(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させる方法であって、そのパルプ材又はパルプにフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌の接種物を適用し、上記接種物からの菌の成長の間、その接種物が上記パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させるために十分な量であるパルプ材又はパルプ100グラム当たり0.5〜10グラムの菌糸体量（脱水菌糸体の湿重量）及び/ 又は基質１キログラム当たり105〜1010コロニー形成単位の胞子量にあり、そしてそのように接種された菌の成長により上記パルプ材又はパルプのピッチ含量の減少を行なわしめるために十分な時間である３〜40日間にわたり上記接種物からの菌の成長を許容する条件下で上記の接種されたパルプ材又はパルプを維持する、前記方法。
【請求項２】
非- 滅菌パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させ且つパルプ材又はパルプのリグニン含量を分解及び/ 又は修飾する方法であって、そのパルプ材又はパルプにフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌の接種物を適用し、上記接種物からの菌の成長の間、その接種物がそのパルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させ且つそのリグニン含量を分解及び/ 又は修飾するために十分な量であるパルプ材又はパルプ100グラム当たり0.5〜10グラムの菌糸体量（脱水菌糸体の湿重量）及び/ 又は基質１キログラム当たり105〜1010コロニー形成単位の胞子量にあり、そしてこのような菌の成長により上記パルプ材又はパルプ中に含まれるピッチ含量の減少且つその中に含まれるリグニンの分解及び/ 又は修飾を行なわしめるために十分な時間である３〜40日間にわたり上記の接種からの菌の成長を許容する条件下で上記の接種されたパルプ材又はパルプを維持する、前記方法。
【請求項３】
前記パルプが、その元のリグニン含量の少なくとも60重量% を保持しているパルプである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非- 滅菌パルプ材をそのピッチ含量を減少させるために接種する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
皮を剥がされた又は剥がされていない材木又は丸太をそのピッチ含量を減少させるために処理する、請求項１、２及び４の中のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記接種物を生物学的に純粋な菌カルチャーから獲得する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の接種されたパルプ材又はパルプを接種から4 〜20日間の期間にわたり菌成長条件下で維持する、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記菌が、NRRL受託第21200 号の菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記菌が、NRRL受託第21253 号の菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理時間が接種から少なくとも20日間である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、セルロース製品の製造において使用される材料のピッチ含量の減少における並びにまたそのリグニンの分解及び/ 又は修飾における特定の菌種の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
木は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン及び木エキス又は樹脂状材料であって一般的に" ピッチ(pitch)"、" 樹脂(resin)"又は" 木樹脂(wood resin)" といわれるものから成る複合材料である。ピッチの組成は研究されており、そして文献中に広く報告されている。例えば、Wood Extractives and Their Significance to the Pulp and Paper Industry, Chapter 10 "Wood Resins" by D.B. Mutton; W.E. Hills, Ed, Academic Press, N.Y. (1962)。
木パルプからの製品の製造において、ピッチの存在は不所望である。なぜなら、その粘度及びテナシティーのために、それがしばしば除去することが困難である沈殿物を形成し、洗浄のための比較的高頻度の且つ長期間の中断時間を引き起こし、そして樹脂がストレーナー板、フィルター上に、そして紙加工装置じゅうに沈殿物として蓄積する傾向があるからである。洗浄前にあまりに長く蓄積に供される場合にピッチがパルプを、そしてそれから形成される紙を変色させることもできることがよく知られている。他の欠点、例えば、排液流汚染が本分野において公知である。
【０００３】
Nilsson, et al.,米国特許第3,486,969 号中、特定の菌が、その木、特にセルロース及びヘミセルロースの他成分の分解を最小にしながら、木チップを接種してその中及びそれからのパルプの樹脂含量を減少させるために使用されることが開示されている。しかしながら、その中に開示された菌の種は、明らかにすべて、その木を変色させるとき、容易に削り落とされることができる表面又は表在性の染みを本質的に作り出す糸状菌型(mold type) 又は表面形成性の菌(fungi) である(J.S. Boyce, Forest Pathology, 3rd. Ed., 1961, McGraw-Hill Book Co. at pp.493-512,特に496-497 を参照のこと。) 。このような菌は我々の知るかぎり実行的成功を達成していない。
公開された欧州特許出願第EP 03 87 187 A2 号中、子嚢菌綱(Ascomycetes) 又は不完全菌綱(Deuteromycetes)として一般的に分類される特定の木- 透過性の菌をパルプ材(pulpwood)及びパルプに適用してそのピッチ含量を減少させることについて記載されている。同様に有用な木- 透過性菌誘導体も、公開された欧州特許出願第EP 0 470 929 A2 号中に開示されている。
【０００４】
英国特許出願第GB 9312226.5中、処理された支持体上白色又は無色で成長しながら非常に良好なピッチ分解及び積極的な成長特性を示す好ましい木- 透過性菌オピオストーマ・ピリフェラム(Ophiostoma piliferum)の他株誘導体について記載されている。
先に記載した好ましく且つ改良された木- 透過性のオピオストーマ・ピリフェラム(O. piliferum)株の成功は、商業的な能力が証明され、そして商業的な成功を達成している。ピッチ減少からの実質的な節約に加えて、( より速い機械速度に翻訳される) より大きな紙強度を初期に示すこと、そしておそらくその菌が樹脂管及び維管束内放射柔組織(ray parenchyma)細胞を実質的に開放する能力のために、特に例えば、化学的パルプ化のために支持体上で使用されるとき、より大きなパルプ化効率をさらに示すことが、確認されている。このような菌が実際に有用であるべき能力は、部分的に、その菌が非- 滅菌基質上で競合的に成長し、そして木源を自然に感染させる他の菌又は生物により排除され又は占領されない能力に帰される。
【０００５】
リグニンは、木細胞の3 つの主要な成分の中の1 つであり、そしてパルプ中で最も不所望な成分である。紙製造における菌及び菌の酵素の潜在的用途の研究の一般的分野において、担子菌綱(Basidiomycetes)、特に白腐れ菌(white rot fungi) が、リグニンを分解し、そしてリグニン分解酵素を生産するそれらの能力について重要である。" 生物パルプ化(biopulping)" といわれる根本的概念は、例えば、木チップの形態におけるパルプ材を初期処理して、それ自体がパルプ粉砕機内に入れられる前にパルプ化又はリグニン除去の工程を開始させるという考えに基づいていた。このような目的に特に好適と判断された白腐れ菌は、米国開封特許第5,055,159 号中に記載されているようなセリポリオプシス・サブバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora) である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、パルプ及びパルプ材、並びに特に非- 滅菌支持体中のピッチの分解において、そしてまたパルプ及びパルプ材、並びに特に非- 滅菌基質中のリグニンの分解及び/ 又は修飾において、有用な菌の分野を拡げることである。
他の目的は、所望の性質、例えば、色効果、ピッチ分解及びリグニン- 分解- 及び/ 又は修飾能力、非- 滅菌基質上での良好な成長、操作温度における柔軟性、様々な木種に対するより大きな作用又は作用の柔軟性、等を有し又は併合するピッチ分解性及びリグニン分解性及び/ 又は修飾性の菌を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、白腐れ菌種、フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)が特に非- 滅菌木基質中のピッチを含む基質のピッチ含量の減少に特に有用であることが発見された。また本発明に従って、フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)による処理が好適に長い時間行われる場合に、フレビア・トレメローザが特に非- 滅菌木基質中のリグニンを含む木基質のリグニン含量の分解及び/ 又は修飾に特に有用であることも発見された。
従って、本発明は、木、特にパルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させる方法であって、そのパルプ材又はパルプにフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌種の接種を適用し、そしてその後そのパルプ材又はパルプのピッチ含量の減少を行なわしめるのに十分な時間にわたりその菌の成長を許容する条件下でその接種されたパルプ材又はパルプを維持するような方法を提供する。
【０００８】
本発明は、木、特にパルプ材又はパルプ中に含まれるピッチ含量を減少させ且つそのリグニン含量を分解及び/ 又は修飾する方法であって、そのパルプ材又はパルプにフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌種の接種を適用し、そしてその後そのパルプ材又はパルプ中に含まれるピッチ含量の減少且つその中に含まれるリグニンの分解及び/ 又は修飾を行なわしめるのに十分な時間にわたりその菌の成長を許容する条件下でその接種されたパルプ材又はパルプを維持するような方法をも提供する。
用語" 樹脂(resin)"又は" ピッチ(pitch)"( これらは互換使用される。) は、一般的にピッチとして知られる木の中の疎水性物質の複雑な混合物であって、中性有機溶媒、例えば、塩化メチレン、ジエチル・エーテル、ベンジル・アルコール、等中で可溶性であるものを意味する。これらは、テルペン類、ジテルペン("樹脂")酸、脂肪酸及びエステル、グリセリド及びワックス、並びにアルコール、炭化水素及びそれに関連する他の化合物を含む。本発明の目的のために、塩化メチレンを使用する標準的なTappi 抽出分析は本発明の目的である樹脂中の減少を測定するのに十分であろう。しかしながら、他の認められた溶媒系、例えば、エタノール/ トルエン又はアセトンも本質的に等しく代表的なものである。
【０００９】
樹脂又はピッチは、軟材、例えば、南松(southern pine) 、針葉樹(conifers)及びヒマラヤスギ(cedars)、及び硬材、例えば、カバノキ(Betula)及びPopulus の両方の重要な構成成分であり、そしてそれは、機械的又は化学的パルプ化工程に送られるフィードの4 重量% 以上程、一般的に、パルプ化のために使用されるほとんどの木について1.5 〜4.0%を占めることができる。軟材は、一般的に、硬材よりも多くの樹脂を含み、松は、軟材の中で最も高い樹脂含量をもつ。硬材中、樹脂は、木がパルプ化されるときその繊維画分のほとんどを形成する維管束内放射柔組織細胞中に主に位置する。軟材中、樹脂は、維管束内放射柔組織細胞、そしてまた樹脂管の両方の中に含まれる。
本発明は、一般的に、セルロース製品の製造において使用されるパルプ材及びパルプのピッチ含量を減少させるために適用されることができる。
【００１０】
用語" パルプ材(pulpwood)" は、本明細書中に使用するとき、紙、ダンボール又は他のセルロース製品、例えば、ビスコース(viscose) の製造においてであるがパルプ化の前に使用される木の材料のいずれかの収穫形態を意味し、そして材木(timber)、丸太(logs)、木チップ(wood chips)、木屑(sawdust) 、等のような形態を含む。用語" 精製パルプ材(refine pulpwood)"は、パルプ化工程に導入されることができる多数の高表面積の小片、例えば、木チップ及び木屑を得るために丸太のような全パルプ材形態に機械的及び/ 又は剪断の力を加えることから生じたパルプ材を意味する。本発明は、また、パルプとして分類されることができるリグニン- 含有セルロース材料に適用されることもできる。化学的パルプを含むいずれの種類のパルプをも本発明に従って処理することができるけれども、処理は、好ましくは、そのリグニン含量を有意に減少させ( そして含有ピッチを放出させ) るのに十分な処理を未だ経験していないパルプ、特にその元のリグニン含量の60% 以上を未だに保持するパルプ、例えば、第一段階機械的パルプに対して行われる。
【００１１】
それ故、本発明は、その1 の態様においては、そのパルプ材又はパルプに上記菌の中の少なくとも1 の接種を適用し、その接種されたパルプ材又はパルプをマスにおいて堆積させ、そして菌によりそのパルプ材又はパルプの樹脂成分における減少を行わしめるのに十分な時間にわたりそのマスにおいて菌の成長を許容し又は促進する条件下でその堆積したマスを維持することにより、精製パルプ材及びパルプ、好ましくは不完全精製パルプの樹脂含量を少なくとも部分的に減少させるために使用されることができる。本発明は、皮を剥がされていない材木の場合においては望ましくは少なくとも部分的に傷つけられた材木を接種し、その木支持体上及び中での菌の成長並びにその樹脂成分中での減少の行使に十分な時間にわたりその材木を維持するすることにより、未精製パルプ材、例えば、皮を剥がされた又は剥がされていない形態における切断された材木に、適用されることができる。
【００１２】
用語" 接種(inoculum)" 等は、本明細書中に使用するとき、上記基質に適用されるとき上記菌の成長をもたらすのに十分に生物活性をもついずれかの菌材料を意味する。典型的な菌接種は、菌カルチャー又は菌カルチャー、望ましくは生物学的に純粋なカルチャーから得られた調製物を含む。ほとんどの菌の基本構造単位は菌糸(fungal filament) 又は" 菌糸(hypha)"である。集合して、これらの菌糸は、菌体細胞" 菌糸体(mycelium)" を構成する。菌は、典型的にはその菌糸体によりつくられた分生子(conidia) といわれる胞子により無性生殖により再生され、厚膜胞子(chlamydiospores) といわれる休止構造をもち又は担子胞子(basidiospores) により有性生殖により再生することもできる。すべてのこのような形態及び菌要素、例えば、菌糸体及び胞子は、本発明における接種として好適に使用されることができる。接種形態は、幾つかの慣用方法のいずれかにおいて菌を培養することにより提供されることができる。固体又は液体培養基、好ましくは液体培地を適宜又は必要により使用することができる。普通には、胞子形成にふさわしい条件下での菌の培養が、可能なときには好ましく、そして一般的に好ましい接種は、その菌カルチャーから生じた多数の胞子を含むであろう。
【００１３】
上記接種物は固体又は液体形態にあることができる。すべての液体カルチャー又はその部分、例えば、菌糸体及び胞子の混合物を使用することができる。生成物は、その中で胞子が接種後の菌を生成するための生物活性成分を構成しているような乾燥接種物を得るために凍結乾燥される。適用のために水により希釈されるべき濃縮物の形態における接種物は、一般的には、所望の生物活性を保存するであろう温度において保存される。液体形態は、普通には、凍結されて、典型的には-5℃〜-80 ℃、より普通には-10 ℃〜-75 ℃の温度において保存される。しかしながら、液体形態は、特定の溶液、高シュクロース溶液中で調製される場合には室温において保存されることもできる。乾燥形態も同様に保存される。但し、作用可能な接種物としての胞子を含む凍結乾燥形態がしばしばより安定であり、そして反対の液体形態よりも高い温度において保存されることができる。接種組成物は、乾燥工程の特定のタイプにおいて導入される他の成分、例えば、保存剤及び安定剤又は不活性担体を含んで成ることができる。
【００１４】
接種物を様々なやり方で木基質に適用することができる。典型的には、接種物を、システム的又は方法論的なやり方で適用する。例えば、接種物を、精製パルプ材のマス中に断続的に、又は好ましくは規則的な間隔において、切断材木の外表面に分配する。より好ましくは、接種物を、均質的又は均一的なやり方で、すなわち、精製パルプのマスの実質的に全体に分配する。しかしながら、それぞれの個々の木チップ、木屑、等が接種されることは必要とされない。個々の片の10% 以下程の少量、好ましくは少なくとも約20% 、より好ましくは少なくとも約50% が接種されることができる。なぜなら、非接種片がその接種された片と接して堆積するからである。成長の間にその感染は非常に容易に拡がるであろう。
【００１５】
木チップのマスの完全な又は均一な接種は、一般的に、その菌がそのマスの実質的に全体に成長するという事実を反映する。しかしながら、マスの幾つかの部分、特に精製木パルプの山(pile)の外層が、それが接種されたとしても、そのマスの残りと比べて小さな成長を示し、又は全く成長を示さないということが起こることができる。
1 つの好ましい態様において、接種物を、それらがその精製操作からされる時であるが山に堆積される前に、木チップ又は木屑上にスプレーする。例えば、木チップ装置は、一般的に、新たに調製されたチップを受け取り、そしてその堆積した山にそれらを運ぶコンベア手段を備えている。この接種調製物を含むスプレー・アプリケーターは、便利には、そのコンベアに、好ましくは、そのチップが空気輸送、例えば、自由落下又は転がるとき、上記チップ装置との接続点において、又はそのコンベアから落下する直前にチップがスプレーされるようにそのコンベアのまさに端において、接続されることができる。
【００１６】
あるいは、接種物を、堆積する山の上でいくぶん連続的にスプレーすることによりその堆積の経過中にその木チップの山に適用することができる。
パルプ又は精製パルプ材を処理するとき、適用される投与量は、幾つかの要因、例えば、処理される木、木の条件又は齢、成長条件、所望の処理時間、等に依存して変化することができる。一般的には、満足できる結果は、パルプ又はパルプ材100 グラム当たり0.5 〜10グラムの菌糸体( 脱水菌糸体の湿重量、実施例1 参照) 、好ましくは処理されるべき基質100 グラム当たり1 〜5 グラムの菌糸体を含む接種物適用の間に得ることができる。脱水に先立つこのような菌糸体は、以下の実施例1 又は実施例A 、好ましくは実施例A 中に記載するように調製されることができ、そして胞子を含むことができる。優先的に又は完全に胞子に基く接種物の投与量は日常的に決定されることができ、そして基質1 キログラム当たり105 〜1010CFU(コロニー形成単位) 、より普通には106 〜109 CFU/kgのレンジであると示されることができる。同様に、表された菌糸体投与量を決定し、そして適用することができる。例えば、菌糸体を例えば、5-10分間均質化し、そして栄養培地上で成長させたときその断片から形成されたコロニーの数を、常法により所定の容量についてのCFUsを測定するために近づけることができる。
【００１７】
この接種投与量は、水- 希釈されたスプレー可能な組成物、例えば、基質1kg 当たり20〜60mlの容量において適用されるべき組成物において適用されるであろう。この菌は、好ましくは、処理まで冷凍又は低温において保存された新たに切断又は精製されたパルプ材又は新たに切断された基質、又は滅菌された基質に適用される。処理前に熟成された非- 滅菌パルプ材、例えば、処理約5 日間以上前に製造された木チップに適用されるとき、接種に先立ちその木に自然に感染した菌の背景成長効果を回避し、抑制し又は克服するために、その接種物投与量その投与量レンジの上限まで増加させることが望ましいかもしれない。
【００１８】
他の態様においては、本発明に従って先に接種され、そしてインキュベートされたチップを接種を有効にし又は強化するために新たなチップ中に分散させることができる。このような接種物は、おそらく生物学的に純粋ではない。
接種後、堆積したマスを、そのマスの実質的に全体にその菌の成長を許容し又は促進するであろう条件下で維持する。本発明がほとんどの場合に開放空気中で行われ、そしてそれ故そのマスが多種多様な気象条件に供されるであろうという事実が与えられるので、処理期間の全体を通じての理想的条件のいずれかの所定のセットを維持することは、普通には達成が困難であり、そしてしばしば実施することも必要とされない。一般的には、菌が死ぬところの高い温度を回避しながら菌が成長するところの温度においてマスを実質的に維持することで十分である。我々の菌が0 ℃以下においていくつかの妥当な成長を示すことができるけれども、一般的には、少なくとも10℃、例えば、10℃〜45℃、より好ましくは15℃〜40℃、より好ましくは22℃〜36℃の温度を保ことがより好適であろう。
【００１９】
温和な又は温暖な気象条件においては、その環境温度に影響を及ぼすことは必要とされず、そしてその接種されたマスを、開放空気中で特別な維持を伴わずに放置することができる。チップが冷気象条件において凍結固化している場合、より好適な温度を維持するための手段をその接種されたマスに提供することが望ましい。これは、その接種されたマスの上又は接して置かれた熱- 保持カバー材料、例えば、大きなプラスチック・シートであることができる。あるいは、接種されたマスがその上に置かれる地面の基礎に加熱パイプ又は暖い空気又は蒸気を放出するための複数の開口を提供することができる。同様のやり方で、内部を加熱し、そして輻射熱を放射することができるコンクリートの" イグルー(igloo)"又は類似の構造を、パルプ材の堆積したマスを支持するために使用することができる。加熱手段を提供するとき、過度の乾燥を回避するための湿度条件を制御することも望ましいであろう。この視点において、熱又は蒸気を換気するための手段が適当であろう。しかしながら、菌の成長及び他の微生物又は自然の効果から堆積したマス内で生成した熱のために、多くの冷気象条件下での操作は、ほとんど又は全く支援なしに首尾よく進行することができる。
【００２０】
接種された精製パルプ材マスが処理される時間は、所望の程度の樹脂の除去、温度及び湿度条件、接種の程度、またリグニン分解及び/ 又は修飾のいずれが望まれるか否か、等を含む多くの要因に依存してかなり変化することができる。しかしながら、ピッチ減少のための満足いく結果は、一般的に3 〜40日、好ましくは4 〜30日間にわたる時間の後に獲得されることができる。好ましい条件下では、非常に有効な結果、例えば、約20% 以上のピッチ減少をその接種の4 〜20日後、普通には5 〜15日後に得ることができる。リグニン分解及び/ 又は修飾も望まれる場合には、その期間は、接種後の、少なくとも14日目、例えば、14〜50日のレンジ内、特に好ましくは少なくとも20日目、例えば、20〜40日のレンジ内に、あるはずである。
非精製パルプ材、例えば、切断材木の処理は、普通には精製パルプ材のものよりもいくぶん長くなるであろうし、そして2 カ月以上に延びることができる。しかしながら、上記の菌によるパルプ及びパルプ材の処理は、一般的には、その基質( 単数又は複数) のセルロース成分に対するいずれかの実質的な攻撃をもたらすであろう余分な期間を避けながら所望のピッチ減少並びにリグニン分解及び/ 又は修飾を行う期間にわたり、行われなければならない。非精製パルプ材のための投与量は、精製パルプ材のものと同様であることができ、そして利用可能な表面の10% 〜100%にわたり、より普通には利用可能な表面の15% 〜50% にわたり適用されることができる。
【００２１】
本発明の実施において使用される菌は、先に公知の種に属し、そして公知のやり方、例えば、それらが自然に成長する木源からの単離により獲得されることができる。株中のいくつかの変種が、それらが単離されることができる木源の如き要因に依存することが予想される得るけれども、我々の菌は、非滅菌Southern Yellow Pine並びにまた硬材、例えば、カエデ(maple) 及びシラカンバ(birch) の両方の上での顕著な成長を証明し、そしてセルロース製品の製造において一般的に使用される他の木のタイプの上でよく成長することを期待することができる。我々の菌の天然単離物は、それらの同定種特性を喪失せずに株選択、接合及び突然変異の様々な公知手段により修飾されることができる。これ故、我々の好ましい天然単離物は、以下に詳述するようにNorthern Regional Research Center(NRRL) に寄託されたが、同一のものが修飾されることができること、そして好ましい菌株がこのような単離物だけでなくいずれかの寄託された株により所有される滅菌Southern Yellow Pine上でのピッチ分解及び/ 又は成長特性を少なくとも実質的に有するすべての他の単離物をも含むであろうことは、明らかであろう。本発明において使用される菌は、パルプ材料及びパルプ上で白色又は本質的に無色で成長するであろう。それらがリグニンを分解及び/ 又は修飾し、そして非滅菌基質を自然に感染する他のより黒い成長菌をほとんど又は完全に排除するために使用されることができるので、本発明に係る菌は、最終紙製品を得るためにほとんど漂白を必要としない製品を製造するために使用されることができる。
【００２２】
寄託
我々は、ブダペスト条約の下、Peoria, Illinois, USA におけるNorthrn Regional Research Center(NRRL)に、生物学的に純粋な2 つの単離物の試料を寄託した。その寄託は、それらの寄託日と共に与えられた以下の寄託番号を付与された。
菌 寄託番号 寄託日
フレビア・トレメローザ            NRRL 21200        1994年2 月17日
(Phlebia tremellosa) BRI-94
フレビア・トレメローザ            NRRL 21253        1994年5 月16日
(Phlebia tremellosa) BRI-118
上記の寄託における株を、以下、単離物BRI-94及び単離物BRI-118 として同定する。
【００２３】
上記の寄託物を米国ミネソタ州の枯れた材木からの天然単離物として得たが、他の単離物を様々な他の地球上の地域から得ることができる。上記の菌は硬材から単離された。フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)としての我々の菌の分類は、Ainsworth & Bisby's dictionary of the Fungi, 7th Edition, 1983 D.L. Hawksworth, B.C. Sutton, & G.C. Ainsworth, Commonwealth Mycological Institute Kew, Surrey UKに従う。
【００２４】
【実施例】
一般的手順: 培養及び接種:
様々な評価をパルプ材基質に対して行って、ピッチ減少及び成長を測定した。軟材特性の評価のために、滅菌及び非- 滅菌Soythern Yellow Pine木チップを使用した。硬材特性の評価のために、主にシラカンバ及びカエデを含んで成る非滅菌木チップを使用した。木チップを評価に先立ち5 ℃において保存した。それぞれの評価を同一の木種の支持体上及び同一の木チップ源から得られた木チップ・サンプルに対して行った。それぞれのテストのために、木チップの個々のサンプル・ロットを最初に計量し、その後、滅菌されるべき木チップ・サンプルをオートクレーブ内で121 ℃において約20分間加熱し、そしてテスト開始前に室温まで冷却に供した。非- 滅菌形態にあるべき木チップ・サンプルを処理せず、そしてそれらの自然条件において使用した。個々のサンプル・ロットを個々の透明プラスチック・バッグに木チップの計量された量を入れることにより調製した; これらのバックは、( 密封してシールすることはできないが) それらが閉じられるのに十分なサイズを有していた。透明バッグの使用は、チップの成長の肉眼観察を許容し、そしてさらに、評価される木チップのサンプルへの周囲の光の進入を許容した。
【００２５】
YNPD液体培養基を、以下の構成成分を使用して調製した( 量は製造された液体培養基の1 リッター当たりのグラム数である。):
10g   グルコース
10g   麦芽エキス
2g   ペプトン
2g   酵母エキス
2g   KH2 PO4 
1g   アスパラギン
1g   MgSO4 ・7 H 2 O
これらを、順番に1 リッターの蒸留水に添加し、そしてその後121 ℃において約20分間オートクレーブに供し、そして室温まで冷却した。その後、1mg のチアミンをその他の構成成分に添加し、その後、このYNPD培地を使用可能状態にした。
【００２６】
先に示したように調製したYNPD培養基を使用して、それぞれの菌を以下の一般条件下で調製した:
(a) 特定の菌のサンプルを先に調製したようなYNPD培養基を含む滅菌ペトリ皿に接種するために使用し、そしてその皿に蓋をし;
(b) 接種されたYNPD培養基を室温( 約20℃) において、接種された菌が菌糸体マット(mats)の形態においてそのYNPD培養基上でよく成長することが肉眼で識別できるまで( 約5 日間) 維持し;
(c) 良好な成長が観察された後、その菌糸体マットを次に( ゴム手袋により覆われた) 手でそのペトリ皿から取り出し、そして本質的に水が全く出なくなるまで手で搾り、そしてその搾ったマットを" 湿重量(wet weight)" を測定するために計量した。この搾った又は脱水したマットをきれいな実験室ビーカー内に入れ、そこで次にそれを5-10mlの蒸留水の添加により均質化してピペットで吸い取ることができるようなスラリーを作り、次にそれをそのビーカーから取り出し、そして基質を接種するために使用し;
【００２７】
(d) ビーカーの内容物を次に目盛り付きシリンダーに注ぎ、ピペットで吸い取ることができるスラリーの容量を測定し、そして一旦測定したら、その内容物を上記実験室ビーカーに戻し、そこからそれを、サンプルの接種のために取り出した。
木チップのサンプルの接種を、木チップの各100 グラムについてその菌糸体マットの2-5 グラムぼ湿重量を含むピペットの内容物を注射することにより行い、その後、上記バッグの開放端を折り返し、そしてその接種物と接するようになるチップの数を最大化するように、そのバッグの内容物を振とう、そして混合した。このバッグの折り返し端を2 箇所で挟んだ。すべての接種木サンプルを次に室温においてそれぞれの特定のテストにおいて示される時間にわたり実験室ベンチ上に置いた。それぞれのテストを、2 〜5 回行い; 本明細書中に報告する菌の成長の報告はこれらの複数の結果の平均である。
【００２８】
ピッチ含量評価:
基質のピッチ含量の評価を標準的なTAPPI Procedure T204 OM-88に従って測定した。これは、塩化メチレンである"DCM" により抽出された基質の1 グラム当たりのピッチ含量のミリグラムとして表されることができる結果を提供する。このTAPPI Procedure に従って、基質、例えば、木チップ上で使用するとき、その処理されたチップを60℃において一夜乾燥させ、そして次に10- メッシュ篩(10 ゲージ・ワイヤー篩) をもつThomas-Wiley Mill を使用した木屑に粉砕した。3 グラムの乾燥木屑を30mlのDCM と併合し、そして得られた混合物を室温( 約20℃) において一夜( 約15時間) 攪拌した。この形態培地をその混合物からピペットにより吸い取り、0.45μm の孔サイズをもつ有機フィルターを通して濾過し、そして次にその液体を室温において一夜風袋消去( 前計量した) 皿内で蒸発せしめる。皿残渣を次に60℃において30分間対流オーブン内で加熱していずれの残DCM をもさらに除去し、その後、その皿を室温まで冷却に供し、そして再計量し; 残渣、すなわち、残ピッチの重量を、ミリグラム(mg)の単位において測定且つ表示し、そして評価される元のサンプルの量に関連付けて、その基質木チップの1 グラム当たりのピッチのmg、又はあるいはその基質木チップ・サンプル中に存在する抽出可能なDCM のパーセントとしての表示を提供して、その結果を等式で結び、そしてその基質中のピッチのパーセント(%エキス) として得る。
【００２９】
ピッチ評価を滅菌及び非- 滅菌基質の両方に対して行うことができる。滅菌基質の対する評価は、普通にはその基質に自然に感染する他の生物のいずれかの可能性のある影響を取り除くであろう。滅菌基質に対する評価は、一般的には、菌が特定の基質に対してピッチを減少させるより客観的な測定を考慮されることができる。しかしながら、滅菌又は非- 滅菌基質のいずれに対して行われるても、ピッチ減少は、一般的には、そのテスト期間( 非- 滅菌基質評価) の間の冷凍状態において保たれる( 滅菌又は基質テストのための) 滅菌された非処理対照に対して評価される。一般的には、接種後21日目までに、好ましくは14日目までに少なくとも20% のこのような対照に対してピッチ減少を達成することが望ましい。特に、良好な結果が21日目までにピッチが25% 減少されるとき、そして特に14日目までにこのような減少が達成されるときに、示される。以下の実施例4 中、エタノール及びトルエンの溶液(2:1重量比) が抽出剤として塩化メチレンの代わりに使用されたことに注意のこと。
【００３０】
カッパ数の測定:
カッパ数は、脱リグニン化の程度を示し、そしてTAPPI Test Methods(Tappi, Atlanta, Ga.) Vol. 1, 1988 "Kappa number of pulp- T 236 cm 85"中に記載されている標準的な方法により測定される。このカッパ数は、上記の方法において特定される条件下で1 グラムの水分- 不含パルプ( オーブン乾燥パルプ; 乾燥を約105 ℃において2 〜10時間行う。) により消費される0.1 N 過マンガン酸カリウム溶液の(ml における) 容量である。この結果を添加した過マンガン酸塩の50% 消費に補正する。より低いカッパ数が望ましい。なぜなら、より少ないリグニン量が存在することを示すからである。
【００３１】
成長評価:
菌の成長の評価を、その成長が測定されるべきいくつかのテストのそれぞれについて評価される個々のサンプルのすべてについて、可能な限り均一に且つ可能な限りほとんど同一なやり方で行う。評価を、無矛盾の基準に基づき適用されるプロトコールにより単純な肉眼観察を使用して行い、そしてそれぞれの評価間隔( ここで、中間評価をテストの間に行う。) において、そしてそれぞれのテストの終わりに、行う。このプロトコールは、正常な読み距離において非援助眼によりそれぞれの個々の木チップ又は基質に対して観察し又は確認されることができる可能性のある菌成長の色カテゴリーに基く。基質を滅菌するとき、1 だけの色カテゴリー、本発明の候補のものが認識されるであろうし、そしてそのプロトコールは、候補菌の肉眼成長を示すチップの数又はパーセンテージを測定するためにすべての木チップの単純肉眼観察を含む。その成長評価を非- 滅菌基質上で行うとき、異なる色カテゴリーが、普通には、本発明又は接種された菌とその基質に自然に感染した菌との間を区別するために、認識されるであろう。
【００３２】
この接種された候補、典型的には最も明るい色が同定されるであろうし、そしてこのような成長を見えるように示す木チップの数及びパーセンテージが計数されるであろう。以下の報告結果を、それぞれのテスト・ケースにおける我々の所望の菌の成長を示すことが観察された木チップのパーセンテージに換算して与える。処理された非- 滅菌木チップは、他の生物、例えば、黒色菌のチップの他の領域内での成長を示すことができ、そしてこのような背景成長の色付けは、同様のやり方で別々に記録されることができる。このような背景成長は、その接種された菌によるその他の陽性成長結果を打ち消すもとのとらえてはならないが、より望ましい菌の候補は、明らかに、このような背景成長を最も良く抑制し又はこれを上回ってはびこるものである。
【００３３】
以下の実施例中、フレビア・トレメローザ(Phlebia Tremellosa)の2 つの異なる単離物を同定物BRI-94及びBRI-118 の下で評価する。
実施例1 
滅菌Southern Yellow Pine上での成長及びピッチ除去:
Southern Yellow Pine上でのBRI-118 の菌成長の評価を滅菌木チップ・サンプル上で行った。このサンプルは、チッピング後約2 日間熟成され、そして滅菌のときに約5%の背景成長をもっていた。このサンプルのそれぞれは、先に記載したように調製した500 グラムの木チップを含んでいた。接種物を先に記載したように調製し、そして25グラムの均一化した菌糸体マットのスラリー( 湿重量) を先に記載したようなやり方で500 グラムのチップのサンプル・ロットを接種するために使用し、これは、1.4 x 107 CFU/チップ500gの投与量を示していた。次にこのバッグを全期間14日間にわたり室温において保存した。菌成長の評価をそのサンプルの接種後3 、6 及び14日目に行った。滅菌した南松上でのこの成長の結果を3 連の平均である以下の表1 中に報告する。ピッチ減少を水接種対照に対して表2 中に報告する。
【００３４】
表1-滅菌Southern Yellow Pine上での成長
単離物 3 日目成長 6 日目成長 14日目成長
BRI-118       85%             100%            100%
表2-滅菌Southern Yellow Pine上でのピッチ減少
単離物 %DCM % 減少
対照          4.70            --
BRI-118       3.37            28.3
【００３５】
実施例2 
実施例1 を繰り返した、但し: 1) BRI-94 とBRI-118 の両方を評価し; そして2) Southern Yellow Pine 木チップはチッピング後2 日目に滅菌され、そしてこれは、滅菌のときに15% の背景成長をもち、これは他の情報と共に、その木がチッピング前によく熟成され、そしてその木チップが菌成長及び/ 又はピッチ分解のために困難な宿主であるであろうことを示唆するものであった。成長結果を表3 中に、ピッチ減少を表4 中に報告する。
【００３６】
表3-滅菌Southern Yellow Pine上での成長
単離物 6 日目成長 9 日目成長 14日目成長
BRI-94        10%             100%            100%
BRI-118       10%              10%             20%
表4-滅菌Southern Yellow Pine上でのピッチ減少
単離物 %DCM % 減少
対照          2.44            --
BRI-94        1.76            27.9%
BRI-118       1.89            22.5%
【００３７】
実施例3 
非- 滅菌軟材( 松) 中のピッチ除去
BRI-94とBRI-118 と命名されたフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌の2 つの別個の単離物を非- 滅菌Southern Yellow Pine中のピッチ除去におけるそれらの効力及び他の特徴について評価した。対照サンプルをも評価して比較表示を提供した。対照サンプルは、そのテスト期間じゅう冷凍して(-20℃) 維持された非- 接種対照サンプル、及び室温において維持された水接種周囲対照サンプルを含んでいた。この周囲温度対照を非- 滅菌木チップ・サンプル上に存在する背景生物のピッチ減少に対する効果の指標として使用し、そしてその菌単離物のピッチ除去をその周囲対照のものを下回るパーセント減少として測定した。すべての評価を接種後14日間の成長の後に非- 滅菌Southern Yelow Pine 木チップ・サンプルの500 グラムのサンプル上で行い、それぞれのテストを3 連で走らせ、そてそれらの結果を平均した。木チップは、齢が知られていなかったが、接種時に20% 青染色及び2%のYellow染色の背景成長をもっており、これは再び、ピッチ除去について困難な挑戦である熟成された木源及び基質を示唆するものであった。比較のために、テストは、正常には非- 滅菌Southern Yelow Pine 上で非常によく行われる登録商標CARTAPIPR 97下で入手可能な製品の形態におけるオフィオストーマ・ピリフェラム(Ophiostoma piliferum)の菌種をも含んでいた。
【００３８】
サンプルのそれぞれを、TAPPI Procedure T204 OS-76に記載したプロトコールに従ってDCM 抽出可能な量について評価した。Klasonリグニンの分析を選択された木チップ・サンプルの対して行ってそのサンプル・チップ中のリグニンの分解の表示を提供し; 5 つの基本的単糖類( グルカン、マンナン、アラビナン、キシラン及びガラクタン) の定量的な測定を絶対基準に基づいて行ってその木の炭水化物組成を定めた。このKlasonリグニン分析を、一般的に、TAPPI T249 cm-85のテスト・プロトコール "Carbohydrate composition of extractive-free wood and good pulp by gas-liquid chromatography"(1984; TAPPI) に従って行った。簡単に言えば、TAPPI T249 cm-85プロトコールに従うKlasonリグニン分析は以下のようである: サンプルを2 段階技術を使用して硫酸により加水分解し; 1 部の加水分解産物を次に中和し、そしてそのサンプル中に存在する糖をホウ素化水素ナトリウムによりそのアルジオールに還元し、これを次に無水酢酸及びピリジンによりアセチル化し、そして次にその酢酸アルジオールを塩化メチレン中に溶解し、そして次にそのガス・クロマトグラフィー中へのインジャクションのために使用した。さらに、選択された木サンプルについてその炭水化物の分析を行ってセルロース及びヘミセルロース分解の程度を評価した。本実施例において、この接種物は、BRI-94の場合に2.3 x 106 / 均質化菌糸体マット1gのCFU カウント並びにBRI-118 の場合に3.5 x 106 / 均質化マット1gのCFU カウントを提示する15グラムの菌糸体マットを含んでいた。
【００３９】
評価されるサンプルの結果、%DCMエキス及び%Klason リグニンを表5 上に報告し、そして選択されたサンプルの炭水化物の分析を両方以下の表6 上に報告する。
0003696652.tif 000002
a) 5 x 10 8 CFU/チップ500gの投与量は、O.piliferum についての全胞子カウントに基くコロニー形成単位を表す( 胞子だけを含む製品) 。
【００４０】
0003696652.tif 000003
【００４１】
このKlasonリグニン・テスト結果から分かるように、本発明に係る菌は、14日間の木チップ上への接種期間の後にその木チップ・サンプルのリグニン含量に適当に影響を与えないことが見つかった。しかしながら、実施例5 中に見られるように、それらは、接種のより長い期間の後にそのリグニン含量に影響を及ぼすであろう。驚くべきことに、本発明に係る菌種は、そのサンプルのピッチ含量における有意な減少を引き起こし、CARTAPIPR 97がピッチの有効な分解剤であると認められていることが注目される。
表6 の結果から分かるように、その周囲対照サンプルと比較したとき我々の菌により処理された松木チップのサンプル中の炭水化物の量における適当な損失は存在しなかった。これ故、セルロース及び/ 又はヘミセルロースの減少は、本ピッチ減少処理の結果としては全く示されなかった。
上記実施例3 の続きとして行われた成長実験においては、CARTAPIPR 97による12日後でさえ菌の成長を検出することが困難であり、これは、事実上容易に検出できない成長を示し、BRI-94はたった20% 、そしてBRI-118 はたった10% を示した。この現象についての様々な可能性のある説明は、そのチップの熟成状態、それらの菌が無色で成長する傾向並びに/ 又はその菌による透過及び内部作用を含む。
【００４２】
実施例4 
非- 滅菌硬材上での成長及びピッチ減少
先の実施例の手順に従って、BRI-118 を、チッピング1 日後に接種され、そして接種時に背景成長を全く示さなかった非- 滅菌混合硬材木チップの500g上での成長及びピッチ減少について評価した。この硬材混合物は、75% のカエデ、20% の黄シロカンバ及び5%オークを含んでいた。BRI-118 を8 日間振とうフラッシュ・カルチャーから収穫し、そしてそれぞれの接種物は、7.1 x 105 / マット1gの推定CFU カウントをもつ3gの菌糸体を含んでいた。処理時間は14日間であった。成長結果を表7 中に、( 周囲対照に対する) ピッチ減少を表8 中に示す。
【００４３】
0003696652.tif 000004
表7 は、硬材上での本発明に係る菌の良好な検出可能な成長を示し、そして表8 は、CARTAPIPR 97を上回る我々の菌についての優れたピッチ減少を示している。
【００４４】
実施例5 
非- 滅菌ポプラ(Aspen) 中のピッチ除去及びリグニン分解
フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa) BRI-118を、チッピング3 日後にその菌により接種された先に記載したように調製された非- 滅菌Aspen 木チップの475gサンプル上でピッチ減少及びリグニン分解について評価した。各接種物は、1 x 106 CFU/mlを含む10mlの菌調製物を含んでいた。次にバッグを全20日間にわたり室温において保存した。全ピッチ・レベルをアセトン抽出(TAPPI手順T204 om-88) により測定した。
カッパ数は、脱リグニン化の程度を示し、そしてTAPPI Test Methods(Tappi, Atlanta, Ga.) Vol. 1, 1988 "Kappa number of pulp- T 236 cm 85"中に記載されている標準的な方法により測定される。このカッパ数は、上記の方法において特定される条件下で1 グラムの水分- 不含パルプ( オーブン乾燥パルプ; 乾燥を約105 ℃において2 〜10時間行う。) により消費される0.1 N 過マンガン酸カリウム溶液の(ml における) 容量である。この結果を添加した過マンガン酸塩の50% 消費に補正する。より低いカッパ数が望ましい。なぜなら、より少ないリグニン量が存在することを示すからである。
【００４５】
0003696652.tif 000005
【００４６】
表9 中に示されるように、カッパ数における有意な減少は、20日間の処理期間後に行われ、一方、( 結果を示していないが)13 日後に、カッパ数におけるほんの僅かな減少が行われた。これは、BRI-118 だけによるリグニン分解/ 修飾が、所定の実験条件( 接種の程度、温度及び湿度条件) 下で接種の約2 週間後に始まることを示しているようである。これは、なぜ実施例3 においてKlasonリグニンにおける有意な減少が全く見られないかということを説明することができるであろう。
【００４７】
実施例A 
液体振とうフラスコ培養における菌の成長特性
フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)(BRI-118) を、先( 実験) に記載したように調製した500ml のYNPD培地を使用して振とう液体培養において成長させた。この培地に、活発に成長している麦芽/ 酵母エキス寒天プレートからの菌糸体の小さなプラグを接種した。このフラスコを11日間23-25 ℃において200rpmにおいて振とうし、そしてそれぞれのカルチャーからの1ml の滅菌サンプルを顕微鏡分析にために取り出した。このカルチャーは、菌糸体ボールの濃密な成長を示し、そしてそのカルチャー・マスは、約0.5 〜1.5%の芽胞子(blastospores)を含むことも示された。この生成物は、接種物として使用され、又は接種物形態を作るための様々な方法、例えば、その後の使用のために均質化及び冷凍することにより、加工されることができる。このカルチャーの胞子含量に本質的に基く接種物を凍結乾燥により調製することもできる。