(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られた試料における肺癌の存在を検出するための方法であって：
（ａ）患者から得た関連の細胞、組織または体液の試料において配列番号３のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白質のレベルを測定し；そして
（ｂ）配列番号３のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白質の測定レベルを、健常ヒトコントロールから得た関連の細胞、組織または体液の試料における配列番号３のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白質のレベルと比較するが、ここで健常ヒトコントロールにおけるレベルに対する患者における配列番号３のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白質の測定レベルの増加が肺癌の存在と関連することを含む前記方法。
【請求項２】
配列番号３のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号８のポリペプチドを測定する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、部分的に、癌、特に肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための、新たに開発されたアッセイに関する。
発明の背景
原発肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、および中皮腫を含む、３つの主な種類に分かれる。小細胞肺癌はまた、「オートムギ細胞」肺癌とも呼ばれるが、これは該癌細胞が特有のオートムギの形状であるためである。同様のパターンの振る舞い、および小細胞肺癌とは異なる、治療に対する反応に基づき、共に分類される、３種類の非小細胞肺癌がある。非小細胞肺癌の３種は、扁平上皮細胞癌腫、腺癌および巨大細胞癌腫である。扁平上皮細胞癌腫は、肺癌の最も一般的な種類である。該癌腫は、気道を裏打ちする細胞から発展する。腺癌もまた、気道を裏打ちする細胞から発展するが、腺癌は、粘液（ｍｕｃｕｓ、ｐｈｌｅｇｍ）を産生する特定の種類の細胞から発展する。巨大細胞肺癌において、該細胞は、顕微鏡下で見ると、巨大でそして丸く見える。中皮腫は、まれな種類の癌であり、肺を被覆する胸膜に影響を及ぼす。中皮腫は、しばしばアスベストに曝露されることにより、引き起こされる。
【０００２】
続発肺癌は、体の別の場所（例えば、乳房または腸（ｂｏｗｅｌ））で始まり、そして肺に広まった癌である。治療選択は、どこで癌が始まったかに依存する。例えば、乳房から広まった癌は、乳癌治療に反応するはずであり、そして腸から広まった癌は、腸癌治療に反応するはずである。癌の病期は、どのくらい癌が広まっているかに関する情報を提供する。癌の治療はしばしばその病期に基づき決定されるため、病期決定は重要である。病期決定は、小細胞肺癌に比べ非小細胞肺癌に対しては異なる。
【０００３】
非小細胞癌は、４つの病期に分かれる。病期Ｉは、非常に局在している癌であり、リンパ節には癌がない。病期ＩＩでは、癌は影響を受けている肺の最上部のリンパ節に広まっている。病期ＩＩＩでは、癌が始まった場所の近くに癌が広まっている。これは胸壁、肺被覆（胸膜）、胸中央（中隔膜）または他のリンパ節であってもよい。病期ＩＶの癌は、体の別の部分に広まっている。
【０００４】
小細胞肺癌は、２つの群に分かれる。これは、小細胞肺癌は、しばしば、非常に初期に広まるためである。癌の広まりがスキャンで見られない場合であっても、ある程度の癌細胞が剥がれ、そして血流またはリンパ系を通じて移動しているであろう可能性がある。したがって、いかなる続発癌が見られてもまたは見られなくても、小細胞肺癌は、あたかも広まっているかのように、治療するのがしばしば好ましい。
【０００５】
小細胞肺癌の２つの病期は、限定された疾患、すなわち１つの肺および近傍のリンパ節にのみ見ることが可能である癌、および広まった疾患、すなわち、肺の外部の、胸または体の他の部分へ広まっている癌である。ごく初期の症例を除き、小細胞癌を治療するのに、通常、手術は用いないため、病期決定は、いくつかの他の種類の癌の場合ほど重要ではない。小細胞肺癌の治療には、通常、放射療法を伴うまたは伴わない化学療法が好ましい。最初のスキャンおよび試験を、後のスキャンおよび試験と比較するのに用い、患者がどの程度、治療に反応しているかを見る。
【０００６】
肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するために用いられる方法は、患者の結果に非常に重要である。例えば、初期肺癌と診断された患者は、一般的に、遠隔転移肺癌と診断された患者の生存率に比べ、はるかに高い５年生存率を有する。明らかに、初期肺癌を検出するための、より感度が高くそして特異的な新規診断法が必要である。
【０００７】
肺癌患者はまた、最初の療法後、そして補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）療法中、療法に対する反応を測定し、そして転移の持続または再発疾患を検出するため、綿密にモニターしなければならない。肺癌再発を検出するのに、より感度が高くそして特異的な肺癌マーカーが、明らかに必要である。
【０００８】
肺癌を管理する、別の重要な段階は、疾患の病期を決定することである。病期決定は、予後判定に有用である可能性があり、そして最適な療法を設計するための規準を提供する。一般的に、病理学的な病期決定は、より正確な予後を提供するため、肺癌の病理学的な病期決定が、臨床的な病期決定より好ましい。しかし、臨床的な病期決定は、病理学的評価のための組織を得る侵襲処置に依存しないため、臨床的な病期決定が少なくとも病理学的な病期決定と同程度に正確であれば、臨床的病理決定が好ましいであろう。肺癌の病期決定は、細胞、組織または体液において、侵襲の異なる病期の間を区別することが可能な新規マーカーを検出することにより、改善されるであろう。
【０００９】
本発明において、６つの肺特異的遺伝子（ＬＳＧ）を介し、肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための方法が提供される。これらの６つのＬＳＧは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５または６のいかなるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク質を指す。あるいは、本明細書において、６つのＬＳＧにより、配列番号１、２、３、４、５または６の配列のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子によりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子のレベルを意味する。
【００１０】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければならない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかになるであろう。
発明の概要
これらの、そして他の目的に向け、患者における肺癌の存在を診断するための方法であって、患者由来の細胞、組織または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを測定し、そしてＬＳＧの該測定レベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、肺癌と関連する、ことを含む前記方法を提供するのが、本発明の目的である。
【００１１】
本発明の別の目的は、患者における転移性肺癌を診断する方法であって、患者由来の細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧレベルを測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、患者における肺癌を病期決定する方法であって、肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較することを含む前記方法を提供することである。コントロールにおけるＬＳＧレベルに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連する可能性があり、一方、コントロールに対する患者における測定ＬＳＧの減少したまたは同等のレベルは、後退または緩解している癌と関連する可能性がある。
【００１３】
本発明の別の目的は、転移の開始に関し、患者における肺癌をモニターする方法を提供することである。該方法は、転移していることが知られていない肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、患者における肺癌の病期の変化をモニターする方法であって、肺癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＬＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＬＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そしてコントロールＬＳＧレベルに対する測定ＬＳＧレベルの減少は、後退または緩解している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければならない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、ＬＳＧレベルを健常ヒトコントロールにおけるＬＳＧレベルと比較することにより、癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための、定量的かつ定性的な診断アッセイおよび方法に関する。本明細書において、「ＬＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５または６のいかなるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク質のレベルを意味する。あるいは、本明細書において、「ＬＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子によりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子のレベルを意味する。こうしたレベルは、好ましくは、少なくとも１つの細胞、組織および／または体液で測定され、正常および異常レベルの決定を含む。したがって例えば、正常なコントロール体液、細胞、または組織試料に比較した、ＬＳＧタンパク質の過剰発現を診断するため、本発明に一致した診断アッセイを用い、肺癌を含む癌の存在を診断してもよい。本発明の方法において、６つのＬＳＧのいずれを単独で測定してもよいし、あるいは６つをすべて共にまたはいかなる組み合わせで測定してもよい。
【００１６】
「コントロール」により、癌でないヒト患者および／または該患者由来の非癌性試料を意味し、また、本明細書において、健常ヒトコントロールも指す；転移に関し診断するまたはモニターするための方法において、コントロールはまた、信頼できる方法により、転移していない肺癌を有すると決定されたヒト患者由来の試料も含んでもよい。
【００１７】
本発明の方法はすべて、所望により、ＬＳＧと共に他の癌マーカーのレベルを測定することを含んでもよい。ＬＳＧに加え、本発明に有用な他の癌マーカーは、試験される癌に依存するであろうし、そして当業者に知られる。
【００１８】
診断アッセイ
本発明は、ヒト健常コントロール由来の、好ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルと比較した、細胞、組織または体液におけるＬＳＧのレベルの変化に関し解析することにより、肺癌の存在を診断する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、肺癌の存在と関連する、ための方法を提供する。
【００１９】
本発明を限定することなく、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験された患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織、または体液レベルが、健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そして最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００２０】
本発明はまた、転移の開始に関し、まだ転移していない肺癌を有する患者において、転移性肺癌を診断する方法も提供する。本発明の方法において、転移している可能性がある（が、転移していることが既に知られていない）肺癌を有すると疑われるヒト癌患者が同定される。これは、当業者に知られる多様な手段により達成される。例えば、肺癌の場合、典型的には、患者は、伝統的な検出法の後、肺癌と診断される。
【００２１】
本発明において、細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルの存在の決定は、転移していない肺癌および転移している肺癌の間を区別するのに、特に有用である。既存の技術では、転移している肺癌および転移していない肺癌の間を区別するのは困難であり、そして適切な治療選択は、しばしばこうした知識に依存する。
【００２２】
本発明において、こうした細胞、組織、または体液において測定される癌マーカーレベルは、ＬＳＧであり、そして健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーが、血清中のＬＳＧのみである場合、本レベルは、好ましくは健常ヒト患者の血清におけるＬＳＧレベルと比較される。健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧの増加は、転移している肺癌に関連する。
【００２３】
本発明を限定することなく、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験されるまたはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性の結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、健常患者の、好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そして最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００２４】
病期決定
本発明はまた、ヒト患者における肺癌を病期決定する方法も提供する。
本方法は、こうした癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料を、ＬＳＧに関し、解析することを含む。その後、該方法は、こうした細胞、組織、または体液におけるＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液と比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そしてＬＳＧのレベルの減少は、後退または緩解している癌と関連する。
【００２５】
モニター
さらに提供されるのは、転移の開始に関し、こうした癌を有するヒトにおける肺癌をモニターする方法である。該方法は、転移していることが知られていない癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料をＬＳＧに関し定期的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における該ＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者における測定ＬＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、ことを含む。
【００２６】
本発明にさらに提供されるのは、こうした癌を有するヒトにおける肺癌の病期の変化をモニターする方法である。該方法は、こうした癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料をＬＳＧに関し定期的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における該ＬＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＬＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＬＳＧレベルの増加は、病期が進行している癌と関連し、そしてＬＳＧのレベルの減少は、病期が後退または緩解している癌と関連する、ことを含む。
【００２７】
転移の開始に関する、こうした患者のモニターは、定期的であり、そして好ましくは、原則として年４回行われる。しかし、癌、特定の患者、および癌の病期に応じ、この頻度はより多くてもまたは少なくてもよい。
【００２８】
アッセイ技術
宿主由来の試料における、本発明のＬＳＧなどの、遺伝子発現のレベルを決定するのに用いてもよいアッセイ技術は、当業者に周知である。こうしたアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。とりわけ、ＥＬＩＳＡは、生物学的流体における遺伝子の発現タンパク質を診断するのに、しばしば好ましい。
【００２９】
商業的供給源から容易に入手可能でない場合、ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、ＬＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、一般的に、ＬＳＧに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射能、蛍光または酵素的試薬、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼに付着している。
【００３０】
ＥＬＩＳＡを実行するため、ＬＳＧに特異的な抗体を、ポリスチレンプレートなど、抗体に結合する固体支持体上でインキュベーションする。その後、非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンとインキュベーションすることにより、プレート上のいかなる未結合のタンパク質結合部位も、被覆される。次に、解析しようとする試料を、プレート中でインキュベーションし、その間、ＬＳＧは、ポリスチレンプレートに付着している特異的抗体に結合する。未結合試料を緩衝液で洗い流す。ＬＳＧに特異的に向けられ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合しているレポーター抗体をプレートに加え、その結果ＬＳＧに連結されているいかなるモノクローナル抗体に対してもレポーター抗体が結合する。その後、未結合レポーター抗体を洗い流す。その後、比色基質を含む、ぺルオキシダーゼ活性のための試薬をプレートに添加する。ＬＳＧ抗体に結合している固定化ペルオキシダーゼは、呈色反応産物を生じる。既定の期間に現れた色の量は、試料に存在するＬＳＧタンパク質の量に比例する。定量的結果は、典型的には、標準曲線に照合することにより、得られる。
【００３１】
競合アッセイを使用してもよく、該アッセイでは、ＬＳＧに特異的な抗体が、固体支持体に付着しており、そして標識ＬＳＧおよび宿主由来の試料を該固体支持体上に流す。すると、固体支持体に付着している、検出される標識の量は、試料におけるＬＳＧの量と相関し得る。
【００３２】
核酸法を用い、肺癌のマーカーとしてＬＳＧ  ｍＲＮＡを検出してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＡＢＡ）を用い、多様な悪性腫瘍の診断およびモニターのため、悪性細胞を検出してもよい。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、何千もの他のｍＲＮＡ種の複合混合物における、特定のｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに用いることが可能な、強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、まず逆転写酵素を使用し、ｍＲＮＡ種を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し；その後ｃＤＮＡを標準的ＰＣＲ反応におけるように、増幅する。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることが可能である。したがって、ｍＲＮＡが該ｍＲＮＡを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲを用い、特定の種類の細胞の存在を同定することが可能である。
【００３３】
固体支持体上にアレー化されているクローンまたはオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション（すなわち、格子化（gridding））を用い、その遺伝子の発現を検出し、そしてかつ該遺伝子の発現レベルを定量化してもよい。本アプローチにおいて、ＬＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、支持体に固定されている。支持体は、限定されるわけではないが、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含む、いかなる適切な種類でもよい。ＬＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部は、支持体に付着し、そしてその後、目的の組織から単離されたＲＮＡでもまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーでもよい解析物とインキュベーションする。支持体結合ＤＮＡおよび解析物の間のハイブリダイゼーションを、限定されるわけではないが、解析物の放射能標識または蛍光標識、あるいはハイブリッドを検出するよう設計された二次分子を含む、いくつかの手段により、検出しそして定量化してもよい。遺伝子発現レベルの定量化は、解析物由来のシグナルの強度を、既知の標準から決定されるものと比較することにより、行ってもよい。標準は、標的遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写し、収量を定量化し、そしてその後その要素を用いて標準曲線を生成することにより、得てもよい。
【００３４】
上記の試験は、多様な患者細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジェネートまたは可溶化組織）、例えば組織生検および検死素材由来の試料に対し、行ってもよい。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液、またはいかなる他の体の分泌物またはその派生物も含まれる。血液には、全血、血漿、血清、またはいかなる血液派生物を含んでもよい。
【００３５】
【実施例】
本発明は、以下の実施例により、さらに説明される。これらの実施例は、特定の態様に言及することにより、もっぱら本発明を例示するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明の特定の側面を例示するが、限定を表現せず、または開示される発明を制限しない。
実施例１：ＬＳＧ
Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州パロアルトから入手可能なＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースの一部として以下の検索ツールを用い、検索を行い、そしてＬＳＧを同定した：
１．ライブラリー比較（１つのライブラリーを他の１つのライブラリーと比較する）は、腫瘍で発現され、そして正常組織に存在しないまたは正常組織で、より低いレベルで発現されるクローンの同定を可能にする。
２．サブセット化（ｓｕｂｓｅｔｔｉｎｇ）は、ライブラリー比較と類似であるが、ライブラリーのプールで発現され、そして第二のライブラリーのプールに存在しないまたは第二のライブラリーのプールで、より低いレベルで発現されるクローンの同定を可能にする。
３．転写画像化は、存在量に基づき、単一のライブラリーまたはライブラリーのプールにおけるすべてのクローンをリストアップする。その後、電子ノーザン（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）を用い、個々のクローンを調べ、その構成要素ＥＳＴの組織供給源を決定してもよい。
４．タンパク質機能：Ｉｎｃｙｔｅは、既知のタンパク質に対する相同性に基づき、タンパク質機能を持つ可能性があるＥＳＴのサブセットを同定してきている。本データベースのいくつかの例には、転写因子およびプロテアーゼが含まれる。その構成要素ＥＳＴが疾患特異性を示すクローンに関し、本データベースを検索することにより、いくつかのリード遺伝子（ｌｅａｄ）を同定した。
【００３６】
電子サブトラクション、転写画像化およびタンパク質機能検索を用い、その構成要素ＥＳＴが、特定の腫瘍由来のライブラリーでのみ、または該ライブラリーで、より頻繁に見られるクローンを同定した。各ＥＳＴが生じた場所を確かめることにより、個々の候補クローンを詳細に調べた。
【００３７】
表１：ＬＳＧ
【００３８】
【表１】
0003688585.tif 000002
【００３９】
別に詳細に記載される場合を除き、当業者に周知でそして日常的な標準的技術を用い、以下の実施例を行った。以下の実施例の日常的な分子生物学的技術は、標準的な実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第二版；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載されるように行ってもよい。
実施例２：ＬＳＧ遺伝子発現の相対定量化
蛍光Ｔａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用した、定量化検出系である。該方法は、５’レポーター色素および下流の３’消光色素で標識された内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａｑｍａｎ）を使用する。ＰＣＲ中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターを放出し、その蛍光をその後、モデル７７００配列検出系（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）のレーザー検出装置により、検出してもよい。
【００４０】
内因性コントロールの増幅を用い、反応に添加された試料ＲＮＡの量を標準化し、そして逆転写酵素（ＲＴ）効率を正規化する。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかをこの内因性コントロールとして用いる。調べたすべての試料の間の相対定量化を計算するため、１つの試料に関する標的ＲＮＡレベルを、比較結果の基本として用いる（基準値（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ））。「基準値」に対し相対的な定量化は、標準曲線法または比較法を用い、得ることが可能である（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２：  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出系）。
【００４１】
正常および癌組織において、各試料に関し、標的遺伝子の組織分布およびレベルを評価した。正常組織、癌組織から、そして癌および対応隣接組織から、総ＲＮＡを抽出した。続いて、逆転写酵素で第一鎖ｃＤＮＡを調製し、そして各標的遺伝子に特異的なプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出装置を用い、結果を解析した。無名数（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｎｕｍｂｅｒ）は、基準値組織に比較した、特定の組織における標的遺伝子の相対発現レベルである。
【００４２】
比較例
比較例として、診断マーカーＰＳＡ（前立腺特異的抗原）およびＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）をコードする遺伝子に関する類似のｍＲＮＡ発現解析を行った。ＰＳＡは、臨床実験室で現在入手可能な、唯一の癌スクリーニングマーカーである。一連の正常組織のプールを解析した際、ＰＳＡは非常に高いレベルで前立腺に発現し、乳房および精巣では発現が非常に低かった。１４の異なる組織由来の５５以上の対応する試料を解析したデータにより、正常組織試料で見られる組織特異性が確認された。前立腺組織の１２の対応する試料に関し、癌および正常隣接組織におけるＰＳＡ発現を比較した。ＰＳＡの相対レベルは、１０の癌試料において、より高かった（８３％）。最近得られた臨床データにより、前立腺癌の病期が後期であることの病期決定マーカーとしてＰＬＡ２を利用することが支持される。我々のｍＲＮＡ発現データは、解析した１２の前立腺対応試料のうち８つでｍＲＮＡの過剰発現を示した（６６％）。ＰＬＡ２の組織特異性は、ＰＳＡに関し記載されるものほど、優れていなかった。前立腺に加え、小腸、肝臓および膵臓でも、高レベルのＰＬＡ２のｍＲＮＡ発現を示した。
【００４３】
配列番号１；クローン番号１２６７５８；遺伝子番号２９９９７（Ｌｎｇ１０１）の測定
表２に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０１（配列番号１）の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００４４】
表２：プール試料におけるＬｎｇ１０１発現の相対レベル
【００４５】
【表２】
0003688585.tif 000003
【００４６】
表２の相対発現レベルは、ＬＳＧ  Ｌｎｇ１０１（配列番号１）のｍＲＮＡ発現が、解析された他の正常組織すべてに比較し、肺（７２７１６）で非常に高いことを示す。相対発現レベル１の、基準値である精巣、心臓（１．５５）、および乳腺（２）だけが、Ｌｎｇ１０１のｍＲＮＡを発現する組織である。これらの結果は、Ｌｎｇ１０１  ｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証した。
【００４７】
表２における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表３−４における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００４８】
表３−４に示される無名数は、４４対の対応する試料におけるＬｎｇ１０１の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００４９】
表３−４：個々の試料におけるＬｎｇ１０１発現の相対レベル
【００５０】
【表３】
0003688585.tif 000004
【００５１】
【表４】
0003688585.tif 000005
【００５２】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、本組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、一連の正常プール試料で得られた組織特異性結果（表２）が確認される。
【００５３】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表３−４は、それぞれの正常隣接組織と比較した６つの肺癌組織（肺試料＃４、８、１０、１４、１６、および１８）におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０１の過剰発現を示す。試験した肺対応試料の３０％に関し、癌組織における過剰発現が見られた（総数２０の肺対応試料）。
【００５４】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の３０％でのｍＲＮＡ過剰発現は、ＬＳＧ  Ｌｎｇ１０１（配列番号１）が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０１（配列番号１）にコードされるアミノ酸配列は、配列番号７に示される。
【００５５】
配列番号３；クローン番号３１０７３１２；遺伝子番号２４２８４２（Ｌｎｇ１０５）の測定
表５に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０５（配列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常腎臓（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００５６】
表５：プール試料におけるＬｎｇ１０５発現の相対レベル
【００５７】
【表５】
0003688585.tif 000006
【００５８】
表５の相対発現レベルは、ＬＳＧ  Ｌｎｇ１０５（配列番号３）のｍＲＮＡ発現が、二番目に高い発現組織（腎臓の５５８）に比較し、正常肺のプール（９２４８）で１６倍以上高いことを示す。解析された他のプール組織試料はすべて、Ｌｎｇ１０５（配列番号３）に関し非常に低いレベルの発現を示した。これらの結果は、ＬＳＧ  Ｌｎｇ１０５（配列番号３）のｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証する。
【００５９】
表５における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表６−８における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００６０】
表６−８に示される無名数は、６１対の対応する試料におけるＬｎｇ１０５（配列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００６１】
表６−８：個々の試料におけるＬｎｇ１０５発現の相対レベル
【００６２】
【表６】
0003688585.tif 000007
【００６３】
【表７】
0003688585.tif 000008
【００６４】
【表８】
0003688585.tif 000009
【００６５】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、肺組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、正常プール試料で得られた組織特異性結果（表５）が確認される。
【００６６】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表６−８は、それぞれの正常隣接組織と比較した１３の肺癌組織（肺試料＃１、３、５、８、９、１０、１１、１２、２０、２１、２２、２４、および２５）におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０５（配列番号３）の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の４６％に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２８の肺対応試料）。
【００６７】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料のほぼ半数でのｍＲＮＡ過剰発現は、Ｌｎｇ１０５（配列番号３）が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０５（配列番号３）によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号８に示される。
【００６８】
配列番号６；クローン番号５８６２７１；遺伝子番号２４２７４５（Ｌｎｇ１０７）の測定
表９に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０７（配列番号６）の相対発現レベルである。すべての値は、正常乳腺（基準値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。
【００６９】
表９：プール試料におけるＬｎｇ１０７発現の相対レベル
【００７０】
【表９】
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【００７１】
表９の相対発現レベルは、ＬＳＧ  Ｌｎｇ１０７（配列番号６）のｍＲＮＡ発現が、基準値乳腺（１）の発現レベルと比較して、正常肺のプール（２３）で２３倍高いことを示す。解析した他の組織はすべて、Ｌｎｇ１０７（配列番号６）に関し陰性だった。これらの結果は、Ｌｎｇ１０７  ｍＲＮＡ発現は、肺に非常に特異的であることを立証する。
【００７２】
表９における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、表１０−１２における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能である。
【００７３】
表１０−１２に示される無名数は、５７対の対応する試料におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０７（配列番号６）の相対発現レベルである。すべての値は、正常前立腺（基準値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。
【００７４】
表１０−１２：個々の試料におけるＬｎｇ１０７発現の相対レベル
【００７５】
【表１０】
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【００７６】
【表１１】
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【００７７】
【表１２】
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【００７８】
０＝陰性
対応試料を解析した際、肺で発現レベルがより高く、本組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、正常プール試料で得られた組織特異性結果（表９）が確認される。
【００７９】
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表１０−１２は、それぞれの正常隣接組織と比較した１５の肺癌組織（肺試料＃１３、４、５、７、８、９、１０、１１、１４、１５、１８、１９、２０、および２２）におけるＬＳＧ  Ｌｎｇ１０７（配列番号６）の過剰発現を示す。試験した肺対応試料の５７％に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２６の肺対応試料）。
【００８０】
要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の半数以上でのｍＲＮＡ過剰発現は、Ｌｎｇ１０７が、肺癌の診断マーカーであることを立証する。Ｌｎｇ１０７によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号９に示される。
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