(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニナーゼの高レベルでの産生のための発現系であって、これは、プロモーターに作動可能に連結されたメチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のタンデムなコピーを含有するＤＮＡ分子であり、
ここで、該ヌクレオチド配列が、ａ）以下の配列に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ｂ）以下の配列において示されるヌクレオチド配列、およびｃ）高ストリンジェンシーの条件下で以下の配列に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるメチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、発現系であって、
ここで、該発現系によって産生される該メチオニナーゼが、全細胞性タンパク質の４０〜７５％に相当する、発現系
【化１】
0003710709.tif 000007
0003710709.tif 000008
。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列ｂ）である、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列ａ）であり、そして１つ以上のＥ．ｃｏｌｉによって好まれるコドンを含有するように改変されたａ）の対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の発現系。
【請求項４】
前記プロモーターが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、請求項１に記載の発現系。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の発現系を含有するように改変された、細胞。
【請求項６】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の発現系を含有する、ベクター。
【請求項９】
メチオニナーゼを産生するための改良された方法であって、該メチオニナーゼが産生される条件下で、請求項５から７のいずれか１項に記載の細胞を培養する工程、および必要に応じて該培養物から該メチオニナーゼを回収する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、メチオニナーゼをコードする２つ以上のタンデムなヌクレオチド配列を含有するメチオニナーゼ発現系、およびそれらから組換えメチオニナーゼを産生する方法に関する。この産生システムによって、大量のメチオニナーゼ活性を生じる。このように産生されたメチオニナーゼは、抗メチオニンおよび抗ホモシステイン治療において有用である。
【０００２】
（発明の背景）
ガンの治療用薬物に基づく処置は、受容可能な量を超えても正常な組織機能には損傷を与えないで、ガン細胞を選択的に阻害するかまたは死滅させる、医薬品の使用に関する。従来の化学療法の困難性は、正常な組織に対する治療用薬物の毒性であった。
【０００３】
多くの腫瘍が、種々の細胞型および評価された腫瘍組織（結腸、乳房、前立腺、卵巣、腎臓、咽頭の黒色腫、肉腫、肺、脳、胃、および膀胱の腫瘍、ならびに白血病およびリンパ腫を含む）において、メチオニンの絶対的な必要性を有することが示されている。メチオニン依存性は、増殖培地中でメチオニンがヘモシアニンによって置き換えられた場合に、腫瘍が増殖できないこととして規定されている。例えば、Ｃｈｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，３３：１８９８−１９０４、１９７３；およびＨｏｆｆｍａｎ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５：１−３０、１９８５を参照のこと。
【０００４】
メチオニンの枯渇は、細胞周期の後期Ｓ／Ｇ2期へとメチオニン依存性腫瘍細胞を選択的に同調させることが示されている。Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７７：７３０６−７３１０，１９８０。メチオニンを欠乏させ、続いてメチオニンを枯渇させる抗メチオニン化学療法を、有糸分裂阻止剤に対する暴露と組み合わせて使用して、腫瘍細胞は、正常な細胞および腫瘍細胞の共生培養物から選択的に排除された。これによって、活発に増殖している正常な細胞の培養物を生じる。Ｓｔｅｒｎら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，７６：６２９−６３９，１９８６。
【０００５】
メチオニン依存性化学療法がインビボで行われるために、循環メチオニンの血清を有効に除去するための手段を有することが必要である。抗腫瘍療法において有効であるに十分な様式で、インビボでの循環メチオニンレベルを低下させるメチオニン枯渇法は、記載されていない。
【０００６】
メチオニンを分解する酵素であるメチオニナーゼが、種々の細菌供給源から精製されており、そしてインビトロでの腫瘍細胞の増殖速度を送らせることが報告されている。Ｋｒｅｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，３３：１８６２−１８６５、および１８６６−１８６９、１９７３；Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６６：３０７−３１１  １９７６；Ｉｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７９：１２６３−１２７２，１９７６；およびＮａｋａｙａｍａら、Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ４８：２３６７−２３６９，１９８４。
【０００７】
Ｋｒｅｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３３：１８６６−１８６９，１９７３は、マウスのモデル中に移植されたガン肉腫細胞の増殖を阻害するための、１１５０ユニット／ｋｇ／日でのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓから単離された高度に不純なメチオニナーゼ調製物の使用を記載した。この酵素は、初代腫瘍細胞の増殖を明らかに低下させたが、腫瘍の直径のＴ／Ｃ（処置対コントロール）比を５０％より下に低下させることは報告されておらず、そして転移にいかなる影響を有することも報告されなかった。著者らはまた、メチオニナーゼの腫瘍特異性が、他の特定されていない介入を伴わずには期待され得ないことを示し、そしてさらに、不純な調製物の内毒素成分または他の成分が、観察された効果の原因となる可能性については説明していない。報告された毒性の研究だけでは、処置期間後における動物の体重の減少、および毒性についてのネガティブな総体的試験は存在しなかった。さらに、著者らは、この酵素が、４時間の血清半減期を有したことを報告する。Ｋｒｅｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３３：１８６６−１８６９，１９７３は、さらに、抗腫瘍療法としてのメチオニンを枯渇させるための手段として、メチオニンを含有しない食餌療法の使用を報告した。しかし、この食餌療法は、メチオニンの不純な調製物の使用と同等の有効性では、腫瘍の増殖を遅延させず、そして動物の体重の持続的な減少の所望されない副作用を生じた。
【０００８】
本明細書中の特許出願（ｐａｒｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、メチオニナーゼを使用して、有害な損傷を伴わずに有利な抗腫瘍効果を提供するように、メチオニンの量を減少させることを指向する、腫瘍の有効な化学療法を開示する。本発明は、少なくとも２コピーのメチオニナーゼ遺伝子を含有する発現系を使用して、商業的に実行可能な量の高度に純粋な組換えメチオニナーゼを産生するための方法を提供することにより、開示される治療方法および診断方法、ならびに組成物を改良する。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のタンデムなコピーを含有するメチオニナーゼ発現系の生成に、一部基づく。本発明の発現系は、全細胞性タンパク質の約４０〜７５％までの範囲のレベルで、適切な宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に組換えメチオニナーゼを産生し得る。
【００１０】
好ましい実施態様において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されたＰ．ｐｕｔｉｄａメチオニナーゼ遺伝子の２つ以上のタンデムなコピーを含有するメチオニナーゼ発現系が、記載される。これらのシステムは、約６．４〜約１２．４ユニット／ｍｌの活性を有し、そして精製前には約３．８〜約１０．２ユニット／ｍｇの特異的活性を有する、約１〜４グラム／リットルで組換えメチオニナーゼを産生するために、適切なインキュベーション条件および精製方法を使用して使用されている。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のメチオニナーゼ発現系を含有する細胞を使用する、組換えメチオニナーゼを産生する方法を提供する。
【００１２】
本発明のメチオニナーゼ発現系を含有する細胞を使用して産生される実質的に純粋な組換えメチオニナーゼは、診断的および治療的使用のための組成物において、特に、心血管疾患、肥満症、および加齢のネガティブな症状の危険性を低下させるため、およびそれらを処置するため、ならびに、腫瘍の診断および画像化のためにメチオニンを枯渇させるために、患者におけるホモシステインレベルを低下させるように腫瘍細胞増殖を阻害するための方法において、有用である。
【００１３】
組換えメチオニナーゼは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーにカップリングされることによって、化学的に改変された形態で提供され得る。
【００１４】
（発明の実施の形態）
本明細書中で使用される場合、「多コピー」または「複数」の発現系は、メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のタンデムなコピーの転写および翻訳を指向する、１つ以上の発現制御エレメントを含有する核酸分子をいう。好ましくは、発現系は、同一であり得るかまたは異なり得る、メチオニナーゼをコードする配列の２〜４個のタンデムなコピーを含有する。所望される場合は、ヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉによって好まれるコドンを提供するために、サイレントな変異を含むように天然に見出される配列から改変され得る。このようなコドンは、当該分野で公知である−−例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの米国特許第４，３５６，２７０号および同第４，５７１，４２１号を参照のこと。
【００１５】
産生される得られる組換えメチオニナーゼは、全細胞性タンパク質の約４０〜７５％、好ましくは、全細胞性タンパク質の５０％以上を代表する。好ましい発現制御エレメントは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの他の例として、ＴａｃおよびＴｒｃプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列は、その配列の転写および翻訳によってメチオニナーゼ活性を有するタンパク質の産生を生じる場合に、メチオニナーゼを「コードする」と言われる。メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列のコピーは、それらが同一または異なるメチオニナーゼをコードする配列の直接的な反復として提供される場合に、「タンデムな」方向である。図３は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａメチオニナーゼ遺伝子の２つのタンデムなコピーを含有する複数の発現系の図を提供する。
【００１７】
Ｌ−メチオニナーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタン−リアーゼまたはメチオニナーゼ）は、脱アミノ化および脱チオメチル化によってメチオニンを分解してα−ケト酪酸を産生する酵素である。メチオニナーゼ活性を測定するための１つの方法は、形成されたα−ケト酪酸の量を決定することである。１ユニット（Ｕ）のメチオニナーゼは、Ｉｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，７９：１２６３−１２７２，１９７６；およびＳｏｄａ，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５：２２８−２３５，１９６８によって記載されている標準的なアッセイ条件下で、メチオニンから、１分当たり１マイクロモルのα−ケト酪酸を産生する酵素の量として規定される。
【００１８】
メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列は、この酵素を天然に産生する生物から得られるように未変更であり得るか、または、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を生じるように改変され得る。
【００１９】
メチオニナーゼをコードする核酸分子は、変更されているかまたは変更されていないかにかかわらず、天然にメチオニナーゼを産生する任意の生物に由来し得る。メチオニナーゼをコードする核酸分子の好ましい供給源は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａである。実施例１は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａからのメチオニナーゼをコードする核酸分子の単離および配列決定を開示する（図１を参照のこと）。他の好ましい供給源として、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
多コピー発現系は、当該分野で既知の方法（例えば、制限消化、続く連結）を使用して調製され得る。
【００２１】
所望される場合は、メチオニナーゼをコードする配列は、得られるタンパク質の精製を容易にするために、例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにポリヒスチジンストレッチを付加することによって変更され得る。次いで、Ｎｉ++セファロースが、得られる融合タンパク質を精製するために使用され得る。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の多コピー発現系の１つ以上を含有するベクターを提供する。ベクターは、宿主細胞中に導入され得、そして宿主中での自律複製が可能であり得るＤＮＡ分子である。従って、ベクターは、天然に存在するプラスミドに由来するエピソームの複製起点、ゲノムの複製起点を含有し得るか、またはウイルスゲノムに由来し得る。本発明の発現系が挿入されるベクターの選択は、所望される機能的特性（例えば、適切なマーカーの存在）および改変されるべき宿主細胞に依存する。
【００２３】
１つの好ましい実施態様において、ベクターは、原核生物のレプリコン（例えば、ＣｏｌＥ１レプリコン）、および選択マーカー（例えば、薬物耐性）を含有する。
【００２４】
真核生物発現ベクターもまた、使用され得、当該分野で周知であり、そしていくつかの市販の供給源から入手可能である。代表的なこのようなベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）および本明細書中で記載されるベクターｐＣＤＭ８である。高レベルの発現ベクターは、バキュロウイルスに基づくベクター系のような昆虫細胞発現系を使用してさらに生成され得る。
【００２５】
メチオニナーゼの産生のための宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。好ましい原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。以下の実施例においては、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。
【００２６】
好ましい真核生物宿主細胞として、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞（好ましくは、ＳＰ６のような昆虫細胞、およびマウス、ラット、サル、またはヒト繊維芽細胞株に由来する細胞のような脊椎動物細胞）が挙げられる。他の好ましい真核生物宿主細胞として、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、および同様の真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
【００２７】
本発明の多コピーメチオニナーゼ発現系での適切な宿主の形質転換は、使用される宿主およびベクターの型に代表的には依存する、周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換は、好ましくは、エレクトロポレーションおよび塩処理による；例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２１１０，１９７２；およびＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｍｍａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）を参照のこと。真核生物細胞の形質転換は、好ましくは、エレクトロポレーションまたはカチオン性脂質の使用による。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ  ５２：４５６，１９７３；およびＷｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６、１９７９を参照のこと。
【００２８】
首尾よく形質転換された細胞（すなわち、本発明の多コピーの発現系を含有する細胞）は、周知の技術によって同定され得る。個々のコロニーに由来する細胞が回収され得、溶解され得、そしてそれらのＤＮＡ内容物が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，９８：５０３，１９７５、またはＢｅｒｅｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８，１９８５によって記載されているような方法を使用して、ｒＤＮＡの存在について試験され得る。あるいは、同時係属中の出願である、米国特許出願番号第０８／６４２，５４１号は、固形の培地上で形成されるコロニーのカラーキャストに基づく、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換体を同定するための迅速なスクリーニング方法を開示している。
【００２９】
組換えメチオニナーゼは、本発明の多コピーメチオニナーゼ発現系の１つ以上で形質転換された宿主を使用して、商業的に有意なレベルで産生される。このような形質転換された宿主は、全細胞性タンパク質の約４０〜７５％までのレベルで組換えメチオニナーゼを発現する。このタンパク質は、所望される場合には、精製され得る。
【００３０】
精製のための好ましい方法が図２に示され、そしてこれは、以下の工程を包含する：
ａ）約４０〜６０℃で約１〜１０分間（好ましくは、５０℃で１分間）、水性緩衝液中で、メチオニナーゼを含有する形質転換された細胞の抽出物を加熱する工程；
ｂ）ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ，Ｄｕ  Ｐｏｎｔ）中で約１０Ｋ〜２０Ｋｒｐｍで約１５分〜１時間（好ましくは、約１３Ｋｒｐｍで約３０分間）、４℃にて加熱した抽出物を遠心分離する工程；
ｃ）約５０Ｋ〜１００Ｋの孔の大きさのフィルター（好ましくは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｅ／Ｓｃａｌｅ：ＴＦＦ  ＰＬＨＫ  １００Ｋ  ２．５ｆｔ2カートリッジ）を使用して、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて上清を限外濾過する工程；
ｄ）約ｐＨ７．０〜７．６の１０〜２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の低イオン強度（約１０〜５０ｍＭまで）のＫＣｌ中でＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを行う工程、および４０〜２００ｍＭのＫＣｌ勾配中に溶出されたメチオニナーゼを含有する画分を回収する工程であって、好ましくは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを使用する、工程；
ｅ）約ｐＨ８．０〜８．６の１０〜２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の中程度のイオン強度（約５０〜１００ｍＭ）のＫＣｌ中で第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを行う工程、および１００〜２００ｍＭのＫＣｌ中に溶出された、リン酸緩衝液（ｐＨ８．３）中に溶出されたメチオニナーゼを含有する画分を回収する工程であって、好ましくは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを使用する、工程；ならびに
ｆ）内毒素を吸着し得るクロマトグラフィー媒体と、工程（ｅ）で回収された上記の画分とを接触させる工程、および溶出物を回収し、それによって上記溶出物から内毒素を除去して、ミリグラムタンパク質あたり少なくとも２０ユニットのメチオニナーゼ活性、および１ｍｇタンパク質あたり１〜１００ｎｇまでの内毒素を有する、内毒素非含有（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ）メチオニナーゼを形成する工程であって、好ましくは、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）  Ｅｔｏｘカラムを使用する。
【００３１】
細胞抽出物は、本発明の多コピーメチオニナーゼ発現系の１つを含有するように変更されている宿主細胞から調製される。細菌細胞抽出物について、抽出物は、回収工程が遠心分離によるかまたは中空ファイバー濾過による（これらの方法は、一般的に周知である）かどうかに依存して、細胞ペースト／ペレットを形成させるための細菌の細胞培養物をまず回収し、そして洗浄することによって、一般的に調製される。
【００３２】
次いで、細胞は、従来の手段を使用して破壊される。好ましくは、細胞は、ホモジナイザー（例えば、ｃａｖｉｔａｔｏｒ型ホモジナイザー（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．モデル＃ＨＣ８０００））を使用して破壊される。
【００３３】
得られる懸濁物は、選択的なタンパク質および他の不溶性物質を沈殿させるために加熱される。代表的な加熱条件は、約４５〜６０℃までで１〜１０分間である。５０℃で１分間の加熱工程が、好ましい。
【００３４】
加熱された抽出物は、破片を除去するために遠心分離され、そして上清が濾過され、そして上記で記載されるような、２工程のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー媒体に載せられる。好ましい吸着および溶出条件は、実施例に記載される。任意の種々のＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー媒体が、これらの工程において使用され得、そして媒体の選択は、限定されるようには構成されるものではない。市販の供給源として、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＢｉｏＲａｄおよびＳｉｇｍａが挙げられる。
【００３５】
その後、内毒素が除去されて、上記に記載されるような内毒素の受容可能なレベルを有するタンパク質が産生される。内毒素の除去工程は、任意の種々の周知の手段において行われ得る。これには、内毒素を吸着し得るクロマトグラフィー媒体と溶液中のタンパク質とを接触させる工程、および内毒素非含有タンパク質を溶出する工程を包含する。内毒素を除去することにおける使用に好ましい市販の試薬は、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）  Ｅｔｏｘである。
【００３６】
（治療用組成物）
本発明の多コピーメチオニナーゼ発現系の１つで形質転換された宿主を使用して産生された、実質的に単離された組換えメチオニナーゼが、治療用組成物中に処方され得る。
【００３７】
これらの組成物は、好ましくは、１ｍｇのタンパク質あたり約１０〜５０ユニット（Ｕ）、代表的には、約１６〜２４Ｕ／ｍｇの比活性を有する組換えメチオニナーゼを含有する。
【００３８】
このような組成物中に含有するために、メチオニナーゼを、好ましくは実質的に精製する。実質的に精製されたとは、酵素が、重量で少なくとも９０％純粋、好ましくは少なくとも９５％純粋、そしてより好ましくは少なくとも９９％純粋、または本質的には均質であることを意味する。均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認され得、単一の検出可能なバンドのみを提供する。
【００３９】
組換えメチオニナーゼは、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与によるように哺乳動物中で生理学的に接触させられた場合の内毒素に関連する所望されない副作用のため、内毒素（例えば、細菌のリポポリサッカライド）を実質的に含まないべきである。実質的に含まないとは、１ミリグラム（ｍｇ）組換えメチオニナーゼタンパク質あたり約１０ナノグラム（ｎｇ）未満、好ましくは、１ｎｇ／ｍｇ未満、そしてより好ましくは、０．１ｎｇ／ｍｇ未満の内毒素を意味する。
【００４０】
治療用組成物はさらに、生理学的に寛容なキャリアを含有し得る。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能」、「生理学的に寛容」、および文法上のバリエーションは両方とも、吐き気、めまい、胃の不調などのような所望されない生理学的な影響の産生を伴うことなく、哺乳動物またはヒトに投与され得る物質である、組成物、キャリア、希釈剤、および試薬をいう。
【００４１】
その中に溶解されたかまたは分散された活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的には、このような組成物は、水性または非水性である液体の溶液または懸濁物のいずれかとして滅菌の注射可能なものとして調製されるが、しかし、使用の前の液体中に入れて溶液または懸濁とするのに適切な固形形態もまた、調製され得る。調製物はまた、乳化され得る。さらに、組換えメチオニナーゼの治療的な量は、薬剤の局所的な送達を提供するために、軟膏中にまたは拡散性パッチ（例えば、包帯）上に存在し得る。
【００４２】
活性成分は、薬学的に受容可能であり、そして活性成分と適合性である賦形剤とともに、そして本明細書中で記載されている治療方法における使用に適切な量で混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望される場合は、組成物は、活性成分の有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などのような補助的な物質を主要ではない量で含み得る。
【００４３】
メチオニナーゼは、酸添加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基を用いて形成される）のような薬学的に受容可能な塩として供給され得る。これは、例えば、塩酸、リン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄の水酸化物のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩に由来し得る。
【００４４】
生理学的に寛容なキャリアは、当該分野で周知である。液体のキャリアの例は、活性成分および水以外の物質を含有しないか、または生理学的なｐＨ値でリン酸ナトリウムのような緩衝剤、生理食塩水、またはそれらの両方（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を含有する、滅菌水溶液である。なおさらに、水性キャリアは、１つより多い緩衝化塩、および塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および他の溶質のような塩を含有し得る。
【００４５】
液体の組成物はまた、本明細書中に記載されるように、水に加えてそして水以外に液相を含有し得る。このようなさらなる液相の例は、グリセリン、植物油（例えば、綿実油）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、および水−油エマルジョン（詳細には、上記に記載されるリポソーム組成物）である。
【００４６】
治療用組成物は、代表的には、全治療組成物の重量あたり少なくとも０．１重量パーセントの活性タンパク質の量、そして好ましくは、少なくとも約２５重量パーセントである、組換えメチオニナーゼの有効量を含有する。重量パーセントは、全組成物に対する組換えメチオニナーゼタンパク質の重量による比である。従って、例えば、０．１重量パーセントは、１００グラムの全組成物あたり０．１グラムの組換えメチオニナーゼである。
【００４７】
分解から組換えメチオニナーゼタンパク質をさらに保護し、そして血清半減期を増強する、組換えメチオニナーゼの制御された送達もまた、達成され得る。
【００４８】
治療用組成物はまた、例えば、ポリマー、ポリマー性ビヒクル、粒子、ラテックス、コアセルベート、イオン交換樹脂、リポソーム、腸コーティング、メディエーター、生体接着物質、マイクロカプセル、ヒドロゲル、および同様のビヒクルのような送達ビヒクルであり得る。例示的な薬物送達ビヒクル（リポソームを含む）は、少なくとも、Ｔａｒｃｈａによって「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０に記載されている。
【００４９】
組換えメチオニナーゼは、例えば、ポリマーへの結合によって、またはそうでなければ一次アミノ酸配列を変更することなく共有結合構造を変化させることによって、化学的に改変され得る。好ましいポリマーは、ポリアルキレンオキサイドまたはポリサッカライドである。ポリマーへの結合は、血清半減期を増大させ、そして得られる化合物の免疫原性または抗原性を低下させる。
【００５０】
好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（特に、ＭＳＣ−５０００  ＰＥＧ）、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、エチレンオキサイドのコポリマー、およびプロピレンオキサイドのコポリマーである。タンパク質を化学的に改変するための方法は当該分野で周知であり、そして組換えメチオニナーゼを改変するために容易に使用され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／１１３１１を参照のこと。
【００５１】
（投与および有用性）
メチオニナーゼは、開発されそして別に記載されている、診断および治療方法において使用され得る。ＰＣＴ／ＵＳ９３／１１３１１を参照のこと。例えば、メチオニナーゼは、１）例えば、腫瘍細胞からメチオニンを枯渇させることによって、種々の形態での抗腫瘍剤として、２）腫瘍細胞中の細胞周期の停止を誘導し、続いて細胞の同調化および有糸分裂阻止剤を使用するために、３）有糸分裂阻止剤と細胞周期特異的細胞毒性薬剤との組み合わせで、４）腫瘍の診断および局在化において使用され得るメチオニンでの標識の前に細胞性のメチオニンを枯渇させるために、そして５）ホモシステインの高い血清レベルによって媒介される心血管疾患を予防および治癒するために血清中ホモシステインを枯渇させるために、使用される。本発明に従って調製される組換えメチオニナーゼは、本明細書中では、９人の患者に投与されている。ここで、２０，０００ユニットまでの注入投与量（１０時間にわたって注入される）は有意な副作用を有さず、そして注入後の１０時間で、メチオニンの枯渇を生じた。
【００５２】
本発明に関する以下の実施例は例示的であり、そして本発明を限定しない。
【００５３】
（実施例１：メチオニナーゼをコードする核酸分子の単離）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＣ−１のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ８２０９に由来する）を鋳型として使用した。使用したプライマーは以下の通りであった：
【００５４】
【化１】
0003710709.tif 000002
ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間の最初の変性、次いで５サイクルの、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長；次いで２５サイクルの、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間、次いで７２℃で１．５分間の伸長；次いで７２℃で１０分間の最後の伸長。ＰＣＲ増幅した産物は２つのバンドであり、そのうち１３６５ｂｐのバンドを回収し、そして挿入物ＯＮＣａｓｅ−１  ＤＮＡとして精製した。
【００５５】
ＯＮＣａｓｅ−１  ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＥｃｏＲＶ  Ｔクローニング部位で連結させた。ｐＯＮＣａｓｅ−１  ＤＮＡを、標準的な手順を使用してＤＨ５−α細菌細胞中に形質転換した。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定を、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼおよびジデオキシヌクレオチド終結反応を使用して行った。プライマー歩行法を使用した。［35Ｓ］ｄＡＴＰを標識のために使用した。配列決定反応物を、８Ｍの尿素を含有する、６％のポリアクリルアミドウェッジ（ｗｅｄｇｅ）または非ウェッジゲル上で分析した。ＤＮＡサンプルを、ＡＣＧＴの順に充填した。ＤＮＡ配列を、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒによって分析した。ＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を、図１に提供する。
【００５７】
（実施例２：高発現クローン）
ｐＯＮＣａｓｅ−１クローンを鋳型として使用した。使用したプライマーは以下の通りである：
【００５８】
【化２】
0003710709.tif 000003
ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間の最初の変性、次いで５サイクルの、９４℃で１分間の変性、５６℃で１．５分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長；次いで２０サイクルの、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間、次いで７２℃で１．５分間の伸長；次いで７２℃で１０分間の最後の伸長。２つのＰＣＲ増幅した産物ＯＮＣａｓｅ−２（１２３８ｂｐ）、ＯＮＣａｓｅ−３（１２２０ｂｐ）のバンドを回収し、そして精製した。
【００５９】
ＯＮＣａｓｅ−２のＤＮＡおよびＯＮＣａｓｅ−３  ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位でｐＴ７．７ベクターと連結した。次いで、ｐＯＮＣａｓｅ−２およびｐＯＮＣａｓｅ−３  ＤＮＡ配列を、標準的な手順を使用してＢＬ２１（ＤＥ３）細菌細胞中に形質転換した。
【００６０】
ポジティブなクローンを、アンピシリン含有プレートから選択した。４℃で２４時間の貯蔵後には、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現するポジティブなクローンは、それらの同定および選択を可能にする、はっきりしたピンク色を有した。ポジティブなクローンのメチオニナーゼの発現レベルを、活性アッセイによって決定した。２つの高発現クローンを、ＯＮＣａｓｅ−３が含まれるｐＡＣ−１クローン、およびＯＮＣａｓｅ−２が含まれるｐＡＣ−２クローンとして選択した。
【００６１】
テトラサイクリン耐性遺伝子を、ＡｖａＩおよびＣｌａＩ部位でｐＢＲ３２２から得た。ＡｖａＩ末端を平滑末端にフィルインし、そして、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化し、ＢａｍＨＩ末端を平滑末端にフィルインしたｐＡＣ−１と連結した。４℃で２４時間の貯蔵後にピンク色になったポジティブなクローンを、テトラサイクリン含有プレートから選択した。高発現組換えメチオニナーゼクローンｐＡＣ−３を、活性アッセイによって選択した。
【００６２】
テトラサイクリン耐性遺伝子をまた、ＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＢＲ３２２から得た。ＡｖａＩ末端を平滑末端にフィルインし、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、ＣｌａＩ末端を平滑末端にフィルインしたｐＡＣ−１と連結した。４℃で２４時間の貯蔵後にピンク色になったポジティブなクローンを、テトラサイクリン含有プレートから選択した。高発現組換えメチオニナーゼクローンｐＡＣ−４を、活性アッセイによって選択した。これらのベクターによって得られた発現のレベルを、表１に示す。
【００６３】
【表１】
0003710709.tif 000004
【００６４】
（実施例３：タンデムなメチオニナーゼ発現系の生成）
プラスミドｐＡＣ−１を、増幅した細胞のバンクからＱＩＡ  ｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉｇｅｎ）を用いて単離し、次いでＢａｍＨＩで消化して単一のメチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する宿主ベクターを得た。
【００６５】
ＯＮＣａｓｅ−３をＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｉｌｌ−ｉｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でフィルインし、そして第２のメチオニナーゼ遺伝子の挿入物としてＢａｍＨＩで消化した。連結を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、より高いＴ４リガーゼ濃度で行った。図３を参照のこと。次いで、得られるプラスミドを、操作マニュアルに従ってコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。
【００６６】
ポジティブなクローンを、アンピシリン含有プレートから選択した。４℃にて一晩の最適な貯蔵後、高レベルのメチオニナーゼを発現したクローンは、ピリドキサルリン酸含有メチオニナーゼの高度な富化に起因して、はっきりした黄橙色を有した。メチオニナーゼ含量の最大の指標を有するクローンを、活性アッセイによって確認した。活性についてアッセイした場合、全ての黄橙色のコロニーがメチオニナーゼについてポジティブであり、そして色を有さないクローンはメチオニナーゼネガティブであった。最も高いメチオニナーゼ活性を有するクローンであるｐＡＣ−１１を選択し、そしてＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ消化によって確認した。
【００６７】
ｐＡＣ−１１は、表２に示すように、全細胞内タンパク質の５０％程度のメチオニナーゼの産生を提供する。
【００６８】
【表２】
0003710709.tif 000005
【００６９】
（実施例４：組換えメチオニナーゼ発現クローンの醗酵）
ｐＡＣ−１およびｐＡｃ−１１を含有する細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ）のいずれかを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地中で、２８℃または３７℃で振盪しながら増殖させた。表３は、これらのベクターから得られるメチオニナーゼの産生のレベルを比較する；これらの結果を、時間経過を示すように図４にグラフにする。
【００７０】
【表３】
0003710709.tif 000006
【００７１】
（実施例５：組換えメチオニナーゼの精製）
精製方法の概要を図２に提供する。
【００７２】
（１）サンプルの予備カラム処理
細菌を、８００×ｇで４℃にて１０分間の遠心分離によって回収した。次いで、細菌のペレットを抽出溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ９．０、１０μＭのピリドキサルリン酸、および０．０１％のβメルカプトエタノール）中に懸濁し、そしてｃａｖｉｔａｔｏｒ型ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．モデル＃ＨＣ８０００）で破壊する。次いで、ホモジネートの熱処理を、５０℃にて１分間行う。懸濁物を、自動冷却遠心分離機（ＳＯＲＶＡＬＬ  Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ  ＲＣ  ２−Ｂ）で４℃にて１３ｋｒｐｍで３０分間、遠心分離する。次いで、上清を回収する。この工程に続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦ  ＰＬＨＫ  １００ｋ  ２．５ｆｔ2カートリッジによる限外濾過を、緩衝液（１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８．３）を用いて行う。ｐＨを、限外濾過によって７．２に調節する。
【００７３】
（２）クロマトグラフィー条件
＜第１のカラム：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ＞
カラム：ＸＫ  １００／６０、高さ：３２ｃｍ、容量：２．５Ｌ
溶液：［Ａ］１０μＭのピリドキサルリン酸および０．０１％のβ−メルカプトエタノールを含有する、４０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．２）。［Ｂ］１０μＭのピリドキサルリン酸および０．０１％のβ−メルカプトエタノールを含有する、２００ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．２）。
流速：５ｍｌ／分。
サンプル：約１００〜２００ｇの全タンパク質（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）を、第１のカラムに載せる。
勾配：［１］ＯＤ280が０．１未満になるまで約１０倍容量の溶液Ａで予め洗浄する。［２］勾配：２０％〜１００％までの溶液Ｂ。
画分：２００ｍｌの溶出画分を回収する。メチオニナーゼを含有する画分を活性アッセイによって同定し、そしてプールする。
【００７４】
＜第２のカラム：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ＞
カラム：ＸＫ  ５０／３０、高さ：２５ｃｍ、容量：５００ｍｌ
溶液：［Ａ］１０μＭのピリドキサルリン酸および０．０１％のβ−メルカプトエタノールを含有する、１００ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．３）。［Ｂ］１０μＭのピリドキサルリン酸および０．０１％のβ−メルカプトエタノールを含有する、２００ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．３）。
流速：５ｍｌ／分。
サンプル：１０μＭのピリドキサルリン酸を含有する１００ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．３）中での２４時間の透析後の、約１０〜２０ｇの全タンパク質（２〜４ｍｇ／ｍｌ）を、第２のカラムに載せる。
勾配：［１］ＯＤ280が０．０５未満になるまで約５倍容量の溶液Ａで予め洗浄する。［２］勾配：０％〜６０％までの溶液Ｂ。
画分：２００ｍｌの溶出画分を回収する。メチオニナーゼを含有する画分を活性アッセイによって同定し、そしてプールする。
【００７５】
＜第３のカラム：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲ＞
カラム：ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０、容量：３２０ｍｌ
溶液：１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中の０．１５Ｍの塩化ナトリウム
流速：１．２ｍｌ／分。
サンプル：約１０ｍｌの濃縮したサンプル（０．１５Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中での１２時間の透析後）を、第３のカラムに載せる。
画分：黄色および活性アッセイによって同定される、メチオニナーゼを含有する２０ｍｌの溶出画分を回収する。
【００７６】
＜第４のカラム：Ａｃｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）  Ｅｔｏｘ＞
１００〜２００ｍｌの容量中の精製メチオニナーゼ（１０〜２０ｍｇのタンパク質／ｍｌ）を、５００ｍｌのＡｃｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）  Ｅｔｏｘカラム上に載せ、そして内毒素を排除するために、溶出緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中の０．１５Ｍの塩化ナトリウム）で溶出する。Ａｃｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）  Ｅｔｏｘは再使用が可能であり、そして１Ｍの水酸化ナトリウムで浄化し得、そしてオートクレーブし得る。
【００７７】
＜最終溶出物の濃度＞
最終的な溶出物を、３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓを用いて濃縮する。精製メチオニナーゼの処方は、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）である。
【００７８】
＜メチオニナーゼヒスチジンの精製：Ｎｉ++  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのクロマトグラフィー＞
細胞のホモジネート（予備処理後）を結合緩衝液（５ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ７．９）中に懸濁する。次いで、カラムを、１０倍容量の結合緩衝液で、続いて６倍容量の洗浄緩衝液（６０ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄する。６倍容量の溶出緩衝液（１Ｍのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ７．９）の後に生じる溶出を、カラムを通して行う。黄色によって同定されるメチオニナーゼを含有する画分を、回収する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａから単離されたメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド（および対応するアミノ酸配列）を提供する。
【図２】  図２は、高度に純粋な、内毒素非含有メチオニナーゼを得るために使用される、精製工程の概略を提供する。
【図３】  図３は、１コピーおよび２コピーのメチオニナーゼ発現系の図である。
【図４】  図４は、１コピーおよび２コピーの発現系を使用する、時間の関数としてのメチオニナーゼ発現レベルを比較する。
図面は、必ずしも尺度に基づいているわけではなく、そして本発明の特定の特徴は、一定の尺度に従って誇張され得、そして明確および簡潔にするために模式的な形態で示され得る。
【図１】
0003710709.tif 000009
【図２】
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【図３】
0003710709.tif 000011
【図４】
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