(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを雲母基板上に伸長固定する方法において、電荷を有しないアルキル基またはアリール基および１個以上３個以内のメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基を有するシラン化合物により表面を被覆した雲母基板上にＤＮＡ含有溶液を置き、ＤＮＡの末端を該被覆基板表面に付着させ、溶液の流れまたは気液界面の移動によりＤＮＡを配向、伸長させることを特徴とするＤＮＡを伸長、固定する方法。
【請求項２】
シラン化合物の有するアルキル基が炭素数１〜４個の低級アルキル基であり、アリール基がフェニル基またはベンジル基であり、アルキル基を有するシラン化合物においてはアルキル基が１個以上３個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下１個以上であり、またアリール基を有するシラン化合物においてはアリール基が１個以上２個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下２個以上であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法。
【請求項３】
アルキル基を有するシラン化合物がメトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシランまたはプロピルトリメトキシシランであり、アリール基を有するシラン化合物がフェニルトリメトキシシランであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法。
【請求項４】
シラン化合物で被覆した雲母基板がシラン化合物の蒸気により雲母基板の表面を被服し、必要に応じて該被覆基板を加熱して固定したものであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法。
【請求項５】
溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段が、重力、遠心力、電気泳動またはポンプによる送液または吸い上げであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡを伸長、固定する方法に関し、詳しくはＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを直線状に引き延ばし基板上に固定することは、ＤＮＡ上の遺伝子や特定塩基配列の位置を決定するために有用であり、生物学的・医学的に非常に重要な意味を持つ。
また、ＤＮＡは、ナノエレクトロニクスの分野においてもナノメートルレベルの自己組織化可能な配線材料として注目されており、ＤＮＡを基板上に配向させて固定することは、その基盤技術となる可能性が示唆されている。
最近、ナノメートルレベルの分解能を持つ原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope, AFM）や走査型近接場光プローブ顕微鏡（Scanning Near-field Optical/Atomic Force Microscope, SNOM/AFM ）などを用いて、DNA や遺伝子の位置を高分解能で検出したり、ナノメートルレベルの操作を行うことが可能になっている。
これらの技術を基板上に固定されたＤＮＡに適用するためには、原子レベルで平坦な表面が必要なため、多くの場合、劈開した雲母板が基板として使われている。
【０００３】
劈開した雲母基板表面および溶液中のＤＮＡ分子の双方とも負電荷を有するため、そのままではＤＮＡは雲母基板上には少量しか固定されない。そこで、従来は、ＤＮＡを雲母基板上に固定するために、基板表面をマグネシウムイオン（Mg2+）で処理したり、正電荷を有するアミノプロピルトリエトキシシラン（APS)などのシラン化合物を被覆するなどの手法（Langmuir 11 (1995),  655-659）がとられていた。また、ＤＮＡ含有溶液の液滴を置き、遠心力によりＤＮＡを引き伸ばして固定する方法（スピンコート法）も行われていた（Analytical Chemistry, 73 (2001), 5984-5991) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法ではMg2+処理またはAPS 被覆雲母基板表面とＤＮＡ分子の相互作用が強すぎるため、ＤＮＡは基板に屈曲した状態で固定されてしまい、直線状に伸長させることは困難であった。
また、スピンコート法では、ＤＮＡはある程度伸長されるが、固定位置が不定でかつ固定量が少ないため、ＤＮＡの位置を走査範囲の狭いAFM やSNOM/AFMにより捜すのは困難であるという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明は、ＤＮＡを雲母基板上の広い範囲に渡って直線状に引き伸ばして固定する方法を提供することを目的とする。
請求項１記載の本発明は、ＤＮＡを雲母基板上に伸長固定する方法において、電荷を有しないアルキル基またはアリール基および１個以上３個以内のメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基を有するシラン化合物により表面を被覆した雲母基板上にＤＮＡ含有溶液を置き、ＤＮＡの末端を該被覆基板表面に付着させ、溶液の流れまたは気液界面の移動によりＤＮＡを配向、伸長させることを特徴とするＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項２記載の本発明は、シラン化合物の有するアルキル基が炭素数１〜４個の低級アルキル基であり、アリール基がフェニル基またはベンジル基であり、アルキル基を有するシラン化合物においてはアルキル基が１個以上３個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下１個以上であり、またアリール基を有するシラン化合物においてはアリール基が１個以上２個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下２個以上であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項３記載の本発明は、アルキル基を有するシラン化合物がメトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシランまたはプロピルトリメトキシシランであり、アリール基を有するシラン化合物がフェニルトリメトキシシランであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項４記載の本発明は、シラン化合物で被覆した雲母基板がシラン化合物の蒸気により雲母基板の表面を被服し、必要に応じて該被覆基板を加熱して固定したものであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
請求項５記載の本発明は、溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段が、重力、遠心力、電気泳動またはポンプによる送液または吸い上げであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡを伸長、固定する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡを基板上に配向、伸長して固定する方法である。本発明の対象とされるＤＮＡに制限はなく、あらゆる生物のゲノムまたはプラスミド、ファージ（ウイルス）、人工染色体などのベクターに由来するものでよく、長さも限定されない。
ＤＮＡを分散させる溶液は、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７〜８）、トリス緩衝液、蒸留水などが用いられ、これらの中ではＴＥ緩衝液が好ましい。
【０００７】
雲母基板の表面を被覆するために用いるシラン化合物としては、アルキル基またはアリール基とメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基の合計が最大４個になるすべての組み合わせが可能である。詳しくは、炭素数１〜４個の低級アルキル基（メチル基、エチル基など）またはアリール基（フェニル基、ベンジル基など）を有し、アルキル基を有するシラン化合物においてはアルキル基が１個以上３個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下１個以上であり、またアリール基を有するシラン化合物においてはアリール基が１個以上２個以下でメトキシ基またはエトキシ基またはクロロ基が３個以下２個以上であるシラン化合物がある。なお、アリール基はアミノ基、ヒドロキシル基などの置換基を有していてもよい。具体的には、メトキシトリメチルシラン、エトキシトリメチルシラン、フェニルトリメトキシシランなどを挙げることができる。
シラン化合物を雲母基板の表面に被覆する方法としては、例えばシラン化合物を蒸気法、すなわちシラン化合物の蒸気にて該基板を被覆し、必要に応じて加熱処理を施して強固に被覆させることができる。
【０００８】
ＤＮＡを含む溶液の流れまたは気液界面の移動を起こす手段としては、例えば重力、遠心力、電気泳動、ポンプ（電動等の自動または手動）などによる送液や吸い上げが挙げられる。いずれの方法でもＤＮＡを伸長することは可能であるが、ポンプによる一定速度での吸い上げ法が望ましい。
【０００９】
以下に、本発明を図面に基づいて詳しく説明する。
図１は、本発明によるＤＮＡの伸長、固定の操作手順を示したフローチャートである。工程１にて雲母板を劈開して新鮮な劈開面を露出させ、工程２で劈開した雲母基板をシラン化合物の溶液とともに密閉容器中に置く。シラン化合物量は容器容積１Ｌあたり１０〜１０００μＬが適当である。また、容器中には窒素などの不活性ガスを充填しても良い。工程３で４℃〜６０℃にて１時間乃至１週間、好ましくは１５〜３０℃にて４時間乃至６日間放置し、雲母基板表面をシラン化合物により被覆する。
【００１０】
工程４で基板を容器から取り出し、必要に応じて６０℃〜１２０℃にて５分間乃至１時間程度、望ましくは１００℃で１５分間以上加熱する。これにより、雲母表面へシラン化合物を強固に被覆することができる。加熱処理をしない場合は速やかに容器から取り出し、その上にＤＮＡ溶液（５〜２０μＬ）を滴下する。
次の工程５で１〜数分間放置する間に、ＤＮＡの末端とシラン化合物で被覆した基板表面との間の疎水性相互作用により、ＤＮＡの末端が疎水性シラン化合物で被覆した基板表面に付着する。
その後、工程６にて適当な吸引手段、例えばピペットまたはポンプにより緩やかに液滴を吸い上げて界面移動または水流を誘起し、ＤＮＡを基板上に伸長、固定する。
【００１１】
図２〜４は、実際に本発明の方法に基づいて雲母基板上に伸長、固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真である。それぞれ、メトキシトリメチルシラン（図２）、エトキシトリメチルシラン（図３）またはフェニルトリメトキシシラン（図４）により被覆した雲母基板を使用している。
基板へのシラン化合物の被覆は、図１に示した方法に従い、窒素充填容器中で１６μＬ（容器容積１Ｌあたり）のシラン化合物を用いて行った。被覆反応の期間は１時間〜７日間が適当で、好適には４時間〜６日間である。フェニルトリメトキシシランの場合のみ、基板を１１０℃、２０分間加熱し、強固なシラン化を行った。その後、λファージＤＮＡ溶液（濃度５μｇ／ｍＬ）を５μＬ滴下し、１分間放置した後、ピペットで吸い上げた。図に示したように、いずれのシラン化合物によって基板表面を被覆した場合にも、多量のＤＮＡが伸長された状態で固定されていることがわかる。
その中でも被覆反応期間４日間のエトキシトリメチルシラン（図２）により被覆された雲母基板および被覆反応期間６日間で被覆した後、加熱により強化したフェニルトリメトキシシラン（図４）により被覆された雲母基板の場合に直線性が良いことがわかった。また、図には示さないが、これらシラン化合物被覆基板の表面荒さが１ｎｍ以下であり、伸長されたＤＮＡ１本がAFM 観察により観察可能なことがわかっている。
【００１２】
このように伸長、固定されたＤＮＡ上の遺伝子を蛍光色素ないしは微小金粒子などにより標識すれば、AFM やSNOM/AFMによりその位置をナノメートルレベルで逐次決定して行くことが可能である。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によれば、原子レベルで平坦な雲母基板上に直線状に引き伸ばしたＤＮＡを多量に固定することができるので、AFM やSNOM/AFMによる遺伝子位置の決定や操作を簡便、かつ正確に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の操作手順の１態様を示すフローチャートである。
【図２】  本発明によりシラン化合物（エトキシトリメチルシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図３】  本発明によりシラン化合物（メトキシトリメチルシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図４】  本発明によりシラン化合物（フェニルトリメトキシシラン）被覆雲母基板上に実際に伸長固定されたＤＮＡを示す蛍光像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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