(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を感染に感受性の組織中で成長させ、ＰＲＲＳに対して動物を防御するのに十分な量までＰＲＲＳＶを複製させる方法であって、組織細胞にＰＲＲＳＶを接種し、複製されたウイルスを採取し、組織細胞からウイルスを放出し、そしてウイルスの抗原性の塊を希釈、濃縮又は抽出することにより、改変された生又は不活化ワクチンの配合物を生産するように調整する工程を含んで成る方法によって調製され、かつ、該ＰＲＲＳＶがＩＳＵ−Ｐとして表示されそしてＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２の受託番号を有する単離体であることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する保護的免疫反応の誘導に有用な、ＩＳＵ−Ｐとして表示されそしてＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２の受託番号を有する豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス単離体。
【請求項３】
ＩＳＵ−Ｐの増殖に好ましい組織培養細胞である、９００９Ｂと表示されそしてＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１３０２の受託番号を有する連続細胞系。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野：
本発明は豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）単離体に関する。さらに詳細には、本発明はブタ生殖及び呼吸病の診断用及び感染防御用の抗原及びワクチン、並びにそれらの製造方法及び使用方法に関する。
先行技術の簡単な記述：
豚繁殖・呼吸障害症候群は、米国及びヨーロッパのブタ飼育業者にとって経済的打撃を受ける病気問題として急速に出現した。この症候群は１９８７年に米国で最初に記載され、２〜３年後にヨーロッパ及びカナダで同様の記載が現れた。この病気症候群は、謎のブタ病、青流産、青耳ブタ病、ブタ流行性流産及び呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）、ブタ不妊及び呼吸症候群（ＳＩＲＳ）を含む多くの異なる名称で呼ばれてきている。これ以後、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）という名称を採用する。
この病気症候群を再現し得る病原剤は、エンベロープで囲まれ、６２ｎｍの平均ビリオン直径及び２５〜３０ｎｍコアを有し、エンベロープを有する球状の小さなＲＮＡウイルスとして同定された。このウイルスを、トガウイルス科内のアルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属の一員として仮に分類した。本明細書中で記述される豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）単離体はこの仮の分類に適合し、そしてこの病気症候群を再現することが示された。
ＰＲＲＳＶに関連する病気症候群は、成体の雌ブタにおける急性及び慢性の生殖不全並びに若いブタにおける重症から軽症までの呼吸病により特徴づけられる。生殖不全は、乾性壊死の、死産のブタ、及び生存する機会が著しく少ない虚弱に生まれたブタの増大した発生率を伴う後期流産により特徴づけられる。また、感染雌ブタの発情期への遅延した回復についての慢性的な問題が記載されている。呼吸病後遺症は、著しい発熱及び間質性肺炎から穏やかな上部呼吸徴候（即ち、くしゃみ、咳及び鼻又は目の分泌物）の範囲に及ぶ。最近（１９９０年）の血清学及び集団病歴研究は、米国のブタ集団の少なくとも５０％がＰＲＲＳＶにさらされたか或いはＰＲＲＳＶ感染を示す生殖不全及びＰＲＲＳＶ感染を示す呼吸病を経験したことを示している。
この病気症候群は最近出現したので、病気の病因論、疫学及び制御は限られている。理解されるように、ＰＲＲＳＶを含む抗原の効率的な増殖及び加工は、豚繁殖・呼吸障害症候群の予防及び制御の助けとしてＰＲＲＳＶワクチンの開発を促進する。
発明の概要
上記に従い、本発明は、豚繁殖・呼吸障害症候群の診断用の抗原の調製並びにブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する感染防御免疫応答の誘発に有用であるＩＳＵ−Ｐと表示されるウイルス単離体を包含する。また、本発明は抗原の製造方法及び使用方法を包含する。
本発明の実施態様において、ＰＲＲＳＶ単離体は、ウイルス感染ブタ由来の１０％重量／容量（ｗ／ｖ）肺ホモジネートを一次ブタ肺胞マクロファージ又は連続細胞系培養物と３５℃で同時培養して、ＰＲＲＳＶを単離する方法で得ることができる。
本発明は、さらに、アフリカミドリザル腎臓連続細胞系（ＭＡ  １０４）及びクローンされた独特なその誘導体（９００９Ｂ）等のような特定の細胞系中におけるウイルスの高力価に至るまでの増殖を包含する。
また、本発明は、生ウイルス又は死滅ウイルス抗原（通常の又は組換えの）、並びに免疫学的に有効な量のウイルスと希釈剤及び／又はアジュバントをそれぞれ組み合わせてそれら抗原から得られるワクチンの、調製方法及び使用方法を包含する。
生ウイルスを用いる雌ブタの直接実験免疫化或いは生ウイルスで免疫化された雌ブタとの接触は、悪性ＰＲＲＳＶによる鼻控内攻撃に伴う生殖不全を防御することが見い出された。
また、非ワクチン接種対照ブタと比較した場合のワクチン接種体におけるウイルス複製の欠如により測られるように、不活化されアジュバントを添加されたワクチンは、攻撃後のＰＲＲＳ感染からブタを防御したことも見い出された。
発明の詳細な説明
上述したように、本発明は、ワクチン及び診断アッセイに使用するウイルス抗原を得る目的でＰＲＲＳＶウイルス単離体ＩＳＵ−Ｐの単離に関する。ＩＳＵ−Ｐ単離体は虚弱に生まれたブタの肺組織から得られた。具体的に説明すると、汚染の可能性を低減するために、肺、脾臓及びリンパ節由来の１０％  ｗ／ｖ組織ホモジネートを、抗生物質を補強した最小必須培地（ＭＥＭ＋Ａ）中で調製した。粗ホモジネートを４℃で１５分間１５００  ｘ  ｇで遠心して澄ませた。澄ませた上清をＭＥＭ＋Ａ中で１：５に希釈し、そして１．０ｍｌを２５ｃｍ2フラスコ中のＭＡ  １０４細胞の４８時間経過した集密的細胞単層又は一次肺胞マクロファージ上に吸着させた。３５℃での２時間の吸着期間に引き続き、単層をＭＥＭ＋Ａで２回洗浄し、そして５．０％のガンマ線照射されたウシ胎児血清を補強した５．０ｍＬのＭＥＭ＋Ａを添加した。ウイルス単離体が入ったフラスコを５％  ＣＯ2雰囲気下で３５℃でインキュベートし、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の形跡を毎日観察した。ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐ細胞変性効果は、５から１０個の細胞の小さなフォーカスの球状化とともに始まり、そして感染後４〜７日間にわたって多くの細胞が核濃縮され、そして基質から分離するにつれて進行した。
ＰＲＲＳＶ基特異的モノクローナル抗原を用いた蛍光抗原染色により、ＩＳＵ−Ｐ単離体はＰＲＲＳＶ単離体として確認され、公にＳＤＯＷ１７と表示された。さらに、ネガティブ染色されたウイルス感染細胞を、ウイルス粒子の存在について透過型電子顕微鏡で検査した。観察されたウイルス粒子は、球状であり、そして６２ｎｍの平均ビリオン直径及び２７ｎｍのコアを有し、エンベロープを有している。この方法で特性決定された組織培養ウイルスを、妊娠雌ブタの後期流産及び生殖不全を実験的に再現するために使用した（表１）。表１は、ＩＳＵ−Ｐ感染肺ホモジネート（ＰＲＲＳ−ｈｍ）或いは細胞培養物（ＰＲＲＳ−ｔｃ）中で成長したＩＳＵ−Ｐのいずれかにさらされた妊娠雌ブタが、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）の典型的な病気徴候を示すことを示している。ＰＲＲＳ−ｈｍ群では、正常に分娩したブタはいなかった。ＰＲＲＳ−ｔｃ群では、３３匹のブタのうち４匹のみが正常に分娩した。対照的に、３０匹の非暴露ブタのうち２９匹（９６．７％）が分娩の際に正常であった。細胞培養物中での精製後でさえも、ＩＳＵ−ＰがＰＲＲＳの病気を再現できる事実は、この単離体がトガウイルス科内のアルテリウイルス属の一員として正しく分類されたことを確認している。またこの単離体は実験感染ブタに穏やかな間質性肺炎を起こさせることが見い出された。
本発明の特徴は、本発明に従うＰＲＲＳＶが、ワクチンに配合するのに必要とされる抗原の塊を十分に供給できるレベルまでウイルスを効率的に複製する特定の組織培養細胞中で成長できることであり、このワクチンはブタ及び／又は妊娠雌ブタをＰＲＲＳ攻撃から感染防御できるものである。具体的に説明すれば、ＰＲＲＳＶはＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓによりＭＡ  １０４と表示された組織培養細胞中で成長できる。３つの異なる給源から得られたＭＡ  １０４細胞を用いて同じ培養条件を採用したウイルス増殖実験により、高力価に至るまでのＰＲＲＳＶ複製を助ける能力の点から、ＭＡ  １０４細胞間に高度のばらつきが存在することが示された。Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．、農業部門、動物健康製品グループによりＭＡ  １０４（Ｍ）と表示され、そして本明細書中で記述された研究に使用した、１つのＭＡ  １０４細胞培養物は、高力価に至るまでのＰＲＲＳＶ複製を一貫して助けた。さらに、ＭＡ  １０４（Ｍ）由来の、９００９Ｂと表示された、Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．、農業部門、動物健康製品グループにより作出された細胞系クローンは、親の細胞系よりも高い力価に至るまでＰＲＲＳＶ複製を助けた。それ故、ＩＳＵ−Ｐの成長のための好適な組織培養細胞は９００９Ｂである。以下に、ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐの細胞培養増殖をさらに詳細に説明する。
組織培養細胞［ＭＡ  １０４（Ｍ）及び９００９Ｂ］を、５％のウシ胎児血清を補強しそして１．３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムで緩衝化した、高グルコースのダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ／ＨＧ）で維持した。十分な細胞数で細胞継代を行い、４８時間で８０〜１００％の集密的細胞単層を達成した。ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐウイルス株を、ＤＭＥＭ／ＨＧ及びＰＩＰＥＳでｐＨ６．８に緩衝化した５％のウシ胎児血清により希釈した。ウイルスを低い感染多重度（ＭＯＩ）で細胞シート上に接種し、３６℃でインキュベートした。感染培養物をＣＰＥについて４〜７日間毎日観察した。９０〜１００％のＣＰＥが明らかになったときに感染培養物を採取した。１回の−７０℃での解凍融解サイクル後、最大のウイルス抗原の塊を得た。ＭＡ  １０４（Ｍ）中での増殖から得られた平均ウイルス・力価は１０3.0〜１０4.5蛍光抗体感染用量50／ｍｌ（ＦＡＩＤ50／ｍｌ）の範囲に及ぶ。９００９Ｂ細胞クローンでの増殖で達成されるウイルス・力価は１０5.5〜１０6.5ＦＡＩＤ50／ｍｌの範囲に及ぶ。この大きさの力価は、十分な抗原の塊を５０Ｌ容量より大きい商業規模のＰＲＲＳＶワクチン製剤中に配合することを可能にする。
当業者に理解されるように、ＰＲＲＳＶが一旦高レベルの抗原の塊に増殖され得ると、本発明に従い有効であるそのサブユニットを含むこのウイルスの誘導体は、例えばウイルスからの抽出のような当業者に公知の方法で得ることができる。さらに、感染防御抗体は分子レベルで同定でき、そして組換え法を用いて再生できかつ発現できる。
ワクチン製剤のためのウイルス流体は２つの方法で不活化された。選択された不活化剤はホルマリン及びバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であった。不活化は本明細書中でより詳細に述べられる標準法で遂行された。ウイルス流体を３７％ホルムアルデヒド原液と混合して０．０５％の最終ホルマリン濃度とすることにより、ホルマリン不活化を達成した。ホルマリン−ウイルス混合物を室温（約２５℃）で２４時間一定に攪拌しながら維持した。試料を０、８、１２及び２４時間で採取しそして９００９Ｂ細胞中の生ウイルスをアッセイした。細胞変性効果及び基特異的モノクローナル抗体を用いた蛍光染色により、０時間で生ウイルスが検出された。
０．１Ｍ  ＢＥＩ原液（０．１７５  Ｎ  ＮａＯＨ中の２０．５ｇ／Ｌ  ２−ブロモ−エチルアミン  ＨＢＲ）をウイルス流体と組み合わせて１．０ｍＭ  ＢＥＩの最終濃度とすることで、ＢＥＩを用いた不活化を達成した。ＢＥＩ−ウイルス混合物を室温で４８時間一定に攪拌しながら維持することで、不活化を達成した。２時間攪拌しながら１．０Ｍチオ硫酸ナトリウムを添加し０．１ｍＭの最終濃度とすることで、ウイルス不活化を停止した。試料を０、２、４、８、１２、２４及び４８時間で採取しそして上述したように生ウイルスをアッセイした。わずか０、２及び４時間で生ＰＲＲＳＶが検出された。
本発明の改変された生の或いは弱毒化されたワクチンの調製の後に、制限された態様で宿主をいまだ感染できるが宿主中で病気徴候を引き起こせないように、ＰＲＲＳＶを改変した。通常、ウイルスのそのような改変は、アフリカミドリザル腎臓細胞のような非宿主細胞を介して継代させることにより生じる。最初、ウイルスは良好に成長できないか或いは全く成長することができない。後者の場合、ウイルスを細胞培養物での成長に適応させることが必要となるかもしれない。ウイルスを細胞培養物の高い又は低い感染多重度（ＭＯＩ）で添加することで、これが達成できる。あるいは、十分な細胞変性効果が観察され、それ故ウイルスが適応したことが示されるまで、ウイルスを細胞と一緒に強制継代又は盲継代することができる。適応が起こり、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−ＰのＭＡ  １０４（Ｍ）細胞系から９００９Ｂ細胞系への継代が起こる場合に観察されるように、ウイルス・力価が増大するであろう。表１は、組織培養継代ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐ（ＰＲＲＳ−ｔｃ）が肺ホモジネートから単離されたものより悪性がより少ないこと、即ち適応の典型的な結果を示す。表２に開示されたデータは、本発明に従うワクチンの製造方法がＰＲＲＳに対する感染防御に特に有効であることを示す。
不活化されたＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐに、以下のようにしてアジュバントを添加した。
不活化された液に、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌｅ）を基材とするアジュバント及びダイアモンド・サイエンティフィク・アジュバントＢ（Ａｄｊ  Ｂ）からなる群から選択されるアジュバントを添加した。これらアジュバントはワクチン製造で使用される主要な種類を示している。油を基材とするアジュバントはＦＣＡ、ＦＩＡ及びＡｄｊ  Ｂにより示される。水を基材とするアジュバントはカルボポールにより示される。不活化されたＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐは、場合により、適当な保存剤を含んでいてもよい。
不活化されたワクチンを乳化して、代表的には等容量の不活化されたウイルス流体及びアジュバントを使用し、１８ゲージ二重ルアー式ロック装置及び２本の注射器を用いて、ＦＣＡ及びＦＩＡを含有するワクチン製剤が調製できる。濃厚な半固体エマルジョンが形成されるまで、注射器間のアセンブリを介して液を繰り返ししぼり出した。エマルジョンを投与用の注射器に直接詰め込んだ。
Ａｄｊ  Ｂ原液を等容量の不活化されたＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐウイルス流体と混合して、Ａｄｊ  Ｂを含有するワクチン製剤を調製した。アジュバントとウイルスとを室温で１時間攪拌して混合した。アジュバントが添加されたワクチンを多用量滅菌瓶に無菌的に移し、そして投与前４℃で貯蔵した。
カルボポール・アジュバント原液を不活化されたウイルス流体と混合し、１０％  ｖ／ｖの最終アジュバント濃度にして、カルボポールを基材とするワクチン製剤を調製した。アジュバントとウイルスとを室温で４時間攪拌して混合した。アジュバントが添加されたワクチンを多用量滅菌瓶に無菌的に移し、そして投与前４℃で貯蔵した。
不活化前の力価が１０5.0ＦＡＩＤ50／ｍｌと低いＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐウイルスを、記載されている種々のワクチン製剤に使用した。
ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−Ｐがブタ生殖及び呼吸症候群に対して防御できることを示すために、２つのワクチン接種／攻撃研究を行った。第一の研究では、ウイルスを口鼻にさらし、直接ルート或いは病気に罹患したブタとの接触のいずれかを介して、４匹の雌ブタを生ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐで免疫化した。同年齢の２匹の雌ブタを未免疫（未暴露）のままにし、分離して住まわせて対照群とした。直接暴露ワクチン接種を受けたブタ（＃５７及び＃５８）は３．０ｍＬのウイルス接種原を鼻控内から受けた。間接蛍光抗体試験に従うと、暴露後１４日までにそれらは血清変換した。接触暴露雌ブタ（＃４７６及び＃４８０）は病気に罹患したブタと接近して接触された後に口鼻ルートで免疫化された。これらブタは暴露後９０日までに血清変換した。血清変換は１：２０より大きいＩＦＡ力価で示される。
免疫化した雌ブタを血清変換した後、それらの発情現象が同時に発生し、そしてそれらは受精された。妊娠を超音波で確認した。妊娠９０日に、ワクチン接種を受けた妊娠雌ブタ及び対照の妊娠雌ブタは、鼻控内から１  ｘ  １０4ＦＡＩＤ50の力価の３．０ｍＬのＰＲＲＳウイルス攻撃を受けた。
対照の雌ブタ＃５２及び＃４７７は、攻撃後２乃至３日間低減した食欲及び高い体温（１０３〜１０４℃）を示し、病気の初期徴候を示した。ＩＳＵ−Ｐ暴露（ワクチン接種を受けた）雌ブタでは、病気の臨床的徴候は認められなかった。これら結果は、臨床的な呼吸病症候群に対する防御を示している。
すべての雌ブタをブタが離乳するまで（分娩後４週間）維持した。表２はこの実験の分娩結果を示す。
分娩結果は妊娠期間（妊娠はＰＲＲＳ感染で通常短縮される）、死産又は死んだ胎児、虚弱なブタ及びひからびた死体として記録された。これら分娩の困難さはすべて妊娠雌ブタにおけるＰＲＲＳ感染を示す。さらに、正常なブタの数が書き留められた。
対照雌ブタは正常なブタを分娩しなかった（２２匹のブタのうち０匹が正常であった）。２２匹のブタのうち７匹が死産であって２２匹のうち１５匹が虚弱に生まれたブタであった。対照雌ブタの妊娠期間は、妊娠ブタにおけるＰＲＲＳに典型的な２．５日だけ短縮された。免疫化群（ｎ＝５０）では、４０匹のブタ又は８０％が正常に生まれた。５０匹のブタのうち６匹が死産であって５０匹のうち４匹の胎児が分娩の際にひからびて見えた。ワクチン接種群では、虚弱なブタはいなかった。雌ブタにおける病気の直接的な臨床徴候の欠如及びそれらがみごもった胎児の防御により例証されているように、生ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐにさらされた後、受精され次に攻撃された雌ブタは、攻撃に対して防御されていることが明らかである。
理解されるように、この研究で雌ブタの血清状態を調べるために使用されたＩＦＡ試験試薬はＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐ由来のものであり、そして、雌ブタの血清状態とＰＲＲＳに対する防御との間に直接的な相関関係があるので、ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐ単離体は、例えば本明細書において例証された間接蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、血清中和アッセイ、直接蛍光抗体アッセイ法及び当業者に公知の他の診断アッセイのような診断試験に有用であることができる。従って、ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐから得られる抗体由来の診断アッセイが調製でき、本発明に従って使用できる。
第二のワクチン接種／攻撃研究では、若いブタ（４〜６週）に、不活化され、アジュバントが添加された数種のＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐワクチンを接種した。ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐを上述したＢＥＩで不活化しそしてカルボポール、ＦＣＡ／ＦＩＡ又はＡｄｊｉ  Ｂのいずれかのアジュバントを添加して、ワクチン抗体プールを調製した。ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−Ｐを上述したホルマリンで不活化しそして上記同じ３種のアジュバントのいずれかを添加して、第二のワクチン抗体プールを調製した。アジュバント及び細胞が偽免疫応答を刺激できないことを確認するために、３種の偽ワクチンを製造した。未感染組織培養細胞にアジュバントを添加して偽ワクチンを調製した。２匹のブタに各ワクチンを接種した。ワクチンを０、２１、４２及び６４日目に皮下投与した。最終のワクチン接種後７日目に、ブタを１０3.5ＦＡＩＤ50の悪性の生ＰＲＲＳＶで鼻控中から攻撃した。攻撃後毎日すべてのブタの病気の臨床徴候について観察した。さらに、血液試料を採取し、そして組織培養物中でウイルスを回収するために加工した。攻撃後に血流中に見い出された生ウイルスは、ウイルス血症が生じたことを意味する。
血清中和力価は研究の始めの、攻撃の日と攻撃後１９日目に評価された。血清中和試験は上述した研究に使用したＩＦＡ試験よりも感度が低いことに留意すべきである。したがって、これら力価結果を上述した力価結果と比較することはできない。
表３は攻撃の結果を列挙する。ワクチン接種を受けた又は対照のブタでは、病気の臨床徴候が観察されなかった。さらに、ワクチン接種を受けた又は対照のブタのいずれもワクチン接種期間中に血清中和力価を上昇させなかった。このことは、この期間中に生ウイルスにさらされなかった（対照群はネガティブのままであった）ことを示し、また、ワクチンは血清中和試験で測定されるのに十分に高い体液性応答を刺激しなかったことを示している。攻撃後の血清中和力価応答が顕著であるという事実は、すべてのブタが生ＰＲＲＳウイルスで有効に攻撃されたことを示している。この攻撃暴露はウイルス血症を示す対照ブタの率で立証されている。対照ブタの１匹以外のすべて（８７．５％）が感染された。ワクチン接種を受けたブタの免疫応答があまりに強力なため、それらはウイルス血症を防御できた。ワクチン接種を受けたブタの１２匹のうちの１匹（８．３％）のみがウイルス血症を示した。したがって、ワクチンは９１．７％のブタを防御した。
特異的に適応させたＭＡ  １０４（Ｍ）のクローンである、アフリカミドリザル細胞（９００９Ｂ）を介する原ＰＲＲＳＶ単離体の強制継代は、ウイルスの１個以上のエピトープを成功裏に改変することができ、その結果、他の科学者等が失敗した分野においてワクチンの製造を可能にするようにこのウイルスの抗原性を高めることができたものと、本発明のどのような特定の理論にも拘束されることなく、信じられている。
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本発明は、具体的に説明する目的で先に詳述されているが、そのような詳細はその目的のためのみであり、請求の範囲により限定されている以外は本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、当業者が改変することができるものと理解されるべきである。
なお、本発明の主な特徴又は態様は次のとおりである。
１．ＰＲＲＳに対して動物を防御するために、或いは該ＰＲＲＳを診断し又は組換え製品の開発用にＰＲＲＳＶの分子構造を同定するために使用するのに、十分な量まで該ウイルスを複製するための、感染されやすい組織培養物中における該ＰＲＲＳＶの増殖方法であって、該ウイルスを該組織培養物上に接種しそして複製されたウイルスを採取することを含んでなる該方法。
２．組織培養物が細胞系を含んでなる前記第１項記載の方法。
３．組織培養物がアフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系である前記第２項記載の方法。
４．アフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系がＭＡ  １０４（Ｍ）と表示される種類のものである前記第３項記載の方法。
５．細胞系がアフリカ・グリーン・モンキー細胞系のクローンであり、該クローンが９００９Ｂと表示される前記第４項記載の方法。
６．前記第１項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。
７．前記第２項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。
８．前記第３項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。
９．>１０5.0／ｍＬのＦＡＩＤ50力価で>２５リットルの商業規模で、前記第１項の記載に従って製造されるＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。
１０．前記第１項に記載されているようにＰＲＲＳＶを供給し、該ウイルスを組織培養細胞から取出し、抗体塊を希釈、濃縮又は抽出により調整して、改変された生の（弱毒化された）、不活化されたサブユニット用或いは組換え製剤用の免疫学的に有効な量の該抗体塊を製造することを含んでなる、ＰＲＲＳに対してブタを防御するのに有効なワクチンの調製方法。
１１．ウイルスがＰＲＲＳの徴候を生じなくなるまで非宿主細胞及び細胞系を介してＰＲＲＳＶを強制継代することにより、改変された生の又は弱毒化されたワクチンを製造するように該ＰＲＲＳＶを適応させる方法。
１２．ＰＲＲＳＶが改変された生のもの（弱毒化された）であり、そして液体、凍結又は粉末形態である、前記第１０項記載の方法で調製されるワクチン。
１３．ＰＲＲＳＶが不活化されそしてアジュバントを添加され、そして場合により適当な保存剤を含んでなる、前記第９項記載の方法を用いて調製されるワクチン。
１４．アジュバントが油を基材とするものであるか或いは水を基材とするものである、前記第１３項記載のワクチン。
１５．アジュバントが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、カルボポールを基材とするアジュバント及びダイアモンド・サイエンティフィク・アジュバントＢからなる群から選択される、前記第１３項記載のワクチン。
１６．不活化剤がバイナリーエチレンイミン、ベータ  プロピロラクトン又はホルマリンである、前記第１３項記載のワクチン。
１７．組織培養物がアフリカ・グリーン・モンキー細胞として分類される種類の細胞系である、前記第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン。
１８．アフリカ・グリーン・モンキー細胞が９００９Ｂと表示される細胞系クローンである、前記第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン。
１９．抗原の塊が不活化され、改変された生の（弱毒化された）、抽出されたものであり、そしてサブユニットとして用いられるか或いは組換え法を介して得られる、前記第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン。
２０．ＰＲＲＳＶが複数のＰＲＲＳＶ単離体を含んでなる、前記第１０項記載の方法により調製されるワクチン。
２１．ＰＲＲＳＶがＩＳＵ−Ｐとして表示される単離体である、前記第１０項記載の方法により調製されるワクチン。
２２．９００９Ｂと表示されるアフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系を介してウイルスを強制継代することにより、抗原性を高めるためのＰＲＲＳＶのエピトープを改変する方法。
２３．前記第２２項記載のＰＲＲＳＶから調製されたワクチン。