(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝実質細胞増殖因子を有効成分とする巨核球増加剤。
【請求項２】
前記ヒト肝実質細胞増殖因子は、前記ヒト肝実質細胞増殖因子をコードし得るＤＮＡが組み込まれた宿主細胞を用いて、産生されたものである請求項１に記載の巨核球増加剤。
【請求項３】
前記宿主細胞は、ほ乳動物細胞である請求項２に記載の巨核球増加剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の巨核球増加剤を含有してなる血小板増加剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、巨核球増加剤および血小板増加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞は、ほとんどが骨髄中に存在し、自己複製能を有し、さらに、赤血球、顆粒球、単球、巨核球、Ｂ細胞やＴ細胞等のすべての血球に分化する能力を有している。
血球のうちの顆粒球系と赤芽球系では、その系統特異刺激因子であるエリスロポエチン（erythropoietin；Epo）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor；GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（macrophage colony stimulating factor；M-CSF）の精製により、その産生調整機構も明らかにされ、臨床へも応用されている。
巨核球は、血液幹細胞（CFU-S）から巨核球コロニー形成細胞（CFU-M）の段階を経て成熟し、８〜３２Ｎの多倍数体細胞となった後、細胞質が断裂して血小板を放出する。この血小板は、血液中の血小板数の増減に応じてその産生を調節するトロンボポエチンなどの因子に制御されていると考えられる。巨核球は骨髄中でも数が少なく、分離も困難なため、他の造血系に比べて研究が遅れている。このため、巨核球−血小板造血系を特異的に作用する刺激因子は、未だ同定されていない。
【０００３】
近年、巨核球のコロニー形成法の確立により、インターロイキン３（以下、ＩＬ３という）［Ikebuchi, K. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84, 9035 (1987).]、インターロイキン６（以下、ＩＬ６という）［Ishibashi, T. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86, 5953 (1989).］やインターロイキン１１（以下、ＩＬ１１という）［Larson, D. et al. Blood 76, 464a (1990).］等のサイトカインが、この造血系に作用し、血小板増加作用を示すことが明らかになった。
これらサイトカインをその機能から分類すると、因子単独で巨核球のコロニーを形成する巨核球コロニー形成刺激因子（以下、Ｍｅｇ−ＣＳＦという）と、因子それ自体は巨核球のコロニーを形成させる作用はないが、Ｍｅｇ−ＣＳＦの存在下で巨核球のコロニー数を増やしたり、その成熟を促進させる巨核球コロニー増殖因子（以下、Ｍｅｇ−ＰＯＴという）に大別される。しかし、これらのサイトカインも、医薬品としては開発段階であり、未だ製品化されていない。特に、ＩＬ３は、単独では、in vivo での効果が確かではなく、発熱や頭痛、筋痛等の副作用を示し、一部では、悪性腫瘍の促進も見られるため、大量に投与したり、長期間の使用は難しい。
【０００４】
また、ＩＬ６は、血小板増加活性を有するが、炎症等における２次性血小板増加の原因を担っていると考えられており［Starneva, JE. et al. Exp. Hematol. 20, 47 (1992).］、生理的な血小板増加因子、つまり、トロンボポエチンではない。そのため、発熱、悪寒、骨痛、食欲不振、頭痛、疲労感、急性期蛋白の上昇などの副作用を誘発する。これらの副作用から、長期間ＩＬ６を投与することは困難と思われ、他の造血因子との併用が求められている。現在、血小板が減少した場合は、血小板輸血に頼っているのが現状であるが、血小板輸血不応性等の問題があり、血小板増加効果のある薬物の出現が望まれている。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明者は、従来、ヒト卵巣腫瘍由来細胞ＨＵＯＣＡから血管新生因子の探索・精製を行ってきた［Ishiwata, I. et al. JNCI. 78, 667 (1987).］が、そのアミノ酸の部分一次配列を決定し、さらに、ｃＤＮＡをクローニングした結果、ＨＧＦｃＤＮＡ［Miyazawa, K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989).]（ＨＧＦ：ヒト肝実質細胞増殖因子）の塩基配列と同一であることがわかった。ＨＧＦは肝実質細胞の増殖を刺激する成長因子であり、他に、上皮系細胞の増殖、分化、分散活性［Matsumoto, K. et al. Exp. Cell. Res. 196, 114 (1991).］を示し、腫瘍細胞に対しては傷害活性を有し［Shima, N. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.180,1151(1991).]、器官形成にも関与している［Montesano, R. et al. Cell 67, 901 (1991).］。
【０００６】
最近、ＨＧＦが、ＩＬ３またはGM-CSF（顆粒球−マクロファージコロニー形成因子）の共存下で骨髄細胞からコロニーを形成させることが報告されている［Kmiecik, T.E. et al. Blood 80, 2454 (1992).］が、巨核球増加に関する報告はない。そこで、ＨＧＦの効果を調べた。その結果、ＨＧＦとＩＬ３の共存下で骨髄細胞を無血清培養すると、ＩＬ３単独時に比べ、約３倍の巨核球の増加がみられた。この巨核球は、断裂して血小板になることから、巨核球の増加は、血小板の増加につながる。すなわち、ＨＧＦを有効成分とすれば、血小板の増加剤を得ることができる。本発明は、前記のような新しい知見に基き、巨核球増加剤、更には血液に関する疾患、特に血小板減少および／または血小板機能異常を伴う疾患の治療薬および／または予防、もしくは外科的手術など出血に伴う血小板減少、癌等の化学療法時などや放射線の被曝に伴う血小板減少および／または血小板機能異常に対する治療および予防に有効な巨核球増加剤を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、以下の本発明によって達成される。
（１）  ヒト肝実質細胞増殖因子（以下、ＨＧＦという）を有効成分とする巨核球増加剤。
（２）  前記ヒト肝実質細胞増殖因子は、前記ヒト肝実質細胞増殖因子をコードし得るＤＮＡが組み込まれた宿主細胞を用いて、産生されたものである上記（１）に記載の巨核球増加剤。
（３）  前記宿主細胞は、ほ乳動物細胞である上記（２）に記載の巨核球増加剤。
【０００８】
また、本発明の巨核球増加剤は、補助剤として、インターロイキン１（ＩＬ１）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等のリンフォカインまたはサイトカインのうち少なくとも１種類以上を含んでなることが好ましい。
（４）  上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の巨核球増加剤を含有してなる血小板増加剤。
【０００９】
本発明に用いるＨＧＦは、主に以下の方法により製造される。
ＨＧＦのタンパク質のアミノ酸配列がコードされた塩基配列をベクターに挿入したＤＮＡ組み換えベクターにより製造する。当該方法については出願番号が特願平４−３３７９００号の公開特許公報に詳細に述べている。
【００１０】
次ぎに、組み換え体ＨＧＦの製造法を示す。
ほ乳動物細胞中で発現させて得られた本因子の精製
ＨＧＦ、またはその全部、もしくはその一部、或いは、その改変体、誘導体をコードし得るＤＮＡをほ乳動物細胞発現用プラスミドに組み込む。この時用いるプラスミドは、ｐＧＭ、ｐＫＣＲ、ｐＳＶＬ等が好ましいが、宿主細胞中でＨＧＦを産生すれば、このプラスミドに限定しない。このプラスミドに組み込まれたＨＧＦＤＮＡをほ乳動物細胞にトランスフェクションする。この時の宿主細胞としては、コス（ＣＯＳ）１細胞、コス７細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等のほ乳動物細胞を用いるのが望ましいが、この限りではない。トランスフェクションの方法としては、リポフェクチン（ギブコ社製）等のリポソームを用いる方法や、リン酸カルシウム法［Chen, C. et al. Mol. Cell Biol. 7, 2745 (1987).］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Maes, R. et al. Biochem Biophis Acta 134, 269 (1967).］、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、その他の方法でも良い。
【００１１】
トランスフェクションによって得られた形質転換体を、数日間適切な培地中で培養する。培地は、イーグルＭＥＭ培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）などを例として挙げることができ、必要に応じて添加物を加える。培養は、通常３７℃位で、５％二酸化炭素存在下で行われるが、細胞が生育すればこれに限定はしない。数日間の培養を行った後、培養上清を回収する。得られた培養上清を抗体、またはヘパリン等のアフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製する。この精製により、巨核球増加を抑制する因子等を除去することができる。精製品は、さらに、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）等に対し、透析する事により、適切な塩濃度に調節することができる。
【００１２】
上記において、本発明のＨＧＦを得るための例について説明したが、本発明のＨＧＦの調製法は特に限定されない。
さらに、本発明において補助剤として、インターロイキン１（ＩＬ１）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等のリンフォカインまたはサイトカインのうち少なくとも１種類以上を加えると、相乗的に巨核球が増殖するため好ましく、インターロイキン３（ＩＬ３）が最も好ましい。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）  ＣＯＳ１細胞で発現させたＨＧＦの精製
ＨＧＦｃＤＮＡを発現させるために、ＨＧＦｃＤＮＡをほ乳動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。まず、発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６［Takebe,Y. et al. Mol. Cell. Biol. 8, 466 (1988).］のプロモーター領域の下流にBgl2認識部位を設けた後、Sal1で消化した。このプロモーター領域を含むSal1消化断片とｐＳＧ５（フナコシ社）のf1 oriを含むSal1消化断片を結合させてｐＧＭベクターを構築した。このｐＧＭベクターをBgl2で消化し、ＨＧＦｃＤＮＡのBamH1断片を結合することにより、ｐＧＭ／ＨＧＦを作製した。構築したプラスミドを図１に示す。
【００１４】
このプラスミドをＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした。即ち、直径９０mmのシャーレに、６×１０5個のＣＯＳ１細胞をまき、一晩、３７℃で５％二酸化炭素存在下で培養した。細胞を燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、５μgのｐＧＭ／ＨＧＦを含む４mlのＤＥＡＥ−デキストラン培地（ＤＭＥＭ培地／５０mM トリス pH７.４／０.４ mg/ml ＤＥＡＥ−デキストラン）を加え、３７℃で２.５時間保温することにより、ｐＧＭ/ＨＧＦを細胞内に取り込ませた。トランスフェクション後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を１０ml加え、５％二酸化炭素存在下で３７℃で３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【００１５】
この培養上清中に含まれているＨＧＦをヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。システムは島津社製のLC7A型高速液体クロマトグラフを用い、カラムはＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー）を使用した。まず、カラムを０.５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液で平衡化させた後、培養上清をカラムにかけ、ＨＧＦを吸着させた。０.５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラムを洗浄した後、０.５ml/分の流速で、燐酸緩衝液存在下で、０.５Ｍから２.０Ｍまでの塩濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦを溶出した。溶出時間２０〜２２分の画分をＨＧＦ溶出画分とした。この時の溶出の様子を図２に示す。得られた溶出画分（溶出時間２０〜２２分の画分）を０.０１％の3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate（ＣＨＡＰＳ）を含む燐酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して一晩透析する事により、ＨＧＦの精製品を得た。
【００１６】
（実施例２）  ウエスタンブロットによる精製品の確認
実施例１で得たＨＧＦの精製品を抗ＨＧＦ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。まず実施例１で得た精製品をLaemmliらの方法［Laemmli. et al. Nature 277, 680 (1970)］に従って、８.５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。この時、分子量マーカーとして、ウサギ筋肉由来ホスホリラーゼ（分子量９７,４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（分子量６６,２００ダルトン）、オボアルブミン（分子量４５,０００ダルトン）を用いた。
【００１７】
泳動終了後、ゲルを０.０１Ｍ ３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸／１０％メタノール（以後、ＣＡＰＳ緩衝液と称す）に浸し、緩衝液を置換した。このゲルの上に、予めＣＡＰＳ緩衝液で親水化したポリビニルジフルオリド膜（ＰＶＤＦ膜、アマシャム社製）をかぶせ、１００mV（CV）の電圧を１.５時間かけることにより、ゲル中のタンパク質を膜にブロッティングした。
ブロッティング後、膜を３％ウシ血清アルブミン−ＴＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉｓ／０.１５Ｍ ＮａＣｌ／０.１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に浸し、室温で２時間振盪させた。膜上にブロッティングされたタンパク質と一次抗体を反応させるために、２０mg/ml抗ＨＧＦ抗体（特殊免疫研究所製）／３％ウシ血清アルブミン−ＴＴＢＳに膜を浸し、室温で２時間振盪させた。
【００１８】
一次抗体と反応させた後、膜をＴＴＢＳで３回洗浄し、二次抗体と反応させた。二次抗体はアルカリフォスファターゼ標識した抗マウス抗体（ストラタジーン社製）を３％ウシ血清アルブミン−ＴＴＢＳで５０００倍希釈したものを用いた。
反応終了後、ＴＴＢＳで３回洗浄し、picoblue immunoscreening kit(anti-mouse)（ストラタジーン社製）により発色させた。図３に示すように、抗ＨＧＦ抗体と反応した分子量６６,０００ダルトンのバンドが観察されたことから、実施例１で得た精製品はＨＧＦであることが確認された。
【００１９】
（実施例３）  肝実質細胞に対するＤＮＡ合成促進活性の測定
肝実質細胞（以下、肝細胞と称す）を高橋らの方法［組織培養 12(8), 308-312 (1986).］に従って分離した。この肝細胞をＷＥ基礎培地に５％ウシ胎児血清と１０-8Ｍデキサメタゾンを含む播種用培地に懸濁して５.０×１０4個細胞／０.２mlに調整した。この肝細胞浮遊液をコラーゲンコートした２４穴マルチプレートに播いて培養した。培養開始４時間後と２０時間後にＷＥ基礎培地に交換し、この際に実施例１で得た本発明のＨＧＦを添加して培養を継続した。培養開始４０時間後に新しいＷＥ基礎培地に交換して3Ｈ−チミジンを添加し、２時間のパルスラベリングを行った。
【００２０】
パルスラベリング後に、培地上清を除き、冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、２％過塩素酸塩、９５％冷エタノールの順に各３回洗浄した後、室温で乾燥させた。１％ＳＤＳ／０.１ＮａＯＨを０.８mlずつ添加し、３７℃で１時間以上静置した。細胞溶解後、ピペッティングして各ウエル当たり０.５mlをシンチレーションバイアルにとり、シンチレーター（オプティフロー；パッカード社製）を７ml加えて混合し、シンチレーションカウンターで放射能を測定して、3Ｈ−チミジンの取り込みを調べた。
また比較のため、インシュリン（１００nM）と上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）（２０ng／ml）を使用して、上記と同様にして試験を行った。この結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
（実施例４）  ウシ大動脈血管内皮細胞に対する増殖促進作用の測定
ウシ大動脈血管内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Flow Laboratory社製）に懸濁して、５×１０3細胞個／ウエルの細胞密度で２４穴（ウエル）マルチプレート（コーニング社製）にまいた。翌日、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培地交換すると共に試料を加えて５日間培養して細胞数を計測した。この結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
（実施例５）  ＨＧＦによる巨核球コロニーの形成の促進
げっ歯類の骨髄においては、アセチルコリンエステラーゼ活性が、巨核球系細胞にほとんど特異的に陽性を示す。このエステラーゼの巨核球特異性により、本発明における、巨核球の増加における本因子の効果を測定することができる。
ＢＤＦ１系の雄マウスの大腿骨骨髄細胞を、細胞密度が２×１０6個／mlとなるように０.１％ペントシリンを含むＩＭＤＭ培地で懸濁した。０.１mlの骨髄細胞懸濁液に、０.１mlの１０%ウシ血清アルブミンと０.０２mlの３０mg/mlトランスフェリン、０.１mlの７７μg/mlコレステロール、０.０１mlのＩＭＤＭ培地、０.１mlの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解している表３に示す各濃度のＨＧＦおよびＩＬ３を加えた。この骨髄細胞液を、０.５mlの予め４１℃に保温しておいた０.６％寒天／ＩＭＤＭ培地と混合した後、直径３５mmのシャーレにまいた。
【００２５】
寒天が固まるまで室温に放置し、その後、７日間３７℃にて培養した。培養後、４０℃で寒天を乾燥させ、これに２mlの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）を加え、２０分間室温放置して、寒天中のアセチルコリンエステラーゼを溶出させた。エステラーゼ溶出後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）を取り除き、２mlの染色液（０.５mg/mlヨウ化アセチルコリン、０.１M燐酸緩衝液pH６.０、０.１Ｍクエン酸、３０mM硫酸銅、５mMフェリシアン化カリウム）を加え、遮光して４時間室温放置した。染色後、染色液を取り除き、顕微鏡下で巨核球のコロニー数をカウントした。計数は、褐色に染まった細胞、即ち、アセチルコリンエステラーゼ陽性細胞を巨核球と判定して行った。また、４個以上の細胞の集塊を１コロニーとし、それ以下の細胞数で構成される集塊はカウントしなかった。この結果を表３に示す。ＨＧＦはＩＬ３存在下で巨核球の増加を促進することがわかった。また、表３からも分かるように、ＨＧＦの濃度を１．６ng/ml以上とすると、巨核球が顕著に増大すると言える。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
【発明の効果】
上述した通り、本発明のＨＧＦを有効成分とする巨核球増加剤は、ＩＬ３存在下で血液幹細胞からの巨核球の増加を促進させる。従って、巨核球増加剤として有効に使用でき、また血小板増加剤としても有効に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＧＦｃＤＮＡをほ乳動物細胞で発現させるための発現プラスミドである。
【図２】  コス（ＣＯＳ）１の培養上清をＴＳＫ−Heparinカラムにかけたとき得られる溶出プロフィールである。
【図３】  ＨＧＦを８.５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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