(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液内に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質としてのリンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ（補酵素Ａのスクシニル誘導体）、コハク酸、フマル酸、アスパラギン酸、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、アセチルＣｏＡ（補酵素Ａのアセチル誘導体）およびグルタミン酸からなる群から選択される基質が添加されていることを特徴とするヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項２】
さらに有機リン酸化合物を含有する請求項１に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項３】
前記脂質に加えて、さらに、トコフェロール類縁体を有する請求項１又は２に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項４】
さらに、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの酵素が添加されている請求項１〜３のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項５】
（ａ）赤血球を溶血して赤血球膜成分を除去し３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液を得て、赤血球膜成分を除去し、ストローマのないヘモグロビン溶液を濃縮し、
（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質としてのリンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ（補酵素Ａのスクシニル誘導体）、コハク酸、フマル酸、アスパラギン酸、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、アセチルＣｏＡ（補酵素Ａのアセチル誘導体）およびグルタミン酸からなる群から選択される酵素反応基質を混和させ、
（ｃ）ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下でリポソーム化することを特徴とするヘモグロビン含有リポソームの製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生体内に投与するヘモグロビン含有リポソームに関する。本発明は、更に詳しくは生体内に投与したときのヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制したヘモグロビン含有リポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液の代用と成り得る薬剤として、ゼラチン分解産物の溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）溶液等の血漿増量剤が使用されている。しかし、これらの代用血液は大量出血等の緊急時に血管内の血漿量を補充し、循環動態を維持する目的で開発された製剤で、天然赤血球の酸素運搬能を代替えする事はできない。近年、こうした血漿増量剤とは異なり、天然赤血球類似の酸素運搬能を保持した代用血液として、人工酸素運搬体の研究開発が進められている。
当初の開発段階にあっては、フッ化炭素エマルジョン（perfluorochemical:PFC/ [通称：fluorocarbon])の酸素溶解能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討されたが、十分な酸素運搬量の不足や体内蓄積性などの問題点が危惧されている。
【０００３】
一方、酸素運搬体として天然赤血球由来ヘモグロビンを利用する試みも行われているが遊離ヘモグロビンの生体内半減期は極端に短く（４時間以内）、末梢への酸素運搬能も低く、腎毒性等の問題点が指摘されており、実用化は難しい。最近、こうした遊離ヘモグロビン溶液の持つ問題点を改善した修飾ヘモグロビン（安定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビンetc.）やリポソーム化ヘモグロビンの開発の検討が中心と成りつつある。
その例として、ヘモグロビンを含有するリポソームとして薄膜法により製造されたものがミラー（Miller）らによって報告されている（米国特許第4,133,874 号）。この方法によればヘモグロビン含有リポソームは、リポソーム形成脂質をクロロホルム等の適当な有機溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜をつくり、この薄膜に溶血ヘモグロビン水溶液を加え、激しく攪拌して多重層リポソームを形成し、次にこれを超音波処理することによって得られる。この方法によれば、ヘモグロビンが酸素に触れる時間が少ないのでヘモグロビンの変性が比較的少ない利点がある。
【０００４】
しかしながら、これらヘモグロビンを原料とした人工赤血球の酸素運搬能はヘモグロビンと酸素分子との可逆的結合により生じ、ヘム鉄（プロトヘム）の原子価が２価の状態（Ｆｅ2+）でのみ保たれる機能である。ヘモグロビンはその可逆的酸素化（oxigenation)の過程で徐々に酸化（oxidation)され酸素結合能を持たない３価のメトヘモグロビン（Ｆｅ3+）に変化する。このため正常赤血球は、これらの酸化作用に対し、ヘモグロビンが酸化されるのを抑制する機構を持っている。しかし、こうした天然赤血球の酸化抑制機構は、人工酸素運搬体として調製されたヘモグロビン溶液においては認められず、ヘモグロビン酸化物の占める割合は経時的に増加する。このため、天然ヘモグロビンならびにその誘導体を医薬品や試薬として使用する場合には、酸化防止剤あるいは還元剤を用いる必要があった。亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一鉄、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム等の物質が知られているが、生体に対して有害となる。また、還元型グルタチオン、アスコルビン酸、トコフェロール類、糖類、アミノ酸類なども一般に用いられる。しかしながら、これらの添加物の抑制効果は低く、特に体内投与後の経時的な酸化抑制効果は不十分であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題点を鑑み以下の課題の少なくとも１つを解決しようとするものである。すなわち、ヘモグロビンの経時の酸化が抑制され、特に、体内に投与した時のヘモグロビンの酸化が抑制されたヘモグロビン含有リポソームを提供するものである。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
この上記課題は下記の構成からなる、本発明のヘモグロビン含有リポソームにより解決される。
（１）脂質からなるリポソーム内に天然赤血球由来および／または酸化還元系の酵素活性を保持したヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液内に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質が添加されていることを特徴とするヘモグロビン含有リポソーム。
ここで、酵素反応基質の添加量が、ヘモグロビン１モルに対し、０．１〜２５モルであるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。
（２）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質が有機酸またはその誘導体であることを特徴とする（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【０００７】
（３）上記有機酸またはその誘導体が、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ（補酵素Ａのスクシニル誘導体）、コハク酸、フマル酸、アスパラギン酸、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、アセチルＣｏＡ（補酵素Ａのアセチル誘導体）、グルタミン酸である（１）及び（２）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
（４）上記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質が嫌気的解糖系糖代謝中間体であることを特徴とする（１）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
（５）上記嫌気的解糖系糖代謝中間体が、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤＰ−グルコース、Ｌ−グロネート、キシリトール、ソルビトール、α−グリセロール−リン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ラクテートである（４）記載のヘモグロビン含有リポソーム。
（６）上記ヘモグロビン溶液内に、さらに有機リン酸化合物が含有されている（１）乃至（５）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。ここで有機リン酸化合物の添加量が、ヘモグロビン１モルに対し、０．０５〜４モルであるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。さらに、有機リン酸化合物が、イノシトールヘキサホスフェート、テトラポリフォスフェート、ピリドキサル５’フォスフェート、又はＡＴＰであるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。
（７）上記脂質中にトコフェロール類またはその誘導体が含有されている（１）乃至（６）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。ここで、トコフェロール類またはその誘導体の添加量が、リポソーム膜の総脂質に対して０．５〜４．５モル％であるヘモグロビン含有リポソームが好ましい。
【０００８】
（８）前記ヘモグロビン溶液内（１）〜（７）のそれぞれに、さらに還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）よりなる群から選ばれる少なくとも１つが添加されている（１）〜（７）のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソーム。
（９）洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下でリポソーム化することを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソームの製法。
ここで、ヘモグロビン溶液中の酵素失活がない緩和な条件が、４０℃以下で、５０〜１８００kg/cm2の圧で細隙から１〜数回吐出させることであるヘモグロビン含有リポソームの製法が好ましい。
【０００９】
本発明はヘモグロビン含有リポソームの酸化変性に対する問題を解決するために、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生じる酵素反応基質を添加し、経時的に生成するヘモグロビン酸化物を還元することにより、ヘモグロビンの経時酸化に伴う機能低下を防止するものである。
【００１０】
本発明に用いるＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質は特に制限されず、生体内に存在する酵素の単数または複数の組み合わせによる酵素反応の結果、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じるものであればよいが、有機酸またはその誘導体が好ましく、特に単数の酵素反応によってＮＡＤＨが生じることからリンゴ酸が好ましいが、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、アルパラギン酸、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、エタノールピルビン酸リン酸、アセチルＣｏＡ、グルタミン酸等のクエン酸回路（トリカルボン酸回路〔ＴＣＡサイクル〕、クレブス回路ともいう）によってリンゴ酸が生じる有機酸も使用できる。また、他にも嫌気的解糖系糖代謝中間体である、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−６−リン酸、ＵＤＰ−グルコース、Ｌ−グロネート、キシリトール、ソルビトール、α−グリセロール−リン酸、グリセラルデハイド−３−リン酸、ラクテートなども使用でき、つまり生体内に存在する酵素の単数または複数を組み合わせた酵素反応の際にＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを生じるものであれば使用できる。また、場合によっては複数の基質を組み合わせて使用してもよい。
本発明において、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質の量（重量モル比）はヘモグロビンを１モルとした場合、０．１〜２５モル、好ましくは１〜２０モル、より好ましくは４〜１２モルである。０．１より少ないとヘモグロビンのメト化防止効果が少なく、また２５より多いと溶液の流動性の問題でリポソーム化効率が低下するのであまり好ましくはない。
【００１１】
本発明に用いるリポソームの脂質としてはリポソームが形成できるものであれば特に制限はなく、天然のもの及び合成のものが利用できる。その例としては、レシチン（＝ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン、等、およびこれらを常法に従って水素添加したものがあげられ、これらを組み合わせて用いることもできる。
本発明に使用するヘモグロビンは、赤血球を常法によって溶血し膜除去した分画分子量１万の膜を使用した限外濾過により３０％（ｗ／ｖ）以上に濃縮したものが使用される。ヘモグロビンは水溶液の形態で取り込まれ、その濃度は３０〜６０％（ｗ／ｖ）、特には４０〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましい。この濃度とするのは、末梢組織への酸素運搬量は、リポソーム内のヘモグロビン量に依存して増大するためリポソーム化が可能な範囲内で最も高濃度であることが好ましいからである。
本発明において、上記のヘモグロビン溶液内にさらに有機リン酸化合物が含まれていてもよい。これは、イノシトールヘキサホスフェート、テトラポリリン酸、ピリドキサル−５’−リン酸、ＡＴＰなどのリン化合物を末梢における酸素放出量を調整するため、好ましくはヘモグロビン１モルに対し、０．５モル〜１．５モル加えても良い。この量は使用するリン化合物により、若干、効果に差がある。
本発明において使用する赤血球は、本発明のヘモグロビン含有リポソームをヒトに使用する場合、ヒト由来のものであれば特に問題はなく、また、新鮮なもの程良いが、採血後４℃以下で５０日以上保存したものでも充分に使用できる。
本発明において、上述の酵素反応基質のみならず、これらに加えて還元型ＮＡＤＨ、酸化型ＮＡＤ、還元型ＮＡＤＰＨ、酸化型ＮＡＤＰ等の酵素をヘモグロビン溶液に加えてもよい。その量はヘモグロビン１モルに対して０．１モル〜２５モルとするのが好ましい。
【００１２】
本発明において、リポソームにはその酸化を防止するためにトコフェロール同族体すなわちビタミンＥを添加してもよい。トコフェロールには、α，β，γ，δの４個の異性体が存在するが、本発明においてはいずれの異性体も使用することができる。また、酢酸トコフェロール・トコフェロールリン酸等の公知のトコフェロール誘導体も同様の目的で使用できる。トコフェロールの添加量はリポソーム膜の総脂質に対して０．５〜４．５モル％、好ましくは１．０〜２．０モル％である。
本発明においては、リポソーム膜の構成成分として所望によりステロール類や脂肪酸等の電荷付与物質を添加して、膜構造の強化や体内消失時間の調節を図ることができる。
【００１３】
本発明のヘモグロビン含有リポソームは、洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃縮ヘモグロビン溶液に、リンゴ酸を添加して混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下で、リポソーム化することによって得ることができる。なお、前記酵素失活が無い緩和な条件下とは、高圧吐出処理が好ましく、５０〜１８００kg/cm2、好ましくは８０〜１２００kg/cm2の圧で細隙から１回〜数回吐出させることである。また、処理温度は４０℃以下に保持する。具体的な例としては、高圧吐出型乳化機に、マイクロフルイダイザー  １１０Ｙ[Microfluidizer 110Y] （マイクロフルイダイザー社[Microfluidics Co.] ）を用いる場合には４８０〜１４５０kg/cm2、パール細胞破砕器（パール社[Parr Co.]）を用いる場合には８０〜２００kg/cm2であり、いずれも４０℃以下、好ましくは４℃〜氷冷下で実施する。
【００１４】
天然赤血球中のヘモグロビンは、経時酸化によりメトヘモグロビンとなるが、図１に示す赤血球酵素の作用により元のヘモグロビンへ還元され、可逆的にヘモグロビン−メトヘモグロビンの反応が起こっている。しかしながら、本発明のようにリポソームに含有させるために天然赤血球外に取り出されたヘモグロビンはこのようなメトヘモグロビン還元機構が働かなくなり、一度メト化したヘモグロビンは再びヘモグロビンに戻ることができず、酸素運搬機能を失ってしまう。これは、リポソーム化の段階でヘモグロビンにかかる物理的エネルギーあるいは熱によって、酵素が失活してしまうのが原因と考えられる。本発明者は、リポソーム化処理条件を検討し、ヘモグロビン溶液中の酵素活性が維持できる５０〜１６００kg/cm2、好ましくは８０〜１２００kg/cm2の圧で細隙から１回〜数回吐出させるなどの穏やかな製造条件を設定してヘモグロビン含有リポソームを製造した。しかしながら、これらのヘモグロビン含有リポソームでもなお、体内投与後の不可逆的なヘモグロビン経時酸化は進行した。
なお、このような酵素失活がない緩和な条件下でリポソーム化すると、ヘモグロビン中のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素の活性残存率が、処理前の７０％以上、好ましくは９０％以上残存する。また、リンゴ酸脱水素酵素活性の残存率は、処理前の５０％以上、好ましくは７０％以上である。
【００１５】
しかし本発明者らはさらに鋭意研究を行った結果、上記のような穏やかな条件で製造するとき、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生じる酵素反応基質をヘモグロビン溶液中に共存させることによって、体内投与後のヘモグロビンの経時酸化を顕著に抑制できることを発見した。
そのメカニズムは次のように考えられ、リンゴ酸を例にして説明する。つまり、上記のような穏やかな条件でリポソーム化を行えば、ヘモグロビン溶液中の酵素は失活することはないが、天然赤血球から膜成分を除去し、ヘモグロビンを取り出す過程、または精製、濃縮の過程で分子量１万以下の酵素基質や補酵素類等の酵素反応に必要な物質も失われてしまい、結果的にメトヘモグロビン還元酵素反応が消失してしまう。そこで、リンゴ酸を添加すると、リンゴ酸がメトヘモグロビン還元反応に必要なＮＡＤＨ再生系の基質となり、つまりリンゴ酸デヒドロゲナーゼによりオキサロ酢酸になると同時にＮＡＤＨを再生し図２に示したような天然赤血球と同じメトヘモグロビン還元反応がおこり、ヘモグロビンの経時酸化の抑制に寄与しているものと推定される。
【００１６】
成熟（天然）赤血球は核もミトコンドリア、リボソームなどの細胞内小器官も持たず、蛋白質や脂質合成能はない。また、ミトコンドリアを有していないためＴＣＡサイクル（クエン酸サイクル）を持たず、その形態と機能を維持するために必要なエネルギーであるＡＴＰ（adenosine triphosphate）産生は主としてエムデン−マイヤーホフ経路（ＥＭＰ、嫌気的解糖系）に依存している。生理的条件下で、グルコースはヘキソキナーゼによりリン酸化を受け、グルコース−６−リン酸となり正常状態では９０％がエムデン−マイヤーホフ経路により代謝される。残りの５〜１０％がヘキソース−１−リン酸回路(HMS or HMP)により代謝されている。
しかし、後に実施例で詳述するように、本発明者等の調製した赤血球膜成分を除去したヘモグロビン溶液には、本来含まれていないとされているＴＣＡサイクルの一部の酵素が活性を保持した状態で残存していることを確認した。
本発明者等は、従来、赤血球膜成分を除去したヘモグロビン溶液中の不純物としてとらえられていた天然赤血球由来残存酵素活性を有効に利用し、必要な基質ならびに補酵素類を補充することにより天然赤血球類似の酵素的メトヘモグロビン還元能を付与したリポソーム型人工酸素運搬体である本発明のヘモグロビン含有リポソームを調製した。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明の実施例に基づいて具体的に説明する。
なお、特に明示しない場合、調製の各工程は冷蔵状態（４℃）に維持し、無菌的環境下で実施した。また、試薬・器具類は減菌処理を行い、重金属イオン・無機イオン等の残留の無い無菌超純水（１５meg Ω℃・cm at ２５℃以上／〔パイロジェンフリー〕）を調製に使用した。
【００１８】
（実施例１）
▲１▼赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）の調製
濃厚赤血球製剤１５Ｌ．（２００ｍｌ×７５バック）を、連続遠心機を用いて生理食塩水で洗浄し、混在する血小板・白血球などの血漿成分を除去した粗洗浄赤血球を得た。さらに、孔径０．４５μｍのフィルターを用いて生理食塩水洗浄を行い、この洗浄赤血球５Ｌ．に対して低張リン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）を１０Ｌ．添加して溶血させた。孔径０．４５μｍの血漿分離器および孔径０．１μｍのフィルターを用いて赤血球膜成分ならびに無菌濾過を行い、ヘモグロビン濃度８％（ｗ／ｖ）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ溶液）、約１２Ｌ．を回収した。得られた溶液はホローファイバー型ダイアライザー（テルモ（株），ＣＬ−Ｃ８Ｎ）を用いて１０ｍＭ  ２−〔４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル）〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ＝７．４）に対して透析を行った後、限界濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０％（ｗ／ｖ）の濃縮ＳＦＨ溶液、約１．８Ｌ．を調製した。
▲２▼濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加
上述の工程を経て調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ中のヘモグロビンモル数に対するモル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium salt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])およびヘモグロビンに対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム（inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/ シグマ社[SIGMA Chem. Co.])を４ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（６０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解し、この１００ｍｌの濃縮ＳＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。
【００１９】
▲３▼濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化
水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉末（日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:0.28(モル比)]) １８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上記実施例１▲２▼で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Microfluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐｓｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を行った。
▲４▼ヘモグロビン含有リポソームの精製
実施例１▲３▼の処理後に得られた生成物は、等量の生理食塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物として回収された。リポソーム化されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はテカンテーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくなるまで繰り返し行った後、孔径０．４５μｍのテュラポア（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター（ミリポア社 [Millipore Ltd.,Minitan system]血漿分離器）を用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホローファイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
【００２０】
（実施例２）
▲１▼濃縮ＳＦＨ溶液の調製
実施例１の▲１▼に準じて濃縮ＳＦＨ溶液の調整を行った。
▲２▼濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加
上述の工程を経て調整した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ中のヘモグロビンモル数に対するモル比で２倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium salt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])、ヘモグロビンモル数に対するモル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウム[inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/SIGMA Chem. Co.]ならびに０．２相当の酸化型β−ＮＡＤ+ (BMY., Grade II/98%)を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮ＳＦＨ溶液中に均一に成るように添加・混合した。
▲３▼濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化
水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:0.28(モル比)]) １８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、実施例２▲２▼で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌを加え、攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をマイクロフルイダイザー (Microfluidics co.,Microfluidizer 110Y)を用いて、氷冷下、１２，０００ｐｓｉ（約８４４kg/cm2）の圧力条件下でリポソーム化を行った。
【００２１】
▲４▼ヘモグロビン含有リポソームの精製
上記実施例２▲３▼の処理後に得られた溶液は、等量の生理食塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物として回収された。リポソーム化されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカンテーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくなるまで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター（Millipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホローファイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
【００２２】
（実施例３）
▲１▼濃縮ＳＦＨ溶液の調製
実施例１の▲１▼に準じてＳＦＨ溶液の調製を行った。
▲２▼濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加
上述の工程を経て調製したヘモグロビン溶液１００ｍｌに対するモル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム（L(-)malic acid, monosodium salt/シグマ社[SIGMA Chem. Co.])、ヘモグロビンモル数に対するモル比で１．０相当のフィチン酸ナトリウム[inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/SIGMA Chem. Co.]ならびに１．０相当のβ−ＮＡＤＰＨ・Ｎａ4 （協和発酵工業）および５．０相当のグルコース−６−リン酸ナトリウム（Sigma Chem. Co.)を１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌの濃縮ＳＦＨ溶液中で均一に成るように添加・混合した。
▲３▼濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化
水素添加率９０％以上の精製飽和ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミリスチン酸（ＭＡ）、トコフェロール（ＴＯＣ）の均一混合粉末〔日本精化：プレソーム [HSPC:Chol:MA:TOC=7:7:2:0.28(モル比)]) １８ｇに同量の無菌精製水を加えて、６０〜７０℃に加温して膨潤させた。この原料脂質に、上記実施例３▲２▼で調製した濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌ．を加え攪拌混合（３０秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をパール細胞破砕器(Parr Co.)に入れ、ヘリウムガスで１００kg/cm2に加圧して３０分間放置後、この圧力を維持した状態で、氷冷下で、パール細胞破砕器の細隙ノズルから吐出させてリポソーム化を行った。
【００２３】
▲４▼ヘモグロビン含有リポソームの精製
実施例３▲３▼の処理後に得られた溶液は、等量の生理食塩水ならびにデキストラン４０注射液を用いて希釈・懸濁液とした後、遠心分離（10,000ｒｐｍ（13,000ｇ）×３０min. at ４℃）を行った。効率良くヘモグロビンを含有しているリポソームは、この遠心処理により沈澱物として回収された。リポソーム化されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料脂質成分を含む上澄はデカンテーションもしくは吸引により除去した。以上の洗浄操作を上澄中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に認められなくなるまで繰り返し行った後、０．４５μｍのテュラポア（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンフィルター（Millipore Ltd., Minitan system）を用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。最終的にホローファイバー型ダイアライザー（テルモ（株）、ＣＬ−Ｓ８Ｎ）で濃縮後、ヘモグロビン濃度が１０％（ｗ／ｖ）と成るように生理食塩水で調整した精製ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液約８０ｍｌを回収した。
【００２４】
（比較例１）
Ｌ−リンゴ酸ナトリウム未添加の脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をワーリングブレンダー処理によりリポソーム化した以外は、実施例１と同様の手法でヘモグロビン含有リポソームを調製した。以下にワーリングブレンダー処理条件を記載する。
ワーリングブレンダー条件
(Waring Co., Blender 7010S)
ＳＦＨ処理量：２００ｍｌ
脂質量：３６ｇ（同量の無菌精製水を用いて膨潤）
回転数：１５，０００ｒｐｍ
処理時間：３０分間
(1) ３分間処理、（2)１０分間冷却（４℃）を繰り返す
【００２５】
（実施例４および比較例２）
▲１▼メトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液の調製
実施例１に準じて調製した濃縮ＳＦＨ溶液を３７℃で４日間加温し、メトヘモグロビン含有率約３５％の濃縮ＳＦＨ溶液を調製した。このＳＦＨにメトヘモグロビン含有率２％以下の新鮮な濃縮ＳＦＨ溶液を混合し、メトヘモグロビン含有（メトヘモグロビン含有率１７％）濃縮ＳＦＨ溶液を調製した。
▲２▼メトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加
試料として、上述の工程を経て調製したメトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液１００ｍｌに対して、ヘモグロビン（Ｈｂ）の重量モル比で４倍量相当のＬ−リンゴ酸ナトリウム[L(-)malic acid, monosodium salt/SIGMA Chem. Co.] 、０．８（Ｈｂ重量モル比）相当のフィチン酸ナトリウム[inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt/SIGMA Chem. Co.]および各０．２（Ｈｂ重量モル比）相当の酸化型β−ＮＡＤ+ 〔β-nicotinamide adenine dinucleotide, oxidized (grade II, 98%)/BMY] ならびに還元型β−ＮＡＤＨ〔β-nicotinamide adenine dinucleotide disodium salt, reduced(grade II, 98%)/BMY] を８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｍｌのメトヘモグロビン含有ＳＦＨ溶液中に均一になるように添加・混合した。
一方、コントロール（比較例２）としてヘモグロビンに対する重量モル比で０．８相当のフィチン酸ナトリウムのみを添加したメトヘモグロビン含有濃縮ＳＦＨ溶液を調製した。
▲３▼濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化
実施例１と同様の条件下でリポソーム化した。
▲４▼メトヘモグロビン含有リポソームの精製
実施例１に記載のヘモグロビン含有リポソームの精製方法と同様に行った。
【００２６】
（試験１）
リポソーム調製後のヘモグロビン酸化率
実施例４および比較例２で調製した調製直後のヘモグロビンの酸化率を後述する多波長分光光度法で測定し、結果を表１に示した。表１の結果から、リンゴ酸・ＮＡＤ+ ・ＮＡＤＨをリポソーム調製前に加えてメトヘモグロビン還元機構を付与したヘモグロビン含有リポソームは、調製過程でヘモグロビン酸化物の濃度を顕著に減少させたことがわかる。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（試験２）
ヘモグロビン経時酸化の測定（in vivo)
ヘモグロビン含量が５％（ｗ／ｖ）となるように調整して上記で得られたヘモグロビン含有リポソーム懸濁液１ｍｌを、ＩＣＲ系雄性マウス（５週令）の尾静脈から投与し、２４時間経過後、腹大静脈から全血を回収し、下記の方法で経時酸化率を算出した。
ヘモグロビン含有リポソームは、浸透圧差に対して強く、この特徴を利用して天然赤血球と分離した。すなわち、ヘパリン添加全血に８〜１０倍容の超純水を添加・攪拌し、マウス天然赤血球を溶血後、18,000ｒｐｍで３０分間（４℃）高速遠心を行いヘモグロビン含有リポソームを沈澱物として回収した。この操作を３回繰り返し、完全に血液成分を洗浄除去した。得られた試料に１０ｗ／ｖ（％）・Triton X100-HEPES 緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）２．０ｍｌを加えて約１分間激しく攪拌し、さらにフロン（フレオンガス溶液）２ｍｌを添加し約１分間攪拌した。この溶液を3,000 ｒｐｍで１５分間遠心処理後、上澄約１．８ｍｌにＨＥＰＥＳ緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）を１ｍｌ加えて調製した試薬の可視領域（４６０ｎｍ〜７００ｎｍ）における吸収スペクトルを測定し、経時酸化率を算出した。結果を表２および図３に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
オキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、ヘミクロームの各濃度は、ヘモグロビンの吸収曲線で事前に得られた実測値をもとに多波長分光光度法（７００ｎｍ，６３０ｎｍ，５７７ｎｍ，５６０ｎｍ）により算出した（下記に示す）。
【００３１】
OxyHb（μM)=29.8 ×ΔAbs(577nm)-9.8×ΔAbs(630nm)-22.2 ×ΔAbs(560nm)
metHb（μM)=7×ΔAbs(577nm)+76.8 ×ΔAbs(630nm)-13.8 ×Abs(560nm)
hemichrome(μM)=-33.2×ΔAbs(577nm)-36 ×ΔAbs(630nm)+58.2 ×ΔAbs(560nm)
ただし、ΔAbs(577nm)=Abs(577nm)-Abs(700nm)
ΔAbs(630nm)=Abs(630nm)-Abs(700nm)
ΔAbs(560nm)=Abs(560nm)-Abs(700nm)
【００３２】
試験２の結果が示す通り、本発明の実施例１、実施例２、実施例３で得られたヘモグロビン含有リポソームは、比較例１のリポソームと比べ、ヘモグロビン酸化物の濃度を顕著に減少させ、ヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制した。
【００３３】
（試験３）
実施例１の▲３▼ＳＦＨ溶液のリポソーム化において、脂質−濃縮ＳＦＨ混合液をマイクロフルイダイザーでリポソーム化する前と後とのＳＦＨ溶液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性と、リンゴ酸脱水素酵素活性とを、以下の条件で測定し結果を表３および４に示す。
【００３４】
１．ＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性の測定
脂質−濃縮ＳＦＨ混合溶液中のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．ｐＨ７．４、３７℃）で希釈した溶液を使用し、単位ヘモグロビン当りの酵素活性値をBeutler(*)の記載した方法を用いて算出した。また、ＭＦ処理によって得られたヘモグロビン含有リポソーム内部のＮＡＤＨ依存型メトヘモグロビン還元酵素活性は、非イオン性界面活性剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソーム膜を可溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。
(*) E.Beutler,NADH methemoglobin reductase(NADH-ferricyanide reductase)in:E.Beutler(ed.),Red Cell Metabolism/A Manual of Biochemical Methods,3rd. ed., Grune & Stratton, Inc., Orlando 1984,pp.81-83.
【００３５】
0003696898.tif 000004
【００３６】
２．リンゴ酸脱水素酵素活性の測定
脂質−濃縮ＳＦＨ混合溶液中のリンゴ酸脱水素酵素活性は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ．ｐＨ７．４、３７℃）で希釈した溶液を使用して単位ヘモグロビン当りの酵素活性値をBergmeyer(*)の記載した方法を用いて算出した。また、ＭＦ処理によって得られたヘモグロビン含有リポソーム内のリンゴ酸脱水素酵素活性は非イオン性界面活性剤であるオクチルグルコピラノシドでリポソーム膜を可溶化し、ＳＦＨ溶液と同様に測定した。
(*)H.U.Bergmeyer,A.F.Smith.E.Bermth, Malate Dehydrogenase,in: H.U.Bergmeyer(ed.),Methods of Enzymatic Analysis,Vol.3,3rd.English ed., Verlag Chemie, Weinheim, 1986,pp163 〜175.
【００３７】
0003696898.tif 000005
【００３８】
なお、比較例１と同様として、ただしWarring Blender （ワーリング  ブレンダー）処理を冷却を行なわずに行なったＮＡＤＨ−メトヘモグロビン還元酵素の残存率を試験３の条件で測定したところ、１７．９％であった。
表３および表４で示すように、リポソームをMicrofluidizer（マイクロフルイダイザー）で製造したヘモグロビン含有リポソームのＮＡＤＨ−メトヘモグロビン還元酵素活性は、９９．６％が残存していた。また、ＴＣＡサイクル構成酵素であり、ヘモグロビン含有リポソーム中の還元型補酵素ＮＡＤの再生系として使用されるリンゴ酸脱水素酵素についても８１．４％の残存率を示し、マイクロフルイダイザーによるリポソーム化の有用性が認められた。
【００３９】
【発明の効果】
上述した通り、本発明のヘモグロビン含有リポソームはヘモグロビンの経時酸化を著しく抑制できる。
一般的にヘモグロビン含有リポソームは、それの製造過程、製品の保存中、特に生体内投与後の循環血流中でメト型ヘモグロビンに酸化され、酸素運搬能が低減ないし喪失するが、本発明のヘモグロビン含有リポソームはヘモグロビンが酸化から保護されているために優れた酸素運搬能を有する。そのため、人工赤血球として優れた性質を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  天然赤血球内におけるヘモグロビンの酸化・還元サイクルを示す。
【図２】  本発明のヘモグロビン含有リポソームにおけるヘモグロビンの酸化・還元サイクルを示す。
【図３】  本発明と比較例のヘモグロビン含有リポソームのメト型ヘモグロビン還元効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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