(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体よりヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有するEscherichia blattae、Serratia ficaria、Klebsiella planticola、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella terrigena、Morganella morganii、Enterobacter aerogenes、Enterobacter aerogenes、Chromobacterium fluviatile、Chromobacterium violaceum、Cedecea lapagei、Cedecea davisiae、Cedecea neteriから選択される微生物を、ｐＨ４．０〜６．５の条件下でヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
【請求項２】
上記微生物が、Escherichia blattae JCM 1650、Serratia ficaria ATCC 33105、Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531)、Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724)、Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257)、Morganella morganii IFO 3168、Enterobacter aerogenes IFO 12010、Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048)、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、Chromobacterium violaceum IFO 12614、Cedecea lapagei JCM 1684、Cedecea davisiae JCM 1685、Cedecea neteri JCM 5909から選択される微生物であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
【請求項３】
上記反応がｐＨ４．５〜５．５、反応温度３０℃〜４０℃の条件で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明はヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法に関する。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルは、調味料、医薬ならびにそれらの原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生化学的な製造法としては、燐酸供与体としてパラニトロフェニル燐酸を用い、ヌクレオシドを燐酸化する方法（特公昭３９−２９８５８号）、無機燐酸を用いる方法（特公昭４２−１１８６号）、アセチル燐酸を用いる方法（特開昭５６−８２０９８号）、アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）を使用する方法（特開昭６３−２３００９４号）が知られている。
また、本発明者らは、ポリ燐酸を用いる方法を開発している（特開昭５３−５６３９０号）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法にあっては使用する基質が高価であったり、不安定であったりして、安定したヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産を行うためには、不利であった。  また、本発明者らが開発してきたポリ燐酸を用いる方法も、その後の詳細な検討の結果、生成物としてヌクレオシド−５’−燐酸エステルのみならず、２’−、３’−ヌクレオチド異性体を副生することが判明し、実用に供するには困難であることが明らかになった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、安定したヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産を行うために種々の検討を加えた結果、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に、弱酸性条件下（ｐＨ４．０〜６．５）にて特定の微生物を作用させることにより、２’−、３’−ヌクレオチドの副生を伴うことなく、効率的にヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生産可能なることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、エンテロバクター属、エシェリヒア属、モルガネラ属、クレブシエラ属、セラチア属、クロモバクテリウム属又はセデシア属に属し、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体よりヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物を、ｐＨ４．０〜６．５の条件下でヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に作用させて、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法を提供するものである。
【０００６】
【作用】
本発明において使用される微生物は、エンテロバクター属、エシェリヒア属、モルガネラ属、クレブシエラ属、セラチア属、クロモバクテリウム属またはセデシア属に属し、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体からヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物であり、例えば、次のような微生物が使用される。
【０００７】
Escherichia blattae JCM 1650
Serratia ficaria ATCC 33105
Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531)
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＩＦＯ  ３３１８  （ＡＴＣＣ  ８７２４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ    ＩＦＯ  １４９４１  （ＡＴＣＣ  ３３２５７）
Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＩＦＯ  ３１６８
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ  １２０１０
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ  １３５３４  （ＡＴＣＣ  １３０４８）
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ  ＩＡＭ  １３６５２
Chromobacterium violaceum IFO 12614
Ｃｅｄｅｃｅａ  ｌａｐａｇｅｉ  ＪＣＭ  １６８４
Ｃｅｄｅｃｅａ  ｄａｖｉｓｉａｅ  ＪＣＭ  １６８５
Ｃｅｄｅｃｅａ  ｎｅｔｅｒｉ  ＪＣＭ  ５９０９
【０００８】
上記の微生物は、炭素源、窒素源、無機イオン等を含む通常の栄養培地中に培養される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、マルトースなどの糖類の他、クエン酸、フマール酸、グルコン酸などの有機酸、エタノール、グリセリンなどのアルコール類が使用される。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガスが好適である。無機イオンとしては、例えば第一鉄イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、燐酸イオン、カリウムイオンが、必要に応じて、添加される。さらに、必要に応じ、アミノ酸、ビタミン等またはこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆蛋白加水分解物等の有機栄養源が添加される。
【０００９】
上記の微生物の培養は、常法によって行われる。例えば、培地のｐＨを５〜８とし、微生物を接種後、２０〜４０℃にて５〜７２時間、好気的に培養すればよい。
【００１０】
上記の微生物を、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に作用せしめヌクレオシド−５’−燐酸エステルを得る方法としては、かくして得られた培養液、培養液から分離した微生物菌体、その乾燥菌体、菌体破砕物或いはその自己消化物などの菌体処理物を、水性媒体中にて、ヌクレオシドとポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体とを接触させればよい。この際、反応のｐＨを４．０〜６．５の範囲の弱酸性に調整することが必要である。
【００１１】
燐酸供与体として用いられるポリ燐酸（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸、又はそれらの混合物もしくはそれらのナトリウム塩、カリウム塩、あるいはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物、又はそれらの混合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウム、又はそれらの混合物などが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃度によって決定される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍量の添加が望ましい。
【００１２】
使用するヌクレオシドとしては、プリンヌクレオシド類として、プリンリボシド、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン等、ピリミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シトシン等が挙げられる。使用するヌクレオシドに対応して、５’−プリンリボチド、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−アデニル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸、５’−シチジル酸などが生成する。
【００１３】
反応液に添加するヌクレオシドの濃度としては、０．１〜１０ｇ／ｄＬが望ましいが、水に難溶性のヌクレオシドを使用する場合には、硼酸あるいはジメチルスルフォオキシドなどの溶解助剤を添加するとよい。
【００１４】
反応は、通常、温度２０〜６０℃、望ましくは３０〜４０℃で、ｐＨ４．０〜６．５、望ましくはｐＨ４．５〜６．０の弱酸性側が好結果を与える。この適当なｐＨ範囲は、従来、報告されているヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産方法におけるｐＨとは異なる範囲であって、この点にも本発明の特徴がある。
【００１５】
反応には、靜置あるいは攪拌の何れの方法をも採用し得る。反応時間は、使用する微生物の活性、基質の濃度などの条件によって異なるが、１〜１００時間が望ましい。
【００１６】
反応液中に生成したヌクレオシド−５’−燐酸エステルの分離は、通常のイオン交換樹脂を用いる方法や、その他の通常に行われる分離方法が用いられる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。なお、本実施例において、原料のヌクレオシドおよび生成したヌクレオシド−５’−燐酸エステルは、高速液体カラムクロマトグラフ法（ＨＰＬＣ、High Performance Liquid Chromatography) により、下記の機器および条件下に分析した。
カラム：コスモジル５Ｃ18−ＡＲ(4.6×150mm)［ナカライテスク社製品］
移動層：5 mM Potassium phosphate (pH 2.8): Methanol = 95:5
流速：1.0 mL／分
温度：室温
検出：ＵＶ 245nm
【００１８】
（実施例１）
ペプトン１ｇ／ｄＬ、酵母エキス０．５  ｇ／ｄＬ、食塩１ｇ／ｄＬを含有する栄養培地（ｐＨ７．０）を５００ｍＬ容坂口フラスコに５０ｍＬ入れ、１２０℃にて２０分加熱殺菌した。これに、斜面培養した表１に示す微生物を接種し、３０℃にて１６時間培養した。かくして得られた培養液より遠心分離によって菌体を回収し、菌体を酢酸バッファー液（ｐＨ５．０）に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。
【００１９】
イノシン２ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸１０ｇ／ｄＬ、ＭｇＳＯ4 ２ｍＭを、酢酸バッファー液に溶解し、これに上記の菌体懸濁液を菌体湿重量で５ｇ／ｄＬとなるように添加し、ｐＨを５．０に調整、維持しながら、３０℃で５時間反応させた。生成した５’−イノシン酸量を表１に示した。  なお、何れの菌株についても、２’−イノシン酸、３’−イノシン酸の副生は、ほとんど認められなかった。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
（実施例２）
実施例１で調製した菌株を用い、反応液中のイノシンに代えて、グアノシンを使用して同様に反応を行った。生成した５’−グアニル酸量を表２に示した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
（実施例３）
実施例１で調製した菌株懸濁液を用い、反応液中のピロ燐酸に代えて、トリポリ燐酸（試薬）または「ポリゴンＰ」［商品名、ポリ燐酸、千代田化学（株）製品］を用い、イノシンと反応させた。生成した５’−イノシン酸量を表３に示した。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
（実施例４）
実施例１で調製した菌体懸濁液を用い、ｐＨ３〜８のバッファー液中で、イノシン１ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸ナトリウム５ｇ／ｄＬ、硫酸マグネシウム２ｍＭを含む反応液を調製し、この反応液中、３０℃で１時間反応した。図１に示す如く、反応に使用したEscherichia blattae JCM 1650、Serratia ficaria ATCC 33105、Klebsiella pneumoniae IFO 3318、Morganella morganii IFO 3168、Enterobacter aerogenes IFO 12010、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、Cedecea lapagei JCM 1684の各菌株の何れもが、ｐＨ５．０〜５．５の範囲において、最も効率的に５’−イノシン酸を生成した。
【００２６】
（実施例５）
実施例１にて調製した菌体懸濁液を用い、ｐＨ５．０の酢酸バッファー液中でイノシン１ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸ナトリウム５ｇ／ｄＬ、硫酸マグネシウム２ｍＭを含む反応液を調製し、この反応液中、１５〜６０℃において反応を行った。図２に示す如く、反応に使用したEscherichia blattae JCM 1650、Klebsiella pneumoniae IFO 3318、Morganella morganii IFO 3168、 Enterobacter aerogenes IFO 12010 、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、 Cedecea lapagei JCM 1684の各菌株の何れもが３０〜４０℃の範囲で、Serratia ficaria ATCC 33105 はは５５℃付近において、最も効率的に５' −イノシン酸を生成した。
【００２７】
（実施例６）
実施例１で調製した菌株を用い、反応液中のイノシンに代えて、ウリジンまたはシチジンを、燐酸供与体としてフェニル燐酸ジナトリウムを使用して同様に反応を行った。生成した５’−ウリジル酸量または５’−シチジル酸量を表４に示した。
【００２８】
【表４】
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【００２９】
（実施例７）
実施例１で調製した菌株を用い、反応液中のイノシンに代えて、ウリジンまたはシチジンを、燐酸供与体としてカルバミル燐酸ジナトリウムを使用して同様に反応を行った。生成した５’−ウリジル酸量または５’−シチジル酸量を表５に示した。
【００３０】
【表５】
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【００３１】
【発明の効果】
ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物を作用せしめ、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを取得する本発明の方法は、異性体の副生を伴うことなく、安定、かつ、効率よくヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成し、採取し得るという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応ｐＨと５’−イノシン酸の生成量との関係を示す線図である。
【図２】反応温度と５’−イノシン酸の生成量との関係を示す線図である。
【図１】
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【図２】
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