(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気絶縁性の基板、前記基板上に配置された作用極及び対極を含む電極系、並びにグルコースをグルコノラクトンに酸化する反応に触媒作用を有する酸化還元酵素、グルコノラクトナーゼ、及び緩衝剤を含む試薬系を備え、前記緩衝剤が、フタル酸及びその塩、マレイン酸及びその塩、コハク酸及びその塩、リン酸及びその塩、酢酸及びその塩、ホウ酸及びその塩、クエン酸及びその塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、イミダゾール、ジメチルグルタル酸、トリエタノールアミン塩酸塩、コリジン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンからなる群より選択されたバイオセンサ。
【請求項２】
前記試薬系が電子伝達体をさらに含む請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記試薬系が親水性高分子をさらに含む請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記酸化還元酵素、グルコノラクトナーゼ、及び緩衝剤が混合した状態でセンサに担持されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記酸化還元酵素とグルコノラクトナーゼとが互いに離れてセンサに担持されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項６】
グルコノラクトナーゼが、大腸菌、酵母、ヒト、ラット、ブタ、ウシ、アスペルギルス・ニガー、アゾトバクター・ヴィネランディー、シュードモナス・フルオレセンス、ザイモモナス・モビリス、ストレプトマイセス・コエリコロール、ダイノコッカス・ラディオデュランス、キシレラ・ファスティディオサからなる群より選択される１種に由来する請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項７】
センサの緩衝剤の担持量が５ｎｍｏｌ／ｍｍ２以下である請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項８】
緩衝剤がｐＨ４〜８の領域に緩衝能を有する請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、及びピラノースオキシダーゼからなる群より選択される請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
基板上に配置されて前記基板との間に電極系への試料液供給路を形成するカバー部材をさらに備えた請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記試薬系が両親媒性化合物をさらに含む請求項１記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、試料中の特定成分を迅速かつ簡便に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
背景技術
一般の人々による体液成分の簡易な定量を実現させることを目的として、近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
以下に、試料液中の成分を定量する方法の一例としてグルコースの定量法について説明する。電気化学的なグルコースの定量法としては、グルコースオキシダーゼと酸素電極あるいは過酸化水素電極とを組み合わせて使用する方法が一般的によく知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社）。
【０００３】
グルコースオキシダーゼは、酸素を電子伝達体として、基質であるグルコースをグルコノラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、グルコースオキシダーゼによるグルコースの酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計測する。酸素の減少量及び過酸化水素の増加量は、試料液中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースを定量することができる。
【０００４】
上記方法では、その反応過程からも推測できるように、測定結果は試料液に含まれる酸素濃度の影響を受けるという欠点があり、試料液に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
【０００５】
そこで、酸素を電子伝達体として用いるのではなく、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いるタイプのグルコースセンサが開発されてきた。このタイプのセンサにおいては、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を電極上で酸化し、その酸化電流量から試料液中に含まれるグルコース濃度を求めることができる。このような有機化合物あるいは金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いた場合には、これら電子伝達体を正確な量かつ安定な状態でグルコースオキシダーゼとともに電極上に担持させて試薬層を形成させることが可能となる。さらに、試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるため、これらの技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサは近年多くの注目を集めている。その代表的な例が、特許第２５１７１５３号公報に示されるバイオセンサである。使い捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに試料液を導入するだけで、容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる。
【０００６】
上記のようなグルコースセンサを用いた測定法では、１〜１０μＡ／ｃｍ２オーダーの応答電流によって、３０秒程度で試料中のグルコース濃度を求めることが可能である。しかしながら、近年、更に迅速かつ高感度にグルコースの定量を行うことのできるセンサの開発が様々な方面から切望されている。
【０００７】
また、従来の電気化学的なグルコースセンサでは、カルボキシメチルセルロースなどの親水性高分子を試薬層に添加することにより、外部から測定器に与えられる振動に測定結果が影響を受けないようにされている。この親水性高分子は、酵素を電極上に緩やかに固定化するバインダーとして機能するといったメリットをも有している。しかしながら、親水性高分子の存在により、グルコースオキシダーゼの触媒活性、あるいはグルコノラクトンのグルコン酸への加水分解反応の熱力学に変化が生じて、グルコースの酸化反応の生成物であるグルコノラクトンが蓄積する場合があった。グルコノラクトンが蓄積すると、逆反応が進行したり、グルコースの酸化反応速度が減少したりする。そのため、短い反応時間における電子伝達体の還元体の生成量は低下し、グルコースに対するセンサの応答電流の大きさ、すなわち感度が低下する。特に、高濃度のグルコースに対して十分な感度を得ようとすると、電子伝達体の還元体を多量に生成させるために、反応時間を増大させることが必要となり、測定に要する時間が長くなる傾向にあった。
【０００８】
本発明は、上記従来の問題点に鑑み、応答性が高く、迅速かつ高感度に試料中の特定成分を定量することができるバイオセンサを提供することを目的とする。
【０００９】
発明の開示
本発明のバイオセンサは、電気絶縁性の基板、前記基板上に配置された作用極及び対極を含む電極系、並びにグルコースをグルコノラクトンに酸化する反応に触媒作用を有する酸化還元酵素、グルコノラクトナーゼ、及び緩衝剤を含む試薬系を備え、前記緩衝剤が、フタル酸及びその塩、マレイン酸及びその塩、コハク酸及びその塩、リン酸及びその塩、酢酸及びその塩、ホウ酸及びその塩、クエン酸及びその塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、イミダゾール、ジメチルグルタル酸、トリエタノールアミン塩酸塩、コリジン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンからなる群より選択される。
【００１０】
発明を実施するための最良の形態
本発明のバイオセンサは、電気絶縁性の基板、前記基板上に配置された作用極及び対極を含む電極系、並びにグルコースをグルコノラクトンに酸化する反応に触媒作用を有する酸化還元酵素、グルコノラクトナーゼ、及び特定の緩衝剤を含む試薬系を備えている。
ここで、前記緩衝剤は、フタル酸、フタル酸塩、マレイン酸、マレイン酸塩、コハク酸、コハク酸塩、リン酸、リン酸塩、酢酸、酢酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、クエン酸、クエン酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）からなる群より選択されるものが好ましい。
【００１１】
本発明の他の実施の形態において、前記緩衝剤は、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、イミダゾール、ジメチルグルタル酸、トリエタノールアミン塩酸塩、コリジン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンからなる群より選択される。
【００１２】
本発明によると、酸化還元酵素の作用によりグルコースが酸化されて生じたグルコノラクトンが、グルコノラクトナーゼによってグルコン酸へ変換される。このためグルコースの酸化反応が進行しやすくなり、測定時間が短い場合でも十分な応答性が得られる。また、反応系のｐＨを調製することにより、バイオセンサに含まれる酸化還元酵素またはグルコノラクトナーゼの活性を向上させることができるので、さらにセンサの応答性が向上する。上記緩衝剤の中で、溶解性が十分高いという観点から、フタル酸、フタル酸塩、マレイン酸、マレイン酸塩、コハク酸、コハク酸塩、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが好ましい。
【００１３】
ここで、試薬系に電子伝達体をさらに含むことが好ましい。試料液中の溶存酸素を電子伝達体として利用しても良いが、試薬系に電子伝達体を含ませておくのが好ましい。電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、オスミウム−トリス（ビピリジニウム）やフェロセン誘導体などの金属錯体、ｐ−ベンゾキノンなどのキノン誘導体、フェナジンメトサルフェートなどのフェナジニウム誘導体、メチレンブルーなどのフェノチアジニウム誘導体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などがあげられる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。
【００１４】
試薬系は親水性高分子をさらに含むことが好ましい。親水性高分子としては、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチン及びその誘導体、アクリル酸またはその塩の重合体、メタクリル酸またはその塩の重合体、スターチ及びその誘導体、無水マレイン酸またはその塩の重合体、アガロースゲル及びその誘導体が好適に用いられる。試薬系が親水性高分子を含むと、外部から測定器に与えられた振動に測定結果が影響を受けない。また、親水性高分子は、酵素を電極上に緩やかに固定化するバインダーとして機能するといったメリットを有する。
【００１５】
グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素、グルコノラクトナーゼ、及び緩衝剤が混合した状態でセンサに担持されていてもよい。このようにすると、バイオセンサの製造過程が単純であり、簡易に試薬層を作製可能である。また、酸化還元酵素とグルコノラクトナーゼとが近傍に位置するので、酸化還元酵素の作用によって生じたグルコノラクトンが、グルコノラクトナーゼによってより速やかにグルコン酸へ変換される。そのためグルコースの酸化反応性が向上し、測定時間がより短い場合でも十分な応答性が得られる。
【００１６】
グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素とグルコノラクトナーゼとが互いに離れてセンサに担持されていてもよい。このようにすると、それぞれの酵素に好適な緩衝剤をそれぞれの酵素に混合して、または酵素の近傍に添加することができ、より効率よくそれぞれの酵素活性を向上することができる。
グルコノラクトナーゼは、大腸菌、酵母、ヒト、ラット、ブタ、ウシ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アゾトバクター・ヴィネランディー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ダイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、キシレラ・ファスティディオサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）からなる群より選択される１種に由来するものが好ましい。これらの中で、生産性が高く、十分な活性を保持しているという理由から、大腸菌、酵母、またはアスペルギルス・ニガーに由来するものがより好ましい。
【００１７】
センサの緩衝剤担持量は、５ｎｍｏｌ／ｍｍ２以下であることが好ましい。このようにすると、グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素とグルコノラクトナーゼの溶解性を低下させることなく、それぞれの酵素が十分な活性を発揮できるように、測定対象の試料液のｐＨを調製することができる。
さらに、上記担持量であれば、グルコース０ｍｇ／ｄｌに対する応答値、すなわちブランク応答値を上昇させないので、信頼性の高いバイオセンサが得られる。さらに好ましい緩衝剤の担持量は０．１〜３ｎｍｏｌ／ｍｍ２である。試料液として血液０．０４〜２０μｌを測定対象とする使い捨てタイプのセンサでは、緩衝剤を含む層の効果的な平滑化及びブランク値の低減化という観点から、センサ１個当たり５〜１０００ｎｍｏｌの範囲が好ましい。
【００１８】
試薬層が緩衝剤を含むと、溶液の展開及び乾燥により形成される試薬層が平滑化される。試薬層をその水溶液からの乾燥により形成する場合、試薬の結晶の粗大化などにより試薬層が凹凸を有するものとなる。特に、電子メディエータのフェリシアン化カリウムを含むとき顕著である。試薬層が緩衝剤を含むとそのような凹凸を有しない平滑な層が得られる。その理由は、緩衝剤はその溶液の乾燥により生成する結晶がより微細なためと思われる。
センサに試料液を供給して試薬層を試料液に溶解する際、試薬層が表面に凹凸を有すると、試料液と試薬層の凹凸部との間に空気が介在し、そのため試薬層を溶解した試料液中に気泡が生じることがある。試料液に気泡が生じると、試料液供給路中を試料液がスムーズに移動できず、測定に支障を来す。試薬層が平滑化されることにより、前記のような不都合を解消することができる。さらに、試薬層が平滑化されるので、試料液供給路内の体積または高さを減少することができ、試料液の微量化が実現できる。
【００１９】
緩衝剤は、ｐＨ４〜８の領域に緩衝能を有するものが好ましい。そのような緩衝剤を用いると、試料液が供給されてバイオセンサに含まれる試薬がその試料液に溶解すると、酵素反応系を構成するその溶液は、ｐＨ４〜８付近に調製される。このようなｐＨ領域においては、反応系全体の反応性が向上し、測定時間がより短い場合でも十分な応答性が得られる。
【００２０】
グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素は、グルコースオキシダーゼ、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、及びピラノースオキシダーゼからなる群より選択されることが好ましい。グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素にグルコースオキシダーゼを用いた場合は、緩衝剤はｐＨ４〜６の領域に緩衝能を有するものがより好ましい。グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素にＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼまたはピラノースオキシダーゼを用いた場合は、緩衝剤はｐＨ５〜８の領域に緩衝能を有するものがより好ましい。
【００２１】
本発明のバイオセンサは、基板上に配置されて前記基板との間に電極系への試料液供給路を形成するカバー部材をさらに備えていてもよい。このような構成にすると、試料量を一定に規定できるという利点がある。また、溶解性の低い緩衝剤を用いた場合、酵素から分離してカバー部材側に担持することができる。さらに、後述する両親媒性化合物をバイオセンサに担持する場合、両親媒性化合物を酵素から分離してカバー部材側に担持することにより、次のような利点がある。すなわち、両親媒性化合物の層を形成するには、通常両親媒性化合物の有機溶媒溶液を塗布し、乾燥する方法がとられる。両親媒性化合物の層を酵素を含む層上に形成すると、両親媒性化合物を溶解している有機溶媒が酵素に影響を与えることがある。両親媒性化合物の層を酵素を含む層とは分離してカバー部材側に形成すると、そのような有機溶媒の酵素への影響を避けることができる。
本発明のバイオセンサは、試薬系に両親媒性化合物をさらに含んでもよい。両親媒性化合物としては、レシチン、トリトンＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ）−１００などが特に好ましい。試薬系が両親媒性化合物を含んでいると、両親媒性化合物の両親媒性作用によってセンサの試料液供給路が親水処理されることによって、血液等の試料液が試料液供給路内に速やかに供給され、さらに試料液供給路内に気泡が発生することを防ぐことができる。
本発明のバイオセンサにおいて用いることができる試料としては、血液、血漿、血清、グルコース水溶液、培養液、発酵液等があげられる。
【００２２】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
図１は、本実施例におけるグルコースセンサの試薬系を取り除いた分解斜視図である。ポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、リード２及び３を形成した。次いで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを基板１上に印刷して作用極４を形成した。この作用極４は、リード２と接触している。さらに、この基板１上に絶縁性ペーストを印刷して絶縁層６を形成した。絶縁層６は、作用極４の外周部を覆っており、これにより作用極４の露出部分の面積を一定に保っている。そして、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストをリード３と接触するように基板１上に印刷してリング状の対極５を形成した。
上記の基板１に、後述のように試薬系を形成した後、スリット１０を有する中カバー８及び空気孔１１を備えた上カバー９を図１の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着することにより、バイオセンサを作製した。基板１に、中カバー８及び上カバー９からなるカバー部材を組み合わせることにより、中カバー８のスリット１０の部分に試料液供給路が形成される。センサの端部におけるスリット１０の開放端部は、試料液供給路への試料供給口となる。
【００２４】
図２は、本実施例におけるバイオセンサの縦断面図である。作用極４及び対極５からなる電極系を形成した基板１上に、まず、親水性高分子の一種であるカルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣで表す）の０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、乾燥することで、ＣＭＣ層７ａを形成した。次に、グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素の一種であるグルコースオキシダーゼ、電子伝達体の一種であるフェリシアン化カリウム、及びアスペルギルス・ニガー由来のグルコノラクトナーゼを、緩衝剤である１ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解した。その溶液４μｌをＣＭＣ層７ａ上に滴下し、乾燥することにより、試薬層７ｂを形成した。ここで、試薬層７ｂの面積が１２ｍｍ２であり、マレイン酸緩衝剤の担持量は０．３３ｎｍｏｌ／ｍｍ２である。本実施例では、試薬系７はＣＭＣ層７ａ及び試薬層７ｂからなる。
【００２５】
一定量のグルコースを含む水溶液を試料液として用いた。センサのスリット１０の開放端部に試料液を接触させると、試料液は毛細管現象により試料液供給路内へ導入された。一定時間（反応時間）経過後に対極５を基準にして作用極４に５００ｍＶの電圧を印加し、その際に作用極４と対極５の間に流れた電流値を測定した。グルコースオキシダーゼの触媒作用によりグルコースがグルコノラクトンへと酸化されるに伴い、フェリシアン化物イオンがフェロシアン化物イオンへと還元される。上記フェロシアン化物イオンの生成濃度は、試料液中のグルコースの濃度に比例する。よって、その酸化電流に基づいてグルコース濃度を測定することができる。このとき生成するグルコノラクトンは、グルコノラクトナーゼの作用によって分解される。
【００２６】
図３に示すように、反応時間５秒において得られた応答電流を、試料液中のグルコース濃度に対してプロットしたところ、両者の間に良好な線形関係が見られた。このことから、５秒という短い反応時間で、測定対象となる基質の濃度を精度良く定量できることがわかった。これは、試薬層中に添加された緩衝剤の作用によって、グルコノラクトナーゼが十分な活性を発揮したためと考えられる。そのため、グルコースの酸化反応の生成物であるグルコノラクトンがグルコノラクトナーゼによって速やかに分解され、溶液中に蓄積しなくなり、グルコースの酸化反応が加速したと推察される。
以上のように、より短い反応時間であっても、十分な応答値が得られるので、センサの測定時間を短縮することができる。
【００２７】
実施例２
図４は、本実施例におけるバイオセンサの縦断面図である。実施例１との相違点は、グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素であるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼと、グルコノラクトナーゼとを分離してセンサに担持した点である。
【００２８】
電極系を形成した基板１上に、まず、親水性高分子の一種であるＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、乾燥することで、ＣＭＣ層７ａを形成した。次に、アスペルギルス・ニガー由来のグルコノラクトナーゼを、緩衝剤である１ｍＭフタル酸水素カリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した。その溶液４μｌをＣＭＣ層７ａ上に滴下し、乾燥することにより、グルコノラクトナーゼ層１２を形成した。ここで、グルコノラクトナーゼ層１２の面積は１２ｍｍ２であり、フタル酸水素カリウム緩衝剤の担持量は０．３３ｎｍｏｌ／ｍｍ２である。そして、グルコノラクトナーゼ層１２上に、グルコノラクトナーゼ層１２と分離する目的で、ポリビニルピロリドン（以下ＰＶＰで表す）の０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、乾燥することで、ＰＶＰ層１３を形成した。さらに、グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素の一種であるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ及び電子伝達体の一種であるフェリシアン化カリウムを、緩衝剤である１ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５）に溶解した。その溶液４μｌをＰＶＰ層１３上に滴下し、乾燥することにより、グルコースデヒドロゲナーゼ層１４を形成した。ここで、グルコースデヒドロゲナーゼ層１４の面積は１２ｍｍ２であり、コハク酸緩衝剤の担持量は０．３３ｎｍｏｌ／ｍｍ２である。本実施例における試薬系は、ＣＭＣ層７ａ、グルコノラクトナーゼ層１２、ＰＶＰ層１３及びグルコースデヒドロゲナーゼ層１４からなる。
【００２９】
本実施例のように、ＰＶＰのような水溶性の高分子によって２種類の酵素を空間的に分離することで、各々の酵素に適する緩衝剤を、それぞれに添加することができる。このとき、ＰＶＰのような水溶性高分子は、血液等の生体試料やグルコース水溶液がバイオセンサに供給されると速やかに溶解するので、酵素の反応性を低下させるおそれはない。
本実施例のバイオセンサについて、一定量のグルコースを含む水溶液を試料液として用いた測定を行った結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００３０】
以上のように、２種類の酵素を用いた場合にも、それぞれの酵素に適する緩衝剤をそれぞれの酵素の近傍に添加することができる。そのため、反応時間がより短時間であっても、測定対象となる基質の濃度を定量する際に十分な応答値が得られ、センサの測定時間を短縮することができる。
上記実施例では、電極系への印加電圧を５００ｍＶとしたが、これに限定されることはない。電子伝達体が作用極において酸化される電圧であればよい。また、測定法として電流を検出する方法を用いたが、電気化学反応の進行に伴って変化する出力であれば、検出に用いる対象とすることができる。例えば、ある時間における通電電荷量を検出してもよい。通電電荷量は、時間に対する電流の積分値であるので、測定対象とする基質の濃度と関連付けることが可能である。
試料液供給路内に非水溶性の担体を設けて、そこに上記試薬系に含まれる試薬のうち１つあるいは複数を前記担体に固定化してもよい。固定化する場合は、共有結合法、架橋固定法、吸着法、または配位結合や特異的な結合性相互作用を用いた固定化法を用いることが好ましい。
【００３１】
上記実施例では、電極材料としてカーボンを用いたが、これに限定されることはない。作用極材料としては、カーボン、白金、金、パラジウムなどのように電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば使用することができる。対極材料としては、カーボンや金を含め、銀、白金などの一般的に用いられる導電性材料であれば使用することができる。作用極及び対極に加え、安定な電位を有する電極を参照極として用いてもよい。その場合、電圧は参照極と作用極の間に印加されることとなる。これら電極系の形状、配置、個数等は上記実施例に示したものに限定されるものではない。電極のリードや端子の形状、配置、個数等もまた上記実施例に示したものに限定されるものではない。
上記実施例では、試薬系が電極系上に形成される場合について述べたが、電極系の近傍、例えば、試料液供給路に露出するように、上カバー側に形成されてもよい。
【００３２】
産業上の利用の可能性
本発明によるバイオセンサは、酸化還元酵素の作用によりグルコースの酸化によって生じたグルコノラクトンが、グルコノラクトナーゼによってグルコン酸へ変換される。これによりグルコースの酸化反応がスムーズに進行し、測定時間が短い場合でも十分な応答性が得られる。また、緩衝剤によって、グルコースの酸化反応に触媒作用を有する酸化還元酵素またはグルコノラクトナーゼの活性が向上するので、センサの応答性を向上させることができる。このように本発明により、応答性が高く、迅速かつ高感度に試料中の特定成分を定量することができるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例におけるバイオセンサの試薬系を除いた斜視図である。
【図２】同バイオセンサの要部縦断面図である。
【図３】同バイオセンサの応答特性図である。
【図４】本発明の他の実施例におけるバイオセンサの要部縦断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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