(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で緑茶抽出液を処理することを特徴とする、混濁あるいは沈殿の生成が抑制された緑茶飲料の製造方法。
【請求項２】
β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で緑茶抽出液を処理すると共に酸化防止剤を配合する、請求項１記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項３】
酵素処理を２０〜７０℃の温度で行う、請求項１又は２記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項４】
ｐH調整剤を少なくとも１回以上添加する、請求項１〜３のいずれか１項記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項５】
β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率が５以上である上記酵素剤で処理することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項６】
β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率が２０以上である上記酵素剤で処理することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項７】
β−マンナナーゼがペニシリウム・マルチカラー由来β−マンナナーゼである、請求項１〜６のいずれか１項記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項８】
ペニシリウム・マルチカラーがペニシリウム・マルチカラー ｍｃｈ１３−２株（FERM BP-6831）である、請求項７記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項９】
β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤の、緑茶飲料の製造のための使用。
【請求項１０】
酵素剤が緑茶飲料の混濁あるいは沈殿の生成を抑制する、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法により、または請求項９もしくは１０に記載の使用により得られる緑茶飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、混濁あるいは沈殿の生成が抑制された緑茶飲料の製造に関し、更に詳しくはβ−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で緑茶抽出液を処理することにより、保存中におけるヘミセルロースなどに起因する綿状沈澱物（フロック）等の二次沈澱物の発生を抑制すると共に、緑茶飲料本来の風味を従来品と比較して一段と向上させることを可能とした新しい高品質の緑茶飲料の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、缶やプラスチックボトル等の密封容器に充填して長期間流通・販売される密封容器入り緑茶飲料の市場は拡大する傾向にある。しかし、茶飲料特に緑茶飲料は製造後の長期保存において混濁や沈殿を生じることがある。ヘミセルロースなどに起因する綿状沈澱物（フロック）等の二次沈澱は、特に透明容器詰め飲料製品の場合、外観を損ない商品価値を著しく低下させる大きな要因となっていた。
緑茶抽出液の混濁や沈殿は、カテキン類（例えばカテキンガレート）とカフェインとのコンプレックスに多糖類が重合して混濁粒子となるとの報告もあるが、茶葉に含まれるポリフェノール、カフェイン、蛋白質、ペクチン、多糖類、カルシウムイオン等の成分が複雑に関与するともいわれている。
【０００３】
沈殿生成メカニズムは複雑であり、また一通りでは無いため沈殿抑制技術も様々な技術の枚挙にいとまがない。従来技術としては沈殿原因物質を物理的に除き沈殿を防ぐ方法、安定化剤を添加して凝集沈殿を防ぐ方法、沈殿原因多糖を酵素分解して沈殿を防ぐ方法などがあげられる。例えば以下の方法が知られている。
【０００４】
特開平４−４５７４４号公報には、緑茶又は生鮮乃至乾燥茶葉を抽出して得た水溶性緑茶成分を、有機素材、無機素材を母体とした限外濾過膜による限外濾過により分画し、分子量約１万以上の高分子成分をほぼ除去することにより、緑茶飲料中に溶解する高分子化合物を除いて、緑茶飲料中の白色糸状、綿状固形物の晶出を防止することが記載されている。
【０００５】
特開平４−３１１３４８号公報には、緑茶を温水抽出好ましくは約４０〜１００℃の温水中で約１〜１０分間抽出した後、金属網、布等により茶殻を除去し、Ｌ−アスコルビン酸を用いて、その抽出液のｐＨを約４．０〜５．０の酸性域に調整し、次いでこれを室温以下、好ましくは２０℃以下に急冷することによって、濁りやオリの形成を促進させ、濁りやオリ中に各種の高分子化合物を取り込んで粒子を形成させた後、遠心分離その他の任意手段によって該粒子を含む濁りやオリの成分を除去し、その後、上澄液に濾過助剤を添加して濾滓濾過して残余する高分子化合物を除去し、その後抽出液のｐＨを約５．５〜７．０の中性域に調整してから瓶、プラスチック容器等、好ましくは透明容器に詰め、常法によって殺菌処理を行い、経時的に濁りやオリの発生の生じない緑茶飲料とする製造方法が記載されている。
【０００６】
特開平６−２６９２４６号公報には、茶を温水抽出し、得られた抽出液を冷却した後、タンニン酸を添加して静置し、次いで遠心分離等によって微細な茶粒子等の混濁物を除去し、更にこの抽出液をケイソウ土濾過によって清澄化させることを特徴とする長期保存性を有する茶飲料の製造方法が記載されている。
【０００７】
特開平２−１００６３２号公報には、緑茶抽出液に水易溶性のフラボノイド類あるいはフラボノイド類の配糖体を添加する方法が記載されている。呈味成分の減少は無いが、この方法は、タンニン、カフェイン、タンパク質等が凝集して沈殿する事の防止には効果を示すものの、ヘミセルロース等の多糖類による沈殿の防止には有効ではない。
【０００８】
特開平８−２２８６８４号公報には、緑茶の温水抽出物を清澄処理した後、アスコルビン酸あるいはその塩の存在下キシラナーゼ（キシラーゼ）を含有するヘミセルラーゼ活性を有する酵素で処理し、必要によりさらに加熱処理してフロックの発止を防止する緑茶飲料の製造方法が記載されている。しかし、茶葉由来多糖の沈澱を解消するための酵素剤の添加量が多く必要である場合、逆に酵素の蛋白質沈澱を引き起こしてしまう問題がある。かつ、酵素剤由来の「土臭」を付与してしまい、いちじるしく呈味が低下する問題もある。
【０００９】
このように、従来、緑茶飲料の二次沈澱を防ぐ方法に関して、種々の方法が提案されている。しかし上記のように分子レベルで濾過する等の方法では、沈殿成分が除去されているため、二次沈殿の発生は抑制できるが、同時に呈味成分も減少するためこく味に欠け、水っぽくなり呈味性が低くなり、風味的に劣る製品になるといった問題がある。
また安定化剤および酵素剤の添加等の方法では、二次沈殿の抑制は完全なものではなく、また効果を得るために添加量を多くすると風味に影響してしまう問題がある。
そこで嗜好飲料としての緑茶飲料に関して、上記のような欠点がなく、優れた風味および呈味を有する高品質の製品を簡便に製造することが可能な新しい製造法の開発が強く望まれている状況にあった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
緑茶飲料の混濁あるいは沈殿の生成抑制に関する前記の従来技術は、物理的濾過による混濁あるいは沈殿除去操作により、茶抽出液中の風味・呈味成分もある程度除かれるという問題がある。また水易溶性フラボノイドの添加では完全に有効ではなく、キシラナーゼを含有するヘミセルラーゼの添加では蛋白由来の沈殿が生じたりして完全に有効なものではなかった。特に上級茶葉では、沈殿原因多糖が多いため、多量の酵素を必要とし、前記した蛋白質由来の沈殿や、好ましくない「土臭」を発生してしまうので、上級茶葉を用いた緑茶飲料の処方を作ることは事実上できなかった。本発明の課題は、複雑な工程を必要とせず、かつ緑茶抽出液本来の風味・呈味を失うことなく、長期間にわたり、濁りあるいは沈殿のない緑茶飲料、特に透明密閉容器入り緑茶飲料を提供することにある。
【００１１】
また、本発明は、緑茶飲料を長期に亘って保存しても、従来、保存中に不可避的にみられた二次沈澱の発生を有効に抑制することができると共に、嗜好飲料としての緑茶飲料の茶感（緑茶本来の風味および呈味）が従来製品と比較して一段と向上した高品質の緑茶飲料の製造法およびその製品を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、意外にも、コーヒー沈殿防止酵素として記載されているβ−マンナナーゼ（特許第３０４３５６０号、特願平１１−３３０５５８号）が、緑茶においても沈殿防止効果を示すことを見いだした。
さらに詳しくは、従来沈殿抑制効果があると言われていたキシラナーゼと比較して、β−マンナナーゼは効果が５〜１０倍程度高いことを見いだした。その結果、β−マンナナーゼを主成分とする酵素剤の場合、閾値添加量が少なくて済むため、酵素由来の「土臭」などの雑味を生じることが無い。また、上級茶葉を用いた場合でも、蛋白質由来の沈殿を生じることなく、完全に二次沈殿（綿状沈殿）を抑制することを見いだした。
本発明は上述のような知見に基づいて完成するに至ったものである。
以上のように、本発明は二次沈殿を生じることがなく、風味及び呈味の良好な高品質の緑茶飲料の製造に関するものである。
すなわち、本発明は、β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で緑茶抽出液を処理することを特徴とする混濁あるいは沈殿の生成が抑制された緑茶飲料の製造方法である。
また本発明は、β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼ活性を主成分として含有する酵素剤の、緑茶飲料の製造のための使用、特に  混濁あるいは沈殿の生成抑制のための使用でもある。
従って本発明は、上記の製造方法または使用により得られた緑茶飲料にも関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明による緑茶飲料の製造方法は、  β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で緑茶  抽出液を処理することを特徴とするものであることは前記したところである。
本発明の基本的な好ましい態様は、緑茶の温水抽出液を通常の遠心分離または濾過により清澄化し、その抽出液に酸化防止剤（例えばＬ−アスコルビン酸またはその塩など）を添加し、必要に応じて任意の工程において１回以上ｐＨ調整剤（例えば炭酸水素ナトリウム（重曹）など）にてｐＨを調節し、β−マンナナーゼを主成分とする酵素剤で処理することを特徴とする二次沈殿（綿状沈殿）を生じない緑茶飲料の製造法である。ただし、ここで示す濾過処理とは後述のように分子レベルでの濾過を示すものではなく、該呈味成分の除去を回避し得る濾過処理のことである。
【００１４】
本発明において緑茶とは、原料の茶葉又は茶芽製造の最初の工程で、茶葉又は茶芽を蒸気で蒸すか、釜で煎ることにより、茶葉又は茶芽中の酵素活性を停止させて、発酵させずに作った不発酵茶をいい、発酵茶である紅茶や半発酵茶であるウーロン茶は含まれない。また、本発明における緑茶の種類としては、煎茶、玉露、抹茶、番茶、ほうじ茶、蒸製玉緑茶、釜煎製玉緑茶等を具体的に例示することができる。なお、本発明において緑茶のことを緑茶葉ということもある。
【００１５】
本発明において使用する緑茶の温水抽出液は、上記緑茶葉を適宜の温度の水性媒体（通常温水）にて常法により抽出し（例えば実施例１参照）、遠心分離等の適宜の手段で茶殼等を分離したものでよい。このとき茶葉の種類、抽出液の濃度等は問わず使用することができるが、濃度に関しては濃縮抽出液を得ることが通常である。
【００１６】
濃縮状態の緑茶抽出液の抽出処理条件としては、例えば茶葉に対して２０〜５０倍、好ましくは３０〜４０倍の重量の水性媒体、特に６０〜７０℃の水性媒体を用い、３〜１０分程度、好ましくは１回〜数回の攪拌を伴う抽出処理を挙げることができる。抽出処理後の固形分や不溶成分の除去方法としては、上記抽出処理終了後、網濾過して茶葉を濾し取り、その後１０〜２０℃付近に冷却して、例えば３０００ｒｐｍ、１０分程度の遠心分離により不溶性成分を除去する方法を例示することができる。ただし、抽出液の遠心分離および濾過処理は前記した限外濾過の如き分子レベルでの分離ではなく、あくまで呈味成分を除去することのない不溶成分除去を意味している。
【００１７】
上記のように遠心分離または濾過して清澄化した液に、通常茶葉に対して酸化防止剤として、例えば０．１〜３重量％のアスコルビン酸を添加する。一般に、緑茶飲料の製造では、Ｌ−アスコルビン酸やアスコルビン酸ナトリウムの添加は、酸化防止のために行われており、本発明においては、アスコルビン酸の添加は、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、または、それらと同効のもの等を用いて常法に準じて行えばよい。
【００１８】
一般に、緑茶飲料の製造は、緑茶を湯水等の水性媒体と接触せしめて茶葉に抽出処理を施した後固形分や不溶成分を除去した緑茶抽出液をそのまま緑茶飲料とする方法や、濃縮状態で得られた緑茶抽出液をイオン交換水等の調合水で希釈して緑茶飲料とする方法が知られているが、工業的生産においては抽出効率や成分・品質調整の簡便さ等の点から、濃縮状態の緑茶抽出液を希釈して緑茶飲料とする方法が採用されている。本発明による沈殿の生成が抑制された緑茶飲料は、前述のようにβ−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤により処理されていることを特徴とするが、緑茶飲料の製造工程におけるβ−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤の配合は、緑茶抽出液用水性媒体への添加配合でもよいが、緑茶抽出液に添加配合する方が好ましい。かかる緑茶抽出液への添加配合の場合、β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤を、緑茶抽出液へ直接添加溶解させることにより、あるいは前記調合水に添加溶解させたものを緑茶抽出液に添加してもよい。
【００１９】
本発明においてβ−マンナナーゼとは、β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を有する基質、たとえばマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンに特異的に作用し非特異的にβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を加水分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する酵素β−マンナナーゼを意味する。このβ−マンナナーゼはアラビノキシラン、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースには作用しない。
【００２０】
本発明においてβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤とは、酵素剤１ｇ当たりのβ−マンナナーゼ活性が通常５，０００Ｕ以上、望ましくは１０，０００Ｕ以上含有し、さらに夾雑酵素として含んでいるキシラナーゼとの活性比率（β−マンナナーゼ／キシラナーゼ）が通常５以上、望ましくは２０以上である酵素剤を意味する。なおβ−マンナナーゼ、キシラナーゼの活性測定法および活性の定義は後の実施例で詳しく記載している通りである。
本発明におけるβ−マンナナーゼまたはこれを主成分として含有する酵素剤としては、上述のような性質を有するものであれば任意のものが使用できるが、上記のようにβ−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率が５以上あるいは２０以上のものが好ましい。このようなものとして具体的には例えば、本発明者らによる既出願（特願平１１−３３０５５８号）のペニシリウム・マルチカラーｍｃｈ１３−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８３１）由来のβ−マンナナーゼ、セルロシンＧＭ５（阪急バイオインダストリー社製）由来のβ−マンナナーゼ、ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」（天野製薬社製）由来のβ−マンナナーゼ等があげられる（後記実施例参照）。この中でも本発明者らによる上記既出願のペニシリウム・マルチカラーｍｃｈ１３−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８３１）由来のβ−マンナナーゼ製剤は、β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率が８０６であり粗酵素剤のなかでも最も好適なものとして使用することができる。
【００２１】
β−マンナナーゼは、定義上ヘミセルラーゼの酵素群に含まれる。これは、ヘミセルラーゼとは単一の基質に作用する酵素をさすのではなく、一般に植物組織からアルカリで抽出されてくる多種多様の多糖類に作用する一群の酵素を総称して用いられているからである。厳密な定義では、不溶性セルロースに強固に水素結合のできる多糖類（アラビノキシラン、キシラン、キシログルカン、グルコマンナン、アラビナン、β−グルカン）に作用する酵素群を意味するものとされている（特開平８−２２８６８４号）。しかしながら、ヘミセルラーゼの定義はあまりにも広義であり、本発明者らが、市販ヘミセルラーゼ製剤の緑茶沈殿抑制効果を検討したところ、すべてのヘミセルラーゼ製剤に緑茶沈殿抑制効果があるというわけではなかった。効果の無かった酵素剤に関しては添加濃度を上げても沈殿生成は抑制できず逆に蛋白質由来の沈殿が生成した。またヘミセルラーゼには属さないが、植物由来多糖を分解する酵素、ペクチナーゼ製剤やセルラーゼ製剤のみでは本発明の効果は得られなかった。
【００２２】
具体的には実施例２に示すように、様々なヘミセルラーゼの緑茶沈殿抑制効果について検討した。ヘミセルラーゼとして検討した酵素は、β−マンナナーゼ、β−キシラナーゼ（キシラナーゼ）、エンド−アラビナナーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、エンドβ−１，４−ガラクタナーゼ、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼである。これらのうち沈殿抑制効果が確認され、かつ最も高かったものはβ−マンナナーゼであった。キシラナーゼにも緑茶沈殿抑制効果は確認されたが、β−マンナナーゼほどではなかった。
【００２３】
そこで精製β−マンナナーゼと精製キシラナーゼについて比較し、緑茶沈殿抑制の閾値添加量を比較した。ヘミセルラーゼが多種多様の多糖類に作用する酵素の総称であり、その活性を示す統一的な値が無いので両酵素を比較するのに、蛋白質量に換算して閾値添加濃度を比較した。その結果、使用した茶葉および茶葉濃度でキシラナーゼは緑茶綿状沈殿を抑制するために０．１２ｍｇ／ｍｌ（終濃度）必要であったのに対し、β−マンナナーゼは０．０１３〜０．０２２ｍｇ／ｍｌ（終濃度）必要であった（４０℃、二週間保存時）。従って、蛋白質量で比較した場合、沈殿抑制酵素がキシラナーゼであればβ−マンナナーゼの約５〜１０倍必要だということになる。すなわち、ヘミセルラーゼ酵素群のうち緑茶沈殿抑制に関して最も有効であるのはβ−マンナナーゼであることを見いだした。
【００２４】
したがって、市販のヘミセルラーゼ酵素剤を比較した場合、β−マンナナーゼ活性の比率が高ければ高いほど緑茶沈殿抑制効果の高い酵素剤である。そのため、この比率の高い酵素剤では緑茶沈殿抑制のための必要添加量も少なくてすむ。すなわち、実際の実施態様である酵素剤においても、β−マンナナーゼ活性比率の高い酵素剤の方が蛋白質の添加量が少なくて済むことが後記の実施例１２において確認されている。たとえば本発明者らによる既出願（特願平１１−３３０５５８号）のペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８３１）由来β−マンナナーゼは、検討したヘミセルラーゼ酵素剤の中でも最もβ−マンナナーゼ活性の比率が高く、それゆえ緑茶沈殿生成抑制効果に関しても最も高いことを見いだした。また、本β−マンナナーゼ製剤に含有されるβ−マンナナーゼは、他のβ−マンナナーゼと比較した場合でも比活性が高いことがわかっている。従って、緑茶沈殿抑制に最も有効でかつ高比活性のβ−マンナナーゼ活性を主成分とした本β−マンナナーゼ製剤は、緑茶沈殿抑制の必要添加量も他のβ−マンナナーゼ製剤に比較しても少なくて済むことが判明した。
【００２５】
一般に、緑茶綿状沈殿は、茶葉が上級になればなるほど、生成されやすいことが知られている。それは茶葉が上級になれば、緑茶抽出液中の多糖類の含有率が高くなるためである。従って上級茶葉の場合、必然と沈殿抑制のための酵素剤必要添加量も高くなる。しかし、酵素剤添加量が多くなれば、蛋白質由来の沈殿の生成を促すこととなり、酵素剤本来の役割を果たすことはできなくなる。しかし、β−マンナナーゼはキシラナーゼに比べ緑茶沈殿抑制効果が約５〜１０倍高いので、β−マンナナーゼ製剤で処理すれば、上級茶葉に対する閾値酵素量を添加しても蛋白質由来沈殿が生成されることなく二次沈殿（綿状沈殿）を抑制することができる。特に、本発明者らによる既出願（特願平１１−３３０５５８号）の当該β−マンナナーゼは比活性が高いため、蛋白質添加量も少なくて済むため、より有利である。これは、従来、綿状沈殿を生じてしまうため実現困難と考えられていた上級茶葉を使ったペットボトル緑茶飲料の処方をも可能とするものであり、工業上、非常に有益なものであると言える。
【００２６】
近年、緑茶二次沈澱は主に分子量２万以上の水溶性多糖類に起因すると云われている。また、緑茶水溶性多糖類に関して分子量１０万以上と平均分子量１万の二つの高分子多糖類が存在する事が報告されている。〔竹尾  忠一、「日本食品科学工学会誌」、Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．４、ｐ２７０−２７２（１９９８）〕。β−マンナナーゼが優位に二次沈殿を抑制するメカニズムとして、以下のような仮説が考えられる。
・  緑茶沈殿多糖には、単一の多糖が含まれており、β−マンナナーゼとキシラナーゼどちらも緑茶多糖を分解できるが、β−マンナナーゼの方が高い分解性を示す。
・  緑茶沈殿多糖には、複数種の多糖が含まれており、β−マンナナーゼで分解可能な多糖の方が量的に多い。キシラナーゼで分解可能な多糖は量的に少ない。・  緑茶沈殿多糖には、複数種の多糖が含まれており、ある多糖はβ−マンナナーゼで分解されやすい性質をもっている。一方、別の多糖はキシラナーゼで分解されにくい性質をもっている。
・  β−マンナナーゼで分解可能な多糖は一部を分解するだけで沈殿を抑制できるが、それに対してキシラナーゼで分解可能な多糖は、すべてを分解しなければ沈殿を抑制できないため、酵素が多量に必要となる。
【００２７】
本発明において、β−マンナナーゼによる通常の処理条件は以下の通りである。
β−マンナナーゼの至適ｐＨはおおむね、４．５〜６．０である。しかし至適ｐＨで酵素処理を行わなくてもｐＨ５．０〜６．５の範囲であればその効果は同等である。緑茶飲料の製造では、酸化防止剤として通常アスコルビン酸またはその塩を添加し、その後、酵素処理に際し、適宜ｐＨ調整剤として通常炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等を添加することにより、ｐＨの調整が容易である。前述のように、緑茶抽出液のｐＨ調整は、上記製造方法における任意の工程（酵素剤処理、酸化防止剤添加、遠心分離等）において、すくなくとも１回以上のｐＨ調整剤の添加によって行うことが好ましい。
【００２８】
次に、β−マンナナーゼ製剤の作用適温の範囲は２０〜７０℃である。β−マンナナーゼ処理は、酵素剤を緑茶抽出用水性媒体へ添加し緑茶抽出と同時に６０〜７０℃の高温にて行うこともできるが、β−マンナナーゼ処理を緑茶抽出液にて２０〜４０℃で行うこともできる。あるいはその両方で行うことも可能である。いずれの場合にも、４０℃を越える時間が長いと緑茶抽出液の劣化が見られる場合があるので好ましくなく、また、いずれの場合にも温度が低すぎると酵素処理時間が長くなり、かえって緑茶抽出液の劣化をまねく恐れがあるため好ましくない。酵素処理の時間は、通常、３０分以上が必要とされるが、使用する酵素の添加量、茶葉の種類および茶葉の濃度等により適宜設定すればよい。しかし、抽出液の劣化を防ぐためにはできるだけ短時間の処理ができるように適宜調節する必要がある。
【００２９】
酵素の添加量は、通常緑茶抽出液１ｍｌ当たりβ−マンナナーゼ活性に換算して０．０５Ｕ〜１００Ｕ、望ましくは０．８Ｕ〜４１Ｕである（４０℃で１ケ月間保存時）。ただし、使用する茶葉の種類、緑茶抽出液の濃度、使用する酵素の種類、性質、諸条件等によってその添加量は変化するので適宜設定する必要がある。
【００３０】
上記製造法により得られる緑茶飲料は、従来の緑茶飲料製品と比較して、一段と風味および呈味が向上するという格別の効果を有する。これは上記のようにβ−マンナナーゼ活性を有する酵素による酵素処理で、茶抽出液中に含まれる多糖類が分解され、また、多種多様の糖類が分解され低分子化し、これらの糖類が、ほどよい風味成分ないし呈味成分として緑茶飲料液の風味及び呈味をさらに向上させる作用に基づくものである。また、酵素添加量が少量で済むため、酵素剤由来の雑味がないという利点がある。
【００３１】
上記酵素処理を行った後、通常適宜加熱殺菌処理と同時に酵素反応を停止させる。これらの処理については、例えば実施例１５等を参照することができる。また、前述のように本発明における各処理工程のいずれかの工程の前および／または後に少なくとも１回以上、炭酸水素ナトリウム等の食用アルカリにより容易にｐＨ調整を行うことができる。本発明方法におけるｐＨ調整のｐＨは、風味維持および品質向上のため、殺菌後の飲料液をｐＨ６．０〜６．５とすることが好ましい。
【００３２】
本発明の典型的な緑茶飲料は、濃縮状態の緑茶抽出液を、イオン交換水等の調合水で希釈後、アスコルビン酸またはその塩等を配合し、炭酸水素ナトリウム等によりｐＨ調節がなされ、β−マンナナーゼ又はβ−マンナナーゼを主成分として含有する酵素剤で処理した後、密封容器に充填される。また密封容器は特に限定されないが、ポリ容器、缶、紙容器、ガラスビン等が例示される。また、充填、殺菌は、通常の処理方法により行えばよく、特に限定されるものではない。例えば、缶の場合は、再加熱、充填、高圧殺菌（レトルト殺菌）を行い、また、ペットボトルの場合は、瞬間殺菌法（１３０〜１３５℃、３０秒前後）を施して、常法により、密封容器入りの緑茶飲料製品が製造される（例えば実施例１５等参照）。このようにして製造された本発明の緑茶飲料は、沈殿の生成が抑制されているので、密封容器入り緑茶飲料、特にペットボトル等の透明密封容器入り緑茶飲料とできることが有利である。
【００３３】
【実施例】
次に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１：緑茶沈殿抑制評価の方法
酵素閾値添加量を求めるための緑茶沈殿抑制評価について以下の方法で行った。
静岡産「やぶきた種」、一番茶中級の緑茶葉（これを茶葉１とする）１０ｇを６５℃のイオン交換水３５０ｇに添加し、５分間静置抽出した（茶葉投入直後、２．５分後にそれぞれ１０秒間攪拌）。３０メッシュと１２０メッシュ  ステンレスフィルターを用いて茶葉を粗濾過後、約２０℃に冷却した抽出液を遠心分離（３０００回転／分、１０分間）し、さらに２００メッシュ  ステンレスフィルターを用いて抽出液を濾過し、清澄液を得た。品質安定化のために、イオン交換水にて３．７倍に希釈後、アスコルビン酸ナトリウムを終濃度０．０４％になるように添加し、その後炭酸水素ナトリウムを滅菌後にｐＨ６．２５になるように添加し調節した。次に１０ｍｌサイズのキャップ付き耐熱試験管に１０ｍｌずつ分注した。そして各酵素剤を各濃度で添加し、３０℃（水浴）、３０分で酵素処理を行った。次いで、１２１℃で１０分の殺菌処理を行い、４０℃で保存した。
【００３４】
実施例２：各種ヘミセルラーゼ類の緑茶沈殿抑制効果の評価
以下の第１表に示す各種市販精製ヘミセルラーゼ酵素剤およびヘミセルラーゼ以外の粗酵素剤の緑茶沈殿抑制効果を検討した（４０℃、一週間保存）。なお緑茶沈殿抑制評価は、実施例１に記載の方法に従って行った。
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この結果から、様々なヘミセルラーゼの中でもβ−キシラナーゼとβ−マンナナーゼに緑茶沈殿抑制効果があることが判明した。しかし、β−キシラナーゼの効果は、β−マンナナーゼよりも弱いものであった。
ヘミセルラーゼには属さないが、植物由来多糖を分解する酵素、例えば、セルラーゼ製剤やペクチナーゼ製剤では緑茶沈殿抑制効果は得られなかった。
【００３５】
実施例３：ペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株のβ−マンナナーゼβ−マンナナーゼ生産菌、ペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株は、群馬県の土壌より単離した。１５ｍｌの試験管に分注した１０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・ガム、１０ｇ／リットルのバクトペプトン（ディフコ社製）、１ｇ／リットルのイースト・エキストラクト（ディフコ社製）、２ｇ／リットルのリン酸二水素カリウム、および０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・七水和物からなる液体培地に植菌して振とう培養を行い、β−マンナナーゼ活性を測定し、最も活性の高い菌株としてｍｃｈ１３−２株を得た。本菌株はペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）ｍｃｈ１３−２株と命名し、通商産業省工業技術生命工学工業技術研究所に（受託番号）ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８３１として寄託してある。
なお、β−マンナナーゼの活性測定は次の方法により行った。
１０ｇ／リットルのローカストビーンガム溶液３ｍｌと１５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍｌに被験液１ｍｌを加えて４０℃で１０分反応させた。反応液中に生じた還元糖をソモギーネルソン法にて定量した。β−マンナナーゼ活性は被験液１ｍｌが１分間に１μｍｏｌｅのマンノースに相当する還元力を生じる酵素活性を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）として示した。なお、ローカストビーンガム（シグマ社製Ｎｏ．Ｇ−０７５３）は、１００℃、３分間攪拌しながら溶解した後、９５００ｒｐｍ、１０分間にて遠心分離した上清を用いた。
【００３６】
実施例４：ペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２由来のβ−マンナナーゼの精製
３０ｇ／リットルのコプラミール（不二製油社製）、２ｇ／リットルのリン酸二水素カリウム、および０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・七水和物を含む培地１．５リットルを、２．５Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、１２１℃、４０分滅菌した。
ペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株を、上記のようにして調製したミニジャーファーメンターに植菌し、２７℃、５００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて、七日間培養した。培養液はヌッチェにて菌体を濾過分離し、培養上清約１．３Ｌを得た。なお、以後の操作は全て４℃にて行った。また、β−マンナナーゼ活性測定法は実施例３に記載の方法にて行った。
上記のようにして得られた培養上清を、限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮した後、加水してＵＦ脱塩し、５２ｍｌの濃縮液を得た。
上記のように遠心分離して得られた溶液に最終濃度５０ｍＭとなるようトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した。その半量ずつを２回に分けて、同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き３００ｍｌの０〜０．３Ｍ食塩の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、最終濃度５０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ硫酸アンモニウムとなるように添加し、１０ｍｌの溶液とした。
この溶液を、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３００ｍｌの１．５Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス・塩酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にてＵＦ洗浄、脱塩濃縮し、２ｍｌの溶液とした。
次に濃縮液を同緩衝液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ）にアプライし、同緩衝液にてβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、２ｍｌの溶液を得た。
最終的にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第２表に示す。
なお、蛋白量は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準物質として、フォーリン・ローリー法にて測定した。
0003628605.tif 000004
【００３７】
実施例５：ペニシリウム  マルチカラー  ｍｃｈ１３−２由来のβ−マンナナーゼの諸性質
実施例４で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
なお、酵素活性は上記実施例３に記載の方法にて測定した。
（１）作用
β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合しているローカストビーンガム０．２％溶液に、本発明の酵素を２．０Ｕ／ｍｌの濃度になるように添加し、経時的にサンプルをとり、反応生成物を液体高速クロマトグラフィー（カラムＢｉｏ−ｒａｄ社Ａｍｉｎｅｘ  ４２Ａ）にて分析した。その結果、反応開始後６０分後には高分子のローカストビーンガムは消失し、主として中〜低分子の酵素分解物が観察されたが、反応開始後５時間後にはそれらがさらに低分子化していた。反応初期に高分子がすみやかに消失し、中〜低分子の酵素分解物が観察されたことで、本酵素がβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合にエンド型で非特異的に作用し、マンノオリゴ糖、マンノースを生成したと考えられる。
（２）基質特異性
ローカストビーンガム（ガラクトマンナン）、グルコマンナン（コンニャク由来）、アラビノキシラン（大麦由来）、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースの各０．２％溶液に本酵素２．０Ｕ／ｍｌになるように混合し、４５℃にて６６時間反応させた。その後、反応を１００℃にて停止後、反応生成物を液体高速クロマトグラフィー（カラムＢｉｏ−ｒａｄ社Ａｍｉｎｅｘ  ４２Ａ）にて分析した。その結果、ローカストビーンガム、グルコマンナンでは低分子化が観察されたが、それ以外のアラビノキシラン、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースでは変化は認められなかった。
（３）分子量
分子量の測定はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。マーカータンパク質として２００，０００、１１６，３００、９７，４００、６６，３００、５５，４００、３６，５００、３１，０００、２１，５００、１４，４００を用いた。その結果、本酵素は糖鎖がついていると考えられ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のバンドはスメアになった。分子量範囲は４２，０００〜４５，０００であり、メインバンドの分子量は４３，０００であった。
（４）等電点
ファーマライトｐＨ２．５〜５．０（ファルマシア社製）３に対してファーマライトｐＨ４．５〜５．４（ファルマシア社製）を１加えた溶液を作成した。さらに、その溶液１に対して１５の割合で純水を加えた液にて膨潤させたアガロースゲルを用いて、等電点電気泳動を行った。その結果、等電点は３．２であった。
（５）安定性
本酵素は５０℃で１時間の処理で安定（１００％の残存活性）であり、６０℃１時間の処理で７０％の残存活性であった。またｐＨ３．０〜１０．０の２０℃で２０時間処理で安定であった。
（６）反応性
本酵素は７０℃付近に反応最適温度、ｐＨ５．５付近に反応最適ｐＨを有する。
（７）各種活性化剤、阻害剤の影響
実施例３のβ−マンナナーゼ活性測定法において、以下の第３表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を行い、活性化または阻害の有無を調べた。その結果、マンガンイオン、Ｎ−ブロモコハク酸イミドにより阻害を受けることがわかった。
0003628605.tif 000005
【００３８】
実施例６：ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」（天野製薬社製）由来のβ−マンナナーゼの精製
ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」は、アスペルギルス属に属する微生物が生産した粗酵素剤である。精製操作は全て４℃にて行った。また、β−マンナナーゼ活性測定法は実施例３に記載の方法にて行った。
ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」１２ｇを、最終濃度５０ｍＭとなるようトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、４０ｍｌの溶液とした。この溶液を同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き３００ｍｌの０〜０．３Ｍ食塩の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、最終濃度１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ硫酸アンモニウムとなるよう添加し、１１ｍｌの溶液とした。
この溶液を、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３００ｍｌの１．５Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス・塩酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にてＵＦ洗浄、脱塩濃縮し、２．５ｍｌの溶液とした。
次に濃縮液を同緩衝液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ）にアプライし、同緩衝液にてβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、１４．４ｍｌの溶液を得た。
最終的にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第４表に示す。
なお、蛋白量は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準物質として、フォーリン・ローリー法にて測定した。
0003628605.tif 000006
【００３９】
実施例７：ヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」由来のβ−マンナナーゼの諸性質
実施例６で得られた精製酵素の酵素学的諸性質の概略は以下の通りであった。なお、酵素活性は上記実施例３に記載の方法にて測定した。
（１）作用
β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合しているローカストビーンガムなどにエンド型で作用するガラクトマンナナーゼ活性を有する。
（２）基質特異性
ローカストビーンガム、グルコマンナン、グアーガムに作用し低分子化が観察されたが、アラビノキシラン、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースでは変化は認められなかった。
（３）分子量
分子量の測定はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。マーカータンパク質として２００，０００、１１６，３００、９７，４００、６６，３００、５５，４００、３６，５００、３１，０００、２１，５００、１４，４００を用いた。その結果、本酵素は糖鎖がついていると考えられ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のバンドはスメアになった。分子量範囲は４１，０００〜４７，０００であった。
（４）反応性
得られた精製酵素は７０℃付近に反応最適温度、ｐＨ４．０〜５．０付近に反応最適ｐＨを有する。
【００４０】
実施例８：セルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト社製）由来のキシラナーゼの精製
セルラーゼＹ−ＮＣは、アスペルギルス属に属する微生物が生産した酵素である。精製操作は全て４℃にて行った。  なお、本発明のキシラナーゼの活性測定は次の方法により行った。
基質溶液（以下に詳細な調製法を示す）４ｍｌに被験液１ｍｌを加えて４０℃で１０分反応させた。反応液中に生じた還元糖をソモギーネルソン法にて定量した。
基質溶液の調整法
１）  乾物０．６２５ｇのキシラン（Ｏａｔ  Ｓｐｅｌｔｓ由来、Ｌｏｔ．ＧＧ０１、東京化成工業製）に３ｍｌ水を加える。
２）  ２Ｎ水酸化ナトリウム５ｍｌ加え、さらに１０ｍｌ水を加え、沸騰水浴中で加温し溶解させる。
３）  水約４０ｍｌを加え、室温まで冷やす。
４）  １Ｍ酢酸２０ｍｌを１０〜３０分、かけて徐々に加える。
５）  １Ｍ酢酸または１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ４．５にする。
６）  水を加え全量を１００ｍｌにする。
以上の手順に従って調製した溶液をキシラナーゼ活性測定の基質溶液とする。
キシラナーゼ活性は被験液１ｍｌが１分間に１μｍｏｌｅのキシロースに相当する還元力を生じる酵素活性を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）として示した。
セルラーゼＹ−ＮＣ５．０ｇを、最終濃度１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、１．０Ｍ硫酸アンモニウムとなるよう添加し、５０ｍｌの溶液とした。この溶液を、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３００ｍｌの１．０Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配でキシラナーゼを溶離した。
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）にてＵＦ洗浄、脱塩濃縮し、１５ｍｌの溶液とした。この溶液を同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、非吸着画分に溶出したキシラナーゼを溶離した。
活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き５０ｍＭトリス・塩酸、０．２ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）にてＵＦ洗浄、脱塩濃縮し、２．０ｍｌの溶液とした。
次に濃縮液を同緩衝液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ）にアプライし、同緩衝液にてキシラナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、１７．６ｍｌの溶液を得た。
最終的にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第５表に示す。
なお、蛋白量は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準物質として、フォーリン・ローリー法にて測定した。
0003628605.tif 000007
【００４１】
実施例９：セルラーゼＹ−ＮＣ由来のキシラナーゼの諸性質
実施例８で得られた精製酵素の酵素学的諸性質の概略は以下の通りであった。なお、酵素活性は上記実施例８に記載の方法にて測定した。
（１）作用
β−１，４−Ｄ−キシロピラノシド結合しているキシランなどにエンド型で作用するキシラナーゼ活性を有する。
（２）基質特異性
アラビノキシラン、キシランに作用し低分子化が観察されたが、ローカストビーンガム、グルコマンナン、グアーガム、トラガントガムでは変化は認められなかった。
（３）分子量
分子量の測定はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。マーカータンパク質として２０５，０００、１１６，０００、９７，４００、６９，０００、５５，０００、３６，５００、２９，０００、２０，１００、１４，３００を用いた。その結果、分子量は約２０，０００であった。
（４）反応性
得られた精製酵素は６０℃付近に反応最適温度、ｐＨ４．０〜５．０付近に反応最適ｐＨを有する。
【００４２】
実施例１０：β−マンナナーゼ精製酵素とキシラナーゼ精製酵素の緑茶沈殿抑制効果の比較
実施例４で得られたペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株由来の精製β−マンナナーゼ（β−マンナナーゼ１）、実施例６で得られたヘミセルラーゼＧＭ「アマノ」由来の精製β−マンナナーゼ（β−マンナナーゼ２）、実施例８で得られたセルラーゼＹ−ＮＣ由来の精製キシラナーゼの緑茶沈殿抑制効果について評価を行った。その方法について以下に示す。
各酵素を下記の濃度で添加し、４０℃、二週間保存時の各酵素の閾値添加量を求めた。なお、閾値添加量あるいは閾値添加濃度とは、沈殿生成評価において「綿状沈殿なし」となる最小量を意味する。
ヘミセルラーゼ活性を示す統一的な値が無いので両酵素を比較するのに蛋白質量に換算して行った（第６表）。また緑茶沈殿抑制効果の評価については実施例１に記載の方法に従って行った。
0003628605.tif 000008
以上の結果を第７表に示す。
0003628605.tif 000009
同様にして４０℃、四週間保存時の結果を第８表に示す。
0003628605.tif 000010
二週間保存時では、β−マンナナーゼは、キシラナーゼに比べ１／９．２４〜１／５．４５量の添加で緑茶沈殿を抑制しており、すなわちβ−マンナナーゼの方が沈殿抑制効果が約５〜１０倍高いことがわかった。
【００４３】
実施例１１：β−マンナナーゼ粗酵素液の酵素処理時のｐＨ検討
緑茶をβ−マンナナーゼ酵素処理する際のｐＨについて検討した。
１．  炭酸水素ナトリウムを滅菌後にｐＨ６．２５になるように添加し調節後、酵素処理した場合。
実施例１に記載の方法に従って行った。これを、炭酸水素ナトリウム一段添加法とする。
２．  炭酸水素ナトリウムを添加しｐＨを５．０に調節後、酵素処理し、さらに炭酸水素ナトリウムを加えて滅菌後にｐＨ６．２５になるように添加する場合。
これを、炭酸水素ナトリウム二段添加法とする。以下に具体的に示す。
静岡産「やぶきた種」、一番茶中級の緑茶葉（茶葉１）１０ｇを６５℃のイオン交換水３５０ｇに添加し、５分間静置抽出した（茶葉投入直後、２．５分後にそれぞれ１０秒間攪拌）。３０メッシュと１２０メッシュ  ステンレスフィルターを用いて茶葉を粗濾過後、約２０℃に冷却した抽出液を遠心分離（３０００回転／分、１０分間）し、さらに２００メッシュ  ステンレスフィルターを用いて抽出液を濾過し、清澄液を得た。品質安定化のために、イオン交換水にて３．７倍に希釈後、アスコルビン酸ナトリウムを終濃度０．０４％になるように添加し、その後炭酸水素ナトリウムをｐＨ５．０になるように加え調節した。次に１０ｍｌサイズのキャップ付き耐熱試験管に１０ｍｌずつ分注した。そしてβ−マンナナーゼ活性を主成分とする粗酵素剤として本発明者らの既出願（特願平１１−３３０５５８号）のペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２由来β−マンナナーゼを使用し、３０℃（水浴）、３０分で酵素処理を行った。酵素処理後、再度炭酸水素ナトリウムを滅菌後にｐＨ６．２５になるように添加し調節した。次いで、１２１℃で１０分の殺菌処理を行った。以上の操作で上記実施例と同様に閾値添加濃度を求めた。
以上二通りの方法で酵素処理を行い、４０℃二週間保存時の閾値添加濃度を第９表にまとめた。
0003628605.tif 000011
以上の結果から酵素反応をｐＨ５．０から６．２５の範囲で行っても閾値添加量は変わらないことがわかった。そして炭酸水素ナトリウムの添加は一回または二回に分けて行っても同様の効果が認められることがわかった。
【００４４】
実施例１２：各種粗酵素剤の蛋白量と、緑茶沈殿防止作用の閾値添加濃度の評価
実施例３で得られたペニシリウム・マルチカラー    ｍｃｈ１３−２株由来の粗酵素液、および以下の第１０表に示す各種粗酵素剤のβ−マンナナーゼ活性とキシラナーゼ活性を実施例３および、８に示す方法にて測定した。
また、フォーリン・ローリー法にて、それぞれの蛋白量を測定した。
0003628605.tif 000012
ついで、実施例１の方法に従って、１０ｍｌの茶溶液に対する粗酵素剤（１０％溶液として用いた）の添加量を２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００μｌとなるよう実験区を設け酵素処理を行い、４０℃、二週間保存後、綿状沈殿が発生しない閾値添加量の測定を行い、それぞれの粗酵素剤について、β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率との関係を評価した。
第１１表に、綿状沈殿抑制の閾値での蛋白添加量と、β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率を示した。なお、綿状沈殿抑制効果のなかったものは除いた。
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この結果からわかる様に、β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率が高い程、閾値での蛋白添加量は少なくて済む事がわかった。すなわち、この現象は精製酵素だけでなく、粗酵素剤でも確認できた。そして、β−マンナナーゼ／キシラナーゼ活性比率は、２０以上で顕著になる事も確認できた。ほとんどがβ−マンナナーゼで構成されるペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２は、８０６と非常に高い値であると同時に、閾値での蛋白添加量は０．０１３ｍｇ蛋白／ｍｌ茶液と、非常に少ないものであった。
なお、含有するキシラナーゼの量と閾値添加量の値を比較すると、β−マンナナーゼとの相加効果がある傾向が認められた。
【００４５】
実施例１３：β−マンナナーゼ精製酵素とキシラナーゼ精製酵素の緑茶沈殿防止作用における相乗効果の評価
実施例４で得られたペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２株由来の精製β−マンナナーゼ、および実施例８で得られたセルラーゼＹ−ＮＣ由来の精製キシラナーゼを用いて、緑茶沈殿防止作用における相乗効果の有無の評価を行った。
実施例  １の方法に従って、以下に示す様に、１０ｍｌの茶液に対して、１０段階希釈した各濃度のβ−マンナナーゼを添加して酵素処理を行った実験区系列を基本に、それに精製キシラナーゼでの閾値添加量（実施例１０で０．１２１ｍｇ／ｍｌ＝２．１８Ｕ／ｍｌと求められている）の３．３割、および６．７割にあたる精製キシラナーゼをさらに添加して酵素処理を行った３つの実験区系列を設けた。これを４０℃、二週間保存し、綿状沈殿が発生しない閾値添加濃度の測定を行った。
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その結果、いずれの実験区系列においても、精製β−マンナナーゼを０．８Ｕ／ｍｌ以上添加したもので綿状沈殿の解消が認められ、キシラナーゼを閾値添加量の６．７割添加しても、β−マンナナーゼでの綿状沈殿解消効果に影響を与えない事がわかり、相乗効果はないものと考えられた。この結果は、実施例１２の両酵素の相加効果が認められる事と一致していた。
【００４６】
実施例１４：上級茶葉での効果の検証
上級茶葉であるほど二次沈殿を引き起こす多糖が多く含まれることが知られている。また、上級茶葉を用いた場合酵素添加量は上がり、蛋白質由来の沈殿が出やすくなる。そこで、セルラーゼＹ−ＮＣと本発明者ら既出願（特願平１１−３３０５５８号）のペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２由来のβ−マンナナーゼ粗酵素液を用いて、上述実施例で用いていた静岡産「やぶきた種」、一番茶中級（茶葉１）の緑茶沈殿評価用茶葉よりも上級な静岡産「やぶきた種」一番茶、中級茶葉（これを茶葉２とする）での閾値添加量の評価を行った。また評価試験は、実施例１に記載の方法と同様に１０ｍｌサイズの耐熱試験管で行った。なお、茶葉２は茶葉１に比べ上級であり、沈殿生成量の多い茶葉である。
酵素濃度については第１２表に示したとおりである。
0003628605.tif 000015
（注）セルラーゼＹ−ＮＣに関してはキシラナーゼ活性で、ｍｃｈ１３−２由来β−マンナナーゼ粗酵素液はβ−マンナナーゼ活性で示している。
４０℃、二週間保存の結果、セルラーゼＹ−ＮＣでは、緑茶沈殿抑制効果は発揮できず、これ以上添加酵素量を上げても蛋白質由来沈殿が生成されるため、上級な茶葉（茶葉２）では効果を得ることができなかった。それに対して、β−マンナナーゼ粗酵素液の場合４１Ｕ／ｍｌで沈殿は完全に抑制できた。従って本β−マンナナーゼ粗酵素液は上級な茶葉（茶葉２）においても緑茶沈殿抑制効果が確認された。蛋白質由来の沈殿が生成されないのは、効果が大きいβ−マンナナーゼを含むこと、および夾雑酵素をほとんど含まないことが考えられる。また本β−マンナナーゼ自体の比活性も高く、添加蛋白量が少ないためと考えられる。以上の結果から、β−マンナナーゼを主成分とするβ−マンナナーゼ粗酵素剤を用いることにより、従来難しいと考えられていた上級茶葉を用いた緑茶飲料の製造も可能になると考えられる。
【００４７】
実施例１５：呈味性の評価
静岡産やぶきた種、一番茶中級緑茶葉（茶葉１）１６０ｇを６５℃のイオン交換水５．６ｋｇに添加し、５分間静置抽出した（茶葉投入直後、２．５分後にそれぞれ１０秒間攪拌）。３０メッシュと１２０メッシュ  ステンレスフィルターを用いて茶葉を粗濾過後、約２０℃に冷却した抽出液を遠心分離（３０００回転／分、１０分間）し、さらに２００メッシュ  ステンレスフィルターを用いて抽出液を濾過し、清澄液を得た。品質安定化のために、イオン交換水にて３．７倍に希釈後、アスコルビン酸ナトリウムを終濃度０．０４％になるように添加し、その後炭酸水素ナトリウムを滅菌後にｐＨ６．２５になるように添加し調節した。そしてβ−マンナナーゼ活性を主成分とする粗酵素剤として本発明者らの既出願（特願平１１−３３０５５８号）のペニシリウム・マルチカラー  ｍｃｈ１３−２由来β−マンナナーゼ粗酵素液または比較例としてセルラーゼＹ−ＮＣを使用し、３０℃（水浴）、３０分で酵素処理を行った。次いで、２００ｍｌサイズ耐熱ガラス瓶に入れ、レトルト殺菌処理を行って、緑茶飲料を得た。
以下の第１３表に示した。
0003628605.tif 000016
（注）セルラーゼＹ−ＮＣに関してはキシラナーゼ活性で、ｍｃｈ１３−２由来β−マンナナーゼ粗酵素液はβ−マンナナーゼ活性で示している。
上記緑茶抽出液を２５℃および４０℃で四週間保存時の緑茶沈殿抑制評価および、一週間保存時の風味について経験豊富なパネラー３名で官能検査を実施してその品質を比較した。その結果を第１４表に示す。ただし２５℃および４０℃保存では同じ結果が得られた。
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以上のように、セルラーゼＹ−ＮＣでは沈殿の生成が抑制されたものの風味には低濃度ですでに酵素由来の土臭が発生していた。一方ｍｃｈ１３−２由来β−マンナナーゼ粗酵素液では、沈殿の抑制ができたと同時にこく味も増し、より茶感が増した。これは明らかに品質向上効果を示すものであった。
【００４８】
【発明の効果】
上述してきたように、本発明によれば、複雑な工程を必要とせず、かつ緑茶抽出液本来の風味・呈味を失うことなく、長期間にわたり、濁りあるいは沈殿のない緑茶飲料、特に透明密閉容器入り緑茶飲料を提供することができる。
また、緑茶飲料を長期に亘って保存しても、従来、保存中に不可避的にみられた二次沈澱の発生を有効に抑制することができると共に、嗜好飲料としての緑茶飲料の茶感（緑茶本来の風味および呈味）が従来製品と比較して一段と向上した高品質の緑茶飲料の製造法およびその製品を提供することができる。
さらに、従来沈殿抑制効果があると言われていたキシラナーゼと比較して、β−マンナナーゼは効果が５〜１０倍程度高く、その結果、β−マンナナーゼを主成分とする酵素剤の場合、閾値添加量が少なくて済むため、酵素由来の「土臭」などの雑味を生じることが無い。また、上級茶葉を用いた場合でも、蛋白質由来の沈殿を生じることなく、完全に二次沈殿（綿状沈殿）を抑制することが可能となった。