(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨを６．８〜８．５の範囲内に制御した液体培地中で、オーレオバシディウム(Aureobasidium)属に属する微生物を突然変異させて得られる、β−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を培養しβ−１，３−グルカンを産生せしめ、これを採取することを特徴とするβ−１，３−βグルカンの製造法。
【請求項２】
β−１，３−グルカンが、グルコース残基1個がβ−１，６−結合で高度に分岐したβ−１，３−グルカンである請求項1記載の製造法。
【請求項３】
変異株がオーレオバシディウム  プルランス(Aureobasidim pullulans)受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９６である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
ｐＨを６．８〜８．５の範囲内、溶存酸素濃度を１０％以上に保持するように制御した液体培地中で、オーレオバシディウム(Aureobasidium)属に属する微生物を突然変異させて得られる、β−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を培養しβ−１，３−グルカンを産生せしめ、これを採取することを特徴とするβ−１，３−βグルカンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オーレオバシディウム（Aureobasidium)属に属する微生物の突然変異株を用いてβ−１，３−グルカン、特にグルコース残基１個がβ−１，６−結合で高度に分岐したβ−１，３−グルカンを製造する方法に関する。
本発明の方法で得られたβ−１，３−グルカンは、医薬、食品添加物、飼料添加物として利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、式［Ｉ］および［II］から構成されるβ−１，６−結合でグルコース１個が分岐した高分子量のβ−１，３−グルカンは知られている。たとえばシゾフィランはスエヒロタケの菌糸体の培養により得られ、抗腫瘍活性を有することが報告されている。また同様の構造を有するものとしてシイタケ（Lentinus edodes）からレンチナンが分離され、抗腫瘍活性を有する医薬品として使用されている。これらのβ−１，３−グルカンの分岐度（主鎖のβ−１，３−結合のグルコース単位の数（式［Ｉ］＋［II］の数）に対する分岐したβ−１，６−結合のグルコース単位の数（式［Ｉ］の数）の割合）はいずれも30〜35％程度と低く、非経口的に利用されているのみである。
【０００３】
【化１】
0003722522.tif 000002
【０００４】
一方、β−１，６−結合でグルコース１個が高度に分岐したβ−１，３−グルカンは安定性に優れ、経口投与により免疫賦活活性を有しており感染症予防剤、抗腫瘍剤として、さらには凝集剤や乳化安定剤としての工業的な利用も拡大してきている。このような用途の拡大と共に多種多様の分岐度、分子量を有する各種のβ−１，３−グルカンが求められるようになっている。従来、きのこ類や微生物など種々の生物を用いて多種類のβ−１，３−グルカンが生産されきたが、通常、同一の生物で得られるものはほぼ同一の分岐度、ほぼ同一の分子量を有するβ−１，３−グルカンであり、同一生物で異なった分岐度のものを生産することは行われていなかった。
【０００５】
本発明者らは、先にオーレオバシディウム属に属する微生物を用いて高度に分岐したβ−１，３−グルカンを生産することを見いだした（特開平6-340701号）。この高分岐度β−１，３−グルカンは分岐鎖の分布に偏りがなく、均一な分布を持つβ−１，３−グルカンであった。しかしこの方法によればプルランを産生せず、β−１，３−グルカンのみを生産するためには炭素源としてキシロースおよびビタミンＣを必須とした。またオーレオバシディウム属に属する微生物は本来メラニン色素を産生するため培養液が緑黒色となり、そのため得られるβ−１，３−グルカンも着色するという問題があった。またpHが高いところでは着色の程度が増加するために、特に高いpHでの培養では生産性を損なうという問題があった。このため培地のpHは 4.5〜6.5 の範囲内に厳密に制御する必要があった（特開平6-340701、特開平7-51080)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来の方法では培養液のpHや培養条件を大きく変化させて培養することが事実上不可能であり、その結果得られるβ−１，３−グルカンは生産量も低く、分子量および分岐度も限られた範囲のものしか得ることができず、用途の広がりに対して十分に対応できるものではなかった。このため生産性が高く、着色のない、しかも目的に応じた分子量および分岐度を有するβ−１，３−グルカンを生産する方法が強く望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、オーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を所定のpHに制御した液体培地中で培養することにより、プルランの産生が全くなく、無着色で高分岐度のβ−１，３−グルカンを高生産量で生産することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。さらに本発明においては、後述するように種々の条件を適宜設定することにより広範囲の分岐度、分子量を有するβ−１，３−グルカンを製造することも可能となった。
すなわち、本発明はpHを 6.8〜8.5 の範囲内に制御した液体培地中で、オーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を培養し、β−１，３−グルカンを産生せしめ、これを採取することによりなるβ−１，３−グルカンの製造法に関する。
【０００８】
以下に本発明を詳述する。
本発明において用いられるオーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株としては、例えばオーレオバシディウム  プルランス ATCC 9348株、ATCC 3092 株、ATCC 42023株、IFO 4464株、IFO 4466株、IFO 6353株、IFO 7757株などを突然変異処理し、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別し、その中からβ−１，３−グルカンを高生産する変異株を選別することにより得ることができる。
【０００９】
突然変異処理はＵＶ照射あるいは化学的処理により行うことができる。化学的処理としては、たとえばニトロソグアニジン、エチディウム  ブロマイド、メタンスルホン酸エチルまたは亜硝酸ナトリウムなど一般的に行われている変異処理剤を用いることができる。次に、突然変異株をコロニーの形に培養し、コロニーに着色させ、親株の着色量よりも低い菌株を採取する場合はメラニン色素を産生し易いように、平板培地で培養した後、通常５〜20℃程度の温度に保ってメラニン色素の産生を促進させた後に、着色していないコロニーを選別して、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別する。
本発明に用いるオーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株としては、具体的には工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているFERM P-15096が好ましく用いられる。
【００１０】
この変異株をpHが 6.8〜8.5 の範囲内に制御した液体培地中で培養することにより高分岐度のβ−１，３−グルカンを得ることができる。
培養中は、培地のpHが大きく変動するが、本発明においてはpHを 6.8〜8.5 の範囲内に制御することが重要である。好ましくは、pHを 7.0〜8.5 、より好ましくは 7.0〜8.0 に制御する。本発明の変異株を上記範囲内のpHで培養することによりプルランの生産が著しく抑制されるため、β−１，３−グルカンのみが生産される。
pHが 6.5より低い場合にはプルランなどの他の生産物が主に生成するようになり、また 8.5よりも高くなるとβ−１，３−グルカンの生産は著しく減少する。本発明においては、培養中のpHを上記範囲内に制御することにより高分岐度のβ−１，３−グルカンを生産できるが、好ましくはpHの変動値を±0.2 以内、より好ましくは±0.1 以内に制御するのが所定の高分岐度、高分子量を有するβ−１，３−グルカンを生産するうえで好ましい。
【００１１】
pHを制御する方法としては、酸およびアルカリを用いる方法が採用される。pHの制御のために用いる酸およびアルカリの種類は特に限定されず、酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、炭酸、シュウ酸，酢酸などの各種の鉱酸や有機酸を用いることができる。またアルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニアなどを用いることができる。
本発明における酸とアルカリのpH調製剤の組み合わせとしては、β−１，３−グルカンの高生産性の観点から強酸と強アルカリまたは弱酸と弱アルカリの組み合わせが好ましく用いられる。具体的には、塩酸と水酸化ナトリウムの組み合わせ、または酢酸と炭酸ナトリウムの組み合わせが好ましく用いられる。
一方、高分子量のβ−１，３−グルカンを生産する観点からは、弱酸と強アルカリの組み合わせからなるpH調製剤が好ましく用いられる。具体的には、酢酸と水酸化ナトリウムの組み合わせを挙げることができる。
用いられる酸およびアルカリの各溶液の濃度は特に限定されないが、通常0.1 〜１０規定、好ましくは１〜５規定である。
添加量は、pHが 6.8〜8.5 の範囲を逸脱しない量であれば特に制限はなく、適宜適当量を添加するが、通常はpHセンサーと連動した添加装置が使用され、pHの変動値が±0.2 以内になるようにpH調製剤が添加される。
【００１２】
本発明においては、pH値、その変動幅、pH調製剤の組み合わせを種々設定することにより、所望の分岐度および分子量を有するβ−１，３−グルカンを生産することができる。
本発明においては、分岐度が60％以上の高分岐度のβ−１，３−グルカンを得ることができ、上記条件の設定により60〜95％の範囲の分岐度のものを目的に応じて調製することができる。
【００１３】
ここで分岐度は下記式で示される。
〔（分岐したβ−１，６−結合のグルコース単位の数）／（主鎖のβ−１，３−結合のグルコース単位の数) 〕×100(％）
すなわち、式［Ｉ］と式［II］を用いれば下記式で示される。
〔 [I]／([I]＋ [II])〕×100(％）
従って、本発明においては主鎖のβ−１，３−結合のグルコース単位１０に対し、分岐したβ−１，６−結合のグルコース単位が６以上、例えば６〜9.5 の割合で有する高分岐度のβ−１，３−グルカンを生産することができる。
【００１４】
分岐度の測定は通常ＮＭＲスペクトルにより行うことができる。
例えば、高分岐度のβ−１，３−グルカンを 100℃でジメチルスルホキシドに溶解し、100 ℃に保持したまま測定した13C −ＮＭＲスペクトルの１例を図１に示す。ここでＳ1 は式［Ｉ］中のＣ−６の炭素に帰属するピーク、Ｓ2 は式［Ｉ］および式［II］のＣ−３の炭素に帰属するピーク、Ｓ3 は式［Ｉ］および式［II］のＣ−１の炭素に帰属するピークである。この図１のδ値８4.5 〜87.0ppm 域のスペクトルを拡大したのが図２である。図２のδ値85.7ppm のシグナルＳa は式［Ｉ］のＣ−３炭素に帰属し、86.2ppm のシグナルＳb は式［II］のＣ−３炭素に帰属される。
【００１５】
さらに本発明においては、分子量を調整したβ−１，３−グルカンを得ることができる。
特にpH調整剤としての酸およびアルカリの組み合わせを適宜選択することにより所望の分子量を有するβ−１，３−グルカンを得ることができ、通常、数平均分子量が50万〜500 万（ゲル濾過法）のものが任意に得られる。
【００１６】
本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の炭素化合物、窒素化合物、無機塩などの必要な栄養成分を適宜含有する液体培地が用いられる。
炭素源としては、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、シュークロース、フラクトース、ビタミンＣなどが適宜用いられる。窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が用いられ、無機塩としては、リン酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などが用いられる。また必要に応じビタミンＢ1 を添加することもできる。
【００１７】
培養は、通常温度０〜60℃、好ましくは10〜40℃にて、通常１〜10日間、好ましくは２〜５日間、通気下に行われる。培養液中の溶存酸素量には特に制限はないが、10％以上、好ましくは15％以上に保つことがβ−１，３−グルカンの生産量を増加させるうえで好ましい。
本発明の好気培養においては、通常、培地を撹拌しながら培養が行われ、撹拌回転数は菌の生育とグルカンの生産が増大するに従い増加させる方法が採用される。この方法により溶存酸素量を10％以上に保つことができる。例えば、培養液の撹拌翼段数を２〜４段として撹拌回転数を培養初期は少なく、菌の生育とグルカンの生産に応じて徐々に増加させる。例えば培養初期では撹拌回転数を 200rpm で行い、グルカンの生産が増大するに従い、徐々に回転数を600rpmまで増加させることにより溶存酸素量を10％以上、好ましくは15％以上に保持して培養を行う。これによりβ−１，３−グルカンの生産量を大幅に増加させることができる。しかしながら、培養初期に撹拌回転数を必要以上に上げすぎると菌体に負荷がかかりすぎるため生産量は反対に低下してしまうので注意する必要がある。
【００１８】
培養終了後、培養液に遠心分離や濾過等の分離手段を施して培養液から菌体を除去し、培養上清からβ−１，３−グルカンを採取する。採取方法は特に限定されないが、培養上清に有機溶媒を加えてβ−１，３−グルカンを沈殿させる方法を好ましく用いることができる。有機溶媒としては特に制限はないが、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類等を好ましく用いることができ、特にエタノールが好ましい。得られるβ−１，３−グルカンはそのまま種々の用途に使用することができるが、用途に応じ精製することもできる。
【００１９】
本発明により得られるβ−１，３−グルカンは経口あるいは非経口投与によって抗腫瘍活性あるいは免疫賦活活性を示し、医薬としてあるいは食品添加剤、飼料添加剤として用いることができる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法により、高分岐度のβ−１，３−グルカンを高生産量で生産することができ、さらにその培養条件を適宜設定することにより所定の分岐度及び分子量を有するβ−１，３−グルカンを製造することが可能となった。
また、培養により培地が着色せず、着色していないβ−１，３−グルカンを得ることができ、精製が容易となった。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
オウレオバシディウム  プルランス(Aureobasidium pullulan）をポテトデキストロース寒天斜面培地で培養し、保存菌株とし、表１に示す組成を有する液体培地Ａ(pH5.0〜6.0)10mLを試験管に入れたものに接種して28℃、一夜培養した培養液１mLを集菌し、0.2 Ｍ酢酸緩衝液（pH5.6)１mLで２回洗浄後、0.04重量％のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む 0.2Ｍ酢酸緩衝液（pH5.6)を調製し、該溶液中に30℃で60分間静置して突然変異処理を行った。次に、この変異処理液を集菌し、0.2moL/L酢酸緩衝液（pH5.6)で洗浄した後、寒天培地（表２に示す組成を有する液体培地Ｂに寒天を1.5 重量％添加したもの）上に塗布して２〜３日間培養後、さらに４〜10℃の低温中に１〜２日静置した。低温に静置するとほとんどの菌株は緑黒色のコロニーを形成するが、無色あるいは着色量の少ないコロニーを選択した。この選択したコロニーについて500mL の坂口フラスコに培地Ａ 200mLを用いて、30℃、120rpmで４日間振とう培養した後にβ−１，３−グルカンの生産量を測定し、生産量の高い変異株を選別した。その結果を表３に示した。この変異株を工業技術院生命工業技術研究所に寄託し、受託番号FERM P-15096を得た。
【００２２】
【表１】
液体培地Ａの組成
スクロース              3 0   ｇ
ビタミンＣ                3   ｇ
NaNO3                     2.5 ｇ
K2HPO4                    0.4 ｇ
KH2PO4                    2.0 ｇ
KCl                       0.5 ｇ
MgSO4 ・ ７H2O             0.5 ｇ
FeSO4 ・ ７H2O             0.01ｇ
蒸留水                    1 Ｌ
pH                        6.0
【００２３】
【表２】
液体培地Ｂの組成
グルコース              3 0   ｇ
酵母エキス                2.0 ｇ
NaNO3                     0.5 ｇ
K2HPO4                    0.4 ｇ
KH2PO4                    2.0 ｇ
KCl                       0.5 ｇ
MgSO4 ・ ７H2O             0.5 ｇ
FeSO4 ・ ７H2O             0.01ｇ
蒸留水                    １Ｌ
pH                        6.0
【００２４】
【表３】
0003722522.tif 000003
【００２５】
【実施例２】
表４に示す組成の培地を調製し、pH7.0 に調整した。次に、実施例１で得られた変異株 (FERM P-15096) を２〜３白金耳でかきとり、試験管中に入れた上記培地10mLに植菌し、25℃、120rpmで往復振とう培養を３日間行い、さらに 500mLの坂口フラスコを用いて同様の培地 200mL中に２重量％になるように接種して30℃、120rpmで30時間振とう培養した後、２段のディスクタービン翼付きの５Ｌの小型発酵槽に同様の培地2.5 Ｌにフラスコ培養液を10重量％を植菌して、通気量１vvm 、撹拌回転数を200rpmから600rpmまで徐々に上げて溶存酸素量を15％以上に保持して28℃で４日間培養した。培養の間、pH調整剤はアルカリとして５Ｎ水酸化ナトリウムを、酸として５Ｎ塩酸を用い、添加によりpHを7.0 ±0.1 に調整して培養を行った。
【００２６】
培養後、約1.5 Ｌの水を加え、遠心分離機を用いて菌体を取り除いた。次いで、得られた培養上清を 120℃、20分間オートクレーブにより加熱した。その後、同量のエタノールを加えて室温で数時間撹拌した。得られた沈殿物を遠心分離により分取し、沈殿物に0.5 Ｎ水酸化ナトリウムを加えて室温で撹拌し、溶解させた。次に、未溶解物を取り遠心分離により除いた後、濃塩酸を用いて中和し、同量のエタノール中に添加してβ−１，３−グルカンを沈殿させた。得られたβ−１，３−グルカンの収量は15ｇ／Ｌであった。
得られたβ−１，３−グルカンの13C −ＮＭＲスペクトルを図３に示す。また85.0〜87.0ppm 域の拡大スペクトルを図４に示した。このスペクトルを測定したところβ−１，３−グルカンの分岐度は90％であり、また数平均分子量は 300万（ゲル濾過法）であった。
【００２７】
【表４】
培地の組成
グルコース                   5 0  ｇ
NaNO3                          2.5ｇ
K2HPO4                         1.7ｇ
KH2PO4                         0.7ｇ
KCl                            0.5ｇ
MgSO4 ・ ７H2O                  0.5ｇ
FeSO4 ・ ７H2O                  0.01 ｇ
蒸留水                      １Ｌ
【００２８】
【実施例３】
実施例２において、pHを変更した以外は実施例２と同様にし変異株の培養を行った。その結果を表５に示した。表５から明らかなように培養条件を変更することにより得られるβ−１，３−グルカンの分岐度を制御することができた。なお、いずれの場合においてもプルランを産生しなかった。
【００２９】
【表５】
0003722522.tif 000004
【００３０】
【実施例４】
実施例２において、pH調整剤を表６に示す各種酸とアルカリの組み合わせに変更した以外は実施例２と同様にして変異株の培養を行った。その結果を表６に示した。表６から明らかなよう  pH調整剤の組み合わせを適宜設定することにより得られるβ−１，３−グルカンの分子量を制御することができた。
【００３１】
【表６】
0003722522.tif 000005
【００３２】
【実施例５】
実施例２において、撹拌回転数を一定のまま培養した以外は実施例２と同様にして変異株の培養を行った。その結果を表７に示した。
表７から明らかなようにβ−１，３−グルカンの生産の増加に従い撹拌回転数を徐々に増加させて溶存酸素量１５％以上に保持した実施例２に比べ、生産量は低かった。
【００３３】
【表７】
0003722522.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】高分岐度のβ−１，３−グルカンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図１のδ値84.5〜87.0ppm 域を拡大したスペクトルを示す。
【図３】本発明の実施例２で得られた高分岐度β−１，３−グルカンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図３のδ値85.0〜87.0ppm 域を拡大したスペクトルを示す。
【図１】
0003722522.tif 000007
【図２】
0003722522.tif 000008
【図３】
0003722522.tif 000009
【図４】
0003722522.tif 000010