(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の悪性Ｂ細胞と、抗原提示細胞上の表面抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞とを融合することにより製造しうる雑種細胞。
【請求項２】
前記悪性Ｂ細胞が、Ｂ細胞白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞またはプラズマ細胞腫細胞である、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項３】
前記ハイブリドーマ細胞が、抗原提示細胞上の表面抗原に対する抗体を産生するリンパ球を骨髄腫細胞と融合することにより得られる、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項４】
前記悪性Ｂ細胞が、前記抗体産生ハイブリドーマ細胞の免疫グロブリンと会合して二重特異性抗体を形成する免疫グロブリンを産生する、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項５】
前記二重特異性抗体が、周囲の培地中に分泌される、請求項４に記載の雑種細胞。
【請求項６】
前記二重特異性抗体がＦｃ受容体に結合する、請求項４または５に記載の雑種細胞。
【請求項７】
前記二重特異性抗体がマンノース−５受容体に結合する、請求項４または５に記載の雑種細胞。
【請求項８】
前記二重特異性抗体がＭＨＣクラスII抗原に結合する、請求項４または５に記載の雑種細胞。
【請求項９】
前記雑種細胞が、前記患者への注射前に複製不能にされていない、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項１０】
前記雑種細胞が、前記患者への注射前に照射により複製不能にされている、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞上の表面抗原が、Ｆｃ受容体、マンノース−５受容体またはＭＨＣクラスII抗原である、請求項１に記載の雑種細胞。
【請求項１２】
治療的有効量の請求項１に記載の雑種細胞と１以上の医薬上許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者由来の悪性Ｂ細胞を、抗原提示細胞上の表面抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞に、本来公知の方法により融合することを特徴とする請求項１に記載の雑種細胞の製造方法。
【請求項１４】
悪性Ｂ細胞が由来するＢ細胞新形成の患者に請求項１に記載の雑種細胞を注射することにより腫瘍免疫を誘導するための医薬の製造における、請求項１に記載の雑種細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、雑種細胞、およびＢ細胞新形成の患者に注射することにより腫瘍免疫を誘導するためのその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学療法および放射線治療が進歩したにもかかわらず、Ｂ細胞リンパ腫などのヒトにおけるＢ細胞の悪性疾患（Ｂ細胞新形成）は、依然として非常に望ましくない予後を有する。これらの疾患を治癒することは不可能である。したがって、新規治療方法を開発することが必要である。この点で、患者の免疫系による腫瘍拒絶を誘導する免疫療法的アプローチに大きな期待が寄せられている。
【０００３】
腫瘍関連抗原が腫瘍細胞上に存在し、原則として免疫系がこれらの抗原を認識し悪性細胞を攻撃する能力を有することが知られている。しかしながら、腫瘍は、免疫反応から逃れるためのある種の仕組を発達させている。例えば、これは、腫瘍関連抗原の不十分な提示および／または一般的に存在する腫瘍特異的Ｔ細胞の不十分な活性化により可能である。
【０００４】
Ｂ細胞リンパ腫などの悪性Ｂ細胞は独特である。なぜなら、該悪性Ｂ細胞は、絶対的な腫瘍特異的抗原、すなわちそれが発現する免疫グロブリンのイディオタイプを担持するからである。しかしながら、これが提示する免疫原は、非常に弱い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトにおけるＢ細胞の悪性疾患の新規治療剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項１でより詳細に特徴づけられる本発明の雑種細胞により達成された。すなわち、本発明は、患者由来の悪性Ｂ細胞と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞とを融合することにより製造しうる雑種細胞を提供するものである。本発明の好ましい実施態様は、従属項により明らかとなる。
また本発明は、治療的有効量の前記雑種細胞と１以上の医薬上許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、患者由来の悪性Ｂ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞に、本来公知の方法により融合することを特徴とする前記雑種細胞の製造方法を提供する。
本発明により提供される雑種細胞系は、該悪性Ｂ細胞が由来するＢ細胞新形成の患者に該雑種細胞を注射することにより腫瘍免疫を誘導するのに使用される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明でこの目的を達成するための目標となるのは、プロフェッショナル（professional）抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるイディオタイプの提示を強化して効率的にＴ細胞を活性化することにより、イディオタイプに対する効率的なＴ細胞反応を誘導することである。
【０００８】
本発明は、プロフェッショナルＡＰＣに対する腫瘍イディオタイプの特異的再指向化（redirection）に基づく。これを達成するために、患者からのリンパ腫細胞などの悪性Ｂ細胞を、ＡＰＣ表面上のタンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマと融合する。該雑種腫瘍細胞をその患者に再注入する。このようにして、以下のことが達成されうる。
【０００９】
該雑種腫瘍細胞は二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を分泌する。この二重特異性抗体は、一方では腫瘍特異的免疫グロブリン（１Ｈ鎖および１Ｌ鎖）を含有し、他方ではＡＰＣ上の表面抗原を認識する抗体半分子（１Ｈ鎖および１Ｌ鎖）を含有する。ＡＰＣに対する結合により、腫瘍イディオタイプは内部移行し、プロセシングされ、腫瘍特異的ペプチドとして免疫系に提示される。腫瘍細胞上の不完全提示とは対照的に、ＡＰＣ上の腫瘍抗原の「プロフェッショナル」提示により腫瘍特異的Ｔ細胞が産生されうる。悪性Ｂ細胞の融合相手（マウスまたはラットハイブリードーマ）に由来する雑種細胞の異種部分のために、それは比較的短時間のうちに免疫系により非自己として認識され破壊される。
【００１０】
これは、２つの利点を有する。すなわち、患者内でこれらの人工的細胞は自己破壊を起こすこと、そして第２に、溶解細胞の食作用による腫瘍免疫のさらなる強化およびそれに続くさらなる腫瘍抗原の提示が達成されることである。これは、該雑種細胞を注射することにより、ex vivoで産生され精製されたｂｓＡｂを注射する場合と比べて、抗腫瘍効力の有意な改善につながる。
【００１１】
２つの抗体産生細胞を融合した後で、一般には、異なるＨ／Ｌ鎖対形成を示す二価抗体の混合集団が得られる。腫瘍担持宿主へｂｓＡｂ産生細胞を注射するための重要な前提条件は、同じ特異性の鎖の間で見いだされる優先的Ｈ／Ｌ対形成である。これは、異種起源細胞が互いに融合した場合に観察される（異種二重特異性抗体の製造法、DE-A-44 19 399、１９９５年３月９日）。該宿主に再注入された雑種腫瘍細胞は、所望の二重特異性構築物を高収率で発現する。
【００１２】
しかしながら、欠陥ＡＰＣ結合アームを有するｂｓＡｂを分泌する雑種細胞は完全な腫瘍防御を誘導する能力を有さないため、該雑種細胞の異種性だけが、得られる抗腫瘍効果の媒介に寄与するのではない。それにもかかわらず、特異的イディオタイプ再指向化とのその相乗作用により、該異種部分は重要と考えられる。該雑種細胞の異種性のため、注射前に照射を行うことはもはや必要でない。これは、細胞ワクチン接種の従来法に対する１つの利点である。
【００１３】
注射前に、ｂｓＡｂの発現を妨害することなく照射して、該雑種細胞を複製不能にすることも可能である。該ｂｓＡｂ産生雑種細胞を患者に注射することのさらなる利点は、臨床に適した量のｂｓＡｂを調製するための複雑な製造工程および精製工程が不要となることである。悪性Ｂ細胞を細胞培養中の成長に適合させることがヒト腫瘍の場合には一般に問題となるが、そのような適合化がもはや不要であることが結局は重要である。該細胞を該ハイブリドーマと融合するのに、細胞分裂は必要ない。
【００１４】
該ハイブリドーマ細胞と融合する悪性Ｂ細胞は、例えば、Ｂ細胞白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞またはプラズマ細胞腫細胞であってもよい。
【００１５】
該ハイブリドーマ細胞は、ＡＰＣ上の表面抗原に対する抗体を産生するリンパ球と骨髄腫細胞との融合体に由来する。該表面抗原は、例えば、Ｆｃ受容体、マンノース−５受容体、またはＭＨＣクラスII抗原であってもよい。該ハイブリドーマ細胞は、本来公知の方法により製造する。例えば、まずKohlerおよびMilsteinの刊行物（Nature, 256巻, 495-497 (1975)）、およびRompp Lexikon Biotechnologie, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, 1992, 379頁を挙げる。特に、必要な特徴を示す現存し商業的に入手可能なハイブリドーマ細胞を用いてもよい。これに関しては、例えば、American Type Culture Collection（ATCC HB-197）で入手可能な抗Ｆｃ受容体ハイブリドーマ細胞系２.４Ｇ２が挙げられる。
【００１６】
本発明により提供される雑種細胞は、その治療的有効量を、好ましくは許容される担体および／または賦形剤と共に、必要に応じて精製後に患者に投与する。本発明の雑種細胞の治療的有効量を含有する、本発明により提供される医薬組成物は、Ｂ細胞新形成の患者に、例えば注射により投与する。Ｂ細胞新形成としては、例えば、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、プラズマ細胞腫などが挙げられる。
【００１７】
悪性Ｂ細胞により産生される免疫グロブリンは、抗体産生ハイブリドーマ細胞の免疫グロブリンと会合して、二重特異性抗体を形成する。これらの二重特異性抗体は、好ましくは、周囲の培地中に分泌される。この二重特異性抗体は、抗原提示細胞上の表面抗原、特にＦｃ受容体、マンノース−５受容体およびＭＨＣクラスII抗原に対する結合能を有する。
【００１８】
以下の参照文献は、従来技術として引用するが、これらは本発明を何ら開示も示唆もするものではない。
【００１９】
Sniderら, J. Exp. Med. 1957-1963 (1990) には、抗原（この場合は、雌鶏の卵白からのリゾチーム）は、抗原提示細胞に対してであれば、低用量であっても強力な免疫原性活性を有することが記載されている。前記刊行物では、これは、二重特異性抗体［該抗原に結合しそれらの他の結合アームによりＡＰＣ上の表面分子を認識する（Ｆｃ受容体またはＭＨＣII）もの］により達成されている。
【００２０】
Guoら（Science 518-520, 263巻, 1994）は、ラットの肝細胞癌モデルを記載している。該動物に雑種腫瘍細胞を投与することにより、野生型腫瘍に対してワクチン接種するが、一定分子を有する特異的腫瘍抗原に対する免疫化は不可能である。該雑種細胞は、該腫瘍抗原をプロフェッショナルＡＰＣに指向させる二重特異性免疫グロブリンを産生しないが、その代わりに、該雑種腫瘍細胞自体がＡＰＣになるのである。これは、該腫瘍細胞を活性化Ｂ細胞に融合することにより達成される。
【００２１】
以下、実施例および２つの図面により本発明をさらに詳しく説明する。
【００２２】
【実施例】
１）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ATCC TIB-208）由来のＢ細胞リンパ腫Ａ２０を、抗Ｆｃ受容体ハイブリドーマ２.４Ｇ２（ATCC HB-197）と融合する。両細胞系は、American Type Culture Collectionから上記の番号にて商業的に入手可能である。融合のために、該ハイブリドーマを、８−アザグアニンの存在下での培養中にＨＡＴ感作する。該融合相手の５×１０6個の細胞を、ヨードアセトアミド中で３０分間インキュベーションし、洗浄し、１.５×１０7個のＨＡＴ感作細胞と混合する。ポリエチレングリコール１５００と共に２分間インキュベーションすることにより、該融合を行う。該細胞をマイクロタイタープレートに接種し、２〜３日後、ＨＡＴ培地に導入して選択する。
【００２３】
２）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、各注射当たり１０5個の雑種細胞（ＢｉＶ細胞）を３週間間隔で２回、腹腔内（i.p.）注射する。７日後、１０5個の野生型腫瘍細胞（Ａ２０）を腹腔内接種する。該前免疫化により、長期間持続する腫瘍防御を得ることができる（図１参照）。１００日以降においてもさらに接種物は拒絶される。１０3個の雑種細胞を用いる免疫化は、それほど成功しない。ＡＰＣに対する結合能を有さない抗体を分泌する雑種細胞は、抗腫瘍効力を示さない（BiVneg）。
【００２４】
３）ＢｉＶ細胞により分泌される二重特異性抗体を、プロテイン−Ａ−セファロースカラムでのクロマトグラフィーにより精製する。該カラムから、０.１M クエン酸緩衝液（pＨ５.８）でｂｓＡｂを溶出し、ＰＢＳに対して透析する。Ａ２０腫瘍の精製単特異性免疫グロブリンの精製ｂｓＡｂ（ＢｉＶタンパク質）５０μg、またはこの免疫グロブリンと抗Ｆｃ受容体抗体（それぞれ２５μg）との混合物を、それぞれ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射する。２１日後にさらに免疫化した後、１０5個の野生型腫瘍細胞を７日間隔で注射する（図２）。
【００２５】
本発明は、動物モデルを用いて行う具体例について説明してきたが、長年の経験から示されるとおり、このようにして得られた結果はヒトにも適用できる。本発明は、特定の実施例により説明してきたが、本発明はこれらの特定の実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で種々改変できると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】腫瘍細胞を投与した後の生存率を示すグラフ。
【図２】腫瘍細胞を投与した後の生存率を示すグラフ。
【図１】
0003676915.tif 000002
【図２】
0003676915.tif 000003