(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥粉末組成物であって、
（ａ）水性溶液中でタンパク質と接触することにより結合する蛍光色素、
（ｂ）水性溶液中に溶かした時に約８．０〜約９．５の範囲内にpHを維持する非求核性の緩衝剤、
（ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム、及び
（ｄ）タンパク質に対して不活性である追跡色素、
を含んで成る乾燥粉末組成物。
【請求項２】
前記緩衝剤がホウ酸ナトリウムである、請求項１記載の乾燥粉末組成物。
【請求項３】
タンパク質含有生物試料のタンパク質組成の電気泳動による分析の為の試料の準備の為の方法であって、
（ａ）前記試料と（ｉ）タンパク質に結合できる色素、（ii）非求核性の緩衝剤、及び（iii ）タンパク質変性剤を含んで成る乾燥粉末混合物を組み合させて懸濁を形成し、そして
（ｂ）前記懸濁物を前記混合物の少なくとも一部分が溶ける迄加熱すること
を含んで成る方法。
【請求項４】
前記変性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）が前記懸濁物を約９０℃〜約１００℃の温度に加熱することを含んで成る、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
様々なタンパク質の種類及び量を特定する生物試料の分析は、様々な分離技術により行われており、その多くは、臨床研究者がタンパク質の位置を知り、同定しそして定量する色素の利用を伴う。色素は視覚的な観察又は機械的な方法によって検出可能及び読み込み可能である。この目的の為に用いられている多くの型色素には、目に対して、処理もしくは賦活化をせずとも可視範囲もしくは紫外範囲において発色するもの、及び励起によって発光する蛍光色素が挙げられる。
【０００２】
色素は、分離を行った後及びタンパク質がゲルにおいて各スポット又はバンドへと単離される間に最も一般的にタンパク質に適用される。色素をこの方法において用い、そして過剰な色素を除くことは、操作を難かしくし、操作する者の誤り及び様々な不均一性を招く、労力を要し且つ時間のかかる手順である。加えて、多くの色素は水に不溶性であり、タンパク質のスポット又はゲル中のバンドに適用する前に先ず最初に有機溶媒中に溶かさなければならない。代わりの方法として、分離が行われる前に試料中のタンパク質に色素を適用する提案がなされている。これらの提案において生ずる懸念には、見掛け上のタンパク質の移動度に対する色素の効果、特に、色素のタンパク質に対する割合が不均一である時の見掛け上のタンパク質の移動度に対する色素の効果、そして水性媒体中での色素の不安定性が挙げられる。
【０００３】
これらの色素が用いられている分野は、変性条件下でのタンパク質の電気泳動である。変性電気泳動、そして特にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、試料中のタンパク質を分析するとても効果的且つ効率的な方法である。その理由は、それが、タンパク質を３次もしくは４次形態の潜在的妨害因子又はそれらのサブユニットの複雑性に影響を与えることなく、同定するからだ。色素の利用により生ずる懸念は、広範囲且つ効果的な用途の観点で、特別な影響力をもって変性電気泳動にもあてはまる。
【０００４】
発明の概要
色素は、粉末形態にある典型的なタンパク質色素及び粉末状の非求核性の緩衝剤、そして、本発明の好適な実施態様においては、粉末状の変性剤も又含んでいる乾燥粉末混合物から非常に効率的な方法において生物試料に適用できうることがこの度発見された。水性の生物試料中での、色素のタンパク質への結合は、粉末混合物と試料とを組み合せること及び混合物を、高いが沸騰はしない温度へと固体物質が溶けるのに十分な時間に渡り加熱することにより達成される。結果は、試料中のタンパク質の実質的に一定の相対的な染色において一貫している。即ち、試料中の様々なタンパク質の間での色素の量はほぼ均一であり、そして実質的に見掛け上のタンパク質の移動度における変化はない。即ち、各タンパク質に対して少量で十分な色素は、試料中の他のタンパク質に対するその分離特性に最小限の影響しか与えない。このようにして調製した溶液は、当業界において公知の汎用の分離手順によって分離できうる分離媒体上へロードする準備が整っている。これらの手順は様々な形態の電気泳動並びに他のプロトコールを含む。分離によりもたらされる各々のタンパク質のバンド及びスポットは、機械による読み込み、又は視覚的な観察によって識別できる。
【０００５】
詳細な実施態様の説明
様々な色素の中で本発明の実施において用いることができうるのは、求電子性活性化形態の蛍光色素には、限定ではないが、キサンチン、シアニン、クマリン、ベンズイミド、フェナントリジンの、スクシニミジルエステル、ビニルスルホネート等、エチジウム色素、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、及びキノリン色素が挙げられる。フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）及びローダミンは、キサンチン色素の特定の型である。所定の例は、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−カルボキシローダミン−６Ｇ、５−カルボキシローダミン−６Ｇ、テトラメチルローダミン、ローダミングリーン、及びローダミンレッドである。ウンベロフェロンはクマリンの１つの例である。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８はベンズイミド色素の１つの例である。テキサスレッドは、フェナントリジン色素の１つの例である。シアニンスクシニミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ）エステル色素の例は、スルホインドシアニンスクシニミジルエステル、（カルボキシアルキル）シアニンスクシニミジルエステル、及びＢＯＤＩＰＹスクシニミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ）である。
【０００６】
緩衝剤は色素の加水分解の速度それ故、粉末混合物を生物試料と組み合せた時には、当該色素がタンパク質に対する結合の為に利用できるようになる速度を制限するのに役立つ。適切な緩衝剤は非求核性のものであり、そして色素と結合するタンパク質と競合しないものである。好適な試薬は約８．０〜約９．５のｐＨの幅を持ち、そしてチオール又は第一級アミンもしくは第二級アミンを含有しないものである。適切な緩衝剤は、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、及びＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。
【０００７】
本発明の好適な実施において、粉末混合物は、（粉末形態においても又）変性剤を含む。これは、臨床研究者が単一の段階でタンパク質の変性及び識別を行うことを可能にする。汎用の変性剤が用いられて良く、その例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、及びグアニジンである。最も好ましいのは、ＳＤＳである。他の物質も又任意の基剤として含まれて良い。例は、糖（スクロース等）であり、密度の調整の為及び分離方法の間の溶質物の最前部を示す追跡標識（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の為である。追跡標識は、粉末混合物又は生物試料中に含まれるタンパク質及び他の成分に対して不活性である任意の標識であって良い。係る標識のある例は、ブロモフェノールブルーである。還元剤（固体形態において）も又含むことが出来うる。適切な還元剤の例は、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）、及びトリス（カルボキシエチル）ホスフィンである。これら全ての添加剤の他の例は当業者により容易に分かるだろう。
【０００８】
粉末混合物中の各成分の相対量は本発明に関して重要ではなく且つ変わって良い。活性色素（即ち、タンパク質に結合する蛍光、紫外線又は可視色素）及び標識色素（移動するイオンの最前部の位置を示す）＋変性剤としてＳＤＳ、密度調整剤としてスクロース、及び緩衝剤としてホウ酸ナトリウムを含む、典型的な組成物において、最終体積１．０ｍＬに対する各々の好適な量は以下のとおり：
活性色素  ２〜１００μｇ
変性剤、例えばＳＤＳ  ０〜２０ｍｇ
密度調整剤、例えばスクロース  ０〜１００ｍｇ
緩衝剤、例えばホウ酸ナトリウム  ２〜２０ｍｇ
標識色素  ０〜２００μｇ
である。
【０００９】
粉末混合物の粉末度は本発明に関して重要ではなく又変わって良い。好適な粉末度の範囲は、約５ミクロン〜約５００ミクロンである。混合物中の粒子の調製及び大きさの調節は、汎用の方法、例えば沈澱、粉砕、ふるい分け、及び当業者は容易に分かるだろう他の方法によって達成される。
【００１０】
利用に際して、粉末混合物は、生物試料が分析の為の分離媒体に適用される直前又は寸前に生物試料と組み合わされる。粉末混合物は、最初に水と混合でき、その後に生物試料と組み合わされる予備溶液を形成する。本発明の他の実施態様において、粉末混合物は試料と直接組み合されており、粉末及び試料は、色素が溶けるのに十分に高い温度であるが、試料の沸騰を避けるのに十分低い温度へと加熱される。好ましい温度は約８０℃より上の範囲、一層好適には約９０℃〜約１００℃、最も好ましくは、９５℃である。次いで混合物は、固体の成分が溶ける十分な時間に渡りその温度に保たれる。多くの場合、良い結果は数分、好ましくは約５分で達成できるだろう。次いで溶液は冷まされそして分離系へとロードされる。
【００１１】
本発明の粉末混合物は、試料中のタンパク質の変性及び様々なタンパク質の区別及び同定の為の色素の利用を含む広範囲な分離手順の為の生物試料を調製するのに用いることができうる。これらの手順に挙げられるものは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、及び様々な形態の電気泳動、例えばキャピラリー、チューブゲルもしくはスラブゲル形態、もしくはチップ上のマイクロチャンネルにおける等電点及び汎用の電気泳動である。本発明は特に二次元電気泳動において有用である。一次元は、棒状の又は細長い形のゲルにおける線形分離でありそして二次元は、棒状又は細長いゲルをスラブゲルの一端に沿って配置し、この棒状又は細長いゲルの側部を出て、垂直方向へとバンドを移動することにより実施する。様々な形態の電気泳動の為の分離媒体は、ポリアクリルアミド、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、でん粉、シリカゲル、及びスチレン及びジビニルベンゼンの重合体、及びにこれら物質の組み合わせが挙げられる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動が特に注目されている。