(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列からなり、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドであって、
その第１７０番目から第１７５番目の塩基配列が、転写活性に関わるＴＣＣＴＣＣモチーフを構成し、当該ＴＣＣＴＣＣモチーフ以降のＣｐＧ配列の一部は、アレル特異的にメチル化されており、
ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列は、アレル特異的にメチル化されており、
−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列はメチル化と非メチル化とが混在した状態であり、
関節リウマチの発症に関与することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列からなり、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドであって、
その第１７０番目から第１７５番目の塩基配列が、転写活性に関わるＴＣＣＴＣＣモチーフを構成し、当該ＴＣＣＴＣＣモチーフ以降のＣｐＧ配列の一部は、アレル特異的にメチル化されており、
ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列は、アレル特異的にメチル化されており、
−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列は非メチル化状態であり、
関節リウマチの発症に抑制的に関与することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較することによって関節リウマチの発症、または、その発症可能性を判定するために利用される判定キットであって、
ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を構成する少なくとも一部のポリヌクレオチド中に含まれるメチル化シトシンの有無を判定するためのメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを含むことを特徴とする判定キット。
【請求項４】
上記メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーは、上記配列番号１に示す塩基配列における第３７４番目から第５６４番目までの塩基配列を少なくとも増幅させることができるように設定されていることを特徴とする請求項３に記載の判定キット。
【請求項５】
滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合、または、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認した場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することを特徴とする請求項３または４に記載の判定キット。
【請求項６】
滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較すること、または、滑膜細胞から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認することによって、関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定を行うことを特徴とする関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定方法。
【請求項７】
上記の判定方法は、
滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球および末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子の各プロモーター領域を重亜硫酸塩含有試薬でそれぞれ処理し、当該プロモーター領域に含まれるＣｐＧ配列中の非メチル化シトシンをウラシルへと変換するＤＮＡ変換工程と、
上記ＤＮＡ変換工程による処理後のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を、メチル化特異的プライマーあるいは非メチル特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させるＤＮＡ増幅工程と、
上記ＤＮＡ増幅工程において、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、メチル化特異的プライマーあるいは非メチル特異的プライマーの何れを用いたポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたかを検出することで、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態を検出するメチル化状態検出工程と、
上記メチル化状態検出工程によって検出された、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較する比較工程、または、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認する確認工程とを含むことを特徴とする請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することを特徴とする請求項６または７に記載の判定方法。
【請求項９】
健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子を比較対照とし、
被験者から採取した滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、上記末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態よりも高メチル化状態である場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することを特徴とする請求項６または７に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの発症に関与するポリヌクレオチド、およびこれを利用した関節リウマチの発症またはその発症可能性の判定方法および判定キット、さらに、当該ポリヌクレオチドを利用した関節リウマチの治療薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis  以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００３】
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く利用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子の存在は、その陽性率が3ヶ月以内で33％、12ヶ月以上においても88％程度（非特許文献１参照）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体IgM抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（特許文献１参照）。
【０００４】
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【０００５】
特許文献２では、本願発明者らが、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、関節リウマチの疾患遺伝子が位置する3カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第1染色体の、マイクロサテライトマーカーD1S214および／またはDlS253がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第8染色体の、マイクロサテライトマーカーD8S556がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトX染色体の、マイクロサテライトマーカーDXSl001、DXS1047、DXS1205、DXS1227および／またはDXS1232がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００６】
また、非特許文献２には、本願発明者らが、前記先願発明の各疾患関与遺伝子にうち、前記（１）の疾患関与遺伝子に関係するマーカーD1S214およびD1S253の疾患関与遺伝子として、デスレセプター３（death receptor 3：「ＤＲ３」または「ＤＲ３遺伝子」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患関与遺伝子である可能性を示唆している。
【０００７】
さらに、特許文献３では、本願発明者らが、ＤＲ３遺伝子のゲノム変異と関節リウマチ（慢性関節リウマチ）発症との関係について開示している。
【特許文献１】特開平１０−５１３２５７号（公開日：平成１０年１２月１５日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ９８／５１７９１号（国際公開日：１９９８年１１月１９日）
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／３４９１２（国際公開日：２００２年５月２日）
【非特許文献１】治療、第73巻、第３号、第23〜27頁、1991年
【非特許文献２】リウマチ、第39号、第2号、第444頁および第445頁（１９９９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高等真核生物において、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ（以下、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧ配列」とする）部分では、当該グアノシン（Ｇ）の５’側に位置するシトシン（Ｃ）がメチル化される現象が知られている。このＣｐＧのメチル化修飾は、遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられており、特にＣｐＧに富む領域が遺伝子のプロモーター領域内に存在する場合には、遺伝子発現に対して重要な影響を及ぼすと考えられている。
【０００９】
通常、染色体における多くの遺伝子は上述したメチル化から保護されているが、何らかの原因により、遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧに富む領域がメチル化された場合、遺伝子の転写が抑制されることになる。このため、ＣｐＧのメチル化の有無が、遺伝子発現に影響を及ぼし、これによって、当該遺伝子の機能を十分に発揮することができなくなり、疾患を発生させるという可能性が考えられる。
【００１０】
しかし、ＲＡの疾患関与遺伝子と考えられている上述のＤＲ３に関して、このＣｐＧのメチル化状態については十分に解明されていないのが現状である。
【００１１】
そこで、本発明では、上記ＤＲ３のプロモーター領域について、そのＣｐＧ配列のメチル化状態について解明し、ヒト関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有用なポリヌクレオチドを提供するとともに、ヒト関節リウマチの発症または発症可能性を高精度に判定することのできる判定キットおよび判定方法を提供することを目的としている。さらに本発明は、ＤＲ３遺伝子に異常を有するＲＡ患者に対する有効な治療薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、上記の目的を達成するために、ヒトゲノムにおいて、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３の翻訳開始点より上流の領域（プロモーター領域を含む）のＤＮＡメチル化解析を行った。その結果、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点（ＡＴＧ）の上流約−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列にアレル特異的なメチル化が存在すること、そして、それより下流のＣｐＧ配列については、健常者及びＲＡ患者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の場合には全て非メチル化状態であり、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子および滑膜浸潤リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の場合には非メチル化とメチル化とが混在した状態であることを見出した。
【００１３】
さらに、この翻訳開始点より上流の領域のシークエンス結果によって、−３８０ｂｐ付近にＴＣＣＴＣＣモチーフの存在を確認し、ＣｐＧ配列のアレル特異的メチル化領域はこのＴＣＣＴＣＣモチーフの付近から始まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなり、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドであって、その第１７０番目から第１７５番目の塩基配列が、転写活性に関わるＴＣＣＴＣＣモチーフを構成し、当該ＴＣＣＴＣＣモチーフ以降のＣｐＧ配列の一部は、アレル特異的にメチル化されていることを特徴とするものである。
【００１５】
ここで、「アレル特異的にメチル化されている」とは、２つの対立遺伝子のうち、片方の対立遺伝子のＣｐＧ配列に特異的にメチル化されているということを意味している。
【００１６】
上記のポリヌクレオチドは、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−１８０ｂｐよりも下流に位置する（すなわち、配列番号１に示す塩基配列の第３７４番目の塩基以降に存在する）ＣｐＧ配列は、メチル化された状態あるいは非メチル化された状態の何れかの状態である。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が挙げられる。
【００１７】
また、上記のポリヌクレオチドは、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在する（すなわち、配列番号１に示す塩基配列の第１７４番目から第３７３番目までの間に位置する）ＣｐＧ配列は、アレル特異的にメチル化されており、−１８０ｂｐよりも下流の（すなわち、配列番号１に示す塩基配列の第３７４番目の塩基以降に存在する）ＣｐＧ配列はメチル化された状態あるいは非メチル化された状態である。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域、あるいは、ＲＡ患者の末梢血リンパ球由来および滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が挙げられる。
【００１８】
本発明にかかる判定キットは、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較することによって関節リウマチの発症、または、その発症可能性を判定するために利用される判定キットであって、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を構成する少なくとも一部のポリヌクレオチド中に含まれるメチル化シトシンの有無を判定するためのメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを含むことを特徴とするものである。
【００１９】
ここで、関節リウマチの「発症可能性」とは、関節リウマチ（ＲＡ）が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけＲＡになりやすく、逆に発症可能性が低ければＲＡになり難いということを示すものである。
【００２０】
上記の判定キットにおいて、上記メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーは、上記配列番号１に示す塩基配列における第３７４番目から第５６４番目までの塩基配列を少なくとも増幅させることができるように設定されていることが好ましい。なお、配列番号１に示す塩基配列における第３３６番目から第５６４番目の塩基配列は、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域であり、配列番号１に示す塩基配列における第３７４番目から第５９２番目の塩基配列は、後述するＣ領域である。
【００２１】
また、上記の判定キットを用いれば、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合、または、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認した場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。
【００２２】
また、上記の判定キットにおいて、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子を比較対照（コントロール）とすれば、被験者から採取した滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、上記末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態よりも高メチル化状態である場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。
【００２３】
本発明の関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定方法は、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較すること、または、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認することによって、関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定を行うことを特徴とするものである。
【００２４】
そして、上記の判定方法は、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球および末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子の各プロモーター領域を重亜硫酸塩含有試薬でそれぞれ処理し、当該プロモーター領域に含まれるＣｐＧ配列中の非メチル化シトシンをウラシルへと変換するＤＮＡ変換工程と、上記ＤＮＡ変換工程による処理後のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を、メチル化特異的プライマーあるいは非メチル特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させるＤＮＡ増幅工程と、上記ＤＮＡ増幅工程において、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、メチル化特異的プライマーあるいは非メチル特異的プライマーの何れを用いたポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたかを検出することで、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態を検出するメチル化状態検出工程と、上記メチル化状態検出工程によって検出された、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較する比較工程、または、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認する確認工程とを含むものであってもよい。
【００２５】
なお、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域の一例としては、配列番号１に示す塩基配列における第３３６番目から第５６４番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
さらに、上記の判定方法では、滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。
【００２７】
また、本発明では、上記の判定方法において、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子を比較対照（コントロール）とし、被験者から採取した滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、上記末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態よりも高メチル化状態である場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することもできる。この方法によって、ヒト関節リウマチの発症または発症可能性を高精度に判定することができる。
【００２８】
本発明にかかる関節リウマチの治療薬剤は、本発明のポリヌクレオチドのうち、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列は、メチル化された状態あるいは非メチル化された状態の何れかの状態であり、−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列は非メチル化状態であるようなポリヌクレオチドの一部をプロモーター領域として有するＤＲ３遺伝子を含んでなることを特徴とするものである。
【００２９】
また、上記の治療薬剤は、上記関節リウマチ患者の滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球へ投与されることが好ましい。
【００３０】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。
【発明の効果】
【００３１】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ヒト関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有効に利用することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、関節リウマチの診断、発症可能性の判定、関節リウマチの治療薬剤として利用することができる。
【００３２】
また、本発明にかかる関節リウマチの判定キットおよび判定方法によれば、関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定を、高精度かつ簡便に行うことができる。それゆえ、関節リウマチの予防および治療に役立てることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３４】
〔１〕本発明のポリヌクレオチドについて
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなり、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドであって、その第１７０番目から第１７５番目の塩基配列が、転写活性に関わるＴＣＣＴＣＣモチーフを構成し、当該ＴＣＣＴＣＣの領域以降のＣｐＧ配列の一部は、アレル特異的にメチル化されていることを特徴とするものである。
【００３５】
上記配列番号１に示す塩基配列は、非特許文献２に記載のヒトゲノム由来の関節リウマチの疾患関与遺伝子のうち、ＤＲ３の翻訳開始点より上流の領域（翻訳開始点（ＡＴＧ）のアデニンを＋１ｂｐとした場合、−５５３ｂｐから−１ｂｐまでの領域：以下、「ＤＲ３の上流領域」とも呼ぶ）および、翻訳開始点から＋３９ｂｐまでの領域である。そして、本願発明者らの研究によって、このＤＲ３の上流領域の−３７９ｂｐから−３８４ｂｐまでの部位（配列番号１における第１７０番目から第１７５番目までの領域）である「ＴＣＣＴＣＣ」が、ＤＲ３遺伝子の転写活性に関わるＴＣＣＴＣＣモチーフを構成していることが明らかとなった。さらに、当該ＴＣＣＴＣＣモチーフ以降のＣｐＧ配列の一部はアレル特異的にメチル化されていることも明らかとなった。
【００３６】
ここで、「ＴＣＣＴＣＣモチーフ以降」とは、本発明にかかるポリヌクレオチドにおいてＴＣＣＴＣＣモチーフが存在する部位よりも下流（すなわち、３’方向）の領域のことを意味する。
【００３７】
また、図１には、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列を示す。図１に示す塩基配列には、ＤＲ３遺伝子のエクソン１（ｅｘｏｎ１）を構成しているＤＲ３遺伝子の翻訳開始点以降の塩基配列の一部も含まれている。また、図１では、塩基配列中のＣｐＧ配列、ＴＣＣＴＣＣモチーフ（図中では、転写因子Ｓｐ１結合因子と記す）、翻訳開始点、プロモーター領域、エクソン１を、それぞれ図示している。
【００３８】
図１に示すように、本発明にかかるポリヌクレオチドは、その配列中の多数のＣｐＧ配列を有している。そして、このＣｐＧ配列のうちのいくつかはメチル化されている。ここで、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列において、第１番目から第１７３番目までの領域をＡ領域、第１７４番目から第３７３番目までの領域をＢ領域、第３７４番目から第５９２番目までの領域をＣ領域とする。なお、図１に示す塩基配列において、実線で囲んだ領域（配列番号１に示す塩基配列においては、第３３６番目から第５６４番目までに相当）は、プロモーターインスペクター（Promoter  Inspector）によってプロモーターと解析された領域であるが、このプロモーター領域は、上記Ｃ領域と一部一致している。また、図１において、破線で囲んだ領域は、エクソン１である。
【００３９】
図２は、図１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの構造、つまり、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点よりも上流の領域の構造を模式的に示したものである。図２では、上記ポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧ配列、ＴＣＣＴＣＣモチーフ、エクソン１（ｅｘｏｎ１）、翻訳開始点（ＡＴＧ）、および、Ａ・Ｂ・Ｃの各領域を示している。また、図２に示すように、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域は、上述のＣ領域とほぼ一致している。
【００４０】
そして、図１および図２に示すポリヌクレオチド、すなわち、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、その配列中の第２，３番目、第５，６番目、第３４，３５番目、第６５，６６番目、第８８，８９番目、第９２，９３番目、第１３７，１３８番目、第１５１，１５２番目、第１８７，１８８番目、第１８９，１９０番目、第１９６，１９７番目、第２５１，２５２番目、第２５８，２５９番目、第２７０，２７１番目、第３００，３０１番目、第３１７，３１８番目、第３２２，３２３番目、第３２４，３２５番目、第３４４，３４５番目、第３５０，３５１番目、第３７４，３７５番目、第３９５，３９６番目、第４０１，４０２番目、第４１１，４１２番目、第４１５，４１６番目、第４２１，４２２番目、第４３１，４３２番目、第４３５，４３６番目、第４４２，４４３番目、第４５３，４５４番目、第４５６，４５７番目、第４５９，４６０番目、第４６１，４６２番目、第４６６，４６７番目、第４７５，４７６番目、第４７９，４８０番目、第４８１，４８２番目、第４９３，４９４番目、第５０１，５０２番目、第５０４，５０５番目、第５１７，５１８番目、第５２３，５２４番目、第５３８，５３９番目、第５４２，５４３番目、第５４５，５４６番目、第５６３，５６４番目、第５６７，５６８番目、第５６９，５７０番目、第５７７，５７８番目、第５７９，５８０番目、第５８２，５８３番目、第５８８，５８９番目、第５９１，５９２番目に、それぞれＣｐＧ配列を有している。
【００４１】
本願発明者らは、健常者および関節リウマチ患者から採取された末梢血リンパ球および滑膜細胞から抽出されたＤＮＡから、上記ＤＲ３遺伝子の上流領域の配列を取得し、上記Ａ領域・Ｂ領域・Ｃ領域のＣｐＧ配列のメチル化状態についての解析を行った。
【００４２】
その結果、Ａ領域については、健常者・ＲＡ患者ともに、そのＣｐＧ配列が全てメチル化状態であることが確認された。また、Ｂ領域については、健常者・ＲＡ患者ともに、そのＣｐＧ配列について、メチル化されたものと非メチル化されたものとが混在した状態であることが確認された。
【００４３】
また、Ｃ領域については、健常者の末梢血リンパ球から採取されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列、および、ＲＡ患者の末梢血リンパ球から採取されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列については、全て非メチル化状態であった。これに対して、ＲＡ患者の滑膜細胞から抽出されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列、および、ＲＡ患者の滑膜浸潤リンパ球から抽出されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列については、上述のＢ領域のようにメチル化されたものと、非メチル化されたものが混在した状態であることが確認された。
【００４４】
なお、本実施の形態における説明では、滑膜細胞および滑膜浸潤リンパ球をまとめて滑膜組織と称する。
【００４５】
以上のような結果から、本発明にかかるポリヌクレオチドのより具体的な一例として、ＲＡ患者の滑膜組織から採取されたＤＲ３遺伝子の上流領域の塩基配列からなるものを挙げることができる。このポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなるものであって、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列（すなわち、Ｂ領域のＣｐＧ配列）にアレル特異的なメチル化が存在し、−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列（すなわち、Ｃ領域のＣｐＧ配列）についてもメチル化状態のものと非メチル化状態のものとが混在しているというものである。
【００４６】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドの具体的な他の例として、健常者の末梢血リンパ球、あるいは、ＲＡ患者の末梢血リンパ球から採取されたＤＲ３遺伝子の上流領域の塩基配列からなるものを挙げることができる。そして、健常者及びＲＡ患者の末梢血リンパ球由来のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなるものであって、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列（すなわち、Ｂ領域のＣｐＧ配列）にアレル特異的なメチル化が存在し、−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列（すなわち、Ｃ領域のＣｐＧ配列）は全て非メチル化状態になっているというものである。また、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなるものであって、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列（すなわち、Ｂ領域のＣｐＧ配列）にアレル特異的なメチル化が存在し、−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列（すなわち、Ｃ領域のＣｐＧ配列）は、メチル化と非メチル化とが混在した状態になっているというものである。
【００４７】
上述の本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＤＲ３遺伝子の発現に重要な役割を果たしていることが示唆されることから、未だ解明されていない部分の多いＲＡの発症のメカニズムの解明に有効に利用することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＡの診断、発症可能性の判定、および、ＲＡの治療に利用できる可能性を有している。
【００４８】
〔２〕本発明のＲＡの発症、または、その発症可能性の判定方法について
本発明にかかるＲＡの発症、または、その発症可能性の判定方法は、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較することを特徴とするものである。
【００４９】
ここで、上記ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域としては、この遺伝子のプロモーター領域として従来から知られたものを採用することができるが、その一例として、配列番号１に示す塩基配列における第３３６番目から第５６４番目までの塩基配列からなるものを挙げることができる。
【００５０】
ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態については、上述のように、健常者の末梢血リンパ球から採取したものの場合は全てのＣｐＧ配列が非メチル化状態であった。一方、ＲＡ患者の場合は、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高いことが確認された。
【００５１】
本発明にかかるＲＡの発症、または、発症可能性の判定方法は、上記の結果に基づいてなされたものである。それゆえ、上記の判定方法においては、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。
【００５２】
本発明にかかる判定方法において、被験者の滑膜組織からＤＮＡを抽出し、さらに、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を取得する方法については、従来公知の目的遺伝子の精製方法を採用すればよい。
【００５３】
また、本願発明者らの研究によって、滑膜組織から取得したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域に関して、ＲＡ患者と健常者との間でそのメチル化状態に違いが確認された。そこで、ＲＡの発症、または、発症可能性の他の判定方法として、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態を検出して、全て非メチル化状態であれば、ＲＡを発症していない、または、ＲＡの発症可能性は低いと判定し、非メチル化したものとメチル化したものとが混在した状態であれば、ＲＡを発症している、または、ＲＡの発症可能性が高いと判定する、という方法も実施可能である。
【００５４】
この方法であれば、上述の末梢血リンパ球と滑膜組織の両方からＤＲ３遺伝子のプロモーターを採取し、そのメチル化状態を比較する方法より精度はやや劣るものの、末梢血リンパ球からＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を取得する必要がなくなるため、サンプルの採取に要する手間を省き、より簡便にＲＡの発症または発症可能性を判定を行うことができる。
【００５５】
なお、ポリヌクレオチドに存在するＣｐＧ配列のメチル化状態を検出する方法については、従来公知の方法を用いることができる。その一例として、重亜硫酸塩ゲノムシークエンス法（bisulfite  genomic  sequencing法）（Clark SJ, Harrison J, Paul CL, and Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res 22, 2990-2997 (1994) 参照）、ＭＳＰ法（methylation  specific  ＰＣＲ法）（Harman JG, Graff JR, Myohanen S et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci 93, 9821-9826 (1996) 参照）などが挙げられる。
【００５６】
このＣｐＧ配列のメチル化状態を検出する方法を利用した本発明の判定方法の具体例については、以下（３）の項において説明する。なお、この方法は、上述のＭＳＰ法を利用したものである。
【００５７】
〔３〕本発明のＲＡの発症、または、その発症可能性を判定する判定キットについて
本発明にかかる判定キットは、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較することによって関節リウマチの発症、または、その発症可能性を判定するために利用される判定キットであって、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を構成する少なくとも一部のポリヌクレオチド中に含まれるメチル化シトシンの有無を判定するためのメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを含むことを特徴とするものである。
【００５８】
ここで、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を構成する少なくとも一部のポリヌクレオチドとは、ヒトＲＡ疾患関与遺伝子ＤＲ３の上流領域の少なくとも一部のことを意味する。上記ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの一部であって、上述のプロモーター領域（配列番号１の第３３６番目から第５５３までの領域）を含むものが挙げられる。
【００５９】
ＤＲ３の上流領域は、上述のように、Ａ領域・Ｂ領域・Ｃ領域に分けられているが、そのうちＣ領域については、健常者とＲＡ患者とでメチル化状態に違いがあることが確認された。つまり、末梢血リンパ球および滑膜組織から採取したＤＲ３の上流領域のうちのＣ領域に関して、健常者の場合は、末梢血リンパ球において、そのＣｐＣ配列が非メチル化状態であることが確認された。これに対して、ＲＡ患者の場合は、末梢血リンパ球由来のものは、そのＣｐＣ配列が非メチル化状態であったにもかかわらず、滑膜組織由来のものは、メチル化されたものと非メチル化されたものとが混在した状態である、すなわち、滑膜組織由来のものの方が末梢血リンパ球由来のものに比べて高メチル化状態であることが確認された。
【００６０】
そこで、本発明の判定キットは、被験者の滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のＣ領域（あるいは、プロモーター領域を含む領域）のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態とを比較することによって、ＲＡの発症、または、その発症可能性を判定するというものである。
【００６１】
この判定キットに含まれる、メチル化シトシンの有無を判定するためのメチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーは、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を構成する少なくとも一部のポリヌクレオチド中に含まれるメチル化シトシンの有無を判定するために、当該プロモーター領域の少なくとも一部を増幅させることができるものであれば、特に限定されることはない。
【００６２】
ここで、「非メチル化特異的プライマー」とは、ＣｐＧ配列を含有するＤＲ３のプロモーター領域に対して特異的にアニーリングするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマーであって、特に、当該プロモーター領域中のすべてのＣ（シトシン）がＴ（チミン）に変換された配列を有するプライマーである。
【００６３】
またここで、「メチル化特異的プライマー」とは、ＣｐＧ配列を含有するＤＲ３のプロモーター領域に対して特異的にアニーリングするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマーであって、特に、当該領域中のＣｐＧ配列は保存されたまま、かつＣｐＧ配列以外のＣ（シトシン）はＴ（チミン）に変換された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００６４】
このように設計することにより、当該メチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、上記メチル化ＣｐＧ含有プロモーター領域と特異的にアニーリング（相補）することができる。なお、フォワードプライマー（Forward Primer）およびリバースプライマー（Reverse Primer）のいずれも、上記メチル化ＣｐＧ含有プロモーター領域と特異的にアニーリングするものであることが好ましい。
【００６５】
上記非メチル化特異的プライマーの具体的な例としては、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ配列を含む領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーであって、当該プロモーター領域中のすべてのＣ（シトシン）がＴ（チミン）に変換された塩基配列を有するプライマーを挙げることができる。
【００６６】
上記メチル化特異的プライマーの具体的な例としては、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ配列を含む領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーであって、当該領域中のＣｐＧ配列は保存されたまま、かつＣｐＧ配列以外のＣ（シトシン）はＴ（チミン）に変換された塩基配列を有するプライマーを挙げることができる。
【００６７】
つまり、上記メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列における第３７４番目から第５６４番目までの塩基配列のうち、ＣｐＧ配列がメチル化されたものあるいはＣｐＧ配列がメチル化されていないものを増幅させることができるように、それぞれ設定されているものを挙げることができる。このようなメチル化特異的プライマーの具体例としては、
フォワードプライマー（ＭＦ３）：GTTTTATTTG GTTTGTTCGT TGTC（配列番号２）
リバースプライマー（ＭＲ３）：CGTACTCTCT ACCCGTCGTA A（配列番号３）
を挙げることができる。
【００６８】
また、非メチル化特異的プライマーの具体例としては、
フォワードプライマー（ＵＦ３）：TTTATTTGGT TTGTTTGTTG TTGTT（配列番号４）
リバースプライマー（ＵＲ３）：ACTCCATACT CTCTACCCAT CATAA（配列番号５）
を挙げることができる。
【００６９】
次に、本発明の判定キットを用いて、上述の本発明にかかるＲＡの発症または発症可能性の判定方法を実施する手順について説明する。
【００７０】
（１）ＤＮＡ変換工程
被験者より従来公知の方法によって採取されたＤＲ３遺伝子のプロモーター領域は、先ず、ＤＮＡ変換工程によって、当該プロモーター領域に含まれるＣｐＧ配列のうち、メチル化されていないシトシンのみがウラシルへと変換される。
【００７１】
このＤＮＡ変換工程は、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域を重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩）含有試薬で処理し、当該プロモーター領域に含まれるＣｐＧ配列のうちの非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程であればよく、その他の具体的な方法、条件等は特に限定されるものではない。
【００７２】
上記ＤＮＡ変換工程では、重亜硫酸塩処理により、ＣｐＧ配列中のメチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理を行っても、シトシンのままである。したがって、ＣｐＧ配列中のシトシンがメチル化されているか否かは、重亜硫酸塩処理により、ウラシルに変換されているかどうかで区別することができる。つまり、同一の塩基配列を有するＤＮＡであっても、メチル化されているか否かで重亜硫酸塩処理後の塩基配列に違いがみられる。
【００７３】
この重亜硫酸塩処理後の塩基配列をシークエンシングすることによって配列決定し、塩基配列の違いによって、ＣｐＧ配列中のメチル化の有無を検出することもできる。この方法が、上述の重亜硫酸塩ゲノムシークエンス法である。
【００７４】
上記「重亜硫酸塩含有試薬」としては、従来公知の重亜硫酸塩を含有する試薬であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、重亜硫酸ナトリウム（亜硫酸水素ナトリウム、ＮａＨＳＯ3ともいう）を好適に用いることができる。さらに、重亜硫酸化合物と尿素とを併用してもよい。
【００７５】
ここで、メチル化の検出に用いられるＤＲ３遺伝子のプロモーター領域は、ヒトの滑膜組織あるいは末梢血リンパ球から抽出されたゲノムＤＮＡから取得されたものである。
【００７６】
（２）ＤＮＡ増幅工程
続いて、上記のＤＮＡ変換工程によって重亜硫酸塩処理されたプロモーター領域からなるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ増幅工程によって増幅される。
【００７７】
このＤＮＡ増幅工程は、上記ＤＮＡ変換工程により得られる、非メチル化シトシンがウラシルへと変換されたＤＮＡ断片をメチル化特異的プライマーを用いて、また、シトシンのままであるメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片を非メチル化特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる工程であればよく、その他の具体的な方法、条件等は特に限定されない。
【００７８】
先ず、上記ＤＮＡ増幅工程では、ＣｐＧ配列中のシトシンがウラシルへと変換したか否かを、判定キットに含まれるメチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、それぞれ調べている。すなわち、このメチル化特異的プライマーは、重亜硫酸塩処理によりＣｐＧ配列中のシトシンがウラシルに変換されていないＣｐＧ含有ＤＮＡ断片（以下、メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡとする）と特異的にアニーリング（相補）する。したがって、上記メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、メチル化されたＣｐＧ配列を有するＤＮＡ断片は特異的に増幅されることになる。このメチル化特異的プライマーとしては、上述のＭＦ３およびＭＲ３などが用いられる。
【００７９】
一方、重亜硫酸塩処理により、ＣｐＧ配列中のシトシンがウラシルに変換されたＣｐＧ含有ＤＮＡ断片（以下、非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡとする）は、上記メチル化特異的プライマーとアニーリングしないため、当該メチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲでは増幅されない。
【００８０】
そこで、上記ＤＮＡ増幅工程では続いて、上記ＤＮＡ変換工程により得られる、非メチル化シトシンがウラシルへと変換されたＣｐＧ含有ＤＮＡを、さらに、非メチル化特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる工程を含んでいる。
【００８１】
これにより、非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲでは、非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡは増幅される。一方、メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡは増幅されない。この非メチル化特異的プライマーとしては、上述のＵＦ３およびＵＲ３などが用いられる。
【００８２】
このように、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果、ＤＮＡ検体が増幅されるか否かにより、ＣｐＧ含有ＤＮＡの塩基配列中のシトシンがメチル化されているか否かを検出することができる。
【００８３】
なお、一つのＤＮＡ断片中にメチル化シトシンと非メチル化シトシンとが混在する場合には、メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲおよび非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲの両方でＤＮＡ断片が増幅される。
【００８４】
またここで、「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）であればよく、その具体的な方法、条件等は特に限定されない。
【００８５】
（３）メチル化状態検出工程
続いて、本発明のＲＡの発症または発症可能性の判定においては、メチル化状態検出工程が実施される。このメチル化状態検出工程は、上記ＤＮＡ増幅工程によって、上記ＣｐＧ含有ＤＮＡ断片（すなわち、ＤＲ３プロモーター領域）が増幅されたか否かを検出する工程であればよく、その具体的な方法、条件等は、特に限定されるものではない。
【００８６】
上記メチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、ＣｐＧ含有ＤＮＡ断片が増幅されるか否かを検出する。これにより、上記ＣｐＧ含有ＤＮＡの塩基配列中にメチル化シトシンが存在するか否かを簡便かつ迅速に、そして高感度で検出することができる。
【００８７】
具体的な検出方法としては、例えば、プライマーを蛍光ラベル、ビオチンラベル、ＤＩＧラベルや放射性同位元素ラベルで標識してもよく、ゲル電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法、キャピラリー電気泳動法、フラグメント解析、免疫染色等、どのような機器、方法を用いてもよい。
【００８８】
（４）比較工程
続いて、本発明のＲＡの発症または発症可能性の判定においては、比較工程が実施される。この比較工程では、上記メチル化状態検出工程によって検出された、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態と、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態との比較が行われる。そして、この比較結果に基づいて、ＲＡの発症または発症可能性についての判定が行われる。
【００８９】
なお、上記比較工程における判定の方法として、例えば、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が、末梢血リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に比べて高い場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。
【００９０】
また、本発明の判定方法には、上記比較工程の代わりに、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であることを確認する確認工程が含まれていてもよい。この確認工程において、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態の検出は、上述の比較工程におけるメチル化状態の検出と同様の方法を用いることができる。そして、このメチル化状態の検出において、滑膜組織から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態であると確認された場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができる。なお、ここで「高メチル化状態」とは、該当するポリヌクレオチド中のＣｐＧ配列のうち、７０％以上のＣｐＧ配列がメチル化された状態のことを言う。
【００９１】
以上のような手順で、被験者から得られたＤＲ３遺伝子プロモーター領域を用いて、ＲＡの発症、または、発症可能性の有無を判定することができる。
【００９２】
このように、本発明にかかる判定キットには、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーが少なくとも含まれていればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。しかし、この判定キットをより利便性の高いものとするために、被検体であるプロモーター領域に含まれるＣｐＧ配列中の非メチル化シトシンをウラシルへと変換するための重亜硫酸塩含有試薬がさらに含まれていることが好ましい。
【００９３】
また、上記キットには、さらに、ＰＣＲ用試薬が含まれることが好ましい。ＰＣＲ用試薬は、従来公知のものを利用可能である。
【００９４】
上述のように、本発明にかかる判定キットを使用することによって、簡便かつ容易に本発明にかかるＲＡの発症、または、発症可能性の判定方法を実施することができる。
【００９５】
なお、後述の実施例にも示されるように、ＤＲ３遺伝子は、ＲＡ患者の滑膜組織（つまり、滑膜細胞および滑膜浸潤リンパ球）において特異的に発現することが確認された。このことから、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態の違いが、ＤＲ３遺伝子の滑膜組織における発現に関与していると考えられ、ひいては、関節リウマチの発症と深く関連している可能性が考えられる。つまり、この結果から、本発明の判定キットや判定方法が、関節リウマチの発症、または、発症可能性の有無の判定に有効であることが裏付けられる。
【００９６】
〔４〕本発明にかかるＲＡの治療薬剤について
本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、本発明にかかるポリヌクレオチドのうち、特にＣｐＧ配列が非メチル化状態のプロモーター領域を有するＤＲ３遺伝子を含んでいることを特徴とするものである。つまり、本発明にかかる治療薬剤は、配列番号１に示す塩基配列のうちの一部をプロモーター領域として有するＤＲ３遺伝子を含むものであって、上記プロモーター領域において、当該ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点から数えて−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列にアレル特異的なメチル化が存在し、−１８０ｂｐよりも下流のＣｐＧ配列は全て非メチル化状態であるというものである。
【００９７】
この治療薬剤は、特に、プロモーター領域が高メチル化状態であるＤＲ３遺伝子を有するＲＡ患者に対して好適に用いることができる。
【００９８】
また、後述の実施例にも示すように、ＲＡ患者から採取されたＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のうち、末梢血リンパ球に由来するものは健常者と同じメチル化状態であり、滑膜組織に由来するもののメチル化状態が異なっている。このことから、ＤＲ３遺伝子が正常に機能するためには、滑膜組織におけるＤＲ３遺伝子のプロモーター領域がメチル化状態であることが必要とされると考えられる。それゆえ、本発明の治療薬剤は、ＲＡ患者の滑膜組織に投与されることが好ましい。
【００９９】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１００】
本実施例では、上述のＭＳＰ法を用いて、ヒト末梢血リンパ球、滑膜細胞、滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＮＡに含まれるＤＲ３遺伝子の翻訳開始点より上流の領域のメチル化の検出を行った。その方法および結果について、以下に説明する。
【０１０１】
（１）ＭＳＰ法によるメチル化状態の検出
まず、従来公知の方法に基づいて、健常者およびＲＡ患者の末梢血リンパ球および滑膜細胞を採取し、bisulfite処理後、各サンプルから取得したＤＲ遺伝子の上流領域について、実施形態において説明したＭＳＰ法によって、その塩基配列中に含まれるＣｐＧ配列のメチル化状態の検出を行った。
【０１０２】
以下に、bisulfite処理の具体的な手順および試薬を示す。
（１）ＮａＯＨを加える。（ＤＮＡを一本鎖に変性させる。）
（２）３７℃で３０分放置する。
（３）Sodium bisulfite（ＮａＨＳＯ３：亜硫酸水素ナトリウム）／hydroquinone（Ｃ６Ｈ６Ｏ２）（ｐＨ５．０）を加え、スルホン化および脱アミノ化する。
（４）５５℃の暗所に２０時間置く。
（５）Wizard DNA Clean-up Systemによる脱塩処理を行う。（脱スルホン化）
（６）ＮａＯＨを加える。（アルカリ処理）
（７）３７℃で１０分放置する。
（８）酢酸アンモニウム／EtOHを加えて転倒混和し、エタノール沈降させる。
（９）蒸留水に溶解する。（bisulfite  ＤＮＡの完成）
また、ここでＡ，Ｂ，Ｃの各領域を増幅させるために用いたメチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーは、以下の通りである。
Ａ領域のメチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＭＦ１）：TTGATTTTAA GTGTTTCGTT CGTT（配列番号６）
リバースプライマー（ＭＲ１）：AAACGCTAAA CTACCTACTA CGACC（配列番号７）
Ａ領域の非メチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＵＦ１）：GATTTTAAGT GTTTTGTTTG TT（配列番号８）
リバースプライマー（ＵＲ１）：AACACTAAAC TACCTACTAC AACC（配列番号９）
Ｂ領域のメチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＭＦ２）：GTAGTAGGTA GTTTAGCGTT TCGC（配列番号１０）
リバースプライマー（ＭＲ２）：CAAATACCCC CTCTACTCGA C（配列番号１１）
Ｂ領域の非メチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＵＦ２）：TAGTAGGTAG TTTAGTGTTT TGTGT（配列番号１２）
リバースプライマー（ＵＲ２）：ACCAAATACC CCCTCTACTC AAC（配列番号１３）
Ｃ領域のメチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＭＦ３）：GTTTTATTTG GTTTGTTCGT TGTC（配列番号２）
リバースプライマー（ＭＲ３）：CGTACTCTCT ACCCGTCGTA A（配列番号３）
Ｃ領域の非メチル化特異的プライマー：
フォワードプライマー（ＵＦ３）：TTTATTTGGT TTGTTTGTTG TTGTT（配列番号４）
リバースプライマー（ＵＲ３）：ACTCCATACT CTCTACCCAT CATAA（配列番号５）
また、ＰＣＲについては、９５℃・１０分の処理を行った後、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル繰り返し、その後、７２℃・５分の処理を行った。
【０１０３】
また、本実施例のメチル化検出においては、ＤＮＡ増幅工程によって増幅された各ＤＮＡ断片についてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、ＣｐＧ配列のメチル化状態が確認された。
【０１０４】
その結果を図３（ａ）、（ｂ）、および、図４に示す。図３（ａ）は、ＲＡ患者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域について、図３（ｂ）は、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域について、そのＡ・Ｂ・Ｃ各領域のメチル化状態を確認した結果を示す図である。図４は、健常者（図では健常人と記す）の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域について、そのＡ・Ｂ・Ｃ各領域のメチル化状態を確認した結果を示す図である。各図に示すゲル電気泳動の結果において、Ｕで示すレーンは、非メチル化特異的プライマーを用いてＤＮＡ増幅を行った場合の増幅断片であり、Ｍで示すレーンは、メチル化特異的プライマーを用いてＤＮＡ増幅を行った場合の増幅断片である。
【０１０５】
これらの図に示すように、Ａ領域に関しては、全てのサンプルについて、そのＣｐＧ配列がメチル化状態であった。また、Ｂ領域に関しては、全てのサンプルについて、そのＣｐＧ配列が非メチル化とメチル化との混在状態であった。一方、Ｃ領域（すなわち、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域）に関しては、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のサンプルのみが非メチル化とメチル化との混在状態であり、それ以外のサンプルについては全てのＣｐＧ配列が非メチル化状態であることが確認された。
【０１０６】
この結果から、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域に、アレル特異的なメチル化が存在すると考えられる。また、ＲＡ患者に関して、滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域は、末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域に比べて高メチル化状態であることが明らかとなった。
【０１０７】
そして、ＤＲ３遺伝子は、片方の対立遺伝子が発現していないインプリント遺伝子である可能性が示されるとともに、ＲＡの発症のメカニズムにＤＲ３遺伝子のインプリンティングが関与していることが示唆された。
【０１０８】
また、図５には、上記と同様の方法で、ＲＡ患者由来の滑膜細胞、滑膜細胞浸潤リンパ球、および、関節液のリンパ球からそれぞれ採取したＤＲ３遺伝子の上流領域について、メチル化状態を検出した結果を示す。なお、図５では、（ａ）がＤＲ３遺伝子の上流領域中のＡ領域の結果を示すものであり、（ｂ）がＤＲ３遺伝子の上流領域中のＢ領域の結果を示すものであり、（ｃ）がＤＲ３遺伝子の上流領域中のＣ領域の結果を示すものである。また、（ａ）〜（ｃ）において、丸付きで示す数字１〜３はそれぞれ、滑膜細胞由来の遺伝子、滑膜細胞浸潤リンパ球由来の遺伝子、関節液中のリンパ球由来の遺伝子を順に示している。
【０１０９】
図５（ａ）および（ｂ）に示すように、Ａ領域およびＢ領域では、滑膜細胞由来のもの、滑膜浸潤リンパ球由来のもの、関節液中のリンパ球由来のものに差は見られなかった。一方、図５（ｃ）に示すＣ領域では、滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子および滑膜浸潤リンパ球由来のＤＲ３遺伝子では、メチル化と非メチル化の混在状態であったが、関節液中のリンパ球由来のＤＲ３遺伝子では、全て非メチル化状態であることが確認された。
【０１１０】
この結果から、Ｃ領域のメチル化状態は関節リウマチによる炎症部位に特異的である可能性が示唆される。
【０１１１】
さらに、検体数を増やして上記のＭＳＰ法によって、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子およびＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を調査した。その結果をまとめたものを図６に示す。これにより、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子とＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子とでは、Ｃ領域におけるメチル化状態が大きく異なることが確認された。また、比較対照として採取した変形性関節症（ＯＡ）患者の滑膜細胞では、ＲＡ患者の滑膜細胞と比較するとメチル化が低いという結果が得られた。なお、健常者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子については、採取が困難であるため結果は得られていないが、ＯＡ患者と同様の結果が得られると考えられる。
【０１１２】
（２）bisulfite  genomic  sequencing法によるメチル化状態の検出
続いて、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子およびＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を、bisulfite  genomic  sequencing法によって解析した。なお、bisulfite  genomic  sequencing法は、上記の参考文献に記載の方法に従って行った。
【０１１３】
その結果を図７に示す。図７において、（ａ）は、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を検出した結果を示す図であり、（ｂ）は、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を検出した結果を示す図である。
【０１１４】
その結果、図７（ａ）に示すように、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子では、Ａ領域はメチル化状態であり、Ｂ領域は非メチル化とメチル化が混在した状態であり、Ｃ領域は非メチル化状態であることが確認された。また、図７（ｂ）に示すように、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子では、Ａ領域はメチル化状態であり、Ｂ領域は非メチル化とメチル化が混在した状態であり、Ｃ領域も非メチル化とメチル化が混在した状態であることが確認された。これは、上述の（１）に示すＭＳＰ法の結果と一致した。
【０１１５】
（３）ＤＲ３遺伝子の滑膜細胞における発現確認
続いて、ＤＲ３遺伝子がＲＡ患者の滑膜細胞において発現しているか否かの実験を行った。
【０１１６】
先ず、ＲＡ患者の滑膜検体から凍結標本および染色標本を以下の手順で作製した。関節形成術の際に患者より切除した関節滑膜から組織を５ｍｍ３程度分離し、ＯＴＣコンパウンドを用いて組織を包埋した後、液体窒素により急速に凍結し、凍結標本を作製した。凍結標本は、クライオスタットで６μｍの厚さに薄切りしてスライドガラスに付着させ、アセトンを用いて固定した。
【０１１７】
また、ＲＡ患者の滑膜検体から滑膜初代培養系細胞株の樹立を以下の手順で行った。関節形成術の際に、ＲＡ患者より切除した関節滑膜を細片化し、コラゲナーゼ処理を行った。その後、定法（参考文献：Hashiramoto A, Sano H, Maekawa T,et al. C-myc antisense oligodeoxynucleotides can induce apoptosis and down-regulate Fas expression in rheumatoid synoviocytes. Arthritis Rheum. 42. 954-62 (1999) ：参照）に従って、滑膜細胞を単離した。樹立した細胞株は、１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地にて維持し、実験に用いた。
【０１１８】
（３−１）免疫染色法によるＤＲ３の検出
上記の方法で作製したＲＡ患者の滑膜組織の凍結標本に対して免疫染色を行い、ＤＲ３の検出を行った。具体的には、上記凍結標本をリン酸緩衝液にて５分間洗浄した後、内在性ペルオキシダーゼ活性を除去するため、０．０３％過酸化水素水溶液で３０分処理した。その後、再度リン酸緩衝液にて５分間・３回繰り返して洗浄し、以降の工程は、ダコＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット（Dako Corporation社、Carpinteria、CA、米国）を用いて定法（参考文献：Miyazaki S,Yoshikawa T, Hashiramoto A, et al. ACTH expression in synovium of patient with rheumatoid arthritis and Lewis rats with adjuvant arthritis.Mod Rheumatol.12.206-212(2002) ：参照）に従い、免疫染色を行った。ＤＲ３タンパク質を検出する目的で、二次抗体には抗ＤＲ３抗体（Neo Marker社、Fremont、CA、米国）を用いた。
【０１１９】
その結果を図９、図１０に示す。図９は、ＲＡ患者の滑膜細胞に対して免疫染色を行い、その組織を１００倍で顕微鏡観察したものである。また、図１０（ａ）は、上述した滑膜標本において、滑膜浸潤リンパ球が集積した部位を１０００倍で観察したもの、また、図１０（ｂ）は、同標本にて滑膜表層部位に集積した滑膜細胞を１０００倍で観察したものである。
【０１２０】
これらの図に示されるように、ＲＡ患者の滑膜細胞および滑膜浸潤リンパ球では、茶褐色に染まるＤＲ３陽性細胞が多数認められた。
【０１２１】
（３−２）ウエスタンブロット法によるＤＲ３の検出
上記の方法で樹立した由来患者の異なる３種の滑膜細胞株からタンパク質を抽出し、定法（参考文献：Yamashita T, Hashiramoto A, Haluzik M,et al. Enhanced insulin sensitivity in mice lacking ganglioside GM3.Proc Natl Acad Sci U S A. 100. 3445-9.2003 ：参照）に従ってウエスタンブロット法を用いてＤＲ３タンパク質を検出した。二次抗体には、抗ＤＲ３抗体（eBioscience社、SanDiego、CA、米国）を用いた。また、比較のための陽性対象として、ＤＲ３を高発現するJurkat細胞を用いた。
【０１２２】
その結果を図１１に示す。図１１では、左から順にSample１，２，３、および、Jurkat細胞である。なお、上記Sample１，２，３は、それぞれ由来患者の異なる滑膜細胞である。図１１に示すように、Sample１，２，３の何れにも、ＤＲ３タンパク質の発現（５８ｋＤａ）が確認された。
【０１２３】
（４）ＲＡ患者と変形性関節症（ＯＡ）患者とのＤＲ３のメチル化状態の比較
上述のbisulfite  genomic  sequencing法を用いて、ＲＡ患者の滑膜細胞（ＳＡＣ）から採取したＤＲ３遺伝子と、変形関節症（ＯＡ）患者の滑膜細胞から採取したＤＲ３遺伝子との上流領域のメチル化状態の比較を行った。
【０１２４】
その結果を図１２に示す。なお、図１２には、ＲＡ患者と健常者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）において、同様にＤＲ３遺伝子との上流領域のメチル化状態を調べた結果も示す。末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）から採取したＤＲ３遺伝子の上流領域については、上述の結果と同様、ＲＡ患者・健常者ともに、Ａ領域は高メチル化状態、Ｂ領域はメチル化と非メチル化との混在状態、Ｃ領域は完全な非メチル化状態であった。図１２の上段に示すＣＬ１／ＣＲ１，ＣＬ２−２／ＣＲ２−２は、本実験に用いたプライマーである。
【０１２５】
滑膜細胞（ＳＡＣ）から採取したＤＲ３遺伝子の上流領域においては、ＲＡ患者由来の遺伝子は高メチル化状態であった。これに対し、ＯＡ患者由来の遺伝子は、ＲＡ患者由来のものと比較してメチル化が低い傾向にあることが確認された。
【０１２６】
また、同じ遺伝子について、上述のＭＳＰ法を用いてメチル化状態の検出を行った。その結果を図１３に示す。図１３の上段に示すＭＦ１／ＭＲ１，ＭＦ２／ＭＲ２，ＭＦ３／ＭＲ３は、本実験に用いたメチル化特異的プライマーであり、ＵＦ１／ＵＲ１，ＵＦ２／ＵＲ２，ＵＦ３／ＵＲ３は、本実験に用いた非メチル化特異的プライマーである。図１３に示すように、ＭＳＰ法を用いた実験でも、上述のbisulfite  genomic  sequencing法を用いた場合と同様の結果が示された。
【０１２７】
この結果から、滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子のＣ領域においては、ＲＡ患者で特に高メチル化状態であることがわかった。
【０１２８】
（５）ルシフェラーゼアッセイによるＤＲ３プロモーター活性の確認
健常者末梢血リンパ球ＤＮＡ由来のインサート４種（ｐＤＲ３−１〜ｐＤＲ３−４）をｐＧＬ３−Enhancer vector（Promega 製）に挿入し、レポータープラスミドを構築した。さらに、ＣｐＧメチル化酵素ＳｓｓＩ（New England Biolabs 製）によって人工的にメチル化させたプラスミドｐＤＲ３−１（ＳｓｓＩ）を作製した。図１４には、本実施例において構築したプラスミドに挿入された各インサート（ｐＤＲ３−１〜ｐＤＲ３−４、および、ｐＤＲ３−１（ＳｓｓＩ））を模式的に示す。図１４に示すように、ｐＤＲ３−１およびｐＤＲ３−１（ＳｓｓＩ）は、ＤＲ３遺伝子のＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域（エクソン１を含む）を含むものであり、ｐＤＲ３−２はＤＲ３遺伝子のＢ領域とＣ領域（エクソン１を含む）とを含むものであり、ｐＤＲ３−３はＤＲ３遺伝子のＣ領域（エクソン１を含む）のみを含むものであり、ｐＤＲ３−４はＤＲ３遺伝子のエクソン１のみを含むものである。
【０１２９】
上記のようにして構築したプラスミドを用いてトランスフェクションを行う前日に、２４ウェルプレートにＣＯＳ−７を１×１０５ｃｅｌｌ／ウェルとなるようにまいた。そして翌日、Lipofect AMINE with PLUS（Invitrogen製）を用いて、ＣＯＳ−７にレポータープラスミドを遺伝子導入した。そして、試薬の調整およびサンプルの調整を行った後、各プラスミドのルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit（Promega製）を用いてルミノメーターで測定した。
【０１３０】
その結果を、相対的ルシフェラーゼ活性として図１５に示す。この図に示すように、ベクターに挿入されたＤＲ３プロモーター領域が、ｐＤＲ３−１からｐＤＲ３−２，３，４へと短くなるにしたがって、相対的ルシフェラーゼ活性が低下していることが確認された。また、メチル化されたプラスミドは、Ａ〜Ｃ領域を全て含んでいるにもかかわらず、メチル化されていないものと比較してルシフェラーゼ活性が低下していることが確認された。
【０１３１】
この結果から、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域は、メチル化の影響によってその発現が抑制されることが示唆される。つまり、プロモーター領域が比較的高メチル化状態であるＲＡ患者の滑膜細胞では、ＤＲ３遺伝子の発現が抑制されており、これがＲＡの発症と関わっていることが示唆される。
【０１３２】
（６）ＤＲ３タンパク質の発現とＤＲ３遺伝子のメチル化状態との関係
本実施例では、健常者由来の末梢血リンパ球およびＲＡ患者由来の滑膜細胞におけるＤＲ３タンパク質の発現を、上記（３−２）に記載の手順と同様のウエスタンブロット法によって確認した。また、同じ検体について上述のＭＳＰ法を用いてＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態の確認を行った。その結果を図１６に示す。図１６（ａ）は、ウエスタンブロット法によるタンパク質発現調査の結果を示し、図１６（ｂ）は、ＭＳＰ法によるＣ領域のメチル化解析の結果を示す。図１６において、ＰＢＭＣ（Ｐ１〜Ｐ５）は、健常者末梢血リンパ球から採取した各検体であり、Synovial cell（Ｓ１〜Ｓ７）は、ＲＡ患者滑膜細胞から採取した各検体である。また、図１６（ｂ）において、Ｕは非メチル化状態のものを示す、Ｍはメチル化状態のものを示す。
【０１３３】
図１６（ａ）に示すように、上段に示すＤＲ３タンパク質のバンドは、健常者由来末梢血リンパ球よりもＲＡ患者由来滑膜細胞において薄くなっていることが確認された。この結果から、ＤＲ３タンパク質の発現量は、健常者由来末梢血リンパ球よりもＲＡ患者由来滑膜細胞において減少していることが明らかとなった。なお、図１６（ａ）の下段に示すウエスタンブロットの結果は、コントロールとして用いたアクチン（Actin）タンパク質の結果である。この結果から、アクチンタンパク質の発現量は、健常者とＲＡ患者との間で違いがないことが確認された。
【０１３４】
また、図１６（ｂ）に示すように、左側に示す健常者由来末梢血リンパ球では、完全に非メチル化状態であり、右側に示すＲＡ患者由来滑膜細胞では、健常者のものと比較して高メチル化状態であることが確認された。特に、ＭＳＰ法において完全にメチル化状態であることが確認された検体Ｓ３，Ｓ７（図１６（ｂ）参照）では、ＤＲ３タンパク質の発現量がより低いことが確認された（図１６（ａ）参照）。
【０１３５】
以上の結果から、ＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が高メチル化状態のＲＡ患者の滑膜細胞では、実際にＤＲ３遺伝子の翻訳産物であるＤＲ３タンパク質の発現量が低下することが確認された。この結果から、プロモーター領域が比較的高メチル化状態であるＲＡ患者の滑膜細胞では、ＤＲ３タンパク質の発現が抑制されており、これがＲＡの発症と関わっていることが示唆される。
【０１３６】
そしてこの実施例の結果から、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子を比較対照（コントロール）とすれば、被験者から採取した滑膜細胞または滑膜浸潤リンパ球から採取したＤＲ３遺伝子のプロモーター領域が、上記末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態よりも高メチル化状態である場合に、関節リウマチを発症している、または、その発症可能性を有すると判定することができることが裏付けられた。
【０１３７】
以上のように、ＤＲ３遺伝子は、ＲＡ患者の滑膜細胞および滑膜浸潤リンパ球に発現していることが確認された。この結果から、ＤＲ３遺伝子が関節リウマチの病態形成に関与している可能性が示唆された。また、ＲＡ患者の滑膜組織においてこのようなＤＲ３遺伝子の発現が確認されたことから、本発明の主要なポイントであるＤＲ３遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態の違いが、ＤＲ３遺伝子の滑膜組織における発現に関与していると考えられ、ひいては、関節リウマチの発症と深く関連していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドは、関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有効に利用することができると考えられる。また、本発明によれば、関節リウマチの発症またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができる。それゆえ、本発明は関節リウマチの予防および治療の分野において、高い利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列を示す図である。
【図２】図１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの構造を示す模式図である。
【図３】本実施例に示すＭＳＰ法において、ＤＮＡ増幅工程によって増幅されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＤＮＡ断片についてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示す図である。なお、（ａ）はＲＡ患者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域の結果を示すものであり、（ｂ）はＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域の結果を示すものである。
【図４】本実施例に示すＭＳＰ法において、ＤＮＡ増幅工程によって増幅されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＤＮＡ断片についてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示す図である。なお、この図は、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域の結果を示すものである。
【図５】本実施例に示すＭＳＰ法において、ＤＮＡ増幅工程によって増幅されたＤＲ３遺伝子の上流領域のＤＮＡ断片についてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示す図である。なお、（ａ）は、ＤＲ３遺伝子の上流領域中のＡ領域の結果を示すものであり、（ｂ）は、ＤＲ３遺伝子の上流領域中のＢ領域の結果を示すものであり、（ｃ）は、ＤＲ３遺伝子の上流領域中のＣ領域の結果を示すものである。また、（ａ）〜（ｃ）において、丸付きで示す数字１〜３はそれぞれ、滑膜細胞由来の遺伝子、滑膜細胞浸潤リンパ球由来の遺伝子、関節液中のリンパ球由来の遺伝子を順に示している。
【図６】本実施例に示すＭＳＰ法によって、健常者とＲＡ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態、および、ＲＡ患者とＯＡ患者の滑膜細胞（ＳＡＣ）由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態について調査した結果をまとめた表である。
【図７】（ａ）は、本実施例に示すbisulfite  genomic  sequencing法によって、健常者の末梢血リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を検出した結果を示す図である。（ｂ）は、本実施例に示すbisulfite  genomic  sequencing法によって、ＲＡ患者の滑膜細胞由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を検出した結果を示す図である。
【図８】本実施例に示すbisulfite  genomic  sequencing法によって、ＲＡ患者の滑膜浸潤リンパ球由来のＤＲ３遺伝子の上流領域のメチル化状態を検出した結果を示す図である。
【図９】本実施例において、ＲＡ患者の滑膜細胞に対して免疫染色を行い、ＤＲ３の発現を確認した結果を示す図である。
【図１０】（ａ）は、本実施例において、ＲＡ患者の滑膜浸潤リンパ球に対して免疫染色を行い、ＤＲ３の発現を確認した結果を示す図である。（ｂ）は、本実施例において、ＲＡ患者の滑膜細胞に対して免疫染色を行い、ＤＲ３の発現を確認した結果を示す図である。
【図１１】本実施例において、ＲＡ患者の滑膜組織におけるＤＲ３遺伝子の発現をウエスタンブロット法で確認した結果を示す図である。
【図１２】本実施例において、ＲＡ患者と変形性関節症（ＯＡ）患者とのＤＲ３上流領域のメチル化状態を、bisulfite  genomic  sequencing法によって調べた結果を示す図である。
【図１３】本実施例において、ＲＡ患者と変形性関節症（ＯＡ）患者とのＤＲ３上流領域のメチル化状態を、ＭＳＰ法によって調べた結果を示す図である。
【図１４】本実施例において構築したプラスミドに挿入された各インサート（ｐＤＲ３−１〜ｐＤＲ３−４、および、ｐＤＲ３−１（ＳｓｓＩ））を示す模式図である。
【図１５】図１４に示す各インサートを挿入したプラスミドにおいて、相対的ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１６】本実施例においてＤＲ３タンパク質の発現とＤＲ３メチル化状態（Ｃ領域）との関係を調査した結果を示す図である。（ａ）は、ウエスタンブロット法によるタンパク質発現調査の結果を示し、（ｂ）は、ＭＳＰ法によるメチル化解析の結果を示す。
【要約】
【課題】  ヒト関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有用なポリヌクレオチドを提供するとともに、ヒト関節リウマチの発症または発症可能性を高精度に判定することのできる判定キットおよび判定方法を提供する。
【解決手段】  本願発明者らは、ヒトゲノムにおいて、関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３の翻訳開始点より上流の領域（プロモーター領域を含む）のＤＮＡメチル化解析を行った。その結果、ＤＲ３遺伝子の翻訳開始点（ＡＴＧ）の上流約−３８０ｂｐ〜−１８０ｂｐに存在するＣｐＧ配列にアレル特異的なメチル化が存在すること、そして、それより下流のＣｐＧ配列については、健常者由来のＤＲ３遺伝子の場合には全て非メチル化状態であり、ＲＡ患者由来のＤＲ３遺伝子の場合には非メチル化とメチル化とが混在した状態であることを見出した。
【選択図】  図１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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