(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞を形質転換するためのシャトルベクターであって：
ａ．原核性複製起源と；
ｂ．昆虫プロモータおよび原核性プロモータ配列を含むプロモータ領域と；
ｃ．昆虫細胞および原核細胞内において、夫々昆虫プロモータ配列および原核性プロモータ配列の転写制御下で、ブレオマイシン／フレオマイシン型の抗生物質に対する耐性を与えることができる選択マーカー遺伝子
とを具備するシャトルベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のシャトルベクターであって、前記原核性プロモータ配列は、昆虫プロモータ内の隠れたプロモータであるシャトルベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のシャトルベクターであって、前記ブレオマイシン／フレオマイシン型の抗生物質がゼオシンであるシャトルベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のシャトルベクターであって、更に、異種ＤＮＡのための挿入部位を具備するシャトルベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のシャトルベクターであって、前記異種ＤＮＡのための挿入部位は、第二の昆虫プロモータの転写制御下にあるシャトルベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のシャトルベクターであって、更に、前記挿入部位に挿入され且つ前記第二の昆虫プロモータの転写制御下にある異種ＤＮＡ配列を具備するシャトルベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のシャトルベクターであって、前記昆虫プロモータは、配列番号１０で表されるＩＥ２Ｂ要素を具備するシャトルベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のシャトルベクターであって、前記昆虫プロモータは、配列番号９および配列番号１０で表されるＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ要素対を具備するシャトルベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のシャトルベクターであって、前記昆虫プロモータは、配列番号１のｂｐ３５１〜ｂｐ５２７に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ該プロモータとして機能できる配列を具備するシャトルベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のシャトルベクターであって、前記昆虫プロモータは、配列番号１に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ該プロモータとして機能できる配列を具備するシャトルベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載のシャトルベクターであって、更に、トランスポゾンを形成するＤＮＡ転移性要素を具備するシャトルベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のシャトルベクターであって、前記選択マーカー遺伝子が前記トランスポゾン内にあるシャトルベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシャトルベクターであって、更に、前記トランスポゾン内に異種ＤＮＡのための挿入部位を具備するシャトルベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシャトルベクターであって、更に、前記挿入部位に挿入され且つ第二の昆虫プロモータの転写制御下にある異種ＤＮＡ配列を具備するシャトルベクター。
【請求項１５】
請求項１１に記載のシャトルベクターであって、更に、前記トランスポゾン内に誘導性トランポザーゼ遺伝子を具備するシャトルベクター。
【請求項１６】
請求項１のシャトルベクターで形質転換された昆虫細胞。
【請求項１７】
請求項１１のシャトルベクターで形質転換された昆虫細胞。
【請求項１８】
昆虫細胞を形質転換させる方法であって：
ａ．昆虫細胞を、昆虫プロモータの転写制御下にある選択マーカー遺伝子を具備する昆虫シャトルベクターを取り込むように誘導すること（ここで、前記選択マーカー遺伝子はブレオマイシン／フレオマイシン型の抗生物質に対する耐性を付与することができ、前記昆虫プロモータは前初期バキュウロウイルスプロモータに対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ該プロモータとして機能できる）と；
ｂ．ブレオマイシン／フレオマイシン型の抗生物質に対して耐性の形質転換細胞を選択することとを具備する方法。
【請求項１９】
請求項１のシャトルベクターで形質転換された組換え昆虫細胞であって、メラノトランスフェリンから選択される異種タンパク質を発現する組換え昆虫細胞。
【請求項２０】
メラノトランスフェリンから選択される異種タンパク質を産生するための方法であって、請求項１９の細胞によって前記異種タンパク質を産生させることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１のシャトルベクターで形質転換された組換え昆虫細胞であって、昆虫イオン輸送ペプチドホルモンから選択される異種タンパク質を発現する組換え昆虫細胞。
【請求項２２】
昆虫イオン輸送ペプチドホルモンから選択される異種タンパク質を産生するための方法であって、請求項２１の細胞によって前記異種タンパク質を産生させることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１のベクターで安定に形質転換された細胞を有する昆虫。
【発明の詳細な説明】
本願は、１９９７年３月２７日出願の同時係属中の米国仮出願第６０／０４９，９４６号に基づく優先権を主張する。該出願は参照として本明細書に組み込まれる。
〔発明の領域〕
本発明は、遺伝子工学用ベクターの領域に関する。本発明は、形質転換された細胞、特に安定的に形質転換された昆虫細胞における異種タンパク質の発現を行うためのベクター、該ベクターを用いるための方法、および該ベクターで形質転換された細胞に関する。
〔発明の背景〕
培養細胞を外来ＤＮＡ配列で形質転換することは、遺伝子発現の研究、および商業的に重要な異種遺伝子産物、例えば有益タンパク質の作製において有用である。単純なタンパク質は、細菌細胞において作製されうる。しかし、多くの真核生物のタンパク質は、適切に機能するために、原核細胞では行われない翻訳後修飾を必要とする。原核細胞におけるタンパク質の発現に関しては、他の問題も存在する。例えば、いくつかの発現された異種タンパク質は、原核細胞において不溶性の封入体として沈積し、それによりタンパク質の回収が困難となる。原核細胞発現系に関連した問題の多くは、形質転換された哺乳動物細胞培養系を使用して、翻訳後プロセシングを受けたタンパク質を作製することにより克服することができる。しかし、哺乳動物細胞培養は、増殖が遅いために比較的効率が低く、維持が困難で、コストを要する。
昆虫細胞の培養における進歩、およびバキュロウイルスを基礎とした発現系の開発により、形質転換された昆虫細胞による異種タンパク質の発現が促進された（Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．，６：４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７−１９９（１９８８））。現在までのところ、形質転換された昆虫セルラインにおける異種タンパク質の発現は、主にバキュロウイルス、オートグラファカリフォルニアマルチキャプシド核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）由来のベクターを用いて達成されている（Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．，６：４７−５５（１９９８）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７−１９９（１９８８））。バキュロウイルスは、典型的な感染周期の最後に、感染された昆虫細胞を溶解させて殺す二本鎖ＤＮＡウイルスである。様々なバキュロウイルスが知られており、それぞれが特定の節足動物種に限って感染する。バキュロウイルスは、節足動物門以外の動物においては複製を行うことが知られていない。この領域における先行技術の理解には、バキュロウイルス感染の分子生物学をある程度認識することが必要である。
昆虫の自然なバキュロウイルス感染の際の遺伝子発現は、高度に制御されており、規則正しいカスケードとして起こる。ウイルス遺伝子は、この遺伝子発現カスケードにおける位置に従い、前初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）（ｉｅ）、後初期（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅａｒｌｙ）（ｄｅ）、後期（ｌａｔｅ）、および超後期（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ）という４つの異なる群に分類され得る。初期の遺伝子発現は、ウイルスＤＮＡ複製の開始前に起こり、後期のウイルス遺伝子発現の誘導に必須であると考えられる（Ｂｌｉｓｓａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｏｈｒｍａｎｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，３５：１２７−１５５（１９９０）；Ｇｕａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：４６３−４７１（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２６：３７６−３８０（１９８３））。実験により、バキュロウイルスｉｅ遺伝子は、他のウイルス性因子の存在なしに、宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されることが証明されている。従って、バキュロウイルスｉｅ遺伝子は、宿主細胞の転写機構により認識されるプロモーターを有していることが理解される。
ＡｃＭＮＰＶ誘導体を基礎とした先行技術の発現系においては、外来遺伝子発現は、一般的に、ポリヘドリン（ｐｏｌ）プロモーターまたはｐ１０プロモーターのような極めて強力な後期ウイルスプロモーターにより行われる。しかし、そのようなバキュロウイルス後期プロモーターからの発現は、ウイルスによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを転写に利用しており、許容性の鱗翅目細胞、即ち溶解性バキュロウイルス感染を許容する細胞に制限されている（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６：１５３−１６０（１９８５））。そのような系により産生された組換えタンパク質の発現、分泌、および回収を最適化するため、多様なバキュロウイルス発現ベクターが設計されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（１９９２）；ＪａｒｖｉｓおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎの米国特許第５，１７９，００７号；Ｌｅｎｈａｒｄら，Ｇｅｎｅ，１６９：１８７−１９０（１９９６））。Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、リン酸化、アシル化、タンパク質分解（Ｋｉｄｄ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｙ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４３：１３７−１５９（１９９３））およびアミド化（Ａｎｄｅｒｓｏｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０：２１９−２２４（１９９１））などの、哺乳動物セルラインにおいて起こることが知られている多くの翻訳後修飾も、ＡｃＭＮＰＶ誘導体に感染した昆虫セルラインにおいて、少なくともある程度は起こる。
ＡｃＭＮＰＶを基礎とした発現系を用い、核または細胞質に局在するタンパク質を適当な量で発現させることができる（１９９３年１月１２日にＪａｒｖｉｓらに付与された米国特許第５，１７９，００７号）。しかし、小胞体に関連した分泌経路に入るタンパク質は、低レベルに発現されることが多い（Ｊａｒｖｉｓ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（１９９３））。この高度に修飾された膜結合タンパク質および分泌タンパク質のサブセットには、細胞表面レセプター（Ｃｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４３−１５４９（１９９５））、抗体（Ｈｓｕら，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，５：５９５−６０３（１９９４））および分泌型ワクチン成分（Ｌｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０４：２６６−２７８（１９９４））のような重要な生物活性種が含まれる。この種のタンパク質は、溶解性ＡｃＭＮＰＶを基礎とした系において、比較的少ない量で、異質の形態で発現されることが多い。発現レベルの減少およびプロセシングの変化は、感染細胞の正常なタンパク質発現機構に対する障害が溶解性バキュロウイルス感染の進展により引き起こされる結果であるかもしれない（Ｋｒｅｔｚｃｈｍａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７５：３２３−３２７（１９９４）；Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１２：５００−５１１（１９９５）；Ｃｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４３−１５４９（１９９５））。従って、感染周期の初期にタンパク質を発現することができるバキュロウイルスベクターの作出に向けて研究がなされている（Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１２８８−１２９２（１９９６）；Ｊａｒｖｉｓら，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，８：１９１−２０３（１９９６））。
溶解性バキュロウイルス感染系に関連した問題を克服するため、昆虫セルラインの安定的な形質転換のための方法が開発された。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）シュネイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞が、異種タンパク質発現を行うためのキイロショウジョウバエメタロチオネインプロモーターおよび形質転換体を同定するためのハイグロマイシン選択を利用する系により安定的に形質転換された（Ｊｏｈａｎｓｅｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，３：８８２−８８９（１９８９）；Ｃｕｌｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１７３−１７７（１９９１））。双翅目セルライン（キイロショウジョウバエおよびアエデスアルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、カ）が、異種タンパク質発現を行うためのキイロショウジョウバエｈｓｐ７０プロモーターまたはＡｃＭＮＰＶ  ｉｅ１プロモーターおよび形質転換体を同定するためのメトトレキセート選択を利用する系により安定的に形質転換された（Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３８０：２５７−２６２（１９９６））。鱗翅目セルライン（Ｓｆ９、フォールアーミーフォーム（ｆａｌｌ  ａｒｍｙ  ｗｏｒｍ）スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来）は、異種タンパク質発現を行うためのＡｃＭＮＰＶ  ｉｅ１プロモーターおよび形質転換体を同定するためのゲネチシン（Ｇ−４１８）選択を利用する系により安定的に形質転換されたが、この系における発現は、比較的効率が低いことが見出された（Ｊａｒｖｉｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：９５０−９５５（１９９０）；１９９１年１２月３１日にＧｕａｒｉｎｏおよびＪａｒｖｉｓに付与された米国特許第５，０７７，２１４号）。これらの各形質転換系においては、あるベクター上の選択マーカーが、異種タンパク質発現カセットを保持する別の発現ベクターと共に形質転換された。共形質転換する必要のある別のプラスミドを使用することにより、形質転換過程が複雑になる。なぜなら、選択マーカーを獲得するセルラインの全てが、所望の発現ベクターをも獲得するわけではないためである。従って、選択マーカーおよび発現カセットの両方を提供することができるベクターが、当分野において必要とされている。
安定的に形質転換された昆虫細胞において異種タンパク質を発現させるための強力なプロモーターも、当分野において必要とされている。この必要を満たすことを試みて、Ａｃ  ｉｅ１プロモーターからの発現を増大させるためｈｒエンハンサー因子が使用された（Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３８０：２５７−２６２（１９９６））。ｈｒエンハンサーは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスのゲノム全体に散在する５つの大きな同種領域として存在し、隣接する遺伝子の転写を活性化するよう機能する（Ｌｅｉｓｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０８：７４２−７５２（１９９５））。しかし、ｈｒ因子の作用を調節するためには特異的な細胞性因子またはバキュロウイルスのコードする因子が必要であるかもしれないため、形質転換系におけるｈｒ因子の使用は困難であるかもしれない（Ｇｌｏｃｋｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３４７６−３４８４（１９９２）；Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：４５４８−４５５１（１９９５）；Ｒｏｄｅｍｓ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：５３６８−５３７５（１９９５））。また、プロモーターにエンハンサー配列を追加することにより、プロモーターの大きさが有意に増大し、必然的に、関連ベクター内の所望の異種遺伝子のための場所が減少する可能性がある。従って、エンハンサー配列を必要とせずに、選択マーカー発現を含む異種タンパク質発現を適当なレベルで行うことができるプロモーターが、当分野において必要とされている。
転移因子は、多数の生物における形質転換ベクターとして使用されている。転移因子は、自律複製能を有し、細胞のゲノム内の様々な位置に挿入されうることを特徴とする可動性ＤＮＡセグメントである。転移因子には、１）短い逆位繰り返し構造クラスのＤＮＡトランスポゾン（「ＤＮＡ転移因子」）および２）ＲＮＡ中間体を経て複製し、転移に逆転写活性を必要とするレトロトランスポゾン（例えば、国際特許公開第８８／０３１６９号に開示されているもの）という２つの異なるクラスが存在する。本発明の一つの面は、レトロトランスポゾンとは区別される短い逆位繰り返し構造クラスのＤＮＡ転移因子に関する。
完全なＤＮＡ転移因子は、因子の転移を媒介するトランスポザーゼ酵素をコードする。トランスポザーゼタンパク質は、因子の末端近傍のＤＮＡ配列と相互作用する。典型的には、ＤＮＡ転移因子がトランスポザーゼ酵素に応答できるためには、完全な末端（通常約１５０から２５０塩基対）が必要である。
ＤＮＡ転移因子Ｐ、ｈｏｂｏ、ｍａｒｉｎｅｒ、Ｉ、およびＨｅｒｍｅｓ（ムスカドメスティカ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来のｈｏｂｏ様可動性因子）は全て、ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエを形質転換するために使用されている（Ｏ’Ｂｒｏｃｈｔａら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  Ｓｕｐｐｌ．，２１Ａ：１９５（１９９５）；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１４：５３３−５４０（１９８８））。Ｐ因子の非コーディング領域内には外来ＤＮＡの大きな断片（＞１２ｋｂ）を組み込むことができ、転移により複製能が損なわれることはない（Ｍｅｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｉｇｌｉａｔｔｉ，Ｇｅｎｏｍｅ，３６：１１６９−１１７５（１９９３））。ＤＮＡ転移因子Ｔｃ１は、回虫カエノラブディテスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｅｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を形質転換するために使用されている。所望の形質転換体の選択は、いずれの形質転換系においても重要な工程である。栄養要求性相補または優性選択に基づく形質転換系が哺乳動物系での使用のためにいくつか設計されているが、昆虫細胞に適合するものは比較的少ない（Ｗａｌｋｅｒ，Ａｄｖ．Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔ．，７：８７−１２４（１９８９）；Ｃａｒｌｓｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，４０：３５９−３８８（１９９５））。細菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を用いたキイロショウジョウバエ細胞のメトトレキセート耐性への形質転換は、Ｂｏｕｒｏｕｉｓ  ａｎｄ  Ｊａｒｒｙ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１０９９−１１０４（１９８３）により最初に記述された。その後、Ｓｈａｔｋｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｆａｌｌｏｎ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２３：８８３−８９３（１９９３）は、カ細胞において優性選択マーカーとして機能するカのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を記述した。これらの例において、形質転換用ＤＮＡは、反復構造として、そして無秩序に組み込まれた単一コピーとしてゲノムに取り込まれた。しかし、選択圧が存在しない場合には、トランスフェクト用ＤＮＡの消失が観察された（Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｆａｌｌｏｎ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２３：８８３−８９３（１９９３））。細菌のネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の導入後、ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性をキイロショウジョウバエ（Ｓｔｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｉｒｏｔｔａ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：１６７−１７１（１９８５））およびその誘導セルライン（Ｌｉｏ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１８３３−１８３８（１９８５））の両方、カ（Ｍａｉｓｏｎｈａｕｔｅ  ａｎｄ  Ｅｃｈａｌｉｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９７：４５−４９（１９８６）；Ｌｙｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ｃｒａｍｐｔｏｎ，Ｇｅｎｅ，１３６：１２９−１３６（１９９３））ならびにＳｆ９鱗翅目セルライン（Ｊａｒｖｉｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．，８：９５０−９５５（１９９０））に与えることができる。しかし、引き続く選択から生じる遺伝子増幅および高頻度の自発的耐性（ＭｃＧｒａｎｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，３９：５０２−５１０（１９８８））のため、いくつかの例においてはこの選択系を使用することが困難である。細菌のハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子により供給されるハイグロマイシン耐性は、Ｇ４１８に基づく選択系よりも信頼性が高く、選択が迅速であることが報告されている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｒａｔｅｎら，Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ（１９８９）；Ｃａｒｌｓｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，４０：３５９−３８８（１９９５））。しかし、ハイグロマイシン耐性へと形質転換されたカセルラインにおいては、導入されたプラスミドが大いに増幅され、長いタンデムアレイ（ｔａｎｄｅｍ  ａｒｒａｙｓ）として、または自律複製性の染色体外偽染色体として存在した（Ｍｏｎｒｏｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７２５−５７２９（１９９２））。遺伝子の再編成、タンデムアレイ、または染色体外因子はいずれも、一旦選択が緩和されると、耐性遺伝子の急速な消失をもたらす。従って、特に安定的に形質転換された昆虫細胞の選択において使用するため、改良された選択系およびＤＮＡを効率的に宿主細胞のゲノムに挿入する方法が必要とされている。
ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）は、ストレプトミセスバーティシラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）から単離された、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）／フレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）ファミリーの抗生物質の一つである（Ｂｅｒｄｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌ  ＩＶ，Ｐａｒｔ１，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ（１９８０））。ゼオシンは、フランス、トゥールーズのＳ．Ａ．Ｒ．Ｌ．Ｃａｙｌａの登録商標であり、そこから入手可能である。ゼオシンは、銅がキレート化した化学式Ｃ５５Ｈ８３Ｎ１９Ｏ２１Ｓ２Ｃｕで表される糖ペプチドである。
ブレオマイシン／フレオマイシンファミリーの抗生物質に対する耐性は、化学量論的に抗生物質に結合する、ストレプトアロテイカスヒンダスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）ｂｌｅ遺伝子の産物である１３．６ｋＤａのタンパク質により付与される（Ｇａｔｉｇｎｏｌら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２３０：１７１−１７５（１９８８））。ｂｌｅ耐性遺伝子は、哺乳動物細胞（Ｍｕｌｓａｎｔら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：２４３−２５２（１９８８））および植物細胞（Ｐｅｒｅｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：３６５−３７３（１９８９））にゼオシン耐性を付与するための使用に成功している。他の属由来の細胞に対するブレオマイシン／フレオマイシン抗生物質の効果は予測できない。
ゼオシンを選択マーカーとして使用することに関しては、多数の問題が考えられる。銅がキレート化した形態の薬物は、不活性である。ゼオシンの作用機序について現在完全には理解されていないが、キレート化した銅をＣｕ２＋からＣｕ１＋に還元するための適当な条件が標的細胞内で満たされ、細胞内で銅イオンがスルフヒドリル化合物により除去された場合にのみ活性化が起こることが示唆されている。高い塩濃度はゼオシンを不活化する可能性がある。酸性または塩基性の溶液によってもこの薬物は不活化されうる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ”ｐＺｅｏＳＶ２（＋）  ｏｒ  ｐＺｅｏＳＶ２（−）”製品マニュアル，Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
昆虫細胞発現系が重要である大きな理由は、複雑な翻訳後修飾を達成できるためである。しかし、所望のタンパク質への正確な翻訳後修飾の性質には、セルラインによりばらつきが存在する可能性がある。従って、いずれのセルラインが所望のタンパク質を最も多く発現しているかを決定するため、多様な種に由来する多数の形質転換された昆虫セルラインをスクリーニングすることが有用であるかもしれない。そのようなスクリーニング過程を達成するため、ある範囲の昆虫セルラインを安定的に形質転換し強力に異種タンパク質を発現させることができる発現ベクターが当分野において必要とされている。
〔発明の概要〕
本発明の一つの面は、昆虫セルラインにおける選択系としてのゼオシンの使用に関する。選択系としてのゼオシン耐性の使用は、先行技術の昆虫選択系よりも優れた重要な予想外の利点を提供しうる。これらの利点には、以下のものが含まれる。選択に必要な抗生物質の濃度が比較的低い（結果として細胞培養コストが減少する）。真核生物系および原核生物系の両方で同一の選択スキームが有効である（従って、ベクターは一つの耐性遺伝子のみを保持していればよく、ベクターの大きさを最小限に抑えることができる）。さらに、ｂｌｅ耐性遺伝子の大きさは小さいため（３７４ｂｐ）、小型のクローニングベクターを開発することが可能である（ここでも、ベクターの大きさを最小限に抑え、それによりベクターが異種配列を取り込む能力を最大にすることができる）。もう一つの間接的な利点として、本発明によりゼオシン耐性選択系が利用可能となることにより、昆虫細胞と共に使用するためのオルタナティブ選択スキームのレパートリーが拡大する。オルタナティブ選択系の使用は、例えば、複数の構築物が集合的または連続的に特定の宿主細胞へと導入され、該構築物がそれぞれ異なる選択系を利用するような場合に、特に有用である。比較的小型のゼオシン選択系から得られるさらなる利点は、β−ガラクトシダーゼまたはグリーンフルオレセントプロテインの遺伝子のような、非干渉性（ｕｎｏｂｔｒｕｓｉｖｅ）のレポーター遺伝子配列を本発明のベクターに追加することが可能な点である。
本発明の一つの面は、ブレオマイシン／フレオマイシン型抗生物質ファミリーに属する抗生物質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子の発現を調節するための、バキュロウイルス前初期プロモーター由来のプロモーターの使用に関する。一つの面において、選択マーカー遺伝子は、昆虫細胞にゼオシン耐性を付与することが本明細書において示される、ストレプトアロテイカスヒンダスタナス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）ｂｌｅ遺伝子であってもよい。選択マーカー遺伝子からの転写を調節するため、オルギアシュードツガタマルチキャプシド核多角体病ウイルス（Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ  ｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＯｐＭＮＰＶ）のｉｅ１遺伝子およびｉｅ２遺伝子に由来するｉｅ１プロモーターおよびｉｅ２プロモーターを、選択マーカー遺伝子に機能的に結合させることができる。プロモーターは、ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーターの一部分、特にＩＥ２Ｂ因子または対ＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ因子（ｐａｉｒｅｄ  ＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と名付けられた配列モチーフを含む部分に相同な配列を包含していてもよい。
本発明の一つの面は、挿入されたコーディング配列をバキュロウイルス前初期プロモーターに機能的に結合させることができる多重クローニング部位を含む発現ベクターである。この発現ベクターは、異種タンパク質を産生する安定的な昆虫セルラインを構築するため、昆虫セルラインに選択優位性を付与する他のベクターと共に使用することができる。
一つの面において、本発明のシャトルベクターは、多重クローニング部位またはバキュロウイルス前初期プロモーターに機能的に結合した異種コーディング配列を含んでいてもよい。本発明のこの面によると、ＯｐＭＮＰＶのｉｅ１プロモーターまたはｉｅ２プロモーターに相同なプロモーターを、形質転換された双翅目セルラインおよび鱗翅目セルラインにおいて異種遺伝子を発現させるため使用することが可能である。
昆虫セルラインおよびイー・コリにおいてゼオシン耐性遺伝子を発現させ、真核生物および原核生物の形質転換体両方の選択を可能にするキメラＯｐ  ｉｅ合成細菌プロモーターを包含する小型シャトルベクターが開示される。広範囲の双翅目および鱗翅目の昆虫細胞における構成性の異種タンパク質発現のため、ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーターを使用する、一連の広域発現ベクターが開示される。いくつかの面において、本発明のベクターは、双翅目セルラインにおける金属誘導性タンパク質発現のためのキイロショウジョウバエメタロチオネイン（Ｍｔｎ）プロモーターを包含する。本発明の他の面は、昆虫細胞における誘導性タンパク質発現のための修飾されたｌａｃＩ／Ｏ成分またはｔｅｔ成分の使用を包含する。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの使用に関連した予想外の利点、例えば広範囲の昆虫細胞宿主における機能、非昆虫セルラインにおける限定された発現、エンハンサー様配列の非存在下での高レベルの発現、および潜在的な原核生物プロモーター機能が開示される。
本発明の面には、形質転換された昆虫セルライン中の高度にプロセシングされたグリコシルホスファチジルイノシトール結合型糖タンパク質、ヒトメラノトランスフェリン、分泌型第Ｘ因子、および分泌型イオントランスポートペプチドホルモン（ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＩＴＰ）を含む、異種遺伝子の構成性および誘導性の発現のため形質転換されたセルラインが含まれる。
本発明のベクターは、形質転換されたセルラインにおけるタンパク質産生能を調査し、それにより高レベルの異種タンパク質を発現するクローナルセルラインまたは細胞集団の回収を促進するために有用な、β−ガラクトシダーゼまたはグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）のコーディング遺伝子のような、非干渉性のレポーター遺伝子を包含していてもよい。これらの非干渉性のレポーター遺伝子を、ゼオシン耐性のような抗生物質耐性遺伝子にインフレームのタンパク質融合により結合させ、抗生物質耐性および／またはＦＡＣＳの両方によりセルラインの分析および選択を可能にすることができる。
本発明のベクターは、トランスポゾンを定義する転移因子を包含するトランスポゾンを基礎としたタンパク質発現カセット、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾン内に存在する異種タンパク質コーディング配列を含んでいてもよい。そのようなベクターをトランスポザーゼ供給源を有するセルラインに導入することができる。トランスポザーゼ供給源を供給するためのいくつかの機序が開示される。一つの実施態様において、誘導性のゲノム由来トランスポザーゼ遺伝子からトランスポザーゼを供給するため、トランスジェニック昆虫セルラインが誘導される。トランスポザーゼが発現すると、酵素はゲノムＤＮＡへとトランスポゾンを侵入させる。トランスポザーゼが発現している間、トランスポゾンを基礎とした発現カセットのコピー数は、新たなゲノム部位へのカセットの重複性転移により次第に増大するかもしれない。トランスポザーゼ発現を調節して、トランスポゾンの移動を制御し、それによりトランスポゾンのコピー数を調節することができる。特定の異種タンパク質の発現レベルは、セルラインが保持するトランスポゾンを基礎とした発現カセットのコピー数を最適化することにより最適化することができる。
本発明の一つの面において、Ｐトランスポゾンを基礎とした発現カセットを、ＳＬ２セルラインを形質転換するために使用することができる。ベクターは、トランスポゾンを定義するＰ因子逆位繰り返し構造トランスポゾン末端を包含していてもよく、トランスポゾン内に、誘導性トランスポザーゼ遺伝子（転移を調節するため）、選択マーカー（形質転換された細胞のみを選択するため）および異種タンパク質発現カセット（多重クローニング部位を含んでいてもよい）を包含していてもよい。他の実施態様において、トランスポザーゼ遺伝子はセルラインのゲノムに安定的に組み込まれてもよい。または、トランスポザーゼ遺伝子は、組み込みを媒介するトランスポザーゼを供給するが、それ自体は転移によりゲノムに組み込まれ得ない形質転換ヘルパープラスミドへと取り込まれてもよい。
本発明は、体細胞においてトランスポザーゼが活性を有するようにさせるため第三イントロンが除去されているＰトランスポザーゼ遺伝子がゲノムに組み込まれているＳＬ２セルラインを含む（△２−３）。この実施態様において、△２−３トランスポザーゼ遺伝子は、トランスポザーゼ発現が誘導されるよう、メタロチオネイン（Ｍｔｎ）プロモーターの調節下にある（セルラインはＳＬ２ＭＴ△２−３と名付けられる）。
いくつかの実施態様において、本発明のトランスポザーゼベクターの因子は、形質転換体を容易に同定するための機序（ゼオシン耐性など）、安定的に組み込まれたベクターのコピー数の増大を誘導するための機序（誘導性トランスポザーゼ）、および異種タンパク質発現が増大している可能性のあるクローンを容易に同定するための機序（異種配列コピー数の指標となる非干渉性のマーカー）を提供するため、組み合わされていてもよい。実際、そのようなベクター内の構造的特徴の新規な組み合わせは、形質転換された昆虫細胞からの異種タンパク質の産生において様々な段階で重要な機能的利点を提供するよう協調作用する。
【図面の簡単な説明】
図１ａ  ＣＡＴレポーター遺伝子構築物ｐＩＥ２ＣＡＴを用いたＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーターの欠失解析。グラフは、Ｓｆ９（サンプルＡおよびＢ）並びにＫｃ１（Ｃ）を用いた２つの代表的なサンプル実験からの相対速度を示している。全ての速度が、欠失−２７５の値を１００％とした相対速度である。グラフの下の数字は、プロモーター欠失構築物の５’末端の、転写開始部位に対する相対位置を示す。グラフの下の概略図は、ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーターの図、ならびにＧＡＴＡ因子（黒丸）、ＩＥ２Ｂ因子（白丸）、リピートＩ  ＢおよびリピートＩＩ  ＡおよびＢ（斜線付の四角）、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＧＴ転写開始部位（黒四角）を含む特定のモチーフのおよその位置を示す。影付きの矢印は、ＣＡＴオープンリーディングフレームを示す。グラフと概略図を連結している線は、ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーター上の欠失の５’末端のおよその位置を示す。
図１ｂ  ＣＡＴレポーター構築物を用いたキメラ合成ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーター構築物の分析。ｐ２ＺｅｏＳｙｎ−２３７と名付けられた基本のプロモーターは、ヌクレオチド−２３７までのＧＡＴＡ配列およびＩＥ−２Ｂ配列を全て含んでいた。この配列を二重化および三重化した効果を、Ｌｄ６５２Ｙセルライン、Ｓｆ９セルライン、Ｋｃ１セルラインで比較する。さらに、ｉｅ−２遺伝子の３’に見出されるエンハンサー（ＯｐＥ）の位置的な効果を研究した。様々なセルラインにおける比較結果を図に示す。
図２ａ  ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２遺伝子およびＡｃＭＮＰＶ  ｉｅｎ遺伝子のプロモーター配列の比較（Ｋｒａｐｐａ  ａｎｄ  Ｋｎｅｂｅｌ−Ｍｏｒｓｄｏｒｆ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：８０５−８１２（１９９１））。転写開始部位をヌクレオチド配列の上下の矢印で示す。アラインメントは、ゼロ（ｚｅｒｏ）のギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いたＧＡＰ配列解析プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９８４））により作製した。ＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーター内に同定された繰り返し構造因子を二重下線で示し、ＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂと記した。ＡｃＭＮＰＶ  ｉｅｎプロモーター（Ｃａｒｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：９４５−９５１（１９９１）；Ｋｒａｐｐａ  ａｎｄ  Ｋｎｅｂｅｌ−Ｍｏｒｓｄｏｒｆ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：８０５−８１２（１９９１））内の逆位繰り返し構造およびＯｐＭＮＰＶ  ｉｅ２プロモーター内の関連配列を下線で示し、ＲＥＰＥＡＴ  Ｉ  Ａ、ＲＥＰＥＡＴ  Ｉ  Ｂ、ＲＥＰＥＡＴ  ＩＩ  ＡおよびＲＥＰＥＡＴ  ＩＩ  Ｂと記した。縦の線は、同一ヌクレオチド配列を示す。配列の上に、図１に示されたＩＥ−２ＣＡＴプロモーター欠失の５’末端の位置も示されている。
図２ｂ  ＩＥ２Ｂプロモーター因子の繰り返し配列のアラインメント。因子のｉｅ２転写開始部位に対する相対位置が番号で示されている。逆向きの因子はＲで表す。図２ｂに示されるリピートＡからＩの位置は、図２ａに括弧内の参照文字で表されている。
図３  Ａｃ  ｉｅ１ｈｒ遺伝子、Ｏｐ  ｉｅ１遺伝子およびＯｐ  ｉｅ２遺伝子に由来するプロモーター領域を用いてβ−ガラクトシダーゼおよびゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）の発現用に構築されたベクター。異なる塗りつぶしパターンは異なるＤＮＡ配列を示す。構築物は実際の大きさに比例して描かれていない。
図４ａ  Ｋｃ１セルライン、ＳＬ２セルライン、およびＳｆ９セルラインの様々な濃度のゼオシンでの増殖。ゼオシン濃度（μｇ／ｍｌ）が各セルラインについて図中に示されている。
図４ｂ  増加していくゼオシン濃度の存在下でのＬｄ６５２ＹセルラインおよびＣｆ１セルラインの生存率。ゼオシン濃度（μｇ／ｍｌ）が各セルラインについて図中に示されている。
図５  ｐＡｃＩＥ１ｈｒＺｅｏ、ｐＡｃＩＥ１ＺｅｏＢまたはｐＯｐＩＥ２ＺｅｒｏＢで形質転換されたＫｃ１セルライン、ＳＬ２セルラインおよびＳｆ９セルラインの様々なゼオシン濃度での増殖。各セルラインが保持するプラスミド構築物および使用されたゼオシン濃度（μｇ／ｍｌ）が図中に示されている。
図６  ゼオシン耐性ベクターで形質転換され、増加していくゼオシン濃度で増殖させられたセルラインのゲノミックサザンブロット解析。セルラインおよび形質転換ベクター（ベクターがプローブとしても使用された）が各オートラジオグラフ上に示されている。レーンの上の数字は、培地中のゼオシン濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、Ｋｃ１は形質転換されていない対照のレーンを示す。分子量マーカーがキロ塩基数で端に示されている。矢じりは、ゼオシン耐性遺伝子の大きさを示す。
図７  クローニングシャトルベクターｐ２Ｚｅｏｋｓ。１０個のクローニングサイトが示されており、アステリスク（＊）はこの領域内の２ヶ所を切断するＢａｍＨＩを示している。
図８ａ  ゼオシン耐性遺伝子シャトルカセットを含む昆虫セルラインタンパク質発現ベクター。各プラスミドは頭字語で記されている。ｐはプラスミド、１Ｚ／２Ｚはゼオシン耐性遺伝子の発現を行うｉｅ１プロモーターまたはｉｅ２プロモーター、Ｏｐ２はタンパク質発現カセット中のｉｅ２プロモーター、Ｍｔｎはタンパク質発現カセット中のキイロショウジョウバエメタロチオネインプロモーター、ＡはｐＡシグナル配列を含まないこと、ＣはＳＶ４０アーリー遺伝子ｐＡシグナル配列、Ｆはｉｅ２遺伝子ｐＡシグナル配列、Ｂｂｘはボンビキシン（ｂｏｍｂｙｘｉｎ）分泌シグナル、Ｈｂｍはミツバチメラチン（ｍｅｌｌａｔｉｎ）分泌シグナルである。構築物は実際の大きさに比例して描かれていない。
図８ｂ  特別な昆虫セルライン発現ベクター。構築物は実際の大きさに比例して描かれていない。ｌａｃＯはｌａｃオペレーター配列、Ｈ６は６個のヒスチジンアミノ酸、Ｔ７はＴ７ポリメラーゼにより同定される配列、ｌａｃＲはｌａｃＩ遺伝子および核移行シグナルをコードする断片、ｔｅｔＯはテトラサイクリンオペレーター配列、ｔＴａはテトラサイクリン転写活性化因子、ｒＴａは逆テトラサイクリン転写活性化因子、ＵＡＳは上流活性化因子配列である。その他の記号は図８ａと同様である。
図９  レポーター遺伝子構築物であるｐ２ＺＭｔｎＦβ−Ｇａｌまたはｐ２ＺＯｐＡβ−Ｇａｌのいずれかで一過性形質転換されたキイロショウジョウバエＫｃ１セルラインおよびＳＬ２セルラインにおける、ＣｕＳＯ４によるβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導。パネルＡは、細胞ペレット中に存在する酵素活性を示し、パネルＢは対応するウェスタンブロット解析を示す。
図１０  ｐＺＯｐ２Ａβ−Ｇａｌレポーター構築物で形質転換された安定的なクローナル昆虫セルラインおよびポリクローナル昆虫セルラインのゲノミックサザンブロット解析。クローナルＳＬ２系由来のＤＮＡを含むレーンは、ＳＬ−Ｃ．♯で表され、ポリクローナルセルラインは−ＰＣで表されている。各レーンのセルラインＤＮＡは以下の通りである。ＳｆはスポドプテラフルギペルダＳｆ９、Ｌｄはリマントリアディスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）（マイマイガ）Ｌｄ６５２Ｙ、ＳＬはキイロショウジョウバエＳＬ２である。形質転換されていないＳＬ２（ＳＬ），Ｓｆ９（Ｓｆ）およびＬｄ６５２ｙ（Ｌｄ）に由来するＤＮＡを含むレーンも示されている。レーン１および２は、それぞれＥｃｏＲＩまたはＰｔＩ−ＳａｌＩで分解されたＤＮＡをさす。パネルＢ．２はＳｆ−ＰＣおよびＬｄ−ＰＣのレーンのバンドを増強するためパネルＢ．１の一部をより長時間感光したものである。左端の矢じりはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（レーン１）およびゼオシン耐性遺伝子（レーン２）の位置を示している。
図１１  一過性発現したヒトメラノトランスフェリン（ｐ９７）（パネルＡ）、またはＭｔｎ（ｐ２ＺＭｔｎ９７）で形質転換し、５００μＭ  ＣｕＳＯ４で＋／−誘導した後、もしくはｉｅ２（ｐ２ＺＯｐ２Ｃ９７）プロモーター−ｐ９７遺伝子構築物で形質転換した後の安定的に形質転換された昆虫セルライン中のヒトメラノトランスフェリン（ｐ９７）（パネルＢ）のウェスタンブロット解析。各レーンのセルラインタンパク質は以下の通りである。ＫｃはキイロショウジョウバエＫＣ１、ＳｆはＳ．フルギペルダＳｆ９、ＬｄはＬ．ディスパーＬｄ６５２Ｙ、ＳＬはキイロショウジョウバエＳＬ２である。ｐ９７対照のレーンは部分精製されたバキュロウイルス発現ｐ９７タンパク質を含む。
図１２ａ  形質転換されたＳｆ９細胞の表面上の組換えヒトメラノトランスフェリン（ｐ９７）の免疫蛍光位置決定。
図１２ｂ  メラノトランスフェリン（ｐ９７）遺伝子から作製され、天然のｐ９７構築物およびニワトリ類似体と比較された欠失構築物。
図１２ｃ  ｐ９７欠失構築物のウェスタンブロット解析。ブロットの左側はペレットサンプルを含み、ブロットの右側は対応する上清サンプルを含む。サンプル１２０．６は上清サンプル中に存在する。
図１２ｄ  １００ｍｌのスピナーフラスコ中で増殖させられた欠失構築物１２０．６の増殖中の分泌型ｐ９７の産生。生存率は左側の縦軸を利用しており、１は１００％と等しい。
図１２ｅ  図１２ｄの欠失構築物１２０．６の増殖期に採取された上清サンプルのウェスタンブロット解析。Ｓｆは陰性対照、ｐ９７は陽性対照である。
図１３ａ  様々な昆虫セルラインまたはバキュロウイルスで発現した組換えイオントランスポートペプチドの生物学的活性。アッセイで使用された上清の量が括弧内に示されている。
図１３ｂ  第Ｘ因子構築物で一過性形質転換された、または安定的に形質転換されたポリクローナルセルラインから採取された上清サンプルのウェスタンブロット解析。
図１４  昆虫セルラインにおけるタンパク質発現用のトランスポゾンを基礎としたベクター。矢じりは逆位繰り返し構造の方向を示している。
図１５  トランスポゾンを基礎としたタンパク質発現カセットの誘導および増幅の系の概略図。
図１６ａ  Ｐトランスポゾンを基礎としたレポーターベクターｐＤＭ７９ＯＰＩＥ２で形質転換されたＳＬ２ＭＴ△２−３ポリクローナルセルラインによるβ−ガラクトシダーゼの数ヶ月にわたる継続的発現。形質転換前に、２５０μＭ  ＣｕＳＯ４に曝すことによりトランスポザーゼ産生を誘導した。次に、細胞を遠心分離により収集し、形質転換し、何も追加していないＴＣ−１００＋７．５％胎児ウシ血清培地（−△−）または１００  ＣｕＳＯ４を含む培地（−▲−）、１００  ＣｕＳＯ４＋１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８（−■−）または１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８（−●−）に播いた。１８週間後、Ｇ−４１８耐性セルラインを分割し、抗生物質による選択圧の存在下（−■−、−●−）または非存在下（−□−、−○−）で培養した。
図１６ｂ  ベクターｐＤＭ７９ＩＥ−２で形質転換された安定的なセルラインに由来するレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）されたＰ因子末端の配列。太字の配列はベクターの配列であり、普通文字はセルライン由来の染色体ＤＮＡである。下線で示された分節は８ｂｐの二重化された領域である。染色体配列およびＰ以外の配列はいずれも、元のベクター由来ではなく、転移イベントが起こったことが証明された。
図１７  Ｐトランスポゾンを基礎としたレポーターベクターｐＤＭ７９ＩＥ２ＧＦＰで形質転換されたＳＬ２ＭＴ△２，３ポリクローナルセルラインによるグリーンフルオレセントプロテインの発現。
〔詳細な説明〕
昆虫セルラインの成長および生存性におけるゼオシンの効果
ゼオシンが、これらの異種昆虫目から得たセルラインに対する標準培養条件で毒性があるかどうかを確認するために、ジプテラン（Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）セルラインＫｃ１およびＳＬ２、および鱗翅目セルラインＳｆ９（エス．フルギペルダ（Ｓ．Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））、Ｌｄ６５２Ｙ（エス．ディスパー（Ｌ．ｄｉｓｐａｒ））およびＣｆ１（クロストネウラ．フメフラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｅｆｅｒａｎａ））を、ゼオシンに対する感受性について試験した。ゼオシンは二本鎖の破壊を誘導するＤＮＡに結合させることによって、その毒性特性を発揮すると考えられる。このような鎖切断は、すぐに、連続細胞分裂に干渉するＤＮＡ複製の中断によって成長を阻害すると考えられる。したがって、すでに分裂に関与した細胞は、ＤＮＡ複製の次の周期までゼオシンによって影響されることは予測されない。したがって、ゼオシンで処理された細胞は、一端分離するが、それらのＤＮＡが無傷でないので、さらなる有糸分裂に耐えることができないことが予測される。
ゼオシンの作用の機構の現在の理解によって、ゼオシンの最小阻害濃度は、１回の二倍増まで培養を限定するために必要とされる抗生物質の量としてここに記載される。Ｋｃ１、ＳＬ２およびＳｆ９セルライン（図４ａ）でのゼオシンの阻害濃度を決定するための成長曲線は、２７℃で、１０％胎児ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．））を有する１ｍｌのＴｃ−１００完全培地（ｐＨ＝６．２）、０．５−１．０×１０6細胞および可変濃度のゼオシン（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を含有する１．５ｍｌの遠心分離管を回転させて行った。サンプルを、毎日取出し、０．４％トリパンブルーで染色し、そして生育可能な細胞の数を血球計測器を用いて４重複写物で測定した。Ｌｄ６５２ＹおよびＣｆ１セルラインに影響を及ぼす最小阻害ゼオシン濃度を、２００μｌのＴＣ−１００完全培地＋１０％胎児ウシ血清＋ゼオシンの総容量で、９６穴マイクロタイタープレートのウエルにおよそ５，０００細胞を種付けすることによって測定した。個々のウエルを、毎日死滅させ、そして０．４％トリパンブルーで染色して、細胞生存性を測定した（図４ｂ）。
Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインＫｃ１およびＳＬ２、およびエル．ディスパー（Ｌ．ｄｉｓｐａｒ）Ｌｄ６５２Ｙセルラインは、ゼオシンに対して高度に感受性があり、そしてＳＬ２セルラインの成長は、Ｋｃ１のものと同じくらい重度に阻害されはしないが、１０μｇ／ｍｌのゼオシン濃度で成長速度を劇的に減少することを示した。５０μｇ／ｍｌおよび７５ｍｇ／ｍｌより大きいゼオシン濃度は、それぞれ、Ｋｃ１およびＳＬ２セルラインと１回以上の周期の細胞分裂を阻害した。Ｓｆ９およびＣｆ１セルラインは、ゼオシンに感受性がなく、そして少なくとも２５０μｇ／ｍｌの必要とされる濃度は、さらに細胞分裂を完全に阻害する。８００および２５０μｇ／ｍｌのゼオシン濃度は、それぞれ、Ｈｉ５（ティー．ニ（Ｔ．ｎｉ））およびＣ６／３６（蚊）セルラインの成長を阻害することが分かった。
これらの結果は、ゼオシンが、異種昆虫目から得た昆虫セルラインのための選択系で使用するための候補抗生物質であることを開示する。このような選択系の経路の生育性は、そのような細胞にゼオシン耐性を供与する異種遺伝子から得たそのようなセルラインで適切な発現を首尾よく指示するプロモーターの、以下に検討される同定法に依存する。
プロモーター発現を試験するためのベクターの構築
様々な双翅類および鱗翅目昆虫セルラインで選択されたプロモーターの効率を評価するβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を使用した。これは、抗生物質耐性または他の異種タンパク質をコードする遺伝子の発現についてそれらを使用する前に、昆虫セルラインでの数種の異なるプロモーターの強度を評価および比較することに備える。
プロモーター発現を試験するためのベクター（図３に示される）を、様々なバキュロウイルス即時型遺伝子から由来したプロモーターの下流に、プラスミドｐＤＭ７９（ＭｉｓｍｅｒおよびＲｕｂｉｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６：５６５−５７８（１９８７年））からβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を挿入することによって構築した：Ａｃ  ＭＮＰＶｉｅ１遺伝子から得たＡｃ  ｉｅ１プロモーター（Ｃａｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：７７２８−７７３７（１９９４年）で特徴づけられる）；Ｏｐ  ＭＮＰＶｉｅ１遺伝子から得たＯｐｉｅ１プロモーター（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８０；４９２−５０８（１９９１年）で特徴づけられる）；および、Ｏｐ  ＭＮＰＶ  ｉｅ２遺伝子から得たＯｐ  ｉｅ２プロモーター（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７；８４−９６（１９９２年）で特徴づけられる）。さらに、ＳＶ４０およびＣＭＶ初期遺伝子（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能な市販のベクターから得た）から得た哺乳類ウイルス性プロモーターを、昆虫細胞での発現レベルについて試験した。プロモーター発現を試験するためのこれらのベクターの構築は、以下に開示される。
Ａｃ  ｉｅ１プロモーターを、以下のとおり構築されたプラスミドｐＡｃＩＥ１hrβ−ｇａｌ内で試験した。Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアルコールデヒドロゲナーゼ５’未翻訳領域およびＡＵＧ翻訳開始部位、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、およびＳＶ４０転写ターミネーターおよびポリアルデヒド化シグナル（ｐＡ）を含むプラスミドｐＤＭ７９から得た４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドｐＢＳＩＩＫＳ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州ラホーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．））にサブクローン化させた。起点の決定後、ＰｓｔＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＩＥhr／ＰＡのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化させた（Ｃａｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６８：７７２８−７７３７（１９９４年））。これは、β−ガラクトシダーゼ転写融合遺伝子の上流にＡｃ  ｉｅ１プロモーターおよびエンハンサー要素（ｈｒ５）に配置する。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを構築し、転写開始位置に比較して位置−６６１から＋３１５までのＯｐ  ｉｅ２プロモーター配列を含んだプラスミドｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌで試験した（図２ａ参照）。このベクターで、Ｏｐ  ｉｅ２遺伝子の第一の９４アミノ酸を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に、そして配列番号１１：ＡＡＴＡＡＡＡの最初のＡが位置＋１として設計される、Ｏｐ  ｉｅ２ポリアデニル化シグナルに比較して−９５から＋１３１までの位置から由来する３’配列に融合させる。これらの配列を、ベクターｐＢＳＫＳ＋（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州ラホーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．））のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化させた。
Ｏｐ  ｉｅ１プロモーターを、Ｏｐｉｅ１プロモーターを含むＯｐＭＮＰＶｉｅ１遺伝子から得た５９８ｂｐＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、β−ガラストシダーゼ遺伝子の上流のｐＤＭ７９（ＭｉｓｍｅｒおよびＲｕｂｉｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６：５６５−５７８（１９８７年））のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって構築されるプラスミドｐＤＭ７９０ｐＩＥ１で試験した。
ｐＤＭ７９０ｐＩＥ１ベクターから得た発現アッセイの結果との直接的比較を容易にするために、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを、ｐＤＭ７９ベクターバックグラウンドに入れた。Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを含むＯｐＭＮＰＶｉｅ２遺伝子から得た７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＳＩＩＫＳ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州ラホーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．））にサブクローニングすることによって、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ２と示されるこの関連のベクターを構築した。この構築物を、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そしてＯｐ  ｉｅ２プロモーターを含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＤＭ７９のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化させた。
プロモーター宿主範囲および効力を試験する
ｇ種々のバキュロウイルスプロモーターの相対的強度を、上に記述される構築物：ｐＡｃＩＥ１hrβ−ｇａｌ、ｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌ、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ１、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ２を用いて一過性形質転換発現アッセイで試験した。双翅類Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインＫｃ１およびＳＬ２、および鱗翅目セルラインＳｆ９（エス．フルギペルダ（Ｓ．Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））およびＬｄ６５２Ｙ（エル．ディスパー（Ｌ．ｄｉｓｐａｒ））を、これらのベクターの各々に形質転換させた。Ｋｃ１、ＳＬ２、Ｌｄ６５２ＹおよびＳｆ９セルラインは、ＡＴＣＣ（米国メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．））から得、そして２７℃で１０％胎児ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．））で補足したＴＣ−１００完全培地で維持した。製造業者のプロトコールにしたがってセルフェクチン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．））を用いてセルラインの形質転換を行った。セルライン形質転換についてのプラスミドＤＮＡを、ＣｓＣｌ勾配で精製した。２マイクログラムのプラスミドＤＮＡおよび５μｌのセルフェクチンを、未補足のグレースの昆虫用培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））中で個々の０．５ｍｌアリコート量として製造し、混合し、そしてその後３０分間２０℃でインキュベートした。およそ１．０×１０6細胞を収穫し、ベンチトップ遠心分離で５００ｒｐｍでペレット化させ、そして５．０ｍｌのプラスチック製試験管内で１．０ｍｌのセルフェクチン／ＤＮＡ溶液中で穏やかに再懸濁させた。試験管を、細胞がペレット化し、そして１０％ＦＢＳおよび１×抗生物質−抗菌剤混合物（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））を補足した３．０ｍｌのＴＣ−１００中で再懸濁させる時間である４時間、２７℃で水平にインキュベートした。
形質転換後、細胞を、６穴組織培養プレートに移行させ、そして２７℃でインキュベートした。プラスミドＤＮＡの導入のおよそ４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性を、５００ｒｐｍで０．５ｍｌの細胞をペレット化させ、６０ｍｌの０．２５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、そして３回凍結−解凍させることによって測定した。細胞の残骸を、微量遠心分離で１４，０００×ｇでペレット化させ、そして５−５０μｌを標準方法（Ｍｉｌｌｅｒ、分子遺伝学についての実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）、（１９７２年））にしたがって活性について分析した。β−ガラクトシダーゼアッセイの結果を、以下に記述し、そして関連の酵素速度を、表１に要約した。
表１。種々のバキュロウイルスプロモーター−レポーター構築物を用いた昆虫セルラインでの相対的β−ガラクトシダーゼ発現
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内融合
ｐＤＭ７９０ｐＩＥ１発現ベクターと形質転換させたＫｃ１、ＳＬ２およびＳｆ９セルラインは、８−３０単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を生じた。ｐＤＭ７９０ｐＩＥ１発現ベクターと形質転換したセルラインは、７０−２００単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を生じた。このアッセイの予想しない結果は、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ２ベクター（Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを有する）が、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ１ベクター（Ｏｐ  ｉｅ１プロモーターを有する）より５−１０倍多い活性を生じたことである。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターは、様々なベクターバックグラウンドでいっそう活性であった。ｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌで形質転換したセルラインは、ｐＤＭ７９０ｐＩＥ２で形質転換したセルラインより１０−１００倍多いβ−ガラクトシダーゼ活性を生じた。８００に近づくβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、それぞれ、形質転換したＬｄ６５２Ｙ、Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳｆ９セルラインで２，０００と２０，０００単位が見られた。ＯｐＩＥ２β−ｇａｌ構築物は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するアミノ末端Ｏｐｉｅ２コーディング領域の間のフレーム内融合体から構成される。ｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌを有するβ−ガラクトシダーゼ発現が増加すると、Ｏｐ  ｉｅ２遺伝子内の翻訳開始部位に即時に近傍の配列が、鱗翅目細胞での遺伝子発現の最大レベルを指向する上で重要であることを示す（表１）。この近傍の配列は、先に、他のバキュロウイルス初期遺伝子（ＢｌｉｓｓａｄおよびＲｏｈｒｍａｎｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：５３７−５５５（１９８９年））で同定されたＣＡＧＴモチーフを含むが、しかし、図２ａで同定されるとおり、翻訳開始部位を挟む配列も含まれる。
Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインでは、エンハンサーのないＯｐ  ｉｅ２プロモーター（ベクターｐＺＯｐ２Ａβ−ｇａｌで）は、ｈｒ５エンハンサーを有するＡｃ  ｉｅ１プロモーター（ベクターｐＩＥhrβ−ｇａｌ中で）に適合性があるβ−ガラクトシダーゼレベルの発現を予想外に指向させた。エンハンサーのないＯｐｉｅ２（ｐＺＯｐ２Ａβ−ｇａｌ中で）も、ｈｒ５エンハンサーを有するＡｃ  ｉｅ１プロモーターに適合するβ−ガラクトシダーゼレベルを示した、形質転換Ｓｆ９セルラインと同様の結果が得られた。Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター（ｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌ中で）の活性は、Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインにあるよりＳｆ９セルラインで１０倍と同じ程度に高かった。
プラスミドｐＺｅｏＳＶｌａｃＺ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））が、形質転換ベクターとして使用されたとき、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーは、試験した昆虫セルラインのいずれかで検出可能な活性を示さなかったことが分かった。これは、先に報告されたＤ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルライン形質転換研究と一致する（ＢｏｕｒｏｕｉｓおよびＪａｒｒｙ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２：１０９９−１１０４（１９８３年））。さらに、ゼオシン耐性遺伝子の発現を起動するＣＭＶプロモーターを使用する、当初のｐＺｅｏＳＶベクターを用いたセルラインの形質転換（以下参照）は、ゼオシン耐性遺伝子の発現を起動するＣＭＶプロモーターを用いており、ゼオシン耐性Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＳｆ９セルラインを生じ損なった。おそらく、哺乳類ＣＭＶプロモーターは、昆虫系で適切な転写を指向する能力がある。
哺乳類セルラインでＯｐ  ｉｅ２プロモーターの行動は、製造業者の推奨にしたがって、セルフェクチン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．））を用いたプラスミドｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌを用いて、ＡＴＣＣ（米国メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．））から得られた数種の哺乳類セルラインを形質転換させることによって決定された。これらのセルラインを、５％ＣＯ2下で３７℃で１０％ＦＢＳで補足したＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．））中に維持した。
ｐＯｐＩＥ２β−ｇａｌ構築物を有するヒト（ＣａＣＯ−２およびＨＥＰ−Ｇ２）、イヌ（ＭＤＣＫ）またはマウス（Ｊ７７４Ａ１０）ラインの形質転換の４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性は観察されなかった。したがって、遺伝子移入プロトコールおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの限界内で、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターは、これらの哺乳類セルラインで機能すると思われない。
ゼオシン耐性昆虫シャトルベクターの構築
図３は、昆虫および細菌の両方でｂｌｅゼオシン耐性遺伝子の発現のために設計されたシャトルベクターの種々の実施形態を例示する。合成細菌ＥＭ−７プロモーターの直接上流にバキュロウイルス即時型プロモーターを配置することによって、これらのシャトルベクターを構築した。バキュロウイルス即時型プロモーターおよび原核細胞プロモーターを、ｂｌｅ遺伝子（ベクターｐＺｅｏＳＶから得た、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））の下流に操作可能に結合させる。これらの新規シャトルベクターで、バキュロウイルス即時型プロモーターは、形質転換昆虫細胞にあるｂｌｅ遺伝子の発現を指向し、そしてその原核細胞プロモーターは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような適切な原核細胞宿主での転写を指向する。他の原核細胞プロモーターは、これらの構築物中でＥＭ−７プロモーターに置換される可能性がある。図３で示されるシャトルベクターの構築は、以下に記載される。
２つのＤＮＡ領域の間の関係を記述する場合、「操作可能に結合された」は、それらが、互いに機能的に関係があることを意味する。例えば、プロモーター配列は、プロモーターが他の配列の転写を制御する場合別の配列に操作可能に結合される。
プラスミドｐＡｃＩＥ１hrＺｅｏを、ｐＡｃＩＥ１hr／ＰＡのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部位に、合成細菌ＥＭ−７プロモーターおよびゼオシン耐性遺伝子を含むｐＺｅｏＳＶから得た５００ｂｐのＰｓｔＩ−ＳａｌＩフラグメントをクローニングすることによって構築した（Ｃａｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：７７２８−７７３７）。
プラスミドｐＡｃＩＥ１ＺｅｏＢを以下のとおり構築した。ＢａｍＨＩでプラスミドｐＺｅｏＳＶを消化させて、ＳＶ４０エンハンサー−プロモーターおよびポリアデニル化シグナル発現カセットを除去し、そしてその後、再ライゲートさせてｐＺｅｏＢを形成した。エンハンサー要素なしにＡｃＩＥ−１プロモーターを含むｐＡｃＩＥ１hr／ＰＡから得た４７０ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｈｅＩ（ヤエナリ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）のヌクレアーゼで平滑末端にされた）フラグメントを、ＥＭ−７プロモーターおよびゼオシン耐性遺伝子の上流にあるｐＺｅｏＢのＰｓｔＩ−ＳｓｐＩ部位に配置した。
ＯｐＩＥ−２プロモーターを含有する５００ｐｂのＰｓｔＩ−ＢｓｐＨＩフラグメントを、ＥＭ−７プロモーターおよびゼオシン耐性遺伝子の上流にあるｐＺｅｏＢのＰｓｔＩ−ＢｓｐＨＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＯｐＩＥ２ＺｅｏＢを構築させた。
ゼオシン耐性に対する昆虫セルラインの形質転換
セルフェクチンを有するセルラインの形質転換を、上述のとおり行った。形質転換後、細胞を６穴組織培養プレートに移し、そしてさらに２４時間、２７℃でインキュベートした。この時点で、細胞を１：１０に分離し、そしてゼオシン耐性セルラインを、１５０μｇ／ｍｌ（Ｋｃ１およびＳＬ２）または５００μｇ／ｍｌ（Ｓｆ９）のゼオシンを培地に添加することで選択した。これらの濃度は、これらのセルラインについて最小阻害濃度を越えて２−３倍増加することを表す。ディスペラン細胞に関して、これらの濃度は、ハイグロマイシンＢ選択法（２００μｇ／ｍｌ；ＢｌｏｃｈｉｎｇｅｒおよびＤｉｇｇｌｅｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２９２９−２９３１（１９８４年））に使用されるものと類似し、そして、Ｇ４１８−耐性の選択のために数回より少なく一般に使用される（５００〜ら１０００μｇ／ｍｌ；ＲｉｏおよびＲｕｂｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１８３３−１８３８（１９８５年））。
非形質転換細胞形状の顕微鏡下の観察は、影響された細胞が、全体的に拡大し、最終的に完全な状態を失い、そして溶解することを示した。組織培養プレートの表面に正常に装着したままであるＳｆ９およびＬｄ６５２Ｙセルラインの場合に、溶解は、装着の損傷の後に来た。ゼオシン感受性細胞中のこの表現型は、かなり有利であり、そして、形質転換細胞を、コロニーを形成するために遊離させながら、非形質転換細胞をプレートの表面から排除したので、単一耐性形質転換コロニーの連続単離を助けた。
自然発生的なゼオシン−耐性昆虫細胞が培地中に生じる頻度は、予想外に低い。プラスミドＤＮＡの不在下で、または耐性遺伝子を保有しないプラスミドで行ったモック形質転換は、ゼオシン耐性昆虫細胞のいずれにも生じなかった。本発明のゼオシン選択系のこの予想外のそして有利な特徴は、Ｇ−４１８のような抗生物質を用いる選択系で報告される比較的高い自然発生的な耐性率と対照的である。
形質転換の３〜４週間内に、細胞の耐性集団を生じた。その後、耐性細胞を、種々のゼオシン濃度で選択性条件下で元に戻される前に、数種の世代についての選択から取出した。個々のゼオシン耐性クローンを単離しなかった。ゼオシン耐性細胞を、ポリクローナル培養物として維持した。
形質転換セルラインについての成長曲線を図５に示す。ｐＡｃＩＥ１hrＺｅｏ構築物を保持するＫｃ１およびＳＬ２セルラインは、１．０ｍｇ／ｍｌを超過する濃度でゼオシンに耐性である。細胞成長の速度は、抗生物質の濃度を増加させながら、基本的に区別可能である。これは、これらのセルラインについての最小阻害濃度を越えて、耐性に１０−１００倍増加を表す。ｈｒエンハンサー配列を欠くＡｃ  ｉｅ１プロモーター構築物で形質転換したＫｃ１セルラインは、エンハンサー要素を保持する対応のセルラインより低レベルの耐性を示した。ｈｒ要素が、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターと組合されている本発明の変異体が構築されることがこれから分かる。エンハンサー要素を欠くＡｃ  ｉｅ１プロモーターで形質転換したＫｃ１セルラインでは、ゼオシン濃度が、５００μｇ／ｍｌを超過する場合に細胞増殖は観察されなかった。
ゼオシン耐性遺伝子の転写を指向する際のＯｐ  ｉｅ２プロモーターの効力を測定するために、Ｋｃ１およびＳｆ９細胞を、プラスミドｐＯｐＩＥ２ＺｅｏＢで形質転換した。得られたＫｃ１セルラインは、１．０ｍｇ／ｍｌを超過するゼオシン濃度に対して耐性がある。抗生物質の濃度が増加するときの成長速度は、ｐＡｃＩＥ１hrＺｅｏ構築物と形質転換したＫｃ１セルラインと類似する。Ｓｆ９形質転換セルラインは、細胞成長の適切な阻害なしに１．５ｍｇ／ｍｌまでのゼオシンレベルで増殖させることができた。これは、エンハンサーのないＯｐ  ｉｅ２プロモーターが、ｈｒエンハンサー要素を付随しなからＡｃ  ｉｅ１プロモーターと同様に機能するという驚くべき結果を示す。
ゼオシン耐性に対して形質転換された昆虫セルラインのゲノム安定性
先に注目したとおり、多くの既知選択系は、形質転換ＤＮＡ配列が、抗生物質選択の存在下で増幅されるという歓迎されない特徴を示す。これらの増幅ＤＮＡ配列は、不安定である可能性があり、そして連続的選択の不在下で迅速に失われやすい。この選択は、本発明によって、ゼオシン耐性に対して形質転換された昆虫セルラインでの形質転換配列の安定性を立証する実験を開示する。
本発明のセルラインでＤＮＡ配列を形質転換する安定性を評価するために、ゼオシン耐性形質転換セルラインを選択し、その後数世代（２〜３週）の間成長し、その後、再度様々の濃度のゼオシンでの選択下で入れ、そして初期定常期（およそ６〜８日）まで成長した。その後、サザンブロッティングを使用して、形質転換ＤＮＡ配列の安定性を評価した。
その後、総ゲノムＤＮＡを、以下のとおりセルラインから単離した：およそ５−１０×１０6細胞を含有する１．５ｍｌアリコート量を、３分間微量遠心分離で、低速度でペレット化させた；細胞ペレットを、０．５ｍｌ  ＨＢ緩衝液［７Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌ］中に再懸濁させた；生じた溶液を、０．５ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）で３回抽出させ、そしてＤＮＡを、１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．６容積のイソプロパノールを添加させることで沈殿させた；ＤＮＡを真空中で乾燥させて、１００μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に再懸濁させ、そして３０分間、３７℃で１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で処理した。ＤＮＡを再懸濁させ、７０％エタノールで洗浄し、真空で乾燥させ、そして５０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁させた。
５マイクログラムの総ゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化させ、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてナイロン膜上にブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。プローブとして本発明の全プラスミド構築物を用いて、ＥＣＬ化学発光システム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国）でサザンブロット分析を行った。
ゼオシン構築物で検知された非形質転換ＳＬ２およびＳｆ９セルラインＤＮＡのサザンブロットは、なんらハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。形質転換セルラインから得た総ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、形質転換構築物が、ゲノムＤＮＡに安定に組込まれたことを示す（図６）。セルラインのポリクローナル特性のために、いくつかのバンドは、各レーンで観察される。しかし、バンドの数および強度は、ゼオシン濃度を増しながら定常性を残しており、ポリクローナル集団が、安定であること、そして遺伝子増幅は、ゼオシン耐性を増加させるために選択されないことを示す。したがって、本発明の構築物にあるゼオシン耐性遺伝子の発現を指示するのに使用されたＯｐ  ｉｅ２およびＡｃ  ｉｅ１hrプロモーターは、ゼオシンの濃度が上昇して耐性についての十分な遺伝子産物を提供すると結論づけるものがいる。
これらの結果は、本発明の予想外の利点、すなわち、形質転換ＤＮＡ配列の安定性を示す。本発明のセルラインでの形質転換ＤＮＡの安定性は、その増殖、および付随のゲノムの不安定性が、先行文献の選択系を用いた場合に起こりうる頻度を開示する上に検討された先行文献の報告と対照的である。
ゼオシン耐性シャトルベクターの構築
ゼオシン耐性シャトルベクターｐ２ＺｅｏＫｓを以下のとおり構築した（図７）。ｐＢＳＩＩＫＳから得た多重クローニング部位の一部を含む８３ｂｐのＡｐａＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＺｅｏＢのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入し、プラスミドｐＺｅｏＢＫＳを作製した。その後、ｐＺｅｏＢＫＳプラスミドを、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで消化させ、そして生じた７５０ｂｐのフラグメントを、ｐＯｐＩＥ２ＺｅｏＢの１３４０ｂｐのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントにライゲートして、シャトルベクターｐ２Ｚｅｏｋｓを得た（図７）。
ｐ２Ｚｅｏｋｓベクターは、Ｏｐ  ｉｅ２遺伝子プロモーターを、当初のｐＺｅｏＳＶベクターから得た、昆虫細胞でのｂｌｅゼオシン耐性遺伝子および小型合成ＥＭ−７原核細胞プロモーターの発現を起動させるのに利用して、イー・コリのような原核細胞宿主での発現を指向させた。２０−２５μｇ／ｍｌゼオシンでの修飾ＬＢ（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いて、形質転換したイー・コリクローンの選択を行うこともできる。昆虫セルラインでの選択は、Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインについては１５０μｇ／ｍｌゼオシン、Ｓｆ９細胞については２５０μｇ／ｍｌゼオシンの存在下で達成することができる。
ｐ２Ｚｅｏｋｓベクターは、比較的小さく（２０９０ｂｐ）、それは、ベクターにクローン化できる異種配列の大きさを最大限にする。このような異種配列は、クローニングに利用可能な１０個の特徴的な制限酵素部位（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩＩ）を有する多重クローニング部位に挿入できる。
構築的昆虫タンパク質発現シャトルベクターの構築
ｐ２Ｚの一連の構築的昆虫発現シャトルベクター（図８ａ）は、クローニングおよびシャトルベクターｐ２ＺｅｏＫＳ（図７）から由来する。一連のｐ２Ｚは、本発明のベクターが、選択性マーカー遺伝子に操作可能に結合した、バキュロウイルス即時型プラスミドおよび原核細胞プロモーターから構成される化合物プロモーターを使用できることを示す。図８の一連のｐ２Ｚで、Ｏｐ  ｉｅ２またはＯｐ  ｉｅ１プロモーターを、ｂｌｅ遺伝子の発現を起動する合成細菌ＥＭ−７プロモーターと組合せ、そして昆虫細胞およびイー・コリの両方でゼオシンに対する耐性を付与する。このキメラプロモーターは、イー・コリ、Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインＫｃ１およびＳＬ２、鱗翅目セルラインＳｆ９およびＬｄ６５２Ｙ並びに蚊セルラインを含めた広範な宿主でゼオシン耐性を指向する能力がある。一連のｐ２Ｚのベクターの構築は、以下に記述される。
ｐ２ＺＯｐ２Ａを構築するために、追加のＯｐ  ｉｅ２プロモーターを、以下のとおりｐ２ＺｅｏＫＳに挿入した。プラスミドｐ２ＺｅｏＢを、ＢａｍＨＩで切断し、５’オーバーハングを、クレノーＤＮＡポリメラーゼを用いてｄＮＴＰで充填させ、そしてその後、ＮｏｔＩで切断した。Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを含むｐＯｐＩＥ−ＮＢａｍＨＩ（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７：８４−９６（１９９２年））から得たＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＫＳＩＩのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｄＮＴＰを有するクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、その後ＮｏｔＩで切断した。Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを含んだこのフラグメントを、上から得たｐＺｅｏＢベクターにライゲートして、ｐ２ＺＯｐ２Ａを生成した。この新規な構築物は、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの下流に６個の特徴的な制限酵素部位を含む多重クローニング部位を保持する。このベクターは、広範な昆虫セルライン中にポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を保持する全長ｃＤＮＡまたはプロモーターなしの遺伝子の発現に適切である。
ｐＡシグナルを欠く遺伝子の発現を容易にするか、または異種遺伝子発現でのｍＲＮＡ安定化シグナルの効果を試験するために、我々は、ＳＶ４０初期遺伝子ｐＡシグナル（ｐ２ＺＯｐ２Ｃ）またはＯｐ  ｉｅ２遺伝子ｐＡシグナル（ｐ２ＺＯｐ２Ｆ）を有するｐ２ＺＯｐ２Ａベクターの変異体を作製した。
ｐＺｅｏＳＶから得たＳＶ４０初期遺伝子ｐＡシグナル配列を含むＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＡのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｃを構築した。
プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｆを以下のとおり構築した。Ｏｐ  ｉｅ２遺伝子から得たｐＡシグナル配列を、オリゴヌクレオチド（５’から３’までと示される）配列番号２：ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＴＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴおよび配列番号３：ＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡを用いたＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にさせたｐｓＺＯｐ２ＡのＳａｃＩＩ部位にクローン化した。多重クローニング部位を、２組の相補的オリゴヌクレオチドを用いて伸長させた。第一組（配列番号４：ＡＡＴＴＴＡＡＡＣＧＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴおよび配列番号５：ＣＴＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡ）をアニーリングさせ、そしてＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入させ、そして第二の組（配列番号６：ＣＴＡＧＡＣＣＧＧＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴおよび配列番号７：ＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＴ）を、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ部位に挿入させた。
我々は、これを一般に使用されたｒｅｃイー・コリ宿主と対抗させなかったが、ｐ２ＺＯｐ２Ｃ中の２つのＳＶ４０ｐＡシグナルのような同じベクターでの相同性配列の存在が、相同性ＳＶ４０ｐＡ配列の間の組換えが起こりうる可能性を起こさせる。当業者は、昆虫由来のｐＡシグナルの使用が、昆虫に機能的に有利にする可能性があることを理解する。したがって、１３個の特徴的な制限酵素部位を有する伸長した多重クローニング部位（ＭＣＳ）を、Ｏｐ  ｉｅ２ｐＡシグナル配列を保有するＦ由来ベクターに組込んだ。さらに、これらのベクターは、切断遺伝子の発現をさせる全ての３つのリーディングフレームにある翻訳終止コドンをも含む。プライマー配列番号８：５’ＴＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡ３’は、Ｏｐ  ｉｅ２ｐＡシグナル配列に特異的であり、そしてフレーム内融合領域をシーケンシングするのに使用され、そして指示された３’欠失シリーズの分析に有用である。
同じベクター内の相同性配列をさらに排除するために、外来遺伝子発現を指向するのに唯一利用できるＯｐ  ｉｅ２プロモーターをさらに活性化させるゼオシン耐性遺伝子を起動するＯｐ  ｉｅ１プロモーターを使用するｐ１Ｚシリーズを、開発した。ベクターｐ１ＺＯｐ２Ａを、Ｏｐ  ｉｅ１プロモーターを含むｐＯＰＩＥ−１Ｂ７４ＢａｍＨＩ（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７；８４−９６（１９９２年））から得たＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをクローニングすることによって生成し、一過性ベクターのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。続いて、ゼオシン耐性遺伝子を指向していたＯｐ  ｉｅ２プロモーターを置換するＮｒｕＩ／ＰｓｔＩフラグメントをｐ２ＺＯｐ２ＡのＢｓｐＨＩ（クレノーＤＮＡポリメラーゼを用いてｄＮＴＰで平滑末端にした）／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
ｐ２ＺＯｐ２ＦのＭＣＳを含む７００ｂｐのＨａｅＩＩフラグメントを、ｐＩＺＯｐ２ＡのＨａｅＩＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐ１ＺＯｐ２Ｆを作製した。
非選択性昆虫発現ベクターの構築
Ｏｐｉｅ２プロモーターの転写下で、しかしゼオシン耐性遺伝子の存在なしに、異種タンパク質を産生する安定なセルラインの選択を可能にするために、別のベクターを構築した。ｐＡＭｐ２Ｅと称されるこのベクターを以下のとおり構築した（図８ａ）。多重クローニング部位昆虫ポリＡ尾部およびＣｏｌＥ１区分であるＯｐｉｅ−２プロモーターを含むｐ２ＺＯｐ２Ｅから得た１５５３ｐｂのＢｓｐＨＩフラグメントを、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｋｓから得た１．０ｋｂのＢｓｐＨＩフラグメントにライゲートした。Ｂ−ラクタマーゼ遺伝子は、アンピシリン選択下で細菌中での選択に必要とされる耐性を供するが、昆虫細胞中での選択のための選択性マーカーは提供されない。このベクターｐＡＭｐ２Ｅは、異種タンパク質発現を指向する能力を有し、そしてＧ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキセートまたはゼオシン耐性遺伝子の存在を示さない同時形質転換実験での他の選択ベクターのような他の選択ベクターと共に使用される可能性がある。ゼオシン選択が可能でない状況で、おそらく、ゼオシン耐性遺伝子を伴うセルラインの先の選択のため、このベクターは、このセルラインの安定な形質転換に利用可能なあらゆる他の選択マーカーで選択しながら異種タンパク質の産生を可能にする。
安定な選択セルライン中でタンパク質産生を最大限にするような比率で、あらゆる選択ベクターを伴う異種タンパク質産生ベクターの混合物も考慮する。ベクターのこのような比率は、１：１、２：１、５：１、１０：１または最大量の異種タンパク質を産生する安定なセルラインを選択するあらゆる他のこのような組み合わせのような異種発現対選択ベクター比率に関与する。
分泌タンパク質発現シャトルベクターの構築
異種タンパク質を培養培地に分泌する能力は、タンパク質のプロセシングの下流に有益なものである。本出願でのいくつかの実施例は、昆虫細胞が、多量の異種タンパク質を分泌する能力があることを示す。基本書（メラノトランスフェリン、トランスフェリン、ＩＴＰ）ですでに示されているシグナルのものの分泌に加えて、ボンビキシンおよびミリチン分泌シグナルの両方を、ベクターに加えた（図８ａ）。
以下の２つのオリゴヌクレオチド配列番号１４：ＢＢＸＦ５’−ＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧ  ＡＴＡＣＴＣＣＴＴＧ  ＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴ  ＡＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＡＴ  ＧＴＧＧＧＴＧＴＣＡ  ＡＣＡＡＧＣＴＴＡ−３’および配列番号１５：ＢＢＸＲ５’−ＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴ  ＴＧＴＴＧＡＣＡＣＣ  ＣＡＣＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴ  ＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡ  ＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡ  ＴＣＴＴＣＡＴをアニーリングすることによって、ボンビシキン分泌シグナルを製造した。このアニールしたフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＤのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。この中間体を、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔで切断し、そしてＭＣＳ、ｏｒｉ、およびｉｅ−２プロモーターを含むｐ２ＺＯｐ２ＦのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントにアニーリングして、ｐ２ＺＯｐ２Ｇを作製した。
蜜蜂のメリチン分泌シグナルを、ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＨＢＭ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）から５０ｂｐのＮｄｅＩ（ＴＮＰおよびクレノーで部分的に充填した）／ＥｃｏＲＩフラグメントとして取出した。これを、ＨｉｎｄＩＩＩ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびクレノーで部分的に充填した）およびＥｃｏＲＩで切断したｐ２ＺＯｐ２Ｆにライゲートし、そして上のフラグメントにライゲートしてｐ２ＺＯｐ２Ｉを作製した。
誘導性昆虫タンパク質発現シャトルベクターの構築
外来タンパク質の発現、特に真核細胞種境界を越えて機能を維持するものは、総タンパク質発現が相当に減少されるような範囲まで細胞生理学を破壊することができる。これらの有害なタンパク質は、生理学的に耐性なレベル内にタンパク質の量を維持する誘導性プロモーターを用いてセルライン系で産生することができる。例えば、ｈｓｐ７０プロモーターを使用して、ゲートで制御した塩素イオンチャンネルの発現を指向させ（Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３８０：２５７−２６２（１９９６年））、そしてＭｔｎプロモーターを使用して、ヒトＨ−ｒａｓ癌遺伝子の発現を制御した（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、３：８８２−８８９（１９８９年））。
本発明の誘導性昆虫発現シャトルベクターを構築するために、ｄＮＴＰを伴うクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にされたＭｔｎプロモーターを含むｐＭＴ−１（Ｋｏｖａｃｈら、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１：３７−４３（１９９２年））から得た５００ｂｐのＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、すでに平滑にされたｐ２ＺｅｏＢのＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐ２ＺＭｔｎＦベクターに組込んだ。生じたベクターであるｐ２ＺＭｔｎを、ＸｂａＩで切断し、ｄＮＴＰを有するクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、そしてその後、ＰｓｔＩで再切断して、ゼオシン耐性遺伝子およびＭｔｎプロモーターを含んだフラグメントを得た。このフラグメントを、伸長したＭＣＳおよび複製の起点を含むｐ２ＺＯｐ２ＦのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（クレノーＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて平滑にした）フラグメントにライゲートして、ｐ２ＺＭｔｎＦベクターを得た。ｐ２ＺＭｔｎＦベクターは、Ｏｐ  ｉｅ２  ｐＡシグナルと同様に効果的なクローニングのための伸長ＭＣＳを含み、そしてＤ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよび蚊のセルラインを含めた昆虫セルラインでの制御された誘導性移入遺伝子発現を提供しうる。
本発明のベクターにある誘導性プロモーターとしてＭｔｎプロモーターを使用することは、ｈｓｐプロモーターを使用することより利点がある可能性がある。例えば、タンパク質は、宿主の生理学に劇的な影響を及ぼすことなく、プロモーターを誘導する低レベルのカドミウムまたは銅塩を用いて、Ｍｔｎプロモーターから連続的に産生することができる。対照的に、ｈｓｐ７０プロモーターは、構築的に低レベルの産物およびを生成し、そして誘導は、細胞成長を害しうる経時的な加熱ショック（ＢｅｒｇｅｒおよびＲｕｄｏｌｐｈ、脊椎動物の細胞系の応用、ＣＲＣプレス社、フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）（１９８９年））を必要とする。
ＬａｃＯ／ＬａｃＲ誘導性システムの構築
ｌａｃレプレッサー系を利用する誘導性発現ベクターを構築した。昆虫細胞でこの系の有効性を評価する、および極度に毒性のあるタンパク質の綿密な制御を供する両方の２つのベクターを構築した。ｌａｃＯ領域、リボソーム結合部位、Ｈｉｓに続くＡＴＧ翻訳開始コドン、およびＴ７タンパク質タグを含むｐＥＴ２８ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））から得た２３５ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＦのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングすることによって、プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｊ−１を構築した。毒性のあるタンパク質については、このベクターは、ｌａｃレプレッサーが存在する場合に細菌中の潜在性ｉｅ−２プロモーター活性の調節についても付与する。
プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｊ−３を以下のとおり構築した。３つの内部ｌａｃＯ領域を伴うＳＶ４０イントロンを含むｐＯＰ１３ＣＡＴから得たＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＡのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位にクローン化した。この中間体から、ＳＶ４０イントロン／ｌａｃＯの組合わせを含むＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ（クレノーおよびｄＮＴＰで平滑にした）フラグメントを、単離し、そしてｐ２ＺＯＰ２ＦのＰｓｔＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントにライゲートして、ｐ２ＺＯｐ２Ｊ−３９を得た（図８ｂ）。
ｌａｃレプレッサーを発現するベクターは、以下の方法で構築した。ｌａｃレプレッサーを含有するフラグメントを、以下のプライマー配列番号１２：５’−ＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧ  ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣ  ＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴ  ＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡ  ＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧ  ＡＴＧＴＣ−３’；および配列番号１３：５’−ＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴ  ＡＴＡＧＣＧＡＴＧＡ  ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴ  ＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧ  ＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧ−３’を用いて、ｌａｃＩ含有ベクターｐｅｔ２１（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））から増幅させた。第二のプライマーは、ｌａｃレプレッサータンパク質を核に指向させるために必要とされる核局在シグナル配列を含む。このフラグメントを、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＯｐ１／ｐＡのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｐＯｐ１ｌａｃＲを得た（図８ｂ）。
Ｔｅｔ系の構築
Ｔｅｔ系は、イー・コリＴｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン−耐性オペロンから由来した２つの調節要素：ｔｅｔレプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔＲが結合するＴｅｔオペロンＤＮＡ配列（ｔｅｔＯ）に基づいている。この系は、テトラサイクリンの添加が転写を終止させるときにＴｅｔ−オフと一般に呼ばれる。代替のＴｅｔＲは、テトラサイクリンの存在下で転写活性化を起こす数種のアミノ酸改変を含む。この系は、Ｔｅｔ−オンと称される。
ベクターｐ２ＺＯｐ２Ｔは、Ｏｐｉｅ２プロモーターと、ｔｅｔＯの７つのコピーから構成されるキメラプロモーターを含む。これは、３００ｂｐのＸｈｏＩ／ＳａｃＩ（Ｔ４ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて平滑にした）フラグメントをｐＴＲＥ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から取出し、そしてこれをｐＢＫＳＯｐＩＥ−２のＸｈｏＩ／ＮａｒＩ（クレノーおよびｄＮＴＰを用いて平滑にした）部位に挿入することによって構築される。これは、Ｏｐｉｅ−２プロモーターの最小プロモーター要素の上流にＴｅｔオペレーターを配置する。その後、このクローニング中間体から、ＴｅｔＯ／Ｏｐ  ｉｅ−２プロモーターを含む８００ｂｐのＸｈｏＩ（クレノーおよびｄＮＴＰを用いて平滑にした）／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ１ＺＯｐ２ＦＢｓｐＨＩ（ｄＮＴＰを用いて平滑にした）／ＥｃｏＲＩ部位に入れて、ｐ１ＺＯｐ２Ｔを得た（図８ｂ）。
その系の第二の主要な構成要素は、ｔｅｔ−制御転写アクチベーター（ｔＴＡ）として知られるハイブリッドタンパク質を発現する「調節」プラスミドである。ｔＴＡは、Ｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を結合し、そしてそれにより、テトラサイクリンの不在下で転写を活性化させる。したがって、テトラサイクリンが培養培地に添加される場合、転写は、用量依存性方法で終止した。ｔＴＡをコードする１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＴｅｔ−オフ（クローンテック、米国）から取出し、そしてｐ２ＺＯｐ２ＤのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化させて、Ｔｅｔ−オフ系と比較しうるプラスミドｐ２ＺＯｐ２ＤｔＴＡを得た（図８ｂ）。Ｔｅｔ−オン（クローンテック）から得た１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントも、ｐ２ＺＯｐ２ＤのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化させて、Ｔｅｔ−オフ系と比較しうるプラスミドｐ２ＺＯｐ２ＤｒｔＴＡを得た（図８ｂ）。
Ｇａｌ４制御系の構築
ｇａｌ４制御系は、２つの段階の系を用いて遺伝子の非常に密接な制御を付与する。異種遺伝子を、ｇａｌ４遺伝子ファミリーから由来した上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と、ｈｓｐ７０遺伝子から由来した最小プロモーターの組の後に配置させる。転写は、ｍｔｎプロモーターによって制御されるｇａｌ４遺伝子産物の存在を必要とする。いったんｍｔｎプロモーターが活性化されると、ｇａｌ４が作られ、そしてこれは、すぐにＵＡＳ部位を結合し、そして異種遺伝子の転写を活性化させる。
ｇａｌ４遺伝子を含むｐＧａＴＮから得た３ｋｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐ２ＺｍｔｎＦのＮｏｔＩ部位に挿入して、ｐ２ＺｍｔｎＦｇａｌ４を得た（図８ｂ）。このベクターは、本特許で上に記述され、そしてｇａｌ４を発現するのに誘導されえたセルラインを構築するのに利用した方法を用いて、ｇａｌ４遺伝子産物の発現を誘導するのに使用される。他の誘導性プロモーター系は、ｇａｌ４の産生を起動するのに使用することもできる。
ベクターｐ２ＺＵＡＳｍＰＦ（図８ｂ）を以下のとおり作製した。ｐＰ［ＵＡＳＴ］から得た５個のＵＡＳを含む４００ｂｐのＳｐｈＩ（Ｔ４およびｄＮＴＰを用いて平滑にした）／ＸｂａＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＦのＢｓｐＨＩ（クレノーおよびｄＮＴＰを用いて平滑にした）／ＸｂａＩ部位に挿入した。このベクターは、５個のＵＡＳ、最小プロモーター、多重クローニング部位を含み、そしてゼオシン下で選択を付与する。Ｂ−ｇａｌレポーター構築物を作製するために、ｐ２ＺｍｔｎＦＢ−ｇａｌから得た３ｋｂのＥｃｏＲＩ  Ｂ−ｇａｌフラグメントを、ＥｃｏＲＩ部位に入れて、ｐ２ＺＵＡＳｍＰＦＢ−ｇａｌを作製した。
宿主スペクトラムおよび産生許容性を評価するためのレポーター遺伝子の発現
β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターカセットのいずれかを含むプラスミドを構築（図８）して、多様な昆虫セルラインでの本発明の発現系の有用性を評価した。各々のタンパク質発現ベクターの構築を以下に説明する。
Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアルコールデヒドロゲナーゼ５’未翻訳領域およびＡＵＧ翻訳開始部位、イー・コリのｌａｃＺ遺伝子、およびＳＶ４０転写ターミネーターおよびポリアルデヒドシグナル（ｐＡ）を含むｐＤＭ７９から得た４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＡのＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ａβ−ｇａｌを構築した。
ＧＦＰ−コード領域を含むｐＧＦＰ１０．１（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：８０２−８０５（１９９４年））から得た８００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＣのＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｃ−ＧＦＰを作製した。
上に記述された４．２ｋｂのＥｃｏＲＩβ−ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントを、ｐ２ＺＭｔｎＦのＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐ２ＺＭｔｎＦβ−ｇａｌを生成した。
β−ガラクトシダーゼの活性を定量的に測定できるので、ｐ２ＺＯｐ２Ａβ−Ｇａｌレポータープラスミドは、特定のセルラインで産生されうる外来タンパク質の量を推定するのに使用できる。２μｇのｐ２ＺＯｐ２Ａβ−Ｇａｌプラスミドおよび１０μｌの陽イオン性リポゾームセルフェクチン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））を用いた一過性発現分析は、８００に接近するβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを、Ｌｄ６５２Ｙで、Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳｆ９セルラインで、それぞれ３０００および２０，０００単位を繰返し生じる。
Ｌｄ６５２Ｙのように、中程度から高いレベルの内因性β−ガラクトシダーゼ活性を示すセルラインで、ＧＦＰレポータープラスミドは、産生許容性を概算するために使用できる。さらに、この控え目なマーカーは、個々の細胞でのタンパク質発現のレベルを測定させる。この小さなレポーターカセットは、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター、ＧＦＰコーディング領域および転写終結から構成され、そしてｐＡ配列は、異種タンパク質発現ベクターに容易に取込むことができるか、または異種タンパク質発現ベクターと協力して同時形質転換することができる。続いて、高度の蛍光を示す個々の細胞、そして得られる高度な異種タンパク質発現は、細胞の生理学の不可逆な破壊なしに、蛍光活性化細胞篩（ＦＡＣＳ）系を用いて選択してもよい。
同じベクター内に抗生物質選択カセット、異種タンパク質発現カセットおよびレポーターカセットを組込む能力は、非常に有益であり、そして本発明の個々のカセットおよびベクターが操作される方法の成果である。小さなサイズのこれらのベクターは、扱いにくいサブクローニング、またはコスミドまたはバクテリオファージベクターへの再篩い分けの必要なしに、比較的大きな遺伝子をクローン化させ、操作し、そして発現させる。標識抗体を用いて検出できる膜貫通タンパク質のような他の控え目なマーカーも、本発明の選択系に用いることができる。
本発明のベクターによって指向される誘導性発現を、ｐ２ＺＭｔｎβ−Ｇａｌレポータープラスミドを用いた一過性発現アッセイでのＤ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインで試験した（図９）。形質転換に続いて、１００ｍＭ保存溶液から得た５０−１０００μＭ  ＣｕＳＯ4（最終濃度）を添加することによって、Ｍｔｎプロモーターを導入した。細胞を、６穴組織培養プレートに移し、そして細胞を収穫するときであるさらに４８時間、２７℃でインキュベートし、微量遠心分離で４，０００×ｇでベレット化させ、そして６０μｌの０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。３回の凍結／解凍によって細胞を溶解させ、残骸をもう一度ペレット化させ、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を、標準法によって上清で定量した。１０μｇの細胞タンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動的に分離し、そしてニトロセルロース膜に移行させることによって、ウエスタンブロット分析を行った。１／１０，０００希釈でのマウスのモノクローナル抗−β−ガラクトシダーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウイスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を一次抗体として、そして１／２０，０００希釈での二次抗体として西洋ワザビペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗マウス抗体（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、カリフォルニア州リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ））を使用して、β−ガラクトシダーゼを検出し、続いてＥＣＬ化学発光システム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）を用いて検出した。
誘導なしで、β−ガラクトシダーゼ活性は、内因性バックグラウンド活性（２．５単位）よりほんのわずかに高く（４−７単位）、そしてウエスタンブロット分析を用いて検出できなかった。ＣｕＳＯ4の濃度を増加させながら添加して、形質転換後４８時間記録したとおり、β−ガラクトシダーゼ産生に対応する増加を生じた。１０００μＭのＣｕＳＯ4濃度を用いた一過性分析で、β−ガラクトシダーゼ発現の誘導は、構築的発現が、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターによって指向される、セルラインについて観察されたものよりおよそ５−１０倍未満であった。β−ガラクトシダーゼアッセイの感受性限度内で、Ｍｔｎプロモーターは、Ｓｆ９またはＬｄ６５２Ｙセルラインで、構築的に、または誘導を伴うかのいずれかで機能しそこなった。
ｌａｃＩ／ＬａｃＯ誘導性系も、昆虫セルラインに使用できる。市販で入手可能なＬａｃＲ抗体（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）を用いて、ｐ２ＺＯｐ２ＦｌａｃＲまたはｐＯｐ１ＬａｃＲとの形質転換から得た４８時間の昆虫細胞ペレットのウエスタンブロット分析は、Ｌａｃレプレッサーを昆虫細胞に作ることを示した。ｌａｃレプレッサーを発現する安定なクローンを生成するために、このクローンは、一連のｐ２ＺＯｐ２Ｊベクターで、昆虫セルラインに同時遺伝子導入した。１０μｌのセルフェクチンと共に１μｇの各々のｐ２ＺＯｐ２ＪおよびｐＯｐ１ＬａｃＲを用いて、同時遺伝子導入を行った。
Ｓｆ９細胞でレポーターとしてＢ−ガラクトシダーゼと共にｐ２ＺＯｐ２Ｊ−１または−３を利用して、Ｂ−ｇａｌレポーターの抑制は、ｐ２ＺＯｐ２Ｊ−１構築物（５０単位）と共に生じるが、抑制は、ｐ２ＺＯｐ２Ｊ−３構築物（１０単位）と共にあるのが最善である。１ミリモルＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）を添加することは、系の抑制解除およびｐ２ＺＯｐ２Ｊ−１Ｂ−ｇａｌからは４００単位そしてｐ２ＺＯｐ２Ｊ−３Ｂｇａｌからは５００単位のＢ−ガラクトシダーゼ産生を供給した。限定されないが、Ｌｄ６５２Ｙ、Ｈｉ５およびＫｃ１を含めた他の昆虫セルラインを用いた連続分析は、ｌａｃレプレッサー系が、これらの系で十分同等に作用することを示した。
ｔｅｔ系も、昆虫細胞で使用することができる。この系から得た発現が、最小プロモーターの作製のため、親ベクターｐ２ＺＯｐ２Ｆからより低いが、ベクターは、酵素カスケードの発現で重要な役割を果たす密接な調節の別の利益を有する。レポーターとしてＢ−ｇａｌを用いて、これらの構築物を、Ｂ−ガラクトシダーゼ発現を制御するそれらの能力について試験した。昆虫細胞でのｐ２ＺＯｐ２ＴＢ−ｇａｌおよびｐ２ＺＯｐ２ＤｔＴＡ（Ｔｅｔ−オフ）の同時遺伝子導入は、デオキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）の存在下で、産生されたＢ−ガラクトシダーゼの量は、バックグラウンドレベルより上ではなかったことを示した。デオキシサイクリンを除去すると、産生したＢ−ｇａｌの量で１０倍の増加を生じた。
昆虫細胞でのベクターｐ２ＺＯｐ２ＴＢ−ｇａｌおよびｐ２ＺＯｐ２ＤｒｔＴＡ（Ｔｅｔ−オン）の同時遺伝子導入は、デオキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）の不在下で、産生されたＢ−ガラクトシダーゼの量も、バックグラウンドより上ではなかった。デオキシサイクリンを添加して、バックグラウンドを越えて産生されたＢ−ｇａｌの量で４倍増加になった。
これらの実験の両方が、Ｔｅｔ系が、昆虫細胞で誘導性系として機能することを示す。
昆虫セルラインでｇａｌ４系を試験するために、ベクターｐ２ＺＵＡＳｍＰＦＢ−ｇａｌを、ｐ２ＺｍｔｎＦｇａｌ４構築物を宿す昆虫セルラインに入れた。代わりに、その構築物を、セルラインに同時遺伝子導入できた。Ｂ−ｇａｌ活性が、一過性および安定な昆虫セルラインのどちらでも検出されなかった。ｍｔｎプロモーターを誘導するのに５００μＭの硫酸銅を添加して、Ｂ−ｇａｌ発現が、この誘導系が昆虫細胞で機能性があることを示す１００単位より大きいと分かった。上の形質転換遺伝子を越えたこの誘導系の利点は、厳密なオン／オフ制御を必要とする酵素カスケードまたはシグナル形質導入経路で処理するとき、重要でありうる２段階の制御系である。それは、誘導性遺伝子産物を昆虫細胞に導入するための第三の系を付与する。これは、多重制御点を必要とするカスケード系を研究するときに重大である。
異種レポーター遺伝子を発現する安定に形質転換した昆虫セルラインの生成
外来遺伝子を発現する本発明の安定な、形質転換したセルラインの能力を、数種のクローナルＳＬ２セルラインと同様にポリクローナルＳｆ９、ＳＬ２およびＬｄ６５２Ｙセルラインを生成し、ｐＺＯｐ２Ａβ−Ｇａｌ構築物を保有することによって試験した。
以下のとおり形質転換を達成した。およそ２×１０6細胞を、製造業者の推奨によって２μｇのＣｓＣｌ−精製プラスミドおよび１０μｌのセルフェクチン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））と形質転換させた。細胞を、６穴組織培養プレートに移行させ、そして４８時間耐性マーカーを回収および発現させた。この時に、細胞を１：１０に分け、そして耐性ポリクローナルセルラインを、それぞれ、Ｌｄ６５２Ｙ、Ｄ．ＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳｆ９セルラインと一緒に１５０、２５０および１０００μｇのゼオシン（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ））を添加して選択した。
４８時間回収されたクローナルＳＬ２セルラインを限定した希釈、それによって１×１０3細胞によって生成し、１×１０4非形質転換フィーダー細胞を伴う９６穴マイクロタイタープレートの個々のウエルに入れた。単離クローンは、２−３週内に一部のウエルに現れた。
上に記述されるとおり総ゲノムＤＮＡを単離した。５マイクログラムの総ゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩおよびＳａｌＩまたはＥｃｏＲＩのいずれかで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてナイロン膜の上にブロットした。全ｐＺＯｐ２Ａβ−Ｇａｌプラスミドをプローブとして用いたＥＣＬ化学発光系（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国）でサザンブロット分析を行った。サザンブロッティングは、クローナルラインを実際に形成させ、そしてベクターと形質転換させることを確認した。予想されるとおり、非形質転換ＳＬ２、Ｓｆ９およびＬｄ６５２Ｙ制御セルラインから単離されたサザンブロットは、なんらハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。
定常選択下を維持した場合、「ポリクローナル」Ｌｄ６５２Ｙ、Ｓｆ９およびＳＬ２セルラインは、２０継代（およそ５ヶ月）後、それぞれ、２、６および５５００単位のβ−ガラクトシダーゼを発現した。安定なＳＬ２クローナルラインは、１０００−４０００単位のβ−ガラクトシダーゼの間で発現した。抗生物質の不在下で、ポリクローナルＳＬ２セルラインによるβ−ガラクトシダーゼ産生は、減少し、最終的におよそ１００単位に安定化した。サザンブロット分析は、酵素産生におけるこの減少が、ベクター配列の態様の損失から生じなかったことを示した。これは、発現カセットの画分のゲノムサイレンシングが、移入遺伝子でしばしば観察されるとおり、選択圧の不在下で起こった可能性を上昇させる（Ｍｅｙｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１３：３３２−３３７（１９９５年））。
ポリクローナルおよびクローナルセルラインを発現するβ−ガラクトシダーゼのサザンブロット分析（図１０）は、ベクターコピー数と酵素発現との間に相関関係が存在することを示す。異種タンパク質を発現する様々な種から由来したセルラインの相対的許容量は、ベクターＤＮＡ取込みおよび組込みを最大限にする形質転換および選択のための条件を発展させることによって増強できる。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターにおけるプロモーター要素の特徴
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの特徴は、それが、多くの区別できる機能性配列要素を含むことを示す。ここに開示されるデータと一緒に先に公表されたデーダは、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの機能的に重要な配列要素に相同性を示す新規プロモーターが、本発明によって構築されうることを共に示す。
Ｏｐ  ｉｅ２の５’シス−作用プロモーター配列を、Ｌｄ６５２ＹおよびＳｆ９鱗翅目昆虫セルライン中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター構築物を用いた総欠失分析によって当初に分析した（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７；８４−９６（１９９２年））。ＣＡＴ発現レベルは、Ｓｆ９細胞でよりいっそう高く、それはＯｐ  ｉｅ２プロモーターのいっそう感受性のある分析を供与した。
予備欠失分析は、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターから配列を指向することに関与していると見られる２つの反復要素を確認した（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７；８４−９６（１９９２年））。反復要素の共通配列は、ＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂ要素と称される、配列番号９：ＣＴＴＡＴＣＧＧおよび配列番号１０：ＡＣＡＧＧＡＣＧＣである。ＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂ要素を、ｉｅ２プロモーターで、それぞれ７および６回反復させた。ＧＡＴＡ要素は、ＯｐＭＮＰＶｅｆｐ／ｇｐ６４およびＡｃＭＮＰＶｐｅ３８プロモーターにある細胞因子を結合すると見られるものと同一である（Ｋｒａｐｐａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３４０４−３５０３（１９９２年））。ＩＥ２Ｂ要素は、他のいかなるバキュロウイルスプロモーターにも見られなかった。ＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂ要素は、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター中の対の要素として３回見られる（図１ａおよび２）。
欠失分析については、ＢａｍＨＩリンカーを用いてＯｐ  ｉｅ２転写開始部位から２０ｂｐ下流にＣＡＴ遺伝子を入れることによって、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターレポータープラスミドであるｐＩＥ−２ＣＡＴを構築した。５’プロモーター領域は、Ｏｐ  ｉｅ２配列１−６７７から由来し、そして３’ポリアデニル化（ｐＡ）配列は、Ｏｐ  ｉｅ２配列１８６５から２０１０までから由来した（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７；８４−９６（１９９２年））。ＣＡＴ遺伝子を、ｐＣＡＴプラスミドのＢａｍＨＩフラグメントとして得た（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９；８５７−８６４（１９８４年））。ＥｘｏＩＩＩおよびヤエナリ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）またはＢａｌ３１のエキソヌクレアーゼ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、ニューヨーク州コールド・スプリング・バーバー（１９８９年）；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、３３：１０３−１１９（１９８５年））のいずれかを用いて、欠失サブクローン（５’から３’まで）のプロモーター領域を生成させた。
ｐＩＥ−２ＣＡＴ５’から３’までの欠失構築物を、Ｓｆ９およびＫｃ１細胞に形質移入させ、細胞を収穫し、そしてＣＡＴ分析（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５：４４４−４４８（１９８７年））について処理し、そして結果は図１ａに要約された。Ｌｄ６５２Ｙ、Ｋｃ１およびＳｆ９細胞にあるＯｐ  ｉｅ２プロモーターからＣＡＴ発現の検出可能なレベルを得るために必要とされる最小または基本のプロモーターは、それぞれ、転写開始部位から１２５ｂｐ、４６ｐｂおよび９８ｂｐ上流であった（図１ａ）。Ｏｐ  ｉｅ２特異的調節要素の機能的顕著さを測定するために、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター領域の微量欠失分析を行った。１７７ｂｐまでの欠失は、Ｓｆ９およびＬｄ６５２Ｙ細胞のいずれかにある最大のＣＡＴ発現に顕著に影響を及ぼさない（図２ａでの−１７７ｂｐから０ｂｐまでのＩＥ−２の配列は、３５１ｂｐから５２７ｂｐまでの配列番号：１に対応する）。位置−１５２に対するさらなる２４塩基対の別の欠失は、ＣＡＴ発現の７５％減少まで生じる。位置−１７７と−１５２の間の領域は、ＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂ要素対を含む。追加の３０ｂｐが位置−１５４から−１２５までを欠失させた場合、配列は、１０％の最大レベルまでさらに減少させる。この領域は、２つのＩＥ２Ｂ要素を含む。ＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ要素対でのほとんどのＧＡＴＡ配列を排除する塩基対−１２５から−１１４までの別の欠失は、ほとんど検出不可能なレベルの発現を生じる。
いくつかの実施形態で、Ｋｃ１細胞と共に、プロモーター活性での減少と、５’プロモーター欠失の増加との間に相関関係がある可能性がある（図１ａ）。しかし、鱗翅目セルラインと違い、Ｋｃ１細胞での最小の検出可能なプロモーター活性のために、唯一単一ＧＡＴＡ配列が必要とされる。ＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ配列の封入を行うときに、いっそうのＧＡＴＡコピーの添加が、Ｋｃ１細胞でのプロモーター活性を増加させる。反復ＩＩＡおよびＢが存在する場合、この実施形態での全長プロモーター活性を達成する。
これらの結果は、ＧＡＴＡ−ＩＥ２Ｂ対が、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの調節要素であることを示す。これらのデータは、−１７７から−１１４の間のＯｐ  ｉｅ２配列に相同な配列に関与するＯｐ  ｉｅ２プロモーターの機能的変異体が、本発明にしたがって構築されることを示唆する。特に、ＧＡＴＡ  ＩＥ２Ｂ要素対に相同な配列に関与する機能的に新規なプロモーターが設計されうる。
プロモーター活性を増加させるために、ｉｅ−２プロモーターの構成成分を活用するキメラプロモーターを構築する研究も行った（図１ｂ参照）。−２３７の５’欠失構築物を塩基（ｐ２ＺＳ２３７）として利用して、多くの合成キメラプロモーター組合せを行い、そしてＣＡＴレポーターを用いて３つのセルラインで試験した。２３７領域を複写することで、ｐ２ＺＳ２３７構築物を越えたプロモーター活性で最小の増加を生じた。その領域を三重複写することで、それぞれ、Ｌｄ６５２ＹおよびＳｆ９細胞でのＣＡＴ活性で１．８および１．５倍増加を起こさせた一方で、Ｋｃ１細胞では、活性に減少が見られた。Ｏｐｉｅ−２遺伝子の下流で確認されたエンハンサー配列（ＯｐＥ）も、プラスまたはマイナス配向性のいずれかで、塩基−プロモーター／ＣＡＴ遺伝子まで５’または３’のいずれかの構築物に添加した。エンハンサー配列ＯｐＥは、６６ｂｐ要素配列番号１６：５’−ＣＣＴＴＴ  ＣＡＡＧＣ  ＧＣＧＴＧＣＧＣＡＣ  ＣＣＧＡＡＡＡＧＣＡ  ＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣ  ＴＧＡＣＧＣＡＣＴＧ  ＣＴＡＡＡＡＡＴＡ  ＧＣＡＣＧＣＧ−３’（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７：９７−１０６（１９９６年））の１２の完全なまたは部分的な反復として確認された。全ての場合に、エンハンサーＯｐＥの封入が、Ｌｄ６５２Ｙ細胞にある塩基プロモーターを越えてカッセイでおよそ２倍の増加をさせた。Ｓｆ９細胞で、エンハンサーが、マイナス配向でのプロモーターに対して５’であった場合のみに、プロモーター活性の増加が見られた。Ｋｃ１細胞は、いずれの配向にあるプロモーターに対するエンハンサー５’で２倍の増加を示した。その遺伝子に対するエンハンサー３’のプラス配向が、活性で１．５倍増加を示す一方で、マイナス配向で、プロモーター活性での減少が見られた。
これらの結果は、種々のキメラプロモーターの組合わせが、種々のセルラインからのタンパク質産生を増加させるのに有用である別の証拠を提供し、１つの実施形態では、ｐ２ＺＳ２３７−ＯｐＥ５組合せは、セルラインで最も増強された活性を供する。
図２は、ＯｐＭＮＰＶｉｅ２遺伝子から得た一列のプロモーター配列および関連のＡｃＭＮＰＶから得た相同のｉｅｎ遺伝子を示す。ＵＷＧＣＧ  ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：３８７−３９５（１９８４年））を用いて、配列を行った。図２にある配列の配置は、最大のＯｐ  ｉｅ２活性のために必要とされるＯｐ  ｉｅ２の−１７７から−１１４領域が、ＡｃＭＮＰＶ  ｉｅｎプロモーターに対するほとんど相同性さないこと含むを示す。ｉｅｎプロモーターは、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターのＩＥ２Ｂ要素を含まない。Ｏｐ  ｉｅ２およびｉｅｎプロモーターの間の別の区別が、Ｏｐ  ｉｅ２の−２７５から−２５７までの領域の欠失の結果から現れた。−２７５から−２５７のＯｐ  ｉｅ２欠失は、Ｓｆ９細胞にあるＡｃＭＮＰＶ  ｉｅｎプロモーターのための正のシス作用調節要素として示されるＡｃＭＮＰＶｉｅｎプロモーターにある要素に非常に相同である反復ＩＢを除去する（Ｃａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５：９４５−９５１（１９９１年））。ここに開示される欠失の結果は、反復ＩＢ領域の完全なコピーが、Ｓｆ９細胞での高いレベルのＯｐ  ｉｅ２に必須でないことを示し、それによりＡｃＭＮＰＶｉｅｎプロモーターから機能的にＯｐ  ｉｅ２プロモーターを区別した。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの特徴
本発明のシャトルベクターにあるＯｐ  ｉｅ２プロモーターの使用と関連した多数の予想外の利点がある。本発明のシャトルベクターで、上で検討されるとおり、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターは、Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）セルラインのいずれかにあるエンハンサーなしのＡｃ  ｉｅ１プロモーターに比較して予想外に高いレベルの相同な遺伝子発現を示す。さらに、ここで開示された形質転換セルラインのβ−ガラクトシダーゼアッセイは、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターの活性が、昆虫細胞に限定され、哺乳類セルラインで検出可能な機能を有しないことを示す。この後者の結論は驚くべきことに、反対の結果、すなわち、哺乳類細胞での活性プロモーター機能が、Ａｃ  ｉｅ１プロモーターについて報告された（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５６：１５３−１６０（１９８５年））ことを示した。
Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターが哺乳類細胞で機能しないという予想外の成果は、哺乳類細胞での機能が可能であるプロモーターを使用する先行文献のベクターを越えて重大な利点を伴う本発明のベクターを付与する。Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを組込む本発明のベクターを使用することは、非標的生物に対する活性の相同な遺伝子の不意の移行のための潜在力を最小限にする。したがって、本発明のこのようなベクターを使用することは、適切な遺伝子構築物の特性が、異種遺伝子が未強化宿主に移すか、または発現される可能性を上昇させる移入遺伝子研究で適切に課されて制限の使用を避けることができる。
欠失分析によってここで確認されたＯｐ  ｉｅ２配列は、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター：無傷のバキュロウイルスの複製に寛大であり、そして非寛大である両方の広範な昆虫細胞での活性；哺乳類細胞での検出可能な活性の欠如；および他の関連プロモーターのものに匹敵するが、エンハンサー要素のための必要性なしの発現レベルという予想外の特性の要因である可能性がある。当業者は、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを自然に生じる厳密な配列が、同様の結果を供する同じ方法で機能するプロモーターを供給するために、ある程度まで修飾することができることを認識し、このような修飾は、本発明の範囲内である。
核酸配列に関してここで使用されるとおり、語句「相同性」または「相同な」は、配列同一性および機能上の類似性の程度を意味する。自然に生じる相同な配列は、それらが共通の祖先の配列を共有するという点で、進化上関連している可能性がある。相同な配列は、合成または突然変異誘発を通して人工的に作製されることもできる。いずれの場合に、ここで同定されるとおりの相同な配列は、その配列に類似の生物学上の機能を供与する十分な程度の配列同一性を示す。語句「相同性」は、２つの配列の間の配列同一性の程度によってここで使用され、その結果、相同な配列は、相同性、すなわち、配列同一性の変化の程度を示す。当業者は、欠失分析によってここで同定されたＧＡＴＡおよびＩＥ２ＢＯｐ  ｉｅ２配列要素のような配列の機能的に重要なセグメントで実質的に相同性を示す配列が、このような配列の他の領域が相当な相同性を示さない場合でさえ、類似の生物学上の特性を示す可能性があることを認識する。相同な配列は、実質的な相同性の領域を示すことが好ましい。配列の間の、または配列の部分の間の実質的な相同性は、このような配列の間に少なくとも７５％配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％配列相同性、そしてさらに好ましくは少なくとも９５％配列相同性を意味する。
１つの実施形態では、本発明は、即時型バキュロウイルスプロモーターに相同性を示し、そしてそれとして機能する能力のある昆虫プロモーターを含む。このようなプロモーターは、あらゆる自然に生じる即時型バキュロウイルスプロモーターに相同性を示す可能性があり、そしてバキュロウイルス系で遺伝子発現を指向するこのようなプロモーターの場所で機能する能力がある。このようなプロモーターは、好ましくは、欠失分析によって、ここで同定されたＧＡＴＡおよびＩＥ２Ｂ  Ｏｐ  ｉｅ２配列要素のようなこのような自然に生じるプロモーターの機能的に重要な領域で自然に生じる即時型バキュロウイルスプロモーターに実質的に相同性を示す。代わりに、このようなプロモーター配列は、Ｏｐ  ｉｅ２のような全ての自然に生じる即時型バキュロウイルスプロモーターに実質的に相同性を示す。代わりに、即時型バキュロウイルスプロモーターに相同性を示し、そしてそれとして機能する能力のある昆虫プロモーターは、緊縮条件下でこのような即時型バキュロウイルスプロモーターにハイブリッド形成する特性によって特徴付けられうる。このようなハイブリダイゼーションのための緊縮条件は、配列依存性であり、そして様々な環境で異なる。一般に、緊縮条件は、所定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列について溶融点（Ｔm）より約５℃低く選択される。Ｔmは、５０％の完全に適合した配列がハイブリッド形成する温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）である。いくつかの実施形態では、緊縮条件は、塩濃度が、ｐＨ７で約０．０２モルまたはそれ未満であり、そして温度が、比較的短い配列で少なくとも約６０℃であるものである。
実施例１
ａ）ヒトメラノトランスフェリン（ｐ９７）の発現
本発明のベクターが高度に修飾された異種タンパク質の発現を行い得ることを、（ｐ９７としても知られている）ヒトメラノトランスフェリンをコードするｃＤＮＡを構成的なプロモーター（Ｏｐ  ｉｅ２）または誘導可能な（Ｍｔｎ）プロモーターのいずれかの制御下で含有する構築物を作製することによって調べた。
メラノトランスフェリンは、典型的な疎水性の膜貫通ドメインによるよりも、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して結合する細胞の外側表面に輸送されるシアロ糖タンパク質である（Ｆｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０３４−３０４０（１９９４））。このタンパク質は、メラノーマに特異的な診断マーカー（Ｂｒｏｗｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：５３９−５４３（１９８１））として最初に報告されたが、その後、アルツハイマー病患者の脳組織において亢進したレベルで存在することが明らかにされた（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、７１２：１２２−１２６（１９９６））。誘導可能なｐ２ＺＭｔｎ９７および構成的なｐ２ＺＯｐ２Ｃ９７の構築物を、ｐ９７ｃＤＮＡの完全なタンパク質コード領域を含有するｐＡ３−２から得られるＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩフラグメントを哺乳動物発現ベクターｐＺｅｏＳＶのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ部位にクローニングして、ｐＺｅｏＳＶ９７を作製することによって作製した。続いて、ｐ９７のコード領域およびＳＶ４０のｐＡ配列を含有するＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＺｅｏＳＶ９７からｐ２ＺＯｐ２ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングして、ｐ２ＺＯｐ２Ｃ９７（構成的発現構築物）を作製した。別の系列において、ｐＺｅｏＳＶ９７のＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをｐ２ＺＭｔｎのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングして、ｐ２ＺＭｔｎ９７（誘導可能な発現構築物）を作製した。細胞を、２μｇのＣｓＣｌ精製したＤＮＡおよび１０μｌのセルフェクチンを用いて前記のように形質転換した。一過性アッセイにおいて、細胞を、形質転換の４８時間後に集め、微量遠心分離機で４，０００×ｇでペレット化し、５０μｌの細胞溶解緩衝液［２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０および０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド］に再懸濁した。安定的に形質転換されたクローンセルラインを上記のように選択したが、Ｓｆ９は、フィーダー細胞のマイクロタイターウエルへの添加を必要としなかった。ウエスタンブロット分析を、１０μｇのタンパク質を１０％非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動的に分離し、ニトロセルロース膜に転写することによって行った。ｐ９７タンパク質を、Ｌ２３５抗ｐ９７モノクローナル抗体を一次抗体としてリン酸緩衝化生理食塩水での培養上清の１／１０稀釈で使用し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を１／２０，０００稀釈で使用し、その後、ＥＣＬ化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）での検出を行うことによって検出した。
ｐ９７特異的モノクローナル抗体を使用する一過性形質転換昆虫セルラインのウエスタンブロット分析により、Ｓｆ９、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、およびより少ない程度でＬｄ６５２Ｙセルラインは、検出可能な量のｐ９７を発現し得ることが明らかにされた（図１１Ａ）。このことは、本発明者らが操作したシステムなどの、様々なセルラインでの発現を可能にするシステムが必要であることを示す。安定的に形質転換されたＳｆ９およびＳＬ２のクローナルセルラインを作製し、これらは、それぞれ、構成的なｉｅ２または誘導可能なＭｔｎプロモーターのいずれかを使用してｐ９７を発現する（図１１Ｂ）。選択下において、これらのセルラインは、３ヶ月間にわたって１２回継代した後、ｐ９７の発現は低下しなかった。β−ガラクトシダーゼを産生するセルラインの場合と同様に、サザンブロット分析は、ベクターのコピー数とタンパク質発現の相対量との相関を明らかにした。Ｓｆ９細胞により産生されるｐ９７の分子量は、バキュロウイルスで産生されるｐ９７の分子量と類似していたが、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞において同じ構築物から産生されるｐ９７の分子量はわずかに小さかった。バキュロウイルスシステムから得られるｐ９７は、ヒトｐ９７よりもわずかに小さい分子量を有する。二次元電気泳動により、ヒト細胞で発現するｐ９７とＳｆ９細胞においてバキュロウイルスにより発現するｐ９７との分子量の違いは、複雑な炭水化物修飾が行われないためであることが明らかにされた。最後に、ｐ９７を検出するために使用したＬ２３５モノクローナル抗体は、タンパク質内にジスルフィド架橋を含むエピトープに特異的である。ｐ９７タンパク質は、高度にプロセシングされているだけでなく、高度に折りたたまれており、従って、これらの昆虫セルラインにおける組換えｐ９７の検出は、ポリペプチドを合成するそれらの能力を反映するだけでなく、複雑な二次構造および三次構造をうまく組み立てるそれらの能力を反映する。
ｂ）形質転換された昆虫細胞における組換えｐ９７の局在化
２つの形態のｐ９７が、哺乳動物において天然に存在する。ヒトｐ９７の約８０％は、タンパク質のカルボキシル末端に共有結合したグリコシルホファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞表面に結合している。全ｐ９７の約２０％を構成する第２の形態は、現在まで知られていない機構によって細胞から細胞外液に運ばれる（Ｆｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：３０３４−３０４０（１９９４））。
間接的な免疫蛍光法を使用して、昆虫セルラインにおいて発現する異種ｐ９７の詳しい細胞局在性が明らかにされた。形質転換細胞を、１ｍｇ／ｍｌのポリＬ−リジン（４００，０００ＭＷ）溶液で予めコーティングされ乾燥させたガラス製カバーガラスに３０分間接着させた。スライドガラスをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に浸し、新しく調製した４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、その後、メタノール：アセトンの１：１溶液で４５秒間インキュベートした。スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで１０分間インキュベートし、その後、さらに３回ＰＢＳで洗浄した。細胞を、２０分間、ＦＡＴＳ（２０％の胎児ウシ血清、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）でブロッキングし、その後、６０分間のインキュベーションをＬ２３５抗ｐ９７モノクローナル抗体（未稀釈のハイブリドーマ上清として使用）を用いて加湿室内で行った。スライドガラスを１０分かけてＰＢＳで３回洗浄し、次いで二次抗体（ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦａｂフラグメントの１／３０稀釈物）と６０分間インキュベートした。スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄し、固定し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかを使用して観察した。
これらの実験により、Ｓｆ９セルラインにおいて発現するｐ９７は、細胞の外膜に正しく局在化していることが明らかにされた（図１２ａ）。逆に、形質転換されたＳＬ２またはＫｃｌセルラインは、ウエスタンブロット分析によって示されるように相当量のｐ９７が産生しているにもかかわらず、細胞の細胞表面に何ら蛍光を示さなかった。時々、細胞内に斑点状の染色が観察されたが、これは、特定の領域またはオルガネラに局在化し得ず、従って細胞質性であり得る。このような現象は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインのいずれかの細胞で発現するｐ９７の大きさが減少したことに関連し得る。なぜなら、小胞体における間の複雑な炭水化物のタンパク質への翻訳後修飾による付加が、正しい局在化に関連していることはよく知られているからである。分子量のわずかな減少にもかかわらず、Ｓｆ９細胞は、十分なコア修飾を行うことができ、この個々のタンパク質の正しい局在化を可能にする。それに対して、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインはそのようなことができない。しかし、これは、本質的には、細胞質タンパク質の下流工程での精製が、膜成分から解離しなければならないタンパク質の場合よりも一層簡略化される点で著しく有利になり得る。このことは、再度ではあるが、様々な属の昆虫に由来するセルラインにおいて機能し、その結果、そのような異なるセルラインの特異的な翻訳後修飾プロセシング能力を効率的にアッセイし得る昆虫の形質転換システムが必要であることを強調する。
ｃ）組換えｐ９７発現の定量
形質転換された昆虫セルラインによって産生されるｐ９７の量を、間接的な免疫蛍光アッセイを使用して定量的に測定した。ｐ９７を、最初に、ＧＰＩ特異性酵素ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）による切断によって細胞表面から遊離し、次いでｐ９７特異的抗体を使用して上清から免疫沈降させた。沈澱物中のｐ９７の量を、標識抗体（この場合、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ）とのインキュベーションにより測定し、蛍光度計を使用して定量した。等しい数の細胞を使用した。Ｓｆ９クローン（Ｃ．１６）は、４，０００蛍光度計単位の細胞表面ｐ９７を発現したが、ＦＡＣＳ選択の増幅組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、細胞表面で約１，０００単位を発現した。この２つのセルラインの相対的な大きさおよび表面積を考慮した場合、発現レベルは匹敵し得る。昆虫セルラインは、典型的には、哺乳動物セルラインよりも高密度に生育することができる。このことは、本発明の形質転換された昆虫セルラインは、増幅されたＣＨＯ細胞よりも多くのｐ９７を産生しないとしても、ｐ９７をそのように生成することを示唆する。形質転換されたＳｆ９細胞からの発現は、多数の方法で最適化することができる：ＦＡＣＳ選択によって、改変された形質転換プロトコルによって発現カセットコピー数を増大させることによって、細胞収穫の最適な時間を決定するために増殖期を通して発現を分析することによって、あるいはこれらの方法を組み合わせることによって、非常に多くのクローンがスクリーニングされる。予想されるように、ｐ９７は、形質転換されたＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインの表面からＰＩ−ＰＬＣ切断によって遊離されなかった。
ｄ）ＧＰＩ欠損構築物を使用するｐ９７の分泌
形質転換されたＳｆ９クローンにおける全長のｃＤＮＡ構築物から発現するｐ９７の大部分は、細胞壁と結合していた。段階限定的な産生がＧＰＩアンカーのプロセシングおよびその結合にあるかどうかを明らかにするために、一連のカルボキシル末端欠失物を作製して、ＧＰＩシグナル配列のコード領域を削除した。
内側の３′欠失物を、ｐ９７のＧＰＩシグナル配列を除去するために、エキソヌクレアーゼ３／Ｓ１ヌクレアーゼ法を使用して作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９）。約１０ｍｇのプラスミドｐＡ３−２を、停止コドンの８７ｂｐ下流を切断するＮｒｕＩで消化し、３０秒〜１８０秒の範囲でエキソヌクレアーゼ３処理を行い、その結果、ＮｒｕＩ部位から末端の２５アミノ酸（約２００ｂｐ）を除いた。末端を、クレノーＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓを使用して平滑化し、開始コドンの５′を切断するＨｉｎｄＩＩＩで消化し、各時間から回収したフラグメントをｐ２ＺＯｐ２ＦのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。このベクターは、３′欠失物を作製したときに除去した停止コドンの代わりをする３通りのすべての読み枠での停止コドンを有する。
いくつかの関連する欠失物を図１２ｂ示す。これらの欠失物は、ニワトリのホモログのアミノ酸配列に関して分類することができる。ヒトｐ９７から末端の１６アミノ酸を除去すること（−１６構築物および−１５構築物）によって、ｍＲＮＡ転写物の異なるスプライシングから生じる分泌型のニワトリ形態［ＭｃＮａｇｎｙ，Ｋ．Ｍ．、Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．およびＧｒａｆ，Ｔ．１９９６。好酸球特異的細胞表面抗原ＥＯＳ４７は腫瘍胎児性抗原メラノトランスフェリンのニワトリのホモログである。Ｂｌｏｏｄ  ８７：１３４３−１３５２］に効果的に類似するタンパク質が得られる。−２０構築物および−２１構築物は、ＧＰＩシグナル配列の大部分を失っているが、ＧＰＩが結合するアラニン残基、および正しいタンパク質折り畳みを確実に行うための最も末端のシステイン残基の両方を保持している。逆に、これらの重要なアミノ酸の両方は、−３５構築物および−３７構築物においては除去された。
構成的なＯｐＩＥ−２プロモーターの制御下にある欠失構築物を用いたＳｆ９の形質転換により、耐性ｐ９７発現クローンが多数得られた。細胞ペレットおよび濃縮した培養上清の対応量のウエスタンブロット分析は、ｐ９７の大部分が培養培地に分泌されていることを明らかにした（図１２ｃ）。−１５、−１６、−２０および−２１の構築物で形質転換された細胞の細胞ペレットは、観測される分子量がわずかに異なる２つのタンパク質を示し、グリコシル化から、あるいはアミノ末端分泌シグナルペプチドのプロセシングから生じる中間体を示していることが考えられる。１個の違ったバンドのみが、培養培地のサンプルにおいて再現性よく観測された。末端のシステイン残基を含有していない−３５構築物は、同様に活性的に分泌されたが、ウエスタンブロットで、より大きく拡がったバンドとして現れた。この人為的な結果は、Ｌ２３５モノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行うときには非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用しなければならないという事実によるためである。なぜなら、抗体が認識するエピトープは、システインジスルフィド結合を有し、従って、タンパク質は部分的に未変性のままであるからである。−３５構築物は、末端のシステイン残基を含有していない。従って、このタンパク質のカルボキシル部分は、自由のままであり、より多くのＳＤＳと結合することができ、その結果、より大きく拡がったバンドが生じる。それにもかかわらず、タンパク質は、細胞の外部に正しく運ばれる。
同じ構成的構築物で形質転換を行ったとき、耐性的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａセルラインクローンはどれも、検出可能なレベルのｐ９７発現を示さなかった。一過性アッセイにおいて、ｐ９７の発現が、細胞ペレットおよび上清の両方においてほぼ等しい比で検出されたが（データ示さず）、タンパク質が分泌されていると結論することはできない。なぜなら、形質転換処理は、それ自体、細胞膜を透過性にし、細胞質内容物の喪失および／または細胞死をもたらす細胞の完全化を含むからである。細胞ペレットと結合したままである認識可能な量のｐ９７は、このことが最もらしいということを示す。
ｐ９７の分泌をもたらすＧＰＩシグナル配列を除去することによっても同様に合成速度が増大するかどうかを明らかにするために、時間経過実験を行った（図１２ｄ）。ｐ９７の産生量を、間接的な免疫蛍光アッセイを使用して測定した（Ｋｅｎｎａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４２：４８０−４８６（１９９３））。発現の全体的な最大速度は、初期〜中期の対数期において生じたが、十分に蓄積するように定常期まで続き、細胞死の開始とともに停止するだけであった。培養における総最大蓄積は１０ｍｇ／ｍｌに達した。これは、Ｓｆ９のｐ９７−１６およびｐ９７−２１に関して、それぞれ、３．３ｍｇ／１０６および５ｍｇ／１０６細胞にほぼ相当する。この量は、低密度のＳｆ９細胞によって産生されたが、形質転換されたＳｆ９細胞で発現する全長のＧＰＩアンカー型形態と比較した場合、６〜７倍の増大した産生を示し、バキュロウイルスと同等である。Ｓｆ９の細胞密度を増大させることによって、５０ｍｇ／ｍｌに達する濃度を得ることができることは明らかである。哺乳動物細胞またはバキュロウイルスシステムのいずれかを使用してＧＰＩ欠損型を発現する試みは行わなかったが、生産性が同様に増加することは予想され得る。ウエスタンブロット分析により、タンパク質は、細胞死および細胞溶解の開始にもかかわらず、培養後の培養液中において、数日間、変化を受けないままであることが明らかにされた（図１２ｅ）。
これらの結果は、天然タンパク質の小さな改変により、細胞内の輸送および／または細胞からの分泌が促進され得ることを明らかにする。類似する構築物は、哺乳動物システムにおいて類似する特性を付与するために適合させることができる。これには、培養で生育する細胞、および適当な哺乳動物発現ベクターを使用するキメラ動物またはトランスジェニック動物の両方が含まれる。
実施例２
ａ）昆虫のイオン輸送ペプチド（ＩＴＰ）の発現
本発明の昆虫のタンパク質発現システムの有用性をさらに例示するために、このシステムを使用して、いくつかの昆虫セルラインが分泌型の昆虫のイオン輸送タンパク質ホルモン（ＩＴＰ）を発現する能力を調べた。インビボにおいてＩＴＰは、側心体によって分泌され、バッタ（Ｓｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の回腸における塩および水の再吸収を促進する。分泌されることに加えて、このタンパク質はまた、広範囲のアミノ末端およびカルボキシル末端でのタンパク質分解的なプロセシング、ジスルフィド結合の作成、およびおそらくは、カルボキシル末端でのアミド化を活性化のために必要とする（Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９９：１０５３−１０６１（１９９６））。
ＩＴＰ発現カセットを含有するプラスミドベクターを下記のように構築した：ＩＴＰのコード領域を含有する４０５ｂｐのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩのｃＤＮＡフラグメントを、ｐＺｅｏＳＶのＳｃａＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。次いで、この中間プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓで平滑化し、その後、ＮｏｔＩで切断して、ＳＶ４０の転写終結およびｐＡ配列に融合したＩＴＰのオープンリーディングフレームを含有する６３０ｂｐフラグメントを除いた。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断され、クレノーＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓで平滑化され、次いでＮｏｔＩで再切断されたｐ２ＺＯｐ２Ａに挿入し、プラスミドｐ２ＺＯｐ２Ｃ−ＩＴＰを作製した。
いくつかの昆虫セルラインを、２μｇのＣｓＣｌ精製したプラスミドＤＮＡおよび１０μｇのセルフェクチンを用いて上記のように形質転換した。形質転換の約４８時間後に、細胞を低速度（３，０００×ｇ）で遠心分離し、Ａｕｄｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１７３：２６１−２７４（１９９２）に従って生物学的活性について上清をアッセイした。高レベルの活性は、形質転換されたＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルライン、ＫｃｌおよびＳＬ２の上清で検出されただけであった（図１３ａ）。より一層低いレベルの活性が鱗翅目セルラインＳｆ９で検出された。Ｌｄ６２５ＹまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉセルラインＨｉ５では活性は認められなかった。
ＩＴＰがＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス発現システムで発現される場合、生物学的活性のレベルは、本発明のＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインで観測されるレベルの約１００倍未満であった。これは、様々な要因によるものであり得るが、バキュロウイルスで発現したＩＴＰペプチドの配列決定により、このペプチドのアミノ末端は正しくプロセシングされていないことが明らかにされた。このようなプロセシングは、活性の低下をもたらし得る。さらに、本発明者らは、組換えＩＴＰを発現するいくつかの安定的に形質転換されたＫｃｌ、ＳＬおよびＳｆ９セルラインを作製した。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒセルラインは、生物学的活性に基づいて、高レベルのＩＴＰを安定的に発現し分泌したが、Ｓｆ９セルラインは、より適度なレベルの生物学的に活性な産物を産生した。これらの結果は、本発明の安定的に形質転換された昆虫セルラインの翻訳後修飾プロセシング能力は溶解性のバキュロウイルス発現システムの翻訳後修飾プロセシング能力と著しく異なることを明らかにする。
実施例３
ａ）第Ｘ因子の発現
本発明の昆虫発現システムはまた、ヒトのトランスフェリン（Ｔｆ）分泌シグナルを使用して、ヒト第Ｘ因子を分泌するいくつかの昆虫セルラインの能力を試験するために使用された。第Ｘ因子は、血液凝固カスケードに参加する血漿の糖タンパク質である（Ｄａｖｉｅら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：２７７−３１８（１９７９））。第Ｘ因子は、１つのジスルフィド結合によって一緒になっている１６．９ｋＤａの軽鎖および４２．１ｋＤａの重鎖からなる。第Ｘ因子のＥ２ドメインは、活性化ペプチドおよび触媒活性ドメインを含有し、ヒト第Ｘ因子ｃＤＮＡの３９９〜１４５６のＤＮＡ配列として規定される（Ｌｅｙｔｕｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：５０９８−５１０２（１９８６））。
第Ｘ因子のＥ２ドメインを含有するプラスミドベクターを下記のように作製した。Ｔｆ分泌シグナル、ＦＸのＥ２ドメインおよびヒスチジン×６標識を含有する１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ２ＺＯｐ２ＦのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
いくつかのセルラインを、２ｕｇのＱｉａｇｅｎ精製したプラスミドＤＮＡおよび１０ｕｌのセルフェクチンを用いて上記のように形質転換した。形質転換の約４８時間後に、培養物を集め、細胞を低速度（３，０００×ｇ）の遠心分離によって除いた。ウエスタンブロット分析を、非変性負荷緩衝液中の２０ｕｌの上清を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースに転写することによって行った。第Ｘ因子タンパク質を、市販の抗第Ｘ因子ポリクローナル抗体を一次抗体として１／５０００稀釈で使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を二次抗体として１／２０，０００で使用し、その後ＥＣＬ化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）による検出を行うことによって検出した。
一過性形質転換および安定的な形質転換の両方のポリクローナルセルラインのウエスタンブロット分析により、第Ｘ因子は、試験したすべてのセルラインにおいて、トランスフェリンのシグナル配列を使用して、培地に効率よく分泌されることが明らかになった（図１３ｂ）。このことは、さらに再度ではあるが、多数の昆虫セルラインに由来する異種タンパク質の発現におけるＯｐ  ｉｅ−２プロモーターの万能性を明らかにする。昆虫細胞が、ヒトのトランスフェリン分泌シグナルを正しくプロセシングし得ることもまた明らかにされる。
産生した第Ｘ因子は、ヒスチジン×６配列がＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に結合することによって培地から回収することができる。回収されたタンパク質が活性化ペプチドで切断されると、タンパク質は、天然の活性化ヒト第Ｘ因子と同様の活性を有する。このことは、第Ｘ因子の正しい翻訳後修飾のすべてが、昆虫細胞において適切に行われていることを示す。
トランスポゾンに基づく形質転換／タンパク質発現ベクターの構築
トランスポゾンを基礎とする発現ベクターを構築することができる。このベクターは、トランスポゾンの逆方向末端反復に機能的に等価な転位可能な因子ＤＮＡ部分を正しい方向で含み、そして転位に必要な隣接のＤＮＡ配列を含む。転位に必要な隣接配列の量は、トランスポゼース酵素を使用するＤＮＡフットプリンティング分析などの生化学的アッセイおよび／または生物学的機能に関する試験によって予め決定することができる。トランスポゾンに基づく本発明のベクターは、転位に必須な転位可能な因子の領域の内部に置かれた異種タンパク質の発現カセットを含有することができる。
本発明のトランスポゾンを基礎とするベクターは、トランスポゼース酵素のコード領域を含むことができ、あるいは含まなくてもよい。トランスポゼース遺伝子は、誘導可能なプロモーターの制御下に置くことができる。１つの実施形態において、トランスポゼース遺伝子は、本発明のベクターを受容することを目的とする宿主昆虫細胞に組み込むことができる。別の実施形態において、誘導可能なトランスポゼース遺伝子は、本発明の発現カセット含有トランスポゾンを用いて同時に形質転換される第２のヘルパープラスミドに置くことができる。そのような実施形態において、トランスポゼース遺伝子を有するヘルパープラスミドは、転位可能な因子の機能的な逆方向末端反復を有しないことがあり、従って、転位により宿主ゲノムに組み込まれ得ない。
別の実施形態は、Ｓｉｎｄｂｉｓ発現システムまたはＩｎｖｉｔｒｏＳｃｒｉｐｔキャップシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ、ＵＳＡ）などの別のシステムで作製されるＲＮＡによる同時トランスフェクションである。このシステムは、細胞内部でトランスポゼースタンパク質に容易に翻訳されるトランスポゼースのメッセージを、本発明の発現カセット含有トランスポゾンとともに含有する。別の実施形態において、公知の生化学的な技術を使用して精製されたトランスポゼースタンパク質は、本発明の発現カセット含有トランスポゾンを用いて同時形質転換を行うことができる。
Ｐ因子、ｈｏｈｏ、ｍａｒｉｎｅｒ、および昆虫に基づく他のトランスポゾンを含有するＤＮＡプラスミドが知られており、これらは様々な形態で容易に入手することができる。本発明は、Ｐ因子、ｍａｒｉｎｅｒおよびｈｏｈｏの因子に基づいた、トランスポゾンに基づく発現カセットを含み、双翅類細胞において使用される。別の面により、本発明は、広範囲のセルラインにおいて使用される、ｍａｒｉｎｅｒおよびｈｏｈｏを基礎とするトランスポゾン発現ベクターを含む。本発明は、昆虫細胞において転位し得る他のトランスポゾンを使用して機能するように適合させることができる。すべてのそのようなベクターは、転位に機能的に関与している末端逆方向反復を含み、発現カセットの機能に必要なすべての情報は、逆方向反復の機能的な境界域の中に存在する。
本発明のゼオシン選択システムをトランスポゾンに基づく本発明の発現ベクターにおける使用に適合させるために、Ｐ因子に基づくベクターを構築した。これらのベクターを、ｐ２ＺＯｐ２Ａπおよびｐ２ＺＯｐ２Ｂπと称する。
ベクターｐ２ＺＯｐ２Ａπは、発現カセットをＰ因子末端の境界域の内部に含有する。このベクターを下記のように構築する：Ｐ因子の逆方向末端反復が隣接するＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのｗｈｉｔｅ遺伝子の一部を含有するプラスミドｐＤＭ２６（ＭｉｓｍｅｒおよびＲｕｂｉｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６：５６５−５７８（１９８７））の１．８ｋｂのＰｖｕＩＩ／ＮｄｅＩフラグメントを、Ｔ４ポリメラーゼを使用して平滑化された発現カセットｐ２ＺＯｐ２ＡのＳａｃＩＩ部位に挿入した。このように挿入された発現カセットは、Ｐ因子の逆方向反復が隣接し、外来遺伝子を挿入するための唯一の制限酵素部位を３つ有する（図１４）。
ベクターｐ２ＺＯｐ２Ｂπは、外来遺伝子を挿入するための唯一の制限酵素部位をさらに有する。このベクターを、ｐ２ＺＯｐ２Ａπにおけるその挿入とは逆方向で発現カセットｐ２ＺＯｐ２Ａを挿入することによって構築した。
ｐ２ＺＯｐ２Ａπおよびｐ２ＺＯｐ２Ｂπのトランスポゾンを基礎とするシャトルベクターは、イー・コリにおけるクローニングおよび遺伝子操作のために、そして昆虫セルラインまたは完全な昆虫のいずれかを異種組換えによって、またはトランスポゼース源が存在する場合には転位によって形質転換するために使用することができる（これらのベクターは、完全なＤ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒを形質転換するために使用されていた）。形質転換体は、ゼオシン耐性によって選択することができる。
公知のＰ因子を基礎とするシャトルベクターは、真核生物および原核生物の異なる選択マーカーを使用する。例えば、真核生物の選択に関しては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのプロモーターの制御下にあるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子またはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が使用され、細菌における選択に関しては、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性などの抗生物質の選択マーカーが使用される。シャトルベクターにおいて別個の選択マーカーを使用することは、そのような従来のベクターの大きさをかなり大きくし、大きな遺伝子の操作および挿入に関するその有用性を制限する。本発明は、キメラ状のＯｐ  ｉｅ２−ＥＭ７プロモーター（または、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター単独、これはＯｐ  ｉｅ２プロモーター配列内から得られる隠された原核生物プロモーター活性を有する）を使用して、真核生物および原核生物の両方における選択を行うためのゼオシン耐性遺伝子を発現させることによってこの問題を解決する。
１つの面において、本発明は、ｈｏｈｏの転位可能な因子に基づくゼオシン耐性のタンパク質発現ベクターを含む。プラスミドｐ１ＺＯｐ２Ａｈｏｈｏを、ｈｏｈｏの逆方向末端反復を含有するｐＵＣｈｏｈｏのＮａｒＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化されたｐ１Ｚｏｐ２ＡのＳａｃＩＩ部位に挿入することによって構築した（図１４）。このベクターにおいて、３つの特徴的な制限部位が、タンパク質をコードする外来遺伝子をｉｅ２プロモーターの制御下でクローニングするために利用できる。
本発明のトランスポゾンを基礎とする遺伝子発現システムを試験するために、いくつかのレポーター構築物を下記のように構築した（図１４）：
プラスミドｐＤＭ７９ＩＥ１を、Ｏｐ  ｉｅ１プロモーター領域を含有するｐＯＰＩＥ−１Ｂ７４ＢａｍＨＩの６５０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＤＭ７９のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって構築した。
プラスミドｐＤＭ７９ＩＥ２を、ＯＰ  ｉｅ２プロモーター領域を含有するｐＯＰＩＥ−ＮΔＢａｍＨＩの７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＢＫＳＩＩのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、５′近位領域にＳａｌＩ部位を置くために中間体ｐＢＫＯｐＩＥ２を作製することによって構築した。次いで、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＤＭ７９にサブクローニングした。
プラスミドｐＤＭ７９ＩＥ２ＧＦＰを構築するために、ＧＦＰのコード領域を含有するｐＧＦＰ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の８１０ｂｐのフラグメントを、ＳｐｅＩで切断することによって調製した。突出端を、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを使用してクレノーＤＮＡポリメラーゼで部分的に修復し、その後、ＢａｍＨＩで切断した。得られるフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、ｄＡＴＰおよびｄＧＲＰを使用してクレノーＤＮＡポリメラーゼで部分的に修復され、次いでＢｇｌＩＩで切断されたｐＡｃＩＥ１hr／ＰＡに挿入した。続いて、このプラスミドｐＡｃＩＥhrＧＦＰをＳａｌＩで切断し、末端を、クレノーＤＮＡポリメラーゼをｄＮＴＰｓとともに使用して平滑化し、次いでＳａｌＩ部位を除くために再連結してｐＡｃＩＥhrＧＦＰＳａｌＩ-を得た。ｐＤＭ７９内の４．０ｋｂのβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を、ＧＦＰのオープンリーディングフレームをコードするｐＡｃＩＥhrＧＦＰＳａｌＩ-の８５０ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入し、その後、ＳＶ４０の転写ターミネーターを含有する２００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを挿入することによってＧＦＰレポーター遺伝子と置換した。最後に、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーターを、ｐＢＫＯｐＩＥ２の７５０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＤＭ７９ＧＦＰを作製した。
プラスミドｐＤＭ７９ＩＥ−２−Ｇａｌを構築するために、Ｇａｌ４遺伝子の一部のセグメントを含有する５００ｂｐのＳａｌＩ／ＸｈｏＩフラグメントをｐＤＭ７９ＩＥ−２のＳａｌＩ部位に挿入した。このベクターは、ＳＬ２ｄｅｌｔａ２，３セルラインにおける可動性因子をサザン分析によって検出するのに有用である。なぜなら、プローブとしてｇａｌ４セグメントを用いることによって生じるバックグラウンドシグナルは、そのような因子を検出するために使用される他のプローブと比較した場合に無視できるからである。
プラスミドｐ１ＺＯｐ１ＡｈｏｈｏＧＦＰを、ＧＦＰのコード領域を含有するｐＧＦＰ１０．１の８００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをｐ１ＺＯｐｐ２ＡｈｏｈｏのＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。
トランスポゼース産生セルラインの構築
完全に機能的なトランスポゾン基礎とする発現カセットは、転位および続く再移動によってゲノムＤＮＡに両方が組み込まれ得るが、そのような発現カセットの導入は、トランスポゼース酵素がベクターＤＮＡの送達時に細胞の核内に存在する場合に促進される。このことは、トランスポゼースが存在しない場合、ベクターは、転位によって組み込まれるよりも、異種組換えによって細胞ＤＮＡにでたらめに組み込まれる可能性が一層大きくなるために重要である。でたらめに組み込まれることによって、トランスポゾンの完全性は破壊され得る。さらに、異種組換えによって組み込まれたプラスミドＤＮＡは不安定であることがあり、強力な選択圧が付加されない限り、ゲノムから除去されやすい。
トランスポゼース酵素は、ベクターＤＮＡの送達時に、多数の方法で得ることができる。そのような方法には、下記の方法が含まれる：
１）形質転換の前に、トランスポゼース遺伝子の改変体をセルラインのゲノムに安定的に取り入れることによる方法。この場合、本来の構成的なトランスポゼースのプロモーターは調節可能なプロモーターによって置換され得る；
２）ベクターおよびヘルパープラスミドを用いて同時に形質転換することによる方法。ただし、このヘルパープラスミドは、トランスポゼース遺伝子を発現し得るが、ゲノムに転位できない；
３）ベクターおよびトランスポゼース酵素自身を用いて同時に形質転換することによる方法；
４）ベクターおよびトランスポゼースをコードするｍＲＮＡを用いて同時に形質転換することによる方法。ただし、このｍＲＮＡは、翻訳されたときにトランスポゼース酵素を産生する；または
５）トランスポゼースを発現する不完全昆虫ウイルスを用いた同時トランスフェクションを前もって行うことによる方法。このウイルスは複製することができず、従って、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために使用することはできない。
トランスポゼースが細胞の核の内部で利用できるように機能するこのような方法および他の方法を使用して、ベクターＤＮＡの送達時に、トランスポゾン基礎とするカセットを転位によって組み込ませることができる。
本発明の１つの面は、発現カセットによる形質転換を行う前にトランスポゼースを産生するように誘導され得るトランスジェニックセルラインを含む（図１５）。この方法を使用して、転位によって組み込まれる確率を最大にすることができる。なぜなら、トランスポゼースの発現は、そのような細胞で、比較的迅速に、典型的には数時間の程度で誘導され得るからである。
Ｐ因子のトランスポゼースｍＲＮＡの天然形態は、体細胞組織では正しくプロセシングされない。従って、天然のトランスポゼース遺伝子は、不死化したセルラインでは機能しない。本発明の１つ面において、エキソン２およびエキソン３の間のイントロンを欠失して、生殖系列および体細胞の両方の組織で活性なトランスポゼースを産生し得るΔ２−３と呼ばれる遺伝子が得られるように改変されているＰ因子のトランスポゼース源が使用される。本発明のこの面によって、トランスポゼースの産生は、調節される誘導可能なプロモーター、例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの金属応答性メタロチオネイン（ｍｔｎ）またはガラクトースによる抑制可能な（ｇａｌ）プロモーターを使用して制御することができる。誘導可能なプロモーターを使用することにより、誘導に応答して、高レベルのトランスポゼースの産生が促進され、誘導因子の非存在下での発現の抑制が容易になる。例えば、ｍｔｎプロモーターは、１細胞あたり１００コピーを超える遺伝子が存在する場合でも、Δ２−３のトランスポゼース遺伝子を効率的に調節することができる。
他のトランスポゼースタンパク質を使用して、トランスポゾン基礎とする発現カセットを他の転位可能な因子と連携して機能させることができる。例えば、他のトランスポゼースは、転位可能な因子のｈｏｈｏ、ｈｅｒｍｅｓ、ｍｉｎｏｓまたはｍａｒｉｎｅｒと連携して使用することができる。それぞれの場合において、トランスポゼース遺伝子は、調節可能なプロモーターのすぐ下流に置くことができる。プロモーターはまた、ハイグロマイシンＢ、Ｇ−４１８、メトトレキセートまたはゼオシンのような抗生物質に関する選択可能な耐性マーカーを含有する発現カセットに作動可能に連結することができる。トランスポゼース含有ベクターは、適当なセルラインにトランスフェクションすることができ、選択される。トランスポゼースの産生および調節は、ウエスタンブロット分析またはノーザンブロット分析によって、そしてトランスポゾンに基づく除去指示ベクターを使用する転位の機能的アッセイによってモニターすることができる。
Ｐ因子のトランスポゼースをｍｔｎプロモーターの制御下で発現するＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＳＬ２セルライン（ＭＴΔ２−３）は、以前に作製され、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０９０１として入手できる（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ、５９：３５９−３７１（１９８８））。このトランスポゼース遺伝子が発現構築物に挿入され、そして非常に多くの構築物がセルラインのゲノムに組み込まれた方法は、誘導が行われないときに、検出可能な量でトランスポゼース遺伝子を発現させる。トランスポゼースを構成的に発現するこのようなセルラインは、本発明による形質転換された誘導可能なタンパク質発現セルラインを作製するのに最も好都合な宿主ではあり得ない。しかし、本発明によるこのようなセルラインを使用することによって、トランスポゾン基礎とする発現カセットの導入および増幅を行うことに関する本発明のシステムの有用性がまさに明らかにされる。
本発明の別の面により、トランスポゼース構築物が作製され、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０９０１細胞の場合よりもさらに低いコピー数でＳＬ２セルラインに挿入され、トランスポゼース産生のより厳密な調節がＳＬ２ＭＴΔ２−３と称する新規なセルラインで得られる。このセルラインを構築するために、２．４ｋｂのΔ２−３Ｐ因子のトランスポゼース遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＭＴ−２（Ｋｏｖａｃｈら、Ｉｎｓｅｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１：３７−４３（１９９２））に含有されるｍｔｎプロモーターの下流に直接挿入した。このプラスミドは、ハイグロマイシン−Ｂ耐性マーカーを含有する。得られるベクターを使用して、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＳＬ２セルラインを形質転換した。ｍｔｎ−トランスポゼース構築物のコピー数が低いセルラインを選択した。ポリクローナル抗血清をＰトランスポゼースタンパク質に対して作製し、ＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインが正しい分子量のトランスポゼースを産生し、その発現が誘導的であることを明らかにするために使用した。トランスポゼースの機能を、ＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインを除去指示プラスミドで形質転換することによって確認した。この場合、ミニＰ因子が正確に削除されることによって、白色コロニーよりも、青色コロニーが生成する。分離したＰ因子を選択し、ＤＮＡの配列決定を行うことによって確認した。
トランスポゼースを産生する誘導可能なセルラインは、ｈｏｈｏ、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓおよびｐｉｇｇｙＢａｃを含む幅広い範囲のトランスポゼースに関して、ならびに、ｃｏｐｉａ、ｇｙｐｓｙおよびＴｙなどを移動するために逆転写酵素を必要とするレトロトランスポゾンに関して作製することができる。
トランスポゼースを発現するセルラインの形質転換
操作されたＤＮＡ構築物を転位によってゲノムに挿入するために、標識したトランスポゾンを作製した。このトランスポゾンは、Ｏｐ  ｉｅ１またはＯｐ  ｉｅ２をプロモーターとするβ−ガラクトシダーゼレポーターカセット、細菌のアンピシリン耐性遺伝子、複製起点、および熱ショックプロモーター−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの選択可能マーカーカセットのすべてが、Ｐ因子逆方向反復と隣接した。この構築物を、ＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインにＧ−４１８の選択下で導入し、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現をモニターした。トランスポゾンを基礎とする発現カセットの転位によるＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインへの組み込みを、中期対数期まで細胞を増殖させ、形質転換の４８時間前に０．２５ｍＭの硫酸銅を添加してトランスポゼースの発現を誘導することによって行った。約４×１０6個の細胞を低速度の遠心分離によってペレット化し、１０μｌのリポソームと２μｇのトランスポゾンを基礎とするベクターＤＮＡとを含有する１．０ｍｌのグレース最少培地に再懸濁した。細胞懸濁液を４時間インキュベートし、このとき２ｍｌのＴＣ―１００完全培地を添加した。細胞をさらに４８時間インキュベートし、次いで、選択を行って、上記のクローナルセルラインまたはポリクローナルセルラインのいずれかを単離した。
ゲノム内の多数の独立した部位に組み込まれた発現カセット構築物。トランスポゾン末端反復に隣接する配列のプラスミドレスキューは、構築物の大部分が細胞のゲノムに転位によって挿入され、組換えによらないことを示した。構築物の転位による導入は、形質転換するＤＮＡ配列に対する安定性をもたらすために重要である。このように、構築物は、ゲノム全体にわたって独立して広く離れた部位に組み込まれ、前後に並んだ反復によって誘導される組換えから生じる遺伝子増幅または遺伝子喪失などの不安定化作用をあまり受けない。セルラインは安定であり、異種タンパク質の発現は、抗生物質による選択が行われないもとで、数百代の細胞世代の間、衰えることなく継続する。ｍａｒｉｎｅｒ因子およびｈｏｈｏ因子などの他のトランスポゾンに基づく同様なシステムは、本発明の範囲に含まれる。
ゲノム組換え事象の分析
トランスポゾンカセットがＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインのゲノムＤＮＡに組み込まれることを、個々のゲノム挿入物のプラスミドレスキュー、その後のトランスポゾンの逆方向末端反復に隣接する特徴的なゲノムＤＮＡの配列分析によって確認した（図１６ｂ）。これらの実験において、ＤＮＡを、ｐＤＭ７９ＯＰＩＥ２で形質転換したポリクローナルＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインから単離した。５′逆方向反復に隣接する配列を、１μｇのゲノムＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、消化したＤＮＡフラグメントを段階稀釈濃度で再連結し、その後、イー・コリＤＨ１０Ｂを再連結ＤＮＡで形質転換し、そしてプレート１枚あたり、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｌの発色性β−ガラクトシダーゼ基質（Ｘ−ｇａｌ）の２０ｍｇ／ｍｌ溶液を補充したＬＢ培地に形質転換イー・コリを播種することによってレスキューした。アンピシリン耐性であり（すなわち、ｐＤＭ７９に存在するβ−ラクタマーゼを含有する）、外見が青色である（Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター内に位置する隠れた細菌性プロモーターからのイー・コリにおけるβガラクトシダーゼ遺伝子の転写から生じる）コロニーを単離し、プラスミドＤＮＡを分析した。この隠れた細菌性プロモーターの存在は、いくつかの実施形態において、ＥＭ７プロモーターが本発明のシャトルベクターにおいて絶対的に必要でないという、驚かずにはいられない全く予想外の結果をもたらす。なぜなら、Ｏｐ  ｉｅ２プロモーター内の隠れた細菌性プロモーターは、その位置において同じ機能を示すからである。白色で、アンピシリン耐性のコロニーもまた現れた。これらのコロニーは、ｍｔｎ−トランスポゼースカセットを導入するために使用された構築物のレスキューから生じる。３′挿入部位に隣接するＤＮＡを、ＸｂａＩによる消化、連結、イー・コリＤＨ１０Ｂの形質転換、および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＬＢ培地での播種によって分析した。（上流の配列内に位置する隠れたプロモーターからのイー・コリにおけるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの転写による）アンピシリンおよびカナマイシンの両方に耐性なコロニーを同定し、分析した。プラスミドＤＮＡを単離し、５００ｂｐのｗｈｉｔｅ遺伝子を放出するＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｗｈｉｔｅ遺伝子は、ｐＤＭ７９ベクターにおける５′逆方向反復と３′逆方向反復との間のスペーサーとして作用し、転位の間に失われる。形質転換されたＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインからレスキューされたプラスミドＤＮＡは、この５００ｂｐのスペーサーフラグメントを示さなかった。このことは、組込みが、転位によって生じ、異種組換えでないことを示す。配列分析は、トランスポゾンが、「正確な」転位によって、ゲノム内の独立した部位に組み込まれたことを明らかにした。いくつかのトランスポゾンは、熱ショック部位、ヘテロクロマチン領域を含むＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのゲノムの十分に特徴づけられた領域に組み込まれ、同様に他のｐＤＭ７９ＯｐＩＥ２トランスポゾンにも組み込まれた。これらの十分に特徴づけられた領域は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのゲノムの明らかに異なる領域であることを示し、独立した部位へ���組込みが確認される。
組換えトランスポゾンセルラインの安定性
ｐＤＭ７９ＯｐＩＥ１またはｐＤＭ７９ＯｐＩＥ２で形質転換されたＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインの安定性を、２６週間にわたって連続した継代培養（約３０代）により測定した。１００μＭのＣｕＳＯ4の存在下または非存在下のいずれかにおいて１ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８で選択される細胞集団は、週毎の小さな変化があるだけで、β−ガラクトシダーゼを全期間にわたって継続的に産生した（図１６ａ）。安定性をさらに示すものとして、選択性の抗生物質を除去しても、異種組換えによって導入された構築物について観測されているように、酵素産生は低下しなかった。本発明の１つの面により、異種タンパク質の産生が、例えば、遺伝子の沈静化または関連する現象の結果として、長時間経過した後に低下した場合、タンパク質発現は、発現カセットの新しい転写的に活性なゲノム部位への転位を誘導することによって再活性化することができる。
セルラインのその後の凍結解凍サイクルによって、産生の安定性がさらに明らかにされた。サンプルを液体窒素の中に数週間置き、取り出して、β−ガラクトシダーゼ産生について分析した。Ｂ−ガラクトシダーゼレベルの低下は、数回の凍結解凍サイクルの間において認められなかった。従って、異種タンパク質の産生レベルが長期間の連続的な継代培養の後に低下する場合、前記の凍結した部分から培養物を再度樹立することは可能である。
トランスポゾンを基礎とする発現カセットの増幅
本発明のトランスポゾンベクターで形質転換されたポリクローナルセルラインの全体的な異質性を調べるために、そしてそのような細胞のどの部分が、増幅された数の発現カセットを含有するかを明らかにするために、ＳＬ２ＭＴΔ２−３セルラインをｐＤＭ７９ＩＥ２ＧＦＰレポータープラスミドで形質転換した。セルラインを調べることによって、約２０〜３０％の細胞が、残りの集団よりも著しく高いレベルのＧＦＰを発現することが示された（図１７）。これらの増幅された細胞は、蛍光活性化細胞分別システムを使用するか、あるいは稀釈分析および手による選別によって、発現性の悪い残りの細胞から分離することができる。改変されたトランスポゾンが別の異種遺伝子のカセットをも含有する場合、このタンパク質の発現は、ＧＦＰ産生と非常に相関することが理解される。実際、本発明は、ＧＦＰなどの控えめなマーカーの使用によって、目的の異種タンパク質の発現を増大させ得る形質転換細胞の容易な同定を可能にする。この意味において、「控えめな」は、控えめなマーカーが発現したときに、マーカー遺伝子が形質転換細胞に対して著しく有害でないことを意味する。このような方法はまた、処理の任意の段階で抗生物質を使用することなく、発現カセットの形質転換、選択および増幅を可能にする。
最初の選択操作の間において単離された形質転換細胞の発現は、続いて転位機構を誘導することによってさらに増強することができる。いくつかの実施形態において、Ｍｔｎプロモーターの制御下におけるトランスポゼース酵素の発現は、０．５ｍＭのＣｕＳＯ4で２４時間誘導することができる。トランスポゼースによって特異的なトランスポゾンが同定され、そしてトランスポゼースは、反復的な転位によって、さらなるコピーのトランスポゾンカセットを増幅し、それを他のゲノム位置に挿入する。クローナルまたはポリクローナルセルラインを樹立し、再度選択して分析する。このような方法は、最適なコピー数のトランスポゾンカセットが得られるまで数回繰り返すことができる。次いで、最適なコピー数のトランスポゾンカセットを有するセルラインは、連続的にタンパク質を製造するために規模を大きくすることができる。
遺伝子増幅の他の評価を下記のように行った。発現カセットｐＤＭ７９ＩＥ−２ｇａｌを含有するトランスポゾンを、ＳＬ２ＭＴｄｅｌｔａ２−３セルラインに下記のように形質転換した。ＳＬ２ＭＴｄｅｌｔａ２−３細胞（１×１０６細胞）を、６ウエル細胞培養プレートの各ウエルにおいて１ｍｌのグレース培地に播種した。細胞を３０分間接着させ、ＣｕＳＯ4を５００ｍＭの最終濃度に添加した。細胞を３時間インキュベートし、その後、培地を除き、細胞を２ｍｌのグレース培地で１回洗浄した。１ｕｇ（Ｐ１）、１００ｎｇ（Ｐ２）、１０ｎｇ（ｐ３）または１ｎｇ（Ｐ４）のいずれかのプラスミドＤＮＡおよび１０ｕｌのセルフェクチンを含有する１ｍｌのグレース培地を、前記のように調製し、ＳＬ２ＭＴｄｅｌｔａ２−３細胞に加えて、細胞を２７℃で４時間インキュベートした。４時間後、培地を細胞から除き、５％のＦＢＳ、２５０ｕｇ／ｍｌのＧ−４１８、２００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する２ｍｌのＴＣ−１００培地と交換した。細胞を４０時間インキュベートした。異なる量の形質転換ＤＮＡを含有する各ウエルを、ポリクローナルセルラインのように調節した。新しいフラスコに３回の移し換えを行った（約２週間）後に、サンプルをＤＮＡ分析およびβ−ガラクトシダーゼ分析のために取り出した。次いで、さらなるサンプルを、５００ｍＭのＣｕＳＯ4で３時間処理し、２ｍｌのグレース培地で洗浄し、２日間回復させ、次いで５００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８、２００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンに播種した。３回の移し換えを行った（約２週間）後に、サンプルをＤＮＡ分析およびβ−ガラクトシダーゼ分析の両方のために取り出した。
結果を表２に示す。表２において、初期セルラインは、最初の形質転換後に調節されたポリクローナル株であり、誘導セルラインは、その特定の初期ポリクローナルセルラインの誘導後に調節されたポリクローナルセルラインである。Ｐ０は、ｌｕｇのプラスミドｐＤＭ７９ＩＥ−２ｇａｌ−ＨｄＩＩＩｄｅｌで形質転換されたセルラインである。このプラスミドは、５００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを欠失させたｐＤＭ７９ＩＥ−２ｇａｌであるが、転位に必要なＰ因子の逆方向反復を含有する。予想されるように、Ｂ−ガラクトシダーゼ活性の増大は、トランスポゼースを誘導した後のこのポリクローナルセルラインについて認められなかった。
0003688718.tif 000003
これらの結果は、トランスポゾン内に発現カセットを含有する細胞におけるトランスポゼースの誘導は、発現カセットに含有される組換えタンパク質のより大きな産生を可能にするセルラインをもたらし得ることを明らかにする。
結論
前記の開示を参照することによって当業者には明らかなように、多くの変化および改変が、本発明の実施において、その精神および範囲から逸脱することなく可能である。本発明の変化は、本明細書中に引用されている参考文献の教示から理解することができる。すべてのそのような参考文献は、参考としてここに組み込まれる。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、様々な抗生物質選択スキームによる使用に適合させることができる。さらなるプロモーター因子を、バキュロウイルスの即時初期プロモーターからの発現を高めるために、本発明に従って使用することができる。Ｏｐ  ｉｅ１およびＯｐ  ｉｅ２遺伝子は、自分自身ならびに他の初期および遅延型初期のバキュロウイルスプロモーターをトランス活性化する転写因子をコードする（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８０：４９２−５０８（１９９１）；ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７：８４−９６（１９９２））。さらに、エンハンサー因子が、ｉｅ２のコード領域の３′末端の近くに同定されている。これは、ｉｅ１遺伝子産物と一緒に機能して、Ｌｄ６５２Ｙ細胞およびＳｆ９細胞において、それぞれ、レポーター構築物からの初期遺伝子発現を１０〜１７倍増大させる（ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＳｔｅｗａｒｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７：９７−１０６（１９９２））。これらの転写アクチベーターを発現する安定的なセルラインは、これらのプロモーターによる発現を高めることができ、あるいはプロモーターが効率的に機能しないセルラインの範囲を広げることができる。いくつかの実施形態において、他のより雑多な転位可能な因子は、発現カセットを、より広い種から誘導されるセルラインに転移させるために適合させることができる。従って、本発明の範囲は、配列表を伴う請求項によって規定される実体に従って解釈しなければならない。
配列表
（１）一般情報：
(i)出願人：
（A）名称：ザ・ユニヴァーシティー・オブ・ブリティッシュ・コロンビア、リサーチ・アドミニストレーション、ルーム３３１、ＩＲＣビルディング
（B）通り：２１９４ヘルス・サイエンス・モール
（C）市：バンクーバー
（D）州：ブリティッシュ・コロンビア
（E）国：カナダ
（F）郵便コード（郵便番号）：Ｖ６Ｔ  １Ｚ３
（G）電話番号：（６０４）８２２−８５９６
（H）テレファックス：（６０４）８２２−８５８９
(ii)発明の名称：昆虫発現ベクター
(iii)配列の数：１６
(iv)コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア:Patent Inリリース＃1.0,バージョン＃1.30（EPO）
(v)パテント・エージェント情報：
（A）名称：スマート・アンド・ビガー
（B）整理番号：８００２１−４６
（２）配列認識番号：１のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：５６４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＮＯ
(v)起源：
（A）生物名：マルチキャプシド・ヌクレオポリヘドロウイルス
（B）株名：オルギア・シュードツガタ(Orgyia pseudotsugata)
(vi)配列の記載：配列認識番号：１：
0003688718.tif 000004
（２）配列認識番号：２のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：４４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＹＥＳ
(v)起源：
（A）生物名：マルチキャプシド・ヌクレオポリヘドロウイルス
（B）株名：オルギア・シュードツガタ(Orgyia pseudotsugata)
(vi)配列の記載：配列認識番号：２：
0003688718.tif 000005
（２）配列認識番号：３のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチ・センス：ＹＥＳ
(v)起源：
（A）生物名：マルチキャプシド・ヌクレオポリヘドロウイルス
（B）株名：オルギア・シュードツガタ(Orgyia pseudotsugata)
(xi)配列の記載：配列認識番号：３：
0003688718.tif 000006
（２）配列認識番号：４のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)配列の記載：配列認識番号：４：
0003688718.tif 000007
（２）配列認識番号：５のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：５：
0003688718.tif 000008
（２）配列認識番号：６のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(ix)配列の記載：配列認識番号：６：
0003688718.tif 000009
（２）配列認識番号：７のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：７：
0003688718.tif 000010
（２）配列認識番号：８のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：８：
0003688718.tif 000011
（２）配列認識番号：９のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：９：
0003688718.tif 000012
（２）配列認識番号：１０のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１０：
0003688718.tif 000013
（２）配列認識番号：１１のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１１：
0003688718.tif 000014
（２）配列認識番号：１２のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：５５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１２：
0003688718.tif 000015
（２）配列認識番号：１３のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：５０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１３：
0003688718.tif 000016
（２）配列認識番号：１４のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：６７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１４：
0003688718.tif 000017
（２）配列認識番号：１５のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：６７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１５：
0003688718.tif 000018
（２）配列認識番号：１６のための情報：
(i)配列特性：
（A）長さ：６６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(iii)配列の記載：配列認識番号：１６：
0003688718.tif 000019
【図１ａ】
0003688718.tif 000020
【図１ｂ】
0003688718.tif 000021
【図２ａ】
0003688718.tif 000022
【図２ｂ】
0003688718.tif 000023
【図３】
0003688718.tif 000024
【図４ａ】
0003688718.tif 000025
【図４ｂ】
0003688718.tif 000026
【図５】
0003688718.tif 000027
【図６】
0003688718.tif 000028
【図７】
0003688718.tif 000029
【図８ａ】
0003688718.tif 000030
【図８ｂ】
0003688718.tif 000031
【図９】
0003688718.tif 000032
【図１０】
0003688718.tif 000033
【図１１】
0003688718.tif 000034
【図１２ａ】
0003688718.tif 000035
【図１２ｂ】
0003688718.tif 000036
【図１２ｃ】
0003688718.tif 000037
【図１２ｄ】
0003688718.tif 000038
【図１２ｅ】
0003688718.tif 000039
【図１３ａ】
0003688718.tif 000040
【図１３ｂ】
0003688718.tif 000041
【図１４】
0003688718.tif 000042
【図１５】
0003688718.tif 000043
【図１６ａ】
0003688718.tif 000044
【図１６ｂ】
0003688718.tif 000045
【図１７】
0003688718.tif 000046