(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
X1−Tyr−Ile−Arg−X2
ここで、
X1はＨ、アシル、アルキルまたはアリールアルキルであり；そして
X2は改変されたＣ末端基、カルボキシ保護基および１〜５個のアミノ酸からなる群から選ばれる基である；
を有する第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物およびその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
一般式
A1−A2−A3−Ｂ
ここで、
A1は、Tyr、Ｆ（pNH2）、mAph、pAphまたはNal（２）であり、これらは０または１個のアミノ保護基を有し；
A2は、IleまたはChgであり、
A3は、Arg、PalMe（３）、Dab（Ｎγ−C3H7N）、Dap（Ｎβ−C3H7N）またはOrn（ＮδC3H7N）であり；そして
Ｂは、−Ｈ、−OH、−NH2、１〜５個のアミノ酸またはカルボキシ保護基である；
を有する第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物およびその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
以下の群より選択される第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物およびその薬学的に許容される塩。
CF3C（Ｏ）−（iBu）Phe（NH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
CF3C（Ｏ）−（iBu）Nal（２）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Phe（3I,4NH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
CF3C（Ｏ）−Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
（５−ベンゾイミダゾイル）−Phe（NH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
CF3C（Ｏ）−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（Chx−CH2）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ｄ−Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Trp−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAgh−Chg−Arg−Gla−Pro−NH2;
Ac−（iBu）Nal（２）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Phe（ｐ−CONH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Phe（pNH2）−Chg−Arg−（Me）Leu−Pro−NH2;
Ac−（Chx−Ch2）Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Chg−Pal（３）Me−Leu−Pro−NH2;
（ベンゾイル）−Phe（pNH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（２−メチルペンタニル）−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（２−メチルブチル）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Phe（pNH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（iBu）−Phe（pNH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（Chx−Ch2）−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2.;
（２−ベンゾフロイル）−pAph−Chg−Pal（３）Me−NH2;
Ac−（iBu）Phe（pNH2）−Chg−Arg−NH2;
Ac−pAph−Chg−Arg−NH2;
CF3C（Ｏ）−（iBu）Phe（pNH2）−Chg−Arg−NH2;
Ac−pAph−Chg−Arg−NH2;
Ac−pAph−Chg−Pal（３）Me−NH2;
CF3C（Ｏ）（iBu）−Tyr−Ile−Arg−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−CH2−Chx;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−2CMT;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−Chx;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Dab（Ｎγ−C3NH7）−Ｌ−Ｐ−NH2;
Bz−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Tos−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Ｙ（３−Ｉ）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
ｙ−Chg−Ｒ−Ｌ−NH2
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−ol;
シクロペンチル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
３−Iqc−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
Bzf−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
３−Iqc−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−NH−２−チアゾリル；
２−フロイル−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
５−Me−２−チエニル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
Ac−Nal（２）−Chg−Ｒ−NH−２−チアゾリル；
２−Bzf−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−（iBu）pAph−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Ｒ−Gla−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Ｒ−Pen（CH2COOH）−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−（Me）Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−OEt;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Orn（Ｎδ−C3H7N）−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−Nal（２）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Dab（Ｎγ−C3H7N）−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Ｒ−NH2;
Ac−pAph−Chg−Ｒ−OH;
DIPA−（ｍ）pAph−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
DIPA−（ｍ）Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Isn−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Pza−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Tfa−（iBu）Ｙ−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;
Tfa−（iBu）Ｙ−Ｉ−Orn（ＮδC3H7N）−Ｌ−Ｐ−NH2:
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−CH2−Chx;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−Chx;
Bzf−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−Ｌ−Ｐ−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
シクロペンチル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
３−Iqc−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
２−フロイル−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
５−Me−チエニル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−ol;
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Ala−NH2;
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）；
Ac−Tyr−｛ψ（CH2NH）｝−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Tyr−Ile−Arg−NH−CH2（４−ピリジル）；
Ac−Tyr−Ile−｛ψ（CH2NH）｝−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Tyr−Chg−Arg（NO2）−｛ψ（CH2NH）｝−Leu−NH2;
Ac−Tyr−Ile−Arg−｛ψ（COCH2）｝−Gly−Pro−NH2;
Ac−Tyr−Ile−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Leu−Ala−NH2;
Ac−Tyr−Ile−PalMe（３）−NH2;
Tyr−Ile−Arg−NH2;
Ｄ−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−（Bzl）Gly（Chx）Gly−（３−グアニドプロピル）Gly−NH2;
シクロ（Gly−Tyr−Ile−Arg−Gly）；
Tfa−（iBu）Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−Nal（２）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;
Ac−pAph−Chg−PalMe−NH2;
Ac−Ｄ−pAph−Chg−Pal（Me）−Leu−Pro−NH2;
Ac−Ｄ−pAph−Chg−Pal（Me）−NH2;および
Ac−Phe（pNH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2。
【請求項４】
請求項１、２または３記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する第X a因子の活性を特異的に阻害する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、概して血餅形成タンパク質の阻害、より詳細には、血餅形成酵素の第X a因子の特異的インヒビターに関する。
背景に関する情報
血餅を形成する能力は、生存に極めて重要である。しかし、ある疾患状態において、循環系内の血餅形成は、それ自体で病的状態の原因である。したがって、血餅形成を防止することが望ましい場合もあり得る。しかし、血餅形成システムを完全に阻害することは望ましくない。なぜなら、生命を脅かすほどの出血が生じるからである。
血餅の血管内形成を軽減するために、当業者はプロトロンビナーゼ、または第X a因子の有効なインヒビターの開発に努力してきた。このインヒビターは、プロトロンビナーゼ複合体に取り込まれる。ここでプロトロンビナーゼ複合体は、血餅形成の間、トロンビンを活性化する。
適切な濃度の第X a因子インヒビターは、血餅形成の開始に必要なプロトロンビナーゼ形成因子のレベルを上昇させるが、一旦閾値濃度のトロンビンが達成されると、血餅形成プロセスが適度に延期される。しかし、このようなインヒビターが所望されていることが長い間認識されているにもかかわらず、現在のところ臨床使用において有効かつ特異的な第X a因子インヒビターはない。
多くの臨床適用において、抗凝固処置について多くの要求がある。現在入手可能な薬物は、多くの特異的臨床適用において十分ではない。例えば、全股関節部交換（total hip replacement）を受けた患者の50％近くは、深静脈血栓症（deep vein thrombosis）（DVT）を発症する。現在認可されている治療は、固定用量の低分子量ヘパリン（LMWH）および可変用量のヘパリンを包含する。これらの薬物レジュメによってでも、患者の10％〜20％はDVTを発症し、そして５％〜10％は出血性の合併症を発症する。
よりよい抗凝固因子を必要とする別の臨床状態は、経管冠動脈形成術を受け、かつ心筋梗塞の危険にある被験体、またはクレッセント狭心症を患う被験体に関する。現行の従来から受け入れられている治療法は、ヘパリンおよびアスピリン投与からなり、この手順の24時間以内に生じる６％〜８％の突然血管閉鎖の割合に伴う。ヘパリンの使用による輸注療法を必要とする出血性の合併症の割合は、約７％である。さらに、閉鎖の遅延は重要であるが、手順終了後のヘパリン投与は、ほとんど価値はなく、そして有害であり得る。
最も広く使用されている血餅形成インヒビターは、ヘパリンおよび関連の硫酸化多糖、LMWHおよびヘパリン硫酸塩である。これらの分子は、血餅形成プロセスの天然の調節因子（抗トロンビンIII）のトロンビンおよび第X a因子への結合を促進することにより、抗血餅形成効果を発揮する。ヘパリンの阻害活性は、主にトロンビンに関し、これは、第X a因子よりも約100倍速く不活化される。ヘパリンに関して、ヘパリン硫酸塩およびLMWHは、トロンビンよりもX aに関する若干強力なインヒビターであるが、インビトロでの差はあまり大きくなく（３〜30倍）、そしてインビボでの効果は、ほとんど望めない。ヒルジンおよびヒルログ（hirulog）は、現在臨床試験にある２つのさらなるトロンビン特異的抗凝固剤である。しかし、トロンビンを阻害を阻害するこれらの抗凝固剤は、出血性の合併症に関連する。
ヒヒおよびイヌにおける前臨床試験は、第X a因子の特異的インヒビターが、直接的なトロンビンインヒビターで観察される出血性の副作用を生じることなく、血餅形成を防止することを示している。このような第X a因子インヒビターには、例えば、2,7−ビス−（４−アミジノベンジリデン）−シクロヘプタノンおよびＮα−トシルグリシル−３−アミジノフェニルアラニンメチルエステル（「TENSTOP」）が挙げられ、これらはそれぞれ、約20nMおよび800nMの有効阻害濃度（Ki）を有する。（＋）−（2S）−２−（４（｛（3S）−１−アセチミドイル−３−ピロリジニル｝オキシ）フェニル）−３−（７−アミジノ−２−ナフチル）プロパン酸もまた、第X a因子インヒビターのクラスの代表である（Katakuraら、Biochem.Biophys.Res.Comm.197:965−972（1993））。しかし、これまでのところ、これらの化合物は臨床的に開発されていない。
第X a因子の特異的タンパク質インヒビターがまた同定されており、そして例えば、アンチスタシン（antistasin）（「ATS」）およびダニ抗凝固ペプチド（「TAP」）が挙げられる。ヒル（Haementerin officinalis）から単離されるATSは、119個のアミノ酸を含み、そして第X a因子に対して0.05nMのKiを有する。ダニ（Ornithodoros moubata）から単離されるTAPは、60個のアミノ酸を含み、そして第X a因子に対して約0.5nMのKiを有する。
組換えにより産生されるATSおよびTAPは、多くの動物モデルシステムで研究されている。両インヒビターは、他の抗凝固剤に比べて、出血時間を減少させ、そしてトロンボプラスチン誘導性の深静脈血栓症の結紮された頸静脈モデルにおいて血餅形成を防止する。このモデルにおいて達成される結果は、現行の選択薬物であるヘパリンを用いて得られる結果と相関する。
皮下ATSもまた、播種性血管内凝固症候群（DIC）のトロンボプラスチン誘導性モデルにおいて有効な処置であることが見出された。TAPは、「ハイシェア」な動脈血栓症（"high−shear"arterial thrombosis）、および活性化された部分的トロンボプラスチン時間（aPTT）の臨床的に受容可能な延長（すなわち、約２倍の延長時間より短い）を生じたレベルで、ポリエステル（「DACRON」）移植物の外科的配置により引き起こされる「流量の減少」を効果的に防止する。比較すると、標準的なヘパリンは、aPTTの５倍の増加を生じる用量でさえ、血栓症を防止せず、そして移植片内の流量を減少した。aPTTは、トロンビンインヒビターに特に感受性である凝固の臨床アッセイである。
ATSおよびTAPは、臨床的に開発されていない。これら２つのインヒビターの１つの主な欠点は、必要な反復用量の投与が、中和抗体の生成を引き起こし、それゆえ、それらの潜在的な臨床使用が制限されることである。しかも、TAPおよびATSのサイズは、経口投与を不可能にし、これらの薬剤から利益を受け得る患者の数をさらに制限する。
第X a因子の特異的インヒビターは、医療の実施において、実質な実施価値を有する。特に、第X a因子インヒビターは、現在の選択薬物、ヘパリンおよび関連の硫酸化多糖が有効でないかまたは僅かしか有効でない情況下で、有効である。したがって、有効であるが、所望しない副作用を引き起こさない、低分子量の第X a因子特異的血餅形成インヒビターが必要とされる。本発明はこの必要性を満たし、そして関連の利点をも提供する。
発明の要旨
本発明は、第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物を提供する。本発明の化合物は、構造X1−Ｙ−Ｉ−Ｒ−X2を有する。ここで、X1は、水素（Ｈ）、アシル、アルキル、アリールアルキル基、または１個以上のアミノ酸であり、そしてX2は、修飾されたＣ末端基、１個以上のカルボキシ保護基（下記を参照のこと）、１個以上のアミノ酸、または他の置換基であり、そしてＹ、Ｉ、およびＲは、それぞれアミノ酸のチロシン、イソロイシン、およびアルギニンをいい、そしてチロシン、イソロイシン、およびアルギニンのそれぞれと同様の機能的活性を有するペプチド疑似物または有機構造をいう。さらに本明細書において定義されるように、本発明の化合物は、構造A1−A2−（A3）ｍ−Ｂを有する。
本発明の化合物は、長さが約２残基と43残基との間で直鎖状または環状であり得、そしてＮ末端またはＣ末端または両方で修飾され得る。このような化合物は、Ki≦100μＭ、好ましくはKi≦2nMで第X a因子活性の特異的阻害を示し、そして凝固カスケードに関与する他のプロテアーゼの活性を実質的に阻害しない。このような化合物の具体的な例は、Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Ala−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）;Ac−Tyr−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2（「Ψ」は、シュードペプチド結合を示し、これは例えば、「（CH2NH）」によって示されるような還元型結合であり得；シュードペプチド結合は、括弧内に挟まれた「Ψ」、「｛Ψ｝」により示される;Ac−Tyr−Ile−Arg−NH−CH2（４−ピリジル）;Ac−Tyr−Ile−｛Ψ（CH2NH）｝−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Tyr−Chg−Arg（NO2）−｛Ψ（CH2NH）｝−Leu−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−｛Ψ（COCH2）｝−Gly−Pro−NH2;Ac−Tyr−Ile−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Leu−Ala−NH2;Ac−Tyr−Ile−PalMe（３）−NH2;Tyr−Ile−Arg−NH2;（Ｄ）−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−（Bzl）Gly（Chx）Gly−（３−グアニドプロピル）Gly−NH2;シクロ（Gly−Tyr−Ile−Arg−Gly）;Tfa−（iBu）Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Nal（２）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;およびその薬学的に受容可能な塩およびアミド、エステル、アルコール、およびアルデヒドのようなＣ末端誘導体（表５もまた参照のこと）を包含する。第X a因子の活性を特異的に阻害する方法、および固体の血餅形成を阻害する方法もまた提供される。第X a因子のレベルまたは活性を検出する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、血液凝固カスケードの概略図である。
図２は、本発明の化合物の構造を例示している。
図３は、本発明のいくつかの化合物を調製するための合成スキームを示す。
発明の詳細な説明
血液凝固は、進行的に増幅された系列の酵素活性化反応に関与する複雑なプロセスである。この活性化反応では、血漿チモーゲンが限定されたタンパク質分解により連続的に活性化される。機構上、血液凝固カスケードは、内因性経路および外因性経路に分けられ、これらは、第Ｘ因子の活性化に収束され；続くトロンビンの生成は、１つの共通の経路を介して進行する（図１を参照のこと）。
現在の証拠は、内因性経路がフィブリン形成の維持および成長に重要な役割を果たしているが、外因性経路は血液凝固の初期段階において極めて重要であることを示唆している。血液凝固が、組織因子／第VII a因子複合体形成の際に物理的に開始されることが一般に受け入れられている。一旦形成されると、この複合体は、第IX因子および第Ｘ因子を活性化することによって、迅速に凝固を開始する。次いで、新たに生成される第X a因子は、第V a因子およびリン脂質と１対１の複合体を形成し、そしてプロトロンビナーゼ複合体を形成して、可溶性フィブリノーゲンから不溶性フィブリンへの変換を担う。時間経過に伴い、第VII a因子／組織因子複合体の活性（外因性経路）は、クニッツ型プロテアーゼインヒビタータンパク質（TFPI）によって抑制される。これが第X a因子と複合体を形成すると、第VII a因子／組織因子のタンパク質分解活性を直接阻害し得る。阻害された外因性システムの存在下で凝固プロセスを維持するために、内因性経路のトロンビン仲介活性を介して、さらなる第X a因子が産生される。したがって、トロンビンは二重の自己触媒的役割（dual autocatalytic role）を果たし、それ自身の産生およびフィブリノーゲンからフィブリンへの変換を仲介する。
トロンビン生成のの自己触媒的な性質は、制御されていない出血に対する重要な保護手段であり、そして一旦、所定の閾値レベルのトロンビナーゼが存在すると、完了するまで血液凝固が進行し、例えば、出血の終了をもたらす。それゆえ、トロンビンを直接阻害することなく、凝固を阻害する薬剤を開発することが最も好ましい。
本発明は、第X a因子活性を阻害するが、血液凝固経路に関与する他のプロテアーゼの活性は実質的に阻害しない化合物であるYIRペプチドを提供する。本明細書において使用されるように、用語「化合物」または「YIRペプチド」は、非天然のTyr−Ile−Arg（YIR）ペプチド、およびそのアナログおよび疑似物をいい、第X a因子活性を阻害し得る。YIR配列自体は、本明細書において「YIRモチーフ」といい、そしてトリペプチドのチロシン−イソロイシン−アルギニン、またはpAph−Chg−PlaMe（３）、pAph−Chg−PlaMe（３）−NH2、およびpAph−Chg−AMP（４）のようなその機能的等価物からなる（略語についての表１を参照のこと）。本発明のそのような化合物は、少なくとも１つのYIRモチーフまたはその機能的等価物を含み、そして第X a因子の活性を特異的に阻害し得る。便宜のために、用語「化合物」および「YIRペプチド」は、本明細書において本発明のペプチドを示すために、広く用いられ、ペプチドアナログ、ペプチド疑似物、および合成有機化合物のような機能的等価物を包含する。本発明のYIRペプチドの機能的等価物は、本明細書に開示されるような構造を有すること、および第X a因子活性の阻害について100μＭ以下のKiを有することにより、ある程度特徴付けられ得る（実施例XXXVIIを参照のこと）。
本発明のYIRペプチドのペプチドアナログは、例えば、非天然のアミノ酸または化学的に修飾されたアミノ酸を含むペプチドを包含する（但し、化合物は第X a因子の阻害活性を保持する）（例えば、表２を参照のこと）。同様に、ペプチド疑似物は、本発明のYIRペプチドの構造に類似する非アミノ酸の化学的構造物であり、そして第X a阻害活性を保持する。このような疑似物は、一般的に、サイズ、電荷、または疎水性のような同様な物理的性質を示すことで特徴付けられる。それらは、通常のYIRペプチド相当物において見出されるような適切な空間的配向に存在する。ペプチド疑似物の具体的な例は、１個以上のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素−炭素結合、または当業者に周知の他の結合（例えば、Sawyer、Peptide Based Drug Design 387〜422頁（ACS、Washington DC 1995）を参照のこと、これは本明細書中に参考として援用される）により、置換される化合物である。それゆえ、本発明は、本明細書において開示されるような構造A1−A2−（A3）ｍ−Ｂ（ここで、ｍは０または１である）を有する第X a因子阻害化合物をさらに提供する（下記を参照のこと）。このようなペプチド（類似化合物であり得る）の例が、本明細書中に提供される。
本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、最も広い意味で使用され、遺伝子コードから翻訳される20個の天然のアミノ酸を意味し、そしてタンパク質のビルディングブロックを含む。これには、他で具体的に述べない限り、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログのような化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシンのようにタンパク質には通常取り込まれない天然のアミノ酸、および当該分野でアミノ酸の特徴であることが公知である特性を有する化学的に合成された化合物を意味する。例えば、フェニルアラニンまたはプロリンのアナログまたは疑似物は、天然のPheまたはProと同様のペプチド化合物のコンホメーションの制限を可能にし、「アミノ酸」の定義内に含まれ、そして当業者に既知である。このようなアナログおよび疑似物は、本明細書においてアミノ酸の「機能的等価物」という。アミノ酸およびアミノ酸アナログの他の例は、RobertsおよびVellaccio（The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,GrossおよびMeienhofer編、第５巻、341頁、Academic Press,Inc.,N.Y.1983、これは本明細書中に参考として援用される）によって挙げられている。アミノ酸、アミノ酸アナログ、および疑似構造物の略語を表１に列挙する。
0003655632.tif 000002
0003655632.tif 000003
0003655632.tif 000004
0003655632.tif 000005
0003655632.tif 000006
本明細書において使用されるように、「第X a因子活性」は、第X a因子自体、またはプロトロンビナーゼ複合体（prothrombinase complex）として公知のサブユニットの構築物における第X a因子が、プロトロンビンからトロンビンへの転化を触媒する能力をいう。第X a因子活性に関して使用される場合、用語「阻害」は、第X a因子活性の直接的阻害および間接的阻害の両方を含む。第X a因子活性の直接的阻害は、例えば、本発明のYIRペプチドが、第X a因子またはプロトロンビナーゼに結合してプロトロンビンのプロトロンビナーゼ複合体活性部位への結合を妨げることにより、達成され得る。第X a因子活性の間接的阻害は、例えば、本発明の化合物が可溶性第X a因子に結合して、第X a因子のプロトロンビナーゼ複合体への構築を妨げることにより、達成され得る。
本明細書において使用されるように、用語「特異的」は、第X a因子活性の阻害に関して使用される場合、プラスミンおよびトロンビンを含む他の特定のプロテアーゼの活性を（同じ濃度のインヒビターを用いて）実質的に阻害することなく、YIRペプチドが第X a因子活性を阻害し得ることを意味する。このようなプロテアーゼは、血液凝固およびフィブリン溶解カスケードに関与する（表２を参照のこと；また、実施例XXVIIを参照のこと）。
0003655632.tif 000007
表２の結果は、本発明のYIRペプチドが、第X a因子のインヒビターとしては有用であるが、血液凝固およびフィブリン溶解のプロセスに関与するトロンビンまたはプラスミンのような他のセリンプロテアーゼの活性を実質的に阻害しないことを示す。
本明細書において使用される用語「置換基」は、本明細書中で開示されるペプチドバックボーンまたはペプチドの側鎖、ペプチドアナログ、擬化合物（mimetic compound）または有機化合物上で置換される任意の種々の化学基をいう。置換基は、当業者に公知の任意の種々の異なる部分を包含し得る（例えば、GiannisおよびKolter、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32:1244−1267（1993）、これは本明細書中に参考として援用されるを参照のこと）。置換基の置換を示す多くの例が本明細書中に開示されているが、これには、例えば、Ｆ（pNH2）を得るためのフェニルアラニン上のpNH2置換基の置換、および例えばＹ（３−Ｉ）またはＹ（3,5−Ｉ）を得るためのチロシン上のハロゲンの置換が含まれる。さらに、置換基は、例えば、窒素（N;例えば、Palを参照のこと）、酸素（O;例えば、Ｏ−メチルチロシンを参照のこと）、または硫黄（S;例えば、Tyr（SO3H）を参照のこと）であり得、これらは置換基で置換され得る。したがって、−SO3HのようなＮ−、Ｓ−、またはＯ−を含む部分は、本明細書において定義されるような「置換基」と考えられる。さらに、置換基は、アミノ保護基またはカルボキシ保護基であり得る。
本明細書において使用される用語「アルキル」は、最も広義に使用され、約１〜13個の炭素原子の飽和または不飽和の、直鎖、分枝鎖、または環状鎖を意味する。したがって、用語「アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、sec−ブチル、１−メチルブチル、2,2−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、2,2−ジメチルプロピル、ｎ−ペンチル、およびｎ−ヘキシル基、アルキレン基、シクロヘキシル基およびシクロペンチル基のような炭素原子の環状鎖、ならびにメチル−シクロヘキシル基またはシクロプロピル−メチレン基のような炭素原子の直鎖または分枝鎖と環状鎖との組み合わせが挙げられる。さらに、本明細書において定義されるようなアルキルは、置換基で置換され得ることが理解されるべきである。同様に、用語「アシル」は、最も広義に使用され、約１〜13個の炭素原子の飽和または不飽和の、直鎖、分枝鎖、または環状鎖を意味し、カルボキシル基を含有する。したがって、用語「アシル」としては、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイルなどのような基が挙げられる。
用語「アリール」は、約５〜13個の炭素原子、および少なくとも１個の共役pi電子系を有する「環」基を含む芳香族基をいう。アリールの例としては、例えば、ヘテロ環式アリール基、ビアリール基、ならびにそのアナログおよび誘導体が挙げられ、これらのすべてが、１つ以上の置換基で必要に応じて置換され得る。用語「アリールアルキル」は、アリール基で置換される上記に定義されるようなアルキルをいう。適切なアリールアルキル基としては、ベンジル、ピコリルなどが挙げられ、これらのすべてが、必要に応じて置換され得る。
用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアリールアルキル」、および「ヘテロアリール」はまた、本明細書において使用され、そしてそれぞれ、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子のような１個以上のヘテロ原子で置換されるアルキル、アリールアルキル、およびアリールをいう。さらに、用語「ヘテロ環式」は、１個以上のヘテロ原子で置換される環式アルキル基またはアリール基に関して使用される。ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロ環式の多くの例は開示されている（例えば、表１および３）か、開示されていないにせよ当該分野において公知である。
本発明のペプチドは、それぞれアミノ保護基またはカルボキシ保護基を用いて、Ｎ末端またはＣ末端で修飾され得る。修飾のような多くの例が本明細書において開示されている（例えば、表３を参照のこと）。ペプチドまたはペプチドアナログのＮ末端は、例えば、アセチル、シクロペンチルカルボキシ、イソキノリルカルボキシ、フロイル、トシル、ピラジンカルボキシ、またはそのような他の基によって置換されるように、Ｎ末端が化学的に修飾され得、これらの基は、上記の置換基によって置換され得る。Ｎ末端アミノ基はまた、例えば、逆アミド結合（reverse amide bond）で置換され得る。用語「アミノ基」は本明細書において広義に使用され、ペプチドに存在する任意の遊離アミノ基（１級、２級、または３級アミノ基を含む）をいう。対照的に、用語「Ｎ末端」は、従来の様式で記載されるペプチド中に存在する最初のアミノ酸のαアミノ基をいう。
本発明のペプチドのＮ末端は、それにアミノ保護基を結合することによって保護され得る。用語「アミノ保護基」は本明細書において広義に使用され、遊離アミノ基（例えば、本発明のペプチドのＮ末端に存在するα−アミノ基を含む）と反応し得る化学基をいう。これらと反応するために、アミノ保護基は、例えば合成手順中または最終化学物に対するエキソペプチダーゼ活性により生じ得る所望しない反応から他の反応性アミノ基を保護する。アミノ基の修飾はまた、さらなる利点（例えば、化合物の可溶性または活性の上昇を含む）を提供し得る。種々のアミノ保護基が本明細書において開示されている（表３を参照のこと）か、または開示されていなくても当該分野において公知であり、そして例えば、アセチル、ピコロイル、tert−ブチルアセチル、tert−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイルオキシカルボニル、ベンゾイル基（例えば、２−アリール−２−Ｏ−ベンジルオキシム（実施例XVIを参照のこと）のようなベンジルオキシムを含む）ならびにアミノアシル残基（それ自体はアミノ保護基によって修飾され得る）のようなアシル基が挙げられる。他のアミノ保護基は、例えば、The Peptides、GrossおよびMeienhofer編、第３巻（Academic Press,Inc.,N.Y.1981）；およびGreeneおよびWuts、Protective Groups in Organic Synthesis、第２版、309〜405頁（John WileyおよびSons、New York（1991）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のペプチドまたはペプチドアナログのＮ末端アミノ基のこのような任意の修飾の生成物を、本明細書中では「Ｎ末端誘導体」という。
同様に、ペプチドのＣ末端に存在するカルボキシ基のようなカルボキシ基は、カルボキシ保護基を用いて化学的に修飾され得る。用語「カルボキシ基」および「Ｃ末端」は、上記に定義されるような用語「アミノ基」および「Ｎ末端」と一致する様式で使用される。ペプチドのＣ末端に存在するようなカルボキシ基は、Ｃ末端のカルボキシ基をアルコールまたはアルデヒドに還元することによって、あるいは経口エステル（oral ester）の形成によって、あるいはチアゾリル、シクロヘキシルまたは他の基のような置換基によるカルボキシ基の置換によって、修飾され得る。経口エステルは当該分野において周知であり、例えば、メトキシメチル、エトキシメチル、イソプロポキシメチルなどのようなアルコキシメチル基；メトキシエチル、エトキシエチル、プロポキシエチル、イソプロポキシエチルなどのようなα−（C1〜C4）アルコキシエチル基;5−メチル−２−オキソ−1,3−ジオキソレン−４−イルメチル、５−フェニル−２−オキソ−1,3−ジオキソレン−４−イルメチルなどのような２−オキソ−1,3−ジオキソレン−４−イルメチル基；メチルチオメチル、エチルチオメチル、イソプロピルチオメチルなどのようなC1−C3アルキルチオメチル基；ピバロイルオキシメチル、α−アセトオキシメチルなどのようなアシルオキシメチル基；エトキシカルボニル−１−メチル基；α−アセトオキシエチルのようなα−アシルオキシ−α−置換メチル基;3−フタリジルまたは5,6−ジメチルフタリジル基;1−（エトキシカルボニルオキシ）エト−１−イル基のような１−（C1〜C4アルキルオキシカルボニルオキシ）エト−１−イル基；および１−（メチルアミノカルボニルオキシ）エト−１−イル基のような１−（C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ）エト−１−イル基が挙げられる。
本発明のペプチドは、それをカルボキシ保護基に結合することによって修飾され得る。カルボキシル保護基は、当該分野において周知であり、そしてペプチドに結合するために、所望しない反応に対してカルボキシル基を保護する（例えば、GreeneおよびWuts、上記、224から276頁（1991）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。当業者は、ペプチドのＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシ基上でもたらされ得る上記のような修飾、同様に例えば、本発明のペプチドのアミノ酸またはアミノ酸アナログの側鎖上に存在する任意の反応性アミノ基またはカルボキシ基上にもたらされ得るそのような修飾を認める。そのような修飾を実施するための方法は、本明細書において開示されているが、開示されていなくても当該分野において公知である。
本発明は、第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物を提供する。本発明の化合物は、一般構造X1−YIR−X2またはその機能的等価物を有する。ここで、X1は、Ｈ、アシル、アルキル、アリールアルキル、または１個以上のアミノ酸であり、そしてX2は、修飾されたＣ末端基、１個以上のカルボキシ保護基、または１個以上のアミノ酸、またはアミノ保護基のような他の置換基である。本発明の化合物は、種々の臨床症状の治療処置のための抗凝固剤として有用である。本発明の化合物はまた、血液サンプルの血餅形成を防止するための種々の研究手順に有用である。
本発明はまた、第X a因子の活性を特異的に阻害する化合物であって、一般式A1−A2−（A3）ｍ−Ｂを有する化合物を提供する。ここで、ｍは、０または１であり、そしてA1はR1−R2−R3であり、A2はR4−R5−R6であり、そしてA3はR7−R8−R9であり；ここで、R1は、１〜20個のアミノ酸；
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からなる群から選択され;Xは、Ｎ、CH、およびNC（Ｏ）からなる群から選択され、そしてR'1およびR"1は独立して、Ｈ、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、およびアミノ保護基からなる群から選択され、そしてここで、R1は置換基で置換され得;R2は−CR99R100−であり、ここで、R99およびR100は独立して、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択され、そしてここで、R99およびR100は独立して、置換基で置換され得;R3は、−Ｃ（Ｏ）−、−CH2−、−CHR99−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）−NR35−CH2−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され、ここで、R35は架橋基−Ｃ（Ｏ）−CR55−の該CHR55基であり;R4は、−CH2−および−NR50−からなる群から選択され、ここで、R50は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、およびヘテロ環からなる群から選択され;R5は＞CR201およびR202であり、ここで、R201R202は独立して、Ｈ、アルキル、アリールおよびアリールアルキルからなる群から選択され、そしてここで、R201およびR202は独立して、置換基で置換され得;R6は、−Ｃ（Ｏ）−、−CH2−、−CHR99−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され;R7は、−CH2−および−NR51−からなる群から選択され、ここで、R51はＨ、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、およびヘテロアリールアルキルであり、そして任意のこれらの部分は、Ｑおよび−（CH2）ｎ−Ｑからなる群より選択される置換基によって置換され、ここで、ｎは１から５であり、そしてここでＱは、アミノ、アミジノ、イミダゾール、およびグアニジノ基（これらの基は置換基で置換され得る）ならびにそれらのモノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−アルキルアンモニウムの薬学的に受容可能な塩、イソウレイド、またはイソチオウレイドからなる群から選択され;R8は−CR210R211−であり、ここで、R210およびR211は独立して、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、およびヘテロ環からなる群から選択され、そして任意のこれらの部分は、Ｑおよび−（CH2）ｎ−Ｑからなる群より選択される置換基によって置換され、ここで、ｎは１から５であり、そしてここで、Ｑは、アミノ、アミジノ、イミダゾール、およびグアニジノ基（これらの基は置換基で置換され得る）ならびにそれらのモノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−アルキルアンモニウムの薬学的に受容可能な塩、イソウレイド、またはイソチオウレイドからなる群から選択され;R9は、−Ｃ（Ｏ）−、−CH2−、および−CHR99−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；そしてここで、ｍが１のとき、Ｂは、１〜20個のアミノ酸、−NHR52−、−NR60R61−、−OR70、および−CHR60R61からなる群から選択され、ここで、R52は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択され；ここで、R60およびR61は独立して、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アリール、ヘテロアリールアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択され、そしてここで、R70は、Ｈ、アシル、アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、そしてここで、ｍが０のとき、Ｂは、１〜20個のアミノ酸、−OR70、−NHR52、および−NR60R61からなる群から選択され、これらはアミド結合またはエステル結合によりR6に結合し；ここで、Ｂ��置換基で置換され得、ただし、R3が−CH2−または−CHR99−Ｃ（Ｏ）−の場合、R4はNR50であり;R4が−CH2−の場合、R3は−Ｃ（Ｏ）−または−CHR99−Ｃ（Ｏ）−であり;R4が−CH2−の場合、R3は−Ｃ（Ｏ）−または−CHR99−Ｃ（Ｏ）−であり;R6が−CH2−の場合、R7は−NHR51−であり;R7がCH2の場合、R6は−Ｃ（Ｏ）−または−CHR99−Ｃ（Ｏ）−であり;R4が−NR50−であって、R1が、
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R50とR'1とは一緒になって式：−Ｃ（Ｏ）−CHR55−を有する架橋基を形成し、ここで、CHR55はR50を表し、そしてカルボニル基はR'1を表し、そしてR"1およびR55は独立して、Ｈ、C1〜C6のアルキル、またはアリールアルキルであり；そしてR3が−Ｃ（Ｏ）−NR35−CH2−Ｃ（Ｏ）−のとき、R4は−NR50−であり、R1は
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−Ｃ（Ｏ）CHR55−を有する架橋基を形成し、ここで、Ｃ（Ｏ）はR'1を表し、そしてCHR55はR35を表し;R"1およびはR55は独立して、ＨまたはC1〜C6のアルキルである（例えば、実施例、図２を参照のこと）。
本発明の化合物は、R1、R2、R3、および所望であればR4により形成される環状Ｎ末端を含み得る。このような化合物は、例えば、上記のように構造A1−A2−（A3）ｍ−Ｂによって定義される。ここで、R4は−NR50−であり、R1は、
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R50とR'1とは一緒になって式−Ｃ（Ｏ）−CHR55の架橋基を形成し、ここで、R55はＨであり;R1はＨまたはメチルであり;R99およびR100は独立して、Ｈ、アリールアルキル、アルキル、およびヘテロアルキル、または１〜３個の炭素原子から選択され、そしてここで、R99およびR100は、フェニル、チエニル、チアゾリル、ピリジル、ナフチル、チオナフチル、インドリル、または飽和アルキル、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、テトラアルキルアンモニウム、アリールアルキルアミノ、アミノアルキルアリール、カルボキシ、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アミド、アミジノ、グアニジノ、トリアゾリル、およびスルホニルからなる群より選択される部分にさらに結合し得、そしてR3は−Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）−NR35−CH2−Ｃ（Ｏ）−からなる群より選択される。
さらに、化合物A1−A2−（A3）ｍ−Ｂにおいて、R'1およびR"1部分は、６個までの置換基（例えば、アルキルを含む）で置換され得、そして−OCH2−、−SCH2−、＞Ｎ−CH2−、＞Ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−CO−、またはNY−CO−NZのような基によって必要に応じて結合される。ここで、ＹおよびＺは、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、またはヘテロアラキル（heteroarakyl）であり得る。さらに、R99およびR100は独立してフェニル、チエニル、チアゾリル、ピリジル、ナフチル、チオナフチル、またはインドリル基、あるいはそれらに対応する飽和基のような置換基で置換され得、必要に応じてアルキル、アルコキシ、モノ−、ジ−、もしくはトリアルキルアミン、テトラアルキルアンモニウム、アリールアルキルアミノ、アミノアルキルアリール、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アミド、アミジノ、グアニジノ、トリアゾリル、またはスルホニルから選択される５個までの基によって必要に応じて置換される。R2位で置換基を有する好適な化合物は、R100がＨであり、そしてR99が
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のうちいずれかであり、ここで、置換された化合物中のＷは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、またはアミジノ基であり得、そしてＪは、例えば、Ｏ、Ｓ、または−NRであり得、ここで、ＲはＨ、またはアルキル、アリール、またはアリールアルキルである。
本発明の化合物は、A2部分上で置換される置換基を含み、そして第X a因子阻害活性を示し、例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳのような１つ以上のヘテロ原子置換基でのR50、R201、またはR202の置換を有し得る。R202はまた、以下から選択される置換基で置換され得：
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ここで、ＸはＣ、Ｎ、またはＳであり、Ｒはなし、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され、これはヘテロ原子によって置換され得；そしてｎは１〜５である。
本発明の化合物は、A3部分上で置換置換される置換基を含み、そして第X a因子阻害活性を示し、例えば、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、またはヘテロ環式のような１つ以上の置換基でのR51の置換を含み得、Ｎ、Ｏ、またはＳのようなヘテロ原子で必要に応じて置換される。R210およびR211は、例えば、置換基−（CH2）ｎ−Ｑであり得、ここで、ｎは約１〜５であり、そしてここでＱは、アミノ、アミジノ、尿素、イミダゾール、グアニジノ、モノ−、ジ−、トリ−、もしくはテトラ−アルキルイミニウムの薬学的に受容可能な塩、イソウレイド、またはイソチオウレイドである。あるいは、R210またはR211は、例えば、アルキル、アリール、またはアルキルアリールであり得る。これらの基は、ヒドロキシまたはC1〜C4アルコキシ基のような置換基でさらに置換され得る。
本発明の化合物は、Ｂ部分を含む置換基の交互の並び（alternative arrangement）を含み得る。このような置換基の交互の並びは、例えば、Ｎ、ＯまたはＳによるR52の置換、または１つ以上のヘテロ原子もしくはアルキル基によるR60、R61またはR70の置換を含み得る。
本明細書において開示される一般構造は、本発明の種々の構造を示し、トリペプチドYIRによって与えられるような第X a因子阻害活性を保持する。非天然のアミノ酸、アミノ酸疑似物、および他の有機構造を含む化合物、および同様の機能を示す置換基もまた、本明細書において開示される構造内に示される。このような機能的等価物は、効果的な第X a因子インヒビターの機能を与える所望の変化および影響力の適切な空間的配置（grouping）を提供する。
本発明の化合物の具体的な例としては、例えば、Ac−Tyr−Ile−Arg−Ala−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）;Ac−Tyr−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−NH−CH2（４−ピリジル）;Ac−Tyr−Ile−｛Ψ（CH2NH）｝−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−Tyr−Chg−Arg（NO2）−｛Ψ（CH2NH）｝−Leu−NH2;Ac−Tyr−Ile−Arg−｛Ψ（COCH2）｝−Gly−Pro−NH2;Ac−Tyr−Ile−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Leu−Ala−NH2;Ac−Try−Ile−PalMe（３）−NH2;Tyr−Ile−Arg−NH2;D−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2、Ac−（Bzl）Gly−（Chx）−Gly−（３−グアニドプロピル）Gly−NH2;シクロ（Gly−Tyr−Ile−Arg−Gly）;Tfa−（iBU）Tyr−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;Ac−pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2;およびAc−Nal（２）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2を包含する。本発明のさらなるYIRペプチドを、例えば、表３および５に示す。
本発明はまた、構造A1−A2−（A3）ｍ−Ｂを有する化合物を提供する。ここで、R1は、
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R'1は、Ｈ、−CO−Ra、−SO2−Ra、アミノ保護基、１〜６個のアミノ酸からなる群より選択され、これらは置換され得、ここで、該１〜６個のアミノ酸のＮ末端は、Ｈ、−CO−Ra、−SO2−Ra、およびアミノ保護基からなる群より選択される置換基で置換され；そしてここで、Raは、アルキル、アリール、およびヘテロアルキルからなる群より選択され;R"1は、Ｈ、アシル、およびアルキルからなる群から選択され;XはＮであり;R2は−CHR99−であり、ここで、R99は、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、およびヘテロアリールからなる群より選択され、これらは、１〜６個のフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノ、ニトロ、アミジノ、アミド、カルボキシ、エステル、エーテル、およびヒドロキシ基からなる群より選択される置換基で置換され得;R3は−Ｃ（Ｏ）−であり;R4は−NH−であり;R5は−CHR201−であり、ここで、R201はアルキルであり;R6は−Ｃ（Ｏ）−であり;R7は−NH−であり;R8は−CHR210−であり、ここで、R210は少なくとも１価の形式正電荷を有するヘテロアルキルであり、ここで、ヘテロ原子は１〜６個の窒素原子であり;R9は−Ｃ（Ｏ）−であり；そしてＢは、−ORbおよび−Ｎ−RcRdからなる群から選択され、ここで、Rbは、Ｈ、アルキル、およびカルボキシ保護基からなる群から選択され、Rcは、Ｈ、およびアルキルからなる群から選択され、そしてRdは、アルキル、ヘテロアルキル、および１から20個のアミノ酸からなる群から選択され、これらは置換基で置換され得、ここで、該化合物のＣ末端はカルボキシ保護基、１級アミド基、またはR1のアミノ基で形成される２級または３級アミド基としての、環状ペプチドの一部で修飾され得る。このような化合物は、１つ以上のアミノ保護基を含み得る。
例えば、本発明の化合物は、Tyr、Ｆ（pNH2）、mAph、pAph、およびNal（２）（これらは０または１個のアミノ保護基を含む）からなる群より選択されるAl;IleおよびChgからなる群より選択されるA2;Arg、PalMe（３）、Dab（Ｎγ−C3H7N）、Dap（Ｎβ−C3H7N）、およびOrn（Ｎδ−C3H7N）からなる群より選択されるA3;および−Ｈ、−OH−、−NH2、１〜５個のアミノ酸またはそれらの機能的等価物、およびカルボキシ保護基からなる群より選択されるＢを有する。このような化合物の例としては、Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−CH2−Chx;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−Chx;Bzf−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−Ｌ−Ｐ−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;シクロペンチル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;3−Iqc−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;2−フロリル−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;5−Me−チエニル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;およびAc−pAph−Chg−PalMe（３）−olが挙げられる（表５をまた、参照のこと）。
本発明はさらに、構造A1−A2−Ｂ、すなわちA1−A2−（A3）ｍ−Ｂを有する化合物であって、ここで、ｍが０である化合物を提供する。このような化合物において、Ｂは、（４−（Ｎ−メチルピリジニウム））メチル;2−（３−（Ｎ−メチルピリジニウム）エト−１−イル;1−（４−（Ｎ−メチルピリジニウム）エト−１−イル）；（ｐ−アミジノ）ベンジル;2−（４−（Ｎ−メチルピリジニウム））プロプ−２−イル；および２−（４−（Ｎ−メチルピリジニウム））エト−１−イルのようなヘテロアリールアルキルであり得る。Ac−pAph−Chg−AMP（４）およびAc−pAph−Chg−AEMP（４）は、このような化合物の例である。
本発明の化合物中にＬ−アミノ酸を含めるか、またはＤ−アミノ酸を含めるかの選択は、一部、ペプチドの所望の特徴に依存する。例えば、１個以上のＤ−アミノ酸の導入は、インビトロまたはインビボで、化合物の安定性を上昇させ得る。１個以上のＤ−アミノ酸の導入はまた、化合物の薬理的活性を上昇または減少し得る。いくつかの場合において、化合物がほんの短い期間だけ活性のままでいることが所望され得る。このような場合、化合物における１個以上のＬ−アミノ酸の導入により、個体中の内因性ペプチダーゼがインビボで化合物を消化することが可能になり得る。それゆえ、個体の活性化合物への曝露が制限される。当業者は、例えば、個体の年齢および全身的な健康状態を考慮することによって、本発明の化合物の要求される所望の特徴を決定し得る。
本発明の化合物は、例えば自動合成機を用いて、化学的に合成され得る（実施例Ｉを参照のこと）。アミノ酸の側鎖またはペプチド中のＮ末端もしくはＣ末端に存在する基のような反応基の選択的修飾は、可溶性の上昇または阻害機能の増強のような所望の特徴を本発明の化合物に与え得る。
固相合成法を用いる場合、発生時のペプチドが樹脂に結合している間、または樹脂からペプチドを切断して例えばＮ末端アセチル化合物のようなＮ末端誘導体を得た後、化合物の化学組成を操作し得る。同様の修飾はまた、化合物のカルボキシ基（Ｃ末端のカルボキシ基を含む）に対して行われ得、例えば、アミデート化され得る。当業者はまた、液相有機化学を用いて、本発明のYIRペプチドを合成し得る。合成された化合物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HPLC;実施例Ｉを参照のこと）のような周知の方法、または化合物のサイズ、電荷、もしくは疎水性に基づく他の分離方法を用いて精製され得る。同様に、アミノ酸配列の分析または質量分析（MS）のような周知の方法は、本発明の化合物の構造を特徴付けるために使用され得る（実施例Ｉを参照のこと）。
本発明のYIRペプチドは、直鎖状または環状であり得る（例えば、表３、下記を参照のこと）。環化は、隣接していない２つの残基、部分、または置換基間に架橋を形成することによって達成され得、これはYIRモチーフの内部または外部であり得る。環化はまた、例えば、YIRモチーフの内部の１個の残基と、YIR配列の外側の隣接していない残基、部分または置換基との間に架橋を形成することによって達成され得る。例えば、ペプチドまたはペプチド疑似物は、Ｓ−Ｓ、−CH2−Ｓ−、−CH2−Ｏ−CH2−、ラクタム、またはエステル結合を介して、あるいは先に報告されているように（Hruby、Life Sci.31:189−199（1982）;Toniolo、Int.J.Pept.Prot.Res.35:287−300（1990）;Katesら、Tetr.Lett.34:1549−1552（1993）（これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）環化され得る。
本明細書において使用される表現「YIRモチーフの外側」は、本発明のYIRペプチドに存在するYIR配列またはその等価物のうち、チロシン、イソロイシン、またはアルギニン残基を含まないことを意味する。対照的に、表現「YIRモチーフの内部」は、YIR配列またはその等価物のうち、少なくとも１つのチロシン、イソロイシン、およびアルギニン残基を含むことを意味する。環化化合物に言及する場合の用語「架橋」は、本発明のYIRペプチドに存在する２つの隣接していないアミノ酸の間に形成される結合を意味する。
例えば、X1とX2との間のジスルフィド結合またはラクタム結合の形成により、環化が達成され得る。ジスルフィド結合を形成し得る残基としては、例えば、Cys、Pen、Mpr、およびMppならびにその２−アミノ基含有等価物が挙げられる。ラクタム架橋を形成し得る残基としては、例えば、Asp、Glu、Lys、Orn、α，β−ジアミノプロピオン酸、α−アミノ−アジピン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸、およびメルカプト安息香酸が挙げられる。本明細書で開示される化合物は、例えばラクタム結合を介して環化され得、これらは、１個の隣接しない残基の側鎖基を利用して、X1またはＹのＮ末端アミノ基への共有結合を形成し得る。交互の架橋構造もまた利用され得、本発明の化合物を環化する。これには、例えば、Ｓ−Ｓ、−CH2−Ｓ−、−CH2−Ｏ−CH2−、ラクタム、エステルまたは他の結合（例えば、Hruby、上記、1982;Toniolo、上記、1990;Katesら、上記、1993を参照のこと）を介して環化され得るペプチドおよびペプチド疑似物が含まれる。
本発明の組成物は、均一の組成物、または置換基の種々の組み合わせを含む化合物の混合物として提供され得る。置換基の選択によって許容されるフレキシビリティーは、ペプチド化合物アナログの物理化学的特性にわたって、多くの制御を可能にする。置換基の選択はまた、化合物の結合親和性に影響する（実施例を参照のこと）。
異なる並びの置換基を含有する種々の化合物は、第X a因子に対して異なるレベルの阻害活性を示す。これらの化合物は、実施例に記載の手順に従って合成された。阻害活性についてのペプチドの試験を、実施例XXXVIIおよびXXXVIIIに記載のアッセイを用いて達成した。このような方法（これらの改変を含む）を用いて、当業者は、本明細書中で開示されるような化合物を合成し得、そして化合物の第X a因子の阻害活性を測定し得る。
本発明は、第X a因子活性を特異的に阻害する化合物を提供する。このような化合物は、第X a因子活性に対して、Ki≦100μＭ、好ましくは≦2nMを有し、そして第X a因子の阻害が関係している凝固およびフィブリン溶解現象に関与する他のプロテアーゼ活性を、実質的に阻害しない（表２（上記）を参照のこと）。このような他のプロテアーゼには、例えば、トロンビンおよびプラスミンが挙げられる。本発明の化合物の特異性を、以下の実施例XXXVIIに示す（上記表２もまた、参照のこと）。
本発明の化合物は、抗凝固剤として有利に使用され得る。この化合物を血液サンプルと接触させ、凝固を防止し得る。例えば、有効量の本発明の化合物を、得られた新鮮な血液サンプルと接触させ、血液サンプルの凝固を防止し得る。本明細書中で使用されるように、用語「有効量」は、本発明の化合物に関して使用される場合、第X a因子活性を阻害する化合物の量を意味する。当業者は、本発明の化合物の有効量が、本明細書中（実施例XXXVIIおよび実施例XXXVIIIを参照のこと）に記載の方法、またはそうでなければ当該分野において公知の方法を用いて測定され得ることを認識する。本発明の化合物の開示される有用性を考慮すると、当業者はまた、ヘパリンのような薬剤が本発明の化合物で置換され得ることを認識する。本発明の化合物のこのような使用の結果、例えば、他の抗凝固剤に比べてコストを低くすることができる。
さらに、本発明の化合物を、種々の臨床症状の処置のために個体に投与し得、これらの処置には、例えば、心血管障害の処置、または、例えば、感染または外科手術関連性合併症の処置が挙げられる。心血管障害の例には、血管形成術後の再発狭窄症、成人呼吸窮迫症候群、多臓器不全、脳卒中および播種性血管内凝固症候群の血餅形成障害が挙げられる。外科手術に関連する関連性合併症の例は、例えば、深静脈血栓症、および近位静脈血栓症などが挙げられ、これらは外科手術後に生じ得る。したがって、本発明の化合物は、個体の望ましくない凝固を減少または阻害するための薬剤として有用である。
本発明のYIRペプチドが第X a因子活性を阻害し得るので、このような化合物は個体の血餅形成を減少または阻害するのに有用である。本明細書で使用される用語「個体」は、ヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物を意味し、個体において第X a因子は血餅形成カスケードに関与している。
個体における血餅形成は、治療有効量の本発明のYIRペプチドを個体に投与することにより、減少または阻害される。本明細書で使用される用語「治療有効量」は、個体における第X a因子活性を阻害するために、個体に投与されるべきYIRペプチドの用量を意味する。より具体的には、本発明の化合物の治療有効量は、プロトロンビナーゼ複合体内で、または可変性サブユニットとして直接的に、または第X a因子のプロトロンビナーゼ複合体への構築を阻害することにより間接的に、そのいずれかで第X a因子触媒活性を阻害する。特に、このような化合物は、Ki≦100μＭで、そして、好ましくは≦2nMで、第X a因子活性を阻害し得る。治療有効量を、例えば、実施例XXXVIIおよびXXXVIIIに記載の方法、または当該分野において公知の方法を用いて、決定し得る。
本発明の治療方法の実施において、個体に投与される治療有効量の薬学的組成物を得るための特定の投薬量は、種々の配慮に依存しており、これらの配慮には、例えば、疾患の性質または疾患の重篤度、投与のスケジュール、ならびに個体の年齢および身体的特徴が挙げられる。適切な投薬量は、医学の分野において周知の臨床アプローチを用いて確立され得る。したがって、本発明は、第X a因子を、配列X1−YIR−X2、またはA1−A2−（A3）ｍ−Ｂ（ここで、ｍは０または１である）を有する化合物、あるいはそれらの機能的等価物と接触させることにより、第X a因子の活性を特異的に阻害する方法を提供する。本発明は、更に、治療有効量の本発明の化合物を投与することにより、個体における血餅の形成を減少させるか、または阻害する方法を提供する。
本発明の化合物は、一般的に、化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物として、個体に投与される。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、個体にとって非毒性であるか、または適切な調節機関により規定されるような受容可能な毒性を有する、媒体または組成物をいう。本明細書で使用される用語、薬学的に受容可能なキャリアは、リン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、または水／油エマルジョン）、または種々の型の任意の湿潤剤のような、任意の標準的な薬学的なキャリアを包含する。適切な薬学的キャリアおよびそれらの処方物は、Martin（Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、（Mack Publishing Co.,Easton 1975）、これは本明細書中に参考として援用される）により記載される。このような組成物は、一般に、個体への投与のために適切な投薬量を包含するように、治療効果量の本発明の化合物を、適切な量のキャリアとともに含む。したがって、請求の範囲の化合物は、個体における第X a因子活性および血餅形成を阻害するための薬剤として有用であり得る。
薬学的に受容可能なキャリアとしてはまた、例えば、薬理学的機能を増強する第X a因子インヒビター化合物に対する他の媒体、化合物、または改変物が挙げられる。薬学的に受容可能な媒体は、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、または、過塩素酸）、または有機酸（酢酸、シュウ酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸）で形成される塩のような酸付加塩を含み得る。他の薬学的に受容可能な塩は、例えば、無機の硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられ、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム）に基づくカチオン、ならびに非毒性アンモニウム、４級アンモニウムおよびアミンカチオン（例えば、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、およびテトラメチルアンモニウム）を含むが、これらに限定されない。
化合物の薬学的機能を増強する改変の例には、例えば、C1〜C6アルキルエステル、好ましくはC1〜C6アルキルエステル（ここでは、アルキル基は直鎖または分枝鎖である）処方物のようなエステル化が挙げられる。他の受容可能なエステルには、例えば、C5〜C7シクロアルキルエステルおよびアリールアルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）が挙げられる。このようなエステルは、ペプチド化学の分野において周知の従来の方法を用いる、本明細書に記載の化合物から調製され得る。
薬学的に受容可能な改変物はまた、例えば、ペプチドアミドの処方物を包含し得る。このようなアミド改変物は、本発明の化合物において達成され得、例えば、アンモニア、１級C1〜C6ジアルキルアミン（ここで、アルキル基は直鎖または分枝鎖であるか、またはアリールアミンは種々の置換基を有する）由来の改変物を含む。２級アミンの場合、アミンはまた、例えば、窒素原子を含有する５または６員複素環の形態であり得る。このようなアミドを調製する方法は、当該分野において周知である。
本発明の別の実施態様において、YIRペプチドは、第X a因子の存在を同定するためのアッセイ、または実質的に精製された形態の第X a因子を単離するためのアッセイにおいて使用され得る。好ましくは、本発明の化合物は、例えば、放射性同位元素で標識され、そして標識化合物を、特定の標識を検出するために有用な日常の方法を用いて検出する。さらに、YIRペプチドは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで第X a因子の位置または量を検出するためのプローブとして、有利に使用され得る。
本発明の種々の実施態様の活性に実質的に影響しない改変物が、本明細書中で開示される本発明内に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は例証を意図するが、本発明を制限することを意図しない。
実施例  Ｉ
ペプチド合成手順
合成に使用した出発物質は、Aldrich、Sigma、Fluka,Nova Biochem、およびAdvance Chemtechのような化学会社から入手した。これらの化合物の合成の間に、これらの方法において使用されたアミノ酸誘導体の官能基をブロック基で保護し、カップリング工程の間の副反応を防止した。適切な保護基およびそれらの使用の例については、The Peptides、上記、1981、および第９巻、UdenfriendおよびMeienhofer編1987、に記載されており、これらは本明細書中に参考として援用される。
一般的な固相ペプチド合成を用いて、本発明の化合物を生成した。このような方法については、例えば、StewardおよびYoung（Solid Phase Peptide Synthesis（Freeman and Co.,San Francisco,1969）に記載されており、これは本明細書中に参考として援用される。
他に示さない限り、１％ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂上でペプチドを合成した。酸性感受性リンカー（Rink Linker）を固体支持体に結合した（Rink,Tetr.Lett.28:3787（1987）;Sieber,Tetr.Lett.28:2107（1987）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。等価量のHOBt存在下で、N,N'−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）を用いてカップリングを実施した。カップリングはすべて、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中またはDMF:ジクロロメタン（1:1混合物）中のいずれかにおいて、室温（RT）で40分間行った。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験でモニターした。
Fmoc基の脱保護は、10分間、DMF溶液中の50％ピペリジンを用いて達成した。遊離したFmocの量は、脱保護後の溶液の300nmでの吸光度、洗浄液の容液、および合成に用いた樹脂の重量から決定した。初回のカップリングが不完全であった場合は、第２の（ダブル）カップリングを実施した。各カップリングおよび方法のサイクルは、以下の通りであった：
0003655632.tif 000015
樹脂上のペプチドの構築完了後、最後のFmocの脱保護を実施し、次いで通常の洗浄サイクルおよび脱保護により遊離したFmoc基の量を測定した。場合により、20倍過剰の無水酢酸／ピリジン（1:1）のDCM溶液とともにペプチド樹脂を15分間振盪することによって、Ｎα−未保護のペプチドをアセチル化した。ペプチド樹脂を、連続して、DCM、DMF、およびDCMで洗浄し、次いで減圧下で乾燥した。
ペプチド樹脂を試薬Ｋ（Kingら、Int.J.Pept.Proc.Res.36:255−266（1990）、これは本明細書中に参考として援用される）カクテル（5ml/gペプチド樹脂）中に180分間、RTで懸濁し、次いで切断混合物を無水ジエチルエーテル中で濾過し、そして固体沈殿物を遠心分離により単離し、そしてKOHの固体ペレットの上で減圧中で乾燥した。乾燥ペプチドを、水およびアセトニトリル（ACN）中の0.1％TFAの適切な勾配を用いて、HPLC精製に供した。意図する合成産物を含むピークを回収した後、ペプチド溶液を凍結乾燥し、そしてペプチドを同定プロセスに供した。このプロセスは、正しい化合物が合成されたことを確認するためのエレクトロスプレーMSおよびアミノ酸分析を包含する。
ペプチド精製のために、粗凍結乾燥ペプチドのサンプルを、10％〜50％のACNを含有する0.1％TFA水溶液の混合物に溶解した。ペプチド溶液は、通常、0.45μｍナイロン"ACRODISC"13（Gelman Sciences;Ann Arbor MI）フィルターに接続したシリンジを介して、濾過した。濾過したペプチド溶液の適切な容積を、セミ−調製用（semi−preparative）C18カラム（Vydac Protein and Peptide C18,218TP1010;The Separation Group;Hesperia（CA）に注入した。溶出剤として0.1％TFA緩衝液とACN（HPLC用）との勾配混合物または定濃度混合物（isocratic mixture）の流速を、Beckmanの「SYSTEM GOLD」HPLCを用いて維持した。ペプチドの溶出を、230nmでのUV検出（Beckman,System Gold、Programmable Solvent Module 126および「SYSTEM GOLD」ソフトウェアにより制御されるProgrammable Detector Module 166）によりモニターした。MSを用いて、合成下の化合物に対応するピークを同定した後、化合物を回収し、凍結乾燥し、そして生物学的に試験した。MSを、SCIEX API III＋の装置を用いて実施した。さらに、General Electricの装置（300MHz）を用いて、NMRを実施した。NMRの場合は、サンプルは典型的に、ヘキサジューテロジメチルスルホキシドまたはジューテロクロロホルム（CDCl3;Aldrich）中で測定した。
当該分野において周知の方法を用いて、アミノ酸アルデヒドを調製した。アミノ酸およびペプチドアルデヒドは、例えば、FehrentzおよびCastro、Synthesis 676（1983）;Bajuszら、J.Med.Chem.33:1729（1990）;Kawamuraら、Chem.Pharm.Bull.17:1902（1969）、およびSomenoら、Chem.Pharm.Bull.,34:1748（1986）（これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）により、報告されている。還元型ペプチド結合の合成は、溶液中のジペプチド（例えば、Tyr−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile）のレベルで実施され、次いで適切に保護されたジペプチドを、固相ペプチド合成法を用いて、樹脂上の残りのペプチドに結合させる。あるいは、保護されたアミノ酸アルデヒドを、Hoら（Pept.Res.6:10〜12（1993）、およびそこに引用される文献、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）に記載の方法を用いて、樹脂上のペプチドに結合させた。
実施例II
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Ala−NH2の合成
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Ala−NH2の合成のために、上記のように、手順において、1gのRink樹脂（0.6mmol NH2/g樹脂）を使用した。得られたペプチドをMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、（Ｍ＋Ｈ）＋実測値:659.4、計算値（calc.）:659.9であった。
実施例III
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
Ac−Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成のために、実施例Ｉに記載のように、手順中において、1gのRink樹脂（0.6mmol NH2/g樹脂）を使用した。得られたペプチドは、（Ｍ＋Ｈ）＋実測値:685.4、計算値:685.9を有した。
実施例IV
Ac−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
1gのRink樹脂（0.6mmol NH2/g樹脂）を使用した。上で概略した一般的な固相合成を使用した。Tyrの脱保護およびペプチド樹脂の適切な洗浄後、２％氷酢酸を含有するDMF中の50当量のイソブチルアルデヒドを添加した。得られた混合物を４時間、RTで振盪した。２％酢酸を含有するDMF（２×8ml）でペプチド樹脂を洗浄後、２％酢酸を含有する10mlのDMF中の1gNaBH3CNを添加した。ペプチド樹脂を30分間振盪し、次いでペプチド樹脂を濾過し、そしてDMF/酢酸中のNaBH3CNの新鮮混合物を添加し、そしてさらに30分間反応を継続した。
次いで、ペプチド樹脂をDMF/2％酢酸（２×8ml）およびDMF（２×8ml）で洗浄した。得られたモノアルキル化ペプチド樹脂をDMF中の無水酢酸トリエチルアミン混合物でアセチル化した（30当量、６時間）。ペプチド樹脂の適切な洗浄後、実施例Ｉのようにペプチドを切断し、そして脱保護した。HPLC精製ペプチドを、MSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:758.4、計算値:758.5であった。
実施例Ｖ
Tfa−（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
実施例IVに記載と同様のプロトコルを用いて、（iBu）Tyr−Ile−Arg−Leu−Pro−Rink樹脂を調製した。ペプチド樹脂を0.7Mトリフルオロ酢酸無水物で、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）およびＮ−メチルイミダゾール（NMI）（1:3:0.3当量）の存在下、45分間処理することによって、最終的にトリフルオロアセチル化を実施した。樹脂からのペプチドの切断、およびペプチドの単離を実施例IVに記載のように行った。精製ペプチドを、MSにより同定した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:812.4、計算値:812.5であった。
実施例VI
Ac−Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）の合成
Boc−Arg（NG−Tos）−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）の合成は、文献の手順（FehrentzおよびCastro、上記、1983）にしたがって達成した。Boc−Arg（Ｎγ−Tos）−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）（200mg）を5mlのトリフルオロ酢酸（TFA）とRTで混合し、そして20分間撹拌した。出発物質の消失は、CHCl3:MeOH:CH3COOH（90:9:1）を用いて薄相クロマトグラフィー（TLC）によりモニターし、そしてニンヒドリンスプレーおよびUVイルミネーションによって可視化した。減圧下で残りのTFAをエバポレートし、およびKOHペレット上で減圧乾燥した結果、適切な質量を有する固体物質を得た。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:371.2、計算値:371.4であった。
１つのフラスコ中で、150mgの上記のように調製した物質を1ml DMFに溶解し、次いで、57μｌのトリエチルアミンを添加して、そして混合物を０℃に冷却した。第２のフラスコ中で、171mgのＺ−Tyr−Ile−OH（Biochem Bioscience Inc.;Philadelphia PA）を無水テトラヒドロフラン（THF）中に溶解し、そして−10℃に冷却し、次いでN2下、44μｌのNNMおよび52μｌのイソブチルクロロホルメートを添加し、そして混合物を15分間撹拌した。先に調製したArg（Tos）Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）のDMF溶液をＺ−Tyr−Ile−OHジペプチドの混合無水物に添加し、そして混合物を−10℃で30分間、次いで一晩、RTで撹拌した。
実施例Ｉに記載のような反応混合物のワークアップ後、ペプチドを減圧下で乾燥し、そして小部分をHPLCにより精製し、そしてMSにより分析した；ペプチドは、予想された分子量（781）を有していた。得られたペプチド、Ｚ−Tyr−Ile−Arg（Tos）−Ｎ（CH3）OCH3を500μｌのアニソールと混合し、そして通常の手順によりHF脱保護に供した。ワークアップ後、169mgの生成物Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）Ｏ（CH3）を単離し、そしてMSにより同定した（実測値:493.6、計算値:494）。次いで、残余ペプチドを1mlの1N HClに溶解し、そして凍結乾燥した。
Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）OCH3・2HCl（76mg）をACNに溶解し、０℃に冷却し、そして13μｌのピリジンを添加し、続いて15μｌの無水酢酸を添加した。混合物を０℃で３時間撹拌し、そして反応の完了をニンヒドリン試験によりモニターした。RTで８時間撹拌後、反応混合物をワークアップし、そして生成物のAc−Tyr−Ile−Arg−Ｎ（CH3）OCH3を、MSにより特徴付けした（実測値:535.6、計算値:535.3）。
実施例VII
Ac−Tyr−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
a.  Fmoc−Tyr（But）−Ｈの合成
4.6g（10.0mmol）のFmoc−Tyr（But）−OH、2.1g（10.1mmol）ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1.26g（10.1mmol）のベンジルメルカプタンおよび0.12gのDMAPを、HoおよびNgu（J.Org.Chem.58:2315（1993）、これは、本明細書中で参考として援用される）に記載のように、DCM中で反応させた。ワークアップ後、Fmoc−Tyr−（But）−Ｓ−CH2C6H5を単離し、そして炭素上10％Pdの存在下、トリエチルシランとともに撹拌することによるチオエステルの還元、およびフラッシュクロマトグラフィーによる精製の際に、81％収率のFmoc−Tyr（But）−Ｈを得た。生成物のNMRおよび質量は、予想の範囲と一致した。
b.  Fmoc−Tyr−（But）−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−（Ｏ−アリル）の合成
20mlの１％AcOH/DMF中の0.73g（1.66mmol）のFmoc−Tyr（But）−OHおよび0.209g（3.32mmol）のNaBH3CNを、2mlのDMF中の0.516g（1.82mmol）TFA.Ile−（Ｏ−アリル）に添加した。２時間後、反応混合物をワークアップし、そして最終生成物をフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート：ヘキサン、35:65）により精製して、適切なNMRおよびMSを有する油状生成物を得た。（Ｍ＋Ｈ）は、実測：値599、計算値:598.7であった。
c.  Fmoc−Tyr（But）−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−OHの合成
10mlのDCM中の0.467g（0.78mmol）のFmoc−Tyr（But）−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−（Ｏ−アリル）に、89μｌ（1.56mmol）のHOAc、20μｌのトリエチルアミン（TFA）、および0.02gのPdCl2（Ph3）２複合体を添加した。231μｌ（0.86nmol）のBu3SnHを一部に添加し、そして混合物を１時間、RTで撹拌した。反応混合物の適切なワークアップ後、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（CHCl3:MeOH、20:1）上で精製し、69％収率（0.319g）の予想ペプチドを得た。（Ｍ＋H+）は、実測値:559、計算値:558。次いで、実施例Ｉに概略したような一般的な固相方法論を用いて、Fmoc−Tyr（But）−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−OHをArg（Pmc）−Leu−Pro−Rink樹脂に結合させた。得られたペプチド樹脂のAc−Tyr（But）−｛Ψ（CH2NH）｝−Ile−Arg（Pmc）−Leu−Pro−Rinkを脱保護し、そして実施例Ｉに記載のように通常通り切断し、そしてC18カラム上のHPLCにより精製した。
実施例VIII
Ac−Tyr−Ile−Arg−NH−CH2（４−ピペリジン）の合成
オキシム樹脂（DeGradoおよびKaiser、J.Org.Chem.45:1295（1980）（0.6mmol/gの0.862g）を一晩、DIC/HOBt存在下で、Boc−Arg（Tos）−OHに結合させた。樹脂をDMF、次いでDCMで洗浄し、そしてDCM中、無水酢酸/DIEA（1:1当量）でアセチル化した。樹脂をDCM、DMF、およびDCMで洗浄した後、DCM中、25％TFAで30分間脱保護した。脱保護した樹脂を、DCM、イソプロパノール、およびDCMで洗浄した。DCM中、1.5当量のDIEA存在下、TFA.Arg（Tos）−OxmRに、対称の無水物形態（symmetrical anhydride form）でBoc−Ile−OH（３当量）を結合させた。上記のように洗浄、アセチル化、および脱保護のサイクルを繰り返した。脱保護後、Boc−Try（２−BrZ）−OHをIleの場合と同様の方法で結合し、次いで得られたペプチド樹脂Boc−Tyr（２−BrZ）−Ile−Arg（Tos）−OxmRを脱保護し、そしてアセチル化してAc−Tyr（２−BrZ）−Ile−Arg（Tos）−OxmRを得た。ペプチド樹脂を減圧下で乾燥し、総量で0.216gを得た。
樹脂の1/3を、6ml DCM中、60μｌの氷酢酸および120μｌのDIEA存在下で、100μｌ（800μmol）の４−（ジメチルアミノ）ピリジンに添加した。樹脂を一晩、RTで撹拌した。DCM溶液の濾過後、樹脂を3mlのDMFで洗浄し、そして洗浄液をDCMの濾液とあわせた。溶媒のエバポレート後、残余ペプチドをHF/アニソールで脱保護し、そして通常通りプロセスして予測ペプチドを得た。エレクトロスプレーMSを実施した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:582.3、計算値:582であった。
実施例IX
Ac−Tyr−Ile−｛Ψ（CH2NH）｝−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
a.  Boc−Ile−Ｈの合成
FehrentzおよびCastro（上記、1983）に記載のように、アルデヒドを1gのBoc−Ile−Ｎ（Me）OMeから合成した。参考文献に記載のように、アルデヒドをTLCおよびNMRによって同定した。
b.  Arg（Tos）−Leu−Pro−MBHAの合成
実施例Ｉに記載の一般的な固相アプローチによって、トリペプチド樹脂の合成を実施した。
C.  Boc−Ile−｛Ψ（CH2NH）｝−Arg（Tos）−Leu−Pro−MBHAの合成
１％酢酸を含有するNaBH3CNのDMF溶液を用いる還元的アミノ化によって、Boc−Ile−Ｈをトリペプチド樹脂のArg（Tos）−Leu−Pro−MBHAに結合した。Boc基を通常通り切断し、そしてDIC/HoBtを用いてAc−Tyr−OHを結合した。得られたペプチド樹脂（0.7g）を脱保護し、そしてHF/チオアニソール混合物を用いて樹脂から切断した。19mgの粗Ac−Tyr−Ile−｛Ψ（CH2NH）｝−Arg−Leu−Pro−NH2をC18カラム上でHPLC精製して、純度90％を上回る予想ペプチドを約5mg得た。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:688.4、計算値:687.9であった。
実施例Ｘ
Ac−Tyr−Ile−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Leu−Ala−NH2の合成
実施例Ｉに記載の方法を用いて、0.2gのSCAL−TG（0.2mmol NH2/g）（Patek ＆ Lebel、Tetr.Lett.32:3891−3894（1991）、これは、本明細書中において参考として援用される）を、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Dab（Boc）−OH、Fmoc−Ile−OH、およびFmoc−Tyr（But）−OHと結合した。Ｎ末端のアセチル化およびTFAによる側鎖の脱保護後、ペプチド樹脂のAc−Try−Ile−Dab−Leu−Ala−SCAL−TGを洗浄し、中和し、そして２時間、0.3M PyBroP/NMIのDMF溶液で処理した。1Mトリフェニルホスフィン／（CH3）3SiClのDCM溶液（３×１時間）、続いて100％TFAを用いて樹脂から切断した。ジエチルエーテル沈殿による粗ペプチドの単離後、ペプチドを0.1％TFAの水溶液から凍結乾燥した。ペプチドのAc−Tyr−Ile−Dab（Ｎγ−C3H7N）−Leu−Ala−NH2をHPLCにより精製し、そしてMSによって特徴付けした。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:676.4、計算値:676.4であった。
実施例XI
Ac−Tyr−Ile−PalMe（３）−NH2の合成
実施例Ｉに記載の方法を用いて、1.0g Rink樹脂（0.48mmol NH2/g）に、Fmoc−Pal（３）−OH、Fmoc−Ile−OH、およびFmoc−Tyr（But）−OHを結合した。0.25gの得られたペプチド樹脂のFmoc−Tyr（But）−Ile−Pal（３）−Rinkに、500μｌのメチルヨード（MeI）のDCM溶液を添加し、そしてペプチド樹脂を６時間振盪した。実施例Ｉに記載のように、得られたペプチド樹脂のFmoc−Tyr（But）−Ile−PalMe（３）−Rinkを脱保護し、そしてアセチル化し、そして切断した。粗ペプチドの一部分をHPLCにより精製し、そして最終ペプチドをMSにより特徴付けした。
実施例XII
Ac−シクロ（Gly−Tyr−Ile−Arg−Leu−Lys）−NH2の合成
実施例Ｉに記載の方法を用いて、1gのSCAL−TG（0.29mmol NH2/g）（実施例Ｘを参照のこと）を、Fmoc−Lys（Boc）−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg（Pmc）−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Tyr（But）−OH、およびFmoc−Glu（OtBu）−OHと結合させた。Fmocの除去後、ペプチド樹脂をアセチル化し、そしてDMF次いでDCMで洗浄した。ペプチド樹脂のAC−Glu（OtBu）−Tyr（But）−Ile−Arg（Pmc）−Leu−Lys（Boc）−SCAL−TGを試薬Ｋで脱保護し、洗浄し、中和し、そしてBOP/HOBt/DIEA（5:5:5当量）のDMF溶液を用いて２時間、環化した。カップリングの完了を、Kaiser（Kaiserら、Anal.Biochem.34:595（1970）、これは、本明細書中において参考として援用される）に記載のように、ニンヒドリン試験によりモニターした。環化後、ペプチドを樹脂から切断し、HPLCにより精製し、そしてMSにより特徴付けした。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:844.5、計算値:844.5であった。
実施例XIII
シクロ（Gly−Tyr−Ile−Arg−Gly）の合成
1gのオキシム樹脂（実施例VIIIを参照のこと）（0.6mmol NH2/g）を一晩、DIC/HOBt存在下でBoc−Gly−OHと結合させた。樹脂の洗浄および脱保護後、実施例VIIIに記載の方法を用いて、Boc−Arg（Tos）−OH、Boc−Ile−OH、およびBoc−Try（２−Brz）−OHを結合した。ペプチド樹脂のBoc−Try（２−Brz）−Ile−Arg（Tos）−Gly−オキシム樹脂の1/3を脱保護し、そしてDIC/HOBtによりBoc−Glyと結合させた。得られたペプチド樹脂を脱保護し、中和し、そして１％の酢酸を含有するDMF中で、一晩、環化した。樹脂を濾過し、そして洗浄（DMF）し、濾液をあわせて、そしてエバポレートにより減圧下で有機溶媒を除去した。残余ペプチドを脱保護（HF/アニソール）し、凍結乾燥し、HPLC精製し、そしてM.S.により特徴付けした。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:547.8、計算値:547.8であった。
実施例XIV
Ｎ−置換グリシン化合物の合成：
Ac−（Bzl）Gly（Chx）Gly−（３−グアニドプロピル）Gly−NH2の合成
Ｎ−置換グリシンの合成のために、Zuckermannらの手順（J.Am.Chem.Soc.114:10646（1992）、これは本明細書中に参考として援用される）を使用した。1gのSCAL−TG（0.29mmol NH2/g）（実施例Ｘを参照のこと）を、DCM/DMF中の対称の無水物を介して、ブロモ酢酸と結合した。各カップリング反応を２回繰り返した。Br−CH2CO−SCAL−TG樹脂に、DMSO中のBoc−NH−CH2−CH2−CH2−NH2を添加し、そして樹脂を２時間振盪した。脱保護後、Br−CH2OOHの樹脂へのカップリング、およびブロモ酢酸樹脂と適切なアミンとの反応を交互に行うプロセスを繰り返した。（Bzl）Gly−（Chx）Gly−（Boc−NH−（CH2）３）Gly−SCAL−TG樹脂を、DMF中の無水酢酸/DIEA/NMI（1:1:0.25）で、一晩アセチル化した。Boc基の脱保護後、樹脂のAc−（Bzl）Gly−（Chx）Gly−（３−アミノプロピル）Gly−SCAL−TGを、1.8Mカルボキシアミジノピラゾール.HCl（Bernatowiczら、J.Org.Chem.57:2497−2502（1992）、これは本明細書中に参考として援用される）で、DMF中のDIEA（1:1）の存在下、RTで３時間処理した。グアニル化の完了を、Kaiser試験によりモニターした。得られたペプチドの切断およびプロセッシングを、実施例Ｘに記載のように実施し、そしてM.S.により分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:502.3、計算値:502.3であった。
実施例XV
ジケトピペラジン化合物の合成：
シクロ（Ser−Ida）−Ile−Arg−Leu−Ala−NH2の合成
保護された出発テトラペプチドのFmoc−Ile−Arg（Pmc）−Leu−Ala−Rinkを、Rink樹脂上のFmocストラテジーにより調製した（実施例Ｉを参照のこと）。ペプチド樹脂のFmoc脱保護後、Fmoc−Ida（OMe）−OH（３当量;DIC、HOBt）およびFmoc−Ser（tBu）−OH（７当量；対称の無水物）を連続的に結合した。50％ピペリジン/DMFに同時に１時間曝すことによって、最終的な脱保護、および自発性閉環が実施された。洗浄工程後、得られたペプチドを切断し、そしてTFA/チオアニソール/H2O（95:2.5:2.5）を用いて脱保護した。得られたペプチドを上記のようにプロセスし、そしてそれをHPLC（95％を超える）およびMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:655.4、計算値:655.38であった。
実施例XVI
Ph−Ｃ（NOCH2Ph）−CO−Ｉ−Ｒ−NH2の合成
0.2gのRink樹脂をFmoc−Arg（Pmc）−OH、Fmoc−Ile−OHと結合し、続いてFmoc保護を除去した（実施例Ｉを参照のこと）。上記のDIC/HOBtプロトコルを用いて、ペプチド樹脂のIle−Arg（Pmc）−RinkをPh−Ｃ（NOCH2Ph）−COOHと結合した。得られたペプチド樹脂のPh−Ｃ（NOCH2Ph）−CO−Ile−Arg（Pmc）−Rinkを、実施例Ｉに記載のようにワークアップし、そしてMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:524.3、計算値:524.6であった。
実施例XVII
Ac−pAph−Ile−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
実施例Ｉの方法に従い、以下のアミノ酸誘導体を用いて、100mg Rink樹脂（0.48mmol/g）上で、合成を実施した:Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg（Pmc）−OH、Fmoc−Ile−OH、およびFmoc−pAph−（Fmoc）−OH（ラセミ混合物）。実施例Ｉに記載のように、ペプチドの切断および単離を行った。両ジアステレオマーペプチドをRP−HPLCにより単離し、そしてMSにより同定した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:754.4、計算値:754.5であった。
実施例XVIII
Ac−Tyr−Chg−Arg−olの合成
実施例Ｉに記載の方法を用い、0.25g Fmoc−Arg（Pmc）−Sasrin樹脂（0.5mmol NH2/g樹脂;Bachem Bioscience）上でペプチド配列を構築した。Ｎ末端のFmoc脱保護およびアセチル化後、保護されたペプチドを、Ｃ末端アルコールのような還元的切断（Merglerら、Peptides 177−178頁（SchneiderおよびEberle;Leiden 1993）これらは本明細書中に参考として援用される）により樹脂から切断した。ペプチド樹脂を2mlのTHF:EtOH（6:1）中、NaBH4（４当量）の溶液とともに24時間振盪した。切断反応後、樹脂をDCMで洗浄し、、次いで切断溶液および洗浄液をあわせ、そして凍結乾燥した。凍結乾燥ペプチドを、TFA/水／チオアニソール（90:5:5）で２時間処理することによって脱保護し、そして沈殿によって単離した。HPLC精製ペプチドをMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:505.3、計算値:505.3であった。
実施例XIX
Ac−Tyr−Chg−Arg−ol.アセテートの合成
実施例XVIIIに記載のように、保護されたペプチドアルコールを調製した。10mgの粗物質をDCM/ACN中に溶解し、そしてTEA（2.4mmol）の存在下で20分間、無水酢酸（2mmol）で処理した。上記のように溶液を濾過し、エバポレートし、そしてペプチドを脱保護した。HPLC精製ペプチドをMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:547.3、計算値:547.3であった。
実施例XX
Ac−Phe（pNH2）−Chg−Orn−（Ｃ（NH）CH3）−Leu−Pro−NH2の合成
1gの「TENTAGEL S」NH2樹脂（0.28mmol NH2/g樹脂;Rapp Polymer;Tubingen Germany）を実施例Ｘに記載のように、SCALリンカーで機能化（functionalized）し、そして以下のアミノ酸を結合した:Fmoc−Pro−OH;Fmoc−Leu−OH;Fmoc−Orn（Boc）−OH、およびFmoc−Chg−OH。ペプチド樹脂Fmoc−Chg−Orn（Boc）−Leu−Pro−SCAL−TGをDCM中の50％TFAで処理（１分間の１回洗浄、次いで30分間の１回洗浄）し、DCMで３回洗浄し、DCM中の５％DIEAで中和し（２×30秒）、そしてDCMで２回中和した。ペプチド樹脂に、4mlの1:1ピリジン:DIEA中の1.5gエチルアセチミデートヒドロクロリド（Aldrich）および3mlのDMFを添加し、そしてカップリングを一晩RTで継続した。
ペプチド樹脂のFmoc−Chg−Orn（Ｃ（NH）CH3）−Leu−Pro−SCAL−TGをDMF中の20％ピペリジンで脱保護し、DMFで４回、DCMで４回洗浄し、そしてFmoc−Phe（pNH−BOC）−OHを、DMF中のDIC/HOBtカップリングを用いて結合した。Fmocの脱保護、および無水酢酸：ピリジン（1:1）を用いた、20分間のアセチル化によりペプチド樹脂のAc−Phe（pNH−BOC）−Chg−Orn（Ｃ（NH）CH3）−Leu−Pro−SCAL−TGを得た。SCALリンカーの還元およびペプチドの切断、続いて粗生成物のHPLC精製により、予想される化合物を得た。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:740.2、計算値:740.48であった。
実施例XXI
Ac−Phe（pNH2）−Chg−Dap（Ｎβ−C6H11N）−Leu−Pro−NH2の合成
0.5gのSCAL−TG（0.32mmol NH2/g）をFmoc−Pro−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Dap（Boc）−OH、およびFmoc−Chg−OHと結合させた。20分間、50％TFAを用いて、側鎖からBoc基を除去し、そしてペプチド樹脂を、10％DIEA/DCMで洗浄することにより中和した。ペプチド樹脂を、DMF中の0.3M PyBroP/NMIで20分間処置することによって、側鎖の遊離のアミノ基をジメチルアミジニウム基に転換した。50％ピペリジン/DMFで60分間、Fmoc基の脱保護を行った結果、Dapの側鎖でジメチルアミジニウムとピペリジニウム基との交換が行われた。Fmoc−Phe（Boc）−OHのカップリングとFmoc基の脱保護により配列を完成した。実施例Ｘに記載のように、ペプチドをアセチル化し、そして切断した。HPLC精製ペプチドをMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:752.4、計算値:752.4であった。
実施例XXII
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2の合成
アセトアミドマロネート法（Wagnerら、ドイツ民主共和国特許第155,954号、1982年、７月21日発行;1988年11月９日再審、これらは本明細書中に参考として援用される）により、ラセミのＨ−Phe（pCN）−OHを合成した。対応するメチルチオイミデートのアンモノリシスによるシアノ基の変換（シアノ基と硫化水素との反応により提供される）およびその後のMeIによるメチル化により、ラセミのAc−pAph−OHを合成した。
1gの「TENTAGEL」樹脂（置換＝0.21mmol NH2/g樹脂）およびKnorrリンカー（Bernatowiczら、Tetr.Lett.30:4645（1989）、これらは本明細書中に参考として援用される）を、ペプチドの合成に使用した。ジペプチドのFmoc−Chg−Pal−Knorr−TGを、実施例Ｉに記載のように構築した。その後、一晩のDCM中の1ml MeIにより、３−ピリジルアラニンをメチル化した。Fmoc脱離後、Ac−pAph−OHを、DIC/HOBt法を用いて結合し、そしてペプチドを実施例Ｉに記載のようにワークアップした。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:550.3、計算値:550.31であった。
実施例XXIII
Ac−Try−Chg−pAph−Leu−Pro−NH2の合成
実施例Ｉに記載のように、0.4gの「TENTAGEL」（置換＝0.2mmol NH2/g樹脂）上でペンタペプチドのAc−Try（But）−Chg−Phe（pCN）−Leu−Pro−Knorr−TGを構築した。樹脂を、H2Sで飽和した8mlのピリジン／トリエチルアミン（75:25）により、密閉シリンジ中で、一晩処置した。8mlアセトン中の0.5mlのMeIを使用して、樹脂結合チオアミドを30分間50℃でメチル化し、次いでアセトンおよびメタノールで洗浄した。メチルチオイミドをメタノール中の酢酸アンモニウムと３時間、55℃で反応させて、最終化合物を得た。これは、上記のように樹脂から切断し、そして精製した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:761.4、計算値:760.43であった。
実施例XXIV
Ac−Phe（pCH2NH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
実施例Ｉに記載のように、1gのRink樹脂（0.6mmol NH2/g樹脂）上でAc−DL−Phe（pCN）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2（粗ペプチド）を合成した。125mgの粗ペプチドを50mlのMeOHに溶解し、そして0.5mlのラネーNi懸濁液（Aldrich）を添加した。ペプチドおよび触媒の混合物を、35psiで、４時間、RTにて水素化した。触媒を濾過し、そして溶液をエバポレートして乾燥した。残渣を、30％ACNを含有する0.1％のTFA水溶液から凍結乾燥した。乾燥粗生成物をHPLCにより精製し、そしてMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:741.4、計算値:741.7であった。
実施例XXV
Ac−Phe（pC（NOH）NH2）−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
実施例XXIVに記載のように調製した21.1mgの粗ペプチドを、1.5ml MeOH中の60.3mg NH2OH.HCl（Aldrich）、0.7mlのピリジン、および0.5mlのTEAと混合した。混合物をRTで72時間撹拌し、次いで溶媒および揮発性物質を減圧下でエバポレートした。ペプチドをHPLCにより精製し、そしてMSにより分析した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:770.4、計算値:770.3であった。
実施例XXVI
A1−A2−Ｂ化合物の合成
A1−A2−Ｂ化合物、すなわちA1−A2−（A3）ｍ−Ｂ化合物（但し、ｍは０）を、図３に概略されるように調製した。簡単に説明すると、ラセミのＮ−アセチル−４−シアノフェニルアラニンとＬ−シクロヘキシルグリシンメチルエステル（Ｈ−Chg−OMe）とのカップリングにより、２つのジアステレオマーのジペプチドの混合物を得、これらをクロマトグラフィーにより分離した。Ｌ−シクロヘキシルグリシンメチルエステルで塩を形成させることにより、ラセミのＮ−アセチル−４−シアノフェニルアラニンを部分的に分割した。ほとんど溶けないD,L−塩を速やかに結晶化し、その後のカップリングにより実質的に純粋な形態でAc−ｆ（pCN）−Chg−OMeを得た。「母液」は、L,L−塩が富化されており、そしてカップリングにより粗Ac−Ｆ（pCN）−Chg−OMeがもたらされ、シリカゲル上のクロマトグラフィーによりさらに精製した。RTで、メタノール／水中の水酸化リチウムを用いて、これらのジペプチドエステルを対応する酸に加水分解した。両ジペプチド酸（dipeptide acid）を、適切なアミン（RNH2）との従来のカップリングにより、置換アミドに変換した。市販されていないアミンは、標準的な化学的方法を用いて調製した。
標準的な化学的方法（チオアミドおよびメチルチオイミデートを介するか、または対応アミドオキシムの水素化（実施例XXV）によるかのいずれか）を用いてシアノ基の対応するアミジンへの変換を実施した。後者は、ニトリルとヒドロキシルアミンとを反応させて得られた。下記の実施例は、これらの選択された方法による表題化合物の調製を例証する。本発明の化合物は、他の種々の方法を用いて調製され得ること、および本明細書中において例示された手段が適宜上選択されたことが認められる。
実施例XXVII
Ac−pAph−Chg−NHCH2−（４−メチルピリジニウム）の合成
実施例XXIIに記載の方法を用いるAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2−（４−ピリジル）変換によって、Ac−pAph−Chg−NHCH2−（４−メチルピリジニウム）の合成を達成した。実施例Ｉに記載のように、最終化合物をHPLCによって精製した。MS分析（Ｍ＋Ｈ）＋は実測値:493.3、計算値:493.29であった。
出発物質は、以下のように調製した：
ａ）Ac−（D,L）−Ｆ（pCN）（2.32g（10mmol））を、温めることによって、75mlのエタノールで溶解した。Ｌ−シクロヘキシルグリシンメチルエステル（1.75g、10mmol）を添加し、そして混合物を２時間、RTで撹拌した。沈殿した結晶を濾取し、そして乾燥して1.55gのD,L−塩を得た。濾液を部分的にエバポレートし、そしてエーテルで希釈した。分離した結晶物を回収し、そして乾燥し、D,L−塩が混入した2.1gのL,L−塩を得た。粗L,L−塩を20mlのDMF、0.71gのHOBt、および1.18gのDCCとあわせた。混合物を24時間、RTで撹拌した。尿素を濾取し、そして濾液をエバポレートした。残渣を塩化メチレンに溶解し、そして溶液を1N HClおよび重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。有機層を乾燥し、そしてエバポレートした。残渣は、60gのシリカゲル上でクロマトグラフし、塩化メチレン中の20％（v/v）アセトンを溶出のために使用した。塩化メチレン／エーテル／ヘキサンからあわせた澄明な画分を結晶化し、178〜180℃の融点を有する無色の結晶として1.6gのAc−Ｆ（pCN）−Chg−OMeを得た。
ｂ）1.93g（5mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OMe（実施例XXVII.a.由来、上記）、100mlのメタノール、10mlの水、および0.75gの水酸化リチウム水素化物の混合物を、窒素下、RTで24時間撹拌した。2mlの酢酸添加後、溶媒をエバポレートし、そして残渣は、20％のイソプロパノールを含有する塩化メチレンと1N HClとの間に分配された。有機層を乾燥し、そして残渣を塩化メチレン／エーテル／ヘキサンから結晶化し、216〜218℃の融点を有する無色の結晶として1.6gのAc−Ｆ（pCN）−Chg−OHを得た。
ｃ）150mg（0.4mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OH（上記）、65mg（0.6mmol）の４−アミノメチルピリジン、124mg（0.6mmol）のDCC、60mg（0.44mmol）のHOBt、および5mlのDMFの混合物を、RTで20時間撹拌した。尿素を濾過によって除去し、そして濾液をエバポレートした。残渣をメチレンでスラリーにし、そして濾過によって不溶性の生成物を回収して、140mgの無色のAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（４−ピリジル）を得た。アセトン：塩化メチレン：メタノール（4:5:1）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーにより、分析サンプルを得た。結晶固体は、250℃より高い融点を有した。
実施例XXVIII
Ac−ｆ（４−アミジノ）−Chg−NHCH2（４−メチルピリジニウム）
150mgのAc−ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（４−ピリジル）（上記を参照のこと）と硫化水素とを反応させ、次いでヨウ化メチルおよび酢酸アンモニウムと反応させることにより、本化合物を調製した。生成物をHPLCにより均一な物質として単離した。MS分析：（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:493.3、計算値:493.29であった。
出発物質を以下のように調製した：
ａ）2.8gのAc−ｆ（pCN），（Ｌ）−シクロヘキシルグリシンメチルエステルと、940mgのHOBtと、1.57gのDCCと、30mlのDMFとの混合物を、２日間、RTで撹拌した。濾過により尿素を除去し、そして濾液をエバポレートした。残渣を塩化メチレンに溶解し、そして溶液を1N HClおよび10％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を乾燥し、そしてエバポレートした。残渣を塩化メチレン／エーテル／ヘキサンから結晶化して、181〜183℃の融点を有する2.05gの無色のAc−ｆ（pCN）−Chg−OMeを得た。
ｂ）100mlのメタノールおよび10mlの水中の0.75g水酸化リチウム一水和物による、1.93gのAc−ｆ（pCN）−Chg−OMe（上記）の加水分解を、実施例XXVII（上記）のL,L−異性体についての記載のように処理し、塩化メチレン／エーテルから結晶化して、180〜182℃の融点を有する1.65gのAc−ｆ（pCN）−Chg−OHを生成した。
ｃ）225mgのAc−ｆ（pCN）−Chg−OH（上記）と、100mgの４−アミノメチルピリジンと、90mgのHOBtと、180mgのDCCと、6mlのDMFとの混合物を、週末にわたり、RTで撹拌した。尿素を濾過して除き、そして濾液をエバポレートした。残渣をメタノールとともに撹拌し、そして固体を濾過により取り出して、250℃より高い融点を有する190mgの結晶物Ac−ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（４−ピリジル）を得た。
実施例XXIX
Ac−pAph−Chg−NHCH2CH2（３−メチルピリジニウム）
125mgのAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2CH2（３−メチルピリジル）と、2mlのDMSOと、10mgピリジンと、5mlトリエチルアミンとの混合物を、氷／水中で冷却しながら、硫化水素で飽和した。シールしたバイアル中で、一晩、RTで撹拌した後、溶媒をエバポレートし、そして残渣をアセトン／エーテルで回収し、そして乾燥して125mgのチオアミドを得た。この物質を、2mlのDMSO、5mlのアセトン、および0,75mlのヨウ化メチルとあわせ、そして混合物をシールしたバイアル中で、一晩、RTで撹拌した。トルエンで希釈した後、溶媒をエバポレートし、そして残渣をエーテルとともに撹拌した。エーテルをデカントして、新鮮なエーテルと置き換え、そして樹脂状の物質が固体化するまで撹拌を継続し、次いで残りのエーテルを濾過して除き、そして残渣を乾燥した。
得られた残渣を20mlのメタノールに溶解し、そして0.3mlの酢酸および0.4gの酢酸アンモニウムで処理した。混合物を55〜60℃で2.5時間、加熱し、次いで溶媒をエバポレートした。残渣を水/ACN/TFAに溶解し、そして凍結乾燥した。粗生成物をHPLCにより精製した。MS分析：（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:507.3、計算値:507.31であった。
出発物質を以下のように得た。150mg（0.4mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OHと、120mg（0.6mmol）の２−（３−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドと、125mgのDCCと、60mgのHOBtと、0.5mlのジイソプロピルエチルアミンと、10mlのDMFとの混合物を24時間、RTで撹拌した。溶媒のエバポレート後、残渣をエタノールとともに撹拌し、そして不溶性の生成物を濾過により回収し、そしてメタノールおよびエーテルで洗浄して、110mgの無色の結晶を得た。濾液をエバポレートし、そして残渣を塩化メチレン／イソプロパノールに溶解した。この溶液を10％の炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥し、そしてエバポレートした。この残渣を、塩化メチレン：アセトン：メタノール（5:4:1）を用いる14gのシリカゲル上でクロマトグラフし、265〜268℃の融点を有する40mgのAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2CH2（３−ピリジル）を得た。
ｂ）２−（３−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドを以下のように調製した。1.3gの３−ピリジルアセトニトリル、約3gのラネーニッケル、10％容量のアンモニアを含有する30mlのメタノールの混合物を、Parrヒドロジェネイターを用いて35psiにて20時間水素化した。セライト上で触媒を濾過して除き、そして濾液をエバポレートした。残渣を塩化メチレンに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてエバポレートした。塩化水素のジオキサン溶液を用いて、生成物をジヒドロクロリドに変換した。メタノール／エーテルから結晶化して、145〜148℃の融点を有する1.4gの無色の結晶物を得た。
実施例XXX
Ac−pAph−Chg−NHCH2CH2（４−メチルピリジニウム）
Ac−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2CH2（４−ピリジル）と硫化水素とを反応させることによってヨウ化メチルでメチル化し、酢酸アンモニウムと反応させることによって上記のような方法を用いて、この化合物を調製した。粗生成物をHPLCで精製した。MS分析：（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:507.3、計算値:507.31であった。
実施例XXIX（上記）に記載のように、Ac−Ｆ（pCN）−Chg−OHと２−（４−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドとをカップリングすることにより、出発物質を得た。
２−（３−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリド（上記）についての記載のように、アンモニア存在下、ラネーニッケル上のピリジル−４−アセトニトリルの水素化により、２−（４−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドを調製した。ジヒドロクロリドは、220℃の融点を有した。
実施例XXXI
Ac−pAph−Chg−NHCH2（４−アミジノフェニル）
上記と同様の方法を用いて、DMSO中の硫化水素、ピリジンおよびトリエチルアミンとともにAc−Ｆ（pCN）−CHg−NHCH2（４−シアノフェニル）を処理することにより、この化合物を調製した。得られたビス−チオアミドを、DMSO/アセトン中のヨウ化メチルでメチル化し、次いで上記のように酢酸アンモニウムと反応させた。粗生成物をHPLCにより精製した。MS分析：（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:520.3、計算値:520.30であった。
出発物質を以下のように得た。75mg（0.2mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OHと、50mg（0.3mmol）の（４−シアノフェニル）メチルアミン塩酸塩と、62mgのDCCと、30mgのHOBtと、0.2mlのDIEAと、2mlのDMFとの混合物を、24時間、RTにて撹拌した。濾過後、溶媒をエバポレートし、そして残渣を20％のイソプロパノールを含有する塩化メチレンに溶解した。溶液を1N HClおよび10％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで乾燥し、そしてエバポレートした。残渣を少量のメタノール／水とともに撹拌し、そして分離した固体を回収し、そして乾燥して、80mgのAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（４−シアノフェニル）を得た。
（４−シアノフェニル）メチルアミン塩酸塩を以下のように調製した。2g（10mmol）のα−ブロモ−ｐ−トルニトリルと、2g（10.8mmol）のフタルイミドカリウムと、30mlのDMFとの混合物を加熱して、１分間還流した。冷却後、混合物を酢酸で酸性化し、そして水で希釈して生成物を結晶化した。結晶物を濾過し、水で洗浄し、そして乾燥して、182〜184℃の融点を有する2.24gの無色のＮ−（４−シアノフェニル）メチルフタルイミドを得た。
1.5gのＮ−（４−シアノフェニル）メチルフタルイミドを50mlの沸騰メタノール中に懸濁し、そして1mlのヒドラジン水和物で処理した。５分後、澄明な溶液を得た。メタノールをエバポレートし、そして残渣を2N HClで処理した。懸濁液を加熱して沸騰させ、次いで氷上で冷却した。固体を濾過して除き、そして濾液をエバポレートした。残渣を水に溶解した。溶液を再び加熱して沸騰させ、冷却し、そして濾過した。濾液を水酸化ナトリウムでアルカリ性にし、そしてイソプロパノールを含有する塩化メチレンで抽出した。有機相を乾燥し、そしてエバポレートし、そして残渣を塩酸塩に変換し、イソプロパノール／エーテルから結晶化し、そして260℃より高い融点を有する0.43gの無色結晶物を得た。
α−ブロモ−ｍ−トルニトリルとフタルイミドカリウムとを反応させることにより、（３−シクロフェニル）メチルアミン塩酸塩を調製し、147〜148℃の融点を有するＮ−（３−シアノフェニル）メチルフタルイミドを得た。上記のように、この物質とヒドラジン水和物の反応、および塩酸塩への変換により223〜226℃の融点を有する（３−シアノフェニル）メチルアミンを得た。
実施例XXXII
Ac−pAph−Chg−NHCH2（３−アミジノフェニル）
上記の方法を用いて、この化合物を調製した。Ac−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（３−シアノフェニル）をDMSO溶液中の硫化水素、ピリジン、およびトリエチルアミンで処理した。得られたビス−チオアミドを、DMSO/アセトン中のヨウ化メチルでメチル化し、次いで上記のように酢酸アンモニウムと反応させた。粗生成物をHPLCにより精製した。MS分析：（Ｍ＋Ｓ）＋は、実測値:520.3、計算値:520.30であった。
出発物質を以下のように得た。300mg（0.8mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OHと、200mg（1.2mmol）の（３−シアノフェニル）メチルアミン塩酸塩と、250mgのDCCと、120mgのHOBtと、0.8mlのDIEAと、10mlのDMFとの混合物を、24時間、RTにて撹拌した。濾過後、溶媒をエバポレートし、そして残渣を20％のイソプロパノールを含有する大容量の塩化メチレンに溶解した。溶液を1N HClおよび10％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥し、そしてエバポレートした。残渣をイソプロパノール／エーテルとともに撹拌し、そして分離した固体を回収し、そして乾燥して、400mgのAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH2（３−シアノフェニル）を得た。
実施例XXXIII
Ac−pAph−Chg−NHCH（Me）（４−メチルピリジニウム）
Ac−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH（Me）（４−ピリジル）の２つのジアステレオマーの混合物を硫化水素と反応させ、次いでMeIおよび酢酸アンモニウムと反応させることによって、表題化合物のジアステレオマーの混合物を調製した。MS分析：（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:507.3、計算値:507.31であった。
出発物質を以下のように調製した。150mg（0.4mmol）のAc−Ｆ（pCN）−Chg−OHと、120mg（0.6mmol）のラセミの１−（４−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドと、125mgのDCCと、60mgのHOBtと、0.5mlのDIEAと、10mlのDMFとの混合物を、24時間、RTにて撹拌した。濾過後、溶媒をエバポレートし、そして残渣を20％のイソプロパノールを含有する大容量の塩化メチレンに溶解した。溶液を10％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥し、そしてエバポレートした。残渣をイソプロパノール／エーテルとともに撹拌し、そして分離した固体を回収し、そして乾燥して、125mgのAc−Ｆ（pCN）−Chg−NHCH（Me）（４−ピリジル）を、２つのジアステレオマーの混合物として得た。
ラセミの１−（４−ピリジル）エチルアミンジヒドロクロリドを、以下のように調製した。1gの４−アセチルピリジン−Ｎ−オキシドと、2gのラネーニッケルと、20％（v/v）アンモニアを含有する30mlのメタノールとの混合物を、24時間、30psiで水素化した。触媒をセライトで濾過して除き、そして濾液をエバポレートした。残渣を塩化メチレンに溶解し、濾過し、そしてエバポレートした。残渣をイソプロパノールに溶解し、そしてエーテル中の塩化水素で処理した。沈殿した結晶を回収し、そして乾燥して、198〜200℃の融点を有する0.9gの物質を生成した。
実施例XXXIV
DIPA（ｍ）pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
a.  （ｐ−シアノベンジル）マロン酸（DIPA（ｍ）Phe（pCN））−OHのN,N−ジイソプロピルアミドの合成
改変手順（Pinoriら、米国特許第5,061,911号（1991年10月）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）により、２−（ｐ−シクロベンジル）マロン酸の合成を達成した。25ml DMF中の3.8gの2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン（Meldrum's acid;Aldrich）および1.12gのNaCNBH3（Aldrich）の溶液に2.3gのｐ−シアノベンズアルデヒド（Aldrich）を添加し、そして混合物を、２時間、RTで撹拌した。反応混合物に400mlの水を添加し、そして溶液を氷浴中で冷却し、そして20％のHCl水溶液を滴下することによって、pHを3.8〜４に調整した。白色の沈殿物をガラス焼結の（centered glass）ブフナー漏斗に回収し、そして冷水で洗浄した。回収した沈殿物をCaCl2上で、24時間、真空で乾燥した。CDCl3中の回収した固体のNMRは、化合物の2,2−ジメチル−５−（ｐ−シアノ）ベンジル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン（DCBD）を示唆した。これは、135〜142℃の融点およびRf値:0.45（CHCl3:MeOH:酢酸;95:4:1）を有した。
45ml DCM中の1.5mlジイソプロピルアミンに、3mlのN,O−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（BSA）を添加し、そして溶液を磁気撹拌器およびCaCl2管でガードした冷却器（condenser）を備えた反応フラスコ中で、７時間、還流した。溶液をRTまで冷却した後、0.8gのDCBDを添加し、そして反応混合物を３時間還流した（TLCにより指示される生成物の変換の完了まで）。反応混合物を冷却した後、５〜8mlの20％のHCl水溶液を注意深く添加した。層の分離後、有機層を水で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、そして乾燥状態までエバポレートして、純度の高い生成物を得た。これを、さらに精製することなく、次の工程で使用した。CDCL3中のNMRおよびMSにより化合物の同定を達成した。
b.  DIPA−（ｍ）pAph−Chg−Arg−Leu−Pro−NH2の合成
実施例Ｉに記載の方法により、ペプチド樹脂、DIPA（ｍ）Phe（pCN）−Chg−Arg（PMC）−Leu−Pro−Rinkを合成した。得られたペプチド樹脂を、実施例XXVに記載のようにヒドロキシルアミン塩酸塩で処理して、DIPA（ｍ）Phe（pC（NOH）NH2）−Chg−Arg（PMC）−Leu−Pro−Rinkを得た。樹脂からのペプチドの切断および凍結乾燥後、粗生成物（120mg）を80mlのMeOHおよび10mlのNH3飽和MeOH溶液に溶解した。反応混合物に0.25mlのラネーニッケル懸濁液（Aldrich）を添加し、そして混合物を45psiで、24時間、水素化した。触媒を濾過し、そして溶媒を乾燥状態までエバポレートし、そして残渣を0.1％TFA水溶液とACNとの1:1溶液から凍結乾燥した。粗ペプチドをHPLCにより精製し、そして化合物をMSにより同定した。（Ｍ＋Ｈ）＋は、実測値:824.2、計算値:824.5であった。
実施例XXXV
合成されそして第X a因子の強力なインヒビターであることが見出された複数の置換基を有する化合物：
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実施例XXXVI
化学変化の組み合わせ（個々の変化は、向上された活性を有し得ない）は、活性を向上し得る
第X a因子活性の阻害を測定した。但し、凝固に対する本発明のYIRペプチドの効果、インビボでの効力、インビボでの半減期、経口バイオアベイアビリティー、経口効力（oral potency）または半減期のような生物学的活性のいずれの関連する測定も、本発明のペプチドの活性の測定のように決定し得る。
多くの特異的変化について示す。一例として、２つの変化を組み合わせて、活性のさらなる向上が、変化を組み合わせることにより得られたことを示した。ここで、元来の１つの変化は、活性を顕著には向上しなかった。１つの化学的変化は、親化合物のＹ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−Ｐ（Ki＝5.3μＭ）に比べて、Ki＝0.49μＭを有するAc−Ｙ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−ＰおよびKi＝2.6μＭを有する（iBu）Ｙ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−Ｐを生成した。これら２つの変化を組み合わせて、Ki＝0.04μＭを有するAc（iBu）Ｙ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2を生成した。したがって、これらの結果は、対応する１つの変化のアナログに比べて、２つの化学的変化の組み合わせを有する本発明のペプチドが、実質的に増加した第X a因子阻害活性を有し得ることを示す。ここで、（iBu）Ｙ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2のような１つの親化合物は、親のＹ−Ｉ−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2に比較して、顕著に向上された活性を有さなかった。
表３は、第X a因子阻害に対して100μＭと1pMとの間のKi値を有する化合物を生じる特異的な化学的改変を例示している。
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実施例XXXVII
選択された精製凝固酵素および他のセリンプロテアーゼのインビトロ阻害
本発明の化合物が、第X a因子、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、およびトリプシンを阻害する能力を、酵素活性を50％阻害するYIRペプチドの濃度（IC50）を測定することにより評価した。発色アッセイにおいて、精製酵素を用いた。阻害定数を決定するため、以下の式を用いて基質との競合についてIC50値を補正した：
Ki＝IC50×（1/｛１＋（（基質濃度）／基質Km）｝）
（ChenおよびPrusoff、Biochem.Pharmacol.22:3099−3018（1973）、これは本明細書中に参考として援用される）。
a.第X a因子のアッセイ
TBS−Ｐ緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.8、200mM NaCl、0.05％（w/v）PEG−8000、0.02％（w/v）NaN3）をこのアッセイに使用した。Coastar半面積（half−area）マイクロタイタープレートの適切なウェルに、25μｌのヒト第X a因子（Enzyme Research Laboratories,Inc.;South Bend IN）のTBS−Ｐ溶液;40μｌの10％（v/v）DMSOのTBS−Ｐ溶液（非阻害コントロール）または10％（v/v）DMSOのTBS−Ｐ溶液に希釈した種々の濃度の試験しようとするペプチド；および基質Ｓ−2765（Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−Arg−Gly−Ｌ−Arg−ｐ−ニトロアニリド;Kabi Pharmacia,Inc.;Franklin OH）のTBS−Ｐ溶液をあわせることによって、測定した。
ペプチドインヒビター＋酵素を10分間プレインキュベートすることによってアッセイを実施し、次いで基質を添加して最終容量を100μｌにすることによって、アッセイを開始した。時間経過の直線部分の間（通常、基質添加後１〜５分）、Bio−tek装置カイネティックプレートリーダー（Ceres UV900HDi）を25℃で使用する、405nMでの吸光度の変化により、発色基質の加水分解の初速度を測定した。加水分解の相対速度（非阻害コントロールと比較して）対ペプチド濃度の対数をプロットした後の直線回帰により、基質加水分解速度の50％の減少を生じるインヒビターの濃度を予測した。酵素の濃度は0.5nMであり、そして基質濃度は140μＭであった。
b.トロンビンアッセイ
TBS−Ｐ緩衝液をこのアッセイに使用した。実施例XXXVII.a.に記載のようにIC50を測定した。但し、基質はＳ−2366（Ｌ−PyroGlu−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−ｐ−ニトリロアニリド;Kabi）であり、そして酵素はヒトトロンビン（Enzyme Research Laboratories,Inc.;South Bend IN）であった。酵素濃度は1nMであり、そして基質濃度は175μＭであった。
c.プラスミンアッセイ
TBS−Ｐ緩衝液をこのアッセイに使用した。実施例XXXVII.a.に記載のように、IC50を測定した。但し、基質はＳ−2251（（Ｄ）−Val−Ｌ−Leu−Ｌ−Lys−ｐ−ニトロアニリド;Kabi）であり、そして酵素はヒトプラスミン（Kabi）であった。酵素濃度は5nMであり、そして基質濃度は300μＭであった。
d.トリプシンアッセイ
10mM CaCl2を含有するTBS−Ｐ緩衝液をこのアッセイに使用した。IC50の測定は、実施例XXXVII.a.に記載のように、測定した。但し、基質はBAPNA（ベンゾイル−Ｌ−Arg−ｐ−ニトロアニリド;Sigma Chemical Co,;St.Louis MO）であり、そして酵素はウシ膵トリプシン（タイプXIII,TPCK処理;Sigma）であった。酵素濃度は50nMであり、そして基質濃度は300μＭであった。
e.エラスターゼアッセイ
Tris−HCl,pH7.4、300mM NaCl、２％（v/v）Ｎ−メチルピロリドン、0.01％（w/v）NaN3緩衝液をこのアッセイに使用した。実施例XXXVII.a.に記載のように、IC50を測定した。但し、基質はスクシニル−Ala−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリド（Calbiochem−Nova Biochem Corp.;San Diego CA）であり、そして酵素はヒト好中球エラスターゼ（Athens Research and Technology、Inc.;Athens GA）であった。酵素濃度は75nMであり、そして基質濃度は600μＭであった。
コントロール化合物の「TENSTOP」（Ｎ−α−トシル−Gly−ｐ−アミジノフェニルアラニンメチルエステル;American Diagnostica,Inc.;Greenwich CT）（これは、第X a因子の可逆性インヒビター（Sturzebecherら、Thromb.Res.54:245−252（1989）;Hauptmannら、Thromb.Haem.63:220−223（1990）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）と比較した選択された試験化合物について、Ki値を、上記の表２に示す。結果は、本発明のYIRペプチドが第X a因子活性を阻害し得るが、血液凝固およびフィブリン溶解のプロセスに関与するトロンビンおよびプラスミンを含む他の種々のセリンプロテアーゼの活性は実質的に阻害しないことを示す。
実施例XXXVIII
凝固の阻害を決定するためのアッセイ
第X a因子活性を阻害する能力について、本発明の化合物を評価した。プールしたヒトドナー血漿を用いるインビトロでのプロトロンビン時間（PT）アッセイにより、種々の化合物の効力を評価した。エクスビボアッセイもまた使用し、ここでは、化合物のラットおよびウサギへの静脈（iv）投与、またはラットへの十二指腸内投与後、種々の時間で血漿を回収し、そしてPTアッセイを用いて分析し、血漿半減期を測定した。長期かつ高度に再現可能な凝固終点（coagulation endpoint）を得るために選択されたトロンボプラスチン希釈で、PTアッセイを開始した（以下、「希釈PTアッセイ」という）。種々の化合物の効力をまた、血栓症のインビボラット動静脈シャントモデルを用いて測定した。
a.インビトロでの希釈プロトロンビン時間アッセイ
100μｌの予め温めておいた（37℃）プールしたヒト乏血小板血漿（platelet poor plasma）（PPP）をフィブロメーターカップ（fibrometer cup）（Baxter Diagnotics.,Inc.:McGaw Park IL）に添加した。50μｌのカルシウムを含むTBS−BSA（50mM Tris−Cl、100mM NaCl、0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン、20mM CaCl2）中の種々の濃度の試験化合物を添加した。コントロール実験では、非阻害凝固時間の測定のために、カルシウムを含むが試験化合物は含まないTBS−BSAを添加した。150μｌの予め温めておいた、カルシウムを含む希釈ウサギトロンボプラスチン（Baxter）をフィブロメーターカップに添加し、そしてフィブロメータータイマー（fibrometer timer）を開始する。化合物を試験する前に、ウサギのトロンボプラスチン希釈曲線を得、そして非阻害コントロールに対して約30秒間のPT時間を可能にするトロンボプラスチン希釈を選択するために用いる。試験化合物で凝固の50％阻害を与える実験濃度（EC50）（表４（下記）を参照のこと）を、希釈曲線時間から算定した。
あるいは、Instrumentation Laboratories（IL）ACL3000−プラス自動凝固装置（IL;Milan、Italy）における「リサーチ」モードを用いて、希釈プロトロンビン時間アッセイを行った。30〜35秒の血餅形成時間が達成されるまで、トロンボプラスチンを希釈した。この血餅形成時間を100％活性とした。希釈したトロンボプラスチン試薬（ウサギ脳（IL商標）トロンボプラスチン）の２倍系列希釈により、標準検量曲線を確立した。アッセイの間、50μｌのサンプル（遠心分離によって分離した血漿）を、100μｌのトロンボプラスチン試薬と混合し、そして比濁計の読みとりを169秒にわたって行った。装置により算定された光散乱の最大速度の変化から、凝固時間を測定した。検量線との比較により決定されるように、活性の百分率として阻害を表す。
b.エクスビボ希釈プロトロンビン時間アッセイ
承認されたプロトコルにしたがって、尾静脈（ラット）または耳静脈（ウサギ）のいずれかを介して、試験化合物をiv投与した。試験化合物投与後、定められた時間間隔で、カニューレを挿入した頸動脈（ラット）または耳介動脈（ウサギ）から1mlの血液サンプルを取り出した。遠心分離してPPPを得た後、直ちに血漿を氷上に保存するか、または凍結させた。
希釈トロンビン時間測定のために、血漿を予め温め、そして上記のようにアッセイした。阻害の百分率をトロンボプラスチン希釈曲線（各系列のサンプルによって作製した）から算定し、そして最初の抗凝固活性の約50％が血漿中に残存する時間（T1/2）を決定するために使用した。この実験の結果は、本発明のYIRペプチドが、インビトロでおよびインビボでの投与後に血液凝固を阻害し得ることを示す（表４を参照のこと）。
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種々の化合物もまた、ラットにおける種々の用量のボーラス静脈内投与後、エクスビボ希釈プロトロンビン時間アッセイを用いて、抗凝固活性について試験した。表５に挙げた化合物は、指示された化合物の2mg/kg以下の投与10分後、少なくとも30％の阻害を示した。これらの結果は、本発明の種々の代表的なYIRペプチドが、実質的な抗凝固活性を有することを示す。表５に挙げたすべての化合物の構造は、MSおよびAAで確認した。
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いくつかの実験において、十二指腸内投与プロトコルを用いて、試験化合物をラットに投与した。承認されたプロトコルにしたがって、体重約300gの雄性Sprague−Dawleyラットをケタミン／キシラジンの併用で、皮下に麻酔した。血液のサンプリングのために、右頸動脈にカニューレを挿入した。開腹し、そして十二指腸にボールチップ針でカニューレ挿入し、そして確実に縫合が挿入部位から遠位にあるような位置で十二指腸を結紮した（tied）。さらなる結紮（tie）を挿入部位から近位に配置して、胃内容物の漏出を防止した。各実験の終了時の圧力試験により、化合物が挿入部位に到達することを妨げている縫合の有効性を試験した。挿入部位は、十二指腸−胃接合部（duodenal−gastric junction）から約4cmであった。化合物を1mlの正常生理食塩水で投与した。試験化合物の投与前、および投与15分、30分、60分、90分、および120分後に、0.7mlの血液サンプルを採取した。遠心分離により血漿を分離し、そして希釈プロトロンビン時間アッセイを用いて凝固の阻害についてアッセイした。
以下の化合物は、50mg/kg以下の化合物の十二指腸内投与後、希釈プロトロンビン時間アッセイにおいて少なくとも30％阻害を示した：
Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−CH2−Chx;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−Chx;Bzf−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−Ｌ−Ｐ−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;Ac−Aph−Chg−AMP（４）；シクロペンチル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;3−Iqc−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;2−フロイル−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;5−Me−チエニル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2、Ac−Ｙ（３−Ｉ）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2、Ac−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−ol、およびAc−pAph−Chg−PalMe（３）−ol。
c.血栓症のラット動静脈シャントモデル
ラット体外動静脈（AV）シャントを用いて、本発明の種々の化合物の抗血栓症効力を評価した。AVシャント回路は、右頸動脈に挿入した20cm長のポリエチレン（PE）60チュービング、6.5cm長のつや出し木綿糸（血流に5cm曝される）を含む6cm長のPE160チュービング、左頸静脈への回路を完成する第２の長さのPE60チュービング（20cm）からなる。挿入前に、回路全体を通常の生理食塩水で満たした。
シリンジポンプおよびバタフライカテーテルを用いる尾静脈への連続注入により、試験化合物を投与した（注入容量1.02ml/時）。化合物を30分間投与し、次いでシャントを開き、そして15分間血液を循環させる（合計45分間注入）。15分間の終了時に、シャントをクランプし（clamped）、そして糸を注意深く取り出し、そして分析天秤（analytical balance）で秤量した。生理食塩水を注入したコントロールラットから得られる血栓の重量を用いて、血栓形成の阻害の百分率を算定した。
以下の化合物は、33μg/kg/分以下の注入後、少なくとも約30％だけ血栓成長を阻害した:Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−CH2−Chx;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH−Chx;Bzf−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−Ｌ−Ｐ−NH2;Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;Ac−pAph−Chg−AMP（４）；シクロペンチル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;3−Iqc−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2;2−フロイル−pAph−Chg−PalME（３）−NH2;5−Me−チエニル−CO−pAph−Chg−PalMe（３）−NH2、Ac−pAph−Chg−PalMe（３）−ol、およびTos−Ｆ（pNH2）−Chg−Ｒ−Ｌ−Ｐ−NH2。
本発明は、開示された実施態様を参考に記載されているが、当業者は、詳細した特定の実験が本発明の例証に過ぎないことを容易に理解する。本発明の主旨から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが、理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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