(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の菌学的性質を有するセルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株。
Ａ．形態的特徴
（１）グラム染色：陽性
（２）形態：培養初期においては、０．３〜０．５μｍ×２〜３μｍ内外の小さな桿菌であるが、培養期間が長くなるにつれて、分枝したり、球状の形態をとる多形性桿菌である。
（３）内生胞子：陰性
（４）運動性：有
（５）鞭毛の着生状態：極鞭毛
Ｂ．各種培地における生育状態
（１）普通寒天培地：小さい凸状のスムースコロニーを形成。３日間以上の培養で黄色の色素を産生する。
（２）ペプトン・トリプトン・酵母エキス・グルコース寒天培地：盛り上がり厚いコロニーを形成。
Ｃ．生理的性質
（１）最適発育温度：３５〜４０℃
（２）最適発育ｐＨ：６．８〜７．２
（３）普通寒天培地６５℃での発育：６５℃２４時間では発育せず。
（４）基質の利用性
１．α−シクロデキストリン          ：利用できず
２．β−シクロデキストリン          ：利用
３．デキストリン                    ：利用
４．グリコーゲン                    ：利用
５．イヌリン                        ：利用できず
６．マンナン                        ：利用できず
７．ツイーン４０                    ：利用できず
８．ツイーン８０                    ：利用できず
９．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン  ：利用できず
10．Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン  ：利用できず
11．アミグダリン                    ：利用
12．Ｌ−アラビノース                ：利用
13．Ｄ−アラビトール                ：利用できず
14．アルブチン                      ：利用
15．セロビオース                    ：利用
16．Ｄ−フルクトース                ：利用
17．Ｌ−フコース                    ：利用
18．Ｄ−ガラクトース                ：利用
19．Ｄ−ガラクツロン酸              ：利用できず
20．ゲンチオビオース                ：利用
21．Ｄ−グルコン酸                  ：利用できず
22．α−Ｄ−グルコース              ：利用
23．ｍ−イノシトール                ：利用できず
24．α−Ｄ−ラクトース              ：利用
25．ラクツロース                    ：利用
26．マルトース                      ：利用
27．マルトトリオース                ：利用
28．Ｄ−マンニトール                ：利用できず
29．Ｄ−マンノース                  ：利用できず
30．Ｄ−メレジトース                ：利用できず
31．Ｄ−メリビオース                ：利用
32．α−メチル−Ｄ−ガラクトシド    ：利用
33．β−メチル−Ｄ−ガラクトシド    ：利用
34．３−メチルグルコース            ：利用
35．α−メチル−Ｄ−グルコシド      ：利用
36．β−メチル−Ｄ−グルコシド      ：利用
37．α−メチル−Ｄ−マンノシド      ：利用できず
38．パラチノース                    ：利用
39．Ｄ−プシコース                  ：利用
40．Ｄ−ラフィノース                ：利用できず
41．Ｌ−ラムノース                  ：利用できず
42．Ｄ−リボース                    ：利用
43．サリシン                        ：利用
44．セドヘプツロサン                ：利用できず
45．Ｄ−ソルビトール                ：利用
46．スタキオース                    ：利用できず
47．スクロース                      ：利用
48．Ｄ−タガトース                  ：利用できず
49．Ｄ−トレハロース                ：利用
50．ツラノース                      ：利用
51．キシリトール                    ：利用できず
52．Ｄ−キシロース                  ：利用
53．酢酸                            ：利用
54．α−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
55．β−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
56．γ−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
57．ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸      ：利用できず
58．α−ケトグルタル酸              ：利用できず
59．α−ケト吉草酸                  ：利用できず
60．ラクトアミド                    ：利用できず
61．Ｄ−乳酸メチルエステル          ：利用できず
62．Ｌ−乳酸                        ：利用できず
63．Ｄ−リンゴ酸                    ：利用できず
64．Ｌ−リンゴ酸                    ：利用できず
65．ピルビン酸メチル                ：利用
66．コハク酸モノメチル              ：利用できず
67．プロピオン酸                    ：利用できず
68．ピルビン酸                      ：利用
69．スクシンアミド酸                ：利用できず
70．コハク酸                        ：利用できず
71．Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸  ：利用
72．アラニンアミド                  ：利用できず
73．Ｄ−アラニン                    ：利用できず
74．Ｌ−アラニン                    ：利用できず
75．Ｌ−アラニルグリシン            ：利用できず
76．Ｌ−アスパラギン                ：利用できず
77．Ｌ−グルタミン酸                ：利用できず
78．グリシル−Ｌ−グルタミン酸      ：利用できず
79．Ｌ−ピログルタミン酸            ：利用できず
80．Ｌ−セリン                      ：利用できず
81．プトレッシン                    ：利用できず
82．２，３−ブタンジオール          ：利用できず
83．グリセロール                    ：利用
84．アデノシン                      ：利用
85．２’−デオキシアデノシン        ：利用
86．イノシン                        ：利用
87．チミジン                        ：利用
88．ウリジン                        ：利用
89．アデノシン−５’−一リン酸      ：利用
90．チミジン−５’−一リン酸        ：利用
91．ウリジン−５’−一リン酸        ：利用
92．フルクトース−６−リン酸        ：利用できず
93．グルコース−１−リン酸          ：利用できず
94．グルコース−６−リン酸          ：利用できず
95．Ｄ−Ｌ−α−グリセロールリン酸  ：利用できず
（５）ゼラチンの液化：液化する。
（６）デンプンの加水分解：分解する。
（７）セルラーゼの生成：生成
（８）キシラーゼの生成：生成
（９）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反応）：陰性
（10）クリステンゼンのクエン酸ナトリウム培地（チトラーテ培地）における硫化水素の産生：陰性
（11）インドールの生成：陰性
（12）硝酸塩還元：還元
（13）尿素の分解：分解せず。
（14）酸素要求性：通性嫌気性
（15）カタラーゼの生成：生成
（16）オキシターゼの生成：生成
（17）ＤＮエース（ＤＮａｓｅ）の生成：陰性
Ｄ．遺伝的性質
ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：７７．５〜７８．５％（Ｔｍ）
【請求項２】
セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株が産生する多糖類分解酵素であって、次の理化学的性質を有する繊維性多糖類分解酵素
（１）作用：セルロース、キシロース、プルラン等の繊維質に作用し、これらを可溶化、分解する。
（２）基質特異性：カルボキシメチルセルロース、アモルファスセルロース、結晶性セルロース、キシラン、キチンによく作用する。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ４〜１１で優れた多糖類分解能を有する。カルボキシメチルセルロース分解活性の至適ｐＨは、ｐＨ６〜９である。
（４）至適温度：２０〜６０℃で強いカルボキシメチルセルロース分解活性を示し、カルボキシメチルセルロース分解活性の至適温度は５０℃である。
（５）酵素組成：９個の酵素の混合物である。
（６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した推定分子量は約１３０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約７３ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約６２ｋＤａ、約５３ｋＤａおよび約４５ｋＤａである。 
【請求項３】
セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の菌体、菌体培養液、菌体もしくは菌体培養液の処理物、またはそれらから分離された繊維性多糖類分解酵素を用いて植物性繊維を分解処理することを特徴とする植物繊維分解方法。
【請求項４】
植物繊維が稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッカス（サトウキビの絞り粕、とうもろこしの芯）、芋のつる、落葉から選ばれる植物繊維性廃棄物であることを特徴とする請求項３記載の植物繊維分解方法。
【請求項５】
植物繊維の分解処理をｐＨ約６〜約９で実施することを特徴とする請求項３または４記載の植物繊維分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セルロモナス（Cellulomonas）属に属する新規微生物Ｋ３２Ａ株、および同微生物が産生する繊維性多糖類分解酵素に関する。また本発明は、同微生物の菌体、菌体培養液、菌体もしくは菌体培養液の処理物またはそれらから分離した繊維性多糖類分解酵素を用いる植物繊維分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
農作物の収穫後の植物体などの植物繊維性廃棄物は、従来、おもに焼却などにより処分されている。しかしながら、植物繊維性廃棄物を焼却処分することについては、種々問題点が指摘されている。たとえば、コメの生産における稲ワラや籾殻は収穫後には不用物となり、コンバインなどで細かく裁断したのちに焼却処分されてきたが、焼却の際の噴煙などによる公害が生じており、社会問題として焼却処分の禁止などが検討されている。
【０００３】
植物繊維性廃棄物の焼却処分にかわる処分方法として、植物繊維性廃棄物を分解することができるセルラーゼなどの多糖類分解酵素やセルラーゼ産生菌などの微生物の利用による処理方法が注目されている。しかしながら、既存のセルラーゼなどの多糖類分解酵素およびそれら産生微生物では、植物繊維性廃棄物の分解能力が低く、所期の目的を達成するにはきわめて不充分であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
植物繊維性廃棄物を難分解性の構造にしているのが、セルロースおよびヘミセルロースである。植物繊維性廃棄物を処理して有効に利用するためには、第一段階としてセルロースおよび／またはヘミセルロースを部分的にでも加水分解することが必要となる。セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解する方法としては、高濃度の酸による方法と酵素による方法があるが、田畑における分解方法としては酵素処理が望ましい。
【０００５】
本発明は、セルロース、ヘミセルロースおよびキシロース等に対し強力な分解能を有する多糖類分解酵素を産生する新規な微生物、および同微生物が産生する繊維性多糖類分解酵素を提供することを目的とする。さらに本発明は、同微生物、その培養液または同微生物産生多糖類分解酵素を用いる植物繊維、たとえば植物繊維性廃棄物、の分解方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる微生物は、新潟県の水田土壌から分離されたセルロモナス属に属する新規微生物であり、当該微生物は植物繊維、たとえば植物繊維性廃棄物、に対し強力な分解能を示す酵素を産生するという産業上優れた有用性を有することを見出し、本発明を完成するにいたった。
【０００７】
本発明にかかる当該セルロモナス属微生物の菌学的性質は、次に示すとおりである。
【０００８】
Ａ．形態的特徴
（１）グラム染色：陽性
（２）形態：培養初期においては、０．３〜０．５μｍ×２〜３μｍ内外の小さな桿菌であるが、培養期間が長くなるにつれて、分枝したり、球状の形態をとる多形性桿菌である。
（３）内生胞子：陰性
（４）運動性：有
（５）鞭毛の着生状態：極鞭毛
【０００９】
Ｂ．各種培地における生育状態
（１）普通寒天培地：小さい凸状のスムースコロニーを形成。３日間以上の培養で黄色の色素を産生する。
（２）ペプトン・トリプトン・酵母エキス・グルコース寒天培地（ＰＴＹＧ寒天培地（ＡＴＣＣ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＃４６４）であり、組成は培地１０００ｍＬあたりペプトン５ｇ、トリプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース５ｇ、寒天１５ｇである。）：盛り上がり厚いコロニーを形成。
【００１０】
Ｃ．生理的性質
（１）最適発育温度：３５〜４０℃
（２）最適発育ｐＨ：６．８〜７．２
（３）普通寒天培地６５℃での発育：６５℃２４時間では発育せず。
（４）基質の利用性
１．α−シクロデキストリン          ：利用できず
２．β−シクロデキストリン          ：利用
３．デキストリン                    ：利用
４．グリコーゲン                    ：利用
５．イヌリン                        ：利用できず
６．マンナン                        ：利用できず
７．ツイーン４０                    ：利用できず
８．ツイーン８０                    ：利用できず
９．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン  ：利用できず
10．Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン  ：利用できず
11．アミグダリン                    ：利用
12．Ｌ−アラビノース                ：利用
13．Ｄ−アラビトール                ：利用できず
14．アルブチン                      ：利用
15．セロビオース                    ：利用
16．Ｄ−フルクトース                ：利用
17．Ｌ−フコース                    ：利用
18．Ｄ−ガラクトース                ：利用
19．Ｄ−ガラクツロン酸              ：利用できず
20．ゲンチオビオース                ：利用
21．Ｄ−グルコン酸                  ：利用できず
22．α−Ｄ−グルコース              ：利用
23．ｍ−イノシトール                ：利用できず
24．α−Ｄ−ラクトース              ：利用
25．ラクツロース                    ：利用
26．マルトース                      ：利用
27．マルトトリオース                ：利用
28．Ｄ−マンニトール                ：利用できず
29．Ｄ−マンノース                  ：利用できず
30．Ｄ−メレジトース                ：利用できず
31．Ｄ−メリビオース                ：利用
32．α−メチル−Ｄ−ガラクトシド    ：利用
33．β−メチル−Ｄ−ガラクトシド    ：利用
34．３−メチルグルコース            ：利用
35．α−メチル−Ｄ−グルコシド      ：利用
36．β−メチル−Ｄ−グルコシド      ：利用
37．α−メチル−Ｄ−マンノシド      ：利用できず
38．パラチノース                    ：利用
39．Ｄ−プシコース                  ：利用
40．Ｄ−ラフィノース                ：利用できず
41．Ｌ−ラムノース                  ：利用できず
42．Ｄ−リボース                    ：利用
43．サリシン                        ：利用
44．セドヘプツロサン                ：利用できず
45．Ｄ−ソルビトール                ：利用
46．スタキオース                    ：利用できず
47．スクロース                      ：利用
48．Ｄ−タガトース                  ：利用できず
49．Ｄ−トレハロース                ：利用
50．ツラノース                      ：利用
51．キシリトール                    ：利用できず
52．Ｄ−キシロース                  ：利用
53．酢酸                            ：利用
54．α−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
55．β−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
56．γ−ヒドロキシ酪酸              ：利用できず
57．ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸      ：利用できず
58．α−ケトグルタル酸              ：利用できず
59．α−ケト吉草酸                  ：利用できず
60．ラクトアミド                    ：利用できず
61．Ｄ−乳酸メチルエステル          ：利用できず
62．Ｌ−乳酸                        ：利用できず
63．Ｄ−リンゴ酸                    ：利用できず
64．Ｌ−リンゴ酸                    ：利用できず
65．ピルビン酸メチル                ：利用
66．コハク酸モノメチル              ：利用できず
67．プロピオン酸                    ：利用できず
68．ピルビン酸                      ：利用
69．スクシンアミド酸                ：利用できず
70．コハク酸                        ：利用できず
71．Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸  ：利用
72．アラニンアミド                  ：利用できず
73．Ｄ−アラニン                    ：利用できず
74．Ｌ−アラニン                    ：利用できず
75．Ｌ−アラニルグリシン            ：利用できず
76．Ｌ−アスパラギン                ：利用できず
77．Ｌ−グルタミン酸                ：利用できず
78．グリシル−Ｌ−グルタミン酸      ：利用できず
79．Ｌ−ピログルタミン酸            ：利用できず
80．Ｌ−セリン                      ：利用できず
81．プトレッシン                    ：利用できず
82．２，３−ブタンジオール          ：利用できず
83．グリセロール                    ：利用
84．アデノシン                      ：利用
85．２’−デオキシアデノシン        ：利用
86．イノシン                        ：利用
87．チミジン                        ：利用
88．ウリジン                        ：利用
89．アデノシン−５’−一リン酸      ：利用
90．チミジン−５’−一リン酸        ：利用
91．ウリジン−５’−一リン酸        ：利用
92．フルクトース−６−リン酸        ：利用できず
93．グルコース−１−リン酸          ：利用できず
94．グルコース−６−リン酸          ：利用できず
95．Ｄ−Ｌ−α−グリセロールリン酸  ：利用できず
（５）ゼラチンの液化：液化する。
（６）デンプンの加水分解：分解する。
（７）セルラーゼの生成：生成
（８）キシラーゼの生成：生成
（９）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反応）：陰性
（10）クリステンゼンのクエン酸ナトリウム培地（チトラーテ培地）における硫化水素の産生：陰性
（11）インドールの生成：陰性
（12）硝酸塩還元：還元
（13）尿素の分解：分解せず。
（14）酸素要求性：通性嫌気性
（15）カタラーゼの生成：生成
（16）オキシターゼの生成：生成
（17）ＤＮエース（DNase）の生成：陰性
【００１１】
Ｄ．遺伝的性質
ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：７７．５〜７８．５％（Ｔｍ）
【００１２】
本発明にかかる当該微生物は、水田畑土壌、森林土壌、倒木腐朽部を採取し、これを滅菌した界面活性剤添加生理的食塩水に懸濁し、この懸濁液を、カルボキシメチルセルロースを添加した普通寒天培地に塗布後２５〜３０℃で培養し、カルボキシメチルセルロースを加水分解せしめるコロニーを、ハロー形成の有無により判断し、ハロー形成の認められたコロニーを選抜して分離することができる。また分離された当該微生物の単離・精製は、たとえばさらに必要に応じて、結晶性セルロース（商品名：Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１、旭化成工業（株）製）をリン酸処理して得られたアモルファスセルロースを添加した培地で同様に選抜し、さらに結晶性セルロース（同上）を添加した培地で同様に選抜し、最後にキシランを添加した培地で同様に選抜するなど、４段階の選抜工程を経て、容易に実施することができる。
【００１３】
本微生物の性質をバージーのシステマチック  バクテリオロジー  ２巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.2）を参考に検索すると、前記Ａ．形態的特徴およびＣ．生理的特徴からグラム陽性、セルラーゼ産生であると判断された。市販の基質利用性に基づいた微生物同定システム（微生物検索同定バイオログシステム、バイオログ社製）を用いた評価では、ジョネシア  デニトリフィカンス（Jonesia denitrificans）が最も近縁であると考えられた。図１に前記同定システムにより作成した基質利用性に基づく系統樹を示す。しかしながら、ＤＮＡのＧＣ含量は、ジョネシア  デニトリフィカンスは４０％程度であるのに対して、本微生物は既知のセルロモナス属のＧＣ含量７１−７６％（Ｔｍ）をわずかに上回る７７．５−７８．５％（Ｔｍ）であり、明らかにジョネシア  デニトリフィカンスとは異なる。
【００１４】
一方、１６Ｓ  ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性比較を基にした系統樹（図２）においては、本微生物は明らかにセルロモナス属に属する。そして、近縁菌としてはセルロモナス  フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）、セルロモナス  ゲリダ（C. gelida）、セルロモナス  フィミ（C. fimi）などが存在する。しかしながら、運動性の有無、Ｄ−リボース、Ｄ−グルコン酸などの各種基質利用性の点でセルロモナス  フラビゲナとは異なり、また同様にラクトースの利用の点でセルロモナス  ゲリダおよびセルロモナス  フィミとも明らかに異なる。表１に１６Ｓ  ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性比較を基にした系統樹（図２）により最も近縁であることが明らかになったセルロモナス  フラビゲナと本微生物の基質利用性の違いを示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
このように、１６Ｓ  ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性では、いずれのセルロモナス属の既知の種とも一致せず、また、ＤＮＡのＧＣ含量においては報告されているセルロモナス属のどの種よりも高い含有量（７７．５−７８．５％）を示す。しかしながら、電子顕微鏡による鞭毛の着生状態の観察からは（図３）、セルロモナス属に一般的な極鞭毛であることが認められ、本微生物はセルロモナス属微生物の一種であると考えられる。なお、図３において、１は本発明のセルロモナス属微生物を、２は鞭毛を示す。
【００１７】
以上の点から、本微生物はセルロモナス属の微生物ではあるものの、既記載のセルロモナス属のいずれかの種に分類することが適当ではないと考えられる。これらのことから、本発明者は、本微生物を新規微生物と認定し、セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株（Cellulomonas sp. K32A）と命名した。
本微生物は国際寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年６月２５日に国際寄託されており、その菌受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−６７６６である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、当該微生物は、通常この技術分野で用いられる培地および培養条件下で培養することができる。炭素源としては、濾紙、セルロース粉末などの各種繊維質原料を、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩およびペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、コーングルーテンミール、綿実油、脱脂大豆などの有機物を用いることができる。その他微量の無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチアミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよい。これらの培地成分は本微生物の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は通常０．０２５〜０．５重量％用いるのが適当である。窒素源は通常０．０５〜１重量％用いるのが適当である。培地は通常ｐＨ６．５〜８．５、好ましくはｐＨ６．８〜７．５、さらに好ましくはｐＨ７．０〜７．２に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は本微生物が生育し得る温度であればよく、通常２０〜４０℃が適当である。本微生物を液体培養するばあいは、振とう培養または通気撹拌培養するのが好ましい。培養時間は種々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気撹拌培養のばあいは１〜５日間、好ましくは２〜３日間が適当である。
【００１９】
得られた培養液は、所望により、遠心分離または濾過することにより、粗酵素溶液を得ることができる。当該粗酵素溶液は、さらに所望とあれば、ウルトラフィルトレーションによる濃縮または硫安塩析法、溶媒沈殿法、透析法などの公知の方法を適用して粗酵素粉末としてもよい。
【００２０】
またさらに、当該培養液、粗酵素溶液および粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィーによる吸着および溶出、分子量の差によるゲル濾過法等一般的酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製することもできる。前記培養液、粗酵素溶液または精製酵素として得られる本発明の繊維性多糖類分解酵素はセルロースのみではなく、農業上の稲ワラ、麦ワラなどの植物繊維性廃棄物を分解し、さらに、これまで分解が難しいとされた籾殻なども分解する強力なセルラーゼおよびキシラーゼを分泌するという特徴を有する。また、植物に含まれるヘミセルロースの本体であるキシロースやプルランをも分解し、これらの酵素が同時に働くことにより天然の多糖類を容易に分解することができるという特徴も有する。さらに当該多糖類分解酵素は、酵素活性の最適ｐＨは中性域であるが、ｐＨ６〜１０の間で活性の８０％以上を維持し、温度に関しては、６５℃まで活性を維持する。
【００２１】
本微生物は、その産生酵素、とくにセルラーゼの作用により、セルロースをたとえばセロビオースにまで分解し、また稲ワラを基質として用いた場合にも、たとえば二単糖を生成させることができる。すなわち、本微生物を用いれば、従来産業廃棄物とされてきた植物繊維性廃棄物から単糖、または二単糖・三単糖その他のオリゴ糖を生産することができる。
【００２２】
当該繊維性多糖類分解酵素の理化学的性質をより具体的に示すと、次のとおりである。
（１）作用：セルロース、キシロース、プルラン等の繊維質に作用し、これらを可溶化、分解する。
（２）基質特異性：カルボキシメチルセルロース、アモルファスセルロース、結晶性セルロース、キシラン、キチンによく作用する。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ４〜１１で優れた多糖類分解能を有する。カルボキシメチルセルロース分解活性の至適ｐＨは、ｐＨ６〜９である。
（４）至適温度：２０℃〜６０℃で強いカルボキシメチルセルロース分解活性を示し、カルボキシメチルセルロース分解活性の至適温度は５０℃である。
（５）酵素組成：９個の酵素の混合物である。本発明の前記培養液または粗酵素溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分画したところ、図６に示すとおり、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＢ、ＣｂｐＣ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＥ、ＣｂｐＦ、ＣｂｐＧ、ＣｂｐＨ、ＣｂｐＩの９個の画分を与えた。ここでＣｂｐは、セルロース結合タンパク質（cellulose binding protein）を意味している。またこれら各画分のエンドグカナーゼ、エクソグルカナーゼおよびキシラナーゼ活性は表５記載のとおりである。
【００２３】
さらに、分画された９個の酵素は、アミノ末端に次に示すアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列の決定は、アクリルアミドゲルから各画分を採取し、公知の方法（Matudaira.P.、１９８７年、 J.Biol.Chem. 第２６２号、１００３５頁〜１００３８頁）で、アミノ酸分析装置（商品名：Procise ４９２ gas-phase sequencer、パーキン−エルマー社（Perkin-Elmer）製）により分析した。その結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
（６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した推定分子量は、ＣｂｐＡ  １３０ｋＤａ、ＣｂｐＢ  １００ｋＤａ、ＣｂｐＣ  ９０ｋＤａ、ＣｂｐＤ  ８０ｋＤａ、ＣｂｐＥ  ７３ｋＤａ、ＣｂｐＦ  ６５ｋＤａ、ＣｂｐＧ  ６２ｋＤａ、ＣｂｐＨ  ５３ｋＤａ、ＣｂｐＩ  ４５ｋＤａである。
【００２６】
本発明によれば、植物繊維の分解反応は、前記培養によって得た微生物の菌体、菌体培養液またはそれらの処理物、あるいは菌体もしくは菌体培養液から分離した繊維性多糖類分解酵素に基質となる植物繊維を作用させて実施することができる。当該分解反応において、菌体の処理物としては、たとえば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、超音波処理物、菌体抽出物等をいずれも使用でき、また培養処理液としては、遠心分離、濾過または共沈等の慣用手段によって培養液から菌体細胞壁などの不溶物を除去したもの、ないしそれらの濃縮液をいずれも使用することができる。菌体もしくは菌体培養液から分離された繊維性多糖類分解酵素は、通常、前記９種の混合物のまま用いるのが好ましく、また所望とあれば、９種の酵素混合物のうち任意の組合せからなる酵素混合物として用いてもよい。一方、当該分解反応に際し、基質としては、植物繊維を主な構成成分とするものであればとくに限定されることはなく、幅広く使用することができる。このような基質の具体例としては、稲作や小麦生産、とうもろこし、サトウキビ等の穀物、豆類、芋類の生産において排出される植物繊維性廃棄物、たとえば稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッカス（サトウキビの絞り粕、トウモロコシの芯）、芋のつる等、さらには落葉を挙げることができる。また、現在大量に消費されている紙、板紙および紙製品、またはパルプ、ビスコース、木材、木粉、綿毛等を基質として用いることもできる。当該分解反応の反応条件は、たとえば酵素の使用量、基質の種類に応じて適宜選択すれば良く、溶媒としては、通常、水、含水アルコール等を用いるのが好ましい。
【００２７】
当該分解反応は、ｐＨ約６〜約９で実施することができる。また反応温度にとくに制約はなく、一般的には室温、たとえば約２５℃〜約３０℃で好適に実施することができる。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
前培養には５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、ペプトン  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／Ｌ）を用いた。該前培養培地にＫ３２Ａ株のシングルコロニーを接種し、旋回振とう機（商品名：Ｇ１０ Gyrotory shaker、ニューブランスウィックサイエンティフィック社（New Brunswick scientific）製）にて３７℃で一晩かけて振とう培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）することにより、前培養液を得る。本培養の培地には、０．０５％アビセル（商品名）を添加した１／５ＰＴＹ培地（酵母エキス１ｇ／Ｌ、トリプトン  １ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  １ｇ／Ｌ）２５０ｍＬを用いた。該本培養培地に前培養液を１％接種して、基質のアビセルが消失するまで３７℃で振とう培養（２５０ｒｐｍ、振幅１０ｍｍ）する（約７２時間）。培養終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）して培養上清を得る。培養上清をろ過滅菌し、硫安を加えて８０％飽和硫安とし上清中のタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を５０ｍＭ  モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＮａＮ3の緩衝液に溶解透析し、これを粗酵素溶液とした。調製した粗酵素溶液中のタンパク質濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。
【００３０】
実施例２
実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素の酵素活性のｐＨ依存性の測定は、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液、５０ｍＭリン酸緩衝液または５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いて３７℃で行なった。基質として０．１ｇのカルボキシメチルセルロースを用い、粗酵素溶液１０ｍＬ（タンパク質濃度５μｇ／ｍＬ）と３０分間反応させ、還元糖の産生量を測定した。その結果、図４に示すとおり、少なくともｐＨ４〜１１の範囲で明らかな活性が認められ、最適ｐＨは６〜９であった。
【００３１】
実施例３
実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素の酵素活性の温度依存性は、１０ｍＬの粗酵素溶液（タンパク質濃度５μｇ／ｍＬ）、基質として０．１ｇのカルボキシメチルセルロースを用い、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液またはｐＨ１０の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いて、２０℃〜７０℃で３０分間反応させ、還元糖の産生量を測定した。その結果、図５に示すとおり、２０℃〜６０℃にわたって明らかな活性が認められ、最適温度は５０℃であった。
【００３２】
実施例４
実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。５０ｍＭ  モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＮａＮ3および１％の基質からなる１０ｍＬの反応溶液を調製する。この反応溶液を３０℃でプレインキュベーションした後、１００μｇの粗酵素を加え、３７℃で３０分間反応を行なった。反応終了後、１ｍＬのサンプルを採取し、遠心（１５０００×ｇ、５分間）して不溶物を除き、３，５−ジニトロサリチル酸法により上清の還元糖の産生量を測定した。結果を表３に示す。なお、スタンダードはグルコースを用いた。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
実施例５
実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。５０ｍＭ  モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＮａＮ3および１％の基質からなる１０ｍＬの反応溶液を調製する。この反応溶液を３０℃でプレインキュベーションした後、１００μｇの粗酵素を加え、３７℃で反応を開始した。反応開始後、１５分間毎に１ｍＬのサンプルを採取し、遠心（１５０００×ｇ、５分間）して不溶物を除き、３，５−ジニトロサリチル酸法により上清の還元糖の産生量を測定した。結果を表４に示す。なお、スタンダードはグルコースを用いた。
【００３５】
【表４】
0003710997.tif 000005
【００３６】
実施例６
実施例１と同様にして粗酵素溶液を得る。該粗酵素溶液にアビセル（商品名）を１ｇ加え、氷温で１０分間結合させる。ついで、遠心（４５００×ｇ、５分間）で沈殿物を集め、これに５ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌ添加５０ｍＭリン酸−１２ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７．０を加え撹拌し、再度遠心操作を行なう。次に５ｍＬの５０ｍＭリン酸−１２ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７．０を加えて撹拌遠心を２回実施し、最後に５ｍＬの滅菌水で同様に洗浄を１回行なう。セルラーゼが結合したアビセル（商品名）に２ｍＬのエチレングリコールを加え、結合した画分を溶出し、この画分をバインディングフラクションとした。このバインディングフラクションを８％のゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって展開されたタンパク質を検出した。
【００３７】
その結果、当該粗酵素溶液に含まれる多糖類分解酵素は、図６に示すとおり、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＢ、ＣｂｐＣ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＥ、ＣｂｐＦ、ＣｂｐＧ、ＣｂｐＨおよびＣｂｐＩからなる９個のバンドとして検出された。
【００３８】
さらに、各タンパク質の定性を行なった。各バンドを採取し、それぞれのエンドグルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を従来法（Walfgang. H. １９８７年、Anatical Biochem.、第１６４号、７２頁〜７７頁）により測定した。エンドグルカナーゼ活性の測定には基質としてカルボキシメチルセルロースを用い、キシラナーゼ活性の測定には基質としてＯｓｔ−ｓｐｅｌｔキシランを用いた。またエクソグルカナーゼ活性は、基質を含まないＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した後、前記の従来法にしたがってＳＤＳを除いた。ついで、これに蛍光基質である４−メチルウンベリフェリルｄ−セルロバイオサイド（4-methylumbelliferyl d-cellobioside）を作用させ、ブラックライト（３６０ｎｍ）で観察し、蛍光が観察されたタンパク質バンドをエクソグルカナーゼ活性ありと判断した。これらの結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】
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【００４０】
実施例７
実施例１にしたがって粗酵素溶液を調製した。粗酵素溶液５ｍＬ中に基質として１ｇの稲ワラまたは籾殻を加え、指定の温度で７２時間および１週間反応させた。反応終了後に遠心（３５００ｒｐｍ、２０００×ｇで１５分間）し、得られた沈殿物に滅菌水を加えて遠心機（商品名：ＫＮ−７０、クボタ製）で遠心（３５００ｒｐｍ、１５分間）することにより３回洗浄し、凍結乾燥後に沈殿物の重量を天秤で測定した。反応後の重量を初期重量から引いた重量が初期重量に占める百分率を除去率とした。この結果を表６および表７に示す。
【００４１】
【表６】
0003710997.tif 000007
【００４２】
【表７】
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【００４３】
実施例８
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＮａＮ3を含んだ５０ｍＭ  モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ  ７．０）に基質として籾殻を１％加えたもの５０ｍＬに、Ｋ３２Ａ株の粗酵素溶液をタンパク質量として１ｍｇ加え、５０℃で２４時間保温した。保温後、遠心分離し、沈殿画分を凍結乾燥して、乾燥重量を対照群（粗酵素溶液を加えなかったもの）と比較した。その結果、粗酵素溶液を加えたものは対照群に比較しその重量が３０−３２％減少していた。また、目視により遠心分離前の溶液を観察すると、籾殻が一部溶解していることが観察された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、植物繊維を難分解性にしているセルロース、ヘミセルロースおよびキシラン等に対し強い分解能を有する繊維性多糖類分解酵素を産生する新規な微生物、ならびに同微生物が産生する繊維性多糖類分解酵素を提供することができる。また当該微生物およびその産生酵素は室温または室温付近において植物繊維に対し強力な分解能を有するため、植物繊維性廃棄物を輸送することなく、分解処理することができる。
【００４５】
さらに当該微生物またはその産生酵素を用いることにより、稲ワラ、籾殻、麦ワラ、バッカス（サトウキビの絞り粕、とうもろこしの芯）、芋のつる、落葉などの植物繊維性廃棄物などを強力に分解することも可能となり、農業に関する分野にとどまらず、現在社会で大量に消費・廃棄されている植物繊維物質を効率よく分解処理することができる。
【００４６】
その上、これらの分解処理物は、単糖、または二単糖・三単糖その他のオリゴ糖などであるため、糖原料として再利用することもできる。
【００４７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号２：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号３：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号４：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号５：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号６：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号７：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号８：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
配列番号９：セルロース結合タンパク質として同定されたアミノ末端アミノ酸配列
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の基質利用性に基づき、バイオログ社データベースを用いて作成した系統樹を示す図である。
【図２】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の相同性比較に基づき、ＢＬＡＳＴ（データベース）を用いて作成した系統樹を示す図である。
【図３】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株の鞭毛の着生状態（倍率：１万倍）を示す図である。
【図４】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株産生セルラーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図５】セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株産生セルラーゼ活性の温度依存性を示すグラフである。
【図６】Ｋ３２Ａ産生多糖類分解酵素とアビセルとの結合実験を示す図である。
【符号の説明】
１  セルロモナス属微生物Ｋ３２Ａ株
２  鞭毛
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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