(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト用食品であって、それぞれの親が、もう一方の親によって共有されないその成長能力に対する遺伝的抑制を有する不完全菌類のメンバーの高倍数性菌株を含む上記食品。
【請求項２】
それぞれの親菌株が異なった代謝産物について栄養要求性であるフザリウム属の食用高倍数性菌株。
【請求項３】
一方の親が、ヒスチジン、アルギニン、ロイシンおよびアデニンから選択される２種類のアミノ化合物について栄養要求性であり、そしてもう一方が、該化合物の別の２種類について栄養要求性である請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
フザリウム属菌株ＩＭＩ  ３６９１９０、ＩＭＩ  ３６９１９１およびＩＭＩ  ３６９１９２。
【請求項５】
死んでいる且つその核酸含有量が２重量％未満である不完全菌類の高倍数性菌株。
【請求項６】
それぞれの親が、もう一方の親によって共有されないその成長能力に対する遺伝的抑制を有する請求項５に記載の菌株。
【請求項７】
菌株が死んでいる且つその核酸含有量が２重量％未満である請求項２〜６のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項８】
菌株が死んでいる且つその核酸含有量が２重量％未満である請求項１に記載の食品。
【請求項９】
請求項５に記載の不完全菌類の菌株を製造する方法であって、不完全菌類の高倍数性菌株を致死させ、そして同時に、その核酸含有量を少なくとも６０℃の温度の水での処理によってその核酸含有量を２重量％未満まで減少させることを含む上記方法。
【請求項１０】
真菌がフザリウム属Ａ３／５である請求項２〜７のいずれか１項に記載の菌株。
【請求項１１】
食用フザリウム属の高倍数性菌株を製造する方法であって、別々の栄養要求栄養素を必要とする２種類の栄養要求性突然変異体を、その両者を成長させる栄養素を含有する培地中で一緒に培養（同時培養段階）した後、このような培養物に由来する微生物を、それらの栄養要求成分を欠いた培地（最小培地）中で培養し（最小培地培養段階）、そしてその最小培地培養段階から高倍数性菌株を回収することを含む上記方法。
【請求項１２】
栄養要求性突然変異体を突然変異及び選択によって製造する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
両方の栄養要求性突然変異体が同じ菌株に由来する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
栄養要求性突然変異体が別々のアミノ化合物を栄養素として要求する請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
それぞれの栄養要求性突然変異体が２種類のアミノ化合物を栄養素として要求し、そのとちらもが、もう一方の栄養要求性突然変異体によって必要とされるのと同じではない請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
同時培養段階から得られた真菌類を、存在する任意の半数体真菌類の大部分を死滅させるのに充分な強度で突然変異誘発させ、同時に、少なくとも若干の高倍数性真菌類を生存させることによって半数体真菌類より大きい割合で高倍数性が突然変異誘発に耐える請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
真菌類を、最小培地培養段階中にまたはそこから回収後に突然変異誘発させ、該突然変異誘発は、存在する任意の半数体真菌類の大部分を死滅させるのに充分な強度であり、同時に、少なくとも若干の高倍数性真菌類を生存させることによって半数体真菌類より大きい割合で高倍数性が突然変異誘発に耐える請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
突然変異誘発を放射能によって行う請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
放射線が紫外線である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト用食品を製造する方法であって、それぞれの親が、もう一方の親によって共有されないその成長能力に対する遺伝的抑制を有する不完全菌類の高倍数性菌株を培養することを含み、１種類または複数の半数体型への復帰または部分復帰を最小限にするような条件下で行う上記方法。
【請求項２１】
不完全菌類の高倍数性菌株を含むヒト用食物であって、その真菌が核酸を除去するようにおよび／またはそのテキスチャー、食味または食感を改良するよう処理された上記食物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、真菌に関する。
ヒト用食品は、半数体真菌であるフザリウム属（Fusarium）から商業的に製造される。特に適当なフザリウム属菌株Ａ３／５，ＩＭＩ  145425は、米国植物特許第4,347号で記載されている。
魅力的な食感のヒト用食品を製造するために、フザリウム属は菌糸分岐をほとんど示さないものであることが望ましく、これはフザリウム属ＩＭＩ  145425の場合である。しかしながら、長期にわたる連続発酵でのフザリウム属は、発酵槽培養物中の変異株の出現のために、常により高度に分岐した状態になる。高度に分岐した変異株の出現は、長期にわたる真菌発酵の共通した特徴であると考えられる。（トリンチ（Trinci）,A.P.J.ら，（1990）Microbial Growth Dynamics,17-38頁，IRLプレス（Press），オックスォード，英国）
したがって、より大きい形態安定性を有するフザリウム属菌株を生産すべきであるということが望まれる。
真菌株育種プログラムにおいて、擬似有性的生活環は、組換え、ヘテロカリオシスまたは二倍性によって二つの個体の有益な特質を組合わせることができるので、それは、商業的に重要な生産菌株を改良する有効な手段としてしばしば報告されてきた。例えば、二倍体は、クエン酸（ダス（Das）およびロイ（Roy），1978年）、ペニシリン（エランダー（Elander）ら，1973年）およびセファロスポリンＣ（タケダ・ケミカル・カンパニー（Takeda Chemical Co.），1977年）の増加した生産性を与えることが主張されてきた。質的改良の報告には、Ｐ．クリンゲヌム（chrysogenum）の胞子形成能力の回復（カラム（Calam）ら，1976年）、Ａ．ニガー（niger）の向上した濾過特性（ボール（Ball）ら，1978年）、Ｃ．アクレモニウム（acremonium）の一般的に向上した活力（ハムリン（Hamlyn）およびボール，1979年）、Ｍ．イニョエンシス（inyoensis）の低下した酸素要求量（クルーガー（Crueger），1982年）およびＰ．クリソゲヌムのｐ−ヒドロキシペニシリンＶ生産の除去（チャン（Chang）ら，1982年）が含まれる。対照的に、フザリウム属の擬似有性性の実証は明確でないと考えられるが（ブース（Booth），1984年）、Ｆ．オキシスポルム（oxysporum）の推定上の二倍体が記載された（ブクストン（Buxton）,1956年）。Ｆ．グラミネアルム（graminearum）ＮＲＲＬ 319の二倍体の生産を実証する試み（ブロック(Bu&Lock）ら，1986年）は不成功であったが、ヘテロカリオート（heterokaryotes）が報告された。
ローランズ（Rowlands）(1984）によれば、二倍体は不安定であるので、ある種の選択圧力を加えることができなければ、生産性の漸進的減少を伴って発酵中に分解すると考えられる。Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）において、適応突然変異は、進化した二倍体において半数体集団の場合よりも高い（ｘ１．６）頻度で起こる形跡がある（パキン（Paquin）およびアダムス（Adams），1983年）。これは、真菌類の二倍体集団が不安定であるという見解を支持する。しかしながら、本発明者は、不完全菌類の若干の高倍数性（higher ploidy）菌株が、典型的な成長条件下において親半数体に相対して（形態）安定性の増加を示すことを見出した。
本発明者は、ここで、高倍数性のフザリウム属菌株を製造し、そして不完全菌類、特に、フザリウム属の他の高倍数性菌株を生産しうる手段を考案した。これらは、半数体菌株より十分な形態安定性を有する。これは、より高度の分岐をもたらす突然変異遺伝子が劣性でありうることおよびこの場合、遺伝特性が無性生殖によって継代されうる前に、高倍数性菌株における重複遺伝子両方の対応する突然変異が必要であることに起因する突然変異に対する感受性が低下するという理由に、少なくとも部分的には依るであろう。不完全菌類は、それらが有性世代を通常経験しないという点で他の真菌類とは異なる。したがって、高倍数性菌株は、半数体型の復帰または部分復帰が無視できるような条件下でそれらを培養するならば、概して、半数体菌株より大きい遺伝特性の安定性を示すであろうと予測できる。
「高倍数性」により、異数体を含めた半数体より高い倍数性を意味する。
本発明は、ヒト用食品であって、それぞれの親がもう一方の親によって共有されないその成長能力に対する遺伝的抑制を有する不完全菌類のメンバーの高倍数性菌株を含む上記食品を含む。本発明はまた、フザリウム属の高倍数性菌株を含む。好ましくは、一方の親は、ヒスチジン、アルギニン、ロイシンおよびアデニンから選択される２種類の化合物について栄養要求性であり、そしてもう一方は、それら化合物の別の２種類について栄養要求性である。適当な菌株は、マーロウ・フーズ・リミデッド（Marlow Foods Limited），ステーション・ロード（Station Road），ストークスリー（Stokesley），ミドルズブラＴＳ９  ７ＡＢによってＩＭＩ 369190、369191および369192として、１９９５年１１月６日の国際真菌研究所（The International Mycological Institute），ベークハム・レーン（Bakeham lane），エグハム（Egham），サリーＴＷ２０  ９ＴＹに寄託されている。
好ましくは、不完全菌類に由来するヒト用食品は、好ましくは２重量％未満の低核酸含有量を有する。
本発明は、死んでいる且つその核酸含有量が２重量％未満である不完全菌類の高倍数性菌株を含む。その真菌は致死していてよいし、そして同時に、その核酸含有量は、少なくとも６０℃の温度の水での処理によって２％未満まで減少していてよく；その水はそれ自体の成長培地であってよい。
遺伝的抑制は、それぞれの親が異なった代謝産物について栄養要求性であること、またはそれぞれが成長に必要な遺伝子産物を生じ、それがもう一方の親の対応する遺伝子産物のものより大きい温度若しくはｐＨ感受性を有することでありうる。適当な環境（上の場合、両親が栄養要求性である栄養素を欠いた環境またはどちらの親も他の遺伝子産物の供給がなければ成長できない温度またはｐＨを有する環境）中で高倍数性菌株を成長させることにより、半数体菌株への復帰に対して選択し、それによって真菌の増加した形態安定性を維持できる。
本発明はまた、不完全菌類の高倍数性菌株を含むヒト用食物であって、その真菌が核酸を除去するようにおよび／またはそのテキスチャー、食味または食感を改良するように処理された上記食物を含む。
高倍数性菌株は、次のように製造することができる。該当する半数体菌株を培養し、そして例えば、紫外線によって、特定の代謝産物を作る能力を失った栄養要求性菌株が生産されるまで突然変異誘発をさせる。培養物は、例えば、寒天平板上に充分に平板培養され、そして栄養要求性突然変異体並びに非突然変異生物を成長させる完全培地を供給されうる。最少培地上へのレプリカ平板法により、非突然変異菌株が識別され、そして栄養要求性突然変異体が完全培地から選択され、そしてそれらの栄養要求性が確認される。次に、例えば、別々のアミノ酸を栄養素として要求する２種類の栄養要求性突然変異体を選択し且つ用いて、次に記載される高倍数性菌株を生産することができるし、またはそれらを別々に培養し、そしてその工程を繰返すことができる（この場合、最少栄養素は、それぞれの栄養要求性突然変異体によって要求される適当な１種類または複数のアミノ酸を含有するであろうことを除いて）。この手段により、２種類の二重栄養要求性突然変異体を、好ましくは、その一方によって要求されるものとは両方とも異なる２種類のアミノ酸を要求するものそれぞれから誘導することができる。所望ならば、三重またはそれより高次の栄養要求性突然変異体を対応する手段によって製造することができ、好ましくは、それらは、共通のメンバーを持たない一群の代謝産物に対して栄養要求性であるべきである。
本発明は、不完全菌類のメンバー、例えば、フザリウム属の高倍数性菌株を製造する方法であって、別々の栄養要求栄養素を必要とする２種類の栄養要求性突然変異体を、両方とも成長するのに必要な栄養素を含有する培地中で一緒に培養（同時培養段階）した後、このような培養物に由来する微生物を、それらの栄養要求成分を欠いた培地（最少培地）中で培養し（最少培地培養段階）、そしてその最少培地培養段階から高倍数性菌株を回収することを含む上記方法を含む。
その同時培養段階では、胞子形成を誘導する必要がある。これは、既知の手段によって、適当には、それら微生物を栄養的刺激にさらすことによって、例えば、主要な栄養素として復合炭素源のみを供給することによって行うことができる。
本発明者は、最少栄養培地、すなわち、栄養要求成分を欠いた培地へ移された場合、両方の栄養要求性突然変異体に由来する高倍数性菌株が、その半数体菌株および同じ栄養要求性突然変異体に由来する高倍数性菌株に相対して増大すること、およびこの作用が、適当には、存在する半数体菌株を高比率で致死させるのに充分な強度での放射線、例えば、紫外線である突然変異源に対してそれら微生物をさらすことによって増加しうることを見出した。
次に、高倍数性菌株を、例えば、平板培養によって、例えば、紫外線による突然変異誘発に対する増加した耐性を選択の判定基準として用いて選択するはずであることは好ましい。必要ならば、選択された微生物を最少培地中で、所望ならば、例えば、紫外線による突然変異誘発の下で再度培養し、そして生存する高倍数性菌株を再度選択することができる。
上のように生産された高倍数性菌株から、成長速度などの他の特性について更に選択を行うことができる。
実施例
１．１  親半数体
フザリウム属菌株Ａ３／５（ＣＭＩ  145425，ＡＴＣＣ 20334）は、半数体野性型である。菌株ＵＭＤＡ４−ＣおよびＵＭＤＡ６−Ｎは、慣用的な突然変異技術を用いて紫外線照射されたＡ３／５胞子の懸濁液から回収された。両方とも二重栄養要求性突然変異体である。ＵＭＤＡ４−Ｃは、ヒスチジンおよびアルギニンに対する栄養要求性を有し且つ塩素酸塩に対してＡ３／５より耐性である。ＵＭＤＡ６−Ｎは、ロイシンおよびアデニンを必要とし且つナイトロジェンマスタードに対してＡ３／５より耐性である。
１．２  培養維持および種培養物の製造
微生物を５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中で菌糸フラグメントとして維持し且つ−１９６℃で保持されたバイアル（２ｍｌ）中で貯蔵した。種培養物は、これらバイアルの一つからのアリコートを、ＲＨＭ成長培地（下記を参照されたい）５０ｍｌまたは２００ｍｌが入っている１リットルエレンマイヤーフラスコへ移すことによって製造された。培養物は、２８℃で最大７２時間までインキュベートすることによって発育した。
１．３  成長培地
１．３．１  ＲＨＭ培地
１リットル当たりの量：ｄ−グルコース，１０ｇ；Ｋ2ＳＯ4，０．３ｇ；ＮＨ4Ｃｌ，４．４ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．２５ｇ；ＫＨ2ＰＯ4，２０．０ｇ；微量元素溶液A，５．０ｍｌ；ビオチン，３０μｇ。
A微量元素溶液１リットルは、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，２．０ｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2，２．０ｇ；クエン酸，１．５ｇ；ＺｎＣｌ2，１．０ｇ；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，１．０ｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．２ｇ；ＣｏＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．２ｇ；ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ，０．２ｇを含んでいた。
最少塩類（グルコースおよびビオチンを除外する）を一緒にし、そして２０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨを用いてそのｐＨを６．０に調整した。次に、得られた溶液を必要に応じてフラスコに分配した。グルコースは、ｄ−グルコース５００ｇ  ｌ-1を含有する原液として別個に調製された。両方とも、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理することによって滅菌した。冷却後、それぞれのフラスコに、必要に応じてグルコースを補足した。ビオチンもまた、ビオチン３０ｍｇ  ｌ-1を含有する別の濾過滅菌原液から加えられた。
１．３．２  ＹＰＧ培地
１リットル当たりの量：酵母エキス，３ｇ；真菌ペプトン，５ｇ；Ｄ−グルコース，１０ｇ。
酵母エキスおよびペプトンを一緒にして基礎溶液を形成し、これを、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理することによって滅菌した。次に、１．３．１の項で記載のように調製されたＤ−グルコース５００ｇ  ｌ-1を含有する別の原液からグルコースを加えた。
１．３．３  ＣＭＣ培地
１リットル当たりの量：カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），１５ｇ；ＮＨ4ＮＯ3，１．０ｇ；ＫＨ2ＰＯ4，１．０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．５ｇ。成分を溶解させ、そして２０％ＮａＯＨを用いてそのｐＨを６．０に調整した後、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理することによって滅菌した。
１．３．４  発酵槽培地
これは、それぞれ１０  ｌの容量で調製された３種類の別々の原液から製造され且つ１２１℃で３０分間オートクレーブ処理することによって滅菌された。
（ａ）最少塩類濃厚物
１０  ｌ当たりの量：Ｋ2ＳＯ4，４０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，１８ｇ；（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｃａ，４ｇ；Ｈ3ＰＯ4（８５％  ｖ／ｖ），２３ｍｌ；微量元素溶液，１０ｍｌ。微量元素溶液１リットルは、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ，４０ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５０ｇ；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ，５ｇ；ビオチン，５０ｍｇ；ｃＨ2ＳＯ4，５ｍｌを含んでいた。
（ｂ）グルコース
Ｄ−グルコース６６ｇ  ｌ-1を含有する原液は、グルコース一水和物７３０ｇを１０  ｌの全容量までの水で溶解させることによって調製された。
（ｃ）鉄
１０  ｌ当たりの量：ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５ｇ；ｃＨ2ＳＯ4，５ｍｌ。
最少塩類濃厚物およびグルコース溶液が入っている容器を、オートクレーブ処理後に互いに接続し、そして内容物を混合して主栄養素流を形成した。Ｆｅ+2を約１００ｍｇ  ｌ-1含有する鉄溶液は別個に供給された。
１．３．５  補足培地
アルギニン、ヒスチジン、ロイシンおよびアデニンを、必要に応じて、最少培地に対して５００ｍｇ  ｌ-1の濃度で加えた。
１．３．６  固形培地
固形培地が必要とされた場合、寒天１５ｇ  ｌ-1をオートクレーブ処理の前に加えた。滅菌後の溶融寒天を５５℃まで冷却させ、引続き充分に回転させて混合した後、約２０ｍｌのアリコートを９ｃｍペトリ皿中に分配した。
１．４  ヘテロカリオンの形成および単離
二重栄養要求性突然変異体の液体培養物を、アルギニンおよびヒスチジンまたはアデニンおよびロイシンを適宜に補足されたＲＨＭ培地（５０ｍｌ）を用いて１．２の項で記載のように製造した。次に、アルギニン、ヒスチジン、アデニンおよびロイシンを加えられたＣＭＣ培地中で両方の菌株を継代培養することによって胞子形成を誘導し、そしてそれらフラスコを２８℃で更に２４時間インキュベートした。得られた大形分生子懸濁液を１：１の比率で混合し、そしてそのアリコート４０μｌずつを、滅菌ＹＰＧ培地１６０μｌが加えられた１０ｘ９６ウェル滅菌微量試験プレートの個々の室に入れた。混合した後、それらプレートを２８℃で４８〜７２時間インキュベートした。若干の場合、これには、樟脳かまたは紫外線照射に対する一定時間の暴露が含まれた。
樟脳  プレートを、ｄ−樟脳の僅かな結晶が底部に散在した密閉容器中に入れることによってそれらを樟脳の雰囲気中において２８℃で４時間インキュベートした。処理後、それらプレートを取出し、そして空気中において２８℃で更に４４時間インキュベートした。
紫外線  プレートを慣用的に２８℃で４８時間インキュベートした後、取出し、そして紫外線に対して２０μＷ．ｃｍ-2で２１０秒間暴露した。暴露後、プレートを２８℃まで戻し、そして更に２４時間インキュベートした。
インキュベーション時間の終りに、アリコート（１０μｌ）を各ウェルから取出し、そして二組目の微量試験プレート中でＲＨＭ培地１９０μｌと混合した。次に、これらを２８℃で７日間インキュベートして、原栄養体成長を顕著にさせた。
１．５  推定上の倍数体のスクリーニングおよび単離
ＲＨＭ培地１９０μｌでプライムされたウェルを含有する新たな微量試験プレートに、原栄養体成長の形跡を示した培養物からのアリコート１０μｌを接種した。次に、それらプレートを２８℃で５日間インキュベートし、そしてそのサイクルを２回繰返して、最少培地中で一貫して成長できる菌株を顕著にさせた。次に、選択された培養物１００μｌを、ＲＨＭ培地５ｍｌが入っているユニバーサルボトルに移すことによって容量を増加させた。これらを撹拌しながら２８℃で最大４日間インキュベートした。
上のスクリーニングプロトコルから回収された菌株を、ユニバーサルボトルから培養物２ｍｌを、ＲＨＭおよびＣＭＣ成長培地５０ｍｌが入っているフラスコへ移すことによって液体中でもう１回継代培養した。両方とも撹拌しながら２８℃で４日間インキュベートした。次に、内容物を集めて且つ用いて、長期間貯蔵用の原料培養物を製造した。
１．６  紫外線照射に対する容量−反応を用いる菌株の分析
所望の菌株の種培養物を、二重栄養要求性突然変異体の必要に応じて加えられた補足物の一緒にＲＨＭ培地５０ｍｌが入っているフラスコ中で成長させた。各フラスコを撹拌しながら２８℃で最大４日間インキュベートした後、ＣＭＣ培地５０ｍｌが入っている次のフラスコに対して１０ｍｌを移し入れることによって継代培養した。これを同じ条件下で１６〜２０時間インキュベートして、胞子形成を促進させた。次に、２層の滅菌レンズ組織を介して滅菌容器中に濾過することによって栄養菌糸体を除去した後、その胞子懸濁液２０ｍｌを９ｃｍペトリ皿に入れた。その懸濁液を、電磁撹拌装置を用いて絶えず撹拌した。
各プレートに、上部からのランプおよび２０μＷ．ｃｍ-2の電力量を用いて紫外線を最大１０分間照射した。試料０．５ｍｌをリンガー液中で連続希釈し、そしてそれぞれの希釈液の０．２ｍｌ容量を、寒天で凝固させたＲＨＭ培地（適宜に補足された）が入っているプレート上に塗抹することにより、暴露時間中の生存能力を測定した。これらを２８℃でインキュベートし、そして４８時間の時点で存在するコロニーの数を用いて、平均生存数の時系列プロットを作成した。これらから、菌株それぞれについての与えられた死滅レベルに関係した暴露時間を定量することが可能であった。
１．７  連続フロー培養
培養物を、ブラウン（Braun）（Ｂ．ブラウン・バイオテク（Braun Biotech），エールズベリー，バッキンガムシャー）バイオスタット（Biostat）ＥＲ３発酵槽中において２．８リットルの作業容量で成長させた。課せられた設定値は、温度２８℃；ｐＨ６．０（７Ｍ  ＮＨ4ＯＨの自動滴定によって維持された）；撹拌１０００ｒｐｍ；気流量２．２１  ｌ分-1であった。発泡は、ポリプロピレングリコール消泡剤油の０．１〜０．２ｍｌ  時-1の速度での時限添加によって抑制された。
発酵槽容器を最少塩類＋グルコース溶液で満たした後、硫酸鉄を補足して、成長培地中において１ｍｇ  ｌ-1の最終Ｆｅ+2濃度を与えた。制御設定値を決定し、そして接種培養物を導入した。成長は、二酸化炭素発生量（ＣＥＲ）を測定するのに用いられた質量分析法による排ガス組成のオンライン分析によって監視された。連続フロー培養は、ＣＥＲが３５ミリモル  ｌ-1時-1に達した時点で、消泡剤、鉄および最少塩類＋グルコースを供給するポンプのスイッチを入れることによって与えられた。鉄は、流入する成長培地中で０．８〜１．０ｍｇ  ｌ-1のＦｅ+2濃度に等しい一定速度で加えられた。
中央制御された変数としてＣＥＲを包含するフィードバックループを用いて、連続フロー中の最少塩類＋グルコース流の流量を調節した。質量分析計から受取った信号は、ＣＥＲ設定値より上または下の変化に反応して２種類の出力電圧の一方を生じるようにプログラム化されたソフトウェアによって処理された。その出力電圧は、最少塩類＋グルコース流を供給する蠕動ポンプの回転速度を制御し、したがって、この流れ単独の後の希釈率は、発酵槽へ通じる全液体流の９５％を越えて補った。実際に、２種類の出力電圧は０．１５〜０．２５時-1の希釈率に対応した。これらは、バイオマスを更に濃縮するかまたは希釈するようにそれぞれ設計された。二つの限界間の調節スイッチ切換えは、ソフトウェアによる管理下で行われ、そしてその平衡は、微生物の最大成長速度に対応する値で維持された。この操作方法は、最大許容希釈率で作業しながら、過剰レベルのグルコースが培養ブイヨン中で維持されることを可能にした。
コロニー形態の監視
新鮮な培養物の試料を発酵槽から毎日取出し、そして滅菌リンガー液中で連続希釈した。適当な希釈液のアリコート（０．１ｍｌ）を、凝固したＲＨＭ培地が入っている１０個の寒天平板の表面上に塗抹した。これらを２８℃で最大７２時間インキュベートし、そしてコロニー変異株の割合を（ウィーブ（Wiebe）ら，1991年）によって記載のように測定した。
２  結果
２．１  原栄養体の選択的回収
合計３４，６５０個体交配を行ったが；１１，５２０個には特別な処理を行わず；１１，５２０個を樟脳に対して暴露し、そして１１，５２０個に紫外線を用いて照射した。表１は、ＲＨＭ最少培地中において三代（最後から２番目）および四代（最後）の選択的継代培養後にそれぞれの方法で得られた原栄養体の数を与える。
0003672571.tif 000002
原栄養体は、従来の交雑からは回収されなかった、すなわち、培養物を樟脳かまたは紫外線に対して暴露しなかった交雑は、原栄養体成長の自然の回収頻度が８．７ｘ１０-5未満であることを示した。樟脳での処理は、明らかに、合計１２菌株を生じ且つ回収頻度を少なくとも２桁、すなわち、１ｘ１０-3まで増加させる最も成功した方法であった。これら菌株は、菌株コードＤ２およびＤ１１〜Ｄ２１を付与された。
紫外線照射を包含するスクリーニングは、最初は異なったコロニー形態を有する２種類の変異株を含んでいた目的の１種類の培養物（コード１１−１／Ｍ１）だけを生じた。これらは、引続き、それらの直径の相対差のために「大形」または「小形」と称された。この２種類の大きい方は、小さい方より明らかに大きい菌糸密度でよく成長もする。用量−反応試験（１．６）は、紫外線照射に対して大形種がより耐性であったことを示し、固有により低い突然変異頻度が示唆された。これに基づき、主としてこの種類に集中することを決定し、したがって、小さい方の種類は無視された。用量−反応試験中に製造された希釈平板上で成長した合計９個の大形コロニーはサブクローンとして回収され、そして菌株コードＤ１およびＤ３〜Ｄ１０を付与された。
２．２  紫外線照射に対する用量−反応を用いる菌株の分析
変異株係数の９０％、９９％および９９．９％減少に該当する暴露（または致死）時間を用いて、各菌株の用量−反応を定量した（表２）。
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微生物Ｄ１、Ｄ２およびＤ２１は、ブダペスト条約の規定に基づき、寄託番号ＩＭＩ 369192、ＩＭＩ 369191およびＩＭＩ 369190として、１９９５年１０月１９日の国際真菌研究所，ベークハム・レーン，エグハム，サリーＴＷ２０９ＴＹ，英国に寄託されている。
Ａ３／５に関するそれぞれの致死時間は、４．４分、５．７分および７．４分であった。二重栄養要求性突然変異体の場合、９９．９％致死（およびＵＭＤＡ４−Ｃの９９％）を示す値が１０分間の暴露時間の範囲内になかったので、比較データを完全なもk
にするために、より長い暴露時間が必要であることは明らかであった。
概して、紫外線交配からの推定の高倍数体で９０％および９９％致死を示す値は、親半数体で記録された値と同様の桁数であった。その群の大部分は、Ａ３／５について得られた値の内の０．５分以内、すなわち、３．９〜４．９分であった９０％致死時間を反映したが、菌株の内の２種類（Ｄ１およびＤ５）は、残りのものとは異なる形跡があった。Ｄ１に関する値は、その群内の他の単離物の値より高かったが、Ｄ５に関する値は一貫して更に低かった。それらプロフィールは、Ｄ１が二重栄養要求性突然変異体と同様である、すなわち、Ａ３／５より耐性であること、およびＤ５がＡ３／５よりごく僅かに耐性が少ないことを示した。
対照的に、樟脳交配から回収された単離物の半数は、９９％致死させるのに１０分間を越える暴露時間を必要とした。大部分は４．９〜６．８分の範囲内に分類されたが、４種類の注目に値する例外があった。菌株Ｄ１４，Ｄ１９およびＤ２１は、より感受性であるように見えたが、Ｄ２０は、明らかに、樟脳群内のみならず、プログラムの経過中に単離された原栄養体全ての内で最も耐性であった。
２．４  Ｄ１およびＤ２の連続フロー培養におけるコロニー変異株の出現
ある限られたコロニー表現型を有する変異株は、通常、Ａ３／５の連続フロー培養において１０７＋／−１４世代の期間、すなわち、４４８＋／−６０時間後に検出される。しかしながら、ある限られたコロニー表現型を有する変異株は、Ｄ１およびＤ２を用いて行われた発酵において、それぞれ５４０および５９４世代（１，９５７および２，０２８時間）まで検出されなかった。（表３）。増加した安定性は、したがって、市販のクオルン（QUORN）▲Ｒ▼発酵の生産的運転長さの少なくとも４倍の増加に近い。
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