(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエートを生産する酵素群をコードするＤＮＡを含んでなる、Arabidopsis thalianaのトランスジェニック植物性物質であって、
前記ＤＮＡが、
−３−ケトチオラーゼの触媒活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列（ａ）、
−アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの触媒活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列（ｂ）、および
−ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼの触媒活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列（ｃ）
を含んでなるものであり、ＤＮＡ配列（ａ）が内因性であり、ＤＮＡ配列（ｂ）および（ｃ）が異所性であり、前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼが、内因性の３−ケトチオラーゼおよび異所性のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを介して供給される物質を基質とするものであり、さらに、ＤＮＡ配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の発現によりポリヒドロキシアルカノエートが前記植物性物質中において１以上の顆粒の形で存在する、トランスジェニック植物性物質。
【請求項２】
異所性のＤＮＡ配列（ｂ）が、配列番号１中の第３９５２〜４６９２番残基によりコードされる酵素をコードするものであり、さらに、
異所性のＤＮＡ配列（ｃ）が、配列番号１中の第８４２〜２６１１番残基によりコードされる酵素をコードするものである、請求項１に記載のトランスジェニック植物性物質。
【請求項３】
異所性のＤＮＡ配列（ｂ）が、配列番号１中の第３９５２〜４６９２番で表されるＤＮＡ配列を有するものであり、さらに、
異所性のＤＮＡ配列（ｃ）が、配列番号１中の第８４２〜２６１１番で表されるＤＮＡ配列を有するものである、請求項２に記載のトランスジェニック植物性物質。
【請求項４】
前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物性物質。
【請求項５】
種子または種子の胎芽である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物性物質。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエートを１以上の顆粒の形で生産する酵素群をコードする異所性のＤＮＡをArabidopsis thaliana植物中に導入する方法であって、
形質転換により、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの触媒活性を有する酵素をコードする異所性のＤＮＡ配列を含んでなる、ポリヒドロキシアルカノエートを生産しない第一のトランスジェニックArabidopsis thaliana植物を製造する工程、
形質転換により、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼの触媒活性を有する酵素をコードする異所性のＤＮＡ配列を含んでなる、ポリヒドロキシアルカノエートを生産しない第二のトランスジェニックArabidopsis thaliana植物を製造する工程、および
有性生殖により、第一および第二のトランスジェニックArabidopsis thaliana植物を交配する工程
を含んでなり、前記ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼが、内因性の３−ケトチオラーゼおよび異所性のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを介して供給される物質を基質とするものである、方法。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）請求項６に記載の方法を実施する工程、および
ｂ）工程ａ）における有性生殖によって得られる子孫からポリヒドロキシアルカノエート顆粒を回収する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はある種の遺伝情報物質、すなわちタンパク質様物質をコードする遺伝子および／またはその生産を調節しまたはそれに影響を与える遺伝子を含むＤＮＡの高等植物の細胞への導入および発現、および遺伝学的に形質転換した細胞からの稔性植物の再生に関する。このような遺伝学的介入の目的は、ヒドロキシ酸の線形ポリエステルからなるポリマー性物質を合成する能力を微生物から高等植物へと移すことである。この種の物質は、通常はポリヒドロキシアルカノエートと呼ばれている。本明細書に示される具体例は、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の生産である。
発明の背景
細菌の多くの種は、炭素貯蔵物として働くヒドロキシアシルモノマーからなるポリエステルの顆粒を蓄積する。細菌性のポリヒドロキシアルカノエートの発生、代謝、代謝上の役割、および、産業上の用途が最近になって再検討されている（Anderson, A.およびDawes, E.A.、Microbiol. Rev., 54:450-472（1990））。この種の最も一般的に見られる化合物は、ポリ（Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチレート）である。しかしながら、幾つかの種では、３−ヒドロキシペンタノエートのような異なるヒドロキシアルカノエートのコポリマーを蓄積する（Wallen, L.L.およびRohwedder,W.K.、Environ. Sci. Technol.,8:576-579（1974））。少なくとも１１種類の短鎖の３−ヒドロキシ酸が、海洋堆積物からのポリマーの成分として見出されている。Alcaligenes eutrophusにおけるポリヒドロキシアルカノエートの生産を検討することにより、グルコースだけを炭素源として用いる培地で細菌を培養すると、ＰＨＢだけが蓄積されることが明らかになっている。しかしながら、グルコースとプロピオン酸とを炭素源として供給すると、細菌は３−ヒドロキシペンタノエートと３−ヒドロキシブチレートのランダムコポリマーを蓄積する（Holmes, P.A.、Phys. Technol., 16:32-36（1985）；Holmes, P.A., Wright, L.P.およびCollins, S.H.、欧州特許第００６９４９７号明細書、１９８３年１月および第００５２４５９号明細書、１９８５年１２月）。更に、A. eutrophusを様々な他の炭素源と共に供給すると、４−ヒドロキシブチレートおよび５−ヒドロキシバレレートモノマーを含むポリエステルが産生される（Anderson, A.J.およびDawes, A.E.、Microbiol.Rev., 54:450-472（1990））の第１表）。このように、ポリマーの組成は、モノマーからポリマーへの合成を触媒する酵素に対して代替基質を利用することができれば、ある程度まで調節されると思われる。
ＰＨＢは、細菌細胞中に直径が約0.24〜0.5μｍの顆粒とて蓄積される。ＰＨＢモノマーの分子量の測定値に基づいて、それぞれの顆粒は最低でも１，０００本のポリマー鎖を有するものと算定されている。これらの顆粒は、脂質およびタンパク質を顆粒重量のそれぞれ約0.5および２％含んでなる皮膜を有するものとされている（Anderson, A.およびDawes, E.A.、Microbiol. Rev., 54:450-472（1990））。ＰＨＢ合成酵素の活性は、この膜と関連しているものと考えられる。顆粒内部のＰＨＢの状態はほとんど解明されていない。最近の報告によれば、顆粒内部のポリマーは非晶質状態であることが示唆されている。任意の生物体でのＰＨＢ顆粒の大きさを調節するものは、知られていない。
ほとんどの生物において、ＰＨＢは、３−ケトチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．１．１．３６）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート）シンターゼによって触媒される連続して起こる三反応によって、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から合成される。反応経路を第１図に示す。Rhodospirillum rubrumでは、ＰＨＢはＬ（＋）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡを介したＤ（−）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの転換によって合成される。３−ケトチオラーゼは、様々なＰＨＢ合成細菌から精製されており、数種の高等植物で検討が行われてきた。高等植物でのこの酵素の役割は、アセトアセチル−ＣｏＡを産生してメバロネートを生産すること並びに脂肪酸の分解にあると考えられている。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、多数のＰＨＢ合成細菌で検出されている。A. eutrophusのような数種は、基質特異性および補助因子要件に関して異なる２種類のイソ酵素を有すると思われる。A. eutrophusのＮＡＤＨレダクターゼはＣ４〜Ｃ10Ｄ（−）−およびＬ（＋）−３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡで活性であるが、ＮＡＤＰＨレダクターゼはＣ４およびＣ５Ｄ（−）−３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡのみで活性である。この種類の酵素は、高等植物で報告されたことはない。ＰＨＢシンターゼ活性は、成長条件によっては、ＰＨＢ蓄積細菌に可溶性酵素としても顆粒結合活性としても検出されている。いずれの形態の酵素も部分的には精製されているが、不安定であるため均質になるまで精製されてはいない。A. eutrophusのＰＨＢシンターゼはＤ（−）−鏡像異性体に特異的であり、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡで試験したところ、Ｃ４およびＣ５基質だけで活性であり、Ｃ４およびＣ５の３−ヒドロキシ酸モノマー単位だけがこの生物によってポリマー中に取り込まれるという観察と一致している。ＰＨＢシンターゼの作用機構は未だ解明されていない。このシンターゼによる連鎖移動の役割によって、場合によっては所定の生物に特徴的な生成するポリマーの分子量が制御されると思われる。ＰＨＢシンターゼ活性は、植物では報告例はない。
いくつかの研究者グループが、独立にA. eutrophusによるＰＨＢの生合成に関与する遺伝子をE. coliでクローニングして発現させた（Slater, S.C.ら、J. Bacteriol., 170:4431-4436（1988）；Schubert, P.ら、J. Bacter-iol., 170:5837-5847（1988））。A. eutrophus由来の5.2kbpのフラグメントを有するE. coliの組換え株は、細胞内顆粒としてＰＨＢをかなりの量蓄積することができた。5.2kbpフラグメントのヌクレオチド配列も、２つのグループによって独立に決定された（Janes, B.B.ら、Dawes, E.A.（監修）Novel Biodegradable Microbial Polymers、Kluwer Academic Publishers、175-190頁（１９９０年）；Peoples, O.P.およびSinskey, A.J.、J. Biol.Chem., 264:15293-15297（1989）；Peoples, O.P.およびSinskey, A.J.、J. Biol. Chem., 264:15298-15303（1989））。遺伝学的な補完的研究に基づく証拠と共にオープンリーディングフレームの推定されたアミノ酸配列を解析することにより、5.2kbpフラグメントはＰＨＢの生産に必要な３種類の酵素をコードする３個の緊密に連結した遺伝子を含んでいることが明らかになった。このクローニングした遺伝子を用いて細菌中に生合成酵素を過剰生産させることに関する特許が出願されている（Peoples, O.P.およびSinskey, A.J.、ＷＯ  ８９／００２０２号明細書、１９８９年１月）。
ある種の細菌は、酵素を分泌し、ＰＨＢおよび関連したポリヒドロキシアルカノエートを分解する能力を有する（Anderson, A.およびDawes, E.A.により概説、Microbiol. Rev., 54:450-472（1990））。多くの自然環境ではこれらの細菌種が広く存在するため、ＰＨＢは土壌および活性化スラッジ中で速やかに分解される。従って、ＰＨＢおよび関連したポリヒドロキシアルカノエートは、再生可能な生分解性の熱可塑性プラスチック源として興味深いものである。細菌の大規模培養によるＰＨＢの工業的生産は、１９８２年に開始された。この方法で生産されたＰＨＢは、ＩＣＩによりBiopolの商品名で発売されている。しかしながら、細菌の多量な培養物の生育および回収には費用が掛かるため、ＰＨＢは多くの種の高等植物で高水準にまで蓄積される澱粉のようなポリマー性物質と比較すると、生産には遥かに費用が掛かる。それ故、遺伝子工学によりＰＨＢを蓄積する高等植物の系統を作成するのが有利であると思われる。
図面および表の簡単な説明
第１図はポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を生産するための生化学的経路を示す。A. eutrophusでは、ＰＨＢは３種類の酵素、すなわちアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する３−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡをＤ（−）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換するアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＤ（−）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをポリヒドロキシブチレートに転換するＰＨＢシンターゼの連続的作用により生産される。植物および動物では、アセトアセチル−ＣｏＡはメバロネートの産生の前駆体である。
第２図はA. eutrophus由来のＰＨＢオペロンのヌクレオチド配列を示す。この配列は、Janes, B., Hollar, J.およびDennis, D.により得られた（Dawes, E.A.（監修）、Novel Biodegradable Polymers、Kluwer Academic Publishers、175-190頁（１９９０年））。ヌクレオチド842から2611までのオープンリーディングフレームはＰＨＢシンターゼ（phbC遺伝子）をコードする（アミノ酸Ｓ１〜Ｓ589）。ヌクレオチド2696から3877までのオープンリーディングフレームは、酵素３−ケトチオラーゼ（phbA遺伝子）をコードする（アミノ酸Ｔ１〜Ｔ393）。ヌクレオチド3952から4692までのオープンリーディングフレームは、酵素アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（phbB遺伝子）をコードする（アミノ酸Ｒ１〜Ｒ246）。制限酵素DdeI、BstBI、PstI、SacIおよびTth111Iに対する配列を下線を引いて示す。これらの制限酵素を用いて、phb遺伝子をサブクローニングした。
第３図はプラスミドpUC-THIOおよびpBI-THIOの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、A. eutrophus由来の３−ケトチオラーゼ遺伝子をCaMV35Sプロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。最上段の図は、A. eutrophusＰＨＢオペロンを、ＰＨＢシンターゼ、３−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼをコードするオープンリーディングフレームの近似的位置と共に示している。横矢印は転写の方向を示している。最下段の図はpBI121由来のプラスミドの主成分である、NPTII、すなわちカナマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子；CaMV35S、すなわちカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター；polyA、すなわちポリアデニル化配列；RB、すなわちＴ−ＤＮＡの右境界配列；およびLB、すなわちＴ−ＤＮＡの左境界配列を示す。最下段の図は縮尺通りには表わしていない。制限酵素部位に対する略号は下記の通りである：D, DdeI；P, PstI；B, BstBI；T, Tth111I；BH, BamHI；S, SacI；H,HindIII。
第４図はプラスミドpUC-SYNおよびpBI-SYNの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、A. eutrophus由来のＰＨＢシンターゼ遺伝子をCaMV35Sプロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。図および略号は、第３図に記載している。
第５図はプラスミドpUC-REDおよびpBI-REDの構築に関する段階を模式的にまとめたものである。この後者のプラスミドの目的は、A. eutrophus由来のアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子をCaMV35Sプロモーターの転写制御下に置き、高等植物で転写されるようにすることである。最上段および最下段の図および略号は、第３図に記載されている。中段の図は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子領域を拡大したものである。ＰＣＲプライマー＃１および＃２の位置および配列が示されている。ＰＣＲプライマーの３′末端における最後のヌクレオチドは第２図のヌクレオチド3952に対応し、レダクターゼ遺伝子に対する開始コドンの最初のヌクレオチドである。ＰＣＲ＃２の３′末端における最後のヌクレオチドは、第２図のヌクレオチド4708に相補的である。ＰＣＲプライマーによって作成された追加のBamHIおよびkpnI制限酵素部位が示されている。
第６図は、形質転換されていないコントロールおよびトランスジェニックA. thaliana植物のサザンブロット分析を示す。形質転換されていないA. thaliana Rschew種およびトランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡ１gを制限酵素HindIIIで消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離して、ナイロン膜に移した。フィルターを、遺伝子(A)phbA、(B)phbBおよび(C)phbC由来の32Ｐを標識したＤＮＡフラグメントにハイブリダイゼーションした。分析を行ったゲノムＤＮＡは、野生型A. thaliana Rschew種（レーンａ）およびトランスジェニックT4-3A（レーンｂ）、T3-2A（レーンｃ）、T4-2A（レーンｄ）、T4-3B（レーンｅ）、RedB-2G（レーンｆ）、RedB-2B（レーンｇ）、RedB-2E（レーンｈ）、RedB-2C（レーンｉ）、RedD-3A（レーンｊ）、RedB-2A（レーンｋ）、RedB-2D（レーンｌ）、S12-3A（レーンｍ）、S8-1-2C（レーンｎ）、S8-1-2A（レーンｏ）およびS8PUC-2B（レーンｐ）である。左側の数値は、キロ塩基対での長さである。
第７図は、形質転換していないコントロールおよびトランスジェニックA. thaliana植物のノザンブロット分析を示している。野生型A. thaliana Rschew種由来のＲＮＡ（10μｇ）とトランスジェニック植物由来のＲＮＡ（20μｇ）との総ＲＮＡを、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル中で電気泳動によって分離して、ナイロン膜に移した。フィルターを遺伝子(A)phbA、(B)phbBおよび(C)phbC由来の32Ｐを標識したＤＮＡフラグメントにハイブリダイゼーションした。分析を行ったＲＮＡは、植物：T3-2A（レーンａ）、T4-2A（レーンｂ）、T4-3B（レーンｃ）、T4-3A（レーンｄ）、野生型A. thaliana（レーンｅ、ｊおよびｒ）、S8PUC-2B（レーンｆ）、S8-1-2（レーンｇ）、S12-3A（レーンｈ）、S8-1-2A（レーンｉ）、RedB-2D（レーンｋ）、RedB-2E（レーンｌ）、RedB-2G（レーンｍ）、RedB-2A（レーンｎ）、RedB-3B（レーンｏ）、RedB-2C（レーンｐ）およびRedD-3A（レーンｑ）由来のものである。数値は、キロ塩基対での長さである。
第８図は、精製したＰＨＢおよび植物抽出物のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）を表わしている。形質転換していない野生型のA. thaliana Rschew種(B)およびトランスジェニック植物S8-1-2AとRedB-2C(C)とのＦ１ハイブリッドからの葉のクロロホルム抽出物のエステル交換したもののＧＣスペクトルを、市販のＰＨＢのエステル交換したもの(A)のクロマトグラムと比較した。矢印は、エチル−ヒドロキシブチレートピークの位置を示す。
第９図は、ＰＨＢ標準品と植物抽出物からのＰＨＢから製造したエチル−ヒドロキシブチレートのガスクロマトグラフィ−マススペクトル分析を示す。(A)市販のＰＨＢのエステル交換したもののマススペクトル；(B)エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間を有するS8-1-2AとRedB-2CとのＦ１ハイブリッドの葉のクロロホルム抽出物からのＧＣピークのマススペクトル（第８Ｃ図に示した通り）。
第10図は、ＰＨＢ陽性のトランスジェニックA. thaliana植物の葉および種子の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を示す。トランスジェニック植物S8-1-2AおよびS8-1-2Cを、トランスジェニック植物RedB-2DまたはRedB-2Aと交配した。生じるＦ１種子を土壌に播種し、２〜３週齢の植物の葉の試料をＴＥＭによって分析した。幾つかのＦ１種子を水に24時間浸漬し、胚を種皮から切除し、子葉をＴＥＭによって分析した（電子顕微鏡写真ｆ）。(a)核における電子半透明（electron-lucent）顆粒の凝集を示すRedB-2DとS8-1-2AとのＦ１ハイブリッドからの２個の隣接した葉肉細胞。(b)顕微鏡写真ａに示された右上方の細胞の核の高倍率写真。(c)顆粒の凝集を示すRedB-2DとS8-1-2AとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞の核。(d)核(N)と液胞(V)における電子半透明（electron-lucent）顆粒を示すRedB-2AとS8-1-2AとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞。(e)細胞質における電子半透明（electron-lucent）顆粒を示すRedB-2AとS8-1-2AとのＦ１ハイブリッドからの葉肉細胞。(f)核における顆粒を示すRedB-2AとS8-1-2CとのＦ１ハイブリッドからの子葉細胞。矢印は電子半透明（electron-lucent）顆粒の凝集を示す。棒線＝顕微鏡写真ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｆでは１μｍ。棒線＝顕微鏡写真ｅでは、0.25μｍ。
発明の概要
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを産生する異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質（トランスジェニック植物材料ともいう。以下において同じ。）に関する。
本発明は、３−ケトチオラーゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。
本発明は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。
本発明は、異種ＰＨＢシンターゼ活性を示すペプチドをコードする異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物性物質にも関する。
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に必要なタンパク質をコードする細菌ＤＮＡを植物に導入する方法であって、ＰＨＢを生産しない二種類の植物を有性生殖によって交配することを含んでなり、それぞれの植物は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼによってヒドロキシアルキル−ＣｏＡの重合して、ポリヒドロキシアルカノエートをコードする植物を生産させる経路における一種類以上の異なる酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる方法に関する。
従って、本発明はＰＨＢまたは関連のポリヒドロキシアルカノエートを生産し、蓄積する遺伝学的に修飾した高等植物を生産する方法を提供する。一つの態様では、ＰＨＢ産生植物は、酵素、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート）シンターゼをコードする細菌の遺伝子をＴｉ−プラスミドを介した形質転換によって植物に安定に導入することによって得られる。細菌の遺伝子は通常は植物細胞に転写されないので、遺伝子を修飾して、植物細胞への転写を誘発するＤＮＡ配列（すなわち、「プロモーター」）によって転写制御されるようにする。遺伝子は、これらの遺伝子の非コード３′−領域に適当なＤＮＡ配列を加えることによっても修飾され、植物細胞中に産生する転写体が適当にポリアデニル化されるようにする。
本発明の一つの態様では、ＰＨＢ産生植物は、ＰＨＢを生産しない２種類の親ラインの間で交配することによって得られる。これは、修飾したＰＨＢシンターゼ遺伝子の異所性コピーに対してホモ接合性のトランスジェニック植物ラインと、修飾したアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の異所性コピーに対してホモ接合性のトランスジェニック植物とを交配することによって行われる。本明細書において、「異所性遺伝子」という用語は生物体に通常は存在しないが、遺伝子形質転換によってゲノムに安定に組込まれている遺伝子を表わす。異所性コピーに対してホモ接合性であるとは、二倍体生物において、いずれの相同染色体も染色体の同じ場所に組込まれた異所性遺伝子を有することを意味する。
発明の具体的説明
本発明の説明を行う前に、以後に用いられるある種の用語の定義を説明するのが有用である。
形質転換とは、何んらかの手段によってＤＮＡを安定に導入することによってレシピエント生物の遺伝子型を変化させる方法を意味する。
トランスジェニック植物は、通常はその種には存在しないが形質転換によって導入されるＤＮＡ配列を含む植物である。
転写とは、ＤＮＡに含まれる遺伝情報に従ったＲＮＡ鎖の形成を意味する。
翻訳とは、ｍＲＮＡ分子における遺伝情報をタンパク質合成の際に特異的なアミノ酸の順序を指示する方法を意味する。
プロモーターは遺伝子物質の転写を引き起こすＤＮＡフラグメントである。本明細書においては、プロモーターは植物細胞において転写を行うＤＮＡフラグメントを表わすのに用いられる。CaMV35Sプロモーターは、多くの種の高等植物の多くの異なる組織で比較的高水準の転写を引き起こすカリフラワーモザイクウイルスからのＤＮＡフラグメントである（Benfey, P.N.およびChua, N.H.、Science, 250:959-966（1990））。
ポリ−Ａ付加部位は、所定の酵素に特異的部位でｍＲＮＡを開裂させ、アデニル酸残基の配列をｍＲＮＡの３′末端に付加させるヌクレオチド配列である。
phbC、phbA、phbBは、それぞれＰＨＢシンターゼ、３−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼについてA. eutrophus遺伝子に与えた遺伝子記号である（Peoples, O.P.およびSinskey, A.J.、J. Biol. Chem., 264:15298-15303（1989））。
トランスジェニック植物の子孫を記載するのに、ＤＮＡの導入を行ってから幾世代の自家受粉を経過したかを表わす決まりを採用するのが有用である。本明細書では、最初の形質転換体をＴ０世代と表わす。この世代の自家受粉から生じる子孫をＴ１世代などと表わす。
２種類の別の親植物の交配の場合には、最初に交配したものから生じる子孫を、Ｆ１世代と表わす。
以下に記載する実験はArabidopsis thaliana（L.）Heynholdという植物種に関するものであるが、記載される方法は一般に形質転換の方法を利用できる任意の高等植物に応用することができる。同様に、本明細書に記載される方法はA. eutrophus由来の遺伝子の使用に関するものであるが、また、記載される方法は一般にＰＨＢを合成することができる任意の生物由来の遺伝子の使用に応用することができる。記載される方法はＰＨＢの産生に関するものであるが、この手順は一般にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼ（ＰＨＢシンターゼを含む）の活性によって微生物中に普通に生産される任意のポリヒドロキシアルカノエートであって、適当なヒドロキシアルキル−ＣｏＡ基質が特定の植物で生産される任意のポリヒドロキシアルカノエートの生産に応用することができることは明らかである。
実験の詳細な説明
実験計画
形質転換した植物の子孫におけるＰＨＢの生産には、下記のように一連の段階を完結することが必要である。(1)プロモーター融合体を含む一連の細菌性プラスミドの構築、(2)これらのプラスミドのAgrobacterium tumefaciensへのトランスファー、(3)A. tumefaciensを用いて、これらの遺伝子の植物（すなわち、この例ではA. thaliana）の細胞への導入、(4)トランスジェニック植物の再生、(5)異所性遺伝子に対してホモ接合性である植物の選択、(6)形質転換した植物での異所性遺伝子の機能を解析して、確実にそれらを発現させ、遺伝子生成物を機能的にすること、(7)交配による２種類以上の異なる異所性遺伝子を含むハイブリッド植物の産生、(8)ＰＨＢの存在に対するハイブリッド物質の分析。これらの段階を、下記の項で詳細に説明する。
転写融合体の構築
高等植物で細菌遺伝子の転写を行うには、細菌性遺伝子を植物プロモーターの付加により修飾して、遺伝子が高等植物に導入されたときに転写されるようにしなければならない。また、ポリ−Ａ付加部位を細菌性遺伝子の３′領域に付加して、高等植物でこれらの遺伝子を適性に発現させることも普通に行われる。これらの要因は、いずれもプラスミドpTZ18U-PHB由来のphbC、phbAおよびphbB遺伝子を二元ＴｉプラスミドベクターpBI121（Clonetech、カリフォルニア）にクローニングすることによって満足される。プラスミドpTZ18U-PHBに含まれるphbC、phbAおよびphbB遺伝子のヌクレオチド配列を第２図に示す。クローニングに用いられる関連した制限酵素部位並びに３種類の遺伝子に対するオープンリーディングフレームと思われる部分を示す。
CaMV35S-phbA遺伝子融合体は、プラスミドpTZ18U-PHBを制限酵素PstIおよびDdeIで消化することによって構築した。３−ケトチオラーゼ遺伝子のコード配列を含む1.3kbの制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって他のＤＮＡフラグメントから分離した。ＤＮＡフラグメントをＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースから回収した（Schleicher & Schuell NA-45 DEAE膜）。ＤＮＡフラグメントのジグザグ末端を、精製した制限フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートと共にインキュベーションすることによって充填した。次に、ブラントフラグメントをプラスミドpUC18中でSmaI部位にクローニングして、プラスミドpUC-THIOを産生させた。1.3kbの制限フラグメントをBamHIとSacIで消化することによってpUC-THIOプラスミドから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドpBI121に連結した。pBI-THIOと呼ぶ生成したプラスミドは、CaMV35SプロモーターおよびpBI121のポリ−Ａ付加部位に対して正確な配向でA. eutrophus３−ケトチオラーゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。pBI-THIOの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第３図として表わす。
CaMV35S-phbC遺伝子融合体を、プラスミドpTZ18U-PHBを制限酵素BstBIおよびTth111Iで消化することによって構築した。ＰＨＢシンターゼのコード配列を含む1.9kbの制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって他のＤＮＡフラグメントから分離した。ＤＮＡフラグメントを、ＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースから回収した。ＤＮＡフラグメントのジグザグ末端を、精製した制限フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートと共にインキュベーションすることによって充填した。次に、ブラントフラグメントをプラスミドpUC18中でSmaI部位にクローニングして、プラスミドpUC-SYNを産生させた。1.9kbの制限フラグメントをBamHIで完全消化しSacIで部分消化することによってpUC-SYNから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドpBI121に連結した。pBI-SYNと呼ぶ生成したプラスミドは、CaMV35SプロモーターおよびpBI121のポリ−Ａ付加部位に対して正確な配向でA. eutrophusＰＨＢシンターゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。pBI-SYNの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第４図として表わす。
CaMV35S-phbB遺伝子融合体を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーに対する一対の合成オリゴヌクレオチドを用いてプラスミドpTZ18U-PHB由来のphbB遺伝子を増幅することによって構築した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列を第５図に示すが、それらはＰＣＲプライマー＃１およびＰＣＲプライマー＃２と表わされる。オリゴヌクレオチドは、増幅したＤＮＡ配列がコード配列の５′末端近くに合成BamHI部位を、配列の３′末端に合成KpnI部位を含む様にデザインした。ポリメラーゼ連鎖反応の790塩基対の生成物をアガロースゲルで分離して、精製し、BamHIおよびKpnIで制限し、同じ２種類の酵素で予め制限しておいたプラスミドpUC18に連結し、プラスミドpUC-REDを産生させた。制限フラグメントをBamHIとSacIで消化してpUC-REDから取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、同じ２種類の酵素で予め消化しておいたプラスミドpBI121に連結した。pBI-REDと呼ぶ生成したプラスミドは、CaMV35SプロモーターおよびpBI121のポリ−Ａ付加部位に対して正確な配向でA. eutrophusアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有することが見出され、高等植物で発現するものと思われた。
pBI-REDの構築に関する段階を模式的にまとめたものを、第５図として表わす。
プラスミドpBI-SYN、pBI-THIOおよびpBI-REDを、エレクトロポレーションによってAgrobacterium tumefaciens C58 pGV3850株に移した。プラスミドを含むコロニーを、親のプラスミドpBI121上に存在するカナマイシン耐性遺伝子の発現について選択することによって回収した。
トランスジェニック植物の生産
前項に記載の組換え二元Ｔｉプラスミドを有するA. tumefaciensの培養物と共に無菌の根組織をインキュベーションすることによってA. thalianaの細胞を形質転換した。A. thaliana Rschew種の無菌の実生からの根は、Valvekens, D.らによって記載の通りに形質転換した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5536-5540（1988））。修飾したphb遺伝子の一つを有するA. tumefaciensの３株のそれぞれを用いて、A. thaliana の根の切片に感染させた。この結果、それぞれの場合に約50カナマイシン耐性のカルス組織が回収された。これらのうち、10〜25％が繁殖力のある苗条を生じ、種子を産生した。種子を産生したそれぞれの植物を異なる番号を割り当て、それが別の形質転換を表わすようにした。
総数が11のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドpBI-REDを有するA. tumefaciensで処理した組織から回収した。これらを、RedB-2A、-2B、-2C、-2D、-2E、-2F、-2G、-2H、-3A、-5AおよびRedD-3Aと呼んだ。RedB-2F、-2Hおよび-5A以外の総てのトランスジェニック植物ラインを下記の項に記載されているように詳細に分析した。
総数が５個のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドpBI-THIOを有するA. tumefaciensで処理した組織から回収した。これらをT3-2A、T4-2A、T4-3A、T4-3BおよびT4-3Cと呼んだ。T4-3C以外の総てのこれらのトランスジェニック植物ラインを、下記の項に記載されているように詳細に分析した。
総数が４個のトランスジェニック植物と思われるものを、プラスミドpBI-SYNを有するA. tumefaciensで処理した組織から回収した。これらをS8-1-2A、S8-1-2C、S12-3AおよびS8PUC-2Aと呼んだ。これら総てのトランスジェニック植物ラインを、下記の項に記載されているように詳細に分析した。
トランスジェニック植物と思われるものにおけるＴ−ＤＮＡの存在を、50μｇ／mlのカナマイシンを含む寒天で固化した無機培地にトランスジェニック植物からの種子を蒔くことによって証明した。このカナマイシンの濃度では形質転換しないA. thaliana植物の生育が妨げられるが、pBI121またはpBI121由来のプラスミド上にNPTII遺伝子を有する植物は正常に生育することができる。トランスジェニック植物T4-2A、RedD-3AおよびS8-1-2Aからの種子は、The American Type Culture Collection、Rockville、メリーランド20852から入手できる。
ホモ接合性のトランスジェニック系統と思われるものの単離
ホモ接合性のトランスジェニック系統を産生させるのに用いられる最低基準は、ホモ接合性植物からの総ての子孫はカナマイシン耐性と思われることであった。ゲノム中の異なる部位においてpBI121由来のNPTII遺伝子の多重異所性コピーの存在が同様な表現型を生じさせることがあるので、この基準は、一次形質転換がただ一つの染色体位置へのＴ−ＤＮＡの挿入を伴うときに最も有用である。
ホモ接合性系統を同定するために、それぞれのトランスジェニック系統からの数種類のカナマイシン耐性Ｔ１植物を生育させて、成熟させ、再生物を単離した。次に、カナマイシン耐性の頻度を、それぞれの系統からの約５０個のＴ２種子の試料で測定した。特定の植物からのＴ２種子が総てカナマイシン耐性であるときには、この系統は暫定的にホモ接合性と考えた。
トランスジェニック植物におけるphb遺伝子の組込みの分析
生産された各種のトランスジェニック植物におけるphb遺伝子の適正な組込みを証明するため、トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡを分析した。コントロールの形質転換しない植物およびプラスミドpBI-THIO、PBI-REDおよびpBI-SYNで形質転換したＴ３トランスジェニック植物からの高分子量ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、ナイロンフィルターに移した。制限酵素HindIIIは、プラスミドpBI-THIO、pBI-REDおよびpBI-SYN中ではCaMV35Sプロモーターの５′末端で１回だけ切断する（第３、４および５図）。従って、phb遺伝子に特異的なプローブを用いて検出したフラグメントは、植物ゲノムＤＮＡを有するＴｉベクターの結合フラグメントまたはコンカテマー化したＴｉベクターの内部フラグメントを表わすものである。プラスミドpUC-THIO、pCU-REDおよびpUC-SYNにおけるインサートをEcoRIおよびHindIIIで処理することによって取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製し、ランダムプライマー化により32Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。次に、標識したphb遺伝子フラグメントを用いてナイロンフィルターを分析した。フィルターをハイブリダイゼーションした後、極めて厳密な条件下で洗浄した。このフィルターハイブリダイゼーションの結果を、第６図に示す。形質転換しないコントロール植物では３種類のphb遺伝子は全く検出することができない（第６Ａ、ＢおよびＣ図、レーンａ）。phbA遺伝子は、プラスミドpBI-THIOを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック系統の４つに検出された（第６Ａ図、レーンｂ〜ｅ）。phbB遺伝子は、プラスミドpBI-REDを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック植物の７つに検出された（第６Ｂ図、レーンｆ〜ｌ）。最後に、phbC遺伝子は、プラスミドpBI-SYNを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック植物の３つに検出された（第６Ｃ図、レーンｍ〜ｐ）。植物系統S12-3Aはカナマイシン50μｇ／mlに耐性であり、NPTII遺伝子が組込まれていることを示唆しているが、phbC遺伝子は検出することができなかった。NPTII遺伝子を有するがphbC遺伝子は持たないＴｉベクターのフラグメントだけが、植物系統S12-3AのゲノムＤＮＡに組込まれたものと思われる。
トランスジェニック植物におけるphb遺伝子の発現の分析
A. eutrophus phb遺伝子が各種のトランスジェニック系統で発現されるかどうかを検討するために、プラスミドpUC-THIO、pUC-REDおよびpUC-SYNに含まれるクローニングした遺伝子をフィルターハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして用いた。総ＲＮＡを形質転換しないコントロールとＴ３トランスジェニック植物から抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動によって分離し、確立された手順によってナイロンフィルターに移した。プラスミドpUC-THIO、pUC-REDおよびpUC-SYNのインサートをEcoRIとHindIIIで処理することによって取り出し、ＤＥＡＥセルロース膜を用いて電気泳動によって精製し、ランダムプライマー化によって32Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。標識したphb遺伝子を用いて、ナイロンフィルターを分析した。これらの実験では、３個のphbプローブのいずれも、形質転換しないコントロール植物ではＲＮＡには全くハイブリダイゼーションしないことを示していた（第７図、レーンｅ、ｊおよびｒ）。対照的に、pBI-THIOを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック植物は、1.6kbpのＲＮＡを有しており、これは３−ケトチオラーゼ遺伝子に相補性であった（第７Ａ図、レーンａ〜ｄ）。pBI121由来のプラスミド上に存在するCaMV35Sプロモーターおよびポリ−Ａ付加配列は、phb融合遺伝子から産生したｍＲＮＡの最終的な長さに約300bp寄与している。３−ケトチオラーゼｍＲＮＡの水準は、植物系統T4-3Aでは他の植物系統と比較して低かった。同様に、pBI-SYNを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック系統の３つは、ｐＨＢシンターゼ遺伝子に対応する2.1kbpのｍＲＮＡを有した（第７Ｂ図、レーンｆ、ｇおよびｉ）。トランスジェニック系統S12-3Aは、phbCプローブにハイブリダイゼーションするｍＲＮＡは検出されなかった（第７Ｂ図、レーンｈ）。この結果は、サザンブロット分析の結果と一致しており、系統S12-3AのゲノムＤＮＡにはphbC遺伝子が組込まれていないことを示している（第６Ｃ図、レーンｍ）。最後に、プラスミドpBI-REDを用いた形質転換によって産生された７つのトランスジェニック系統は、1.1kbpのｍＲＮＡを有し、これはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子に相補性であった（第７Ｃ図、レーンｋ〜ｑ）。従って、３種類のphb遺伝子のそれぞれについて、予想された大きさの相補性ＲＮＡを発現する少なくとも３種類の独立なトランスジェニック植物が得られた。
ＲＮＡが存在することは遺伝子が転写されることを示しているが、それらの遺伝子が翻訳されまたは翻訳生成物が機能的であることについては全く情報が提供されない。これは、トランスジェニック植物の酵素活性を分析することによって検討した。
pBI-THIOを用いる形質転換によって産生されたトランスジェニック植物を、Senior, P.J.およびDawes, E.A.、Biochem. J., 134:225-238（1973）に記載の方法を若干変更することによって、３−ケトチオラーゼ活性について分析した。Ｔ３植物からの凍結した葉の組織をトリス緩衝液中でホモゲナイズし、透明にした粗抽出物を３−ケトチオラーゼ活性について分析した。これらの実験の結果を、第１表に示す。形質転換しないA. thaliana植物からの抽出物は、分析条件下では３−ケトチオラーゼ活性は極めて低い水準であった。対照的に、phbA遺伝子を転写することが見出されたそれぞれのトランスジェニック植物は、チオラーゼ活性が実質的に増加した水準にあった。これは、細菌性チオラーゼ遺伝子がトランスジェニック植物で発現するときには機能的であることを示していた。しかしながら、各種のトランスジェニック植物に検出される３−ケトチオラーゼの比活性は、プラスミドpTZ18U-PHB上にphbA遺伝子を有するE. coliから調製した抽出物と比較すると著しく低かった。
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プラスミドpBI-REDを用いる形質転換によって産生したトランスジェニック植物をSenior, P.J.およびDawes, E.A.、Biochem. J., 134:225-238（1973）に記載の方法を若干変更することによって、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性について分析した。Ｔ３植物からの葉をリン酸カリウム緩衝液中でホモゲナイズし、透明にした粗抽出物をアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性について分析した。これらの実験の結果を、第２表に示す。形質転換しないA. thaliana植物からの抽出物は、分析条件下ではアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は検出不能な水準であった。対照的に、phbA遺伝子を転写することが見出されたそれぞれのトランスジェニック植物では、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は高水準であった。これは、細菌性アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子がトランスジェニック植物で発現するときには機能的であることを示している。更に、分析を行った７つのトランスジェニック植物の内の６つに検出されたアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの比活性は、プラスミドpTZ18U-PHB上にphbB遺伝子を有するE. coliからの抽出物の比活性よりも著しく高かった。
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プラスミドpBI-REDを用いる形質転換によって得られるトランスジェニック植物は、チオラーゼおよびレダクターゼ活性がない場合には、この構想の活性を測定することが技術的に困難であるため、ＰＨＢシンターゼ活性の存在については分析しなかった。
ハイブリッド植物の生産および分析
高等植物は内因性の細胞質性３−ケトチオラーゼ活性を有するので、ＰＨＢを生産するのに必要なわずかな追加の酵素はアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼである。これらの２種類の遺伝子を、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子とホモ接合性であると考えられるトランスジェニック系統とＰＨＢ遺伝子とホモ接合性であると考えられるトランスジェニック系統とを交配することによって同じ植物に導入した。これらの交配から生じるハイブリッド種子を土壌中で２〜３週間生育させた後、ＰＨＢの存在に就いて分析を行った。
植物中でのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼ遺伝子の存在がＰＨＢの生産および蓄積に十分であるかどうかを検討するために、クロロホルム可溶性物質の抽出物をコントロールおよびこれらの遺伝子を両方とも含むハイブリッド植物から作成した。これらの抽出物中のＰＨＢの存在を、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によって分析した。２つの方法を用いて、ＧＣ分析用の植物抽出物を調製した。これらの方法は、ＰＨＢの高度に重合した性質（A.eutrophusから生産されるＰＨＢについては平均で10６ダルトン）およびそれのクロロホルムのような塩素化した炭化水素に対する選択的溶解性を利用している。簡単に言えば、第一の方法では、全部の葉をクロロホルムと水との１：１溶液に入れ、65℃で16時間反転振盪する。約50,000ダルトンより大きな分子は植物細胞壁を通過できないので、これらの条件下では低分子量の水またはクロロホルム可溶性生成物だけが葉から抽出される。次に、高分子量のＰＨＢと思われるものを、残っている組織をホモゲナイズして細胞壁を破壊することによって葉から抽出し、これを１：１クロロホルムと水との溶液中で65℃で12時間再抽出する。第二の方法では、全部の葉の試料を50％エタノール中で55℃で２時間、100％メタノール中で55℃で２時間および100％ジエチルエーテル中で20℃で15分間連続的に抽出する。次に、残りの組織を100℃でクロロホルム中で４時間ホモゲナイズし、抽出した。これらの方法から得られる最終的なクロロホルム抽出物に含まれる生成物をエタノールと塩酸でエステル交換し、ガスクロマトグラフィによって分析した。エステル交換した植物生成物の保持時間を、A. eutrophusから精製したエステル交換した市販のＰＨＢ（Sigma Chemical Co., ミズーリー）の保持時間と比較した。
トランスジェニック植物S8-1-2Aおよび／またはS8-1-2Cをトランスジェニック植物RedB-2A、-2C、-2D、-2GおよびRedD-3Aと交配した。生成するＦ１種子を土壌に蒔き、２〜３週齢の植物の葉の試料または全若枝を採取してＰＨＢの存在について分析した。第一の精製法を用いて得られた結果の例を、第８図に示す。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するＦ１植物の抽出物中に含まれる生成物は、市販のＰＨＢのエステル交換した生成物の保持時間と比較することによって測定したところ、エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間であった。この新規な生成物は、暫定的にエチル−ヒドロキシブチレートについて同定したが、活性なアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼトランスジーンとＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するＦ１ハイブリッド植物だけに検出された。同様な生成物は前記の遺伝子の一方だけを有するトランスジェニック植物または形質転換しないA. thaliana植物では検出されなかった。更に、この生成物は、予めホモゲナイズしなかった植物抽出物のクロロホルム抽出物では検出されなかった。これは、エチル−ヒドロキシブチレートは高分子量前駆体から誘導されることを示している。
エチル−ヒドロキシブチレートと同じ保持時間の新規な植物生成物の同定はガスクロマトグラフィ−マススペクトル分析法（ＧＣ−ＭＳ）によって行った。ＧＣ−ＭＳ分析はMSU-NIH Mass Spectrometry Facilityによって行った。第９Ａ図に、真のＰＨＢから調製したエチル−ヒドロキシブチレートのマススペクトルを示す。第９Ｂ図には、トランスジェニック植物S8-1-2AおよびRedB-2Cの交配から生じたＦ１ハイブリッド植物から抽出したエチル−ヒドロキシブチレートと思われるもののマススペクトルを示す。これらの結果は、エチル＝ヒドロキシブチレートと同じ保持時間で溶出する新規な植物生成物は、エチル−ヒドロキシブチレートの真正試料と同じ開裂パターンも有することを示している。この新規な生成物が予めホモゲナイズしておいた葉の組織からの抽出物中にだけ検出することができるという事実は、エチル−ヒドロキシブチレートが分子量が約50,000ダルトン（植物細胞壁の近似的気孔率）より大きな物質から誘導されることを示している。また、これらのデーターは、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼ遺伝子を両方とも含むトランスジェニック植物がポリヒドロキシブチレートを蓄積することも示している。第３表は、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳによって分析したＦ１植物をまとめて示している。ＧＣ分析によれば、Ｆ１ハイブリッドの葉に蓄積されるＰＨＢの量はRedD-3AとS8-1-2Cとの間のＦ１ハイブリッド対して葉の新鮮な重量１ｇ当たりＰＨＢが約５μｇからRedB-2CとS8-1-2Aとの間のＦ１ハイブリッドからの葉の新鮮な重量１ｇ当たりＰＨＢが約100μｇの範囲であった。
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ハイブリッド植物におけるＰＨＢ顆粒の目視観察
ＰＨＢを蓄積する細菌の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）から、直径が0.2〜0.5μｍの電子半透明顆粒が約２nmの厚みの皮膜によって囲まれていることが明らかになった（Lundgren, D.G.、Pfister, R.M.およびMerrick, J.M.、J. Gen. Microbiol., 34:441-446（1964））。ＧＣ−ＭＳ分析によりＰＨＢの産生について陽性であることが示されているハイブリッド植物で同様な顆粒が検出されるかどうかを検討するため、植物組織を透過型電子顕微鏡法によって検討した。トランスジェニック植物S8-1-2Aおよび／またはS8-1-2CをトランスジェニックなRedB-2A、-2C、-2D、-2GおよびRedD-3Aに交配した。生成するＦ１のハイブリッド種子および成熟した葉の物質を固定して、透過型電子顕微鏡法によって分析した。簡単に説明すれば、組織を３％グルタルアルデヒドと１％四酸化オスミウムで固定して、エポキシ樹脂に埋設した。80〜90nmの切片を５％ウラニルアセテートとクエン酸鉛で染色した。
一連の実験において、Ｆ１種子を土壌に蒔き、２〜３週齢の植物の葉を採取してＴＥＭ分析を行った。葉に含まれる細胞を検査したところ、電子半透明顆粒の凝集体が含まれることが明らかになった。これらの顆粒は、ＰＨＢシンターゼ遺伝子を有するトランスジェニック体とアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有するトランスジェニック体との交雑によって生じる総ての分析を行ったＦ１ハイブリッド植物で検出された。幾つかの例を第10図に示す。同様な顆粒は、ＰＨＢシンターゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子のみを有する親のトランスジェニック系統では検出されず、形質転換していないA. thalianaでも検出されなかった。Ｆ１ハイブリッドの葉の組織では、顆粒は葉肉細胞に検出された（第10図、顕微鏡写真ａ〜ｅ）。電子半透明顆粒の凝集体は核に最も頻繁に検出されたが（第10図、顕微鏡写真ａ〜ｃ）、同様な構造はＦ１ハイブリッドの葉の組織の細胞質（第10図、顕微鏡写真ｅ）および液胞（第10図、顕微鏡写真ｄ）でも検出された。核および細胞質では、個々の顆粒は最大約0.18μｍの大きさにまでなることができた。液胞では、顆粒は一般的に大きめで、最大直径は約0.55μｍに達した。更に倍率を上げると、核の顆粒は電子の濃い(electron-dense)物質によって囲まれていると思われる。これらの顆粒の大きさおよび見掛けの構造は共に、ＰＨＢを蓄積する細菌で観察された顆粒に極めて類似している。
第二の系列の実験では、Ｆ１種子を水に24時間浸漬し、胚を種皮から取り出し、組織を固定した。胚性子葉を分析したところ、核に電子半透明顆粒の凝集体が含まれていた（第10図、顕微鏡写真ｆ）。顆粒の最大直径は0.18μｍに達することができた。これらの顆粒は、ＰＨＢシンターゼ遺伝子を有するトランスジェニック系統とアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を有するトランスジェニック系統との交配によって生成するＦ１ハイブリッドの胚の核に検出されただけであった。異所性遺伝子一方だけを有する親のトランスジェニック植物や形質転換しない野生型のA.thalianaでは、顆粒は検出されなかった。第３図に、ＴＥＭによって分析されたＦ１植物をまとめて示す。
前記のデーターは、ＧＣ−ＭＳによるＰＨＢの検出と電子顕微鏡水準での顆粒の存在との間に正の相関があることを示している。個々の顆粒を取り巻く電子の濃い物質の大きさ、形状および存在はＰＨＢを産生する細菌に含まれる顆粒に極めてよく類似している。最後に、ＧＣ−ＭＳによるＰＨＢの検出と電子半透明顆粒の存在は、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼトランスジーンを両方とも有するハイブリッド植物だけで観察される。また、これらのデーターは、Ｆ１ハイブリッド植物で観察される顆粒がポリヒドロキシブチレートからなることを示している。
考  察
これらの検討において、ＰＨＢ合成に必要な酵素をコードする細菌遺伝子を高等植物に安定に導入して、遺伝子を転写させて、予想した大きさの転写体を産生するようにすることができることを説明してきた。更に、phbAおよびphbB遺伝子の場合には、トランスジェニック植物にこれらの遺伝子が含まれていればそれぞれ３−ケトチオラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ酵素活性の水準がそれぞれ増加することも示した。従って、これらの２個の遺伝子の生成物は植物で翻訳されるときには機能的であることは明らかである。ＰＨＢシンターゼ活性を直接分析することは技術的に困難であるため、トランスジェニック植物におけるＰＨＢシンターゼ活性の量は測定しなかった。
アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼを両方とも発現するＦ１トランスジェニック植物からの植物抽出物だけが、エタノールおよび塩酸でエステル交換するとエチル−ヒドロキシブチレートを産生する新規な高分子量のクロロホルム可溶性の化合物を生産することが示された。これらのデーターは、新規な化合物がポリヒドロキシブチレートであることを示している。また、これらのデータはトランスジェニック植物における機能性ＰＨＢシンターゼの産生の間接的な証拠である。これは、ＰＨＢシンターゼ活性についてイン・ビトロ分析を行うことができないので、重要である。更に、ＰＨＢの産生は、ＰＨＢシンターゼの基質であるＤ（−）−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが植物で産生されることも間接的に示している。このヒドロキシアシル−ＣｏＡは、天然には植物体には見られないものである。
透過型電子顕微鏡法も、ＰＨＢがトランスジェニック植物で生産されることを立証している。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼを両方とも発現するＦ１トランスジェニック植物の胚の子葉および成熟した葉を分析したところ、A.eutrophusのようなＰＨＢを産生する細菌に見られる顆粒に極めて類似した大きさおよび構造を有する電子半透明顆粒の凝集体であった。これらの顆粒は核に最もよく見られるが、Ｆ１ハイブリッド植物の液胞および細胞質でも検出された。
本明細書に記載の実験では、特異的なアミノ酸配列をタンパク質に加えて特異的に任意の細胞小器官にへと向けることはなかったので、A. eutrophus由来のphbA、phbBおよびphbC遺伝子の生成物はほとんどが細胞質で発現するものと思われる。植物細胞の細胞質は３−ケトチオラーゼを既に含んでいるので、ＰＨＢを産生するには、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼとＰＨＢシンターゼの追加的発現が必要なだけである。顆粒が核と液胞に見出されることは、細胞質での酵素の発現と必ずしも矛盾するものではない。核膜は細胞分裂の際にはばらばらになり（dissemble）、再集合するので、細胞質で最初に産生したＰＨＢ顆粒は核の新たに再形成する膜内部に取り込まれることができる。あるいは、ＰＨＢ顆粒が疎水性であるため、核または液胞の膜を通過することができる。別の方法では、ＰＨＢの産生は、ＰＨＢ合成に関与する酵素の細胞小器官に標的を定めた発現によって特異的な植物細胞の細胞小器官に局在化させることができた。この場合には、標的を定めた細胞小器官が活性な３−ケトチオラーゼを発現しない場合には、ＰＨＢの産生にはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼの外に外因性３−ケトチオラーゼ活性の発現が必要となる。
高等植物でのＰＨＢまたはＰＨＡ産生の将来的な目的は、脂質、澱粉またはデルペノイドのような主要な保存化合物から炭素を方向転換させ、ＰＨＡ合成に向けることである。この目的には、ＰＨＡ合成に関与した酵素の組織特異的発現あるいは細胞小器官特異的発現が必要となる。
油状生成物産生穀物も、同様に遺伝子工学の目標である。脂質はアセチル−ＣｏＡを用いてプラスチドで合成され、同じ前駆体はＰＨＢおよび他のＰＨＡの合成用いられる。それ故、油状穀物の遺伝子工学では、ＰＨＡ生合成酵素をプラスチドに向けることが必要になる。遺伝子操作を行ってＰＨＡを産生させることができる油状穀物の例には、アブラナ、ヒマワリ、ギネアアブラヤシがある。アブラナおよびヒマワリは北米における主要な穀物であり、異種ＤＮＡで形質転換することができる。あるいは、ＰＨＡ産生は、ギネアアブラヤシの実の中果皮に標的を向けることができる。中果皮で産生する脂質は樹木または胚の生存には必須のものではないので、ＰＨＡの産生はヤシの木に悪影響を及ぼすことはない。不運なことには、形質転換技術は、ギネアアブラヤシには未だ利用できないのである。
ＰＨＡ産生は、テンサイおよび多量の澱粉を蓄積する穀物であるジャガイモの根および塊茎に標的を向けることもできる。この方法での主要な問題点は、澱粉とＰＨＡは同じ前駆体を用いないので、炭素が澱粉からＰＨＡに転換する前に、炭素の代謝において多くの修飾を行う必要があることである。
ＰＨＡの産生に最も直接的な方法と思われるものは、カロチノイドを蓄積するニンジン、またはステロールを蓄積するメキシコイモのような、多量のテルペノイドを蓄積する穀物を使用することである。テルペノイドはＰＨＡと同じ前駆体を用いるので（アセチル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−ＣｏＡ）、炭素を転換してＰＨＡを産生させることは更に容易に行うことができる。
材料および方法
ＤＮＡ組換体の構築
プラスミドを有するE. coli DH5 αを、カナマイシン（50μｇ／ml）またはアンピシリン（50μｇ／ml）を補足したＬＢブロスで生育させた。プラスミドＤＮＡの大規模製造は、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載のアルカリリーシスおよびポリエチレングリコール沈澱法によって行った。プラスミドＤＮＡを製造業者の指示に従って制限エンドヌクレアーゼで開裂し（New England Biolabs、マサチューセッツ；Promega Corp.、ウイスコンシン；Boehringer Mannheim Biochemicals、インデァアナ；Stratagene、カリフォルニア）、アガロースゲル電気泳動によって分離し、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載のエチジウムブロミド染色によって可視化した。ＤＮＡフラグメントをＤＥＡＥ膜（NA-45 DEAE膜、Schleicher & Schuell, Inc.、ニューハンプシャー）を用いてアガロースゲルから回収した。簡単に説明すれば、ＤＮＡをNA-45のストリップで電気泳動し、膜を0.15M ＮａＣｌ、0.1mM ＥＤＴＡおよび20mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄する。ＤＮＡを、次に1.0MＮａＣｌ、0.1mM ＥＤＴＡおよび20mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で65℃で１〜２時間溶出させる。
ＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって更に生成する。幾つかの実験では、ＤＮＡフラグメントの凹部を形成した３′末端を、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載のプロトコールを用いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端に転換した。ＤＮＡフラグメントと粘着若しくはブラント末端との連結は、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載の50mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、5mM ＭｇＣｌ２、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００、0.5mM ＡＴＰおよび5mMジチオスレイトールを含む緩衝液中で14℃で16時間行った。連結反応の画分を、Hanahan, D.、J. Mol. Biol., 166:557-580（1983）に記載の塩化ルビジウム法によってE. coli中に移した。形質転換した細菌を、ＬＢブロスと50μｇ／mlのカナマイシンまたは50μｇ／mlのアンピシリンを含む寒天プレートに塗布した。組換えプラスミドを含む細菌コロニーは、ナイロン膜（Hybond-N、Amersham、イリノイ）をニトロセルロース膜の代わりに用いたこと以外は、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載の32Ｐを標識したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによって同定した。放射能標識を行ったＤＮＡプローブの調製およびハイブリダイゼーションを、下記の項で説明する。プラスミドＤＮＡのスモールスケールでの調製は、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載のアルカリンライシス法によって行った。
オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems 380A DNA合成装置で、製造業者の指示に従って合成した（Applied Biosystems、カリフォルニア）。５′末端にジメトキシトリチル基を結合させたオリゴヌクレオチドは、Ｃ18カラムを備えたVarian 5000 HPLCで精製した（Varian Instrument Group、テキサス）。オリゴヌクレオチドを0.1Mトリエチルアミンに再懸濁して、12％アセトニトリル／88％0.1Mトリエチルアミン−アセテート（ｐＨ７）（溶媒Ａ）で予備平衡にしておいたＣ18カラムに注入した。ＨＰＬＣの条件は次のように設定した。流速0.9ml／分；最大圧200psi；時間０分、88％溶媒Ａ／12％溶媒Ｂ（アセトニトリル）；時間３分、88％溶媒Ａ／12％溶媒Ｂ；時間21分、65％溶媒Ａ／35％溶媒Ｂ；時間25分、65％溶媒Ａ／35％溶媒Ｂ。精製したオリゴヌクレオチドを80％酢酸中で10分間脱トリチル化し、窒素雰囲気下にて乾燥した。オリゴヌクレオチドを10mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および0.1mMＥＤＴＡに溶解し、等容の酢酸エチルで３回抽出し、エタノールで沈澱させた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Perkin-Elmer Cetus DNAサーマル・サイクラー（Perkin-Elmer、コネチカット）を用いて行った。反応混合物は、オリゴヌクレオチド100ピコモル、ＰＣＴプライマー＃１および＃２（第５図参照）、制限酵素EcoRIで線形にしたプラスミドpTZ18U-PHB200ng、125μM ｄＮＴＰ、50mM ＫＣｌ、10mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、2.5mM ＭｇＣｌ２、0.01％ゼラチンおよびＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer、コネチカット）2.5単位を含んだ。ＤＮＡサーマル・サイクラーの測定条件は次の通りであった。94℃で３分間、94℃で１分間、55℃で３分間、72℃で３分間を40サイクル、最後に72℃で７分間。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動およびＤＥＡＥセルロース膜で溶出することによって単離した。
トランスジェニック植物の生産
トランスジェニック植物を生産するのに用いたＴｉプラスミドベクターを、最初にエレクトロポレーションによってAgrobacterium tumefaciens C58-pGV3850株に移した（Zabrisky, P.ら、EMBO, 2:2143-2150（1983）；およびSambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、Molecular Cloning a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年））。Arabidopsis thaliana Rschew種を、Estelle, M.A.およびSomerville, C.、Mol. Gen. Genet., 206:200-206（1987）およびSchefelbein, J.W.およびSomerville, C.R.、Plant Cell, 2:235-243（1990）に記載の無機元素、0.8％寒天（Difco）および１％スクロースを含む縦型ペトリ皿で無菌的に生育させた。10〜12日令の植物からの根を取り出して、Valvekens, D.、Van Montagu, M.およびVan lijsebettens, M.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5536-5540（1988）に記載の通りに形質転換に用いた。
Ｔ０およびＴ１トランスジェニック植物からの種子を無機元素、１％スクロース、0.8％寒天（Difco）および50μｇ／mlのカナマイシンを含む培地で生育させた。10〜14日間の生育の後、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）のトランスジェニック植物は緑色の葉を着けたが、形質転換しないカナマイシン感受性（Ｋｍｓ）の植物は黄色の葉を着けた。この段階で、Ｋｍｒ植物を寒天プレートから取り出し、肥沃にした土壌に移植することができた。
ゲノムＤＮＡの抽出および制限エンドヌクレアーゼ開裂
野生型とトランスジェニック植物を土壌で２〜３週間生育させ、約５ｇの葉の物質を収集し、液体窒素で冷凍した。高分子量ＤＮＡを、Rogers, S.C.およびBendich, A.J.、Plant Molecular Biology Manual A6:1-10（1988）に記載の方法によって凍結した植物組織から抽出した。酵素HindIIIによる制限エンドヌクレアーゼ開裂は、製造業者が勧める条件で行った（New England Biolabs Inc.、マサチューセッツ）。
アガロースゲル電気泳動およびハイブリダイゼーションの手順
アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ分析とナイロン膜（Hybond-N、Amersham、イリノイ）への移行は、Southern, E.M.、J. Mol. Biol., 38:503-517（1975）およびSambrook, J. Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、Molecular Cloning a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載の確立された方法を用いて行った。プローブとして用いられる特異的にクローニングしたＤＮＡフラグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼでベクターから取り出し、インサートをアガロースゲル電気泳動およびＤＥＡＥセルロース膜を用いる電気溶出によってベクターから精製した。プローブは、Feinberg, A.P.およびVolgelstein, S.、Anal. Biochem., 136:6-13（1983）に記載の方法によってヘキサマーを用いてランダムプライマー伸張法によって32Ｐ−デオキシリボヌクレオチドで標識した。ナイロンフィルターを標識したプローブでハイブリッドし、Poirier, Y.およびJolicoeur, P.、J. Virol., 63:2088-2098（1989）に記載の方法によってフィルター上に暴露した。
ＲＮＡ単離および電気泳動
全ＲＮＡを、Puissant, C.およびHoudebine, L.M.、BioTechniques, 8:148-149（1990）に記載の方法によって凍結した葉の試料から単離した。単離したＲＮＡをホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動によって分離し、Sambrook, J. Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載の方法によってナイロン膜（Hybond-N、Amersham、イリノイ）に移した。ナイロンフィルターを、前項に記載の標識したプローブでハイブリッドした。
３−ケトチオラーゼ活性の分析
凍結した葉の試料１ｇを、100mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、40mMＭｇＣｌ２および5mM β−メルカプトエタノールを含む氷冷緩衝液２ml中でホモゲナイズした。ホモゲネートを10,000×gで２分間遠心分離して透明にし、上清を新しい試験管に移した。抽出物のタンパク質含量を、BioRadタンパク質分析キット（Biorad Laboratories、カリフォルニア）を用いてBradford法によって測定した。分析当たりに、３〜30μｇの植物タンパク質抽出物を用いた。タンパク質抽出物は、細菌からも調製した。この場合には、細菌の静止培養物を遠心分離によってペレット化し、氷冷した分析緩衝液で１回洗浄し、同じ緩衝液200μｌに再懸濁した。細菌懸濁液を超音波処理によって溶菌し、ホモゲネートを遠心分離によって透明にし、抽出物のタンパク質含量をBradford法によって測定した。分析当たりに、細菌タンパク質抽出物0.2〜１ｇを用いた。様々な抽出物の３−ケトチオラーゼ酵素の活性を、Senior, P.J.およびDawes, E.A.、Biochem. J., 134:225-238（1973）に記載の方法に従って測定した。
アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の測定
凍結した葉の試料１ｇを、100mM ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５）、0.02mMＭｇＣｌ２および4.0mM β−メルカプトエタノールを含む氷冷緩衝液２ml中でホモゲナイズした。ホモゲネートを10,000×gで２分間遠心分離することによって透明にし、上清を新しい試験管に移した。抽出物のタンパク質含量を、BioRadタンパク質測定キットを用いてBradford法によって測定した。分析当たりに、植物タンパク質抽出物0.8〜10μｇを用いた。細菌抽出物も、本質的に前項に記載の方法によって分析緩衝液中で調製した。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の活性は、Senior, P.J.およびDawes, E.A.、Biochem. J., 134:225-238（1973）に記載の方法に従って測定した。
ガスクロマトグラフィおよびマススペクトロメトリー分析
２つの方法を用いて、ＧＣ分析用の植物抽出物を調製した。第一の方法では、新鮮なまたは凍結した植物物質（葉または全若枝）0.005〜0.05gを、クロロホルムと水の１：１溶液１〜２mlで、65℃で16時間、一定速度で撹拌を行いながら抽出した。次に、植物物質を水中でホモゲナイズし、クロロホルムと水の１：１溶液中で16時間65℃で一定速度で撹拌しながら再抽出した。クロロホルム相を新しい試験管に移し、等容の水で１回抽出した。クロロホルム相の最終容積を0.5mlに調整し、下記のようにエタノールとＨＣｌとでエステル交換に用いた。第二の方法では、凍結または新しい植物物質0.005〜0.15ｇを50％エタノールで55℃で２時間、100％メタノールで55℃で２時間および100％ジエチルエーテルで室温で15分間、連続的に抽出した。次に、残っている組織を水中でホモゲナイズし、乾燥して、クロロホルム0.5mlで100℃で４時間抽出した。
第一および第二の方法によって得た最終的なクロロホルム抽出物（0.5ml）を、濃ＨＣｌ0.2mlおよび100％エタノール1.7mlを加え、100℃で２時間加熱することによってエステル交換した。次に、反応混合物を室温まで冷却し、クロロホルム相を0.9％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）２mlで２回抽出し、最終的な有機相を100μｌに減少させた。標準品としては、市販のＰＨＢ（Sigma Chemical Co.、ミズーリー）を加温したクロロホルムに溶解し、１mgを前記のようにしてエステル交換した。
エチルエステルを含むクロロホルム相をＧＣ用バイアル瓶に移して、１μｌをプログラム可能なオートサンプラーとSP-2330ガラス毛細管カラムを備えたHewlett Packard 5890シリーズIIＧＣに注入した。キャリヤーガスとしてのヘリウムの近似的な直線速度は20cm／秒であった。注入部の温度は220℃に設定し、フレームイオン化検出器部の温度は220℃に設定した。下記の温度勾配を用いた。65℃で４分間、その後温度を20℃／分の速度で195℃まで上昇させ、195℃で3.5分間。実験後の温度は20℃／分の速度で65℃まで低下させる。
目的のピークの同定は、ＧＣ−マススペクトロメトリーによって行った。電子衝撃マススペクトルデーターは、Hewlett Packard 5890 GCを凍結したJEOL JMS-AX505Hマススペクトロメーターで得た。下記のパラメーターを用いた。ソース温度、200℃；イオン化電流、100μＡ；加速電圧、３keV。J &W Scientific Co.製カラムDB-225をマススペクトロメーター源に直接挿入し、ヘリウムをキャリヤーとして用いた。スプリットレス・インジェクターを260℃に保持し、トランスファー系統を260℃に保持した。同じＧＣオーブン温度勾配を用いた（前節を参照）。
透過型電子顕微鏡法
植物組織を0.1Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で３％グルタルアルデヒドで、室温で1.5〜２時間固定した。試料を0.1Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で４回洗浄し、リン酸緩衝液中１％ＯｓＯ４中に室温で２時間固定した。次に、組織を等級付けした一連のエタノールで脱水し、Spurrsエポキシ樹脂に埋設した。80〜90nmの切片を切断し、銅グリッド上に置き、５％酢酸ウラニルで30〜45分間染色した後、Reynoldsのクエン酸鉛で３〜４分間染色した。切片を、80kVで操作するJEOL 100CX II透過型電子顕微鏡で観察した。
他の植物
本明細書に記載の発明の具体例は、植物Arabidopsis thalianaおよびAlcaligenes eutrophus由来の遺伝子を含むものであったが、しかし本発明は一般的に利用され得るものである。植物におけるポリヒドロキシブチレートおよび／またはポリヒドロキシアルカノエートの産生に関する請求の範囲はArabidopsis thalianaに限定されず、Alcaligenes eutrophus由来の遺伝子の使用に特異的に連ながるものではない。下記の請求の範囲は植物細胞に異種ＤＮＡ物質を導入することによる植物におけるポリヒドロキシアルカノエートを産生させる一般的方法を記載する。このような植物には、前記の植物およびニンジン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびジャガイモ等があげられる。
植物の各種の系統由来の種子は、ブダペスト条約に基づき、the American Type Culture Collection、12301パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド20852に寄託されている。これらの系統にはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を含むRedD-3A（ATCC 75044）、ＰＨＢシンターゼ遺伝子を含むS8-1-2A（ATCC 75043）および３−ケトチオラーゼ遺伝子を含むT4-2A（ATCC 75042）がある。これらの遺伝子はそれぞれ配列番号１に示される通りである。
上記の具体的な説明は単に本発明の例示のためのものであり、本発明は、請求の範囲によってのみ制限されるものである。
付属書類
（１）一般的情報
0003696233.tif 000005
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９８０ｂｐ
（Ｂ）型  ：ペプチド前駆体をコードする核酸
（Ｃ）鎖  ：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型
（Ａ）種類：Genomic ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）：アンチセンス：Ｎｏ
（iv）：起源
（Ａ）：生物：Alcaligenes eutrophus
（vii）：直接の起源
（Ａ）：ライブラリー：Genomic
（Xi）：配列番号１
0003696233.tif 000006
0003696233.tif 000007
0003696233.tif 000008
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0003696233.tif 000010
0003696233.tif 000011
【図１】
0003696233.tif 000012
【図２Ａ】
0003696233.tif 000013
【図２Ｂ】
0003696233.tif 000014
【図２Ｃ】
0003696233.tif 000015
【図２Ｄ】
0003696233.tif 000016
【図２Ｅ】
0003696233.tif 000017
【図２Ｆ】
0003696233.tif 000018
【図２Ｇ】
0003696233.tif 000019
【図２Ｈ】
0003696233.tif 000020
【図２Ｉ】
0003696233.tif 000021
【図２Ｊ】
0003696233.tif 000022
【図３】
0003696233.tif 000023
【図４】
0003696233.tif 000024
【図５】
0003696233.tif 000025
【図６Ａ】
0003696233.tif 000026
【図６Ｂ】
0003696233.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
0003696233.tif 000029
【図７Ｂ】
0003696233.tif 000030
【図７Ｃ】
0003696233.tif 000031
【図８Ａ】
0003696233.tif 000032
【図８Ｂ】
0003696233.tif 000033
【図８Ｃ】
0003696233.tif 000034
【図９Ａ】
0003696233.tif 000035
【図９Ｂ】
0003696233.tif 000036
【図１０Ａ】
0003696233.tif 000037
【図１０Ｂ】
0003696233.tif 000038
【図１０Ｃ】
0003696233.tif 000039
【図１０Ｄ】
0003696233.tif 000040
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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