(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質に対する抗体又は抗原を固定化した、ラテックスからなる平均粒径０．０５〜０．５μｍの担体を用いるラテックス凝集法による免疫測定方法において用いられ、
前記被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体若しくはその断片、又は、免疫学的に反応しない抗原を固定化した不溶性担体からなり、かつ、不溶性担体は上記担体よりも小さい粒径のラテックス粒子であることを特徴とする非特異反応抑制剤。
【請求項２】
免疫学的に反応しない抗原は、担体に固定化した免疫学的に反応しない物質と同じ物質である請求項１記載の非特異反応抑制剤。
【請求項３】
被測定物質に対する抗体又は抗原を固定化した、ラテックスからなる平均粒径０．０５〜０．５μｍの担体を用いるラテックス凝集法による免疫測定方法において用いられ、
不溶性担体からなり、かつ、不溶性担体は上記担体よりも小さい粒径のラテックス粒子であることを特徴とする非特異反応抑制剤。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の非特異反応抑制剤を含有することを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項５】
被測定物質を含む試料を請求項１、２若しくは３記載の非特異反応抑制剤によって予め処理した後免疫反応させるか、又は、請求項１、２若しくは３記載の非特異反応抑制剤の存在下で被測定物質を含む試料を免疫反応させることを特徴とする免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不溶性担体を使用し、抗原抗体反応を利用する免疫反応に基づいて被測定物質を測定するために用いられ、高い検出感度を有し、かつ、非特異反応の少ない非特異反応抑制剤、免疫測定試薬、及び、免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液、尿等に含まれる微量物質の測定に免疫測定方法が使われている。免疫測定方法は、抗原抗体反応の特異的な強い結合に基づいており、種々の物質が潜在する試料からでも、目的物質を特異的に感度良く測定することが可能である。
【０００３】
しかし、このような測定法においては、血清等の検体と反応させたとき、被測定物質である抗原を含む陽性検体のみならず、これら抗原を含まない陰性検体に対しても反応を起こすことがある。このような非特異反応が起こる理由は明らかではないが、一つには血清中に含まれる補体等の因子によるものと考えられている。
【０００４】
また、例えば、不溶性担体に測定物質に対する抗原を固定化した場合、固定化時に変成した抗体のＦｃ部分に、被検液中のリウマチ因子が反応し、非特異凝集を惹起することもある。更に、不溶性担体を懸濁させる緩衝液に、不活性なタンパク質（ウシ血清アルブミン等）を安定剤として添加する場合があるが、使用する試薬のグレードによって、不純物が多く含まれていたり、ある種のタンパク質分解酵素が含まれていた場合には、正・負の誤差を含めて、正確な測定ができない場合が多かった。
【０００５】
上述のような非特異反応を減少することを目的として、検体をグリシン等の緩衝液で希釈したり、又は、血清中の補体を失活させる非動化処理が従来から行われている。しかし、このような処理によっては、非特異反応を充分に抑制することが困難であり、また、手間がかかるという問題がある。また、動物の変成グロブリンを添加したり、タンパク質分解酵素阻害剤を添加する方法も報告されているが、これらはいずれも、変成条件の設定が微妙で安定した変成グロプリンの製造が困難であったり、コストが高くつく等の問題があり、いずれも非特異反応の抑制という点では不充分であった。
【０００６】
このような問題を解決するため、従来より、抗原抗体反応にゼラチン、アルブミン等のタンパク質や、ポリアニオン類等を添加する方法が知られている。また、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミドや低級アルキルスルホキシド（特開昭５５−６０８５号公報）、アルキルセルロース（特開平２−１７３５６７号公報）、カルボキシアルキルセルロース（特開平２−２３８３６０号公報）等を添加する方法が開示されているが、より優れた方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、血清の非動化等の煩雑な処理を行うことなく、非特異反応が抑制され、かつ、検出感度が高い非特異反応抑制剤、免疫測定試薬、及び、免疫測定方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被測定物質に対する抗体又は抗原を固定化した担体を用いる免疫測定方法において用いられ、上記被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体若しくはその断片、又は、免疫学的に反応しない抗原を固定化した不溶性担体からなる非特異反応抑制剤である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明の非特異反応抑制剤は、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体若しくはその断片、又は、免疫学的に反応しない抗原を固定化した不溶性担体からなる。
【００１０】
上記不溶性担体に固定化する抗体は、被測定物質である抗原に特異的な反応性を持たない抗体である。上記抗体としては、例えば、ヒト由来の血液や尿等の検体を対象に免疫測定を行う場合であれば、ヒト以外の正常動物血清由来の抗体等が挙げられる。
上記抗体と、被測定物質である抗原に特異的な反応性を持つ抗体（以下、「特異抗体」ともいう）とは、動物種、抗体クラスが同一の方が非特異抑制効果が高いので好ましい。
【００１１】
上記抗体は、正常動物血清から一般的に用いられている方法で精製される。上記精製方法としては例えば、塩析法、電気泳動法、ゲルろ過法、疎水性クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等が挙げられる。
【００１２】
上記精製法については、数種の精製法を組み合わせて用いる場合もあるが、好ましくは各精製段階の中で、特異抗体と部分的に同じ方法を取り得る段階があれば、特異抗体と同様の方法を行ったほうが望ましい。
【００１３】
上記抗体は、一般的に用いられている方法で断片化されてもよい。上記断片化の方法としては、通常、各種酵素により抗体分子を分解する方法が挙げられ、例えば、パパイン等による分解ではＦａｂ断片が得られ、またペプシン等による分解ではＦ（ａｂ′）２  断片が得られる。
上記抗体と特異抗体とは、同じ酵素による断片化を受けたものが好ましい。
【００１４】
上記特異抗体として、例えば、被測定物質に特異的反応性をもつ、家兎由来のサブクラスＩｇＧ抗体をペプシン処理によって断片化し、カラムクロマトグラフィー（ゲルろ過）及びアフィニティークロマトグラフィーによって精製したＦ（ａｂ′）２  断片を用いる場合、本発明の非特異反応抑制剤に用いる抗体としては、被測定物質に特異的反応性をもたない、家兎由来のサブクラスＩｇＧの抗体をペプシン処理によって断片化し、カラムクロマトグラフィー（ゲルろ過）によって精製したＦ（ａｂ′）２  断片が使用できる。
【００１５】
上記免疫学的に反応しない抗原としては、被測定物質である抗原又は抗体に特異的な活性を示すものでなければ特に限定されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、カザミノ酸等が挙げられる。上記免疫学的に反応しない抗原としては、また、被測定物質に対する抗体又は抗原（以下、「特異抗体又は特異抗原」ともいう）を固定化した担体に使用するブロッキング剤や、免疫測定試薬に安定化剤として用いられているものと同一でも異なるものであってもよい。
【００１６】
上記免疫学的に反応しない抗原としては、担体に固定化した免疫学的に反応しない物質と同じ物質が好ましい。上記担体に固定化した免疫学的に反応しない物質とは、通常、免疫測定法において使用されるブロッキング剤をいう。上記ブロッキングは、特異抗体又は特異抗原を担体に固定化した後、試料中のタンパク質等が担体へ非特異的に吸着するのを防止するために、特異抗体又は特異抗原に対して免疫学的に反応しないタンパク質等を更に結合させることである。
【００１７】
上記担体に固定化した免疫学的に反応しない物質としては、例えば、通常の免疫測定法において使用されているウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。
【００１８】
上記不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において一般的に用いられている微粒子の担体等が挙げられ、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１９】
上記工業的に大量生産が可能な有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体及び共重合体（ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）の微粒子；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体の微粒子；不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の有機系高分子；官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２  ）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子等が挙げられる。
【００２０】
上記不溶性担体としては、そのほか、動物の赤血球や細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、金、チタン、鉄、ニッケル、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子等が挙げられる。
上記不溶性担体の形状としては、球状粒子、粉末、片状等が挙げられる。
【００２１】
上記不溶性担体の種類、材質、形状は、使用される測定原理、測定方法によって、その非特異反応抑制効果、特異抗体又は特異抗原を固定化した不溶性担体と被測定物質との反応に対する妨害の有無、調製のしやすさ、使用簡便性等の観点から選択される。
【００２２】
上記不溶性担体の材質は、特異抗体又は特異抗原を固定化する担体の材質と同じものが好ましい。上記不溶性担体の形状は、その調製のしやすさや使用簡便性から球状粒子が好ましい。
【００２３】
本発明においては、抗体の吸着性に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、ラテックスからなる不溶性担体が好ましく、ポリスチレン系のラテックス粒子がより好ましい。
【００２４】
上記不溶性担体の大きさ（球状粒子の場合は平均粒径）は、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体の形状、大きさ、検出方法、測定機器等によって、０．００５μｍ〜１０ｍｍのものが適宜選択される。
【００２５】
上記不溶性担体への固定化方法は、一般に使用されている方法を採用することができ、例えば、不溶性担体表面に物理的に吸着させる手法や、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法や共有結合法により、効率的に結合する手法が挙げられる。好ましくは．特異抗体又は特異抗原の担体への固定化方法と同じ方法、条件で固定化する方法である。
【００２６】
上記不溶性担体への固定化量は、特異抗体又は特異抗原の不溶性担体への固定化量、使用される測定原理、測定方法によって、その非特異反応抑制効果、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体と被測定物質との反応への妨害の有無、調製のしやすさ等の観点から選択される。
【００２７】
上記不溶性担体に被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又はその断片を固定化する場合、その抗体の固定化量（不溶性担体の単位表面積当たりの固定化量）が、特異抗体の固定化量（担体の単位表面積当たりの固定化量）の２０％〜５００％であることが望ましい。上記の場合、不溶性担体には、更にブロッキング処理を施してもよい。上記ブロッキング剤としては、上述したものを使用することができ、ブロッキング剤の固定化方法は、一般に使用されている物理吸着又は化学結合が採用できる。好ましくは、特異抗体を固定化した担体に用いられているブロッキング剤と同一の物質を用い、同一の固定化方法を実施することである。
【００２８】
上記不溶性担体に免疫学的に反応しない抗原を固定化する場合には、好ましくは、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体に免疫学的に不活性な物質をブロッキングする際の処理量の０．０５〜５０倍であることが好ましい。なお、処理量とは、担体１体積当たりの総表面積に対する免疫学的に不活性な物質の重量である。
【００２９】
上記被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体若しくはその断片、又は、免疫学的に反応しない抗原を固定化した不溶性担体は、通常懸濁液の状態で調製され、非特異反応抑制剤として使用される。
【００３０】
上記懸濁用媒体としては、被測定物質の種類、使用される測定原理、測定方法に応じた各種緩衝液が用いられる。上記緩衝液としては、測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。好ましくは、グッド緩衝液群に属するものであり、例えば、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン及びスルホン酸基を有するものである。より好ましくは、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＥＳ）等である。
【００３１】
上記ｐＨは、好ましくは７．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．０である。上記緩衝液には、特異性を高めるための塩化コリン等の第４級アンモニウム塩；反応促進剤；アルブミン、ショ糖等の安定化剤；感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類；防腐剤としてアジ化ナトリウム；塩濃度調整のための塩化ナトリウム等を適宜添加することもできる。上記添加物は、被測定物質を失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないものであればいずれも利用できる。
【００３２】
本発明においては、上記の非特異反応抑制剤を用いることによって、免疫反応における非特異反応を抑制するものである。即ち、特異抗体の精製処理、その酵素による断片化処理、及び、特異抗体を不溶性担体に固定化する際に、試薬のｐＨやイオン強度等により特異抗体が何らかの変性を受けてしまっている場合や、これらの処理の際に、目的とする抗体又はその断片以外の物質が混入したり生成する場合がある。これらの変性を受けたり副反応生成物等が混入することが原因で、検体中の非特異反応誘起物質と反応が起こってしまう場合がある。本発明は、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又はその断片を不溶性担体に固定化して非特異反応抑制剤として用いることによって、検体中の非特異反応誘起物質が本発明の非特異反応抑制剤と反応を起こすために、特異抗体を固定化した担体と非特異反応誘起物質との反応が阻害（抑制）され、非特異反応を抑制できると考えられる。
【００３３】
上記ブロッキング剤として用いられる物質は、また、免疫学的に不活性であり、被測定物質である抗原又は抗体と特異的な反応性をもたないが、血清中の非特異反応誘起物質と反応が起こる場合がある。また、不溶性担体との相互作用や結合反応の副反応によって、何らかの変性を受けている場合があり、このような変性が原因で、血清中の非特異反応誘起物質と反応が起こってしまう場合がある。本発明の非特異反応抑制剤は、また、免疫学的に反応しない抗原、特に、ブロッキング剤として使用した物質と同じ物質を固定化した不溶性担体を使用することにより、それが血清中の非特異反応誘起物質と反応を起こすために、非特異反応が阻害（抑制）されると考えられる。
【００３９】
本発明３は、被測定物質に対する抗体又は抗原を固定化した担体を用いる免疫測定方法において用いられ、不溶性担体からなる非特異反応抑制剤である。
上記不溶性担体としては、本発明１において挙げたものが使用できる。
上記不溶性担体は、何も固定化されていないものを使用し、通常懸濁液の状態で調製され、非特異反応抑制剤として使用される。上記懸濁用媒体としては、本発明１で挙げたものが使用できる。
【００４０】
本発明の非特異反応抑制剤は、被測定物質に対する抗体又は抗原（特異抗体又は特異抗原）を固定化した担体を用いる免疫測定方法において用いられるものである。
【００４１】
上記被測定物質としては、生体試料中に含まれる生理活性物質であり、抗原抗体反応を利用して測定し得る物質であれば特に限定されず、例えば、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質、レセプター、酵素、ウイルス抗原・抗体等が挙げられ、具体的には、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲン、リウマチ因子、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）、ＨＢｓ抗原、フェリチン、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体等が挙げられる。
【００４２】
上記被測定物質としては、また、臨床検査上重要な項目であり、従来までラテックス凝集法では検出感度が不足であるとされていた項目についても特に有用であり、例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定される、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９等の１ｎｇ／ｍＬまで検出感度が要求される項目等が挙げられる。
【００４３】
上記免疫測定方法において使用される特異抗体としては、モノクローナル抗体であってもよいし、免疫源を通常のウサギ、マウス、馬、ヤギ等の動物に接種することによって得られるポリクローナル抗体であってもよい。
上記モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、またそれらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、取得できる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」岩崎辰夫ら著、講談社）。
【００４５】
上記免疫測定方法において使用される担体としてラテックスからなる不溶性担体を使用する場合、その平均粒径は、担体上の特異抗体又は特異抗原と被測定物質との抗原抗体反応により惹起される凝集反応の結果生じた凝集塊が、肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさを呈するものであればよく、平均粒径０．０５〜０．５μｍのものである。
上記担体の表面に特異抗体又は特異抗原を感作させる手法としては、上述した不溶性担体への固定化方法が採用できる。
【００４６】
本発明４は、本発明１又は本発明３の非特異反応抑制剤を含有する免疫測定試薬である。
上記本発明１又は本発明３の非特異反応抑制剤は、その添加方法によって、非特異反応抑制効果、使用簡便性等の観点からその剤型を選択し、免疫測定試薬として使用される。上記免疫測定試薬は、例えば、上記非特異反応抑制剤を含み、特異抗体若しくは特異抗原を固定化した担体を含まない液状試薬（懸濁液）として、又は、上記固定化された不溶性担体及び特異抗体若しくは特異抗原を固定化した担体を含む液状試薬（懸濁液）として調製できる。
【００４７】
本発明５は、被測定物質を含む試料を本発明の非特異反応抑制剤によって予め処理した後免疫反応させるか、又は、本発明の非特異反応抑制剤の存在下で被測定物質を含む試料を免疫反応させる免疫測定方法である。
本発明５の免疫測定方法においては、被測定物質を含む試料を本発明の非特異反応抑制剤で処理することからなるものである。
【００４８】
上記非特異反応抑制剤の処理方法としては、例えば、（第１法）非特異反応抑制剤を含む液を被測定物質を含む試料に予め添加し、試料中の非特異反応誘起物質を吸収させ、非特異反応抑制剤を添加したまま、非特異反応抑制剤と試料の混合物を、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体に接触させ、被測定物質である抗原又は抗体との特異的反応を起こす方法、（第２法）非特異反応抑制剤を含む液を被測定物質を含む試料に予め添加し、試料中の非特異反応誘起物質を吸収させ、その後、非特異反応抑制剤である不溶性担体を取り除き、その残液を、特異抗体又は特異抗原を固定化した不溶性担体に接触させ、被測定物質である抗原又は抗体との特異的反応を起こす方法、並びに、（第３法）非特異反応抑制剤及び特異抗体を固定化した不溶性担体とを含む反応系に、被測定物質を含む試料を添加し、試料中の非特異反応誘起物質を吸収させる反応と、特異抗体と被測定物質である抗原との特異的反応を同時に起こす方法が挙げられる。
【００４９】
上記非特異反応抑制剤の処理方法としては、被測定物質の種類、使用される測定原理、測定方法によって、その非特異反応抑制効果、使用簡便性等の視点から上記（第１法）、（第２法）又は（第３法）のなかから選択できる。
【００５０】
上記処理方法として（第１法）又は（第３法）を採用する場合、非特異反応抑制剤に使用される不溶性担体は、０．０１〜２０μｍの平均粒径のものが好ましい。０．０１μｍ未満であると、非特異反応抑制剤として調製する際、非常に手間がかかる場合がある。２０μｍを超えると、不溶性担体の単位重量当たりの表面積が小さくなり、担体数を多くしないと非特異反応の抑制効果が充分でなかったり、その不溶性担体が示すシグナルに対して、被測定物質である抗原又は抗体と特異抗体又は特異抗原を固定化した不溶性担体との特異的反応を示すシグナルが小さくなり、結果として検出感度が悪化することがある。
【００５１】
上記処理方法として（第２法）を採用する場合は、非特異反応抑制剤に使用される不溶性担体は、０．０１〜１０μｍの平均粒径のものが好ましい。０．０１μｍ未満であると、非特異反応抑制剤として調製する際、非常に手間がかかる場合がある。２０μｍを超えると、不溶性担体の単位重量当たりの表面積が小さくなり、担体数を多くしないと非特異反応の抑制効果が充分でない場合がある。
【００５２】
本発明５の免疫測定方法において、非特異抑制剤の添加濃度としては、その不溶性担体に固定化された非特異抑制用物質の量、不溶性担体の大きさ、種類及び平均粒径、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体の濃度、種類及び平均粒径、検出方法、並びに、測定機器によって、その非特異反応抑制効果、特異抗体又は特異抗原を固定化した担体と抗原との反応への妨害の有無、使用簡便性等の観点から適宜選ばれる。
【００５３】
具体的には、上記非特異反応抑制剤の処理方法として（第１法）又は（第３法）を採用する場合、不溶性担体の濃度は、好ましくは、抗原抗体反応液に対して、０．００１〜５重量％を添加する。０．００１重量％未満であると、非特異反応の抑制効果が充分でない場合がある。５重量％を超えると、不溶性担体が示すシグナルに対して、被測定物質である抗原又は抗体と特異抗体又は特異抗原を固定化した不溶性担体との特異的反応を示すシグナルが小さくなり、結果として検出感度が悪くなることがある。
【００５４】
上記非特異反応抑制剤の処理方法として（第２法）を採用する場合、不溶性担体の濃度は、抗原抗体反応液に対して、好ましくは、０．００１〜１０重量％を添加する。０．００１重量％未満であると、非特異反応の抑制効果が充分でない場合がある。１０重量％を超えると、これを検体に添加した際、検体中の被測定物質である抗原又は抗体が不溶性担体に非特異的に吸着し、抗原と特異抗体を固定化した不溶性担体との特異的反応を示すシグナルが小さくなり、結果として検出感度が悪くなることがある。但し、この方法では、抗原抗体反応の反応系には非特異反応抑制剤は存在せず、前もって取り除かれた状態にあるので、非特異反応抑制剤の添加量は、仮に非特異反応抑制剤を取り除かなかった場合の濃度を表わすものとする。
【００５５】
上記特異抗体又は特異抗原を固定化した担体としてラテックス粒子を使用する場合には、上記非特異抑制剤の不溶性担体の濃度は、後に抗原抗体反応を行う際に添加されるそのラテックス液の濃度と併せて、検出系の測定上限を越えない範囲であれば、特に限定されない。例えば、分光光度計による検出を行う際には、反応終了後の吸光度が３．０を超えない範囲であればよい。プレート上で肉眼判定する場合では特に限定されない。
【００５６】
上記特異抗体又は特異抗原を担持させた担体と、被測定物質である抗原又は抗体を含む試料との反応は抗原抗体反応であり、この反応が起こりうる条件であれば、その条件は特に限定されない。上記反応は恒温で行うのがよく、特に２５℃〜３７℃で行うのが好ましい。上記反応時間についても特に限定されないが、５秒から１５分が好ましい。
【００５７】
上記反応において、最終的に抗原抗体反応を行う反応液中にあって、非特異反応抑制剤以外の緩衝液成分、即ち、検体の希釈用緩衝液等については、一般的に生化学的な用途に用いられているリン酸、グリシン、トリス等特に限定されず、上記不溶性担体の懸濁用媒体として例示したものが挙げられる。
【００５８】
本発明５の免疫測定方法は、抗原抗体反応を利用して抗原又は抗体を定量するラテックス凝集法による免疫凝集反応測定法である。
【００５９】
上記ラテックス凝集法の場合は、例えば、以下のようにして行うことができる。
上記ラテックス凝集法において使用される試薬としては、検体の希釈及び前処理用液状試薬（抗原抗体反応の特異性、感度等を向上させる目的）である検体希釈液、並びに、特異抗体又は特異抗原を固定化させた担体（ラテックス粒子）を含む液状試薬であるラテックス液からなる。本発明の非特異反応抑制剤を含む場合の試薬の構成としては、非特異反応抑制剤を含むラテックス液のみの１試薬系、非特異反応抑制剤を含む検体希釈液と非特異反応抑制剤を含まないラテックス液との２試薬系、非特異反応抑制剤を含まない検体希釈液と非特異反応抑制剤を含むラテックス液との２試薬系、非特異反応抑制剤を含む検体希釈液と非特異反応抑制剤を含むラテックス液との２試薬系が挙げられる。
【００６０】
上記非特異抑制剤による処理方法は、（第１法）〜（第３法）のいずれであってもよい。上記処理方法としては、例えば、まず、検体と非特異反応抑制剤を含む検体希釈液とを混合し、一定時間置く。その後、非特異反応抑制剤を含まないラテックス液を上記混合液に添加し、特異抗体を固定化したラテックス粒子の凝集の度合を観察又は測定する。上記処理方法として他の例を挙げると、まず、検体と非特異反応抑制剤を含まない検体希釈液とを混合し、一定時間置く。その後、非特異反応抑制剤を含むラテックス液を上記混合液に添加し、特異抗体又は特異抗原を固定化したラテックス粒子の凝集の度合を観察又は測定する。
【００６１】
上記免疫測定方法がラテックス凝集法の場合、上記非特異反応抑制剤である不溶性担体は、ラテックス粒子であることが好ましく、特異抗体又は特異抗原を固定化したラテックスの粒径に応じて、０．０１〜５０μｍの粒径のものが適宜選択される。上記非特異反応抑制剤である不溶性担体を比較的濃い濃度で使用するときは、特異性抗体を固定化したラテックス粒子の凝集の度合を観察または測定する際、バックグラウンドが大きくなってしまうので、特異抗体又は特異抗原が固定化されたラテックス粒子よりも小さい粒径の粒子を用いるとよい。
【００６２】
上記ラテックスの凝集の程度を測定する方法は、特に限定されない。上記凝集を定量的に測定する場合、簡便性及び精度の点からは、例えば光学的に測定することが好ましく、具体的には、上記測定は散乱光、吸光度又は透過光強度を測定する光学機器で行う。上記測定の波長としては、３００〜１２００ｎｍが使用できる。上記測定方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体の大きさ、その濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度又は過光強度の増加若しくは減少を測定することにより行われる。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００６３】
上記ラテックス凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能であり、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないし平均粒径の変化としてとらえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）等が挙げられる。
【００６４】
上記それぞれの測定法について、速度試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、これらの時点間における該測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める）が利用可能である。好ましくは、測定の簡便さ、迅速性の点から、比濁法を用いた速度試験を行うことである。
【００６５】
上記ラテックスの凝集反応においては、反応開始後の凝集の度合を、定性的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、上記結合物の凝集の程度を目視によって判定することも可能である。
【００６６】
上記不溶性担体の凝集の度合を肉眼で判定する試薬においては、通常、試料と感作不溶性担体とを含む溶液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の有無を判定する。上記凝集判定には、単に肉眼判定以外に、ビデオカメラで撮影し、画像処理を施すことも可能である。
【００７０】
【発明の実施の形態】
（実施例）
以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００７１】
実施例１
（１）非特異反応抑制剤用抗体の調製
正常家兎血清１０ｍＬを２５℃で攪拌しながら硫酸ナトリウム１．８ｇを加えた。３０分放置した後、２５℃、７０００Ｇで１０分間遠心した。沈殿を採取し、これを０．０３Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ−ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．５、以下「ＰＢＳ」という）１０ｍＬに溶解させた。その後、ＰＢＳに対し２４時間透析した後、１０００Ｇで１０分間遠心した。上清をＰＢＳで平衡化した陽イオン交換樹脂であるＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し、ＩｇＧ画分液を採取した。得られたＩｇＧ画分液を濃縮した。
【００７２】
（２）特異抗体の調製
ＨＢｓ抗原として、サブタイプＡｄ、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ、純度９５％以上（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＩＮＣ．社製）のものを、兎１匹に対して８ｍｇ免疫し、免疫注射より３か月後に採血した。ＨＢｓ抗原を免疫感作した家兎抗血清１０ｍＬを２５℃で攪拌しながら硫酸ナトリウム１．８ｇを加えた。３０分放置した後、２５℃、７０００Ｇで１０分間遠心した。沈殿を採取し、これをＰＢＳ１０ｍＬに溶解させた。ＰＢＳに対し２４時間透析した後、１０００Ｇで１０分間遠心した。上清をＰＢＳで平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し、ＩｇＧ画分液を採取した。その後、得られたＩｇＧ画分液を、ＨＢｓ抗原を固定化したアガロースゲルを充填したカラムに通しアフィニティー精製を行い、ＨＢｓ抗原に特異性を持つＩｇＧ成分のみを含む特異抗体液を得た。その後、得られた特異抗体液を濃縮した。
【００７３】
（３）非特異反応抑制剤の懸濁液の作成
非特異反応抑制剤用抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液３．７５ｍＬに、平均粒径が０．１μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳを１．２５ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを２．０重量％含有したＰＢＳを６ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１０ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、非特異反応抑制剤の懸濁液を調製した。
【００７４】
実施例２
（１）ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製
実施例１（２）の特異抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．２５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．７５ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを２．０重量％含有するＰＢＳを６ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物に実施例１（３）の非特異反応抑制剤の懸濁液を１ｍＬ、ＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを９９ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ．ＨＢｓ抗体感作ラテックス液を調製した。
【００７５】
（２）検体希釈液の調製
ＰＢＳにポリエチレングリコール（和光純薬製、平均分子量；５０万）を０．３重量％、及びＢＳＡを０．５重量％の濃度になるように溶解した。
【００７６】
（３）ＨＢｓ抗原測定用試薬
本実施例のＨＢｓ抗原測定用試薬は、上記（１）項のＨＢｓ抗体感作ラテックス液からなる第１試薬と、上記（２）項の検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２試薬系の試薬である。
【００７７】
（４）標準ＨＢｓ抗原液
ＨＢｓ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清を使用した。
【００７８】
（５）ＨＢｓ抗原陰性検体及びＨＢｓ抗原陽性検体
ＨＢＳ抗原陰性検体（健常人血清）１０検体と、ＨＢＳ抗原陽性検体（Ｂ型肝炎感染者血清）５検体を使用した。
【００７９】
（６）測定方法
上記（４）の標準ＨＢｓ抗原液２０μＬに、上記（２）項の検体希釈液１５０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）のＨＢｓ抗体感作ラテックス液１５０μＬを添加攪拌した。この後、１分後及び５分後の波長７５０ｍｎでの吸光度を測定し、この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＯ．Ｄ．）とした。測定は日立自動分析装置７１５０形を使用した．
標準ＨＢＳ抗原液を測定して、予め検量線を作成しておき．検体の吸光度変化量と上記検量線から検体中のＨＢｓ抗原濃度を算出した。
【００８０】
実施例３  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例２における（１）ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製及び（２）検体希釈液の調製の項を、次のようにして行ったことを除いては．実施例２と同様にしてＨＢｓ抗原測定用試薬を作成した。
（１）ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製
実施例１（２）の特異抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．２５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳを３．７５ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを２．０重量％含有するＰＢＳを６ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗体感作ラテックス液を調製した。
【００８１】
（２）検体希釈液の調製
ＰＢＳに実施例１の非特異反応抑制剤の懸濁液を１体積％、ポリエチレングリコール（和光純薬製、平均分子量；５０万）を０．３重量％、及びＢＳＡを０．５重量％の濃度になるように溶解した。
【００８２】
実施例４  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例２における（１）ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製、（４）標準ＨＢｓ抗原液、及び、（５）検体の項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例２と同様にしてＨＢｓ抗原測定用試薬を作成した。
（１）ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製
実施例１（２）の特異抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．２５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学杜製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．７５ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを２．０重量％含有するＰＢＳを６ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗体感作ラテックス液を調製した。
【００８３】
（４）標準ＨＢｓ抗原液
ＨＢｓ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清１．  ６ｍＬに実施例１の非特異反応抑制剤の懸濁液０．  １２ｍＬを添加混合して使用した。
【００８４】
（５）ＨＢＳ抗原陰性検体及びＨＢＳ抗原陽性検体
ＨＢｓ抗原陰性検体（健常人血清）１０検体と、ＨＢｓ抗原陽性検体（Ｂ型肝炎感染者血清）５検体を１．  ６ｍＬに実施例１の非特異反応抑制剤の懸濁液０．  １２ｍＬを添加混合して使用した。
【００８５】
比較例１  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例２における（１）ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製の項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例２と同様にしてＨＢｓ抗原測定用試薬を作成した。
【００８６】
（１）ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製
実施例１（２）の特異抗体を１．  ０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．  ２５ｍＬに、平均粒径が０．  ３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．  ０ｍＬとＰＢＳ３．  ７５ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを２．  ０重量％含有するＰＢＳを６ｍＬ添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗体感作ラテックス液を調製した。
【００８７】
実施例２〜４及び比較例１の結果を表１に示した。
表１は、実施例２〜４及び比較例１の試薬により、ＨＢｓ抗原陽性検体及びＨＢｓ抗原陰性検体を測定したときの測定値（ＩＵ／ｍＬ）を示したものである。
なお、実施例２〜４及び比較例１におけるカットオフポイントを８ＩＵ／ｍＬに設定し、８ＩＵ／ｍＬ未満の検体を陰性、８ＩＵ／ｍＬ以上の検体を陽性と判定した。
【００８８】
【表１】
0003623657.tif 000002
【００８９】
表１から明らかなように、ＨＢｓ抗原陰性検体中の数例で実施例２〜４では陰性判定されているにもかかわらず、比較例１では陽性と判定され、非特異凝集反応が起こっていることが示唆される。
【０１００】
実施例６  非特異反応抑制剤の懸濁液の作成
ＢＳＡを２重量％の濃度でＰＢＳに溶解した液１８ｍＬに、平均粒径が０．１μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学杜製）１ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳ１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、非特異反応抑制剤の懸濁液を作成した。
【０１０１】
実施例７  ラテックス凝集法によるＨＢＳ抗体の測定
（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製
ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．５ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した（この操作を感作と呼ぶ）。次いで、この液にＢＳＡ２重量％含有するＰＢＳ６ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物に実施例６の非特異反応抑制剤の懸濁液を１ｍＬ、ＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを９９ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製した。
【０１０２】
（２）検体希釈液の調製
ＰＢＳにポリエチレングリコール（和光純薬製、平均分子量；５０万）を０．４重量％、及びＢＳＡを１．０重量％の濃度になるように溶解した。
【０１０３】
（３）ＨＢｓ抗体測定用試薬
本実施例のＨＢｓ抗体測定用試薬は、上記（１）項のＨＢｓ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬と、上記（２）項の検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２試薬系の試薬である。
【０１０４】
（４）標準ＨＢｓ抗体液
ＨＢｓ抗体を０、１５０、３００、６００、１２００ｍＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清を使用した。
【０１０５】
（５）ＨＢｓ抗体陰性検体及びＨＢＳ抗原陽性検体
ＨＢｓ抗体陰性検体（健常人血清）１０検体と、ＨＢＳ抗体陽性検体（Ｂ型肝炎既往歴がある血清）５検体を使用した。
【０１０６】
（６）測定方法
上記（４）の標準ＨＢｓ抗体液２０μＬに、上記（２）項の検体希釈液１２０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）のＨＢｓ抗原感作ラテックス液１２０μＬを添加攪拌した。この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの吸光度を測定し、この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（△Ｏ．Ｄ．）とする。測定は日立自動分析装置７１５０形を使用した。
標準ＨＢｓ抗体液を測定して、予め検量線を作成しておき、検体の吸光度変化量と上記検量線から検体中のＨＢｓ抗体濃度を算出した。
【０１０７】
実施例８  ラテックス凝集法によるＨＢＳ抗体の測定
実施例６における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製及び（２）検体希釈液の調製の項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例６と同様にしてＨＢｓ抗体測定用試薬を作成した。
【０１０８】
（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製
ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．５ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した（この操作を感作と呼ぶ）。次いで、この液にＢＳＡ２重量％含有するＰＢＳ６ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ．ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製した。
【０１０９】
（２）検体希釈液の調製
ＰＢＳに実施例６の非特異反応抑制剤の懸濁液を１体積％、ポリエチレングリコール（和光純薬製、平均分子量；５０万）を０．４重量％、及びＢＳＡを１．０重量％の濃度になるように溶解した。
【０１１０】
実施例９  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗体の測定
実施例７における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製、（４）標準ＨＢｓ抗体液及び（５）検体の項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例７と同様にしてＨＢＳ抗体測定用試薬を作成した。
【０１１１】
（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製
ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％．積水化学杜製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．５ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した（この操作を感作と呼ぶ）。次いで．この液にＢＳＡ２重量％含有するＰＢＳ６ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製した。
【０１１２】
（４）標準ＨＢｓ抗体液
ＨＢｓ抗体を０、１５０、３００、６００、１２００ｍＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清１．６ｍＬに実施例６の非特異反応抑制剤の懸濁液０．１２ｍＬを添加混合して使用した。
【０１１３】
（５）ＨＢｓ抗体陰性検体、およびＨＢｓ抗体陽性検体  ＨＢｓ抗体陰性検体（健常人血清）１０検体と、ＨＢｓ抗体陽性検体（Ｂ型肝炎既往歴がある血清）５検体１．６ｍＬに実施例６の非特異反応抑制剤の懸濁液０．１２ｍＬを添加混合して使用した。
【０１１４】
比較例３  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗体の測定
実施例７における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製の項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例７と同様にしてＨＢｓ抗体測定用試薬を作成した。
（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製
ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した液１．５ｍＬに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳ３．５ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した（この操作を感作と呼ぶ）。次いで、この液にＢＳＡ２重量％含有するＰＢＳ６ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、洗浄した。洗浄操作は３回行った。えられた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳを１００ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製した。
【０１１５】
実施例７〜９及び比較例３の結果を表３に示した。
表３は、実施例７〜９及び比較例３の試薬により、ＨＢｓ抗体陰性検体及びＨＢｓ抗体陽性検体を測定したときの測定値（ｍＩＵ／ｍＬ）を示す。
なお、実施例７〜９及び比較例３におけるカットオフポイントを３０ｍＩＵ／ｍＬに設定し、３０ｍＩＵ／ｍＬ未満を陰性、３０ｍＩＵ／ｍＬ以上を陽性と判定した。
【０１１６】
【表３】
0003623657.tif 000003
【０１１７】
表３から明らかなように、ＨＢｓ抗体陰性検体中の数例で実施例７〜９では陰性判定されているにもかかわらず、比較例１では陽性と判定され、非特異凝集反応が起こっていることが示唆される。
【０１１８】
実施例１０  非特異反応抑制剤の懸濁液の作成
ＢＳＡを２重量％の濃度でＰＢＳに溶解した液１０ｍＬに、平均粒径が０．１μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％、積水化学社製）１．０ｍＬとＰＢＳ９ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで１８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物にＢＳＡ０．５重量％含有するＰＢＳを１０ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁させ、非特異反応抑制剤の懸濁液を作成した。
【０１１９】
実施例１１  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例２（１）ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製において、実施例１（３）の非特異反応抑制剤の懸濁液の代わりに、実施例１０の非特異反応抑制剤の懸濁液を使用し、実施例２（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡの濃度を１．０重量％としたこと以外は、実施例２と同様にして、ＨＢｓ抗原の測定を行った。
【０１２０】
実施例１２  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例３（２）検体希釈液の調製において、実施例１の非特異反応抑制剤の懸濁液の代わりに、実施例１０の非特異反応抑制剤の懸濁液を使用したこと以外は、実施例３と同様にして、ＨＢｓ抗原の測定を行った。
【０１２１】
実施例１３  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
実施例４（４）標準ＨＢｓ抗原液の調製において、実施例１の非特異反応抑制剤の懸濁液の代わりに、実施例１０の非特異反応抑制剤の懸濁液を使用したこと以外は、実施例４と同様にして、ＨＢｓ抗原の測定を行った。
【０１２２】
比較例４  ラテックス凝集法によるＨＢｓ抗原の測定
比較例１の検体希釈液の調製において、ＢＳＡの濃度を１．０重量％としたこと以外は、比較例１と同様にして、ＨＢｓ抗原の測定を行った。
【０１２３】
実施例１１〜１３及び比較例４の結果を表４に示した。
表４は、実施例１１〜１３及び比較例４の試薬により、ＨＢｓ抗原陰性検体及びＨＢｓ抗原陽性検体を測定したときの測定値（ＩＵ／ｍＬ）を示す。
なお、実施例１１〜１３及び比較例４におけるカットオフポイントを８ＩＵ／ｍＬに設定し、８ＩＵ／ｍＬ未満を陰性、８ＩＵ／ｍＬ以上を陽性と判定した。
【０１２４】
【表４】
0003623657.tif 000004
【０１２５】
表４から明らかなように、ＨＢｓ抗原陰性検体中の数例で実施例１１〜１３では陰性判定されているにもかかわらず、比較例４では陽性と判定され、非特異凝集反応が起こっていることが示唆される。
【０１３９】
実施例１６
本実施例で使用した試薬及び材料は以下の通りである。
抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体：２種類の抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．ＣＥＡ  ４−Ｇ６７、ＩｇＧ−１、及び、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．ＣＥＡ  ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１；ＤＡＫＯ社製）を用いた。
ラテックス：０．  ４０μｍ、０．  ３０μｍのポリスチレンラテックス（いずれも固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）を用いた。
ラテックス懸濁用緩衝液：１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（和光純薬社製）水溶液を０．１Ｎ  ＮａＯＨを加えてｐＨが７．  ５０になるように調整したものに、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｇｒａｄｅ、Ｍｉｌｅｓ  Ｃｏｒｐ社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ３  （試薬特級、ナカライテスク社製）を０．  １％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ラテックス懸濁用緩衝液として用いた。
ブロッキング用緩衝液：１００ｍＭ  Ｎａ２  ＨＰＯ４  と１００ｍＭ  ＮａＨ２  ＰＯ４  をｐＨ７．  ４０になるように混合し、ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ３  を０．  １％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、プロッキング用緩衝液として用いた。
ＣＥＡ標準品：ＣＥＡ標準品（ダイナボット社、ＣＥＡ・リアビーズキット添付品）の０、５、２０、１００、５００ｎｇ／ｍＬをそのまま用いた。
ＣＥＡ陽性検体：ダイナボット社、ＣＥＡ・リアビーズキット添付品を用いてＣＥＡ濃度を測定したヒト血清２０検体を用いた。
【０１４０】
（１）ＣＥＡ測定用試薬の調製
平均粒径０．  ３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス懸濁用緩衝液９容を添加希釈し、１．  ０％ラテックス液とした。抗ＣＥＡ抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．ＣＥＡ  ４−Ｇ６７）は、タンパク濃度が１２．  ５μｇ／ｍＬになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。１．  ０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液６００μＬを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液１２００μＬを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を３．  ０ｍＬ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にラテックス懸濁用緩衝液４．  ０ｍＬを添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を１．  ８ｍＬ添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行った。これにブロッキング用緩衝液を１．  ８ｍＬ添加し、固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬〔１〕とした。このようにして調製したＣＥＡ測定用試薬〔１〕は４℃にて保存した。Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．ＣＥＡ  ４−Ｇ１１についても同様の方法でラテックスに固定化し、固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬〔２〕とした。
【０１４１】
（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製
上記（１）において、抗ＣＥＡ抗体を固定化する代わりに１％ＢＳＡ９容を添加したこと以外は、上記（１）と同様の操作によりラテックス懸濁液（固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ））を得、ＢＳＡが固定化された非特異反応抑制剤とした。
ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７，５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し、更に、上記非特異反応抑制剤を０．０００１％になるように懸濁して、検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【０１４２】
（３）ＣＥＡ量の測定
ＣＥＡ量の測定は、生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行った。上記（１）で得られた固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬〔１〕及び〔２〕を等量混合したものをＲ２液（固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りである。
検体容量              ２０μＬ
検体希釈液（Ｒ１液）１８０μＬ
試薬（Ｒ２液）        ９０μＬ
測定波長            ７００ｎｍ
測定温度              ３７℃
試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（△ＯＤ５７０）を測定し、この吸光度の差を１０，０００倍したものを吸光度変化量とした。既知濃度の上記ＣＥＡ標準品を用いて、吸光度変化量を測定し、検量線を作成した。ＣＥＡ標準品の測定結果を、表７に示した。
【０１４３】
（４）患者血清中のＣＥＡ量測定
ＣＥＡ陽性血清を検体として、上記（３）ＣＥＡ量の測定に従って吸光度変化量を測定し、上記（３）で得られた検量線を用いてＣＥＡ濃度を求めた。これらの測定結果を表８に示した。ＣＥＡ・リアビーズキット（ダイナボット社）を用いて、ＲＩＡ法によりＣＥＡ陽性血清中のＣＥＡ量を測定した結果も合わせて表８に示した。
ＲＩＡ法により測定したＣＥＡ陽性血清中のＣＥＡ量測定値と、実施例１６により得られたＣＥＡ量測定結果の相関関係を示すグラフを図１に示した。
【０１４４】
実施例１７
実施例１６の（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製において、１％ＢＳＡ９容を添加する代わりに１％カゼイン９容を添加して、カゼインが固定化された非特異反応抑制剤を調製したこと以外は、実施例１６と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を、表７、表８及び図２に示した。
【０１４５】
実施例１８
実施例１６の（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製において、１％ＢＳＡ９容を添加する代わりに１％カザミノ酸９容を添加して、カザミノ酸が固定化された非特異反応抑制剤を調製したこと以外は、実施例１６と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表７、表８及び図３に示した。
【０１４６】
実施例１９
実施例１６中の（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製、及び、（３）ＣＥＡ量の測定におけるＲ２液の調製を下記にように行ったこと以外は、実施例１６と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表７、表８及び図４に示した。
【０１４７】
（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製
ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７，５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【０１４８】
（３）ＣＥＡ量の測定
実施例１６（１）において、抗ＣＥＡ抗体を固定化する代わりに１％ＢＳＡを添加したこと以外は、上記（１）と同様の操作によりラテックス懸濁液（固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ））を得、ＢＳＡが固定化された非特異反応抑制剤とした。
実施例１６（１）で得られた固形分０．  １７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬〔１〕及び〔２〕を等量混合し、更に、上記非特異反応抑制剤を０．０００１％になるように懸濁させたものをＲ２液とした。
【０１４９】
実施例２０
実施例１９（３）ＣＥＡ量の測定のＲ２液の調製において、１％ＢＳＡを添加する代わりに１％カゼインを添加して、カゼインが固定化された非特異反応抑制剤を調製したこと以外は、実施例１９と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を、表７、表８及び図５に示した。
【０１５０】
実施例２１
実施例１９（３）ＣＥＡ量の測定のＲ２液の調製において、１％ＢＳＡを添加する代わりに１％カザミノ酸を添加して、カザミノ酸が固定化された非特異反応抑制剤を調製したこと以外は、実施例１９と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表７、表８及び図６に示した。
【０１５１】
比較例６
非特異反応抑制剤を使用せずに、ブロッキング用緩衝液にポリエチレングリコール６０００（平均分子量７，５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いたこと以外は、実施例１６と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表７、表８及び図７に示した。
【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
実施例２２
実施例１６（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製を下記のように行ったこと以外は、実施例１６と同様の操作を行い、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表９、表１０及び図８に示した。
【０１５５】
（２）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）の調製
ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７，５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し、更に、平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを０．０００１％になるように懸濁して、検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【０１５６】
実施例２３
実施例２２において、平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを添加する代わりに、実施例１６（１）ＣＥＡ測定用試薬の調製で得られたＣＥＡ測定用試薬〔１〕を添加したこと以外は、実施例２２と同様にして、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表９、表１０及び図９に示した。
【０１５７】
実施例２４
実施例２２において、平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを添加する代わりに、実施例１６（１）ＣＥＡ測定用試薬の調製で得られたＣＥＡ測定用試薬〔２〕を添加したこと以外は、実施例２２と同様にして、ＣＥＡ量の測定を行った。結果を表９、表１０及び図１０に示した。
【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
表７〜表１０及び図１〜図１０から明らかなように、純度の高い標準品を用いて測定した検量線は、実施例、比較例とも大きな差は見られなかったが、実検体において、比較例では検体中の共存物質に起因すると思われる非特異反応による正誤差が多く見られたのに対し、本発明では、ＲＩＡ法の結果と良く一致する正確な結果が得られた。
これは、使用する材料や、検体中の共存物質による非特異凝集を、あらかじめ加えておいた非特異反応抑制剤であるラテックス液が吸収し、本来の抗原抗体反応を正確に測定できた結果と推察される。以上の結果から、本発明によるＣＥＡ定量法は、従来のラテックス凝集免疫試薬よりも高感度かつ安定で優れた定量法であることが確認された。
【０１６１】
【発明の効果】
本発明の非特異反応抑制剤、並びに、それを使用した免疫測定試薬及び免疫測定方法は、上述の構成よりなるので、免疫学的反応に基づく被測定物質の測定において、非特異反応が抑制され、かつ、高い検出感度を得ることができる。これにより被検試料中の被測定物質を正確に定量することが可能になり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例１６における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例１６における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例１６の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図２】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例１７における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例１７における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例１７の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図３】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例１８における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例１８における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例１８の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図４】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例１９における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例１９における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例１９の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図５】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例２０における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例２０における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例２０の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図６】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例２１における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例２１における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例２１の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図７】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び比較例６における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、比較例６における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する比較例６の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図８】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例２２における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例２２における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例２２の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図９】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例２３における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例２３における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例２３の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図１０】ヒト血清２０検体中のＣＥＡ濃度を、ＲＩＡ法及び実施例２４における試薬によって測定した結果の相関図である。縦軸は、実施例２４における試薬によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）であり、横軸は、ＲＩＡ法によるＣＥＡ濃度測定結果（ｎｇ／ｍＬ）である。図中に、ＲＩＡ法の結果に対する実施例２４の結果の一次回帰式及び相関係数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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