(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードし、且つ配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体であって前記ヌクレオチド配列のいずれかに対して１個または数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有する配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するDNA分子であって、但し前記タンパク質がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのサブユニットとして機能することを特徴とする前記DNA分子。
【請求項２】
前記DNA分子がゲノムDNAであることを特徴とする請求項１に記載のDNA分子。
【請求項３】
アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を組換え宿主で発現させる発現ベクターであって、前記ベクターは請求項１または２に記載のDNA分子を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載のDNA分子を含有することを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項５】
請求項３に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのサブユニットとして機能し、且つアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質として機能する、請求項１または２に記載のDNA分子によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列番号３、配列番号４、およびそれらの機能的誘導体であって前記アミノ酸配列のいずれかに対して１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載のタンパク質に免疫反応性を有する単一特異性抗体。
【請求項９】
アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に転移させる段階と、
（ｂ）段階（ａ）の宿主細胞を、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現ベクターから発現させる条件下で培養する段階
を包含する前記方法。
【請求項１０】
アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性を調節する化合物の同定方法であって、
（ａ）アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性のモジュレーターを、請求項６に記載のタンパク質と混合する段階と、
（ｂ）前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果を測定する段階
を包含する前記方法。
【請求項１１】
グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターを、請求項６に記載のタンパク質を発現する細胞と混合する段階と、
（ｂ）前記チャンネルに対する前記モジュレーターの効果を測定する段階
を包含する前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
アベルメクチン（avermectin）は、もともと放線菌（Streptomyces avermitilis）から単離された大環状ラクトン類の一員である。半合成アベルメクチン誘導体であるイベルメクチン（ivermectin:22,23−ジヒドロ−アベルメクチンB1a）は、ヒトおよび動物の寄生蠕虫症および昆虫害虫を処置するのに世界中で使用されている。約15年前に発見されて以来、アベルメクチンは宿主に対して低毒性で最も有効なブロードスペクトルの体内及び外部寄生虫殺虫剤（endectocide）となっている。アベルメクチンは線虫（シェーファー［Schaeffer］,J.M.＆ハインズ［Haines］,H.W.、Biochem.Pharm.38、2329−2338（1989）；カリー［Cully］,D.F.＆パレス［Paress］,P.S.、Molecular  Pharm.40、326−332（1991））および昆虫（ローラー［Rohrer］,S.P.、マインケ［Meinke］,P.T.、ヘイズ［Hayes］,E.C.、ムロジック［Mrozik］、H.＆シェーファー［Schaeffer］,J.M.、Proc.Natl.Acad.Sci.、89、4168−4172（1992））膜の高親和性部位と基本的に不可逆的な相互作用を示し、また線虫（マーチン［Martin］,R.J.＆ペニントン［Pennington］,A.J.、Br.J.Pharmacol.98、747−756（1989））、節足動物（スコット［Scott］,R.H.＆デュース［Duce］,I.R.、Pestic.Sci.16、599−604（1985））、（デュース［Duce］,I.R.＆スコット［Scott］,R.H.、Brit.J.Pharmacol.、85、395−401（1985））および甲殻類（ズフォール［Zufall］,F.、フランケ［Franke］,C.＆ハット［Hatt］,H.、J.Exp.Biol.、142、191−205（1989））において、膜の塩素イオン透過性の増加を誘発する。アベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルの天然のリガンドは明らかになっていない（ターナー［Turner］,M.J.＆シェーファー［Schaeffer］,J.M.、Ivermectin and Abamectin（キャンベル［Campbell］,W.C編）、73−88（ニューヨーク州、Springer−Verlag、1989）。グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネル（glutamate−gated chloride channel）即ちＨ−レセプターは節足動物の神経および筋肉中に同定されている（リングル［Lingle］,C.＆マーダー［Marder］,E.、Brain  Res.212、481−488（1981））、（ホースマン［Horseman］,B.G.、セイモア［Seymour］,C.、ベルムデス［Bermudez］,I.＆ビードル［Beadle］,D.J.、Neurosci.Lett.85、65−70（1988））、（ワホード［Wafford］,K.A.＆サテレ［Sattelle］,D.B.、J.Exp.Bio.144、449−462（1989））、（リー［Lea］,T.J＆アシャーウッド［Usherwood］,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、333−350（1973））、（カル−キャンディ［Cull−Candy］,S.G.、J.Physiol.255、449−464（1976））。アベルメクチン類がバッタの筋肉のグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルを活性化させるということが提案されている（スコット［Scott］,R.H.＆デュース［Duce］,I.R.、Pestic.Sci.16,599−604（1985））。
土中線虫のCaenorhabditis  elegansはアベルメクチンに対して非常に敏感であり、各種の駆虫剤化合物の効果を調べるためのin  vitroモデルとして使用される（シェーファー［Schaeffer］,J.M.＆ハインズ［Haines］,H.W.、Biochem.Pharm.38、2329−2338（1989））。C.elegans  poly（Ａ）+RNAを注入されたアフリカツメガエル卵母細胞は、アベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルを発現する（アリーナ［Arena］,J.P.、リュー［Liu］,K.K.、パレス［Paress］,P.S.＆カリー［Cully］,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368−374（1991））。このチャンネルはまた、グルタメートに対しても感受性があることが確認されている（アリーナ［Arena］,J.P.、リュー［Liu］,K.K.、パレス［Paress］,P.S.、シェーファー［Schaeffer］,J.M.＆カリー［Cully］,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339−348（1992））。バッタの筋肉からのＨ−レセプターと同様に、グルタメートおよびアベルメクチン感受性の電流はイボテネート［ibotenate］で活性化され、低親和力でピクロトキシンにより遮断される（スコット［Scott］,R.H.＆デュース［Duce］,I.R.、Pestic,Sci.16、599−604（1985））、（リー［Lea］,T.J＆アシャーウッド［Usherwood］,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、333−350（1973））、（カル−キャンディ［Cull−Candy］,S.G.、J.Physiol.255、449−464（1976）、（アリーナ［Arena］,J.P.、リュー［Liu］,K.K.、パレス［Paress］,P.S.、シェーファー［Schaeffer］,J.M.＆カリー［Cully］,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339−348（1992））。
発明の概要
無脊椎動物中のアベルメクチン作用の標的をクローン化および特徴付けしたが、これはリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの新しいクラスに属するものである。組換え発現システムを使用して、無脊椎動物のグルタメートおよびアベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルをコードする２つの機能性DNA分子を単離した。これらタンパク質の電気生理学および構造的特性を、アミノ酸およびヌクレオチド配列と共に開示する。この組換えタンパク質は、チャンネルのモジュレーターを同定するのに有用である。この方法により同定されるモジュレーターは、治療薬、殺虫剤および駆虫剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１−GluClαのヌクレオチド配列を示す。
図２−GluClβのヌクレオチド配列を示す。
図３−GluClαのアミノ酸配列を示す。
図４−GluClβのアミノ酸配列を示す。
図５−アフリカツメガエル卵母細胞中のグルタメート感受性およびIVMPO4感受性電流の電気生理学的特性を示す。
図６−GluClαおよびGluClβの透過性および電圧依存性を示す。
図７−IVMPO4によるグルタメート感受性電流の調節を示す。
図８−GluClαおよびGluClβの系統発生分析を示す。発明の詳細な説明
本発明は無脊椎動物のグルタメートおよびアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネル（GluCl）をコードするDNAに関するもので、このチャンネルはGluCl産生細胞から単離されたものである。本明細書においてはGluClは、グルタメートによって開閉される（gated）アニオンチャンネルとして特異的に機能することができるタンパク質を意味する。
無脊椎動物のGluClのアミノ酸配列は従来知られておらず、またGluClをコードしたヌクレオチド配列も不明であった。本発明はグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルのクローン化に関する初めての報告である。これはまた、アベルメクチンの無脊椎動物標的および無脊椎動物のアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルのクローン化に関する最初の報告でもある。アベルメクチン感受性のすべての生物は、ここに記述したグルタメートおよびアベルメクチン感受性チャンネルを含むものと考えられる。GluCl産生能力のある無脊椎動物細胞には、アベルメクチンに感受性を示す生物から単離された筋肉または神経細胞などがあるが、それらに限定されない。アベルメクチンに感受性の動物は多岐にわたり、節足動物門および線虫門に属する無脊椎動物などがこれに含まれる。
その他の細胞および細胞系もまたGluCl  cDNAの単離に使用するのに好適なものがありうる。好適な細胞の選択は、細胞抽出物中のGluCl活性をスクリーニングすることによって行うことができる。GluCl活性は、3H−イベルメクチン結合検定（カリーおよびパレス、前掲；ローラーら、前掲）またはグルタメートおよびアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルの直接電気生理学的測定（マーチン［Martin］,R.J.＆ペニントン［Pennington］,A.J.、Br.J.Pharmacol.98、747−756（1989）；スコット［Scott］,R.H.＆デュース［Duce］,I.R.、Pestic.Sci.16、599−604（1985）；デュース［Duce］,I.R.＆スコット［Scott］,R.H.、Brit.J.Pharmacol.、85、395−401（1985）；ズフォール［Zufall］,F.、フランケ［Franke］,C.＆ハット［Hatt］,H.、J.Exp.Biol.、142、191−205（1989））を実施することによりモニターすることができる。この検定でGluCl活性を有する細胞は、GluCl  DNAまたはmRNAの単離用に好適でありうる。
GluCl  DNAの分子クローン化には、当分野で公知の種々の方法のいずれも使用することができる。これらの方法としては、適当な発現ベクター系中にGluCl含有cDNAライブラリを構築した後、GluCl遺伝子の直接機能発現を行うものがあるが、これらに限定されない。別の方法としては、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたGluCl含有cDNAライブラリを、GluClサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリーニングするものである。その他の別法としては、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたGluCl含有cDNAライブラリを、GluClサブユニットをコードする部分的cDNAを用いてスクリーニングするものがある。この部分的cDNAは、精製GluClサブユニットのアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を通して、GluCl  DNAフラグメントの特異的PCR増幅により得られる。
別の方法は、GluCl産生細胞からRNAを単離し、そのRNAをin  vitroまたはin  vivo翻訳システムを通してタンパク質に翻訳するものである。RNAをペプチドタンパク質に翻訳すると、GluClタンパク質の少なくとも一部が産生し、そのタンパク質は例えば抗GluCl抗体との免疫反応性またはGluClタンパク質の生物学的活性によって同定することができる。この方法においては、GluCl産生細胞から単離されたRNAプールを分析して、GluClタンパク質の少なくとも一部をコードするRNAの存在を知ることができる。RNAプールをさらに分別して、GluCl  RNAを非GluCl  RNAから精製できる。この方法によって産生されたペプチドまたはタンパク質を分析して、アミノ酸配列を得、それをGluCl  cDNA産生のためのプライマーを得るために使用し、あるいは翻訳に使用したRNAを分析してGluClをコードするヌクレオチド配列を得、そしてGluCl  cDNA産生のためのプローブを作ることができる。この方法は当分野では既知のものであり、例えば、マニアティス［Maniatis］,T.、フリッチュ［Fritsch］,E.F.、サンブルック［Sambrook］,J.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989に記述されている。
当業者には、他の型のライブラリー、並びに他の細胞または細胞型から構築されたライブラリーが、GluClをコードするDNAの単離に有用でありうることは周知のことである。他の型のライブラリーとしては、他の細胞由来のcDNAライブラリー、C.elegans以外の生物からのcDNAライブラリー、およびYAC（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを含むゲノムDNAライブラリーなどがあるが、これらに限定されない。
当業者には、適当なcDNAライブラリーがGluCl活性を有する細胞または細胞系から調製できることは周知のことである。GluCl  cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの調製用に使用する細胞または細胞系の選択は、まず細胞に連関しているGluCl活性を、アベルメクチンおよびグルタメート感受性塩素イオンチャンネルの電気生理学的測定、あるいはグルタメートまたはアベルメクチンのリガンド結合検定により測定することによって行うことができる。
cDNAライブラリーの調製は当分野で周知の標準手法によって実施できる。周知のcDNAライブラリー構築手法は、例えば、マニアティス,T.、フリッチュ,E.F.、サンブルック,J.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual第２版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989）に記載されている。
当業者にはまた、GluClをコードするDNAは適当なゲノムDNAライブラリーから単離できることも周知である。ゲノムDNAライブラリーの構築は当分野で周知の標準手法によって行うことができる。周知のゲノムDNAライブラリー構築手法は、マニアティス,T.、フリッチュ,E.F.、サンブルック,J.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual第２版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989）に記載されている。
上記の方法によってGluCl遺伝子をクローン化するためには、GluClのアミノ酸配列が必要であろう。これを達成するためには、GluClタンパク質を精製し、そして自動配列決定装置によって部分的アミノ酸配列を決定すればよい。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的GluCl  DNAフラグメントのPCR増幅のためのプライマーを作成するために、タンパク質の２つの領域の６から８のアミノ酸の直線配列を決定する。
好適なアミノ酸配列が同定された後、それらをコードする能力のあるDNA配列が合成される。遺伝子コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために１つ以上のコドンが使用され、従って、アミノ酸配列は類似DNAオリゴヌクレオチドのセットのいずれにもコードされる。セットの一員だけがGluCl配列と同一であるが、その一員はミスマッチのDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえもGluCl  DNAにハイブリダイズする能力がある。このミスマッチのDNAオリゴヌクレオチドはなお、GluClをコードするDNAの同定および単離を可能にするのに充分な程度にGluCl  DNAとハイブリダイズする。これらの方法によって単離されたDNAを用いて多種類の細胞型由来、また無脊椎および脊椎動物源由来のDNAライブラリーをスクリーニングし相同遺伝子を単離することができる。
精製された生物学的活性を有するGluClはいくつかの異なった物理的形態を有することがある。GluClは、全長の新生またはプロセシングを受けていないポリペプチド、あるいは部分的にプロセシングを受けたポリペプチドまたはプロセシングを受けたポリペプチドの組み合わせとして存在しうる。全長新生GluClポリペプチドは、特異的な蛋白分解開裂によって翻訳後に修飾することができ、それによって全長新生ポリペプチドのフラグメントが形成される。単一のフラグメント、または物理的に会合したフラグメントはGluClに関連する完全な生物学的活性（グルタメートゲーテッドおよびアベルメクチンゲーテッド塩素イオンチャンネル）を有するが、GluCl活性の程度は個々のGluClフラグメントと物理的会合GluClポリペプチドフラグメントでは差がありうる。
本明細書に述べた方法により得られるクローン化GluCl  DNAは、適当なプロモーターおよびその他適当な転写制御エレメントを含む発現ベクターへの分子クローン化により、組換え的に発現させることができ、原核または真核宿主細胞中に転移させて、組換えGluClを産生させることができる。そのような操作技法は前掲のマニアチス,Tらに詳述されており、また当分野では周知である。
発現ベクターとは、本明細書では、適当な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写およびそれらのmRNAの翻訳に必要なDNA配列と定義される。そのようなベクターを用いて、E.Coliなどのバクテリア、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、および動物細胞のような各種の宿主中で真核遺伝子を発現させることができる。
特異的に設計されたベクターは、バクテリア−酵母またはバクテリア−動物細胞またはバクテリア−真菌細胞またはバクテリア−無脊椎動物細胞のような宿主間でDNAの相互自律増殖（shuttling）を可能とする。適切に構築された発現ベクターには次のものが含まれていなければならない：宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高次コピー能、および活性なプロモーター。プロモーターとは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させ、そしてRNA合成を開始させるDNA配列と定義される。強力なプロモーターとは、mRNAを高頻度で開始させるものである。発現ベクターとしては、クローン化ベクター、修飾されたクローン化ベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスなどがあるが、これらに限定されない。
哺乳類細胞中で組換えGluClを発現させるのに各種の哺乳類発現ベクターを使用できる。組換えGluCl発現に好適と考えられる市販の哺乳類発現ベクターとしては、pMAMneo（Clontech）、pcDNA3（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO−pSV2−neo（ATCC  37593）、pBPV−１（８−２）（ATCC  37110）、pdBPV−MMTneo（342−12）（ATCC  37224）、pRSVgpt（ATCC  37199）、pRSVneo（ATCC  37198）、pSV2−dhfr（ATCC  37146）、pUCTag（ATCC  37460）およびlZD35（ATCC  37565）などがあるが、これらに限定されない。
バクテリア細胞中で組換えGluClを発現させるのに各種のバクテリア発現ベクターを使用できる。組換えGluCl発現に好適と考えられる市販のバクテリア発現ベクターとしては、pETベクター（Novagen）およびpQEベクター（Qiagen）などがあるが、これらに限定されない。
酵母のような真菌細胞中で組換えGluClを発現させるのに各種の真菌細胞発現ベクターを使用できる。組換えGluCl発現に好適と考えられる市販の真菌細胞発現ベクターとしては、pYES2（Invitrogen）およびPichia発現ベクター（Invitrogen）などがあるが、これらに限定されない。
昆虫細胞中で組換えGluClを発現させるのに各種の昆虫細胞発現ベクターを使用できる。GluClの組換え発現に好適と考えられる市販の昆虫細胞発現ベクターとしては、pBlueBac II（Invitrogen）などがあるが、これらに限定されない。
GluClをコードするDNAはまた、組換え宿主細胞で発現させるために発現ベクターにクローン化されてもよい。組換え宿主細胞は原核または真核とすることができ、E.Coliのようなバクテリア、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系などの哺乳類細胞、ならびに、ショウジョウバエおよび蚕由来の細胞系などの昆虫細胞などがあるが、これらに限定されない。哺乳動物種由来の細胞系として好適且つ市販されているものには、CV−１（ATCC  CCL70）、COS−１（ATCC  CRL1650）、COS−７（ATCC  CRL1651）、CHO−K1（ATCC  CCL61）、3T3（ATCC  CCL92）、NIH/3T3（ATCC  CRL1658）、HeLa（ATCC  CCL2）、C127I（ATCC  CRL1616）、BS−Ｃ−１（ATCC  CCL26）、MRC−５（ATCC  CCL171）、Ｌ−細胞類、およびHEK−293（ATCC  CRL1573）などがあるが、これらに限定されない。
発現ベクターは宿主細胞中に、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、および電気穿孔など、多くの技法のいずれかにより導入することができるが、技法はこれらに限定されない。発現ベクターを含む細胞はクローン増殖され、それらがGluClタンパク質を産生するかどうかを調べるために個々に分析する。GluClを発現する宿主細胞クローンの同定は、抗GluCl抗体との免疫反応性、宿主細胞連関GluCl活性の存在の確認など、いくつかの方法により行うことができるが、方法はこれらのものに限定されない。
GluCl  DNAの発現はまた、in  vitro産生の合成mRNAを使用しても行うことができる。合成mRNAまたはGluCl産生細胞から単離されたmRNAは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物などの各種の無細胞システム、並びにカエル卵母細胞へのマイクロ注入などの細胞ベースシステムで効率的に翻訳させることができるが、カエル卵母細胞へのマイクロ注入が好ましい。しかし、これらに限定されない。
最適レベルのGluCl活性および／またはGluClタンパク質を産生するGluCl  DNA配列（群）を決定するためには、下記のものを含むGluCl  DNA分子を構築することができる:GluClα（52,550kDa）およびGluClβ（49,900kDa）サブユニットをコードするGluCl  cDNAの全長オープンリーディングフレーム、それぞれおよそ塩基51からおよそ塩基1,433までと、およそ塩基14からおよそ1,315まで（これらの数字は第１メチオニンの最初のヌクレオチドおよび第１停止コドンの前の最後のヌクレオチドに相当）のもの、およびGluClタンパク質をコードするcDNAの一部を含むいくつかの構築物。但しこれらに限定されるものではない。すべての構築物はGluCl  cDNAの5'または3'非翻訳領域を全く含まないか、または全部もしくは一部を含むものに設計することができる。GluCl活性およびタンパク質発現のレベルは、これらの構築物を単独または組み合わせで適当な宿主細胞に導入した後に測定することができる。一過性検定で最適発現を与えるGluCl  DNAカセットの決定後、このGluCl  DNA構築物を種々の発現ベクターに転移し、哺乳類細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、E.Coli、および酵母S.cerevisiaeなどの宿主細胞で発現させるが、宿主細胞はこれらに限定されない。
トランスフェクトされた宿主細胞およびマイクロ注入卵母細胞は、下記の方法によりGluClチャンネル活性のレベルおよびGluClタンパク質のレベルの両方について検定する。組換え宿主細胞の場合には、１つまたはそれ以上のサブユニットをコードするGluCl  DNAを含む１つあるいは可能であれば２つまたはそれ以上のプラスミドで同時トランスフェクションを行う。卵母細胞の場合には、１つまたはそれ以上のGluClサブユニット用に合成RNAを同時注入する。発現させるために適当な時間をおいた後、細胞性タンパク質を、例えば35S−メチオニンで24時間代謝的に標識し、その後細胞溶解産物および細胞培養上清を採取し、GluClタンパク質に対するポリクローナル抗体で免疫沈降する。
GluCl活性を検出するための他の方法は、GluCl  cDNAによりトランスフェクトされた細胞丸ごとまたはGluCl  mRNAを注入された卵母細胞のGluCl活性を直接測定するものである。GluCl活性は、GluCl  DNAを発現する宿主細胞の特異性リガンド結合および電気生理学的特性により測定する。GluClを発現する組換え宿主細胞の場合は、パッチ電圧クランプ法を用いて塩素イオンチャンネル活性を測定し、GluClタンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合には、塩素イオンチャンネル活性を測定し、GluClタンパク質を定量するために、パッチクランプ法並びに二電極式電圧クランプ法を使用することができる。
宿主細胞中のGluClタンパク質のレベルは、免疫親和および／またはリガンド親和法により定量される。GluClを発現する細胞は、細胞膜に結合した放射性グルタメートまたはイベルメクチンの量を測定することにより、発現されたGluCl分子の数に関し検定することができる。例えば35S−メチオニン標識または無標識GluClタンパク質を単離するのに、GluCl特異性の親和性ビーズまたはGluCl特異性抗体が使用される。標識GluClタンパク質はSDS−PAGEによって分析される。無標識GluClタンパク質は、GluCl特異性抗体を用いてウエスタンブロット法、ELISAまたはRIA検定により検出される。
遺伝子コードは縮重しているため、ある特定のアミノ酸をコードするのに２つ以上のコドンを使用することができ、従ってアミノ酸配列は類似DNAオリゴヌクレオチドのひとつのセットの内のいずれかによりコードさせることができる。そのセットの一員だけはGluCl配列に同一であるが、ミスマッチのDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえも、適当な条件下ではGluCl  DNAにハイブリダイズする能力がある。別の条件下では、ミスマッチのDNAオリゴヌクレオチドはなおGluCl  DNAにハイブリダイズすることができ、GluClをコードするDNAの同定および単離を可能にする。
特定の生物からのGluClをコードするDNAは、他の生物からのGluCl相同体を単離し、精製するのに使用することができる。これを行うためには、適当なハイブリダイズ条件で第１のGluCl  DNAをGluCl相同体をコードするDNAを含むサンプルと混合すればよい。ハイブリダイズされたDNA複合体を単離し、そこからDNA相同体をコードするDNAを精製することができる。
特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには相当数の重複があることが知られている。従って、本発明は結果として同一のアミノ酸の翻訳をコードする別のコドンを含むDNA配列にも関する。この明細書の目的においては、１つまたはそれ以上の置換コドンを有する配列を、縮重変異体と定義する。同じく本発明の範疇に入るものとして、発現されたタンパク質の最終的な物性を実質的に変化させないDNA配列または翻訳タンパク質のいずれかにある変異もある。例えば、バリンとロイシン、アルギニンとリシン、またはアスパラギンとグルタミンの置換は、ポリペプチドの機能性に変化を起こさない可能性がある。
ペプチドをコードするDNA配列は、天然のペプチドの特性と異なる特性のペプチドをコードするように変えることができることが知られている。DNA配列を変更する方法としては、部位指向性突然変異誘発があるが、これに限定されない。変更される特性の例としては、基質に対する酵素の親和性またはリガンドに対するレセプターの親和性の変化などがあるが、これらに限定されない。
本明細書においては、GluClの“機能性誘導体”とはGluClの生物活性と実質的に同様の生物活性（機能的または構造的いずれか）を有する化合物である。“機能性誘導体”という用語は、GluClの“フラグメント”、“変異体”、“縮重変異体”、“アナログ”および“相同体”または“化学的誘導体”を含むものとする。“フラグメント”という用語は、GluClのポリペプチドのサブセットをすべて意味するものとする。“変異体”という用語は、GluCl分子全体またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似した構造および機能の分子を指すものとする。ある分子がGluClと“実質的に類似”するということは、両方の分子が実質的に同様の構造を有するか、あるいは両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合のことである。従って、もし２つの分子が実質的に同様の活性を有する場合、それらはたとえ一方の分子の構造が他方の分子に見られなくても、あるいは２つのアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体とみなされる。“アナログ”という用語は、GluCl分子全体またはそれのフラグメントのいずれかの機能が実質的に類似している分子を指す。
組換え宿主細胞中でGluClを発現した後、GluClを活性な形で得るためにGluClタンパク質を回収する。いくつかのGluCl精製方法が利用でき、好適に使用できる。前述の天然源からのGluClの精製のように、組換えGluClも、細胞溶解産物および抽出物、或いはならし培養培地から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィーの、単独または種々の組み合わせにより精製することができる。
さらに、組換えGluClは、全長の新生GluCl、GluClのポリペプチドフラグメントまたはGluClサブユニットに対して特異性のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いた免疫親和性カラムを使用して、他の細胞性タンパク質から分離することができる。
GluClに対して単一特異性の抗体は、GluClに対して反応性の抗体を含む哺乳類の高血清から精製するか、またはケーラー［Kohler］およびミルスタイン［Milstein］、Nature  256:495−497（1975）の方法を用いて、GluClに反応性のモノクローナル抗体として調製する。単一特異性抗体とは、本明細書においては、GluClに対して均質な結合特性を有する単一抗体種或いは複数抗体種と定義される。均質な結合とは、本明細書において、前述のGluClに連関したものなどの、特異的抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を意味する。GluCl特異性の抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマのような動物に、免疫アジュバントを使用または使用しないで、適当な濃度のGluClを用いて免疫することにより作成されるが、ウサギを使用するのが好ましい。
初回免疫に先立って免疫前の血清を採取する。各動物に、約0.1mgから約1000mgの間のGluClを、許容される免疫アジュバントとともに与える。そのような許容アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium  parvumを含む油中水滴型エマルションおよびtRNAなどがあるが、これらに限定されない。初回免疫は、皮下（SC）、腹腔内（IP）のいずれか、または両方で、複数の部位に、GluClを好ましくはフロイントの完全アジュバントに入れて与える。各動物は一定間隔で、好ましくは毎週採血して抗体価を測定する。動物には初回免疫後に、追加免疫をしてもしなくてもよい。追加免疫を受ける動物は、通常フロイントの不完全アジュバントに入れた等量の抗原を同じ経路で与える。追加免疫は最高の抗体価となるまで約３週間の間隔で与える。各追加免疫の約７日後、または１回免疫の後ほぼ毎週動物から採血し、血清を集めて、アリコートを約−20℃で保存する。
GluClに反応性のモノクローナル抗体（mAb）は、近交系マウス、好ましくはBalb/cをGluClで免疫して調製される。マウスはIPまたはSC経路によって、約0.1mgから約10mg、好ましくは約1mgのGluClを、前述のように等量の許容アジュバントを加えた約0.5mlの緩衝液または生理食塩水に入れたもので免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。マウスは０日目に初回免疫を受け、約３から約30週間放置される。免疫されたマウスは経静脈（IV）経路により約0.1から約10mgのGluClをリン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液に入れたもので１回ないしそれ以上追加免疫する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当分野で公知の標準手法により、免疫マウスから脾臓を取り出すことによって得る。この脾リンパ球を適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と安定なハイブリドーマの形成ができるような条件下で混合して、ハイブリドーマ細胞を作る。融合相手としては、下記に限定されるものではないが、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1;MPC−11;S−194およびSp2/0などがあり、Sp2/0が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、濃度約30％から約50％で約1,000の分子量をもつポリエチレングリコール中で融合される。融合したハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン添加ダルベッコの修正イーグル培地（DMEM）中で、当分野で公知の手法により増殖して選択される。上清液を増殖陽性ウェルから約14、18、および21日目に集め、抗原としてGluClを使用して固相免疫放射検定（SPIRA）のような免疫検定により抗体産生物をスクリーニングする。この培養液はまたモノクローナル抗体のアイソタイプを検査するためにオクタロニー沈降検定によっても試験される。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞はマクファーソン［MacPherson］の軟寒天技法（クルーズ［Kruse］およびパターソン［Paterson］編、Tissue Culture Methods and Applications,Academic Press、1973刊中のSoft Agar Techniques）のような方法によりクローン化される。
モノクローナル抗体は、プリスタン初回感作Balb/cマウスに、初回感作約４日後に約２×106から約６×106のハイブリドーマ細胞を、マウス１匹当り約0.5ml注入することにより、in  vivoで作成される。細胞転移の約８〜12日後に腹水を採取し、当分野で公知の方法によりモノクローナル抗体を精製する。
抗GluClモノクローナル抗体のin  vitro産生は、約２％のウシ胎児血清を含むDMEM中でハイブリドーマを増殖させ、充分な量の特異性モノクローナル抗体を得ることで行なう。このモノクローナル抗体は当分野で公知の方法により精製される。
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降法、受動凝集法、酵素結合イムノソルベント抗体法（ELISA）および放射免疫検定（RIA）法などの各種の血清学的または免疫学的検定法により測定されるが、これらに限定されない。体液または組織および細胞抽出物中のGluClの存在を検出するためにも、同様の検定法が使用される。
当業者には、単一特異性抗体を調製する上述の方法が、GluClポリペプチドフラグメント、または全長新生GluClポリペプチド、あるいは個々のGluClサブユニットに特異性の抗体を作るために利用できることは周知のことである。特に、ただ１つのGluClサブユニットまたは完全に機能的なグルタメートゲーテッド／アベルメクチンゲーテッド塩素イオンチャンネルに特異性の単一特異性抗体が作れることは、当業者には自明である。
GluCl抗体親和性カラムは、Ｎ−ヒドロキシ  スクシンイミドエステルで活性化されたゲル支持体であるAffigel−10（Biorad）に、アガロースゲルビーズ支持体と抗体が共有結合をするように抗体を付加することによって作られる。次いで、この抗体はスペーサーアームを有するアミド結合によりゲルに結合する。次いで残った活性化エステルは1MエタノールアミンHCl（pH8）で消去（クエンチ）される。カラムを水洗後0.23MグリシンHCl（pH2.6）で洗浄し、非接合抗体または余分のタンパク質をすべて除去する。このカラムは次にリン酸緩衝生理食塩水（pH7.3）中で平衡させ、GluClまたはGluClサブユニットを含む細胞培養上清または細胞抽出物を緩やかにカラムに通す。このカラムを次に光学密度（A280）がバックグラウンド値に落ちるまでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、さらにタンパク質を0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）で溶出させる。精製されたGluClタンパク質は、次いでリン酸緩衝生理食塩水で透析する。
pGluClαおよびpGluClβと命名された２つのDNAクローンが同定されたが、これらはアフリカツメガエル卵母細胞で発現された時に、グルタメートおよびイベルメクチン−４−Ｏ−リン酸（IVMPO4）に感受性の塩素イオンチャンネルを形成するタンパク質をコードする。それぞれのサブユニットは明確に異なる電気生理学的および薬理学的特性を示すホモマーの塩素イオンチャンネルを形成する能力を有するものである。GluClαおよびGluClβサブユニットが同時に発現された場合、その特性は２つのタンパク質の相互作用を示し、卵母細胞中でヘテロマーの塩素イオンチャンネルを形成する。GluClα及びβの同時発現は、GluClをコードするpoly（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で観察される特性を再構築することになる（アリーナ,J.P.、リュー,K.K.、パレス,P.S.＆カリー,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368−374（1991））、（アリーナ,J.P.、リュー,K.K.、パレス,P.S.、シェーファー,J.M.＆カリー,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339−348（1992））。これらの特性には、IVMPO4、グルタメートおよびイボテネートによる電流の直接活性化；グルタメートの存在下の脱感作;IVMPO4によるグルタメート感受性電流の強化;I/V関係の外向き矯正（outwardly rectifying）；ピクロトキシンおよびフルフェナム酸による低親和性遮断；並びにGABAおよびグリシンに対する不感受性などが含まれる。
グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルは無脊椎動物においてのみ報告されており、昆虫の筋肉および神経細胞体、甲殻類筋肉中で見出され、そして昆虫筋肉poly（Ａ）+RNAから卵母細胞で発現される（リングル,C.＆マーダー,E.、Brain  Res.212、481−488（1981））、（ホースマン,B.G.、セイモア,C.、ベルムデス,I.及びビードル,D.J.、Neurosci.Lett.85、65−70（1988））、（ワホード,K.A.＆サテレ,D.B.、J.Exp.Biol.144、449−462（1989））、（リー,T.J.＆アシャーウッド,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、333−350（1973））、（カル−キャンディ,S.G.、J.Physiol.255、449−464（1976））。フレーザー［Fraser］,S.P.ら、Mol.Brain  Res.8、331−341（1990））。Ｈ（過分極）レセプターという用語は、グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルを、バッタ筋肉の興奮性Ｄ（脱分極）グルタメートレセプターから区別するために使用される（リー,T.J.及びアシャーウッド,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、333−350（1973））、（カル−キャンディ,S.G.、J.Physiol.255、449−464（1976））。GluClα及びβ  RNAを注入した卵母細胞と同じように、節足動物Ｈ−レセプターはイボテネートで特性的に活性化され、ピクロトキシンにより低親和性で遮断され、またGABAでは活性化されない（リングル,C.＆マーダー,E.、Brain  Res.212、481−488（1981））、（ワホード,K.A.＆サテレ,D.B.、J.Exp.Biol.144、449−462（1989））、（カル−キャンディ,S.G.、J.Physiol.255、449−464（1976））、（リー,T.J.＆アシャーウッド,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、351−363（1973））。バッタ筋肉Ｈ−レセプターは、C.elegans  poly（Ａ）+RNAから発現されたグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルと同じように、アベルメクチンで直接活性化される（スコット,R.H.＆デュース,I.R.、Pestic,Sci.16、599−604（1985））、（アリーナ,J.P.、リュー,K.K.、パレス,P.S.、シェーファー,J.M.＆カリー,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339−348（1992））。さらに、バッタ神経細胞体のグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルはアベルメクチンにより増強され、直接活性化される（アイダール［Aydar］,E.、ハーディング,L.、ビードル,D.J.＆ベルムデス,I.、Proceedings  of  the  British  Pharmacological  Society  24頁（1993））。したがって、GluClαおよびGluClβは節足動物のＨ−レセプターに関係するリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの１種であると考えられる。このクラスのチャネルは、C.elegans中でアベルメクチンの標的となり、他の生物中でアベルメクチンの駆虫および殺虫作用を媒介すると考えられる。
系統発生分析では、GluClαおよびGluClβがリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの特殊なサブクラスであり、グリシンαおよびβ、Lym  ｚおよびDros  rdlタンパク質に関連するものであることが示唆されている。これらのタンパク質は系統発生学的には関連しているが、異なるリガンドに応答し、薬理学的にも異なる（シュミーデン［Schmieden］,V.、グレニンロー［Grenningloh］,G.、ショフィールド［Schofield］,P.R.＆ベッツ［Betz］,H.、EMBO  Journal  ８、695−700（1989））、（フレンチ−コンスタント［ffrench−Constant］,R.H.、ロシュロー［Rocheleau］,T.A.、スタイヘン［Steichen］,J.C.＆チャーマーズ［Chalmers］,A.E.、Nature  363、449−451（1993））、（グレニンロー,G.ら、Neuron  ４、963−970（1990））、（ハットン［Hutton］,M.L.、ハーベイ［Harvey］,R.J.、アーレイ［Earley］,F.G.P.、バーナード［Barnard］,E.A.＆ダーリソン［Darlison］,M.G.、FEBS  letters  326、112−116（1993））。GluClαサブユニットとGluClβサブユニットの関連性は、グルタメートとIVMPO4の両方の結合部位が明らかに保存されている点にも現れている。ホモマーのGluClβチャンネルはグルタメートで直接活性化されるが、IVMPO4も結合する。なぜならば、グルタメートによる電流の活性化はIVMPO4の後では阻害されるからである。ホモマーのGluClαチャンネルでは、IVMPO4で直接活性化された電流はグルタメートで一層活性化され、GluClα上にグルタメートの結合部位があることを示している。
アベルメクチンは、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルファミリーのその他のものとも相互作用することが報告されている。線虫および昆虫ではアベルメクチンはGABA感受性電流を遮断するが、クレイフィッシュ（ザリガニ）中ではアベルメクチンはマルチトランスミッターゲーテッド塩素イオンチャンネル（グルタメート、アセチルコリン、GABA）を直接活性化する（マーチン,R.J.＆ペニントン,A.J.、Br.J.Pharmacol.98、747−756（1989））、（ズフォール,F.、フランケ,C.＆ハット,H.、J.Exp.Biol.、142、191−205（1989））、（ホールデン−ダイ［Holden−Dye］,L.＆ウォーカー［Walker］,R.J.、Parasitology  101、265−271（1990））、（ベルムデス,I.、ホーキンス［Hawkins］,C.A.、テイラー［Tayler］,A.M.＆ビードル,D.J.、Journal  of  Receptor  Research  11、221−232（1991））。ヒヨコ脳GABAaレセプターを発現している卵母細胞では、アベルメクチンはGABA応答を強化する（シーゲル［Sigel］,E.＆バウル［Baur］,R.、Mol.Pharmacol.32、749−752（1987））。さらに、アベルメクチンは哺乳類グリシンレセプターへのストリキニーネの結合を阻害する（グラハム［Graham］,D.、ファイファー［Pfeiffer］,F.＆ベッツ,H.、Neurosci.Letters  29、173−176（1982））。しかしながら、GluClαおよびGluClβタンパク質は、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルファミリーの中で、グルタメートおよびイボテネートに関して特異な薬理学的特性を示す唯一のものであり、従ってリガンドゲーテッドイオンチャンネルファミリーの新しいサブクラスである。
本発明はまた、GluClをコードするDNAまたはRNAの発現、ならびにin  vivoでのGluClタンパク質の機能を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。これらの活性を調節する化合物は、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性有機分子でありうる。これらの化合物はGluClをコードするDNAまたはRNAの発現、またはGluClタンパク質の機能を、強化または減弱化することにより調節しうる。GluClをコードするDNAまたはRNAの発現、あるいはGluClタンパク質の機能を調節する化合物は、各種の検定法により検出することができる。検定は、発現または機能に変化があるかどうかを測定する単純な“yes/no"検定とすることができる。この検定は、テストサンプルの発現または機能を、標準サンプルの発現または機能のレベルと比較することにより定量的なものとすることができる。この方法により同定されるモジュレーターは、治療薬剤、殺虫剤および駆虫剤として有用である。
GluCl  DNA、GluClに対する抗体、またはGluClタンパク質を含むキットを作ることもできる。そのようなキットは、サンプル中のGluCl  DNAにハイブリダイズするDNAを検出したり、またはGluClタンパク質またはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用される。そのような特徴付けは、法的分析および伝染病学研究など、これらに限定されるものではないが、各種の目的に有用なものである。
本発明のDNA分子、RNA分子、組換えタンパク質および抗体は、GluCl  DNA、GluCl  RNAまたはGluClタンパク質をスクリーニングしたり、またそれらのレベルを測定するのに使用することができる。組換えタンパク質、DNA分子、RNA分子、および抗体はそれ自体で、GluClの検出およびタイプ分け用に好適なキットを構成できる。そのようなキットは少なくとも１つの容器内にきっちり保持するのに適した区画された（compartmentalized）キャリヤを包含したものとなろう。このキャリヤにはさらに、GluCl検出に適した組換えGluClタンパク質または抗GluCl抗体のような試薬も含むものとなろう。このキャリヤはまた標識抗原または酵素基質などのような検出手段も含むものとすることができる。
アンチセンス治療のために、GluClをコードするDNA配列に相補的なヌクレオチド配列を合成することができる。これらのアンチセンス分子は、DNA、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなDNAの安定誘導体、RNA、2'−Ｏ−アルキルRNAのようなRNAの安定誘導体、またはその他のGluClアンチセンスオリゴヌクレオチド疑似体とすることができる。GluClアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入またはアンチセンス配列を有するベクターからの発現によって細胞に導入することができる。GluClアンチセンス治療は、GluCl活性を低減させるのが有効な疾病の治療に特に有用である。
GluCl遺伝子治療は、GluClを標的生物の細胞に導入するのに使用されうる。GluCl遺伝子はウイルスベクターに結合させることができ、このベクターが受手の宿主細胞に感染してGluCl  DNAの転移を媒介する。好適なウイルスベクターとしてはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどがある。かわりにGluCl  DNAを、リガンド−DNA接合体またはアデノウイルス−リガンド−DNA接合体を使用するレセプター媒介の標的DNA転移、リポフェクション膜融合または直接マイクロインジェクションなどの非ウイルス技法により、遺伝子治療用に細胞に転移することもできる。これらの方法およびそれらの変形法は、ex  vivoならびにin  vivoのGluCl遺伝子治療に好適である。GluCl遺伝子治療は特に、GluCl活性を引き上げるのが有効な疾病の治療に有用でありうる。
GluCl  DNA、GluCl  RNA、またはGluClタンパク質、あるいはGluClレセプター活性のモジュレーターを含む薬学的に有用な組成物は、薬学的許容キャリヤとの混合のような公知の方法で調製することができる。そのようなキャリヤおよび処方調製法の例は、レミントンの薬剤科学［Remington's Pharmaceutical Sciences］に記述されている。有効な投与に適する薬学的許容組成物を作るためには、そのような組成物に有効量のタンパク質、DNA、RNA、またはモジュレーターを含ませることになる。
本発明の治療または診断用組成物は、GluCl関連活性の変調が示されている疾病の治療または診断に必要充分な量をもって個体に投与される。有効量は個体の状態、体重、性別および年齢のような種々のファクターによって異なりうる。その他のファクターとしては投与方法もある。該薬剤組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内など種々の経路で個体に投与することができる。
“化学的誘導体”という用語は、通常はベース分子の一部を構成するものではない付加的な化学的部分を含む分子を意味する。そのような部分は、ベース分子の溶解性、半減期、吸収などを改善することもある。あるいはそうした部分は、ベース分子の望ましくない副作用を弱めたり、ベース分子の毒性を軽減させることもある。そのような部分の例は、レミントンの薬剤科学のような種々のテキストに記述されている。
本明細書で開示した方法に基づいて同定された化合物は、毒性の可能性を最小に抑さえ、且つGluClレセプターまたはその活性の最適抑止効果を得るために、通常のテストによって適当な処方量を求め、単独で使用することができる。さらに、その他の薬剤との同時投与また順次投与が望ましいこともある。
本発明はまた、本発明の新規な治療法用として好適な、局所、経口、全身および非経口薬剤組成物を提供するという目的も有する。GluClレセプターの調節用の活性成分として本発明に基づいて同定された化合物を含む組成物は、従来の投薬用賦形剤中の種々の治療投与形態で投与することができる。例えば、これらの化合物は錠剤、カプセル（それぞれ時間指定放出性および徐放性組成物を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエマルションのような経口投与形態で、または注射により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内（ボーラスおよび輪液の両方）、腹腔内、皮下、遮蔽または遮蔽しない局所、あるいは筋肉内形態で投与することもでき、すべての使用形態は薬剤分野の者に周知である。望ましい化合物の有効量且つ非毒性量を、GluClモジュレーターとして使用することもできる。
これら生成物の日用量は、患者１人につき１日当り0.01から1,000mgの広い範囲にわたる。経口投与の場合は、組成物は治療する患者に対して症状に合わせた投与のために活性成分として、好ましくは0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0および50.0ミリグラムを含むスコア付き（scored）またはスコアなしの錠剤の形として投与する。有効量の薬剤は通常、１日当り体重1kgにつき約0.0001mgから約100mgの投与レベルで与えられる。この範囲はさらに具体的には、１日当り体重1kgにつき約0.001mgから10mgである。GluClレセプターモジュレーターの処方量は、望ましい効果を達成するために組み合わせる場合には調節する。他方、これら種々の薬剤の処方量を個別に最適化し、いずれかの薬剤を単独で使用した場合よりも症状を軽減させるような相乗的結果を得るために組み合わせることもできる。
便宜的には、本発明の化合物は１日１回投与してもよく、または合計日用量を１日２、３または４回の用量に分割して投与することもできる。さらに、本発明の化合物を適当な点鼻用賦形剤を局所的使用する点鼻用剤の形、あるいは当業者に周知の経皮性皮膚パッチの形態を使用した経皮経路で投与することもできる。経皮デリバリーシステムの形で投与する場合は、もちろん全投与を通じて、処方量の投与は間欠的ではなく連続的なものとなる。
１つ以上の活性薬剤を使用する組合せ治療において、活性薬剤が個別の組成物となっている場合、それら活性薬剤を同時に投与することもできるし、或いはそれぞれを個別に時間をずらして投与することもできる。
本発明の化合物を使用する処方法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および症状；治療すべき症状の程度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓の機能；並びに使用される特定の化合物、など多くのファクターに応じて選択される。通常の技術の医者または獣医であれば、症状の進行の予防、対抗、または阻止に必要な薬剤有効量を簡単に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を発揮させるような範囲の薬剤の濃度を達成するために最適精度で決めるためには、標的部位への薬剤の到達の動態をベースとした処方が必要である。これには薬剤の分布、平衡、および排除といったことを考慮に入れなけらばならない。
本発明の方法において、本明細書で詳細に述べた化合物は活性成分を構成することができ、典型的にはこれらを投与しようとする形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップなどに応じて、また従来の薬学的慣行に沿って適切に選択された薬用希釈剤、賦形剤またはキャリヤ（ここではこれらを集合的に“キャリヤ”物質と呼ぶ）と混合した形で投与される。
例えば、錠剤またはカプセルの形での経口投与の場合には、活性薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などの、経口用の非毒性で薬学的に許容される不活性キャリヤと組み合わせることができる。さらに、望ましい場合または必要な場合には、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も混合物中に組み入れることができる。適当な結合剤としては、限定はされないが、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはベータラクトースのような天然糖類、とうもろこし甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどがある。これらの投与形態で使用される潤滑剤としては、限定はされないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。崩壊剤としては、限定はされないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどがある。
液体形状の場合は、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの天然および合成ゴムのような、適当にフレーバーのある懸濁剤または分散剤と活性薬剤成分を組合せることができる。その他使用できる分散剤としてグリセリンなども含まれる。非経口投与の場合は、滅菌した懸濁液または溶液が望ましい。静脈投与が望ましい場合には、通常適当な保存剤を含んだ等張性調剤が用いられる。
活性薬剤成分を含んだ局所調剤の場合は、たとえばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、PPG2プロピオン酸ミリスチルなどのような当業界で周知の各種キャリヤ物質と混合し、たとえばアルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、ならびにクリームまたはゲル組成物のシャンプーなどを作ることができる。
本発明の化合物はまた、小さい単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞および多重ラメラ小胞のようなリポソームデリバリーシステムの形で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような各種のリン脂質から作ることができる。
本発明の化合物はまた、その化合物分子を結合させたモノクローナル抗体を個々のキャリヤとして使用することによって送達されることもできる。本発明の化合物はまた、標的薬剤キャリヤとして溶解性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーとしては、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンなどがある。さらに本発明の化合物は、薬剤のコントロール放出を達成するのに有用な一群の生物分解性ポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーなどに結合することができる。
これらの化合物は、ヒト、動物、および植物に多くの寄生虫疾患を引き起こす体内および外部寄生虫、特に蠕虫および節足動物に対する抗寄生虫剤である。
寄生虫疾患は体内寄生虫または外部寄生虫のいずれかで引き起こされる。体内寄生虫とは、宿主の体内の器官内（胃、肺、心臓、腸など）または単純に皮膚の下に生息する寄生虫である。外部寄生虫とは、宿主の外表面に生息し、なおかつ宿主から栄養素を吸収する寄生虫である。
蠕虫病と一般的に呼ばれる体内寄生虫疾患は、蠕虫として知られている寄生虫に宿主が感染することによるものである。蠕虫病は、豚、羊、馬、牛、ヤギ、犬、猫、および家禽のような飼養動物への感染によって広く蔓延し、かつ世界的に深刻な経済的問題となっている。これら感染の多くは、線虫と呼ばれる一群の虫によって引き起こされるものであり、世界全土で各種の動物に疾病をもたらす。これらの疾病は重篤なものが多く、感染動物を死に至らせることがある。上記の動物に感染する最も一般的な線虫属は、Haemonchus、Trichostrongylus、Ostertagia、Nematodirus、Cooperia、Ascaris、Bunostomum、Oesophagostomum、Chabertia、Trichuris、Strongylus、Trichonema、Dictyocaulus、Capillaria、Heterakis、Toxocara、Ascaridia、Oxyuris、Ancylostoma、Uncinaria、Toxascaris、およびParascarisである。多くの寄生虫は種特異性（ただ一種類だけの宿主に感染）であり、またそれらのほとんどは動物内に好みの感染部位を持っている。HaemonchusおよびOstertagiaは主として胃に感染するのに対し、NematodirusおよびCooperiaは主として腸を攻撃する。その他の寄生虫は、心臓、眼、肺、血管などに好んで住みつくが、さらに他の種のものは皮下寄生虫である。蠕虫症は弱体化、体重減少、貧血、腸の損傷、栄養不良、およびその他の器管に損傷を与えることがある。これらの疾病を治療せずに放置すると動物を死に至らせることがある。
マダニ、ダニ、シラミ、サシバエ、ツノサシバエ、クロバエ、ノミなどのような外部寄生節足類による感染もまた深刻な問題である。これらの寄生虫による感染は、血液減少、皮膚の病変を起こし、また正常な食習慣を損なわせ、体重減少を招くことがある。これらの感染はまた、脳炎、アナプラズマ症、豚痘など、致命的な重病に至らせることもある。
動物は同時に数種類の寄生虫に感染されることがあるが、これは一種類の寄生虫による感染が動物を弱らせ、第２の寄生虫種による感染に対して敏感になるためである。したがってこれらの疾病の治療には、広範な活性領域を有する化合物が特に有利である。本発明の化合物はこれらの寄生虫に対する活性を有するものであり、さらに犬のDirofilariaに対しても、齧歯類のNematospiroidesおよびSyphacia、咬傷昆虫に対しても、また牛のHypoderma  sp.、馬のGastrophilusのような移動性双翅目幼虫に対しても活性である。
これらの化合物はまた、ヒトに寄生虫疾患をもたらす体内および外部寄生虫に対しても有用である。ヒトに感染するそれら体内寄生虫の例としては、Ancylostoma、Necator、Ascaris、Strongyloides、Trichinella、Capillaria、Trichuris、Enterobius属などの胃腸寄生虫がある。ヒトに感染するその他の体内寄生虫は、血液中またはその他の器官中に発見される。そのような寄生虫の例としては、Wucheria、Brugia、Onchocercaなどのフィラリア性虫、ならびにStrongylidesおよびTrichinellaである腸管内寄生虫の腸外段階のものがある。ヒトに寄生する外部寄生虫には、マダニ、ノミ、ダニ、シラミなどの節足動物があり、また家畜動物においてはこれらの寄生虫による感染は、重大な、時には致命的な病気に至らせることがある。本発明の化合物は、これら体内および外部寄生虫に対して活性であり、加えてヒトを悩ます咬傷昆虫およびその他の双翅目害虫に対しても活性である。
これらの化合物はまた、Blatella  sp.（ゴキブリ）、Tineola  sp.（シミ）、Attagenus  sp.（カツオブシムシ）、Mucsa  domestica（イエバエ）およびSolenopsis  Invicta（外来フシアリ）などの一般的な屋内の害虫に対しても有用である。
これらの化合物はさらに、アブラムシ（Acyrthiosiphon  sp.）、バッタ、およびメキシコワタミゾウムシのような農業害虫、並びにTribolium  sp.のような貯蔵穀物を荒らす昆虫害虫、および植物組織に生息する未成熟段階の昆虫に対しても有用である。これらの化合物はまた、農業的に重大な土中線虫の抑制用の線虫殺虫剤としても有用である。
動物の抗寄生虫剤として使用する場合には、これらの化合物は経口または注射により体内に、あるいは浸液またはシャンプーとして局所的に投与することができる。
経口投与の場合、これらの化合物はカプセル、錠剤、またはボーラスの形で投与することもでき、あるいは代わりに動物の餌に混合することもできる。カプセル、錠剤、およびボーラスは、活性成分と澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、またはリン酸二カルシウムのような適当なキャリヤ・賦形剤を組み合わせて含むものとする。これらの単位投与形態のものは、活性成分が、希釈剤、充填剤、崩壊剤、および／または結合剤などの適当な微粉状不活性成分と、均一な混合物となるように十分に混合して調製される。不活性成分とは、これらの化合物と反応せず、また治療しようとする動物に対して非毒性のものである。好適な不活性成分としては、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のゴムおよび油などがある。これらの組成物には、治療する動物種の大きさと種類および感染の種類と程度など、多くのファクターに応じて大幅に異なった量の活性および不活性成分を含みうる。活性成分はまた、それら化合物を単純に餌と混ぜるか、または化合物を餌の表面に塗布することによって、餌の添加物として投与することもできる。代わりに、活性成分を不活性キャリヤと混合し、その組成物を餌と混ぜるか、あるいは動物に直接給餌するか、のいずれかとすることもできる。好適な不活性キャリヤとしては、コーンミール、シトラスミール、発酵残留物、大豆粗粉、乾燥穀物などがある。活性成分はこれらの不活性キャリヤと、粉砕、撹拌、摩砕、あるいは回転混合により、最終組成物が0.001から５重量パーセントの活性成分を含むように十分に混合する。
代わりにこれらの化合物は、活性成分を不活性液体キャリヤに溶解した組成物を注射することによって、非経口的に投与することもできる。注射は筋肉内、こぶ胃内（intraruminal）、気管内、または皮下のいずれかとすることができる。注射可能な組成物は、活性成分を適当な不活性液体キャリヤと混合したもので構成される。許容される液体キャリヤとしては、ピーナッツ油、綿実油、胡麻油などの植物油、ならびにsolketal、グリセロール・フォーマルなどのような有機溶剤がある。代わりに、水性の非経口組成物も使用できる。植物油は好ましい液体キャリヤである。これらの組成物は、活性成分を液体キャリヤに、最終組成物が0.005から10重量パーセントの活性成分を含むように、溶解または懸濁させて調製する。
これらの化合物の局所適用は、本発明化合物を水性溶液または懸濁液として含む液浸またはシャンプーを使用することにより可能である。これらの組成物は通常、ベントナイトのような懸濁剤を含み、また普通は消泡剤も含む。活性成分を0.005から10重量パーセント含む組成物が許容される。好ましい組成物は、本発明化合物を0.01から５重量パーセント含むものである。
これら化合物は主に、牛、羊、馬、犬、猫、ヤギ、豚、および家禽類のような飼養動物の蠕虫症の治療および／または予防のための抗寄生虫剤として有用なものである。それらはまた、マダニ、ダニ、シラミ、ノミなどの外部寄生虫によるこれら動物の寄生虫感染の予防および治療にも有用である。それらはまた、ヒトの寄生虫感染の治療にも有用である。そのような感染の治療において、これら化合物は個別に使用するか、または互いに組み合わせるか、または無関係のその他の抗寄生虫剤と組み合わせて使用することもできる。最良の結果を得るために必要なこれら化合物の処方量は、動物の種類と大きさ、感染の種類と程度、投与方法と使用する化合物などのいくつかのファクターに応じて異なる。化合物の処方レベルとしては、動物の体重1kg当り0.0005から10mgを、１回処方または数日間の間隔を置いた数回処方とする、経口投与が一般的に良好な結果をもたらす。通常これら化合物の１種類の１回処方で良好に病状をコントロールできるが、再感染に対抗したり、あるいは異常に頑固な寄生虫種に対しては、繰り返し処方をしてもよい。これら化合物を動物に投与する技法については、獣医学の分野の者には公知のことである。
これらの化合物はまた、農場または貯蔵中の収穫物を攻撃する農業害虫に対抗するためにも使用することができる。そのような用途にはこれらの化合物をスプレー、粉剤、エマルションなどの形で、栽培中の植物または収穫物に適用する。このような方法でこれらの化合物を適用する技法については、農業分野の者には公知のことである。
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
実施例１
C.elegans  RNAの単離
C.elegans培養物を、E.coliを播種した寒天ペトリ皿上で維持し、SulstonおよびHodgkin〔The  Nematode  Caenorhabditis  Elegans、p602〜603（1988）、W.B.Wood編、出版社:Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、New  York〕の記載に従って60％ショ糖浮遊法により単離した。C.elegans調製物を液体窒素中で急速に凍結し、液体窒素に沈めた状態で乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。4Mのグアニジニウムチオシアネート、5mMのクエン酸ナトリウム（pH7.0）、および0.1Mのβ−メルカプトエタノールを含有する溶液を、虫1g当り10mlの割合で冷凍粉末化した虫を加えながら、ポリトロン・ホモジナイザーによって混合した。５分間ホモジネートした後、0.5％のサルコシルナトリウムを加え、充分混合し、そして溶液を10,000rpmで10分間遠心分離した。上清を5.7MのCsClクッション上に重ね、33,000rpmで16時間遠心分離した。RNAペレットを70％エタノールにて洗浄し、H2O中に再懸濁し、クロロホルム：イソブタノール（4:1）にて抽出を行い、エタノールにて沈澱させた。オリゴ（dT）−セルロースカラム上で精製を２回行いポリＡ（＋）RNAを単離した。ポリＡ（＋）RNAのアガロースゲル精製
ゲル化温度が極めて低いアガロース（SeaPrep、FMC）を使用してポリＡ（＋）RNAをサイズ分画した。15mMのNaPO4、1mMのEDTA（pH6.5）中でアガロース（２％）をボイルして、一旦完全に溶解させ、15mMのヨード酢酸（IAA）を加え、アガロースを更に２分ボイルして存在するRNaseをすべて不活性にした。全ての溶液を0.1％ジエチルピロカーボネートにて12時間処置し、15分間オートクレーブに付した。ゲル装置と分取用くしを15mMのIAA中に12時間浸し、DEPで処理したH2Oにて濯いだ。ゲルを作成し、緩衝液を循環させながら、15mMのNaPO4と1mMのEDTA（pH6.5）中で、４℃、6.5V/cmで電気泳動を行った。約20時間、若しくはゲル中のキシレンシラノールが7cmなるまでRNAの電気泳動を行った。ゲル内7.5cmの所からゲルの原点までの部分から約１〜2mmのゲルスライスを切り出し、１〜47の番号を（下から上の順で）付した。
RNAのサイズ分画
約150μｇのC.elegansポリＡ（＋）RNAをエタノールにて沈澱させ、その乾燥ペレットを400μｌのホルムアミド中に再懸濁し、65℃で３分間変性させ、50μｌの１％SDSと10mMのEDTAとを加え、混合し、得られたサンプルを65℃で３分間加熱した。50μｌのRNAローディング（loading）緩衝液（50％グリセロール、1mMのEDTA、0.4％BPB、0.4％XC）を加え、サンプルを直ちにロードした。
RNAの回収
ゲルスライスを15mlのチューブに加え、融解するまで65℃の浴中に置いた。10mlの予め温めた１倍（１×）のオリゴdT結合緩衝液（BB）を加え（0.5MのKCl、10mMのHEPES（pH7.5）、1mMのEDTA）、サンプルを混合し、室温（約23℃）にした。1gのオリゴdTセルロース（タイプ７、Pharmacia）を１倍BB中で水和し、1ug/mlのtRNAと25u/mlのRNasin（Promega）を含む15mlの１倍BB中に再懸濁した。200μｌのオリゴdTセルロース懸濁液を、溶融した各アガロースサンプル中に取り分け、１時間、反転（end−over−end）揺動した。サンプルを遠心分離し、１倍のBBにて１回洗浄し、１倍の洗浄緩衝液（0.1MのKCl、10mMのHEPES（pH7.5）、1mMのEDTA）にて２回洗浄した。サンプルをチューブに移し、10,000×ｇにて１分間遠心分離し、ペレットを200μｌの溶出緩衝液（10mMのHEPES（pH7.5）、1mMのEDTA）に再懸濁した。緩衝化したフェノールを用いて65℃で、またCHCl3を用いて22℃でRNAを抽出し、酢酸ナトリウムを１μｇのキャリヤtRNAとともに0.3M加え、２容量のエタノールにてRNAを沈澱させた。エタノールによる沈澱を繰り返し、使用時までRNAをエタノール沈澱物として−20℃で貯蔵した。
実施例２
プラスミドの調製
StratageneからプラスミドベクターpBluescript  SK II（＋）を得た。150mMのNaCl、6mMのTris−HCl（pH7.9）、6mMのMgCl2および1mMのDTTを含む46μｌの溶液中の20ユニットのNot Iと24ユニットのEcoR Vにより、プラスミド（４μｇ）を37℃で２時間消化分解した。酵素を65℃で10分間加熱して不活化し、緩衝化したフェノールにて２回、CHCl3にて２回抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウムと２容量の100％エタノールにて沈澱させた。ペレットを20.5μｌの水に再懸濁し、2.5μｌの10倍量AP緩衝液（0.5MのTris−HCl（pH9.0）、10mMのMgCl2、1mMのZnCl2、10mMのスペルミジン）を１μｌ（１ユニット）のアルカリフォスファターゼ（Promega）と共に加え、42℃で30分反応させ、１ユニットのAPのアリコートを追加して更に37℃で30分反応させた。TAE緩衝液（40mMのTris−アセテート、1mMのEDTA（pH8.3））中の0.8％SeaKem  LEアガロースゲルでサンプルを電気泳動し、Clean  Gene（Bio101）を使用してゲルから線状ベクターDNAを精製した。
連  結
EcoR V−Not Iによって消化した線状のpBluescript  SK II（＋）DNA約75ngを、CL6Bカラムの最初から約3.1mlの内の15μｌ中の約6ngのcDNAと混合し、0.5ユニットのT4DNAリガーゼ（Boehringer  Mannheim）にて16時間、16℃で処理した。8Mの酢酸NH4を7.5μｌと100％エタノールを２容量添加してサンプルを沈澱させた。ペレットを70％エタノールにて洗浄し、乾燥し、そして２μｌの水に再懸濁した。
実施例３
pGluClαとpGluClβのクローニング
cDNAの合成
第１ストランドの合成：画分21および22からのRNAの約半分を使用してcDNAを合成した。RNA沈澱物を遠心分離し、ペレットを70％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。RNAペレットをDEP処置した25μｌのH2O中に再懸濁し、10分間65℃で加熱して、氷上に置いた。下記の試薬を氷上に加えた:2μｌのRNasin（40u/μｌ）、１μｌのアクチノマイシンＤ（100％エタノール中で用時調製、800μg/μｌ）、10μｌの５倍RT緩衝液（250mMのTris−HCl（pH8.3）、375mMのKCl、15mMのMgCl2、BRL）、0.1MのDDTを５μｌ、5mMのdNTPを５μｌ、11ng/μｌのプライマーオリゴヌクレオチド:5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号:5）を2.8μｌ、および200u/μｌのMoloney  Murine  Leukemiaウイルスリバーストランスクリプターゼを0.5μｌ。反応液を37℃で60分間インキュベートし、フェノール:CHCl3（1:1（容量比）、Tris−HCl（pH7.4）にて緩衝化したフェノール（BRL））にて抽出し、製造業者（Boehringer  Mannheim）の仕様に従ってセファロースＧ−50カラム上で精製した。
第２ストランドの合成:G−50カラム（Boehringer  Mannheim）からの第１ストランド生成物を55μｌに調整し、下記の試薬類を４℃で加えた:10μｌの10倍第２ストランド緩衝液（200mMのTris（pH7.4）、70mMのMgCl2、1MのKCl）、５μｌのBSA（1mg/ml）、5mMのdNTP（ヌクレオチドトリフォスフェート）を３μｌ、10μｌのNAD（1.4mM、pH7.2、RNaseを含まない方法で調製し、−20℃で保存）、５μｌのP32dCTP（3000Ci/mmol、10.0mCi/ml）、2.5μｌのE.coliリガーゼ（NEBL:6u/μｌ）、1.1μｌのRNaseH（1.1u/μｌ、Pharmacia）、および７μｌのDNApol I（4u/μｌ、Pharmacia）。反応液を60分間は16℃、120分間は22℃、10分間は65℃とし、次いで氷上に置いた。反応液を、緩衝化フェノールを用いて２回、CHCl3:イソアミルアルコール（24:1（容量比））を用いて２回抽出した。１μｌのサンプルをcDNA合成の定量のために取り出し、酢酸ナトリウムを、20μｇのグリコーゲン（Boehringer  Mannheim）と２容量の100％エタノールと共に加えて0.3Mにし、DNAを−20℃で沈澱させた。cDNA合成をTCA沈澱によって定量した。第２ストランド合成の後1:10の希釈液を作成し、１μｌを10mlのAquasolに加え、添加された放射性物質の総量を見積もった。１μｌのアリコートを50μｇのキャリヤDNA（100μｌ）および100μｌの25％TCAと混合し、0.1％のNaピロフォスフェートを15分氷上に加えた。10％TCAと0.1％Naピロフォスフェートとの中に予め浸漬しておいたGF−Ｂガラスフィルター上で４℃にて真空濾過して沈澱物を回収し、氷冷した10％のTCAにてフィルターを洗浄した。フィルターを10mlのAquasolを含むバイアルに加え、放射能を定量した。画分21および22からのRNAの約半分からのcDNAの見積り収量は282ngであった。
第２ストランド合成からのDNAをT4DNAポリメラーゼにて処理し、DNA端末を平滑化した。DNAペレットを25μｌの水の中に再懸濁し、３μｌの10倍T4DNAポリメラーゼ緩衝液を1.5μｌの5mM  dNTPおよび0.5μｌのT4DNAポリメラーゼと共に加えた。30分間37℃で反応させた後、0.5μｌの500mM  EDTAを加えて反応を停止し、緩衝化したフェノール:CHCl3（1:1）にて２回、CHCl3にて２回抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウムと２容量の100％エタノールとにより沈澱させた。DNAペレットを水17μｌ、1mg/ml  BSA0.2μｌ、10倍Not I緩衝液（NEBL）２μｌ、及び0.4μｌ（4u）のNot Iの中に再懸濁し、37℃にて３時間インキュベートした。サンプルを、緩衝化したフェノール:CHCl3（1:1）にて２回、CHCl3にて２回抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウムと２容量の100％エタノールとで沈澱させた。DNA沈澱物を25μｌの水に再懸濁し、５分間65℃で加熱し、氷上で冷却し、2.5μｌの5M  NaClを加え、予め平衡化したセファロースCL6Bカラム（0.7×22cm）にサンプルを加え、0.5MのNaCl、10mMのTris−HCl（pH7.4）および1mMのEDTA中を通過させた。100μｌのサンプルを回収し、カラムから排除されカラムのボイド容量（約3.1ml）中で溶出したcDNAを含む画分についてCherenkoffカウントにてモニターした。TCA沈澱から得た特異活性に基づきcDNAを定量し、Cherenkoffカウントの測定効率を21％と見積もった。ピーク８の画分から得たcDNAは約268ngと見積もられた。100μｌの画分の各々を10μｇのグリコーゲンと２容量の100％エタノールにてエタノール沈澱した。ペレットを10μｌの水中に再懸濁し、緩衝化したフェノール:CHCl3（1:1）にて抽出し、５μｌの水を用いてフェノールクロロフォルムを逆抽出し、CHCl3で２度抽出し、1.5μｌの3M酢酸ナトリウム、及び16.5μｌのイソプロパノールを22℃で加えた。遠心分離によってペレットを回収し、洗浄し、乾燥し、そして５μｌの水に再懸濁した。DNAをTOP10E.coliセル（Invitrogen）に電気穿孔し、アンピシリンを含む液体培地中で生育させてクローンを選択した。２×105の組換え体を表す増幅されたライブラリーから抽出したDNAをNot Iで消化し、ゲル電気泳動によってサイズで分別した。4.0〜4.7Kbの線状DNAを回収し（Clean  Gene（Bio101）使用）、再度クローニングし、5000の組換え体のプールを得た。5000のコロニーを個々のLB−Amp寒天プレート上に置き、一晩生育させ、LB培地中に剥離し、1/3を細菌ストックとして−70℃で冷凍し、残りを用いてPromega  Wizard  MiniprepシステムにてDNAを調製した。Not IによってDNAを線状化し、インビトロRNAの合成に使用した。
実施例４
pGulClα及びpGluClβの特徴付け
前述した当業界で公知の標準的な方法〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.およびCully,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368〜374（1991）;Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）〕を使用してアフリカツメガエルの卵母細胞の調製・注入を行った。雌の成熟アフリカツメガエルを0.17％のトリカインメタンスルホネートで麻酔し、卵巣を外科的に取り出し、82.5mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、1.8mMのCaCl2、5mMのHEPESを含み、NaOHによってpH7.5に調整した（OR−２）皿の中に置いた。卵巣の葉を破壊して開き、数回濯ぎ、0.2％のコラゲナーゼ（Sigma、タイプ1A）を含むOR−２中で２〜５時間穏やかに震とうした。濾胞層（follicular layer）の約50％が除去された時、ステージＶとVIの卵母細胞を選択し、注入の前に、86mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、1.8mMのCaCl2、5mMのHEPES、2.5mMのピルビン酸ナトリウム、0.5mMのテオフィリンおよび0.1mMのゲンタマイシンから成り、NaOHによってpH7.5に調整された培地（ND−96）に24〜48時間置いた。50〜70nlのポリ（Ａ＋）RNA（1mg/ml）または50nlのGluClα（0.1〜100ng）および／またはGluClβ（0.1〜100ng）を卵母細胞に注入した。コントロール卵母細胞には50nlの水を注入した。記録の前にND−96中で卵母細胞を２〜10日間インキュベートした。インキュベーションとコラゲナーゼの消化は18℃で行った。
記録は、注入の後室温で２〜10日行った。特に示されていない限り、記録は、115mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、1.8mMのCaCl2および10mMのHEPESから成り、NaOHによってpH7.5に調整された標準のカエル生理食塩水の中で行った。標準的な双微小電極増幅器（Dagan8500またはTEV−200、Minneapolis、MN）を使用して卵母細胞を電圧クランプした。ピペットは3MのKClで満し、抵抗は0.5〜3.0メガオームであった。プレキシガラスの記録チャンバー（容量:200μｌ）を10ml/minの速度で常時灌流した。Ag/AgCl電極を用いて記録チャンバーを直接、若しくは細胞外塩素イオンが変化する場合にはKCl（3M）の寒天ブリッジを介して接地した。低塩素イオン溶液については、NaClを、等モル濃度のイセチオン酸ナトリウムと置き換えた。低ナトリウム溶液については、NaClを、等モルKClまたはコリンClと置き換えた。TL−１インターフェースを有するPCLAMP（Axon  Instruments、Foster  City、CA）を使用してデータの収集と解析を行った。−80mVの保持電位における膜電流を記録した。薬剤の存在下で得たピーク電流から−80mVにおける保持電流を引くことによって薬剤に感応する電流の振幅を測定した。データを30Hzでフィルタリングし、16.6Hzでサンプリングした。電流／電圧の関係（I/V）と反転電位（Erev）は、−110から＋80mVの電圧範囲全体に渡る１〜３秒の電圧勾配を用いて決定した。電圧勾配については、データを0.3〜3KHzでフィルタリングし、160Hzでサンプリングした。薬剤が存在する場合の電流から薬剤を含まない溶液での電流を引いて薬剤に感応する電流／電圧の関係を得た。
C.elegansポリ（Ａ）+RNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞は、急速に活性化する可逆性グルタメートおよび非可逆性イベルメクチン４−Ｏ−ホスフェート（IVMPO4）に感応する電流を示した（図５〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）;Arenaら、1991、前掲〕）。グルタメートおよびIVMPO4感応性チャンネルのための機能性cDNAクローンを分離するために、サイズ分画したC.elegansポリ（Ａ）+RNAの1.7〜1.9kB画分から指向性cDNAライブラリーを構築した。5000cDNAのプールから合成したインビトロRNAの注入後、グルタメートおよびIVMPO4感応性電流が観察された。cDNAの集団を小さいプールに再分画した結果、グルタメートおよびIVMPO4反応を回復するためには二つの異なったサブユニットが必要であることが示された。一緒に加えると両方の反応が回復する２つの500cDNAのプールが同定された。或る再分画したプールからのRNAと500cDNAの第２のプールからのRNAを共注入することによってcDNAクローンpGluClαを単離した。cDNAクローンpGluClβは、500クローンの第２プールの再分画とpGluClαからのインビトロRNAとの共注入によって単離した。再分画したプールの複雑さが25cDNAまで減少した時、単一のプールを注入した卵母細胞での反応が認められた。
pGluClαおよびpGluClβからのインビトロRNAを注入した卵母細胞における電気生理学的特徴を調べた（図５）。GluClαおよびβタンパク質を同時に発現する卵母細胞は、ポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞において見られた、急速に活性化する可逆性グルタメートおよび非可逆性IVMPO4感応性電流（図５）を示した。IVMPO4感応性電流の活性化が最大になるのは、GluClαおよびβについては42±２秒の時点であり、ポリ（Ａ）+RNAについては36±３秒の時点であった。ポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で見られたグルタメート感応性の電流の不感応（desensitization）は、GluClαおよびβを注入した卵母細胞においても、グルタメートの濃度が1mMよりも大きい場合に観察された。GluClαまたはGluClβの個々のサブユニットは、それぞれIVMPO4またはグルタメートに選択的に反応する機能性ホモマーのチャンネルを発現した（図５）。ホモマーのGluClαチャンネルのIVMPO4活性化の時間は18±１秒で、GluClαおよびβまたはポリ（Ａ）+RNAについて観察されたよりも速かった（ｐ＜0.001）。GluClαチャンネルは、10mMの高いグルタメート濃度には非感応的であったが、グルタメートを用いてのホモマーのGluClβチャンネルを活性化するための閾値は50μＭであった。共注入された卵母細胞と同程度の振幅を有する電流を得るためには、個々のサブユニットの10倍以上のRNAを注入しなければならなかった。これはホモマーのチャンネルの機能的形成の効率が低いことを示唆している。
グルタメートおよびIVMPO4の用量反応曲線の分析の結果、GluClαおよびβの共発現は、リガンド親和性とHill係数の変化をもたらすことが示された（図５）。GluClαとGluClβを共注入した場合、グルタメートについてのEC50が380から1360μＭにシフトした（図1b）。GluClβについてのHill係数が1.9でGluClαおよびβについてのHill係数が1.7であったことは、チャンネルを開閉するためには一つより多くのグルタメート分子が必要であることを示唆している。IVMPO4電流活性化についてのEC50は、GluClα注入卵母細胞とGluClαおよびβを注入した卵母細胞でそれぞれ140nM、190nMであり（図５）類似していた。しかし、Hill係数は、GluClαの場合の1.5であったが、GluClαおよびβの場合2.5に変化した。これは、チャンネルを開くために必要なIVMPO4分子の数が増大したことを示唆している。EC50およびHill係数において観察された変化は、グルタメートによるGluClαチャンネルの活性化またはIVMPO4によるGluClβチャンネルの活性化によるものではありえない。何故なら、これらのホモマーのチャンネルはこれらのリガンドには応答しないからである（図５）。
GluClαおよびβチャンネルを発現する卵母細胞における透過性と電流電圧の関係はポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞において観察されたものと同様であった（図６）〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.およびCully,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368〜374（1991）;Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）〕。GluClαおよびβチャンネルは、外部NaClをイソチオン酸ナトリウムと置換した後におけるグルタメートまたはIVMPO4感応性電流についての逆転電位（Erev）におけるシフトとして観察されるように、塩素イオンに対して選択的であった（図６）。GluClαおよびβチャンネルは、一価のカチオンに対しては透過性でなかった。何故なら、外部NaClのKClまたはコリンClとの置換によりErevをシフトしなかったからである（図６）。また、ホモマーのGluClαまたはGluClβチャンネルについての透過性の研究により、カチオンよりアニオンに対する選択性が明らかになった（図６）。GluClαおよびGluClβチャンネルの何れにおいても、NaClのイソチオン酸ナトリウムとの置換はErevを正の電圧にシフトし、KClまたはコリンClとの置換はErevには影響しなかった（図６）。イソチオン酸ナトリウムにおけるGluClαチャンネルについてのErevは、大きなアニオンであるイソチオネートに対して透過性があり、塩素イオンに対する割合は0.2であることを示した〔Goldman,D.E.、J.Gen.Physiol.27、37〜60（1943）;Hodgkin,A.L.＆Katz  B.:J.Physiol.（Lond.）108、37〜77（1949）〕。
GluClαおよびβを注入した卵母細胞における電流と電圧の関係（I/V）は、外側に向けて矯正（rectifying）する電圧依存を示した（図６）。グルタメートまたはIVMPO4感応性電流についてのI/Vは、データが定電場式に適合することによって確認されたように同様の電圧依存性を示した（図６）〔Goldman,D.E.、J.Gen.Physiol.27、37〜60（1943）;Hodgkin,A.L.＆Katz  B.:J.Physiol.（Lond.）108、37〜77（1949）〕。ホモマーのGluClαまたはGluClβチャンネルについてのI/V曲線は、GluClαおよびβについてのI/V曲線から大きく偏寄しており、定電場の仮定にはうまく適合しなかった（図６）。GluClβチャンネルからのグルタメート感応性電流は、急な外側に矯正する電圧依存性を示し、負の電圧においては小電流を示した（図６）。GluClαチャンネルからのIVMPO4感応性電流は、本質的に直線的な電圧依存性を示した（図６）。
IVMPO4はC.elegansポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞に対し２重の効果を及ぼす〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.およびCully,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368〜374（1991）〕、〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）〕。電流の直接的な活性化（図５）に加え、グルタメート感応性の電流は、IVMPO4の低い濃度によって増強される（図７）。〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）〕。同様に、IVMPO4（5nM）は、GluClαおよびβを注入した卵母細胞におけるグルタメート感受性電流を490±45％増強した（図７）。IVMPO4とグルタメートを両方適用した場合には、グルタメートについてのEC50が1360μＭから360μＭにシフトし、Hill係数が1.7から1.3に減少した。ホモマーGluClβチャンネルからのグルタメート反応は、IVMPO4によって強化されなかった（図７）。一方、IVMPO4の濃度を高くすると（１μＭ）、GluClβを注入した卵母細胞におけるグルタメート感応性電流が88±４％減少した（図７）。グルタメートに反応しないGluClαチャンネルを発現する卵母細胞においては（図５）、電流の活性化をIVMPO4により前もって行うことにより、グルタメートによる電流が20±４％増大した（図７）。GluClαチャンネルを注入した卵母細胞からのグルタメート感受性電流は、IVMPO4による電流活性化の後だけで観察されたが、10μＭの低いグルタメート濃度で観察できた。
GluClαおよびβを注入した卵母細胞の薬理学的プロフィルは、他のクローニングしたリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルやグルタメートゲーテッドカチオンチャンネルの何れとも異なっていた（表１）。リガンドゲーテッドイオンチャンネル作用薬および拮抗薬の幾つかをGluClαおよびβを注入した卵母細胞でテストした（表１）。グルタメート感受性の塩素イオンチャンネルを活性化することで知られている、グルタメートの構造的類似物であるイボテネートを除き全ての化合物が不活性であった〔Cull−Candy,S.G.、J.Physiol.255、449〜464（1976）;Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）;Lea,T.J.およびUsherwood,P.N.R.、Comp.Gen.Pharmacol.4、351〜363（1973）〕。グルタメートおよびIVMPO4感受性電流はピクロトキシンおよびフルフェナム酸によって遮断され、C.elegansポリ（Ａ）+RNAについて報告されたものと同様な濃度依存性があった〔Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress,P.S.およびCully,D.F.、Mol.Pharmacol.40、368〜374（1991）;Arena,J.P.、Liu,K.K.、Paress.P.S.、Schaeffer,J.M.およびCully,D.F.、Mol.Brain  Res.15、339〜348（1992）〕。
幾つかの証拠によって、GluClαおよびβの共発現はヘテロマーのチャンネルの形成をもたらすことが示された。サブユニットの会合の第１の証拠は、反応を引き起すためにcDNAのプールを２つ要するクローニング操作時においてみられた。第２に、共注入した卵母細胞について得られた発現レベルを達成するために個々のサブユニットでは10倍以上のRNAを注入する必要がある。更に、リガンド特異的反応における下記の変化が、GluClαおよびβを共発現する卵母細胞において観察された：電流のIVMPO4活性化の時間変化；グルタメートに対する親和性と電流のIVMPO4活性化のHill係数;I/V関係の矯正における差異；イセチオネートに対する透過性；およびグルタメート反応のIVMPO4による増強。共注入した卵母細胞におけるグルタメートおよびIVMPO4感受性I/V曲線の電圧依存性が同一であることは、形成されたチャンネルの大部分がヘテロマーであることを示唆している。もし多数のホモマーのGluClαおよびGluClβチャンネルが共注入された卵母細胞内に存在するとしたら、グルタメート感受性I/V曲線はIVMPO4感受性電流についてのI/Vに比べもっと外側に矯正するはずである。これらの結果は、共注入された卵母細胞において観察された特性がヘテロマーのチャンネルの特性を表していることを示唆している。
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GluClαおよびGluClβのRNA（各25pg）を卵母細胞に同時に注入した。ｎは各グループにつき少なくとも４。a:データは10mMのグルタメートによって引き起こされた反応の％で表す。b:NR＝反応なし。c:N−メチル−Ｄ−アスパルテート。d:a−アミノ−３−ヒドロキシル−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸。e:もし遮断剤の存在下での反応がコントロールに対して±３％以内である場合遮断は零と考えた。f:（−）−ビククリンメトクロライド。g:6−シアノ−７−ニトロキノ−キサリン−2,3−ジオン。
実施例５
GluCl  RNA注入卵母細胞を用いたグルタメートおよびイベルメクチン結合アッセイ
GluClαおよびGluClβインビトロRNAを注入した卵母細胞を用いて3H−イベルメクチン結合アッセイと3H−グルタメート結合アッセイとを行った。GluClα（1ng）またはGluClβ  RNA（1ng）を別個にあるいは同時に（この場合は各0.5ng）卵母細胞に注入し、２日後、卵母細胞をdounceホモジナイザーで破壊して卵黄タンパク質を当業界で公知の標準方法によって除去した。慣用方法によって平衡リガンド結合アッセイを行った。GluClαおよびβの双方あるいはGluClα単独を発現する卵母細胞はいずれも約0.2nMという高親和性で3H−イベルメクチンと結合した。GluClαを注入した卵母細胞からの膜調製物において、特異的な3H−グルタメート結合が観察された。GluClαおよびβを発現する卵母細胞を用いて他の化合物群の結合親和性を測定すると共に、それらの化合物が3H−イベルメクチンおよび3H−グルタメート結合と置換する置換能を測定した。
実施例６
GluClαとGluClβチャンネルの一次構造
pGluClαとpGluClβのヌクレオチド配列は、約1383および約1302塩基対の単一大オープンリーディングフレームを示した。それらのcDNAは、pGluClαについては約50ヌクレオチドの5'−非翻訳延長部と約90ヌクレオチドの3'−非翻訳延長部とを有し、pGluClβについては約13ヌクレオチドの5'−非翻訳延長部と約144ヌクレオチドの3'−非翻訳延長部とを有している。pGluClαとpGluClβそれぞれのオープンリーディングフレーム領域中のヌクレオチド配列は、約50％の同一性を示した。推定分子量（Mr）約52,550のGluClαタンパク質と推定Mrが約49,900のGluClβタンパク質とが予想されるオープンリーディングフレームの開始コドンとして、フレーム内第一のメチオニンを指定した。両タンパク質とも疎水性アミノ末端残基を含有していたが、このアミノ末端残基は、GluClαでは21番目のアミノ酸から、GluClβでは23番目のアミノ酸から始まる成熟タンパク質をもたらすシグナル開裂部位を強く示唆する配列を有した。GluClαタンパク質とGluClβタンパク質とを比較すると、アミノ酸の同一性は45％で類似性は63％であった。
予想されたGluClαタンパク質とGluClβタンパク質とをヌクレオチドデータベースおよびタンパク質データベースに対して整列させた結果、グリシンレセプターおよびGAVAaレセプターに関連するものであることが判明した。GluClαとGluClβとにおけるアミノ酸の約21％が強く保存されており、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルのファミリー内におけるアミノ酸の同一性は少なくとも75％であることを示した。このチャンネルファミリーにおける保存モチーフ（大NH2−末端細胞外ドメインや４つの疎水性トランスメンブラン・ドメインであるM1〜M4）は、GluClα配列およびGluClβ配列においてもまた見いだされた。GluClαタンパク質とGluClβタンパク質とは、全部のリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの細胞外ドメインに見られる保存されたシステイン残基を有していた（GluClαでは191番目と205番目のアミノ酸、GluClβでは161番目のアミノ酸と175番目のアミノ酸）。それ以外の２つのシステイン残基が存在したが、それらもまたグリシンゲーテッド塩素イオンチャンネル中に見いだされる（GluClαでは252番目と263番目のアミノ酸、GluClβでは223番目のアミノ酸と234番目のアミノ酸）。GluClαタンパク質は、推定メンブランドメインM3とM4との間に位置するプロテインキナーゼＣリン酸化部位に対する強いコンセンサス配列を有していた。GABAaレセプターサブユニットにおいては、M3とM4との間の細胞内ドメインに同様のリン酸化部位が位置しており、これらはチャンネル調節において何らかの役割を果たすと考えられる［Leidenheimer,N.J.、McQuilkin,S.J.、Hahner,L.D.、Whiting,P.及びHarris,R.A.、“Mol.Pharm."41、1116〜1123（1992年）、［Kellenberger,S.、Malherbe,P.及びSigel,E.、“J.Biol.Chem."267、24660〜25663（1992年）］。GABAAレセプター配列及びグリシンレセプター配列において見いだされるように、GluClαタンパク質とGluClβタンパク質とは、提案された細胞外ドメインに推定Ｎ−結合糖鎖形成部位を有していた。アセチルコリン及びグルタメートカチオンチャンネルサブユニットを用いたアラインメント分析の結果、GluClα及びGluClβはそれぞれ約10％及び＜５％の類似性を有していることが判明した。
GluClα及びGluClβタンパク質の全配列と、GABAa及びグリシンレセプターサブユニットと、関連の無脊椎動物由来タンパク質配列とを用いて系統発生分析を行った。GABAAα及びγサブユニットを残りのタンパク質から分ける２本の大きな枝の分枝によってこのタンパク質ファミリーにおける進化論的分裂が示された。これらの大きな枝は、タンパク質群をGABAaα、β、γ、δ（ｄ）、ρ（ｒ）、及びグリシンα及びβ等それぞれのサブクラスにグループ分けする下位の枝を有していた。Drosophila  melanogaster（Dros）及びLymnae  stagnalis（Lym）の配列は、リガンドゲーテッドアニオンチャンネルに類似した、利用可能な無脊椎動物タンパク質配列を示している。C.elegansのGluClα及びGluClβタンパク質配列は、グリシンα及びβ、Lymツェータ（ζ）及びDros  rdlタンパク質と同じ枝に緩くグループ化（loosely grouped）していたが、これは、これらのタンパク質が共通の祖先に由来することを示唆している。GluClαタンパク質とGluClβタンパク質とは、結合枝の長さ（joining limb lengths）が最も短いことによって示唆されるように、グリシンａタンパク質との関連性が非常に高い。この分析は、GluClαタンパク質とGluClβタンパク質とが他のタンパク質とは別個の独立した下位の枝を形成することを示唆している。最大パーシモニー（parsimony）プログラムを用いて、GluClα若しくはGluClβの細胞外若しくはメンブランスパニングドメインを別に分析して、同様な系統樹を得た。
GluClα及びGluClβタンパク質はグリシンα及びβ、Lymツェータ（ζ）及びDros  rdlタンパク質と系統発生的に関連しているとはいえ、両タンパク質は薬理学的には別個である。アフリカツメガエルの卵母細胞における発現の研究によって、グリシンに感受性を有するグリシンαタンパク質［Schmieden,V.、Grenningloh,G.、Schofield,P.R.及びBetz,H、“EMBO  Journal"8、695〜700（1989）］とGABAに感受性を有するDros  rdlタンパク質［ffrench−Constant,R.H.、Rocheleau,T.A.、Steichen,J.C.及びChalmers,A.E.、“Nature"363、449〜451（1993）］とによって機能あるホモマー塩素イオンチャンネルが形成されることが判明している。ホモマーのグリシンｂチャンネル形成の効率は非常に低く［Grenningloh,G.ら、“Neuron"4、963〜970（1990）］、Lymツェータ（ζ）タンパク質は機能あるホモマーチャンネルを形成しない［Hutton,M.L.、Harvey,R.J.、Earley,F.G.P.、Barnard,E.A.及びDarlison,M.G.、“FEBS  letters"326、112〜116（1993）］。GluClα及びGluClβホモマーチャンネルは、GABA、グリシン及びこれに関連するチャンネル作用薬及び拮抗薬に対して非感受性であるので（表１参照）、これらのチャンネルは系統発生的関連チャンネルとは別に、異なるリガンド選択性を進化させてきたものと考えられる。
C.elegansゲノムDNAとポリA+RNAでハイブリダイゼーション分析を行った。プローブとしてはGluClα  cDNA及びGluClβ  cDNAを用いた。cDNAプローブの制限消化したゲノムDNAとの高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションによって、GluClのcDNAは単一のコピーDNAフラグメントのみにハイブリダイズすることが判明した。C.elegans  RNAへの高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションによって、GluClαは2.4及び1.7KbのRNAにハイブリダイズし、GluClβは1.7KbのRNAにハイブリダイズすることが示された。この研究に用いたプローブは単一の大オープンリーディングフレームをコードするGluClα  cDNA及びGluClβ  cDNAの領域のみを表している。GluClα及びGluClβプローブをC.elegans  YACとコスミッドライブラリーにハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションの結果、染色体Ｖ、YAC＃Y42B4、及びコスミッド＃C25D4上にGluClα遺伝子が見いだされた。染色体Ｉ、YAC＃Y24C9、及びコスミド＃C04E4上にはGluClβ遺伝子が位置している。YACとコスミドの分類は英国ケンブリッジ、MRCラボのJohn  Sulstonによるものである。
実施例７
E.coli発現ベクターへのGluCl  cDNAのクローニング
GluCl発現カセットをE.coli発現ベクター（pETシリーズ（Novagen）等であるが、これに限定されない）に転移させ、E.coli内で組換えGluClを産生させる。pETベクターによって、GluClの発現は厳密に調節されたバクテリオファージT7プロモーターの制御下に置かれる。誘導性lacプロモーターによって制御されるT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有するE.coli宿主内にこの構築物を転移させた後、適切なlac基質（IPTG）を培養物に添加してGluClを発現させる。発現したGluClのレベルは上記のアッセイによって決定する。
GluClα及びGluClβの全オープンリーディングフレームをコードするcDNAをpET［16］11aのNde I部位に挿入する。配列分析によって正の配向にある構築物を同定して発現宿主株BL21の形質転換に用いる。次いで形質転換体を使用して、GluClタンパク質産生のために培養物を接種する。培養物はM9またはZB培地で生育させることができるが、その組成は当業者には公知である。OD600値が1.5となるまで生育させた後、37℃で３時間、1mMのIPTGによってGluClの発現を誘導する。
実施例８
哺乳類発現ベクターへのGluCl  cDNAのクローニング
哺乳類発現ベクターpMAMneo及びpcDNA3にGluCl  cDNAをクローニングした。GluClα及びGluClβブルースクリプト・プラスミドをNot Iで消化分解し、クレノー酵素で処理して平滑クローニング端を得た。インサートをSal I消化で切断し、アガロースゲル電気泳動で精製した。pMAMneoベクターをXho I、クレノー酵素、次いでSal Iと子ウシ腸フォスファターゼ（CIP）で処理した。線状ベクターをアガロースゲル上で精製して、それを使用してGluCl  cDNAインサートに連結した。組換え体を単離してGluClα−pMAMneo及びGluClβ−pMAMneoと命名し、それを使用してCaPO4−DNA沈澱法によって哺乳類細胞（Ｌ細胞）にトランスフェクトした。細胞を、GluClα−pMAMneo、GluClβ−pMAMneo、あるいはGluClα−pMAMneoとGluClβ−pMAMneoの両方でトランスフェクトした。G418の存在下で生育させることにより、安定細胞クローンを選択した。G418抵抗性の１個のクローンを単離した。このクローンは完全なGluClα遺伝子、GluClβ遺伝子、又はGluClαとGluClβ遺伝子双方を含有することが判明した。GluClタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫沈澱法、ウェスタン・ブロッティング、免疫蛍光法等の免疫学的手法によってGluCl  cDNA含有クローンの発現を分析する。抗体は、GluCl配列から予測されたアミノ酸配列から合成されたペプチドを接種したウサギから得る。パッチクランプ電気生理学的技法や3H−イベルメクチンおよび3H−グルタメート結合アッセイによっても発現を分析する。
pcDNA3にGluClαまたはGluClβ遺伝子を挿入した。GluClα−ブルースクリプトSK II＋及びGluClβ−ブルースクリプトSK II＋をXho I及びNot Iで消化分解し、cDNAインサートをアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターpcDNA3をXho IとNot Iで消化分解し、CIPで処理し、線状ベクターをゲル電気泳動で単離してcDNAインサートに連結した。組換えプラスミドであるGluClα−pcDNA3及びGluClβ−pcDNA3を用いて哺乳類COS細胞又はCHO細胞を形質転換する。
GluClα又はGluClβ、及びGluClαとGluClβの双方を安定的にあるいは一時的に発現する細胞を用いてアベルメクチン及びグルタメートに感受性を有する塩素イオンチャンネルの発現とリガンド結合活性とについて試験する。これらの細胞を用いて、アベルメクチン及びグルタメートに感受性を有する塩素イオンチャンネルに対するその他の化合物の調節能、阻害能若しくは活性化能、あるいは放射活性イベルメクチンやグルタメート結合との競合能を同定・試験する。
プロモーターに関して正の配向にあるGluCl  cDNAを含有するカセットを、プロモーターの適切な制限部位3'に連結し、制限部位マッピングおよび／または配列決定によって同定する。これらのcDNA発現ベクターを例えばCOS−７（ATCC＃CRL1651）、CV−1tat［Sackevitzら、“Science"238:1575（1987）］、293、Ｌ（ATCC＃CRL6362）等の繊維芽宿主細胞中に標準法によって導入する。標準法としては電気穿孔や化学的方法（カチオン性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム）が挙げられるがこれらに限定されない。トランスフェクトされた細胞および細胞培養上清を集め、本明細書の記載に従ってGluClの発現について分析する。
哺乳類の一時的発現に用いられるベクターのすべてが、GluClを発現する安定した細胞系を確立させるために用い得る。発現ベクター中にクローニングされた未改変のGluCl  cDNA構築物は、GluClタンパク質を作るように宿主細胞をプログラムすると考えられる。また、分泌タンパク質のシグナル配列をコードするDNAとGluCl  cDNA構築物とを連結することにより、GluClは分泌タンパク質として細胞外に発現される。トランスフェクション宿主細胞としてはCV−１−Ｐ［Sackevitzら、“Science"238:1575（1987）］、tk−Ｌ［Wiglerら、“Cell"11:223（1977）］、NS/0、及びdHFr−CHO［Kaufman及びSharp、“J.Mol.Biol."159:601（1982）］が挙げられるがこれらに限定されない。
GluCl  cDNAを含有するいずれかのベクターを薬剤選択プラスミドと共トランスフェクトさせることによって安定にトランスフェクトされたクローンが選択される。この薬剤選択プラスミドとしてはG418、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホルトンスフェラーゼ;APRT、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。GluClのレベルは本明細書中に記載のアッセイによって定量される。
また、GluCl  cDNA構築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカー含有ベクターに連結して、最高可能レベルでGluClを合成する哺乳類細胞クローンを産生させる。これらの構築物を細胞に導入した後、プラスミドを含有するクローンを適切な薬剤によって選択して、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローン細胞を前記薬剤の用量を増加させながら選択することによって単離する。
組換えGluClの発現は、哺乳類宿主細胞中に完全長のGluCl  cDNAをトランスフェクトさせることによって達成される。
実施例９
昆虫細胞中での発現のための、バキュロウイルス発現ベクターへのGluCl  cDNAのクローニング
昆虫細胞のSf9系（ATCC  CRL＃1711）にcDNAを高レベルに発現させるように、AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルスベクターを設計する。GluCl  cDNAを発現する組換えバキュロウイルスは、次の標準法によって作成される（In  VitrogenのMaxbacマニュアルより）:GluCl  cDNA構築物を、pAC360及びBlueBacベクター（In  Vitrogen）等の各種バキュロウイルス転移ベクターにおいてポリヘドリン遺伝子と連結する。組換えバキュロウイルスの生成は、バキュロウイルス転移ベクターと線状化したAcNPVゲノムDNA［Kitts,P.A.、Nuc.Acid.Res.18:5667（1990）］とをSf9細胞に共トランスフェクトした後に相同的組換えを行って達成する。組換えpAC360ウイルスは、感染細胞中に封入体が存在しないことによって同定し、組換えpBlueBacウイルスは、βガラクトシダーゼ発現（Summers,M.D.及びSmith,G.E.、Texas  Agriculture  Exp.Station  Bulletin  No.1555）に基づいて同定する。プラーク精製に引き続きGluClの発現を本明細書に記載のアッセイによって測定する。
GluClサブユニットの完全オープンリーディングフレームをコードするcDNAを、pBlueBac IIのBamH I部位に挿入する。配列分析によって正の配向にある構築物を同定し、それを使用して線状AcNPVのマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞にトランスフェクトさせる。
真正の活性GluClは感染細胞の細胞質中に見いだされる。活性GluClを感染細胞から低張若しくは界面活性剤での溶解によって抽出する。
実施例10
酵母発現ベクターへのGluCl  cDNAのクローニング
異種タンパク質の細胞内若しくは細胞外発現をさせるように設計した発現ベクターに最適GluCl  cDNAシストロンを挿入して、酵母S.cerevisiaeで組換えGluClを作成する。細胞内発現の場合には、EmBLyex4等のベクターをGluClシストロンに連結する［Rinas,U.ら、“Biotechnology"8:543〜545（1990）;Horowitz  B.ら、“J.Biol.Chem.265:4189〜4192（1989）］。細胞外発現の場合には、分泌シグナル（酵母または哺乳類ペプチド）をGluClタンパク質のHN2末端に融合する酵母発現ベクターに、GluClシストロンを連結する［Jacobson,M.A.、Gene85:511〜516（1989）;Riett  L.及びBellon  N.“Biochem."28:2941〜2949（1989）］。
これらのベクターとしては、pAVE1＞６及びベクターpL8PLが挙げられるがこれらに限定されない。前者はヒト血清アルブミンシグナルを発現cDNAに融合する［Steep  O.“Biotechnology"8:42〜46（1990）］。後者はヒトリゾチームシグナルを発現cDNAに融合する［Yamamoto,Y.“Biochem."28:2728〜2732）］。また、GluClは、ベクターpVEP［Ecker,D.J.、“J.Biol.Chem."264:7715〜7719（1989）、Sabin,E.A.、“Biotechnology"7:705〜709（1989）、McDonnell  D.P.、“Mol.Cell  Biol."9:5517〜5523（1989）］を用いて、ユビキチン結合融合タンパク質として、酵母で発現される。発現したGluClのレベルは、本明細書に記載のアッセイによって決定される。
実施例11
組換えGluClの精製
組換え技法によって産生されたGluClは、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。
GluCl抗体アフィニティーカラムは、Affigel−10（Biorad）に抗GluCl抗体を添加することによって作成する。Affigel−10は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体である。次いで、スペーサーアームを用いてアミド結合を介して抗体をゲルに結合させる。次に、残存する活性化エステルを1MのエタノールアミンHCl（pH8）で消去する。カラムを水、次いで0.23MのグリシンHCl（pH2.6）で洗浄し、未結合抗体や外部由来のタンパク質が存在すれば除去する。リン酸緩衝生理食塩水（pH7.3）を界面活性剤などの適切な膜溶解剤と共に用いてカラムを平衡化し、溶解したGluCl若しくはGluClサブユニットを含有する細胞培養上清または細胞抽出液をゆっくりとカラムに通す。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を界面活性剤と共に用いて、光学密度（A280）がバックグラウンドレベルとなるまでカラムを洗浄し、タンパク質を0.23Mのグリシン−HCl（pH2.6）と界面活性剤とで溶出させる。次に精製GluClタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:1542
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
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配列番号:2
配列の長さ:1479
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
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配列番号:3
配列の長さ:510
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号:4
配列の長さ:487
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号:5
配列の長さ:46
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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