(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）の正常機能を干渉する分子を同定する方法であって、
（ａ）以下に示すヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列における１７０番目から１７４番目、１７５番目から１７９番目、１７０番目から１７９番目、あるいは４０５番目から４１４番目までのアミノ酸配列からなるターゲットペプチドを用意して、
（ｂ）該ターゲットペプチドを、ペプチドライブラリーあるいは合成有機分子ライブラリーから得られる候補分子、または細菌培養生成物、かび培養生成物、真核細胞培養生成物もしくは粗サイトカインプレパレーションと接触させ、次いで、
（ｃ）該ターゲットペプチドに結合する分子を同定する、
ことからなる上記同定方法。
0003683263.tif 000004
0003683263.tif 000005
【請求項２】
ＴＮＦ−Ｒの正常機能を干渉する分子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１に示すヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列における１７０番目から１７４番目、１７５番目から１７９番目、１７０番目から１７９番目、あるいは４０５番目から４１４番目までのアミノ酸配列からなるターゲットペプチドを用意して、
（ｂ）該ターゲットペプチドを、ペプチドライブラリーあるいは合成有機分子ライブラリーから得られる候補分子と接触させ、次いで、
（ｃ）該ターゲットペプチドのＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダクションを干渉する能力を同定する、
ことからなる上記同定方法。
【請求項３】
該工程（ｃ）が該分子のＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダクションを抑制する能力を同定することからなり、ＴＮＦ−Ｒと干渉してＴＮＦ−Ｒによるシグナルトランスダクションを抑制する分子を同定する請求項２の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ- Ｒ）によるシグナルトランスダクションの修飾およびこれらのＴＮＦ- Ｒの開裂の修飾に関する。さらに詳しくは，本発明は，ＴＮＦ- Ｒまたはその受容体と相互作用するエフェクター蛋白質に干渉し，したがってＴＮＦの機能に関連する疾患の予防的または治療的応用に使用できるペプチドまたは他の分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦは，主としてマクロファージによって産生される前炎症サイトカインであって，病原体に対する宿主の防御，ならびに細胞機能に対する様々な作用を介して炎症の有害な各種兆候の発現に関与している（非特許文献１）。これらの作用は，大部分の種類の細胞上に発現される，特異的高親和性細胞表面受容体（ＴＮＦ- Ｒ）へのＴＮＦの結合によって開始される（非特許文献２;非特許文献３;非特許文献４; 非特許文献５; 非特許文献６;非特許文献７）。この受容体はＴＮＦに対する細胞応答として細胞内シグナルを提供する（非特許文献８）。種類の異なる細胞に別個に発現するＴＮＦの２つの分子種，ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦー Ｒが同定されている（非特許文献９;非特許文献１０）。
【０００３】
他の免疫系メディエーターと比較して最も明瞭なＴＮＦの特性の一つは，その細胞死を誘発する能力出有る。自己免疫疾患，慢性関節リウマチ，移植片拒絶および移植片対宿主病のような多くの重篤な疾患において，ＴＮＦは病的組織破壊の主要な原因であると思われる。したがって，これらの状態におけるＴＮＦ活性の遮断は，これらの疾患における新たな治療法の開発に極めて重要である。
【０００４】
一方，他のある種の状況，たとえばＴＮＦの抗腫瘍活性または抗細菌活性が有益な状況では，その機能の増強が有利である。
【０００５】
線維芽細胞および上皮細胞に対するＴＮＦの細胞傷害作用の主要なメディエーターは，これらの細胞系において優勢なＴＮＦ- Ｒでもあるｐ５５ＴＮＦ- Ｒである。この受容体の遮断はＴＮＦの細胞破壊作用を消失させ，一方，この受容体分子の集合の誘導はＴＮＦの細胞傷害性と類似の作用を発現させることができる。
【０００６】
この受容体の溶解型ならびに他の（ｐ７５）ＴＮＦ- Ｒの溶解型は，ＴＮＦ能の阻害作用を示すことが明らかにされている。これらの溶解型が細胞表面型から蛋白分解的に誘導されることの証拠も示されている（非特許文献１１; 非特許文献１２; 非特許文献１３）。
【非特許文献１】Old et al., Bonavida, B. And Granger, G. (eds) "Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role of Disease and Treapy, Karger, Basel pp. 1-30
【非特許文献２】Baglioni, et al., (1985) J. Biol. Chem., 260, pp.13395-13397
【非特許文献３】Beutler, B. Et al., (1985) J. Exp. Med., 161, pp.984-995
【非特許文献４】Kull, F.C.J. et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, pp.5756-5760
【非特許文献５】Tsujimoto, M. et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, pp.7626-7630
【非特許文献６】Aggarwal, B.B. et al., (1985) Nature, 318, pp. 665-667
【非特許文献７】Israel, S. et al., (1986) Immunol. Lett., 12, pp.217-742
【非特許文献８】Engelmann, H. et al., (1990a) J. Biol. Chem., 265, pp.14497-14505
【非特許文献９】Engelmann, H. et al., (1990b) J. Biol. Chem., 265, pp. 1531-1536
【非特許文献１０】Brockhaus, M. et al., (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, pp.3127-3131
【非特許文献１１】Nophar, Y. Et al., (1990) EMBO J. 9, pp.3269-3278
【非特許文献１２】Porteu, F. And Nathan, C. (1990) J. Exp. Med., 17, pp.599-6-7
【非特許文献１３】Porteu, F. Et al., (1991) J. Biol. Chem., 266, pp.18846-18853
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
受容体によるシグナリングおよび受容体の開裂の両者が，受容体とある細胞性エフェクター蛋白質の間の相互作用を反映するものと思われる。すなわち，調節型プロテアーゼとの相互作用による開裂，およびあるシグナリング活性を有する蛋白質との相互作用によるシグナリングである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ- Ｒ）におけるシグナルトランスダクションおよび／または開裂の修飾方法であり，ＴＮＦ- Ｒの配列における１個または２個以上のアミノ酸またはＴＮＦ- Ｒと相互作用するエフェクター蛋白質に干渉することからなる方法を提供する。
【０００９】
この干渉は，ＴＮＦ- Ｒの正常機能に影響し，またはそれと相互作用するエフェクター蛋白質に影響し，その結果，その部分的もしくは全体的阻害を生じることによりシグナルトランスダクションを修飾し，または受容体の脱落に影響し，すなわち溶解型の開裂を停止させる。
【００１０】
本発明はさらに，受容体自体と相互作用する，すなわち受容体配列における１個もしくは２個以上のアミノ酸と相互作用するか，またはエフェクター蛋白質と相互作用する，すなわちＴＮＦ- Ｒの正常機能を修飾するペプチドまたは他の分子を提供する。上記分子には抗体またはそのフラグメントも包含される。
ペプチドおよび他の物質は慣用方法または組換え方法で製造できる。
【００１１】
本発明はまた，上記ペプチドまたは他の物質からなる，ＴＮＦ関連疾患処置用の医薬組成物を提供する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は，ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し，サークルで囲んだ部分はリーダーおよび膜通過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異および欠失を示す。
図２は，調べた様々な欠失変異体を例示する。
図３は，アミノ酸４１５〜４２６が欠失したｐ５５ＴＮＦ- Ｒの変異体が，なお細胞破壊作用のシグナルを発することがでるのに対し，それからさらに１０個のアミノ酸が欠失した変異体Δ：４０５〜４２６はシグナリングを生じないことを示す。
図４は，１９７ｓｅｒがａｌａで置換されたｐ５５ＴＮＦ- Ｒ変異体では，細胞破壊作用のシグナルをトランスデュースする能力が低下していることを示す。
図５は，１９７ｓｅｒがａｌａで置換された変異体では，ｐ５５ＴＮＦ- Ｒの細胞外部分の脱落の誘導が消失していることを示す。
図６は，アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７９のいずれかの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７９の欠失が，ｐ５５ＴＮＦ- Ｒの細胞外部分の脱落の誘導を消失させることを示す。
【００１３】
ｐ５５ＴＮＦの細胞内部分におけるアミノ酸の短いストレッチが同定され，これはＴＮＦによる細胞死の誘発に必須であることが見出された。細胞内部分にＣ末端欠失があるｐ５５ＴＮＦ- Ｒの変異体では，アミノ酸のこのストレッチが欠失していると，細胞傷害作用のシグナルを発することができない。これに対し，先端部切断受容体でも，このアミノ酸配列を含有すれば，細胞死を完全に誘導できる。この配列に特異的に結合できる分子，またこの配列構造に類似するが細胞死の刺激能力を欠く分子も同様に，ＴＮＦに対する細胞内阻害剤として適用できる。これらは，ＴＮＦ- Ｒの，シグナルトランスダクション連鎖における下流を機能化する分子との相互作用を阻害する。
【００１４】
しかも，ＴＮＦの完全な細胞傷害作用の誘発に必要であり，またこの受容体の溶解型の脱落に決定的な役割を果す，ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒの膜通過ドメインにおける特異的アミノ酸が同定された。このアミノ酸を「中性」アミノ酸と交換すると，シグナリングは著しく損われるが，シグナルトランスダクション機構の完全な不活性化は招来しない。これは受容体の溶解型の脱落も消失させる。したがって，このアミノ酸と特異的に相互作用するように設計された分子は，ＴＮＦの細胞傷害作用を緩和することができ，また受容体の細胞外，溶解型の脱落の阻害により細胞表面上の受容体部位の利用を高め，細胞死を誘発することなくＴＮＦの治療目的での使用を可能にする。
【００１５】
膜通過領域から外部に出たばかりの受容体領域におけるアミノ酸の他のストレッチが受容体の溶解型の開裂に必須であることも見出された。したがって，このストレッチへの干渉，またはそれと相互作用するエフェクター蛋白質への干渉も，受容体の機能化に影響することが考えられる。
【００１６】
ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒの野生型および変異体を発現するＡ９細胞のクローンが，放射標識ヒトＴＮＦの結合によって同定された。非トランスフェクトＡ９細胞または対照トランスフェクト，すなわちネオマイシン耐性付与プラスミドのみでトランスフェクトされたＡ９細胞に比較して，ＴＮＦ結合が約１０倍増大したクローンを以下の研究に使用した。
【００１７】
トランスフェクトされた細胞の，ＴＮＦ細胞傷害作用に対する感度を，ＴＮＦ作用を模倣できるヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒに対するモノクローナル抗体で調べたところ，野生型または変異受容体によるトランスフェクタントの間に異なる効果が観察された。野生型ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒでトランスフェクトされた細胞は，非トランスフェクトまたは対照トランスフェクトＡ９細胞に対しては全く作用を示さなかったこれらの抗体の細胞傷害作用に対して，著しく感受性になった。これに反して，細胞内アミノ酸４０５〜４２６の欠失をもつ変異受容体を発現するトランスフェクタントは，同じレベルの受容体を発現しているにもかかわらず，ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒに対する抗体には全く応答しなかった。しかしながら，これらの細胞は，ＴＮＦに対する内因性マウス受容体を介して作用するヒトＴＮＦには応答できて，非感受性がシグナルトランスダクション経路におけるポスト受容体の遮断によるものではなかったことが証明された。
【００１８】
しかしながら，上述の変異体の場合よりも１０アミノ酸短い欠失を有する受容体変異体（ｄｅｌ：４１５〜４２６）は，トランスフェクトされた細胞に，ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒに対する抗体の細胞破壊作用への高い応答性を付与した。
これは，アミノ酸４０５〜４１４，またはその一部分が，ＴＮＦの細胞傷害作用のためのヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒのシグナリングに必須であり，一方，アミノ酸４１５〜４２６は必須ではないことを示している。
【００１９】
第三の変異体においては，膜通過ドメインにおける単一のセリン残基（アミノ酸１９７）が特定部位の突然変異誘発により，アミノ酸配列のすべての既知二次構造と適合できるといわれるアミノ酸，アラニンによって交換された。この受容体変異体でトランスフェクトされた細胞を機能的に分析したところ，これらの細胞には，ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒに対する模倣抗体に応答しての細胞死の誘発に有意な損傷が明らかにされた。しかしながら，この機能的崩壊は完全ではなく，わずかな細胞破壊作用は，なお観察された。
【００２０】
アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７９，または両者すなわちアミノ酸１７０〜１７９が欠失したさらに他の変異体では，受容体の可溶性細胞外型の脱落が消失した。この所見は，膜通過ドメインのすぐ外側にある，受容体のアミノ酸１７０〜１７９またはその一部分の領域が，可溶性ＴＮＦ受容体の形成を可能にするためには，無傷でなければならないことを示している。したがって，この領域への干渉，またはそれと相互作用するエフェクター蛋白質は，脱落を消失させることになる。この場合，エフェクター蛋白質は蛋白分解酵素であると考えられる。
【００２１】
上述のように，本発明は，とくに，受容体自体もしくはそのある領域または受容体と相互作用するエフェクター蛋白質のいずれかと相互作用できるペプチドおよび他の分子，ならびにこれらのペプチドおよび他の分子の製造方法を提供する。
【００２２】
この目的では，受容体の関連領域と相互作用する蛋白質を，細胞抽出物から，たとえばこれらの領域をリガンドとして用いるリガンドアフィニティー精製法によって単離する。ついで，その受容体または単離されたエフェクター蛋白質のいずれかに結合し，したがってそれらの相互作用に干渉する物質についてスクリーニングを実施した。このようなスクリーニングは以下の方法のいずれかによって行われる。
【００２３】
１）シグナルトランスダクションおよび／または脱落に重要であることが見出されたＴＮＦ- Ｒのアミノ酸領域に相当する標的ペプチドを合成し，ペプチドライブラリーを，それに結合するリガンドについてスクリーニングした。これらの領域に結合するペプチドはさらに，ＴＮＦ- Ｒにも結合するものについてスクリーニングする。標的ペプチドおよびＴＮＦ- Ｒの両者に高いアフィニティー結合が可能なペプチドを最後に，所望の生物学的活性を発揮する，すなわちＴＮＦ-Ｒの正常な機能に影響する能力についてスクリーニングする。
【００２４】
２）同様にして，他の適応症で知られている薬剤を含めて様々な有機分子について，ＴＮＦ- Ｒの正常な機能に干渉する能力をスクリーニングする。これは，これらの分子が，ＴＮＦ- Ｒのシグナルトランスダクションおよび／または脱落に重要であることが見出されたアミノ酸またはアミノ酸領域と異なる様式で結合または相互作用できるか否かを調べることにより決定される。
【００２５】
３）有機分子に加えて，細菌培養生成物，かび培養生成物，真核細胞培養生成物および粗サイトカインプレパレーションのような生物学的物質のブロスも，上述のアミノ酸標的ペプチドによりスクリーニングする。このスクリーニングで得られた分子をついで，所望の生物学的機能を行う能力についてスクリーニングする。
【００２６】
同様に，たとえば標的ペプチドが連結する樹脂を通した全抽出物のクロマトグラフィーによって得られるエフェクター蛋白質を，上記ペプチドライブラリー，有機分子および生物学的ブロスのスクリーニングに使用する。この方法でエフェクター蛋白質に結合することが見出された分子を，ついで，エフェクター蛋白質とＴＮＦ- Ｒの間の相互作用を阻止する能力，すなわちＴＮＦ- Ｒの正常機能に干渉する能力について調べる。
【００２７】
別法として，受容体またはエフェクター蛋白質におけるアミノ酸領域の四次元構造に空間的にフィットし，したがってこの両者の相互作用に干渉する分子を設計する。
【００２８】
上述の操作によって得られた活性分子は，それらが生物学的物質である限り，生物工学的手法によっても製造できる。この方法により，これらの分子の大量生産が可能になる。ペプチドは，既知のペプチド合成法により，またはそれらをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて製造できる。酵素的方法出産生される他の分子の場合には，適当な培養細胞中に包含された酵素を製造することにより，作成できる。
【００２９】
本発明のペプチドまたは他の分子を含有する医薬組成物は，哺乳動物におけるＴＮＦの有害作用に拮抗するため，すなわち過剰のＴＮＦが内因的に形成されるか外因的に投与された状態の処置に，またはＴＮＦの有益作用を増強するために，すなわち腫瘍の処置に，使用できる。
【００３０】
このような組成物は，活性成分として，本発明のペプチドまたは他の分子を含有する。この医薬組成物は，ＴＮＦが過剰な状態，たとえば敗血症ショック，カヘキシー，移植片対宿主反応，自己免疫疾患たとえば慢性リウマチ等を適応とする。この医薬組成物は，たとえば外因的に投与された過量のＴＮＦの作用を消すためにも使用できる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は，処置すべき状態に応じて，許容された投与経路を介して投与される。たとえば，敗血症ショックの場合，静脈内投与が好ましいが，関節炎の場合には局所注射を指示できる。この医薬組成物は，連続的に，すなわち輸液の方法でも，また経口的にも投与できる。処方および用量は，処置すべき状態，投与経路，および処置される患者の状態や体重に依存する。正確な用量は担当医師によって決定されることになる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は，常法により，たとえば活性成分を，場合に応じて，医薬的および生理的に許容される担体および／または安定剤および／または賦形剤と混合して製造され，たとえば投与量バイアル中での凍結乾燥により剤形に調製される。
【００３３】
以下の実施例により本発明を例示するが，これらは本発明を限定するものではない。
例１：変異ｐ５５ＴＮＦ受容体の構築
ヒトｐ５５ＴＮＦ- ＲのｃＤＮＡ（Nopharら,1990 ）をＢanIIおよびＮheI 制限酵素で消化して，大部分の５′および３′非コード領域を除去した。変異体Δ：４０５〜４２６およびΔ：４１５〜４２６（図３）は，Promega の突然変異誘発キット"Altered Sites" を用いて，このｃＤＮＡの短縮型の特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発によって生成させた。停止コドンは，システイン４０４（変異体Δ：４０５〜４２６；受容体中のアミノ酸の番号は Loetscherら,1990 による）の後にオリゴヌクレオチド５′ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＣＡＴ３′を用いて，またグリシン４１４（変異体Δ：４１６〜４２６）の後にオリゴヌクレオチド５′ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＴ３′を用いて挿入した。ｃＤＮＡの他の変異体は同様に，試験した残りの変異体についての所望の突然変異を指図する適当なオリゴヌクレオチドを用いて製造した。野生型および突然変異ｃＤＮＡを，骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター，ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する真核細胞発現ベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Arteltら,1988 ）に導入した。
【００３４】
例２：培養細胞中での野生型および変異受容体の発現
マウスＡ９系の細胞を，１０％胎児ウシ血清，１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，生育培地）で培養した。細胞を，野生型および変異受容体をネオマイシン耐性付与プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏとともにコードする発現構築体で，リン酸カルシウム沈降法（Graham & van der Eb,1973）を用いてトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Sigma ）含有生育培地中での１０〜１４日選択後，耐性コロニーを単離し，細胞に対するＴＮＦ結合を測定することにより，ヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒ（ｈｕー ｐ５５ー ＴＮＦ- Ｒ）の発現を調べた。全トランスフェクタント中，少なくとも３つの異なるクローンを機能アッセイで分析して，それらの性質のクローン間の変動をチェックした。
【００３５】
例３：細胞に対するＴＮＦ結合の測定
Genentech Co., San Francisco, CA  によって製造された組換えヒトＴＮＦ-α（ＴＮＦ，６×１０７単位／ｍｇ蛋白質）は，Boehringer Institute, Vienna,  Austria  の G.Adolf  博士によって恵与された。ＴＮＦは，クロラミンＴにより，比放射能２０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌに放射標識した（Israelら,1986 ）。ＴＮＦの結合の測定には，細胞を１５ｍｍの組織培養プレートに，２×１０５細胞／プレート密度で接種した。３７℃で２４時間インキュベート後，プレートを氷に移し，生育培地を除去し，１ｍＭ  Ｃa Ｃl２，１ｍＭ  Ｍg Ｃl２，０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｎa Ｎ３を含有するＰＢＳ（０．１５４塩化ナトリウム＋１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，結合緩衝液）２００μｌ中，０．１ｎＭ濃度の放射標識ＴＮＦを単独または１０００倍過剰の非標識ＴＮＦとともに適用した。氷上で３時間インキュベートしたのち，細胞を洗浄し，ついで５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中でインキュベートして解離させた。細胞結合放射能はガンマーカウンターで測定した。
【００３６】
例４：ＴＮＦおよびｈｕー ｐ５５ー ＴＮＦ- Ｒに対する抗体の細胞破壊作用の定量
アッセイの２４時間前に，細胞を，９６ウエルのプレートに３０，０００細胞／ウエルの密度で接種した。ついで，生育培地を，シクロヘキシミド（ＣＨＩ，Ｈe Ｌa 細胞については２５μｇ／ｍｌ，他の細胞種につては５０μｇ／ｍｌ）ならびにヒトＴＮＦ- αもしくはヒトｐ５５ＴＮＦ- Ｒに対するモノクローナル抗体（Engelmann ら,1990b）を含有する生育培地１００μｌで交換した。さらに３７℃で１１時間インキュベート後，前述の中性レッドの取り込みアッセイにより，細胞の生存度を評価した（Wallach,1984）。
【００３７】
例５：リガンドアフィニティー精製によるエフェクター蛋白質の単離
配列がシグナリングまたは開裂に重要なことが見出された受容体の領域に相当する合成ペプチドを，固体樹脂たとえばセファロース，アガロースまたはアクリルアミドヒドラジドアガロース等に，グルタルアルデヒドのような共有結合リンカーによって連結させる。細胞または細胞膜の抽出物をこのようなカラムに適用し，それらに結合した蛋白質を，たとえばｐＨを低下させて溶出させる。蛋白質を含有する分画を集め，慣用方法によってさらに精製する。この更なる精製においては，蛋白質はそれらの比活性（蛋白分解またはシグナリング）の測定によって追跡できる。
【００３８】
例６：ＴＮＦ- Ｒまたはエフェクター蛋白質と相互作用する抗体またはそのフラグメントの調製
ＴＮＦー Ｒもしくはその中のその機能に必須であることが見出された領域，またはそれらと相互作用する精製エフェクター蛋白質を，適当なプロトコールを用いて抗体の開発に一般に使用されるマウス，ウサギまたは他の適当な動物に注射する。モノクローナル抗体は常法により，免疫処置動物の脾臓を用いて上記蛋白質に対して発生させる。脾臓細胞からまたはそれによって生成させたハイブリドーマから抽出されたＤＮＡを使用して，組換えＤＮＡ技術により抗体を産生させる。この方法で，その受容体のシグナルトランスダクションまたは開裂に干渉することによりＴＮＦの機能を修飾する抗体が得られる。
抗体をコードするＤＮＡを用い，その構造が抗体およびその誘導体の超可変領域に相当し，同じ結合活性を有するもっと小さな分子が構築される。これらの分子は，受容体の細胞質内ドメインまたは細胞質内エフェクター蛋白質と相互作用するために細胞膜の透過が可能なように設計される。
【００３９】
例７：受容体ー エフェクター蛋白質相互作用に干渉する有機分子または生物学的ブロスの他の成分の同定
例５のように単離され，精製されたエフェクター蛋白質を，たとえば１２５Ｉもしくは他の放射性トレーサー，または蛍光マーカーで標識し，固相に結合した受容体分子またはそのフラグメントとの相互作用の効率を，その相互作用に干渉できる分子を同定するために，各種生物学的ブロスまたは合成有機分子の存在下に測定する。同じ方法により，このような分子の粗プレパレーションからの精製を追跡することができる。
【００４０】
例８：ＴＮＦー Ｒの機能（シグナルトランスダクションまたは脱落）に干渉できるペプチドの製造
Ａ．標的ペプチドの合成
標的ペプチドは以下の配列を有する。
ペプチドＡ：Ile Glu Asn Val Lys
ペプチドＢ：Gly Thr Gln Asp Ser
ペプチドＣ：Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Gln Asp Ser
ペプチドＤ：Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly
ペプチドＡは図１に示すＴＮＦ- Ｒのアミノ酸配列のアミノ酸１７０〜１７４に，ペプチドＢはアミノ酸１７５〜１７９に，ペプチドＣはアミノ酸１７０〜１８９に，ペプチドＤはアミノ酸４０５〜４１４に相当する。
標的ペプチドは通常の操作，たとえば Chang C.D. & Meienhoffer,J.(1978); Grandas,A.ら(1989); Fournier,A. ら(1989); Stewart,M.J. & Young,J.D.(1984) または類似の方法により，Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体を用いて合成される。
【００４１】
Ｂ．組合せペプチドライブラリーの合成
ビーズおよびリンカー
組合せペプチドライブラリーは，適当なビーズ担体，たとえばジビニルベンゼン（１％ＤＶＢ）で架橋されたポリエチレン製で，直径約２００ミクロン，約１ミリ当量の結合部位たとえば一級アミンまたは酸不安定性クロロメチル基を含むビーズ上に合成スル。シスタミンのようなリンカーを，適当なクロスリンカーたとえばグルタルアルデヒドを用いてカップリングさせることができる。ペプチド合成はシステアミンの遊離アミン上で行われる。合成の終結時には，システアミン橋を，緩和な還元たとえばジチオスレイトールの使用により切断し，遊離のＣ末端ＳＨ基を有するペプチドを生成させる。多くのペプチドに独特なこの基は，認識分子の結合のための，たとえばイミノビオチンー マレイミドとの反応による，特異的修飾部位として働く。
【００４２】
ライブラリー合成の戦略
一次ライブラリー
ライブラリー合成の戦略は９もしくはそれ以上の残基サイズのペプチドのスクリーニングが可能のように設計され，約１００までの異なるアミノ酸誘導体から構成される。最初の６個のアミノ酸はすべての異なるアミノ酸誘導体を各合成サイクルに導入することによって，ランダムに合成される。最後の３回の合成サイクルでは，ビーズ毎に独特の配列が，以下のように合成される。
６番目のアミノ酸の導入後，ビーズを小分けする。小分けの数は異なるアミノ酸誘導体の数と同一とする。ついで，単一の小分けのすべてのビーズの成長ポリペプチド連鎖の７番目の位置には，単一のアミノ酸誘導体が導入される。次に，すべて一緒に混合し，前のように再分配する。この操作を３回反復すると，各ビーズ毎に計３個の独特なアミノ酸残基の導入が起こる。合成のこのフォーマットは，位置１〜６でのペプチド合成に使用されたランダム合成フォーマットと区別するために，「体系化合成」と呼ばれる。
一次ライブラリーはついで，上述のようにスクリーニングする。スクリーニングの結果は標的配列に結合可能な特異的トリペプチド配列の選択を可能にする。
【００４３】
二次ライブラリー
一次ライブラリーの合成は，一次ライブラリーのスクリーニングによって適当なトイペプチド配列が同定されたのちに行われる。二次ライブラリーの合成は，考え方は一次ライブラリーと同様に実施される。最初の３個のアミノ酸残基はランダムに合成され，次の３固のアミノ酸残基は体系化合成で合成され，最後の３つのアミノ酸は一次ライブラリーのスクリーニングから誘導された配列に従って合成される。
【００４４】
三次ライブラリー
三次ライブラリーの合成は，考え方は二次ライブラリーと同様に合成される。最初の３個のアミノ酸残基は体系化合成で合成され，最後の６つのアミノ酸残基は一次および二次ライブラリーのスクリーニングから誘導された配列に従って導入される。
【００４５】
Ｃ．延長合成／スクリーニング過程
上述の過程により，標的リガンドに特異的に結合できる９個のアミノ酸残基からなるペプチドが同定される。結合が改良される可能性があるさらに長いペプチドを調製するために，合成／スクリーニング過程を継続することもできる。また，ペプチドをさらに修飾すること，たとえば，側鎖の架橋によるペプチドコンフォーメーションの安定化，ペプチド結合の改変による蛋白分解的切断に対する保護，側鎖への疎水基の接合による膜通過輸送能の増大等も，その活性の改良に有利である。ついで，上記戦略による修飾を行うこともできる。このアプローチは多くの修飾ペプチドの迅速なスクリーニングを可能にし，所望のペプチドの同定に必要な時間を著しく短縮する。
【００４６】
ライブラリーのスクリーニング
ライブラリー（ペプチド）のスクリーニングは，２つの相に分けることができる。すなわち，
Ａ相：リガンド結合，すなわち標的ペプチドおよびネイティブ蛋白質への結合のスクリーニング，
Ｂ相：ペプチドが，ＴＮＦに応答したＴＮＦー Ｒ脱落を低下もしくは消失させる能力またはＴＮＦー Ｒによるシグナルトランスダクションを遮断する能力のスクリーニング，である。
【００４７】
Ａ相：リガンド結合能のスクリーニング
ライブラリーを，リガンドたとえば上述の標的ペプチドまたは精製ＴＮＦー Ｒに暴露する。結合リガンドの検出は，リガンドの以下の直接標識たとえばテトラメチルローダミンのような蛍光染料による標識，または特異的なポリクローナル抗体および適当なマーカーたとえば酵素アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングした適当な第二の抗体の使用によって行うことができる。結合した酵素は適当な基質，たとえばアルカリホスファターゼについてはニトロブルーテトラゾリウムのようなテトラゾリウムにカップリングしたＢＣＩＰ，または西洋ワサビペルオキシダーゼについてはクロロナフトールもしくはテトラメチルベンチジンを用いて検出される。
【００４８】
リガンドを結合するビーズの検出は，たとえばＦＡＣＳ装置を用いるビーズの蛍光のモニタリング，または肉眼検査によるビーズの色のモニタリングによって行われる。標識ビーズを混合物から回収し，個々のビーズのペプチドを自動ペプチドシーケンサーにより配列決定する。得られた配列データ二より，以後のライブラリーの設計が可能になる。
標的ペプチドに結合するビーズの検出後，それらの標的ペプチドを有する蛋白質への結合を確認する。これは，高度に精製したＴＮＦー Ｒをリガンドとして使うほかは，標的ペプチドの結合の測定に使用したのと同じ方法を用いて行われる。
【００４９】
Ｂ相：生物活性のスクリーニング
上述のライブラリースクリーニングサイクルにより，標的ペプチドとの高アフィニティー結合およびＴＮＦー Ｒへの結合が可能なペプチドの同定が行われたのち，ペプチドの所望の生物活性を発揮する能力についてのスクリーニングを行う。これにより，細胞の外部での作動が期待されるペプチド（ＴＮＦー Ｒ脱落の遮断を意図するペプチド）と，細胞質の内部で作動を意図する，たとえばＴＮＦー Ｒのシグナルトランスダクションの遮断を意図するペプチドが識別される。
【００５０】
例９：ＴＮＦー Ｒ脱落の消失を意図するペプチドのスクリーニング
標的ペプチドＡ，ＢまたはＣおよびＴＮＦー Ｒの細胞外ドメインに結合できる全ペプチドについて，ＴＮＦに応答したＴＮＦー Ｒの脱落を低下させる能力を試験する。
細胞を，ＴＮＦー Ｒの細胞外ドメインに結合できるペプチドの混合物と反応させる。インキュベーション後，細胞を溶解し，ＴＮＦー Ｒ分子を適当なＭc Ａb上イムノアフィニティーによって精製する。各ペプチドによって脱落が妨害された細胞表面にのみＴＮＦー Ｒ分子が残ると考えることができる。したがって，精製されたＴＮＦー Ｒ分子はそれらの阻害ペプチドをもつことが期待される。ペプチドを，精製ＴＮＦー Ｒプレパレーションから精製し，その配列を決定する。別法として，所望のペプチドを細胞自体から直接溶出し，ＴＮＦー Ｒを精製する必要をなくすこともできる。ＴＮＦー Ｒは細胞膜に極めて近接した部位で切断されて細胞から脱落するので，切断部位から遠い部位で結合するペプチドはすべて，脱落したＴＮＦー Ｒセグメントとともに細胞表面から除去されることが期待される。細胞から抽出されたペプチドはＳＥＣ- ＨＰＬＣで精製するか，またはペプチドはイミノビオチンで標識し（上述のように），アビジンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【００５１】
例１０：ＴＮＦー Ｒによるシグナルトランスダクションの阻害を意図したペプチドのスクリーニング
ＴＮＦー Ｒによるシグナルトランスダクションを阻害できるペプチドのスクリーニングはもっと複雑である。ペプチドがＴＮＦー Ｒのシグナル変換能に干渉する能力のための主要な障害作用を発揮するには，細胞膜を通過し，標的細胞内の細胞質に十分高い濃度で蓄積する必要がある。
したがって，スクリーニングは分けて行われなければならない。最初の試験では，上述のようにして，ペプチド（ビーズ上）が標的ペプチドおよびＴＮＦー Ｒ分子の精製細胞内ドメインに結合する能力について，ペプチドを試験する。結合可能なペプチドについて，ＴＮＦー Ｒのシグナルトランスダクションを遮断する能力をスクリーニングする。細胞膜を通過して細胞質内にペプチドが輸送されるのを容易にするためには，ペプチドをビーズ上で，たとえば（１）メチオニンのスルフォキシドへの酸化，（２）ペプチド結合のそのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ2 ）による置換（Zacharia,S. ら,1991 ），（３）ラウロイル誘導体の導入（Muranishi ら,1991 ）により，化学的に修飾する。
ペプチドの修飾は，ペプチドがビーズ上にあるときに行われる。修飾されたペプチドについて，ＴＮＦー Ｒの細胞内ドメインに結合する能力をスクリーニングする。ＴＮＦー Ｒへの結合能力を維持しているペプチドをビーズ上から切断し，ＴＮＦー Ｒを発現する肝細胞を用いて，細胞膜を通過してＴＮＦー Ｒのシグナルトランスダクションを遮断する能力を試験する。
【００５２】
例１１：機能に必須であることが見出されたＴＮＦー Ｒの領域に空間的にフィットする，シグナリングおよび開裂のインヒビターの創製
ＴＮＦー Ｒの三次元構造を，それから生成させた結晶のＸ線結晶構造解析によって決定される。突然変異分析（図３〜６）により，受容体のシグナリングまたは開裂に必須であることが見出された領域の構造にとくに注意しなければならない。これらの重要な領域の構造を完全なものにするため，既知分子の三次元構造をを上記分析によって想定された構造と比較する。この方法で，誘導された相補構造に類似すると考えられる分子について，受容体のシグナリングおよび開裂との干渉能力を調べる。効果の何らかの兆候が見出されたならば，所望の相補構造にさらに近づくために，これらの分子をそれらの誘導体を創製することによって改良する。構造のこのような連続的改変および生物活性の測定によって，シグナリングおよび蛋白分解の効果的なインヒビターが得られる。
【００５３】
例１２：活性ペプチドおよび他の分子をコードするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子の創製ならびにそれらの発現
ペプチドおよび他の分子はまた，遺伝子操作技術によっても製造できる。これらの製造には，これらの技術で用いられるすべてのツールが包含される。すなわち，このようなペプチドおよび他の生物学的分子をコードするヌクレオチドからなるＤＮＡ分子が提供される。これらのＤＮＡ分子は，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡおよびそれらの組合せのいずれであってもよい。
これらのペプチドおよび他の分子のアミノ酸配列が決定されたならば，このようなペプチドおよび分子をコードするＤＮＡ分子の創製は慣用手段で行われる。
【００５４】
組換え蛋白質の発現は，真核細胞，細菌または酵母中で，適当な発現ベクターを用いて行うことができる。本技術分野で知られている任意の方法が採用できる。
たとえば，上述の方法で得られたペプチドまたは他の分子をコードするＤＮＡ分子は，適当に構築された発現ベクター中に，本技術分野でよく知られた技術によって挿入される（Maniatisら,1982 参照）。二本鎖ｃＤＮＡを，合成ＤＮＡリンカーまたはブラント末端リゲーション法の使用を含むホモポリマーテーリングまたは制限連結によって，プラスミドベクターに連結される。ＤＮＡリガーゼはＤＮＡ分子をリゲートするために使用され，望ましくない連結はアルカリホスファターゼによる処置で回避される。
【００５５】
所望の生物学的物質すなわちペプチドまたは蛋白質（以下，簡単に「蛋白質」という）を発現できるためには，発現ベクターはさらに，遺伝子発現および蛋白質の生成を可能にするように，所望の蛋白質をコードするＤＮＡに連結された転写および翻訳調節情報を含む特異的ヌクレオチド配列から構成されていなければならない。第一に，遺伝子が転写されるために，ＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターによって先行されていなければならない。これにポリメラーゼが結合し，その結果，転写過程が開始される。このようなプロモーターとしては様々なものが使用されていて，その効率も多様である（強いプロモーターや弱いプロモーターがある）。原核細胞用と真核細胞用でも異なっている。
【００５６】
本発明に使用できるプロモーターは，構造性プロモーター，たとえばバクテリオファージΔのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ- ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＣＡＴプロモーター等，また誘導性プロモーター，たとえばバクテリオファージΔの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ），大腸菌のｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーター，もしくはｔｒｐ- ｌａｃハイブリドプロモーター等である（Glick,B.R.,1987）。
【００５７】
大量のｍＲＮＡを発生させるための強力なプロモーターの使用に加えて，原核細胞中での高レベルの遺伝子発現のためには，ｍＲＮＡの効率的な翻訳を確実にするためには，リボソーム結合部位の使用も必要である。一例には，開始コドンから適当な位置に配置され，１６Ｓ  ＲＮＡの３′末端と相補性のシャイン- ダルガノ配列（ＳＤ配列）がある。
【００５８】
真核宿主の場合には，宿主の性質に応じて，異なる転写および翻訳調節配列が使用される。それらには，ウイルス起源たとえばアデノウイルス，ウシパピローマウイルス，シミアンウイルス等に由来するものがある。この場合，調節シグナルは特定の遺伝子に関連し，高い発現レベルを有する。たとえば，ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等がある。転写開始調節シグナルは，遺伝子の発現を調節できるようにリプレッションおよびアクティベーションを可能にするものが選択される。
【００５９】
本発明のペプチドまたは他の分子をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子ならびに操作性に連結された転写および翻訳調節シグナルは，所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体中に統合できるベクターに挿入される。導入されるＤＮＡをその染色体中に安定に統合された細胞は，その発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１種または２種以上のマーカーも導入することによって，選択できる。マーカーは，栄養要求宿主への栄養要求性，殺生物剤耐性たとえば抗生物質または銅のような重金属等への耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子は，発現させるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか，または同じ細胞にコトランスフェクションによって導入できる。他の要素もまた，単一鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの至適合成には必要である。これらの要素には，スプライスシグナル，ならびに転写プロモーター，エンハンサーおよび終結シグナル等が包含される。このような要素が導入されたｃＤＮＡ発現ベクターには，Okayama （1983）によって記載されたベクターがある。
【００６０】
好ましい実施態様においては，導入されるＤＮＡ分子は，レシピエント宿主中で自律複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクター中に挿入される。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択に重要な因子は，そのベクターを含有するレシピエント細胞のそのベクターを含まないレシピエント細胞からの選択の容易性，特定の宿主細胞中に望まれるベクターのコピー数，宿主細胞と異なる種の間でベクターを「シャトル」できることが望まれるか否か等である。
【００６１】
好ましい原核細胞ベクターには，大腸菌中で複製可能なプラスミド，たとえばｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥ１，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４等（Maniatisら,1982参照）；バチルスプラスミドたとえばｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等（Gryczan,T.,1982 ）；ストレプトミセスプラスミドたとえばｐＩＪ１０１等（Kendall,K.J.ら,1987 ）；ストレプトミセスバクテリオファージ，たとえばΦＣ３１（Chater,K.F. ら, Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology）；およびシュードモナスプラスミド（John,J.F. ら,1986,Izaki,K.ら, 1978）が包含される。
【００６２】
好ましい真核細胞プラスミドには，ＢＰＶ，ワクシニア，ＳＶ４０，２ー ミクロンサイクル等，またはそれらの誘導体が包含される。このようなプラスミドは本技術分野においてよく知られている（Botstein,D. ら,1982; Broach,J.R.: TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance,1981; Broach,J.R.,1982; Bollon,D.P. ら,1980; Maniatis,T.: Cell Biology:  A Comprehensive Treatise, Vol.3: Gene Expression,1980）。
【００６３】
構築体を含有するベクターまたはＤＮＡが発現用に準備されたならば，ＤＮＡ構築体を，様々な適当な手段，たとえばトランスフォーメーション，トランスフェクション，接合，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，リン酸カルシウム沈降，直接マイクロインジェクション等の任意の手段により，適当な宿主脂肪に導入される。
【００６４】
本発明に使用される宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい厳格宿主には，大腸菌，バチルス，ストレプトミセス，シュードモナス，サルモネラ，セラチア等芽包含される。最も好ましい原核宿主は大腸菌である。とくに興味がある細菌宿主には，大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６），大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７），大腸菌Ｗ３１１０（Ｆー ，ラムダー ，原栄養性，ＡＴＣＣ２７３２５），および他の腸内細菌，たとえばネズミチフス菌または霊菌およびシュードモナス種がある。このような条件下には，蛋白質はグリコシル化されない。原核宿主は発現プラスミド中のレプリコンまたは制御配列に適合性でなければならない。
【００６５】
好ましい真核宿主は，蛋白分子に正しいフォールディングまたは正しい位置でのグリコシル化を含む翻訳後修飾を与えるので，哺乳動物細胞，たとえばヒト，サル，マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。酵母細胞でも，グリコシル化を含む翻訳後修飾を行うことができる。所望の蛋白質の酵母中での製造に利用できる，強力なプロモーター配列と高コピー数のプラスミドを使用する多くの組換えＤＮＡ戦略がある。酵母は，クローン化哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し，リーダー配列をもつペプチド（すなわち，プレペプチド）を分泌する。
【００６６】
ベクターの導入後，宿主細胞を，ベクター含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖っせる。クローン化遺伝子配列の発現により，所望の蛋白質の産生が起こる。
組換え蛋白質の精製は，この目的で知られている方法に任意の方法によって実施できる。
以上，ｐ５５ー ＴＮＦー Ｒを参照しながら説明したが，ｐ７５ー ＴＮＦー Ｒについての知識から，ｐ７５ー ＴＮＦー Ｒについても同様に機能することは明白である。したがって，本発明は，既知の両ＴＮＦ受容体のシグナルトランスダクションおよび／または開裂を包含するものである。
【００６７】
引用文献一覧表
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引用文献一覧表（つづき）
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。サークルで囲んだ部分はリーダーおよび膜通過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異および欠失を示す。
【図２】欠失変異体の例。
【図３】アミノ酸４１５〜４２６欠失ｐ５５ＴＮＦ- Ｒ変異体の細胞破壊作用のシグナリング，およびさらに１０個のアミノ酸が欠失した変異体Δ：４０５〜４２６のシグナリングの消失。
【図４】１９７ｓｅｒがａｌａで置換されたｐ５５ＴＮＦ- Ｒ変異体の細胞破壊作用のシグナルトランスダクションの低下。
【図５】１９７ｓｅｒがａｌａで置換された変異体の，ｐ５５ＴＮＦ- Ｒの細胞外部分の脱落の誘導の消失。
【図６】アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７９のいずれかの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７９の欠失の，ｐ５５ＴＮＦ- Ｒ細胞外部分の脱落誘導の消失。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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