(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0003650648.tif 000005
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ４−アルキル基、置換又は非置換のＣ２〜Ｃ４−アルケニル基、置換又は非置換のアリール基又は（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨを表し、ここで、ｎ＝０、１、２、３であり、Ｘは、１、２、３、４、５の数である］のエナンチオマー純粋なラクタムを、式Ｉのラセミ体から製造する場合に、Ｉの一つのエナンチオマーを選択的に変換する生体触媒としてロドコッカス又はシュードモナス属の微生物を、Ｉのラセミ混合物上に作用させ、生じた生成物混合物から、変換されなかったエナンチオマーを単離することを特徴とする、エナンチオマー純粋なラクタムの製法。
【請求項２】
生体触媒としてのＤＳＭ  ９００２を用いて、式Ｉの（Ｓ）−エナンチオマーを製造する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体触媒としてのＤＳＭ  ９００１を用いて、式Ｉの（Ｒ）−エナンチオマーを製造する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（Ｓ）−５−ビニルピロリジノンを製造する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（Ｒ）−５−ビニルピロリジノンを製造する、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、式Ｉ：
【０００２】
【化２】
0003650648.tif 000002
【０００３】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、Ｈ、置換又は非置換のＣ1〜Ｃ4−アルキル基、置換又は非置換のＣ2〜Ｃ4−アルケニル基、置換又は非置換のアリール基又は（ＣＨ2）ｎ−ＣＯＯＨを表し、ここで、ｎ＝０、１、２、３であり、Ｘは、１、２、３、４、５の数である］のエナンチオマー純粋なラクタムを製造する方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
欧州特許（ＥＰ）第４２４０６４号明細書には、微生物を用いるラクタムの立体選択的分解が記載されている。この方法では、それぞれ一つのエナンチオマーを相当するアミノ酸に加水分解する２種の異なる微生物が使用される。しかしながら、この方法は、基質として特定の二環式ラクタムに限定され、従って広範には使用できない欠点を有する。
【０００５】
更に、ドイツ特許（ＤＥ）第２１５７１７１号明細書からは、ラセミ性α−アミノ−ε−カプロラクタムから光学的に純粋なリジンが製造される方法が公知である。ここで使用されている菌株もしくはこの菌株から単離された酵素Ｌ−α−アミノ−ε−カプロラクタム−ヒドロラーゼの基質スペクトルは、極めて狭い。その記載から、構造的に非常に類似の化合物、例えば、ε−カプロラクタム、  δーバレロラクタム、α−ブチロラクタム、α−アミノカルボン酸又はＤ−及びＬ−ピロリドンカルボン酸の環状オリゴマーは加水分解されないことが確認される（ドイツ特許第２１５７１７１号、１８頁、基質特異性）。この規則の唯一の例外は、欧州特許第３５７０２９号明細書及びＴ．フクムラ（Ｆｕｋｕｍｕｒａ）のＰｌａｎｔ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：１１７３ー１１７６（１９７７）に記載のようなα−アミノ−置換δーバレロラクタムの変換である。従って、この方法は、広い用途にも好適ではなく、もっぱらそこに記載の反応のためにだけ使用できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、前記の構造的制限を有せず、式Ｉのエナンチオマー純粋なラクタムを良好な収率で製造することのできるエナンチオマー純粋なラクタムの製法を提供する課題が存在した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
式Ｉのラセミ体から、式Ｉ：
【０００８】
【化３】
0003650648.tif 000003
【０００９】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、Ｈ、置換又は非置換のＣ1〜Ｃ4−アルキル基、置換又は非置換のＣ2〜Ｃ4−アルケニル基、置換又は非置換のアリール基又は（ＣＨ2）ｎ−ＣＯＯＨを表し、ここで、ｎ＝０、１、２、３であり、Ｘは、１、２、３、４、５の数である］のエナンチオマー純粋なラクタムを製造する方法が発見され、これは、Ｉのエナンチオマーを選択的に変換する生体触媒を、Ｉのラセミ混合物に作用させ、生じた生成物から変換されなかったエナンチオマーを単離することよりなる。
【００１０】
本発明の方法のために、式Ｉのラセミ性ラクタムのうち、Ｃ−原子４、５または６の環の大きさ（Ｘ＝２、３又は４）を有し、１個以外の全ての置換基Ｒ1及びＲ2がＨであり、１個の置換基が前記のものの１つを表すものを使用するのが有利である。
【００１１】
これらラクタムのうちで、Ｈとは異なる特有の置換基Ｒ1がメチル又はビニルであるものが、特に有利である。
【００１２】
本発明の方法のために、生体触媒としては、式Ｉで示されている化合物の一つのエナンチオマーのみを変換するが、他のエナンチオマーには影響しない特性を有する微生物が好適である。このような微生物は、容易に慣用法で、例えば、土壌試料から単離でき、この際、この方法の一つは、実施例１に記載されている。
【００１３】
有利な微生物は、真菌類及び細菌類である。特に、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のものが有利である。一つの又は他のエナンチオマーを選択的に加水分解する微生物の代表的なものとして、次の菌株をドイツ微生物寄託局ＤＳＭに１９９４年２月２８日に寄託した：
Ｌｕ  ８６７６（ロドコッカス  エリスロポリス；Ｒ．ｅｒｉｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）：  ＤＳＭ  ９００２
Ｌｕ  ８７４５（シュードモナス  アエルギノサ；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）：  ＤＳＭ  ９００１。
【００１４】
これら寄託菌株のエナンチオマー選択性は、後の実施例に詳述されている。
【００１５】
もう一つの好適な微生物は、シュードモナス  アエルギノサとして分類されるＬｕ  ８７４４である。
【００１６】
ラクタムの立体選択的な分解のためには、原則的に、一つのエナンチオマーを相当するアミノ酸に分解するが、他のエナンチオマーには影響しない酵素だけが必要である。この理由から、本発明の方法のための生体触媒としては、微生物完全体以外に、これからの抽出物又は単離された酵素を使用することもできる。
【００１７】
生体触媒は、そのものとして又は不動化された形、例えば担体固定された形で使用することができる。
【００１８】
生体触媒を用いて選択的にラセミ体の一つのエナンチオマーが加水分解された後に、生成物混合物は、一つのアミノ酸のエナンチオマー及び一つのラクタムのエナンチオマーからなる。
【００１９】
このような反応生成物は、成分の異なる物理−化学的パラメータに基づき、容易に慣用の方法で分離することができる。
【００２０】
このためには、例えば、蒸留、抽出、結晶化又はクロマトグラフィ法、例えばイオン交換クロマトグラフィが好適である。
【００２１】
むしろ、  変換されなかったラクタムのエナンチオマーだけが検出可能であり、他のエナンチオマーは、明らかに更に分解される。
【００２２】
生体触媒とラセミ体の反応は、一般に、０〜５０、有利に２０〜４０℃の温度で行われる。
【００２３】
微生物完全体を生体触媒として使用する場合には、変換すべきラクタムが添加される栄養培地中で操作するのが有利である。
【００２４】
栄養培地中のラクタムの濃度は、一般に、栄養溶液１リットル当たりラクタム１〜１００ｇである。
【００２５】
生体触媒として、相応する微生物からの酵素抽出物又は精製酵素を使用する場合には、水溶液中又は有機溶剤中又はこれら双方の混合物中でのラセミ体の変換が推奨される。
【００２６】
この変換は、生体触媒がなお高い活性を有するｐＨ−媒体中で実施するのが有利である。これは、一般に、３〜９、有利に４〜８のｐＨ−値の場合である。
【００２７】
本発明の方法は、特に、エナンチマー純粋な置換２−ピロリジノン例えば、メチル−又はビニル−置換２−ピロリジノンの製造のために好適である。
【００２８】
本発明の方法は、変換すべきラクタムの構造的パラメータに関して、環の大きさ又は置換基の種類及び場所は制限が少ない。
【００２９】
本発明のもう一つの課題は、生体触媒により変換されたエナンチオマーを単離し、そのものとして又は再びラクタムに変じた後に使用することである。
【００３０】
例えば、ラクタムの（Ｓ）−形を生体触媒により選択的に加水分解すると、このラクタムの（Ｒ）−形は、不変のまま残り、直接この混合物から単離することができる。
【００３１】
加水分解され、相応するエナンチオマー純粋なアミノ酸として存在する（Ｓ）−形は、そのもの自体として、又は閉環して（Ｓ）−形にした後に使用することができる。
【００３２】
エナンチオマー純粋なラクタムは、医薬品−及び植物保護剤分野での作用物質を得るための重要な中間体である。
【００３３】
【実施例】
次の実施例につき本発明を更に詳述する。
【００３４】
例１
土壌試料からの立体選択的ラクタマーゼ活性を有する菌株の単離
土壌試料各々約２ｇに、ラクタマーゼ培地３０ｍｌを有するエーレンマイヤーフラスコ中で、ラクタム、例えば、ピロリドン２ｇ／ｌを加え、２５℃で、２〜７日間、振動下に恒温保持した。
【００３５】
ラクタマーゼ培地：
ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ                         ０．５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                                ０．０５ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2                                ０．０２ｇ／ｌ
微量元素溶液                                  ２ｍｌ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                                  １．５ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                                  ３．６ｇ／ｌ
グリセリン                                      ５ｇ／ｌ
微量元素溶液：
硫酸鉄（ＩＩ）−１水和物                        ２００ｍｇ／ｌ
硫酸亜鉛（ＩＩ）−４水和物                        １０ｍｇ／ｌ
塩化マンガン−４水和物                              ３ｍｇ／ｌ
ほう酸                                            ３０ｍｇ／ｌ
塩化コバルト（ＩＩ）−６水和物                    ２０ｍｇ／ｌ
塩化銅（ＩＩ）−２水和物                            １ｍｇ／ｌ
塩化ニッケル（ＩＩ）−６水和物                      ２ｍｇ／ｌ
モリブデン酸ナトリウム−２水和物                    ３ｍｇ／ｌ
エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）          ５００ｍｇ／ｌ  。
【００３６】
適当な菌株の増殖のために、この培養物各１ｍｌを新しい培地中に接種し、再び数日間振動させ、同じ工程を再度繰り返した。次いで、培養物を増殖培地と同じ組成を有する寒天プレート上に塗布した。このプレートから単一コロニーを取り出し、試験した：
菌株をラクタマーゼ培地中で、ラセミ性ラクタム５−ビニルピロリジノン５ｇ／ｌと共に２〜７日培養させた。毎日試料を取り出し、光学活性生成物が形成されたか否かを試験した。
【００３７】
培養物３ｍｌに酢酸エステル３ｍｌを加え、激しく混合し、相分離の目的で遠心させた。０．２μｍ−フィルターを通す濾過の後に、酢酸エステル抽出物を直接旋光度測定のために、分光光度計中で使用した。
【００３８】
このスクリーニングから合計５個の光学活性生成物を形成する菌株が単離された。２菌株は、右旋性の５−ビニルピロリジノンを産出し、３菌株は左旋性の５−ビニルピロリジノンを産生した。
【００３９】
同様に、ラクタマーゼ培地中で菌株を、ラセミ性ラクタム５−メチルピロリジノン５ｇ／ｌと共に培養し、検査した。右旋性３−メチルピロリジノンを産生する２菌株が単離された。
【００４０】
例２
（Ｒ，Ｓ）−５−ビニルピロリジノンからの（Ｓ）−５−ビニルピロリジノン５−ビニルピロリジノン５ｇ／ｌを有するラクタマーゼ培地２５ｍｌに、ＤＳＭ９００２を接種し、３０℃で４日間振動させた。この予備培養物を、主培養と同じ培地５００ｍｌに接種し、５日間振動下に恒温保持した。
【００４１】
細胞を遠心分離し、細胞不含の上澄みを酢酸エステルで１２時間連続的に抽出した。酢酸エステル抽出物から溶剤を除くと、５−ビニルピロリジノン１．４３ｇの残分が得られた。単離された生成物の構造をＮＭＲで確認した。
【００４２】
生成物に関して次の旋光度が測定された：
［α］D＝＋２７．０（ｃ＝１、酢酸エステル）
［α］D＝＋４５．３（ｃ＝１、エタノール）
この旋光度を文献データ（英国特許第２１３３００２号、例１０）と比較すると、これは、Ｓ−エナンチマーであることが明らかとなった。
【００４３】
エナンチオマーの割合を測定することは、キラールＧＣを用いて実施し、９８．６％ｅｅのエナンチオマー過剰が得られた（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β−Ｉ／Ｐ，５０ｍ×０．３２ｍｍ）。
【００４４】
このエナンチオマーは、高収率で得られた。酢酸エステル抽出により、なお少量の有機成分が同伴単離されるが、これは容易に分離可能である。
【００４５】
例３
（Ｒ，Ｓ）−５−ビニルピロリジノンからの（Ｒ）−５−ビニルピロリジノンピロリドン２ｇ／ｌを有するラクタマーゼ培地５００ｍｌに、ＤＳＭ  ９００１を接種し、３０℃で２日間振動させた。次いで、ラセミ性５−ビニルピロリジノン２．５ｇを添加し、この培養物を更に５日間振動させた。培養を中断させ、例２におけると同様に後処理した。（Ｒ）−５−ビニルピロリジノン０．８２ｇの残分が得られた。
【００４６】
この生成物は、［α］D＝−２７．７（ｃ＝１、酢酸エステル）の旋光度を有した。
【００４７】
例４
種々のラクタム及び酸アミドの立体選択的変換
例１からの菌株を第１表に記載の化合物の１種５ｇ／ｌを有するラクタマーゼ培地中で２〜７日間培養した。この培養物から  １〜２日の間隔で試料を取り出し、光学活性生成物が生じたか否かを試験した。試料の取得は、例１の記載と同様に行った。
【００４８】
0003650648.tif 000004