(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性膜結合キメラレセプターを発現する細胞障害性Ｔリンパ球であって、該レセプターが、（ａ）ＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞を特異的に認識してそれと結合しうる細胞外ＣＤ４部分、および（ｂ）上記リンパ球にシグナルを送って、レセプター結合ＨＩＶまたはレセプター結合細胞を破壊しうる、Ｔ細胞レセプターζ由来のトランスメンブラン部分からなる、上記リンパ球。
【請求項２】
キメラレセプターが、第８Ａ図のアミノ酸１〜３４を含んでなる、請求項１に記載のリンパ球。
【請求項３】
タンパク質性膜結合キメラレセプターを発現する細胞障害性Ｔリンパ球であって、該レセプターが、（ａ）ＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞を特異的に認識してそれと結合しうる細胞外ＣＤ４部分、および（ｂ）上記リンパ球にシグナルを送って、レセプター結合ＨＩＶまたはレセプター結合細胞を破壊しうる、ＦｃＲγIIＡまたはＦｃＲγIIＣタンパク質由来の細胞内部分またはトランスメンブラン部分からなる、上記リンパ球。
【請求項４】
細胞内またはトランスメンブラン部分が、ＦｃＲγIIＡタンパク質由来である、請求項３に記載のリンパ球。
【請求項５】
結合が、ＭＨＣ独立性である、請求項１または３に記載のリンパ球。
【請求項６】
キメラレセプターが下記のアミノ酸を含んでなる、請求項３に記載のリンパ球：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸４２１〜４６２；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸４０２〜４１９；または
（ｃ）第１５Ａ図のアミノ酸Ｔｙｒ２８２〜Ｔｙｒ２９８。
【請求項７】
細胞障害性Ｔリンパ球が、ＣＤ８+細胞障害性Ｔリンパ球である、請求項１または３に記載のリンパ球。
【請求項８】
（ａ）ＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞を特異的に認識してそれと結合しうる細胞外ＣＤ４部分、および
（ｂ）リンパ球にシグナルを送って、レセプター結合ＨＩＶまたはレセプター結合細胞を破壊しうる、Ｔ細胞レセプターζ由来のトランスメンブラン部分、または
リンパ球にシグナルを送って、レセプター結合ＨＩＶまたはレセプター結合細胞を破壊しうる、ＦｃＲγIIＡまたはＦｃＲγIIＣタンパク質由来の細胞内部分またはトランスメンブラン部分、
からなるキメラレセプターをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のキメラレセプターＤＮＡを含んでなるベクター。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、免疫系の機能を再設定することができる機能性Ｔ細胞レセプター、ＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターに関する。更に詳細には、本発明は、キメラ体の、リンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞または顆粒球における発現によってこれらの細胞を制御し、これらの細胞にキメラ体によって認識される標的に対する応答を起こさせることに関する。本発明は、機能性Ｔ細胞レセプター、ＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターキメラ体であって、治療細胞に、特異的な感染性因子に感染した細胞、感染性因子自身、腫瘍細胞または自己免疫によって生じる細胞を特異的に認識させて破壊させることができるものにも関する。更に詳細には、本発明は、細胞障害性Ｔリンパ球に、ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現する細胞を特異的に認識させ、溶解させることができるＴ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ体の生産に関する。したがって、本発明は、ＨＩＶウイルスによって引き起こされるＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）のような疾患の治療法を提供するものである。
発明の背景
Ｔ細胞レセプターによりＴ細胞が抗原を認識することは、ある領域における免疫学的現象の基礎である。Ｔ細胞は、細胞性免疫と呼ばれるものを制御する。これには、異種組織または感染細胞の免疫系の細胞による破壊が挙げられる。免疫応答を調節する「ヘルパー」および「サプレッサー」細胞や異常細胞を直接的に殺すことができる細胞障害性（または「キラー」）細胞のような各種のＴ細胞が存在する。
別の細胞の表面上に示される特異抗原を認識して結合するＴ細胞が活性化した後、増殖することができ、これが細胞障害性細胞である場合には、これは結合した細胞を殺すことができる。
自己免疫疾患は、宿主組織と反応する抗体または自動反応性である免疫エフェクターＴ細胞を産生することを特徴とする。場合によっては、体組織中の同様な化合物と交差反応する抗原を含む異種物質または生物によって活性化される正常なＴおよびＢ細胞応答によって自己抗体が生じることがある。臨床的に関連性のある自己抗体の例は、重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプターに対する抗体、および全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ、抗赤血球および抗血小板抗体である。
ＨＩＶおよび免疫病原性
１９８４年に、ＨＩＶはＡＩＤＳの病因物質であることが明らかにされた。それ以来、ＡＩＤＳの定義は、どのような判定基準を診断に包含させるべきかということに関して幾度も変更されてきた。しかしながら、診断パラメーターは様々に変動してきたが、ＡＩＤＳの単純な共通している基準はＨＩＶによる感染とそれに続く一貫した体質的な症状および二次感染症、新生物および神経疾患のようなＡＩＤＳを画定する疾患の展開である。Harrison's Principles of Internal Medicine、１２版、マックグロウ・ヒル（１９９１年）。
ＨＩＶはレンチウイルス群のヒトレトロウイルスである。４種類の認知されたヒトレトロウイルスは、２種類の異なる群に属する。ヒトＴリンパ球親和性（または白血病）レトロウイルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、およびヒト免疫不全症ウイルス、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２。前者は形質転換ウイルスであり、後者は細胞変性ウイルスである。
ＨＩＶ−１は、世界中におけるＡＩＤＳの最も一般的な起因菌として同定されている。ＨＩＶ−２とＨＩＶ−１との間の配列の相同性は約４０％であり、ＨＩＶ−２はサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）の群の幾つかの方に一層緊密に関連している。Curran, J.ら、Science, 329:1357-1359（1985）;Weiss, R.ら、Nature, 324:572-575（1986）。
ＨＩＶは、ウイルスの複製および他の生物学的活性に関与した６個の追加の遺伝子の外に、通常のレトロウイルス遺伝子（ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ）を有している。前記のように、ＡＩＤＳに共通の特徴は、主に細胞によって媒介される免疫力の著しい免疫抑制である。この免疫抑制により、様々な日和見的疾患、特にある種の感染症および腫瘍が起きる。
ＡＩＤＳにおいて免疫が欠損することのおもな原因は、胸腺由来の（Ｔ）リンパ球のサブセット、Ｔ４個体数における定量的および定性的欠損として同定されている。この細胞のサブセットは、ＨＩＶの細胞レセプターであることが示されているＣＤ４表面分子の存在により表現形で定義される。Dalgleishら、Nature, 312:763（1984）。Ｔ４細胞はＨＩＶに感染した主要な細胞種であるが、表面でＣＤ４分子を発現する本質的に総てのヒト細胞がＨＩＶに結合して、感染することができる。
伝統的には、ＣＤ４+Ｔ細胞にはヘルパー／インデューサーの役割が割り当てられ、それらの機能はＢ細胞に活性化シグナルを供給し、または相互ＣＤ８マーカーを有するＴリンパ球を細胞障害性／サプレッサー細胞とすることであることが示されている。ReinherzおよびSchlossman、Cell, 19:821-827（1980）;Goldsteinら、Immunol. Rev., 68:5-42（1982）。
ＨＩＶは、ウイルスエンベロープのアミノ酸の伸張部（ｇｐ１２０）を介してそのＮ−末端付近に位置するＣＤ４分子のＶ１領域の一部に特異的且つ高い親和性で結合する。結合の後、ウイルスは標的細胞膜と融合し、インターナライズする。一旦、インターナライズしたならば、ウイルスは酵素、逆転写酵素、を用いてそのゲノムＲＮＡをＤＮＡに転写し、これが細胞ＤＮＡに組み込まれて、生活し続けまたは「プロウイルス」としての細胞のために存在する。
このプロウイルスは潜伏したままであることがあり、または活性化してｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡを転写してタンパク質合成、アッセンブリ、新規なビリオン形成、および細胞表面からのウイルスの発芽へと至ることもある。ウイルスが細胞死を誘発する正確な機構は解明されていないが、主要な機構は細胞表面から多量のウイルスが発芽して、血漿膜を破壊し、浸透圧を不安定にすることであると思われる。
感染の経過中に、宿主生物は、主要なエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１を含むウイルスタンパク質に対する抗体を発現する。この体液性免疫にも拘らず、疾患は進行して、複合日和見感染症、寄生虫血症、痴呆および死を特徴とする致死的免疫抑制を生じる。宿主の抗ウイルス抗体によって疾患の進行を押さえることができないことは、この感染症の最も論議されており且つ心配な側面の一つを表わしており、、従来の方法に基づくワクチン法には見通しが暗い。
免疫不全症ウイルスに対する体液性応答の効力には、２つの要因が関与することがある。第一に、他のＲＮＡウイルスと同様に（特に、レトロウイルスと同様に）、免疫不全症ウイルスは宿主の免疫サーベイランスに応じて高い突然変異率を示す。第二に、エンベロープ糖タンパク質自身は高度にグリコシル化された分子であり、高親和性結合に好適なエピトープは少ない。ウイルス性エンベロープが示す標的の抗原性が余り高くないため、宿主は特異的抗体産生によりウイルス感染を制限する機会はほとんどない。
ＨＩＶウイルスに感染した細胞は、その表面上にｇｐ１２０糖タンパク質を発現する。ｇｐ１２０は、ウイルスが未感染細胞に入り込む反応と同様な反応によってＣＤ４+細胞内での融合を媒介し、寿命の短い多核巨細胞を形成するようになる。シンシチウムの形成は、ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質とＣＤ４タンパク質との直接的相互作用によって変化する。Dalgleishら、上記文献；Klatzman, D.ら、Nature, 312:763（1984）;McDougal, J.S.ら、Science, 231:382（1986）;Sodroski, J.ら、Nature, 322:470（1986）;Lifson, J.D.ら、Nature, 323:725（1986）;Sodroski, J.ら、Nature, 321:412（1986）。
ＣＤ４−ｇｐ１２０結合がＣＤ４抗原を有する細胞のウイルス感染に関与しているという証拠には、特異的複合体がｇｐ１２０とＣＤ４との間に形成されるという知見が挙げられる。McDougalら、上記文献。他の研究者らは、ＨＩＶに対して非感染性である細胞ラインが、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ遺伝子トランスフェクションおよび発現の後に感染性細胞ラインに転換したことを示している。Maddonら、Cell, 46:333-348（1986）。
ウイルス吸着やシンシチウムによって媒介される細胞伝達を妨げる受動因子としての可溶性ＣＤ４に基づく治療法が多数のグループによって提案され、イン・ビトロで成功し（Deenら、Nature, 3221:82-84（1988）;Fisherら、Nature, 331:76-78（1988）;Husseyら、Nature, 331:78-81（1988）;Smithら、Science, 238:1704-1707（1987）;Transneckerら、Nature, 331:84-86（1988））、続いて半減期が伸び且つ適度な生物活性を有するＣＤ４免疫グロブリン融合タンパク質が開発された（Caponら、Nature, 337:525-531（1989）;Transneckerら、Nature, 339, 68-70（1989）;Byrnら、Nature, 344:667-670（1990）;Zettlmeisslら、DNA Cell Biol., 9:347-353（1990））。
ＣＤ４免疫毒素抱合体または融合タンパク質は、イン・ビトロで感染細胞に対して強力な細胞毒性を示すが（Chaudharyら、Nature, 335:369-372（1988）;Tillら、Science, 242:1166-1168（1988））、免疫不全症候群は潜伏するので、いずれかの単一処理による療法がウイルスの負荷を除去するのに有効であるとは思われず、異種融合タンパク質の抗原性により反復投与を必要とする処理おける許容度が限定されるものと思われる。
ＳＩＶに感染したサルでの試験では、可溶性ＣＤ４は、著しいＣＤ４血球減少なしに動物に投与すると、ＳＩＶタイターを減少させ、骨髄ポテンシャルのイン・ビトロの尺度を向上させ得ることが示されている（Watanabeら、Nature, 337:267-270（1989））。しかしながら、処理を中断すると、ウイルスが速やかに再度出現することが観察されており、漸進的な免疫系の衰弱を防止するには一生涯服用し続ける必要があることを示唆している。
Ｔ細胞およびＦｃレセプター
Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）の最も多量に存在する形態の細胞表面での発現には、少なくとも６種類の異なるポリペプチド鎖が同時発現することが必要である（Weissら、J. Exp. Med., 160:1284-1299（1984）;Orloffhashiら、Nature, 316:606-609（1985）;Berkhoutら、J. Biol. Chem., 263:8528-8536（1988）;Sussmanら、Cell, 52:85-95（1988））α／β抗原結合鎖、ＣＤ３複合体の３種のポリペプチド、およびζ。これらの鎖のいずれかがなければ、この複合体の残りの部分の安定な発現は起こらない。ζは完全な複合体の表面発現のための制限ポリペプチドであり（Sussmanら、Cell, 52:85-95（1988））、リガンドのレセプター認識により誘発される細胞活性化プログラムの少なくとも１画分を媒介すると考えられる（Weissmanら、EMBO J., 8:3651-3656（1989）;Frankら、Science, 249:174-177（1990））。３２ｋＤａのＩ型内在性膜ホモ二量体であるζ（ツェーター或いはゼータ）には、Ｎ−結合グリカン付加の部位を持たない９残基の細胞外ドメインと、１１２残基（マウス）または１１３残基（ヒト）の細胞内ドメインがある（Weissmanら、Science, 238:1018-1020（1988a）;Weissmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9709-9713（1988b））。η（エーター）と呼ばれるζのイソ型（Baniyashら、J. Biol. Chem., 263:9874-9878（1988）;Orloffら、J. Biol. Chem., 264:14812-14817（1989））であって、交互ｍＲＮＡスプライシング経路から生じるもの（Jinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319-3233（1990））は、抗原レセプターを発現する細胞中に少量含まれている。ζ−ηヘテロ二量体は、イノシトールリン酸の形成並びにアポプトーシスと呼ばれるレセプターで開始されるプログラムされた細胞死を媒介すると考えられる（Mercepら、Science, 242:571-574（1988）;Mercepら、Science, 246:1162-1165（1989））。
ζおよびηと同様に、Ｆｃレセプターに関連したγ鎖は付加的ポリペプチドとの細胞表面複合体で発現し、その幾つかがリガンド認識を媒介し、他のものは不確定機能を有する。γ（ガンマ）は、ζに極めて類似したホモ二量体構造と全体的構成を有し、肥満細胞／好塩基性細胞高親和性ＩｇＥレセプター、ＦｃεＲＩであって少なくとも３本の異なるポリペプチド鎖から成るもの（Blankら、Nature, 337:187-189（1989）;Raら、Nature, 241:752-754（1989））と、マウスではＦｃγＲＩＩαと表わされ（Raら、J. Biol. Chem., 264:15323-15327（1989））、ヒトではマクロファージおよびナチュラルキラー細胞によるＣＤ１６サブタイプ発現、ＣＤ１６TM（ＣＤ１６トランスメンブラン）と表わされ（Lanierら、Nature, 342:803-805（1989）;Andersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2274-2278（1990））、機能が同定されていないポリペプチドを有する（Andersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2274-2278（1990））ＩｇＧに対する低親和性レセプターの一つのいずれもの成分である。最近になり、γはマウスＴ細胞ラインＣＴＬによって発現され、ホモ二量体並びにγ−ζおよびγ−ηヘテロ二量体を形成することが報告されている（Orloffら、Nature, 347:189-191（1990））。
Ｆｃレセプターは免疫複合体の食作用、トランスサイトーシスおよび抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する（RavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492（1991）;Unkelessら、Annu. Rev. Immunol.,6:251-281（1988）;及びMellman, Curr. Opin. Imuunol.,1:16-25（1988））。最近になり、ネズミの低親和性Ｆｃレセプターイソ型の一つ（ＦｃＲγＩＩＩＢ１）はＩｇをコーティングした標的のクラスリンをコーティングした核へのインターナリゼーションを媒介し、もう一方の低親和性レセプター（ＦｃｒγＩＩＩＡ）は「トリガー分子」の小さな単位の１以上の成員との関連によりＡＤＣＣを媒介することが示されている（Miettinenら、Cell, 58:317-327（1989）;およびHunzikerおよびMellman, J. Cell Biol., 109:3291-3302（1989））。これらのトリガー分子であるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ζ鎖、ＴＣＲη鎖およびＦｃレセプターγ鎖は、異なる免疫系レセプターのリガンド認識ドメインと相互作用し、集合の後に、細胞溶解のような細胞エフェクタープログラムを自立的に開始することができる（Samelsonら、Cell, 43:223-231（1985）;Weismanら、Science, 239:1018-1020（1988）;Jinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319-3323（1990）;Blankら、Nature, 337:187-189（1989）;Lanierら、Nature, 342:803-805（1989）;KurosakiおよびRavetch、Nature, 342:805-807（1989）;Hibbsら、Science, 246:1608-1611（1989）;Andersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2274-2278（1990）;およびIrvingおよびWeiss、Cell, 64:891-901（1991））。
しかしながら、ネズミおよびヒトの低親和性Ｆｃレセプター類を比較したところ、ヒトＦｃＲγＩＩＡとＣイソ型にはネズミの対応物がないことが明らかになった。一部はこのために、それらの機能は未だ確定されていない。
ＣＤ４に基づく体液性因子によりイン・ビボでの有用性が制限されることがあるので、本発明者らはＨＩＶに対する細胞性免疫の増加の可能性について検討を開始した。その結果、本発明者らは、タンパク質キメラ体の調製であってＣＤ４の細胞外ドメインをＴ細胞レセプター、ＩｇＧＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターシグナル形質導入要素のトランスメンブランおよび／または細胞内ドメインに融合することを特徴とする調製を報告する。細胞外ＣＤ４ドメインを含むキメラ体を発現する細胞溶解性Ｔ細胞は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現する細胞標的の、強力なＭＨＣとは無関係の破壊を示す。この方法の極めて重要且つ新規な成分は、単一Ｔ細胞レセプター、またはＦｃレセプターおよびＢ細胞レセプター鎖であって、その集合が細胞の応答を開始するのに十分であるものを同定することであった。
この方法の一つの特に有用な応用は、細胞溶解性Ｔリンパ球にＨＩＶｇｐ１２０を発現する細胞を認識させて殺すＣＤ４とζ、ηまたはガンマーとの間のキメラ体の発明であった。
発明の要約
天然のＴ細胞、Ｂ細胞およびＦｃレセプターは、極めて複雑に多重結合した構造をしており、操作に好都合ではないことがあるが、本発明は、標的の認識という仕事を果たすことができる様々な分子の任意のものの分子内ドメイン間でキメラ体を作成することができることを明らかにする。特に、適当に設計された抗体分子の分子外部分に結合したＴ細胞／Ｆｃレセプターツェーター、エーターまたはガンマー鎖の分子内部分から成るキメラ体を形成することによって、免疫系の標的認識力を細胞外抗体部分によって認識される抗原に特異的に再設定することができる。したがって、病原体の表面上のある種の決定基を認識することができる抗体部分を用いれば、キメラ体を備えている免疫系細胞はその配列に適するエフェクタープログラムを有する病原体の存在に応答し、例えばヘルパーＴリンパ球は標的に対する細胞障害活性によって応答し、Ｂリンパ球は活性化されて抗体を合成するようになる。マクロファージと顆粒球は、サイトカインの放出、食細胞および反応性酸素の発生などのエフェクタープログラムを行う。同様に、腫瘍細胞を認識することができる抗体部分では、腫瘍に対する免疫系応答は効果的に上昇する。自己決定基と不適当な反応性を有する免疫細胞を認識することができる抗体では、自動反応性細胞を選択的に標的設定して破壊することができる。これらの例は好都合な説明の道具として抗体キメラ体を用いたものによっているが、本発明は抗体キメラ体に範囲を限定するものではなく、実際に、特異的な非抗体細胞外ドメインを用いることが極めて有利であることもある。例えば、ウイルス、細菌または寄生虫のレセプターである細胞外部分では、キメラ体を備えた細胞はウイルス、細菌または寄生虫決定基を発現する細胞を特異的に標的とする。抗体を使用することに比較してこの方法が有利である点は、病原体に対する天然のレセプターは病原体に対して傑出した高選択性または親和性を有することがあり、得られる免疫応答の精度が高いことである。同様に、自己抗原と不適当に反応する免疫系細胞を欠失させるには、（Ｂ細胞欠失療法の場合には完全なタンパク質のような、またはＴ細胞欠失療法の場合にはＭＨＣ複合体のような）抗原を細胞内ツェーター、エーターまたはガンマー鎖に結合させることによって、自己決定基に不適当に応答する細胞の特異的標的設定に影響を与えるだけで十分であることがある。
キメラ体のもう一つの用途は、他の形態の遺伝子工学の後にイン・ビボでの細胞の個体数を制御することである。例えば、腫瘍に浸潤するリンパ球又はナチュラルキラー細胞を用いて細胞障害性因子を腫瘍部位に運ぶ方法が提案されている。本発明は、これらのリンパ球および細胞を患者の体内から取り出してイン・ビトロで増幅することなくこれらの数および活性を制御する好都合な手段を提供する。例えば、キメラレセプターの細胞内ドメインは細胞の増殖性応答を媒介するので、細胞外ドメインに特異的な各種の統合的刺激（例えば細胞外ドメインに特異的な抗体）により細胞外ドメインを配位することによってキメラ体を有する細胞を増幅する。
本発明の具体的な態様はツェーター、エーターまたはガンマー鎖の間に又はこれらの活性断片の間にキメラ体を有するが、例えば顆粒球またはＢリンパ球におけるこれらの分子と同様な機能を有する任意のレセプター鎖を用いて本明細書に開示される提案を行うことができる。所望な免疫細胞トリガー分子の顕著な特徴は、自律的に（すなわち、一本鎖として）発現することができること、細胞外ドメインに融合して生成するキメラが治療細胞の表面に含まれるようにすることができること、および標的リガンドとの遭遇に続く集合の際に細胞エフェクタープログラムを開始することができることである。
現在のところ、キメラ体を免疫系細胞へ伝達する最も好都合な方法は、ある種の遺伝子療法によるものである。しかしながら、キメラ体レセプターを有する免疫系細胞を適当に可溶化し精製したキメラタンパク質と混合することによるこの細胞の再構成では、キメラ体の細胞外ドメインによって認識される標的に応答することができる遺伝子操作を行った細胞群も形成される。同様な方法を、例えば完全なＨＩＶレセプター、ＣＤ４を赤血球に導入して治療が行われている。この場合には、遺伝子操作を行った細胞個体群は自己再生を行うことができない。
本発明は、機能的な単純化したＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターおよびＦｃレセプターキメラ体であって免疫系の機能を再設定することができるものに関する。更に詳細には、本発明は、リンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞または顆粒球中でキメラ体を発現させ、これらの細胞がキメラ体によって認識される標的に応答するようにすることによりこれらの細胞を制御することに関する。本発明は、細胞性応答を感染性因子、腫瘍または癌性細胞、または自己免疫によって生じた細胞に向ける方法にも関する。哺乳類における細胞性応答を指示する方法は、この哺乳類に治療細胞の有効量を投与し、この細胞が前記の感染性因子、腫瘍、癌細胞または自己免疫によって生じた細胞を認識して破壊することができるようにすることから成る。
もう一つの態様では、細胞性応答を感染性因子に向ける方法は、この因子を認識して破壊することができる治療細胞を投与することからなり、ここで因子は特異的ウイルス、細菌、原生動物またはカビである。更に具体的には、この方法はＨＩＶおよびPneumocystis cariniiのような因子に対して向けられる。
具体的には、本発明はＨＩＶに感染した細胞に対する細胞性応答を指示する方法を提供する。この方法は、細胞障害性Ｔリンパ球の有効量を患者に投与することからなり、このリンパ球はＨＩＶに感染した細胞を特異的に認識して溶解することができることを特徴とするものである。
したがって、一つの態様では、本発明によればＨＩＶに感染した細胞に対して細胞性応答させる方法であって、患者にＨＩＶに感染した細胞を特異的に認識して溶解することができる細胞障害性Ｔリンパ球の有効量を投与することから成る方法が提供される。
更にもう一つの態様では、細胞障害性Ｔリンパ球にＨＩＶに感染した細胞を認識させて溶解させるキメラレセプタータンパク質が提供される。更にもう一つの本発明の態様は、キメラレセプターを含んで成るベクターで形質転換した宿主細胞から成る。
更にもう一つの態様では、本発明は、本発明のキメラレセプターに対する抗体を提供する。
ＨＩＶに感染した細胞に特異的に結合して溶解する細胞障害性Ｔリンパ球を得るために、本発明者らはレセプターキメラ体を試みた。これらのキメラレセプターは機能的に活性であり、ｇｐ１２０を発現する細胞に特異的に結合して溶解することができる顕著な能力を有する。
次に、本発明の目的は、ＨＩＶに感染した患者の治療法を提供することである。したがって、本発明はＡＩＤＳの療法に多くの重要な進歩を提供する。
本発明のこれらおよび他の非制限的態様は、下記の本発明の詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
下記の詳細な説明では、分子生物学および免疫学の分野における技術者に知られている各種の方法論を参照する。参照する既知の方法論に記載されている刊行物および他の材料は、それらを全部完全に記載されているものとして本明細書に開示の一部として引用するものである。
組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載している標準的な参考書には、Watson, J.D.ら、「遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of the Gene),」第ＩおよびＩＩ巻、the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.出版社、メンロ・パーク、カリフォルニア州（１９８７年）；Darnell, J.E.ら、「分子細胞生物学(Molecular Cell Biology)」、Scientific American Books, Inc.出版社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８６年）；Lewin, B.M.、「遺伝子ＩＩ（Genes II）」、John Wiley & Sons出版社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８５年）；Old, R.W.ら、「遺伝子操作の原理：遺伝子工学入門(Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering)」、第２版、University of California Press出版社、バークレイ、カリフォルニア州（１９８１年）;Maniatis, T.ら、「分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」第２版、Cold Spring Harbor Laboratory出版社、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（１９８９年）；及び「分子生物学における最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」Ausubelら、Wiley Press、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８９年）が挙げられる。
定義
「クローニング」とは、ベクター分子へ特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列を挿入するイン・ビトロでの組換え技術の使用を意味する。所望な遺伝子のクローニングを成功させるためには、ＤＮＡフラグメントを生成させてこのフラグメントをベクター分子に結合させる方法、複製することができる宿主細胞に複合ＤＮＡ分子を導入する方法、および感受性のある宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択する方法を用いる必要がある。
「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から産生される相補的またはコピーＤＮＡを意味する。したがって、「ｃＤＮＡクローン」とは、クローニングベクター中で行われる目的のＲＮＡ分子に相補的な二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。
「ｃＤＮＡライブラリー」とは、ｃＤＮＡライブラリーが作成される時点で細胞によって発現されるｍＲＮＡのＤＮＡコピーを有するｃＤＮＡインサートを含む組換えＤＮＡコピーのコレクションを意味する。このようなｃＤＮＡライブラリーは、当業者に知られている方法によって作成することができ、例えばManiatisら、「分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、上記引用、に記載されている。一般的には、最初に、ゲノムから特定の遺伝子をクローニングすることが所望な生物の細胞からＲＮＡを単離する。本発明の目的に好ましいものは哺乳類、特にヒトのリンパ球細胞ラインである。この目的に現在のところ好ましいベクターは、ワクシニアウイルスＷＲ株である。
「ベクター」とは、例えばＤＮＡのフラグメントをインサートまたはクローニングすることができるプラスミド、バクテリオファージまたは哺乳類若しくは昆虫のウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１個以上のユニークな制限部位を有し、定義された宿主または媒体生物中で自律複製を行い、クローニングされる配列が再現性を有するようにすることができる。したがって、「ＤＮＡ発現ベクター」とは、組換えペプチドの合成を命令することができる任意の自律要素を意味する。このようなＤＮＡ発現ベクターには、細菌性プラスミドおよびファージ、および哺乳類および昆虫プラスミドおよびウイルスが挙げられる。
「実質的に純粋」とは、自然の状態ではそれに伴う成分を実質的に含まない化合物、例えばタンパク質、ポリペプチドまたは抗体を意味する。一般的には、試料中の全材料の少なくとも６０％、更に好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％が目的の化合物であるときには、化合物は実質的に純粋である。純度は任意の適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。核酸の場合には、「実質的に純粋」とは、核酸配列、セグメントまたはフラグメントであって天然に存在する状態ではこれの側面にある遺伝子を持たない（例えば、元のゲノム位置では核酸の側面にある配列を持たない）ものを意味する。「機能性誘導体」とは、分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または「化学的誘導体」を意味する。分子の「フラグメント」、例えば本発明のｃＤＮＡ配列の任意のものとは、分子の任意のヌクレオチドサブセットを指すことを意味する。分子の「変異体」とは、分子全体またはそのフラグメントに実質的に類似している天然に存在する分子を表わすことを意味する。分子の「類似体」とは、分子全体またはそのフラグメントに実質的に類似している天然に存在しない分子を表わすことを意味する。両方の分子のアミノ酸配列が実質的に同じであるときには、一方の分子は他方の分子に「実質的に類似している」といわれる。実質的に類似しているアミノ酸分子同士は、同様な生物活性を有する。したがって、２つの分子が同じ活性を有している場合には、、これらの分子の一方が他方の分子には見られない追加のまたは若干数のアミノ酸残基をたとえ有していても、またはアミノ酸残基の配列が同一ではないときであっても、本明細書で用いられている用語の変異体であると考えられる。本明細書で用いられる分子とは、これが通常は分子の一部ではない追加の化学的残基を含むときには、もう一方の分子の「化学的誘導体」であるといわれる。このような残基は分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを向上させることができる。これらの残基は、分子の毒性を減少させ、分子のあらゆる好ましくない副作用を除去または少なくすることなどもできる。このような作用を媒介することができる残基は、例えば「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、１６版、Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルバニア州（１９８０年）に開示されている。
同様に、本発明のレセプターキメラ体の「機能性誘導体」とは、ヌクレオチド配列が「実質的に同様」であることができ且つ例えばＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレセプターキメラ体に対して同様な活性を有する分子をコードする遺伝子の「フラグメント」、「変異体」または「類似体」を包含することを意味する。
したがって、本明細書で用いられるＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレセプターキメラ蛋白質とは、「野生型」キメラ体に実質的に同様であることができ且つ同様な活性（すなわち、最も好ましくは野生型レセプターキメラ体の活性の９０％）、更に好ましくは７０％、好ましくは４０％、または少なくとも１０％）を有する任意の機能性誘導体、フラグメント、変異体、類似体または化学的誘導体を包含することを意味する。機能性キメラレセプター誘導体の活性には、（その細胞外部分による）標的とした因子または細胞への特異的結合と（その細胞内またはトランスメンブラン部分によって指示される）その結果としてのその因子または細胞の破壊が挙げられ、これらの活性は、例えば本明細書に記載の分析法のいずれかを用いて試験することができる。
本発明のＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレセプターキメラ体をコードするＤＮＡ配列またはその機能性誘導体は、連結のためのブラント末端または付着端、適当な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜付着端の充填、好ましくない連結を防止するためのアルカリホスファターゼ処理および適当なリガーゼによる連結などの従来の手法によりベクターＤＮＡと組換えを行うことができる。このような操作の手法は、Maniatisら、上記引用文献に開示されており、当業者には周知である。
ＤＮＡのような核酸分子は、転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を有し且つこれらの配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」している場合には、ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。作動可能な連結は、制御ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡ配列を遺伝子発現を行うことができるように接続している結合である。遺伝子の発現に要する制御領域の正確な性状は、生物毎に変化してもよいが、一般的にはプロモーター領域を有し、これは原核生物では（ＲＮＡ転写の開始を指示する）プロモーターとＤＮＡ配列であってＲＮＡに転写されるときタンパク質合成の開始のシグナルを送るものとを含んでいる。これらの領域は、通常は転写および翻訳の開始に関与する５′−非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などがある。
所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列に対する非コード領域は前記の方法によって得ることができる。この領域は、その転写終止制御配列、例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。よって、通常はタンパク質をコードするＤＮＡ配列に隣接する３′−領域を保持することにより、転写終止シグナルを供給することができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞では十分に機能しないときには、宿主細胞中で機能する３′領域に置換することができる。
２個のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列およびＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラコード配列）は、これらの２個のＤＮＡ配列の間の性質が（1）フレームシフト変異を導入せず、（2）レセプターキメラ遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力を妨げず、または（3）プロモーター領域配列により転写されるレセプターキメラ遺伝子配列の能力を妨げない場合には、作動可能に連結されているといわれる。もしプロモーターがＤＮＡ配列の転写を行うことができるならば、プロモーター領域はこのＤＮＡ配列に作動可能に連結されるだろう。したがって、タンパク質を発現するには、適当な宿主によって認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
本発明は、原核または真核細胞のいずれかでのＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラタンパク質（またはその機能性誘導体）の発現を包含するが、真核細胞（特にヒトのリンパ球）での発現が好ましい。
本発明による抗体は、様々な方法のいずれによって調製することもできる。例えば、レセプターキメラタンパク質を発現する細胞またはその機能性誘導体を動物に投与して、キメラ体に結合することができるポリクローン性抗体を含む血清の産生を誘導することができる。
好ましい方法では、本発明による抗体はモノクローン性抗体である。このようなモノクローン性抗体は、ハイブリドーマ手法を用いて調製することができる（Kohlerら、Nature, 256:495（1975）;kohlerら、Eur. J. Immunol., 6:511（1976）;Kohlerら、Eur. J. Immunol., 6:292（1976）;Hammerlingら、「モノクローン性抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）」、Elsevier、ニューヨーク、563〜684頁（１９８１年））。総体的には、これらの手法はＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ抗原により動物を免疫することから成っている。これらの動物の脾細胞を抽出し、適当なミエローマ細胞ラインと融合する。任意の好適なミエローマ細胞ラインを本発明に準じて用いることができる。融合した後、生成するハイブリドーマ細胞を選択的にＨＡＴ培地に保持した後、Wands, J.R.らが報告した方法により希釈を制限することによってクローニングする（Gastroenterology, 80:225-232（1981））。次に、このような選定によって得られるハイブリドーマ細胞を分析して、キメラ体に結合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。
本発明による抗体はポリクローン性抗体（ポリクローナル抗体）でよいが、好ましくは領域特異的ポリクローナル性抗体である。
本発明によるＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ体を用いて、患者のキメラレセプター（キメラレセプターを有する細胞）の量を観察することができる。これらの抗体は、免疫学的または「サンドイッチ」アッセイ、例えば前進サンドイッチ、逆サンドイッチおよび同時サンドイッチアッセイのような当該技術分野に既知の標準的な免疫診断法で使用するのに極めて好適である。これらの抗体は、許容可能な特異性、感度および精度を有するイムノアッセイを行うため過度の実験を行うことなく技術者が測定を行うことができるような任意の数の組み合わせで用いることができる。
免疫学の一般的原理を記載している標準的参考書には、Roitt, I.、「免疫学要論(Essential Immunology)」、第６版、Blackwell Scientific Publications出版社、Oxford（１９８８年）；Kimball, J.W.、「免疫学入門(Introduction to Immunology)、第２版、Macmillan Publishing Co.出版社、ニューヨーク（１９８６年）；Roitt, I.ら、「免疫学（Immunology）」、Gower Medical Publishing Ltd.出版社、ロンドン（１９８５年）；Burdon, R.ら監修「生化学および分子生物学の実験室技術（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」第１３巻、Elsevier出版社、アムステルダム（１９８４年）中の「モノクローン性抗体テクノロジー（Monoclonal Antibody Technology）」；Kelin, J.、「免疫学：自己−非自己識別の科学（Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination）」John Wiley & Sons出版社、ニューヨーク（１９８２年）；およびkennett, R.ら監修、「モノクローン性抗体（モノクローナル抗体）、ハイブリドーマ：生物学的分析における新たな次元（Monoclonal Antibodies, Hybridoma:A New Dimension In Biological Analysis）」、Plenum Press出版社、ニューヨーク（１９８０年）が挙げられる。
「検出する」とは、ある物質の存在または非存在の決定または物質の量の定量を包含することを意図する。したがって、この用語は、本発明の材料、組成物および方法を用いて定性的および定量的測定を行うことを表わす。
本明細書に記載したのと同じ特異性を有するモノクローン性抗体を分泌する他のハイブリドーマを単離することは、抗イディオタイプスクリーニングの手法によって行うことができる（Potocmjakら、Science, 215:1637（1982））。簡単に説明すれば、抗イディオタイプ抗体は、目的とするクローンによって産生される抗体上に存在するユニークな決定基を認識する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、目的とするモノクローン性抗体で、モノクローン性抗体の源として用いられる同じ株の動物を免疫することによって作成する。免疫下動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を産生することによって免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識して、応答する。
複製には、ハイブリッド細胞を、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で培養することができる。イン・ビボでの生産が高いことから、これが現在のところ好ましい培養法となっている。簡単に説明すれば、個々のハイブリッド株からの細胞をプリスタンを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与して、所望なモノクローン性抗体を高濃度で含む腹水を生成させる。イソ型ＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローン性抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィ法を用いて培養した上澄液から精製することができる。
本発明による抗体はイムノアッセイに用いるのに特に好適であり、それらは液相に用いることもまたは固相担体に結合させることもできる。また、これらのイムノアッセイにおける抗体を各種の方法で検出可能に標識することができる。
多くの異なる標識および当該技術分野で知られている標識法がある。本発明に用いることができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位元素、螢光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物および金属キレートがある。当該技術分野で通常の技術を有する者であれば、抗体に結合するための他の好適な標識については知るであろうし、あるいは日常的実験を用いることによって同じことを確かめることもできるであろう。更に、これらの標識の抗体への結合は、当該技術分野における通常の技術を有する者に普通に知られている標準的な手法を用いて行うことができる。
本発明による抗体を検出可能に標識化することができる方法の一つは、抗体を酵素に連結することによる方法である。また、この酵素は、後でその基質に暴露すると、例えば分光光度法または螢光法によって検出することができる化学的部分を生じるように該基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素の例には、マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
検出可能に標識された抗体の存在は、抗体を放射性同位元素で標識した後、これをガンマーカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段により測定することによって検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位体は、3Ｈ、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、36Ｃｌ、57Ｃｏ、59Ｆｅおよび75Ｓｅである。
抗体を螢光化合物で標識することによって、検出可能に標識した抗体の結合を検出することも可能である。標識した抗体を適当な波長の光に暴露すると、その存在は染料の螢光によって検出することができる。最も普通に用いられる螢光標識化合物はフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンである。
本発明の抗体は、152Ｅｕのような螢光放射金属またはランタニド系列の他の金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属を、ジエチルエンテリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化剤を用いて抗体分子に結合させることができる。
抗体は、それらを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することもできる。化学発光標識をした抗体の存在を、次に化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミナール、イソルミナール、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキザレートエステルおよびジオキセタンである。
同様に、生物発光化合物を用いて本発明による抗体を標識することができる。生物発光は、生物系において見られる化学発光の一種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる。生物発光抗体の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識の目的に重要な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼエークォリンがある。
本発明の抗体および実質的に精製した抗原は、理想的にはキットの調製に好適である。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１種類以上の容器手段をとじた区画に収容するための区画に分けたキャリヤー手段を有しており、前記の容器手段のそれぞれには用いるアッセイの別々の要素を入れる。
キットの形態で組み込むことができるアッセイの種類は多く、例えば競合および非競合アッセイが挙げられる。本発明の抗体を用いることができるアッセイの典型的な例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫学的、またはサンドイッチ、イムノアッセイである。
「イムノメトリックアッセイ」或いは「サンドイッチイムノアッセイ」という用語には、同時サンドイッチ、前進サンドイッチおよび逆サンドイッチイムノアッセイが含まれることとする。これらの用語は当業者により充分理解されている。当業者は又、本発明の抗体が現在知られている或いは将来開発されうるアッセイの他の変法や形式において有用であることを認識するであろう。これらは本発明の範囲に属すると意図されている。
分析を行う好ましい方式では、インキュベーション媒質（通常は標識した可溶性抗体を加えたもの）にある種の「ブロッカー」が含まれていることが重要である。この「ブロッカー」は、非特異的タンパク質、プロテアーゼまたは実験試料に含まれるマウス免疫グロブリンに対するヒト抗体が交差したり、固相担体上の抗体や放射能標識したインディケーター抗体を破壊して間違った陽性または間違った陰性の結果を生じることがないようにするために加えられる。それ故、「ブロッカー」の選択は、本発明に記載されるアッセイの特異性に実質的に加える。
アッセイに用いるのと同じクラスまたはサブクラス（イソ型）の多数の関連性のない（すなわち非特異的）抗体（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２a、ＩｇＭなど）をブロッカーとして用いることができることが見出だされている。「ブロッカー」の濃度（通常は１〜１００μｇ／μｌ）は、適正な感度を保持し且つヒト血清中で交差反応性タンパク質を相互に生じることによる好ましくない干渉を抑制する上で重要である。更に、「ブロッカー」を含む緩衝剤系を最適にする必要がある。好ましい緩衝剤は、イミダゾール、ＨＥＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＲＩＳなどの弱有機酸を基剤とする生理的ｐＨ範囲のものである。好ましさは若干落ちる緩衝剤は、ホスフェート、ボレートまたはカーボネートのような無機緩衝剤である。最後に、既知のプロテアーゼインヒビターを、「ブロッカー」を含む緩衝剤に加えるべきである（通常は０．０１〜１０μｇ／ｍｌ）。
これまでに用いられてきており且つ本発明に用いることができる多くの固相免疫吸着剤がある。周知の免疫吸着剤には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロンおよび他の材料のチューブ、ビーズおよびこれらの材料から形成されるまたはこれらの材料をコーティングしたマイクロタイタープレートなどの形態をしたものが挙げられる。固定化抗体を、アミドまたはエステル結合を介する共有結合のような手法によってまたは吸収によって、固相免疫吸着剤に共有結合的にまたは物理的に結合させることができる。当該技術分野であれば、抗体を固定する多くの他の好適な固相免疫吸着剤および方法を知るであろうし、または日常的実験だけを用いてこれを確かめることができるであろう。
イン・ビボ、イン・ビトロまたは現場での診断のために、放射性核種のような標識を本発明による抗体に直接または媒介の機能性基を用いることによって結合することができる。金属カチオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合するのにしばしば用いられる媒介基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である。この方法で結合される金属カチオンの典型的例は、99mＴｃ、123Ｉ、111Ｉｎ、131Ｉ、97Ｒｕ、67Ｃｕ、67Ｇａおよび68Ｇａである。本発明の抗体は、診断の目的で非放射性同位元素で標識することもできる。この方法に特に有用な元素は、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒおよび56Ｆｅである。
本発明の抗原は、本発明による抗体を用いて実質的に純粋な形態で単離することができる。例えば、本発明の一つの態様は実質的に純粋なＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ体を提供し、前記の抗原は、本発明の抗体によって認識され、これに結合することを特徴としている。もう一つの態様では、本発明はレセプターキメラ抗原とレセプターキメラ体に向けられた１種類以上の抗体との複合体を形成することによって、前記の抗原を単離しまたは精製する方法を提供する。
逆に、本発明の実質的に純粋なＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ抗原を用いて、血清または尿のような試料のキメラに対する抗体を検出または測定することもできる。したがって、本発明の一つの態様は、試料中のレセプターキメラ抗原に対する抗体の存在または量を検出する方法であって、キメラ抗原に対する抗体を含む試料を検出可能に標識したレセプターキメラと接触させ、その標識を検出することから成る方法である。キメラの免疫反応性画分と免疫反応性類似体を用いることもできることが理解されるであろう。
「免疫反応性画分」という用語は、レセプターキメラに対して向けられる抗体に対して同等な免疫応答を示すキメラ抗原の任意の部分を意味する。「免疫反応性類似体」という用語は、１種類以上のアミノ酸がレセプターキメラタンパク質とは異なるが、本発明の抗体に対して同等な免疫応答を示すタンパク質を意味する。
「特異的に認識し、結合する」とは、キメラレセプターポリペプチドを認識し結合するが、試料、例えばレセプターポリペプチドを含む生物試料中の他の分子を実質的に認識して結合することがない抗体を意味する。
「自己免疫によって生成した細胞」とは、宿主組織または自己反応性である免疫エフェクターＴ細胞と反応する抗体を産生する細胞を意味し、このような細胞にはアセチルコリンレセプター（例えば、重症筋無力症を引き起こす）または抗−ＤＮＡ、抗−赤血球および抗−血小板自己抗体（例えば、全身性エリテマトーデスを引き起こす）に対する抗体を含む。
「治療細胞」とは、本発明のキメラによって形質転換された細胞であって、特異的な感染因子、特異的因子に感染した細胞、腫瘍または癌性細胞、または自己免疫によって生じた細胞を認識して、破壊することができる細胞を意味し、好ましくはこのような治療細胞は造血系の細胞である。
「細胞外」とは、少なくとも分子の一部が細胞表面に露出していることを意味する。「細胞内」とは、少なくとも分子の一部が治療細胞の細胞質に露出していることを意味する。「トランスメンブラン」とは、少なくとも分子の一部が血漿膜に股がっていることを意味する。本明細書に用いられる「細胞外部分」、「細胞内部分」および「トランスメンブラン部分」は、隣接の細胞区画に伸びているフランクアミノ酸配列を含むことができる。
「オリゴマー化する」とは、他のタンパク質と複合体を形成して、二量体、三量体、四量体、または他の高級オリゴマーを形成することを意味する。これらのオリゴマーは、ホモオリゴマーであることもヘテロオリゴマーであることもできる。「オリゴマー化する部分」は、複合体（すなわち、オリゴマー）形成を命令する分子の領域である。
「細胞溶解性」とは、細胞（例えば、病原体に感染した細胞、腫瘍または癌性細胞、または自己免疫によって生成した細胞）を破壊することができること、または感染性因子（例えば、ウイルス）を破壊することができることを意味する。
「免疫不全症ウイルス」とは、霊長類の宿主のＴ４細胞に感染することができ且つレンチウイルス亜科のウイルスの形態形成および形態学的特性を有する野生型のレトロウイルスを意味する。この用語は、制限なしでＨＩＶおよびＳＩＶの総ての変異体、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｍｍ、ＳＩＶｍａｎ、ＳＩＶｍａｎｄおよびＳＩＶｃｐｚを包含する。
「ＭＨＣ独立」とは、細胞の細胞溶解性応答が標的となる細胞表面上にＭＨＣクラスＩＩ抗原が存在することを必要としないことを意味する。
「機能性の細胞溶解性シグナル形質導入誘導体」とは、（前記に定義した通りの）機能性誘導体であって、野生型分子の生物活性の少なくとも１０％、好ましくは４０％、更に好ましくは７０％、或いは最も好ましくは少なくとも９０％を指示することができる誘導体を意味する。本明細書に用いられる、「機能性の細胞溶解性シグナル形質導入誘導体」は、治療細胞に直接シグナルを送り、レセプターに結合した因子または細胞を破壊することによって作用することができ（例えば、細胞内キメラレセプター部分の場合）、または治療細胞の細胞溶解性シグナル形質導入タンパク質でオリゴマー化を促進することにより間接的に作用することができる（例えばトランスメンブランドメインの場合）。これらの誘導体の効力を、例えば本明細書に記載のイン・ビトロでのアッセイを用いて、試験することができる。
「機能性のＨＩＶエンベロープに結合する誘導体」とは、任意のＨＩＶエンベロープタンパク質に結合することができる（前記に定義した通りの）機能性誘導体を意味する。機能性誘導体は、例えば本明細書に記載のイン・ビトロアッセイを用いて同定することができる。
治療薬の投与
本発明の形質転換細胞を用いて、多数の疾病を治療することができる。このような形質転換細胞の現在の投与法には、養子免疫療法または細胞転移療法がある。これらの方法では、形質転換した免疫系細胞を血流に戻すことができる。Rosenberg, S.A.、Scientific American, 62（１９００年５月）；Rosenbergら、The New England Journal of Medicine, 323（9）:570（1990）。
本発明の薬学組成物は、本発明の化合物の有益な効果を経験することができる任意の動物に投与することができる。このような動物のうちで一番最初に挙げられるのはヒトであるが、本発明はこれに限定することを意図するものではない。
詳細な説明
最初に、図面について説明する。
【図面の簡単な説明】
第１図  ＣＤ４キメラ体の特性決定。第１Ａ図は、ＣＤ４（残基１〜３６９）と異なるレセプター鎖との間の融合部位についてのアミノ酸配列を表わす。下線を付けた配列は、融合の構成に用いられるＢａｍＨＩ部位内でコードされるアミノ酸の位置を示す。トランスメンブランドメインの始まりは、垂直の棒で示す。η配列はアミノ末端におけるζ配列と同じであるが、カルボキシル末端では異なっている（Jinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319-3323（1990））。第１Ｂ図は、ＣＶ１細胞中のＣＤ４、ＣＤ４：ζ、ＣＤ４：γ及びＣＤ４：ηの表面発現のフローサイトメトリー分析を表わしている。細胞をＣＤ４キメラまたはＣＤ１６PIを発現するウイルスに感染させ、３７℃で９時間インキュベーションし、フィコエリトリン抱合抗−ＣＤ４ＭＡｂＬｅｕ３Ａで染色した。第１Ｃ図は、ＣＶ１細胞中で発現する標識したＣＤ４：ζ、ＣＤ４：γまたは天然のＣＤ４の免疫沈澱を表わす。レーンは、還元性因子を用いて（Ｒ）、または還元性因子なしで（ＮＲ）行った。ｋＤでの分子質量の基準を左側に示す。
第２図  ＣＤ１６TM単独（密な点線）の同時感染の後のＣＤ１６TMの表面発現、またはＣＤ４：γ（破線）またはＣＤ４：ζ（実線）を発現するウイルスで同時感染したＣＤ１６TMの表面発現。疎らな点線は、ＣＤ４：ζ単独で感染した細胞を示し、３Ｇ８で染色した（Fleitら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3275-3279（1982））（抗−ＣＤ１６ＭＡｂ）。
第３図  ζＡｓｐ−１５を欠く突然変異体ＣＤ４：ζキメラレセプターはＣＤ１６TMの同時発現を支持しない。第３Ａ図は、還元し（Ｒ）または還元せずに（ＮＲ）電気泳動した免疫沈澱した突然変異体キメラのオートラジオグラムである。第３Ｂ図は、ＣＤ１６TMを発現するウイルスと下記のζキメラとによる同時感染の後のＣＤ１６TMの表面発現を詳細に表わしたものである。ＣＤ４：ζ（太線）、ＣＤ４：ζＣ１１Ｃ（実線）、ＣＤ４：ζ（破線）；ＣＤ４：ζＣ１１Ｇ／Ｄ１５Ｇ（密な点線）；同時感染なし（ＣＤ１６TM単独、疎らな点線）。細胞は、抗−ＣＤ１６ＭＡｂ３Ｇ８およびマウスＩｇＧに対するフィコエリトリン抱合Ｆａｂ′2ヤギ抗体と共にインキュベーションした。ζキメラの発現の程度は、分析を行った他の突然変異体と本質的に同一であり、ＣＤ１６TMを発現するウイルスとζキメラとを用いる細胞同時感染はキメラの表面発現を余り変化させなかった（データーは示していない）。
第４図  細胞内の遊離カルシウムイオンが増加するとＴ細胞ライン中の突然変異体ζキメラの架橋が起こる。ジュルカットＥ６細胞（Weissら、J. Immunol., 133:123-128（1984））を、組換えワクシニアウイルスで感染させ、フローサイトメトリーによって分析した。図示した結果は、ゲートしたＣＤ４+の個数に対するものであり、関連するキメラタンパク質を発現する細胞だけを分析する。紫色／青色Ｉｎｄｏ−１螢光の平均比率は個体群全体における細胞内の遊離カルシウム濃度を反映しており、応答する細胞の割合は、予め決定した閾値比（未処理細胞の１０％が陽性となるように設定）を超過する細胞の画分を反映している。第４Ａ図および第４Ｂ図はＣＤ４：ζ（実線）またはＣＤ１６：ζ（破線）を発現するジュルカット細胞であって、抗−ＣＤ４ＭＡｂＬｅｕ３ａ（フィコエリトリン抱合体）に暴露した後、マウスＩｇＧに対するヤギ抗体で架橋したものを示している。点線は、抗−ＣＤ３ＭＡｂＯＫＴ３に対する未感染細胞の応答を示す。第４Ｃ図および第４Ｄ図は、ＣＤ４：ζＤ１５Ｇ（実線）；ＣＤ４：ζＣ１１Ｇ／Ｄ１５Ｇ（破線）；またはＣＤ４：ζＣ１１Ｇ（点線）を発現するジュルカット細胞を示し、これらは第４Ａ図および第４Ｂ図と同様に処理して、分析した。
第５図  ＣＤ４：ζ、ＣＤ４：ηおよびＣＤ４：γレセプターにより、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＨＩＶ−１ｇｐ１２０／４１を発現する標的を殺すことができる。第５Ａ図：黒丸、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４：ηを発現するＣＴＬ；白丸、未感染ヘラ細胞とインキュベーションしたＣＥ４：ζを発現するＣＴＬ；黒四角、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションした未感染ＣＴＬ；白四角、未感染ヘラ細胞とインキュベーションした未感染ＣＴＬ。第５Ｂ図：黒丸、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ；白丸、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４：γを発現するＣＴＬ；白四角、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣ１１Ｇ／Ｄ１５Ｇ二重突然変異体ＣＤ４：ζキメラを発現するＣＴＬ。第５Ｃ図：第５Ｂ図に用いたＣＴＬによるＣＤ４発現のフローサイトメトリーによる分析。標的／エフェクター比を補正するため、ＣＤ４キメラを発現する細胞比率を、ヒストグラムを重ね合わせることによって概算した陰性（未感染）個体数を差し引くことによって測定した。この図で比較の目的で、未感染細胞にヒストグラムの引き算とほぼ同じ他の細胞個体数に対して陽性の画分を与える任意閾値を指定した。
第６図  ＣＤ４に対する細胞溶解の特異性。
第６Ａ図：黒丸、ＣＤ１６PIを発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ；白丸、ｇｐ１２０を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４を発現するＣＴＬ；黒四角、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ１６：ζを発現するＣＴＬ；白四角、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ１６PIを発現するＣＴＬ。第６Ｂ図：黒丸、ラジ（ＭＨＣクラスＩＩ+）細胞でインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ；白丸、ＲＪ２．２．５（ＭＨＣクラスＩＩ+ラジ突然変異体）細胞でインキュベーションした未感染ＣＴＬ細胞；黒四角、ラジ（ＭＨＣクラスＩＩ+）でインキュベーションした未感染ＣＴＬ；白四角、ＲＪ２．２．５（ＭＨＣクラスＩＩ-）でインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ。縦軸の尺度は拡大している。
第７図  ＣＤ１６：ζキメラレセプターの特性決定。
第７Ａ図はＣＤ１６：ζ融合タンパク質を模式的に表わしたものである。モノマー性ＣＤ１６のホスファチジルイノシトール結合した形態をトランスメンブランドメインの直ぐ外側の二量体性ζに連結した。融合接合部のタンパク質配列を一番下に示す。第７Ｂ図は、ＴＣＲ陽性またはＴＣＲ陽性またはＴＣＲ陰性細胞ラインにおけるＣＤ１６：ζキメラの架橋の後のカルシウム起動のフローサイトメトリー分析を示す。時間０における抗体で処理した細胞個体数の中の紫色／青色螢光の平均比率（相対的カルシウムイオン濃度の尺度）を示す。黒四角、抗−ＣＤ３ＭＡｂＯＫＴ３に対するジュルカット細胞の応答；黒三角、ＲＥＸ３３ＡＴＣＲ-突然変異体における抗−ＣＤ１６ＭＡｂ３Ｇ８架橋に対するＣＤ１６：ζの応答、白四角、ジュルカットＴＣＲ-突然変異体ラインＪＲＴ３．Ｔ３．５におけるＣＤ１６：ζの架橋に対する応答、白三角、ジュルカット細胞におけるＣＤ１６：ζ架橋に対する応答、十文字、ジュルカット細胞における非キメラＣＤ１６に対する応答；および点線、ＲＥＸ３３ＡＴＣＲ-細胞ラインにおける非キメラＣＤ１６に対する応答。
第８図  細胞溶解力の欠失分析。
第８Ａ図は、ζ欠失末端点の位置を示す。ここでは、他の場合と同じく、ζにおける突然変異は元の残基−位置−突然変異体残基の慣習によって表わされているので、例えばＤ６６*は終止コドンによるＡｓｐ−６６の置換を表わしている。第８Ｂ図は、未欠失ＣＤ１６：ζおよび顕著なζ欠失の細胞溶解分析の結果を示している。ＣＤ１６に対する表面抗体を発現するハイブリドーマ細胞に51Ｃｒを加え、ＣＤ１６：ζキメラを発現するワクシニア組換体で感染した多数のヒト細胞溶解性リンパ球（ＣＴＬ）と共にインキュベーションした。放出された51Ｃｒの比率を、エフェクター（ＣＴＬ）対標的（ハイブリドーマ細胞の比率（ｅ／ｔ）の関数としてプロットする。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆｉ１８．７）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解；黒四角、ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*（ｍｆｉ９４０．２）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解；白四角、ＣＤ１６：ζＧｌｕ６０*（ｍｆｉ１６．０）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解；白丸、ＣＤ１６：ζＴｙｒ５１*（ｍｆｉ１７．４）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解；黒三角、ＣＤ１６：ζＰｈｅ３４*（ｍｆｉ１７．８）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解；白三角、非キメラＣＤ１６（ｍｆｉ５９１）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解。この実験では、ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*の発現は他の融合タンパク質の発現に匹敵しなかったが、同じ実験で同等な水準でＣＤ１６：ζを発現する細胞による細胞溶解はＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*を発現する細胞によって示されたのと（図示せず）本質的に同一な結果を得た。
第９図  トランスメンブラン相互作用の力の除去により細胞溶解を媒介することができる短いζセグメントが明らかになる。第９Ａ図は、モノマー性の２文節系および３文節系キメラを模式的に表わしたものである。一番上には、残基６５で切形し、トランスメンブランＣｙｓおよびＡｓｐ残基を欠くＣＤ１６：ζ構成物がある。その下に、ＣＤ１６：ＣＤ５：ζおよびＣＤ１６：ＣＤ７：ζ構成物および関連したコントロールが示されている。細胞内ドメインのペプチド配列を、下の方に示す。第９Ｂ図は、モノマー性キメラ欠失突然変異体の細胞溶解活性を示す。ＣＤ１：ζを発現する細胞の細胞溶解活性（黒丸；ｍｆｉ４９５）を、ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*を発現する細胞（黒四角；ｍｆｉ５２７）または突然変異体ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ａｓｐ６６*（白四角；ｍｆｉ３３８）およびＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ｇｌｕ６０*（黒三角；ｍｆｉ２５９）の細胞溶解活性と比較した。第９Ｃ図は、３文節系融合タンパク質によって媒介される細胞溶解活性を示す。黒三角、ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*；白四角、ＣＤ１６：５：ζ（４８−６５）；黒四角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）；白三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−５９）；白丸、ＣＤ１６：５；黒丸、ＣＤ１６：７。第９Ｄ図は、ＴＣＲ陰性のジュルカットＪＲＴ３．Ｔ３．５突然変異細胞ラインにおける突然変異体および３文節系キメラによるカルシウム起動を示す。白丸、二量体性ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*を発現する細胞の応答；黒四角、ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ａｓｐ６６*を発現する細胞の応答；白四角、ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ｇｌｕ６０*を発現する細胞の応答；黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）を発現する細胞の応答；およびＣＤ１６：ζ（４８−５９）を発現する細胞の応答。
第１０図  １８残基の細胞溶解性シグナル形質導入モチーフの活性に対する個々のアミノ酸の寄与。第１０Ａ図および第１０Ｂ図は、細胞溶解活性を示し、第１０Ｃ図は、カルボキシル末端のチロシン（Ｙ６２）付近の点突然変異を有するキメラによって媒介されるカルシウムイオンの起動を示す。第１０Ａ図および第１０Ｂ図は、ＣＤ１６：ζ融合タンパク質をそれぞれ少量および多量に発現する細胞について集められたデーターを表わす。カルシウム起動および細胞溶解分析については同じ記号を用い、右側に１文字コードで示されている。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆｉ、Ａでは２１、Ｂでは３７６）を発現する細胞；黒四角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）（ｍｆｉ、Ａ、３１；Ｂ、８２）；白四角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｇｌｕ６０Ｇｌｎ（ｍｆｉ、Ａ、３３；Ｂ、９２）；十文字、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ａｓｐ６３Ａｓｎ（ｍｆｉ、Ａ、３０；Ｂ、７４）；黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｔｙｒ６２Ｐｈｅ（ｍｆｉ、Ａ，２４；Ｂ，８８）；白丸、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｇｌｕ６１Ｇｌｎ（ｍｆｉ、Ａ，２０；Ｂ，６２）；および白三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｔｙｒ６２Ｓｅｒ（ｍｆｉ、Ｂ，６４）。第１０Ｄ図および第１０Ｅ図は細胞溶解活性を示し、第１０Ｆ図はアミノ末端チロシン付近の点突然変異を有するキメラによるカルシウムイオン起動を示す（Ｙ５１）。カルシウム起動および細胞溶解分析について同じ記号を用い、右側に示している。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆｉ、Ｄ，２１．２；Ｅ，６７２）を発現する細胞；黒四角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）（ｍｆｉ、Ｄ，３１．３；Ｅ，１７９）を発現する細胞；黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ａｓｎ４８Ｓｅｒ（ｍｆｉ、Ｄ，２２．４；Ｅ，２０９）；白四角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｌｅｕ５０Ｓｅｒ（ｍｆｉ、Ｄ，２５．０；Ｅ，１４２）；および白三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−５５）Ｔｙｒ５１Ｐｈｅ（ｍｆｉ、Ｄ，３２．３；Ｅ，２９４）。
第１１図  ζの内部反復の配列およびそれらの細胞溶解を支持する能力の比較。第１１Ａ図はζ細胞内ドメインを３分の１に分割し、それらにＣＤ１６：７キメラのトランスメンブランドメインを付けることによって形成されるキメラを模式的に表わしたものである。細胞内ドメインの配列を下の方に示すが、共有する残基を箱に囲っており、関連残基に星印を付けている。第１１Ｂ図は、３個のζサブドメインの細胞溶解力を示している。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆｉ、４７６）を発現する細胞；黒四角、ＣＤ１６：７：ζ（３３−６５）（ｍｆｉ、６８）；白四角、ＣＤ１６：７：ζ（７１−１０４）（ｍｆｉ、１１４）；および黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（１０４−１３８）（ｍｆｉ、１０４）。
第１２図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラを模式的に表わしたものである。
第１３図  ＣＤ４：ＦｃＲγＩＩおよびＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラの架橋の後のカルシウム起動。第１３Ａ図は、ＣＤ１６細胞外ドメインと抗体を架橋した後時間の関数として示されたカルシウム感受性の螢光団Ｉｎｄｏ−１を有する細胞によって放射される紫色／青色螢光の比率を示す。第１３Ｂ図は、抗体と架橋した後のＣＤ４：ＦｃＲγＩＩキメラを有する細胞の紫色／青色螢光の比率の増加の同様な分析を示す。
第１４図  ＣＤ４：ＦｃＲγＩＩおよびＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラの細胞溶解分析。第１４Ａ図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラ（エフェクター細胞）を発現する多数の細胞障害性Ｔリンパ球に細胞を暴露するときに、抗−ＣＤ１６ハイブリドーマ（標的）細胞から放出される51Ｃｒの比率を示す。第１４Ｂ図は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現する標的細胞に対してＣＤ４：ＲｃＲγＩＩキメラによって媒介される細胞障害性の同様な分析を示す。
第１５図  細胞溶解に重要なＦｃＲγＩＩＡ尾における残基の同定。第１５Ａ図は、欠失構成物を模式的に表わしたものである。第１５Ｂ図および第１５Ｃ図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩＡのカルボキシル末端欠失変異体によるカルシウム起動および細胞溶解を示す。第１５Ｄ図および第１５Ｅ図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩＡの細胞内尾のアミノ末端が漸進的に少なくなる３文節系キメラによるカルシウム起動および細胞溶解を示す。
第１６図（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）は、ＣＤ３デルタレセプタータンパク質のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部分を表わす。
第１７図（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）は、Ｔ３ガンマーレセプタータンパク質のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部分を表わす。
第１８図（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は、ｍｂ１レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部分を表わす。
第１９図（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）は、Ｂ２９レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部分を表わす。
実施例Ｉ
ヒトＩｇＧ１：レセプターキメラの構築
ヒトＩｇＧ１重鎖配列をＣH３ドメインにおける配列を、抗体ｍＲＮＡのトランスメンブラン形の３′末端由来のｃＤＮＡフラグメントに結合することによって作成した。３′末端フラグメントは基質としての扁桃ｃＤＮＡライブラリー、およびそれぞれ所望なＤＮＡフラグメントの５′および３′末端に対応する配列：
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）および
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
を有するオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。５′オリゴは、ヒトＩｇＧ１のＣH１ドメインにおけるある部位に相補性であり、３′オリゴはメンブランに股がるドメインをコードする配列の５′の部位に相補性である。ＰＣＲ生成物をＢｓｔＸＩおよびＢａｍＨＩで消化し、可変および定常領域を有する半合成ＩｇＧ１抗体遺伝子のＢｓｔＸＩとＢａｍＨＩ部位の間に連結させた。ＢｓｔＸＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントをインサートした後、構成物の増幅部分を制限フラグメント相互交換によってＣH３のＳｍａＩ部位まで置換し、Ｓｍａｉ部位と３′オリゴの間の部分のみがＰＣＲ反応に由来するようにした。
ヒトＩｇＧ１：ζキメラレセプターを作成するため、ＢａｍＨＩ部位の重鎖遺伝子末端を下記のζキメラのＢａｍＨＩ部位に連結して、抗体配列が細胞外部分を形成するようにした。キメラをコードするプラスミドでトランスフェクション下ＣＯＳ細胞をフローサイトメトリーによって分析したところ、軽鎖ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを同時トランスフェクションするときには抗体決定基は高度に発現し、軽鎖の発現プラスミドがないときには、抗体決定基の発現は中程度であった。
ηまたはγに融合したヒトＩｇＧ１を含む同様なキメラ（下記を参照）またはＴ細胞レセプターまたはＦｃレセプタータンパク質の任意のシグナル形質導入部分は一般的には分子生物学の標準的手法を用いて構築することができる。
重鎖も軽鎖も単一プロモーターから発現させることができる単一の転写単位を作成するために、ビシストニックｍＲＮＡをコードするプラスミドを、重鎖および軽鎖コード配列およびｇｒｐ78またはＢｉＰとして知られる７８ｋＤのグルコース制御したタンパク質コードするｍＲＮＡの５′未翻訳部分から作成した。ｇｒｐ７８配列は、それぞれ５′および３′末端における配列
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）および
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
を有するプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得た。これらのオリゴ体とのポリメラーゼ連鎖反応は、１０％ジメチルスルホキシドの存在下にて行った。ＰＣＲによって得られたフラグメントをＮｏｔＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、ヒトＩｇＧ１コード配列の下流のＮｏｔＩおよびＨｐａＩ部位の間にインサートした。ヒトＩｇＧカッパー軽鎖ｃＤＮＡをコードする配列を、次にｇｒｐ７８リーダーの下流にＨｉｎｃＩＩ部位およびベクターのもう一つの部位を用いてインサートした。これらの操作から得られる発現プラスミドは、半合成重鎖遺伝子と、ｇｒｐ７８リーダー配列と、カッパー軽鎖ｃＤＮＡ配列と、ＳＶ４０ＤＮＡフラグメント由来のポリアデニル化シグナルから成っていた。発現プラスミドによりＣＯＳ細胞をトランスフェクションしたところ、プラスミドコード重鎖決定基単独のトランスフェクションと比較して、著しく改良された重鎖決定基の発現が得られた。
重鎖／レセプターキメラおよび軽鎖とから成るビシストロニック遺伝子を作成するため、上流の重鎖配列を本明細書に記載の任意のキメラ重鎖／レセプター遺伝子で置き換えることができる。
実施例ＩＩ
ＣＤ４レセプターキメラの構築
ヒトζ（Weissmanら、Proc． Natl. Acad. Sci. USA, 85:9709-9713（1988b））およびγ（Kuesterら、J. Biol. Chem., 265:6448-6452（1990））ｃＤＮＡをＨＰＢ−ＡＬＬ腫瘍細胞ライン（Aruffoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8573-8577（1987b））およびヒトナチュラルキラー細胞から調製したライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応によって単離し、一方、ηｃＤＮＡ（Jinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319-3323（1990））をネズミ胸腺細胞ライブラリーから単離した。ζ、ηおよびγｃＤＮＡを、膜に股がるドメインの直ぐ上流にBamHI部位を有するＣＤ４の設計された形態の細胞外ドメインに連結し（Aruffoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8573-8577(1987b);Zettlemeisslら、DNA Cell Biol., 9, 347-353（1990））、これを膜に股がるドメインの数残基上流の同様な位置のζおよびηｃＤＮＡに自然に含まれるＢａｍＨＩ部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１，３，４および６）に連結した。γと融合タンパク質を形成させるため、ＢａｍＨＩ部位を、同じ近似部位の配列に組み込んだ（第１図；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および５）。遺伝子融合を、選択可能なマーカーとしてＥ．ｃｏｉｌ  ｇｐｔ遺伝子を有するワクシニアウイルス発現プラスミド中に導入し（M. AmiotおよびB.S.、未発表）、ミコフェノール酸中での成長のための同族組換えおよび選択によりワクシニアＷＲ株のゲノムにインサートした（Falknerら、J. Virol., 62:1849-1854（1988）；Boyleら、Gene, 65:123-128（1988））。フローサイトメトリー分析を行ったところ、ワクシニア組換体は細胞表面でＣＤ４：ζおよびＣＤ４：γ融合タンパク質を多量に産生する指示を行っていたが、ＣＤ４：ηの発現は実質的に弱いことを示していた（第１図）。後者の知見は、ηｃＤＮＡ発現プラスミドのネズミハイブリドーマ細胞ライン中へのトランスフェクションはこれに匹敵するζ発現プラスミドのトランスフェクションよりも実質的に発現が少ないという最新の報告と一致する（Claytonら、J. Exp. Med., 172:1243-1253（1990））。ワクシニア組換え体に感染した細胞の免疫沈澱を行ったところ、融合タンパク質は天然に存在するＣＤ４抗原とは異なり共有結合による二量体を形成することが判った。モノマー性ＣＤ４：ζおよびＣＤ４：γ融合タンパク質の分子質量および元のＣＤ４は、それぞれ６３、５５および５３ｋＤであることが判った。融合タンパク質の大きな方の質量は細胞内部分の大きな方の長さとほぼ一致し、これは元のＣＤ４の長さを７５（ＣＤ４：ζ）または５（ＣＤ４：γ）残基だけ超過する。
実施例ＩＩＩ
ＣＤ４キメラは他のレセプター鎖と関連することができる。
トランスフェクタント上でのヒトＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６TM）のマクロファージ／ナチュラルキラー細胞形態の細胞表面発現はネズミ（Kurosakiら、Nature, 342:805-807（1989））またはヒト（Hibbsら、Science, 246:1608-1611（1989））γでの同時トランスフェクション並びにヒトζ（Lanierら、Nature, 342:803-805（1989））により促進される。
これらの報告内容と一致していることであるが、キメラの発現は、組換えワクシニアウイルスで同時トランスフェクションまたは同時感染することにより標的細胞へ伝達するとき、ＣＤ１６TMの表面発現を行うこともできる（第２図）。ζによる（ＣＤ１６TM）表面発現の促進は検討を行った細胞ラインにおけるγによる促進（第２図）よりも一層顕著であったが、元のＣＤ４（データーは図示せず）はＣＤ１６TM表面発現を促進しなかった。
実施例ＩＶ
Ａｓｐζ突然変異体はＦｃレセプターと同時関連しない。
存在する抗原又はＦｃレセプターと関連しないキメラを作成するため、膜内Ａｓｐまたは膜内Ｃｙｓ残基または両者を欠いている突然変異ζ融合タンパク質を作成した。フローサイトメトリーを行ったところ、異なる突然変異キメラによる細胞表面発現の強度は、突然変異をしていない前駆体（データーは図示せず）とは余り変わらず、免疫沈澱実験では、キメラによる総発現量は同じであった（第３図）。予測されたように、トランスメンブランシステイン残基を欠く突然変異キメラ体は、ジスルフィド結合二量体を形成しないことが判った（第３図）。Ａｓｐを欠く２種類の突然変異キメラ体はＣＤ１６TMの表面発現を支持することができなかったが、Ｃｙｓを欠くがＡｓｐを有するモノマー性キメラ体はＣＤ１６TMを同時発現させることができたが、親二量体より効率は低かった（第３図）。
実施例Ｖ
突然変異レセプターはカルシウム応答を開始する能力を保持する。
融合タンパク質の架橋によりＴ細胞抗原レセプターで起こることが知られているものと同様な方法で遊離の細胞内カルシウムを蓄積するかどうかを決定するため、ヒトＴ細胞白血病ラインの細胞であるジュルカットＥ６（ＡＴＣＣ  寄託番号ＴＩＢ１５２、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州）をワクシニア組換え体で感染させ、細胞外ドメインと抗体との架橋の後、相対的細胞質カルシウム濃度を測定した。フローサイトメトリー測定を、カルシウム感受性染料Ｉｎｄｏ−１を添加した細胞で行った（Grynkiewiczら、J. Biol. Chem., 260:3340-3450（1985）;Rabinovitchら、J. Immunol., 137:952-961（1986））。第４図に、ＣＤ４：ζおよびζのＡｓｐ-およびＣｙｓ-突然変異体に感染した細胞でのカルシウムフラックス実験の結果を示す。キメラ体の架橋により、細胞内カルシウムは再現可能に増加した。ＣＤ４：ηおよびＣＤ４：γも同様に感染細胞中の細胞内カルシウムを蓄積した（データーは図示せず）。ジュルカット細胞は、細胞表面上でＣＤ４を低い水準で発現したが、ＣＤ１６：ζの存在または非存在下での元のＣＤ４の架橋（C.R.およびB.S.、未発表）（第４図および図示していないデーター）では細胞内カルシウム濃度に変化はなかった。
実施例ＶＩ
ＣＤ４：ζ、ηおよびγキメラ体はＨＩＶｇｐ１２０／４１を発現する標的の細胞溶解を媒介する。
キメラレセプターが細胞溶解エフェクタープログラムを誘導するかどうかを測定するため、ＨＩＶエンベロープｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体のＣＤ４認識に基づいたモデル標的：エフェクター系を作成した。ヘラ細胞をｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させ（Charkrabartiら、Nature, 320:535-537（1986）;Earlら、J. Virol., 64:2448-2451（1990））、51Ｃｒで標識した。標識細胞を、ＣＤ４：ζ、ＣＤ４：ηまたはＣＤ４：γキメラを発現するワクシニア組換え体またはＣＤ４：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ：Ａｓｐ１５Ｇｌｙ二重突然変異キメラに感染されたヒトの同種特異的な（ＣＤ８+、ＣＤ４-）細胞障害性Ｔリンパ球ラインからの細胞と共にインキュベーションした。第５図は、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞がＣＤ４キメラを発現する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって特異的に溶解することを示している。未感染ヘラ細胞は、ＣＤ４：ζキメラを有するＣＴＬによって標的とはされず、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞は未感染ＣＴＬによって認識されなかった。各種のキメラの効力を比較するため、エフェクター／標的比をＣＤ４キメラを発現するＣＴＬの画分に就いて補正し、且つフローサイトメトリーで測定したように、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞の画分について補正した。第５Ｃ図は、第４Ａ図および第４Ｂ図に示した細胞溶解実験に用いたＣＴＬによるＣＤ４発現のサイトメトリー分析を示す。表面ＣＤ４：ζの平均密度はＣＤ４：ηの平均密度を大きく上回ったがどちらの形態を発現する細胞の細胞溶解効率も同じであった。ｇｐ１２０を発現する標的の画分を補正すると、ＣＤ４：ζおよびＣＤ４：ηタンパク質によって媒介される細胞溶解の効率は特異的Ｔ細胞レセプター標的：エフェクター対について報告された最良の効率に匹敵する（ＣＤ４：ζを発現するＴ細胞による５０％放出に対する平均エフェクター／標的比は１．９±０．９９、ｎ＝１０であった）。ＣＤ４：γ融合体の活性は、トランスメンブランＡｓｐおよびＣｙｓ残基を欠くＣＤ４：ζ融合体の活性と同様に低かった。しかしながら、いずれの場合にも、有意な細胞溶解が観察された（第５図）。ワクシニア感染がＣＴＬによる人工的認識を促進することがあるという可能性を制御するため、同様な細胞溶解実験をＣＤ１６のホスファチジルイノシトールと結合した形態（ＣＤ１６PI）を発現するワクシニア組換え体で感染し、51Ｃｒで標識した標的細胞、及びＣＤ１６PIまたはＣＤ１６：ζを発現するコントロール組換え体に感染したＣＴＬで行った。第６Ａ図は、非−ＣＤ４キメラを発現するＴ細胞は元のヘラ細胞またはｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞を認識しないことを示しており、同様に、ＣＤ４キメラを発現するＴ細胞は他のワクシニアでコードされた表面タンパク質を発現するヘラ細胞を認識しないことを示している。また、非キメラＣＤ４を発現するＣＴＬはｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞を有意に溶解しない（第６Ａ図）。
実施例ＶＩＩ
ＭＨＣクラスＩＩを有する細胞はキメラによって標的とはならない。
ＣＤ４は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって発現される非多形配列と相互作用するものと考えられる（Gayら、Nature, 328:628-629（1987）;Sleckmanら、Nature, 328:351-353（1987））。ＣＤ４とクラスＩＩ抗原との間の特異的相互作用は精製したタンパク質では報告されていないが、ある条件下ではＣＤ４を発現する細胞とクラスＩＩ分子を発現する細胞とが付着することを示すことができる（Doyleら、Nature, 330:256-259（1987）;Claytonら、J. Exp. Med., 172:1243-1253（1990）;Lamarreら、Science, 245:743-746（1989））。次に、クラスＩＩを有する細胞に対して殺生を検出することができるかどうかを検討した。第６Ｂ図は、クラスＩＩの抗原を多量に発現するラジＢ細胞ラインに対してＣＤ４：ζによって指示される特異的細胞溶解はないことを示している。温和な（約５％）細胞溶解が観察されるが、ラジ細胞のクラスＩＩ陰性突然変異体、ＲＪ２．２．５（Accolla, R.S.、J. Exp. Med., 157:1053-1058（1983））は、未感染のＴ細胞とインキュベーションしたラジ細胞と同じ感受性を示す。
実施例ＶＩＩＩ
Ｔ細胞抗原／Ｆｃレセプターツェーター鎖による細胞溶解の誘導のための配列要件
ＣＤ４とζとのキメラは細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を有して、ＨＩＶｇｐ１２０を発現する標的細胞を殺すことができるが、ＣＤ４に対する代替物を検索してヒトＴ細胞ラインに導入されるツェーターキメラの特製を明確に比較した。これらのラインはＣＤ４を発現し、異なるキメラのカルシウム起動および細胞障害力の種類または程度の関係を特異的に定義することを困難にしうる。これを回避するために、キメラをＣＤ１６の細胞外ドメインがツェーターのトランスメンブランおよび細胞内配列に結合しているζとＣＤ１６との間に作成した（第７Ａ図）。遺伝子融合体を、選択可能なマーカーとしてＥ．Ｃｏｌｉ  ｇｐｔ遺伝子を有するワクシニアウイルス発現プラスミドに導入し、同族組換えおよび選択によってワクシニアＷＲ株のゲノムにインサートしてミコフェノール酸中で成長させた（FalknerおよびMoss、J. Virol., 62: 1849（1988）;BoyleおよびCoupar、Gene, 65:123（1988））。
Ｔ細胞ラインにワクシニア組換え体を感染させ、細胞外ドメインを抗体と架橋した後、相対的細胞質遊離カルシウムイオン濃度を測定した。分光学的螢光法（嵩固体数）およびフローサイトメトリー（単一細胞）による測定を染料Ｉｎｄｏ−１を添加した細胞で行った（Gryn-kiewiczら、J. Biol. Chem., 260:3440（1985））。第７Ｂ図は、ＣＤ１６：ツェーター融合タンパク質を発現するワクシニア組換え体で感染させたジュルカットヒトＴ細胞白血病の細胞から収集したデーターの分析を示している。このキメラ体を架橋すると細胞内カルシウムが再現可能に増加するが、非キメラＣＤ１６を発現する細胞を同様に処理したところほとんどまたは全く効果がなかった。キメラを抗原レセプターを欠く突然変異体細胞ラインで発現したところ、ＲＥＸ３３Ａ（Breitmeyerら、J. Immunol., 138:726（1987）;Sanchoら、J. Biol. Chem., 264:20760（1989））またはジュルカット突然変異体ＪＲＴ３．Ｔ３．５（Weissら、J. Immunol., 135:123（1984））、またはＣＤ１６抗体の架橋に対する強力な応答が見られた。同様なデーターはＲＥＸ２０Ａ（Breitmeyerら、上記引用文献, 1987;Blumbergら、J. Biol. Chem., 265:14036（1990））突然変異体細胞ラインおよび本実験室で確立されたジュルカット細胞ラインのＣＤ３／Ｔｉ陰性突然変異体について収集した（データーは図示せず）。ＣＤ１６：ζを発現する組換え体で感染すると、抗−ＣＤ３抗体に対する応答は保存されないことから、融合タンパク質は細胞内ＣＤ３複合体鎖を取り戻すことによって作用しないことを示している（データーは図示せず）。
キメラが細胞によって媒介される免疫を再設定する能力を評価するため、ＣＴＬをＣＤ１６キメラを発現するワクシニア組換え体に感染させ、膜結合した抗ＣＤ１６抗体を発現するハイブリドーマ細胞を特異的に溶解するのに用いた（下記参照）。このアッセイは、Ｆｃレセプターを有する細胞のエフェクター機構を分析するために最初に開発されたハイブリドーマ細胞障害性アッセイの延長である（GrazianoおよびFanger、J. Immunol., 138:945, 1987;GrazianoおよびFanger, J. Immunol., 139:35-36, 1987;Shenら、Mol. Immuno., 26:959, 1989;Fangerら、Immunol. Today, 10:92, 1989）。第８Ｂ図は、細胞障害性Ｔリンパ球におけるＣＤ１６：ζを発現することにより、修飾したＣＴＬが３Ｇ８（抗−ＣＤ１６；Fleitら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3275,1982）ハイブリドーマ細胞を殺すことができるが、ＣＤ１６のホスファチジルイノシトール結合形を発現するＣＴＬは不活性であることを示している。ＣＤ１６：ζを有するＣＴＬも、無関係な抗体を発現するハイブリドーマ細胞を殺さない（データーは図示せず）。
細胞溶解に必要な最少限のζ配列を同定するため、ζ細胞内ドメインを順次カルボキシル末端から除いた一連の欠失突然変異体を作成した（第８Ａ図）。ツェーターの細胞内ドメインのほとんどは、細胞溶解力で容易に取り除くことができ、完全な長さのキメラＣＤ１６：ζは本質的に残基６５まで欠失したキメラ、ＣＤ１６ζＡｓｐ６６*と効力がほとんど同じであった（第８Ｂ図）。ζ残基５９まで欠失すると（キメラＣＤ１６：ζＧｌｕ６０*）細胞障害性が実質的に減少し、残基５０まで更に欠失すると活性が若干低下した。しかしながら、細胞内ドメインが３残基トランスメンブランアンカーまで減少しても活性は完全にはなくならなかった（第８Ｂ図）。
ζはジスルフィド結合二量体であるので、細胞溶解活性の保持は、内因性ζがキメラζ欠失を有するヘテロ二量体を形成することによって活性が再構築されるものと説明される。この考え方を試験するため、ζ残基１１および１５をそれぞれＡｓｐとＣｙｓからＧｌｙへ変え（Ｃｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ）、免疫沈澱を下記のようにして行った。約２×１０6個のＣＶ１細胞を血清不含ＤＭＥ培地で１時間組換えワクシニアに感染させ、感染個数（ｍｏｉ）を少なくとも１０とした。感染後６〜８時間後に、細胞をＰＢＳ／１ｍＭＥＤＴＡでプレートから脱着させ、ClarkおよびEinfeldの方法によってラクトペルオキシダーゼおよびＨ2Ｏ2を用いて２×１０6個の細胞当たり０．２ｍＣｉの125Ｉで表面標識した（Leukocyte Typing II, pp.155-167, Springer-Verlag、ニューヨーク、１９８６年）。標識した細胞を遠心分離によって収集し、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．２Ｍヨードアセタミドおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦで溶解した。核を遠心分離によって除去し、ＣＤ１６タンパク質を抗体３Ｇ８（Fleitら、上記引用文献, 1982;Medarex）および抗−マウスＩｇＧアガロース（Cappel, ダーハム、ノース・カロライナ州）と免疫沈澱した。試料を８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル中で非還元性条件下で、または１０％ゲル中で還元条件下で電気泳動を行った。これらの免疫沈澱により、ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙキメラはジスルフィド結合した二量体構造中では会合しないことが確認された。
突然変異体レセプターの細胞溶解活性も試験した。残基６５まで欠失した突然変異体キメラ（ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ａｓｐ６６*）の細胞溶解分析での活性は、アッセイの条件によっては匹敵する突然変異していないキメラであって、因子が通常はＣＤ１６：ζの２以内であるかまたは活性が区別できないもの（ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*）の２〜８分の１であった（第９Ｂ図）。突然変異キメラの活性の減少は、同様な構造のＣＤ４キメラで見られた減少に匹敵し（前記参照）、二量体に比較してζモノマーの効率が低いことによるものと思われる。対照的に、残基５９まで欠失したＡｓｐ-、Ｃｙｓ-突然変異キメラ、細胞溶解活性を持たず（第９Ｂ図）、トランスメンブランＣｙｓおよび／またはＡｓｐ残基によって媒介される他の鎖との会合が残基６５よりも多いアミノ末端の欠失における細胞溶解活性が弱く持続することに関与するという仮説を支持している。
フローサイトメトリーの検討を行ったところ、トランスメンブランＡｓｐおよびＣｙｓを欠く欠失突然変異体はＴＣＲ-突然変異体ジュルカット細胞ラインにおける抗体の架橋に応答して、遊離の細胞内カルシウムイオンの増加を促進することができることを示していた（第９Ｄ図）。同様な結果は親のジュルカットラインで発現したキメラについても得られた（図示せず）。ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１Ｇｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ｇｌｙ６０*の場合には、これらのデーターは、カルシウム応答を媒介する能力は細胞溶解を支持する能力とは突然変異的には分離することができることを示している。
ζトランスメンブラン残基の可能な寄与を明確に除去するために、ζのトランスメンブランおよび最初の１７の細胞質性残基を、膜スパンニングおよびＣＤ５またはＣＤ７抗原のそれぞれ最初の１４または最初の１７個の細胞質性残基をコードする配列で置換した（第９Ａ図）。生成する３文節系融合タンパク質、ＣＤ１６：５：ζ（４８−６５）およびＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）は、より単純なＣＤ１６：ζキメラと同様にジスルフィド結合二量体を形成しなかったが、これはζトランスメンブランドメインにシステイン残基を欠いていたためである。いずれの３文節系キメラもジュルカットおよびＴＣＲ陰性細胞ラインでカルシウムを起動し（第９Ｄ図）、ＣＴＬにおける細胞溶解応答を示すことができた（第９Ｃ図、データーは図示せず）。しかしながら、キメラＣＤ１６：７：ζ（４８−５９）における残基５９までのζ部分の欠如により、ＴＣＲ陽性または陰性のジュルカット細胞におけるカルシウム応答性を指示する３文節系融合体の能力または成熟ＣＴＬにおける細胞溶解を指示する能力がなくなる（第９Ｃ図および第９Ｄ図、データーは図示せず）。
１８残基のモチーフの中の個々の残基の寄与を検討するため、部位指定突然変異誘発により多数の突然変異体を作成し、それらのキメラレセプターの低発現（第１０Ａ図および第１０Ｄ図）または高発現（第１０Ｂ図および第１０Ｅ図）の条件下でレセプター指定殺生を媒介する能力を評価した。第１０図は、残基５９から６３まで及んでいる多数の比較的控え目な置換（すなわち、酸性残基をその同族アミドにより置換またはチロシンをフェニルアラニンで置換）により、細胞溶解効力が幾分減少し、一般的に変異体はカルシウムを起動する能力を保持していることを示している。しかしながら、集合的には、これらの残基は、これらの欠失により細胞溶解活性が欠如するかぎりは、重要なサブモチーフを有する。Ｔｙｒ６２をＰｈｅまたはＳｅｒに変換すると、いずれも細胞障害性およびカルシウム応答がなくなった。１８残基のセグメントのアミノ末端では、Ｔｙｒ５１をＰｈｅで置換するとカルシウム起動も細胞溶解活性も完全になくなるが、５０位のＬｅｕをＳｅｒで置換すると、カルシウム応答はなくなるが細胞溶解性は部分的に損なわれるだけである。特定の仮説に束縛されることなく、短期フローサイトメトリー分析でＬｅｕ５０Ｓｅｒ突然変異体がカルシウムを起動することができないことは、細胞溶解分析の長期に亙る遊離の細胞内カルシウムイオンの実質的な増加を媒介する能力を十分に反映しないからと推定される。しかしながら、カルシウム不感受性の細胞溶解活性はある種の細胞溶解性Ｔ細胞ラインについて報告されており、同様な現象が本明細書に記載の結果の基となっているという可能性は除外されてはいない。Ａｓｎ４８をＳｅｒで置換すると、幾つかの実験では細胞障害性が部分的に損なわれたが、他の実験ではほとんど効果はなかった。
余剰の配列要素の潜在的な役割を検討するため、ζの細胞内ドメインを３個のセグメント、スパニング残基３３〜６５、７１〜１０４および１０４〜１３８に分割した。これらのセグメントのそれぞれを、ＣＤ７の細胞内ドメインの塩基性膜アンカー配列の末端に導入されるＭｌｕＩ部位によってＣＤ１６：ＣＤ１７キメラに結合した（下記を参照、第１１Ａ図）。３個の要素の細胞溶解効力を比較したところ、これらの効力は等しかった。配列を比較したところ（第１１Ａ図）、第二のモチーフはチロシン間に１１個の残基を有し、第一および第三のモチーフは１０個の残基を持っていた。
Ｔ細胞活性化の方法は正確に説明されてはいないが、抗原レセプター、またはζ細胞内配列を有するレセプターキメラの集合により、カルシウム起動、サイトカインおよび顆粒の放出、および活性化の細胞表面マーカーの出現が誘導されることは明らかである。ζの活性部位である、固有の酵素活性を有するには小さすぎると思われる短い直線状ペプチドも、１個または精々数個のタンパク質と相互作用を行って、細胞活性化を媒介する。細胞溶解を媒介する能力は、突然変異的にカルシウム蓄積を媒介する能力と分離することができるので、遊離カルシウムの起動はそれだけでは細胞の活性化には十分ではないことも明らかである。
本明細書に示されるように、ζの細胞内ドメインからの１８残基をトランスメンブランおよび２個の関係のないタンパク質の細胞内ドメインに付加すると、生成するキメラ体が融合タンパク質の細胞外部分に結合する標的細胞に対して細胞溶解活性を再設定することができる。１８残基のモチーフを有するキメラの活性は、完全な長さのζに基づいたキメラの約８分の１であるが、減少した活性は、通常は野生型のζがジスルフィド結合二量体を形成することができるトランスメンブラン相互作用を喪失していることによるものと思われる。すなわち、モチーフと同じカルボキシル末端を有し且つトランスメンブランＣｙｓおよびＡｓｐ残基を欠くζ欠失構成物の活性は、典型的には１８個の残基モチーフだけを有するキメラより若干低い。
本発明者らが注目した細胞溶解能を有する要素は２個のチロシンを有するがセリンまたはスレオニンはなく、活性に対するホスホリル化の可能な寄与が制限される。
どのチロシンでも突然変異すると、活性が破壊され、予備実験でも１８残基のモチーフを有するキメラ表面抗原の架橋の後に実質的なチロシンのホスホリル化が示されていないが、このホスホリル化の低水準での寄与の可能性は除外できない。２個のチロシン残基で注目された効果の外に、このモチーフのアミノおよびカルボキシル末端における多数のアミノ酸における置換によって、低レセプター密度の条件下では活性が低下する。
ζ活性モチーフと同様な配列は、数種類の他のトランスメンブランタンパク質の細胞質ドメイン、例えばＣＤ３δおよびγ分子、表面ＩｇＭに関連したタンパク質ｍｂ１およびＢ２９、および高親和性ＩｇＥレセプター、ＦｃεＲＩのβおよびγ鎖に見出だすことができる（Reth、Nature, 338:383, 1989）。これらの配列の機能は確定されていないが、効率的に発現される場合には、それぞれは自律的Ｔ細胞活性化を行うことができ、このような活性によってζ陰性突然変異細胞ラインに見られる残基のＴＣＲ応答性を説明することができる（Sussmanら、Cell, 52:85, 1988）。
ζ自身はほぼ等間隔になった３個の配列を有し、細胞内ドメインのラフな３区分は、それぞれが細胞溶解応答を開始することができることを示している。ζの接合イソ形であるη（Jinら、上記引用文献, 1990;Claytonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5202, 1991）は、第三のモチーフのカルボキシルハーフを欠いている。第一のモチーフのカルボキシルハーフが除去されると活性が失われるので、ηの生物学的有効性の大半は最初の２つのモチーフに寄与するものと思われる。異なる測定によれば、ηは抗原によって媒介されるサイトカイン放出（Bauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3842, 1991）または再設定した細胞溶解の促進ではζと同等な活性を有するが、ηはレセプター刺激に応じてはホスホリル化されない（Bauerら、上記引用文献、1991）。したがって、ホスホリル化には総ての３種類のモチーフが存在することが必要であり、または第三のモチーフは未同定のチロシンキナーゼに対する好ましい基質である。
実施例ＩＸ
ヒトＦｃレセプターによる細胞溶解性シグナル形質導入
異なるヒトＦｃレセプターサブタイプの作用を評価するために、ヒトＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ１６抗原の細胞外ドメインをＦｃＲＩＩγＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＣサブタイプのトランスメンブランおよび細胞内ドメインに連結したキメラ分子を作成した（RavetchおよびKinetの命名法、Ann. Rev. Immunol., 9:457, 1991）。具体的には、前記したＦｃＲＩＩＡ、Ｂ１およびＢ２イソ形のトランスメンブランおよび細胞質ドメインに対応するｃＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、予め存在するクローンＰＣ２３または（標準的な手法によって構築された）ヒト扁桃ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；ＲｃＲＩＩＡ前進）
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；ＦｃＲＩＩＡ復帰）
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０；ＦｃＲＩＩＢ１およびＦｃＲＩＩＢ２前進）および
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２１；ＦｃＲＩＩＢ１およびＦｃＲＩＩＢ２復帰）。
これらのプライマーはそれぞれ酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩの開裂部位を含み、５′末端から６残基だけインデントした。ＮｏｔＩ部位の後ろには、直ぐアンチセンス停止コドンＣＴＡまたはＴＴＡが続いていた。総てのプライマーは、所望なフラグメントの５′および３′末端に相補的な１８個以上の残基を含んでいた。ＩＩＡイソ形とは１アミノ酸残基だけ異なるＦｃＲＩＩγＣ細胞質ドメインに対応するｃＤＮＡフラグメント（残基２６８におけるＰの代わりにＬ）を、下記の配列のプライマーを用いてＰＣＲを重複させることによる部位指定突然変異誘発によって生成した。
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２２）および
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２３）。
ＰＣＲフラグメントを、それぞれＣＤ１６またはＣＤ４細胞外ドメインを含むワクシニアウイルス発現ベクターにインサートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔの同時組み込みの選択を用いてチミジンキナーゼ座で組換えにより野生型のワクシニアウイルスにインサートして、所望な組換体の同定を容易にした。総てのイソ形（第１２図に示されている）が同一であることは、ジデオキシ配列決定によって確認した。
キメラレセプタータンパク質の産生を、更に免疫沈澱法によって確認した。約１０7個のＪＲＴ３．Ｔ３．５細胞を血清不含ＩＭＤＭ培地で組換えワクシニアで１時間感染させ、感染多重度を少なくとも１０とした。感染から１２時間後、細胞を集めて、ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ法を用いて１０7個の細胞当たり０．５ｍＣｉの125Ｉで表面標識した（ClarkおよびEinfeld、上記引用文献）。標識した細胞を遠心分離によって収集し、１％ＮＰ−４０、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．２Ｍヨードアセタミドおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦで溶解した。核を遠心分離によって除去し、ＣＤ１６融合タンパク質を抗体４Ｇ８および抗−マウスＩｇＧアガロースで免疫沈澱した。試料を還元条件下で電気泳動した。総ての免疫沈澱したキメラレセプター分子は、予想した分子質量のものであった。
キメラレセプターが細胞質不含カルシウムイオンの増加を媒介する能力を試験するため、組換えウイルスを用いて（本明細書に記載の）ＴＣＲ-突然変異体ジュルカット細胞ラインをを感染させ、（本明細書に記載の）モノクローン性抗体３Ｇ８またはＬｅｕ−３Ａによるレセプター細胞外ドメインの架橋の後に、細胞質不含カルシウムを（本明細書に記載の）細胞中で測定した。これらの実験から、ＦｃＲγＩＩＡおよびＣの細胞内ドメインは細胞外ドメインの架橋の後細胞質不含カルシウムイオンの増加を媒介することができるが、ＦｃＲγＩＩＢ１およびＢ２の細胞内ドメインは同様な条件下では不活性であることが判った（第１３Ａ図および第１３Ｂ図）。ＦｃＲγＩＩＡのＣＤ４、ＣＤ５およびＣＤ１６ハイブリッドは、カルシウム応答を促進する能力を本質的に等しく有した（第１３図、データーは図示せず）。単球およびリンパ球ラインからの他の細胞ラインは、細胞外ドメインの架橋によって開始されるシグナルに応答することができた（データーは図示せず）。
細胞溶解に異なるＦｃＲγＩＩ細胞内ドメインを包含させることを検討するため、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＣキメラを発現するワクシニア組換え体に感染させた。次に、感染した細胞を、ＣＤ１６に対する細胞表面抗体を発現した51Ｃｒを標識したハイブリドーマ細胞（すなわち、３Ｇ８  １０−２細胞）と同時培養した。この分析法では、キメラのＣＤ１６細胞外ドメインがリンパ球エフェクタープログラムを活性化することができる細胞内セグメントに連結している場合には、ＣＤ１６キメラを有するＣＴＬはハイブリドーマ標的細胞を殺し（遊離51Ｃｒを放出することができた）。この細胞溶解分析法を下記に詳細に説明する。第１４Ａ図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩＡおよびＣを有するが、ＦｃＲγＩＩＢ１またはＢ２を持たないＣＴＬは、細胞表面抗−ＣＤ１６抗体を発現する標的細胞を溶解することができることを示している。
特異的細胞溶解が、場合によってはＣＤ１６部分との相互作用に起因するといった可能性を除外するため、細胞溶解実験を行い、ＦｃＲＩＩ細胞内ドメインをＣＤ４細胞外ドメインに結合した。この場合には、標的細胞は、ＨＩＶエンベロープｇｐ１２０／４１タンパク質を発現するヘラ細胞（具体的には、ワクシニアベクターｖＰＥ１６（ナショナル・インスティテュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクションズ・ディジーズ・ＡＩＤＳ・デポジトリー、ベセスダ、メリーランド州、から入手可能）で感染したヘラ細胞）であった。ＣＤ１６系と同様に、ＨＩＶエンベロープを発現する標的細胞は、ＣＤ４：ＦｃＲγＩＩＡキメラを発現するが、ＦｃＲγＩＩＢ１またはＢ２を発現しないＴ細胞によって溶解されやすい（第１４Ｂ図）。
ＦｃＲγＩＩＡおよびＣの細胞内ドメインは、延長したＦｃＲγ／ＴＣＲζ科の部分を含む任意の他のタンパク質と評価し得るほどの配列の相同性を共有していない。細胞溶解の誘導に関与する配列要素を定義するため、分子内ドメインコード配列の５′および３′欠失（下記に記載され、第１５Ａ図に示される）を作成し、（本明細書に記載の方法で）カルシウム起動および細胞溶解分析における効力を評価した。細胞内ドメインのアミノ末端部分を除去した実験では、ＦｃＲγＩＩのトランスメンブランドメインを無関係なＣＤ７抗原のトランスメンブランドメインで置換して、膜に股がるドメインによって媒介される相互作用の寄与の可能性を排除した。
第１５Ｂ図および第１５Ｃ図は、チロシン２９８を含む１４個のカルボキシル末端残基を除去することにより、細胞溶解能が完全に喪失し、カルシウム起動能が実質的に減少することを示している。チロシン２８２の直前まで更に欠失を行ったところ、同一の表現形を得た（第１５Ｂ図および第１５Ｃ図）。細胞内ドメインのＮ−末端から残基２６８までの欠失では、カルシウムプロフィールまたは細胞溶解能のいずれについても実質的な効果はないが、残基２７５まで欠失を行うと、遊離のカルシウム放出は著しく損なわれるが細胞溶解に就いてはほとんど影響がなかった（第１５Ｄ図および第１５Ｅ図）。残基２８２まで更に欠失を行うと、ＦｃＲγＩＩ尾が得られ、これはカルシウムを起動しまたは細胞溶解を誘導する能力を欠いていた（第１５Ｄ図および第１５Ｅ図）。「これらの大まかな測定によって定義される「活性要素」は比較的大きく（３６アミノ酸）、１６残基数だけ離れた２個のチロシンを含んでいる。
実施例Ｘ
本発明による他の細胞内およびトランスメンブランシグナル形質導入ドメインは、Ｔ細胞レセプタータンパク質、ＣＤ３デルタおよびＴ３ガンマー、およびＢ細胞レセプタータンパク質、ｍｂ１およびＢ２９から誘導することができる。これらのタンパク質のアミノ酸配列を、第１６図（ＣＤ３デルタ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、第１７図（Ｔ３ガンマー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、第１８図（ｍｂ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）および第１９図（Ｂ２９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）に示す。細胞溶解シグナルの形質誘導に十分な（したがって、好ましくは本発明のキメラレセプターに包含される）配列の部分を括弧で示す。これらのタンパク質ドメインを含むキメラレセプターを構築し、一般的には前記のように本発明の治療法に用いる。
実施例ＸＩ
実験的方法：ワクシニア感染および放射免疫沈澱法
約５×１０6個のＣＶ１細胞を血清不含のＤＭＥ培地で、組換えワクシニアで１時間感染させ、感染多重度（ｍｏｉ）を少なくとも１０とした（ＣＶ１細胞について測定したタイター）。感染の後、細胞を新鮮な培地に移し、メチオニンおよびシステイン不含ＤＭＥＭ（Gibco；グランド・アイランド、ニューヨーク州）中で２００μＣｉ／ｍｌ35Ｓ−メチオニン＋システイン（Ｔｒａｎ35Ｓ−ラベル、ＩＣＮ；コスト・メサ、カリフォルニア州）で代謝的に６時間標識した。標識した細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで脱着させ、遠心分離によって収集し、１％ＮＰ−４０、０．１ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦで溶解した。核を遠心分離によって除去し、ＣＤ４タンパク質をＯＫＴ４抗体および抗−マウスＩｇＧアガロースで免疫沈澱した（Cappel、ダーハム、ノース・カロライナ州）。試料を、非還元（ＮＲ）条件下および還元（Ｒ）条件下で８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル中で電気泳動を行った。35Ｓで標識した試料を含むゲルをＥｎ3Ｈａｎｃｅ（New England Nuclear,ボストン、マサチューセッツ州）に浸漬した後、オートラジオグラフィを行った。ＣＤ１６のトランスメンブラン形、ＣＤ１６TMの促進された発現を、単にＣＤ１６TMで感染されたＣＶ１細胞における発現を、ＣＤ１６TMおよびζまたはガンマーキメラをコードするウイルスで同時感染した細胞での発現と比較することによって測定した。感染し、６時間以上インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡでプレートから脱着させ、ＣＤ１６ＴＭまたはキメラの発現を間接免疫螢光およびフローサイトメトリーによって測定した。
カルシウムフラックス分析
ジュルカットサブラインＥ６（Weissら、J. Immunol., 133:123-128（1984））細胞を、血清不含ＩＭＤＭ中で組換えワクシニアウイルスにｍｏｉ１０で１時間感染させ、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で３〜９時間インキュベーションした。細胞を遠心分離によって収集し、１ｍＭ  Ｉｎｄｏ−１アセトメトキシエステル（Grynkiewiczら、J. Biol.Chem., 260:3340-3450（1985））（分子プローブ）を含む完全培地に３×１０6個の細胞数／ｍｌで再懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。Ｉｎｄｏ−１を添加した細胞をペレット化し、血清不含ＩＭＤＭ中に１×１０6／ｍｌで再懸濁し、室温で暗所に保存した。細胞をフローサイトメトリーにより紫色および青色螢光放射を同時に測定することによって遊離のカルシウムイオンを分析した（Rabinovitchら、J. Immunol., 137:952-961（1986））。カルシウムフラックスを開始するため、フィコエリトリン（ＰＥ）抱合Ｌｅｕ−３Ａ（抗−ＣＤ４）（Becton Dickinson、リンカーン・パーク、ニュージャージー州）を１μｇ／ｍｌで細胞懸濁液に加えた後、時間０に未抱合のヤギ抗−マウスＩｇＧ１０μｇ／ｍｌを加えるか、または未抱合３Ｇ８（抗−ＣＤ１６）モノクローン性抗体を１μｇ／ｍｌ細胞懸濁液に加えた後、時間０にＰＥ−抱合Ｆａｂ2′ヤギ抗−マウスＩｇＧを１０μｇ／ｍｌを加えた。紫色／青色放射比のヒストグラムは、ＰＥ陽性（感染）細胞の個体群から収集し、これは典型的には全細胞数の４０〜８０％であった。未感染細胞でのＴ細胞抗原レセプターは、架橋なしに抗体ＯＫＴ３によって誘導された。ＣＤ１６キメラレセプターを含む実験には、（抗体なしで）低めの細胞内カルシウムに対するベースラインの変動を示す試料は分析から除外した。次に、ヒストグラムデーターをライト・ハンド・マン（クーパーシティ、フロリダ州）ソフトウェアを用いて二元データーをＡＳＣＩＩに転換した後、フォートランプログラムのコレクションを用いる分析によって解析した。第二の抗体試薬を添加する前に紫色／青色放射比を用いて、初期の比率を規格化して、１に設定し、残りの閾値の比を、残りの個体数の１０％が閾値を越えるように設定した。
細胞溶解分析
ヒトＴ細胞ラインＷＨ３、ＣＤ８+ＣＤ４-ＨＬＡＢ４４制限細胞溶解性ラインをＩＭＤＭ、ＩＬ−２  １００Ｕ／ｍｌ含む１０％ヒト血清に保持し、放射線照射した（３０００ラッド）ＨＬＡに釣り合わない末梢血リンパ球およびフィトヘマグリチニン１μｇ／ｍｌで非特異的に、または放射線を照射したＢ４４を含む単核細胞で周期的に刺激した。非特異的刺激から１日後に、ＰＨＡに新鮮な培地を添加して０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、３日後に培地を取り替えた。刺激を加えてから少なくとも１０日間、細胞を生育させた後、細胞障害性分析に用いた。細胞を血清不含培地中で組換えワクシニアに１時間感染させ、少なくとも１０の感染多重度とした後、完全培地中で３時間インキュベーションした。細胞を遠心分離によって収集し、１×１０7個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。完全培地１００μｌ／ウェルを含むＵ字形マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに１００μｌを加えた。細胞を、２倍の連続段階で希釈した。それぞれ試料についての２つのウェルにはリンパ球が含まれておらず、クロムの放出が自然に起こり、全クロム吸収を測定することができた。ヘラサブラインＳ３からの標的細胞を、６．０または１０．０ｃｍのプレート中で、ｍｏｉが約１０で１時間血清不含培地中で感染させた後、完全培地で３時間インキュベーションした。次に、これらをＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで皿から脱着させ、計数した。標的細胞１０6個のアリコート（ヘラ、ラジ、またはＣＤ４キメラレセプター実験用のＲＪ２．２．５細胞および３Ｇ８  １０−２細胞；Shenら、Mol. Immunol., 26:959（1989）、ＣＤ１６キメラレセプター実験用）を遠心分離し、無菌の51Ｃｒ−クロム酸ナトリウム（１ｍＣｉ／ｍｌ、Dupont、ウィルミングトン、デラウェア州）５０μｌに３７℃で断続的に混合しながら１時間再懸濁させた後、ＰＢＳで３回線状した。培地に１０5個の細胞数／ｍｌで再懸濁した標識した細胞１００μｌを、それぞれのウェルに加えた。ラジおよびＲＪ２．２．５標的細胞を、ヘラ細胞と同様に標識した。マイクロタイタープレートを７５０×ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション期間が終了したならば、それぞれのウェルの細胞を緩やかにピペッティングすることによって再懸濁させ、試料を採取して取り込まれた総カウント数を測定し、マイクロタイタープレートを７５０×ｇで１分間回転させた。上澄液１００μｌアリコートを採取し、ガンマー線シンチレーションカウンターで計数した。殺生率を、フローサイトメトリーによって測定した感染した標的細胞の画分（通常は５０〜９０％）について補正した。感染したエフェクター細胞に対して、エフェクター：標的比を、感染した細胞の割合（通常はＣＤ４キメラレセプター実験に対して２０〜５０％であり、ＣＤ１６キメラレセプター実験に対して＞７０％）に対して補正した。
ζ配列のイン・ビトロでの突然変異誘発
ζ配列のアミノ酸残基１１および／または１５で点突然変異を作り出すために、ζトランスメンブランドメインの上流のＢａｍＨＩ部位から伸びており且つ元のζ残基１１をＣｙｓからＧｌｙへ（Ｃ１１Ｇ）または残基１５をＡｓｐからＧｌｙへ（Ｄ１５Ｇ）へ転換し、または両方（Ｃ１１Ｇ／Ｄ１５Ｇ）を行う合成オリゴヌクレオチドプライマーを作成し、ＰＣＲ反応で用いて、突然変異したフラグメントを生成させ、これを野生型ＣＤ４：ζｌ構成物に再インサートした。
ζ欠失を作るために、ζｃＤＮＡ配列を、残基５０、５９または６５の後に停止コドン（ＵＡＧ）を作るように設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。プライマーは、通常はCGC GGG CGG CCG CTA（SEQ ID NO:11）の形態の配列で、最後の３残基は停止アンチコドンに対応する５′末端から５または６残基数インデントした酵素ＮｏｔＩに対する開裂部位を含んでいた。ＮｏｔＩおよび停止アンチコドン配列の後には、フラグメントの所望な３′末端に相補的な１８個以上の残基が続いた。生成するキメラは、それぞれＣＤ１６：ζＹ５１*、ＣＤ１６：ζＥ６０*およびＣＤ１６：ζＤ６６*と呼ばれた。トランスメンブランドメインの上流のＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ部位を用いて、野生型ＣＤ１６：ζ構成物に再導入されるフラグメントを生成させた。モノマー性ζキメラを、前記のＡｓｐ-およびＣｙｓ-ＣＤ４：ζ構成物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化することによってζトランスメンブランおよび膜近位細胞内配列を解放し、このフラグメントをそれぞれＣＤ１６：ζＥ６０*およびＣＤ１６：ζＤ６６*にインサートすることによって作った。
ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）およびＣＤ１６：７ζ（４８−５９）の３文節系キメラの構築
構成物ＣＤ１６：ζＤ６６*を作成するため、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインの１７個の引き続く残基に対応するζｃＤＮＡ配列を、ＣＤ５およびＣＤ７ｃＤＮＡから得られた対応するトランスメンブランおよび細胞質ドメインに置き換えた。ＣＤ５およびＣＤ７フラグメントは、ＢａｍＨＩ制限開裂部位を有し且つそれぞれＣＤ５およびＣＤ７のトランスメンブランドメインの直ぐ上流の領域に対応する前進オリゴヌクレオチドおよびこれに続くそれぞれＣＤ５およびＣＤ７配列と重複する復帰オリゴヌクレオチドおよびＳａｃＩ制限開裂部位を含むζ配列を用いるＰＣＲ反応によって生成した。
ＣＤ５：ζ：CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG（SEQ ID NO:12）
ＣＤ７：ζ：CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG（SEQ ID NO:13）。
ＣＤ５およびＣＤ７  ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したＣＤ１６：ζＥ６０*に連結し、ＢａｍＨＩからＳａｃＩまでのζ配列をＣＤ７フラグメントで置き換えた。構成物ＣＤ１６：ＣＤ５及びＣＤ１６：ＣＤ７を作成するため、ＣＤ５およびＣＤ７フラグメントを、ＮｏｔＩ制限開裂部位を含みそれぞれＣＤ５およびＣＤ７の残基Ｇｌｎ４１６およびＡｌａ１９３の後の停止コドン（ＵＡＡ）をコードするオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって得た。ＣＤ５およびＣＤ７  ＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６*構成物に挿入した。
ζ細胞溶解性シグナル形質導入モチーフ内のＮ−末端残基のイン・ビトロでの突然変異誘発
ζモチーフ内のＳａｃＩ部位から伸張し、元の残基４８をＡｓｎからＳｅｒへ（Ｎ４８Ｓ）、残基５０をＬｅｕからＳｅｒへ（Ｌ５０Ｓ）、残基５１をＴｙｒからＰｈｅへ（Ｙ５１Ｆ）転換する合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲ反応で使用し、野生型ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）構成物に再導入するフラグメントを生成させた。
ζ細胞溶解性シグナル形質導入モチーフ内のＣ−末端残基のイン・ビトロでの突然変異誘発
ＮｏｔＩ部位３′から停止コドンまで伸張し、元の残基６０をＧｌｕからＧｌｎへ（Ｅ６０Ｑ）、残基６１をＧｌｕからＧｌｎ（Ｅ６１Ｑ）、残基６２をＴｙｒからＰｈｅまたはＳｅｒへ（Ｙ６２ＦまたはＹ６２Ｓ）、残基６３をＡｓｐからＡｓｎへ（Ｄ６３Ｎ）転換する合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲで用いて、ＢａｍＨＩ部位からＮｏｔＩ部位までの野生型のＣＤ１６：ζＤ６６*構成物にサブクローンした。
ＣＤ１６：７：ζ（３３−６５）、ＣＤ１６：７：ζ（７１−１０４）、ＣＤ１６：７：ζ（１０４−１３７）キメラ構築物
トランスメンブランと細胞内ドメインとの間の接合部にＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ部位を有するＣＤ７トランスメンブランフラグメントを、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって得た：
CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA（SEQ ID NO:14）。
生成するＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）構成物に再インサートした。残基３３〜６５、７１〜１０４および１０４〜１３７をコードするζフラグメントを、前進プライマーの５′末端にＭｌｕＩ部位および停止コドンと、続いて復帰プライマーの５′末端にＮｏｔＩ部位を含むプライマーの対を用いてＰＣＲ反応によって得た。それぞれの場合に、制限部位をプライマーの５′末端から６残基数インデントして、制限酵素による開裂が確実に起こるようにした。
ζ３３：CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAG ACA（SEQ ID NO:15）
ζ７１：CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG（SEQ ID NO:16）および
ζ１０４：CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC（SEQ ID NO:17）。
ＦｃＲγＩＩＡ欠失突然変異体の構築
カルボキシル末端ＦｃＲＩＩＡ欠失突然変異体は、完全な長さの構成物についてと同様に、２８２及び２９８の位置のチロシンをコードする配列を停止コドン（ＴＡＡ）に転換して、ＰＣＲによって構築した。Ｎ−末端欠失は、生成するフラグメントをＭｌｕＩおよびＮｏｔＩ制限部位の間の、ＣＤ７トランスメンブランドメインに融合したＣＤ１６細胞内ドメインをコードする予め構築されている発現プラスミドに挿入することができるオリゴヌクレオチドであって、ＣＤ７トランスメンブランドメインがこのトランスメンブランと細胞内ドメインとの間の接合部におけるＭｌｕＩ部位に末端があるものを用いて、ＰＣＲによって細胞内ドメインを順次少なくコードするフラグメントを増幅することによって得た。
他の態様
前記の実施例は、ζ、ηまたはγキメラの集合がＴ細胞で細胞溶解性エフェクター細胞応答を開始するのに十分であることを示している。Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好塩基性顆粒細胞、マクロファージおよび肥満細胞を含むζ、ηおよびγが既知の範囲で発現することは、保存された配列モチーフが造血臓器の細胞に共通な感覚装置と相互作用することができ、免疫系における宿主防御の重要な成分をレセプターが集合することによって媒介することができることを示している。
細胞溶解性応答の効力と、ＭＨＣクラスＩＩレセプターを有する標的細胞に対する応答がないことは、ζ、ηまたはγに基づくキメラが養子免疫療法によりＡＩＤＳに対する遺伝子による介在の基礎を形成することを示している。内因性ζおよびγが広く分布しており、γに関連したＦｃレセプターが異なる細胞種における細胞障害性を媒介することが明らかなことから（Fangerら、Immunol. Today, 10:92-99（1989））、様々な細胞をこの目的に考慮することができる。例えば、好中性顆粒球は、循環において寿命が極めて短く（約４時間）、細胞溶解性が高いものであり、キメラの発現のための好ましい標的細胞である。好中球がＨＩＶに感染しても、ウイルスを放出しないと思われ、これらの細胞（最も有力なものは白血球）が多量に存在することから宿主の防御が容易になる。もう一つの注目に値する宿主細胞の可能性は、レトロウイルスの処理に現在のところ容易に入手し得る個体の成熟Ｔ細胞である（Rosenberg, S.A.、Sci. Am., 262:62-69（1990））。組換えＩＬ−２の助けにより、Ｔ細胞の個体群は培養で比較的容易に増加させることができ、しかも増加した個体群は、再浸出するときには、典型的には寿命が短いのである（Rosenbergら、N. Engl. J. Med., 323:570-578（1990））。
適当な条件下では、ＣＤ４キメラを発現する細胞によりＨＩＶが認識されると、細胞分裂を誘発する刺激も供給され、修飾された細胞群はウイルスの負荷に対してダイナミックに応答することができる。本明細書出は細胞溶解性Ｔリンパ球における融合タンパク質の挙動に注目してきたが、ヘルパーリンパ球でキメラ体が発現すれば、サイトカインのＨＩＶによって起動される供給源が提供され、このサイトカインはＡＩＤＳでのヘルパー細胞サブセットの崩壊を防止することができる。ウイルスの浸透以外の段階での感染の防止処理の幾つかの方法の最近の報告（Friedmanら、Nature, 335:452-454（1988）；Greenら、Cell, 58:215-223（1989）;Malimら、Cell, 58:205-214（1989）;Tronoら、Cell, 59:113-120（1989）;Buonocoreら、Nature, 345:625-628(1990））は、ＣＤ４キメラを有する細胞を設計により、作用の細胞内部位を有する適当な因子の発現によりウイルスの産生を妨げるようにすることができることを示唆している。
自律的キメラによりＴリンパ球にシグナルを伝達することができれば、イン・ビボでレトロウイルスによって操作されたリンパ球を制御することもできるようになる。例えば、補体結合ドメインを除去するように操作された特異的ＩｇＭ抗体によって媒介される架橋刺激により、これらのリンパ球の数をその場で増加させることができ、同様な特異的ＩｇＧ抗体（例えば、キメラ鎖に操作を行ったアミノ酸変異体を認識するもの）で、操作された個体を選択的に欠失することができる。更に、抗−ＣＤ４ＩｇＭ抗体はＣＤ４：ζキメラ体を発現するジュルカット細胞でカルシウムを起動するのに追加の架橋を必要としない（データーは示していない）。反復した体外での増幅に頼ることなしに細胞個体数を制御することができれば、遺伝子操作を行ったＴ細胞について提案される現在の用途の範囲および効力を実質的に拡大することができる。
ζ、ηまたはγ細胞内配列から成る他のキメラ体を作るためには、レセプターの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列に、選択するトランスメンブランドメインの直ぐ前の位置に導入される制限部位を付与することができる。次に、制限部位に末端がある細胞外ドメインフラグメントを、ζ、ηまたはγ配列に結合することができる。典型的な細胞外ドメインは、補体、炭水化物、ウイルスタンパク質、細菌、原生動物または後生動物寄生虫、またはそれらによって誘導されるタンパク質を認識するレセプターから誘導することができる。同様に、病原体または腫瘍細胞によって発現されるリガンドまたはレセプターをζ、ηまたはγ配列に結合し、これらのリガンドを認識するレセプターを有する細胞に対する免疫応答を指示することができる。
本発明をその具体的な態様に関して記載してきたが、更に変更を行うことができ、且つ本出願は本発明の変異体、使用または適合を包含し、本発明が関係する技術分野にあり且つ請求の範囲に記載されている上記の本質的な特徴に応用することができる本発明の開示からの離反を包含することを理解されるであろう。
配列リスト
（1）  一般的情報
（i）出願人：ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
（ii）  発明の名称：レセプターキメラによる細胞性免疫の再設定
（iii）  配列の数：２７
（iv）  連絡先
（A）住所：フィッシュ・アンド・リチャードソン
（B）番地：２２５、フランクリン・ストリート
（C）市：ボストン
（D）州：マサチューセッツ
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：０２１１０−２８０４
（V）  コンピューターで判読可能な形態：
（A）媒体の種類：3.5"ディスク、1.44Mb
（B）コンピューター：IBM PS／2モデル50Zまたは55SX
（C)オペレーティング・システム：IBM P.C. DOS（3.30版）
（D)ソフトウェア：ワードパーフェクト（5.0版）
（vi）  現在の出願データー
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）  弁理士／代理人情報：
（A）名称：クラーク、ポール・ティー
（B）登録番号：30,162
（C）参照／証明書番号：00786/119002
（ix）  電話連絡情報：
（A）  電話：（617）542-5070
（B）  ファクシミリ：（617）542-8906
（C）  テレックス：200154
（2）  SEQ ID NO:1に対する情報
（i）  配列の特徴
（A)長さ：1728塩基対
（B）種類：核酸
（C）鎖：２本鎖
（D)トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:1
0003696232.tif 000002
0003696232.tif 000003
（2）  SEQ ID NO:2についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：1389塩基対
（B）種類：核酸
（C）鎖：２本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:2:
0003696232.tif 000004
0003696232.tif 000005
（2）  SEQ ID NO:3についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：1599塩基対
（B）種類：核酸
（C）鎖：２本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:3:
0003696232.tif 000006
0003696232.tif 000007
（2）SEQ ID NO:4:についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：575アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D)トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：タンパク質
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:4:
0003696232.tif 000008
0003696232.tif 000009
（2）  SEQ ID NO:5についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：462アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：タンパク質
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:5:
0003696232.tif 000010
0003696232.tif 000011
（2）  SEQ ID NO:6についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：532アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：タンパク質
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:6:
0003696232.tif 000012
0003696232.tif 000013
0003696232.tif 000014
（2）  SEQ ID NO:7についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:7:
0003696232.tif 000015
（2）  SEQ ID NO:8についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：50塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:8:
0003696232.tif 000016
（2）  SEQ ID NO:9についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:9:
0003696232.tif 000017
（2）  SEQ ID NO:10についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:10:
0003696232.tif 000018
（2）  SEQ ID NO:11についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：15塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:11:
0003696232.tif 000019
（2）  SEQ ID NO:12についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：42塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:12:
0003696232.tif 000020
（2）  SEQ ID NO:13についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：48塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:13:
0003696232.tif 000021
（2）  SEQ ID NO:14についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:14:
0003696232.tif 000022
（2）  SEQ ID NO:15についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：36塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:15:
0003696232.tif 000023
（2）  SEQ ID NO:16についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:16:
0003696232.tif 000024
（2）  SEQ ID NO:17についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：33塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:17:
0003696232.tif 000025
（2）  SEQ ID NO:18についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：26塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:18:
0003696232.tif 000026
（2）  SEQ ID NO:19についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：42塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:19:
0003696232.tif 000027
（2）  SEQ ID NO:20についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：30塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:20:
0003696232.tif 000028
（2）  SEQ ID NO:21についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：32塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:21:
0003696232.tif 000029
（2）  SEQ ID NO:22についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：31塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:22:
0003696232.tif 000030
（2）  SEQ ID NO:23についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：31塩基
（B）種類：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：核酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:23:
0003696232.tif 000031
（2）  SEQ ID NO:24についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：171アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：アミノ酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:24:
0003696232.tif 000032
（2）  SEQ ID NO:25についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：182アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：アミノ酸
（xi）  配列の説明：SEQ IN NO:25:
0003696232.tif 000033
（2）  SEQ ID NO:26についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：220アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：アミノ酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:26:
0003696232.tif 000034
（2）  SEQ ID NO:27についての情報
（i）  配列の特徴：
（A）長さ：228アミノ酸
（B）種類：アミノ酸
（D）トポロジー：線状
（ii）  分子の種類：アミノ酸
（xi）  配列の説明：SEQ ID NO:27:
0003696232.tif 000035
【図１ａ】
0003696232.tif 000036
【図１ｂ】
0003696232.tif 000037
【図１ｃ】
0003696232.tif 000038
【図２】
0003696232.tif 000039
【図３ａ】
0003696232.tif 000040
【図３ｂ】
0003696232.tif 000041
【図４ａ】
0003696232.tif 000042
【図４ｂ】
0003696232.tif 000043
【図４ｃ】
0003696232.tif 000044
【図４ｄ】
0003696232.tif 000045
【図５ａ】
0003696232.tif 000046
【図５ｂ】
0003696232.tif 000047
【図５ｃ】
0003696232.tif 000048
【図６ａ】
0003696232.tif 000049
【図６ｂ】
0003696232.tif 000050
【図７ａ】
0003696232.tif 000051
【図７ｂ】
0003696232.tif 000052
【図８ａ】
0003696232.tif 000053
【図８ｂ】
0003696232.tif 000054
【図９ａ】
0003696232.tif 000055
【図９ｂ】
0003696232.tif 000056
【図９ｃ】
0003696232.tif 000057
【図９ｄ】
0003696232.tif 000058
【図１０ａ】
0003696232.tif 000059
【図１０ｂ】
0003696232.tif 000060
【図１０ｃ】
0003696232.tif 000061
【図１０ｆ】
0003696232.tif 000062
【図１０ｄ】
0003696232.tif 000063
【図１０ｅ】
0003696232.tif 000064
【図１１ａ】
0003696232.tif 000065
【図１１ｂ】
0003696232.tif 000066
【図１２】
0003696232.tif 000067
【図１３ａ】
0003696232.tif 000068
【図１３ｂ】
0003696232.tif 000069
【図１４ａ】
0003696232.tif 000070
【図１４ｂ】
0003696232.tif 000071
【図１５ａ】
0003696232.tif 000072
【図１５ｂ】
0003696232.tif 000073
【図１５ｃ】
0003696232.tif 000074
【図１５ｄ】
0003696232.tif 000075
【図１５ｅ】
0003696232.tif 000076
【図１６】
0003696232.tif 000077
【図１７】
0003696232.tif 000078
【図１８】
0003696232.tif 000079
【図１９】
0003696232.tif 000080