(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ活性を示す第２の熱安定酵素に添加された場合に増幅プロセスの忠実度を増大する、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、DNAポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素であって、
ｉ）アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）から得られ得るものであり、かつ
ｉｉ）SDS-PAGEによる測定での分子量が約３２，０００ダルトンである、
熱安定酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の第１の熱安定酵素およびDNAポリメラーゼ活性を示す第２の熱安定酵素を含有してなる組成物であって、第２の熱安定酵素単独の使用と比較して該組成物の使用により増幅プロセスの忠実度が増大する、組成物。
【請求項３】
第２の熱安定酵素が、プルーフリーディング活性を欠失しているか、またはTaqポリメラーゼである請求項２記載の組成物を用いてDNAを増幅する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の熱安定酵素を用いるDNAの増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細にはポリヌクレオチド合成に関する。また、本発明は、実質的に純粋な熱安定エキソヌクレアーゼ、大腸菌における熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩのクローニングおよび発現、ならびに増幅反応におけるそれの使用に関する。本発明は、持ち越し汚染からの除染を可能にする条件下でのＤＮＡの高忠実度増幅および長鎖産物の合成を促進する。
【０００２】
インビトロ核酸合成は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてさらなるポリペプチド有りまたは無しでルーチン的に行われる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製および修復に関連する酵素のファミリーである。大腸菌等の中温微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離に関して広範な研究が行われてきた。例えば、ベスマン  （Ｂｅｓｓｍａｎ）ら、（１９５７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２３：１７１〜１７７、およびブーチン（Ｂｕｔｔｉｎ）およびコーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：５４１９−５４２７参照。
【０００３】
サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）等の好熱菌からのＤＮＡポリメラーゼの単離および精製に関する研究が行われてきた。キーエン（Ｃｈｉｅｎ），Ａら、（１９７６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：１５５０−１５５７は、サーマス・アクアティカスＹＴ１株からの８０℃の至適温度を有するＤＮＡポリメラーゼの単離および精製を開示している。米国特許第４，８８９，８１８号は、約８６，０００〜９０，０００ダルトンの分子量を有するＴ．アクアティカスに由来する精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼを開示している。さらに、欧州特許出願０  ２５８  ０１７は、ＰＣＲプロセスにおける使用に好ましい酵素としてＴａｑポリメラーゼを開示している。
【０００４】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有するが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼＩＩＩ機能を保持しないことが研究により示されている［ローヤー（Ｌａｗｙｅｒ），Ｆ．Ｃ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：６４２７−６４３７；バーナード（Ｂｅｒｎａｄ）Ａ．ら、（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５９：２１９］。ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、「プルーフリーディング活性」と一般に呼ばれる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー−テンプレート二重鎖の３’末端でミスマッチした塩基を除去する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の存在は、核酸鎖の複製の忠実度における増大および成熟前に終結した産物の伸長を導くので有利であり得る。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチしたプライマー末端を除去し得ないので、塩基取り込みエラーを生じやすく、所定の適用においてはその使用は望ましくない。例えば、遺伝子のいずれのコピーもランダムな誤取り込み現象のためにエラーを含み得るので、増幅した遺伝子をクローンニングしようとする試みは問題がある。エラーが生じるサイクル（例えば、初期の複製サイクルにおける）に依存して、増幅したＤＮＡ全体が、誤って取り込んだ塩基を含み、従って、変異した遺伝子産物を生じうる。
【０００５】
高忠実度ＤＮＡ増幅に使用される熱安定古細菌に由来するＢ型ポリメラーゼのような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す数種の熱安定ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において知られている。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定ポリメラーゼは、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）［精製された熱安定ピロコッカス熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、マザー（Ｍａｔｈｕｒ）Ｅ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、国際公開第９２／０９６８９号パンフレット、ＵＳ５，５４５，５５２；ピロコッカス種由来の精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、コーム（Ｃｏｍｂ）Ｄ．Ｇ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＥＰ０  ５４７  ３５９；古細菌ピロコッカスフリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の機能とヌクレオチド配列、ウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ）Ｔら、（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：２５９−２６５．］、ピロディクタム種から（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）［熱安定核酸ポリメラーゼ、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）Ｄ．Ｈ．，Ｆ．ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ、ＥＰ０  ６２４  ６４１；ピロディクタム種由来の精製された熱安定核酸ポリメラーゼおよびＤＮＡコード配列、ゲルファンド  Ｄ．Ｈ．，Ｆ．，ホフマン−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳ５，４９１，０８６］、サーモコッカスから［例えば、サーモコッカス種に由来する熱安定DNA ポリメラーゼ  ＴＹ、ニーハウス（Ｎｉｅｈａｕｓ）Ｆ．ら、国際公開第９７／３５９８８号；精製されたテルモコッカス・バロッシィ（Ｔｈｅｒｍｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ルーム（Ｌｕｈｍ）Ｒ．Ａ．、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、国際公開第９６／２２３８９号；ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ等に有用な中間エキソヌクレアーゼ活性および高温でより長期間の安定性を有するサーモコッカス・バロッシィ由来のＤＮＡポリメラーゼ、デネゼル（Ｄｈｅｎｎｅｚｅｌ）Ｏ．Ｂ．、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、国際公開第９６／２２３８９号；ＤＮＡ操作における使用のためのサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｏｍｂ  Ｄ．Ｇ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳ５，３２２，７８５、ＥＰ０  ４５５  ４３０；古細菌由来の組換え熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｏｍｂ  Ｄ．Ｇ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳ５，３５２，７７８、ＥＰ０  ５４７  ９２０、ＥＰ０  ７０１  ０００；サーモコッカス・ゴルゴナリウスから得られる新規に単離された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、アンゲラー（Ａｎｇｅｒｅｒ）Ｂ．ら、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、国際公開第９８／１４５９０号］から単離され、クローン化され得る。
【０００６】
プルーフリーディング機能の存在下でＰＣＲを付与する他の可能性は、ポリメラーゼ酵素、かかるプルーフリーディング活性を示すポリメラーゼの混合物の使用である。（例えば、増大された熱安定性を有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼならびに増強された長さおよび効率のプライマー伸長法、バルネス（Ｂａｒｎｅｓ）Ｗ．Ｍ．，ＵＳ５，４３６，１４９、ＥＰ  ０６９３  ０７８；新規ポリメラーゼ組成物およびその使用、ソージ（Ｓｏｒｇｅ）Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、国際公開第９５／１６０２８号）。少なくとも１つの熱安定ＤＮＡポリメラーゼの主要な成分と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す微少成分とを含有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等の製剤を使用することは一般的な慣習である。これらの混合物中において、進行性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）は、ＴａｑポリメラーゼのようなｐｏｌＩ型酵素と、Ｐｆｕのような熱安定Ｂ型ポリメラーゼによるプルーフリーディング機能とにより付与される。高忠実度ＤＮＡ合成は、核酸増幅における１つの所望されるパラメータであり、他の重要な特徴は、除染の可能性である。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応は、単一分子を十億倍より多くに増幅しうる。従って、微少量の夾雑物でさえも、増幅され、偽陽性結果を導きうる。かかる夾雑物は、しばしば以前のＰＣＲ増幅に由来する産物である（持ち越し汚染）。それゆえ、研究者らは、かかる汚染を回避する方法を開発した。
【０００８】
手順は、ウラシル含有ＤＮＡ（Ｕ−ＤＮＡ）を産生するためにＰＣＲ増幅の間にｄＵＴＰでＴＴＰを置き換えることに依存している。続いて、ＰＣＲ増幅の前にＰＣＲ反応混合物をウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）で処理することにより、増幅に適さない混入した核酸を分解する。ｄＵＴＰは、ｐｏｌＩ型熱安定ポリメラーゼにより容易に取り込まれるが、Ｂ型ポリメラーゼには取り込まれない［Ｇ．スルップハウク（Ｓｌｕｐｐｈａｕｇ）ら、（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：１６４−１６９］。Ｂ型ポリメラーゼによるｄＵＴＰの低取り込みは、テンプレートの同じ型がＰＣＲ増幅により繰り返し分析される研究室におけるそれらの使用を制限する。
【０００９】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）［サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）に由来する好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｌａｔｅｒ  Ｍ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、国際公開第９６／４１０１４号；テルモトガ・ネアポリタナ由来のクローン化されたＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体、ヒュース（Ｈｕｇｈｅｓ）Ａ．Ｊ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．国際公開第９６／１０６４０号；テルモトガ・マリチマ（Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）に由来する精製された熱安定核酸ポリメラーゼ酵素、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）Ｄ．Ｈ．ら、ＣＥＴＵＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、国際公開第９２／０３５５６号］のような真正細菌からも単離された。これらの酵素は、誤取り込みまたはミスマッチした塩基を除去しうる強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この酵素の遺伝学的に操作された改変体は、ＵＬＴｍａ、ＰＣＲプロセスにさらなるポリペプチドなしで使用されうるＤＮＡポリメラーゼとして市販されている。この酵素は、誤取り込みされた塩基を除去し、ｄＵＴＰを取り込みうるが、忠実度が、不明な理由のためにＴａｑポリメラーゼのそれよりも高くない［ポリメラーゼ連鎖反応における複製の正確さ、ディアズ（Ｄｉａｚ）Ｒ．Ｓ．ら、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９８）３１：１２３９−１２４２；ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼおよび他の熱安定ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度、クライン（Ｃｌｉｎｅ）Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９６）２４：３５４６−３５５１］。
【００１０】
高忠実度ＤＮＡ合成のために、Ｂ型ポリメラーゼまたはそれらを含有する混合物の使用に代わる他のものは、好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、１８ポリペプチド鎖の複合体の使用である。これらの複合体は、細菌の染色体のレプリカーゼと同一であり、数百キロベースまたは全染色体のＤＮＡ鎖を合成するのに必要な全ての因子を含む。この酵素の１０個の異なるサブユニット（それらのいくつかはマルチコピーで存在する）は、組換え技術により作製され、再構築され、インビトロＤＮＡ合成に使用されうる。これらの複合体の考えられうる使用としては、数千から数十万塩基対の核酸のＰＣＲ増幅が提案される［染色体レプリカーゼとして機能する好熱性生物酵素に由来する酵素、その調製および使用、ユリーバ（Ｙｕｒｉｅｖａ）Ｏ．ら、Ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，国際公開第９８／４５４５２号；新規好熱性ポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、マックヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ）Ｃ．、ＥＮＺＹＣＯ  Ｉｎｃ．、国際公開第９９／１３０６０号）。
【００１１】
本発明の目的は、好ましくは同時にｄＵＴＰを取り込むことができる高忠実度ＰＣＲ系を開発することであった。本発明によれば、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素が提供され、この酵素は、ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素に加えられた場合に増幅の忠実度を増強する。提供される酵素は、ＤＮＡ合成プロセスの間にミスマッチしたプライマー末端を切り出し、ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素を再会合させ、伸長を再開させることを可能にしうる。本発明の酵素は、プルーフリーディング酵素としてポリメラーゼ活性を示す第２の酵素と協力しうる。当該課題に適することが見出された酵素は、例えば、熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩである。３’から５’方向に働き、５’のリン酸を切断し、３’ヒドロキシル基を保存し、理想的には２本鎖ＤＮＡのみで働くエキソヌクレアーゼＩＩＩが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ機能は、２本鎖および単鎖ＤＮＡにおいて有効である。後者の活性は、ＰＣＲアッセイにおいて所望されないプライマー分解を導き得る。上記酵素は、７０℃〜８０℃で活性であり、変性サイクルを乗り越えるのに十分に活性であり、ＰＣＲプロセスの完了後に未分解のＰＣＲ産物を保存するための低温では不活性であることが好ましい。これらの特徴を示す酵素は、好熱性真正細菌に由来するか、または好熱性古細菌（ａｒｃｈａｅａ）由来の酵素に関連しうる。３つの熱安定古細菌のゲノムが配列決定されている。メタノコッカス・ヤナシィ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）［メタン生成古細菌、メタノコッカス・ヤナシィの完全なゲノム配列、ブルト（Ｂｕｌｔ）Ｃ．Ｊ．ら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：１０５８−１０７２）、メタノバクテリウム・サーモオートトロヒクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）［メタノバクテリウム・サーモオートトロヒクムΔＨの完全なゲノム配列：機能的解析および比較ゲノミクス、スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｒ．ら、Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１７９：７１３５−７１５５］およびアーケオグロブス・フルギダス（超好熱性、硫酸還元古細菌アーケオグロブス・フルギダスの完全なゲノム配列、クレング（Ｋｌｅｎｋ）Ｈ．−Ｐ．ら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：３６４−３７０］。
【００１２】
詳細には、２本鎖ＤＮＡにおいて３’から５’方向にプライマーまたはポリヌクレオチドのミスマッチした末端の分解を触媒する、アーケオグロブス・フルギダスから得られうる熱安定酵素が提供される。アーケオグロブス・フルギダス  （Ａｆｕ）から得られうる熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子を、クローン化し、大腸菌において発現させ、単離した。上記酵素は、ＰＣＲ反応に使用されるインキュベーションおよび温度条件下で活性である。上記酵素は、良好な収率で反応混合物に存在するｄＵＴＰを伴うか、伴うことなく、低エラー率のＤＮＡ合成およびゲノムＤＮＡにおける３ｋｂよりも大きな産物（Ｔａｑポリメラーゼにより合成される産物の上方の範囲）の合成を行うことにおいてＴａｑのようなＤＮＡポリメラーゼを支持する。好ましくは、２，５ＵのＴａｑポリメラーゼ当たり５０〜５００ｎｇのＡｆｕから得られうるエキソヌクレアーゼＩＩＩを、至適なＰＣＲパフォーマンスを得るために使用した。より好ましくは、ＰＣＲ反応中の２，５ＵのＴａｑポリメラーゼ当たり６７ｎｇ〜３８０ｎｇのＡｆｕから入手可能であるエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用である。
【００１３】
従って、本発明の酵素は、プルーフリーディング酵素としてＴａｑポリメラーゼと協力しうる。他の酵素と比較した本発明の酵素の使用の利点は、本発明の酵素が、２本鎖ＤＮＡにおいて好適に活性であることである。本発明の熱安定酵素は、かかる酵素が必要または所望されるいかなる目的のためにも使用され得る。特に好ましい態様において、上記酵素は、成熟前の停止を導くミスマッチしたプライマー末端を除去するため、ポリメラーゼによりさらに効率的に伸長されるプライマー末端を提供するため、塩基取り込みエラーを校正するため、ポリメラーゼが長いＰＣＲ産物を産生することを可能にするために、ＰＣＲとして知られる核酸増幅反応において熱安定ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用される。
【００１４】
さらに、本発明の主題は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を示す第２の酵素を含有する組成物に関し、ここで、増幅プロセスの忠実度は、第２の酵素単独の使用と比較してこの組成物の使用により増強される。また、本発明の３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の減少を示すか、またはかかる活性を全く示さない適切な酵素を含む。本発明においてＤＮＡポリメラーゼ活性の減少とは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す酵素の該活性の５０％よりも少ないことを意味する。好ましい態様において、本発明の組成物の第２の酵素は、プルーフリーディング活性を欠失している。特に好ましくは、第２の酵素は、Ｔａｑポリメラーゼである。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を示す第２の酵素を含有する混合物を用いるＤＮＡの合成方法である。この方法によれば、成熟前に終結した鎖が、３’から５’の分解によりトリミングされる。プライマーまたは成長する鎖のいずれかのミスマッチした末端がこの方法により除去される。
【００１６】
本発明は、ｄＵＴＰが反応混合物中に存在し、部分的または完全にＴＴＰを置換する上記の方法をさらに含む。本方法により、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧまたはＵＮＧ）が、混入する核酸の分解のために使用されることが好ましい。
【００１７】
好ましくは、本方法によると、
−３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素と
−ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素と
の混合物は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下でポリメラーゼ活性を示す第２の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより低いエラー率を有するＰＣＲ産物を産生する。本方法において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素とポリメラーゼ活性を示す第２の酵素との混合物が、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下でポリメラーゼ活性を示す第２の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより長いＰＣＲ産物を産生する。さらに、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素は、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩＩＩに関連するが、本方法により熱安定である。上記方法のさらなる態様は、平滑末端を有するＰＣＲ産物が得られる方法である。
【００１８】
本発明の主題はまた、３’エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない本発明の熱安定酵素を得る方法およびこの酵素を産生するための手段および材料、例えば、ベクターおよび宿主細胞（例えば、ＤＳＭ番号１３０２１）である。
【００１９】
以下の実施例は、説明するために提供され、限定することを意図しない。
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
【００２１】
実施例Ｉ
コード配列の単離
本明細書の好ましい熱安定酵素は、アーケオグロブス・フルギダス  ＶＣ−１６株（ＤＳＭ  Ｎｏ．４３０４）から得られうる高度熱安定エキソデオキシリボヌクレアーゼである。該株をイタリア、ナポリ（Ｎａｐｌｅｓ、Ｉｔａｌｙ）のヴルカーノ島（Ｖｕｌｃａｎｏ  Ｉｓｌａｎｄ）およびストゥーフェ・ディ・ネローネ（Ｓｔｕｆｅ  ｄｉ  Ｎｅｒｏｎｅ）の海底熱水系から単離した〔ステッター（Ｓｔｅｔｔｅｒ），Ｋ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：８２２−８２４〕。この生物は、最適条件８３℃で６０℃〜９５℃の増殖範囲を有する高度好熱性硫黄代謝古細菌である。〔クレンク（Ｋｌｅｎｋ），Ｈ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：３６４−３７０〕。ゲノム配列はＴＩＧＲデータベースに寄託されている。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｘｔｈＡ) をコードすると推定される遺伝子は、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０５８０を有する。
【００２２】
既知の分子量のタンパク質標準と比較した場合、アーケオグロブス・フルギダスから得られうるエキソデオキシリボヌクレアーゼの見かけの分子量は、約３２，０００ダルトンである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) 。本発明の熱安定酵素の正確な分子量は、アーケオグロブス・フルギダス  エキソデオキシリボヌクレアーゼＩＩＩ遺伝子のコード配列から決定され得る。
【００２３】
実施例ＩＩ
アーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子のクローニング
所望の発現ベクターの多クローニング部位に適合性があり、アーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩ遺伝子のＮおよびＣ末端に相補的な制限部位を有する以下のプライマーを設計した：
配列番号：１
Ｎ末端（ＢａｍＨＩ部位）：  5'-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C-3'
配列番号：２
Ｃ末端（ＰｓｔＩ部位）： 5'-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3'
【００２４】
最初に、１つの２ｍｌエッペンドルフキャップで５，０００ｒｐｍで遠心分離を繰り返すことにより細胞を集めた。ＤＮＡ単離は、細菌細胞からの単離について記載されたいずれの方法で行なってもよい。今回は、Ｈｉｇｈ  ＰｕｒｅTM  ＰＣＲテンプレート調製キット（ロシュ  ディアグノスティクス（ＲＯＣＨＥ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７９６８２８）で、アーケオグロブス・フルギダスゲノムＤＮＡを調製した。この方法で、染色体ＤＮＡ約６μｇを７２ｎｇ／μｌの濃度で得た。
【００２５】
ＥｘｐａｎｄTM  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（ロシュ  ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７３２６４１）中で、４つの同一の調製でキャップ当たり１００ｎｇのアーケオグロブス・フルギダスゲノムＤＮＡで、上記プライマーを用いてＰＣＲを行なった。下記の条件で、ＰＣＲを行なった：
１  ×  ９４℃、２分；
１０×  ９４℃、１０秒；５４℃、３０秒；６８℃、３分；
２０×  ９４℃、１０秒；５４℃、３０秒；６８℃、３分、各サイクルにつき２０秒サイクル延長を伴う；
１  ×  ６８℃、７分；
終濃度１０ｍＭまでＭｇＣｌ2 を添加した後、各１０ユニットのＢａｍＨＩおよびＰｓｔ  ＩでＰＣＲ産物を２時間３７℃で切断した。低融解アガロースゲルで反応生成物を分離した。電気泳動後、適切なバンドを切り出して、ゲルスライスをあわせ、溶解し、ＤＮＡフラグメントをアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）消化により単離し、ＥｔＯＨで沈澱させた。乾燥ペレットを３０μｌのＨ2 Ｏで希釈した。
【００２６】
適切な発現ベクター、本明細書ではｐＤＳ５６ Ｔを、挿入に使用するように同一の制限酵素で消化して、同一の方法で洗浄した。
【００２７】
Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ  ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１６３５３７９）での挿入物とベクターのライゲーション後、プラスミドを発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ３９２  ｐＵＢＳ５２０で形質転換した〔ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）Ｕ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ８５：１０９−１１４〕。
【００２８】
Ｈｉｇｈ  ＰｕｒｅTMプラスミド単離キット（ロシュ    ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７５４７７７）を用いて形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩでの制限消化およびアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。
【００２９】
−７０℃のグリセロール培養で、陽性Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＵＢＳ５２０  ＥｘｏＩＩＩ形質転換体を保存した。ＤＮＡ配列決定で、エキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子の配列を確認した。それを図１に示す。
【００３０】
アーケオグロブス・フルギダスまたは他の好熱性生物由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩのクローニングおよび発現は、当該分野における従来技術を用いる他の技術によって行なってもよい（例えば、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂ．、１９８９を参照のこと）。
【００３１】
実施例ＩＩＩ
組換えＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの発現
実施例Ｉからの形質転換体を、適切な抗生物質を含むリッチ培地で発酵槽中で培養した。細胞を光学密度〔Ａ540 〕５．５で遠心分離により収集し、必要となるまで凍らせるか、またはリゾチームでの処理により溶解してアーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性を含む粗細胞抽出物を作製した。
【００３２】
アーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性を含む粗抽出物を、実施例ＩＶに記載された方法もしくはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の他の精製技術により精製する。
【００３３】
実施例ＩＶ
組換えＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの精製
１０ｌの発酵槽でトリプトン（２０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１０ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／ｌ）およびアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含む培地で、実施例ＩからのＥ．ｃｏｌｉ  ｐＵＢＳ５２０  ＥｘｏＩＩＩ（ＤＳＭ  Ｎｏ．１３０２１）を３７℃で増殖し、ＩＰＴＧ（０．３ｍＭ）で指数増殖期の中間に誘導し、さらに４時間インキュベートした。遠心分離により細胞約４５ｇを収集し、−７０℃で保存した。細胞２ｇを溶解し、４ｍｌの緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ）で懸濁した。リゾチーム１．２ｍｇを添加して４℃で３０分間、デオキシコール酸ナトリウム４．５６ｍｇを添加して室温で１０分間次いで０℃で２０分間の攪拌下で、細胞を溶解した。粗抽出物を７５０ｍＭ  ＫＣｌに調整し、７２℃で１５分間加熱し、変性タンパク質の除去のために遠心分離した。
【００３４】
９０℃までの温度の加熱はまた、アーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩを破壊（変性）することなく可能である。１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 に調整した緩衝液Ｂ（１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ）に対して上清を透析し、緩衝液Ｂで平衡化した寸法１×７ｃｍおよび５．５ｍｌベッド容積を有するＢｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍカラム（ＳＥＲＶＡ、Ｎｏ．６７０３１）に供した。１６．５ｍｌの緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、緩衝液Ｂ中に０〜３Ｍ  ＮａＣｌの８２ｍｌリニアグラジエントでエキソヌクレアーゼタンパク質を溶出した。１０〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルの電気泳動によるアーケオグロブス・フルギダス  エキソデオキシリボヌクレアーゼタンパク質に対するカラム画分をアッセイした。１６．５ｍｌの活性な画分をプールし、Ａｑｕａｃｉｄｅ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｏ．１７８５１）で濃縮し、保存緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９；１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  ＫＣｌ；５０％グリセロール）に対して透析した。透析後、ＴｈｅｓｉｔおよびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を、それぞれ終濃度０．５％となるように添加した。この調製物を−２０℃で保存した。
【００３５】
得られたアーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩは、ＳＤＳゲル電気泳動による見積もりで９５％の純度であった。収量は、２．３ｇ細胞質量当たりタンパク質５０ｍｇであった（湿重量）。
【００３６】
実施例Ｖ
アーケオグロブス・フルギダス由来の組換えエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱安定性
熱変性に対する耐性を解析することによって、実施例ＩＩに記載のクローン化されたアーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱安定性を測定した。実施例ＩＶに記載の溶解後、エッペンドルフ遠心分離機で１０分間１５，０００ｒｐｍで粗抽出物１００μｌを遠心分離した。５つの新しいエッペンドルフキャップに上清をアリコートした。５つの異なる温度、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃で１０分間、キャップをインキュベートした。上記の遠心分離後、１０〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルでの電気泳動により上清のアリコートを解析した。図２に示されるように、９０℃でのインキュベーション後のアーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩタンパク質の量は、より低温で処理されたサンプルの量と同じであった。熱変性により検出可能な有意な損失はなかった。この結果から、半減期が９０℃で１０分間より長いと結論できる。
【００３７】
実施例ＶＩ
ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの活性
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二重鎖ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端からモノヌクレオチドの段階除去を触媒する〔ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）Ｇ．Ｓ．およびヴァイス（Ｗｅｉｓｓ）  Ｂ．（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：２０１−２１１）。限定数のヌクレオチドを、各結合事象の間に除去する。好ましい基質は、平滑または陥凹３’末端である。酵素は一本鎖ＤＮＡ上では活性ではなく、３’突出末端は、開裂に対してより耐性がある。ＤＮＡ分子量マーカーＩＶ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ、Ｎｏ．１０６２５９０）は、ＨｉｎｆＩ消化したｐＢＲ３２８と混合したＢｇｌＩ消化したｐＢＲ３２８からなる。ＨｉｎｆＩ消化の産物は、３’陥凹末端を有し、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる分解に好ましい基質であると予期され、ＢｇｌＩ開裂の産物は、３塩基突出部分を伴う３’突出末端を有し、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる開裂に対してより耐性がある。
【００３８】
２５μｌの以下のインキュベーション緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ；１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で、パラフィンで覆って、ＤＮＡ分子量マーカーＩＶ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ、Ｎｏ．１０６２５９０）０．５μｇと共に、実施例ＩＶからのアーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩの連続希釈物を７２℃で２時間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ、Ｎｏ．７７９７０９）１０ユニットを対照として含ませた。対照反応を３７℃で行なった。５μｌの停止溶液（０．２％アガロース、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を添加後、混合物を１％アガロースゲルで分離した。結果を図３に示す。ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩは２つの異なる型の基質を識別する。好ましい基質は、３’陥凹末端を有するフラグメント（例えば、１７６６ｂｐフラグメント）であり、３’突出末端（例えば、２１７６ｂｐ、１２３０ｂｐ、１０３３ｂｐフラグメント）は、分解に対してより耐性である。より多い量のタンパク質で、レーン１と同程度に基質を分解し、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩＩＩの産物を解析した。Ａｆｕエキソヌクレアーゼタンパク質の量を増加させることによりＤＮＡ基質はほとんど残らず（レーン１５〜１９）、残りのフラグメントの妨害は調製物中の不純物としてのＤＮＡ結合タンパク質のためであり得る。
【００３９】
実施例ＶＩＩ
ＰＣＲにおけるＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでのミスマッチプライマー補正
ＰＣＲにおけるＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ／Ｔａｑポリメラーゼ混合物の修復効率を、３’末端のミスマッチプライマーを用いて試験した。アッセイの原理を図４に示す。ＰＣＲのために、フォワードプライマーがテンプレートＤＮＡと塩基対形成できない１つまたは２つのヌクレオチドを３’末端に有するプライマーの増幅セットを使用する。ミスマッチプライマー末端の切り出しおよび修復されたプライマーの増幅は、その後制限エンドヌクレアーゼＢｓｉＥＩで切断し得る産物を生じ、一方、ミスマッチプライマーから生じる産物は、切断に対して耐性を有する。
【００４０】
使用したプライマー配列：
１．リバース： 5'- GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG - 3'（配列番号：３）
２．フォワード１（ｇ：ａミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCA - 3' （配列番号：４）
３．フォワード２（ｇ：ｔミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCT - 3' （配列番号：５）
４．フォワード３（ｇ：ｃミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCC - 3' （配列番号：６）
５．フォワード４（２塩基ミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TAT - 3' （配列番号：７）
【００４１】
２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ  ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１４３５０９４）、実施例ＩＶからのアーケオグロブス・フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩを０．２５μｇ、バクテリオファージλ由来のＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー０．４μＭ、２００μＭ  ｄＮＴＰ’、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、１６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲを５０μｌのＰＣＲ容積で、以下の条件で行なった：
１  ×  ９４℃、２分；
４０×  ９４℃、１０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分；
１  ×  ７２℃、７分；
エキソヌクレアーゼ／Ｔａｑポリメラーゼ混合物の機能を、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．３ユニットのＴｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ  ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ）の対照および０．７５μｌのＥｘｐａｎｄTM  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（ロシュ  ディアグノスティクス  ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７３２６４１）と比較した。ＢｓｉＥＩでのＰＣＲ産物の十分な消化により示されるように、Ａ．フルギダス  エキソヌクレアーゼＩＩＩは、記載された全てのミスマッチ補正活性を９０〜１００％の効率で示した（図５）。予期されるようにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは補正活性を示さなかったが、一方、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼは同様に完全に補正した。ＥｘｐａｎｄTM  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステムは、２塩基ミスマッチでのみ１００％補正活性を示した。他のミスマッチを約５０％の効率で修復した。
【００４２】
実施例VIII
PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合物の忠実度
PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合物の忠実度は、機能的なlac Iqq アレレを含むpUC19 誘導体pUCIQ17 の増幅、環化および形質転換に基づくアッセイで決定された (フレイ(Frey, B.)およびサップマン(Suppmann B.) (1995) Biochemica 2 ：34-35)。lac I におけるPCR で得られた変異は、lacZαの発現の脱抑制と続くX-gal 呈示プレート上の容易に検出されうる機能的βガラクトシダーゼ酵素の形成をもたらす。本lac I に基づくPCR 忠実度アッセイで決定されたTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物のエラー率は、Taq DNA ポリメラーゼおよびExpand HiFi PCR システム (ロシュモレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)) ならびに対照としてPwo DNA ポリメラーゼ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ) と比較して決定された。
【００４３】
プラスミドpUCIQ17 は、試験される酵素によるPCR 増幅の基質として働くように、DraII による消化によって直鎖状にした。
【００４４】
使用される両プライマーは、5'末端にClaI部位を有する：
配列番号：８
プライマー１： 5'-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3'
配列番号：９
プライマー２： 5'-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3'
得られるPCR 産物の長さは、3493bpである。
前記PCR を、最終容量50μl の1.5mM MgCl2 、50mMトリス-HCl、pH8.5 (25 ℃) 、12.5mM（NH4)2SO4、35mM KCl、200 μM dNTPs 、および2.5 単位のTaq ポリメラーゼとそれぞれ125ng 、175ng 、250ng 、375ng および500ng のAfu エキソヌクレアーゼIII の存在下に行なった。
【００４５】
サイクル条件は、次の通りであった：
0003655240.tif 000002
PCR の後、PCR 産物を、PEG-沈澱 (バーンズ（Barnes, W. M.) (1992) Gene 112：229)し、DNA を、ClaIで制限(restricted)し、アガロースゲル電気泳動によりて精製した。単離されたDNA を、Rapid DNA Ligation Kit（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ) を用いて連結し、ライゲーション産物を、E.coli DH5αに形質転換し、TN Amp X-Galプレートにプレーティングした。得られたプラスミドpUCIQ17 (3632bp)で形質転換されたα相補性E.coli DH5α株は、アンピシリン (100 μg/ml) とX-Gal (0.004% w/v)とを含むTNプレート(1.5% バクトトリプトン、1% NaCl 、1.5%寒天）上で、白 (lacI+ ) コロニーを示す。変異は、青コロニーをもたらす。
【００４６】
37℃で一晩培養後、青コロニーと白コロニーをカウントした。キョハボン(Keohavong) およびツィリー(Thilly)(Keohavong, P.およびThilly, W. (1989) PNAS USA 86:9253) により刊行された再配列式(rearranged equation) ：
f=-lnF/d × b bp
( 式中、F は、白コロニーの分数であり：
F= 白 (lacI+ ) コロニー/ 全体のコロニー数；
d は、DNA 複製の数であり：
2d アウトプットDNA/インプットDNA ；
およびb は、lacI遺伝子(1080bp)の有効標的サイズであり、ここで、該有効標的サイズは、プロボスト(Provost) ら(Provostら（1993） Mut. Res. 288:133) によれば349bp である)
により、bpあたりのエラー率(f) を計算した。
【００４７】
図6Aと図6Bに示される結果は、反応混合物中における熱安定性エキソヌクレアーゼIII の存在がより低いエラー率をもたらすことを説明する。エキソヌクレアーゼに対するポリメラーゼの割合に依存して、エラー率が減少している。最も至適なTaq ポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII 混合物 (4,44×10-6) で達成される忠実度は、Taq/Pwo 混合物（Expand HiFi ；2,06×10-6）の忠実度に類似した範囲である。至適緩衝液条件の評価は、さらに忠実度を改善するであろう。ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼとの間の割合は、至適化されるべきである。多量のエキソヌクレアーゼは、産物収量を減らし、明らかに増幅効率を減少させる（Taq/Exo 1:10は、 2.5単位の Taqポリメラーゼと500ng のAfu エキソヌクレアーゼIII に相当する) 。
【００４８】
本システムの忠実度は、緩衝液成分を変えること、各成分の濃度を至適化することまたはサイクル条件を変えることによって、例えば、当該分野における慣用の技術を用いて、さらに最適化されるかもしれない。
【００４９】
実施例IX：
PCR におけるAfu エキソヌクレアーゼIII の存在下でのdUTPの取り込み
dUTPにより完全に置換されるTTP を用いたDNA 合成について、Afu エキソヌクレアーゼ/Taqポリメラーゼ混合物を試験した。TTP またはdUTP取り込みの各々の比較は、β- グロビン遺伝子を標的として用い、鋳型としての未変性ヒトゲノムＤＮＡについて、0.125 μg 、0.25μg 、0.375 μg および0.5 μg の実施例IVのアーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)エキソヌクレアーゼIII の存在下において、2.5 単位のTaq DNA ポリメラーゼを用いるPCR で決定された。以下のプライマーを使用した：
フォワード： 5'-TGG TTG AAT TCA TAT ATC TTA GAG GGA GGG C-3'
（配列番号：１０）
リバース：   5'-TGT GTC TGC AGA AAA CAT CAA GGG TCC CAT A-3'
(配列番号：１１）
【００５０】
PCR は、以下のサイクル条件：
1x  2 分, 94℃；
40x 10秒, 94℃； 30 秒, 60℃； 1分, 72℃；
1x  7 分, 72℃；
で50μl 容量で行なわれた。
【００５１】
PCR 反応物のアリコートは、アガロースゲルの上で分離された。図７に示されるように、本鋳型/ プライマー系により、dUTPの存在下におけるDNA 合成は、375ng までのAfu エキソヌクレアーゼIII で可能である。 dUTP 取り込みは、環境温度における30分間、PCR 反応産物のアリコートをウラシルDNA グリコシラーゼ処理（ROCHE Diagnostics 社（No.1775367））することおよび、続く95℃5 分のインキュベーションによる、断片の完全な分解に至るポリヌクレオチドのアプリン部位での切断により、さらに証明されうる。アガロースゲル電気泳動による反応産物の解析は、図８に示される。
【００５２】
実施例X ：
PCR 産物の長さにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII の影響
Taq ポリメラーゼは、ゲノムの鋳型において、3kb 長までのPCR 産物を合成しうる。より長い産物の合成についてのTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物の能力を推定するために、前記酵素混合物をヒトゲノムDNA を鋳型とし、9.3kb 、12kbおよび15kp長の産物を増幅するようにデザインされた3 対のプライマー対を用いて解析した。使用された緩衝液系は、Expand Long Template PCRシステム由来のものであった（Roche Molecular Biochemicals Cat. No 1 681 834）。反応は、表１も概説される条件で、250ng のヒトゲノムＤＮＡ、220ng の各プライマー、350 μM のdNTPs ならびに2.5 単位のTaq ポリメラーゼおよび62,5ngのAfu エキソヌクレアーゼの50μl 容量で行なわれた：
【００５３】
【表１】
0003655240.tif 000003
【００５４】
使用されたtPA 遺伝子の増幅のための特異的なプライマー：
プライマー7a  フォワード： 5'-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3'  （配列番号：１２）
プライマー14a リバース： 5'-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C −3'  （配列番号：１３）
プライマー1 フォワード： 5'-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TCC C-3'  （配列番号：１４）
プライマー2 リバース： 5'-ACT GTG CTT CCT GAC CCA TGG CAG AAG CGC CTT C-3'  （配列番号：１５）
プライマー3 リバース： 5'-CCT TCT AGA GTC AAC TCT AGA TGT GGA CTT AGA G −3'  （配列番号：１６）
【００５５】
図９に示されるように、Taq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物により、少なくとも15kb長の産物を合成することができる。
【００５６】
実施例XI
熱安定エキソヌクレアーゼIII は、ポリメラーゼ活性が減少したが、3 ´エキソヌクレアーゼ- 活性が増加したポリメラーゼ変異体によって置換されうる
国際公開第97/35988号パンフレットまたはGene（1997）204 （1-2 ）、153-8 においてニーハウス(Niehaus F.)、フレイ(Frey B.) およびアントラニキャン(Antranikian G.)に記載された、チロシンがアスパラギンに置換された385 位のアミノ酸置換を有するサーモコッカス  アグレガンス(Thermococcuss aggregans)(Tag)由来のDNA ポリメラーゼ（刊行物と欧州特許出願第00105 155.6 号明細書としてベールケ（Boehlke)らが提出した）は、野生型DNA ポリメラーゼのわずか6.4%のポリメラーゼ活性であるが、205%のエキソヌクレアーゼ活性を示す。本酵素が、発明がエキソヌクレアーゼIII 型酵素に限定されるものではなく、3'エキソヌクレアーゼ活性に寄与する他の型の酵素を含むことを証明するために使われた。
【００５７】
反応1-4 に使用されるサイクルプログラム：
1x  94℃, 2 分
10x 94℃, 10秒
62℃, 30秒
68℃, 4 分
20x 94℃, 10秒
62℃, 30秒
68℃, 4 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長
1x  68℃, 7 分
反応5-8 ：
1x  94℃, 2 分
10x 94℃, 10秒
65℃, 30秒
68℃, 8 分
20x 94℃, 10秒
65℃, 30秒
68℃, 8 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長
1x  68℃, 7 分
【００５８】
PCR産物を、エチジウムブロマイド含有1%アガロースゲルで解析した（図10）。データは、Taq ポリメラーゼが4.8kb の断片を増幅できるが、低い収量であることを示す。Taq ポリメラーゼとTag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との組み合わせは、産物収量の強い増加をもたらす。Tag ポリメラーゼ変異酵素それ自体では、本産物を合成できない。
類似した結果が、9.3kb 系で得られた。Taq ポリメラーゼだけを用いると、産物が検出できない。Tag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との組み合わせにより、期待されるPCR 産物が、高収率で得られる。
【００５９】
これらの結果は、Taq ポリメラーゼが、ゲノムＤＮＡ由来の数kbのＤＮＡ断片を増幅できず、PCR 増幅の長さの限界がミスマッチ塩基対の取り込みの部位における低い効率の伸長に起因するバーンズの仮説 (バーンズ(Barnes, W. M.)(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：2216-2220)を支持することを示す。プライマー末端でのミスマッチヌクレオチドの除去の後、Taq ポリメラーゼは、DNA 合成を再び行ないうる。全長産物としての完全な核酸鎖は、ついで、つづくサイクルにおけるプライマー結合のために鋳型として働きうる。
【００６０】
実施例XII
Afu Exo III は、直鎖状一本鎖DNA 上で作用しない
270ng のAfu Exo III 、5 μg の49mer オリゴヌクレオチドを含み、MgCl2 を有するExpand HiFi PCR 緩衝液50μl 容量で、反応を行ない、65℃で0 、1 、2 、3 、4 および5 時間インキュベートした。10μl のプロテイナーゼK 溶液（20mg/ml ）の添加後、試料を37℃で20分インキュベートした。反応生成物を、エチジウムブロミド含有3.5%アガロースゲル上で解析した。
【００６１】
結果を、図11に示す。全てのレーンにおいて、核酸が、同じサイズを有することがわかる。Afu Exo III とともに5 時間までインキュベーション後に得られた産物（レーン6 ）は、対照（レーン1 、7 および8 ）と同じサイズを有する。全長オリゴヌクレオチドまたは分解産物由来のスミアのいずれの強度の有意な減少も、観察できない。
【００６２】
実施例XIII
プライマー分解活性での熱安定B-型ポリメラーゼによるAfu エキソヌクレアーゼIII の比較
熱安定B-型ポリメラーゼが一本鎖および二本鎖ヌクレアーゼ活性 (コング (Kong H.)ら、(1993) Journal Biol. Chem. 268：1965-1975 ）を有することが報告される。この活性は、鋳型または一本鎖にハイブリダイズするかどうかかかわらないプライマー分子を分解することができる。反応混合物における熱安定B-型ポリメラーゼの熱安定エキソヌクレアーゼへの置換は、反応混合物における一本鎖プライマーまたは存在する他の核酸の安定に関して有利であるかもしれない。
【００６３】
プライマー分解活性を試験するために、鋳型ＤＮＡのない反応混合物を72℃で1 時間インキュベートし、ついで、DNA を添加し、PCR を行なった。結果を、熱安定B-型ポリメラーゼ (アンゲラー（Angerer B.) ら、国際公開第98/14590パンフレット）の例としてTgo ポリメラーゼ含有反応物と比較した。対照として、同じ混合物を、インキュベーション前以外に使用した。結果を、表2 にまとめる。
【００６４】
【表２】
0003655240.tif 000004
【００６５】
増幅のための標的として、p53 遺伝子の断片を選び、プライマー： p53I 5 '-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3 ' （配列番号： 18 ）およびp53II 5'-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3 '（配列番号： 19 ）を使用した。PCR 反応を、50μl の容量で行なった。
反応番号 1〜10は、200ng のヒトゲノムDNA 、40pmole の各プライマー、10mM Tris-HCl 、pH 8.5、17.5mM（NH4)2SO4、1.25mM MgCl2、0.5% Tween、2.5% DMSO 、250 μg/ml BSAおよび1 単位のTgo ポリメラーゼ（反応番号1 、3 、5 、7 および9 ）または1.5 単位のTgo ポリメラーゼ（反応番号2 、4 、6 、8 および10）および200 μM dNTPs を含んだ。
反応番号11〜16は、2.5 単位Taq ポリメラーゼ、Mg++を含むExpand HiFi 緩衝液、40pmole のプライマー、200 μM dNTPs 、100ng ヒトゲノムDNA を含んだ。反応番号12および15は、37.5ngのAfu Exo III を含み、反応番号13および16は、75ngのAfu Exo III を含んだ。
【００６６】
表2 に記載されるように、反応1 、2 、5 、6 および11〜13を、鋳型ＤＮＡの非存在下に、72℃で1 時間インキュベートした。PCR を開始する前に、鋳型ＤＮＡを添加した。反応5 、6 、9 および10を、ヌクレオチドの非存在下にプレインキュベートし、反応9 および10に、プレインキュベーションステップ後、さらに40pmole のプライマーを補った。Taq ポリメラーゼの5'- エキソヌクレアーゼ活性のため、プレインキュベーション後、酵素を反応11〜13に添加した。
【００６７】
PCR 条件：
1x  94℃, 2 分
35x 94℃, 10秒
55℃, 30秒
72℃, 4 分
1x  72℃, 10分
【００６８】
反応生成物を、アガロースゲル上で解析し、エチジウムブロマイドで染色した（図12）。
【００６９】
鋳型ＤＮＡの非存在下に、Tgo ポリメラーゼを、プライマーとともにインキュベート (反応1 、2 、5 および6)し、プレインキュベーションなしの対応の反応(3、4 、7 および8)と比較した場合、明らかな違いが観察された。プレインキュベーションは、少なくとも1 つの必須成分、恐らく、PCR プライマーに明らかに影響を及ぼす強く減少したPCR 産物をもたらす。プレインキュベーションステップ後の40pmole のPCR プライマーの特別な添加（反応9 および10）は、プレインキュベートされなかった対照反応に匹敵する強度で、強いシグナルをもたらす。これは、dNTPs が存在するかどうかに関係なく、熱安定B-型ポリメラーゼであるTgo ポリメラーゼが、鋳型の非存在下に、PCR プライマーを分解することを示す。
【００７０】
鋳型ＤＮＡおよびTaq ポリメラーゼの添加前に、Afu エキソヌクレアーゼIII とともに、プライマーがプレインキュベートされた反応12および13で得られたPCR 産物は、プレインキュベーションステップを用いない反応15および16で得られたものと同様のバンドを与えた。類似した強いバンド強度から、プライマーの分解がほとんど生じないか、あるいは全く生じず、一本鎖オリゴヌクレオチドがAfu エキソヌクレアーゼIII のための不十分な基質であると結論されるうる。PCR 産物の強いバンド強度または収量の増加から、酵素が増幅プロセスにおける忠実度を促進すると結論されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１：
アーケオグロブス・フルギダスのエキソヌクレアーゼＩＩＩに由来するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列。
【図２】図２：
実施例Ｖに記載される大腸菌において発現されるアーケオグロブス・フルギダスの組換えエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱変性に対する耐性。
レーン１：５０℃でのインキュベーション
レーン２：６０℃でのインキュベーション
レーン３：７０℃でのインキュベーション
レーン４：８０℃でのインキュベーション
レーン５：９０℃でのインキュベーション
レーン６：ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子で形質転換されていない大腸菌宿主細胞抽出物
レーン７：大腸菌のエキソヌクレアーゼ
レーン８：分子量マーカー
【図３】図３：
実施例ＶＩに記載されるＤＮＡフラグメントにおけるＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ活性。
レーン１：１０ユニットの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、３７℃でのインキュベーション
レーン２：５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン３：１００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン４：１５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン５：１００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン６：２００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン７：３００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン８：２５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン９：７５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１０：１μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１１：５００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１２：１μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１３：１．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１４：１．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１５：３μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１６：４．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１７：７．６μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１８：１５．２μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン１９：２２．８μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュベーション
レーン２０：エキソヌクレアーゼ添加せず
【図４】図４：
ミスマッチ補正アッセイの原理。
【図５】図５：
実施例ＶＩＩに記載のＰＣＲにおけるミスマッチしたプライマー補正。
レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＶ（ロシェモルキュラーバイオケミカルズ  （ＲＯＣＨＥ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｎｏ．８２１０５）
レーン２：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン３：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン４：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステムでの増幅
レーン５：レーン４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン６：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン７：レーン６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン８：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼで増幅
レーン９：レーン８と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン１０：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで増幅
レーン１１：レーン１０と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン１２：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステムでの増幅
レーン１３：レーン１２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン１４：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン１５：レーン１４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン１６：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン１７：レーン１６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン１８：ＤＮＡ分子量マーカーＶ
レーン１９：  ＤＮＡ分子量マーカーＶ
レーン２０：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン２１：レーン２０と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン２２：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステムでの増幅
レーン２３：レーン２２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン２４：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン２５：レーン２４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン２６：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン２７：レーン２６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン２８：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
レーン２９：レーン２８と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン３０：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステム
レーン３１：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン３２：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ
レーン３３：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン３４：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン３５：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断した
レーン３６：ＤＮＡ分子量マーカーＶ
【図６Ａ】図６Ａ：
ＰＣＲにおける種々のポリメラーゼのエラー比率。
【図６Ｂ】図６Ｂ：
実施例ＶＩＩＩに記載のＰＣＲ混合物中に存在するＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩによる忠実度の改善。
青色：白色コロニーの比率を、ブロットし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの種々の混合物（１２５ｎｇ、１７５ｎｇ、２５０ｎｇ、３７５ｎｇおよび５００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、それぞれと混合した２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼに相当する、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：３０、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：２０、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：１５、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：１２，５、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：１０）を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステム（ＨｉＦｉ）およびＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏ）と比較して試験した。
【図７】図７：
実施例ＩＸに記載されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ混合物によるｄＵＴＰの取り込み。
レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ  Ｎｏ．１７２１９３３）
レーン２：２．５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでの増幅
レーン３：２．５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン４：２．５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび２５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン５：２．５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび３７５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
レーン６：２．５ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび５００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅
【図８】図８：
実施例ＩＸに記載されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼによるＰＣＲ産物を含むｄＵＴＰの分解。
レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ  Ｎｏ．１７２１９３３）
レーン２：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた１μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理。
レーン３：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた２μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理。
レーン４：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた３μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理。
レーン５：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた４μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理。
レーン６：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理。
レーン７：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物、その後ＵＮＧなし熱処理なし。
レーン８：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物、その後ＵＮＧなし熱処理あり。
レーン９：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ  Ｎｏ．１７２１９３３）
【図９】図９：
ＰＣＲ産物の長さに対するＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの効果。実施例Ｘに記載されるようにヒトゲノムＤＮＡに関してＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ／ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ混合物を解析した。
レーン１：Ｔａｑ／Ｅｘｏ  ＩＩＩ混合物と９，３ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
レーン２：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と９，３ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
レーン３：Ｔａｑ／Ｅｘｏ  ＩＩＩ混合物と１２ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
レーン４：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と１２ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
レーン５：Ｔａｑ／Ｅｘｏ  ＩＩＩ混合物と１５ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
レーン６：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と１５ｋｂ  ｔＰＡフラグメント
【図１０】図１０：
実施例ＸＩに記載されるように、減少したポリメラーゼ活性を有するが、増大した３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体により、熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩを置換できる。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：反応１、Ｔａｑポリメラーゼ、４．８ｋｂフラグメント
レーン３：反応２、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ｔａｇポリメラーゼ変異体、４．８ｋｂフラグメント
レーン４：反応３、Ｔａｑポリメラーゼなし、Ｔａｇポリメラーゼ変異体、４．８ｋｂフラグメント
レーン５：反応４、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ａｆｕ  ＥｘｏＩＩＩ、４．８ｋｂフラグメント
レーン６：反応５、Ｔａｑポリメラーゼ、９．３ｋｂフラグメント
レーン７：反応６、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ｔａｇポリメラーゼ変異体、９．３ｋｂフラグメント
レーン８：反応７、Ｔａｑポリメラーゼなし、Ｔａｇポリメラーゼ変異体、９．３ｋｂフラグメント
レーン９：反応８、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ａｆｕ  ＥｘｏＩＩＩ、９．３ｋｂフラグメント
レーン１０：分子量マーカー
【図１１】図１１：
実施例ＸＩＩに記載されるように、ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩは線状一本鎖ＤＮＡ上では活性でない。
レーン１：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、インキュベーョンなし
レーン２：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、６５℃で１時間
レーン３：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、６５℃で２時間
レーン４：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、６５℃で３時間
レーン５：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、６５℃で４時間
レーン６：：Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、６５℃で５時間
レーン７：酵素なしの反応緩衝液、インキュベーションなし
レーン８：酵素なしの反応緩衝液、６５℃で５時間
レーン９：分子量マーカー
【図１２】図１２：
実施例ＸＩＩＩに記載されるプライマー分解活性でのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱安定Ｂ型ポリメラーゼとの比較。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：１ｕ  Ｔｇｏ  プレインキュベート（反応１）
レーン３：１．５ｕ  Ｔｇｏ、プレインキュベート（反応２）
レーン４：１ｕ  Ｔｇｏ、プレインキュベートなし（反応３）
レーン５：１．５ｕ  Ｔｇｏ、プレインキュベートなし（反応４）
レーン６：１ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベート（反応５）
レーン７：１．５ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベート（反応６）
レーン８：１ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベートなし（反応７）
レーン９：１．５ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベートなし（反応８）
レーン１０：１ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下で、追加のプライマーを補足してプレインキュベート（反応９）
レーン１１：１．５ｕ  Ｔｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下で、追加のプライマーを補足してプレインキュベート（反応１０）
レーン１２：Ｔａｑポリメラーゼ、プレインキュベート（反応１１）
レーン１３：Ｔａｑ＋３７，５ｎｇ  Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、プレインキュベート（反応１２）
レーン１４：Ｔａｑ＋７５ｎｇ  Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、プレインキュベート（反応１３）
レーン１５：Ｔａｑポリメラーゼ、プレインキュベートなし（反応１４）
レーン１６：Ｔａｑ＋３７，５ｎｇ  Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、プレインキュベートなし（反応１５）
レーン１７：Ｔａｑ＋７５ｎｇ  Ａｆｕ  Ｅｘｏ  ＩＩＩ、プレインキュベートなし（反応１６）
レーン１８：分子量マーカー
【図１】
0003655240.tif 000005
0003655240.tif 000006
【図２】
0003655240.tif 000007
【図３】
0003655240.tif 000008
【図４】
0003655240.tif 000009
【図５】
0003655240.tif 000010
【図６Ａ】
0003655240.tif 000011
【図６Ｂ】
0003655240.tif 000012
【図７】
0003655240.tif 000013
【図８】
0003655240.tif 000014
【図９】
0003655240.tif 000015
【図１０】
0003655240.tif 000016
【図１１】
0003655240.tif 000017
【図１２】
0003655240.tif 000018