(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５'位置から３'位置方向に、サイトメガロウイルスの初期プロモーター（immediate early promoter）、ＤＲ１エレメント、エプシロンエレメント（epsilon，nt．1849-1909）、配列番号１のアルファ−エレメント（nt．2818-3052）、ＤＲ２エレメント、（nt．1592-1602）、配列番号２のベータ−エレメント（nt．1607-1804）、ＤＲ１エレメントを含み、前記エプシロンエレメントの末端位置と前記アルファ−エレメントの開始位置の間、および前記アルファ−エレメントの末端位置と前記ＤＲ２エレメントの間に外来遺伝子の挿入部位を有する、プロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項２】
前記ベクターが、さらにＨＢＶ遺伝子中内在性ウイルスプロモーターを用いる、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項３】
前記ベクターが、ＨＢＶ遺伝子中内在性ウイルスプロモーターの中のコアプロモーターとプリＳ２／Ｓプロモーターをそれぞれ選択して用いる、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、野生型３．２Ｋ ｂｐ ＨＢＶゲノムの大きさを超えることなく、エプシロンエレメントとアルファエレメントの間に０．９０Ｋ ｂｐまでの異種遺伝子の塩基配列の挿入部位を有する、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項５】
前記ベクターが、野生型3.2Ｋ bp ＨＢＶゲノムの大きさを超えることなく、アルファエレメントとＤＲ２エレメントの間に1.7Ｋ bpまでの異種遺伝子の塩基配列の挿入部位を有する、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、複製に必須のコアタンパク質、またはポリメラーゼ遺伝子が欠け複製不能（replication-defective）である、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、少なくとも一つの異種遺伝子（heterologous gene）を発現することができる異種塩基配列を含む、請求項１記載のプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療用組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターに関し、より詳しくは、肝細胞にのみを特異的に標的としｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療に用いることができる組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
一般に遺伝子治療は、細胞内の遺伝子発現の異状による幾多の疾患を根本的に治すことができるので、次世代治療法として認識されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２）。遺伝子治療法は未だ商業化されていないが、ゲノムプロジェクトの完成でその重要性がさらに浮き彫りにされ幾多のバイオテク会社と大学病院で関心を持って研究開発が進められている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３）。現在遺伝子治療は大きくレトロウイルス、又はアデノウイルス等のウイルスを利用したウイルスベクターや、リポソーム又はｎａｋｅｄ  ＤＮＡ等を利用した非ウイルス性ベクターに分類することができる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９９９）。異種遺伝子を治療用目的に利用する場合に、重要な目標は、目的とする細胞に特異的に標的とすることと治療効果の持続性である。しかし、細胞特異性の欠乏と非効率的な遺伝子伝達は遺伝子治療の主要な改善点として持ち上がってきた。それだけでなく、症状が緩和するか完治するまで治療用の遺伝子産物の効果が持続し得るようにすることも重要な問題であり、大部分のベクターが細胞で消滅及び分解され持続性の不足も問題となり、その効果をさらに低下させる問題点があった（Ｃｒｙｓｔａｌ，１９９５）。
【０００３】
現在、主に用いられている遺伝子伝達システムは遺伝子の効率的な伝達のため、ウイルスから由来したベクター等を主に用いる。特に、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ；ＡＡＶ）等が主に用いられる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９９９）。これらは病原性がなく、ウイルス増殖による危険を防ぐため複製能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）がないように考案されたウイルスベクターである。しかし、これらウイルス由来のベクターは対象細胞に効率的に遺伝子を伝達し発現するには理想的でない欠点がある。先ず、レトロウイルスは対象細胞のゲノムに統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）され持続的に発現する利点があるが、低いタイター（ｔｉｔｅｒ）と、ただ分裂する細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）のゲノムにのみ統合する制限性によりｉｎ  ｖｉｖｏ治療には使用が困難である。その反面、アデノウイルスは非常に高いタイター（ｔｉｔｅｒ）と効率的な遺伝子伝達能力、そして、分裂しない細胞（ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）にも遺伝子を伝達する利点がある。しかし、発現が持続的でなく、宿主に免疫反応を誘発する問題点がある。さらに、治療効果を誘導するために必ず伴う反復的な投与は甚だしい免疫反応を誘発する副作用がある（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０００４】
このような問題点のため、レトロウイルスとアデノウイルスベクターは臨床的に用いられるには幾多の改善が必要である。さらに、現在臨床研究で最も多く用いられるレトロウイルスとアデノウイルスベクターは細胞特異性がないので治療対象組織だけでなく、その他の組織にも感染するためｉｎ  ｖｉｖｏの治療には副作用が伴う問題がある。
【０００５】
前記ウイルスベクターには組織特異性、肝細胞特異性等がないため、肝疾患にはｉｎ  ｖｉｖｏプロトコールは副作用等に制限され主にｅｘ  ｖｉｖｏプロトコールが用いられる。ｅｘ  ｖｉｖｏプロトコールによる肝標的治療は外科的な摘出手術が必須なので、組換ウイルスベクターを処理して作った修飾肝細胞（治療能力を有する肝細胞）を患者の肝、脾臓に形質導入することがが不可避になる。しかし、このような摘出された肝細胞を実験室内で培養するには幾多の困難と複雑さ、そして莫大の費用を必要とすることになる。
【０００６】
好ましくは、肝標的遺伝子治療ベクターは肝細胞にのみ特異的に伝達されなければならない。ＨＢＶのように肝向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスから由来した遺伝子治療ベクターは、血管内注射又は野生型ウイルスが利用する肝細胞の受容体を利用して患者内に注入することができる。ＨＢＶから由来した肝標的治療用ベクターの開発にはＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレメントに対する情報が先行しなければならず、シス−エレメントに対する完全な解明がなければベクターへの利用は非常に制限される。
【０００７】
ＨＢＶはヘパドナウイルス科（ｈａｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、宿主特異性と組織特異性を有する小さいＤＮＡウイルスである（Ｇａｎｅｍ，Ｄ．，１９９６）。ヘパドナウイルスは人間（ＨＢＶ）、北米産マーモット（ｗｏｏｄｃｈｕｃｈ；ＷＨＶ）、北米産斑りす（ＧＳＨＶ）のような哺乳動物と、北京鴨（ＤＨＢＶ）、灰色のサギ（ＨＨＢＶ）のような鳥類からも発見されている（Ｇａｎｅｍ，１９９６）。
【０００８】
遺伝子治療用組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターの開発において困難であった問題点は、ウイルスのゲノム複製に必須のシス−エレメントに対する正確な情報を知ることができなかった点である。よって、ＨＢＶゲノム全体に亘るシス−エレメントに関する情報が、遺伝子治療用の組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターの開発において必ず先行しなければならない部分である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記の問題点を解決し前記の必要性により考案されたものであり、本発明の目的は遺伝子治療用の組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターを提供することである。
【００１０】
発明の構成
前記の目的を達成するため、本発明はＨＢＶゲノム複製に必須の新しい２種類のシス−エレメントである配列番号１に記載されたアルファ−エレメント（ｎｔ．２８１８−３０５２）、及び配列番号２に記載されたベータ（β）−エレメント（ｎｔ．１６０７−１８０４）配列を含むプロトタイプ（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）のＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクターを提供する。
【００１１】
本発明のベクターは、５’位置から３’位置の方向にサイトメガロウイルスの初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＤＲ１エレメント、エプシロンエレメント（ｅｐｓｉｌｏｎ，ｎｔ．１８４９−１９０９）、アルファ−エレメント（ｎｔ．２８１８−３０５２）、ＤＲ２エレメント、ベータ−エレメント（ｎｔ．１６０７−１８０４）、ＤＲ１エレメントを含む配列番号３に記載されたプロトタイプのＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクターであるのが好ましい。
【００１２】
配列番号３で、サイトメガロウイルスの初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は塩基配列７４０８から７９９９であり、ＤＲ１エレメントは７から１７、エプシロンエレメント（ｅｐｓｉｌｏｎ，ｎｔ．１８４９−１９０９）は３０から９０、アルファ−エレメント（ｎｔ．２８１８−３０５２）は９９８から１２３３であり、ＤＲ２エレメントは２９５５から２９６５であり、ベータエレメント（ｎｔ．１６０７−１８０４）は２９７０から３１６７であり、ＤＲ１エレメントは３１８９から３１９９であり、９１から９９７までと１２３３から２９５４までにそれぞれ約０．９ｋｂと約１．７ｋｂの外来遺伝子が挿入され得る部位が存在する。
【００１３】
即ち、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクターは、前記エプシロン（ｎｔ．１８４９−１９０９）と前記アルファ−エレメント（ｎｔ．２８１８−３０５２）の間と、前記アルファ−エレメント（ｎｔ．２８１８−３０５２）と前記ＤＲ２（ｎｔ．１５９２−１６０２）の間に外来遺伝子の挿入部位が存在する（図８参照）。
【００１４】
尚、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクターにおいて、前記ベクターはＨＢＶ遺伝子中内部ウイルスプロモーターを用い、内部ウイルスプロモーターの中でコアプロモーターとプリＳ２／Ｓプロモーターをそれぞれ選択して用いるのが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明のＢ型肝炎ウイルスプラスミドベクターは野生型３．２Ｋ  ｂｐ  ＨＢＶゲノムの大きさを増加させず、エプシロンエレメントとアルファエレメントの間に０．９０Ｋ  ｂｐまでの塩基配列を挿入することができ、アルファエレメントとＤＲ２エレメントの間に１．７Ｋ  ｂｐまで挿入できるベクターである。
【００１６】
さらに、本発明のベクターにおいて、前記ベクターは複製に必須のコアタンパク質、またはポリメラーゼ遺伝子が欠けた複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）のベクターである。
【００１７】
本発明のベクターは、少なくとも一つの異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）を発現することができる異種塩基配列を含むベクターである。
【００１８】
尚、本発明はＢ型肝炎ウイルスのキャプシド化に必須の“エプシロン”エレメントが欠け複製することができないが、Ｂ型肝炎ウイルスのタンパク質を現わして組換ＨＢＶベクターにウイルス遺伝子複製に必要なタンパク質（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）を発現するヘルパープラスミド（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は前記の組換ＨＢＶベクターと前記のヘルパープラスミドを肝細胞株に共にトランスフェクションし、組換ＨＢＶ粒子を作ることができる方法を提供する。
【００２０】
前記の組換ＨＢＶベクターはウイルス遺伝子複製に必須のシス−エレメントを含み、少なくとも一つの遺伝子治療用異種遺伝子を発現することができ、さらに、ウイルス遺伝子複製に必要なウイルス遺伝子中少なくとも一種類を発現することができず、前記のヘルパープラスミド（またはパッケージングプラスミド）は、ウイルス遺伝子複製に必要なタンパク質（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）中少なくとも一種類を発現することのできない組換ＨＢＶベクターにこの欠乏したタンパク質を提供し、組換ＨＢＶベクターを補って（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）感染性のあるウイルスを生産できなければならず、前記肝細胞株は複製に必要なタンパク質（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が提供されると組換ＨＢＶベクターが複製できる肝細胞株である。
【００２１】
本発明で肝細胞は人間の肝細胞、鳥類の肝細胞、げっ歯類の肝細胞の集団から選択された肝細胞であるのが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は前記の組換ＨＢＶ粒子を血管内又は肝組織内投与方法で標的細胞に感染させる方法を提供する。
【００２３】
標的細胞に感染させる方法において、前述した挿入できる外部遺伝子は多様な遺伝子に対するアンチセンス遺伝子とリボザイムを含み、特にＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスのアンチセンス遺伝子とリボザイムを作る遺伝子を含む。さらに、多様な癌抑制遺伝子、成長因子、ホルモン、サイトカイン、細胞膜受容体、血液凝固因子をコードする異種遺伝子を含む。
【００２４】
尚、組換ＨＢＶ粒子を標的細胞に感染させる方法で次を含む。
ＨＢＶに慢性感染した患者の肝組織内に、直接組換ＨＢＶベクターＤＮＡの投与方法を含み、前記で言及した挿入できる外部遺伝子は、多様な遺伝子に対するアンチセンス遺伝子とリボザイムを含み、特に、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスのアンチセンス遺伝子及びリボザイムを作る遺伝子を含む。さらに、多様な癌抑制遺伝子、成長因子、ホルモン、サイトカイン、細胞膜受容体、血液凝固因子をコードする異種遺伝子を含む。
【００２５】
本発明の理解を助けるため、次の用語を下記のように定義する。
“エレメント”はＤＮＡ、またはＲＮＡの塩基配列で特定の機能を有する塩基配列を言う。“シス−エレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）”は同一ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子内で調節機能を有して作用する塩基配列を言う。“キャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）”は“パッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）”と同じ意味で用いられており、コア粒子内にウイルス遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が入る過程を言う。“異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ｇｅｎｅ）”はＨＢＶ遺伝子でない遺伝子を言い、“外部遺伝子（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ）”と同じ意味で用いられた。“ベクター”はＤＮＡ切片を含んで他の細胞に運搬する機能のある核酸塩基配列を言い、プロトタイプのベクターは異種遺伝子を挿入でき一般に用いることができるベクターを言う。
【００２６】
本発明でＨＢＶの塩基配列は２種類に示されている。先ず、明細書の本文では特に指摘しない場合は全てＧａｌｉｂｅｒｔの方法に従いＨＢＶ塩基配列を示した（Ｇａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。この場合ｎｔ．−−−−で示した。一方、添付の塩基配列表はプリゲノミックＲＮＡの開始部位であるｎｔ．１８２０を１にし、それぞれプラスミドの塩基配列を示した。
【００２７】
【発明の実施態様】
以下、本発明を詳しく説明する。
Ｉ．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）はヘパドナウイルスに属し、急性肝炎だけでなく慢性肝炎を起す臨床的に非常に重要なウイルスである。マーモット肝炎ウイルス（ＷＨＶ）、斑りす肝炎ウイルス（ＧＳＨＶ）、北京鴨肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）等がヘパドナウイルス科に属する（Ｇｅｎｅｍ，１９９６）。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであるがプリゲノミックＲＮＡを鋳型にし、ＨＢＶ  ＤＮＡ重合酵素が有する逆転写活性（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を介してＤＮＡ遺伝子に複製する非常に特異なゲノム複製を有するウイルスである。ＨＢＶは約３．２  ｋ  ｂｐのプラス−ＤＮＡ鎖に間隙が存在する円形のＤＮＡ遺伝子を有しており、コア（Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）、表面抗原（Ｓ）、そしてＸタンパク質の四つのウイルスタンパク質を有する。
【００２８】
ＩＩ．ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）の感染周期
ヘパドナウイルスの感染周期は図２に示されている（Ｇｅｎｅｍ，１９９６）。ヘパドナウイルスは受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して肝細胞に侵入することが知られている。肝細胞に入った後、隙間（ｇａｐ）が存在するＨＢＶゲノムは、転写の鋳型になる共有結合性閉環状ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：ＣＣＣ  ＤＮＡ）に切り替えられる。四つのウイルスの転写体が合成されたあと細胞質に移動する。３．５ＫｂｐのプリゲノミックＲＮＡはコアとポリメラーゼのｍＲＮＡとして作用するだけでなく、ウイルス遺伝子複製の鋳型としても作用する。
【００２９】
ＩＩＩ．逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）過程
ＨＢＶはレトロウイルスとは別の逆転写過程を有する（Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＨＢＶはウイルス複製のため、コアタンパク質とプリゲノミックＲＮＡを認識するポリメラーゼが同時にコア粒子にキャプシド化した後、このコア粒子内でポリメラーゼによる遺伝子複製が発生する。ポリメラーゼタンパク質とプリゲノミックＲＮＡの結合が遺伝子複製に必須のコア粒子形成に重要である。プリゲノミックＲＮＡの５’位置の末端部位に存在する“エプシロン”と言われる約８５塩基対の特異な２次構造の塩基配列が、キャプシド化段階でシス−エレメントに作用する（Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。このエプシロンはステム−ループ構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を成し、ヘパドナウイルスに属する全てのウイルスに非常に高く保存されている。
【００３０】
ＨＢＶポリメラーゼの逆転写過程はＨＢＶの独特なゲノム構造ほど非常に複雑である（図３；Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。野生型の完全な二重−鎖ＤＮＡゲノムを形成するためには下記のような鋳型スイッチング過程（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）が必要である（図３）。第一、コア粒子内にキャプシド化したプリゲノミックＲＮＡを鋳型にし、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼが逆転写過程でマイナス−鎖ＤＮＡを合成する。このマイナス−鎖ＤＮＡ合成のプライマーと、ポリメラーゼに同時にＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼが利用される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。即ち、タンパク質−プライミング（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｉｍｉｎｇ）によりマイナス−鎖ＤＮＡ合成が開始される。
【００３１】
このプライミング過程で５’に存在するエプシロン（ε）がＨＢＶマイナス−鎖ＤＮＡ合成の開始部位に作用する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。次いで、このマイナス−鎖ＤＮＡはエプシロンとＤＲ１（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）の間の４塩基対の相同性を利用して５’から３’ＤＲ１に移動する（Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。この過程をマイナス−鎖移動（ｍｉｎｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）と言う。マイナス−鎖ＤＮＡが合成されると、ＨＢＶポリメラーゼが有するＲｎａｓｅ  Ｈ活性によりプリゲノミックＲＮＡは５’−末端側の１８ヌクレオチドＲＮＡのみを除いて分解される（Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００３２】
次に、５’−末端キャップＲＮＡが３’ＤＲ２に伝達された後、ＲＮＡプライマーに作用してプラス−鎖ＤＮＡを合成する。次いで、ＤＲ２部位に鋳型スイッチングを行なってプラス−鎖ＤＮＡ合成を始め、プラス−鎖ＤＮＡはＤＲ２に転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）される円形化段階を経て円形のゲノムを合成する（Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。このプラス−鎖ＤＮＡの合成が完了する前に、ＨＢＶ  ＤＮＡはウイルス表面抗原粒子に取り囲まれ細胞の外に出る。結局、ＨＢＶは円形の隙間が存在する二重鎖ゲノムを有することになる。
【００３３】
ＩＶ．ＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレメント
前記で記述されているように、ＨＢＶは３回の鋳型スイッチングを介して線形のプリゲノミックＲＮＡを円形の二重鎖ＤＮＡに複製する。過去２０年間、分子生物学的な技法でウイルスＤＮＡ複製に重要な役割を果たすエレメントが明らかにされた（Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。文献に報告されたシス−エレメントを並べてみれば、キャプシド化信号に利用される５’位置エプシロンエレメントが知られており（Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ウイルス複製段階中にプライマー移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）過程で利用されるＤＲ１とＤＲ２（Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｏｎｄｒｅａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、円形化（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）段階で利用されるｒ（ｒｅｐｅａｔ）が作用する（Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。そして、転写後ＲＮＡプロセッシングエレメント（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＰＲＥ）等がある（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。このようなシス−エレメントは大部分ＨＢＶプリゲノムの両側に存在する（図１と図８）。
【００３４】
一方、ヘパドナウイルス中のＤＨＢＶ（Ｄｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）の場合、３Ｅ、Ｍ、５Ｅと名付けられた三つのエレメントが遺伝子複製に必要であることが報告されており、プラス−鎖ＤＮＡの合成時に鋳型スイッチングに必要である（Ｈａｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＤＨＢＶとは別に、ＨＢＶは未だ複製に必要なシス−エレメントが解明されていない。このような理由で、ＨＢＶゲノムは遺伝子治療用ベクターに利用されていない。遺伝子治療ベクターは、複製に必要なシス−エレメントを必ず含んでいなければならない。本発明ではＨＢＶ遺伝子複製に必要なシス−エレメントを解明した後、この情報に基づく組換ＨＢＶベクターを設計した。
【００３５】
Ｖ．プロトタイプのＨＢＶベクターの設計
ＨＢＶゲノム複製に必要な全てのシス−エレメントを解明し複製に必須のウイルスタンパク質（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が提供されれば、複製能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）の存在する異種遺伝子を有する遺伝子治療用ベクターに開発することができる。簡単に言えば、ＨＢＶベクターはウイルスタンパク質を発現しないにも拘らず、ウイルスゲノム複製に必要な全てのシス−エレメントをコードしている。それにも拘らず、ヘルパープラスミドやパッケージング細胞株を介してウイルスタンパク質（例えば、コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、表面タンパク質）が提供されれば、組換ＨＢＶベクターは複製され得る（図４）。異種遺伝子の挿入部位の選定、挿入された異種遺伝子の大きさ、異種遺伝子の発現のために利用されるプロモーター等が遺伝子治療用ベクター開発の成功のポイントになり得る。
【００３６】
先ず、本発明では２つのシス−エレメントを解明した。１つはアルファエレメントで、他の１つはベータエレメントである（図８）。本発明の方法を具体化するため、本発明では２つの挿入可能部位を選定した（図８）。一つは５’エプシロンとアルファエレメントの間で、もう一つはアルファエレメントとＤＲ２エレメントの間である。この二つの挿入部位はウイルス複製において欠損可能部位（ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）である。しかし、挿入部位の選定を現在のものに限定はせず、プロトタイプＨＢＶベクターの５’エプシロンとアルファ−エレメントの間に異種遺伝子の挿入も可能である（図８）。挿入できる異種遺伝子の大きさは野生型のゲノム大きさを固定させるようにしたとき、それぞれ０．９０Ｋ  ｂｐと１．７Ｋ  ｂｐまで可能である（図８）。
【００３７】
最近、野生型より約０．２Ｋ  ｂｐ程度大きい大きさのプリゲノミックＲＮＡまで、マイナス−鎖ＤＮＡ合成が可能であることが報告された（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。従って、本発明では前記の２個所の挿入位置に、それぞれ１．１Ｋ  ｂｐ、１．９Ｋ  ｂｐまでの大きさの切片を挿入しても複製する可能性はなくならない。幸いに、挿入部位より上側に存在する２つの内在するウイルスプロモーター（即ち、コアプロモーターとプリ−Ｓ２／Ｓプロモーター）を利用して異種遺伝子が転写されるよう設計した。さらに進んで、本発明の組換ＨＢＶベクターはバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターに考案されているため、２つの挿入部位に挿入された異種遺伝子が同時に発現可能である。
【００３８】
ヘパドナウイルスの肝向性（ｌｉｖｅｒ  ｔｒｏｐｉｓｍ）は、肝疾患の遺伝子治療においてＨＢＶを利用しようとする最も重要な特性である。本発明で提供する肝標的ＨＢＶベクターは肝炎、肝硬変、肝癌等の肝疾患だけでなく、家族性高コレステロール血症、血液凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＶが欠けて発生する血友病等の肝細胞に遺伝子発現が欠けて発生する代謝性遺伝病治療にも活用することができる。さらに、肝標的ＨＢＶベクターは慢性肝炎患者の治療にも非常に有用である。Ｂ型肝炎ウイルスに既に感染した慢性感染者はウイルスの複製に必要なコアタンパク質とポリメラーゼが肝細胞内に常に現われている。従って、本発明で提供するＨＢＶベクターに治療用遺伝子が挿入された組換ＤＮＡを、慢性感染者の肝細胞に直接又は血液循環を介して注入すれば、組換ウイルスがＨＢＶ慢性感染者の肝細胞では複製が持続的に可能である。これは慢性感染治療に非常に効率的である。
【００３９】
本発明では、ＨＢＶの複製に必須のＢ型肝炎ウイルスゲノムのシス−エレメント（α−ｅｌｅｍｅｎｔ、β−ｅｌｅｍｅｎｔ）に対する情報を提供しており、アルファエレメント、ベータエレメントのヌクレオチド配列を提供している。
【００４０】
本発明では組換ＨＢＶゲノムを利用しているが、本発明がＨＢＶに限定されるのではない。ヘパドナウイルスに属するマーモット肝炎ウイルス（ＷＨＶ）、斑リス肝炎ウイルス（ＧＳＨＶ）、北京鴨肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）等も互いのゲノムも類似するので、本発明が他のヘパドナウイルスの遺伝子治療用ベクター開発にも利用することができる。
【００４１】
本発明を具体化するため、ウイルス遺伝子複製に必須のシス−エレメントを完全に解明した後、これらシス−エレメントを保存したプロトタイプのＨＢＶベクターを設計した。しかし、本発明で提示する２つの新しいシス−エレメント（アルファエレメント、ベータエレメント）の位置を限定する必要はない。最大のパッケージングサイズ（ｍａｘｉｍａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｚｅ）以内では、野生型プリゲノミックＲＮＡの大きさである３．５ｋｂより大きいサイズのプリゲノミックＲＮＡ挿入も可能であり、新しいシス−エレメントはベクターの機能に影響を及ぼさない範囲内で、ベクター内のシス−エレメントの相対的な位置変更も可能である。
【００４２】
本発明で提供する組換ＨＢＶゲノムのキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）のため、次のような過程が先行しなければならない。第一、組換ＨＢＶベクターは少なくとも一つ以上の異種遺伝子を発現する。第二、ヘルパープラスミドはウイルスのキャプシド化とゲノム複製に必須のコアタンパク質、ポリメラーゼ、及び表面抗原をトランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）で提供する。即ち、ヘルパープラスミドと組換ＨＢＶベクターは肝細胞内で互いに相互補完現象（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）でキャプシド化され、ウイルス粒子を形成することができる。本発明が利用できる肝細胞群株は次のようなＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｃｈａｎｇ肝細胞等の人間肝細胞株とげっ歯類肝細胞株を含む一連の肝細胞株がある。
【００４３】
ＨＢＶの遺伝子に異種遺伝子を挿入または置換し、組換ＨＢＶの可能性を探索した研究が幾つかの文献に報告されている（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｃｈａｉｓｏｍｃｈｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｐｒｏｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。本発明は米国特許第５，９８１，２７４号とは幾つかの点で区別される（Ｔｙｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，９８１，２７４，１９９９；Ｃｈａｉｓｏｍｃｈｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。前記特許は異種遺伝子をＨＢＶポリメラーゼのスペーサ（ｓｐａｃｅｒ  ｏｒ  ｔｅｔｈｅｒ）ドメインに挿入させた。
【００４４】
何よりも、米国特許第５，９８１，２７４号で用いた外部遺伝子挿入部位は本発明で解明したアルファ−エレメント部位に該当する。即ち、このアルファ部位はＨＢＶ遺伝子複製に必須なので、この部位に外部遺伝子の挿入は複製を阻害する。遺伝子を発現するためには小さなサイズ（２７０または３７４ｂｐ）の切片を挿入しており、挿入後ベクターの複製が約５０倍減少したのでベクターというのは困難である。このような理由で、前記の米国特許第５，９８１，２７４号は遺伝子治療用ベクターでに分類され得ない。
【００４５】
一方、台湾のＤｒ．Ｃｈａｎｇの研究室で約０．７Ｋｂの発光遺伝子（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をＨＢＶ遺伝子の２箇所に置換し、組換ＨＢＶ粒子を生産することが報告されている（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さらに、最近ＤＨＢＶとＨＢＶを組換ベクターに用いた最初の成功事例が報告された（Ｐｒｏｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。この報告ではウイルス遺伝子複製に必須のシス−エレメントに対する情報なしに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはインターフェロン遺伝子を、ＨＢＶまたはＤＨＢＶ遺伝子の何箇所に挿入した結果、そのうち表面抗原ＯＲＦ（ｉ．ｅ．，Ｓ  ＯＲＦ）に異種遺伝子を置換したときウイルスが生産されることを観察した。
【００４６】
本発明で提供するＨＢＶベクターは前記報告と幾つかの面で区別される利点を有する。先ず、本発明はシス−エレメントを完全に解明して設計したプロトタイプのＨＢＶベクターを提供する。即ち、表面抗原ＯＲＦを含む２箇所の挿入部位を提供するだけでなく、挿入する遺伝子の最大の大きさの限界をそれぞれ０．７９ｋｂまたは１．７ｋｂであることを具体的に提供する。即ち、一般に異種遺伝子を挿入して用いることができる本格的な意味の組換遺伝子ベクターである。
【００４７】
本発明で提供するＨＢＶベクターを構築するために用いられたトランスフェクション技術は、文献とこの分野の専門家等が多く用いる実験材料と実験方法を利用した。
【００４８】
本発明で提供するＨＢＶベクターを作るために用いる接合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）技術と制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）技術は、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｎ．Ｙ．２００１）に記述されている方法を用いた。
【００４９】
本発明では次のような略語を用いた：ＤＲ１（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  １）、ＤＲ２（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ２）、ε（ｅｐｓｉｌｏｎ）、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｍ（ｍｏｌａｒ）、ｍＭ（ｍｉｌｌｏｍｏｌａｒ）、ｍｌ（ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ）、μｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ）、ｍｇ（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ）、Ｋ  ｂｐ（ｋｉｌｏ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）。
【００５０】
以下、本発明を実施例によりより詳しく説明する。
但し、次の実施例はただ本発明を例示するためのものだけであり、次の実施例が本発明を限定するものではない。
【００５１】
【実施例】
実施例１
野生型ＨＢＶ発現ベクター（Ｒ０１５；ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０）の製造
ＨＢＶ遺伝子治療ベクターを設計するためには、ＨＢＶの遺伝子複製に必須の塩基配列部位（シス−エレメント）の完全な解明が先行しなければならない。このような複製に必要な塩基配列部位を解明するため細胞にトランスフェクションしたとき、ＨＢＶ遺伝子複製能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）を有するベクターを製造した。即ち、野生型ＨＢＶを生成するＨＢＶプリゲノミックＲＮＡ発現ベクターを製造した。異種プロモーターによりＨＢＶプリゲノミック（ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡと同じ構造及び塩基配列のｍＲＮＡが転写されると、ＨＢＶのゲノム複製と同じ過程を介してウイルス粒子を作ることができるということは公知の事実である（Ｎａｓｓａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。よって、ＨＢＶを発現するプラスミドを製造するため優先的に考慮しなければならない事柄は、直ちに転写されるｍＲＮＡがＨＢＶプリゲノミックＲＮＡと同じように作ることである。以後、転写されたｍＲＮＡから複製に必要なウイルスのタンパク質が作られ、ウイルス遺伝子の複製及びウイルス粒子が生産される。
【００５２】
特に、エプシロン（ε）というキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）信号は、ウイルスの複製の第一段階でキャプシド化に必須の重要な因子である（Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。このエプシロン信号はプリゲノミックＲＮＡの５’−末端から約３０ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）離れている（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００５３】
本発明で用いた塩基配列番号は、Ｇａｌｉｂｅｒｔ等（Ｇａｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９７９）の方法に従いＨＢＶ  ａｙｗサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）の塩基配列を、ＨＢＶ内の制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ位置を１番にして３１８２番まで表記したものである。表示された塩基配列番号はＨＢＶのものであり、若し他のものの塩基配列番号を用いるときは別に示しておいた。プリゲノミックＲＮＡの５’位置末端部位は１８２０配列番号に示しており、転写開始位置を意味する。Ｒ０１５プラスミドの塩基配列は配列番号３に示されている。
【００５４】
１−１．Ｒ４０２プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／１６４）の製造
ＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶ  ａｙｗ  ｓｕｂｔｙｐｅの遺伝子を有するｐＳＶ２Ａ−Ｎｅｏ（ＨＢＶ）２プラスミドを利用した（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。先ず、ＨＢＶのプリゲノミックＲＮＡの５’−末端と３’−末端が同じ塩基配列及び構造（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有するので、線状（ｌｉｎｅａｒ）のプラスミド転写でこれを保つためプロモーターの下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にゲノム大きさより大きいゲノムを挿入した（Ｇａｎｅｍ，１９９６）。よって、ＣＭＶプロモーターから宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＩＩにより転写が発生するｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）のクローニングサイトにあるＥｃｏＲ  ＶとＸｂａ  Ｉの制限酵素認識部位の間に、ＨＢＶ全体遺伝子より１７２ヌクレオチドがさらに重なる長さのＨＢＶ  ａｙｗサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）遺伝子（Ｇａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）をＦｓｐ  ＩとＸｂａ  Ｉに切断して挿入した（図５ａ参照）。
【００５５】
これにより作られたＲ４０２プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／１６４）は、野生型ＨＢＶとは別に５’−末端からエプシロン信号が１６４ヌクレオチド離れているｍＲＮＡに転写される。これは野生型に比べエプシロンの位置が５’−末端から１３４ヌクレオチドさらに遠く離れているものである（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００５６】
このような結果は、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐの転写が始まる地点が挿入部位より上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置するためである。
【００５７】
１−２．野生型ＨＢＶプリゲノミックＲＮＡを発現するＲ０１５プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０）製造
野生型ＨＢＶプリゲノミックＲＮＡのような塩基配列及び構造を有するｍＲＮＡを転写するように作るため、実施例１−１で作ったプラスミドの５’−末端塩基を除去した。図５ａでのように、Ｒ４０２プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／１６４）をＳａｃ  ＩとＢｓｐＥ  Ｉに切断し、同じ制限酵素認識部位を両端に保有したＨＢＶ遺伝子切片をＰＣＲによって増幅した（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このとき、人為的な制限酵素認識部位を挿入し、Ｒ４０２プラスミドの転写開始部位にＨＢＶプリゲノミックＲＮＡ開始部位が正しく一致するようプライマー（ＨＢＶ１８２０）を製造した。用いたプライマー塩基配列は次の通りである。
【００５８】
0003621355.tif 000002
【００５９】
これらプライマーとＲ４０２プラスミドを鋳型にして作られたＰＣＲ産物を、再びＳａｃ  Ｉ（ｎｔ  ２８９４  ｏｆ  ｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ）とＢｓｐＥ  Ｉ（ｎｔ．２３３１）に切断してプラスミドＲ４０２に挿入した。
【００６０】
１−３．ヘルパープラスミドＲ０６３（ｐＣＭＶ−ＣＰＳ）プラスミドの製造
ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）のＥｃｏＲ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ認識部位にＲ０１５プラスミドを鋳型にして作ったＰＣＲ生成物（ｎｔ．１９０３−ｔｏ−２４５４）を挿入した。詳しく説明すれば、正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’位置末端部位にＥｃｏＲ  Ｉ認識部位を作り、逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’位置末端部位にＸｈｏ  Ｉ認識部位を作ったＰＣＲ生成物の０．５Ｋ  ｂｐのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ切片を、ｐｃＤＮＡ３プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ認識部位に挿入してＲ０６２プラスミドを作った。その次に、Ｒ０１５プラスミドのＢｓｐＥ  Ｉ（ｎｔ．２３３１）、Ａｐａ  Ｉの間の約２．６Ｋ  ｂｐの切片をＲ０６２プラスミドのＢｓｐＥ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ切片と置換してＲ０６３プラスミドを作った。Ｒ０６３プラスミドはコア、ポリメラーゼ、表面抗原を発現するヘルパープラスミドに用いられた。
【００６１】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴ−３’
（下線：ＥｃｏＲ  Ｉ部位）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ−３’
（下線：Ｘｈｏ  Ｉ部位）
【００６２】
実施例２
Ｒ０１５プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０）で転写されるプリゲノミックＲＮＡの複製能
２−１．肝癌細胞株の細胞増殖とトランスフェクション
肝癌細胞株のＨｕｈ７細胞を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）と、１０ｍｇ／ｍｌ  ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎを投入したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）培地に３日ごとに分株して細胞を育てた。トランスフェクションする一日前にＨｕｈ７細胞を７５％で６０ｍｍプレートに培養させて細胞を用意する。先ず、燐酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を２回洗浄し新しい培養液に取り替えた後、前記プラスミド１０μｇを０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２が含まれた２５０ｍｌの水に混合してから、同量の２Ｘ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液［２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ａｃｉｄ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．１）］に揺り動かしながら一滴ずつ滴下して混合物を作る。以後、この混合物を常温で３０分間反応させて白色の沈澱物が生じるようにした後、プレートに均等に散布する。トランスフェクション１６時間後新しい培養液［ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１０ｍｇ／ｍｌ  ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ］に取り替え、３日後ウイルスコア粒子を抽出した。
【００６３】
２−２．コア粒子からＨＢＶ  ＤＮＡ抽出及びサーザンブロットを介したＨＢＶｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＤＮＡの調査
トランスフェクション３日後、ＰＥＧ沈澱法で細胞内のコア粒子を抽出してＨＢＶのＤＮＡを用意した（Ｓｔａｐｒａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。詳しく説明すれば、先ず燐酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を２回洗浄し、細胞溶液緩衝溶液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８％  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０］で細胞をプレートから外す。残留するトランスフェクションしたプラスミドを除去するため、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２とＤｎａｓｅ  Ｉ（５０μｇ／ｍｌ）処理を３７℃  ３０分間行なった後、４Ｘ  ＰＮＥ［２６％  ＰＥＧ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭＥＤＴＡ］でコア粒子を沈澱させ、遠心分離を行なってコア粒子のみ分離した。得られたコア粒子タンパク質を分解するため、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で３７℃で２時間反応させた。以後、フェノールとクロロホルム（１：１）でタンパク質を除去しエタノールでコア粒子を沈澱させた後、ＴＥ「１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ」でＤＮＡを抽出した。
【００６４】
抽出したウイルスＤＮＡを１．２５％アガロースゲルを介して電気泳動し、文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）に記載のサーザンブロット方法で分析した。
【００６５】
実施例３
Ｒ０１５プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／３０）の欠損変異体の製造
一般的な遺伝子組換技術を利用して次のような欠損変異体を製造した。
３−１．Ｒ０６０（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１９１０−１９９２）プラスミドの製造
ＨＢＶ遺伝子（Ｇａｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９７９）のＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）のＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移した後、ＰＣＲでｎｔ．１９１０−１９９２を削除したＲ０５９プラスミド（ｐＢＳ＋Δ１９１０−１９９２）を製造した。Ｒ０５９プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をＲ０１５プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移してＲ０６０プラスミドを製造した。
【００６６】
３−２．Ｒ０４８（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１８８４−２４５９）プラスミドの製造
ＨＢＶ遺伝子（Ｇａｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９７９）のＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）の間の切片をｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移してＲ０４６プラスミドを作った後、１５１ｂｐのＸｂａ  Ｉ切片（１９９２−２１４３）を削除したＲ０４７プラスミドを製造した。Ｒ０４７プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をＲ０１５プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移してＲ０４８プラスミドを製造した。
【００６７】
３−３．Ｒ０５６（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２１４３−２４５９）プラスミドの製造
Ｒ０１５プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）のＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移してＲ０４９プラスミドを作った。Ｒ０４９プラスミドのＳｔｙ  Ｉ（ｎｔ．１８８４）−Ｓｔｙ  Ｉ（ｎｔ．２４５９）切片を逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’位置末端部位にＳｔｙ  Ｉ認識部位を作ったＰＣＲ生成物であるＳｔｙ  Ｉ（ｎｔ．１８８４）−Ｘｂａ  Ｉ（ｎｔ．２１４３）切片に置換させてＲ０５１プラスミドを製造した。Ｒ０５１プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をＲ０１５プラスミドのＳａｃ  Ｉ、ＥｃｏＲ
Ｉの位置に移してＲ０５６プラスミドを製造した。
【００６８】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣ−３’
（下線：Ｓａｃ  Ｉ部位）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴ−３’
（下線：Ｓｔｙ  Ｉ部位）
【００６９】
３−４．Ｒ０２１（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２４５９−２８１７）プラスミドの製造
Ｒ０１５プラスミドのＳａｃ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ（ｎｔ．１２９）の間の切片をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）のＳａｃ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉの位置に移してＲ４０７プラスミドを製造した。Ｒ４０７プラスミドのＳｔｙ  Ｉ（ｎｔ．２４５９）、ＢｓｔＥ  ＩＩ（ｎｔ．２８１７）の間を切断してクレノー切片で満たし（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、ライゲーションしてｎｔ．２４５９−２８１７を削除したＲ０１８プラスミドを製造した。Ｒ０１８プラスミドからＢｓｐＥ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの間の切片をＲ０１５のＢｓｐＥ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉの位置に移してＲ０２１プラスミドを製造した。
【００７０】
３−５．Ｒ０２２（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２６６２−３１８２／０）プラスミドの製造
Ｒ０１５プラスミドをＢｓｔＥ  ＩＩ（ｎｔ．２６６２）とＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）に切断してクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてｎｔ．２６６２−３１８２を削除したＲ０２２プラスミドを製造した。
【００７１】
３−６．Ｒ０４５（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２８３９−３１８２／０）プラスミドの製造
先ず、Ｒ０１５プラスミドをＢｓｔＥ  ＩＩ（ｎｔ．２８１７）とＳｐｈ  Ｉ（ｎｔ．１２３９）に切断した後、ｐＧＥＭ−４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に移してＲ７０１プラスミドを製造した。Ｒ７０１プラスミドのＢｇｌ  ＩＩ（ｎｔ．２８３９）とＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）切片を削除しクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてｎｔ．２８３９−３１８２を削除したＲ０４３プラスミドを製造してから、Ｒ０４３プラスミドをＢｓｔＸ  Ｉで切断した切片をＲ０１５プラスミドのＢｓｔＸ
Ｉ（ｎｔ．２８１７−６２０）の間の切片に置換してＲ０４５プラスミドを製造した。
【００７２】
３−７．Ｒ０４４（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ３０５２−３１８２／０）プラスミドの製造
Ｒ７０１プラスミドのＢｓｕ３６  Ｉ（ｎｔ．３０５２）とＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）の間の切片を消去しクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてｎｔ．３０５２−３１８２を削除したＲ０４２プラスミドを製造してから、Ｒ０４２プラスミドをＢｓｔＸ  Ｉで切断した切片をＲ０１５プラスミドのＢｓｔＸ  Ｉ（ｎｔ．２８１７−６２０）の間の切片に置換してＲ０４４プラスミドを製造した。
【００７３】
３−８．Ｒ０２３（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ３１８２／０−１２９）プラスミドの製造
Ｒ０１５プラスミドをＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）とＸｈｏ  Ｉ（ｎｔ．１２９）に切断しクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてｎｔ．３１８２／０−１２９を削除したＲ０２３プラスミドを製造した。
【００７４】
３−９．Ｒ０４０（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１２９−４９０）プラスミドの製造
Ｒ０１８プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）、Ｓｐｈ  Ｉ（ｎｔ．１２３９）の間の切片をｐＧＥＭ−４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）プラスミドに挿入してＲ０３７プラスミドを製造した。Ｒ０３７プラスミドをＸｈｏ  Ｉ（ｎｔ．１２９）、ＢａｍＨ  Ｉ（ｎｔ．４９０）に切断した後クレノー切片で満たし、ライゲーションしてｎｔ．１２９−４９０を削除したＲ０３８プラスミドを製造した。Ｒ０３８プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉの間の８７７ｂｐ大きさの切片を、Ｒ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉの位置に移してＲ０４０プラスミドを作った。
【００７５】
３−１０．Ｒ０４１（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ４９０−８２７）プラスミドの製造
Ｒ０３７プラスミドをＢａｍＨ  Ｉ（ｎｔ．４９０）とＡｃｃ  Ｉ（ｎｔ．８２７）に切断した後クレノー切片で満たし、ライゲーションしてｎｔ．４９０−８２７を削除したＲ０３９プラスミドを製造した。Ｒ０３９プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉの間の８９７ｂｐ大きさの切片を、Ｒ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉの位置に移してＲ０４１プラスミドを製造した。
【００７６】
３−１１．Ｒ０２５（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ８２７−１２３８）プラスミドの製造
Ｒ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）とＡｐａ  Ｉの間の切片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）に移してＲ０５０プラスミドを製造した。Ｒ０５０プラスミドのＡｃｃ  Ｉ（ｎｔ．８２７）とＳｐｈ  Ｉ（ｎｔ．１２３８）の間の切片を除去してＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライゲーションしてｎｔ．８２７−１２３８を削除したＲ００８プラスミドを製造した。Ｒ００８プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に移してＲ０２５プラスミドを製造した。
【００７７】
３−１２．Ｒ０２６（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１２３８−１３７４）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドをＳｐｈ  Ｉ（ｎｔ．１２３８）、Ｎｃｏ  Ｉ（ｎｔ．１３７４）に切断した後Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライゲーションしてｎｔ．１２３８−１３７４を削除したＲ００９プラスミドを製造した。次いで、Ｒ００９プラスミドのＥｃｏＲ  ＩとＡｐａ  Ｉの間の１８６６ｂｐ大きさの切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に置換してＲ０２６プラスミドを製造した。
【００７８】
３−１３．Ｒ０２７（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１３７４−１４１９）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドをＮｃｏ  Ｉ（ｎｔ．１３７４）、Ａａｔ  ＩＩ（ｎｔ．１４１９）に切断した後Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライゲーションしてｎｔ．１３７４−１４１９を削除したＲ０１２プラスミドを製造した。次いで、Ｒ０１２プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）、Ａｐａ  Ｉの間の１９５７ｂｐ大きさの切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に移してＲ０２７プラスミドを製造した。
【００７９】
３−１４．Ｒ０２８（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１４１９−１８０４）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドをＡａｔ  ＩＩ（ｎｔ．１４１９）、Ｆｓｐ  Ｉ（ｎｔ．１８０４）に切断した後Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ライゲーションしてｎｔ．１４１９−１８０４を削除したＲ０１３プラスミドを作った。Ｒ０１３プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）、Ａｐａ  Ｉの間の１６１７ｂｐ大きさの切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に移してＲ０２８プラスミドを製造した。
【００８０】
３−１５．Ｒ０５３（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１４１９−１８０４）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドのＡａｔ  ＩＩ（ｎｔ．１４１９）とＡｐａ  Ｉの間の切片を、正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’位置末端部位にＡａｔ  ＩＩ認識部位を製造したＰＣＲ生成物であるＡａｔ  ＩＩ（ｎｔ．１５９２）−Ａｐａ  Ｉ切片に置換してＲ０５２プラスミドを製造した。次いで、Ｒ０５２プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの間の切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に移してＲ０５３プラスミドを製造した。
【００８１】
３−１６．Ｒ０３５（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１６０７−１８０４）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドをＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）−Ｂｓａ  Ｉ（ｎｔ．１６０７）の間のブラント（ｂｌｕｎｔ）切片を製造した後、Ｒ０１５プラスミドをＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）−Ｆｓｐ  Ｉ（ｎｔ．１８０４）の間の切片と置換してＲ０３５プラスミドを製造した。
【００８２】
３−１７．Ｒ０２９（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１８０４−１８８４）プラスミドの製造
Ｒ０５０プラスミドのＦｓｐ  Ｉ（ｎｔ．１８０４）−Ｓｔｙ  Ｉ（ｎｔ．１８８４）の間の切片を消去しクレノー切片で満たした後、ライゲーションしてｎｔ．１８０４−１８８４を削除したＲ０１０プラスミドを製造した。次いで、Ｒ０１０プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）、Ａｐａ  Ｉの間の１９２２ｂｐ大きさの切片をＲ０１５プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉの位置に移してＲ０２９プラスミドを製造した。
【００８３】
実施例４
ＨＢＶゲノム複製に必須のシス−エレメントの分析
４−１．コア粒子からＨＢＶ  ＤＮＡ抽出及びサーザンブロット
トランスフェクション、ＤＮＡ抽出とサーザンブロットを実施例２−２と同じように行なった。ＨＢＶ遺伝子複製に必要なウイルスのタンパク質を提供するため、コアタンパク質とポリメラーゼを提供することができるヘルパープラスミド（Ｒ０６３、ｐＣＭＶ−ＣＰＳ）を同時にトランスフェクションした。図７で１７種の欠損変異体等のサーザンブロットの結果を示している。ＨＢＶ遺伝子ゲノム複製で説明したように、コア粒子に存在するＨＢＶ遺伝子複製の中間体はＳＳ（一本鎖ＤＮＡ）、ＤＬ（二本鎖ＤＮＡ）、ＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ、リラックスド環形）の形で存在する。この中でＲＣ（リラックスド環形）形のＤＮＡがウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）に存在するＨＢＶゲノム複製の最終産物であるため、ＲＣ形ＤＮＡの存在有無で各欠損変異体に欠けた塩基配列が複製に必要なシス−エレメントであるか否かを判断することができる。
【００８４】
４−２．シス−エレメント分析
ＨＢＶ複製に必要なシス−エレメントを解明するため制限酵素の位置を利用して幾つかの欠損変異体を製造した。これら欠損変異体はそれぞれ約０．１−０．４Ｋ  ｂｐの切片を欠いており、全部合わせるとＨＢＶ全体ゲノムを含む。
【００８５】
表１はＢ形肝炎ウイルスの遺伝子中シス−エレメントを解明するため製作した、欠損変異体の欠損位置に伴う複製可否を要約した表である。
【表１】
0003621355.tif 000003
【００８６】
サーザンブロットの結果を分析してみると、Ｒ０２２プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２６６２−３１８２／０）をトランスフェクションした場合、ＲＣ  ＤＮＡは検出されずＳＳ  ＤＮＡのみ検出された（図７、表１）。この部位をさらに詳しく解明するためＲ０２２プラスミドをＲ０４５プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２８３９−３１８２／０）と、Ｒ０４４プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ３０５２−３１８２／０）に区分した後サーザンブロットを行なった。その結果、Ｒ０４４プラスミドはＳＳ  ＤＮＡ、ＤＬ  ＤＮＡだけでなくＲＣ  ＤＮＡが検出されたため、Ｒ０４４の欠損部位は複製に不要であることが分かった（図７、表１）。その反面、Ｒ０４５プラスミドは少量のＳＳ  ＤＮＡのみ検出されたため、Ｒ０４５プラスミドの欠損部位（ｎｔ．２８３９−３１８２／０）が複製に必要な部位を含んでいることが分かった（図７、表１）。
【００８７】
一方、Ｒ０２１プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２４５９−２８１７）はＳＳ  ＤＮＡ、ＤＬ  ＤＮＡだけでなくＲＣ  ＤＮＡが検出されたため、Ｒ０２１の欠損部位は複製に不要である（図７、表１）。前記四種類の欠損変異体の結果から（ｎｔ．２８１８−３０５２）が新しいシス−エレメントであることが分かった。本発明でこの部位をアルファ−エレメント（α）と名付けた。
【００８８】
Ｒ０２８プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１４１９−１８０４）はＤＲ２（ｎｔ．１５９２−１６０２）が欠けている変異体である。Ｒ０２８プラスミドのサーザンブロットの結果をみれば、ＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡが現われず、一本鎖ＤＮＡのみ感知された（図７、表１）。この結果でＤＨＢＶでマイナス−鎖ＤＮＡ合成にＤＲ２が重要な役割を果たすとの報告と一致する（Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｏｎｄｒｅａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。これを確認するためＤＲ２部分前までのみ削除したＲ０５３プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１４１９−１５９２）を製造してサーザンブロットを行なった結果、ＲＣ  ＤＮＡを確認した（図７、表１）。よって、Ｒ０２８プラスミドは新しいシス−エレメントを含むものではなく、ＤＲ２エレメント（ｎｔ．１５９２−１６０２）が欠けているためＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡが現れないことが分かった。
【００８９】
一方、Ｒ０３５プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１６０７−１８０４）はＤＲ１とＤＲ２の間が欠けた変異体であり、ＤＮＡ合成が全く生じなかった（図７、表１）。マイナス−鎖ＤＮＡ合成の開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ位置）であるＤＲ１が存在するが、複製が生じないためＤＲ１とＤＲ２の間の塩基配列は複製に必要であることが分かった。即ち、この部分はマイナス−鎖ＤＮＡ合成に必要である。この部分は新しいシス−エレメントであるため、ベータ−エレメント（β）と名付けた。
【００９０】
Ｒ０２９プラスミド（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１８０４−１８８４）はＤＲ１（ｎｔ．１８２６−１８３６）が欠けた変異体であり、マイナス−鎖ＤＮＡ合成が全く感知されなかった（図７、表１）。これは文献の報告と一致した結果を見せている（Ｃｏｎｄｒｅａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００９１】
結論的に、本発明ではＨＢＶ遺伝子複製に必要な二つの新しいシス−エレメント等を解明した。このようなサーザンブロットの結果により、ＨＢＶゲノム複製で重要なシス−エレメントに対する総合的な理解でプロトタイプのＨＢＶベクターを設計することができた。
【００９２】
一方、ＨＢＶ遺伝子の一部はＨＢＶ遺伝子複製に不要な欠損可能部位（ｄｅｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）であることが明らかになった。欠損してもＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡを形成することができるものに現われた欠損変異体らはＲ０６０（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１９１０−１９９２）、Ｒ０４８（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１９９２−２１４３）、Ｒ０５６（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２１４３−２４５９）、Ｒ０２１（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ２４５９−２８１７）、Ｒ０４４（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ３０５２−３１８２／０）、Ｒ０２３（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ３１８２／０−１２９）、Ｒ０４０（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１２９−４９０）、Ｒ０４１（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ４９０−８２７）、Ｒ０２５（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ８２７−１２３８）、Ｒ０２６（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１２３８−１３７４）、Ｒ０２７（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１３７４−１４１９）、Ｒ０５３（ｐＣＭＶ−ａｙｗ  Δ１４１９−１５９２）を含む。
【００９３】
実施例５
プロトタイプＨＢＶ遺伝子治療ベクター設計
本発明ではＨＢＶ遺伝子複製に必要な新しいシス−エレメント等を全て解明した。文献上ではＨＢＶゲノム複製段階に重要なエレメントが幾種類既に明らかになっている。このエレメント等はキャプシド化の信号に用いられる５’位置のエプシロン（Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＤＲ１とＤＲ２エレメント（Ｃｏｎｄｒｅａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｓｅｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、円形化（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に作用するｒ（ｒｅｐｅａｔ）エレメント（Ｌｏｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇに必要なＰＲＥ  エレメント（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）等がある。この他に、本発明では全体ＨＢＶゲノムのマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）を介して二種類の新しいシス−エレメントを解明した。
【００９４】
ＨＢＶ遺伝子複製に必須のシス−エレメント等を解明することにより、プロトタイプのＨＢＶ遺伝子治療ベクターを設計することができる礎石を設けた（図８参考）。ＨＢＶ遺伝子治療ベクター開発において最も考慮すべき点は異種遺伝子の挿入位置と異種遺伝子の大きさである。本発明ではプロトタイプのＨＢＶ遺伝子治療ベクターを開発するため、二つの異種遺伝子の挿入可能部位を選定した。先ず、５’位置エプシロン（ε）とアルファ（α）−エレメント（ｎｔ．１９０９−２８１７）の間にＨＢＶ遺伝子を異種遺伝子の置換が可能である。この挿入部位に少なくとも０．９Ｋ  ｂｐ大きさの異種遺伝子ＤＮＡ切片の挿入が可能である。さらに、この挿入部位の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置し、コアプロモーター（ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を挿入された異種遺伝子発現に活用することになる。第二に、アルファ（α）−エレメントとＤＲ２エレメントの間を異種遺伝子に置換することができる。ここでは、１．７Ｋ  ｂｐ大きさのＤＮＡ切片を異種遺伝子に置換することができる。最初の挿入部位と類似するよう、第二の挿入部位の上流にプリ（ｐｒｅ）−Ｓ２／Ｓプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が位置している。よって、この部位に挿入した異種遺伝子はプリ（ｐｒｅ）−Ｓ２／Ｓプロモーターを利用して発現することができる。
【００９５】
実施例６
異種遺伝子が挿入されたＨＢＶ  ｖｅｃｔｏｒの製造
実施例５で設計されたＨＢＶベクターの欠損可能部位に外部遺伝子を挿入してその複製を調査するため、異種遺伝子の緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）遺伝子を挿入させたＲ７１１プラスミドを（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ）製造した（図９参考）。
【００９６】
６−１．挿入部位とプロモーター
次のような事柄を考慮し挿入部位を決定した。第一、ＨＢＶゲノム複製に必須の全てのシス−エレメントは存在しなければならない。第二、最大のパッケージングされ得る大きさ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｌｉｍｉｔ）を超過しない範囲で発現能力を有する内在ウイルスプロモーターが必要である。
【００９７】
６−２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のＨＢＶベクターへの挿入
外部遺伝子が挿入された組換ＨＢＶベクターを製造するため、約０．７Ｋ  ｂｐの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をＨＢＶベクターに挿入した。先に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をＰＣＲ生成物に作った後、このときＧＦＰ  ＰＣＲ産物の両端にはプライマーを介して作られた制限酵素認識部位が生成されるように製作した。先ず、Ｒ７０９プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ΔＰＳ２ＧＦＰ）は、Ｒ０１５プラスミドのＢｓｕ３６  Ｉ（ｎｔ．３０５２）−ＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）の間の切片を、両端にＢｓｕ３６  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位を有する０．７Ｋ  ｂｐ大きさのＧＦＰ遺伝子を発現するＰＣＲ生成物に置換して作った。具体的に、プライマーＧＦＰ  ＢｓｕＦ  ＩＩの５’末端からクローニングのためのＢｓｕ３６  Ｉの制限酵素認識部位を、そして、プライマーＧＦＰ  ＥｃｏＲ  ＩＩの５’末端にＥｃｏＲ  Ｉの制限酵素認識部位を挿入してＰＣＲに利用した。
【００９８】
具体的な塩基配列は次の通りである。
0003621355.tif 000004
【００９９】
一連のクローニング過程の中でプリ（ｐｒｅ）−Ｓ２／Ｓプロモーターの一部が欠ける。欠けたｐｒｅ−Ｓ２／Ｓプロモーター部位を復旧させるため、Ｂｓｕ３６  Ｉ（ｎｔ．３０５２）−Ｂｓｕ３６  Ｉ（ｎｔ．３１６６）の間の切片をＲ７０９プラスミドに挿入し、Ｒ７１０プラスミド（ｐＣＭＶ−ｐｒｅＨＢＶ／ＧＦＰ）を製造した。ついで、Ｒ７１１プラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ）（配列番号４）を製造するため、Ｒ７１０プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）−Ｓｐｈ  Ｉ（ｎｔ．１２３８）の間の切片を削除した。結局、１．３Ｋ  ｂｐ大きさのＨＢＶ遺伝子の一部が０．７Ｋ  ｂｐのＧＦＰ遺伝子に置換される。よって、ベクターは全体ゲノム大きさが１．３Ｋ  ｂｐ程度が削除され、ＧＦＰ遺伝子の０．７Ｋ  ｂｐが添加されてＨＢＶゲノム大きさより０．６Ｋ  ｂｐが小さくなるよう製造した。
【０１００】
実施例７
組換ＨＢＶ遺伝子ベクターの複製確認
組換ＨＢＶベクターの複製能力を確認することにより、遺伝子治療ベクターとしての有用性を確認した。Ｒ７１１プラスミドとｐＣＭＶ−ＣＰＳ（ヘルパー）をＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。実施例２−２のようにコアＤＮＡを抽出し、ＨＢＶプローブ（ｐｒｏｂｅ）を利用したサーザンブロットを行なった（図１１ａ）。対照群でＨＢＶを生産する肝癌細胞株のＨｅｐＧ２．２．１５細胞へのコア粒子から抽出したＤＮＡを比較分析した（Ｓｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。図１１ａに示されるように、陽性対照群のＨｅｐＧ２．２．１５細胞とＲ０１５プラスミドがトランスフェクションされた細胞でＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡ、ＤＬ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｌｉｎｅａｒ）ＤＮＡ、ＳＳ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＤＮＡ等が検出された。その上に、Ｒ７１１プラスミドをトランスフェクションさせたときの場合にも、ＲＣ  ＤＮＡが検出されることを確認することができた。さらに、ＲＣ  ＤＮＡの量が野生型ＨＢＶクローンのＲ０１５プラスミドをトランスフェクションした場合と類似するとのことも確認することができた。
【０１０１】
さらに、図１１ｂでＧＦＰプローブを利用したサーザンブロットの結果からＲ７１１プラスミドベクターの複製能力を再確認することができた。結論的に、本発明が提供するプロトタイプのＨＢＶベクターは異種遺伝子を挿入しても複製能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）に損傷がないため、有用な遺伝子治療ベクターとしての可能性が立証された。
【０１０２】
プラスミドＲ７１１（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ）は、ＨＢＶゲノムの大きさが野生型に比べ０．６Ｋ  ｂｐ小さい。ＨＢＶゲノムの大きさがマイナス−鎖の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に影響を及ぼす可能性があるため（ＨＯ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、これを補うため野生型のゲノム大きさと同じＲ７１２（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ３．２）プラスミド（配列番号５）を製造した。Ｒ７１２プラスミドはＲ７１０プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．３１８２）−Ａｐａ  Ｉ切片を削除し、ＰＣＲを利用して正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’位置末端部位にＥｃｏＲ  Ｉ認識部位を作ったＰＣＲ生成物のＥｃｏＲ  Ｉ（ｎｔ．７３２）−Ａｐａ  Ｉ切片に置換してＲ７１２プラスミドを製造した。プライマーの具体的な塩基配列は次の通りである。
【０１０３】
0003621355.tif 000005
【０１０４】
Ｒ７１２プラスミドは、削除されたＨＢＶサイズ程度の異種遺伝子が入っているため全体のサイズが野生型と同じである。Ｒ７１２プラスミドをトランスフェクションさせたときの場合、Ｒ７１１と同様にサーザンブロットの結果からＲＣ  ＤＮＡを確認することができた。
【０１０５】
【発明の効果】
前記の構成の本発明によれば、本発明で提供する組換ウイルスは肝細胞にのみ選択的に感染し、治療用遺伝子を伝達する特性があるためｉｎ  ｖｉｖｏ治療とｅｘ  ｖｉｖｏ治療が可能な利点があり、このような新しい遺伝子治療用組換Ｂ型肝炎ウイルスベクターは肝組織にＤＮＡを直接挿入、循環等の方法で注入（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）させると、肝に異種遺伝子を伝達して発現させるのに直接利用が可能である。
【０１０６】
他の引用文献
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Ｇａｎｅｍ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｅ．  Ｖａｒｍｕｓ．    Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５６：６５１−５９３（１９８７）．
Ｇａｎｅｍ，  Ｄ．，  ”Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ．  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９６．
Ｈａｖｅｒｔ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌ．  Ｌｏｅｂ．    ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｏｎｏｒ  ａｎｄ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｔｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｄｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：  ５３３６−５３４４（１９９７）．
Ｈｉｒｓｃｈ，  Ｒ．  Ｃ．，  Ｄ．  Ｄ．  Ｌｏｅｂ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｐｏｌｌａｃｋ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇａｎｅｍ．  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  ３３０９−３３１６（１９９１）．
Ｈｏ，  Ｔ．−Ｃ．，  Ｋ．−Ｓ．  Ｊｅｎｇ，  Ｃ．−Ｐ．  Ｈｕ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃｈａｎｇ．    Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ．    Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．  ７４：  ９０１０−９０１８（２０００）．
Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｓ．  Ｂ．  Ｙｅｎ．    Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．    Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：  ３８６４−３８６９（１９９５）．
Ｊｅｏｎｇ，  Ｊ．−Ｋ．  ，  Ｇ．−Ｓ．  Ｙｏｏｎ，  ａｎｄ  Ｗ．−Ｓ．  Ｒｙｕ．    Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ５’−ｅｎｄ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：５５０２−５５０８（２０００）
Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｒ．  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈａｌｌｅｒ．  Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ＲＮＡ．    ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：３３８９−３３９６（１９９０）．
Ｌｏｅｂ，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｒ．  Ｃ．  Ｈｉｒｓｈ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇａｎｅｍ．    Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌｕｓ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．    ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３５３３−３５４０（１９９１）．
Ｌｏｅｂ，  Ｄ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｔｉａｎ．    Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｕｓ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｔ  ｉｎｖａｒｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｐｒｅｆｅｒｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：  ６８６−６８９１（１９９５）．
Ｌｏｅｂ．，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｒ．  Ｔｉａｎ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｇｕｌｙａ．    Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ＤＲ２  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｍｉｎｕｓ−  ａｎｄ  ｐｌｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：  ８６８４−８６９０（１９９６）．
Ｌｏｅｂ．，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｋ．  Ｇｕｌｙａ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｔｉａｎ．    Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｎｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ  ｐｌｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．      Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：  １５２−１６０（１９９７）．
Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｒ．  Ｃ．，    Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：  ９２６−９３２（１９９３）．
Ｎａｓｓａｌ，  Ｍ．，  Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈａｌｌｅｒ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＨＢＶ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．    Ｃｅｌｌ  ６３：  １３５７−１３６３（１９９０）．
Ｎａｓｓａｌ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｒｉｅｇｅｒ．    Ａ  ｂｕｌｇｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：２７６４−２７７３（１９９６）．
Ｎａｓｓａｌ，  Ｍ．，  Ｈ．  Ｓｃｈａｌｌｅｒ．  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ３：  ２１７−２２６（１９９６）．
Ｐｏｌｌａｃｋ，  Ｊ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇａｎｅｍ．    Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｔｏｗ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：  ＲＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：５５７９−５５８７（１９９４）．
Ｐｒｏｔｚｅｒ，  Ｕ．，  Ｍ．  Ｎａｓｓａｌ．，  Ｐ．−Ｗ．  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｍ．  Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈａｌｌｅｒ．    Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１０８１８−１０８２３（１９９９）
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （２００１）．
Ｓｅｌｌｓ，  Ｍ．  Ａ．，  Ａ．  Ｚ．  Ｚｅｌｅｎｔ，  Ｍ．  Ｓｈｖａｒｔｓｍａｎ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ａｃｓ．    Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｉｏｎｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：  ２８３６−２８４４（１９８８）．
Ｓｅｅｇｅｒ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍａｒａｇｏｓ．    Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：５１９０−５１９５（１９９１）．
Ｓｈｉｈ，  Ｃ．  Ｌ．，  Ｓ．  Ｌｉ，  Ｓ．  Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈ．  Ｈｏ．    Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６３２３−６３２７（１９８９）
Ｓｔａｐｒａｎｓ，  Ｓ．，  Ｄ．  Ｄ．  Ｌｏｅｂ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇａｎｅｍ．    Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ  ｐｌｕｓ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  １２５５−１２６２（１９９１）．
Ｗａｎｇ，  Ｇ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓｅｅｇｅｒ．    Ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．    Ｃｅｌｌ  ７１：６６３−６７０（１９９２）．
Ｗａｎｇ，  Ｇ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓｅｅｇｅｒ．    Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６５０７−６５１２（１９９３）．
Ｙａｎｇ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍ．  Ｗｉｌｓｏｎ．    Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＤ４＋  ＣＴＬｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．    Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：２５６４−２５７０（１９９５）．
Ｙｅｎ．，  Ｔ．  Ｓ．  Ｂ．    Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ．    Ｓｅｍｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８：３１９−３２８（１９９８）．
【０１０７】
0003621355.tif 000006
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0003621355.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１：Ｂ型肝炎ウイルスのプリゲノミックＲＮＡを図式化した図であり、次のｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔが示されている：ＤＲ１（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  １）、ＤＲ２（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ２）、ｅｐｓｉｌｏｎ（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）、ｒ（ｒｅｐｅａｔ）ｅｌｅｍｅｎｔ、ＰＲＥ（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）。さらに、四つのＯＲＦを矢印状ボックス図で示している：Ｃ（ｃｏｒｅ）ＯＲＦ、Ｐ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＯＲＦ、Ｓ（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ａｎｄ  Ｘ  ＯＲＦ。
【図２】図２：Ｂ型肝炎ウイルスの肝炎周期を示す。
【図３】図３：ウイルスのポリメラーゼがプリゲノミックＲＮＡを鋳型にし、逆転写過程を介してＢ型肝炎ウイルスの遺伝子複製過程が図式化されている。
【図４】図４：異種遺伝子（ＧＦＰ）が挿入されたＨＢＶ組換ベクターの細胞内での作用を要約した図で、ＨＢＶ組換ウイルスの複製に必要なウイルスタンパク質が提供されるｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅにトランスフェクションさせ、細胞内核でＣＣＣ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）形態のＤＮＡに復旧され、野生形と同じく異種遺伝子を有するＨＢＶ組換ベクターでの異種遺伝子発現過程を図式化した図である。ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅはヘルパープラスミドに代置することができる。
【図５】図５ａ：Ｒ０１５プラスミド（Ｂ型肝炎ウイルスのプリゲノミックＲＮＡを発現するプラスミド）を製造するための図式である。
【図６】図５ｂ：Ｒ０１５プラスミド（Ｂ型肝炎ウイルスのプリゲノミックＲＮＡを発現するプラスミド）を表す。
【図７】図６：Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子中シス−エレメントを解明するため製作した欠損変異体の欠損位置を要約した図であり、欠損部位を太い線で表示。左下の挿入された図はＤＲ２、ＤＲ１部位の拡大図である。
【図８】図７：Ｂ型肝炎ウイルス欠損変異体の複製の可否をＨＢＶプローブ（ｐｒｏｂｅ）にサーザンブロットした結果であり、ここでＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ）、ＤＬ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ）、ＳＳ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）は、それぞれＨＢＶ遺伝子複製の中間体。
【図９】図８：プロトタイプのＨＢＶ組換ベクターの地図で、Ｂ型肝炎ウイルスの複製に必要な新しいシス−エレメント（アルファとベータ）と、異種遺伝子の挿入可能部位と挿入可能遺伝子の大きさを図式化したものである。
【図１０】図９：異種遺伝子（ＧＦＰ；ｇｒｅｅｎ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挿入されたＨＢＶ組換ベクター（Ｒ７１１プラスミド）を製造するための過程を示す図式図である。
【図１１】図１０：シス−エレメントを含む異種遺伝子で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ｇｒｅｅｎ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挿入されたＨＢＶ組換ベクター（Ｒ７１１プラスミドとＲ７１２プラスミド）の図式図。Ｒ７１１プラスミドは、野生型より約０．６Ｋ  ｂｐ小さい遺伝子を有する組換ＨＢＶを生産することになり、Ｒ７１２プラスミドは、野生型と同じ大きさの遺伝子を有する組換ＨＢＶを生産することになる。
【図１２】図１１ａ：異種遺伝子に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挿入されたＨＢＶ組換ベクターＲ７１１（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ）の複製の可否をＨＢＶプローブで確認したサーザンブロットの結果であり、ここでＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ）、ＤＬ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ）、ＳＳ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ
ＤＮＡ）は、それぞれＨＢＶ遺伝子複製の中間体である。
【図１３】図１１ｂ：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挿入されたＨＢＶ組換ベクターＲ７１１（ｐＣＭＶ−ＨＢＶ／ＧＦＰ）の複製の可否をＧＦＰプローブで確認したサーザンブロットの結果であり、ここでＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ）、ＤＬ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ）、ＳＳ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）は、それぞれＨＢＶ遺伝子複製の中間体である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003621355.tif 000033
【図８】
0003621355.tif 000034
【図９】
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【図１０】
0003621355.tif 000036
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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