(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーを用いる生体試料中のカテコールアミンの分析方法において、
第一の移動相中に混在する該生体試料を、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成されたカチオン交換カラムに導入して粗カテコールアミンを溶出し、次いで該粗カテコールアミンを、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填したホウ酸カラムに導入し、含有するカテコールアミンを吸着させて精製する精製工程と、
該精製されたカテコールアミンを酸性の第二の移動相により溶出して分離カラムに導入し、該カテコールアミン中の成分を展開して検出する工程とからなることを特徴とするカテコールアミンの分析方法。
【請求項２】
前記ホウ酸カラムの充填剤はＳｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、
該ホウ酸カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする請求項１に記載のカテコールアミンの分析方法。
【請求項３】
前記カチオン交換カラムの充填剤の内容量は、２．０ミリリットル未満であることを特徴とする請求項１又は２に記載のカテコールアミンの分析方法。
【請求項４】
前記第一の移動相は中性であり、
前記第二の移動相は酸性であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項にカテコールアミンの分析方法。
【請求項５】
前記精製工程での前記の生体試料又は粗カテコールアミンのホウ酸カラムへの導入は該ホウ酸カラムの排出側から行われ、
精製されたカテコールアミンの溶出は排出側とは逆の導入側からの第二の移動相の送液により行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のカテコールアミンの分析方法。
【請求項６】
生体試料中のカテコールアミンの分析装置において、
表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填してカテコールアミンを吸着可能な構成とされた濃縮カラムと、
第一の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第一の供給手段と、
該濃縮カラムと該第一の供給手段の間に配設されて該生体試料を該濃縮カラムに供給する試料導入管と、
第二の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第二の供給手段と、
分離カラムと、
該分離カラムの排出側に接続された電気化学検出器と、
Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成される、前記濃縮カラムと前記試料導入管との間に配設されたカチオン交換カラムとを具備し、
該試料導入管からの該生体試料を該第一の溶媒と共に該カチオン交換カラムを通した後に該濃縮カラムに導入し、次いで該濃縮カラムに該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入して分離し、電気化学検出器でカテコールアミンを検出する構成とされたことを特徴とする分析装置。
【請求項７】
前記濃縮カラムに充填される充填剤は、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、
該濃縮カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする請求項６に記載の分析装置。
【請求項８】
前記カチオン交換カラムの充填剤の内容量は、２．０ミリリットル未満であることを特徴とする請求項６又は７に記載の分析装置。
【請求項９】
前記濃縮カラムと前記カチオン交換カラムとの間に配設されて、該濃縮カラムの排出側とカチオン交換カラムの接続、ないし該濃縮カラムの排出側と前記分離カラムとの接続及び第二の供給手段と該濃縮カラムの導入側との接続を行う構成とされた接続制御手段を具備し、
前記の該試料導入管からの生体試料を該濃縮カラムに排出側から導入し、次いで該接続制御手段を制御して該濃縮カラムに該導入側から該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入する構成とされたことを特徴とする請求項６乃至８のいずれか一項に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明は生体試料中のカテコールアミンの分析方法及び分析装置に関し、特に生体試料中の夾雑物を除いて実質的にカテコールアミンのみを分離・分析することの可能なカテコールアミンの分析方法及び分析装置に関する。
【従来の技術】
【０００３】
カテコールアミンは、ベンゼン骨格中の隣接する二つの炭素原子にそれぞれ水酸基が導入されてなるカテコール骨格を持つ生体アミンの３種、すなわちエピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミンの総称である。これらは腎髄質ホルモン（エピネフリン、ノルエピネフリン）であり、また交感神経伝達物質であり、細胞間情報物質として高等動物で殊に重要な生理作用を発現する。
【０００４】
かかるカテコールアミンをヒト尿等生体試料中で正確に定量する等、その分析を可能とすることは臨床医学的にも重要な意味を持つ。しかし、生体試料中のカテコールアミンの濃度は低く、また生体試料中にはカテコールアミン以外にもたんぱく質等の巨大分子をはじめ類似の構造や化学的性質を持つ多様な夾雑物が含まれており、分析手段は高い感度と選択性が要求される。
【０００５】
このような要求に答えうる分析方法、分析装置として現在高速液体クロマトグラフィー技術が広く用いられている。通常の高速液体クロマトグラフィー技術を用いたカテコールアミンの分析においては、固定相側に分離カラムとして逆相カラムを用い、移動相側にはリン酸緩衝液にイオンペア剤やアセトニトリルやメタノール等を試料に合わせて種々の割合で混合して調製した溶媒を用いる。
【０００６】
そして、最近は主に除たんぱく質処理を目的とした巨大分子除去用のプレカラムと専用の溶媒供給手段を設け、生体試料中のカテコールアミンの分析を行うことが多くなっている。図６は、カテコールアミンの分析用に構成された従来の高速液体クロマトグラフィー装置の要部構成を示す図である。
【０００７】
液体クロマトグラフィー装置１００は第一の溶媒の満たされた第一の容器１０１と、第二の溶媒の満たされた第二の容器１０２と、第一のポンプ１０３と、第二のポンプ１０４と、試料導入管１０５と、通常の巨大分子除去用のプレカラム１０６と、接続切り換え装置１０７と、通常の逆相カラム１０８と、第一の廃液槽１０９と、第二の廃液槽１１０と、検出器１１１とレコーダー１１２と各装置をそれぞれつなぐ送液管１１３とから構成される。
【０００８】
第一のポンプ１０３は、第一の容器１０１と送液管１１３で繋がれ、第一の容器１０１より第一の溶媒を汲み上げ、その先に設けられた装置各部に第一の溶媒を正確な流速で送る。そして、試料導入管１０５によってカテコールアミンを含有する生体試料が溶液状態でプレカラム１０６に導入され、カテコールアミン等の所望の低分子量成分がプレカラム１０６に保持され、その移動速度は溶媒の流速に比べ著しく低速となる。
【０００９】
一方、生体試料中のたんぱく質など不要な巨大分子はプレカラム１０６に保持されず、第一の溶媒の流れに沿って素早くプレカラム１０６を通り過ぎ、接続切り換え装置１０７を通って第一の廃液槽１０９に廃棄される。たんぱく質除去後、適当な時点を見計らって接続切り換え装置１０７が制御され、プレカラム１０６と逆相カラム１０８の接続を行う。そうして、プレカラム１０６から溶出したカテコールアミン等の所望の低分子量成分は第一のポンプ１０３に圧送されて逆相カラム１０８に導入される。
【００１０】
導入後、適当な時点を見計らって接続切り換え装置１０７が再び制御され、第二のポンプ１０４と逆相カラム１０８が接続切り換え装置１０７を介して接続される。そして、第二のポンプ１０４により第二の容器１０２から汲み上げられて圧送される第二の溶媒と逆相カラム１０８中の充填剤の作用により、カテコールアミン等の所望の低分子量成分は逆相カラム１０８内で展開され、分離される。
【００１１】
その分離されたカテコールアミン等の各成分は検出器１１１で検出され、その後第二の廃液槽１１０に廃棄される。検出結果はレコーダー１１２で生体試料のクロマトグラムとして記録される。このクロマトグラムを解析して、生体試料中のカテコールアミン分析を行う。かかる高速液体クロマトグラフィー装置を用いて実際にヒト尿中のカテコールアミンの分析を行った際の分析結果を次に示す。
【００１２】
尚、分析条件は以下に示すとおりとする。
【００１３】
試料注入量：１０マイクロリットル
検出器：電気化学検出器
第一の溶媒：５ｍＭのイオンペア剤を含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）
第二の溶媒：５ｍＭのイオンペア剤を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液／アセトニトリル混合液（混合比は９４／６）（ｐＨ２．３）
流速：１００マイクロリットル／分
図７には、従来高速液体クロマトグラフィー装置により得られた生体試料のクロマトグラムを示す。
【００１４】
図７に示すクロマトグラムは、生体試料中のカテコールアミンが従来高速液体クロマトグラフィー装置により検出されたことを示す。すなわち、エピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、ドーパミン（ＤＡ）の存在がクロマトグラム中に確認できる。
【００１５】
しかし、図６の従来高速液体クロマトグラフィー装置により得られた生体試料のクロマトグラムでは、分析対象であるカテコールアミン３種の他に多様な夾雑物のピークもまた存在する。このように目的とする物質のピークの他に多数の夾雑物由来のピークが存在するとともに、その夾雑物由来のピークが目的物質のピークに重なるようなクロマトグラムからは、カテコールアミン３種の存在は何とか認識できるものの、定量等の詳細な分析は到底不可能となる。
【００１６】
すなわち、従来の高速液体クロマトグラフィー装置を用いた生体試料中の分析方法では、カテコールアミン以外の夾雑物がクロマトグラム上に不要なピークとして現れ、カテコールアミンの分析精度を低下させるという問題を有していた。また、多量の夾雑物の存在は、検出器、特に電気化学検出器に大量の物質の検出を行わせることにもなり、敏感な電気化学検出器の寿命を不必要に短くすることにもなっている。
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以上より、本発明の課題は、上記の問題を解決した新規なカテコールアミンの分析方法及び分析装置を提供することである。即ち、高速液体クロマトグラフィー装置を用いた生体試料中のカテコールアミンの分析方法において、カテコールアミン以外の生体試料中の夾雑物を分離カラム導入前に除去して検出器で検出される物質の量を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
請求項１に記載の発明は、液体クロマトグラフィーを用いる生体試料中のカテコールアミンの分析方法において、第一の移動相中に混在する該生体試料を、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成されたカチオン交換カラムに導入して粗カテコールアミンを溶出し、次いで該粗カテコールアミンを、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填したホウ酸カラムに導入し、含有するカテコールアミンを吸着させて精製する精製工程と、該精製されたカテコールアミンを酸性の第二の移動相により溶出して分離カラムに導入し、該カテコールアミン中の成分を展開して検出する工程とからなることを特徴とする。
【００１９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のカテコールアミンの分析方法において、前記ホウ酸カラムの充填剤はＳｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、該ホウ酸カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００２０】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載のカテコールアミンの分析方法において、前記カチオン交換カラムの充填剤の内容量は、２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００２１】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項にカテコールアミンの分析方法において、前記第一の移動相は中性であり、前記第二の移動相は酸性であることことを特徴とする。
【００２２】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のカテコールアミンの分析方法において、前記精製工程での前記の生体試料又は粗カテコールアミンのホウ酸カラムへの導入は該ホウ酸カラムの排出側から行われ、精製されたカテコールアミンの溶出は排出側とは逆の導入側からの第二の移動相の送液により行うことを特徴とする。
【００２３】
請求項６に記載の発明は、生体試料中のカテコールアミンの分析装置において、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填してカテコールアミンを吸着可能な構成とされた濃縮カラムと、第一の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第一の供給手段と、該濃縮カラムと該第一の供給手段の間に配設されて該生体試料を該濃縮カラムに供給する試料導入管と、第二の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第二の供給手段と、分離カラムと、該分離カラムの排出側に接続された電気化学検出器と、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成される、前記濃縮カラムと前記試料導入管との間に配設されたカチオン交換カラムとを具備し、該試料導入管からの該生体試料を該第一の溶媒と共に該カチオン交換カラムを通した後に該濃縮カラムに導入し、次いで該濃縮カラムに該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入して分離し、電気化学検出器でカテコールアミンを検出する構成とされたことを特徴とする。
【００２４】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の分析装置において、前記濃縮カラムに充填される充填剤は、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、該濃縮カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００２５】
請求項８に記載の発明は、請求項６又は７に記載の分析装置において、前記カチオン交換カラムの充填剤の内容量は、２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００２６】
請求項９に記載の発明は、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の分析装置において、前記濃縮カラムと前記カチオン交換カラムとの間に配設されて、該濃縮カラムの排出側とカチオン交換カラムの接続、ないし該濃縮カラムの排出側と前記分離カラムとの接続及び第二の供給手段と該濃縮カラムの導入側との接続を行う構成とされた接続制御手段を具備し、前記の該試料導入管からの生体試料を該濃縮カラムに排出側から導入し、次いで該接続制御手段を制御して該濃縮カラムに該導入側から該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入する構成とされたことを特徴とする。
【発明の実施の形態】
【００２７】
本発明の第１の実施形態は、液体クロマトグラフィーを用いる生体試料中のカテコールアミンの分析方法において、第一の移動相中に混在する該生体試料を、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填したホウ酸カラムに導入し、含有するカテコールアミンを吸着させて精製する精製工程と、該精製されたカテコールアミンを酸性の第二の移動相により溶出して分離カラムに導入し、該カテコールアミン中の成分を展開して検出する工程とからなることを特徴とする。
【００２８】
本発明の第２の実施形態は、本発明の第１の実施形態のカテコールアミンの分析方法において、前記ホウ酸カラムの充填剤はＳｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、該ホウ酸カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００２９】
本発明の第３の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態のカテコールアミンの分析方法において、前記の精製工程は、前記第一の移動相中に混在する前記生体試料をカチオン交換カラムに導入して粗カテコールアミンを溶出し、次いで該粗カテコールアミンを前記ホウ酸カラムに導入して前記の精製をするものであることを特徴とする。
【００３０】
本発明の第４の実施形態は、本発明の第３の実施形態のカテコールアミンの分析方法において、前記カチオン交換カラムは、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成されるものであり、その内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００３１】
本発明の第５の実施形態は、本発明の第１乃至第４の実施形態の何れか一項記載のカテコールアミンの分析方法において、前記第一の移動相は実質的に中性であり、前記第二の移動相は酸性であることを特徴とする。
【００３２】
本発明の第６の実施形態は、本発明の第１乃至第５の実施形態の何れか一項記載のカテコールアミンの分析方法において、前記精製工程での前記の生体試料又は粗カテコールアミンのホウ酸カラムへの導入は該ホウ酸カラムの排出側から行われ、精製されたカテコールアミンの溶出は排出側とは逆の導入側からの第二の移動相の送液により行うことを特徴とする。
【００３３】
本発明の第７の実施形態は、生体試料中のカテコールアミンの分析装置において、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填してカテコールアミンを吸着可能な構成とされた濃縮カラムと、第一の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第一の供給手段と、該濃縮カラムと該第一の供給手段の間に配設されて該生体試料を該濃縮カラムに供給する試料導入管と、第二の溶媒を該濃縮カラムに供給可能な構成とされた第二の供給手段と、分離カラムと、該分離カラムの排出側に接続された電気化学検出器とを具備し、該試料導入管からの該生体試料を該第一の溶媒と共に該濃縮カラムに導入し、次いで該濃縮カラムに該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入して分離し、電気化学検出器でカテコールアミンを検出する構成とされたことを特徴とする。
【００３４】
本発明の第８の実施形態は、本発明の第７の実施形態の分析装置において、前記濃縮カラムに充填される充填剤は、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなり、該濃縮カラムの内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００３５】
本発明の第９の実施形態は、本発明の第７又は第８の実施形態の分析装置において、カチオン交換カラムを前記濃縮カラムと前記試料導入管との間に配設し、該試料導入管からの前記生体試料を該第一の溶媒と共に該カチオン交換カラムを通した後に前記濃縮カラムに導入する構成とされたことを特徴とする。
【００３６】
本発明の第１０の実施形態は、本発明の第９の実施形態の分析装置において、前記カチオン交換カラムは、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなる充填剤を充填して構成されるものであり、その内容量は２．０ミリリットル未満であることを特徴とする。
【００３７】
本発明の第１１の実施形態は、本発明の第７又は第８の実施形態の分析装置において、前記濃縮カラムと前記試料導入管との間に配設されて、該濃縮カラムの排出側と該試料導入管の接続、ないし該濃縮カラムの排出側と前記分離カラムとの接続及び前記第二の供給手段と該濃縮カラムの導入側との接続を行う構成とされた接続制御手段を具備し、前記の試料導入管からの生体試料を該濃縮カラムに排出側から導入し、次いで該接続制御手段を制御して該濃縮カラムに該導入側から該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入する構成とされたことを特徴とする。
【００３８】
本発明の第１２の実施形態は、本発明の第９又は第１０の実施形態の分析装置において、前記濃縮カラムと前記カチオン交換カラムとの間に配設されて、該濃縮カラムの排出側とカチオン交換カラムの接続、ないし該濃縮カラムの排出側と前記分離カラムとの接続及び第二の供給手段と該濃縮カラムの導入側との接続を行う構成とされた接続制御手段を具備し、前記の該試料導入管からの生体試料を該濃縮カラムに排出側から導入し、次いで該接続制御手段を制御して該濃縮カラムに該導入側から該第二の溶媒を供給し、得られた溶出液を該分離カラムに導入する構成とされたことを特徴とする。
【００３９】
本発明の第１の実施形態によれば、分析対象であるカテコールアミンはカテコール骨格を分子内に有しており、そのカテコール骨格が特異的に配位するホウ酸基を表面に具備するカラム充填剤を用いることにより、ホウ酸カラムにおいて生体試料から選択的にカテコールアミンを取り分けることが可能となる。その結果、後の分離カラムでのカテコールアミンの分離を夾雑物に妨害されることなく高精度に行うことが可能となる。すなわち、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４０】
本発明の第２の実施形態によれば、多孔性担体の持つ極性基（例えば、多孔性担体がシリカゲルである場合はシラノール基）の影響を受けること無く、表面のホウ酸基が持つカテコール骨格との相互作用特性を発揮することができ、効率よく生体試料中のカテコールアミンを配位させることが可能となる。よって、多孔性担体に溶剤等による膨潤などの欠点の無い高信頼のシルカゲル担体を使用することも可能となり、カラムに用いる充填剤の高性能化が可能となる。また、カラムの内容量を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用の影響が少なくなり、後の分析作業を行いやすくなると共に、早い速度でカテコールアミンを分析することが可能となる。従って、カテコールアミンの吸着と脱着を高い性能で素早く行い、そして、高信頼性も併せ持つホウ酸カラムを使用することにより、カテコールアミンの分析方法をより精度が高くより高効率のものとすることが可能となる。
【００４１】
本発明の第３の実施形態によれば、カチオン交換カラムの使用により、カテコールアミン等のカチオン性物質のみをカラム内に残留させて、生体試料中の不要なたんぱく質等の巨大分子やアニオン性物質を除去することが可能となり、従来必要とされた除たんぱく等のための生体試料の前処理がカテコールアミンの分析において不要となる。よって、分析のための作業・方法をより簡便なものとすることが可能となり、また、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４２】
本発明の第４の実施形態によれば、充填剤は親水性基（Ｒ’）を持つことよりその一部が親水性となり、生体試料中のたんぱく質の吸着を抑える。そしてスペーサー部分（Ｒ）の先端にスルホン基を有することによりカチオン交換機能を発揮して、アニオン性物質を排除し、生体試料中からカテコールアミン等カチオン性物質のみを選択的に濃縮することが可能となる。また、カラムの内容量を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用の影響がなくなり、後の分離作業を行いやすくなると共に、早い速度でカテコールアミンの濃縮をすることが可能となる。よって、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から効率良く低減して、検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４３】
本発明の第５の実施形態によれば、第一の移動相を中性とすることにより、ホウ酸カラムへのカテコールアミンの配位が可能となり、不要な生体試料中の成分との分離を可能とする。またカチオン交換カラムを使用する場合は、生体試料中のカテコールアミンの充填剤での保持が適度に調整され、たんぱく質等の不要な成分との分離を可能とする。そして、第二の移動相を酸性とすることにより、ホウ酸カラム内に吸着されたカテコールアミンは配位状態から開放されて容易に溶出することが可能となり、更にカテコールアミンを構成する成分間の分離を分離カラムで精度良く行うことが可能となる。従って、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減することが容易に行えて、検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４４】
本発明の第６の実施形態によれば、生体試料等をホウ酸カラムの排出側から導入することにより、ホウ酸カラムの排出側末端にカテコールアミンは濃縮されて吸着されることになる。この状態で該排出側とは逆側であるホウ酸カラムの通常の導入側から第二の移動相を送液すれば、ホウ酸カラムから分離カラムへの導入前に第二の移動相中に高濃度に濃縮されたカテコールアミンを含む溶出液を得ることができる。よって、分離カラムでの高精度の成分分離が可能となる。従って、カテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４５】
本発明の第７の実施形態によれば、分析対象であるカテコールアミンはカテコール骨格を分子内に有しており、そのカテコール骨格が特異的に配位するホウ酸基を表面に具備するカラム充填剤を充填して用いることにより、ホウ酸カラムにおいて生体試料から選択的にカテコールアミンを取り分けることが可能となる。その結果、後の分離カラムでのカテコールアミンの分離を夾雑物に妨害されることなく高精度に行うことが可能となる。すなわち、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４６】
本発明の第８の実施形態によれば、多孔性担体の持つ極性基（例えば、多孔性担体がシリカゲルである場合はシラノール基）の影響を受けること無く、表面のホウ酸基が持つカテコール骨格との相互作用特性を発揮することができ、効率よく生体試料中のカテコールアミンを配位させて吸着させることが可能となる。よって、多孔性担体には溶剤等による膨潤などの欠点の無い高信頼のシルカゲル担体を使用することも可能となり、カラムに用いる充填剤の高性能化が可能となる。また、カラムの内容量を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用の影響が少なくなり、後の分析作業を容易にすると共に、早い速度でカテコールアミンを分析することが可能となる。従って、カテコールアミンの吸着と脱着を高い性能で素早く行い、そして、高信頼性も併せ持つホウ酸カラムを使用することができ、カテコールアミンの分析精度がより高く、より高効率の分析装置の提供が可能となる。
【００４７】
本発明の第９の実施形態によれば、使用方法が容易で他の装置と共に装置内に組み込んだ形での使用の可能なカチオン交換カラムの使用により、カテコールアミン等のカチオン性物質のみをカラム内に残留させて、生体試料中の不要なたんぱく質等の巨大分子やアニオン性物質を除去することが可能となる。よって、従来必要とされた除たんぱく等のための生体試料の前処理工程や専用の複雑で大がかりな装置を不要とできる。従って、単純な装置を用いることにより分析のための作業をより簡便にすると共に、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から確実に低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４８】
本発明の第１０の実施形態によれば、充填剤は親水性基（Ｒ’）を持つことよりその一部が親水性となり、生体試料中のたんぱく質の吸着を抑える。そしてスペーサー部分（Ｒ）の先端にスルホン基を有することによりカチオン交換機能を発揮して、アニオン性物質を排除し、生体試料中からカテコールアミン等カチオン性物質のみを選択的に濃縮することが可能となる。また、カラムの内容量を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用の影響がなくなり、後の分離カラムでの分離を容易にすると共に、早い速度でカテコールアミンの濃縮をすることが可能となる。よって、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から効率良く低減して、検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００４９】
本発明の第１１及び第１２の実施形態によれば、単純で操作の容易な手段により生体試料等をホウ酸カラムの排出側から導入することができ、ホウ酸カラムの排出側末端にカテコールアミンは濃縮されて吸着されることになる。そして、この状態のまま、再び単純で容易な操作で該排出側とは逆側であるホウ酸カラムの通常の導入側から第二の移動相を送液することができ、ホウ酸カラムから分離カラムへの導入前に第二の移動相中に高濃度に濃縮されたカテコールアミンを含む溶出液を得ることができる。よって、単純な構成でありながら、分離カラムでの高精度の成分分離が可能となる。従って、容易にカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００５０】
本発明は、高速液体クロマトグラフィー技術を用いた生体試料中の分析方法において、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して、クロマトグラム上のピークを低減することによりカテコールアミンの分析精度を向上する。
【００５１】
生体試料中から目的とするカテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に低減する方法については、特に、カテコールアミン特有の分子構造由来の性質を利用する。本発明において、カテコールアミン特有の分子構造とはアミン構造とカテコール骨格を意味する。
【００５２】
まず、アミン構造の利用について説明する。カテコールアミンのアミン構造部分は水中等でアンモニウムイオンとなり、カチオン性を示すことが可能である。よって、備えられるカチオン性を利用して他の成分との分離を行う。具体的には、カチオン交換体を充填剤とするカチオン交換カラムにカテコールアミンを含む生体試料を導入すれば、カラム内でカチオン交換反応が起こり、カテコールアミンを含むカチオン性の化合物のみがカラムに強く保持される。一方、その他のアニオン性の化合物やたんぱく質などの巨大物質は強カチオン充填剤との間に大きな相互作用は無く、カチオン交換カラムをカテコールアミン等に比べて著しく高速度で通りすぎてしまう。
【００５３】
従って、アニオン性の化合物やたんぱく質などの巨大物質が除去された後、カテコールアミン等のみを溶出して集めることにより、生体試料中からカテコールアミン等、即ち粗カテコールアミンのみを分け取ることが可能となる。尚、上記目的のカチオン交換カラムにおいて、その容量を小さくし、内径を１〜２ｍｍとして内容量を２．０ミリリットル未満とすることが望ましい。
【００５４】
つまり、内容積を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用の影響が少なくなり、後の分析作業を行いやすくすることができるからである。また、カチオン交換体には、シリカ系保持体にイオン交換基を結合したものや、ジビニルベンゼンで架橋結合したポリスチレン骨格を有する樹脂を基材とし、末端のベンゼン環にイオン交換基を結合させたのも使用可能である。このときイオン交換基としては、−ＳＯ３Ｎａ基，−ＳＯ３Ｈ基，−ＣＯＯＨ基が使用可能である。
【００５５】
そして、カチオン交換体には、Ｓｉ−Ｒ−Ｘ（Ｒはスペーサー部分、Ｘはスルホン基）結合、及びＳｉ−Ｒ’（Ｒ’は親水性基）結合を有するシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体も使用可能である。この時、親水性基Ｒ’は水酸基を有する親水性基であることが望ましい。またスペーサー部分Ｒは炭素数１〜４０の炭化水素残基又は該炭化水素残基の構成炭素原子の一部を酸素原子若しくは窒素原子で置換した置換基とすることが望ましい。
【００５６】
このような多孔性担体は、その表面の一部が親水性であるために、生体試料に対して用いられた場合、生体試料の含有するタンパク質等が吸着されることはなく、また安定でしかも分離能に優れているため、たんぱく質等の巨大分子除去を確実に行うことができ、しかも安定した処理を実現できる。次に、カテコール骨格の利用について説明する。
【００５７】
カテコールは、中性環境下では、具備する二つの水酸基を用いて例えばホウ酸に配位して強く相互作用することが知られている。そして、この配位状態は酸性環境下では容易に解消されるという特質も併せ持つ。よってこの二つの水酸基の具備する特異的な性質、即ち特定の化合物と特異的に相互作用する性質を利用する。
【００５８】
具体的には、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤を充填したカラムに上記の粗カテコールを導入すれば、含有するカテコールのみが該充填剤に吸着し、他のカチオン性の成分などは該充填剤との間に大きな相互作用は無く、該カラムをカテコールアミン等に比べ著しく高速度で通りすぎてしまう。従って、ホウ酸基と相互作用しないカチオン性物質等が除去された後、カテコールアミンのみを酸性条件下で溶出して集めることにより、生体試料中からカテコールアミンを分け取ることが可能となる。
【００５９】
なお、表面にホウ酸基を有するカラム充填剤については、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤が使用可能である。そして、この時多孔性担体にはシリカゲルが使用可能である。尚、上記目的のカラム充填剤を充填したカラムにおいて、その容量を小さくし、内径を１〜２ｍｍとして内容量を２．０ミリリットル未満とすることが望ましい。
【００６０】
つまり、内容積を小さくすることにより、注入される生体試料の量が少なくてもカラム内部で試料が希釈されてしまう希釈作用は発生せず、確実にカラム内にカテコールアミン等が濃縮されて、後の分離カラムでの分離を行いやすくするからである。こうして得られたカテコールアミンは夾雑物が非常に少なく、通常の逆相カラム等を利用して定法に従い分離すれば、得られるクロマトグラムに夾雑物に由来するピークは少なく、含有する３成分の分離状況は格段に向上し、その分析精度は非常に高いものとなる。
【００６１】
また、分離される物質が少ないことから検出器に電気化学検出器を使用しても、不要な物質の検出による不必要な負担をかけることがなく、電気化学検出器の長寿命化を可能とする。以上の知見をもとに構成された高速液体クロマトグラフィー技術を用いるカテコールアミンの分析方法を以下に示す。
【００６２】
（１）第一工程：第一の移動相たる溶媒中にカテコールアミンを含有する生体試料を混在させ、該溶媒と共にカチオン交換カラムに導入してたんぱく質等の巨大分子の除去処理を行い、粗カテコールアミンを得る。
【００６３】
（２）第二工程：得られた粗カテコールアミンを、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を充填したホウ酸カラムに第一の移動相たる溶媒と共に導入して、含有するカテコールアミンを吸着させて濃縮し、精製する。
【００６４】
（３）第三工程：第二の移動相たる溶媒をカテコールアミンの吸着したホウ酸カラムに導入して、精製されたカテコールアミンを該溶媒により溶出し、そのまま分離カラムに導入する。そして、該カテコールアミン中の成分を展開して検出手段により検出して対応するクロマトグラムを取得する。尚、第二工程での粗カテコールアミンのホウ酸カラムへの導入は該ホウ酸カラムの排出側から行うことが得られるカテコールアミンの濃縮効果を高めるうえで望ましい。その場合、ホウ酸カラムからの精製カテコールアミンの溶出は該排出側とは逆の通常の導入側から第二の移動相たる溶媒が導入されて行われる。
【００６５】
また、第一の移動相たる溶媒は実質的に中性であり、第二の移動相たる溶媒は酸性であることが望ましい。上記方法においては、対応する各充填剤のカテコールアミンの保持が適度に調整され、不要な成分との分離及び、カテコールアミンを構成する成分間の分離を精度良く行うためである。また、分離カラムには通常の逆相カラムが使用可能である。即ち、充填されて使用される充填剤には、シリカゲル等の適当な多孔性担体表面にオクタデシル基（−Ｃ１８Ｈ３７）、オクチル基（−Ｃ８Ｈ１７）、フェニル基（−Ｃ６Ｈ５）を修飾基として持つものが使用可能である。
【００６６】
また、検出器には通常の光学的検出器等が使用可能であるが、より精度の高い電気化学検出器を用いることが望ましい。以上の方法により得られたクロマトグラムには、夾雑物に由来するピークは少なく、カテコールアミンの含有する３成分の分離状況は格段に向上しており、その分析精度は非常に高い。
【００６７】
また、予め除たんぱく処理された生体試料を分析する場合等、たんぱく質等の巨大分子の除去のための処理が試料の分析において不要な場合がある。その場合は、上記第一工程を省略し、該処理後の生体試料を用いて上記第二工程から分析を始めることも可能である。その場合も、上記と同様に得られるクロマトグラムには、夾雑物に由来するピークは少なく、カテコールアミンの含有する３成分の分離状況は格段に向上しており、その分析精度は非常に高いものとなる。
【実施例】
【００６８】
以下、図面を用いて、本発明の実施例について説明する。
【００６９】
（実施例１）
図１は本発明にかかる第一実施例であるカテコールアミンの分析装置の要部構成を説明する図である。そして、図２は第一実施例であるカテコールアミンの分析装置を使用してカテコールアミンの分析を行う方法を説明する図である。
【００７０】
分析装置１は、生体試料中のカテコールアミンを分析する装置であり、カテコールアミンを吸着可能な濃縮カラム２と、第一の溶媒を第一の容器３から濃縮カラム２に供給可能な第一のポンプ４と、濃縮カラム２と第一のポンプ４の間に配設されて該生体試料を濃縮カラム２に供給する試料導入管５と、第二の溶媒を第二の容器６から濃縮カラム２に供給可能な第二のポンプ７と、分離カラム８と、分離カラム８の排出側に接続された電気化学検出器９と、濃縮カラム２と試料導入管５との間に配設されて、濃縮カラム２の排出側と試料導入管５の接続、ないし第二のポンプ７と濃縮カラム２の導入側との接続及び濃縮カラム２の排出側と分離カラム８の接続を行う接続制御手段１０とを具備する。
【００７１】
この時、濃縮カラム２は、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を充填したクロマトグラフィー用カラムである。そして内容積は２．０ミリリットル未満であり、具体的なサイズは内径１．５ｍｍで長さ３５ｍｍを有する。更に、第一の溶媒は実質的に中性であり、第二の溶媒は酸性（ｐＨ３）である。
【００７２】
そして、この分析装置１を用いてカテコールアミンの分析を行う場合、生体試料注入前は、図２（Ａ）に示すように接続制御手段１０により制御がなされて必要とする接続が行われ、第一の溶媒は濃縮カラム２にのみ流れており、第二の溶媒は分離カラム８に流れてそれぞれの系を安定化させている。次に、試料導入管５からの生体試料が注入されると、第一のポンプ４からの圧送により第一の溶媒と共に生体試料は接続制御手段１０を介して濃縮カラム２に排出側から導入される。該生体試料中のカテコールアミンは、ここで濃縮カラム２の排出側末端に濃縮されて保持される。
【００７３】
次いで、接続制御手段１０により制御がなされて図２（Ｂ）に示す接続が再び行われ、濃縮カラム２の排出側を分離カラム８に接続すると共に第二のポンプ７により濃縮カラム２に酸性の第二の溶媒を供給する。濃縮カラム２の排出側に濃縮されて保持されていたカテコールアミンは直ちに溶出され，接続された分離カラム８に導入される。
【００７４】
そして分離カラム８を固定相、第二の溶媒を移動相として分離カラム８内で含有する３成分（ノルエピネフリン（ＮＥ），エピネフリン（Ｅ），ドーパミン（ＤＡ））を展開して分離し、電気化学検出器９で各成分を検出し分析をする。分析結果はクロマトグラムとしてレコーダー（図示されない）により記録される。
【００７５】
以上の分析装置１を用いて予め通常の除たんぱく処理のなされたヒト尿を用いてカテコールアミンの分析を行ったところ、夾雑物に妨害されること無く、分析対象であるカテコールアミン３種の分析を高感度に行うことができた。更に、夾雑物が殆どないため、電気化学検出器に不要な大量の物質の検出を行わせる必要が無くなり、敏感な電気化学検出器の長寿命化が可能となった。
【００７６】
（実施例２）
図３は本発明にかかる第二実施例であるカテコールアミンの分析装置の要部構成を説明する図である。そして、図４は第二実施例であるカテコールアミンの分析装置を使用してカテコールアミンの分析を行う方法を説明する図である。分析装置２１は、生体試料中のカテコールアミンを分析する装置であり、カテコールアミンを吸着可能な濃縮カラム２２と、第一の溶媒を第一の容器２３から濃縮カラム２２に供給可能な第一のポンプ２４と、濃縮カラム２２と第一のポンプ２４の間に配設されて該生体試料を濃縮カラム２２に供給する試料導入管２５と、濃縮カラム２２と試料導入管２５の間に配設されるカチオン交換カラム４０と、第二の溶媒を第二の容器２６から濃縮カラム２２に供給可能な第二のポンプ２７と、分離カラム２８と、分離カラム２８の排出側に接続された電気化学検出器２９と、濃縮カラム２２とカチオン交換カラム４０との間に配設されて、濃縮カラム２２の排出側とカチオン交換カラム４０の接続、ないし第二のポンプ２７と濃縮カラム２２の導入側との接続及び濃縮カラム２２の排出側と分離カラム２８の接続を行う接続制御手段３０とを具備する。
【００７７】
この時、濃縮カラム２２は、Ｓｉ−Ｃ結合により結合したホウ酸基を含むシリコーンポリマーで被覆された多孔性担体よりなるカラム充填剤を充填したクロマトグラフィー用カラムである。そして内容積は２．０ミリリットル未満であり、具体的なサイズは内径１．５ｍｍで長さ３５ｍｍを有する。また、カチオン交換カラム４０は表面にスルホン基を有したイオン交換体を充填して構成され、陽イオン交換機能を有する。そして内容積は２．０ミリリットル未満であり、具体的なサイズは内径２．０ｍｍで長さ１０ｍｍを有する。
【００７８】
更に、第一の溶媒は実質的に中性であり、第二の溶媒は酸性（ｐＨ３）である。そして、この分析装置２１を用いてカテコールアミンの分析を行う場合、生体試料注入前は、図４（Ａ）に示すように接続制御手段３０により制御がなされて必要な接続が行われ、第一の溶媒はイオン交換カラム４０にのみ流れており、第二の溶媒は濃縮カラム２２の導入側と接続する第二のポンプ２７の圧送により、濃縮カラム２２の導入側から濃縮カラム２２及び接続制御手段３０及び分離カラム２８内を流れてそれぞれの系を安定化させている。
【００７９】
次に、試料導入管２５からの生体試料が注入されると、第一のポンプ２４からの圧送により第一の溶媒と共に生体試料はカチオン交換カラム４０に導入され、たんぱく質等の巨大分子やアニオン性物質の排除が短時間のうちに起こる。同時にカチオン性物質の保持が起こる。被分析試料であるカテコールアミンは中性の溶媒中ではアミノ基の効果（−ＮＨ３＋）により他のカチオン性物質とともにカチオン交換カラム４０に保持される。
【００８０】
この保持作用はさほど強力なものではなく、カテコールアミンは数分のうちに徐々にカチオン交換カラム４０から溶出する。次に、カテコールアミンが溶出する時間だけ接続制御手段３０により制御がなされて、図４（Ｂ）に示すように必要な接続の変更が行われる。図４（Ｂ）に示す接続状態においては、カチオン交換カラム４０と濃縮カラム２２の排出側との接続がなされる。よって、溶出により得られた粗カテコールアミンを接続制御手段３０を介して濃縮カラム２２に排出側から導入される。カテコールアミンはカチオン交換カラム４０から希釈されて溶出されるが、ここで濃縮カラム２２の排出側末端に濃縮されて保持される。
【００８１】
次いで、接続制御手段３０により制御がなされて図４（Ａ）に示す接続が再び行われ、濃縮カラム２２の排出側を分離カラム２８に接続すると共に第二のポンプ２７により濃縮カラム２２に酸性の第二の溶媒を供給する。濃縮カラム２２の排出側に濃縮されて保持されていたカテコールアミンは直ちに溶出され、接続された分離カラム２８に導入される。
【００８２】
そして分離カラム２８を固定相、第二の溶媒を移動相として分離カラム２８内で含有する３成分（ノルエピネフリン（ＮＥ），エピネフリン（Ｅ），ドーパミン（ＤＡ））を展開して分離し、電気化学検出器２９で各成分を検出し分析をする。分析結果はクロマトグラムとしてレコーダー（図示されない）により記録される。
【００８３】
試料注入量：１０マイクロリットル
検出器：電気化学検出器
第一の溶媒：２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）
第二の溶媒：５ｍＭの１−オクタンスルホン酸ナトリウムと１０μＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液／アセトニトリル混合液（混合比は９７．５／２．５）（ｐＨ３）
流速：１００マイクロリットル／分
図５には、分析装置２１により得られた上記生体試料のクロマトグラムを示す。
【００８４】
図５に示すクロマトグラムは、生体試料中のカテコールアミンが分析装置２１により高感度に検出されたことを示す。すなわち、エピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、ドーパミン（ＤＡ）に対応するピークが分離良くクロマトグラム中に確認される。
【００８５】
さらに、図５のクロマトグラムでは、分析対象であるカテコールアミン３種の他に妨害となる夾雑物のピークはほぼ存在しない。このように目的とする物質のピークのみが分離良く存在し、夾雑物由来のピークが目的物質のピークに重なることのないクロマトグラムからは、定量等の詳細な分析が可能となる。
【００８６】
すなわち、従来の高速液体クロマトグラフィー装置を用いた生体試料中の分析方法では、先に示した図７のようにカテコールアミン以外の夾雑物がクロマトグラム上に不要なピークとして現れ、カテコールアミンの分析精度を低下させるという問題を有していたが、かかる問題は本発明にかかる実施例である分析装置では全くないことが分かった。
【００８７】
更に、夾雑物が殆どないため、電気化学検出器に不要な大量の物質の検出を行わせる必要が無くなり、敏感な電気化学検出器の長寿命化が可能となった。以上より、本発明にかかる実施例である分析装置を用いた生体試料中の分析方法において、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することができた。
【００８８】
本発明の第１の実施形態によれば、ホウ酸カラムにおいて生体試料から選択的にカテコールアミンを取り分けることが可能となる。その結果、後の分離カラムでのカテコールアミンの分離を夾雑物に妨害されることなく高精度に行うことが可能となる。すなわち、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００８９】
本発明の第２の実施形態によれば、カテコールアミンの吸着と脱着を高い性能で素早く行い、そして、高信頼性も併せ持つホウ酸カラムを使用することにより、カテコールアミンの分析方法をより精度が高くより高効率のものとすることが可能となる。
【００９０】
本発明の第３の実施形態によれば、分析のための作業・方法をより簡便なものとすることが可能となり、また、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９１】
本発明の第４の実施形態によれば、アニオン性物質を排除し、生体試料中からカテコールアミン等カチオン性物質のみを選択的に濃縮することが可能となる。また、希釈作用の影響がなくなり、後の分離作業を行いやすくなると共に、早い速度でカテコールアミンの濃縮をすることが可能となる。よって、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から効率良く低減して、検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９２】
本発明の第５の実施形態によれば、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減することが容易に行えて、検出される物質を減少させ、検出器を用いるなどして得られるクロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９３】
本発明の第６の実施形態によれば、分離カラムでの高精度の成分分離が可能となる。従って、カテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９４】
本発明の第７の実施形態によれば、分離カラムでのカテコールアミンの分離を夾雑物に妨害されることなく高精度に行うことが可能となる。すなわち、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９５】
本発明の第８の実施形態によれば、濃縮カラムに用いる充填剤の高性能化が可能となる。また、希釈作用の影響が少なくなり、後の分析作業を容易にすると共に、早い速度でカテコールアミンを分析することが可能となる。従って、カテコールアミンの吸着と脱着を高い性能で素早く行い、そして、高信頼性も併せ持つホウ酸カラムを使用することができ、カテコールアミンの分析精度がより高く、より高効率の分析装置の提供が可能となる。
【００９６】
本発明の第９の実施形態によれば、従来必要とされた除たんぱく等のための生体試料の前処理工程や専用の複雑で大がかりな装置を不要とできる。従って、単純な装置を用いることにより分析のための作業をより簡便にすると共に、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から確実に低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９７】
本発明の第１０の実施形態によれば、カチオン交換カラムにおいて、アニオン性物質を排除し、生体試料中からカテコールアミン等カチオン性物質のみを選択的に濃縮することが可能となる。また、カラム内部での希釈作用の影響がなくなり、後の分離カラムでの分離を容易にすると共に、早い速度でカテコールアミンの濃縮をすることが可能となる。よって、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から効率良く低減して、検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【００９８】
本発明の第１１及び第１２の実施形態によれば、単純な構成でありながら、分離カラムでの高精度の成分分離が可能となる。従って、容易にカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となる。
【発明の効果】
【００９９】
本発明によれば、カテコールアミン以外の夾雑物を分離カラム導入前に生体試料中から低減して検出器で検出される物質を減少させ、クロマトグラム上のピークを低減してカテコールアミンの分析精度を向上することが可能となるカテコールアミンの分析方法及び分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかる第一実施例であるカテコールアミンの分析装置の要部構成を説明する図である。
【図２】本発明にかかる第一実施例であるカテコールアミンの分析装置を使用してカテコールアミンの分析を行う方法を説明する図である。
【図３】本発明にかかる第二実施例であるカテコールアミンの分析装置の要部構成を説明する図である。
【図４】本発明にかかる第二実施例であるカテコールアミンの分析装置を使用してカテコールアミンの分析を行う方法を説明する図である。
【図５】本発明にかかる第一実施例であるカテコールアミンの分析装置により得られた生体試料のクロマトグラムである。
【図６】カテコールアミンの分析用に構成された従来の高速液体クロマトグラフィー装置の要部構成を示す図である。
【図７】従来高速液体クロマトグラフィー装置により得られた生体試料のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１，２１  分析装置
２，２２  濃縮カラム
３，２３  第一の容器
４，２４  第一のポンプ
５，２５  試料導入管
６，２６  第二の容器
７，２７  第二のポンプ
８，２８  分離カラム
９，２９  電気化学検出器
１０，３０  接続制御手段
４０  カチオン交換カラム
【図１】
0003628495.tif 000002
【図２】
0003628495.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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