(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寒流魚類から抽出したものであって、熱変性温度が１６〜１９℃のコラーゲンを皮膚や頭髪に用いる化粧品材料に配合したことを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項２】
請求項１において、前記寒流魚類は、鮭、鱒、鱈のいずれかであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項３】
請求項１において、前記コラーゲンは、一種又は二種以上の寒流魚類から抽出したものであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において、前記化粧品材料に前記コラーゲンを配合して乳液、化粧水、ゼリー濃縮物、ヘアーリキッド、口紅、頭皮や頭髪のクリームのいずれかとしたことを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において、前記コラーゲンはペプシン処理によりアテロ化されたことを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項において、前記コラーゲンは弱酸性から中性領域で溶解するサクシニル化コラーゲンであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項において、前記コラーゲンはヒアルロン酸と併用されることを特徴とするコラーゲン入り化粧品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、動物の結合組織、すなわち皮膚、血管、腱、骨、歯などの主要タンパク質であるコラ−ゲンを配合した化粧品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、コラ−ゲンの人体への適用性の素晴らしさから、人工皮膚、人工血管等への応用がなされ、また化粧品へのコラ−ゲンの配合がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらに使用されるコラ−ゲンの由来は、牛、豚であり、ゼリ−状になる熱変性温度が３５〜４０℃であった。そのため、一般的に２０℃前後である室温で保存され、皮膚や頭髪など外気に当たる部分に使用される化粧品にあっては、コラ−ゲン粒子が固形化して延びが無く、皮膚や頭髪等に十分な皮膜を作ることが出来ず、水分の発散を許し、また均質な化粧表面を得ることが出来なかった。そこで、この発明は室温近傍が熱変性温度であるコラ−ゲンを配合して皮膚等に使用したとき、延びが良く、保水性、均質性に優れた化粧品を提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するため、この発明は以下のようにしている。
【０００５】
請求項１の発明は、寒流魚類から抽出したものであって、熱変性温度が１６〜１９℃のコラーゲンを皮膚や頭髪に用いる化粧品材料に配合したことを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【０００６】
請求項２の発明は、請求項１において、前記コラーゲンは、一種又は二種以上の寒流魚類から抽出したものであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【０００７】
請求項３の発明は、請求項１の発明において、前記コラーゲンは、一種又は二種以上の寒流魚類から抽出したものであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【０００８】
請求項４の発明は、請求項１〜３のいずれか１項の発明において、前記化粧品材料に前記コラーゲンを配合して乳液、化粧水、ゼリー濃縮物、ヘアーリキッド、口紅、頭皮や頭髪のクリームのいずれかとしたことを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【０００９】
請求項５の発明は、請求項１〜４のいずれか１項の発明において、前記コラーゲンはペプシン処理によりアテロ化されたことを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【００１０】
請求項６の発明は、請求項１〜５のいずれか１項の発明において、前記コラーゲンは弱酸性から中性領域で溶解するサクシニル化コラーゲンであることを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【００１１】
請求項７の発明は、請求項１〜６のいずれか１項の発明において、前記コラーゲンはヒアルロン酸と併用されることを特徴とするコラーゲン入り化粧品としている。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を実施例に基づいて説明するが、これに限定されるものでないことは勿論である。
【００１３】
水産加工工程で発生する大量の魚皮、骨、頭、内臓など大部分は水産廃棄物として処理され、その量も年々増加している。これら水産廃棄物の中で鮭、鱒、鱈等寒流魚類の皮から得られるコラ−ゲンに注目した。コラ−ゲンは、由来生物の生活温度によって変性温度が異なることが知られており、寒流魚類は、低温の水中に生活しており、その組織を作っている蛋白質のコラ−ゲンは１６〜１９℃の変性温度でゼラチンに変性する。そこで室温付近で熱変性する寒流魚類由来のコラ−ゲンを化粧品に混ぜることに想到した。
【００１４】
以下、寒流魚類中鮭から、特に大量に得られ、処理も比較的容易な鮭皮からコラ−ゲンを抽出し、抽出したコラ−ゲンの物性を明らかにする。
【００１５】
実験例１
そこで鮭皮からのコラ−ゲンは、室温付近で熱変性するので、その抽出は、温度を４℃にし、保存は０℃以下に保って図１に示すフロ−チャ−トにしたがって試みた。
【００１６】
実験方法
１．鮭皮から残っている肉、鱗等を取り除くため、蒸留水でよく洗浄した。
２．抽出効率を上げるため、鮭皮３００ｇをミンチ器を用いて細断（ミンチ）した。
３．これをクロロホルム４５０ｍｌ（ミリリットル）、ＭｅＯＨ（メタノ−ル）９００ｍｌ、水１８３ｍｌの混合物に加え、１０分間撹拌し、さらに１０分間静置し、脂質の抽出を行った。
４．３．の抽出残渣にクロロホルム４５０ｍｌを加え、１分間撹拌し、さらに水４５０ｍｌを加え、６分間撹拌し、脂質の抽出を行った。
５．ブフナ−漏斗で脂質を濾過し、残渣をクロロホルム４５０ｍｌで洗浄後、ＭｅＯＨで洗浄しコラ−ゲンを抽出した。
６．５．で得たコラ−ゲンをガ−ゼにくるみ、流水中でよく洗浄した後、４℃の０．２Ｍ  （モル）ＡｃＯＨ（酢酸）２リットルを加え、４℃で７２時間放置した。
７．不溶分を遠心分離器（日立（株）社製ＨＩＭＡＣ  ＳＣＲ２０Ｂ／１８）で荷重３，０００ｇ、１０分間の条件で遠心分離した後、上澄みを蒸留水に対して透析を行い、凍結乾燥して酸可溶性非アテロ化コラ−ゲン（後述のアテロ化コラ−ゲンと区別するため）を得た。
【００１７】
実験結果
得られた非アテロ化コラ−ゲンは、白色スポンジ状の固体で、酸可溶性のものであった。収率は、元の湿重量に対して、６〜７％であったが、次に述べる方法で残渣から数回抽出することにより収率を向上させることが出来る。
【００１８】
実験例２
実験例１の７．で行った遠心分離によって得られた残渣をさらにペプシン処理してテロペプチドを除去して非アテロ化コラ−ゲンと同様に酸可溶性のアテロ化コラ−ゲンを得る。
【００１９】
実験方法
１．酢酸抽出し、遠心分離した残渣を０．２Ｍ（モル）  ＡｃＯＨに分散した。
２．コラ−ゲン重量に対して１％のペプシンを加え、所定温度で所定時間放置した。
３．遠心分離をして残渣を除いた。
４．ＤＥＡＥ−セルロ−ス（Ｗｈａｔｍａｎ社製  ＤＥ５２）を１５Ｗ／Ｖ（重量／体積）になるように０．５Ｎ（規定）の  ＨＣｌ（塩酸）水溶液に加え、３０分間攪拌した。
５．ｐＨ４．０になるまで蒸留水で洗浄し、同様１５Ｗ／Ｖとなるように０．５Ｎ  ＮａＯＨに加え、３０分間攪拌した。
６．４．と５．の操作を後４回づつ繰り返し最後に中性になるまで蒸留水で洗浄した。
７．以上のように平衡化したＤＥＡＥ−セルロ−ス１５ｇ（グラム）をオ−プンカラムに詰め、０．００５Ｍ  ＡｃＯＨに６５ｍｇ／ｍｌになるようにアテロ化コラ−ゲンを溶かし、それをカラムに流し一晩放置した。
８．透析、凍結乾燥を行ってアテロ化された酸可溶性アテロ化コラ−ゲンを得た。
【００２０】
実験結果
ＤＥＡＥ−セルロ−スによる一回の精製で７４％のペプシンが除去されることが分かり、さらに４回の精製でほぼ１００％のペプシンが除去された。コラ−ゲンは、その両端にテロペプチドと呼ばれる構造を持った螺旋構造を呈している。テロペプチド構造中には１２から２７個のアミノ酸残基を含んでおり、コラ−ゲンの抗原性はこの部分によって発現するといわれている。このペプシン処理によりテロペプチドを除去して、抗原性のないアテロ化コラ−ゲンを得ている。
【００２１】
以上、実験例１と２で得られた酸可溶性コラ−ゲンは、前者が非アテロ化コラ−ゲンであり、後者がアテロ化コラ−ゲンである。
【００２２】
〈鮭皮コラ−ゲンの分子量及びその分布〉
分子量分布は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定した。この方法はポリアクリルアミドゲル中にタンパク質を通し、一定電圧をかけることによりゲルのポアサイズとタンパク質のサイズとのかねあいによってタンパク質を同分子量ごとに分けるものである。コラーゲンは前述のようにタイプによって分子量の分布が変わるのでそれについてこの方法で同定できる。
【００２３】
実験方法
１．以下の各溶液を調整した。
Ａ溶液：アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを純水に溶解し、１００ｍｌとした。
Ｂ溶液：トリスヒドロキシメチルアミノタン（以下トリスという）１８．２ｇとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．４ｇ、ＨＣｌ２ｍｌに純水を加え、１００ｍｌとした。
Ｃ溶液：トリス６．１ｇ、ＳＤＳ０．４ｇ、ＨＣｌ４．ｍｌに純水を加え、１００ｍｌとした。
Ｄ溶液：１０％過硫酸アンモニウム
２．Ａ溶液３ｍｌ、Ｂ溶液４．５ｍｌと純水１０．５ｍｌを混合した後、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．０１ｍｌとＤ溶液０．０８ｍｌを添加、緩やかに混合し、ガラスプレート間に流し込んだ。
３．１時間後、Ａ溶液０．９ｍｌ、Ｃ溶液１．５ｍｌ、Ｄ溶液０．０２ｍｌ、ＴＥＭＥＤ０．０１ｍｌ、純水３．６ｍｌを混合し、さらにガラス板間に流し込み３０分間放置した。
４．試料の調製を行った。ＳＤＳ  ０．１ｇ、２−メルカプトエタノール０．１ｍｌ、Ｃ溶液１ｍｌ、グリセリン２ｍｌを蒸留水で１０ｍｌとし、０．０５％になるように試料を溶かし、ピロリンＹを加え、１００°Ｃで３分間放置した。
５．アクリルアミドゲルにサンプル溶液を添加し、１０ｍＡで３０分間、２０ｍＡで９０分間電流を流した。
６．０．２５％クーマシーブリリアントブルー（ＫＯＤＡＣ）、１０％ＡｃＯＨ、３０％ＭｅＯＨ混合溶液にゲルを浸し、１晩浸透した。
７．１０％ＡｃＯＨ、３０％ＭｅＯＨ混合溶液で数回脱色後、乾燥した。
８．詳しくは図２にこの電気泳動法を示した。
【００２４】
実験結果
鮭皮コラーゲン、５°Ｃでのアテロ化鮭皮コラーゲン、室温でのアテロ化鮭皮コラーゲンの実験で得られた泳動パターン（図示省略）によれば、５°Ｃにおいてアテロ化した鮭皮コラーゲンは元の鮭皮コラーゲンと同じ泳動パターンを示した。よって低温ではアテロ化はほとんど進行しないと言える。室温でアテロ化した鮭皮コラーゲンは分子量２１万、１２万、８万付近に元のパターンにはないバンドが現われた。これはアテロ化によりテロペプチドがはずれ、分子量が低下したためと考えられる。また鮭皮コラーゲンの泳動パターンより鮭皮から得られた酸可溶性コラーゲンは種々のタイプのうちＩ型（宮田暉夫，繊維学会誌，３９，１１，４２７（１９８３））であることが分かった。
【００２５】
〈鮭皮コラ−ゲンのアミノ酸分析、元素分析〉
アミノ酸組成はその蛋白質の性質を司る重要な因子であり、蛋白質の有する置換基、等電点等様々な性質を予測することができる。北海道大学機器分析センタ−の分析の結果、表１を得た。
【００２６】
【表１】
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これによれば、これらコラ−ゲンの全てにおいて、全アミノ酸残基中約１／３がグリシンであるという特徴的組成を有している。
【００２７】
〈サクシニル化コラ−ゲンと各種原料との相溶性〉
【表２】
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【表３】
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【表４】
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〈溶解性〉
＊  試験方法
ｐＨ２．５に調整したコラ−ゲン溶液に希水酸化ナトリウム溶液を加え、それぞれのｐＨでの吸光度を測定した結果を図３に示す。吸光度が高いほどコラ−ゲン繊維が多く析出し溶解性が低いことを示している。
【００２８】
＊  結果及び考察
一般的なコラ−ゲンは、弱酸性及び中性領域では溶解しないが、サクシニル化コラ−ゲンはこれらの領域で十分に溶解していることが認められる。すなわち、サクシニル化コラ−ゲンは、弱酸性から中性領域において溶解するようにした特殊なコラ−ゲンである。従来から市販されている多くのコラ−ゲンを化粧品に配合する場合は、ｐＨ調整や塩類の添加など煩わしい操作が必要であったが、本サクシニル化コラ−ゲンはこれらの手間を省くことが出来る。
【００２９】
〈保湿性〉
＊  試験方法
表皮角層水分量測定装置（高周波インピ−ダンスメ−タ−Ｍｏｄｅｌ  ＩＢ−３３５：アイ・ビ−・エス株式会社）を使用し、外周直径６ｍｍ、中心電極直径１ｍｍの電極で皮膚の電気伝導度（Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）を測定した。測定部位は、前腕屈側内側（直径１ｃｍ）とし、測定部位の電気伝導度をあらかじめ測定し、次に測定部位に試験液を塗布し、その後一分間毎に電気伝導度を測定（２５℃、湿度５５％、無風の室内で測定）した。  これを図４に示す。
【００３０】
＊  結果及び考察
図４によりサクシニル化コラ−ゲンは、優れた保湿性を有することが認められる。また、ヒアルロン酸と併用することにより、さらに高い保湿効果を発揮することが認められる。したがって、サクシニル化コラ−ゲンは、保湿剤としての応用に適した化粧品材料で、特にヒアルロン酸との併用においては優れた保湿作用を発揮するため、多くの化粧品処方への配合が可能である。
【００３１】
〈鮭皮コラ−ゲンのＮ−サクシニル化〉
一般に抗凝血性が高く、溶解ｐＨ領域が未修飾コラ−ゲン（酸可溶性コラ−ゲンまたはアテロ化コラ−ゲン）より広いサクシニル化コラ−ゲンの合成を試みた。
【００３２】
＊  実験方法
１．鮭皮コラ−ゲン５００ｍｇを１０％ＡｃＯＨ１７ｍｌ，ＭｅＯＨ６７ｍｌに完全溶解した。
２．１．の溶液に無水コハク酸６．４ｇを加え、無水コハク酸が完全に溶解した後２４時間、４℃で放置した。
３．４℃で透析し、析出物を遠心分離で回収し、凍結乾燥した。
【００３３】
＊  実験結果
透析に用いた蒸留水は空気中の炭酸ガスを含んでいるため若干酸性（ｐＨ４．５〜５．０）である。このｐＨ領域で未反応の鮭皮コラ−ゲンは可溶であるため析出してきたものは何らかの反応が起こった生成物であると考えられる。図５のＩＲスペクトルからは反応が確認できなかったので、ＴＮＢＳ（ｔｒｉｎｉｔｒｏ  ｂｅｎｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎ−ａｔｅ）法によるフリ−アミノ基の定量により反応率を求めた。結果を図６に示す。これによれば、生成物中のフリ−のアミノ基の量が未反応物の３２．１％に減少していることが分かる。これより鮭皮コラ−ゲン中のアミノ基がコハク酸のカルボキシル基によってアミド化されたことが分かる。
【００３４】
また、各ｐＨ領域における生成物の溶解性を測定したところ、未反応の鮭皮コラ−ゲンとは全く異なる溶解曲線（図７）が得られた。図７によれば、ｐＨ４〜５の間で溶解性が大きく減少し、ｐＨ５〜６にかけて急激に溶解性を増し、ｐＨ６以上において１００％となる。従ってふつうの鮭由来のコラ−ゲンは、白丸で示すように弱酸性及び中性では溶解しないが、黒丸で示すようにサクシニル化した鮭由来のコラ−ゲンは、たとえば人間の肌に適応させる必要条件であるこれら弱酸性及び中性の領域で十分に溶解する。
【００３５】
前述した黒丸で示す曲線のように大きく溶解性が減少したことから等電点がｐＨ４〜５の間にシフトしたことが分かる。そして  つまりそれだけ鮭皮コラ−ゲンがアニオン性になったということである。この結果からカチオン性のアミノ基が減少し、アニオン性のカルボキシル基が増加したと考えられる。以上より生成物は図６に示す反応物であるといえる。
〈コラゲナ−ゼ活性測定〉
＊  試薬の調整
コラ−ゲン溶液
アテロ化コラ−ゲン（鮭由来）、非アテロ化コラ−ゲン（鮭由来）及び牛皮コラ−ゲンについて、それぞれ凍結乾燥されたものを０．０１ＮのＨＣｌ水溶液に溶かし、５ｍｇ／ｍｌの溶液を作った。
コラ−ゲン溶液用緩衝液（トリス緩衝液）
０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  グルコ−ス、０．０４％ＮａＮ３
コラゲナ−ゼ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）
０．０５Ｍ  トリス、ｐＨ７．５  調整後、活性測定時にｐＨが７．５になるように、あらかじめ少量の０．０１Ｎ  ＨＣｌ、コラ−ゲン溶液用緩衝液、コラゲナ−ゼ緩衝液をとって、１：１：２で混合し、１Ｎ  ＨＣｌを適量加えてｐＨを合わせ、それと相当量のＨＣｌをコラゲナ−ゼ緩衝液に加えた。
コラゲナ−ゼ溶液
上で調整したコラゲナ−ゼ緩衝液で０．０１ｍｇ／ｍｌコラゲナ−ゼ溶液を調整する。
なお、コラゲナ−ゼは、新田ゼラチンのＣＯＬＬＡＧＥＮＡＳＥ  Ｎ−２  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｐａｒｖｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｓを用いた。
反応阻害剤
０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＴＡ）
濁度測定用溶液
６０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
＊  測定方法
１．  各コラ−ゲンについてコラ−ゲン溶液とコラ−ゲン溶液用緩衝液を１：１で混ぜ、３７℃の恒温槽に３０分以上浸責した。
２．  コラゲナ−ゼ溶液を１．で混合した溶液と等量混合し、その時間を反応開始時間０とした。
３．  各時間で反応溶液を適量取り、ＥＴＡとその溶液を１：２で混合し反応を止めた。
４．  測定後、反応を止めた溶液とＴＣＡを３：１で混合し、３０分後３４０ｎｍで濁度を測定した。
５．  同様にして１７℃においてもコラゲナ−ゼ活性を調べた。
なお、活性反応終了後の各溶液の組成は、コラ−ゲン溶液：コラ−ゲン溶液用緩衝液：コラゲナ−ゼ溶液：ＥＴＡ＝１：１：２：２である。濁度測定の対象はコラ−ゲンを含まない反応終了混液を別に調整した。
【００３６】
＊  結果
測定された結果を表５に示す。
【００３７】
【表５】
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表５のデ−タから図８、図９に示すように、濁度を時間に対して示した。これによれば、図８に示す３７℃においては、反応開始後すぐから非アテロ化、アテロ化、牛由来の各コラ−ゲンともゼラチン化して水溶性になり十分溶解し濁度は高いところにあり、その後２０分ぐらいで反応が進み分子が大きくなって沈殿し低いところに落ち着く。
【００３８】
一方、図９に示す１７℃においては、非アテロ化、アテロ化の両コラ−ゲンは、反応開始後から溶液中に溶けだし高い濁度を示しているが、反応は大きく進まず、沈殿量も時間が経過しても少なく、わずかな下降線を描いている。これに対して、牛由来コラ−ゲンは、このような低温では、ゼラチン化していないため水溶性となっておらず、分子量も大きく沈殿しており濁度は低い。
【００３９】
【発明の効果】
以上説明したように、鮭由来のコラ−ゲンが室温近傍で熱変性することを突き止め、これが寒流魚類から得られるコラ−ゲンもその生活温度が同じで同様な物性を持つことが分かった。このコラ−ゲンを化粧品に適用したこの発明は以下の効果を奏する。
【００４０】
温帯で生息する人間の皮膚や頭髪などは、一般に１６〜１９℃で晒されており、この温度付近でゼラチン化し水溶性になるコラ−ゲンを混入することにより、皮膚や頭髪へのコラ−ゲンの吸収がよく、延びが良く、保水性、均質性に優れた化粧品を提供することができる。
【００４１】
また、サクシニル化することによって、人間の肌に適正である弱酸性から中性領域でより使用しやすい化粧品とすることができる。
【００４２】
さらに、ヒアルロン酸と併用することによって、優れた保湿作用を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】鮭由来コラ−ゲンの抽出フロ−チャ−ト図である。
【図２】電気泳動法の説明図である。
【図３】ｐＨに対するコラ−ゲンの溶解性を示すグラフ図である。
【図４】コラ−ゲン、及びヒアルロン酸を併用したコラ−ゲンの保湿性を示すグラフ図である。
【図５】サクシニル鮭コラ−ゲンのＩＲスペクトラを示すグラフ図である。
【図６】化合物を有するアミノグル−プコラ−ゲンのブロック度を示すグラフ図である。
【図７】鮭コラ−ゲン誘導体の溶解性を示すグラフ図である。
【図８】３７℃でのコラゲナ−ゼ活性を示すグラフ図である。
【図９】１７℃でのコラゲナ−ゼ活性を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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