(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の発現すべき独特な核酸を含むライブラリーであって、該ライブラリーは多数の区画を有し、該多数の区画のそれぞれは、前記ライブラリーに添加された水性培地中に１つ以上のアデノウイルスベクターを有し、該アデノウイルスベクターは、発現すべき独特な核酸を少なくとも１つ有するとともに、
（ｉ）前記発現すべき独特な核酸を宿主細胞に導入することができ、
（ｉｉ）前記発現すべき独特な核酸の生産物を前記宿主細胞内で発現させることができ、
（ｉｉｉ）前記宿主細胞内で複製に必要なアデノウイルスゲノムの一部が取り除かれていることを特徴とするライブラリー。
【請求項２】
前記発現すべき独特な核酸によって発現した全ての生産物の機能は、前記ライブラリーが初めて作製された時に知られていないことを特徴とする請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記区画は、前記取り除かれたアデノウイルスゲノムの一部を含むパッケージング細胞を除き、複製可能なアデノウイルスベクターを含まないことを特徴とする請求項１又は２に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記宿主細胞は、ゼブラフィッシュの細胞や人間の細胞などの動物細胞の真核細胞であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記宿主細胞は、ゼブラフィッシュ胚などの動物の一部であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項６】
少なくとも１つの前記区画は、少なくとも２つの前記アデノウイルスベクターを有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項７】
少なくとも１つの前記区画は、前記アデノウイルスベクターを１つ有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記アデノウイルスベクターは、アデノウイルスキャプシドにパッケージされていることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域タンパク質をコードする配列が削除されたアデノウイルスゲノム配列を有することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記アデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ領域タンパク質をコードする配列、Ｅ２Ｂ領域タンパク質をコードする配列、完全なＥ２領域タンパク質をコードする配列及びＥ３領域タンパク質をコードする配列からなる群より選択された配列が削除されたアデノウイルスゲノム配列を有することを特徴とする請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記アデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ領域タンパク質をコードする配列、Ｅ２Ｂ領域タンパク質をコードする配列及び完全なＥ２領域タンパク質をコードする配列からなる群より選択された配列と、Ｅ３領域タンパク質をコードする配列とが削除されたアデノウイルスゲノム配列を有することを特徴とする請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターは、多数のアデノウイルス繊維タンパク質をコードする配列を有し、該多数のアデノウイルス繊維タンパク質は、少なくとも２つのアデノウイルス血清型に由来するものであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記アデノウイルスベクターは、最小ベクターであることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記最小ベクターは、インキャプシデーションシグナルと、アデノウイルスの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の少なくとも１つのコピーとを有することを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記最小ベクターは、アデノ関連ウイルス末端反復を有することを特徴とする請求項１３又は１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記アデノウイルスベクターは、前記発現すべき独特な核酸と操作可能にリンクした誘導プロモーターを有することを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記誘導プロモーターは、アデノウイルスＥ１遺伝子生産物により抑制されることを特徴とする請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記誘導プロモーターは、ＡＰ１依存性プロモーターであることを特徴とする請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記多数の区画は、少なくとも６ウエルのマルチウエルフォーマットを含むことを特徴とする請求項１から１８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記多数の区画は、少なくとも９６ウエルのマルチウエルフォーマットを含むことを特徴とする請求項１から１８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２１】
多数の前記発現すべき独特な核酸のそれぞれは、核酸の集団の構成員に由来し、該核酸の集団は、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、遺伝子及び遺伝子サプレッサー要素からなる群より選択された天然に生じる核酸の集団と、合成オリゴヌクレオチドと、アンチセンス核酸とを有することを特徴とする請求項１から２０のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記多数の区画のそれぞれは、パッケージング細胞の粗製リゼイトを有することを特徴とする請求項１から２１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２３】
多数の区画に配置された多数の発現すべき独特な核酸からなるライブラリーを作製する方法であって、前記多数の区画のそれぞれは、少なくとも１つの前記発現すべき独特な核酸を有する複製欠損アデノウイルスベクターを有し、
前記方法は、（ｉ）（ａ）そのゲノムに組み込まれた第１のアデノウイルスゲノム部分を包含するパッケージング細胞と、（ｂ）プロモーターに操作可能にリンクされた前記発現すべき独特な核酸と第２のアデノウイルスゲノム部分を含み、該第２のアデノウイルスゲノム部分は、アデノウイルスの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を少なくとも１つ有する核酸デリバリービーイクル及び（ｃ）第３のアデノウイルスゲノム部分を主成分とするヘルパー核酸の混合物とを混合する形質移入工程を含み、
（ｉｉ）前記第１のアデノウイルスゲノム部分の配列は、第２のアデノウイルスゲノム部分の配列及び第３のアデノウイルスゲノム部分の配列とは重複しておらず、
（ｉｉｉ）前記第１のアデノウイルスゲノム部分と第２のアデノウイルスゲノム部分と第３のアデノウイルスゲノム部分は、インキャプシデーションと複製とに必須のアデノウイルスタンパク質がパッケージング細胞内で発現可能なように配列されていることを特徴とするライブラリーを作製する方法。
【請求項２４】
前記第２のアデノウイルスゲノム部分の配列と前記第３のアデノウイルスゲノム部分の配列は、デリバリービーイクル核酸とヘルパー核酸との相同組換体と少なくとも部分的に重複していることを特徴とする請求項２３に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項２５】
前記デリバリービーイクル核酸と前記ヘルパー核酸とに含まれるアデノウイルスゲノムの配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の部分を含まないことを特徴とする請求項２３又は２４に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項２６】
前記パッケージ細胞の系列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域が組み込まれた真核細胞を有していることを特徴とする請求項２３から２５のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項２７】
前記真核細胞は、アデノウイルスゲノムのＥ２領域が組み込まれていることを特徴とする請求項２６に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項２８】
前記真核細胞に組み込まれたアデノウイルスゲノムのＥ２領域は、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域又はアデノウイルスゲノムのＥ２Ｂ領域であることを特徴とする請求項２７に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項２９】
前記真核細胞は、アデノウイルスゲノムのＥ４領域が組み込まれていることを特徴とする請求項２７又は２８に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３０】
前記デリバリービーイクル核酸の配列とヘルパー核酸の配列は、混合される制限酵素によって線状化可能なものから選択され、該制限酵素は、パッケージング細胞への形質移入工程前に除去されることを特徴とする請求項２３から２９のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３１】
前記デリバリービーイクルは、制限酵素によって分割可能な制限酵素部位配列を少なくとも１つ有し、該制限酵素は、前記発現すべき独特な核酸がコードされた配列を分解しないものであることを特徴とする請求項２３から３０のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３２】
前記制限酵素部位配列は、特異な切断制限エンドヌクレアーゼ又はイントロンコード化エンドヌクレアーゼが認識するための配列を有することを特徴とする請求項３１に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３３】
前記制限酵素部位配列は、ＰａｃＩ、ＢｓｆＢＩ及びＰｉＰｓｐＩからなる群より選択された制限酵素によって認識される配列であることを特徴とする請求項３１又は３２に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３４】
前記パッケージング細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞 （ＥＣＡＣＣ ｄｅｐｏｓｉｔ ｎｕｍｂｅｒ ９６０２２９４０）又は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞由来のものであることを特徴とする請求項２３から３３のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３５】
前記パッケージング細胞は、アデノウイルスゲノムのＥ２領域を有することを特徴とする請求項３４に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３６】
行うべき工程の少なくとも１つは自動化されていることを特徴とする請求項２３から３５のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３７】
前記（ｉ）の形質移入工程では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が形質移入剤として使用されていることを特徴とする請求項２３から３６のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３８】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、パッケージング細胞の粗製リゼイト存在下で宿主細胞への形質移入に使用されることを特徴とする請求項２３から３７のいずれか１項に記載のライブラリーを作製する方法。
【請求項３９】
ハイスループット設定で、その機能が知られていない発現すべき独特な核酸の機能を測定する機能測定方法であって、
請求項１から２２のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターの組換え体のライブラリーを調達する第１工程と、
前記第一工程のアデノウイルスベクターの組換え体を宿主細胞に導入する第２工程と、
前記発現すべき独特な核酸の生産物を前記宿主細胞内で発現させることで該宿主細胞の表現型を改変する第３工程と、
該改変された宿主細胞の表現型を同定する第４工程と、
発現すべき独特な核酸によってコード化された前記生産物の機能を割り当てる第５工程と、
からなることを特徴とする機能測定方法。
【請求項４０】
ライブラリー内に存在する前記発現すべき独特な核酸の機能測定のための請求項１から２２のいずれか１項に記載のライブラリーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
（発明の背景）
本発明は、サンプル核酸とその産物の機能を同定するための高度処理能力を有する方法に関する。本発明は、サンプル核酸の産物を機能させるよう高度処理能力設定で組換えアデノウイルスベクターを産生するために、Ｅ1欠失プラスミドをベースとする生成システムと組み合わせたＥ１相補性アデノウイルスパッケージング細胞系列ＰＥＲ.Ｃ６の使用により例示される。
【０００２】
ヒトゲノム計画の最終目標は、ヒトゲノム全体を配列決定することである。この努力により予想される結果はヒトにおいて発現される７万〜１０万の遺伝子の正確な遺伝子地図である。しかし、ヒトコード配列のかなり完全な一覧表が近いうちに公表されて入手可能になる可能性が大きい。１９８０年代初頭以来、非常に多くのＥＳＴ（Expressed Sequence Tags;ｃＤＮＡ分子の末端から読み出された部分ＤＮＡ配列）が政府および民間研究機関の両方により得られてきた。ワシントン大学ゲノム配列決定センターおよびＩＭＡＧＥ（Integrated Molecular Analysis of Gene Expression;遺伝子発現の組込み分子分析）会議（http:/www-bio.llnl.gov/bbrp/image/image.html）のメンバーの間の協力により実施されているこうした努力の特徴は、公共のドメインへのそうした配列の急速な蓄積およびそれに付随していくつかの配信業者から得られるシーケンスタッグ（sequence-tagged ）されたｃＤＮＡクローンであった（Marraら, (1998)Trends Genet. 14 (1):4-7）。現在、ｃＤＮＡのコレクションは、肝臓、脳、脾臓、Ｂ細胞、腎臓、筋肉、心臓、消化管、網膜、視床下部を含むさまざまな組織で発現されるおよそ５万の異なるヒト遺伝子を代表していると考えられており、またその数は日に日に増加している。
【０００３】
がんゲノム解剖計画のそれに類する、目立った動きが最近あって、１９９９年までのＵｎｉｇｅｎｅセット（公表されていて入手可能なｃＤＮＡクローンのセット）のクローンの完全長配列を得るための努力を支援している。同時に、商業ベースの団体が、１９９９年までに４万の完全長ｃＤＮＡクローンを評価（再配列決定）することを提案しており、また個々のクローンは関心をもっているいずれの団体でも入手可能である。新規の遺伝子のコード配列が同定される速度は、それらの遺伝子の機能が解明される速度とは非常に対照的である。データベースのｃＤＮＡに対してそれらの機能を対応させること、あるいは機能的ゲノムは、今日のバイオテクノロジーにおける１つの主要な挑戦となっている。
【０００４】
数十年間、新規の遺伝子は生物学的プロセスあるいは遺伝性疾患およびその同定よりも重要である遺伝子の機能を説明するために計画された研究の結果として同定された。機能的ゲノムにおいては、遺伝子のコード配列はまずクローン化され、また配列決定され、またその配列はその後に機能を見出すために使用される。ショウジョウバエ、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュなどのほかの生物体が基本的な遺伝子の分析には高度に有用であり、複雑な哺乳動物の生理学的形質（血糖、心血管系疾患、炎症）に関しては、動物モデル系列が欠かせない。しかし、再生産の速度が遅いこと、また動物モデルの飼育収容コストの高さが、遺伝子の機能的な高度処理能力分析には主要な制約となっている。労働集約的な努力が、遺伝子機能の解明を可能にする表現型あるいはヒト疾患に関連している研究における化学的にあるいは遺伝子工学的処理により変異した（標識された）遺伝子によりマウス株のライブラリーを確定するために努力が行われているが、哺乳動物遺伝子の完全なスペクトルの系列立った分析は、それがヒトあるいは動物に関するものにせよ、１つの意義のある課題である。
【０００５】
配列データの量に遅れないようにするため、機能的ゲノムの分野では、真のゲノム機能の高度な処理能力の分析を行う能力が必要とされている。最近、遺伝子発現に特異的な組織と細胞を遺伝子機能に結び付けるように設計された数々の技術が開発されてきている。これら技術には、ｃＤＮＡマイクロアレー、遺伝子チップ技術、ディファレンシャルディスプレイｍＲＮＡが含まれる。ＳＡＧＥ（遺伝子発現連続分析；Serial Analysis of Gene Expression）あるいはｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイにより、腫瘍組織では発現するが、各正常あるいは健常組織にはない遺伝子を同定することができる。このように、調節機能を有する潜在的な遺伝子が、少量薬剤スクリーニングあるいは遺伝子治療計画に有用であるという機会がより少ない、普遍的に発現される過剰な遺伝子から選択することができる。遺伝子チップ技術は、たった数時間のうちに、非常に数の多い遺伝子の細胞におけるｍＲＮＡ発現レベルの測定により遺伝子発現のモニタリングを可能にする潜在能力を有している。さまざまな条件下で培養される細胞は、ｍＲＮＡ発現パターンに関して分析され、比較することができる。現在では、４万の非冗長ヒト遺伝子を伴うＤＮＡマイクロアレイチップが生産されており、また１９９９年には市場に登場する計画がある（特集頁（1998）Nat. Genet. 18 (3):195-7）。しかし、これらの技術は本来的には、がん細胞をスクリーニングするために設計されているもので、特定の遺伝子機能に関してスクリーニングするために設計されているわけではない。
【０００６】
二重あるいは三重ハイブリッドシステムもまた、ゲノムデータベースに機能的なデータを付け加えるために使用されている。これらの技術測定法は、酵母あるいは哺乳動物細胞におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、あるいはタンパク質−ＤＮＡ相互作用に関して測定するために使用される（BrentとFinley (1997) Annu. Rev. Genet. 31:663-704）。しかし、この技術は、分化、運動性、シグナル形質導入、酵素および輸送活動などのほかの遺伝子機能の数々に関しては測定するための手段を提供してはいない。酵母発現システムは、 哺乳動物起源の天然に分泌されるものおよび膜タンパク質に関してスクリーニングするのに使用されるものが開発されている（Kleinら, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (14):7108-13）。このシステムはまた、大きなライブラリーを特定の遺伝子および遺伝子産物の同定に助けとなるある種の特性をもったライブラリーへの分解を見込んでもいる。このシステムの短所は、主として分泌タンパク質をコードする遺伝子が選択されることである。第２に、この技術は異種発現システムとしての酵母をベースにしており、またしたがって、偏ったライブラリーに結果的になる、適切に折り込まれているのではない遺伝子産物が存在することであろう。
【０００７】
ほかの現在の戦略には、トランスジェニックマウスあるいはノックアウトマウスの作成が含まれる。こうしたアプローチによる遺伝子発見の成功例は、オステオプロテジェリン(osteoprotegerin) 遺伝子の同定である。ＤＮＡデータベースは、同族体の遺伝子にコードされる分泌タンパク質を示唆する特徴を備えたＥＳＴを選択するためにスクリーニングされた。その遺伝子の生物学的機能が、肝特異的プロモーターの制御下に対応する完全長ｃＤＮＡを置くことにより評価された。こうしたコンストラクトのそれぞれについて作成されたトランスジェニックマウスは結果的には、該当するタンパク質の高いプラズマレベルを有している。引き続き、トランスジェニック動物は定性的および定量的な表現型の研究調査の総合的試験にかけられた。マウスのなかにトランスフェクションされた遺伝子の１つが、骨密度が増加したマウスを産み、それが、その後に、潜在能力のある抗骨粗鬆症因子の発見につながった(Simonetら, (1997) Cell. 89 (2):309-19)。こうした方法は、コストがかかり、また非常に時間を費やすものであるという短所を有している。
【０００８】
機能的ゲノムにおける挑戦は、上述されたすべての技術を開発し、磨き上げ、また、いかに遺伝子機能が細胞の代謝および新規な製剤の開発のなかで使用するために注入されるこの知識のための手段を構成しているかの青写真の発展を準備するよく発展させたデータベースにおける既存のデータとその結果を総合することである。現在の技術には制約があり、また真の機能的なデータを必ずしも生じてはいない。したがって、適当なin vitro測定システムと動物モデルにおいて高度な処理能力が設定されている、遺伝子のコレクション（遺伝子プールあるいは個々のクローン）から単一の遺伝子機能の直接的な測定を見込んだ方法に対する需要がそこにはある。
【０００９】
高度な処理能力スクリーニングの開発は、JayawickremeとKost, (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634のなかで論じられている。稀に転写される分化発現遺伝子に関する高度な処理能力のスクリーニングが、von Steinら、(1997) Nucleic Acids Res. 35:2598-2602のなかで説明されている。高度な処理能力により遺伝子型別に分けることは、Hallら, (1996) Genome Res. 6:781-790のなかに開示されている。トランスドミナント細胞内エフェクターペプチドおよびＲＮＡ分子はNolan, ＰＣＴ国際公開第WO 97/ 27212号、第WO 97/ 27213号に開示されている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで使用される諸方法と成分は、プラスミドをベースにするＥ１欠損アデノウイルスベクターシステムおよびＥ1相補性宿主細胞を使用して、機能が未知のサンプル核酸の機能を高度な処理能力の設定で、直接的に、迅速にまた曖昧な点のないように測定するために提供される。その方法には、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＥＳＴ、遺伝子、合成オリゴヌクレオチドあるいは核酸のライブラリーのセットをＥ１欠損アダプタープラスミドに挿入することによりアダプタープラスミドのセットを構築する工程と、アダプターブラスミドのセットあるいはライブラリーおよびアダプタープラスミドのセットのなかにある配列に相同性である配列を有するプラスミドとともにＥ１相補性細胞系列をコトランスフェクションする工程とが含まれ、その方法にはまた、好ましくは、小型化した、高度な処理能力を有する設定において、組換え体アデノウイルスベクターのセットあるいはライブラリーを産生するための複製およびパッケージングにするために必要であって、相補性細胞系列あるいはアダプタープラスミドにより提供されることがないすべてのアデノウイルスが含まれる。サンプル核酸によりコードされる産物を同定し、また機能を対応させるために、宿主は、サンプル核酸の産物を発現し、それによって宿主の表現型を改変する組換えアデノウイルスベクターを高度な処理能力を有する設定で形質導入される。改変された表現型は同定され、また、サンプル核酸によりコードされる産物に機能を対応させるために基礎的なものとして使用される。プラスミドをベースとしたシステムは、高度な処理能力を有するスクリーニングのために好適にはＲＣＡが遊離したアデノウイルスベクターライブラリーを迅速に産生するのに使用される。この方法の各ステップは複数ウエルフォーマットで実施することができ、またこのシステムの容量をさらに増加するために自動化することができる。この高度な処理能力システムは、in vitroおよびin vivoでのヒトおよびほかの生物体から得られる非常に多数のサンプル核酸の発現分析を容易にし、また当分野におけるそのほかの入手可能な技術を上回って著しく改良されている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
１つの態様において、本発明は、多数の区画を有する発現可能な核酸のライブラリーを提供するものであり、各区画が、前記ライブラリーの少なくとも１つの核酸を有する少なくとも１つのビーイクルを有している。これにより、前記ビーイクルは、その核酸を発現させることができるように、細胞のなかに前記少なくとも１つの核酸を非常に効率的に導入することができる。前記ライブラリーの１つの長所は、前記ライブラリーが非常に効率的に細胞のなかに導入できることである。前記ライブラリーのもう１つの長所は、各区画が少なくとも１つの核酸を有する、多数の区画を有することである。前記ライブラリーは、細胞のなかで発現させた核酸の効果を研究するのに好んで使用される。このアーキテクチュアを備えたライブラリーは、細胞内で発現させるときにある一定の効果を発揮する少なくとも１つの核酸を有するそうした区画を迅速に選択するのに好んで使用することができる。区画が、たった１つの核酸を有する場合には、その核酸は効果を発揮することがわかる。１つの区画が１つよりも多い核酸を有する場合には、その１以上の核酸のうちの少なくとも１つは、効果を発揮することがわかる。どの区画が、ある一定の効果を発揮することができる核酸を有するかを知ることの有利性は、前記区画がかなり少ない異なった核酸を有する場合により大きく、また、前記区画が、たった１つの核酸を有する場合には、それが最高となる。とくに大きなライブラリーでは、区画毎の異なる核酸の数を正確に知っていることもまた長所となる。
【００１２】
発現可能な核酸は、タンパク様分子、ＲＮＡ分子あるいはＤＮＡ分子をコードする核酸などのいずれかの発現可能な核酸でありうる。
１つの好適な実施態様においては、前記ビーイクルは、ウイルスエレメント、あるいは機能的部分、その誘導体および／またはその類似体を有する。ウイルスエレメントは、アデノウイルスに限定するものではないが、そうしたものなどの外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）レトロウイルス粒子あるいは非外被（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスのウイルスキャプシドに限定されないが、そうしたウイルス粒子を包含する。一つのウイルス粒子は、１つの細胞のなかに前記少なくとも１つの核酸を容易に効率よく導入することが可能であるので好ましい。ウイルスエレメントはまた、細胞のなかで前記ライブラリーの増幅を可能にするウイルス核酸を含むことができる。ウイルスエレメントは、前記ビーイクルがウイルス粒子である場合には、１つのビーイクルのなかに前記少なくとも１つの核酸をパッケージングすることを可能にするウイルス核酸を含むことができる。
【００１３】
１つの好適な実施態様においては、前記ウイルスエレメントは１つのアデノウイルスから由来する。好適には、前記ビーイクルは１つのアデノウイルスキャプシドのなかに詰め込まれたアデノウイルスベクターを有する。
細胞は、いかなる種類のものもありうる。例えば、前記ライブラリーが潜在的な治療的価値を備えた核酸の存在に関してスクリーニングされる場合には、前記細胞は好ましくは、真核細胞であり、好適には哺乳動物の細胞である。
【００１４】
１つの実施態様においては、少なくとも１つの区画は、前記少なくとも１つのビーイクルの少なくとも２つを有する。とくに、大きなライブラリーに限定されるわけではないが、行う必要のあるスクリーニング測定の数を少なくとも部分的に減らすために、区画の数を減らすことは長所となる。例えば、そうしたケースでは、１つよりも多いビーイクルを有するライブラリーが提供される。スクリーニング測定に引き続いて、ある一定の効果がある一定の区画に相関している場合には、前記区画のなかの前記ビーイクルは、その発現が効果を発揮する核酸を有するビーイクルを選択するために、付加的なスクリーニング測定において、別に分析されることができる。他方ではしかし、１つの区画のなかにビーイクルが１つよりも多く存在することは、もう１つの設定のなかで使用するのに都合がよいと考えられる。例えば、区画毎に１つのビーイクルを含む１つのライブラリーが、１つの特定のほかの核酸と組み合わせて効果を発揮することができる核酸に関してスクリーニングされる場合である。前記ほかの核酸は、その後に、そのスクリーニング測定を行う前に、すべての区画に対して前記特定のほかの核酸から成る１つのビーイクルを加えることにより、前記細胞に提供することができる。同様に、前記少なくとも１つのビーイクルは、少なくとも２つの核酸を有することができる。
【００１５】
１つの好適な実施態様においては、アデノウイルスから誘導される前記核酸は、アデノウイルス後期タンパク質あるいは機能的な部分、その誘導体および／またはその類似体をコードする核酸を含む。例えば、アデノウイルス後期タンパク質であるアデノウイルス線維タンパク質は、ある一定の細胞に対して前記少なくとも１つのビークイルを標的にするのに、あるいは前記細胞に対して前記少なくとも１つのビーイクルの送達の促進を誘発するために、好んで使用することができる。好適には、アデノウイルスから誘導される前記核酸は、アデノウイルスキャプシド全体あるいは機能的な部分、その類似体および／またはその誘導体の形成を可能にするすべてのアデノウイルス後期タンパク質を主にコードする。好適には、アデノウイルスから誘導された前記核酸は、アデノウイルスＥ２Ａ又は機能的な部分、その誘導体および／またはその類似体をコード化する核酸を含む。好適には、アデノウイルスから誘導された前記核酸は、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質あるいは機能的な部分、その誘導体および／またはその類似体をコードする核酸を含む。したがって、細胞内のアデノウイルス誘導核酸の少なくとも部分的な複製を容易にする。
【００１６】
１つの実施態様においては、アデノウイルスから誘導される前記核酸は、少なくとも１つのＥ１領域タンパク質あるいは機能的な部分、誘導体および／またはその類似体をコードする核酸を含む。Ｅ１領域タンパク質をコードするアデノウイルス核酸は、細胞内の前記核酸の少なくとも部分的な複製を容易にする。こうした複製能力は、スクリーニングが、腫瘍細胞を照射することができる発現可能な核酸に対して行われる場合に、例えば、ある一定の適用において好まれる。こうした場合には、例えば、腫瘍細胞を有する哺乳動物における前記ビーイクルの増幅につながるアデノウイルス核酸の複製は、また転移腫瘍細胞の照射にもつながる可能性がある。一方、Ｅ１領域タンパク質をコードするアデノウイルス核酸の存在は、例えば、細胞内の前記核酸の少なくとも部分的な増幅を容易にし、例えば、前記アデノウイルス核酸を有するビーイクルの増幅を容易にする。
１つの実施態様においては、前記ビーイクルはさらに、アデノ関連ウイルス末端反復あるいは機能的部分、誘導体および／またはその類似体を含む核酸を有する。このように、細胞のなかの前記少なくとも１つの核酸の組込みは可能となる。１つの実施態様においては、アデノウイルスから誘導される前記ウイルスエレメントは、アデノウイルスキャプシド、あるいは機能的部分、誘導体および／またはその類似体を含む。アデノウイルスの生物学は、分子レベルにおいてもまた比較的よく知られている。アデノウイルスベクターに対する多くのツールが開発されてきて、また引き続き開発されており、したがって、アデノウイルスキャプシドを本発明のライブラリーのなかに組み込むための選り抜きの好適なビーイクルとする。アデノウイルスは広範なさまざまな細胞を感染させることができる。しかし、異なるアデノウイルス血清型が細胞に対する異なった選好を有する。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスキャプシドが入ることができる標的細胞集団を組み合わせ、及び広げるために、前記ビーイクルは、少なくとも２つのアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含む。
【００１７】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明によるライブラリーのなかに存在する少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの機能を測定するための方法であって、前記ライブラリー由来の少なくとも１つの核酸を有する少なくとも１つのビーイクルにより多様な細胞に形質導入する工程と、前記少なくとも１つの核酸の発現を見込む一方で前記細胞を培養する工程と、及びその発現された機能を測定する工程とを有する方法を提供する。現在、さらに多くの核酸が配列決定され、またクローン化されている。事実、核酸のクローン化と配列決定は、新たにクローン化され配列決定されている核酸の大半のものは、こうした速度で進められているが、その機能が分かっていない。公知の機能を備えた核酸に関してもまた、すべての機能が分かっているわけではない。本発明の１つの目的は、核酸の機能を測定するための方法を提供することである。それゆえ、本発明の一つの態様においては、本発明のライブラリーをスクリーニングするための方法を提供するが、核酸の機能を評価することができるスクリーニング測定法である。こうした測定法においては、その機能が中心的なものである。また、本発明のライブラリーは前記機能の少なくとも一部に影響を与えることができる発現可能な核酸の存在に関してスクリーニングされる。
【００１８】
１つの好適な実施態様においては、前記多様な細胞は、多くの区画化に区分けされ、各区画は前記ライブラリー由来の少なくとも１つの核酸を有する少なくとも１つのビーイクルを有する。前記の多くの区画の数は、好適には、前記ライブラリーの前記数多くの区画の多様性に対応する。１つの好適な実施態様においては、前記方法はさらに、所望される機能を有するビーイクルを選択する工程を有する。
【００１９】
もう１つの態様においては、本発明は、細胞のなかで発現するときに、所望される機能を有する発現可能な核酸を得るための方法を提供するが、前記方法は本発明によるライブラリーにおいて存在する少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの機能を測定する工程を有し、前記方法は、前記ライブラリー由来の少なくとも１つの核酸を有する少なくとも１つのビーイクルにより多様な細胞に形質導入する工程と、前記少なくとも１つの核酸の発現を見込む一方、前記細胞を培養する工程と、発現させた機能を測定する工程とを有する。
【００２０】
もう１つの態様においては、本発明は、各区画が少なくとも１つの核酸送達ビーイクルを有し、各区画が少なくとも１つの核酸から成る数多くの区画を有する１つのライブラリーを産生するための方法を提供し、前記方法は、少なくとも１つの核酸によりビーイクル核酸を組み換える工程を有し、それによって、発現可能な方法で、細胞に前記少なくとも１つの核酸を送達することができるビーイクルを産生する。核酸の発現に関しては、当技術分野では周知の数多くの分子エレメント、たとえば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始、停止シグナルなどの分子エレメントに限定されるわけではないが、それらが必要となり、および／または、使用される。
【００２１】
前記組換えは、ＰＣＲおよびＮＡＳＢＡなどの分子クローニングおよび／またはポリメラーゼ仲介増幅技術といった手段などのいずれかの手段により、行うことが可能である。しかし、前記組換えは好適には、ビーイクル核酸において少なくとも部分的に重複している配列と前記少なくとも１つの核酸の間の相同組換えを含む。とくに、大きなウイルス由来核酸の創製には、相同組換えが好ましい。好適には、前記ビーイクル核酸および／または前記少なくとも１つの核酸は、アデノウイルス核酸あるいは機能的部分、その誘導体および／またはその類似体を含む。１つの実施例においては、前記アデノウイルス核酸は、非ヒト霊長類細胞においてアデノウイルスを複製することができる宿主域変異を含む。
【００２２】
１つの態様においては、本発明は、本発明の方法により得ることができるライブラリーを提供する。
本発明はさらに、本発明の１つのライブラリーのなかに存在する少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの機能を測定するための本発明の方法により得ることができるライブラリーの使用法を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、前記ビーイクルを細胞に供給する工程と、前記ビーイクルの増幅を可能にする前記細胞を培養する工程と、前記細胞により増幅されるビーイクルを収集する工程とを、本発明の１つのライブラリーのなかに存在するビーイクルを増幅するための方法において、提供する。好適には、前記細胞は霊長類の細胞である。このように、前記ビーイクル核酸の複製を可能にするウイルスエレメントを含むビーイクルの増幅を可能にする。好適には、前記細胞はアデノウイルスＥ１領域タンパク質をコードする核酸を含む。このように、Ｅ１領域の少なくとも一部分の機能的欠失を有するアデノウイルス核酸を有するアデノウイルスに由来するウイルスエレメントを有するビーイクルの増幅を、とりわけ可能にする。好適には、前記細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）あるいは機能的なその誘導体および／またはその類似体である。前記ＰＥＲ．Ｃ６細胞あるいはその機能的誘導体および／またはその類似体における前記アデノウイルス核酸と染色体核酸が、複製コンピテントアデノウイルスの形成につながる前記アデノウイルスと染色体核酸間の相同組換えを可能にする配列重複を有していない例のなかで、ＰＥＲ.Ｃ６細胞あるいはその機能的誘導体および／またはその類似体は、複製コンピテントな（複製応答能を有する）アデノウイルスに付随する産生を伴うことなく、Ｅ１コード領域の欠失したアデノウイルス核酸の複製を可能にする。
【００２４】
好適には、前記細胞はさらに、アデノウイルスＥ２Ａおよび／またはアデノウイルスＥ４領域タンパク質あるいは機能的部分、その誘導体および／またはその類似体をコードする核酸を含む。このように、アデノウイルスＥ２Ａおよび／またはアデノウイルスＥ４領域タンパク質をコードする核酸の機能的欠失したアデノウイルス核酸の複製を可能にし、それによって、アデノウイルスＥ２Ａおよび／またはアデノウイルスＥ４領域タンパク質あるいは機能的部分、誘導体および／またはその類似体をコードする核酸を有しない細胞、例えば、ある一定の機能を表示することができる細胞のなかの前記アデノウイルス核酸の複製を阻害する。
【００２５】
１つの実施例においては、ビーイクル核酸は、Ｅ１領域コードタンパク質が存在しない場合に複製することができるビーイクル核酸の形成につながる、前記細胞のなかに存在するほかの核酸との配列重複を有してはいない。
【００２６】
本発明はさらに、前記多様な区画が複数ウエルフォーマットを含む、本発明によるライブラリーあるいは本発明による方法を提供する。複数ウエルフォーマットは、本発明の諸方法の少なくとも一部分の自動化実施には非常に適している。
【００２７】
１つの態様においては、本発明は、前記少なくとも１つの核酸が機能未知の産物をコードするライブラリーを提供する。
本発明のライブラリーおよび／または本発明の諸方法は、好適には、少なくとも実質的に自動化された設定において使用される、あるいは実施される。
【００２８】
本発明はさらに、本発明によるライブラリーを含む多様性のある細胞を提供する。
本発明は、サンプル核酸の発現産物に機能を対応させる１つの手段として、宿主の表現型を改変するために、宿主のなかのアデノウイルスベクターライブラリーの高度な処理能力を備えたスクリーニングにより追跡される１つあるいはそれ以上のサンプルを含む組換え体アデノウイルスベクターライブラリーの高度処理能力を備えた生成法を使用する。Ｅ１欠失アデノウイルスのライブラリーは、核酸コンストラクトと形質転換相補性的パッケージング細胞を使用して、高度な処理能力を備えた設定において創製される。サンプル核酸ライブラリーは、明確に定義されたあるいは定義されていない配列のセットでありうるし、あるいは定義されていない、あるいは定義された配列のプールでありうる。第１の核酸コンストラクトは相対的に小さく、また、操作可能な形態で少なくとも左ＩＴＲ、パッケージングシグナル、及び発現カセットを有するアダプタープラスミドを、サンプル核酸とともに操作するのが容易である。
第２の核酸コンストラクトには、各ほかのおよび／または第１のコンストラクトにおける配列と部分的に重複する１つあるいはそれ以上の核酸分子が含まれており、また、アダプタープラスミドあるいはパッケージング細胞によっては提供されない組換えアデノウイルスの複製およびパッケージングのために必要な少なくともすべてのアデノウイルス配列が含まれる。第２の核酸コンストラクトは、ウイルス生成に必要な配列、および／またはＥ２Ａ、Ｅ３および／またはＥ４領域配列のほかに、Ｅ１領域配列および任意にはＥ２Ｂ領域配列において欠失を引き起こしている。パッケージング細胞のなかへの第１および第２の核酸コンストラクトのコトランスフェクションは、第１および第２の核酸コンストラクトにおける重複配列の間、および、それが１つの核酸分子以上のものから作り上げられている場合には、第２のコンストラクトの間での相同組換えにつながる。一般的には、その重複配列は、５０００ ｂｐ以上ではなく、またウイルス産生に欠かせないＥ２Ｂ領域配列を包含する。組換えウイルスＤＮＡは、組換え体アデノウイルスベクターライブラリーを産生するためにＥ１相補性パッケージング細胞において複製および増幅することができるＥ１欠失により生成される。アデノウイルスベクターライブラリーは、その生物学的活性の検出と分析を可能にするために、サンプル核酸によりコードされる産物の十分な発現を可能にするように増殖される高度処理能力を備えた設定における宿主のなかに導入される。宿主は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞あるいは動物あるいは植物モデルでありうる。サンプル核酸によりコードされる産物の十分な発現はその宿主の表現型を改変する。生物学的活性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびまたはｉｎ ｖｉｖｏでのさまざまな測定法のいずれかを使用して、改変された表現型が同定され、また分析され、機能はそれによって、サンプル核酸の産物に対応付けられる。本出願において説明されているプラスミドをベースにするアデノウイルスベクターシステムは、ヒト疾患に適用可能な新規な遺伝子に関してスクリーニングするのに使用することができる大きな遺伝子転移ライブラリーの作成が提供される。特定のアデノウイルス仲介形質導入による有用あるいは有益な生物学的効果の同定により、結果的には、ヒト疾患の治療に対する小さな分子薬剤のための有用な遺伝子治療用産物あるいは標的を得ることができる。
【００２９】
現在入手可能な技術を上回る長所が、対象となっている本発明にはいくつかある。プロセス全体では９６ウエルあるいはそのほかの複数ウエルフォーマットにおいて実施される場合にはとくに自動化に適合している。数多くの異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法を使用した高度な処理能力を備えたスクリーニングは、かなり短い時間で機能情報を効率的に得る手段を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｓｉｔｕで宿主に所望される表現型を示すあるいは導入する組換えアデノウイルスライブラリーの構成員（単数／複数）は、組換えアデノウイルスベクターの管理可能な数あるいは動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができるクローンにそのライブラリーを分解するために同定される。
【００３０】
対象となっている本発明のもう１つの明確な長所は、本諸方法がＲＣＡ遊離アデノウイルスライブラリーを産生することである。ライブラリーを通してＲＣＡ汚染が、とくに、複数のスクリーニング計画で使用されるライブラリーが継続的に増幅されている場合には、主要な障害となる可能性がある。さらに対象となる本発明の長所は、プロセスに関係しているステップの数を少なくしている点である。対象となっている本発明の諸方法は、高度な処理能力を備えたスクリーニング計画において使用する前に、各個々のアデノウイルスのクローニングを必要とすることはない。ほかのシステムには、ベクター生成に必要な、さまざまなアデノウイルスプラスミドに対して相同組換えを達成するために、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて１つあるいはそれ以上のステップが含まれる（Chartierら, (1996)J. Viro. 70(7):4805-4810;Crouzetら, (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94(4):1414-1419;Heら, (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. 95(5):2509-2514）。アデノウイルス組換えおよびアデノウイルスベクター生成に使用されてきて、また、ヒト細胞における相同組換えをベースにしているもう１つのプラスミドシステムは、プラスミドのｐＢＨＧシリーズである。しかし、これは２９３細胞で使用されており、そのプラスミドはＥ１配列との重複を有しており、それに加えて、そのプラスミドの不安定性につながる２つのＩＴＲをプラスミドｐＢＨＧは一緒に近しく含んでいる。すべてこれらの特徴は望ましいものではなく、またＲＣＡ産生あるいはそうでなければ、欠陥の多いアデノウイルスベクター産生につながる（Bettら,(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (19):8802-8806）。対象となっている本発明の組換え核酸は、これらの望ましくはない特徴を備えた構成を回避するために設計された。
対象となっている本発明のさらに長所は、導入されたサンプル核酸の高度な発現という結果になる、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのさまざまな哺乳動物細胞と組織における組換え遺伝子を効率的に導入し、また発現する組換えアデノウイルスの能力である。静止状態の細胞に生産的に感染する能力は、さらに、組換えアデノウイルスライブラリーの有用性を拡張する。さらに、高い発現レベルが、サンプル核酸の産物（単数／複数）が、十分なレベルで発現されて、検出されるべき宿主の表現型の変化を誘導し、かつその測定されるサンプル核酸によってコードされる産物（単数／複数）の機能を許容することを保証する。
【００３１】
サンプル核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、事前にクローン化されたＤＮＡ、遺伝子、ＥＳＴ、合成二本鎖オリゴヌクレオチド、あるいは１つあるいは複数の関連あるいは非関連配列から誘導される無作為な配列でありうるし、またポリペプチド、アンチセンス核酸あるいは遺伝抑制因子（ＧＳＥ）として直接的に発現することができる。サンプル核酸配列は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス）、魚（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、サケ）、線虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、酵母、真菌、細菌、植物から得ることができる。代替的には、サンプル核酸は商業的に入手可能なＤＮＡシンセサイザーおよびキットを使用して合成オリゴヌクレオチドとして作成される。サンプル核酸と相補鎖のポリペプチドあるいは産物のオープンリーディングフレームをコードする鎖は個々に作成され、また二本鎖ＤＮＡを形成するためにアニーリングされる。特別なアニール化の条件は必要ない。サンプル核酸の配列は、無作為化されるが、あるいは変異原性化あるいは組換えを促進する方法によらずに行われる。サンプル核酸は生物学的活性が分かっていない産物をコードする。生物学的活性という用語は、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで検出可能かあるいは測定可能である活性を意味することが意図されている。生物学的活性の実施例には、改変された生存率、形態学的変化、アポトーシス誘発、ＤＮＡ合成、腫瘍発生、疾患あるいは薬物感受性、化学応答性あるいは分泌、タンパク質発現に限定されるわけではないが、それらが含まれる。
【００３２】
サンプル核酸には好適には、正しい配向でのベクターへの結合を容易に、また、プロモーターにサンプル核酸を操作可能にリンクするために、適合性のある末端が含まれる。合成二本鎖オリゴヌクレオチド結合の例では、ベクターに対して適合性のある末端が、オリゴヌクレオチドのなかに入れるように設計することができる。サンプル核酸はＥＳＴ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子あるいは事前にクローン化したＤＮＡである場合には、適合性のある末端は制限酵素による消化あるいは適当な制限酵素部位を含むＤＮＡへのリンカーの結合により形成することができる。代替的には、ベクターはリンカーを使用することにより修飾することができる。ベクター由来のサンプル核酸の転写が所望される産物、すなわち、ポリペプチド、アンチセンス核酸あるいはＧＳＥを産生するように、制限酵素部位は選択される。
【００３３】
サンプル核酸が好適に導入されるベクターには、サンプル核酸のライブラリーの挿入のためには、操作不可能な形態、ＩＴＲ、少なくとも1つのクローン化部位、あるいは好適には、マルチプルクローニングサイトが含まれ、そして、宿主におけるサンプル核酸の送達と発現には、転写調節構成要素が含まれる。一般的には、後期遺伝子発現、Ｅ２Ａ領域配列、Ｅ３領域配列あるいはＥ４領域配列に必要なそうしたもののほかには、Ｅ１領域配列、Ｅ２Ｂ領域配列は含まれない。Ｅ１欠失送達ベクターあるいはアダプタープラスミドは、それが合成二本鎖オリゴヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、あるいは事前にクローン化されたＤＮＡであるかどうか、サンプル核酸の直接的なクローニングのために適当な末端を作り出すために、適当な制限酵素により、同時にか、順々にかのいずれかで、加水分解される。制限酵素分解は、製造業者のプロトコールに従って市販されていて入手可能な試薬を使用して、日常的に行われ、また選択される制限酵素によりさまざまに変化させられる。サンプル核酸の別個のセットあるいはプールが、アデノウイルスベクターの産生用プラスミドの対応するセットあるいはライブラリーを産生するためにＥ１欠失アダプタープラスミドのなかに挿入される。アダプタープラスミドの1つの実施例は、アデノウイルスヌクレオチド１−４５８、それに続いてアデノウイルス主要後期プロモーター、機能的に単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子にリンクされ、また続いてアデノウイルスヌクレオチド３５１１−６０９５により作り上げられるｐＭＬＰＩ．ＴＫである。アダプタープラスミドの他の実施例は、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ（図１）およびｐＡｄ／Ｃｌｉｐ（図２２）である。ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡには、アデノウイルスヌクレオチド１−４５４、マウスのＨＳＡ遺伝子にリンクされるＬ４２０プロモーター、ポリＡシグナル、それに続いてアデノウイルスヌクレオチド３５１１−６０９５が含まれる。ｐＡｄ／ＣＬＩＰは、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、イントロン、ポリＡシグナルを備えた発現カセット（Ｌ４２０−ＨＳＡ）の置換によりｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡから作成された。
【００３４】
一旦加水分解されると、ベクターとサンプル核酸は、ゲル電気泳動法により精製される。その核酸は、例えば、アガロース加水分解、電気溶出、溶解あるいは高塩抽出法によりさまざまなゲルマトリックスから抽出することができる。これらの諸方法と組み合わせて、あるいは代替的に、加水分解核酸は、クロマトグラフィ（例えば、Qiagenあるいは等価のＤＮＡ結合レジン）あるいはフェノール／クロロホルム抽出法、エタノール沈降法により精製することができる。最適な精製方法は、ベクターとサンプル核酸のサイズとタイプによる。両方とも精製を行わずに使用することができる。一般的には、サンプル核酸には、５’−リン酸基が含まれ、またベクターは、核酸−ベクター結合を促進し、またベクター−ベクター結合を防ぐためにアルカリ性ホスファターゼにより処理される。サンプル核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合には、５’−リン酸基が化学的あるいは酵素的な手段により加えられる。結合に際しては、サンプル核酸（挿入）のベクターＤＮＡに対するモル比は、およそ１０：１〜０．１：１の範囲である。結合反応は、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼあるいは、二本鎖ＤＮＡライゲーションを触媒するいずれかのほかの酵素を使用して行われる。反応時間と温度はそれぞれ、約５分間〜１８時間、約１５℃〜室温の範囲で変動させることができる。
【００３５】
発現の強度は、転写活性において異なるプロモーター（ＣＭＶ即時型プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ）を使用して調節することができる。サンプル核酸を、ＣＭＶ即時型プロモーターおよび任意に1つあるいはそれ以上のエンハンサー構成要素などの強力なプロモーターに操作可能にリンクすることにより、宿主の表現型を改変するために感染の数を少なくして使用することを可能にする高発現率という結果を生じる。低めの感染の数を使用するという選択肢は、ライブラリーをｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる回数が増加する。さらに、スクリーニング計画、測定、動物モデルで使用されている感染および投与量のウイルスライブラリーの数を低くすると、形質導入宿主での毒性効果を喚起する機会が減少し、本発明の主題であるシステムの信頼性が再び増大する。ライブラリーの発現に関連する可能な毒性効果を減らすもう1つの方法は、一時的なおよび／または細胞型に特異的な制御をスクリーニング測定を通して提供するために、調節可能なプロモーター、とくにウイルス生産の間に抑制されるが、しかし、アデノウイルスライブラリーにより機能的なスクリーニングの間に始動することができ、あるいは活性化する調節可能なプロモーターを使用することである。このように、ライブラリーの構成員であり、また相補性細胞系列に毒性があり、あるいは阻害性があり、あるいはいずれかの方法でアデノウイルス複製および生産を干渉するサンプル核酸が、いまだにアデノウイルスベクターとして産生することができる（WO 97/20943）。プロモーターのこのタイプの例としては、アデノウイルスＥ１遺伝子産物により抑制されるＡＰ１依存性プロモーターがあり、これによりアデノウイルスライブラリー産生時にサンプル核酸の発現が遮断されることになる（van Damら,(1990)Mol.Cell.Biol. 10(11):5857-5864を参照）。こうしたプロモーターは、コンビナトリアル技術を使用して作成することができ、あるいはプロモーターの天然あるいは適応形態を含めることができる。ＡＰ１依存プロモーターの例としては、コラーゲナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、単核細胞化学誘因物質タンパク質（ＪＥあるいはｍｃｐ−１／ＪＥ）、ストロメライシン遺伝子由来のプロモーターがある（Hagemyerら,(1993)EMBO J.12(9);3559-3572;Offringaら, (1990)Cell 62(23):527-538; Offringaら,(1998)Nucleic Acids Res. 16(23):10973-10984; van Damら, (1989) Oncogene 4(10):1207-1212）。代替的には、複合ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングが用いられるあるいはｉｎ ｖｉｖｏモデルが用いられ、また組織調節発現が所望される場合にはとくに、ほかのさらに特異的であるが、しかしより強力なプロモーターを使用することができる。選択された宿主のなかで機能的ないずれかのプロモーター／エンハンサーシステムを使用することができる。組織調節プロモーターの例としては、アルブミンプロモーターなどの肝臓において特異的な活性あるいは促進活性を備えたプロモーターが含まれる（Troncheら, (1990)Mol.Biol.Med. 7(2):173-185）。促進発現に対するもう1つのアプローチは、３’−非翻訳領域における安定化配列を含めることにより、サンプル核酸から転写されたｍＲＮＡの半減期を増加させることである。複製とパッケージングに必要なすべての必要��アデノウイルス遺伝子を保持する、Ｅ１欠失アダプタープラスミドにおける配列に相同的な配列を有する第２の核酸コンストラクトであるヘルパープラスミドもまた作成される。好適には、ヘルパープラスミドは、複製応答能のあるアデノウイルスの産生につながると考えられるパッケージング細胞により発現される相補性配列は有していない。さらに、好適には、ヘルパープラスミド、アダプタープラスミド、パッケージング細胞は、相同組換えおよびＲＣＡ形成につながると考えられる配列重複は有していない。アダプタープラスミドとヘルパープラスミドの間で共有されている配列重複の領域は、相同組換えや、Ｅ１欠失、複製欠損性組換えアデノウイルスゲノムの形成を可能にしている。一般的には、重複領域は後期遺伝子発現に必要であるＥ２Ｂ領域配列を包含する。ライブラリーのインサートサイズを認識できるほどに減らすことなくもっとも良い効率を提供する重複領域のサイズは、経験的に決定することができる。配列重複は、一般的には１０ｂｐ〜５０００ｂｐであり、さらに好適には、２０００〜３０００ｂｐである。
【００３６】
所望されるアデノウイルスライブラリーにおけるサンプル核酸あるいはＤＮＡインサートのサイズは、数百塩基対（例えば、神経ペプチドをコードする配列）から３０ ｋｂｐ（例えば、タイチン）まで変化することができる。アダプタープラスミドを使用して産生されるアデノウイルスベクターのクローン化能力は、Ｅ１相補性細胞系列の誘導体によりその後に容易に補足される付加的なアデノウイルス遺伝子（単数／複数）により増加させることができる。１つの例としては、欠失のための候補遺伝子には、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４が含まれる。例えば、アデノウイルス複製およびパッケージングに欠かせない領域は、アダプターならびにヘルパープラスミドから欠失され、また、例えば、その相補性細胞系列により、発現される。Ｅ３欠失に関しては、この領域における遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに関してパッケージング細胞に補足される必要はなく、またｉｎ ｖｉｖｏモデルに関して組換えウイルスの免疫原性上でのインパクトは、その時々のものに限って対処することをベースにして評価することができる。
【００３７】
特定のアダプタープラスミドのセットあるいはライブラリーあるいはアダプタープラスミドのプール（単数／複数）は、アデノウイルスベクターのセットあるいはライブラリーに変換される。サンプル核酸を含むアダプタープラスミドは線状化され、アダプタープラスミドにある配列に相同な配列を有し、また複製とパッケージングに必要なすべてのアデノウイルス遺伝子を含んでいるヘルパープラスミドと一緒に、好適には、９６、３８４、１，５３６あるいはそれ以上のプレート毎のウエル（穴）を備えたマイクロ力価組織培養培地プレートに接種されたＥ１相補性細胞系列にトランスフェクトされる。好適には、Ｅ１相補性細胞系列において複製およびパッケージされるＥ１欠失、複製欠損性アデノウイルスゲノムを生成するために、アダプターおよびヘルパープラスミドにより共有されている相同性配列の間の組換えは、好ましくは、Ｅ１相補性細胞系列内において、複製され、パッケージングされる、Ｅ１欠損、複製欠損性のアデノウイルスゲノムを生成する。１つ以上のヘルパープラスミドが使用される場合には、一方の腕側でのヘルパープラスミドの間で共有されている相同性領域の間の組換えと、アダプタープラスミドとの相同組換えとにより、結果として、複製欠損性組換えアデノウイルスゲノムが形成される。アダプターおよびヘルパープラスミドの間の配列重複の領域は、約数百ヌクレオチドあるいはそれ以上に変化させることができる。組換え効率は、重複のサイズを増加することにより、増加することになる。
【００３８】
転移相補性パッケージング細胞により供給されるＥ１機能は、Ｅ１欠失組換えアデノウイルスゲノムの複製およびパッケージングを可能にする。アダプターおよび／またはヘルパープラスミドは、好適には、それらの間に配列重複を有さず、あるいは複製応答能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の形成につながるパッケージング細胞における相補性配列を含む配列重複を有しない。好適には、アダプター及びヘルパープラスミド上の少なくとも一つのＩＴＲが、アデノウイルス配列あるいは発現カセットに存在しない一つの制限酵素部位によって隣接されており、ＩＴＲがその制限酵素によるＤＮＡの消化によってベクター配列から遊離されるようになっている。このように、複製の開始はさらに効率的に起こる。組換えアデノウイルス生成の効率を増加させるために、より高度な処理能力が、大きな組織培養培地バイアルあるいはフラスコを使用する代わりに、プレート毎に９６、３８４、１，５３６穴を有するマイクロ力価組織培養プレートを使用することにより得ることができる。Ｅ１相補性細胞系列が、マイクロ力価プレートのなかで増殖され、また、アダプタープラスミドおよびヘルパーブラスミドのライブラリーとがコトランスフェクションされる。例えば、ロボットは、産生することができるアデノウイルスベクターの数をさらに増加することができる（Hawkinsら, (1997)Science 276(5320):1887-9,Houston, (1997)Methods Find. Exp.Clin. Pharmacol. 19 Suppl.A:43-5）。
【００３９】
アダプタープラスミドに対する1つの代替物として、サンプル核酸は「最小」アデノウイルスベクタープラスミドに結合することができる。本発明によるいわゆる「最小」アデノウイルスベクターは、複製に必要とされる線状アデノウイルスゲノムの末端に由来するＤＮＡ配列である逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の少なくとも機能的一部分あるいは誘導体の少なくとも1つのコピーだけではなく、ウイルス粒子のなかへのゲノムのインキャプシデーションに必要であるウイルスゲノムの少なくとも一部分（インキャプシデーションシグナル）を保持している。最小ベクターは、好適には、ヘルパーフリー及びＲＣＡフリーの組換えアデノウイルスベクターのストックの創製と生産に使用され、また、３８ｋｂまでの外因性ＤＮＡを収容することができる。最小アデノウイルスベクターのヘルパー機能は、好適には、ベクターゲノムにある相補性細胞あるいは遺伝子に存在するそうした遺伝子は例外として、必要とされる遺伝子産物をコードするすべてのウイルス遺伝子を含むインキャプシデーション欠損、複製応答能のあるＤＮＡ分子によってトランスに供給される。
【００４０】
「最小」アデノウイルスベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルスによる、あるいは代替的には、パッケージング欠損複製ヘルパーシステムによる、Ｅ１相補性細胞系列のコトランスフェクションにより達成される。好適には、パッケージング複製ヘルパーは、トランスフェクションの後に増幅され、またパッケージング細胞系列によっては発現しない最小アデノウイルスベクターの複製およびパッケージングに必要な配列を発現させる。そのサイズがアデノウイルスビリオンの容量を越えるため、および／またはそれは機能的インキャプシデーションシグナルを欠くため、パッケージング欠損複製ヘルパーはアデノウイルス粒子のなかに詰め込まれることはない。パッケージング欠損複製ヘルパー、最小アデノウイルスベクター、相補性細胞系列は、好ましくは、ＲＣＡ形成を可能にする配列重複の領域は有していない。
【００４１】
複製、パッケージング欠損ヘルパー分子には常に、パッケージング細胞系列により供給されるものにより、あるいはそれによらずに、複製およびパッケージングに必要なタンパク質を産生するすべてのアデノウイルスコード配列が含まれる。前記ヘルパー分子それ自体の複製は、アデノウイルスタンパク質およびＩＴＲにより仲介される、あるいは仲介されないことがある。アデノウイルスタンパク質（細胞タンパク質と一緒に作用するＥ２遺伝子産物である）の活性により複製するヘルパー分子には、アデノウイルスから誘導される少なくとも1つのＩＴＲが含まれる。Ｅ２遺伝子産物は、Ｅ１依存性あるいはＥ１依存性プロモーターにより発現させることができる。1つだけのＩＴＲがアデノウイルスから誘導される場合には、ヘルパー分子には、好ましくは、ヘアピン様構造を形成するために分子内でアニール化される配列も含まれる。
【００４２】
Ｅ２遺伝子産物発現の後、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼはヘルパー分子上にＩＴＲを認識し、また一本鎖コピーを産生し、および３’−末端が分子内でアニール化され、逆鎖合成のためのプライマーとして役立つヘアピン様構造を形成する。逆鎖合成の産物は1つの末端にＩＴＲを伴う二本鎖ヘアピンである。このＩＴＲは、ＩＴＲを両方の末端に伴う二本鎖分子を産生するアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼにより認識され（例えば、図１３を参照）、またトランスフェクションされた分子の長さの２倍になる（われわれの実施例では、それは３５Ｋｂ〜７０Ｋｂから複製される）。ヘルパーＤＮＡの複製はアデノウイルスタンパク質の十分なレベルの産生を促進する。好適には、複製分子のサイズはアデノウイルスビリオンのパッケージング容量を越え、また、したがって、アデノウイルス粒子のなかには詰め込まれることはない。ヘルパー分子に機能的インキャプシデーションシグナルがない場合は、そのヘルパー分子がパッケージング欠損であることが保証される。産生アデノウイルスタンパク質がコトランスフェクションされた、あるいはコインフェクションされた最小ベクターの複製およびパッケージングを仲介する。
【００４３】
ヘルパー分子の複製がアデノウイルスＥ２タンパク質には依存していない場合には、ヘルパーコンストラクトには、好適には、ＳＶ４０に由来する複製起点が含まれる。ＳＶ４０ラージＴタンパク質をも誘導的に発現させる、あるいは効率的な複製に必要とされる分量のＳＶ４０由来タンパク質を誘導的に発現させるＥ１含有パッケージング細胞系列における最小アデノウイルスベクターと一緒にされたこのＤＮＡのトランスフェクションは、ヘルパーコンストラクトの複製とアデノウイルスタンパク質の発現につながる。これらは、その後に、コトランスフェクションあるいはコインフェクションされた最小アデノウイルスベクターの複製およびパッケージングを開始する。好適には、そこには、ＲＣＡの生成につながることがある複製欠損パッケージングコンストラクト、最小アデノウイルスベクター、相補性細胞系列によって共有される重複配列が存在しない。
【００４４】
最小アデノウイルスベクターの増殖時には、最小ベクターはそれ自体はＥ１相補性細胞上では複製することができないため、Ｅ１相補性細胞上の各増幅ステップは説明したヘルパー分子のいずれかのトランスフェクションに付随して行われている。代替的には、安定的にゲノム内に組み込まれる複製およびパッケージングに必要なすべてのアデノウイルス遺伝子を含有し、また切断および条件的に複製が可能である細胞系列は使用することができる（ValerioとEinerhand, PCT/NL9800061）。
【００４５】
細胞への核酸のトランスフェクションは、ウイルス粒子のなかへの組換えベクターのパッケージングのために必要であり、またリポソーム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、ホスファゼンあるいはホスファゼン誘導体を含むさまざまな化学物質により媒介されうる。リポソームは、さまざまな商業的な供給者から入手可能であり、それにはＤＯＴＡＰ（Boehringer-Mannheim社）、Ｔｆｘ−５０R、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍR、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎR(Promega社,Madison市,ウィスコンシン州)、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎR、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎR、ＬｉｐｆｅｃｔＡｃｅR(GibcoBRL,Gaithersburg,メリーランド州)が含まれる。溶液中で、脂質は核酸に関連している小胞を形成し、また細胞膜との小胞の融合によりあるいはエンドサイトーシスにより細胞のなかへのその導入を容易にする。ほかのトランスフェクション法には、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈降法、マイクロインジェクション法がある。任意の細胞系列に対するトランスフェクション条件が確立されていなかった場合、あるいは分からない場合には、それら条件は経験的に決定することができる（Maniatisら, Molecular Cloning, 16.30-16.55頁）。
【００４６】
組換え体アデノウイルスのウイルスベクターの収量は、Ｅ１相補性細胞系列へトランスフェクションする前に二本鎖プラスミドＤＮＡを変性させることにより増加させることができる。変性は、例えば、９５〜１００℃にて二本鎖プラスミドＤＮＡを融解することにより、それに引き続いて、重複配列を有するアダプターおよびヘルパープラスミドのさまざまな割合のものを使用して急速冷却することにより、行われる。また、Ｅ２Ａ（ＤＮＡ結合タンパク質）および／またはＥ２Ｂ遺伝子（ｐＴＰ−Ｐｏｌ）を安定的に、あるいは一過性に発現させるＰＥＲ．Ｃ６誘導体は、細胞当たりの複製比率を増加させることにより、ウエル当たりのアデノウイルス産生を増加させるのに使用することができた。代替的には、リコンビナーゼタンパク質（単数／複数）あるいはリコンビナーゼＤＮＡ発現コンストラクト（単数／複数）すなわち、Kluyveromyces waltii由来のリコンビナーゼのコトランスフェクション(Ringroseら, (1997) Eur. J. Biochem. 248(3):903-912)、あるいは、いずれかのほかの遺伝子あるいは相同組換え効率を増加させることができる遺伝子コード因子を使用することができる。パッケージング細胞上でのトランスフェクションおよび／または複製中における０．１〜１００ｍＭ酪酸ナトリウムの封入は、ウイルス産生を増加させることができる。これらの改良により、マイクロ力価ウエル当たりのウイルス収量が改善される結果となり、またしたがって、単一のライブラリーにより実施することができる試験の数とタイプは増加し、また、ライブラリー中のさまざまな遺伝子あるいはサンプル核酸間の変異性を克服することになるであろう。
【００４７】
Ｅ１領域産物を発現するアデノウイルスベクターの産生に使用される細胞系列には、例えば、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ  ９６０２２９４０）、あるいは９１１細胞が含まれる。これらの細胞系列のそれぞれはアデノウイルスＥ１領域をコードする核酸によりトランスフェクションされている。これらの細胞はＥ１領域遺伝子産物を安定的に発現させ、また、Ｅ１欠失組換え体アデノウイルスベクターをパッケージすることが示された。ＰＥＲ．Ｃ６細胞上で得られる組換え体アデノウイルスの収量は、２９３細胞上で得られるよりも高い。
【００４８】
これらの細胞系列のそれぞれは、例えば、対応する遺伝子における変異、欠失、あるいは挿入を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にするＥ２ＢあるいはＥ２Ａコンストラクト（例えば、ｔｓ１２５Ｅ２Ａおよび／またはｈｒＥ２Ａ）、あるいはＥ４などの導入のための基礎を提供する。これらの細胞は、適当なアデノウイルス遺伝子を安定的に発現させる組換え核酸の導入によって付加的なアデノウイルス遺伝子産物を発現させるように修飾することができる、あるいは、適当な遺伝子（単数／複数）、例えば、パッケージング欠損複製ヘルパー分子あるいはヘルパープラスミドを一過性に発現させる組換え核酸を導入することができる。
【００４９】
マイクロ力価プレートウエル（９６、３８４、１,５３６あるいはそれ以上のウエル）で増殖されるすべてあるいはすべてに近いトランス相補性細胞は、アダプタープラスミドかあるいは最小アデノウイルスプラスミドライブラリーおよび適当なヘルパー分子（単数／複数）かのいずれかによりトランスフェクションの後に、組換えアデノウイルスを産生する。非常に多くの数のアデノウイルス遺伝子転移ベクターあるいはライブラリーは、それぞれ独特な遺伝子を発現するが、このように、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の特定遺伝子産物の生物学的活性の分析を可能にする規模で都合よく生産することができる。アデノウイルスベクターの広範な組織の向性のために、数多くの細胞および組織タイプは、アデノウイルスライブラリーを形質導入可能である。
【００５０】
遺伝子あるいはサンプル核酸のライブラリーは、好ましくは、ＲＣＡフリーのアデノウイルスライブラリーに対する上述の諸方法を使用して変換される。未知の機能を有する遺伝子あるいはサンプル核酸のアデノウイルスライブラリーは、その後に、ＥＬＩＳＡ法を含む免疫学的測定法、増殖測定法、薬物耐性測定法、酵素活性測定法、臓器培養、分化測定法、細胞毒性測定法など、数多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法を含めた高度な処理能力を備えたスクリーニングを行うのに使用される。アデノウイルスライブラリーは、初代内皮および平滑筋細胞培養培地を含む組織あるいは組織部位、あるいは組織誘導初代短期生存細胞培養培地（Wijnbergら,(1997) Thromb Haemost 78(2),880-6）、冠動脈バイパス移植ライブラリー（Vassalliら, (1997) Cardiovasc Res. 35(3), 459-69; FusterとChesebro, (1985) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot Res. 13, 285-99）、ＨＵＶＥＣを含む臍帯組織(Gimbrone, (1976) Prog. Hemost. Thromb. 3, 1-28; Strikerら, (1980)Methods Cell. Biol. 21A, 135-51)、couplet肝細胞（ Grafら, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(20), 6516-20）、表皮培養培地（Fabre, (1991) Immunol. Lett. 29(1-2), 161-5; Phillips, (1991)Transplantation 51(5), 937-41）上で試験することができる。懸濁培養培地を含む植物細胞培養培地はまた、ヒト由来ＤＮＡ配列ならびに植物由来配列を含むいずれかのＤＮＡ配列を保持するアデノウイルスライブラリーに対する宿主細胞としても使用することができる(de Vriesら, (1994) Biochem. Soc. Symp. 60,43-50; Fukadaら, (1994) Int. J. Devel. Biol. 38(2), 287-99; Jones, (1983)Biochem. Soc. Symp. 48, 221-32; Kieranら, (1997) J. Biotechnol. 59(1-2), 39-52; Stanleyら, (1993)Curr. Opin. Genet. Dev. 3(1), 91-6; Taticekら, (1994)Curr. Opin. Biotechnol. 5(2), 165-74)。
【００５１】
初期非選択ライブラリーのサイズにより、一旦遺伝子のアデノウイルスライブラリーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ測定により、合理的な数の候補群に分解されると、そのアデノウイルスは適当な動物モデルで試験することができる。使用することができる動物モデルの実施例には、アルツハイマー病、動脈硬化症、不活性化された遺伝子（単数／複数）を有するマウスを含む内因性あるいは外因性遺伝子の発現を改変したトランスジェニック動物、特定部位に移植されたがんを有する動物、がん転移モデル、パーキンソン病モデル、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスなどのヒト骨髄キメラマウスなどモデルが含まれる。付加的な試験が必要であるので、候補であるアデノウイルスの菌株は、適当なトランス相補性条件下でアデノウイルスを継代していくことにより拡張することができる。
【００５２】
使用された動物モデルにより、アデノウイルスベクターあるいはアデノウイルスベクターの事前に選択されたプールの混合物を、非ヒト霊長類の肺（Seneら, (1995)Hum. Gene Ther. 6(12):1587-93）、アルツハイマー病（Walkerら, (1997)Brain Res. Brain Res. Rev. 25(1):70-84）のための正常およびアポＥ欠損マウスの脳（Robertsonら, (1998)Neuroscience 82(1):171-80）、パーキンソン病モデルの脳（Hockmanら, (1971)Brain Res. 35(2):613-8.; Zigmondと Stricker, (1984)Life Sci. 35(1):5-18）などの所望される動物の適当な部位に点滴、あるいは塗布あるいは投与することができ、肝不全およびウイルソン病を含む肝疾患モデル(Cuthbert, (1995) J. Investig. Med. 43(4):323-36; Karrerら, (1984) Curr. Surg. 41(6):464-7)や、転移モデルを含む腫瘍モデル(Esandiら, (1997)Gene Ther. 4(4):280-7; Vincentら, (1996)J. Neurosug.85(4):648-54; Vincentら, (1996)Hum. Gene Ther. 7(2):197-205 )の血液流（例えば、静脈内）に注射することができる。選択アデノウイルスベクターをヒトキメラＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄中に直接注射することも可能である（Dickら, (1997)Stem Cells 15 Suppl. 1:199-203; Mosierら, (1998)Nature 335 (6187);256-9）。最終的に選択されたアデノウイルスは、例えば、再狭窄動物モデルの疾患血管組織に局所的に適用することができる(Karasら, (1992)J. Am. Coll. Cardiol. 20(2):467-74)。
【００５３】
さらに、実験室での生の測定法は、アデノウイルスライブラリーが構築されている配列データベースの電子版を使用することにより、補完することができる。これにより、例えば、タンパク質モチーフ検索、およびしたがって、ファミリーの新しい構成員を、同じファミリーの既知の機能を有する既知の構成員にリンクすることが可能になる。「隠蔽マルコウモデル（Hidden Markow Model）」（ＨＭＭ）（Eddy. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(4):1414-1419）を使用すると、ファミリーの重要な特徴を抽出し、またその構成員たちがどんな様子であるはずのものなのかについて１つのモデルを構築することにより、新規のファミリーを確立することができる。最終的には、これは、既知の構造をスレッドとして使用し、スレッデングアプローチを使用することにより新規なタンパク質の実際の構造を決定することをせずに推定構造を見出すことを試み、構造的なデータと組み合わせることができる（Rastanと Beeley (1997)Curr. Opin. Genet. Dev. 7(6):777-83）。当然のことながら、本出願において開示されている諸方法により作成されるアデノウイルスライブラリーを使用して得られる機能的データは、予想されるあるいは所望される諸機能を備えた新規な遺伝子を発見する努力の基礎となり、また機能的ゲノム学の核となることであろう。最終的には、一度アデノウイルスベクターの数が、動物実験を実施することができるレベルになれば、その方法にもう１つ付け加えるのは、候補となる遺伝子を保持する候補となるアデノウイルスベクターの選別法を発展させることである。これは、例えば、線維のノブドメインのＨｉループで標識化されたアデノウイルスを使用することにより、そのクローンの精製によって得られるであろう。あるいは、大規模なＨＰＬＣ分析が、さらに精製されたアデノウイルス調製が所望される動物実験あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング用の部分的に精製されたアデノウイルスサンプルを得るために、半調製的な形態で使用される。したがって、前記方法と試薬によれば、遺伝子のコレクションを、そうでなければ可能にならないであろう限られた数の動物のｉｎ ｖｉｖｏでの研究へ迅速に移行させることが可能となる。ロボットを使用した手順の各ステップを自動化すれば、さらに、機能させることができる遺伝子ならびにサンプル核酸の数を向上させることになる。
【００５４】
１つの態様においては、本発明は組換え体アデノウイルスベクターライブラリーを産生する方法であって、アデノウイルスＥ１−相補性配列を含む複数の細胞を、
ｉ）前記複数の細胞におけるＥ１領域配列、あるいは前記パッケージング細胞のなかに挿入される組換え核酸と重複するＥ１領域配列を有していないアデノウイルスをベースとするか、あるいはそのアデノウイルスに由来するアダプタープラスミドを含むアダプタープラスミドライブラリーであって、前記複数の細胞において複製応答能のあるアデノウイルスの生成につながり、本質的なＥ２Ｂ配列のほかにはＥ２Ｂ領域配列はなく、Ｅ２Ａ領域配列がなく、Ｅ３領域配列がなく、Ｅ４領域配列がなく、操作可能な形態において、機能的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、機能的インキャプシデーションシグナル、前記組換え核酸との相同組換えを許容するのに十分なアデノウイルス配列と、プロモーターに操作可能にリンクされる前記アダプタープラスミドのなかに挿入されるサンプル核酸インサートのライブラリーと、
ii）アデノウイルスをベースにし、あるいはアデノウイルスに由来する組換え核酸であって、前記組換え核酸は、操作可能な形態において、機能的な逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と複製用の十分なアデノウイルス配列を含み、前記組換え核酸は、複製欠損、組換えアデノウイルスに導くような相同組換えを許容する前記アダプタープラスミドライブラリーと部分的に重複する組換え核酸；
とを含む多数の細胞を含有する細胞培養を、組換え体アデノウイルスベクターライブラリーが産生される条件下で増殖させる工程を、備える方法を提供する。
【００５５】
好ましくは、前記アダプタープラスミドライブラリーの少なくとも1つと前記組換え核酸は前記複数の細胞あるいは前記複数の細胞の子孫にトランスフェクションする前に熱により変性される。
好ましくは、前記アデノウイルスＥ１相補性配列と、前記アダプタープラスミドライブラリーと、前記組換え核酸が、それらが導入される細胞中での複製応答能のあるウイルスに導くような相同組換えを許容する重複配列を有しない。
【００５６】
１つの態様においては、本発明は組換え体アデノウイルスベクターライブラリーを産生する方法であって、アデノウイルスＥ１−相補性配列を含む複数の細胞を、
ｉ）アデノウイルスをベースにするか、あるいはアデノウイルスに由来する第1の組換え核酸を有する組換え核酸ライブラリーであって、操作可能な形態において、2つの機能的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、1つの機能的インキャプシデーションシグナルを有し、また機能的なアデノウイルス遺伝子がなく、プロモーターに操作可能にリンクされる前記第1の組換え核酸に挿入されるサンプル核酸のライブラリーを有する、ライブラリーと、
ｉｉ）アデノウイルスをベースとするか、あるいはそれに由来する第２の組換え核酸であって、操作可能な形態において、2つの機能的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、複製のための十分なアデノウイルス配列とを有し、前記第２の組換え核酸は、少なくともＥ１領域の欠失と、前記アデノウイルスのインキャプシデーションシグナルとを有する、核酸、
とを含むアデノウイルスＥ１相補性配列を含む複数の細胞を含む細胞培養を、組換えアデノウイルスベクターライブラリーが産生される条件下で、増殖させる工程を有する、方法を提供する。
好適には、前記細胞培養培地は、複数ウエルフォーマットのなかにある。
好適には、前記アデノウイルスＥ１相補性配列と、前記第１の組換え核酸と、前記第２の組換え核酸が、それらが導入される細胞中の複製応答能のあるウイルスに導くような相同組換えを許容する重複配列を有しない。
好ましくは、前記細胞培養は、前記細胞培養培地がＰＥＲ．Ｃ６細胞培養培地である。
１つの実施例においては、前記細胞培養の増殖培地には、前記組換えアデノウイルスベクターライブラリーの産生を促進するのに十分な量で酪酸ナトリウムを含んでいる。
好適には、前記複数の細胞はさらに、アデノウイルス前期末端タンパク質と、ポリメラーゼ相補性配列の少なくとも１つを含む。
好適には、前記複数の細胞が、さらに、アデノウイルスＥ２相補性配列を含む。好適には、前記Ｅ２相補性配列はＥ２Ａ相補性配列あるいはＥ２Ｂ相補性配列である。
【００５７】
１つの態様においては、前記複数の細胞はさらに、リコンビナーゼタンパク質から成り、それによって、複製欠損、組換えアデノウイルスにつながっていく前記相同性組換えが促進される。好適には、前記リコンビナーゼタンパク質はKluyveromyces waltiiリコンビナーゼである。
【００５８】
もう１つの態様においては、前記複数の細胞はさらに、リコンビナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。好適には、前記組換えタンパク質がKluyveromyces waltiiリコンビナーゼである。
【００５９】
１つの態様においては、前記組換えアデノウイルスベクターライブラリーの構成員が同一である。
１つの態様においては、前記プロモーターは誘導的プロモーターである。好適には、前記プロモーターは、アデノウイルスＥ１遺伝子産物により抑制されるかあるいはダウンレギュレーションされる。１つの態様においては、前記プロモーターは、ＡＰ１依存性プロモーターを有する。好適には、前記ＡＰ１依存性プロモーターは、コラーゲナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、単核細胞化学誘因物質タンパク質あるいはストロメライシン遺伝子に由来する。
【００６０】
１つの態様においては、前記サンプル核酸は、機能未知の産物をコードする。  もう１つの態様においては、前記サンプル核酸は合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、ＥＳＴ、アンチセンス核酸、あるいは遺伝子抑制構成要素からなる群から選択される構成されるグループから選択される。
【００６１】
１つの態様においては、本発明はサンプル核酸によりコードされる産物に機能を対応させるための方法を提供し、
本発明の方法により産生される組換えアデノウイルスベクターライブラリーを含む宿主細胞を増殖させる工程であって、それによって、前記サンプル核酸によりコードされる産物が、前記宿主細胞のなかで少なくとも１つの改変された表現型を産生するように発現される工程と、
前記少なくとも１つの改変された表現型を同定する工程であって、それによって、１つの機能を前記サンプル核酸によりコードされる前記産物に対応させる工程と、
を備える方法を提供する。
好ましくは、前記宿主細胞は植物細胞あるいは動物細胞である。好ましくは、前記動物細胞はヒト細胞である。
【００６２】
１つの態様においては、前記宿主細胞は細胞培養の構成員である。好適には、前記細胞培養は複数ウエルフォーマットのなかにある。
好適には、本発明の方法は自動化されたものである。
【００６３】
本発明は、さらに、組換え複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーを含む非ヒト宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、組換え複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーを提供し、前記複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーは、本発明の方法による方法によって産生される。
【００６４】
本発明はさらに、複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーを含む分離された宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーを含む分離された宿主細胞を提供し、前記複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーは、本発明による方法によって産生される。好ましくは、前記宿主細胞はヒト細胞である。
【００６５】
本発明はさらに、組換えアデノウイルスベクターライブラリーを産生する方法であって、
アデノウイルスＥ１−領域配列を発現し、Ｅ２Ａ領域及びＥ４領域から選択される少なくともひとつのアデノウイルス領域によってコードされた１またはそれ以上の機能的産物を発現する複数の細胞を含む細胞培養を増殖させる工程を有し、前記複数の細胞は、
ｉ）前記複数の細胞におけるＥ１領域配列あるいは前記パッケージング細胞に挿入される組換え核酸と重複するＥ１領域配列を有していないアデノウイルスをベースとして、あるいはそのアデノウイルスに由来するアダプタープラスミドを有するアダプタープラスミドライブラリーであって、アデノウイルスは本質的なＥ２Ｂ配列のほかにはＥ２Ｂ領域配列を有せず、Ｅ２Ａ領域配列を有せず、Ｅ３領域配列を有せず、Ｅ４領域配列を有せず、アデノウイルスは、操作可能な形態で、機能的逆方向末端反復配列と、機能的インキャプシデーションシグナルと、前記組換え核酸との相同組換えを許容する十分量のアデノウイルス配列と、プロモーターに操作可能にリンクされる前記アダプタープラスミドのなかに挿入されるサンプル核酸のライブラリーを有する、ライブラリーと、
ii）前記複数の細胞中のＥ１配列と重複しているＥ１領域配列を有しておらず、また、複製応答能のあるアデノウイルスの生産につながる、前記複数の細胞において発現されるＥ２Ａ領域配列あるいはＥ４領域配列を有していない、アデノウイルスをベースにし、あるいは該アデノウイルスに由来する組換え核酸であって、操作可能な形態において、機能的アデノウイルス逆方向末端反復配列と、前記複数の細胞における複製のための十分なアデノウイルス配列を有し、前記組換え核酸は、前記パッケージング細胞における組換えアデノウイルスの産生につながる相同組換えを提供するために前記アダプタープラスミドと十分な十分を有している、組換え核酸、
とともに、
組換えアデノウイルスベクターライブラリーが前記複数の細胞中で産生される条件下で、前記細胞培養を増殖させる工程を有する、方法を提供する。
【００６６】
好適には、前記複数の細胞は、少なくとも１つの機能的Ｅ２Ａ遺伝子産物を発現させる。好適には、前記少なくとも１つの機能的Ｅ２Ａ遺伝子産物は変異遺伝子産物である。好適には、前記変異遺伝子産物は温度感受性である。
好適には、前記アダプタープラスミドライブラリーと前記組換え核酸の少なくとも１つが、前記複数の細胞あるいは前記複数の細胞の子孫をトランスフェクションする前に熱により変性される。
【００６７】
好適には、前記複数の細胞は、Ｅ２Ｂ領域配列によりコードされる１つあるいはそれ以上の機能的遺伝子産物を発現させ、また、ウイルス生成に必要とされるそうしたもの以外に、前記機能的Ｅ２Ｂ領域遺伝子産物のためのＥ２Ｂ領域配列が、前記組換え核酸から削除され、また、任意にはすべてのＥ２Ｂ遺伝子領域配列にいたるまでが前記アダプタープラスミドから削除される。
【００６８】
好適には、前記複数の細胞は、Ｅ２Ｂ領域配列によりコードされるすべての遺伝子産物を発現させ、また、ウイルス生成に必要とされるそうしたもの以外には前記機能的Ｅ２Ｂ領域遺伝子産物のためのＥ２Ｂ領域配列が前記組換え核酸から削除され、また任意には、すべてのＥ２Ｂ遺伝子領域配列にいたるまでが前記アダプタープラスミドから削除される。
【００６９】
好適には、前記細胞培養培地はＰＥＲ．Ｃ６細胞培養培地である。
好適には、前記プロモーターは誘導可能なプロモーターである。
【００７０】
１つの態様においては、本発明は、組換え複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーを含む複数の細胞を提供し、前記組換え複製欠損アデノウイルスベクターライブラリーは、本発明の方法により産生される。好適には、前記複数の細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
【００７１】
本発明はさらに、組換え核酸を提供し、
前記組換え核酸は、
Ｅ１領域配列を有しないアデノウイルスをベースにする、あるいは該アデノウイルスに由来する核酸を有し、前記核酸は、それが導入されるパッケージ細胞で複製応答能を有するアデノウイルスの産生を導くＥ１領域配列を有さず、また、前記核酸は、操作可能な形態で、機能的アデノウイルス逆方向末端反復配列と、前記パッケージング細胞において組換えアデノウイルスの産生を導く相同組換えのために供給されるアダプタープラスミドと十分な重複を有する、核酸である。好適には、前記組換え核酸は、前記パッケージング細胞において発現するウイルス生成のために欠かせないＥ２Ｂ領域配列以外にＥ２Ｂ領域配列を有していない。好適には、前記組換え核酸はＥ３領域配列を有していない。好適には、前記十分な重複は約１０ ｂｐ〜約５０００ ｂｐである。好適には、前記十分な重複は、約２０００ｂｐ〜約３０００ｂｐである。好適には前記十分な重複は、ウイルス生成に欠かせないＥ２Ｂ領域配列から成る。
【００７２】
本発明はさらに、アダプタープラスミドを提供し、前記アダプタープラスミドは、
アデノウイルスをベースにする、あるいは該アデノウイルスに由来する核酸を有し、それが導入されるパッケージング細胞におけるＥ１領域配列と重複し、複製応答能を有するアデノウイルスの産生に導く、Ｅ１領域配列を有さず、不可欠なＥ２Ｂ配列以外にＥ２Ｂ領域配列を有さず、Ｅ２Ａ領域配列を有さず、Ｅ３領域配列を有さず、前記パッケージング細胞にインサートされる、あるいは前記パッケージング細胞に含まれる他の核酸と重複するＥ４領域配列を有さず、そして、操作可能な形態で、機能的逆方向末端反復配列と、機能的インキャプシデーションシグナルと、複製欠損組換えアデノウイルスにつながる前記他の核酸との相同組換えを許容する十分なアデノウイルスと、クローニングサイトあるいはマルチクローニングサイトを備えている。好適には、前記クローニングサイトあるいはマルチクローニングサイトはプロモーターに操作可能にリンクされる。好適には前記プロモーターは誘発性プロモーターである。好適には、前記プロモーターは、アデノウイルスＥ１遺伝子産物により抑制され、あるいはダウンモデュレーションされる。好適には、前記プロモーターはＡＰ１依存性プロモーターである。好適には、前記ＡＰ１依存性プロモーターはコラーゲナーゼ遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子、単核細胞化学誘因物質タンパク質遺伝子あるいはストロメライシン遺伝子に由来する。好適には、サンプル核酸のライブラリーは前記マルチクローニングサイトのなかに挿入される。
好適には、本発明の方法は自動化される。
【００７３】
実施例
（実施例１）
Ｅ１欠損組換えアデノウイルス・ベクターをトランス相補にできるセルラインの作製
９１１セルライン
Ｅ１欠失組換えアデノウイルスをトランス相補にすることのできるアデノウイルス５型のＥ１配列を宿すセルラインが作製された（Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７巻：２１５−２２２頁（１９９６年））。このセルラインを、Ａｄ５の番号８０−５７８８を含むｐＡｄ５ＸｈｏＩＣを用いたヒトニ倍体ヒト胚網膜芽細胞（ＨＥＲ）の形質移入によって得た。生じる形質転換体の内の１つは、９１１と称された。このセルラインは、Ｅ１欠損組換えアデノウイルスの増殖に有用であることが示された。それは、２９３細胞より優れていることが分かった。２９３細胞と異なり、９１１細胞は、アデノウイルス・パッケージングラインとしてより優れた作用をする原因で最もありそうな十分に形質転換した表現型を欠く：
プラークアッセイを、いっそう迅速に行う（２９３では８−１４日の代わりに４−５日）ことができ、９１１細胞の単層は、プラークアッセイのために必要とされるとおり寒天上塗り下でよりよく生存し、Ｅ１欠失ベクターの増幅が多くなる。
さらに、共有したアデノウイルスＤＮＡで形質移入された２９３細胞と異なり、規定された構築物を用いて９１１細胞を形質移入させた。９１１細胞の形質移入効率は、２９３のものに匹敵する。
【００７４】
新たなパッケージング構築物
アデノウイルス配列の源
アデノウイルス配列は、ヒトアデノウイルス５型（Ｂｅｒｎａｒｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２７巻：４５−５３頁（１９８３年））の番号８０〜９４６０を含むｐＡｄ５．ＳａｌＢから、または野生型Ａｄ５のＤＮＡから由来する。ＰＡｄ５．ＳａｌＢを、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化させ、そして大型断片を、再連結し、そしてこの新規クローンを、ｐＡｄ５．Ｘ／Ｓと名付けた。ｐＴＮ構築物（オランダ国、イントロジェンのＲ．Ｖｏｇｅｌｓ博士によって構築された）を、ヒトＰＧＫプロモーターおよびＮＥＯ遺伝子の源として使用した。
【００７５】
ヒトＰＧＫプロモーターおよびＮＥＯ遺伝子（ＮＥＯR  ｇｅｎｅ；商標名）
新規パッケージング構築物中のＥ１Ａ配列の転写は、骨格としてｐＵＣ１１９（Ｖｉｅｉｒａら、酵素学における方法、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、３〜１１頁（１９８７年））を使用するプラスミドｐＴＮ（Ｒ．Ｖｏｇｅｌｓの贈与）から誘導されるヒトＰＧＫプロモーター（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０巻：４７２−４７６頁（１９８３年）；Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍら、Ｇｅｎｅ  ３２巻：４０９−４１７頁（１９８４年））によって起動される。このプラスミドも、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリアデニル化シグナルに融合したＮＥＯ遺伝子の源として使用した。
【００７６】
ＰＧＫプロモーターのＥ１遺伝子への融合（図１）
Ａｄ５のＥ１遺伝子配列（ＩＴＲ、複製の起点およびパッケージングシグナル）を、異質配列に交換するために、プライマーＥａ１（配列番号：２７）およびＥａ２（配列番号：２８）を用いて、ＰＣＲによってＡｄ５のＥ１配列（番号４５９から番号９６０まで）を増幅した（表Ｉ参照）。生じたＰＣＲ産物を、ＣｌａＩで消化させ、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に連結し、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで予備消化させ、それにより構築物ｐＢＳ．ＰＣＲＩを得た。
【００７７】
ベクターｐＴＮを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（部分的に）およびＳｃａＩで消化し、そしてＰＧＫプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を、ＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＰＢＳ．ＰＣＲＩに連結させた。生じた構築物ＰＢＳ．ＰＧＫ．ＰＣＲＩは、Ａｄ５  Ｅ１配列の番号４５９から番号９１６までに操作的に連結されたヒトＰＧＫプロモーターを含む。
【００７８】
ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂの構築（図２）
ＰＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘは、ＰＧＫプロモーターの指向性下でＥ１ＡおよびＥ１Ｂコーディング配列を含む。Ａｄ５配列番号４５９から番号５７８８までが、この構築物中に存在する場合、アデノウイルスのｐＩＸタンパク質も、このプラスミドによってコード化される。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘは、ｐＡＴ−Ｘ／ＳのＳｃａＩ−ＢｓｐＥＩ断片を、ＰＢＳ．ＰＧＫ．ＰＣＲＩから得られる対応の断片（Ｅ１Ａ配列に連結したＰＧＫプロモーターを含む）に置換することによって作製した。
【００７９】
ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯの構築（図３）
完全なＥ１Ｂプロモーターを誘導し、そしてＥ１Ｂ  ２１ｋＤのＡＵＧコドンが、ＮＥＯ（ＮＥＯR；商標名）のＡＵＧコドンとして正確に機能するような手段でこのプロモーターを融合させるために、プライマーＥａ３（配列番号：２９）およびＥｐ２（配列番号３０）を使用して、Ｅ１Ｂプロモーターを増幅させた。ここで、プライマーＥｐ２は、ＰＣＲ断片にＮｃｏＩ部位を導入する。その結果生じる、ＰＣＲＩＩと称されるＰＣＲ断片を、ＨｐａＩおよびＮｃｏＩで消化させ、そしてｐＡＴ−Ｘ／Ｓに連結させ、そしてそれを、ＨｐａＩで、そしてＮｃｏＩで予備消化させた。生じるプラスミドを、ｐＡＴ−Ｘ／Ｓ−ＰＣＲ２と称した。ＮＥＯ遺伝子と部分的なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリアデニル化シグナルを含むｐＴＮのＮｃｏＩ−ＳｔｕＩ断片を、ＮｃｏＩおよびＮｒｕＩで消化されているｐＡＴ−Ｘ／Ｓ−ＰＣＲ２にクローニングした。生じる構築物は、ｐＡＴ−ＰＣＲ２−ＮＥＯであった。ポリアデニル化シグナルは、ｐＡＴ−ＰＣＲ２．ＮＥＯのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＴＮの対応の断片に置換することによって完了され、それによりｐＡＴ．ＰＣＲ２．ＮＥＯ．ｐ（Ａ）を生じた。ｐＡＴ．ＰＣＲ２．ＮＥＯ．ｐ（Ａ）のＳａｃＩ−ＸｂａＩを、Ｅ１Ａ遺伝子に連結したＰＧＫプロモーターを含んだｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−Ｘの対応の断片に置き換えた。生じる構築物を、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯと名付け、そしてそれゆえヒトＰＧＫプロモーターの制御下でＡｄ５Ｅ１配列（番号４５９から番号１７１３まで）を含む。
【００８０】
ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂの構築（図４）
ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコード化するＡｄ５の番号４５９から番号３５１０までを含む。Ｅ１Ｂ配列が、番号３５１１にあるスプライシングアクセプターで終止される。pＩＸ配列で、この構築物に存在するものはない。
ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂを、以下のとおり作製した。Ｅ１Ｂ  ５５ｋｄのＮ末端アミノ酸をコードする配列を、プライマーＥｂ１（配列番号：３１）、およびＸｈｏＩ部位を導入するＥｂ２（配列番号：３２）を用いて増幅させた。生じるＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩで消化させ、そしてｐＡＴ−Ｘ／ＳのＢｌＩＩ／ＮｒｕＩにクローニングさせ、それによりｐＡＴ−ＰＣＲ３を得た。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのＸｂａ−ＳａｌＩ断片、およびｐＡＴ．ＰＣＲ３のＸｂａＩ  ＸｈｏＩ断片の交換によって、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのＨＢＶポリ（Ａ）配列を、ｐＡＴ−ＰＣＲ３のＥ１Ｂ配列の下流に導入した。
【００８１】
ｐＩＧ．ＮＥＯの構築（図５）
この構築物は、樹立細胞を、Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ構築物に形質移入させ、そしてＮＥＯ選択を要求する場合の用途のものである。ＮＥＯ発現が、Ｅ１Ｂプロモーターによって指示されるので、ＮＥＯ耐性細胞が、同時発現することが予想される。Ｅ１Ａ、それは細胞の長期培養期間じゅうのＥ１Ａの発現を高いレベルに維持することに有益でもある。Ａｄ５  Ｅ１Ｂプロモーターの制御下でＮＥＯ遺伝子を含むｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのＨｐａＩ−ＳｃａＩ断片を、ＥｃｏＲＶおよびＳｃａＩで消化させたｐＢＳにクローニングすることによって、ｐＩＧ．ＮＥＯを作製した。
【００８２】
構築物の試験
構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．ＸおよびｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂの組込みを、制限酵素マッピングによって評価した。さらに、ＰＣＲ分析によって得られた構築物の一部を、配列分析によって確認した。ヌクレオチド配列における変化は、見られなかった。
構築物を、一次ＢＲＫ（仔ラット腎臓）細胞に形質移入し、そしてこれらの細胞を不死化する（ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯ）、または十分に形質転換する（ｐＡｄ５．ＸｈｏＩＣ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．ＸおよびｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ）それらの能力について試験した。６日齢のＷＡＧ−Ｒｉｊラットの腎臓を単離し、均質化し、そしてトリプシン消化した。ＢＲＫ細胞培養のサブコンフルーエント皿（直径５ｃｍ）を、１または５μｇのｐＩＧ．ＮＥＯ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ、ｐＩＧ／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ、ｐＡｄ５ＸｈｉＩＣで、またはＳＶ４０初期プロモーターの制御下でＡｄ５．Ｅ１Ｂ遺伝子を担持するＰＤＣ２６（Ｅｌｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２８巻：３７７−３９０頁（１９８３年））と一緒にｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯで形質移入させた。発生点が見える形質移入の３週後、皿を固定し、ギムサ染色し、そして発生点を計数した。
【００８３】
作製アデノウイルスパッケージング構築物の概観、およびＢＲＫを形質転換するそれらの能力が、図６に表される。結果では、構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢおよびｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘが、用量依存手法で、ＢＲＫ細胞を形質転換することができることが示される。形質転換の効率は、両方の構築物に類似し、そして９１１細胞、特にｐＡｄ５．ＸｈｏＩＣを作製するのに使用された構築物で見られるものに匹敵する。
予想されるとおり、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯは、ほとんどＢＲＫを不死化することはできなかった。しかし、Ｅ１Ｂ発現構築物（ＰＤＣ２６）の同時形質移入は、形質転換体の数の明らかな増加を起し（１８対１）、それにより、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯによってコードされたＥ１Ａが機能性があることが示された。したがって、我々は、新たに作製されたパッケージング構築物が、新規アデノウイルスパッケージングラインの作成に適していると結論づけた。
【００８４】
新規パッケージング構築物セルラインを用いたセルラインの作製および細胞培養
ヒトＡ５４９気管支癌腫細胞（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５３０巻：１９７〜２０７頁（１９７８年）、ヒト胎児網膜芽細胞（ＨＥＲ）、Ａｄ５−Ｅ１−形質転換ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（２９３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６巻：５９〜７２頁（１９７７年）およびＡｄ５−形質転換ＨＥＲ細胞（９１１；Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７巻：２１５−２２２頁（１９９６年））およびＰＥＲ細胞を、３７℃で、５％のＣＯ2雰囲気下で１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）および抗生物質で補足したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で育成した。細胞培養培地、試薬および血清は、ジブコ・ラボラトリーズ（ニューヨーク州、グランド・アイランド）から購入した。培養用可塑物は、グレニエール（Ｇｒｅｉｎｅｒ）（ドイツ国ノッティンゲン（Ｎ，ｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））およびコーニング（ニューヨーク州コーニング）から購入した。
【００８５】
ウイルスおよびウイルス技術
組換えアデノウイルスベクターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃ、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫの構築は、欧州特許出願第９５２０２２１３号に詳細に記述されている。組換えアデノウイルスベクターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｎｌｓ．ｌａｃＺは、Ａｄ２主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の存在下で、β−ガラクトシダーゼをコードするイー．コリｌａｚＺ遺伝子を含み、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ｌｕｃは、Ａｄ２  ＭＬＰによって起動されるホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含み、そしてアデノウイルスベクターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫは、それぞれ、Ａｄ２  ＭＬＰおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーターの制御下で単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含む。
【００８６】
形質移入
製造業者のプロトコルにしたがって、ジブコ・カルシウム・リン酸形質移入システム（ジブコ・ビーアールエル・ライフ・テクノロジーズ・インク．、米国カイザースバーグ）を用いて、カルシウム−リン酸沈殿ＤＮＡ（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６−４６７頁（１９７３年））によって全ての形質移入を行った。
【００８７】
ウエスタン・ブロッティング
急激に成長する２９３、９１１およびＡｄ５−Ｅ１−形質転換Ａ５４９およびＰＥＲ細胞のサブコンフルーエント培養物を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＦｏｓ−ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０，０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１％  ＮＡ−ＤＯＣ、０，５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、０，５ｍＭトリプシン阻害剤、５０ｍＭ  ＮａＦおよび１ｍＭナトリウムバナデート）に掻き寄せた。室温で１０分後、溶解液を、遠心分離によって透明にした。バイオラッド・タンパク質アッセイキッドを用いてタンパク濃度を測定し、そして２５μｇの総細胞タンパク質を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＡゲルに掛けた。電気泳動後、タンパク質を、ニトロセルロース上に移した（３００ｍＡで１時間）。予め染色した標準（シグマ、米国）を、平行に起動させた。フィルターを、１時間、ＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％ツイーン−２０）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で遮断した。一次抗体は、マウスのモノクローナル抗Ａｄ５−Ｅ１Ｂ−５５−ｋＤＡ抗体Ａ１Ｃ６（Ｚａｎｔｅｍａら、未出版）、ラットのモノクローナル抗Ａｄ５−Ｅ１Ｂ−２２１−ｋＤａ抗体Ｃ１Ｇ１１（Ｚａｎｔｅｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４２巻：４４−５８頁（１９８５年））であった。二次抗体は、西洋ワザビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（プロメガ）であった。シグナルは、増強ケモルミネッセンス（アマシャム・コープ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）、英国）によって可視化された。
【００８８】
サザン・ブロット分析
高分子量ＤＮＡを単離し、そして１０μｇを、完全に消化させ、そして０．７％アガロースゲルで分画した。０．４ＭのＮＡＯＨ、０．６ＭのＮａＣｌ転移溶液（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８４年）を用いて、ハイボンドＮ+（アマシャム、英国）へのサザン・ブロットの転移を行った。ｐＡｄ５．ＳａｌＢから得られる２４６３−ｎｔ  ＳｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｂｅｒｎａｒｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２７巻：４５−５３頁（１９８３年））を用いてハイブリダイゼーションを行った。この断片は、Ａｄ５ｂｐ．  ３４２〜２８０５から構成される。ランダム・ヘキサヌクレオチド・プライマーおよびクレノーＤＮＡポリメラーゼを使用して、α32p＝ｄＣＴＰで断片を、放射性標識した。サザン・ブロットを、−８０℃で、コダックＸＡＲ−５フィルムに、そしてビー・アンド・エル・システムズ・モレキュラー・ダイナミックス・ソフトウエアによって分析されるホスホ−イメージャー・スクリーンにさらした。
【００８９】
Ａ５４９
Ａｄ５−Ｅ１−形質転換Ａ５４９ヒト気管支癌腫セルラインを、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯで形質移入させ、そしてＧ４１８耐性について選択することによって、作製した。３１個のＧ４１８耐性クローンを樹立した。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂと、ｐＩＧ．ＮＥＯとの同時形質移入は、７個のＧ４１８耐性セルラインを生じた。
【００９０】
ＰＥＲ
Ａｄ５−Ｅ１−形質転換ヒト胎児網膜（ＨＥＲ）細胞を、プラスミドｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂを用いた一次ＨＥＲ細胞の形質移入によって作製した。形質転換セルラインは、十分に分離した発生点から樹立された。我々は、ＰＥＲ．Ｃ１、ＰＥＲ．Ｃ３、ＰＥＲ．Ｃ４、ＰＥＲ．Ｃ５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ８およびＰＥＲ．Ｃ９と称する７つのクローナルセルラインを樹立できた。ＰＥＲクローンの内の１つ、特にＰＥＲ．Ｃ６は、番号９６０２２９４０号の下にＥＣＡＣＣに寄託された。
【００９１】
形質転換Ａ５４９およびＰＥＲ細胞でのＡｄ５  Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の発現
樹立したＡ５４９およびＰＥＲ細胞におけるＡｄ５  Ｅ１Ａおよび５５−ｋＤａおよび２１ｋＤａのＥ１Ｂタンパク質の発現は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用によるウエスタン・ブロッティングの手段によって調査された。ｍＡｂ  Ｍ７３は、Ｅ１Ａ産生物を認識する一方で、ＭａｂのＡＩＣ６およびＣｌＧ１１は、それぞれ５５−ｋＤａおよび２１ｋＤａのＥ１Ｂタンパク質に向けられる。抗体は、親株のＡ５４９または一次ＨＥＲ細胞からの抽出物中のタンパク質を認識しなかった（データは示されず）。ｐＩＧ．ＮＥＯおよびｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂの同時形質移入によって作製されたＡ５４９クローンで、検出可能なレベルのＥ１ＡまたはＥ１Ｂタンパク質を発現したものはなかった（図示せず）。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯで形質移入されて作製されたＡ５４９クローンの内のいくつかは、Ａｄ５  Ｅ１Ａタンパク質を発現した（図７）が、そのレベルは、２９３細胞から得られるタンパク質溶解液で検出されるものよりかなり低かった。ＲＥＲ細胞から得られるタンパク質抽出物で検出される安定な状態のＥ１Ａレベルは、Ａ５４９由来の細胞から得られる抽出物で検出されるものよりかなり高かった。全てのＰＥＲセルラインは、同様のレベルのＥ１Ａタンパク質を発現した（図７）。Ｅ１Ｂタンパク質の発現、特にＥ１Ｂ  ５５  ｋＤａの場合には、いっそう変動する。９１１および２９３に比較すると、ＰＥＲクローンの大半は、高いレベルのＥ１Ｂ  ５５  ｋＤａおよび２  ｋＤａを発現する。安定な状態のＥ１Ｂ  ２１  ｋＤａのレベルは、ＰＥＲ．Ｃ３で最高であった。ＰＥＲクローンで、細胞の一連の継代でＡｄ５  Ｅ１遺伝子の発現を失ったものはなかった（図示せず）。ＰＥＲ細胞中でのＥ１発現のレベルは、少なくとも１００の集団倍加について安定性を維持することが分かった。我々は、いっそう詳細にＰＥＲクローンを特徴づけることを決断した。
【００９２】
ＰＥＲクローンのサザン分析
ＰＥＲクローンでのＡｄ５−Ｅ１コード化配列の配置を調べるために、サザン分析を行った。細胞性ＤＮＡを、全ＰＥＲクローンから、そして２９３および９１１細胞から抽出させた。そのＤＮＡを、Ａｄ５  Ｅ１領域で一度切るＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。放射性標識Ａｄ５−Ｅ１−特異的プローブを用いた、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＤＮＡにおけるサザンハイブリダイゼーションでは、ＰＥＲクローンのゲノム中にｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂのいくつかの組込みコピーの存在が示された。図８は、異なるＰＥＲセルラインの高い分子量のＤＮＡでのＥ１配列の分布パターンを示す。コピーを、単独バンドで濃縮し、そしてそれは、タンデム反復しとして組込まれることを示唆する。ＰＥＲ．Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６およびＣ９の場合に、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂの切断したコピーの存在を示す低分子量の別のハイブリダイゼーションバンドを知見した。コピーの数を、ホスホイメージャーを使用して測定した。我々は、ＰＥＲ．Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８およびＣ９が、それぞれ、Ａｄ５  Ｅ１コーディング領域の２、８８、５、４、５、５および３コピーを含むこと、および９１１および２９３細胞が、それぞれ、Ａｄ５  Ｅ１配列の１および４コピーを含むと概算した。
【００９３】
形質移入効率
組換えアデノベクターを、２９３細胞へのアダプター・プラスミドおよびＡｄ５の大型ＣｌａＩ断片の同時形質移入によって作製する（欧州出願第９５２０２２１３号）。組換えウイルスＤＮＡは、プラスミドおよびアデノウイルスＤＮＡに存在する相同ウイルスの配列の間で相同組換えによって形成される。選択的攻略法のものと同様に、この方法の効力は、ヘルパー細胞の形質移入性におおいに依存する。したがって、我々は、レセプターとしてイー．コリβ−ガラクトシダーゼ・コード化ｌａｃＺ遺伝子を用いて、ＰＥＲクローンの内のいくつの形質移入効率を、９１１細胞と比較した（図９）。
【００９４】
組換えアデノウイルスの産生
２９３、９１１、ＰＥＲ．Ｃ３、ＰＥＲ．Ｃ５およびＰＥＲ．Ｃ６に様々なアデノウイルス・ベクターを接種した後に得られる組換えアデノウイルスの収量は、表ＩＩに表される。
結果は、ＰＥＲ細胞で得られた組換えアデノウイルス・ベクターの収量が、少なくとも、現存のセルラインで得られるものと同じくらい高いことを示す。さらに、新規アデノウイルス・ベクターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫの収量が、試験された全てのセルラインにおける他のウイルスベクターについて得られた収量に類似であるか、またはそれより高い。
【００９５】
新規アデノウイルス・ベクターの作製（図１０）
使用される組換えアデノウイルス・ベクター（欧州特許出願第９５２０２２１３号参照）を、Ｅ１配列４５９からｎｔ．３３２８までについて欠失させる。構築物ｐＥ１Ａ．Ｅ１Ｂが、Ａｄ５配列４５９からｎｔ．３５１０までを含むとき、パッケージング構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂと、例えばＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．ＴＫのような組換えアデノウイルスにあるＥ１Ｂ配列の間に１８３ｎｔ．の配列重複がある。重複配列が、新たなアデノウイルス・ベクターから欠失された。さらに、元の構築物に存在するｌａｃＺから誘導される非コーディング配列も、同様に欠失された。これは、プライマーＳＶ４０−１（配列番号：３３）（ＢａｍＨＩ部位を導入する）およびＳＶ４０−２（配列番号：３４）（ＢｇｌＩＩ部位を導入する）を用いて、ｐＭＬＰ．ＴＫから得られるＳＶ４０ポリ（Ａ）配列のＰＣＲ増幅によって達成された（図１０）。さらに、この構築物に存在するＡｄ５配列を、ｎｔ．２４９６（Ａｄ５、ＢｇｌＩＩ部位を導入する）からｎｔ．２７７９（Ａｄ５−２）までを増幅させた。両方のＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩで消化させ、そして連結させた。連結産物を、プライマーＳＶ４０−１およびＡｄ５−２（配列番号：３６）を用いてＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで切断し、そして同じ酵素で予め消化させたｐＭＬＰ．ＴＫに連結した。ｐＭＬＰＩ．ＴＫと称される生じた構築物は、ｎｔ．４５９からｎｔ．３５１０までのアデノウイルスＥ１配列での欠失を含む。
【００９６】
パッケージング・システム
なんら配列重複を有しない、新規パッケージング構築物ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂと、組換えアデノウイルスｐＭＬＰＩ．ＴＫとの組合せは、図１１に表される。この図で、配列重複が示される元の状態も、表される。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１ＢおよびｐＭＬＰＩ．ＴＫの間の重複配列の不在（図１１ａ）は、パッケージング構築物と組換えウイルスとの間の相同組換えの可能性を排除し、したがって、元の状況と比較すると組換えアデノウイルスの産生についての明らかな改善である。
図１１ｂでは、その状況は、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯおよびＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫについて描写される。樹立細胞への形質移入された場合、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯは、Ｅ１欠失組換えアデノウイルスの増殖を支持するのに十分であることが予想される。この組合せは、なんら配列重複を有せず、それにより、相同組換えによるＲＣＡの産生を予防する。さらに、この従来のパッケージング・システムは、Ｅ１Ａ配列のみについて欠失させて、そしてＥ１Ｂ配列については欠失されていない組換えアデノウイルスの増殖を可能にする。
Ｅ１Ａの不在下でＥ１Ｂを発現する組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂタンパク質と同様に活発であり、特に、Ｅ１Ｂ１９ｋＤは、感染ヒト細胞を、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）による溶解から守ることができる（Ｇｏｏｄｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５巻：３０８３−３０９４頁（１９９１年））。
【００９７】
ｐＭＬＰＩ．ＴＫから誘導される組換えアデノウイルスの作製
組換えアデノウイルスを、ＳａｌＩ線状化ｐＭＬＰＩ．ＴＫ  ＤＮＡおよびＣｌａＩ線状化Ａｄ５  ｗｔ  ＤＮＡを用いた２９３細胞の同時形質移入によって作製した。その手段は、図１２に図式で表される。
【００９８】
（実施例２）
組換えアデノウイルス・ベクターの高速ＲＣＡ不含生成についてのプラスミド基本システム
アデノウイルス・クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１２２）の構築
ＩＴＲ配列の平滑末端クローニングを促進するために、野生型ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡを、過剰のｄＮＴＰの存在下でクレノー酵素で処理した。クレノー酵素の不活性化およびフェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈降させることによる精製の後、ＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ製品を、以下のとおり製造されたｐＢｒ３２２由来ベクターＤＮＡとの連結反応でさらに精製することなしに使用した。ｐＢｒ３２２ＤＮＡを、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＴＳＡＰ酵素（ライフ・テクノロジーズ）で処理することによって脱リン酸化し、そしてＬＭＰアガロースゲル（シープラーク・ジーティージー（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ））上で精製した。コンピテント・イー．コリＤＨ５ａ（ライフ・テクノ）への形質転換およびアンピシリン耐性コロニーの分析の後、Ａｄ５にあるＢａｍＨＩ部位から、右側ＩＴＲまで伸長する挿入物ついて予想されるとおりの消化パターンを示す１つのクローンを選択した。右側ＩＴＲにあるクローニング境界の配列分析では、ＩＴＲの最も３’のＧ残渣が失われたことが示され、そのＩＴＲの残りは、正しいことが分かった。上記の失われたＧ残渣は、複製の間、他のＩＴＲによって相補される。
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１９号）
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。アデノウイルス挿入物を含むベクター断片を、ＬＭＰアガロース（シープラーク・ジーティージー）で単離し、そしてｗｔ  Ａｄ５  ＤＮＡから得られた４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結し、そしてジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１，インク．）で精製した。１つのクローンを選択し、そしてＡｄ５配列の組込みを、制限酵素分析によって決定した。クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲは、１６７４６ｂｐにあるＳａｌＩ部位から、ｒＩＴＲ（最も３’のＧ残渣を欠く）まで、そしてそれを含むアデノ５型配列を含む。
【００９９】
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１７号）
ｗｔアデノ５型ＤＮＡを、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして２０．６ｋｂ断片を、電気溶離によってゲルから単離した。ｐＢｒ３２２を、同じ酵素で消化し、そして、ジーンクリーンによってアガロースゲルから精製した。両方の断片を連結し、そしてコンピテントＤＨ５αに形質転換させた。生じたクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを、制限酵素消化によって分析し、そしてｂｐ９１９から２１５６６までのアデノウイルス配列を有する挿入物を含むことが示された。
ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１４号）
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを、ＥｃｏＲＩ（ｐＢｒ３２２中）で線状にし、そしてＡｆｌＩＩで部分的に消化した。６５℃で、２０分間、ＡｆｌＩＩの加熱不活性化の後、断片末端を、クレノー酵素で満たした。その後、ＤＮＡを、ＰａｃＩ部位（５’−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡ−３’）（配列番号：１）を含む平滑二本鎖オリゴリンカーに連結した。このリンカーを、以下の２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ−３’（配列番号：２）および５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：３）をアニーリングすることによって作製し、続いて、クレノー酵素で平滑にした。連結ＤＮＡを沈殿させて、緩衝液を交換した後、連結物を、過剰のＰａｃＩ酵素で消化して、オリゴのコンカテマーを除去した。３５３４ｂｐから２１５６６までのＡｄ５配列およびベクター配列を含む２２０１６ｂｐ部分断片を、ＬＭＰアガロース（シープラーク・ジーティージー）中で単離させ、再連結し、そしてコンピテントＤＨ５αに形質転換させた。ＰａｃＩ部位を含むことが分かり、そして大型アデノ断片を保持した１つのクローンを選択し、そして（失われた）ＡｆｌＩＩ部位にあるＰａｃＩリンカーの順行挿入を確認する５’末端で配列決定した。
【０１００】
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ番号２（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１２０号）およびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ番号８（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１２１号）
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲにあるＡｄ５のＩＴＲのそばにＰａｃＩ部位を挿入させるために、約１９０ヌクレオチドを、ｐＢｒ３２２骨格中のＣｌａＩ部位と、ＩＴＲ配列の出発点の間から除去した。これは、以下のとおり行われた。ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲを、ＣｌａＩで消化し、そして可変の時間の長さ（２分、５分、１０分および１５分）、ヌクレオチドＢａｌ３１で処理した。ヌクレオチド除去の程度は、同一の緩衝液および条件を用いて、ｐＢｒ３２２ＤＮＡ（ＣｌａＩ部位でも消化された）上で分離反応を続けた。Ｂａｌ３１酵素を、１０分間、７５℃でのインキュベーションにより不活性化させ、ＤＮＡを沈殿させ、そして少量のＴＥ緩衝液に再懸濁させた。平滑末端を確保するために、ＤＮＡを、さらに過剰のｄＮＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ＳａｌＩを用いた（対照）ｐＢｒ３２２ＤＮＡの消化後、１０分または１５分間、処理されたサンプル中に満足な分解（〜１５０ｂｐ）が観察された。１０分または１５分処理されたｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲサンプルを、その後、上述の平滑ＰａｃＩリンカー（ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ参照）に連結した。沈殿によって連結物を精製し、過剰のＰａｃＩで消化し、そしてＬＭＰアガロースゲル上でリンカーから分離した。再連結後、ＤＮＡを、コンピテントＤＨ５αに形質転換させ、そしてコロニーを分析した。およそ所望の長さの欠失を示す１０個のコロニーを、選択し、そしてさらにこれらを、Ｔトラック配列決定（Ｔ７配列決定キット、ファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））によって分析した。２つのコロニーが、ｒＩＴＲのちょうど下流に挿入されたＰａｃＩリンカーを有することが分かった。ＰａｃＩでの消化の後、クローン番号２は、２８ｂｐを有し、そしてクローン番号８は、ＩＴＲに粘着した２７ｂｐを有する。
【０１０１】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１６号）
コスミドベクターｐＷＥ１５（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、大型Ａｄ５挿入物をクローン化した。第一に、特徴的なＰａｃＩ部位を含むリンカーを、ｐＷＥ１５のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それによりｐＷＥ．ｐａｃが作製された。このために、ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩについて記述されるとおり二本鎖ＰａｃＩオリゴを使用したが、ここで、そのＥｃｏＲＩ突出末端を有する。その後、以下の断片：ＰａｃＩで消化されたｐＷＥ．ｐａｃ、ＰａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＢｒ／ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ、およびＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化されたｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ番号２を、アガロースゲルから電気溶離によって単離した。これらの断片を、一緒に連結させ、そして製造業者のプロトコルによって、λファージパッケージング抽出物（ストラタジーン）を使用して封入した。宿主細菌への感染の後、コロニーを、平板上に載せ、そして完全挿入物の存在について分析した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲは、３５３４ｂｐ（ＡｆｌＩＩ部位）から右側ＩＴＲ（最も３’Ｇ残渣を欠く）まで、そしてそれを含む全てのアデノウイルス５型配列を含む。
アデノ５ｗｔＤＮＡを、過剰のｄＮＴＰの存在下でクレノー酵素で処理し、そして続いてＳａｌＩで消化した。それぞれ、左側ＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）およびＳａｌ（１６．７）−右側ＩＴＲと称される、生じた断片の内の２つを、ＬＭＰアガロース（シープラーク・ジーティージー）で単離した。ｐＢｒ３２２ＤＮＡを、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで消化し、そしてホスファターゼ（ライフ・テクノロジーズ）で処理した。ベクター断片を、ジーンクリーン法（バイオ１０１，インク．）を使用して単離し、そしてＡｄ５  ＳａｌＩ断片に連結した。９．４ｋｂ断片との連結のみが、挿入物を有するコロニーを供した。コロニー境界の分析および配列決定の後、全長ＩＴＲ配列を含み、そして９４６２ｂｐでＳａｌＩ部位まで伸長するクローンを選択した。
【０１０２】
ｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（１６．７）（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１８号）
ｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）を、ＳａｌＩで消化し、そして脱リン酸化（ＴＳＡＰ、ライフ・テクノロジーズ）した。このクローンを、Ａｄ５にある第三のＳａｌＩ部位まで伸長するために、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを、ＢａｍＨＩで線状にし、そしてＳａｌＩで部分的に消化した。９４６２−１６７４６までのアデノウイルス配列を含む７．３ｋｂ  ＳａｌＩ断片を、ＬＭＰアガロースゲルで単離し、そしてＳａｌＩ消化したｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）ベクター断片に連結させた。
【０１０３】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ
ｐＷＥ．ｐａｃを、ＣｌａＩで消化し、そして５’突出末端を、クレノー酵素を用いて充填した。その後、ＤＮＡを、ＰａｃＩで消化し、そしてアガロースゲルから単離した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲを、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてクレノー酵素で処理した後、ＰａｃＩで消化した。アデノウイルス配列を含む大型２４ｋｂ断片を、アガロースゲルから単離し、そしてクローンテックから得たライゲーション・エクスプレス（商標名）キットを用いて、ＣｌａＩ消化および平滑ｐＷＥ．ｐａｃベクターに連結した。ストラタジーンから得たウルトラコンピテントＸＬ１０−金細胞の形質転換の後、予想される挿入物を含むクローンを、同定した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩは、３５３４−２７３３６ｂｐから得られるＡｄ５配列を含む。
【０１０４】
新規アダプタープラスミドの構築
パッケージングセルライン中の組換えアデノウイルスとＥ１配列との間の配列重複の不在は、新規組換えウイルスの安全なＲＣＡ不含生成、および増殖に必須である。アダプタープラスミドｐＭＬＰＩ．ＴＫ（図１０）は、本発明の改善されたパッケージング・セルラインとの組合せで、本発明による使用のために設計されたアダプタープラスミドの例である。このプラスミドは、出発材料として使用されて、特異的プロモーターおよび遺伝子配列を含む核酸分子が、容易に交換されうる新たなベクターを作製した。
第一に、ＰＣＲ断片を、以下のプライマー：ＬＴＲ−１：５’−ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＴＧ−３’（配列番号：４）およびＬＴＲ−２：５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  Ｇ−３’（配列番号：５）を用いてｐＺｉｐΔＭｏ＋ＰｙＦ１０１（Ｎ-）テンプレートＤＮＡ（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００１９５で記述される）から作製した。Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、以下の温度サイクルで、製造業者のプロトコルに従って使用した。すなわち、１回、５分間９５℃で；３分間５５℃で；そして１分間７２℃で、そして１分間９５℃で、１分間６０℃で、１分間７２℃での３０サイクル、続いて、１回、１０分間７２℃で使用した。その後、ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＬＰ１０（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１巻：１９５−２０２頁（１９９１年））ベクターに連結し、それによりベクターｐＬＴＲ１０を生成した。このベクターは、１ｂｐから４５４ｂｐまでのアデノウイルス配列、続いて野生型エンハンサー配列が、突然変異ポリオーマウイルス（ＰｙＦ１０１）から得たエンハンサーに交換されているＭｏ−ＭｕＬＶ  ＬＴＲの一部を包含するプロモーターを含む。プロモーター断片は、Ｌ４２０と称された。
次に、ネズミＨＳＡ遺伝子のコーディング領域を挿入した。ｐＬＴＲ１０を、ＢｓｔＢＩで消化し、続いてクレノー処理し、そしてＮｃｏＩで消化した。ＨＳＡ遺伝子を、以下のプライマー：ＨＳＡ１、５’−ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号：６）およびＨＳＡ２、５’−ＧＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＡＡ−３’（配列番号：７）を使用して、ｐＵＣ１８−ＨＳＡ（Ｋａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４５巻：１９５２−１９５９頁（１９９０年））上でのＰＣＲ増幅によって得た。２６９ｂｐ増幅断片を、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いて、シャトルベクターにサブクローニングした。配列決定は、ＨＳＡ遺伝子の順行コーディング配列の組込みを確認したが、ＴＡＧ終止コドンに直接続く余剰ＴＡＧ挿入物を有した。その後、ＴＡＧ複写を含むＨＳＡ遺伝子のコーディング領域を、ＮｃｏＩ（粘着）−ＳａｌＩ（平滑）断片として削除し、そしてｐＬＴＲ１０から得た３．５ｋｂ  ＮｃｏＩ（粘着）／ＢｓｔＢＩ（平滑）断片にクローニングし、それによりｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０を生じた。
最後に、左側ＩＴＲ、パッケージング・シグナル、Ｌ４２０プロモーターおよびＨＳＡ遺伝子を含む断片が、同じ酵素で消化されたベクターｐＭＬＰＩ．ＴＫに挿入され、それによりプロモーターおよび遺伝子配列を置換した後、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。これは、プロモーターおよび遺伝子配列の周囲に種々の制限酵素についての都合のよい認識部位を含む新たなアダプター・プラスミドｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ（図１９）を生じた。ＳｎａＢＩおよびＡｖｒＩＩは、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩと組合せて、プロモーター配列を交換することができる一方で、後者の部位は、ＨＳＡコーディング領域かれ得られるＣｌａＩまたはＢａｍＨＩ３’部位と組合せて、この構築物中の遺伝子を置換することができる。
ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ中のプロモーター、遺伝子およびポリＡ配列を、ＣＭＶプロモーター、多クローニング部位、イントロンおよびポリ−Ａシグナルに置換することによって、核酸分子の交換を容易にさせるように設計された別のアダプター・プラスミドを、作製した。この目的のために、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡを、ＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、続いてクレノーで処理して、平滑末端を得た。ｐＢｒ３２２ベクターおよびアデノウイルス配列を有する５．１ｋｂ断片を単離し、そしてＨｈａＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって得られるｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ（インビトロゲン）から得られる平滑１５７０ｂｐ断片に連結した。このアダプター・プラスミドは、ｐＣＬＩＰと名付けられた（図２０）。
【０１０５】
組換えアデノウイルスの作製
ｗｔ  Ｅ３配列を有するＥ１−欠失組換えアデノウイルス
新たなプラスミド基本システムでＥ１−欠失組換えアデノウイルスを作製するために、以下の構築物を、作成した。重複アデノウイルスゲノム断片の３’部位で切断する制限酵素で線状にした目的の遺伝子を有する発現カセットを含み、好ましくはなんらｐＢｒ３２２ベクター配列を含まないアダプター構築物；ＰａｃＩで消化した相補的アデノウイルスゲノム構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ。
さらに、これらの２つのＤＮＡ分子を、フェノール／クロロホルム抽出およびＥｔＯＨ沈殿によって精製する。アデノウイルス・パッケージング・セルライン、好ましくは本発明によるセルラインにこれらのプラスミドを形質移入させて、アダプターと、相補的構築物（図２１）との間の１段階の相同組換えによって、組換え体複製欠失アデノウイルスを作製した。選択股として、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲの代わりに、他の断片、例えばＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを使用できるか、またはＰａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩを、ＳａｌＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲと組合わせることができる。この場合に、３つのプラスミドを組合せ、そして２つの相同組換えが、組換え体アデノウイルスを得るのに必要とされる（図２２）。当業者は、本発明から逸脱することなしに、アダプターおよび相補的プラスミドの他の組合せを使用しうると解釈されるべきである。
以下に概説される一般のプロトコルおよび本発明の限定されない例としての手段が、種々のアダプター・プラスミドおよびＡｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ断片を用いて数種の組換えアデノウイルスを産生するために行われた。アデノウイルスのパッケージング・セル（ＰＥＲ．Ｃ６）を、〜２５ｃｍ2のフラスコに蒔き、そしてそれらが、〜８０％集密度にある次の日に、製造業者によって記述されるとおりＤＮＡおよびリポフェクタミン剤（ライフ・テクノ）の混合物に形質移入させた。日常的に、４０μｌリポフェクタミン、４μｇアダプター・プラスミドおよび４μｇの相補的アデノウイルスゲノム断片ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（または二重相同組換えについては２μｇの全ての３つのプラスミド）を使用した。これらの条件下で、ｐＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺアダプターを用いた対照形質移入で測定されるとおり、〜５０％（形質移入後４８時間）の一過性形質移入効率が得られた。２日後、細胞を、〜８０ｃｍ2フラスコに継代し、そしてさらに培養した。およそ５日（単独の相同組換えのため）から１１日（二重相同組換えのため）後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られ、それにより、機能性アデノウイルスが形成したことが示された。細胞および培地を、全ＣＰＥで回収し、そして組換えウイルスを、凍結−解凍によって放出する。当初の段階で、力価が、全ＣＰＥの発生にもかかわらず可変性であることが分かったので収量を増加するために、８０ｃｍ2フラスコでの余剰の増幅段階を、日常的に行った。増幅後、ウイルスを回収し、そしてプラークを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で精製した。個々のプラークを、活性移入遺伝子を有するウイルスについて試験した。
ヒト・インターロイキン−３遺伝子（図１参照、ＷＯ８８／０４６９１）、ヒト内皮硝酸遺伝子（Ｊａｎｓｓｅｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：１４５１９−１４５２２頁（１９９２年））、Ｔｃ１Ａトランスポサーゼ遺伝子（Ｖｏｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７巻：１２４４−１２５３頁（１９９３年））、または細菌ＬａｃＺ遺伝子（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３９巻：４９９−５０９頁（１９８４年））を含む４つの異なる組換えアデノウイルスが、このプロトコルを使用して生成された。全ての場合に、機能性アデノウイルスを形成し、そして全単離プラークは、活性移入遺伝子を有するウイルスを含んだ。
【０１０６】
Ｅ３またはＥ４領域中の修飾を伴うＥ１−欠失組換えアデノウイルス
Ｅ１領域中の置換を別として、Ｅ３機能が、組換えウイルスの複製、パッケージングおよび感染のために必要でないので、アデノウイルス中のＥ３領域を欠失するか、またはＥ３領域の一部を置換することが可能である。これは、最大封入可能サイズ（ｗｔゲノム長のおよそ１０５％）を超えることなしに、大型挿入物を使用するか、または１つ以上の遺伝子を挿入する機会を作り出す。これは、例えば、ＸｂａＩで消化し、そして再連結することによってｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲクローン中のＥ３領域の一部を欠失させることによって行うことができる。これは、全ての公知Ｅ３コーディング領域を含むＡｄ５ｗｔ配列２８５９２−３０４７０を除去する。別の例は、新たな配列の挿入をさせるポリリンカーを有するＥ３領域中のｇｐ１９Ｋのコーディング領域の厳密な置換である。これは、全ての他の無傷のコーディング領域を残し、移入遺伝子が、Ｅ３プロモーターおよびｐＡ配列によって起動されるので異質プロモーターについての必要を回避し、それによりコーディング配列のための空間をいっそう残し、そして少なくとも、対照Ｅ１置換ベクターでと同じくらいよく非常に高い移入遺伝子発現を生じる。
この末端に、Ｅ３領域の５’部分を含むｗｔ  Ａｄ５から得られる２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ-）（ストラタジーン）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。次に、ポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩを用いた消化によって除去し、続いて再連結させた。生じるクローンｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩを、ｇｐ１９Ｋコーディング領域を欠失するのに使用した。プライマー１（５’−ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＡＧＧＣＧＣＡ−３’）（配列番号：８）および２（５’−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＧ−３’）（配列番号：９）を使用して、ｗｔ  Ａｄ５  ＤＮＡ中の配列２８５１１に対応するｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩから２８７３４まで配列を増幅した。プライマー３（５’−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＡ−３’）（配列番号：１０）および４（５’−ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  Ｇ−３’）（配列番号：１１）を同じＤＮＡ上に使用して、Ａｄ５配列２９２１７から２９４７６までを増幅した。２つの生じたＰＣＲ断片を、新たに導入されたＮｃｏＩ部位に基づいて一緒に連結し、そしてＸｂａＩおよびＭｕｎＩで消化した。その後、この断片を、ＸｂａＩおよびＭｕｎＩで部分的に消化されたｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩベクターに連結し、それによりｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋを生じた。
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位への外来遺伝子の挿入を可能にするために、ＸｂａＩ欠失を、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋ中で行い、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー中のＢａｍＨＩ部位を除去した。生じたプラスミドｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩΔｇｐ１９ＫΔＸｂａＩは、Ａｄ５中で配列２８７３３（ＨｉｎｄＩＩＩ）および２９２１８（ＢａｍＨＩ）に対応する特徴的なＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む。これらの部位への外来遺伝子の導入の後、欠失ＸｂａＩ断片を、再導入するか、または挿入物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよび、例えばＭｕｎＩを用いてｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩΔｇｐ１９Ｋに再クローン化するかのいずれかである。この手段を使用して、我々は、ＨＳＶ−ＴＫ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．８巻：５９４９〜５９６４頁（１９８０年）およびＶｉｎｃｅｎｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１９７〜２０５頁（１９９６年））、ｈＩＬ−１α（Ｅｓａｎｄｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：ｘｘｘ−ｙｙｙ（１９９８年））、ラットＩＬ−３β（Ｅｓａｎｄｉら、Ｇｅｎｅ  １１２４２：ｘｘｘ−ｙｙｙ（１９９８年））、ルシフェラーゼ（ＤｅＷｉｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７巻：７２５〜７３７頁（１９８７年））またはＬａｃＺを発現するプラスミドを作製した。ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Ｄｇｐ１９Ｋプラスミド中の特徴的なＳｒｆＩおよびＮｏｔＩ部位（目的の挿入遺伝子を有するか、または有しない）を使用して、目的の遺伝子を含む領域を、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲの対応の領域に移行させ、それにより構築物ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲＤｇｐ１９Ｋ（目的の挿入遺伝子を有するか、または有しない）を生じる。この構築物を、上記に記述されるとおり使用して、組換えアデノウイルスを生成する。ウイルスに関連して、挿入遺伝子の発現は、アデノウイルスＥ３プロモーターによって起動される。
Ｅ１およびＥ３の両方を欠失させた組換えウイルスは、目的の第一の遺伝子の挿入を伴うか、または伴わない本発明によるＥ１置換についてのアダプター・プラスミド、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片、および目的の第二の遺伝子の挿入を伴うか、または伴わないｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔｇｐ１９Ｋプラスミドを含むプラスミド基本システムを用いたＥ１置換ベクターについて上に記述されるとおり二重相同組換え手段によって生成される。
【０１０７】
制限のない例では、我々は、Ｅ１領域にネズミＨＳＡ遺伝子、およびｇｐ１９Ｋ領域にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスの生成および機能性を記述する。ルシフェラーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ構築物としてｐＡｄ／ＭＬＰ−Ｌｕｃ（欧州特許第０７０７０７１号に記述される）から削り、そしてｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９ＫΔＸｂａＩのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。その後、ルシフェラーゼ遺伝子を含むＭｓｃＩ−ＭｕｎＩ断片を、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５Δｇｐ１９Ｋの対応の部位にクローニングして、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５Δｇｐ１９Ｋ．ｌｕｃを生成した。これは、Ｅｃｏ−Ｅｃｏ断片を保持するが、ここで、ｇｐ１９Ｋの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を有する。
さらに操作を簡単にするために、ルシフェラーゼ挿入物中の内部ＥｃｏＲＩ部位を、ルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を変えることなしに突然変異させた。一方のＥｃｏＲＩ部位は、ルシフェラーゼ挿入物の５’−非コーディング領域にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接し、そして他方は、出発のＡＴＧから５８８ｂｐの３’に配置された。６９５ｂｐ  ＰＣＲ産物を、以下のプライマー：５’−ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  Ｔ−３’（配列番号：１２）および５’−ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ−３’（配列番号：１３）を用いて作製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化した。その後、この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ消化ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５Δｇｐ１９Ｋ．ｌｕｃに連結し、それによりこのベクター中の対応の挿入物を置換した。生じた構築物は、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５Δｇｐ１９Ｋ．ｌｕｃ2と称される。その後、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＥ３領域の一部を、ＳｒｆＩおよびＮｏｔＩを用いてこのクローンから削除し、そしてｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ中の対応の部位に導入し、それによりクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔｇｐ１９Ｋ／ｌｕｃ2を生じた。
二重挿入ウイルス中のＥ１の置換のために使用されたアダプター・プラスミドｐＡｄ５／Ｓ１８００ＨＳＡは、レトロウイルスＬＴＲ−基本プロモーターによって起動されるネズミＨＳＡ遺伝子を含有する。このアダプター・プラスミドは、プロモーター配列の置換によって、以下に記述されるｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡ構築物から作製された。第一に、ＰＣＲ産物を、Ｌ４２０プロモーター断片（以下に記述される）の増幅のためと同じプライマーを使用して、ＷＯ９５／３４６６９に記述されるＭＦＧ−Ｓベクターに基づいたレトロウイルス・ベクター上で産生させた。このＰＣＲは、ＭＦＧ−Ｓベクター中の４５３〜８７７ｂｐに対応する配列を増幅する。その後、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡ中のＬ４２０プロモーター（図２１）を、特徴的なＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて、ＰＣＲ断片について交換した。その後、生じた構築物ｐＡｄ５／Ｓ４３０−ＨＳＡを、ＮｈｅＩおよびＳｃａＩで消化し、そしてＨＳＡ遺伝子、ｐＡ配列、Ａｄ５配列およびアンピシリン遺伝子中のＳｃａＩ部位に対するベクター配列を含む４５０４ｂｐ断片を、単離した。
【０１０８】
構築物ｐＡｄ５／Ｓ４３０−ＨＳＡを、ＸｂａＩおよびＳｃａＩで消化し、そして１２５２ｂｐ断片（アンピシリン遺伝子の残り、アデノウイルスから得られる左側ＩＴＲおよびパッケージング・シグナル、およびＳ４３０プロモーターの５’部分を含む）を単離した。１５７６ｐｂの第三の断片を、ＭＦＧ−Ｓ−基本レトロウイルス・ベクターから単離し、続いてＸｂａＩ消化を行い、そして６９５〜２２７１ｂｐに対応するＭＦＧ−Ｓ配列を含む。
アダプター・プラスミドｐＡｄ５／Ｓ１８００−ＨＳＡを、３つの単離断片を連結することによって構築した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞への以下のＤＮＡ断片の形質移入によって（上述のとおり）、二重挿入ウイルスｐＡｄ５／Ｓ１８００−ＨＳＡ．Ｅ３ｌｕｃを作製した：ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（２μｇ）で消化したｐＡｄ５／Ｓ１８００−ＨＳＡ。ＣＰＥの発生で、ウイルスを回収し、そしてＰＥＲ．Ｃ６細胞での一連の継代によって増幅した。このＨＳＡ−ｌｕｃウイルスの活性を、Ｅ１領域中のＳ１８００−ＨＳＡまたはＣＭＶ−ｌｕｃ転写単位のいずれかを含むシングル挿入ΔＥ１ウイルスと比較した。Ａ５４９細胞を、２×１０5細胞／ウエルに蒔き、そして５時間後、様々な量のウイルスに感染させた。２日後、移入遺伝子発現を測定した。ルシフェラーゼアッセイ・システム（プロメガ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、そしてネズミＨＳＡ遺伝子の発現を、α−ＨＳＡ抗体（Ｍ１／６９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した。結果は、表ＩＩＩに列記される。
この実験では、プラスミド基本組換えシステムを用いて、二重挿入ウイルスを、作製できること、および両方の挿入物が機能性があることが示される。さらに、二重挿入ウイルスのルシフェラーゼ活性は、対照ウイルスのＣＭＶ−起動ルシフェラーゼ活性に匹敵する。したがって、我々は、Ｅ３プロモーターが、Ｅ１Ａタンパク質の不在下でさえ、Ａ５４９細胞で非常に活性であると結論づけた。
Ｅ３領域での操作に加えて、Ｅ４領域の（一部の）変化は、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲで容易に達成することができる。しかし、ある種の場合には、このようなウイルスの産生および増殖は、トランス位で相補性を必要とする。
【０１０９】
（実施例３）
アデノウイルス遺伝子を含有し、そして発現する細胞中の二本鎖ＤＮＡ分子の産生のための逆行鎖合成についてのプライマーとしての役割を果すヘアピン構造を形成する能力のある合成ＤＮＡ配列の感応性の例示
使用されるプラスミドの名付け慣例：
ｐ  プラスミド
Ｉ  ＩＴＲ（アデノウイルス逆方向末端反復）
Ｃ  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーターの組合せ
Ｌ  ホタルのルシフェラーゼ・コーディング配列
ｈａｃ、ｈａｗそれぞれ、順行および逆行の配向の両方で制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で消化した後に形成されうる強力なヘアピン（図１５）。
名付け慣例は、以下のおとり例示される。ｐＩＣＬｈａｗは、アデノウイルスＩＴＲ、続いて逆行（非機能性）配向でＣＭＶ−起動ルシフェラーゼ遺伝子およびＡｓｐ７１８ヘアピンを含むプラスミドである。プラスミドｐＩＣＬｈａｃ、ｐＩＣＬｈａｗ、ｐＩＣＬＩおよびｐＩＣＬを、標準技術を用いて作製した。これらのプラスミドの図式表示は、図１６〜１９に示される。
プラスミドｐＩＣＬは、以下のプラスミドから誘導される。
ｎｔ．１    ４５７  ｐＭＬＰ１０（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１巻：１９５−２０２頁（１９９１年））
ｎｔ．４５８    １２１８  ｐＣＭＶβ（クローンテック、ＥＭＢＬ  Ｂａｎｋ番号Ｕ０２４５１）
ｎｔ．１２１９    ３０１６  ｐＭＬＰ．ｌｕｃ（イントロジーン、未出版）
ｎｔ．３０１７    ５６２０  ｐＢＬＣＡＴ５（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ９巻：４５３１〜４頁（１９８９年））
プラスミドは、以下のとおり構築された。
プラスミドｐＭＬＰ１０のｔｅｔ遺伝子は、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の欠失によって不活性化されて、ｐＢＬＰ１０ΔＳＢを生じた。プライマー組ＰＣＲ／ＭＬＰ１（配列番号：３７）およびＰＣＲ／ＭＬＰ３（配列番号：３８）を使用して、合成ＳａｌＩ制限部位に隣接したＡｄ５−ＩＴＲを有する２１０ｂｐの断片を、ｐＭＬＰ１０ＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｇｒＡＩで消化して、１９６ｂｐの断片を作製した。プラスミドｐＭＬＰ１０ΔＳＢを、ＥｃｏＲＩおよびＳｇｒＡＩで消化して、ＩＴＲを除去した。この断片を、ＥｃｏＲＩ−ＳｇｒＡＩ処理ＰＣＲ断片に置換して、ｐＭＬＰ／ＳＡＬを作製した。
プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃを、完了までＰｖｕＩＩで消化し、そして再循環させて、ＳＶ４０−由来のポリアデニル化シグナル、およびＡｄ５左側端末を除いたＡｄ５配列を除去した。生じたプラスミドで、ＸｍｎＩ−ＳａｃＩＩ断片を交換することによって、ｐＣＭＶ−ｌｕｃΔＡｄ、Ａｄ５  ＩＴＲを、プラスミドｐＭＬＰ／ＳＡＬから得られるＳａｌ部位隣接ＩＴＲに置換した。生じたプラスミドで、ｐＣＭＶ−ｌｕｃΔＡｄ／ＳＡＬ、Ａｄ５左側末端およびＣＭＶ−起動ルシフェラーゼ遺伝子を、ＳａｌＩ−ＳｍａＩ断片として単離し、そしてＳａｌＩおよびＨｐａＩ消化プラスミドｐＢＬＣＡＴＳに挿入して、プラスミドｐＩＣＬを形成した。プラスミドｐＩＣＬは、図１９に表され、その配列番号は、図２０に表される。
プラスミドｐＩＣＬは、以下の特性を含む。
ｎｔ．１〜４５７  Ａｄ５左側末端（ヒトアデノウイルス５型の配列１〜４５７）
ｎｔ．４５８〜９６９  ヒトサイトメガロウイルス・エンハンサーおよび最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１巻：５２１〜５３０頁（１９８５年））（プラスミドｐＣＭＶβから、クローンテック、米国パロアルト）
ｎｔ．９７０〜１２０４  ＳＶ４０  １９Ｓエクソンおよび切断１６／１９Ｓイントロン（プラスミドｐＣＭＶβから）
ｎｔ．１２１８〜２９８７  ホタルのルシフェラーゼ遺伝子（ｐＭＬＰ．ｌｕｃから）
ｎｔ．３０１８〜３１３１  後期転写から得られるＳＶ４０タンデム・ポリアデニル化シグナル（プラスミドｐＢＬＣＡＴ５から誘導される）
ｎｔ．３１３２〜５６２０  ｐＵＣ１２骨格（プラスミドｐＢＬＣＡＴ５から誘導される）
ｎｔ．４３３７〜５１９１  β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ−耐性遺伝子、逆配向）
【０１１０】
プラスミドｐＩＣＬｈａｃおよびｐＩＣＬｈａｗ
プラスミドｐＩＣＬｈａｃおよびｐＩＣＬｈａｗは、制限酵素Ａｓｐ７１８を用いたｐＩＣＬの消化によって、プラスミドｐＩＣＬから誘導された。線状化プラスミドを、ウシ−インテスチンのアルカリ性ホスファターゼで処理して、５１のリン酸基を除去した。部分的に相補な合成一本鎖オリゴヌクレオチドＨｐ／ａｓｐ１（配列番号：３９）およびＨｐ／ａｓｐ２（配列番号：４０）を、アニールし、そしてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてそれらの５’末端にリン酸化した。
リン酸化二本鎖オリゴマーを、脱リン酸化ｐＩＣＬ断片と混合し、そして連結した。プラスミドに挿入された単独コピーの合成オリゴヌクレオチドを含むクローンを単離し、そして制限酵素消化物を用いて特徴づけた。１つの連結でのＡｓｐ７１８部位へのオリゴヌクレオチドの挿入は、Ａｓｐ７１８認識部位を再作製する一方で、他方の連結部では、認識部位を、中断させる。挿入オリゴヌクレオチドの配向および組込みは、配列分析によって選択クローンで確認された。順行配向（３２０５ＥｃｏＲＩ部位に密接したＡｓｐ７１８部位）でオリゴヌクレオチドを含むクローンを、ｐＩＣＬｈａｃと表した。逆行配向（ＳＶ４０由来のポリシグナルに密接したＡｓｐ７１８部位）にオリゴヌクレオチドを有するクローンを、ｐＩＣＬｈａｗと表した。プラスミドｐＩＣＬｈａｃおよびｐＩＣＬｈａｗは、図１６および１７に表される。
プラスミドｐＩＣＬＩを、ｐＩＣＬから得られるＳａｌＩ−ＳｇｒＡＩ断片の挿入によってプラスミドｐＩＣＬから作製し、それにより、ｐＩＣＬのＡｓｐ７１８部位へのＡｄ５−ＩＴＲを含んだ。１９４ｂｐのＳａｌＩ−ＳｇｒＡＩ断片を、ｐＩＣＬから単離し、そしてイー．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）およびｄＮＴＰを用いて、粘着末端を、平滑末端に変換した。ブンドウのヌクレアーゼで処理することによって、Ａｓｐ７１８粘着末端を、平滑末端に変換した。連結によって、プラスミドｐＩＣＬのＡｓｐ７１８部位中のＩＴＲを含むクローンを、作製した。順行配向でＩＴＲ断片を含むクローンを、ｐＩＣＬＩと称した（図１８）。
アデノウイルスＡｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫの生産。組換えアデノウイルスを、特許出願第９５２０２２１３号に記述される方法にしたがって構築した。組換えアデノウイルスを作製するのに２つの構成要素が、必要とされた。第一に、ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルを含むアデノウイルスゲノムの左側末端、目的の遺伝子を有する発現カセット、および相同組換えのために使用しうるアデノウイルスゲノムの一部を含有するアダプタープラスミド。さらに、アデノウイルスＤＮＡは、前述のアダプター・プラスミドを伴う組換えのために必要とされる。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫの場合には、プラスミドＰＣＭＶ．ＴＫは、基本として使用される。このプラスミドは、ｎｔ．１〜４５５のアデノウイルス５型ゲノム、ｐＣＭＶβから由来するｎｔ．４５６〜１２０４（クローンテック、ＣＭＶエンハンサー・プロモーターおよびシミアンウイルス４０から得られる１６Ｓ／１９Ｓイントロンを含むＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ断片）、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子（欧州特許出願第９５２０２２１３．５号に記述される）、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０配列のｎｔ．２５３３〜２６６８）、続いてＡｄ５のＢｇｌＩＩ−ＳｃａＩ断片（Ａｄ５配列のｎｔ．３３２８〜６０９２）を含む。これらの断片は、ｐＭＬＰ１０由来（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１巻：１９５〜２０２頁（１９９１年））の骨格に存在する。プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶｈｃ−ＴＫを作製するために、プラスミドｐＣＭＶ．ＴＫを、ＣｌａＩ（特徴的なＣｌａＩ部位は、ＴＫ開放読取枠のすぐ上流に配置される）で消化し、そしてウシ−インテスチン・アルカリホスフェートで脱リン酸化した。ヘアピン構造を作製するために、合成オリゴヌクレオチドＨＰ／ｃｌａ１（配列番号：４１）およびＨＰ／ｃｌａ２（配列番号：４２）をアニールし、そしてＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰで、それらの５’−ＯＨ基上でリン酸化した。二本鎖オリゴヌクレオチドを、線状ベクター断片に連結し、そしてイー．コリ株Ｓｕｒｅを形質転換するのに使用した。ＣｌａＩ部位へのオリゴヌクレオチドの挿入は、ＣｌａＩ認識部位を中断する。オリゴヌクレオチドは、その末端の内の１つの側に新たなＣｌａＩ部位を含む。選択クローンで、挿入オリゴヌクレオチドの配向および組込みは、配列分析によって確認された。順行配向（ＩＴＲ側でＣｌａＩ部位）でオリゴヌクレオチドを含むクローンは、ｐＡｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫと表された。このプラスミドを、９１１細胞に、ＣｌａＩ消化野生型アデノウイルス５型ＤＮＡとの同時形質移入をした。ＣＭＶ−ｈｃＴＫ発現カセットが、Ｅ１配列を置換する組換えアデノウイルスを単離し、そして標準手段を用いて増殖させた。
複製がＩＴＲで出発した後に、ヘアピンが、置換した鎖での逆行鎖の合成のためのプライマーとして使用されうるかどうかを調べるために、プラスミドｐＩＣＬｈａｃを、９１１細胞、例えばアデノウイルスＥ１領域で形質転換したヒト胚網膜細胞に導入した。プラスミドｐＩＣＬｈａｗは、対照として役割を果した。これは、逆行配向でオリゴヌクレオチド対ＨＰ／ａｓｐ１（配列番号：３９）および２（配列番号：４０）を含むが、しかしそうでなければ、プラスミドｐＩＣＬｈａｃと完全に一致する。さらに、この調査に含まれるのは、プラスミドｐＩＣＬＩおよびｐＩＣＬである。プラスミドｐＩＣＬＩでは、ヘアピンは、アデノウイルスＩＴＲに置換される。プラスミドｐＩＣＬは、ヘアピンもＩＴＲ配列のいずれも含まない。これらのプラスミドは、対照として役割を果して、末端のヘアピン構造に基づいて、複製の効率を決定した。ＤＮＡ複製のために必要とされるＥ１タンパク質以外のウイルス性産物（これらは９１１細胞によって製造される。）を供するために、培養物を、形質移入の後、ウイルスＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫで感染させた。数種のパラメーターは、形質移入ＤＮＡ分子の適切な複製を示すために調べられるべきであった。第一に、先述のプラスミドで形質移入され、そしてＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫウイルスで感染された細胞培養物から得られるＤＮＡを、サザンブロッティングによって、予測される複写中間体の存在について、並びに、複写ゲノムの存在について分析した。さらに、形質移入し、そしてＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫで感染した細胞集団から、ルシフェラーゼマーカー遺伝子を、ルシフェラーゼ陰性細胞に移行し、そしてそれを発現できるウイルスを単離した。
プラスミドｐＩＣＬｈａｃ、ｐＣＬｈａｗ、ｐＩＣＬＩおよびｐＩＣＬのプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化し、そしてブンドウのヌクレアーゼで処理して、生じたＤＮＡ断片の４個のヌクレオチド一本鎖伸長を除去した。この方法で、ＤＮＡ断片上の天然のアデノウイルス５’ＩＴＲ末端を作製した。続いて、ｐＩＣＬｈａｃおよびｐＩＣＬｈａｗプラスミドの両方を、制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で消化して、ヘアピン構造を形成する能力のある末端を作製した。消化プラスミドを、標準リン酸カルシウム同時沈降技術を使用して、９１１細胞に導入した（各プラスミドについて４つの皿）。形質移入の間、各プラスミドについて、培養物の内の２つを、細胞当たり５つの感染性ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫ粒子を用いて、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫウイルスに感染させた。形質移入の２４時間後、および後期形質移入の４０時間に、１つのＡｄ．ｔｋウイルス感染および１つの未感染培養物を使用して、Ｈｉｒｔにより修正された手段（Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２巻：３３６〜３４３頁（１９９５年）に記述されるとおり）を用いて、低分子量ＤＮＡを単離した。アリコート量の単離ＤＮＡを、サザン分析のために使用した。プローブとしてルシフェラーゼ遺伝子を使用して制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩでのサンプルの消化の後、およそ２．６ｋｂのハイブリッド形成断片を、プラスミドｐＩＣＬｈａｃで形質移入されたアデノウイルス感染細胞から得られたサンプルから検出した。この断片のサイズは、ルシフェラーゼマーカー遺伝子の予測複写と一致した。これは、挿入ヘアピンが、逆行鎖合成についてのプライマーとして役割を果す能力があるという結論を支持する。ハイブリッド形成断片は、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫウイルスが省略される場合、またはヘアピンオリゴヌクレオチドが、逆配向に挿入される場合、不在であった。
【０１１１】
制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩは、テトラヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識するが、しかしメチル化ＤＮＡのみを切断する（つまり、イー．コリで増殖され、誘導されるプラスミドＤＮＡのみであって、哺乳類細胞に複製されたＤＮＡではない）。制限エンドヌクレアーゼＭｂｏＩは、同じ配列を認識するが、しかし、未メチル化ＤＮＡ（主に、哺乳類細胞で増殖されたＤＮＡ）のみを切断する。形質移入細胞から単離されたＤＮＡサンプルを、ＭｂｏＩおよびＤｐｎＩと共にインキュベートし、そしてサザンブロットで分析した。これらの結果は、ｐＩＣＬｈａｃおよびｐＩＣＬプラスミドで形質移入された細胞でのみ、大型ＤｐｎＩ耐性断片が存在し、それは、ＭｂｏＩ処理サンプルでは不在であったことを示した。これらのデータは、プラスミドｐＩＣＬＩおよびｐＩＣＬｈａｃの形質移入の後にのみ、その断片の複製および複写が起こることを示す。
これらのデータは、一本鎖形態で存在している時に、アデノウイルス感染細胞で、一方の末端にアデノウイルス由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有し、そして他方の末端で、同じ鎖にある配列にアニールできるヌクレオチド配列を有する線状ＤＮＡ断片が、それによりヘアピン構造を生じ、そして両方の末端上に逆方向末端反復配列を有する構造に変換されることを示す。生じたＤＮＡ分子は、野生型アデノウイルスゲノムと同じ機構によって複製する。
【０１１２】
（実施例４）
ルシフェラーゼマーカー遺伝子、ＩＴＲの単独コピー、封入シグナルおよびヘアピン構造を形成する能力のある合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が、ビリオンに封入されうるＤＮＡ分子を生成するのに十分であることの例示
ＣＭＶ−ｌuｃマーカー遺伝子の２つのコピーを含む、実施例３で生じたＤＮＡ分子が、ビリオンに封入されうることを例示するために、ウイルスを、３回サイクルの凍結−解凍破砕を介して残りの２つの培養物から回収し、そしてネズミ繊維芽細胞を感染するのに使用した。感染の４８時間後、感染細胞を、ルシフェラーゼ活性について分析した。ルシフェラーゼ活性が、ウイルス粒子を介してよりむしろ遊離ＤＮＡの移行によって誘導されている可能性を排除するために、ウイルス保存物を、ＤＮエースＩで処理して、ＤＮＡ混入物を除去した。さらに、別の対照として、アリコート量のウイルス保存物を、５６℃で６０分間インキュベートした。加熱処理は、混入ＤＮＡに影響を及ぼさないが、しかしウイルスを不活性化する。明らかなルシフェラーゼ活性は、ｐＩＣＬｈｃおよびｐＩＣＬＩプラスミドで形質移入されたＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫ−感染細胞から誘導されるウイルス保存物に感染させた後の細胞にのみ見られた。非感染細胞でも、あるいはｐＩＣＬｈｗおよびｐＩＣＬで形質移入された感染細胞のいずれでも、明らかなルシフェラーゼ活性が示されたものはなかった。ＤＮエースＩ処理ではなく、加熱不活性化が、ルシフェラーゼ発現を完全に排除し、それにより、アデノウイルス粒子そして不含でない（混入）ＤＮＡ断片は、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の移行に起因したことが示された。
これらの結果は、これらの小型ウイルスゲノムを、アデノウイルス粒子に封入できることを示し、そしてＩＴＲおよび封入シグナルが、アデノウイルス粒子への線状ＤＮＡ断片の封入に十分であることが示唆された。これらのアデノウイルス粒子は、有効な遺伝子移行のために使用できる。少なくともある程度のアデノウイルス遺伝子（主に、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬおよびＶＡ）を含み、そして発現する細胞に導入するとき、少なくとも１つのＩＴＲ、少なくとも一部の封入シグナル、並びにヘアピン構造を形成する能力のある合成ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子は、ビリオンに封入しうる組換えゲノムを独立に生成する固有の許容量を示す。このようなゲノムおよびベクターシステムは、遺伝子移行に使用しうる。
【０１１３】
（実施例５）
アデノウイルス５型ゲノム（したがって、Ｅ１タンパク質コーディング領域、右手ＩＴＲおよび封入配列を欠く）のヌクレオチド３５１０〜３５９５３（主に、９．７〜１００地図単位）、およびＩＴＲ以外の一本鎖形態で存在し、そしてその結果として、ヘアピン構造を形成する能力のある場合にＤＮＡ分子の同じ鎖の部分に相補的である末端ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が、９１１細胞中で複製できることの例示
上述のＩＣＬｈａｃベクターゲノムおよび似ていない最小アデノベクターに、ヘルパー細胞を介してアデノウイルス粒子に封入させることが必要とされるアデノウイルス産物を提供できる複製ＤＮＡ分子を開発するために、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫアデノウイルスベクターを開発した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域およびチミジンキナーゼ遺伝子との間で、アニールしたオリゴヌクレオチド対（表Ｉ）ＨＰ／ｃｌａ１および２を挿入した。ベクターＡｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫを増殖させ、そして標準手段を使用して９１１細胞中で生成した。このベクターを育成し、そして形質移入のために使用されるＤＮＡの源として排他的に増殖させた。アデノウイルスＡｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫのＤＮＡを、標準技術によってＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を使用して精製されたウイルス粒子から単離した。ウイルスＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩで消化した。消化ＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で寸法分取し、そして大型断片を単離し、そして別の実験に使用した。９１１細胞の培養物を、標準リン酸カルシウム同時沈殿技術を用いてＡｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫ  ＤＮＡの大型ＣｌａＩ−断片で形質移入させた。プラスミドｐＩＣＬｈａｃを用いた先の実験でといっそう同様に、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈｃは、右手ＩＴＲで出発しながら複製する。いったん一本鎖が置換されると、ヘアピンは、その断片の左手末端に形成されうる。これは、右手側に向かって鎖のＤＮＡポリメラーゼ伸長を促進する。その過程は、置換鎖が、その二本鎖形態に完全に変換されるまで進行する。最終的に、右手ＩＴＲを再作製し、そしてこの配置で、正常なアデノウイルス複製−開始および伸長が起こる。ポリメラーゼは、ヘアピンを通して読取り、それにより分子を複写する。一方の側にはアデノウイルスＩＴＲ配列を、そしてヘアピン構造を形成する許容量を示した他方の側にはＤＮＡ配列を有する３３２５０ｂｐの入力ＤＮＡ分子は、複写され、その結果両方の末端が、ＩＴＲ配列を含む。生じたＤＮＡ分子は、およそ６６５００ｂｐのパリンドロム構造から構成される。
この構造は、サザン分析を使用して、形質移入細胞から抽出される低分子量ＤＮＡで検出される。ＤＮＡ断片のパリンドロム特性は、適切な制限エンドヌクレアーゼおよびプローブとしてＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を用いたサザンブロッティングを用いた低分子量ＤＮＡの消化によって示されうる。この分子は、細胞内に存在するアデノウイルス遺伝子産物に基づいて形質移入細胞でそれ自身を複製できる。部分的に、アデノウイルス遺伝子は、標的細胞のゲノム（主に、Ｅ１遺伝子産物）中に取り込まれるテンプレートから発現され、他方の遺伝子は、ＤＮＡ断片それ自身を複製する上で存在する。この線状ＤＮＡ断片は、ビリオンに封入されえない。それが、封入か要求される全てのＤＮＡ配列を欠くのみでなく、そのサイズも、大きすぎるので、封入されえない。
【０１１４】
（実施例６）
アデノウイルス５型ゲノム（したがって、Ｅ１タンパク質コーディング領域、右手ＩＴＲおよび封入配列を欠く）のヌクレオチド３５０３−３５９５３（すなわち、９．７−１００マップ単位）、およびＩＴＲ以外のＤＮＡ分子の同じ鎖の一部に相補的であり、そして結果として、ヘアピン構造を形成する能力のある末端ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子は、９１１細胞で複製でき、そしてｐＩＣＬＩおよびｐＩＣＬｈａｃ由来のＤＮＡ断片を封入するのに必要とされるヘルパー機能を提供できることの例示
次の一連の実験の目的は、実施例５に記述されるＤＮＡ分子が、実施例３および４に記述される最小アデノベクターを封入するのに使用できることを示すことである。
Ａｄ−ＣＭＶ−ｈｃＴＫ  ＤＮＡのエンドヌクレアーゼＣｌａＩ−消化の後単離された大型断片を、エンドヌクレアーゼＳａｌＩ、ブンドウ・ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８処理プラスミドｐＩＣＬｈａｃと、あるいは対照として同様に処理したプラスミドｐＩＣＬｈａｗと一緒に９１１細胞に導入した（実施例５に記述されるとおり）。４８時間後、ウイルスを、形質移入細胞集団の凍結−解凍破砕によって単離した。ウイルス製品を、ＤＮエースＩで処理して、混入している遊離ＤＮＡを除去した。ウイルスを、ラット２繊維芽細胞を感染するのに連続して使用した。感染の４８時間後、細胞を、ルシフェラーゼ活性について分析した。ｐＩＣＬｈａｗプラスミドでなく、ｐＩＣＬｈａｃプラスミドで形質移入した細胞から単離されたウイルスに感染した細胞でのみが、明らかなルシフェラーゼ活性を示した。感染の前のウイルスの加熱不活性化は、ルシフェラーゼ活性を完全に破壊し、それにより、ルシフェラーゼ遺伝子が、ウイルス粒子によって移行されることが示された。ウイルス保存物を有する９１１細胞の感染は、あらゆる細胞組織学上の効果を生じず、それによりｐＩＣＬｈａｃが、９１１細胞で増殖されるべきなんらの感染性ヘルパーウイルスもなしに生成されたことが示された。これらの結果は、提起の方法が、アデノウイルス形質転換ヒト細胞で、または非アデノウイルス形質転換ヒト細胞で独立に複製できる感染性ヘルパーウイルスを完全に欠いている最小アデノウイルスベクターの保存物を生成するために使用できることを示す。
【０１１５】
（実施例７）
最小アデノウイルスベクターの産生および生成のためのプラスミドの構築
最小アデノウイルスベクターは、移行されるべき外来核酸分子と共に、またはなしに、操作可能に結合した成分として、複製およびパッケージングのために必要であるアデノウイルス由来のシス要素を含む。最近、アデノウイルスベクターの十分なパッケージングについての下の限界は、ゲノム長の７５％で決定された（ＰａｒｋｓおよびＧｒａｈａｍ、１９９７年）。種々の長さの詰める断片の柔軟な組込みを可能にするために、多クローニング部位（ＭＣＳ）を、最小アデノウイルスベクターに導入した。本発明による最小アデノウイルスベクターを得るために、以下の構築物を作製した：ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ（図１９）を、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてベクター含有断片を単離した。この断片は、Ａｄ５から得られる左側ＩＴＲおよびパッケージングシグナル、改質したレトロウイルスＬＴＲによって起動されたネズミＨＳＡ遺伝子を含む。アデノウイルスの右側ＩＴＲを、以下のプライマー：ポリＬ−ＩＴＲ：５’−ＡＡＣ−ＴＧＣ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＡＴＣ−ＧＡＴ−ＡＣＴ−ＡＧＴ−ＣＡＡ−ＴＴＧ−ＣＴＣ−ＧＡＧ−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＣＴＡ−ＣＧＴ−ＣＡＣ−ＣＣＧ−ＣＣＣ−ＣＧＴ−ＴＣＣ−３’（配列番号：１４）およびＩＴＲ−ＢＳＮ：５’−ＣＧＧ−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＴＣＧ−ＡＣＧ−ＣＧＧ−ＣＣＧ−ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＣＡＡ−ＴＡＡ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−３’（配列番号：１５）を用いたｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＨＩ−ｒＩＴＲテンプレートＤＮＡ上でのＰＣＲによって増幅した。増幅断片を、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして同じ酵素で消化したｐＵＣ１１９にクローン化した。ＩＴＲおよびＭＣＳの補正増幅の配列確認の後、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を単離し、そして上述されるＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ断片にクローン化させた。生じたクローンは、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ．ＩＴＲと名付けられた。
３０ｋｂを越す長さの構築物を操作することができるために、最小アデノウイルスベクターｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ．ＩＴＲを、コスミドベクターのバックグランドにサブクローニングした。この終わりに、コスミドベクターｐＷＥ１５を、改質して、骨格にある制限部位を除去した。ｐＷＥ１５を、ＰｓｔＩで消化し、そして４ｋｂおよび２，３６ｋｂの断片を、アガロースゲルから単離し、そして一緒に連結した。ＳＶ４０ｏｒｉ／初期プロモーターおよびネオマイシン耐性コーディング配列を剥いで生じたクローンは、ｐＷＥ２０と名付けられた。その後、ｐＷＥ２０を、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして粘着末端を、クレノー酵素で充填した。６３５４ｂｐ平滑断片を、以下の配列：５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＣＧ−３’（配列番号：１６）を有するリン酸化ＮｓｉＩリンカーに連結した。連結したＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨで沈殿させて、緩衝液を交換し、そして過剰ＮｓｉＩで消化した。消化ＤＮＡを、電気泳動によってリンカーから分離し、単離し、そして再連結した。生じたクローンを、ｐＷＥ２５と名付けた。ＮｓｉＩリンカーの順行挿入を、制限酵素消化および配列決定によって確認した。最小アデノウイルスベクターを構築するために、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ．ＩＴＲを、ＳｃａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてアンピシリン遺伝子の一部およびアデノＩＴＲを含む２ｋｂ断片を、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＷＥ２５にクローニングした。生じたクローンは、ｐＭＶ／Ｌ４２０Ｈと名付けられた（図２４）。このクローンは、プロモーターおよび／または遺伝子を変換する簡単な操作を可能にし、そしてさらに、正常なプラスミド骨格に容易にクローン化されない長さのＤＮＡ断片の挿入を可能にする。
Ｌ４２０−ＨＳＡ断片（ＳｎａＢＩ−ＢａｍＨＩ）を、ＣＭＶプロモーターおよびＬａｃＺコーディング配列を含むｐｃＤＮＡ３−ｎｌｓＬａｃＺ（ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ）から得られる断片に交換することによって、プラスミドｐＭＶ／ＣＭＶ−ＬａｃＺを作製した。ｐｃＤＮＡ３−ｎｌｓＬａｃＺを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）へのｎｌｓＬａｃＺコーディング配列のＰＣＲ増幅後に得られるＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片の挿入によって構築した。プライマー１：５’−ＧＧＧ−ＧＴＧ−ＧＣＣ−ＡＧＧ−ＧＴＡ−ＣＣＴ−ＣＴＡ−ＧＧＣ−ＴＴＴ−ＴＧＣ−ＡＡ−３’（配列番号：１７）および２：５’−ＧＧＧ−ＧＧＧ−ＡＴＣ−ＣＡＴ−ＡＡＡ−ＣＡＡ−ＧＴＴ−ＣＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣ−３’（配列番号：１８）を用いて、ｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺテンプレートＤＮＡ上でＰＣＲ反応を行った。９１１細胞における一過性形質移入実験でβ−ガラクトシダーゼ発現を分析することによって、順行増幅およびクローニングを確認した。
ベクターｐＡｄ／ＭＬＰｎｌｓＬａｃＺを、以下のとおり作製した。ｐＭＬＰ１０（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１巻：１９５〜２０２頁（１９９１年））を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして３つの部分のライゲーションで、Ｌ７ＲＨｂｇａｌから得た３．３ｋｂのＡｖｒＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ  ４９９〜５０９頁（１９８４年））、およびＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩオーバーハングを有する合成リンカーに連結した。配列５’−ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＧＧ    ＧＴＡ  ＣＣＴ−３’（配列番号：１９）および５’−ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ−３’（配列番号：２０）の２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、リンカーを作製した。生じたクローンを、ｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺ／−Ａｄと名付けられた。次に、ｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺ／−Ａｄを、ＢａｍＨＩおよびＮｒｕＩで消化し、そして断片を含むベクターを、ｐＡｄ５ＳａｌＢ（Ｂｅｒｎａｒｄｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２０巻：４２２〜４３２頁（１９８２年））から得られる２７６６ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳｃａＩ断片に連結した。これは、アダプター・プラスミドｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺを生じた（欧州０  ７０７  ０７１号に記載された）。
最小アデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス遺伝子産物の発現によってのみ達成できる。多量のウイルスの産生を保持するのに十分な高さのレベルで、アデノウイルス遺伝子産物の発現は、コーディング核酸分子の複製を必要とする。したがって、通常に、ヘルパーウイルスを複製することは、最小アデノウイルスベクターを補足するに使用される。しかし、本発明は、ヘルパーウイルスの使用なしに、最小アデノウイルスベクターについてのパッケージングシステムを供する。本発明の方法の内の１つは、５’−ＩＴＲおよびｂｐ３５１０と３５９３８の間の全アデノウイルス配列、すなわち、Ｅ１領域およびパッケージングシグナルを除いた完全なアデノウイルスゲノムを含む複製ＤＮＡ分子を利用する。構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’（図２３）は、２つのアデノウイルスＩＴＲ  ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’を含む、本発明による複製分子の例である。３つの断片から得たコスミドベクターのバックグランドで行われた。第一に、以下のプライマー：ＩＴＲ−ＥＰＨ：５’−ＣＧＧ−ＡＡＴ−ＴＣＴ−ＴＡＡ−ＴＴＡ−ＡＧＴ−ＴＡＡ−ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＣＡＡ−ＴＡＡ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−３’（配列番号：２１）およびＩＴＲ−ｐＩＸ：５’−ＡＣＧ−ＧＣＧ−ＧＣＧ−ＣＴＴ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＣＧＣ−ＣＣＡ−ＣＡＣ−ＡＴＴ−ＴＣＡ−ＧＴＡ−ＣＧＴ−ＡＣＴ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＧＴ−ＣＡＣ−ＣＣＧ−ＣＣＣ−ＣＧＴ−ＴＣＣ−３’（配列番号：２２）を使用して、Ａｄ５から得られる５’ＩＴＲを増幅した。生じたＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩで消化し、そして同じ酵素で消化したベクターｐＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラボズ）にクローン化した。生じた構築物を、ｐＮＥＢ／ＩＴＲ−ｐＩＸと名付けた。配列決定で、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）による予測配列（寄託番号：Ｍ７３２６０／Ｍ２９９７８）との単独ミスマッチを除きｐＩＸプロモーター（Ａｄ５配列３５１１から３５３８まで）に結合した左側ＩＴＲ（Ａｄ５配列１から１０３まで）にあるＡｄ５配列の順行増幅が確認された。すなわち、余剰のＣ残渣が、ＡｆｌＩＩ部位のちょうど上流に見られた。このＩＴＲ−ｐＩＸ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＡｆｌＩＩで単離し、そしてＡｄ５配列３５３９〜２１５６７を含むＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩベクター断片に連結した。ＥｃｏＲＩで、そして部分的にＡｆｌＩＩでｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ（上記）を消化することによって、後者の断片を得た。生じたクローンは、ｐＡｄ／ＬＩＴＲ（Δ５’）−ＢａｍＨＩと名付けられた。ＰａｃＩで消化したコスミドベクターｐＷＥ１５．Ｐａｃ（上記）を、ＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＡｄ／ＬＩＴＲ（Δ５’）−ＢａｍＨＩおよびＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ番号２（上記）に連結されることによって、最終構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’を作製した（図２３）。
【０１１６】
本発明によるヘルパーウイルスの使用なしに、最小アデノウイルスベクターについてのパッケージングシステムを作製する別の方法は、Ｅ１領域およびパッケージングシグナル以外の完全なアデノウイルスゲノムを含み、そしてＩＴＲの内の１つが、ＩＴＲ以外の同じ鎖の一部に相補であるＤＮＡ配列を含む断片に置換され、そしてしたがって、ヘアピン構造を形成できる複製ＤＮＡ分子を使用することである（図１０）。限定されない例では、ＩＴＲ以外の同じ鎖の一部に相補である上記ＤＮＡ配列は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）末端反復から誘導される。このような複製ＤＮＡ分子は、ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’について記述されるとおり同じクローニング攻略法に続いて作製されが、しかしここで、アデノウイルスｐＩＸプロモーターの一部に結合したＡＡＶ末端反復で出発する。この終わりに、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むｐｓｕｂ２０１（＋）（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３巻：３８２２〜３８２８頁（１９８９年））から得られるＰｖｕＩＩ／ＸｂａＩ断片を導入することによって、構築物ｐＮＥＢ／ＩＴＲ−ｐＩＸ中のＨｐａＩおよびＳｐｅＩ部位の間のアデノウイルスＩＴＲ配列を、ＡＡＶ  ＩＴＲに交換した。これは、Ｅ１相補セルラインで複製する構築物ｐＷＥ／ＡＡＶ．Δ５’を生じる。
最小アデノウイルスベクターについての別の選択的パッケージングシステムは、以下に記述され、そしてＳＶ４０の複製システムを利用する。この方法による機能性ヘルパー分子は、Ｅ１配列およびパッケージングシグナルではなく最小構築物のパッケージングを保持するのに必要である少なくともアデノウイルス配列を含み、好ましくはＩＴＲをも欠く。このアデノウイルス由来の本質は、細菌での増殖のために必要とされる配列に加えて、ＳＶ４０ウイルスから複製の起点を含むベクターに存在しなければならない。Ｅ１タンパク質に加えて、ＳＶ４０由来の大型Ｔ抗原タンパク質を発現するパッケージングセルライン（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６）への、上記で記述された最小アデノウイルスベクターと一緒のこのような分子の形質移入は、アデノウイルス由来のヘルパー構築物の大きなＴ依存性複製を生じる。この複製は、最小アデノウイルスベクターの複製、およびウイルス粒子への封入のために必要である高いレベルのアデノウイルス・タンパク質になる。この方法で、最小アデノウイルスベクター構築物およびヘルパー分子の間の相同組換えに至る配列重複はない。さらに、一方の側でヘルパー分子と最小アデノウイルスベクター、そして他方の側でパッケージング細胞のＥ１配列の間の相同組換えに至る配列重複はない。
４０ｋｂアデノウイルス構築物の複製を、ＳＶ４０大型Ｔタンパク質を発現する細胞について調査した。これに関して、２×１０6Ｃｏｓ−１細胞を、リポフェクタミン試薬（ライフ・テクノ．）：８ｋｂコスミドベクターｐＷＥ．ｐａｃ、４０．５ｋｂ構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲおよび４０．６ｋｂ構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’（以下に記述される）の３つのクローン（番号１、番号５および番号９）と複合した以下の構築物を用いてＴ２５フラスコに形質移入させた。ＳＶ４０ｏｒｉ配列なしに、ＰａｃＩ酵素およびＣＭＶ−ＬａｃＺ発現ベクターで消化した構築物ｐＷＥ．ｐａｃおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲで対照形質移入を行った。形質移入効率は、４８時間後ＣＭＶ−ＬａｃＺベクターおよびＸ−ｇａｌ染色を使用する別々の形質移入によって測定される場合、５０％であった。全ての細胞を、形質移入に続く４８時間に回収し、そしてＤＮＡを、ハート（Ｈｉｒｔ）の手段（Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２巻：３３６−３４３頁（１９９５年）に記述されるとおり）によって抽出した。最終ペレットを、５０μｌのＴＥ＋ＲＮエース（２０μｇ／ｍｌ）中に再懸濁させ、そして１０μｌサンプルを、ＭｂｏＩ（３７℃で、一夜、３５単位）で消化させた。未消化サンプル（５μｌ）およびＭｂｏＩ消化サンプルを、標準の手段によって、０．８％アガロースゲルにかけ、ナイロンフィルター（アメシャム）に移行し、そして放射性活性プローブにハイブリッド形成した。１つのプローブは、コスミドベクターｐＷＥ．ｐａｃから得られる８８７ｂｐのＤｐｎＩ断片から誘導され、そして１つは、アデノウイルス配列から得られる１８６４ｂｐのＢｓｒＧＩ−ＢａｍＨＩ断片から誘導された。これらのプローブは、ＭｂｏＩ消化材料中の、それぞれ８８７ｂｐバンドおよび１４１６ｂｐにハイブリッド形成する。細菌起点からの入力ＤＮＡを、メチル化させ、そしてしたがって、ＭｂｏＩで消化されない。この方法で、真核生物細胞で複製されるＤＮＡを特異的に検出することが可能である。図２６Ａは、構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’および複製のＳＶ４０起点の配置、ｐＷＥ由来のプローブおよびアデノウイルス由来のプローブの図式表現を示す。下方部分は、アデノウイルスプローブ（Ｂ）およびｐＷＥプローブ（Ｃ）にハイブリッド形成したサザンブロットのオートラジオグラムを表す。サンプル負荷の説明についての記号一覧参照。これらの実験は、ＳＶ４０  ｏｒｉを宿すプラスミドに形質移入されるＣｏｓ−１細胞から得られる材料を含む全てのレーンが、ＭｂｏＩ感受性ＤＮＡを含むことを示し、そして予想の長さの特定のバンドを示す。ＰａｃＩ消化材料で形質移入されたＣｏｓ−１細胞を有するレーン（レーンＢ１７／１８およびＣ１５−１８）での複製に特異的なバンドは、おそらく不完全なＰａｃＩ消化から生じる。これらの実験から、真核生物細胞中でＳＶ４０大型Ｔ／ｏｒｉシステムを用いて大型ＤＮＡ断片を複製する可能性があることが結論づけられる。
（実施例８）
ＩＴＲ配列を欠く機能性アデノウイルス・ヘルパー分子を、上記に記述されるクローンｐＷＥ／Ａｄ．５’で出発しながら構築した。ｐＷＥ／Ａｄ．５’を、Ｂｓｔ１１０７Ｉで消化し、１７．５ｋｂベクター含有断片を、再連結して、ｐＷＥ／Ａｄ．５’−Ｂｓｔ１１０７Ｉを得た。その後、このクローンを使用して、右側ＩＴＲなしにアデノウイルスゲノム配列の３’部分を増幅した。２６４５ｂｐのＰＣＲ断片を、プライマーＡｄ３’／Ｆｏｒｗ：５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧ−３’（配列番号：２３）およびＡｄ３’／Ｒｅｖ：５’−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＴＧ−３’（配列番号：２４）を用いて作製した。増幅断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして同じ酵素で消化したｐＢｒ３２２にサブクローニングした。配列決定による順行増幅の確認後、このクローンの２５５８ｂｐのＳｂｆＩ−ＣｌａＩ断片を、同じ酵素で消化したｐＷＥ／Ａｄ．５’−Ｂｓｔ１１０７Ｉに再クローン化した。生じた構築物は、右側ＩＴＲを欠き、そしてｐＷＥ／ΔｒＩ−Ｂｓｔ１１０７Ｉと名付けた。次に、このクローンで、左側ＩＴＲを、ＰａｃＩおよび以下のプライマー：ＰＡ−ｐＩＸ１  ５’−ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号：２５）およびＰＡ−ｐＩＸ２  ５’−ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  Ｔ−３’（配列番号：２６）をアニーリングすることによって作られるＡｆｌＩＩオーバーハングを有するリンカーに置換した。これは、左側ＩＴＲを除去し、そしてｐＩＸプロモーターの順行配列を再保存した。そのクローンは、ｐＷＥ／ΔＩＴＲ−Ｂｓｔ１１０７Ｉと称される。配列決定によって二本鎖リンカーの順行挿入が確認された。その後、欠失Ｂｓｔ１１０７Ｉ断片を、ｐＷＥ／ΔＩＴＲ−Ｂｓｔ１１０７Ｉに戻りクローニングし、そして制限消化によって順行配向を検査した。生じたクローンは、ｐＷＥ／Ａｄ−Ｈと称される。アデノウイルスＥ１タンパク質およびＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するパッケージング細胞へのこのＤＮＡ分子の形質移入に続いて、その分子の複製は、その分子でのアデノウイルスの本質によってコードされるアデノウイルスタンパク質のレベルが高くなりながら、起こる。
【０１１７】
（実施例９）
組換えアデノウイルスベクターの小型化された多ウエル産生
９６孔のマイクロタイター組織培養平板（プレート１）（グレイネル（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、オランダ国、カタログ番号６５５５１８０号）は、２０〜１２０分間、室温で各ウエルをインキュベートすることによって滅菌水中に溶解されたポリＬ−リシン（ＰＬＬ、０．１ｍｇ／ｍｌ）（シグマ）で最初に被覆した。一方、予め被覆した９６孔平板を使用することができる（ＢｅｃｔｏｎおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＰＬＬでインキュベートした後、各ウエルを、１００μｌ滅菌水で２回洗浄し、そして室温で、少なくとも２時間、乾燥させた。形質移入の前日に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、そして計数した。その後、その細胞を１００μｌ当たり４５，０００個の細胞の懸濁液に希釈し、続いて、ＰＬＬ被覆９６孔平板のウエル当たり１００μｌを種蒔きした。次の日に、２．６μｌのＳａｌ  Ｉ線状化ｐＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺおよび２．６μｌのＰａｃＩ線状化ｐＷＥ−Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲプラスミドＤＮＡ（両方とも１μｇ／μｌ）および９５μｌの血清不含ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を、ＤＮＡ混合液にリポフェクタミンを添加することによって、７４．４μｌの血清不含ＤＭＥＭで希釈した２５．６μｌのリポフェクタミンと混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合液を、１．３ｍｌ血清不含培地を添加した後３０分間、室温に放置した。その後、後者の混合液を、形質移入前に２００μｌのＤＭＥＭで洗浄したＰＥＲ．Ｃ６播種ウエルに添加（ウエル当たり３０μｌ）した。湿潤ＣＯ2インキュベーター（３７℃、１０％ＣＯ2）で、１０％仔ウシ血清を有する２００μｌのＤＭＥＭを３時間後、各ウエルに添加し、そしてその平板を、湿潤ＣＯ2インキュベーター（３７℃、１０％ＣＯ2）に戻した。次の日に、各ウエルの培地を、２００μｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2に換えた。その後、平板を、ウエルが、−２０℃で、少なくとも１時間、凍結にかけ、続いて解凍し、そして繰返しのピペット採取によって再懸濁させた後さらに３日間、湿潤ＣＯ2インキュベーターに放置した。形質移入効率を、別の平板でｌａｃＺ染色を使用して測定し、そしてＰＥＲ．Ｃ６細胞の各形質移入ウエルについておよそ４０％であることが分かった。アリコート量の１００μｌの凍結／解凍した形質移入細胞を、ＰＬＬ被覆平板（平板２）なしに、上に記述されるとおり播種した新たなＰＥＲ．Ｃ６細胞を用いて平板の各ウエルに移行させた。第一の形質移入平板の凍結／解凍細胞溶解物と共にインキュベートしたＰＥＲ．Ｃ６細胞を有する第二の９６孔平板を、ＣＰＥについて検査した。ウエルの少なくとも５％は、２日後に透明なＣＰＥを示した。平板１から得られる溶解物で感染させた４日後、平板を、１回の凍結−乾燥サイクルにかけ、そして各溶解ウエルから得られる１０μｌを、Ａ５４９細胞を播種した平板のウエルに添加した（ＤＭＥＭ中１００μｌに播種したウエル当たり１×１０4個の細胞、前日に１０％ＦＣＳ）。感染の２日後、ウエルを、ＬａｃＺ活性のために染色した。感染ウエルの内、９６％が感染され、そして青色に染色した。染色した全てのウエルおよび多数のウエルは、１００％青色染色し、そしてそれゆえアデノウイルスベクター���有する全細胞の形質導入は、ｌａｃＺを担持することを示した。組織培養フラスコ中でのＭＯＩ実験から得られると推定すると、ウエル産生ウイルスのアデノウイルス滴定は、ｍｌ当たり１０6−１０7感染単位あたりである。
目的の発明は、未知機能の産物をコードするサンプル核酸（類）の宿主での高い生産量の送出および発現についての方法および組成物を開示する。方法は、セルラインを相補する構築、サンプル核酸を含み、アデノウイルス由来のプラスミドを、アデノウイルスベクターに封入し、宿主を、宿主中のサンプル核酸（類）の産物を発現するアデノウイルスベクターで感染し、サンプル核酸の産物（類）によって宿主で誘導される改変表現型を同定し、そしてそれにより、サンプル核酸によってコードされる産物（類）に対する機能を付与するアデノウイルス由来のプラスミドのライブラリーについて記述される。サンプル核酸は、例えば、合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡでありえ、そして例えば、ポリペプチド、アンチセンス核酸またはＧＳＥをコードできる。その方法は、十分に自動化でき、そして従来の高い生産量分析サンプル核酸ライブラリーに充てる多ウエルフォーマットで行われうる。
【０１１８】
（実施例１０）
治療的およびマーカー移入遺伝子を担持するＥ１およびＥ２Ａ欠失組換えアデノウイルスベクターの小型化多ウエル産生
ｃＤＮＡ配列のそれぞれのレパートリーを有するｃＤＮＡライブラリーの構築、小型化アデノウイルス産生システムのクローニング許容量を可能にするために、ＰＥＲ．Ｃ６の誘導体、主にＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａを使用した。このセルラインは、アデノウイルス発現カセットの３つの欠失：Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ３を有するベクターの産生を可能にする。これらの３つの欠失は、約１０．５ｋｂまでの長さの移入遺伝子サイズを示すベクターの理論的クローニングを認める。ここで、我々は、様々なヒトおよびマウスｃＤＮＡ、並びに追加のマーカー遺伝子を担持するＥ１およびＥ２Ａ欠失ベクターの産生を示す。
形質移入の前日、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、計数した。その後、細胞を、１００μｌ当たり２２．５００細胞の懸濁まで培養培地（１０％仔ウシ血清および１０ｍＭのＭｇＣｌ2を有するＤＭＥＭ）で希釈し、続いてポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）被覆９６孔平板（ベクトン・アンド・ディキンソン）のウエル当たり１００μｌを播種した。翌日、ＤＮＡ混合液にリポフェクタミン混合液を添加することによって、１００μｌの量の血清不含ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の２．６μｇの線状化アダプター分子および２．６μｇのＰａｃＩ線状化ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．デルタＥ２ＡプラスミドＤＮＡ（実施例１９参照）を、７４．４μｌ血清不含ＤＭＥＭに希釈した２５．６μｌリポフェクタミンと混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合液を、１．３ｍｌ血清不含培地が添加された後、室温に３０分間放置した。その後、後者の混合液を、形質移入の前に２００μｌのＤＭＥＭで洗浄したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ播種ウエルに添加（ウエル当たり３０μｌ）した。湿潤ＣＯ2インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ2）で３時間後、１０％仔ウシ血清および１０ｍＭのＭｇＣｌ2を有する２００μｌのＤＭＥＭを各ウエルに添加し、そしてその平板を、湿潤ＣＯ2インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ2）に戻した。翌日、各ウエルの培地を、１０％仔ウシ血清および１０ｍＭのＭｇＣｌ2を有する２００μｌのＤＭＥＭに交換した。その後、その平板を、ウエルが−２０℃で一夜凍結にかけ、続いて解凍し、そして反復ピペット採取によって再懸濁させた後、さらに７日間、湿潤ＣＯ2インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ2）に戻した。アリコート量の１００μｌの凍結／解凍した形質移入細胞を、上で正常な９６孔組織培養平板（平板２）で記述されるとおりに播種した新たなＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を有する平板の各ウエルに移行させた。培養し、それゆえ第一の形質移入平板の凍結／解凍細胞溶解液で感染させたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を有する第二の９６孔平板を、ＣＰＥ形成について調べ（図２７参照）、そして−２０℃で保存した。図２７で、新たなＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に対する凍結／解凍細胞の増殖の後等級付けされた細胞（ＣＰＥ陽性）ウエルを産生するウイルスの含有率が描かれた。明らかに、本出願の小型化システムは、様々な移入遺伝子挿入物を有するデルタＥ１／Ｅ２Ａ二重欠失ベクターの十分な産生を可能にする。
【０１１９】
（実施例１１）
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａを用いた小型化産生システムで生成されたアデノウイルスベクター粒子の定量
９６孔組織培養平板の１つのウエルで産生されるアデノウイルスベクターの力価を決定するために、アデノウイルスプラークアッセイを行った。
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、そして計数した。その後、細胞を、２ｍｌ当たり１．５×１０6細胞の懸濁まで培養用培地（１０％仔ウシ血清および１０ｍＭのＭｇＣｌ2を有するＤＭＥＭ）で希釈し、続いてＰＬＬ被覆６孔平板（ベクトン・アンド・ディキンソン）のウエル当たり２ｍｌを播種した。アデノウイルスベクター溶解液を含むマイクロタイター平板を解凍し、そして各アデノウイルスのランダムに選択したウエルの５０μｌを使用して、培養用培地中のアデノウイルスの一連の１０倍希釈を行った。同じ日に種播きされたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の培地を、ウエル希釈ウイルス当たり２ｍｌに交換し、そして５０−６０％単層を、湿潤ＣＯ2インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ2）でおよそ１６時間感染させた。感染後、細胞を、ウエル当たり３ｍｌのアガロース混合液（２×ＭＥＭ、２％仔ウシ血清、１ｍＭのＭｇＣｌ2、ＰＢＳおよび１％アガロース）で上に載せ、そして湿潤ＣＯ2インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ2）に戻した。２週間後、１つの陰性対照を含めた９つの個々のプラークを、２００μｌの培養用培地に移し、そして−２０℃で保存した。アリコート量の２５μｌのこの材料を使用して、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞（１００μｌ中のウエル当たり２．２５×１０4細胞）を感染し、感染前の１日に、９６孔組織培養平板に種蒔きした。これを、完全ＣＰＥの存在が観察されるまで、湿潤ＣＯ2インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ2）にインキュベートし、そして続いて−２０℃で保存した。
９６孔組織培養平板のウエルで産生されるアデノウイルスの最終力価を、個々のプラークを引き上げた１週間後に測定した。図２８で、９６孔平板のウエルに産生されたｐｆｕ／ｍｌでのアデノウイルスの力価が描かれる。０．８±０．７×１０9ｐｆｕ／ｍｌの平均力価は、３８４孔平板を用いた機能性ゲノムスクリーンでの特に細胞基本アッセイで必要とされるＭＯＩによって、十分なウイルスが、４００−４０００アッセイ（１００−１０のＭＯＩ）について産生されることを暗示する。これは、１つのライブラリーを用いた複数スクリーンを可能にする。
【０１２０】
（実施例１２）
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞におけるマイクロタイター平板で産生されるアデノウイルスベクターの品質
産生組換えアデノウイルスの機能性を試験するために、それぞれのアデノウイルスベクターに感染した細胞における以下の機能性アッセイを行った。
−β−ガラクトシダーゼアッセイ
−ｈＩＬ３アッセイ
−ルシフェラーゼアッセイ
−ｃｅＮＯＳアッセイ
−ＧＬＶＲ２アッセイ
−ＥＧＦＰアッセイ
【０１２１】
−β−ガラクトシダーゼアッセイ
Ａ５４９細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、そして計数した。その後、細胞を、１００μｌ当たり１０，０００個の細胞の懸濁まで培養用培地（１０％加熱不活性化ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）で希釈し、続いて、９６孔組織培養平板のウエル当たり１００μｌを種蒔きした。翌日、ｌａｃＺ形質導入アデノウイルス並びに陰性対照（新たなＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で増幅された一次ウエルおよびプラークの両方）を含む全ＣＰＥ陽性ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａウエルを使用して、Ａ５４９細胞を感染させた。この目的のために、凍結ウエルを解凍させ、そして各ウエルの２０μｌの凍結／解凍細胞溶解液を使用して、Ａ５４９細胞の１つのウエルを感染させた。感染の２日後、感染Ａ５４９細胞の培地を除去し、そして各ウエルを、２回、１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。洗浄後、ウエル当たり１００μｌ固定剤（１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルジアルデヒド）を添加することによって、細胞を、室温で５分間固定化した。細胞を、２回、ＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのＸ−ｇａｌ染色溶液（０．２ＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6、０．２ＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6、ＤＭＳＯ中のＸ−ｇａｌおよび０．１ＭのＭｇＣｌ2）を各ウエルに添加した。
ＣＰＥ陽性ウエルで感染されたウエルの全てが、青く染色した。多数のウエルは、１００％青色染色、そしてそれゆえｌａｃＺを担持するアデノウイルスベクターを有する全細胞の形質導入を示した（図２９参照）。
【０１２２】
ｈＩＬ−３アッセイ
感染の前日、Ａ５４９細胞を、上述のとおり播いた。翌日、ヒトインターロイキン−３（ｈＩＬ−３）形質導入アデノウイルス（新たにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で増幅された一次ウエルおよびプラークの両方）、並びに陽性および陰性対照を含む全ＣＰＥ陽性ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａウエルを使用して、Ａ５４９細胞を感染させた。この目的のために、凍結ウエルを解凍し、そして各ウエルの２０μｌの凍結／解凍細胞培養液を使用して、Ａ５４９細胞の１つのウエルを感染させた。感染の３日後、感染したＡ５４９細胞の１００μｌの上清上でのｈＩＬ−３濃度の定量を、ヒトＩＬ−３免疫アッセイ（商標クアンティキン）を用いて測定した。
ＣＰＥ陽性ウエルで感染されたウエルの全ては、高いｈＩＬ−３濃度を示した（図２９参照）。
【０１２３】
ルシフェラーゼアッセイ
感染の前日、Ａ５４９細胞を、上述のとおり播種した。翌日、ルシフェラーゼ形質導入アデノウイルス（新たにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で増幅された一次ウエルおよびプラークの両方）、並びに陽性および陰性対照を含む全ＣＰＥ陽性ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａウエルを使用して、Ａ５４９細胞を感染させた。この目的のために、凍結ウエルを解凍し、そして各ウエルの２０μｌの凍結／解凍細胞培養溶解液を使用して、Ａ５４９細胞の１つのウエルを感染させた。感染の２日後、感染したＡ５４９細胞の培地を除去し、そして各ウエルを、１００μｌのＰＢＳで洗浄した。１００μｌの１×レポーター溶解緩衝液（プロメガ）を添加したのち、ウエルを凍結／解凍にかけ、続いて２０μｌの凍結／解凍細胞溶解液でのルシフェラーゼ活性を測定した。
ＣＰＥ陽性ウエルで感染されたウエルの全ては、高いルシフェラーゼ活性を示した（図２９参照）。
【０１２４】
ｃｅＮＯＳアッセイ
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、そして計数した。その後、細胞を、１００μｌ当たり２２，５００個の細胞の懸濁まで培養用培地（１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ2でフェノール赤を欠いているＤＭＥＭ）で希釈し、続いて、９６孔組織培養平板のウエル当たり１００μｌを種蒔きした。翌日、ｃｅＮＯＳ形質導入アデノウイルス（新たなＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で増幅された一次ウエルおよびプラークの両方）、並びに陰性対照を含む全ＣＰＥ陽性ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａウエルを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を感染させた。この目的のために、凍結ウエルを解凍させ、そして各ウエルの２０μｌの凍結／解凍細胞溶解液を使用して、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の１つのウエルを感染させた。感染の３日後、５０μｌ着色溶液［１：１比でのグリッセＡ試薬（０．１％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）およびグリッセＢ試薬（５％リン酸中の２５％スルファニルアミド）］を、感染ＰＥＲ．Ｃ６Ｅ２Ａ細胞の５０μｌの上清に加えた。着色溶液を添加した後、陽性ｃｅＮＯＳ活性を示す上清は、直ぐにピンク色になった。
ＣＰＥ陽性ウエルに感染されたウエルの全ては、陽性ｃｅＮＯＳ活性を示した（図２９参照）。
【０１２５】
ＧＬＶＲ２両種性レセプターアッセイ
両種性レトロウイルスのためのレセプターであるＧＬＶＲ２のアデノウイルス指向性形質導入を、ヒト神経成長レセプター（ＮＧＦＲ）の切断バージョンを移行する両種性レトロウイルスの上清を使用する以外は、基本的に記述される（Ｌｉｅｂｅｒら、１９９５年）とおりに測定した。ＧＬＶＲ２アデノウイルスの上清で感染されたＣＨＯ細胞のレトロウイルス形質導入を、抗ＮＧＦＲ抗体およびフローサイトメーターを用いて検出した。
ＧＬＶＲ２形質導入アデノウイルス（新たにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で増幅されたプラーク）を含むＣＰＥ陽性ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａウエルで感染されたウエルの全ては、陽性のＧＬＶＲ２活性を示した（図２９参照）。
【０１２６】
ＥＧＦＰアッセイ
マイクロタイター平板フルオリメーター上で、またはフローサイトメーターによってＥＧＦＰ発現を測定した。
結論として、ウエルから生じた両方のウイルス、並びに生成ウエルから精製された（すなわち、クローン化された）プラークは、それらの別々の移入遺伝子の形質導入を示した。したがって、システムは、機能性アデノウイルスベクターの産生について高い忠実度を示し、そして試験された移入遺伝子の挿入物について異常な形態をなんら産生しない。
【０１２７】
（実施例１３）
ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６−Ｅ２Ａ細胞におけるアデノウイルスベクターの産生のための十分に精製したプラスミドＤＮＡを産生するＤＮＡ単離法
真核生物の細胞での形質移入調査のために使用されるプラスミドＤＮＡは、高いレベルの形質移入効率を達成するのに十分な純度および内毒素不含のものでなければならないことはよく知られている。イー．コリからプラスミドＤＮＡを精製するための従来の方法は、アルカリ性溶解手段（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ，Ｊ．の組換えプラスミドＤＮＡをスクリーニングする高速アルカリ性溶解手段。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ７巻：１５１３−１５２２頁（１９７９年））、続いて塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配上でのプラスミドＤＮＡの結合（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９年）参照）、または陰イオン交換樹脂での結合および溶出（例えば、キアゲン・インク．の商標キアゲン・プラスミド精製法；およびライフ・テクノロジーズの商標コンサート・プラスミド精製システム参照）を包含する。しかし、それらは、単離当たりに相当な手作業時間を必要とするので、これらの方法の全ては、高生産量ＤＮＡ単離には不適切である。したがって、そして単離当たりの経費を減少するために、他の方法を試験した。
ＳａｌＩ線状化アデノウイルスアダプタープラスミドｐＣＬＩＰ−ＳａｌＩ  ＬａｃＺおよびＥ２Ａ欠失ヘルパー断片ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．デルタＥ２Ａを使用して試験された方法：アルカリ溶解、続いてカラム基本のプラスミド精製（キアゲン）
１．アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびＴＥ緩衝液での溶解化２．アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化
３．アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化、続いてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
４．標準臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）プラスミド単離（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１６20；１４８８）
５．ｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化以外は、標準ＣＴＡＢプラスミド単離、続いてフェノール／クロロホルム抽出
等容量の生じたプラスミドを、ＳａｌＩ、続いてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で線状化させた。ＴＥ緩衝液での溶解化およびアガロースゲル上での検査に続いて、等容量のＤＮＡ（臭化エチジウム染色によって測定されるとおり）を、実施例９および１０で記述されるとおりリポフェクタミンを用いてＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に形質移入させた。増殖後、ウエルを、ウエル産生についての測定としてＣＰＥ形成について等級付けした。
図３０で、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の形質移入の後、アデノウイルスベクター（ＣＰＥ陽性）を産生する相当量のウエルが、ｐＣＬＩＰ−ＬａｃＺで形質移入され、６つの異なるプロトコルで精製した。キアゲン：標準アルカリ溶解、続いてキアゲン・プラスミド精製；ＡｌｋＬｙｓ：アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびＴＥ緩衝液での溶解化；ＡＬ＋ＲＮエース：アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮＡエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化；ＡＬ＋Ｒ＋フェノール：アルカリ溶解、続いてイソプロパノール沈殿、およびｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化、続いてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿；ＣＴＡＢ：標準ＣＴＡＢプラスミド単離ＣＴＡＢ＋フェノール：ｍｌ当たり１０マイクログラムでＲＮエースを含むＴＥ緩衝液での溶解化以外は標準ＣＴＡＢプラスミド単離、続いてフェノール／クロロホルム；ＤＮＡの品質が、６つ全て別々に単離されたプラスミドが、ＣＰＥで類似の量のウエルを産生したとき、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の、そしてそのウイルス産生の形質移入についての主な決定基でないことは明らかである。
結論として、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の、そしてそのウイルス産生の高い生産量の形質移入について、標準アルカリ溶解、続いてＴＥ緩衝液での溶解化の後、０．６容量のイソプロパノールで沈殿したプラスミドＤＮＡを使用するのに十分である。
【０１２８】
（実施例１４）
ミニチュア化された様式でのアデノウイルスベクターの創製のための未精製の消化アダプターおよびヘルパーアデノウイルスＤＮＡ分子の使用
総じての価格、および手法における誤差の機会を最小化し、かつ高スループット様式で組換えアデノウイルスを生産する場合のスループットを最大化するために、可能な限り多くの工程を省くのが望ましい。より小さく低いスループット規模でアデノウイルスベクターを創製する場合にもいずれのここでの改良も適用できる。組換えアデノウイルスを生産する場合に最も困難な自動化工程は、細胞のＤＮＡでのトランスフェクションに先立ってのＤＮＡクリーンアップ工程バイフェノールクロロホルム抽出（ｐ／ｃ）である。線状化後にＤＮＡを精製して無酵素ＤＮＡを得る。これは、アダプターおよびヘルパーＤＮＡ分子でのトランスフェクション後に高パーセンテージのウイルス生成を得るのに重要であると考えられる。ｐ／ｃ精製手法を省くためのさらなる動機は、ウイルスの創製に負の効果を有し得る、トランスフェクションで用いるＤＮＡにおける痕跡量のフェノールおよびクロロホルムの危険性である。従って、ｐ／ｃのクリーンアップの複雑な工程を、本出願のミニチュア化されたアデノウイルスベクター創製プロトコル主題から省くことができるか否かを調べた。この方法は、センスまたはアンチセンスｃＤＮＡ発現ライブラリーのごときライブラリーの高スループット構築の基礎を形成する。いくつかの独立した実験を行って、アデノウイルスベクター創製の効率に対するｐ／ｃ工程を省く効果をテストした。ｐ／ｃ精製は以下のごとくに行った。アダプター−ＤＮＡおよびｒＩＴＲ−ＤＮＡを適当に制限酵素で消化した後、等容量のフェノールおよびクロロホルム  （１：１）を添加し、徹底的に混合し、遠心した（５分、１４，０００ｒｐｍ）。水性層を新しいミクロ遠心管に移し、等容量のクロロホルムを加えた。再び、これを徹底的に混合し、遠心した（５分、１４，０００ｒｐｍ）。水性層を新しいミクロ遠心管に移し、１／１０容量３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容量の無水エタノールを添加した。これを−２０℃で少なくとも２０分間保持し、引き続いて遠心し（１５分、１４，０００ｒｐｍ）、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡを風乾し、適当な容量の滅菌水を添加した  （層流気流キャビネット中）。ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を用いてトランスフェクションを実施例９に記載したごとくに行った。全てのウイルスをＥ１およびＥ２Ａ欠失し、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞中で生産した。第１の実験では、（実施例１３に記載したごとく）６つの異なるＤＮＡ単離プロトコルのβ−ガラクトシダーゼ（ｐＡｄ５．Ｃｌｉｐｓａｌ．ＬａｃＺ）を含有するアダプター−ＤＮＡを分析し、ＣＰＥ形成につきモニタリングすることによってアデノウイルスベクターを生産するその効率を比較した。全てのＤＮＡ試料のうち、半分を適当な制限酵素  （ＳａｌＩ）を用いる線状化後にｐ／ｃ精製し、半分は線状化後に精製しなかった。制限酵素は加熱不活化した。なぜならば、ＳａｌＩ部位は使用され、かくして、ヘルパーＤＮＡの不慮の消化を排除するｒＩＴＲデルタＥ２Ａヘルパー断片に存在するからである。この実験においては、ｐ／ｃ精製ｒＩＴＲデルタＥ２ＡヘルパーＤＮＡを用いた。用いたＤＮＡ単離方法の全てにおいて、ＣＰＥは効率的に形成された（図３１���）。ある場合には、フェノールクロロホルム抽出による精製の省略は、より高いＣＰＥ効率を与えた。結論として、線状化酵素で消化したアデノウイルスアダプターＤＮＡは先行精製なくしてトランスフェクションで用いることができる。
第２の実験において、増強された緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）および増強された黄色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）（ｐＡｄ５．Ｃｌｉｐｐａｃ．ＥＧＦＰおよびｐＡｄ５．Ｃｌｉｐｐａｃ．ＥＹＦＰ）を含有するアダプター−ＤＮＡを用いて精製および精製しないことを比較した。Ｑｉａｇｅｎ単離方法を用いてアダプタープラスミド−ＤＮＡを単離した。用いたｒＩＴＲデルタＥ２Ａをｐ／ｃで精製した。トランスフェクション前に加熱不活化される必要のないＰａｃＩを用いてアダプター−ＤＮＡを線状化した。なぜならば、ｒＩＴＲに存在するＰａｃＩ部位はないからである。観察したＣＰＥのパーセンテージで首尾一貫した差異は見いだされず、アデノウイルスベクターの生産は効率的であった（図３１Ｂ）。第３の実験は過剰の変数を含むものであった。ｒＩＴＲを精製する必要性をテストした。用いたアダプターＤＮＡはＥＧＦＰ  （ｐＡｄ５．Ｃｌｉｐｐａｃ．ＥＧＦＰ）を含有し、Ｑｉａｇｅｎ単離方法を用いて単離した（図３０Ｃ）。トランスフェクションおよび増幅後の結果は、制限酵素消化後におけるアダプターおよびｒＩＴＲ  ＤＮＡ双方の精製は必要ないことを示す。
全ての結果を考慮し、アダプターＤＮＡおよびｒＩＴＲのフェノールクロロホルム精製工程は高パーセンテージのＣＰＥを得るのには、かくして、アデノウイルスベクター生産には必要ないことは明らかである。例えば実施例９および１０に記載された手法の前記修正の結果、自動設定においてアデノウイルスベクターライブラリーを創製した場合、およびより小さな規模で手動にてベクターを作成した場合にスループットの有意な増加がもたらされる。
【０１２９】
（実施例１５）
生産されたベクターの安定性に関するアデノウイルスベクターの生産
本明細書中で種々の実施例に記載した組換えアデノウイルスの創製は、マルチウェル組織培養プレートで増殖させたトランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６細胞（および誘導体）で生産されたウイルスの増幅から後ほぼ５ないし１１日後に機能的アデノウイルスが形成されるであろうことを示す。細胞病理学効果（ＣＰＥ）の観察は、機能的アデノウイルスが形成され、それが複製されつつあることを示す。トランスジーンインサートの性質および実験条件の変動はウイルス創製の速度論が可変的であるようにする。非常に多数のウェル、かくしてアデノウイルスベクターを含有するプレートを取り扱う高スループット設定において、プレートを収穫するのに間に合わせ、アデノウイルスベクター生産につきスコアを取るのは望ましい。アデノウイルスベクター創製における前記変動は、可能な限り長い間、すなわち、よりゆっくりとしたウェルも生産されたアデノウイルスベクターを持つようになるまでプレートの収穫を遅延させることによって克服することができる。この目的で、一旦、少数のウイルスから出発してそれが多数のウイルスまで生産されれば、本発明者らは組換えｌａｃＺアデノウイルス（ｐＣＬＩＰ−ｌａｃＺ）の安定性をテストし、次いで、力価を測定し（実施例１１参照）、加えて、３週間後までウイルスのｌａｃＺ形質導入能力を測定した。４．１０4細胞／ウェルを用い、Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を２列の９６−ウェルマイクロタイター組織培養プレートに接種した。プレートを３９℃で一晩インキュベートした。翌日、血清型５の精製されたＬａｃＺ−アデノウイルスベクターでＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａを感染させた。感染は、以下のスキームに従って異なるＭＯＩで行った  （合計２１プレート）。
【０１３０】
【表１】
0003672494.tif 000002
ウェル中で生産されたアデノウイルスの安定性に対する温度の効果を測定するために、７つのプレートを３２℃、７つのプレートを３４℃、および７つのプレートを３９℃でインキュベートした。感染後２、３、６、９、１３、１６および２１日に、かくインキュベーション温度に対する１つのプレートを凍結させた。以下の実験において細胞溶解物を用いた。生産されたアデノウイルスの形質導入能力を測定するために、Ａ５４９細胞を１．１０4細胞／ウェルにて９６−ウェルマイクロタイター組織培養プレートに接種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を５０μｌ細胞溶解物で感染させ、３７℃でインキュベートした。２日後、細胞を毒性につきスクリーニングし、続いてｌａｃＺ染色した。ＭＯＩを増加させ、感染時間を増加させると明瞭な毒性効果が観察された。以下の表は、全ての細胞がいつ全てのウェルで青色に染色されたかをまとめる。
【０１３１】
【表２】
0003672494.tif 000003
感染から３週間後に、１００％の青色細胞／ウェルが依然として観察され、かくして、全ての細胞はｌａｃＺを担うアデノウイルスベクターを持つ。かくして、これは３週間までのインキュベーションに際して低下した感染性を示さなかった。細胞溶解物におけるウイルスの感染性ウイルス粒子の数を測定するために、各インキュベート温度ＭＯＩに対応して感染から２、６および２１日インキュベートした試料につき力価測定アッセイを行った。感染から３週間後、ＭＬ当たり２×１０10ｐｆｕの平均力価が観察された。力価の全体像を図３２に与える。
前記実験は、プレートの収穫を可能な限り長く支援する、すなわち、より遅いウェルも生産されたアデノウイルスベクターを有するまで遅延することによって、アデノウイルスベクター創製における変動が克服できることを示す。本発明者らは増加するＭＯＩおよび増加する感染時間にて明瞭な毒性効果を観察したが、感染性の減少および生産されたアデノウイルスベクターの力価の減少はない。
【０１３２】
（実施例１６）
アンチセンスＤＮＡ配列を担い、アンチセンスｍＲＮＡ配列を発現するアデノウイルスベクターのミニチュア化された生産
アンチセンスｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いるスクリーンにおける内因性遺伝子発現を減少させることは、機能的ゲノミックスプログラムで非常に有用である。また、遺伝子有効化およびアンチセンス遺伝子治療剤の開発で個々のアンチセンスアデノウイルスベクターを用いることができる。その例はアンチセンス−血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の使用である。ＶＥＧＦは、内皮細胞の増殖を促進し、新生血管形成および神経膠細胞腫の増殖で主たる役割を果たす腫瘍血管形成における非常に重要な分子である。ＶＥＧＦ−アンチセンス分子はイン・ビボで腫瘍増殖を阻害する（Ｓｅｏｃｋ−Ａｈら，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９，  ８９５−９００）。アデノウイルスベクターで大きくかつ複雑なアンチセンスライブラリーを構築することは、機能的ゲノミックススクリーニングプログラムで価値があり非常に有用である。
実施例１０に記載されたごとくに、アンチセンス向きの規定されたヒトｃＤＮＡ配列および線状化ｒＩＴＲデルタＥ２ＡヘルパーＤＮＡを含有する線状化アダプターＤＮＡでＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を共トランスフェクトした。アダプターＤＮＡ中のアンチセンス向きにクローン化された遺伝子を後記表に記載する。ｐＣＬＩＰでは、トランスジーンインサートに応じて線状化するための部位としてのＳａｌＩまたはＰａｃＩにて２つの変異体を用いた。
【０１３３】
【表３】
0003672494.tif 000004
【０１３４】
図３３において、本発明のミニチュア化生産システムを用いるアンチセンスｃＤＮＡアデノウイルスベクターの創製のための前記ｃＤＮＡのいくつかの例を与える。これらのウイルスを用いてテストした細胞の内因性発現を低下させようと試みる。
【０１３５】
（実施例１７）
組換えアデノウイルスの創製および生産のための、特に、アデノウイルス発現ライブラリーの創製および生産のためのアダプタープラスミドの構築
センスまたはアンチセンスｃＤＮＡ配列の効果的なクローニングおよびこれらのベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーを含めた核酸のライブラリーの創製を可能とする、多重向きの多重クローニング部位を含有する（短いアダプター中の）アデノウイルスアダプタープラスミドを構築した。さらに、これらの新しいアダプタープラスミドは、左側アデノウイルスＩＴＲと境界を接する新規制限酵素認識配列およびＡｄ５ウイルスゲノムのヌクレオチド６０９５までヘルパー断片と重複する配列をこれらの新しいアダプタープラスミドは含有する。アデノウイルスアダプタープラスミドのこれらの修飾は、挿入されたトランスジーンまたはトランスジーンライブラリーの消化なくしてアダプタープラスミドを線状化する可能性を有意に増強する。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．デルタＥ２Ａでの共トランスフェクションに続き、改良されたアダプタープラスミドおよびアデノウイルスコスミドの間の相同組換えの結果、機能的アデノウイルスが創製される。
第１のアダプター構築体ｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ  （図３４Ａ）およびｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗ  （図３４Ｂ）はｐＡｄ５／ＣＬＩＰ−Ｐａｃに由来し、左側ＩＴＲの全面に−１１ｂｐ位に新しいＩ−ＰｐｏＩ線状化部を含有する。加えて、ｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗは、異なるまれな切断制限エンドヌクレアーゼおよびイントロン−コード化エンドヌクレアーゼのための制限酵素認識配列を含むＣＭＶプロモーターの下流に改良されたポリーリンカー配列を含有する。イントロン−コード化エンドヌクレアーゼのための認識配列は、ヒトゲノムを含めたゲノムで極端にまれであり、１１−２３塩基対よりなる。これらのイントロン−コード化エンドヌクレアーゼ−部位はアデノウイルスゲノムに存在しないので、無インサートｐＣＬＩＰ−ＩＰｐｏＩから得られた全アデノウイルスベクターゲノムに配列を直接挿入することができる（後記も参照）。
このアダプタープラスミドを構築するために、以下のプライマー：ＰＣＬＩＰＰＡＣＩＰＰＯ：５’−ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  Ｇ−３’およびＰＣＬＩＰＢＳＲＧＩ：５’−ＧＣＧ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  Ｇ−３’およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （ＬＴＩ；  Ｂｒｅｄａ，  オランダ国）からのＥｌｏｎｇａｓｅポリメラーゼを用い、ｐＣＬＩＰ−ＰａｃＩ鋳型プラスミドＤＮＡでのＰＣＲによって、Ａｄ５の左側ＩＴＲの一部を増幅した。プライマーｐＣＬＩＰ−ＰａｃＩはＩ−ＰｐｏＩ配列の５’側にＰａｃＩ部位を含有する。増幅された断片をＰａｃＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、同一酵素で消化したｐＡｄ５／ＣＬＩＰ−ＰａｃＩから得られた６４７１ｂｐの断片に２５５ｂｐの得られた断片をクローン化し、１％アガロースゲルで単離した。ジデオキシヌクレオチド配列分析によってヌクレオチド配列を確認した。各々、３３ヌクレオチドおよび１１ヌクレオチドの距離の左側ＩＴＲの５’側にＰａｃＩおよびＩ−ＰｐｏＩ認識配列を含有するこの構築体をｐＣＬＩＰ−Ｉ−ＰｐｏＩと命名した（図３４Ａ）。この構築体を引き続いて、ゲルで分離したＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これを用いて新しい合成リンカー配列を挿入した。２つの一本鎖のアニールしたオリゴヌクレオチド：ＬＩＮＫＥＲＰＯＬＹＮＥＷ−Ｓ：５’−ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  Ｔ−３’；およびＬＩＮＫＥＲＰＯＬＹＮＥＷ−ＡＳ：５’−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  Ａ−３’よりなるこのリンカー配列を消化した構築体に直接連結した。  ｐＣＬＩＰ−Ｉ−ＰｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗと名付けたこの構築体は、今や、ポリリンカー中に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰａｃＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩおよびＸｂａＩのための認識配列を含有する（図３４Ｂ）。このリンカーの正しい挿入は、各酵素での消化および配列分析によって証明した。
【０１３６】
ｐＣＬＩＰ−ベースのアデノウイルスアダプターよりも強力なＣＭＶプロモーターならびに異なるポリ（Ａ）配列を含有する異なるアダプター構築体ｐＡＤＡＰＴを骨格として用いて、アダプタープラスミドのもう１つの組を構築した。線状化の可能性を増強するために、多数のｐＡＤＡＰＴ誘導体を設計し、構築した。この目的で、ｐＡＤＡＰＴプラスミドＤＮＡをＳａｌＩで消化し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリ性ホスフォアターゼで処理して再連結を減少させた。以下の２つのリン酸化されアニールされたオリゴ：ＥｘＳａｌＰａｃＦ  ５’−ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡ−３’；およびＥｘＳａｌＰａｃＲ  ５’−ＴＣＧ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’よりなるリンカーを消化された構築体に直接連結し、それにより、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、ＳｗａＩおよびＰａｃＩによってＳａｌＩ制限部位を置き換えた。さらに、以下のプライマー：ＰＣＬＩＰＭＳＦ：５’−ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ−３’およびｐＣＬＩＰＢＳＲＧＩ（前記参照）を用いるＰＣＲによって、ｐＡＤＡＰＴの左側ＩＴＲの一部を増幅した。増幅した断片をＭｕｎＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐＣＬＩＰ−ＥｃｏＲＩにクローン化し、これを部分的にＥｃｏＲＩで消化し、精製後にＢｓｒＧＩで消化した。制限酵素分析後に、構築体をＳｃａＩおよびＳｇｒＡＩで消化し、８００ｂｐ断片をゲルから単離し、ＳｃａＩ／ＳｇｒＡＩ消化ｐＡＤＡＰＴ＋ＥｘＳａｌＰａｃリンカーに連結した。ｐＩＰｓｐＳａｌＡｄａｐｔと命名された得られた構築体（図３４Ｃ）をＳａｌＩで消化し、脱リン酸化し、前記したリン酸化ＥｘＳａｌＰａｃＦ／ＥｘＳａｌＰａｃＲ二本鎖リンカーに連結した。ＰａｃＩ部位がＩＴＲに最も近いクローンを制限分析によって同定し、配列分析によって配列を確認した。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔと命名されたこの新規なｐＡＤＡＰＴ構築体（図３４Ｄ参照）は、かくして、ＰａｃＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＢｓｔＢＩのための認識配列を含有する２つのＥｘＳａｌＰａｃリンカーを保有し、これはアデノウイルスアダプター構築体のアデノウイルス部分を囲み、かつアデノウイルスヘルパー断片での共トランスフェクションに先だってプラスミドＤＮＡを線状化するのに用いることができる。
【０１３７】
さらにトランスジーンクローニング過突然変異を増大させるために、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに基づいて多数のポリリンカー変異体を構築した。この目的で、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔをまずＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した。以下の２つのリン酸化されアリールされたオリゴ：Ｅｃｏｌｉｎｋｅｒ+：５’−ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  Ｃ  ３’およびＥｃｏｌｉｎｋｅｒ-：  ５’−ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  Ｇ  ３’よりなるリンカーをこの構築体に連結し、それにより、ＡｓｃＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩのための制限部位を生じさせた。両方の向きの、このリンカーが得られ、制限分析および配列分析によって配列を確認した。順番５’  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＡｇｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｓｃＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＣｌａＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｐａＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでポリリンカーを含有するプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ１と命名し（図３４Ｅ参照）、他方、順番ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩ、ＨｐａＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでポリリンカーを含有するプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２と命名し（図３４Ｆ参照）。ｃＤＮＡライブラリーを作成する分野の同業者であれば、オリゴＧａｌＭｌｕ−Ｆ：５’−ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  Ｃ−３’およびＧａｌＭｌｕ−Ｒ：５’−ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＡＴ−３’よりなる過剰ポリリンカーがｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ１のＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入してｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６を生じることを認識するであろう（図３４Ｇ参照）。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６はＲｓｒＩＩ、ＭｌｕＩおよびＮｒｕＩのための過剰制限部位を含有し、これを導入してＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位の間の距離を増大させ、これはこれらの酵素の組合せの消化を改良するであろう。さらに、それらは、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでの制限に先だってこのベクターのプレ−消化および脱リン酸化を可能とし、これは個々のインサートまたはＳａｌＩ−およびＮｏｔ−適合突出を持つライブラリーの場合にバックグラウンド組換えを減少させるであろう。また、ＧａｌＭｌｕオリゴをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２にクローン化し、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ７に至る（図３４Ｈ参照）。
他のセンスまたはアンチセンス構築体のクローニングを容易とするために、以下の２つのオリゴヌクレオチドよりなるリンカーを設計してｐＩＰｓｐＡｄａｐｔのポリリンカーを逆にした：ＨｉｎｄＸｂａ+  ５’−ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  Ａ−３’：ＨｉｎｄＸｂａ-  ５’−ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  Ｇ−３’。このリンカーをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化のｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに連結し、正しい構築体を単離した。制限酵素分析および配列決定によって確認を成した。この新しい構築体ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔＡ（図３４Ｉ参照）をＥｃｏＲＩで消化し、前記Ｅｃｏｌｉｎｋｅｒをこの構築体に連結した。両方の向きの、このリンカーが得られ、その結果、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ３が得られ（図３４Ｊ参照）、これは順番ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｓｃＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＣｌａＩ、ＮｏｔＩ、ＡｇｅＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでポリリンカーを含有する。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ４は順番ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｇｅＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでポリリンカーを含有する（図３４Ｋ参照）。全ての配列は制限酵素分析および配列決定によって確認した。
【０１３８】
前記したごとく、イントロン−コード化エンドヌクレアーゼはまれな切断酵素であり、アデノウイルスゲノムを消化しない。当業者であれば、これらの酵素はアデノウイルスゲノムにおける配列の直接的連結を可能とすることを認識するであろう。というのは、それらはアデノウイルスゲノムに認識配列を有しないからである。ポリリンカー中のイントロン−コード化エンドヌクレアーゼのための認識配列を含有するｐＡＤＡＰＴバージョンを得るために、一本鎖配列：５’−ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＡＡＴ−３’；および５’−ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＴＴＡ−３’よりなる、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化したｐＩＰｓｐＡｄａｐｔにリンカーを連結した。このリンカーは４つのオリゴ：ＩｎｔｒｏｌｉｋｅｒＦ１、ＩｎｔｒｏｌｉｋｅｒＦ２、ＩｎｔｒｏｌｉｋｅｒＲ１およびＩｎｔｒｏｌｉｋｅｒＲ２よりなり、イントロン−コード化エンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＰｐｏＩおよびエンドヌクレアーゼＰａｃＩおよびＳｗａＩのための認識配列を含有する。構築体の正しさは配列分析によって確認し、構築体はｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５と詠んだ（図３４Ｌ参照）。
ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５またはｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗを含有するウイルスからのアデノウイルスＤＮＡを単離し、コスミドベクターｐＷＥ１５／ＳｎａＢ１にクローン化した。リン酸化オリゴヌクレオチドＰａｃＳｎａ：５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’を自己アニーリングし、ＰａｃＩ−消化し、脱リン酸化したｐＷＥ１５／ＰＡＣ、ｐＷＥ１５の誘導体  における得られた二本鎖配列を連結することによって、ｐＷＥ１５／ＳｎａＢ１を創製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ら編  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  第２版．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）。 これはＳｎａＢ１についての制限部位を生じ、これはＰａｃＩ部位によって近接挟まれている。アデノウイルスＤＮＡ−含有コスミドの創製については、平滑末端化したアデノウイルスＤＮＡをＤＮａｓｅ、プロテイナーゼＫを用いる標準実験室的手法に従って単離し、続いてアニヨン交換樹脂回転カラムで溶出した。モル過剰の得られた精製アデノウイルスＤＮＡをＳｎａＢ１−制限ｐＷＥ１５／ＳｍａＢ１に連結し、得られた連結混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ２細胞  （ＬＴＩ，  Ｂｒｅｄａ）にトランスフェクトした。
得られたプラスミドＤＮＡをイン・ビトロ連結で引き続いて用いた（図３４Ｍ参照）。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５−由来コスミドＤＮＡの使用は以下における例として使用されるであろう：適合する突出を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドをＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位の間、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＰｐｏＩの間、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩの間、およびＩＳｃｅＩおよびＩ−ＰｐｏＩの間で連結した。引き続いて、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて連結後に構築体を線状化し、それにより、左側および右側ＩＴＲを遊離させるのみならず、非組換え体を排除した。この場合、ＰＥＲ．Ｃ６／ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッキング細胞またはその変異体におけるトランスフェクションで連結混合物を直接的に用い、それにより、機能的アデノウイルスを生じさせるための交差または相同組換え事象の必要性を排除することができる。
【０１３９】
代替法として、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５またはｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗから作成したアデノウイルスＤＮＡを含有するアダプタープラスミドおよびコスミドを用いて、左側ＩＴＲおよびポリリンカーの第１の部分の間の領域を含むか、あるいはポリリンカーの第２の部分を右側ＩＴＲまで含む断片を生じさせた。左側および右側ＩＴＲは区別される非適合制限酵素で線状化されることに注意されたい。というのは連結効率はさもなければひどく低下するからである。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５−由来コスミドＤＮＡは例として用いられる：プラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５をＢｓｔｂＩ−ＣｅｕＩまたはＢｓｔＢＩおよびＩ−ＳｃｅＩいずれかで切断して左側ＩＴＲを含有するアデノウイルス断片を生じさせた。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５−由来アデノウイルスＤＮＡを含有するコスミドをＩ−ＰｐｏＩおよびＰａｃＩまたはＰＩ−ＳｃｅＩおよびＰａｃＩで制限して、右側ＩＴＲを含有する断片を生じさせた。左側および右側ＩＴＲを含有する断片を０．８％アガロースゲルで単離し、アニオン交換樹脂で精製した。引き続いて、５’末端におけるＩ−ＣｅｕＩまたはＩ−ＳｃｅＩまたは３’末端におけるＩ−ＰｐｏＩまたはＰＩ−ＳｃｅＩいずれかのための適合突出を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、左側および右側ＩＴＲを含有する断片と等モル量にて連結した。得られた連結混合物を、ＰＥＲ．Ｃ６／ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッキング細胞またはその変異体へのトランスフェクションのために用い、再度、機能的アデノウイルスを生じさせるための交差または相同組換え事象の必要性を排除した。
【０１４０】
イン・ビトロで連結産物の直接的トランスフェクションは、アデノウイルスベクターＤＮＡを単離する別の方法から利益を受ける。イン・ビトロ連結反応のトランスフェクション後にウイルス生産の効率を改良するために、アデノウイルスベクターＤＮＡを精製アデノウイルス粒子から単離することができる（Ｐｒｏｎｋ，  Ｒ．ら，  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０２：Ｓ３９−Ｓ４５  （１９９２））。このビリオンＤＮＡはＩＴＲ配列に共有結合した末端蛋白質（ＴＰ）の２分子を含有する。ＴＰ−ＤＮＡは無蛋白質ＤＮＡと比較して２０倍を超えてアデノウイルスＤＮＡ複製を刺激する。従って、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５−またはＰＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗ−由来アデノウイルスＤＮＡは、記載されているごとくグアニジニウム塩酸塩を用いてビリオンから単離することができる（Ｖａｎ  Ｂｅｒｇｅｎ，  Ｂ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１：１９７５−１９８９  （１９８３））。このＤＮＡをイントロン高度化制限エンドヌクレアーゼの適当な組合せで消化し、イン・ビトロ連結反応で用いた。連結後、ＰａｃＩでの消化によって非組換え体を除去した。さらなる手法は前記され、実施例１０におけるものであり、およびそれを超えるものである。例としてｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２についての図３４Ｎに示されたごとく、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔアダプタープラスミドを、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッキング細胞においてｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲＢＥ２Ａで共トランスフェクトして、組換えアデノウイルスを生じさせた。
【０１４１】
（実施例１８）
ミニチュア化アデノウイルスベクター生産系におけるより大きなＤＮＡインサートのクローニングのためのＥ３領域に欠失を持つＥ１−欠失またはＥ１＋Ｅ２Ａ−欠失組換えアデノウイルス
培養細胞ではアデノウイルスの複製、パッキングおよび感染にＥ３−コード化蛋白質のいずれも要しないことは知られている。これは、組換えアデノウイルスからのＥ３領域の可能な除去を成し、最大パッキング能力を超えることなくより大きな遺伝子または複雑な調節エレメントを挿入する機会を生じる。例えば、Ｅ３領域の一部は、（Ａｄ５  ｗｔ配列２８５９２−３０４７０に対応する）ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を欠失することによって除去することができる。もう１つの例は、ｐＶＩＩＩの停止コドンおよび（Ａｄ５  ｗｔ配列２７８６５−３０９９５に対応する）繊維の翻訳開始コドンの間の配列が除去されたＥ３領域の拡大された欠失である。
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａの創製：
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１６）からのＥ２Ａコーディング配列の欠失は以下のごとく達成された。左側および右側部位におけるＥ２Ａコーディング領域を近接挟むアデノウイルス配列を、製造業者のプロトコルに従い、Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲシステム  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でのＰＣＲ反応でプラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ．ｒＩＴＲ  （ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１９）から増幅した。以下のプライマーを用いた：
【０１４２】
右側フランキング配列（対応するＡｄ５ヌクレオチド２４０３３ないし２５１８０）：
ΔＥ２Ａ．ＳｎａＢＩ：  ５’−ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’
ΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−スタート：  ５’−ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＣ−３’
増幅されたＤＮＡ断片をＳｎａＢＩおよびＮｓｉＩで消化した（ＮｓｉＩ部位を下線を施した、プライマーΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−スタート中に生じさせた）。
【０１４３】
左側フランキング配列（対応するＡｄ５ヌクレオチド２１５５７ないし２２４４２）：
ΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−停止：  ５’−ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  Ｇ−３’
ΔＥ２Ａ．ＢａｍＨＩ：    ５’−ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＧＡＧ−３’
増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＮｓｉＩで消化した  （ＮｓｉＩ部位を下線を施した、プライマーΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−停止中に生じさせた）。引き続いて、消化されたＤＮＡ断片をＳｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ消化のｐＢｒ／ａｄ．ＳａｌｒＩＴＲに連結した。配列決定により、プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２ＡにおけるユニークなＮｓｉＩ部位でのＤＢＰコーディング領域の正確な置換が確認された。ユニークなＮｓｉＩ部位を用いて、組換えベクターによって導入されるべき遺伝子のための発現カセットを導入することができる。
Ｅ２Ａコーディング配列の欠失は、頂部ストランドにおける１００Ｋコーディング２４０４８位のＬ４−遺伝子のスプライスアクセプター部位が無傷のままであるように行った。加えて、Ｅ２Ａコーディング配列の左側部位における元のＥ２Ａ−ＲＮＡおよびＬ３−ＲＮＡのポリアデニル化シグナルは無傷のままであった。これは、アデノウイルスのライフサイクルの間におけるＬ３−遺伝子および１００Ｋ  Ｌ４−蛋白質をコードする遺伝子の適切な発現を保証する。
次に、プラスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを生じさせた。プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２ＡをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。Ｅ２Ａコーディング領域がユニークなＮｓｉＩ部位によって置き換えられた３．９−ｋｂ断片を単離した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。それからＥ２Ａコーディング配列を含有するＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ断片が除去された３５  ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離した。断片を連結し、製造業者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってλファージ−パッキング抽出物を用いてパッキングし、プラスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを得た。このコスミドクローンを用いて、アデノウイルスベクターを生じさせ、消化されたアダプタープラスミドと共にＰａｃＩ消化ＤＮＡを、機能的Ｅ２Ａ遺伝子産物を発現するパッキング細胞に共トランスフェクションすることによってＥ２Ａにつき欠失することができる。Ｅ２Ａ補充細胞系の例は後でおよび次に記載する：
【０１４４】
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐの創製
ベクターｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲにおける３’ＩＴＲは末端Ｇ−ヌクレオチドを含まない。さらに、ＰａｃＩ部位は右側ＩＴＲからほとんど３０ｂｐのところに位置する。これらの特徴は共に、３’ＩＴＲにおける複製の効果的でない開始のためウイルス創製の効率を減少させ得る。ウイルスの創製の間に、アダプタープラスミドにおける左側ＩＴＲは無傷であり、相同組換え後にウイルスＤＮＡの複製を可能とすることに注意されたし。
３’ＩＴＲにおける複製の開始の効率を改良するために、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲを以下のごとく修飾した：構築体ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ＃２をまずＰａｃＩでまず消化し、次いで、ＡｖｒＩＩで部分的に消化し、断片を含有する１７．８ｋｂベクターを単離し、ＳＡＰ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて脱リン酸化した。この断片はヌクレオチド３５４６４ないし該３’ＩＴＲからアデノウイルスを欠く。鋳型としてのｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲおよびプライマーＩＴＲ−ＥＰＨ：
５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ−３’および
Ａｄ１０１：  ５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＧＣ−３’を用い、６３０ｂｐ  ＰＣＲ断片を３’Ａｄ．５配列に対応させて生じさせた。この断片を引き続いてベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＰＣＲ断片を含有するクローンを単離し、配列決定して該ＤＮＡの正しい増幅をチェックした。次いで、ＰＣＲクローンをＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、０．５ｋｂアデノインサートを、ＰａｃＩ／部分的ＡｖｒＩＩ消化のｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ＃２断片に連結し、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐを生じさせた。次に、この構築体を用いて、アデノ配列３５３４ないし３５９３８に対応するインサートを有するコスミドクローンを生じさせた。このクローンをｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐと命名した。
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａの創製
プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐをＥ．  ｃｏｌｉ株ＤＭ１  （ｄａｍ-，  ｄｃｍ-）  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において増殖させた。プラスミドをＸｂａＩで消化し、１．８８−ｋｂ  ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を除去し、再度連結した。得られたクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａを用いて記載されているごとくにヘルパーコスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａを構築した。略言すると、以下の断片をアガロールゲル（ＱＩＡＧＥＮ）からの抽出によって単離し：ｐＷＥ．ｐａｃをＰａｃＩで消化し、ｐＢｒ／ＡｆｌＩＩ−ＢａｍをＰａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、およびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＸｂａをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化した。これらの断片をいっしょに連結し、製造業者の指示  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってラムダファージパッキングを用いてパッキングした。宿主細菌で組み立てたファージ感染後、得られたコロニーを無傷インサートの存在につき分析した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａはｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐのそれと同一な配列を含有するが、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片は欠失している。
【０１４５】
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａの創製
Ｅ２ＡおよびＥ３の二重欠失を持つＥ１−欠失組換え体アデノウイルスの創製のために、プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａを構築した。Ｅ２Ａ欠失を含有するＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａから単離し、ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−消化のｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＸｂａに挿入し、プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａを得た。このプラスミドを用い、前記したごとく３断片連結を用いてヘルパーｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａを構築した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＸｂａはｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐのそれと同一な配列を含有するが、Ｅ２Ａ領域およびＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片の二重欠失を有する。
【０１４６】
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ３およびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ３のおよびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＥ３およびｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＥ３の創製
なおより大きなＤＮＡ断片の挿入を行うために、完全なＥ３コーディング領域が除去されたＥ３領域の拡大された欠失を構築した。プライマー１（５’−ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ−３’）（配列番号：１）および２（５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＣＣＧ−３’）（配列番号：２）を用いて、ｗｔＡｄ５ゲノムにおける配列２７３２６ないし２７８５７に対応する、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐからの配列を増幅した。プライマー３（５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＣＧＣ−３’）（配列番号：３）および４（５’−ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ−３’）（配列番号：４）を用いて、ｗｔ／Ａｄ５ゲノムにおける配列３０９９４ないし３５５０２に対応する、同一ＤＮＡ鋳型からの配列を増幅した。増幅産物を、各々、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩおよびＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、一緒に連結した。ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化されたｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐおよびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２Ａのベクターに得られたＥｃｏＩ−ＡｖｒＩＩ断片をクローン化し、各々、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ３およびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔＥ３を得た。これらの２つのプラスミドを用いて前記したごとくにコスミドヘルパー分子を構築した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ３はｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐのそれと同一の配列を含有するが、ｗｔ  Ａｄ５ゲノムにおける配列２７８５７−３０９９４に対応するＥ３領域の欠失を用い、他方、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ２ＡΔｄＥ３はｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐΔＥ３と同一であるが、Ｅ２Ａ領域のさらなる欠失を持つ。
前記したコスミドは、アデノウイルス発現ライブラリ、特に、大きなインサートのコレクションを担うライブラリの生産で特に有用である。また、実施例１９および２０参照。
【０１４７】
（実施例１９）
治療およびマーカートランスジーンを担うＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ３欠失組換え体アデノウイルスベクターのミニチュア化されたマルチウェル生産
実施例１０に記載したごとく、Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ３の組合せ欠失は、サイズがほぼ１０．５ｋｂまでの外来性ＤＮＡ配列のクローニングを可能とする。ここに、本発明者らは、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞におけるｃＤＮＡならびにマーカー遺伝子を担うＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ３欠失ベクターの生産を示す。
細胞培養条件は実施例１０に記載した。ＤＮＡトランスフェクションについては、実施例１４に従ってアダプターおよびヘルパー分子を調製した。４つの異なるＰａｃＩ−線状化ヘルパーコスミド、すなわち、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ．ｄＥ２Ａ、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ．ｄＸｂａ、およびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲでの組合せにおけるトランスフェクションのために、線状化アダプタープラスミドｐＡＤ／ＣＬＩＰ−ｃｅＮＯＳおよびｐＡＤ／ＣＬＩＰ−ｌａｃＺを用いた。ＤＮＡトランスフェクション手法は実施例１０に記載したものと同一であった。凍結−解凍溶解物の１００μｌのアリコットを用いて、第２の９６−ウェルプレートをＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞で感染させ、ＣＰＥ形成をモニターした。図３５は、凍結／解凍したトランスフェクト細胞の増殖後におけるＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の９６−ウェルプレートにおけるウイルス生産ウェル（ＣＰＥ陽性）のパーセントを示す。明らかに、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞において治療およびマーカートランスジーンを担うＥ１およびＥ３欠失組換え体アデノウイルスベクターを生産することが可能である。
【０１４８】
（実施例２０）
表現型の選択のためのセンスまたはアンチセンスの整列されたアデノウイルス発現ライブラリの構築
アデノウイルスベクター生産のミニチュア化はクローン化したまたはプールした遺伝子発現ライブラリの大規模、高スループット構築を可能とする。ＰＥＲ．Ｃ６（および誘導体）に基づいてアデノウイルスベクター様式でクローン化し整列させたｃＤＮＡ発現ライブラリを構築するために、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用い、ヒト胎盤のポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを単離し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＬＴＩ；Ｂｒｅｄａ，  オランダ国）ごとき販売業者によって供給された材料および試薬を用いてｃＤＮＡに変換した。得られた二本鎖ｃＤＮＡ分子は５’末端にＳａｌＩ−適合突出および３’末端にＮｏｔＩ−適合突出を含有する。全ｃＤＮＡを（ｃＤＮＡインサートのセンス向きのための、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６または（ｃＤＮＡインサートのアンチセンス向きのための）ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ７に連結した（アダプター立体配置については実施例１７参照）。このために、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６およびｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ７を制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩで消化し、続いて熱感受性アルカリ性ホスファターゼ（ＬＴＩ）を用いて５’突出を脱リン酸化した。ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでの消化後、０．８％アガロースゲルで線状化プラスミドを単離し、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。プラスミドへのｃＤＮＡ分子の連結に続き、ＢＴＸ６００電気細胞操作機または同等物でのエレクトロポレーションによってＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａエレクトロコンピテント細菌に得られたライブラリを導入した。非増幅ライブラリを分割し、グリセロールストックとして凍結した。
平板培養の日に、バイアルを解凍し、１．５％寒天および１ｍｌ当たり５０マイクログラムのアンピシリンを含むＬＢ培地を含有する大きなペトリ皿に平板培養した。平板培養したコロニーの均一な分布を得るために、平板培養しつつガラスビーズを用いた。３７℃での一晩の増殖後、寒天−プレートを自動コロニーピッキングロボットに移した（Ｆｌｅｘｙｓ；  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。個々のコロニーを拾い、ロボットによって３００μｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地および１ｍｌ当たり５０マイクログラムのアンピシリンを含むマイクロタイタープレートに移した。このようにして接種したプレートを、次いで、酸素を通気するＨｉＧｒｏインキュベーター（Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ）に移し、製造業者のマニュアルに従って１２−１６時間増殖させた。しかる後、個々のプラスミドをＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されたごとく通常のアルカリ性溶解プラスミドＤＮＡ単離方法によって個々のプラスミドを単離した。このために、プレートをまず遠心機（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０ＲまたはＨｅｒａｅｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  ２．０）に移し、細菌を１５００×ｇで２０分間ペレット化した。液体ロボットハンドラーを用い、個々のプレートの個々のウェル中の上清を取り出し、捨てた。細菌ペレットを、５０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１００μｌの２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０に懸濁させ、１００μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳを添加することによって細菌を溶解させる。１００μｌの５Ｍ酢酸カリウムを添加することによる中和に続き、真空マニフォールドを用い、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＮＡ溶解物清浄プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂ．Ｖ．，  Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ）またはその同等物での濾過によって清浄溶解物を得る。引き続いて、２００μｌの２−イソプロパノールを添加し、４℃にて３０分間１５００×ｇで遠心することによって、清浄溶解物中のプラスミドＤＮＡを沈殿させる。７０％エタノールで沈殿を一回洗浄し、風乾後、２０μｌのＴＥに取る。
各ウェルからのプラスミドＤＮＡのアリコットを適当な希釈の新鮮なプレートに移すことによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｅｕｇｅｎｅ，  オレゴン州、米国）によって記載されているごとくＰｉｃｏｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ定量キットを用いて、各個々のウェル中の単離されたプラスミドＤＮＡを定量する。一方、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａのごとき誘導体を、ミニチュア化アデノウイルス創製のための他の例下で記載されたごとく接種する。各ウェルでは、５５ナノグラムの精製されたプラスミドＤＮＡを新しいプレートに移し、６５℃で６０分間ＰｉＰｓｐＩで線状化した。次いで、このプラスミドを適当なヘルパーＤＮＡ分子（例えば、（ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．デルタＥ２Ａのごとき）Ｅ２Ａ欠失またはＥ２Ａ／Ｅ３欠失またはＥ２Ａ／Ｅ３／Ｅ４欠失、例えば、実施例１８参照）でＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッキング細胞に共トランスフェクトする。トランスフェクションは、マイクロタイタープレートにおけるアデノウイルス創製のための実施例９、１０または２５に記載された実験および方法と同様である。個々のウェルにおけるウイルス形成は、ＣＰＥ形成、ブロットベースのウイルスアッセイまたはレポーターシステムを用いて定量する。次いで、整列されたアデノウイルスライブラリーは細胞ベースのスクリーニングで用いる準備ができており、ここに、特定の表現型につき選択することができる。
図３６において、前記したごとくに構築し整列されたアデノウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリーのスキームにつき概観を与える。このスキームは、高スループット様式での個々にクローン化されたアデノウイルスベクターライブラリーのライブラリーの構築を記載する。プールされたライブラリーに対するこの戦略の改良は、増殖利点を持つウイルスについての偏りが起こり得ないことである。これは、ライブラリーの個々のメンバーがライブラリーの平板培養後の個々のコロニー戦略の様式であり、全てのさらなる手法の間に個々に維持されるからである。
アデノウイルス発現ライブラリーは、この目的で設計した適当な未修飾細胞タイプまたはレポーター細胞系いずれにおけるキャピラリー形成、細胞増殖、細胞移動またはマーカー遺伝子発現のごとき特定の表現型の選択に適当な異なる細胞の感染である。これらの表現型の検出は、例えば、形態変化またはレポーター蛋白質の細胞内局所化の変化の自動イメージ分析を用いてなすことができる。一旦これが選択されると、クローン化細菌ＤＮＡバージョンは、Ｅ．  ｃｏｌｉで生産されたｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６またはｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ７アダプタープラスミドの形態で配列分析に直ちに利用できる。これは、プールされたレトロウイルスまたはプラスミド−ベースの発現ライブラリーの場合のように救済が必要ではないことを意味する。
所望であれば、（例えば、液体ハンドラーロボットを用いまたは手動により）、一列または一行あるいは１つのプレートまたは複数プレートに個々のアデノウイルスベクターを含有する個々のウェルをアッセイを行う前にプールすることができる。これは、もし所望のアッセイが高スループット分析に使用できず、合計数のウェルが初代スクリーニングで減少させる必要がある場合に当てはまる。プールされたが外来クローン化されたアデノウイルスベクターのさらなる改良または利点は、マルチ遺伝子依存性表現型が選択できることである。
【０１４９】
（実施例２１）
３８４ウェル組織−培養プレートのウェルにおけるウイルス生産
特に、この実験は、以下の些細な変化を除き、実施例１０に記載されたごとくに行われた。トランスフェクションの前の日に、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を培養培地（１０％胎児ウシ血清および１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＤＭＥＭ）で２５μｌ当たり１１．２５０細胞の懸濁液に希釈し、続いて、１６チャンネルマルチチャンネルピペット（Ｆｉｎｎ）を用い３８４−ウェル−組織−培養プレートのウェル当たり２５μｌ接種した。１．３ｍｌの無血清ＤＭＥＭをＤＮＡ／リポフェクチミン混合物に添加した後、ウェル当たり１５μｌのこの混合物を、次いで、トランスフェクションに先だって２５μｌのＤＭＥＭで洗浄したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ接種ウェルに添加した。湿潤インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ２）における３時間後、５０μｌ培養培地を各ウェルに添加し、プレートを湿潤インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ２）に移した。翌日、各ウェルの培地を５０μｌの培養培地で置き換えた。次いで、プレートを湿潤インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ２）にさらに４日間戻し、しかる後、ウェルを−２０℃の一晩の凍結に付し、続いて、解凍し、反復ピペッティングによって再懸濁した。凍結／解凍トランスフェクト細胞の２５μｌのアリコットを、３８４−ウェル−組織プレート（プレート２）上に前記したごとくに接種した新鮮ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含むプレートの各ウェルに移した。第１のトランスフェクトしたプレート凍結／解凍細胞溶解物と共にインキュベートし、かくしてそれで感染させたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含む第２の３８４−ウェルプレートをＣＰＥ形成につきチェックし、−２０℃で貯蔵した。前記実験は２回行った。図３７において、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に対する凍結／解凍トランスフェクト細胞の増殖後にスコア取りしたパーセントＣＰＥ陽性ウェルを示す。
【０１５０】
（実施例２２）
ウイルス形成のスピードおよび生産効率に対する、増殖の省略または増殖の代わりの培養培地の更新の効果
全手法の単純化のための自動コールにより適用できるミニチュア化アデノウイルスベクター生産のプロセスを作成する。１つの労力がかかり時間を浪費する工程は、新鮮な細胞でのトランスフェクトＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞からの細胞溶解物の増殖であり、従って、この工程の省略が望ましい。以下の実験がこの目標に到達する。凍結／解凍トランスフェクトＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞（例えば、実施例１０その他参照）を用いて新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞（増殖）感染させるかまたは全く増殖を省略する代わりのトランスフェクト細胞の培地の変更の効果を測定するために、以下の実験を行った。トランスフェクションの前日に、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて収穫し、計数した。次いで、細胞を培養培地（１０％胎児ウシ血清および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＤＭＥＭ）で１００μｌ当たり２２．５００細胞の懸濁液に希釈し、続いて、９６−ウェル−組織培養プレートのウェル当たり１００μｌ接種した。翌日、１００μｌの無血清ダルベッコウの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）の容量中の２．６μｇの線状化アダプター分子および２．６μｇのＰａｃＩ線状化ｐＷＥ−Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｄＥ２ＡプラスミドＤＮＡを、リポフェクタミンミックスをＤＮＡミックスに添加することによって、７４．４μｌ無血清ＤＭＥＭ中に希釈した２６．５μｌリポフェクタミンを混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を室温で３０分間放置し、しかる後１．３ｍｌの無血清ＤＭＥＭを添加した。次いで、トランスフェクションに先だって２００μｌのＤＭＥＭで洗浄したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ接種ウェルに後者の混合物を添加された（ウェル当たり３０μｌ）。トランスフェクションの全ては二連で行った。湿潤ＣＯ２インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ２）中の３時間後、２００μｌ培養培地を各ウェルに添加し、プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ２）に戻した。翌日、各ウェルの培地を２００μｌ培養培地で置き換えた。次いで、プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター（３２℃，、１０％ＣＯ２）に戻した。数日後、トランスフェクトした２つのプレートのうち１つの培地を２００μｌ培養培地で置き換え、湿潤ＣＯ２インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ２）に戻し、しかる後ＣＰＥの形成を追跡した。図３８Ａにおいて、増殖および増幅新鮮ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の代わりにトランスフェクト細胞の培地を変更した後にスコア取りしたウイルス生産細胞（ＣＰＥ陽性ウェル）のパーセンテージを示す。
第２のプレートのウェルを−２０℃で一晩の凍結に付し、続いて解凍し、および反復ピペッティングにより再懸濁した。１００μｌの凍結／解凍トランスフェクト細胞のアリコットを、感染の１日前に９６−ウェル−組織−培養−プレート中に接種した、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞（１００μｌ中のウェル当たり２．２５×１０4細胞）を含むプレートの各ウェルに移した。これを、十分なＣＰＥの存在が観察されるまで湿潤ＣＯ２インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ２）中でインキュベートした。図３８Ｂにおいて、新鮮なＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞での増殖後にスコア取りしたウイルス生産細胞（ＣＰＥ陽性ウェル）のパーセンテージを示す。全ての実験において、非トランスフェクトウェルを交差汚染の対照のために含めた。全ての３つのウェルはＣＰＥ形成につき陰性のままであった。図３８Ｃにおいて、実施例１０に記載したごとき平行正常手法の結果を与える。これらの結果は、培地の置き換えまたはトランスフェクション後のいずれかの操作の完全な省略が、初代トランスフェクタントプレートからの溶解物での新鮮なＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の再感染を置き換えることができることを示す。
【０１５１】
（実施例２３）
ウイルス形成のスピードおよび生産効率に対するＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の細胞増殖の影響の測定
アデノウイルス遺伝子発現ライブラリーの構築のため、アデノウイルスベクターのミニチュア化生産の条件は最適である必要がある。この目的で、ウイルス創製に影響し得る多数のパラメーターを変化させ、アデノウイルスベクター生産におけるその効果を測定した。いかにしてマイクロタイタープレートにおける接種に先だっての補充細胞系ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａの細胞密集がウイルス生産のスピードおよび効率に影響するかを測定するために、以下の実験を行った。第１日にトリプシン−ＥＤＴＡを用いてＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を収穫し、計数し、続いて３つの異なる１７５ｃｍ2−組織−培養フラスコにおいて収穫された細胞の１／１０、１／５および１／２．５を接種した。表９において、３つの異なる実験で各１７５−組織−培養フラスコに接種した細胞の数を示す。４日後、各フラスコからのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を収穫し、計数し、次いで、培養培地（１０％胎児ウシ血清および１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＤＭＥＭ）で１００μｌ当たり２２．５００細胞の懸濁液に希釈した。各細胞懸濁液から、２つの９６−ウェル−組織−培養プレートをウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液で接種した。翌日、６００μｌ無血清ダルベッコウ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）の容量中の１０．６μｇのＳａｌＩ線状化ｐＡｄ／Ｃｌｉｐ−ｌａｃＺおよび１０．６μｇのＰａｃＩ線状化ｐＷＥ−Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｄＥ２ＡプラスミドＤＮＡを、リポフェクタミンミックスをＤＮＡミックスに添加することによって、４４６．４μｌ無血清ＤＭＥＭ中に希釈した１５３．６μｌリポフェクタミンと混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を室温で３０分間放置し、しかる後、７．８ｍｌ無血清ＤＭＥＭを添加した。次いで、トランスフェクションに先だって２００μｌ  ＤＭＥＭで洗浄したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ接種ウェルに後者の混合物を添加した（ウェル当たり３０μｌ）。湿潤ＣＯ２インキュベーター（３９℃、１０％ＣＯ２における３時間後、１０％胎児ウシ血清および１０／ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む２００μｌ  ＤＭＥＭを各ウェルに添加し、プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター（３９℃、１０％  ＣＯ２）に戻した。翌日、各ウェルの培地を、１０％胎児ウシ血清および１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む２００μｌ  ＤＭＥＭで置き換えた。次いで、プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ２）に戻した。２日後、トランスフェクトした２つのプレートのうち１つを用いて、ｌａｃＺ染色を用い、トランスフェクション効率を測定した。表９において、３つの異なる実験におけるｌａｃＺ染色後にスコア取りした各９６−ウェル−組織−培養プレートのトランスフェクション効率を示す。２つのトランスフェクトプレートの第２のプレートをウイルス生産で用いた。トランスフェクションから７日後、第２のプレートのウェルを−２０℃での一晩の凍結に付し、続いて解凍し、反復したピペッティングにより再懸濁した。１００μｌの凍結／解凍トランスフェクト細胞のアリコットを、感染の１日前に９６−ウェル−組織−培養−プレートに接種した、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞（１００μｌ中のウェル当たり２．２５×１０4細胞）を含むプレートの各ウェルに移した。十分なＣＰＥが観察されるまで、これを湿潤ＣＯ２インキュベーター（３２℃、１０％ＣＯ２）中でインキュベートした。図３９において、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞への凍結／解凍トランスフェクト細胞の増殖後にスコア取りしたウイルス生産細胞（ＣＰＥ陽性）ウェルのパーセンテージを示す。データーは、アデノウイルスアダプターおよびヘルパーＤＮＡ分子でのトランスフェクションに先だってのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の密集のレベルがウイルス生産ウェルの最終パーセンテージに影響を与えることを示し、より高い密集はウイルスを生産するウェルの絶対的最終数およびウイルス創製がおこるスピードで最も最適である。
【０１５２】
（実施例２４）
アデノウイルス上清での長期インキュベーションは遅い表現型の検出を可能とする。
機能的ゲノム中のアデノウイルスベクターライブラリーの使用は、検出可能であって、実施例１２で用いたもののごときものを探す遺伝子に重要な表現型に加え、ＨＴＳに適用可能である適当な細胞ベースのアッセイおよびミニチュア化の使用を必要とする。例えば、実施例２０に記載された設定における、アデノウイルス発現ライブラリーでの感染後にアッセイする時間は可変的であって、アッセイされるべき表現型を決定するパラメーターに依存する。例えば、自動イメージ分析を用い、各ウェルにおける毛細血管の形成は、単に、毛細血管の形成を検出することによってアッセイすることができる。脈管形成または血管形成の指標であるこれらの構造の形成は、関連前駆体細胞の感染によって誘導することができる。かかる細胞は、関連トランスジーンを担うアデノウイルスベクター、例えば、血管内皮細胞様成長ベクター（ＶＥＧＦ）と共に、心臓または腫瘍起源からの内皮細胞であり得る。しかしながら、毛細血管形成のごとき複雑な表現型のみが数日ないし数週間後に出現する。従って、ある場合におけるアデノウイルス発現カセットによって媒介される遺伝子のライブラリーの発現は、表現型が現れるのを可能とするのに十分長い必要がある。図４０において、９６ウェルプレートでＡ５４９細胞を感染させるのに用いられたＥＧＦＰ−アデノウイルスベクターでの実験結果を示す。実施例１５に記載された安定性特徴に基づき、（ＤＭＥＭにおける）アデノウイルス希釈は除去されなかったが、２週間まで残り、正規の間隔でＥＧＦＰ発現を測定した。明らかに、これらの実験は、アデノウイルス形質導入が半安定と見なすことができ、経時的に増加さえすることを示し、これは、再感染および／または新しく分裂した細胞の感染が起こることを示唆する。これは、一過性アデノウイルスベクター系を用いて表現型につきスクリーンをすることができ、マルチウェルプレート（９６，３８４ウェルまたはそれより少）中の細胞にアデノウイルス上清を残すことによって現れるのに２週間以上かかることを意味する。
【０１５３】
（実施例２５）
ＤＮＡトランスフェクション剤としてのコスト的に有利なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いる組換えアデノウイルスベクターのミニチュア化されたマルチウェル生産
コスト低下および可変的毒性低下の目的では、リポソームトランスフェクション試薬のリポフェクタミンを置き換えるのが望ましい。カチオン性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をこの目的で、ミニチュア化されたマルチウェル（９６−ウェル）アデノウイルスベクター生産システムにおいてテストした。また、実施例９および１０参照。アデノウイルスヘルパープラスミド：ＬａｃＺおよびＥＧＦＰにおける異なるトランスジーンインサートにて、ＰＥＲ．Ｃ６ならびにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２ＡのトランスフェクションにつきＰＥＩをテストした。異なるパラメーターをテストした：ＰＥＩ／ＤＮＡ比率、単一ウェル当たりのＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のインキュベーション時間量。
【０１５４】
異なるＰＥＩ／ＤＮＡ比率でのＰＥＩのテスト
実施例１０に記載したごとく、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞でのトランスフェクションの前日に９６ウェルマイクロタイタープレートを接種した。翌日、１６ウェルにつき（異なるプレートに対し二連の８ウェル）、ＰＥＲ．Ｃ６についての３マイクログラムのＳａｌＩ線状化ｐＣＬＩＰ−ＬａｃＺおよび３マイクログラムのＰａｃＩ線状化ｐＷＥＡｆｌＩＩｒＩＴＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２ＡについてのｐＷＥＡｆｌＩＩｒＩＴＲｄＥ２Ａを１５０μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に希釈し、室温で１０分間インキュベートした。また、２０ｍＭ  ２５ｋＤａ  ＰＥＩ溶液を異なる量にて１５０μｌの１５０ｍｌ  ＮａＣｌに希釈して異なるＰＥＩ／ＤＮＡ比率を得、室温で１０分間インキュベートした。表４参照。
ＤＮＡへの滴下によりＰＥＩを添加することによってＤＮＡおよびＰＥＩ溶液を混合し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を１００μｌの無血清ダルベッコウ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ウェルで洗浄した。次いで、１．３ｍｌのＤＭＥＭをミックスに添加し、ウェル当たり８０μｌの各ウェル中の細胞に添加した。陽性対照として、（実施例９に従って調製した）ＤＮＡ／リポフェクタミン複合体をトランスフェクトした。さらなる対照インキュベーションはＤＭＥＭのみ、ＤＮＡなしのＰＥＩのみ（比率１３）であって、２倍量のＰＥＩ／ＤＮＡ比率１３を含めた。ＰＥＩトランスフェクションでは、湿潤ＣＯ２インキュベーターにおけるＰＥＲ．Ｃ６についての３７℃でのおよびＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａにおける３９℃でのインキュベーションの４時間後に、８０μｌのＰＥＩＰＥＲ．Ｃ６培地（２０％ｖ／ｖ胎児ウシ血清（ＦＣＳ）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）／ウェルを細胞に添加した。リポフェクタミントランスフェクションでは、１８０μｌのＤＭＥＭ  １０％ｖ／ｖ  ＦＣＳ  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２／ウェルを細胞に添加し、プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーターに戻した。翌日、各ウェルの培地を２００μｌのＤＭＥＭ  １０％／ｖ／ｖ  ＦＣＳ  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２で置き換えた。次いで、プレートを、湿潤ＣＯ２インキュベーター中ＰＥＲ．Ｃ６プレートでは３７℃で、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａプレートでは３２℃で放置した。３日後、二連プレートのうちの１つをＸ−ｇａｌで染色してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション効率結果を表５に示す。トランスフェクションの４日後に、プレートを２０℃での４時間の凍結に付し、続いて解凍し、反復ピペッティングにより再懸濁した。前日、前記したごとく接種したＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の新しいプレートに１００マイクロリットルのアリコットを移した。次いで、プレートをＣＯ２インキュベーターに戻した。増殖後１４日に、ウイルス形成用のインジケーターとしてのＣＰＥをスコア取りし、プレートを２０℃での４時間の凍結に付し、続いて、解凍し、反復ピペッティングによって再懸濁した。１００μｌの容量中の９６ウェルプレートのウェル当たり１．１０4  Ａ５４９細胞で接種したプレートのウェルに２０μｌのアリコットを移した。感染の２日後、実施例９に記載したごとくＬａｃＺ活性につき、ウェルをＸ−Ｘａｌで染色した。結果を表６にまとめる。
【０１５５】
ウェル当たりの異なる量の複合体での組合せにおける異なるＰＥＩ／ＤＮＡ比率でのＰＥＩのテスト
最適をテストするために、毒性であることなく細胞に適用することができる２つの比率でのＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の最適な絶対量をテストするために、ＰＥＩ／ＤＮＡ比率の５および１１．７をテストした。これをＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａでテストした。標準濃度（１Ｘ）は前記したトランスフェクション実験に記載した濃度である（表４参照）。
０．９および４２μｌの間のＰＥＩの量でＰＥＩ溶液を作成するために、種々の量の１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ溶液を２０  ｍＭ  ２５ｋＤａ  ＰＥＩ  （Ｆｌｕｋａ  ｃａｔ．ｎｒ．０３８８０）に３００μｌの最終容量まで添加した。この溶液から、１５０マイクロリットルをＤＮＡミックスに添加した（表７参照）。
１５０  ｍＭ  ＮａＣｌでの１５０マイクロリットルへのＤＮＡ（５０％  ｐＣＬＩＰ−ＬａｃＺおよび５０％  ｐＷＥＡｆｌＩＩｒＩＴＲｄＥ２Ａ）
トランスフェクションを前記したごとくに行った。リポフェクタミンを陽性対照ならびにいずれの添加剤もなくしてのＤＮＡまたはＰＥＩまたはＤＭＥＭとして用いた。３日後、二連プレートをｌａｃＺ発現につき染色し、結果を表８に与える。まず、細胞を毒性につきチェックした。２つの比率の間で差異が観察できた。比率１１．７では２倍濃度（２Ｘ）はより毒性であるが、トランスフェクション効率はＸほど高い。両比率での濃度０．１Ｘでは染色後に青色細胞は観察されず、これは細胞がトランスフェクトされなかったことを示す。
プロセッシング、ＣＰＥモニタリング、Ａ５４９形質導入およびｌａｃＺ染色を以下のごとく行った。定量的に毒性をテストするために、後者のトランスフェクションを反復し、培地置換の２日後、細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、生細胞の数およびＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の毒性を測定した。全ての操作は製造業者のプロトコルに従った。３７℃でのインキュベーションの４時間後、マイクロプレートマネージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてプレートを読んだ。ＰＥＩ比率５および１１．７についてのこの実験の結果は図４１にまとめる。明らかに、毒性は、比率５において（標準量の１．５倍）および標準状態の比率１１．７において（標準量の０．５および１．５倍の間）最低であって、ウイルス創製に最適である。
【０１５６】
異なるＰＥＩ／ＤＮＡ比率での、異なる遺伝子および温−対−冷ＰＥＩでのＤＮＡキャリアーとしてのＰＥＩのテスト
ＰＥＩの温度が複合体形成に影響するかをテストするために、前記プロトコルを４℃および室温にてＰＥＩでテストした。加えて、もう１つのトランスジーンインサートをテストした；ＥＧＦＰ。また、２つの比率の最良濃度をこのトランスフェクション実験で用いた（４５０  ｍｇ  ＤＮＡ／ウェル  ＰＥＩ／ＤＮＡ比率５および３００  ｎｇ  ＤＮＡ／ウェル  ＰＥＩ／ＤＮＡ比率１１．７）。プロセッシング、ＣＰＥモニタリング、Ａ５４９形質導入およびｌａｃＺ染色は記載したごとくに行い、図４２に観察することができる。温および冷ＰＥＩ間で観察された有意な差異はなかった。ＥＧＦＰおよびＰＥＩでのウイルス形成は非常に良く働いた（ＰＥＩ比率５温および陽性対照リポフェクタミン  共１００％ＣＰＥ）。
【０１５７】
ウェル当たりの異なるＰＥＩ／ＤＮＡ複合体容量でのＤＮＡキャリアーとしてのＰＥＩのテスト
ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体の容量が前記したプロトコルでウイルス創製の効率に影響するかのテストをするために、異なる容量のＰＥＩ／ＤＮＡ複合体（ウェル当たり比率５  ４５０  ｎｇ  ＤＮＡ、ＰＥＩ  ２０  ｍＭ  ２５ｋＤａ  Ｆｌｕｋａ）を細胞に添加した。この場合、ウェル当たり３０、８０および１２０マイクロリットルを添加した。プロセッシング、ＣＰＥモニタリング、Ａ５４９形質導入およびｌａｃＺ染色は前記したごとくに成した。図４３でわかるごとく、３０μｌ、８０μｌ、および１２０μｌを適用する間でトランスフェクション効率に有意な差異がある。３０μｌを用いると、ウェル内の細胞の１％のみが青色に染色され、他方、８０μｌでは細胞の６０％が青色に染色された。複合体の量を１２０μｌに増加させた結果、８０μｌを適用するのと同一の結果が得られた。ウイルス形成では、同一の傾向が観察された；３０μｌではＣＰＥは見いだされず、他方、８０および１２０μｌは同様のパーセンテージを与えた（示さず）。結論として、ＰＥＩを用いてミニチュア化設定でアデノウイルスベクターを生産することができる。
【０１５８】
（実施例２６）
トランスフェクションに先だって細胞洗浄工程がない組換えアデノウイルスベクターのミニチュア化マルチウェル生産
組換えアデノウイルスベクターのミニチュア化マルチウェル生産の自動化における工程の減少およびコストの低下の目的で、トランスフェクションに先だってのＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞または誘導体の無血清培地（ＳＦＭ）洗浄工程を標準プロトコルから取り除いた。トランスフェクションは実施例１０に記載したごとくに行った。ヒトｃｅＮＯＳをトランスジーンインサートとして用いてトランスフェクションを行い、細胞洗浄工程の除去をテストし、洗浄を含む標準手法と比較した。プロセッシングおよびＣＰＥモニタリングは前記したごとくに成し、図４４でわかるごとく、細胞がトランスフェクションに先だって洗浄されない場合、ウイルス生産で観察された有意な減少はない。
結論として、標準トランスフェクションプロトコルの一部としての血清蛋白質のバルクを除去する細胞洗浄工程の取り除きはＣＰＥ効率に影響することなく可能である。組換えアデノウイルスベクターのミニチュア化およびマルチウェル生産を自動化する場合に望ましい全プロセスの複雑性を減少させる場合に後者は非常に有用である。
【０１５９】
（実施例２７）
ゼブラフィッシュにおいて遺伝子発現を変調するためのアデノウイルス構築体の使用
全動物におけるアデノウイルス構築体による遺伝子発現の変調は遺伝子の機能について重要な情報を与えることができる。例えば、全長蛋白質をコードするセンスｃＤＮＡ構築体を発現するアデノウイルス構築体は動物モデル系においてその蛋白質の過剰発現で用いることができ、他方、アンチセンスｃＤＮＡを発現するアデノウイルス構築体は内因性蛋白質の発現レベルを減少させるのに用いることができる。加えて、アデノウイルス−コード化蛋白質の過剰発現は突然変異体表現型を救済し得る。動物モデルにおける遺伝子発現のアデノウイルス−媒介変調は遺伝子の機能についての重要な情報を与えることができる。
本実施例では、ゼブラフィッシュ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏはアプローチの可能性を示すために動物モデル系として議論されるであろう。この目的で、本出願に記載した方法によって同定され単離されたｃＤＮＡでゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされるであろう。全長蛋白質をコードするかく得られた相同ゼブラフィッシュｃＤＮＡは単離され、ｐＩＰＳＰＡｄａｐｔシリーズのアダプタープラスミドにおいて、両方の向き、センスおよびアンチセンスにクローン化されるであろう（実施例１７参照）。引き続いて、これらを用いて組換えアデノウイルスが創製され、これを用いて野生型または突然変異体（例えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９６  Ｖｏｌｕｍｅ１２３，  １２月参照）ゼブラフィッシュ胚いずれかを感染させるであろう。ゼブラフィッシュを育種する方法は同業者によく知られている。
野生型または突然変異体胚または成体魚において、遺伝子発現の上昇−または下降−変調の効果を実験することができる。胚は以下のごとくに収集されるであろう：ゼブラフィッシュはその育種において光周期的であり、日の出後まもなくの毎朝胚を生じる。比較的少数の胚（１日につきタンク当たり３０−５０）の連続的生産には、等しい数の雄および雌を用いる。昼−夜のサイクルは自動タイマー（１４時間照射／１０時間暗所）で制御する。タンクの底を単一層の大理石で覆って、魚が新しく産んだ卵を食べないようにする。タンクの底からサイフォン処理することによって新たに生産された胚を各朝収集し、組換えアデノウイルスで感染させる。これは後記するごとくいくつかの方法で達成することができる。選択された方法は遺伝子の発現パターンに依存する。
組換えウイルスは卵膜液に直接注入することができ、しかる後胚を洗浄し、系の水中でさらに培養する。同様に、組換えアデノウイルスは、例えば、血流への注入によって、あるいは経口もしくは直腸投与によって胚または成体魚中の特定の部位に沈積させることができる。注入は、胚を１．５％アガロースにてプラスチックモールドで作成した楔形形状の箱中に胚を保持することによって行うことができ、ここに、その卵膜を除去する必要はない。各箱は（卵膜と共に）ほぼ３５の胚を保持することができる。胚はそれをピンセットで軽く叩いて落とすことによって整列させることができる。もしピペット先端が事故により表面に接触してもそれは一般に壊れないので、アガロースは有用である。ピペットが卵膜に侵入するにつれ、胚は箱の後方垂直壁に対して押し付けられる。胚内のピペット先端の正確な位置決めは、ミクロマニプュレーターでのピペットのわずかな動きによって、あるいはステージの動きによって達成される。別法として、胚は脱卵膜することができ（後記参照）、組換えアデノウイルスを含有する培地中でインキュベートすることができる。
注入後、２５−３０の卵が２５０ｍｌのビーカーに沈積されるであろう。孵化の後、稚魚を新しいビーカーに移し、その卵膜から完全に分離する。稚魚は当業者によく知られた標準条件下で育てる。
ゼブラフィッシュのアデノウイルス感染後のモニタリング変化は、胚段階ほど早期に成すことができる。ゼブラフィッシュ発生のいくつかの観察は卵膜を直接介して成すことができる。しかしながら、ほとんどの手法では、卵膜を除去するのが良好である。卵膜は鋭いピンセットで容易に除去することができる。２８．５℃で育てると、ゼブラフィッシュはその卵膜の外部で正常に発育する。その卵膜から取り出した胚は、火煙研磨したパスツールピペットでそれらを温和にピペッティングすることによるか、温和な注入によって１つの容器からもう１つの容器に移すことができる。小さなペトリ皿（３５ｍｍ直径）が、発生の最初の数日の間に２５までの胚を保持するのに適切である。培地を円状運動で温和に撹拌することによって観察するために胚を皿の中央まで運ぶことができる。稚魚および成体魚をさらに処理することなくモニターすることができる。より精巧な分析方法は、古典的な組織学的方法による、あるいは分子レベルでの差異を見るためのアンチセンスハイブリダイゼーションまたは抗体とのインキュベーションのごとき特別の方法を用いることによるセクションの染色を含む。
組換えアデノウイルスでのゼブラフィッシュの感染後に観察された表現型変化は、イン・ビボでコード化遺伝子の機能について重要な情報を与えることができる。また、前記した方法は他の動物モデルに適用することもできる。
【０１６０】
【表４】
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【０１６１】
【表５】
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【０１６２】
【表６】
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【０１６３】
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０１６４】  本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が関する当業者のレベルを示す。各個々の刊行物または特許出願は引用により具体的かつ個々に本明細書の一部と見なすごとく、引用によりここに同一程度一体化させる。
さて、本発明を十分に記載してきたが、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変形および修飾を成すことができるのは当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｐＢＳ．ＰＧＫ．ＰＣＲＩ．の構築。ｐＢＳ．ＰＧＫ．ＰＣＲＩ．は、アデノウイルス５（Ａｄ５）Ｅ１ヌクレオチド４５９〜９１６に作用可能にリンクされているヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）をコードする。このプラスミドを構築するために、アデノウイルス５（Ａｄ５）Ｅ１ヌクレオチド４５９〜９１６を、プライマーＥａ−１（配列識別番号：２７）およびＥａ−２（配列識別番号：２８）によりＰＣＲ法によって増幅し、Ｃｌａ Iにより分解し、また、pBluescript（Stratagene）のＣｌａ I-ＥｃｏＲＶ部位にクローン化して、ｐＢＳ．ＰＣＲＩ．を得た。ＰＧＫプロモーターを、ＳｃａＩによる完全な分解及びＥｃｏＲＩによる部分的な分解によってｐＴＮから切り出し、またｐＢＳ．ＰＣＲＩの対応する部位にクローン化することで、ｐＢＳ．ＰＧＫ．ＰＣＲＩを得た。
【図２】  ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ．の構築。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ．は、ヒトＰＧＫプロモーターに作用的にリンクされているＡｄ５ヌクレオチド４５９−５７８８（Ｅ１ＡとＥ１Ｂ領域）をコードする。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ．はまた、Ａｄ５ ｐＩＸタンパク質をコードする。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ．は、ｐＡＴ−Ｘ／ＳのＳｃaＩ−ＢｓｐＥ１断片を、ｐＢＳ.ＰＧＫ.ＰＣＲＩの対応する断片に置換することによって構築された。
【図３Ａ】  ｐＡＴ−ＰＣＲ２−ＮＥＯの構築。このプラスミドを構築するために、Ｅ１ＢプロモーターおよびＥ１Ｂ ２１ｋＤａタンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）を、プライマーＥａ−３（配列識別番号：２９）およびＥｐ−２（配列識別番号：３０）によりＰＣＲ法で増幅した。なお、Ｅ−２は２１ｋＤａタンパク質開始コドンにＮｃｏＩ部位（５’−ＣＣＡＴＧＧ）を導入する。ＰＣＲ産物（ＰＣＲＩＩ）はＨｐａＩおよびＮｃｏＩにより分解され、また、ｐＡＴ−Ｘ／Ｓの対応する部位に結合され、ｐＡＴ−Ｘ／Ｓ−ＰＣＲ２を産生した。ＮｅｏRを含むｐＴＮのＮｃｏＩ−ＳｔｕＩ断片とＨＢＶポリ（Ａ）部位の一部分がｐＡＴ−Ｘ／Ｓ−ＰＣＲ２のＮｃｏＩ−ＮｒｕＩ部位に結合されて、ｐＡＴ−ＰＣＲ２−ＮＥＯを産生した。
【図３Ｂ】  ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯの構築。ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯは、ヒトＰＧＫプロモーターに作用的にリンクされているＡｄ５ヌクレオチド４５９〜１７１３をコードする。また、ネオマイシン耐性遺伝子（ ＮｅｏR）とＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリ（Ａ）シグナルに機能的にリンクされるＥ１Ｂプロモーターもコードされる。この構築では、Ｅ１Ｂ ２１ｋＤａタンパク質のＡＵＧコドンがＮｅｏRの開始コドンとして機能する。ｐＡＴ−ＰＣＲ２−ＮＥＯのＨＢＶポリ（Ａ）シグナル（図３Ａを参照）は、ｐＡＴ−ＰＣＲ２−ＮＥＯのＳｃａＩ−Ｓａ１Ｉ断片を、ｐＴＮの対応する断片に置換することで完成し、ｐＡＴ．ＰＣＲ２−ＮＥＯ.ｐ(Ａ)が産生され、またｐＡＴ．ＰＣＲ２−ＮＥＯ.ｐ(Ａ)のＳｃａＩ−ＸｂａＩ断片をｐＩＧ.Ｅ１Ａ.Ｅ１Ｂ.Ｘの対応する断片に置換して、ｐＩＧ.Ｅ１Ａ.ＮＥＯを産生した。
【図４】  ｐＩＧ.Ｅ１Ａ.Ｅ１Ｂの構築。ｐＩＧ.Ｅ１Ａ.Ｅ１Ｂは、ＰＧＫプロモーターおよびＨＢＶポリ（Ａ）シグナルに作用的にリンクされるＡｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質）を含む。このプラスミドは、プライマーＥｂ−１（配列識別番号：３１）およびＥｂ−２（配列識別番号：３２）によりＥ１Ｂ ５５ ｋＤタンパク質のＮ末端アミノ酸のＰＣＲ法による増幅によって構築されたが、それはＸｈｏＩ部位を導入しており、ＢｇｌＩＩで分解され、また、ｐＡＴ−Ｘ／ＳのＢｇｌＩＩ−ＮｒｕＩ部位にクローン化されて、ｐＡＴ−ＰＣＲ３を産生した。ｐＡＴ−ＰＣＲ３のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片は、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのＸｂａＩ−ＳａｌＩ（ＨＢＶポリ（Ａ）部位を含む）に置換されて、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂが産生された。
【図５】  ｐＩＧ．ＮＥＯの構築。ｐＩＧ．ＮＥＯは、Ｅ１Ｂプロモーターに作用的にリンクされるＮｅｏRを含有する。ｐＩＧ.ＮＥＯは、Ｅ１ＢプロモーターおよびＮｅｏRを含むｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのＨｐａＩ−ＳｃａＩ断片を、ｐＢＳのＥｃｏＲＶ−ＳｃａＩ部位に結合することにより構築された。
【図６】  アデノウイルスのパッケージングコンストラクトによる初代仔ラットの腎臓（ＢＲＫ）の細胞の形質転換を示す。ＢＲＫ細胞のサブ融合性培養皿は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でＡｄ５ Ｅ１Ｂ遺伝子を発現させるｐＩＧ．ＮＥＯ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．Ｘ、ｐＡｄ５ＸｈｏＩＣ、あるいはｐＤＣ２６を加えたｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯのいずれかの１あるいは５μｇでトランスフェクトされた。トランスフェクト後３週間で、細胞増殖巣が観察されて、細胞が固定されたので、ギムザ染色して、細胞増殖巣を数えた。図示の結果は、５複製培養皿毎に細胞増殖巣の平均数である。
【図７】  ｐＩＧ.Ｅ１Ａ．ＮＥＯによってトランスフェクトされたＡ５４９クローンと、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ（ＰＥＲクローン）によりトランスフェクトされたヒト胚性網膜芽細胞（ＨＥＲ細胞）のウェスタンブロット分析。トランスフェクトされたＡ５４９細胞およびＰＥＲ細胞におけるＡｄ５ Ｅ１ＡとＥ１Ｂ ５５ ｋＤおよび２１ ｋＤタンパク質の発現は、Ｅ１Ａ遺伝子産物を認識するマウスのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｍ７３、及びそれぞれＥ１Ｂ ５５ ｋＤａタンパク質および２１．ＫＤＡタンパク質を認識するＭａｂｓ ＡＩＣ６及びＣ１Ｇ１１によるウェスタンブロットによって測定された。Ｍａｂ結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識化したヤギ抗マウス抗体を用いて、化学発光を向上させることで視認化した。２９３と９１１細胞はコントロールとして使用した。
【図８】  ２９３、９１１とＰＥＲ細胞系列のサザンブロット分析。細胞のＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで分解して、電気泳動してＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（アマシャム社（Amersham））に移した。膜は、ｐＡｄ５．ＳａｌＢ（Ａｄ５ヌクレオチド３４２〜２８０５）のＳｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの無作為プライミングにより生成された放射能標識されたプローブにハイブリダイズした。
【図９】  ＰＥＲ．Ｃ３、ＰＥＲ．Ｃ５、ＰＥＲＣ６および９１１細胞のトランスフェクション効率。細胞は６−ウェルの皿に培養し、リン酸カルシウム共同沈降法により５μｇ ｐＲＳＶ．ｌａｃＺによって、二重にトランスフェクトされた。トランスフェクト後４８時間で、細胞をＸ−Ｇａｌで染色し、青色細胞を数えた。示された結果はウェル毎の青色細胞の平均パーセンテージである。
【図１０】  アデノウイルスベクター、ｐＭＬＰＩ．ＴＫ．の構築。ｐＭＬＰＩ．ＴＫは、パッケージングコンストラクトであるｐＩＧ.Ｅ1Ａ.ＥＡＢと重複する配列を有しないように設計された。ｐＭＬＰＩ．ＴＫは、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂと重複する配列の領域を欠失させ、ｌａｃＺから誘導されたコードしない配列を欠失させることによって、ｐＭＬＰ．ＴＫから誘導された。ｐＭＬＰ．ＴＫのＳＶ４０ポリ（Ａ）配列は、ＢａｍＨＩ部位を導入するためのプライマーＳＶ４０−１（配列識別番号：３３）、およびＢｇｌＩＩ部位を導入するためのＳＶ４０−２（配列識別番号：３４）とによってＰＣＲ法によって増幅された。ｐＭＬＰ．ＴＫ Ａｄ５の配列２４９６〜２７７９は、ＢｇｌＩＩ部位を導入するプライマーＡｄ５−１（配列識別番号：３５）とＡｄ５−２（配列識別番号：３６）とによって、ＰＣＲ法によって増幅された。両方のＰＣＲ産物は、ＢｇｌＩＩで分解されて結合され、プライマーＳＶ４０−１およびＡｄ５−２によりＰＣＲ法によって増幅された。この第３のＰＣＲ法による産物は、ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩＩで分解されて、ｐＭＬＰ．ＴＫの対応部位に結合されて、ｐＭＬＰＩ．ＴＫが産生された。
【図１１Ａ】  新しいアデノウイルスのパッケージングコンストラクト、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＥＡＢは、新しいアデノウイルスベクター、ｐＭＬＰＩ．ＴＫと重複する配列を有していない。９１１細胞に発現されるパッケージングコンストラクト、ｐＡｄ５ＸｈｏＩＣと、相同性組換えおよび複製能力を有するアデノウィルスの形成が可能なアデノウィルスベクター、ｐＭＬＰ．ＴＫとの間の重複する配列領域を示す。対照的にＰＥＲ．Ｃ６細胞で発現する新しいパッケージングコンストラクト、ｐＩＧ．ＥＡＩ．ＥＩＢと、新しいアデノウィルスベクター、ｐＭＬＰＩ．ＴＫの間には配列重複の領域はない。
【図１１Ｂ】  新しいアデノウィルスパッケージングコンストラクト、ｐＩＧ．ＥＩＡ．ＮＥＯは、新しいアデノウィルスベクターｐＭＬＰＩ．ＴＫ．と重複する配列を有しない。新しいパッケージングコンストラクト、ｐＩＧ．Ｅ１Ａ．ＮＥＯと、相同性組換えおよび複製能力を有するアデノウイルスの形成を可能な、新しいアデノウイルスベクター、ｐＭＬＰＩ．ＴＫとの間には、配列が重複する領域がない。
【図１２】  組換え体アデノウイルス、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫの創製。組換え体アデノウイルス、ＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫは、ＳａｌＩによって線形化されたｐＭＬＰＩ．ＴＫと、ＣｌａＩで分解された野生型Ａｄ５ ＤＮＡの右アームとで、２９３細胞のコトランスフェクションにより生成された。線形化されたｐＭＬＰＩ．ＴＫと野生型Ａｄ５ ＤＮＡとの間の相同性組換えによって、ヌクレオチド４５９〜３５１０のＥ１欠失を含有するＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫ ＤＮＡが産生される。２９３細胞は、欠失したＡｄ５ゲノムをトランスコンプリメントし、それによりＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰＩ．ＴＫ ＤＮＡの複製と、このＤＮＡのウイルス粒子のへのパッケージングを可能にする。
【図１３】  アデノウイルス複製タンパク質を発現する細胞において二重にし、また複製するアデノウイルス由来の誘導組換えＤＮＡ分子の設計の原理。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＬ領域のおおよその位置を示すアデノウイルス二本鎖ＤＮＡゲノムの線図を示す。５’−末端に付加された末端ポリペプチド（ＴＰ）は、閉サイクルで示される。アデノウイルスゲノムの右アームは、制限酵素加水分解による左アームの除去によって精製することができる。２９３あるいは９１１細胞への右アームのトランスフェクションに続いて、右アームにコードされたアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ（白矢印）は一本鎖の形態のみを産生する。二本鎖あるいは一本鎖ＤＮＡのどちらも1つの末端にＩＴＲを欠いているために複製することができない。ＤＮＡポリメラーゼの基質として役立せることができ、３’−末端でヘアピン構造を形成することができる配列を一本鎖ＤＮＡに提供することにより、分子の全長に沿ってヘアピン構造が伸長する。この分子はまた、ＤＮＡポリメラーゼのための基質して用いることができるが、その産物は、両末端にＩＴＲを有する二重分子で、アデノウイルスタンパク質の存在下で複製することができる。
【図１４】  アデノウイルスゲノムの複製。アデノウイルスゲノムを一番上の左に示す。原始体あるいは複製体は、ゲノム末端にある左および右のＩＴＲ内に位置している。ＤＮＡ複製は２段階で起こる。複製は、１つの右のＩＴＲが、娘二本鎖とアデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ、白丸）により被覆されている、置換された親一本鎖を生成することから進行し、両末端でのＩＴＲ配列のアニーリングによりパンハンドル構造が形成される。このパンハンドル部分は、二本鎖ゲノムＤＮＡを産生するためのＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ：白矢印）の基質である。あるいは、複製は両方のＩＴＲから進行して、２つの娘分子を生成し、それによってパンハンドル構造の必要をなくす。
【図１５】  ＨＰ／ａｓｐ配列（配列識別番号：４７）を含有する一本鎖ＤＮＡ分子の潜在的なヘアピンコンホメーション。クローン化されたオリゴヌクレオチド、ＨＰ／ａｓｐ１およびＨＰ／ａｓｐ２を含有するｐＩＣＬｈａのＡｓｐ７１８Ｉ加水分解は、1つの末端にＡｄ５ ＩＴＲを有し、もう1つの末端にＨＰ／ａｓｐ配列を有する線形二本鎖ＤＮＡを産生する。細胞内では、アデノウイルスＥ２領域が発現し、５’末端にＡｄ５ ＩＴＲを有し、また３'末端にヘアピンコンホメーションを有する一本鎖ＤＮＡが産生される。一度形成されると、そのヘアピンは、一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換するための、細胞および／またはアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして利用することができる。
【図１６】  ｐＩＣＬｈａｃの線図。ｐＩＣＬｈａｃは、ｐＩＣＬ（図１９）のすべての構成要素を含有するだけでなく、Ａｓｐ７１８部位に、ＨＰ／ａｓｐ配列を、Ａｓｐ７１８加水分解と、アデノウイルスＥ２タンパク質を発現する細胞へのトランスフェクションによる線形化に引き続いて、図１５に示されているヘアピン構造を産生する配向で含有する。
【図１７】  ｐＩＣＬｈａｗの線図。ｐＩＣＬｈａｗは、挿入されたＨＰ／ａｓｐ配列が反対の配向であることを除いて、ｐＩＣＬｈａｃ(図１６)と同一である。
【図１８】  ｐＩＣＬＩの概略図。ｐＩＣＬＩは、ｐＩＣＬ（図１９）のすべての構成要素を含有し、Ａｓｐ７１８部位にＡｄ５ ＩＴＲを含有する。
【図１９】  ｐＩＣＬの線図。ｐＩＣＬは以下のものから誘導される。すなわち、（ｉ）左ＩＴＲを含む、ヌクレオチド１〜４５７、Ａｄ５ヌクレオチド１〜４５７、（ｉｉ）ヌクレオチド４５８〜９６９、ヒトＣＭＶエンハンサー、即時型初期プロモーター、（ｉｉｉ）ヌクレオチド９７０〜１２０４、ＳＶ４０ １９Ｓエキソン、トランケート１６／１９Ｓイントロン、（ｉｖ）ヌクレオチド１２１８〜２９８７、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、（ｖ）ヌクレオチド３０１８〜３１３１、後期転写から得られるＳＶ４０縦列ポリアデニル化シグナル、（ｖｉ）ヌクレオチド３１３２〜５６２０、Ａｓｐ７１８部位を含むｐＵＣ１２配列、（ｖｉｉ）逆配向でのアンピシリン耐性遺伝子。
【図２０】  ｐＢｒ３２２（プラスミド）あるいはｐＷＥ１５（コスミド）誘導ベクターでクローン化されたアデノウイルス断片の概念図を示す。一番上の列はそのＩＴＲ（黒矩形）が側面に位置し、またいくつかの制限部位を示した完全なアデノウイルスゲノムを示している。制限部位に続く数字は、Ａｄ５ゲノムにおけるおおよその加水分解部位（ｋｂ単位で）示す。
【図２１】  アダプタープラスミドｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡの図である。
【図２２】  アダプタープラスミドｐＡｄ／Ｃｌｉｐの図である。
【図２３】  プラスミドベースのシステムを使用した組換え体アデノウイルスの創製の略図である。一番上には、Ａｄ５のゲノム組織が、異なる初期および後期転写領域ならびに側面に位置するＩＴＲを黒く塗った箱型で表して示されている。中間には、単一相同性組換えに使用され、また、パッケージング細胞へのトランスフェクト後に、組換えウイルス（一番下に提示）を導入するのに使用されるる２つのＤＮＡを表わす。
【図２４】  最小のアデノウイルスベクターｐＭＶ／Ｌ４２０Ｈの図である。
【図２５】  最少アデノウイルスベクターの複製とパッケージングのためのヘルパーコンストラクトを示す。ヘルパーコンストラクトｐＷＥ／ＡｄΔ５’生成のためのクローン化ステップの略図である。
【図２６】  ＣＯＳ−１細胞における大きなアデノウイルスコンストラクトのＳＶ４０−ＬａｒｇｅＴ／ｏｒｉに仲介される複製の証拠。図２６Ａは、コンストラクトｐＷＥ／Ａｄ．ＡｄΔ５’の略図を示す。ＳＶ４０ ｏｒｉ配列とプローブを作成するのに使用される断片の位置が示されている。ＣＯＳ−１細胞における大きなアデノウイルスコンストラクトのＳＶ４０−ＬａｒｇｅＴ／ｏｒｉに仲介される複製の証拠である。図２６Ｂは、アデノウイルスプローブにハイブリダイズされたサザンブロット法のオートラジオグラムを示す。図２６Ｃは、ｐＷＥにプローブハイブリダイズされたサザンブロッド法のオートラジオグラムを示す。レーン１、マーカーレーン；ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより加水分解されたλＤＮＡ。レーン４は空白である。レーン２、５、７、９、１１、１３、１５、１７には、未分解のＤＮＡが含まれ、またレーン３、６、８、１０、１２、１４、１６、１８には、ＭｂｏＩで加水分解されたＤＮＡが含まれる。すべてのレーンには、本文で説明したように、ｐＷＥ．ｐａｃ（レーン２および３）、ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’コンストラクト＃１（レーン５および６）、＃５（レーン７および８）、＃９（レーン９および１０）、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ(レーン１１および１２)、ｐＭＶ／ＣＭＶ−ＬａｃＺ（レーン１３および１４）、ＰａｃＩにより加水分解されたｐＷＥ．ｐａｃ（レーン１５および１６）あるいはＰａｃＩにより加水分解されたｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（レーン１７および１８）によりトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞由来のＤＮＡが含まれる。矢印は、１４１６ ｂｐ（図２６Ｂ）および８８７ｂｐ（図２６Ｃ）の予想されるポジティブシグナルを指している。
【図２７】  Ｅ１／Ｅ２Ａ欠失アデノウイルスベクターの産生とに基づく小型化ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａをベースとする産生システム（実施例１０）におけるその効率。
【図２８】  ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａをベースにするプラーク測定（実施例１１）を使用して測定した９６ウェルプレートで産生される平均濃度を示す。
【図２９】  種々のマーカーおよびヒトｃＤＮＡ形質転換遺伝子の小型化ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａをベースにする産生システム（実施例１２）におけるアデノウイルスベクター産生の適合度を示す。
【図３０】  ６つの異なるプロトコルにより精製された、ｐＣＬＩＰ−ＬａｃＺとのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞のトランスフェクション後のＣＰＥを有するウェルの相対的な量を示す（実施例１３）。Qiagen：標準アルカリ性溶液への溶解の後、Qiagenプラスミドの精製；AlkLys：アルカリ性溶液への溶解の後、イソプロパノール沈降とＴＥ緩衝液における可溶化；ＡＬ＋ＲＮＡｓｅ：アルカリ性溶液へ溶解後、イソプロパノール沈降と、１０マイクログラム／ｍｌでＲＮＡｓｅを含むＴＥ緩衝液による可溶化；ＡＬ＋Ｒ＋フェノール：アルカリ性溶液への溶解後、イソプロパノール沈降と１０マイクログラム／ｍｌでＲＮＡｓｅを含むＴＥ緩衝液において可溶化し、その後にフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈降；ＣＴＡＢ：標準ＣＴＡＢプラスミド分離；ＣＴＡＢ＋フェノール：標準ＣＴＡＢプラスミド分離、しかし、１０マイクログラム／ｍｌでＲＮＡｓｅを含むＴＥ緩衝液において可溶化し、その後にフェノール／クロロホルム抽出。
【図３１】  フェノール−クロロホルム洗浄をしないトランスフェクションで加水分解プラスミドを使用する効果（実施例１４）。すべての実験の結果は、ＣＰＥ形成を示すウェルのパーセンテージとして示されまた表現される。Ａ）ＬａｃＺ−アダプターＤＮＡは、６つの異なる分離方法を使用して分離された（実施例１３を参照）；１：Qiagen、２：アルカリ性溶解、３：アルカリ性溶解＋ＲＮＡｓｅ処理、４：アルカリ性溶解＋ＲＮＡｓｅ処理＋線形化の前にＤＮＡのｐ／ｃ精製、５：ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、６：ＣＴＡＢ＋線形化の前にＤＮＡのｐ／ｃ精製、ｒＩＴＲはｐ／ｃ精製された、Ｂ）精製および未精製ＥＧＦＰ−およびＥＹＦＰ−アダプターＤＮＡ、ｒＩＴＲはｐ／ｃ精製された、Ｃ）ＥＧＦＰ−アダプターＤＮＡおよびｒＩＴＲは精製および精製されていないものが試験された；１：両方のアダプターおよびｒＩＴＲを精製（コントロール）、２：ｒＩＴＲを精製、アダプターＤＮＡ未精製、３：ｒＩＴＲおよびアダプターを未精製。
【図３２】  小型化フォーマットで産生され、また３つの異なる温度で３週間インキューベートされ、アデノウイルスベクターに関するプラーク形成検定を使用して測定されたアデノウイルスの安定性（実施例１５）。
【図３３】  アンチセンス（ＡＳ）配向のｃＤＮＡを含むいくつかのアデノウイルス（Ｅ１およびＥ２Ａ欠失）のウイルス創製後の、ＣＰＥのパーセンテージにみるウイルス創製の効率を示す（実施例１６）。
【図３４Ａ〜Ｍ 】  アデノウイルスアダプタープラスミドのプラスミド遺伝子地図を示す（実施例１７）。これらのアデノウイルスアダプタープラスミドは、本出願の目的物などのアデノウイルスベクターにおける発現ライブラリーの構築に、特に有用である。それらは、アダプターやアダプターのライブラリーの線形化（形質転換遺伝子の挿入による）に関しては非常に稀な制限部位を有しており、挿入断片の加水分解によりアダプターを不活性化することはない。
【図３４Ｍ】  ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ５−あるいはｐＣＬＩＰ−ＩｐｐｏＩ−ｐｏｌｙｎｅｗ−から誘導されたアデノウイルスＤＮＡを含有するコスミドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合に使用することができる。適合性のあるオーバーハングを含有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｉ−ＣｅｕＩとＩ−ＰｐｏＩの間、Ｉ−ＳｃｅＩとＰＩ−ＳｃｅＩの間、Ｉ−ＳｃｅＩとＩ−ＰｐｏＩの間で結合される。ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼは、結合後にコンストラクトを線形化して、左と右のＩＴＲを解放するだけでなく、非組換え体を除外するのにも使用される。
【図３４Ｎ】  ｐＣＬＩＰ−ＬａｃＺおよびアダプタープラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２によるＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞のトランスフェクション後のＣＰＥを伴うウェルの相対的な量を示す。
【図３５】  (実施例１９)凍結／融解トランスフェクトされた細胞リゼイトの増殖後の、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞の９６ウェルのプレートにおけるウイルス産生ウェル（ＣＰＥ陽性）のパーセンテージを示す（実施例１９）。コトランスフェクションに使用されるヘルパー分子は、（１）ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ、（２）ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ．ｄＥ２Ａ、（３）ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐ．ｄＸｂａ、及び（４）ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲである。
【図３６（ＩおよびＩＩ）】  （実施例２０）配列されたアデノウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築するところを示す概念図である。
【図３７】  (実施例２１)３８４ウェルプレートでの異なるアダプタープラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲＤＥ２Ａのトランスフェクションの９６ウェルプレートでのコトランスフェクションとの比較を示す。図示されているのは、トランスフェクション後５日（上方パネル）あるいはトランスフェクション後７日（下方パネル）の新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に対して、凍結融解トランスフェクション細胞の増殖後に示された、異なる時点で評価されたウイルス産生ウェル（ＣＰＥポジティブウェル）のパーセンテージである。
【図３８Ａ，Ｂ，Ｃ】（実施例２２）トランスフェクションから７日後のトランスフェクトされた細胞の培地を変化させた後の異なる時点でのウイルス産生ウェル（ＣＰＥポジティブウェル）のパーセンテージ（Ａ）、培地を取り替えなかった後（Ｂ）、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞への凍結融解トランスフェクション細胞の標準的な増殖の後。
【図３９】  （実施例２３）トランスフェクション時に融合性を示すトランスフェクションのためにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を使用した３つの異なる実験において、新しいＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞への凍結融解トランスフェクション細胞の増殖後に評価されたウイルス産生細胞（ＣＰＥ陽性）ウェルのパーセンテージを示す。数字と凡例は、各実験における各フラスコから得られた細胞の絶対数が数えられている表９を引用している。これらのフラスコから得られた細胞は、アデノウイルスアダプターとヘルパーＤＮＡ分子によるトランスフェクションのための９６ウェルプレートに接種するのに使用された。
【図４０】  アデノウイルス発現ライブラリーの感染後、表現型の遅延読み出しを伴う測定法のための半安定発現システムとしてのアデノウイルス発現ベクターの使用を示す（実施例２４）。使用されている形質転換遺伝子：グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）。粗製ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ産生リゼイトは、約５００〜１０００のＭＯＩで使用された。
【図４１】  小型化されたフォーマット（実施例２５）におけるアデノウイルスベクターの創製でのＰＥＩの使用を示す。トランスフェクション効率、ウイルス形成（ＣＰＥ）および増殖(proliferation)（毒性）が示されている。
【図４２】  ＣＰＥ効率におけるトランスフェクション時のＰＥＩ温度の効果を示す（実施例２５）。Ｗ：暖温度（室温）およびＣ：冷温度（４＿Ｃ）。
【図４３】  トランスフェクション効率におけるＰＥＩトランスフェクション容積の影響を示す（実施例２５）。
【図４４】  リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体を適用する前の無血清培地でのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａの洗浄を示す（実施例２６）。
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３４Ｉ】
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【図３４Ｊ】
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【図３４Ｋ】
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【図３４Ｌ】
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【図３４Ｍ】
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【図３４Ｎ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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