(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示す１番目のメチオニンから693番目のアラニンまでのアミノ酸配列を有するSPA-1蛋白質。
【請求項２】
配列番号：１に示す１番目のメチオニンから693番目のアラニンまでのアミノ酸配列において、該アミノ酸配列における１又は２個以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有する、細胞分裂機構調節蛋白質。
【請求項３】
配列番号：１に示す1200番目のＡ（アデノシン）から3278番目のＣ（シトシン）までの塩基配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされている、細胞分裂機構調節蛋白質。
【請求項４】
配列番号：１に示す１番目のメチオニンから190番目のロイシンまでのアミノ酸配列を有する Span-N 蛋白質。
【請求項５】
配列番号：１に示す191番目のアラニンから327番目のロイシンまでのアミノ酸配列を有する Span-C 蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号：１に示す1200番目のＡ（アデノシン）から3278番目のＣ（シトシン）までの塩基配列を有する、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
遺伝子が cDNA である、請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：２に示す配列中のエクソン１〜４を含んで成るゲノムDNA。
【請求項１２】
配列番号：３に示す配列中のエクソン５〜16を含んで成るゲノムDNA。
【請求項１３】
配列番号：３に示す配列中のオープンリーディングフレームによりコードされているアミノ酸配列をコードするゲノムDNA。
【請求項１４】
配列番号：３に示すオープンリーディングフレームを含んで成るゲノムDNA。
【請求項１５】
配列番号：１又は３中のコード領域の発現により得られるポリペプチド。
【請求項１６】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を含んで成る発現ベクター。
【請求項１７】
請求項16に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法であって、請求項17に記載の宿主細胞を培養し、培養物から当該蛋白質を採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞分裂の調節に関与する蛋白質であるＳＰＡ−１蛋白質及びその断片、それらをコードする遺伝子、並びにそれらの蛋白質に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リンパ系の細胞は、その細胞増殖能において他の多くの体細胞と比べユニークな特性を有している。即ちそれは、他の体細胞同様一定の前駆細胞から多くの細胞分裂を経ながら分化し成熟した細胞となり、一旦静止状態（Ｇ０／Ｇ１）に入る。その後これらが、抗原や特定の増殖因子の刺激を受けると再び細胞周期に入り一定の再分化をとげつつクローナルに増大し、やがてまた静止状態へと戻る（メモリー細胞）。生体の免疫応答においては、リンパ球の特有な機能分化や発現と並んでこの反復性細胞増殖（クローン増幅）が極めて大きな要素を成している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記の反復性細胞増殖の制御に関与すると予想される新規な蛋白質ＳＰＡ−１及びその活性断片、それらをコードする遺伝子、並びにそれらの蛋白質に対する抗体を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、哺乳類の細胞の細胞周期において、静止状態では発現されず細胞周期進入後に核内に発現される細胞分裂機構調節蛋白質に関する。この蛋白質はＳＰＡ−１と称され、図２に示す構造を有する。
ｃＤＮＡの塩基配列から推定されるＳＰＡ−１のアミノ酸配列は、配列番号：１において１位のＭｅｔから始まり、６９３位のＡｌａに終るアミノ酸配列を有する。
【０００５】
しかしながら、本発明のポリペプチド又は蛋白質は、上記のものに限定されず、正確なアミノ酸配列内の小さな変更があっても本発明の活性を有する場合には本発明の範囲に含まれる。このような変更には、配列内のアミノ酸の置き換え、及び１又は複数のアミノ酸の付加と又は欠失が含まれ、そして本発明の活性が維持される限り、これらの変形もまた定義に含まれる。
【０００６】
ここで、アミノ酸の付加、欠失又は置換は出願前周知技術である部位特定変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ６４８７〜６５００，１９８２を参照のこと）により実施することができ、アミノ酸の付加、欠失又は置換に関し、１又は複数のアミノ酸とは、部位特定変異誘発法により付加、欠失又は置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【０００７】
上記のポリペプチド又は蛋白質は、遺伝子工学的方法により、上記のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させることにより製造することができる。上記ポリペプチドをコードする遺伝子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は化学合成ＤＮＡとして得ることができる。
【０００８】
ＳＰＡ−１をコードするｃＤＮＡは、リンパ球の静止期（Ｇ0 ／Ｇ1 期）にはほとんど発現されず、増殖期（Ｓ期）に発現される遺伝子をクローニングすることにより得られる。例えばＧ0 ／Ｇ1 期及びＳ期のリンパ球から、常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これらをハイブリダイズせしめ、Ｓ期に由来するｃＤＮＡとハイブリダイズしないＧ0 ／Ｇ1 期由来のｃＤＮＡを選択することによりＳＰＡ−１をコードするｃＤＮＡが得られる。具体的な方法の１例を実施例１（１）に記載する。
【０００９】
ゲノムＤＮＡを得るには、例えば対象動物からゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、これを、前記のようにして得られたｃＤＮＡ、例えば全長ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングすることにより得られる。この具体的な方法を実施例３に具体的に記載する。例えばＳＰＡ−１をコードするゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの５．７kbp のＢａｍＨＩ断片（Ｓｐａ−ＧＣ２と称する）及び６．６kbp のＢａｍＨＩ断片（Ｓｐａ−ＧＣ９と称する）として得られる。
【００１０】
図５並びに配列番号：２及び３に示すごとく５．７kbp のＤＮＡ断片（Ｓｐａ−ＧＣ２）には４個のエクソン（エクソン１〜４）が含まれており、これらは５．７kbp 断片の３′−末端側の約２．５kbp 部位に存在する。また６．６kbp 断片（Ｓｐａ−ＧＣ９）には１２個のエクソン（エクソン５〜１６）が散在している。これらのエクソン１〜１６が前記のｃＤＮＡの全体を含んでいる。また、ｃＤＮＡのコード領域はエクソン５の後半からエクソン１６の前半に含まれている。
【００１１】
本発明において、ＳＰＡ−１又はその蛋白質断片をコードするＤＮＡを得るには、上記のごときｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをエクソヌクレアーゼにより処理して不要部分を除去するか、あるいは適切な制限酵素により切断した後、必要であれば不足の配列をオリゴヌクレオチドの付加により補い、又は不要部分をエクソヌクレアーゼ等により除去すればよい。また、生来のアミノ酸配列に対して、１〜複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているポリペプチドをコードする遺伝子は、上記のようにして得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、常法に従って、例えば部位特異的変異誘発にかけることにより得られる。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号：１〜３に記載の塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡをも包含する。この様なハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡは、好ましくはＳＰＡ−１又はその蛋白質断片の生物学的機能を保持しているものであり、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ，１０％Ｎａ−デキストラン、２０mM  Ｎａ−ホスフェート（pH６．５）、４２℃のハイブリダイゼーション条件下で前記ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズするものである。
【００１３】
本発明のポリペプチド又は蛋白質は、常法に従って真核細胞又は原核細胞において発現させることができる。真核細胞としては、動物、例えばヒト又は他の動物の塩基細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃｏｓ−１細胞、ＣＨＯ細胞等が用いられ、さらに真核性微生物、例えば酵母又は糸状菌が用いられる。酵母としてはサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等が挙げられ、糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等が挙げられる。原核生物としては細菌が挙げられる。例えばバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばバシルス・ズブチリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等が使用される。
【００１４】
これらの宿主において前記ＤＮＡを発現させるためには、前記コード領域を含むＤＮＡと該ＤＮＡのための発現制御領域を含んで成る発現ベクターを用いる。この発現ベクターにおいて使用する発現制御領域としては、常用のものを用いることができる。例えば、動物細胞での発現のためには、ウイルス性プロモーター、例えばＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いることができ、大腸菌での発現のためにはＴ７プロモーター、ＬａｃＺプロモーター等を用いることができ、また酵母用プロモーターとして、例えばα−接合因子プロモーターが用いられる。
【００１５】
本発明のポリペプチド又は蛋白質は、前記の発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培養物から目的ポリペプチドを採取することにより得られる。発現ベクターによる宿主の形質転換は、宿主の種類に応じて常法に従って行うことができる。形質転換された宿主の培養も常法に従って行うことができる。
培養物から目的とするポリペプチドを回収、精製するには、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、濃縮、凍結乾燥等、蛋白質の精製に用いられる常法により行うことができる。
【００１６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に記載する。
実施例１．  ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡのクローニング及び特性決定
（１）ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡのクローニング
本発明においてはまず、リンパ球の静止期（Ｇ0 ／Ｇ1 期）においてはほとんど発現されず増殖期（Ｓ期）において発現され遺伝子をクローニングするため、静止期（Ｇ0 ／Ｇ1 ）のリンパ系細胞株（ＬＦＤ−１４）から常法（Ａｕｆｆｒａｙ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，３０３，１９８０）に従ってｍＲＮＡを調製し、次にこのｍＲＮＡに基いて、常法（Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８５７３，１９８７）に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【００１７】
次に、同じ細胞株（ＬＦＤ−１４）をＩＬ−２（１００Ｕ／ml）により増殖刺激し、約２０時間後（Ｓ期）に常法に従ってｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡに基いて常法によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。次に、これらのｃＤＮＡライブラリー間でディフエレンシヤル・ハイブリダイゼーションを行い、Ｓ期の細胞においてのみ発現しているｃＤＮＡクローンを得、これをＳＰＡ−１  ｃＤＮＡと命名した。また、このｃＤＮＡを含むベクターをｐｃＳＰＡ−１と命名した。このベクターを制限酵素ＸｈｏＩで切断することによりＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを切り出すことができる。
【００１８】
（２）ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡの構造
ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡの塩基配列を常法に従って決定した結果を配列番号：１に示す。このｃＤＮＡは全長約３．５kbから成り、その５′−末端側に多くの短いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む長い（約１．２kb）５′−非翻訳領域を持つ。同領域はある種のがん遺伝子に共通して認められる強い翻訳抑制領域で、同遺伝子発現が翻訳レベルでも強く制御されていることを示す。
【００１９】
このｃＤＮＡはさらに、約２．１kbから成る１つのオープンリーディングフレーム（配列番号：１中第１２００番目の塩基Ａ（アデノシン）から第３２７８番目の塩基Ｃ（シトシン）まで）を含有する。このオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列のＮ−末端側１９０アミノ酸からなる配列（「Ｓｐａｎ−Ｎ」と称する）はヒトＲａｐ１ＧＡＰ（ＧＡＰ3 ）と高い相同性を示していた。Ｓｐａｎ−ＮとＧＡＰ3 のアミノ酸配列の相同性を図１に示す。
【００２０】
（３）ＳＰＡ−１Ｎ末端側の各ドメインに対するモノクローナル抗体の調製
ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、Ｓｐａｎ−ＮをコードするＤＮＡ断片及びそれに続く約１４０アミノ酸からなるポリペプチド（「Ｓｐａｎ−Ｃ」と称する）をコードするＤＮＡ断片を得、これをｐＧＥＸ−１ベクター（ファルマシア）のＰｓｔＩ末端をＴ4 ポリメラーゼで平坦化し、ＥｃｏＲＩリンカーをつけて、ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、Ｓｐａｎ−Ｎ又はＳｐａｎ−ＣとＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質をコードする配列を含む発現プラスミドｐＧＥＸ−ＳｐａｎＮ及びｐＧＥＸ−ＳｐａｎＣを得た。この発現プラスミドを大腸菌にて発現せしめ、発現生成物を回収・精製することによりＳｐａｎ−Ｎ／ＧＳＴ融合蛋白質及びＳｐａｎ−Ｃ／ＧＳＴ融合蛋白質を得た。
【００２１】
これらの融合蛋白質各２００μｇをフロイント完全アジュバントと混合したものをアルメニアハムスター（♂、５ｗ）の皮下に免疫した。その後２週間おきに３回、融合蛋白質２００μｇをフロイント不完全アジュバントと混合し、ハムスター腹腔内に投与した。最終免疫から３日後にハムスター脾臓を摘出、細切し脾細胞液を調整した。これをＬｅｏ，Ｏらの方法（ＰＮＡＳ  ８４：１３７４，１９８７）に従い、マウスミエローマ株Ｐ３Ｕ１と細胞融合させ、ハイブリドーマを得た。
【００２２】
これらハイブリドーマのうち目的とする抗体を産生するクローンは、ハムスターの免疫に用いた各々の融合蛋白を抗原としたＥＬＩＳＡ法により選別した。つまり、各々の融合蛋白（ＧＳＴ−ＳｐａｎＮ，ＧＳＴ−ＳｐａｎＣ）１μｇ／ウェルあるいはＧＳＴ蛋白のみ１μｇ／ウェルを結合させた９６ウェルプレートを用意し、これに各ハイブリドーマ上清１００μｌを反応させた。
【００２３】
次にこれに抗ハムスターＩｇＧ−ペルオキシダーゼを反応させ、基質としてＡＢＴＳ（２−２′−アジノ−ジ−３−エチル−ベンゾチアノジノ−６−硫酸）を用い呈色反応を行い、ＧＳＴには反応せず各融合蛋白にのみ反応するものを陽性とした。陽性を示すウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、単一細胞よりクローンを得た。Ｓｐａｎ−Ｎに対するモノクローナル抗体をＦ６、Ｓｐａｎ−Ｃに対するモノクローナル抗体をＨ１０と称する。図７に各々のモノクローナル抗体と融合蛋白の反応性をウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す。
【００２４】
すなわち、図７は、各１０μｇの、ＧＳＴ−ＳｐａｎＮおよびＧＳＴ−ＳｐａｎＣ融合蛋白あるいは、ＧＳＴのみをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、メンブランにブロットし、これを各々Ｆ６あるいはＨ１０抗体液（１０μｇ／ml）にて反応させ、 125Ｉ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ（アマシャム社）で検出した結果を示す。
【００２５】
なお、モノクローナル抗体Ｆ６を生産するハイブリドーマはＦ６と命名され寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８３９として平成６年１０月１８日に、そしてモノクローナル抗体Ｈ１０を生産するハイブリドーマはＨ１０と命名され寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８４０として平成６年１０月１８日に、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００２６】
（４）モノクローナル抗体によるＳＰＡ−１蛋白質の検出
リンパ球細胞株ＬＦＤ１４細胞（Ｋｕｂｏｔａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３９２４，１９９０）の培養細胞から、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌｅｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１５７９，１９８６の方法により蛋白質を抽出し、前記モノクローナル抗体を用いるイムノブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）法、免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ）法等により蛋白質の同定を行った。
【００２７】
この結果、例えばモノクローナル抗体Ｆ６を用いるウエスタン・ブロット法において、リンパ球ＬＦＤ１４からの蛋白質は分子量約６８kDa のバンドとして検出された。このことから、ＳＰＡ−１遺伝子は約６８kDa の核内蛋白質をコードしていることが予想される。
すなわち、本発明のＳＰＡ−１蛋白質は配列番号：１の１番目のアミノ酸メチオニンから６９３番目のアミノ酸アラニンまでのアミノ酸配列を有すると推定される。
【００２８】
実施例２． ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡの発現
（１）ＳＰＡ−１蛋白の発現
インビトロ転写／翻訳法による発現
図８に様々な長さのＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを鋳型として用いたインビトロ転写／翻訳法により発現したＳＰＡ−１蛋白の解析結果を示す。鋳型としては図８に示した様に、全長のＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ+ −Ｓｐａ１プラスミド、この５′側を様々な長さで欠くクローン（＃５２，＃３５，＃３３，＃９２）あるいは、ＯＲＦを完全に含み翻訳時に負に働く５′非翻訳領域を欠く＃３５プラスミドをその下流の様々な位置（ＮｃｏＩ（１７２９），ＢａｌＩ（２２３１），ＥｃｏＲＩ（２８８１），ＤｒａＩ（３０３８））で切断したプラスミドを用いた。
【００２９】
これらの鋳型ＤＮＡ１０μｇを用い、ＲＮＡ転写キット（ストラタジーン社）により相補的ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。このｃＲＮＡをＴａｇａｗａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：２００２１，１９９０）に従い、インビトロ発現翻訳キット（ストラタジーン社）により、インビトロにてウサギ網状赤血球破砕物（プロメガ社）を用い、35Ｓ−メチオニン（アマシャム社）の存在下で翻訳し、翻訳生成物を前記Ｈ１０抗体とプロテインＡビーズ（ファルマシア社）とにより免疫沈降したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。
【００３０】
その結果、ＯＲＦおよび３′非翻訳領域を完全に含む全長のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ+ −ＳＰＡ−１、＃５２および＃３５のプラスミドを鋳型とした時には約８５kDa の特異バンドが検出されたが、ＯＲＦの一部を欠くプラスミド（＃３３）では、その欠いた長さに応じた翻訳物（約５０kDa)が検出された。さらにＯＲＦ以下の３′非翻訳領域を欠くプラスミド（＃３５／ＢａｌＩ，＃３５／ＥｃｏＲＩおよび＃３５／ＤｒａＩ）ではその長さに応じて８５kDa より小さい翻訳物が検出された。
これらの結果は、ＳＰＡ−１蛋白は１２００番目のメチオニンから３２７８番目のアラニンまでの６９３アミノ酸からなるポリペプチドとして翻訳されていることを示している。
【００３１】
安定な動物細胞トランスフェクタントによる発現
ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ−ＤｒａＩにより切り出し、ｐＳＲα発現ベクター（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８，４６６−４７２，１９８８）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して発現ベクターＳＲα−ＳＰＡ−１を作製し、これをＮｅｏ遺伝子を含むプラスミドｐＳＶ2 ＮｅＯと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）に導入したのちＧ４１８により選択し、安定なトランスフェクタントを得た（ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞）。
【００３２】
ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞は、図９のＡに示すごとく通常の培養条件下（５％血清添加）では、コントロールのＳＲαベクターのみを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ／ＳＲα細胞）と何ら変らない増殖を示すが、同細胞を血清除去にてＧ１相に同調し（ｅｘｔｅｎｔｅｄ  Ｇ１）、一定時間後に血清を加えて細胞周期を回転させると、Ｓ期中〜後期において急速な細胞死のおこることがわかった（図１０のＡ）。形態学的には、細胞が丸くなり著明な核凝縮がみられ、いわゆる分裂破綻（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅｓ）によるものと推定された（図９のＢ）。また、このような細胞周期同調に伴いＳＰＡ−１は特有な発現の変動を示し、サイクリン群同様その発現は、細胞周期に伴う調節をうけていることも示唆された（図１０のＢ，Ｃ）。
【００３３】
図９は、ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ／Ｓｐａ−１）におけるＧ1 期細胞周期ブロック後の増殖刺激による細胞死の誘導を示しており、この図のＡは、ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞（●）、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＳＲαベクターのみを遺伝子導入したＮＩＨ／ＳＲα細胞（○）をほぼ飽和状態になるまで５％血清存在下で培養した後、０．５％血清加培地に移し、０，２４あるいは４８時間培養した。その後２０％血清加培地に移し細胞数を経時的に測定した結果を示す。
【００３４】
図９のＢは、４８時間０．５％血清存在下で培養したＮＩＨ／ＳＲα細胞およびＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞に２０％の血清を加え培養１８時間後の細胞の鏡検像であり、右側はその時の細胞の核の状態をヘキスト３３４２７（シグマ社）にて示している。ＮＩＨ／ＳＰＡ−１で核の萎縮が認められる。
図１０において、ＡはＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞における細胞周期の解析結果を示し、上段がＮＩＨ／ＳＲα、下段がＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞である。血清再添加後１６時間の時点で、ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞は死滅している（コントロールの細胞はＳ期に入っている）。Ｂは血清非存在下培養（Ｇ1 ａｒｒｅｓｔ）時のＳＰＡ−１蛋白の蓄積を示し、ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞ではｔｒａｎｓｆｅｃｔしたＳＰＡ−１ｍＲＮＡは検出されているのにもかかわらず、通常の培養下（ｏｈのレーン）では、ＳＰＡ−１蛋白はウェスタンブロット法でほとんど検出されない（恐らく、常時分解されている）。しかし、一旦血清濃度を０．５％に下げ細胞周期をＧ1 に止めた状態（Ｇ1 ａｒｒｅｓｔ）にすると、ＳＰＡ−１蛋白の蓄積が観察される。
【００３５】
図１０のＣは血清添加後のＳＰＡ−１蛋白の動態を示し、４８時間のＧ1 ａｒｒｅｓｔ後血清再添加により細胞周期を再び開始させ、各時間ごと生存している細胞のみを回収し、ＳＰＡ−１蛋白の発現を調べた。ＮＩＨ／ＳＰＡ−１細胞でも血清再添加後２４時間でも一部（約一割）の細胞は生き残っており、これらの細胞ではｃαｃ２の活性化が観察される。これに対し、ＳＰＡ−１蛋白はこの時点ではすでに減少している。
【００３６】
組換えＳＰＡ−１の大腸菌での発現
ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ（塩基１１７１位を切断）及びＤｒａＩ（塩基３０３８位を切断）により切断し、ＢｇｌＩ−ＤｒａＩ切断を得、これをＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化した。このＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶにより切断されたプラスミドＢＳ−ＳＫ（ストラタジーン社）に連結してプラスミドＳＫ+ −ＳＰＡ−１を得た。次に、このプラスミドのＨｉｎｄIII 部位にＢａｍＨＩリンカーを付与し、これをＢａｍＨＩにより消化し、得られたＢａｍＨＩ断片を、ＢｇｌIIにより消化した発現プラスミドｐＥＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、米国）に挿入し、発現プラスミドｐＥＴ−ＳＰＡ１を得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌を形質転換した。
【００３７】
この大腸菌を培養し、培養物からの発現生成物を電気泳動の後前記モノクローナル抗体Ｆ６により検出したところ、分子量８５kDa の部位にバンドが検出され、組換えＳＰＡ−１（ｒＳＰＡ−１）が発現したことが確認された。
上記発現プラスミドの作製過程を図３に示す。
【００３８】
（２）Ｓｐａｎ−Ｎの生理活性
Ｓｐａｎ−ＮがＧＡＰ３と相同性を有するので、前述のＧＳＴ−ＳｐａｎＮ融合蛋白質を用いてＧＡＰ活性を検討した。対照としてヒトＧＡＰ３（７５〜６６３アミノ酸残基）ＧＳＴ融合蛋白質を用い、酵母Ｒｓｒ１（１−２７２残基）、ヒトＲａｐ１Ａ（Ｇｌｕ63）（１−１８４残基）、ヒトＨａ−Ｒａｓ（１−１８９残基）、およびヒトＲｈｏＡ（１−１９３残基）ＧＳＴ融合蛋白質（文献：Ｎｕｒ−Ｅ−Ｋａｍａｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３１：１４３７−１４４２，１９９２．，Ｎｕｒ−Ｅ−Ｋａｍａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６７：１４１５−１４１８，１９９２）のＧＴＰａｓｅ活性に及ぼす影響について、Ｍａｒｕｔａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６６１−１１６６８，１９９１）に従い解析した。その結果Ｓｐａｎ−ＮはＨａ−Ｒａｓ，Ｒａｃ１，Ｒｈｏ１等には無効であるがＲａｐ１及びＲｓｒ１に対して選択的ＧＡＰ活性を有することが示された。この結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0003683000.tif 000002
【００４０】
また、図４に、Ｓｐａｎ−Ｎ濃度とＲｓｒ１ＧＴＰａｓｅ活性化の関係を示す。この図はＳｐａｎＮのＲｓｒＧＴＰａｓｅ活性が濃度に依存していることを示している。ＧＡＰ活性の測定は先のＭａｒｕｔａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６６１−１１６６８，１９９１）に従い行った。
ＳＰＡ−１は核内蛋白であり、他方Ｒａｐ１が核に存在するという報告はない。そこで唯一核内に存在することが明かな低分子Ｇ蛋白Ｒａｎに対する活性を検討したところ、Ｓｐａｎ−ＮはＲａｎに対して明かなＧＡＰ活性を示すことが判明した。この結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
0003683000.tif 000003
【００４２】
また、図５に、Ｓｐａｎ−Ｎ濃度とＲａｎＧＴＰａｓｅ活性化との関係を示す。
【００４３】
実施例３． ゲノム遺伝子のクローニング
（１）マウスゲノムライブラリー（ＥＭＢＬ３−Ａｄｕｌｔ  ＤＢＡ／２Ｊ肝ＤＮＡ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＭＬ  １００９ｄ）１．０×１０6 をＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+ 膜（アマシャム、ＲＰＮ３０３Ｂ）にブロッティングした。ＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを挿入したベクターＳＰＡ−１  ｃＤＮＡ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＸｈｏＩ（ＴｏＹｏＢｏ，ＸＨＯ−１０１）で切断することにより全長のＳＰＡ−１  ｃＤＮＡを切り出し、このＤＮＡ断片を、Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム、Ｎ５０００）によりα32Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャムＰＢ（０２０５）により標識した。
【００４４】
このプローブをＲａｐｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（アマシャム  ＲＰＮ１６３６）の存在下で前記ゲノムライブラリーと反応せしめた。一次スクリーニングの結果、陽性、疑陽性あわせて１５個のシグナルを得た。さらに二次スクリーニングの結果、９個の陽性クローンを得た。これらをさらに三次スクリーニングにかけることにより、得られた９株がクローン化されていることを確認した。これらのクローン中のゲノムＤＮＡを、それぞれＧＣ１〜ＧＣ９と称する。
【００４５】
（２）マウス全ＤＮＡの調製
４週令のＢａｌｂ／ｃマウスの尾を２cm切り取り、１．５mlのエッペンドルフチューブに入れた。次にこれをはさみにより切り刻んだ。これに、５００μｌの混合溶液（４３９μｌの１×ＳＳＣ、５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（pH８．０）、５０μｌの１０％ＳＤＳ、及び５μｌの２０mg／mlプロティナーゼＫ）を加え、３７℃にて１２時間インキュベートした。
【００４６】
次に、これに５００μｌの緩衝化フェノールを加え、５分間穏和に混合した。この混合物を１０，０００rpm にて５分間室温で遠心分離した。液相を新たなチューブに移し、これに７００μｌのイソプロパノールを加え、そしてチューブを数回反転し、線状の沈澱を生じさせた。
この沈澱を、５００μｌの７０％エタノールを入れた新たなチューブに移し、次に７０％のエタノールを除去し、１００％エタノールにより沈澱を洗浄した。沈澱を空気乾燥し次に１００μｌのＴＥ緩衝液を加えて全ＤＮＡを調製した。
【００４７】
（３）ＳＰＡ−１をコードするゲノムＤＮＡのスクリーニング
前記（２）において調製した全ＤＮＡをＢａｍＨＩ（ＴｏＹｏＢｏ，ＢＨＡ−１０２）又はＥｃｏＲＩ（ＴｏＹｏＢｏ，ＥＣＯ−１０１）により切断し、次にこれをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜にブロッティングし、前記（１）において調製したＳＰＡ−１ｃＤＮＡ全長プローブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーションは、前記（１）と同様Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中で行った。
【００４８】
この結果、５．７kb及び６．６kbのＢａｍＨＩ断片、並びに９．２kb，５．２kb及び１．４kbのＥｃｏＲＩ断片が陽性であった。５．７kb及び６．６kbのＢａｍＨＩ断片にはＳＰＡ−１  ｃＤＮＡの全長が含まれていた。また、これらの断片は、それぞれ前記ゲノム断片Ｓｐａ−ＧＣ２及びＳｐａ−ＧＣ９に対応した。これらが挿入されたファージベクターをそれぞれＳｐａ−ＧＣ２／ＥＭＢＬ−３及びＳｐａ−ＧＣ９／ＥＭＢＬ−３と命名した。
【００４９】
（４）配列決定
これらのファージベクターを調製し、ＢａｍＨＩにより切断し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔ（フナコシ）によりＳｐａ−ＧＣ２／ＥＭＢＬ−３からの５．７kb  ＢａｍＨＩ断片、及びＳｐａ−ＧＣ９／ＥＭＢＬ−３からの６．６kb  ＢａｍＨＩ断片を調製した。
【００５０】
次に、これらを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）（ＴｏＹｏＢｏ，ＳＣ２１２２０５）のＢａｍＨＩ部位に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  ６０２１）により挿入し、サブクローニングした。次に、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，６０３０）により欠失変異体を作製し、７−ｄｅａｚａ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＴｏＹｏＢｏ，ＵＳ７０７７７）により配列決定を行った。その結果、Ｓｐａ−ＧＣ２にはその３′側半分にエクソン１〜４が、Ｓｐａ−ＧＣ９にはエクソン５〜１６が散在していることがわかった。
【００５１】
Ｓｐａ−ＧＣ２の塩基配列を配列番号：２に示し、そしてＳｐａ−ＧＣ９の塩基配列を配列番号：３に示す。Ｓｐａ−ＧＣ９中、エクソン５の後半からエクソン１６の前半に、ｃＤＮＡ中のアミノ酸コード領域が含まれている。
なお、Ｓｐａ−ＧＣ２及びＳｐａ−ＧＣ９を含めて、ゲノム断片の相互位置を図６に示す。
【００５２】
【発明の効果】
ＳＰＡ−１蛋白は、正常リンパ球細胞周期のＳ期以降に強く発現することから、ＤＮＡ複製や細胞分裂に関与している可能性が示唆された。他方、同蛋白のＮ末には、ＲａｎＧＡＰ活性ドメインの存在することが示された。Ｒａｎは、唯一核内に存在する低分子Ｇ蛋白で、ＲＣＣ−１遺伝子と会合している。ＲＣＣ−１は、酵母から哺乳類に至るすべての細胞によく保存されている核内蛋白で、Ｇ2 ／Ｍ移行のチェック機構（即ち、ＤＮＡ複製完了前の細胞分裂の防止）に関与する遺伝子として有名であるが、近年他にもＤＮＡ複製開始やＲＮＡの核外輸送など、細胞核の機能の多くの局面に関与していることがわかっている。
【００５３】
さらにＲＣＣ−１はＲａｎに対して、ＧＴＰ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒとして作用する。このＲＣＣ−１／Ｒａｎ系はしかし、共に細胞周期に関係なく構成的に発現されており、従って、周期とＲＣＣ−１／Ｒａｎをつなぐ因子として、周期依存性因子、とりわけＧＡＰ分子の介在が長らく推定されてきているがその本体は不明であった。今回の一連の結果は、ＳＰＡ−１が正しくこの介在分子であることを強く示唆するものである。さらに、ＳＰＡ−１過剰発現により有糸分裂破綻（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅｓ）がおこるという今回の知見は、ＳＰＡ−１が、周期依存性にこのＲＣＣ−１／Ｒａｎ系の機能制御にあたる中枢的分子であることを示唆しよう。
【００５４】
ＤＮＡ合成と細胞分裂を促進するエンジンに相当するｃｙｃｌｉｎ／ｃｄｃ２系に対して、ブレーキにあたるＲＣＣ１／Ｒａｎ系がＳＰＡ−１を介していかに微調整の役割を果たすかの詳細は今後の重要な検討課題である。とりわけＳＰＡ−１が、ユニークな細胞増殖特性を有するリンパ系細胞に高発現される事実は、それが、同細胞系の増殖調節とそのチェック機構において重要な機能を果たしていることを示唆するものである。
従って、本発明の蛋白質はリンパ球の分化調節剤等としての有用性が期待される。さらに、本発明の蛋白質を腫瘍細胞で発現させれば、細胞周期のＳ期で細胞死を誘導することができるため、抗腫瘍剤としても有用である。
【００５５】
【配列表】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＳｐａｎ−Ｎのアミノ酸配列とＧＡＰ３ｍ蛋白質のアミノ酸配列とを比較した図である。
【図２】図２はＳＰＡ−１蛋白質の構造の模式図である。
【図３】図３はＳＰＡ−１蛋白質の組換え発現用プラスミドの作製過程を示す図である。
【図４】図４はＳｐａｎ−Ｎが濃度依存的にＲｓｒ１ＧＴＰａｓｅを活性化することを示すグラフである。
【図５】図５はＳｐａｎ−Ｎが濃度依存的にＲａｎ１ＧＴＰａｓｅを活性化することを示すグラフである。
【図６】図６は本発明のＳＰＡ−１をコードするゲノムＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図７】図７は、モノクローナル抗体Ｆ６及びＨ１０のＧＳＴ及びＧＳＴ／ＳｐａｎＮ融合蛋白質への反応性を示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図８】図８は、種々の領域を欠失させたＳＰＡ遺伝子からの発現生成物の様子を示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図９】図９は、動物細胞を血清飢餓と血清の再添加により同調培養した場合に、その動物細胞に導入されたＳＰＡ−１遺伝子がその細胞に与える影響を示すものであり、生物の形態を表わす図面に代る写真である。
【図１０】図１０は、動物細胞を血清飢餓と血清の再添加により同調培養した場合に、その動物細胞に導入されたＳＰＡ−１遺伝子がその細胞に与える影響を示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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