(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記の４つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。工程Ａ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと逆転写酵素との結合反応、工程Ｂ：工程Ａで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｃ：工程Ｂで反応した抗体と未反応の抗体とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｄ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程。
【請求項２】
請求項１記載の工程Ａにおいて、２価の金属イオンを生じせしめる水溶性の金属塩の存在下に結合反応せしめる請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項３】
２価の金属イオンが、０．１ｍＭ〜５００ｍＭである請求項２記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項４】
２価の金属イオンが、マグネシウムまたはカルシウムまたはマンガンイオンである請求項２記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項５】
オリゴデオキシチミンヌクレオチドが、５〜１０００００塩基数である請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項６】
アデニンリボポリヌクレオチドが、５〜１０００００塩基数である請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項７】
逆転写酵素が、２μＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌである請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項８】
デオキシモノヌクレオチド３リン酸が、少なくともビオチン標識デオキシウリジン３リン酸である請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項９】
検体が、血清または血漿から得られたもので、１倍〜１０００００倍に希釈されたものである請求項１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１０】
検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記も４つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。工程Ｅ：逆転写酵素と逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｆ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと工程Ｅの反応液と結合反応せしめ、工程Ｇ：工程Ｆでの反応物と未反応物とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｈ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程。
【請求項１１】
請求項１０の工程Ｆにおいて、２価の金属イオンを生じせしめる水溶性の金属塩の存在下に結合反応せしめる請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１２】
２価の金属イオンが、０．１ｍＭ〜５００ｍＭである請求項１１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１３】
２価の金属イオンが、マグネシウムまたはカルシウムまたはマンガンイオンである請求項１１記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１４】
オリゴｄＴが、５〜１０００００塩基数である請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１５】
アデニンリボポリヌクレオチドが、５〜１０００００塩基数である請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１６】
逆転写酵素が、２μＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌである請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１７】
デオキシモノヌクレオチド３リン酸が、ビオチン標識デオキシウリジン３リン酸である請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１８】
検体が、血清または血漿から得られたもので、１倍〜１０００００倍に希釈されたものである請求項１０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項１９】
検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記の３つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。工程Ｉ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと逆転写酵素とを結合反応せしめ、工程Ｊ：工程Ｉで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とデオキシモノヌクレオチド３リン酸を同時に添加することにより固相上の逆転写酵素によって鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｋ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程。
【請求項２０】
請求項１９の工程Ｉにおいて、２価の金属イオンを生じせしめる水溶性の金属塩の存在下に結合反応せしめる請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２１】
２価の金属イオンが、０．１ｍＭ〜５００ｍＭである請求項２０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２２】
２価の金属イオンが、マグネシウムまたはカルシウムまたはマンガンイオンである請求項２０記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２３】
オリゴｄＴが、５〜１０００００塩基数である請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２４】
アデニンリボポリヌクレオチドが、５〜１０００００塩基数である請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２５】
逆転写酵素が、２μＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌである請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２６】
デオキシモノヌクレオチド３リン酸が、ビオチン標識デオキシウリジン３リン酸である請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【請求項２７】
検体が、血清または血漿から得られたもので、１倍〜１０００００倍に希釈されたものである請求項１９記載の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法に関する。詳しくは、検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも固相上の実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドと実質的なアデニンリボポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション物と逆転写酵素との結合反応において、少なくとも下記の４つの工程を行うことを特徴とし、好適には下記工程Ａにおいて２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて結合反応せしめることを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ａ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと逆転写酵素との結合反応、工程Ｂ：工程Ａで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｃ：工程Ｂで反応した抗体と未反応の抗体とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｄ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程。
【０００２】
または、検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも固相上の実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドと実質的なアデニンリボポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション物と逆転写酵素との結合反応において、少なくとも下記の４つの工程を行うことを特徴とし、好適には下記工程Ｆにおいて２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて結合反応せしめることを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ｅ：逆転写酵素と逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｆ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと工程Ｅの反応液と結合反応せしめ、工程Ｇ：工程Ｆでの反応物と未反応物とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｈ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程。
【０００３】
または、検体中ヒト免疫不全ウイルス由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも固相上の実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドと実質的なアデニンリボポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション物と逆転写酵素との結合反応において、少なくとも下記の３つの工程を行うことを特徴とし、好適には下記工程Ｉにおいて２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて結合反応せしめることを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ｉ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチドとそれにハイブリダイズした実質的なアデニンリボポリヌクレオチドと逆転写酵素とを結合反応せしめ、工程Ｊ：工程Ｉで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とデオキシモノヌクレオチド３リン酸を同時に添加することにより固相上の逆転写酵素によって鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｋ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程に関する。
【０００４】
【従来の技術】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症は、未だに完全な治療法がなく、また感染後の５〜１０年ともいわれる潜伏期を経て発症に至るプロセスは明らかにされていない。従って、発症時期の予測が未だに確立されておらず、従来のこの感染症の診断はウイルス感染の有無を判断するための方法がほとんどであった。
【０００５】
これまでＨＩＶ感染を診断する方法として感染者の血清、血漿、唾液、尿等の体液中に存在する抗原または抗体を検出する方法が一般的であった。
抗原を検出する方法としては例えば、ポリスチレンボールなどの固相上にＨＩＶの外被タンパクに対する抗体を固相化させておき、これに検体である血清を添加しウイルスタンパクと結合反応を行わせる。この抗体−ウイルスタンパク複合体にさらにウイルスタンパクの別の部位を認識する酵素標識した抗体と反応させ、抗体−ウイルスタンパク−抗体−酵素の複合体を形成せしめ、最終的に固相担体上に存在する酵素活性を測定することによってウイルスの存在を確認する。この方法は既に診断キットとして市販され（アボット社：ＨＩＶ抗原ＥＩＡアボット）、医療の場でも応用されている。
【０００６】
しかしながら、この酵素免疫測定法による抗原の検出方法では、ウイルス感染直後の急性感染期や、エイズ発症によってウイルス血症となった時にしか検出されず、潜伏期には検出はほとんどできないため、感染者の病態やそのウイルスの性状のマーカーとして使用する場合は、ウイルス検出が可能なある限られた時期だけにしか使用できなかった。
【０００７】
また、別な方法で潜伏期でウイルス抗原の検出をする方法も存在する。例えば、感染の疑われる患者の末梢リンパ球を分離し、これに非感染のＭｏｌｔー４細胞と感染させ、細胞を２週間ほど培養したのちに細胞培養上清中のウイルスの存在を上記酵素免疫測定法にて測定するかまたは逆転写酵素活性を測定して判断する（感染症学雑誌、１９９０年、第６４巻、第１０号、１２８７〜１２９４頁）。しかしこの方法では感染者のすべてがウイルス分離されるわけではないうえ、分離されたウイルスの性状を個々に調べなければならず、しかも判定までに２週間という時間がかかり、潜伏期の５〜１０年間継続的に細胞培養を行うための多大なる労力と検査コストの面からも多検体の処理を必要とするＨＩＶ感染の診断には一般的ではなかった。
【０００８】
一方、抗原検出のかわりに血清中に存在するＨＩＶウイルスに対する抗体を測定する手法が考えられる。実際に、酵素免疫測定法が用いられており市販もされている（デュポン社：デュポン    ＨＩＶ    ＥＬＩＳＡ）。例えばその具体的な手法は、ＨＩＶ抗原を固相化した９６ウエルマイクロプレートに、血清希釈検体を添加し室温で２時間インキュベートした後、反応液を洗浄除去し、酵素標識抗ヒト抗体を添加して室温で１時間インキュベートした後、反応液を洗浄除去し、酵素基質を添加して３７℃、３０分発色反応させ、プレートリーダーなどで吸光度を測定して検出する。この抗体測定法はＨＩＶ感染の潜伏期でも検出できるため、感染者のスクリーニング検査のために多用されている。
【０００９】
スクリーニング検査以外の目的として、この抗体測定法は病態マーカーとしての使用も可能でもある。ＨＩＶ感染者は、病態がＡｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ    Ｃａｒｉｅｒ（ＡＣ）からＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ    Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＡＲＣ）を経てエイズ発症に向かう際に、ＨＩＶのコアタンパクであるｐ２４抗原に対する抗体が減少する傾向が報告されている（Ｐａｕｌ、Ｄ．Ａ．、ｅｔ    ａｌ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｏｌ．、２２：３５７、１９８７）。しかしながら、これらの手法は、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ２４、ｐ１５等のウイルスタンパクに対する抗体すべてを検出するもので、ある特定のエピトープを限定して測定するわけではなく、感染後のウイルスの変異に対応した抗体の変化を見ることができない欠点があるため、感染者の潜伏期の病態やある時点のウイルスの性状を反映するマーカーとしては利用されてこなかった。
【００１０】
抗体測定法において、ＨＩＶ抗原蛋白に対する抗体のエピトープを分類して測定し、その量と病態との関わりを調べることも幾種類か考えられている。例えば、合成的な手法を用いて数種類の合成ペプチドを用意し、これに対する感染者検体中の抗体の反応性を検討する手法が考えられている。しかし抗体が物質の立体構造を認識する点を考慮すると、必ずしもウイルス由来の自然に近い形の抗原分子に対する抗体を検出できるわけではない。
【００１１】
また、これとは別に逆転写酵素活性を阻害する抗体を測定する手法が感染宿主の抗体のエピトープを限定する手法として考案されている。これは逆転写酵素反応時に感染者の血清中に存在する逆転写酵素活性を阻害する抗体を添加し、一定量の酵素に対してどれだけ酵素反応を阻害したかを定量することによって、抗体量を定量する手法が知られている（Ｓａｎｏ    Ｋ．、ｅｔ    ａｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：２４１５〜２４１７、１９８７、特開平３−４７０９８号公報）。この方法は上記抗体測定法とは異なり、抗原である逆転写酵素に対して酵素活性を阻害するような抗体だけを検出することによりエピトープを限定して測定する。
【００１２】
しかしながら、一般的に用いられるこの方法はラジオアイソトープを用いる酵素活性測定法に合わせて測定されるために特別の施設を必要とし、しかも操作の煩雑さからＨＩＶ感染者のような多くの検体を扱わなければならないのには不向きである。また、この方法を用いても、エピトープは逆転写酵素活性の活性中心などを主とした部位を認識する抗体群を定量するためにウイルスの細部の変異または潜伏期間中の抗体の産生のされかたなどの変化を抗体にて追跡することは困難であった。
【００１３】
また、固相上で逆転写酵素活性阻止抗体を測定する方法として、あらかじめ固相上に逆転写酵素の鋳型となるオリゴｄＴとポリアデニンリボヌクレオチドとのハイブリダイズ物をＥＩＡ用の９６穴プレート上に固定しておき、これに逆転写酵素とデオキシチミンモノヌクレオチド、ビオチン標識デオキシウリジンモノヌクレオチドと活性阻止抗体含有被検体を同時に添加、反応せしめる。未反応物を洗浄除去した後に伸長したビオチン化核酸をストレプトアビジン−アルカリホスファターゼと反応させ、未反応物を洗浄除去した後、固相上のアルカリホスファターゼ活性を測定し、逆転写酵素活性阻止抗体を測定する方法が知られている（ＥＰ公開第４８０４０８号明細書）。
【００１４】
しかしながら、従来のＨＩＶ由来の逆転写酵素にはＤＮＡとＲＮＡのハイブリダイズ物のうちのＲＮＡのみを分解する酵素活性であるＲＮａｓｅＨ活性を持つことが知られており（Ｌ．Ａ．Ｋｏｈｌｓｔｅａｄｔ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２、Ｖｏｌ．２５６、１７８３−１７９０）、従って固相上のＤＮＡとＲＮＡのハイブリダイズ物と逆転写酵素を単純に接触させ、ハイブリダイズ物と逆転写酵素の複合体を形成させ、その後に逆転写酵素反応させることは、ハイブリダイズ物のＲＮａｓｅＨ活性による分解が予想されることから、測定し難いことが想定された。
【００１５】
さらに、最近では活性阻害抗体のうちエピトープをさらに、鋳型−プライマーと抗体との競合する抗体群または結合を阻害する抗体群に特定して測定する手法が考えられている（Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｌ．Ｄ．ｅｔ    ａｌ、ＡＩＤＳ    Ｒｅｓｅａｒｃｈ    ａｎｄ    Ｈｕｍａｎ    Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１９９４、Ｖｏｌ．１０、Ｎｕｍｂｅｒ８、９５３−９６０）。具体的には、ラジオアイソトープ基質を用いたＨＩＶ由来逆転写酵素活性を測定する際に活性阻害抗体を含む希釈血清を添加して測定する方法で、活性測定に用いる鋳型−プライマー量を変動させてその量ごとの活性阻害を定量し、酵素の鋳型プライマー認識部位をめぐって、鋳型プライマーと活性阻止抗体の競合反応または結合阻害反応を検出できる。しかし、この方法で用いている逆転写酵素はＨＩＶ粒子から調製した酵素を使用しているためウイルス由来の鋳型−プライマーが酵素活性測定系に混入した系で測定され、正確かつ再現の良い活性阻害測定ができない欠点があった。また、バイオハザードの面からも簡便性に欠けていた。
【００１６】
さらに最近では、鋳型−プライマーを固相上に固定化した担体上で逆転写酵素活性を測定する手法が開発されている（中野ら、感染症学雑誌、１９９４年、第６８巻、第７号、９２３−９３１）。この方法は、９６ウエルマイクロプレート上に鋳型−プライマーを固相化させておき、逆転写酵素と逆転写酵素のＤＮＡ合成基質であるビオチン標識デオキシウリジン３リン酸を添加して逆転写酵素反応させ、最終的に固相に形成されたビオチン化ＤＮＡ量を非ラジオアイソトープ的な手法で定量する方法である。この方法を用いて、活性阻害抗体のうちエピトープをさらに、鋳型−プライマー酵素との結合阻害抗体群に限定して測定するために、逆転写酵素と活性阻止抗体を予め反応させておき、そのうえで固相上の鋳型−プライマーと逆転写酵素とを結合させ、その後でＤＮＡ合成基質をべつに添加して、逆転写酵素反応させる方法が想像できる。
【００１７】
しかし、実際にはＨＩＶ由来逆転写酵素がリボヌクレアーゼＨ活性を有しているため、固相上にて逆転写酵素をあらかじめ固相上の鋳型−プライマーと結合反応させようとしても、鋳型−プライマーの分解で安定にかつ効率よくまた再現良く結合反応させることができかったことから、中野らの手法を利用した逆転写酵素活性阻止抗体のエピトープ群を分けて抗体測定することは実用化されてこなかった。
【００１８】
以上、感染者の持つ抗体を用いて、ウイルスの変異を研究することは、体内にて生成される抗体がポリクローナル性であるために困難であった。しかも、これを解決するための手法として考えられる、ウイルス抗原を認識する抗体のエピトープを分類する手法もまた上述の如く困難であるという理由から、ＨＩＶ感染においてウイルスの性質または感染者の病態を反映できるような診断マーカーとして、抗体を用いた優れた手法の確立はされておらず、研究段階でしかなされてこなかった。そしてその手法は極めて煩雑であるため研究コストと労力の両面でこの分野の研究を圧迫してきた。このため、この分野の研究用試薬としてウイルス抗原に存在するタンパクに対する抗体のうち、簡便にかつ再現良くエピトープを限定して分類できかつそれらの抗体量を定量できるような測定系が望まれていた。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
前記ウイルス抗原に存在するタンパクに対する抗体のうち、簡便かつ再現良くエピトープを限定して抗体量を定量できるような測定系ができるようになれば、ＡＣのような潜伏期間中に検出が困難であるウイルスのかわりに抗体によってウイルスの性状との関連を研究することが可能となり、５〜１０年という長い年月の間に変異を続けた結果のウイルスの性状や、薬剤投与によってどのような耐性を獲得したかを抗体測定から研究可能となる。
【００２０】
また、病気の進行とともに感染宿主内の抗体の産生能力等を含めたホスト側の変化をより的確かつ迅速に捕らえられるようにもなることが予想される。さらには抗体を用いるために検体の入手は容易であるうえにウイルスを培養するなどの手間が少なくなり、ＨＩＶ等の診断のように検査量が極端に多い項目では非常に有効な手段となりうる。また、抗体がウイルス抗原自体よりも安定性が高い利点や検体の界面活性剤処理が可能であるなどバイオセイフティーの点からも抗体を用いた測定はＨＩＶ感染症の研究分野においては必然の要求であり、逆転写酵素活性阻止抗体をエピトープ群に分けて測定する方法を提供するものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、逆転写酵素反応の第一段階；鋳型−プライマーと逆転写酵素との結合反応、と第二段階；鋳型ＲＮＡに相補的塩基配列のＤＮＡ合成反応の２段階に分けて酵素活性を測定する測定系を見い出し、特に、第一段階における安定かつ再現の良い反応法を発見した。また、固相担体上に固定化した鋳型−プライマーにあらかじめ逆転写酵素を結合反応させる際に好適には２価の金属イオンを生じさせうる水溶性金属塩の存在下反応させることにより再現良く安定に反応させることを見い出し、逆転写酵素活性阻止抗体の阻害様式を利用して活性阻害抗体を大きく３つのエピトープ群に分けて測定する方法を完成した。つまり、１．逆転写酵素と検体（抗体）との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群、２．酵素の鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群、３、逆転写酵素と検体（抗体）との反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群、の３つである。
【００２２】
具体的にその原理を説明すると、まず１の阻害抗体群は、固相上の実質的なオリゴデオキシチミンヌクレオチド（オリゴｄＴ）と実質的なアデニンリボポリヌクレオチド（ポリＡ）とのハイブリダイゼーション物と一定量のＨＩＶ由来の逆転写酵素とを、好適には少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応させ、次いで未反応の酵素を洗浄除去したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体と反応させ、未反応の検体を洗浄分離したのち、逆転写酵素のＤＮＡ合成基質であるデオキシモノヌクレオチド３リン酸を含む酵素反応液を添加して逆転写酵素反応させ、最終的に合成された核酸量を定量し、その量に基づいて検体と反応したことによって抑制された酵素活性を定量して逆転写酵素活性阻止抗体を測定する方法を見い出した。
【００２３】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、ＨＩＶ由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記の４つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ａ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴｄＴとそれにハイブリダイズした実質的なポリＡと逆転写酵素との結合反応、工程Ｂ：工程Ａで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｃ：工程Ｂで反応した抗体と未反応の抗体とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｄ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程を特徴とする。
【００２４】
特に、上記逆転写酵素活性阻止抗体の測定法における工程Ａにおいて、少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応させることである。
本発明における検体中の逆転写酵素活性阻止抗体とは、逆転写酵素活性を阻害するようなイムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ、イムノグロブリンＤ、イムノグロブリンＥなどで、検体とはこれらが含有された生体液などで、例えば、血清、血漿、尿、唾液、涙液などが挙げられるが、特にこれに限定されるものではなく、好ましくは血清または血漿が挙げられる。
【００２５】
その反応に供される検体は１〜１００００００倍の希釈範囲で測定できるが、好ましくは１〜１０００００倍の希釈の範囲で使用するのがよい。
固相担体は透明なまたは半透明なまたは着色したものであればよく、オリゴｄＴを固相化することができれば何でも用いることができ、よく用いられるものはＥＩＡ用プレート、磁性ビーズ、ＥＩＡ用プラスチックボール、チューブ等で、その材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスチック、ステンレス、アルミ、チタン等の金属、ガラス及びゴム等が挙げられる。
【００２６】
基材への核酸の固相化方法は、固相担体への吸着や、核酸の５’末端から直接基材へ化学結合する手法（Ｖ．Ｌｕｎｄｅｔ．ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１６，２２，    １０８６１−１０８８０    １９８８）、核酸の５’末端、３’末端または、核酸のプリンもしくはピリミジン環部分にビオチン、ハプテン、レセプターなどを修飾し、基材に予め固相化しておいたアビジンや抗体などのリガンドと結合させることなどによって簡単に固相化できる。
【００２７】
本発明における結合反応とは、ＲＮＡからＤＮＡへと転写する逆転写酵素反応ではなく、逆転写酵素が鋳型−プライマーを認識し、これと結合する反応を意味する。その反応の目的は、酵素の鋳型−プライマーとの結合反応とＤＮＡ伸長反応とを別々に行わせるためである。従って、結合反応は酵素反応とは異なり、そして、本発明において２価の金属イオンを生じせしめる水溶性の金属塩の存在下にて安定にかつ効率よく結合反応させるようにすることを見いだしたものである。
【００２８】
逆転写酵素と鋳型−プライマーとの結合反応である工程Ａでの条件は、２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて反応させることが好適であり、水溶液中で２価の陽イオンを生じさせうる金属イオンの種類としては、例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、カルシウム（Ｃａ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）等の２価陽イオン体が挙げられ、例えばＭｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｃｕ等の２価陽イオンを放出できる塩化物、フッ化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸塩、炭酸水素塩などの水溶性塩類が挙げられ、その好適な金属塩としては、例えば、ＭｇＣｌ２  、ＭｎＣｌ２  、ＣａＣｌ２  、ＺｎＣｌ２  、ＣｄＣｌ２  、ＣｕＣｌ２  、ＭｇＳＯ４  、ＭｎＳＯ４  、ＣｄＳＯ４  、ＣｕＳＯ４  等が挙げられるが、好ましくはＭｇＣｌ２  、ＭｎＣｌ２  、ＣａＣｌ２  、である。その濃度は、ＭｇＣｌ２  、ＭｎＣｌ２  、ＣａＣｌ２  のいずれを用いた場合でも０．０１ｍＭ〜１Ｍで、好適には０．１ｍＭ〜５００ｍＭであれば反応させることができる。
【００２９】
結合反応液中のｐＨは結合に至適なｐＨを考慮のうえ、最適な値をとればそれでよく、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９であればそれでよいが、特にこれに限定されるものではない。反応液に用いる緩衝液は設定するｐＨにあわせて選択すればそれで良く、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液、などから１種類かそれ以上選択すればそれでよい。そして、必要に応じてＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液であれば、なんでも用いることができる。
【００３０】
そして、反応させる温度は溶液が凍結する温度以上でかつ酵素活性が測定できる程度に維持されるような温度で反応させれば良く、その範囲は０℃〜５０℃であればよい。また、反応時間は、鋳型−プライマーと結合した酵素が検出できるような時間で反応させればそれでよく、その範囲は１秒〜２４時間であればよい。
【００３１】
また、工程Ｂにおける酵素と抗体の反応条件は、通常の抗原抗体反応に用いるような反応条件でよく、反応液中のｐＨは至適なｐＨを考慮のうえ、最適な値をとればそれでよく、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９であればそれでよいが、特にこれに限定されるものではない。例えば、適当な緩衝液で抗原抗体反応に最適なｐＨを合わせ、そのｐＨにあわせて種類を選択すればよい。その緩衝液としてはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液、などから１種類かそれ以上選択すればそれでよく、そして、必要に応じてＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液であれば、なんでも用いることができる。また固相上の核酸を安定化させるためにエチレングリコールやリボヌクレアーゼインヒビターを添加しても用いることができる。
【００３２】
また工程Ｂの反応時間は逆転写酵素活性阻止抗体が検出可能な程度に抗原抗体反応できれば良く、その時間は１秒〜２４時間であれば良い。
また、工程Ｃにおける逆転写酵素の反応条件は、逆転写酵素反応が進行する条件なら何でも用いることができる。例えば、ｐＨは至適なｐＨを考慮のうえ、最適な値をとればそれでよく、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９であればそれでよいが、特にこれに限定されるものではない。例えば、適当な緩衝液で抗原抗体反応に最適なｐＨを合わせ、そのｐＨにあわせて種類を選択すればよい。その緩衝液としてはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液、などから１種類かそれ以上選択すればそれでよく、そして、必要に応じてＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の１価の塩または塩化マグネシウムや塩化マンガンなどの２価の金属塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液に基質となるデオキシモノヌクレオチド３リン酸を添加した液であれば、なんでも用いることができる。また固相上の核酸を安定化させるためにエチレングリコールやリボヌクレアーゼインヒビターを添加しても用いることができる。
【００３３】
固相上のオリゴｄＴは、逆転写酵素の転写開始部位として認識される実質的な構造、例えば少なくともオリゴｄＴの長さとして３以上，好ましくは５以上の塩基数構造を構成するものであればよく、市販もされており容易に入手できる（ファルマシア社、シグマ社等）。また、合成的な手法で調製することも容易であり、委託調製が可能である（宝酒造社、ニッポンジーン社等）。さらには７００塩基数以上の長さのオリゴｄＴが必要な場合は酵素的に自家調製することも容易である。例えば、上記市販のオリゴｄＴを基質として、１本鎖ＤＮＡに対してその５’リン酸基と３’水酸基とをフォスフォジエステル結合で連結する酵素活性を有している酵素（Ｔ４ＲＮＡリガーゼ；宝酒造社より市販）にて反応させて得ることも可能である。別の酵素としてはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社より市販）にてオリゴｄＴの３’水酸基からデオキシチミンヌクレオチドを重合していくことでも得られる。本発明において、そのオリゴｄＴの長さは３〜１０００００塩基数が良く、好ましくは５〜１０００００塩基数であればそれでよい。
【００３４】
また、ポリＡは固相上のオリゴｄＴとハイブリッド反応できかつ逆転写酵素の鋳型ＲＮＡとして認識、合成ができればよく、市販もされており容易に入手できる（ファルマシア社）。また、合成的な手法で調製することも容易であり、委託調製が可能である（宝酒造社）。さらには５００塩基数以上の長さのポリＡが必要な場合は酵素的に自家調製することも容易である。例えば、上記市販のポリＡを基質として、１本鎖ＲＮＡに対してその５’リン酸基と３’水酸基とをフォスフォジエステル結合で連結する酵素活性を有している酵素（Ｔ４ＲＮＡリガーゼ；宝酒造社より市販）にて反応させて得ることも可能である。本発明において、そのポリＡの長さは３〜１０００００塩基数が良く、好ましくは５〜１０００００塩基数であればそれでよい。その塩基の長さは３〜１０００００塩基数で、好ましくは５〜１０００００塩基数が良い。
【００３５】
使用する逆転写酵素はＲＮＡを鋳型として、これと相補的な塩基配列のＤＮＡを合成する活性を保有するＨＩＶ由来の酵素であり、１型と２型が知られといる。これら酵素は直接ウイルスから酵素を分離することによって容易に入手でき、例えばＬＡＶ−１株、ＬＡＶ−２株、ＧＨ−１株、ＧＨ−２株、ＧＨ−３株、ＧＨ−４株、ＧＨ−５株、ＧＨ−６株、などのウイルス粒子にトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等の界面活性剤で処理することによって簡単に調製でき、必要に応じてウイルス由来の核酸を核酸分解酵素などで分解、分離すればよい。また、大腸菌によって組み換え体を大量発現して得られた酵素は市販されており、簡単に入手できる（生化学工業社）が、好ましくは鋳型となる核酸が混入していない大腸菌にて発現させた組み換え逆転写酵素を用いるのがよい。その量は、被検液を添加しないときに得られる酵素活性を１００％としたときに、血清などの検体を用いた被検液を添加したときに得られる逆転写酵素の活性が０％よりも大きな値で検出できるような酵素量を用いればそれでよく、その濃度は０．１μＵ／ｍｌ〜１００００Ｕ／ｍｌの範囲であれば良く、好ましくは２μＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲であればそれでよい。
【００３６】
デオキシモノヌクレオチド３リン酸は非標識体としてデオキシチミジンモノヌクレオチド３リン酸、標識体としてビオチン標識デオキシウリジンモノヌクレオチド３リン酸、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジンモノヌクレオチド３リン酸、トリチウムまたは３２Ｐ標識デオキシチミジンモノヌクレオチド３リン酸等がありこれらを１種類以上使用すればよいが好ましくは非標識体としてデオキシチミジンモノヌクレオチド３リン酸、標識体としてビオチン標識デオキシウリジンモノヌクレオチド３リン酸を組み合わせて使用するのがよい。その量は逆転写酵素反応できかつ酵素活性を標識体から検出できるような量があればそれでよく、標識体と非標識体の比率は、例えば、標識体が１分子に対して非標識体が０分子である比率から標識体が１分子に対して非標識体が５００分子である比率まで測定できる。
【００３７】
次に２．に示した酵素の鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を検出するための具体的原理を以下に説明する。まず一定量のＨＩＶ由来の逆転写酵素と逆転写酵素活性阻止抗体を含有する検体とを接触反応させ、その反応液と、固相上の実質的なオリゴｄＴと実質的なポリＡとのハイブリダイゼーション物とを、好適には少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応させ、次いで未反応物を洗浄除去したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体と反応させ、未反応の被検液を洗浄分離したのち、逆転写酵素のＤＮＡ合成基質であるデオキシモノヌクレオチド３リン酸を含む酵素反応液を添加して逆転写酵素反応させ、最終的に合成された核酸量を定量し、その量に基づいて検体と反応したことによって抑制された酵素活性を定量して逆転写酵素活性阻止抗体を測定する方法を見いだした。
【００３８】
すなわち、ＨＩＶ由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記の４つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ｅ：逆転写酵素と逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とを反応させ、工程Ｆ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴｄＴとそれにハイブリダイズした実質的なポリＡと工程Ｅの反応液と結合反応せしめ、工程Ｇ：工程Ｆでの反応物と未反応物とを洗浄分離したのち、固相上の逆転写酵素によってデオキシモノヌクレオチド３リン酸から鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｈ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程を特徴とする。
【００３９】
上記の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法の工程Ｆにおいて、少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応せしめることが好適である。
２．の抗体群を検出する工程において逆転写酵素と鋳型−プライマーとの結合反応は工程Ｆにおいて行われ、この工程は上述の１．の抗体群検出の工程Ａに相当する。従って、工程Ｆでの反応条件は上述の工程Ａでの条件と同じく、逆転写酵素と鋳型−プライマーとの結合反応は、２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて反応させればそれでよい。そして、その種類、濃度、反応温度、及びその他反応に好適に用いられる各種成分もまた、上記工程Ａの組成及び条件が好ましい。
【００４０】
また、これら工程Ｆに用いられる成分は、あらかじめ工程Ｅにおける抗体と酵素の抗原抗体反応時に最初から添加しておき、その反応液を直接工程Ｆに用いても良いが、工程Ｅ終了後に別に添加して、その液を工程Ｆに供しても良い。
また、２．の抗体群を検出するための工程Ｅは１．の抗体群を検出するための工程Ｂに相当する酵素と逆転写酵素活性阻止抗体との抗原抗体反応であり、従って、工程Ｅでの反応条件は上述の工程Ｂでの条件と同じであることが好ましい。
【００４１】
そして２．に示した阻害抗体群を測定する際の、検体、固相担体、基材への核酸の固相化方法、固相上のオリゴｄＴ、ポリＡ、使用する逆転写酵素、デオキシモノヌクレオチド３リン酸は上述の１．に示した抗体群の場合と同一でよい。
次に３．に示した逆転写酵素と検体（抗体）との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を検出するための具体的原理を以下に説明する。固相上の実質的なオリゴｄＴと実質的なポリＡとのハイブリダイゼーション物と一定量のＨＩＶ由来の逆転写酵素とを、少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応させ、未反応の酵素を洗浄除去したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体と逆転写酵素のＤＮＡ合成基質であるデオキシモノヌクレオチド３リン酸とを含む酵素反応液を同時に添加して逆転写酵素反応させ、最終的に合成された核酸量を定量し、その量に基づいて検体と反応したことによって抑制された酵素活性を定量して逆転写酵素活性阻止抗体を測定する方法を見いだした。
【００４２】
すなわち、ＨＩＶ由来の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法において、少なくとも下記の３つの工程を行うことを特徴とする逆転写酵素活性阻止抗体の測定法で、工程Ｉ：透明なまたは半透明なまたは着色した固相上に固相化された実質的なオリゴｄＴとそれにハイブリダイズした実質的なポリＡと逆転写酵素とを結合反応せしめ、工程Ｊ：工程Ｉで反応した酵素と未反応の酵素とを洗浄分離したのち、逆転写酵素活性阻止抗体を含む検体とデオキシモノヌクレオチド３リン酸を同時に添加することにより固相上の逆転写酵素によって鋳型ＲＮＡに対して相補的な核酸を合成せしめ、工程Ｋ：合成された核酸量に基づいて、抗体の酵素活性阻止を定量する工程を特徴とする。
【００４３】
上記の逆転写酵素活性阻止抗体の測定法の工程Ｉにおいて、少なくとも２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下で結合反応せしめることが好適である。
３．の抗体群を検出する工程において逆転写酵素と鋳型−プライマーとの結合反応は工程Ｉにおいて行われ、この工程は上述の１．の抗体群検出の工程Ａ、または上述の２．の抗体群検出の工程Ｆに相当する。従って、工程Ｉでの反応条件は上述の工程Ａでの条件と同じく、逆転写酵素と鋳型−プライマーとの結合反応は、２価の金属イオンを生ぜしめる水溶性の金属塩の存在下にて反応させればそれでよい。そして、その種類、濃度、反応温度、及びその他反応に好適に用いられる各種成分もまた、上記工程Ａの組成及び条件が好ましい。
【００４４】
工程Ｊにおいては、逆転写酵素反応と、逆転写酵素と活性阻止抗体との抗原抗体反応とが同時に行われ、上述の１．の抗体群検出の工程Ｂ及びＣまたは２．抗体群検出の工程Ｅ及びＧに相当する。工程Ｊの反応条件は、逆転写酵素反応が検出できる程度に反応できるような条件であればそれで良く、１．の抗体群検出における工程Ｂの反応条件に逆転写酵素のＤＮＡ合成基質、例えば  ３ＨｄＴＴＰ、３２ＰｄＴＴＰ、ビオチン標識ｄＵＴＰを酵素活性が検出できる程度に添加されていればよい。また、１．の抗体群検出における工程Ｃの反応条件の溶液中に、通常の抗原抗体反応に用いる反応組成が含まれていればよい。含まれる組成としては例えば、適当な緩衝液で抗原抗体反応に最適なｐＨを合わせ、そのｐＨにあわせて種類をトリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液、などから１種類かそれ以上選択すればそれでよく、そして、必要に応じてＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液であれば、なんでも用いることができる。また固相上の核酸を安定化させるためにエチレングリコールやリボヌクレアーゼインヒビターを添加しても用いることができる。
【００４５】
３．に示した阻害抗体群を測定する際の、検体、固相担体、基材への核酸の固相化方法、固相上のオリゴｄＴ、ポリＡ、使用する逆転写酵素、デオキシモノヌクレオチド３リン酸は上述の１．に示した抗体群の場合と同一でよい。
そしてこれら上述の３つの抗体群の測定法において、逆転写酵素によって形成される新たな固相上の核酸の検出法は逆転写酵素基質にラジオアイソトープ基質を用いればよく、例えば  ３ＨｄＴＴＰや３２ＰｄＴＴＰを用いた場合、逆転写酵素反応後未反応の基質を洗浄除去したのち、固相上に残存する放射活性を測定すればよい。また、好適には逆転写酵素基質として、非ラジオアイソトープ基質であるビオチン標識ｄＵＴＰを用いるのがよい。逆転写酵素反応後未反応の基質を洗浄除去後、パーオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼで標識したアビジンまたはストレプトアビジンと反応させ、さらに未反応物を洗浄除去したのち固相上に残存する酵素活性を測定すればそれでよく、この手法は通常用いられる手法である（中野ら、感染症学雑誌、１９９４年、第６８巻、第７号、９２３−９３１ページ）。
【００４６】
さらに具体的に手法を説明すれば、１．に示した逆転写酵素と検体（抗体）との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を測定する場合、例えば、逆転写酵素を５０ｍＭの塩化マグネシウム溶液中に溶解させておき、この液を鋳型−プライマーとしてオリゴｄＴ−ポリＡを固相化させた９６穴ＥＩＡ用プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートし酵素と鋳型プライマートを結合させる。
【００４７】
この後未反応の酵素を洗浄除去し、そのあと、逆転写酵素活性阻害抗体を含む被検液を１％トリトンＸ−１００等で希釈した検体溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートし未反応の検体を洗浄除去後、ビオチン標識ｄＵＴＰを含む逆転写酵素反応基質液を添加し、３７℃で２時間逆転写酵素反応させる。反応後未反応の基質を洗浄除去後アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、未反応物を洗浄除去した後アルカリフォスファターゼ基質であるパラニトロフェニルフォスフェートを添加して３７℃３０分間の発色を４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定する。その際、検体のかわりに検体を希釈した１％トリトンＸ−１００溶液のみを用いて測定したときの吸光度を１００％として、検体を用いたときの吸光度から残存活性％を求めると簡単に定量できる。
【００４８】
また、２．に示した酵素の鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を測定する場合、例えば、予め別の試験管内でＨＩＶ由来の逆転写酵素と逆転写酵素活性阻止抗体を含む血清検体を混合し、混合液の組成が、５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムとなるように調製し、３７℃で１時間インキュベートすることにより酵素と抗体の抗原抗体反応を行わせる。反応液に塩化マグネシウムを添加し反応液中の塩化マグネシウム濃度が５０ｍＭとなるように調製する。この液を鋳型−プライマーとしてオリゴｄＴ−ポリＡを固相化させた９６穴ＥＩＡ用プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートし酵素と鋳型プライマーとを結合させる。この後未反応物を洗浄除去し、ビオチン標識ｄＵＴＰを含む逆転写酵素反応基質液を添加し、３７℃で２時間逆転写酵素反応させる。そして固相上に新たに形成した核酸を検出するために１．の抗体群を検出する手法に従って行えば簡単に定量できる。
【００４９】
また、３に示される逆転写酵素と検体（抗体）との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を定量する場合、例えば、ＨＩＶ由来の逆転写酵素を５０ｍＭの塩化マグネシウム溶液中に溶解させておき、この液を鋳型−プライマーとしてオリゴｄＴ−ポリＡを固相化させた９６穴ＥＩＡ用プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートし酵素と鋳型プライマーとを結合させる。この後未反応の酵素を洗浄除去し、そのあと、逆転写酵素活性阻害抗体を含む被検液を１％トリトンＸ−１００等で希釈した検体溶液とビオチン標識ｄＵＴＰを含む逆転写酵素反応基質液を同時に添加し、３７℃で２時間逆転写酵素反応させる。反応後未反応の基質を洗浄除去後、固相上に新たに形成した核酸を検出するために１．の抗体群を検出する手法に従って行えば簡単に定量できる。
【００５０】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施例によりさらに例示するが、本発明は何らこれにより制限されるものではない。
【００５１】
【実施例１】
（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製
１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＣＤＩと略す；ペプチド研究所製）と、１００ｍＭの１−メチル−イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０；ＩＭＤと略す；シグマ社製）を含む水溶液に、オリゴｄＴ１９−２４  （平均鎖長：２２塩基；シグマ社製）を２００ｎｇ／１００μｌとなるように溶解し、その１００μｌずつを９６ウエルアミノプレート（住友ベークライト社製）のウエルにそれぞれ分注し、室温で２４時間反応させた。反応後この溶液を捨て、０．１５Ｍ    塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；以下、ＴＢＳと呼ぶ）２００μｌでウエルを３回洗浄した。このウエルに、８０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６Ｍ塩化ナトリウム、４ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液中にポリＡ（ファルマシア社製）が１０μｇ／１００μｌとなるように調製された溶液を１００μｌ添加し３７℃で１６時間インキュベートした。プレート上のポリＡ溶液を捨てた後、ＴＢＳで３回洗浄し、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートとした。
（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応
０．１％トリトンＸ−１００、ＨＩＶ−１型逆転写酵素（組換大腸菌による発現体；生化学工業社製）０．１ｍＵ／１００μｌ溶液中に０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００ｍＭの塩化マグネシウム濃度となるように調製し、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄し、逆転写酵素結合プレートとした。
（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応
ＨＩＶ感染血友病患者５名およびＨＩＶ非感染者５名の血清をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００溶液で２００倍に希釈し、１００μｌを逆転写酵素結合プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後反応液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。また、対照群として血清希釈液のかわりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００溶液を１００μｌを逆転写酵素結合プレートに添加して同様に操作した。
（４）逆転写酵素活性検出
（３）にて洗浄したプレートに、９０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１２６ｍＭ塩化カリウム、９ｍＭ塩化マグネシウム、０．４５ｍＭジチオスレイトール、１．０８ｍＭ還元型グルタチオン、１％トリトンＸ−１００、１．８％エチレングリコール、１１７μＭデオキシチミジントリフォスフェート（ｄＴＴＰ）、３μＭビオチン標識デオキシウリジントリフォスフェート（Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ；ベーリンガーマンハイム社製）溶液を１００μｌ添加し３７℃で２時間の逆転写酵素反応を行った。
【００５２】
反応後５Ｍ塩化ナトリウム溶液を１０μｌ添加しプレートを室温で５分静置したのち液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。プレートに、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、２％牛血清アルブミン溶液中にアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製）を２００００倍希釈した溶液を各ウエルに１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間インキュベート後、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。
【００５３】
洗浄後、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解したパラニトロフェニルフォスフェートジソディウム（シグマ社製）溶液を１５０μｌ添加し３７℃で３０分インキュベート後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ添加し、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定した。
（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量
（４）にて得られた吸光度において、血清検体を用いたときの吸光度を血清検体を用いないときに得られた吸光度で除し、血清検体を用いないときの酵素活性を１００％としたときの、残存活性％を計算した。その結果を表１に示した。
【００５４】
【表１】
0003618168.tif 000002
【００５５】
表１に示されるように、どのマグネシウムイオン濃度でも逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
また、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の時に、０．１％トリトンＸ−１００、逆転写酵素５ｍＵ／１００μｌ溶液中にマグネシウムが濃度０で試験した結果は、ＨＩＶ感染者Ｈ．Ｋ．で５６％、Ｋ．Ｋ．で６３％、Ｋ．Ｓ．で７１％、ＨＩＶ非感染者Ｍ．Ｔ．で１０３．４％、Ｔ．Ｅ．で１００．３％、Ｔ．Ｔ．で１１０．４％の残存活性であった。
【００５６】
【実施例２】
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従って、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の中の塩化マグネシウムのかわりに塩化マンガンまたは塩化カルシウムを用いて逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１の（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応、（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表２に示した。
【００５７】
【表２】
0003618168.tif 000003
【００５８】
表２に示されるように、用いたどの金属イオンにおいても、逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量でき、しかもどのイオン濃度でも定量できた。
【００５９】
【実施例３】
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製における、オリゴｄＴ１９−２４  のかわりにオリゴｄＴ５  、オリゴｄＴ１０（シグマ社製）、オリゴｄＴ２５−３０  、ポリｄＴ（平均鎖長７９４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の中の塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１の（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応、（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表３に示した。
【００６０】
【表３】
0003618168.tif 000004
【００６１】
表３に示されるように、用いたどの長さのオリゴｄＴでも、逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００６２】
【実施例４】
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製におけるポリＡのかわりにオリゴＡ１２ー１８  、ポリＡ（平均鎖長５３４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の中の塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１の（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応、（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表４に示した。
【００６３】
【表４】
0003618168.tif 000005
【００６４】
表４に示されるように、用いたどの長さのポリＡでも、逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００６５】
【実施例５】
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の中の塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素量を０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｍＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用いて、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを用い、実施例１の（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応、における、血清をＨＩＶ感染血友病患者５名のを用いて反応を行った。
【００６６】
その後実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。    また、これとは別に、上記手法の中で、逆転写酵素量を０．１、１、１０μＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用いた時、実施例１の（４）逆転写酵素活性の検出において、２時間の逆転写酵素反応のかわりに２４時間の逆転写酵素反応を行い、その他の操作条件は、同一で実施した。その結果を表５に示した。
【００６７】
【表５】
0003618168.tif 000006
【００６８】
表５に示されるように、用いたどの濃度の逆転写酵素でも、逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００６９】
【実施例６】
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の中の塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１の（３）逆転写酵素結合プレートと被検液との反応における血清の希釈を１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈液をそれぞれ用いて行いて抗原抗体反応を行わせ、その後実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表６に示した。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
表６に示されるように、用いたどの希釈濃度でも、逆転写酵素と検体との不可逆的結合による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００７２】
【実施例７】
（６）実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。
（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応
試験管に０．１％トリトンＸ−１００、ＨＩＶ−１型逆転写酵素（組換大腸菌による発現体；生化学工業社製）０．２ｍＵ／１００μｌ溶液中に０．０２、０．２、２、２０、２００、２０００ｍＭの塩化マグネシウム濃度となるように調製し酵素液とした。この酵素液に別の試験管に用意したＨＩＶ感染血友病患者５名およびＨＩＶ非感染者５名の血清をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００溶液で２００倍に希釈した被検液を別の試験管中で２００μｌずつ等量混合し、３７℃で１時間反応させた。また、対照群として血清希釈液のかわりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００溶液を用いて同様に操作した。
（８）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへの逆転写酵素の結合反応
（７）の反応後、反応液の１００μｌを（６）で調製したオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、液を捨て、プレートを０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。洗浄したプレートを実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表７に示した。
【００７３】
【表７】
0003618168.tif 000008
【００７４】
表７に示されるように、どのマグネシウムイオン濃度でも、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
また、逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応時に酵素液濃度５ｍＵ／１００μｌ、塩化マグネシウム濃度を０濃度としたときに結果は、ＨＩＶ感染者Ｈ．Ｋ．で２３．２％、Ｋ．Ｋ．で５４．４％、Ｋ．Ｓ．で４８．０％、ＨＩＶ非感染者Ｍ．Ｔ．で１１１．．％、Ｔ．Ｅ．で１０４．８％で、Ｔ．Ｔ．で１０２．７％の残存活性であった。
【００７５】
【実施例８】
実施例７の（６）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。試験管に実施例７の（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応における塩化マグネシウムのかわりに塩化マンガンまたは塩化カルシウムを用いて反応させた。反応液を実施例７の（８）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへの逆転写酵素の結合反応、実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表８に示した。
【００７６】
【表８】
0003618168.tif 000009
【００７７】
表８に示されるように、用いたどの金属イオンにおいても、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量でき、しかもどのイオン濃度でも定量できた。
【００７８】
【実施例９】
実施例７の（６）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製における、オリゴｄＴ１９−２４  のかわりにオリゴｄＴ５  、オリゴｄＴ１０（シグマ社製）、オリゴｄＴ２５−３０  、ポリｄＴ（平均鎖長７９４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。試験管中で、実施例７の（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして同様に反応させ、調製しておいたオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ反応液１００μｌを添加し、３７℃１時間インキュベート後、液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。洗浄したプレートを実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表９に示した。
【００７９】
【表９】
0003618168.tif 000010
【００８０】
表９に示されるように、用いたどの長さのオリゴｄＴでも、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００８１】
【実施例１０】
実施例７の（６）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製におけるポリＡのかわりにオリゴＡ１２ー１８  、ポリＡ（平均鎖長５３４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。試験管中で、実施例７の（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして同様に反応させ、調製しておいたオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ反応液１００μｌを添加し、３７℃１時間インキュベート後、液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。洗浄したプレートを実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１０に示した。
【００８２】
【表１０】
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【００８３】
表１０に示されるように、用いたどの長さのポリＡでも、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００８４】
【実施例１１】
実施例７の（６）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。試験管中で実施例７の（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素量を０．２、２、２０、２００、２０００、２００００、２０００００ｍＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用い、血清をＨＩＶ感染血友病患者５名のものを用いて同様に反応させた。この反応液を調製しておいたオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ１００μｌ添加し、３７℃１時間インキュベート後、液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。
【００８５】
洗浄したプレートを実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。    また、これとは別に、上記手法の中で、逆転写酵素量を０．２、２、２０μＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用いた時、実施例１の（４）逆転写酵素活性の検出において、２時間の逆転写酵素反応のかわりに２４時間の逆転写酵素反応を行い、その他の操作条件は、同一で実施した。その結果を表１１に示した。
【００８６】
【表１１】
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【００８７】
表１１に示されるように、用いたどの濃度の逆転写酵素でも、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００８８】
【実施例１２】
実施例７の（６）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。試験管中で実施例７の（７）逆転写酵素と被検液との抗原抗体反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、血清の希釈を２、２０、２００、２０００、２００００、２０００００倍希釈液をそれぞれ用いて同様に抗原抗体反応を行わせた。この反応液を調製しておいたオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートへ１００μｌ添加し、３７℃１時間インキュベート後、液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。洗浄したプレートを実施例１の（４）逆転写酵素活性検出、（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１２に示した。
【００８９】
【表１２】
0003618168.tif 000013
【００９０】
表１２に示されるように、用いたどの希釈濃度でも、酵素と鋳型−プライマーとの結合阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【００９１】
【実施例１３】
（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製
実施例１の（１）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従い、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。
（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応
調製したオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートから、実施例１の（２）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応に従い、逆転写酵素結合プレートを調製した。
（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応
調製したプレートに、ＨＩＶ感染血友病患者５名およびＨＩＶ非感染者５名の血清をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００溶液で１００倍に希釈した溶液５０μｌを添加し、さらに、１８０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、２５２ｍＭ塩化カリウム、１８ｍＭ塩化マグネシウム、０．９ｍＭジチオスレイトール、２．１６ｍＭ還元型グルタチオン、２％トリトンＸ−１００、３．６％エチレングリコール、２３４μＭデオキシチミジントリフォスフェート（ｄＴＴＰ）、６μＭビオチン標識デオキシウリジントリフォスフェート（Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ；ベーリンガーマンハイム社製）溶液を５０μｌ添加し３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後５Ｍ塩化ナトリウム溶液を１０μｌ添加しプレートを室温で５分静置したのち液を捨て、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。
【００９２】
プレートに、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、２％牛血清アルブミン溶液中にアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製）を２００００倍希釈した溶液を各ウエルに１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間インキュベート後、０．０２％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＴＢＳ溶液で５回洗浄した。
【００９３】
洗浄後、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解したパラニトロフェニルフォスフェートジソディウム（シグマ社製）溶液を１５０μｌ添加し３７℃で３０分インキュベート後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ添加し、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定した。この後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１３に示した。
【００９４】
【表１３】
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【００９５】
表１３に示されるように、どのマグネシウムイオン濃度でも、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
また、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートでの逆転写酵素の結合反応の時に、０．１％トリトンＸ−１００、逆転写酵素５ｍＵ／１００μｌ溶液中にマグネシウムが濃度０で試験した結果は、ＨＩＶ感染者Ｈ．Ｋ．で３３．２％、Ｋ．Ｋ．で２８．４％、Ｋ．Ｓ．で４９．２％、ＨＩＶ非感染者Ｍ．Ｔ．で１０２．６％、Ｔ．Ｅ．で１０６．５％、Ｔ．Ｔ．で１０７．１％の残存活性であった。
【００９６】
【実施例１４】
実施例１３の（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従って、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１３の（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応における塩化マグネシウムのかわりに塩化マンガンまたは塩化カルシウムを用いて逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応に従い同様に操作した。その後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１４に示した。
【００９７】
【表１４】
0003618168.tif 000015
【００９８】
表１４に示されるように、用いたどの金属イオンにおいても、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量でき、しかもどのイオン濃度でも定量できた。
【００９９】
【実施例１５】
実施例１３の（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製における、オリゴｄＴ１９−２４  のかわりにオリゴｄＴ５  、オリゴｄＴ１０（シグマ社製）、オリゴｄＴ２５−３０  、ポリｄＴ（平均鎖長７９４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１３（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応に従い同様に操作した。その後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１５に示した。
【０１００】
【表１５】
0003618168.tif 000016
【０１０１】
表１５に示されるように、用いたどの長さのオリゴｄＴでも、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【０１０２】
【実施例１６】
実施例１３の（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製におけるポリＡのかわりにオリゴＡ１２ー１８  、ポリＡ（平均鎖長５３４塩基）（ファルマシア社製）を用いて、オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１３の（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応に従い同様に操作した。その後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１６に示した。
【０１０３】
【表１６】
0003618168.tif 000017
【０１０４】
表１６に示されるように、用いたどの長さのポリＡでも、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【０１０５】
【実施例１７】
実施例１３の（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１３の（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素量を０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｍＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用いて、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応、における血清をＨＩＶ感染血友病患者５名のものを用いその他は同様に操作した。その後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。
【０１０６】
また、これとは別に、上記手法の中で、逆転写酵素量を０．１、１、１０μＵ／１００μｌの濃度の逆転写酵素を用いた時、実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応において、２時間の逆転写酵素反応のかわりに２４時間の逆転写酵素反応を行い、その他の操作条件は、同一で実施した。その結果を表１７に示した。
【０１０７】
【表１７】
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【０１０８】
表１７に示されるように、用いたどの濃度の逆転写酵素でも、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【０１０９】
【実施例１８】
実施例１３の（９）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートの調製に従いオリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレートを調製した。調製したプレートに実施例１３の（１０）オリゴｄＴ−ポリＡ固相化プレート上での逆転写酵素の結合反応における塩化マグネシウム濃度を５０ｍＭとして用い、逆転写酵素結合プレートを調製した。調製した酵素結合プレートを実施例１３の（１１）抗原抗体反応と逆転写酵素反応の同時反応における、血清の希釈を１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈液をそれぞれ用いて行いて抗原抗体反応を行わせ、同様に操作した。その後、実施例１の（５）逆転写酵素活性阻止抗体による活性阻止の定量を行った。その結果を表１８に示した。
【０１１０】
【表１８】
0003618168.tif 000019
【０１１１】
表１８に示されるように、用いたどの希釈濃度でも、逆転写酵素と抗体との競合反応による鋳型ＲＮＡからのＤＮＡ伸長反応阻害抗体群を活性阻害量として定量できた。
【０１１２】
【発明の効果】
逆転写酵素活性阻止抗体の研究用試薬において、簡便かつ再現良く活性阻止のエピトープ群を３つに分類することでウイルスの変異を抗体によって追跡検討でき、この分野の研究コストの低減化がはかれる。