(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列のうち１つで表されるヒトパピローマウイルス１８のＥ７タンパク質における血清反応性エピトープである抗原決定部位からなるペプチド。
【化１】
0003676195.tif 000006
【請求項２】
ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質Ｅ７に対する特異的抗体を同定するための診断用組成物であって、請求項１に記載されたペプチドから選択されるペプチドの１種またはそれ以上を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
患者血清中のヒトパピローマウイルス１８タンパク質を同定するための診断用組成物であって、請求項１に記載されたペプチドに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８のタンパク質Ｅ１、Ｅ６及びＥ７における血清反応性領域に関する。
【０００２】
本発明は上記ウイルスタンパク質の血清反応性領域のアミノ酸配列を有するペプチドを含有したワクチン及び上記ペプチドを含有した診断用キットにも関する。
【０００３】
ＨＰＶ１８は最初にProc.Natl.Acad.Sci.USA,80,3813-3815(1983) で記載された特定タイプのヒトパピローマウイルスである。
【０００４】
ＨＰＶ１８のウイルスゲノムのＤＮＡ配列及び構成はVirology,145,181-185(1985)で公表された。
【０００５】
ＨＰＶ１８は肛門性器路の良性病変ばかりでなく子宮頸部、ペニス及び膣の悪性腫瘍をも誘導する。しかしながら、ＨＰＶ１８は臨床的症状のない個体からの生殖器切片でもみられる。現在まで、ＨＰＶ１８及び他のパピローマウイルスによる感染に対する免疫応答性に関してはほとんど知られていない。
【０００６】
最初の実験では、ＳＴＤ患者、頸部腫瘍のある患者及び健康体からのヒト血清がウイルスタンパク質に対する抗体の存在に関して試験された。これらのウイルスタンパク質は様々な原核生物ペプチドにそれらのＮ末端を介して共有結合した融合タンパク質として発現された。そこでこのタイプの融合タンパク質がウェスターンブロット実験で抗原として用いられた。しかしながら、この試験は比較的時間浪費的かつ複雑であって、多大な費用でのみ行うことができ、そのため多量のヒト血清の定量分析には適さないようである。加えて、様々なパピローマウイルスタイプがそれらのタンパク質コアの面でも関連し合い、このため異なるパピローマウイルスタイプからのタンパク質又は融合タンパク質と抗体との交差反応が除外しえないことから、この試験はさほど特異的でない。
【０００７】
したがって、本発明の目的はヒトにおけるＨＰＶ１８起因性疾患の予防、診断及び治療における補助として適したＨＰＶ１８のウイルス構造を確認することである。このような構造（タンパク質ドメイン）に関する知識は、多量のヒト血清が特定ＨＰＶの存在に関して検査されうる試験の確立上必須である。
【０００８】
従って、本発明は下記アミノ酸配列：
【化３】
0003676195.tif 000002
を有するＨＰＶ１８のＥ１タンパク質における血清反応性エピトープ、下記アミノ酸配列：
【化４】
0003676195.tif 000003
のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ６タンパク質における血清反応性エピトープ、及び下記アミノ酸配列：
【化５】
0003676195.tif 000004
のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ７タンパク質における血清反応性エピトープ、に関する。
【０００９】
本発明は前記血清反応性エピトープの本発明によるアミノ酸配列のいずれか１種またはそれ以上を含んだペプチドにも関する。
【００１０】
本発明はＨＰＶ１８のタンパク質の前記血清反応性エピトープの１種またはそれ以上のアミノ酸配列を含んだペプチドに基づくワクチンにも関する。
【００１１】
ＨＰＶ１８  Ｅ１、Ｅ６及びＥ７タンパク質に対する特異的抗体は本発明による診断用キットを用いて患者血清において検出することができる。このキットは本発明によるペプチドを含有している。
【００１２】
更に、血清反応性領域を含んだ特定ウイルスタンパク質がこれらの領域に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いて適時に血清中で同定されることも予防目的から可能である。したがって、本発明はＨＰＶ１８の血清反応性領域に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を含有した診断用キットにも関する。
【００１３】
下記の相互に独立した方法は血清反応性エピトープを同定するために用いられた：
Ａ．ショットガン発現バンクのスクリーニング：細菌プラスミドベクター
ｐＳＰ６５でクローニングされたＨＰＶ１８  ＤＮＡは超音波剪断しかる後ＤＮアーゼ処理で平均サイズ１００塩基対の断片に変換された。これら断片の末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで補充され、ファージ発現ベクターｆｕｓｅ１に結合された。ｆｕｓｅ１はバクテリオファージｆｄから誘導され、Science,228,1315- 1317(1985)で記載されている。そのファージは大腸菌Ｋ９１と共にプレーティングされ、レプリカがニトロセルロースフィルターで作製され、フィルターが適切なポリクローナルウサギ血清と共にインキュベートされた。陽性クローンはいくつかの選抜ステップで単離され、免疫反応性ペプチド配列はＤＮＡ配列決定により確認された。
【００１４】
Ｂ．ペプチド重複
ＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７タンパク質の短いセグメントに相当する１２７の重複ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いてポリエチレンピン上で合成した〔Proc. Natl.Acad.Sci.82,178(1985)〕。Ｅ６及びＥ７タンパク質のタンパク質配列は次のペプチドと８アミノ酸で一致する１０マー（mer)に分割された。そのペプチドは適切な抗血清中でＥＬＩＳＡにより調べられた。
【００１５】
【実施例】
例  １
線維状ファージｆｄの誘導体を用いて、ＨＰＶ１８  ＤＮＡ断片に関する発現系を得た。このため、ｆｕｓｅ１〔ｆｄ‐ｔｅｔ‐Ｊ６，Science,228,1315- 1317(1985);Gene,73,305-318(1988)〕を単一ＰｖｕII開裂部位で切断した。ＤＮＡ修復後のＤＮアーゼＩ消化によるゲノムＨＰＶ１８  ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで平滑末端結合させた。ｆｕｓｅ１ベクターを形質転換するため、大腸菌Ｋ８０２株〔Ｆ- galK2 galT22 metB1 supE44 hsdr(2);Journal of Molecular Biology,16,118-133(1966) 〕をJournal of Molecular Biology,166,557-580(1988)におけるHanahan の方法で用いた。ｔｅｔ耐性コロニーは、それらのＦ- 表現型のために細菌に感染しないバクテリオファージを産生する。ファージを培養するため、大腸菌Ｋ９１株〔Ｆ+ ，大腸菌Ｋ３８の誘導体,Virology,49,45-60(1972)〕を用いた。
【００１６】
例  ２
前記ランダムバンクから約５０，０００の組換えファージを最少寒天プレート上で１０mMＭｇＳＯ４含有０．５％アガロース３．５ml中指数的増殖大腸菌Ｋ９１細胞０．２mlと共にプレーティングした。プレートのレプリカをニトロセルロースフィルターで作製し、しかる後シグナルを高めるため新鮮最少寒天上３７℃で更に６時間インキュベートした。次いでフィルターをＰＢＳ中１０％低脂肪ミルクで６０分間ブロックし、１：１００〜１：１０００のＨＰＶ特異性抗血清希釈の５％ミルク／ＰＢＳ中において一夜インキュベートした。特異的ＨＰＶ抗血清の代わりにモノクローナル抗体を用いることも可能である。抗血清を音波処理Ｋ９１細胞で前吸着させた。次いでフィルターを特にＰＢＳ／０．１％ツイーン２０で５分間しかる後ヤギ抗ウサギ抗体と共に室温で３時間、で５回洗浄するか、又はモノクローナル抗体が用いられる場合には５％低脂肪ミルク中で抗マウスペルオキシダーゼ抗体（１：１０００）と共にインキュベートした。フィルターを洗浄した後、それらをジアミノベンジジン３０mg、３０％強度Ｈ２Ｏ２３０μｌ及び１％強度ＮｉＳＯ４１．５ml含有ＰＢＳ５０mlで染色した。次いでフィルターをＨ２Ｏで３０分間洗浄し、しかる後濾紙上で乾燥させた。
最初に２５のファージをＨＰＶ１８  Ｅ７に対するポリクローナルウサギ血清を用いて単離し、そのうち１８が次の精製ステップで陽性とわかった。次いでファージ粒子を培養増殖させ、一本鎖ＤＮＡを得た。
【００１７】
例  ３
例２の場合と同じ方法をでＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質に関しても選択した。用いられたポリクローナルウサギ血清は非ウイルスエピトープと交差反応したため、ウェスターンブロット法以外ではすべての反応性組換え体の中からＨＰＶ１８  Ｅ６部分のあるものを同定するために特定ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた。７０，０００の組換えファージから１５を単離し、最後に配列決定した。エピトープＨＰＶ１８  Ｅ６ No.１は、例えば調べられたファージバンクの中で合計１０回みつけられた。
【００１８】
例  ４
ｆｕｓｅ１組換え体からの一本鎖ＤＮＡの製造
このためにProc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467(1977) の操作を用いた。ＬＭ５０mlをｆｕｓｅ１プラスミドを有するｔｅｔ耐性大腸菌Ｋ９１細胞と共にインキュベートし、この混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで細菌を６０００rpm で３０分間かけてペレット化した。上澄に４０％強度ＰＥＧ６０００の２ml及びｐＨ６．５の５Ｍ酢酸ナトリウム２mlの添加後、ファージを０℃で６０分間かけて沈降させ、沈降物を６０００rpm で６０分間遠心した。ペレットをＴＥ０．３mlに再懸濁した。２回のフェノール抽出の後、ＤＮＡ沈降させた。次いで約２５％の調製物を配列決定に用いた。
【００１９】
例  ５
配列決定
標準ＵＳＢ〔ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルズ(United StatesBiochemicals) 〕法（USB,1987) をＤＮＡ配列決定に用いた。ユニバーサルプライマーを２０マーオリゴヌクレオチド(5´-TCCAGACGTTAGTAAATGAA-3´)に代えた。
【００２０】
例  ６
ペプチド合成
短いセグメントでＯＲＦのＨＰＶ１８  Ｅ６及びＥ７を表す１２７の重複ペプチドをProc.Natl.Acad.Sci.USA,82,178(1985) 及びProc.Natl.Acad.Sci.81,3998(1985)で記載されたようにポリエチレンピン上でＦｍｏｃ化学により合成した。β‐アラニンで誘導されたポリエチレンピンはＣＲＢイングランド(CRB England) から得た。前記文献とは異なり、タンパク質配列は隣接ペプチドと８アミノ酸で重複したデカペプチドに分割した。合成はＦｍｏｃ化学及びＢＯＰ〔カストロ(Castro)試薬〕によるin situ 活性化を利用して行った〔Tetrahedron Letters,14,1219(1975) 〕。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（６μmol)、ＢＯＰ及びＮ‐メチルモルホリン溶液を合成されるペプチド配列に応じてポリエチレンピン（ＣＲＢ）に分配した。すべての他の反応はＣＲＢプロトコールに従い行った。
【００２１】
例  ７
ポリエチレンピンをＥＬＩＳＡアッセイ法で前記ポリクローナルウサギ血清と共にインキュベートし、結合抗体をプロテインＡペルオキシダーゼを用いて検出した。非特異的結合で生じるバックグラウンドは第一抗体なしにプロテインＡインキュベーションで定量した。反応性ペプチドは血清反応性エピトープとしてファージスクリーニングにより確認された領域に位置する。
すべてのアッセイはポリエチレンピンに共有結合されたペプチドで行われ、また、そのピン上にそれらが最初に合成されていた。マイクロタイタープレートのウェルに導入されうるような配置で固定された９６ピンを有するラックを用いた。ＥＬＩＳＡのためのインキュベーションを行い、一方でピンをウェルに浸漬した。ピンをメタノール及びＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％ゼラチン、０．１％ツイーン２０により３７℃で２時間かけてブロックし、しかる後０．１２５％ゼラチン及び０．０５％ツイーン２０で１：２００〜１：４０００希釈された血清と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ツイーン２０によるもう１回の洗浄ステップ後、ピンをプロテインＡ‐ペルオキシダーゼ１：４０００と共に３７℃で１時間インキュベートし、しかる後もう１回洗浄ステップ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で１５分間染色を行った。染色ステップは染色溶液からピンを引上げて０．２モルＨ２ＳＯ４溶液１００μｌを加えることにより停止させた。次いで吸着量を自動ＥＬＩＳＡ読取機で測定した。ＥＬＩＳＡ法の後に抗体‐酵素複合体を除去するため、ピンをＰＢＳ／１％ＳＤＳ／０．１％β‐メルカプトエタノール中６０℃で１時間超音波（水浴、３０Ｗ、４８KHz)下でインキュベートし、最後にメタノールで洗浄した。この操作の効率は一次血清を含むことなしにプロテインＡ／ペルオキシダーゼを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。同じペプチドは下記ＥＬＩＳＡで４０回以上調べた。
【００２２】
【表１】
0003676195.tif 000005