(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学純度９５％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６８２）。
【請求項２】
資化可能な炭素源から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６８２）を培養し、この培養物から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を採取することを特徴とする、Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項３】
資化可能な炭素源として、グルコース、マルトース、フラクトースおよびラクトースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖質を用いることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
嫌気的条件下で培養することを特徴とする、請求項２〜３項のうちのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高純度Ｌ−乳酸の生産菌およびこの生産菌を用いたＬ−乳酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−乳酸は、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料、食品、医薬品、醸造、皮なめし、光学材料等に用いられるものである。
【０００３】
乳酸をポリ乳酸の原料として用いる場合、光学純度の高い乳酸を原料とする方が、結晶性の高いポリマーが得られる。このことは例えば、Kulkarni,R.K., Moore,E.G., Hegyeli,A.F., and Leonard,F. (1971) Biodegradable poly(lactic acid)polymers. J. Biomed. Mater. Res.（ジャーナル  オブ  バイオメディカルマテリアル  リサーチ），5:169-181.や、Ohara,H. (1994) Poly-L-Lactic acid as biodegradable plastic. Biosci. Indust.（バイオサイエンスとインダストリー），52:642-644. に記載されている。そして、結晶性の高いポリ乳酸は、延伸フィルム、紡糸に適している。
【０００４】
また、高純度Ｌ−乳酸は液晶に使用可能であり、例えば、Sato,k., Eguchi,T., Toshida,y., Yoshinaga,K., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group. Polymer preprints, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. や、Yoshinaga,K., Eguchi,T., Sato,K., Toshida,Y., and Takasu,Y. (1990) Properties of the ferroelectric polymer liquid crystals containing a chiral lactic acid derivative group(II). Polymer preprings, Japan,（高分子化学大会予稿集）39:1962-1964. に記載されている。
【０００５】
さらに、FAO （国連食糧農業機関）とWHO （世界保健機関）は、乳幼児に与える乳酸はＬ−乳酸であることが好ましいとしている。このことは、FAO and WHO (1974) Toxicological evaluation of certain food additives with a review of general principles and of specifications. World Health Organization, Geneva,p23. に記載されている。
【０００６】
このように、Ｌ−乳酸は有用であり、しかも高純度であることが要求されている。
【０００７】
従来より、発酵によりＬ−乳酸を製造する方法が知られている。例えば、
(1) ストレプトコッカス  フェカリス(Streptococcus faecalis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ohara,H., Hiyama,K., and Yoshida,T. (1993) Lactic acid production by a filter-bed-type reactor. J. Ferment. Bioeng. （ジャーナル  オブ  ファーメンテーション  アンド  バイオエンジニアリング）76:73-75. に記載され、
(2) ラクトバチルス  ヘルベティクス(Lactobacillus helvetics) を用いたＬ−乳酸の製造が、Aeschlimann,A., Di Stasei,L., and von Stockar,U. Continuous production of lactic acid from whey permeate by Lactobacillus helvetics in two chemostats in series. Enzyme Microbiol. Technol. （エンザイムマイクロバイオロジー  アンド  テクノロジー）12:926-932. に記載され、
(3) ラクトバチルス  アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)を用いたＬ−乳酸の製造が、Nakamura,L.K. and Crowell C.D. (1979) Lactobacillus amylovorus, a new starch-hydrolyzing species from swine waste-com fermentation. Div. Ind. Microbiol. 20:531-540.に記載され、
(4) ラクトバチルス  デルブルッキー(Lactobacillus delbruekii)を用いたＬ−乳酸の製造が、Stenroos,S.L., Linko,Y.Y., and Linko,P. (1982) Production of L-lactic acid with immobilized Lactobacillus delbruekii. Bacteriol. Lett.（バイオテクノロジーレター）4:159-164.に記載され、
(5) ラクトコッカス  ラクティス(Lactococcus lactis)を用いたＬ−乳酸の製造が、Ishizaki,A. and Kobayashi,G. (1990) Computer simulation of L-lactate batch fermentation applying the enzyme inactivation scheme. J. Ferment. Bioeng. 70:139-140.に記載されている。
【０００８】
以上(1) 〜(5) は乳酸菌を用いたＬ−乳酸の製造である。しかし、これらの乳酸菌は栄養要求性が高く、培地がコスト高となる。乳酸菌を用いた乳酸製造の培地がコスト高になることは、Boer,J.P.de, Mattos,M.J.T.de, and Neijssel O.M. (1990) D(-)Lactic acid production by suspended and aggregated continuous cultures of Bacillus laevolacticus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に記載されている。培地がコスト高となれば、当然のことながら、製品としてのＬ−乳酸が高価なものとなる。
【０００９】
そこで、乳酸菌以外の菌を用いたＬ−乳酸の製造法も報告されている。例えば、リゾプス  オリザエ(Rhizopus oryzae) によるＬ−乳酸の製造が、Tamada,M., Bagum,A.A., and Sadai,S. (1992) Production of L(+)-lactic acid by immobilized cells of Rhizopus oryzae with polymer supports prepared by γ ray induced polymerization. J. Ferment. Bioeng. 74:379-383.に記載されている。しかし、この方法では、発酵時間が４０〜５０時間と長く、生産効率が良くない。
【００１０】
また、バチルス  ラエボラクティス(Bacillus laevolactis)によるＤ−乳酸製造は、前述の Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:149-153. に報告があるが、Ｄ−乳酸ではしかたない。
【００１１】
また、バチルス  コアグランス(Bacillus coagulans)によるＬ−乳酸の製造が、特開昭５８−４００９３号公報、特公昭６０−６２００号公報、米国特許US.5079164号明細書に記載されている。しかしながら、バチルス  コアグランスは、本明細書の実施例で示すが栄養要求性が高く、その結果、培地がコスト高となる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、高純度のＬ−乳酸を安価に製造することのできる新規なＬ−乳酸生産菌を提供することにある。さらに、本発明の目的は、このＬ−乳酸生産菌を用いて高純度Ｌ−乳酸を安価に製造する方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の高純度Ｌ−乳酸の生産菌は、光学純度９５％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６８２）である。
【００１４】
本発明のＬ−乳酸の生産菌バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭＢＰ−５６８２）は、牛乳から分離された桿菌である。このバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１の分離は、牛乳をＢＣＰカウントプレートアガー（ニッスイ製薬製）に画線し、これをＢＢＬ  ＧａｓＰａｋに入れ、３４℃で２４時間培養する。生育したコロニーのうち酸を生成しているものの周辺のアガーは、ブロムクレゾールパープルが紫色から黄色に変色している。このコロニーを白金耳で取り、再び新しいＢＣＰカウントプレートアガーに画線培養する。これを通常２〜５回行なう。このようにしてスクリーニングされたコロニーを、グルコース２％、酵母エキス１％、ポリペプトン１％およびリン酸第２カリウム３．５％を含む培地（ＨＣｌによってｐＨ７．０としたもの）１０ｍｌに植え、ガスパック中、３４℃で２４時間培養する。そして、培養液を分析し、高い光学純度のＬ−乳酸を生成している微生物より選ぶことにより、目的とするバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１を得ることができる。なお、培養液中のＬ−乳酸の光学純度の分析法は、本明細書の実施例で記載の方法による。得られた分離菌は実質的に純粋な菌である。
【００１５】
バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１の菌学的性質は、次の通りである：
(a) 形態的性質
形：  桿状体
大きさ：  長さ５μｍ、幅２μｍ
運動性：  ＋
胞子の形成：  ＋
胞子嚢：  非膨出
胞子の形：  楕円形
胞子の位置；  中立〜亜端立
(b) 生理学的性質
グラム染色性：  ＋
カタラーゼ活性：  ＋
エッグヨークレシチナーゼ反応：  ＋
(Egg-yolk lecithinase)
インドールの生成：  −
Voges-Proskauer テスト：  ＋
糖の資化性：
グルコース：  ＋
マルトース：  ＋
フラクトース：＋
サッカロース：−
ラクトース：  ＋
ラフィノース：−
マンニット：  −
以上より、本菌株ＳＨＯ−１はバチルス(Bacillus)属に属するものである。
【００１６】
本菌株ＳＨＯ−１の上記の生理学的特徴は、他の公知のバチルスと特に変わるところはない。ただ、実施例で見られるように、非常に高い光学純度のＬ−乳酸を高い変換率で生成する能力を有するものである。従って、本菌株ＳＨＯ−１は公知のバチルス属微生物と一致しないので、バチルス(Bacillus)属に属する新菌株と考えられる。
【００１７】
本菌株バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１は、独立行政法人産業技術総合研究所に微生物寄託番号第ＢＰ−５６８２号として寄託されている。
【００１８】
本菌株バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１は、乳酸菌やバチルス・コアグランスよりも栄養要求性が低く安価な培地で培養でき、高い光学純度のＬ−乳酸を安価に製造できるので、非常に有用である。
【００１９】
次に、本発明のＬ−乳酸の製造方法について説明する。本発明のＬ−乳酸の製造方法は、資化可能な炭素源から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６８２）を培養し、この培養物から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を採取することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の方法において、資化可能な炭素源として、グルコース、マルトース、フラクトースおよびラクトースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖質を用いることができる。これら糖質の培地中の濃度は、通常２〜１５重量％程度である。
【００２１】
また、副原料として、ポリペプトン、チーズホエー、コーンスティープリカーなど安価な原料を用いることができる。これら副原料の培地中の濃度は、通常０．１〜２重量％程度である。特に、ポリペプトンの培地中の濃度は、０．５〜２重量％程度である。
【００２２】
また、培地中には、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、苛性ソーダ、塩酸、各種緩衝液等のｐＨ調整剤、マンガン化合物、マグネシウム化合物等を含むことができる。
【００２３】
菌体の培養は、通常STR (Stirred Tank Reactor)で回分式に行なうが、これに限らず、CSTR(Continuous Tank Reactor）で連続的に行なうこともできる。また、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、光硬化性樹脂等への固定化や膜型リアクター、電解透析型リアクターにより生産しても良い。膜型リアクターは、例えば、Dialysis（透析型）のものが、Coulman らによる、Applied Environmental Microbiology, 1977年34巻、725-732 頁や、Stieber and Gerhardtによる、Biotechnology and Bioengineering, 1981年２３巻、523-534 頁などに記載されている。また、Cross-Flow型の膜型リアクターは、Major and Bullによる、Biotechnology and Bioengineering, 1989年34巻592-599 頁などに記載されている。
【００２４】
培養のｐＨおよび温度は、バチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１の性質から、通常ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、温度２０〜４０℃、好ましくは３０〜４０℃である。
【００２５】
また、本発明において、培養は、好気的条件下で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ましい。バチルス属は好気性または通性好気性の微生物であり、通常、通気等を行うことにより好気的に培養する。この様な好気的条件では、グルコース等の糖はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。本発明ではバチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１を嫌気的条件下で培養することにより、ピルビン酸からより高純度のＬ−乳酸を、より高変換率で得ることができる。嫌気的条件は、炭酸ガス、不活性ガス（窒素ガス、アルゴンガス等）の通気によって保つことができる。
【００２６】
菌体バチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１の培地中への導入は、従来公知のいずれの方法により行なっても良く、また、生産されたＬ−乳酸の分離精製も、従来公知のいずれの方法を用いても良い。
【００２７】
本発明の方法によれば、資化可能な炭素源から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を生産する能力を有するバチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１を培養するので、光学純度９５％以上の高純度でＬ−乳酸を製造することができる。しかも、バチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１は、乳酸菌やバチルス・コアグランスより栄養要求性が低く安価な培地で培養できるので、より安価にＬ−乳酸を製造することができる。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２９】
［実施例１］
バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１の分離操作を以下のように行なった。
牛乳をＢＣＰカウントプレートアガー（ニッスイ製薬製）に画線し、これをＢＢＬ  ＧａｓＰａｋに入れ、３４℃で２４時間培養した。生育したコロニーのうち酸を生成しているものの周辺のアガーは、ブロムクレゾールパープルが紫色から黄色に変色していた。このコロニーを白金耳で取り、再び新しいＢＣＰカウントプレートアガーに画線培養した。この操作を５回行なった。このようにしてスクリーニングされたコロニーを、グルコース２％、酵母エキス１％、ポリペプトン１％およびリン酸第２カリウム３．５％を含む培地（１ＭのＨＣｌによってｐＨ７．０と調整したもの）１０ｍｌに植え、ガスパック中、３４℃で２４時間培養した。そして、得られた培養液を分析し、高い光学純度のＬ−乳酸を生成している微生物より選んだ。
このようにして、バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６８２）株を得た。
【００３０】
［実施例２］
バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１をブレインハートインフュージョン培地（Becton Dickinson社製）で３４℃で１０時間培養し、これを種菌とした。この０．１ｍｌづつを２本の各試験管中の次の組成からなる液体培地１０ｍｌに植菌した。
ポリペプトンＳ（日本製薬製）１０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、およびリン酸第２カリウム３５ｇ／ｌ：なお、この培地は１ＭのＨＣｌによって、ｐＨ７．０に調整した。
各試験管の口には通気可能な多孔質のシリコン栓をし、１本の試験管では嫌気的培養を行ない、他の１本の試験管では好気的培養を次のように行なった。
＜嫌気的培養＞
試験管をＢＢＫ  ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れ、３４℃で１０時間、静置培養した。ガスパック中で行なったので、次の振盪培養よりも嫌気度が高い。
＜好気的培養＞
試験管をＢＢＫ  ＧａｓＰａｋ（Becton Dickinson社製）に入れることなく、３４℃で１０時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。
【００３１】
培養後、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を以下のようにして求めた。
【００３２】
＜乳酸生成量および消費グルコース量＞
乳酸生成量および消費グルコース量は、それぞれ培養液中の乳酸濃度（ｇ／ｌ）および消費グルコース量（ｇ／ｌ）として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により次の条件で定量した。なお、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；示差屈折率計（ＲＩＤ−６Ａ、島津製作所製）、カラム；Shim-pack SCR-101H（島津製作所製）、カラム温度；６０℃、溶離液；２．５ｍｍｏｌの過塩素酸水溶液、流速；０．９ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３３】
＜変換率＞
変換率は、
変換率（％）＝（乳酸生成量(g/l) ／消費グルコース量(g/l) ）×１００
で計算される。ここで、乳酸生成量は、Ｌ−体及びＤ−体の合計量である。
【００３４】
＜光学純度＞
Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される：
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
培養液サンプルをＵＦ膜（ＵＦＰＩ，ミリポア）で濾過して、分子量５０００以上の分子をカットした。これを高速液体クロマトグラフィーにより測定し、培養液中のＬ−乳酸とＤ−乳酸の濃度を定量した。ＨＰＬＣ；（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）、検出器；分光計（島津製作所製、ＳＰＤ−６ＡＶ）、カラム；ＣＲＳ１０Ｗ（三菱化成製）、カラム温度；３０℃、検出波長；２５４ｎｍ、溶離液；２ｍＭのＣｕＳＯ4 、流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３５】
［比較例１］
実施例２のバチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１に代えて、菌株としてバチルス・コアグランス(Bacillus coagulans) JCM 2257 を用いた以外は、実施例２と同様の操作で培養を行ない、乳酸生成量（ｇ／ｌ）、消費グルコース量（ｇ／ｌ）、変換率（％）および光学純度（％）を求めた。
【００３６】
実施例２、比較例１の結果を表に示す。
【表１】
0003682679.tif 000002
【００３７】
表より、菌株としてバチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１を用いた実施例２の場合は、高変換率で、しかも高い光学純度でＬ−乳酸が生成した。また、好気的培養に比べ嫌気的培養の方が、高い変換率と高い光学純度が得られた。一方、菌株としてバチルス・コアグランスを用いた比較例１の場合は、好気的培養した場合でも乳酸生成量は少なく、光学純度も７０％に満たないものであった。嫌気的培養の場合は、乳酸生成が認められなかった。
【００３８】
また、実施例２の結果で注目すべきは、グルコース以外の副原料としてポリペプトンＳで良いということであり、このことは、乳酸菌ではまずあり得ない。つまり、バチルス  ｓｐ．ＳＨＯ−１株が乳酸菌やバチルス・コアグランスよりも栄養要求性が低く、培地を選ばないということであり、より安価な培地で高純度のＬ−乳酸を生産できることが明かとなった。
【００３９】
［実施例３］
バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１を、ポリペプトンＳ：１０ｇ／ｌ、リン酸アンモニウム：５ｇ／ｌ、およびグルコース１００ｇ／ｌからなる培地で培養した。培養は５００ｍｌの培養器（培養液量５００ｍｌ）を用い、３０℃、６０ｒｐｍで攪拌を行い、６Ｍ苛性ソーダによりｐＨを７．０に保った。また、嫌気的条件を保つため３０ｍｌ／ｍｉｎで窒素ガスを通気し、３０℃で１５時間培養した。培養液の乳酸濃度は９７ｇ／ｌであり、光学純度は９９．９％と非常に高いものであった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の菌株バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１は、高い光学純度のＬ−乳酸を生産する能力を有し、しかも乳酸菌やバチルス・コアグランスよりも栄養要求性が低く安価な培地で培養できるので、高い光学純度のＬ−乳酸を安価に製造できる菌株として非常に有用である。従って、この菌株バチルス(Bacillus)  ｓｐ．ＳＨＯ−１を用いた本発明の方法によれば、高い光学純度のＬ−乳酸を安価に製造することができる。