(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸のα位のアミノ基をターシャルブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護し、かつカルボキシル基をターシャルブチルエステル基（ＯｔＢｕ基）で保護してなるグルタミン酸誘導体（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）を溶媒に溶解し、この溶液に縮合剤と水溶性活性エステル試薬とを加えて尿素誘導体を析出させ、更にエチルアミン塩酸塩とｐＨ調整剤との混液を加えてターシャルブチルオキシカルボニル−γ−エチルアミドグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ）を得、これを酸処理してα位のアミノ基及びカルボキシル基のＯｔＢｕ基を脱離させることを特徴とするテアニンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ペプチド合成によりＬ−グルタミン酸−γ−エチルアミド（Ｌ−テアニン）を製造する方法であって、特に食品添加剤として安全に使用できるテアニンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
お茶のうま昧成分として知られているテアニンは、カフェインによる興奮の抑制作用、血圧降下作用、リラックス作用、脳機能改善作用などの有用性が知られている。
しかし、茶葉中に含まれるテアニン量はわずかに１〜２重量％で、茶ポリフェノールが１０〜１５重量％含まれているのに比べると非常に少ない。したがって、茶葉から抽出したテアニンを産業的に利用することは量的にもコスト的にも実用的でなく、従来から食品添加物や医薬品原料として安価で安全なテアニン製造方法が求められていた。
【０００３】
従来のテアニンの化学合成法としては、先ず、実験室的製法として、グルタミン酸を塩酸存在下で無水エタノールと振り混ぜた後、低温下で過剰の塩酸とエタノールとを除き、析出した塩酸塩をメタノールに溶かし、この溶液に計算量のアンモニアを加えて冷却してＬグルタミン酸−γ−エチルエステルを得、これをクロロカルボキシル酸ベンジルエステルと反応させてＮカルボキシベンジル−Ｌグルタミン酸−γ−エチルエステルとし、次にこれをエチルアミンと反応させてＮ−カルボキシベンジル−Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルアミドとし、次いで白金触媒下で水秦添加してＬ−グルタミン酸−γ−エチルアミド（Ｌ−テアニン）を得る方法が開示された（酒戸弥二郎ら：日農化誌23,269(1950)）。
その後、工業的製法として、例えば特開平５−７０４１９号公報等において、Ｌ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基をベンジル化して保護すると共に、アミノ基をトリチル化して保護し、これをペプチド合成の出発原料とするテアニンの製造方法等が開示されている。
【０００４】
しかしながら、従来の製法の多くは、高純度のテアニンを得られたとしても工程数が多く煩雑でしかも収率が低く、得られるテアニンは高価なものとなってしまうのが現実であった。例えば、グルタミン酸をペプチド合成の出発原料に使用する場合、γ−カルボキシル基をベンジルエステルで保護するのが一般的であったが、ベンジル基の脱離が困難であるため、工程数が多くなるか、工程時間が長くなるか、或いは反応の条件が過酷となるなどの問題があった。
一方、得られたテアニンを食品添加物として使用することを考慮すると、純度を高くすることは勿論、人体に有害な有機溶媒や金属をできるだけ使用しない製法が望まれるところである。
【０００５】
そこで本発明は、より少ない工程で高純度のテアニンを高収率で得ることができ、しかも人体に有害な有機溶媒や金属をできるだけ使用しないテアニンの製造方法を開発することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる目的のための本発明は、グルタミン酸のα位のアミノ基をターシャルブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護し、かつカルボキシル基をターシャルブチルエステル基（ＯｔＢｕ基）で保護してなるグルタミン酸誘導体（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）を溶媒に溶解し、この溶液に縮合剤と水溶性活性エステル試薬とを加えて尿素誘導体を析出させ、更にエチルアミン塩酸塩とｐＨ調整剤との混液を加えてターシャルブチルオキシカルボニル−γ−エチルアミドグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ）を得、これを酸処理してα位のアミノ基及びカルボキシル基のＯｔＢｕ基を脱離させることを特徴とする。
【０００７】
すなわち、本発明の第一の特徴は、グルタミン酸のα位のアミノ基をターシャルブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護し、かつカルボキシル基をターシャルブチルエステル基（ＯｔＢｕ基）で保護してなる「グルタミン酸誘導体（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）」をペプチド合成の出発原料としたことにある。
このようにアミノ基をＢｏｃ基で保護し、カルボキシル基をＯｔＢｕ基で保護することにより、酸処理によって両保護基の脱離を一度に行うことができ、しかもかかる脱離を穏やかな条件下で行うことができる。更には、脱離反応に伴う生成物はイソブチレンガスと二酸化炭素であるから容易に系外に除去することができるほか、アミノ分解（アミノリシス）も受けないのでエチルアミンとの反応にも安定である。
なお、アミノ基の保護にベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基を用いてテアニンを得ることも可能ではあるが、本発明によればＺ基で保護する場合に比べて保護基の脱離が一段階少なくなるためテアニンの収率をより高めることができる。
【０００８】
本発明の第二の特徴は、「Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ」を「溶媒」に溶解し、この溶液に「縮合剤」と「水溶性活性エステル試薬」とを加えて尿素誘導体を析出させ、更に「エチルアミン塩酸塩」と「ｐＨ調整試薬」との混液を加えて「ターシャルブチルオキシカルボニル−γ−エチルアミドグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ）」を得た工程、すなわちエチルアミンとして「エチルアミン塩酸塩」を加えると共に、これと組み合わせて「ｐＨ調整試薬」を加えた点、更には「縮合剤」に「水溶性活性エステル試薬」を加えた点にある。
【０００９】
エチルアミンとして、無水エタノールアミンではなくエチルアミンの塩酸塩を加えることにより、取り扱いが簡便（無水エタノールアミンは反応が激しく危険を伴う。）になるばかりか、非常に穏和な条件下で合成することができる。ただし、本発明はエチルアミンの塩酸塩を中和する必要があることも見い出し（後述の比較例２参酌）、このため「ｐＨ調整試薬」と組み合わせて加えるようにしている。
また、「縮合剤」に「水溶性活性エステル試薬」を加えて組み合わせて使用することにより、テアニンの収率を顕著に高めることができ、しかも反応の進行を早めることができる。更に、「水溶性活性エステル試薬」を加えることにより、グルタミン酸誘導体を水溶性活性エステルとすることができ、含水溶媒中で縮合を進めることができる。
【００１０】
ここで、「溶媒」としては、ジクロロメタン、エチルアルコール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム、テトラヒドロフランなどのＢｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを溶解可能な溶媒であれば用いることができるが、反応促進と人体に対する安全性との観点からするとエチルアルコールが最も好ましい。
「縮合剤」としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ）を好ましく使用することができる。そのほか、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）やＮ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）など通常ペプチド合成で使用される縮合剤を使用することも可能であるが、テアニンの収率及び含水溶媒中での溶解性などの点から上記のＤＣＣ、ＢＯＰが好ましい。
【００１１】
「水溶性活性エステル試薬」としては、「４−ハイドロキシフェニルジメチルスルフォニウムメチルサルフェイド」を好ましく使用することができる。上記エチルアミン塩酸塩が溶けなければ反応はうまく進まないが、エチルアミン塩酸塩は水にとても可溶であるため、含水溶媒で反応を行うことができれば反応は促進する。この点、「４−ハイドロキシフェニルジメチルスルフォニウムメチルサルフェイド」は溶媒として水を３０％以内で用いることができるのである。また、本発明では、特にＤＣＣと組み合わせて使用するとテアニンの収率を顕著に高めることができることを見い出している。
「ｐＨ調整試薬」としては、特にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が好ましい。ＤＭＡＰは、ｐＨ調整試薬としてだけではなく、活性化剤としても働き反応を促進する。
【００１２】
本発明において「Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ」の酸処理は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩化水素ガスをギ酸若しくはジオキサン中に吹き込んだ溶液、又は塩酸水溶液で処理すればよい。このような酸処理によってα位のアミノ基及びカルボキシル基のＯｔＢｕ基を一度に脱離させることができる。特に、反応性及び反応時間の点からすればＴＦＡやギ酸中に塩化水素ガスを吹き込んだ溶液すなわちＨＣｌｉｎＨＣＯＯＨで処理するのが好ましく、更に環境の点を加味すると、特にＨＣｌｉｎＨＣＯＯＨが好ましい。しかも、塩酸濃度を１Ｎ〜１．２Ｎに調整し、かつグルタミン酸誘導体の３０等量分を用いて２０分間反応させるのが好ましい。
【００１３】
上記製法により得られたテアニンは、有機溶媒（エタノール）中での再結晶、イオン交換樹脂、ゲル濾過、クロマトグラフィーによる吸着などによって精製することができテアニンの純度を一層高めることができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明して本発明を詳述する。
【００１５】
（実施例１）
〔出発原料の調製〕
グルタミン酸をジオキサンに懸濁し、濃硫酸を加えてドライアイス−アセトンで冷却し、次いで同量のイソブチレンを加えて耐圧ビンに入れて一夜室温で放置した。放置後、冷却した２ＭのＮａＯＨ中に注ぎ、エーテルで抽出し、エーテル層を乾燥し減圧濃縮してＨ−Ｇ１ｕ−ＯｔＢｕを得た。
次に、得られたＨ−Ｇ１ｕ−ＯｔＢｕをジオキサン−水（２：１）に溶かして氷冷下かき混ぜながら、１Ｍ−ＮａＯＨと（Ｂｏｃ）2 Ｏ（ジ−ｔ−ブチルカルボナート）とを加えて室温で３０分かき混ぜ、その後減圧濃縮し、５％硫酸水素カリウム水溶液でｐＨ２．３にして酢酸エチルで３回抽出した。全ての酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸ナトリウムで一夜乾燥させた後減圧濃縮し、残ったオイル状のものを結晶化し、ターシャルブチルオキシカルボニルグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇ１ｕ−ＯｔＢｕ）を得た。
【００１６】
〔Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕの合成〕
出発原料であるＢｏｃ−Ｇ１ｕ−ＯｔＢｕ５．７２ｇをエチルアルコール１００ｍｌに溶解し、氷冷下に冷却し、攪拌しつつ４−ハイドロキシフェニルジメチルスルフォニウムメチルサルフェイト（商品名：サンセラーＤＳＰ、以下ＤＳＰという）５．８６ｇとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４．５３ｇとを加えて尿素誘導体を析出させて、エチルアミン塩酸塩１．７９ｇとジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）との混液を加えて２日間攪拌した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で反応追跡して反応終了を確認した後、尿素誘導体（ＤＣＵｒｅａ）を濾別し、濾液を減圧濃縮し、オイル状の残査を酢酸エチルに溶かし、この溶液を水で洗浄し、酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加えて一夜乾燥させた。その後硫酸ナトリウムを濾別し、濾液を減圧濃縮し、更に氷冷下で石油エーテルを加えて結晶化させ、ターシャルブチルオキシカルボニルグルタミン酸ターシャルブチルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ）の結晶を得た（収率：７０重量％、Ｒｆ1 ：０．３６、Ｒｆ2 ：０．９４、融点：７５〜７６℃、比旋光度：〔α〕Ｄ25：−２５（Ｃ＝１、メタノール））。なお、Ｒｆ1 は薄層クロマトグラフィにより、展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：水＝９５：５：１（ｖ／ｖ）を用いて行い、Ｒｆ2 は展開溶媒としてブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１：１：２（ｖ／ｖ）を用いて行った。
【００１７】
〔保護基の除去とＬ−テアニンの精製〕
上記で得た「Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ」０．３１ｇとアニソール３０ｍ１とを氷冷下に冷却し、トリフルオロ酢酸２４０ｍ１を加えて時々振り混ぜながら３０分間室温で放置した。その後濃縮して過剰のトリフルオロ酢酸を除去し、次いで未反応物を酢酸エチルで抽出除去し、水層を強陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２４）に通して１Ｎアンモニア水１００ｍｌで溶出し、溶出液を濃縮し、これをエタノールで結晶化した（収率：８７重量％、Ｒｆ1 ：０．００、Ｒｆ2 ：０．５２、融点：２１８〜２１９℃、比旋光度：〔α〕Ｄ25：＋１３（Ｃ＝１、水））。この結晶の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＦＡＢｍａｓｓの測定結果を、図１及び図２に示した。この結果、得られた結晶は非常に高純度のＬ−テアニンであると判明した。
【００１８】
（実施例２）
〔保護基の除去とＬ−テアニンの精製〕
実施例１において得られた「Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ」０．３１ｇを、塩化水素ガスをギ酸中に吹き込んだ溶液（１．２７Ｎ  ＨＣｌｉｎＨＣＯＯＨ）１２０ｍｌに加え、時々振り混ぜながら３０分間室温で放置した。その後濃縮して過剰の塩化水素を除去し、次いで冷却したエーテルを加えながらエーテルで結晶化させ、さらにエタノールで再結晶させた（収率：８８重量％、Ｒｆ1 ：０．００、Ｒｆ2 ：０．５４、融点：２１８〜２１９℃、比旋光度：〔α〕Ｄ25：＋１３（Ｃ＝１、水））。この結晶の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＦＡＢｍａｓｓの測定結果を、図３及び図４に示した。これより、得られた結晶は非常に高純度のＬ−テアニンであると判明した。
【００１９】
（実施例３）
〔保護基の除去とＬ−テアニンの精製〕
実施例１において得られた「Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨＣ2 Ｈ5 ）−ＯｔＢｕ」０．３１ｇとアニソール３０ｍｌとを氷冷下に冷却し、トリフルオロ酢酸２４０ｍｌを加えて時々振り混ぜながら３０分間室温で放置した。その後冷却したエーテルを加えながら濃縮して過剰のトリフルオロ酢酸を除去し、次いで冷却したエーテルを加えながらエーテルで結晶化させ、さらにエタノールで再結晶させた（収率：８７重量％、Ｒｆ1 ：０．００、Ｒｆ2 ：０．５２、融点：２１８〜２１９℃、比旋光度：〔α〕Ｄ25：＋１３（Ｃ＝１、水））。この結晶の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＦＡＢｍａｓｓの測定結果を、図５及び図６に示した。これより、得られた結晶は非常に高純度のＬ−テアニンであると判明した。
【００２０】
（比較例１）
実施例１のエチルアルコールに代えて、溶媒としてＤＭＦを使用したところ、エチルアミン塩酸塩がなかなか溶けなかった。エチルアミン塩酸塩は水に良く溶けるため、水を少量添加した後縮合させようとしたが縮合は進まなかった。
（比較例２）
実施例１において、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加せずに反応させた（エチルアルコール溶液：ｐＨ４）が、ｐＨの問題でうまく反応が進行しなかった。
（比較例３）
実施例１において、ＤＳＰを添加せずに反応させたが、反応は進行しなかった。
（比較例４）
グルタミンの銅塩を合成し、ＤＣＣ及びＤＳＰを用いてエチルアルコールを脱水縮合させようとしたが反応が進行しなかった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のテアニンの製造方法によれば、従来の化学合成法に比べて製造コストがより安くなる上、製造工程中に人体に有害な物質を使用しないため、得られたテアニンを食品添加物として安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたテアニンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定結果を示した図である。
【図２】同じく実施例１で得られたテアニンのＦＡＢｍａｓｓの測定結果を示した図である。
【図３】実施例２で得られたテアニンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定結果を示した図である。
【図４】同じく実施例２で得られたテアニンのＦＡＢｍａｓｓの測定結果を示した図である。
【図５】実施例３で得られたテアニンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定結果を示した図である。
【図６】同じく実施例３で得られたテアニンのＦＡＢｍａｓｓの測定結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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