(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有することを特徴とする新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ。
作用：非還元末端にあるβ−グルコシド結合に作用し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離する。
基質特異性：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド（Km値0.101 mM），ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド（Km値0.114 mM）至適ｐＨ：７．１
安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．５（３０℃で１時間）
至適温度：４３℃
熱安定性：３７℃まで１００％活性保持（ｐＨ７．１で１時間）
分子量：２４０ｋＤａ〜３２０ｋＤａ（ゲルろ過法）
酵素阻害物質：Ｚｎ2+、Ｃａ2+、Ｆｅ2+
酵素活性化物質：Ｃｕ2+
【請求項２】
ビブリオ属細菌P2K-5菌株（FERM BP-5769）を培養し、培養物から請求項１に記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを採取することを特徴とする、請求項１に記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ生産菌、該微生物を用いてβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを製造する方法並びに新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ−１，４−結合した多糖であるキチンを加水分解して得られる単糖が変形性関節症の改善、治療薬として有用であることが注目され、来るべき高齢化社会に備えるべく、キチナーゼとともにキチンを分解してＮ−アセチルグルコサミンを製造するために有用なβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を持つ酵素の工業的な供給が求められている。
【０００３】
また、近年の研究によって、生体内では糖脂質および糖タンパク質が多く存在し、β−グルコシド結合を含む糖鎖が重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。そこで、これらの糖鎖の構造解析が注目され、β−グルコシド結合を切断し単糖を遊離するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの提供が求められている。
【０００４】
一方、人間には強力なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼがあることは知られているが、医学あるいは工業等で利用できる酵素については、まだ研究が始められたばかりであり、現在研究用として低ユニットでしかも高価格のアスペルギルス（カビ）由来酵素と大腸菌による遺伝子組み換え酵素があるのみである。これらの酵素は酸性側に活性域があり、また低温では作用しない。従って、低温でも活性を有し、中性域で活性の強い酵素の提供が望まれている。また、キチンの有効利用に関しては、現在カニ、エビの甲殻を水酸化ナトリウム溶液内で熱処理しタンパク質を除去後、塩酸で灰分を除いて得られたキチンを、限定塩酸加水分解法によって低分子化してＮ−アセチルグルコサミンを得ている。あるいはキチンを完全酸分解して得られるグルコサミンのアセチル化によって製造される。いずれの方法においても、装置また廃水の処理に多大な費用を要するという欠点を有し、さらに食品分野で用いるためには化学合成法を避けたい要求がある。そこで、基質特異性により目的とする箇所のみに作用するため副生物が少なく、また常温、中性付近の温和な反応条件を有するためコストの軽減も期待されるβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる酵素的製造法が求められているが、未だ酵素の生産技術は確立されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ生産菌、該微生物を用いてβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを製造する方法並びに非還元末端にあるβ−グルコシド結合に作用し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離する新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、海洋低温細菌であるビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属についてキチン分解酵素の生産を鋭意研究した結果、該微生物が作用温度域が広く安定性の高いβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を持つ酵素を生産する事を見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の微生物、製造法および酵素を提供するものである。
項１．ビブリオ属に属するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ生産菌。
項２．前記微生物がビブリオ属細菌Ｐ２Ｋ−５菌株又は当該菌株と同一な菌学的性質を有する微生物である項１記載のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ生産菌。
項３．項１または２に記載の微生物を培養し、培養物からβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを採取することを特徴とするβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法。
項４．以下の特性を有することを特徴とする新規なβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ。
Ｋｍ値：０．１０１  ｍＭ（基質：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド）
０．１１４  ｍＭ（基質：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド）
至適ｐＨ：７．１
安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．５（３０℃で１時間）
至適温度：４３℃
熱安定性：３７℃まで１００％活性保持（ｐＨ７．１で１時間）
分子量：２４０ｋＤａ〜３２０ｋＤａ（ゲルろ過法）
酵素阻害物質：Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋
酵素活性化物質：Ｃｕ２＋
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ生産菌として使用可能な微生物は、ビブリオ属に属し、該β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの生産能を有するものであれば、いずれも使用することができる。好ましくは、本発明者らが房総沖日本海溝の深層水から分離したビブリオ属に属する海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）並びに該菌株と同一な菌学的性質を有しβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの生産能を備えた微生物を例示することができる。ここで、同一な菌学的性質とは下記に示した菌学的性質が同一であればよく、その他の菌学的性質の一致、不一致は問わない。
【０００９】
前記Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）の菌学的性質は、下記の通りである。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９として寄託されている。
１．形態的性質
（１）細胞形態  ：稈状（ｒｏｄ）
（２）鞭毛形態  ：極べん毛
２．生理的性質
（１）増殖温度
４℃：＋
２５℃：＋
３０℃：＋
（２）Ｏ−Ｆテスト：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ
（３）塩類要求性  ：＋
（４）色素生産    ：−
（５）オキシダーゼ：＋
（６）カタラーゼ  ：＋
（７）グラム染色：陰性
（８）発光性：−
（９）増殖ｐＨ：６〜９
３．分離源：房総沖日本海溝の水深６０００ｍの海水
上記菌学的性質の試験方法は、主として絵面良男：沿岸環境調査マニュアルＩＩ〔水質・微生物篇〕（日本海洋学会編、恒星社厚生閣、ｐ．３５７−３６４（１９９０））に従った。また、駒形和男：微生物の分類と同定（下）（改訂版、長谷川武治編著、学会出版センター、ｐ．９９−１６１（１９８５））を参考にした。
【００１０】
以上の菌学的性質を、絵面と清水の海洋細菌の簡易同定図式（沿岸環境調査マニュアルＩＩ〔水質・微生物篇〕、日本海洋学会編、恒星社厚生閣、ｐ．３５７−３６４（１９９０））に基づき、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒ，  １９８４）及びＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第９版、Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，  Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ，Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ，  Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒ，  １９８４）を参考にして対比した結果、本海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）は、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する菌株と同定された。
【００１１】
この海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）を用いて、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを生産するには、当該菌体を適当な培地に接種し、好ましくは誘導物質の存在下で常法に従って培養すればよい。この誘導物質としては、キチン、変成キチン、キチン分解物、キチン誘導体を単独又はこれらのうち２種以上を組み合わせたものを使用できる。誘導物質は、０．１  ｇ／ｌ以上、好ましくは１〜５０  ｇ／ｌの濃度で培地中に加える。培地としては通常の培地が用いられる。例えば、炭素源としてグルコース、マルトース、キシロース、スクロース、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の有機窒素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素が例示できる。また誘導物質を炭素源、窒素源としてもよい。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用できる。上記培地のｐＨは、適当な酸または塩基を加えることにより、好ましくは６．５から８．５の範囲内に調整され、オートクレーブにより殺菌される。培養温度は、５〜３５℃、好ましくは２０から２８℃で２０〜７２時間好気的に振とうまたは撹拌しながら培養を行う。また上記の炭素源、窒素源、無機塩、及び寒天を適宜含む平板培地を使用し、培養温度５〜３５℃、好ましくは２０から２８℃で２０〜１２０時間培養を行う。また、本菌の培養は、静置でも行われる。
【００１２】
培養によって得られた培養物から培養液と菌体とを分離する方法としては、従来から行われている遠心分離法やろ過等の方法が使用できるが、遠心分離法が好適である。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出する方法としては、従来から行われている超音波による菌体破砕、あるいはガラス・ビーズとともに回転させるダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取することができる。
【００１３】
これらの方法で抽出された粗酵素液からβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼをさらに精製する必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、調製用電気泳動法等を適宜組み合わせることによって、精製を行うことができる。
【００１４】
上記のようにして得られた本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、以下の理化学的性質を有する。
（１）作用：非還元末端にあるβ−グルコシド結合に作用し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離する。各反応でのＫｍ値は、
基質  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド：０．１０１  ｍＭ
基質  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド：０．１１４
ｍＭ
なお、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドには反応しない。
（２）至適ｐＨ：７．１
（３）安定ｐＨ範囲：５．０〜９．３（３０℃で１時間）
（４）至適温度：４３℃
（５）熱安定性：３７℃まで１００％活性保持（ｐＨ７．１で１時間）
（６）分子量：２４０ｋＤａ〜３２０ｋＤａ（ゲルろ過法）
（７）酵素阻害物質：Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋
（８）酵素活性化物質：Ｃｕ２＋
なお活性は、以下の方法により測定した。
【００１５】
試験管に基質溶液（０．１５％）０．１  ｍｌ、及び０．１  Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）０．３  ｍｌを入れ３分間３０℃の恒温槽で予熱した後、酵素溶液０．１  ｍｌを加えて２０分間振とうする。その後、０．１  Ｍ    炭酸ナトリウム溶液３．５  ｍｌを加え、生成したｐ−ニトロフェノールをフェノレートとし、４００  ｎｍでの吸光度により測定する。なお酵素の１単位（ユニット）は、１分間に１  μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を表す。
【００１６】
従来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、酸性側に活性域があり、低温では作用しない。これに対し、本発明の酵素は低温でも活性を保持し、ｐＨ４．５〜１１近くまで活性を保持している。
【００１７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例１
シリコン栓（信越ポリマー）付き試験管中の１／２ＴＺ培地（Ａ．Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ａ．Ｍｉｔａ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ，  Ｊ．  Ｏｃｅａｎｏｇｒ．  ４９，  ３５３−３７６，１９９３）（成分（ｇ／ｌ）：ｐｏｌｙ  ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄａｉｇｏ）    ２．５、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）  ０．５、ＨＥＰＥＳ（Ｄｏｊｉｎ）  ４．７７、塩化ナトリウム  ２１．５３３、硫酸ナトリウム  ３．６０７、塩化カリウム  ０．６０９、炭酸水素ナトリウム  ０．１７６、臭化カリウム  ０．０８８、ホウ酸  ０．０２３、フッ化ナトリウム  ０．００３、塩化マグネシウム・６水塩  ９．７４７、塩化カルシウム・２水塩  １．３６８、塩化ストロンチウム・６水塩  ０．０２２）５  ｍｌに冷蔵保存菌Ｐ２Ｋ−５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）２００  μｌを植菌し、２５℃で終夜振とうした。その後、本培養液１  ｍｌをＭａｒｉｎｅ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）１００  ｍｌに加え、さらに２４時間振とう培養した。該培養液２５  ｍｌを、キチン粉末２０  ｇを含む１／２ＴＺ培地１  ｌに添加、２５℃で４８時間、好気的に振とう培養した。その後、培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離を行い、湿重量４０  ｇの菌体を得た。得られた菌体は、７０  ｍｌの生理食塩水にけん濁し、０℃で１０分間超音波処理（２０秒間作動、２０秒間休止）を行った後、１６０００×ｇで１時間遠心分離を行い、上清液を得た。この上清液中の活性をｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドを基質として測定した結果、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしての総活性は１７２ユニット、比活性は０．２４３ユニット／ｍｇ−タンパク質であった。
【００１９】
この粗酵素液を、予めリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）で平衡化した５０  ｍｌのＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ−Ｑ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（商品名、東ソー製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階的に塩化ナトリウムの濃度を変化させて目的酵素を溶出し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの総活性２９．０ユニット、比活性０．１７７ユニット／ｍｇ−タンパクを有する酵素画分を得た。
【００２０】
さらに上記の活性画分を、予め１．５  Ｍの硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（商品名、ファルマシア製）カラムに通し、目的とする酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、段階的にリン酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を変化させて目的酵素を溶出し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの総活性２５．７ユニット、比活性０．２８６ユニット／ｍｇ−タンパク質を有する酵素標品を得た。またこの活性画分を濃縮した後、０．１５  Ｍの塩化カリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ（商品名、ファルマシア製）カラムに添加、同緩衝溶液を用いて目的酵素を溶出し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの総活性８．６ユニット、比活性１．９１ユニット／ｍｇ−タンパク質を有する酵素画分を得た。
【００２１】
試験例１
実施例１で得られたβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしての比活性１．９１ユニット／ｍｇ−タンパク質の酵素標品を用いて、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とし、その濃度を変化させて反応の初速度を測定し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットからＫｍ値を求めた。その結果、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドには全く反応せず、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドの場合０．１０１  ｍＭ、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニドでは０．１１４  ｍＭの値が得られた。
【００２２】
試験例２
試験例１で用いた酵素標品を用いて、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の至適ｐＨ及びｐＨ安定性を以下の方法で調べた。
【００２３】
試験管にｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド溶液（０．１５％）０．１  ｍｌ、及びｐＨ緩衝液０．３  ｍｌを入れ３分間３０℃の恒温槽で予熱した後、酵素溶液０．１  ｍｌを加えて２０分間振とうする。その後、０．１  Ｍ    炭酸ナトリウム溶液３．５  ｍｌを加え、生成したｐ−ニトロフェノールをフェノレートとし、４００  ｎｍでの吸光度により測定した。ｐＨの調整には、６．５以下は酢酸塩緩衝液、９．１まではリン酸緩衝液、それ以上では０．１Ｍ塩化カリウムを含むリン酸−水酸化ナトリウム溶液を用いた。また、安定性に対するｐＨの影響は、酵素溶液０．１  ｍｌに各種緩衝液０．１  ｍｌを加えて所定のｐＨに調整し３０℃で１時間静置した後、ｐＨを７．１に再調整し３０℃で２０分間反応を行い、残存活性を測定した。
【００２４】
至適ｐＨ曲線及びｐＨ安定性曲線を図１に示す。
【００２５】
試験例３
試験例１で用いた酵素標品を用いて、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の至適温度及び熱安定性を以下の方法で調べた。
【００２６】
試験管にｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド溶液（０．１５％）０．１  ｍｌ、及びリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３  ｍｌを入れ３分間所定の温度で予熱した後、酵素溶液０．１  ｍｌを加えて２０分間振とうする。その後、０．１  Ｍ    炭酸ナトリウム溶液３．５  ｍｌを加え、生成したｐ−ニトロフェノールをフェノレートとし、４００  ｎｍでの吸光度により測定した。また、安定性に対する温度の影響は、酵素溶液０．１  ｍｌにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３  ｍｌを入れ、所定の温度に１時間静置した後、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド溶液（０．１５％）０．１  ｍｌを加えて３０℃で２０分間反応させ、残存活性を測定した。
【００２７】
至適温度曲線及び熱安定性曲線を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ＳＰ．Ｐ２Ｋ−５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６９）由来酵素のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の至適ｐＨ曲線及びｐＨ安定性曲線を示す。
【図２】同酵素のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の至適温度曲線及び熱安定性を示す。
【図１】
0003621985.tif 000002
【図２】
0003621985.tif 000003