(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ配列からなるペプチドを抗原として認識する抗チロシローゼ抗体のＦａｂフラグメント。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１記載のＦａｂフラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧであり、サブクラスがＩｇＧ1である請求項２記載のＦａｂフラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体がマウス細胞由来である請求項２又は３記載のＦａｂフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、チロシナーゼの検知や構造解析に有用な、抗チロシナーゼ抗体、特に抗チロシナーゼモノクローナル抗体のＦａｂフラグメント及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チロシナーゼは生体内でメラニン色素を生合成する上で最も重要な酵素であり、粗面小胞体のリボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃縮、活性化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノソームへ選択的に転送されると考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
生体内でチロシナーゼの生合成が阻害されると、重大な皮膚障害が起こることが知られており、例えば、色素異常症はチロシナーゼ自身の構造の変異やその生合成過程での異常が原因であるといわれている。また、色素異常症にはチロシナーゼのプレメラノソームへの選択的転送の異常が関与している可能性もある。
【０００４】
このような疾病の診断あるいは原因の究明には、チロシナーゼの構造や生体或は細胞に於ける挙動を知ることがたいへん有益であると考えられ、かかる観点から、従来よりチロシナーゼの挙動を知るための努力がなされてきた。特に抗原・抗体反応を用いた方法は、感度も高いことから種々の検討がなされてきており、チロシナーゼに対する抗体の作製が古くからなされてきた。しかしながら、チロシナーゼは抗原として抗体に認識されにくく、且つ、チロシナーゼに物性的に極めて近似したチロシナーゼ関連蛋白が存在するが故に、幾度とない失敗を克服して抗チロシナーゼモノクロナール抗体が作られたのはつい最近のことである。従って、抗チロシナーゼモノクロナール抗体が認識する抗原部位等の詳細な研究は為されておらず、それらの解明のために抗体側の認識部位の構造解析が望まれていた。
【０００５】
更に、代表的な抗体分子であるイムノグロブリンγ（ＩｇＧ）は、抗原を認識するＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２の部分とマクロファージなどと結合するＦｃ部分より構成されていることが知られているが、このうちＦａｂ部分の構造によっては非特異的反応を招くことがあり、得られた抗チロシナーゼ抗体の特異性を証明するためにもＦａｂフラグメントの解析が求められていた。
【０００６】
又、Ｆｃ部分はマクロファージと結合するため、マクロファージが多く存在する環境では抗チロシナーゼ抗体そのものを使用することは不合理であり、Ｆｃ部分を含まない部分、すなわちＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２の部分が求められていた。
【０００７】
一方、チロシナーゼを特異的に認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメントはまだ得られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記のような観点からなされたものであり、抗チロシナーゼ抗体の特性把握のため、チロシナーゼの少なくとも一部を抗原として認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメント、即ち、抗ヒトチロシナーゼ抗体よりマクロファージ等と結合するＦｃ部分を除いたフラグメントを提供すること及びその製造法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、チロシナーゼのアミノ酸配列のうちチロシナーゼに非常に類似した蛋白であるチロシナーゼ関連蛋白（ＴＲＰ）には認められない配列を有するペプチドを抗原に用いることにより、チロシナーゼを認識するモノクローナル抗体が得られることを見出し、これを蛋白分解酵素により部分消化することによりこのＦａｂフラグメントを得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、チロシナーゼの少なくとも一部を抗原として認識する抗チロシナーゼ抗体のＦａｂフラグメントである。前記抗体のチロシナーゼに対する認識部位としては、配列番号１に示すアミノ配列の少なくとも一部が挙げられる。また、本発明のＦａｂフラグメントの具体的態様して、前記抗チロシナーゼ抗体が抗チロシナーゼモノクローナル抗体である上記Ｆａｂフラグメント、前記モノクローナル抗体がＩｇＧであり、サブクラスがＩｇＧ１である上記Ｆａｂフラグメント、分子量が４００００〜６００００である上記Ｆａｂフラグメント、さらにチロシナーゼがヒトチロシナーゼである上記Ｆａｂフラグメントが挙げられる。
【００１１】
また本願発明は、下記工程を含む上記のＦａｂフラグメントの製造法を提供する。
（ａ）チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結合物を用いて哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細胞と融合してハイブリドーマを作製し、
（ｂ）チロシナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
（ｃ）前記ハイブリドーマを適当な培地で培養した培養上清、あるいは前記ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して得られる腹水から抗体蛋白を採取し、
（ｄ）前記抗体蛋白を蛋白分解酵素により部分消化してＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントとに切断し、Ｆａｂフラグメントを分離する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
チロシナーゼの中でもヒトチロシナーゼのｃＤＮＡ配列は既に知られており（Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅｔ，  ６４，  １２１−１３５（１９８９））、また、ＴＲＰのｃＤＮＡ配列も既に知られている（Ｓｉｇｅｋｉ  Ｓｈｉｂａｈａｒａ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．  ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １５６，  ４０３−４１４（１９８８））。本発明者らはこれらのｃＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳した結果、チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する部分が、ＴＲＰと相同性が低いことを見いだした。この配列はヒトチロシナーゼに特有であるが、マウス等の実験動物のチロシナーゼともＴＲＰよりははるかに高い相同性を有している。
【００１３】
本発明者らは、この点に注目し、上記配列を有するペプチド（以下、「チロシナーゼに特異的なペプチド」ともいう）の合成を（株）ペプチド研究所に委託した。入手したペプチドを用いて哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養細胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマにチロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を生産させることに成功した。この抗体はヒトチロシナーゼを強く認識し、更には、弱いながらマウスのチロシナーゼも認識した。さらに、その抗体に対し酵素処理を施すことにより特異性および反応性の高い抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントを得た。以下に、モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの製造法の一例を、製造手順に沿って説明する。
【００１４】
＜１＞抗原
哺乳動物を免疫する際に用いる抗原としては、ヒトチロシナーゼに特異的なアミノ酸配列を有するペプチドが好適である。そのようなアミノ酸配列として、配列番号１に示す配列が挙げられる。このアミノ酸配列を有するペプチドは常法により化学合成することができる。例えば、市販されているペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入力すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入手してもよい。
【００１５】
かくして得られるペプチド（以下、「合成ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いることができるし、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ：Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）等の担体と結合させて用いることもできる。このような担体を用いると、ペプチドのみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選択する段階で取り除くことができる。
【００１６】
＜２＞哺乳動物の免疫
上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いられている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペプチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、フロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜２週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法が挙げられる。
【００１７】
このときの合成ペプチドあるいは担体に結合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度が適当である。投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ未満では抗体を十分に生成しないことがある。また、５０ｍｇ／ｋｇを越えても更なる免疫効果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目的とする抗体が得られない恐れがある。
【００１８】
＜３＞ハイブリドーマの作製
上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。
【００１９】
融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが好ましい。
【００２０】
例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられる。このような細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別できる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１株、ＦＯ株、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株等のミエローマ細胞の市販株が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２１】
細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤とともに混合することにより行われる。融合促進剤としては、細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示できる。また電気パルスによって融合させてもよい。
【００２２】
細胞融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいはＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育させる。
【００２３】
＜４＞ハイブリドーマの選別
上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノクローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを株の混合体であるので、これらの中から前記合成ペプチド、すまわちヒトチロシナーゼに特異的なペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。
【００２４】
この選別の方法としては、抗原に用いた合成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレート等に固相化しておきこれにハイブリドーマ培養上清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質で標識した第２抗体を加え、結合した標識量から合成ペプチドに結合する抗体量を知ることができる。或は、ハイブリドーマが産生する抗体を固相化し、これに合成ペプチド、標識第２抗体を順次加えてインキュベートしてもよい。
【００２５】
このようにして得られたハイブリドーマの１株は、平成６年５月２７日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＰＭ  Ｐ−１４３４０として寄託されており、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８０１として寄託されている。
【００２６】
＜５＞チロシナーゼに特異的に結合する抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントの調製及びその利用法
上記のようにして得られたハイブリドーマからチロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例えば、抗体産生ハイブリドーマを常法に従って硫安分画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等で精製すればよい。後記実施例で得られたモノクローナル抗体は、ヒトチロシナーゼには特異的に強く結合し、マウスチロシナーゼとは特異的に弱く結合する。これは、チロシナーゼのアミノ酸配列に於いて、配列番号１の配列はヒトに特異的なものであり、マウスのチロシナーゼではこれに相当する部分ではアミノ酸１個分異なっている。これらのことより、チロシナーゼのこの領域は動物種により若干異なるものの、割合相同性の高い部分であり、上記モノクローナル抗体はどの動物種に於いてもある程度チロシナーゼを認識することが期待できる。更に、この配列を少し変えるだけでそれぞれの動物に特有のチロシナーゼを認識させることが出来る。本発明のＦａｂフラグメントは、これらの抗チロシナーゼモノクロナール抗体のＦａｂフラグメントを包含するものである。
【００２７】
かくして、抗チロシナーゼモノクロナール抗体が得られるわけであるが、これをさらに蛋白分解酵素にて部分消化し、プロテインＡカラム等を用いてＦｃフラグメントを除けばＦａｂフラグメントが得られる。かかる酵素としては、ｐＨ等の条件を適切に設定することによりＦａｂフラグメントを切断できるものであれば特段の限定はなく、例えば、不溶化パパインやフィシン等が例示できる。
【００２８】
また、前記と同様にして合成ペプチドで哺乳動物を免疫し、その血液から通常の抗体の精製と同様にしてイムノグロブリン画分を調製すれば、抗チロシナーゼポリクローナル抗体が得られる。こうして得られた抗チロシナーゼポリクローナル抗体もチロシナーゼに特異的に結合するものであり、この抗チロシナーゼポリクローナル抗体前記蛋白分解酵素で消化しても、本発明のＦａｂフラグメントが得られる。
【００２９】
本発明のチロシナーゼに特異的に結合する抗チロシナーゼ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトチロシナーゼと特異的に反応するので、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の免疫染色における染色体用抗体、さらにはウェスタンブロットあるいはミクロオートラジオグラフィーにおける染色用抗体として使用可能であり、ヒトチロシナーゼの定性あるいは定量のための検知用試薬として利用することができる。更にＦｃ部分を含まないため、マクロファージの影響を受けにくい。又、動物のチロシナーゼともＴＲＰよりははるかに特異的に結合するので、上記と同様の実験を、動物を用いても行うことが出来る。
【００３０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明について詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
＜１＞ハイブリドーマの作製
ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、株式会社ペプチド研究所に依頼した。
【００３２】
上記の担体結合合成ペプチド１００μｇを生理食塩水１００μｌに溶かし、完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ製）１００μｌと混合乳化したものを、８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）の腹腔内に投与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結合合成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液２００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の投与から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解した生理食塩水１００μｌを静脈注射した。
【００３３】
３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。一方、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（大日本製薬より購入）を、細胞融合に合わせて対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。
【００３４】
１０８個の脾細胞に対し、２×１０７個のミエローマを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞をペレットにした。上清を除いた後、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４０００（ＳＩＧＭＡ製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分間穏やかに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地２ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しながら滴下した。
【００３５】
滴下終了後、遠心分離により上清を除いた後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌに懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベークライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注した。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培養上清を半分除き、１００μｌのＧＩＴ培地を添加した。
【００３６】
細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成したが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製）を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により検定した。このうち、抗体価の高かったウェル中のハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。さらに、合成ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、ヒトチロシナーゼ及びマウスチロシナーゼに結合し、チロシナーゼ関連蛋白に実質的に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４８０１として寄託されている。
【００３７】
＜２＞チロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの調製
上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、チロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を行った。
【００３８】
上記ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養し、細胞濃度が約５×１０６個／ｍｌになったところで培養上清を遠心分離により回収し、これをポアーサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテインＡカラムキット（アマシャム・ジャパン製）により精製し抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を得た。
【００３９】
得られたモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスをアイソタイピングキット（アマシャム・ジャパン製）により調べたところ、クラスはＩｇＧであり、サブクラスはＩｇＧ１であることが判明した。
【００４０】
得られた抗体をＩｇＧ１Ｆａｂ調製キット（ピアス社製）を用いて部分消化し、消化物からＦｃフラグメントをプロテインＡカラムに吸着させて除去し、Ｆａｂフラグメントを得た。このものの分子量は、電気泳動により測定したところ約５００００であり、この数値より、得られたフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントではなく、Ｆａｂフラグメントであることが判った。
【００４１】
＜３＞抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの評価
（１）抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントのヒトチロシナーゼに対する特異性
上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントについて、ＭｅＷｏ細胞（ヒト悪性黒色腫由来培養細胞）およびＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚ガン由来培養細胞）の抽出物を用いて、特異性の評価をウエスタンブロット法（エンザイムイムノブロット法）により行った。
【００４２】
培養フラスコで培養したＭｅＷｏおよびＨｅＬａ細胞の培養上清を除き、ダルベッコＰＢＳバッファー（以下、単に「ＰＢＳ」という）で数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．９）に懸濁した。
【００４３】
この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタンパク濃度を測定し、試料蛋白とした。これを、５〜２０％の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（パジェル：ＡＴＴＯ製）を用いた電気泳動に供した。アプライ量は、１レーン当りタンパク量として１０μｇ／レーンである。なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し１レーンを切り取り、チロシナーゼの活性染色（ＤＯＰＡ染色）を行いゲル上のチロシナーゼの位置を検出した。
【００４４】
一方、ゲルの残りのレーンをトランスファーバッファー（１００ｍＭ，Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ，ｇｌｙｃｉｎ）に浸漬した後、ブロッティング装置（セミドライブロッティング装置：ＡＴＴＯ製）を用い、泳動物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬したメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；ミリポア社製）へ転写した。
【００４５】
泳動物を転写したメンブレンを、ＰＢＳバッファーに１５分間浸漬した後、ブロッキングバッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー）に浸し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。
【００４６】
その後、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー（ＴＰＢＳバッファー）を用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で得られたＦａｂフラグメント溶液（５μｇ／ｍｌ溶液を約２ｍｌ）に浸漬し、約１時間２５℃で緩やかに振盪した。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体：ＴＡＧＯ社製、１０，０００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、２５℃で約１時間緩やかに振盪した。
【００４７】
メンブレンをＴＰＢＳバッファーにより洗浄（１５分１回，５分４回）した後、市販のＨＲＰ検出キット（アマシャム社製ＥＣＬキット）を使用して、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントが結合した泳動物のバンドを検出した。尚、ＨＲＰが結合したバンドは、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用しても検出する事ができる。
【００４８】
上記のようにして行ったイムノブロッティングの結果、前記活性染色の結果からチロシナーゼと考えられるＤＯＰＡ染色バンドと同じ位置に、バンドが認められ、上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトチロシナーゼ活性を有する蛋白のバンド、すなわちヒトチロシナーゼに結合することが判明した。さらにこのＦａｂフラグメントは、ＨｅＬａ細胞の抽出物には結合しなかった。
【００４９】
（２）抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの反応性
上記で得られたモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントについて、酵素標識抗体測定法（ＥＬＩＳＡ）により、非特異的染色性を蛋白分解酵素処理してないＩｇＧと比較した。
【００５０】
培養フラスコで培養したＭｅＷｏ細胞の培養上清を除き、ダルベッコＰＢＳバッファー（ＰＢＳ）で数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを使用して回収した。回収した細胞を、再びＰＢＳで数回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．５％含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．９）に懸濁した。
【００５１】
この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電機製）で３０秒処理して破砕し、１６，０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタンパク濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを、抗原蛋白とした。
【００５２】
次にこの抗原蛋白をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（スミロンｔｙｐｅＨ（住友ベークライト製））の各ウェルに抗原蛋白（１０μｇ／ｍｌ）５０μｌずつを入れ３７℃で１時間放置後、１％ウシ血清由来アルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、２５℃で１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳにて２回洗浄しチロシナーゼを含む抗原固相ウェルを作製した。このプレートに精製チロシナーゼモノクローナル抗体ＩｇＧ（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＦａｂフラグメント（５００ｎｇ／ｍｌ）を各々５０μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。上記と同様に洗浄後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ’ｓ（γ＋Ｌ）抗体（ＴＡＧＯ社製）５０μｌを加え３７℃で１時間インキュベートした。同様に洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンハイドロクロライドを含む発色液を７５μｌ加え３７℃で３０分インキュベートした。２５μｌの１Ｍ硫酸で反応を停止し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
表１に示すようにチロシナーゼに対する反応性はＩｇＧに比較してＦａｂのほうが高く、実使用においてはさらに低い濃度で使用する事ができ、非特異的反応を防止することができる。
【００５４】
【表１】
0003623271.tif 000002
【００５５】
本発明のＦａｂフラグメントは弱いながら、同様の操作で、マウスメラノーマ細胞であるメラノーマＢ−１６にも特異的に反応することが判った。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントは、チロシナーゼに対する反応性が高く非特異的結合を防止することが可能である。又、Ｆｃ部分を含まないためマクロファージの影響を受けにくい。このモノクローナル抗体は、本発明抗チロシナーゼモノクロナール抗体の蛋白分解酵素による部分消化により得られる。
【００５７】
【配列表】
0003623271.tif 000003