(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質を示す受託番号 FERM BP-5445であるラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171またはその変異株；
（1）高たんぱく質分解活性を有する
（2）６時間以内にカゼイントリプシン加水分解物の苦味を除去する       活性を有する
（3）著しく高いプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
（4）著しく高いジェネラルアミノペプチダーゼ活性を有する。
【請求項２】
醗酵工程において請求項1の微生物を利用する方法。
【請求項３】
醗酵工程がチーズの熟成工程である請求項2による方法。
【請求項４】
請求項1の微生物を生理活性ペプチドの分解に利用する方法。
【請求項５】
請求項1の微生物が、乳酸桿菌が通常生育する条件下で乳から得られた調製物の存在下で生育する、乳から得られた調製物の醗酵方法。
【請求項６】
乳調製物が新鮮なチーズカードである請求項5による方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高たんぱく質分解力および苦味除去能を有し、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  に属する新規な乳酸菌、特にＳＢＴ  ２１７１株及びその培養物に関する。さらに、本発明は、この乳酸菌より得られるたんぱく質分解酵素及びその利用法に関する。
本発明の乳酸菌、培養物あるいはこれから得られるたんぱく質分解酵素を、食品、飼料および医薬品のたんぱく質の分解過程で利用することにより、これらの製品を、人および動物に対して苦みおよび臭気がなく、安全で、しかも低コストで製造することが可能となる。従って本発明は、食品、飼料および医薬の分野で利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、たんぱく質を分解する方法は様々な方法がある。酸による分解、酵素による分解、微生物による分解などである。酸による分解は、製造コストを低く抑えることができるが、酸を使用するので利用できる製品は制限される。また、食品への応用には、人および動物に対する安全性が問題であり、たとえ、その安全性が科学的に証明されたとしても、消費者は、心理的に拒否反応を示すことが多い。トリプシン、ペプシンなどの消化酵素を用いた場合は、高たんぱく質分解力をもつために比較的製造コストを低く抑えることができる。しかも、安全性の問題は回避できるが、これら消化酵素は、苦味のもととなるペプチドを生じさせるため、風味を劣化させ、良質な風味をもつ製品を製造できない。また、微生物を利用する方法は、微生物の種類によって、その安全性に問題を残す。安全な微生物とは、伝統的発酵食品に含まれているもので、古来より人類が食し、これまでに何ら問題のないものとされている。その代表的なものに、酪農乳酸菌がある。しかし、チーズに広く用いられている乳酸球菌は、たんぱく質分解活性が低いため、製造コストが高くなる欠点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
チーズに広く用いられている乳酸球菌は、人および動物に対する安全性は高いが、たんぱく質分解力が低いために、製造コストが高くなり、産業上適用範囲が制限される。また、一部の酪農乳酸菌は、たんぱく質分解力は高いが、苦味を生じさせ、製品の風味を損なわせるものが存在する。
従って、本発明の目的は、安全性の高い酪農乳酸菌のなかから、たんぱく質分解力が高く、しかも苦味および臭気除去能を有する酪農乳酸菌及びたんぱく質分解酵素を提供することにある。
【０００４】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、乳および乳製品より分離した乳酸桿菌のたんぱく質分解力および苦味除去能を詳細に比較研究した結果、高いたんぱく質分解力および苦味除去能を有するラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  ＳＢＴ  ２１７１株を獲得し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、発酵乳を滅菌した生理食塩水に懸濁し、さらに滅菌した生理食塩水で菌株１０６  〜１０７  となるように希釈した懸濁液を調製する。この懸濁液を市販のＭＲＳ  培地に寒天を１．５  ％になるように加えたＭＲＳ  寒天培地に塗沫し、３７℃で２日以上培養する。こゝで出現するコロニーを採取してＭＲＳ  培地に接種し、３７℃で１日間培養し、後記するようなスクリーニングを行い、その活性の最も高い菌株を採取し、継代培養を行った。こゝで得られた株の菌学的特徴は次のとおりであった。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
この菌学的性質から、Ｂｅｒｇｙ’ｓ    ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ２，ｐｐ．  １２２２−１２２４（１９８６）  の記載を参酌して検索すると、この菌株は、ラクトバチルス    ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  と同定された。そして得られた菌株をラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ  ２１７１  としてオランダＣｅｕｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）  に受託番号ＣＢＳ  ４０４．９３として寄託した。なお、この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ  ２１７１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３８１）  として寄託され、その後ブタペスト条約に基づく寄託に移管された。そして、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４５が付されている。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
材料と方法
この乳酸菌を取得するためのスクリーニングは以下のように行った。
微  生  物
乳および乳製品から分離された乳酸桿菌１２菌種１６８  株及び乳酸球菌９株のたんぱく質分解力および苦味除去能を比較した。比較した菌種名および菌株数は以下のものである。
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【０００９】
これらの標準菌株は、ナショナル  コレクション  オブ  フード  バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  ＮＣＦＲ）、アグリカルチュラル    アンドフード  リサーチ  カウンセル（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）及び英国のイスティチュート    オブ    フード  リサーチ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）より取得したものである。また、後のＳＢＴ番号を付した菌株は、雪印乳業  （株）  標準菌株コレクション（Ｓｎｏｗ  Ｂｒａｎｄ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より得たものである。
【００１０】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ＡＭ１、Ｅ８、ＨＰ、ＳＫ１１２  並びにＷｇ２  、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＭＬ３はオランダ、Ｅｄｅ  にあるネザーランド    インスティチュート    フォー  デアリー  リサーチ（ＮＩＺＯ）（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  より入手した。
微生物は常法で３  世代に亘りＭＲＳ  培地（Ｍｅｒｃｋ  、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  、ドイツ）を用い３０または３７℃で継代培養し、１０％（ｖ／ｖ）  グリセリン含有ＭＲＳ  培地中、−５５  ℃で保存した。
【００１１】
成長曲線
各菌株から、成長曲線は保存菌株（ｓｔｏｃｋ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ）からＭＲＳ  培地またはＭＲＸ  培地１０  ｍｌ  中に第１  世代を１％種培養（ｓｅｅｄ−ｃｕｌｔｕｒｅ）して得て、第２  世代の前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）に継代した。次いでＭＲＳ  培地  １０  ｍｌを含有するねじ込み栓付１３  ｘ  １５０ｍｍ試験管にその１％を接種した。菌の成長は波長６５０  ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定して観察した。
【００１２】
無菌体抽出液の調製
ＭＲＳ  液体培地４００  ｍｌ中で成長した細胞菌体は、対数増殖期の後期に、４  ℃、７，５００  ｘ  Ｇ  で１０分間遠心分離して回収し、１０  ｍＭ  塩化カルシウムを含有する５０ｍＭ４−（２−  ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−  エタンスルホン酸〔４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＨＥＰＥＳ）  〕１００ｍｌ  、ｐＨ  ７、で洗浄し、この緩衝液１０  ｍｌ  中に懸濁させた。２次スクリーニングの為に、菌株は塩化カルシウム  １５  ｍＭを含有するＤｅ  Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（７）のＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚ  ｅｔａｌ．  （１５）  変法培地であるＭＲＸ  培地で成長させた。
菌体抽出物は菌体を超音波破砕器（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ：  Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．  、米国、コネチカット州、Ｄａｎｂｕｒｙ  ）で、出力５０％  、パルス２０％  、０  ℃、１０分間間隔、１０分間超音波処理で破壊して得た。無菌体抽出液は破壊した菌体を３０，０００  ｘ
Ｇ、４  ℃、１０分間遠心分離で得た。
【００１３】
酵素アッセイ
たんぱく質分解活性は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  菌種について記載されている種々のたんぱく質分解酵素に対応する広範な合成した色素産生（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）  基質を用いて測定した（表２参照）。
ｐ−ニトロアニリド（Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を含有する基質の加水分解は、Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ（１２）  の方法で測定した。酵素混合物は菌体抽出物２０μｌ  及び１００  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ２００μｌ  、ｐＨ  ７とした。反応は２  ｍＭ  ｐ−  ニトロアニリド（ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）基質溶液  ２００μｌ  を添加して開始し、３０℃に数分間保持した。反応は５２％（ｖ／ｖ）酢酸１００  μｌ  を添加して終了させた。反応混合物は１４，０００  ｒｐｍで５  分間遠心分離し、上清中のｐ−ニトロアニリド（ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）の量は４１０  ｎｍで測定した（Ｕ−２０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．日立製作所、日本）。ｐ−ニトロアニリド  （Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）  の濃度はモル吸収係数（ｍｏｌａｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）  （ε＝  ８，８００    Ｍ−１  ｍ−１）  より算出した。
【００１４】
β−  ナフチルアミド（Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）  基質の加水分解はＥｌｌｅｍａｎ（１１）  の変法で測定した。酵素混合物は菌体抽出物２０μｌ  及び１００  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ２００μｌ  、ｐＨ  ７とした。反応は  ２  ｍＭ  β−  ナフチルアミド（Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）  基質水溶液  ２００μｌ  を添加して開始し、３０℃で数分間インキュベートした。反応はＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣ  １  ｍｇ／ｍｌ  及び５％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ  ３５を含有する１Ｍ    酢酸塩  ２００μｌ  、ｐＨ  ４．０、を添加して終了させた。反応混合物は最適な発色を示す迄１０分間保持し、次いで１４，０００  ｒｐｍで５  分間遠心分離した。上清中のβ−  ナフチルアミド（Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）  の量は５５０  ｎｍで測定した（Ｕ−２０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，  日立製作所、日本）。β−  ナフチルアミド（Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）  の濃度はモル吸収係数（ε  ＝  ２０，０００    Ｍ−１  ｍ−１）  より算出した。
【００１５】
非色素非産生性（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）  合成ペプチドの加水分解はＤｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（８）のｃａｄｍｉｕｍ−ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ  法の変法に依る遊離アミノ酸の放出で測定した。酵素混合物は１００  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７）中、希釈菌体抽出物１００  μｌ  を含有させて調製した。反応は２  ｍＭペプチド溶液１００  μｌ  を添加して開始させ、３０℃で数分間反応させた。反応はＣｄ  Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ試薬  １．５  ｍｌ  を添加して終了させ、次いで８４℃で５  分間加熱した。冷却後、反応混合物は１４，０００  ｒｐｍで５  分間遠心分離し、吸光度はＶｉｔａｌａｂ  １０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｉｅｒｅｎ、オランダ）を用いて５１５  ｎｍで測定した。
ペプチダーゼの比活性は、測定条件下の１  分間当り基質からのＬ−ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）１μモルに相当するアミノ酸を生成するに要する酵素量と定めた（２６）。
【００１６】
Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ  標識カゼイン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ）の加水分解は、５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  中、３７℃で、製造者によって示されたプロトコールに従って測定した。
すべての試験混合物は反応開始前に３０℃に調整した。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
ＡＰＩＺＹＭ試験方法
ＡＰＩＺＹＭキット（ＬＡＲ  ＺＹＭ  ＡＰ  １〜６  ）はＡＰＩ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｌａ  Ｂａｌｍｅ  Ｌｅｓ  Ｇｒｏｔｔｅｓ、フランス）から得た。たんぱく質６５または１２５  ｍｇ／ｍｌ  を含有し、菌体抽出液または無菌体抽出液７０μｌ  を、脱水した色素産生酵素基質を含有する各ウエルに添加し、混合物を３７℃で  ２または４  時間反応させた。反応はＺＹＭ  Ａ  試薬５０μｌ  の添加で終了させ、ＺＹＭ  Ｂ  試薬５０μｌ  の添加で発色させた。酵素活性は５分間の発色を製造者から提供されたカラーチャートと比較して測定した。
【００１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウム−  ポリアクリルアミド    ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びプレパラティブスラブ    ゲル電気泳動は、それぞれＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  及び  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  Ｘｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）を用いて、製造者の提供したインストラクションマニュアルに記載の通り実施した。酵素分子の大きさは予め染色した１４，４００〜９７，４００  Ｄａ  の標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）を用いて測定した。
【００２０】
イムノブロット法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ゲル上に分離したたんぱく質は、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）を用いて、製造者のマニュアルに記載の通りポリビニリデン    ジフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  、ＰＶＤＦ）シートに転写した。ＰＶＤＦ膜は１％スキムミルクで飽和し、種々のたんぱく質分解酵素に対する抗体、即ちポリクローナル及びモノクローナル抗体を、それぞれ１／４，０００  〜１／８，０００  及び１／１０希釈液と共に反応させた。反応物は１５０  ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０  ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ  ８．０）（ＴＢＳＴ）、で洗浄後、膜は１／３，０００  に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ    イムノグロブリン血清またはヤギ抗マウス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）と反応させた。
【００２１】
ＰＶＤＦ膜はＴＢＳＴで洗浄し、酵素抗体複合体は、０．１  Ｍ  ＮａＨＣＯ３及び１．０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２から成るｐＨ  ９．８のカーボネート緩衝液中７０％  ジメチルフォルムアミド中の３０  ｍｇ／ｍｌの１％（ｖ／ｖ）  ニトロブルーテトラゾリウム（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）  及び１００％ジメチルフォルムアミド中の１５  ｍｇ／ｍｌの１％（ｖ／ｖ）  ５−ブロモ−４−  クロロ−３−  インドリルフォスフェート    ジソジウム塩（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）  と反応させて発色させた。抗体はＧｒｏｎｉｎｇｅｎ  大学、微生物学部（オランダ）より得た（１４，１８，２７）。
【００２２】
ポリアクリルアミド    ゲル上のペプチダーゼ活性の検出
無菌体抽出液中のたんぱく質は７．５％プレパラティヴ    スラブ    ゲル電気泳動で分離した。ゲルは垂直に７  ｍｍのゲル片に切断し０．１  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、（ｐＨ  ７）、で１０分間２  回洗浄した。ゲル片は１ｍＭ  β−  ナフチルアミド（Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ）  基質を含有する１００  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １０  ｍｌ中、３７℃で２  〜６０分反応させた。ペプチダーゼ活性は、Ｆａｓｔ  Ｇａｍｅｔ  ＧＢＣ  ２ｍｇ／ｍｌ  水溶液１０ｍｌの添加後  ５分以内に発色測定した（Ｓａｒａｈ  ｅｔ  ａｌ．）。もしくは、ペプチダーゼ活性は、ゲル片中に、ｏ−ジアニシジン（ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）  を酸化して赤褐色に発色する複合酵素反応でロイシンを検出することで測定した。ゲル片は１００  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．５）８  ｍｌ  、５０  ｍＭ  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  またはＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  溶液  １６０μｌ  、０．１Ｎ  ＨＣｌ中２３．３  ｍＭ  ｏ−ジアニシジン（ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）８０  μｌ  、３．２  Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４  中５，０００  Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）８０μｌ  及び３．２  Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４  中  １  ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−  アミノ酸オキシダーゼ８０μｌ  を含有する溶液８．４  ｍｌ中で、３７℃、１０分間反応させた。
【００２３】
官能テスト
トリプシン消化カゼインを含有する２５  ｍＭ  燐酸カリウム（ｐＨ  ７）、及び菌体抽出たんぱく質  ０．５  ｍｇ  の混合物２ｍｌ  を、３０℃で６時間反応させた。カゼイン消化物の苦味は、６名のパネルに依る官能試験で評価した。苦味に変化がなければ「苦い」、苦味が残れば「僅かに苦い」、また苦味が感じられなければ「完全に苦味を除去した」として表わした。
【００２４】
種々のペプチダーゼの部分精製
ＦＰＬＣに依るＭｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィーの精製条件は、以下の様に設定した：無菌体抽出物４ｍｇを含む溶液  １００μｌ  を、Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５  カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  、Ｕｐｐｓａｌａ  、スウェーデン）に吸着させた。酵素活性は２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）の０．１５〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）  で、流速１  ｍｌ／  分に依り溶出し、溶出液は１  ｍｌ毎に採取し、種々の  （色素産生）  ペプチドを用いてペプチダーゼ活性を検定した。
【００２５】
たんぱく質測定
たんぱく質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとしてＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州、米国）により測定した。
【００２６】
化学薬品及び試薬
本発明で使用した全てのアミノ酸及びペプチド誘導体は、特に規定のある外は、Ｌ−体のアミノ酸である。全ての化学薬品は試薬規格で、市販品を用いた。
【００２７】
結  果
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  の１７８  菌株のスクリーニング
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  の１７８  菌株の無菌体抽出液は、更に１３の亜種に分類し、以下の基質を用いてそのたんぱく質分解活性をテストした：ジェネラルアミノペプチダーゼ活性にはＬｙｓ−ｐＮＡ  及びＡｒｇ−ｐＮＡ  、グルタミル    アミノペプチダーゼ活性にはＧｌｕ−ｐＮＡ  、プロリダーゼ活性にはＰｒｏ−ｐＮＡ  、Ｘ−プロリル−  ジペプチジル    アミノペプチダーゼ活性にはＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  、エンドペプチダーゼまたはプロティナーゼ活性にはＳｕｃ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ  及びＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  を用いた。
【００２８】
図１  は基質、Ｌｙｓ−ｐＮＡ  、図２  は基質、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  、及び図３  は基質、ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  に対する、各菌別のたんぱく質分解活性の平均を示し、最大及び最小値も示した。結果は各菌種に非常に多様なたんぱく質分解活性を明瞭に示した。高い活性も見出されたが、非常に低い活性も見出された。この結果はその他の基質に就いても同様であった（結果は表示せず）。
この結果はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓが、全３  種の色素産生ペプチドに対する最高の平均活性を有することを示した。その他のペプチドに就いても、Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ  を例外とする外は同様である（結果は表示せず）。
【００２９】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  類の苦味除去能を測定する為に、カゼインのトリプシン消化物の苦味除去試験を実施した（材料と方法の項参照）。図４  は６  時間以内にカゼインのトリプシン消化物の苦味を除去することのできる菌株数を示す（完全苦味除去：黒、一部除去：縦線、除去できない：白をそれぞれ示す）。特にＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓの２０菌株及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  の２  菌株、Ｌｂ．  ｃａｓｅｉ  の５  菌株は顕著な苦味除去能を示した。
【００３０】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  及びその他の乳酸菌のたんぱく分解活性の比較      Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１、その他高いたんぱく質分解活性を示したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  の８菌株及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  の２菌株に就いて、そのペプチダーゼ（Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  及びプロティナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）活性を検討した。
基質２１種に就いての加水分解活性テストの結果は、表３に要約した。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  は、カルボキシペプチダーゼ基質を含む、２１種の基質中１２種に最高活性を示した。更に、同菌株はその他大部分の基質に就いても最高の活性を有していた。
特に主要ペプチダーゼの活性は  Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１株が最高であった。つまり、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（トリペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活性を示す）  、Ｌｙｓ−ｐＮＡ（アミノペプチダーゼ活性を示す）  、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活性を示す）  およびＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ（エンドペプチダーゼ活性を示す）  の分解活性が他の菌株と比較して最大であった。さらに、Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性に対応るすＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  分解活性及びプロティナーゼ活性に対応するｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−ｃａｓｅｉｎ分解活性に関しても二番目に高い値を示した。
さらに、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−βＮＡ、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−４ＭβＮＡ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−βＮＡ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−βＮＡ及びＳｅｒ−Ｍｅｔ−βＮＡを最も加水分解した（結果は表示せず）。
【００３１】
【表３】
0003618122.tif 000006
【００３２】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  のたんぱく質分解酵素活性を、Ｌ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  Ｗｇ２  及びＬ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＳＫ１１２  の乳酸球菌と比較すると、最も顕著な相違が認められた。例えば、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  はＬｙｓ−ｐＮＡ  に対して５  〜７  倍の活性を示し、Ｐｒｏ−ｐＮＡ  に対しては９０倍以上の活性を、またＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  に対しては、ほぼ１０倍の活性を示した。更に、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ  を除くその他すべての基質に対してもＳＢＴ  ２１７１菌株のほうが分解活性が高かった。
これらの結果はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  が、数種の乳酸球菌を含めてテストしたすべての菌株で、最も強力なたんぱく質分解能を有する菌株であることを明瞭に示す。
【００３３】
苦味除去活性試験は、種々の高いたんぱく質分解能を有する菌株に就いて実施した。その結果はすべての菌株が多少なりとも苦味除去活性を有することを示し、中でも  Ｌｂ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の活性が高かった（図５）。
【００３４】
更にＡＰＩＺＹＭ試験を若干の乳酸桿菌及乳酸球菌に実施した。この試験にはＡＰＩ  からＶＩに至る５９種の基質を用いた。大部分の菌株は広範な基質に対して加水分解作用を示した。ＡＰＩＺＹＭ試験もＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  が広範な基質に対して加水分解活性を有することを明瞭に示した  （表４）。
【００３５】
【表４】
0003618122.tif 000007
【００３６】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  のザイモグラム染色法に依るペプチダーゼ活性の検出ザイモグラム法は、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  中に存するエキソ型ペプチダーゼ（ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を定量する為に実施した。Ｌｃ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｗｇ２を対照菌株として用いた。表５は両菌株の無菌体抽出物の、７．５％  ＰＡＧＥ  に依る種々の基質に就いて検出された加水分解活性のＲｆ−  値を示す。この結果はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  が、少なくとも４種の異なったペプチダーゼを有することを示した：即ち広範な基質特異性を有するアミノペプチダーゼ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−βＮＡに対するＸ−プロリル    ジペプチジル    アミノペプチダーゼ（Ｘ−ｐｒｏｌｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）及びＬｅｕ−Ｌｅｕ  に対する２  種の異なったジペプチダーゼ（ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  である。トリペプチダーゼ（Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を含む同型のペプチダーゼが    Ｌｃ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｗｇ２に検出されている。しかしながら、Ｒｆ−  値はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の酵素とは非常に異なっている。更に、Ｌ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  Ｗｇ２  は１１種の基質中の６  種のみを加水分解し、一方、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  はゲル中の全ての基質が加水分解可能である。これらの結果は異なったたんぱく質分解酵素がＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  とＬｂ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｗｇ２中に存することを示す。
【００３７】
【表５】
0003618122.tif 000008
【００３８】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物のイムノブロット法
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  及びＬｃ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｗｇ２の無菌体抽出物中のたんぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、次いで種々の乳酸球菌のたんぱく質分解酵素に対して得たモノクローナル及びポリクローナル抗体と共に反応させた。結果を表６  に要約する。全８  種のたんぱく質分解酵素がＬｃ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｗｇ２に存することを示した。ＰｒｔＰ、ＰｅｐＮ、ＴＲＰ  及び  ＤＩＰに対するモノクローナル抗体及びＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  との免疫反応は認められなかった。ＰｅｐＯ及びＰｅｐＣに対して生じさせたポリクローナル抗体は、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物中の数種のたんぱく質を認識した。しかしながら、分子量はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓから得た対応する酵素とは異なっているが、ＰｅｐＣに対する抗体は例外で、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓから得たものと同様に５０  ｋＤａのたんぱく質バンドを認識した。ＰｅｐＸ及びＴＲＰ  に対するポリクローナル抗体は免疫反応を全く示さなかった。
これらの結果に基づいて、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  に由来する大部分のたんぱく質分解酵素は、少なくともＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するたんぱく質分解酵素とは免疫学的に異なっているといえる。さらにその他の菌株のたんぱく質分解酵素とも免疫学的に異なっている  （表７  参照）  。
【００３９】
【表６】
0003618122.tif 000009
【００４０】
【表７】
0003618122.tif 000010
【００４１】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の種々のペプチダーゼの部分精製
図６  はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物のイオン交換クロマトグラフィー後の溶出状態を示す。分画を採取し、種々の基質と反応させた。各基質に就いての結果は図の下に示した。図中の縦縞はペプチダーゼ活性を示し、黒は活性のピークを示す。６  種の異なったペプチダーゼ活性が分離された。即ち、１．第１９分画中のＬｅｕ−Ｌｅｕ  加水分解ジ−  またはアミノペプチダーゼ活性、２．第２０分画中のＰｒｏ−Ａｌａ  加水分解活性、３．第２４分画中のＰｒｏ−Ａｌａ  及びＰｒｏ−ｐＮＡ  加水分解活性、４．第２６分画中のＬｙｓ−ｐＮＡ  、Ｇｌｕ−ｐＮＡ  、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  及びＰｒｏ−ｐＮＡ  を加水分解可能な一般的アミノペプチダーゼ活性、５．第２８及び２９分画中のＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  を加水分解可能なＸ−プロリル    ジペプチジル    アミノペプチダーゼ活性、６．第３２及び３３分画中のＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  加水分解可能なトリまたはアミノペプチダーゼ活性である。また少なくとも３  種の異なったプロティナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）及びエンドペプチダーゼ活性を分離した。即ち、１．第１  、２３及び３５分画中のｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−ｃａｓｅｉｎ加水分解プロティナーゼ活性、２．第２３分画中のＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  加水分解活性、及び第２６分画中のＣｂｚ−Ｃｙｓ−ｐＮＡ  加水分解活性である。
この精製に依ってザイモグラム法の５種を超える少なくとも９種の異なったたんぱく質分解酵素が区別された。
【００４２】
本発明では種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属から得られたたんぱく質分解活性を述べた。ペプチダーゼ類の比較研究はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  の亜種に就いて先に実施されている（１，２，９  ）。この報告ではＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  の僅か数種の菌株及び酵素活性が述べられていたが、一方、本発明ではＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  の１２菌種の１７８  菌株のたんぱく質分解活性を比較検討した。更に、約１３種の異なったペプチダーゼ及びプロテイナーゼ活性を、２０を超える異なった基質を用いて各菌株に就いて測定し、またさらに５９種の基質を微量酵素ＡＰＩＺＹＭシステムを用いて測定した。
本発明の結果は試験したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属菌株中のたんぱく質分解活性の多様な違いを明瞭に示した。たんぱく質分解性の高い菌株が存していたが、殆ど活性のない菌株も検出された。更に同一菌種の菌株のたんぱく質分解活性は大きく異なり、例えば、大部分のＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ菌株のたんぱく質分解活性は高かったが、一方Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ０３５１  のたんぱく質分解活性はほとんど検出されなかった（結果は表示せず）。
その他のテストした乳酸桿菌及び乳酸球菌の中では  Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  が、広範囲な基質に対して最もたんぱく質分解活性の高い菌種であった。しかも、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓの細胞含有抽出物を用いたトリプシンに依るβ−  カゼイン消化物の反応で認められた苦味の減少は、その他の乳酸菌種より有意に高度であった。ペプチダーゼの比活性と苦味除去活性との間には明瞭な相関は認められなかったが、この現象は混合物中の苦味ペプチドの減少によるものであると説明できるだろう。
【００４３】
種々の高度にたんぱく質分解性のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属菌株を選出した検討の結果、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  が最もたんぱく質分解活性の高い菌株であることが見出された。
この菌株はＬｙｓ−ｐＮＡ  、Ａｒｇ−ｐＮＡ  、Ｇｌｕ−ｐＮＡ  、Ｈｉｓ−βＮＡ（対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ）、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ  （対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びジペプチダーゼ）  、Ｌｅｕ−ｌｅｕ−Ｌｅｕ  （対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びトリペプチダーゼ）  、Ｐｒｏ−ｐＮＡ  及びＰｒｏ−Ａｌａ  （対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びプロリン    イミノペプチダーゼ）  、ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  、Ｂｚｌ−Ｃｙｓ−ｐＮＡ  （対応する酵素としてエンドペプチダーゼまたはプロティナーゼ）  、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ  、Ｚ−Ａｌａ−Ｉｌｅ  及びＨｙｐ−Ｌｙｓ（対応する酵素としてカルボキシペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼ）  に対して最高のたんぱく質分解活性を有していた。しかし、同様に非常に高い活性がその他の基質、例えばＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  （Ｘ−  プロリル  ｐジペプチジル    アミノペプチダーゼ活性）  及びＲｅｓｏｒｕｆｉｎ−ｃａｓｅｉｎ  （プロティナーゼ）  に対して認められた。
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  のジェネラルアミノペプチダーゼは、Ｐｒｏ−ｐＮＡ  も加水分解する。この点はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに就いてはこれまで報告されていなかったので興味深い。
【００４４】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物のザイモグラム試験により、本発明の菌株が少なくとも４  種のエキソペプチダーゼを利用することを示した、即ちジェネラルアミノペプチダーゼ、Ｘ−プロリル    ジペプチジル    アミノペプチダーゼ及び２  種のジペプチダーゼである。同一のＲｆ−  値を有する単一または複数の酵素が含まれる可能性があるので、これらの基質に対する加水分解作用が、単一のＰｅｐＮまたは複数のＰＩＰ  もしくはＧＡＰ  ペプチダーゼに依るのかは不明である。もし単一のジェネラルアミノペプチダーゼのみが関与するなら、この酵素は非常に重要と見なさねばならない。数種の基質、例えばＨｙｐ−Ｌｙｓ  、Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ  、Ｍｏｏ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  及びＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−βＮＡ、に対するＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物に依る加水分解作用に反して、ザイモグラム染色に依ってはこれらの基質に対する活性は認められなかった。恐らく、現在ではゲルで分離される２  種以上の酵素の相乗作用が、発色群の放出に必要、またはその関与する酵素の特異的活性が、本発明における方法で検出されるには不十分であったのであろう。
【００４５】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物が、イオン交換クロマトグラフィーで分離された際には、少なくとも９種の異なったたんぱく質分解活性が判別される。ザイモグラム試験との比較では、種々のプロティナーゼ及びエンドペプチダーゼを含む５  種を超えるたんぱく質分解酵素が検出された。
イムノブロット試験はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓから得た種々のたんぱく質分解酵素に対する抗体の大部分は、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の無菌体抽出物中のたんぱく質と反応しないことを示す。この点はＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに由来する大部分のたんぱく質分解酵素は、少なくともＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来する酵素とは免疫学的に異なっていることを示す。
【００４６】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  は、テストしたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の菌株より高いたんぱく質分解活性を示すと結論出来る。この結論は、エメンタール及びグリエールチーズ以外の大部分のチーズの熟成（１９）に、主として、菌株のたんぱく質分解への主たる寄与を意味するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  属スターター培養が利用されていることを考慮すると興味深い。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓの様な優れたたんぱく質分解作用を有する菌株の発育がチーズの熟成に大きく影響することが明かである。従って、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  のチーズ熟成の促進に関する適用が最も有用である。    Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の高いたんぱく質分解活性はその固有の酵素に依るのであろうが、発現及び制御因子が関与しているかは不明である。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ０６２１  が全くたんぱく質分解活性を示さない事実は、この菌株がたんぱく質分解酵素の発現及び制御に欠けているといえるだろう。もしそうであるなら、これらの制御システムの一層の研究は非常に興味深い。
【００４７】
チーズの熟成及びたんぱく質加水分解生成物
チーズの熟成期間は、その種類に依り数週間から２  年間に及び、長期間の冷蔵保存、資本の固定化に依る高価格及び好ましからざる苦味−  臭の生成等の異常発酵に依る損失が生じる。これらの経費を低減させるために熟成工程の研究が重要性となる。この発明の一部は熟成工程に含まれる酵素系に主として寄与する乳酸菌に利用可能である。
種々の起源から加水分解されたたんぱく質は、食品産業に多く使用されるが、これらは種々の疾患及び代謝異常に苦しむ患者の栄養補給にも使用できる。しかしながら、酸または酵素に依る加水分解は、目的とする栄養分の損失及び好ましからざる苦味や臭の発生の様な欠陥を多く生じる。乳酸菌からのたんぱく質分解酵素の使用は、欠陥なしに理想的な加水分解生成物を生じ得るるので、非常に重要となるであろう。
【００４８】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の乳製品発酵への意義
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓは、発酵乳製品から１９８０年に分離された。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに依ると、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  （Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍ、Ｏｒｌａ−Ｊｅｎｓｅｎ  、１９１９）は、桿状、グラム陽性で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属の偏性ホモ型発酵性菌である。この乳酸菌は至適生育が４５℃で、最高生育温度５０〜５２℃、また９０％  以上の菌株はガラクトース、グルコース、ラクトース及びソルビトールの炭水化物を資化出来る（表ｂ  参照）。
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓは酸乳、チーズ    スターター培養物及びチーズ、特にエンメンタール及びグリエールチーズから分離された（１９）。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓは  ｉ）  食品製造に酸味を与え、従って製品の悪化を予防し、ｉｉ）たんぱく質を分解し、ｉｉｉ）製品に風味と味覚を生じさせ、ｉｖ）若干のＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに依る細胞外多糖類の生成に依って製品のレオロジー特性を変える。
【００４９】
Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の様なｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  類のたんぱく質分解系の優れた性質は、スターターカルチャー及び熟成工程のより良いコントロールの改善に寄与出来る。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  、その菌体抽出物及び精製たんぱく質分解酵素は、チーズの熟成促進またはいわゆる酵素調製チーズ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｈｅｅｓｅ、ＥＭＣ  ）の生産改善に用いられる。乳酸菌及びその（部分的）精製酵素の種々の適用に就いては、先に述べられている（１０，１９，２０）。更に、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  、その酵素抽出物または精製酵素は、酵素によるたんぱく質加水分解及び／またはポリペプチド材料の工程に用いられ、実質的に苦味のない加水分解生成物を生じる。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ    ＳＢＴ  ２１７１は、種々の食品生産物の増粘剤として多糖類の生産に用いられる。
更に、たんぱく質分解系または多糖類及びその他の産生に関連する遺伝子及びプラスミドの様なすべての遺伝子組情報は、理想的な発酵の特徴を現わす遺伝子組換え菌株を得る為に用いられる。一方、たんぱく質、ペプチド及び糖鎖に対して生じた抗体は、食品製造中の菌体または菌体構成物の検出に適用可能である。Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  の基礎的研究がもたらす、保健効果、抗菌剤、ファージ抵抗性、及びその他の制御並びに代謝系の研究に重要となり、一層の適用を実行すべきである。
【００５０】
【発明の効果】
異なったＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属菌種及び菌株は、顕著な苦味除去能と同様に、多様で特異的なエキソペプチダーゼ（ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）及びエンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性を示した。大部分のＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ菌株は、カルボキシペプチダーゼ基質を含む殆どの基質に対して非常に高い加水分解活性を示した。
中でもＬｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  は最も強力なたんぱく質分解菌株であることが見出された。ザイモグラム法及び部分精製試験を根拠として、本菌株は少なくとも９  種の異なったたんぱく質分解酵素を利用していた。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（乳酸球菌）から得た種々のたんぱく質分解酵素に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体で、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  から得た酵素と反応するものはなかった。このことは、Ｌｂ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＳＢＴ  ２１７１  のたんぱく質分解系の酵素が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓから得られた酵素とは、少なくとも免疫学的に異なることを示す。
本発明によると苦味、臭気等を発生することなく、高いたんぱく質分解活性をもつ乳酸桿菌及びその乳酸桿菌由来のたんぱく質分解酵素を得ることができる。得られた乳酸桿菌及びたんぱく質分解酵素は、チーズ等の乳製品あるいはたんぱく質加水分解物製造のさいに用いられ、製品の苦味、悪臭の生成を防止することができる。
【００５１】
【引用文献】
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７．    Ｄｅ  Ｍａｎ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｍ．  Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅ．  Ｓｈａｒｐ．  １９６０．    Ａ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２３：  １３０−１３５．
８．    Ｄｏｉ，  Ｅ，  Ｓｈｉｂａｔａ  Ｄ．  ａｎｄ  Ｍａｔｏｂａ  Ｔ．  １９８１．  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：  １７３−１８４．
９．    Ｅｌ  Ａｂｂｏｕｄｉ，  Ｍ．，  Ｅｌ  Ｓｏｄａ，  Ｍ．，  Ｐａｎｄｉａｎ  Ｓ．，  Ｂａｒｒｅａｕ，  Ｍ．，  Ｔｒｅｐａｎｉｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｉｍａｒｄ，  Ｒ．Ｅ．  １９９１．  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｄｅｂｉｔｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｅｂｉｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ．  Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．  １：  ５５−６４．
１０．    Ｅｌ  Ｓｏｄａ，  Ｍ．  Ａ．  １９９３．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｃｈｅｅｓｅ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ．  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  （ＦＥＭＳ）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ４ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｎｏｏｒｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．
１１．    Ｅｌｌｅｍａｎ，  Ｔ．  Ｃ．  １９７４．  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｅａ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １４１：  １１３−１１８．
１２．    Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ，  Ｆ．Ａ．  １９７５．  Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＨＰ．  Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．  ２９：  ３０３−３１８．
１３．    Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ，  Ｆ．Ａ．  １９９０．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｃｅｌｌ−ｅｖｅｌｏｐｅ−ｌｏｃａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  ３３：  ４０１−４０６．
１４．    Ｈａａｎｄｒｉｋｍａｎ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｋｏｋ，  Ｈ．  Ｌａａｎ，  Ｓ．  Ｓｏｅｍｉｔｒｏ，  Ａ．Ｍ．  Ｌｅｄｅｂｏｅｒ，  Ｗ．Ｎ．  Ｋｏｎｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｖｅｎｅｍａ．  １９８９．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１：  ２７８９−２７９４．
１５．    Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｓ，  Ｊ．，  Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ，  Ｆ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗ．Ｎ．  Ｋｏｎｉｎｇｓ．  １９８４．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｓ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４８：  １１０５−１１１０．
１６．    Ｋｈａｌｉｄ，  Ｎ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｈ，  Ｅ．Ｍ．  １９９０．  Ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＣＮＲＺ  ３２．  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３：  ３１１−３１９．
１７．    Ｋｈａｌｉｄ，  Ｎ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．  Ｍａｒｔｈ．  １９９０．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｘ−ｐｒｏｌｙｌ−ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＣＮＲＺ  ３２．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５５：  ３８１−３８８．
１８．    Ｌａａｎ，  Ｈ．，  Ｅ．Ｊ．  Ｓｍｉｄ，  Ｌ．  ｄｅ  Ｌｅｉｊ，  Ｅ．  Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗ．Ｎ．  Ｋｏｎｉｎｇｓ  １９８８．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｏｆ  Ｌ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  Ｗｇ２．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４：  ２２５０−２２５６．
１９．    Ｌａｗ，  Ｂ．Ａ．  １９８４．  Ｆｌａｖｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｈｅｅｓｅｓ，  ｐ．  １８７−２０８．  Ｉｎ  Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．  Ｌａｗ  （ｅｄ．），  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｅｓｅ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｍｉｌｋ．  Ｅｌｚｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌ．  Ｓｃｉ．，  Ｌｏｎｄｏｎ．
２０．    Ｌａｗ，  Ｂ．Ａ．  １９８７．  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｃｈｅｅｓｅ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ．  Ｉｎ  Ｐ．Ｆ．ＦＯＸ  （ｏｄ．），  Ｃｈｏｏｃｏ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｅｌｚｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌ．  Ｓｃｉ．，  Ｌｏｎｄｏｎ．
２１．    Ｍａｃｈｕｇａ，  Ｅ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｈ．  Ｉｖｅｓ．  １９８４．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｕｓ  Ｒ−２６．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ７８９：  ２６−３６．
２２．    Ｍａｒｔｈ，  Ｅ．Ｈ．  １９６３．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｄｄａｒ  ｃｈｅｅｓｅ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ４６：  ８６９−８９０．
２３．    Ｍｉｙａｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｓ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｓ．  ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｔｏｍｉｔａ．  １９９１．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｘ−ｐｒｏｌｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＬＢＵ−１４７．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ７４：  ２３７５−２３８１．
２４．    Ｎａｅｓ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，  Ｊ．Ｎ．  １９９２．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３８：  ３１３−３１８．
２５．    Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｒ．Ｔ．  １９９０．  Ｎｏｎ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｉｎ  Ｃｈｅｄｄａｒ  ｃｈｅｅｓｅ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ７３：  １３９５−１４１０．
２６．    Ｓａｒａｔｈ，  Ｇ  １９８９．  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｅｄ．  Ｂｅｙｏｎｄ，  Ｒ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｏｎｄ，  Ｊ．Ｓ．  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ．
２７．    Ｔａｎ，  Ｐ．Ｓ．Ｔ．，  Ｍ．Ｐ．  Ｃｈａｐｏｔ−Ｃｈａｒｔｉｅｒ，  Ｋ．Ｍ．  Ｐｏｓ，  Ｍ．  Ｒｏｕｓｓｅａｕ，  Ｃ．Ｙ．  Ｂｏｑｕｉｅｎ，  Ｊ．Ｃ．  Ｇｒｉｐｏｎ  ａｎｄ  Ｗ．Ｎ．  Ｋｏｎｉｎｇｓ．  １９９２．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５８：  ２８５−２９０．
２８．    Ｔａｎ，  Ｐ．Ｓ．Ｔ．，  Ｐｏｏｌｍａｎ，  Ｂ  ａｎｄ  Ｋｏｎｉｎｇｓ  Ｗ．Ｎ．  １９９３．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．
２９．    Ｖｉｓｓｅｒ，  Ｓ．  １９９３．  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｈｅｅｓｅ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｌａｖｏｕｒ：  Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．  ７６：  ３２９−３５０．
３０．    Ｗｏｈｌｒｏｂ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｂｏｃｋｓｌｍａｎｎ  Ｗ．  １９９２．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ．  Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．  ２：  ３４５−３６３．
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の乳酸菌の基質、Ｌｙｓ−ｐＮＡ  に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。
【図２】種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の乳酸菌の基質、Ａｌａ−ｐＮＡ  に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。
【図３】種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の乳酸菌の基質、Ｍｅｏ−Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｐ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ  に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。
【図４】種々の乳酸菌によるカゼイン消化物の苦味度の低減を示す。
【図５】種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属菌株の菌体抽出物による加水分解に基づく、カゼインのトリプシン消化物の苦味度を示す。
【図６】本発明のラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  ＳＢＴ  ２１７１のモノＱ  イオン交換カラム分画物のペプチダーゼ活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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