(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリパノソーマ、サルモネラ、ニューモシスティス、トキソプラズマ、リステリア、ミコバクテリアおよびリーシュマニアからなる群から選択される、病原性または日和見感染性生物に感染した哺乳動物の治療のための組成物であって、CD40リガンドおよび医薬的に許容される担体を含む、前記組成物。
【請求項２】
投与されるCD40結合タンパク質の量が、10ng/kg/日から100μg/kg/日の間である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、有効な量のCD40リガンドのオリゴマー、そしてその代わりに有用な合成物を投与することを含む、個体において免疫反応を刺激する方法に関する。
発明の背景
病原体に対する免疫反応は、広くは、細胞依存性（細胞性免疫）あるいは抗体依存性（液性免疫）のどちらかに分類されうる。細胞性免疫においては、活性化されたマクロファージと細胞傷害性リンパ球が病原体の除去を行う。これに対して液性免疫は基本的には抗体産生を通じて機能する。現在のところ考えられているのは、免疫反応のこれら２種類の様式は、特定の一連のサイトカインを分泌するヘルパーＴ細胞（TH）の特徴的なサブセットにより調節されている。（Immunological  Reviews誌,123,1991にレビューされている。）
１型TH細胞（TH1細胞）は遅延型過敏症（DTH）を媒介し、そしてインターフェロン−γ（IFN−γ）とインターロイキン−２（IL−２）を分泌する。一方２型TH細胞（TH2細胞）は基本的にはインターロイキン−４、５そして10（それぞれIL−４、IL−５そしてIL−10）を分泌し、そしてＢ細胞の補助の役割を果たす。TH1あるいはTH2経路を介した免疫反応の誘導は、感染初期にしばしば顕著であり、そして感染を引き起こす微生物のタイプにより（Scott  and  Kaufmann,Immunol.Today 12:346,1991）、また感染宿主の遺伝的性質により支配されているように見える。免疫反応が不適切に進行したときには、結果として疾病の解決ができず、あるいは免疫病理学が発達することになりうる。TH1、つまり細胞依存性反応、あるいはTH2、つまり抗体依存性反応、のどちらかのために免疫反応を巧みに扱うことが可能になることにより、感染症においてのみならず炎症やアレルギー疾患においても有効な手段を提供できるだろう（例えば、Powrie  and Coffman,Immunol.Today 14:270,1993を参照）。
発明の概要
本発明は、微生物に対する防御的TH1免疫反応を刺激するのに効果的な量のCD40結合タンパク質を投与することを含む、病原性あるいは日和見感染性微生物に感染した哺乳動物の治療方法に関する。CD40結合タンパク質は、CD40に結合ができそして生物学的シグナルを引き起こすことができる薬剤組成物である。病原性あるいは日和見感染性微生物としては、例えば、リーシュマニア、リステリア、ミコバクテリア、サルモネラ、トリパノソーマ、ニューモシスティスそしてトキソプラズマが単独に又は複合したものとして含まれる。CD40結合タンパク質はCD40リガンド、CD40に特異的に結合するモノクローナル抗体、そしてこれらの複合物からなる群により選択された。
インターロイキン−12（IL−12）は、マクロファージ／単球により産生され、防御的TH1反応の誘導に作用するときに重要な、鍵となるサイトカインである。IL−12はCD40結合タンパク質により刺激されて産生される。CD40結合タンパク質は、TH1反応が起こることが望ましい病気の治療をするときに、適切なTH1反応を誘導することを通じて病気を予防するときに、そして細胞依存性免疫が低下してしまった患者において病気の治療をするときに有効なものとなり得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗CD3抗体で活性化されたCD40L欠損マウス由来の脾細胞では、IL−２、IFN−γあるいはIL−10の産生能力は低下しないものの、IL−12の産生能力が低下していることを示している。脾細胞は実施例３で記載されるように処置され、そして培養上清をIL−12あるいはIL−２の存在を調べる際にはバイオアッセイ（bioassay）で（図1Aおよび1B）、IFN−γあるいはIL−10の場合には酵素免疫測定法を用いて試験した（図1C及び1D）。
図２は、抗IL−10によりＴ細胞依存性IL−12産生が高められていることを示している。検定は、実施例４で記載されるように行われた。抗IL−10存在下において抗CD3で刺激した対照脾細胞の培養上清には、抗IL−10非存在下において生成されたものの、およそ４倍の濃度のIL−12が含まれていた。さらに抗CD3及び抗IL−10存在下において培養されたCD40L  KOマウス（CD40L欠損マウス）由来脾細胞の培養上清中に、低濃度のIL−12が検出された。
図３は、CD40Lが抗原に対する細胞免疫反応の誘導に不可欠であることを確認する結果を示している。実験は実施例６に記載されるように行われた。検定されたCD40L  KOマウスの個体間ではDTH反応に差異があるものの（図3A）、群としては、CD40L欠損マウスにおいては抗原に対するDTH反応を開始する能力が重度に低下していた（図3B）。
図４は、CD40L欠損マウスが由来する親のマウス系統とは対照的に、L.major（Leishmania  major）の感染に引き続いて起こる足の肉趾（footpad）の進行性の腫脹が、CD40L欠損マウスにおいて観察されることを示している。マウスには実施例７で記載されるように感染させ、疾患の進行は足の肉趾の厚さを測定することにより検定した。
図５は、CD40LT（組換えCD40Lの三量体）の投与により、感受性マウスでの感染の重篤性が低下されることを示す結果を示している。感染マウスは実施例８で記載されるように処置され、そして処置の効果は足の肉趾の厚さを測定することにより検定した。
図６は、感受性であるCD40リガンド欠損マウスにおいて、ニューモシスティス感染が、CD40LTにより調節あるいは改善されていることを示している。マウスは実施例９で記載されるように処置され、死因を確定するために剖検された。
発明の詳細な説明
本発明は、病原体に対する免疫反応を刺激するのに効果的な量のCD40結合タンパク質を投与することを含む、病原性あるいは日和見感染性の（opportunistic）微生物に感染した哺乳動物の治療方法に関する。病原性リーシュマニアに感染したマウスを、CD40結合タンパク質で処置し、CD40結合タンパク質は病原体に対する効果的な免疫反応を刺激した。使用したマウスのモデルは、当業者により、ヒトを含む種々の哺乳動物の種において得られた結果と関連しうる、そしてその他の感染性の微生物とも関連する結果を提供すると考えられている。
このように、本明細書中に記載した予言的な動物モデルにおける知見により、病原性あるいは日和見感染性の微生物に感染した哺乳動物を、CD40結合タンパク質活性をもつ物質を含む薬剤組成物により治療するという、発明の方法を十分に可能にするデータが提供される。
病原性あるいは日和見感染性の微生物
病原性微生物は、健康な個体に病気を引き起こすことができる微生物をいい、一方日和見感染性微生物は、通常は健康な個体には病気を引き起こさないが免疫力の低下した宿主において病気の状態に帰着しうるものをいう。どちらのタイプの微生物にも、ウィルス、細菌、酵母、真菌、そして原生動物が含まれる。さらにいくつかの徴候では、複数の微生物が存在し、また徴候の原因となる役割を果たす可能性がある。
典型的な病原原生動物はリーシュマニア（Leichmania）であり、これは内蔵、皮膚あるいは粘膜の傷害により特徴づけられる様々な疾患を引き起こす、マクロファージの細胞内でのみ生息できる寄生虫である。リーシュマニアの異なる種そして単離した種で、生体内（in vivo）及び試験管内（in vitro）のどちらにおいてもマクロファージ内での感染及び複製の能力が変化する。臨床的には、L.braziliensisによる感染では一つあるいは複数の皮膚の傷害を呈し、低い割合ではあるがより重篤な粘膜の疾患に進行する。皮膚の傷害は自然に治癒しあるいは化学化学療法によく反応する可能性がある一方で、粘膜の傷害はしばしばひどく破壊的で比較的治療に対して無反応性である。たとえ粘膜の傷害が治癒してもしばしば、恐らく数年後に、自然に再発する。原生生物およびマクロファージ病原性のリーシュマニアによる感染の経過は、これら微生物にとっては排他的な作用をもつ宿主の細胞であるマクロファージの細胞内における初期複製により、部分的ではあるが確定されている。リーシュマニアの抑制あるいは増殖に寄与する因子はよくは知られていないが、ある種のサイトカインは感染の過程に影響を与えうる。例えばIL−12により感受性であるBALB/cマウスにおいてリーシュマニア症が治癒する（Heinzel  et  al.,J.Exp.Med.177:1505,1993）。
病原性の住血鞭毛虫類（hemoflagellate）に属する原生動物であるTrypanosoma  cruzi（T.cruzi）は、ラテンアメリカの多くの国々で公衆衛生上の主要な問題であるシャガス病を引き起こす。この寄生虫による感染は、急性あるいは慢性となりうるもので、そしてしばしば心臓、食道及び結腸の組織において進行性の病状を発生させる場合を含む。寄生虫は、マクロファージを含む様々な有核細胞に感染する。ヒト及び実験動物のどちらにおいても、T.cruzi感染はＴ細胞とマクロファージにより媒介される非特異的な免疫抑制をともなう。急性及び慢性の状態の間の寄生虫の複製を調節する機構、そして慢性の状態にある間、数は少ないが持続的な数の寄生虫を血液中に維持する機構は、よくは解明されていない。
病原体のさらなる例には、Mycobacterium  tuberculosisやMycobacterium  leprae並びに原虫であるToxoplasma  gondiiが含まれる。真菌であるHistoplasma  capsulatum、Candida  albicans、Candida  parapsilosisそしてCryptococcus  neoformansもまた日和見感染性あるいは病原性微生物と考えられ得る。ある種のリケッチア、例えばR.prowazekii、R.coroniiそしてR.tsutsugamushiもまた、２種類あるいはそれ以上の微生物の組合せとして含まれる。
ヒトの感染に加えて、これらの微生物の多くはその他の哺乳動物に感染し、そしてそれらの動物はヒトによっては感染の保有宿主（レゼルボア）として働きうる。例えば飼いイヌはリーシュマニアの主要な保有宿主として働いていると考えられており、一方でネコはトキソプラズマを保有していることが知られている。これら微生物に対する哺乳動物の免疫反応および／または炎症反応を増大させる方法は、従ってヒト以外の種々の哺乳動物において有効であるようである。
CD40
ヒトCD40抗原（CD40）は分子量30,600の277アミノ酸からなるペプチドである（Stamenkovic  et  al.,EMBO J.8:1403,1989）。ヒトCD40をコードするcDNAは、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株のRajiから調製されたcDNAライブラリーから単離された。CD40のcDNAによりコードされる推定のタンパク質は、推定リーダー配列、膜貫通ドメインそして膜結合型受容体タンパク質に共通のその他の特徴を多く含んでいる。CD40はＢリンパ球、上皮細胞そしていくつかのガン細胞株で発見されていることが知られている。
CD40は、細胞外領域にシステインを多く含む（システインリッチの）モチーフが存在することで定義づけられる、腫瘍壊死因子（TNF）／神経成長因子（NGF）受容体ファミリーの一つである（Smith  et  al.,Science 248:1019,1990;Mallett  and  Barclay,Immunology  Today  12:220,1991）。このファミリーには、リンパ球抗原のCD27、CD30（ホジキン病のリンパ腫及びリード・スターンバーグ細胞にみられる抗原）、TNFに対する２種類の受容体、４ー1BBと呼ばれているマウスタンパク質、ラットOX40抗原、NGF受容体そしてFas抗原が含まれる。
CD40は、当該技術分野で知られているいくつかの方法のうちのどの一つによっても細胞の表面で検出される。例えば、CD40に特異的な抗体は、細胞がCD40を発現しているかどうかを測定するために、蛍光標識細胞選別技術（FACS）の手法において使用されうる。細胞表面の分子を検出するその他の方法もまた、CD40を測定する際に有効である。
CD40モノクローナル抗体
CD40表面抗原に対して指向するモノクローナル抗体（CD40  mAb）は、ヒトＢ細胞で様々な生活活性を媒介することが示されてきた。例えば、CD40  mAbは同型接着や異型接着を引き起こし（Barrett  et  al.,J.Immunol.146:1772,1991;Gordon  et  al.,J.Immunol.140:1425,1988）、そして細胞の大きさを拡大させる（Gordon  et  al.,J.Immunol.140:1425,1988;Valle  et  al.,Eur.J.Immunol.19:1463,1989）。CD40  mAbはまた、抗IgM、CD20  mAbあるいはフォルボールエステルを単独で（Clark  and  Ledbetter,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  83:4494,1986;Gordon  et  al.,Leukocyte  Typing  III（白血球分類III）;A.J.McMichael  ed.Oxford  University  Press.Oxford,p.426;Paulie  et  al.,J.Immunol.142:590,1989）、あるいはIL−４と強力して（Valle  et  al.,Eur.J.Immunol.19:1463,1989;Gordon  et  al.,Eur.J.Immunol.17:1535,1987）、活性化させたＢ細胞の増殖を引き起こし、そしてIL−４で刺激したＴ細胞を取り除いた培養からは、IgE（Jabara  et  al.,J.Exp.Med.172:1861,1990;Gascan  et  al.,J.Immunol.147:8,1991）、IgG及びIgM（Gascan  et  al.,J.Immunol.147:8,1991）が産生される。
加えて、CD40  mAbが、Ｂ細胞からのIL−４媒介性の可溶化CD23/FcεR IIの放出を高めること（Gordon  and  Guy,Immunol.Today  8:339,1987;Cairns  et  al.,Eur.J.Immunol.18:349,1988）、そしてＢ細胞でのIL−６の産生を増加させること（Clark  and  Shu,J.Immunol.145:1400,1990）が報告されている。最近、CDw32＋接着細胞の存在下で、IL−４とCD40  mAbにより処置された初代培養Ｂ細胞集団から、ヒトＢ細胞株が確立された（Banchereau  et  al.,Science,241:70,1991）。さらに、胚中心の中心細胞は、CD40および／または抗原に対する受容体を介して活性化した場合には、アポトーシスが起こらないようにすることができる（Liu  et  al.,Nature  342:929,1989）。上記の刊行物のそれぞれは、Ｂ細胞の生物活性を刺激するCD40  mAbについて記載している。
1993年10月１日に出願された米国特許出願第08/130,541号は、参考文献として援用される関連する開示であるが、hCD40m2とhCD40m3と呼ばれている、CD40に特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を開示する。他のCD40  mAbと異なり、hCD40m2（ATCC  HB11459）とhCD40m3はCD40に結合し、CD40Lを構成要素として発現する細胞に対するCD40の結合を阻害する。無関係なIgGまたは対照のCD40  mAbであるG28.5と比較して、hCD40m2あるいはCD40  mAbであるM3を用いると、12.5μg/mlの低濃度で、95％以上の結合阻害が観察された。hCD40m2はまた、CD40Lに誘導されるTNF−α産生を阻害することができた。
その他のCD40モノクローナル抗体は、通常の技術を用いて生成されうる（本明細書中で参考文献として援用される、米国特許第RE32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号そして第4,411,993号を参照；同様に本明細書中で参考文献として援用されている、”モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物解析の新次元",Plenum  Press,Kennett,McKearn,and  Bechtol（eds.）,1980,そして、”抗体：研究室マニュアル",Harlow  and  Lane（eds.）,Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,1988も参照）。
簡単に説明すると、CD40に対する免疫反応を引き起こすのに適している形状のCD40を動物に注射する。動物は必要に応じて、CD40に対する血清中の抗体濃度がプラトーに達するまで、再免疫されうるものであり、その後可溶化CD40の最終免疫をされ、３ないし４日後に犠牲にされる。脾臓やリンパ節のように多数のＢ細胞を含む臓器が回収され、メッシュの網に臓器を通すことにより、あるいは細胞を含む脾臓あるいはリンパ節の膜を破断することにより、細胞同士をバラバラに分離した細胞の懸濁液にまで分離する。
もう一つの方法は、試験管内（in  vitro）免疫法を利用することにより、モノクローナル抗体を作成するのに適した細胞を得る。簡単にいうと、動物を犠牲にし、脾臓あるいはリンパ節の細胞を分離する。細胞同士をバラバラに分離した細胞の懸濁液を作成し、上記のような免疫反応を引き起こすのに適した形態のCD40を含む培養中に細胞を静置する。続いて、リンパ球を回収し以下に記載するように融合する。
試験管内（in  vitro）免疫法を利用することにより、あるいは上記のように免疫をした動物から得られた細胞は、ウィルスの感染（トランスフェクション）により不死化されうる。例えば、エプスタイン・バーウィルス（EBV;Glasky  and  Reading,Hybridoma  ８（４）:377−389,1989参照）により、ヒトＢ細胞を形質転換できる。あるいは、回収された脾臓および／またはリンパ節細胞の懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌する”ハイブリドーマ”を作成するために、適当なミエローマ細胞と融合される。条件のあったミエローマ細胞は、抗体の構成あるいは発現が不完全であることが好ましく、そして加えて免疫をした動物から得られた細胞と遺伝的に共通な細胞であることが好ましい。多くのこのようなミエローマ細胞株が当該技術分野ではよく知られており、これらはメリーランド州ロックヴィルにあるAmerican  Type  Culture  Collection（ATCC）のような供給者から入手しうる（細胞株およびハイブリドーマカタログ，第６版,ATCC,1988参照）。
CD40リガンド
活性化されたCD4＋Ｔ細胞は、高濃度のCD40に対するリガンド（CD40L）を発現している。ヒトCD40Lは、膜結合型糖タンパク質であるが、最近Spriggsら、J.Exp.Med.176:1543（1992）および本明細書中でも参考文献として援用される開示であるところの1992年10月23日に出願された米国特許出願第07/969,703号において記載されているように、末梢血Ｔ細胞からクローニングされた。マウスCD40Lのクローニングは、Armitageら、Nature  357:80,1992において記載されている。CD40Lは、その他のいかなる共刺激の非存在下でＢ細胞の増殖を誘導し、そして種々のサイトカインの存在下では免疫グロブリンの産生も誘導しうる。加えて、CD40リガンドをトランスフェクトされた細胞は、単球を抗腫瘍細胞となるように刺激しうる（Alderson  et  al.,J.Exp.Med.178:669,1993）。
CD40Lは、Ｃ末端側に細胞外領域をもち、膜貫通領域をもちそしてＮ末端側に細胞内領域をもつ、II型膜ポリペプチドである。可溶型CD40Lは、CD40Lの細胞外領域（配列番号１である、47番アミノ酸から261番アミノ酸）を含むか、あるいはそれの断片を含む。CD40Lの生物活性は、CD40Lの細胞外領域がCD40に結合することにより媒介され、そしてＢ細胞の増殖と抗体分泌（IgEの分泌を含む）の誘導が含まれる。
米国特許出願第07/969,703号において、CD40L/FC2と呼ばれる、可溶型のCD40L/Fc融合タンパク質の調製が記載されている。CD40L/FC2は、Hoppら（Hopp  et  al.,Bio/Technology  6:1204,1988;Flag（Ｒ）と呼ばれている）により記載された８アミノ酸からなる親水性配列、IgG1  Fcドメイン、連結配列（米国特許第5,073,627号に記載）、並びにヒトCD40Lの細胞外領域を含む。同様に米国特許出願第07/969,703号において、三量体CD40Lと呼ばれている可溶型CD40L融合タンパク質についても記載されており、この三量体CD40Lには、”ロイシンジッパー”と呼ばれている33アミノ酸の配列、Hoppら（前記）により記載された８アミノ酸からなる親水性配列が含まれており、ヒトCD40Lの細胞外領域がその後につながっている。オリゴマー型のCD40Lは両方とも、その他のいかなる共刺激の非存在下でヒトＢ細胞の増殖を誘導し、そして（適切なサイトカインと組み合わせることで）結果としてIgG、IgE、IgAそしてIgMを産生させる。
米国特許出願第07/969,703号において記載されたCD40L/FC2および三量体CD40Lは、本発明の方法において有効であり得るし、また組換えタンパク質を作成する既知の方法を利用して調製されうる他の形態のCD40Lでも有効であり得る。
他のCD40結合タンパク質
結合タンパク質はまた、CD40に対する抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むための組換えDNA技術を利用して、構築されうる（以下を参照。James  W.Larrick  et  al.,"混合プライマーを利用したポリメラーゼチェーンリアクション：単一のハイブリドーマ細胞からのヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子のクローニング"Biotechnology  7:934−938,September  1989;Reichmann  et  al.,"治療のためのヒト抗体の再構築"Nature  332:323−327,1988;Roberts  et  al.,"タンパク質工学による、その抗原に対して亢進された親和性および特異性をもつ抗体の生成"Nature  328:731−734,1987;Verhoeyen  et  al.,"ヒト抗体の再構築：抗リソザイム活性の移植"Science  239:1534−1536,1988;Chaudhary  et  al.,"シュードモナスの外毒素と融合した２種類の抗体可変領域を含む組換え免疫毒"Nature  339:394−397,1989）。
簡単にいうと、CD40  mAbの抗原結合部位（あるいはCD40結合ドメイン；可変領域）をコードするDNAが単離され、増幅され、そして別のタンパク質、例えばヒトIgG（Verhoeyen  et  al.,上記;Reichmann  et  al.,上記を参照）をコードするDNAに連結される。あるいは、抗原結合部位（可変領域）が、別の完全に異なるタンパク質と連結されるかあるいはその中に挿入されうる（Chaudhary  et  al.,上記を参照）もので、結果として抗体の抗原結合部位と同時に全く異なるタンパク質の機能的活性をもつ新しいタンパク質ができる。
さらに、哺乳動物のCD40と特異的に結合する、抗体のもっと小さな部分あるいは可変領域もまた、本発明の状況において利用しうる。同様に、CD40リガンドのCD40結合領域（細胞外ドメイン）は、他のCD40結合タンパク質を調製するために利用しうる。オリゴマーを形成するタンパク質あるいはペプチドをコードするDNA配列は、CD40抗体の抗原結合ドメインあるいはCD40リガンドの細胞外ドメインを含むCD40結合タンパク質を調製する際に、特に有用になりうるだろう。このようなオリゴマーを形成するタンパク質のうちのあるものは、米国特許出願第07/969703号において開示されている；別のものとして、有用なオリゴマーを形成するタンパク質が1993年８月13日に出願された米国特許出願第08/107353号、および1993年９月29日に出願された米国特許出願第08/145830号において開示されている。
一旦好ましい抗体あるいは結合タンパク質が得られれば、当業者にはよく知られている多くの方法によりそれらを分離あるいは精製しうる（”抗体：研究室マニュアル",Harlow  and  Lane（eds.）,Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,1988を参照）。望ましい技術として、ペプチドあるいはタンパク質アフィニティー（親和性）カラム、HPLCあるいはRP−HPLC、プロテインＡあるいはプロテインＧカラムでの精製、あるいはこれらの技術のあらゆる組合せが含まれる。組換えCD40結合タンパク質は、標準の方法に従って調製することができ、そして、例えばELISA、ABCあるいはドットブロットアッセイを含む、当該技術分野で既知の検定により、並びにCD40  mAbのために記載されたような生物活性分析によって、CD40に対する結合の特異性を検定することができる
試験管内（in  vitro）及び生体内（in  vivo）モデル
本明細書中で記載されたリーシュマニア症のマウスモデルは、TH1反応を必要とする感染性疾患の動物モデルとして相応しいものとして認識されている。その他のヒトの感染性疾患の多くについてのマウスモデルが、当該技術分野では知られている。例えば、Sher（Imm.Rev.127:183−204,1992）は、後天性免疫不全症候群（AIDS）、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、そしてシストソーマ症を含むいくつかの別々のヒトの疾患のマウスモデルについて検討している。Nathan（”感染微生物、腫瘍そして同種移植片に対する宿主の抵抗性のメカニズム”、R.M.Steinman  and  R.J.North,eds.,Rockefeller  University  Press,New  York,pp.165−184,1986）もまた、様々なヒトの疾患の研究におけるマウスの利用についてレビューしており、そしてさらには、マウスモデルにおいて当初観察された結果を確証する、ヒトで行われた研究の結果を示している。ラットおよび／またはマウスはまた、クリプトスポリジウム症（Meulbroek  et  al.,Workshop  on  Pneumocystis,Cryptospridium  and  Microsporidium  113S）、Salmonella  typhimurium感染症（Hougen  et  al.,APMIS  98:30,1990）、Mycobacterium  avium感染症（Furney  et  al.,Antimicrobial  Agents  and  Chemotherapy  34:1629,1990）そしてPneumocystis  carinii肺炎（Boylan  and  Current,J.Protozool.38:138S,1991;Soulez  et  al.,Workshop  on  Pneumocystis,Cryptospridium  and  Microsporidium  123S）の動物モデルとしても利用されている。
他の種もまた、有用な動物モデルを提供する。例えば、Wyand（AIDS  Res.and  Human  Retroviruses  8:349,1992）は、SIVに感染したアカゲザルをAIDS治療薬やワクチンの前臨床的評価のために利用することを検討している。サルおよびネコのモデル（Gardner,Antiviral  Res.15:267,1991;Stahl−Hennig  et  al.,AIDS  4:611,1990）そしてマウスのモデル（Ruprecht  et  al.,Cancer  Res.50:5618S,1990）が、抗レトロウィルス治療の評価のために提案されている。アカゲザルはまた、シャガス病のモデルとしても利用されている（Bonecini−Almeida  et  al.,Mem.Inst.Osaldo  Cruz  85:163,1990;Rio  de  Janeiro）。様々なヒト以外の霊長類が自然的にあるいは実験的に後天性のらい病に罹ることが観察されてきた（Meyers  et  al.,Am.J.Trop.Med.and  Hyg.44:24,1991）。当業者はマクロファージ病原体により引き起こされる疾患の、これらのそして他の多くの可能性がある動物モデルを認識している。
マクロファージ／単球
活性化されたマクロファージは、微生物を摂取（食菌）し、反応性の高い細胞内酸素種を生成して放出し、そして一種類あるいは複数の微生物に対する哺乳動物の免疫反応および炎症反応を上昇させる様々なサイトカインを分泌する。マクロファージの活性化は、これらの活性の一つあるいは複数を測定することを含む様々な方法により、試験管内（in  vitro）においても確証されている。
末梢血中の単球の基本的な機能の一つは、酵素、血漿タンパク質そしてサイトカインを含む一連の生物学的な活性分子を合成そして分泌することにより、免疫反応あるいは炎症反応を調節することである。単球由来のサイトカインには、IL−１α、IL−１β、IL−６、IL−８、IL−12そしてTNF−αが含まれる。単球により生成されるこれらのサイトカインのすべては、感染に対する宿主の反応にとって中心となる、広範囲な免疫調節の特徴を示している。
LPSやペプチドグリカンといった微生物の産物は、単球によるサイトカインの分泌の効果的な誘導物質である。単球により合成されたサイトカインはまた、自己調節的に単球のサイトカイン合成を調節していることが証明されている。特に、IL−１α、IL−１β、TNF−α、TGF−β、IFN−γ、GM−CSFそしてIL−３はすべて、単独で働いても他の刺激物質と組み合わせて働いても、単球のサイトカイン分泌のいくつかの状況を刺激することが示されている。逆にIL−４は、サイトカイン分泌と呼吸破裂活性を両方とも含む単球の活性化の誘導には、効果的な拮抗薬としての効果を有する。
活性化されたマクロファージは、以下に示す様々なサイトカイン、つまりインターロイキン−６（IL−６）、インターロイキン−１αおよびβ（IL−１α、IL−１β）、腫瘍壊死因子α（TNF−α）、インターロイキン−８（IL−８）、マクロファージ抑制ペプチド−１α（MIP−１α）、マクロファージ抑制ペプチド−１β（MIP−１β）、インターロイキン−12（IL−12）そして成長調節タンパク質（GRO）、を産生しそして分泌する。このように、これらのサイトカインの一種類あるいは複数の分泌を測定することにより、あるいはこれらのサイトカインの一種類あるいは複数のmRNAの転写濃度を解析することにより活性化は測定しうる。さらに、マクロファージは、（試験管内（in  vitro）あるいは生体内（in  vivo）のどちらかにおいて活性化した後）試験管内（in  vitro）でも得られそして培養することができ、また、微生物の食菌効果および／あるいは様々なサイトカインの産生を調べることにより、活性化を測定しうる。反応性酸素種の産生および放出を測定する方法は、当該技術分野ではよく知られている。
ある種の刺激に反応してマクロファージにより合成されるIL−12は、細胞性免疫に対する初期サイトカインであると考えられている（Scott,P.,Science  260:496,1993;Romagnini,S.,Immunol.Today  13:379,1992;Locksley,R.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:5970,1993）。単球／マクロファージは、様々な病原体に反応してIL−12を放出し、それによりナチュラルキラー細胞（NK）や特定の分化をしていないＴ細胞を刺激してIFN−γを分泌させる（Trinchierei,G.,Immunol.Today  14:335,1993）。IL−12はまた、Ｔ細胞やNK細胞の細胞融解活性を高め（Gately  et  al.,Int.Immunol.6:57,1994）、また多くの感染性疾患において重要な働きをしていることが示されている（Gazzinelli  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:6115,1993;Heinzel  et  al.,J.Exp.Med.177:1505,1993;Hsieh  et  al.,Science  260:547,1993;Tripp  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:3725,1993;Sypek  et  al.,J.Exp.Med.177:1797,1993）。
他の研究では、IL−12は抗腫瘍あるいは抗転移活性を示した（Brunda  et  al.,J.Exp.Med.178:1223,1993）。さらに、IL−12産生が、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）の感染者においては減少していることが見いだされている；すなわち、IL−12の産生能力の減少は、HIV関連疾患の顕著な特徴である免疫不全において重要な役割を果たしていると考えられている（Chehimi  et  al.,J.Exp.Med.179:1361,1994）。IL−12の濃度は、例えばZhangら（J.Clin.Invest.93:1733,1994）により記載されるように、あるいは本明細書に記載されているような酵素免疫測定法や生物学的定量により測定できる。
CD40結合タンパク質の投与
本発明において、効果的な量のCD40結合タンパク質と好ましい希釈液そして担体を含む医薬組成物を用いる方法、および免疫反応あるいは炎症反応を調節する方法が提供される。可溶型のサイトカイン受容体あるいはサイトカインと組み合わせて、またはその他の免疫調節分子と組み合わせてCD40結合タンパク質を使用することもまた企図されている。例えば、CD40結合タンパク質は、単球／マクロファージを活性化させることが知られている因子、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF），インターフェロン−γ（IFN−γ）そして米国特許第5,073,627号に記載されているようなGM−CSFを含む融合タンパク質と組み合わせて使用することができる。CD40結合タンパク質とその他の因子は、好ましい溶液と組合せうるし、あるいはそれらを同時に、連続してあるいは別々に投与することができる。
療法的な利用としては、精製されたCD40結合タンパク質が患者に、好ましくはヒトに、指示に沿った適切な方法で治療の目的で投与される。このように、免疫反応および炎症反応を増大させるために投与されるCD40結合タンパク質組成物は、例えば、巨丸剤の注入、持続点滴、インプラントからの持続的な放出あるいはその他の好ましい技術により投与されうる。一般的には、治療薬は生理学的に許容される担体、補形薬あるいは希釈液と組み合わせた、精製されたCD40結合タンパク質を含む、組成物の形で投与されうる。このような担体は、用いられる投薬量および濃度において受容者に非毒性なものであるだろう。
通常は、このようなCD40結合タンパク質の組成物の調製には、CD40結合タンパク質と緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化物質、低分子量（だいたい10残基以下）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ブドウ糖やショ糖やデキストリンを含む炭水化物、EDTAのようなキレート剤、グルタチオンやその他の安定化剤および補形薬とを組み合わせることを必要とする。中性の緩衝塩類溶液あるいは同種の血清アルブミンを混合した塩類溶液が、好ましい希釈液としては典型的である。好ましくは、生成物は、希釈液として好ましい補形薬溶液（例えばショ糖）を用いて凍結乾燥されたものとして処方される。
好ましい投薬量は、最初は好ましい動物モデルにおける、続いて治療が行われる種における施行により決定されうる。投与の量および頻度は、もちろん、治療される症候の性質および重症度、期待される反応、治療される患者の体調などの因子に左右されるだろう。好ましい投薬量は、単独であるいは他の免疫反応調節物質と組み合わせて、約10ng/kg/日から約100μg/kg/日の範囲内である。好ましくは、100ng/kg/日から約1000ng/kg/日の量をおよそ１〜20日間投与することにより、適切な生物学的効果が誘導されることが期待されうる。もう一つの方法としては、約１μg/kg/日から約100μg/kg/日の巨丸剤の注入であれば、免疫反応および／または炎症反応を介した効果を持続するために、およそ４日間隔で投与されうる。
本明細書中で引用したすべての参考文献についての関連した開示は、具体的に参考文献として援用する。以下の実施例は、発明の特定の態様を説明することを目的としており、発明の請求の範囲を限定するものではない。
実施例１
本実施例は、CD40リガンドが脾臓抗原提示細胞（APC）からのIL−12の産生のＴ細胞依存的な調節に関与しているということを示す。この機構においては、抗CD3が脾臓Ｔ細胞を活性化し、そしてそれらの細胞に脾臓APCからのIL−12の産生を調節されると推測された。
非分画の、放射線標識していない、特定の実験を受けたことがない（naive）C57BL/6マウスから得た脾細胞を、CD3に対する抗体（333ng/穴）でコートした96穴培養皿において、10μg/穴の抗CD40L（MR1;ファーミンジェン、San  Diego,CAから入手）の存在下あるいは非存在下の条件で、４×105細胞／穴の濃度で培養した。培養上清は、20時間後に取り除き、そして様々なサイトカインの存在を測定した。IFN−γ濃度は、商業的に入手できるモノクローナル抗体の組合せ（PharMingen、San Diego,CA）を利用して、two  site  ELISAを用いて測定し、ファーミンジェンから供給されたプロトコルに従い行われた。IFN−γに対するELISAは、ジェンザイム（Cambridge,MA）から入手したマウスIFN−γをスタンダードとして利用して、IFN−γにして100pg/mlの感度で測定した。IL−12の検定は、Kennedyら、Eur.J.Immunol.24:2271（1994）に記載されているように行われた。下の表１に示したように、IL−12がこれらの培養において産生され、そして抗CD40Lが含まれることにより、IL−12の産生が90％以上抑制された。
0003657271.tif 000002
抗CD40Lはまた、IFN−γの産生は部分的に抑制するが、しかしIL−２の産生は抑制しない。さらに抗CD40Lは、刺激された脾細胞からのIL−10の産生を亢進しない。このことから、抗CD40Lは、IL−10を誘導することによりIL−12産生を抑制したのではなかった。
実施例２
本実施例は、抗原依存性機構におけるIL−12の産生はCD40Lに依存しているということを示す。様々な数のCD6として呼ばれているTH1クローン化細胞（スカシガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin;KLH）に特異的）を、４×105個の放射線標識した遺伝子の共通した脾細胞と、抗原（50μg/ml  KLH）とともに、抗CD40Lの存在下あるいは非存在下で、96穴培養皿において刺激した。培養上清は20時間の時点で回収され、IL−12あるいはIFN−γについて上に記載したように測定した。結果は以下の表２に示されている。
0003657271.tif 000003
抗CD40Lが含まれることにより、この抗原依存性機構におけるIL−12の産生は90％以上も抑制された。これと対称的に、IFN−γに対する中和抗体が含まれることにより、IL−12の産生には抑制効果はなかった。IL−12産生に対するその強力な抑制効果にも関わらず、抗CD40Lはこれらと同様な培養においてもIFN−γの産生はほんの部分的にしか抑制しなかった。IL−２はどの培養上清からも検出されなかった。
C3G9と呼ばれるＨ−2d特異的同種反応性TH1クローン化細胞を、放射線標識したC.B17  SCIDの脾細胞、あるいは接着性BALB/cの腹膜滲出細胞（PEC）とともに刺激したときにも、同様な結果が観察された。どちらの場合にも、抗CD40Lがこれらの培養中に含まれることによりIL−12産生は90％以上抑制されるが、これに対して、抗IFN−γが含まれていても抑制効果はなかった。
実施例３
本実施例は、機能的なCD40Lを欠損したマウス由来の脾細胞では、Ｔ細胞依存性IL−12産生が欠損しているようであるということを示す。脾細胞は実質的に上記の実施例１において記載したように刺激された。非分画の、放射線標識していない、特定の実験を受けたことがないC57BL/6X129/JマウスでCD40リガンド遺伝子を欠損する同型接合型のマウス（1994年１月20日に出願され、現在係属中である米国特許出願第08/184,422号に記載された、CD40リガンドノックアウトあるいはCD40L  KOマウス）から得た脾細胞、あるいは対照のB6（C57BL/6）あるいはF1（B6×129）から得た脾細胞を、CD3に対する抗体（333ng/穴）でコートした96穴培養皿において、４×105細胞／穴の濃度で培養した。培養上清は20時間後に取り除き、そして様々なサイトカインの存在を、生物学的定量（IL−12およびIL−２、図1Aおよび1B）あるいはELISA（IFN−γおよびIL−10、図1Cおよび1D）のどちらかで測定した。IL−２の生物学的定量（bioassay）は、上記のKennedyらによって記載されたように、CTLL−２細胞を利用した。IL−10のELISAは、PharMingenから入手したモノクローナル抗体とプロトコルを利用している、以前に記載されているIFN−γのELISAと同様である。スタンダードとして使用する精製されたIL−10は、Biosource  International（Camarillo,CA）あるいはGenzyme（Cambridge,MA）から入手できる。結果は図１に示し、そして結果は３つの実験の平均値である。
IL−12は、抗CD3で刺激されたB6とF1のマウス由来の脾細胞からは産生されたが、しかし抗CD3で刺激されたCD40L  KOの脾細胞から得られた培養上清中には検出できなかった（2pg/ml以下）。これと対称的に、CD40L  KOの脾細胞から産生されたIFN−γの濃度（ng/ml）は対照群のそれより低いものの、CD40L脾細胞は、IL−２、IL−10あるいはIFN−γの産生能力の点からみると明らかな欠陥は存在しない（図1C）。CD40L  KOおよびB6対照のマウスの両方により産生されたIL−10の量は、F1の対照マウスにより産生された量よりも明らかに低量であった（図1D）。抗CD3が存在しない培養中では、どんなサイトカインも検出されなかった。
実施例４
本実施例は、抗IL−10および可溶性の三量体CD40L（CD40LT）が、CD40L  KO由来の脾細胞からのＴ細胞依存性IL−12産生を促進するということを示す。IL−12産生を抑制するIL−10もまた、上に記載した培養中に存在しているため、二重の培養を上に記載したように調製し、抗CD3単独の存在下あるいは抗CD3と抗IL−10（２μg/ml）を同時に含む条件下で培養した。抗IL−10の存在下で抗CD3で刺激した対照の脾細胞から得た培養上清には、抗IL−10の非存在下において生成されたものと比べて、IL−12の濃度がおよそ４倍含まれていた（図２）。さらに、抗CD3および抗IL−10の両方とともに培養したCD40L  KO由来の脾細胞から得た培養上清中には低濃度のIL−12が検出された（図２）。
CD40LTの存在下、あるいは非存在下というこれらの条件下での、CD40L  KO由来の脾細胞のIL−12産生能は、以下の表３に示されている。
0003657271.tif 000004
抗CD3、抗IL−10およびCD40L三量体（25μg/ml）により刺激したCD40L  KO由来脾細胞は、抗CD3と抗IL−10のみにより刺激したCD40L  KO由来脾細胞と比べて、およそ５倍の濃度のIL−12を産生した。CD40LTはまた、抗CD3は含まれるが抗IL−10が含まれない培養中で、低濃度のIL−12を誘導した。抗CD3により活性化されたCD40L  KO由来の脾細胞からのIL−12産生に関するその効果とは対称的に、CD40LTは、これらの培養条件においては一貫してIL−２およびIFN−γの産生を促進しなかった。抗CD3の存在しない培養中ではサイトカインは何も検出されなかった。
実施例５
本実施例は、可溶型の三量体CD40L（CD40LT）によりヒト単球からのIL−12産生が促進されるということを示す。二つの異なる提供者から全血を採取し、そしてAldersonらJ.Exp.Med.178:669（1993）において記載されているようにカウンターカレントエルトリエーション法（向流洗浄）により単球を分離した。単球は、培養液のみあるいはCD40LT（１μg/ml）、IFN−γ（10ng/ml）あるいはGM−CSF（10ng/ml）それぞれ単独あるいは組合せ（CD40LT＋IFN−γあるいはCD40LT＋GM−CSF）の存在下のどちらかで、24穴培養皿（Costar  Corp.、Cambridge,MA）を用いて、５×105細胞／穴の濃度で培養した。共刺激の効果が特異的なものか調べるため、CD40Lの中和モノクローナル抗体（10μg/ml）が加えられた。24時間の培養の後培養上清を回収し、そしてヘテロ二量体IL−12を検出する商業的に入手できるEIAを用いて（Ｒ＆Ｄシステムズ、Minneapolis,MN）、IL−12の存在を測定した。結果は以下の表４に示されている。
0003657271.tif 000005
CD40LTとIFN−γとを培養液中に添加することで、IFN−γだけを添加したときと比べて、結果としてIL−12産生が促進（４ないし５倍）された。CD40Lに特異的に結合し、かつその受容体であるCD40へのCD40の結合を阻害するモノクローナル抗体により、その（CD40LT）の効果を抑制することができることからも示されるように、この促進はCD40LTに特異的によるものであった。GM−CSFおよびCD40LTは、これらの実験において、単独でもあるいは組み合わせでもIL−12の分泌を刺激せず、これは膜結合型のCD40Lで刺激された単球によるその他のサイトカインの産生を共刺激するというGM−CSFあるいはIFN−γの活性とは顕著に異なるものであった（Alderson  et  al.,上記）。これらの結果は、可溶型CD40Lはヒト単球によるIL−12の分泌に対して潜在的な共刺激物質であるということである。
実施例６
この実施例は、CD40L  KOマウスが激しいＴ細胞アネルギー（anergy）を示すということである。本質的にGrayとJennings（Ann.Rev.Tuberculosis  72:171,1955）の方法に従い、Van  Burenら、Transplantation  40:694（1985）に記載されたように、CD40L  KOマウスとの対照のC57BL/6X129/JのF1雑種（F1）とで、精製タンパク質誘導体（PPD）に対する、遅延型過敏症（DTH）反応の試験が行われた。
マウス（CD40L  KOあるいは対照）には、200μｌのフロイントの完全アジュバント（CFA;H37Ra）を皮下に免疫した。三週間後、免疫したマウスおよび非免疫の対照群は、50μｌの容量中の２μｇのPPDを後跂の肉趾（rear  footpad）に皮内注射を施された。同時に、等量の通常の塩類溶液を反対側の肉趾に注射した。
48時間後に、肉趾の厚さがミクロメータを用いて測定された；結果は、PPDを投与された肉趾と塩類溶液を投与された肉趾との間で腫脹の程度の差として記述され、そして免疫していない動物にPPDを投与して得られた腫脹の程度と比較された。結果は図３に示されている。
結果から示されることは、試験したCD40L  KOマウスの個体間には反応にいくらかのばらつきがあるものの（図3A）、群としてはCD40L欠損マウスは抗原に対してDTH反応を開始する能力が極端に失われているということである（図3B）。これらの結果から、CD40Lは抗原に対する細胞性免疫の発生に対して決定的なものであることが確認された。
実施例７
本実施例は、CD40リガンドがリーシュマニアに対する細胞性免疫反応の発生において重要であるということを示す。異なる近交系マウスにおけるL.majorの感染経過は、TH1あるいはTH2 CD4＋Ｔリンパ球の分化発生により決定されている。IL−４を分泌するTH2細胞が増加することにより、BALB/cマウスが疾患や寄生虫の播種に感受性になる。これに対してIFN−γを産生するTH1細胞が増加することにより、C57BL/6および129/Jを含む抵抗性のマウス系統が防御的免疫を確立することができる。
CD40L  KOマウスあるいは対照マウス（129/J、C57BL/6）には、後跂の肉趾に、２×105のL.majorを注射により感染させた。疾患の進行は生理学的症状を観察することにより、また非感染の反対側の足と比較しながら感染させた肉趾の厚さを測定することにより、測定された。CD40L  KOマウスでは、プロマスティゴート（promastigote）の接種後４〜６週間の間に感染を受けた後跂で大きな外傷が形成された。これに対して、対照のマウスはL.major感染の進行に抵抗した。肉趾の大きさの平均の変化は図４に示されている。
感染を受けた動物の脾臓由来およびリンパ節（LNC）から取り出されたリンパ球は、試験管内（in  vitro）で、固定化された抗CD3あるいは可溶型のリーシュマニア抗原により刺激され、そしてサイトカイン分泌が測定された。IFN−γ濃度は、前記のようにtwo  site  ELISAにより測定された。IL−４濃度は、PharMingenから入手した抗体とプロトコルを用い、Immunex（Seattle,WA）で作成された組換えマウスIL−４をスタンダードとして用いることで、同様な方法により測定した。結果は表５に示されている。
0003657271.tif 000006
CD40L  KOマウス由来の細胞が、対照のマウス由来の細胞と比較して、有意に少ないIFN−γを、また有意に多くのIL−４を産生していることから、CD40L  KOマウスはリーシュマニアに対するTH 1反応を開始する能力に欠けていることが示されることが示唆される。これらの結果から、CD40L  KOマウスは抵抗性の背景をもつにも関わらず、L.majorに対して感受性であるということが示される。
実施例８
本実施例は、可溶型の三量体CD40リガンドにより感受性マウスにおけるリーシュマニア症の経過が改善されるということを示すである。CD40L  KOマウス、感受性BALB/cマウスおよび対照のC57BL/6X129/JのF1雑種（F1）に、上記のようにL.majorを感染させた。可溶型の三量体組換えCD40リガンド（CD40LT）が、二週間にわたって毎日マウスに投与され（50μg/日）、感染の日を第０日とした。疾患の進行は、前記のように肉趾の厚さを測定することにより、また疾患の症状を観察することによりモニターした。結果は図５に示されている。CD40リガンドにより、CD40L  KOマウスおよび感受性BALB/cマウスの双方においてリーシュマニア症の生理学的重症度を減少させた。
実施例９
本実施例は、可溶型の三量体CD40リガンドにより、ニューモシスティスによる感受性マウスの感染が、調節あるいは改善されているということを示す。CD40L  KOマウスは、特定病原体のいない（SPF）環境で維持された。１つめのグループ（ｎ＝12）には、生後２日目から、１週間に３回、12週間にわたって、CD40LT（50μg/日）が投与された。２つめのグループ（ｎ＝12）には、生後16週目から、１週間に３回、５週間にわたって、CD40LT（50μg/日）が投与された。対照群のマウス（ｎ＝34）には、CD40LTを投与しなかった。結果は図６に示されている。
対照群のマウスは、およそ５カ月齢から死亡しはじめた；さらに、それらのすべてが約11カ月齢までに死亡した。死亡した動物については剖検し、そして死亡原因を特定するため組織学的調査が行われた。特定された唯一の病原性／日和見病原性微生物は、ニューモシスティスであった；すなわち、死亡したマウスの肺は、銀染色によりニューモシスティス感染の特徴的な病変を示していた。これと対称的に、生後直後から12週間にわたってあるいは16週齢から５週間にわたってCD40LTを投与されたマウスは、かなり長く生存した；すなわち、最も早い死亡例は約10カ月齢のときであり、マウスの大多数は生存し、また１歳を超えても一見すると健康である。このようにCD40L  KOマウスはニューモシスティス感染の動物モデルとして有用である；すなわち、この日和見感染性病原体は「通常の」細菌叢としてマウス体内に存在しているようだが、しかし疾患は通常の細胞媒介性の免疫システムにより抑制されている。CD40リガンドは、感受性の個体においてニューモシスティス感染を調節するのに有用であるだろうし、また同様に、細胞性免疫反応が低下した患者においてその他の疾患を調節する際に有用であるだろう。
【図１】
0003657271.tif 000007
【図２】
0003657271.tif 000008
【図３Ａ】
0003657271.tif 000009
【図３Ｂ】
0003657271.tif 000010
【図４】
0003657271.tif 000011
【図５】
0003657271.tif 000012
【図６】
0003657271.tif 000013