(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール検体の含有が疑われるサンプルと、その活性が前記検体の存在に関係するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を含んでいるアッセイ試薬とを含むアッセイ媒体を形成し、前記アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の活性を前記エタノール検体の存在に相関させることを含み、その場合前記サンプル中の乳酸デヒドロゲナーゼの存在が前記アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の活性の測定を妨害する、前記サンプル中のエタノール検体の存在を検出する方法であって、前記アッセイ媒体は前記乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の阻害剤を含み、該阻害剤は構造式Ｌ−Ｄを有し、ここでＬは炭素原子８〜16の炭化水素鎖であり、Ｄはカルボキシレート基（CO2-）または硫酸エステル基（OSO3-）を有する炭素原子１〜３の炭素鎖であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記阻害剤は前記アッセイ試薬中に含められる請求項１の方法。
【請求項３】
前記阻害剤はサンプルへ添加される請求項１の方法。
【請求項４】
前記阻害剤はラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸、ミリストオレイン酸、ドデシル硫酸ナトリウムおよびデシル硫酸ナトリウムよりなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項５】
前記阻害剤は、ラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸およびミリストオレイン酸よりなる群から選ばれ、該阻害剤は低分子量カルボキシル酸と組合せて用いられる請求項１の方法。
【請求項６】
前記低分子量カルボキシル酸はシュウ酸である請求項５の方法。
【請求項７】
前記アルコールデヒドロゲナーゼはNADまたはNADP依存性デヒドロゲナーゼである請求項１の方法。
【請求項８】
前記乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を含んでいるアッセイ試薬は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を含んでいるアッセイ試薬を混合する前に前記サンプルと混合される請求項１の方法。
【請求項９】
内因性乳酸デヒドロゲナーゼを含んでいるサンプル中のエタノール検体の存在を検出するためのアッセイを実施するためのキットであって、包装した組合せにおいて、レポーターアルコールデヒドロゲナーゼと、内因性乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤とを含み、前記阻害剤は構造式Ｌ−Ｄを有し、ここでＬは炭素原子８〜16の炭化水素鎖であり、Ｄはカルボキシレート基（CO2-）または硫酸エステル基（OSO3-）を有する炭素原子１〜３の炭素鎖であることを特徴とする前記キット。
【請求項１０】
前記包装した組合せは少なくとも二つの容器を含んでいる請求項９のキット。
【請求項１１】
前記阻害剤はラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸、ミリストオレイン酸、ドデシル硫酸ナトリウムおよびデシル硫酸ナトリウムよりなる群から選ばれる請求項９のキット。
【請求項１２】
前記阻害剤はラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸およびミリストオレイン酸よりなる群から選ばれ、該阻害剤は低分子量カルボキシル酸と組合せて用いられる請求項９のキット。
【請求項１３】
前記低分子量カルボキシル酸はシュウ酸である請求項12のキット。
【請求項１４】
エタノール検体の含有が疑われ、前記エタノール検体の検出を妨害する乳酸デヒドロゲナーゼを含んでいるサンプル中のエタノール検体の存在を検出する方法であって、前記サンプルと、その活性が前記エタノール検体の存在に関係するアルコールデヒドロゲナーゼおよび補酵素NADを含んでいるアッセイ試薬と、前記乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を含んでいるアッセイ媒体を形成し、そして前記アルコールデヒドロゲナーゼの活性を前記エタノール検体の存在に相関させることを含み、前記阻害剤は構造式Ｌ−Ｄを有し、ここでＬは炭素原子８〜16の炭化水素鎖であり、Ｄはカルボキシレート基（CO2-）または硫酸エステル基（OSO3-）を有する炭素原子１〜３の炭素鎖であることを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
前記阻害剤はラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸、ミリストオレイン酸、ドデシル硫酸ナトリウムおよびデシル硫酸ナトリウムよりなる群から選ばれる請求項14の方法。
【請求項１６】
前記阻害剤はラウリン酸、アガール酸、カプリン酸、リノレン酸およびミリストオレイン酸よりなる群から選ばれ、該阻害剤は低分子量カルボキシル酸と組合せて使用される請求項14の方法。
【請求項１７】
前記低分子量カルボキシル酸はシュウ酸である請求項16の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の分野
本発明は、デヒドロゲナーゼ酵素の活性に基づくハプテンおよびマクロ分子の検出のための診断アッセイに関する。これらのアッセイは、関心ある検体の検出のため臨床および非臨床環境において広く使用される。これらのアッセイにおいて有意義な問題は、上昇した信号および偽陽性応答へ導く内因性デヒドロゲナーゼにより引き起こされる妨害である。さらに全血中の内因性デヒドロゲナーゼの存在のため、デヒドロゲナーゼ活性の測定に基づくアッセイは全血サンプルに使用することができない。
この問題を回避するために提案された一つの解決法は、タンパク不含限外濾液についてアッセイを実施することである。しかしながらこれは厄介であり、特別の設備を必要とする余分の濾過ステップをアッセイ操作へ導入する。また、テストを熟練者が実施すべきことを必要とする。特別の設備および熟練者の使用を必要としないアッセイを持つことが望ましいであろう。そのようなアッセイは、テストをより広い環境においてもっと速やかにそして低コストで実施することを許容するであろう。
関連技術の概要
False−Positive  Ethanol  in  Clinical  and  Postmortem  Sera  by  Enzymatic  Assay:Elimination  of  Interference  by  Measuring  Alcohol  in  Protein−Free  Ultrafiltrate;William  C,Thompson,Deepak  Malhorta,David  P.Schammel,Watter  Blackwell,Michael  E.Ward  and  Amitava  Dasgupta;Clinical  Chemistry,40（８）:1594−５（1994）は、限外濾過による乳酸デヒドロゲナーゼの除去はEmitTMエチルアルコールアッセイにおける妨害を除去することを開示した。
Sera−Ethanol  Determination:Comparison  of  Lactate  and  Lactate  Dehydrogenase  Interference  in  Three  Enzymatic  Assays;Jeffrey  S.Nine,M.Moraca,M.A.Virji  and  K.N.Rao;Journal  of  Analytical  Toxicology,19:192−196（1995）は、上昇した血清−乳酸およびLDH濃度は酵素アッセイにおいて偽陽性エチルアルコール濃度の変動する濃度を招き得ることを示した。
Nonpolar  Interactions  Inhibitors  with  the  Nicotinamide  Adenine  Dinucleotide−binding  Sites  of  Ｌ−ｄ−Glycerophosphate  Dehydrogenase;Soo  Ja  Kim  and  Bruce  M.Anderson;Journal  of  Biological  Chemistry,244（２）:231−５（1969）は、脂肪族カルボキシル酸の同族体シリーズによるＬ−ｄ−グリセロフォスフェートデヒドロゲナーゼの阻害を開示する。
Detergents  as  Selective  Inhibitors  and  Inactivators  of  Enzymes;M.T.Vincenzini,F.Favill,M.Stio,P.Vanni  and  C.Treves;Physiological  Chemistry  and  Physics  and  Medical  NMR,17:279−295（1985）は、ピリジン依存性デヒドロゲナーゼに対する洗剤の効果を検討した。
Effects  of  Some  Antitumor  Agents  on  Growth  and  Glycolytic  Enzymes  of  the  Flagella  Crithidia;Cyrus  J.Bacchi,Edward  I.Ciaccio  and  Lois  E.Koren;Journal  of  Bacteriology,99（１）:23−28（1969）は、アガール酸はリンゴ酸およびα−グリセロフォスフェートデヒドロゲナーゼに対し高度に阻害性であることを開示した。
Catalytic  Enzyme  Activity  Concentration  in  Tissue  of  Man,Dog,Rabbit,Guinea  Pig,Rat  and  Mouse;J.Lindena,Ute  Sommerfeld,Cornelia  Hopfel  and  I.Trantschold;J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,24（１）:35−47（1986）は、死後組織中のデヒドロゲナーゼ活性の存在を開示した。
The  cytosolic  and  Glycosamal  glyceraldehyde−３−phosphate  dehydrogenase  from  Trypanosoma  Drucei:Kinetic  properties  and  comparison  with  homologous  enzymes;A.M.Lambeir,A.M.Loiseau,D.A.Kuntz,F.M.Vellieux,P.A.Michels  and  F.R.Opperdoes;Eur.J.Biochem.198（２）:429−35（1991）は、トリパノソム  NAD−依存性グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ酵素に対するアガール酸の効果を研究した。
False  Postive  Ethanol  Results  by  Emit;Kathy  Thedes−Reynolds  and  Gerge  F.Johnson;Chin.Chem.39:1143（Abstract  0111）（1993）は、偽陽性エタノール結果は、多分血清乳酸および試薬NADのNADHおよびピルベートへの乳酸デヒドロゲナーゼ触媒変換によることを報告した。
本発明の概要
本発明は、レポーター酵素としてデヒドロゲナーゼを用いるアッセイにおいて、内因性デヒドロゲナーゼによる妨害を除去する方法に関する。アッセイマトリックス中へデヒドロゲナーゼ酵素阻害剤の添加は、前に述べた上昇した信号および偽陽性結果を排除することが予想外にも発見された。従って本発明の一面は、検体含有の疑いあるサンプル中の該検体の存在を検出する方法の改良である。該方法は、サンプルとアッセイ試薬を含んでいるアッセイ媒体を形成することを含む。アッセイ試薬は、その活性が検体の存在に関係する第１のデヒドロゲナーゼ酵素を含んでいる。サンプル中の第２のデヒドロゲナーゼ酵素の存在はこの活性の測定を妨害する。改良は、第２のデヒドロゲナーゼ酵素の阻害剤の有効量をアッセイ媒体中に含め、第２のデヒドロゲナーゼ酵素による妨害を防止することよりなる。これにより、第１のデヒドロゲナーゼ酵素の活性を検体の存在に正確に関連させることができる。第２のデヒドロゲナーゼ酵素の阻害剤は、アッセイ試薬またはその一部として含めるか、またはサンプルへ添加することができる。本発明の他の面は、第１のデヒドロゲナーゼがアルコールデヒドロゲナーゼであり、第２のデヒドロゲナーゼが乳酸デヒドロゲナーゼである上記方法を含んでいる。やはり本発明の一部を形成するのは、第２のデヒドロゲナーゼの阻害剤が疎水性基と親性基を含んでいる両親媒性種である改良であり、これはアニオン性でもカチオン性でもよい。本発明はまた、内因性デヒドロゲナーゼを含有するサンプル中の検体の存在を検出するためのアッセイを実施するためのキットを含む。キットは、包装した組合わせにおいて、レポーターデヒドロゲナーゼと、そして内因性デヒドロゲナーゼの阻害剤を含んでいる。
本発明の詳細な説明
定義および一般的パラメーター
本発明を記載するためここに使用される種々の術語の意味および範囲を示しそして定義するため、以下の定義を述べる。
術語「アルキル」は、炭素原子１ないし30の分岐または直鎖非環状一価飽和炭化水素基を意味する。例は、ヘプチル（−C7H15）,2−エチルヘプチル（−C9H20），ドデシル（−C12H25），およびセチル（−C16H33）を含む。
術語「低級アルキル」は、炭素原子１ないし６のアルキル基を意味する。この語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルおよび３−メチルペンチルのような基によって例示される。
術語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素間二重結合を含んでいる、炭素原子１ないし30の分岐または直鎖非環状一価不飽和炭化水素基を意味する。例は、１−デセニル、２−デセニルおよび9,12−オクタデカジエニルを含む。
術語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素間三重結合を含んでいる、炭素原子１ないし30の分岐または直鎖非環状一価不飽和炭化水素基を意味する。例は、１−デシニル、２−デシニルおよび３−ドデシニルを含む。
術語「両親媒性種」は、例えばラウリルアルコール、ラウリン酸、ステアリン酸ナトリウム、カプリン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、または例えばｎ−デシルアンモニウムクロライドのようなアルキルアンモニウム塩のような、水溶性（親水性）部分と、そして水不溶性（疎水性）部分を持っている分子を意味する。
術語「脂肪酸」は、メチル基のカルボキシル基COOHへの酸化の均等により炭化水素から誘導された有機一塩基性酸を意味する。脂肪酸は、酢酸、ヘキサン酸およびラウリン酸のような飽和酸C2N+1COOH;ジメチルアクリル酸、オレイン酸およびリノール酸のような不飽和酸C2N+1COOH;アセチレン酸C2N+3COOH;およびリノレン酸のようなポリ不飽和酸C2N+5COOHを含む。
術語「ハロ」は、フルオロ、ブロモ、クロロおよびヨードを意味する。
術語「デヒドロゲナーゼ」は、ドナー化合物からアクセプター化合物へ水素または電子の移動を触媒するオキシドレダクターゼクラス（EC1）の酵素を意味する。デヒドロゲナーゼは、酸化される基質（ドナー化合物）に従って通常命名される。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼはアルコールからアクセプターへ水素を移動することによってアルコールを酸化する酵素を意味し、乳酸デヒドロゲナーゼは水素をアクセプターへ移動することにより乳酸をピルビン酸へ酸化する酵素を意味する。代表的デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む。
術語「有効量」は、所望の効果を発生するのに必要な量を意味する。所望の効果が妨害する内因性デヒドロゲナーゼの活性を阻害することによって検体の存在を正確に決定すべき場合、阻害剤の「有効量」は、そのような正確な決定を許容する阻害剤の量である。典型的には、阻害剤の「有効量」は内因性デヒドロゲナーゼの活性を約90％，好ましくは約98％，もっと好ましくは99％阻害するであろう。
術語「信号発生システム」は、サンプル中の検体の存在または量に関係する信号を発生するのに必要な種を意味する。それは検体のアッセイに用いられ、そして少なくとも一成分がレポーターデヒドロゲナーゼである一以上の成分を持つであろう。それはレポーターデヒドロゲナーゼによって使用される助因子を含んでいる。信号発生システムは、測定可能な信号を発生するのに必要な試薬の全部を含んでいる。
本発明は、レポーター分子もしくは標識（レポーターデヒドロゲナーゼ）として採用したデヒドロゲナーゼ酵素の活性にその検出が基づいている検体の検出のための方法における改良を含んでいる。典型的には、デヒドロゲナーゼの活性は存在する検体の量に関係している。しばしば、そのような検出系は、検体を含んでいるサンプル中に存在する内因性デヒドロゲナーゼからの妨害を蒙る。改良は、アッセイ媒体中へ内因性デヒドロゲナーゼの阻害剤を含めることよりなる。内因性デヒドロゲナーゼの選択的阻害は、レポーターデヒドロゲナーゼに相当する活性の正確な測定を許容し、該活性は存在する検体の量に関係づけることができる。
検体は、体液または組織のようなサンプル中に、例えば全血、血清、尿、唾液、血漿、羊水、脳脊髄液、死後心臓組織、腎臓、肝臓、胃液、筋肉、脂肪、脾臓、脳、胸膜液、硝子体液などに存在することができる。検体は、薬物、天然に存在する生理学的化合物（例えばタンパク、抗体およびホルモン）、汚染物質等のような広範囲の物質のどれでもよい。検体の一部の正確な性格およびその多数の例が、Litmanらの米国特許No.4,299,916、特にカラム16ないし23に開示されており、その開示を参照としてここに取り入れる。典型的には、検体はレポーターデヒドロゲナーゼのための基質であり、そしてレポーターデヒドロゲナーゼの活性は酵素反応の生産物を検出することによって測定される。生産物は、検体がそれへ変換される種か、または酵素反応の絶対的助因子からの生産物であることができる。検体を基質として利用できる内因性デヒドロゲナーゼはこの酵素反応を妨害する。同様に、絶対的助因子としてレポーターデヒドロゲナーゼによって使用される同じ助因子を使用する内因性デヒドロゲナーゼもこの酵素反応を妨害する。そのような状況において、内因性デヒドロゲナーゼは、検体の存在に関係なく助因子の検出可能な種への変換を触媒し、偽陽性結果を与える。
本発明の改良は、標識としてレポーターデヒドロゲナーゼを使用する検体のためのどんなアッセイにも使用することができる。競合および非競合プロトロールの両方を使用することができる。競合プロトコールにおいては、検体と、レポーターデヒドロゲナーゼ標識検体が検体のための受容体への結合に対して競合し、そして受容体への標識検体結合の程度が決定される。この結合の程度は存在する検体へ関連づけされ、そして標識レポーターデヒドロゲナーゼによって生産された信号の量を測定することによって決定される。そのようなアッセイの一例は、Rubinsteinらの米国特許No.3,813,837に見られる。
前に述べたように、本発明は、多種類のレポーターデヒドロゲナーゼの一つを使用することができる多種類の検体の測定に適用を有する。そのようなレポーターデヒドロゲナーゼを用いるアッセイの限定ではなく例証として、EmitTMエタノールアッセイがその一例である。EmitTMエタノールアッセイにおいては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）が、以下の式に従って、同時にNADHを形成するように還元される補酵素NAD（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を使用してエチルアルコールのアセトアルデヒドへの酸化を触媒する。エチルアルコール＋NAD→アセトアルデヒド＋NADH
NADHの生産によって測定されるADH活性は、このようにしてサンプル中のエチルアルコールの量に関連づけられる。もしサンプル中にNAD依存性デヒドロゲナーゼが存在すれば、その基質の存在下では、それはサンプル中にアルコールが存在しようとしまいとNADHを生産するであろう。例えば、サンプル中に乳酸と乳酸デヒドロゲナーゼが存在すれば、エチルアルコールの不存在下でさえも検出可能種としてNADHの同時生産を伴って乳酸がプルビン酸へ変換され、そのため偽陽性結果を与えるであろう。他のデヒドロゲナーゼは、NADの代わりにNADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を使用し得る。本発明は、内因性デヒドロゲナーゼの阻害剤をアッセイ媒体中に含めることにより、これを防止する方法を開示する。
特にEmitTMエタノールアッセイは乳酸および乳酸デヒドロゲナーゼを含有するサンプルの妨害を蒙る。乳酸デヒドロゲナーゼは、NADHの同時生産を伴って乳酸のピルビン酸への変換を触媒し、エチルアルコールが存在しなくても信号が発生する。我々は、アッセイ媒体中へ乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤の添加はこの偽陽性結果を防止することを発見した。単独および組合せにおいてカルボキシル酸およびアルキル硫酸の塩が特に有効であることが発見された。内因性デヒドロゲナーゼからの妨害を受ける、任意のデヒドロゲナーゼ系アッセイがそのような改良に服し得る。第２の内因性デヒドロゲナーゼの活性による妨害を蒙る任意のデヒドロゲナーゼに基づくアッセイ系は、アッセイ媒体中に第２の内因性デヒドロゲナーゼの阻害剤を含めることにより、そのような態様で改良され得る。
この改良は、レポーターデヒドロゲナーゼとしてアルコールデヒドロゲナーゼを、そして絶対助因子としてNADを使用するアルコールのアッセイを使用して前記のように例証された。助因子としてNADまたはNADPを使用する他の酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、マンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリオキシル酸レダクターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ等を含む。同様に、妨害内因性デヒドロゲナーゼも上に挙げた酵素を含むことができる。デヒドロゲナーゼ酵素によって使用される代わりの助因子は、チトクロム、O2、H2O2等を含む。
阻害剤の選択は、レポーターデヒドロゲナーゼの性格、内因性デヒドロゲナーゼ、およびアッセイプロトコールの関数である。デヒドロゲナーゼ酵素に対する特定の化合物の阻害活性の測定は、当業者に良く知られた方法によって決定することができる。典型的には、デヒドロゲナーゼの活性が阻害化合物の変化量の存在下に決定される。Nonpolar  Interactions  of  Inhibitors  with  Nicotinamide  Adenin  Dinucletide−binding  Sires  of  Ｌ−α−Glycerophosphate  Dehydrogenase,by  Soo  Ja  Kim  and  Bruce  M.Anderson;Journal  of  Biochemistry;244（２）:231−５（1969）を見よ。好ましくは阻害剤は内因性デヒドロゲナーゼを選択的に阻害する。そのような選択的阻害は動力学的コントロールまたは平衡コントロールによって得られる。そのため、もし内因性デヒドロゲナーゼの阻害速度がレポーターデヒドロゲナーゼの阻害より十分に速ければ、内因性デヒドロゲナーゼとレポーターデヒドロゲナーゼの両方を阻害をする阻害剤を使用することができる。代わりに、アッセイプロトコールを、レポーターデヒドロゲナーゼおよび／または絶対助因子（もし助因子を使用するならば）を添加する前に、阻害剤をサンプルへ加えるようにしてもよい。もし阻害剤が非選択的であるならば、可逆的阻害剤は、アッセイ時間が阻害の逆転の時間フレームに比較して短いことを通常必要とするであろう。
本発明に使用される阻害剤は、極性親水性基へ連結された疎水基を持っている。親水性基はアニオン性またはカチオン性でよい。そのような阻害剤の構造は式Ｌ−Ｄによって表わされ、ここでＬは疎水性基であり、Ｄは極性アニオン性またはカチオン性基である。Ｌは、炭化水素鎖に存在する不飽和の程度に応じ、式CNH2N+1,CNH2N-1,CNH2N-3,CNH2N-5等により表わされる飽和または不飽和炭化水素鎖であろう。Ｎは１ないし30,もっと典型的には約５ないし25,そして好ましくは８ないし16の範囲であろう。Ｌは、場合によりハロ、SHおよびOHのような非イオン性基で置換されてもよい。Ｄは、−OH,−CO2H,−SO3H,−PO3H,−OSO3H,−PO（OR）OH,−PO（OH）2,−OPO（OH）2,−OPO（OR）OH,および−NH2よりなる群から選ばれた、少なくとも１個の極性基X,通常１ないし５個の極性基X,好ましくは１ないし３個の極性基X,そしてもっと好ましくは１個の極性基で置換された短炭素鎖または１ないし６炭素原子の炭素環よりなるであろう。ここでＲは低級アルキル基を表わし、そして炭素鎖または炭素環をそれぞれ有するＤに相当する、式CnXaH2n+1-aまたはCnXaH2n-1-aによって表わされる。ｎは１〜６であり、ａは１ないし５である。そのような混合疎水性／親水性種は、NAD/NADP依存性デヒドロゲナーゼの疎水性結合部位とピロリン酸結合部位とへ同時に結合するものと推測されている。前出Journal  of  Biological  Chemistry,244（２）:231−５（1969）参照。
特に好ましい阻害剤は、Ｌが８〜16炭素原子の炭化水素鎖であり、そしてＤが少なくとも１個のカルボキレート基CO2-またはサルフェート基−OSO3-を有する１〜３炭素鎖である阻害剤である。そのようなカルボキシル酸および硫酸エステルは、レポーターデヒドロゲナーゼとしてNADまたはNADP依存性デヒドロゲナーゼが使用されるアッセイにおいて有用である。そのようなアッセイに特に好ましいのは、妨害内因性デヒドロゲナーゼが乳酸デヒドロゲナーゼである時特に、ラウリン酸、アガール酸、リノレン酸、ミリストオレイン酸、およびデシル硫酸ナトリウムである。
阻害剤は酸の混合物でよい。いくつかの酸は、例えばシュウ酸、β−フルオロヒルビン酸、マロン酸、２−ケトマロン酸、ジヒドロキシルロン酸、オキザロリンゴ酸、リンゴ酸、２−ケトグルタル酸、２−オキソ酪酸、コハク酸、グリコール酸、イソフタル酸、グルオキシル酸等のような低分子量酸との組合せにおいて一層有効である。しばしば、低分子量酸の脂肪酸阻害剤との併用は、他の場合よりも低い濃度において脂肪酸の使用を許容する。このことは、脂肪酸の溶解度が制限因子である時に有利である。例えば、モル比1:2（カプリン酸：シュウ酸）におけるシュウ酸との組合せで使用されるカプリン酸は、独立に使用する時よりも、ENITTMエタノールアッセイにおける偽陽性の排除において一層有効である。典型的には、使用される脂肪酸に対する低分子量酸のモル比は、約1:3,好ましくは1:1,もっと好ましくは2:1,さらに好ましくは4:1である。
好ましい阻害剤の他のクラスは、アルキル硫酸のアルカリ金属塩である。ナトリウムおよびカリウム塩が特に好ましい。アルキル基は基CnH2n+1によって表わされ、ｎは１〜30,好ましくは６〜20,もっと好ましくは８〜12の範囲である。
種々の添加順序を使用し得るが、好ましくは阻害剤がサンプルへ添加され、レポーターデヒドロゲナーゼ（もし必要ならば助因子も）の添加が続く。望ましくは、１回目の添加は阻害剤のサンプルとの平衡化を許容するためのインキュベーションが続くであろう。種々の希釈およびインキュベーションをアッセイに使用することができる。すなわち、各添加の前または同時に、試薬の正確な移動を提供するため、測定機器により要求される体積を増加する等のため追加の水性媒体を加えることができる。インキュベーションステップは、通常的10秒ないし６時間、普通約10秒ないし１時間、好ましくは約30秒ないし30分、もっと好ましくは約１分ないし30分変動するであろう。
アッセイ媒体は、全部または一部が水性でよい全部が液相であることができる。それは例えばレポーターデヒドロゲナーゼがビーズもしくは紙ストリップ上に固定化されそしてサンプルへ暴露される時のように、固相へ固定化された試薬を含むことができる。アッセイ媒体を通常約pH5〜10の範囲、もっと普通には約６〜9.5の範囲、好ましくは約７〜9.5の範囲内に緩衝化されるであろう。種々の緩衝液を使用し得るが、特に状況においては一つの緩衝液が好ましいであろう。例示的緩衝液は、ホウ酸塩、リン酸塩、バルビタール、トリス等を含む。
添加およびインキュベーションの種々の状態の間の温度は、一般に約10〜50℃，もっと普通には約15〜45℃，好ましくは24〜37℃の範囲であろう。
本発明は、妨害内因性デヒドロゲナーゼを含んでいるサンプル中の検体の存在を決定するためのキットを含んでいる。このキットは、包装した組合せにおいて、レポーターデヒドロゲナーゼと、そして内因性デヒドロゲナーゼの阻害剤を含んでいるアッセイ試薬よりなる。加えて、キットは、例えばNADまたはNADPのような絶対的助因子を含むことができる。アッセイ試薬は同じまたは別々の容器に包装することができる。BLG（β−ラクトグロブリン）、PEG（ポリエチレングリコール）、RSA,BSA,Mod−μ−Cyte,Sol−μ−pro等のようなバルキング剤;Tween−20,Plurafac  A38,Triton  Ｘ−100,Pluronic  25R2等のような消泡剤および界面活性剤を含む界面活性添加剤；およびこの分野で普通使用される他の材料を、溶解性を改良し、そして表面への試薬および検体の非特異的結合を減らすために添加することができる。アジ化物、チメロサール、ゲンタマイシン等の抗微生物剤を、試薬の貯蔵寿命を延長するために試薬へ添加することができる。キットはさらに、信号発生系のメンバー、補助試薬等を含む、アッセイを実施するための他の包装した試薬を含むことができる。
以下の実施例は本発明の特定具体例をさらに記載する。これらは典型的な例証実施例であり、本発明を記載することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例
材料
カプリン酸、シュウ酸、ラウリン酸およびミリストオレイン酸のようなカルボキシル酸は、Aldrich  Chemical  Co.,Milwaukee,Wisconsinのような販売元から入手し得る。アガール酸は、Janssen  Chimica,New  Brunswick,New  Jerseyから入手し得る。ドデシル硫酸ナトリウムは、Sigma  Chemical  Co.,St.Louis,Missouriから入手し得る。デシル硫酸ナトリウムは、Oakwood  Products,West  Columbia,South  Carolinaから入手し得る。
EmitTMエチルアルコールアッセイのためのEmitアッセイ試薬は、Syva  Company,San  Jose,Californiaから得た。
方法
内因性デヒドロゲナーゼを含んでいるサンプルについて偽陽性結果を防止する阻害剤の能力は、Syva  Company,San  Jose,Californiaから入手し得るEmitエチルアルコールアッセイ（商品No.9K219）を使用することによって決定された。このアッセイは、Syva  Companyによって提供されたプロトコールを使用し、製造者指示書に従ってCobas  Mira−Ｓ分析機（Roche  Diagnostics  Inc.,Nutley,New  Jersey）上で実施された。概略して、Emitエチルアルコールアッセイは、二つの試薬、試薬１および試薬２からなっている。試薬１はトリスバッファー、安定剤および保存剤を含んでいる。試薬２は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、バルキング剤、安定剤、界面活性剤および保存剤を含んでいる。試薬２は乾燥した形で出荷され、そして製造者の指示書に従って復元される。アッセイを実施するため、試薬１および試薬２がサンプルへ添加された。混合およびインキュベーション後、340nmにおける吸光度の変化がモニターされた。反応はリニヤーであり、そして較正はSyva  Companyにより供給された、100mg/dL（0.10％）較正液を使用して一点較正によって得られた。結果の較正は必要としなかった。機器は定量的結果をプリントする。
以下の実施例において、現行Emitのカラムに報告した結果は、阻害剤不存在下においてEmitエチルアルコールアッセイを用いて観察された結果を意味する。阻害剤Emitのカラムに報告した結果は、指定した阻害剤の存在下Emitエチルアルコールアッセイを用いて観察された結果を意味する。カラムGCのもとに報告した結果は、ガスクロマトグラフィーを用いて得た確認結果を意味する。実施例１〜６は血清サンプルを用いて実施された。実施例７は全血サンプルを使用した。
実施例１
アガール酸による改良アッセイ
アガール酸をEmitエチルアルコール試薬１中に加熱攪拌して25mMの濃度へ溶解した。アガール酸は無色の試薬１を淡黄色へ転じた。溶液のpHを測定し、Emitエチルアルコール試薬のpH（pH9.0）へ少量のNaOHで調節した。アガール酸の効力をテストするために使用した患者サンプルは、ガスクロマトグラフィーによりエタノール陰性と確認されたが、しかしEmitエチルアルコールアッセイによって偽に上昇した血漿サンプルであった。これらの矛盾するサンプルを順次アガール酸を含むアッセイをもってEmitエチルアルコールアッセイを使用して分析した。以下のデータは、Emitエチルアルコールアッセイにおいて観察された上昇したエタノール結果はアガール酸の存在下で排除されたことを示す。
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実施例２
ラウリン酸による改良アッセイ
実施例１の操作に従って、アガール酸をラウリン酸に代えた時、以下の結果が得られる。ラウリン酸は試薬１中50mMの濃度に調製した。加熱は要しなかった。以下のデータは、ラウリン酸の存在下で、Emitエチルアルコールアッセイにおいて観察された上昇したエタノール結果は排除されたことを示す。
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実施例３
ミリストオレイン酸による改良アッセイ
実施例１の操作に従って、アガール酸を試薬１中50mMの濃度のミリストオレイン酸に代えた時、以下の結果が得られた。Emitエチルアルコールアッセイにおいて観察された上昇したエタノール結果は、ミリストオレイン酸の存在下で排除されたことを示す。
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実施例４
カプリン酸＋シュウ酸による改良アッセイ
カプリン酸をEmitエチルアルコールアッセイ試薬１中に、最終試薬１濃度の２倍の50mMに溶解した。シュウ酸をEmitエチルアルコールアッセイ試薬１中に、最終試薬１濃度の２倍の100mMに溶解した。両方の化合物は無色溶液を形成して試薬１中に容易に溶解した。試薬１へカプリン酸の添加は最終pHのシフトを生じないが、試薬１へシュウ酸の添加は少量の5N  HClを用いてpH9.0へのpH調節を必要とする。次に二つの溶液を1:1容積で混合し、カプリン酸とシュウ酸を含有するEmitエチルアルコールアッセイ試薬１カクテルを調製した。データは、矛盾するエタノール定量化はカプリン酸／シュウ酸の存在により有意義に減ったことを示す。
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実施例５
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）による改良アッセイ
実施例１の操作に従い、アガール酸を試薬１中ドデシル硫酸ナトリウム12.5mMの濃度に代えた時、以下の結果が得られた。以下のデータは、Emitエチルアルコールアッセイにおいて観察された上昇したエタノール結果はドデシル硫酸ナトリウムの存在下排除されたことを示す。
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実施例６
デシル硫酸ナトリウムによる改良アッセイ
実施例１の操作に従い、アガール酸をデシル硫酸ナトリウムに代えた時、以下の結果が得られた。デシル硫酸ナトリウムは60mMの最終濃度で用いた。以下のデータは、Emitエチルアルコールアッセイにおいて観察された上昇したエタノール結果は、デシル硫酸ナトリムウの存在で排除されたことを示す。
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実施例７
全血サンプルについての改良アッセイ
実施例１および４に記載した操作に従い、しかし全血サンプルを代わりに使用し、以下の結果が得られた。
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データは、現行のEmit製品に対する、全血エタノールサンプルの分析についてアガール酸またはカプリン酸／シュウ酸の存在下のEmitエチルアルコールアッセイの改良された精度を示している。