(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーによって核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するプライマー伸長方法であって、
該プライマーの３’末端から相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸（プライマー相補核酸）またはその誘導体が連結されたプライマーの存在下で、プライマーと鋳型鎖との反応を行い、かつプライマー相補核酸またはその誘導体の鎖長が、プライマーよりも短いことを特徴とする方法。
【請求項２】
プライマー、プライマー相補核酸、および鋳型鎖が、それぞれ独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマー相補核酸またはその誘導体が、その一部にプライマーと相補的でないヌクレオチドを含むものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プライマー相補核酸またはその誘導体が、その一部にプライマーと弱く水素結合をするヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーと、プライマー相補核酸またはその誘導体とが直接または間接的に連結された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーと、プライマー相補核酸またはその誘導体とがリンカーによって連結されたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
プライマーに相補的な核酸の誘導体がペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
プライマー伸長法が、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＲ法、ＳＤＡ法、Ｐ／ＬＣＲ法、およびサンガー法からなる群から選択されるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プライマー伸長法においてプライマーの非特異的伸長を抑制する方法に関する。
【０００２】
背景技術
核酸の鋳型（テンプレート）に相補的な核酸を形成するプライマー伸長反応は、生体内で重要な役割りを演じているのみならず、遺伝子工学においても不可欠な技術として利用されている。すなわち、鋳型およびそれに相補的なプライマーが二本鎖を形成し、ポリメラーゼによってモノヌクレオチドをプライマーの３′末端に鋳型と相補的に付加していくものである。Ｖａｒｙ等は上記鋳型依存的プライマー伸長反応を利用する核酸の検出法を提案している（米国特許４，８５１，３３１号）。
【０００３】
このプライマー伸長法を利用する遺伝子増幅法が種々開発され（例えば、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＲ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢ法： Keller,G.H. et al.,DNA PROBES,p255-297,Stockton press(1993),Persing,D.H. et al.,Diagnastic Molecular Microbilogy,p51-87,American Society for Microbiology(1993)）、遺伝子工学分野において非常に大きな進歩をもたらした。
【０００４】
しかしながら、これらのプライマー伸長法を利用した遺伝子増幅反応においては、特定の遺伝子を１００万倍程度に増幅するために、反応の初期過程では増幅しようとする遺伝子に対して反応に関与する試薬（ポリメラーゼ、プライマー、単位核酸など）を大過剰に存在させることになる。従って、非特異的ハイブリッド形成が非常に起りやすい（Chou et al.,Nucleic Acids Res., 20,1717(1992))。また、特異性において最も優れていると思われるＰＣＲ法においても、鋳型の核酸が非常に少量の場合、およびサンプル由来の不純物が多量に混入している場合には、特異性の高い増幅を行うことは容易ではなかった。更に、ＰＣＲ法においては、予想できなかったプライマー・ダイマーという問題が生じることがわかった（Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,4580-4584(1990) ）。
【０００５】
これらの問題を解決するために、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ法（Chou et al.,Nucleic Acids Res,20,1717-1723(1992)）およびポリメラーゼに対する抗体を使う方法（Kellogg et al.,Bio Techniques 16,1134-1137(1994),Sharkey et al.,BIO ／ TECHNOLOGY 12,506-507(1994)）等が提案されているが、いずれの方法もＰＣＲ反応開始後の非特異的ハイブリッド形成および伸長反応を十分に抑制することができず、また、ＰＣＲ法以外の増幅法に応用することはできない。また特異性を向上させる確実な方法としては二組のプライマーを使うｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法（Pierre et al., J.Clin.Microbiol.29,712-717(1991)）があるが操作性を考えると実用的ではないと考えられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、プライマー伸長法における非特異的ハイブリッド形成を抑制する方法の提供をその目的としている。
【０００７】
また、本発明は、プライマー伸長法においてプライマーの核酸の鋳型鎖への非特異的ハイブリッド形成を抑制する試薬の提供をその目的としている。
【０００８】
本発明によるプライマーによって核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するプライマー伸長反応は、
該プライマーに相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸（プライマー相補核酸）またはその誘導体の存在下で、プライマーと鋳型鎖との反応を行うことを特徴とするもの、である。
【０００９】
また、本発明によるプライマーの核酸の鋳型鎖への非特異的ハイブリッド形成抑制用試薬は、特定のプライマーに相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸またはその誘導体とを含んでなるもの、である。
【００１０】
本発明によればプライマーの伸長反応において非特異的ハイブリッド形成が抑制される。これは、プライマーに相補的な核酸が存在することにより、プライマーの核酸の鋳型鎖への非特異的なハイブリッド形成が減少することに起因すると思われる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本明細書において「核酸」とは、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドからなるものをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ並びにリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが混合したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００１２】
また、本明細書において「核酸の誘導体」とは、核酸の塩基部分、リボース部分、リン酸ジエステル結合部分等の原子（例えば、水素原子、酸素原子）もしくは官能基（例えば、水酸基、アミノ基）が他の原子（例えば、水素原子、硫黄原子）、官能基（例えば、アミノ基）、もしくは炭素数１〜６のアルキル基で置換されたものまたは保護基（例えばメチル基またはアシル基）で保護されたもの、またはこれらの部分が非天然型の成分（例えば、ペプチド結合）で置換されたものをいう。
【００１３】
このような誘導体としては、例えば塩基部分をペプチド結合で連結したペプチド核酸（ＰＮＡ）（Nielsen et al., J.Amer.Chem.Soc.,114,9677-9678(1992)）、天然に存在する稀な核酸（Nucleic Acids Reseach,Vol.22,No12,2183(1994)) 、塩基のアミノ基の水素原子を炭素数１〜６のアルキル基で置換した核酸、リボース部分の水酸基の立体配置を変換した核酸、およびリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換した核酸等が挙げられる。
【００１４】
更に、本明細書において「プライマー」とは、核酸の生合成開始反応に要求される核酸分子およびその誘導体をいう。従って、前記ＤＮＡおよびＲＮＡのみならず、その誘導体もここにいうプライマーとすることができる。
【００１５】
本発明による方法は、基本的に、プライマーによって核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するプライマー伸張反応であり、このプライマーと鋳型鎖の反応を、プライマーに相補的であり、かつプライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対するプライマーの親和性と同等かまたはそれ以下である核酸（プライマー相補核酸）またはその誘導体の存在下で行うものである。なお、以下、「プライマー相補核酸」とは、その誘導体を含む意味で用いられるものとする。
【００１６】
以下の理論に拘束されるわけではないが、本発明において非特異的ハイブリッドの形成が抑制される理由は次のように考えられる。まず、非特異的ハイブリッドは、プライマーが本来ハイブリッドを形成する目的領域以外の部分にプライマーがハイブリダイズし、その部分から目的とする配列以外の配列が形成されてしまう現象であると考えられる。ここで、プライマーに対し相補的であり、かつ鋳型鎖に対するプライマーの親和性と同等またはそれ以下の親和性を有するプライマー相補核酸が存在すると、このプライマー相補核酸が、本来目的とする領域にハイブリッドしなかったプライマーをとらえ、ハイブリッドを形成すると考えられる。その結果、プライマーが目的とする領域以外の部分にハイブリッドする機会が低くなり、これによって非特異的ハイブリッドの形成が抑制されるものと考えられる。なお、プライマーに対するプライマー相補核酸の親和性は、プライマーに対する鋳型鎖の親和性よりも同等かまたは低いことから、プライマーの目的領域に対するハイブリッドの形成には、このプライマー相補核酸は悪影響を与えない。
【００１７】
ここで、「親和性」とは、例えば融解温度Ｔｍで表される熱依存的な安定性を指標にして表すことが出来る（Higgins et al.,Nucleic acid hybridization p80,IRL PRESS(1985) ）。すなわち、Ｔｍが大きいときは親和性が高く、Ｔｍが低いときは親和性が低いことを意味する。
【００１８】
プライマー相補核酸とプライマーとの親和性を低くする方法としては、プライマー相補核酸の鎖長をプライマーと比較して短くすることが挙げられる。プライマーの３’末端に近い領域ほど鋳型に対する非特異的ハイブリッド形成に関して重要であると考えられるので、プライマー相補核酸の３’末端側から鎖長を短くすることが好ましい。プライマー相補核酸の鎖長は、親和性を考慮して適宜決定することができるが、例えばプライマーの鎖長を１とすると、１〜０．４が好ましく、より好ましくは０．９〜０．６である。
【００１９】
また、親和性の低下は、プライマー相補核酸の中にプライマーとは相補的ではないヌクレオチドを導入することによっても達成することができる。また、プライマーの塩基と相補的であるがより弱い水素結合により相補鎖を形成する塩基、例えばイノシン（Martin et al.,Nucleic Acids Res.13,8927-8938(1985)）、を導入することによっても親和性をより低くすることができる。
【００２０】
本発明によるプライマー相補核酸は、それ自身がプライマーとなりうることからプライマー伸長活性に関し不活性化しておくことが好ましい。不活性化の方法としては、例えば、３’末端のデオキシ化（例えば、３’末端ヌクレオチドを２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチドとする）または保護基（例えば、メチル基またはアシル基等）による保護等が挙げられる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、プライマーと、プライマー相補核酸とが結合されて、一分子とされてもよい。両者が同一分子上にある、すなわちプライマー相補核酸が物理的に極めて近いところに存在していると、プライマーが目的とする鋳型鎖にハイブリッドしなかった場合、プライマー相補核酸の部分が容易にプライマー部分を捕らえ、分子内結合を形成する。これによって、効率よく、非特異的ハイブリッド形成を抑制することが出来る。
【００２２】
従って、「一分子」とは、プライマー相補核酸がハイブリッド形成以外の様式（例えば、共有結合）でプライマーと直接または間接的に結合している状態をいう。
【００２３】
一分子とする方法としては、プライマーおよびプライマー相補核酸のハイブリッド形成能を低下させない方法であるのが好ましい。ハイブリッド形成能を低下させない結合位置としては、プライマーに関しては５’末端の水酸基部分、塩基部分、リン酸ジエステル部分等が挙げられ、プライマー相補核酸に関しては５’または３’末端の水酸基、塩基部分、リン酸ジエステル部分等が挙げられる。
【００２４】
具体的に一分子とする方法としては、例えばオリゴヌクレオチドを修飾（Ecrstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL PRESS(1991) ）してリンカーを導入し、市販の架橋剤によって両者を架橋する方法が挙げられる。
【００２５】
リンカーの長さは、プライマーとプライマー相補核酸とのハイブリッド形成を妨げない長さであればよく、プライマーおよびプライマー相補核酸の長さまたは架橋位置によって異なるが、例えば３原子〜５０原子（好ましくは５原子〜３０原子）程度離れていればよい。リンカーの構成元素はプライマーとプライマー相補核酸とのハイブリッド形成、またはプライマーの伸長反応に影響を与えないものであれば特に限定されるものではない。
【００２６】
リンカーとしては、例えば、飽和または不飽和炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、複素環式基が挙げられる。飽和炭化水素基としては、炭素数３〜５０のアルキル基が挙げられ、炭素数５〜３０のアルキル基が好ましく、更に好ましくは炭素数５〜１０のアルキル基である。
【００２７】
リンカーは、基中にエステル結合、エーテル結合、ペプチド結合、酸素原子、硫黄原子、または窒素原子を単独でまたは組み合わせて含んでいてもよく、また、その１以上の水素原子が、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、水酸基、またはハロゲン原子によって置換されていてもよい。リンカーは、また、直鎖であっても、分岐鎖を含んでいてもよい。リンカーは親水性であることが好ましく、例えばリンカーにエーテル結合またはペプチド結合等を含んでいてもよい。
【００２８】
具体的な架橋法としては、双方の核酸にアミノ基とチオ基を有するリンカーを導入し、二官能性の架橋剤（例えば、Ｎ−（６−マレイミド−カプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））を用いて架橋する方法が挙げられる。また、ヌクレオチド間にスペーサーを導入できる試薬（Nelson et al.,Nucleic Asids Res 20,6253-6259(1992)）を用いてプライマーとプライマー相補核酸とをＤＮＡ合成機を用いてひと続きに合成する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明において「プライマー伸長反応」とは、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸をポリメラーゼによってプライマーの３’末端に付加していく反応をいい、プライマー伸長法を用いた具体的な反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、Self-sustained Sequence Replication 法（３ＳＲ法）、Nucleic Acid based amplification法（ＮＡＳＢＡ法）、Repair chain Reaction 法（ＲＣＲ法）、Strand Displacement Amplification 法（ＳＤＡ法）、Polymerase/Ligase Chain Reaction法（Ｐ／ＬＣＲ法）等の遺伝子増幅法、サンガー法が挙げられる。
【００３０】
プライマー伸長反応は、核酸の鋳型鎖、プライマー、ポリメラーゼおよびモノヌクレオチド等を含んだ反応液において行うことができる。まず、反応液をハイブリダイゼーション形成条件下（例えば融解温度以下）に置き、次いでポリメラーゼを働かせることによってプライマーの伸長を行うことができる。
【００３１】
プライマー相補核酸の反応液中における量は、プライマーの鋳型への特異的結合および非特異的結合の抑制を考慮して適宜決定されるが、例えばプライマー１モルに対して１モル以上が好ましく、より好ましくは２〜１０モルである。
【００３２】
また、反応液は、核酸の鋳型鎖、ポリメラーゼおよびモノヌクレオチド等を含むことができる。核酸の鋳型鎖はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またはそれらの誘導体であってもよい。用いることができるポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。モノヌクレオチドとしては、例えば、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体（例えば３’水酸基がデオキシ化されたもの）等が挙げられ、あるいはこれらの混合物であってもよい。
【００３３】
非特異的ハイブリッド形成を抑制する方法においては、プライマー相補核酸はあらかじめその反応液に存在させておいても、プライマー伸長反応の直前に加えてもよい。
【００３４】
さらに本発明の別の態様によれば、特定のプライマーに相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸またはその誘導体を含んでなる、プライマー伸長法におけるプライマーの核酸の鋳型鎖への非特異的ハイブリッド形成抑制用試薬が提供される。
【００３５】
「特定のプライマー」とは、試薬において鋳型となる核酸との関係において相対的に定まるものであり、従ってプライマーに相補的な核酸もこれに対応して定まる。例えば、鋳型となる核酸が黄色ブドウ球菌のプロテインＡ遺伝子である場合には、特定のプライマーは該遺伝子に相補的な配列を持つ核酸となり、例えば実施例１に記載されるＳＰＡ１およびＳＰＡ２がこれに該当する。
【００３６】
上記のプライマーに相補的な核酸の非特異的ハイブリッド形成抑制用試薬中における量および試薬中に含んでいてもよいものは前記と同様とすることができる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが本発明はこれら実施例に限定されものではない。
【００３８】
本発明におけるオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成はＣａｒｕｔｈｅｒｓらのホスホルアミダイト法（Tetrahedron Lett.,22,1859(1981))に基づいて、ＤＮＡ自動合成機モデル３８１Ａ（アプライドバイオシステム社製）を用いて行った。また、５′末端に標識物を導入したオリゴヌクレオチドは、まずそれぞれの５′末端アミノ基をオリゴヌクレオチドに導入し、次いで適当な標識試薬（例えば、ビチオン基、ジニトロフェノール基等）を用いて標識することによって調製した。更に、３′末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドはＮｅｌｓｏｎらの方法（Nelsonら、Nucleic Acids Res., 17,7187-7194(1989)）に従って調製した。ＰＣＲ反応はＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Innis,M.A.S.Academic Press(1990)）に記載される方法を参考にして行った。
【００３９】
また、ＰＣＲ反応における増幅はＥＤ−ＰＣＲ法（特開平１−２５２３００号）によって行った。
【００４０】
実施例１ ＰＣＲ法による特定遺伝子の検出
特定遺伝子の検出として、黄色ブドウ球菌特有であるプロティンＡ遺伝子の検出を行った（Shuttleworth,H.L. et al., Gene 58,283-295(1987) ）。以下に示す一組のプライマーを用い２２４塩基対のプロティンＡをコードする遺伝子の一部をＰＣＲ法にて特異的に増幅し、アガロース電気泳動法で確認した。
ＳＰＡ１：５′−ＢＩＯ−ＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧ−３′（配列番号１）
ＳＰＡ２：５′−ＤＮＰ−ＴＡＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＴＧＧ−３′（配列番号２）
【００４１】
ここで、ＳＰＡ１については５′末端にビオチン基（ＢＩＯ）を、ＳＰＡ２については５′末端にジニトロフェノール基（ＤＮＰ）を導入した。
【００４２】
上記プライマーを用いたＥＤ−ＰＣＲ法によるＰＣＲ生成物の検出方法は以下の通りであった。
【００４３】
まず、ＰＣＲ反応液を以下のように調製した。
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                        ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                        ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                      １μｌ
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                      １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ポリメラーゼ（１．２５Ｕ／μｌ）    １μｌ
Ｈ２Ｏ                                                  ４１．５μｌ
【００４４】
これに黄色ブドウ球菌ＤＮＡ（４００ｐｇ／μｌ；１μｌ）を加えたものと何も加えないものについてＰＣＲ反応を行った。プライマーはＳＰＡ１およびＳＰＡ２を用いた。温度条件は９４℃で３０秒、５０℃３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返す条件でＰＣＲ反応を行った。反応液１０μｌをアルカリフォスファターゼ標識抗体と一緒にストレプトアビジンプレート中で反応させた。３０分後反応液を除き、洗浄液で３回洗浄した。最後に緩衝液と発色基質（１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８），０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸）を加えて反色反応を行い、吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。
【００４５】
その結果、１０分後の発色は、鋳型として何も加えない場合には０．０１であり、鋳型として黄色ブドウ球菌のＤＮＡ４００ｐｇを加えた場合には１．８０であった。一方、ＰＣＲ反応をサイクル数４０回で行った場合には、１０分後の発色は、鋳型として何も加えない場合には１．００であり、鋳型として黄色ブドウ球菌のＤＮＡを４００ｐｇ加えた場合には１．９３であった。
【００４６】
このように、ＰＣＲ反応のサイクル数を３５回から４０回へ増加させると黄色ブドウ球菌の陽性と陰性の判定が困難になった。
【００４７】
実施例２ ＰＣＲ法における非特異性伸長反応の抑制（１）
プライマーＳＰＡ１およびＳＰＡ２に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ法における非特異性伸長反応の抑制を試みた。
ＳＰＡ１−Ｃ１：５′−ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣ−３′ＮＨ２（配列番号３）
ＳＰＡ２−Ｃ１：５′−ＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡ−３′ＮＨ２（配列番号４）
【００４８】
ＳＰＡ１−Ｃ１は、プライマーＳＰＡ１の３′末端からの１３塩基と相補的であり、ＳＰＡ２−Ｃ１はプライマーＳＰＡ２の３′末端からの１３塩基と相補的である。また、それぞれのプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドの３′末端にはアミノ基（ＮＨ２）を導入した。
【００４９】
以下に示すＰＣＲ反応液を調製し、ＳＰＡ１およびＳＰＡ２をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとし、これを４０サイクル繰り返す条件で行った。
【００５０】
反応液１
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ／μｌ）
１μｌ
ＳＰＡ１−Ｃ１  ５００ｎｇ／μｌ                                ５μｌ
ＳＰＡ２−Ｃ１  ５００ｎｇ／μｌ                                ５μｌ
Ｈ２Ｏ                                                    ３１．５μｌ
反応液２
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
────────────────────────────────────
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ１．２５Ｕ／μｌ    １μｌ
ＳＰＡ１−Ｃ１  ５００ｎｇ／μｌ                              １０μｌ
ＳＰＡ２−Ｃ１  ５００ｎｇ／μｌ                              １０μｌ
────────────────────────────────────
Ｈ２Ｏ                                                    ２１．５μｌ
反応液３
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ                    １μｌ
Ｈ２Ｏ                                                    ４１．５μｌ
【００５１】
それぞれの反応液に関し、黄色ブドウ球菌ＤＮＡ（４００ｐｇ／μｌ：１μｌ）を加えた場合および加えない場合についてＰＣＲ反応を行い、実施例１と同様に吸光度を測定した。
【００５２】
その結果、１２分後の発色は以下の通りであった。
反応液１      反応液２      反応液３
鋳型として何も加えない場合      ０．０５      ０．０４      １．５７
鋳型として黄色ブドウ球菌の
ＤＮＡを加えた場合              ２．１２      １．２２      ２．４７
【００５３】
実施例３ ＰＣＲ法における非特異的伸長反応の抑制（２）
プライマーＳＰＡ１およびＳＰＡ２に相補的なオリゴヌクレオチドとしてＳＰＡ１−Ｃ２およびＳＰＡ２−Ｃ２を用い、ＰＣＲ法における非特異的伸長反応の抑制を試みた。
ＳＰＡ１−Ｃ２：５′−ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴ３′−ＮＨ２（配列番号５）
ＳＰＡ２−Ｃ２：５′−ＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＣＡＡＣＴ３′−ＮＨ２（配列番号６）
【００５４】
ＳＰＡ１−Ｃ２は、プライマーＳＰＡ１の３′末端からの１８塩基と相補的であり、ＳＰＡ２−Ｃ２はプライマーＳＰＡ２の３′末端からの１８塩基と相補的である。
【００５５】
以下に示す反応液を調製し、ＳＰＡ１およびＳＰＡ２をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとし、これを４０サイクル繰り返す条件で行った。
【００５６】
反応液４
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ／μｌ）
１μｌ
Ｈ２Ｏ                                                    ４１．５μｌ
反応液５
────────────────────────────────────
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
────────────────────────────────────
ＳＰＡ２  ５０ｎｇ／μｌ                                        １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ／μｌ）
１μｌ
ＳＰＡ１−Ｃ２  ５００ｎｇ／μｌ                                １μｌ
ＳＰＡ２−Ｃ２  ５００ｎｇ／μｌ                                １μｌ
Ｈ２Ｏ                                                    ３９．５μｌ
【００５７】
それぞれの反応液について実施例２と同様にＰＣＲ反応を行い、吸光度を測定した。また、ヒトＤＮＡ（７００ｎｇ／反応）を鋳型として加えたものについても同様に実験を行った。
【００５８】
その結果、１０分後の発色は以下のとおりであった。
反応液４    反応液５
鋳型として何も加えない場合                      ０．３５    ０．００
鋳型としてヒトDNA 700ng を加えた場合            ０．０９    ０．００
鋳型として黄色ブドウ球菌のDNA 400ng 加えた場合  ２．２１    １．１６
【００５９】
実施例４ ＰＣＲ法における非特異的伸長反応の抑制（３）
（１）プライマー相補核酸を結合したプライマーの合成
下式で示すプライマー相補核酸を結合したプライマーを合成した。
ＳＰＡ１Ｃ：
５′Ｂｉｏ−ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣ−（リンカー）−ＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号７）
ＳＰＡ２Ｃ：
５′ＤＮＰ−ＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡ−（リンカー）−ＴＡＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号８）
【００６０】
まずＳＰＡ１を合成するにあたり、最初にプライマー部分の合成を行った。プライマー部分は一般的なオリゴヌクレオチド合成に従い、３′末端から上記配列を順次付加し、プライマーの５′末端の塩基を付加した後、チオールを導入するためにＣ６−チオールモディファイヤー（商品名）（クロンテック社）を付加した。合成終了後は常法通り担体からの脱離、及び保護基の除去を行い、ゲル濾過法（セファデックスＧ−５０、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ７．２）により粗精製した。粗精製品１０  Ａ２６０ユニットを蒸発乾固し、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート），ｐＨ７．５（１００μｌ）に溶解した。これに、１．０Ｍ  ＡｇＮＯ３（１５μｌ）を加え室温で３０分反応した。次に、１．０Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）（１０μｌ）を加え室温でさらに１５分間反応した。反応後沈殿を遠心で除き、ゲル濾過法（セファデックスＧ−５０、４０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．０）で精製し、溶出液はそのまま次の反応に用いた。
【００６１】
一方、プライマーに相補的な部分は以下のように合成した。３′末端にアミノ基を導入するためにＮｅｌｓｏｎの方法（Nelson,Nucleic Acids Res.,17,7187-7194）の担体を原料にし、プライマーに相補的な部分の塩基配列を順次付加した。最後の塩基を付加した後、５′末端にビオチンを導入するためにビオチンＯＮホスホルアミダイト（クロンテック社）を付加した。合成終了後は常法通り担体からの脱離、及び保護基の除去を行い、ゲル濾過法（セファデックスＧ−５０、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ７．２）により粗精製した。粗精製品１０  Ａ２６０ユニットを蒸発乾固し、Ｈ２Ｏ（４０μｌ）に溶解した。１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１０μｌ）を加え、さらにＥＭＣＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）のＤＭＦ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、５０μｌ）を加えて室温で５時間反応した。反応後はゲル濾過法  （セファデックスＧ−５０、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．２）により試薬を除去した。
【００６２】
上記２種のオリゴヌクレオチドを以下のように結合した。まず、５′末端にビオチン、３′末端にアミノ基を導入したオリグヌクレオチドを蒸発乾固し、５′末端にチオール基を導入したオリゴヌクレオチドのリン酸緩衝液全量を加えて室温で１６時間反応した。反応後、ゲル濾過法（セファデックスＧ−５０、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ７．２）によりバッファー交換を行い、蒸発乾固した。得られた混合物を８．３Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動により精製した。移動度の遅い方のバンドからオリゴヌクレオチドを回収し、プライマー相補核酸を結合したＳＰＡ１Ｃプライマーを得た。
【００６３】
ＳＰＡ２Ｃプライマーについても同様に合成したが、５′末端にＤＮＰを導入するためにプライマーに相補的な部分を合成する際にＤＮＰ−ＯＮホスホルアミダイト（クロンテック社）を使用した。
【００６４】
（２）プライマーＳＰＡ１ＣおよびＳＰＡ２Ｃによる非特異的増幅反応の抑制
以下に示す反応液を調製しプライマーに相補的な核酸を結合したプライマーの非特性的反応抑制の効果を調べた。
１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）反応液                          ５μｌ
２０ｍＭ  ｄＮＴＰ                                          ０．５μｌ
ＳＰＡ１Ｃ  １００ｎｇ／μｌ                                    １μｌ
ＳＰＡ２Ｃ  １００ｎｇ／μｌ                                    １μｌ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ／μｌ）１μｌ
Ｈ２Ｏ                                                    ４１．５μｌ
【００６５】
上記反応液に鋳型として黄色ブドウ球菌のＤＮＡを加えたもの、鋳型として何も加えないもの、鋳型としてＤＮＡを加えた場合の３種類について実施例２と同様にＰＣＲ反応を行い吸光度を測定した。その結果１０分後の発行は以下の通りであった。
鋳型として何も加えない場合                                  ０．００
鋳型としてヒトＤＮＡ（７００ｎｇ）を加えた場合              ０．００
鋳型として黄色ブドウ球菌のＤＮＡ（４００ｎｇ）を加えた場合  ０．５３
【００６６】
以上のように、非特異的増幅反応を抑制することができたが、特異的増幅も抑制された。
【００６７】
（３）プライマーに相補的な核酸であってその鎖長を短くしたものを結合したプライマーの結果
以下に示すプライマーに相補的な核酸であってその鎖長を短くしたものを結合したプライマーを（１）に示す方法と同様にして合成し、その結果を調べた。
ＳＰＡ１ＣＳ：
５′Ｂｉｏ−ＣＡＣＣＡＧＧＴ−（リンカー）−ＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号９）
ＳＰＡ２ＣＳ：
５′ＤＮＰ−ＣＣＡＴＴＣＡＴ−（リンカー）−ＴＡＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号１０）
【００６８】
（２）と同じ条件でＰＣＲ反応を行い、吸光度を測定した。
鋳型として何も加えない場合                                  ０．００
鋳型としてヒトＤＮＡ（７００ｎｇ）を加えた場合              ０．００
鋳型として黄色ブドウ球菌のＤＮＡ（４００ｎｇ）を加えた場合  ２．１５
【００６９】
以上のようにプライマーに相補的な核酸の鎖長を短くすることにより、非特異的増幅反応を抑制したまま、特異的反応を効率良く行わせることができた。
【００７０】
本発明は下記の通りである。
（１）  プライマーによって核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するプライマー伸長反応であって、
該プライマーに相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸（プライマー相補核酸）またはその誘導体の存在下で、プライマーと鋳型鎖との反応を行うことを特徴とする、方法。
（２）  前記プライマー、前記プライマー相補核酸、および前記鋳型鎖が、それぞれ独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡである、（１）に記載の方法。
（３）  前記プライマー相補核酸またはその誘導体の鎖長が、前記プライマーよりも短いものである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  前記プライマー相補核酸またはその誘導体が、その一部に前記プライマーと相補的でないヌクレオチドを含むものである、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）  前記プライマー相補核酸またはその誘導体が、その一部に前記プライマーと弱く水素結合をするヌクレオチドを含んでなるものである、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）  プライマーと弱く水素結合をする前記ヌクレオチドがイノシンである、（５）に記載の方法。
（７）  前記プライマーと、前記プライマー相補核酸またはその誘導体とが結合されて一分子としてなる、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）  前記プライマーと、前記プライマー相補核酸またはその誘導体とがリンカーによって連結されたものである、（７）に記載の方法。
（９）  リンカーが、飽和または不飽和炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、および複素環式基からなる群から選択されるものである、（８）に記載の方法。
（１０）  リンカーが飽和炭化水素基である、（９）に記載の方法。
（１１）  リンカーが炭素数５〜３０のアルキル基である、（１０）に記載の方法。
（１２）  前記プライマー相補核酸の誘導体が、その３’末端の水酸基が水素原子もしくは官能基によって置換されているか、または保護基で保護されたものである、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法。
（１３）  プライマーに相補的な核酸の誘導体がペプチド核酸（ＰＮＡ）である、（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）  プライマー伸長法が、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＲ法、ＳＤＡ法、Ｐ／ＬＣＲ法、およびサンガー法からなる群から選択されるものである、（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の方法。
（１５）  特定のプライマーに相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸またはその誘導体を含んでなる、プライマー伸長法におけるプライマーの核酸の鋳型鎖への非特異的ハイブリッド形成抑制用試薬。
【要約】
【要約】
【課題】  本発明は、プライマー伸長法においてプライマーの非特異的伸長反応を抑制することをその目的とする。
【解決手段】  本発明による方法は、プライマーによって核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するプライマー伸長反応であって、該プライマーの３′末端側に相補的であり、かつ該プライマーに対するその親和性が核酸の鋳型鎖に対する該プライマーの親和性と同等またはそれ以下である核酸またはその誘導体が連絡されたプライマーの存在下で、プライマーと鋳型鎖との反応を行うことを特徴とするもの、である。
【選択図】  なし
【配列表】
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