(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的に活性な化合物を同定するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）潜在的な薬学的に活性な化合物を投与された哺乳動物由来の陰茎組織中の、インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量をインビトロ分析するための手段；ならびに
ｂ）該インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体の量の増加および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量の減少を引き起こす化合物を選択することを選択することを指示する、指示書
を含む、キット。
【請求項２】
前記状態が勃起機能不全である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
請求項２に記載のキットであって、前記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、病的状態の勃起機能不全、加齢依存性の勃起機能不全または勃起機能不全の疾病素質である、キット。
【請求項４】
請求項１〜３のうちの１項に記載のキットであって、前記サンプルが、前記動物由来の陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルである、キット。
【請求項５】
請求項１〜４のうちの１項に記載のキットであって、ここで、前記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、キット。
【請求項６】
請求項５に記載のキットであって、ここで、前記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、前記サンプル中の該Ｅｘ１１＋−改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対して、該Ｅｘ１１−−改変体の量を比較することによって決定される相対量である、キット。
【請求項７】
請求項１〜６のうちの１項に記載のキットであって、ここで、前記インビトロ分析が、前記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードする核酸の分析を含む、キット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットであって、ここで、前記インビトロ分析が、前記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、キット。
【請求項９】
請求項１〜８のうちの１項に記載のキットであって、ここで、前記インビトロ分析が、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体タンパク質および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体タンパク質の分析を含む、キット。
【請求項１０】
請求項７〜９のうちの１項に記載のキットであって、ここで、前記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、キット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちの１項に記載のキットであって、ここで、前記哺乳動物がげっ歯類である、キット。
【請求項１２】
前記げっ歯類がラットである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちの１項に記載のキットであって、前記指示書は、前記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量を、前記潜在的な薬学的化合物の投与前に同じ動物において決定された同じスプライス改変体の量と比較することをさらに指示する、キット。
【請求項１４】
インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１〜１３のうちの１項に従って、薬学的に活性な化合物を同定する工程；および
ｂ）該化合物を薬学的に受容可能なキャリアと処方する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記薬学的組成物が非経口投与のために処方される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物が注射による投与のために処方される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的組成物が、局所投与のために処方される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬学的組成物が、経口投与のために処方される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬学的組成物が、投薬量単位形態で処方される、請求項１４〜１８のうちの１項に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物におけるインスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態を検出する方法であって、該哺乳動物の陰茎組織におけるインスリンレセプタースプライス改変体の量をインビトロ分析する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記インスリンレセプタースプライス改変体が、Ｅｘ１１−−改変体および／またはＥｘ１１＋−改変体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態が勃起機能不全である、請求項２０〜２１のうちの１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、加齢依存的勃起機能不全、または勃起機能不全に対する疾病素質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のうちの１項に記載の方法であって、前記哺乳動物から陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルのようなサンプルを取り出す工程、ならびに該サンプル中のインスリンレセプタースプライス改変体の量を分析する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のうちの１項に記載の方法であって、ここで、分析される前記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、分析される前記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、前記サンプル中の、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対する、Ｅｘ１１−−スプライス改変体の量の比較によって決定される相対量である、方法。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のうちの１項に記載の方法であって、ここで、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードする核酸の分析を含む、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のうちの１項に記載の方法であって、ここで、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプタータンパク質の分析を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のうちの１項に記載の方法であって、ここで、前記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２０〜３１のうちの１項に記載の方法であって、前記インスリンレセプタースプライス改変体の量を、前記状態に罹患していないコントロール哺乳動物のインスリンレセプタースプライス改変体の量と比較する工程をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の分野）
本発明は、インスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の処置のための、薬学的に活性な化合物を同定する方法に関する。本発明はさらに、インビトロのアッセイを使用する、哺乳動物における状態を診断する方法に関する。本発明はまた、インスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の処置のための、薬学的組成物を調製するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
陰茎の勃起応答は、性的刺激に応答して首尾よい貫入および性交を可能にする、十分な硬さを増大および到達する能力に依存する。このプロセスは、同時の静脈閉塞と組み合わせた、陰茎海綿体および陰茎小動脈中の平滑筋細胞の弛緩の結果として生じ、陰茎海綿体における血液の保持をもたらす。非アドレナリン作用性の、非コリン作用性の神経伝達物質および血管作用性の物質は、平滑筋の緊張の局所的制御を媒介する。能動的な平滑筋の弛緩は、正常な勃起における中心的な段階であると考えられ、そして血管性インポテンスのほとんどの場合に存在する勃起機能不全に関与する重要な段階であり得る（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照のこと）。
【０００３】
勃起機能不全は、少なくとも５０％の試みにおいて、性交に十分な勃起を一貫して獲得または維持できないこととして、定義される（例えば、非特許文献４を参照のこと）。現在、勃起機能不全は、患者の病歴または陰茎のプレチスモグラフィによって決定される。
【０００４】
勃起機能不全の重要な危険因子の１つは、年齢であり、これは、一般に、性欲の減少と関連する（例えば、非特許文献５を参照のこと）。この状態において通常見出される問題は、陰茎腫脹の持続時間および程度の減少である。勃起機能不全は、しばしば、血管疾患（例えば、動脈硬化および高血圧）を同時に示すが、海綿体組織における変性性の超微細構造的な細胞変化もまた、勃起不全と関連することが公知である（例えば、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと）。
【０００５】
アンドロゲンは、男性の性的挙動（陰茎勃起を含む）のいくつかの局面に対する、主な刺激効果を有することが、長く知られてきた。性機能の低下した男性のアンドロゲン処置は、性的な関心および活動を回復することが示されている（例えば、非特許文献７、非特許文献８を参照のこと）。過去数年、いくつかの研究が、ラットの勃起応答に対する、去勢およびテストステロン置換の影響を調査してきた（例えば、非特許文献７を参照のこと）。陰茎において、アンドロゲンの枯渇は、平滑筋のアポトーシス、結合組織含量の相対的増加、および陰茎における機能の低下した弛緩能力を生じる（例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１を参照のこと）。さらに、アンドロゲンは、ラットにおいて、ＮＯ誘導性の勃起活性に最も重要であることが示された（例えば、非特許文献１２を参照のこと）。勃起のＮＯ媒介性の刺激に関与する、主なアンドロゲンは、ジヒドロテストステロンである（例えば、非特許文献１３、非特許文献１４を参照のこと）。従って、加齢が関連する循環アンドロゲンレベルの低下は、加齢が関連する勃起機能不全に寄与し得る可能性があるが、その証拠は、これまでいまだ入手できていない。
【０００６】
勃起機能に重要な関連性を有する別のホルモンは、インスリンであり、これは、血管平滑筋、血管内皮またはこれら両方のいずれかに関与する、多くの可能性のある機構によって引き起こされる血管拡張を誘導し得る（例えば、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８を参照のこと）。インスリンは、過分極および減少したカルシウム流入によって、血管平滑筋に対する直接的な弛緩効果を有することが示されている。インスリンは、培養内皮細胞においてｅＮＯＳの発現を調節することによって、ＮＯの生成を増加させ得ることがさらに示唆され、このことは、インスリンレセプターを介したＮＯＳの活性化を示す（例えば、非特許文献１９、非特許文献２０を参照のこと）。従って、インスリンは、血管緊張を調節し得る。血管損傷から主に生じる、糖尿病に関連する勃起機能不全は、十分調査されている（例えば、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３を参照のこと）。
【０００７】
勃起機能不全は、糖尿病に一般的であるので、勃起機能におけるインスリンの関与は、十分実証されている（例えば、非特許文献２１、非特許文献２４を参照のこと）。ラット陰茎の平滑筋細胞の、一酸化窒素制御された血管拡張および血管収縮の系における、インスリンの可能な役割はまた、インスリンをｅＮＯＳの活性化と関連させる大動脈内皮細胞におけるインスリンの血管拡張効果を実証することによって、提案されてきた（例えば、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２５を参照のこと）。
【０００８】
インスリンの生物学的効果は、膜糖タンパク質によって媒介され、この膜糖タンパク質は、インスリンを結合する２つの細胞外α−サブユニット、および２つの膜貫通β−サブユニットから構成され、細胞内のインスリン誘導性シグナルを伝達するための、固有のチロシンキナーゼ活性を保有する（例えば、非特許文献２６、非特許文献２７を参照のこと）。ヒトインスリンレセプターは、２２個のエキソンからなり、これは、α−サブユニット（エキソ１〜１１）およびβ−サブユニット（エキソン１２〜２２）をコードする（例えば、非特許文献２８を参照のこと）。成熟インスリンレセプターは、２つのアイソフォームとして存在し、これらは、α−サブユニットのカルボキシ末端で１２アミノ酸が存在するか存在しないかによって異なる。これらの２つのレセプターアイソフォームは、３６塩基対のエキソン１１の組織特異的な選択的スプライシングによって生成される（例えば、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１を参照のこと）。これら２つのスプライスアイソフォーム（Ｅｘ１１＋／Ｅｘ１１−）の発現は、ヒト、ラットおよびサルにおいて、組織型に依存して変化する（例えば、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２を参照のこと）。培養細胞中に発現された２つのインスリンレセプターは、異なる機能的特性を示す。エキソン１１を欠くレセプター改変体（Ｅｘ１１−）は、エキソン１１を含む改変体（Ｅｘ１１＋）よりも、インスリンに対するより高い親和性（例えば、非特許文献３４、非特許文献３５を参照のこと）、およびより高い内部移行速度（例えば、非特許文献３６を参照のこと）を示す。対照的に、Ｅｘ１１＋アイソフォームは、より高いインスリン刺激されたチロシンキナーゼ活性を有する（例えば、非特許文献３７を参照のこと）。
【０００９】
レセプターの特性は、基本的にスプライシングによって影響されることが報告されている（例えば、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３を参照のこと）。一方では、Ｅｘ１１＋は、増強されたレセプターの自己リン酸化およびレセプターの基質リン酸化を示し、この形態が、Ｅｘ１１−よりもより効率的にシグナル伝達することを示唆する（例えば、非特許文献３７を参照のこと）。他方では、Ｅｘ１１−レセプタータンパク質は、インスリンに対するより高い親和性および増加した内部移行速度を示す（例えば、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６を参照のこと）。
【００１０】
肝臓、筋肉および心臓におけるインスリンレセプターの発現に対する加齢の影響は、Ｖｉｄａｌらによって分析された（例えば、非特許文献３８を参照のこと）。この著者らは、加齢が、肝臓および心臓において、総インスリンレセプターｍＲＮＡレベルの有意な減少を誘導することを実証したが、筋肉については変更が記載されなかった。３つ全ての組織において、Ｅｘ１１＋  ｍＲＮＡの割合は、有意に減少した。Ｗｉｅｒｓｍａらによる研究（例えば、非特許文献３９を参照のこと）は、１２月齢のラットが、肝臓、心臓および脛骨筋におけるＥｘ１１＋  ｍＲＮＡの相対的発現の有意な減少によって特徴付けられたことを明らかにした（例えば、非特許文献３９を参照のこと）。他方では、彼らは、加齢の影響が、Ｅｘ１１−  ｍＲＮＡの改変なしに、これらの組織中のＥｘ１１＋  ｍＲＮＡの絶対レベルの減少に一致することを示した。
【００１１】
現在、勃起機能不全を処置するための医薬は、ほとんど存在しない。しかし、これらの医薬は、全ての患者において効果的であるわけではない。さらに、この化合物の副作用が、処置を必要とする多くの患者に対して、この化合物を使用することを不可能にしている。
【００１２】
結果的に、勃起機能不全の処置において有用な新規化合物を同定する必要性がなお存在する。しかし、現在まで、化合物がこのような状態の処置において有効であるか否かを評価することを可能にする、信頼できるスクリーニング方法は存在しない。
【００１３】
【非特許文献１】
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｋ−Ｅ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｇ．１９９５  ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ  ７５：１９１−２３６
【００１４】
【非特許文献２】
Ｌｕｅ  Ｔ，Ｄａｈｉｙａ  Ｍ．１９９７  Ｍｏｌ  Ｕｒｏｌ  １：３５−４８
【００１５】
【非特許文献３】
Ｕｄｅｌｓｏｎ  Ｄ，Ｎｅｈｒａ  Ａ，Ｈａｔｚｉｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｄ，Ａｚａｄｏｉ  Ａ，Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ＲＢ，Ｋｒａｎｅ  ＲＪ，Ｓａｅｎｚ  ｄｅ  Ｔｅｊａｄａ  Ｉ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｉ．１９９８  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｐｏｔ  Ｒｅｓ  １０：１５−２４
【００１６】
【非特許文献４】
Ｆｒａｎ  Ｅ，Ｋａｉｓｅｒ  ＭＤ．１９９９  Ｍｅｄ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ８３：１２６７−１２７８
【００１７】
【非特許文献５】
Ｍｏｎｇａ  Ｍ．１９９９  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｕｒｏｌ  ９：２７−３７
【００１８】
【非特許文献６】
Ｍｏｒｇｅｎｔａｌｅｒ  Ａ．１９９９  Ｌａｎｃｅｔ  ３５４：１７１３−１７１８
【００１９】
【非特許文献７】
Ｍｉｌｌｓ  ＴＭ，Ｄａｉ  Ｙ，Ｓｔｏｐｐｅｒ  ＶＳ，Ｌｅｗｉｓ  ＲＷ．１９９９  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６４：６０５−６０９
【００２０】
【非特許文献８】
Ａｖｅｒｓａ  Ａ，Ｉｓｉｄｏｒｉ  ＡＭ，Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｏ  ＭＵ，Ｃａｐｒｉｏ  Ｍ，Ｆａｂｂｒｉｎｉ  Ｅ，Ｒｏｃｃｈｉｅｔｔｉ−Ｍａｒｃｈ  Ｍ，Ｆｒａｊｅｓｅ  Ｇ，Ｆａｂｂｒｉ  Ａ．２０００  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｉｎｏｌ  ５３：５１７−５２２
【００２１】
【非特許文献９】
Ｂａｓｋｉｎ  ＬＳ，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＲＳ，Ｄｉ  Ｓａｎｄｒｏ  ＭＪ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＳＷ，Ｌｉｐｓｈｕｌｔｚ  Ｊ，Ｃｕｎｈａ  ＧＲ．１９９７  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １５８：１１１３−１１１８
【００２２】
【非特許文献１０】
Ｓｈａｂｓｉｇｈ  Ｒ．１９９７  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １５：２１−２６
【００２３】
【非特許文献１１】
ＴｒａｉｓｈＡＴ，Ｐａｒｋ  Ｋ，Ｋｉｍ  ＮＮ，Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ＲＢ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｉ．１９９９  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：１８６１−１８６８
【００２４】
【非特許文献１２】
Ｒｅｉｌｌｙ  ＣＭ，Ｚａｍｏｒａｎｏ  Ｐ，Ｓｔｏｐｐｅｒ  ＶＳ，Ｍｉｌｌｓ  ＴＭ．１９９７  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ  １８：１１０．１１５
【００２５】
【非特許文献１３】
Ｌｕｇｇ  ＪＡ，Ｒａｊｆｅｒ  Ｊ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ  ＮＦ．１９９５  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：１４９５−１５０１
【００２６】
【非特許文献１４】
Ｓｃｈｉｒａｒ  Ａ，Ｂｏｎｎｅｆｏｎｄ  Ｃ，Ｍｅｕｓｎｉｅｒ  Ｃ，Ｄｅｖｉｎｏｙ  Ｅ．１９９７  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：３０９３−３１０２
【００２７】
【非特許文献１５】
Ｆｅｅｎｅｒ  ＥＰ，Ｋｉｎｇ  ＧＬ．１９９７  Ｌａｎｃｅｔ  ３５０（ｓｕｐｐｌ１）：ＳＩ９−ＳＩ１３
【００２８】
【非特許文献１６】
Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｕ，Ｓａｒｔｏｒｉｏ  Ｃ．１９９７  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：４１０４−４１１３
【００２９】
【非特許文献１７】
Ｂａｒｏｎ  ＡＤ，Ｂｒｅｃｈｔｅｌ−Ｈｏｏｋ  Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ，ＣｒｏｎｉｎＪ，Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＨＯ．１９９６Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１：Ｅ１０６７−Ｅ１０７２
【００３０】
【非特許文献１８】
Ｙｋｉ−Ｊａｒｖｉｎｅｎ  Ｈ，Ｕｔｒｉａｉｎｅｎ  Ｔ．１９９８  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１：３６９−３７９
【００３１】
【非特許文献１９】
Ｚｅｎｇ  Ｇ，Ｑｕｏｎ  ＭＪ．１９９６  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：８９４−８９８
【００３２】
【非特許文献２０】
Ｋｕｂｏｋｉ  Ｋ，Ｊｉａｎｇ  ＺＨ，Ｔａｋａｈａｒａ  Ｎ，Ｈａ  ＳＷ，Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｍ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｔ，Ｆｅｅｎｅｒ  ＥＰ，Ｈｅｒｂｅｒｔ  ＴＰ，Ｒｈｏｄｅｓ  ＣＪ，Ｋｉｎｇ  ＧＬ．２０００  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：６７６．６８１
【００３３】
【非特許文献２１】
Ｅｌ−Ｒｕｆａｉｅ  ＯＥＦ，Ｂｅｎｅｒ  Ａ，  Ａｂｕｚｅｉｄ  ＭＳＯ，Ａｌｉ  ＴＡ．１０９７  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ  Ｒｅｓ  ４３：６０５−６１２
【００３４】
【非特許文献２２】
ＭｃＫｅｎｄｒｉｃｋ  ＪＤ，Ｓａｌａｓ  Ｅ，Ｄｕｂｅ  ＧＰ  ＭｕｒａｔＪ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＪＣ，Ｒａｄｏｍｓｋｉ  ＭＷ，１９９８  Ｂ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １２４：３６１−３６９
【００３５】
【非特許文献２３】
Ｈｏｎｉｎｇ  ＭＬＨ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＪ，Ｂａｎｇａ  ＪＤ，Ｓｔｒｏｅｓ  ＥＳＧ，Ｒａｂｅｌｉｎｋ  ＴＪ．１９９８  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  １４：２４１−２４９
【００３６】
【非特許文献２４】
Ｒｅｈｍａｎ  Ｊ，Ｃｈｅｎｖｅｎ  Ｅ，Ｂｒｉｎｋ  Ｐ，ＰｅｔｅｒｓｏｎＢ，Ｗａｌｃｏｔｔ  Ｂ，Ｗｅｎ  ＹＷ，Ｍｅｌｍａｎ  Ａ，Ｃｈｒｉｓｔ  Ｇ．１９９７  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４１）：Ｈ１９６０−１９７１
【００３７】
【非特許文献２５】
Ｋａｈｎ  ＡＭ，Ｈｕｓｉｄ  Ａ，Ａｌｌｅｎ  ＪＣ，Ｓｅｉｄｅｌ  Ｃ，Ｓｏｎｇ  Ｔ．１９９７  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３０：９２８−９３３
【００３８】
【非特許文献２６】
Ｒｏｓｅｎ  ＯＭ．１９８７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１４５２−１４５８
【００３９】
【非特許文献２７】
Ｗｈｉｔｅ  ＭＦ，Ｋａｈｎ  ＣＲ．１９９４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１−４
【００４０】
【非特許文献２８】
Ｓｅｉｎｏ  Ｓ，Ｓｅｉｎｏ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉ  Ｓ，Ｂｅｌｌ  ＧＩ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１１４−１１８
【００４１】
【非特許文献２９】
Ｓｅｉｎｏ  Ｓ，Ｂｅｌｌ  ＧＩ．１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １５９：３１２−３１６
【００４２】
【非特許文献３０】
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＢＪ，ＤｕｄｌｅｙＡＬ．１９９０  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ４：２３５−２４４
【００４３】
【非特許文献３１】
Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｋ，Ｍｕｒａｋａｗａ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｘｕ  Ｇ，Ｓｉｍａ  ＡＡＦ．２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ１６：３５４−３６３
【００４４】
【非特許文献３２】
Ｍｏｌｌｅｒ  ＤＥ，Ｙｏｋｏｔａ  Ａ，Ｃａｒｏ  ＪＦ，Ｆｌｉｅｒ  ＪＳ．１９８９  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ３：１２６３−１２６９
【００４５】
【非特許文献３３】
Ｈｕａｎｇ  Ｚ，Ｂｏｄｋｉｎ  ＮＬ，Ｏｒｔｍｅｙｅｒ  ＨＫ，Ｈａｎｓｅｎ  ＢＣ，Ｓｈｕｌｄｉｎｅｒ  ＡＲ．１９９４  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１４：１２８９−１２９６
【００４６】
【非特許文献３４】
Ｍｏｓｔａｆ  Ｌ，Ｇｒａｋｏ  Ｋ，Ｄｕｌｌ  ＴＪ，Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  Ｌ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ，ＭｃＣｌａｉｎ  ＤＡ．１９９０  ＥＭＢＯ  Ｊ  ９：２４０９−２４１３
【００４７】
【非特許文献３５】
ＭｃＣｌａｉｎ  ＤＡ．１９９１  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ５：７３４−７３９
【００４８】
【非特許文献３６】
Ｋｅｌｌｅｒｅｒ  Ｍ，  Ｌａｍｍｅｒｓ  Ｒ，Ｅｒｍｅｌ  Ｂ，Ｔｉｐｐｍｅｒ  Ｓ，Ｖｏｇｔ  Ｂ，Ｏｂｅｒｍａｉｅｒ−Ｋｕｓｓｅｒ  Ｂ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ，Ｈａｒｉｎｇ  ＨＵ．１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：４５８８−４５９８
【００４９】
【非特許文献３７】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｆｌｉｅｒ  ＪＳ，Ｙｏｋｏｔａ  Ａ，Ｂｅｎｅｃｋｅ  Ｈ，Ｂａｃｋｅｒ  ＪＭ，Ｍｏｌｌｅｒ  ＤＥ．１９９１  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：２０５８−２０６６
【００５０】
【非特許文献３８】
Ｖｉｄａｌ  Ｈ，Ａｕｂｏｅｕｆ  Ｄ，Ｂｅｙｌｏｔ  Ｍ，Ｒｉｏｕ  ＪＰ．１９９５  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４４：１１９６−１２０１
【００５１】
【非特許文献３９】
Ｗｉｅｒｓｍａ  ＭＭＬ．Ａｕｂｏｅｕｆ  Ｄ，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ−Ｂａｋｋｅｒ  ＩＭ，Ｒａｄｄｅｒ  ＪＫ，Ｒｉｏｕ  ＪＰ，Ｖｉｄａｌ  Ｈ．１９９７．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７２：Ｅ６０７−Ｅ６１５
【００５２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、勃起機能不全を処置する方法、勃起機能不全を処置するための医薬を提供すること、勃起機能不全の処置において有用な新規化合物を同定すること、そしてこのような化合物がこのような状態の処置において有効であるか否かを評価することを可能にする、信頼できるスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００５３】
【課題を解決するための手段】
（発明の要旨）
この問題は、インスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の処置のための、薬学的に活性な化合物を同定する方法によって解決され、この方法は、以下の工程：
ａ）可能性のある薬学的に活性な化合物を、哺乳動物に投与する工程；ならびに
ｂ）続いて、この哺乳動物の陰茎組織におけるインスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量をインビトロで分析する工程；ならびに
ｃ）インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体の量の増加および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量の減少を生じる化合物を選択する工程、を包含する。
【００５４】
１つの局面において、本発明は、インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的に活性な化合物を同定するためのキットであって、上記キットは、以下：
ａ）潜在的な薬学的に活性な化合物を投与された哺乳動物由来のサンプル中の、インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量をインビトロ分析するための手段；ならびに
ｂ）上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体の量の増加および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量の減少を引き起こす化合物を選択することを選択することを指示する、指示書
を含む、キットを提供する。
【００５５】
１つの実施形態において、上記状態が勃起機能不全である、上記のキットを提供する。
【００５６】
１つの実施形態において、上記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、病的状態の勃起機能不全、加齢依存性の勃起機能不全または勃起機能不全の疾病素質である、上記キットを提供する。
【００５７】
１つの実施形態において、上記サンプルが、上記動物由来の陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルである、上記キットを提供する。
【００５８】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、上記キットを提供する。
【００５９】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、上記サンプル中の上記Ｅｘ１１＋−改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対して、上記Ｅｘ１１−−改変体の量を比較することによって決定される相対量である、上記キットを提供する。
【００６０】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析が、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードする核酸の分析を含む、上記キットを提供する。
【００６１】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析が、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、上記キットを提供する。
【００６２】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析が、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体タンパク質および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体タンパク質の分析を含む、上記キットを提供する。
【００６３】
１つの実施形態において、上記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、上記キットを提供する。
【００６４】
１つの実施形態において、上記哺乳動物がげっ歯類である、上記キットを提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、上記げっ歯類がラットである、上記キットを提供する。
【００６６】
１つの実施形態において、上記指示書は、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量を、上記潜在的な薬学的化合物の投与前に同じ動物において決定された同じスプライス改変体の量と比較することをさらに指示する、上記キットを提供する。
【００６７】
１つの局面において、インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的組成物を調製するための方法であって、上記方法は、以下：
ａ）上記に従って、薬学的に活性な化合物を同定する工程；および
ｂ）上記化合物を薬学的に受容可能なキャリアと処方する工程
を包含する、方法を提供する。
【００６８】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物が非経口投与のために処方される、上記方法を提供する。
【００６９】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物が注射による投与のために処方される、上記方法を提供する。
【００７０】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物が、局所投与のために処方される、上記方法を提供する。
【００７１】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物が、経口投与のために処方される、上記方法を提供する。
【００７２】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物が、投薬量単位形態で処方される、上記方法を提供する。
【００７３】
１つの局面において、哺乳動物におけるインスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態を検出する方法であって、上記哺乳動物の陰茎組織におけるインスリンレセプタースプライス改変体の量をインビトロ分析する工程を包含する、方法を提供する。
【００７４】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプタースプライス改変体が、Ｅｘ１１−−改変体および／またはＥｘ１１＋−改変体である、上記方法を提供する。
【００７５】
１つの実施形態において、上記状態が勃起機能不全である、上記方法を提供する。
【００７６】
１つの実施形態において、上記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、加齢依存的勃起機能不全、または勃起機能不全に対する疾病素質である、上記方法を提供する。
【００７７】
１つの実施形態において、上記哺乳動物から陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルのようなサンプルを取り出す工程、ならびに上記サンプル中のインスリンレセプタースプライス改変体の量を分析する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【００７８】
１つの実施形態において、分析される上記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、上記方法を提供する。
【００７９】
１つの実施形態において、分析される上記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、上記サンプル中の、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対する、Ｅｘ１１−−スプライス改変体の量の比較によって決定される相対量である、上記方法を提供する。
【００８０】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードする核酸の分析を含む、上記方法を提供する。
【００８１】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、上記方法を提供する。
【００８２】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプタータンパク質の分析を含む、上記方法を提供する。
【００８３】
１つの実施形態において、上記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、上記方法を提供する。
【００８４】
１つの実施形態において、上記哺乳動物がヒトである、上記方法を提供する。
【００８５】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプタースプライス改変体の量を、上記状態に罹患していないコントロール哺乳動物のインスリンレセプタースプライス改変体の量と比較する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【００８６】
１つの局面において、インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的に活性な化合物を同定するための方法であって、上記方法は、以下：
ａ）潜在的な、薬学的に活性な化合物を哺乳動物に投与する工程；
ｂ）引続いて、上記哺乳動物由来の陰茎組織中のインスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量をインビトロ分析する工程；ならびに
ｃ）上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体の量の増加および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量の減少を引き起こす化合物を選択する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００８７】
１つの実施形態において、上記状態が勃起機能不全である、上記方法を提供する。
【００８８】
１つの実施形態において、上記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、病的状態の勃起機能不全、加齢依存性の勃起機能不全または勃起機能不全の疾病素質である、上記方法を提供する。
【００８９】
１つの実施形態において、上記動物から陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルのようなサンプルを取り出す工程、ならびに上記サンプル中の上記Ｅｘ１１＋−スプライス改変体および／または上記Ｅｘ１１−−スプライス改変体の量を分析する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【００９０】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、上記方法を提供する。
【００９１】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量が、上記サンプル中の、上記Ｅｘ１１＋−改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対する、Ｅｘ１１−−改変体の量の比較によって決定される相対量である、上記方法を提供する。
【００９２】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析する工程が、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードする核酸の分析を含む、上記方法を提供する。
【００９３】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析する工程が、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、上記方法を提供する。
【００９４】
１つの実施形態において、上記インビトロ分析する工程が、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体タンパク質および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体タンパク質の分析を含む、上記方法を提供する。
【００９５】
１つの実施形態において、上記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、上記方法を提供する。
【００９６】
１つの実施形態において、上記哺乳動物がげっ歯類である、上記方法を提供する。
【００９７】
１つの実施形態において、上記げっ歯類がラットである、上記方法を提供する。
【００９８】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプターのＥｘ１１＋−スプライス改変体および／またはＥｘ１１−−スプライス改変体の量を、上記潜在的な薬学的化合物の投与前に同じ動物において決定された同じスプライス改変体の量と比較する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【００９９】
１つの局面において、哺乳動物においてインスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の診断方法であって、上記哺乳動物の陰茎組織におけるインスリンレセプタースプライス改変体の量をインビトロ分析する工程を包含する、方法を提供する。
【０１００】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプタースプライス改変体が、Ｅｘ１１−−改変体および／またはＥｘ１１＋−改変体である、上記方法を提供する。
【０１０１】
１つの実施形態において、上記状態が勃起機能不全である、上記方法を提供する。
【０１０２】
１つの実施形態において、上記勃起機能不全が、急性勃起機能不全、加齢依存的勃起機能不全、または勃起機能不全に対する疾病素質である、上記方法を提供する。
【０１０３】
１つの実施形態において、上記哺乳動物から陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプルのようなサンプルを取り出す工程、ならびに上記サンプル中のインスリンレセプタースプライス改変体の量を分析する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【０１０４】
１つの実施形態において、分析される上記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、相対量または絶対量である、上記方法を提供する。
【０１０５】
１つの実施形態において、分析される上記インスリンレセプタースプライス改変体の量が、上記サンプル中の、Ｅｘ１１＋−スプライス改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対する、Ｅｘ１１−−スプライス改変体の量の比較によって決定される相対量である、上記方法を提供する。
【０１０６】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードする核酸の分析を含む、上記方法を提供する。
【０１０７】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプター改変体をコードするｍＲＮＡの分析を含む、上記方法を提供する。
【０１０８】
１つの実施形態において、インビトロ分析する工程が、インスリンレセプタータンパク質の分析を含む、上記方法を提供する。
【０１０９】
１つの実施形態において、ここで、上記分析が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロット、または免疫結合アッセイを介して実行される、上記方法を提供する。
【０１１０】
１つの実施形態において、上記上記哺乳動物がヒトである、上記方法を提供する。
【０１１１】
１つの実施形態において、上記インスリンレセプタースプライス改変体の量を、上記状態に罹患していないコントロール哺乳動物のインスリンレセプタースプライス改変体の量と比較する工程をさらに包含する、上記方法を提供する。
【０１１２】
【発明の実施の形態】
驚くべきことに、現在、加齢の間の、陰茎組織におけるインスリンレセプターｍＲＮＡのスプライシング機構の変更が、本質的に、去勢された若齢の被験体における変更と一致することが見出された。このことは、観察されたスプライシングパターンを逆にする薬学的に活性な化合物の能力によって、このような状態の処置において有用な化合物を同定する、改善された可能性を提供する。
【０１１３】
本出願において、用語「Ｅｘ１１＋改変体」は、その配列内にエキソン１１を含むインスリンレセプターのスプライス改変体をいうために使用される。本明細書中で使用される場合、エキソン１１は、インスリンレセプタータンパク質のα−サブユニットのＣ末端部分をコードするエキソンを定義する。哺乳動物において、エキソン１１は、１２アミノ酸をコードする３６ｂｐのフラグメントを含む。
【０１１４】
用語「Ｅｘ１１−改変体」は、本発明に従って使用されて、その配列内にエキソン１１を欠くインスリンレセプターのスプライス改変体をいう。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態において、インスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態は、勃起機能不全である。本発明の文脈において、勃起機能不全は、急性勃起機能不全、病理学的状態、加齢依存性の勃起機能不全、または勃起機能不全の素因であり得る。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、勃起機能不全は、勃起の障害、すなわち、陰茎が、性的刺激に応答して首尾よい貫入のための十分な硬さを増大および到達するか、または維持する能力がないことを定義する。この機能障不全は、一次的（すなわち、恒久的な）機能不全または二次的機能不全（すなわち、別個の状況において同時に生じる機能不全）であり得る。
【０１１７】
勃起機能不全はまた、動脈の（ａｔｅｒｉａｌ）異常に起因する組織の不十分な血液供給のような器官的原因；海綿体の不十分な遮断（例えば、筋細胞変性による）、神経学的疾患（例えば、手術の結果としての神経の機械的損傷）；またはホルモン障害（例えば、テストステロンの枯渇など）に起因し得る。本明細書中で使用される場合、年齢依存性の勃起機能不全は、その発症が、哺乳動物の加齢に関連する勃起機能不全である。
【０１１８】
本発明において使用される場合、勃起機能不全の素因とは、哺乳動物の生理学的状態および遺伝的状態をいい、これは、上記のような勃起機能不全または勃起機能不全に関連する症状の発症の危険性を示す。
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態において、サンプル（例えば、陰茎組織サンプル、血液または血清）は、哺乳動物から採取される。サンプルを採取し、そして、インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量を続いて分析する。レセプタータンパク質またはそれをコードする核酸を細胞から放出するため、サンプルの細胞を、当業者に公知の方法によって溶解させ得る。これらの方法としては、例えば、溶解酵素または界面活性剤（ＳＤＳなど）の細胞サンプルへの添加、ならびに超音波処理または凍結および引き続く解凍によって細胞を破壊することが挙げられる。本発明に従って、サンプルとして、直接陰茎組織を取り巻く血液または血清を使用することもまた可能であり得る。
【０１２０】
分析されるべきインスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量は、相対量または絶対量であり得る。本明細書中で使用される場合、インスリンレセプタースプライス改変体の絶対量とは、規定されたサンプル単位（例えば、μｇ当たり）で検出されるような、この分子の数または重量をいう。分子数は、定量的検出方法（例えば、当業者に公知のＲＴ−ＰＣＲまたは分光測定など）から推測され得る。サンプル単位は、ｍｇまたはｍｌのような、測定の標準的なＩＵＰＡＣ単位によって規定され得る。
【０１２１】
本発明に従って、インスリンレセプタースプライス改変体の相対量は、同じかまたは異なるサンプル由来の、内部コントロールとして使用される第二の分子の量に対して、分子の量を分析することによって決定され得る。
【０１２２】
この目的のために、同時検出は、インスリンレセプタースプライス改変体の検出に使用される条件と同じ条件下で実行され得る。組織サンプルを使用する場合、同時検出は、細胞において構成的に発現される参照分子に関し得る。同時検出に適切な分子は、当該分野で周知であり、そしてとりわけ、グロブリンをコードするｍＲＮＡを含む。特に好ましい実施形態において、インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の相対量は、Ｅｘ１１−スプライス改変体の量を、インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体の量、または酵素（グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））の量と比較することによって、決定される。好ましくは、これら両方は、インスリンスプライス改変体に使用される方法と同じ方法を使用して検出される。
【０１２３】
本発明のさらなる実施形態において、インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量をインビトロで分析する工程は、Ｅｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体コード核酸の分析を包含し得る。好ましくは、分析する工程は、Ｅｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体をコードするｍＲＮＡの量の決定を包含する。あるいは、分析する工程は、Ｅｘ１１＋スプライス改変体タンパク質および／またはＥｘ１１−スプライス改変体タンパク質の量の決定を包含する。
【０１２４】
検出される分子の性質に依存して、分析する工程は、ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲのような核酸増幅、または異なるスプライス改変体を特異的に検出し得るプローブを使用するサザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロットのようなブロット法を包含し得る。分析する工程はさらに、当業者に公知の免疫結合アッセイを包含し得る。例えば、Ｅｘ１１＋改変体を特異的に検出するために、エキソン１１によってコードされた１２アミノ酸フラグメントに対するモノクローナル抗体が産生され得、そしてフルオレセイン−イソチオシアネートのような色素に結合され得る。検出に適した基質に抗体を結合させるための多くの方法は、当該分野で利用可能である。
【０１２５】
もちろん、スプライス改変体を単離し、そしてクロマトグラフ的測定または分光学的測定により（例えば、ＮＭＲ分光法またはＨＰＬＣによって）改変体の相対量または絶対量を分析する手順によって、インスリンレセプタースプライス改変体を検出および単離することもまた、可能である。このような検出に適した方法は、当業者に周知である。
【０１２６】
本発明に従って、薬学的に潜在的に活性な化合物が投与される哺乳動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）であり得る。好ましくは、げっ歯類は、ラットである。
【０１２７】
本発明のさらなる実施形態において、薬学的に活性な化合物を同定するための方法は、インスリンレセプターのＥｘ１１＋スプライス改変体および／またはＥｘ１１−スプライス改変体の量を、薬学的に潜在的に活性な化合物の投与の前に同じ哺乳動物において決定された同じインスリンレセプタースプライス改変体の量と比較する工程をさらに包含する。潜在的に活性な化合物の投与の前および後に、特定のインスリンレセプタースプライス改変体の量を比較することは、この化合物が、罹患した哺乳動物における上記スプライス改変体の量を増加および／または減少させ得るか否かに関する直接的な評価を可能にする。
【０１２８】
本発明は、インスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的組成物を調製するための方法にさらに関し、この方法は、以下：
ａ）本発明の方法に従って薬学的に活性な化合物を同定する工程；および
ｂ）上記化合物を薬学的に受容可能なキャリアと混合する工程、
を包含する。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、例えば、薬物投与に適する、溶媒、分散媒体、コーティング剤および吸収遅延剤を含む。本発明に従って、水、生理食塩水、プロピレングリコール、グリセリン、リンガー液、デキストロース溶液、ヒト血清アルブミンを含む溶液、ならびに不揮発性油が、適切なキャリアとして使用され得る。これらのキャリアの使用は、当業者に周知である。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態に従って、薬学的組成物は、非経口投与のために処方される。例えば、この組成物は、注射による投与のために処方され得る。注射用途に適切な組成物は、一般的に、滅菌水溶液または分散剤を含む。静脈内適用のために、適切なキャリアは、静菌水、またはリン酸緩衝化生理食塩水を含む。この組成物は、微生物の増殖を防止するための薬剤をさらに含み得る。
【０１３１】
あるいは、薬学的組成物は、局所投与について処方され得る。これらの組成物は、通常、界面活性剤のような浸透剤または活性化合物が通過すべき障壁（例えば、皮膚の経皮障壁）を通って浸透するのを可能にするのに有用な他の物質を含む。局所投与のために、薬学的組成物は、標準的な方法に従って、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームの形態で処方され得る。
【０１３２】
他方、薬学的組成物は、経口投与のために処方され得る。これらの組成物は、一般に、不活性または食用のキャリアを含む。経口投与のための組成物は、例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルの形態で提供され得る。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態に従って、薬学的組成物は、投薬単位形態で処方される。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、「投薬単位形態」は、処置される哺乳動物のための単位投薬量として適した物理的に別々の単位に関する。１単位は、所望の治療効果を生成するために十分な所定の量の薬学的組成物を含む。単位投薬形態に寄与する所定の活性化合物の正確な量は、特定の化合物ならびに使用されるキャリアに明確に依存する。
【０１３５】
本発明はさらに、哺乳動物中のインスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の診断の方法に関し、この方法は、この哺乳動物の陰茎組織におけるインスリンレセプタースプライス改変体の量をインビトロで分析する工程を包含する。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態において、陰茎組織において決定されるインスリンレセプタースプライス改変体は、Ｅｘ１１−改変体および／またはＥｘ１１＋改変体である。
【０１３７】
診断される状態は、勃起機能不全であり得る。好ましくは、これは、急性、加齢依存性、または勃起機能不全の素因である。
【０１３８】
この診断方法はさらに、哺乳動物からサンプル（例えば、陰茎組織サンプル、血液サンプルまたは血清サンプル）を取り出す工程、およびサンプル中のインスリンスプライス改変体の量を分析する工程を包含する。
【０１３９】
分析されるインスリンレセプタースプライス改変体の量は、相対量または絶対量であり得る。好ましい実施形態に従って、分析されるインスリンレセプタースプライス改変体の量は、サンプル中のＥｘ１１−スプライス改変体の量の、Ｅｘ１１＋スプライス改変体の量またはＧＡＰＤＨの量に対する比較によって決定される相対量である。
【０１４０】
上記の方法と同様に、分析は、インスリンレセプター改変体をコードする核酸（例えば、インスリンレセプター改変体をコードするｍＲＮＡ）の分析ならびにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ウエスタンブロット、もしくはノーザンブロットまたは免疫結合アッセイによるインスリンレセプタータンパク質の分析を包含し得る。
【０１４１】
本発明に従って、診断が適用される哺乳動物は、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトであり得る。
【０１４２】
本発明の代替的な実施形態に従って、哺乳動物において決定されたインスリンレセプタースプライス改変体の量は、勃起機能不全に罹患していないコントロール哺乳動物のインスリンレセプタースプライス改変体の量と比較される。加齢依存性勃起機能不全を検出するために、コントロール哺乳動物が有利に使用され、これは、診断されるべき哺乳動物よりも若い。好ましくは、その生物学的種に関して、コントロール哺乳動物は、実質的に最大の性活動が予測され得る年齢であるべきである。診断がヒトに適用されるべき限り、コントロール哺乳動物は、好ましくは、１８〜２５歳の間であるべきである。
【０１４３】
本発明の過程において、Ｅｘ１１＋改変体は、若年ラット（３か月齢）において主に発現されるが、Ｅｘ１１−改変体は、２３か月の老年ラット中に最も豊富な改変体を示すことが示された（図２ａ）。さらに、この変更は、心臓、肝臓または筋肉のような他の組織において観察され得ないため、陰茎組織に特異的であることが示された（図３）。本質的に同じ発現パターンが、若年去勢ラット（３か月）について見出された。
【０１４４】
加齢および去勢から生じるスプライス改変体の相対的分布における変化は、陰茎特異的影響であるので、この変化は、陰茎組織の低下したインスリン感受性の原因となり、局所的なインスリン耐性を生じ、それにより、勃起機能不全を発症する。従って、インスリンレセプターｍＲＮＡスプライシングの特定のパターンは、スプライス改変体の１つまたは両方を検出し得るインビトロアッセイを使用して、哺乳動物における勃起機能不全を診断する可能性、およびインスリンレセプターの変更された発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的に活性な化合物を同定する可能性を提供する。
【０１４５】
本発明は、インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的に活性な化合物を同定する方法に関する。本発明はさらに、インビトロアッセイを用いて哺乳動物の状態を診断する方法に関する。本発明はまた、インスリンレセプターの変化した発現によって引き起こされる状態の処置のための薬学的組成物を調製するための方法に関する。
【０１４６】
【実施例】
（実施例１）
（動物および組織）
雄のｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的な実験用ラット飼料および水を適時与えて、標準の飼育条件（１２時間の日照、１２時間の暗闇の周期、２３℃）で維持した。
【０１４７】
ラットを各々４匹づつを含む３つの群に分けた。Ａ群は、３ヶ月齢からなり、Ｂ群は、１４ヶ月齢からなり、そしてＣ群は、２３ヶ月齢のラットを含んだ。陰茎、心臓、肝臓、脳および筋肉の組織片を、動物の屠殺直後に回収した。これらの組織の一部を組織学的評価のためにＢｏｕｉｎ溶液中で固定し、別の部分を、後のＲＮＡ調製のために液体窒素中で凍結した。血液を、ラジオイムノアッセイを用いての、全および遊離テストステロンの決定のために回収した。このアッセイを、製造業者の指示書に従って実施した（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ１２５ＩＲＩＡキット、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｌｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）。
【０１４８】
（実施例２）
（ＲＮＡ調製）
組織サンプル（１００〜２００ｍｇ）を液体窒素中で粉砕した。総ＲＮＡをチオシアン酸グアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｏｃｙａｎａｔｅ）、フェノール−クロロホルム抽出（ｐｅｃＬａｂ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ＲＮＡをイソプロパノールを用いて、−２０℃で２時間、沈降させ、７５％エタノールで洗浄し、ジエチルピロカーボネート水中に溶解し、２６０ｎｍで分光測定的に定量した。全ての調製物の吸光度比は、１．８と２．０との間であった。濃度が、各サンプル中で同一であることを確実にするために、エチジウムブロマイド染色後の１％アガロースゲル電気泳動上で２８ｓＲＮＡの強度を比較した。総ＲＮＡを−８０℃にて、さらに使用するまで保存した。
【０１４９】
（実施例３）
（ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連鎖反応増幅）
第１鎖ｃＤＮＡ合成を、市販のキット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて実施した。簡潔には、４μｇの総ＲＮＡを、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８を用いてプライムし、７０℃で１０分間インキュベートした。各サンプルについて、１×第１鎖緩衝液（ｐｕｆｆｅｒ）、０．２Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰおよび２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を添加した。逆転写を、４２℃で５０分間実施し、７０℃で１５分間加熱することにより終了した。得られたｃＤＮＡテンプレートを−２０℃で保存するか、またはＰＣＲに直接用いた。
【０１５０】
３分間の変性期間の後に、６０秒間９５℃、６０秒間６０℃および６０秒間７２℃の３５サイクルによるＰＣＲ反応を続けた。ＰＣＲを、６μｌ  ｃＤＮＡ、１０ｍＭ各ｄＮＴＰ、５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｈｅｒｍ）ならびに５０ｐｍｏｌのセンスおよびアンチセンスの両方のプライマーを用いて、ＰＣＲ緩衝液中で実施した。各反応物の最終容量は、５０μｌであった。反応生成物（１５μｌ）を２．５％アガロースゲル上で電気泳動した。ＰＣＲに用いたプライマーは、以下の通りである：
・５’−ＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号１；アンチセンス、２４３８位で開始するインスリンレセプターｃＤＮＡ配列に相補的であり（下線）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位も含む）；および
・５’−ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＧＡ−３’（配列番号２；センス、２１８１位からのラットインスリンレセプターｃＤＮＡ配列に同一であり（下線）、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を含む；２５）。
【０１５１】
インスリンレセプターｍＲＮＡスプライス改変体レベルの濃度測定分析を、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ５．０ソフトウェアを用いて実施した。
【０１５２】
２つのインスリンレセプターｍＲＮＡ改変体のｍＲＮＡレベルの割合について、平均値の差の有意性を独立スチューデントｔ−検定により決定した。有意性の閾値を、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１５３】
（実施例４）
（ラットの多様な組織中でのインスリンレセプターｍＲＮＡの選択的スプライシング）
ラットの異なる組織由来の総ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析を、実施例１〜３に従って実施して、若年ラット（３ヶ月齢）の多様な組織中で選択的にスプライシングされたインスリンレセプターｍＲＮＡ改変体の相対量を決定した。ラットインスリンレセプターのエキソン１１スプライス部位に対応するドメインに隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを選択し、アイソフォームＥｘ１１＋（２７３ｂｐ）およびアイソフォームＥｘ１１−（２３７ｂｐ）を示した。スプライシング機構における改変を、濃度測定評価を用いた定量分析により確認した。グリセリンアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを内部標準として用いた。ＧＡＰＤＨの増幅に用いたＰＣＲ−オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の通りであった：
プライマー  ＧＡＰＤＨ−１：５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号３）；および
プライマー  ＧＡＰＤＨ−２：５’−ＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号４）。
【０１５４】
ＰＣＲ反応の結果を、アガロースゲル電気泳動により試験した。図１において見られるように、肝臓においてのみ、より長い改変体が発現していることが観察され、このことは、既に公開されたデータ（２７、２８）と一致する。心臓において、両方の改変体が発現していることが見出され、ｅｘ１１＋アイソフォームがまた優性であった。骨格筋において、両方の改変体は、同程度に発現した。脳において、Ｅｘ１１−改変体の独占的な発現が注目された（図１）。
【０１５５】
（実施例５）
（インスリンレセプタースプライス改変体の陰茎における相対的発現および加齢の影響）
陰茎組織のＲＴ−ＰＣＲ分析を、実施例１〜３に従って実施した。この結果を図２ａに示す。若年ラット（３ヶ月齢）の陰茎において、より長いＥｘ１１＋アイソフォームが、ほぼ独占的に発現されることが見出された。対照的に、老年ラット（２３ヶ月齢）の陰茎組織において、より短いＥｘ１１−改変体が優先的に発現した。中年の動物（１４ヶ月齢）における２つのスプライス改変体の分布は、老年ラットと同様であった（図２ａ）。しかし、Ｅｘ１１−インスリンレセプターの最も高い発現レベルは、老年ラットにおいて検出され得た（図２ａ）。
【０１５６】
若年ラット対老年ラットの、陰茎組織におけるインスリンレセプターＥｘ１１＋ｍＲＮＡの定量測定は、若年ラットの陰茎における最も優勢なインスリンレセプター形態が、Ｅｘ１１＋であることを確証した（８５．９％）。対照的に、中年および老年ラットは、若年ラットと比較して、陰茎におけるＥｘ１１＋ｍＲＮＡの相対的発現が減少していることによって、特徴付けられた。インスリンレセプターアイソフォームの発現のより短い形態が優勢になる切り替えは、図２ｂに示すように、中年ラット（７９．９％）および老年ラット（７８．４％）の両方において、顕著であった。
【０１５７】
従って、類似した年齢依存性のインスリンレセプターｍＲＮＡ発現パターンのバリエーションが、他の組織において、同様に観察され得るか否かを調査することに興味が持たれた。しかし、陰茎と対照的に、このようなアイソフォーム特異的な分布の年齢依存性の変化は、肝臓、心臓、骨格筋および脳において観察され得なかった（図３ａ、３ｂ）。従って、インスリンレセプターｍＲＮＡ発現パターンの加齢と関連した変化は、陰茎組織特異的であった。
【０１５８】
（実施例６）
（ラット陰茎におけるインスリンレセプターｍＲＮＡ発現パターンの、加齢と関連したバリエーションのアンドロゲン依存性についての、去勢術およびテストステロン置換による試験）
テストステロン移植またはプラセボ移植のためのペレットを、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓａｒａｓｏｔａ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡから入手した。去勢術およびテストステロン置換の影響を評価するため、雄のｗｉｓｔａｒラット（３ヶ月齢、ｎ＝２１）を３群に分けた：１群、インタクト（偽手術、背部の皮膚下にプラセボ小片を移植した、ｎ＝７）、２群、去勢した（プラセボ小片の移植、ｎ＝７）、および３群、去勢したが１５ｍｇのテストステロン移植をした（ｎ＝７）。処置の３週間後に、ラットを屠殺し、陰茎組織および血液サンプルを、実施例１に記載のように処理した。試験研究を、実験動物の取り扱いおよび使用に対する一般的な合衆国の法律に従って実施した。
【０１５９】
若年ラット対老年ラットの血清中のテストステロンのレベルは、それぞれ４．４３６±１．１ｎｇ／ｍｌおよび０．５７±０．１７ｎｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ、ｎ＝４）である点に着目し、老化した動物の循環中のテストステロンレベルの低下を示した。これは、Ｚｉｒｋｉｎｓの研究室と一致する（４０、４１）。インスリンレセプターｍＲＮＡの２つのスプライス改変体の発現における、加齢に関連した観察される変化が、加齢したラット中のアンドロゲンレベルが低下することに起因し得るか否かを判別するために、本発明者らは、睾丸摘出術を若年ラットに実施した。去勢したラットの１群は、アンドロゲンを放出する皮下移植片を受けた。去勢後に、体重に対する陰茎の相対重量は、コントロール動物と比較して劇的に減少した（７７．３±７．３ｍｇ／１００ｇ体重  対  ４６．８±４．３ｍｇ／１００ｇ体重）。同様の影響が、コントロール動物および去勢した動物の前立腺重量で観察された（９６．７±３０．４  対  ７．４±２．４；表１）。しかし、テストステロン置換は、両方の器官でのこの影響の逆転を誘導した（表１）。去勢およびアンドロゲン置換の、若年ラットの陰茎組織におけるインスリンレセプターｍＲＮＡ発現における影響は、図４ａに示される。インタクトな動物において、より長い改変体のみが発現していることが見出された。去勢した後に、より短いスプライス改変体の出現が観察され、このパターンは、老年動物のものと類似していた。このアイソフォームが、アンドロゲン補充を受けた去勢動物においてさえも持続したことに注目した。
【０１６０】
インタクト、去勢、去勢およびアンドロゲン置換を受けた若年ラットの陰茎におけるインスリンレセプターｍＲＮＡ改変体の相対的発現の定量分析を、図４ｂに示す。インタクトコントロールの陰茎において、インスリンレセプターをコードするｍＲＮＡのほぼ全ては、Ｅｘ１１＋（８５．９％）改変体で構成された。対照的に、去勢したラットにおいて、Ｅｘ１１＋改変体は、総レセプターｍＲＮＡの１９．２％のみを占め、一方、インスリンレセプターｍＲＮＡのほとんど（８０．８％）は、Ｅｘ１１−改変体により提示される。去勢したラットについてのアンドロゲン補充は、Ｅｘ１１−に対するＥｘ１１＋の相対的な割合（それぞれ２２．８％および７７．２％）を変更し得なかった。両方の組織において、Ｅｘ１１＋  ｍＲＮＡの割合は、若年コントロールラットに比較した場合、顕著に減少した。
【０１６１】
【表１】
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（表１：若年コントロールラット（ＣＯＮ）、去勢した若年ラット（ＣＡＳＴＲ）および去勢したがテストステロンで置換した若年ラット（ＴＥＳＴＯ）の体重に対する器官重量（ｍｇ／１００ｇ体重））
加齢依存性のインスリンレセプター発現における変化は、インスリンレセプターに共役したシグナル伝達機構が最適に機能しない状態へと導き、インスリン抵抗性症候群について記載される状態に類似した病態生理学的状態へと導き得る。このような症候群において、循環中に十分な量でかまたは増加した量でインスリンが存在するにも関わらず、糖尿病様状態が発症する。糖尿病は、加齢においても観察されるインポテンスの発生の増加に関する。加齢におけるインスリンレセプタースプライス改変体の変更された発現パターンが、陰茎におけるインスリン抵抗性症候群に類似した局所状態を導くことが提案される。インスリン抵抗性症候群は、今までのところ有効に処置されていなかった。しかし、チアゾリジンジオンインスリン感作物質様化合物（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＢＪ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．、３、２６７〜２７５（１９９９）；およびＡｌｉｃｉａ  ｄｉ  Ｒａｄｏ、ｗｗｗ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／ｈｓｃ／ｉｎｆｏ／ｐｒ／ｌｖｌ７／７２１／ｉｎｓｕｌｉｎ．ｈｔｍｌ、２００１による報告を参照のこと）は、インスリン抵抗性症候群の処置を提案した。これらの薬物は、多くの副作用を有し（ｗｗｗ．ｄｉａｂｅｔｉｓ−ｄｒｕｇ．ｎｅｔ、２００１を参照のこと）、そしてより有効で副作用がより少ない関連化合物を開発するために、さらなる研究が必要である。
【０１６２】
それ故に、類似した処置レジメン、または新たな化合物もしくはよりよい処方物に基づいて改善された処置レジメンを使用して、加齢に関連したインポテンス状態（この病態生理は、インスリン抵抗性症候群に類似した状態により決定されるように思われる）を改善し得ることが考えられる。
【０１６３】
【表２】
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【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
【発明の効果】
本発明により、勃起機能不全を処置する方法、勃起機能不全を処置するための医薬、勃起機能不全の処置において有用な新規化合物の同定、このような化合物がこのような状態の処置において有効であるか否かを評価することを可能にする、信頼できるスクリーニング方法などが提供される。
【０１６８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＲＴ−ＰＣＲによって示されるように、ラットの種々の組織における２つの選択的にスプライシングされたＩＲ  ｍＲＮＡ転写物の発現を示す。ｃＤＮＡの増幅を、選択的にスプライシングされたエキソン１１に隣接するプライマーセットを使用して実施した。２つの主な増幅産物は、２７３ｂｐおよび／または２３７ｂｐであり、それぞれ、エキソン１１を有するかまたは有さない２つのＩＲ  ｍＲＮＡ種を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、内部標準として増幅した。反応産物を、２．５％臭化エチジウム染色したアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。
【図２ａ】図２ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって示されるように、若年（ｙ）ラット、中年（ｍａ）ラットおよび老年（ｏ）ラットの陰茎組織における２つの選択的にスプライシングされたＩＲ  ｍＲＮＡ転写物の発現を示す。ｃＤＮＡの増幅を、選択的にスプライシングされたエキソン１１に隣接するプライマーセットを使用して実施した。２つの主な増幅産物は、２７３ｂｐおよび／または２３７ｂｐであり、それぞれ、エキソン１１を有するかまたは有さない２つのＩＲ  ｍＲＮＡ種を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、内部標準として増幅した。反応産物を、２．５％臭化エチジウム染色したアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。Ｍ＝１００ｂｐ  ＤＮＡラダー。
【図２ｂ】図２ｂは、若年ラット、中年ラット、および老年ラットの陰茎組織における２つのインスリンレセプターｍＲＮＡスプライス改変体の相対量を示す。エキソン１１（ＥＸ１１＋）ｍＲＮＡ形態の割合を、左側のこの割合の平均±ＳＤと共に、バーの濃い部分によって表す。＊若年コントロール動物に対してｐ＜０．０５。
【図３ａ】図３ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって表されるように、若年（ｙ）ラットおよび老年（ｏ）ラットの陰茎組織における２つの選択的にスプライシングされたＩＲ  ｍＲＮＡ転写物の発現を示す。ｃＤＮＡの増幅を、選択的にスプライシングされたエキソン１１に隣接するプライマーセットを使用して実施した。２つの主な増幅産物は、２７３ｂｐおよび／または２３７ｂｐであり、それぞれ、エキソン１１を有するかまたは有さない２つのＩＲ  ｍＲＮＡ種を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、内部標準として増幅した。反応産物を、２．５％臭化エチジウム染色したアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。Ｍ＝１００ｂｐ  ＤＮＡラダー。
【図３ｂ】図３ｂは、若年（ｙ）ラットおよび老年（ｏ）ラットの種々の組織における２つのインスリンレセプターｍＲＮＡスプライス改変体の相対量を示す。エキソン１１（ＥＸ１１＋）ｍＲＮＡ形態の割合を、上部のこの割合の平均±ＳＤと共に、バーの濃い部分によって表す。＊若年コントロール動物に対してｐ＜０．０５。
【図４ａ】図４ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって表されるように、若年（ｙ）ラット、老年（ｏ）ラット、若年去勢（ｃａ）ラット、ならびに去勢およびテストステロン置換（ｔｅ）ラットの陰茎組織における２つの選択的にスプライシングされたＩＲ  ｍＲＮＡ転写物の発現を示す。ｃＤＮＡの増幅を、選択的にスプライシングされたエキソン１１に隣接するプライマーセットを使用して実施した。２つの主な増幅産物は、２７３ｂｐおよび／または２３７ｂｐであり、それぞれ、エキソン１１を有するかまたは有さない２つのＩＲ  ｍＲＮＡ種を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、内部標準として増幅した。反応産物を、２．５％臭化エチジウム染色したアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。Ｍ＝１００ｂｐ  ＤＮＡラダー。
【図４ｂ】図４ｂは、若年ラット、老年ラット、若年去勢ラット（ｃａｓｔｒａｔｅ）、ならびに去勢したがテストステロン置換した若年ラット（ｔｅｓｔｏ）の陰茎組織における２つのインスリンレセプターｍＲＮＡスプライス改変体の相対量を示す。エキソン１１（ＥＸ１１＋）ｍＲＮＡ形態の割合を、上部のこの割合の平均±ＳＤと共に、バーの濃い部分によって表す。＊若年コントロール動物に対してｐ＜０．０５。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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