(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルの基台に形成された逆円錐形状のウェル内に配置された試料と該試料を取り囲む前記セル内の溶液間に物質収支が存在する場合に、前記逆円錐形状のウェル内に形成された計測対象物の不均一な濃度分布を計測することにより、前記試料−溶液間の物質移動速度を定量することを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【請求項２】
請求項１記載の電気化学的多検体分析方法において、前記計測対象物を測定する際に、複数のウェルを有するセルを用いることを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【請求項３】
請求項１記載の電気化学的多検体分析方法において、前記計測対象物を測定する際に、該計測対象物の濃度勾配がウェル内部にのみ存在し、複数のウェル間の物質移動が存在しないように構成されたウェルを用いることを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【請求項４】
請求項１記載の電気化学的多検体分析方法において、前記試料が生体試料であることを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【請求項５】
請求項４記載の電気化学的多検体分析方法において、前記生体試料が哺乳動物胚や動物細胞であることを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【請求項６】
請求項４記載の電気化学的多検体分析方法において、前記生体試料がタンパク質や核酸であることを特徴とする電気化学的多検体分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気化学的多検体分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、試験溶液中に含まれる分析対象物質の濃度を定量する目的で、広く適用されているマルチタイタープレートは、容積３ｍｌ−１００μｌのマイクロウェルを有し、１２−９６個の検体の連続的分析を可能とする。このマルチタイタープレートによる分析では、吸光、蛍光、発光計測が検出原理として採用され、いずれの検出系においても、一つ一つの容器における分析対象物質の濃度を全自動で連続的に測定する装置が市販されている。このマルチタイタープレートを用いた分析において、注目する目的物質の容器内の濃度は均一であることが大前提となっている。
【０００３】
マルチタイタープレートを用いた分析手法の中には、電気化学検出を採用した手法も多くある。しかし、この手法は、連なる容器の一つ一つが独立で、検出電極（作用極）のみならず、参照極／対極も一つ一つの容器ごとに配置されることが一般的であって、構成は複雑である。電気化学検出の場合、試料溶液と電極表面の間に濃度勾配が形成されるが、これは検出電流を獲得するに際して形成される濃度勾配であり、目的物質の容器内における沖合濃度は均一であることが大前提であることに変わりはない。高感度分析を目的とし、比較的微体積の容器と電気化学検出を組み合わせた分析システムでは、容器内に存在する目的物質をすべて反応させた際の電気量を出力として得る方法も既に知られている。
【０００４】
上述の分析システムのコンセプトと全く異なり、本発明は、一対（微小電流計測用の作用極および参照極／対極）の電気化学計測系で多数配列された容器の濃度および濃度勾配を一つ一つ連続的に計測する方法を提供する。
【０００５】
また、本発明は、下記の特許文献１における装置構成の一部である「試料保持装置」を使用せず、独自の形状を有するウェル（容器）を用いた酸素消費量計測方法に関する。
【０００６】
本発明は、装置の操作に習熟した人以外でも簡単に計測を実施することを可能にする。さらに、容器は複数の試料を保持することが可能であり、胚１個あたりの計測に要する時間を大幅に短縮できる。
【０００７】
また、走査型電気化学顕微鏡は、微小電極を探針とし、試料表面近傍の濃度勾配の計測を可能にする装置である。しかし、注目物質の濃度勾配の計測から試料−溶液間の物質収支速度が定量できるケースは極めて限られているのが現状である。例えば、サイズが微小（半径１００μｍ程度あるいはそれ以下）でかつ球あるいは円といったシンプルな形状の試料については、球面拡散の式が適用でき、試料−溶液間の物質収支速度が定量できる。本発明では、容器内部に形成される濃度勾配を計測し、試料−溶液間の物質移動速度を定量する。
【０００８】
解析工程は球面拡散の仮定および理論式に縛られず、試料は球形である必要がない。また、計測の際に電極を試料に最近接させる必要がない。更に、計測および解析工程は哺乳動物胚の酸素消費量計測以外にも応用可能であり、その場合、特許文献１に束縛されることはない。
【０００９】
特許文献１には哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及びその装置が示され、特に、個々の胚における酸素消費量を基準に胚の正常性を判定するようにしている。
【００１０】
非特許文献１には、溶液の濃度分布に関する測定手法が記載されている（詳細は後述）。
なお、本願発明者らによるセルを用いた電気化学的分析装置及び方法が特願２００２−２６９６５１として既に提案されている。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２−１２２５６８号、第４〜６頁
【非特許文献１】
珠玖ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６９，８０６−８１０（２００１）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１における呼吸計測工程は、試料の保持や電極の位置決めに関してマニピュレーターを使用し、煩雑な工程が不可避であった。また、計測に要する時間は計測を実施する人の修練度により大きく左右されるという問題があった。
【００１３】
本発明では、容器内に配置された計測対象試料と周囲の溶液との間で物質移動が起こり溶液中に濃度勾配が形成される場合に、この容器内の濃度勾配から試料−溶液間の物質移動速度を定量する。
【００１４】
本発明を、呼吸量計測を基に哺乳動物胚の品質評価を行う特許文献１の呼吸計測工程に適用した場合、以下の３点において改善が期待でき、計測をより効率的に実施することを可能にする。
【００１５】
（１）特許文献１における「単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測を行う電気化学顕微鏡計測装置」を構成する諸装置中に挙げられていない、計測用ウェルを新たに設計した。すなわち、マニピュレータ等の特別な装置は一切使用せず、手動で目的の位置に試料を配置する。しかも、試料をウェル内に配置した際の位置決め精度は１０μｍ程度である。
【００１６】
（２）従来法においては、試料の呼吸に起因する周囲水溶液中の酸素濃度勾配が試料の中心を原点として全方位に向け球状に形成される。これに対し本発明を用いると、試料の呼吸に起因する試料近傍の酸素濃度勾配の形成は著しく方位が狭められ、濃度変化が一定方向に集約できる。
【００１７】
（３）複数の試料を同一容器上に配置できる。
【００１８】
本発明は、上記状況に鑑みて、ウェル内に形成された計測対象物の不均一な濃度分布を計測することにより、試料−溶液間の物質移動速度を定量することができる電気化学的多検体分析方法を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕電気化学的多検体分析方法において、セルの基台に形成された逆円錐形状のウェル内に配置された試料とこの試料を取り囲む前記セル内の溶液間に物質収支が存在する場合に、前記逆円錐形状のウェル内に形成された計測対象物の不均一な濃度分布を計測することにより、前記試料−溶液間の物質移動速度を定量することを特徴とする。
【００２０】
〔２〕上記〔１〕記載の電気化学的多検体分析方法において、前記計測対象物を測定する際に、複数のウェルを有するセルを用いることを特徴とする。
【００２１】
〔３〕上記〔１〕記載の電気化学的多検体分析方法において、前記計測対象物を測定する際に、この計測対象物の濃度勾配がウェル内部にのみ存在し、複数のウェル間の物質移動が存在しないように構成されたウェルを用いることを特徴とする。
【００２２】
〔４〕上記〔１〕記載の電気化学的多検体分析方法において、前記試料が生体試料であることを特徴とする。
【００２３】
〔５〕上記〔４〕記載の電気化学的多検体分析方法において、前記生体試料が哺乳動物胚や動物細胞であることを特徴とする。
【００２４】
〔６〕上記〔４〕記載の電気化学的多検体分析方法において、前記生体試料がタンパク質や核酸であることを特徴とする。
【００２５】
上記したように、複数のウェルを配置したセルを用い、ウェル内に生体試料を配置し、ウェル内の濃度分布を計測することにより、試料と溶液間の物質移動量を定量することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２７】
図１は本発明にかかる電気化学的多検体分析セルの模式図であり、図１（ａ）はその平面図、図１（ｂ）はそのＡ−Ａ線断面図である。図２はそのウェルの拡大断面図〔図１（ｂ）点線部拡大図〕である。
【００２８】
これらの図において、１はセル、２は基台、３は枠体、４は複数のウェル、５は計測溶液である。因みに各部の寸法は次の通りである。基台２の長さＬ1 は８０ｍｍ、基台２の幅Ｌ2 は３０ｍｍ、基台２の厚さＬ3 は５ｍｍ、枠体３の長さ（外壁と外壁の距離）Ｌ4 は６０ｍｍ、枠体３の長さ（内壁と内壁の距離）Ｌ5 は５０ｍｍ、枠体３の外幅Ｌ2 は３０ｍｍ、枠体３の内幅Ｌ6 は２０ｍｍ（したがって、枠体３の幅Ｌ7 は１０ｍｍ）、枠体３の高さＬ8 は５ｍｍ、ウェル４間の距離（ピッチ）Ｌ9 は６ｍｍである。また、枠体３内に形成される複数のウェル４の形状は、図２に示すように、逆円錐形状で半径Ｌ11と深さＬ12が共に２ｍｍである。円錐の頂角２θは９０°となる。
【００２９】
なお、この電気化学的多検体分析セルにおいては、ウェル４に試料が配置され、これらの複数のウェル４に共通する計測溶液（計測溶液で電気的に短絡される）５が与えられるとともに、一対（微小電流計測用の作用極および参照極／対極）の電気化学計測装置系が設けられる。
【００３０】
〔Ａ〕球面拡散の理論式に基づく物質移動速度の算出（従来法）
試料表面における反応種の濃度が均一である球状試料（半径ｒs ）と周囲の溶液の間で物質収支が存在し、溶液側に形成される濃度勾配が定常である場合に、溶液の濃度分布Ｃ（ｒ）は球座標軸ｒに対し、次式で表される（非特許文献１参照）。
【００３１】
ｌ＝（ｒ＋ｒs ）
Ｃ（ｒ）＝（Ｃs −Ｃ* ）ｒs ／ｌ＋Ｃ*                       …（１）
ここで、ｌは電極先端と試料の中心間の距離、ｒs は試料半径、ｒは試料表面からの距離、Ｃs は表面濃度、Ｃ* は沖合濃度を示している。
【００３２】
上記式（１）より、試料の中心を通る水平線に沿って、試料の最近接地点から沖合方向に探針電極を走査し、溶液中の濃度勾配を直接計測することで、沖合との試料表面の濃度差（ΔＣ＝Ｃs −Ｃ* ）が、Ｃ（ｒ）ｖｓｒs ／（ｒ＋ｒs ）プロットの傾きとして得られる。このとき、試料全体から溶液へ移動する流束の総和（Ｆdirect〔ｍｏｌｓ-1〕）および、試料表面における流束密度（ｆs 〔ｍｏｌｃｍ-2ｓ-1〕）は、
Ｆdirect＝４πｒs ＤΔＣ                                    …（２）
ｆs ＝ＤΔＣ／ｒs                                           …（３）
で表される。
【００３３】
同様の実験系で、図３に示すように、試料の最近接地点（点Ａ）から鉛直方向（ｚ軸方向）に探針電極を走査した場合、電極先端と試料の中心間の距離ｌは、  ｌ＝（ｚ2 ＋ｒs 2 ）0.5 
であり、ｚ軸方向の濃度勾配Ｃ（ｚ）は、
Ｃ（ｚ）＝ΔＣｒs ／ｌ＋Ｃ*                               …（１）′
このとき、ΔＣはＣ（ｚ）ｖｓｒs ／ｌプロットの傾きとして得られる。
【００３４】
以下、同様に上記式（２）、（３）が適用できる。
【００３５】
逆円錐型ウェルの底に球状試料を静置した場合も、Ｃ（ｚ）ｖｓｒs ／ｌプロットの線形性は良好であり、ΔＣwellを得ることができる。
【００３６】
〔Ｂ〕ウェルに形成された濃度勾配から試料の物質移動速度を定量する方法
図３に計測工程を示した。球状試料（半径ｒs ）が逆円錐形のウェル４に設置される場合を想定し、試料の中心を原点Ｏとするｘ−ｙ−ｚ座標を図３に示す通りに設定する。逆円錐の頂角を２θとする。逆円錐の頂点と試料中心Ｏの距離ｈは、
ｈ＝（１／ｓｉｎθ）ｒs 
である。ｚ＝ｚ0 において、逆円錐の頂点からの距離（ｈ＋ｚ0 ）を半径とする球のうちウェル内部におさまる部分の球の表面積Ｓz=z0は、
Ｓz=z0＝２π（１−ｃｏｓθ）（ｈ＋ｚ0 ）2 
である。頂角２θ＝９０°の逆円錐型ウェルを用いた場合、ｈ＝√２ｒs 、Ｓz=z0＝２π（１−１／√２）（ｈ＋ｚ0 ）2 となる。沖合から試料／溶液界面に定常的な物質収支が存在し、総流束をＦ〔ｍｏｌｓ-1〕で表す。
【００３７】
球面Ｓz=z0を通過する総流束Ｆz=z0は、
Ｆz=z0＝∫ｆz=z0（ｘ，ｙ，ｚ）ｄＳ
ここで、Ｓz=z0＝∫ｄＳ、ｆz=z0（ｘ，ｙ，ｚ）は、球面Ｓz=z0の任意の座標（ｘ，ｙ，ｚ）における流束密度〔ｍｏｌｃｍ-2ｓ-1〕である。
【００３８】
Ｆｉｃｋの第一法則より、
ｆz=z0（ｘ，ｙ，ｚ）＝Ｄ（∂Ｃ／∂ｘ＋∂Ｃ／∂ｙ＋∂Ｃ／∂ｚ）
ここで、ＤおよびＣは注目する物質の拡散係数〔ｃｍ-2ｓ-1〕および濃度〔ｍｏｌｃｍ-3〕である。ｆz=z0が球面内で一様である場合には、
Ｆz=z0＝ｆz=z0Ｓz=z0
と表せる。沖合から供給される物質量と試料が消費する物質量が等しい場合は、濃度勾配および流束が時間に依存して変化せず定常状態に収束する。
【００３９】
〔Ｃ〕ウェルの中の濃度勾配（実測例１）
ここでは、藻類ハネモのプロトプラストを球状試料として選択した。ハネモ半径１５４μｍ、計測は常温、溶液は海水、酸素の拡散係数Ｄ＝２．１×１０-5ｃｍ2 ｍｏｌ-1、沖合酸素濃度Ｃ* ＝０．２０４×１０-6ｍｏｌｃｍ-3とした。
【００４０】
ウェル内の酸素濃度勾配を、微小電極を走査させることにより測定した。局所の酸素濃度は、電極電位を−０．６ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌに固定してＰｔディスク電極（電極半径１μｍ）を走査し、酸素還元電流を記録することにより求めた。
【００４１】
図４は容器内において酸素濃度の等しい点をプロットした図である。
【００４２】
ここで、太線はＳz （ウェルの頂点を中心とする同心円）、実線はＳ′z （原点を中心とする同心円）を表す。
【００４３】
この図より、ウェルの濃度勾配が球状に広がることが分かる。ウェルの頂点を中心とする球のうちウェル内部におさまる部分の球の表面積Ｓz は上述のとおり次式で表せる。
【００４４】
Ｓz ＝２π（１−１／√２）（ｈ＋ｚ）2 
これに対し、原点を中心とする球のうちウェル内部におさまる部分の球の表面積Ｓ′z は、
Ｓ′z ＝２π（１−ｃｏｓψ）ｚ2 
ｓｉｎψ＝（ｚ−ｈ）／ｚ
（ψは円錐の軸と、球Ｓとウェルの交点の角）
ウェル内部の等濃度面はｚ＜２ｒs では球面Ｓ′z よりむしろ球面Ｓz とよく一致していることが分かる。
【００４５】
座標（ｘ，ｙ，ｚ）＝（０，０，ｒs ）の点Ｂを走査開始点として＋ｚ方向に酸素濃度勾配を記録し（図３参照）、図５に示すように、いくつかの点でｚと流束密度ｆz=z0、ウェルの球面積Ｓz=z0、球面を通過する総流束Ｆz=z0の関係を得た。なお、図５において、図５（Ａ）は図３の点Ｂよりｚ軸方向の無次元濃度勾配を示す図、図５（Ｂ）はいくつかの点におけるｚと流束密度ｆz=z0の関係を示す図、図５（Ｃ）はｚと球面積Ｓz の関係を示す図、図５（Ｄ）はｚと球面を通過する総流束Ｆz=z0の特性図である。
【００４６】
これらの図から明らかなように、ｚが大きくなるとｆz は減少し、Ｓz は増加する。総流束Ｆz はｚに依らずよく一致している。すなわち、ｚ軸方向の勾配を計測することにより、総流束Ｆz=z0を求めることができる。
【００４７】
〔Ｄ〕従来法と本発明のウェルを用いた計測の比較
実際の種々のサイズを有するハネモとウシ胚について、各単一試料を平底容器と逆円錐形ウェルに各々設置し、酸素消費量を定量した。まず、平底容器に設置した試料の酸素濃度差ΔＣdirectと、同一試料をウェルに移し同様に定量した濃度差ΔＣwellを比較した（図６）。
【００４８】
なお、図６において、図６（Ａ）はハネモについて従来法の平底容器で定量した濃度差ΔＣdirectと、本発明における逆円錐形ウェルで定量した濃度差ΔＣwellの関係を示す図、図６（Ｂ）はウシ胚について従来法の平底容器で定量した濃度差ΔＣdirectと、本発明における逆円錐形ウェルで定量した濃度差ΔＣwellとの関係を示す図であり、ΔＣdirectは、上記式（１）より得た。ΔＣwellは、図３の点Ａから鉛直方向（ｚ軸方向）に探針電極を走査して式（１）′より得た。その結果、ハネモ、ウシ胚とも、サイズによらず、
ΔＣwell＝２・ΔＣdirect
の関係式を得た。すなわち、逆円錐形ウェルを用いると、試料の酸素濃度変化を、従来法に比べ２程度増幅して観測可能であることが分かった。
【００４９】
次に、平底容器に設置した試料の酸素消費量Ｆdirectと、同一試料をウェルに移し、上述の工程に従い算出した酸素消費量Ｆz を比較した（図７）。なお、試料はウシ胚（体外受精後、１，５，６，８日間培養した胚）を用いた。図７において、●は図３の点Ｂから鉛直方向に探針電極を走査した場合、○は図３の点Ａから鉛直方向に探針電極を走査した場合を示している。
【００５０】
Ｆz とＦdirectを比較した結果、試料のサイズや走査開始点の違いによらず、
Ｆz ＝０．８・Ｆdirect
の関係式を得た。平底容器に比べ逆円錐形ウェルの方が酸素供給の角度が限られており、Ｆz ／Ｆdirectが１より小さいことは妥当であると考える。
【００５１】
以上の計測例から以下のことが分かった。
【００５２】
逆円錐形ウェルあるいはそれに準ずる形状の容器に十〜数百μｍオーダーの試料を設置し、試料とその回りの溶液間の物質収支速度を定量する場合、〔ここでは半径２ｍｍ、深さ２ｍｍの逆円錐形状ウェルにハネモあるいはウシ胚を設置し、試料の呼吸活性（酸素消費速度）を定量する場合〕、試料から比較的離れた距離においては、容器内に分布する流束密度と物質移動の存在する断面積との積により、溶液−試料間の総物質収支を求めることができる。ここで、「試料から比較的離れた距離」とは、例えば、半径ｒs の球状試料の場合、ｚ＞２ｒs とすることができる。
【００５３】
また、図４より、試料−溶液間の濃度勾配はウェルの内部にのみ存在しており、個々のウェル同士では物質移動が存在しないことが分かる。従って、各ウェルは隣接するウェルにより外乱を受けることなく、独立性を保持している。エンザイムイムノアッセイは、通常９６穴プレート（１２ｃｍ×８ｃｍ）を使用して、実施されるが、本発明により、プレートの小型化、使用する試料・試薬量の微量化が期待できる。
【００５４】
図８は本発明を適用可能なウェルを９６個配列した場合のセルの概略平面図である。
【００５５】
この図において、セル１０には、９６個のウェル１３が配列されている。因みに、基台１１の長さＬ21は８０ｍｍ、基台１１の幅Ｌ22は５０ｍｍ、枠体１２の長さ（外壁と外壁の距離）Ｌ23は７０ｍｍ、枠体１２の長さ（内壁と内壁の距離）Ｌ24は６０ｍｍ、枠体１２の外幅Ｌ22は５０ｍｍ、枠体１２の内幅Ｌ25は４０ｍｍである。
【００５６】
上記実施例では、生体試料として、藻類ハネモやウシ胚について述べたが、広くは、哺乳動物胚や動物細胞、タンパク質（抗原、抗体、酵素）や核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの生体試料に適用できることは言うまでもない。
【００５７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００５８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００５９】
（Ａ）複数のウェル内に配置された試料と試料を取り囲む溶液間に物質収支が存在する場合に、ウェル内に形成された計測対象物の不均一な濃度分布を計測することにより、試料−溶液間の物質移動速度を定量することができる。
【００６０】
（Ｂ）多数配列された計測対象物容器の一つ一つ連続的に計測することができる。
【００６１】
（Ｃ）計測対象の形状（球や円などの簡単な形状）には制限がなく、適用範囲が広い。
【００６２】
（Ｄ）さらに、哺乳動物胚の呼吸計測に際し、操作性の向上を図り、胚１個あたりの計測に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００６３】
なお、本発明によれば、走査型電気化学顕微鏡をベースにした分析化学的アプローチの中で初めて、多検体・多項目計測の全自動化が期待できる。また、哺乳動物胚の呼吸計測以外にもエンザイムイムノアッセイへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にかかる電気化学的多検体分析セルの模式図である。
【図２】  本発明にかかる電気化学的多検体分析セルのウェルの拡大断面図である。
【図３】  本発明にかかるウェルに形成された濃度勾配から試料の物質移動速度を定量する方法の説明図である。
【図４】  本発明にかかる容器内において酸素濃度の等しい点をプロットした図である。
【図５】  本発明にかかるいくつかの点でｚと流束密度ｆz=z0、ウェルの球面積Ｓz=z0、球面を通過する総流束Ｆz=z0の関係を示す図である。
【図６】  ハネモについて従来の平底容器で定量した濃度差ΔＣdirectと、本発明における逆円錐形ウェルで定量した濃度差ΔＣwellの関係とを示す図、及びウシ胚について、従来の平底容器で定量した濃度差ΔＣdirectと、本発明にかかる逆円錐形ウェルで定量した濃度差ΔＣwellとの関係を示す図である。
【図７】  ウシ胚についての各単一試料を、従来の平底容器で定量した酸素消費量Ｆdirectと、本発明にかかる逆円錐形ウェルで定量した酸素消費量Ｆz との関係を示す図である。
【図８】  本発明を適用可能なウェルを９６個配列した場合のセルの概略平面図である。
【符号の説明】
１，１０    セル
２，１１    基台
３，１２    枠体
４，１３    複数のウェル
５    計測溶液
【図１】
0003688671.tif 000002
【図２】
0003688671.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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