(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有する、フサリウム（Fusarium）属微生物由来のメタロプロテアーゼ：
（１）SDS-PAGEにより決定される分子量が45kDである；
（２）基質FTC−カゼインを用いて決定される至適温度が50℃である；
（３）基質FTC−カゼインを用いて決定される至適pHが9.5であり、pH8とpH11.5との間で最大活性の50％超の活性を示す；
（４）室温にて20分間のインキュベーションにより決定されるpH安定性は、pH8において最も安定であり、そして許容されるpH範囲はpH6.5とpH9との間である；及び
（５）基質Suss−Ala−Ala−Ala−pNAを加水分解しない。
【請求項２】
配列番号：２に示すＮ−末端アミノ酸配列を有する、請求項１に記載のメタロプロテアーゼ。
【請求項３】
配列番号：４の245位のAlaから632位のCysまでのアミノ酸配列のメタロプロテアーゼ。
【請求項４】
配列番号：４の245位のAlaから632位のCysまでのアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列のメタロプロテアーゼ。
【請求項５】
配列番号：４の245位のAlaから632位のCysまでのアミノ酸配列に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列のメタロプロテアーゼ。
【請求項６】
配列番号：４に示されるアミノ酸配列中の245位のAlaから632位のCysまでのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の保存的置換により修飾されたアミノ酸配列のメタロプロテアーゼ。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のメタロプロテアーゼの製造方法において、
フサリウム（Fusarium）属に属しメタロプロテアーゼを生産することが出来る微生物を培養し、そして
前記培養物からメタロプロテアーゼを採取する、
ことを含んで成る方法。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のメタロプロテアーゼの製造方法において、
前記メタロプロテアーゼをコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、そして
前記培養物からメタロプロテアーゼを採取する、
ことを含んで成る方法。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のメタロプロテアーゼをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項10に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項10又は11に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
サンプル中の活性化可能なプロ酵素の量を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のメタロプロテアーゼとプロ酵素とをインキュベートし、
（ｂ）上記工程（ａ）のインキュベーション後の混合物に、活性化されたプロ酵素のための基質を添加し、そして
（ｃ）上記工程（ｂ）に加えられ、切断された基質の量を測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１４】
サンプル中の活性化可能なプロ酵素の量を決定するためのキットであって、
（１）請求項１〜６のいずれか１項に記載のメタロプロテアーゼ、及び
（２）活性化されたプロ酵素のための基質、
を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、増加された蛋白質分解活性を有する真菌から得られうる新規なメタロプロテアーゼ及び該メタロプロテアーゼをコードする単離された核酸フラグメントに関する。本発明は、前記核酸フラグメントを含むベクター、DNA構成物、及び組換え宿主細胞に更に関する。
発明の背景
メタロプロテアーゼは、ペプチド骨格の加水分解において寄与する触媒亜鉛金属中心を含む（Power and Harper, in Protease Inhibitors, A.J.Barrett and G.Salversen(eds.）Elsevier, Amsterdam 1986, p.219)。活性亜鉛中心は、その活性がカルシウムの存在に依存するカルパイン及びトリプシンからこれらのいくつかのプロテアーゼを異ならせる。メタロプロテアーゼの例は、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、及びサーモリシンを含む。
メタロプロテアーゼは、いくつかの原核生物及び真核生物ソース、例えばバチルス・サブチリス(bacillus subtilis）(McConn et al., 1964, J. Biol. Chem. 239:3706）；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium)；セラティア（Serratia）(Miyata et al., 1971, Agr. Biol. Chem. 35:460)；クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridium bifermentans）（MacFarlane et al., 1992, App. Environ. Microbiol. 58:1195〜1200）、レギオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）(Moffat et al., 1994, Infection and Immunity 62:751〜３）が単離されている。特に、酸性のメタロプロテアーゼは、広範囲のアメリカマムシ毒液（Johnson and Ownby, 1993, Int. J. Biochem. 25:267〜278)、ガラガラヘビ毒液（Chlou et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:389〜396)及び関節の軟骨（Treadwell et al., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 251:715〜723)から単離されている。中性のメタロプロテアーゼ、特に中性のpHにおいて最大活性を有するものは、アスペルギルス・ソジアエ（Aspergillus sojae）（Sekine, 1973, Agric. Biol. Cherm. 37:1945〜1952）から単離されている。アスペルギルスから得られた中性のメタロプロテアーゼは、npＩ及びnpIIの２つのグループに分離されている（Sekine, 1972;Agric. Biol. Chem. 36:207〜216)。これまでは、これらの真菌の中性のメタロプロテアーゼからのアミノ酸配列情報を得ることにおける成功は限られていた。アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から単離されたnpIIメタロプロテアーゼは、文献において示されるアミノ酸配列を基礎にしてクローニングされていた(Tatsumi et al., 1991, Mol. Gne. Genet. 228:97〜103)。しかしながら、今日まで、クローニング又はシークエンシングされたnpＩ真菌メタロプロテアーゼはない。アルカリ性のメタロプロテアーゼは、例えば、シュードモナス・エアルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)(Baumann et al., 1993, EMBO J 12:3357〜3364）及び昆虫病原体キセノルハブダス・ルミネセンス(Xenorhabdus luminescens）(Schmidt et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 54:2793〜2793）から単離されている。
メタロプロテアーゼは、いくつかの使用があることが見い出されている。例えば、メタロプロテアーゼは、血管収縮薬エンドセリン−１の生体内蛋白質分解過程に関連する。ラットメタロプロテアーゼは、ペプチドホルモン処理に関することが見い出されている。しかしながら、メタロプロテアーゼがチモーゲンの試験管内処理に有用であり得ることの従来技術において示される証拠はない。
従って、特定の範囲の基質に新規のメタロプロテアーゼを供することは有利であろう。特に、組換え製造されたプロ酵素からのプロ配列を試験管内で切断することができる新規なメタロプロテアーゼを製造することは有用であろう。メタロプロテアーゼが試験管内で用いられ得るであろうように高収率で新規のメタロプロテアーゼを単離する、又はメタロプロテアーゼを製造することも有利であろう。例えば保存性及び非保存性の領域及び活性部位を決定するためにこれらのメタロプロテアーゼのアミノ酸及び／又は核酸配列を決定することも有利であろう。
発明の概要
本発明は、真菌から得られうる実質的に純粋なメタロプロテアーゼであって、（ａ）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される約40,000ダルトン〜約50,000ダルトンの分子量；（ｂ）約5.5〜10.0のpHにおいて最適に作用する；（ｃ）約30〜60分間、約25〜30℃で約6.0〜7.5のpHにおいて、1983年６月６日にブタベスト条約下において番号DSM2672下においてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Germanyに寄託されたＦ．オキシスポルム（F.oxysporum）の株から得られうる活性型トリプシン様プロテアーゼにプロ酵素を転化することにおいて、バチルス（Bacillus）から得られうるメタロプロテアーゼより少くとも約10倍有効である；そしてカゼインのペプチド骨格を切断することにおいてバチルスから得られうるメタロプロテアーゼより効果的でないことを特徴とするメタロプロテアーゼに関する。
１つの実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、約5.5〜6.0のpHにおいて最適に作用する。他の実施形態において、このメタロプロテアーゼの活性の約50％超が約８〜11のpHの間である。特定の実施形態において、このメタロプロテアーゼは約9.5の最適なpHを有する。このメタロプロテアーゼは約50℃の最適な温度も有し得る。
他の実施形態において、メルカプトペプチドと切断することにおいて、メタロプロテアーゼ、例えばバチルス、例えばバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus）及びバチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）から得られうるサーモリシンより約10〜50倍有効であり得る。メタロプロテアーゼの有効性は、特定の基質に関して１つのメタロプロテアーゼを他のメタロプロテアーゼと比較することにより決定され得る。
特定の実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、配列番号１：
0003726968.tif 000002
で示されるＮ末端アミノ酸配列を有する。ほとんどの実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、配列番号：２又は３に示されるＮ末端アミノ酸配列を有する。他の実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のメタロプロテアーゼは、（ａ）真菌株の発酵；（ｂ)(ａ）の発酵物の上清の回収；そして（ｃ)(ｂ）の上清からメタロプロテアーゼを単離して実質的に純粋なメタロプロテアーゼを得ることにより得られうる。
本発明は、先に記載される本発明のメタロプロテアーゼをコードする核酸配列を含む単離された核酸フラグメントにも関する。１つの実施形態において、前記核酸フラグメントは、配列番号：５に示される核酸配列を含む。他の実施形態において、前記核酸フラグメントは、配列番号：６に示される核酸配列を含む。
新規のメタロプロテアーゼの製造を容易にするために、本発明は、先に記載の核酸フラグメントを含むベクター、DNA構成物及び組換え宿主細胞も提供し、このベクター、DNA構成物及び組換え宿主細胞はメタロプロテアーゼの組換え体製造において有用である。この核酸フラグメントは、選択された宿主細胞におけるメタロプロテアーゼの発現を誘発することができる転写及び翻訳シグナルに作用的に結合され得る。本発明のメタロプロテアーゼの組換え体製造は、本発明の核酸フラグメントを形質転換又はこれを移入された宿主細胞又はその子孫をメタロプロテアーゼの発現に適した条件下において培養してこの培養物からメタロプロテアーゼを回収することにより達成される。
本発明のメタロプロテアーゼは、活性型又は成熟した酵素の産生を引きおこすプロ酵素からpro配列を切断することに用いられ得る。更に、本発明のメタロプロテアーゼは、前記酵素からのpro配列の切断の後の活性型酵素の活性のレベルを測定するための方法及び／又はキットにおいて用いられ得る。
定  義
本明細書において“最適に作用する”とは、特定の基質Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロアニリドヒドロクロライド(L-BAPNA）を用いて番号DSM2672下においてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Germanyにおいて寄託されたフサリウム・オキシスポルム（Fusarium-oxysporum）の株から得られうるプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムからの遊離トリプシン活性により測定される約5.5〜10.0の間のpH範囲内で大きな（即ち最大値の少くとも約30％、好ましくは少くとも約50％最も好ましくは50％〜最大の）活性を示すことをいう。特に、メタロプロテアーゼをＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼと混合し、約25〜30℃において約30〜60分間インキュベートし、そして基質としてL-BAPNAを用いて、405nmにおける吸収変化を測定することにより、トリプシン活性の量が決定される。この結果は、標準のフサリウムトリプシン様プロテアーゼのトリプシン成分と比較して計算される。あるいは、プロテアーゼの活性は、当該技術において周知である普通のメタロプロテアーゼアッセイにより決定され得る。例えば、カゼインのような蛋白質基質を用いてプロテアーゼ活性を検出することができる。特に、メタロプロテアーゼがスクシニル化カゼインを切断する試験管内比色アッセイにより定量することができる。蛋白質加水分解により生じた遊離した最初のアミノ基は比色的に定量される。他の基質は、これらの限定されないが、ジニトロフェニル誘導体を含む。カゼインが蛍光標識、例えばFTC(フルオレセインイソチオシアネート）を含む場合、試験管内蛍光アッセイにより活性を定量することもできる。
本明細書において定義される“有効でない”とは、メタロプロテアーゼが、例えば実施例５に記載される手順を用いて、pH約6.5、約30〜60分間、約25〜30℃におけるインキュベーションの後、サーモリシン、ジスパーゼ(dispase）及び／又はバチルス−ステアロサーモフィルス中性メタロプロテアーゼより少くとも25％少いカゼインを加水分解することを示す。
本明細書において定義される“実質的に純粋な”メタロプロテアーゼは、他の非メタロプロテアーゼ蛋白質が本質的に（即ち90％以上）ないメタロプロテアーゼである。
本明細書において定義される“活性型トリプシン様プロテアーゼ”とは、当該技術において周知である手順により決定される酵素活性を示す酵素の形態を示す。
本明細書において定義される“プロ酵素”という言葉は、酵素の前駆体又は前駆形態を示す。典型的には、プロ酵素は、活性酵素のアミノ酸配列を含むプロペプチド部分及びポリペプチド部分により構成される。プロ酵素は、チモーゲン又は前駆体とも言われ得る。
本明細書において定義される“発酵”という言葉は、メタロプロテアーゼの発現又は単離を引きおこす細胞の培養のいずれかの方法を示す。これにより、発酵は、適した発酵媒体において行われ、メタロプロテアーゼが発現され、もしくは単離されることを許容する条件下における研究室又は工業的発酵槽等における（連続的、バッチ及びフェド・バッチ(fed-batch）発酵を含む）フラスコ振とう培養、小量又は大量発酵を含むとして理解され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、後の実施例において更に記載される組換えトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの発現のために用いられる発現プラスミドpSX183の作製を示す。
図２は、Ｆ．オキシスポルム蛋白質分解酵素の、プロＦ．オキシスポルムプロテアーゼを処理するのに用いられるバチルスメタロプロテアーゼのそれとの比較を示す。
図３は、ｐ45のゲノムDNA配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
図４は、プラスミドpDM120の地図を示す。
図５は、プラスミドpSO2の地図を示す。
図６は、プロＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼとＦ．オキシスポルムｐ45メタロプロテアーゼの両方の遺伝子を含むＡ．オリザエ（A.oryzae）形質転換体のSDS-PAGE分析を示す。レーンは、レーン１，分子量マーカー；レーン２，対照Ａ．オリザエ株（形質転換されていない）；レーン３，ｐ45のみで形質転換されたＡ．オリザエ；レーン４，pSX183トリプシン様プロテアーゼのみで形質転換されたＡ．オリザエ；レーン５〜10，ｐ45及びプロＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの両方で形質転換されたＡ．オリザエからの上清を含む。
図７は、精製されたnpＩのＮ末端アミノ酸配列のｐ45との比較を示す。
図８は、スクシニル化カゼインアッセイを用いた中性プロテアーゼ活性の比較を示す。
図９は、ｐ45メタロプロテアーゼとバチルスサーモリシンの温度安定性プロファイルを示す。
図10は、ｐ45メタロプロテアーゼ及びバチルスサーモリシンのpHプロファイルを示す。
図11は、プロテアーゼの塩耐性を示す。
発明の詳細な記載
メタロプロテアーゼの単離
本発明のメタロプロテアーゼは、真菌細胞の発酵物の上清から回収することができる。１つの実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、フサリウム発酵物、例えばフサリウム・オキシスホルム、特に、番号DSM2672下においてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Germanyにおいて寄託されたＦ．オキシスポルムの株の上清から得られうる。他の実施形態において、本発明のメタロプロテアーゼは、アスペルギルス（Aspergillus)、発酵、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)、又はアスペルギルス・ニジュラン（Aspergillus nidulan)の株の上清から得られうる。
真菌は、当該技術において周知である手順を用いて培養することができる（例えば、Bennett. J.W. and LaSure, L.(eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。本発明のメタロプロテアーゼは、遠心又はろ過により培地から回収され、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清又はろ過物の蛋白質の構成物を沈殿させ、次に種々のクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
単離されたメタロプロテアーゼは、例えばSDS-PAGEによりキャラクタライズされ、当該技術において周知である手順を用いてアッセイすることができる。例えば、先に記載のように、メタロプロテアーゼは、特定の基質Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロアニリドヒドロクロライド（L-BAPNA)を用いて番号DSM2672下のDeutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Germanyにおいて寄託されたＦ．オキシスポルムの株から得られうるプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスホルムプロテアーゼによりコードされる組換え体前駆形態からの遊離トリプシン活性についてアッセイすることができる。本発明のメタロプロテアーゼの活性は、カゼインからの一次アミノ基を切断する能力によってもアッセイすることができる。
メタロプロテアーゼ遺伝子のクローニング及び発現
本発明のメタロプロテアーゼ及び本発明のDNA構成物をコードする核酸配列は、ゲノム又はDNA源のものであり得る。例えばこれは、適切な生物のゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、例えば標準的な技術（例えばSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989)に従ってプロ酵素又はメタロプロテアーゼのアミノ酸配列を基礎として調製された合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成することによりプロ酵素又はメタロプロテアーゼの全部又は一部についてコードする核酸配列についてスクリーニングすることにより得られる。
本発明の核酸配列及びDNA構成物は、確立されている標準的技術、例えばビューケージらの論文（Beaucage et al.（1981), Tetrahedron Letters 22, pp.1859〜1869）及びマシューズらの論文（Matthes et al.（1984), The EMBO J. 3:801〜805)により記載されるホスホアミジト法(phospoamidite）法るにり合成的に調製することもできる。ホスホアミジドに従って、例えば自動DNA合成機において合成し、精製し、結合し、そして適切なベクター内においてクローニングする。
最後に、核酸配列及びDNA構成物は、標準的な技術に従って、（適切なものとして）合成ゲノム又はDNA源のフラグメント、即ち完全なDNA構成物の種々の部分に相当するフラグメントを結合することにより調製される混合された合成及びゲノムの、混合された合成及びcDNAの、又は混合されたゲノム及びcDNAの源のものであり得る。
本発明の方法における本発明のメタロプロテアーゼの発現のために用いられる細胞は、適切には、培養により大量の本発明のメタロプロテアーゼを産生する細胞である。先に記載のように、細胞は、本発明のメタロプロテアーゼを産生する天然のものであり得るが、好ましくは、メタロプロテアーゼをコードする核酸配列で形質転換されている本発明の細胞である。細胞は、都合よくは、これらに限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞を含む原核又は真核細胞のいずれにおける組換え蛋白質を産生する宿主として以前から用いられているものであり得るが、好ましくはバクテリア又は真菌のような微生物である。“真菌”という言葉は、糸状菌及びイーストを含むことを意図する。
適切なバクテリアの例は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniforms）、バチルス・レンタス(Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium）、バチルス・サーキュランンス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウトゥス(Bacillus lautus）のようなバチルス属及びストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）のようなストレプトマイセス属のグラム陽性バクテリアである。適切なグラム陰性バクテリアの例は、大腸菌のような大腸菌属のバクテリアである。バクテリアの宿主細胞の形質転換は、例えばプロトプラスト形質転換により、又はそれ自体周知である方法においてコンピテント細胞を用いることにより行われ得る。他の適切なバクテリア細胞は、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・フラジ(Pseudomonas fragi）、シュードモナス・グラジオリ（Pseudomonas gladioli）、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・ストゥトゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・グルマエ（Pseudomonas glumae）又はシュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）のようなシュードモナス種の細胞である。
あるいは、細胞は、真菌、即ちイースト又は糸状菌の細胞であり得る。イースト細胞は、例えば、Ｓ．セレビシアエ（S.cerevisiae）のようなサッカロマイセス(Saccharomyces）属の細胞であり得る。糸状菌宿主生物は、例えばＡ．ニゲル(A.niger）、Ａ．ニジュランス（A.nidulars）又はＡ．オリザエ（A.oryzae）のようなアスペルギルス(Aspergillus）種の株であり得る。アスペルギルス宿主細胞を形質転換して組換え蛋白質の発現を得るために用いられる技術は、適切には、EP238023に記載されるものである。あるいは、真菌宿主細胞は、Ｆ．オキシスポルム(F.oxysporum）のようなフサリウム（Fusarium）の株であり得、この形質転換は、Malardier. et al., 1989, Gene 78:147〜156により記載されるように行われ得る。
発現を得るために、メタロプロテアーゼをコードする核酸配列は、プロモーターにより通常、先行される。プロモーターは、選択された宿主において強い転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素のような細胞外又は細胞内蛋白質をコードする遺伝子から得られうる。適切なプロモーターの例は、特にバクテリアの宿主を用いる時、大腸菌のlacオペロン、ストレプトマイセス・コエレコロル(Streptomyces coelicolor）アガロース遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)αのプロモーター、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis）xylA及びxinB遺伝子のプロモーターである、イースト宿主において有用なプロモーターは、eno-1プロモーターである。真菌宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（A.oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei）アスパラギンプロテアーゼ、Ａ．ニゲル（A.nigel）α−アミラーゼ、Ａ．ニゲル酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニゲル又はＡ．アワムッシ(A.awamsii）グルコアミラーゼ（gulA）、リゾミコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei）リパーゼ、Ａ．オリザエアルカリプロテアーゼＡ、Ａ．オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニジュランス（A.nidulams）アセタミダーゼをコードする遺伝子から得られるものである。好ましいのは、TAKA−アミラーゼ及びgluAプロモーターである。
メタロプロテアーゼの発現に関連する他の配列は、終止及びポリアデニル化配列並びにリボソーム結合部位を含み、適切には、前記プロモーターと同じソースから得られうる。ベクターは、該ベクターが問題の宿主細胞、例えば複製の適切な源内において複製することを可能にする核酸配列を更に含むことができる。
ベクターは、選択可能マーカー、例えばＢ．サブチリス又はＢ．リケニルホルミスからのdal遺伝子のような、宿主細胞内において不足物を補足する産物の遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を与えるものも含み得る。アスペルギルス選択マーカーの例は、ハイグロマイシン耐性を起こさせるamdS, pyrG, argB, niaD及びsCを含む。アスペルギルス宿主細胞において用いるために好ましいのは、Ａ．ニジュランス又はＡ．オリザエのamdS及びpyrGマーカーである。頻繁に用いられる哺乳動物マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子である。更に、例えばWO91／17243において記載されるような共形質転換(co-transformation）により選択が行われ得る。
本発明のDNA構成物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素各々を結合するために、そしてそれらを複製のために必要な情報を含む適切なベクター内に挿入するために用いられる手順は当業者に公知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。
先に記載される本発明のDNA構成物又は発現ベクターを含むいずれの本発明の細胞も、本発明の酵素の組換え体産生において宿主細胞として有利に用いられる。宿主細胞は、都合よくは、組換え宿主細胞を得るために宿主染色体内においてDNA構成物を一体化させることにより、本発明のDNA構成物で形質転換することができる。この一体化は、DNA配列としての利点であると一般的に考えられ、細胞内に安全に維持されることがより好ましい。宿主染色体内へのDNA構成物の一体化は、慣用の方法に従って、例えば同種又は異種組換えにより行われ得る。あるいは、細胞は、異なる型の宿主細胞に関連した先に記載の発現ベクターで形質転換し得る。
結果として生じる組換え宿主細胞の発酵のために本発明の方法において用いられるブイヨン又は培地は、問題の細胞を増殖させるのに適したいずれの慣用の培地でもあり得る。適切な培地、例えば最小又は複合培地は、供給元から市販されており、（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログにおける）出版されている方法に従って調製することができる。
本発明のメタロプロテアーゼは、これらに限定されないが、必要に応じて細胞の破砕後に遠心又はろ過によりブイヨンから細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清又はろ過の蛋白質の構成物を沈殿させ、次に種々のクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー等により精製することを含む慣用の方法によりブイヨンから回収され得る。実際の回収方法は問題の蛋白質の種類による。
当業者は、本発明が特に本明細書に開示される、例えば図３における核酸フラグメントの使用に限定されないことを認めるであろう。本発明は、図３に示されるのと同じアミノ酸配列をコードするが、遺伝コードの縮退によりこれらの特に示されたヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含むことも明らかであろう。本発明は、特に、いずれの変異ヌクレオチド配列及びそれによりコードされた蛋白質をも含み、この蛋白質は、図３に示されるアミノ酸配列の１つ又はその他と少くとも約80％、好ましくは90％、最も好ましくは95％の相同性又は同一性を保持し、本明細書に記載される配列のメタロプロテアーゼ及びpH最適活性を保持する。特に、前記メタロプロテアーゼの高度に保存された領域において高レベル（即ち80％以上）の相同性を保持する変異体が考えられる。更に、本発明は、以下の条件下においてメタロプロテアーゼのヌクレオチド配列とハイブリッド形成するいずれの変異体も含む：５×SSC中に予備浸漬して、20％ホルムアルデヒド、５×Denhardt's溶液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、及び50μｇ変性音波処理されたウシ胸腺DNAの溶液中で約40℃において１時間予備ハイブリッド形成し、次に約40℃において18時間、100μＭ ATPが補足された同じ溶液中でハイブリッド形成し、次に約45℃の温度において0.4×SSC中で洗浄する。
先に記載されるカテゴリー内における有用な変異体は、例えば保存性のアミノ酸置換が行われ該置換が蛋白質の活性に重大な影響を与えないものを含む。保存性の置換によるとは、同じクラスのアミノ酸がそのクラスのいずれの他のものによっても置換され得ることを意味する。例えば、非極性脂肪残基Ala, Val, Len、及びIleが、塩基性残基Lys及びArg、又は酸性残基Asp及びGluで行い得るように相互交換し得る。同様に、Ser及びThrは、互いに保存性の置換であり、Asn及びGlnも同様である。このような置換が分子の機能に重大な領域の外で行われ、なお活性酵素を生じ得ることは当業者に明らかであろう。要求される活性の保持は、先に記載されるアッセイ方法を用いることにより直ちに決定することができる。
使  用
本発明のメタロプロテアーゼは、いくつかの異なる方法において有用である。例えば、本発明のメタロプロテアーゼは、活性型又は成熟した酵素の産生を生じるプロ酵素からのプロ(pro）配列を切断するのに用いることができる。
先の開示から、メタロプロテアーゼは、転換されるべきプロ酵素を産生する細胞が培養されている発酵ブイヨンに上述のように添加することができる。このメタロプロテアーゼは、バッチ様に、又は連続的に添加することができる。
あるいは、発酵ブイヨンにおけるメタロプロテアーゼの存在は、プロ酵素及びメタロプロテアーゼを発現することができる細胞を作製し、プロ酵素及びメタロプロテアーゼの産生及び次のメタロプロテアーゼによるプロ酵素の活性化を導く条件下において前記細胞を培養することにより達成され得る。適切な細胞は、１以上の発現ベクター上に任意に存在するプロ酵素及びメタロプロテアーゼをコードする核酸配列で形質転換することにより作製することができる。あるいは、例えばプロ酵素をコードする核酸配列を含む非相同核酸フラグメントを既に含む細胞を選択し、組換えDNA法により前記細胞内にメタロプロテアーゼをコードする核酸配列を導入する（又はその逆）ことができる。
あるいは、プロ酵素を発現する細胞及びプロ酵素を活性形態に転換することができるメタロプロテアーゼを発現する細胞は、前記プロ酵素及び前記メタロプロテアーゼの発現並びにプロ酵素の活性酵素への転化を許容する適切な条件下において同時発現され得る。活性酵素は養物から回収される。この実施形態に従うと、前記プロ酵素及び祖メタロプロテアーゼの少くとも一つが変異体であることが好ましい。
本発明のメタロプロテアーゼは、サンプル中に存在する活性可能プロ酵素の量を測定するための方法及び／又はキットにおいて用いられ得る。このような方法は、（ａ）約30分間〜約１時間、室温において、本発明のメタロプロテアーゼ、プロ酵素をインキュベートし；（ｂ）活性化プロ酵素のための基質を混合物（ａ）に添加し；そして（ｃ）切断された（ｂ）中に添加された基質の量を測定することを含む。特定の実施形態において、プロ酵素は例えばフサリウム・オキシスホルムからのトリプシン様プロテアーゼの組換え体形態である。基質は、２，４−ジニトロフェニル誘導体、トリプシンのためのパラ−ニトロフェノール誘導基質、カゼイン又はL-BAPNAからなる群から選択され得る。好ましい実施形態において、切断された基質は、例えば、種々の間隔（例えば0.5分で405における）のサンプルの吸収における増加を測定することにより可視分光法により検出され得る。キットは、（ａ）本発明のメタロプロテアーゼ及び（ｂ）活性プロ酵素のための基質を含む。本発明のキットは、緩衝液も含むことができる。
実施例
実施例１：フサリウム・オキシスポルムからのｐ45メタロプロテアーゼの単離及びキャラクタリゼーション
材料及び方法：
精製：
Ｆ．オキシスポルムブイヨンを9000rpmで10分間、遠心し、その上清を0.45μｍフィルターを通してろ過する。ろ液200mlをAmicon cell（PM10メンブラン）及びCentriprep-O（Amicon）で10mlに濃縮する。濃縮物５mlを100mlに希釈して酢酸でpHを５に調節し、次の緩衝液：70分にわたる０→0.5Ｍ塩化ナトリウムの勾配において0.1Ｍホウ酸塩、10mM DMG, ２mM塩化カルシウム、pH5.2でこの緩衝液で洗浄した後１ml／minの流速で１ml MonoSカラムにかけ、1.5mlフラクションを収集してCentricon-10（Amicon）で濃縮する。
Superose 12（HR 10／30, Pharmacia)を用いるゲルろ過を0.1Ｍホウ酸塩、10mM DMG, ２mM CaCl2, pH6.5中において流速0.4ml／minで、0.4mlフラクションを収集し、200μｌサンプルを注入して行う。
蛋白質分解酵素アッセイ：
0.1Ｍトリス、２mM CaCl2, pH７（低pHで100mMホウ酸塩、10mM DMG, ２mM CaCl2を用いる）中で25℃で30〜60分間予備インキュベーションした後、番号DSM2672下においてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, Germanyにおける寄託されたプロトリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼからの遊離トリプシン活性としてメタロプロテアーゼ活性を測定する。トリプシン活性をマイクロタイタープレートにおいて測定する；100μｌサンプルを100μｌの基質（保存：緩衝液中に50倍に希釈されたDMSO中87mg／mlのL-BAPNA（Sigma))と混合し、Molecular Devicesからのサーモマックス(Thermomax）マイクロプレートリーダーを用いて405nmにおける吸収を測定する。
SDS-PAGE及びPVDF上へのエレクトロブロッティング
製造元の説明書に従ってSDS-PAGE（10〜27％；Novex)を行う；かけるべきサンプルをサンプル緩衝液を加える前にPMSFと予備インキュベートする。プローブロットメンブラン（Applied Biosystems）上へのエレクトロブロッティングを、Novexからのブロッテンィグモジュールを用いて２時間、30Ｖにおいて３mM Na2CO3, 10mM NaHCO3, 20％ MeOH, pH9.9中で行う。プローブロットをApplied Biosystemsにより記載されるように染色する。
IEF−オーバーレイ：
等電点電気泳動  （IEF）（Ampholine PAG-plate;pH3.5〜9.5, Pharmacia）を、製造元の説明書に従って行い、染色する。オーバーレイされるべきゲルを0.1Ｍトリス，２mM CaCl2, pH8.1中に15分間最初に平衡化し、その後、300μｌのL-BAPNA保存液及び500μｌの前掲の組換えプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（約0.25mg／ml）が添加された10mlの１％アガロース0.1Ｍのトリス，２mMのCaCl2, pH8.1でオーバーレイする。
アミノ酸分析及びアミノ酸シークエンニング：
MDS-2000ハイドロソシス・ステーション(CEM）を用いて、凍結乾燥されたサンプルのマイクロウエーブ・ファシリティティド気相加水分解を行う。１％フェノール（スカベンジャー）を含む６Ｎ HClを気相を形成するために用いる。加水分解時間は、70psiにおいて20分である（約148℃）。加水分解されたサンプルを凍結乾燥して、内的標準として500pmol／μｌのサルマシン及びノルバリン20μｌ中に再溶解する。製造元の説明書に従ってHewlett-packaredからのAminoQuantを用いて分析を行う；１μｌのサンプルを注入する。アミノ酸シークエンシングを製造元の説明に従ってApplied Biosystemsからの476A Protein Sequencerを用いて行う；オンライン−HPLCのために予備混合された緩衝液を用いる。
トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを発現することができる組換えＡ．オリザエ株の作製
トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのプロ酵素形態をコードし、添付の配列番号：１に示されるDNA配列を有するcDNAをノマらの論文（Noma et al.（1986), Nature 319:640〜646)に記載されるベクターpCDV1-PL内に挿入してプラスミドpSX180とする。cDNAのコーディング領域をNcoI-XaIフラグメントとして、BamHIで、及びXbaIで部分的に切断されたアスペルギルス発現プラスミドｐ777（EPO 489 718）内に挿入する。複製されたDNAの５′末端をベクターに連結するために、合成リンカーDNA KFN709／710(図１に示す）を連結反応に加える。結果として生じるプラスミドpSX183をＡ．ニジュランス（WO91／17243)からのamdSを有するプラスミドpToC90と共にＡ．オリザエ(IFO4177）内に同時形質転換する。
結  果
Ｆ．オキシスポルムブイヨンからのｐ45の精製
陽イオン交換クロマトグラフィー(MonoS）を用いることにより濃縮されてろ過された発酵ブイヨンからｐ45メタロプロテアーゼを精製し、Superose12でゲルろ過する。前掲のプロトリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼからの遊離トリプシン様活性としてメタロプロテアーゼ活性についてアッセイすることによりMonoSからのフラクションを選択する。Superose12カラムからのフラクションを含むメタロプロテアーゼを、MonoS−フラクションについてのものと同じアッセイ方法を用いることにより同定する。この精製されたメタロプロテアーゼは45kDaにおいてSDS-PAGE上単一バンドとして表れる。このメタロプロテアーゼの２つのイソ形態が各々pI8.9及び8.7においてIEF（pH3.5〜9.5)において観察される。
アミノ酸分析の結果は、このメタロプロテアーゼ（ｐ45）が配列番号：２として配列表に示されるＮ末端アミノ酸配列を有する。
精製されたＦ．オキシスポルムｐ45メタロプロテアーゼは、高い特異活性を示す。
ゲルろ過カラムからの要求されるメタロプロテアーゼフラクションをプールして調製用IEF装置上に充填する。アンペア数が安定した後、１時間、1000Ｖ、その後、各々３mlの30フラクションが収集される前に500Ｖで更に30分間サンプルを走らせる。このフラクションから得られるフサリウムメタロプロテアーゼの280nmにおけるサンプルの吸収を基礎とした特異活性は、前掲のプロトリプシン様フサリウムオキシスポルムプロテアーゼを成熟させるのに用いた慣用のバチルスメタロプロテアーゼのそれより約10倍大きいことを示した（図２）。
ｐ45はメタロプロテアーゼである。
メタロプロテアーゼはペプチド骨格の加水分解に寄与する触媒の亜鉛金属中心を含む。活性亜鉛中心は、その活性がカルシウムの存在に依存するカルパインからこれらのプロテアーゼを異ならせる。メタロプロテアーゼとしてのプロテアーゼの確認は、１，10−フェナントロリン（１mM）での亜鉛中心の除去により蛋白質分解活性が消失し、それに続くZn2+(0.1〜100μＭ）の適定で完全な活性が回復する。
表１は、前掲の実施例１の材料及び方法において開示されるトリプシン様フサリウムオキシスホルムプロテアーゼが、インヒビターを添加した、又は添加しない同様のトリプシン活性が各々33.8×10-4及び34.0×10-4ΔAbs／分であったことから１，10−フェナントロリンにより阻害されることを証明する。前掲のプロトリプシン様フサリウムオキシスポルムプロテアーゼ又はフサリウムオキシスポルムメタロプロテアーゼサンプル単独は、いずれのトリプシン活性も有さない（表１）。しかしながら、組み合わせた時に、メタロプロテアーゼは、前掲の組換えプロトリプシン様フサリウムオキシスポルムプロテアーゼを切断して活性型トリプシンプロテアーゼを作り出す。メタロプロテアーゼ活性は、１mMの１，10−フェナントロリンの添加により停止する。しかしながら、１mMのZn2+の添加によりフサリウムメタロプロテアーゼの十分な活性が起こる。１，10−フェナントロリンの代わりにEDTA（１mM）を置換した場合にも同様の結果が得られる。
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実施例２：フサリウム・オキシスポルムｐ45遺伝子のクローニング
Ｆ．オキシスポルムｐ45遺伝子の一部分をPCRにより最初にクローニングする。１つのプライマーをＮ末端蛋白質配列（配列番号：７）を用いてデザインし、逆のプライマーを内部のメタロプロテアーゼペプチド配列（配列番号：８）からデザインする。DNAプライマー及びフサリウム・オキシスポルムから単離されたゲノムDNAを用いてPCRを行う。ゲノムDNAを次のように単離する。約15ｇの湿重量のＦ．オキシスポルムを30℃でMY50培地（50ｇ／ｌマルトデキストリン、２ｇ／ｌ Ma2SO4、10ｇ／ｌ KH2PO4、２ｇ／ｌクエン酸、10ｇ／ｌイーストエキス、２ｇ／ｌ尿素、２ｇ／ｌ K2SO4、５Ｎ NaOHでpH＝６にした微量金属溶液）中で増殖させる。菌糸体を16ml TE（10mM Tris-HCl, １mM EDTA, pH＝8.0)中に懸濁し、２つのチューブに分割し、各々のチューブに0.45〜0.52mmガラスビーズ（Thomas Scientific）約12ｇを加える。このサンプルを検出可能な粘度の低下がおこるまで30秒間の間隔でボルテキシング及び氷冷を交互に行う。サンプルを更に２回30秒間隔でボルテキシングする。各々のサンプルに2.5mlの20％ SDSを加える。サンプルを反転させることにより混合し、室温で10分間インキュベートして再び混合する。サンプルを室温で3.5Ｋで８分間、回転させる上清を50mlポリプロピレンチューブ内で組み合わせる。サンプルをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:１）で平衡化された等量のTEで抽出し、その後４℃で10,000rpmで10分間遠心する。この上清を300μｌの10mg／mlプロティナーゼＫで25℃で30分間処理する。DNAを先に記載されるようにフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｐ／Ｃ／Ｉ）抽出し、エタノールで沈殿させて５ml TE中に溶解する。このサンプルを65℃で15分間、その後25℃で15分間、150μｌの10mg／ｌ RNAaseAで処理する。このサンプルを再びプロティナーゼＫで処理し（25℃で1.5時間、100μｌの10mg／ml）、その後２回Ｐ／Ｃ／Ｉで抽出しエタノールで沈殿させる。DNAを曲がったバスツールピペットの上に巻きとり、５mgの80％エタノールに移す。このサンプルを10,000rpmで３分間、回転させる。このDNAペレットを手短かに乾燥させ、その後１ml TE中に溶解させる。
以下のようにＦ．オキシスポルムｐ45の一部分クローニングするのにPCRを用いる：50〜100mgのＦ．オキシスポルムゲノムDNAを１×Taq緩衝液(Boehringer Mannheim）中の合成PCRプライマーDNAの各々約100ｐモル並びにdGTP, dATP, dTTP及びdCTPの各々100μＭの濃縮物と50μｌの容量において混合する。Taq DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim）、１〜５ユニットを加えてPCRインキュベーションを95℃で５分間、その後、〔95℃30秒間：50℃１分間：72℃１分間〕の35サイクルを行う。PCR反応は、約1.0及び1.3kbの長さの２つのDNAフラグメントを作り出す。これらのフラグメントをゲル電気泳動により単離し、精製し、プラスミドを複製する大腸菌内にクローニングし、分子生物学の技術において周知である標準的な方法を用いてシークエレシングする。この1.0kbのDNAフラグメントは、直接の蛋白質シークエンシングから得られたアミノ酸配列とのDNAの翻訳の比較によりＦ．オキシスポルムｐ45遺伝子配列を含むことが見い出される。それゆえ、この1.0kb PCR生成DNAフラグメントは、Ｆ．オキシスポルムゲノムDNAライブラリーから完全なメタロプロテアーゼ遺伝子を複製するためのプローブとして用いられる。
ラムダファージにおけるゲノムDNAライブラリーをサムブルックらの論文(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)に記載されるような方法を用いてＦ．オキシスポルムゲノムDNAから調製する。全部で50μｇのゲノムDNAを10mMのトリス、pH7.5, 50mM NaCl, ７mM MgCl2, ７mM  ２−メルカプトエタノール、及び４ユニットの制限酵素Sau3Aを含む200μｌの容量中において、25℃で１分間、消化する。分子サイズ10／20kbの部分的に消化されたDNAをアガロースゲル電気泳動、次に電気溶出により透析膜内に単離して、Elutip-Dカラム（Schleicher and Schuell）を用いて濃縮する。制限酵素BamH1で切断され、ホスファターゼ(Clonetech）で処理されているEMBL4のファージのラムダアームの１μｇを標準条件下において25μｌの容量における300〜400μｇ Sau3A切断ゲノムDNAに連結する（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。製造元の説明書に従って市販のキット（Gigapack Cold II, Stratagene）を用いてこの連結混合物から調製する。約18,000の組換えラムダファージのプレーティング及びフィルターリフト（Ｎ＋フィルター；Amersham）の製造を標準的な方法（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)を用いて行った。このろ液を製造元により供される説明書を用いる非放射性核酸検出（Boehringer Mannheirm）のためのGenius Kitでのハイブリッド形成のために処理する。ｐ45プローブとして用いられるDNAは先に記載される1.0kb PCRフラグメントである。このプローブを製造元により供給されるDIG標識キット及び説明書を用いるジオキシジエニン(DIG）のPCR組み込みにより標識する。1.0kbのｐ45フラグメントの15mgを、全量80μｌにおける各々Ｎ末端プライマー（配列番号：７）及び内部の逆プライマー（配列番号：８）、並びに１〜５ユニットTaqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim）100ｐモルとの１ Taq×緩衝液(Boehringer Mannheim）１×DIG標識混合物(Boehringer Mannheim）、中に混合する。反応条件は95℃３分間、35×〔95℃30秒；50℃１分；72℃１分〕、72℃５分である。DIG標識プローブを用いるフィルターハイブリッド形成及び洗浄条件は、Genius Kit製造元により供される説明書を用いて行った。
ハイブリッド形成しているファージをアルカリ性リン酸接合抗ジゴキシジエニル抗体で検出し、製造元（Boehringer Manheim）により示されるようにLumiphos530で視覚化する。Qiagen Lambda Midi Kit（QIAGEN, Inc:）を用いて陽性のラムダクローンからDNA標品を作製する。１つの標品からのDNAを制限酵素EcoRIで消化し、6.3kbフラグメントをプラスミドpUC118内にサブクローンする。このサブクローンの部分のDNA配列分析は、ｐ45遺伝子の完全なコーディング領域を同定した（図３及び配列番号：４を参照のこと）。
以下の改良を加えた先に出版されているプロトコル（Chirguin et al., Biochemistry 18:5294〜6299（1989), Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69:1408〜1412（1972))に従ってＦ．オキシスポルムから全RNA及びポリ−Ａ RNAを調製する。特に菌糸体を液体窒素中で破砕して細かい粉末にした後、４Ｍグアニジウムチオシアネート、0.5％Na−ラウリルサルコシン、25mMクエン酸ナトリウム、及び0.1Ｍ２−メルカプトエタノール、pH＝7.0に再懸濁して室温で30分撹拌する。細胞デブリスを低速（5000rpmで30分間）遠心することにより除去する。典型的には、Boehringer Manheimから得られるオリゴ（dT）セルロースを用いてポリ−Ａ RNAフラグメントを単離する。
ヘアピン／RNaseH法（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)を用いてcDNAを作るのにポリＡ RNAを用いる。特に５μｌ水中の５μｇポリＡ RNAを70℃に加熱した後、氷上におく。５μｌのポリＡ RNA、50mMトリス（pH＝8.3)、75mM KCl、３mM MgCl2、10mM DTT、各々１mM dGTP, dATP, dTTP及びdCTP、40ユニットRNasin、10μｇオリゴ(dT12-18）プライマー、及び1000ユニットSuper ScriptII RNaseH−逆転写酵素(Bethesda Plesearch Laboratories）を含む全反応混合物50μｌを調製するこの混合物を45℃で１時間インキュベートする。その後、10mMトリス、pH7.5、１mM EDTA、40μｇグリコーゲン担体（Boehringer Manheim）、0.2容量10Ｍ酢酸アンモニウム、及び2.5容量エタノールの30μｌを加えて核酸を沈殿させる。遠心後、このペレットを20mMトリス(pH7.4）、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM硫酸アンモニウム、16μＭ  β-NAD+、各々100μＭ dGTP, dATP, dTTP, dCTP, 44ユニット大腸菌DNAポリメラーゼＩ、6.25ユニットRNaseH、及び10.5ユニットDNAリガーゼ中に懸濁する。第２鎖DNA合成を16℃で３時間この溶液中で行う。このDNAをエタノール沈殿により濃縮し、このペレットを30mM酢酸ナトリウム(pH7.6）、300mM NaCl、１mM ZnSO4、0.35mM DTT、２％グリセリン、及び30ユニットMung Beanヌクレアーゼ（Bethesda Research Laboratories）の30μｌ中に30℃で30分間、再懸濁する。このDNA溶液を70μｌの10mMトリス、pH7.5、１mM EDTAで中和し、フェノール抽出してエタノールで沈殿させる。このペレットを50μｌ緩衝液（20mMトリス−アセテート、pH7.9、10mM酢酸マグネシウム、50mM酢酸カルシウム、１mM DTT、各々0.5mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP）中で25℃で15分間、7.5ユニットＴ４ポリメラーゼ（Invitrogen）で処理する。この反応をEDTAを20mMまで加えることにより停止させ、その後フェノールで抽出してエタノールで沈殿させる。この方法の結果物は、DNAリンカーの結合及びいずれかのベクターへのクローニングに適した平滑断端を有する二本鎖cDNAである。
EcoRIリンカーを有するcDNAをアガロースゲルでサイズ分画して分子サイズ0.7kb以上のcDNAを得る。このcDNAを電気溶出によりゲルから回収してフェノール抽出及びエタノール沈殿により精製する。サイズ分画されたcDNAをラムダcDNAライブラリーを作製するのに用いる。このcDNAをラムダZIPLOXアーム(Gibco BRL）内にクローニングする。先に記載されるようなプラークリフト及びDNAハイブリッド形成の技術でプローブとして467bpジゴキシジエニン標識フラグメント（ゲノムクローンのbp336〜803)を用いて全長のcDNAラムダクローンを同定する。全長のcDNAを製造元（Gibco BRLからの株及びプラスミド）により記載されるようにプラスミドpZL1中に回収する。全長のcDNAをシークエンシングしてゲノムcDNAの配列を比較する。ゲノムDNAは長さ2049bpで３つのイントロンを含む。プレプロ−ｐ45メタロプロテアーゼの予測されるコーディング領域は推定18アミノ酸シグナル配列、226アミノ酸プロ領域、及び388アミノ酸成熟領域からなり、これを配列番号：４及び図３に示す。
実施例３：同じ微生物宿主（A.oryzae）における蛋白質分解酵素及びトリプシン様プロテアーゼの両方の同時発現
2102bp BamHI／NruIゲル、プレプロ−ｐ45プロテアーゼフラグメントをTAKAアミラーゼプロモーターとアミログルコシダーゼ(AMG)ターミネーターとの間に挿入する。これを行うために、遺伝子の５′末端をPCR技術を用いて修飾し、ATG開始コドンの直線上流にBamHIを導入する。遺伝子の３′末端において、終止コドンから44bp下流にある内在性NruI部位を用いる。ｐ45発現プラスミドをpDM120と呼ぶ（図４）。pyrG-Aオリザエ宿主株をプラスミドpDM120及びpSO2で同時形質転換する。プラスミドpSO2はＡ．オリザエpyrGマーカーを含む（図５参照）。
プロトプラスト法（Christensen et al. Biotechnology ６;1419〜1422（1988), Yelton et al. Proceedings of the National Academy of Sciences（USA）81:1470〜1474（1984))によりＡ．オリザエの形質転換を行う。典型的には、Ａ．オリザエ菌糸体を豊かな栄養ブイヨン中で増殖させる。この菌糸体をろ過、遠心等のような技術によりブイヨンから分離する。酵素標品Novozyme▲Ｒ▼（Novo Nordisk）をリン酸ナトリウムでpH＝5.8に緩衝された1.2Ｍ MgSO4のような浸透性安定化緩衝液中の菌糸体に加える。この上清を60分間、30℃で撹拌しながらインキュベートする。プロトプラストを収集して、このプロトプラストをSTC（1.2Ｍソルビトール、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH＝7.5)のようなカルシウムを含む浸透性安定化緩衝液中に懸濁する。形質転換するDNAを約100μｌプロトプラスト懸濁液中に加えた後、200μｌ PEG溶液（60％ PEG4000、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH＝7.5)を加えてこの混合物を室温で20分、インキュベートする。更に１mlポリエチレングリコール溶液を加えてこの溶液を室温で20分間、再びインキュベートする。形質転換されたプロトプラストを８ml STC緩衝液で希釈して選択プレートにおく。（増殖のための唯一の窒素源としての）アセタミドプレートは、外来的に供されたamdSマーカーを含む形質転換体について選択するのに用い得る。最小プレートを、外来的に供されたpyrG遺伝子を含む形質転換体のために用いることができる。
M400Da培地（マルトデキストリン、50.0ｇ／Ｌ；MgSO4・７H2O, 2.0ｇ／Ｌ；KH2PO4, 2.0ｇ／Ｌ；クエン酸、4.0ｇ／Ｌ；イースト抽出液、8.0ｇ／Ｌ；尿素、2.0ｇ／Ｌ；（先に記載の）微量金属溶液、0.5ml／Ｌ；５Ｎ NaOHでpH＝6.0としたもの）中で25℃で形質転換体を増殖させ、SDS／PAGEによりｐ45の産生についてブイヨンを分析する。少くとも一つの形質転換体、株DLM7において、約45kDに移動した主要なバンドが見られ、ｐ45は対照培養物においては見られない。DLM7において産生された組換えｐ45を蛋白質配列分析により分析し、Ｎ末端残基とＦ．オキシスポルムから産生されたｐ45の成熟Ｎ末端に適合させる。それゆえ、ｐ45はＡ．オリザエにおいて作られる時正しく処理される。
ｐ45及びトリプシン様プロテアーゼの両方を発現する宿主生物を作るために、トリプシン様プロテアーゼを含むプラスミドpSX233及び選択可能マーカーとしてのＡ．ニジュランスamdS遺伝子を含むpToC90で同時形質転換させる。プラスミドpSX233は、分子生物学の標準的な技術を用いて前駆体トリプシン様プロテアーゼ遺伝子の開始におけるDNAリンカーが、
0003726968.tif 000004
に変えられているプラスミドpSX183の誘導体である。下線のATGは、開始メチオニンコドンの位置を示す。同時形質転換体をFG4P培地中で増殖させ、L-BAPNAアッセイを用いてＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ活性について分析する。６つの形質転換体はｐ45を含まない対照株よりかなり多くのトリプシン様プロテアーゼを作った。これらの形質転換体培養物（及び対照）からの上清をSDS／PAGEにより分析する（図６）。全ての形質転換体は、同じ宿主細胞からのトリプシン様プロテアーゼ及びｐ45の両方の産生を示した。この結果は、同じ宿主細胞（Ａ．オリザエ）における（前駆体）トリプシン様プロテアーゼ及びＦ．オキシスポルムｐ45の同時発現が活性型トリプシン様プロテアーゼの大きく増強された発現を引きおこすことを示す。
実施例４：アスペルギルス・オリザエからの中性メタロプロテアーゼ(npI）の精製及び初期的キャラクタリゼーション
材料及び方法
精製：10ｌのＡ．オリザエ1560（７Cl-58）発酵物を収集する。９ｌのブイヨンを得て、0.1μｍハローファイバー（hollow fibre)(Amicon）を通してろ過し、３kDaカットオフスパイラルウルトラフィルトレーションカートリッジ（Amicon）で700mlに濃縮する。
300mlを1000mlに希釈(1.5mS未満；pH7.1)し、0.1Ｍホウ酸塩、10mM DMG、２mM CaCl2、pH6.2で平衡化された150ml(内径2.6cm)Q-Sepharoseカラムに５ml／minの流速で流す。カラムを緩衝液で洗浄して６ml／minで1050mlにおける０→１Ｍ NaCl勾配で溶出する。12mlフラクションを収集して、前掲のフロトリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼについてのメタロプロテアーゼ活性についてアッセイする。フラクションを含むメタロプロテアーゼをプールしてYM３メンブランで濃縮する。
その後、このプールを80mlに希釈(1.5未満、pH7.5)して、20mMトリス、２mM CaCl2、pH7.5で平衡化された20mM MonoQカラム(1.6cm内径）に流して６ml／minの流速で300mlにおける０→0.5Ｍ NaCl勾配で溶出する。4.5mlフラクションを収集してメタロプロテアーゼ活性についてテストする。活性を有するフラクションをプールしてCentriprep-10で濃縮する。
３mlのMQ１を100mMホウ酸塩、10mM DMG、２mM CaCl2, pH6.2で平衡化されたHiLoad Superdey 200 16／60カラムを用いて１ml／minの流速でゲルろ過を行う。１mlのフラクションを収集する。メタロプロテアーゼ活性を有するフラクションをプールする。
フェニル−スーパーロース５／５（流速0.5ml／min、25mMトリスpH７中60分間、1.7→０Ｍ（NH4)2SO4勾配、１mlフラクションを収集又）又はCH Sepharose 4Bに結合されたバシトラシン（15mlカラム、1.6cm内径、流速：２ml／min、80分で０→100％  Ｂ（Ａ：25mMアセテート、pH５、Ｂ：0.1Ｍトリス、１Ｍ NaCl、25％イソプロパノール、pH7.5)、３mlフラクションを収集）のも通すことにより更なる精製ステップを確立する。２mlのＳ２を各々のラン（各々の緩衝液の3.5mlで溶出されたもの）についてPD-10で脱塩して３mlとする、メタロプロテアーゼ活性を有するフラクションをプールする。バシトラシンカラムを用いて大容量を精製する；３mlのＳ12＋３mlのＳ13＋１mlのＳ２をPD10で25mMアセテート、pH５中に脱塩して10mlをカラムにかける。メタロプロテアーゼ活性を有するフラクションをプールして(entricon-10及びMicrocon-10で濃縮する。
バシトラシンのカップリング：
活性化CHセファロース４Ｂ(Pharmacia）へのバシトラシンのカップリングを、製造元の記載に従って行う。6.6ｇのCHセファロース（１mM HClで膨潤してカップリング緩衝液で洗浄）を用いて、室温で２時間、0.1Ｍ NaHCO3, 0.5Ｍ NaCl, pH８中の0.25ｇ（18250ユニット）のバシトラシン(Sigma）とカップリングする。過剰な活性基を0.1Ｍトリス、pH８でブロックした後、0.1Ｍ酢酸、0.5Ｍ NaCl, pH４で洗浄する。
酵素アッセイ：
npIの活性を0.1Ｍトリス、２mM CaCl2、pH7.5中で25℃で30分の予備インキュベーションの後、前掲のプロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（約25μｇ／ml）からの遊離トリプシン活性として測定する。トリプシン活性をマイクロタイタープレートにおいて測定する；100μｌの基質（保存した：DMSO中87mg／ml L-BAPNA(Sigma）、緩衝液で50倍に希釈）及び405nmにおける吸収をMolecular DevicesからThermomaxマイクロプレートリーダーを用いて測定する。
SDS-PAGE及びPVDFへのエレクトロブロッティング：
製造元の説明書に従ってSDS-PAGE（10〜27％, Novex)を行う(125Ｖ，２時間）；移動させるべきサンプルをサンプル緩衝液を加える前にPMSF(0.2％）で予備インキュベートする。プローブロットメンブラン（Applied biosystems）へのエレクトロブロッティングを、Novexからのブロッティングモジュールを用いて2.5時間、25Ｖで３mM Na2CO3, 10mM NaHCO3, 20％ MeOH, pH9.9中で行う。このプローブセットをApplied Biosystemsにより記載されるように染色する。
IEF−オーバーレイ：
製造元の説明に従ってIEF(Ampholine PAG-plate:pH3.5〜9.5, Pharmacia）を行い（1500Ｖ, 50mA, 1.25時間）、染色する。オーバーレイされるべきゲルを0.1Ｍトリス、２mM CaCl2, pH７中で15分間、最初に平衡化し、その後L-BAPNA保存液（50倍希釈）及び先に記載されるプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（粗濃縮ブイヨン１mg／ml, 50倍希釈）が添加された１％アガロース、0.1Ｍトリス、２mM CaCl2, pH７でオーバーレイする。オーバーレイ緩衝液中に１％スキムドミルクを有することによりカゼインオーバーレイを行う。
アミノ酸シークエンシング：
製造元の説明に従ってApplied Biosystemsからの476A Protein Sequencerを用いてアミノ酸シークエンシングを行う；予め混合された緩衝液をオンライン−HPLCのために用いる。
結  果
前掲の精製方法は、3300倍超の精製度となる（純度95％超（SDS-PAGE))。精製されたnpIはSDS-PAGEから約46kDaの分子量を有し、IEFから約4.5のpIである。（前掲のプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ及びL-BAPNAを重ねられた）オーバーレイドIEF−ゲルは、蛋白質分解又はメタロプロテアーゼ活性がpI約4.5でおこり、カゼイン切断も見られる。精製されたnpIをＮ末端アミノ酸シークエンシングした時、１つの配列が得られる（最初のいくつかのサイクルはいくらかのバックグラウンドを含んでいる）。このアミノ酸配列は、PVDF−メンブラン上のSDS−ゲルからブロットされる46kDaバンドから得られるＮ末端アミノ酸配列に相当し、図７に示されるアミノ酸配列を与える。Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｆ．オキシスポルムからのｐ45についてのＮ末端配列と64％の相同性である（図７）。プロテアーゼpH最適条件は約5.5〜6.0であることが見い出される。前掲のプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼとのインキュベーションは種々のpHにおける溶出緩衝液中で行われる。
実施例５：カゼインを加水分解することにおけるｐ45メタロプロテアーゼと他の中性メタロプロテアーゼとの能力の比較
400μｌのカゼイン溶液（Pierce）を100μｌのプロテアーゼと共に小さなテストチューブに加える。このチューブをボルテキシングして室温で40分間、インキュベートする。インキュベーション（及びアッセイ）緩衝液は１Ｍホウ酸塩、２mM CaCl2及び10mMジメチルグルタレード；pH6.5である。インキュベーションの終りに、60マイクロリッターのトリクロロ酢酸(100％ｗ／ｖ）を加えて、チューブをボルテキシングして5000×ｇで１分間、遠心する。結果として生じる上清の20マイクロリッターをBCA作業試薬（Pierce）200マイクロリッターと共にマイクロタイターウェルにおく。その後、このプレートをボルテキシングして、更に30分間インキュベートした後、Biomek1000マイクロタイタープレートリーダーを用いて600nmにおいて読み取る。
図８に示すデーターは、ｐ45が最も低い蛋白質分解活性を有することを示し、サーモリシン、ジスパーゼ及びバチルス・ステアロサーモフィルス(Bsmat）からの中性メタロプロテアーゼと比較した時、全てがｐ45より大きい程度カゼインを加水分解することを明らかにする、即ち、３つ全ては0.47近辺又はそれを超える最大吸光度を有する。しかしながら、ｐ45を用いる時の最大吸光度は約0.3 O.D.ユニット（他の３つのプロテアーゼの約60％）であることが明らかになる。
実施例６：組換えｐ45のキャラクタリゼーション
材料及び方法
試薬：
バチルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolyticus)(B.t.）からのサーモリシンをBoehringer Mannheimから購入する。FAGLA；Ｎ−（３−（２−フリル）アクリロイル)-Gly-LeuをSigmaから購入する。Ac-Pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタソイル〕-Leu-Gly-OEtをBachemから購入する。Ellman's溶液（５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）；DTNB）及びｐ−ニトロアニリンをSigmaから購入する。
100mgのペンタペプチド（ピロGlu-Glu-Zle-Pro-Asn-COOH;HPLCによる判定で87％純度）をChiron Mimotopes Peptide Systems (3550 General Atomics Court, San Diego, CA 92121〜1122）から購入する。生化学的分析の前にペンタペプチドを更に精製する（HPLC, ０〜60％, 0.1％ TFA中０〜60％アセトニトリル勾配）。
万能緩衝液(0.1Ｍホウ酸塩、0.1Ｍ酢酸、及び0.1Ｍリン酸）はBritton & Robinsonの“改良型”緩衝液（Quelle:Biochemisches Taschenbuch, H. M. Raven, II. Teil, S. 93u. 102, 1964)である。トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼサンプル緩衝液は0.1Ｍホウ酸塩、２mM CaCl2及び10mMジメチルグルタレート、pH6.5からなる。
SDS-PAGE分析：
SDS-PAGE分析のために、サンプルの30マイクロリッターを10マイクロリッターのSDS-PAGEサンプル緩衝液、２マイクロリッターのPMSF（イメプロピルアルコール中２％）、及び２マイクロリッターのグリセリンに加える。このサンプルを４分間、沸騰水中におき、40マイクロリッターをゲル(Novex, 10〜27％勾配ゲル）の各々のウェルに注入する。ゲルを約２時間125Ｖで作動させた後、標準的なプロトコルを用いて処理する。
等電点電気泳動分析：
ｐ45メタロプロテアーゼを通常のIEFゲル(Novex：pH３〜10）に注入して、標準的なNovex IEFプロトコルを行う（１時間100Ｖ，１時間200Ｖ，そして0.5時間500Ｖ）。このゲルを固定して標準的なNovexプロトコルに従って染色する(Coomassie）。
ｐ45メタロプロテアーゼ精製：
アスペルギルス・オリザエにおける組換えｐ45メタロプロテアーゼを含むブイヨン（pH＝６）2300mlをS1Y-3スパイラルメンブランカートリッジ（３kDa Mhカットオフ；Amicon）を用いて約300mlに濃縮する。この溶液を10kDaの周知の分子量を除く膜であるPM-10メンブラン（Amicon）を用いて更に175mlに濃縮する。濃縮の後、この溶液を氷酢酸でpH５に調節し、水で950mlに希釈して最終的な伝導度1.6mSにする。
この溶液を0.1Ｍホウ酸塩、２mM CaCl2、10mMジメチルグルタレート、pH5.2を含む緩衝液で予め平衡化されたSP−セファロース（陽イオン交換）カラム(1.6×29cm）に流して、次に70mlの同じ緩衝液で洗浄する。カラムに結合した組換えｐ45メタロプロテアーゼを溶出するのに０〜0.5Ｍ NaCl勾配を用いる。流速は４ml／min.であり、10mlフラクションを収集する。メタロプロテアーゼは約0.17Ｍ NaClにおいて単一ピークとして溶出した。
部分的に精製されたｐ45メタロプロテアーゼを含むフラクションをプールして直ちにNaOHでpH7.2に調節し、その後−20℃で保存する。精製された標品のSDS-PAGE分析は完全に純粋な蛋白質（95％超）を表す。３〜４の主要なバンドが（約９, 11.5, 26,及び44kDaの分子量において）観察され、シークエンシングしてｐ45メタロプロテアーゼであることが示される。
この溶液を10kDaの周知の分子量を除くメンブランであるPM-10メンブランを用いて1.75mlまで更に濃縮する。この標品からの組換えｐ45メタロプロテアーゼの最終濃度は13.35mg／mlである。
プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ精製：
フサリウム・オキシスポルムからの発酵ブイヨン3000mlをS1Y-3スパイラルメンブランカートリッジ（Amicon）を用いて約250mlに濃縮する。濃縮の後、溶液を氷酢酸でpH５に調節して水で2000mlに希釈して最終的な伝導度を1.0mSとする。
組換えプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの一部（85ml）を0.1Ｍホウ酸塩、２mM CaCl2及び10mMジメチルグルタレート、pH5.2を含む緩衝液で予め平衡化されたSP−セファロース（陽イオン交換）カラム(1.6×29cm）に流し、同緩衝液70mlで洗浄する。カラムに結合したプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを溶出するのに０〜0.5Ｍ NaCl勾配を用いる。流速４ml／min.で10mlフラクションを収集する。プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼはトリプシン活性を含む他のピークの前の単一のピークとして溶出した。残ったプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを精製するために更に２回、この方法を行う。
（部分的に精製されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを含む）３つの陽イオン交換精製ステップからのフラクションをプールしてNaOHでpH7.2に調節して−20℃で保存する。ｐ45メタロプロテアーゼにおいて、精製標品のSDS-PAGE分析は極めて純粋な蛋白質を示す（95％超）。この溶液を10kDaの周知の分子量を取り除くメンブランであるPM-10メンブランを用いて更に８mlに濃縮する。この標品からの組換えｐ45メタロプロテアーゼの最終濃度は25.45mg／mlである。
トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ標準：
組換えトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ標準をＱ−セファロース（陰イオン交換）及びSP−セファロース（陽イオン交換）クロマトグラフィーの発酵ブイヨンから精製する。発酵ブイヨン(950ml；約３ｇのトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ）をろ過（0.22ミクロンメンブラン；コーニング使い捨て滅菌ボトルトップフィルター）して、同緩衝液で予め平衡化されたＱ−セファロース（陰イオン交換）カラム(2.6×24cm;127ml)に流す。溶出液（１Ｌ）を収集し、S1Y-3スパイラルカートリッジ（3K MWカットオフ；Amicon）で200mlに濃縮して、次に水で１Ｌに希釈する（伝導度＝２mS）。
希釈された溶出液の200ml(トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの600mg)を同緩衝液中で予め平衡化されたSP−セファロースカラム(1.6×26cm;53ml）に流す。このカラムを同緩衝液の２カラム容量で洗浄して０〜１Ｍ NaCl勾配溶出を行う。精製されたトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼは約100mM NaClで単一バンドとして溶出した。このサンプルを濃縮(Centriprep 10, Amicon）して、グリセリンを加えて50％の最終濃度とし、このサンプル（50ml;９mg／mlトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ）を−20℃で保存する。
トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼアッセイ：
サンプル緩衝液（即ち0.1Ｍボレート、２mM CaCl2, 10mM DMG, pH6.5;全量＝100マイクロリッター）中のトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ及び100マイクロリッターの基質（同緩衝液で50倍に希釈されたDMSO中87mg／ml L-BAPNA保存液）を含むマイクロタイターウェル中で、トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性を測定する。トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性をL-BAPNAの添加後直ちに（サーモマックスマイクロタイタープレートリーダー、Molecular Devices Inc.により)405nmにおける吸光度における増加として測定する。
プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼアッセイ：
活性化可能プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを、精製されたフサリウム・オキシスポルムメタロプロテアーゼ（約６μｇ）での室温での40分の予備インキュベーションの後のプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼからの遊離トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ（トリプシン）活性としてマイクロタイターウェルにおいて測定する。
処理されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ（即ち、成熟トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ）活性を、予めインキュベートされたメタロプロテアーゼ／プロトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ反応混液（全量＝100マイクロリッター）及び100マイクロリッターの基質（同緩衝液で50倍に希釈されたDMSO中87mg／ml L-BAPNA保存液）を含むマイクロタイタープレートから直接測定する。更に、活性トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼをL-BAPNAを加えた後直ちに405nmにおける吸光度における増加として測定する。
FTC標識カゼインを用いるプロテアーゼ分析：
FTC標識カゼインをトワイニングらの論文（Twinning, 1984, An al. Biochem. 143:30）の方法に従って調製する。FTC−カゼイン（20マイクロリッター、50mM Tris-Cl, pH7.2中0.5％ｗ／ｗ）及びプロテアーゼ（サンプル緩衝液中10マイクロリッター、約0.9μｇ）をサンプル緩衝液（10マイクロリッター、50mMホウ酸ナトリウム、pH９）に加える。サンプルを30分間、室温でインキュベートする。インキュベーションの終りに、150マイクロリッターの５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えてサンプルを４℃で60分間、沈殿させる。次にサンプルを遠心(14,000rpm, ５分）して上清の30マイクロリッターを３mlの0.5Ｍホウ酸ナトリウム、pH９に加える。
サンプルの蛍光度を2.5nmスリット幅、490nm励起、525nmにおける発光を用いて測定する（Perkin-Elmer fluorimeter）。
クアンティクリーブ(Quanti Cleave）法を用いる組換えｐ45メタロプロテアーゼ及び他のメタロプロテアーゼによるカゼイン加水分解
400マイクロリッターのカゼイン溶液（Pierce）を緩衝液“Ａ”（0.1Ｍボレート、２mM CaCl2及び10mMジメチルグルタル酸）中のプロテアーゼの100マイクロリッターと共に小さなテストチューブに加える。インキュベーションの終りに、60マイクロリッターのトリクロロ酢酸(100％ｗ／ｖ）を加えて、チューブをボルテキシングして、5000×ｇで１分間、遠心する。結果として生じる上清の20マイクロリッターを200マイクロリッターのBCA作動試薬（Pierce）と共にマイクロタイタープレートウェルに加える。その後、このプレートをボルテキシングして更に30分インキュベートした後、Biomek 1000マイクロタイタープレートリーダーを用いて600nmにおいて読み取る。
熱分解基質の加水分解：
Ac-Pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル〕-Leu-Gly-OEt
ｐ45メタロプロテアーゼ及びB.t.サーモリシンを更に特徴づけするために熱分解基質Ac-Pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル〕-Leu-Gly-OEt（即ちメルカプトペプチド）を用いる。
反応混合物は、同緩衝液中に100マイクロリッターのAc-Pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル〕-Leu-Gly-OEt（１mM、及び１mM Ellman's試薬）並びにB.t.サーモリシンもしくは精製されたｐ45メタロプロテアーゼ（０〜３μｇ／ml）のいずれも含む、熱分解活性を、マイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices）で２分間にわたり吸光度の増加として測定する。
ｐ45メタロプロテアーゼ及びサーモリシンによるFAGLA加水分解熱分解基質FAGLA：Ｎ−（３−〔２−フリル〕アクリロイル）-Gly-Leuアミドをｐ45メタロプロテアーゼ及びB.t.サーモリシンを更に特徴づけるために用いる。反応混合物は100マイクロリッターのＮ−（３−〔２−フリル〕アクリロイル）-Gly-Leuアミド(FAGLA)(２mM）及び種々の濃度のサーモリシン(Boehringer Mannheim）又は精製されたｐ45メタロプロテアーゼのいずれかの100マイクロリッターを含む、熱分解活性をレコーディング分光光度計で１分間(Shimazu, UV160V）、345nmにおける吸光度の減少として測定する。サーモリシンについてのアッセイの直線状の範囲はアッセイ混合液中10〜500μｇ／mlサーモリシンである。
ｐ45メタロプロテアーゼ熱安定性：
精製されたｐ45メタロプロテアーゼ又はB.t.サーモリシン(Boehringer Mannheim)(50マイクロリッター、0.1mg／ml）を万能緩衝液pH７で15分間、種々の温度でインキュベートする。その後、サンプル10マイクロリッターを30マイクロリッターの万能pH緩衝液（pH７）に加えて20マイクロリッターのFTC標識カゼインを37℃で１時間、インキュベートする。５％TCA150マイクロリッターをカゼインを酸性化して沈殿させるために添加する（室温で１時間）。その後、サンプルを遠心（５分、14Krpm）して、その上清の30マイクロリッターを３μｌの緩衝液(0.5Ｍボレート、pH９）に加える。その後、サンプルを蛍光度計（スリット幅＝2.5nm；励起周波数＝490nm；発光周波数＝525nm；積分時間＝２秒）で分析する。
ｐ45メタロプロテアーゼpHプロファイル：
精製されたｐ45メタロプロテアーゼ（10マイクロリッター、0.005mg／ml）を30マイクロリッターの万能pH緩衝液（pH５〜11.5）に加え、20マイクロリッターのFTC標識カゼインを37℃で１時間、インキュベートする。150マイクロリッターの５％TCAをカゼインを酸性化して沈殿させるために加える（室温で１時間）。その後サンプルを遠心（５分間、14Krpm）してその上清の30マイクロリッターを３μｌ緩衝液(0.5Ｍボレート、pH９）に加える。その後、サンプルを蛍光度計（スリット幅＝2.5nm；励起周波数＝490nm；発光周波数＝525nm；積分時間＝２秒）。
プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼアッセイを利用して第２pHプロファイルを測定することにより、ｐ45メタロプロテアーゼ活性をプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの活性型トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼへの処理を基礎にしてｐ45メタロプロテアーゼ活性を測定する。125μｇの精製されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ及び0.13μｇの精製されたｐ45メタロプロテアーゼを含む反応混合物（即ちプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ／ｐ45のモル比＝1750：１）を異なるpH（即ち2.72, 4.11, 5.2, 6.05, 6.46, 6.98, 8.18, 9.02, 10.03及び11.03のpH値）に調製された“万能溶液”に加え、この反応混合物を室温で15分間、インキュベートする。インキュベーションの後、各々のサンプルから５マイクロリッターを取り、90マイクロリッターのサンプル緩衝液（即ち0.1Ｍボレート、２mM CaCl2、及び10mM DMG、pH6.5)及び10マイクロリッターのホスホラミドン（20μｇ）を含むマイクロタイターウェルに加える。100マイクロリッターのL-BAPNA(1.74mg／ml）を各々のウェルへ添加した後直ちに、各々のサンプルからトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを測定する。ｐ45活性を阻害してプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのいずれの更なる成熟も停止させるためホスホラミドンを加える。
ｐ45メタロプロテアーゼpH安定性
組換えｐ45メタロプロテアーゼのpH安定性を測定するために、部分精製されたｐ45メタロプロテアーゼを3.5, 4, 4.5, 5.2, 5.64, ６, ７, ８, ９,及び10のpHの万能緩衝液中に10倍に希釈して20分間、室温で予備インキュベートする。予備インキュベートされたサンプル（10マイクロリッター）を0.1Ｍボレート、２mM CaCl2、及び10mMジメチルグルタレート、pH6.5を含む緩衝液及び50マイクロリッターのプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを含む粗Ａ．オリザエブイヨンに加えて、次に更に30分間インキュベートする。30分後に、サンプル緩衝液中BAPNA(約２mg／ml)100マイクロリッターを加えて、５分間にわたる405nmにおける吸光度の増加をトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性についてアッセイするために測定する。
ｐ45メタロプロテアーゼ活性のNaCl阻害
トワイニング（Twinning）(1984)の方法に従ってFTC標識カゼインを調製する。トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼサンプル緩衝液中のFTC−カゼイン（20マイクロリッター、50mM Tris-Cl, pH7.2中0.5％ｗ／ｗ），NaCl（０〜２μ）、並びにトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ（10マイクロリッター、1.8μｇ）もしくはｐ45メタロプロテアーゼ（10マイクロリッター、0.33μｇ）のいずれかをトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼサンプル緩衝液に加えて全量50マイクロリッターにする。サンプルを室温で30分間、インキュベートする。インキュベーションの終わりに、150マイクロリッターの５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えてこのサンプルを４℃で60分間、沈殿させる。次にサンプルを遠心(14,000rpm, ５分）してその上清の30マイクロリッターを３mlの0.5Ｍホウ酸ナトリウム、pH９に加える。
このサンプルの蛍光を2.5nmスリット幅、490nm励起、525nmにおける発光の検出を用いて測定する(Perkin-Elmer, fluorimeter)
結果及び議論
ｐ45メタロプロテアーゼ熱安定性：
ｐ45メタロプロテアーゼが基質FTC−カゼインを加水分解するであろう最適温度は50℃である。この結果は、バチルス・サーモプロテオリチカス（80℃）よりかなり低い（図９）。
ｐ45メタロプロテアーゼpHプロファイル：
ｐ45メタロプロテアーゼによるFTC−カゼインの加水分解万能pH緩衝液（pH５〜11.5）中で測定する。FTC−カゼインのｐ45メタロプロテアーゼ加水分解についての最適pHはpH9.5である（図10）。このプロファイルはいくらか広く（最大活性の50％超がpH８〜11.5の間でおこる）、バチルス・サーモプロテオリチカスからのサーモリシンのそれよりかなり広いことに注意のこと。
プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼアッセイを利用して第２pHプロファイルを測定することにより、プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの活性型トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼへの処理を基礎にしてｐ45メタロプロテアーゼ活性を測定する。処理されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの最大レベルはpH9.5でおこる。本実験の時間は、ｐ45メタロプロテアーゼが利用できるプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの全てを十分に処理することを決して許容しないことに注意することが重要である。−これらの条件下において利用できるプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを十分に処理するには少くとも25分かかる。更に、これらの条件下において、pH6.5において処理されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのレベルはpH９において処理されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのレベルの約24％である。
ｐ45メタロプロテアーゼpH安定性：
ｐ45メタロプロテアーゼはpH８において最も安定することが明らかになる。しかしながら、そのピークはpH6.5〜９の許容されるpH範囲でいくらか広い。
0003726968.tif 000005
培養ブイヨン中の組換えｐ45メタロプロテアーゼレベルは少くとも10ｇ／Ｌのプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼにおいて処理することができる。
精製されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを組換えｐ45メタロプロテアーゼ（約90mg／Ｌ）を含む新鮮なＡ．オリザエ発酵ブイヨンに加えて室温で１，２又は３時間のいずれかでインキュベートする。インキュベーション混合液中のプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのレベルは100μｇ／ml〜13mg／mlの範囲である。それゆえ、これらの条件下において、組換えｐ45メタロプロテアーゼは、１時間以内に活性化可能プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの80〜100％を容易に処理することができる。
精製されたプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ（100μｇ／ml）を種々の量の精製された組換えｐ45メタロプロテアーゼ又は精製されたB.s.メタロプロテアーゼのいずれかに加える。１モルのプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを処理するのに１モルのB.s.メタロプロテアーゼが必要とされることが明らかになる。しかしながら、同様の条件下において、１モルのｐ45メタロプロテアーゼは、１時間以内に約50モルのプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを処理することができる（表２も参照）。
ｐ45メタロプロテアーゼは、プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの濃度が増加するにつれてプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを処理するのにより効果的になる。これは、高いプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼレベル（１〜15ｇ／Ｌ）が処理のためにより少いｐ45メタロプロテアーゼ(100mg／Ｌ未満）を必要とするからである。
組換えｐ45メタロプロテアーゼ及び他のメタロプロテアーゼによるカゼイン加水分解
ｐ45メタロプロテアーゼは活性型トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを活性化するためのプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの成熟化のための最良の（処理）酵素であるが、スクシニル化カゼインを加水分解する時、（他の中性メタロプロテアーゼと比較した時）最も低い蛋白質分解活性を有する（表２）。３つの他の中性メタロプロテアーゼ（即ち、サーモリシン、シスパーゼ(Dispase）、及びバチルス・ステアロサーモフィルスからの中性メタロプロテアーゼ）全てがｐ45メタロプロテアーゼより大きい範囲でカゼインを加水分解すること（即ち３つ全ては0.47近くの最大吸光度を有する）が明らかになったことに注目することは興味深い。しかしながら、ｐ45メタロプロテアーゼを用いる場合の最大吸光度は、約0.3 O.D.ユニット（他の３つのプロテアーゼのそれの約60％）であることが明らかになる。このデータは、ｐ45メタロプロテアーゼが他の３つのメタロプロテアーゼよりより特異的なプロテアーゼであり得、これによりより少いカゼインを加水分解することを示すことができる。
熱分解基質：Ac-pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル〕-Leu-Gly-OEtの加水分解
熱分解基質Ac-Pro-Leu-Gly〔２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル〕-Leu-Gly-OEt（即ちメルカプトペプチド）を、ｐ45メタロプロテアーゼ及びB.t.サーモリシンを更に特徴づけるのにも用いる。このｐ45メタロプロテアーゼはこの熱分解メルカプトペプチドを加水分解することにおいて、B.s.サーモリシンより約25倍有効である。
ｐ45メタロプロテアーゼ及びサーモリシンによるFAGLA加水分解：
熱分解基質FAGLA：Ｎ−（３−〔２−フリル〕アクリロイル)-Gly-Leuアミドをｐ45メタロプロテアーゼ及びB.t.サーモリシンを更に特徴づけるのに用いる。サーモリシンのための直線範囲をアッセイ混合物において10〜500μｇ／mlサーモリシンと決定する。FAGLAに対するｐ45メタロプロテアーゼの特異活性は、サーモリシンのそれより約250倍低い。
ｐ45メタロプロテアーゼ及びB.s.サーモリシンは基質Succ-Ala-Ala-Ala-pNAを加水分解しない。
ｐ45メタロプロテアーゼ及びフラボバクテリウム・メニンゴセブチクム（Flavobacterium meningosepticum）により分泌される中性亜鉛エンドペプチダーゼの両方は、基質Ｎ−（３−〔２−フリル〕アクリロイル)-Leu-Gly-NH2をほとんど加水分解しない。しかしながら、フラボバクテリウム・メニンゴセブチクムにより分泌される中性亜鉛エンドペプチダーゼは、サーモリシンが加水分解することができない基質である脊椎動物エラスターゼ基質スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリドを加水分解するであろう（表２）。それゆえ、ｐ45メタロプロテアーゼによるスクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド加水分解を研究する。しかしながら、0.1Ｍトリス、pH８において、ｐ45メタロプロテアーゼもB.s.サーモリシンもスクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(4.4mM）を加水分解しないであろう。この効果は他の存在するメタロプロテアーゼからｐ45メタロプロテアーゼを区別する。
ペンタペプチドはｐ45メタロプロテアーゼ活性を阻害しない：
合成ペンタペプチド＜Glu-Glu-Ile-Pro-Asn(プロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼのプロ配列を表すペプチド）を精製されたｐ45メタロプロテアーゼ及びプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼを含む混合物に加える。静かに振とうしながら室温で45分間、プレインキュベーションした後、この混合物を500倍に希釈してトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性についてアッセイする。500倍の希釈の後、いずれの存在するペンタペプチドもアッセイにおいてトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性を大きく阻害しないであろうことに注意のこと。この結果は、ペンタペプチドのレベルがｐ45メタロプロテアーゼによるプロ−トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼの通常の処理を変化させないことを示し、このペプチドがｐ45メタロプロテアーゼ活性のインヒビターでないことを示す。
更に、このペンタペプチドはｐ45メタロプロテアーゼ切断部位のアミノ末端に全ての残基を含むので、ｐ45メタロプロテアーゼの重大な結合（及びおそらく阻害）が、切断部位のカルボキシ末端（Ｐ１′−Ｐ？′）における残基においておこるはずである。
ｐ45メタロプロテアーゼ活性のNaCl阻害：
ｐ45メタロプロテアーゼはいくらか塩に感受性があることが明らかになる。１ＭのNaClはｐ45メタロプロテアーゼ活性を85％だけ阻害するが、トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ活性は２Ｍ NaClを用いて25％しか阻害されない（図１）。バクテリアのサーモリシンは１Ｍ NaClで38％だけ阻害される。
ｐ45メタロプロテアーゼ対トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼによるFTC−カゼイン加水分解：
トリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼ及びｐ45メタロプロテアーゼは、両方とも9.5近くのpHにおいて最適に機能するアルカリ性プロテアーゼ（PI８超）である。しかしながら、ｐ45メタロプロテアーゼはpH９において、モルを基礎にしてトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼより約16倍高くFTC−カゼインを加水分解するであろう。それゆえ、ｐ45メタロプロテアーゼはアルカリ性プロテアーゼを必要とする適用において利用が見い出される。組換えｐ45メタロプロテアーゼ産物の発酵はＡ．オリザエにおいて９ｇ／Ｌを超えることも興味深い。
他のメタロプロテアーゼインヒビターを用いるｐ45メタロプロテアーゼ活性の阻害：
バチルスサーモリシンからｐ45メタロプロテアーゼを更に区別するために他のメタロプロテアーゼインヒビターを利用する。１，10−フェナントロリン、ホスホラミドン、及びCdCl2についての阻害定数を、ｐ45メタロプロテアーゼに対して130μＭ，１μＭ，及び67μＭと決定する（表３）。１，10−フェナントロリン、ホスホラミドン、及びCdCl2についての阻害定数は、バチルス・ステアロサーモフィルスサーモリシンに対して85μＭ，26μＭ，及び２μＭである。競合阻害を示すB.s.サーモリシン活性のCdCl2阻害の他は、全てのインヒビターは、速度分析の後に決定される非競合的である。ホスホラミドンは多くのバクテリアのメタロ−エンドペプチダーゼの有効なインヒビターであるが、哺乳動物源のものにはほとんどそうでないことに注目することが興味深い。また、CdCl2がメタロプロテアーゼのこのような有効なインヒビターであることが見い出されたことも興味深い。文献においてメタロプロテアーゼのCdCl2阻害の証拠は発見されていない。
0003726968.tif 000006
ｐ45メタロプロテアーゼへの重金属の添加の影響
精製されたメタロプロテアーゼ(0.9μｇ）にZnCl2, CoCl2,及びCdCl2を加えて、基質としてFTC−カゼインを用いてプロテアーゼ活性を測定する。ｐ45メタロプロテアーゼ活性はZnCl2（0.2mM）の添加により約２倍増加するが、CoCl2(０〜４mM）の添加による活性の増加は観察されない。この結果は、いくらかのアポ−ｐ45メタロプロテアーゼがこの精製されたサンプル中に存在し得ることを示す。ｐ45メタロプロテアーゼの金属分析(ICP）の後に不足当量レベルのZnが見い出されたことは興味深い。これは、亜鉛レベルがサンプル中のｐ45メタロプロテアーゼのレベルを基礎として予想される５％だけであることを明らかにする。ｐ45マチュラーゼサンプルにおいて他の重金属（即ちCd, Cr, Co, Cu, Mo, Ni, Li, Zn, Fe, Mn, As, Pb,又はSe）は存在しない。
微生物の寄託
以下の生物材料はAgricultural Research Service Patent Culture Collection（NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USAに寄託されている。
0003726968.tif 000007
37C.F.R.§1.14及び35V.S.C.§122下において、及びブタペスト条約の条件下においてCommissioner of Patents and Trademarksにより決定されるものに、本特許の係属の間この培養物へのアクセスが利用できるであろうことを確かにする条件下において前記株は寄託されている。寄託物は各々の株の生物学的に純粋な培養物を表す。この寄託物は、目的の出願の副本又はその子が出願されている国における外国の特許法により要求されるように利用できる。しかしながら、寄託物の利用可能性は、行政行為により許可される特許権の低下において本発明を実施するための認可を構成しないことが理解されるべきである。
本明細書に記載される本発明は、本明細書内に開示される特定の実施形態により範囲において限定されないべきである。これは、これらの実施形態が本発明のいくつかの態様の実例として意図されるからである。いずれの等価の実施形態も本発明の範囲内であることを意図する。実際本明細書においてこれらの記載されるものに加えて、本発明の種々の改良が先の記載から当業者に明らかになるであろう。これらの改良も添付の請求の範囲の範囲内であることを意図する。
種々の引用が本明細書内に言及されており、これらの開示はその全体から引用により組み込まれている。
配列表
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：13アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0003726968.tif 000008
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：14アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003726968.tif 000009
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：14アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0003726968.tif 000010
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：632アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0003726968.tif 000011
0003726968.tif 000012
0003726968.tif 000013
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：2052塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0003726968.tif 000014
0003726968.tif 000015
0003726968.tif 000016
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1899塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0003726968.tif 000017
0003726968.tif 000018
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：32アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0003726968.tif 000019
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：29アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0003726968.tif 000020
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：36塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0003726968.tif 000021
（２）配列番号：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：13塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：10：
0003726968.tif 000022
【図１】
0003726968.tif 000023
【図２】
0003726968.tif 000024
【図３Ａ】
0003726968.tif 000025
【図３Ｂ】
0003726968.tif 000026
【図３Ｃ】
0003726968.tif 000027
【図３Ｄ】
0003726968.tif 000028
【図４】
0003726968.tif 000029
【図５】
0003726968.tif 000030
【図６】
0003726968.tif 000031
【図７】
0003726968.tif 000032
【図８】
0003726968.tif 000033
【図９】
0003726968.tif 000034
【図１０】
0003726968.tif 000035
【図１１】
0003726968.tif 000036