(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの肝細胞増殖因子を免疫原として得られヒト肝細胞増殖因子に特異反応性を有するモノクローナル抗体を用いて、血液中の肝細胞増殖因子を免疫測定法により測定して、血栓症を検出することを特徴とする血栓症の検出方法。
【請求項２】
血栓症が脳血栓症である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ヒトの肝細胞増殖因子を免疫原として得られヒト肝細胞増殖因子に特異反応性を有するモノクローナル抗体を必須成分として含有することを特徴とする、血液中の肝細胞増殖因子を免疫測定法により測定して血栓症を検出するための血栓症診断剤。
【請求項４】
血栓症が脳血栓症である請求項３に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト肝細胞増殖因子に対するモノクローナル抗体を免疫測定法に利用して血栓症を検出する方法及び該方法に利用される血栓症診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血栓症とは、血液の性状変化、血流のうっ滞、血管壁の変化等により、心臓又は血管内で血液が凝固し、血流が止まり、その血管等で養われている部分に生じる病変をいう。その原因は動脈硬化であることが多く脳血栓症や心筋梗塞がその極めて重要な疾患である。
【０００３】
しかして、上記血栓症の最も代表的な一つである心筋梗塞につき詳述すれば、そのうち、急性心筋梗塞は、その基本的病変として、冠状動脈の比較的近位部に粥状硬化が生じている部分において粥腫が崩壊し、その内容物が血管内に一部流出し、内膜面が不安定状態になり、そこに続発的に血栓が形成され、本来あった狭窄と相まって比較的容易に内腔閉塞が生じるものと考えられている。また、上記血栓ができれば、そこにＴＸＡ2（トロンボキサンＡ2）が形成され、それがまた血小板凝集を惹起し、一方、冠状動脈の攣縮（スパスム）を生じさせることが知られており、この悪循環が上記心筋梗塞や狭心症の基本的な病態をなすとも考えられている。
【０００４】
急性心筋梗塞がＣＣＵにて治療されるようになり、心電図モニターや心肺蘇生術の導入、抗不整脈薬や心臓ペースメーカーの応用等が急性期死亡率の減少に大きく貢献した。また、近年急性期死亡の大部分を占める急性心不全、あるいはショック症候群に対しても、より効果的な治療法開発のための努力がなされている。
【０００５】
心筋梗塞に伴う急性心不全に対してより合理的且つ有効な治療を行い、虚血の進展を予防しつつ心機能の維持、改善を図るには、まず個々の梗塞例における血行力学的障害の程度を正しく把握することが必要であり、また心筋障害の推移をモニターしつつ、変遷する障害の程度に応じて適切な治療法を選択する慎重さが要求される。
【０００６】
最近まで、心筋梗塞剖検症例での冠動脈血栓頻度が２１％から９７％と研究者により著しい差が見られる故に、両者の因果関係について議論が絶えなかった。それは、当然のごとく検索対象及び方法上に差があることは勿論のこと、臨床的な意味での心筋梗塞と剖検上形態学的に確認されたそれとのギャップ、更に病理学的にも種々の梗塞型があること等が絡み合っての結果であると推考される。
【０００７】
しかしながら、最近になって、急性心筋梗塞に対する積極的な臨床的診断法・治療法の開発によりこの議論には終止符が打たれようとしている。即ち、ドウッド（DeWood）らによると、発症後２４時間以内の５１７例の貫壁性心筋梗塞例での冠動脈造影等による臨床的検索で、冠動脈血栓が７３％に認められ、６時間以内例では８０％、６〜１２時間例では５９％、１２〜２４時間例では５４％であり、冠動脈血栓溶解療法の広い応用の妥当性をも含めて、心筋梗塞発症因子としての冠動脈血栓の重要性が改めて認識されている。
【０００８】
急性心筋梗塞の発症に伴って、壊死心筋より血中に流出する物質、特に心筋逸脱酵素をとらえて生化学的診断を行うという試みは、心筋梗塞時に血清中のＧＯＴ（glutamic oxaloacetic transaminase）、ＬＤＨ（lactic deydrogenase）等が上昇することを、１９５４年にカーメン（karmen）らが初めて報告したことに始まる。その後、ＨＢＤ（α-hydroxybutyrate dehydrogenase）、ＣＰＫ（creatine phosphokinase、国際呼称：creatine kinase, CK）等の酵素の上昇が知られるようになり、臨床診断に広く応用されている。
【０００９】
しかしながら、診断確度の向上と重症度の推定のためには、更に改善が求められ、ＣＰＫアイソザイムであるＣＰＫ−ＭＢや構造蛋白であるミオシン軽鎖等の測定が行われるようになってきている。
【００１０】
ＧＯＴは心臓と肝臓に最も多く含まれている酵素であり、更に、骨格筋、腎、膵臓等にも存在する。ＧＯＴの上昇は心筋梗塞の診断には欠かせないが、肝疾患との鑑別が問題となることがある。最高値は１２〜３０時間後に出現し、３〜５日間上昇する。しかしＧＯＴは肝炎、肝鬱血、外科手術でも上昇することから、之を指標とする心筋梗塞診断の特異性は低い。
【００１１】
ＬＤＨは腎、心臓に最も多く含まれているが、骨格筋、赤血球、膵、脾、肝、脳、肺にも広く分布するため、ＧＯＴと同様に他疾患との鑑別が必要である。ＬＤＨはＧＯＴと同様に９０％以上の症例で上昇するが、肝臓、骨格筋、赤血球にも多く含まれるため、同様に特異性が低い。
【００１２】
ＨＢＤはＬＤＨアイソザイムの内、α−hydroxybutyrateに親和性の高い分画で、ＬＤＨ1、ＬＤＨ2とほぼ同様の酵素であり、心筋に対する特異性が高い。ＨＢＤ／ＬＤＨ比が０．８１以上の時は心筋梗塞の可能性が高いといわれている。
【００１３】
ＣＫは骨格筋に最も多く、次に心臓、脳、腸管、胃の順に多く含まれているが、肝、腎、血液には殆ど含まれていないことより、之を指標とする検査は、心筋梗塞の診断に最も特異的な検査法と考えられ、梗塞サイズの推定も可能である。該ＣＫは心筋梗塞の診断以外で、筋肉注射、電気ショック、外科手術、心原性ショック等で上昇をきたし問題となるが、之等の場合、ＣＫのアイソザイムであるＣＫ−ＭＢを測定することにより、鑑別可能である。
【００１４】
上記ＣＫのアイソザイムには、ＭＭ、ＢＢ、ＭＢの３つが知られていて、ＭＭは骨格筋、ＢＢは脳、ＭＢは心筋にそれぞれ特異的である。心筋には、１０〜４０％のＣＫ−ＭＢが含まれ、残りがＣＫ−ＭＭであるが、骨格筋のＣＫ−ＭＢの含量は３％以下である。ＣＫの上昇が見られる場合、成人では、総ＣＫ値に対してＣＫ−ＭＢが５％以上あれば心筋由来と考えてよいといわれている。
【００１５】
しかしながら、該ＣＫの値は、測定法と測定用の分析器によって大きく異なり、同一サンプルを測定しても、施設間の測定値の差はときに４倍程度にもなることが知られており、それ故、異なる施設で測定された値を比較することはできない欠点がある。
【００１６】
上記のように心筋梗塞を始めとする血栓症を簡便に、より確実に検出する方法は、いまだなく、かかる検出法の確立が斯界で要望されている。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は上記斯界で要望されている血栓症の検出法を確立することにある。
【００１８】
本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、ヒトの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を免疫原として得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノクローナル抗体を利用して、例えば患者血清中のＨＧＦを測定するときには、測定値がよく血栓症を反映することを見いだし、ここに本発明を完成するに至った。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、ヒトＨＧＦを免疫原として得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノクローナル抗体を用いて、血液中のＨＧＦを免疫測定法により測定して、血栓症を検出することを特徴とする血栓症の検出方法、及びヒトＨＧＦを免疫原として得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノクローナル抗体を必須成分として含有することを特徴とする血栓症診断剤が提供される。
【００２０】
本発明は、心筋梗塞や脳血栓で代表される血栓症患者の検出、特に早期診断を初めて可能としたものであり、その臨床的価値は非常に高い。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に利用するモノクローナル抗体及び該抗体の利用による免疫測定法につき順次詳述する。
【００２２】
本発明に利用する抗体は、ヒトＨＧＦを免疫原として得られ、ヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノクローナル抗体より適宜選択することができる。ここで免疫抗原として利用されるヒトＨＧＦは、ヒト由来の天然のＨＧＦである必要はなく、遺伝子工学的手法により得られる組み換え型ＨＧＦやそれらの部分構造を有する同効物（断片）であってもよい。また上記ＨＧＦやその断片をハプテンとして利用して、通常の免疫抗原の製造技術に従って之等を結合試薬により担体と結合させて得られるものも利用することができる。之等は適当なヒト細胞等より別途単離、調製してもよく、また公知のものを適宜入手、利用することもできる。
【００２３】
之等を免疫抗原として利用した所望モノクローナル抗体の製造は、より具体的には、例えば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハイブリドーマ、hybridoma)を作成し、これより所望のＨＧＦを認識する抗体（モノクローナル抗体）を産生するクローンを選択し、該クローンを培養することにより実施できる。かかるモノクローナル抗体の製造は、基本的には常法に従うことができる〔例えばHanfland,P., Chem.Phys.Lipids, 15, 105 (1975) : Hanfland,P., Chem.Phys.Lipids, 10, 201 (1976) : Koscielak,J., Eur.J.Biochem., 37, 214 (1978)等参照〕。
【００２４】
該方法において、免疫抗原で免疫される哺乳動物としては、特に制限はないが細胞融合に使用される形質細胞腫細胞との適合性を考慮すれば、一般には、マウス、ラット等が有利に用いられる。免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与することにより実施できる。より具体的には、例えばマウスの場合、免疫抗原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）や生理食塩水等で適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５００μｇ／マウス程度になるようにするのが好ましい。上記アジュバントとしては、百日咳ワクチン、完全フロインドアジュバント、アラム等を好ましく利用できる。また免疫抗原としては、上記最終投与の約３日後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。
【００２５】
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、例えばｐ３／×６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Nature, 256, 495-497 (1975) 〕、ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）〔Current Topics in Microbiology and Imunology, 81, 1-7 (1978)〕、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）〔Eur. J．Immunol., 6, 511-519 (1976) 〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）〔Nature, 276, 269-270 (1978) 〕、ＦＯ〔J. Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980) 〕等や、ラットにおける２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）〔Nature，277, 131-133 (1979) 〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。
【００２６】
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Milstein）らの方法〔Method in Enzymology, 73, 3 (1981)〕等に準じて行なうことができる。より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもできる。また、電気処理（電気融合）による方法等を適宜採用することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通である。融合反応時の培地としては、上記形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを例示でき、通常之等培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加して遠心分離し、上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリドーマが形成される。
【００２７】
得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。
【００２８】
目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法〔Engvall,E., Meth.Enzymol.,70, 419-439 (1980)〕、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー（uchterlony ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第30-53 頁、昭和５７年３月５日〕に従い実施することができ、この検索には前記免疫抗原が利用できる。
【００２９】
かくして得られるＨＧＦを認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存することができる。上記ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養してその培養上清として得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００３０】
上記方法に従い得られる抗体産生ハイブリドーマ培養上清やマウス腹水は、之等をそのまま粗製抗体液として用いることができ、また之等は常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とすることができる。特に好ましい、上記モノクローナル抗体の一具体例としては、例えば特公平５−６０３５９号公報記載のものを例示することができる。
【００３１】
次いで、本発明の血栓症検出のための免疫測定法につき詳述すれば、これは、例えば通常の酵素免疫検定法としてのサンドイッチ法等に従うことができ、また通常の競合法、サンドイッチ法等によるＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、凝集法等に従うこともできる。之等各方法の操作、手順等は常法に従うことができる。
【００３２】
殊に本発明方法は、ＨＧＦモノクローナル抗体を用いた３ステップサンドイッチ法によるのが、高感度であり好ましい。この方法は、例えば代表的には以下の如くして実施される。即ち、９６ウェルプレート等の適当な担体に固相化させたＨＧＦモノクローナル抗体を第１抗体として用い、これとＨＧＦ標準溶液及び測定物質（実験サンプル等の検体）とを、室温にて一夜静置反応させ〔第１ステップ〕、次いで、第２抗体としての抗ＨＧＦ家兎血清（家兎抗ＨＧＦポリクローナル抗体）を上記プレートに加え、室温で２時間程度反応させることにより、該第２抗体と第１ステップでの反応物（モノクローナル抗体と被測定物質との反応物）とを反応させ〔第２ステップ〕、更に酵素標識抗家兎ＩｇＧ抗体等の標識抗体の一定量を、上記第２ステップでの反応物（モノクローナル抗体と被測定物質と第２抗体との反応複合体）と室温にて２時間程度反応させ〔第３ステップ〕、次いで上記第３ステップで得られた反応複合体と標識抗体との結合体から非結合標識抗体を分離除去した後、発色溶液を加えて発色反応させ、２Ｎ硫酸にて発色反応を停止させ、得られる発色反応液の吸光度を測定することにより実施される。かくして検体中のＨＧＦを定量することができる。
【００３３】
上記において、用いる各抗体の固相化（不溶化）は、常法に従い之等の抗体を不溶性担体に物理的又は化学的に結合させることにより実施できる。上記不溶化のための担体としては、例えばポリスチレン、セファデックス、イオン交換樹脂、プラスチックチューブ、アミノ共重合体等を使用でき、不溶化は共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学反応、或はイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法、ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法等によって行なうことができる。
【００３４】
上記ポリクローナル抗体としては、ＨＧＦを認識するものである限り、特に限定はなく、前記した本発明抗体もしくは該抗体の製造において開示した免疫抗原を哺乳動物に投与して生体内に産生される抗血清を利用でき、これは常法に従い採取できる。
【００３５】
また、上記において標識に用いられる標識抗体としては、公知のものでよく、例えば既に市販のマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ等の動物に免疫して得られる抗血清を、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、酸性ホスファターゼ等で酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体、即ち、ＰＯＤ標識抗家兎ＩｇＧ抗体、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体等を使用することができる。この酵素標識は、常法に従って実施できる。
【００３６】
本発明検出法において、検体としては、例えば血清もしくは血漿形態の血液が好ましいが、他に細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、膵臓液、骨髄液、唾液等の各種体液を用いることもできる。また、上記血漿は、クエン酸血漿、ＥＤＴＡ血漿、メシル酸ナフアモスタット血漿等であってもよい。
【００３７】
上記測定系に利用される溶媒としては、反応に悪影響を与えない通常の各種のものをいずれも利用でき、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５．０〜９．０程度の緩衝液の利用が好ましい。尚、本発明においては、上記溶媒に、約０．１〜３０ｗ／ｖ％程度の血清（測定対象のＨＧＦが含まれていないもの）及び／又は約０．１〜２Ｍ程度のＮａＣｌを含ませるのが、上記検定法の目的により合致していて好ましい。
【００３８】
免疫検定の際の免疫反応条件は、特に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものとすることができる。一般には約４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程度の温度条件下に、約１〜８０時間程度を要して免疫反応を行なえばよい。
【００３９】
本発明検出法では、免疫反応終了後の固相−液相（前記３ステップサンドイッチでの反応複合体と標識抗体との結合体−非結合標識抗体）の分離を、例えば遠心分離、濾別、デカンテーション、洗浄等の通常の方法により行なうことができる。
【００４０】
またかくして分離された各物質の酵素標識活性の測定は、使用した酵素の種類に応じて、公知の各種方法に従い実施することができる。その際用いられる発色溶液としては、通常のもの、例えばパーオキシダーゼを用いる場合には、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）等を用いることができ、発色反応の停止も常法に従い例えば反応液に１〜４Ｎの硫酸等の適当な酵素活性阻害剤を添加することにより実施できる。
【００４１】
かくして、本発明方法によれば、検体中のＨＧＦを高精度、高感度をもって、しかも簡便な操作で定量でき、これによって血栓症を検出することができる。
【００４２】
即ち、健常人のＨＧＦ値は平均０．１９±０．０５ｎｇ／ｍｌであり、男女間での有意差は認められず、劇症肝炎での平均値は１０．１７±２４．７７ｎｇ／ｍｌであり、劇症肝炎「亜急性型」と類似の病態を呈する亜急性肝炎での平均値は２．７１±２．５２ｎｇ／ｍｌであり、更に急性肝炎（０．４０±０．１６ｎｇ／ｍｌ）、慢性肝炎（０．３５±０．１６ｎｇ／ｍｌ）、肝硬変（０．６０±０．３５ｎｇ／ｍｌ）、肝ガン（０．５６±０．３６ｎｇ／ｍｌ）等は低値を示すのに対して、本発明方法に従い測定された心筋梗塞患者の結果によれば、該患者では１６．３９±１６．０５ｎｇ／ｍｌと高値を示し、しかもこの値は約１５時間持続し、２日後でもなお１．９１±１．７２ｎｇ／ｍｌであった。また、本発明方法によれば、上記心筋梗塞患者に限らず、各種血栓症患者でも、略同様の高値を示した。
【００４３】
これらのことから、本発明方法によれば、血栓症患者の検出が行い得ることは勿論のこと、心筋梗塞患者において、発作後時間の経過した症例の場合も容易にその診断が可能であり、各種血栓症の診断、予後の経過の観察をも行い得る利点のあることが明らかとなった。
【００４４】
本発明はまた上記免疫測定に適した血栓症診断剤をも提供する。
【００４５】
該診断剤は、ＨＧＦモノクローナル抗体を必須の試薬成分として含有し、他に例えば前記３ステップ法を例にとれば、標識抗体や第２抗体を含有することができる。該診断剤中のモノクローナル抗体試薬中には、例えばグリセロールや牛血清蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加存在させることもできる。この抗体試薬は、好ましくは凍結乾燥したものであるのがよく、診断剤中には水溶性もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることもできる。更に抗体試薬には再構成された試薬系を一定のｐＨに保つための緩衝液や試料が悪化するのを防止するための保存剤及び／又は安定剤を配合することができる。緩衝液としては本測定法を実施する際にｐＨを約５．０〜９．０とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は、好ましくは水を含んだものであるが、該水の一部又は全部を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。この水と混和し得る溶媒としては、よく知られている例えばグリセリン、アルコール類、グリコールエーテル類等を例示できる。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、心筋梗塞や脳血栓等の血栓症の診断、検出、特に早期診断の可能な診断剤及び検出法が提供される。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明は之等に限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１】
心筋梗塞患者の検出
３０分以上続く胸痛、心電図上２つの誘導異常でのＳＴの０．１ｍＶ以上の上昇及び血清中のＣＰＫの上昇をもとに心筋梗塞と判断された患者９名について、胸痛発症後、３、９、１５、２４及び４８時間後にそれぞれ採血し、得られた血清中のＨＧＦを次の通り測定した。
【００４９】
即ち、９６ウェルの抗体プレートの各ウェルに、洗浄液３５０μｌを加えて３回洗浄し、ペーパータオルの上に載せて充分に水分を取り除いた。次に各ウェルにリン酸緩衝液５０μｌを加え、更にＨＧＦ標準液又は上記検体５０μｌをそれぞれ加え、シールで密封した後、シェーカーで振盪しながら室温（２５℃）で１時間反応させた。反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄した。洗浄後、第１抗体（抗ＨＧＦモノクローナル抗体）を１００μｌずつ各ウェルに加え、シールで密閉した後、シェーカーで振盪しながら室温（２５℃）で１時間反応させた。反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄した。次に、第２抗体液（抗ＨＧＦポリクローナル抗体、ウサギ）を１００μｌずつ各ウェルに加え、シールで密閉した後、シェーカーで振盪しながら室温（２５℃）で１時間反応させた。反応液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄した。洗浄後、各ウェルにＯＰＤ基質液を１００μｌずつ加えて、室温（２５℃）で１０分間反応させた。この反応液に反応停止液１００μｌを加えて反応を停止させ、マイクロプレート用吸光度計を用いて波長４９２ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。
【００５０】
上記の結果を下記表１に示す。
【００５１】
【表１】
0003682571.tif 000002
【００５２】
該表より、本発明ＨＧＦモノクローナル抗体を利用したＥＬＩＳＡ系によって、心筋梗塞患者の検出を行い得ることが明らかである。
【００５３】
【実施例２】
雄ラット（２５０〜３００ｇ）をペントバルビタールナトリウムで麻酔させ、開胸後、左冠動脈走行部を結紮し、１時間の虚血の後に再灌流して心筋梗塞を惹起させ、結紮後１時間、再灌流後１，３，６，１２及び２４時間後に、血漿を採取し、特殊免疫研究所社製のラットＨＧＦ  ＥＩＡキットにより、ＨＧＦの測定を行なった。
【００５４】
結果（ｎ＝３の平均±ＳＥ）を、下記表２に示す。
【００５５】
【表２】
0003682571.tif 000003
【００５６】
尚、表２には、結紮、再灌流を行わなかったコントロールの同測定値を併記する。
【００５７】
表２より、ラット心筋梗塞モデルにおける血漿ＨＧＦ量は、再灌流３時間後という非常に早期において、その最大値を示し、この測定によって、心筋梗塞の検出、早期診断を行い得ることが明らかとなった。
【００５８】
【実施例３】
この試験には、ラット頚動脈内皮細胞を剥離し狭窄を加えることで血栓を形成させた血栓モデル（ＳＩＡＴモデル）を使用した〔Circulation Research, Vol.77, No.2, August 1995, pp.310-316〕。
上記施術前（Ｐｒｅ）、施術（内皮細胞剥離＋狭窄処置）１５分後、６０分後及び１２０分後に、各ラット（１群４〜５匹）の血漿ＨＧＦ量を、特殊免疫研究所社製のラットＨＧＦ  ＥＩＡ測定キットにより、測定した。
【００５９】
また、各ラットにつき、頚動脈１３ｍｍ当りの処置血管重量（Ｌ）及び無処置血管重量（Ｒ）をそれぞれ求め、下式に従って血栓重量（ｎ＝５の平均±ＳＥ）を算出した。
【００６０】
血栓重量（ｍｇ／１３ｍｍ，平均±ＳＥ）＝〔Ｌ−Ｒ〕
かくして得られた結果を、下記表３に示す。
【００６１】
【表３】
0003682571.tif 000004
【００６２】
表３より、血栓症モデルラットの血漿ＨＧＦ量と血栓重量とは、よく相関しており、従って、血漿ＨＧＦ量の測定によって、血栓症の検出、診断が可能であることが判る。