(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコフェノール酸を内因性タンパク質との錯体から遊離させる方法であって、前記錯体を含有すると思われる媒体を、下式
0003706895.tif 000015
（式中、Ｒ1はアルキル；Ｒ2は水素またはアルキル；ＸはＯ，ＳまたはＮ；ｎはＸがＯまたはＳの時は１そしてＸがＮの時は２；ｍは１または２である）の化合物の有効量と接触させることからなる方法。
【請求項２】
ＸがＯである請求項１の方法。
【請求項３】
前記化合物はメトキシ安息香酸である請求項１の方法。
【請求項４】
前記化合物はｏ−メトキシ安息香酸である請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.  発明の分野
本発明はリガンド−レセプター結合検定技術に関する。血清その他の体液中の、特異的結合対（specific binding pair）の要素（「sbp要素」）であるリガンド被検体およびその相捕的レセプターの存在または濃度の決定は、特異的結合検定技術に依ることがますます多くなっている。これらの技術は、sbp要素間の錯体（その錯体のいずれか一方を、直接的または間接的にシグナルを生成する部分で標識することができる）の形成に基づいている。競争特異的結合検定技術の場合、その存在について調べようとする液体試料中の被検体は、限られた量の相補的sbp要素に対する結合について、既知量の標識された被検体と競争する。したがって、sbp要素に結合する標識被検体の量は、試料中の被検体の量に逆比例して変化する。免疫測定法では、通常、被検体はリガンドであり、その検定法には相補的sbp要素と第２の標識レセプター（通常は抗体）を使用する。このような検定法では、錯体と結合した標識レセプターの量が、液体試料中の被検体の量と正比例する。被検体の検出には、例えばその被検体のレセプターのレセプターを使用したり、アビジン−ビオチンのような他の結合対を使用するなど、上述の方法の変法が数多く使用される。
試料中に問題の被検体または当該被検体の検定に使用する試薬と非特異的に結合する１またはそれ以上の干渉物質（例えば、アルブミンなどのタンパク質）が存在する場合、それはリガンド−レセプター検定の定量性を損なう重大な要因となりうる。被検体は通常、極めて少量にしか存在しない。干渉物質は、より多量に存在する場合があり、またかなりの数の被検体分子に結合しうるので、検定感度を減少させることになる。多くの場合、干渉物質の量は試料毎に変化するので、観測されるシグナルを被検体の濃度に換算するために通常使用される標品または較正用試料（キャリブレーター）に対する正確な参照が妨害される。検定の精度を向上させるには、観測されるシグナルに対する干渉物質の影響を減少させるか、完全に取り除くことが望ましい。
ミコフェノール酸（「MPA」）は、いくつかのペニシリウム種の発酵によって生産される。これは広い活性スペクトルと特異的な作用様式を持ち、大用量でも副作用は最小限で許容できる（Epinetteら，Journal of the American Academy of Dermatology 17（6）:962-71（1987））。MPAは、抗細菌活性および抗真菌活性（Nelsonら，Journal of Medicinal Chemistry 33（2）: 833-838（1990））と共に、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、抗乾癬活性、免疫抑制活性、抗炎症活性（Leeら，Pharmaceutical Research 7（2）:161-166（1990））を持つことが示されている。これは、プリンヌクレオチドの新規（デノボ）合成における酵素、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する（Wu,Perspectives in Drug Discovery and Design（1994）2: 185-204）。Ｔリンパ球とＢリンパ球は主としてこのデノボ合成に依存するので、MPAは、免疫反応の主要因であるリンパ球増殖を阻害することができる。
MPAのモルホリノエチルエステル、（E）-6-（1,3-ジヒドロ-4-ヒドロキシ-6-メトキシ-7-メチル-3-オキソ-5-イソベンゾフラニル）-4-メチル-4-ヘキサン酸モルホリノエチル（「MPA-M」）は、生体内で迅速に加水分解されてMPAになる。MPAをこのエステル型で投与すると、MPAの生体内有効率が著しく改善される。
MPAは強力な生理活性物質であるから、有効な免疫検定法はその生体内有効率を監視するのに役立つであろう。また、治療薬レベル、すなわち適切な免疫抑制に必要な至適薬物レベルを監視することも重要だろう。MPA-MはMPAにすばやく加水分解されるので、MPAの検定はMPA-M投薬を調節し最適化する手段となりうる。MPAは血漿中では高度にタンパク質結合性（83〜＞98％）であり、患者の血漿タンパク質濃度を変化させる要因はいずれも、MPA検定法の精度に影響を与えうることがわかっている（Shawら，Therapeutic Drug Monitoring（1995）17:690-699）。
MPAとシクロスポリンまたはタクロリムスによる処置を受けている患者には、アザチオプリン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、心血管薬、糖尿病薬および利尿剤を含む（ただしこれらに限らない）数多くの薬物が同時投与される場合がある。これらの薬物の多くは代謝に絶大な効果を持ち、種々の血清／血漿成分の濃度の変化をもたらす。したがって、対象患者集団内のMPAを測定する場合、これらの成分により直接的また間接的な干渉を受ける可能性がある。
血清検定法は一般に、患者集団内の血漿タンパク質濃度の変動という問題によって制限される。また、MPAの結合画分と遊離画分を変化させるアルブミン濃度のような試料マトリックス成分の変動は、MPAをその結合画分から遊離させず、免疫検定結果を不正確にする可能性がある。特に、MPAの見かけ上の濃度はその試料中のタンパク質濃度に依存して、高くなったり、低くなったりするだろう。例えば、移植後初期には、アルブミン濃度が正常な血漿タンパク質濃度を持つ較正用試料と比較して低いため、これらの患者の試料のMPA定量値は高くなるだろう。移植後の期間、同時投与された薬物による代謝的相違、あるいは患者の疾患状態を含むいくつかの要因が、異常なタンパク質濃度をもたらし得る。これらの異常タンパク質濃度はMPAの遊離−結合比を変動させる可能性があり、したがって免疫検定結果の精度に影響を与えうる。試料のタンパク質濃度の関数としての可変的な回収は、較正用試料のために全ての試料を代表する１つの平均タンパク質濃度を選択する妨げとなる。
サリチル酸塩（salicylate）は、長期にわたってアスピリンを投与した場合に認められるような濃度で存在すると、正常ヒト血漿中のMPA遊離画分を増大させることが知られている（Nowak，下記参照）。しかし我々は、サリチル酸塩を遊離剤として使用すると、MPA酵素免疫検定法における総用量作用曲線が25〜50％減少しうることを発見した。8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸（ANS）が免疫検定法で遊離剤として機能することも知られている（Nerliら，Arch Int Physiol Biochim Biophys（1994）102（1）: 5-8およびSethら，Clin Chem（1975）21（10）: 1406-1413）。しかしANSには、340nmにバックグラウンド吸光性を持ち、光分解を受けやすいという欠点がある。このバックグラウンド吸光性は酵素免疫検定法では特に不都合である。しかしANSは、その欠点を許容できる状況では、一定の酵素検定法で使用されてきた。
本発明には、リガンド検定法で遊離剤として使用される上記既知化合物の欠点がない。
2.  関連技術の説明
Nowakら，Clin Chem（1995）41（7）:1011-1017は、ヒト血清アルブミンに対するミコフェノール酸の結合、その特徴づけおよび薬力学との関係について議論している。
Langmanら，Therapeutic Drug Monitoring（1994）16:802-807は、ミコフェノール酸の血中分布について議論している。
欧州特許0 218 309 B1は、生物分泌物中の遊離リガンドを測定する方法を開示している。テトラヨードチロニンとトリヨードチロニンの標識類似物がアルブミンおよび甲状腺結合プレアルブミン（thyroid binding pre-albumin）と結合するのを防止するために、サリチル酸ナトリウムと2,4-ジニトロフェノールが使用されている。
欧州特許出願0 392 332 A2は、蛍光偏光免疫検定法とそのための試薬類を開示している。血清アルブミンその他の尿中タンパク質に結合しているマリファナ代謝産物を遊離型に変換するための種々の化合物が開示されている。これらの化合物には、なかんずくANS、サリチル酸および5-メトキシサリチル酸が含まれる。
発明の概要
本発明の一側面は、リガンドをその錯体から遊離させる方法に関する。この方法は、そのような錯体を含有すると思われる媒質を、次式の化合物（化合物Ｉ）の有効量と接触させることからなる：
0003706895.tif 000002
式中、R1は、R2は水素またはアルキル、ＸはＯ、ＳまたはＮ、ＸがＯまたはＳである場合、ｎは１、ＸがＮである場合、ｎは２、ｍは１または２である。
本発明のもう１つの側面は、特異的結合対の要素である被検体を含むと思われる試料中の当該被検体を測定する方法の改善である。その方法は（ａ）検定媒質にその試料とその被検体の結合相手を供給する処置と、（ｂ）その被検体に対するその結合相手の結合を検出する処置とからなる。その改善は、その検定媒質中にその測定の精度を向上させるに足る量の化合物Ｉを含めることからなる。
本発明のもう１つの態様は、ミコフェノール酸をその錯体から遊離させる方法に関する。この方法は、その錯体を含有すると思われる媒質を、化合物Ｉの有効量と接触させることからなる。
本発明のもう１つの態様は、ミコフェノール酸を含有すると思われる試料中のミコフェノール酸を測定する方法の改善である。その方法は（ａ）検定媒質にその試料とミコフェノール酸の結合相手を供給し、（ｂ）ミコフェノール酸に対するその結合相手の結合を検出することからなる。その改善は、その検定媒質にその測定の精度を向上させるに足る量の化合物Ｉを含めることからなる。
本発明のさらなる態様は、ミコフェノール酸とそのミコフェノール酸に結合する内因性タンパク質とを含有すると思われる試料中のミコフェノール酸の量を測定する方法の改善である。その方法は（ａ）水性媒質中でその試料、検出可能な標識と複合体化したミコフェノール酸、およびミコフェノール酸を結合できる抗体を混合し、（ｂ）その標識の活性に対するその試料の影響を決定することからなる。その改善は、その媒質に次式の化合物（化合物II）を、その内因性タンパク質からそのミコフェノール酸を遊離させるのに有効な量で含めることからなる：
0003706895.tif 000003
（式中、R1はアルキルであり、R2は水素またはアルキルである）。
さらに本発明は、被検体測定用の検定を実施するためのキットをも包含する。このキットは、被検体の結合相手と化合物Ｉが詰め合わされてなる。
ミコフェノール酸測定用の検定を実施するためのキットは、ミコフェノール酸に結合できる抗体、検出可能な標識に結合したミコフェノール酸からなる化合物、および化合物Ｉが詰め合わされてなる。
特定の態様の説明
本発明の特定の態様を説明する前に、いくつかの用語を定義しておく。
被検体--検出すべき化合物または組成物。被検体は特異的結合対（sbp）の要素からなることができ、通常は一価（モノエピトープ性）、通常はハプテン性で、単一の化合物もしくは少なくとも１つの共通するエピトープ部位または決定基部位を共有する複数の化合物であるリガンドでありうる。
モノエピトープ性リガンド被検体は、一般的には約100から2,000までの分子量を持ち、より一般的には125から1,000までの分子量を持つだろう。被検体には、薬物、代謝産物、農薬、汚染物質などが含まれる。代表的な被検体には、例えば次に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：（Ｉ）モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、それらの誘導体および代謝産物を含むモルヒネアルカロイド；コカインおよびベンジルエクゴニン、それらの誘導体および代謝産物を含むコカインアルカロイド；リセルグ酸のジエチルアミドを含む麦角アルカロイド；ステロイドアルカロイド；イミナゾイル（iminazoyl）アルカロイド；キナゾリンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キニンおよびキニジンを含むキノリンアルカロイド；ジテルペンアルカロイド、それらの誘導体および代謝産物などのアルカロイド；（ii）エストロゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカル（andreocortical）ステロイド、胆汁酸、ジゴキシンとジゴキシゲニン、サポニンとサポゲニンを含む強心性配糖体とアグリコン、それらの誘導体および代謝産物を含むステロイド；ジエチルスチルベストロールのようなステロイド模倣物質；（iii）バルビツール酸塩（エステル）（barbituates）（例えばフェノバルビタールやセコバルビタール）、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトサクシミドおよびそれらの代謝産物を含む、５〜６員環を持つラクタム；（iv）２〜３炭素原子のアルキルを持つアミノアルキルベンゼン（アンフェタミン類を含む）；エフェドリン、L-ドーパ、エピネフリンを含むカテコールアミン類；ナルセイン；パパベリン；およびそれらの代謝産物；（ｖ）オキサゼパム、クロルプロマジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝産物を含む、複素環がアゼピン類、ジアゼピン類およびフェノチアジン類であるところのベンズ複素環式化合物；（vi）テオフィリン、カフェイン、それらの代謝産物および誘導体を含むプリン類；（vii）カンナビノールとテトラヒドロカンナビノールを含む、マリファナから誘導される薬物；（viii）チロキシン、コルチゾール、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲストロン（progestrone）などのホルモン、アンギオテンシンやLHRHなどのポリペプチド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸（MPA）などの免疫抑制剤；（ix）ビタミンＡ、Ｂ（例えばB12）、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、チアミンなどのビタミン類；（ｘ）ヒドロキシル化の程度と不飽和度が異なるプロスタグランジン類；（ｘｉ）イミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、クロミプラミン、ドキセピン、デスメチルドキセピンを含む三環式抗うつ剤；（ｘii）メトトレキサートを含む抗新生物薬；（ｘiii）ペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、それらの代謝産物および誘導体を含む抗生物質；（ｘiv）適当な糖置換基およびリン酸エステル置換基を持つATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジン、シチジンを含むヌクレオシドとヌクレオチド；（ｘｖ）メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカイン���ミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン薬、クロラムフェニコール、アトロピンのような抗コリン作用薬、それらの代謝産物および誘導体を含む様々な個々の薬物；（ｘvi）スペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリン１型を含む、疾患状態に関係する代謝産物；（ｘvii）ゲンタマイシン、カナマイシン、イブラマイシン、アミカシンなどのアミノ配糖体；（ｘviii）ポリハロゲン化ビフェニル類、リン酸エステル類、チオリン酸エステル類、カルバミン酸エステル（カルバメート）、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それらの代謝産物および誘導体などの農薬。
本発明は、一価被検体と同じ非特異的結合を受ける部位を持つ多価リガンド被検体に適用することができる。これらの多価被検体は通常、ポリペプチドやタンパク質などのポリアミノ酸、多糖類、核酸およびそれらの組み合わせである。その組み合わせには、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が含まれる。
被検体という用語には、m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA、DNA-RNA二本鎖などといったオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド被検体も含まれる。
被検体は、宿主から得られる生物組織（体液を含む）などの試料中に直接見つけられる分子でありうる。試料は直接調べることができ、あるいは試料を前処理して望ましくない物質を除去することにより、被検体をより検出しやすくしてもよい。試料の前処理により、細胞を分離または溶解したり、タンパク質を加水分解または変性したり、脂質を加水分解したり、被検体を可溶化したりすることができる。このような前処理には、遠心分離；有機溶媒（例えばメタノールなどのアルコール）により試料の処理；界面活性剤による処理があるが、これらに限るわけではない。試料は、その検定を妨げない任意の便利な媒質中に調製することができる。水性媒質が好ましい。
また、目的の被検体の証拠を示す物質、例えば試料中に目的の被検体が存在する場合にのみその存在が検出される目的の被検体に相補的な特異的結合対要素などを検出することによって、目的の被検体を測定することもできる。したがって被検体の証拠を示す物質は、その検定法で検出される被検体になる。
生物組織には、宿主の器官その他の身体部分から摘出された組織と、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳髄液、涙、粘液などの体液が含まれる。試料は血漿または血清であることが好ましい。
ミコフェノール酸エステル--これには、MPAイソベンゾフラニル環系の1'位に結合した側鎖のカルボン酸基におけるMPAのエステル類（例えばMPA-M）が含まれるが、これらに限るわけではない。
MPA代謝産物--MPAの代謝の産物、好ましくはイソベンゾフラニル環系を含有する産物、より好ましくは側鎖の一部をも含有する産物、例えばMPAのアシルまたはフェノールグルクロニドなど。
被検体の量を測定する--定量的、半定量的および定性的方法と、その他の被検体測定法はすべて、被検体の量を測定する方法とみなされる。例えば、単に、被検体を含有すると思われる試料中の被検体の存在または不在を検出するだけの方法も、本発明の範囲に包含されるとみなされる。「検出」や「決定」という用語が、その他の一般的な測定の類義語と共に、本発明の範囲で予期される。
〜と〜とを識別することができる--第２のリガンドと比較して第１のリガンドに優先的に結合することができるレセプターまたは抗体の能力。通常、その抗体をそれらのリガンドを含有する試料と混合すると、第２リガンドより少なくとも５倍は多い第１リガンドが結合するだろう。好ましくは少なくとも10倍量、より好ましくは少なくとも20倍量の第１リガンドが結合するだろう。各リガンドの相対的結合はその試料中の相対濃度に依存するだろうが、第１リガンドに対する抗体の結合定数が第２リガンドに対する結合定義と少なくとも等しく、好ましくは第２リガンドに対する結合定義の少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも50倍であれば、通常、これらの条件は満たされる。
複合体（コンジュゲート）--互いに（任意に連結基を介して）結合することにより単一の構造を形成している２またはそれ以上の分子からなる分子。その結合は、当該分子間の直接結合（例えば化学結合）によって、あるいは連結基の使用によって形成することができる。例えば酵素に結合（複合体化）した被検体類似物は、被検体類似物−酵素複合体である。
特異的結合対の要素（「sbp」要素）--表面上または空洞中に他方の分子に特異的に結合する領域を持ち、それゆえに当該他方の分子の特定の空間的構造および極性構造と相補的であると定義される２つの異なる分子の一方。sbpの要素は、免疫学的対（例えば抗原−抗体）の要素のように、リガンドおよびレセプターと呼ぶことができる。相補的sbp要素は、例えばリガンドとその相補的レセプターのように、互いに結合する。２つの相補的sbp要素に関して、その一方を他方の「結合相手」と呼ぶこともできる。sbp要素は抗原と抗体のような免疫学的対であってもよいし、アビジンとビオチンのような非免疫学的対であってもよい。sbp要素は、小分子または小分子の残基およびそれらのレセプターであってもよい。小分子は100〜2000（好ましくは150〜1000）の分子量を持ち、その小分子に対するレセプターは存在するか、もしくは調製することができる。小分子の例には、ビオチンの誘導体、リセルグ酸、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ビタミンB12があり、それらに対応するレセプターはそれぞれアビジンまたはストレプトアビジン、抗リセルグ酸、抗フルオレセインおよび内在因子がある。小分子はしばしば他のsbp要素に共有結合されて、少なくとも１つの小分子、多くの場合2〜20個の小分子を持つ複合体を形成する。sbp要素に対する小分子の結合は、その小分子の水素原子を当該sbp要素への結合に置き換える化学反応や、その小分子とsbp要素の間に任意のサイズ（ただし、その小分子とsbp要素に対するレセプターの両方の当該複合体への結合を可能とするのに必要なサイズ以上には、大きくないことが好ましい）の連結基を介在させることにより、達成することができる。
リガンド--任意の有機化合物であって、それに対するレセプターが天然に存在するか、もしくは製造することができるもの。
リガンド類似物（被検体類似物）--レセプターに関して類似するリガンドと競争することができる、通常は分子量100以上の修飾されたリガンド、有機ラジカルまたは被検体類似物であり、その修飾はリガンド類似物をもう１つの分子に結合する手段を提供する。通常、リガンド類似物は、当該リガンドとは、水素がそのリガンド類似物をハブ（hub）または標識に連結する結合で置換されている以上に異なるだろうが、そうである必要はない。リガンド類似物は当該リガンドと類似する様式でレセプターに結合することができる。類似物は、例えば当該リガンドに対する抗体のイディオタイプに対する抗体であってもよい。
レセプター（「抗リガンド」）--ある分子の特定の空間的構造および極性構造（例えばエピトープ部位または決定基部位）を認識することができる任意の化合物または組成物。レセプターの具体例には、天然に存在するレセプター、例えばチロキシン結合性グロブリン、抗体、酵素、Fab断片、レクチン、核酸、プロテインＡ、補体成分C1qなどがある。
特異的結合--２つの異なる分子の一方の他方に対する、他の分子の本質的に低い認識と比較して特異的な認識。一般に、それらの分子は、その表面上または空洞内に、当該２つの分子間に特異的認識を生じさせる領域を持つ。抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用などは、特異的結合の典型例である。
非特異的結合--特定の表面構造には比較的無関係な分子間の非共有結合。非特異的結合は、分子間の疎水相互作用を含むいくつかの要因によってもたらされうる。
リガンドの非特異的錯体--もう１つの物質（通常は分析しようとする試料中に存在する内因性物質）に非特異的に結合したリガンド。この内因性物質は一般的には血漿タンパク質（例えばアルブミン、グロブリン、糖タンパク質、リポタンパク質）などの内因性タンパク質である。
抗体--もう１つの分子に特異的に結合し、それゆえに当該もう１つの分子の特定の空間的構造および極性構造と相補的であると定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、宿主の免疫と血清の収集（ポリクローナル）あるいは連続的ハイブリッド細胞系の調製と分泌されたタンパク質の収集（モノクローナル）あるいは少なくとも天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその突然変異型のクローニングと発現などといった、当技術分野でよく知られる技術によって調製することができる。抗体としては、完全な免疫グロブリンまたはその断片を挙げることができ、その免疫グロブリンにはIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3、IgMなどといった様々なクラスとイソタイプが含まれる。その断片としては、Fab、FvおよびF（ab'）2、Fab'などを挙げることができる。また、免疫グロブリンまたはその断片の会合体、多量体および複合体も、特定の分子に対する結合親和力が維持されているかぎり、適宜使用することができる。
抗体（ポリクローナル）を含有する抗血清は、ウサギ、モルモットまたはヤギのような動物を適当な免疫原で免疫し、適当な待機期間後にその免疫動物の血液から抗血清を得ることを伴う、十分に確立された技術によって得られる。技術水準の概観は、Parker著、Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds（Prentice-Hall社、米国ニュージャージー州エングルウッドクリフス、1976）、Bulter著、J.Immunol. Meth. 7:1-24（1975）; BroughtonおよびStrong著、Clin. Chem. 22:726-732（1976）; Playfairら著、Br. Med. Bull. 30: 24-31（1974）に記述されている。
抗体は体細胞ハイブリッド作成技術によって得ることもでき、そのような抗体は一般にモノクローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体は
0003706895.tif 000004
Nature 265:495-497, 1975の標準的技術に従って作成することができる。モノクローナル抗体技術の概説は、「Lymphocyte Hybridomas」（Melchersら編、Springer-Verlag社、ニューヨーク、1978）、Nature 266:495（1977）、Science 208:692（1980）およびMethods of Enzymology 73（Part B）:3-46（1981）に認められる。適当な免疫原調製物の試料をマウスなどの動物に注射し、十分な期間の後、その動物を犠牲にして脾細胞を得る。別法として、非免疫動物の脾細胞を試験管内で免疫原に感作することもできる。所望の免疫グロブリンの塩基配列をコードする脾細胞染色体は、その脾細胞を一般的には非イオン界面活性剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下に骨髄腫細胞系と融合することによって、圧縮することができる。融合したハイブリドーマを含む得られた細胞を、HAT培地のような選択培地で生育し、生き残った不死化細胞を限界希釈条件を用いて同様の培地で生育する。その細胞を適当な容器（例えばマイクロタイターウェル）中で生育し、その上清を所望の特異的を持つモノクローナル抗体についてスクリーニングする。
モノクローナル抗体の収量を増大させるには、ハイブリドーマ細胞をその細胞を許容する哺乳類宿主の腹腔内に注射してその腹水を収集するなどといった様々な技術が存在する。腹水中に量的に不十分なモノクローナル抗体しか集まらない場合は、その宿主の血液から抗体を収集する。別法として、所望の抗体を産生する細胞を中空糸細胞培養装置か攪拌フラスコ装置で生育することもでき、これらの装置はどちらも当技術分野でよく知られている。モノクローナル抗体を他のタンパク質および他の汚染物質から単離精製するには、種々の従来法が存在する（
0003706895.tif 000005
前掲を参照）。
抗体を調製するもう１つの方法として、抗体結合部位をコードする配列を染色体DNAから切り出し、それを細菌中で発現できるクローニングベクターに挿入して、対応する抗体結合部位を持つ組換えタンパク質を生産することができる。
一般に、抗体はクロマトグラフィー（例えばDEAEクロマトグラフィー、ABxクロマトグラフィーなど）や濾過などの既知技術によって精製することができる。
ハプテン--対応する抗体に特異的に結合できるが、それ自体は抗体調製用の免疫原（または抗原）として作用しない化合物。ハプテンを認識する抗体は、免疫原性（抗原性）担体に結合したハプテンからなる化合物に対して調製することができる。ハプテンはリガンドの部分集合である。
MPA類似物--修飾されたMPA。その修飾はその類似物をもう１つの分子に結合する手段を提供する。通常、この類似物は、MPAとは、水素がその類似物をハブまたは標識に連結する結合で置換されている以上に異なるだろう。
免疫原性担体--ハプテンと複合体化して、哺乳動物に注射した時に、免疫反応を誘導し、そのハプテン（この場合はMPA）に結合する抗体の産生を引き出す基。免疫原性担体は抗原性担体とも呼ばれる。典型的な免疫原性担体には、ポリアミノ酸、多糖類、核酸および粒子（生物素材および合成素材）が含まれるが、これらに限らない。Davalianらの米国特許第5,089,390号の第４欄57行〜第５欄５行（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）には、様々な種類のこれら担体が開示されている。その他の好適な免疫原性担体には、アルブミン、血清タンパク質（例えばグロブリン）、眼の水晶体タンパク質およびリポタンパク質が含まれる。タンパク質の具体例には、ウシ血清アルブミン、キホールリムペットヘモシアニン（「KLH」）、卵白アルブミンおよびウシガンマグロブリンがある。
支持体または表面--小片、棒、板、窪み（ウェル）、粒子およびビーズなどといったいくつかの形状のいずれであってもよい多孔性または非多孔性の水不溶性素材である固相（通例、支持体または表面）。Ullmanらの米国特許第5,185,243号の第10〜11欄、Kumらの米国特許第4,868,104号の第６欄21行〜42行およびMilburnらの米国特許第4,959,303号の第６欄14行〜31行（これらは参考文献として本明細書の一部を構成する）には、種々の好適な支持体が開示されている。支持体または表面に対するsbp要素の結合は、一般に文献に求めることができるよく知られた技術によって達成できる。例えばIchiro Chibata著「Immobilized Enzymes」（Halsted Press社，ニューヨーク（1978））やCuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059（1970）を参照のこと。本明細書において「支持体に結合させることができる」とは、例えば、抗被検体抗体などの試薬を第1sbp要素または小分子に結合し、相補的な第2sbp要素またはその小分子のレセプターを支持体に結合することを意味する。あるいは、抗マウス抗体などの抗被検体抗体に対するレセプターを支持体に結合し、それを用いてその抗被検体抗体を捕捉する。したがって、抗被検体抗体を支持体に実際に結合しているのではなく、相補的sbp要素またはレセプターが加えられた時に結合した状態になるのである。
シグナル生成系（signal producing system:「sps」）--結合標識および／または非結合標識の量、すなわち検出される化合物に結合した標識または結合していない標識の量に関係する検出可能なシグナルを生成する１またはそれ以上の成分であって、その少なくとも１成分は検出可能な標識であるもの。標識はシグナルを生成する任意の分子またはシグナルを生成するように誘導されうる任意の分子であって、蛍光剤、放射性同位体標識、酵素、化学発光剤または感光剤であることが好ましい。したがって、シグナルは蛍光または発光、放射能、酵素活性または吸光度によって検出および／または測定される。
好適な標識には、例えばアルカリホスファターゼ、グルコール-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（「G6PDH」）および西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；リボザイム（ribozyme）; QBレプリカーゼなどのレプリカーゼの基質；助触媒（プロモーター）；色素；フルオレセイン、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド（phthaldehyde）およびフルオレスカミンなどの蛍光剤；イソルミノールなどの化学発光剤；増感剤；補酵素；酵素基質；125I、131I、14C、3H、57Coおよび75Seなどの放射性同位体標識；ラテックスや炭素粒子のような粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；色素、触媒その他の検出可能基でさらに標識してもよい細胞などがあるが、それらに限るわけではない。Litmanらの米国特許第4,275,149号の第19〜28欄とBoguslaskiらの米国特許第4,318,980号の第10〜14欄には好適な酵素と補酵素が開示されており、Litmanらの米国特許第4,275,149号の第30および31欄には好適な蛍光剤と化学発光剤が開示されている（これらの開示は参考文献として本明細書の一部を構成する）。
標識が外部手段によって（例えば視認、電磁気放射、熱および化学試薬などによって）検出可能なシグナルを生成できる方法は数多くある。標識その他のsps要素を、もう１つの分子であるsbp要素、または支持体に結合することもできる。
標識はシグナルを直接生成することができ、それゆえにシグナルの生成に追加の成分を必要としない。数多くの有機分子（例えば蛍光剤）は紫外および可視光を吸収することができ、この場合、その光吸収はこれらの分子にエネルギーを転移し、それらを励起エネルギー状態に高める。次に、この吸収されたエネルギーは、第２の波長の光の放出によって放散する。シグナルを直接生成することができるその他の標識には、放射性同位体と色素がある。
別法として、標識はシグナルの生成に他の成分を必要としてもよく、その場合、そのシグナル生成系は測定可能なシグナルを生成するのに必要な成分の全てを含むことになり、これには基質、補酵素、増強剤（エンハンサー）、追加の酵素、酵素生成物と反応する物質、触媒、活性化因子、補因子、阻害剤、補集剤、金属イオンおよびシグナル生成物質の結合に必要な特異的結合物質が含まれうる。好適なシグナル生成系の詳細な議論は、Ullmanらの米国特許第5,185,243号の第11〜13欄（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）に認めることができる。
標識は、数多くのsbp要素；抗体；抗体に対するレセプター；抗体と複合体化した小分子に結合できるレセプター；またはリガンド類似物に共有結合させることができる。sbp要素に対する標識の結合は、その標識の水素原子をそのsbp要素に対する結合に置き換える化学反応によって達成することができ、これにはその標識とsbp要素の間の連結基も含まれうる。他のsps要素をsbp要素に共有結合させてもよい。例えば蛍光剤と消光剤のような２つのsps要素のそれぞれを、被検体と特異的錯体を形成する異なる抗体に結合することができる。その錯体が形成されると蛍光剤と消光剤がきわめて接近することになり、それゆえにその消光剤が蛍光剤と相互作用してシグナルを生成することが可能になる。複合体化の方法は当技術分野でよく知られている。例えばRubensteinらの米国特許第3,817,837号（この特許は参考文献として本明細書の一部を構成する）を参照のこと。また本発明では、第1sps要素に結合した抗体と、第2sps要素としての検出可能標識とを持つことも予期される。例えば、検出可能な標識をリガンド類似物に結合すれば、その類似物に対する抗体の結合の程度を、それらsps要素の相互作用によって生成するシグナルを検出することによって測定することができる。
補助物質--本発明による検定法ではしばしば種々の補助物質が使用されるだろう。例えば、検定媒質には通常、緩衝剤が存在し、検定媒質用の安定化剤と検定成分も存在するだろう。これらの添加剤に加えて、アルブミンなどの追加タンパク質や、界面活性剤（特に非イオン界面活性剤）、結合促進剤（例えばポリアルキレングリコール）、保存剤、抗微生物剤などが含まれることも多い。
連結基--２個またはそれ以上の部分構造を連結する構造の一部。連結基は結合であってもよいし、またその部分構造間に伸びた水素（または他の一価原子）以外の原子の連続した鎖を少なくとも１つ持ってもよい。鎖中の原子数は少なくとも１個で、連結される部分構造間の最短経路に沿って水素以外の原子数を数えることによって決定され、一般的には、炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群よりそれぞれ独立して選択される１〜30原子、通常は２〜10原子、好ましくは３〜８原子である。連結基中の総原子数は、全ての炭素、酸素、窒素、硫黄およびリン原子（すなわち水素以外の原子）を数えることによって決定される。通例、連結基は合計30個未満、好ましくは20個未満、より好ましくは10個未満の原子を持つ。一般則として、特定の連結基の長さは、合成の都合と所望の基の組み込みとを考慮して、恣意的に選択することができる。ジアゾ基の場合は通常、芳香族基が伴うであろうが、連結基は脂肪族でも芳香族でもよい。酸素は通常、炭素、硫黄、窒素またはリンに結合したオキソまたはオキシとして存在するだろう。窒素は通常、ニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在し、これらは通常、炭素、酸素、硫黄またはリンに結合しているだろう。硫黄も酸素と同様だろう。一方、リンは、炭素、硫黄、酸素または窒素に、通常はホスホン酸およびリン酸モノまたはジエステルとして結合しているだろう。
複合体化される分子と連結基の間に共有結合を形成する一般的な官能基は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、ジチオール、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボン酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、アミドおよびチオエステルである。
アルキル--脂肪族炭化水素からＨ原子を１つ除去することによって得られる一価の分枝または非分枝ラジカル；低級アルキルと高級（upper）アルキルの両方を包含する。
低級アルキル--１〜５個の炭素原子を含有するアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチルなど。
高級（upper）アルキル--６個以上の炭素原子（通常は６〜20炭素原子）を含有するアルキル、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチルなど。
本発明の一側面は、リガンドをその非特異的錯体（そのリガンドが別の物質（内因性試料タンパク質その他の非特異的物質など）に非特異的に結合している錯体など）から遊離させる方法に関する。この方法は、そのような錯体を含有すると思われる媒質を有効量の化合物Ｉと接触させることからなる。
上記の構造式を持つ化合物の代表例を表１に示すが、これらは例示であって限定ではない。
0003706895.tif 000006
本発明の方法で使用する化合物は、カルボキシ基と置換基--XR1がオルトの関係にあり、次の構造式を持つことが好ましい（これを化合物I'と名づける）：
0003706895.tif 000007
（式中、R1はアルキル、R2は水素またはアルキル、ＸはＯ、ＳまたはＮである）。この範疇に含まれる代表的化合物は、例えば上記の化合物I-M、I-P、I-S、I-V、I-YおよびI-BBであるが、これらに限るわけではない。
好ましい上記式Ｉの化合物は、化合物IIの構造式を持つ化合物である。このグループに属する代表的化合物は、例えば上記の化合物I-M、I-N、I-O、I-P、I-QおよびI-Rであるが、これらに限るわけではない。
より好ましくは、本発明で有用な化合物は次式の化合物（化合物III）である：
0003706895.tif 000008
（式中、R1はアルキルであり、R2は水素またはアルキルである）。このグループに属する代表的化合物は、例えば上記の化合物I-MおよびI-Pであるが、これらに限るわけではない。この範疇で特に好ましい化合物は、R1が低級アルキル（より好ましくはメチル）である化合物である。
より好ましい化合物は次式の化合物（化合物IV）である：
0003706895.tif 000009
（式中、R3は低級アルキルである）。特に好ましい化合物o-メトキシ安息香酸であり、これはo-アニス酸としても知られている。
本発明では、使用するその化合物Ｉが、被検体の検定に使用するsbp要素または被検体の結合相手に有意な程度に結合しないことが重要である。何が有意な程度を構成するかは、その検定法に必要な感度に依存し、その検定法に要求される感度が高いほど、sbp要素または被検体の結合相手との間に許容できる結合量は少なくなる。「有意な程度」という用語は、その化合物Ｉが検定結果の精度あるいは定量的または定性的性質に影響を与えるほどには、sbp要素または結合相手に結合しないという意味である。したがって、その化合物Ｉとsbp要素または結合相手の間の結合は、好ましくは１％未満、より好ましくは0.01％以下、最も好ましく０％であるべきである。このようなパーセンテージは、与えられた量の遊離剤の見かけ上の被検体定量値を測定し、その結果を実際の濃度の分数として表わすことにより決定される。さらに、選択したその化合物Ｉが、sbp要素同士の結合や、シグナル生産系が試料中の被検体の存在または量に関してシグナルを生成する能力と干渉する場合、それはごくわずかでなければならない。
「有効量」という用語は、好ましくはリガンドの少なくとも90％、より好ましくはリガンドの少なくとも99％、最も好ましくはリガンドの100％が当該錯体を含まない形態をとるように、リガンドを当該錯体から遊離させるに足る量を意味する。特定の検定で使用すべき化合物Ｉの有効量は、そのリガンドとその検定法の性質およびそこで使用する試薬類の性質に依存するだろう。有効量は、試料中の被検体の推測される濃度範囲に基づいて実験的に決定されることが好ましい。一般に、化合物Ｉの有効量は、推定される被検体量より過剰な量である。例えば、試料中の予想薬物レベルが約1.5〜45μMであるようなMPAの検定について考えると、その検定媒質中の化合物Ｉの有効量は約0.1〜約100mM、好ましくは約１〜約25mM、より好ましくは約２〜12mMであるが、これに限られるわけではない。
本発明で有用な化合物の多くは市販されており、かつ／または、それらの合成が文献で知られている。本発明の方法で有用な化合物は、安息香酸やヒドロキシ安息香酸などの容易に入手できる出発物質から既知の手法で製造することができる。それらの手法には、ベンゼン環上に１個またはそれ以上のアルコキシ基を形成し、エステルが所望であれば、得られた化合物をエステル化することが含まれる。これらはどちらも周知の方法で達成することができ、それらの方法をここに再掲することはしない。例えばHeathcockら著「Introduction to Organic Chemistry」（MacMillan Publishing Company，ニューヨーク州ニューヨーク，第3版，1985）の814頁と493頁；Carey著「Organic Chemistry」（McGraw Hill Inc., ニューヨーク州ニューヨーク，第２版，1987）の994〜995頁と609頁を参照のこと。
本発明の方法は、sbp要素である被検体を測定するための検定法、特に遊離被検体（例えば遊離ハプテン）を測定するための検定法のほとんどに適用することができる。一般的には、被検体を含有すると思われる試料を、検定媒質中で、その被検体の結合相手および実施するその検定に応じてその他の試薬と混合する。被検体に対する結合相手の結合があれば、それを検出する。化合物Ｉの有効量をその検定媒質に含める。検定は、何らかの検定成分または検定生成物を分離せずに（均一系）または分離して（不均一系）行なうことができる。均一免疫検定法の典型例には次に挙げるものがある：Rubensteinらの米国特許第3,817,837号の第３欄６行〜第６欄64行に開示されているEMIT▲Ｒ▼検定製品（Behring Diagnostics Inc., 元Syva Company，カリフォルニア州サンホゼ）；Ullmanらの米国特許第3,996,345号の第17欄59行〜第23欄25行に開示されているような免疫蛍光法；Maggioらの米国特許第4,233,402号の第６欄25行〜第９欄63行に開示されているような酵素チャネリング法（enzyme channeling techniques）；その他の酵素免疫検定法、例えば酵素結合イムノソルベント検定法（「ELISA」）はMaggio, E.T.ら（前掲）に議論されている。不均一検定法の典型例は、Yolowら，J. Clin. Invest. 39:1157（1960）に開示されている放射免疫検定法である。上記の開示はすべて参考文献として本明細書の一部を構成する。
典型的な非競争サンドイッチ検定法は、Davidらの米国特許第4,486,530号の第８欄６行〜第15欄63行（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）に開示されている検定法である。この方法では、化合物Ｉの有効量を含む検定媒質中に、免疫サンドイッチ錯体を形成させる。この錯体は、被検体、その被検体に結合する一次抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）および被検体または被検体と一次抗体の錯体に結合する二次抗体からなる。次に、その免疫サンドイッチ錯体を検出し、それを試料中の被検体の量に関連づける。一次抗体と二次抗体のいずれかまたは両方が標識または標識と結合しうる置換基を含有する場合（例えばビオチンに結合した抗体を用意し、標識に結合したアビジンを用意した場合など）、この免疫サンドイッチ錯体は、その錯体中の標識の存在によって検出される。
本発明の検定法を実施する際に有用なもう１つの方法は、Ullmanらの米国特許第4,857,453号の第11欄21行〜第14欄42行と第18欄21行〜第21欄55行（これらは参考文献として本明細書の一部を構成する）に開示されている。
本検定は通常、一般に最適な検定感度を与える穏やかなpHの水性緩衝媒質中で行われる。水性媒質は水のみでもよいし、ある割合の補助溶媒（例えば０〜40体積％の補助溶媒）を含んでもよい。媒質のpHは通例４〜11の範囲、より一般的には５〜10の範囲にあり、6.5〜9.5の範囲にあることが好ましい。pHは通例、特異的結合対の結合要素の最適な結合、本発明による被検体のその非特異的錯体からの最適な遊離、およびその検定法の他の試薬類（シグナル生成系の要素など）にとって最適なpHの間で妥協した値になるだろう。
所望のpHを達成し、そのpHを測定時間中維持するには、種々の緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の具体例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリスおよびバルビタールがある。使用する緩衝剤は本発明にとって決定的な問題ではないが、個々の検定では、いずれかの緩衝剤が好ましい場合もある。
通例、本検定を行なうには穏やかな温度が使用され、通常は（特に速度決定の場合は）測定期間中一定の温度が使用される。保温温度は通例、５〜45℃の範囲であり、より一般的には15〜40℃の範囲だろう。測定中の温度は一般に10〜50℃、より一般的には15〜40℃の範囲だろう。
検定できる被検体の濃度は一般に10-4Mから10-13Mまで変化し、より一般的には10-5Mから10-7Mまで変化するだろう。その検定が（試料中に存在する被検体の量に関して）定性的、半定量的、定量的のいずれかであるか、その検出技術および被検体の濃度などの考察は、通例、種々の試薬類の濃度を決定するだろう。
検定における種々の試薬類の濃度は、一般的には、被検体の関連濃度範囲によって決まるだろう。しかし通例、各試薬の最終濃度は、その範囲でその検定法の感度が最適となるように実験的に決定されるだろう。すなわち有意な被検体濃度の変動は、正確に測定できるシグナル差を与えるべきである。
添加の順序は多岐にわたりうるが、その検定法の性質によって一定の優先度はあるだろう。最も簡単な添加順序は、均一検定法のように、全ての物質を同時に添加し、その検定媒質がそのシグナルに対して持つ影響を決定することである。別法として、試薬類を逐次混合することもできる。任意に、各添加後に、概して30秒から６時間まで（より一般的には１分から１時間まで）にわたる保温処置を含めてもよい。
次の例で本発明のこの態様をさらに説明するが、これは本発明の説明を意図するものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。例示のためにMPA検定法について述べるが、限定を意図するものではない。
均一検定法では、全ての試薬類を混合し終えた後にシグナルを測定し、それをその試料中のMPAの量と関連づける。例えば、MPAのEMIT検定法では、MPAを含むと思われる試料を、水性媒質中で、MPA-酵素複合体およびMPAとその複合体とを認識できる抗体と、同時にもしくは逐次混合する。媒質は有効量の化合物Ｉをも含有する。一般的には、当該酵素の基質を添加すると、酵素触媒反応により発色性または発蛍光性生成物の生成が起こる。好ましい酵素はグルコール-6-リン酸デヒドロゲナーゼとアルカリホスファターゼである。化合物Ｉは、MPAを試料中に存在しうる任意の非特異的錯体から遊離させるように作用する。MPAとMPA-酵素複合体は、抗体上の結合部位に関して競争する。次に、媒質中の酵素活性を（通常は分光測光法で）測定し、それを既知量のMPAを含む較正用試料または参考試料を試験した時に測定される酵素活性と比較する。通例、これらの較正用試料は、MPAを含有すると思われる試料の試験と同様の方法で試験される。これらの較正用試料は通例、異なる濃度（ただし既知濃度）の検定すべきMPA被検体を含む。較正用試料中に存在する濃度範囲は、未知試料中の推定MPA濃度範囲にまたがることが好ましい。
不均一検定法は、通例、１またはそれ以上の分離処置を含み、競争または非競争法で行なうことができる。種々の競争検定方式と非競争検定法式がDavalianらの米国特許第5,089,390号の第14欄25行〜第15欄９行（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）に開示されている。典型的な競争検定法では、MPAを結合させるための抗体を持つ支持体を、試料および酵素などの検出可能な標識と複合体化したMPAを含む媒質と接触させる。その媒質は有効量の化合物Ｉをも含有する。試料中のMPAは、その抗体への結合に関して上記複合体と競争する。支持体と媒質を分離した後、支持体または媒質の標識活性を従来技術で測定し、それを試料中のMPA量と関連づける。
上述のように、本発明には、被検体を分析用試料中に存在する非特異的結合物質から遊離させるための既知化合物をしのぐ利点がある。本発明では、被検体の100％までを血漿タンパク質などの内因性非特異的結合物質から遊離させることができる。したがって、較正用試料のマトリックスと比較したタンパク質濃度の関数として可変的な被検体の回収は、本質的に軽減または排除される。さらに、同時投与される薬剤の存在の関数として可変的な被検体の回収は、内因性非特異的結合物質上の結合部位に関する被検体とそのような物質に結合する他の薬物の間の競争が軽減または排除されるので、本質的に軽減または排除される。既知薬剤のいくつかに伴う高いバックグラウンド吸光度は、本発明では避けられる。したがってこの方法は、約300〜約700nmの範囲にシグナルを生成するシグナル生成系を使用する検定法では特に有利である。このことは、特に分光測光法に基づく免疫検定法には重要な利点である。本発明の化合物を使用するもう１つの利点は、本化合物を使用しない検定法では生じてしまう総用量作用曲線に対する有害な影響の回避である。本発明のさらなる利点は、この遊離剤が光感度低下を示さないということである。
本発明によるMPA検定法の１つでは、MPAとそのエステルおよび代謝産物に結合することができる抗体を使用する。本発明によるもう１つのMPA検定法では、MPAとMPA-Mのようなミコフェノール酸エステルとを識別することができる抗体を使用する。本発明によるMPA検定法のもう１つの態様では、使用する抗体がMPAとMPA-GのようなMPA代謝産物とを識別することができる。
MPAに対する抗体の結合は、当技術分野で知られる数多くの方法で検出できる。抗体とMPAの結合は、直接または間接的に検出できる免疫錯体を形成する。例えば使用する抗体が標識に複合体化されている場合、この免疫錯体は直接検出される。検定媒質中での免疫錯体形成がシグナル生成系に及ぼす影響を調べることによって、あるいは本発明の抗体に特異的に結合する標識レセプターを使用することによって、免疫錯体は間接的に検出される。
本発明のもう１つの側面は、被検体を測定するための検定を便利に実施するのに役立つキットに関する。本発明のキットは、被検体の結合相手と化合物Ｉが詰め合わされてなる。このキットは検出可能な標識に結合した被検体の複合体をさらに含んでもよい。MPA測定用キットは、MPAに結合できる抗体、MPAと標識の複合体、および化合物Ｉが詰め合わされてなる。
本発明の汎用性を高めるため、キット試薬類を、その試薬類の比率がその方法と検定を十分に最適化するように、同じ容器または独立した容器に、液状または凍結乾燥型で詰め合わせて供給することができる。試薬類はそれぞれ独立した容器に入れることができ、また試薬類の交差反応性と安定性に応じて、種々の試薬を１個またはそれ以上の容器に混合することもできる。例えば、化合物Ｉの水溶液は、独立した容器に入れて供給することができる。別法として、化合物Ｉを、検定を実施するための試薬類の１つの中に含めることもできる。例えば化合物Ｉを、抗体試薬を含有する水性媒質中に含めることができる。そのような水性媒質は独立した容器に包装することができる。
本キットはさらに、別個に包装された他の検定実施用試薬類（追加のsbp要素や補助酵素基質などの補助試薬類など）を含んでもよい。キット内の種々の試薬類の相対量は、その方法の実施中に起こる必要がある反応を十分に最適化するような試薬類の濃度を与え、さらにその検定法の感度が十分に最適化されるように、変更することができる。それが適当な場合は、キット中の１またはそれ以上の試薬類を、溶解時に本発明の方法または検定を行なうのに適した濃度を持つ試薬溶液が得られるような賦形剤入り乾燥粉末（通常は凍結乾燥されたもの）として供給することができる。本キットにはさらに、上述のような本発明方法の説明書を含めることができる。
実施例
下記の実施例により本発明をさらに論証する。本明細書における割合と百分率は特に示さない限り重量に基づく。温度は摂氏温度（℃）で表わす。
実施例１
MPAの検定における遊離剤としてのオルト−アニス酸
下記の試薬を調製した。
0003706895.tif 000010
0003706895.tif 000011
試薬Ａと試薬Ｂは次のように調製した。
両試薬に使用するため、Pluronic 25R2の1.028％（重量／重量）溶液を２〜25℃で調製した。
試薬Ａは、まずアニス酸溶液を作ることによって調製した。アニス酸を、アニス酸1.52gあたり25mLに相当する量の1N NaOHに溶解した。別の容器に、最終重量の70％の脱イオン水を計り取り、それに成分１から５までを加え、調製したPluronic 25R2溶液を最終溶液1017.9g（または１リットル）あたり10mL使用して成分６をも加えた。この溶液を攪拌し、上記アニス酸溶液を加えた。必要であれば、調製物のpHを6N NaOHで5.50〜5.70の範囲内に調節した。次に、成分８と９を加え、その溶液を攪拌した。必要ならばpHを上述の範囲に調節した。次に、その溶液を脱イオン水で最終重量にし、0.2ミクロンフィルターを通して濾過した。最終pHは5.50〜5.70だった。得られた溶液をＡ希釈液と名づけた。試薬Ａは、抗体（すなわち成分10）をＡ希釈液に最終抗体濃度が7.5mg/L（または7.5μg/mL）になるように加えることによって完成させた。
試薬Ａはヒト血清アルブミンと同様にMPAを結合するBSAを含有するが、このBSAは、評価した他のタンパク質より好ましい試薬Ａの安定剤であることがわかったため、試薬Ａに含めたものである。したがってこのBSAの効果と分析する試料に由来する結合を克服するために、MPA用の遊離剤を処方することになる。上記の製剤は試薬Ａ中のBSAに対して500モル過剰以上のo-アニス酸を含有する。このo-アニス酸濃度は、系中のMPAをすべて遊離させ、それを遊離したままにしておくに足る濃度以上であることがわかった。
試薬Ｂの場合は、最終重量の80％に相当する量の水を計り取った。この水に、成分12から17までを攪拌しながら加えると共に、最終溶液1016.1g（または1.0リットル）あたり30mLのPluronic 25R2溶液を使用して、成分18をも加えた。その溶液を脱イオン水で最終重量にし、pHを8.0〜8.3にして、0.2ミクロンフィルターを通して濾過した。その時点でその溶液をＢ希釈液と名づけ、それを用いて、相対的に無視しうる体積または重量の成分19および20を添加することにより、試薬Ｂを作成した。例えば、20.6mg/mLの安定化抗体0.37mLと0.8mg/mLの複合体6.1mLを、10L（または10.18kg）の試薬Ｂに加えた。安定化抗体（成分20）は最終濃度が0.75mg/L（または0.75μg/mL）になるように加えた。複合体（成分19）は300±10mA/分の速度が得られるように加えた。速度は反応時間１分あたりの340nmでの吸光度変化と定義され、通常mA/分の単位で表される。
速度はCobas Mira Plus▲Ｒ▼（装置（Roche Diagnostics Systems, Inc.,ニュージャージー州ブランチバーグ）で測定した。温度は検定中常に37℃に維持した。各サイクルが25秒であるサイクルで時間的調節を行なった。最初のサイクル、サイクル１では、水75μLと試料3μLを光路長0.6cmのキュベット中で155μLのＡ希釈液と混合した。この混合物をサイクル７における試薬Ｂの添加まで保温した。複合体速度（conjugate rate）を設定するために、MPAを一切含まない試料を使用した。次に、サイクル７で、75μLの試薬Ｂとそれに続いて20μLの水をキュベットに加え、混合し、サイクル25の最後まで保温し、その時点で検定を終了した。検定中、340nmでの吸光度測定を各サイクルの最後に行なった。次に、サイクル14からサイクル25までの12個の連続する吸光度測定値のみを用いて、時間（分）に対して最適線形近似を行なった。この直線の傾きを速度とした。
次に、Ａ希釈液に抗体を異なるレベルで添加することにより、試薬Ａ調製物を作成した。次に、これらの滴定レベルを、試薬Ｂおよび異なるレベルのMPA（例えば０、0.5、2.0、5.0、10.0および15.0μg/mL）を含む較正用試料で測定した。次に、２つの低濃度帯較正用試料間と２つの高濃度帯較正用試料間で最大の速度分離を与える抗体のレベルを用いて、最終試薬Ａを処方した。
試薬Ａと試薬Ｂを調製したら、それらを較正用試料と共に使用して、未知のMPA濃度を決定した。
未知のMPA濃度を決定するために、較正用試料を試薬Ａと試薬Ｂで処理し、Ａ希釈液の代わりに抗体を含む試薬Ａを使用する点以外は上述のようにして、それぞれの速度を決定した。通例、各較正用試料につき２回づつ速度を測定し、平均した。MPA濃度、平均較正用試料速度およびlogit/log4モデルフィット（logit/log4 model fit）のような適当な数理モデルを用いて、検量線変数を計算した。このフィット（適合）は、次の等式中の変数Ro、KC、ａおよびｂを最適化する適当なコンピュータープログラムまたは分析装置によりオンラインで行なった：
0003706895.tif 000012
（式中、Ro、Kc、ａ、ｂは曲線変数、ＣはMPA濃度、ＲはそのMPA濃度で観測される速度である）。
Ｃについてこの等式を解くことにより、未知のMPA濃度をその速度、Ｒおよび曲線変数から、
Ｃ＝exp [[a＋1n [Kc/(R-Ro) -1.0]]/-b]
として決定することができる。
その結果を以下に要約する。
正常ヒト血漿プール（NHP）中の10μg/mL MPAスパイクの定量と、BioWhittaker（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入したダルベッコリン酸緩衝食塩水（PBS）中の同様のスパイクの定量との一致を測定することにより、o-アニス酸を含む製剤の有効性を評価した。NHPとPBSのどちらについても、２つの独立したスパイクを施した。PBSは最終pH6.4〜7.6で0.2g/L KCl、0.2g/L KH2PO4、2.16g/L Na2HPO4・7H2Oおよび8.0g/L NaClを含んだ。このPBSはタンパク質を含まないので、MPAのタンパク質結合は起こり得ない。較正用試料は、０、0.3、0.5、2.5、５、10および20μg/mLの７レベルのMPAを含むNHPとした。NHPスパイクとPBSスパイクはほぼ同じ定量値となり、それぞれ10.2および10.4μg/mL MPA（合同（pooled）標準偏差（sd）＝0.4μg/mL）の平均値を与えた。これらの結果は、この方法が総MPA量を測定していたこと、そしてMPAの正常血清アルブミン結合によって左右されなかったことを示している。
実施例２
MPA検定法における遊離剤としてのアニス酸異性体とANSの比較
この実施例では４種類の薬剤、o-アニス酸（o-AA）、そのメタ異性体（m-AA）とパラ異性体（p-AA）および既知の遊離剤8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸（ANS）を比較した。アニス酸はすべてSigma Chemical Company（ミズーリ州セントルイス）から購入し、ANSはCalbiochem（カリフォルニア州ラホーヤ）から入手した。
これらの実験では、試薬Ａ（Rgt A）用の希釈液を実施例１とはやや異なる方法で作成した。しかしその組成は、成分７（遊離剤、o-アニス酸）と成分10（MPA抗体の濃度）を除いて同じとした。５種類の希釈液を調製した。そのうちの４つは上記薬剤のいずれか１つを含み、１つは薬剤を含まない対照である。まず、２×溶液を実施例１に記述した方法で作成した。ただしこれは成分１から５までと成分９のみを表記の量の２倍量含有する。次に、これらの希釈液のうち３つについて、３種類のアニス酸異性体のそれぞれを最終的な容積モル濃度が12.5mMとなるように計量し、最終体積の1/4量の水と最小量の6N NaOH（アニス酸0.2gにつき約６滴）に予備溶解した。第４の希釈液には、薬剤ANSを最終濃度が0.25mMになるように計量し、最終体積の1/4量の水に加えた。第５の希釈液（対照）は遊離剤を含まない。これら５種類の希釈剤のそれぞれを作るために、適当量の２×溶液、１×量のBSA（成分８）および１×量のPluronic 25R溶液（成分６）を混合した。次に、これらのうちの４つに適当な薬剤を入れた。全てをよく混合した。必要であれば、pH調節を上述のように行い、各調製物を脱イオン水で最終体積にすることにより、各成分を１×濃度とした。次に、これらＡ希釈液のそれぞれを0.2ミクロンフィルターに通して濾過した。それぞれの最終pH測定値はすべて5.5〜5.7だった。これら５つのＡ希釈液のそれぞれについて、MPAに対する抗体を最終濃度が6.5μg/mLになるように添加することにより、対応する試薬Ａを作成した。試薬Ｂ（Rgt B）は、成分20を省略し、BLGの代わりに0.1%BSA（Miles Diagnostics，イリノイ州カンカキー）を使用した点以外は、実施例１に記述したように調製した。
試薬Ａ中のANS濃度が、バックグラウンド吸光度に対するその寄与ゆえに制限されたことに注目すべきである。より高いANS濃度では、スケール外の吸光度測定値になり、速度データの収集が妨げられる。また、試薬Ａ調製物が、ANSを含む試薬Ａ（これは黄褐色がかった黄色である）を除いて、視覚的に無色であったことにも注目すべきである。
合計２回の測定で、薬剤を含まない対照と比較した上記４つの薬剤の効果を、(1) 340nmにおけるバックグラウンド吸光度、(2) 陰性MPA試料の速度、(3) ０μg/mL MPAと10μg/mL MPAの間の速度幅（rate span）、および(4) NHPおよび緩衝液中の10μg/mL MPAスパイクの速度一致の近さに関して調べた。どちらの測定にも対照試薬Ａを含めた。第１の測定ではANSを含む試薬Ａを評価し、第２の測定ではアニス酸の構造異性体を含む試薬Ａ調製物を評価した。
MPAをNHPおよび緩衝液（Buff）に添加（スパイク）して、10μg/mL MPAの最終濃度にした。この実施例での緩衝液は、0.1％（重量／体積）のアジ化ナトリウムを含むpH7.1の50mM MES（Sigma Chemical Companyから入手した2-［N-モルホリノ］-エタノールスルホン酸）である。PBSの場合と同様に、この緩衝液もタンパク質を含まず、したがってMPAのタンパク質結合は起こり得ない。
どちらの測定でも、各試薬Ａについて340nmでのバックグラウンド吸光度を、陰性NHP3μL、脱イオン水72μLおよび試薬Ａ 155μLからなる230μLの組み合わせで、２回づつ測定した。セル光路長は0.6cmである。平均A340（Ａ＝吸光度）値を表１のＣ欄に示す。実施例１と同様にスパイクしたNHPと緩衝液およびスパイクしていないNHPと緩衝液について２回づつ速度を決定した。速度決定に関する実施例１との唯一の相違は、操作のタイミングにある。これらの相違は次に示す通りである。試薬Ｂと水をサイクル４で加えた。分析はサイクル15の最後に終了した。速度はサイクル11から15までの５つの吸光度測定値を用いて決定した。
これらの速度の平均を表２のＥ欄ないしＨ欄に示す。
0003706895.tif 000013
スパイクした緩衝液速度からスパイクしたNHP速度を差引くこと（Ｈ欄−Ｆ欄）により、遊離剤の有効性を決定した。この値が０に近いほど、遊離効果が高い。この基準によれば、Ｊ欄の結果からわかるように、３種類のアニス酸剤はすべて、対照より良好なMPA遊離を示した。このように、これら３種類のアニス酸剤はすべてMPA測定に対するNHPの効果を軽減または排除し、総MPA量が測定されていることを示した。
さらに、ANSは遊離剤として機能することができるが、アニス酸の構造異性体がバックグラウンド吸光度に殆どもしくは全く影響しないのに対して、ANSはバックグラウンド吸光度に有害な寄与をする（Ｃ欄とＤ欄）ことがわかる。また、ANSを含む試薬Ａは光にさらすと可視的に退色することがわかった。これは対照やアニス酸試薬では起こらなかった。
４つの薬剤はすべて、陰性速度および／または速度幅に、対照値と比べて、有害でないか、または許容できる影響を示した。このことは、これらの薬剤がNHPのマトリックス効果を軽減するという効果以外の効果を持っていることを示した。ANSでは速度幅が最も大きく増大した。アニス酸類では陰性速度が対照より著しく増大したが、ANSは殆どもしくは全く影響を与えなかった。アニス酸を含まない試薬に比べて陰性速度にはこれらの影響があるものの、緩衝液とNHPに関して陰性速度は同じだったので（Ｅ欄とＧ欄を参照）、検定の実施に対する影響はないようだった。o-アニス酸では極めて良好な検定感度が得られた。
要約すると、この研究の結果は、上記３つのアニス酸がすべて遊離剤として良好に機能し、o-アニス酸が陰性速度に対する効果が少ないという理由でそのメタおよびパラ異性体よりいくらか良い結果を示すことを明らかにした。これらの結果は、ANSが吸光度の増大や光にさらした時に退色するなど、いくつかの実施上望ましくない影響を持つことを示した。ANSは、試薬Ａ中に0.25mMという比較的低レベルでさえバックグラウンド吸光度に有意な寄与を持つので、検定での使用、特に吸光度極大を持つ検定での使用が制約される。
アニス酸異性体は、吸光度または光照射による退色に対してこれらの効果を示さず、非タンパク質マトリックス（緩衝液）とNHPにおけるMPAの速度が等価もしくはほぼ等価であることからわかるように、いずれもNHPからのMPAの遊離に有効だった。これらの薬剤がない場合、緩衝液中のMPAはNHP中の同じ濃度のMPAよりも高い速度（より多い見かけ上のMPA）を与える。オルト異性体は陰性速度に対する影響がもっとも小さい。さらに、o-アニス酸は無タンパク質マトリックス中でもNHPでもMPAを等しく定量することがわかった。
実施例３
遊離剤としてのサリチル酸
別個の試験として、もう１つの薬剤サリチル酸（2-ヒドロキシ安息香酸）を試薬Ａ中に12.5mMおよび25mMで処方した。この薬剤は、遊離剤なしの対照と比べて、緩衝液速度幅を47％減少させ、陰性速度を38％増大させた。速度は実施例２に記載の方法と同様の方法で決定した。また、25mMサリチル酸では、340nmで対照バックグラウンドより0.311吸光度単位高くなった。サリチル酸の試薬Ａ調製物がわずかにピンク色の色合いをもったことも注目される。この可視色と340nmにおけるバックグラウンド吸光度は、Merck Index（第11版，Merck & Co., Inc.,ニュージャージー州ローウェイ）の8300頁に報告されているように、サリチル酸とごくわずかな第二鉄塩との相互作用によるのだろう。サリチル酸はこれらの実験結果ゆえに、より詳細な比較試験から除外した。
実施例４
同時投与薬物およびサリチル酸の存在下でのMPA速度に対するo-アニス酸の効果
別個の試験として、MPA血漿スパイクの速度に対するサリチル酸塩の影響を排除するo-アニス酸の能力を比較した。２組の抗体試薬（試薬Ａ）を上記実施例２に記載の基本的処方で調製した。一方の試薬には遊離剤を加えなかった。他方の試薬にはo-アニス酸を12.5mMの濃度で加えた。共通の試薬Ｂを実施例２に記述したように調製した。
血漿中の４種類のレベルのMPAスパイクと血漿対照について、各試薬セットを用いて速度を測定した。非干渉性の同時投与薬物を含む血漿で同様の一組の血漿スパイクを調製し、非干渉性薬物とサリチル酸塩とを含むもう一組の血漿スパイクを調製した。非干渉性薬物の濃度はμg/mLの単位で次に示すとおりである：アンピシリン，36；セファクロル，26；クロラムフェニコール，64；トリメトプリム，２；アルブテロール，７；イソプロテレノール，18；メトプロロール，77；ジルチアゼム，28；ニフェジピン，22；ベラパミル，12，フェノプロフェン，16；インドメタシン，36；ケトコナゾール，75；ミコナゾール，106；イソニアジド，120；5-フルオロウラシル，23；グリセオフルビン，10；メトトレキサート，２；ジフェンヒドラミン，93；dl-エフェドリン，103；フェニレフリン，76；ジソピラミド，52；プロカインアミド，64；メトクロプラミド，５；ナイアシン，25；ナイアシンアミド，47;アセトアミノフェン，87；およびリドカイン，43。サリチル酸塩は659μg/mLの濃度で存在した。
速度は、吸光度測定枠をサイクル20（この時点で検定を終了した）まで延長した点を除いて、上記実施例２に記述したように測定した。速度は、サイクル11からサイクル20までの10個の連続する吸光度測定値を用いて決定した。その結果を表３に要約する。
0003706895.tif 000014
要約すると、サリチル酸塩は遊離剤の不在下に正常ヒト血漿中のMPAの速度を増大させた。これは検定においてMPAの不正確な定量をもたらしうる。遊離剤としてo-アニス酸が抗体試薬中に存在すると、MPAの検定におけるこの潜在的問題が排除された。
上述の考察には、本発明に関わる機構に関して一定の理論が含まれている。本発明が上記の結果を達成したことは立証されているのだから、これらの理論はいかなる点でも本発明を制限すると見なすべきでない。
上述の説明と実施例は、本発明をその好ましい態様を含めて完全に開示している。当業者にとって自明な上記方法の改良は、下記の請求の範囲に包含されると解される。