(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の免疫抑制剤アスコマイシンまたはシクロスポリンの濃度を生体外（ex vivo）で測定する方法であって、当該体液がサイトカインＩＬ−２，ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４遺伝子発現を阻害できる程度を当該サイトカインのレポータ遺伝子検定（reporter gene assay）による測定で定量的に検定し、この検定による阻害の程度を上記免疫抑制剤の濃度と関連つける（correlating）ことを特徴とする方法。
【請求項２】
体液が全血である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アスコマイシンがＦＫ５０６であり、シクロスポリンがシクロスポリンＡである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
更に先ず、検定すべき体液から、選択的親和分離（selective affinity separation）により、測定すべき免疫抑制剤以外の選択された免疫抑制剤を除外することを含む、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
体液中の免疫抑制剤アスコマイシンまたはシクロスポリンの濃度を測定するための検定キットであって、サイトカインＩＬ−２，ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４に対するプロモータ遺伝子のコントロール下にレポータ遺伝子でトランスフェクトされたＴ細胞クローンと、測定すべき上記免疫抑制剤の標準試料を含むことを特徴とするキット。
【請求項６】
レポータ遺伝子が細菌性lacZ遺伝子またはPhotinusルシフェナーゼ遺伝子である、全血中の免疫抑制剤アスコマイシンまたはシクロスポリンの濃度を測定するための請求項５記載のキット。
【請求項７】
アスコマイシンがＦＫ５０６であり、シクロスポリンがシクロスポリンＡである、請求項５または６記載のキット。
【請求項８】
更に測定すべき免疫抑制剤以外の選択された免疫抑制剤に親和性を有する化合物を含む、請求項５〜７のいずれか記載のキット。
【請求項９】
体液中の免疫抑制剤アスコマイシンまたはシクロスポリンの濃度を生体外で測定するための、サイトカインＩＬ−２、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４レポータ遺伝子検定の使用。
【請求項１０】
レポータ遺伝子検定が全血中の免疫抑制剤アスコマイシンまたはシクロスポリンの濃度を測定するために使用される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
アスコマイシンがＦＫ５０６であり、シクロスポリンがシクロスポリンＡである、請求項９または１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子発現に影響する免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンＡまたはシクロスポリンＧのようなシクロスポリン類、FK-506のようなアスコマイシン類、ラパマイシンのようなラパマイシン類の体液中の濃度を監視する新規検定方法に関し、レポータ遺伝子検定、例えば、免疫抑制シクロスポリン類およびアスコマイシン類のIL-2レポータ遺伝子検定または免疫抑制ラパマイシン類のc-junレポータ遺伝子検定を用いる。
シクロスポリン類は、構造的に明確で、環状のポリ−Ｎ−メチル化ウンデカペプタイド群からなり、一般に免疫抑制、抗炎症、抗ウイルスおよび／または抗寄生性作用を有し、各々その程度は異なっている。シクロスポリン類で最初に同定されたのは真菌代謝物シクロスポリンＡすなわちCiclosporinであり、その構造は、The Merck Index,11th Edition;Merck & Co.,Inc;Rahway,New Jersey,USA(1989)に番号2759として掲載されている。その後に同定されたシクロスポリン類は、シクロスポリンＢ、Ｃ、ＤおよびＧであり、これらもまたMerck Indexに番号2759で掲載されている。多数の合成類似体も知られており、代表的な例がEP 296123、EP 484281およびGB 2222770に開示されている。シクロスポリンＡおよびその構造上の類似体および誘導体は、本明細書の目的のため「シクロスポリン類」と一般的に言及する。
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)により生産されるマクロライド系の免疫抑制剤であって、種々の用途に製薬上用いられることが知られており、特に臓器移植の拒絶反応および自己免疫疾患の治療および予防に免疫抑制剤として用いられる。ラパマイシンの構造はKesseler,H.,et al.;1993;Helv.Chim.Acta;76:117に記載されている。ラパマイシンの多くの誘導体が合成されており、その中には、例えば、40-O-(2-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン(WO 94/09010)、いくつかのアシルおよびアミノアシル-ラパマイシン類(米国特許第4316885、第4650803および第5151413)、27-デスメチル-ラパマイシン(WO 92/14737)、26-ジヒドロ-ラパマイシン(米国特許第5138051)、いくつかのピラゾール誘導体(米国特許第5164399)、いくつかのアルコキシエステル誘導体(米国特許第5233036)および多数の他の化合物を含む。ラパマイシンおよびその構造上の類似体は、本明細書では「ラパマイシン類」と総称する。
アスコマイシン類は一般に免疫抑制マクロライドの別群であり、そのうちFK-506が最もよく知られている。FK-506はストレプトマイセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsukubaencis)No.9993が生産するマクロライド免疫抑制剤である。その構造はMerck Indexのappendixにitem A5として記載されている。FK-506の基本構造と免疫抑制作用を保持する多数の関連化合物が知られている。これらの化合物は種々の文献、例えばEP 184162、EP 315973、EP 323042、EP 423714、EP 427680、EP 465426、EP 474126、WO 91/13889、WO 91/19495、EP 484936、EP 532088、EP 532089、WO 93/5059などに記載されている。アスコマイシン、FK-506およびその構造上の類似体および誘導体は、本明細書では「アスコマイシン類」と総称する。
シクロスポリン類(特に、シクロスポリンＡおよびＧ)、ラパマイシン類(例えば、ラパマイシンおよび40-O-(2-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン)およびアスコマイシン類(例えば、ＦＫ-506)は、その非常に有用な薬としての作用により、例えば移植拒絶の予防および自己免疫疾患の処置などに広く用いられている。しかし、これらの化合物は高用量では副作用を有し、それ故、その血中濃度を一定の治療範囲に保たねばならない。生物学的利用性および代謝変換率は患者特異的になりがちで、従って用量は患者特異性である。かかる薬剤の血中レベルを監視し、その最適血中レベルに達するための用量に調製し、免疫抑制効果を最大にし、有害副作用を最小にすることが望まれる。
現在までのところ、免疫抑制剤の血中レベルを測定する選択方法は、試験しようとする免疫抑制剤に特異なモノクローナル抗原(MAbs)によるイムノアッセイを用いるか、MAb検定が利用できないか、実用的でないときは、HPLCを用いる。イムノアッセイ法はいくつかの非常に大きい欠点がある。第一に、異なるMAbsでは、免疫抑制剤およびその代謝物に対する親和性が異なったレベルにある。従って、異なったMAbsを用いた医師から得たデータについて意味のある比較をすることは、困難である。第二に、MAbsは、薬理学的に活性な代謝物と不活性な代謝物とを識別できない。例えば、元の薬剤に非常に特異的であるMAbは、薬理学的に活性な代謝物と結合し得ないで、免疫抑制剤の血中レベルを低く示し、過用量の重篤な危険性を導くことになる。他方、特異性が低いMAbは、薬理学的に活性な代謝物と同様に不活性な代謝物とも結合し、免疫抑制剤の血中レベルを高く示す。同じく、HPLCは、免疫抑制代謝物に対する非免疫抑制代謝物レベルについて情報を与えず、更に、比較的時間が掛かり、かつ難しい方法である。
イムノアッセイ法に関する問題は、FK-506の場合に特に深刻である。FK-506の大きい免疫抑制活性が、FK-506自体からでなく、種々の同定されていないFK-506の代謝物からもたらされる。例えば、１３人の臓器移植患者についての研究でFK-506とHPCLで検出可能な未同定免疫抑制代謝物の一つとの比率が血清中で１：１０であったことが報告されている。更に、FK-506の代謝は非常に不規則であり、患者によって大きく変わる。最後に、FK-506の非常に高い効力からして、極めて低い濃度、例えば、低いナノモルやサブ−ナノモル濃度において、この薬剤の正確な測定をなし得ることが必要である。種々のイムノアッセイで見られるFK-506のレベル間の大きい相違、および、より信頼でき、かつ一定した検定を開発する必要が指摘されている。
免疫抑制剤およびその薬理学的に活性な代謝物の血中レベルを正確に検出し得る監視システムを提供することは、明らかに必要であり、まだなされていないことである。本発明は、この必要性を満たすものであり、レポータ遺伝子検定を用いて免疫抑制剤の血中レベルを監視する簡単かつ感度のよい方法を提供する。この検定システムは、用量依存的に遺伝子の発現に影響を及ぼすいかなる薬剤の濃度をも測定するのに用いられるが、アスコマイシン類、特にFK-506の濃度を測定するのに特に感度がよく、そして適切であることが見いだされた。
いくつかのレポータ遺伝子検定は以前から文献に記載されているが、かかる検定を診断検定に使用することは新規でかつ進歩性があり、特にこの検定の阻害程度が免疫抑制剤の濃度と充分近接的に相関し得て、免疫抑制剤のサブナノモル濃度の非常に正確な測定を可能にすることは、以前には示されていなかった。本使用は、体液中の免疫抑制物質の非常に低濃度の測定について長く求められてきた必要性を充足する。
本発明方法で用いられるレポータ遺伝子検定において、監視すべき免疫抑制剤により影響を受けるサイトカインについてのヒトプロモータ遺伝子の転写コントロールの下にレポータ遺伝子を含んでキメラ遺伝子構築体が作られ、そしてこの構築体は適当な細胞系に組み込まれる。この細胞系は、望ましくはヒトT-細胞系またはマクロファージ細胞系、例えばJurkat細胞系であり、目的とする遺伝子生成物の高度な自然生産ついて好ましく選択され、例えばIL-2レポータ遺伝子検定の場合、刺激に対する反応でIL-2が生産されることについてである。このレポータ遺伝子は、容易に観察可能な生物、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのような酵素標識あるいは他の適当な酵素標識を発現するいかなる遺伝子であってもよい。例えば、酵素標識がβ−ガラクトシダーゼのときは、レポータ遺伝子は例えば、細菌性lacＺ遺伝子であり、酵素標識がルシフェラーゼのときは、遺伝子は例えばPhotinus luciferase遺伝子である。他の適当な標識はバイオ発光クラゲにより生産されるグリーン蛍光蛋白の遺伝子であり、例えばChalfie et al.,Science(1994)263:802-805に記載されている。プロモータ遺伝子は、転写が監視すべき薬剤により刺激あるいは抑制されるサイトカインまたは蛋白についてのプロモータ遺伝子である。例えば、監視すべき薬剤がシクロスポリンまたはFK-506のときは、プロモータ遺伝子は哺乳動物IL-2、TGF-β、IFN-γ、またはIL-4のプロモータ遺伝子であり、これは、これらの薬剤が哺乳動物においてこれらのサイトカイン類の遺伝子発現を阻害することが知られているためである。好ましくは、検定する薬剤がシクロスポリンまたはアスコマイシン、例えばシクロスポリンＡまたはＧ、あるいはFK-506のときは、プロモータ遺伝子はヒトIL-2のプロモータである。監視する薬剤がラパマイシンのときは、プロモータ遺伝子は好ましくは哺乳動物proto-oncogene c-junのプロモータである。なぜなら、ラパマイシンは哺乳動物においてc-junの遺伝子発現を阻害することが知られているためである。例えば、Shan et al.,Clinical Immunology and Immunopathology(1993)69:314-317参照。
患者からの血液サンプルを希釈し、上記の方式での遺伝子発現に対する効果を測定し、免疫抑制物質の既知濃度を用いて検定を標準化する。ルシフェラーゼIL-2レポータ遺伝子検定を用いたFK-506、シクロスポリンＡ、およびシクロスポリンＧの標準曲線を図１に示す。FK-506にやや類似の構造を有する強力な免疫抑制剤であるが、IL-2発現に対する作用のないラパマイシンおよび非免疫抑制シクロスポリンであるシクロスポリンＨを対照として含める。0.1%および0.3%に希釈した全血サンプル中のFK-506濃度についての標準曲線は、ルシフェラーゼIL-2レポータ遺伝子検定で測定され、その各々を図２および３に示す。これらの曲線が示すように、遺伝子発現の阻害は低濃度で用量依存的であり、例えばFK-506はこの方式を用いて0.01ng/ml以下の濃度で測定され得る。1%および0.3%に希釈した全血サンプル中のシクロスポリンＡ(ＣｓＡ)濃度についての標準曲線は、ルシフェラーゼIL-2レポータ遺伝子検定で測定され、それを図４に示す。FK-506の場合と同様に、シクロスポリンＡによるIL-2遺伝子発現は低濃度で用量依存的であり、サブナノモル程度でシクロスポリンＡ濃度も測定し得る。
さらに本発明を具体化すると、患者が複数の免疫抑制剤を服用しているとき、レポータ遺伝子検定法は特定の免疫抑制剤に目標を絞り得る。すなわち、他の免疫抑制剤を、特異的親和性分離技法、例えば特異的な抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナル)またはかかる免疫抑制剤に対する特異的レセプター(例えば、シクロスポリンについてシクロフィリン、FK-506またはラパマイシンについてFKBP-12またはコルチコステロイドについて特異的レセプター)を用いて除外または抑制し、次いで残っている免疫抑制剤を測定する。特に、患者にコルチコステロイドとFK-506またはシクロスポリンＡのようなIL-2遺伝子抑制の免疫抑制剤との両者を投与したときは、コルチコステロイドを除外することがまず望まれる。例えば、臓器移植を受けたような患者がFK-506またはシクロスポリンＡそして加えるにコルチコイド、例えばプレドニソンを服用しているとき、そのFK-506またはシクロスポリンのレベルは次の様にして測定される。まず、患者から血液を採り、血液をプレドニソンに対するモノクローナル抗体でコートしたビーズと接触せしめ、ビーズから血液を分離し、血液の存在におけるIL-2レポータ遺伝子検定でのIL-2遺伝子発現の抑制を測定し、その抑制レベルを既知濃度のFK-506またはシクロスポリンの存在において観測されるレベルと比較する。シクロスポリン類またはアスコマイシン類と併用されるかもしれない他の薬剤、例えばアザチオプリン、ブレキナール、デオキシスペルグアリンおよびラパマイシンは、治療濃度、例えば低ナノモルではIL-2レポータ遺伝子検定に影響を与えないので、除去する必要はない。
FK-506およびラパマイシンを含むアスコマイシン類およびラパマイシン類はマクロフィリン類に細胞中で結合し(例えば、FK-結合蛋白、すなわちFKBP-12)、シクロスポリン類はシクロフィリン類に結合する。これらの化合物は、非免疫抑制性イムノフィリン結合競合物の過剰で処理するか、またはイムノフィリンを変性、例えば熱処理することにより、各々のイムノフィリンから遊離され得る。免疫抑制シクロスポリンの結合競合物として用いるのに適した非免疫抑制シクロフィリン結合シクロスポリン類の例は、EPA 484 281に記載されている。免疫抑制マクロライド類、例えばラパマイシン類およびアスコマイシン類の結合競合物として用いるのに適した非免疫抑制マクロフィリン結合マクロライド類の例は、WO 94/18207に記載されている。
本出願の優先日後に、本発明のある観点は発明者の一人によりその博士論文に公表された。Wenner,P.(1994)の学位論文
0003688294.tif 000002
を参照。より詳細な背景および試験システムを知りたいときは、この論文を参照することが望まれる。
要約すれば、本発明は次のことを提供する。
全血などの体液中の免疫抑制剤の濃度を生体外で測定する方法であって、レポータ遺伝子検定において測定して、遺伝子発現の阻害または促進をなし得る体液の程度を定量的に検定する段階を含む方法である。
例えば、全血などの体液中の免疫抑制アスコマイシンまたはシクロスポリン(例えば、FK-506またはシクロスポリンＡ)の濃度を測定する方法であって、IL-2レポータ遺伝子検定おいて測定して、IL-2遺伝子発現の阻害または促進をなし得る体液の程度を定量的に検定する段階を含む方法であり、または、全血などの体液中の免疫抑制ラパマイシン(例えば、ラパマイシンまたは40-O-アルキル化ラパマイシン)の濃度を測定する方法であって、c-junレポータ遺伝子検定で測定して、c-junの遺伝子発現の阻害または促進をなし得る体液の程度を定量的に検定する段階を含む方法である。
上記方法は、任意に更に、選択的親和分離を用いて、検定すべき体液から選択した免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイドまたは第二の免疫抑制剤）をまず除去する工程および／または
任意に更に、例えば体液を過剰の非免疫抑制性イムノフィリン結合性化合物で処理するか、または例えば体温を実質的に越えた温度、例えば４５−９５℃、好ましくは５０−６０℃で体液のインキュベーションにより、イムノフィリン結合性免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アスコマイシン、ラパマイシン）をイムノフィリンとの複合体（例えば、アスコマイシンまたはラパマイシンの場合、イムノフィリンはマクロフィリン（例えばＦＫＢＰ−１２）であり、シクロスポリンの場合、イムノフィリンはシクロフィリンである）からまず遊離させる工程および／または
任意に更に、体液を、例えば蒸留水で、例えば５％以下の濃度、好ましくは０．１−１％の濃度に希釈する工程
を含んでもよい。
本発明は、これらの方法のいずれかを実施するのに適した検定キットをも提供する。例えば、
適当な細胞系、例えばその刺激が測定されるべき免疫抑制剤(例えば、T-細胞クローン、例えば、Jurkatクローン)により抑制され得、プロモータ遺伝子(例えば、サイトカインまたは蛋白のプロモータで、その発現が測定されるべき免疫抑制剤により抑制される)のコントロールの下にレポータ遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのような標識遺伝子)でトランスフェクトされる細胞系を含む体液中、例えば全血中の免疫抑制剤の濃度を測定するための検定キット、例えば、プロモータ遺伝子がヒトIL-2のプロモータ遺伝子であり、レポータ遺伝子が細菌性lacZ遺伝子またはPhotinusルシフェラーゼ遺伝子である、免疫抑制アスコマイシンまたはシクロスポリン(例えば、FK-506またはシクロスポリンＡ)のレベルを測定するための検定キット、
該キットは選択的に更に、測定されるべき免疫抑制剤の標準サンプル、例えばキットを標準化するのに充分な量に前もって定めた濃度のサンプルを含む。
該キットは選択的に更に、選択された免疫抑制剤(例えば、測定されるべき免疫抑制剤と相違する免疫抑制剤、特にコルチコステロイド)に親和性を有する化合物を含む、
該キットは選択的に更に、非免疫抑制性イムノフィリン結合シクロスポリンまたはマクロライドを含む。
第三の具体化において、本発明は、定量的測定手段としてレポータ遺伝子検定の新しい第二用途を提供する、例えば、
生体外で体液中の免疫抑制剤のレベルを測定するためのレポータ遺伝子検定の使用、例えば、
全血中の免疫抑制性アスコマイシンまたはシクロスポリン(例えば、FK-506またはシクロスポリンＡ)を測定するためのレポータ遺伝子検定の使用。
実施例１−β-ガラクトシダーゼIL-2レポータ遺伝子検定
ａ．T-細胞クローンの製造
ヒトIL-2プロモータの-583乃至+40位からのRsaI制限断片を、いずれかの端に適当なHindIII制限を有するDNAプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法により増幅する。増幅断片をゲル精製し、HindIIIで消化し、次いで、lacZ遺伝子(placZH,L.Herzenberg,Stanford大学提供)を含むプラスミドにおいて適当な5'制限位からlacZ翻訳の出発位まで右方向にクローン化すると、プラスミドpIL-2-lacZが得られる。Norton,et al,Molecular and Cellular Biology(1985)5:281-290に記載されているものと類似の方法。
真核細胞でのβ-ガラクトシダーゼ発現(E.coli lacZ遺伝子によりコード)について、例えば、van Doren,et al.,J.Virol.50:606(1984)に記載のように、翻訳の出発領域はモロニイネズミ白血病ウイルスエンベロープ遺伝子から誘導され、ポリアデニル酸配列はSV-40のsmall tイントロンから誘導される。増幅IL-2プロモータ断片のDNA配列および融合点はクローニング後の配列化で確認される。PIL-2-lacZのCsCl-精製DNAを、ハイグロマイシン耐性遺伝子の3'を直ちに切断するKpnIでトランスフェクションのため線状にする。107Jurkat細胞(例えば、Jurkat K16,clone 41-19)を、1ml serum-free RMPI mediumにおいて、線状化されたpIL-2-lacZの20μgで、BioRad apparatusを250Vおよび960μFで用い、例えば、Mattila,et al.,EMBO J.9:4425(1990)に記載のように、エレクトロポレイトする。
DNA操作は、例えば、Sambrook,et al.(eds.)Molecular Cloning - A Lad Manual,2nd ed.,(1989,Cold Spring Harbor Lad Press)およびAusubel,et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology(1987,Wiley-Interscience,New York)に記載の標準的方法を用いて行う。
ｂ．IL-2転写抑制剤の生体外全血検定
段階a）で作られた細胞が、IL-2転写を抑制する化合物の体液中の存在を検定するために使用され得る。これらのT−細胞のマイトジェン刺激は内在性IL-2とβ-ガラクトシダーゼとの平行発現をもたらす。この酵素の発現は、その基質、4-メチルウムベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ(MUG、商業的に、例えばSigma社から得られる)の開裂で生じる蛍光により測定される。免疫抑制シクロスポリン類およびアスコマイシン類のような、IL-2遺伝子発現の用量依存抑制を示す免疫抑制性化合物の存在および量は、トランスフェクト細胞によるβ-ガラクトシダーゼの発現阻害として測定され得る。
全血中の免疫抑制剤の濃度を測定するために、患者からのEDTA全血サンプルを直ちに試験するか、または直ちに凍結して-20℃で保存する。採取直後または溶融直後の血液の部分検体200μlを、56℃で30分間、熱で不活性化し、Medium C(すなわち、アルブミン、トランスフェリンおよびレシチンを含むIsocove's Modified Dulbecos Medium(IMDM-ATL)、例えば、Schreier,et al.,Immunological Methods(1981,Academic Press)vol.2に記載)で３％に希釈する。試験は96-穴プレート(Costar)において全量200μl/穴で行う。希釈血20μlを各穴に加えて、最終濃度を0.3%とする。この濃度で、血液成分の小さい阻害作用のみがIL-2レポータ遺伝子検定でみられる。各サンプルは4回測定する。穴ごと5×104細胞(上記のように形質変換したJurkat pIL-2-lacZ)をマイトジェン フィトヘマグルチニン(PHA、1μg/ml)およびフォルバル12-ミリステイト13-アセテイト(PMA、20ng/ml)で刺激する。16時間培養後、プレートを10分間遠心分離し(RCF=700)、上澄液を除き、そして反応緩衝液(100mM NaPO4、pH 9.0;10mM KCl;0.1% Triton X-100;0.5mM MUG)180μlを各穴に加える。プレートを10分間振り、暗所で22℃で2時間インキュベートし、CytoFluor 2300蛍光測定器(Millipore)で蛍光を測定する(excitation-filter=360nm,emission-filter=460nm)。
実施例２−ルシフェラーゼIL-2レポータ遺伝子検定
ａ．T-細胞クローンの製造
このIL-2レポータ遺伝子検定(IL-2 RGA)も上記の実施例に記載したように、キメラ遺伝子構築を利用し、これはヒト白血病T-細胞系(例えば、Jurkat K16、クローン41-19)に安定的に結合される。この構築において、アメリカホタルPhotinus pyralis(Promega,Madison,Wisconson,USAからのpGL2-Basic vector E1614に由来)を、オネマイシン耐性カートリッジを含むベクター(Stratagene,LaJolla,Ca.,USAからのpMClNeo Poly A vector 213201に由来)中でヒトIL-2プロモータの制御のもとに置き、上記の実施例１に記載のように、Jurkat細胞に導入する。(トランスフェクション ベクターの図解を図５に示す)。形質転換された細胞のマイトジェン刺激は、IL-2のみでなく、ルシフェラーゼの内在性発現をもたらし、その酵素活性は、光を生成するD-ルシフェリン(D-luciferin sodium,ChemieBrunshwig AG製)の酸化的デカルボキシル化を触媒する活性により測定される。この発光は、形質転換細胞におけるマイトジェン刺激ルシフェラーゼ発現に直接的に相関し、発光スキャン リーダ(Labsystem,Helsinki,Finland)で定量化される。阻害は、試験液を刺激細胞に加えなかった対照(100%)に比較して、発現の％で示す。この試験は、免疫抑制剤の既知濃度を用いて標準化して、免疫抑制濃度とIL-2の転写阻害度の相関グラフを得る。このルシフェラーゼIL-2レポータ遺伝子検定は、約2ng/mlのシクロスポリンＡのIC50および0.1ng/ml以下のFK-506のIC50で、IL-2の転写に影響する免疫抑制性物質に非常に鋭敏である。
ｂ．IL-2転写抑制の生体外での全血検定
全血サンプルを、試験するまでは-20℃に保つ。解かした後ただちに、100μlの部分検体を30分間56℃で熱により不活性化し、次いでMedium Cで3%または10%に希釈する。試験は、全量200μl/穴の96-穴プレートで行う。希釈血20μlを各穴に加え、最終濃度を0.3%または1%にする。全量200μlの5×104細胞/穴を37℃で16時間マイトジェン-刺激(PMA 40ng/ml+イオノマイシン2μM)を行う(5%CO2)。刺激後、プレートを10分間遠心分離し(700rcf)、上澄み液を取り除く。リシス緩衝液(25mM トリス-ホスフェイト(pH7.8)、2mM DTT、2mM 1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N-テトラ酢酸、10%(v/v)グリセロールおよび1%(v/v)Triton X-100)20μlを各穴に加え、プレートを10分間振る。プレートを発光スキャン リーダにかけると、ルシフェラーゼ検定反応緩衝液50μlが自動的に加えられて、最終濃度が20mM Tricine、1.07mM(MgCO3)4-Mg(OH)2-5H2O、2.67mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3 DTT、270μM Coenzyme A、470μMルシフェリン、530μM ATP、pH 7.8になり、発光が測定される。すべてのサンプルについて測定を４回行う。
実施例３−コルチコステロイドの除去
プラスチックビーズをプレドニソンに対するモノクローナル抗体(例えば、免疫原性抗原としてのプレドニソンまたは他の所望するコルチコステロイドをFreund'adjuvantと共に注入して用い、Kohler,et al.,Nature(1975)256:49-51に記載の方法により製造)でコートする。FK-506およびプレドニソンを服用する患者からの血液サンプルを上記のようにMedium Cに希釈し、当該ビーズを含むコラムに通す。コルチコステロイドを除去した後、血液を実施例１または２に記載のように残留IL-2転写阻害剤の存在で検定する。これはFK-506とその免疫抑制性代謝物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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