(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボにおいて通常はホスホリル化されておらず所望の活性を有する第１のポリペプチド配列と、プロテインキナーゼに対するホスホリル化認識配列を含み前記第１のポリペプチド配列とは異種の第２のポリペプチド配列とを有するホスホリル化可能な融合タンパク質であり、ホスホリル化認識配列においてホスホリル化した際にも、所望の活性が残存しているホスホリル化可能な融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
第１のポリペプチドが哺乳類のポリペプチドである請求項１記載の核酸。
【請求項３】
第１のポリペプチドが細胞外ポリペプチドである請求項１記載の核酸。
【請求項４】
第２のポリペプチドが第１のポリペプチドの末端に融合されている請求項１記載の核酸。
【請求項５】
第２のポリペプチドが第１のポリペプチド内に挿入されている請求項１記載の核酸。
【請求項６】
第１のポリペプチドが糖タンパク質である請求項１記載の核酸。
【請求項７】
第１のポリペプチドが分泌性タンパク質である請求項１記載の核酸。
【請求項８】
第１のポリペプチドがホルモン、サイトカイン、リンホカインおよび増殖因子からなる群から選択される請求項１記載の核酸。
【請求項９】
第１のポリペプチドが抗体あるいはそのFabもしくはFab′断片である請求項１記載の核酸。
【請求項１０】
ホスホリル化認識配列がセリン／スレオニンキナーゼの認識配列である請求項１記載の核酸。
【請求項１１】
ホスホリル化認識配列がチロシンキナーゼの認識配列である請求項１記載の核酸。
【請求項１２】
第２のポリペプチドが２またはそれ以上のホスホリル化認識配列を含む請求項１記載の核酸。
【請求項１３】
ホスホリル化認識配列がArg−Arg−Xaa−Ser−Xaaの配列を含む請求項１記載の核酸（ただし、Xaaはいずれかのアミノ酸を示す）。
【請求項１４】
ホスホリル化認識配列がArg−Arg−Ala−Ser−Val−Alaの配列を含む請求項１記載の核酸。
【請求項１５】
ホスホリル化認識配列がサイクリック−AMP依存性プロテインキナーゼによってホスホリル化される請求項１記載の核酸。
【請求項１６】
ホスホリル化可能な融合タンパク質が第１のポリペプチドに対するレセプターに結合可能な請求項１記載の核酸。
【請求項１７】
第１のポリペプチドがヒト・インターフェロン−αタンパク質である請求項１記載の核酸。
【請求項１８】
ヒト・インターフェロン−αタンパク質がヒト・インターフェロン−αＡタンパク質である請求項17記載の核酸。
【請求項１９】
ホスホリル化可能な融合タンパク質が以下の配列で示されるHu−IFN−αA/γタンパク質である請求項17記載の核酸。
0003621948.tif 000012
【請求項２０】
ホスホリル化可能な融合タンパク質が、次のアミノ酸配列
0003621948.tif 000013
からなる群から選択される配列を含む請求項１記載の核酸。
【請求項２１】
第１のポリペプチドがヒト・インターフェロン−βタンパク質である請求項１記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１〜21のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項22記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
インビボにおいて通常はホスホリル化されておらず所望の活性を有する第１のポリペプチド配列と、プロテインキナーゼに対するホスホリル化認識配列を含み前記第１のポリペプチド配列とは異種の第２のポリペプチド配列とを有するホスホリル化可能な融合タンパク質であり、ホスホリル化認識配列においてホスホリル化した際にも、所望の活性が残存しているホスホリル化可能な融合タンパク質。
【請求項２５】
インビボにおいて通常はホスホリル化されておらず所望の活性を有する第１のポリペプチド配列と、プロテインキナーゼに対するホスホリル化認識配列を含み前記第１のポリペプチド配列とは異種の第２のポリペプチド配列とを有し、ホスホリル化認識配列においてホスホリル化され、かつ所望の活性が残存しているホスホリル化された融合タンパク質。
【請求項２６】
第１のポリペプチドが抗体のポリペプチドまたはその抗原結合部を含む断片である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項２７】
抗体の断片が抗体のFab断片である請求項26記載のタンパク質。
【請求項２８】
抗体の断片が抗体のFab′断片である請求項26記載のタンパク質。
【請求項２９】
抗体のポリペプチドが腫瘍関連抗原に結合する請求項26記載のタンパク質。
【請求項３０】
腫瘍関連抗原が乳癌関連抗原、結腸癌関連抗原、卵巣癌関連抗原または腺癌関連抗原である請求項29記載のタンパク質。
【請求項３１】
第１のポリペプチドが細胞外ポリペプチドである請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３２】
第１のポリペプチドが哺乳類のポリペプチドである請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３３】
第２のポリペプチドが第１のポリペプチドの末端に融合されている請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３４】
第２のポリペプチドが第１のポリペプチド内に挿入されている請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３５】
糖タンパク質である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３６】
分泌性タンパク質である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３７】
ホルモン、サイトカイン、リンホカインおよび増殖因子からなる群から選択される請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３８】
ホスホリル化認識配列がセリン／スレオニンキナーゼの認識配列である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項３９】
ホスホリル化認識配列がチロシンキナーゼの認識配列である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４０】
２またはそれ以上のホスホリル化認識配列を含む請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４１】
ホスホリル化認識配列がArg−Arg−Xaa−Ser−Xaaの配列を含む請求項24または請求項25記載のタンパク質（ただし、Xaaはいずれかのアミノ酸を示す）。
【請求項４２】
ホスホリル化認識配列がArg−Arg−Ala−Ser−Val−Alaの配列を含む請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４３】
ホスホリル化認識配列がサイクリック−AMP依存性プロテインキナーゼによってホスホリル化される請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４４】
第１のポリペプチドに対するレセプターに結合可能な請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４５】
第１のポリペプチドがヒト・インターフェロン−αタンパク質である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４６】
ヒト・インターフェロン−αタンパク質がヒト・インターフェロン−αＡタンパク質である請求項45記載のタンパク質。
【請求項４７】
以下の配列で示されるHu−IFN−αA/γたんぱく質である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
0003621948.tif 000014
【請求項４８】
次のアミノ酸配列
0003621948.tif 000015
からなる群から選択される配列を含む請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項４９】
第１のポリペプチドがヒト・インターフェロン−βタンパク質である請求項24または請求項25記載のタンパク質。
【請求項５０】
タンパク質がリン同位体もしくは硫黄同位体により高い比放射性活性でホスホリル化されている請求項24または請求項25記載のタンパク質を含む標品。
【請求項５１】
さらに、薬学的に許容できるキャリヤーを含む請求項50記載の標品。
【請求項５２】
精製された請求項25記載のタンパク質。
【請求項５３】
放射性のラベルでホスホリル化された請求項52記載のタンパク質。
【請求項５４】
ラベルがβ線を放出する原子である請求項53記載のタンパク質。
【請求項５５】
原子がリンおよび硫黄からなる群から選択される請求項54記載のタンパク質。
【請求項５６】
放射性のラベルが32Pおよび33Pからなる群から選択されるリン原子である請求項55記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は組換DNA技術の分野に関し、さらにこの技術を用いて放射能標識される１個もしくはそれ以上の燐酸（もしくはチオ燐酸）基を有する有用な機能性蛋白もしくはポリペプチドを合成する方法、並びに診断、予防および治療を包含する生物医学、医学および生化学の用途に有用なこれらおよびその他の各種の生産物に関するものである。
より詳細には、本発明は新規なインタフェロン類、特に１個もしくはそれ以上の放射性のホスホリル化された基を有する白血球インタフェロン（すなわちα−インタフェロン）および繊維芽細胞インタフェロン（すなわちβ−インタフェロン）、並びにこれら新規なインタフェロンをコードする推定のホスホリル化しうる部位をコードするDNA配列に関するものである。
〔従来の技術〕
放射性標識された蛋白は多くの医学、生物学、臨床、科学およびその他の用途を有する。特に125Iで標識されたインタフェロンは、結合および架橋の研究に用いられている。ヒトIFN−α、−βおよび−γは全て各種の方法により放射性沃素化されている。しかしながら、放射性沃素で標識された蛋白は周知の重大な欠点および危険性を有する。
インタフェロンに関する細胞表面リセプタの研究は、高い生物学的活性と高い放射線特異活性とを有するたとえば125Iで標識されたインタフェロンのような放射性標識されたインタフェロンを必要とする。数年前、γ−インタフェロンは生物学的活性を保持しながら極めて高い放射線特異活性までホスホリル化しうることが見出だされた。たとえば、それぞれヒトおよびネズミIFN−γリセプタを研究するため〔32P〕Hu−およびMu−IFN−γが用いられた。これらの研究は、ヒトおよびネズミγ−インタフェロン（Hu−およびMu−IFN−γ）を牛心筋からの環式AMP−依存性蛋白キナーゼおよび〔γ−32P〕ATPでホスホリル化することにより行なわれた。これらホスホリル化されかつ32P−標識されたインタフェロンは、細胞表面リセプタを研究しかつHu−IFN−γおよびMu−IFN−γリセプタに関する遺伝子をコードする染色体を同定するための高い放射線特異性を持った貴重な試薬を提供する。これらの研究および用途の全てにつき、ホスホリル化されるインタフェロンは特に有用である。幾つかの報告は、Hu−およびMu−IFN−γのホスホリル化部位をCOOH末端に近いセリン残基として確認した。
しかしながら、IFN−γのホスホリル化に使用された条件下にて、Hu−IFN−αＡおよびHu−IFN−βは環式AMP（cAMP）−依存性蛋白キナーゼによってホスホリル化しえないことが報告された。種々の種類または群のインタフェロンおよびその他の蛋白に関するホスホリル化の調査は、γ−インタフェロンをホスホリル化した条件下で研究者がHu−IFN−αもしくはHu−IFN−βのホスホリル化に成功しなかったことを確認している。事実、組換IFN−αおよびIFN−βはホスホリル化されなかったと報告されており、したがって利用しうる部位が存在するかどうか不確定であった。
沃素化された化合物に伴う問題および沃素化されたIFN−γの利用に対する制限に鑑み、多くの実用的、科学的および産業的用途のため標識しうるホスホリル化されたHu−IFN−αおよび−βを入手しうるようにする緊急の興味およびニーズが存在する。
同様に、この種の化学構成ではまだ入手しえない他のホスホリル化された（標識された）ポリペプチドにつき興味およびニーズが存在する。たとえば、ホスホリル化しうる腫瘍壊死因子（TNF）は、TNF用のリセプタを研究するのに貴重である。TNFは、cAMP−依存性の牛心臓キナーゼによりホスホリル化しえない。事実、蛋白ホスホリル化における興味が過去数年間にわたり著しく増大していると報告されている。
以下、詳細に説明する本発明は、これらおよびその他のニーズを満たすのに貢献する。
本明細書で使用する「Hu−IFN−α」という用語は、全ゆる異なる種類のα−インタフェロンを包含することを意図する。種々の種類からのインタフェロンに対応する多数のDNA配列が分離されかつ同定されている。同様に、各種のIFN−βおよびIFN−γも開示されている。本発明は、これら全ての種類のインタフェロンを包含する。
本明細書で使用する「原」という用語は、天然に生産される蛋白（例えばインタフェロン）を意味し、「合成」および「非天然」という用語は、合成もしくはDNA−組換法により産生される蛋白を意味し、いずれの種類もホスホリル化しうる部位を持たず（或いはたとえば蛋白の構成によりホスホリル化しうる部位に到達しえず）、この蛋白を本発明にしたがってホスホリル化することができる。
IFN−αにつき説明する場合、この用語は各種のα種類を包含することを意図する。
「改変」という用語は本明細書において広義に使用され、かつたとえば蛋白につき説明する場合はホスホリル化しうる部位を備えた或いは燐ラベル（もしくは同類のラベル）を備えた蛋白を意味する。推定ホスホリル化部位を有するこの種のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も、必要に応じ改変」と称する。
「ホスホリル化しえない」蛋白という用語は、一般に何らかの理由で、たとえば推定のホスホリル化しうる部位を持たず、したがって蛋白をコードするDNA配列が推定アミノ酸認識配列をコードするDNA配列を持たない理由で、或いはこの種の部位がホスホリル化につき利用しえない配列で、ホスホリル化しえなかった（或いはホスホリル化されなかった）蛋白を意味する。
「与えた」もしくは「備えた」などの用語は、本明細書において広義に使用され「融合」および「挿入」の両者を意味する。その例は、それぞれハイブリッド融合Hu−IFN−αA/γ（第１図に例示）およびHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3（第８図に例示）である。たとえば、ヌクレオチド挿入物は遺伝子のコード領域内にてその１端部に存在し或いはコード領域内のどこかに存在することができる。これら変種が全て「改変」という用語に包含されると考えられ、この用語は以下の説明から明らかとなるようにアミノ酸配列またはヌクレオチド配列につき使用することができる。
「からなる」または「含む」という用語は、アミノ酸認識配列（またはこれをコードするヌクレオチド配列）が存在する状況とは無関係に全ゆる状況を包含する。
本発明の好適方法に関する他の従来技術によれば、ホスホリル化は蛋白キナーゼを用いて行なわれる。蛋白キナーゼは、ATPのγ−ホスホリル基がアクセプタ蛋白基質へ移動するのを触媒する。しかしながら、本明細書中で説明するように、本発明はアクセプタ部位が特定アミノ酸（たとえばセリン）であるキナーゼに限定されず、この部位が配列中の他のアミノ酸であるようなものをも包含し、一般に蛋白キナーゼを、全体として包含する。
蛋白に関し本明細書中に使用する「生物学的活性」などの用語は、広義に解釈することを意図する。インタフェロン類似蛋白の場合、これはHu−IFN−αもしくはHu−IFN−βに対し特異的または両者に共通の性質を包含する全ゆる公知の（または将来見出される）性質、たとえばその抗ウィルス活性および主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）の抗原を変調させ、特にβ−マクログロブリンを包含する種類のＩのMHC抗原の表面発現における増加を誘発するその能力を包含する。
「機能性」蛋白は、生物学的もしくはその他の活性または用途を有する蛋白である。
「活性領域」もしくは「生物学的活性」領域もしくはセグメントという用語または均等な用語は、しばしば蛋白分子の特定の構成もしくは折畳の存在を意味し、たとえば配列内の特定アミノ酸の間における特定のジスルフィド架橋を意味するが、これに限定されないことは勿論である。
本明細書中に使用する「ベクター」という用語は、（１）宿主細胞内で複製することができ、（２）宿主細胞を形質転換することができ、かつ（３）形質転換細胞を同定するのに適した標識を有するようなプラスミド、ファージDNAまたはその他のDNA配列を意味する。
本明細書の説明全体にわたり、「単数」は「複数」をも包含し、たとえばホスホリル化しうる部位またはホスホリル化部位は特記しない限り少なくとも１個この種の部位を意味する。
本明細書中に用いる他の用語は以下の説明から明らかとなるであろう。
本発明の主題については従来多くの文献並びにインタフェロンに関する多くの米国特許公報に開示されており、必要に応じ参照することができる。
〔発明の要点〕
広義において本発明は、標識しうるおよび標識された蛋白、たとえば放射性標識しうるおよび放射性標識させた蛋白、並びにこれら放射性標識しうる蛋白をコードするDNAおよびcDNA分子を包含する。
本発明は、１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位を持った機能性蛋白をコードする組換DNA配列；機能性蛋白を発現する発現ベクター；形質転換された宿主；改変蛋白を発現する方法；並びに改変された蛋白をも包含する。
１具体例において、本発明は放射性標識されたヒトインタフェロンおよび標識された蛋白；高放射線特異活性までホスホリル化しうると共に生物学的活性を保持するホスホリル化しうる改変Hu−IFN−α（Hu−IFN−αＡ−Ｐ）；燐の各同位元素（たとえば32P,33P）または硫黄（たとえば35P,38S）で改変された他のヒトインタフェロン；燐を有する標識蛋白もしくは同族体を提供する。本発明によれば、ヒトインタフェロンおよび改変蛋白は単一もしくは複数の放射性ラベルを有することができる。
さらに本発明は、燐もしくは硫黄で放射性標識されたHu−IFN−αＡ−Ｐヒトインタフェロン並びに組換DNAで産生されかつ放射性標識されたポリペプチドおよび蛋白を包含する、組換DNA技術により作成されたインタフェロンおよび蛋白を提供する。
さらに本発明は、１個もしくはそれ以上の標識用部位を有しかつ蛋白配列がインタフェロンの生物学的性質の少なくも１つ（たとえば抗ウィルス、細胞成長阻止および免疫調節特性）を有するよう充分にヒトインタフェロンを複製しうる機能性蛋白をコードするDNA配列をも提供する。さらに、キナーゼに関する推定認識部位のコード配列を有する組換DNA;組換発現ベクター;DNA配列を有する発現ベクターで形質転換された宿主生物；および発現された改変蛋白も提供される。本発明においては、適当な発現ベクターを作成するための部位特異性突然変異を含む方法と、ベクターで形質転換された宿主とを用い、かつ改変された蛋白、特に改変されたヒトインタフェロンを発現させる。
本発明は、その幾つかの実施態様の１つにおいて、１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位をコードするDNA配列を提供し、これら配列はそれぞれ少なくとも１個の推定ホスホリル化部位を有すると共にHu−IFN−αもしくは−βの生物学的性質の少なくとも１つを有する機能性蛋白をコードし；さらにたとえばλPLプロモータもしくはその他の下記するプロモータのような適するプロモータの制御下で機能性改変Hu−IFN−αもしくは−βを発現するための発現ベクター、並びに生物学上活性なホスホリル化されたHu−IFN−αおよび−βを提供する。
これら改変されたヒトインタフェロンおよび蛋白の数種の興味ある有用な用途についても本出願によって開示する。
さらに本発明は、Hu−IFN−αもしくは−β以外のインタフェロンもしくは蛋白をも包含し、これらは単一のホスホリル化部位を有する対応のインタフェロンよりも高い放射線特異活性まで標識されかつこれを許容するホスホリル化部位の付加によって改変される。ホスホリル化部位の「付加」という用語は、本発明においては従来得られなかった或いは得がたいホスホリル化部位が改変されて、このホスホリル化部位を利用しうるようにしたインタフェロンもしくは蛋白を包含することを意図する。
さらに本発明は、セリン残基以外のアミノ酸残基（たとえばスレオニンおよび／またはチロシン残基）が適するキナーゼによりホスホリル化されたインタフェロン、特にHu−IFN−α、並びに１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位をコードしかつ前記インタフェロンをコードするDNA配列をも包含する。
本発明によれば、ホスホリル化認識配列の１部（全配列でない）が付加されれば充分であり、ただし天然蛋白配列は前記認識配列の残余（または他の相補的）アミノ酸（たとえばArg−Arg−Ala−Ser）を有する。本発明のこの具体例においては、配列における１〜４個のアミノ酸（Arg−Arg−Ala−Ser−Valの場合）を蛋白に供給して、完成された必要なSer−含有の認識配列を構成することができる。種類Hu−IFN−αＡ−P1および−P2の間の比較に１例を見ることができ（第８図）、ここで天然インタフェロン配列は本発明にしたがって作成される場合Hu−IFN−αＡ−P2におけるホスホリル化認識配列に１個のArgを付与する。
Hu−IFN−αＡ−P3において、コード化配列（すなわち追加アミノ酸配列）にはHu−IFN−αＡをコードする天然配列の下流に位置する認識配列をコードするヌクレオチド配列が供給されている。たとえばHu−IFN−αＡ−P3は、追加アミノ酸配列がHu−IFN−αＡの認識配列と天然アミノ酸配列との間に位置する例である。
これは、推定ホスホリル化部位を持ったアミノ酸認識配列をコードするヌクレオチド配列を位置決定するための本発明の有能性を示す。
すなわち本発明によれば、推定ホスホリル化部位を形成するのに要する必要個数の特定アミノ酸をコードするヌクレオチド配列が作成される。
上記の観察から、上記特定のアミノ酸認識配列以外の任意のアミノ酸配列を作成するためにも同じ原理を適用することができる。
ホスホリル化部位がセリン（上記の例）以外である場合、DNA配列はスレオニン、チロシンなどを含有する推定認識部位を持った適するアミノ酸配列の１部もしくは全部をコードする。すなわち、任意特定の蛋白において１個もしくはそれ以上のアミノ酸（アミノ酸配列の任意の位置における）がキナーゼに関するアミノ酸認識配列のアミノ酸と同じである場合は、アミノ酸認識配列のこれら相補的アミノ酸を付加して（または改変して）その配列を完成すれば充分である。これは、所望のアミノ酸配列をコードするDNA配列を作成することにより達成される。事実、このような付加（または改変）が一層望ましい過程である場合も存在し、たとえば改変すべき蛋白分子の一体性を保持し（たとえば特定の活性、たとえば生物学的活性に影響を与える危険性を最小化させ）或いは遺伝子操作を単純化することが重要であり、或いはいずれかもしくは両末端またはその他の位置をより接近し易くすることが重要である。
キナーゼ認識配列は、特定のホスホリル化アミノ酸とは無関係に、DNAコード配列の末端もしくはその他の位置のいずれかに位置することができる。
本発明によれば、蛋白のホスホリル化しうる部位のホスホリル化は任意適当なホスホリル化手段で行なうことができる。蛋白キナーゼおよび蛋白ホスファターゼにより触媒される蛋白のホスホリル化および脱ホスホリル化は、多数の蛋白に影響を及ぼすことが知られている。多数の蛋白キナーゼが開示されており、かつ本発明に使用すべく当業者に入手することができる。この種の蛋白キナーゼは主として２つの群に分類することができる：すなわち蛋白およびペプチドにおけるセリンおよび／またはスレオニン残基のホスホリル化を触媒するもの、並びにチロシン残基のホスホリル化を触媒するものである。これら２つの主分類はさらに次の群にサブ分類することができる。たとえば、セリン／スレオニン蛋白キナーゼは環式AMP（cAMP）−依存性蛋白キナーゼと環式GMP（cGMP）−依存性キナーゼと環式ヌクレオチド依存性蛋白キナーゼとにサブ分類することができる。蛋白キナーゼの多くに関する認識部位が従来推定されている。
短い合成ペプチドにおいて、cAMP−依存性蛋白キナーゼは配列Arg−Arg−Xxx−Ser−Xxx〔ここでXxxはアミノ酸を示す〕を認識する。上気したように、cAMP−依存性蛋白キナーゼはアミノ酸配列Arg−Arg−Xxx−Ser−Xxxを認識するだけでなく、その他の幾つかの特定配列、たとえばArg−Thr−Lys−Arg−Ser−Gly−Ser−Valをも認識することができる。その他多くの蛋白セリン／スレオニンキナーゼ、たとえばグリコーゲンシンセターゼキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、カゼインキナーゼＩおよびII、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ、蛋白キナーゼＣおよびミオシン軽鎖（light  chain）キナーゼが報告されている。
ペプチド基質におけるチロシン（セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンでない）をホスホリル化しかつそれに特異性を示す蛋白キナーゼは、蛋白チロシンキナーゼ（PTK）である。この種のPTKは公知文献に起債されている。PTKは、本発明に使用すべく入手しうる他の種類のキナーゼである。
他の入手しうる種類のキナーゼは環式GMP−依存性（cGMP−依存性）蛋白キナーゼである。cGMP−依存性蛋白キナーゼは、cAMP−依存性蛋白キナーゼにより示される特異性と同一ではないが類似した基質特異性を示す。ペプチド−Arg−Lys−Arg−Ser−Arg−Lys−Gluは、cAMP−依存性蛋白キナーゼによるよりも、cGMP−依存性蛋白キナーゼによって一層良好にセリンでホスホリル化された。さらにcAMP−依存性蛋白キナーゼは、合成ペプチド−Leu−Arg−Arg−Ala−Hyp−Leu−Glyにおけるヒドロキシプロリンをホスホリル化することができる。
真核性生物に広く分布しかつたとえばカゼインのような酸性蛋白を基質として優先的に使用するカゼインキナーゼは２つの群、すなわちカゼインキナーゼＩおよびIIに分類されている。カゼインキナーゼIIは合成ペプチドSer−Glu−Glu−Glu−Glu−Gluをホスホリル化する。合成ペプチドおよび天然蛋白基質を用いた結果の評価は、燐酸アクセプタ部位を包囲する比較的短いアミノ酸配列がカゼインキナーゼIIの特異性に対する基礎を与えることを示した。したがって、セリンのカルボキシル末端側に対し位置３および５における酸性残基が最も重要であると思われる。セリンが、スレオニンと比較して優先的にホスホリル化された。他の研究において、ペプチドArg−Arg−Arg−Glu−Glu−Glu−Thr−Glu−Glu−GluはカゼインキナーゼIIの特異的基質となることが判明した。しかしながら、Arg−Arg−Arg−Glu−Glu−Glu−Ser−Glu−Glu−Gluは一層良好な基質であった。さらに、Arg−Arg−Arg−Asp−Asp−Asp−Ser−Asp−Asp−AspはArg−Arg−Arg−Glu−Glu−Glu−Ser−Glu−Glu−Gluよりも良好な基質であった。すなわち、アスパラギンはグルタミンよりも好適である。セリン〔スレオニン〕のCOOH末端側における酸性残基は、現在知られている最も必要とされるものである。セリン（スレオニン）のアミノ末端側における酸性残基は、ホスホリル化を向上させるが絶対必要とされるものではない。すなわちAla−Ala−Ala−Ala−Ala−Ala−Ser（Thr）−Glu−Glu−GluはカゼインキナーゼIIの基質として作用するが、Ala−Ala−Ala−Glu−Glu−Glu−Ser（Thr）−Glu−Glu−Glu〔ここで、記号Ser（Thr）はセリンもしくはスレオニンを意味する〕よりも効果が低かった。カゼインＩおよびIIは多くの同じ基質をホスホリル化するが、カゼインキナーゼＩはここに示したいずれのデカマーペプチド基質をもホスホリル化しなかった。各種の合成ペプチドを用いた研究から、配列Ser−Xxx−Xxx−Glu（および推論すればSer−Xxx−Xxx−Asp）はカゼインキナーゼIIにより認識するための最小の要件を満たす配列の１種類を示しうるが、他のペプチドおよび配列でも充分であると結論された。
上記したように、他のキナーゼも開示されている。ミトゲン活性化S6キナーゼは、肝臓からのプロテアーゼ活性化キナーゼと同様に、合成ペプチドArg−Arg−Leu−Ser−Ser−Leu−Arg−Alaをホスホリル化する。ロドプシンキナーゼは、ペプチドThr−Glu−Thr−Ser−Glu−Val−Ala−Pro−Alaのホスホリル化を触媒する。他の蛋白セリン／スレオニンキナーゼが開示されており、そのホスホリル化部位が説明されている。
チロシンキナーゼの基質特異性も報告されている。各種の合成もしくは天然ペプチド基質も開示されている。
したがって当業者は、認識過程に関し比較的高い特異性を有するがアミノ酸認識部位の特定配列に関し柔軟性を有する本発明に使用しうるキナーゼを充分選択することができる。これらキナーゼは、所望蛋白における推定ホスホリル化部位をホスホリル化するための手段を与える。
改変に最も適した分子の位置の選択は特定の蛋白（およびその構成）に依存する。複数の推定ホスホリル化部位（およびホスホリル化しうる部位）を改変蛋白に含ませる場合、アミノ酸認識配列を形成するため分子の一端部もしくは両端部およびその他の位置の潜在的利用性が考慮される。すなわち本発明によれば、ホスホリル化認識配列を天然蛋白配列における任意の個所に導入しうるが、ただしこの導入された配列が所望の生物学的活性に悪影響を与えないものとする。
特定の蛋白キナーゼに関する認識部位が確認されれば、本発明は対応の推定標識部位を含有すべき機能性蛋白をコードするDNA配列の内部に位置する或いは融合した或いは結合したキナーゼに対し認識部位をコードするDNA配列を組換DNA技術により作成する方法を提供する。
本発明は、上記本発明の方法により放射性標識することができかつ対応の未標識（または標識しえない）蛋白の性質の少なくとも１つを有する蛋白を包含する。本発明によれば、ホスホリル化されてない（またはホスホリル化しえない）蛋白を改変して、推定のホスホリル化しうる部位をアミノ酸配列中に導入する。これは、推定ホスホリル化部位をコードするDNA配列（１部もしくは全部）により蛋白のアミノ酸配列をコードするDNA配列を改変した後に行なわれる。インタフェロンの場合、本発明は天然もしくは「非天然」インタフェロンの全インタフェロンを包含し、上記したように種々の刊行物に報告されたような構造上改変されたインタフェロン（たとえばハイブリッドインタフェロン、改変インタフェロンなど）、並びに将来報告されるであろう他の改変インタフェロンを包含する。
天然および「非天然」（改変を含む）種類のインタフェロンは種々の生物学的活性を有し、かつこの種の活性は種々異なる割合で生ずることが知られている。すなわち本発明は、これら性質のいずれか１つを任意の割合で有する放射性標識されたインタフェロンだけでなく、公知種類のインタフェロンにおいてまだ確認されてない生物学的もしくはその他の性質を有するものも包含する。ホスホリル化は、蛋白の性質の１つもしくはそれ以上を多かれ少なかれ改変しうることが認められている。事実、蛋白の改変前に検出しえなかったような性質を向上させ或いは発現させうる場合が存在する。
さらに本発明は、特に興味ある標識しうるおよび標識された蛋白類似のホスホリル化された抗体（特にモノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体または改変抗体）、ホルモンおよび「改変」ストレプトアビジンを提供する。改変ストレプトアビジンは個々のビオチニル化された抗体に結合することができ、各ストレプトアビジンは単一もしくは複数のホスホリル化された基により改変することができ、その生成物は極めて向上した放射線を有し、したがって診断および治療用途を有する。
さらに本発明は、Hu−IFN−γのCOOH−末端16アミノ酸領域が融合したHu−IFN−αＡで構成されるハイブリッドインタフェロン蛋白Hu−IFN−αA/γを供給し、これは推定ホスホリル化部位を有すると共にハイブリッドインタフェロン融合蛋白が燐で標識されている。融合蛋白は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異により作成された発現ベクターで合成された。さらに本発明は、融合ハイブリッドインタフェロン蛋白のためのDNAコード配列、発現ベクターおよび形質転換微生物、たとえばイー・コリ宿主およびその他の適する下記の宿主をも提供する。
以上、本発明の特徴および実施態様につき説明したが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。以下、本発明を一層詳細に説明する。
本発明の１部を構成する添付図面により、本発明の原理を説明すべく本発明を実施例につき詳細に説明する。
本発明によれば、常態にてホスホリル化しえない蛋白を改変して、これらをホスホリル化しうるようにすることができる。特に、本発明に関し極めて興味あることは、Hu−IFN−γとは異なりホスホリル化しえなかった（上記した通り）特定の蛋白、すなわちインタフェロンHu−IFN−αＡのホスホリル化を達成しうるかどうかを確認することである。この結果を特にその生物学的活性の喪失なしに達成する方法は、他の蛋白を改変すると共にこれらをホスホリル化しうるようにする能力を与えた。すなわち、本発明によれば、Hu−IFN−αＡを一般に蛋白のホスホリル化に関するモデルとして用いた。
本発明によれば、Hu−IFN−αＡを改変して２種の具体例を得、これらにつき以下説明する。両具体例は一般に蛋白に適用することができ、当業者には特定の状況下で最も適するものを選択するであろう。
第１の具体例はホスホリル化しうるハイブリッドもしくは融合蛋白、すなわちHu−IFN−αA/γの作成であり、第２の具体例は以下詳細に説明する挿入物を持ったホスホリル化しうる改変Hu−IFN−αＡである。
以下限定はしないが特定例につき説明する。
Hu−IFN−αA/γ、すなわちHu−IFN−αＡとHu−IFN−γのCOOH末端16アミノ酸とのハイブリッド蛋白
以下、Hu−IFN−αＡとHu−IFN−γとのハイブリッドもしくは融合蛋白につき説明する。融合蛋白に用いるインターフェロンHu−IFN−αＡは、ヒトのアルファーインターフェロンのファミリーの１つであり、165個のアミノ酸を有し、次のアミノ酸配列を有するものである（図３参照）。
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オリゴヌクレオチド−指向性突然変異により作成された発現ベクターによって、融合−ハイブリッド蛋白を発現させた。発現ベクターの作成、蛋白の発現および精製、機能性ハイブリッド蛋白のホスホリル化、および細胞（MDBK）に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合につき以下説明する。ハイブリッド蛋白は抗ウィルス活性を有する。
本発明により作成された融合蛋白は、Hu−IFN−γのCOOH末端16アミノ酸が融合したHu−IFN−αＡからなっている。この蛋白は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異（oligonucleotide−directed mutagenesis）により発現ベクターを構成して作成される。ハイブリッド蛋白Hu−IFN−αA/γをファージλPLプロモータの制御下で発現させた。蛋白をモノクローナル抗体によりHu−IFN−αに対し或いはHu−IFN−γのCOOH末端アミノ酸配列に対し精製した。精製された蛋白はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて単一の主バンドを示すと共に、ヒトおよび牛細胞に対し抗ウィルス活性を示す。Hu−IFN−αＡと異なるがHu−IFN−γと同様に、ハイブリッドHu−IFN−αA/γは〔γ−32P〕ATPおよびcAMP−依存性蛋白キナーゼによりホスホリル化しうることが判明した。ホスホリル化された分子はIFN−αA/βリセプタに結合する。
推定ホスホリル化部位を有するHu−IFN−γの領域の融合によるHu−IFN−αＡ中へのホスホリル化部位の導入は、標識インタフェロンが有用であるリセプタ結合、薬物動態学などの研究に関する新規な試薬を提供する。
すなわち本発明によれば、Hu−IFN−αＡのCOOH末端にHu−IFN−γのCOO末端を融合させて推定ホスホリル化部位を有するハイブリッド蛋白を得ることにより、ハイブリッド蛋白を作成した。このホスホリル化された蛋白は生物学上活性であることが判明した。
ハイブリッドHu−IFN−αA/γを発現させるためのプラスミドの作成は次のように行なった。
第２図に示したように、Hu−IFN−αＡおよびHu−IFN−γのDNA配列をM13mp18中にクローン化した。融合蛋白をコードするプラスミドpXZ−８を、図示したようにオリゴヌクレオチド指向性欠失（oligonucleotide−directed deletion）により作成した。
プラスミドpXZ−８は、ATCCに受託番号40510号として寄託し、かつpHu−IFN−αA/γと称する。
適正な欠失を有するプラスミド組換体をスクリーニングするため、プローブとしてオリゴマーを用いることにより200個のコロニーにつきコロニーハイブリッド化を行なって、53個のコロニーが陽性であることを観察した。53個の陽性コロニーのうち36個をEcoR Iでの制限切断により分析した結果、２個のコロニーのみが予想の制限断片を含有した。DNA配列決定は、Hu−IFN−γの16COOH末端アミノ酸をコードする配列の5'末端がHu−IFN−αＡのコード配列の3'末端に融合したことを確認した（第１、２および３図）。732bp断片が正確な組換体にて欠失した。ハイブリッドHu−IFN−αA/γの遺伝子を作成し、かつλPLプロモータの制御下で発現させた。ハイブリッドHu−IFN−αA/γは181個のアミノ酸で構成され、次のアミノ酸配列を有するもので、下線で示されるホスホリル化部位を有している。（第３図）。
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下記するように、種々の発現ベクターにおける他のプロモータも使用することができる。
ハイブリッドHu−IFN−αA/γの特性化およびホスホリル化を次のように行なった。
プラスミドpXZ−８を有するイー・コリRR1（pRK248cIts857）細胞またはイー・コリAR68（pRK248cIts857）細胞を42℃で増殖させてHu−IFN−αA/γを誘発ささせ、かつ後記するようにモノクローナル抗体親和性クロマトグラフィーによりハイブリッド蛋白を精製した。精製された蛋白４×168単位/mgの比活性を示した。２−メルカプトエタノールの存在下におけるSDS−ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて、これはHu−IFN−αＡより遅く移動する単一の主バンドを示し、かつHu−IFN−αＡ−P3のほぼ同じ位置に第４図および第５図に示したように182個のアミノ酸を有する他のHu−IFN−αＡ誘導体を示した。Hu−IFN−αA/γはHu−IFN−αＡほど安定でないことが観察された。実験過程と精製過程と貯蔵との間に、イー・コリRR1から抽出された蛋白の減成が観察された。イー・コリAR68を宿主細胞として用いた場合は、ずっと少い減成が観察された。
ハイブリッドHu−IFN−αA/γは〔γ−32P〕ATPと牛心筋cAMP−依存性蛋白キナーゼとによりホスホリル化しうることが判明した。〔32P〕Hu−IFN−αA/γの比放射能はイー・コリRR1から分離された調製物につき約５μCi/μｇの蛋白であり、イー・コリAR68から分離されたHu−IFN−αA/γの調製物において比放射能は約141μCi/μｇまで増大し、これは恐らくカルボキシル末端の一層大きい組込みを反映する。これらの数値は〔125I〕IFN−αＡにつき得られた数値の範囲に近似する。〔32P〕IFN−αA/γは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて２−メルカプトエタノールの存在下に未標識IFN−αA/γと同じ位置に単一物質として移動する（第５図）。
細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合は、次のようにして行なった。
結合試験には牛MDBK細胞を使用した。何故なら、Hu−IFN−αＡはこの細胞ラインに対し高い抗ウィルス活性を示すと共にこれに結合するのに対し、Hu−IFN−γはそうでないからである。Hu−IFN−αA/γが牛MDBKおよびヒトダウジ細胞に特異的に結合するかどうかを決定するため、これら細胞を種々の濃度の〔32P〕Hu−IFN−αA/γと共に未標識Hu−IFN−αＡの不存在下および存在下で培養した。MDBK細胞とダウジ細胞との両者に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの特定結合を第６図および第７図に示す。
〔32P〕Hu−IFN−αA/γを用いたこれらの結果は、Hu−IFN−αＡ（これ自身はホスホリル化することができない）のCOOH末端に対するHu−IFN−γのホスホリル化部位の融合が蛋白の結合能力を破壊しなかったことを示す。さらに、Hu−IFN−αA/γ蛋白もその活性を保持した。
本発明のこの第１実施例の説明は、推定ホスホリル化部位を有するアミノ酸配列をコードしうるハイブリッドDNA配列の作成と、適する発現ビークルおよび完全な推定ホスホリル化部位を有するハイブリッド蛋白を容易に発現する形質転換宿主の作成と、そのホスホリル化とに成功したことを示す。
本発明の第２の主たる実施例は若干異なる方法で初期の目的を達成し、しかもホスホリル化しうる改変インタフェロンをもたらした。
上記第１実施例においてはホスホリル化しえない全蛋白（この場合にはHu−IFN−αＡ）をコードするDNA配列を推定のホスホリル化しうるアミノ酸配列をコードする配列にその配列の末端を融合させて改変させるが、第２実施例は配列の末端における融合を必要とせず、実際に融合工程を必要としない。
すなわち第２実施例は、一般に蛋白に対する本発明の幅広い適用性を示す。
第２実施例においては、得られる蛋白を適当なホスホリル化しうる配列の挿入により改変した。
以下、第２実施例につき説明する。
標識しうる部位を挿したHu−IFN−α
本発明の重要な特徴は、キナーゼ認識しうるアミノ酸配列を選択された蛋白中に組込み（或いは蛋白キナーゼにより認識しえないアミノ酸配列を、このように認識される配列に変換し）かつ推定のキナーゼ認識しうるホスホリル化部位を有する蛋白をキナーゼ触媒作用による選択された放射性ラベルの結合によって標識することである。
一般に、これらの工程は、DNA組換法によりヌクレオチド配列のレベルで行なわれる。蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸共通配列が同定された後、このアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を規定しかつ作成することができる。この開示の目的で、蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を「PKヌクレオチド配列」と称する。同様に、蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列を「PKアミノ配列と称する。PKヌクレオチド配列は、任意の選択されたヌクレオチド配列（特に蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）に導入することができる。好ましくは、PK配列を蛋白をコードするヌクレオチド配列に、蛋白生成物が生物学上生化学上などで活性となるよう挿入し或いは結合させる。「生物学上活性」という用語は、その一般的意味において使用する。すなわち、改変蛋白はホスホリル化可能であり、しかも生物学上活性である。さらに、ホスホリル化された改変蛋白も所望の用途に関し充分活性でなければならない。或る場合、ホスホリル化蛋白は生物学上不活性とすることもでき、それでもたとえば放射性免疫分析にて有用である。
本発明において唯一の必要なことは、ホスホリル化用の部位を含むまたは部位であるアミノ酸共通配列の大部分を組込むことである。同様に、DNAレベルにて唯一の必要なことは、キナーゼにより認識されるアミノ酸をコードするコドンを与えることである。蛋白キナーゼの一般的性質であると報告されている絶対的基質特異性の欠如は、ヌクレオチド配列または認識アミノ酸をコードするコドンの選択において他の手段を与える。
「組込む」、「組込み」または「挿入」などの用語は、必ずしもアミノ酸認識配列（またはこのアミノ酸配列もしくはその１部をコードするヌクレオチド配列）が実際に所望の蛋白（またはこれをコードするヌクレオチド配列）に存在することを意味せず、改変生成物をコードする改変蛋白の部分またはヌクレオチド配列の部分（もしくはその１部）とすれば充分である。
本発明の特定例は本発明による遺伝子処理されたHu−IFN−αＡであり、これは公知のHu−IFN−αＡ（原、天然もしくは遺伝子処理）とは異なりホスホリル化可能かつホスホリル化された改変Hu−IFN−αである。ホスホリル化されたHu−IFN−αＡ−Ｐは生物活性を保持すると共に、高放射性比活性をも有する（2,00〜12,000Ci/ミリモル）。環式AMP（cAMP）−依存性キナーゼであるる触媒牛心臓キナーゼを用いてホスホリル化を行なった。cAMP−依存性蛋白キナーゼのアミノ酸認識（もしくは共通）配列は、特にArg−Arg−Ala−Ser−ValおよびArg−Arg−Ala−Ser−LeuおよびArg−Arg−Ala−Ser−Val−Alaであると同定された。一般に、cAMP−依存性蛋白キナーゼは配列Arg−Arg−Xxx−Ser−Xxxを認識する。Hu−IFN−αＡのアミノ酸およびヌクレオチド配列、並びにその対応コード配列が報告されている。
セリンは、ネズミおよびヒトIFN−γの両者に対するホスホリル化の標的アミノ酸であることが示された。さらに、Hu−IFN−γにはcAMP−依存性蛋白キナーゼによりホスホリル化しうる２個のセリン、すなわちセリン132および142が存在することも示された。
本発明によれば、ホスホリル化されたHu−IFN−αの３種の特定例（ここではHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3）において、ホスホリル化部位を含有するようカルボキシル末端アミノ酸を改変し、かつ推定ホスホリル化部位をコードするヌクレオチド配列を作成した。
部位特異性突然変異法（文献に記載されかつ以下さらに説明する）によりHu−IFN−αＡのカルボキシル末端にて挿入および置換を生ぜしめると共に適当なDNA配列をファージM13mp19中に挿入するよう設計したオリゴデオキシリホ−ヌクレオチドを用いて、改変インタフェロンを作成した。改変カルボキシル末端をHu−IFN−αにイー・コリで合成するために使用した一般的方法は従来技術で開示されている。
カルボキシル末端におけるアミノ酸は改変されるものとする必要はない。改変は配列のアミノ末端とすることができ、したがってヌクレオチド配列の5'末端とすることができる。改変は、ホスホリル化部位が完全蛋白においてキナーゼにより認識されうる限り、蛋白配列の任意の位置（および対応のコード領域）とすることができる。
Hu−IFN−αに関し上記したように、蛋白キナーゼのような酵素により認識しうるアミノ酸配列をコードする１個もしくはそれ以上の推定部位をヌクレオチド配列中に導入すれば、この種の部位が存在しない或いは得にくに蛋白またはこの種の追加部位を導入することが望ましい蛋白を改変するための新たな幅広い重要な可能性を与える。
蛋白キナーゼのうち、アクセプタ蛋白基質のセリンおよび／またはスレオニンヒドロキシル基へのATPのγ−ホスフェートの移動を触媒する公知の環式ヌクレオチド−依存性蛋白キナーゼ、カルシウム−依存性蛋白キナーゼ、チロシン特異性蛋白キナーゼ、環式ヌクレオチド−およびカルシウム−非依存性蛋白キナーゼが存在する。本発明はこれら蛋白キナーゼ、ホスホリル化の対応推定部位の１個もしくはそれ以上をコードするヌクレオチド配列、およびこの選択された蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列を持った改変蛋白、並びに放射性ラベルを有するホスホリル化蛋白の使用を包含する。この種のラベルは燐または硫黄、或いはここに説明する他の基とすることができる。さらに、これは放射性ラベルではなくてもよい。これは「同定しうる」ラベルであれば充分である。
広義において、本発明はホスホリル化しうる部位を導入した後の蛋白キナーゼによる種々の蛋白のホスホリル化を包含する。すなわち、従来ホスホリル化しえなかった蛋白にホスホリル化用の適する部位を与える本発明の幅広い利用性が認められるであろう。
本明細書の全体にわたり「ホスホリル化しうる」（または「ホスホリル化された」）という用語を用いる。また、たとえばγ−チオホスフェート同族体のようなホスフェートドナーATPの同族体についてもこの用語を用いる。本明細書において、「ホスホリル化」などの用語は一般的にたとえば31P,32Pもしくは33Pが35Sもしくは硫黄同族体により置換される「チオホスホリル化」をも包含することを意図する。
ここに説明したように、キナーゼはセリンだけでなくスレオニンもしくはチロシンにおいてもホスホリル化を触媒することが報告されている。すなわち、選択されたキナーゼを認識する推定部位をコードするヌクレオチド配列の作成、並びにこに開示したと同様な複製しうる発現ビークルの作成、適する宿主中へのその導入、および次いで改変されたホスホリル化しうる蛋白の発現も本発明の範囲内である。適する場合、改変されたホスホリル化しうる蛋白は外来性および成熟蛋白である。次いで、ホスホリル化しうる蛋白をホスホリル化することができる。勿論、同様にホスホリル化された蛋白の同族体（たとえば硫黄標識されたもの）も作成することができる。
cAMP−依存性蛋白キナーゼにより認識される改変Hu−IFN−αの場合、推定ホスホリル化部位をコードするヌクレオチド配列は、第９図に示すようにDNAのレベルにおけるオリゴデオキシリボヌクレオチド指向性挿入によって形成される。
改変インタフェロンの作成
ホスホリル化部位を有するHu−IFN−αの発現プラスミドの作成を次のように行なった。Hu−IFN−αＡのコード配列を持ったpIFLγＡからのEcoR I−Pst I断片をM13mp19のEcoR I−Pst I部位に挿入してM13・BL27を形成し、これを第９図に示したように部位特異性改変の雛型として使用した。Hu−IFN−αＡ−P1および−P2のコード配列を作成するため、２種のオリゴデオキシリホ−ヌクレオチドを合成してM13BL27に融合させると共に、ヌクレオチドの挿入を可能にスルーループを形成して、COOH−末端にホスホリル化部位のコード配列を生ぜしめた（枠内の残基、第８図）。それぞれHu−IFN−αＡ−P1および−P2を作成するために使用したオリゴヌクレオチドは次の通りである。AGT−TTA−AGA−AGT−AAG−AGA−AGG−GCA−AGT−GTT−GCA−TGA−AAA−CTG−CTT−CAA;およびACA−AAC−TTG−CAA−AGA−AGT−TTA−AGA−AGG−GCA−AGT−TTA−GCA−TGA−AAA−CTG−CTT−CAA。下線を施こしたヌクレオチドはHu−IFN−αＡをコードするcDNAのコード配列および3'非コードヌクレオチド配列と同類である。下線を施してないヌクレオチドはP1およびP2のための他の残基を挿入するループを形成する。部位特異性突然変異、並びに挿入をP2オリゴヌクレオチドを用いて行なった。オリゴヌクレオチドをM13BL27からの一本鎖DNAに融合させた後、第２のヌトランドを合成し、次いでこれを制限エンドヌクレアーゼEcoR I−Pst Iで切断した。次いで、得られたEcoR I−Pst I断片を第９図に示したようにファージM13mp19のEcoR I−Pst I部位を再挿入し、次いでイー・コリを二本鎖DNAで形質転換させた。不完全二本鎖分子（第９図の右上）はPst I−EcoR I二本鎖断片を形成しない。この切断および再結合工程を行なって、部位特異性突然変位の効率を増大させることにより約40％の陽性クローンの全収率を与えた。個々のファージM13プラークから作成されたRF  DNA試料を挿入EcoR I−Pst I断片の存在につきスクリーニングした。陽性クローン（すなわち挿入物を有するもの；プラークの約75〜90％）を公知のサンガー・ジデオキシヌクレオチド法により配列決定して、適正に突然変異した組換体を同定すると共に配列を確認した。この方法により、配列決定された形質転換体の約50％がホスホリル化部位を有する突然変異したコード配列を有した。次いで、EcoR I−Pst I断片をファージ（M13BL28,M13BL29およびM13BL30）からの各RF  DNA調製物より切断し、かつpRC23tのEcoR I−Pst I部位に再結合して第９図に示すように発現ベクターpBL281,pBL291およびpBL301を得た。pRC23tから得られた２種のEcoR I−Pst I断片は、IFN−βコード配列の直ぐ下流にtrpターミネータを有するMu−IFN−βの発現プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られた。
Hu−IFN−αＡ−P1発現ベクターの作成に際し、P1−オリゴヌクレオチドの重複と、Lysに関するコドン164の１個のＡの単一ヌクレオチド欠失と、下流P1オリゴヌクレオチドからの11個の3'末端残基（AA−CTG−GTT−CAA）の第２欠失とを有するクローンを分離した。この一連の工程は、僅かに大きいHu−IFN−αＡ−P3と称する分子に新たなホスホリル化部位のための同相コード配列を形成した（第８図および第９図）。
ここで用いた一般的な組換DNA法は従来開示されている。これらの方法を参考のためここに引用する。組換体のクローン化および蛋白の発現に関するファージλPLプロモータを含むベクターの使用については多くの刊行物に開示されている。野生型および突然変異型ファージλに対しリソゲニックであるか或いはファージλリプレッサをコードするプラスミドを含んだ各種のイー・コリ菌株が、プラスミドの増殖および／またはプラスミドでコードされた蛋白の発現につき使用されている。たとえば、特に次のイー・コリ菌株がプラスミドの複製および／またはファージλPLプロモータの制御下における蛋白の発現につき使用されている：イー・コリ294,AR13,AR58,AR68,AR120,C600,N99,RR1,W3110。感温性リプレッサを有するイー・コリ菌株（cI857）を用い、この菌株を30℃で増殖させてプラスミドを作成することができる。温度を42℃まで移行させると、リプレッサが失活しかつファージλPLプロモータの制御下でDNA配列が発現される。かくして、菌体を30℃で高密度まで増殖させ、次いで、興味ある蛋白を42℃で発現させた。或いは、野生型ファージλリプレッサ（cI−）を用い、ナリジキ酸を使用することによりファージλPLプロモータの制御下で遺伝子の発現を誘発することができる。本発明に関する研究において、感温性リプレッサ（cIts857）を用いてファージλPLプロモータの制御下に遺伝子の発現を制御することが望ましいと判明した。プロテアーゼを欠乏した菌株を用いてイー・コリで組換蛋白の高度産生を達成する必要はないと判明したが、プロテアーゼを欠失する菌株が或る場合に有利であると判明した。
Hu−IFN−αＡのヌクレオチド配列を有する細菌プラスミドの作成および同定は従来公知である。Hu−IFN−αの種類に対応するDNA配列を持った組換プラスミドの分離についても従来記載されている。イー・コリ菌株Ｋ−12誘導体RR1が、本発明に有用な宿主であると考えられる。
本発明の目的に適した部位特異性突然変異は種々の刊行物に記載されており、これを本明細書に引用することができる。さらに、本発明の方法に関する従来技術はたとえば米国特許第4,751,077号公報に見られ、これを参考のためここに引用する。
本発明によれば、アミノ酸共通配列（これは推定ホスホリル化部位を有する）をコードするヌクレオチド配列を、Hu−IFN−αＡのヌクレオチド配列中のどこでも挿入することができる。これは、第８図に示したオリゴヌクレオチド配列から見ることができる。しかしながら、ヌクレオチド配列の挿入は、好ましくはHu−IFN−αＡをコードするヌクレオチド配列の部位で行なわれ、得られる組換蛋白の生物学的活性に対し（この種の生物学的活性が重要である場合）望ましくない作用を最少化させる。
細菌によるHu−IFN−αＡ−Ｐの発現
Hu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白をコードする発現プラスミドにて形質転換されたイー・コリにおける改変インタフェロンの発現、およびHu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白の精製を次のように行なった。上記３種のベクターのそれぞれを、プラスミドpRK248cIts857を有するイー・コリ菌体に導入した。それぞれpBL281,pBL291およびpBL301プラスミドを有する適合性プラスミドpRK248cIts857を持ったイー・コリAR68菌体およびイー・コリRR1菌体はそれぞれHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3をPLプロモータおよびtrpターミネータの制御下に42℃で発現した。イー・コリAR38（pRK248）におけるHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3の収率は同じプラスミドを有するイー・コリRRI（pRK248）におけるよりも高かった。42℃にてイー・コリAR68で発現された産生物を用いて、下記するように免疫親和性クロマトグラフィーによりHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3蛋白を精製した。得られた組換インターフェロンであるHu−IFN−αＡ−P1、−P2および−P3はそれぞれ、170個、167個、182個のアミノ酸残基を有するものであり、それらのアミノ酸配列はそれぞれ次のとおりのもので、下線部で示されるホスホリル化部位を有するものである。
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下記第１表におけるデータは、抗ウィルス活性の50％以上が回収されたことを示している。Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3をそれぞれ蛋白1mg当り、1.2×108、1.1×108および1.5×108単位の比活性まで精製した。
プラスミドpBL281をATCCに受託番号40509号として寄託し、かつpHu−IFN−αＡ−P1と称する。
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Hu−IFN−αＡ−Ｐおよびその32P−標識生成物の特性化を次のように行なった。精製されたHu−IFN−αＡ−P1,−P2およびＰ−P3蛋白を、２−メルカプトエタノールの存在下にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（第10図）。Hu−IFN−αＡ−P1もしくはP2につき銀染色されたゲルに、単一のバンドが観察された。Hu−IFN−αＡ−P2は、Hu−IFN−αＡ−P1よりも僅かに早くかつHu−IFN−αＡよりも僅かに遅く移動した。Hu−IFN−αＡ−P3は２つのバンドを生じ、遅く移動するバンドは完全分子である。
Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3を、cAMP−依存性蛋白キナーゼより〔γ−32P〕ATPを用いて2,000〜12,000Ci/ミリモルの比放射能までホスホリル化した。ホスホリル化の後、〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1および−P2はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて２−メルカプエタノールの存在下に単一バンドとして移動すると共に、19,000〜20,000の見掛け分子量（第11図）は銀染色された未標識バンドと同じ位置に対応する。標識されたHu−IFN−αＡ−P3は、予想通り−P1もしくは−P2生成物よりも遅く移動した。より急速に移動するP3バンドは未標識であるため（第10図および第11図参照）、ホスホリル化部位を有する−P3のCOOH末端延長部は全長生成物から切断されて、より急速に移動する形態をもたらすと思われる。未標識Hu−IFN−αＡおよび〔125I〕Hu−IFN−αＡを分子量標準および比較として用いた（第10図および第11図）。
新規なインタフェロンの抗ウィルス活性
Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3の抗ウィルス活性に対するホスホリル化の作用を並行実験で決定した。ホスホリル化は、牛MDBK細胞およびヒトWISH細胞の両者を用いて測定されるHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3の抗ウィルス活性に対し殆んどまたはまったく作用を示さないことが判明した。
下記第２表は、ホスホリル化されてない並びにホスホリル化されたインタフェロンα蛋白の抗ウィルス活性を示している。
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リセプタに結合する能力
リセプタに結合する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの能力を次のように示した。〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1およびP2は牛MDBK細胞およびヒトダウジ細胞（第12図）に結合すると共に、特異結合はより高い濃度で飽和に近づく。データのスカッチャード分析は次の推定を与えた。牛MDBK細胞は、それぞれ〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1および−P2の結合から計算して細胞１個当り約3,800および9.450個のリセプタを含有し、ダウジ細胞は細胞１個当り約1,650および4,900個のリセプタを含有する。解離恒数（Ｋ）はヒトおよび牛の両細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1の結合につき1.4×10-10Mであると計算され、かつそれぞれヒトおよび牛の細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P2の結合につき、3.5×10-10Mおよび2.2×10-10Mであると計算された。同様な結果が〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P3についても得られた。
これら全てのホスホリル化された〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐ誘導体は、ダウジ細胞に対するその結合がHu−IFN−αＡおよびHu−IFN−βにより競合的に阻止されたがHu−IFN−γでは阻止されなかったので、Hu−IFN−α／βリセプタに結合する。
リセプタに対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの架橋
リセプタに対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの架橋を次のように行なった。〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3をそれぞれ、細胞に結合させた後にスベリン酸ジスクシンイミジルとの反応によりリセプタに共有架橋させた（第13図）。放射性複合体は分子量100K〜200Kを有する数種のバンドとしてダウジ細胞から移動し、或いは約150Kの見掛け分子量を有する幅広バンドとしてMDBK細胞からSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析に際し移動した。〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3による細胞に対するリセプタの架橋複合体はSDS−ポリアクリルアミドゲルにて同じであると思われるが、ヒトダウジ細胞で形成された〔32P〕Hu−IFN−γの架橋複合体とは相違する。結合反応の際に過剰の非放射性Hu−IFN−αＡを含ませれば、架橋複合体も遊離〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3も見られない（第12図および第13図）。
ホスホリル化部位を有するHu−IFN−β
Hu−IFN−β類似蛋白をコードしかつcAMP−依存性蛋白キナーゼにより認識しうる推定ホスホリル化部位を持った同様なヌクレオチド配列を作成した。
次の手順は、牛心臓からのcAMP−依存性蛋白キナーゼにより認識しうる部位を持った改変Hu−IFN−βを発生する。Hu−IFN−βをコードするcDNAからのPst I−Bgl II363bp断片を、発現ベクターpFIFtrp69から切除した。この363bp断片をファージM13mp18のPst IおよびXma I部位に挿入した。先ず最初にPst I−Bgl II断片のPst I末端を、制限エンドヌクレアーゼPst IおよびXma Iで切断されたM13mp18のdsDNAに結合させた。次いで、断片のBgl II末端を、M13mp18ベクターにBgl II−Xma Iリンカーを用いて結合させ：
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これはBgl IIおよびXma I部位を制限する。M13mp18のポリリンカー領域にはBgl II部位が存在しないので、このBgl II−Xma Iリンカーを用いてBgl II部位を保持すると共に、Xma Iで切断することにより中間組換体の１種を作成した（下記および第８図の同様な作成を参照）。Hu−IFN−βのコード領域における5'末端からの363bp断片を有するM13mp18は、部位特異性突然変異の雛型として使用されるM13−Ａを次のように形成した。部位特異性挿入を、上記のHu−IFN−αＡ−P1の作成と同様の方法により行った。Hu−IFN−β−Ｐ、すなわち改変Hu−IFN−βのコード配列を作成するため、オリゴデオキシリボヌクレオチド（CTT−ACA−GGT−TAC−CTC−CGA−AGG−GCA−AGT−GTT−GCA−TGA−AGA−TCT−GCG−CGC−GCC−CGG）を合成してM13−Ａに融合させると共に、ヌクレオチドを挿入してCOOH末端にホスホリル化部位のコード配列を生ぜしめるループを形成した。上記オリゴヌクレオチドの下線部分はHu−IFN−βをコードするcDNA断片を含んだファージM13−Ａのヌクレオチドと同類である。
Hu−IFN−βとHu−IFN−β−Ｐとの比較を下記に示す。
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165〜170からの改変Hu−IFN−β−Ｐの下線部分は、cAMP−依存性蛋白キナーゼ認識部位を示す。上記オリゴオチドにおける下線を施こしてないヌクレオチドは、Hu−IFN−β−Ｐの残基166〜170を挿入するためのループを形成するM13−Ａからの一本鎖DNAにオリゴヌクレオチドを融合させた後、第２ストランドを合成し、次いで制限エンドヌクレアーゼPst IおよびXma Iで切断した。次いで、得られたPst I−Xma I断片を第８図に示したと同様にファージM13mp18のPst I−Xma I部位に再挿入し、次いでイー・コリを二本鎖DNAで形質転換させた。この切断および再結合工程を行なって、部位特異性突然変異の効率を増大させた。個々のファージM13プラークからのRF  DNA調製物を、挿入Pst I−Xma I断片の存在につきスクリーニングした。陽性クローン（すなわち挿入物を有するもの）をサンガー・ジデオキシヌクレオチド法により配列決定して、適正に突然変異した組換体を同定すると共に配列を確認した。この方法により、配列決定された数種の形質転換体はホスホリル化部位を有する突然変異したコード配列を有する（M13−Ｂ）。次いで、Pst I−Bgl II断片をファージM13−ＢからのRF  DNAより切除し、かつpFIFtrp69のPst I−Bgl II部位に再結合させて、原ベクターと同様な発現ベクターを得た。用いた一般的な組換DNA法は従来の刊行物に記載されている。
ホスホリル化しうる改変インタフェロンは公知のように発現することができ、かつ対応するHu−IFN−βのための手順にしたがって精製することができる。
〔実施例〕
以下、限定はしないが例示の目的で本発明を実施例につき説明する。
細菌菌株、酵素および薬品
ファージλPLプロモータの感温性リプレッサを有するプラスミドpRK248cIts857を持ったイー・コリRR1をロバート・クラウルから入手した。プラスミドpPRK248cIts857を、形質転換によりイー・コリAR68中に導入した。
制限エンドヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼはニュー・イングランド・ビオラブス社から入手した。用いた緩衝条件は製造業者により説明された通りである。大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片およびT4DNAリガーゼはインターナショナル・バイオテクノロジース・インコーポレーション社から入手した。牛腸ホスファターゼ（c.i.p.）はベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社から入手した。結合反応は、低融点アガロースゲルの存在下で行なった。
20,000単位/mlの比活性を有する牛心筋からの触媒単位のcAMP−依存性蛋白キナーゼをシグマ社から入手した。5,000Ci/ミリモルの比放射能を有する〔γ−32P〕ATPはアメルシャム社から入手し、ジチオスレイトール（DTT）はベセスダ・リサーチ・ラボラトリース社から入手し、牛血清アルブミン（BSA）はマイルズ・ラボラトリース社から入手し、アクリルアミドおよびN,N1−メチレンビスアクリルアミドはインターナショナル・バイオテクノロジース・インコーポレーション社（IBI）から入手し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）はシグマ社から入手し、かつスベリン酸ジスクシンイミジル（DSS）はピアス・ケミカル・カンパニー社から入手した。
インタフェロンおよび蛋白の分析
インタフェロン活性は、水胞性口内炎ウィルスおよび牛MDBK細胞を用いる細胞病理作用抑制分析により決定した。インタフェロンの測定値は全て、ナショナル・インスティチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクチャス・ディジーズ、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス、ミズーリ州、ベセスダの抗ウィルス物質プログラムから得られたヒト白血球インタフェロン（Ｇ−023−901−527）の比較標準に対し検量された比較単位/mlで表わす。蛋白濃度は、標準として牛血清アルブミンを用いるブラッドフォードの方法により決定した。
以下は融合ハイブリッドHu−IFN−αA/γの製造を例示する。
オリゴヌクレオチドの合成およびホスホリル化
オリゴヌクレオチド指向性突然変異およびハイブリッド化スクリーニングに用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドCTGACTCCTTTTTCGCTTTTCCTTACTTCTTAACは、従来開示されているように合成しかつホスホリル化した。ホスホリル化反応の後、反応混合物を3.5mlの６×SSC（0.9MのNacl,90mMのクエン酸ナトリウム）で希釈し、かつハイブリッド化によるスクリーニングのため直接使用した。
オリゴヌクレオチド指向性欠失
約100pモルのホスホリル化されたオリゴマーを10μｌの30mMトリス−Hcl（pH7.5）、10mMのMgCl2中にて1pモルのssDNA雛型と80℃で５分間融合させ、かつ除々に30℃まで30分間かけて冷却し、次いで氷上に置いた。容積を20μｌの30mMトリス−Hcl（pH7.5）、10mM  MgCl,0.5mM  dATP,0.5mM  dCTP,0.5mM  dGTP,0.5mM  dTTP,1mM  ATP,10mMジチオスレイトール（DTT）に調整した。このオリゴマーを2.5単位のDNAポリマーゼＩのクレノー断片により６単位のT4  DNAリガーゼの存在下に16℃にて24時間にわたり延長させた。次いで、反応混合物を同容積のフェノールおよびクロロホルム（1:1）で１回抽出し、かつ1/10容積の2.5M酢酸ナトリウムおよび２容量の95％エタノールで沈澱させた。75％エタノールで洗浄した後、DNAをSpe Iで切断して突然変異DNAを増加させ、次いでRR1（λ−cIts857）を形質転換させた。スクリーニングするため、コロニーハイブリッド化法を公知のように用いた。M13mp18/Hu−IFN−αA/γからの600bp  Hinc II/Pst I断片をM13mp19のHinc IIおよびPst I部位に挿入した後に、ジデオキシ配列決定法によりDNA配列決定を行なった。
Hu−IFN−αA/γの作成および精製
Hu−IFN−αA/γを有するイー・コリRR1（pRK248cIts857）菌体をLBブロスにて30℃で１晩増殖させた。40mlの一晩培養物を、0.4％のカザミノ酸と50μg/mlのアンピシリン（Ap）と25μg/mlのテトラサイクリンとを含有する200mlのM9培地まで希釈した。細菌を600mmにおける菌体密度が1.0に達するまで30℃にて増殖させ、この時点で菌体を42℃に２〜３時間移した。菌体を7,000rpmにて10分間遠心分離することにより回収し、かつ−20℃にて使用するまで貯蔵した。
精製するため、全ての工程を４℃で行なった。凍結した菌体（10g）を、25mMトリス−HCl（pH7.5）における３容量（40ml）の7Mグアニジン塩酸塩に懸濁させた。この懸濁物を１時間混合し、かつ17,000rpmにて30分間遠心分離した。上澄液を10容量の燐酸塩緩衝塩水（PBS）で希釈した。固体硫酸アンモニウムを65％飽和になるまで激しく撹拌しながら添加した。懸濁物を４℃にて２時間保ち、次いで10,000rpmにて20分間遠心分離した。ペレットを20mlのPBSに懸濁させ、かつPBSに対し徹底的に透析した。得られた懸濁物を10,000rpmにて20分間遠心分離し、かつ上澄液をアフィゲル10に結合したHu−IFN−αＡ（LI−８）に対するモノクローナル抗体0.3mlと１時間混合した。次いで、混合物を1mlの使い捨て注射器に入れた。４倍カラム容積（0.3ml）の0.5M  NaCl、25mMトリス−HCl（pH7.5）で洗浄した後、カラムを４カラム容積の0.15M  NaClで濯ぎ、次いで４カラム容積の0.2N酢酸および0.15M  NaCl（pH2.5）で溶出させた。抗ウィルス活性は最初の２つのフラクションに溶出した。これを牛MDBK細胞に対する細胞病理作用抑制分析により測定した。蛋白の濃度は、牛血清アルブミンを標準として用いるラウリーもしくはブラッドフォードの方法により決定した。これら２つの方法により得られた濃度は一致した。この方法により４×108単位/mgの比活性を有する240μｇのHu−IFN−αA/γが得られた。
発現プラスミドpXZ−８を有するイー・コリAR68（pRK248cIts857）からのHu−IFN−αA/γ蛋白の作成、およびHu−IFN−αに対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによる精製は、Hu−IFN−α−Ｐ蛋白につき下記する通りである。50mlの細菌培養物からの収量は、2.3×107単位/mgの比活性を有するHu−IFN−αA/γの388μｇであった。Hu−IFN−γのCOOH末端配列に対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによる精製法は上記と同じである。酸による溶出は、50mlの細菌培養物から1.36×107単位/mgの比活性を有する281μｇのHu−IFN−αＡ−γを与えた。
Hu−IFN−αA/γのホスホリル化
Hu−IFN−αA/γを、Hu−IFN−γにつき記載したように若干の改変を加えてホスホリル化した。約１μｇのHu−IFN−αA/γを0.5mCiの〔γ−32P〕ATP（＞5,000Ci/ミリモル、アメルシャム・コーポレーション社）および10単位の牛心臓cAMP−依存性蛋白キナーゼ（シグマ社）の触媒単位と共に30μｌの20mMトリス−HCl（pH7.4）、100mM  NaCl、12mM  MgCl2および3mMDTTにて30℃で60分間培養し、次いで氷上で冷却して反応を停止させた。10mMのピロ燐酸ナトリウム（pH6.7）における5mg/mlの牛の血清アルブミン0.3mlを添加した後、反応混合物を10mMのピロ燐酸ナトリウム（pH6.7）に対し４℃で徹底的に透析した。Hu−IFN−αA/γ中への放射能の組込みを、トリクロル酢酸で蛋白を沈澱させた後に液体シンチレーションスペクトロメータで測定した。
細胞に対するHu−IFN−αA/γの結合
牛MDBK細胞を結合試験に使用した。MDBK細胞を、10％胎児牛血清と50μg/mlのゲンタマイシンとが補充された培地（ギブコＦ−11）における６−ウェル組織培養プレートにて融合するまで清澄させた。培地を取出し、かつ1mlの新たな培地を各ウェルに添加した。20分間後、〔32P〕Hu−IFN−αA/γを0.6μｇの未標識Hu−IFN−αＡ（108単位/mg）の存在下または不存在下に添加した。室温にて１時間培養した後、これらプレートを氷上に載置しかつ各ウェルを1mlづつの冷PBSで３回洗浄した。次いで、1mlの１％SDSを添加して細胞をウェルから除去した。10mlのシンチレーションフルオル中に1mlの試料を入れることにより液体シンチレーションカウンタで放射能を測定した。ヒトダウジ細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合については、Hu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白に関し下記に説明する。
以下は「挿入」による改変インタフェロンの製造を例示する。
改変インタフェロンの作成
上記したハイブリッド−融合法および生産物には或る種の限界が存在するため、他の作成法を開発した。その際、推定ホスホリル化部位をHu−IFN−αのヌクレオチド配列中に導入しうることが突き止められた。
cAMP−依存性蛋白キナーゼに対するアミノ酸認識もしくは共通配列は、特にArg−Arg−Ala−Ser−ValおよびArg−Arg−Ala−Ser−Leuとして同定されている。Hu−IFN−αＡのアミノ酸配列およびその対応のコード化配列も報告されている。Hu−IFN−αＡ並びにその他のインタフェロンは、trpおよびファージλPLプロモータの制御下でイー・コリ発現ベクターにて発現されている。Hu−IFN−αにおける最後の10個のカルボキシル末端アミノ酸に対応する末端ヌクレオチドを第８図に示し、さらに推定ホスホリル化部位を有する改変分子Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3に対応する配列も示す。これらの分子を作成するため、オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成して、部位特異性突然変異法によりHu−IFN−αＡのカルボキシル末端にて示したように挿入および置換を行なうと共に（第８図）、適当なDNA配列をファージM13mp19中に挿入した。cAMP−依存性蛋白キナーゼにより認識されるHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3（第８図）におけるホスホリル化部位は、第８図に示したように、DNAのレベルでオリゴデオキシリボヌクレオチド指向性挿入によって形成された
それぞれHu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3をコードする発現プラスミドpBL281,pBL291およびpBL301を、第８図に要約したように作成した。改変インタフェロンをコードする配列を、同様に第８図に示したようにファージλPLプロモータの制御下で発現ベクター中に挿入した。適合性プラスミドpRK248cIts857を含有するイー・コリAR68を、第８図に示すCOOH末端配列を持ったHu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白をコードする各発現プラスミドで形質転換させた。ホスホリル化しうる改変インタフェロンを、さらに下記するように発現させかつ精製した。
Hu−IFN−αＡ−Ｐの発現および作成
Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3コード配列を有するpBL281,pBL291もしくはpBL301プラスミドを持ったイー・コリRR1（pRK248cIts857）菌体を、次のように改変した所定濃度の或る種の成分を有するM9CA培地にて30℃で１晩増殖させた:1％のカザミノ酸、１％のグリコース、10mMのMgSO4および1mMのCaCl2。さらに、２μg/mlのチアミンと50μg/mlのアンピシリンと12.5μg/mlのテトラサイクリンとを含有した。Hu−IFN−αＡおよび改変蛋白を発現させるため、100mlのM9CA培地に３〜5mlの１晩培養物を接種した。細菌を菌体濃度が600nmにて0.3〜0.5の光学密度に達するまで30℃にて２〜３時間増殖させ、この時点で培養物を42℃にさらに２時間移した。細菌の菌体を遠心分離により集め、かつ8Mグアニジン塩酸塩と50mMトリス−HCl（pH7.6）とで０℃にて10分間溶菌させた。14,000rpm（SA−600ソルバール型ロータ）にて30分間遠心分離した後に得られた上澄液を用いて、抗ウィルス活性を分析し或いはHu−IFN−αＡおよび改変インタフェロンを精製した。
Hu−IFN−αＡ−Ｐコード配列を含有するプラスミドpBL281,pBL291もしくはpBL301を持ったイー・コリAR68（pRK248cIts857）菌体を、50μg/mlのアンピシリンと12.5μg/mlのテトラサイクリンとを含有するLB培地にて32℃で１晩増殖させた。１晩培養物を、上記と同濃度の抗生物質を含有する新たなLB培地で５倍に希釈し、次いで32℃にて２〜３時間増殖させた、Hu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白を発現させ、菌体を収穫しかつ上澄液を作成するため、イー・コリRR1菌体につき使用した上記の手順を用いた。
Hu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白の精製は次のように行なった。Hu−IFN−αＡ−Ｐ物質の精製に関する全ての工程は４〜８℃で行なった。100mlの発現培養物から得られた10mlのグアニジン塩酸塩上澄液を冷燐酸塩緩衝塩水（PBS）で10倍希釈し、かつ硫酸アンモニウムの65％飽和により４℃で１晩沈澱させた。沈殿物を10,000rpm（ソルバールGSAロータ）で５℃にて20分間遠心分離することにより回収した。上澄液をデカントして集めた。残留ペレットを再び10mlの冷PBSに溶解させ、かつ溶液を上記と同様に遠心分離した。合した上澄液30mlを1mlのアフィゲル10と混合し、これにモノクローナル抗体LI−８（Hu−IFN−αに対する）を結合させかつ懸濁物を４℃で１時間振とうした。免疫吸着剤を2mlの使い捨て注射器の本体に入れ、かつ20倍容積もしくはそれ以上の次の低温溶液のそれぞれで順次に洗浄した:PBS、緩衝液Ｆ（0.5M  NaCl,25mMトリス−HCl（pH7.5）および0.2％トリトンＸ−100）；および0.15M  NaCl。次いで、インタフェロンを緩衝液Ｈ（0.2M酢酸、0.15M  NaCl（pH2.6））で溶出させ、かつ0.4mlのフラクションを集めた。溶出されたフラクションを1Mトリス塩基でpH7.0まで中和し、かつピーク抗ウィルス活性のフラクションを集めた。
Hu−IFN−γおよびHu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白のホスホリル化を次のように行なった:Hu−IFN−αＡ−ＰもしくはHu−IFN−γを、Hu−IFN−γにつき記載したように若干の改変を伴って〔γ−32P〕ATPおよびcAMP−依存性蛋白キナーゼで標識した。約0.25〜0.65μｇのHu−IFN−γもしくはHu−IFN−αＡ−Ｐを、上記したような成分を含有する30μｌにおいて0.25mCiの〔γ−32P〕ATP（5000Ci/ミリモル、アメルシャム社）および7.5触媒単位のcATMP−依存性蛋白キナーゼと共に30℃で１時間培養した。次いで、反応混合物を氷浴中で冷却し、かつ10mMのピロ燐酸ナトリウム（HaPPi）（pH6.7）における5mg/mlの牛血清アルブミン270μｌを添加した後に10mMのNaPPiに対し４℃で徹底的に透析した。〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐと結合した放射能をベックマンモデルLS3801型シンチレーションスペクトロメータで測定した。このホスホリル化されたHu−IFN−αＡ−Ｐを液体窒素中で小容量にて貯蔵した。
32Pでホスホリル化されたHu−IFN−γは〔125I〕IFN−γにつき報告されているよりも10倍高い比放射能を有すると報告されている。
本発明によるホスホリル化インタフェロンは、生物学的活性を保持しながら従来得られているよりも高い放射線比活性（1,000〜12,000Ci/ミリモル）を有する分子を与える。したがって、Hu−IFN−αＡ中にCOOH末端にて挿入されたホスホリル化部位は生物学的活性（抗ウィルス活性）に対し悪影響を与えず、かつcAMP−依存性蛋白キナーゼにより効果的に認識することができる。
さらにHu−IFN−αＡ−P1および−P2は精製およびホスホリル化の際に安定である。第８図に示したようにCOOH末端に追加セプチデシルペプチドを有するHu−IFN−αＡ−P3を少なくとも２種の断片に分裂させた。
或る種の生物学的用途につき、ホスホリル化された改変インタフェロンおよびたとえばＳを含有するような燐酸同族体で標識されたものは血清中にて安定にすべきであることは明らかである。
牛MDBK細胞およびヒトダウジ細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3の結合を行なった。細胞に架橋した〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3は、牛MDBK細胞に対し約150Kの１種の複合体を示すと共にヒトダウジ細胞に対し100〜200Kの数種の複合体を示した。
細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの結合を次のように行なった：牛MDBK細胞の融合した単層をトリプシン処理し、かつ10％の失活した胎児牛血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ギブコ社）とを有するデュルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社）における細胞懸濁物1ml（１×106細胞）を、６−ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞単層は融合に達し、かつ37℃での１晩の培養に際し約２倍となり、この時点でこれらを用いて〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの結合を測定した。結合を開示させるため、培地を除去し、次いで〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐを指示濃度で含有する1mlの新鮮培地を各ウェルに添加し、その際拮抗体として過剰の非放射性Hu−IFN−αＡ（添加した〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐよりも500倍以上）を存在させ（＋）または存在させなかった（−）。これらプレートを振とうしながら室温（24℃）で60分間培養し、次いでこれらを氷上に載置して冷却した。各ウェルを1mlづつの冷PBSで３回洗浄して、未結合の放射性配位子を除去した。洗浄した後、1.5mlの水中の１％ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに添加し、さらに細胞を溶解させかつ放射能を結合させた後、全体で1.5mlを2mlのハイドロフルオル・シンチレーション液にてベックマン・モデルLS3801型シンチレーションカウンターにて計数した。
ヒトダウジ細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの結合を、若干の改変を伴なって従来開示されているように行なった。ダウジ細胞を1,000×ｇにて10分間遠心分離することにより回収し、増殖培地（RPMI−1640、ギブコ−H18,12.5mMのナトリウムHEPES,10％の胎児牛血清および50μg/mlのゲントマイシンを補充）にて２回洗浄し、かつ１×107細胞/mlの濃度まで培地中に再懸濁させた。全容積125μｌにおける1.25×106個のダウジ細胞に対する示した濃度における〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの結合を、拮抗体としての非放射性Hu−IFN−αＡの不存在下もしくは存在下で室温（24℃）にて60分間にわたり15分間毎に緩和に再懸濁しながら進行させた。60分間の培養時間の終了後、100μｌの細胞懸濁物を試料カップにおけるPBS中10％蔗糖のクッション300μｌに層状化させ、かつ２分間遠心分離（ベックマン・ミクロフュージ・タイプＢ型）でペレット化させた。チューブをドライアイス−エタノール浴で凍結させ、次いで細胞ペレットを含有するチューブの先端を切除し、かつ上記と同様に計数した。〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの所定濃度における比結合は、過剰の非放射性Hu−IFN−αＡの不存在下で培養した試料（全体）と存在下（非特異性）との間の結合放射能の差として規定される。
リセプタに対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの共有架橋を次のように行なった:75mlの組織培養フラスコにおける牛MDBK細胞の単層をデュルベッコ燐酸塩緩衝塩水で２回洗浄し、2mlのトリプシン−EDTA溶液（１×燐酸塩緩衝塩水、ギブコ・ラボラトリース社）により37℃で細胞が組織培養フラスコから放出されるまでトリプシン処理した。10％の失活した胎児牛血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社）とを含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ギブコ・ラボラトリース社）の10〜20mlを添加した後、細胞を500×ｇにて５〜10分間遠心分離することにより集め、かつ同じ培地中に約１×107細胞/mlの濃度まで再懸濁させた。約５×105cpmの〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐ（2,000〜12,000Ci/ミリモル）を、拮抗体としての１μｇの非放射性Hu−IFN−αＡと共に或いはそれなしに0.5mlの細胞に添加した。室温（24℃）にて振とうしながら１時間培養した後、細胞をエッペンドルフ・ミクロフュージにて14,000rpmで20秒間ペレット化させ、1mlの冷PBSで２回洗浄し、次いで0.5mMのスベリン酸ジスクシンイミジル（ジメチルスルホキシド中で新たに作成）の最終濃度で４℃にて20分間処理した。細胞リセプタ蛋白に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐの架橋をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、従来技術で詳細に開示されているように８％アクリルアミドを含有する厚さ1.5mmのスラブゲルにて分析した。このようにして架橋が確認された。
上記と同様にして、35S−標識蛋白がHu−IFN−αＡ−P1と同様に得られる。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
蛋白、標識生成物および共有架橋複合体を、レムリの方法により厚さ1.0もしくは1.5mmのSDS−ポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動により分析した。電気泳動の後、蛋白を銀またはクーマシーブリリアントブルーで染色した。放射性試料を含有するゲルを減圧下で乾燥させ、かつ標識された配位子については室温で、また共有架橋された複合体については−170℃にてコダックＸ−Ｏマットフィルムおよび強化スクリーンを用いて放射能写真処理した。
他の発現ベクター、宿主細胞など
改変インタフェロンを発現させ、各種のヌクレオチド配列を作成し、かつ特定宿主を形質転換させるのに現在好適な方法につき説明したかが、本発明は決してこれらのみに限定されないことが明らかである。真核性および原核性の両宿主細胞を用いることができる。遺伝子分離、並びに細菌菌体および異質細胞におけるインタフェロンの発現は、本発明の改変インタフェロンの製造に全く適している。たとえば、酵母によりヒトインタフェロンを産生しかつ分泌させるための酵母ベクターの使用に関し、幾つかの従来技術が存在する。イー・コリの他の微生物菌株を用いることができ、或いは異質遺伝子配列を複製しかつ発現しうるプラスミドを持った細菌類、たとえば枯草菌、腸チフス菌も使用することができる（米国特許第4,727,138号に開示されている）。他の発現ベクターがたとえば米国特許第4,559,300号公報に示されている。さらに、多くの他のプロモータ系（ここに開示したもの以外）、たとえばtrpおよびlauプロモータなども使用することができる。これら全ての従来技術を参考のため本明細書中に含ませる。
同様に、改変インタフェロンは脊椎動物の細胞培養物から製造することができ、たとえばサル腎臓繊維芽細胞のCOS−７ラインを改変インタフェロンの製造につき適する発現ベクターと共に宿主として使用することができる。他の細胞ラインも適しており、かつ公知である。真核細胞で発現されるためのレトロウィルス系ベクターの使用の例も従来技術で示されている。真核発現ベクターの他の多くの例も従来示されている。
形質転換宿主細胞にて複製するのに本発明で有用なベクターは、機能的複製のオリジン（レプリコン）を含有したDNA断片を有する。プラスミドおよびファージDNAは、その性質により宿主細胞における複製を促進するレプリコンを有する。ベクターは、形質転換細胞を未形質転換細胞から選択するのに有用な性質を形質転換可能な宿主細胞に移行させるDNA断片を有する。選択目的には、広範囲の性質を用いることができる。最も一般的に用いられる性質の１つは抗生物質耐性、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性である。
上記２種の要素は一般に容易に入手しうる認識されたクローンベクターに存在する。適するクローン化ベクターの例は細菌プラスミド、たとえばpBR322,pMB89,ColE1,pCR1を包含するイー・コリからのプラスミド;RP4を包含する広範な宿主範囲のプラスミド；たとえばλのようなファージDNAなどである。必ずしも全てでないが殆んどの上記ベクターは、既に上記した２種の要素を有する。勿論、公知のように或る種の組換体において、DNAはレプリコンも付着標識も含有する必要がない。
すなわち、任意適当な発現ベクターを用いて、本発明により推定ホスホリル化部位を有する改変インタフェロンを発現することができる。
公知方法によれば、DNAは制御セグメントとコード領域とを含む。すなわち本発明は、例として開示した遺伝子組換体を作成する特定の手段に限定されず、さらに当業者は余計な実験を行なうことなくこの目的に最も適した方法を採用し、変化させ或いは選択しうることが明らかである。
技術および追加材料（分子クローン化、cDNAの合成およびクローン化、イー・コリ中へのプラスミドおよびバクテリオファージλDNAの導入などに使用するベクター、宿主系、プラスミド、酵素など）についても従来公知であり、これら従来技術を参考のためここに含ませる。
補足の一般的観察
上記したようにHu−IFN−αＡおよびHu−IFN−βはホスホリル化できない（cAMP−依存性牛心臓キナーゼにより）のに対し、Hu−IFN−γおよび対応のRa−およびMu−IFN−γはDNA配列の改変なしにホスホリル化しうることが示されている。
すなわち、本発明によれば、追加ホスホリル化部位をHu−IFN−γ中に導入して、１個のみのホスホリル化部位しか持たない蛋白（たとえばインタフェロン）よりも高い放射性比活性まで標識しうるインタフェロン蛋白を得ることができる。
すなわち、既に１個（または多数）のこの種の部位を有する蛋白に部位（ホスホリル化、チオホスホリル化）の個数を増加させることも本発明の範囲内である。
ホスホリル化しうるヌクレオチド配置のオリジンをさらに変化させることができる。Hu−IFN−γに対応するPKヌクレオチド配列を使用する代りに、その他任意のインタフェロン（たとえばネズミインタフェロン）に対応するPK配列を使用することができ、或いはこの点に関しPKヌクレオチド配列をホスホリル化可能なことが知られた蛋白をコードする他の任意のヌクレオチド配列から誘導することもできる。このようにして、極めて興味あるホスホリル化しうる蛋白（およびホスホリル化された蛋白）を実用に供することができる。
さらに、沃素標識よりも有利である放射性ラベルでは従来ホスホリル化しえなかったHu−IFN−αＡおよび−βのような蛋白を放射性標識することも本発明の範囲内である。したがって、硫黄を燐の代りに用いる放射性ATPの硫黄同族体を使用することも本発明の範囲内である。たとえば、ATPのγ−35S同族体を、適当な認識部位にて蛋白中に組込むことができる。すなわち本発明は、たとえば35S,38S,31P,32Pおよび33Pのような硫黄および燐の同位元素の使用を包含する。これら同位元素の幾種かは、容易に入手しえず或いはその半減期のため、まだ広く使用されていない。同位元素のリストは勿論入手することができる。標識すべき化合物中に導入しうる同位元素も本発明に包含される。
下記第３表から見られるように、2.87時間の半減期と1.1Mevのエネルギーとを有する38Sは、照射が適当であると思われる場合、腫瘍およびその他の組織の理想的な照射線源となりうる。2.9時間という短い半減期を持ったこの種の同位元素でホスホリル化された蛋白は、32Pで得られる比活性の約100倍の比活性を有する。さらに、同位元素の短い半減期は、同位元素が数日間以内に患者から除去されるという利点をも有する。さらに、32Pよりも100倍の比活性を発生する能力はより少量の蛋白の使用を可能にする結果、抗原副作用（すなわち、これら蛋白に対する抗体生産）が最小化される。33P燐酸化合物は、32Pの約1/7のエネルギーを有するＢ粒子を生成する。同位元素は24.2日間の半減期を有し、33Pを含有する燐酸同族体でホスホリル化された蛋白は32Pで標識された同族体に比べ約半分の比活性（14.2日間の半減期）を有する。33Pの照射は、32Pを含有する誘導体よりも腫瘍細胞を包囲する領域に対し低い作用を示す。すなわち、本発明による生産物の使用は重要かつ有利な利点をもたらしうる。
改変蛋白の追加用途および使用
本発明により１種もしくはそれ以上のホスホリル化された基またはその同族体（たとえば硫黄）の存在により改変されたインタフェロンおよび同様に改変された蛋白は、生物学、医学、生物医学（治療および診断を含む）並びにその他の科学にて多くの用途を有する。
本発明により改変された蛋白はさらに特定の用途を有すると考えられる。これら用途の２〜３の例を以下に説明する。
1.蛋白の薬物動力学
動物および患者における注射された蛋白の経過を追跡するのがしばしば有用である。幾種かのこれら蛋白に結合した燐はヒトおよび胎児牛の血清にて比較的安定である。したがって、蛋白の薬物動力学を便利に検討することができる。すなわち、ホスホリル化された蛋白は特にこの種の用途に適している。
蛋白がヒトもしくは動物の血清に接触すると予想される本発明によるホスホリル化蛋白もしくは同族体の使用については、蛋白誘導体がヒトもしくは動物の血清にて安定であることが必要である。薬物動力学の研究（または応用）を行なうべき種類の動物の血清、或いは生物学的観点から研究を行なうべき動物の種類の血清と同等な血清において、蛋白誘導体は安定でなければならない。
たとえば、上記研究において、Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3に結合したホスフェートは胎児牛血清中で37℃にて安定である。ヒト血清の存在下では、Hu−IFN−αＡ−P1およびHu−IFN−αＡ−P3に結合したホスフェートは37℃にて安定であるが、Hu−IFN−αＡ−P2に結合したホスフェートは不安定であった。37℃にて６時間および16時間の後、ホスフェートの約62％および74％が〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P2から加水分解された。かくして、ホスホリル化誘導体の安定性が重要である用途の場合、血清−安定性の誘導体が使用される。同様な配慮が、改変Hu−IFN−βにも適用される。血清における安定性が必須でない用途については、血清−不安定なホスホリル化同族体も使用することができる。
ここに説明した用途は、セリン残基にてホスホリル化された蛋白に限定されない。たとえばスレオニンもしくはチロシンのような他のアミノ酸をどのようにキナーゼがホスホリル化するかについて上記した。すなわち、これらアミノ酸にて改変された蛋白は本発明の範囲内である。この種の誘導された標識蛋白の構成により、対応のセリン−ホスホリル化誘導体が充分に血清安定性でなければ、血清中のその安定性を向上させうることも排除するものでない。
2.一般的な診断試薬
本発明による改変蛋白の他の特定用途につき説明する価値がある。ここに説明したように、ほぼ全ての蛋白は単一もしくは複数のホスホリル化（もしくは類似）部位を導入するよう処理することができる。この種の蛋白は広範な種類の科学目的、すなわち動物もしくはヒトにおけるこれら蛋白の経過の研究、その安定性の研究、または放射性蛋白が有益である実験室試薬としての使用などに用いることができる。
たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動には分子量標準が一般的に使用される。ホスホリル化部位を有する蛋白はたとえば分子量標識、等電点集中標識もしくはその他の標識など便利な放射能写真標識となる。この種の用途の場合、血清安定性は一般に重要でなく、蛋白（たとえばインタフェロン）の生物学的活性の保持も重要でない。したがって、或る種の用途の場合、本発明によるホスホリル化しうる蛋白が生物活性を有することは必須でない。
3.抗癌治療「ボンブ」
本発明により可能となる特に貴重かつ興味ある用途は、いわゆる治療上もしくはより詳細には抗腫瘍性の「治療照射ボンブ」である。この種の生物学上活性な組成物は、腫瘍特異性のモノクローナル抗体（Mab）（またはより好適にはFabもしくはFab′断片）に結合したビオチンおよび各Mab結合ビオチンに結合した複数の「改変」ストレプトアビジンを使用し、各ストレプトアビジンは複数のホスホリル化された基を有する点で改変されている。ストレプトアビジン自身は四量体であるため、複数の放射性基がかくして与えられる。これらの複数の放射性基は、著しく増幅されかつしたがってより容易に検出しうると共に一層大きい腫瘍破壊力をもたらす照射線を腫瘍に露出する。高度にホスホリル化しうる場合、これはずっと容易に検出することができる。したがって、各腫瘍特異性Mabに結合したビオチンの各１個が複数のストレプトアビジン分子に堅固に結合し、これらストレプトアビジン分子は複数の標識燐原子またはその同等な同位元素を有する。
治療もしくは診断目的に応じて、ストレプトアビジンは全て放射性燐で標識し或いは部分的もしくは全体的に放射性チオ燐で標識し或いは照射線エネルギーの異なる減衰モードもしくはレベルを有する異なる燐もしくは硫黄同位元素で標識しうることが明らかである。この種の同位元素につき下記に説明する。
抗体分子自身は複数鎖分子であるため、本発明の方法により多くの部位を直接に抗体またはFab断片に導入することができる。
4.ホルモン・サイトキン・リンホキン・成長因子
放射性燐もしくは硫黄で標識されたホルモンが、本発明の範囲内における他の種類の生物学的物質である。たとえば、ホスホリル化（たとえば33P,32P）ホルモンは、他の組織に対し特定の細胞種類に種々異なって結合することができる。この種のホルモンに対するリセプタの個数が増加した癌組織を適当にホスホリル化されたホルモンで処理することができ、これらホルモンは上記細胞に特異的に結合し、かくして治療が顕著に改善される。
さらに、標識されたホルモンは、細胞表面リセプタ、可溶性リセプタまたはその他の試薬および材料へのその結合を検査するためのリセプタ研究に一般的に使用される。
本発明に含まれる標識ホルモン（33P,32P）の典型例は成長ホルモン、インシュリン、FSH、LHなどである。遺伝的に形成されるこの種のホルモンは１個もしくはそれ以上の推定のホスホリル化しうるもしくはチオホスホリル化しうる基の導入を可能にすることが明らかである。
ホルモンにつき上記したように、同じことがサイトキン、リンホキン、成長因子（すなわちIL−1,IL−2,IL−3,TNF−α,TNF−β、各種のCSF分子、エリスロポイエチンEGF、NGFなど）、並びに多かれ少なかれ細胞および／または組織特異性を有する蛋白についても当てはまる。
5.抗体
ホスホリル化により標識されたストレプトアビジンを、未標識ストレプトアビジンまたは酵素結合した未標識ストレプトアビジンの置換体として免疫分析を向上させるべく直接使用することができる。さらに、本発明は遺伝子操作された抗体、より詳細にはMabまたはFabもしくはFab′断片に燐もしくは同族体ラベルを導入することも包含する。この種のMabは診断および治療目的に有用である。ホスホリル化されたMabは特定の腫瘍関連抗原または各種の腫瘍、たとえば乳癌、大腸癌の細胞、悪性黒色腫細胞、卵巣癌細胞およびその他の悪性腫瘍を標的とすることができる。
6.他の治療用途
本発明に包含される他の用途は次の通りである：抗体および／または抗体断片（たとえばFabもしくはFab′断片）のモノクローナルもしくは適するカクテルは、本発明によりホスホリル化またはその他の標識しうる部位を導入しうる価値ある分子である。治療における32Pの使用が真性多血球血症およびその他の悪性病につき示されている。すなわち、抗細胞剤として高エネルギーβ粒子が有効であることは明らかである。Mabもしくはその適する断片（FabおよびFab′）におけるホスホリル化部位の導入を介する32Pの結合も、これらモノクローナル抗体が特異性である腫瘍の治療に有効である。乳癌、大腸癌、卵巣癌およびその他の腺癌、悪性黒色腫およびその他多くの腫瘍からの腫瘍関連性抗原に対し、多数のモノクローナル抗体が開発されている。たとえば、これら腫瘍の腫瘍関連性抗原に指向するMabは、32Pで標識すれば高度に効果的となることが予想される。標識は、ホスホリル化部位のカセットを用いて或いは完全蛋白もしくは適当な断片中への遺伝子操作を介する複数ホスホリル化部位の導入により直接に増加させることができる。「カセット」という用語は多機能成分を意味する。
複数の標識されたホスホリル化部位を本発明によりMabに導入すれば、これは標的とされる特定エピトープに対する改変Mabの結合特異性および／または親和性を低下させる。この種の状態にて、複数ホスホリル化ストレプトアビジンに結合したビオチニル化Mabの使用（上記した通り）は明確な利点を与えることが判るであろう。Mabの特異性は変化せず、しかも診断剤の放射能が何倍にも増大する。
さらに本発明は、患者が悪抗原反応を発生すると思われる治療剤の製造をも包含する。すなわち、モノクローナル抗体を、種々異なるホスホリル化部位により本発明にしたがって好適に処理することができる。ホスホリル化部位のため、注射された抗体に対し敏感となった或いは抗体を生成するようになった患者に導入すれば、異なるホスホリル化部位に変化することにより蛋白の抗原特性を改変することができる。かくして、この種の抗体を上記種類の抗体と反応する患者における複数の順次の治療食餌中に使用することができる。この目的で、種々のホスホリル化部位を有する一連の抗体を開発することができる。各シリーズは異なるエピトープ構造を有するよう設計され、かつ順次に使用されるであろう。或いは、この種の異なる抗体のカクテルを、いずれか一つが全体の１部に存在するよう最初に使用することもできる。これは、新たな部位のいずれか一つに抗体形成を最小化させるであろう。
7.種々の同位元素
本発明によれば、上記したようにホスホリル化誘導体は或る種の用途につき血清安定性とせねばならない。特定の治療目的で他のものよりも効果的である各種の同位元素を用いることができる。たとえば、ホスホリル化反応にて32Pの代りに33Pを用いることができる。約89日間の半減期を有する35Sは、一般に低いエネルギーβ放出体であるため、抗細胞剤として有用であるとは思われない。しかしながら、恐らく治療および／または診断において、35S標識モノクローナル抗体につき特定用途が存在すると思われる。
下記第３表は、本発明により蛋白中に導入するのに特に有用である各種の同位元素（並びに他の適切な詳細）を示している。
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所定時点における減衰ファクターおよび放射能は、文献から得ることができる。たとえば、125Iおよび131Iと他方では32Pおよび35Sとの間の比較につき、公知文献を参照することができる。
したがって本発明は、特定の生物学的目的に、処理された蛋白を提供する。
本発明の重要な特徴は、低いエネルギー放出レベルおよび放射線放出の性質に基づき、標識Mabの高い安定性である。特に、32Pもしくは33Pで標識されたMabは、蛋白に対する樌用の放射性ラベル（たとえば125I）よりも顕著に低いエネルギー放出レベルを有する。さらに、燐および硫黄同位元素（32P,33P,35Pおよび38S）の崩壊放出は、現存する標識プロトコールに共通である125Iのγ線と比較してβ粒子である。
本発明によるβ−標識された蛋白（たとえばMabもしくはストレプトアビジン）の安定性の特徴（上記した通り）は、本発明の診断および治療用途に極めて重要である。β線は腫瘍に滲透するが、γ線ほど容易には患者から周囲の医療スタッフおよび付添人まで放出されない。
35S（これは87日間の半減期を有する）および32Pに同族である35S燐酸ATPを選択することにより、治療剤の有効放射性寿命を顕著に増大させることができる。
かくして、本発明により標識された蛋白は、従来容易には得られなかった種類の極めて有利な性質を有する。
本発明は、不安定な同位元素の使用に限定されない。将来はNMR、核活性化または将来開発される方法により検出するのに適した安定な同位元素で蛋白を標識するのが有利となろう。同定しうるラベルである限り、標識は「放射性」ラベルである必要はない。
8.標識された抗原を用いる放射性免疫分析
本発明によれば、放射性標識された成分としてホスホリル化蛋白を一般に使用することができる。これら放射性免疫分析はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共に使用することができる。蛋白中への新たなホスホリル化部位の導入がホスホリル化部位の領域にて或は蛋白の遠隔直線位置でさえ蛋白の抗原構造を変化させかつ抗原特製をも変化させれば、本発明による蛋白を異なる位置でホスホリル化部位を導入するよう改変して、抗原特性を安定に維持すると共に蛋白を興味あるポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体に結合させることができる。
したがって、本発明はラベルを導入しうる位置に関し相当の多様性を与える。一般に、燐（またはその他の放射性ラベル）は抗原−抗体結合を破壊しない部位に導入するが好適である。
9.サンドイッチ放射性免疫分析
モノクローナル抗体を用いるサンドイッチ放射性免疫分析において、本発明による抗体中へのホスホリル化部位の導入は、第２の抗体の結合を追跡するため鋭敏な方法である。したがって、この種のサンドイッチ放射性免疫分析の感度を相当に増大させることができる。特に、複数のホスホリル化部位を本発明により蛋白中へ直接に或いは融合ホスホリル化カセットの追加により導入する場合、この種の分析の感度は何倍にも増大するであろう。
本発明の他の利点に注目すべきである。ホスホリル化反応は緩徐であるため、沃素もしくはその他の試薬で蛋白を放射性標識するのに必要な沃素化またはその他の化学的改変とは異なり、化学過程もしくは沃素化過程により失活されるモノクローナル抗体がホスホリル化法では失活されないと思われる。したがって、本発明の方法は、一般に沃素での標識に対し敏感過ぎる蛋白のホスホリル化を可能にする。35S同族であるホスフェートの導入は、長い半減期を有する放射性標識された蛋白誘導体を与える（125Iより1.5倍長くかつ32Pより６倍長い）。たとえば、Mabを35Sで標識すれば、32Pもしくは125I放射性標識された誘導体と対比して相当長い寿命を有する。
上記したように、本発明はたとえば125Iと比べて最も適する標識用同位元素の選択を可能にする。
10.影像処理
一般に動物もしくは患者における腫瘍もしくは組織の影像処理には、一般に多量に組織によって吸収される高エネルギーβ線よりも高エネルギーγ線が好適である。しかしながら、動物もしくは患者における或る種の影像研究においては32P、33Pもしくは35Sを本発明により導入されたホスホリル化部位を介して結合させるMabが有用である。
たとえば32P,33Pもしくは35Sで標識されたMabは、生検試料を検査せねばならない生体内試験において有用である。手術の際の腫瘍の範囲は、この腫瘍の局部的範囲を追跡すると共に手術の範囲を調べる放射性同位元素検出プローブを用いて追跡することができる。さらに、固定され或いは凍結される組織試料を採取して、これに上記蛋白（すなわち腫瘍関連性抗原もしくはその他の配位子）を結合させ続けることができる。したがって、組織断片の放射能写真は腫瘍広がりの程度に関する情報を与えることができ、さらに腫瘍関連性抗原に対する特異的モノクローナル抗体の結合程度を完全に測定することができる。さらに、細胞もしくは組織スライスと共にインビトロ試薬として、この種の標識された抗体は通常の種類の分析法を用いることにより腫瘍関連性抗原もしくはその他の抗原を検出するための極めて敏感な試薬となる。
11.抗−抗体
たとえば抗−ネズミ、抗−ヒト、抗−羊および抗−山羊抗体などの抗−抗体または単一体もしくはカクテルとしてのモノクローナル抗体につき多くの用途が知られている。この種の抗体を本発明により処理して単一もしくは複数のホスホリル化部位を導入することができ、したがって上記したように各種の同位元素で標識することができる。これらは、抗−抗体が必要とされる分野、特に放射性免疫分析、放射能写真または抗−抗体が有益であるその他任意の反応に一般的試薬を供給する。
12.ホスホリル化蛋白の迅速精製
さらに、本発明は蛋白を分離しかつ精製する用途をも有する。ホスホリル化された蛋白をホスホリル化されないものから分離することができ、また他のものよりも一層ホスホリル化された蛋白を分離することもできる。
たとえば、蛋白をホスホリル化しうる場合、分子の極く僅かをホスホリル化するのが一般的である。勿論、本発明にしたがって僅かな分子がホスホリル化を逃れるよう複数のホスホリル化部位を蛋白に導入することにより全ホスホリル化を向上させうることは勿論である。ホスホリル化蛋白を非ホスホリル化蛋白から分離しうることは、ホスホリル化分子と非ホスホリル化分子とが集団中に存在する場合、単一のホスホリル化部位を有する分子につき特に有用である。このようにして、ホスホリル化誘導体の効果が増大する。非ホスホリル化分子からのホスホリル化分子の分離は、誘導された燐酸基を用いてまたは用いずにホスホリル化部位に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を発生させて達成することができる。この種のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、蛋白を精製する際に相当な価値を有することが期待され、かつ従来記載されている。
13.蛋白の脱ホスホリル化
本明細書中にて、ホスホリル化の面に関しかなり強調した。ラベルの除去が容易化されるホスホリル化（燐酸基もしくはチオ燐酸基による）の場合は蛋白から125Iを除去するための従来技術における方法よりも蛋白分子の破壊性が低い傾向を有するため、脱ホスホリル化がより緩和な過程となる。すなわち、放射性同位元素を除去するのが有益である場合、これは酵素反応により比較的容易かつ緩和に達成することができる。この目的で、各種のホスファターゼを使用することができる。大抵のホスファターゼは比較的低い特異性を有するが、たとえば糖ホスファターゼに作用するもの並びにグリコーゲンシンセターゼｂおよびホスホリラーゼｂを脱ホスホリル化する酵素のような極めて特異性の高いものも存在する。さらに、ホスホリル化された蛋白の特異的脱ホスホリル化は、蛋白−セリンおよび−チロシンキナーゼの反応の逆転により達成することができる。実際に老化、変成もしくはその他の操作でなくホスフェート付加が蛋白の活性に変化をもたらすかどうかを確認する必要があれば、ホスフェートを除去して蛋白の活性を再び測定することができる。このようにして、蛋白の活性に対するホスホリル化の効果を明確に評価することができる。これは、各種のホスホリル化インタフェロンの活性を決定する際に有用である。
「脱ホスホリル化」の概念は、ここに教示したとは実質的に「逆」の興味ある用途を有する。天然状態の蛋白における部位が自然にホスホリル化しうるものであれば、この部位の除去は自然にホスホリル化しうる蛋白が望ましくない結果をもたらすことが知られている場合に特に望ましい。１例は、たとえばラウス肉腫ウィルス（RSV）および細胞オンコゲンのような発癌性ウィルスに関連した蛋白である。
14.ホスホリル化カセット
さらに本発明は、ホスホリル化部位（もしくはカセット）のコード配列を蛋白のヌクレオチドコード配列に挿入しないが本発明を用いて蛋白を標識するための他の方法を包含する。この方法は、各種の分析に使用するたとえば免疫グロブリンのような大型蛋白につき特に有用である。この種の代薬方法は、ホスホリル化されて大型蛋白に化学結合するポリペプチドを要求する。結合は、当業界で知られているように、任意の二官能性試薬または活性化誘導体（たとえばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド）によることができる。
この技術は、蛋白内部またはその１端部に導入しうる直列の或いは「カセット」としての複数のホスホリル化部位を有するポリペプチドを使用する。直列ホスホリル化部位をコードするDNAを制限部位と整列させて、容易に切断すると共に大型蛋白に結合すべき蛋白のコード配列を持ったDNAに挿入することができる。この種のホスホリル化カセットは小型ポリペプチドとして発現することができ、次いでホスホリル化し、次いで大型蛋白に化学結合させることができる。
15.ホスホリル化しうるヒト、もしくは動物のドナー遺伝子
さらに、適するベクターもしくは細胞ライン中に或いは動物中にさえトランスゲニック技術によりDNA配列を組込むことも本発明の範囲である。すなわち細胞もしくは動物は、ホスホリル化部位が本発明の方法により蛋白中に導入された後に、たとえば免疫グロブリンのようなホスホリル化しうる（および／またはホスホリル化された）蛋白を生成することができる。ネズミ可変領域およびヒト一定領域を有するホスホリル化しうるキメラ抗体を開発することができる。ドナー分子として用いられるヒト抗体を、単一もしくは複数のホスホリル化部位を有するよう処理することができる。同様に、これは免疫グロブリン以外の蛋白にも応用することができる。
16.蛋白の第三構造を地図化するためのホスホリル化部位の使用
小さいホスホリル化認識部位を全蛋白線状鎖に沿ってランダムに蛋白中へ導入することにより、蛋白の第三構造に関する情報を得ることができる。ホスホリル化部位をコードする配列は、興味ある蛋白をコードするDNA配列の内部にランダムに挿入される。この挿入は、ホスホリル化配列が上流および下流のコドンと整列するように行なってホスホリル化部位のための挿入が翻訳期を中断せずに行なわれるようにしなければならない。したがって、発現された蛋白は初期蛋白と同一の線状配列を有し、ホスホリル化部位は連鎖に沿った所定位置に挿入される。多数の挿入（理想的には蛋白連鎖の各アミノ酸位置の後）を行なうことにより、簡単な分析でその位置におけるホスホリル化の割合および程度を決定する意味において、キナーゼが配列を認識するかどうかを決定することができる。ホスホリル化の割合および程度は、第三構造における位置（外側、内側、埋設など）を反映するホスホキナーゼに対するその位置のアクセス性に依存する。全連鎖に沿ったホスホリル化部位のアクセス性の完全な線状マップは、第三構造配置における外側および内側の蛋白の構造の概略を示す。アミノ酸の挿入は、混乱を最小化するよう設計すべきである。或る場合には、ホスホリル化部位の挿入は、ホスホリル化認識部位を含む数個のアミノ酸を挿入するのでなく、１個もしくはそれ以上のアミノ酸を単に変化させるだけで生じうる。
挿入しうる突然変異蛋白の適当な種類を作成すべくこの種のDNA挿入を行なうには多くの方法がある。挿入は、飽和突然変異に匹敵する方法により系統的もしくはランダムに蛋白連鎖に沿って導入することができる。或いは、ホスホリル化部位をコードする配列をDNA中に挿入することにより所定のDNA配列から突然変異種を生ぜしめる代りに、全DNA連鎖が新たに合成されるよう合成オリゴヌクレオチドを生ぜしめることができる。これらの方法および一般的クローン化技術を組み合わせることにより、新たな突然変異蛋白の全保存物を容易に供給することができ、ホスホリル化部位を連鎖に沿って直接分布させることができる。
この方法は、溶液における蛋白の第三構造および折畳みに関する情報を与える。結晶における蛋白の第三構造に関する情報を与える推奨しうる方法は、たとえばＸ線結晶写真技術である。さらに、この方法は、Ｘ線結晶写真構造を決定するのに適した結晶を得るための努力を妨げるような蛋白の第三構造を決定するのに有用である。
この分野は、理想的には蛋白の配列における各アミノ酸の後に多数の推定ホスホリル化部位を有する蛋白、および対応のホスホリル化蛋白の例である。同様に、これは興味ある選択された蛋白をコードするDNA配列に挿入された推定ホスホリル化部位をコードするDNA配列の例である。
17.他の用途
本発明による標識蛋白には他の用途もある。一般に、ラベル（放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ラベル、酵素ラベルなどを有する任意の蛋白を、本発明にしたがい代薬としてホスホリル化部位の導入によりホスフェートで標識することができる。この種の蛋白の精製は、鋭敏な分析により酵素活性を追跡せずに燐酸基を受入れる能力を単に測定するだけで追跡することができる。したがって、本発明により処理されたこれら蛋白を容易に精製して、これを類似する他の蛋白の精製を追跡するためトレーサーとして使用することができる。たとえば、蛋白構造自身を極めて僅かに改変して処理された単一のホスホリル化部位を有する蛋白は、未改変蛋白と同様に精製されると思われる。
実際に、ホスホリル化しうる蛋白もくは一連のマーカーを貯蔵することにより、所望に応じて単にホスホリル化反応を行なうことにより、標識された誘導体を便利に作成することができる。したがって、ホスホリル化しうる本発明の蛋白は、対応する標識蛋白の有用な在庫を与える。
18.医薬および生物学上活性な組成物
本発明の改変蛋白は、医薬上有用な組成物を製造するため公知方法にしたがって処方することができる。たとえば、本発明によるヒトα−インターフェロン類似蛋白は、医薬上許容しうるキャリヤビークル混合される。適するビークルおよびその組成はたとえばE.W.マーチンによるレミントン・ファーマス−チカル・サイエンスに記載されており、これを参考のためここに引用する。この種の組成物は有効量のインタフェロン類似蛋白もしくはその他の蛋白を適当量のビークルと一緒に含有して、宿主に対し有効投与するのに適した医薬上許容しうる組成物を製造する。宿主は哺乳動物であってもなくてもよい。キャリヤは液体、固体などとすることができる。勿論、本発明の生物学上活性な組成物については、ヒトおよび動物の治療用途が目的とされる。本発明の生物学上活性な組成物は生物学上または治療上有効な量で投与することができ、この量は当業者により容易に決定することができる。一般に、これは実用上の目的またはその他の目的には過剰である量に対し所望の反応が得られる最少量である。
本発明の生物学上活性な組成物は、さらに所望の活性（特に本発明の改変蛋白の活性もしくは使用）に悪影響を与えない任意その他の生物学上活性な物質を含むこともできる。
本発明の改変蛋白は、組換DNA技術によるのでなく、化学的および／または酵素的合成によって得られることも理解される。
以上、本発明により可能となる特定の好適実施例および幾つかの用途につき説明したが、本発明はこれらのみに限定されず、本発明の思想および範囲内において多くの改変をなしうることが当業者には了解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１〜７図は融合−ハイブリッドインタフェロンを示し、第８〜13図は本発明により作成された他の改変インタフェロンを示すものである。
第１図はHu−IFN−αＡとHu−IFN−γとのハイブリッドインタフェロンHu−IFN−αA/γの略図であり、Hu−IFN−γセグメントは16個のCOOH−端末アミノ酸を示すと共に推定ホスホリル化部位を有し、
第２図はHu−IFN−αＡとHu−IFN−γとからの融合蛋白、すなわちHu−IFN−αA/γの作成概略を示す工程図であり〔ここで、pRC23/IFN−γからのEcoR I断片をpXZ−６（pIFN−αＡ）のBstE IIに対し平滑末端結合により結合させてpXZ−７を得た。pXZ−７のEcoR I断片をM13mp18に挿入してM13mp18/IFN−αA/IFN−γを得た。オリゴヌクレオチド指向性欠失を後者の生成物につき図示したオリゴヌクレオチドで行なって、適正な欠失を有する組換体（M13mp18/IFN−αA/γ）を得た。このM13組換体からのEcoR I断片でpXZ−６のEcoR I挿入物を交換してpXZ−８（pIFN−αA/γ）を得、この発現プラスミドはHu−IFN−αA/γ融合蛋白をコードする。適正な構造は、組換体の配列決定により確認された。T4−ｔはファージT4転写ターミネータを示し、Apはアンピシリンを示し、cipは牛腸ホスファターゼを示す〕、
第３図はハイブリッドHu−IFN−αA/γのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、
第４図は精製蛋白のポリアクリルアミドゲル電気泳動図であり〔ここで、レーン１はHu−IFN−αＡを示し、レーン２は融合蛋白Hu−IFN−αA/γを示し、かつレーン３はHu−IFN−γを示し、分子量標準（STD）は右側の欄に示され、ゲルは銀染色で発色させた〕、
第５図はホスホリル化されたHu−IFN−γおよび融合蛋白Hu−IFN−αA/γのポリアクリルアミドゲル電気泳動図であり〔ここで、図面の左側パネルはクーマシー青で染色されたゲルを示し、右側パネルは左側パネルで示したと同じゲルの放射線写真図を示し、MW69,000における重染色バンドはホスホリル化反応に添加された牛血清アルブミンを示す〕、
第６図はダウジ細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合を示す説明図であり〔ここで、ダウジ細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合は「実験手順」に記載したように行なった。特定の結合（●）は全結合（○）と非特異的結合（△）との間の差を示す。非特異的結合は、過剰の未標識Hu−IFN−α/A存在下における結合を示す。〔32P〕Hu−IFN−αA/γの特異活性は約141μCi/μｇであった〕、
第７図はMDBK細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αA/γの結合を示し〔ここで、記号および説明は第６図と同様である〕、
第８図はHu−IFN−αA,Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3のCOOH末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列図であり〔ここで、Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3で形成されたcAMP−依存性蛋白キナーゼにより認識されるホスホリル化部位を矩形内に示す。これら部位は追加アミノ酸と一緒にcAMP−依存性牛心臓キナーゼに対する認識配列Arg−Arg−Ala−Ser−LeuもしくはArg−Arg−Ala−Ser−Val（このSerをホスホリル化するため）を有する。インタフェロンのヌクレオチド配列とアミノ酸配列とを比較のため整列させた〕、
第９図はホスホリル化部位を有するHu−IFN−αＡのための発現プラスミドの作成図であり、
第10図はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるHu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白の分析図であり〔ここで、ゲルは銀染色した。分子量標準を１番左側のレーンに示す〕、
第11図はホスホリル化された蛋白のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の放射線写真図であり〔ここで、Hu−IFN−γが第10図におけると同様な内部分子量標準として役立つ〕、
第12図は細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−Ｐ蛋白の結合を示す説明図であり〔ここで、挿入図は特定結合データのスカッチャード分析を示し、「Ｂ」は細胞に結合した配位子の放射能を示し、かつ「Ｆ」は遊離もしくは未結合配位子の放射能を示し、「Ａ」および「Ｂ」はそれぞれダウジ細胞およびMDBK細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1の結合を示し、「Ｃ」および「Ｄ」はそれぞれダウジ細胞およびMDBK細胞に対する〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P2の結合を示す〕、
第13図は架橋した〔32P〕Hu−IFN−αＡ−P1,−P2および−P3リセプタ複合体の電気泳動分析図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１２】
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