(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
群II/IIIの天然草花粉アレルゲンと抗体および・又はIgE交叉反応性を示すが、群Ｉの天然−又は組換え草花粉アレルゲンとの間にIgE交差反応性のない、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸塩基配列を有することを特徴とする組換えDNA分子。
【請求項２】
前記核酸塩基配列が配列番号２の塩基配列を含む請求項１に記載の組換えDNA分子。
【請求項３】
発現コントロール塩基配列と結合して機能的に発現構造となることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換えDNA分子。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えDNA分子を有することを特徴とする宿主。
【請求項５】
群II/IIIの天然草花粉アレルゲンと抗体および・又はIgE交叉反応性を示すが、群Ｉの天然−又は組換え草花粉アレルゲンとの間にIgE交差反応性のない、請求項１又は２に記載の組換えDNA分子でコードされる組換え又は合成ポリペプチド。
【請求項６】
前記組換え又は合成蛋白質又はポリペプチドが、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の組換え又は合成蛋白質又はポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換えDNA分子と、他の公知のポリペプチドをコードするDNA分子とから誘導される請求項５又は６に記載の組換え又は合成ポリペプチドと他の公知のポリペプチドとの融合タンパク質。
【請求項８】
前記他の公知のポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼ又は融合に適したその他のポリペプチドである請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の組換えもしくは合成ポリペプチド又は融合タンパク質を含むことを特徴とする診断用試薬。
【請求項１０】
患者の血清中のIgE抗体反応を請求項５〜８のいずれかに記載の組換えもしくは合成ポリペプチド又は融合タンパク質で測定することを特徴とする、患者のPhl p IIアレルゲンに対するアレルギーをインビトロ（in−vitro）で検出する方法。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれかに記載の組換えもしくは合成ポリペプチド又は融合タンパク質を使用して細胞性反応を刺激又は阻止することを特徴とする、Phl p IIアレルゲンに対する細胞性反応をインビトロ（in−vitro）で検出する方法。
【発明の詳細な説明】
草花粉アレルギーは夏季の最も重要な植物アレルギーの一つである。花粉アレルギー患者の20％以上が草花粉によってアレルギー症状を示す。最も重要な草花粉アレルゲンに属すのは群Ｉ（１）、群Ｖ（２）、群II/III（３）及び群IV（４、５）アレルゲンである。そうこうするうちにプロフィリンも草花粉アレルゲンとして発見された（７、８）。上記のアレルゲンは免疫学的並びに構造的に近い類縁分子として種々の草に見いだされ、１つの群の類縁アレルゲンは患者のIgEと交差反応性を示す。これまでこれらのアレルゲン系列が組換え技術によって分離され、E.coliにおいて発現された（９）。E.coliで発現されたアレルゲンの多くは天然蛋白質と類似の性質を示し、したがってアレルギー性疾患の診断及び治療に用いることができる（10、11、12）。今始めて、Phl p IIをコード（暗号解読）する（coding）完全なcDNAの分子特性、並びにこの蛋白質のE.coliにおける発現について説明する。群II/IIIの完全組替え草花粉アレルゲンはこれまでは自由に使えなかったのであるが、そして実施例からわかるように、細胞操作に用いられるような抗原−抗体相互作用に基づく方法に、天然蛋白質と同様に用いることができる；というのは全部のＴ−細胞エピトープが天然分子にあるのと同様に組換え分子上にもあるからである。さらに組換えPhl p IIは測定可能の仲介物質遊離を生じさせる操作に適している。免疫調節プロセス、抗原抗体相互作用、Ｔ−細胞反応性及び仲介物質遊離に対する作用に基づく治療に組換えPhl p IIを使用できるのは、天然−及び組換え蛋白質が構造的並びに生物学的に類似しているからである。本発明では組換えPhl p IIアレルゲンをコードする完全cDNAを利用する。cDNAから誘導されるアミノ酸配列に基づいてPhl p IIアレルゲンのＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープを決定する。組換えPhl p IIアレルゲンはE.coliを使って作られ、群II/IIIの天然−草花粉アレルゲンと同様な性質をもつ。そこで組換えPhl p IIアレルゲンも群II/IIIの天然アレルゲンも抗原−抗体−相互作用、抗原依存性Ｔ−細胞作用又は抗原依存性仲介物質遊離に基づく操作に使用することができ、その際実に組換えアレルゲンの方がより高い純度とより高い特異性という長所を示す。
材料及び方法：
1.  cDNAジーンバンク（ライブラリー）の構築
光−及び電子顕微鏡によって純度を調べたアワガエリ草花粉（Allergon AB Engelholm,スウェーデン）を用いてポリアデニル化RNAを単離した（13）。cDNA合成はオリゴーdT及びランダムプライマーで行われ、cDNA末端はT4−ポリメラーゼで平滑に消化し（glattverdauen）、EcoR I−リンカーを取り付けた。リンカーをもったcDNAを脱燐酸化Lambda gtl1アーム（Arme）に結合し、パック（verpackt）する。800.000の独立クローンから成るcDNAジーンバンクが得られる（13）。
2.  cDNAジーンバンクのスクリーニング、サブクローニング及びDNA塩基配列解析
アワガエリ草花粉cDNAジーンバンクのIgEスクリーニングをBritenederらの方法によって行った（14）。IgE結合クローンを富化し、これらのクローンからファージ−DNAをつくった（15）。Kpn I及びSac I切断によって２つのDNA断片を得た；それらは完全Phl p II cDNAの両部分と側面の（flankierend）lambda gtl1配列とを含んでいた。生じたKpn I/Sac I及びSac I DNA断片をプラスミドpUC18にサブクローニングし、それでE.coli XL−１ブルーを形質変換した。制限酵素分析によって適したクローンを決定し、lambda gtl1前進シーケンシングプライマー（22−mer）及びlambda gtl1逆シーケンシングプライマー（22−mer）（Clontech Laboratories、Palo Alto、USA）により、並びにM13 pUC18前進−及び逆プライマー（ドイツ）によってSanger（16）の方法で両鎖（beidstr ngig）の塩基配列を決定した。
3.  RNA（Northern）ブロット
アワガエリ草（Phleum pratense）及びドクムギ草（Lojium perenne）の花粉から得た総RNA10μｇを変性ゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース上にブロットした（17）。Phl p IIをコードするcDNAを単離するために、組換えファージから始めて、相当するDNAインサートをPCRによって増やした。その時々に５ピコモルのプライマー［lambda gtl1前進シーケンシングプライマー（22−mer）及びlambda gtl1逆シーケンシングプライマー（22−mer）、Clontech Laboratories、USA］を使用した。PCR−生産物をアガロースゲル上で分離し、バンドをDEAE−イオン交換濾紙を用いて溶出した（18）。得られたDNAをランダムプライミングによって32Pで標識化した（19）。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを標準法によって行った（15）。ブロットを3.0xSSC（20xSSC＝3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）;1.5SSC、0.1％SDS及び最後に0.75％SSC、0.1％SDSで50℃で洗い、オートラジオグラフィー（Hyperfilm MP,Amersham,ロンドン、英国）した。
4.  溶原性E.coli Y1089におけるPhl p II cDNAのβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質としての発現
IgEスクリーニングを利用して、Phl p IIアレルゲンをコードする完全cDNAコローンを得た。組換えLambda gtl1ファージを溶原性E.coli種Y1089に感染させ、付着物（沈殿物）（Ansatz）からβ−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質を得た（20）。付着物を7.5％ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動により分離し（21）、ニトロセルロースにブロットした（22）。その融合蛋白質は草花粉アレルギー患者の血清−IgE及びヨード標識家兎抗ヒトIgE抗体（Pharmacia、アプサラ、スウェーデン）によって検出された。
添付の図はこの組換えPhl p IIアレルゲンを、抗原−抗体−相互作用、抗原依存性仲介物質遊離、並びに抗原依存性細胞反応性に基づく操作に利用できることを説明するものである。図１は組換えPhl p IIアレルゲンのcDNA及びそれから誘導されるアミノ酸配列を示す。Phl p IIアレルゲンの完全cDNA塩基配列が示される。塩基長さ24のnon−coding（ノンコーディング）（非翻訳）配列がcDNAの5'末端に見いだされ、それに続いて78塩基長さの先導配列がある；それは図中で下線を引いたシグナルペプチドを規定する。成熟蛋白のアミノ酸配列は塩基78以下から導かれ、バリンで始まる。コードする塩基配列を3'末端で打ち切る停止コドンには星印をつける。３つのnon−coding塩基配列はポリＡ末端で終わりである。
図２は組換えPhl p IIアレルゲンのアミノ酸配列とその他の群II/III草花粉アレルゲンのアミノ酸配列との類似性を示す。
図３は組換えPhl p IIアレルゲンのＢ−細胞エピトープの説明である。
図４はＴ−細胞エピトープを示す。
図５は組換えPhl p IIアレルゲンと草花粉アレルギー患者の血清IgEとの反応性を示す。組換えPhl p IIはファージ感染及びIPTG誘導によって、βーガラクトシダーゼ融合蛋白として溶原性E.coli Y1089に発現される。組換えPhl p IIを含むE.coli蛋白質を電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移す。ライン１では群II/IIIのアレルゲンに反応するアレルギー性患者の血清IgEが用いられ、ライン２及び３では群II/IIIアレルゲンで反応を示さなかったアレルギー患者のIgEによって検出され、ライン４は非アレルギー性のコントロール患者の血清による検査を示す。
図６は或る草花粉アレルゲンに対してIgE反応性を示す草花粉アレルギー患者のパーセンテージを列挙した表である。種々の草花粉アレルゲンをもった草花粉アレルギー患者の反応性の頻度が示される。数値は、代表的数の患者において天然−及び組換え草花粉アレルゲンによる試験によって明らかにされた概算値である。
図７は組換えPhl p IIが天然−群II/IIIアレルゲン−IgE−阻害と同様のIgE−エピトープを担うことを証明している。群II/IIIアレルゲン（10−12kD）及び群Ｉアレルゲン（約30kD）とのIgE反応性を示す草花粉アレルギー患者の血清を、組換えPhl p II（ライン２）、組換えPhl p I（ライン３）、組換えBetνＩ（ライン４）、又はE.coli−蛋白質（ライン１）と共にプレインキュベーションした。組換えPhl p IIとのプレインキュベーションは、12kD領域における天然Phl p IIへのIgE結合をほとんど完全に消失せしめたが、30kDにおけるPhl p IIとの反応性には影響を与えない。組換えPhl p Iは天然Phl p Iへの結合のみを減少させ、Phl p IIへのIgE結合には影響を及ぼさない。コントロール蛋白質、組換えBetνＩ及びE.coli蛋白質とのプレインキュベーションは天然Phl p I及びPhl p IIへのIgE結合に害を及ぼさない。このことから、組換えPhl p IIは天然Phl p IIと類似の又は同じIgE−エピトープをもつが、群Ｉの天然−又は組換えアレルゲンとの間に抗原類縁関係がないことがわかる。
図８は、Phl p IIを規定するcDNAの、アワガエリ草及びドクムギ草のmRNAとのハイブリダイゼーションを明らかにする。ドクムギ草（ライン１）及びアワガエリ草（ライン２）花粉から総RNAを単離し、10μｇを変性アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロースにブロットした。Phl p IIをコードする、32Pで標識化したcDNAは大体18S RNAの高さでドクムギ草−並びにアワガエリ草RNAとハイブリダイゼーションし、明らかにそれ以下でも約600塩基の転写大きさでハイブリダイゼーションする。交差ハイブリダイゼーションは、種々の草類の群II/IIIアレルゲンをコードする転写物（トランスクリプト）が構造的に類似していることを示す。
図9A及びＢは組換えPhl p IIアレルゲンと群II/III草花粉アレルゲン特異的抗体との反応性を示す
A:アワガエリ草花粉アレルゲン及びシラカバの主要アレルゲン、BetνＩ（Co）を発現するLanbda gtl1ファージ、並びに組換えてないファージ（λ）をDot Blot法で草花粉アレルゲン特異抗体で試験した。4B1は群Ｖアレルゲンに結合し、R4は群Ｉアレルゲンを検出し、R5は群Ｖ及び群II/IIIアレルゲンを確認する。B:グラフはクローン記号をあらわす。組換えPhl p IIはクローンＡによって発現される。
実施例：
組換えPhl p IIアレルゲンの塩基配列解析−他の群II/IIIアレルゲンとの類似性
Phl p IIアレルゲンのDNA塩基配列をSanger（16）の方法によりcDNAのシーケンシングによって決定した。図１は決定されたDNA−塩基配列及びそれから誘導されるアミノ酸配列を示す。成熟蛋白質に先行するシグナルペプチドが他の真核生物シグナルペプチドと顕著な相同性を示すことから、群II/IIIアレルゲンは明白な遺伝子断片によってコードされるもので、群Ｉアレルゲンから蛋白分解性互解によって生じるものではないことが明らかに証明される。図２に示された組換えPhl p IIとドクムギ草からの相同蛋白質（Lot p II及びLot p III）との高い塩基配列相同性（約70％の塩基配列が一致）は、これらの蛋白質の構造的に狭い類縁関係を示し、したがって種々の種の群II/IIIアレルゲンの免疫学的類縁関係の分子的基礎を与える。
組換えPhl p IIアレルゲンのＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープの決定
Phl p IIアレルゲンの誘導されたアミノ酸配列に基づいて、Ｂ−細胞及びＴ−細胞エピトープを適切なコンピュータープログラム（24、25）を利用して決定することができた。重要なＢ−細胞及びＴ−細胞エピトープを図３及び図４にまとめる。Ｂ−細胞エピトープに相当する合成ペプチドは草花粉アレルギー患者のIgEに結合し、一方Ｔ−細胞エピトープに相当する合成ペプチドは草花粉アレルギー患者のＴ−細胞の増殖を促進し、その結果H3−チミジンの取り込みが高まる。
Phl p IIをコードするcDNAの、E.coliにおける組換えPhl p IIアレルゲンとしての発現
Phl p IIをコードするcDNAを含む組換えファージを溶原性E.coli Y1089に感染させた。液体培養におけるIPTG（イソプロピル−β−チオガラクトシド）誘導によって組換えβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質が得られた（20）。コントロール蛋白質、β−ガラクトシダーゼはウェスターン−ブロット法ではIgE結合を示さなかったが、組換えPhl p II融合蛋白質は、種々の草種の群II/IIIアレルゲンに反応する患者の血清IgEで、特異的に顕著なIgE結合を示した。
組換えPhl p IIアレルゲンのIgE結合能力
群II/IIIの天然アレルゲンと反応する草花粉アレルギー患者の血清を組換えPhl p IIとプレインキュベートし、その後群II/III特異的IgEを分離した。図６は、群II/III天然アレルゲンとの結合がプレインキュベーションによってほとんど完全に消失し、一方群Ｉ及び群Ｖアレルゲンとの結合は影響を受けなかったことを示す。これは天然群II/IIIアレルゲンのIgEエピトープが組換えPhl p IIによって覆われたこと、及び群Ｉ、群Ｖ及び群II/IIIアレルゲンの間の交差反応性は多分些細であることを示すものである。
Phl p II  cDNAとLol p II/III mRNAとの交差ハイブリダイゼーション
ドクムギ草−及びアワガエリ草花粉の総RNAを単離し、変性アガロースゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。その膜を、Phl p IIを規定する完全cDNAとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション−バンドは18SリボソームRNAの高さ及び明らかにその下にあらわれる。臭化エチジウムでゲルを着色した後ほぼ同量の総RNAを用いたとはいえ、ハイブリダイゼーションはドクムギ草RNAとよりもアワガエリ草RNAとの方がより強い。それにもかかわらず厳密な条件のもとで交差ハイブリダイゼーションに達することができた。より大きい転写物（トランスクリプト）は、場合によっては、より大きい、だが未熟なRNAを生じる、なぜならばそのハイブリダイゼーションは厳しい洗浄にも耐えるからである。この実施例は種々の種の群II/III草花粉アレルゲンの相同性を証明するものである。
参考文献
1.フライドホフ,L.R.,エルリッヒ−カウツキィ,E.,グラント,J.H.,メイヤーズ,D.A.,およびマーシュ,D.G.（1986）ジャーナル  オブ  アレルギー  クリニカル  イミノロジー  78巻、1190−1201頁［Freidhoff,L.R.,Ehrlich−Kautzky,E.,Grant,J.H.,Meyers,D.A.,and Marsh,D.G.（1986）J Allergy Clin Immunol 78,1190−1201］
2.マチエッセン,F.,ローエンステイン,H.クリニカル  エキスペリメンタル  アレルギー  21巻、309−320頁［Matthiesen,F.,Lowenstein,H.Clin Exp Allergy 21,309−320.］
3.アンサリ,A.A.,シンバガムルチ,P.,およびマーシュ,D.G.（1989）ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー264巻、11181−11185頁［Ansari,A.A.,Shenbagamurthi,P.,and Marsh,D.G.（1989）J.Biol.Chem.264,11181−11185］
4.キシル,F.T.,ジャギ,K.S.,リン,Z.W.,エクラモデュラ,A.K.M.（1989）シェーン  A.H.,クラフト,D.,クンケル  G.編  アトピー性アレルゲンのエピトープ、22−25頁［Kisil,F.T.,Jaggi,K.S.,Lin,Z.W.,Ekramodullah,A.K.M.（1989）in Sehon A.H.,Kraft,D.,Kunkel,G.eds.Epit opes of Atopic Allergens,22−25.］
5.ジャギ,K.S.,エクラモデュラ,A.K.M.,キシル,F.T.,ドッバーフィッシャ,J.M.M.,レクター,E.S.,およびシェーン,A.H.（1989）ジャーナル  オブ  アレルギー  クリニカル  イミノロジー  83巻、845−852頁［Jaggi,K.S.,Ekramodullah,A.K.M.,Kisil,F.T.,Dzuba−Fischer,J.M.M.,Rector,E.S.,and Sehon,A.H.（1989）J Allergy Clin Immunol 83,845−852.］
6.ファン  リー,R.,ディエッセン,N.B.M.,ファン  リューエン,W.A.,スタペル,S.O.,およびアールベルセ、R.C.（1992）クリニカルエキスペリメンタル  アレルギー［van Ree,R.,Driessen,N.B.M.,vanLeeuwen,W.A.,Stapel,S.O.,and Aalberse,R.C.（1992）Clin Exp Allergy.］
7.バレンタ,R.,デュッケン,M.,エブナー,C.,バレント,P.,シラベル,C.,デビレル,P.,フェレイラ,F.,デジクル,M.,エデルマン,H.,クラフト,D.,およびシュナイナ,O.（1992）ジャーナル  オブ  エキスペリメンタル  メディシン175巻、377−385頁［Valenta,R.,Duchene,M.,Ebner,C.,Valent,P.,Sillaber,C.,Deviller,P.,Ferreira,F.,Tejkl,M.,Edelmann,H.,Kraft,D.,and Scheiner,O.（1992）J Exp Med 175,377−385.］
8.バレンタ,R.,デュッケン,M.,ビルタラ,S.,バレンタ,P.,シラベル,C.,フェレイラ,F.,デジクル,M.,ヒルスベール,R.,エブナー,C.,クラフト,D.,およびシュナイナ、O.（1993）インタナショナルアーキブズ  オブアレルギー  アプライド  イミノロジー  99巻、271−273頁［Valenta,R.,Duchene,M.,Vrtala,S.,Valent,P.,Sillaber,C.,Ferreira,F.,Tejkl,M.,Hirschwehr,R.,Ebner,C.,Kraft,D.,and Scheiner,O.（1993）Int Arch Allergy Appl Immunol 99,271−273.］
9.シャイナー,O.,ボール,B.,ブライテンバッハ,M.,ブライテンダ,H.,デュッケン,H.,エブナー,C.,フェレイラ,F.,ヒルシューベル,R.,ホフマン−ゾンメルグルバ,K.,ペテンブルガー,K.,ルンポルド,H.,シュタイナ,R.,テジクル,M.,バレンタ,R.,およびクラフト,D.（1992）アレルギー学と臨床免疫学の進歩、ゴダルド,P.,ボウスケット,J.,およびミッチェル,F.B.編  パルテノン刊行グループ［Scheiner,O.,Bohle,B.,Breitenbach,M.,Breiteneder,H.,Duchene,M.,Ebner,C.,Ferreira,F.,Hirschwehr,R.,Hoffmann−Sommergruber,K.,Pettenburger,K.,Rumpold,H.,Steiner,R.,Tejkl,M.,Valenta,R.,and Kraft,D.（1992）in:Advances in Allergology and Clinical Immunology,Godard,P.,Bousquet,J.,and Michel,F.B.eds.The Parthenon Publishing Group.］
10.バレンタ,R.,デュッケン,M.,ブラタラ,S.,ビルクナー,T.,エブナー,C.,ヒルシュベール,R.,ブライテンバッハ,M.,ルンポルド,H.,シャイナー,O.,およびクラフト,D.（1991）ジャーナル  オブ  アレルギー  クリニカル  イミノロジー  88巻、889−894頁［Valenta,R.,Duchene,M.,Vrtala,S.,Birkner,T.,Ebner,C.,Hirschwehr,R.,Breitenbach,M.,Rumpold,H.,Scheiner,O.,and Kraft,D.（1991）J Allergy Clin Immunol 88,889−894.］
11.バレンタ,R.,フルタラ,S.,エブナー,C.,クラフト,D.,およびシャイナー,O.（1992）インタナショナル  アーキブズ  オブ  アレルギー  アプライド  イミノロジー  97巻、287−294頁［Valenta,R.,Vrtala,S.,Ebner,C.,Kraft,D.,and Scheiner,O.（1992）Int Arch Allergy Appl Immunol 97,287−294］
12.バレンタ,R.,スペル,W.R.,フェレイラ,F.,バレント,P.,シラバ,C.,ティークル,M.,デュッケン,M.,エブナー,C.,レヒナー,K.,クラフト,D.,およびシャイナー,O.（1993）ジャーナル  オブ  アレルギー  クリニカル  イミノロジー  91巻、88−97頁［Valenta,R.,Sperr,W.R.,Ferreira,F.,Valent,P.,Sillaber,C.,Tejkl,M.,Duchene,M.,Ebner,C.,Lechner,K.,Kraft,D.,and Scheiner,O.（1993）J Allergy Clin Immunol 91,88−97.］
13.フルタラ,S.,スパ,W.R.,ライミッツア,I.,ファンリー,R.,ラフアー,S.,ミューラー,W.D.,バレント,P.,レヒナー,K.,ルンポルド,H.,クラフト、D.,シャイナー,O.,およびバレンタ,R.（1993）ジャーナル  オブ  イミノロジー（受領された改訂版）［Vrtala,S.,Sperr,W.R.,Reimitzer,I.,vanRee,R.,Laffer,S.,Muller,W.−D.,Valent,P.,Lechner,K.,Rumpold,H.,Kraft,D.,Scheiner,O.,and Valenta,R.（1993）J Immunol（accepted provided revision）．］
14.ブライテンダー,H.,ペテンブルガー,K.,ビト,A.,バレンタ,R.,クラフト,D.,ルンポルド,H.,シャイナー,O.,およびブライテンバッハ,M.（1989）EMBO  ジャーナル  ８巻、1935−1938頁［Breiteneder,H.,Pettenburger,K.,Bito,A.,Valenta,R.,Kraft,D.,Rumpold,H.,Scheiner,O.,and Breitenbach,M.（1989）EMBO J 8,1935−1938］
15.アウスベル,F.M.（1990）分子生物学の最新の手法  ワイリー，ニューヨーク．［Ausubel,F.M.（1990）in Current protocols in molecular biology,Wiley,New York.］
16.サンガー,F.,ニックレン,S.,コールソン,A.R.（1977）プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミック  サイエンス  USA  74巻、5463−5468頁［Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.（1977）Proc Natl Acad Sci USA 74,5463−5468.］
17.バレンタ,R.,ブライテンダー,H.,ペテンブルガー,K.,ブライテンバッハ,M.,ルンポルド,H.,クラフト,D.,およびシャイナー,O.（1991）ジャーナル  オブ  アレルギー  クリニカル  イミノロジー  87巻、677−682頁［Valenta,R.,Breiteneder,H.,Pettenburger,K.,Breitenbach,M.,Rumpold,H.,Kraft,D.,and Scheiner,O.（1991）J Allergy Clin Immunol 87,677−682.］
18.サムブルック,J.,フリッシュ,E.F.,マニアティス,T.（1989）分子クローニング：実験マニュアル．コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー出版［Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.（1989）Molecular cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.］
19.フェインベルグ,A.P.,およびフォーゲルスタイン,B.（1983）アナリティカル  バイオケミストリー132巻、６−13頁［Feinberg,A.P.,and Vogelstein,B.（1983）Anal Biochem 132,6−13.］
20.ヒンフ,T.V.,ヤング,R.A.,デービス,R.W.（1985）cDNAクローニング  オックスフォード、IRL出版、vol I、49−78頁［Huynh,T.V.,Young,R.A.,Davis,R.W.（1985）in:cDNA cloning,Oxford,IRL Press,vol I,49−78.］
21.ラエムリ  U.K.（1970）ネイチャー227巻、680−685頁［Laemmli U.K.（1970）Nature 227,680−685.］
22.トウビン,H.,スタエヘリン,T.,ゴードン,J.（1979）プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミック  サイエンス  USA76巻、4350−4354頁［Towbin,H.,Staehelin,T.,Gordon,J.（1979）Proc Natl Acad Sci USA 76,4350−4354.］
23.ガベル,Y.,およびベイジン,G.（1990）フェブス  レター261巻、455−458頁［Gavel,Y.,and Heijne,G.（1990）FEBS Lett 261,455−458.］
24.カイト,J.およびドーリトル,R.F.（1982）ジャーナル  オブ  モレキュラーバイオロジー157巻、105−132頁［Kyte,J.and Doolittle,R.F.（1982）J Mol Biol 157,105−132.］
25.マルガリット,H.,スポウジ,J.L.,コルネット,J.L.,シース,K.B.,デリシ,C.,およびベルツォフスキー,J.A.（1987）ジャーナル  オブ  イミノロジー138巻、2213−2229頁［Margalit,H.,Spouge,J.L.,Cornette,J.L.,Cease,K.B.,DeLisi,C.,and Berzofsky,J.A.（1987）J Immunol 138,2213−2229.］
【図１】
0003657604.tif 000002
【図２】
0003657604.tif 000003
【図３】
0003657604.tif 000004
【図６】
0003657604.tif 000005
【図４】
0003657604.tif 000006
【図７】
0003657604.tif 000007
0003657604.tif 000008
【図５】
0003657604.tif 000009
【図８】
0003657604.tif 000010
【図９Ａ】
0003657604.tif 000011
0003657604.tif 000012
【図９Ｂ】
0003657604.tif 000013