(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化されたCpG含有核酸を検出する方法であって、核酸含有検体を、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させ、該検体中のCpG含有核酸をCpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅し、その際、該オリゴヌクレオチドプライマーは修飾された非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するものであり、そして、該増幅工程において生成される増幅産物の存在または不在に基づいてメチル化核酸を検出することを含んでなる方法。
【請求項２】
増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾試薬が重亜硫酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シトシンが修飾されてウラシルとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
CpG含有核酸がプロモーター領域に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが癌抑制遺伝子のプロモーターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌抑制遺伝子がp16、p15、ＥカドヘリンおよびVHLよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
CpG含有核酸がアンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、TGF−β１、TGF−β２、p130、BRCA2、NF1、NF2、TSG101、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、06−MGMT、MLHI、MSH2およびGFAPよりなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検体が脳、結腸、尿生殖器、肺、腎臓、造血組織、乳房、胸腺、精巣、卵巣および子宮よりなる群から選択される組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検体が血清、尿、唾液、脳脊髄液、痰、射出精液、血液および糞便よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記制限エンドヌクレアーゼがMsp I、Hpa II、BssH II、BstU IおよびNot Iよりなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記検体におけるメチル化CpG含有核酸の存在が細胞増殖性疾患を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が低度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、白血病、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌および神経芽細胞腫よりなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが配列番号１〜104よりなる群から選択される配列を有する標的ポリヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーが配列番号105〜208よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有する第１の容器を含む１個以上の容器を密着拘束状態で受容する区画化されている保持手段、およびCpG含有核酸の増幅用プライマーを含有する第２の容器を含んでなる、メチル化CpG含有核酸検出用キットであって、但し該プライマーが修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸とを区別するものである、前記キット。
【請求項１８】
前記修飾試薬が重亜硫酸塩である、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
前記試薬がシトシンを修飾してウラシルにするものである、請求項17に記載のキット。
【請求項２０】
前記プライマーが配列番号１〜104よりなる群から選択される配列を有する標的ポリヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、請求項17に記載のキット。
【請求項２１】
前記プライマーが配列番号105〜208よりなる群から選択される、請求項17に記載のキット。
【請求項２２】
サンプルからメチル化CpG含有核酸を検出するためのキットであって、
ａ）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する試薬、
ｂ）野生型の修飾されていない対照核酸、
ｃ）非メチル化CpG含有核酸の増幅用プライマー、
ｄ）メチル化CpG含有核酸の増幅用プライマー、および
ｅ）修飾されていない対照核酸の増幅用プライマー、
を含んでなり、但し該非メチル化CpG含有核酸の増幅用プライマーと該メチル化CpG含有核酸の増幅用プライマーとが修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸とを区別するものである、前記キット。
【請求項２３】
核酸増幅緩衝液をさらに含む、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
非メチル化シトシンを修飾する試薬が重亜硫酸塩である、請求項22に記載のキット。
【請求項２５】
前記プライマーが配列番号１〜104よりなる群から選択される配列を有する標的ポリヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、請求項22に記載のキット。
【請求項２６】
前記プライマーが配列番号150〜208よりなる群から選択される、請求項22に記載のキット。
【請求項２７】
メチル化CpG含有核酸を検出するための単離されたオリゴヌクレオチドプライマー対であって、該プライマー対のそれぞれのプライマーが配列番号１〜104よりなる群から選択される配列を有する標的ポリヌクレオチド配列と高ストリンジェシー条件でハイブリダイズするものであり、そして、該プライマー対は、そのプライマー対を用いて生成される増幅産物の存在または不在に基づいて、修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸とを区別するものである、上記プライマー対。
【請求項２８】
配列番号順で対にした配列番号105〜208の配列の対よりなる群から選択される、請求項27に記載のプライマー対。
【請求項２９】
メチル化されたCpG含有核酸を検出する方法であって、
核酸含有検体を重亜硫酸塩と接触させて非メチル化シトシンを修飾し、
該検体中のCpG含有核酸をCpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅し、その際、該オリゴヌクレオチドプライマーは修飾された非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するものであり、および
前記増幅工程において生成される増幅産物の存在または不在に基づいてメチル化核酸を検出すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項３０】
核酸配列の5'調節領域中のメチル化されたCpGを検出する方法であって、核酸含有検体を、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させ、
該検体中のCpG含有核酸をCpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅し、その際、該オリゴヌクレオチドプライマーは該5'調節領域中の修飾された非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するものであり、そして、
前記増幅工程において生成される増幅産物の存在または不在に基づいてメチル化核酸を検出すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項３１】
前記試薬が重亜硫酸塩である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものである、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
シトシンが修飾されてウラシルとなる、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
5'調節領域がプロモーター領域内に存在する、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロモーターが癌抑制遺伝子のプロモーターである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
癌抑制遺伝子がp16、p15、ＥカドヘリンおよびVHLよりなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記検体が脳、結腸、尿生殖器、肺、腎臓、造血組織、乳房、胸腺、精巣、卵巣および子宮よりなる群から選択される組織に由来する、請求項30に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３９】
前記制限エンドヌクレアーゼがMsp I、Hpa II、BssH II、BstU IおよびNot Iよりなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記5'調節領域におけるメチル化CpGの存在が細胞増殖性疾患を示す、請求項30に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が低度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、白血病、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌および神経芽細胞腫よりなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記プライマーが配列番号１〜104よりなる群から選択される配列を有する標的ポリヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、請求項30に記載の方法。
【請求項４３】
前記プライマーが配列番号105〜208よりなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、概して遺伝子発現の調節に関するものであり、さらに詳細には所与の遺伝子座中のCpG部位のDNAメチル化状態を測定するための方法に関する。
発明の背景
高等真核生物において、DNAは、CpGジヌクレオチド中のグアノシンの５′側に位置するシトシンでのみメチル化される。この修飾は、遺伝子発現において、特に含まれているCpGに富む領域（CpG島として知られている）が多くの遺伝子のプロモーター領域に存在する場合に重要な制御効果を有する。常染色体では殆ど全ての遺伝子関連の島がメチル化から保護されているが、CpG島の広範にわたるメチル化は、所与の刷込み遺伝子の転写の不活性化および雌の不活性Ｘ染色体上の遺伝子の転写の不活性化と関連している。通常はメチル化されていないCpG島の異常なメチル化は、不死化細胞または形質転換細胞では頻繁に見られる事象であることが記載されており、ヒト癌における特定の癌抑制遺伝子の転写の不活性化と関連している。
ヒト癌細胞は、典型的には、重要な遺伝子の突然変異、増幅または欠失を特徴とする体細胞改変ゲノムを含んでいる。さらに、ヒト癌細胞由来のDNA鋳型は、DNAのメチル化という体細胞の変化を示すことが多い（E.R.Fearonら,Cell,61:759,1990;P.A.Jonesら,Cancer Res.46:461,1986;R.Holliday,Science,238:163,1987;A.De Bustrosら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:5693,1988;P.A.Jonesら,Adv.Cancer Res.,54:1,1990;S.B.Baylinら,Cancer Cells,3:383,1991;M.Malosら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:1929,1992;N.Ohtani−Fujitaら,Oncogene,8:1063,1993）。しかしながら、ヒトの腫瘍発生における異常なDNAメチル化の正確な役割は立証されていない。DNAメチラーゼは、メチル基を、普遍的メチル供与体であるＳ−アデノシルメチオニンからDNA上の特定の部位へと転移させる。幾つかの生物学的機能は、DNA中のメチル化された塩基に起因している。最も確立された生物学的機能は、コグネイト制限酵素による消化からのDNAの保護である。これまで、制限修飾現象は細菌でしか見られなかった。しかしながら、哺乳動物細胞にも別のメチラーゼがあり、これは、（CpGの）グアニンの５′側に隣接するDNA上のシトシン残基だけを限定的にメチル化する。このメチル化は、幾つかの系統の証拠によって、遺伝子活性、細胞分化、腫瘍発生、Ｘ染色体の不活性化、遺伝子刷込み、およびその他の主要な生物学的プロセスにおいて或る役割を担っていることが示されている（Razin,A.,H.,おゆびRiggs,R.D.編,DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance,Springer−Verlag,New York,1984）。
最近、CpGに富む領域（すなわち「CpG島」）が17p13.3において同定され、この領域は、ヒト癌の多くの共通タイプにおいて異常に高メチル化（hypermethylated）されている（Makos,M.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1929,1992;Makos,M.ら,cancer Res.,53:2715,1993;Makos,M.ら,Cancer Res.53:2719,1993）。この高メチル化は、脳の癌、結腸癌および腎臓癌における17p喪失およびp53変異のタイミングや頻度と符号している。通常はメチル化されていないプロモーター領域CpG島の高メチル化に関わるサイレント遺伝子転写は、癌抑制遺伝子を不活性化するためのコード領域の突然変異のもう１つの機構と見なされている（Baylin,S.B.ら,Cancer Cells,3:383,1991;Jones,P.A.およびBuckley,J.D.,Adv.Cancer Res.,54:1−23,1990）。現在、この変化は、3pに存在する腎臓癌の癌抑制遺伝子であるVHL（J.G.Hermanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:9700−9704）、6q上に存在するエストロゲン受容体遺伝子（Ottaviano,Y.L.ら,Cancer Res.,54:2552,1994）および11p上に存在するH19遺伝子（Steenman,M.J.C.ら,Nature Genetics,7:433,1994）の発現の喪失と関連づけられている。
真核細胞では、グアノシンの５′側に直に存在しているシトシン残基のメチル化は、CGに乏しい領域で優先的に起こる（Bird,A.,Nature,321:209,1986）。これに対して、CpG島と呼ばれる不連続なCGジヌクレオチドからなる領域は、正常細胞ではメチル化されないままであるが、但し、Ｘ染色体の不活性化（Migeonら，前掲）および親特異的刷込み（Liら,Nature,366:362,1993）の間だけはメチル化され、この場合、この５′調節領域のメチル化によって転写が抑制され得る。Rb遺伝子のde novoメチル化が網膜芽細胞腫の一部で実証されており（Sakaiら,Am.J.Hum.Genet.,48:880,1991）、最近、さらに詳細なVHL遺伝子の分析により、散発性腎臓細胞癌腫のサブセットにおける異常なメチル化が示された（Hermanら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:9700,1994）。癌抑制遺伝子の発現はまた、通常はメチル化されていない５′CpG島のde novo DNAメチル化によっても破壊できる（Issaら,Nature Genet.,7:536,1994;Hermanら，前掲;Merloら,Nature Med.,1:686,1995;Hermanら,Cancer Res.,56:722,1996;Graffら,Cancer Res.,55:5195,1995;Hermanら,Cancer Res.,55:4525,1995）。
現在までにメチル化シトシン検出用に開発されてきた方法の大部分は、メチル化感受性制限酵素またはメチル化反応性化学物質（例えば、ヒドラジン：これは、シトシンとその５−メチル化誘導体とを区別する）を用いてシトシン残基に並ぶホスホジエステル結合を切断させることに基づくものである。メチル化感受性酵素の使用には、広く一般に適用できないという欠点がある。その理由は、ゲノム中でのメチル化されている可能性がある部位の或る限られた割合だけしか分析できないからである。ゲノムDNA中の５−MeC残基を、どのようなマクサム・ギルバート配列決定反応を用いても切断されない部位として同定するゲノム配列決定プロトコールは、最初のゲノム配列決定法の実質的な改善であるが、大量のゲノムDNAを必要とすること、および種々の強度のバンドを含む可能性のあるシークエンシングラダー中のギャップを検出することが困難であること、といった不都合な点が依然としてある。
DNA中でのメチル化領域のマッピングは、主に、サザンハイブリダイゼーション法によるものであり、これは、メチル化感受性の制限酵素が、１つ以上のメチル化CpG部位を含んでいる配列を切断する能力を持たないことに基づいている。この方法は、CpG島の全体のメチル化状態の評価（幾つかの定量分析を含む）を提供するが、比較的感受性がなく、大量の高分子量DNAを必要とし、メチル化感受性制限酵素により認識される配列中に見出されるCpG部位についての情報だけしか提供できない。メチル化パターン検出のさらに感度の高い方法は、メチル化感受性酵素の使用とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とを組合せたものである。そのような酵素を用いてDNAを消化した後、DNAの切断がメチル化によって阻止される場合にだけ、PCRによって制限部位に隣接するプライマーから増幅が起こる。サザン系の方法と同様に、この方法は、メチル化感受性制限部位のCpGメチル化だけしかモニターできない。さらに、非メチル化DNAの制限酵素切断（restriction）は完全でなければならない。何故ならば、切断されていないDNAであれば如何なるものもPCRにより増幅されてしまい、メチル化に関して誤差を含む結果が生じるからである。この方法は、高比率の対象対立遺伝子がメチル化されているサンプルの研究、例えば、刷込み遺伝子およびＸ染色体の不活性化された遺伝子の研究に有用である。しかしながら、制限酵素切断が不完全であることとメチル化された対立遺伝子の数が少ないこととの区別が困難であるために、この方法は、メチル化対立遺伝子が集団のほんの一部分にしか該当しない少量サンプルにおける癌抑制遺伝子の高メチル化を検出するには信頼性がない。
制限エンドヌクレーゼを使用しなくても済む別の方法は、DNAの重亜硫酸塩（disulfite）処理を利用して、全ての非メチル化シトシンをウラシルに転換するものである。この改変DNAを増幅し配列決定を行って、全てのCpG部位のメチル化状態を示す。しかしながら、この方法は、技術的に難しく、非常に労力を要し、しかも増幅した生成物をクローニングせず、サザン分析よりも感度が低く、検出には約10％の対立遺伝子がメチル化されていることが必要である。
腫瘍発生において最も早期の遺伝子変化を同定することは、分子レベルでの癌研究において大きく注目されている。これらの変化の同定をベースとする診断方法により早期の検出方策の実施の可能性が見込まれ、これらの早期の変化を標的とする新規な治療方法はより有効な癌治療をもたらすであろう。
発明の概要
CpG島におけるDNAメチル化パターンの正確なマッピングは、Ｘ染色体不活性化、ヒト癌で沈黙している癌抑制遺伝子、刷込み遺伝子の調節といった様々な生物学的プロセスを理解するために必要不可欠になってきている。本発明は、メチル化感受性制限酵素の使用に依存しない、CpG島内の任意のCpG部位群のメチル化状態の迅速な評価方法を提供する。PCRの使用と重亜硫酸修飾の使用に関する当業者の知識にもかかわらず、本発明以前には、独立して、PCR反応そのものを用いて化学的に修飾されたメチル化DNAと非メチル化DNAとを区別するような、重亜硫酸反応に特異的なプライマーをだれひとりとして作製したものはいなかった。
本発明の方法は、重亜硫酸ナトリウムまたは全ての非メチル化シトシン（メチル化シトシンではない）をウラシルに変換する同等の試薬によりDNAを修飾し、次いで非メチル化DNAと比較してメチル化DNAに特異的なプライマーにより増幅することを含む。この「メチル化特異的PCR」つまりMSPの方法は、ごく少量のDNAを必要とするだけであって、所定のCpG島遺伝子座の0.1％のメチル化対立遺伝子に感受性であり、また、例えばパラフィン包埋サンプルから抽出したDNAに対して実施可能である。メチル化DNAと非メチル化DNAを区別するために示差的な制限酵素切断に依存している、PCRに基づいた従来法ではもともと偽陽性の結果が出現しやすいが、MSPではかかる結果を排除できる。
本発明の特定の実施態様において、MSPはヒト癌形成の際の癌抑制遺伝子（例えば、p16、p15、ＥカドヘリンおよびVHL）の転写不活性化と関連したプロモーター領域の高メチル化変化を同定するのに有用である。メチル化されることが判明した他の遺伝子には、エストロゲン受容体、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、06−MGMT、MLH1、MSH2およびGFAPなどがある。これらのうち、エストロゲン受容体、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、06−MGMTおよびMLH1は、正常組織と比較して癌形成組織において高メチル化されていることがMSPで明らかにされた。本発明は、初めて、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤であるTIMP−２が正常組織と比べたとき癌形成組織において高メチル化されているという証拠を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、p16のゲノム配列を示している。示されている配列は、ゲルの下部に最も5'側の領域を有するもので、これは主転写開始部位に対して＋175から始まる（Hara,et al.,Mol.Cell Biol.,16:859,1996）。非メチル化細胞系H249中のすべてのシトシンはチミジンに変換されたが、メチル化細胞H157中のCpGジヌクレオチドのすべてのＣはＣのままであった。］は、Genbank配列U12818中の転写開始部位に対して−59にあるBstU I部位を囲んだものであるが（Hussussian,et al.,Nat.Genet.,8:15,1994）、この部位は、配列X94154中でCGCAとして誤って同定されている（Haraら，前掲）。このCGCG部位は、p16 MSPに対して使用されたセンスプライマーの３′位置を表している。
図２のパネルＡ〜Ｅは、p16のメチル化特異的PCR産物を有するポリアクリルアミドゲルを示している。増幅に使用したプライマーセットは、非メチル化（Ｕ）、メチル化（Ｍ）、または非修飾／野生型（Ｗ）として記されている。＊は、分子量マーカーpBR322−Msp I消化物を表している。パネルＡは、癌細胞系および正常リンパ球由来の重亜硫酸塩処理DNA、ならびに未処理DNA（細胞系H249由来）の増幅を示している。パネルＢは、種々の量のH157 DNAと１μｇのH249 DNAとを混合した後に重亜硫酸塩処理を行うことによるメチル化対立遺伝子に対するMSPの検出感度の評価を示している。原発性肺癌サンプルおよび正常肺由来の修飾DNAもまた示されている。パネルＣは、表１に記載のp16−U2プライマー（Ｕ）およびp16−M2（Ｍ）プライマーを用いた増幅を示している。パネルＤは、BstU Iを用いて制限酵素消化された（＋）または制限酵素消化されていない（−）パネルＣの増幅されたp16産物を示している。パネルＥは、メチル化特異的であるセンスプライマーp16−U2（Ｕ）およびp16M2（Ｍ）ならびにメチル化特異的でないアンチセンスプライマーを用いて、MSPを有するCpG島の局所的メチル化に対する試験を行った結果を示している。
図３のパネルＡ〜Ｅは、数種の遺伝子の解析から得られたMSP産物のポリアクリルアミドゲルを示している。増幅に使用したプライマーセットは、非メチル化（Ｕ）、メチル化（Ｍ）、または非修飾／野生型（Ｗ）として記されていない。＊は、分子量マーカーpBR322−Msp I消化物を表し、＊＊は、123bpの分子量マーカーを表している。DNAサンプルは、未処理と記されたもの以外はいずれも、重亜硫酸塩処理を施した。パネルＡは、p15に対するMSPから得られた結果を示している。パネルＢは、BstU Iを用いて制限酵素消化された（＋）または制限酵素消化されていない（−）p15産物を示している。パネルＣは、VHLに対するMSPの産物を示している。パネルＤは、BstU Iを用いて制限酵素消化された（＋）または制限酵素消化されていない（−）VHL産物を示している。パネルＥは、Ｅ−カドヘリンに対するMSPの産物を示している。
好ましい実施態様の説明
本発明は、DNAメチル化パターンを同定するためのメチル化特異的PCR（MSP）を提供する。MSPはPCR反応そのものを利用して修飾されたメチル化DNAと非メチル化DNAとを識別するものであるが、これによりメチル化検出感度が改良される。
CpG配列を避けるように特異的にデザインされた増幅プライマーを利用するメチル化同定のための従来型ゲノム配列決定法と異なり、MSPプライマー自体はCpG部位を認識するように特異的にデザインされ、メチル化の差異をうまく利用して本発明のアッセイにより同定される特異的産物の増幅を行う。
以下の実施例中に示されているように、MSPは、メチル化のアッセイを行うために使用される従来のPCR法および他の方法よりもかなり優れた利点を提供する。MSPはサザン分析よりも著しく感度が高いため、少数のメチル化対立遺伝子の検出および少量のサンプルから得られるDNAの研究が容易になる。MSPを用いると、サザン分析ではこれまで分析することのできなかったパラフィン包埋材料の研究が可能となる。また、MSPを用いると、メチル化感受性制限酵素により認識される配列内の部位を除くすべてのCpG部位を調べることが可能となる。これにより、アッセイの対象となりうるこうした部位の数が著しく増大し、CpGに富んだ領域全体にわたるメチル化パターンの迅速かつ精密なマッピングが可能となるであろう。また、MSPを用いると、メチル化検出のための従来のPCR法に特有のメチル化感応性酵素の部分的消化に起因してしばしば得られる偽陽性結果を低減させることができる。更に、MSPを用いれば、単一サンプル中の非メチル化産物およびメチル化産物を同時に検出することにより、PCR用鋳型としてDNAの完全性を確認でき、しかもサザン分析の結果と相関づけられる対立遺伝子タイプの半定量的評価が可能となる。最後に、制限パターンの差により増幅産物を確認する能力は、更なる利点である。
規定された領域内のほとんどのCpG部位に対してMSPよりも直接的な分析を行うことのできる唯一の技法はゲノム配列決定法である。しかしながら、MSPは、同じような情報を提供できるとともに、次のような利点を有する。第１に、MSPの方がゲノム配列決定法よりもかなり単純であり、しかも所要時間が短かくて済む。この場合、典型的なPCRおよびゲル分析を行うのに４〜６時間かかる。これとは対照的に、ゲノム配列決定、増幅、クローニング、およびそれに続く配列決定を行うには数日かかる可能性がある。MSPはまた、高価な配列決定用試薬の利用や放射能の利用を回避することができる。これらの要因の両方により、MSPは多数のサンプルの分析により適したものとなっている。第３に、MSPにおいてメチル化DNAと非メチル化DNAとの識別ステップとしてPCRを使用することにより、メチル化検出の感度が増大する。例えば、DNAのゲノム配列決定を行う前にクローニングを行わない場合、非メチル化DNAのバックグラウンド中で10％未満のメチル化DNAを認識することはできない（Myohanenら，前掲）。PCRおよびクローニングを利用するとゲノム配列決定法により非常に少量のDNA中のメチル化パターンを感度良く検出することができるようになる（Frommerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1827,1992;Clarkら,Nucleic Acids Research,22:2990,1994）。しかしながら、これは、実際には、10％のメチル化を検出するのに10個のクローンの配列分析が必要であり、１％のメチル化を検出するのに100個のクローンの配列分析が必要であり、更に、本発明者らがMSPを用いて得た感度レベル（1:1000）に達するためには1000個の各クローンの配列を決定しなければならないであろうことを意味する。
第１の実施態様において、本発明は、核酸含有試料を、非メチル化シトシンを修飾する試薬に接触させる工程、修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸とを識別するCpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用して試料中のCpG含有核酸を増幅する工程、及びメチル化された核酸を検出する工程を包含する、メチル化されたCpG含有核酸の検出方法を提供する。増幅ステップは場合に応じて利用されるが、本発明の好ましい方法では増幅ステップを利用することが望ましい。本発明の方法は、修飾された（例えば、化学的に修飾された）メチル化DNA及び非メチル化DNAとを識別するためにPCR反応そのものを利用する。
本明細書中で使用する場合、用語「修飾」とは、非メチル化シトシンを、非メチル化シトシンとメチル化シトシンとが識別される他のヌクレオチドへ変換することを意味する。好ましくは、試薬は、非メチル化シトシンを修飾してウラシルを形成する。好ましくは、非メチル化シトシンの修飾に使用される試薬は重亜硫酸ナトリウムであるが、非メチル化シトシンを同じように修飾するがメチル化シトシンは修飾しない他の試薬を本発明の方法に使用することもできる。重亜硫酸ナトリウム（NaHSO3）は、シトシンの5,6−二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとはそれほど反応しない。シトシンが重亜硫酸イオンと反応すると、脱アミノ化を起こし易いスルホン化シトシン反応中間体を形成し、その結果、スルホン化ウラシルを生じる。スルホネート基は、アルカリ条件下で除去可能であり、結果としてウラシルが形成される。ウラシルは、Taqポリメラーゼによりチミンとして認識されるため、PCRを行うと、得られる産物には、最初の鋳型DNA中で５−メチル−シトシンが存在していた場所にだけシトシンが含まれる。
試料中のCpG含有核酸を増幅するために本発明で使用されるプライマーは、重亜硫酸塩修飾の後で、特に、未処理または非修飾DNA、メチル化DNA、および非メチル化DNAを識別する。非メチル化DNAに対してMSPプライマーは、好ましくは、３′CG対中にＴを有し、メチル化DNA中に保持されているＣとこのＴとが区別され、この補体（compliment）がアンチプライマー用としてデザインされる。センスプライマー中にはＣが存在せず、アンチセンスプライマー中にはＧが存在しないであろうから、通常、MSPプライマーには、その配列中に比較的少量のＣまたはＧが含まれる（Ｃは修飾されてＵ（ウラシル）となり、このウラシルは増幅産物中ではＴ（チミン）として増幅される）。
本発明のプライマーは、多形座において有意な数の核酸上で重合を特異的に開始するように、十分な長さおよび適切な配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでいる。特に、用語「プライマー」とは、本明細書中で使用する場合、２つ以上、好ましくは３つ以上、最も好ましくは８つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む配列を意味するが、この配列は、プライマー伸長産物の合成を開始することができ、更に、多形座の鎖に実質的に相補的である。合成の助けとなる外界条件としては、ヌクレオシド三リン酸および重合用試薬、例えば、DNAポリメラーゼの存在、ならびに適切な温度およびpHが挙げられる。プライマーは、増幅効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、最初に、個々の鎖に分離するようにプライマーを処理し、その後で伸長産物の調製に使用する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合誘発剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成など、多くの要因に依存するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、12〜20個またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それよりも少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。
本発明のプライマーは、増幅されるゲノム座の各鎖に「実質的に」相補的となるように、しかも上述したように適切なＧまたはＣヌクレオチドを含むようにデザインされる。このことは、プライマーが、重合用の試薬が機能できる条件下で、それぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分な相補性をもたなければならないことを意味する。言い換えると、プライマーは、５′および３′隣接配列との十分な相補性を有し、それらとの間でハイブリダイズすることができ、しかもゲノム座の増幅を可能にするものでなければならない。代表的なプライマーが配列番号105−208で示されているが、配列番号１−104の標的配列とハイブリダイズする任意のプライマーが本発明に包含され、記載のようにメチル化核酸を検出するための本発明の方法に有効であると考えられる。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与する反応ステップの数に対して指数関数的な量の標的座を生成する酵素的連鎖反応である増幅プロセスに利用される。典型的には、一方のプライマーは、標的座のマイナス（−）鎖に相補的であり、他方のプライマーは、プラス（＋）鎖に相補的である。プライマーを変性核酸にアニールさせ、続いて、DNAポリメラーゼＩの大きな断片（クレノウ断片）などの酵素およびヌクレオチドを用いて伸長を行うと、標的座配列を含有する新たに合成された＋鎖および−鎖が得られる。これらの新たに合成された配列もまた鋳型であるので、変性、プライマーのアニーリング、および伸長のサイクルを繰り返すと、プライマーにより規定される領域（すなわち、標的座配列）が指数関数的に産生される。連鎖反応の産物は、利用した特異的プライマーの端部に対応した末端を有する離散した（discrete）核酸二本鎖である。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、従来型のホスホトリエステル法およびホスホジエステル法、またはそれらが自動化された実施態様など、任意の好適な方法を用いて調製してもよい。このような自動化された実施態様の１つにおいて、出発原料としてジエチルホスホルアミダイトを使用されるが、この化合物は、Beaucageらの報告（Tetrahedron Letters,22:1859−1862,1981）に従って合成可能である。改変固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１方法が、米国特許第4,458,066号に記載されている。
精製または未精製の形態の任意の核酸試料が、出発原料として利用できるが、ただし、この試料には標的座（例えば、CpG）を含有した特異的核酸配列が含まれるかまたは含まれる可能性があるものとする。従って、本発明では、例えば、DNAまたはRNA（伝令RNAを含む）を利用することができ、この場合、DNAまたはRNAは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。RNAを鋳型として使用する場合、鋳型を逆転写してDNAを形成するために最適な酵素および／または条件が利用されることになるであろう。このほか、それぞれの一本鎖を含有するDNA−RNAハイブリッドを使用してもよい。核酸の混合物を利用してもよいし、または同一もしくは異なるプライマーを用いて本明細書中に記載の増幅反応で産生された核酸を利用してもよい。増幅される特異的核酸配列、すなわち、標的座は、より大きな分子の断片であってもよいし、または特異的配列が核酸全体を構成するような離散分子として最初に存在させることも可能である。増幅される配列が最初に純粋な形態で存在する必要はなく、全ヒトDNA中に含まれているような複合混合物中の少量断片であってもよい。
メチル化CpGの検出に使用される核酸含有試料は、脳、結腸、尿生殖器、造血器、胸腺、精巣、卵巣、子宮、前立腺、乳房、結腸、肺、および腎臓の組織など、任意の供給源に由来するのであってよく、更に、Maniatisらの記載（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY,pp280,281,1982）の技法など、種々の技法により抽出されたものであってもよい。
抽出されたサンプルが不純である場合（例えば、血漿、血清、糞便、射出精液、痰、唾液、脳脊髄液、もしくは血液、またはパラフィン中に包埋されたサンプル）、増幅を行う前に、細胞、流体、組織、またはサンプルの動物細胞膜を開裂させて核酸の鎖の露呈および／または分離を行うのに有効な量の試薬で処理してもよい。こうした溶解および核酸変性ステップにより鎖の露呈および分離を行うと、増幅がかなり容易に行えるようになるであろう。
サンプルの標的核酸配列が２本の鎖を含む場合、核酸の鎖を分離させた後で鋳型として使用できるようにする必要がある。鎖の分離は、プライマー伸長産物の合成と別のステップとして行うこともできるし、同時に行うこともできる。この鎖の分離は、物理的、化学的、または酵素的な手段を含む種々の好適な変性条件を用いて行うことができるが、この「変性」という用語には、こうした手段がすべて含まれる。核酸の鎖を分離する物理的方法の１つには、変性するまで核酸を加熱する工程が含まれる。典型的な加熱変性処理では、約１〜10分間にわたり約80〜105℃の温度を利用してもよい。鎖の分離はまた、ヘリカーゼとして知られる酵素のクラスに属する酵素により、またはヘリカーゼ活性を有する酵素RecAにより、更に、DNAを変性させることが知られているriboATPの存在下で誘発させてもよい。ヘリカーゼを用いた核酸の鎖分離に好適な反応条件は、Kuhn Hoffmann−Berlingにより報告されており（CSH−Quantitative Biology,43:63,1978）、更に、RecAの利用技術についてはC.Raddingによる総説がある（Ann.Rev.Genetics,16:405−437,1982）。
１種または複数種の核酸の相補鎖を分離する場合、核酸が最初に二本鎖であったかまたは一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は更なる核酸の鎖を合成するための鋳型としてのそのまま使用される。この合成は、プライマーのハイブリダイゼーションにより鋳型の生成が可能な条件下で行われる。一般的には、緩衝された水溶液中で、好ましくはpH7〜９で、最も好ましくは約pH8で合成を行う。好ましくは、モル過剰（ゲノム核酸に対してモル過剰で、通常、約108:1プライマー：鋳型）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、分離された鋳型鎖を含有する緩衝液中に添加される。しかしながら、本発明の方法を診断用途に使用する場合には相補鎖の量が未知である場合もあり、この結果、相補鎖の量に対するプライマーの量が正確に決定できない場合があると考えられる。しかしながら、実際問題として、添加されるプライマーの量は、増幅される配列が複雑な長い核酸の鎖の混合物中に含まれる場合、一般的には相補鎖（鋳型）の量よりもモル過剰で存在させることになるであろう。本発明の方法の効率を向上させるためには、かなりモル過剰にすることが好ましい。
プライマーと別にまたは一緒に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを、適切な量で合成混合物に添加し、得られた溶液を約１〜10分間（好ましくは１〜４分間）にわたり約90〜100℃まで加熱する。この加熱時間の終了後に、溶液を室温まで冷却させるが、これはプライマーのハイブリダイゼーションにとって好ましい操作である。この冷却させた混合物に、プライマー伸長反応を行うために適切な試薬（本明細書中では「重合度試薬」という）を添加し、当該技術分野で周知の条件下で反応を起こさせる。重合用試薬は、熱に安定であれば他の試薬と一緒に添加してもよい。この合成（または増幅）反応は、室温から重合用試薬がもはや機能しなくなる温度までの間で行ってもよい。この場合、例えば、DNAポリメラーゼを試薬として使用するならば、温度は、一般的には、約40℃以下である。反応を室温で行うのが最も便利である。
重合用試薬は、プライマー伸長産物の合成を行う働きをする任意の化合物または系であってもよく、具体的には酵素が挙げられる。この目的に好適な酵素としては、例えば、E.coli DNAポリメラーゼＩ、E.coli DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、および他の酵素、例えば、熱に安定な酵素（すなわち、変性を引き起こすのに十分な高温に暴露した後でプライマー伸長を起こす酵素）が挙げられる。好適な酵素は、適切な方法で、ヌクレオチドの混合物が、各座の核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのを助長するであろう。一般的には、合成は、各プライマーの３′末端で開始され、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行し、様々な長さの分子を生成する。しかしながら、５′末端で合成を開始し、上記のものと同じ方法を用い他方の方向に反応を進行させる重合用試薬を存在させてもよい。
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを得るために使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質により変化するであろう。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、GC対AT含有量）、および核酸のハイブリダイズ領域の核酸タイプ（例えば、RNA対DNA）を、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。他の考慮点としては、例えば、フィルター上で核酸の１つを不動化させるか否かという点が挙げられる。
徐々に高くなる順でストリンジェンシー条件を列挙すると、例えば、次のようになる：室温付近で２×SSC/0.1％SDS（ハイブリダイゼーション条件）；室温付近で0.2×SSC/0.1％SDS（低ストリンジェンシー条件）；約42℃で0.2×SSC/0.1％SDS（中ストリンジェンシー条件）；および約68℃で0.1×SSC（高ストリンジェンシー条件）。これらの条件のうちの１つだけ、例えば、高ストリンジェンシー条件を用いてウォッシングを行うことが可能であり、またはこれらの条件のいずれかを用いることが可能であり、例えば、列挙したステップのいずれかまたはすべてを上記の順にそれぞれ10〜15分間繰り返して使用することもできる。しかしながら、上述したように、最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応により変化するであろう。また、最適条件は経験的に決定することもできる。
好ましくは、増幅の方法は、本明細書に記載されているような、及び当業者により普通に使用されているようなPCRによるものである。この他の増幅方法も報告されているが、これらの方法も、本発明のプライマーを用いてPCRにより増幅されたメチル化座および非メチル化座がこうした他の手段により同じように増幅されるのであれば利用可能である。
増幅産物は、好ましくは、配列決定法により、メチル化されたものまたはメチル化されていないものとして同定される。本発明の方法により増幅された配列は、特異的DNA配列の検出に普通に適用される任意の方法、例えば、PCR法、オリゴマー制限法（Saikiら,Bio/Technology,3:1008−1012,1985）、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分析法（Connerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:278,1983）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら,Science,241:1077,1988）などにより、溶液状態でまた固形支持体に結合させた後で、更に評価、検出、クローニング、配列決定などを行うことができる。DNA分析のための分子技術については総説が報告されている（Landegrenら,Science,242:229−237,1988）。
場合に応じて、核酸のメチル化パターンは、制限酵素消化およびサザンブロット分析により確認することができる。５′CpGのメチル化を検出するために使用できるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼとしては、例えば、Sma I、Sac II、Eag I、Msp I、Hpa II、BstU I、およびBssH IIが挙げられる。
本発明は、メチル化CpG島を有する細胞の検出、および被験体の組織または生体液中のメチル化CpGに関連した細胞増殖性疾患の検出を行う方法を提供するが、この方法には、メチル化CpGを有するかまたはCpG関連障害を有する遺伝子を発現する可能性がある標的細胞成分を、その成分に結合する試薬と接触させる工程が含まれる。標的細胞成分は、DNAもしくはRNAなどの核酸、またはタンパク質であってもよい。成分が核酸である場合、試薬は核酸プローブまたはPCRプライマーである。細胞成分がタンパク質である場合、試薬は抗体プローブである。プローブは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素で検出可能に標識することができる。当業者は、抗体に結合させるための他の好適な標識について分かるであろう。または通常の実験を用いてこうした標識を確認することができるであろう。
活発に転写される遺伝子には、一般に、DNA中の平均値よりも少ないメチル化CGが含まれる。高メチル化は、制限エンドヌクレアーゼ処理およびサザンブロット分析により検出可能である。従って、本発明の方法において、検出される細胞成分がDNAである場合、例えば、プロモーターの高メチル化を検出するためには制限エンドヌクレアーゼ分析が好ましい。認識部位の一部分としてCGを含み、かつＣがメチル化された場合に抑制される任意の制限エンドヌクレアーゼが利用できる。好ましくは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、BssH II、Msp I、またはHpa IIであり、これらは単独でまたは組合せて使用される。他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、当業者には分かるであろう。
本発明の目的のために、生体液または組織中のポリペプチドのレベルの検出（抗体を用いて）またはポリヌクレオチドのメチル化の検出（核酸プローブを用いて）を行うことによってメチル化の存在を検出すべく遺伝子または遺伝子産物に特異的な抗体または核酸プローブを使用することが可能である。抗体に基づく検出では、ポリペプチドのレベルを、対応する「正常」組織中に見られるポリペプチドのレベルと比較する。TIMP−２、エストロゲン受容体、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、またはMLH1の配列中のプロモーターの任意のコーディング配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、PCRによるDNAの増幅に有用である。これらの遺伝子は、単に具体例として列挙したものであり、これらに制限されるものではない。検出可能な量のポリヌクレオチドまたは抗体を含有する任意の試料が利用可能である。好ましくは、被検体はヒトである。
本発明は、正常組織と比較して癌組織中の方がTIMP−２がメチル化されるという発見を提供する。例えば、TIMP−２は結腸癌組織中ではメチル化されるが正常な結腸組織中ではメチル化されないことが判明した。TIMP−２などの遺伝子を発現する細胞、またはCpG含有TIMP−２のメチル化に関連した細胞増殖性疾患、または上記のものを含む任意の遺伝子を検出する方法は、臨床的に緩解状態にある被検体中の残存癌または他の悪性疾患の検出に利用できる。このほか、細胞中のポリペプチドを検出方法は、正常細胞または組織中で発現されるポリペプチドと比較して、疾患の疑いのある組織中で、ポリペプチドを発現する細胞中のポリペプチドのレベルを測定することにより、細胞増殖性疾患を検出するために有用である。本発明の方法を使用することにより、細胞中においてTIMP−２などの任意の遺伝子の発現を同定することができるので、適切な治療方法を利用することができる（例えば、センス遺伝子治療または薬剤治療）。例えばTIMP−２などの遺伝子の発現パターンは、細胞の悪性度により変化する可能性があり、従って、乳房または結腸の組織などのサンプルを、遺伝子または遺伝子産物に特異的な一群の試薬（すなわち、核酸プローブまたは抗体）を用いてスクリーニングすることにより、TIMP−２などの遺伝子の発現を検出し、細胞の悪性度を診断することができる。
モノクロナール抗体を本発明の方法に使用することができ、例えば、イムノアッセイにおいて液相中でまたは固相担体に結合させて使用することができる。更に、これらのイムノアッセイにおいて、モノクロナール抗体を検出可能に種々の方法で標識することができる。本発明のモノクロナール抗体を利用できるイムノアッセイのタイプとしては、例えば、直接方式または間接方式のいずれかで行われる競合および非競合イムノアッセイが挙げられる。このようなイムノアッセイには、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイがある。本発明のモノクロナール抗体を用いた抗原の検出は、フォワードモード、リバースモード、または同時モードのいずれかで行われるイムノアッセイ、例えば、生理学的サンプルに関する免疫組織化学的アッセイ、を利用して行うことができる。当業者は、余計な実験を行うことなく他のイムノアッセイの方式について分かるかまたは容易に識別可能である。
「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチアッセイ」という用語には、同時サンドイッチイムノアッセイ、フォワードサンドイッチイムノアッセイ、およびリバースサンドイッチイムノアッセイが含まれる。これらの用語は、当業者にはよく理解されている。当業者はまた、本発明に係る抗体が、現在知られているかまたは将来開発される可能性のある他の変形手法およびアッセイ方式においても有用であることが分かるであろう。これらについても本発明の範囲内に含まれるものとみなされる。
モノクロナール抗体を多種多様な担体に結合させてTIMP−２の存在の検出に利用することができる。周知の担体としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的においては、可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、モノクロナール抗体を結合させるための他の好適な担体について分かるかまたは通常の実験を用いてこうした担体を確認することができるであろう。本発明の目的においては、TIMP−２は、生体液および組織中に存在する場合、モノクロナール抗体により検出可能である。検出可能な量のTIMP−２を含有するサンプルであれば全てを使用することができる。サンプルは、射出精液、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、または組織、糞便などの固体もしくは半固体、あるいはまた、組織診断で普通に使用されるような固形組織であってもよい。
アッセイを行うとき、インキュベーション媒体中に特定の「遮断薬」を加えることが望ましい場合がある（通常、標識された可溶性抗体と共に添加される）。この「遮断薬」を添加すると、実験サンプル中に存在する抗TIMP−２イムノグロブリンに対して非特異的なタンパク質、プロテアーゼ、または抗異好性イムノグロブリンが固相支持体上の抗体または放射能標識された指示抗体の架橋または破壊を生じて偽陽性または偽陰性の結果をもたらさないようにすることができる。従って、「遮断薬」の選択により、本発明に記載アッセイの特異性を実質的に増大させることが可能である。
抗原のin vivo検出を行うためにモノクロナール抗体を使用する場合、検出可能に標識されたモノクロナール抗体は、診断的に有効な用量で与えられる。「診断的に有効」という用語は、検出可能に標識されたモノクロナール抗体が、モノクロナール抗体が特異的に作用するTIMP−２抗原を有する部位の検出を可能にするために十分な量で投与されることを意味する。
投与される検出可能に標識されたモノクロナール抗体の濃度は、TIMP−２を有する細胞への結合が背景と対照して検出可能となるのに十分なものでなければならない。更に、最良の標的対背景シグナル比を得るために、検出可能に標識されたモノクロナール抗体を循環系から迅速に除去することが望ましい。
一般的には、in vivo診断に対する検出可能に標識されたモノクロナール抗体の用量は、個人の年齢、性別、および疾患の度合いなどの要因により変化するであろう。モノクロナール抗体の用量は、約0.001mg/m2〜約500mg/m2、好ましくは0.1mg/m2〜約200mg/m2、最も好ましくは約0.1mg/m2〜約10mg/m2で変化させることができる。このような用量は、例えば、複数回の注入を行うか否か、腫瘍の重度、および当業者に公知の他の要素により変化する場合もある。
in vivo診断画像化では、利用可能な検出機器の種類が、所定の放射性同位体を選択する際の主要素である。選択される放射性同位体は、所定の種類の装置により検出可能なタイプの崩壊を有するものでなければならない。
in vivo診断に対して放射性同位体を選択するときの更にもう１つの重要な要素としては、放射性同位体の半減期が、標的による最大摂取の時間において依然として検出可能となるように十分に長いが、宿主に対する有害な放射が最小限に抑えられるように十分に短いことが挙げられる。理想的には、in vivo画像化に使用される放射性同位体は、粒子放出を伴わず、従来のガンマカメラで容易に検出可能な140〜250keVの範囲の多数の光子を生成する。
本発明の方法に有用なモノクロナール抗体はまた、in vivo診断の目的において、磁気共鳴画像法（MRI）または電子スピン共鳴（ESR）の場合のように、常磁性の同位体で標識することもできる。一般的には、診断画像化を可視化するための従来型の任意の方法が利用できる。通常、カメラ画像化に対してはガンマ線および陽電子を放出する放射性同位体が使用され、MRIに対しては常磁性の同位体が使用される。こうした技法に特に有用な元素としては、157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、および56Feが挙げられる。
本発明の方法で使用されるモノクロナール抗体は、TIMP−２関連細胞増殖性疾患の回復過程をモニターするために使用することができる。この場合、TIMP−２を発現する細胞の数の増加もしくは減少または種々の体液中に存在するTIMP−２の変化を測定することにより、疾患の改善を目的とした特定の治療手順が有効であるかを調べることができるであろう。
「調節」という用語には、TIMP−２のメチル化を抑制すること（例えば、プロモーター）、またはTIMP−２が発現不足の場合にTIMP−２遺伝子発現を増大させることが含まれる。細胞増殖性疾患がTIMP−２発現と関連する場合、５−アザシタジンのようなメチル化抑制試薬を細胞に導入することができる。このほか、細胞増殖性疾患がTIMP−２ポリペプチドの発現不足と関連する場合、プロモーター領域もしくは構造遺伝子に作動可能に結合されたプロモーターをコードするセンスポリヌクレオチド配列（DNAコーディング鎖）、またはTIMP−２ポリペプチドを細胞に導入することができる。
本発明はまた、TIMP−２により媒介される細胞増殖性疾患を治療するための遺伝子療法を提供する。こうした療法では、正常TIMP−２プロモーター領域を単独でまたはTIMP−２構造遺伝子（センス）と組合せて含有する適切なTIMP−２ポリヌクレオチドを、増殖性疾患を有する被験者の細胞中に導入することによって、その治療効果が得られるであろう。このほか、TIMP−２構造遺伝子を導入して異種プロモーターに作動可能に結合させることもできる。センスTIMP−２プロモーターポリヌクレオチド構成体の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて行うことができる。
本発明の方法で使用されるプロモーターポリヌクレオチド配列は、天然のままの非メチル化配列であってもよいし、あるいはメチル化できない類似体が配列中に置換されている配列であってもよい。好ましくは、この類似体は、５−アザシタジンのようなシチジンのメチル化できない類似体である。他の類似体は、当業者には公知であろう。このほか、このようなメチル化できない類似体を単独で、またはTIMP−２用のセンスプロモーターもしくは対応する遺伝子に対する構造遺伝子（例えば、TIMP−２構造遺伝子を有するTIMP−２プロモータ）と作動可能に結合されたセンスプロモータと同時に、薬物治療として被験者に投与することもできるであろう。
本発明はまた、TIMP−２プロモーターポリヌクレオチド、またはTIMP−２構造遺伝子と作動可能に結合されたTIMP−２プロモーターポリヌクレオチドをそれぞれ、製剤学的に許容しうる賦形剤または媒体中に含んでなる薬剤または医薬用組成物に関するが、この薬剤は、TIMP−２関連細胞増殖性疾患の治療に使用される。
本発明はまた、in situメチル化分析のためのMSPの利用を提供する。例えば、無傷の細胞の核中のDNAのメチル化を検出するためにMSPを使用することができる。組織切片、細胞、または細胞集団を、固体支持体（例えば、スライド）上に配置または固定し、適切な配列を増幅するためにMSPプライマーを直接細胞上で使用する。プライマーは、典型的には、例えば蛍光標識などのレポーター手段で検出可能に標識される。このほか、メチル化配列の増幅を検出するために、MSP増幅配列を検出するまたはMSP増幅配列にハイブリダイズするプローブを使用する。MSPを用いたin situメチル化分析は、例えば、隣接する組織病理学的かつ外科的周縁、および標準的な組織学的手法で調べた場合には外見上「正常」に見える局所的リンパ節などのより離れた組織において、原発性癌に関連した変異体ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するうえで有用である。MSPを用いると、正常に見える組織中に存在する多数の疾患状態と既に関連付けられた細胞から標的核酸を検出することが可能となる。細胞病理学的治療に対する補助としてMSPをin situで使用すると、危険性の高い集団のスクリーニングを行って、化学的予防または化学療法を受けている危険性の高い患者をモニターすることができる。
本発明のプライマーがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチド配列の例は、以下に列挙されているような配列を有する。
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上記の配列にハイブリダイズする本発明に包含されるプライマー対の例は次の通りである：
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典型的には、CpG含有核酸は、構造遺伝子のプロモーターの領域に存在する。例えば、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域は、メチル化CpG島を含有することが確認された。p16、p15、VHL、およびＥ−カドヘリンなどの腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域は、典型的には、本発明の方法においてPCRにより増幅される配列である。正常組織に対してメチル化CpG新生組織を含有することがMSPにより判明した他の遺伝子としては、エストロゲン受容体、MDGI、GST−pi、カルシトニン、HIC−１、エンドセリンＢ受容体、TIMP−２、O6−MGMT、およびMLH1が挙げられる。MSPによりメチル化されていることが判明した遺伝子としてこのほかに、アンドロゲン受容体（例えば、Ｘ染色体の不活性化を伴ってメチル化される）、GEAP（特定の神経膠芽腫細胞系でメチル化が起こるが、正常組織でも起こる）、およびMSH2が挙げられる。MSPプライマーが正常な非メチル化DNAとメチル化DNAとを識別することが判明した他の遺伝子としては、TGF−β１、TGF−β２、p130、BRCA2、NF1、NF2、およびTSG101が挙げられる。
検体中のメチル化CpG含有核酸の検出および同定により、細胞増殖性疾患または腫瘍形成を調べることが可能である。このような疾患としては、例えば、低度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、白血病、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および神経芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。メチル化CpG状態の同定は、ゲノムインプリンティング、脆弱Ｘ症候群、およびＸ染色体不活性化の検出および診断にも有用である。
本発明の方法を使用することにより、TIMP−２遺伝子が正常組織に対して新生組織に関連し、かつ新生組織においてメチル化されることが確認された。
こうして本発明の方法は、メチル化CpG含有核酸の検出に有用なキットの基礎を提供する。このキットには、１つ以上の容器を密着拘束状態で受容できるように区画された担体手段が含まれる。例えば、第１の容器には、非メチル化シトシンを修飾する試薬、例えば、重亜硫酸ナトリウムを入れる。第２の容器には、CpG含有核酸の増幅を行うためのプライマー、例えば、配列番号105−208として先に一覧したプライマーを入れる。
本発明はまた、メチル化CpG含有核酸の検出用キットを提供するが、このキットには、ａ）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する試薬と、ｂ）対照の核酸と、ｃ）非メチル化CpG含有核酸の増幅を行うためのプライマーと、ｄ）メチル化CpG含有核酸の増幅を行うためのプライマーと、ｅ）対照の核酸の増幅を行うためのプライマーとが含まれる。このキットには更に、核酸増幅緩衝液が含まれていてもよい。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する試薬は、重亜硫酸塩である。
本発明のキットでは、DNAサンプルのメチル化状態を調べるために、DNAサンプルの化学的修飾およびPCR増幅を行うのに必要な試薬を提供することが意図されている。キットに含まれるプライマーセットとしては、アニールすると化学的修飾が行われた非メチル化DNAを生成するセット、アニールすると化学的修飾が行われたメチル化DNAを生成するセット、および化学的修飾の効率についての対照としての働きをするプライマーセットが挙げられる。対照のプライマーセットは、アニールした場合に、化学的メチル化に供されていないあらゆる（非メチル化もしくはメチル化）DNAを生じるものでなければならない。化学的修飾が不完全な場合（約50％まで）、データの解読を継続しなければならない可能性がある。
これまでに開示された内容は、本発明を概要的に説明したものである。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解が得られるであろうが、これらの実施例は、単に例示を目的とするものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
DNAおよび細胞系  ゲノムDNAは、文献（Merloら,Mature Medicine,1:686,199;Hermanら,Cancer Research,56:722,1996;Graffら,Cancer Research,55:5195,1995）の記載に従って、細胞系、原発癌および正常な組織から取得した腎癌細胞系は、メリーランド州ベセスダ（Bet sda,MD）の国立がん研究所（National Cancer Institute）のMichael Lehrman博士の厚意により入手した。
重亜硫酸塩による修飾  容量50μｌ中の１μｇのDNAをNaOH（最終濃度0.2M）により37℃で10分間処理して変性させた。ナノグラム量のヒトDNAのサンプルに対して、キャリアーとして１μｇのサケ精子DNA（Sigma）を修飾の前に加えた。30μＬの10mMヒドロキノン（Sigma）および520μＬのpH5の3M重亜硫酸ナトリウム（Sigma）を、どちらも直前に調製して加え、混合した後、サンプルに鉱油を上層して50℃で16時間インキュベーションした。修飾されたDNAはWizardTMDNA精製樹脂を用いて、製造業者（Promega）の取扱説明書に従って精製し、50μＬの水に溶出した。NaOH（最終濃度0.3M）により室温で５分間処理して修飾を完了させた後、エタノールで沈殿させた。
ゲノムの配列決定  固相DNA配列決定法（Myohanenら,DNA Seq.,5:1,1994）を用いて、重亜硫酸塩により修飾されたDNAのゲノムの配列決定をおこなった。100ngの重亜硫酸塩により修飾されたDNAをp16遺伝子特異的プライマー、5'−TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG−3'（センス）（配列番号209）および5'−CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA−3'（アンチセンス）（配列番号210）を用いて増幅した。PCR条件は以下の通りである。96℃で３分間、80℃で３分間、1UのTaqポリメラーゼ（BRL）を加えた後、96℃で20秒、56℃で20秒、72℃で90秒のサイクルを35回、次いで72℃で５分間おこなった。PCR混合物は、1X緩衝液（BRL）と1.5mMのMgCl2、20pmolのそれぞれのプライマーおよび0.2mMのdNTPを含んでいた。配列決定用の産物を得るために、5pmolの内側のプライマーを加えて２回目のPCRをおこなった。この反応において、センスプライマー、5'−GTTTTCCCAGTCACCACAGTATTAGGAGGAAGAAAGAGGAG−3'（配列番号211）は、配列決定を開始する位置として導入されたM13−40配列（下線の部分）を含む。また、アンチセンスプライマー、5'−TCCAATTCCCCTACAAACTTC−3''（配列番号212）は、配列決定に先立って産物の精製を容易にするためにビオチン化される。上記のように、PCRを2.5mMのMgCl2を加えて32サイクルおこなった。ゲノム配列決定用のすべてのプライマーは配列中にCpGが存在しないようにデザインされた。ビオチン化されたPCR産物は、ストレプタビジンでコートした磁性ビーズ（DynalAB,Norway）を用いて精製し、SequenaseTMおよびM13−40配列決定プライマーを加えて製造業者（USB）により特定された条件下で配列決定反応をおこなった。
PCR増幅  表１に記載されたプライマーの対はLife Technologiesから購入した。PCR混合物は、1X PCR緩衝液（16.6mM硫酸アンモニウム、67mM TRIS pH8.8、6.7mM MgCl2、および10mMβ−メルカプトエタノール）、dNTP（それぞれ1.25mM）、プライマー（それぞれの反応ごとに300ng）、および亜重硫酸塩により修飾されたDNA（約50ng）または修飾されていないDNA（50−100ng）を含み、最終容量を50μＬとした。修飾されていないDNAに特異的なPCRには５％ジメチルスルホキシドも加えた。反応を95℃、５分間の高温で開始した後、1.25ユニットのTaqポリメラーゼ（BRL）を加えた。増幅は、Hybaid OmniGene温度サイクラーで35サイクル（95℃で30秒、表１に示したアニーリング温度で30秒、72℃で30秒）おこない、最後に72℃で４分間伸長させた。PCR反応のそれぞれのセットについてDNAを加えない対照実験をおこなった。それぞれのPCR反応液から10μＬずつを未変性の６−８％ポリアクリルアミドゲルに直接載せ、臭化エチジウムで染色し、UV照射して直接可視化した。
制限分析  50μＬのPCR反応液のうち10μＬを10ユニットのBstU I（New England Biolabs）を用い、製造業者により特定された条件に従って４時間消化した。制限消化物をエタノールで沈殿させた後ゲル分析をおこなった。
実施例２
初期の研究は、CpG島のメチル化状態を評価するというMSPの戦略の正当性を立証するために必要であった。5'CpG島の高メチル化を有することが報告されているp16癌抑制遺伝子（Merloら、上記;Hermanら,Cancer Research,55:4525,1995;Gonzalez−Zuluetaら,Cancer Res.55:4531,1995,27）は、多くの癌のタイプにおける遺伝子発現の完全な消失と関連しており、試験される重要な領域におけるメチル化の密度が、本明細書において開示されるプライマーのデザインを容易にするのに十分な程度の大きいか否かを決定するための代表的な遺伝子として用いた。メチル化感受性酵素に対する認識配列に位置するCpG部位以外については、メチル化の密度およびその転写のサイレンシング（silencing）との相互関係はまだ確立されていなかった。そこで、この関係性を探るためにゲノム配列決定技術を用いた。
図１にp16のゲノム配列決定を示す。示された配列はゲルの底部に最も5'側の領域を有し、主要な転写開始点から＋175で始まる（Haraら,Mol.Cell Biol.,16:859,1996）。非メチル化細胞系H249におけるすべてのシトシンはチミジンに変換されたが、メチル化細胞H157におけるCpGジヌクレオチドのすべてのＣはＣのままであって、メチル化を示している。BstU I部位を含んでおり、BstU I部位は、Genbank配列U12818（Hussussianら,Nat.Genet.,8:15,1994）における翻訳開始点から−59に位置するが、配列X94154（Haraら，上記）においてはCGCAと誤って同定されている。このCGCG部位はp16 MSPに使われたセンスプライマーの3'位置を表す。
この方法で試験した他のCpG島で見いだされたのと同様に（Myohanenら、上記;Parkら,Mol.Cell Biol.,14:7975,1994;Reebenら,Gene,157:325,1995）、p16のCpG島は、それらの細胞系およびサザン分析によりメチル化されていないことが以前に見いだされている正常な組織において全くメチル化されていなかった（図１）（Merloら、上記;Hermanら、上記）。しかしながら、サザン分析によりメチル化されていることが示された癌細胞系では、それは広範にメチル化されていた（図１）。実際、p16の転写を欠いている癌では、この領域のCpGジヌクレオチド内のすべてのシトシンが完全にメチル化された。重亜硫酸塩処理後の配列におけるこの際だった違いは、メチル化あるいは非メチル化対立遺伝子の特異的な増幅のための本発明の方法がDNAサンプルにおけるメチル化パターンの同定に有用であることを示唆している。
プライマーは、重亜硫酸塩処理後のメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子を識別するように、また、重亜硫酸塩により修飾されたDNAと修飾されていないDNAを識別するようにデザインされた。これを達成するために、プライマーの配列は、多くのシトシンを含み（非修飾DNAと修飾DNAを識別するため）、プライマーの3'末端の近くにCpGの対を含む（PCR反応においてメチル化DNAと非メチル化DNAの最大の識別ができるように）領域を選んだ。重亜硫酸塩処理の後にはDNAの二本の鎖はもはや相補的ではないので、プライマーはどちらの修飾された鎖についてもデザインすることができる。便宜上、プライマーはセンス鎖に対してデザインされた。増幅されるべきDNAの断片は故意に小さくしたので、限られた領域におけるメチル化パターンの評価が可能となり、また、より大きい断片の増幅が不可能なパラフィンブロックのようなサンプルへのこの技術の適用が容易になった。表１には、試験されたすべての遺伝子についてのプライマーの配列が示されており、これらはMSPの特異性に寄与する三つのタイプのDNAの間の配列の違いを強調するものである。これらの異なるタイプのDNAに特異的なこれらのプライマーにおける多数のミスマッチは、それぞれのプライマーの対は、意図した鋳型からのみの増幅を与えることを示唆している。
p16に対してデザインされたプライマーを、メチル化状態があらかじめサザン分析により明確にされた、癌細胞系および正常組織由来のDNAを用いて試験した（Merloら、上記;Hermanら、上記）。
図２のパネルＡ−Ｄには、p16のメチル化特異的PCR産物を含むポリアクリルアミドゲルが示されている。増幅に用いられたプライマーの対は、非メチル化（Ｕ）、メチル化（Ｍ）、または非修飾／野生型（Ｗ）として表される。＊は分子量マーカーのpBR322−Msp I消化物を表す。パネルＡは、癌細胞系および正常なリンパ球から得られたDNAを重亜硫酸塩処理したもの、および（細胞系H249から得られた）未処理のDNAの増幅を示す。パネルＢは、メチル化対立遺伝子に対するMSPの検出感度を評価するために重亜硫酸塩処理の前にさまざまな量のH157 DNAを１μｇのH249 DNAと混合したものを示す。また、原発性肺癌のサンプルおよび正常な肺から得られた修飾DNAをも示す。パネルＣには、表１に記載されたp16−U2（Ｕ）プライマー、およびp16−M2（Ｍ）を用いた増幅が記載されている。パネルＤには、パネルＣの増幅されたp16産物で、BstU Iによって制限されたもの（＋）または制限されていないもの（−）を示す。
すべての場合に、使用したプライマーの対はサザン分析によって決定されたメチル化の状態を裏付けた。たとえば、肺癌細胞系U1752およびH157、およびp16でメチル化された他の細胞系は、メチル化されたプライマーでのみ増幅した（図２、パネルＡ）。正常な組織（リンパ球、肺、腎臓、乳房、および結腸）およびメチル化されていない肺癌細胞系H209およびH249から得られたDNAは、非メチル化プライマーでのみ増幅した（図２、パネルＡ中の例）。これらのプライマーによるPCRは５％DMSOを加えてまたは加えずにおこなうことができる。重亜硫酸塩で処理されていない（修飾されていない）DNAは、メチル化された、あるいはメチル化されていない特異的プライマーのどちらのセットによっても増幅しなかったが、修飾前の配列に特異的なプライマーによって容易に増幅した（図２、パネルＡ）。重亜硫酸塩処理後の細胞系H157由来のDNAは非修飾プライマーによって比較的弱い増幅をもたらしたが、このことは重亜硫酸塩の反応が不完全であることを示唆している。しかしながら、この非修飾DNAは、以前のメチル化感受性制限酵素によるPCRアッセイにおける制限酵素により部分的に切断されたDNAと異なり、メチル化DNAに特異的なプライマーによって認識されない。そのため、これは偽陽性の結果を与えることがなく、またはメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子を識別する能力を妨げることがない。
メチル化されたp16対立遺伝子の検出に対するMSPの感受性を評価した。メチル化細胞系から得られたDNAを重亜硫酸塩で処理する前に非メチル化DNAと混合した。非メチル化サンプル中の0.1％のメチル化DNA（およそ50pg）が、常に検出された（図２、パネルＢ）。導入されるDNAの量の感度限界は、MSPにより検出可能なキャリアーとしてサケ精子DNAと混合したヒトDNAで1ng程の微量であることが判明した。
新鮮なヒト腫瘍サンプルはしばしば正常な組織と腫瘍組織を含んでおり、腫瘍に特異的な変化を検出することを困難にしている。けれども、MSPの感度により、異常にメチル化された対立遺伝子がサンプル中で全体のDNAに対して比較的少量しか存在していない場合でもこれを検出することができるので、原発性の腫瘍に対しても有用であることが示唆される。それぞれの場合に、正常な組織は全くメチル化されていないのに対して、サザン分析によりp16においてメチル化されていることが判明した腫瘍は、いくつかの非メチル化対立遺伝子に加えて、MSPにより検出されるメチル化DNAをも含んでいた（図２、パネルＢ中の例）。パラフィンに包埋された腫瘍に由来するDNAもまた使用され、これらのサンプルにおいてメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の検出が可能であった（図２、パネルＢ）。これらの結果がこのプライマーセットに独特のものでないことを確かめるため、少し大きい断片を増幅するような、p16に対する第二の下流プライマーが用いられた（表１）。この第二のプライマーセットによって上記と同様の、サザンブロット分析によって明らかにされたメチル化状態を裏付ける結果が得られた（図２、パネルＣ）。
メチル化対立遺伝子に対するプライマーの特異性をさらに証明するため、また、増幅された領域内で特定のシトシンがメチル化されるかどうかを確認するために、メチル化／修飾DNAと非メチル化／修飾DNAの間の配列の差異を利用した。具体的には、BstU I認識部位、CGCGは、重亜硫酸塩処理および増幅後に両方のＣがメチル化された場合にはCGCGのままであるが、メチル化されていない場合にはTGTGになる。増幅された産物をBstU Iで消化するとこれらの二つの産物が識別される。p16増幅産物の制限酵素による切断はこれを例証するものである。非修飾産物およびメチル化／修飾産物のみは、両方ともCGCG部位を保持しており、Bst Iによって開裂したのに対し、非メチル化／修飾プライマーにより増幅された産物は開裂しなかった（図２、パネルＤ）。
上で論じられたプライマーセットは、高度にメチル化されたCpG島とメチル化されていない対立遺伝子を識別するためにデザインされたものである。これをおこなうために、上側（センス）および下側（アンチセンス）プライマーの両方が、重亜硫酸塩処理後にメチル化に依存した配列の差異を作り出すことができるCpG部位を含むようにした。CpG島のメチル化のさらに局地的な側面を試験するためにMSPを用いることができる。これを試験するために、ただ一つのプライマーの配列におけるメチル化に依存した差異について、これによってもまだ非メチル化p16対立遺伝子とメチル化p16対立遺伝子の識別が可能かどうかを決定するための試験をおこなった。ゲノムの配列決定に使用されたアンチセンスプライマー、5'−CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA−3'（配列番号213）を、このプライマーにより認識される領域はCpG部位を含まないので、アンチセンスプライマーとして用い、メチル化されたセンスプライマーまたはメチル化されていないセンスプライマーのどちらかとセットにした（表１）。313塩基対のPCR産物の増幅は、H209およびH249（サザン分析によりメチル化されていない）では非メチル化センスプライマー、およびH157およびU1752（サザン分析によりメチル化されていた）ではメチル化センスプライマーによってのみ起こり、このことは、規定された領域内のCpG部位のメチル化は特異的プライマーにより認識され、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子を識別できることを示している（図２、パネルＥ）。パネルＥは、メチル化に特異的なセンスプライマーp16−U2（Ｕ）およびp16−M2（Ｍ）、およびメチル化に特異的でないアンチセンスプライマーを用いた、MSPによるCpG島の局地的なメチル化について試験した結果を示している。
実施例３
上記のp16を用いた実験を、ヒトの癌において5'CpG島の異常な高メチル化によって転写をサイレントにされた他の三つの遺伝子を含むように拡張した。
図３、パネルＡ−Ｅには、数個の遺伝子の分析により得られたMSP産物のポリアクリルアミドゲルが示されている。増幅に用いたプライマーのセットは非メチル化（Ｕ）、メチル化（Ｍ）、または非修飾／野生型（Ｗ）として表されていない。＊は、分子量マーカーpBR322−Msp I消化物を表し、＊＊は、123塩基対の分子量マーカーを表す。DNAサンプルは、処理されないことが示されたものを除き、すべて重亜硫酸塩で処理された。パネルＡには、p15に対するMSPの結果が示されている。パネルＢには、BstU Iにより制限された（＋）、または制限されていない（−）p15産物が示されている。パネルＣには、VHLに対するMSPの産物が示されている。パネルＤには、BstU Iにより制限された（＋）、または制限されていない（−）、VHL産物が示されている。パネルＥには、Ｅカドヘリンに対するMSPの産物が示されている。
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤のp15は、多くの白血病細胞系および原発性白血病において異常にメチル化されている（Hermanら、上記）。MSPは、p15についても、サザン分析により決定されたメチル化の状態が正しいことを証明した。たとえば、正常なリンパ球および癌細胞系SW48およびU1752は、すべてサザン分析によりメチル化されていなかったが（Hermanら、上記）、メチル化されていないプライマーのセットによってのみ増幅したのに対し、肺癌細胞系H1618および白血病細胞系KG1Aはメチル化されたプライマーのセットによってのみ増幅し（図３、パネルＡ）、以前のサザン分析の結果（Hermanら、上記）と一致した。細胞系Rajiは、メチル化プライマーにより強いPCR産物を生成し、非メチル化プライマーにより弱いバンドを生成した。この結果は、以前にサザン分析により得られたメチル化されているという結果と同様であった（Hermanら、上記）。培養されていない白血病サンプルは、p16について研究した原発性腫瘍と同様に、メチル化プライマーセットおよび非メチル化プライマーセットによって増幅された。この不均質性もまたサザン分析と一致している（Hermanら、上記）。また、p16と同様に、p15の増幅産物におけるBstU I制限部位の異なった修飾を、MSPによる特異的な増幅を証明するために用いた（図３、パネルＢ）。細胞系H1618およびRajiから得たメチル化プライマーのセットまたは非修飾プライマーのセットを用いて増幅された産物はBstU Iにより完全に開裂したのに対し、メチル化されていない増幅産物は開裂しなかった。原発性AMLサンプルは、これもメチル化産物においてのみ開裂が見られたが、あまり完全でない開裂が見られた。これは、いくつかの対立遺伝子において、プライマー配列領域内の多くのCpG部位が、メチル化特異的プライマーがこの領域を増幅するのに十分な程度にメチル化されるのに対し、他のCpG部位は完全にはメチル化されないために生じるメチル化における不均質性を示唆している。
CpG島のプロモーター領域の異常なメチル化は、透明腎癌の約20％におけるVHL癌抑制遺伝子の不活性化と関連している（Hermanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:9700,1994）。この現象は、VHLの突然変異（Gnarraら,Nature Genetics,7:85,1994）と同様に、透明腎癌に制限される（Hermanら、上記）。VHLの配列に対してデザインされたプライマーを、サザン分析によりVHLがメチル化される腎細胞癌系RFX393、およびこの遺伝子座においてはメチル化されていない肺癌細胞系U1752から得られたDNAの研究に用いた（Hermanら、上記）。それぞれの場合において、MSPにより決定されたVHLのメチル化状態はサザン分析によって得られた結果を裏付けるものであり（図３、パネルＣ）、BstU I制限部位分析はPCR産物の特異性を立証するものであった（図３、パネルＤ）。
侵入／転移抑制遺伝子、Ｅカドヘリンの発現は、乳癌、前立腺癌、および他の多くの癌において、5'プロモーターの異常なメチル化によりしばしばサイレントにされる（Graffら、上記;Yoshiraら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7416,1995）。Ｅカドヘリンプロモーター領域について、この遺伝子に対してMSPが使用できるかどうかを調べるためにプライマーをデザインした。それぞれの場合において、MSP分析は、遺伝子のメチル化状態についてサザンブロット分析と一致した（Graffら、上記）。乳癌細胞系MDA−MB−231、HS578t、および前立腺癌細胞系DuProおよびTSUPr Iは、すべてサザン分析により高度にメチル化されていたが、MSP分析で突出したメチル化を示した。MCF7、T47D、PC−３、およびLNCaPは、すべてサザン分析によりメチル化されていなかったが、高感度のMSPアッセイではメチル化の証拠は見られなかった（図３、パネルＥ）。MSP分析により、Hs578t、TSUPr IおよびDuProに非メチル化対立遺伝子が存在することが明らかになったが、これは、これらの細胞系において低いパーセンテージの非メチル化対立遺伝子が以前サザン分析により検出されたことと一致している（Graffら、上記）。ここでもBstU I制限分析によってPCR増幅の特異性が裏付けられた。
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実施例４
p16の間接的in situメチル化。間接的in situ PCR（間接的IS−PCR）は、標識取り込みのない熱サイクルによりアンプリコンが生成される技術である。サイクル反応の終了後に、増幅産物を、標識プローブを使用する標準的なin situハイブリダイゼーションにより検出する。
サンプルの調製および前処理。ホルマリンで固定されパラフィンに埋込まれたHN12細胞に対して、キシレン中で５分間パラフィンの除去を行い、100％エタノール中で５分間ずつ２回すすいだ。スライドを風乾し、スライドカバーの下で、プロテイナーゼＫ（50mM Tris中10μg/ml）で37℃にて30分間処理した。スライドを蒸留水中ですすぎ、37℃にて10分間0.2N NaOHに入れ、次いでヒドロキシキノンを含有する3M重亜硫酸ナトリウムに入れた。この溶液に鉱油を重層し、50℃にて16時間放置した。この油を除去し、スライドを水ですすぎ、室温にて0.3M NaOHに５分間入れた。スライドを、70％、80％、および100％のエタノール中で脱水し、風乾させた。
間接的IS−PCRプロトコール。PCR混合物には、50μｌの反応につき、１×PCR緩衝液（16.6mM硫酸アンモニウム/67mM Tris（pH8.8）/6.7mM MgCl2/10mM2−メルカプトエタノール）、dNTP（2.5ラムダの25mM混合物）、300ngの各プライマー、および2.5ユニットのTaqポリメラーゼが含まれていた。この混合物を95℃にて５分間「高温開始（ホットスタート）」させ、GeneCombを配置して予め80℃に温めておいたスライドに直接添加した。in situモジュールのあるHybaid Omnigene CyclerでPCRを行った。90℃にて30秒間、58℃にて45秒間、そして70℃にて45秒間を、キャブレーション番号50で30サイクル行った。PCRの直後、スライドを蒸留水中で１回すすぎ、その後70％、80％、および100％のエタノール中で脱水し、風乾させた。
間接的IS−PCR in situハイブリダイゼーションおよび蛍光検出。PCRの後、PCR産物の局在を維持するために検体を簡単に固定した。これは、プローブを適用する前に、切片を100％エタノール中で15分間固定させ、風乾させて行った。メチル化p16 PCR産物を生成し、ジゴキシゲニンで標識し、in situハイブリダイゼーションの標識プローブとして使用した。ジゴキシゲニンで標識されたプローブを、２×SSC/10％デキストラン硫酸/50％ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中に最終濃度10ng/μｌで懸濁した。10.0μｇのハイブリダイゼーション混合物（100.0ngのプローブ）を各サンプルに添加し、スライドガラスカバーで覆い、ラバーセメントでシールした。次いで、細胞調製物を、95℃にて５分間インキュベートし、加湿チャンバ内で37℃にて一晩ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーションの後、HN12サンプルを、免疫学的検出の前に、２×SSC（塩クエン酸ナトリウム）中で室温にて５分間後洗浄（post−washed）し、室温にて１×PBD（リン酸緩衝化界面活性剤）中に入れた。
ハイブリダイズしたHN12細胞サンプルの全てを、フルオレセイン標識アビジン（Vector Laboratories,CA）で免疫細胞化学的に染色した。フルオレセイン標識アビジン（10μg/ml）、１×PBS、５％粉末乾燥ミルク、および0.02％アジ化ナトリウムからなる60μｌの検出試薬を、プラスチックスライドカバー下のスライドに添加し、加湿チャンバ内で37℃にて５分間インキュベートした。これらのスライドを１×PBD中で数回洗浄し、非退色溶液中のヨウ化プロピジウム（0.3μg/ml）で対比染色した。
蛍光顕微鏡法のために、100ワットの水銀灯を備えたZeiss Axiophot 20エピ−蛍光顕微鏡（Zeiss、西ドイツ）と、100X Plan−Neofluar油浸対物レンズ（Zeiss、西ドイツ）と、Zeiss MC−100カメラ（Zeiss、西ドイツ）と、フルオレセイン（FITC）/PI蛍光に適したフィルターセット（Chroma、VT）とを使用した。OIS（Oncor Instrument Systems）3CCD冷却カメラシステムおよびOIS 2.01画像分析ソフトウェアを用いて、画像の分析および記録保存を行った。
陰性のPCR対照HN12細胞サンプルに対して、初めの重亜硫酸塩反応を用いてDNAを修飾した後、p16遺伝子のプロモーター領域のメチル化DNAに特異的なプライマーを用いたPCR増幅およびin situハイブリダイゼーションを行って処理した。陰性の対照は、PCR反応が不完全なため予想通り可視的なシグナルを示さなかった。
p16メチル化HN12細胞に対して、重亜硫酸塩修飾を行い、p16遺伝子のプロモーター領域のメチル化DNAに特異的なプライマーを用いてPCR増幅を行い、そして標識プローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。細胞に、メチル化p16プロモーター領域の増幅され局在化された産物に特異的な蛍光シグナルが認められた。
p16メチル化HN12細胞に対して、重亜硫酸塩修飾を行い、p16遺伝子のプロモーター領域の非メチル化DNAに特異的なプライマーを用いてPCR増幅を行い、そして標識プローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。細胞に蛍光シグナルは認められなかった。
実施例５
痰サンプルにおけるメチル化の変化についてMSPの使用を試験する。痰サンプル由来のDNAにメチル化の変化があるかを検出するためにMSPを使用した。調べたサンプルの中には、p16に対するプライマー（表1;配列番号105〜110）、および肺癌を患っていることが分かっている２人の患者の痰サンプルから抽出したDNAが含まれていた。p16については、非メチル化対立遺伝子は検出されたがメチル化対立遺伝子は検出されなかった。MSPはメチル化されていない対立遺伝子と作用したことから、患者の痰はメチル化p16を持っていなかったと考えられる。この仮説を調べるため、１つの痰サンプルに、高メチル化p16遺伝子を有する確立した肺癌細胞系Calu 3由来の細胞でスパイクした（spiked with）。これらのp16メチル化対立遺伝子は、この混合DNAにおいて容易に検出された。
実施例６
hMLH1およびhMSH2高メチル化を検出するためのMSP。hMLH1遺伝子およびhMSH2遺伝子はミスマッチ修復タンパク質をコードし、hMLH1遺伝子およびhMSH2遺伝子のそれぞれにおける突然変異はマイクロサテライト不安定性の特徴を有する遺伝性形態の結腸癌を生じる場合がある。非遺伝性の結腸癌を患う患者の約20％も、マイクロサテライト不安定性の表現型の腫瘍を有する。この後者の腫瘍を生じる正確なメカニズムについては明確でない。Kaneら（Cancer Research,57:808,1997）は、マイクロサテライト不安定性の散発性結腸癌を患う患者由来の一連の小さい腫瘍において、hMLH1遺伝子のプロモーターが高メチル化されていることを報告している。この所見について、一連のより大きい腫瘍においてさらに調査するために、hMSH2およびhMLH1の条件およびプライマーセット（表2;配列番号161〜172）を用いたMSPを使用した。このような腫瘍を持つ約14人の患者の内、85％がhMLH1の高メチル化を生じており、マイクロサテライト不安定性のない21個の結腸癌では５％のみがこの変化を示した。hMSH2の高メチル化は、どちらのグループにおいても認められなかった。このデータから、マイクロサテライト不安定性の腫瘍を持っていることが分かっている結腸癌を患う全患者のおよそ15％が腫瘍DNAにおいてhMLH1遺伝子の高メチル化を生じ、この変化と関連した転写サイレンシング（transcriptional silencing）がこの場合における遺伝子不安定性の原因であることが示される。
実施例７
メタロプロテイナーゼII（TIMP2）遺伝子の組織阻害剤のMSP研究。TIMP2は、多様な細胞型の侵食能を制限するのに必要なメタロプロテイナーゼ阻害剤のファミリーのメンバーである。この遺伝子のための条件およびMSPプライマー（表2;配列番号157〜160）を用いたところ、原発性結腸癌の約50％においてTIMP2プロモーターの高メチル化が認められた。この変化、およびこれに伴うこの遺伝子の発現の低下は、これに関わる結腸癌の侵食能を増す要因である可能性がある。
実施例８
TGF−β受容体ＩおよびII遺伝子のMSP研究。上記したMSPプライマーおよび条件（表2;配列番号177〜184）をTGF−β受容体ＩおよびII遺伝子のためにうまく用いた。腫瘍におけるプロモーターの高メチル化の形跡は今までのところ認められていない。
本発明は、現時点において好ましい態様について説明したが、本発明の思想から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるであろう。よって、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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