(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウ−タウ会合を調整するかまたは阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）
ａ）固相に結合しているタウタンパク質またはタウコアフラグメントを有するその誘導体を、
ｂ）タウ−タウ会合を調整するかまたは阻害することができると推測される物質、および
ｃ）ａ）の固相タウタンパク質または誘導体と結合することができる液相タウタンパク質またはその誘導体と接触させる工程；ならびに
（ii）前記工程ｃ）の液相タウタンパク質または誘導体の、前記工程ａ）の固相タンパク質または誘導体への結合の阻害により示される、タウ−タウ結合の阻害を検出する工程；
を包含する方法。
【請求項２】
前記液相タウタンパク質または誘導体を標識する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識が、放射活性のまたは酵素的に検出可能な標識である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｃ）のタウタンパク質が、前記工程ａ）のタウタンパク質とは免疫学的に異なっていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）の固相タウタンパク質または誘導体に結合することができる液相タウタンパク質またはその誘導体が、Glu−391で終結している短縮型コアタウフラグメントである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
固相に結合しているタウタンパク質またはタウコアフラグメントを含むその誘導体が、Ala−390で終結する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記タウタンパク質の結合が、抗体によって検出されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
タウのチューブリンへの結合が、脱重合したチューブリン調製物または微小管調製物を、前記工程ｂ）およびｃ）で定義した化合物と接触させ、続いてタウ−チューブリン結合の検出により決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記固相への結合が、pH9〜pH10のアルカリ性緩衝液中で行われることを特徴とする、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タウ−タウ結合が、50〜400mMの塩化ナトリウム、または匹敵するイオン強度の塩もしくは塩混合物中で、pH4〜pH10の範囲のpHで行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記物質および液相タウタンパク質または誘導体を、前記固相タウタンパク質または誘導体と接触させる工程を、生理学的緩衝液条件で実施する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記タウタンパク質またはそのフラグメントの結合後の過剰な結合部位が、ブロッキング剤によってブロックされることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）コアフラグメントに相当し、Ala−390で終結している短縮型タウタンパク質を、タウ−タウ会合にとって好ましくない緩衝液条件下で固相上に接種し、
ｂ）チューブリンタンパク質を同じ緩衝液条件下で固相に接種し、
ｃ）完全長タウタンパク質を、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することができるがタウ−チューブリン会合は妨害しないと推測される物質と一緒に液相で添加し、そして
ｄ）タウ−タウ結合を、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを認識する抗体を用いて免疫化学的に検出する、
ことを特徴とする、タウ−タウ結合およびタウ−チューブリン結合の検出のためのELISAアッセイを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害するおよび／または凝集タウの細胞毒性を打ち消す物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）
ａ）タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体、またはタウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を発現することのできるベクターによってトランスフェクションされた細胞系を、
ｂ）前記物質と接触させる工程、および
（ii）前記細胞におけるタウ−タウ凝集の阻害および／または凝集タウに起因する細胞毒性の阻害もしくは打ち消しを検出する工程
を包含する方法。
【請求項１５】
タウ−タウ凝集もしくはその阻害、および／または細胞毒性の阻害もしくは打ち消しを、細胞生存率、細胞形態またはタウの細胞骨格分布により決定する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
タウの細胞骨格分布が、細胞の内因性微小管ネットワークへのタウタンパク質の取込みとして見られる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞系が線維芽細胞もしくはニューロン細胞系である、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞系が、線維芽細胞3T3、PC−12、もしくはNIE−115細胞系である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記タウタンパク質が短縮型タウタンパク質である、請求項14〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記短縮型タウタンパク質がコアタウユニットである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記タウタンパク質の発現が、構成的制御下にある請求項14〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記タウタンパク質の発現が、誘導制御下にある請求項14〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記タウタンパク質またはその誘導体が、リポフェクションにより細胞に導入される、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
タウ−MAP2会合を調整するかまたは阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）
ａ）固相に結合しているMAP2タンパク質を、
ｂ）タウ−MAP2会合を調整するかまたは阻害することができると推測される物質、および
ｃ）固相MAP2タンパク質に結合することができる液相タウタンパク質またはその誘導体と接触させる工程；ならびに
（ii）前記工程ｃ）の液相タウタンパク質もしくは誘導体の、前記工程ａ）のMAP2タンパク質への結合の阻害により示される、タウ−MAP2結合の阻害を検出する工程；
を包含する方法。
【請求項２５】
タウ−MAP2会合を調整するかまたは阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）
ａ）固相に結合しているタウタンパク質またはタウコアフラグメントを有するその誘導体を、
ｂ）タウ−MAP2会合を調整するかまたは阻害することができると推測される物質、および
ｃ）固相タウタンパク質またはａ）の誘導体に結合することができる液相MAP2タンパク質と接触させる工程；および
（ii）液相MAP2タンパク質の、前記工程ａ）の固相タウタンパク質もしくは誘導体への結合の阻害により示される、タウ−MAP2結合の阻害を検出する工程；
を包含する方法。
【請求項２６】
引き続き前記物質を、
（ｉ）毒性試験に付し、
（ii）医薬として製剤化する
ことを特徴とする、請求項１〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
下記式：
0003612078.tif 000024
（式中、
R1、R3、R4、R6、R7およびR9は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロアルキルまたはアルコキシから選択され；
R5、各R10および各R11は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロアルキルまたはアルコキシから選択される）
で示されるフェノチアジン化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、異常なタウ−タウもしくはMAP2−タウ会合または異常な神経フィラメント凝集の予防もしくは治療のための医薬組成物。
【請求項２８】
R1、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10およびR11が、独立して、水素、−CH3、−C2H5または−C3H7から選択される、請求項27記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記化合物が、式（Ｉ）で示されるフェノチアジンである、請求項27または請求項28に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
R5が、水素である、請求項29記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記化合物が、メチレンブルー、トルイジンブルーＯ、チオニン、AzureA、AzureBまたは1,9−ジメチル−メチレンブルーから選択される、請求項27記載の医薬組成物。
【請求項３２】
異常タウ−タウ会合の予防または治療のための、請求項27〜31のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項３３】
アルツハイマー病、運動ニューロン病、Lewy小体病、ピック病、および進行性核上性麻痺の処置のための、請求項27〜32のいずれか一項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、異常な（pathological）タウ−タウタンパク質会合および異常な神経フィラメント凝集を調整するかもしくは阻害し得る物質を検出するための新規な方法に関する。本発明の方法は、アルツハイマー病の予防および処置のための物質のスクリーニングに特に有用である。
アルツハイマー病（AD）は、後期の人生における痴呆の最も一般的な単一の原因である（Livingstone（1994）The  scale  of  the  problem.Dementia（eds.Burns  and  Levy）Chapman  ＆  Hall,London,pp.21−35）。アルツハイマー病の個体は、記憶の喪失の増大、判断力、知覚および言語における障害、ならびに全体的な知力の悪化を呈する進行性の痴呆によって特徴付けられる（Roth and Iversen（1986）Brit.Med.Bull.,42（special volume））。
アルツハイマー病の主な病的特徴は、老人斑（senile plaque）および神経原線維変化（neurofibrillary tangle）であり、どちらも対になったらせん状線維（paired helical filaments:PHF）を含み、微小管関連タンパク質タウが、その構成成分である（Wischik et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4506−4510）。（老人）斑もまた、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおける未だに不確定の異常から誘導されるβアミロイド原線維を含む（APP;Kang et al.（1987）Nature,325,733−736。
アルツハイマー病の研究は、正常な微小管関連タンパク質タウの喪失（Mukaetova−Ladinska et al.（1993）Am.J.Pathol.,143,565−578;Wischik et al.（1995a）Neurobiol.Ageing,16:409−417;Lai et al.（1995b）Neurobiol.Ageing,16:433−445）、異常な対になったらせん状原線維の蓄積（PHFs;Mukaetova−Ladinska et al.（1993），前出;Harrington et al.（1994a）Dementia,５,215−228;Harrington et al.（1994b）Am.J.Pathol.,145,1472−1484;Wischik et al.（1995a）前出）および認知障害の強い明確なマーカーとしての中−前頭皮質におけるシナプスの喪失（Terry et al.（1991）Ann.Neurol.,30,572−580）を指摘してきた。シナプスの喪失（Terry et al.前出）および錐体（pyramidal）細胞の喪失（Bondareff et al.（1993）Arch.Gen.Psychiatry,50,350−356）は、どちらもタウ反応性神経原線維異常の形態（morphometric）測定と相関しており、これは、アルツハイマー病における、可溶性形態から重合した形態（PHF）へのタウタンパク質プールのほとんど完全な再分布（redistribution）と分子レベルで相関している（Mukaetova−Ladinska et al.（1993），前出;Lai et al.（1995），前出）。これらの変化の可能な説明は、タウタンパク質のPHFへの異常な再分布が、錐体細胞内での軸索チューブリンの重合状態の維持の不足を介して、皮質−皮質関連回路における軸索の輸送の不足を引き起こすということである（Wischik et al.（1995a），前出;Wischik et al.（1995b）Meurobiol.Ageing,印刷中;Wischik et al.（1995c）Structure,biochemistry and molecular pathogenesis of paired helical filaments in alzheimer's disease.Eds.A.Goate and F.Ashall,印刷中;Lai et al.（1995），前出）。突出細胞体（projection soma）から遠位の関連新皮質までのシナプス成分の輸送の不足の結果、シナプスの損失と認知障害に至る。さらなる要因は、錐体細胞におけるPHF蓄積の直接的な毒性（Bondareff et al.,（1993）,Arch.Gen.Psychiat.50:350−356;（1994）,J.Neuropath.Exp.Neurol.53:158−164）、および細胞の機能を損なう短縮型タウの蓄積という直接的毒性の可能性（Mena et al.（1991）,J.Neuropath.Exp.Neurol.50:474−490）を含む。
モデル系における分子的病因の研究はβ−アミロイド蓄積の神経毒性の役割を強調してきたが（Harrington and Wischik（1994）Molecular Pathobiology of Alzheimar's disease.Dementia（eds.A.Burns and R.Levy）.Chapman ＆ Hall London,pp.211−238に概説）、β−アミロイド沈着をヒトにおける認知障害と直接的に関連付ける証拠は薄弱である。APPの改変されたプロセシングが、タウタンパク質の改変されたプロセシングを開始し得るいくつかの可能な要因の唯一のものであることの方がありそうである。他の開始要因は、apoE4に関連する未知のプロセス（Harrington et al.1994b），前出）、第21染色体のトリソミー（Mukaetova−Ladinska et al.（1994）Dev.Brain Dysfunct.7:311−329）、および環境要因、例えば、アルミニウムの亜毒性レベルへの長時間の曝露（Harrington et al.（1994c）Lancet,343,993−997）を含む。他の病因因子は、タウタンパク質プロセシングにおける一般的なパターンの障害を引き起こすことができ、その障害は:Glu−391でのＣ−末端短縮化、PHFタウポリマーの形成、可溶性タウの喪失および異常にリン酸化されたタウ種の蓄積を含む（Wischik et al.（1996）Int.Rev.Psychit.,印刷中）。
PHFのプロテアーゼ耐性コア構造の不可欠な成分であることが示されてきた微小管関連タンパク質タウのフラグメントは、タウの微小管結合ドメインから誘導される93/95アミノ酸残基フラグメントである（Wischik et al.（1988），前出;Kondo et al.,（1988）Neuron,１,827−834;Jakes et al.,（1991）EMBO J.,10,2725−2729;Novak et al.,（1993）EMBO J.,12,365−370）。タウタンパク質は、成人の脳に、352〜441アミノ酸残基の６つのアイソフォームで存在する（Goedert et al.（1989）Neuron,３,519−526）。一般的な構造では、タウ分子は、252残基の長いＮ−末端ドメインで微小管から突出しているもの、３または４個の縦列反復物からなる93〜125残基の縦列反復領域で微小管結合ドメインであるもの、および64残基のＣ−末端尾部からなっている。各縦列反復物は、19残基のチューブリン結合セグメント、および12残基のリンカーセグメントを含んでいる（Butner and Kirschner（1991）J.Cell.Biol.,115,717−730;図１）。主なタウの成分はプロテアーゼ耐性コアPHF濃縮調製物から抽出することができ、３反復および４反復アイソフォームのどちらからも誘導される12kDaのフラグメントであるが、アイソフォームに関わらず３縦列反復物の等価物に限定される（Jakes et al.,前出；図２）。フラグメントのＮ−末端およびＣ−末端の境界は、特徴的なプロテアーゼ耐性コアPHFタウユニットの正確な長さを規定する。それは、Butner and Kirschner、前出、により定義された正常な分子の結合物／リンカー構成（図１）に関して、14/16残基分フェーズドシフトし、Glu−391で、または４反復アイソフォームの第３番目の反復物内の同じ場所でＣ−末端が短縮されている（Novak et al.（1993）、前出；図３）。このＣ−末端短縮点を特異的に認識するモノクローナル抗体（mAb 423）が入手可能であり、この抗体を用いる組織学的研究は、神経原線維退化の全ての段階でGlu−391でＣ−末端が短縮されたタウタンパク質の存在を示した（Mena et al.（1995）Acta Neuropathol.,89,50−56;Mena et al.（1996）Acta Neuropathol.（印刷中））。したがって、PHF構築に関与する可能な翻訳後修飾は、異常なタンパク質分解である。
AD脳組織に見られるいくつかのタウプール：正常可溶性タウ、リン酸化されたタウ、およびプロテアーゼ耐性PHF、の区別を可能にする方法が開発されてきた（Harrington et al.,（1990），（1991），（1994a），前出）。これらの方法は、重篤なADおよびダウン症候群の研究（Mukaetova−Ladinska et al.,（1993;1995）、前出）、初期段階のADで将来を見越して評価された症例（Wischik et al.（1995a）、前出;Lai et al.（1995）前出）ならびにLewy小体型の老人性痴呆およびパーキンソン病型を含む他の神経病理学的診断の症例（Harrington et al.（1994a），（1994b），前出）において展開されてきた。脳組織内の全PHF含有量は、アルツハイマー型の痴呆を有する患者と有さない患者との間では明白に異なる。PHF含有量には19倍の違いがあり、側頭皮質では、その違いは40倍にも達する。PHFが蓄積する主な部位は、組織学的研究から予測されるように、プロテアーゼ耐性PHFもしくはリン酸化されたタウタンパク質種のいずれの蓄積に関しても老年期のコントロールと異ならない（Harrington et al.（1994a），（1994b），前出）。さらに、皮質のLewy小体のアポリポタンパク質Ｅの遺伝子型の場合は、E4アレル体の頻度がADにおいて見られるのとほぼ同じ程度に上昇したことを示した。したがって、E4アレル体の存在が、ADの特徴的なタウ異常の唯一の原因ではあり得ない。なぜなら、これはLewy小体の場合では見られなかったからである（Harrington et al.（1994b），前出）。
ADを有する場合と有さない場合を区別するさらなるパラメーターは、正常可溶性タウタンパク質の量である。タウレベルは灰白質内より白質内の方が高いが、軸索微小管関連タンパク質について予測されるように、灰白質内に見いだされる量は求心性の軸索の神経分布も反映する。ADの場合、全脳領域に一様に作用する正常可溶性タウタンパク質の実質的な喪失がある（Mukaetova−Ladinska et al.（1993）、前出）。この一様な減少の分子的基礎は未知であり、タウmRNAの減少によって説明することはできない（Goedert et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4051−4055）。PHFの蓄積と可溶性タウの喪失という２つのプロセスの正味の効果は、タウタンパク質プールの、白質主体から灰白質主体への、前頭皮質主体から側頭皮質主体への、解剖学的再分布である。
ADにおけるタウタンパク質の再分布の全体的な範囲は、図４に示されるデータから理解することができ、そこでは全遊離タウプールおよびPHF結合プールが比較されている。コントロールでは97％のタウタンパク質プールが可溶性期にあるのに対し、ADでは、83％のタウタンパク質プールが不溶性期にあることが見いだされ、ほぼ全体が短縮されPHFに重合した形態である（Mukaetova−Ladinska et al.（1993）前出）。臨床的診断器具CAMDEXによって将来を見越して評価された場合（Roth et al.（1986）Brit.J.Psych.,149,698−709）およびBraak and Braakの実施基準により死後と分類された場合（（1991）,Acta Neuropathol.82,239−259）における早期のADの研究は、可溶性タウの喪失がもつれの数（tangle count）とPHF蓄積の程度に直接関係していることを示した（Lai et al.（1995）前出）。
異常にリン酸化されたタウタンパク質は、可能なPHF前駆体と考えられてきたがLee et al.（1991）Science,251,675−678;Goedert et al.（1994）,in Microtubules（Hyams and Lloyd eds.）pp.183−200.John Wiley ＆ Sons,NY）、正常なタウは、以前にはPHF関連タウタンパク質において異常にリン酸化されていると考えられていた多くの部位でリン酸化されていることがわかった（Matsuo et al.（1994）Neuron 13,989−1002）。初期ADの研究において、不溶性過リン酸化タウ種は、はじめ、PHFへのかなりのタウ再分布が起こった後に見られた（Lai et al.1995;図５）。PHFもしくは神経原線維のもつれの現れる前のリン酸化された種の選択的蓄積の証拠はなかった（Lai et al.（1995），前出）。同様に、異常の進行の間にリン酸化されたタウが全PHF結合プールに送り込まれるという証拠はなかった（Lai et al.,（1995），前出）。タウタンパク質のリン酸化は、それが異常である限りにおいて、異常のどの段階でも約５％のPHFに影響を及ぼす二次的なプロセスのようである（Wischik et al.（1995a），（1995c），前出）。
初期段階のアルツハイマー病の研究はまた、可溶性タウのPHFへの変化の速度は、PHFレベルに関して幾何級数的であり、PHFレベルがより高い環境での取り込み速度は漸進的に増加するということも示した（Lai et al（1995），前出；図6B）。さらに、異常の進行をともなう可溶性タウの観察された喪失率は、観察されたPHFの蓄積率を完全に説明できるほど十分ではない。周囲の可溶性タウレベルが580pmol/gより低下するにつれ漸進的により多くの新しいタウ合成が誘導され、そしてこれもPHFの構築に送り込まれる（図6A）。したがって、PHFの構築率は、可溶性前駆体の状態もしくは濃度により測定されるのではなく、それはADにおいてさえ完全に正常であるようである（Wischik et al.（1995a），（1995b），前出）。むしろ可溶性タウのPHFへの変化率は、周囲のPHF−タウレベルにより決定され、そのことは、PHF構築を行う重要な翻訳後修飾が、タウのPHFへの取り込みの時点で起こることを示唆している。
これらの発見の適当な説明は、タウタンパク質が、PHFへの取り込みの時点で、誘導された構造的な変化を受け、それが、先に詳細に記載された縦列反復領域における半反復フェーズドシフト（phase shift）に関係しているということである（Novak et al.（1993）、前出）。この構造的な変化は、さらなるタウ分子の捕獲および誘導された構造的修飾等を可能にする高親和性タウ捕獲部位を露出させることができる。PHF構築の速度を決定するタウタンパク質における重要な構造的変化は、したがって、可溶性タウの化学的修飾である必要はなく、タウタンパク質の異常な基質への結合により生じる誘導された構造的変化でなければならない。この過程は、例えば、APP代謝の産物（Caputo et al.（1992）Brain Res.,597,227−232）、修飾されたミトコンドリアタンパク質（Wallace（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,8739−8746）などのような非タウタンパク質により開始することができる。一旦タウの捕獲が開始されると、この過程は、さらなるタウの捕獲速度が異常なタウ複合体の分解（degradation）速度を上回る場合に限り継続し得る。分解は、PHFのコアタウ複合体がプロテアーゼに対して耐性であるという事実によって限定される（Wischik et al.（1998）、前出;Jakes et al.前出）。そのような過程は、「タウタンパク質のアミロイド沈着」であり、一般的に示唆されているように、可溶性タウタンパク質の介在する化学的修飾が無くても開始され、そして幾何級数的に進行し得る。
図７は、アルツハイマー病におけるタウタンパク質のPHFへの型転換を略図的に示している。PHFコアの主要なタンパク質成分は、正常なら微小管結合ドメインとして機能するタウ分子のフェーズシフトした形態の縦列反復領域を含む93残基のフラグメントにまで短縮されたタウタンパク質の形態である。PHFの構築は、異常なタウ−タウ結合が中枢的役割を果たす繰り返される一連の事象の結果起こると考えることができる。この遊離のタウの結合は、一方のタウ分子が既に異常な捕獲（例えば、APP代謝産物への捕獲（Caputo et al.（1992）Neurobiol.Ageing,13,267−274）、あるいは変更されたミトコンドリアタンパク質への捕獲（Jancsit et al.（1989）Cell Motil.Cytoskel.,14,372−381;Wallace,前出））を受けている不均衡な場合においてのみ生理学的濃度で好都合であり、そしてさらなるタウ結合は、短縮型タウユニットのみを残して捕獲された種の部分的なタンパク質分解過程により促進される。一旦完全長もしくは短縮型ユニットが完全長分子に結合すると、異常な複合体の部分的タンパク質分解過程は結果として二量体のコアタウユニットを産生し、それは、以前の完全な分子のＮ−末端およびＣ−末端を欠いている。タンパク質分解過程の限界は、タウ−タウ会合領域により決定され、それは、正確に、本発明者らが記載した最小プロテアーゼ耐性タウユニットに対応する（Novak et al.（1993）、前出；図16および17参照）。しかし、この部分的タンパク質分解の最終的な結果は、コアタウユニットの再生であり、それは、さらなる完全長タウ分子を捕獲することができる。この過程は、無期限に反復することができる。それは、利用可能なタウタンパク質プールが無くなる点まで継続するための２つの重要な工程を必要とする。まず第１は、短縮型ユニットによる完全長タウの反復捕獲であり、そして第２は、コアユニットを再生するための結合した完全長タウの短縮化である。
これまでは、異常なタウ−タウ会合の信頼し得る測定方法は利用可能でなく、かつ異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得る物質も記述されたことはない。
上記の技術的問題の解決は、請求の範囲において特徴付けられる実施態様を提供することにより達成される。
したがって、本発明は、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得る物質の検出方法に関し、該方法は、
ａ）タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を、
ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得ると推測される物質、および
ｃ）工程ａ）のタウタンパク質に結合し得る標識されたタウタンパク質もしくは標識されたその誘導体と、または工程ａ）のタウタンパク質とは区別されるがやはり工程ａ）のタウタンパク質と結合し得るタウタンパク質もしくはその誘導体と接触させる工程、ならびに
ｄ）タウ−タウ結合の検出工程、
を包含する。
タウのPHFへの重合を行うタウの修飾は、タウの前述のいかなる化学的翻訳後修飾よりむしろ物理的な構造的変化によって促進される。驚くべきことに、異常なタウの捕獲の時点でin vivoで誘導されるこの修飾を、固相へ最初にタウを結合させることにより、上記の過程にしたがって、in vitroの方法に移行することが可能である。ラットの新生児の脳から単離したタウは、PHFのコアタウユニットに結合することが全くできなかった（図14;POTr）。しかし、以前には固相マトリックスに受動的に結合していた新生児タウは、未修飾完全長タウタンパク質を、コアタウユニットによって示されていたものと同じ高い親和性で結合するように誘導された（図17）。したがって、異常な結合ができないタウ種を高い親和性でさらなるタウ分子を捕獲することのできる種に変換するのに必要とされる重要な要因は、新生児タウの固相基質への受動的結合により誘導される構造的な変化である。このことは、高親和性タウ捕獲部位の露出は、タウが適切な基質に結合する場合に生じる構造的な変化により物理的に誘導することができ、いかなる他の化学的修飾も必要としないことを実証する。
本発明によれば、in vitroで再現される異常な結合は、ヒトの脳においてみられるのと同じ特定の重要な性質を有していた。このことは、特に、Ala390で終結し、したがって、モノクローナル抗体423によって認識されるのに必要なGlu−391を欠いているコアアウユニット（図21、SEQ ID NO:4）に結合した完全長タウタンパク質が、結合したタウ複合体を広範囲のプロテアーゼ、すなわちPronaseで処理した後でも、Pronase消化の範囲においては量に依存するように、mAb423と反応するようにさせることができる（図16）。Ｎ−末端タウ免疫反応性の消化依存性喪失は、コアPHFの特徴であるmAb423免疫応答性の獲得と平行して起こることを示すことができる（図17）。したがって、PHFのコアから単離され、アルツハイマー病の脳において産生されるタウユニットの創製に必要とされる必須の要件は、in vitroで再現される異常なタウ−タウ相互作用である。
さらに、完全長タウのAla−390で終結しているコアタウユニットへの結合の反復サイクル、続くPronase処理、その次の完全長タウの結合とさらなるPronase消化など４サイクルまでは、Ｃ−末端がGlu−391で短縮されているタウの漸進的な蓄積と関連し（図18）、かつ各サイクル後のさらなる完全長タウの結合のための能力の漸進的な増強と関連する（図18）。このことは、図７に示したモデルにおけるタンパク質分解の実質的な役割が飽和を防ぎ、したがって、可溶性タウのコアPHFの短縮型タウユニットへの無制限の漸進的変形を促進することであることを示している。
図７に示された全ての工程が、in vitroで再現され得ること、およびその過程の進行の重要な要件が高親和性タウ捕獲工程であることが示されてきたので、高親和性タウ−タウ相互作用をブロックし得る化合物を見いだすための結合アッセイの使用を示すことが可能である。ほとんどの潜在的な阻害性化合物が、タウに関してモル比1:1で存在する場合に、20％の競合的阻害を示すことができ、さらなる阻害は、モル比10:1までの範囲内でほぼ直線的であることがわかった（図19）。
縦列反復領域は全体として機能するので、その分子の同じ領域を介するタウのチューブリンへの正常な結合を干渉しない、異常なタウ−タウ結合の選択的な競合的阻害を示すことが可能であろうということは予想外のことである。いかなる可能な干渉、すなわち、タウもしくはその誘導体のチューブリン分子への結合、をも決定する方法は、脱重合したチューブリン調製物もしくはタキソール安定化微小管の調製物を、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得ることが推定される物質、および上記の工程ｃ）で言及したタウ化合物と接触させる工程、それに続くタウ−チューブリン結合の検出を包含する。
用語「タウタンパク質」とは、上記で言及したタウタンパク質ファミリーの任意のタンパク質およびそれらの誘導体をいう。タウタンパク質は、構築と分解という反復サイクルの間に微小管と同時に精製される多数のタンパク質ファミリーのうちの１つのファミリーとして特徴付けられ（Shelanski et al.（1973）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,70,765−768）、微小管関連タンパク質（MAP）として知られている。さらに、このタウファミリーは、このファミリーの全てのメンバーが共有している特徴的なＮ−末端セグメント、このＮ−末端セグメントに挿入されている〜50アミノ酸の配列で、脳において発生上調節されるもの、31〜32アミノ酸の３または４個の縦列反復物からなる特徴的な縦列反復領域、およびＣ−末端尾部の存在により特徴付けられる（図２）。
本発明の好ましい実施態様においては、このタウタンパク質は図21のアミノ酸配列（SEQ ID NO:5）で、「T40」（Goedert et al.（1989）,Neuron 3:519−526）といわれるもの、もしくはそのフラグメントを含み、そして２つのＮ−末端挿入物および４つの縦列反復物を有するタウタンパク質の形態を含む。
用語「タウコアフラグメント」は、その最も基本的な形態において、縦列反復領域から誘導される短縮されたタウタンパク質配列を含むタウフラグメントとして定義され、それは適当な条件下でさらなるタウタンパク質の縦列反復領域に高い親和性で結合し得る。通常、好ましいタウタンパク質、タウタンパク質誘導体、およびタウタンパク質コアフラグメントは、対応するヒトタウタンパク質アミノ酸配列（図21、SEQ ID NO:5）と少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは少なくとも80％、そして最も好ましくは少なくとも90％の同一性を有し、さらにそれらはヒトタウフラグメントに結合し得ることで特徴づけられる。このアッセイ方法の特に好都合な実施態様は、図22（SEQ ID NO:6;Novak et al.,1993）に示したアミノ酸配列を有するタウコアフラグメントを含む。E.coliによってin vitroで発現されるこの組換えタウペプチドは、プロテアーゼ耐性コアPHF調製物から単離される種と同じである（Wischik et al.（1988）。前出;Jakes et al.（1991），前出）。用語「タウコアフラグメント」はまた、以下に記載されるような、そして図25および26（SEQ ID NO:9および10）で言及されるような、それらの誘導体も含む。
用語「タウタンパク質誘導体」および「タウコアフラグメント誘導体」は、天然に生じるもしくは天然に生じないタウタンパク質、および少なくともタウタンパク質の縦列反復領域に似た部分アミノ酸配列を含む関連タンパク質、すなわち、天然のタウもしくはそのフラグメントの１以上のアミノ酸が結合活性を失うことなく置換もしくは欠失されているタンパク質を含む。縦列反復領域において配列類似性を有する天然に生じるタンパク質の例は、微小管関連タンパク質である（MAP2;図25および26;SEQ ID NO:9および10;Kindler and Garner（1994）Mol.Brain Res.26,218−224）。そのようなアナログは、ペプチド化学法という公知の方法により、あるいは組換えDNA技術により産生されてもよい。
用語「タウタンパク質誘導体」および「タウコアフラグメント誘導体」は、残基上に側鎖として生じる官能基から、またはＮ−末端もしくはＣ−末端基から、当該分野で公知の手段により調製することができる誘導体を含む。これらの誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイル基もしくは炭素環式アロイル基）により形成されるアミノ酸残基の遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル部分により形成される遊離のヒドロキシル基の（例えば、セリル残基もしくはトレオニル残基のそれ）Ｏ−アシル誘導体を含み得る。
コアPHFタウフラグメントは、AD脳組織からWischik et al.（（1988）；（1995a），前出）に記載された方法により単離することができる。この方法は、経験に基づいて決められた緩衝液および密度条件下で行われる一連の異なる遠心分離工程に依存し、最後の重要な遠心分離工程は、密度が1.05〜1.18までの範囲の連続的なスクロース勾配で、10μg/mlのPronase存在下で行われ、高密度塩化セシウムとの境界でプロテアーゼ耐性コアPHF画分を生じる。タウタンパク質は、そのPHF調製物を濃縮蟻酸で処理し、凍結乾燥し、そしてpH5.5の緩衝液中で音波処理した後に、実質的に精製された調製物としてpH5.5の上清中に（50mmol酢酸アンモニウム）コアPHFから放出され得る。
正常な可溶性タウは、AD、コントロールのヒト脳組織、もしくは動物の脳組織から、３時間未満の死後遅延で、単離することができる。微小管タンパク質は、Shelanski et al.（1973,前出）による３サイクルの温度依存性構築−分解により入手される。タウタンパク質は、温度安定性画分からゲル濾過により精製される（Herzog and Weber（1978）Eur.J.Biochem.,92,1−８）。あるいは、タウタンパク質は、Lindwall and Cole（1984;J.Biol.Chem.,259,12241−12245）の手法によりタウタンパク質の2.5％過塩素酸中の可溶性に基づいて単離することができる。
タウタンパク質およびフラグメントの産生は、さらに、当業者が熟練した従来の組換えDNA技術により達成することができる。そのような技術は、文献にさらに説明されており、例えば、Sambrook,Fritsch ＆ Maniatis"Molecular Cloning.A Laboratory Manual"（1989）Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.およびAusubel et al."Current Protocols in Molecular Biology",Green Publish.Association ＆ Wiley Interscienceを参照されたい。
さらに、完全なもしくは部分的タウタンパク質をコードするDNA分子もしくはそのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技法を用いて入手することができる。当該DNA分子の3'および5'部分をコードするプライマーを目的のタウタンパク質のために合成してもよく、そしてタウタンパク質ファミリーの個々のメンバーを増幅するためにそれを用いることができる。
チューブリンタンパク質もしくはそのフラグメントの調製物は、当該分野で公知であり、例えば、Slobada et al.（1976,Cell Mobility（R.Goldman,T.Pollard and J.Rosenbaum,eds.）,Cold Spring Laboratory,Cold Spring Harbor,New York.,pp1171−1212）により記載されている。
DNA配列およびDNA分子は、幅広い種々の宿主／ベクターの組合せを用いて発現させることができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成DNA配列のセグメントからなっていてもよい。そのようなベクターの例は、SV40の種々の公知の誘導体のようなウイルスベクター、E.coli由来のプラスミドのような細菌ベクター、λファージ、M13および他の線状一本鎖DNAファージの多くの誘導体のようなファージDNA、ならびに２μプラスミドの誘導体のような酵母において有用なベクター、真核生物細胞において有用なベクター、より好ましくは動物細胞において有用なベクター、例えば、SV40、アデノウイルスおよび／またはレトロウイルス誘導体DNA配列を含むものである。
本明細書中で用いるように、「DNA配列」とは、別々のフラグメントの形態で、あるいはより大きなDNA構築物の成分としてのDNAポリマーをいい、それは、少なくとも一回は実質的に精製された形態に単離されたDNA、すなわち、内在性物質の混入が無く、標準的な生化学的方法、例えば、クローニングベクターを用いるような方法によりその配列およびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収が可能な量もしくは濃度であるDNAから誘導される。そのような配列は、好ましくは内部非翻訳配列もしくはイントロン（真核生物遺伝子に典型的に存在する）によって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供される。しかし、当該配列を含むゲノムDNAもまた用いることができるというのも明らかであろう。非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレームから5'側または3'側に存在してもよく、そこで、それらはコード領域の操作もしくは発現を干渉しない。
本明細書中で用いられるように、用語「発現ベクター」および「発現プラスミド」とは、次の部品を含む転写ユニットを含むプラスミドをいう（１）遺伝的エレメントもしくは遺伝子発現において調節的役割を有するエレメント、例えばプロモーターもしくはエンハンサー、（２）mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列もしくはコード配列、および（３）適当な転写および翻訳の開始ならびに停止配列。種々の真核生物発現系における使用が意図される構造エレメントは、好ましくは、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列もしくは輸送配列なしで発現される場合、それはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、最終産物を提供するため、発現された組換えタンパク質からその後任意に切断することができる。
DNA配列の発現に用いられる宿主細胞は、種々の公知の宿主から選択することができる。そのような宿主の例は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞である。多数のそのような宿主が、American Type Culture Collection（ATCC）もしくは
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のような種々の寄託機関から利用可能である。原核生物細胞宿主の例は、E.coli、B.subtilis等のような細菌株である。好ましい宿主は、マウス3T3細胞のような哺乳動物細胞、NIE−115、N2A、PC−12のような神経芽腫細胞系、あるいはSV40で形質転換したアフリカミドリザル腎臓細胞系COSなどで、市販されている。
この発明のDNA配列により形質転換された原核生物および真核生物宿主の発酵により産生されるタウタンパク質は、次いで、実質的に均一になるまで、例えば、異なる速度での遠心分離による、硫酸アンモニウムを用いる沈殿による、透析（正常圧もしくは減圧下で）による、調製的等電点電気泳動による、調製的ゲル電気泳動による、もしくはゲルろ過、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、イオン交換クロマトグラフィー、逆相▲Ｒ▼クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー（例えば、Sepharose Blue CL−6Bもしくは担体結合モノクローナル抗体上での）のような種々のクロマトグラフィー法によるような公知の方法により精製することができる。
本発明によれば、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含むそのフラグメントを、タウタンパク質と、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得ると推定される物質と一緒にインキュベーションする。この物質の阻害能力に相関するタウ−タウ結合の範囲は、種々の方法により検出することができる：
好ましい方法においては、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含むそのフラグメントを、最初のタウタンパク質とは異なる、好ましくは免疫学的に異なっているタウ誘導体とインキュベーションする。この場合、タウ誘導体の結合は、例えば、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体あるいはその誘導体を介して検出される。この種の検出の例は、コアフラグメントに相当する短縮型タウタンパク質を、試験物質および完全長タウタンパク質もしくは水相でコアPHFタウユニットを刺激する短縮型タウタンパク質フラグメントのいずれかと一緒にインキュベーションすることを特徴とするタウ−タウ結合の検出のアッセイ方法である（図８および10）。
この場合、タウ−タウ結合は、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを認識する抗体、あるいは、例えば、Glu−391で短縮されたコアタウフラグメントを認識するmAb 423のような抗体を用いて従来の方法で免疫化学的に検出することができる。好都合には、本発明のモノクローナル抗体自身が、マーカーもしくは以下に例示するようなマーカーに直接的もしくは間接的にカップリングする基を有する。また、ポリクローナル抗血清を用いることもできる。これは、対応するタウタンパク質を動物、好ましくはウサギに注射し、ポリクローナル抗体を抗原の結合したカラムを通過させて免疫親和性精製により抗血清を回収し、そのポリクローナル抗体を従来の方法で溶出させることにより生じる。
本発明の方法の特に好都合な実施態様は、タウタンパク質のＮ−末端に近いGly−16とGln−26との間のヒト特異的セグメントに対する抗体の使用を包含する。この種の抗体の使用は、完全長組換えヒトタウの、種々の発生段階にある他の動物種（例えば、ラット）由来の完全長タウアイソフォームへの結合を測定することを可能にする。短縮型タウの結合は、Ala−390で終結しmAb 423によって認識されない似たようなフラグメントに結合する、Glu−391で終結している短縮型コアタウフラグメントを検出するmAb 423のような抗体の使用により検出することができる（図８）。
抗体もしくはそのフラグメントは、当該分野で公知の任意のイムノアッセイ系において用いることができ、それらは、ラジオイムノアッセイ、「サンドイッチ」アッセイ、酵素免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどを含むがこれらに限定されない。
特に好ましいのは、タウ−タウ結合アッセイのための次の構成である（図10）：タウフラグメント、好ましくは組換えタウフラグメントであって、コアPHFの短縮型タウユニットに相当するものが固相、例えば、従来のELISAプレートに、タウ−タウ会合に適当でないことが示された緩衝液条件下で結合している。この短縮型タウタンパク質は、好ましくは受動的（passively）にその固相に結合している。なぜなら、これは縦列反復領域内の高親和性タウ−タウ結合部位を露出することがわかっているからである。この固相は、通常、ポリ（ビニルクロライド）であるが、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、もしくはポリプロピレンのような他のポリマーであってもよい。固相支持体は、チューブ、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレート、あるいはアッセイを行うのに適した他の表面であって、タウタンパク質の受動的結合の際に高親和性タウ捕獲部位を露出する表面の形態であってよい。結合後、この固相−抗体複合体を試験サンプルの準備のために洗浄する。
驚くべきことに、自己会合がなく、そして縦列反復領域中の高親和性タウ捕獲部位への妨害もない、コアPHFの短縮型タウユニットの固相基質への結合に適当な緩衝液条件を決定することができた。アッセイ系を図８に示すように確立し、そこでは、Ala−390で短縮されたコアタウユニットを最初に固相マトリックスに結合させた。次に、Glu−391で終結した短縮型ユニットをインキュベーションした。後者のみをmAb 423免疫反応性として検出することができた。図９は、このアッセイの特異性を実証し、そこで、mAb 423の免疫反応性は、タウ−タウ結合が予想される条件下でのみ見られた。アルカリ性緩衝液（炭酸ナトリウム、trisなど）、好ましくはpH9−10、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH9.6）はコアタウユニットの無視し得る自己会合に関連していることがわかった（図９）。したがって、固相マトリックスへの受動的結合のためのコアタウユニットの接種は、この緩衝液中で行われた。所望なら、同じ緩衝液中の脱重合したチューブリン調製物もしくは微小管の調製物を、タウ−チューブリン結合の測定用の受動的結合のために接種することができる。過剰な結合部位をブロックするための適切な物質は、牛乳抽出物、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなどである。固相結合コアタウユニットを生理学的緩衝液条件へ移し、標準的なアッセイ形式において完全長タウとインキュベーションした後（図10）、正常完全長タウタンパク質の非常に高い親和性捕獲を実証することが可能であった。固相に前もってコアタウユニットを接種しないと、完全長タウの結合は見られなかった。どちらの種も存在する場合には、結合は両種の濃度に依存することがわかった。固相種もしくは水相種のいずれかが飽和している場合、他方の種の結合定数は８−25nMであり、測定されたタウの特定のアイソフォームに依存していた（図11）。タウ−タウ結合用の緩衝液条件には、適切な塩濃度および適切なpH値を含むべきである（図12および13）。タウ−タウ結合用の塩濃度は、好ましくは50〜400mMの塩化ナトリウム、より好ましくは100〜200mMの塩化ナトリウム、または対応する塩もしくは匹敵するイオン強度の塩混合物、例えば、PBS（137mM塩化ナトリウム、1.47mMリン酸二水素カリウム（potassium dihydrogen phosphate）、8.1mMリン酸水素二ナトリウム、2.68mM塩化カリウム）である。pHの範囲は、pH4〜pH10の、より好ましくは、pH5〜pH8のpH値を含むべきである。過剰な結合部位を飽和させるため、および非特異的結合を避けるため、固相をブロッキング剤、例えば、牛乳抽出物、ウシ血清アルブミン、もしくは好ましくはゼラチンと一緒にインキュベーションしてもよい。受動的に結合したコアタウユニットを生理学的緩衝液条件下に移した後では、著しく高い親和性の正常完全長タウタンパク質の捕獲（Kd＝８〜25nM、テストした特定のタウ種に依存する）を示すことが可能である。
固相のタウタンパク質に結合し得るタウタンパク質を含む液相を、テスト物質と一緒に、結合させるのに十分な時間にわたって固相タウタンパク質に添加する。結合したタウ複合体を、二次的に結合したタウ種を選択的に検出するが最初の固相種は検出しない抗体の添加の準備のため、再度洗浄する。この抗体をレポーター分子に連結する。このレポーター分子の可視性のシグナルは第２のタウタンパク質種の結合を示すために用いられる。
あるいは、結合の検出は、第１の標識されていないタウ特異的抗体に結合し得る二次抗体を用いて行ってもよい。この場合、その二次抗体は、レポーター分子に連結されている。
本明細書中で用いられる「レポーター分子」により、その化学的性質により抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に検出し得るシグナルを提供する分子が意味される。検出は、サンプル中の抗原の量の検出を可能にするため、少なくとも相対的な定量が可能でなければならず、これは、絶対項（absolute terms）で計算してもよいし、あるいは公知の正常レベルの抗原を含む標準（もしくは一連の標準）との比較により行われてもよい。
このタイプのアッセイに最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素もしくは蛍光団のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、ある酵素を二次抗体に、しばしばグルタルアルデヒドもしくはペリオデートにより結合させる。しかし、容易に認識されるように、幅広い種々の異なる結合技術が存在し、それらは当業者に周知である。一般に用いられる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼなどを含む。
特定の酵素と一緒に用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に、検出し得る色の変化を生じるということに関して選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼ結合体との使用に適切であり；ペルオキシダーゼ結合体には1,2−フェニレンジアミンもしくはテトラメチルベンジジンが一般的に用いられる。蛍光性（fluorogenic）基質を用いることもまた可能である。それは上記の色素生産性基質よりむしろ蛍光産物を生じるものである。どの場合においても、酵素標識した抗体を、対応するタウ−タウタンパク質複合体に添加し、その複合体へ結合させ、次いで、過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質、すなわち過酸化水素を含む溶液を、抗体−抗原−標識複合体という三次複合体（tertiary complex）に添加する。この基質は抗体に連結されている酵素と反応し、定性的な可視シグナルを与え、それはさらに、通常は分光光度計で定量されて、血清サンプル内に存在する抗原の量の評価を与える。
あるいは、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光化合物を抗体の結合能を変えることなく抗体に化学的にカップリングさせてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化される場合、蛍光色素で標識した抗体は、光エネルギーを吸収して分子内に励起力を誘導し、それに特徴的なより長い波長での光の放射が続く。この放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。酵素イムノアッセイ（EIA）においてのように、蛍光標識抗体は、第一の抗体−タウ−ペプチド複合体に結合することができる。非結合試薬を洗浄した後、残った三重複合体を、次に適当な波長の光に曝露し、観察された蛍光が抗原の存在を示す。
もう一つの好ましい実施態様においては、テスト物質と一緒に液相に添加される第２のタウタンパク質種は、上記のレポーター分子に連結されていてもよい。第２のタウ種は直接的に改変されていてもよいし（例えば、放射性のもしくは酵素的に検出可能な標識でマークされている）、あるいは分子のドメイン、例えば、Ｎ−末端セグメントであって、高親和性タウ−タウ結合部位に含まれていないことが知られており、それにより、それ自身がタウ−タウ結合アッセイにおいてリガンドとしておよびレポーター分子としての両方で機能するドメイン内で、（例えば蛍光色素に）結合されていてもよい。
本発明の特に好ましい実施態様を、実施例１に詳細に記載する。
本発明の方法に用いられる抗体もしくはそのフラグメントは、従来の方法によって産生され、すなわち、タウエピトープに選択的なモノクローナル抗体は、
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の方法によって調製することができる。タウエピトープに対する適切なモノクローナル抗体を公知の方法で改変してFabフラグメントもしくは（Fab'）２フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは短鎖抗体にした態様を提供することができる。
タウ−タウ相互作用における結合親和性を測定するのにも、in virtoで示される結合とヒトの脳において生じる結合との間の免疫化学的関係を示すのにも有用なモノクローナル抗体の例を以下に示す：
Ｎ−末端もしくはＣ−末端タウエピトープを認識するモノクローナル抗体により、短縮型タウ種と完全長タウ種との間の結合を測定することが可能である。特に有用なのは、ヒト特異的エピトープを認識する抗体である。モノクローナル抗体（AK 499と表される）は、それが非ヒト起源から誘導される限りにおいて、タウのGly−16とGln−26との間の領域に存在するヒト特異的エピトープを認識し、それにより、完全長タウ種間の結合の測定もまた可能にする（Lai（1995）The role of abnormal phosphorylation of tau protein in the development of neurofibrillary pathology in Alzheimar's disease.博士論文,University of Cambridge）。抗体342は、Ser−208とAsn−265との間に位置する非種特異的な一般的エピトープ（図21、SEQ ID NO:4）を認識するが、それはタウ−タウ相互作用の過程において部分的に妨げられる（Lai,前出）。
他の有用な抗体は、既に記載されている：抗体423は、タウのＣ−末端がGlu−391で短縮されているものを認識する（Novak et al.（1993），前出）。この短縮化は、アルツハイマー病におけるPHF構築の過程で自然に生じる（Mena et al.（1995），（1996），前出;Novak et al.（1993），前出;Mena et al.（1991）前出）。同じＣ−末端短縮化は、完全長タウの、Ala−390で終結している短縮型タウフラグメントであって、mAb 423によって認識されないフラグメントへの結合と（Novak et al.（1993），前出）、それに続く広範囲のプロテアーゼ、すなわちPronaseによる消化後にin virtoで示すことができる（図18）。この構成において、mAb 423の免疫反応性の唯一の可能な起源は、結合した完全長タウの消化からであり、そしてこれは、Pronaseの増加にともなって濃度依存性に増加することを示し得る（図18）。このことは、in vitroで生成されるタウ−タウ結合相互作用の分子コンホメーションが、脳において生じるそれと全く同じであり、したがって、in vitroで示される結合の選択的阻害はヒトの脳に普遍化することができる。
抗体7.51は、タウの最後から３番目の反復物に位置する一般的なタウエピトープを認識し（Novak et al.（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,5837−5841）、それは、タウがPHF様免疫化学的構成の状態で結合する場合には閉鎖されるが、蟻酸処理後に露出され得る（Harrington et al.（1990），（1991），前出;Wischik et al.（1995a）、前出）。正常な可溶性タウ、もしくは微小管に結合したタウは、蟻酸処理しなくてもmAb 7.51により検出することができる（Harrington et al.（1991），前出;Wischik et al.（1995a）、前出）。タウ−タウ結合アッセイにおける完全長タウの結合は、mAb 7.51エピトープの部分的閉鎖に関連している。
本発明の実施において、98〜108nMのKiで結合の阻害を生じるフェノチアジンが同定された（図19）。20％の阻害は、タウに関しては1:1のモル比で示すことができ、さらなる阻害は10:1までのモル比の範囲ではほぼ線状であった。これらの発見は、以下の仮定に一致：タウ−タウ結合は、限られた数の飽和可能な結合部位により決定され、したがって、特異的である；協同性がない、すなわち、１分子のタウの結合は、阻害の生じる部位でのさらなるタウ分子の結合に影響を及ぼさない；結合は可逆性であり、そして動的平衡状態にあり、そこでは結合は濃度および結合親和性のみによって決定される。
タウの縦列反復領域がチューブリン結合ドメインとして正常に機能すると仮定すれば、そしてその分子の同じ領域がPHF構築を行う高親和性タウ捕獲部位をも含むと仮定すれば、より些細な分子的差違をこれら２つのタイプの結合の間で示すことができる場合、タウの異常な結合を妨げる薬学的な介在を予見することが可能となるだけである。その介在により、正常なタウ−チューブリン結合を阻害しない、異常なタウ−タウ相互作用の選択的な阻害が可能である。なぜなら、シナプス小胞の軸索輸送（Okabe and Hirokawa（1990）Nature,343,479−482）を含む多くの正常な細胞過程が、チューブリンを重合状態に維持する細胞の能力に依存しているからである。以前の実験は、免疫化学的差違（タウ−タウ結合相互作用においてはmAb 7.51エピトープの閉鎖があるが、タウ−チューブリン相互作用には閉鎖はない;Harrington et al.（1991），前出;Novak et al.（1991）、前出）および分子的差違（PHF様構成で結合したタウは、特徴的なＮ−およびＣ−末端タンパク質分解性開裂部位により示されるチューブリン結合ドメインの正常なチューブリン結合セグメント／リンカーセグメント機構に関して14/16アミノ酸残基のフェーズシフトを示す;Novak et al.（1993）、前出；図３）を示した。驚くべきことに、これらの差違はまた、十分に確立されている薬の分類内で小分子を用いる薬の識別のための基礎をも提供することができる。特に、異常なタウ−タウ会合を阻害することが示されたフェノチアジンの効果が、正常なタウ−チューブリン結合の阻害に関してテストされた。実質的に、タウに関しては、モル比1000:1までは結合の阻害は示されなかった（図20）。にもかかわらず、タウの過リン酸化は、タウ−チューブリン相互作用を阻害することが示されていたが、このタウ−チューブリン結合アッセイにおいても同等の阻害を生じることが示された（Lai,前出）。したがって、異常なタウ−タウ会合を阻害する本発明によって提供される化合物は、タウのチューブリンへの正常な結合を阻害しない。このことは、本発明の重要な発見を示している。なぜなら、それは、PHF中の縦列反復領域の異常な結合と、タウ−チューブリン相互作用における縦列反復領域の縦列の正常な結合とを薬学的に識別し得る本明細書中に記載されたスクリーニング系に基づいて化合物を発見する技術的可能性を示すからである。
これまでにPHFコア内で同定された唯一の微小管関連タンパク質は、タウタンパク質である。にもかかわらず、PHFは、主な微小管関連タンパク質がMAP2である樹状突起細胞体区分に結集する（Matus,A.Microtubules（Hyams and Lloyd,eds）pp155−166,John Wiley and Sons,NY）。MAP2のアイソフォームは、縦列反復領域ではほとんどタウタンパク質と同じであるが、Ｎ−末端ドメインの配列と長さがどちらも実質的に異なる（図25および26、SEQ ID NO:9および10）。実施例３に示すように、縦列反復領域での凝集は、特定のタウコアアミノ酸配列に選択的ではなく、チオニンの様なフェノチアジン阻害剤の阻害活性は、タウの独特な配列に依存しない。
さらに、本発明はまた、対応するin vivoの方法にも関する。これらの方法は、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質のスクリーニングに関し、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体によって、あるいはタウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を発現し得るベクターによってトランスフェクションした細胞系を、タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することが推測される物質と接触させ、続いてその細胞系の生存および／またはその細胞系の形態を検出することを特徴とする。
実施例４および５は、線維芽細胞が、トランスジェニック完全長タウタンパク質を発現する場合に十分生存可能であり、トランスジェニック完全長タウタンパク質の細胞骨格分布（cytoskeltal distribution）が、潜在的なタウ−タウ結合阻害物質を有する培養細胞によって妨げられない、ということを明らかにする。フェノチアジンであるチオニンは、実質的な内在性毒性を有しているようにはみえない。しかし、線維芽細胞は、PHFのトランスジェニックコアタウユニットを発現する場合に生存可能ではないし、正味の形態的異常も示さない。生存トランスフェクタントの頻度および短縮型タウの発現レベルは、トランスフェクション後にチオニン中で細胞を増殖させることにより用量依存性に増加する。短縮型タウを発現している生存トランスフェクタントは、チオニンに依存し、その投与の中止により生存率は低下して異常な形態に戻る。
これらの発見は、したがって、非ニューロン細胞系における本発明の主たる発見を実証するものである。すなわち：その細胞内の高レベルのPHF−コアタウは毒性であり：この毒性は異常なタウ−タウ結合相互作用の選択的な阻害物質である化合物により取り消すことができ：そしてそのような化合物はタウのチューブリンへのin vivoでの正常な結合を破壊しない。これらの発見は、短縮型タウタンパク質による細胞の誘導トランスフェクション系および直接トランスフェクションを含む他の実験モデルにも普遍化することができる。
これまでの結果は、タウ−タウ結合阻害物質を短縮型タウユニットの毒性を打ち消すことに使用することを支持しているが、これらの過程のニューロンモデルを確立することが所望される。一般に、神経芽腫細胞系は、発生の過程で微小管ネットワークの発生とそれに対応する神経フィラメントのネットワークの発生との間のバランスに応じた複雑な細胞骨格変化を受ける。より高分子量の微小管関連タンパク質（MAP1A、MAP1B）は、これらの細胞骨格系の間の架橋を提供すると考えられる（Schoenfield et al.（1989）J.Neurosci.９,1712−1730）。微小管系と脱重合物質（Wisniewski and Terry（1967）Lab.Invest.17,577−587）、もしくはアルミニウム（Langui et al.（1989）Brain Res.438,67−76）との直接的な干渉は、細胞質内に特徴的な螺旋（whorl）を形成する中間体フィラメントの崩壊にいたることが知られている（Wischik and Crowther（1986）Br.Med.Bull.42,51−56）。神経フィラメント細胞骨格の同様の凝集が、分化できない神経芽腫細胞系内で同時に起こるのを見ることができる。これらの凝集体形成におけるMAPの役割は、現在のところわかっていない。しかし、これらの凝集体の形成、悪化および阻害は、微小管用細胞骨格が神経フィラメント細胞骨格と関連し、それを新しく形成された神経突起に輸送する能力の間接的なマーカーを示す。
実施例６および７は、チオニンのようなフェノチアジン阻害剤が２μＭまでの濃度ではニューロン細胞系にとって毒性ではなく、チオニンはトランスジェニックタウタンパク質の内在性微小管ネットワークへの取り込みを妨害しないことを明らかにする。これらのフェノチアジンは、短縮型タウを発現しているプラスミドによる安定なトランスフェクションに続く生存可能なニューロン細胞系の生成に必要である。さらに、短縮型タウの構成的発現は、pNFH凝集体の形成を強調し、一方、後者は完全長タウ発現により阻害される。細胞質pNFH凝集体の形成は、チオニンのようなフェノチアジンにより阻害され、pNFH免疫反応性のニューロン過程への取り込みは、これらの化合物により容易になる。
これらの発見は、短縮型タウによるニューロン細胞系の安定なトランスフェクションが、本来毒性であること、そして生き残っている細胞における微小管系の不安定化により、結果的に、発生過程の神経突起に輸送されない推定される神経フィラメント凝集体の形成にいたることを示した。これらの作用は、in vivoでタウ−タウ凝集をブロックするその能力によって選択される化合物により阻害することができ、この作用は、おそらく、内在性タウもしくは微小管の安定化に必要な他のMAPの発現に対する消極的作用により仲介される。チオニンのようなフェノチアジンはまた、トランスフェクションされていない細胞における神経フィラメントの凝集を、ニューロン分化を容易にすることによるか、もしくは神経フィラメントの凝集を直接阻害することによりブロックする予期せぬ能力を有する。アルツハイマー病におけるタウ凝集の予防におけるそれらの使用の可能性に加えて、そのような化合物は、運動ニューロン病およびLewy小体病のような異常な神経フィラメント凝集によって特徴付けられる疾患の処置における使用のさらなる可能性を有し得る。神経フィラメントサブユニットを過剰発現するトランスジェニックマウスが、神経フィラメントの凝集を、変性を受ける大きな運動ニューロン内で選択的に進行させ、筋肉の喪失と虚弱にいたることが見いだされた（Cote et al.（1993）Cell 73,35−46;Xu et al.（1993）Cell 73,23−33）。他の神経変性疾患、すなわちピック病および進行性核上性麻痺は、異常な短縮型タウのそれぞれ歯状回および新皮質の星状錐体細胞における蓄積を示す。既に記載された化合物もまたこれらの神経変性疾患において有用性を有する。
したがって、本発明は、特に、上記の方法に関し、ここで、前記細胞系は好ましくは線維芽細胞もしくはニューロン細胞系であり、より好ましくは線維芽細胞3T3、PC−12もしくはNIE−115細胞系である。これらの細胞系は、好ましくは短縮型タウタンパク質であって少なくともコアタウユニットを有するものによりトランスフェクションされている。このタウタンパク質の発現は、構成的制御下でもしくは誘導制御下にあるか、あるいはこのタウタンパク種は直接トランスフェクションされてもよい。
本発明はまた、上記に記載した任意の方法により入手可能なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する化合物にも関する。
上記の結果に基づくと、本発明はまた下式のフェノチアジン：
0003612078.tif 000004
式中、R1、R3、R4、R6、R7およびR9は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、置換または非置換アルキル、ハロアルキルもしくはアルコキシから選択され；
R2およびR8は独立して水素もしくは下式：
0003612078.tif 000005
から選択され、
R5は、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシもしくは単（一重）結合から選択され；
R10およびR11は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシもしくは単結合から選択される；
および薬学的に受容可能なその塩の、異常なタウ−タウもしくは異常な神経フィラメントの凝集の予防用かつ処置用の、特にアルツハイマー病、運動ニューロン病およびLewy小体病の予防用かつ処置用の組成物の製造における使用も提供する。
本明細書中で用いる用語「アルキル」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状の基をいい、好ましくは１〜８個の、より好ましくは１〜６個の炭素原子を有する。例えば、「アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等をいうことができる。本発明に用いる置換アルキル基の適切な置換基は、メルカプト、チオエーテル、ニトロ、アミノ、アリールオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、およびカルボニル基、ならびにアリール、シクロアルキル、および非−アリール複素環基を含む。
用語「アルコキシ」とは、上記本明細書中で定義するように、アルキル基をいい、場合により、そのアルキル基はそれらの間に挿入された酸素原子、およびそれらが付着する基質残基を有する。
用語「ハロアルキル」は、１、２、もしくは３個のハロゲン原子が付着した１〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状アルキル鎖を表す。代表的なハロアルキル基は、クロロメチル、２−ブロムエチル、１−クロロイソプロピル、３−フルオロプロピル、2,3−ジブロムブチル、３−クロロイソブチル、ヨード−ｔ−ブチル、トリフルオロメチルなどを含む。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードを示す。
本発明のいくつかの化合物は、１以上の非対称的に置換された炭素原子を有し、したがって、ラセミ体および光学活性体で存在する。本発明はまた、化合物のラセミ体形態ならびにそれらの任意の光学活性形態を包含することを意図する。
薬学的に受容可能な酸付加塩は、式（Ｉ）の塩基性化合物と、無機酸、例えば、塩酸および臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸（hydrohalic acid）、硫酸、硝酸、リン酸など、もしくは有機酸、例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの間に形成される。
特に好ましい実施態様においては、本発明は、上記のフェノチアジン、
式中、
R1、R3、R4、R6、R7およびR9は独立して、水素、−CH3、−C2H5、もしくは−C3H7から選択され；
R2およびR8は独立して
0003612078.tif 000006
から選択され、式中R10およびR11は独立して単結合、水素、−CH3、−C2H5、もしくは−C3H7から選択され；
R5は、単結合、水素、−CH3、−C2H5もしくは−C3H7から選択される、および薬学的に受容可能なそれらの塩を提供する。
特に好ましいのは、以下のフェノチアジンである：
0003612078.tif 000007
異常なタウ−タウ会合のブロッキングに有用な化合物、好ましくはフェノチアジン（図23および24）は、0.4未満の結合係数およびタウ−チューブリン結合アッセイにおける阻害の欠除により特徴付けられ、好ましくは、タウのモル濃度に関してモル比が1000:1までである。
本発明のフェノチアジンは、当該分野で公知であり、標準的なテキストに示された方法により製造することもできる（例えば、Merck Manual,Houben−Weyl,Beilstein E III/IV 27,1214 ff,J.Heterocycl.Chem.21,613（1984），など）。
上記の式の化合物、それらの薬学的に受容可能な塩、または示したアッセイにおいて定義された性質を有することがわかった他の化合物は、毒性に関するさらなるテストの後に薬物として用いることができる（例えば、医薬製剤の形態で）。幅広い範囲の医学的適応症におけるメチレンブルーの薬学的使用が以前から記載されてきており、それらには、メトヘモグロビン血症の処置および躁鬱病の予防が含まれ（Naylor（1986）Biol.Psychiatry 21,915−920）、そして全身投与後のCNS浸透も記載された
0003612078.tif 000008
Azure AおよびAzure Bの生成は、メチレンブルーの正常な代謝変性産物として生じる（Disanto and Wagner（1972a）J.Pharm.Sci.61,598−602;Disanto and Wagner（1972b）J.Pharm.Sci.61,1086−1094）。医薬の投与は、例えば経口で（錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質および軟質ゼラチンカプセル、溶液、乳濁液もしくは懸濁液の形態で）、鼻腔に（例えば、鼻腔スプレーの形態で）、直腸に（例えば、坐薬の形態で）局所的に行うことができる。しかし、投与はまた筋肉内もしくは静脈内のような局所的にも行うことができる（例えば、注射溶液の形態で）。
錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセルの製造のため、式Ｉの化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸付加塩を、薬学的に不活性な無機もしくは有機賦形剤を用いて加工することができる。ラクトース、トウモロコシデンプンもしくはその誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩等を、例えば、そのような賦形剤として、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセルに用いることができる。
軟質ゼラチンカプセルに適した賦形剤は、例えば、植物油、ロウ、脂質、半固体および液体ポリオールなどである。
溶液およびシロップの製造に適した賦形剤は、例えば、水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコースなどである。
注射用溶液に適した賦形剤は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等である。
坐薬に適した賦形剤は、例えば、天然のもしくは固化した油、ロウ、脂質、半固体もしくは液体ポリオールなどである。
さらに、この医薬調製物は、保存料、可溶化剤、増粘物質、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を変化させる塩、緩衝液、コーティング剤もしくは抗酸化剤を含むこともできる。それらはまた、さらに治療的に価値のある物質を含むことができる。
本発明によると、上記の式の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な塩は、アルツハイマー病の処置もしくは予防に、特に異常なタウ−タウ会合のブロッキング、調整、および阻害のために用いることができる。用量は幅広い範囲で変化し得、もちろん、各々特定の場合における個々人の必要性に合わせる。一般に、経口投与の場合、一日に約50mg〜約700mgで十分のはずであり、好ましくは約150mg〜約300mgを好ましくは１〜３ユニットの用量に分け、それらは例えば、同量である。しかし、上記に示した上限は、これが指示されたものとわかっている場合には、越えることができるということが理解されるであろう。
本発明は、添付の図面と一緒に読む場合、よりいっそう理解することができる：
図1:微小管に結合しているタウタンパク質の図（Butner and Kirschner、前出、の後に改変）。
図2:タウタンパク質のアイソフォームの略図、図21に示したアミノ酸配列およびcDNA配列に対応。252残基のＮ−末端ドメインは、さらに58残基にのぼる１または２個の挿入物（"1"、"2"）、それに続く３または４個の縦列反復物を有する93〜125残基の縦列反復領域、および64残基のＣ−末端尾部を有する。濃縮プロテアーゼ耐性PHF−コア調製物から単離したタウフラグメントは、"F5.5"と命名され、３反復および４反復アイソフォームの両方から誘導した種の混合物からなるが、93〜95残基で、３反復に相当するものを含み、それらは縦列反復領域の縦列の正常な機構に関して14〜16残基フェーズシフトしている。全てのF5.5種および正常タウは、mAb7.51によって認識されるが、mAb423は、Glu391で終結しているF5.5フラグメントしか認識しない。mAb499、AT8および342に対するエピトープの位置もまた示されている。
図3:コアPHF調製物から放出された12kDaのF5.5フラグメントのＮ−末端配列分析は、３−反復（A:反復１−3;SEQ ID NO:1）もしくは４−反復（B:反復１−3;SEQ ID NO:2、またはC:反復２−4;SEQ ID NO:3）アイソフォームに由来する３組に分けることのできる６個の異なるペプチドの存在を明らかにした（Jakes et al.,前出）。mAb423免疫反応性は、Glu−391でのＣ−末端境界を規定するのに役立つ（矢印で示す、Novak et al.（1993），前出）。このようにして、Ｎ−およびＣ−末端境界は、配列相同性反復に関して14−16残基シフトしているPHFコア内の縦列反復領域の同調化（phasing）を規定するのに役立つ。この最小限のプロテアーゼ耐性コアPHFタウユニットは、93/95残基の長さであり、３反復したものと正確に等価である。このユニットの境界はまた、Butner and Kirschner（前出）によって提案されたチューブリン結合ドメインに関してはフェーズ外にあり、下線を付して示されている。
図4:コントロールおよびアルツハイマー病における総タウタンパク質含有量。正常可溶性タウ（白色）は、コントロール中に見られる主な形態であり、一方、アルツハイマー病においては、タウの主な形態は、PHFに重合している（黒）。
図5:アルツハイマー病の初期の可溶性タウ、リン酸化されたタウ、およびもつれの数における変化（Lai et al.（1995），前出）。PHF結合タウの蓄積を水平軸に示す。これは、正常可溶性タウにおける相対的な喪失と同調している。リン酸化されたタウの最初の出現は、もつれの最初の出現と緊密に関連している。しかし、これらの両方とも、可溶性から重合したタウへのフェーズの実質的な再分布の後でないと出現しない。
図6:アルツハイマー病の初期における、新しいタウの合成から可溶性タウプールへの移行の計算された速度（ａ）、および可溶性タウからPHF結合プールへの移行の計算された速度（ｂ）（Lai et al.（1995），前出）。可溶性タウレベルが580pmol/gより下がるにつれて、PHF産生速度に追いつくように漸進的により多くのタウ合成が必要とされ、これは、可溶性タウの周囲のレベルに関してネガティブフィードバック形式で調節されているようである（ａ）。可溶性タウからPHFへの移行速度は、PHF−タウの周囲のレベルに関して幾何級数的である（ｂ）。
図7:アルツハイマー病におけるタウタンパク質のPHFへの形態変化の仮説的概要。一旦タウが固定されて短縮されると、高親和性の異常なタウ捕獲部位が露出される。タウのさらなる分子が捕獲されると、部分的なタンパク質分解のみが可能となる。なぜなら、高親和性タウ−タウ会合の領域は、さらなるタウ分子の捕獲に利用し得るさらなる高親和性タウ捕獲部位を残して、タンパク質分解から保護されているからである。可溶性から短縮型PHF結合相へのタウタンパク質の再分布は自己触媒的であり、反復性の高親和性タウ捕獲と部分的タンパク質分解により仲介される。
図8:2つの短縮型ユニットの結合を測定するタウ結合アッセイの構成。Ala−390で終結した種（"a"）で最初にELISAプレートを被覆する（炭酸ナトリウム緩衝液中:50mM、pH9.6）。次いで、Glu−391で終結している第２の短縮型タウ種（"e"）を、図９に示した種々の緩衝液条件下でインキュベーションする。"e"種のみがmAb423によって認識され、したがって、mAb423の免疫反応性は、第２のインキュベーションの間に結合するタウのみを測定する。
図9:リン酸緩衝正常生理食塩水（”正常”）、水（”水”）および炭酸ナトリウム緩衝液（”炭酸”、50mM、pH9.6）中での"e"種（０または20μg/ml）の"a"（０または10μg/ml）への結合。垂直方向の軸は、mAb423免疫反応性を示す。"a"種のみで被覆した場合には免疫反応性は検出されない。なぜなら、mAb423は、"a"を認識しないからである。前もって"a"を接種しないで"e"をインキュベーションすると、免疫反応性は検出されない。これは、用いたブロッキング条件が、"e"のELISAプレートへの非特異的結合を妨げるからである。免疫反応性は、"a"および"e"がどちらも存在する条件下でのみ見られ、"a"に結合した"e"のみの特異的検出を示す。"e"が炭酸ナトリウム緩衝液に添加される場合には、結合は見られない。したがって、この条件は、この条件で自己凝集が最小化されるので、最初の"a"の接種にとっては最適な条件である。
図10:完全長タウ（"t"）の、先に固相に受動的に結合している短縮型コアタウユニット（"a"）への結合の測定のための一般的な構成。コアPHFの短縮型タウユニットに相当する組換えタウフラグメント（"a"）を、ELISAプレートに種々の濃度で、タウ−タウ会合にとっては好ましくないことが示された条件下で接種する（図９）。ブロッキング後、完全長組換えタウ（"t"）を、タウ−タウ結合の選択的な検出を可能にする条件下で接種する。結合は、適切な抗体で検出され、この抗体は、完全長タウのＮ−末端近くに位置するエピトープを認識する。この抗体は"a"を認識しない。
図11:完全長タウ（"T40"）の、Ala−390で終結する短縮型コアタウユニット（"a"）への結合のKdの、結合した完全長ヒトタウを測定するmAb499を用いる測定。上部グラフの水平方向の軸は、用いたT40の濃度を示し、そして垂直方向の軸は、mAb499の免疫反応性を示す。各結合曲線は、示された"a"の接種濃度で入手する。"a"がない場合、結合はなく、用いたアッセイ条件下でのT40の非特異的結合がないことを確証する。結合は、T40の濃度と"a"の濃度の両方に依存する。下の図は、"a"の各接種濃度に対応するKdの計算値を示す。"a"の濃度が増大するにつれ、飽和条件は漸近的に近づき、そしてこれは、T40の短縮型コアタウユニットへの結合の飽和Kdを表し、この実験では、22.8nMと測定された。
図12:図10に示した標準的アッセイ形式を用い、"a"種を10μg/mlの濃度で被覆し、そしてT40を示した濃度（０〜50μg/mlの範囲）で加え、一定のpH（pH7.4）で、塩化ナトリウム濃度を変えて結合を測定した。安定状態は、生理学的塩濃度である137mMの付近で観察された。結合は、適度に低い、および高い塩濃度で低下するが、非常に低い塩濃度がより好ましい。
図13:図12に示したのと同様の実験で、塩化ナトリウム濃度を137mMで一定に保ち、pHを０〜10の範囲で変化させ、比較のため、生理学的リン酸緩衝正常生理食塩水（"PBS"、pH7.4）中での結合をしめす。結合は、極端なpHで低下する。mAb499および342によって検出された結合を示す。
図14:固相の短縮型コアタウユニットの"a"を用い、Biernat et al.,（1992）EMBO J.11,1593−1597）の方法を用いてin vitroでリン酸化した（"T40P"）もしくはリン酸化しない（"T40"）完全長タウをインキュベーションする典型的な結合曲線。Kdは、この実験でリン酸化されることにより、10倍減少したが、水相および固相におけるリン酸化の状態を規則正しく変化させると、リン酸化の全体としての効果は、平均して20倍の結合阻害を示すことができる。リン酸化の胎児状態は、異常なタウ−タウ結合を測定するために重要であると幾人かの人々によって提案されており、水相に導入される場合のラット胎児タウ（"POTr"）がコアタウユニットへ異常な結合ができないことをここに示す。
図15:図14とは対照的に、胎児タウが固相に受動的に結合された後、完全長非リン酸化タウの結合が可能である。完全長タウ（"T40"）および胎児タウ（"POTau"）の濃度を示した濃度範囲内で変化させた典型的な結合曲線をＡに示す。誘導された漸近的なKdをＢに示す。完全長タウが短縮型コアタウユニットに結合するように、完全長タウの固定された胎児タウへの結合も、〜20nMという同じKdを有する。したがって、胎児タウは水相で存在する場合にはタウに結合しないが（図14）、固相への受動的な結合だけでタウ結合種に変換される。したがって、タウの固体マトリックスへの受動的な結合は、高親和性タウ捕獲部位を露出する。
図16:水相もしくは固相において示される種を用いるタウ−タウ結合アッセイにおけるKd値の比較。水相で用いられる完全長組換えタウのリン酸化は、図14に示したように、因子により結合を10倍阻害し、ラット由来の胎児／新生児タウは結合しない。新生児タウを固相で用いる場合、T40は、短縮型コアPHFユニットに対するのと同じ親和性で結合する。水相のT40のリン酸化は、30倍の結合阻害を生じる。固相の新生児タウの過リン酸化は、同程度まで阻害し、両相における過リン酸化は、50倍の結合阻害を生じる。したがって、リン酸化の仮説とは逆に、リン酸化は、本アッセイ全ての構成においてタウタンパク質の異常な自己凝集を阻害する。
図17:凝集した完全長タウタンパク質のタンパク質分解的消化。（Ａ）完全長タウ（20μg/ml）を、PBS中でdGA（20μg/ml）に結合し、洗浄し、示された濃度のPronaseと水中で５分間インキュベーションした。免疫反応性は、mAb'342（▲）、499（○）、および423（●）を用いて測定した。（Ｂ）完全長タウ（10μg/ml）は、dGA非存在下では固相で半分凝集しており、同様に消化されて、免疫反応性をmAb'342（▲）および423（●）を用いて測定した。どちらの場合にも、mAb'499および／または342に対する免疫反応性のプロテアーゼ濃度依存的な喪失が、mAb423免疫反応性の獲得とともに生じた。（Ｃ）（Ａ）の結果を略図で示す。インキュベーションされていた（hatched）固相を最初に被覆していた短縮型dGAは、反復領域との相互作用を介して高親和性で完全長タウに結合する。どちらの種も消化前はmAb423エピトープを欠いている。この複合体のタンパク質分解消化（点線）は、示したような位置にあるmAb499および342エピトープの喪失を伴いながら、完全長タウ分子のＮ−末端部分を除去する。mAb423との免疫反応性の獲得は、完全長タウのGlu−391での短縮を示す。タンパク質分解に対して安定な複合体の正確なＮ−末端の長さはわかっていないが、反復領域にすぐ隣接するmAb342エピトープは含まれず、タウ結合ドメインが含まれる。
図18:短縮型タウの反復するタウ捕獲による蓄積。固相の短縮型タウフラグメント（dGA,20μg/ml）からはじめて、完全長組換えヒトタウ（20μg/ml）を結合させ、Pronase（1ng/ml）で５分間消化し、洗浄し、そしてこの調製物を再度完全長タウ（20μg/ml）と一緒にさらにインキュベーションし、もう一度消化した。この結合／消化サイクルを４回繰り返した;mAb499の免疫反応性を、各Pronase消化工程の前後に測定し、そしてmAb423は後だけに測定した。（Ａ）複合体のPronase消化は、各消化サイクルの後に固相でGlu−391で短縮化されているタウタンパク質の増加的蓄積に関連していた。（Ｂ）完全長タウの結合は、タウのＮ−末端への免疫反応性の出現により検出され（mAb499）、それは、Pronase消化により完全に破壊された。続くインキュベーションサイクルでは、水相中で一定濃度でインキュベーションした完全長タウについては結合能力は増加した。増加したmAb499の免疫反応性は、先行サイクルから残された残りの免疫反応性によって説明することはできない。したがって、Pronase消化後に残されたタンパク質分解に安定な複合体は、さらなるタウに結合する能力を保持しており、そしてこの結合能力は、短縮型タウが固相に蓄積するにつれて、増加する。
図19:標準的な阻害性のフェノチアジンの増加する濃度（水平方向の軸）の存在下での相対的タウ−タウ結合（垂直方向の軸）。この阻害は、標準的な競合阻害モデルによって表すことができ、Kiの計算値は98〜108nMである。これらの近似値の相関係数は、0.99であり、示すように統計的に高度に有意である。
図20:チオニンによるタウ−タウの選択的阻害。短縮型タウタンパク質を、489nMで、図８においてのように、水相および固相のアッセイの両方において用いた（黒丸）。タウ−チューブリンアッセイでは、脱重合したチューブリンを200nMで被覆して（白丸）、タウを400nMでインキュベーションした。結合データは、標準的モデルにより数理的に記載することができ、それは、高親和性タウ捕獲部位での競合阻害を呈する。そのKi値は、完全長タウを用いる同様の結合研究から得たKd値を用いて計算した。データの点は４回測定した平均を示す。
図21:ヒトタウタンパク質アイソフォームのヌクレオチド配列と予測されるアミノ酸配列（SEQ ID NO:4）。cDNAクローンhtau40から推定される配列は、以前に決定した３反復型（Goedert et al.（1988），前出）とは異なり、アミノ末端領域（下線）に余分な58アミノ酸が挿入され、そして以前に記載された（Goedert et al.（1989）,EMBO J.８ 393−399）31アミノ酸の余分な反復（下線）がある。ヌクレオチドは5'−3'方向に番号付けされている。このcDNAクローンhtau40（Goedert et al.（1989b）Neuron ３,519−526）は、Nde I部位（5'末端）に挿入された上記の配列およびコドン終結（＊＊＊）への3'側のEcoR I部位を有する。
図22:PHF−コアタウユニットのアミノ酸配列およびcDNA配列（SEQ ID NO:6;Novak et al.（1993），前出）および好ましいコアタウユニットの構築に用いたプライマー（SEQ ID NO:7および８）。
図23:タウ−タウ相互作用の阻害による化合物のランキング。ランキングは化合物の非存在下で見られた結合と比較し、１μg/mlおよび10μg/mlで観察された平均として採った標準化した結合に基づいている。このランキングにおいて、"1"は、化合物の非存在下で観察された結合に等しいものを表し、一方、"0.2"は、結合が、試験化合物の濃度が１μg/mlおよび10μg/mlで平均の20％まで減少したことを表す。したがって、数が小さければ小さいほど、ｅおよびａの結合の阻害における化合物の効果も大きくなるのである。見て解るように、最初の５つのフェノチアジンは、標準化した結合係数が0.4より低い。すなわち、１〜10μg/mlの範囲で見られる結合は、化合物の非存在下で見られるそれの40％より少ないのである。
図24:試験した化合物の化学構造と図23により標準化した結合に関する値。
図25:タウ、MAP2（成体型）、MAP2C（幼若型）、および高分子量タウ（末梢神経系および神経芽細胞系で見いだされる）の略図。これらのタンパク質は、同じ微小管−結合ドメインを有しているが、Ｎ−末端突出（projection）ドメインの配列および長さは実質的に異なっている。タウおよびMAP2の幼若型は縦列反復を３つしか有していない。４−反復型のMAP2も存在する。
図26:ヒトタウ（上の線;SEQ ID NO:9）およびヒトMAP2（下の線;SEQ ID NO:10）の縦列反復領域における配列の違い。垂直方向の矢印は、Glu−391で終結する短縮型PHF−コアフラグメントの境界を示し、チューブリン−結合セグメントは下線を付して示されている。
図27:pIF2発現ベクターは、SV40を基にした真核生物発現ベクターである（pSV2neo;Sambrook et al.（1989），前出;SEQ ID NO:11および12、外来DNAの発現を行うβグロビンプロモーターを含むように改変されている（M.N.Neuberger））。それは、Geneticin選択のためネオマイシン耐性マーカーを有する。
図28:PIF2::T40でトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、完全長ヒトタウタンパク質（T40）を発現し、mAb7.51（上図）およびmAb499（下図）で免疫標識したもの。細胞は、細長い過程を形成し、タウの免疫反応性もまた核周囲部において細胞骨格分布を有することがわかる。
図29:PIF::dGAEでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、Glu−391で終結した短縮型PHF−コアタウフラグメントを発現し、mAb7.51で免疫標識したもの。トランスフェクションし、チオニンなしで成長させた初期細胞系。細胞は、大いに異常であり、多核であり、液胞化し、細胞質内にタウタンパク質の凝集体を有する。
図30:リポフェクチン／タウタンパク質の、PIF2::T40でトランスフェクションした3T3細胞への移動。相対的細胞生存率（タンパク質なしでリポフェクチン処理した後、細胞数に正規化した）を、3.5μＭのチオニンなしの場合（陰なし）およびありの場合（陰あり）における、ほぼ等モル濃度の完全長タウ（T40、220nM）および短縮型タウ（dGAE、300nM）について示している。等モル濃度の場合、完全長タウの場合には総タンパク負荷は５倍以上であるという事実にも関わらず、完全長タウ（ｐ＝0.02）よりも短縮型タウの方がより毒性が強い。
図31:（Ａ）短縮型タウの毒性の打ち消し：リポフェクチンを介して完全長タウを発現している3T3細胞に移動した短縮型タウの毒性は、濃度依存性である。チオニン（実線）は、短縮型タウの３つ全ての濃度においてチオニンの非存在下で見られる毒性を打ち消した。（Ｂ）完全長タウが、リポフェクチンを介して完全長タウを発現している3T3細胞に移動した同様の実験。毒性およびチオニンの効力はともに明確さが低下した。
以下の実施例は、本発明の詳細を説明することを目的とし、それにより本発明をどのようにも限定するものではない。
実施例
実施例１:1タウ−タウ−結合アッセイ
このアッセイは、96ウェルのPVCマイクロタイタープレートを用いて行い、溶液を添加し、そして個々のウェルに関して読みとる：
ａ）50mM炭酸ナトリウム溶液中（pH9.6）０−50μg/ml（０、１、５、10、50μg/ml）の範囲で濃度が変化する50μｌの精製短縮型タウペプチド溶液を各ウェルに添加して37℃で１時間インキュベーションする。
ｂ）このマイクロタイタープレートを0.05％のTween▲Ｒ▼と一緒に、もしくはそれ無しで水で３回洗浄する。
ｃ）リン酸緩衝正常生理食塩水（"PBS"、137mM塩化ナトリウム、1.47mMリン酸二水素カリウム、8.1mMリン酸水素二ナトリウム、2.68mM塩化カリウム）で作製した200μｌの２％牛乳抽出物（"Marvel"）溶液を各ウェルに添加して37℃で１時間インキュベーションする。
ｄ）このプレートをｂ）のように洗浄する。
ｅ）１％ゼラチン、0.05％Tween▲Ｒ▼を含むPBS中の上記ａ）と同じ範囲の濃度の50μｌの完全長組換えタウ（T40）溶液を各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションする。
ｆ）このプレートをｂ）のように洗浄する。
ｇ）50μｌのモノクローナル抗体499溶液を、組織培養上清をPBS中２％牛乳抽出物（"Mervel"）で1/2に希釈して各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションする。
ｈ）このプレートをｂ）のように洗浄する。
ｉ）0.05％Tween▲Ｒ▼を含むPBSで1/1000に希釈した50μｌの二次抗体溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したブロッティンググレードの親和性精製ヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）、Bioradカタログ番号170−6516）を各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションする。
ｊ）このプレートを水中0.05％のTween▲Ｒ▼溶液で３回洗浄し、次いで水で一回洗浄する。
ｋ）発色溶液の調製は以下の通りである。10〜15mgの3,3'、5,5'−テトラメチルベンジジン（TMB;BCLカタログ番号784974）をジメチルスルホキシド中に最終濃度が10mg/mlとなるように溶解する（TMB溶液）。水90mlに10mlの酢酸ナトリウム保存液（0.5M、pH5.0）を添加する。撹拌中に1mlのTMB溶液をゆっくりと添加し、次いで10μｌの過酸化水素を添加する。
ｌ）50μｌのTMB溶液を各ウェルに添加してペルオキシダーゼ呈色反応を行い、発色速度を２分間にわたって650nmで、Molecular Devices Microplate reader中で、Kinetic L1 Softmax sofware packageを用いて読みとる。
実施例２：組換えタウフラグメントの調製
タウのcDNAを、標準的なプロトコール（Sambrook et al.,前出）を用いて、その組織を死後３時間で入手したアルツハイマー病患者の脳組織から単離したmRNAから生成した。cDNAライブラリーを、PHFコアタンパク質（Goedert et al.（1988），前出）の一部に由来する配列から誘導した合成17merオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングした。完全長cDNAクローンをM13mp18のEcoR I部位にサブクローニングし、部位特異的変異を用いて開始コドンに関連するNde I部位を誘導した。Nde IおよびEcoR Iによる開裂に続き、得られたcDNAフラグメントをNde I/EcoR Iで切断した発現プラスミドpRK172のT7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流にサブクローニングした（McLeod et al.（1987）EMBO.J,６,729−736）。pRK172は、pBR322の誘導体で、pBR322のコピー数の制御領域を除去してあるため、E.coli内で非常に多くのコピー数に増える。このプラスミドは、組換えクローンの選択のため、アンピシリン耐性遺伝子を有している。
タウの短縮型をコードしている構築物は、Novak et al.（1993,前出）に記載されたようにmRNAから調製した。このmRNAを、特別なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の鋳型として用いた。このセンスプライマーは、Nde I部位を有し、アンチセンスは、EcoR I部位を有する。PCRフラグメントを、上記のようにpRK172にサブクローニングした。dGAEの構築に用いたプライマーを図22に示す。発現用に用いた全てのDNAの正当性は、両鎖の完全長配列決定により確認した。
htau40（"T40"）cDNAの構築の詳細は、（Goedert et al.（1989），前出）に記載されている。この配列は、CNS中に見いだされたタウの最長の形態で、各々が29アミノ酸の２つのＮ−末端挿入物とチューブリン結合ドメイン中の余分な31アミノ酸反復物を有するタウタンパク質をコードしている。このDNA配列およびその予測されるアミノ酸配列を図21に示す（SEQ ID NO:4）。
組換えプラスミドを用いて、E.coli BL21（DE3）を形質転換した。この株は、原核生物の発現に用いられ、lacUV5プロモーターの制御下にあるバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有している（Studier and Moffat（1986）,J.Mol.Biol.189,113−130）。指数的に増殖する培養物をIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）で３時間誘導した。
タウフラグメントの大規模精製（1L細菌培養物）を、改変を少し加えて、Goedert and Jakes（1990,EMBO J.,９,4225−4230）によって記載されたように行った。細胞を、液体窒素中で細胞ペレットを急速冷凍することにより破壊した。次いで、このペレットを50mM PIPES、1mMジチオスレイトール（DTT）（pH6.8）を含む緩衝液で懸濁した。上清中の温度安定性のタンパク質をPIPES/DTTに対して透析し、次いで、同じ緩衝液で平衡化したホスホセルロースの入ったカラムにのせた。タウタンパク質を、上記緩衝液中のNaCl勾配（０−0.5M）により溶出させた。画分をSDS−PAGEにより、クーマシー染色およびイムノブロッティングの両方で分析した。タウを含む画分をプールし、25mM MES、1mM DTT（pH6.25）に対して透析し、約5mg/mlで−20℃で保存した。タンパク質濃度はLowry法により測定した（Harrington（1990），前出）。
実施例３：胎児MAP2Cの短縮型タウおよび完全長タウへの結合
PHF内のMAP2の欠除の一つの可能な説明は、MAP2が、反復領域における配列の違いのために、PHFのコアタウユニットに結合することができないというものである。これを２つの構成で標準的な結合アッセイを用いて実験的に試験した：固相の短縮型タウと水相の胎児MAP2C、および固相のMAP2Cと水相の完全長タウである。結合は、どちらの構成でも見ることができ、チオニンがタウ/map2結合の相互作用をブロックしていた。したがって、縦列反復領域における凝集はタウに対して選択的ではなく、チオニンのようなフェノチアジン阻害剤の阻害活性は、タウの独特な配列に依存しない。MAP2がPHF中に見られない理由は、現在のところ解らないが、いくつかの要因には、成人形態のMAP2に見られる大きなＮ−末端ドメインの貢献、細胞内の区分の違い、あるいはMAP2分子のプロセシング中の他の違いが含まれるかもしれない。
実施例４：ヒトタウタンパク質によるマウス3T3細胞のトランスフェクション
マウス線維芽細胞3T3を、βグロビンプロモーターの構成的制御下にある完全長および短縮型タウタンパク質を含む真核生物発現ベクター（pIF2）を用いてトランスフェクションした。このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして有している（pSV2neo;Sambrook et al.（1989），前出、M.N.Neubergerにより改変）。細胞を、抗菌剤および10％ウシ胎児血清を含む規定された最少必須混合物（DMEM）内で37℃で、５％CO2雰囲気内で培養した。それらを標準的なリン酸カルシウムプロトコールもしくはリポフェクション（製造者のプロコールにしたがって;Gibco BRL）のいずれかを用いてプラスミドDNAによりトランスフェクションした。プラスミドDNAが組み込まれた細胞をGeneticinを含む培地（0.5mg/ml;Southern and Berg（1982）,J.Mol.Appl.Genet.１,327）中の生存により選択した。
完全長タウタンパク質を発現している安定にトランスフェクションされた3T3線維芽細胞は容易に産生された。発現は、一般的な（mAB7.51）およびヒト特異的（mAB499）抗タウ抗体を用いて組織学的に（図28）、および細胞抽出物のイムノブロット（示していない）により示すことができた。短縮型コアタウユニットを有する同じベクターを用いてトランスフェクションを実施した場合、２つの生存可能な細胞系が生じた。短縮型タウはこれらの細胞において組織学的に示すことができたが、これらの細胞の形態は完全長タウを発現しているものに比べて大いに異常であった（図29）。異常さには、プロセス進展の欠除、大きな丸い細胞の形成、タウの細胞質蓄積、および細胞質の液胞形成を含む。しかし、これらの細胞は、不安定であることがわかり、そして、Geneticinの継続的な存在にも関わらず、短縮型タウタンパク質を発現しない形態に容易に転換した。短縮型タウの毒性は、細胞における毒性のタウ−タウ凝集体の蓄積、もしくは細胞にとって必須な外因性マウスMAPへの短縮型タウの結合のいずれかにより説明することができるかもしれない。
実施例５：タウでトランスフェクションした細胞のフェノチアジン阻害剤存在下での成長
短縮型コアタウユニットの毒性は、標準的なフェノチアジン阻害剤がin vivoでの自己凝集をブロックするために用いられる場合には、部分的に可逆的であり得る。これは、タウ−タウ結合をブロックするために必要とされる濃度で、その化合物が本来毒性でない場合に限り可能である。3T3において最も低い毒性を有する阻害剤は、チオニンおよびアクリフラビンであり、細胞は、in vitroのタウ−タウ結合の阻害のためのKi値（100nM）を実質的に越える濃度のこれらの化合物への長い露出でも生存し得る。実際には、3T3細胞は、２μＭのチオニンの存在下で数ヶ月成長することができた。
チオニンがタウ−チューブリン結合相互作用に及ぼす影響を、完全長タウタンパク質でトランスフェクションした3T3線維芽細胞を、ある範囲の濃度のチオニン存在下で培養することによりin vivoで試験した。タウ免疫反応性の正常な細胞質分布の破壊が、４−８μＭの範囲で見られ、それはin vitroでのタウ−チューブリン結合相互作用の阻害の公知のKi（８μＭ）に匹敵するが、トランスフェクションされた3T3細胞が日常的に培養されている濃度範囲（0.5−２μＭ）では、何の影響も見られなかった。これらの発見は、トランスフェクションした細胞系を、標準的な阻害剤の存在下で、細胞の生存能およびトランスジェニック完全長タウタンパク質の正常な細胞骨格分布のどちらも損なうことなく培養し得る可能性を実証する。
トランスフェクションした細胞をタウ−タウ結合の阻害剤の存在下で成長させることは、短縮型タウでトランスフェクションした細胞の生存能を用量依存性に高めることがわかった。短縮型タウでトランスフェクションした細胞系の生存数は、その細胞を高濃度のチオニン存在下で成長させた場合に増加した。さらに、半定量的規模で免疫組織化学的に測定した短縮型タウの発現の強さは、トランスフェクション後に用いられたチオニン濃度の関数として増加することが解った。
3T3細胞の形態および短縮型タウタンパク質の分布は、トランスフェクションした細胞系をチオニン存在下で産生させると異常性が大いに低くなる。短縮型タウタンパク質は、内在性の微小管ネットワークの分布に従うようであるが、タウ染色は完全長タウで見られるより壊れた特徴を有している。高レベルの短縮型タウを発現している細胞は、チオニンを除去すると、細胞の細胞質の全体的な崩壊を伴って凝集体を形成することが解った。これは、チオニンの非存在下でトランスフェクションされた細胞に関する最初の発見と類似している。
実施例６：トランスフェクションされない正常細胞系
ニューロン細胞系（N2A,NIE−115）を、２％もしくは10％のウシ胎児血清および５％のウマ血清を含むDMEM中で、コラーゲンに被覆された組織培養プレート上で培養した。これらを全て37℃で５％CO2を含む雰囲気下で成長させた。トランスフェクション前のはじめのニューロン細胞系の免疫組織化学的研究は、ジブチリル−cAMP（db−cAMP、組織培養物中の神経芽細胞を分化させることが知られている）による短時間の処理の後に、未分化な神経芽細胞（N2A細胞）の細胞質内およびPC−12細胞内に形成される、mAb423と免疫反応性の細胞質凝集体の同定にいたった。これらの構造は、神経フィラメントタンパク質（NFH;SMI−31、Sternberger et al.（1985）PNAS 82,4274−4276））を認識する抗体と免疫反応性であり、そして神経フィラメントに結合することが知られているMAP1Aを認識する抗体とは、より乏しい免疫反応性であることが示された。分化の過程で、この内在性のmAb423免疫反応性は細胞質から神経突起へシフトすることが解った。これらの細胞からのmAb423の免疫反応性の免疫沈降は、SMI−31によって認識される、ゲル移動度が230kDaの種の同定に至った。これらの結果は、齧歯類ニューロン細胞系内でmAb423によって認識される構造は、凝集した状態の高分子量神経フィラメントタンパク質を含むということを示唆するが、それらが変化したMAPをも含むという可能性も排除しない。本発明者らは、それらを推定的NFH凝集体（pNFH）という。細胞質内のpNFH凝集体の用量依存的阻害は、トランスフェクションされていないPC−12細胞においてチオニンを用いて実証することができた。
実施例7:ニューロン細胞系の完全長および短縮型タウタンパク質によるトランスフェクションおよびタウ凝集阻害剤の効果
A.  PC−12細胞
PC−12細胞を、Glu−391で短縮されたPHFコアタウフラグメントもしくは完全長タウタンパク質を有するpIF2ベクターでトランスフェクションした。3T3線維芽細胞と同じように、トランスフェクション後にチオニン中で細胞を成長させなかった場合には、短縮型タウでトランスフェクションした生存細胞系は産生されなかった。一旦安定化させて、トランスフェクションした細胞を、db−cAMPの存在下もしくは非存在下で、およびチオニンの存在下もしくは非存在下で分析した。２つの目的：細胞質pNFH凝集体の形成、およびpNFH免疫反応性の神経突起への分布、を試験した。
db−cAMPとの短時間のインキュベーションは、神経フィラメント凝集体を有する細胞の割合を９％から37％に増加させた（ｐ＜0.001）。この効果は、短縮型タウによってトランスフェクションされた細胞（10％ vs 47％、ｐ＜0.001）においても見られ、短縮型タウの異なる効果はそれ自身有意であった（ｐ＝0.005）。したがって、短縮型タウによるトランスフェクションは、db−cAMPに反応したpNFH凝集体の形成を強調した。
db−cAMP処理後のチオニン回収の効果は、pNFH凝集体を有する細胞の頻度を二倍にした（27％ vs 49％、ｐ＝0.05）。これらの増加は、完全長タウによってトランスフェクションされた細胞（16％ vs 32％）でも短縮型タウによってトランスフェクションされた細胞（36％ vs 60％）でも見られた。さらなる効果は、pNFH免疫反応性の神経突起へのチオニン依存性取り込みであった。これは、短縮型によってトランスフェクションしたPC−12細胞において特に明らかであったが、完全長タウもしくはトランスフェクションしなかった細胞ではそうではなかった（pNFH−神経突起指数は、チオニンありもしくは無しでそれぞれ0.49 vs 0.04、ｐ＝0.07）。
B.  NIE−115細胞
一般に、N2A細胞の細胞質に見られるpNFH凝集体は、トランスフェクションされていないNIE細胞では生じなかった。pNFHの免疫反応性は、初期の核周囲弓期（perinuclear−arc stage）も見られたが、むしろ、通常、分化の過程で成長しつつある神経突起に取り込まれる。NIE細胞を、上記のように、完全長もしくは短縮型タウタンパク質を有するpIF2ベクターによりトランスフェクションし、チオニン存在下で成長させた。チオニン存在下もしくは非存在下でのdb−cAMPの添加の効果を、次に試験した。
PC−12細胞と同様に、短縮型タウでトランスフェクションされた安定なNIE細胞は、チオニンの非存在下では産生されなかった。短縮型タウでトランスフェクションされたものは、完全長タウでトランスフェクションされた細胞より有意に高い頻度のpNFH凝集物を細胞質中に生じ（９％ vs 26％、ｐ〈0.001）、db−cAMPとのインキュベーションは、短縮型タウによってトランスフェクションした細胞においてpNFHの凝集を誘導したが、完全長タウによってトランスフェクションしたものでは誘導しなかった（６％ vs 36％、ｐ〈0.001）。
完全長タウでトランスフェクションした細胞では、チオニンの存在は、トランスジェニックタウタンパク質の微小管細胞骨格（微小管組織化中心、拡散した細胞質分布、および神経突起への伸長を含む）への取り込みを妨害しなかった。完全長タウでトランスフェクションした細胞におけるチオニンの回収はpNFH凝集体を有する割合を増大させた（７％ vs 16％、ｐ＝0.03）。短縮型タウでトランスフェクションした細胞では、チオニンの回収は結果的に特定の細胞系におけるpNFH凝集体を増加させ（例えば、NIE−ND6、14％ vs 44％、ｐ＝0.07）、それは分化の抑制によっても特徴付けられた。以前にはNIE細胞においてではなく未分化なN2A細胞においてのみ見られた表現形へのこの修正は著しかった。
PC−12細胞と同様に、チオニン依存性のpNFHの神経突起への取り込みは、特定の細胞におけるdb−cAMP処理後に実証することができた（例えば、チオニンありもしくは無しの場合のNIE−ND1、pNFH−神経突起指数は、それぞれ0.1 vs 0.66、ｐ＝0.01であった）。pNFHの神経突起へのチオニン依存性の移動は、チオニン存在下でのトランスフェクションされた細胞における細胞質神経フィラメントと神経突起神経フィラメントNHFとの間の免疫反応性の関係の逆転として定量的に見ることができた（チオニン無しおよびありの場合のｒ＝−0.52 vs r＝＋0.52;それぞれｐ＝0.01および0.02）。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ホフマン−ラ  ロシュ  アーゲー
（Ｂ）通り：グレンツアーヘルストラッセ124
（Ｃ）市：バーゼル
（Ｄ）州:BS
（Ｅ）国：スイス国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:CH−4070
（Ｇ）電話番号:061−688 51 08
（Ｈ）FAX番号:061−688 13 95
（Ｉ）TELEX番号:962292/965542 hlr ch
（ii）発明の名称：タウ−タウ会合の阻害
（iii）配列の数:12
（iv）コンピューター読み取り形態：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウエア:PatentIn Release＃1.0,Version＃1.30（EPO）
（２）SEQ ID NO:1の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:109アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
0003612078.tif 000009
（２）SEQ ID NO:2の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:108アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:2:
0003612078.tif 000010
（２）SEQ ID NO:3の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:109アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:3:
0003612078.tif 000011
（２）SEQ ID NO:4の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:1326塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1..1326
（xi）配列:SEQ ID NO:4:
0003612078.tif 000012
0003612078.tif 000013
0003612078.tif 000014
（２）SEQ ID NO:5の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:442アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:5:
0003612078.tif 000015
0003612078.tif 000016
（２）SEQ ID NO:6の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:291塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:6:
0003612078.tif 000017
（２）SEQ ID NO:7の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:48塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:7:
0003612078.tif 000018
（２）SEQ ID NO:8の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:47塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:8:
0003612078.tif 000019
（２）SEQ ID NO:9の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:140アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:9:
0003612078.tif 000020
（２）SEQ ID NO:10の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:140アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:10:
0003612078.tif 000021
（２）SEQ ID NO:11の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:11:
0003612078.tif 000022
（２）SEQ ID NO:12の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:SEQ ID NO:12:
0003612078.tif 000023
【図１６】
0003612078.tif 000025
【図１】
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【図２】
0003612078.tif 000027
【図３】
0003612078.tif 000028
【図４】
0003612078.tif 000029
【図５】
0003612078.tif 000030
【図６Ａ】
0003612078.tif 000031
【図６Ｂ】
0003612078.tif 000032
【図７】
0003612078.tif 000033
【図８】
0003612078.tif 000034
【図９】
0003612078.tif 000035
【図１２】
0003612078.tif 000036
【図１０】
0003612078.tif 000037
【図１１】
0003612078.tif 000038
【図１３】
0003612078.tif 000039
【図１４】
0003612078.tif 000040
【図１５Ａ】
0003612078.tif 000041
【図２６】
0003612078.tif 000042
【図１５Ｂ】
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【図１７】
0003612078.tif 000044
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
0003612078.tif 000048
【図２１Ｂ】
0003612078.tif 000049
【図２２】
0003612078.tif 000050
【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
0003612078.tif 000053
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
0003612078.tif 000055
【図２５】
0003612078.tif 000056
【図２７】
0003612078.tif 000057
【図２８】
0003612078.tif 000058
【図２９】
0003612078.tif 000059
【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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