(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性フェニルアラニン含有水溶液から光学活性フェニルアラニン無水物結晶を晶析温度Ｔ（℃）が３７℃以下で晶析するに際し、浸透圧π（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）が１０５００−４５０Ｔ＋４．４Ｔ２以上になるように光学活性フェニルアラニン含有溶液を調整し、調整した光学活性フェニルアラニン含有水溶液のフェニルアラニン濃度をＣ１とし、晶析温度Ｔ(℃)で光学活性フェニルアラニンの結晶化及び析出を行った後の母液のフェニルアラニン濃度をＣ２とするとき、Ｃ１／Ｃ２の値が１〜３の範囲で、調整した光学活性フェニルアラニン含有溶液から光学活性フェニルアラニンの結晶化及び析出を行うことを特徴とする光学活性フェニルアラニン無水物結晶を取得する晶析法。
【請求項２】
添加物を加え、請求項１に記載される浸透圧π（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）を１０５００−４５０Ｔ＋４．４Ｔ２以上に調整することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
添加物が、塩化アルミニウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、マルトース、メタノール、エタノール、プロパノールおよびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬原末、医薬中間体、甘味料の原料として有用な光学活性フェニルアラニンの無水物結晶の晶析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸として栄養上不可欠なアミノ酸であるとともに、甘味料としてのＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの原料としての用途を持つ産業上有用な物質である。
【０００３】
光学活性フェニルアラニンの製法としては、脱脂大豆等の蛋白質の加水分解物から分離する方法、発酵法、合成法が知られているが、いずれの方法においても精製手段として通例光学活性フェニルアラニンの晶析が行われる。光学活性フェニルアラニン含有液をｐＨ３〜９の範囲にて晶析すると、通常、光学活性フェニルアラニンの無水物結晶（以後α晶と呼ぶ）と１水和物結晶（以後β晶と呼ぶ）のいずれかの結晶が得られる。α晶が板状またはりん片状であるのに対し、β晶は微細な針状晶である。また、α晶は、結晶の母液との分離性が良い、付着母液も少ないなど、β晶に比べ工業的に利点が多いため、高品質のα晶を安定的に晶析する方法は、種々検討されてきた。
【０００４】
高品質のα晶を得るための方法としてこれまでに以下の方法がある。
（１）フェニルアラニンを含有する水溶液に２０（ｇ／１００ｇ水）以上の塩化ナトリウムを添加して３０℃以下まで冷却してフェニルアラニンを晶析する方法（特開平４−９１０６２号）
（２）フェニルアラニン、塩化アンモニウムを含有する水溶液にソルビタンアルキルエステルやポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル系の界面活性剤を添加してフェニルアラニンを晶析する方法（特開平４−１０３５６５号）
（３）培養中のフェニルアラニン発酵液のフェニルアラニン濃度が溶解度以上になった条件下でα晶の種晶を添加してフェニルアラニンを晶析する方法（特開平５−３０４９７１号）
また高収率でフェニルアラニンを得るための方法としてこれまでに以下の方法がある。
（４）フェニルアラニン含有水溶液に２０〜４０重量％の硫酸アンモニウムを加え３０℃以下で濾過するフェニルアラニンの単離方法（特開平５−１６３２１５号）
（５）桂皮酸とアンモニアとの酵素反応により得られるフェニルアラニン水溶液に硫酸アンモニウムを８重量％以上加えることを特徴とするフェニルアラニンの晶析方法（特開平５−１７８８０１号）
しかし、これまでの方法はα晶を安定的に取得することを目的として検討されてきたものでなかったり、α晶が得られたケースについても個々の物質についてその濃度を規定しているのみで統一的な考えがなされていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのＬ−フェニルアラニンの晶析工程において、操作性に優れるα晶のまま高品質のフェニルアラニン結晶を得る方法に属するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
光学活性フェニルアラニンは一定の温度（転移点）以上でα晶、それ以下ではβ晶を示す。水系では光学活性フェニルアラニンの転移点は３７℃前後である。得られた結晶は顕微鏡観察、粉末Ｘ線解析等により容易にα晶かβ晶かの区別はつくが、転移温度の測定は一般に困難であった。その理由としては、一般にα晶の領域と言われている４０℃で晶析しても、晶析液の光学活性フェニルアラニン濃度が高濃度になるとβ晶が析出して見かけ上転移点が上昇したものと測定されてしまうことがあげられる。
【０００７】
本発明者らはこの光学活性フェニルアラニンの晶析現象を鋭意研究する過程において、晶析温度と溶液の光学活性フェニルアラニン濃度、溶液の浸透圧、その時に析出した光学活性フェニルアラニンの結晶形を丹念に観察した。その結果、図１に示す通り、溶液の浸透圧が高いところはα晶となり、溶液の浸透圧が低いとβ晶となることを見いだした。そして、α晶領域とβ晶領域の間の境界線は晶析温度と溶液の浸透圧の関数として表された。したがって、所定の晶析温度Ｔ（℃）においてα晶を取得しようと思えば、光学活性フェニルアラニン含有液の浸透圧（π）の値を１０５００−４５０Ｔ＋４．４Ｔ２以上に調整し、晶析することで、晶析温度Ｔ（℃）が純系における転移点以下の温度であっても安定的にα晶の取得が可能なことを見出した。すなわち、水系において、その転移点である３７℃以下の温度で晶析したとしても、浸透圧を上記のように調整することで、従来は取得することが困難であったα晶を容易に安定的に取得することが可能になったわけである。
【０００８】
ここでいう浸透圧は氷点降下を測定原理とする浸透圧計を用いて測定した値であり、単位はｍＯｓｍ／ｋｇ水である。
【０００９】
光学活性フェニルアラニン含有液の浸透圧πを望ましい値に調整するために各種添加物を使用することができる。添加物は、晶析温度で望ましい浸透圧を示すことが出来るものであれば何でもよく、無機化合物、有機化合物等その種類を問わない。例えば無機化合物としては、塩化アルミニウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどの塩化物、または、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウムなどの硝酸化物、または、炭酸アンモニウムなどの炭酸化物、または、硫酸アルミニウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの硫酸化物などの電解質が使用可能であり、有機化合物としては酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウムなどの有機電解質、またはガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、マルトースなどの糖、ポリエチレングリコールなどの高分子物質のような非電解質であってもよい。またメタノール、エタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、グリセリンのような多価アルコールでもよい。また、単品である必要もなく、それらから選ばれる混合物であっても、望ましい浸透圧を示すことができれば使用可能である。好ましくは無機塩のような低分子量の電解質の方が浸透圧上昇には好都合である。
【００１０】
ところで添加物によっては塩化ナトリウムのように光学活性フェニルアラニンの溶解度を低下させるものもある。そのような場合、晶析前の光学活性フェニルアラニンの濃度（ｇ／１００ｇ水）（Ｃ１とする）は同じでも添加物を加えて晶析したのちの結晶分離母液の光学活性フェニルアラニン濃度（Ｃ２とする）が低下するために、晶析時の過飽和度（Ｃ１／Ｃ２とする）が高くなる。晶析時の過飽和度Ｃ１／Ｃ２が３を越えると一時的にβ晶が析出してしまうため添加物を加える時は浸透圧を高くすることとともに過飽和度が上がることを考慮しなければならない。したがってＣ１／Ｃ２が１〜３の範囲、好ましくは１〜２の範囲で晶析した方がよい。
【００１１】
光学活性フェニルアラニン含有水溶液としては、発酵法の場合には発酵液、それをイオン交換樹脂あるいは脱色剤で処理して得られた液、そこから晶析して得られた粗結晶の溶解液及び粗結晶を分離した母液等、蛋白分解法の場合には蛋白加水分解液、これをイオン交換樹脂あるいは脱色樹脂で処理して得られた液、そこから晶析して得られた粗結晶の溶解液及び粗結晶を分離した母液等、合成法の場合、ＤＬ−アセチルフェニルアラニンをアシラーゼと反応させた液等、光学活性フェニルアラニンの結晶化および析出が可能な液であれば、その由来は問わない。例えば、発酵液のように浸透圧が高い光学活性フェニルアラニン含有水溶液からの晶析では、望ましい浸透圧に調整するための添加物の量が少なくてすむため、効率的である。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。実施例中のＣ１は、晶析前の光学活性フェニルアラニン濃度（ｇ／１００ｇ水）を表し、Ｃ２は、晶析後の母液中の光学活性フェニルアラニン濃度（ｇ／１００ｇ水）を表す。
【００１３】
実施例１
Ｌ−フェニルアラニン結晶（シグマ社製）１．７ｇに水５０ｇを加え、６０℃にて溶解し、Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１が３．４であるＬ−フェニルアラニン溶液を調製した。次に所定の浸透圧になるように硫酸アンモニウムを添加し、６０℃にて溶解した後、３０℃まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンを晶析した。その際、所定の浸透圧が９６０（＝１０５００−４５０＊３０＋４．４＊３０＊３０）（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上となるように硫酸アンモニウムはそれぞれ２．５ｇ、５ｇ、６ｇ、８ｇ添加された。また、比較例として、浸透圧が９６０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以下となるように硫酸アンモニウムを０ｇ、１ｇ、２ｇ添加した系についても晶析を実施した。母液のフェニルアラニン濃度と得られたフェニルアラニンの結晶形を表１に示す。
【００１４】
表１から明らかなように浸透圧が９６０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上では、無水物結晶（α晶）が優先的に得られた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
実施例２
Ｌ−フェニルアラニン結晶（シグマ社製）１．８ｇに水５０ｇを加え、６０℃にて溶解し、Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１が３．６であるＬ−フェニルアラニン溶液を調製した。次に所定の浸透圧になるようにブドウ糖を添加し、６０℃にて溶解した後、２５℃まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンを晶析した。その際、所定の浸透圧が２０００（＝１０５００−４５０＊２５＋４．４＊２５＊２５）（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上となるようにブドウ糖はそれぞれ２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ添加された。また、比較例として、浸透圧が２０００（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以下となるようにブドウ糖を８ｇ、１２ｇ、１６ｇ添加した系についても晶析を実施した。母液のフェニルアラニン濃度と得られたフェニルアラニンの結晶形を表２に示す。
【００１７】
表２から明らかなように浸透圧が２０００（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上では、無水物結晶（α晶）が優先的に得られた。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
実施例３
Ｌ−フェニルアラニン結晶（シグマ社製）１．７ｇに水５０ｇを加え、６０℃にて溶解（Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１＝３．４）した後、塩化ナトリウムをそれぞれ６ｇ、８ｇ、１０ｇ、１２ｇを添加し、６０℃にて溶解し、４種類のフェニルアラニン水溶液を調製した。次に、これらの水溶液を所定の温度まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンを晶析した。実験条件と結果（フェニルアラニン結晶型）を表３に示す。尚、各晶析温度（２５℃、２０℃、１５℃、１０℃）におけるα晶とβ晶の境界となる溶液の浸透圧は２０００、３２６０、４７４０、６４４０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）である。
【００２０】
表３から明らかなように、フェニルアラニン水溶液の浸透圧がその晶析温度におけるα晶とβ晶の境界となる溶液の浸透圧以上であるときは、無水物結晶（α晶）が優先的に得られた。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
実施例４
Ｌ−フェニルアラニン結晶（シグマ社製）を７０℃にて溶解し、Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１がそれぞれ５．２、４．５、３．５、３．０である４種類のＬ−フェニルアラニン溶液を調整した。次に塩化ナトリウムをそれぞれ９ｇを添加し、７０℃にて溶解後、１５℃まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンの晶析を実施した。母液のフェニルアラニン濃度と得られたフェニルアラニンの結晶形を表４に示す。尚、晶析温度１５℃におけるα晶とβ晶の境界となる溶液の浸透圧は４７４０（＝１０５００−４５０＊２５＋４．４＊２５＊２５）（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）である。
【００２３】
表４に示されるように、浸透圧が４７４０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上であっても、Ｃ１／Ｃ２が３．１の系ではα晶に混じってβ晶が析出したのに対し、Ｃ１／Ｃ２が３以下の系においては、α晶のみが析出した。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
実施例５
特開昭５１−２１０７９号特許公報に記載の実施例１に準じて、製造したＬ−フェニルアラニン発酵液を遠心分離して除菌した。この除菌液を濃縮後、冷却晶析した。析出した結晶を分離、洗浄後、乾燥し、Ｌ−フェニルアラニン粗結晶を得た。（Ｌ−フェニルアラニン含量９５％）この粗結晶１．７ｇに水５０ｇを加え、６０℃にて溶解（Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１＝３．２）した後、ブドウ糖２５ｇを添加し、６０℃にて溶解した。次に所定の浸透圧となるように食塩を添加し、６０℃にて溶解した後、１５℃まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンを晶析した。その際、所定の浸透圧が４７４０（＝１０５００−４５０＊１５＋４．４＊１５＊１５）（Ｏｓｍ／ｋｇ水）上となるように食塩はそれぞれ５ｇ、６ｇ、７ｇ添加された。また、比較例として、浸透圧が４７４０ｍＯｓｍ／ｋｇ水以下となるように食塩を２ｇ、３ｇ、４ｇ添加した系についても晶析を実施した。母液のフェニルアラニン濃度と得られたフェニルアラニンの結晶形を表５に示す。
【００２６】
表５から明らかなように浸透圧が４７４０（Ｏｓｍ／ｋｇ水）上では、無水物結晶（α晶）が優先的に得られた。
【００２７】
【表５】
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【００２８】
実施例６
実施例５にて得られたＬ−フェニルアラニン発酵液を濃縮し、Ｌ−フェニルアラニン濃度Ｃ１が４．０（ｇ／１００ｇ水）である溶液を得た。次にこの溶液が所定の浸透圧になるように硫酸アンモニウムを添加し、４０℃にて溶解した後、２０℃まで冷却して、Ｌ−フェニルアラニンを晶析した。その際、所定の浸透圧が３２６０（＝１０５００−４５０＊２０＋４．４＊２０＊２０）（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上となるように硫酸アンモニウムはそれぞれ８ｇ、１０ｇ、１２ｇ添加された。また、比較例として、浸透圧が３２６０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以下となるように硫酸アンモニウムを２ｇ、４ｇ、６ｇを添加した系についても晶析を実施した。母液のフェニルアラニン濃度と得られたフェニルアラニンの結晶形を表６に示す。
【００２９】
表６から明らかなように浸透圧が３２６０（ｍＯｓｍ／ｋｇ水）以上では、無水物結晶（α晶）が優先的に得られた。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、分離性に優れた光学活性フェニルアラニン無水物結晶を安定的に取得でき、また、従来より低温領域で取得出来ることから取り上げ収率の向上等が期待され、工業的な製造においてメリットが大きい
。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】晶析温度を縦軸に、溶液の浸透圧を横軸にした時、析出する光学活性フェニルアラニンの結晶形を示した説明図である。
【図１】
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