(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ７．０〜１０．０の可溶化コラーゲン溶液を、陰イオン交換繊維に接触させ、Ｖ型コラーゲンを吸着分離することを特徴とするＶ型コラーゲンの精製方法。
【請求項２】
前記陰イオン交換繊維の繊維素材の長さが、１ｍｍ〜２０ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可溶化コラーゲン溶液が、豚の腸、胃または胎盤に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コラーゲンの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｖ型コラーゲンは、多細胞生物の結合組織には、殆ど普遍的に分布しており、ヘパリン、インシュリンなどの生理活性物質と結合する能力を有し、特定の細胞の増殖を阻害する作用があり、医薬品として注目されている。
【０００３】
現在、Ｖ型コラーゲンは、非常に高価で、しかも胎盤を原料とすること、および希釈沈殿法によって精製することから、大量入手が困難なために、試薬程度でしか利用されていない。
【０００４】
そのため、高純度のＶ型コラーゲンを安価に供給することが可能になれば、抗血管新生剤などの新たな医薬品の開発に結び付くものと期待される。
【０００５】
このＶ型コラーゲンを分画する方法としては、従来、（１）ＮａＣｌによる分画法（「コラーゲン実験法」永井  裕・藤本  大三郎  編、第４０〜４８頁、講談社サイエンティフィク）、（２）硫安による分画法（J.Biological Chemistry,Vol.259,14170-14174(1984)）、（３）KCl-Phosphate による分画法（Analytical Biochemistry,Vol.169,26-32(1988))の３種類があった。
【０００６】
（１）、（２）の方法は、いずれも塩により沈殿させる方法で、抽出と塩析を繰り返すことから精製に最短でも２週間（通常、３〜４週間）を要し、大量処理には向かない。また、この方法のみでは、かなりの不純物の混入が認められることから、高純度のＶ型コラーゲンを得るには更なる精製操作が必要である。
【０００７】
（３）の方法では、比較的簡便な方法ではあるが、他の混入物がかなり認められる他、超遠心分離（１０万Ｇ以上）による分画が必要であるため、大量分取の手段としては不適当である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大量且つ高純度に精製可能な、Ｖ型コラーゲンの精製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、可溶化コラーゲン溶液を、陰イオン交換繊維に接触させることにより、Ｖ型コラーゲンが精製されることを見出した。
【００１０】
即ち、本発明は、可溶化コラーゲン溶液を、陰イオン交換繊維に接触させ、Ｖ型コラーゲンを吸着分離することを特徴とするＶ型コラーゲンの精製方法である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明において、可溶化コラーゲン溶液とは、動物の臓器や組織等を、アルカリ処理や、プロテアーゼ処理によって可溶化されたコラーゲンの溶液をいう。
【００１３】
該可溶化コラーゲン溶液のｐＨは、７．０〜１０．０、好ましくは７．６〜８．６であり、緩衝液を用いなくてもよいが、用いるのが好ましい。
【００１４】
本発明において用いられる動物の臓器や組織等としては、特に限定されるものではないが、例えばヒトの胎盤、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物の胎盤、腸（例えば小腸、大腸）、胃又は皮などを用いる。
【００１５】
次に、可溶化コラーゲン溶液を陰イオン交換繊維に接触させること、について述べる。
【００１６】
本発明において、陰イオン交換繊維とは、繊維素材に陰イオン交換基を付加させたものである。
【００１７】
陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、アミノエチル（ＡＥ）、グアニドエチル（ＧＥ）、エクテオラ（ＥＣＴＥＯＬＡ）、パラアミノベンジル（ＰＡＢ）などが挙げられ、特に、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）が好ましい。
【００１８】
繊維素材とは、綿、麻、木材パルプ等の繊維性セルロースが挙げられる。
【００１９】
繊維素材の長さは、１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは、１ｍｍ〜１０ｍｍである。
【００２０】
繊維素材に陰イオン交換基を導入する方法は、公知の方法に従う。
【００２１】
前記陰イオン交換繊維に、可溶化コラーゲン溶液を接触させるとは、具体的には、可溶化コラーゲン溶液を、前記陰イオン交換繊維を詰めたカラムに通すことをいい、カラム式以外にも、バッチ式等で接触させてもよい。
【００２２】
前記陰イオン交換繊維を詰めたカラムに流す溶出液としては、塩を含む溶液を緩衝液などで、コラーゲン溶液と同じｐＨに調整したものを用いる。
【００２３】
塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 などが挙げられ、好ましくは、ＮａＣｌである。
【００２４】
塩の濃度は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００２５】
上記緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、モルホリノエタンスルホン酸  （ＭＥＳ）−ＮａＯＨ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液が挙げられ、好ましくは、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液である。
【００２６】
上記溶出液には、必要に応じて他の成分も添加することができ、その成分としては、尿素などが挙げられる。
【００２７】
前記溶出液としては、例えば、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液を２Ｎ  ＨＣｌを用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調製したものを用いる。
【００２８】
前記の陰イオン交換繊維を用いれば、コラーゲン溶液のような粘性試料を通しても目詰まりすることなく、簡便に精製することができる。
【００２９】
前記陰イオン交換繊維と可溶化コラーゲン溶液との割合は、可溶化コラーゲン１ｇあたり、陰イオン交換繊維２ｇ〜５０ｇ、好ましくは、１０ｇ〜３０ｇ使用する。
【００３０】
前記陰イオン交換繊維で可溶化コラーゲン溶液を通すことにより、通常主要なコラーゲン成分であるＩ型コラーゲンは、非吸着成分に含まれ、目的とするＶ型コラーゲンは、吸着成分として分離される。
【００３１】
上記吸着成分を分離する時に使用する溶出液としては、最初の溶出液の成分中、塩濃度を３００ｍＭ〜２Ｍにしたものを用いる。
【００３２】
上記溶出液としては、例えば、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液を２Ｎ  ＨＣｌを用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調製したものを用いる。
【００３３】
この吸着成分には、Ｖ型コラーゲン及びその他の成分も若干含まれており、この吸着成分を脱塩、イオン交換クロマトグラフィー及びＨＰＬＣ等による公知の手段により、Ｖ型コラーゲンを単離精製できる。
【００３４】
本発明では、精製したコラーゲンを、アミノ酸組成、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分析結果から、Ｖ型コラーゲンであることを確認した。
【００３５】
分析の結果、Ｖ型コラーゲンの分子量は、α１鎖が９６，０００〜１０４，０００、α２鎖が８６，０００〜９４，０００、コラーゲン分子としての分子量は、２７８，０００〜３０２，０００であった。
【００３６】
尚、文献値によると、Ｖ型コラーゲンの分子量は、α１鎖が９５，０００〜１０５，０００、α２鎖が８５，０００〜９５，０００、コラーゲン分子としての分子量は、２７５，０００〜３０５，０００である。
【００３７】
本発明のＶ型コラーゲンおよびそのα１（Ｖ）サブユニットは、例えば、動物組織から以下の（１）〜（１２）の方法に従い調製される。
【００３８】
（１）ブタ腸などの目的の動物組織から、脂肪組織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り取り除く。
【００３９】
（２）残りを細切し、０．１Ｎ−ＮａＯＨに懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１０分間）して沈殿を得る操作を数回繰り返す。
【００４０】
（３）冷蒸留水で洗浄を繰り返す。
【００４１】
（４）湿重量の５−１０倍量の０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行う。
【００４２】
（５）沈殿物に０．５Ｍ酢酸を加え、塩酸でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
【００４３】
（６）遠心分離（３０００ｇ、１０分間）により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
【００４４】
（７）このペプシン処理および遠心分離操作を３回繰り返す。
【００４５】
（８）ペプシン可溶性コラーゲン２００部に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ  ＮａＣｌの混合溶液６０部を加え、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨを８．０に調整する。
【００４６】
（９）１０ｍＭ  ＨＣｌ、２Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液を２Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調整する。
【００４７】
（１０）ＤＥＡＥセルロースカラムを工程（９）で用いた緩衝液で平衡化する。
【００４８】
（１１）ペプシン可溶性コラーゲン溶液３０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液で洗浄後、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２０部で溶出する。この溶出液を工程（９）で用いた緩衝液で透析する。
【００４９】
（１２）透析後の溶出液を、工程（９）で用いた緩衝液で平衡化したフラクトゲル  ＥＭＤＳＯ3-６５０Ｓカラムに注入し、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）１０部で洗浄後、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）１０部で溶出した。この溶出液を水で透析後、凍結乾燥し、精製Ｖ型コラーゲンを得る。
【００５０】
尚、可溶化コラーゲンを得る方法としては、上記工程（１）〜（６）に記載された方法の他に、例えば、以下の方法が挙げられる。
【００５１】
アルカリ処理は必要であるが、ペプシン処理は不要である方法としては、胎児やラチリズム（薬剤投与によってコラーゲン間の架橋が弱められること）を起こした動物を材料とし、これをアルカリ処理すれば、ペプシン処理をせず可溶化コラーゲンを得ることができる（「コラーゲン実験法」永井  裕・藤本  大三郎  編、第３４頁、講談社サイエンティフィク）。
【００５２】
また、アルカリ処理は不要で、ペプシン処理が必要である方法としては、例えば、組織の脂肪と軟骨を丁寧に除去し、細切後に４種のタンパク質分解酵素阻害剤（４ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルオリド、１０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド、１μｇ／ｍｌペプスタチン）を含む冷蒸留水で１〜２日間繰り返し洗浄し、続いて、Ｖｉｒｔｉｓホモジナイザーでホモジナイズし（３０００ｒｐｍ、３０秒間、３回繰り返す）、上記洗浄液で１〜２日間洗浄して、ペプシン処理して可溶化コラーゲンを得る方法（「コラーゲン実験法」永井  裕・藤本  大三郎  編、第４２〜４３頁、講談社サイエンティフィク）が挙げられる。
【００５３】
次に、得られたＶ型コラーゲンからのα１（Ｖ）サブユニットの分離は、例えば以下の（ｉ）〜（ｖ）の方法により行うことができる。
【００５４】
（ｉ）Ｖ型コラーゲン１ｍｇに、２Ｍ尿素を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃で５分間加熱してサブユニットを解離させる。
【００５５】
（ii）この溶液を、上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したBakerbond PEI Scotカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ａ製）に注入し、流速１ｍＬ／分で２０分間、０〜３５０ｍＭの直線勾配により、蛋白質を溶離する。
【００５６】
(iii）各サブユニットを含む画分を集め、凍結乾燥により濃縮する。
【００５７】
（iv）２Ｍ尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳＫ  ＧＥＬ  ＳＷ３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重合物を除去する。
【００５８】
（ｖ）塩および緩衝液を除くため、Bakerbond Butyl Scotカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ａ製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０〜８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行う。
【００５９】
上記のＶ型コラーゲンの分離方法及びサブユニットの解離・精製方法は、単なる例示であり、当業者であれば容易にその条件を適宜変更することができる。
【００６０】
尚、Ｖ型コラーゲンは、従来、ヒト胎盤由来のものは知られているが、本願発明において得られたＶ型コラーゲンは、ヒト胎盤由来のものではなく、ヒト胎盤以外から得られたものであり、従来のＶ型コラーゲンとは異なるもの、と考えられる。その物性値を実施例に示す。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、簡便且つ大量に、高純度のＶ型コラーゲンを精製することができる。
【００６２】
【実施例】
以下、本発明を実施例および比較例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６３】
実施例１
＊Ｖ型コラーゲンの精製
以下のプロトコール（１）〜（１２）に従い、原料であるブタ腸（小腸及び大腸）、ブタの胃及びブタ胎盤の湿重量１００ｇから、精製Ｖ型コラーゲンを、それぞれ、４．３７ｍｇ、４．５２ｍｇ、４．６４ｍｇ得た。
【００６４】
（１）ブタ腸などの目的の動物組織から、脂肪組織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り取り除く。
【００６５】
（２）残りを細切し、０．１Ｎ−ＮａＯＨに懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１０分間）して沈殿を得る操作を数回繰り返す。
【００６６】
（３）冷蒸留水で洗浄を繰り返す。
【００６７】
（４）湿重量の５−１０倍量の０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行う。
【００６８】
（５）沈殿物に０．５Ｍ酢酸を加え、塩酸でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
【００６９】
（６）遠心分離（３０００ｇ、１０分間）により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
【００７０】
（７）このペプシン処理および遠心分離操作を３回繰り返す。
【００７１】
（８）ペプシン可溶性コラーゲン２００部に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ  ＮａＣｌの混合溶液６０部を加え、２Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液でｐＨを８．２に調製する。
【００７２】
（９）４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液を２Ｎ  ＨＣｌを用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調製する。
【００７３】
（１０）ＤＥＡＥセルロースカラムを工程（９）で調製した緩衝液で平衡化する。
【００７４】
（１１）ペプシン可溶性コラーゲン溶液３０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液で洗浄後、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２０部で溶出する。この溶出液を工程（９）で用いた緩衝液で透析する。
【００７５】
（１２）透析後の溶出液を、工程（９）で用いた緩衝液で平衡化したフラクトゲルＥＭＤ  ＳＯ3-６５０Ｓカラムに注入し、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）１０部で洗浄後、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）１０部で溶出した。この溶出液を水で透析後、凍結乾燥し、精製Ｖ型コラーゲンを得る。
【００７６】
＊サブユニットの分離
上記で得られたＶ型コラーゲン凍結乾燥物１ｍｇに、２Ｍ尿素を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃で５分間加熱してサブユニットを解離させた。この溶液を、上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したBakerbond PEI Scotカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ａ製）に注入し、流速１ｍＬ／分で２０分間、０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配により、蛋白質を溶離した。各サブユニットを含む画分を集め、凍結乾燥により濃縮した。２Ｍ尿素、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳＫ  ＧＥＬ  ＳＷ３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重合物を除去した。
【００７７】
さらに、塩および緩衝液を除くため、Bakerbond Butyl Scotカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ａ製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０〜８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行った。
【００７８】
分析試験
＊α１（Ｖ）、α２（Ｖ）のアミノ酸分析
上記実施例１で得られたＶ型コラーゲンのα１（Ｖ）及びα２（Ｖ）のアミノ酸組成を、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用いてＰＩＴＣ法により分析した。その結果を表１に示す。
【００７９】
また、公知文献（METHOD IN ENZYMOLOGY,VOL.82,20）に記載されているアミノ酸分析結果を表２に示す。
【００８０】
【表１】
0003650851.tif 000002
【００８１】
【表２】
0003650851.tif 000003
【００８２】
＊収率
クロマトグラフィーによる回収率
ブタの腸  ：４．３７ｍｇ／１００ｇ湿重量
ブタの胃  ：４．５２ｍｇ／１００ｇ湿重量
ブタの胎盤：４．３７ｍｇ／１００ｇ湿重量
以上の結果より、ブタの腸や胃からも胎盤とほぼ同等の回収率でＶ型コラーゲンを精製することができた。