(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される賦形剤中の有効量のＢＭＰ−９蛋白からなる、肝細胞増殖のための医薬組成物。
【請求項２】
ＢＭＰ−９蛋白が図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃８から＃１１０までのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＢＭＰ−９蛋白が図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃１から＃１１０までのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＢＭＰ−９蛋白が、各サブユニットが少なくとも図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃８から＃１０までのアミノ酸配列からなるダイマーである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＢＭＰ−９蛋白が、各サブユニットが少なくとも図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃１から＃１１０までのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＢＭＰ−９蛋白が、下記工程
（ａ）図３（配列番号：８）に示すヌクレオチド＃１２４から＃４５３までのヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡで形質転換された細胞を培養し；次いで、
（ｂ）図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃１から＃１１０までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製する
により製造される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＢＭＰ−９蛋白が、下記工程
（ａ）図３（配列番号：８）に示すヌクレオチド＃１２４から＃４５３までのヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡで形質転換された細胞を培養し；次いで、
（ｂ）図３（配列番号：９）に示すアミノ酸＃８から＃１１０までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製する
により製造される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
有効量の請求項１記載の組成物からなる、肝細胞の増殖を必要とする患者における肝細胞の増殖を誘導する医薬の製造方法。
【請求項９】
下記工程
（ａ）ＢＭＰ−９蛋白をコードしているＤＮＡヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡで形質転換された細胞を培養し；次いで、
（ｂ）該ＢＭＰ−９蛋白を培地から回収し精製する、
を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
下記工程
（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド＃６１０から＃１８９３までのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、または
（ｉｉ）厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイゼーションし、肝細胞増殖を誘導する配列
で形質転換された細胞を培養し；次いで、
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸＃１から＃１１０までからなる蛋白を該培地から回収し精製する
を含む、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＢＭＰ−９と命名された精製蛋白の新規ファミリー、およびそれらを得るための方法に関する。これらの蛋白を用いて骨および／または軟骨の形成を誘導することができ、傷の治癒ならびに組織の修復、および肝臓の増殖および機能に使用することができる。
ネズミ・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。ヒト・ＢＭＰ−９配列を図３（配列番号：８および配列番号：９）に示すＢＭＰ−９蛋白は軟骨および／または骨の形成を誘導することができると考えられる。さらに、後に記載するラット・骨形成アッセイにおける軟骨および／または骨形成活性を示す能力によりＢＭＰ−９蛋白を特徴づけてもよい。
図１のアミノ酸＃３１９から＃４２８（配列番号：２のアミノ酸＃１〜１１０）よりなることによって、ネズミ・ＢＭＰ−９は特徴づけられる。図１（配列番号：１）に示すヌクレオチド＃６１０から＃１８９３よりなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、図１（配列番号：２）に示すアミノ酸＃３１９から＃４２８からなるアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から精製することによりネズミ・ＢＭＰ−９を製造してもよい。
ヒト・ＢＭＰ−９はネズミ・ＢＭＰ−９と相同的であると期待され、図３（配列番号：９）のアミノ酸＃１（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）から＃１１０（Ａｒｇ）までからなることにより特徴づけられる。本発明は、ヒト・ＢＭＰ−９をコードするＤＮＡ配列を得る方法を包含する。この方法は、ネズミ・ＢＭＰ−９ヌクレオチド配列またはその一部を用いてプローブを設計し、標準的方法を用いてヒト・遺伝子またはそのフラグメントを求めてライブラリーをスクリーニングすることを包含する。ＢＭＰ−９のＤＮＡで形質転換された細胞を培養し、培地からＢＭＰ−９を回収し精製することによりヒト・ＢＭＰ−９を製造してもよい。発現された蛋白を培地から単離し、回収し、精製する。精製された発現蛋白は同時生成される他の蛋白性物質ならびに他の混入物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白は、軟骨および／または骨形成活性を示すと考えられる。後に説明するラット・骨形成アッセイにおける軟骨および／または骨形成活性を示す能力により本発明蛋白をさらに特徴づけてもよい。
配列番号：８に示すヌクレオチド＃１２４から＃４５３からなるＤＮＡ配列で間質転換された細胞を培養し、配列番号：９のアミノ酸＃１からアミノ酸＃１１０のアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することによりヒト・ＢＭＰ−９を製造してもよい。
本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中に医薬上有効量のＢＭＰ−９蛋白を含有している医薬組成物を提供する。本発明ＢＭＰ−９組成物を軟骨の形成に使用してもよい。さらに、これらの組成物を骨の形成に使用してもよい。ＢＭＰ−９組成物を傷の治癒および組織の修復に用いてもよい。さらに本発明組成物は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ８８／００２０５、ＷＯ８９／１０４０９およびＷＯ９０／１１３６６に開示されたＢＭＰ蛋白ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ならびにＢＭＰ−７、および１９９１年１月１５日出願の米国出願第０７／６４１，２０４号、１９９０年５月１６日出願の第０７／５２５，３５７号および１９９１年１１月２０日出願の０７／８００，３６４号に開示されたＢＭＰ−８のごとき少なくとも１種の治療上有用な薬剤を含有していてもよい。
本発明組成物は、ＢＭＰ−９蛋白のほかに、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）のごとき増殖因子を包含する他の治療上有用な薬剤からなっていてもよい。また、組成物は適当なマトリックス、例えば、組成物を支持し、骨および／または軟骨の増殖のための表面を提供するためのマトリックスを含んでいてもよい。マトリックスは骨誘導性蛋白のゆっくりとした放出および／またはその存在に適した環境を提供しうる。
多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周病および種々のタイプの傷の治療方法にＢＭＰ−９組成物を使用してもよい。本発明によれば、これらの方法は、かかる骨および／または軟骨の形成、傷の治癒または組織の修復を必要とする患者に有効量のＢＭＰ−９蛋白を投与することを必要とする。また、これらの方法は、上記共同出願に開示された少なくとも１種の新規ＢＭＰ蛋白と組み合わせて本発明蛋白を投与することを伴うこともある。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＩＧＦを包含する他の増殖因子とともにＢＭＰ−９蛋白を投与することを包含する。
本発明のさらなる態様は、ＢＭＰ−９蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、図１（配列番号：１）および図３（配列番号：８）に示す５’から３’方向のヌクレオチド配列、または厳密な条件下で上記１もしくは図３のＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし軟骨および／または骨の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。結局、図１または図３の配列の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるヌクレオチド変化がペプチド配列の変化を引き起こすとしても、引き起こさないとしても、本発明に包含される。
本発明のさらなる態様は、発現調節配列と作動可能に結合された上記ＤＮＡ配列からなるベクターを包含する。発現調節配列と作動可能に結合されたＢＭＰ−９蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された細胞系が適当な培地で培養され、ＢＭＰ−９蛋白がそこから回収され精製される本発明ＢＭＰ−９蛋白新規製造方法において、これらのベクターを用いてもよい。この方法には、ポリペプチド発現のための細胞として、原核および真核双方の多くの知られた細胞を用いることができる。
本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明およびその好ましい具体例を考慮すれば明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、さらに以下に説明するクローンＭＬ１４ａからのネズミ・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列からなる。
図２は、Ｕ２ＯＳ−３  ＡＴＣＣ＃４０３４２からのヒト・ＢＭＰ−４のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列からなる。
図３は、λ  ＦＩＸ／Ｈ６１１１  ＡＴＣＣ＃７５２５２からのヒト・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列および推定アミノ酸列からなる。
図４は、関節の軟骨のアッセイであり、硫酸根の取り込みの結果を示す。
図５は、ＨｅｐＧ２細胞への特異的ＢＭＰ−９結合の結果を示す。
図６は、ＢＭＰ−９によるＨｅｐＧ２細胞増殖の刺激の結果を示す。
図７は、ＢＭＰ−９による初期ラット・肝細胞の刺激の結果を示す。
発明の詳細な説明
ネズミ・ＢＭＰ−９ヌクレオチド配列（配列番号：１）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。図１（配列番号：１）のヌクレオチド＃６１０からヌクレオチド＃１８９３までのＤＮＡコーディング配列からなるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し、図１（配列番号：２）のアミノ酸＃３１９から＃４２８により示されるアミノ酸配列または実質的に相同的な配列を含む蛋白を培地から精製することにより、本発明の精製ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白を製造する。培地から回収されたＢＭＰ−９蛋白を、同時生成される他の蛋白性物質および存在する他の混入物質から単離することによって精製する。
ヒト・ＢＭＰ−９ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号：８および９に示す。成熟ヒト・ＢＭＰ−９は、アミノ酸＃１（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）から＃１１０（Ａｒｇ）よりなると考えられる。
配列番号：８に示すヌクレオチド＃１２４から＃４５３からなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、配列番号：９のアミノ酸＃１からアミノ酸＃１１０までのアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白であって同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−９を製造してもよい。
軟骨の形成を誘導する能力によりＢＭＰ−９蛋白を特徴づけてもよい。さらに、骨の形成を誘導する能力によりＢＭＰ−９蛋白を特徴づけてもよい。後で説明するラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および／または骨の形成活性を示す能力によりＢＭＰ−９蛋白をさらに特徴づけてもよい。
本発明により提供されるＢＭＰ−９蛋白は、図１および３（配列番号：１および８）の配列と同様の配列によりコードされる因子をも包含するが、該因子には修飾が自然に行われているか（例えば、ポリペプチドのアミノ酸変化をもたらす可能性のあるヌクレオチド配列における対立遺伝子変種）あるいは人工的に誘導されている。例えば、合成ポリペプチドは、図１および図３（配列番号：２および９）のアミノ酸残基の全体または部分を複製した連続配列であってもよい。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンホーメーションの特徴を図１および図３の骨増殖因子ポリペプチドと共有することにより、それらに共通した骨増殖因子の生物学的特徴を有することができる。よって、それらを、天然のＢＭＰ−９または他のＢＭＰ−９ポリペプチドに対する生物学的に活性のある代替物として治療プロセスに使用することができる。
本明細書に記載のＢＭＰ−９蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかである（通常、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）。グリコシレーション認識部位における第１または第３のアミノ酸の位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列のおけるグリコシレーションを生じさせない。
さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列と結合していない、ＢＭＰ−９蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、図１または図３（配列番号：１および８）に示された５’から３’方向への配列、および厳密な条件下、例えば、６５℃における０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ［マニアティス(Maniatis)ら，「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・アニュアル）（Molecular Cloning(A Laboratory Manual）」，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年），３８７〜３８９頁］においてそれらの配列にハイブリダイズし、軟骨および／または骨誘導活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。
同様に、図１または図３の配列によりコードされるＢＭＰ−９蛋白をコードするＤＮＡ配列であるが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変種（特異的な集団における天然に生じる塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある）によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増強するための、点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換）により引き起こされる図１または図３（配列番号：１および８）のＤＮＡ配列における変化も、本発明に包含される。
本発明のもう１つの態様は、ＢＭＰ−９蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明ＢＭＰ−９蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された宿主細胞を培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。
適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター・卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増殖、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野において知られている。例えば、ゲシング（Gething）およびサムブルック（Sambrook），ネイチャー（Nature），第２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）、あるいは、カウフマン（Kaufman）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell. Biol.），第５巻（７）：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）もしくはホウリー（Howley）ら，米国特許第４，４１９，４４６号参照。付記した実施例に記載した別の適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当でありうる。
細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することができる。
当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞として使用することもできる。例えば、ミラー（Miller）ら，ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering），第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス（Plenim Press）１９８６年）およびその中で引用されている文献参照。
本発明のもう１つの態様は、これらの新規ＢＭＰ−９ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードしている上記の新規ＤＮＡ配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、ＢＭＰ−９蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記修飾配列を含むベクターも、本発明の具体的である。ベクターを細胞系の形質転換方法に用いてもよく、該ベクターは、選択された宿主細胞において複製および発現を指令しうる、本発明ＤＮＡコーディング配列に作動可能に結合した選択調節配列を含んでいる。かかるベクターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は常套的であり、本発明の一部を形成しない。
骨が正常に形成されない環境における軟骨および／または骨の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷に適用される。ＢＭＰ−９蛋白を用いるかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨原性薬剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷、あるいは腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さらに美容整形手術にも有用である。ＢＭＰ−９蛋白を歯周病の治療、およびその他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せるための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することができる。本発明ＢＭＰ−９ポリペプチドは骨粗鬆症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨融合性および骨誘導性因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第１４８，１５５号および第１６９，０１６号参照。
本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。傷のタイプは、熱傷、切り傷、潰瘍を包含するが、これらに限定しない（傷の治癒および関連組織の治療の議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。
本発明蛋白はニューロンの生存率を向上させ、それゆえ、萎縮およびニューロンの生存率の低下を示す症状の治療に有用でありうる。
また本発明ＢＭＰ−９蛋白は、肝臓の増殖および肝細胞の修復ならびに再生を包含する機能において有用でありうる。
本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および／または骨の欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物からなる。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白からなる。本発明蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と協同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記共有出願に開示された治療量の少なくとも１種の他のＢＭＰ蛋白を伴った、治療量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白からなる。かかる混合物は、個々の分子または異なるＢＭＰ部分よりなる異種分子からなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−９蛋白サブユニットおよび上記「ＢＭＰ」蛋白の１つに由来するサブユニットからなるジスルフィド結合二量体からなっていてもよい。さらなる具体例はＢＭＰ−９部分のヘテロダイマーからなっていてもよい。さらに、骨および／または軟骨の欠損、傷、または問題の組織の治療に有益な他の薬剤と組み合わせてＢＭＰ−９蛋白を用いてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子を包含しうる。
ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当業者の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、ＢＭＰ蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、ヒト以外には家畜およびサラブレットのマウスが、本発明ＢＭＰ−９での治療に関する望ましい患者である。
本発明治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、あるいはインプラントもしくはデバイスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態である。さらに望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位に送達するためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に所望により含有されていてもよい、ＢＭＰ−９蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において、ＢＭＰ組成物と同時または逐次的に、ＢＭＰ組成物に変えて、あるいは付加的に投与してもよい。好ましくは、骨、軟骨または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷を受けて修復を必要とする組織の部位にＢＭＰ−９または他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に再吸収されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、ＢＭＰ−９および／または他の骨誘導蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の浸潤のための正しい構造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他の移植される医薬用具に使用する材料から作られる。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。ＢＭＰ−９組成物のそれぞれの適用により適切な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、骨、腱または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分からなる。他の有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなっていてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中においてバイオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分解性を変化させてもよい。
ＢＭＰ−９蛋白の作用を変化させる種々の要因、例えば、形成が望まれる骨の量、骨損傷部位、損傷を受けた骨の状態、傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染の重さ、投与期間および他の臨床的要因を考慮して医師により投与規則が決定されるであろう。用量を、復元に用いるマトリックスのタイプおよび組成物中のＢＭＰ蛋白のタイプとともに変更してもよい。ＩＧＦ  Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき他の知られた増殖因子の最終組成物への添加も用量に影響しうる。骨の増殖および／または修復を定期的に評価することにより、例えば、Ｘ線、組織形態学的調査およびテトラサイクリン標識によって、進行をモニターすることができる。
以下の実施例は、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白の回収および特徴づけ、およびヒトまたは他のＢＭＰ−９蛋白を回収するためのその使用、ヒト・蛋白の取得および組み換え法による蛋白の発現における本発明の実施例を説明する。
実施例Ｉ
ネズミ・ＢＭＰ−９
ベクターであるラムダＺＡＰ（ストラタジーン（Stratagene）／カタログ番号９３５３０２）中の作成されたマウス・肝ｃＤＮＡライブラリーの７５００００個の組み換え体をプレーティングし、二重ニトロセルロースレプリカ（duplicate nitrocellulose replicas）を作成する。図２（配列番号：３）（ヒト・ＢＭＰ−４配列）のヌクレオチド１３３０〜１６２７に対応するヒト・ＢＭＰ−４  ＤＮＡフラグメントを、ファインバーグ（Feinberg）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１３２巻：６〜１３頁（１９８３年）のランダムプライミング法により32Ｐ標識し、ＳＨＢ中６０℃で２〜３日、両セットのフィルターとハイブリダイゼーションさせる。両セットのフィルターを厳密性を減じた条件下（６０℃、４ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄する。種々の強度の二重のハイブリダイゼーションする組み換え体が記録される（約９２個）。最も強くハイブリダイゼーションしている５０個の組み換えバクテリオファージをプラーク精製し、製造者（ストラタジーン）により記載されたインビボ切断プロトコールによってそれらのインサートをプラスミドであるBluescript SK（+/-）に移行させる。数個の組み換え体のＤＮＡ配列の分析により、それらが他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白と相同的な蛋白をコードしてことが示される。ＭＬ１４ａと命名された１の組み換え体のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を図１（配列番号：１）に示す。
クローンＭＬ１４ａのヌクレオチド配列は、４２８個のアミノ酸のＢＭＰ−９蛋白をコードしている１２８４ｂｐの読み取り枠を含んでいる。３つすべてのの読み取り枠においてストップコドンを伴う６０９ｂｐの５’非翻訳配列がコーディング配列に先行しているので、コードされている４２８個のアミノ酸のＢＭＰ−９蛋白は１次翻訳産物であると考えられる。該４２８個のアミノ酸配列は分子量４８０００ダルトンのＢＭＰ−９蛋白を予想させる。
他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白に関する知識によると、前駆体ポリペプチドは、認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ−Ｘ−ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＡＲＧにおいて開裂されると予想される。この位置におけるＢＭＰ−９前駆体ポリペプチドの開裂は、位置＃３１９のアミノ酸ＳＥＲから始まる１１０個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gentry）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Moll.& Cell.Biol.)，第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら，ネイチャー（Nature），第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］と同様の様式での、二量体化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。
それゆえ、ＢＭＰ−９の成熟活性種は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットはアミノ酸＃３１９〜＃４２８からなり、その予想分子量は約１２，０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は、アミノ酸＃３２６〜＃４２８からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−βの他のメンバーと同様に、ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、アミノ末端領域より保存性が高い配列を示す。他のヒト・ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白の対応領域に対するＢＭＰ−９蛋白のシステインに富むＣ末端ドメイン（アミノ酸＃３２６〜＃４２８）のアミノ酸同一性は以下のとおり：ＢＭＰ−２，５３％；ＢＭＰ−３，４３％；ＢＭＰ−４，５３％；ＢＭＰ−５，５５％；ＢＭＰ−６，５５％；ＢＭＰ−７，５３％；Ｖｇ１，５０％；ＧＤＦ−１，４３％；ＴＧＦ−β１，３２％；ＴＧＦ−β２，３４％；ＴＧＦ−β３，３４％；インヒビンβ（Ｂ），３４％；およびインヒビンβ（Ａ），４２％。
実施例II
ヒト・ＢＭＰ−９
ネズミおよびヒトの骨誘導因子の遺伝子は有意に相同的であると考えられ、それゆえ、ネズミのコーディング配列またはその一部を、ヒト・ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、あるいは類似のヒト・軟骨および／または骨蛋白を合成するヒト・細胞系または組織を同定するためのプローブとして使用する。ヒト・ゲノムライブラリー（トール（Toole）ら、上記文献）をかかるプローブでスクリーニングして、推定上陽性のものを単離し、ＤＮＡ配列を得ることができる。この組み換え体がヒト・ＢＭＰ−９の一部をコードしているという証拠は、ネズミ／ヒトの蛋白および遺伝子構造の相同性による。
ヒト・軟骨および／または骨誘導因子分子の一部をコードしているＤＮＡを含む組み換えバクテリオファージが得られたならば、ヒト・コーディング配列をプローブとして用いて、ＢＭＰ−９を合成するヒト・細胞系または組織を同定することができる。別法として、ネズミ・ＢＭＰ−９のコーディング配列をプローブとして用いてかかるヒト・細胞系または組織を同定することもできる。簡単に説明すると、選択された細胞または組織を源としてＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動してニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ネズミまたはヒト・ＢＭＰ−９のコーディング配列由来のプローブとハイブリダイズさせる。オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立された方法により（トール（Toole）ら，上記文献）、λｇｔ１０またはラムダＺＡＰ中にクローン化する。
当業者に知られたさらなる方法を用いて、本発明のヒトおよび他の種のＢＭＰ−９蛋白を単離してもよい。
Ａ．ヒト・ＢＭＰ−９  ＤＮＡの単離
ベクターであるλＦＩＸ（ストラタジ−ンのカタログ番号９４４２０１）中に構築されたヒト・ゲノムライブラリーの１００万個の組み換え体をプレーティングし、二重ニトロセルロースレプリカを作成する。図１（配列番号：１）に示す配列のヌクレオチド＃１６６５〜＃１７０４および＃１８３７〜＃１８７６に基づいて設計された２種のオリゴヌクレオチドプローブを自動ＤＮＡ合成装置で合成する。これら２種のオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0003706133.tif 000002
これら２種のオリゴヌクレオチドプローブをγ32Ｐ−ＡＴＰで標識し、それぞれを、ＳＨＢ中６５℃で１セットの二重ニトロセルロースレプリカとハイブリダイゼーションさせ、６５℃において１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。両方のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションする３つの組み換え体が記録される。３つすべてのハイブリダイゼーション陽性組み換え体をプラーク精製し、バクテリオファージストックを調製し、バクリオファージＤＮＡをそれぞれから単離する。これらの組み換え体のうち１つ（ＨＧ１１１と命名）のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、１．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメントに局在化している。このフラグメントをプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−３）中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行う。ＨＧ１１１は、１９９２年６月１６日に、ブタペスト条約の要請下で、米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ、１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託され、ＡＴＣＣ＃７５２５２と命名された。このサブクローンをｐＧＥＭ−１１１と命名する。クローンｐＧＥＭ−１１１のＤＮＡ配列の一部を図３（配列番号：８／ヒト・ＢＭＰ−９配列）に示す。この配列は、ヒト・ＢＭＰ−９の成熟領域全体およびプロペプチドの一部をコードしている。この配列は予備的なデータからなることに注意すべきである。詳細には、プロペプチド領域をさらなる分析および特徴付けに供する。例えば、ヌクレオチド＃１から＃３（ＴＧＡ）は翻訳停止をコードしているが、配列の予備的な性質により不正確かも知れない。ｐＧＥＭ−１１１（ｐＧＥＭ中にサブクローン化されたＨＧ１１１の１．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメント）およびＨＧ１１１に存在するさらなる配列が、ヒト・ＢＭ−９プロペプチド領域のさらなるアミノ酸をコードしていると予測される。
他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白に関する知識によると、前駆体ポリペプチドは、認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ−Ｘ−ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＡＲＧ（配列番号：９のアミノ酸＃−４から＃−１）において開裂されると予想される。この位置におけるヒト・ＢＭＰ−９前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：９の位置＃１のアミノ酸ＳＥＲ（配列番号：８のヌクレオチド＃１２４から＃１２６によりコードされている）から始まる１１０個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ヒト・ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gently）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Moll.& Cell.Biol.），第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら，ネイチャー（Nature），第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］と同様の様式での、二量体化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。
それゆえ、ヒト・ＢＭＰ−９の成熟活性種は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットは配列番号：９のアミノ酸＃１から＃１１０よりなり、その予想分子量は約１２，０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は、アミノ酸＃８〜＃１１０からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−βの他のメンバーと同様に、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、アミノ末端領域より保存性が高い配列を示す。他のヒト・ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーに属する他の蛋白の対応領域に対するヒト・ＢＭＰ−９蛋白のシステインに富むＣ末端ドメイン（アミノ酸＃８〜＃１１０）のアミノ酸同一性は以下のとおり：ＢＭＰ−２，５２％；ＢＭＰ−３，４０％；ＢＭＰ−４，５２％；ＢＭＰ−５，５５％；ＢＭＰ−６，５５％；ＢＭＰ−７，５３％；ネズミ・ＢＭＰ−９，９７％；Ｖｇ１，５０％；ＧＤＦ−１，４４％；ＴＧＦ−β１，３２％；ＴＧＦ−β２，３２％；ＴＧＦ−β３，３２％；インヒビンβ（Ｂ），３５％；およびインヒビンβ（Ａ），４１％。ＢＭＰ−９は、ニワトリ胚からクローン化されたＢＭＰ様蛋白であるニワトリ・ドルサリン−１に対して８０％の相同性を示す。
実施例III
ローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析（Rosen-Modified Sampath-Reddi Assay）
サムパスおよびレディ，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ，第８０巻：６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラット・骨形成分析の変更バージョンを用いて、骨、軟骨および／または他の結合組織に対するＢＭＰ−９蛋白の誘導活性を評価する。この変法分析を、本明細書においてはローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析と呼ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、分析すべきフラクションの水に対する透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）に置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０．１％ＴＦＡに対して平衡化する。得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。蛋白処理していない模擬ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。カプセルを、２１〜４９日齢のオスのロング・エバンズ・ラット（Long Evans Rat）の腹胸部の皮下に移植する。各移植物の半分をアルカリ性ホスファターゼ分析に用いる［レディらプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ，第６９巻：１０６１頁（１９７２年）参照］。
各移植物のもう半分を固定し、組織学的分析用に加工する。１μｍのグリコールメタクリラート切片をフォン・コッサ（Von Kossa）および酸性フクシンで染色して、各移植物に見られる誘導された骨および軟骨の形成量について評点をつける。＋１ないし＋５の評点は、新たに骨および／または軟骨細胞およびマトリックスにより占められている移植物に各組織学的切片の面積を示す。評点＋５は、移植物の５０％を上回る部分が移植物中の蛋白の直接的結果として産生された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１はそれぞれ、移植物が４０％、３０％、２０％および１０％を上回る新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。改変された評点法において、各インプラントから３つに隣接していないセクションを評価し、平均した。「＋／−」は実験的な軟骨または骨の同定を示し；「＋１」は各セクションの＞１０％が新たな軟骨または骨であることを示し；「＋２」は＞２５％；「＋３」は＞５０％；「＋４」は〜７５％；「＋５」は＞８０％を示す。「−」はインプラントが回復されないことを示す。
マトリックス試料のＢＭＰ−９含有試料の用量応答的性質により、形成された骨および／または軟骨の量が試料中のＢＭＰ−９の量に伴って増加することが示されるであろうということが考えられる。対照試料は骨および／または軟骨の形成を生じないであろうということが考えれる。
上記「ＢＭＰ」蛋白のごとき他の軟骨および／または骨誘導蛋白の場合のように、形成された骨および／または軟骨はマトリックスにより占められた空間に物理的に閉じ込められると考えられる。試料を、ＳＤＳゲル電気泳動および等電点焦点、次いで、オートラジオグラフィーによっても分析する。活性は蛋白バンドおよびｐＩに対応する。特定のフラクション中の蛋白純度を評価するために、１０Ｄ／ｍｇ−ｃｍの吸光係数を蛋白の評価に用い、蛋白をＳＤＳ  ＰＡＧＥに供し、次いで銀染色するか、または放射性ヨウ素化し、オートラジオグラフィーを行う。
実施例IV
ＢＭＰ−９の発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−９を製造するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクター中に移行させ、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主中の導入する。生物学的に活性のある組み換え型ヒト・ＢＭＰ−９の好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。
当業者は、図１（配列番号：１）または図３（配列番号：８）の配列、もしくはＢＭＰ−９蛋白をコードしている他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾された配列およびｐＣＤ［オカヤマ（Okayama）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell Biol.），第２巻：１６１〜１７０頁（１９８２年）］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ゴウ（Gough）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，第４巻：６４５〜６５３頁（１９８５年）］ならびにｐＭＴ２  ＣＸＭのごとき知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。
哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２  ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）（ウォング（Wong）ら，サイエンス（Science）第２２８巻：８１０〜８１５頁，１９８５年）の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためにＸｈｏＩ部位を有することにおいてｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２  ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており（カウフマン，アール・ジェイ（Kaufman,R.J.)，１９８５年，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：６８９〜６９３頁）、アデノウイルス・ＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０・複製開始点、５’スプライス部位ならびにアデノウイルス・後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス・大後期プロモーター、３’スプライス受容部位、ＤＨＦＡ挿入断片、ＳＶ４０・初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。
ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭを得る。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託されている。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切除され、直鎖状のｐＭＴ２が得られ、それは連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン変異誘発［モリナガ（Morinaga）ら，バイオテクノロジー（Biotechnology）第８４巻：６３６頁（１９８４年）］を用いてｐＭＴ２  ＣＸＭを構築する。これにより、ｐＭＴ２のＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄIII部位に対応する塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらに、そのヌクレオチド１１４５の位置に以下の配列：
0003706133.tif 000003
を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２  ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭおよびｐＭＴ２３  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。
ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２ｂ１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切除され、直鎖状のｐＭＴ２が得られ、それは連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。
ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。最初に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６ｂｐの５’非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に以下の配列：
0003706133.tif 000004
を得る。
次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、単一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０ｂｐの断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１［エス・ケイ・ジュング（S.K.Jung）ら，ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol）第６３巻：１６５１〜１６６０頁（１９８９年）］から得られ、これは２７５２ｂｐのフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。以下の配列：
0003706133.tif 000005
を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端を用いて６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を合成する。
この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣ２β１を得る。
このベクターは、ＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス・大後期プロモーター、アデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０・ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルス・ＶＡ  Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。
ベクターの構築はＢＭＰ−９のＤＮＡ配列の修飾を包含する。例えば、コーディング領域の５’および３’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去することにより、ＢＭＰ−９のｃＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、ＢＭＰ−９蛋白の発現に適する宿主細胞中に形質転換する。当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、図１または図３（配列番号：１および８）の配列を操作することができる。例えば、コーディング配列をさらに操作することができる（例えば、他の既知リンカーに結合する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを修飾する）。次いで、ティー・タニグチ（T.Taniguchi）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），第7７巻：５２３０〜５２３３頁（１９８０年）に記載されたような方法を用いて修飾されたＢＭＰ−９コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的なな細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−９蛋白を発現させる。細菌細胞においてＢＭＰ−９蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ  １７７，３４３参照。
昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うための操作を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５，４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３，２８９号記載の方法参照］。
高レベルの本発明ＢＭＰ−９蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種ＢＭＰ−９遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp），ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.），第１５９巻：６０１〜６２９頁（１９８２年）の方法により、メトトレキサート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。
例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＢＭＰ−９の発現を可能にする他のプラスミドの配列と機能的に連結された本発明ＢＭＰ−９に関するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp），モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），第２巻：１３０４頁（１９８２年）］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢII中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、カウフマン（Kaufman）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），第５巻：１７５０頁（１９８３年）記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合（例えば、０．０２、０．２、１．０、次いで、５μＭのＭＴＸという連続的工程）の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体をクローン化し、生物学的に活性のあるＢＭＰ−９の発現を、実施例IIIにおいて上で説明したローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析によりモニターする。ＢＭＰ−９の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［35Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、ＢＭＰ−９ポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連ＢＭＰ−９蛋白を製造することができる。
Ａ．ＢＭＰ−９ベクターの構築
本発明ヒト・ＢＭＰ−９蛋白を製造するために、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の成熟領域をコードしているＤＮＡ配列を、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白のプロペプチド領域をコードしているＤＮＡ配列に結合させてもよい。このネズミ／ヒト・ハイブリッドＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中に挿入し、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞中または他の好ましい真核もしくは原核宿主中に導入する。発現プラスミドを含んでいるこのネズミ／ヒト・ＢＭＰ−９の構築を以下に説明する。
ヌクレオチド＃１０５から＃４７０までのヌクレオチド配列からなるヒト・ＢＭＰ−９配列（配列番号：８）の誘導体を特異的に増幅する。下記オリゴヌクレオチド
0003706133.tif 000006
をプライマーとして用いて、上記クローンｐＧＥＭ−１１１由来のヒト・ＢＭＰ−９配列（配列番号：８）のヌクレオチド＃１０５から＃４７０までの増幅を可能にする。この手順により、ヌクレオチド＃１０５の直前にヌクレオチド配列ＡＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴの挿入およびヌクレオチド＃４７０の直後にヌクレオチド配列ＧＡＡＴＴＣＧＣＴの挿入が生じる。これらの配列の付加により、特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントの各末端にＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が生じる。得られた３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＧＥＭ−７ｆＺ（＋）（プロメガ（Promega）のカタログ番号ｐ２２５１）中にサブクローン化する。得られたクローンをｐｈＢＭＰ９ｍｅｘ−１と命名する。
ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）に基づいて下記オリゴヌクレオチド
0003706133.tif 000007
を設計し、上記ネズミ／ヒト発現プラスミドの構築を容易にするように修飾する。これらのオリゴヌクレオチドは相補的配列を含んでおり、互いに付加されると２種の個々の配列のアニーリング（塩基対形成）が容易になり、下記のような様式：
0003706133.tif 000008
で２本鎖合成ＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−１と命名）の形成が起こる。このＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−１）は、ネズミ／ヒト発現プラスミドの構築に必要な引き続いての操作を容易にするために必要な制限エンドヌクレアーゼの認識配列、ならびに哺乳動物発現系における異種配列の最大発現に必要な配列を含んでいる。より詳細には（ヌクレオチド＃５／ＬＩＮＫ−１の配列番号付け参照）、ヌクレオチド＃１〜＃１１は制限エンドブクレアーゼＢａｍＨＩおよびＳａｌＩのための認識配列からなり、ヌクレオチド＃１１〜＃１５は哺乳動物発現系における異種配列の最大発現を可能にし、ヌクレオチド＃１６〜＃３１はネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）のヌクレオチド＃６１０〜＃６２５に対応し、ヌクレオチド＃３２〜＃３３は２個の隣接した制限エンドヌクレアーゼ部位（ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩ）の効果的な制限消化を容易にするために挿入されており、ヌクレオチド＃３４〜＃６０はネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃１５１５〜＃１５４１に対応しているが、ネズミ／ヒト・ハイブリッド発現プラスミドのさらなる操作を容易にするために合成オリゴヌクレオチド＃５のヌクレオチド＃５８が、配列番号：１の位置＃１５３９にあるＡではなくてＧとなっていることを除く（このヌクレオチド変換により、ＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列が作られるが、コードされるアミノ酸配列は変化しない）。ＬＩＮＫ−１（オリゴヌクレオチド＃５および＃６の２本鎖アニーリング産物）を、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＧＥＭ−７ｆＺ（＋）中にサブクローン化する。このことにより、通常はｐＧＥＭ−７ｆＺ（＋）プラスミドのポリリンカーのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に存在する配列が上記ＬＩＮＫ−１の配列で置換されているプラスミドが生じる。得られたプラスミドクローンをｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋと命名する。
ｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃１〜＃３４を除去する（オリゴ＃５の番号付け参照）。配列番号：１に示す配列からなるインサート含むクローンＭＬ１４ａも、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、配列番号：１（ネズミ・ＢＭＰ−９）のヌクレオチド＃１〜＃１５１５からなる配列を除去する。このマウス・ＢＭＰ−９のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをＭＬ１４ａプラスミドクローンの残りの部分から単離し、上記合成リンカー配列の除去により生じたＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位中にサブクローン化する。得られたクローンをｐ３０２と命名する。
ｐ３０２クローンを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５およびＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃３５〜＃５９（オリゴヌクレオチド＃５の番号付け参照）に対応するヌクレオチドを切除する。上記のＡからＧへの変換によりＬＩＮＫ−１中に作られたＡｐａＩ制限部位はＥｃｏＯ１０９Ｉの認識配列の１つであり、それゆえ、ＥｃｏＯ１０９Ｉでのｐ３０２の消化により、ＡｐａＩ部位ならびに本来存在するネズミのＥｃｏＯ１０９Ｉ部位（配列番号：１の＃６１９〜＃６２５）が開裂され、上記配列からなる９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＡｐａＩ）フラグメントの切除が起こる。この９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＡｐａＩ）フラグメントをｐ３０２プラスミドクローンの残りの部分から単離し、同様にＥｃｏＯ１０９Ｉで消化しておいたクローンｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋ中にサブクローン化する。ＬＩＮＫ−１の２個の隣接したＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩ制限部位のより完全な消化を容易にするために元々設計されたものであり、今やｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋ（上記）の一部となっているヌクレオチドＧＧ（オリゴヌクレオチド＃５の＃３２〜＃３３）により、Ｄｃｍメチル化認識配列が作られる。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９ＩはＤｃｍメチル化に感受性があり、それゆえ、この配列（オリゴヌクレオチド＃５／ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃２５〜＃３１）の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉによる開裂はこの部位において防止される。それゆえ、上記のごとき制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉでの消化によりプラスミドクローンｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋはＡｐａＩ部位において開裂されるが、ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位においては開裂されず、ＬＩＮＫ−１のＥｃｏＯ１０９ＩとＸｂａＩとの間の配列（オリゴヌクレオチド＃５の番号付けによれば＃３２〜＃５５となる）の除去が防止される。このことにより、ｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋのＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＡｐａＩ）部位における９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＡｐａＩフラグメントの挿入が起こる。得られたクローンをｐ３１８と命名する。
クローンｐ３１８を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＡｐａＩで消化し、ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃６〜＃５６（位置についてはオリゴ＃５を参照）、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５、およびＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃３５〜＃６０（位置についてはオリゴ＃５を参照）からなる配列が切除される。得られた上記９７２ｂｐのＳａｌＩ／ＡｐａＩフラグメントをｐ３１８プラスミドクローンの残りの部分から単離し、引き続いての操作に使用する。
ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の成熟領域全体とプロペプチドの一部をコードするＤＮＡ配列を含んでいるクローンｐｈＢＭＰ９ｍｅｘ−１（上記）を、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。このことにより、ヒト・ＢＭＰ−９配列（配列番号：８）のヌクレオチド＃１０５〜＃４７０および制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩのための認識配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー＃３および＃４のさらなるヌクレオチドからなる３７４ｂｐのフラグメントの切除が起こる。この３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ３１８由来の９７２ｂｐのＳａｌＩ／ＡｐａＩフラグメント（単離については上記した）に結合し、次いで、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいた哺乳動物発現プラスミドｐＥＤ６（ｐＥＭＣ２β１の誘導体）に結合する。得られたクローンをｐ３２４と命名する。
クローンＭＬ１４ａ（ネズミ・ＢＭＰ−９）をＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩで消化して、配列番号：１のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５からなるフラグメントを得る。
以下のオリゴヌクレオチド：
0003706133.tif 000009
を自動ＤＮＡ合成装置で合成し、それらの相補的配列が互いに塩基対を形成してＬＩＮＫ−２と命名された２本鎖合成ＤＮＡリンカー：
0003706133.tif 000010
が生じるように結合させる。この２本鎖合成ＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−２）は、下に示すＳａｌＩ（一方の末端）またはＥｃｏＯ１０９Ｉ（他方の末端）で消化されたＤＮＡフラグメントに適合する１本鎖末端を生じるようにアニーリングする。
このＬＩＮＫ−２合成ＤＮＡリンカーを、上記ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５からなる８９５ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＸｂａＩフラグメントに結合する。このことにより、９１５ｂｐのＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントが得られる。
クローンｐ３２４をＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化して，ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃６〜＃５６（位置についてはオリゴ＃５を参照）およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５からなる配列を除去する。ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃３５〜＃６０（位置についてはオリゴ＃５を参照）からなる配列およびｐｈＢＭＰ９ｍｅｘ−１由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（ヒト・ＢＭＰ−９配列）からなる配列はｐＥＤ６骨格に結合したままである。ＬＩＮＫ−２配列およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５からなる９１５ｂｐのＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントを、上記ＳａｌＩからＸｂａＩまでの配列が除去されているｐ３２４クローン中に結合する。
得られたプラスミドをＢＭＰ−９ｆｕｓｉｏｎと命名し、それは、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＤ６のＳａｌＩとＥｃｏＲＩとの間に挿入された、ＬＩＮＫ−２、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）のヌクレオチド＃６２１〜＃１５１５、ＬＩＮＫ−１のヌクレオチド＃３５〜＃５９（オリゴヌクレオチド＃５の番号付け参照）、およびクローンｐＢＭＰ９ｍｅｘ−１（上記）由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（ヒト・ＢＭＰ−９）からなる。
Ｂ．発現
当業者に知られた標準的方法を用いてＢＭＰ−９ｆｕｓｉｏｎをＣＨＯ細胞中にトランスフェクションしてヒト・ＢＭＰ−９を発現しうる安定な細胞系を作る。細胞系を適当な培養条件下で培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培地から単離し精製する。
１の具体例において、Ｆ１２およびＤＭＥプラスさらなる非必須アミノ酸プラスさらなるビオチンおよびＢ１２および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．２ζＭメトトレキサート（ＭＴＸ）の５０：５０混合物を基礎とするＲ１培地中で細胞を増殖させる。集密的ローラーボトル（confluent roller bottles）を用いる培地において細胞は増殖し、ローラーボトル中に広がる。増殖培地を含有する血清を捨て、ローラーをＰＢＳ−ＣＭＦですすぎ、さらなるアミノ酸プラスインスリン（５ζｇ／ｍｌ）、プトレシン（１２．９ζＭ）、ヒドロコルチゾン（０．２ζＭ）、セレン（２９ｎＭ）、およびＰＶＡ（０．６ｇ／Ｌ）を含有する無血清生産用培地を添加する。デキストラン硫酸をこのＣＭに用いる（１００ζｇ／ｍｌ）。ならし培地（ＣＭ）を２４時間目に集め、ローラーに新鮮無血清培地を再注入する。２４時間培養を４回行って収穫物を集める。５ζ（pass Profile）の孔サイズのフィルターおよび０．２２ζ（millipore Duropore）の孔サイズのフィルターを通すことにより、精製のためにならし培地を清澄化する（ＣＭ中の浮遊細胞を除去する）。
実施例Ｖ
発現されたＢＭＰ−９の生物学的活性
上記実施例IVで得られた発現されたＢＭＰ−９蛋白の生物学的活性を測定するために、細胞培養物から蛋白を回収し、同時生成される他の蛋白性物質ならびに他の混入物質からＢＭＰ−９蛋白を単離することにより精製した。実施例III記載のラット・骨形成アッセイによって精製蛋白をアッセイしてもよい。
当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。他のＢＭＰ蛋白と同様、精製にヘパリンセファロースを包含していてもよいと考えられる。
１の具体例において、実施例IV−Ｂから得た４０リットルのならし培地を濃リン酸ナトリウムｐＨ６．０を用いてｐＨ６．９とし、前以て５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９で平衡化しておいたセルファイン硫酸に負荷する。樹脂を５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、次いで、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ａｒｇ、ｐＨ６．９で洗浄する。ＢＭＰ−９は洗液ならびに溶出液に見いだされるが、溶出液プール中の混入物質の濃度が低い。セルファイン硫酸のプールを濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣに直接負荷して最終精製とする。各濃度プールを希ＴＦＡでｐＨ３．８とし、０．４６Ｘ２５ｃｍのＣ4逆相カラムに負荷し、１００分で３０％Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）から５５％Ｂ（０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル）までの直線グラジエントを行う。ＢＭＰ−９モノマーはベースライン分析によりＢＭＰ−９ダイマーから分離される。モノマーおよびダイマーのプールの同一性を、Ｎ−末端配列決定により確認する。Ｎ−末端における不均一性が予想されるが、配列決定により、配列番号：９のアミノ酸＃１から始まる優勢種Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａが明らかになった。
銀染色［アール・アール・オークリー（R.R.Oakley）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０５巻：３６１頁（１９８０年）］で染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［ユー・ケイ・レムリ（U.K.Laemmli）、ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）］のごとき標準的方法を用い、さらにイムノブロット［エイチ・トウビン（H.Towbin）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：４３５０頁（１９７９年）］により蛋白の分析を行う。ＣＨＯ細胞においてＢＭＰ−９は、還元的条件下で分析した場合、１４ｋＤａのグリコシレーションされていない蛋白として効果的に発現される。ＢＭＰ−９はその合成から４時間以内に効果的に分泌される。
実施例VI
Ａ．Ｗ−２０バイオアッセイ
インジケーター細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ蛋白での処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく［シース（Thies）ら，ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of Bone and Minaral Research），第５巻：３０５頁（１９９０年）；およびシース（Thies）ら，エンドクリノロジー（Endocrinology），第１３０巻：１３１８頁（１９９２年）］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's Hospital）のディー・ナサン（D.Nathan）博士の研究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。ある種のＢＭＰ蛋白でのＷ−２０細胞の処理は、（１）アルカリ性ホスファターゼ産生増加、（２）ＰＴＨにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン（osteocalcin）合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、我々は、ＢＭＰで処理した場合のみ起こるＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察してきた。この様式において、ＢＭＰ処理されたＷ−２０細胞により示されるインビトロ活性は、ＢＭＰについて知られているインビボでの骨形成活性と相関がある。
新規骨誘導分子のＢＭＰ活性を比較することにおいて有用な２種のインビトロでの分析を以下に説明する。
Ｂ．Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコール
Ｗ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ2のインキュベーター中３７℃において細胞を一晩付着させる。
マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。
試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。
Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。
ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に供する。
５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０．０５％トリトンＸ−１００、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭリン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０．３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。
３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。
各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。
0003706133.tif 000011
既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。
0003706133.tif 000012
次いで、これらの値を用いて既知量のＢＭＰ−９活性をＢＭＰ−２活性と比較する。
Ｃ．オステオカルシンＲＩＡプロトコール
Ｗ−２０細胞を、２４ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに、２ｍｌのＤＭＥ（１０％熱不活性化ウシ退治血清、２ｍＭグルタミンを含有）中１０6個となるように撒く。９５％空気、５％ＣＯ2中３７℃において細胞を一晩付着させる。
翌日、培地を、２ｍｌの全体積中１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥに交換する。各試験物質を３系のウェルに入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間（４８時間目に同じ培地で培地交換）インキュベーションする。
９６時間のインキュベーションの終わりに、各ウェルから５０μｌの試験培地を取り、マウス・オステオカルシンについてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分析の詳細は、マサチューセッツ州０２０７２、スタウトン（Stoughton）、ペイジ・ストリート３７８のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Biomedical Techologies Inc.）により製造されたキットに説明がある。分析のための試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウス・オステオカルシン標準）、ＢＴ−４３２（ヤギ・抗−マウス・オステオカルシン）、ＢＴ−４３１Ｒ（ヨウ素化されたマウス・オステオカルシン）、ＢＴ−４１５（正常ヤギ・血清）およびＢＴ−４１４（ロバ・抗−ヤギＩｇＧ）として見いだされる。ＢＭＰ処理に応答したＷ−２０細胞により合成されたオステオカルシンについてのＲＩＡを、製造者により提供されるプロトコールに記載されたようにして行う。
試験試料に関して得られた値をマウス・オステオカルシンの既知標準に関する値と比較し、既知量のＢＭＰ−２での処理に応答してＷ−２０細胞により産生されたオステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０によるオステオカルシン合成量を表IIIに示す。
0003706133.tif 000013
実施例VII
関節軟骨アッセイ
関節軟骨プロテオグリカンおよびＤＮＡ合成に対するＢＭＰ−９の効果をアッセイして、ＢＭＰ−９が分化した関節軟骨の代謝調節に関与しているかどうかを調べる。
ウシ・手根関節からの関節軟骨外移植片を、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、４ｍＭグルタミンおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ中に３日間維持する。サイトカイン（ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−４、ｒｈＢＭＰ−６およびｒｈＢＭＰ−９、ＩＧＩ−１、ｂＦＧＦ（１〜１０００ｇ／ｍｌ）、およびＴＧＦβ（１〜１００ｎｇ／ｍｌ））を培地に添加し、さらに３日間培養を継続する。培地を毎日交換する。収穫２４時間前に外移植片を５０μＣｉ／ｍｌの35ＳＯ4または２５μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−チミジンでパルスする。外移植片を可溶化し、ゲルクロマトグラフィーにより遊離同位体の分離を行う。各外移植片の全ＤＮＡをスペクトル分光測定アッセイにより測定する。ＢＭＰ−９は、１０ｎｇ／ｍｌの用量で、対照レベル以上のプロテオグリカン合成を刺激する（ｐ＜０．０５）。
ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９およびＴＧＦβは、１００ｎｇで、プロテオグリカン合成の刺激において有意に活性が高い。試験した最高サイトカイン用量（１μｇ／ｍｌ）において、すべてのサイトカインに曝露された外移片によるプロテオグリカン合成は対照外移植片によるよりも有意に高められる（ｐ＜０．０５）。硫酸根取り込みの結果を図４に示す。
組み換えヒト・ＢＭＰ−９は、用量応答様式で骨前駆細胞系Ｗ−２０−１７におけるアルカリ性ホスファターゼ活性を刺激し、ＥＤ50は４ｎｇ／ｍｌである。インビボにおいて、高用量のｒｈＢＭＰ−９は異所性骨形成を誘導し、移植１０日後にｒｈＢＭＰ−９により誘導された軟骨および骨組織は２５μｇ／移植片である。
実施例VIII
肝細胞の刺激
ＢＭＰ−９を肝臓の修復または再生に用いてもよいと考えられる。全胚切片または全マウント法の使用により、複数の組織におけるｍＲＮＡの発現を同時にスクリーニングする。１１．５ｄｐｃマウス・胚において、ＢＭＰ−９  ｍＲＮＡは発生中の肝臓に専ら局在化している。現在まで研究されているすべての他のＢＭＰと同様にＢＭＰ−９は、細胞増殖および分化の局部的レギュレーターとして作用し、それゆえ、この非常に特異的な発現パターンは肝臓がＢＭＰ−９の標的組織であることを示唆する。
ヨウ素化されたＣＨＯ由来のＢＭＰ−９に結合する能力につき４種の肝細胞系をスクリーニングすることにより、実質の肝細胞におけるＢＭＰ−９応答性を試験する。４種の肝細胞系、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）、ＮＭｕｌｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６３８）、ＣｈａｎｇおよびＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９．１）はすべて125Ｉ−ＢＭＰ−９にある程度特異的に結合し、ＨｅｐＧ２およびＮＣＴＣ１４６９細胞系は最高の結合を示す。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコの改変イーグル（ＤＭＥ）中で集密になるまで増殖したＨｅｐＧ２細胞を、結合バッファー（１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．３７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．６４ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．３４ｍＭ  Ｎａ2ＰＯ4、０．４４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．５％ＢＳＡ，ｐＨ７．４）中で２ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ＢＭＰ−９および未標識ＢＭＰ−９（濃度を上昇させていく）とともにゼラチン被覆した６ウェルプレート上で４℃で２０時間インキュベーションして結合平行に達せしめることにより、ＨｅｐＧ２細胞へのＢＭＰ−９の特異的結合を行う。結合バッファーのみの中での３７℃１時間のプレインキュベーションの後にこのインキュベーションを行う。クロスリンク実験のために、結合後、細胞を５００μＭのジサクシンイミジルスベラートとともに４℃で２０分インキュベーションした。細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図５に示すように、ＨｅｐＧ２細胞は高親和性のＢＭＰ−９受容体を豊富に発現した。これらの結合データのスキャッチャード分析により曲線プロットが得られ、細胞１個あたり約１００００個の高親和性受容体となった。これらの受容体は０．３ｎＭのＫdを示した。スキャッチャードプロットの曲線的性質は、ＢＭＰ−９受容体間の負の共同作用、あるいはＨｅｐＧ２細胞が異なる親和性のＢＭＰ−９受容体の２つの集団を発現することを示すものである。125Ｉ−ＢＭＰ−９を用いるＨｅｐＧ２細胞についてのクロスリンク分析により、見かけの分子量５４ｋＤおよび８０ｋＤの２種の結合蛋白が得られる。クロスリンクしたリガンド／受容体複合体は、非還元的条件下では７８ｋＤおよび１００ｋＤにおいて観察され、還元的条件下では６７ｋＤおよび９４ｋＤにおいて観察された。ＢＭＰ−９ダイマーおよびモノマーの分子量をそれぞれ差し引けば、これらのＢＭＰ−９受容体蛋白は約５４ｋＤおよび８０ｋＤの分子量を有すると見積もられる。ＢＭＰ−９に対する高親和性結合部位はＫdは、ＨｅｐＧ２細胞について約２７０ｐＭと見積もられる。ＢＭＰ−９に対する受容体の結合特異性を試験するために、ＨｅｐＧ２細胞を125Ｉ−ＢＭＰ−９および２５０倍過剰の別の未標識リガンドとともにインキュベーションした。ＨｅｐＧ２細胞上に発現されたＢＭＰ−９受容体は、ＢＭＰ２および４とは限定されたわずかな交差反応性を示し、ＢＭＰ３、５、６、７、１２および２／６、またはＴＧＦ−β１もしくはＴＧＦ−β２とは交差反応性を示さない。
集密であり血清飢餓状態のＨｅｏＧ２細胞に対するＢＭＰ−９の影響を第１に示すものとして、3Ｈ−チミジン取り込みおよび細胞計数により決定して細胞増殖を試験する。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートに１０6個／ウェルとしてプレーティングし、ＤＭＥ／０．１％  ＦＣＳ中で４８時間培養して細胞周期を同調させ、０．１％ＦＣＳ存在下でＢＭＰ−９添加または無添加において２４時間処理する。3Ｈ−チミジン取り込みアッセイにおいて、処理の最後の４時間において3Ｈ−チミジンが取り込まれ、９６ウェルプレートセルハーベスターを用いて細胞ＤＮＡ集めた。エタノール沈殿可能な3Ｈ−チミジン取り込みを液体シンチレーション計数により定量することにより増殖をアッセイした。細胞計数アッセイのために、細胞をトリプシン処理し、血球計数盤で計数した。すでに記載されているようにして［ミカロプロス（Michalopoulos）ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）第４２巻：４６７３〜４６８２頁（１９８２年）］コラゲナーゼ消化によりオスのフィッシャー３４４ラット（チャールズリバー（Cherles River）、マサチューセッツ州ウィルミントン）から単離された初期ラット・肝細胞を、ミカロプロス（Michalopoulos）ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）第４２巻：４６７３〜４６８２頁（１９８２年）に記載されたようにコラーゲン被覆したプレート上で集密に至らないように無血清培地中にプレーティングし（５０００〜１００００個／ｃｍ2）、ｒｈＢＭＰ−９で３６時間処理または処理せずにおく。3Ｈ−チミジンは処理期間中ずっと取り込まれ、アンシャー（Anscher）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New England J.Med.）第３２８巻：１５９２〜１５９８頁（１９９３年）により記載されたようにして取り込まれた3Ｈ−チミジンを定量した。ＢＭＰ−９はＨｅｐＧ２細胞における3Ｈ−チミジン取り込みを約５倍刺激する。細胞計数実験におけるＢＭＰ−９の刺激効果によってこの効果を確認する。図６に示すように、ＢＭＰ−９は、用量応答様式でＨｅｐＧ２細胞における3Ｈ−チミジン取り込み刺激した。ＥＤ50値は見積もられた結合親和性と矛盾せず（Ｋd＝０．３ｎＭ＝８ｎｇ／ｍｌ）、この生物学的効果が説明したＢＭＰ−９受容体によって伝達されることが示唆される。
ＢＭＰ−９のこの増殖効果がＨｅｐＧ２肝腫瘍細胞系のみに対する効果であるかどうかを決定するために、図７に示すように、取り込まれた3Ｈ−チミジンに対するＢＭＰ−９の効果に関して初期ラット・肝細胞を試験した。ＢＭＰ−９は初期肝細胞において3Ｈ−チミジン取り込みを刺激するが、ＥＧＦほど顕著ではない。この刺激効果は初期ラット・肝臓細胞において細胞密度依存的である。集密に至っていない細胞はＢＭＰ−９に応答した刺激効果を示したが、集密となった初期肝細胞は刺激効果を示さなかった。図７に示すように、ｒｈＢＭＰ−９とは対照的に、ＴＧＦ−β１は阻害的であり、初期ラット・肝臓細胞に対して刺激的でなかった。
上記説明は本発明の好ましい具体例を詳述するものである。その実施における多くの修飾および変更は、これらの説明を考慮すれば当業者の範囲内であると考えられる。それらの修飾および変更は添付した請求の範囲内に包含されると確信する。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：ローゼン，ビッキー・エイ
ウォズニー，ジョン・エム
セレステ，アンソニー・ジェイ
（ｉｉ）発明の名称：ＢＭＰ−９組成物
（ｉｉｉ）配列の数：９
（ｉｖ）連絡先：
（Ａ）名称：ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
（Ｂ）通り名：リーガル・アフェアーズ−ケンブリッジパーク・ドライブ８７番
（Ｃ）都市名：ケンブリッジ
（Ｄ）州名：マサチューセッツ
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：０２１４０
（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release #1.0）、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（ｖｉ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：カピノス，エレン・ジェイ
（Ｂ）登録番号：３２２４５
（Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＩ  ５１８６Ｃ−ＰＣＴ
（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：６１７  ８７６−１２１０
（Ｂ）テレファックス：６１７−８７６−５８５１
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４４７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖｉ）本来の起源：
（Ａ）生物名：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
（Ｂ）株：Ｃ５７Ｂ４６ｘＣＢＡ
（Ｆ）組織型：肝臓
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー：マウス・肝ｃＤＮＡ
（Ｂ）クローン：ＭＬ１４Ａ
（ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置：
（Ｃ）単位：塩基対
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）存在位置：１５６４．．１８９３
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：６１０．．１８９６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ
（Ｂ）存在位置：１．．２４４７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
0003706133.tif 000014
0003706133.tif 000015
0003706133.tif 000016
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４２８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
0003706133.tif 000017
0003706133.tif 000018
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９５４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖｉ）本来の起源：
（Ａ）生物名：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
（Ｂ）細胞型：骨癌腫細胞系
（Ｆ）細胞系：Ｕ−２ＯＳ
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー：ラムダｇｔ１０中のＵ−２ＯＳ  ｃＤＮＡ
（Ｂ）クローン：ラムダＵ２ＯＳ−３
（ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置：
（Ｃ）単位：塩基対
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：４０３．．１６２９
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）存在位置：１２７９．．１６２６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ
（Ｂ）存在位置：９．．１９３４
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：
0003706133.tif 000019
0003706133.tif 000020
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：
0003706133.tif 000021
0003706133.tif 000022
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
0003706133.tif 000023
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
0003706133.tif 000024
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
0003706133.tif 000025
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４７０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし
（ｖ）フラグメント型：Ｃ−末端
（ｖｉ）本来の起源：
（Ａ）生物名：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
（Ｈ）細胞系：Ｗ１３８（ゲノムＤＮＡ）
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー：ヒト・ゲノムライブラリー
（Ｂ）クローン：ラムダ１１１−１
（ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置：
（Ｃ）単位：塩基対
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：エキソン
（Ｂ）存在位置：１．．４７０
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．４５６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）存在位置：１２４．．４５３
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ
（Ｂ）存在位置：１．．４７０
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
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（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
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【図１】
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0003706133.tif 000029
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0003706133.tif 000034
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【図２】
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0003706133.tif 000037
0003706133.tif 000038
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0003706133.tif 000041
【図３】
0003706133.tif 000042
【図４】
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【図５】
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【図６】
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0003706133.tif 000046
【図７】
0003706133.tif 000047