(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-、γ-及びδ-ケトエステルをNADH-依存酵素反応させて対応する光学的に活性なβ-、γ-及びδ-ヒドロキシ酸エステルとすることができる、ケトエステル-還元酵素を回収するにあたり、カンジダ  パラプシロシスCandida parapsilosis)、ヤローヴィニア  セロビオサ(Yarrowinia  cellobiosa)、ロードコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)又はシュードモナス  アシドボランス(Pseudomonas acidovorans)の菌株を培養し、微生物によって産出される酵素を細胞-粗抽出物からPEG-分別沈殿によって単離して、上記還元酵素を得られ、この際この酵素は精製された形で下記パラメーター：
−pH-最適条件が、ケトエステル-還元に関してpH7.8ないし8.0及び逆反応に関して約pH9.5である；
−ケトエステル-還元に最適な温度が、36℃ないし40℃及び逆反応に最適な温度は50℃ないし56℃である；
−Hg2+-、Pb2+-、Ag+、Cu2+-、Ni2+-、Sn2+-及びCo2+-イオンによる急速な脱活性化、p-ヒドロキシ安息香酸水銀、5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾアート）及びヨードアセトアミドによる並びにキレート化された2,2'-ビピリジル及びo-フエナン  トロリンによる著しい阻害、及びSH-保護試薬、たとえばジチオトレイトールによる安定化；
−脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ジケトン、ケタール及びアルデヒドの還元のための並びに第一及び第二アルコールの酸化のための更なる能力；
を有することを特徴とする、上記ケトエステル-還元酵素の回収方法。
【請求項２】
更に酵素を精製するために、引き続きクロマトグラフィー分離を行う、請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
C-源として長鎖のアルカン酸又はアルカンを含有する培地で菌株の増殖を行う、請求の範囲１又は２記載の方法。
【請求項４】
カンジダ  パラプシロシス株(DSM 16428)を培養する、請求の範囲１又は２記載の方法。
【請求項５】
β-、γ-及びδ-ケトエステルをNADH-依存酵素反応させて対応する光学的に活性なβ-、γ-及びδ-ヒドロキシ酸エステルにすることができる、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載の方法によって得られるケトエステル-還元酵素。
【請求項６】
請求の範囲５記載のケトエステル-還元酵素を、光学的に活性なS-ヒドロキシ-化合物の形成下にNADHの存在下でオキソ-化合物を酵素還元するために使用する方法。
【請求項７】
請求の範囲５記載のケトエステル-還元酵素を光学的に活性なR-ヒドロキシ-化合物を製造するために使用するにあたり、R-及びS-ヒドロキシ-化合物のラセミ化合物から出発し、S-対掌体を酵素によりNADの存在下にオキソ-化合物に変え、次いで分離することを特徴とする、上記使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の対象は、β-、γ-及びδ-ケトエステルをNADH-依存酵素反応して対応する光学的に活性なβ-、γ-及びδ-ヒドロキシ酸エステルにすることができる、新規ケトエステル-還元酵素であり、これはカンジダ  パラプシロシス(Candida parapsilosis)、ヤローヴィニア  セロビオサ(Yarrowinia cellobiosa)、ロードコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)又はシュードモナス  アシドボランス(Pseudomonas acidovorans)の菌株から単離することができる。
光学的に活性なβ-、γ-及びδ-ヒドロキシカルボン酸エステルは、価値あるキラル合成構成成分であり、これは薬剤、芳香物質、フエロモン、農業用化学物質、酵素阻害剤中に広く使用される。これは通常の化学方法で極めて入手が困難である。というのは化学的還元によって生じる対掌体混合物の分離が複雑であり、かつ費用がかかるからである。
微生物を用いるβ-、γ-及びδ-ヒドロキシカルボン酸の発酵製造処理は、公知である。その際、微生物細胞を常に過剰に使用し、収量及び過剰の対掌体は細胞の起源に応じて広い範囲にわたって変化する。その際パン焼き用酵母サッカロマイセス  セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)がもっとも頻繁に使用される。
サッカロマイセス  セレビジアエから単離される酸化還元酵素もすでに知られている。この酵素は、対応するケトエステルのβ-、γ-及びδ-ケト基の酵素還元に触媒作用を呈し、対応する光学的に活性なヒドロキシ化合物とする（ハイドラス(Heidlas)等、(1988)、Eur. J. Biochem. 172:633-639)。この公知の酸化還元酵素は共触媒としてNADPHを必要とし、その再生が困難であり、それ故にこの公知の酵素による合成法は工業的に採算が合わない。
したがって本発明の目的は、NADHによって共触媒反応を生じる、β-、γ-及びδ-ケトエステルの酵素反応及びこれに適する酵素である。
これは驚くべきことに特定の酵母及び細菌中に、すなわちカンジダ  パラプシロシス及びヤローヴィニア  セロビオサ中に並びにロードコッカス  エリスロポリス及びシュードモナス  アシドボランス中に見い出され、これらはn-アルカン又はn-アルカン酸を利用することができる。カンジダ  パラプシロシス及びロードコッカス  エリスロポリスから単離されたケトエステル-還元酵素は広範囲にわたって研究されている。
長鎖アルカン酸又はアルカン、すなわち特にドデカン酸及びテトラデカンを炭素源として含有する栄養培地上でカンジダ  パラプシロシス又はロードコッカスエリスロポリスを増殖した場合、新規ケトエステル-還元酵素(KERed)の特に高い活性が得られる。
カンジダ  パラプシロシスＤＳＭ１６４２８によるKERedの形成及びこの菌株から酵素の単離及び精製が特に著しく研究されている。
精製されたKERedは次のパラメーターの点で優れている：
――pH-最適条件は、ケトエステル-還元に関してpH7.8ないし8.0及び逆反応に関して約pH9.5である。
――ケトエステル-還元に最適な温度は、36ないし40℃及び逆反応に最適な温度は50℃ないし56℃である。
――Hg2+-、Pb2+-、Ag+、Cu2+-、Ni2+-、Sn2+-及びCo2+-イオンによる急速な脱活性化。p-ヒドロキシ安息香酸水銀ベンゾアート、5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾアート）及びヨードアセトアミドによる並びにキレート化された2,2'-ビピリジル及びo-フエナントロリンによる著しい阻害。SH-保護試薬、たとえばジチオトレイトールによる安定化。
――脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ジケトン、ケタール及びアルデヒドの還元のための並びに第一及び第二アルコールの酸化のための更なる能力。
β-、γ-及びδ-ケトエステルを、酵素還元反応に付して対応する光学的活性ヒドロキシカルボン酸エステルとすることは、次の反応式に従って行われる：
0003672307.tif 000002
式中R及びR'は幅広い意味を有することができ、それはたとえば表４から明らかである。nは1〜3の値をとることができる。更に基質結合部位のモデル（図５、表５、例３．Ｇ）で基質受容の範囲を図示する。
ケトエステルの他にKERedによって他のオキソ化合物が基質として挙げられる。たとえば特に1,1-ジクロルアセトン、クロルアセトン、3-クロル-2-ブタノン、2-オクタノン、2-ブタノン、2-ペンタノン、2-メチル-3-ペンタノン、メトキシ-2-プロパノン、アセトフエノン、3-クロルアセトフエノン、4-フルオルアセトフエノン、4-ブロムアセトフエノン、プロピオフエノン、2,4-ヘキサンジオン、2,4-ペンタジオン並びにアセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びプロピオンアルデヒドである。アセトフエノンを(S)-フエニルエタノールへ、3-オキソ酪酸エチルエステルを(S)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを、そして5-オキソヘキサン酸エチルエステルを(S)-5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルへ変換する。
このことに関連して、特にNADH-共触媒中でアセトフエノン、4-ブロムアセトフエノン、3-クロルアセトフエノン及び4-フルオルアセトフエノンの対応する(S)-フエニルエタノールへの変換が重要である。というのは従来(R)-特異変換し起こらないからである。
逆反応（ヒドロキシ基の酸化）を、同様に酵素によって実施することができ、特にこれを利用して、R-及びS-ヒドロキシ化合物のラセミ化合物の対掌体を変換することによって場合により所望されたR-対掌体を得ることができる。
下記に、個々に記載されたケトエステル-還元酵素は上述の様にケトエステルのβ-、γ-、δ-ケト基の還元を可能にするばかりでなく、更に広範囲のカルボニル化合物の還元に使用することができる。したがってこの酵素をカルボニル-還元酵素として表示することもできる。
新規酵素を、EC-分類内で番号〔EC 1.2.1〕に分類することができる。EC-番号の正確な指定は勿論まだ結着がづいていない。説明を簡略化するために、新規酵素を下記の説明でケトエステル-還元酵素(KERed)と表示する。
KERedが公知方法で上記微生物の培養（通常の栄養培地中で、場合によりアルカン及び（又は）アルカン酸の存在下）によって得られ、その粗抽出物から使用可能な酵素調製物をPEG-分別沈殿によって得ることができる。この際、先ず比較的低分子量ポリエチレングリコール(PEG)を用いて随伴たん白質の沈殿を行い、一方KERedはまだ溶液中に残存し、次いで液体からこれをより一層高い分子量を有するPEGによって沈殿させ、沈殿物から緩衝溶液を再び“抽出”する。
あるいは種々のPEG-濃度と共にしかも1,000ないし10,000の範囲、特に約5,000の一定の分子量を処理することができる。クロマトグラフィー分離法による他の精製は、下記例で示される様により高い比活性を有する、好ましい単離物を生じる。
次に、本発明を例によって詳述する。その際、ここでの説明は添付の図面を参照して述べられている。図面は下記の通りである：
図１及び２  グリセリン(1)又はドデカン酸(2)上で培養した場合、C.パラプシロシスによるKERedの形成。
図３  C.パラプシロシスからのKERedの活性を調節。
a)5.4％グルコース、b)0.8％グルコース、c)2％グリセリン、d)2％グリセリン＋0.1％誘導物質、e)1％ドデカン酸、F)1％ドデカン酸＋0.1％誘導物質；誘導物質：3-オキソヘキサン酸エチルエステル。
図４  酸化及び還元の際のKERed-活性のpH-依存性。
図５  C.パラプシロシスからのKERedの基質結合部位モデル。
図６  (a)ラセミ混合物に対する及び(b)本発明によるKERed-反応生成物に対する(R)-及び(S)-3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルのクロマトグラフィー分離。
図７  本発明によるKERed-反応生成物に対する(R)-及び(S)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルのクロマトグラフィー分離。
例１：酵素の回収
１．スクリーニング
DMS(ドイチェ  ザンムルング  フォン  マイクロオルガニスメン  ウント  ツエカルチャー(Dutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen)GmbH、ブランシュバイク(Braunschweig))の寄託菌株をDMSによって推挙された培地中で培養し、菌体を遠心分離して集め、湿潤粉砕によって上澄みを酵素源（粗抽出物）として使用し、ケトエステル-還元酵素-活性を試験する。テストを光度測定によって実施する。この際、次の成分を含有する：
−0.2mM MAD(P)H
−8mMケトエステル
−0.1Mトリエタノールアミン(TEA)-NaOH-緩衝液、pH7
−粗抽出物の限定量
NAD(P)H-減少は334nmで１分間にわたって進行する。活性度を算出するために、6.18M-1cm-1の吸収係数を使用する。表１に65種のテストされる微生物のグループから有効であると実証された、個々の微生物に対する得られた比活性をまとめて示す。
微生物１種につき、第１行にNADH-依存性比活性、第２行にNADPH-依存比活性をmU/mgで示す。U(ユニット）は、１分あたり１μmol還元された補酵素の変換率に相当する。
0003672307.tif 000003
２．カンジダ  パラプシロシスの増殖
酵素を調製するために、カンジダ  パラプシロシスを次の培地中で増殖する。
（１ｌにつき）：
酵母抽出物            10g
リン酸カリウム         1g
硫酸アンモニウム      1.2g
グリセリン            20g（抑制しない）
又はグルコース        54g（抑制する）
又はグルコース         8g（脱抑制する）
又はドデカン酸        10g
場合により3-オキソヘキサン酸エチルエステルの0.1％添加（誘導物質）
この溶液のpH-値を、4.5に調製し、次いで15分間121℃で(2バール）滅菌する。菌体を好気性培養する。10ｌ-規模で30℃の培養温度に達した後に、この培地に20時間たっている培養液を植菌する。この様な10ｌ-バッチ中で時間に対する酵素活性の経過を例示的に測定する。この際試料を種々の時間で取り出し、ケトエステル-還元酵素の活性を細胞の砕解後に測定する。図１中にこの経過を示し、ケトエステル-還元酵素の活性は20時間後最大値に達し、次いで再び減少する。細胞を20時間後遠心分離によって集める。この際8ｌ培地から湿性物175gが得られる。細胞物質を−20℃で凍結して保存する。この際、数週間にわたって活性損失は認められない。
３．酵素単離（粗抽出物）
完全な細胞からの酵素遊離は、公知方法（超音波、高圧-均一化、湿潤粉砕等々）によって行うことができる。この際細胞をガラス球で湿潤粉砕して砕解する。更に細胞物質(175g)を緩衝液(200mM TEA-NaOH-緩衝液(pH7.5))中に５mMジチオトレイトール及び1mMプロテアーゼ-阻害物質(Pefabloc，メルク社、ダルムシュタット）の添加下に懸濁する。その際、細胞湿性物質の濃度は25％である（最終容量700ml)。
細胞内容物を、冷却された懸濁液(4℃）からガラスパールミル(Desintegrator S, IMA社、フチンクフルト）を用いる機械的砕解によって遊離する。粉砕容器をガラス球(0.5mm:0.3mm=2:1-割合、90ml）で満たし、25％細胞懸濁液60mlで満たす。砕解を4000UpMの撹拌波動回転数で実施する。冷却マントルを、操作の間冷却する。9分の砕解時間が最適であると分り、細胞砕解に使用する。細胞砕開後、上澄みをデカンテーションし、ガラス球を２回砕解緩衝液で洗滌する。
酵母湿性物質175gは、体積活性6.6U/ml及びたん白質含有量10.7mg/mlを有する粗抽出物285mlを生じる。これから発酵混合物100ｌからケトエステル-還元酵素約23000単位が得られうる(1酵素単位とは１分あたり1μmolアセチル酪酸エチルエステルが反応する酵素量である。）ことが算出される。
４．酵素の濃縮
酵素をたん白質精製の公知方法、たとえば二段階のポリエチレングリコール分別沈殿、イオン交換-クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮し、精製する。
４．１  ポリエチレングリコール-分別沈殿
氷冷された粗抽出物(4℃）を、撹拌及びpH-コントロール(pH7-7.5)下でポリエチレングリコール（分子量：5000）を加えて、濃度4％(w/v)とする。10分間10000UpMで遠心分離後に得られた沈降物は、ケトエステル-還元酵素-活性を含有し、トリエタノールアミン-NaOH-緩衝液、20mM、pH7.5中に取り、凍結乾燥する。酵素は、この条件下で数ケ月間活性損失することなく維持される。
４．２  イオン交換クロマトグラフィー
30％PEG-沈殿物から得られた再懸濁された沈降物1ml（例１：４．１に対応）を、Q-セファロース-ファーストフロー(Fastflow)-カラム（アニオン-交換体、高負荷、高処理、16/10、容量20ml）に装填する(FPLC-クロマトグラフィーシステム、フアルマシア社、フライブルグ）。カラムを緩衝液で平衡化する（20mMトリエタノールアミン-NaOH-緩衝液；pH7.5)。カラムを緩衝液Ａで十分に洗滌した後、ケトエステル-還元酵素を線状NaCl-勾配(0-200mM）で溶離し、その際酵素が約100mM NaClで溶離する。クロマトグラフィー分離を、流出割合1m／分で実施する。得られた濃縮物を表２中にまとめて示す。
４．３  アフィニティークロマトグラフィー
最も高い活性を有するQ-セファロース-クロマトグラフィーの分画を集め、限外濾過セル（アミコン、ヴィッテン／ルール）を用いて濃縮し、更に寒天-NAD（シグマ社、ダイセンホーフエン）でクロマトグラフィー分離して精製する。ファルマシア社の低圧-クロマトグラフィーシステムを使用する。ゲル床は5mlである。クロマトグラフィーを流出割合0.5ml/分で実施する。濃縮を表２中にまとめて示す。
0003672307.tif 000004
ケトエステル還元酵素の見かけの天然分子量13KDa(±11KDa)を、セファデックスG-200でゲルパーミテーション-クロマトグラフィーによって測定する。その際チログロブリン、フエリチン、カタラーゼ、アルドラーゼ、子牛血清アルブミン、オバルブミン、キモトリプシノーゲンＡ及びリボヌクレアーゼＡを標準たん白質として使用する。２つの同一の大きい構成単位は見かけ分子量67KDaを有し、たとえばこれはSDS-ゲル電気泳動によって測定される。分子量標準として、α2-マクログロブリン、ホスホリラーゼb、子牛血清アルブミン、グルタマート-デヒドロゲナーゼ、レクタート-デヒドロゲナーゼ及びトリプシン阻害物質から成る混合物を使用する。
KERedの種々の起源に応じて、分子量中での一定の差異が一定作用（β-、γ-及びδ-ケトエステルのNADH-依存還元）で予想される。
例２：ケトエステル-還元酵素の制御
ケトエステル-還元酵素の制御を調べる。細胞を異なるC-源（例１；２参照）上に200ml-規模で塗布する。ケトエステル酸-還元酵素の活性が最大である時点を決め、回収時点として確定する（図１参照）。
3-オキソヘキサン酸チルエステルに対するケトエステル-還元酵素の比活性は、種々のC-源上での増殖に関係なく図３中に示す。カンジダ  パラプシロシスのケトエステル-還元酵素はカタボライト(Katabolit)-抑制を受ける。脱抑制化条件（培地中で0.8％グルコース）下で酵素の比活性は、抑制条件（培地中5.4％グルコース）下よりも約36％高い。非-抑制条件（培地中で2％グリセリン）は抑制条件下よりも約300％高い。ドデカン酸での増殖の場合、カンジダ  パラプシロシスのケトエステル-還元酵素の活性は700％以上に上昇する。培地にケトエステルの添加(0.1％）は、C-源としてグリセリンの場合比活性の上昇を350％に上昇させる。
例３：ケトエステル-還元酵素の特性
次の試験に関して、部分的に精製された酵素（Q-セファロース-クロマトグラフィー後、67倍濃縮）を使用する。
Ａ．反応のpH-依存性
活性のpH-値依存性を測定する。その際5-オキソヘキサン酸エチルエステル(35mM)をNADH(0.2mM)及び10ul酵素溶液と種々のpH-値(0.2M緩衝溶液）で混合し、活性を340nm(30℃）で光度測定によって追跡する。図４はpH-値に左右される得られた活性値を示し、5-オキソヘキサン酸エチルエステル-還元の最適条件は、pH7.9である。
同様な方法で、逆反応、すなわち5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル-酸化に対するpH-最適条件を測定する。(R/S)-5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル(35mM)を４〜10のpH-値を有する0.2M緩衝液中に溶解し、0.2mM NADH及び10μｌ酵素溶液を加え、NAD-形成率を340nmで光度測定によって追跡する。図４は得られた値を示す、酸化のpH-最適条件はpH9.5である。
Ｂ．還元の温度依存性
還元の最適温度を決めるために、酵素活性を30〜60℃で測定する。テスト混合物は次の物質を含有する：
5-オキソヘキサン酸エチルエステル  35 mM
NADA                              0.2mM
酵素溶液                          10μｌ
TEA-NaOH-緩衝液、0.1M；pH7.9
C.パラプシロシスからのKERedeは、36〜40℃の還元最適温度を有する。
Ｃ．酸化の最適温度
酸化の最適温度を決定するために、酵素活性を30〜60℃で測定する。テスト混合物は次の物質を含有する:
5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル  35 mM
NAD                                   0.5mM
酵素溶液                              10μｌ
TRIS-HCl-緩衝液、0.1M，pH9
C.パラプシロシスからのKERedは、50〜60℃の酸化最適温度を有する。
Ｄ．KERedに対する種々の試薬の影響
酵素活性への種々の金属カチオン及び試薬の影響を調べる。この際例３．Ｂに記載したテスト混合物を使用する。
阻害試験の結果を表３中にまとめて示す。注目すべきことは、酵素がキレート化剤、o-フエナントロリンによって比較的強く阻害されるが、これに反してEDTAによって実質上阻害されないことである。ケトエステル-還元酵素は、o-フエナントロリンによって除去される必須金属イオンを有することが明らかである。このことは更に活性損失を導く。チオール-試剤、たとえばN-エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、2,2'-ジチオ-ビス(2-ニトロベンゾアート）及びp-ヒドロキシ安息香酸水銀によるケトエステル-還元酵素の増加する著しい阻害は、酵素が少なくとも１個の必須SH-基を含有することを示す。
0003672307.tif 000005
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0003672307.tif 000007
Ｅ．KERedの活性に対する緩衝液濃度の影響
ケトエステル-還元酵素の活性への緩衝液濃度の影響をテストする。更に例3.Bに記載したテスト混合物を緩衝液濃度の変化によって使用する。
酵素活性は、0.1Mの緩衝液モル濃度で最大である。
Ｆ．KERedの基質スペクトル
例３．Ｂに対応して、5-オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに一連の芳香族及び脂肪族ケトエステル、ケト酸、ケトン、ジケトン及びアルデヒドを、これらが酵素触媒による還元されるかどうかを調べる。その際化合物を常に8mM最終濃度で添加する。結果を、表４中にまとめて示す。酵素は多数の芳香族及び脂肪族オキソ化合物を基質として受け入れることが分かる。
5-オキソヘキサン酸エチルエステルによる活性は、実質上100％とする。
0003672307.tif 000008
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0003672307.tif 000010
α-ケトカルボン酸及び-エステル及びアリル-ケトンは反応しない。
明らかに、ケトエステル-還元酵素の基質スペクトルは著しい広い。この際β-、γ-及びδ-ケトエステルの他に、1,3-及び1,4-ジケトン、場合により置換された、特にハロゲン化された脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ケトアセタール及びアルデヒドを受け入れる。
Ｇ．KERedの反応速度特性
選ばれた基質に関して、上記光度測定テストによってC.パラプシロシスからのKERedの選ばれた基質を反応速度の点で測定する。反応速度特性の結果は、表５中にまとめて示す。
0003672307.tif 000011
0003672307.tif 000012
0003672307.tif 000013
すべてのVmaxは、2-ブタノンに対してである(6U/mg、部分的に精製された酵素):基質阻害をクロルアセトン(Kis：121.3mM)、3-ヘキサノン(Kis：612mM）及び2-ノナノン(Kis：24.9mM)で観察する。一般に最大反応速度及びミカエリス・メンテン定数の標準誤差は、値の5-10％である。
これらの結果から、KERedの基質結合部位に対するモデルを導くことができる。このモデルによって、KERedの特定の考えられる基質が受け入れられるか、されないか予想することができる。図５中に基質結合部位のモデルを示す。
これによれば基質結合部位は、容量と疎水性の点で異なる２つの領域から成る。小さい袋はメチル-、エチル-及びプロピル基を取り込む。それは共に置換されたメチル基、たとえばクロルメチル基も受け入れる。大きい袋は、長い及び疎水性残基を結合する。表５から明らかな様にこれはC8までの脂肪族残基（2-デカノン）であることができる。大きい袋は立体的要求の多い残基も多く取り込み、酵素の極めて広い基質スペクトルを決定することができる。
Ｈ．バッチ-混合物中で3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルの酵素触媒による製造
3-オキソ酪酸メチルエステルの溶液(100mM）を、ケトエステル-還元酵素(10U）及び補酵素(0.1mM）と反応させ(100ml全容量）、その際補酵素NADHをギ酸ナトリウム(1M)及びホルマート-還元酵素(40U）とのカップリングによって再生する。一定の間隔で試料を取り出し、薄層クロマトグラフィー(DC)を用いて形成された3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルを分析する。対掌体純度をGC-分析によって測定する。
DCの分離条件:
固定相:シリカゲル60 F 254
移動相:ジエチルエーテル：石油エーテル60-80=2:1
展開距離:5cm
浸漬溶液:4％HClを有する無水エタノール中
10％モルブダートリン酸-ヒドラート-溶液
処理:飽和シリンダーで傾斜クロマトグラフィー
試料容量:2-10μl
展開挙動:ヒドロキシ酸/-エステルは、ケト酸/-エステルより小さい幅で展開する
36時間の反応が経過した後、対掌体純度の測定のために、反応混合物をクロロホルムで抽出し、沈殿したたん白質を分離し、有機相をトリフルオル無水酢酸(TFAA)を用いて誘導する。試料をキラルガスクロマトグラフィーで分析する。
GCの分離条件:
Sカラム:リポデックス(Lipodex)E(25m×0.25mm ID）
ヘリウム:0.8バール
水素:0.5バール
試料容量:1μl
Tカラム:80℃又は90℃
Tインゼクター:260℃
保持時間:
3-(R)-ヒドロキシ酪酸メチルエステル  10.5分
3-(S)-ヒドロキシ酪酸メチルエステル  14.9分
キラルGC-カラムでの対掌体の溶離順序を、3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルの純粋な対掌体を用いて(S)の前に(R)を特定化する。GC-分析の結果を図６に示す。カンジダパラプシロシスからのケトエステル-還元酵素は、98％の過剰対掌体及び95％収率の3-オキソ酪酸メチルエステルを(S)-3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルに変換する。
Ｉ．バッチ-混合物中で5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルの酵素触媒による製造
例３．Ｈと同様に、5-オキソヘキサン酸エチルエステルを、実験室規模で酵素によって還元する。試料をキラルクロマトグラフィーによって分析する(Ts:90℃).保持時間:
5-(R)-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル  25.0分
5-(S)-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル  26.9分
DC-分析の結果を、図７中に示す。カンジダ  パラプシロシスからのケトエステル-還元酵素は、95％の過剰対掌体及び96％収率を有する5-オキソヘキサン酸エチルエステルを(S)-5-ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルに変換する。
Ｊ．酵素の立体特異性の検出
酵素の立体特異性及び生成物の対掌体純度の検出のために、２つの方法を使用する。一方で酵素により製造された生成物を、(R)-及び(S)-ヒドロキシエステルを相互に分離することができるキラルクロマトグラフィーで調べ、他方で(R)-及び(S)-ヒドロキシ酸エステル並びに(R)-及び(S)-フエニルエタノールの市販の純粋な異性体を用いて光度測定によって酸化反応を測定する。
１．キラルGC
酵素反応の生成物並びに視線の純粋な対掌体を、例３．Ｈと同様にキラル相でガスクロマトグラフィーによって分離する。ピークの配分は、3-ヒドロキシ酪酸メチルエステルの市販の純粋対掌体と比較して行われる。溶離順序:(S)の前の(R)は、ヒドロキシエステルの対応する順序にも適用される。図６は、酵素による反応によって純粋な(S)-ヒドロキシ酪酸メチルエステルに達することを示す。
２．(R)-又は(S)-ヒドロキシ化合物との逆反応
立体特異性の光度測定による検出のために、次のテスト混合物を用いる:
Ｉ）35mM  (R)-ヒドロキシ酪酸メチルエステル
0.5mM  NAD
10μl  酵素溶液
TRIS-HCl-緩衝液、pH9，0.1M
II)35mM  (S)-ヒドロキシ酪酸メチルエステル
0.5mM  NAD
10μl  酵素溶液
トリス-Cl-緩衝液、pH9，0.1M
温度:56℃
III)8mM  (R)-フエニルエタノール
0.5mM  NAD
10μl  酵素溶液
TRIS-HCl-緩衝液、pH9，0.1M
IV)8mM  (S)-フエニルエタノール
0.5mM  NAD
10μl  酵素溶液
TRIS-HCl-緩衝液、pH9，0.1M
活性測定を340nmで光度測定によって行う。
結果:
混合物Ｉ:  ７％        混合物II:100％
混合物III:1.1％        混合物IV:100％
結果は、酵素が(S)-3-ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び(S)-フエニルエタノールに対して極めて特異的であることを明らかに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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