(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元または誤って折り畳まれた（ミスフォールディング）形態のインシュリン様成長因子（IGF）をインシュリン様成長因子結合たんぱく質（IGF−BP）と結合させ、そして天然のインシュリン様成長因子（IGF）を回復させることから成るインシュリン様成長因子（IGF）を再折り畳みする（リフォールディング）方法。
【請求項２】
結合たんぱく質がIGF−BP−1,IGF−BP−2,IGF−BP−3,IGF−BP−4,IGF−BP−５およびIGF−BP−６のいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インシュリン様成長因子がIGF−Ｉである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
インシュリン様成長因子がIGF−Ｉである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
結合たんぱく質がIGF−BP−１である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
結合たんぱく質がIGF−BP−１である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
結合たんぱく質とIGFとが等しい分子量で用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
結合たんぱく質がIGFのものと等しい分子量で用いられる請求項２に記載の方法。
【請求項９】
結合が生体外で行なわれ、そしてIGF−BPとIGF−Ｉとが混合され、その後天然のIGF−Ｉが回復される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
結合が生体外で行なわれ、そしてIGF−BPとIGF−Ｉとが混合され、その後天然のIGF−Ｉが回復される請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
IGF−BPとIGF−Ｉとが酸化還元系統の存在において混合される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
IGF−BPとIGF−Ｉとが酸化還元系統の存在において混合される請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
結合たんぱく質とIGFとが等しい分子量で使用される請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
結合たんぱく質とIGFとが等しい分子量で使用される請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、インシュリン様成長因子（IFG）を再折り畳み（リフオールデイング）するためにインシュリン様成長因子たんぱく質（IGF−BP）を使用する方法およびシステイン残留物６〜48と、18〜61と、47〜52との間のジスルフイド基を得るために還元または誤って折り畳まれた（ミスフオールデイング）形態のIGF−ＩをIGF−BPで処理することを特徴とする生物学的に活性で天然のIGF−Ｉを製造する方法に関するものである。
従来技術
ヒトインシュリン様成長因子Ｉ（IGF−Ｉ）は血清から最初に単離された70個のアミノ酸の単一鎖ペプチド成長因子である。IGF−Ｉは成長ホルモン（GH）により確実に調整され、そして多数の細胞型に分裂促進作用を示す。それゆえ、IGF−ＩはGHの成長促進作用を介在するものと考えられている。同族関係の領域において、IGF−Ｉとインシユリンとは３つのジスルフイド基を備える６つのシステイン残留物を包含する49％同族である。IGF−Ｉの立体的構造はインシユリンのＸ線構造を基礎にしてモデル化され、そしてこのモデルはIGF−Ｉの２−DNMRの分光器の使用により得られた間隔拘束によつてジスルフイド基領域中で最近確認された（IGFについての考察に関して、ハンベル・アール・イー著、ヨーロッパ生化学ジャーナル、第190巻、第445頁乃至第462頁、1990年、インシュリン様成長因子ＩおよびII参照「for  ａ  review  on  IGF,see:Insulin−like  growth  factors  Ｉ  and  II,Humbel  R.E.Eur.J.Biochem.190,445−462,1990」）。
ヒト組み換えIGF−Ｉは大腸菌とサツカロミセス・セレビシエの双方における分泌生成物として製造された。両方の種からの分離材料において、IGF−Ｉは主として分子間のジスルフイドを有する誤って折り畳まれた形態として見出された。意外にも、２つの別個の単量体形態が、それらのジスルフイド結合パターンの差により、識別された。これらの２つの形態の一方はインシユリン構造から予期されるジスルフイド結合位相を含有し、そしてこの形態（ジスルフイド６〜48,47〜52および18〜61）は生物学的に活性である。「誤整合」として指定されている他の単量体形態（天然の６〜48,47〜52に代わってジスルフイド６〜47,48〜52）はIGF−Ｉレセプタ親和力が不足している。加えて、酸素により還元されたIGF−Ｉの生体外再折り畳みは天然で、誤整合かつ集合されたIGF−Ｉが希釈再折り畳み状態下においても集積することを示した（イワイ、エム氏等著、1989年、生化学ジャーナル、106巻、第949頁及びサミユエルソン・イー氏等著、1991年、バイオテクノロジー、第９巻、第363頁「Iwai,M.,et  al（1989）J.Biochem.Vol.106,page  949,Samuelsson,E.,et  al（1990）Bio/Technology  Vol.9,Page  363」）。
血清中及び他の体液中において、IGF−I,IGF−II、およびこれら２つのIGFの変異体IGFsはIGF結合たんぱく質（IGF−BPs）として示されている特別な担体たんぱく質に結合されている。現在まで、６つの別個であるが同族の、IGF−BPsの特性が示されている。たんぱく質の解体および分解低下からIGFを保護するため、IGFを異なる組織に搬送するため、ホルモン調整の作用をなすため、インシユリンレセプタに対するIGF−Ｉの結合を抑止することにより低血糖を阻止するため、細胞面と相互に作用することによりIGFsの効能を増加するため、組織からIGFsを除去するため、かつIGFsの生物学的活性を抑止するための、種々のIGF−BPsの生物学的意義に関して、多数の報告があり、それらの幾つかは矛盾がある（IGF−BPsについての最近の考察に関しては、シマサキ・アンド・リング著、1992年、成長因子研究における進展、第３巻、第243頁参照「for  ａ  recent  review  on  IGF−BPs,see  Shimasaki  and  Ling（1992）Progress  in  Growth  Factor  Research,Vol.3,Page  243」）。
IGFとIGF−BP53との間の複合体を製造するための発現系統が国際特許出願公開第WO89/09268号公報（ジエネンテツク）に開示されている。ホスト細胞はCHO細胞である。複合体は哺乳動物における循環系に代謝作用を及ぼすために有用であると提案されている。
組み換えたんぱく質が効率の良いバクテリア発現系統において過剰生産されるときの大きな問題はたんぱく質生成物をそれらの天然構造に折り畳む（フオールデング）ことに関連している。大腸菌中の多数の高レベル発現系統は変性たんぱく質の集合体、いわゆる封入体の発生を生じさせ、該封入体は幾つかの場合に所望の天然たんぱく質に再折り畳み（リフオールデイング）され得る。この再折り畳み工程において、封入体は、例えば、グアニジンまたは尿素のごとき、変性剤により溶解させねばならない。必要ならば、ジスルフイド結合の減少も行われる。希釈または透析により、たんぱく質はその天然の立体構造に再折り畳みされ得る。しかしながら、再折り畳み方法の収量はたんぱく質生成物がしばしば集合または変形されるので予測できない。加えて、IGF−ＩおよびIIに関して、溶解可能な再折り畳みされた断片は誤って折り畳まれた種類を包含し、そして正しく折り畳まれた成長因子の全体収量はむしろ低い（サミユエルソン、イー氏等著、1991年、バイオテクノロジー、第９巻、第363頁「Samuelsson,E.,et  al（1991）Bio/Technology  Vol.9,Page  363」）。
再折り畳みを容易にしかつより有効にする方法が記載されている。１つの方法はシヤペローンと呼ばれる熱−ショック−たんぱく質（HSP）の種類の使用でありかつ他の方法は折り畳み酵素を利用することである。HSPを使用することにより、集合を回避させることができかつ折り畳み酵素を使用することにより、再折り畳みの速度を加速することができる。しかしながら、すべてのたんぱく質がこれらの方法を可能にする訳ではなくそして再折り畳み収量を高めるための他の解決策が示唆されている。1992年10月号の、バイオテクノロジー、第10巻、ジエイ・デイー・カールソン氏による論文（an  article  by  J.D.Carlson  et  al  in  Biotechnology,Vol.10,January  1992）において、天然のたんぱく質、とくにＳ−たんぱく質の収量を高めるために、たんぱく質再折り畳み中のモノクローン抗体の使用が開示されている。
正しく折り畳まれたIGFの収量を増大させるために、種々の方法が提案された。
組み換えIGF−Ｉの再折り畳み収量はブドウ球菌たんぱく質Ａから派生された２つのIgG−結合領域（ZZ）からなる溶融され溶融パートナーを利用することにより著しく改善された（サミユエルソン、イー氏等著、1991年、バイオテクノロジー、第９巻、第363頁「Samuelsson,E.,et  al（1991）Bio/Technology  Vol.9,Page  363」）。ZZ溶融パートナーは還元および再酸化前、中および後に、誤って折り畳まされた分子を可溶性にするために使用されている。正しく折り畳まれたIGF−Ｉの収量は実質上増加するように示されているが、しかし、まだ顕著な量の誤って折り畳まれたIGFがある。
誤って折り畳まれたIGFの問題を記載しかつ種々の改善を示唆した特許および特許出願が存在する。国際特許出願公開第WO91/02807号公報（アムゲン）及び米国特許第5158875号明細書には、溶融された短い確実に負荷されたリーダー配列の存在においてIGFを再折り畳みするための方法を開示しており、該リーダー配列において、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのごときアミノ酸がIGF−ＩのＮ−末端で溶融されている。国際特許出願公開第WO93/11240号公報（ジエネンテツク）において単一の緩衝液系における可溶性および再折り畳みを伴う溶融不能かつ不適切に折り畳まれたIGF−Ｉの再折り畳み方法が記載されている。
しかしながら、誤って折り畳まれたIGFをその天然のジスルフイド構造に定量的に再折り畳みするための方法はまだ記載されていない。
この再折り畳みの問題の生物物理的説明は記載されている（ホーバー・エス氏等著、1992年、バイオケミストリー、第31巻、第1749頁「Hober  S.et  al（1992）Biochemistry  Vol.31,Page  1749」）。IGF−Ｉの折り畳みの問題は熱力学であり、そして予期されているような動力学ではなく、そして３つのジスルフイド基（47〜52）の少なくとも１つは天然の構造においてエネルギ的に望ましくない。
発明の概要
本発明はIGFが還元または誤って折り畳まれた状態から得られる方法において正確に折り畳まれた天然のIGFを高い量で得る問題を解決した。最も驚くべきことに、インシュリン様成長因子結合たんぱく質１（IGF−BP−１）の存在において、IGF−Ｉ中に天然のジスルフイドが定量的に形成されることを見出した。これらの結果はIGF−BPがIGF分子中に正しいジスルフイドの構造を案内するために生体外で作用することを示す。
したがつて、本発明はインシュリン様成長因子（IGF−ＩまたはIGF−II）を再折り畳みするためにインシュリン様成長因子結合たんぱく質（IGF−BP）を使用するIGF−BPの使用方法に関する。結合たんぱく質はIGF−BP−1,IGF−BP−2,IGF−BP−3,IGF−BP−4,IGF−BP−５およびIGF−BP−６のいずれかにすることができる。インシュリン様成長因子は好ましくはIGF−Ｉでありそして結合たんぱく質は好ましくはIGF−BP−１である。IGFおよび結合たんぱく質の相対的な量は好ましくは等しい分子量である。
本発明はまだ還元または誤って折り畳まれた形状におけるIGF−ＩまたはIGF−IIがIGF−BP、好ましくはIGF−BP−１により処理されることを特徴とする生物学的に活性の天然IGF−ＩまたはIGF−IIを製造する方法に関する。IGFおよび結合たんぱく質の相対的な量は好ましくは等しい分子量である。
本発明の方法は生体外の処理即ちIGF−BPとIGF−Ｉを好ましくは酸化還元系統の存在において混合させ、その後天然のIGF−ＩまたはIGF−IIを回復させるか、または生体内系統中でIGF−Ｉと結合たんぱく質とを大腸菌で共同発現させ、その後天然のIGF−ＩまたはIGF−IIを回復させるための方法である。この共同発現は天然の正しく折り畳まれたIGFを蓄積するために行われる。
本発明の方法はIGF−ＩおよびIGF−BP−１で例示したが、当業者においては、結合たんぱく質がすべて同族であるときこの例示をIGF−IIおよび他の結合タンパク質に関して適用することもできる（シマサキ・アンド・リング氏著、1992年、成長因子研究における進展、第３巻、第243頁「Shimasaki  and  Ling（1992）Progress  in  Growth  Factor  Researgh,Vol.3,Page  243」）。
発明を実施するための最良の形態
材料および方法
IGF−Ｉの天然で誤整合された形態および還元された形態の製造
天然でかつ誤整合されたIGF−Ｉが溶融たんぱく質として大腸菌中で製造され、そして記載されたように同質性に純化された（フオルスバーグ、ジー氏等著、1990年、生化学ジャーナル、第271巻、357頁「Forsberg,G.,et  al（1990）Biochem.J.Vol.271,Page  357」）。天然でかつ誤整合されたIGF−Ｉを0.1Mトリス、pH8.7,0.2MKCL,1mMEDTA,8M尿素と10mMの還元されたジチオトレイトール（DTT）とを含有する緩衝材中において170mMの濃度で１時間37℃で培養することにより還元されたIGF−Ｉを製造した（ホーバー・エス氏等著、1992年、バイオケミストリー、第31巻、第1749頁「Hober  S.et  al（1992）Biochemistry  Vol.31,Page  1749」）。
IGF−BP−１の製造
組み換えIGF−BP−１はヒトIGF−BP−１遺伝子を発現するDON細胞の調節された媒体から純化された。その遺伝子はウシ乳頭腫ウイルスベクター上に宿った。IGF−BP−１はIGF−Ｉ親和力クロマトグラフイおよびRP−HPLCにより同質性に純化された。
たんぱく質分析
IGF−Ｉの濃度が特殊吸収定数A280（0.1％,1cm）＝2.1を使用する280nmでそれらの吸収度から計算された。UV−吸収度スペクトルがコントロン860分光光度計（コントロン、スイス国）において測定された。
IGF−Ｉのジスルフイド交換反応
ジスルフイド交換反応を0.1Mトリス、pH8.7、0.2MKCl、1mMEDTA、10mMの還元されたグルタチオン（GSH）と1mMの酸化されたグルタチオン（GSSG）とを含有する緩衝剤中において30mMのIGF−Ｉ濃度において37℃で１時間実施させた。ジスルフイド交換を160mMビニルピリジン（VP）を使用して自由チオールをアルキル化することにより終了させた。ピリジルエチル化反応を暗がりで15分間続行させ、その後緩衝剤をセフアデツクスＧ−25（フアーマシア・エルケービー・バイオテクノロジー、スエーデン国）でのゲル濾過を使用して10mMHClに交換させた。
IGF−Ｉ変異体およびIGF−Ｉペプチド断片の分離
IGF−Ｉのピリジルエチル化変異体はRP−HPLCにより分離された。使用されたコラムは孔径18nmを有する7mm粒子のクロマジルC8（エカ・ノーベル、スエーデン国）であつた。使用された勾配は1ml/分の流量および30℃の温度で、30分以上の0.25％ペンタフルオロプロピオン酸（PFPA）中の30〜45％アセトニトリルであつた。溶出は直列のダイオードアレイ検出器と蛍光検出器（ヒユーレツト・パツカード、アメリカ合衆国）とにより監視された。
例
IGF−BP−１の存在におけるIGF−Ｉの折り畳み
IGF−Ｉの折り畳みを促進するためのIGF−BP−１の能力がグルタチオン緩衝剤（酸化されたグルタチオン／還元されたグルタチオン;GSSG/GSH）において研究された。天然で誤整合されかつ還元されたIGF−ＩがIGF−BP−１の存在または不存在においてそれぞれ折り畳まれた。再折り畳み混合物が平衡に達した（30分）後、ビニルピリジンによる自由チオールのアルキル化によりジスルフイド交換反応が終了した。異なる形状のIGF−Ｉが図2Aおよび図2Bに示したようにRP−HPLCで分離された。異なるピークの蛍光（280nmで励起かつ305nmで放出）が測定された。図2AのクロマトグラムはIGF−BP−１の存在（ａ）および不存在（ｂ）におけるグルタチオン緩衝剤中の還元されたIGF−Ｉの培養からのサンプルを示す。図2BのクロマトグラムはIGF−BP−１有り（ｃ）および無し（ｄ）で１時間中の還元されたIGF−Ｉの空気酸化を示す。
GSSG/GSH緩衝系統およびIGF−BP−１の不存在において、天然のIGF−Ｉは平衡においてIGF−Ｉの合計量の22％を占め、そして最もそこに存在する種類は２つののジスルフイド基のみを有する（ホーバー・エス氏等著、1992年、バイオケミストリー、第31巻、第1749頁「Hober  S.et  al（1992）Biochemistry  Vol.31,Page  1749」）。しかしながら、IGF−Ｉと同様のモル濃度におけるIGF−BP−１の存在において、IGF−Ｉはその天然の構造を89％に達した（表１、図2A、約18分において）。IGF−Ｉの分析された種々の形態の相対的な量は表１に示されている。
IGF−BP−１が折り畳みにおいて触媒機能を有するかどうか、またはIGF−BP−１がその結合により平衡を変化させることにより作用するかどうかを研究するために、IGF−BP−１を超えるIGF−Ｉの10Xおよび100X過剰により再折り畳みの実験を行った。これらの結果はIGF−BPが結合によつて折り畳み平衡を移動することにより作用すること、およびしたがつてIGF−BPとIGF−Ｉの等しい分子量がIGF−Ｉの天然の形態を定量的に発生させるために必要であることを示唆する。対照実験としてアルブミンが平衡混合物に添加され、そしてIGF−Ｉのジスルフイド交換熱力学についての作用は観察されなかった（表１）。
再折り畳みの実験はまたIGF−BP−１の存在および不存在においてそして酸化剤として空気酸素を利用して行われた。IGF−BP−１の不存在において、１時間後、IGF−Ｉの幾つかの異なる形態が検出された。これらは主として１つのジスルフイドを有するかまたはジスルフィド基の無いIGF−Ｉであつた（図2B、ｄ）。反対に、IGF−ＩがIGF−ＩおよびIGF−BPの等しい分子量の存在において再折り畳みされたとき、主としてIGF−Ｉの天然の形態が混合物中に認められた（図2B、ｃ、訳18分）。
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かくして、IGF−Ｉの熱力学的な折り畳み問題がIGF−BP−１により解決されることを示した。平衡実験において、酸化還元反応がIGF−BP−１の存在において続行させるとき、84％ないし89％と同量の天然のIGF−Ｉが存在する（表１）。IGF−BP−１とともに酸素により還元されたIGF−Ｉの酸化が結合たんぱく質なしの酸素酸化より速くかつより選択的である（表１）。
【図面の簡単な説明】
図１は天然のIGF−Ｉを示す概略図である。
図2AはIGF−Ｉの種々の形態のRP−HPLC分離を示し、グルタチオン酸化還元緩衝剤においてａがIGF−BP−１の存在をｂがその不存在を示すグラフ図である。
図2BはIGF−Ｉの種々の形態のRP−HPLC分離を示し、還元されたIGF−Ｉの空気酸化をIGF−BP−１を有して１時間をｃでかつIGF−BP−１なしで１時間をｄで示すグラフ図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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