸５０μｌに溶き、そしてＣ−１８逆相パッキングを充填した５００μ  ｉｄ（内径）  ｘ  ２５  ｃｍキャピラリーカラム上でＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。ＨＰＬＣ液相は、５分後１０％、１０５分後８５％のアセトニトリル／水勾配であった。溶出タンパク質は２１５  ｎｍで検出した。各タンパク質が溶出すると、別個の分画に集め、そして分画中のペプチドのＮ末端配列解析を、製造者の指示にしたがい、４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ配列決定装置上で行った。
【００９９】
上述のように得られたＲＰ−ＨＰＬＣ分画を、真空遠心機で乾燥し、０．５％酢酸を含む５０％メタノール６μｌに分画中のペプチドを溶解した。各ペプチド溶液２μｌをナノスプレーチップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、デンマーク、オーゼンセ）に装填した。データは、ナノスプレー供給源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７００  三重四重極質量分析計（カリフォルニア州サンホセ）で得た。質量スペクトルは、単位分解能で得た。直列質量分析には、第一の四重極を３−４Ｄａの幅を通過するのに十分な分解能で作動させ、そして第三の四重極を単位分解能（ｕｎｉｔ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で作動させた。衝突ガスは、４  ｍトールの圧で供給した。標準的エステル化法を用い、メチルエステル化を行った。
【０１００】
トリプシン生成ペプチドの直列質量分析解析により、精製タンパク質の単離部分に関するアミノ酸配列情報が提供された。直列質量スペクトルデータを、部分的ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム検索ツール（Ｅｎｇ，  Ｊ．Ｋ．ら，  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  １９９４）を用い、コンピューターが補助する非重複性タンパク質データベースおよびＥＳＴデータベースのスクリーニングで用いた。配列番号２のアミノ酸４２１−４２８に対応するペプチド照会（ｑｕｅｒｙ）配列ＧｌｕＧｌｕＴｈｒＰｒｏＶａｌＰｈｅＴｙｒＬｙｓ、およびアミノ酸４３６−４４５に対応するＡｓｎＩｌｅＴｙｒＩｌｅＴｙｒＬｅｕＴｈｒＡｌａＧｌｙＬｙｓは、ＥＳＴ第２４８５３４号（寄託番号Ｎ７８２２０号）が、照会ペプチド配列に対し１００％同一性を有する含有ペプチド配列を含むと同定した。アミノ酸３８８−４０１に対応するＴｈｒＶａｌＬｅｕＰｈｅＬｅｕＧｌｙＴｈｒＧｌｙＡｓｐＧｌｙＧｌｎＬｅｕＬｅｕＬｙｓは、ＥＳＴ第Ｒ０８９４６号が、照会に対し１００％同一性を含むと同定した。
【０１０１】
ＥＳＴ  ２４８５３４の部分および精製タンパク質の３つのペプチド断片の間の１００％同一性は、ＥＳＴ  ２４８５３４内に含まれるｃＤＮＡは、精製タンパク質のコード領域に対するヌクレオチド配列の部分を代表することを、強く示唆した。セマフォリン受容体ｃＤＮＡの供給源は、ファージライブラリースクリーニング法およびＥＳＴ  ２４８５３４に基づくＰＣＲプライマーを用い、同定した。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドプライマーは、以下のヌクレオチド配列を有した：
0003621883.tif 000005
ヒト組織ｃＤＮＡファージライブラリーの一団をＰＣＲ反応のテンプレートとして用い、ＰＣＲ単離および増幅方法論を実行した。ＰＣＲ反応混合物は、最終反応体積３０μｌ中に、ファージライブラリーストック１μｌ、０．３μＭの最終濃度のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、１  ｘ  ＰＣ２緩衝液（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）各０．２  ｍＭ、１６：１混合Ｋｌｅｎ−Ｔａｑ／Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｋｌｅｎ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｉｎｃ．およびＶｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）０．２μｌを含んだ。ＰＣＲ反応サイクルは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤのＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ９６を用い、９８℃５分間での１サイクル；９８℃４５秒間での３０サイクル；６８℃４５秒間での３０サイクル；７２℃４５秒間での３０サイクル；および７２℃５分間での１サイクルを含んだ。いくつかのライブラリー中のｃＤＮＡが、電気泳動ＰＣＲ産物中の適切なサイズのＤＮＡバンドの出現に基づき、精製ＶＥＳＰＲタンパク質をコードするＤＮＡを含むとして、陽性に同定された。
【０１０３】
ファージライブラリーの２つ、ヒト包皮繊維芽細胞およびヒト真皮繊維芽細胞を、さらなる解析のため選択した。ライブラリーを確立された方法にしたがって蒔き、そしてＥＳＴ  ２４８５３４をテンプレートとして用いたＰＣＲ増幅産物由来の放射標識ランダムプライマープローブで探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。増幅産物を得るために用いたＰＣＲ条件は、上述の通りであり、そしてプローブはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤのＰｒｉｍｅ−ＩＴ  ＩＩランダムプライマー標識キットを用い、生成した。およそ１  ｘ  １０６  ｃｐｍ／ｍｌの精製プローブを用い、ナイロン膜フィルター上のヒト包皮ファージライブラリーを、１０  ｘ  デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）溶液、ｐＨ  ７．５の５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ピロリン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、および２００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション緩衝液中で、６３℃で一晩探査した。探査後、探査した膜を、６３℃で、一度、６  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間、一度、２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間、一度、１  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間、そして一度、０．１  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間、洗浄した。探査しそして洗浄したフィルターをＸ−ｏｍａｔ  ＡＲ  Ｘ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｒｐ．）に一晩曝露した。４つのオーバーラップしているｃＤＮＡを同定した。オーバーラップしているＤＮＡを、配列決定されたトリプシン消化生成タンパク質断片と共に用い、配列番号１に示されるようなＶＥＳＰＲのコード配列および配列番号２に提示されるアミノ酸配列を完了し、そして確認した。
実施例６
Ａ３９Ｒセマフォリンに対するモノクローナル抗体
本実施例は、Ａ３９Ｒセマフォリンに対する抗体を調製するための方法を例示する。精製Ａ３９Ｒ／Ｆｃを上の実施例１に記載されるように調製した。精製タンパク質を用い、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるようにＡ３９Ｒセマフォリンに対する抗体を生成した。簡潔には、マウスをＡ３９Ｒ／Ｆｃで１０μｇで、０、２および６週に免疫した。初回免疫は、Ｖａｘｃｅｌｌ，  Ｉｎｃ．のＴＩＴＥＲＭＡＸアジュバントと共に調製し、そして続く免疫は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と共に調製した。１１週目に、ＰＢＳ中のＡ３９Ｒ／Ｆｃ  ３−４μｇでマウスをＩＶ追加免疫した。ＩＶ追加免疫の３日後、脾臓細胞を採取し、そして５０％水性ＰＥＧ  １５００溶液を用い、Ａｇ８．６５３骨髄腫融合パートナーと融合させた。ハイブリドーマ上清を、Ａ３９Ｒ／Ｆｃおよび不適切なＦｃタンパク質に対するドットブロットアッセイにより、Ａ３９Ｒ抗体に関しスクリーニングした。
実施例７
セマフォリン受容体を発現している組織に関するノーザンブロット解析
以下は、本発明のＶＥＳＰＲポリペプチドを発現する組織および細胞種を同定するため行われたノーザンブロット実験を記載する。該結果は、フローサイトメトリー解析およびＡ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質を用いて得られた細胞結合結果を確認する。
【０１０４】
実施例５に記載されるように、ＥＳＴデータベース検索の結果、配列番号２のＶＥＳＰＲの部分的クローンと考えられるＥＳＴ（ＥＳＴ  ２４８５３４）が発見された。ＰＣＲ技術およびＥＳＴ  ２４８５３４のヌクレオチド１−３７２に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用い、リボプローブテンプレートを生成した。ＥＳＴ  ２４８５３４のヌクレオチド１−３７２を含む上流および下流プライマーは以下の配列を有した：
0003621883.tif 000006
下線部分は、Ｔ７部位である。
【０１０５】
２つのプライマーを用い、リボプローブの生成に用いるため、ＥＳＴ２４８５３４からＰＣＲ産物を単離し、そして増幅した。ＡｍｂｉｏｎのＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ  ＳＰ６／Ｔ７キットを用い、３μｌのＲＮＡｓｅ不含水、２μｌの１０  ｘ転写緩衝液、１０  ｍＭ  ｄＡＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ各１μｌ、５μｌの５’／３’  ＥＳＴ  ２４８５３４  ＰＣＲ産物、５μｌのＡｍｅｒｓｈａｍ［α３２Ｐ］ＵＴＰ  １０  ｍＣｉ／ｍｌ、２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを室温で合わせることにより、リボプローブを生成した。組み合わせたものを微量遠心分離し簡潔に回転させ、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、１μｌのＤＮＡｓｅを混合物に添加し、そして３７℃で１５分間反応させた。反応産物をＧ−２５パッキング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の２カラム体積に通過させた。リボプローブ１μｌをシンチレーションカウンターで１分間カウントし、ｃｐｍ／ｍｌを測定した。
【０１０６】
多様な細胞株由来のポリアデニル化ＲＮＡを、１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル上に分画し、そして該ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）上にブロットすることにより、ノーザンブロットを生成した。Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載されるような標準的ノーザンブロット生成法を用いた。総ＲＮＡ多数組織ノーザンブロットは、商業的に購入した（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンレアンドロ、カタログ番号０２１００１、０２１００２、０２１００３）。
【０１０７】
ノーザンブロットを、５０％ホルムアミドハイブリダイゼーション溶液（３０  ｍｌの２０  ｘ  ＳＳＣ、２  ｍｌの１００  ｘ  デンハルト試薬、１  ｍｌの１０  ｍｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、５０  ｍｌの１００％ホルムアミドおよび２０  ｍｌの１０％  ＳＤＳ）中でプレハイブリダイゼーションした。総ＲＮＡブロットは４２℃で４時間プレハイブリダイゼーションし、そしてポリＡ＋  ＲＮＡブロットは６３℃で４時間プレハイブリダイゼーションした。リボプローブを、１０６  ｃｐｍ／ｍｌのカウントで、清浄なハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液と同じ）に添加した。プレハイブリダイゼーション溶液をブロットから除去し、そしてハイブリダイゼーション溶液およびリボプローブをブロットに添加した。ハイブリダイゼーションを一晩、穏やかに震蕩しながら進めた。総ＲＮＡブロットは６３℃でハイブリダイズさせ、そしてポリＡ＋  ＲＮＡブロットは６３℃でハイブリダイズさせた。
【０１０８】
探査した総ＲＮＡブロットを、４２℃で、一度、０．０５％  ＳＤＳを含む２  ｘ  ＳＳＣで３０分間、そして５５℃で、一度、０．０５％  ＳＤＳを含む２  ｘ  ＳＳＣで３０分間；６３℃で、二度、０．１％  ＳＤＳを含む０．１  ｘ  ＳＳＣで３０分間；三度、０．１％  ＳＤＳを含む０．１  ｘ  ＳＳＣで３０分間、洗浄し、そしてその後Ｘ線フィルムに曝露した。ポリＡ＋ブロットを、６３℃で、一度、０．０５％  ＳＤＳを含む２  ｘ  ＳＳＣ溶液で３０分間、そして一度、０．１％  ＳＤＳを含む１  ｘ  ＳＳＣで３０分間、洗浄し、そしてその後Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１０９】
ノーザンブロットを探査した結果および陽性結合プローブに関する生じたＸ線フィルムの視覚化により、ＶＥＳＰＲがフローサイトメトリー実験において陽性結合が示されたものと同一の細胞に発現されていることが確認される。ハイブリダイズしているＲＮＡはＭＰ−１、ＨＦＦおよびＣＢ２３細胞で検出された。陽性ＲＮＡを示した初代組織には、心臓、脳、肺、脾臓および胎盤が含まれた。ＲＡＪＩ細胞にはＲＮＡは検出されなかった。
実施例８
ＡＨＶセマフォリンＦｃ融合タンパク質の生成
以下は、ＡＨＶセマフォリン／免疫グロブリン融合タンパク質（ＡＨＶセマ／Ｆｃ）を調製することを記載する。該方法は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を調製し、該ＤＮＡ構築物で細胞株をトランスフェクションし、そしてトランスフェクションされた細胞から上清を採取することを含んだ。
【０１１０】
ＡＨＶ−セマをコードするＤＮＡは、Ｅｎｓｓｅｒら，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒ．  ７６：１０６３−１０６７，  １９９５に記載される。アルセラフィン・ヘルペスウイルスＤＮＡ株ＷＣ１１（Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，  Ｗ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  １８８：１１６７−１１６９，  １９６０）から、ＰＣＲ技術、および配列が公表されているＡＨＶ−セマ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＡＨＶ−セマアミノ酸７０−６５３をコードするＤＮＡを単離し、そして増幅した。上流オリゴヌクレオチドプライマーにより、Ｓｐｅ  １部位を導入した。下流オリゴヌクレオチドプライマーにより、終止コドンの下流にＮｏｔ  １部位を導入した。可溶性ＡＨＶセマを単離するのに用いた一般的な方法は、Ｓｐｒｉｇｇｓら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７０：５５５７（１９９６）に記載されている。
【０１１１】
Ｇｏｏｄｗｉｎら，  Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−４５６，  １９９３に記載されるような免疫グロブリンの突然変異タンパク質Ｆｃ領域を含む制限断片を、ネズミＩＬ−７シグナルペプチドおよび米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるようなＦＬＡＧＴＭオクタペプチドを含む発現ベクター（ｐＤＣ４０９）内に連結した。その後、コードする、ＰＣＲ増幅ＡＨＶセマＤＮＡを、突然変異タンパク質ヒトＦｃ領域、ネズミＩＬ−７シグナルペプチドおよびＦＬＡＧＴＭペプチドを含む発現ベクター内に二方向連結で連結した。生じたＤＮＡ構築物をサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡに（ｐＳＶ３ｎｅｏの共トランスフェクションと共に）トランスフェクションした。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地で７日間培養した後、０．２％アジ化物溶液を上清に添加し、そして０．２２μｍフィルターを通し上清を濾過した。その後、およそ１ｌの培養上清を、１０  ｍｌ／分で、４．６  ｘ  １００  ｍｍプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａ）を用い、ＢｉｏＣａｄ  プロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製系を通過させた。プロテインＡカラムは、上清中の融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定し、そして上清中の他の構成要素がカラムを通過するのを可能にする。カラムを３０  ｍｌのＰＢＳ溶液で洗浄し、そして結合している融合タンパク質をｐＨ  ３．０に調整したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出させた。溶出した精製融合タンパク質は、溶出の際、ｐＨ  ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を用い、中和した。
実施例９
組換えセマフォリン受容体の発現
実施例５に記載されるように精製されたタンパク質のセマフォリン受容体（ＶＥＳＰＲ）アミノ酸配列、並びに、やはり実施例５に記載されるような、ＥＳＴデータベース検索から得られた情報および放射標識プローブでのハイブリダイゼーション方法論を用いて得られたｃＤＮＡを用い、ｃＤＮＡを生成し、そして該ｃＤＮＡで細胞をトランスフェクションし、組換えＶＥＳＰＲポリペプチドの発現を可能にする。
【０１１２】
ｐＤＣ４０６由来のＤＣ４０９発現ベクター中のｃＤＮＡを、標準的技術（ＭｃＭａｈｏｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）を用いＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションする。より詳細には、ＣＶ１  ＥＢＮＡ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補ったダルベッコの最小必須培地（培地）１０  ｍｌ中に、１０  ｃｍプレート当たり２  ｘ  １０６細胞の密度で蒔く。細胞を３７℃で一晩付着させる。６６．７μＭクロロキンおよびＶＥＳＰＲをコードするｃＤＮＡ  ５μｇを含むＤＮＡ混合物を含む培地１．５  ｍｌで、培地を置換する。１７５μｌおよび２５μｌのＤＥＡＥデキストランを含む培地を細胞に添加する。細胞およびｃＤＮＡを３７℃で５時間インキュベーションする。ｃＤＮＡ混合物を除去し、そして１０％  ＤＭＳＯを含む新鮮な培地１  ｍｌで、細胞に２．５分間ショックを与える。新鮮な培地で培地を置換し、そして細胞を少なくとも３日間増殖させる。
【０１１３】
ＶＥＳＰＲの可溶性型を回収するため、可溶性型を含む上清を集め、そしてＨＰＬＣ技術またはアフィニティークロマトグラフィー技術を用い、ＶＥＳＰＲタンパク質を回収する。ＶＥＳＰＲの膜結合している型を回収するため、トランスフェクション細胞を採取し、１％  パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、そしてその損なわれていない型で用いる。
実施例１０
ＶＥＳＰＲ結合研究
本発明の受容体ポリペプチドの結合特性を調べるため、膜結合ＶＥＳＰＲ細胞外ドメインを発現している細胞を、Ｇｏｏｄｗｉｎら，  Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−４５６（１９９３）およびＳｐｒｉｇｇｓら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５５５７（１９９６）に記載されるスライド結合アッセイに供することにより、結合研究を行った。
【０１１４】
ｐＤＣ４０６（ＭｃＭａｈｏｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）由来であるが、単一のＢｇｌ  ２を有するｐＤＣ４０９発現ベクターを、クローニング法のため、選択した。アミノ酸１９−１１００をコードするＶＥＳＰＲ  ｃＤＮＡを、Ｓａｌ  １（５’）およびＮｏｔ  １（３’）部位を通じ、ｐＤＣ４０９発現ベクターにサブクローンし、ＤＮＡ構築物を形成した。
【０１１５】
ｐＤＣ４０９中の２μｇのＶＥＳＰＲ  ｃＤＮＡ（アミノ酸１９−１１００をコードする）と共にＤＥＡＥ／デキストランを介し、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションした（Ｇｉｒｉら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：２８２２，  １９９４）。トランスフェクション細胞を３日間培養し、そしてＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞単層を、Ａ３９Ｒ／Ｆｃ、ＡＨＶセマ／Ｆｃ、またはコントロールＦｃタンパク質１μｇ／ｍｌとインキュベーションした。その後、インキュベーション細胞を洗浄し、そして１２５Ｉ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）とインキュベーションした。よく洗浄した後、細胞を固定し、Ｇｅａｒｉｎｇら，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：３６６７−３６７６（１９８９）に記載されるように写真感光乳剤に浸し、そして現像した。陽性結合は、Ｆｃタンパク質に結合しているＶＥＳＰＲを発現している細胞を覆う、露出されたまたは黒ずんだ銀粒の存在により、決定した。
実施例１１
フローサイトメトリーおよび阻害結合研究
以下は、Ａ３９Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質（実施例１）およびＡＨＶセマ／Ｆｃ融合タンパク質（実施例９）に対する結合に関するＣＢ２３細胞のフローサイトメトリー解析を記載する。やはり以下に記載されるのは、実施例２に記載されるように調製されたＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質の過剰量でのＡＨＶセマおよびＡ３９Ｒ結合の阻害を測定することに向けられた研究である。
【０１１６】
フローサイトメトリー解析は、まず約１  ｘ  １０６のＣＢ２３細胞を、３％正常ヤギ血清および３％正常ウサギ血清を含むＦＡＣＳ緩衝液中で、氷上で３０分間インキュベーションし、非特異的結合をブロッキングすることにより、行った。Ａ３９Ｒ／Ｆｃ、ＡＨＶセマ／ＦｃおよびコントロールＦｃタンパク質の一部を多様な濃度で添加し、そしてインキュベーションを３０分間続けた。細胞を洗浄し、そしてその後、ＦＡＣＳ緩衝液中のフィコエリトリン結合Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧとインキュベーションした。細胞を洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォードのＦＡＣＳｃａｎ上で解析した。結果は、ＡＨＶセマフォリンおよびＡ３９Ｒセマフォリンの陽性結合を示した。
【０１１７】
結合阻害研究は、約１  ｘ  １０６のＣＢ２３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で、氷上で３０分間インキュベーションすることにより、行った。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓおよびコントロールＨｉｓタンパク質を多様な濃度で異なる試料に添加し、そしてインキュベーションをもう３０分間続けた。その後、Ａ３９Ｒ／ＦｃまたはＡＨＶセマ／Ｆｃを多様な濃度でインキュベーション細胞に添加し、そしてインキュベーションをもう３０分間続けた。細胞を洗浄し、そしてその後、ＦＡＣＳ緩衝液中のフィコエリトリン結合Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧとインキュベーションした。細胞を再び洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ上で解析した。結果は、Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓを用い、Ａ３９ＲおよびＡＨＶセマが完全に阻害されるが、異種性Ｈｉｓ含有タンパク質では阻害されないことを立証した。
実施例１２
Ａ３９ＲセマフォリンでのヒトＢ細胞凝集
Ａ３９Ｒセマフォリンに対するヒトＢ細胞反応を調べるため、Ｓｐｒｉｇｇｓら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：１５４３（１９９２）に記載されるように、ヒト扁桃腺Ｂ細胞を精製した。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質を実施例２に記載されるように調製した。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質の溶液は、最終Ａ３９Ｒ濃度が１μｇ／ｍｌになるよう調製し、そしてＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質溶液を、約１０５の精製Ｂ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中でインキュベーションした。インキュベーションを約２４時間続けると、細胞凝集が生じた。融合タンパク質を培養に添加する前に、実施例６に記載されるように調製された、Ａ３９Ｒに対するモノクローナル抗体の１０倍モル過剰量を融合タンパク質調製に添加すると、細胞凝集は遮断された。さらに、Ａ３９Ｒセマフォリンを、培養に添加する前に、熱不活化すると、凝集は遮断された。
【０１１８】
本研究は、ＶＥＳＰＲがＢ細胞上に発現され、そしてＡ３９ＲおよびＶＥＳＰＲの間の相互作用がＢ細胞凝集を生じることを確認する。Ｂ細胞凝集は、Ｂ細胞の活性化を示す。活性化Ｂ細胞は、サイトカインを分泌し、抗体を産生し、または抗原提示細胞になることが知られる。
実施例１３
Ａ３９Ｒセマフォリンでのマウス樹状細胞およびマクロファージ凝集
Ａ３９Ｒに対する樹状細胞およびマクロファージ反応を調べるため、マウス細胞培養をＡ３９Ｒセマフォリンと接触させ、そして該組み合わせの影響を観察した。マクロファージを含むマウス樹状細胞培養は、Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１９５３（１９９６）に記載されるように、マウスをＦｌｔ−３で免疫し、そして細胞を単離しそして精製することにより、得た。
【０１１９】
簡潔には、メスＣ５７Ｂｌ／６マウスに、連続９−１０日間、ＰＢＳ  １００μｌ中のＦｌｔ３Ｌ  １０μｇおよびマウス血清アルブミン１μｇの溶液を、毎日一度注射した。免疫後、ＮＨ２Ｃｌの存在下で、すりガラスのスライドの間で脾臓組織を破壊し、赤血球を枯渇させることにより、脾臓の単一細胞懸濁物を調製した。残存細胞を、Ｔｈｙ−１、Ｂ２２０、ＮＫ１．１、およびＴＥＲ１１９に対するｍＡｂとインキュベーションし、そしてその後、１０％ウサギ補体とインキュベーションした。その後、インキュベーション細胞を洗浄し、そして抗免疫グロブリン（Ｉｇ）被覆磁気ビーズを用い、残ったｍＡｂ被覆細胞を除去した。残存濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）細胞を培養し、または多様な細胞集団に関し分類した。
【０１２０】
分類のため選択した細胞を、Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１９５３−１９６２，  １９９６に記載されるように、抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＣＤ１１ｂで染色し、そしてＣおよびＤ／Ｅ集団に関し分類した。
【０１２１】
Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質を実施例２に記載されるように調製した。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質溶液は、最終Ａ３９Ｒ濃度１μｇ／ｍｌで、約１０５の分類または枯渇マウス細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中でインキュベーションした。４−６時間以内に、細胞は凝集し始めた。融合タンパク質をマウス細胞培養に添加する前に、実施例６に記載されるように調製された、Ａ３９Ｒに対するモノクローナル抗体の１０倍モル過剰量をＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質調製に添加すると、凝集は遮断された。
【０１２２】
本研究は、ＶＥＳＰＲが樹状細胞およびマクロファージ上に発現され、そしてＡ３９ＲおよびＶＥＳＰＲの間の相互作用が樹状細胞およびマクロファージ凝集を生じることを確認する。
実施例１４
Ａ３９ＲセマフォリンはＣＤ６９活性化抗原を上方制御する
培養樹状細胞に対するＡ３９Ｒセマフォリンの影響を調べるため、マウスに９日間、毎日Ｆｌｔ３−Ｌ調製を注射した。マウス樹状細胞を採取し、そしてその後、１０％  ＦＢＳおよび２０  ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で５日間培養した。
【０１２３】
５日目、Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質１μｇ／ｍｌを培養に添加した。６日目、細胞を診断抗体で染色した。診断抗体染色実験の結果により、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞（樹状細胞）が発現するＣＤ６９活性化抗原量が増加していることが示され、したがって、Ａ３９Ｒセマフォリンおよびその受容体の相互作用がＣＤ６９発現を上方制御することが立証された。
【０１２４】
融合タンパク質が熱で不活性化されると、融合タンパク質はＣＤ６９抗原に対し、影響を持たなかった。非染色および染色細胞の間の平均蛍光強度の典型的な変化は、およそ５００チャンネルないし２５００チャンネルの間だった。再び、これらの結果は、細胞活性化の一過性でそして初期の発現マーカーである、ＣＤ６９活性化抗原の制御に対する、Ａ３９Ｒセマフォリンおよびその膜結合受容体の間の相互作用の有意な影響を立証する。
実施例１５
ＩＬ−１２産生におけるＡ３９Ｒの影響の評価
マウス脾臓細胞からのＩＬ−１２の産生におけるＡ３９Ｒの役割を研究するため、実施例１３に記載されるように、マウスをｆｌｔ３−Ｌで免疫し、そして樹状細胞を生成し、採取しそして精製した。
【０１２５】
およそ５  ｘ  １０５細胞／０．５  ｍｌの精製された未分類樹状細胞を、以下のもう１つの存在下で修飾ＤＭＥＭ培地中でインキュベーションした（１  ｘ  １０６／ｍｌで５００μｌ）：２０  ｎｇ／ｍｌ  ｍｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ、ワシントン州シアトル）、２０  ｎｇ／ｍｌ  γ−ＩＦＮ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチューセッツ州ボストン）、１０μｇ／ｍｌ  ＳＡＣ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラホヤ）。各細胞調製をさらに、１μｇ／ｍｌのＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質単独で、あるいは１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのｍｕＣＤ４０Ｌ三量体（Ｉｍｍｕｎｅｘ、ワシントン州シアトル）と組み合わせて処理した。培養は、加湿３７℃、空気中の１０％  ＣＯ２中で、１６−１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、培養細胞の各群の生存率を測定し、そして上清を集め、そしてＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチューセッツ州ボストン）を用い、ｍｕＩＬ１２（Ｐ７０）に関しアッセイした。組換えサイトカインで構築した標準曲線を参考にし、ｍｕＩＬ１２レベルを計算した。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡ試験により、特に、Ａ３９Ｒはその受容体と相互作用し、未分類マウス樹状細胞からのＩＬ−１２の産生においてインターフェロンおよびＳＡＣと相乗作用することが立証された。このｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１２誘導はナチュラルキラー細胞活性化およびガンマインターフェロン産生を促進し、そしてガンマインターフェロン感受性サイトカインを上方制御するのに寄与する。
実施例１６
単球上のＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８６の制御に対するＡ３９Ｒの影響の試験
以下の実験は、Ａ３９Ｒとその膜結合受容体との相互作用による、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８６の上方制御を記載する。健常ドナーからの末梢血を、低内毒素ＰＢＳで、ｐＨ  ７．４および室温で１：１に希釈した。その後、希釈血３５  ｍｌをＩｓｏｌｙｍｐｈ（Ｇａｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州カールプレース）１５  ｍｌに上層し、そして室温で、２２００  ｒｐｍで２５分間遠心分離した。血漿層を保存した。ＰＢＭＣ層を採取し、そして３回洗浄し、Ｉｓｏｌｙｍｐｈを除去した。洗浄したＰＢＭＣをＸ−Ｖｉｖｏ  １５血清不含培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）に再懸濁し、そしてＴ１７５フラスコに加えた。フラスコは、先に２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で被覆し、そして保存した血漿層で３０分間前処理してあった。ＰＢＭＣを３７℃、５％  ＣＯ２で９０分間付着させ、そしてその後、低内毒素ＰＢＳの１０  ｍｌ洗浄で、穏やかに３回リンスした。酵素不含解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，  ＢＲＬ）中で細胞をインキュベーションし、そして細胞を何度もＰＢＳ中で洗浄することにより、付着単球細胞を採取した。単球を２５００  ｒｐｍで５分間遠心分離し、計数し、そして１  ｍｌ中に５  ｘ  １０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに並べた。培養は９５％純粋だった。
【０１２７】
細胞をより樹状細胞様表現型に分化させるため，精製単球細胞を、２０  ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび１００  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４の存在下で、７−９日間培養した。７−９日目に、１μｇ／ｍｌのＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓまたはコントロールポリＨｉｓ含有タンパク質で培養を処理し、そして翌日、解析のため、細胞および上清を採取した。
【０１２８】
単球由来樹状細胞表面マーカーを調べるためのフローサイトメトリー実験において、特定のタンパク質に対して向けられる結合体化ｍＡｂで細胞を染色した。染色により、試験した末梢血ドナーのほとんどで、Ａ３９Ｒ処理はこれらの細胞上のＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ発現を下方制御することが示された。ＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ分子は、樹状細胞による亢進した抗原提示のマーカーであるため、これらの下方制御により、Ａ３９Ｒとこの細胞集団上のその受容体との相互作用の免疫抑制性の影響が示唆される。
実施例１７
ＣＤ５４の上方制御
以下は、Ａ３９Ｒセマフォリンおよび精製単球上のその受容体の間の相互作用の影響、およびより詳細には、セマフォリンとのインキュベーション後の単球上のＣＤ５４発現の影響を記載する。Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓまたはコントロールタンパク質の存在下で、一晩培養に置いた以外は、実施例１６に記載されるように、末梢血ドナーから新たに単離された単球を精製した。
【０１２９】
一晩培養の後、培養細胞および単球特異的細胞表面マーカーに対して向けられるｍＡｂを用い、フローサイトメトリーを行った。試験されたドナーすべてで、ＣＤ５４表面発現のレベルは、Ａ３９Ｒの存在下で亢進されたが、熱不活化Ａ３９Ｒの存在化では亢進されなかった。同様に、コントロールタンパク質を含む培養では、ＣＤ５４表面発現は亢進されなかった。
【０１３０】
ＣＤ５４はＩＣＡＭ−１としても知られるが，付着分子であり、その増加した発現は、細胞活性化を示すとみなされている。これらのデータにより、Ａ３９Ｒのその受容体との相互作用を促進することにより、新たに単離されたヒト単球を活性化することが可能であることが示される。
実施例１８
新たに単離されたヒト単球からのサイトカイン誘導
実施例１６に記載されるように、新たに単離されたヒト単球を精製し、そして実施例１７に記載されるように培養した。一晩Ａ３９Ｒ／ポリＨｉｓとインキュベーションした後、炎症誘発性サイトカインの存在に関し、単球上清を調べた。試験したドナーすべてで、ＩＬ−６およびＩＬ−８がＡ３９Ｒタンパク質により誘導された。熱不活化Ａ３９Ｒおよびコントロールタンパク質は、ＩＬ−６またはＩＬ−８を誘導しなかった。さらに、サイトカイン産生は、Ａ３９Ｒに対して向けられるｍＡｂを含むことにより遮断された。
【０１３１】
本実験の結果は、Ａ３９Ｒ、または本タンパク質の相同体がその受容体との相互作用により、新たに単離された単球によるサイトカイン産生を誘導する可能性があることを立証する。都合のよいことに、ＶＥＳＰＲの可溶性型は、Ａ３９Ｒまたはその相同体に反応し、単球の炎症誘発性活性を阻害するのに用いることが可能である。
実施例１９
単球凝集研究
セマフォリンのその単球上の受容体に対する相互作用に対する、ヒト単球の反応を調べるため、実施例１７に記載されるように単球を精製し、そして実施例２に記載されるようにＡ３９Ｒ／ポリＨｉｓ融合タンパク質を調製した。該融合タンパク質および精製された培養単球をインキュベーションした。インキュベーションを２０時間続けると、単球凝集を生じた。実施例１７に立証される結果により、観察された単球凝集はＣＤ５４上方制御の結果として起こると示唆された。しかし、他の要因もまた、凝集に寄与している可能性がある。
【０１３２】
本研究は、本発明のセマフォリン受容体が単球上に発現し、そしてＡ３９ＲおよびＶＥＳＰＲの間の相互作用は単球凝集を生じることを確認する。Ｂ細胞同様、単球凝集は、単球の活性化を示す。
実施例２０
ＶＥＳＰＲに対するモノクローナル抗体
本実施例は、ＶＥＳＰＲポリペプチドに対する抗体を調製するための方法を例示する。精製ＶＥＳＰＲポリペプチドを実施例１０に記載されるように調製する。精製タンパク質を用い、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるように、ＶＥＳＰＲに対する抗体を生成する。簡潔には、マウスを０、２および６週間目にＶＥＳＰＲで１０μｇで免疫する。初回免疫は、Ｖａｘｃｅｌｌ，  Ｉｎｃ．のＴＩＴＥＲＭＡＸアジュバントと共に調製し、そして続く免疫は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と共に調製する。１１週目に、ＰＢＳ中のＶＥＳＰＲ  ３−４μｇでマウスをＩＶ追加免疫する。ＩＶ追加免疫の３日後、脾臓細胞を採取し、そして５０％水性ＰＥＧ  １５００溶液を用い、Ａｇ８．６５３骨髄腫融合パートナーと融合させる。ハイブリドーマ上清を、ＶＥＳＰＲおよび不適切なＦｃタンパク質に対するドットブロットアッセイにより、ＶＥＳＰＲ抗体に関しスクリーニングする。
【配列表】
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