(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ゲノムの遺伝子１５に突然変異を有し、ＥＨＶ遺伝子１５によってコードされる抗原又はポリペプチドを産生することのできないＥＨＶ突然変異株。
【請求項２】
ＥＨＶ突然変異株が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子１５に突然変異を有するＥＨＶ−１であることを特徴とする請求項１に記載のＥＨＶ突然変異株。
【請求項３】
ＥＨＶ突然変異株が、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子１５に突然変異を有するＥＨＶ−４であることを特徴とする請求項１に記載のＥＨＶ突然変異株。
【請求項４】
突然変異が挿入及び／又は欠失であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のＥＨＶ突然変異株。
【請求項５】
突然変異が、ウマ病原体の抗原をコードする異種遺伝子を含む挿入であることを特徴とする請求項４に記載のＥＨＶ突然変異株。
【請求項６】
ＥＨＶゲノムの突然変異を含む遺伝子１５の領域及びそのフランキング配列を含む核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含んでいる組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子及びＥＨＶゲノムＤＮＡで培養細胞をトランスフェクトすることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のＥＨＶ突然変異株の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＥＨＶ突然変異株に感染させた細胞培養株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウマヘルペスウイルス突然変異株、ウマヘルペスウイルス核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした又はウマヘルペスウイルス突然変異株に感染させた宿主細胞、及び前記ウマヘルペスウイルス突然変異株を含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、潜在性疾病から致命的疾病に至る様々なウマ感染を引き起こす抗原の異なる生物学的要素群を含んでいる。
【０００３】
ウマヘルペスウイルス−１（ＥＨＶ−１）は至る所に存在し、流産の流行、気道疾患及び中枢神経系疾患に関連する経済的に非常に重要なウマ病原体である。幼少ウマの上方気道に一次感染すると熱性疾患が生じ、これは８〜１０日間続く。既に免疫のあるメスウマが気道から再度感染して、症状が現れないことがあり得る。その結果、一般に兆候なしに流産をおこす。神経系症候群は、呼吸器疾患又は流産に関連し、年齢を問わず両性の動物に作用して、共調不能、薄弱（ｗｅａｋｎｅｓｓ）及び後方マヒを引き起こし得る（Ｔｅｌｆｏｒｄ，  Ｅ．Ａ．Ｒ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９，  ３０４−３１６，１９９２）。
【０００４】
ＥＨＶ−２、即ちウマサイトメガロウイルスは、至る所に存在し、抗原が異種であり、通常成長が遅く、既知の疾病を引き起こさないウイルス群である。
【０００５】
ＥＨＶ−３、即ちウマコウ疹ウイルスは、メスウマ及びオスウマの比較的軽い生殖器表面の発疹を引き起こす病原体である。
【０００６】
以前にＥＨＶ−１の亜型２として分類されたＥＨＶ−４は、散発性ＥＨＶ−４誘発流産が報告されてはいるが、主に呼吸器疾患に関連する。
【０００７】
ＥＨＶのゲノム構造は、２個の共有結合セグメント（ＵL及びＵS）からなる二本鎖線状ＤＮＡ分子を含む他のαヘルペスウイルスのゲノム構造と類似している。ＵSセグメントは逆方向反復によりフランキングされている。
【０００８】
ＥＨＶ−１ゲノムの特性分析はＷｈａｌｌｅｙ，  Ｊ．Ｍ．等により報告されており（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５７，  ３０７−３２３，  １９８１）、ＥＨＶ−４ゲノムの特性分析はＣｕｌｌｉｎａｎｅ，  Ａ．Ａ．等により開示されている（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９，  １５７５−１５９０，１９８８）。
【０００９】
ＥＨＶの分子生物学に関する研究の大半はＥＨＶ−１に関するものであった。最近、ＥＨＶ−１の完全ＤＮＡ配列が１９９２年にＴｅｌｆｏｒｄ等により発表された（上掲）。ゲノムが約１５０，０００ｂｐからなることが判明し、現在までに７６個の異なる遺伝子が認識されている。これらの遺伝子は、ＥＨＶ−１ゲノム上に正確にマッピングされ、これらの遺伝子と対応するＨＳＶ−１類似体との関係がこの文献内で決定されている。これは、ＨＳＶ−１類似体ＵL４５と共直線性のＥＨＶ−１ゲノムのＵLセグメント内にマッピングされた遺伝子１５を含んでいる。以前には、ＥＨＶ−１の（糖）タンパク質をコードする数種の遺伝子、例えばｇＢ（Ｗｈａｌｌｅｙ，  Ｊ．Ｍ．等，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０，  ３８３−３９４）、ｇＣ（Ａｌｌｅｎ，  Ｇ．Ｐ．等，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２，  ２８５０−２８５８，  １９８８）、ｇＤ，ｇＩ，ｇＥ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，  Ｊ．Ｃ．等，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１，  ２９６９−２９７８，  １９９０）、ｇＨ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｇ．Ｒ．等，ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １，  ２４１−２４９，  １９９１）、及びＴＫ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｇ．Ｒ．等，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １６，  １１３０３−１１３１７，  １９８８）がマッピングされた。
【００１０】
ＥＨＶ−４の（糖）タンパク質をコードする数種の遺伝子、例えばｇＨ及びｇＢ（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，  Ｌ．等，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１，  １７９３−１８００，  １９９０）、ｇＥ（Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ，  Ａ．等，１９８８、上掲）、ＴＫ（ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４５）、並びにｇＣ（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，  Ｌ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９，  ３７８−３８７，  １９９０）のマップ位置及びヌクレオチド配列も決定されている。後者は、ＥＨＶ−１遺伝子１５類似体のヌクレオチド配列も開示している。
【００１１】
更に、ＥＨＶ−１遺伝子及びＥＨＶ−４遺伝子が互いに非常に共直線性であり、またＨＳＶ−１の対応部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）とも共直線性であることが実証された（Ｔｅｌｆｏｒｄ等、１９９２年、  上掲；  Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ等、１９８８年、上掲）。このことは、特定ウイルスのある遺伝子が他のヘルペスウイルスに位置的な対応部分を有することを示している。
【００１２】
【発明が解決しようする課題】
ワクチン接種によるＥＨＶ感染の抑制は長年探求されてきた目標であった。これらのウイルスに対する現在のワクチンは化学的に不活化したウイルス又は弱毒生ウイルスを含んでおり、これらは多数回の投与を必要とし、また効能が限定されている。
【００１３】
不活化ワクチンは一般に、ごく低レベルの免疫を誘発し、追加免疫を必要とし、不利にはアジュバントを必要とし、且つ製造コストが高い。更には、幾つかの感染ウイルス粒子は不活化処理しても生存し、動物への投与後に疾病を引き起こす。
【００１４】
一般には、弱毒生ウイルスワクチンの方が、（しばしば体液及び細胞で）長時間持続する免疫応答を誘発し、製造も簡単なために好ましい。
【００１５】
今日までのところ、組織培養でビルレント株の連続継代によって弱められた生ウマヘルペスウイルスを主成分とする弱毒生ウマヘルペスウイルスワクチンしか市販されていない。しかしながら、この処理によって、非調整（ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）突然変異がウイルスゲノム内に導入されて、毒性及び免疫性が異質なウイルス粒子集団となる。更には、このような従来の弱毒生ウイルスワクチンが毒性を取り戻すことによって、接種動物が羅患し、病原体が他の動物に蔓延する可能性があり得ることはよく知られている。更には、既存の弱毒生ウマヘルペスウイルスワクチンでは、ウマヘルペスウイルス感染について陽性血清試験が得られている。かくして、既存のウマヘルペスウイルスワクチンでは、特定動物がビルレントウイルスの（潜伏）キャリアーであるのか、それともワクチン接種を受けているのかを（血清）試験、例えばＥｌｉｓａで決定することはできない。
【００１６】
更には、ウマヘルペスウイルス株をウマヘルペスウイルス感染及び他のウマ病原体を共に防御するワクチンとして使用することができれば有利であろう。これは、ウマヘルペスウイルスの複製によってウマヘルペスウイルス抗原及び他のウマ病原体の抗原が共に発現されるように、ウマ病原体の関連抗原をコードする遺伝子をウマヘルペスウイルスのゲノム内に挿入することにより達成され得る。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＥＨＶの遺伝子１５に及ぶ領域内のＥＨＶゲノムに突然変異を含んでいるＥＨＶ突然変異株を提供する。
【００１８】
突然変異とは、前記領域の遺伝子情報が、天然ＥＨＶのゲノムの同領域に存在する遺伝子情報に対して変化することと理解する。
【００１９】
突然変異は例えば、核酸の置換、欠失、挿入若しくは逆位、又はこれらの組み合わせであり、これらによって、ＥＨＶ遺伝子１５によってコードされる任意の抗原又は機能ポリペプチドを産生することのできないＥＨＶ突然変異株が生じる。
【００２０】
好ましくは、ＥＨＶゲノムの限定された領域に導入された突然変異は、ＥＨＶ遺伝子１５の全体若しくは一部分の欠失、及び／又はその部分への異種核酸配列の挿入である。
【００２１】
特に、本発明は、ＥＨＶの遺伝子１５に及ぶＥＨＶゲノムの領域に導入された異種核酸配列を含んでいることを特徴とする挿入ＥＨＶ突然変異株を提供する。
【００２２】
本発明のＥＨＶ突然変異株は、入手可能な任意のＥＨＶ株、例えば株Ｍ８、Ａｂ４、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｄ又はＴ４３１及び１９４２から誘導され得る。
【００２３】
本明細書で使用する“挿入ＥＨＶ突然変異株”という用語は、異種核酸配列、即ちＥＨＶ内に天然に確認されるＥＨＶ遺伝子１５内には存在しない核酸配列を含んでいるＤＮＡのウイルスゲノム内への取り込みによって遺伝学的に修飾した感染性ウイルスを意味する。
【００２４】
挿入ＥＨＶ突然変異株によって細胞が感染すると、細胞は、異種ポリペプチド形態で異種遺伝子を発現し得る。
【００２５】
“ポリペプチド”という用語は、アミノ酸の分子鎖を意味し、産物の特定長さを意味するものではなく、必要とあれば、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によってｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾させることができる。従って、とりわけペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に包含される。
【００２６】
有用なＥＨＶ突然変異株の前提条件は、異種核酸配列の挿入のような突然変異が、ＥＨＶの重要な機能（例えば感染又は複製に必要な機能）を破壊せずに、ＥＨＶゲノムの任意の位置又は領域、即ち突然変異の取り込みのために使用され得る位置又は領域に取り込まれることである。
【００２７】
本発明で取り上げた突然変異の取り込みのための領域、即ちＥＨＶの遺伝子１５は以前は、非重要領域であるとして同定されなかった。驚くべきことに、ＥＨＶの重要な機能を破壊せずに、異種核酸配列の挿入又はこの領域（の一部分）の欠失のような突然変異が許容されることが判明した。
【００２８】
予期しないことであったが、先に規定した領域内への突然変異の導入が、ＥＨＶ突然変異株の防御性に作用せずに、生ＥＨＶ突然変異株の毒性を弱めることが判明した。この発見により、例えば前記領域内に欠失又は挿入をもたらすことによって弱毒ＥＨＶ突然変異株の産生が可能となる。この突然変異株は、ワクチン接種すべき動物に生形態で投与することができる。
【００２９】
“ＥＨＶの遺伝子１５”という用語は本明細書では、ＥＨＶの型とは関係なく、糖タンパク質Ｃ相同体（ｇＣ）をコードする遺伝子に隣接し、更には遺伝子１５の読み取り枠（ＯＲＦ）の５’フランキング遺伝子間配列、即ちｇＣ相同体をコードする遺伝子と遺伝子１５との間のヌクレオチド配列を含んでいるＥＨＶゲノム３’に存在するＯＲＦを同定するために使用する。
【００３０】
ＥＨＶ−１のｇＣ相同体をコードする遺伝子の正確な位置は（ＢａｍＨＩ  Ｈ断片上に）マッピングされ、１９８８年にＡｌｌｅｎ等により配列決定されている（上掲）。ＥＨＶ−４については、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等から同様の情報が入手可能である（１９９０年、上掲）。
【００３１】
ＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４の遺伝子１５はそれぞれ、Ｔｅｌｆｏｒｄ等（１９９２年、上掲）及びＮｉｃｏｌｓｏｎ等（１９９０年、上掲）により同定されている。しかしながら、ＥＨＶの遺伝子１５とＨＳＶ−１又はＶＺＶに位置的対応部分を有する遺伝子との間に配列の相同性は存在しないように思えた。
【００３２】
ＥＨＶ−１の遺伝子１５のＯＲＦは塩基対２１１７０（開始）−２０４８７（終止）に及び（Ｔｅｌｆｏｒｄ等、１９９２年、上掲）、２２７アミノ酸を有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す）。
【００３３】
ＥＨＶ−４の遺伝子１５のＯＲＦは、塩基対２１１０（開始）−２７９０（終止）に及び（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等、１９９０年、上掲）、２２６アミノ酸を有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号３及び４に示す）。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様では、ＥＨＶ突然変異株は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域内に突然変異を有するＥＨＶ−１であるか、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域内に突然変異を有するＥＨＶ−４である。
【００３５】
特に、前記領域は、それぞれ配列番号１（ＥＨＶ−１）又は配列番号３（ＥＨＶ−４）に示すヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
各ＥＨＶゲノムのＤＮＡ配列については、個々のＥＨＶウイルス間に自然変異が存在し得ることが理解されよう。これらの変異は１個以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位又は付加となり得る。
【００３７】
上記ＥＨＶ変種は、本明細書に記載の遺伝子１５の配列とは異なる対応遺伝子１５をコードし得る。かかる変種ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１及び３に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズしたり、物理マップを比較して前記遺伝子をコードする類縁領域の位置を決定するなど、幾つかの方法でその位置を決定し得る。従って本発明は、任意のＥＨＶ株から入手可能な突然変異を導入する領域を与える。
【００３８】
更に、上記領域のＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ配列をもたらす上記変種を生じる遺伝子工学技術を使用し得る可能性もある。かかる関連ＤＮＡ配列を特徴とする突然変異がＥＨＶゲノム内に位置する領域中に取込まれたＥＨＶ突然変異株も本発明の範囲内に含まれることは明らかである。
【００３９】
更に、上記領域はウイルスの必須機能を示さないので、該領域を一部または全部欠失させ、次いで所望であれば異種核酸配列を前記欠失中に取込むことができる。
【００４０】
遺伝子１５の挿入不活化のためにＥＨＶゲノム中に挿入される異種核酸配列は、例えばウイルス、原核細胞、真核細胞または合成物質などの任意の供給源から誘導し得る。
【００４１】
本発明の特定の実施態様においては前記挿入異種核酸配列は非コーディングオリゴヌクレオチドであり、その長さ及び配列は限定的ではないが、長さは８〜１００ヌクレオチドであるのが好ましい。
【００４２】
極めて適当な非コーディングオリゴヌクレオチドは、適当な、例えば固有の制限酵素切断部位のほかに、存在し得る読み枠のそれぞれに、両方向で翻訳終結コドンを含む。
【００４３】
本発明の別の目的は、ウマヘルペスウイルス感染に対するワクチンだけでなく他のウマ感染症に対するワクチンをも製造するために使用し得る突然変異ウマヘルペスウイルスを提供することである。安全な弱毒化ウマヘルペスウイルス突然変異株の生体をベースとするかかるベクターワクチンは、免疫宿主の感染細胞内で他の病原体の抗原を発現することによりその病原体に対して免疫化する可能性を与えるが、これは、特定のウマヘルペスウイルスとは異種のポリペプチドをコードする異種核酸配列を、上記のウマヘルペスウイルスゲノムの領域に挿入することにより得ることができる。
【００４４】
前記異種核酸配列は、ウマインフルエンザウイルス、ウマロタウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、動脈炎ウイルス、脳炎ウイルス、ウマボルナ病ウイルス、ウマベルネ（Ｂｅｒｎｅ）ウイルス、Ｅ．ｃｏｌｉまたはストレプトコッカス・エクイヌスのごときウマ病原体の抗原をコードし得る。
【００４５】
異種とは、特定タイプのＥＨＶ、例えばＥＨＶ−１を、別のタイプのＥＨＶ、例えばＥＨＶ−４の抗原をコードする核酸配列を取込むためのベクターウイルスとして使用したり、またはこの逆を行い得ることを意味する。
【００４６】
ＥＨＶ突然変異株による異種核酸配列の発現には、該異種核酸配列に操作可能に連結された適当なプロモーターが必然的に要求される。
【００４７】
プロモーターの選択は、真核細胞、原核細胞、または、ＥＨＶ突然変異株に感染した細胞内で遺伝子転写を誘導し得るウイルスプロモーター、例えばレトロウイルス長鎖末端反復配列（Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，１４２２−１４２７，１９８０）またはサイトメガロウイルス直前（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）プロモーター（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｃｅｌｌ  ４１，５２１−５３０，１９８５）にまで及ぶことは当業者には明らかである。
【００４８】
ＤＮＡ配列をクローニングベクター中に挿入する公知の方法及びｉｎ  ｖｉｖｏ同種組換えまたはコスミドクローニング技術を使用し、突然変異をウマヘルペスウイルスゲノム中に導入し得る（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（１９８２），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；欧州特許出願第７４．８０８号明細書；Ｂ．及びＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，１２０８；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ら，（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，７３５１）。
【００４９】
簡単に述べると、これは、ウマヘルペスウイルスＤＮＡを用いて組換えするための組換えＤＮＡ分子を構築することにより行い得る。かかる組換えＤＮＡ分子は、任意の適当なプラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージから誘導し得、上記同定領域のウマヘルペスウイルスＤＮＡを含むベクターＤＮＡを含む。
【００５０】
適当なクローニングベクターの例としては、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２）、種々のｐＵＣ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、コスミドベクター（例えばＴＨＶ、ｐＪＢ８、ＭＵＡ−３及びＣｏｓＩ）、バクテリオファージ（例えばλ−ｇｔ−ＷＥＳ−λ  Ｂ、カロン２８及びＭ１３ｍｐファージ）またはウイルスベクター（例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマ及びアデノウイルス）が挙げられる。本発明に使用されるベクターは更に、例えばＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８のごとき文献に略述されている。
【００５１】
上記領域に導入する欠失は、まず、切断部位が遺伝子１５の読み枠内またはその近傍に正確に位置する１種以上の酵素を用いて制限酵素消化することによりＥＨＶの遺伝子１５を担う組換えＤＮＡ分子内に導入し得る。残りの組換えＤＮＡ分子を再環化すると、上記同定領域内に存在するコーディング配列の少なくとも一部が欠失した誘導体がもたらされ得る。或いは、遺伝子１５の配列内に存在する制限酵素切断部位内から出発して１つまたは２つの方向で順次欠失（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を導入してもよい。ＢａｌＩ、Ｂａｌ３１またはエキソヌクレアーゼＩＩＩのごとき酵素をこのために使用し得る。再環化した分子をＥ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、上記領域内に導入された欠失の寸法を決定するために、個々のコロニーを制限マップ作成によって分析することができる。欠失の正確な位置は配列決定によって決定し得る。
【００５２】
異種核酸配列の挿入が所望される場合は、ＥＨＶ遺伝子１５を含む組換えＤＮＡ分子を適当な制限酵素で消化して直線状分子を生成し、次いで所望であればプロモーターに結合させた異種核酸配列を該直線状分子に連結し、更に組換えＤＮＡ分子を再環化し得る。
【００５３】
必要によっては、異種核酸配列の挿入と同時にＥＨＶ遺伝子１５中に欠失を導入する。
【００５４】
ＥＨＶ遺伝子１５を切断するために使用される適当な制限酵素は例えばＳｃａＩ（ＥＨＶ−１）及びＢｇｌＩＩ、ＮａｒＩまたはＸｂａＩ（ＥＨＶ−４）である。
【００５５】
本発明のＥＨＶ突然変異株の製造にｉｎ  ｖｉｖｏ同種組換え法を適用する場合は、欠失遺伝子１５配列または挿入異種核酸配列にフランキングするＥＨＶ配列は、ウイルスＥＨＶゲノムによるｉｎ  ｖｉｖｏ同種組換えが起こるのに適当な長さ、例えば５０〜３０００ｂｐであるべきである。
【００５６】
続いて、細胞、例えばウマ皮膚細胞（ＮＢＬ−６）のごときウマ細胞または例えばＰＫ１３、Ｖｅｒｏ及びＢＨＫ細胞のごとき他の種由来の細胞を、適当なＥＨＶ配列によってフランキングされた突然変異を含む組換えＤＮＡ分子の存在下にＥＨＶ  ＤＮＡを用いてトランスフェクトすると、組換えＤＮＡ分子中のＥＨＶ配列とＥＨＶゲノム中の対応配列との間で組換えが起こる。
【００５７】
次いで組換えウイルスの子孫を細胞培養物中で生産し、それを例えばハイブリダイズしたり、異種核酸配列と同時に組込まれた遺伝子によってコードされる酵素活性を検出したり、組換えＥＨＶによって免疫的に発現される抗原性異種ポリペプチドを検出するなど、遺伝子型及び表現型によって選択し得る。組換えウイルスは、ネオマイシン、ゲンタンマイシンまたはミコフェノール酸のごとき化合物に対する耐性に基づいて陽性のものを選択することもできる。選択したＥＨＶ突然変異株を細胞培養物中で大規模に培養し、前記ＥＨＶによって発現される物質または異種ポリペプチドを含むＥＨＶ突然変異株をそこから回収することができる。
【００５８】
或いは、全ＥＨＶゲノムを包含する複数の一部重複フラグメントを含むと共に、１つのコスミドは突然変異遺伝子１５を含むＥＨＶゲノムの１つのフラグメントからなるコスミドセットの同時トランスフェクションによって（ｄｅ  Ｗｉｎｄ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ６４，４６９１−４６９６，１９９０）、本発明のＥＨＶ突然変異株を生産することもできる。
【００５９】
本発明のＥＨＶ突然変異株を生産するために使用し得る極めて適したコスミドセットは実施例１に示す。ＥＨＶ−１遺伝子１５は、ｂｐ．１〜４２７５０に広がるコスミド２Ｄ３内にクローニングされたＥＨＶ−１挿入物中に位置する（番号はＴｅｌｆｏｒｄら，１９９２，前出から誘導されてたものである）。
【００６０】
別の好ましい実施態様においては、本発明は上記のごときＥＨＶ突然変異株を提供するが、この突然変異株は更に、ＥＨＶゲノムの別の遺伝子内の突然変異、所望であれば弱毒化突然変異、特に欠失または挿入を含む。
【００６１】
上記突然変異は、遺伝子がもはや機能性ポリペプチドを発現できずに毒性が低下したＥＨＶ突然変異株を生じるような遺伝子の失活化をもたらし得る。これは、例えばｇＥ、ＴＫ、ＲＲまたはＵL２１をコードする遺伝子（Ｔｅｌｆｏｒｄら，１９９２，前出；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，１９８８，前出；国際特許出願公開第ＷＯ  ９２／０１０４５号明細書）内に突然変異を導入することにより行い得る。
【００６２】
本発明の生きたＥＨＶ突然変異株、特に特定のウマ病原体の１種以上の異種ポリペプチドを発現する生きたＥＨＶ突然変異株を使用してウマを予防接種し得る。かかる生ベクターワクチンによる予防接種のあとは、好ましいことに接種宿主においてＥＨＶ突然変異株が複製され、ＥＨＶポリペプチドと一緒に異種ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。接種宿主において発現されたポリペプチドは、ＥＨＶ及び特定の病原体の両方に対して免疫応答を誘起する。特定の病原体から誘導される異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を刺激し得る場合、本発明のＥＨＶ突然変異株を接種された動物は、その病原体による感染に対して免疫となる上に、ＥＨＶによる感染に対しても免疫となる。即ち、本発明のＥＨＶゲノムの領域に取り込まれた異種核酸配列はｉｎ  ｖｉｖｏで継続的に発現され、ウマ病原体に対する確実で安全な、長期持続性のある免疫を与える。
【００６３】
１種以上の異種ポリペプチドを含有及び発現する本発明のＥＨＶ突然変異株は一価または多価ワクチンとして作用し得る。
【００６４】
生ワクチン製造のためには、本発明のＥＨＶ突然変異株をウマ由来の細胞培養物または他の種由来の細胞上で増殖させ得る。このように増殖させたウイルスを、組織細胞培養液及び／または細胞を回収することにより入手し得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造することもできるし、凍結乾燥してもよい。
【００６５】
免疫有効量のＥＨＶ突然変異株に加え、ワクチンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得る。
【００６６】
本発明に有用な医薬的に容認可能な担体または希釈剤の例としては、安定剤（例えばＳＰＧＡ）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、しょ糖、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミンまたはカゼイン）、タンパク質含有物（例えばウシ血清またはスキムミルク）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。
【００６７】
必要によっては、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムもしくは酸化アルミニウム、油性エマルジョン（例えばＢａｙｏｌＦ(R)またはＭａｒｃｏｌ  ５２(R)）、サポニンまたはビタミンＥ可溶化物が挙げられる。
【００６８】
有効な投与量は、対象動物の年齢及び体重並びに投与形態に従って変わる。適当な用量は例えばウマ１頭当たり１０3・0〜１０8・0  ＴＣＩＤ50のＥＨＶ突然変異株であり得る。
【００６９】
また、本発明のＥＨＶ突然変異株を使用して不活化ワクチンを製造することもできる。
【００７０】
動物に投与するためには、本発明のＥＨＶ突然変異株は特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与え得る。
【００７１】
【実施例】
実施例１
ＥＨＶ-１ウィルスを発生させるためのコスミドの構築
スーパーコス(SuperCos)１コスミドベクターキットを、ストラタジーン社（カタログ＃２５１３０１）から購入した。このベクターに更なる制限酵素部位を付加することにより、更に修飾した。以下の制限酵素部位：ＢａｍＨＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、およびＢａｍＨＩを含有するＤＮＡリンカーをファルマシア社から購入した。スーパーコス１ベクターおよびリンカーの両方を、製造元の指示書に従いＢａｍＨＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で切断した。ＢａｍＨＩで消化したベクターを製造元の指示書に従いアルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ社）で脱燐酸化した。ＢａｍＨＩで消化したリンカーを、次いで、製造元の指示書に従いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）でスーパーコス１ベクター中にライゲーションした。次いで、その結果できたベクターを、更にＥＨＶ-１インサートのクローニング用に用いた。
【００７２】
ＥＨＶ-１感染の重度の兆候を示すウマから単離した病原性ＥＨＶ-１菌株であるＥＨＶ-１  Ｍ８菌株からウィルスのＤＮＡを得た。この菌株を、ベロ(Vero)細胞の集密的細胞単層上で１：１のＭＯＩでインキュベーションした。８０％ＣＰＥ細胞で４日後、上澄の凍結、解凍を３回繰り返した。細胞の構成成分を取り除くために、ソーバル(Sorval)高速遠心機（ＲＣ-５Ｃ）内で５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた。次いで、上澄を取りだし、ベックマンの超遠心機（Ｌ８-７０）内で１９，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけた。ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。各々１０ｍＭおよび２％の最終濃度になるようにＥＤＴＡおよびＳＤＳを加えウィルスを溶解することによりＤＮＡ抽出を行った。
【００７３】
この混合物を、次いで、もはや境界面が観察されなくなるまで標準技法により少なくとも３回フェノールで抽出した。次いで、ＤＮＡを、２倍量の１００％エタノールで室温で沈澱させた。１２０００ｒｐｍで１０分間回転させた後、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。次いで、ペレットを風乾し、水に再懸濁した。
【００７４】
ＥＨＶ-１ＤＮＡを切断または消化してコスミドセットに必要なインサートを得た。ＥＨＶ-１ＤＮＡをＰａｃＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化することによりコスミドを構築した。Ｍ８  Ｐａｃ-１消化物をフェノールで抽出した後、その末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）で平滑処理し、次いで、製造元の指示書に従ってアルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ社）で脱燐酸化した。コスミドベクターをＥｃｏＲＶ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化し、インサートをＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）でベクター内にライゲーションした。ライゲーションミックスを、製造元の指示書に従いパッケージングミックス（Gigapackパッケージング抽出物、ストラタジーン社）内にパックした。パックしたＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１を一晩培養した新鮮な培養物に加え、３７℃で１時間静置した。細菌懸濁液を、次いで、アンピシリンを含有する寒天プレート上に広げた。制限酵素分析によりそのインサートについて全てのコロニーを分析した。別のコスミド構築のために同様の手法に従ったが、但し、ウィルスのＤＮＡは、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＲｓｒＩまたはＮｏｔＩで消化し、次いで、全ての末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、ベクターのＥｃｏＲＶ部位内にインサートをライゲーションした。コスミドの第三世代を得るために、ウィルスのＤＮＡを、１９Ｇニードルを介して２回切断し、末端を、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、フェノール抽出および沈澱後、インサートを、コスミドベクターのＥｃｏＲＶ部位内に再度クローンした。インサートを有するベクターを、次いで、パックし、細菌に導入し、コロニーを分析した。得られた全てのコロニーから、多重消化により制限酵素地図を決定した。次いで、クローンの制限酵素地図とＥＨＶ-１の制限酵素地図とを比較することにより異なるクローンの位置を決定した。これらの方法により生じた全コスミドおよびそれらの特徴を図１にまとめた。これらのデータに基づいていくつかのコスミドセットを形成し、新規なウィルスを生じさせるその能力について検査した。表１に示したコスミドセットを用い、生存ウィルスを再生することが可能である。ウィルスの再生のために、Ｓｃｅ-Ｉ（ニューイングランドバイオラボ社）消化によりＥＨＶ-１インサートをコスミドから切り取った。次いで、ＢＨＫ細胞の集密的細胞単層を、燐酸カルシウム法により各コスミドのセット０．２μｇでトランスフェクションした。この方法で、トランスフェクション１回当たり生存ウィルスが存在する３０個以上のプラークを得た。
【００７５】
【表１】
0003710838.tif 000002
【００７６】
（菌株Ａｂ４のそれとの比較から誘導されるナンバリング）。
【００７７】
実施例２
ＥＨＶ-１遺伝子１５ミュータントの作製
遺伝子１５を不活性にするために、１００μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドの存在下、コスミド２Ｄ３をＳｃａＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化した。ＳｃａＩは、コスミド２Ｄ３内で６箇所切断するが、エチジウムブロマイドの存在下で消化を行うことによる全鎖長直鎖のコスミド分子の産生は、好都合である。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）により平滑末端コスミドにし、次いで、これらの末端を、アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。全解読枠内に３個の終結コドン、およびＩ-ＰｐｏＩ認識配列（配列番号：５）を含む５７ｂｐリンカーを直線化した２Ｄ３内にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＩの形質転換後に生じた全てのクローンを、制限酵素分析により分析した。遺伝子１５のみにリンカーインサートを有するクローンを単離した。遺伝子１５  ２Ｄ３／１５ｓｉ（図２および表１）中のコスミド２Ｄ３をリンカーインサートを有するコスミドで置換し、上記のような形質転換を行うことにより、ミュータントウィルスの再生を行った。再生したウィルスは、プラークを３回精製し、制限酵素分析により分析した。
【００７８】
実施例３
遺伝子１５組換え体ＥＨＶ-１の作製
１．遺伝子１５欠失／挿入ミュータントの構築
ＥＨＶ-１コスミド２Ｄ３をＢａｍＨＩで消化した。その結果できた、遺伝子１５相同体（２０４８７-２１１４６）を含有する７ｋｂ断片（１９３９８-２６２６０）を、ｐＩＣ２ＯＨ（Marsh, J.L., Erfle, M. and Wykes,  E. J. 1984, Gene 32, 481-485)のＢａｍＨＩ部位内にクローンした。ＳｔｕＩを用い、遺伝子１５内で（２０７１９で）このプラスミド構築物を直線化した。直線化プラスミドを、次いで、Ｂａｌ  ３１エキソヌクレアーゼ消化に供し、インキュベーション時間を変えてインキュベーションした後、プラスミドを平滑末端にし、配列番号：５のオリゴヌクレオチドにライゲーションし、再環状化して遺伝子１５の欠失した部分にリンカーインサートを有するプラスミドを作製した。この構築物を７Ｇ５と命名した。制限酵素地図作製および、配列番号：５に示したオリゴヌクレオチド内のＣＭＡおよびＣＭＢ部位を用いた配列決定により、欠失の範囲を測定し、挿入を確認した。欠失は、ヌクレオチド２０６３９から２０８９４までとして示した。遺伝子１５を含有する６００塩基対断片を生じさせる、７Ｇ５のＤｒａＩ／ＮｒｕＩ二重消化により二番目の遺伝子１５欠失／挿入構築物を作製し、これを、ｐＧＥＭ-３ＺのＳａｌＩ部位にクローンした。この構築物を遺伝子１５-Ｅ３と命名した。
【００７９】
２．７Ｇ５および遺伝子１５-Ｅ３のＥＨＶ-１  ＤＮＡを用いたコトランスフェクション
ストラタジーン燐酸カルシウムプロトコールを用い、直径８ｃｍの組織培養プレート上でＢＨＫ細胞またはブタの腎臓（ＳＫ）細胞の細胞単層に、６μｇのＥＨＶ-１ゲノムＤＮＡおよび細胞（乳児ハムスターの腎臓、ＢＨＫ）ＤＮＡ調製物ならびに２μｇの７Ｇ５もしくは遺伝子１５-Ｅ３をトランスフェクションした。ＤＮＡ-燐酸塩沈澱物と共に５時間インキュベーションし、細胞を、ヘペス緩衝生理食塩水（ｐＨ６．９）に加えた２５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで３分間″ショック″をかけた（トランスフェクション効率を高めるために）。培地中での２回の洗浄後、細胞は、２％仔ウシ胎児血清を有するＭＥＭに加えた１．５％低融点アガロースを重層し、３７℃でインキュベーションした。４-５日培養後、プラークを観察した。この時点で重層を取りだし、４℃で貯蔵した。細胞単層をニトロセルロースフィルターに接着し、１．５Ｍ-塩化ナトリウム／０．５Ｍ-水酸化ナトリウムに浸したワットマンの濾紙上で５分間インキュベーションすることにより細胞を破裂（または、ＤＮＡを変性）させた。１Ｍ-トリスＣｌ（ｐＨ７．４）／１．５Ｍ-塩化ナトリウムでアルカリを中和し、２ｘＳＳＣで２回洗浄し、濾紙を真空オーブン内で８０℃で２時間加熱した。濾紙を１Ｍ-塩化ナトリウム／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで７０℃で３０分間洗浄して蛋白および細胞破片を除去し、続いて、Ｈ-ミックス（１Ｍ-塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび４ｘデンハルト液を含有する１０ｍＭ-トリスＣｌ（ｐＨ８．０））中で６０℃で３０分間プレハイブリダイゼーションした。配列番号：５の32Ｐ-末端標識した一本鎖またはアンチセンスストランドを、次いで、Ｈ-ミックスに加え、濾紙を一晩ハイブリダイゼーションした。全てのものが０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣおよび０．５ｘＳＳＣを用い、６５℃で一連の１５分の洗浄により、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルを除去した。濾紙を、-７０℃で２日間Ｘ線フィルムに露出した。
【００８０】
３．組換え遺伝子１５-ＥＨＶ-１の同定および検証
オリジナルのプレート上のプラークの位置、オートラジオグラフのスポットおよびオリエンテーション（プレート、重層、フィルターおよびフィルム上に印をつけた）を用い、アガロースのプラグを可能性のある組換えプラークの位置で重層からパンチした。これらを０．５ｍｌの培地と共に撹拌してウィルスを放出させ、更にＳＫまたはＢＨＫ細胞を感染させるのに用いた。これらの感染物から得た上澄を段階希釈により用いて更にＳＫまたはＢＨＫ細胞を感染させ、これを、ウィルス吸着後、重層し、次いで、オリジナルのコトランスフェクションのために上記で述べたものと同じ方法で処理した。プラークを１または２回精製した後、配列番号：５のアンチセンスストランドで大部分のプラークがハイブリダイズしたことを観察した。その結果、４個のプラークから精製したウィルスを取り上げ、大きいフラスコのＢＨＫまたはＳＫ細胞を感染させるのに用いた。ＤＮＡをこれらの細胞（オリジナルのコトランスフェクションに用いたような、ウィルスおよび細胞ＤＮＡのミックス）から精製し、ＰＣＲによる分析およびＤＮＡ配列決定（ＣＭＡおよびＣＭＢを用い）に供してウィルスゲノム内の欠失／挿入遺伝子１５ミュータントの存在を確認した。
【００８１】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６８４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
起源
生物名：ウマヘルペスウイルス１
株名：Ａｂ４
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．６８４
配列：
【００８２】
【表２】
0003710838.tif 000003
【００８３】
配列番号：２
配列の長さ：２２７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
【００８４】
【表３】
0003710838.tif 000004
【００８５】
配列番号：３
配列の長さ：６８１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
起源
生物名：ウマヘルペスウイルス４
株名：１９４２
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．６８１
配列：
【００８６】
【表４】
0003710838.tif 000005
【００８７】
【表５】
0003710838.tif 000006
【００８８】
配列番号：４
配列の長さ：２２６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
【００８９】
【表６】
0003710838.tif 000007
【００９０】
配列番号：５
配列の長さ：５７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表わす記号：−
存在位置：１．．５７
他の情報：／ラベル＝合成リンカー
配列：
【００９１】
【表７】
0003710838.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】  生成された全ての、ＥＨＶ−１ゲノムの表記のフラグメントを含む一部重複コスミドをまとめて示す図である。上段はＥＨＶ−１ゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素マップを示す。
【図２】ＥＨＶ−１遺伝子１５-突然変異株の一般生産方法を示す。
【図３】遺伝子１５プラスミド欠失構築物を示す。
【図１】
0003710838.tif 000009
【図２】
0003710838.tif 000010
【図３】
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