(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号24に示すアミノ酸配列を含むヒトカルシウムチャネルのα1E-1サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子。
【請求項２】
配列番号24に示すアミノ酸配列をコードする配列番号24に示すヌクレオチド配列を含む請求項１に記載のDNA分子。
【請求項３】
配列番号25に示すアミノ酸配列を含むヒトカルシウムチャネルのα1E-3サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子。
【請求項４】
配列番号25に示すアミノ酸配列をコードする配列番号25に示すヌクレオチド配列を含む請求項３に記載のDNA分子。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のDNA分子によってコードされる実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項６】
配列番号24または配列番号25のいずれかに示すアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項７】
機能的な組換えカルシウムチャネルを発現する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の単離されたDNA分子によってトランスフェクトあるいは形質転換された真核細胞。
【請求項８】
ヒトカルシウムチャネルのα１サブユニットをコードする異種DNAとヒトカルシウムチャネルのβ２サブユニットをコードする異種DNAによってトランスフェクトまたは形質転換された、機能的な異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞であって、該α１サブユニットは配列番号24または配列番号25のいずれかに示すアミノ酸配列を含み、該β２サブユニットは配列番号26、配列番号37または配列番号38のいずれかに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする真核細胞。
【請求項９】
α１サブユニットをコードする異種DNAが配列番号24または配列番号25のいずれかに示すヌクレオチド配列を含む請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
β２サブユニットをコードする異種DNAが配列番号26、配列番号37または配列番号38のいずれかに示すヌクレオチド配列を含む請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
ヒトカルシウムチャネルのα１サブユニットをコードする異種DNAおよびヒトカルシウムチャネルのβサブユニットをコードする異種DNAを含む、機能的な異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞であって、該α１サブユニットが配列番号24または配列番号25に示すアミノ酸配列を含むα１サブユニットからなる群より選択される真核細胞。
【請求項１２】
異種核酸が、配列番号24または配列番号25のいずれかに示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むDNA分子にコードされるRNAである、請求項７乃至11のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項１３】
ヒトカルシウムチャネルのα２サブユニットをコードする異種核酸を更に含む、請求項７乃至12のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１４】
カルシウムチャネルの活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）機能的な異種カルシウムチャネルを有する真核細胞を、化合物およびカルシウムチャネル選択イオンを含む溶液中に浮遊させる工程、
（ｂ）上記細胞の細胞膜を脱分極させる工程、および
（ｃ）細胞内に流入する電流を検出する工程から成り、
（ｉ）上記異種カルシウムチャネルは、該細胞に対して異種起源であるDNAまたはRNAにコードされるヒトカルシウムチャネルサブユニットを少なくとも１つ含み、
（ii）少なくとも１つのサブユニットは、α1E-1およびα1E-3から成る群より選択され、配列番号24または25に示すアミノ酸配列を含み、
（iii）検出される電流が、同一のカルシウムチャネル選択イオンの存在下であるが該化合物の非存在下で同一または同様の細胞を脱分極させることによって発生する電流とは相違することを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
α1E-1およびα1E-3から成る群より選択されるヒトカルシウムチャネルサブユニットであって、配列番号24または25のいずれかに示すアミノ酸配列を含むサブユニット。
【発明の詳細な説明】
技術的分野
本発明は分子生物学及び薬理学に関する。特に、本発明は、カルシウムチャンネル組成物並びにその製造方法及び使用方法に関する。
発明の背景
カルシウムチャンネルは、Ca2+イオンを細胞外の流体から細胞内へ調節的に流入させ得る膜貫通型タンパク質であり、多数のサブユニットを有している。動物界のあらゆる細胞及び少なくともある種の細菌、菌類及び植物の細胞は１タイプ以上のカルシウムチャンネルを有している。
最も普遍的なタイプのカルシウムチャンネルは電圧依存性である。細胞内へCa2+イオンを流入させるように電圧依存性チャンネルが「開く」ためには、チャンネル保有細胞の内部と細胞を浸漬させている細胞外媒体との間の電位差があるレベルになるまで脱分極する必要がある。細胞内へのCa2+イオンの流入量はこの電位差に依存する。中枢神経系（CNS）のニューロン、末梢神経細胞、並びに、骨格筋、心筋、静脈及び動脈の平滑筋などの筋細胞のような動物体内のすべての「興奮性」細胞は、電圧依存性カルシウムチャンネルを有している。
骨格筋、心筋、肺、平滑筋及び脳などの種々の組織に由来の哺乳類細胞中で多くのタイプのカルシウムチャンネルが同定されている〔例えば、Bean,B.P.（1989）Ann.Rev.Physiol.51:367−384及びHess,P.（1990）Ann.Rev.Neurosci.56:337参照〕。種々のタイプのカルシウムチャンネルは、電流カイネティクス（kinetics）、静止電位（holding potential）感受性及びカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストに対する感受性に基づいて認識可能なＬ−、Ｔ−、Ｎ−及びＰ−型の４種類に大別される。
カルシウムチャンネルは、約130〜約200キロダルトン（kD）の分子量をもちα１及びα２と呼ばれる２つの大サブユニットと、約60kD未満の分子量をもつ１〜３個の異なる小サブユニットとから成るマルチサブユニットタンパク質である。大サブユニットの少なくとも１つ及び任意に小サブユニットのいくつかがグリコシル化されている。いくつかのサブユニットはリン酸化されることも可能である。α１サブユニットは、哺乳類筋組織から単離後にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分析すると分子量約150〜約170kDを有し、種々の1,4−ジヒドロピリジン（DHP）及びフェニルアルキルアミンに特異的に結合する部位を有している。α２サブユニットは、非還元性条件下（Ｎ−エチルマレイミドの存在下）のSDS−PAGEによって分子量約160〜190kDに対応するバンドとして泳動する。還元によって、大断片とより小さい断片とが遊離する。ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルのβサブユニットは、SDS−PAGE分析による測定分子量52〜65kDのリン酸化タンパク質である。このサブユニットは還元性条件に感受性でない。カルシウムチャンネルのγサブユニットは、精製されたすべての調製物中で観察されるとは限らないが、SDS−PAGE分析による測定見掛け分子量30〜33kDの糖タンパク質であると考えられる。
カルシウムチャンネルの構造及び機能を研究するためには、大量の純粋なチャンネルタンパク質が必要である。これらのマルチサブユニットタンパク質が複合体の性質を有すること、タンパク質が由来した組織中のカルシウムチャンネルの濃度が多様であること、組織中にカルシウムチャンネルの混合集団が存在すること、目的の組織を得ることが難しく、また単離手順中に天然型タンパク質の修飾が生じることから、高度に精製された完全にインタクトなカルシウムチャンネルタンパク質を大量に得ることは極めて難しい。
大多数の細胞中に種々のタイプのカルシウムチャンネルの混合集団が存在することが、全細胞の分析による特定タイプのカルシウムチャンネルのキャラクタリゼーションを極めて難しいものにしている。個々のカルシウムチャンネルを試験するために使用される単一チャンネル記録方法は、チャンネルの分子構造または生化学組成に関する情報を全く与えない。更に、この種の分析を行う場合には、天然機能及び薬理学的相互作用に重要であると考えられる他の細胞構成成分からチャンネルが単離される。
種々のタイプのカルシウムチャンネルの別のキャラクタリゼーション手段として、カルシウムチャンネルをコードする１つまたは複数の遺伝子のキャラクタリゼーションがある。カルシウムチャンネルタンパク質をコードする遺伝子のコーディング領域の完全ヌクレオチド配列から決定されたアミノ酸配列は、タンパク質の一次構造を示す。更に、一次構造の分析に基づいて、カルシウムチャンネルタンパク質の二次構造及び膜に対するタンパク質の関係を予測し得る。例えば、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルのα１サブユニットタンパク質のハイドロパシープロットは、α１サブユニットが、６個の推定トランスメンブラン領域を各々が含む４個の内部リピートを含むことを示す〔Tanabe,T.ら（1987）Nature328:313〕。
カルシウムチャンネルは種々の組織に存在し細胞内カルシウムイオン濃度の調節に中心的役割を果たすので、神経伝達物質放出、筋収縮、ペースメーカー活性、ホルモン及び他の物質の分泌などの動物体内の多数の生命プロセスに関与する。これらのプロセスは、CNS及び心血管疾患のような多数のヒト疾患に関与すると考えられる。従ってカルシウムチャンネルもまた多数の疾患に関与する。ヒトを含めた動物の種々の心血管疾患の治療に有用な多数の化合物は、心臓及び／または血管の平滑筋に存在する電圧依存性カルシウムチャンネルの機能を変調することによってその有益な効果を作用させると考えられている。これらの化合物の多くはカルシウムチャンネルに結合し、細胞膜の脱分極に反応して細胞内へのCa2+の流入を阻害したりまたは流入速度を減少させたりする。
ウサギのカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするcDNAクローン及びcDNAクローンの転写物の組換え発現の研究結果は、α１サブユニットがカルシウムを細胞に流入させるポアを形成することを示す。これらの組換え細胞中で発生したバリウム電流と、夫々のα１サブユニットを１成分として含有するカルシウムチャンネルによってin vivoに発生した実効電流との関連は不明である。種々のカルシウムチャンネルのタイプの完全且つ正確に特性決定及び評価するためには、in vivoに見出されるサブユニットを全て含有する組換えチャンネルの機能特性試験が必須である。
この試験を実施しカルシウムチャンネルの構造及び機能を完全に理解するために、できるだけ多数のカルシウムチャンネルサブユニットを同定し特性決定することが極めて重要である。また、カルシウムチャンネルと相互作用する化合物の同定に使用される組換え細胞を調製するために、所定のサブユニットを含有するカルシウムチャンネルの均一な集団を発現する細胞を産生することが必要である。
CNSのような他の器官系においてカルシウムチャンネルと相互作用する化合物の薬理学を理解することができれば、例えば神経変性疾患及び心血管疾患の治療において所望の治療効果を与えるようにヒトカルシウムチャンネルのサブタイプと特異的に相互作用する化合物の合理的な設計が促進されるであろう。しかしながら、特にCNS中ではヒトカルシウムチャンネルのタイプ及び個々のサブタイプの分子的性質を独立に決定できないこと、また、カルシウムチャンネル作動化合物（calcium channel−dffecting compounds）の特異性を評価するために必要な特定チャンネルサブタイプの純粋な調製物を入手できないことが、このような理解及び治療有効化合物の合理的設計の妨げとなっていた。従って、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを同定し、カルシウムチャンネルサブユニット及び機能性カルシウムチャンネルを発現するためにこのようなDNAを使用できれば、治療有効化合物のスクリーニング及び設計が促進されるであろう。
従って、本発明の１つの目的は、特定カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを提供し、組換え組織特異的または組換えサブタイプ特異的カルシウムチャンネルを保有する真核細胞を提供することである。本発明の目的は更に、カルシウムチャンネルのアンタゴニスト及びアゴニストとして作用する有望な治療用化合物の同定アッセイを提供することである。
発明の概要
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする単離及び精製された核酸フラグメントが提供される。ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードするDNA、及び、かかるDNAの転写によって作製された上記サブユニットをコードするRNAが提供される。特に、電圧依存性ヒトカルシウムチャンネル（VDCC）のα１サブユニットのタイプＡ、タイプＢ（VDCC IVとも呼ぶ）、タイプＣ（VDCC IIとも呼ぶ）、タイプＤ（VDCC IIIとも呼ぶ）及びタイプＥをコードするDNAフラグメントが提供される。
α1A、α1B、α1C、α1D及びα1EサブユニットをコードするDNAが提供される。配列番号１の残基10−2161として示すアミノ酸を実質的に含むα1DサブユニットをコードするDNAが提供される。配列番号１のアミノ酸373−406に置換して配列番号２のアミノ酸１−34として示すアミノ酸を実質的に含むα1DサブユニットをコードするDNAが提供される。また、配列番号３または配列番号６として示すアミノ酸を実質的に含むα1CサブユニットをコードするDNA及び配列番号７または配列番号８として示すアミノ酸配列を実質的に含むα1BサブユニットをコードするDNAも提供される。
α1AサブユニットをコードするDNAも提供される。このようなDNAは、配列番号22もしくは23で示すDNAによってコードされるアミノ酸配列を実質的に同じアミノ酸配列を有しているα1AサブユニットをコードするDNA、または、配列番号22もしくは23で示す配列の全部もしくは一部を含むα1Aの他のスプライス変異体をコードするDNAを含む。配列番号22で示す配列はα1A-1と呼ばれるスプライス変異体であり、配列番号23で示す配列はα1A-2と呼ばれるスプライス変異体である。α1AサブユニットをコードするDNAはまた、配列番号21、22もしくは23を有するDNAまたはブダペスト条約に従ってAmerican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852 U.S.A.に受託番号75293で寄託されたα1AサブユニットをコードするDNAを含む大腸菌宿主のファージ溶菌液から得られたDNAの全部または一部を用いて単離され得るサブユニットをコードするDNAを含む。このようなファージ中のDNAは配列番号21で示す配列を有するDNAフラグメントを含む。このフラグメントは、高緊縮性条件下でα1AをコードするDNAに選択的にハイブリダイズするが、α1BをコードするDNAにハイブリダイズしないので、α1AサブユニットをコードするDNAを単離するために使用され得る。
ヒトカルシウムチャンネルのα1EサブユニットをコードするDNAも提供される。このDNAは、配列番号24で示すDNAによってコードされたα1E-1と呼ばれるα1Eスプライス変異体をコードするDNA、及び、配列番号25で示すDNAによってコードされたα1E-3と呼ばれる変異体をコードするDNAを含む。このDNAはまた、配列番号24及び25に示すヌクレオチドの配列の全部または一部によってコードされたアミノ酸の配列をコードする他のスプライス変異体を含み、また、高緊縮性条件下で配列番号24または25のDNAにハイブリダイズしα1Eスプライス変異体をコードするDNAを含む。
ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするDNA及び該サブユニットをコードするRNAも提供される。該RNAは該DNAの転写によって作製されたものである。組織特異的スプライス変異体のようなα２サブユニットのスプライス変異体をコードするDNAも提供される。特に、サブユニットのα2a−α2eサブタイプをコードするDNAが提供される。特に好ましい実施態様では、配列番号11に示すアミノ酸をコードするDNAと、配列番号11のヌクレオチド1624と1625との間に挿入された配列番号13のDNAとを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるα２サブユニットをコードするDNAが提供される。α2a−α2eのDNA及びアミノ酸を夫々配列番号11及び29〜32に示す。
β１、β２、β３及びβ４サブユニット並びにβサブユニットのスプライス変異体をコードするDNAのような、ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードする単離及び精製DNAフラグメントが提供される。DNAの転写によって作製されたβサブユニットをコードするRNAも提供される。
また、配列番号９に示すアミノ酸をコードしているが配列番号９のヌクレオチド615−781に置換して配列番号12の挿入DNAを含んでいるDNAを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるβ１サブユニットをコードするDNAも提供される。配列番号９に示す配列を有しており、配列番号９のヌクレオチド615−781に置換して配列番号12の挿入DNAを含み、以下のヌクレオチド配列：配列番号12のヌクレオチド14−34、配列番号12のヌクレオチド13−34、配列番号12のヌクレオチド35−55、配列番号12のヌクレオチド56−190、配列番号12のヌクレオチド191−271、の１つ以上が欠失している転写物によってコードされるβ１サブユニットをコードするDNAも提供される。特に、後述するようなβ１サブユニットスプライス変異体β1-1−β1-5（配列番号９、10及び33−35参照）が提供される。
配列番号26、29及び30の全部または一部分を含むβ２サブユニットスプライス変異体β2c−β2eが提供される。配列番号19及び20に示す配列を有するβ３サブユニットスプライス変異体のようなβ３サブユニットスプライス変異体、配列番号27に示す配列を有するDNAを含むβ４サブユニットをコードするDNA、配列番号28に示すアミノ酸配列が提供される。
また、β３をコードするDNAを保有するプラスミドを内包する大腸菌（E.coli）宿主細胞は、ブダペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに受託番号69048で寄託された。寄託されたクローンは、配列番号19のヌクレオチド122−457及び配列番号20の107−443を包含する。
配列番号９に示すアミノ酸をコードするDNAを含む転写物またはATCC受託番号69048で寄託されたβ３をコードする一次転写物のような、βサブユニットをコードし且つ任意に選択的エキソンを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるβサブユニットをコードするDNAは、本発明で提供されるかまたは本発明で提供されるDNAから構築され得る。
ヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするDNAも提供される。DNAの転写によって作製されたγサブユニットをコードするRNAも提供される。特に、配列番号14で示すヌクレオチドの配列を含むDNAが提供される。
ヒトカルシウムチャンネルのα1A、α1D、α1B、α1C及びα1Eなどのスプライス変異体を含むα１サブユニット、α２サブユニット並びにβ1-1−β1-5、β2C、β2D、β2E、β3-1及びβ４などのβサブユニットをコードする全長DNAクローン及び対応するRNA転写物が提供される。また、対応する全長サブユニットをコードする全長DNAクローンを調製するための、電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルのいくつかのα1Cサブタイプのサブユニット及びγサブユニットの実質的部分をコードするDNAクローンも提供される。本文中に記載のように、開示されたDNAをプローブとして用いると全長クローンが容易に得られる。
本発明では、α1Aサブユニット、α1Cサブユニット、α1Eサブユニット及びそのスプライス変異体、β2D、β2C及びβ2Eサブユニット並びにβ４サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸が特に重要である。
１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニット、特にヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする異種DNAを含むか、または、１つ以上のサブユニットをコードするDNAクローンのRNA転写物を含む真核細胞が提供される。単一のα１サブユニットは１つのチャンネルを形成し得る。しかしながら、選択された細胞中で活性の有るチャンネルを形成するために必要なサブユニットの組み合わせは、本文中に記載の方法を用いて実験的に決定され得る。例えば、選択されたα１サブタイプまたは変異体が選択された細胞系中で活性の有るチャンネルを形成しないならば、活性の有るチャンネルが形成されるまで、１つまたは複数の追加のサブユニットを付加し得る。
好適実施態様において、細胞は、ヒトα１サブユニット、好ましくは少なくとも１つのα1D、α1B、α1Aまたはα1EサブユニットをコードするDNAまたはRNAを含む。より好ましい実施態様では、細胞が、少なくとも１つのβ、α２またはγサブユニットのような追加の異種サブユニットをコードするDNAまたはRNAを含む。このような実施態様においては、α１、α１＋β、α１＋β＋α２のいずれかをコードするDNAのような１、２、３または４つのサブユニットをコードするDNAクローンのいずれかの組み合わせによって安定にまたは一過的にトランスフェクトされた真核細胞が提供される。
本発明で提供される真核細胞は、α１サブユニットをコードする異種DNAを含むかまたはα１サブユニットをコードする異種DNAとβサブユニットをコードする異種DNAとを含む。少なくとも１つのサブユニットは、α1A-1、α1A-2、α1C-2、α1E-1、α1E-3、β2C、β2D、β2F、β3-1、β3-2サブユニットまたはβ４サブユニットから選択される。好適実施態様では、細胞がこのような異種カルシウムチャンネルサブユニットを発現し、膜貫通型異種カルシウムチャンネル中に１つまたはそれ以上のサブユニットを含む。より好ましい実施態様では、真核細胞が、生理的濃度で異種カルシウムチャンネルの活性を変調するカルシウムチャンネル選択イオン及び／または結合化合物の通過を制御する機能性異種カルシウムチャンネルを発現させる。いくつかの実施態様では、異種カルシウムチャンネルが少なくとも１つの異種カルシウムチャンネルサブユニットを含む。極めて好ましい実施態様では、真核細胞の表面で発現されるカルシウムチャンネルが実質的にまたは完全に、異種DNAまたはRNAによってコードされたサブユニットから構成される。好ましい実施態様において、このような細胞の異種カルシウムチャンネルは宿主細胞のいかなる内因性カルシウムチャンネルからも識別される。このような細胞は、カルシウムチャンネルの均質集団を得るための手段を提供する。典型的には、細胞は、選択されたカルシウムチャンネルを、細胞によって発現される唯一の異種イオンチャンネルとして含む。
いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネルサブユニットをコードする異種DNAを含む組換え真核細胞は、１つ以上のサブユニットをコードするDNAのトランスフェクションによって産生されるか、または１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAのRNA転写物の注入によって産生される。DNAは直鎖状DNAフラグメントとして導入されてもよく、または、サブユニットをコードするDNAを安定にまたは一過的に発現させるための発現ベクター中に含まれてもよい。また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを保有するベクターも提供される。
異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞はカルシウムチャンネル機能アッセイで使用され得る。または、細胞が、機能性組換えヒトカルシウムチャンネルを構成するために必要な数よりも少数のサブユニットをコードする核酸で形質転換された場合には、このような細胞は、カルシウムチャンネル活性に対する追加サブユニットの効果を評価するために使用され得る。引き続いてこのような細胞をヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つ以上のDNAクローンまたはRNA転写物でトランスフェクトすることによって追加サブユニットを提供し得る。
膜貫通型異種カルシウムチャンネルを発現する組換え真核細胞は、カルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定する方法に使用され得る。特に、細胞は、ヒトのカルシウムチャンネル活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するアッセイ及び／またはカルシウムイオンの輸送及び輸送の調節に対する種々のカルシウムチャンネルサブユニットの寄与を評価するアッセイに使用される。細胞は、カルシウムチャンネルの均質集団を構成するので、このような集団の各々に特異的なカルシウムチャンネル活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する手段が提供される。
また、真核細胞を使用してカルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定するアッセイが提供される。これらのアッセイを実施するときには、本発明で提供されるDNAによってコードされるサブユニットを少なくとも１つ含む異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞を、被検化合物とカルシウムチャンネル選択イオンとを含有する溶液中に導入し、細胞膜を脱分極させ、細胞に流入する電流を検出する。被検化合物がカルシウムチャンネル活性を変調する化合物である場合、検出される電流は、同じカルシウムチャンネル選択イオンが存在するが化合物の非存在下で同じまたは実質的に同じ細胞の脱分極によって生じる電流とは違っている。好適な実施態様においては、脱分極ステップ前の細胞を、細胞に内在するカルシウムチャンネルを実質的に不活化する静止電位に維持する。好適な実施態様においてはまた、細胞は哺乳類細胞、極めて好ましくはHEK細胞または両生類卵母細胞である。
α1D、α1C、α1B、α1A及びα1E、α２、β１、β２、β３及びβ４などのβスプライス変異体並びにγサブユニットをコードするDNAの連続ヌクレオチドを、少なくとも約14、好ましくは16、または所望の場合には20もしくは30以上含み、検出のために典型的に標識された核酸プローブが提供される。これらのプローブを使用したカルシウムチャンネルサブユニットコーディングDNAの単離及びクローニング方法も提供される。これらのDNAは組織内部のスプライス変異体及び組織間の変異体を包含する。
精製されたヒトカルシウムチャンネルサブユニット及び精製されたヒトカルシウムチャンネルが提供される。サブユニット及びチャンネルは、サブユニットをコードするDNAをトランスフェクトした真核細胞から単離され得る。
別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたはヒトカルシウムサブユニットのエピトープ含有フラグメントの実質的に純粋な調製物で免疫した動物の血清から得られる免疫グロブリンまたは抗体が提供される。ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたはそのエピトープ含有フラグメントを免疫原として用いて産生されたモノクローナル抗体も提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのフラグメントを含む大腸菌融合タンパク質も免疫原として使用され得る。このような融合タンパク質は、カルシウムチャンネルサブユニットペプチドに融合した大腸菌TrpEタンパク質のような細菌性タンパク質またはその一部分を含み得る。カルシウムチャンネルサブユニットまたは精製カルシウムチャンネルを免疫原として用いて産生された免疫グロブリンは、他の特性のうちでも特に、生物サンプル中またはかかる生物サンプルに由来の溶液中に存在し得るヒトカルシウムチャンネルまたはそのサブユニットに特異的及び優先的に結合するか及び／またはその免疫沈降を惹起する能力を有している。このような抗体はまた、抗体の特異性の対象であるサブユニットを含有するカルシウムチャンネルを発現する細胞を選択的に単離するために使用され得る。
また、カルシウムチャンネルを有効量の上記抗体と接触させることによってイオンチャンネルの活性を変調させる方法が提供される。
また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットに対するまたは組換えヒトカルシウムチャンネルもしくはそのサブユニットを発現する真核細胞に対するLES免疫グロブリンＧ（IgG）の免疫反応性に基づいてヒトのランベール・イートン症候群（Lambert Eaton Syndrome,LES）の存在を判定する診断方法が提供される。特に、個人の血清またはそのIgG画分（被検血清）とα及びβサブユニットのようなカルシウムチャンネルタンパク質とを結合させ、被検血清中の抗体が、罹患していないことが既知の個人または個人群から得られた対照血清中の抗体に比べて、１種以上のサブユニットまたは１種以上のサブユニットを発現する組換え細胞とより高度に反応することを確認することによって個人のランベール・イートン症候群を診断するイムノアッセイ方法が提供される。この方法には、血清中の所与の抗原に対する抗体を検出するために当業界で公知の任意のイムノアッセイ手順を使用し得る。
発明の詳細な説明
定義：
他に定義されない限り、本文中で使用したすべての技術用語及び科学用語は、本発明が所属する分野の当業者によって理解される慣用の意味と同義である。本文中で引用したすべての特許及び刊行物は参照によって本発明に含まれるものとする。
言及されたカルシウムチャンネルサブユニットの各々は、本文中で詳細に開示されるサブユニット、及び、開示されたDNAをプローブとして用い少なくとも低緊縮性下に適当なヒトcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得るDNAによってコードされたヒトカルシウムチャンネルサブユニットを包含する。かかるDNAはまた、本文中に記載されたサブユニットタンパク質のいずれかに約40％の相同性を有するタンパク質をコードするDNA、または、少なくとも低緊縮性条件下に本発明で提供されるDNAにハイブリダイズするDNAを包含し、かかるDNAによってコードされているタンパク質は機能または分子量のような追加の識別特性値を示す。
開示されたサブユニットまたは他のこのようなサブユニットのスプライス変異体を示す転写物によってコードされるサブユニットは、任意の１つのサブユニットに対しては合計40％未満の相同性を示すであろうが、１つ以上のサブユニットとの間でこのような相同領域を含むであろうことは理解されよう。また、40％の相同性とは、約40％またはそれよりもやや少ない程度のアミノ酸を共有し且つ保存的なアミノ酸置換を含み、タンパク質の活性が実質的に変化していないタンパク質を意味する。
本文中では、種々の遺伝子によってコードされるα１サブユニットのタイプは、タイプα1A、α1B、α1C、α1D及びα1Eとして示されている。これらのタイプについて、α1BはVDCC IV、α1CはVDCC II、α1DはVDCC IIIとも呼ばれている。スプライス変異体であるサブユニットのサプタイプは例えば、α1B-1、α1B-2、α1C-1などと呼ばれる。
従って、本文中で使用された「α１サブユニットをコードするDNA」とは、少なくとも低緊縮性の条件下で本発明によって提供されるDNAにハイブリダイズするDNAを意味するか、または、ヒトカルシウムのα１サブユニットをコードする本文中に開示されたDNAによってコードされるタンパク質に少なくとも約40％の相同性を有するサブユニットをコードするDNAを意味する。α１サブユニットはカルシウムチャンネルを形成する能力によって同定され得る。典型的には、α１サブユニットは、少なくとも約120kDよりも大きい分子量を有している。また、推定されたα１サブユニットアミノ酸配列のハイドロパシープロットは、α１サブユニットが、６個の推定されたトランスメンブランドメインを各々が含む４個の内部リピートを含むことを示す。
カルシウムチャンネルの活性は、電気生理学的方法及び本文中に記載の他の方法のような当業者に公知の方法によってin vitroで評価され得る。典型的には、α１サブユニットは、1,4−DHPまたはω−CgTxのような１つ以上のカルシウムチャンネル活性モジュレーターと直接または間接に相互作用する領域を含む。α１サブユニットの種々のタイプは、結合特異性に基づく方法のような当業者に公知の任意の方法によって識別され得る。例えば、本文中では、α1Bサブユニットは従来Ｎ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与し、α1Dサブユニットは従来Ｌ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与することが知見され、α1Aサブユニットは従来Ｐ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの典型的な特徴を示すチャンネルの形成に関与すると考えられる。従って例えば、α1Bサブユニットを含むチャンネルの活性は1,4−DHPに感受性でないが、α1Dサブユニットを含むチャンネルの活性は1,4−DHPによって変調されるかまたは変化する。現在では、薬理学的特徴及び電流カイネティクスに基づいてカルシウムチャンネルを命名し、過去の呼称を避けるのが好ましい。α１サブユニットのタイプ及びサブタイプは、サブユニットまたはサブユニットを含むチャンネルに対するこのようなモジュレーターの効果並びにサブユニットを含むカルシウムチャンネルによって生じる電流及び電流カイネティクスの差異に基づいて特性決定し得る。
本文中で使用された「α２サブユニット」は、低緊縮性条件下で本発明で提供されるDNAにハイブリダイズするかまたは本発明で開示されたタンパク質に少なくとも約40％の相同性を有するタンパク質をコードするDNAによってコードされている。このようなDNAは、典型的には約120kDよりも大きい分子量を有するがα１サブユニットの非存在下にカルシウムチャンネルを形成しないタンパク質をコードしており、α１サブユニットを含むカルシウムチャンネルの活性を変化させ得る。スプライス変異体として生じるα２サブユニットのサブタイプは、α2a、...α2eのような下付き文字で示される。更に、α２サブユニット及びタンパク質を還元条件下で処理したときに産生される大フラグメントは、少なくともＮ−結合した糖によってグリコシル化されると考えられ、α１サブユニットに特異的に結合する1,4−DHP及びフェニルアルキルアミンに特異的に結合しない。より小さいフラグメント、Ｃ−末端フラグメントは、δサブユニットと呼ばれており、約946（配列番号11）からほぼＣ−末端までのアミノ酸を含む。このフラグメントは、α２サブユニットを還元性条件に暴露したときにα２の残りの部分から解離し得る。
本文中で使用された「βサブユニット」は、低緊縮性条件下で本発明で提供されるDNAにハイブリダイズするかまたは本発明で開示されたタンパク質に少なくとも約40％の相同性を有するタンパク質をコードするDNAによってコードされており、これは、典型的にはαサブユニットよりも小さい約50〜80kDのオーダーの分子量を有しており、α１サブユニットの非存在下に検出可能なカルシウムチャンネルを形成しないが、α１サブユニットまたはα１及びα２サブユニットを含むカルシウムチャンネルの活性を変化させ得るタンパク質である。
種々の遺伝子によってコードされているβサブユニットの種々のタイプはβ１、β２、β３及びβ４のような下付き文字で示される。特定タイプのスプライス変異体として生じるβサブユニットのサブタイプは、タイプ及び変異体に関する下付き数字で示される。β１スプライス変異体に関するこのようなサブタイプの例としてはこれに限定されないが、β1-1−β1-5があり、β２変異体に関するこのようなサブタイプの例としてはこれに限定されないが、β2c−β2Eがある。
本文中で使用された「γサブユニット」は、γサブユニットをコードするDNAとして本文中で開示されたDNAによってコードされるサブユニットであり、本文中でプローブとして開示されたDNAを使用し、ハイブリダイゼーションまたは当業者に公知の他の同様の方法によって単離及び同定され得る。従って、γサブユニットをコードしている全長クローンを単離または構築し得る。γサブユニットは低緊縮性条件下で本発明で提供されたDNAにハイブリダイズするかまたは本文中に記載されたγサブユニットに少なくとも約40％の相同性を有するタンパク質をコードすべく十分な配列相同性を示すDNAによってコードされるであろう。
従って、当業者は、本発明の開示に基づいて、スプライス変異体を示す種々の遺伝子及びサブタイプによってコードされているタイプを含むカルシウムチャンネルのα１、α２、β、δ及びγサブユニットをコードするDNAを同定し得る。例えば、本発明で開示されたDNAに基づくDNAプローブは、プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいてゲノムまたはcDNAのライブラリーのような適当なライブラリーをスクリーニングし、全タンパク質をコードする読み取りフラグメントを含む１つ以上のクローン中のDNAを取得するために使用され得る。本発明に開示されたDNAで適当なライブラリーをスクリーニングした後で、単離DNAについて、コードされたタンパク質の配列を与えたと推定される読み取り枠の存在を試験する。分子量の決定及び本発明の配列との比較によってサブユニットをα１、α２などのサブユニットとして同定し得る。必要な場合には、機能性アッセイを使用してサブユニットがα１、α２サブユニットであるかβサブユニットであるかを判断してもよい。
例えば、α1AサブユニットをコードするDNAは、ヒトα1Aサブユニットの全部または一部をコードするDNAによって適当なライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。このようなDNAとしては、ATCC受託番号75293で寄託されたファージ中のα１サブユニットの一部分をコードしているDNAがある。α1AサブユニットをコードするDNAは、配列番号21、22及び／または23に示す配列の全部もしくは一部分を有するオリゴヌクレオチドまたは寄託ファージ中のDNAによって適当なライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。または、このようなDNAが、配列番号22または23によってコードされているα1Aサブユニットをコードする配列を有していてもよい。
同様に、β３をコードするDNAは、ATCC受託番号69048で寄託されたプラスミドβ1.42から調製されたDNAプローブによってヒトcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離されることができ、または、配列番号19及び／または20に示された配列に従って調製された配列を有するプローブを用いて適当なライブラリーから得ることができる。更に、β４をコードするDNAは、β４サブユニットをコードするクローンのDNA配列を示す配列番号27に示すDNAに従って調製されたDNAプローブによってヒトcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。そのアミノ酸配列を配列番号28に示す。DNAの単離及び同定並びに全長ゲノムまたはcDNAクローンの調製のためには本文中に例示した方法を含む当業者に公知の任意の方法を使用し得る。
DNAコーディング
単離したDNAによってコードされるサブユニットは、本発明で提供されるサブユニットのDNA及びアミノ酸の配列比較によって同定され得る。スプライス変異体は広い相同領域を共有しているが、非相同領域も含み、種々の遺伝子によってコードされたサブユニットが非相同配列の均一分布を共有している。
本文中で使用された「スプライス変異体」とは、２タイプ以上のmRNAを与えるゲノムDNAの一次転写物の異なるプロセシングによって産生される変異体を意味する。スプライス変異体は、１つの組織内部または複数の組織で発生し得る（組織特異的変異体）。従って、等しいアミノ酸の領域及び異なるアミノ酸配列の領域を有するカルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプをコードするcDNAクローンを本文中で「スプライス変異体」と呼ぶ。
本文中で使用された「カルシウムチャンネル選択イオン」とは、細胞膜を貫通するカルシウムチャンネルに対して、Ca2+の流れが許容または阻害されるときと実質的に同様の条件下でその流れが許容または阻害されるイオンを意味する。Ba2+はカルシウムチャンネル選択イオンの一例である。
本文中で使用された「カルシウムチャンネル活性を変調する化合物」とは、カルシウムチャンネル選択イオンを通過させるカルシウムチャンネルの能力に影響を与えるか、または、電流カイネティクスような他の検出可能なカルシウムチャンネルの特徴に影響を与える化合物を意味する。このような化合物としては、カルシウムチャンネルアンタゴニスト及びアゴニスト並びにカルシウムチャンネルの活性に直接及び間接に影響を与える化合物がある。
本文中で使用された「実質的に純粋な」サブユニットまたはタンパク質とは、SDS−PAGEで均質に出現するようにまたは明確に配列決定されるように他の夾雑ポリペプチドが十分に除かれたサブユニットまたはタンパク質を意味する。
本文中で使用された「選択的にハイブリダイズする」とは、DNAフラグメントが、複数のフラグメントから第２のフラグメントを同定または単離し得るように、第２のフラグメントに対して十分な特異性でハイブリダイズすることを意味する。一般に、選択的ハイブリダイゼーションは高緊縮性条件下で生じる。
本文中では、異種または外来DNA及びRNAなる用語は互換的に使用されており、それらを存在させるゲノムの一部として天然に存在するものでないDNAもしくはRNAまたは天然に存在する場所とは異なるゲノム内の１つまたは複数の場所に見出されるDNAもしくはRNAを意味する。これは、細胞に内因性でなく、細胞内に人為的に導入されたDNAまたはRNAである。異種DNAの例としては以下に限定されないが、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNA、転写、翻訳または他の調節可能な生化学プロセスに影響を与えることによって内因性DNAの発現を媒介または変化させるRNAまたはタンパク質をコードするDNAがある。カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAのような異種DNAを発現する細胞は、同じまたは異なるカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを含み得る。異種DNAは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノムに取り込まれるかまたはエピソーム的に維持されるように導入されてもよい。
本文中で使用された「プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳の終止部位並びに他のシグナル配列のような調節ヌクレオチド配列及びエフェクターヌクレオチド配列に対する異種DNAの機能し得る結合」とは、このようなDNAとこのようなヌクレオチド配列との間の機能的関係を意味する。例えば、プロモーターに対する異種DNAの機能し得る結合とは、DNAを特異的に認識し結合し読み取り枠に転写するRNAポリメラーゼによってこのようなDNAの転写がプロモーターから開始されるようなDNAとプロモーターとの物理的及び機能的関係を意味する。
本文中で使用された「実質的に純粋な単離DNA」とは、当業者によって使用される標準技術に従って精製されたDNAフラグメントを意味する〔例えばManiatisら（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY参照〕。
本文中で使用された「発現」とは、核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。核酸がゲノムDNAに由来する場合、適正な真核宿主細胞または生物が選択されるならば発現はmRNAのスプライシングを含み得る。
本文中で使用された「ベクターまたはプラスミド」とは、異種DNAを発現させるかまたはクローン化異種DNAを複製させるために細胞内に異種DNAを導入するために使用される個別要素（discrete elements）を意味する。このようなベクター及びプラスミドの選択及び使用は当業者の標準的な知識の範囲内である。
本文中で使用された「発現ベクター」とは、このようなDNAフラグメントの発現を惹起し得るプロモーター領域のような調節範囲と機能し得るように結合しているDNAフラグメントを発現し得るベクターを包含する。従って、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入された時クローンDNAを発現するプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような、組換えDNAまたはRNA構築物を意味する。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／または原核細胞中で複製可能なベクター、並びにエピソームとして維持されるかもしくは宿主細胞ゲノムに取り込まれ得るベクターがある。
本文中で使用された「プロモーター領域」とは、機能し得るように結合したDNAの転写を調節する遺伝子のDNA部分を意味する。プロモーター領域は、RNAポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分なDNAの特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと呼ぶ。更に、プロモーター領域は、RNAポリメラーゼの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作用因子でもよくまたはトランス作用因子に反応性でもよい。調節の性質次第でプロモーターは構成的または調節的である。
本文中で使用された「組換え真核細胞」とは異種DNAまたはRNAを含む真核細胞を意味する。
本文中で使用された「組換えまたは異種カルシウムチャンネル」とは、組換えカルシウムチャンネルを発現する真核細胞に導入され該真核細胞中で発現する異種DNAによってコードされた１つ以上のサブユニットを含むカルシウムチャンネルを意味する。組換えカルシウムチャンネルはまた、細胞に内在するDNAによって産生されるサブユニットも包含する。いくつかの実施態様において、組換えまたは異種カルシウムチャンネルは、異種DNAによってコードされたサブユニットだけを含んでいてもよい。
組換えまたは異種カルシウムチャンネルに関して本文中で使用された「機能性」なる用語は、チャンネルが、Ca2+またはBa2+に限らないがCa2+またはBa2+などのカルシウムチャンネル選択イオンを刺激に反応して流入させるかまたは流入を調節するか及び／またはチャンネル親和性リガンドを結合させる能力を有することを意味する。好ましいことにはこのようなカルシウムチャンネル活性は、電気生理学的、薬理学的及び当業者に公知の他の手段によって宿主細胞中の内因性カルシウムチャンネル活性から識別可能である。
本文中で使用された「実質的に特定の配列番号で示されたアミノ酸配列を有するペプチド」とは、同じ機能を有するが僅かな配列変異、例えばペプチドの活性を変化させない保存性アミノ酸変異または小さい欠失もしくは挿入を含み得るペプチドを意味する。カルシウムチャンネルレセプターサブユニットペプチドの活性とは、他のこのようなサブユニットと共に機能性カルシウムチャンネルを形成する能力を意味する。
本文中で使用された「化合物の生理的濃度」とは、生物プロセスを惹起するために必要且つ十分な濃度を意味する。例えば、カルシウムチャンネル選択イオンの生理的濃度は、チャンネルが開いたときに内向きの電流を与えるために必要且つ十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度である。
本文中で使用された「カルシウムチャンネルの活性」とは、カルシウムチャンネルを通るカルシウムチャンネル選択イオンの移動を意味する。このような活性は当業者に公知の任意の方法によって測定されることができ、例としては、刺激に反応して組換えチャンネルを流れる電流の量を測定する方法があるがこれに限定されない。
本文中で使用された「機能性アッセイ」なる用語は、機能性カルシウムチャンネルを同定するアッセイを意味する。従って、機能性アッセイは機能を評価するアッセイである。
当業者に理解されるであろうが、カルシウムチャンネル活性を変調するアンタゴニスト及びアゴニストのような化合物を同定するアッセイ方法では一般に、対照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つのタイプは、対照培養物を被検化合物に接触させない以外は被検化合物に接触した細胞または培養物と実質的に同様に処理した細胞または培養物である。別のタイプの「対照」細胞または「対照」培養物は、対照培養物に使用した細胞が機能性カルシウムチャンネルを発現しない以外はトランスフェクト細胞に等しい細胞または細胞培養物から成る。この場合には、アッセイの目的となる化合物の存在下で各タイプの細胞または細胞培養物を実質的に同じ反応条件に維持し、このときの被検化合物に対する被検細胞の反応と、被検化合物に対するカルシウムチャンネル陰性細胞の反応（または反応の欠如）とを比較する。例えば、パッチ固定（patch clamp）電気生理学的手順を用いる方法では、細胞を浸漬させる外部溶液を当業界で公知のように交換することによって被検化合物の存在下及び非存在下で同じ細胞を試験し得る。
また、本文中に開示されたサブユニットの各々は保存性アミノ酸置換を行うことによって修飾され、得られた修飾サブユニットも本発明の目的であることが理解されよう。適当な保存性アミノ酸置換は当業界で公知であり、通常は得られる分子の生物学的活性を変化させることなく行われるであろう。ポリペプチドの非必須領域の単一アミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことは当業者の一般認識である（例えば、Watsonら,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Bejacmin/Cummings Pub.cp.,p.224参照）。このような置換は好ましくは以下の表１に示す置換に従って行われるが、これらに限定はされない。
0003628693.tif 000002
他の置換も可能であり、実験的にまたは既知の保存性置換に従って決定され得る。ポリペプチドのこのような修飾はいずれも、当業者に公知の任意の手段によって得られる。突然変異は、当業者に公知の任意の方法、例えばタンパク質をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発即ち特定部位の突然変異誘発及びDNA鋳型に変異を導入し増幅するためのプライマーを用いるDNA増幅方法の使用などを包含する。
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ヒトカルシウムチャンネルのα１、α２、β及びγサブユニットをコードするDNAの同定及び単離方法が提供される。
かかるDNAの同定及び単離は、所望のサブユニットをコードするDNAが単離される少なくとも低緊縮性の適当な条件下で、制限酵素消化したヒトDNAと、本文中に配列識別番号で示したヌクレオチド配列を有するDNAの任意の連続部分に由来する少なくとも14、好ましくは16またはそれ以上のヌクレオチドを有する標識プローブとをハイブリダイズさせることによって行う。ハイブリダイゼーション反応でハイブリダイズするフラグメントを同定し、当業者に公知の標準クローニング技術を用いてクローニングし得る。完全読み取り枠の存在によって全長クローンを同定し、コードされたタンパク質の同一性を、本発明で提供されたサブユニットとの配列比較及びカルシウムチャンネル形成能力または他の機能を評価する機能性アッセイによって確認する。この方法は、サブユニットをコードするゲノムDNAを同定するため、またはゲノムサブユニットDNAの一次転写物の選択的スプライシングによって生じたヒトカルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体をコードするcDNAを同定するために使用され得る。例えば、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNA、cDNAまたはゲノムDNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションによって同定され、制限マッピング、DNA配列決定のような当業者に公知の方法によって特異決定され、DNAの配列中の異質性（heterogeneity）または異形性（divergence）を識別するために本発明で提供されたDNAと比較される。このような配列の差異は、cDNAの産生の出発材料となる転写物が、非相同領域及び相同領域がクラスターである場合には一次転写物の選択的スプライシングに由来し、非相同領域がクローン化したDNA全体に分布している場合には別の遺伝子に由来することを示す。
本発明で提供されたDNAを用いて遺伝子を単離するために、適当な任意の方法を使用し得る。例えば、配列差異の領域に対応するオリゴヌクレオチドは、全長スプライス変異体をコードするDNAをハイブリダイゼーションによって単離するために使用されているが、ゲノムクローンを単離するために使用することができる。組織特異的エキソンのようなヒトカルシウムチャンネルの１つのサブユニットの少なくとも一部分をコードする、本発明で開示されたヌクレオチド配列に基づくプローブは、近縁DNAをクローニングするため、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする全長cDNAまたはゲノムクローンをクローニングするために、プローブとして使用され得る。
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも一部分をコードする核酸の少なくとも14の実質的に連続の塩基、好ましくは16以上、通常は少なくとも30の連続塩基から成る標識されたRNAまたは一本鎖DNAが提供される。標識の例としては放射性標識または酵素標識などがあるがそれに限定されない。該核酸の配列は本明細書で配列番号を付けて示した核酸配列のセグメントに対応する。このような核酸セグメントは、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAをクローニングするために本発明で提供される方法においてプローブとして使用され得る。一般的には、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。
更に、当業者で公知の核酸増幅技術を用い、異なる配列プライマーを包囲するDNA配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用してヒトRNAまたはゲノムDNAを増幅することによって、カルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体の所在を検出し得る。増幅産物の大きさ及び配列の決定によってスプライス変異体を確認し得る。更に、ハイブリダイゼーションによるヒトゲノムDNA配列の単離は、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むDNAを与える。
電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルのα１、α２、β及びγサブユニットの各々のタイプ及びサブタイプをコードするDNAは、本発明では、選択された組織に由来のcDNAの核酸増幅によって、または、かかるカルシウムチャンネルを有するヒト由来の細胞系または組織の単離ポリA+mRNAから調製されたヒトcDNAライブラリーのスクリーニングによって、クローニングされ得る。mRNAを得るためのかかる細胞または組織のソースとしては、ヒト脳組織、または、神経芽腫細胞系のようなヒト神経起原の細胞系、ヒト骨格筋もしくは平滑筋細胞などがある。cDNAライブラリーの調製方法は当業界で公知である〔全般的にはAusubelら（1987）Current Protocols in Molecular Biology,Wiley−Interscience,New York;Davisら（1986）Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing Co.,New York参照〕。
プローブ構築の出発点となる好ましい領域としては、5'及び／または3'コーディング配列、トランスメンブランドメインをコードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位、及び、他の機能的に有意な配列（後出の表参照）などがある。全長サブユニットをコードするDNAまたはそのフラグメントを、好ましくは検出を容易にする適当なラベル手段によって標識してプローブとして使用し得る。フラグメントをプローブとして使用するとき、DNA配列が典型的にはカルボキシル末端をコードするDNA部分に由来するのが好ましく、推定アミノ酸配列のハイドロパシー分析に基づいて予測されたトランスメンブランドメインをコードする部分を含むのが極めて好ましい〔例えば、Kyte ＆ Doolittle（1982）J.Mol.Biol.167:105参照〕。
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的なリボプローブを調製した。これらのプローブは選択された組織及び細胞中の特定サブユニットの発現を同定するために有用である。プローブ調製の出発点となった領域を、すべての既知のαまたはβサブユニットのサブタイプのDNA及びアミノ酸の配列と比較することによって同定した。相同の最も少ない領域、好ましくはヒト由来の配列、一般的にほぼ約250〜約600ヌクレオチドを選択した。α及びβサブユニットの多数のリボプローブを調製した。これらのいくつかを以下の表にまとめる。
0003628693.tif 000003
pGEMシリーズはPromega,Madison WIより入手できる。米国特許第4,766,072号参照。
上記ヌクレオチド領域はまた、後述するように、サブユニット特異的抗体調製用タンパク質の領域を選択するためにも有用である。
従って、本発明で提供されるDNAクローン及びそのフラグメントは、各サブユニットをコードするゲノムクローンを単離するため、及び、種々のヒト組織から調製されたライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによってスプライス変異体を単離するために使用され得る。当業界で公知の核酸増幅技術はまた、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体をコードするDNAを検出するために使用され得る。これは、（１つまたは複数の）異なる配列を包囲するDNA配列に基づくオリゴヌクレオチドをヒトRNAまたはゲノムDNAを増幅するためのプライマーとして使用することによって達成される。増幅産物の大きさ及び配列の決定によって、スプライス変異体の存在が確認され得る。更に、ハイブリダイゼーションによってヒトゲノムDNAを単離すると、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むDNAが得られる。
カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを単離した後、特定のカルシウムチャンネルサブユニットまたは変異体をコードするmRNAをどの組織が発現したかを決定するためにリボヌクレアーゼ（RNアーゼ）保護アッセイを使用し得る。これらのアッセイは、全細胞性RNAの複合混合物中でRNA種を検出及び定量するための高感度の手段を提供する。サブユニットDNAを標識し、細胞性RNAとハイブリダイズさせる。細胞性RNA中に相補性mRNAが存在するときは、DNA−RNAハイブリッドが生じる。次に、RNAサンプルをRNアーゼで処理すると、一本鎖RNAが分解される。RNA−DNAハイブリッドはRNアーゼ分解から保護されており、ゲル電気泳動及びオートジオグラフィーによって可視化され得る。また、特定のカルシウムチャンネルサブユニットをコードするmRNAをどの組織が発現したかを決定するために、in situハイブリダイゼーション技術も使用され得る。サブユニットmRNA発現を可視化するために標識サブユニットDNAを種々の組織切片にハイブリダイズさせる。
ヒトカルシウムチャンネルのサブユニット（α１、α２、βまたはγ）の各々に関して、チャンネルサブユニットをコードするDNAを核酸スクリーニング方法によって同定し、単離されたクローンを使用して、オーバーラップするクローンを同定するために更にスクリーニングした。クローニングされたDNAフラグメントのいくつかは、pIBI24/25（IBI,New Haven,CT）、M13 mp18/19、pGEM4、pGEM3、pGEM7Z、pSP72及び当業界で公知の他のこのようなベクターにサブクローニングでき、DNA配列決定及び制限酵素マッピングによって特性決定した。従って逐次シリーズのオーバーラップクローンを、各サブユニットに関する全長クローンが調製されるまで、翻訳開始（start）コドン及び翻訳終止（stop）コドンの同定を含む当業界で公知の方法で作製し得る。クローン化したDNAを発現させるために、このようなクローンの5'非コーディング領域並びに他の転写及び翻訳調節領域を、有効なリポソーム結合部位及び当業界で公知の他の調製領域によって置換し得る。翻訳及び／または転写効率を最適にするために必要な当業界で公知の他の5'端修飾を必要に応じて行ってもよい。
後出の実施例II〜VIIIは、ヒトカルシウムチャンネルの種々のサブユニット、サブタイプ及び組織特異的変異体のようなスプライス変異体の各々のクローニングを詳細に記載している。サブユニットの部分配列が開示された少数の例においては、本文中の教示に基づいて、対応する全長クローン及びそのサブユニット、サブタイプまたはそのスプライス変異体をコードする配列を得ることは、上記に記載し後記に例示する方法を用いて当業界が容易に成し得ることである。
α１サブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ヒトCNS及び他の組織中で発現される多数の電圧依存性カルシウムチャンネルα１サブユニット遺伝子を同定し、α1A、α1B（またはVDCC IV）、α1C（またはVDCC II）、α1D（またはVDCC III）及びα1Eと命名した。サブユニットの各タイプをコードするヒト神経cDNAライブラリーから単離されたDNAを単離した。スプライス変異体として生じるタイプの各々のサブタイプをコードするDNAも提供される。本文中ではサブタイプを例えばα1B-1、α1B-2などとして示す。
電圧依存性カルシウムチャンネルのα１サブユニットのタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、並びに、そのサブタイプは、DHP、フェニルアルキルアミン、オメガコノトキシン（ω−CgTx）、クモ毒（funnel web spider toxin）ω−Aga−IV及びピラゾノイルグアニジンのような既知のカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのクラスに対して異なる感受性を示す。これらのサブユニットタイプはまた、静止電位が違っており、且つ、α１サブユニットの種々のタイプを包含するカルシウムチャンネルを含む細胞膜の脱分極のときに発生する電流のカイネティクスも違っていると考えられる。
ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ω−CgTx、クモ毒成分、ピラゾノイルグアニジンなどから選択された少なくとも１つの化合物に結合するα１サブユニットをコードするDNAが提供される。例えば、本発明で提供されるα1Bサブユニットは、Ｎ−型チャンネル内でω−CgTxと特異的に相互作用すると考えられ、本発明で提供されるα1DサブユニットはＬ−型チャンネル内でDHPと特異的に相互作用する。
ヒトカルシウムチャンネルα1DサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットcDNAのフラグメントをヒト神経芽腫細胞系IMR32のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用い、α1DサブユニットcDNAを単離し、クローンα1.36を作製した。このクローンをプローブとして用いて追加のIMR32細胞cNDAライブラリーをスクリーニングして、オーバーラップするクローンを作製し、このクローンを用いてスクリーニングして次のクローンを作製するという手順を、ヒトα1Dサブユニットをコードするヌクレオチド配列の全長に及ぶ十分なシリーズのクローンが得られるまで継続した。実施例IIに記載のように部分的α1Dクローンの断片を結合することによってα1Dをコードする全長クローンを構築した。配列番号１はα1DサブユニットをコードするcDNAの7,635ヌクレオチドの配列を示す。2,161アミノ酸の配列をコードする6,483ヌクレオチドの配列の読み取り枠が存在する（配列番号１に示す）。
配列番号２はα1DサブユニットのIS6トランスメンブランドメインをコードする選択的エキソンの配列を与える〔トランスメンブランドメインなる用語の記載に関してはTanabe,T.ら（1987）Nature 328:313−318参照〕。
配列番号１はまた、ヒト神経細胞カルシウムチャンネルα1Dサブユニットから推定された2,161アミノ酸の配列を示す。アミノ酸配列に基づいて、α1Dタンパク質は計算分子量245,163を有している。カルシウムチャンネルのα1Dサブユニットは推定された４つの内部反復配列領域を含む。４つの内部反復領域は、24の推定トランスメンブランセグメントを示し、アミノ−及びカルボキシル−末端が細胞内に伸びている。
α1Dサブユニットが、DHP−感受性の、高電圧活性化される、長期持続カルシウムチャンネル活性を媒介することが判明した。このカルシウムチャンネル活性は、α1D及びβ1-2サブユニットをコードするRNA転写物、またはα1D、α2b及びβ1-2サブユニットをコードするRNA転写物を同時注入した卵母細胞で検出された。この活性は、β1-2±α2bサブユニットをコードするRNA転写物を卵母細胞に注入したときに検出されるBa2+電流とは違っていた。これらの電流は、非注入卵母細胞で報告されたCa2+電流に薬理学的及び生物物理学的に類似していた。
ヒトカルシウムチャンネルα1AサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
α1Aサブユニットの一部分をコードするDNAを含有する生物材料は、特許手続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びこの条約に基づいて発布された条例の規約に従って、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockvile,Maryland 20852 U.S.A.に寄託されている。寄託材料のサンプルは現在及び今後、上記の条約及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合衆国の特許法及び条例あるいは本願もしくは本願を優先権主張する出願が出願されたかまたはかかる出願に対して許諾されるいかなる特許も許諾される他のすべての国家または国際機関の特許法及び条例に基づいて、特許事務所及び他の法的有資格者に入手可能であろう。
α1Aサブユニットの一部分は、宿主大腸菌NM514株中のα1.254と命名されたλgt10ファージ中の約3kbのインサートによってコードされている。この材料のファージ溶菌液は、上記のようにAmerican Type Culture CollectionにATCC受託番号75293で寄託されている。α1AをコードするDNAはまた、配列番号21:
5'CTCAGTACCATCTCTGATACCAGCCCCA3'
を有するDNAから調製されたプローブでスクリーニングすることによって同定され得る。
α1Aスプライス変異体も作製した。２つのα1Aスプライス変異体、α1a-1及びα1a-2の配列を配列番号22及び23に示す。上記のごときヒトライブラリーのスクリーニングまたは配列番号22及び23に示した配列の全部または一部分を用いることによって他のスクリーニング変異体を得ることができる。
ヒトカルシウムチャンネルα1BサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするcDNAのフラグメントでヒト脳幹神経節cDNAライブラリーをスクリーニングすることによってα1BサブユニットをコードするDNAを単離した。１つの陽性クローンの一部分を使用してIMR32細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。脳幹神経節DNAプローブにハイブリダイズしたクローンを使用してIMR32細胞cDNAライブラリーを更にスクリーニングして、オーバーラップするクローンを同定し、このクローンを使用してヒト海馬cDNAライブラリーをスクリーニングした。このようにして、ヒトα1Bサブユニットをコードするヌクレオチド配列のほぼ全長に及ぶ十分なシリーズのクローンを作製した。IMR32細胞のα1BmRNAの特定領域の核酸増幅によって、α1Bをコードする配列の追加のセグメントが得られた。
実施例II.Cに記載の部分的cDNAクローンの断片を結合することによって全長α1B DNAクローンを構築した。配列番号７及び８は、α1BサブユニットをコードするDNAクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。配列番号７によってコードされたα1Bサブユニットをα1B-1サブユニットと呼ぶが、これは、α1Bサブユニット転写物の選択的スプライシングによって得られた配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされた別のα1Bサブユニット即ちα1B-2と区別するためである。
α1B-1をコードするDNA内部のヌクレオチド配列に従って設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたIMR32細胞mRNAの核酸増幅によって、異なるコーディング配列を含むのでスプライス変異体であると考えられるα1B転写物の変異体を同定した。
ヒトカルシウムチャンネルのα1CサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
多数のα1C特異的DNAクローンを単離した。配列のキャラクタリぜーションによって、α1Cコーディング配列、α1C翻訳開始配列及びα1Cの選択的スプライス領域が判明した。α1Cサブユニットの選択的スプライス変異体が同定された。配列番号３はα1Cサブユニットの実質的な部分をコードするDNAを示す。配列番号４及び配列番号５に示すDNA配列は、α1Cタンパク質の可能な２つのアミノ末端をコードする。配列番号６はIV S3トランスメンブランドメインの選択的エキソンをコードする。α1C-1及びα1C-2と命名された２つのα1Cスプライス変異体の実質的な部分の配列を夫々、配列番号３及び36に示す。
α1Cサブユニットの部分をコードするDNAクローンの単離及び同定を実施例IIに詳細に記載する。
ヒトカルシウムチャンネルのα1EサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
オリゴdT−プライムしたヒト海馬ライブラリーからヒトカルシウムチャンネルα1EサブユニットをコードするDNAを単離した。得られたクローンはスプライス変異体であり、これをα1E-1及びα1E-3と命名した。α1E-1と命名されたサブユニットは、配列番号24に示すアミノ酸配列を有し、α1E-3と命名されたサブユニットは、配列番号25に示すアミノ酸配列を有している。双方のスプライス変異体の違いは、配列番号24のヌクレオチド2405と2406との間の57塩基対のインサートに基づく。
本文中で示したα1Eサブユニットは、高電圧活性化カルシウムチャンネル及び低電圧活性化チャンネルの特性を有するカルシウムチャンネルの形成に関与すると考えられる。これらのチャンネルは他の高電圧活性化カルシウムチャンネルに比較して迅速に不活性化される。更にこれらのチャンネルは、電圧活性化チャンネルに類似しているが、ある種の高電圧活性化チャンネルを遮断するDHP及びω−Aga−IVAに感受性である薬理学的プロフィルを示す。α1Eサブユニットを含むチャンネルの電気生理学及び薬理学に関しては実施例VIIのＦに更に詳細に記載する。
追加のヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットのタイプ及びサブタイプをコードするDNAの同定及び単離
追加のα１サブタイプをコードするDNAをα1A、α1B、α1C、α1D及びα1Eサブユニットに関して本発明で提供されたDNAを用いるかまたは当業者に公知の他の方法を用いて単離及び同定し得る。特に、近縁DNAを単離するための適当なライブラリーをスクリーニングするために本発明で提供されるDNAを使用し得る。本文中に記載されたような方法を用いて全長クローンを構築でき、得られたサブユニットの配列並びに電気生理学的及び薬理学的特性を、本文中で例示したサブユニットのものと比較することによって特性決定した。
ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
β１をコードするDNA
β１サブユニットをコードするDNAを単離するために、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβサブユニットをコードするDNAフラグメントに対するハイブリダイゼーションによってヒト海馬cDNAライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンを選択し、これを使用して、完全ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードするDNAを包含するオーバーラップクローンが単離され配列決定されるまでオーバーラップクローンを単離した。
ヒトカルシウムチャンネルβ１サブユニットの５つの選択的スプライス形態を同定し、多数の形態をコードするDNAを単離した。これらの形態について、骨格筋で発現された形態をβ1-1と命名し、CNSで発現された形態をβ1-2と命名し、同じくCNSで発現された形態をβ1-3と命名し、大動脈及びHEK293細胞で発現された形態をβ1-4と命名し、HEK293細胞に発現された形態をβ1-5と命名した。β1-2及びβ1-3サブユニットをコードする全長DNAクローンを構築した。サブユニットβ1-1、β1-2、β1-4及びβ1-5をβサブユニットの選択的スプライス形態として核酸増幅分析によって同定した。β１スプライス変異体の配列を配列番号９、10及び33〜35に示す。
β２をコードするDNA
β２スプライス変異体をコードするDNAが得られた。これらのスプライス変異体はβ2C−β2Eを包含する。スプライス変異体β2C−β2Eは、スプライス変異体間で違っている5'末端（ヌクレオチド182まで）の部分を除いて配列番号26に示された配列全部を含む。配列番号26に示す配列はβ2Dをコードしている。追加のスプライス変異体は、本文に記載の方法と配列番号26に示すDNAの全部もしくは一部分を含むオリゴヌクレオチドとを用いて単離でき、または、実施例に記載のごとく調製もしくは取得できる。β２スプライス変異体β2C及びβ2Eを夫々配列番号37及び38に示す。
β３をコードするDNA
β３サブユニット及びその任意のスプライス変異体をコードするDNAは、配列番号19、20に従って調製されたDNAプローブを用いるかまたは寄託されたβ３クローンプラスミドβ1.42（ATCC受託番号69048）の全部もしくは一部分を用いてβ１サブユニットに関する上記の記載と同様にライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。
β３サブユニットをコードするDNAを含むプラスミドβ1.42を保有する大腸菌宿主は、特許手続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びこの条約に基づいて発布された条例の規約に従って、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockvile,Maryland 20852 U.S.A.にATCC受託番号69048で寄託した。寄託材料のサンプルは現在及び今後、上記の条約及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合衆国の特許法及び条例あるいは本願もしくは本願を優先権主張する出願が出願されたかまたはかかる出願に対して許諾されるかいかなる特許も許諾される他のすべての国家または国際機関の特許法及び条例に基づいて、特許事務所及び他の法的有資格者に入手可能であろう。
β３をコードするプラスミドをβ1.42と命名する。プラスミドはベクターpGem7zF（＋）に挿入されたβ３をコードする2.5kbのEcoR Iフラグメントを含有し、宿主大腸菌DH5α株中で寄託した。β3-1及びβ3-2と命名されたβ３スプライス変異体の配列を夫々配列番号19及び20に示す。
ヒトカルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ヒトゲノムDNAライブラリーをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするDNAのフラグメントで低及び高緊縮性条件下にプローブする以外は、α１サブユニットをコードするDNAを単離するために使用した方法と実質的に同様の方法で、ヒト神経細胞カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするDNAを単離した。フラグメントは、ウサギ背骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAを含むヌクレオチド43から272までのヌクレオチド配列に対応する配列を有するヌクレオチドを含んでいた。これはPCT国際特許出願公開No.WO89/09834に開示されており、これは米国出願07/620,520（現在は許諾米国出願07/914,231）に対応し、この米国出願は1988年４月４日出願の米国出願176,899の一部継続出願である。
実施例IVは、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするDNAクローンを単離するために、ゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションによって同定されたゲノムDNA及びcDNAクローンをプローブとして用いた方法を記載している。
配列番号11及び29〜32は、α２サブユニットをコードするDNAの配列を示す。実施例Ｖに記載したように、ヒト骨格筋、脳組織及び大動脈からのRNAを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットから分岐するヒト神経細胞α２サブユニットcDNAの領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅分析し、ヒトカルシウムチャンネルα２サブユニット転写体のスプライス変異体を同定した。
ヒトカルシウムチャンネルγサブユニットをコードするDNAの同定及び単離
ヒト神経細胞カルシウムチャンネルγサブユニットの一部分をコードするDNAを実施例VIに詳細に記載の手順で単離した。配列番号14は、43アミノ酸残基の配列をコードする読み取り枠を含むこのDNAの3'端のヌクレオチド配列を示す。得られた部分は、許諾された同一出願人の米国出願07/482,384に記載のウサギクローンに相同であるから、クローンの残りの部分は常用の方法によって得られる。
抗体
カルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプまたはカルシウムチャンネルのタイプに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、サブユニットタンパク質またはその部分を抗原として用いる当業者に公知の標準技術を用いて調製され得る。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体を使用し得る〔例えば、Bahouthら（1991）Trends Pharmacol.Sci.12:338−343;Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら,eds.）John Wiley and Sons,New York（1984）〕。免疫原として（合成ペプチドまたは組換え的に産生された細菌性融合タンパク質として）使用するためのカルシウムチャンネルサブユニットの部分を選択するときに考慮すべき要因としては、抗原性発揮の可能性（即ち、細胞外ドメイン及び細胞質ドメイン）、特定サブユニットに対する特異性（uniqueness）、及び当業者に公知の他の要因がある。
サブユニット特異的抗体を入手できることにより、多様なサブユニットの分布及び発現密度をモニターするために免疫組織化学の技術を適用することが可能である（例えば、正常脳組織対疾患脳組織）。このような抗体はまた、LES診断のような診断目的、または、カルシウムチャンネルの活性を変調する抗体を用いる治療目的で使用され得る。
抗体は、例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内もしくは皮下注射、移植または経皮投与方式、などの標準方法を用いて患者に投与され得る。当業者は、使用される投与方式に従って投与形態、治療計画などを実験的に決定し得る。
サブユニット特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を調製した。公知のすべてのα及びβサブユニットのサブタイプのDNA及びアミノ酸配列の比較によって抗原が由来した領域を同定した。最も相同性の小さい、好ましくはヒト由来の配列を選択した。選択領域または選択領域を保有する融合タンパク質を免疫原として使用する。また、選択したタンパク質領域及び融合タンパク質中の残基の疎水性分析を実施する。高疎水性の領域が回避される。また、より重要には、細菌宿主中で融合タンパク質を調製するときに微量コドンが回避される。特に、選択された宿主中の連続する３個以上の微量コドンの含有が回避される。αまたはβサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的な多数のモノクローナル及びポリクローナル抗体を調製した。これらのいくつかを以下の表に示す。代表的な抗体及び抗体の調製に使用したペプチド抗原を以下の表に示す。
0003628693.tif 000004
＊GST遺伝子融合系はPharmaciaから入手できる。Smithら（1988）Gene 67:31参照。系は、遺伝子または遺伝子フラグメントをSchistosoma japonicum GSTとの融合物として誘発可能な高レベル発現させるように設計されたpGEXプラスミドを与える。細菌宿主中で発現させ、得られた融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解液から精製する。
GST融合タンパク質の各々は、同様の融合物及び抗血清の調製が可能なα1C及びα1Dを含むすべてのサブタイプにおいてサブタイプ相同性の小さい領域である細胞質ループ領域II S6−II S1に特異的である。
異種カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを含有する組換え真核細胞の調製
１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニットまたは１つのカルシウムチャンネルサブユニットの一部分をコードするDNAを、DNAを発現または複製する宿主細胞に導入し得る。これらのDNAは、以下の実施例に記載の方法を用いるかまたは当業者に周知の他の手順で導入され得る。クローン化したDNAを適当な発現ベクターに組込み、プラスミドベクターまたは各々が１つ以上の異なる遺伝子をコードするプラスミドベクターの組合わせまたは直鎖状DNAを用いて真核細胞をトランスフェクションし、トランスフェクト細胞を選択する手順も当業界で周知である〔例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press〕。ヒトカルシウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードするクローン化した全長DNAをプラスミドベクターに組み込んで真核細胞中で発現させ得る。このようなDNAはゲノムDNAでもよくまたはcDNAでもよい。各々が少なくとも１つのカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つのプラスミドまたは組み合わせプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし得る。あるいは、当業界で周知の方法を用い、直鎖状DNAを宿主細胞にトランスフェクトし得る。
本発明で提供されるDNAは、P.pastorisのような酵母細胞を含む任意の真核細胞中で発現し得るが〔例えば、Creggら，（1987）Bio/Technology5:479参照〕、本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAの発現には哺乳類発現系が好ましい。
異種DNAをコードするベクターによるトランスフェクションのような当業界で周知の任意の方法によって異種DNAを導入し得る。哺乳類細胞のトランスフェクションに特に好ましいベクターは、SV40初期プロモーター、マウスdhfr遺伝子、SV40ポリアデニル化及びスプライス部位、ベクターを細菌中に維持するために必要な配列を含有するpSV2dhfr発現ベクター、または、pCDNA1もしくはpcDNA−ampのようなサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターベースのベクター、並びに、MMTVプロモーターベースのベクターである。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAをCMVプロモーターの直後の位置でベクターpCDNA1に挿入された。現在ではベクターpCDNA1が好ましい。
安定にまたは一過的にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシンに耐性の遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子を有する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって当業界に周知の方法で調製でき、一過的トランスフェクションの場合には、マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下でトランスフェクト細胞を増殖させる。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを含有するベクターpCNDA1の誘導体でトランスフェクトしたHEK293細胞中で機能性電圧依存性カルシウムチャンネルが産生された。
異種DNAはエピソーム要素として細胞中に維持されてもよく、または細胞の染色体DNAに組み込まれてもよい。次に、得られた組換え細胞を培養するか、または、このような培養物もしくはその継代培養物から継代培養する（哺乳類細胞の場合には継代させる）。組換え細胞のトランスフェクション、注入及び培養の方法は当業者に周知である。DNAまたはRNAを導入する真核細胞は、このようなDNAまたはRNAによってトランスフェクト可能であるかまたはこのようなDANの注入が可能であるいかなる細胞でもよい。実質的にいかなる真核細胞も異種DNAのビヒクルとして有用であり得る。好ましい細胞は、更にDNA及びRNAを発現し得る細胞であり、極めて好ましい細胞は異種DNAによってコードされた１つ以上のサブユニットを含む組換えまたは異種カルシウムチャンネルを形成し得る細胞である。このような細胞は実験的に同定されてもよくまたは容易にトランスフェクトまたは注入される既知の細胞から選択されてもよい。DNA導入用の好ましい細胞は、一過的にまたは安定にトランスフェクトされ得る細胞であり、その例としては、COS細胞、マウスＬ細胞、CHO細胞、ヒト胚性腎細胞、アフリカミドリザル細胞及び他の当業者に周知のこのような細胞などの哺乳類起原の細胞、アフリカツメガエル卵母細胞のような両生類細胞、またはSaccharomyces cerevisiaeもしくはPichia pastorisのような酵母細胞があるがそれに限定されない。注入されたRNA転写物またはcDNAの発現に好ましい細胞はアフリカツメガエル卵母細胞である。DNAのトランスフェクションに好ましい細胞は容易にかつ効率的にトランスフェクトされる細胞である。このような細胞は当業者に周知であるかまたは実験的に同定され得る。好ましい細胞としては、DG44細胞及びHEK293細胞があり、特に、液体窒素中で凍結でき次いで解凍させて増殖を再開させ得るHEK293細胞が好ましい。このようなHEK293細胞は例えばGormanの米国特許第5,024,939号に記載されている〔Stillmanら，（1985）Mol.Cell.Biol.5:2051−2060も参照〕。
細胞は、その内部に導入された異種DNAを複製するかまたはその内部に導入された異種DNAを発現させるためのビヒクルとして使用され得る。いくつかの実施態様においては、細胞は、実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたは異種カルシウムチャンネルを産生する手段として異種DNAを発現させるビヒクルとして使用される。異種DNAを含有する宿主細胞をカルシウムチャンネルが発現し得る条件下に培養するとよい。カルシウムチャンネルサブユニットを当業者に周知のタンパク質精製方法を用いて精製し得る。例えば、サブユニットまたはサブユニット含有カルシウムチャンネルをアフィニティ精製するために、本発明で提供される抗体のような１つ以上のサブユニットに特異的に結合し得る抗体を使用してもよい。
ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及びヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットの実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルのサブユニットが提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも１つを含む実質的に純粋な単離されたカルシウムチャンネルも提供される。また、宿主細胞によってコードされた１つ以上のサブユニットと細胞に導入された異種DNAもしくはRNAによってコードされた１つ以上のサブユニットとの混合物を含有する実質的に純粋なカルシウムチャンネルも提供される。また、実質的に純粋なサブタイプ−または組織−型特異的カルシウムチャンネルも提供される。
別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及びヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットの少なくとも１つをコードする異種DNAを含有する真核細胞が提供される。１つの好適実施態様においては、異種DNAが真核細胞中で発現され、好ましくはそれはヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードしている。
異種カルシウムチャンネルの発現：電気生理学及び薬理学
カルシウムチャンネル活性を測定する電気生理学的方法は当業者に周知であり本文中に例示されている。機能性カルシウムチャンネルの形成を検出し、得られる電流のカイネティクス及び他の特徴を特性決定するために任意のこのような方法を使用し得る。カルシウムチャンネルを更に特性決定するために、薬理学的試験を電気生理学的測定と併用してもよい。
機能性異種カルシウムチャンネルの活性の測定に関しては、測定される異種カルシウムチャンネル活性のS/N比を増加させるために、内因性イオンチャンネル活性及び所望の場合には所望のサブユニットを含有しないチャンネルの異種チャンネル活性をディファレンシャル静止電位差の使用のような化学的、薬理学的及び電気生理学的手段によって有意な程度に阻害し得る。
従って、本発明で提供されるDNAによってコードされるサブユニットの種々の組み合わせを真核細胞に導入する。得られた細胞を試験して、機能性チャンネルが発現されたか否かを確認しチャンネルの特性を決定し得る。特に好ましい様相では、異種DNAを含有する真核細胞が該DNAを発現し、組換え機能性カルシウムチャンネル活性を形成する。より好ましい様相では、組換えカルシウムチャンネル活性が、非トランスフェクト宿主細胞には欠如しているタイプの活性であるかまたは非トランスフェクト細胞中で示されない量及び／または薬理学的特性を有するかまたは生物物理学的特性を示すので、容易に検出され得る。
真核細胞は本発明で提供されるサブユニットのサブタイプの種々の組み合わせによってトランスフェクトされ得る。得られる細胞は、カルシウムチャンネル活性を研究し本発明で提供される薬剤スクリーニングアッセイでの使用に適したカルシウムチャンネルの均一集団を提供するであろう。行った実験は、従来の分類図式が適当でないことを示した。
トランスフェクト細胞のうちでも機能性異種カルシウムチャンネルを有する組換え真核細胞が好ましい。組換え細胞は、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードする異種DNAまたはRNA転写物の導入及び発現、より好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする異種DNA及び／またはヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードする異種DNAも発現する異種DNAまたはRNA転写物の導入及び発現によって産生され得る。特に好ましくは、このような異種DNAまたはRNA転写物によってコードされるα１、β及びα２サブユニットの各々、及び、任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードする異種DNAまたはRNA転写物をこのような組換え細胞中で発現させる。機能性カルシウムチャンネルは好ましくはヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット及びβサブユニットを少なくとも含み得る。これらの２つのサブユニットを発現する真核細胞及び追加のサブユニットを発現する細胞を、DNAのトランスフェクション及びRNA転写物の注入によって調製した。このような細胞は、１つ以上の異種ヒトカルシウムチャンネルサブユニットを含有するカルシウムチャンネルに帰因する電圧依存性カルシウムチャンネル活性を示した。例えば、α１サブユニットとβサブユニットとに加えてα２サブユニットを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞は、脱分極に応じて細胞膜を透過するカルシウム選択イオン流量を増加させ、これは、α２サブユニットがカルシウムチャンネル機能を強めることを示す。漸増比のα２対α１によって細胞をコトランスフェクトし、得られたカルシウムチャンネルの活性を測定した。結果は、他のトランスフェクトされたサブユニットに対してα２をコードするDNAの量を増加させるとカルシウムチャンネル活性が増加することを示す。
ヒトα１サブユニット、ヒトβサブユニット及びヒトα２サブユニットを少なくとも含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞が好ましい。α１サブユニットだけをコードしているかまたはβ及び／またはα２サブユニットと組み合わせてコードしているcDNAまたはRNA転写物を含有する組成物で形質転換した真核細胞を、機能性カルシウムチャンネルを発現する細胞を産生するために使用し得る。異種cDNAまたはRNAによってコードされたヒトサブユニットの全部を含有するヒトカルシウムチャンネルを発現する組換え細胞が特に好ましいので、異種DNAまたはRNAによってコードされたヒトサブユニットを含有するカルシウムチャンネルを形成するために十分な濃度のサブユニットコーディング核酸をこのような宿主細胞に注入またはトランスフェクトするのが好ましい。サブユニットをコードするDNAまたはRNAの正確な量及び比は実験的に決定でき、サブユニット、細胞及びアッセイ条件の個々の組み合わせ毎に最適化し得る。
特に、哺乳類細胞は１つ以上のヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAで一過的及び安定にトランスフェクトされた。このような細胞は、ヒトカルシウムチャンネルに帰因し得る薬理学的及び電気生理学的特性を示す異種カルシウムチャンネルを発現する。しかしながら、このような細胞は均質集団を示し、薬理学的及び電気生理学的データは、ヒトカルシウムチャンネル活性の解明についてこれまでは得られなかった手掛かりを与える。例えば、HEK細胞を、α1E-1、α2b及びβ1-3サブユニットをコードするDNAで一過的にトランスフェクトした。得られた細胞はこれらのサブユニットを一過的に発現し、これらは、Ｌ−、Ｎ−、Ｔ−及びＰ−型のチャンネルとは異なる電圧活性化カルシウムチャンネルの薬理学的クラスであると考えられる特性を有するカルシウムチャンネルを形成する。観察されるα1E電流は、他のクラスの電圧活性化カルシウムチャンネルを定義するためにこれまで使用されてきた薬剤及び毒素に感受性でない。
α1B-1、α2b及びβ1-2をコードするDNAで一過的にトランスフェクトされたHEK細胞は、ω−コノトキシンに対する感受性及びＮ−型チャンネルの典型的な電流を示す異種カルシウムチャンネルを発現する。均等なmRNAレベルを達成するために細胞に導入するα1B-1、α2b及びβ1-2のモル比を変更すると、細胞あたりのレセプターの数、電流密度が有意に増加し、ω−コノトキシンのKdに影響を与えた。
α1B-1、α2b及びβ1-2から産生されたこれらのチャンネルの電気生理学的特性を、α1B-1、α2b及びβ1-3をコードするDNAでHEK細胞を一過的にトランスフェクトすることによって産生されるチャンネルの特性と比較した。チャンネルは、同様の電圧依存性活性化、実質的に等しい電圧依存性、同様の活性化のカイネティクス、単一指数によって調製され得るテール電流を示した。不活性化のカイネティクスの電圧依存性はすべての被検電圧において有意に違っていた。
いくつかの実施態様においては、少なくとも１つのRNA転写物を含有する第１組成物を細胞に導入し、この転写物を細胞中でヒトカルシウムチャンネルのサブユニットとして翻訳することによって、異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞を産生する。好ましい実施態様においては、翻訳されるサブユニットが、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットを含む。より好ましくは、導入される組成物が、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードするRNA転写物を含有し、且つ、（１）ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードするRNA転写物及び／または（２）ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするRNA転写物を含有する。特に好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルのα１、β及びα２サブユニット及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするRNAを導入する。クローン化したDNAのin vitro転写の方法、及び、得られたRNAの真核細胞注入方法は当業界で周知である。ヒトカルシウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードする全長DNAのいずれかの転写物を、細胞中で発現させるために真核細胞中に単独で注入してもよくまたは他の転写物と組み合わせて注入してもよい。本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットcDNAクローンのin vitro転写物の発現には両生類母細胞が特に好ましい。機能性異種カルシウムチャンネルを発現する両性類卵母細胞をこの方法によって産生した。
細胞のアッセイ及び臨床使用並びにカルシウムチャンネルアッセイ
カルシウムチャンネル活性を変調する化合物の同定アッセイ
１つ以上のサブユニットを組換え的に発現する真核細胞の用途としては、被検化合物がカルシウムチャンネルアゴニスト活性を有するかアンタゴニスト活性を有するかを判定するアッセイがある。これらの真核細胞はまた、既知のカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストから特定のカルシウムチャンネルサブタイプ特異性を示すものを選択し、従って疾患特異的または組織特異的な治療薬として有効な化合物を選択するために使用され得る。
異種ヒトカルシウムチャンネルを発現する真核細胞を使用して、カルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのようなカルシウムチャンネルの活性変調（modulate）化合物を同定するためのin vitro方法が提供される。
アッセイでは特に、ヒトカルシウムチャンネルに特異的な有力なカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするため、特に特定のヒトカルシウムチャンネルサブタイプに特異的な化合物をスクリーニングするために、本発明で提供される異種DNAによってコードされた異種ヒトカルシウムチャンネルサブユニットを発現する真核細胞を使用する。このようなアッセイは、構造がいくらか異なるアゴニスト及びアンタゴニストからヒトカルシウムチャンネルの活性変調に特に有用なものを選択し、サブタイプ特異的または組織特異的カルシウムチャンネルアンタゴニスト及びアゴニスト活性を示す化合物を設計または選択するための合理的な薬剤設計の方法と組み合わせて使用され得る。これらのアッセイは、ある種のヒト疾患の治療に対する化合物の相対治療効果を正確に予想させる。更に、サブタイプ特異的及び組織特異的カルシウムチャンネルサブユニットが提供されるので、組織特異的またはサブタイプ特異的組換えカルシウムチャンネルを有する細胞を調製し、ヒトカルシウムチャンネル組織特異的またはサブタイプ特異的薬剤の同定アッセイに使用され得る。
カルシウムチャンネルサブユニット発現用の宿主細胞は、リガンド結合アッセイにおける異種カルシウムチャンネルサブユニットの検出を実質的に妨害したりまたは機能性アッセイにおけるカルシウム電流の発生のような異種カルシウムチャンネル機能の検出を実質的に妨害したりするタイプまたは量の内因性カルシウムチャンネルサブユニットを産生しないのが望ましい。また、宿主細胞は、生理学的濃度で（一般にはナノモルまたはピコモルの濃度で）、本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットの１つまたは全部を含有するカルシウムチャンネルに対する親和性を有する化合物の検出を妨害する内因性カルシウムチャンネルを産生しないのが好ましい。
カルシウムチャンネルに対する親和性を有する化合物を同定するリガンド結合アッセイに関しては、少なくとも１つの異種α１サブユニットを発現する細胞を使用するのが好ましい。少なくとも１つのα１サブユニットを発現するトランスフェクト真核細胞は、例えばカルシウムチャンネルと特異的に相互作用することが分かっている標識化合物の相互作用を阻害する被検化合物の能力を評価することによって、異種カルシウムチャンネルに特異的に結合する被検化合物の能力を判断するために使用し得る。このようなリガンド結合アッセイはインタクトなトランスフェクト細胞または該細胞から調製された膜に対して実施し得る。
異種カルシウムチャンネルまたはそのサブユニットを含有する膜に結合または他の方法で相互作用する被検化合物の能力は、任意の適当な方法、例えば、カルシウムチャンネルに対して既知の親和性を有する１種以上の濃度の化合物の存在下または非存在下でこのような膜の結合能力を測定するスキャッチャードプロットのような競合結合分析を用いて測定し得る。必要な場合、結果を、当業者に周知の方法に従って設計された対照実験に比較し得る。例えば、１つ以上のサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトしない宿主細胞からの膜調製物を同様に処理したアッセイ結果を陰性対照とし、双方の結果を比較し得る。
アッセイは、ヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのサブユニット、好ましくはヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのα１サブユニットを発現する組換え真核細胞の細胞膜を被検化合物と接触させ、膜に特異的に結合するかまたは膜の異種カルシウムチャンネルの活性を変化させるかもしくは変調する被検化合物の能力を測定する処理を含む。
好ましい実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及び／またはヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットと組み合わせて含有するカルシウムチャンネルを有する組換え細胞をアッセイに使用する。このようなアッセイでは、ヒトα１、β及びα２サブユニットの各々を含有する、及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。
いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定するアッセイは、被検化合物及びカルシウムチャンネル選択イオンを含有する溶液に細胞を接触させたときに異種機能性カルシウムチャンネルを有する真核細胞が示すカルシウムチャンネル活性を測定し、測定されたカルシウムチャンネル活性を被検化合物非含有の溶液中の同じ細胞または実質的に等しい対照細胞のカルシウムチャンネル活性に比較することによって行う。チャンネルが開いたときに内向きの電流を与えるために十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度を有する溶液中に細胞を維持する。このようなアッセイでは、ヒトカルシウムチャンネルのα１、β及びα２サブユニットの各々及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットを含むカルシウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。このようなアッセイの実施方法は当業者に公知である。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞とアセチルコリン受容体とを用いる同様の方法〔Mishinaら（1985）Nature 313:364〕及びこのような卵母細胞とナトリウムチャンネルとを用いる同様の方法〔Nodaら（1986）Nature 322:826−828〕がある。アセチルコリン受容体を用いて行った同様の試験に関しては、例えばClaudioら〔（1987）Science 238:1688−1694〕を参照するとよい。
機能性の組換えまたは異種カルシウムチャンネルは当業者に周知の任意の方法で同定され得る。例えば、細胞のイオン選択膜を透過する電流を測定する方法として公知の電気生理学的手順を使用し得る。本発明において提供される１つ以上のサブユニットをコードするDNAを含有する組換え細胞の異種カルシウムチャンネルを透過するカルシウム選択イオン流の量及び時間を、２電極及び全細胞パッチ固定法を用いる電気生理学的記録法を用いて測定した。アッセイ感度を向上させるために、組換えチャンネルを通るカルシウム電流を測定するときに、非カルシウム電流及び内因性カルシウムチャンネルから生じるカルシウム電流を除去または減少させる公知の方法を使用し得る。
例えば、DHP Bay K 8644は、チャンネルの開状態の持続時間を延長することによってＬ−型カルシウムチャンネル機能を特異的に増進させる〔例えば、Hess,J.B.ら（1984）Nature 311:538−544参照〕。チャンネルの開時間が延長されると、その結果としてカルシウム電流の量が増加し持続時間が延長する。脱分極電圧コマンドによってイオンチャンネルを活性化した後で細胞膜を再分極するとテール電流を観察し得る。開いたチャンネルは、再分極されて閉鎖即ち「不活性化」するまでに有限時間を要し、この期間にチャンネルを流れる電流をテール電流と呼ぶ。Bay K 8644はカルシウムチャンネルの開口事象を延長させるので、テール電流を延長し、より大きくする。
実際には好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルの１つ以上のサブユニットを含有する電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルを発現する安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞または注入された細胞は、カルシウムチャンネル活性を変調するカルシウムチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストのような物質を同定するアッセイで使用され得る。未知の活性を有する化合物から成る被検化合物がヒトカルシウムチャンネルを介してカルシウムイオンまたは他のイオンの流れを強化、阻害または他の方法で変更するか否かを判断するためのカルシウムチャンネルのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関する被検化合物の機能性試験は、（ａ）カルシウムチャンネル選択イオンを含有する媒体中で細胞に流入するカルシウムチャンネル選択イオンの流量を調節し得る異種機能性カルシウムチャンネルを発現するようにトランスフェクトまたは注入された真核細胞を、被検化合物の（ｉ）存在下及び（ii）非存在下に維持し、（ｂ）異種カルシウムチャンネルが実質的に閉鎖され細胞の内因性カルシウムチャンネルが実質的に阻害される条件下に細胞を維持し、（ｃ）段階（ｂ）に維持された細胞の膜を、異種カルシウムチャンネル（好ましくは実質的に該チャンネルだけ）がカルシウムチャンネル選択イオンに透過性になるために十分な程度及び時間を要して脱分極し、（ｄ）被検化合物の存在下の電流の細胞流入量及び持続時間を、被検化合物の非存在下の電流の同一細胞または実質的に同じ細胞への流入量及び持続時間に比較することによって行う。
従ってアッセイは、本発明で提供される異種機能性カルシウムチャンネルを発現する細胞を使用し、異種機能性チャンネルを介してCa++またはBa++のようなカルシウムチャンネル選択イオン流の量及び持続時間を強化、拮抗または他の方法で変調する被検化合物の能力を機能的、例えば電気生理学的に測定する。細胞の組換えカルシウムチャンネルを流れる電流の量は、例えば電気生理学的に直接測定されてもよく、または、カルシウム（または他の）イオンに依存的な影響を直接受けながら細胞内で生じる独立反応をモニターすることによって測定されてもよい。任意のカルシウムチャンネル活性評価方法を、本発明で提供される細胞及びアッセイと併用し得る。例えば、化合物のカルシウムチャンネル活性変調能力を試験する方法の１つの実施態様では、異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞を使用してカルシウムチャンネル選択イオン感受性反応の変調による電流量を測定する。該真核細胞は更に、指示（indicator）タンパク質をコードする構造遺伝子に機能し得るように結合された発現用の転写調節要素を含む。指示遺伝子の転写に使用される転写調節ヨウ素は、Ca++及びBa++のようなカルシウムチャンネル選択イオンに細胞内で反応性である。このような転写に基づくアッセイの詳細は、1990年８月７日出願の同一出願人所有の許諾された米国出願07/563,751を優先権主張した1991年８月７日出願の同一出願人所有のPCT国際特許出願PCT/US91/5625に記載されている。また、係属中の米国出願08/229,150及び08/244,985に対応する同一出願人所有の公開PCT国際特許出願PCT/US92/11090も参照されたい。
LESの診断アッセイ
LESは、神経インパルスに正常に反応する運動神経末端からのアセチルコリン放出が不十分であることを特徴とする自己免疫疾患である。LES患者の免疫グロブリン（IgG）は個々の電圧依存性カルシウムチャンネルをブロックし、従ってカルシウムチャンネル活性を阻害する〔Kim ＆ Neher,Science 239:405−408（1988）〕。ランベルト−イートン症候群（LES）の診断アッセイが本発明で提供される。LESの診断アッセイは、組換え細胞の表面で発現されたヒトカルシウムチャンネルまたは１つもしくは複数の特定サブユニットとLES IgGとの免疫学的反応に依存する。例えば、このようなアッセイは、本発明によって提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニット及びこのようなサブユニットを発現する細胞によるLES IgGの免疫沈降に基づいてもよい。
臨床応用
様々な疾病状態の治療に関しては、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAが入手可能になると、ある種の疾病状態の発生に相関関係を有し得る遺伝子の何らかの変異（例えば突然変異）を同定することが可能になる。更に、このような疾病状態の動物モデルを作製し、上記のごとき突然変異を合成DNAフラグメントに特異的に導入し、次に実験動物に導入するかまたはin vitroアッセイ系に導入することによっその効果を判定することが可能になる。
また、ヌクレオチド配列をプローブとして使用して遺伝子スクリーニングを行うことが可能になる。従って、いずれか１つまたはそれ以上のカルシウムチャンネルサブユニットの変異／修飾が関与する疑いのある病理状態を有する患者の核酸サンプルを適当なプローブによってスクリーニングし、内因性カルシウムチャンネルのいずれかに関して何らかの異常が存在するか否かを判断し得る。同様に、カルシウムチャンネル機能不全に関連した疾病状態の家族歴を有する被検者をスクリーニングして、彼らもまたこのような疾病状態に対する素質があるか否かを判断し得る。
実施例
以下の実施例は例示の目的で与えられており、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例Ｉ：ヒト神経電圧依存性カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAの単離に使用するライブラリーの調製
A.  RNA単離
1.  IMR32細胞
IMR32細胞を、American Type Culture Collection（ATCC受託番号No.CCL127,Rockville,MD）から入手し、DMED、10％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO,Grand Island,NY）と1.0mMのジブチリルcAMP（dbcAMP）中で10日間増殖させた。H.C.Birnboim〔（1988）Nucleic Acids Research 16:1487−1497〕に記載された手順で全RNAを細胞から単離した。ポリ（A+）RNAを標準手順に従って選択した〔例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;pg.7.26−7.29〕。
2.  ヒト視床組織
National Neurological Research Bank,Los Angeles,CAから入手し、−70℃で冷凍保存しておいたヒト視床組織（2.34g）を液体窒素の存在下に乳鉢と乳棒とを用いて微粉砕し、細胞を12mlの溶解バッファ（5Mのイソチオシアン酸グアニジニウム、50mMのTris,pH7.4、10mMのEDTA、５％のβ−メルカプトエタノール）中で溶解した。その溶解液に溶解バッファを添加し、最終容量17mlとした。Ｎ−ラウリルサルコシン及びCsClを、最終容量18ml中の最終濃度が夫々４％及び0.01g/mlになるまで混合物に添加した。
Sorvall SS34ローター内でサンプルを9,000rpmで室温で10分間遠心し、不溶物をペレットとして除去した。上清を等しい部分量に分け、各アリコートを、別の遠心管に収容した5.7MのCsCl、0.1MのEDTAの溶液からなる2mlのクッションに重層し、管あたり約9mlとした。サンプルをSW41ローター内で37,000rpmで20℃で24時間遠心した。
遠心後、各RNAペレットを3mlのETS（10mMのTRIS,pH7.4、10mMのEDTA、0.2％のSDS）中に再懸濁させ、１つの管に一緒に導入した。RNAを0.25MのNaCl及び２倍容の95％エタノールで沈殿させた。
沈殿物を遠心によって収集し、4mlのPKバッファ（0.05MのTRIS,pH8.4、0.14MのNaCl、0.01MのEDTA、１％のSDS）中に再懸濁させた。サンプルにプロテイナーゼＫを最終濃度200μg/mlまで添加した。サンプルを22℃で１時間インキュベートし、次いで、等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（50:48:2）で２回抽出し、次いで等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）で１回抽出した。RNAをエタノール及びNaClで沈殿させた。沈殿物を400μｌのETSバッファに再懸濁させた。全RNAの収量は約1.0mgであった。実施例I.A.1に記載の標準方法に従ってポリA+RNA（30μｇ）を全RNAから単離した。
B.  ライブラリー構築
標準方法に従って二重鎖cDNAを合成した〔例えばSambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Chapter 8参照〕。（１）第１ストランドのcDNAをプライムするために使用したオリゴヌクレオチド、（２）二重鎖DNAに結合したアダプター、（３）遊離または非使用アダプターの除去に使用した方法、及び、（４）λファージベクターに結合した分画cDNAの大きさ、が違う以外は、各ライブラリーを実質的に同様に調製した。
1.  IMR32 cDNAライブラリー＃１
IMR32ポリ（A+）RNA（実施例I.A.1）を鋳型として用いて一本鎖cDNAを合成し、オリゴ（dT）12-18（Collaborative Research Inc.,Bedford,MA）を用いてプライムした。一本鎖cDNAを二重鎖cDNAに変換すると、収量約２μｇが得られた。次に、SnaB I及びXho I制限部位も含むEco Iアダプター：
5'−AATTCGGTACGTACACTCGAGC−3'＝22−mer（配列番号15）
3'−    GCCATGCATGTGAGCTCG−5'＝18−mer（配列番号16）
を以下の手順で二重鎖cDNAに付加した。
a.  18−merのリン酸化
10μｌの総量で18−mer（225ピコモル）と〔32P〕γ−ATP（7000Ci/ミリモル;1.0μｌ）及びキナーゼ（2U）とを一緒にし、37℃で15分間インキュベートする標準方法〔例えばSambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Chapter 8参照〕によって18−merをリン酸化した。インキュベーション後、１μｌの10mMのATPと追加の2Uのキナーゼとを添加し、37℃で15分間インキュベートした。次に10分間煮沸してキナーゼを失活させた。
b.  22−merのハイブリダイゼーション
225ピコモルの22−mer（及び容量15μｌを与える水）の添加及び65℃で５分間のインキュベーションによって22−merをリン酸化18−merにハイブリダイズさせた。次に反応物を室温まで徐冷した。
この場合アダプターは15ピコモル／μｌの濃度で存在し、cDNA−アダプター結合の準備が整った。
c.  cDNAに対するアダプターの結合
標準プロトコル〔例えばSambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Chapter 8参照〕を用いてEcoR I、SnaB I、Xho Iアダプターを二重鎖cDNAに結合した後で、混合物を72℃で15分間加熱してリガーゼを失活させた。cDNA結合反応物（20μｌ）に、試薬すなわち水（24μｌ）、10×キナーゼバッファ（３μｌ）、10mMのATP（１μｌ）及びキナーゼ（2U/μｌを２μｌ）を添加し、37℃で30分間加熱した。２μｌの0.5MのEDTAを添加して反応を停止させ、次いでフェノール／クロロホルムで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出した。
d.  cDNAの大きさ選択及びパッケージング
5mlのセファロースCL−4Bカラム（Sigma,St.Louis,MO）を用いて遊離または非結合アダプターを除去することによって、EcoR I、SnaB I、Xho Iアダプターと結合した二重鎖cDNAを精製した。100μｌの画分を収集し、放射能のモニターによってcDNA含有と判定された画分をプールし、エタノール沈殿させ、TEバッファに再懸濁させ、１％アガロースゲルにロードした。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、１〜3kbの画分をゲルから切り出した。アガロースに封入されたcDNAを“Geneluter Electroelution System"（Invitrogen,San Diego,CA）を用いて溶出させた。溶出したcDNAをエタノール沈殿によって収集し、0.10ピコモル／μｌでTEバッファに再懸濁させた。cDNAを５μｌの反応容量中で、１μｇのEcoR I消化し脱リン酸化したλgt11に、cDNAがλgt11ベクターよりも２倍〜４倍のモル過剰比になる量で結合させた。cDNAインサートを含む結合λgt11を、Gigapack（Stratagene,La Jolla,CA）キットを用いてλファージビリオンにin vitroパッケージした。パッケージしたファージを大腸菌Y1088の菌叢上で平板培養してスクリーニング用に調製した。
2.  IMR32 cDNAライブラリー＃２
このライブラリーは、１〜3kbのフラグメントでなく３〜9kbのcDNAフラグメントをλgt11に結合させる以外は上記（実施例I.B.1）と同様に調製した。
3.  IMR32 cDNAライブラリー＃３
IMR32細胞ポリ（A+）RNA（実施例I.A.1）を鋳型として使用して一本鎖cDNAを合成した。第１ストランドcDNA合成のプライマーは、ランダムプライマー（ヘキサデオキシ−ヌクレオチド〔pd（Ｎ）６〕Cat ＃5020−１、Clontech,Palo Alto,CA）であった。二重鎖cDNAを合成し、EcoR I、SnaB I、Xho IアダプターをcDNAに付加し、未結合のアダプターを除去し、アダプターと結合した二重鎖cDNAを実施例I.B.1の記載と同様にアガロースゲルで分画した。1.8kbよりも大きいcDNA画分をアガロースから溶出させ、λgt11に結合し、パッケージし、（実施例I.B.1に記載のように）Y1088の菌叢に平板培養した。
4.  IMR32 cDNAライブラリー＃４
IMR32細胞ポリ（A+）RNA（実施例I.A.1）を鋳型として使用して一本鎖cDNAを合成した。第１ストランドcDNA合成のプライマーは、α1D（VDCC III）タイプのα１サブユニット（実施例II.A参照）をコードする配列（配列番号１のヌクレオチド2927−2956の相補的配列）に特異的なオリゴヌクレオチド89−365a、α1C（VDCC II）タイプのα１サブユニット（実施例II.B参照）をコードする配列（配列番号３のヌクレオチド852−873の相補的配列）に特異的なオリゴヌクレオチド89−495、α1Cサブユニットをコードする配列に特異的なオリゴヌクレオチド90−12（配列番号３のヌクレオチド2496−2520の相補的配列）であった。次に、1.8kbでなく1.5kbを上回る大きさのcDNA画分をアガロースから溶出させる以外は上記（実施例I.B.3）と同じ手順でcDNAライブラリーを構築した。
5.  IMR32 cDNAライブラリー＃５
1.8kbでなく1.2kbを上回る大きさのcDNA画分をアガロースから溶出させる以外は上記（実施例I.B.3）と同じ手順でcDNAライブラリーを構築した。
6.  ヒト視床cDNAライブラリー＃６
ヒト視床ポリ（A+）RNA（実施例I.A.2）を鋳型として使用して一本鎖cDNAを合成した。第１ストランドの合成をプライムするためにオリゴ（dT）を使用した（実施例I.B.1）。二重鎖cDNAを合成し（実施例I.B.1）、配列：
5'CCATGGTACCTTCGTTGACG3'＝20−mer（配列番号17）
3'GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA5'＝24−mer（配列番号18）
のEcoR I、Kpn I、Nco Iアダプターを用い、上記（実施例I.B.1）の18−merの代わりに20−mer、22−merの代わりに24−merを二重鎖cDNAに結合した。cDNA−アダプター混合物を1mlのBio Gel A−50（Bio−Rad Laboratories,Richmond,CA）カラムに通すことによって未結合のアダプターを除去した。画分（30μｌ）を収集し、放射能の第１ピークに存在する１μｌの各画分を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを真空ゲルドライヤーで乾燥し、ｘ線フィルムに露光した。600bpよりも大きいcDNAフラグメントを含有する画分をプールし、エタノール沈殿させ、λgt11に結合させた（実施例I.B.1）。cDNAライブラリーの構築を上記（実施例I.B.1）の手順で完了した。
C.  ハイブリダイゼーション及び洗浄条件
cDNAライブラリー、DNAサザン転移物またはノーザン転移物をスクリーニングするために、定型化した方法で固定化DNAに対する放射性標識核酸のハイブリダイゼーションを標準ハイブリダイゼーション条件下で実施した〔ハイブリダイゼーション:50％脱イオン化ホルムアミド、200μg/mlの音波処理ニシン精子DNA（Cat ＃223645、Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN）、５×SSPE、５×Denhardt、42℃；洗浄:0.2×SSPE、0.1％SDS、65℃〕。SSPE及びDenhardtの配合比並びに脱イオン化ホルムアミドの調製は、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Chapter 8に記載されている。いくつかのハイブリダイゼーションにおいては、標準ハイブリダイゼーション条件の50％脱イオン化ホルムアミドを10％の脱イオン化ホルムアミドに代えることによってより低い緊縮性条件を使用した。
フィルターから非特異的プローブを除去する洗浄条件は以下に記載のような高、中または低緊縮性条件を使用した。
（１）高緊縮性:0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃
（２）中緊縮性:0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃
（３）低緊縮性:1.0×SSPE、0.1％SDS、50℃
選択的バッファ、塩及び温度を用いて同様の緊縮性が得られることは理解されよう。
実施例II：ヒト神経カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするDNAの単離
A.  α1DサブユニットをコードするDNAの単離
1.  部分的α1D cDNAクローンの参照表
5'及び3'の非翻訳配列の部分を加えた完全α1Dコーディング配列を特性決定するために、多数のα1D特異的cDNAクローンを単離した。配列番号１は、完全α1D DNAコーディング配列と、翻訳開始と推定されるアデニンヌクレオチドに隣接のグアニジンヌクレオチドで終結するα1D5'非翻訳配列の510ヌクレオチドと、3'非翻訳配列の642ヌクレオチドとを示す。配列番号１はまた、推定アミノ酸配列を示す。α1D配列と配列番号１に示された全長α1D cDNAに対する各クローンのヌクレオチド位置とを特性決定するために使用した部分的cDNAクローンの表を以下に示す。これらのクローンの単離及びキャラクタリゼーションについては後述する（実施例II.A.2）。
0003628693.tif 000005
＊IMR32 1.136の5'の1627ヌクレオチドは実施例II.A.2.dに記載のイントロン及び追加エキソンをコードしている。
＠IMR32 1.80はヌクレオチド2984−3131及びヌクレオチド5303−5349（配列番号１）の２つの欠失を含む。148ヌクレオチドの欠失（ヌクレオチド2984−3131）を実施例II.A.3.bに記載のポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって修正した。
＃IMR32 1.36は132ヌクレオチド（ヌクレオチド3081−3212）の欠失を含む。
2.  実施例II.A.1に表示した個々のクローンの単離及びキャラクタリゼーション
a.  IMR32 1.36
IMR32 cDNAライブラリー＃１（実施例I.B.1）の２×106の組換え体を、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα1 cDNAをコードする領域の放射性標識フラグメントの混合物を用いて150mmのプレートあたり約200,000プラークの密度でスクリーニングする重複試験を行った〔ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットcDNAの配列に関してはTanabeら（1987）Nature 328:313−318参照〕。
フラグメント                      ヌクレオチド
Kpn I−EcoR I                           −78−1006
EcoR I−Xho I                           1006−2653
Apa I−Apa I                            3093−4182
Bgl II−Sac I                           4487−5310
低緊縮性ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、フィルターを低緊縮性条件下（実施例I.C）で洗浄した。スクリーニングした２×106の組換え体のうちでα1D特異的組換え体（IMR32 1.36）が１つだけ同定された。IMR32 1.36を標準方法でプラーク精製し（J.Sambrookら（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Chapter 8）、pGEM3（Promega,Madison,WI）にサブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。
b.  IMR32 1.80
IMR32 cDNAライブラリー＃２（実施例I.B.2）の約１×106の組換え体を、IMR32 1.36 cDNAフラグメント（実施例II.A.1）をプローブとして用いて150mmのプレートあたり約100,000プラークの密度でスクリーニングする重複試験を実施した。標準ハイブリダイゼーション条件を使用し、フィルターを高緊縮性条件下（実施例I.C）で洗浄した。３つの陽性プラークが同定され、その１つがIMR32 1.80であった。IMR32 1.80を標準方法によってプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。
c.  IMR32 1.144
IMR32 cDNAライブラリー＃３（実施例I.B.3）の約１×106の組換え体をIMR32 1.80のEcoR I−Pvu IIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド2083−2518）でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下で（実施例I.C）フィルターを洗浄した。３つの陽性プラークを同定したが、その１つがIMR32 1.144であった。IMR32 1.144をプラーク精製し、制限地図を作製し、cDNAインサートをpGEM7Z（Promega,Madiosn,WI）にサブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、IMR32 1.144が７つの開始可能メチオニン（配列番号１のヌクレオチド511−531）をコードする一連のATGコドンを有することが判明した。核酸増幅分析及びこれらの７つのATGコドンをコードするクローン化した核酸増幅分析産物のDNA配列決定によって、この配列がdbcAMP誘発IMP32細胞中で発現されたα1D転写物中に存在することが確認された。
d.  IMR32 1.136
IMR32 cDNAライブラリー＃４（実施例I.B.4）の約１×106の組換え体をIMR32 1.80（実施例II.A.1）のEcoR I−Pvu IIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド2083−2518）でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークを同定したが、その１つがIMR32 1.136であった。IMR32 1.136をプラーク精製し、制限地図を作製し、cDNAインサートを標準プラスミドベクターpSP72（Promega,Madison,WI）にサブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、IMR32 1.136が不完全にスプライスされたα1D転写物をコードしていることが判明した。クローンは約640bpのイントロンに続く配列番号１のヌクレオチド1627−2988を含む。このイントロンの前に、α1DサブユニットのIS6トランスメンブランドメインをコードしている代替エキソンである104ヌクレオチドのエキソン（配列番号２）が存在し、このエキソンは完全にスプライスされたα1D転写物を産生すべく配列番号１のヌクレオチド1627−1730に置換し得る〔I S1−IV S6トランスメンブラン用語の記述に関しては、例えばTanabeら（1987）Nature 328:313−318を参照されたい〕。
e.  IMR32 1.163
IMR32 cDNAライブラリー＃３（実施例I.B.3）の約１×106の組換え体を、ヌクレオチド5811−6468（配列番号１）を含むIMR32 1.80（実施例II.A.1）のNco I−Xho Iフラグメントでスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。３つの陽性プラークを同定したが、その１つがIMR32 1.163であった。IMR32 1.163をプラーク精製し、制限地図を作製し、cDNAインサートを標準プラスミドベクターpSP72（Promega,Madison,WI）にサブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、IMR32 1.163がα1D末端コドン、ヌクレオチド6994−6996（配列番号１）を含むことが判明した。
3.  全長α1D cDNA〔pVDCC III（Ａ）〕の構築
α1D cDNAクローンIMR32 1.144、IMR32 1.136、IMR32 1.80及びIMR32 1.163（実施例II.A.2）はオーバーラップしており、ヌクレオチド2984−3131（配列番号１）の148bpの欠失以外は全α1Dをコードする配列であるヌクレオチド511−6993（配列番号１）を含む。真核細胞発現ベクター中で全長α1D cDNAを作製するためにこれらの部分的cDNAクローン断片を結合した。得られたベクターをpVDCC III（Ａ）と呼ぶ。pVDCC III（Ａ）の構築は以下に詳細に記載する４段階で行った。（１）IMR32 1.144、IMR32 1.136及びIMR32 1.80の断片を用いるpVDCC III/5'の構築、（２）pVDCC III/5'のIMR32 1.80部分の148ヌクレオチドの欠失を修正するpVDCC III/5'.3の構築、（３）IMR32 1.80部分及びIMR32 1.163部分を用いるpVDCC III/3'.1の構築、及び、（４）pVDCC III/5'.3インサートの一部分とpVDCC III/3'.1のインサートとpcDNA1（Inbitrogen,San Diego,CA）との結合によるpVDCC III（Ａ）の形成。ベクターpcDNA1は、哺乳類宿主細胞RNAポリメラーゼIIによって認識される構成的プロモーターであるサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含有する真核細胞発現ベクターである。
全長構築物の調製に使用したDNAフラグメントの各々を、DE81フィルターペーパー（Whatman,Clifton,NJ）に対するアガロースゲル電気泳動及び1.0MのNaCl、10mMのTRIS,pH8.0、1mMのEDTAを用いるフィルターペーパーからの溶出によって精製した。典型的には、10μｌの反応容量中に等モル比のインサートフラグメントをベクターに対して２倍のモル過剰量のインサート総量で用いて結合させた。DNAの使用量は通常は約50ng〜100ngであった。
a.  pVDCC III/5'
pVDCC III/5'を構築するために、IMR32 1.144（実施例II.A.2.c）をXho I及びEcoR Iで消化し、ベクター（pGEM7Z）、α1Dのヌクレオチド１−510（配列番号１）及びα1Dのヌクレオチド511−1732（配列番号１）を含有するフラグメントをゲル電気泳動によって単離した。IMR32 1.136（実施例II.A.2.d）のヌクレオチド1733−2671（配列番号１）のEcoR I−Apa Iフラグメントを単離し、IMR32 1.80（実施例II.A.2.b）のヌクレオチド2672−4492（配列番号１）のApa I−Hind IIIフラグメントを単離した。３つのDNAクローンを結合させて、ヌクレオチド１−510（配列番号１の5'非翻訳配列）とヌクレオチド511−4492（配列番号１）とを含有するpVDCC III/5'を形成した。
b.  pVDCC III/5'.3
IMR32 1.36及びIMR32 1.80のDNA配列の比較から、これらの２つのcDNAクローンはヌクレオチド2984−3212のα1Dコーディング配列が違うことが判明した。IMR32 1.80及びdbcAMP誘発（1.0mM、10日間）IMR32細胞質RNA（Ausubel,F.M.ら（Eds）（1988）Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New Yorkに従って単離）の核酸増幅分析によれば、IMR32 1.80がヌクレオチド2984−3131（配列番号１）の148ヌクレオチドの欠失を有し、IMR32 1.36がヌクレオチド3081−3212の132ヌクレオチドの欠失を有することが判明した。核酸増幅分析を行うために、増幅反応をα1D特異的オリゴヌクレオチド112（配列番号１のヌクレオチド2548−2572）及び311（配列番号１のヌクレオチド3928−3957の相補的配列）によってプライムした。次に、これらの産物をα1D特異的オリゴヌクレオチド310（配列番号１のヌクレオチド2583−2608）及び312（ヌクレオチド3883−3909の相補的配列）を用いて再増幅した。Acc I及びBgl II制限部位を含むこの再増幅産物をAcc I及びBgl IIによって消化し、ヌクレオチド2765−3890（配列番号１）のAcc I−Bgl IIフラグメントを、Acc I−Bgl II消化したpVDCC III/5'にクローニングして、欠失を有するAcc I−Bgl II pVDCC III/5'フラグメントに置換した。この新しい構築物をpVDCC III/5'.3と命名した。pVDCC III/5'.3の増幅領域の配列決定によれば、IMR32 1.80中の148ヌクレオチドの欠失が確認された。
c.  pVDCC III/3'.1
pVDCC III/3'.1を構築するために、IMR32 1.163（実施例II.A.2.e）のcDNAインサートをpBluescript II（Stratagene,La Jolla,CA）にXho Iフラグメントとしてサブクローニングした。cDNAフラグメントのXho I部位に、cDNAライブラリーの構築に使用したアダプター（実施例I.B.3）を付加した。得られたプラスミドの制限酵素消化物の分析によって確認すると、インサートは、IMR32 1.163のインサートの翻訳方向がプラスミド中に存在するlacZ遺伝子の方向の逆になるように配向されていた。その理由は、このプラスミドによって形質転換されたDH5α細胞中でlacZ遺伝子との融合によってα1D配列の発現の可能性が生じることを防止するためである。次に、このプラスミドをHind III及びBgl IIによって消化し、Hind III−Bgl IIフラグメント（Hind III部位はベクターに由来し、Bgl II部位は配列番号１のヌクレオチド6220にある）を除去し、このようにしてIMR32 1.163クローンのヌクレオチド5200−6220（配列番号１）を欠失させ、ヌクレオチド6221−7635（配列番号１）にあたる3'のBgl II−Xho Iフラグメントを含むプラスミドの残部からこの配列を除去する。次に、IMR32 1.80からのHind III−Pvu IIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド4493−5296）と、IMR32 1.163からのPvu II−Bgl IIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド5294−6220）と、IMR32 1.163の3'のBgl II/Xho Iフラグメント（配列番号１のヌクレオチド6221−7635）を含むHind III−Bgl II消化したpBluescriptプラスミドとを一緒にスプライシングすることによってpVDCC III/3'.1を作製した。
d.  pVDCC III（Ａ）：全長α1D構築物
pVDCC III（Ａ）を構築するためにpVDCC III/5'.3（実施例II.A.3.b）のDra I−Hind IIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド330−510の5'非翻訳配列及び配列番号１のヌクレオチド511−4492のコーディング配列）を単離した。pVDCC III/3'.1のHind III−Xho Iフラグメント（配列番号１のヌクレオチド4493−7635とアダプターのXho I部位とを含む）（実施例II.A.3.c）を単離した。プラスミドベクターpcDNA1をEcoR V及びXho Iによって消化し、アガロースゲルで単離した。３つのDNAフラグメントを結合し、MC1061−P3（Invitrogen,San Diego,CA）を形質転換した。単離クローンを制限マッピング及びDNA配列決定によって分析し、互いに正確に結合したDra I−Hind III、Hind III−Xho I、Xho I−EcoR Vフラグメントを含み、平滑末端Dra I及びEcoR V部位が一緒に結合して環状プラスミドを形成したpVDCC III（Ａ）を同定した。
α1Dサブユニットのアミノ末端は連続する７つの5'メチオニンコドン（配列番号１のヌクレオチド511−531）によってコードされている。この5'部分と２つのリシン残基をコードするヌクレオチド532−537とがpVDCC III（Ａ）から欠失し、有効なリボソーム結合部位（5'−ACCACC−3'）によって置換されてpVDCC III.RBS（Ａ）を形成していた。この構築物の転写物をアフリカツメガエル卵母細胞に注入した発現実験では、組換え電圧依存性カルシウムチャンネル発現レベルがpVDCC III（Ａ）の転写物を注入した卵母細胞の発現レベルに比べて向上していなかった。
B.  α1CサブユニットをコードするDNAの単離
1.  部分的α1C cDNAクローンの参照表
α1Cコーディング配列、α1C翻訳開始及びα1Cの代替スプライス領域を特性決定するために多数のα1C特異的cDNAクローンを単離した。配列番号３は１つのα1Cコーディング配列（α1C-1）と推定アミノ酸配列とを示す。配列番号36はα1C-2と命名した別のスプライス変異体を示す。配列番号４及び５は、α1Cスプライス変異体の可能な２つのアミノ末端をコードしている。配列番号６はIV S3トランスメンブランドメインの代替エキソンをコードしている。他のα1C変異体は配列番号３または36の末端に代えて代替アミノ末端を選択し、及び／または、ヌクレオチド3904−3987に代えて例えば配列番号３の適当な位置に代替エキソン（配列番号６）を挿入することによって構築され得る。更に、別のα1Cスプライス変異体を産生するために、75ヌクレオチドの配列（配列番号３のヌクレオチド1391−1465）を欠失または挿入し得る。
α1C配列を特性決定するために使用したクローンと、特性決定したα1C配列（配列番号３）に対する各クローンのヌクレオチド位置とを以下の表に示す。これらのcDNAクローンの単離及びキャラクタリゼーションに関しては後述する（実施例II.B.2）。
0003628693.tif 000006
＊IMR32 1.86はウサギ心筋カルシウムチャンネルα１サブユニットcDNA配列に比較して73ヌクレオチドの欠失を有している。
＠1.16Gはα1cゲノムクローンである。
2.  実施例II.B.1に記載のクローンの単離及びキャラクタリゼーション
a.  CNS1.30
ヒト視床cDNAライブラリーNo.6（実施例I.B.6）の約１×106の組換え体を、実施例II.A.2.aに記載のウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα1 cDNAのフラグメントによってスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークを同定し、その１つがCNS1.30であつた。CNS1.30をプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。CNS1.30は、ヌクレオチド2199−3903（配列番号３）のα1C特異的配列と、その直後に続く２つの同定された代替α1Cエキソン（配列番号６）の一方のヌクレオチド１−84とをコードしている。配列番号６の3'のCNS1.30はイントロンを含み、従って、CNS1.30は部分的にスプライスされたα1C転写物をコードしている。
b.  1.16G
ウサギ骨格筋cDNAフラグメント（ヌクレオチド−78〜1006、実施例II.A.2.a）を用いてλEMBL3に基づくヒトゲノムDNAライブラリー（Cat＃HL1006d Clontech Corp.,Palo Alto,CA）の約１×106の組換え体をスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。14の陽性プラークを同定し、その１つが1.16Gであつた。クローン1.16Gをプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、部分をDNA配列決定によって特性決定した。DNA配列決定から、1.16Gが実施例II.B.1に記載のようなα1C特異的配列をコードしていることが判明した。
c.  IMR32 1.66及びIMR32 1.67
IMR32 cDNAライブラリー＃５（実施例I.B.5）の約１×106の組換え体を、α1C配列（配列番号３のヌクレオチド758−867）をコードしている1.16G（実施例II.B.2.b）の151bpのKpen I−Sac Iフラグメントでスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを行った。次に、フィルターを65℃の0.5×SSPEで洗浄した。陽性プラークのうちで、IMR32 1.66及びIMR32 1.67を同定した。ハイブリダイズするプラークを精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。これらのcDNAクローンの２つ、IMR32 1.66及び1.67は、記載したような（実施例II.B.1）α1Cサブユニットをコードしている。更に、IMR32 1.66は916ヌクレオチド（配列番号３）の3'のヌクレオチドで始まるGTスプライスドナージヌクレオチドによってマークされる部分的にスプライスされたα1C転写物をコードしている。1.66の内部のイントロン配列は101ヌクレオチドの長さである。IMR32 1.66はヌクレオチド１−３（配列番号３）のα1C翻訳開始をコードしており、5'非翻訳配列の132ヌクレオチド（配列番号４）がIMR32 1.66の開始コドンに先行して存在する。
d.  IMR32 1.37及びIMR32 1.38
IMR32 cDNAライブラリー＃１（実施例I.B.1）の約２×106の組換え体をCNS1.30 cDNAフラグメント（実施例II.B.2.a）によってスクリーニングした。低緊縮性ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。４つの陽性プラークを同定し、プラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、DNA配列決定によって特性決定した。２つのクローンIMR32 1.37及びIMR32 1.38は実施例II.B.1に記載のようなα1C特異的配列をコードしている。
IMR32 1.37とIMR32 1.38とのDNA配列比較から、α1C転写物がIVS3トランスメンブランドメインをコードする２つのエキソンを含むことが判明した。IMR32 1.37はヌクレオチド3904−3987（配列番号３）の単一エキソンを有しており、IMR32 1.38はヌクレオチド3904−3987（配列番号３）とそれに続くヌクレオチド１−84（配列番号６）とから成る２つの並列エキソンを含むように変則的にスプライスされていると考えられる。IVS3領域をコードする２つのエキソンのいずれかを含むようなα1C転写物の代替スプライスは、CNS1.30配列とIMR32 1.37配列との比較によって確認された。CNS1.30は、IMR32 1.37のヌクレオチド2199−3903（配列番号３）と同じ配列に先行されたヌクレオチド１−84（配列番号６）を含んでいる。実施例II.B.2.aに記載されているように、ヌクレオチド１−84（配列番号６）の後にイントロンが続いている。２つの代替エキソンは、CNS1.30及びIMR32 1.37によって示されるヌクレオチド3903（配列番号３）に隣接してスプライスされている。
e.  IMR32 1.86
オリゴヌクレオチドプローブ90−９（配列番号３のヌクレオチド1462−1491）及び90−12（配列番号３のヌクレオチド2496−2520）を用いた重複試験によってIMR32 cDNAライブラリー＃１（実施例I.B.1）をスクリーニングした。IMR32 1.67の3'端（配列番号３のヌクレオチド1717）とCNS1.30の5'端（配列番号３のヌクレオチド2199）との間のα1Cサブユニットをコードするクローンを単離するためにこれらのオリゴヌクレオチドプローブを選択した。ハイブリダイゼーション条件は、50％脱イオン化ホルムアルデヒドを20％に減らした以外は標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）であった。フィルターを低緊縮性条件下（実施例I.C）で洗浄した。３つの陽性プラークを同定し、その１つがIMR32 1.86であった。IMR32 1.86をプラーク精製し、サブクローニングし、制限マッピング及びDNA配列決定によって特性決定した。IMR32 1.86は実施例II.B.1に記載したようなα1C配列をコードしている。DNA配列決定によるキャラクタリゼーションから、IMR32 1.86がウサギ心筋カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするDNAに比較してヌクレオチド2191−2263の73ヌクレオチドの欠失を含むことが判明した〔Mikamiら，（1989）Nature 340:230〕。これらの欠失ヌクレオチドは配列番号３のヌクレオチド2176−2248に対応する。CNS1.30の5'端はIMR32 1.86の3'端にオーバーラップするので、これらの欠失ヌクレオチドのいくつか、即ち配列番号2205−2248はCNS1.30によって占められている。IMR32 1.86中の73ヌクレオチドの欠失のうちの残りの欠失ヌクレオチド（即ち配列番号３のヌクレオチド2176−2204）は、dbcAMP誘発IMR32細胞RNAの核酸増幅分析によって決定された。73ヌクレオチドの欠失は、フレームシフト突然変異であり、従って、修正される必要はない。この領域の正確なヒト配列（CNS1.30のDNA配列及びIMR32細胞RNAの核酸増幅分析によって決定）を標準方法、例えば制限フラグメント置換または部位特異的突然変異誘発によってIMR32 1.86に挿入し得る。
f.  IMR32 1.157
IMR32 cDNAライブラリー＃４（実施例I.B.4）の１×106の組換え体を、α1Cのヌクレオチド50−774（配列番号３）をコードするIMR32 1.67のXho I−EcoR Iフラグメントによってスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）を用いてハイブリダイゼーションを実施した。低緊縮性条件下（実施例I.C）でフィルターを洗浄した。陽性プラークの１つがIMR32 1.157であると同定された。このプラークを精製し、インサートの制限地図を作製し、標準プラスミドベクターpGEM7Z（Promega,Madison,WI）にサブクローニングした。配列決定によってDNAを特性決定した。IMR32 1.157は、ヌクレオチド１−89（配列番号５）で始まりヌクレオチド１−873（配列番号３）が後続したα1C配列の代替5'部分をコードすると考えられる。1.66及び1.157の5'配列の分析を以下に示す（実施例II.B.3）。
3.  α1C翻訳開始部位のキャラクタリゼーション
IMR32 1.157（配列番号５のヌクレオチド57−89、配列番号３のヌクレオチド１−67）及びIMR32 1.66（配列番号４のヌクレオチド100−132、配列番号３のヌクレオチド１−67）の配列の部分をウサギ肺CaCBレセプターcDNA配列、ヌクレオチド−33−67〔Bielら，（1990）FEBS Lett.269:409〕と比較した。ヒト配列は翻訳開始領域をコードするα1C転写物の可能な代替5'端である。IMR32 1.66は、CaCBレセプターcDNA配列に緊密に整合し、CaCBレセプターcDNA配列からヌクレオチド112（配列番号４）で始まる5'方向に分岐する。CaCBレセプターcDNA配列中で同定された開始コドンはα1Cコーディング配列を記述するために使用したヌクレオチド１−３（配列番号３）の開始コドンと同じである。
α1C-1及びα1C-2と命名したα1Cスプライス変異体の配列を配列番号３及び36に示す。
C.  α1Bサブユニットをコードする部分的cDNAクローンの単離及び全長クローンの構築
ヒト脳幹神経節cDNAライブラリーを、ウサギ骨格筋α１サブユニットcDNAフラグメント（フラグメントの記述に関しては実施例II.A.2参照）によって低緊縮性条件下にスクリーニングした。IMR32細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするためにハイブリダイズするクローンの１つを使用し、追加の部分的α1B cDNAクローンを作製し、次にこれを使用してIMR32細胞cDNAライブラリーを更にスクリーニングして追加の部分的cDNAクローンを作製した。部分的IMR32 α1Bクローンの１つをヒト海馬ライブラリーのスクリーニングに使用してα1Bコーディング配列の3'端をコードする部分的α1Bクローンを作製した。cDNA配列の正確度を決定するために部分的cDNAクローンの領域のいくつかの配列をIMR32細胞RNAの核酸増幅分析産物の配列に比較した。
α1BサブユニットをコードするDNAの終結コドンの5'及び3'に位置する配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたIMR32細胞RNAとゲノムDNAとの核酸増幅分析から、IMR2細胞中の代替的にスプライスされたα1BをコードするmRNAが判明した。この第２のmRNA産物は、最初に単離した他の3'α1B cDNA配列に対応するmRNA中に存在しない別のエキソンを含むようにα1Bサブユニット転写物をディファレンシャルスプライシングした結果として得られる。α1Bサブユニットのこれらのスプライス変異体を識別するために、追加のエキソンを含む形態に対応するDNA配列によってコードされたサブユニットをα1B-1（配列番号７）と呼ぶ。他方、追加のエキソンが欠失した形態に対応するDNA配列によってコードされたサブユニットをα1B-2（配列番号８）と呼ぶ。α1B-1の配列は、ヌクレオチド6633（配列番号７）で始まるα1B-2の配列から分岐する。α1B-1中の追加エキソンの配列（配列番号７のヌクレオチド6633−6819）の後のα1B-1及びα1B-2の配列は等しい（即ち、配列番号７のヌクレオチド6820−7362及び配列番号８のヌクレオチド6633−7175）。配列番号７及び８は、α1B-1をコードするDNAの5'非翻訳配列の143ヌクレオチド（ヌクレオチド１−143）と3'非翻訳配列の202ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド7161−7362）及びα1B-2をコードするDNAの3'非翻訳配列の321ヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド6855−7175）を示す。
α1B転写物のIS6領域の核酸増幅分析から、増幅反応の産物を含む臭化エチジウム染色アガロースゲルで観察された多様なフラグメントの大きさに基づく追加のスプライス変異体が存在するらしいことが判明した。
pcDNA−α1B-1と命名した全長α1B-1 cDNAクローンを以下の８段階プロセスで調製した。
段階1:pGEM3（Promega,Madison,WI）のSac I制限部位をSac I部位で消化することによって破壊し、T4 DNAポリメラーゼで処理することによって平滑端を作製し、再結合させた。新しいベクターをpGEMΔSacと命名した。
段階2:フラグメント１（Hind III/Kpn I;配列番号７のヌクレオチド2337−4303）をHind III/Kpn I消化したpGEM3ΔSacに結合してｐα1.177HKを産生した。
段階3:フラグメント１は２つのヌクレオチド欠失（配列番号７のヌクレオチド3852及び3853）を有している。IMR32 RNAの増幅フラグメント（フラグメント２）をｐα1.177HKに挿入することによって欠失を修復した。従って、フラグメント２（Nar I/Kpn I;配列番号７のヌクレオチド3828−4303）をNar I/Kpn I消化したｐα1.177HKに挿入してフラグメント１のNar I/Kpn I部分に置換させ、ｐα1.177HK/PCRを作製した。
段階4:フラグメント３（Kpn I/Kpn I;配列番号７のヌクレオチド4303−5663）をKpn I消化したｐα1.177HK/PCRに結合してｐα1B5'Kを作製した。
段階5:フラグメント４（EcoR I/Hind III;EcoR Iアダプターと配列番号７のヌクレオチド１−2337との連続）及びフラグメント５（ｐα1B5'KのHind III/Xho Iフラグメント；配列番号７のヌクレオチド2337−5446）をEcoR I/Xho I消化したpcDNA1（Invitrogen,San Diego,CA）に結合してｐα1B5'を作製した。
段階6:フラグメント６（EcoR I/EcoR I;両端にEcoR Iアダプターと配列番号７のヌクレオチド5749−7362とが付加されている）を、EcoR I消化したpBluscript II KS（Stratagene,La Jolla,CA）に、フラグメントの5'端をポリリンカー中のKpn I部位に近接させて結合して、ｐα1.230を作製した。
段階7:フラグメント７（Kpn I/Xho I;配列番号７のヌクレオチド4303−5446）及びフラグメント８（Xho I/Csp I;配列番号７のヌクレオチド5446−6259）を、Kpn I/Csp I消化したｐα1.230に結合して（ｐα1.230にコードされた配列番号７のヌクレオチド5749−6259を除去し、配列番号７のヌクレオチド6259−7362を維持する）、ｐα1B3'を作製する。
段階8:フラグメント９（Sph I/Xho I;配列番号７のヌクレオチド4993−5446）及びフラグメント10（ｐα1B3'のXho I/Xba I;配列番号７のヌクレオチド5446−7319）を、Sph I/Xba I消化したｐαB5'に結合して（ｐα1B5'にコードされた配列番号７のヌクレオチド4993−5446を除去し、配列番号７のヌクレオチド１−4850を維持する）、pcDNAα1B-1を作製する。
得られた構築物pcDNAα1B-1はpCDNA1中に、5'非翻訳配列（配列番号７のヌクレオチド１−143）及び3'非翻訳配列（配列番号７のヌクレオチド7161−7319）を付加したα1B-1をコードする全長コーディング領域（配列番号７のヌクレオチド144−7362）を、CMVプロモーターの転写調節下で含んでいる。
D.  ヒトカルシウムチャンネルα1AサブユニットをコードするDNAの単離
1.  部分的クローンの単離
ヒトカルシウムチャンネルα1Aサブユニットの部分をコードするDNAクローンは、ヒト小脳cDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング及びヒト小脳RNAの核酸増幅によって得られた。ランダムにプライムした小脳cDNAライブラリー（長さ2.8kbよりも大きいインサートに関しては大きさ選択）の１×106の組換え体を、低緊縮性条件下（６×SSPE、５×Denhart溶液、0.2％のSDS、200μg/mlの音波処理したニシン精子DNA、42℃）で、ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド6190−6217を含むオリゴヌクレオチド704でスクリーニングすることによって、α1Aコーディング配列の3'端に対応するクローンを単離した〔Starrら，（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5621−5625〕。低緊縮性条件下で洗浄した。プローブにハイブリダイズした複数のクローン（クローンα1.251−α1.259及びα1.244）を精製し、制限酵素マッピング及びDNA配列分析によって特性決定した。少なくとも２つのクローンα1.244及びα1.254は翻訳終結コドンを含んでいた。クローンα1.244とα1.254とは異なる長さを有しているが、双方がα1A転写物の末端の極限の3'端に対応するヌクレオチドの配列を含む。即ち、２つのクローンはオーバーラップしている。これらの２つのクローンは、クローンα1.244がα1.254に存在しない５ヌクレオチドの配列と12ヌクレオチドの配列とを含む以外はオーバーラップ領域で等しい。
追加のα1Aをコードするクローンを得るために、ランダムにプライムした小脳cDNAライブラリーの１×106組換え体（長さ1.0−2.8kbの範囲のインサートに関して大きさで選択）を、３つのオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチド701（ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド2288−2315を含む）、オリゴヌクレオチド702（ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド3559−3585を含む）、及び、オリゴヌクレオチド703（ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド4798−4827を含む）に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングした。洗浄を45℃で行う以外は最初のオリゴヌクレオチド704のスクリーニングに使用した条件と同じ条件を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行った。20のクローン（クローンα1.269−α1.288）がプローブにハイブリダイズした。数個のクローンをプラーク精製し、制限酵素マッピング及びDNA配列分析によって特性決定した。１つのクローンα1.279はコーディング配列の同じ領域に対応する他のクローンに存在しない約170のヌクレオチドの配列を含んでいた。この領域は他のスプライス変異体中に存在するかもしれない。どのクローンも翻訳開始コドンを含んでいなかった。
ヒトα1Aコーディング配列の5'端に対応するクローンを得るために、第１鎖のcDNA合成を特異的にプライムするオリゴヌクレオチド720（配列番号22のヌクレオチド2485−2510を含む）を用いて別の小脳cDNAライブラリーを調製した。ライブラリー（８×105組換え体）を、３つのオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチド701、オリゴヌクレオチド726（ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド2333−2360を含む）、及び、オリゴヌクレオチド700（ラットα1Aコーディング配列のヌクレオチド767−796を含む）に対する低緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件に基づいてスクリーニングした。約50のプラークがプローブにハイブリダイズした。ハイブリダイズするクローンα1.381−α1.390をプラーク精製し、制限酵素マッピング及びDNA配列分析によって特性決定した。少なくとも１つのクローンα1.381は翻訳開始コドンを含んでいた。
精製クローンの配列を位置合わせすると、配列が完全α1Aコーディング配列を含むようにオーバーラップすることが判明した。しかしながら、部分クローンのオーバーラップ配列は、全長α1Aコーディング配列を構築するための部分クローンの結合に使用される適当な酵素制限部位を必ずしも含んではいなかった。全長α1A DNAを構築するときに使用される適当な制限酵素部位を含むDNAフラグメントを得るために、ヒト小脳組織から単離したRNAからcDNAを合成し、核酸増幅処理した。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、選択された制限酵素部位の5'及び3'に位置するヒトα1Aコーディング配列に対応した。従って、最初の増幅反応では、オリゴヌクレオチド753（配列番号22のヌクレオチド2368−2391を含む）及び728（配列番号22のヌクレオチド3179−3202を含む）をプライマー対として使用した。所望のDNAフラグメントを十分な量で提供するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド753及び754（配列番号22のヌクレオチド3112−3135を含む）をプライマー対として用いて再増幅した。得られた産物は長さ768bpであった。第２の増幅反応では、オリゴヌクレオチド719（配列番号22のヌクレオチド4950−4975を含む）及び752（配列番号22のヌクレオチド5647−5670を含む）をプライマー対として使用した。所望の第２のDNAフラグメントを十分な量で提供するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド756（配列番号22のヌクレオチド5112−5135を含む）及び752をプライマー対として用いて再増幅した。得られた産物は長さ559bpであった。
2.  全長α1Aコーディング配列の構築
クローンα1.381と、768bpの核酸増幅産物と、クローンα1.278と、559bpの核酸増幅産物と、クローンα1.244とを、適当な制限部位で結合して、全長α1Aコーディング配列を作製し、α1A-1と命名した。
クローンα1.244とα1.254との配列分析の結果を比較すると、α1Aサブユニット遺伝子の一次転写物が代替的にスプライスされて、α1Aサブユニットの異なる形態をコードする少なくとも２つの変異体mRNAを生じることが判明した。１つの形態α1A-1は配列番号22に示す配列によってコードされている。第２の形態α1A-2をコードする配列は、3'端がクローンα1.244に見出される５ヌクレオチド（配列番号22のヌクレオチド7035−7039）が欠失している点でα1A-1をコードする配列と違っている。この欠失は読み取り枠をシフトさせ、翻訳終結コドンを導入し、その結果として、α1A-1スプライス変異体によってコードされるサブユニットよりも短いα1Aサブユニットをコードするα1A-2コーディング配列となる。従って、α1A-1コーディング配列の3'端の一部分は実際はα1A-2 DNA中の3'非翻訳配列である。クローンα1.381と、768bpの核酸増幅産物と、クローンα1.278と、559bpの核酸増幅産物と、クローンα1.254とを結合することによって構築され得るα1A-2の完全配列を配列番号23に示す。
E.  α1EサブユニットをコードするDNAの単離
ヒトカルシウムチャンネルのα1EサブユニットをコードするDNAをヒト海馬ライブラリーから単離した。選択されたクローンを配列決定した。α1EサブユニットをコードするDNAクローンのDNA配列分析は、同じα1Eサブユニット一次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態が発現されることを示した。１つの形態は配列番号24に示す配列を有しており、α1E-1と命名し、他の形態は配列番号24のヌクレオチド2405と2406との間に57塩基対のフラグメントを挿入することによって得られる配列を有しており、α1E-3と命名した。得られた配列を配列番号25に示す。
α1E-1と命名されたサブユニットは計算分子量254,836を有しており、α1E-3と命名されたサブユニットは計算分子量257,348を有している。α1E-3はα1E-1に比べて、トランスメンブランドメインII S6とIII S1との間の細胞質ループであると考えられる領域に19アミノ酸の挿入（配列番号25によってコードされている）を有している。
実施例III：ヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
A.βサブユニットをコードする部分的cDNAクローンの単離及びβ１サブユニットをコードする全長クローンの構築
ヒト海馬cDNAライブラリーを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットcDNAフラグメント〔ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットcDNAの単離及び配列に関しては米国特許出願第482,384号またはRuthら（1989）Science 245:1115を参照〕によって標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C.）を用いてスクリーニングした。追加のcDNAクローンを得るために、ハイブリダイズする１つのクローンの一部分を使用して海馬ライブラリーを再スクリーニングした。ハイブリダイズするクローンのcDNAインサートを制限マッピング及びDNA配列決定によって特性決定し、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットcDNA配列に比較した。
部分的β１サブユニットcDNAクローンの部分を結合して全β１サブユニットをコードする全長クローンを作製した。配列番号９はβ１サブユニットコーディング配列（ヌクレオチド１−1434）と3'非翻訳配列の一部分（ヌクレオチド1435−1546）とを示す。推定アミノ酸配列も配列番号９に示す。発現実験を実施するために、全長β１サブユニットcDNAクローンを以下のごとく構築した。
段階1:DNAフラグメント１（〜800bpの5'非翻訳配列に配列番号９のヌクレオチド１−277を付加）を、DNAフラグメント２（配列番号９のヌクレオチド277−1546に448bpのイントロン配列を付加）に結合し、pGEM7Zにクローニングした。得られたプラスミドｐβ１−1.18は、448bpのイントロンを含む全長β１サブユニットcDNAクローンを含んでいた。
段階2:pβ１−1.18の5'非翻訳配列をリボソーム結合部位で置換するために、EcoR I部位、リボソーム結合部位をコードする配列（5'−ACCACC−3'）及び配列番号９のヌクレオチド１−25を含む二重鎖アダプターを合成した。Sma I消化したｐβ１−1.18にアダプターを結合し、結合反応の産物をEcoR Iによって消化した。
段階3:EcoR Iアダプターと有効なリボソーム結合部位と配列番号９のヌクレオチド１−1546とイントロン配列とを含む段階２で得られたEcoR Iフラグメントを、プラスミドベクターにクローニングしてｐβ１−1.18RBSと命名した。ｐβ１−1.18RBSのEcoR IフラグメントをEcoR I消化pcDNA1に、開始コドンをCMVプロモーターに近接させてサブクローニングし、pHBCaCHβ1aRBS（Ａ）を作製した。
段階4:イントロン配列の欠失したβ１サブユニットをコードする全長クローンを作製するために、DNAフラグメント３（配列番号９のヌクレオチド66−1146に448bpのイントロン配列とその配列に続く配列番号９のヌクレオチド1147−1546を付加したもの）の部位特異的突然変異を誘発してイントロン配列を欠失させ、これによってｐβ１（−）を作製した。ｐβ１−1.18RBSのEcoR I−Xho Iフラグメント（リボソーム結合部位と配列番号９のヌクレオチド１−277を含む）を、ｐβ１（−）のXho I−EcoR Iフラグメント（配列番号９のヌクレオチド277−1546を含む）に結合し、翻訳開始をCMVプロモーターに近接させてpcDNA1にクローニングした。得られた発現プラスミドをpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）と命名した。
B.スプライス変異体β1-3
β１サブユニットをコードするDNAクローンのDNA配列分析は、CNS中に同じヒトβ１サブユニット一次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態が発現されることを示した。１つの形態は配列番号９に示す配列を有し、β1-2と呼ぶ。β1-2の配列と代替形態β1-3の配列とはヌクレオチド1334（配列番号９）で分岐（diverge）する。3'非翻訳配列（ヌクレオチド1795−1851）を含む完全β1-3（ヌクレオチド１−1851）を配列番号10に示す。
実施例IV：ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
A.  cDNAクローンの単離
完全ヒト神経α２コーディング配列（ヌクレオチド35−3310）と5'非翻訳配列（ヌクレオチド１−34）と3'非翻訳配列の一部分（ヌクレオチド3311−3600）とを配列番号11に示す。
ヒト神経α２サブユニットをコードするDNAを単離するために、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAフラグメント〔ヌクレオチド43−272、Ellisら（1988）Science 240:1661〕を用いたヒトゲノムサザンブロットをプローブすることによって、ヒトα２ゲノムクローンを先ず単離した。ヒトゲノムDNAをEcoR Iで消化し、電気泳動にかけ、ブロットし、標準ハイブリダイゼーション条件（実施例I.C）及び低緊縮性洗浄条件（実施例I.C）を用いてウサギ骨格筋プローブによってプローブした。3.5kb及び3.0kbの２つの制限フラグメントを同定した。これらのEcoR I制限フラグメントを、2.2kb〜4.3kbの範囲のヒトゲノムEcoR Iフラグメントを含むλgt11ライブラリーを調製することによってクローニングした。ライブラリーをウサギα２プローブを用いて上記のようにスクリーニングし、ハイブリダイズするクローンを単離し、DNA配列決定によって特性決定した。HGCaCHα2.20は3.5kbのフラグメントを含み、HGCaCHα2.9は3.0kbのフラグメントを含んでいた。
制限マッピング及びDNA配列決定によれば、HGCaCHα2.20は650bpのPst I−Xba I制限フラグメント上に82bpのエキソン（配列番号11のヒトα２コーディング配列のヌクレオチド130−211）を含み、HGCaCHα2.9は750bpのXba I−Bgl II制限フラグメント上に105bpのエキソン（配列番号11のコーディング配列のヌクレオチド212−316）を含むことが判明した。これらの制限フラグメントを使用してヒト脳幹神経節cDNAライブラリーをスクリーニングした（実施例II.C.2.a）。HBCaCHα2.1を単離し（配列番号11のヌクレオチド29−1163）、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852から得られたヒト脳幹cDNAライブラリー（ATCC受託番号37432）をスクリーニングするために使用した。２つのクローン、HBCaCHα2.5（配列番号11のヌクレオチド１−1162）及びHBCaCHα2.8（配列番号11のヌクレオチド714−1562とこれに続く1600ヌクレオチドの介在配列）を単離した。HBCaCHα2.8の2400bpのフラグメント（配列番号11のヌクレオチド759で始まりイントロンのSma I部位で終わる）を使用して、脳幹ライブラリーを再スクリーニングしHBCaCHα2.11（配列番号11のヌクレオチド879−3600）を単離した。クローンHBCaCHα2.5とHBCaCHα2.11とはオーバーラップして完全ヒト脳α２タンパク質をコードする。
B.  pHBCaCHα2Aの構築
全長ヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするDNAを含むpHBCaCHα2Aを構築するために、HBCaCHα2.5の（EcoR I）−Pvu IIフラグメント（配列番号11のヌクレオチド１−1061、EcoR Iアダプター、Pvu II部分消化物）と、HBCaCHα2.11のPvu II−Pst Iフラグメント（配列番号11のヌクレオチド1061−2424;Pvu II部分消化物）とを、EcoR I−Pst I消化したpIBI24（Stratagene,La Jolla,CA）に結合した。次いで、（EcoR I）−Pst Iフラグメント（配列番号11のヌクレオチド１−2424）を単離し、EcoR I消化したpIBI24中のHBCaCHα2.11のPst I−（EcoR I）フラグメント（配列番号11のヌクレオチド2424−3600）に結合し、全長ヒト脳α２サブユニットをコードするDNA、HBCaCHα２を作製した。HBCaCHα２の3600bpのEcoR Iインサート（配列番号11のヌクレオチド１−3600）をpcDNA1（pHBCaCHα2A）に、メチオニン開始コドンをCMVプロモーターに近接させてサブクローニングした。HBCaCHα２の3600bpのEcoR Iインサートを、SV40初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子、SV40ポリアデニル化部位及びスプライス部位、ベクターを細菌中に維持するために必要な配列を含むpSV2dHFR〔Subramaniら（1981）Mol.Cell.Biol.1:854−864〕にサブクローニングした。
実施例Ｖ
A.ヒトβ１転写物及びヒトα２転写物のディファレンシャルプロセシング
骨格筋、大動脈、海馬と脳幹神経節、及び、HEK293細胞中に存在するヒトβ２転写物の核酸増幅分析によれば、各組織中で配列番号９のヌクレオチド615−781に対応する領域のディファレンシャルプロセシングが判明した。この領域に異なるプロセシングを生じた５つのβ１転写物を与えた４つの異なる配列を同定した。異なる組織に由来のβ１転写物は、HEK293細胞中で発現された１つのβ１転写物（β1-5）で４つの配列全部が欠失している以外は、４つの配列の異なる組み合わせを含んでいた。
どのβ１転写物も４つの配列の各々を含んでいなかった。しかしながら、参照を容易にするために、４つの配列全部を末端同志をつないだ長い単一配列として配列番号12に示す。ディファレンシャルプロセシングされた４つの配列は、配列１（配列番号12のヌクレオチド14−34）、配列２（配列番号12のヌクレオチド35−55）、配列３（配列番号12のヌクレオチド56−190）及び配列４（配列番号12のヌクレオチド191−271）である。同定されたβ１転写物の形態は、（１）β1-1と呼ばれる配列１の欠失した形態（骨格筋で発現される）、（２）β1-2と呼ばれる配列２及び３の欠失した形態（CNSで発現される）、（３）β1-4と呼ばれる配列１、２及び３の欠失した形態（大動脈及びHEK細胞で発現される）、及び、（４）β1-5と呼ばれる配列１−４の欠失した形態（HEK細胞で発現される）を含む。更に、β1-4及びβ1-5は、β1-1及びβ1-2の形態中に欠失しているグアニンヌクレオチド（配列番号12のヌクレオチド13）を含む。β１スプライス変異体の配列を配列番号９、10及び33−35に示す。
B.α２サブユニットをコードする転写物のディファレンシャルプロセシング
完全ヒト神経α２コーディング配列（ヌクレオチド35−3307）と5'非翻訳配列の一部分（ヌクレオチド１−34）と3'非翻訳配列の一部分（ヌクレオチド3308−3600）とを配列番号11に示す。
骨格筋、大動脈及びCNS中に存在するヒトα２転写物の核酸増幅分析によれば、各組織中で配列番号11のヌクレオチド1595−1942に対応する領域のディファレンシャルプロセシングが判明した。
分析は、ヌクレオチド1595−1942に対応するヌクレオチドを含むゲノムDNAの一次転写物が、配列番号11のヌクレオチド1624と1625との間に挿入された追加の配列（配列番号13:5'CCTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTTAAGAAAAAGGAGACCCAATATCCAG3'）を含むことを示した。配列番号11のヌクレオチド1595−1942と、ヌクレオチド1624と1625との間に挿入された配列番号13とを含む一次転写物の領域の１〜３個の異なる部分の有無に起因する差異を生じた５つの選択的スプライス変異体転写物が同定された。種々の組織に由来のα２をコードする５つの転写物は、大動脈中に発現する１つのα２転写物中で３つの配列全部が欠失している以外は、３つの配列の異なる組み合わせを含む。どのα２転写物も３つの配列の各々を含んでいなかった。ディファレンシャルプロセシングされた３つの領域の配列は配列１（配列番号13）、配列２（配列番号11のヌクレオチド1625−1639である5'AACCCCAAATCTCAG3'）及び配列３（配列番号11のヌクレオチド1908−1928である5'CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG3'）で示される。同定された５つのα２形態は、（１）α2aと呼ばれる配列３の欠失した形態（骨格筋で発現される）、（２）α2bと呼ばれる配列１の欠失した形態（CNSで発現される）、（３）α2cと呼ばれる配列１及び２の欠失した形態（大動脈で発現される）、（４）α2dと呼ばれる配列１、２及び３の欠失した形態（大動脈で発現される）、及び、（５）α2eと呼ばれる配列１及び３の欠失した形態（大動脈で発現される）である。
α2a−α2eの配列を夫々配列番号29−32に示す。
実施例VI：ヒト脳cDNAライブラリーからのカルシウムチャンネルγサブユニットをコードするDNAの単離
A.γサブユニットをコードするDNAの単離
ベクターγJ10〔Jay,S.ら（1990）Science 248:490−492〕に含まれているウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットcDNAの484bpの配列（コーディング配列のヌクレオチド621−626に3'−非翻訳配列の438ヌクレオチドを付加したもの）に対するハイブリダイゼーションによって、λgt11に基づくヒト海馬cDNAライブラリー（Clontech catalog＃HL1088b,Palo Alto,CA）に由来の約１×106の組換え体をスクリーニングした。中度の緊縮性条件（20％の脱イオンホルムアミド、５×Denhardt、６×SSPE、0.2％のSDS、20μg/mlのニシン精子DNA、42℃）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、低緊縮性条件下（実施例I.C参照）で洗浄した。このプローブにハイブリダイズしたプラークを精製し、インサートDNAをpGEM7Zにサブクローニングした。このcDNAインサートをγ1.4と命名した。
B.γ1.4のキャラクタリゼーション
γ1.4をDNAハイブリダイゼーションによって確認し、DNA配列決定によって特性決定した。γ1.4の1500bpのSst Iフラグメントはサザンブロットでウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットcDNA γJ10にハイブリダイズした。このフラグメントの配列分析によれば、このフラグメントが約500ヌクレオチドのヒトDNA配列及び〜1000ヌクレオチドのλgt11配列を含むことが判明した（後者の配列が含まれる理由は、λgt11中のEcoR Iクローニング部位の１つの見掛けの破壊が生じるからである。）。ヒトDNA配列は、その直後に翻訳終結コドン及び3'非翻訳配列（配列番号14）を有する129ヌクレオチドのコーディング配列を含む。
ヒトλサブユニットcDNAの残りの5'配列を単離するためには、先ず、ヒトCNS cDNAライブラリー及び／またはヒトCNS組織からのmRNA調製物を、γ1.4のγ DNA特異的配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅分析方法によって検定し得る。追加のヒト神経γサブユニットをコードするDNAは、核酸増幅分析アッセイの結果に基づいて、γ特異的増幅可能cDNAを含むcDNAライブラリーから単離され得る。または、核酸増幅分析アッセイの結果に基づいて、γ特異的増幅可能転写物を含むmRNA調製物からcDNAライブラリーを構築し得る。このようなライブラリーは、ポリA+RNAからの第１鎖のcDNA合成をプライムするためにオリゴdTを用いる標準方法によって構築される（実施例I.B参照）。または、γ1.4中のヒトDNA配列に基づくγ cDNA特異的オリゴヌクレオチドによって第１鎖のcDNAをプライムすることによって第１鎖のcDNAを特定し得る。次にこの第１鎖の合成に基づいてcDNAライブラリーを構築し、γ1.4のγ特異的部分でスクリーニングし得る。
実施例VII：ヒト神経カルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
ヒトカルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするDNAの単離
実施例IIIに記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経カルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするクローンが判明した（β20と命名、配列番号26参照）。このクローンの5'端に基づくオリゴヌクレオチドを使用してヒト海馬cDNAライブラリーをプライムした。低度から中度の緊縮性の条件下（50℃、0.5×SSPEで最終洗浄）でこのβ２クローンでライブラリーをスクリーニングした。複数のハイブリダイズするクローンを単離し配列決定した。これらのクローンとして、β2C、β2D及びβ2Eをコードしているクローンが存在した。例えば、β2Cの配列を配列番号37に示し、β2Eの配列を配列番号38に示す。
次に、ランダムプライムした海馬ライブラリーを、β2DをコードするクローンとATCC受託番号69048で寄託されたβ３クローンの一部分との組み合わせを用いてスクリーニングした。多数のハイブリダイズするクローンが単離された。これらのクローンをβ101、β102及びβ104と命名した。β101はβ２のスプライス変異体の5'端をコードすると考えられ、β2Eと命名した。β102及びβ104はβ２の3'端の部分をコードしている。
β２スプライス変異体が配列番号26のヌクレオチド182−2294を含み、開始コドンと配列番号26の212に対応するヌクレオチドとの間だけが違っている。
実施例VIII：ヒトカルシウムチャンネルβ４及びβ３サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
A.ヒトβ４サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
翻訳開始コドンとβ４コーディング配列の約60％とを含むクローンがヒト小脳cDNAライブラリーから得られた（配列番号27のヌクレオチド１−894参照）。β４コーディング配列の残りの3'部分をコードするDNAを得るために、高緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で核酸増幅産物のハイブリダイゼーションに基づいてヒト小脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。β４サブユニットコーディング配列の3'端に対応する配列と終結コドンとを含むクローンを同定するために、ハイブリダイズするクローンを精製し、制限酵素マッピング及びDNA配列分析によって特性決定する。選択されたクローンをβ４コーディング配列の5'半鎖を含むクローンに適当な制限部位で結合し、β４サブユニットをコードする全長cDNAを作製する。全長β４クローンの配列を配列番号27に示す。アミノ酸配列を配列番号28に示す。
B.ヒトβ３サブユニットをコードするcDNAクローンの単離
実施例IIIに記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経カルシウムチャンネルβ３サブユニットをコードするクローンが判明した。このクローンはプラスミドβ1.42（ATCC受託番号69048）として寄託された。
完全β３サブユニットをコードする全長cDNAクローンを単離するために、ヒト海馬cDNAライブラリー（Stratagene,La Jolla,CA）を、より低い緊縮性のハイブリダイゼーション条件（20％の脱イオンホルムアミド、200μg/mlの音波処理ニシン精子DNA、５×SSPE、５×Denhardt溶液、42℃）及び洗浄条件を用いて、β1-2をコードするcDNAの5'EcoR I−Pst Iフラグメントに対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンの１つは、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドンの双方を含み、β3-1と命名された完全β３サブユニットをコードしている（配列番号19）。cDNAのin vitro転写物を調製し、実施例IX.Dと同様の方法を用いてα1B-1 cDNA及びα2b cDNAの転写物と共にアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。卵母細胞を２電極電圧固定法で記録すると、卵母細胞が有意な電圧依存性の内向きのBa2+電流を示した。
β3-2と命名された別のβ３サブユニットをコードするクローンは、ヒト小脳cDNAライブラリーを、より低い緊縮性の（20％の脱イオンホルムアミド、200μg/mlの音波処理ニシン精子DNA、５×SSPE、５×Denhardt溶液、42℃）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、実施例VIII.Aに記載の核酸増幅産物に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングすることによって得られた。このクローン（配列番号20、β3-2）とβ3-1（配列番号19）と命名された第１β３サブユニットとは5'端に差異を有しており、β３遺伝子のスプライス変異体である。
実施例IX：ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするcDNA及びRNA転写物の哺乳類細胞中での組換え発現
A.ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAのDG44細胞中での組換え発現
1.  DG44細胞の安定なトランスフェクション
コロンビア大学のLawrence Chasinから入手したDG44細胞〔dhfr-チャイニーズハムスター卵巣細胞：例えばUrlaub,G.ら（1986）Som.Cell Molec.Genet.12:555−566参照〕を、CaPO4沈殿法〔Wiglerら（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1371−1376〕によって、トランスフェクト細胞中でポリシストロン性発現／選択を行わせるヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNA（実施例IV参照）を含むpSV2dhfrベクターで安定にトランスフェクトした。発現ベクターに取り込まれた細胞を選択するために、ヒポキサンチンまたはチミジン非含有の10％DMEM培地でトランスフェクタントを増殖させた。この培地で生残能力を示した12のトランスフェクタント細胞系を樹立細胞系とした。
2.  トランスフェクトDG44細胞中のα２サブユニットcDNA発現の分析
ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAを含むpSV2dhfrで安定にトランスフェクトした４つのDG44細胞系から、Birnboim〔（1988）Nuc.Acids Res.16:1487−1497〕の方法で全RNAを抽出した。RNA（レーンあたり〜15μｇ）を１％アガロースホルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、ランダムプライムしたヒト神経カルシウムチャンネルα2 cDNAにハイブリダイズした（ハイブリダイゼーション:50％ホルムアミド、５×SSPE、５×Denhardt、42℃）；洗浄:0.2×SSPE、0.1％SDS、65℃）。ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAを含むpSV2dhfrで安定にトランスフェクトした４つのDG44細胞系から得られた全RNAをノーザンブロット分析すると、４つの細胞系の１つが10mMの酪酸ナトリウムの存在下で２日間増殖させるとα２サブユニットcDNAの転写物に関して予測された大きさ（cDNAの大きさに基づいて5000ヌクレオチド）のハイブリダイズするmRNAを含むことが判明した。酪酸塩は転写を非特異的に誘発し、しばしばSV40初期プロモーターを誘発するために使用される〔Gorman,C ＆ Howard,B.（1983）Nucleic Acids Res.11:1631〕。この細胞系44α２−９はまた、α2 cDNAに基づくプローブハイブリダイズしたα2c DNAの転写物に関して予測された大きさ（5000ヌクレオチド）よりも小さいmRNA種（複数の種）及び大きい（6800ヌクレオチド）mRNA種を産生した。このトランスフェクタントによって産生された5000ヌクレオチド及び6800ヌクレオチドの転写物は、完全α２サブユニットコーディング配列を含み、従って全長α２サブユニットタンパク質を産生する筈である。弱くハイブリダイズする8000ヌクレオチドの転写物が非トランスフェクト及びトランスフェクトの双方のDG44細胞中に存在していた。明らかに、DG44細胞は、カルシウムチャンネルα２サブユニットまたは同様の遺伝子を低レベルで転写する。この内因性α２サブユニット転写物の発現レベルは、ノーザン分析のためにRNAを単離する前に細胞を酪酸塩に接触させた場合にも変わらないことが観察された。
ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットcDNAを含むpSV2dhfrで安定にトランスフェクトされた３つのDG44細胞系から全タンパク質を抽出した。約107個の細胞を50mMのHEPES、1mMのEDTA、1mMのPMSFを含む300μｌの溶液中で音波処理した。等容量の２×のローディング色素〔Laemmli,U.K.（1970）Nature 227:680〕をサンプルに添加し、タンパク質を８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーした。ニトロセルロースをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニット（K.Campbell,University of Iowaから入手）に対するモルモットのポリクローナル抗血清（希釈度1:200）と共にインキュベートし、次いで〔125I〕−プロテインＡと共にインキュベートした。ブロットを−70℃でＸ線フィルムに露光した。トランスフェクト及び非トランスフェクトの双方のDG44細胞から得られたタンパク質の少数のサンプルが、ヒト神経カルシウムチャンネルのα２サブユニットに関して予測された大きさ（130−150kDa）の免疫反応性タンパク質を含んでいた。この免疫反応性タンパク質のレベルは、酪酸ナトリウムの非存在下で増殖させた44α２−９細胞中よりも10mMの酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた44α２−９細胞中で高かった。これらのデータは、44α２−９及び非トランスフェクトDG44細胞の全RNAのノーザン分析で得られた結果と十分な相関関係を有している。44α２−９細胞系はまた、110kDの免疫反応性タンパク質を産生し、これは全長α２サブユニットのタンパク質分解産物であるか、または、α２サブユニットcDNAプローブにハイブリダイズした細胞系中で産生された１つの短い（＜5000ヌクレオチド）mRNAの翻訳産物である。
B.ヒト神経カルシウムチャンネルα１、α２及びβ１サブユニットをコードするDNAのHEK細胞中の発現
ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAでヒト胚性腎細胞（HEK293細胞）を一過的及び安定にトランスフェクトした。個々のトランスフェクタントについて、電圧活性化バリウム電流及び機能性組換え電圧依存性カルシウムチャンネルの存在を電気生理学的に分析した。
1.  HEK293細胞のトランスフェクション
ヒト神経カルシウムチャンネルα1D、α２及びβ１サブユニットをコードするDNAを含む個別の発現ベクター、即ちプラスミドpVDCC III（Ａ）、pHBCaCHα2A及びpHBCaCHβ1aRBS（Ａ）を夫々、実施例II.A.3、IV.B及びIII.B.3に記載のように構築した。これらの３つのベクターを使用してHEK293細胞を一過的にコトランスフェクトした。HEK293細胞の安定なトランスフェクションのためには、β１サブユニットをコードするDNAを細胞に導入するためにpHBCaCHβ1aRBS（Ａ）に代えてpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）（実施例III.B.3）を、pVDCC III（Ａ）及びpHBCaCHα2Aと共に使用した。
a.一過的トランスフェクション
発現ベクターpVDCC III（Ａ）、pHBCaCHα2A及びpHBCaCHβ1aRBS（Ａ）を、HEK293細胞（ATCC受託番号CRL1573）の２組の一過的トランスフェクションに使用した。一方のトランスフェクション手順では、HEK293細胞を、α１サブユニットcDNA発現プラスミド、α２サブユニットcDNA発現プラスミド、β１サブユニットcDNA発現プラスミド及びプラスミドpCMVβgal（Clontech Laboratories,Palo Alto,CA）によって一過的にコトランスフェクトした。プラスミドpCMVβgalはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターに融合したlacZ遺伝子（大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする）を含んでおり、この遺伝子は、トランスフェクション効率をモニターするマーカー遺伝子としてトランスフェクションに参加した。他方のトランスフェクション手順では、HEK293細胞を、α１サブユニットcDNA発現プラスミドpVDCC III（Ａ）及びpCMVβgalによって一過的にコトランスフェクトした。双方のトランスフェクションで、10cmの組織培養皿中で２〜４×106のHEK293細胞を、実験に使用した５μｇの各プラスミドによって、標準CaPO4沈殿トランスフェクション手順に従って一過的にコトランスフェクトした（Wiglerら（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373−1376）。β−ガラクトシダーゼとＸ−gal基質とを用いる反応の産物の直接染色〔Jones,J.R.（1986）EMBO 5:3133−3142〕及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定〔Miller,J.H.（1972）Experiments in Molecular Genetics,pp.352−355,Cold Spring Harbor Press〕によってトランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼ発現を分析した。これらのトランスフェクタント中のサブユニットcDNAの発現を評価するために、サブユニット転写物産生（ノーザン分析）、サブユニットタンパク質産生（細胞溶解液のイムノブロット分析）及び機能性カルシウムチャンネル発現（電気生理学的分析）について細胞を分析した。
b.安定なトランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション手順〔Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Wiley Inter−Science,Supplement 14,Unit 9.1.1−9.1.9（1990）〕を用いてHEK293細胞をトランスフェクトした。各々が１〜２×106のHEK293細胞を収容した10cmの培養皿に、５μｇのpVDCC III（Ａ）、５μｇのpHBCaCHα2A、５μｇのpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）、５μｇのpCMVBgal及び１μｇのpSV2neo（選択マーカーとして）を含む1mlのDNA/リン酸カルシウム沈殿物をトランスフェクトした。500μｇのG418を含む培地中で10〜20日間増殖させた後、コロニーが形成されたので、クローニングシリンダーを用いて単離した。
2.  ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを一過的にトランスフェクトしたHEK293細胞の分析
a.β−ガラクトシダーゼ発現の分析
細胞溶解物（実施例VII.A.2に記載の手順で調製）のβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（Miller,J.H.,（1972）Exeriments in Molecular Genetics,pp.352−355,Cold Spring Harbor Press）及び固定細胞の染色（Jones,J.R.（1986）EMBO 5:3133−3142）によって、一過的トランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼの発現を検定した。これらのアッセイの結果は、HEK293細胞の約30％がトランスフェクトされたことを示した。
b.ノーザン分析
α１、α２及びβ１サブユニットの各々をコードするDNAとlacZ遺伝子を用いるかまたはα１サブユニットとlacZ遺伝子とを用いて一過的にトランスフェクトしたHEK293細胞からInvitrogen Fast Trank Kit（Invitrogen,San Diego,CA）を用いてポリＡ＋ RNAを単離した。RNAをアガロースゲルで電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。次にニトロセルロースを以下の放射性標識プローブの１つ以上とハイブリダイズさせた:lacZ遺伝子、ヒト神経カルシウムチャンネルα1DサブユニットをコードするcDNA、ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするcDNAまたはヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするcDNA。α１サブユニットをコードするcDNAとハイブリダイズした２つの転写物が、α１、α２及びβ１サブユニットの各々をコードするDNAとlacZ遺伝子とによってトランスフェクトされたHEK293細胞中及びα１サブユニットcDNAとlacZ遺伝子とによってトランスフェクトされたHEK293細胞中で検出された。１つのmRNA種はα１サブユニットcDNAの転写物に関して予測された大きさ（8000ヌクレオチド）を有していた。第２のRNA種はこの転写物に関して予測された大きさよりも小さかった（4000ヌクレオチド）。lacZ遺伝子の転写物であると予測される大きさのRNAは、α１、α２及びβ１サブユニットをコードするcDNAとlacZ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞中及びα１サブユニットcDNAとlacZ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞中で、lacZ遺伝子配列に対するハイブリダイゼーションによって検出された。
また、α１、α２及びβ１サブユニットをコードするcDNAとlacZ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞のRNAはα２及びβ１サブユニットのcDNAプローブとハイブリダイズした。２つのmRNA種がα２サブユニットcDNAプローブにハイブリダイズした。１つの種はα２サブユニットcDNAの転写物であると予測された大きさ（4000ヌクレオチド）を有していた。他方の種はこの転写物に関して予測された大きさよりも大きかった（6000ヌクレオチド）。α１、α２及びβ１サブユニットをコードするcDNAとlacZ遺伝子とによってコトランスフェクトされた細胞中の多数のRNA種はβ１サブユニットcDNAプローブにハイブリダイズした。βサブユニットcDNA発現ベクターが２つのポリA+付加可能部位を含むので、種々の大きさのβサブユニット転写物が多数産生された。
c.電気生理学的分析
パッチ固定法〔Hamillら（1981）Pflugers Arch.391:85−100〕の全細胞変法を用い、一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞の各々について、電圧依存性バリウム電流を検定した。これらの実験の陰性対照として、pCMVβgalだけで一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞のバリウム電流を検定した。細胞を電流キャリアーとして作用するバリウムイオン含有の浴液に配置した。ナトリウムまたはカリウムチャンネルを流れる電流を除去するために浴液の主要塩成分としてNaClまたはKClの代わりに塩化コリンを使用した。浴液は1mMのMgCl2を含有し、10mMのHEPESでpH7.3に緩衝した（pHを水酸化ナトリウムまたは水酸化テトラエチルアンモニウムで調整した）。135mMのCsCl、1mMのMgCl2、10mMのグルコース、10mMのEGTA、4mMのATP及び10mMのHEPESを含む溶液（水酸化テトラエチルアンモニウムでpHを7.3に調整）をパッチピペットに充填した。セシウムイオン及びテトラエチルアンモニウムイオンは殆どの型のカリウムチャンネルを遮断する。ピペットはSylgard（Dow−Corning,Midland,MI）でコートされ、１−４メガオームの抵抗を有していた。IBM互換性PCのLabmaster（Scientific Solutions,Solon,OH）データ取得ボードとインタフェースしたAxopatch IC（Axon Instruments,Foster Dity,CA）増幅器によって500メガオームのヘッドステージ抵抗器を通る電流を測定した。pClamp（Axon Instruments）を使用して電圧コマンドを発生させ、データを取得した。データをpClampまたはQuattro Professional（Borland International,Scotts Valley,CA）プログラムで分析した。
薬剤を付加するために、試験中の細胞から数マイクロメーター以内に配置された「吹管（puffer）」ピペットを使用し圧力を加えて溶液を付加した。薬理学的キャラクタリゼーションに使用される薬剤を浴液と同じ溶液に溶解した。DMSO中で調製したBay K 8644（RBI,Natick,MA）の10mMのストック溶液のサンプルを付加する前に、15mMのBa+2を含有する浴液で最終濃度１μＭに希釈した。
21の陰性対照HEK293細胞（lacZ遺伝子発現ベクターpCMVβgal単独で一過的にトランスフェクトした）を、電流を記録するパッチクランプ法の全細胞変法によって分析した。１つの細胞だけが識別可能な内向きのバリウム電流を示した。この電流は１μＭのBay K 8644の存在によって影響されなかった。更に、Ba2+電流を示さなかった４つの細胞にBay K 8644を付加してもいかなる電流も出現しなかった。
α１、α２及びβ１サブユニットをコードするcDNAとlacZ遺伝子とによるHEK293細胞の一過的トランスフェクションの２日後に、個々のトランスフェクタントの電圧依存性バリウム電流を検定した。９つのトランスフェクタントで電流が記録された。１つの細胞のトランスフェクション効率は別の細胞のトランスフェクション効率とは異なっているので、個々のトランスフェクタント中の異種タンパク質の発現の程度は一様でなく、異種DNAを取り込まない細胞または発現しない細胞もある。これらの９個のトランスフェクタントのうちの２つで内向きのバリウム電流が検出された。これらのアッセイにおいて、膜の静止電位は−90mVであった。膜を一連の電圧段階で種々の試験電位に脱分極し、１μＭのBay K 8644の存在下及び非存在下の電流を記録した。内向きのバリウム電流の量はBay K 8644の付加によって有意に増加した。内向きのバリウム電流の最大値（〜160pA）は、１μＭのBay K 8644の存在下で膜を0mVに脱分極したときに記録された。Bay K 8644の非存在下及び存在下の夫々の場合の各脱分極後に記録された最大電流対脱分極電圧をプロットすることによってＩ−Ｖ曲線を作成し、双方の曲線を比較すると、Bay K 8644の存在下で電圧活性化電流が増加することが判明した。
α１、α２及びβ１サブユニットをコードするcDNA及びlacZ遺伝子によってトランスフェクトされたHEK293細胞中のBay K 8644の存在下に発生した電流の軌跡中に顕著なテール電流が検出されたが、これはこのトランスフェクタントで記録された電圧活性化バリウム電流の原因である組換えカルシウムチャンネルがDHP感受性であると考えられることを示す。
内向きのバリウム電流を示した２つのトランスフェクト細胞のうちの第２の細胞は、膜を−90mVから脱分極したときに〜50pAの電流を示した。この電流は、確認されたカルシウムチャンネルブロッカーである200μＭのカドミウムによってほぼ完全に遮断された。
α１サブユニットをコードするDNAとlacZ遺伝子とによって一過的にトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの２日後に全細胞パッチ固定法によって分析した。これらの細胞の１つは30pAの内向きのバリウム電流を示した。この電流は１μＭのBay K 8644の存在下で２倍に増幅された。更に、Bay K 8644の存在下で小さいテール電流が検出された。これらのデータは、HEK293細胞中のヒト神経カルシウムチャンネルα1DサブユニットをコードするcDNAの発現が機能性DHP感受性カルシウムチャンネルを生じることを示す。
3.  ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞の分析
一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞の電気生理学的分析に関する記載（実施例VII.B.2.c）と同様にして、安定にトランスフェクトされた個々のHEK293細胞の電圧依存性バリウム電流の存在を電気生理学的に分析した。サイクリックAMP依存性キナーゼ媒介リン酸化〔Perzerら（1990）Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.114:107−207〕を介してカルシウムチャンネル活性を最大にするために、cAMP（Na塩、250μＭ）をピペット溶液に添加し、いくつかの記録採取では浴液にフォルスコリン（10μＭ）を添加した。これらの化合物の有無にかかわりなく定性的に同様の結果が得られた。
Bay K 8644（１μＭ）の非存在下及び存在下で安定にトランスフェクトされた細胞からバリウム電流が記録された。細胞をBay K 8644の非存在下で−90mVの静止電位から−10mVまで脱分極させると、急速に失活するテール電流を伴う約35pAの電流が記録された。Bay K 8644を添加したときは、同様の脱分極プロトコルで、テール電流の上昇及び延長を伴う約75pAの電流が誘発された。この同じ細胞から記録された電流のピーク量を一連の脱分極電圧の関数として評価した。Bay K 8644の存在下の応答が増加しただけでなく、電流−電圧関係全体が約−10mVシフトした。従って、Bay K 8644の典型的な３つの特徴、即ち電流量の増加、テール電流の延長及び活性化電流の負シフトが観察され、これらは明らかに、安定にトランスフェクトされた細胞中のDHP感受性カルシウムチャンネルの発現をと示す。非トランスフェクトHEK293細胞中ではcAMPまたはフォルスコリンの有無にかかわりなく、Bay K 8644のこのような効果は全く観察されなかった。
C.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするDNAを発現するためのpCMVに基づくベクター及びpcDNA1−に基づくベクターの使用
1.  構築物の調製
pCMVを用いて追加の発現ベクターを構築した。pVDCC III（Ａ）からの全長α1D cDNA（実施例II.A.3.d）、HBCaCHα２からの3600bpのEcoR Iフラグメントに含まれた全長α2 cDNA（実施例IV.B）及びpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）からの全長β１サブユニットcDNA（実施例III.B.3）を、プラスミドpCMVβgalに個別にサブクローニングした。lacZ遺伝子を除去するためにプラスミドpCMVβgalをNot Iで消化した。pCMVと呼ばれるプラスミドの残りのベクター部分のNot I部位に平滑末端を与えた。個別のEcoR Iフラグメントに含まれた全長α２をコードするDNA及びβ１をコードするDNAを単離し、平滑末端を与え、pCMVの平滑末端を有するベクターフラグメントに個別に結合させ、pCMV中のCMVプロモーターとSV40ポリアデニル化部位との間にcDNAを配置した。α1DをコードするcDNAをpCMVと結合するために、CMVプロモーターの5'に直結するポリリンカー及びSV40ポリアデニル化部位の3'に直結するポリリンカー中の制限部位をpCMVから除去した。Not I部位に１つのポリリンカーを付加した。このポリリンカーは制限酵素認識部位に以下の配列を有していた：
0003628693.tif 000007
pVDCC III（Ａ）からBamH I/Xho Iとして単離されたα1DをコードするDNAを次に、CMVプロモーターとSV40ポリアデニル化部位との間に配置するためにXba II−Sal I消化したpCMVに結合した。
プラスミドpCMVはpcDNA1と同様にCMVプロモーターを含んでいるが、挿入されたサブユニットをコードするDNAに対するスプライスドナー／スプライスアクセプターの位置がpcDNA1とは違っている。スプライスドナー／スプライスレセプターの部位はCMVプロモーターの3'及びサブユニットをコードするDNAの開始コドンの5'に位置している。サブユニットをコードするDNAをpcDNA1に挿入した後、スプライスドナー／スプライスアクセプターの部位はサブユニットcDNA終結コドンの3'に位置している。
2.  HEK293細胞のトランスフェクション
実施例VII.B.1.aに記載したように、HEK293細胞を、pCMV中のα1D、α２及びβ１サブユニットをコードするDNAまたはpcDNA1中のα1D、α２及びβ１サブユニットをコードするDNA（夫々ベクターpVDCC III（Ａ）、pHBCaCHα2A及びpHBCaCHβ1bRBS（Ａ））によって一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクション効率の測定手段として各トランスフェクションにプラスミドpCMVβgalを導入した。トランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は（実施例VII.B.2参照）、HEK293細胞がpCMV−及びpcDNA1−に基づくプラスミドによって等しい効率でトランスフェクトされたことを示した。しかしながら、現在では、カルシウムチャンネルレセプター発現のためにはpcDNA1に基づくプラスミドが好ましいとされている。
D.ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするRNAのアフリカツメガエル卵母細胞中での発現
in vitro調製されたヒト神経α1D、α２及びβ１サブユニットをコードするDNAの転写物の種々の組み合わせをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。α1Dを含む組み合わせを注入した卵母細胞は電圧活性化バリウム電流を示した。
1.転写物の調製
mCAP mRNA CAPPING KIT（Stratagene,La Jolla,CA catalog＃200350）の指示に従って、ヒト神経カルシウムチャンネルα1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を合成した。pcDNA1とリボソーム結合部位で始まるα1D cDNAとコーディング配列の８番目のATGコドンとを含むプラスミドpVDCC III.RBS（Ａ）（実施例III.A.3.d参照）、pcDNA1とα２サブユニットcDNAをと含むプラスミドpHBCaCHα1A（実施例IV参照）、及び、pcDNA1とイントロン配列が欠失しリボソーム結合部位を含むβ1 DNAとを含むプラスミドpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）（実施例III参照）を、制限消化によって直鎖化した。α1D cDNA及びα２サブユニットをコードするプラスミドをXho Iで消化し、β１サブユニットをコードするプラスミドをEcoR Vで消化した。DNAインサートをT7 RNAポリメラーゼによって転写した。
2.卵母細胞の注入
アフリカツメガエル卵母細胞を単離し、コラゲナーゼ処理によって濾胞を除去し、100mMのNaCl、2mMのKCl、1.8mMのCaCl2、1mMのMgCl2、5MのHEPES,pH7.6、20μg/mlのアンピシリン及び25μg/mlのストレプトマイシン中に19〜25℃で注入後２〜５日間維持した後、記録採取した。卵母細胞に注入された各転写物に、細胞あたり6ngの特異的mRNAを注入し、総量50nlとした。
3.細胞内電圧記録
注入卵母細胞の電圧依存性バリウム電流を、２電極電圧固定法〔Dascal,N.（1987）CRC Crit.Rev.Biochem.22:317〕を用いて試験した。電圧コマンドを発生しデータを取得して分析するために、pClamp（Axon Instruments）ソフトウエアパッケージを、Labmaster 125kHzのデータ取得インターフェースと共に使用した。この分析にはQuattro Professionalも使用した。電流信号を１−5kHzでディジタル化し、適宜濾過した。浴液は、40mMのBaCl2、36mMのテトラエチルアンモニウムクロリド（TEA−Cl）、2mMのKCl、5mMの４−アミノピリジン、0.15mMのニフルミン酸（niflumic acid）、5mMのHEPES,pH7.6を含んでいた。
a.ヒト神経カルシウムチャンネルα１、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の電気生理学的分析
非注入の卵母細胞を２電極電圧固定法によって試験すると、７つの分析細胞中の１つの細胞だけで極めて小さい（25nA）内因性の内向きBa2+電流が検出された。
α1D、α２及びβ１サブユニット転写物を同時注入した卵母細胞は、−90mVまたは−50mVの静止電位から膜を脱分極させると、内向きのバリウム電流（154±129nA,n＝21）が持続した。これらの電流は典型的には、140〜700msec.の試験パルスを投与したときに失活をほとんど示さなかった。一連の電圧に脱分極すると、電流は約−30mVで初めて出現し約0mVでピークになることが判明した。
DHP Bay K 8644を添加すると、電流量が増加し、細胞の脱分極のときに存在するテール電流の持続が延長し、電流活性化に超分極シフトが誘発された。Bay K 8644をDMSO中のストック溶液から新しく調製し、還流ポンプを停止させながら60μｌの浴に10×濃縮物として直接導入した。細胞と接触する最終希釈薬剤溶液のDMSO濃度は0.1％を決して超過しなかった。対照実験は、0.1％のDMSOが膜電流に全く影響しないことを示した。
DHPアンタゴニストであるニフェジピンの添加（DMSO中で調製しBay K 8644の添加に関して記載したように細胞に付加）は、α1D、α２及びβ１サブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流のかなりの部分（91±６％,n＝７）を遮断した。内向きのバリウム電流の残留失活性分は典型的にはニフェジピン添加後に残存していた。内向きのバリウム電流は、50μＭのCd2+によって完全に遮断されたが、100μＭのNi2+によれば約15％遮断されただけであった。
α1D、α２及びβ１サブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流に対するωCgTXの効果を試験した。キャリアータンパク質として作用させるために、ωCgTX（Bachem,Inc.,Torrance CA）を0.1％のシトクロムＣ（Sigma）を加えた15mMのBaCl2浴液中で調製した。対照実験は、シトクロムＣが電流に全く影響しないことを示した。−90mVの静止電位から0mVまでの一連の電圧パルスを20msec.間隔で記録した。二価カチオンによるωCgTX結合の阻害を減少させるために、15mMのBaCl2、73.5mMのテトラエチルアンモニウムクロリドと40mMのBa2+記録溶液に等しい残りの成分中で記録を採取した。テール電流の延長によって識別されるDHP感受性電流成分に対するωCgTXの効果を判定するために、ωCgTXの添加に先立ってBay K 8644を細胞に添加した。比較的高い濃度（10−15μＭ）のωCgTXによって内向きのバリウム電流は弱く（54±29％,n＝７）且つ可逆的に遮断された。試験電流及び随伴するテール電流はωCgTXの添加後２〜３分以内に徐々に遮断されたが、ωCgTXを浴から洗浄除去すると双方が部分的に回復した。
b.ヒト神経カルシウムチャンネルα1Dをコードする転写物単独またはα1Dと他のサブユニットとをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析
α1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流に対するα２及びβ１サブユニットの貢献度を、α1Dサブユニット単独による発現及びβ１サブユニットまたはα２サブユニットとの併用による発現によって評価した。α1D cDNAの転写物単独を注入した卵母細胞では、Ba2+電流が全く検出されなかった（ｎ＝３）。α1D及びβ１のcDNAの転写物を注入した卵母細胞では、−90mVの静止電位から膜を脱分極したときにα1D、α２及びβ１のcDNAの転写物を注入した細胞で観察される電流に類似の小さい（108±39nA）Ba2+電流が検出されたが、電流量は少なかった。α1DをコードするDNA及びβ１をコードするDNAの転写物を注入した４つの卵母細胞のうちの２つでは、Ba2+電流はBay K 8644に対して、α1D、α１−、α２−及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞で発現されたBa2+電流のBay K 8644感度と同様の感度を示した。
α1D及びα２サブユニットをコードする転写物を注入した５つの卵母細胞のうちの３つでは、−90mVの静止電位から膜を脱分極したときに極めて小さいBa2+電流（15−30nA）を示した。これらのバリウム電流はBay K 8644に殆どまたは全く反応しなかった。
c.ヒト神経カルシウムチャンネルα２及び／またはβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析
α1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で検出された内向きのバリウム電流に対するα1Dα１−サブユニットの貢献度を評価するために、ヒト神経カルシウムチャンネルα２及び／またはβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞のバリウム電流を検定した。α２サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は検出可能な内向きのバリウム電流を全く示さなかった（ｎ＝５）。β１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は脱分極されると測定可能な（54±23nA,n＝５）内向きのバリウム電流を示したが、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は、β１をコードするDNA単独の転写物を注入した卵母細胞で検出されたよりも約50％大きい（80±61nA,n＝18）内向きのバリウム電流を示した。
β１サブユニットをコードする転写物またはα２とβ１との双方のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は典型的には、膜が−90mVの静止電位から−30mVまで脱分極したときに最初に観察され、膜が10〜20mVに脱分極したときにピークを示した。巨視的には、α２とβ１との双方のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流とβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流とを識別することはできなかった。α1D、α２及びβ１サブユニットcDNAの転写物を同時注入した卵母細胞中の電流と対比して、これらの電流は、試験パルス中に有意な失活を示し静止電位に対して強力な感度を示した。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は通常は、140msecのパルス中にピーク量の10〜60％まで失活し、α1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中の電流よりも静止電位に対する感度が有意に増加していた。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞の膜の静止電位を−90mVから−50mVに変化させると、これらの細胞の内向きのバリウム電流の量が約81％（ｎ＝11）減少した。これに対比して、α1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で測定された内向きのバリウム電流は静止電位を−90mVから−50mVに変化させたときに約24％（ｎ＝11）減少した。
α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流はα1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で観察された内向きのバリウム電流とは薬理学的に違っていた。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞はBay K 8644に不感受性の内向きのバリウム電流を示した（ｎ＝11）。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中でニフェジピンの静止電位感度及び電流が観察されたので、ニフェジピン感度の測定は難しい。しかしながら、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した２つの卵母細胞は−50mVの静止電位から脱分極したときに測定可能な（25〜45nA）の内向きのバリウム電流を示した。これらの電流はニフェジピン（５〜10μＭ）に感受性でなかった。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の内向きのバリウム電流は重金属に対して、α1D、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中で検出された電流と同じ感度を示した。
ヒト神経α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中で検出された内向きのバリウム電流は、非注入のアフリカツメガエル卵母細胞中のカルシウム電流に類似する薬理学的及び生物物理学的特性を有していた。このヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットのアミノ酸はトランスメンブランドメインを形成し得る疎水性セグメントが欠失しているので、組換えβ１サブユニット単独でイオンチャンネルを形成し得るとは考え難い。むしろ、卵母細胞中に相同内因性α１サブユニットが存在し、このようなα１サブユニットによって媒介される活性がヒト神経β１サブユニットの発現によって強化される可能性が高い。
E.ヒト神経カルシウムチャンネルα1B、α2B及びβ1-2サブユニットをコードするDNAのHEK細胞中での発現
1.  HEK細胞のトランスフェクション
ヒト神経α1B-1、α2b及びβ1-2サブユニットの一過的発現をHEK293細胞中で試験した。５％の限定補充したウシ胎仔血清（Hyclone）とペニシリンＧ（100U/ml）及び硫酸ストレプトマイシン（100μg/ml）とを含むダルベッコの改質イーグル培地（Gibco）中でHEK293細胞を単層培養物として増殖させた。HEK293細胞のトランスフェクションを前述のようにリン酸カルシウムによって媒介した。トランスフェクトした細胞の電圧依存性Ca2+チャンネルによって媒介される内向きのバリウム電流（IBa）を試験した。
ポリリシンをコートしたプレートあたり２×106の細胞をトランスフェクトした。標準トランスフェクション（10cmの皿）は、８μｇのpcDNAα1B-1、５μｇのpHBCaCHα2A、２μｇのpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）（実施例II.A.3、IV.B及びIII参照）及び２μｇのCMVβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド及び20μg/mlの一定質量を維持するためのpUC18とを含んでいた。トランスフェクションの48〜72時間後に細胞を分析した。β−ガラクトシダーゼ活性に対するin situ組織化学染色（Sanesら（1986）EMBO J.,5:3133）によって測定したトランスフェクション効率（±10％）は概して50％を上回っていた。
2.トランスフェクタント電流の電気生理学的分析
a.材料及び方法
組換え発現されたCa2+チャンネルの特性を全細胞パッチ固定法によって試験した。トランスフェクションの２〜３日後にトランスフェクトHKE293細胞において記録を採取した。記録採取の24時間前に、ポリリシンをコートした35mmの組織培養皿（Falcon,Oxnard,CA）あたり100,000〜300,000の細胞を平板培養した。水酸化テトラエチルアンモニウム（浴液）で調整した10mMのBaCl2、125mMの塩化コリン、1mMのMgCl2及び10mMのHepes（pH＝7.3）で細胞を潅流した。水酸化テトラエチルアンモニウムで調整した135mMのCsCl、10mMのEGTA、10mMのHepes、4mMのMg−アデノシン三リン酸（pH＝7.5）をピペットに充填した。Sylgard（Dow−Corning,Midland,MI）コートし、火炎研磨し、充填したピペットは、gigohmのシールを細胞に設ける前には１〜２メガオームの抵抗を有していた。
Bay K 8644及びニフェジピン（Research Biochemicals,Natick,MA）をストック溶液（ジメチルスルホキシド中）から調製し、浴液に希釈した。細胞と接触する最終薬剤溶液中のジメチルスルホキシドの濃度が0.1％を超過することはなかった。対照実験は、0.1％のジメチルスルホキシドが膜電流に全く影響しないことを示した。ωCgTX（Bachem,Inc.,Torrance,CA）を、キャリアータンパク質として作用する0.1％のシトクロムＣ（Sigma,St.Louis,MO）を加えた15mMのBaCl2浴液中で調製した。対照実験はシトクロムＣが電流に全く影響しないことを示した。これらの薬剤を浴液に溶解し、所与の実験の必要に応じた吹管ピペットによって連続的に添加した。室温で（22℃〜25℃）、記録採取を行った。典型的には２〜3.5メガオームのピペットアクセス抵抗に起因する電圧誤差を最小にするための直列抵抗補償（70〜85％）を使用した。0.5〜3kHzの範囲のサンプリング速度の1/4〜1/5の周波数で電流信号を濾過した（−3dB,4極Bessel）。電圧コマンドを発生させ、データをCLAMPEX（pClamp,Axon Instruments,Foster City,CA）で取得した。報告された全データを直線状リーク及び容量成分に対して補正した。CLAMPFIT（Axon Instruments,Foster City,CA）によって電流を指数調整（exponential fit）を行った。
b.結果
トランスフェクタントの流入Ba2+電流（IBa）を試験した。α1B-1、α2b及びβ1-2サブユニットをコードするDNAでコトランスフェクトした細胞は高い電圧活性化Ca2+チャンネルを発現した。IBaは膜が−90mVの静止電位から−20mVに脱分極したときに最初に出現し、10mVでピーク量に到達した。95細胞中の39の細胞が（12の独立トランスフェクション）30〜2700pAの範囲の平均433pAのIBaを有していた。平均電流密度は26pA/pFであり、最大密度は150pA/pFであった。典型的にはIBaは記録採取の最初の５分間で２〜20倍に増加した。長期間の記録採取中には反復する脱分極によってIBaの減少が生じたが、この減少は通常は10分以内で20％を超過することはなかった。IBaは典型的には10分以内に活性化され、46〜105msの範囲の高速時定数及び291〜453ms（ｎ＝３）の範囲の低速時定数の双方で失活した。失活は、複合的な電圧依存性を示し、≧20mVで誘発されたIBaは、より低い試験電圧で誘発されたIBaよりも遅く失活した。その理由は恐らく、高い試験電圧では高速失活成分に比べて低速失活成分の量が増加しているためであろう。
組換えα1B-1α2bβ1-2チャンネルは静止電位に感受性であった。多様な静止電位における30〜60秒のコンディショニング後に測定したIBaの定常状態の失活は−60mVと−70mVの間の静止電位では約50％であり、−40mVの静止電位では約90％であった。失活したIBaの回復は通常は不完全であり、静止電位をより大きい負の電位に戻した後１分以内では初期量の55〜75％であった。これはある程度の減少が存在すること、即ち低速の回復が存在することを示す。
組換えα1B-1α2bβ1-2チャンネルはまた、実験の時間規模中に0.5〜10μＭの範囲の濃度のω−CgTxによって不可逆的に遮断された。５μＭの毒素（ｎ＝７）を添加すると２分以内に活性が完全に遮断され、浴からω−CgTxを洗浄した後も15分間はIBaの回復が観察されなかった。d2+の遮断（50μＭ）は速く完全で可逆的であった。DHP Bay K 8644（１μM;n＝４）またはニフェジピン（５μM;n＝３）は識別可能な影響を与えることはなかった。
組換えα1B-1、α2b及びβ1-2サブユニットをコードするDNAでコトランスフェクトした細胞は、主として単一クラスの飽和可能な高親和性ω−CgTx結合部位を示した。測定された解離定数（Kd）の値は54.6±14.5pM（ｎ＝４）であった。β−ガラクトシダーゼをコードするDNAまたはα2bβをコードするDNAだけを含むベクターでトランスフェクトした細胞は特異的結合を全く示さなかった。α1B-1α2bβトランスフェクト細胞の結合容量（Bmax）は細胞あたり28,710±11,950部位（ｎ＝４）であった。
これらの結果は、α1B-1α2bβ1-2トランスフェクト細胞が高電圧で活性化されるCa2+チャンネル活性を発現し、この活性は失活する成分を含み、ω−CgTxによって不可逆的に遮断され、DHPに不感受性で静止電位に感受性であることを示す。これらの細胞中に形成されたチャンネルの活性化及び不活性化のカイネティクス並びに電圧感受性は、神経細胞のＮ型Ca2+チャンネルの従来のキャラクタリゼーションとほぼ合致する。
F.ヒト神経カルシウムチャンネルα1B-1、α1B-2、α2B、β1-2及びβ1-3サブユニットをコードするDNAのHEK細胞中での発現
非トランスフェクトHEK293細胞中で有意なBa2+電流は検出されなかった。更に、非トランスフェクトHEK293細胞は検出可能なω−CgTx GVIA結合部位を発現しない。
トランスフェクトHEK293細胞中の三量体α1B、α2b、β１タンパク質複合体の均質集団の発現の近似状態を得るために、α1B、α2b、β１の発現レベルを変化させた。トランスフェクションに使用したα1B、α2b、β１発現プラスミドのモル比を調節することによって細胞表面におけるチャンネル複合体の発現効率及び組立効率を最適にした。タンパク質発現を評価する免疫試薬の非存在下でほぼ最適のチャンネル発現を決定するために、トランスフェクタントのmRNAレベル、ω−CgTx GVIA結合及びCa2+チャンネル電流密度を分析した。α2bのモル比が高いほどカルシウムチャンネル活性が増加するらしいと考えられた。
1.トランスフェクション
HEK293細胞を、DMEM（Gibco＃320−1965AJ）、5.5％限定／補充ウシ胎仔血清（Hyclone＃Ａ−2151−Ｌ）、100U/mlのペニシリンＧ及び100μg/mlのストレプトマイシン中に維持した。Ca2+リン酸塩ベースの一過的トランスフェクションを行って前述のように分析した。細胞を、８μｇのpcDNA1α1B-1（実施例II.Cに記載）、５μｇのpHBCaCHα2A（実施例IV.B参照）、２μｇのpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）（β1-2発現プラスミド；実施例III.A及びIX.E参照）及び２μｇのpCMVβ−gal〔Clontech,Palo Alto,CA〕（Ca2+チャンネルサブユニット発現プラスミドのモル比2:1.8:1）、または、３μｇのpcDNA1α1B-1もしくはpcDNA1α1B-2、11.25μｇのpHBCaCHα2A、0.75もしくは1.0μｇのpHBCaCHβ1bRBS（Ａ）もしくはpcDNA1β1-3及び２μｇのpCMVβ−gal（Ca2+チャンネルサブユニット発現プラスミドのモル比2:10.9:1）とコトランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドであるプラスミドpCMVβ−galを組織化学的染色によってトランスフェクション効率を推定させ得るマーカーとしてトランスフェクションに導入した。３個未満のサブユニットが発現したときは、cDNAインサートが欠失したpCMVプロモーター含有ベクターであるpCMVPL2で置換してトランスフェクション中に等モルのpCMVベースのDNAを維持するようにした。トランスフェクション中のDNAの総量を20μg/プレートに維持するためにpUC18を使用した。
トランスフェクト細胞のRNAのカルシウムチャンネルサブユニットmRNA発現を、ランダムプライムした32P標識サブユニット特異的プローブを用いたノーザンブロットによって分析した。α1B-1、α2b及びβ1-2発現プラスミド（夫々８、５及び２μg;モル比＝2:1.8:1）でコトランスフェクトしたHEK293細胞は、各Ca2+チャンネルサブユニットmRNAを等しいレベルで発現しなかった。α1B-1及びβ1-2のmRNAは比較的高いレベルで発現されたが、α2bのmRNAは有意に低いレベルで発現された。３つのmRNAの全部で等価の信号を生じるために必要なオートラジオグラフ露光に基づいて、α2b転写物のレベルは、α1B-1及びβ1-2転写物のレベルよりも５〜10分の１であると推定された。非トランスフェクトHEK293細胞は検出可能なレベルのα1B-1、α2bまたはβ1-2 mRNAを発現しなかった。
等価のCa2+チャンネルサブユニットmRNA発現レベルを達成するために、種々の量のα1B-1、α2b及びβ1-2発現プラスミドを用いた一連のトランスフェクションを行った。α1B-1及びβ1-2のmRNAがα2bのmRNAに比べて極めて高いレベルで発現したので、トランスフェクション実験でα1B-1及びβ1-2プラスミドの量を減らし、α2bプラスミドの量を増やした。夫々３、11.25及び0.75μｇのα1B-1、α2b及びβ1-2発現プラスミド（モル比＝2:10.9:1）を用いたコトランスフェクションで、各Ca2+チャンネルサブユニットmRNAが均等な発現レベルに近づいた。α1B-1及びβ1-2発現プラスミドに対するα2b発現プラスミドの相対的モル量を６倍に増やした。トランスフェクション中のα1B-1及びβ1-2プラスミドの量が2.67倍減少し、α2bプラスミドの量が2.25倍増加した。ほぼ等しい量のmRNAレベルを得るために必要なα2bのモル量がα1B-1及びβ1-2の６倍であったということは、α2bのmRNAの相対量が５〜10分の１であるというこれまでの推定と合致する。種々の量の発現プラスミドでトランスフェクトした細胞に対するω−CgTx GVIA結合は、夫々３、11.25及び0.75μｇのα1B-1、α2b及びβ1-2プラスミドがチャンネル複合体の細胞表面発現レベルを改良したことを示した。α1B-1を一定に維持してα2b及びβ1-2発現プラスミドの量を更に増加させても、α2b及びβ1-2を一定に維持してα1B-1発現プラスミドの量を変化させても、細胞あたりのω−CgTx GVIA結合部位の細胞表面発現レベルがほぼ最適になることが判明した。その後のすべてのトランスフェクションは、夫々３、11.25及び0.75μｇまたは1.0μｇのα1B-1もしくはα1B-2、α2b及びβ1-2もしくはβ1-3発現プラスミドを用いて実施した。
2.トランスフェクト細胞に対する125I−ω−CgTx GVIA結合
分散量の１方向分析（ANOVA）及び多数を対合比較するTukey−Kramerテスト（ｐ≦0.05）を順次に用いてKd及びBmaxの統計的分析を行った。ヒト電圧依存性Ca2+チャンネルサブユニット、α1B-1、α1B-2、α2b、β1-2、β1-3、の種々の組み合わせについて125I−ω−CgTx GVIAの飽和結合を試験した。アッセイあたり約200,000の細胞を使用したが、α1B-1、α1B-2、α1B-1α2b、α1B-2α2bの組み合わせの場合は、管あたり１×106細胞を用いて検定した。トランスフェクト細胞は、単一クラスの飽和可能な高親和性結合部位を示した。種々の組み合わせについて解離定数（Kd）及び結合容量（Bmax）の値を測定した。結果を以下にまとめる。
0003628693.tif 000008
N.D.＝検出不能
α1B-1またはα1B-2サブユニットが欠失したサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞は検出可能な125I−ω−CgTx GVIA結合を全く示さなかった（≦600部位／細胞）。α1B-2単独またはα1B-2α２をトランスフェクトしたHEK293細胞に対する125I−ω−CgTx GVIA結合は信頼できるScatchardデータ分析を得るためにはあまりにも低かった。Kd値及びBmax値の比較から、サブユニットの特定の組み合わせとトランスフェクト細胞の結合親和性及び容量との間のいくつかの関係が判明した。３つのサブユニット全部でトランスフェクトした細胞（α1B-1α2bβ1-2、α1B-1α2bβ1-3、α1B-2α2bβ1-2またはα1B-2α2bβ1-3トランスフェクタント）中では、44.3±8.1pM〜54.9±11.1pMの範囲のKd値が識別不可能であった（ｐ＞0.05）。α2bサブユニットの欠失した２つのサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞（α1B-1β1-2、α1B-1β1-3、α1B-2β1-2またはα1B-2β1-3）中では、16.4±1.2〜22.2±5.8pMの範囲のKd値は３つのサブユニットの組み合わせよりも有意に低かった（ｐ＜0.01）。α1B-1サブユニット単独でトランスフェクトした細胞は31.7±4.2pMのKd値を有しており、この値は、α2bの欠失した２つのサブユニットの組み合わせと違っていなかった（ｐ＜0.05）。α1Bα2bβ１対α1Bβ１の４つの組み合わせの比較と同様に、α1B-1がα2bと同時発現したとき、Kdは31.7±4.2から84.6±5.3pMまで有意に増加した（ｐ＜0.05）。これらのデータは、α1B-1、α1B-1β1-2、α1B-1β1-3、α1B-2β1-2またはα1B-2β1-3などのサブユニットの組み合わせとα2bサブユニットとの同時発現が125I−ω−CgTx GVIAに対する細胞表面レセプターの結合親和性を低下させることを示す。種々のサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞のBmax値もかなり違っていた。α1B-1サブユニット単独でトランスフェクトした細胞は低いが検出可能な数の結合部位（約750結合部位／細胞）を発現した。α1B-1サブユニットをα2bサブユニットと同時発現させると、結合容量は約３倍に増加するが、β1-2またはβ1-3をα1B-1と同時発現させると表面結合の発言が８または10倍に増加した。３つのサブユニット全部でトランスフェクトした細胞は最大数の細胞表面レセプターを発現した。α1B-1α2bβ1-3またはα1B-2α2bβ1-3の組み合わせでトランスフェクトした細胞の結合容量は、β1-2サブユニットを含む対応する組み合わせの約２倍であった。同様に、α1B-1α2bβ1-2またはα1B-1α2bβ1-3の組み合わせでトランスフェクトした細胞はα1B-2を含む対応する組み合わせの約2.5倍の結合部位を細胞あたりに含んでいた。すべての場合に、α2bサブユニットをα1B及びβ１と同時発現させたときの表面レセプター密度は、対応するα1B及びβ１の組み合わせだけでトランスフェクトした細胞に比べて増加していた。α1B-1α2bβ1-2では約８倍、α1B-1α2bβ1-3では10倍、α1B-2α2bβ1-2では９倍及びα1B-2α2bβ1-3では13倍であった。従って、Bmax値の比較は、毒素結合サブユニットα1B-1またはα1B-2は、α2bまたはβ1-2もしくはβ1-3サブユニットと同時発現されたときに細胞表面でより効率的に発現および組立られ、α2bまたはβ２サブユニットが存在するときに極めて効率的に発現される。
3.電気生理学
全細胞記録法を用いてα1B-1α2bβ1-2及びα1B-1β1-2サブユニットの機能性発現を評価した。周囲細胞と非接触で簡単な形態を有しているトランスフェクト細胞をトランスフェクションの約48時間後に記録採取に使用した。ピペット溶液は、（mMで）135CsCl、10EGTA、1MgCl2、10HEPES及び4mMのMg−ATP（pH7.3、TEA−OHで調整）であった。外部溶液は（mMで）15BaCl2、125コリンCl、1MgCl2及び10HEPES（pH7.3、TEA−OHで調整）であった。キャリアーとして作用する0.1％のシトクロムＣ（Sigma）を含むω−CgTx GVIA（Bachem）の外部溶液を調製した。対照実験は、シトクロムＣがBa2+電流に全く影響しないことを示した。
α1B-1プラスミドとβ1-2プラスミドとの相対量を一定に維持して、種々の量のα2b発現プラスミドでトランスフェクトした細胞中のBa2+電流の巨視的電気生理学特性を試験した。これらのトランスフェクタントの全細胞から記録されたBa2+電流（15mMのBaCl2）の振幅及び密度は劇的な違いを示した。３種類のトランスフェクション（α2b非含有；〔α1B-1:α2b:β1-2〕のモル比2:1.8:1;〔α1B-1:α2bβ1-2〕のモル比2:10.9:1）の７〜11の細胞からの平均電流を測定した。トランスフェクションにα2bが含まれていないときに最小電流（範囲:10〜205pA）が記録され、α1B-1α2bβ1-2プラスミドが比2:10.9:1であるときの最大電流（範囲:50〜8300pA）が記録された。この比は、各サブユニット転写物のmRNAレベルがほぼ等価になった値である。α2bプラスミドの量を、ほぼ等しい量のサブユニットmRNAが生じるように調整すると、平均のピークBa2+電流は433pAから1,824pA（4.2倍）に増加し、対応する平均電流密度の増加は26pA/pFから127pA/PF（4.9倍）であった。この増加は、トランスフェクション中に1/2.7倍に減量したα1B-1及びβ1-2発現プラスミドの存在下で生じる。全部のトランスフェクション中で、Ba2+電流の量は正規分布に従っていなかった。
サブユニットの組み合わせを比較しα2bの効果を判定するために、α1B-1β1-2または2:1.8:1（α1B-1:α2b:β1-2）のモル比または2:10.9:1（α1B-1:α2b:β1-2）のモル比のα1B-1α2bβ1-2でトランスフェクトした細胞の電流−電圧特性を試験した。α2b非含有及び11.25μｇのα2b含有（モル比2:10.9:1）の極限実施例は、0mV〜＋40mVの試験電位で電流電圧プロットの有意な違いを示さなかった（ｐ＜0.05）。電流電圧プロットのピーク領域の両側で観察された僅かな差異は正規化に起因すると考えられる。α1B-1β1-2でトランスフェクトした細胞で観察された極めて小さい電流は、試験パルスによって活性化されたバリウム電流に比べてかなり高い残留リーク成分を有していた。電流電圧プロットを正規化すると、このリークはα1B-1α2bβ1-2でトランスフェクトした細胞中よりもはるかに大きい成分であり、その結果として、電流電圧プロットの幅が広くなったと考えられる。特に、α1B-1β1-2でトランスフェクトした細胞の電流−電圧プロットがピークの両側で開いていくという事実から考えると、これが電流電圧プロットの見掛けの差異の最も正しい説明であろうと考えられる。典型的には、電圧依存性活性化がシフトすると、電流−電圧プロット全体がシフトするが、これは観察されなかった。各々のカイネティクスを定性的に比較するために、−90mV〜10mVの試験パルスの平均応答を正規化しプロットした。どの組み合わせに関しても、全細胞Ba2+電流の活性化または不活性化のカイネティクスの有意な差異は観察されなかった。
G.ヒト神経カルシウムチャンネルα1E-3α2Bβ1-3及びα1E-1α2Bβ1-3サブユニットをコードするDNAのHEK細胞中での発現
α1E-1α2Bβ1-3及びα1E-3α2Bβ1-3並びにα1E-3の機能性発現を全細胞記録法を用いて評価した。
1.方法
周囲細胞と非接触で簡単な形態を有する一過的にトランスフェクトしたHEK293細胞の記録をトランスフェクションの２日後に採取した。
トランスフェクトした組換えカルシウムチャンネルからのバリウム電流を記録するためにピペット充填に使用した内部溶液は、（mMで）135CsCl、10EGTA、1MgCl2、10HEPES及び4mMのMg−ATP（pH7.4−7.5、TEA−OHで調整）であった。バリウム電流を記録するための外部溶液は、（mMで）15BaCl2、150コリンCl、1MgCl2及び10HEPES及び5TEA−OH（pH7.3、TEA−OHで調整）であった。Ca2+をBa2+に置換した実験では、細胞外溶液を完全に交換しBa2+とCa2+との混合を完全に防止するために層流室を使用した。キャリァーとして作用する0.1％のシトクロムＣを含むω−CgTx GVIAの外部溶液を調製した。加圧した吹管ピペットによって毒素を添加した。直列抵抗を70−85％補償し、直列抵抗からの電圧誤差が5mV未満のときにだけ電流を分析した。リーク抵抗及びキャパシタンスは、pClamp（Axon Instruments）によって作成されたP/−４プロトコルによって観察された標準化電流を減算することによって修正した。
2.電気生理学的結果
α1E-1α2bβ1-3またはα1E-3α2bβ1-3は全細胞パッチ固定記録法によって強いバリウム電流を示した。α1E-3α2Bβ1-3を発現する細胞は、α1E-1α2bβ1-3を発現する細胞よりも大きいピーク電流を有していた。更に、活性化及び不活性化のカイネティクスは、α1Eカルシウムチャンネルを発現する細胞中よりも明らかに実質的に速い。α1E-3単独を発現するHEK293細胞は有意な程度の機能性カルシウムチャンネルを含み、α1Eα2bβ1-3を発現する細胞と同様の特性を有するが実質的により小さいピークバリウム電流を有する。従って、α1Eの場合、α２及びβ１サブユニットはα1E媒介カルシウムチャンネルの機能性発現のためには不要であるが、機能性カルシウムチャンネルの数を実質的に増加させる。
α1Eα2bβ1-3を発現する細胞の電流電圧特性の試験は、α1E-3α2bβ1-3が高電圧活性化カルシウムチャンネルであり、同じくα2bとβ１、及びα1Bとα1Dを発現する他の神経カルシウムチャンネルをやや下回る正の電位でピーク電流に達することを示す。α1E-1α2bβ1-3及びα1E-3α2bβ1-3の電流電圧特性はα1B-1α2bβ1-3の電流電圧特性とは統計的に違っている。α1E-1α2bβ1-3及びα1E-3α2bβ1-3の電流電圧曲線は、α1E-3単独の電流電圧曲線と同様に約＋5mVでピークに達する。
双方のプレパルス（200ms）を用いる失活及び定常状態の失活のカイネティクス及び電圧依存性を試験した。α1E媒介カルシウムチャンネルは従来のクローン化されたカルシウムチャンネル及び他の電圧活性化カルシウムチャンネルに比べて速やかに失活する。α1E-1α2bβ1-3媒介カルシウムチャンネルは速やかに失活し、従って、比較的短い（200ms）プレパルス及び長いプレパルス（＞20s定常状態失活）の双方に感受性であるが、定常状態失活から速やかに回復する。速やかな失活のカイネティクスは２つの成分を有しており、一方は約25msの時定数をもち、他方は約400msの時定数をもつ。
α1E媒介カルシウムチャンネルが低電圧活性化カルシウムチャンネルの特性を有するか否かを判断するために、−60〜＋90mVの範囲の試験パルスによって活性化されたテール電流を−60mVで詳細に測定した。−60mVで記録されたテール電流は、150〜300μｓの単一指数によって十分に調整できた。この値は、低電圧活性化カルシウムチャンネルで典型的に観察された値よりも少なくとも１桁速い。
α1E-3α2bβ1-3を発現するHEK293細胞は、荷電キャリヤーとBa2+及びCa2+によって搬送される電流とが異なる電流−電圧特性を有するときにBa2+によってより多くの電流を流す。更に、不活性化の時間的進行はより緩徐であり、プレパルスの不活性化の量はCa2+が荷電キャリヤーであるときにより少ない。
本発明をある程度詳細に説明して来たが、通常の知識をもつ当業者に明らかな修正が本発明の範囲を逸脱することなく可能であろう。このような修正は当業者に明らかであるから、本発明は請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:7635
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
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配列の特徴
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配列
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トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴
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他の情報:/note＝Alpha−1Cの代替エキソン
配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴
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配列の特徴
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配列の特徴
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配列の特徴
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配列の特徴
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配列
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配列
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配列の特徴
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
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配列
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配列の型：核酸
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配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
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配列
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配列の特徴
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配列
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配列の特徴
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配列
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配列の特徴
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配列の長さ:7089
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配列の特徴
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配列
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配列の特徴
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配列
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配列の特徴
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配列
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配列番号:29
配列の長さ:3636
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:35...3346
他の情報:standard_name＝“Alpha−2a"
特徴を表す記号:5'UTR
存在位置:1...34
特徴を表す記号:3'UTR
存在位置:3347...3636
配列
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配列番号:30
配列の長さ:3585
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:35...3295
他の情報:standard_name＝“Alpha−2c"
特徴を表す記号:5'UTR
存在位置:1...34
特徴を表す記号:3'UTR
存在位置:3296...3585
配列
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配列番号:31
配列の長さ:3564
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:35...3374（1625−1639 ＆ 1908−1928）
他の情報:standard_name＝“Alpha−2d"
特徴を表す記号:5'UTR
存在位置:1...34
特徴を表す記号:3'UTR
存在位置:3375...3565
配列
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配列番号:32
配列の長さ:3579
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:35...3289
他の情報:standard_name＝“Alpha−2e"
特徴を表す記号:5'UTR
存在位置:1...34
特徴を表す記号:3'UTR
存在位置:3289...3579
配列
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配列番号:33
配列の長さ:1681
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1...1437
他の情報:standard_name＝“Beta−１−1"
特徴を表す記号:3'UTR
存在位置:1435...1681
配列
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配列番号:34
配列の長さ:1526
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1...651
他の情報:standard_name＝“Beta−１−4"
配列
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配列番号:35
配列の長さ:1393
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1...660
他の情報:standard_name＝“Beta−１−5"
配列
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配列番号:36
配列の長さ:6725
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:226...6642
他の情報:standard_name＝“Alpha−1C−2"
配列
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配列番号:37
配列の長さ:2970
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:502...2316
他の情報:standard_name＝“Beta−2C"
配列
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配列番号:38
配列の長さ:2712
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（Genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:223...2061
他の情報:standard_name＝“Beta−2E"
配列
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