(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ε−Ｌ−リジン）の少なくとも一部あるいは全部のＬ−リジン残基のα−アミノ基がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸とアミド結合してなるポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体。
【請求項２】
前記ポリ（ε−Ｌ−リジン）の重合度が３０〜７００である請求項１記載のポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体。
【請求項３】
Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸が結合したＬ−リジン残基の数が、ポリ（ε−Ｌ−リジン）を構成するＬ−リジン残基の総数の５〜１００％である請求項１又は２記載のポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なポリアミノ酸誘導体に関し、詳しくは、細胞接着性及び細胞増殖性に優れ、生体機能材料等に適用可能なポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴ糖鎖がペプチドと結合した物質は、血液、細胞膜、結合組織、細胞間マトリックスなどに広く存在し、糖タンパク質、プロテオグルカン、ペプチドグルカンなどと呼ばれて、多彩な機能を果たしている。糖部分は、タンパク質のコンフォメーションの安定化、生物学的な特異性の決定、タンパク質の寿命のコントロール、細胞間認識などをはじめとして、物理化学的及び生物学的な役割を担っている。
【０００３】
上記の様にオリゴ糖とペプチドが結合した物質の様々な物理化学的及び生物学的機能が解明されるにつれ、新しいタイプの生体機能材料を開発するために、糖−ペプチド複合体の人工的な構築が試みられるようになった。しかし、この糖−ペプチド（ポリアミノ酸も含めて）複合体の化学合成分野における研究成果はまだ多くなく、細胞接着性や細胞増殖性に優れる等、生体機能材料として有用な糖−ペプチド複合体の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、細胞接着性や細胞増殖性に優れ、生体機能材料等に適用可能な新規な糖置換ポリアミノ酸を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、新規な糖置換ポリアミノ酸としてポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体を合成することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、ポリ（ε−Ｌ−リジン）の少なくとも一部あるいは全部のＬ−リジン残基のα−アミノ基がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸とアミド結合してなるポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体である。
【０００７】
ここで、本明細書のおいて用いる「置換」とは、例えば、上記ポリ−α−置換ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体で用いる「置換」のように、酸アミド結合によりポリアミノ酸ポリマー側鎖のアミノ基の水素原子がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸残基と置き換わった場合についても、用いる概念とする
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の糖置換ポリアミノ酸であるポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体は、ポリ（ε−Ｌ−リジン）の少なくとも一部あるいは全部のＬ−リジン残基のα−アミノ基がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸とアミド結合したものであり、以下にその化学式を示す。
【０００９】
【化１】
0003691096.tif 000002
【００１０】
但し、化１中ｎ及びｍは１以上の整数をそれぞれ表し、ｎ≧ｍである。
上記一般式（Ｉ）で示される本発明のポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体（以下、必要に応じてこの化合物をＰεＬｙｓ−ＬＡと表す。）は、ポリ（ε−Ｌ−リジン）の少なくとも一部あるいは全部のＬ−リジン残基のα−アミノ基がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸とアミド結合したものであるが、上記主鎖を構成するポリ（ε−Ｌ−リジン）の重合度、すなわち一般式（Ｉ）におけるｎは、３０〜７００であることが本発明においては好ましい。  上記ポリ（ε−Ｌ−リジン）は、ジアミノモノカルボン酸（塩基性アミノ酸）であるＬ−リジンのカルボキシル基とε−アミノ基による酸アミド結合が繰り返されて得られるポリアミノ酸であり、α−位のアミノ基は上記縮重合反応には関与せずにポリマー主鎖に側鎖の状態で反応性官能基として残される。本発明のＰεＬｙｓ−ＬＡは、この様なポリ（ε−Ｌ−リジン）の少なくとも一部あるいは全部の、上記一般式（Ｉ）で言えばｍ個の、Ｌ−リジン残基のα−アミノ基がＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸とアミド結合してなるものであり、前記Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸が結合したＬ−リジン残基の数が、ポリ（ε−Ｌ−リジン）を構成するＬ−リジン残基の総数の５〜１００％であることが、本発明においては好ましい。これを、上記一般式（Ｉ）中のｎ及びｍを用いて表せば、０．０５≦ｍ／ｎ≧１という関係になる。
【００１１】
ここで、本明細書においては、ポリ（ε−Ｌ−リジン）を構成するＬ−リジン残基の総数に対するＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸が結合したＬ−リジン残基の数の百分率を、必要に応じて、ポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率と呼ぶことにする。上記ポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率が５％未満では、得られるポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体が細胞毒性を示すことがある。
【００１２】
本発明のＰεＬｙｓ−ＬＡの製造方法であるが、基本的には、ポリ（ε−Ｌ−リジン）のＬ−リジン残基のα−アミノ基とＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸のカルボキシル基とを酸アミド結合する方法を考えればよい。原料のポリ（ε−Ｌ−リジン）は、一般法に従い、Ｌ−リジンをそのε−アミノ基とα−カルボキシル基の酸アミド結合により必要な重合度にまで縮重合させて得られる他、チッ素株式会社等より市販されているもののうち適当な重合度のポリ（ε−Ｌ−リジン）を選択してこれを用いることも可能である。
【００１３】
上記ＰεＬｙｓ−ＬＡの製造方法としては、例えば、ポリ（ε−Ｌ−リジン）をＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）緩衝液に溶解し、Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）を添加して２０〜３０℃で３〜７日間反応させる方法等が挙げられる。得られた反応粗製物には、反応終了後、必要に応じて、反応液を透析チューブ等を用いて透析する等の精製処理、凍結乾燥等の乾燥処理等が施される。
【００１４】
ここで、ポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率の調整は、反応液へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の添加量を調整することにより行うことができる。また、実際に得られたＰεＬｙｓ−ＬＡにおけるポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率は、ＮＭＲ測定を行い、εＣＨ2（３．１６ｐｐｍ付近）、骨格ＣＨ（３．７７ｐｐｍ付近）、Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸残基（３．４〜４．４９ｐｐｍ）によるシグナルを用いて計算することが可能である。
【００１５】
この様な、本発明のポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体は、後述のように細胞接着性や細胞増殖性に優れ、生体機能材料等に適用可能な糖置換ポリアミノ酸である。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を説明する。
１ｇのポリ（ε−Ｌ−リジン）（チッ素株式会社製、分子量５１００、７．８ｍｍｏｌ）を５０ｍＭのＴＥＭＥＤ緩衝液（ｐＨ４．７）１５ｍＬに溶解し、Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸の２．１６ｇとＥＤＣの０．９１ｇを添加して３昼夜、室温で反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ（スペクトラム、分子量カット３５００）に移し、３０Ｌの蒸留水に対して透析を行った。透析終了後、凍結乾燥を行って０．６ｇのＰεＬｙｓ−ＬＡを得た。この様にして得られたＰεＬｙｓ−ＬＡのＩＲ及びＮＭＲの測定を行った。その結果を図１（ＩＲ）及び図２（ＮＭＲ）に示す。
【００１７】
次に、上記図２に示すＮＭＲチャートを用いて上記で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡにおけるポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率を求めた。
【００１８】
図２において３．１６ｐｐｍ付近の強いシグナルは、εＣＨ2によるもので積分比は２となる。次に、３．７７ｐｐｍ付近は骨格ＣＨによるもので積分比は１となる。また、３．４〜４．４９ｐｐｍのシグナルは、Ｄ−ガラクトピラノシルグルコン酸残基によるものであり、ポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入割合をＸとすると、積分比は２１Ｘとなる。
【００１９】
図２より実際に得られる３．４〜４．４９ｐｐｍのシグナル対３．１６ｐｐｍ付近のシグナルのシグナル比は６．１７５：２．０であることから、関係式６．１７５：２．０＝２１Ｘ＋１：２が成り立ち、この方程式よりＸ＝０．２４６が得られる。つまり、上記実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡにおけるポリ（ε−Ｌ−リジン）へのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸の導入率は、２４．６％と算出された。
【００２０】
＜糖結合ポリマーの評価＞
上記実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡ及びヒト表皮角化細胞、ヒト胎児肺線維芽細胞を用いて、本発明のＰεＬｙｓ−ＬＡの細胞接着性及び細胞増殖性について評価を行った。
【００２１】
（１）細胞接着性試験
実験には、ヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８を用いた。
上記実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡを蒸留水に０．０１重量％濃度で溶解させ１日放置した後、この溶液を１５分間超音波処理し濾過滅菌した。更に、この溶液をディッシュにコーティングする直前に１５分間の超音波処理を行った。３５ｍｍディッシュ（ファルコン１００８）４個に、上記ＰεＬｙｓ−ＬＡ溶液を２ｍＬずつ加え、室温で６０分間放置後、余分な溶液を吸引除去した。各ディッシュをＰＢＳ（−）で２回洗ってから乾燥させた。
【００２２】
上記の様にしてＰεＬｙｓ−ＬＡでコーティングされたディッシュ４個のそれぞれに、９％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地１ｍＬ当たりにヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８が１０万個懸濁した細胞懸濁液を２ｍＬずつ加え、ＣＯ2インキュベーターに入れ、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ディッシュから培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗った。その後、各ディッシュ上に残った細胞のＤＮＡ量を測定し、このＤＮＡ量の各ディッシュ毎に播種した全細胞のＤＮＡ量に対する百分率を求め、これを細胞接着率として評価に用いた。
【００２３】
また、コントロールとして、何もコーティングしてない無コートのディッシュ４個を用いて同様の細胞接着試験を行い、細胞接着率を求めた。結果を図３に示す。
【００２４】
この結果から、コントロールの無コートのディッシュと比較して、実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡをコーティングしたディッシュでは、ヒト胎児肺線維芽細胞の接着率が高く、本発明のＰεＬｙｓ−ＬＡが細胞接着性を有することが明らかである。
【００２５】
（２）細胞増殖性試験
実験には、ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（クラボウ）及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８を用いた。
【００２６】
上記実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡを蒸留水に０．０１重量％濃度で溶解させ１日放置した後、この溶液を１５分間超音波処理し濾過滅菌した。更に、この溶液を２４ウエルマルチプレート又はディッシュにコーティングする直前に１５分間の超音波処理を行った。３５ｍｍディッシュ（ファルコン１００８）４個に、上記ＰεＬｙｓ−ＬＡ溶液を２ｍＬずつ加え、室温で６０分間放置後、余分な溶液を吸引除去した。各ディッシュをＰＢＳ（−）で２回洗ってから乾燥させた。
【００２７】
また、２４ウエルマルチプレート（コーニング２５８２０１）の各ウエルには、上記ＰεＬｙｓ−ＬＡ溶液を０．５ｍＬずつ加え、室温で６０分間放置後、余分な溶液を吸引除去した。このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗ってから乾燥させ、更に、細胞の播種３時間前に各ウエルに、１０μｇ／ｍＬの割合でＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を０．５ｍＬずつ加え、室温で３０分間放置後、余分な溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗った。
【００２８】
上記の様にしてＰεＬｙｓ−ＬＡでコーティングされたディッシュ４個に、９％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地１ｍＬ当たりにヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８が５万個懸濁した細胞懸濁液を２ｍＬずつ加え、また、ＰεＬｙｓ−ＬＡでコーティングされた２４ウエルマルチプレートの各ウエルに、９％ＦＣＳ添加ＫＭＧ培地１ｍＬ当たりにヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫが４万個懸濁した細胞懸濁液を０．５ｍＬずつ加え、ＣＯ2インキュベーターに入れ、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ディッシュ及び、２４ウエルマルチプレートから培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗った。その後、各ディッシュ上、及び２４ウエルマルチプレートの各ウエル上に残った細胞のＤＮＡ量を測定し細胞増殖性をみた。
【００２９】
また、コントロールとして、何もコーティングしてない無コートのディッシュ４個、無コートの２４ウエルマルチプレートを用いて同様の細胞増殖試験を行い、細胞増殖性をみた。結果を、ヒト胎児肺線維芽細胞については図４に、ヒト表皮角化細胞については図５に示す。尚、図中＊＊は、その値がコントロールの値と比較して１％の危険率で有意であることを示すものである。
【００３０】
この結果から、コントロールの無コートのディッシュと比較して、実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡをコーティングしたディッシュでは、ヒト胎児肺線維芽細胞の増殖性が高く、また、コントロールの無コートの２４ウエルマルチプレートと比較して、実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡをコーティングした２４ウエルマルチプレートでは、ヒト表皮角化細胞の増殖性が高く、本発明のＰεＬｙｓ−ＬＡが細胞増殖性に優れることが明らかである。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポリ−α−置換  ε−Ｌ−リジンのＤ−ガラクトピラノシルグルコン酸誘導体は、細胞接着性や細胞増殖性に優れ、これを生体機能材料等に適用する可能性は十分にあると言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡのＩＲ測定結果を示す図。
【図２】  実施例で得られたＰεＬｙｓ−ＬＡのＮＭＲ測定結果を示す図。
【図３】  実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡのヒト胎児肺線維芽細胞の細胞接着率を示す図。
【図４】  実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡのヒト胎児肺線維芽細胞の細胞増殖性を示す図。
【図５】  実施例のＰεＬｙｓ−ＬＡのヒト表皮角化細胞の細胞増殖性を示す図。
【図１】
0003691096.tif 000003
【図２】
0003691096.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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