(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程:
１）反復ゲノム配列に相補的なプライマーを用いることによる核酸増幅法により試料中に含まれるＤＮＡを増幅し、そして
２）得られた増幅されたＤＮＡを検出する、
を含んでなる試料中のゲノムＤＮＡを定量する方法であって、
１）従来公知の方法における増幅の前に、一定量の少くとも１つの公知の核酸を内部標準として試料に加え(その標準核酸は少くとも１つの検出可能な特徴において定量すべきゲノムＤＮＡと異る);そして
２）増幅されたゲノムＤＮＡの量と増幅された標準核酸の量を測定し、得られた標準核酸の量から出発してサンプル中に始めに存在するゲノムＤＮＡの量を測定する;
ことを特徴とする定量方法。
【請求項２】
増幅において蛍光性若しくは放射性基、またはアフィンタンパク質およびその後の検出反応で検出可能な化学基を有するプライマーを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出可能な化学基が蛍光性基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ａlu配列をコードする増幅プライマーを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
増幅工程を指数期において中止することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
増幅された核酸の量の測定を、核酸検出装置を用いて行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸検出装置が蛍光感受性核酸検出装置であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
混入しているゲノムＤＮＡを測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
増幅された標準核酸の量から試料中の定量すべきゲノムＤＮＡ量を検量用直線により測定することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ａluイクイバレント共通配列の部分に相補的な増幅プライマーを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ａluイクイバレント共通配列が齧歯類または霊長類のＡluイクイバレント共通配列であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＨＯ、Ｖero、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈepl、ハイブリドーマまたはＣＥＣ細胞のゲノムＤＮＡを定量することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生物学的製品の品質をチェックし、品質管理する方法であって、該方法は請求項１〜１２のいずれかに記載の方法を含んでなる方法。
【請求項１４】
生物学的製品がバイオテクノロジーにより製造された製品である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的製品が、ウイルスタンパク質、gp１６０、組換え血液因子、血漿タンパク質、ワクチンまたはモノクローナル抗体である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により測定して、用量当り１０pgまたは１００pgの限界以下の染色体ＤＮＡの含量を含み、実質的に外来遺伝子を含まない生物学的製品。
【請求項１７】
生物学的製品がバイオテクノロジーによって製造される請求項１６に記載の製品。
【請求項１８】
ウイルスタンパク質、gp１６０、組換え血液因子、血漿タンパク質、ワクチン、およびモノクローナル抗体から選択されることを特徴とする請求項１６または１７に記載の生物学的製品。
【請求項１９】
ワクチンが、ヘルペス、インフルエンザまたはＴＢＥウイルスに対するものである請求項１８に記載の生物学的製品。
【請求項２０】
配列番号１に記載の配列を有するプライマー。
【請求項２１】
配列番号２に記載の配列を有するプライマー。
【請求項２２】
配列番号３に記載の配列を有するプライマー。
【請求項２３】
配列番号４に記載の配列を有するプライマー。
【請求項２４】
標準プラスミドpＡlu−wt。
【請求項２５】
標準プラスミドpＡlu−２０。
【請求項２６】
標準プラスミドpＣＲ１−wt。
【請求項２７】
標準プラスミドpＣＲ１＋１１。
【請求項２８】
１）定量すべき核酸と少なくとも一つの検出可能な特徴において異なる、内部標準としての少なくとも一つの公知の核酸、
２）標準の核酸および定量すべき核酸に結合する蛍光ラベルしたプライマー、
３）既知量のゲノム核酸を含むポジティブ対照、
４）核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム核酸定量用キット。
【請求項２９】
１）内部標準としてのプラスミドpＡlu２０、
２）蛍光ラベルしたプライマーＡlu Ａ２／２およびＡlu Ｂ、
３）既知量のＶero細胞ＤＮＡを含むポジティブ対照、
４）ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム霊長類ＤＮＡ定量用キット。
【請求項３０】
１）内部標準としてのプラスミドpＣＲ１＋１１およびpＣＲ１−８、
２）蛍光ラベルしたプライマーＣＲ１およびＣＲ１Ａ、
３）既知量のトリＤＮＡを含むポジティブ対照、
４）ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノムトリＤＮＡの定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、
１）反復ゲノム配列に相補的なプライマーを用いることによる核酸増幅法により試料中に含まれるＤＮＡを増幅し、そして
２）得られた増幅されたＤＮＡを検出する、
工程を含んでなる、試料中のゲノムＤＮＡを定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学の分野において、バイオテクノロジーにより得られたタンパク質を用いることは、その製品の品質管理に関し製薬産業に新しい問題を提出する。細胞培養に由来する不純物を測定するための新しい検出法が確立されねばならない。かくして例えば世界健康機関(Ｗorld  Ｈealth  Ｏrganization)は、組み換え製品中におけるヘテロガスな混入ＤＮＡの量は投与される用量(dose)当り１００pg以下であることを要求し、他方米国食品薬品局(Ｕ.Ｓ.Ｆood  and  Ｄrug  Ａdministration)の要求によれば、個々の用量当り僅か１０pgのみのＤＮＡが受容される。
【０００３】
今日まで、組換え製品中の混入ＤＮＡの測定は膜にハイブリダイズさせることにより主に行われている。Ｐor［Ｃlin．Ｃhem．３５巻(１９８９)、１８５９ページ］は、放射性ラベルのゲノムプローブを用いると５pgという少量のＤＮＡが検出できることを示す。しかしながら１４の研究室が参加した研究室間試験は、ハイブリダイジングによるＤＮＡ測定は、一研究室内でも、いくつかの研究室を比較した場合も、満足すべき再現性のある結果を生じないことを示した［ＲobertsonおよびＨeath、Ｂiologicals、２０巻(１９９２)、７３ページ］。
【０００４】
Ｇillilandは競合的ＰＣＲに基づく定量的なＰＣＲ法を記載する［ＰＮＡＳ、８７巻(１９９０)、２７２５ページ］。ＤＮＡ量を測定するために、彼は試料と同時に増幅する内部標準の希釈シリーズを使用する。そのＰＣＲは飽和まで行う。これはエチジウムブロマイド染色によるＰＣＲ生成物の検出を可能にする。その後ＰＣＲ生成物をゲル上で分離し、試料のコピー数を標準希釈シリーズのコピー数と比較し、試料の濃度を計算する。標準および試料濃度が反応容器中で約１:１の比で増幅されているならこの濃度評価は正確であろう。標準希釈物を多く用いるほどＤＮＡ量の測定はより正確であることをこのことは暗示する。
【０００５】
ＲＮＡを定量する方法もＷang等により提案されている［ＰＮＡＳ、８６巻(１９８９)、９７１９ページ］。このＰＣＲは指数期に中止する。様々な標準濃度を増幅することにより、著者は検量線を提供する(外部標準化)。指数的な反応期においては、ＰＣＲ生成物の数は存在するＲＮＡ分子の数に比例して増加するので、この検量線は直線であり、増幅された試料濃度を最終的に読むことができる。この方法の欠点は、ＰＣＲ生成物の最終濃度が比較的低く、感度の高い検出法を検出のために用いなければならないということである。Ｗang等は放射性ラベルのヌクレオチドを用いる。
【０００６】
Ｐorcher等［Ｂiotechnique、１３巻(１９９２)、１０６ページ］は、蛍光ラベルのプライマーを用い、ＰＣＲ生成物を自動レーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーにより定量することによって少量のＰＣＲ生成物の検出を改良することに成功した。
【０００７】
これ等すべての方法は、ある遺伝子、ウイルスのＤＮＡ部分またはmＲＮＡ等の少量のホモロガスな配列の測定を可能にする。しかしながら混入したヘテロジニアスなゲノムＤＮＡを測定する正確な方法を見出すことは可能でなかった。
【０００８】
国際公開９４／１２６６９号において、混入するＤＮＡの検出のためのＰＣＲ法が提案され、該方法ではゲノムの反復配列を増幅させる。この方法では０．１pg〜０．０１pgのＤＮＡ量が検出可能であると言われる。しかしながら染色体ＤＮＡの適当な定量はこの方法では可能でない。増幅反応前の標準の添加も、試料中に最初に含まれる全染色体ＤＮＡを増幅したＤＮＡから再計算できる方法も開示されていない。反復配列は試料を汚染する器官のゲノム中に少くとも１％の濃度で存在しなければならないと述べられているだけである。しかし実施例に記載されたハムスター細胞(ＣＨＯ)の混入ＤＮＡの測定において、ＣＨＯゲノム中にいかに多くの反復配列が含まれるか述べられていない。また同文献中にこれに関するデータを見出すのは不可能であった。しかしながら原理的にこれらのデータなしには試料中の混入ＤＮＡ含量を正確に再計算するのは不可能である。何故ならそのような再計算のためにはとにかく増幅されたＤＮＡ片および全染色体ＤＮＡの間の定量的関係が必要であるからである。
【０００９】
国際公開９４／１２６６９号によればＰＣＲ生成物の検出は、ＤＮＡ中に析出する染料ヘキスト３２２５８を用いて行われることも述べておく。この染料はＰＣＲ後に反応生成物に加える。この分析が内部標準の使用を除外するという事実にもかかわらず、このキャクタリゼーションはその低感度のためＤＮＡの正確な定量には適しない。しかしこれは国際公開９４／１２６６９号の目的ではなかった。ＤＮＡ検出のこの方法は、染色体ＤＮＡが調べるべき試料中の含まれているか否かという疑問へのイエス／ノーの答を提供することを意図しただけであった。
【００１０】
しかしＰＣＲによる正確なＤＮＡ濃度測定には内部標準を添加する必要がある。何故ならＰＣＲの効率は反応容器ごとにしばしば異ることが示されているからである。この効率の差異は１０5までの結果の差異をもたらす。国際公開９４／１２６６９号の方法では、この誤差の原因は完全に無視されており、したがって国際公開９４／１２６６９号の方法の再現性は疑わしい。
【００１１】
本発明は、試料中に存在する染色体ＤＮＡの全量に関して非常に正確な定量的な情報を与えることのできる染色体ＤＮＡの定量方法を提供することをその目的として有する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明による、そして最初に定義されるタイプの方法は、
１）従来公知の方法における増幅の前に、一定量の公知の核酸を内部標準として試料に加え(その標準核酸は少くとも１つの検出可能な特徴において定量すべきゲノムＤＮＡと異る);そして
２）増幅されたゲノムＤＮＡの量と増幅された標準核酸の量を測定し、得られた標準核酸の量から出発して試料中に始めに存在するゲノムＤＮＡの量を測定する;
ことに特徴がある。
【００１３】
この方法によって、染色体ＤＮＡのある部分的な量(現在の場合にはある反復配列)の定量により試料中に存在する染色体ＤＮＡの含量を測定することが始めて可能となった。
原理的には核酸増幅はＭullis等および他の人々によって開発され技術(米国特許第４,６８３,１９５号および同４,６８３,２０２号)、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション(ＰＣＲ)、リガーゼーＣＲ(ＬＣＲ)の逆転写酵素−ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)をベースにした方法を意味する。
標準核酸は、増幅すべきゲノムＤＮＡと少くとも１つの検出可能な特徴において異らなければならないが、それは同じプライマーの助けにより増幅させることができるべきである。増幅すべきゲノムＤＮＡの大きさと異なる大きさを有し、増幅すべきゲノムＤＮＡのそれと異なる制限切断部位を有する標準核酸が便利であることがわかった。好ましくは標準核酸はＤＮＡである。何故なら標準核酸と試料中に含まれる定量すべき染色体ＤＮＡの間の類似性ができるだけ大きくなければならないからである。これはＧＣ含量、制限部位、配列にもあてはまる。好ましい標準は増幅すべき染色体ＤＮＡと、１〜２０％の長さだけ異る。標準核酸の正確な配列は勿論知られているべきである。
【００１４】
増幅工程に用いるプライマーは、増幅された核酸の検出限界を増大させる基、例えば蛍光性若しくは放射性の基、またはアフィン(affine)タンパク質およびその後の検出反応により検出できる化学基(例えばビオチン−アビジン、ジゴキシゲニンラベリング等)を好ましくは含む。蛍光性の基を有するプライマーが特に好ましい。
【００１５】
ＤＮＡ分析のための好ましい反復ゲノム配列はＡlu配列またはＡlu−イクイバレント配列であり、プライマーはＡlu−イクイバレント(equivalent)共通配列、特に哺乳動物、特に齧歯類および霊長類のＡlu−イクイバレント共通配列の部分に好ましくは結合する。
【００１６】
増幅後のＤＮＡ量の測定(ＤＮＡ量は例えば或るＤＮＡ分子の質量の形で(mg、μg、ng、pg、…)またはコピー数として与えられる)は様々な方法で行い得るが、大ていの場合増幅した標準核酸を定量すべき増幅されたゲノムＤＮＡと分離し、その分離したＤＮＡ量を別に測定する工程が提供されねばならない。好ましくはこの分離工程はゲル電気泳動またクロマトグラフ法による。
【００１７】
自動的に行われ、分離および定量工程を一緒にした検出方法が特に適していることがわかった。かくして本発明による方法の好ましい態様は、増幅した核酸量の測定を、核酸検出製造、好ましくは蛍光感受性核酸検出装置を用いることにより行う。そのような核酸検出装置の例はレーザー誘起蛍光測定装置［例えばＡpplied  Ｂiosystemsのジーン・スキャナー(Ｇene Ｓcanner)(登録商標)３７３Ａ］またはＨＰＬＣ装置を有する自動ＤＮＡシークエンサーである。これらの装置を用いれば長さで１塩基対しか異ならないＤＮＡ分子を互いに分離することが可能である。
【００１８】
ジーン・スキャナーの特別の利点は、一つの単一レーン中で異る蛍光染料間を区別することが可能なことである。これは一つのゲル上で多数の試料を同時に処理することを可能にする。何故ならゲル上で利用できるすべてのレーンが試料用に使用し得るからである。さらに一つの単独レーンで、異る蛍光染料でラベルした多数のＰＣＲ生成物を分析し(マルチプレックス−ＰＣＲ)、それによって或る試料中の様々な起源のゲノムＤＮＡを検出することが可能である。例えば１試料中の２つの異る核酸を同時に検出する場合、経費はほとんど半分に節減できる。ルーチン操作で本発明の方法を用いる場合、これは特に有利である。これと対照的に、Ｐorcher等によりＰＣＲ生成物の分析に用いられた自動レーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーはレーン当りただ１つの蛍光染料(従ってただ１つのＤＮＡ)を分析できるだけである。
【００１９】
本発明による方法の好ましい態様では増幅工程は指数期ですでに中止する。
それによって増幅された標準のコピー数の比は反復配列のコピー数に比例する。さらに、単一の標準の共増幅によって反復配列のコピー数を測定できる。これに関して本発明による方法はＧilliland等のしばしば用いられた方法に比べはるかに優れている。何故なら試料当りただ１つの標準を実験する必要があるだけであるのに対し、Ｇillilandによる方法は、異った試料における異った希釈においてより多くの標準を用いるほど、より正確であるからである。
【００２０】
本発明の方法によれば、好ましくは混入しているゲノムＤＮＡを測定する。この測定は、ワクチンにおいて、または細胞培養に由来する組換え製品の品質管理において、混入したＤＮＡを測定する場合特に重要である。
試料中に含まれた定量すべきゲノムＤＮＡの量は、増幅された標準核酸の量から、検量線により好ましくは決定する。
【００２１】
これまで、前もって測定した少量(反復配列のコピー数)からより多い全体の量(ゲノムＤＮＡ)へいかに結論を引き出すかに関する文献はなかった。ゲノム中の反復配列の部分は１〜１０％範囲にあることが知られているだけである。これまで増幅された反復配列とゲノムＤＮＡの全量との間の直線的関係は開示されていない。
【００２２】
好ましくはこの関係づけは次の方法において見出すことができる検量線によって行うことができる:
様々な既知の濃度のある種のゲノムＤＮＡを、内部標準を用いることにより競合的核酸増幅法で本発明の本法を用いて増幅させる。その方法を指数期で中止し、増幅された核酸量を測定する。
【００２３】
増幅された内部標準により生じたピーク面積(＝コピー数)は、用いたゲノムＤＮＡの増幅された反復配列のピーク面積(＝コピー数)に比例する。検量線を得るために、それから計算された反復配列のコピー数を、最初に用いたゲノムＤＮＡ量に対してプロットする。これに関して低ＤＮＡ濃度で(０〜６０pg／ml)この検量線は直線であることが驚くべきことに見出された。この直線から係数を計算し、未知のＤＮＡ量を測定するのに最終的に用いる。
【００２４】
本発明の方法によれば、かくしてゲノムＤＮＡ量は以下の式によりpg／mlで計算される。
【数１】
m(試料) ＝ Ａ(試料)／Ａ(標準) × Ｎ(標準) × Ｆ1 × Ｄ × １／Ｆ2
【００２５】
［式中、Ａ(試料)は試料の増幅された染色体ＤＮＡのピーク面積であり、
Ａ(標準)は増幅された内部標準のピーク面積であり、
Ｎ(標準)は内部標準の用いたコピーであり、
Ｆ1は標準の体積と抽出した体積との比であり、
Ｄは希釈係数であり(試料が抽出の前に希釈されているなら)、そして
Ｆ2は反復配列のいかに多くの検出可能なコピーが１pgのゲノムＤＮＡ当り含まれるかを示す換算係数である］
この検量線は用いたゲノムＤＮＡ、用いたプライマーおよび特に選択した増幅条件に特有である。
【００２６】
染色体ＤＮＡの定量における更なる指標は感度と再現性である。本発明の方法を用いると、１pg〜１００pgの範囲のＤＮＡ量を非常に正確に再現性よく測定できる。この方法の感度限界はいかなる方法によっても到達されていない。
【００２７】
本発明による方法はバイオテクノロジーにより製造されたタンパク質のチェックおよび品質管理に特に適しており、これ等のタンパク質の製造方法についての制限はない。例えば、組換えタンパク質、トランスジェニックタンパク質またはハイブリドーマ技術により得られたタンパク質を、本発明の方法により、それらの染色体ＤＮＡ含量につき分析できる。多数の分析はハイブリドーマ細胞系で得られたモノクローナル抗体を、由来の種の混入ＤＮＡにつき簡単で有効な方法で分析することを可能にする。
【００２８】
特にワクチンまたは組換えタンパク質の場合には品質管理がバックグラウンドの問題に直面している。霊長類細胞培養物中の混入染色体ＤＮＡを測定する場合、生成物の製造または処理中の取扱いによって起る不純物も、用いるプライマーが霊長類のすべてのＡlu配列に特異的であるなら、本発明の方法によりカバーできる。しかし組換えタンパク質の生産が、例えばＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣細胞)、ＢＨＫ(ベビーハムスター腎臓細胞)またはＣＥＣ(ニワトリ胚細胞)などの非霊長類の細胞培養中で行われるなら、本発明の方法の場合の検出限界ははるかに小さい。何故なら試料の取扱いにより起る不純物の問題は排除されるからである。本発明の定量法はＣＨＯ−、Ｖero−(モンキー細胞系)、ＢＨＫ−、ＳＫ−Ｈepl−(ヒト肝臓細胞系)、ハイブリドーマ細胞またはＣＥＣ細胞について特に好ましく用いられる。何故ならこれらの細胞培養は、ワクチン、組換えタンパク質またはモノクローナル抗体の製造に最も一般的に用いられているからである。
【００２９】
本発明の方法の再現性は少くとも９５％に達する。これを得るために、標準および試料の増幅反応の効率が等しいよう注意すべきである。増幅反応の効率は、それが指数期に中止されるなら第１に重要である。
【００３０】
従って本発明の他の態様は、生物学的製品、特にバイオテクノロジーによって製造された製品のチェックおよび品質管理のために本発明の方法を用いることに関する。何故ならこれ等の場合ＤＮＡで汚染される危険が特に大きいからである。本発明の方法は、ＨＩＶ表面抗原、gp１６０、組換え血液因子、血漿タンパク質およびワクチン［例えばヘルペス、インフルエンザ、およびダニ媒介脳炎(ＴＢＥ)ウイルスに対するワクチン］のチェックおよび品質管理に用いられる。
本発明の方法の高感度および特に低い検出限界のため、混入している核酸の非常に低い含量または核酸が含まれないことによって定義される新しい品質基準が生物学的製品につき測定できる。
【００３１】
更なる態様によれば、本発明は、用量(dose)当り本発明の方法を用いて測定して１０または１００pgの許容限界以下に少くともある染色体ＤＮＡの含量を有し、従って実質的に外来遺伝子を含まない、生物学的な、特にバイオテクノロジー製品に関する。
特に好ましいのはgp１６０等のウイルスタンパク質、組換え血液因子、血漿タンパク質、および特にヘルペス、インフルエンザ、肝炎またはＴＢＥウイルスに対するワクチンである。
【００３２】
ＰＣＲの効率は、例えばプライマーの標準および試料核酸への結合によって影響される。この理由で好ましくは同じプライマーを標準および試料について用いる。これ等のプライマーは標準および増幅すべきゲノムＤＮＡのプライマー結合部位にできる限り１００％相同性であるべきである。合成標準の場合これは問題でないが、増幅すべきゲノム配列の場合には問題である。反復配列は必ずしも１００％相同的ではなく、しばしば異る配列を有する。プライマーを選択する場合、最も完全に保存されたヌクレオチド配列を用いるよう注意しなければならない。プライマーがゲノムの反復配列に相同性が小さいほどプライマーの結合は弱くなり、ＰＣＲの効率も小さくなる。本発明の方法においては、ジーンデータライブラリーの反復配列内部の保存されたＤＮＡ部分の配列(alignment)により選択する。
【００３３】
それ故更なる態様によれば本発明は本方法に用いるプライマーに関する。すなわち
【００３４】
【化１】
Ａlu  Ａ2／2:GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT  bp １４９−１７６
(配列番号１)
Ａlu  Ｂ:  GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG  bp ２９４−２６７
(配列番号２)
［Ｂatzer等による番号づけ(Ｎucl．acid  Ｒes．１８巻(１９９０)６７９３頁)］
ＣＲ１:    ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC    bp ２６０−２８３
(配列番号３)
ＣＲ１Ａ    CAGGGCCACATCCAGCCTGG     bp ３４５−３２６
(配列番号４)
［Ｓtumph等による番号づけ(ＰＮＡＳ、８１巻(１９８４)、６６６７〜６６７１ページ)］
【００３５】
本発明は標準製造用のプラスミドにも関する。すなわち
pＡlu−wt(公知のpＣＲＩＩプラスミドおよび多数のクローニングサイト中の挿入物よりなり、該挿入物はＢatzer等からのＡlu繰返し特異配列の塩基対(bp)１４８〜２９４を含む。)、
pＡlu２０(pＡlu−wtから誘導され、Ｂatzer等からのＡlu繰返し特異配列のbp１７８における２０bpを削除する。)、
pＣＲ１−wt(公知のpＣＲＩＩプラスミド(インビトローゲンの)およびpＣＲＩＩプラスミドのＥcoＲＩ部位における挿入物よりなり、該挿入物はＳtumph等(１９８４)からのＣＲ１配列のbp２６０〜３４５を含む。)、
pＣＲ１＋１１(プラスミドpＣＲ１−wtより誘導され、bp３００部位に１１ヌクレオチドを挿入する。)、
pＣＲ１−８(プラスミドpＣＲ１−wtより、３０２位置(Ｓtumph等による)において８個のヌクレオチドを削除することにより誘導する。)。
【００３６】
増幅反応の効率は、増幅すべきＤＮＡ分子の種類にもよる。本発明の方法の場合、増幅の前にリニアー化(linearised)の形の内部標準を加えるのが有利であることがわかった。それによって反応効率の更なる相異が補償され、増幅すべき異なった形のＤＮＡに戻る。
【００３７】
本発明の他の態様によれば、本発明は試料中のゲノム核酸を定量するためのキットにも関し、該キットは
１）定量すべき核酸と少なくとも一つの検出可能な特徴において異なる、内部標準としての少なくとも一つの公知の核酸、
２）標準の核酸および定量すべき核酸に結合する蛍光ラベルしたプライマー、
３）既知量のゲノム核酸を含むポジティブ対照、
４）核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる。
【００３８】
本発明によるキットの好ましい態様は以下のようなものである：
１．１）内部標準としてのプラスミドpＡlu２０、
２）蛍光ラベルしたプライマーＡlu Ａ２／２およびＡlu Ｂ、
３）既知量のＶero細胞ＤＮＡを含むポジティブ対照、
４）ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノム霊長類(primate)ＤＮＡ定量用キット。
２．１）内部標準としてのプラスミドpＣＲ１＋１５およびpＣＲ１−８、
２）蛍光ラベルしたプライマーＣＲ１およびＣＲ１Ａ、
３）既知量のトリ(avian)ＤＮＡを含むポジティブ対照、
４）ゲノム核酸を含まない緩衝液を含むネガティブ対照、および
５）マニュアル
を含んでなる、試料中のゲノムトリＤＮＡの定量用キット。
【００３９】
本発明を実施例および図面によってより詳細に説明するがそれに限定されるものではない。特に、本発明の方法が様々な試料中の染色体ＤＮＡのルーチンな、早い、しかし正確で再現性のある定量に特に適していることを図面は示す。
【００４０】
【実施例】
１．一般式な作業指示
１．１  方法の原理
様々な起源の核酸を、蛍光性の基を有するプライマーを用いることによりＰＣＲにより増幅させる(Ｓaiki等、Ｓcience、２３９巻(１９８５)、４８７〜４９１ページ)。得られた増幅されたＰＣＲ生成物の分析および定量を、レーザー誘起蛍光測定手段を有する自動ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied  Ｂiosystemsの３７３Ａジーン−スキャナー)の助けにより行った。この装置は、変性条件下においてポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動により蛍光ラベルのＰＣＲ生成物を大きさにより分離し、その量を定量的に測定することができる。試料中のある配列のコピー数を、染色体ＤＮＡおよび内部標準のＰＣＲ生成物について得られた強度を基準にして測定する。ＤＮＡの標準の質量当りの増幅された反復染色体配列の数の間の与えられた比を用いることにより(「検量線の提供」項参照)、試料中に存在する全染色体ＤＮＡへの直接的結論を引き出すことが可能である。
【００４１】
１．２  核酸の抽出
試料５００μlに５μlの１Ｍトリス／ＨＣl(pＨ８．０)および１０μlのプロテナーゼＫ(Ｂoehringer  Ｍanheim、２０mg／ml)、および２０μlの２０％ＳＤＳ溶液を加える。一定量の標準核酸および１μgのヘリング(herring)精液ＤＮＡを加え、その試料を５６℃で１時間インキュベートする。その試料をフェノールおよびクロロホルムで首尾よく抽出し、１０μlのグリコゲン(Ｂoehringer  Ｍanheim、２０mg／ml)を加える。その後ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離し、ペレットを洗滌し、最終的に水に再溶解する。
【００４２】
１．３  ＰＣＲ
公知の方法におけるＰＣＲセットアップは、抽出された核酸のアリコート、ＰＣＲ緩衝液(Ｂoehringer  Ｍanheim)、ＭgＣl2、dＮＴＰ、プライマー、Ｔaq−ＤＮＡポリメラーゼ(Ｂoehringer  Ｍanheim、５．０Ｕ／μl)および水を含む。ＰＣＲは緩衝液および酵素の製造者の指示に従い、および一般的な作業指示に従い［Ｍullis等、Ｍethods  in  Ｅnzymology、１５５巻(１９８７)、３３５ページ］ＰＣＲ装置(Ｐerkin−ＥlmerのＧeneＡmp  Ｓystem  ９６００)で行う。
【００４３】
１．４  生成物の分析
ＰＣＲ生成物を測定および定量するために、ＰＣＲ溶液から０．５〜１．０μlを取り出し、Ａpplied  Ｂiosystemsの３７３Ａ装置および特別なジーンスキャンソフトウェアで製造者の指示に従い分析する。
【００４４】
２．１  実施例１:  ゲノムモンキーＤＮＡの定量
この定量において、いわゆる「Ａlu  繰返し」配列中の高度に保存された領域に結合し、１４６bp断片を増幅するプライマーを用いる［Ｊelinek等、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．５１巻(１９８２)、８１３〜８４４ページ］。すなわち、
【００４５】
【化２】
Ａlu  Ａ２／２:  GCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGT  bp  149-176
(配列番号１)
Ａlu  Ｂ:  GAGACAGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGG  bp  294-267
(配列番号２)
(番号付けはＢatzer等による)。
【００４６】
プライマーはホスホアミダイト化学を用いてＤＮＡシンセサイザー(ＡppliedＢiosystems  ３９４  ＤＮＡ  Ｓinthesizer)で調製した。
標準プラスミドpＡlu２０はプラスミドpＡlu−wtから誘導され、pＡlu−wtは公知のpＣＲＩＩプラスミド(インビトロゲンの)およびpＣＲＩＩプラスミドの多数のクローニング部位における挿入物からなり、該挿入物はＢatzer等からのＡlu繰返し特異配列のbp１４８〜２９４を含む。
pＡlu２０においてはbp１７８〜１９７を削除した。そのプラスミドを精製し(ＱＵＩＡＧＥＮ法)、濃度を２６０nmにおける分光学的測定により測定した。それをＥcoＲＩで解裂させ、１０mＭトリス／ＨＣl(pＨ８)／０．１mＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中に希釈した［Ｓambrook等、Ｍolecular  Ｃloning、第２版、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌab  Ｐress、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor(１９８９)］。
標準および野性型ＤＮＡのＰＣＲ生成物の長さは１２６および１４６bpである。
【００４７】
２．１  モンキーＤＮＡを用いる検量線の提供
ゲノムモンキーＤＮＡの１pg当りのＡluコピー数を測定するため、３つの検量用実験を行った(ブランク、２pg、５pg、１０pg、２０pg、４０pg、６０pg、１００pg  ＤＮＡ／ml)。得られたすべてのデータ(濃度段階当り６つのＰＣＲ)を表１に要約し、回帰(リグレッション)直線を図１に説明する。
【００４８】
【表１】
0003691556.tif 000002
0003691556.tif 000003
【００４９】
ＤＮＡ:  pg／mlで表したＤＮＡ
ＣＦ:  見出されたコピー
ＲＧ:  リグレッション(regression)
ＭＶ:  平均値
ＳＤ:  標準偏差
ＶＣ:  変動係数
【００５０】
データの計算は次の関係により行った。
面積(試料):面積(pＡlu−２０)＝x
Ｘ−(面積(ブランク)):(面積(pＡlu−２０))＝y(補正した面積比)
y×１０００００＝５００μlの試料中のコピー数＝z(５００μlを抽出し、標準プラスミドの１０００００コピーを加えた)
z×２＝ml当りのコピー数
リグレッションの直線(y＝４５３３．９＋８７２０．１x)を計算した後、ゲノムモンキーＤＮＡpg当りの９２００コピーの平均値を得た。
【００５１】
２．２  染色体のモンキーＤＮＡ(ベロ(vero)細胞)の定量
Ｂarrett等［ＡＩＤＳ  Ｒesearch  and  Ｈuman  Ｒetroviruses、５巻(１９８９)、１５９〜１７１頁］により製造したワクチンバッチの前段階物を、ＤＮＡ抽出、およびプライマーＡlu Ａ２／２およびＡlu Ｂ、並びに同じプライマーによって認識されるが異なった大きさのＰＣＲ生成物を生じる内部標準(pＡlu２０)の助けによる定量的ＰＣＲにより分析した。分析の結果を表２および図２〜図１０に説明する。
【００５２】
表２に測定した試料の種類、程度および測定値を掲げる。１欄は標準プラスミドpＡlu２０のコピー数を示す;  ２欄は試料の希釈段階を示し、１は希釈しない試料である;  ３欄は試料の抽出した体積を示す、４および５欄は試料のタイプを示す(gp１６０製品のバッチ数;緩衝液および標準の希釈);  ６欄は試料１ml当りのＶeroの全ＤＮＡのpgで表した測定値を示す;  ７欄はこれらの測定の平均値を示す;  ８欄は試料を分析したレーンの数を示す(図２〜１０も参照);  ９および１０欄は測定した標準ピークの面積および測定すべき染色体ＤＮＡのピークの面積を示す。第１線は対照線である。
【００５３】
【表２】
0003691556.tif 000004
【００５４】
図２〜１０はＰＣＲ生成物の定量的測定のグラフ的な評価を説明する。ＰＣＲ生成物(および副生物)の蛍光シグナルの強度を様々なレーンで説明する。その生成物はその定義された大きさで同定される(bpで)。標準pＡlu２０(Ｓ)は１２６bpに表れ、野性型のピーク(Ｐ)は１４６bpに表れる。ピーク面積およびＤＮＡ量の計算を表２に示す。
【００５５】
３．１．染色体チキンＤＮＡの定量
プライマーとＰＣＲの条件を最高に活用するという考えは、１mlの試料あたり１pg〜１００pgの濃度範囲のチキンのＤＮＡにおける正確なそして特異的な測定である。pg領域での測定の望ましい特異性と感度を得るために反復ＤＮＡファミリーの配列をＰＣＲの標的配列として選んだ。これらのＤＮＡファミリーは種に非常に特異的であるばかりでなく、ゲノム中の非常に多数のコピーがあり、したがって少量の特異的ＤＮＡの測定のための基準に合致する。アベス(aves)(鳥)のファミリーにおけるＣＲ１反復ＤＮＡファミリーが記載され、ゲノムあたり７０００〜２００００コピー存在すると言われる(Ｓtumpf等、Ｎucleic  Ａcids  Ｒes．、９巻(１９８１)、５３８３〜５３９７ページ)。このファミリーの様々なメンバー間で比較すると、部位２６１〜３９１に高度に保存された領域があることを示す(Ｓtumpf等による番号づけによる)。チキンのＤＮＡを測定するためのプライマーのペアは、その反復配列のアライメント(alignment)により選択され、それはこの保存された配列の内部で特異的に結合し、８４bpの長さを有するＤＮＡフラグメントを増幅する。すなわち、
【００５６】
【化３】
ＣＲ１:   ATGAGGCACTGGAACAGGTTGCCC bp 260-283  配列番号３
ＣＲ１Ａ  CAGGGCCACATCCAGCCTGG      bp 345-326  配列番号４
［Ｓtumpf等(１９８４)による番号づけ］
【００５７】
プライマーはホスホアミダイト化学を用いることによりＤＮＡシンセサイザー(Ａpplied  Ｂiosystems  ３９４  ＤＮＡ  Ｓynthesizer)で調製した。
【００５８】
標準プラスミドpＣＲ１＋１１およびpＣＲ１−９は、pブル−スクリプト(pＢluescript)ベクターのＮcoＩおよびＳacI部位間に、２６０〜３４５位置(Ｓtumph等による)からのＣＲ１に由来する配列を含む合成ヌクレオチドを挿入することにより得た。pＣＲ１＋１１の場合、ＣＲ１配列は１１ヌクレオチドの挿入を含み、標準プラスミドpＣＲ１−８については３０２位置(Ｓtumph等による)における８ヌクレオチドの削除を含む。それ故これら標準プラスミドから誘導されたＰＣＲ生成物は長さが９５bpまたは７６bpである。そのプラスミドを精製し(ＱＵＩＡＧＥＮ法)、濃度を２６０nmにおける分光学的測定により測定する。それをＥcoＲＩで解裂させ、１０mＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣl(pＨ８)／０．１mＭ  ＥＤＴＡ緩衝液に希釈した［Ｓambrook等、Ｍolecular  Ｃloning、第２版、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌab  Ｐress、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor(１９８９)］。
【００５９】
検量用の直線を２．１と同様提供した。実験において２００、４０、２０、１０、４および２pgのゲノムＤＮＡをチキンの細胞(ＣＥＦ−細胞)から抽出し、蛍光ラベルプライマーＣＲ１およびＣＲ１Ａを用いるＰＣＲに付した。特異性の対照として１００pgのマウスおよびヒトの染色体ＤＮＡもＰＣＲに付した。１０μlの水がネガティブ対照として役立った。
【００６０】
分析の結果を表３および図１１〜１４に説明する。
表３は測定した試料の種類、程度、および測定値を示す。１欄には測定の数(図１１〜１４中の１レイン数に対応する)を示す。２欄はＣＥＦ細胞のゲノムＤＮＡの用いた量を示す;３欄は測定したピークの面積を示す。
【００６１】
【表３】
0003691556.tif 000005
【００６２】
図１１〜１４にはＰＣＲ生成物測定の図的な評価を示す。ＰＣＲ生成物(および副生物)の蛍光シグナルの強度を様々なレーンで示す。生成物はそれらの定義された大きさ(bpで)により同定できる。野性型のピークが８６bpで生じ、ピーク面積は表３に示す。
チキンのＤＮＡを用いたすべてのレーンにおいて、定義された(defined)ピークが８６bpに生じる。これとは対照的に、大量のヒトまたはマウスを用いたとしても有意な量の８６bp特異的な生成物は検出されなかった。これらの結果をベースにして、染色体のチキンＤＮＡの検出限界は本発明の方法においては２pg／ml未満であると決定できる。
【００６３】
３．２．チキンＤＮＡの定量
チキンＤＮＡ２５、１０、５、２.５および１pg／mlの希釈物および水を抽出し、ＰＣＲに付した。表４は、加えた標準プラスミドpＣＲ１＋１１およびプラスミドpＣＲ１−８の数(１および２欄)、希釈(３欄)、体積(４欄)、試料の記述(５欄)、コメント(６欄)、−標準(７欄)または＋標準(８欄)を用いて計算した試料中のＣＲ１配列の数、チキンＤＮＡのpgで表した平均値(９欄)、試料を分析したレーン(１０欄)、−標準のピーク面積(１１欄)、野生型のピーク面積(１２欄)、＋標準のピーク面積(１３欄)を示す。ＰＣＲ生成物の測定の図的な評価を図１５に示す。ＰＣＲ生成物はその大きさにより同定できる。野生型のピークは０４bpに、マイナス標準ピークは７６bpに、プラス標準ピークは９５bpに生じる。蛍光シグナルのピーク面積を表４に示す。
【００６４】
【表４】
0003691556.tif 000006
【００６５】
【配列表】
配列番号:  １
配列の長さ:  ２８
配列の型:  核酸
鎖の数:  １本鎖
トポロジー:  直鎖状
配列の種類:  合成ＤＮＡ
配列
ＧＣＣＧＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴＡＧＴ      ２８
【００６６】
配列番号:  ２
配列の長さ:  ２８
配列の型:  核酸
鎖の数:  １本鎖
トポロジー:  直鎖状
配列の種類:  合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧ      ２８
【００６７】
配列番号:  ３
配列の長さ:  ２４
配列の型:  核酸
鎖の数:  １本鎖
トポロジー:  直鎖状
配列の種類:  合成ＤＮＡ
配列
ＡＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＣＣＣ      ２４
【００６８】
配列番号:  ４
配列の長さ:  ２０
配列の型:  核酸
鎖の数:  １本鎖
トポロジー:  直鎖状
配列の種類:  合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ        ２０
【図面の簡単な説明】
【図１】  染色体のモンキーのＤＮＡについての検量用直線を示す。ｐｇ／ｍｌで表したゲノムＤＮＡ量をｍｌあたりの見出されたコピー数に対してプロットした。
【図２】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図３】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図４】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図５】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図６】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図７】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図８】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図９】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１０】  染色体のモンキーＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１１】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１２】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１３】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１４】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１５】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１６】  染色体のチキンＤＮＡの定量の結果を示す。
【図１】
0003691556.tif 000007
【図２】
0003691556.tif 000008
【図３】
0003691556.tif 000009
【図４】
0003691556.tif 000010
【図５】
0003691556.tif 000011
【図６】
0003691556.tif 000012
【図７】
0003691556.tif 000013
【図８】
0003691556.tif 000014
【図９】
0003691556.tif 000015
【図１０】
0003691556.tif 000016
【図１１】
0003691556.tif 000017
【図１２】
0003691556.tif 000018
【図１３】
0003691556.tif 000019
【図１４】
0003691556.tif 000020
【図１５】
0003691556.tif 000021
【図１６】
0003691556.tif 000022