(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキソン病を治療するための組成物であって、L-ドーパの脳への利用性を高めるL-ドーパ腎臓細胞外トランスファーを阻害するために、L-ドーパと組み合わせて、フェニルベンゾピランの誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1種の化合物を含む組成物。
【請求項２】
フェニルベンゾピランの誘導体がフラボノイド化合物を含むことを特徴とする請求項1記載の組成物。
【請求項３】
フラボノイド化合物が一般式
【化１】
0003677002.tif 000003
(式中、X基は、同一又は異なり、かつ、H及びOHから選択されて、Y基は、同一又は異なり、かつ、H及びORから選択されて、RはH,CH3、又はCH2-Phである。)、を有するか、相当する誘導体であって、C6HY4基が前記ベンゾピラン環の3位に存在する誘導体である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
トランス-スチルベン誘導体が一般式
【化２】
0003677002.tif 000004
を有し、X基は、同一又は異なり、かつ、H及びOHから選択されることを特徴とする請求項2記載の組成物。
【請求項５】
阻害化合物が、
5,7-ジヒドロキシ-2-(4-メトキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(アカセチン),5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(アピゲニン),5,6,7-トリヒドロキシ-2-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(バイカレン),5,7-ジヒドロキシ-2-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(クリシン),([2R、3R])-2-[3,4-ジヒドロキシフェニル]-3、4-ジヒドロ-1[2H]ベンゾピラン-3,5,7−トリオール((-)-エピカテキン), 2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,7-ジヒドロキシ−４H−１−ベンゾピラン-4-オン(フィセチン)、5,7-ジヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(ゲニステイン),3,5,7-トリヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(ケンフェロール),2-(2,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-４H-1-ベンゾピラン-4−オン(モリン),3,5,7-トリヒドロキシ-2-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(ミリセチン),3 -(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6-トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン(フロレチン),2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5、7-トリヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(ケルセチン),2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5,6,7-テトラヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラン-4−オン(ケルセタゲチン),4’-ベンジルオキシ-3‘、5’-ジメトキシ-3,5,7−トリヒドロキシフラボン、3,7−ジヒドロキシ-3‘,4’,5’-トリメトキシフラボン-3’,４’,7,8−テトラヒドロキシフラボン、3,5,7−トリヒドロキシ-3‘,4’,5’-トリメトキシフラボン、3,3’,４’,5’−テトラヒドロキシ-トランス-スチルベン（ピセアタノール）、トランス-4-スチリルフェノール、及び3,4’,5-トリヒドロキシ-トランス-スチルベン(レスバラトール)から選択されることを特徴とする請求項1記載の組成物。
【請求項６】
阻害化合物が、3,4’,5-トリヒドロキシ-トランス-スチルベン(レスバラトール)である請求項１，４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
酵素アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又は酵素カテコール−o−メチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１〜６項のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤がベンセラジド又はカルビドーパを含有し、酵素カテコール−o−メチルトランスフェラーゼ阻害剤がエンタカポネ又はトルカポネを含有することを特徴とする請求項7記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、さらに不活性薬剤許容賦形剤を含む、請求項１〜８項のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
いずれかの形態のパーキンソン病の治療、又は悪化の防止用の薬剤の調製において、請求項１〜９項のいずれか1項に記載の組成物を使用する方法。
【請求項１１】
逐次又は同時投与のいずれかの療法において使用するために、L-ドーパと組み合わせて、フェニルベンゾピランの誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤からなるパーキンソン病治療用の複合薬剤。
【請求項１２】
少なくとも１つの阻害剤化合物が請求項２〜6項のいずれか1項に記載のものから選択される請求項11記載の少なくとも1つの複合薬剤。
【請求項１３】
L-ドープと組み合わせた逐次又は同時投与のいずれかの療法によるいずれかの形態のパーキンソン病の治療、又は悪化の防止用の薬剤の調製において、フェニルベンゾピランの誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤の使用方法。
【請求項１４】
黒質線状体の経路のネットドーパミン作用性活性の修飾、及びL-ドーパでの逐次又は同時投与による運動障害の治療用薬剤の調製において、フェニルベンゾピラン誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファーの使用方法。
【請求項１５】
パーキンソン病の治療用に、対象において投与されたL-DOPAの巡回レベルを増大させるための薬剤の製造において、フェニルベンゾピラン、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファーの使用方法。
【請求項１６】
パーキンソン病の治療用に、対象の脳への投与されたL-ドーパの利用性を向上させるための薬剤の製造において、フェニルベンゾピランの誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロレチン）から選択される少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害化合物の使用方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの阻害化合物が、請求項２〜６のいずれかに記載されたものから選択されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１８】
阻害剤化合物が投与当たり40〜30,000μg/kgを提供する量で存在する請求項13〜17項のいずれか1項に記載の使用方法。
【請求項１９】
治療が、アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤又はカテコール−o−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の同時又は逐次投与からなる請求項13〜18項のいずれか1項に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記デカルボキシラーゼ阻害剤がベンセラジド又はカルビドーパを含有し、カテコール−o−メチルトランスフェラーゼ阻害剤がエンタカポネ又はトルカポネを含有することを特徴とする請求項１９記載の使用方法。
【請求項２１】
逐次又は同時投与L-ドーパの周辺のデカルボキシル化を阻害することによるパーキンソン病の治療用薬剤の調製における請求項1〜6項のいずれか1項に記載のものから選択される少なくとも1つの阻害剤化合物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パーキンソン病を治療する際に使用する組成物に関する。特に、本発明は、前記組成物の成分としてL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パーキンソン病（PD）は、黒質に起因し、ストリア−タムへ突出する大量の脳ドーパミンニューロンへ影響を与える原因不明の慢性の神経変性疾患である。臨床的には、PD患者は、震え、硬直、及び歩行異常によってより一般に認められる緩やかな運動障害を示す。PDに悩まされる患者は、脳神経伝達物質ドーパミンの前駆体であるL-ドーパと、カルビドーパ又はベンセラジドを投与したとき、かなりの運動改善を示す。後者の化合物は、抹消芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)の有力な阻害剤であり、それらの投与は、抹消組織におけるLドーパのドーパミンへの転化を防ぐ傾向にあり、それゆえ、抹消器官（心臓血管及び胃腸）におけるドーパミン作用に関する悪影響の出現を防ぐ。抹消AADCの阻害は、影響されない脳のドーパミン作用性のニューロンにおけるドーパミン保存のより効果的な補充を生じるL−ドーパの生物学的利用能を向上させることによっても達成される。
【０００３】
しかしながら、L-ドーパの相対的に短い半減期は、PD患者のメインテナンス治療における限界であり、L-ドーパの多量の投与を要求する。そのような理由から、L-ドーパの遅い放出配合物が,最近利用されていて、より持続した運動改善を達成し、毎日の投与の数を減少させている。この方法は、いまだに限られた成功でしかない。なぜなら、循環しているL―ドーパは、尿に迅速に排出され、この除去ルートは多くの重要性を有するからである。尿中に現われる大部分のL-ドーパは、濾過されたL-ドーパにその由来を有するが、濾過されたL−ドーパのかなりの量は、ナトリウム依存及びナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターを通じてネフロンに沿って近位細管のレベルで再吸収され、吸収されたL−ドーパは容易にドーパミンへ変わることができる。L−ドーパとAADC阻害剤を与えられた患者において、腎臓近位細管におけるL−ドーパのドーパミンへの転化は阻害され、大部分の細胞内のL-ドーパは、先端の細胞境界を通じて細胞からはなれると考えられており、これは、阻害が細胞内区画におけるL-ドーパのかなりの蓄積を誘導するキャリアー媒体トランスポート系である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この腎臓細管L-ドーパ外トランスファー系は、サイクロスポリンA(pestana,等、1995、Br.J.pharmacol.115,1349-1358)に鋭敏であることが見出され、更なる証拠は、P-グリコプロテインは、L-ドーパの外部トランスファーを伴うことを示唆した(Soares-da-Silva等、1998、Br.J.Pharmacol,123,13-22；Soares-da-Silva  ＆  Serrao,2000,K.Pharmacol.Exp.Ther.293,697-704)。PDのL-ドーパでの治療における主要な問題は、その短い半減期と減少する生物学的利用能に関係するので(Cederbaum,  1989、  Clin.  Neuropharmacol．12，147-166；Koller  ＆  Tolosa，1998、Neurology、５０(suppl.6),S1-S48), (その腎臓分泌物を促進する)腎臓細管L-ドーパ先端外部トランスファーの阻害は、その尿素への排出を減少させて、生物学的利用能を向上させるかもしれない。これは、L-ドーパの細管上皮組織から腎臓間質組織へ，その後循環に戻る動きを支持するであろう。不幸にも、PD患者におけるL-ドーパ生物学的利用能を向上させる際に有益であると立証できる可能性のある大部分のP-グリコプロテイン阻害剤は、周知の細胞傷害性剤，又は毒性がなくとも、P-グリコプロテインを阻害するのに必要な濃度が、生体内条件下で非実用的である。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、L-ドーパの腎臓での排出を減少させる能力を有する化合物からなるPD治療用の組成物を提供することである。また、本発明の目的は，L-ドーパと組み合わせた逐次又は同時投与の治療用の薬剤の調整における前記化合物の少なくとも1つの使用を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
したがって，与えられた特許請求の範囲に記載されているようなパーキンソン病の治療用組成物を提供する。
【０００７】
別の側面において、与えられた特許請求の範囲に記載されているような逐次又は同時投与のいずれかによるパーキンソン病又は運動障害の治療用の薬剤の調整において、少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤の使用方法を提供する。本発明は、与えられた特許請求の範囲に記載されているようなパーキンソン病の治療用薬剤の調整において、L-ドーパと組み合わせて少なくとも1つの当該阻害剤化合物を含む組成物の使用方法も提供する。
【０００８】
更なる側面において、本発明は、与えられた特許請求の範囲に記載されているような治療において使用するために、L-ドーパと組み合わせて少なくとも1つのL-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤を提供する。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、パーキンソン病を治療する方法を提供し、その方法は、当該治療を必要な哺乳類種へ、L-ドーパと組み合わせた逐次又は同時において、L-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害化合物の薬剤的に有効的な量を投与することからなる。
【００１０】
加えて、本発明のさらなる側面によれば、方法は、L-ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害化合物の薬剤的に有効的な量を、脳及び制御運動に対して逐次又は同時投与されたL-ドーパの利用性を向上させるのに投与することを特徴とするパーキンソン病患者の運動を制御することを提供する。
【００１１】
本発明の前記阻害剤化合物は、与えられた請求項１〜６項のいずれか1項に記載のものから選択される。
【００１２】
別の側面において、本発明は、哺乳類種における投与L-ドーパの循環レベルを増加させることと、脳へのL−ドーパの利用性を向上させることの両方の方法も提供し、前記方法は、L-ドーパと組み合わせて逐次又は同時において、上述した少なくとも1つの阻害化合物の薬剤的に有効的な量を前記種へ投与することからなる。
【００１３】
腎臓細管L-ドーパ先端外トランスファーを阻害することに加えて、ここで述べた阻害化合物は、同時に抹消AADCを阻害する。これらの化合物は、血漿における投与されたL-ドーパの循環レベルを増加し、抹消におけるAADCを阻害し、投与されたL-ドーパの脳への有用性を向上させる。
【００１４】
好ましくは、本発明の方法は、さらにAADC（ベンセラジド又はカルビドーパなど）、又はカテコール−o−メチルトランスフェラーゼ（エンタカポネ又はトルカポネなど）の既知の阻害剤を、逐次又は同時のいずれかで他の活性化合物とともに投与することを含む。加えて、不活性薬剤許容キャリアーを活性化合物と混合する。薬剤許容キャリアーは、固体か液体のいずれかとすることができる。固体は、粉末、タブレット、分散可能な顆粒、及びカプセルを含む調合を形成する。液体キャリアーは、希釈剤、風味剤、可溶化剤、潤滑剤、縣濁剤、結合又はタブレット崩壊剤としても作用することができる1又はそれ以上の物資であり、カプセルに包まれた材料とすることもできる。
【００１５】
好ましくは、薬剤調合は、パッケージ調合などのユニット投与形態であり、パッケージは、パックされたタブレット、カプセル、水薬びん又はアンプル中の粉末など調合の個別の量を含む。
【００１６】
投与量は、患者の要求、病気の重篤度、使用する特定の化合物に依存して変えることができる。便宜上、全体の日々の投与量は、1日を通じて部分的に、分けて投与することができる。特別な状況における適当な投与量の決定は、医薬分野における当業者の範囲内であるが、前記阻害化合物の場合、治療当たり約４０μg〜約３０,０００μg／kgの範囲が好ましいであろう。
【００１７】
本発明の実施態様は、例によってのみ詳細に、与えられた図面を参照して説明される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
物及び方法
培養中の近位細管上皮細胞のいくつかの特性を保持するブタ由来の近位腎臓細管上皮細胞株（Hull,  R.N.  等、1976、Vitro  12,670−677）である細胞培養LLC-PK1細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville,MD)から得た。LLC-PK1細胞（ATCC  CRL  1392;passages 198-206）を５％CO2−９５％空気の湿潤大気中、３７℃で維持し、１００U／mlのペニシリンG、０.２５μg／mｌのアンフォテリシン、１００μg／mlのストレプトマイシン(Sigma社)、３％胎児ウシ血清(Sigma)及び２５mM  N-２−ヒドロキシエチルピパラジン-N‘-２-エタンスルホン酸(HEPES;Sigma)。サブ培養用に、細胞を０.０５％トリプシン-EDTA、スピリット１：４で分離し、７５又は１６２cm２生育領域でカスターフラスコ中でサブ培養した(Costar,Badhoecedorp,The  Netherlands)。取り込み研究用に、細胞をコラーゲン処理した２４ウエルプラスチック培養クラスター(内径１６ｍｍ、Costar)で、ウエル当たり４０,０００細胞の密度で、又はコラーゲン処理した０.２μmポリカーボネートろ過支持体(内径１２ｍｍ  Transwell、Costar)上でウエル当たり１３,０００細胞の密度(２.０×１０４細胞ｃｍ２)で播種した。細胞培地を２日ごとに変え、インキュべーションの３〜５日後、細胞を集めた。各実験前２４時間、細胞培地は、胎児ウシ血清が無かった。細胞を集めた後、実験を概ね２〜３日行なった。最初の播種後６〜８日間、各cm２は、約８０μgの細胞タンパク質を含んだ。
【００１９】
LLC−PK1細胞におけるトランスポート実験
実験の日に、生育培地を生育させて、細胞をHank培地で洗浄し、その後、細胞単一層を１５分間Hank培地で３７℃で予備インキュベートした。Hank培地は以下の組成（ｍM）であった。すなわち、NaCl１３７、KCl５、MgSO4０．８、Na２HPO4０．３３、KH2PO4０．４４、CaCl2０．２５、MgCl2１．０、TrisHCl０．１５、及び酪酸ナトリウム１．０、pH＝７.４。インキュベーション培地は、それぞれ、酵素AADC、カテコール−o−メチルトランスフェラーゼを阻害するために、ベンセラジド（１μM）及びトルカポネ(1μM)も含む。細胞を0.5μM基質で1,3,6及び12分間インキュベートする試験において、時間経過試験を行なった。飽和試験を、6分間L-ドーパの濃度を(2.5〜250μM) 増加させてインキュベートした細胞において行なった。試験基質を先端側のみから適用し、予備インキュベーション及びインキュベーション期間中に存在した。予備インキュベーション及びインキュベーション中、細胞を連続的に攪拌し、３７℃に維持した。先端取り込みを基質の与えられた濃度を有する2mlのHank培地の添加によって開始した。パスツールピペットに接続した真空ポンプにより取り込み溶液を迅速に除去することにより終了させて、その後、冷却Hank培地で迅速に洗浄し、0.2ｍM過塩素酸の250μlを加えた。酸性化したサンプルを、L-ドーパ分析用高速液体クロマトグラフィーに注入する前に4℃で貯蔵した。
【００２０】
以前の研究は、LLC-PK1細胞に蓄積したいくつかのL-ドーパは、先端外トランスポーターを通じて細胞をでることができ（Soares-da-Silva等、1998、Am  J.  Physiol.274,F243-F251）、阻害は、L-ドーパの細胞内蓄積の増加を導くことを示した（Soares-da-Silva等、1998、Br.J.Pharmacol.  123,12-22）。それゆえ、L−ドーパの細胞内蓄積を増加する薬剤の効果を研究するのに設計された実験において、細胞を、基底細胞境界から適用された25μML−ドーパでインキュベートし、取り込み(細胞単一層における蓄積)及び流量(反対のチャンバーへ移動したもの)を6分間に渡り測定した。試験薬剤を先端側だけから適用し、予備インキュベーション及びインキュベーション期間中に存在させた。インキュベーションの最後で、細胞を氷上に置き、先端細胞境界を含む培地を集めて、酪酸で酸性化し、L-ドーパの分析まで4℃で貯蔵した。細胞を氷冷Hank培地で洗浄し、0.2ｍM酪酸を加えて(高いチャンバーと低いチャンバーでそれぞれ100μlと500μl)、酸性化したサンプルをL-ドーパ分析用高速液体クロマトグラフィーに注入する前に4℃で貯蔵した。
【００２１】
デカルボキシル化試験
実験の日に、生育培地を生育させて、細胞(LLC-PK1)をHank培地で洗浄し、その後、細胞単一層を15分間、Hank培地において37℃で予備インキュベートした。Hank培地は、以下の組成を有した。すなわち、NaCl１３７、KCl５、MgSO4０．８、Na２HPO4０．３３、KH2PO4０．４４、CaCl2０．２５、MgCl2１．０、TrisHCl０．１５、及び酪酸ナトリウム１．０、pH＝７.４。インキュベーション培地は、ピリドキサルリン酸(120μM)、トルカポネ(1μm)、パーギリン(100μm)も含んだ。飽和試験を、6分間L-ドーパを増加させた濃度(2.5〜250μM)でインキュベートした細胞において行なった。L-ドーパの脱カルボキシル化でのテスト化合物の影響を研究するのに設計した実験において、細胞を30分間テストすべき化合物の存在下予備インキュベートした。予備インキュベート後、細胞を、6分間250μML-ドーパを有するHank培地においてインキュベートした。250μlの0.2mM酪酸を加えることによって反応を終了させた。酸性化させたサンプルを、ドーパミン分析用高速液体クロマトグラフィーに注入する前に4℃で貯蔵した。
【００２２】
細胞の生存性
プラスチック支持体において培養された細胞は、15分間37℃で予備インキュベートして、その後、L-ドーパ及びテスト化合物の存在,又は不存在下でさらに6分間インキュベートした。ついで、細胞を37℃で2分間、トリパンブルー(0.2％w/v)でリン酸緩衝液中でインキュートした。細胞を2回Hank培地でゆすぐことによってインキュベーションを停止して、細胞をライカ顕微鏡を使用して調査した。これらの状況下、95％より多くの細胞を染料から除外した。
【００２３】
生体内試験
これらの実験を、L-ドーパの生物学的利用能及び脳アクセスでのテスト化合物の影響を評価するために設計した。170〜280gの重量のオスウィスターラットを、制御された環境条件下(12時間明/暗サイクル、室温24℃)で、かご当たり2匹保持した170〜280gの重量のオスウィスターラットを、すべての実験において使用した。定義した間隔で首を切断することによって忌避し、それらの脳、肝臓、及び腎臓を除去し、L−ドーパ、ドーパミン、及びDOPACを決定するのに使用した。
【００２４】
ラット組織におけるAADCの分析
いくつかの実験において、AADC活性を、前述したように(Soares-da-Silva,等、1994、Br.J.Pharmacol.112.611-615)、Vmax状況下で脳、肝臓、及び腎臓において決定した（５ｍML−ドーパ；15分インキュベート）。500μlの２M過塩素酸を加えることによって停止させ、調合物を4℃で60分間保持した。サンプルをその後、遠心分離し(200g、2分、4℃)、スピンXフィルター管(Coatar)上で濾過した上清の500μl分画をドーパミンの分析用に使用した。
【００２５】
L−ドーパ、ドーパミン、及びアミン代謝産物の測定
L−ドーパ、ドーパミン、及びアミン代謝産物(DOPCA及びHVA)を、以前報告されたような(Soares-da-Silva  and Garrett,等、1990、Neuropharmacol.29.869-874；Soares-da-Silva、等、1998、Am.J.Physiol.274,F243-F251)、電気化学検出器を備えた高速液体クロマトグラフィーによって定量化した。高速液体クロマトグラフィーシステムは、圧力計モジュール(Gilson  model 802 C) に連結したポンプ(Gilson  model 302; Gilson Medical Electronics, Villiers le Bel, France),及び25cmの長さのステンレススチール5μmODSカラム(Biophase；Bioanalytical  Systems,  West  Lafayette,  IN)からなり、サンプルをGilsonダイリューター（model 401）に連結した自動サンプルインジェクター(Gilson model 231)によって注入した。移動相は、クエン酸(0.1mM)、オクチル硫酸ナトリウム(0.5mM)、酢酸ナトリウム(0.1m)、EDTA(0.17mM)、ジブチルアミン(1mM)、メタノール(8％v/v)の脱ガス溶液であり、過塩素酸(2M)でpH3.5へ調整され、1.0ml/分の速度で送り出された。検出を、ガラスカーボン電極、Ag/AgCl参照電極、電流検出器(Gilson  model 141)で電気化学的に行い、検出器セルは、0.75Vで作動した。生産した電流を、Gilson  712HPLCソフトウエアを使用してモニターした。L-ドーパ、ドーパミン、DOPAC、３−MT及びHVAの検出の低限は、350〜500fmolの範囲であった。
【００２６】
データ分析
飽和実験に決定されたように、L-ドーパの取り込み用にKm及びVmax値を、Graph  Pad  Prism統計ソフトウエアパッケージ(Motulsky,ｐ.Spannard,R.Neubig.Graph  Pad  Prism(バージョン1.0)、San  Diego,USA：GraphPadPrism  Sofuteare  Inc.,1994)を使用する非線形回帰分析から計算した。
【００２７】
先端の分画アウトフローを式
L-ドーパapical fluid/( L-ドーパapical fluid+ L-ドーパcell)
を使用して計算した。式中、L-ドーパapical fluidは、先端チャンバーに到達したL-ドーパ(nmol/mg タンパク質で)の量を示し、L-ドーパcell(nmol/mg タンパク質で)は、細胞単一層に蓄積したL-ドーパの量を示す。
【００２８】
計算手段は、S.E.M.によって与えられた。統計的な分析は、多重比較用ニューマン-ケイル(Newman-Keuls)テストにしたがって分散の一方向分析（ANOVA）によって行なった。0.05未満のP値は、かなりの違いを示すと仮定した。
【００２９】
結果
L−ドーパの非飽和濃度(0.5μM)の蓄積は、実験の時間経過において、いくらかの時間直線的に増加した。6分間インキュベーションで、取り込みが時間に関して直線で、細胞内の水が7.0±0.7μl/mgタンパク質(Soares-da-Silva,等、1998、Am.J.Physiol.274.F243-F251)であると考えられたとき、細胞内L−ドーパ濃度は、0.5μMの培地濃度で4.0±0.4μMであった。これは、相当する培地濃度より8倍高いL-ドーパの細胞濃度を示した。L-ドーパ先端トランスファーの動的パラメータを決定するのに設計された実験において、細胞を6分間基質濃度を増加させて(１〜250μM)インキュベートした。L−ドーパの飽和曲線の非線形分析は、47±８のKm値(μMで)及び3069±224のVmax値(pmol mg タンパク質/6分)を明らかにした。L-ドーパ取り込み用の代謝要求を評価するために、細胞を4℃でインキュベートした。予備インキュベーション及びインキュベーション中に37℃〜4℃へ温度を減少させた影響は、L−ドーパ蓄積(2.5μM)における顕著な減少だった(77±2％減少)。
【００３０】
細胞外ナトリウムの減少(140ｍMから70、35及０ｍMへ)は、L-ドーパの蓄積に影響を与えなかった。また、細胞外ナトリウムの不存在下において(コリンの等モル濃度で置換した)、L−ドーパのKm及びVmax値は、ナトリウムの存在下において観察されたものと同様であった。N-(メチルアミノ)−イソブチル酸(MeAIB)は、L−ドーパの取り込みに影響を与えない一方、2-アミノビシクロ(2,2,1)-ヘプタン-2-カルボン酸(BHC)は、L-ドーパ取り込み(IC50＝407μM)の濃度依存阻害を示した。L-ドーパの蓄積での1mMBHCの阻害効果は,L-ドーパ取り込みのKm(130±19μM)は増加するが、Vmax値(3783±244  pmol/mg タンパク質／6分は増加しないによって証明されるように競争型であった。一まとめにして考えると、これらの結果は、L-ドーパの先端外トランスファーは、BHC感度及びナトリウム非依存L-型アミノ酸トランスポーターを通じて促進することができる(Audus  and Borchardt, 1986 , J.Neutochem. 47, 484-488)。
【００３１】
L-ドーパ腎臓細胞外トランスファーの阻害剤は、EC50の濃度依存法で、６から339μMまでL-ドーパ(2.5μM)の蓄積が増加するのを見出した(図1)。テスト化合物での細胞の予備処理は、Km値の顕著な変化なしにL-ドーパの濃度を増加させて最大蓄積(Vmax)をかなり増加(p＜0.05)させることを見出した。
【００３２】
テスト化合物によって誘導されたL−ドーパの増加した蓄積は、(最近蓄積した)細胞内L-ドーパの減少した外部トランスファーのためのであることを証明するために、ポリカーボネートフィルターで培養した細胞を、基底細胞境界から適用したL-ドーパ(25μM)でインキュベートし、L-ドーパの基底から先端への流量を測定した。図2に示すように、テスト化合物は、L-ドーパの基底から先端への流量を顕著に減少させて、細胞内のL-ドーパの蓄積を増加させて、明白にL−ドーパ腎臓細胞外トランスファーの阻害剤としてのそれらの効果を示した。
【００３３】
実験の次の段階は、AADC上のテスト化合物の阻害特性を評価するものである。この目的のために、LLC-PK1細胞を30分間テスト化合物又はベンセラジドの濃度を増加させて、予備インキュベートして、その後、細胞を飽和に近いL-ドーパの濃度(250μM)でインキュベートした。図3に示すように、L-ドーパのドーパミンへの転化によって測定されたように濃度依存法においてAADC活性を阻害するのを見出した。IC50は、0.07μM(ベンセラジドに対して)から393μM(効力の少ないものに対して)まで変化した。
【００３４】
生体内で行なった実験において、L-ドーパ又はL-ドーパプラスベンセラジドの投与30分前に経口ルートでテスト化合物をラットに与えた。ベンセラジドの高い投与量は、脳におけるAADCの阻害を生じるかもしれないので(Da  Prada等、1987、Eur.Neurol、27,9−21)、脳におけるAADC活性の影響のないベンセラジドの投与量を決定するために、予備実験を行なった。
【００３５】
図4に示すように、脳AADC上の影響のない肝臓及び腎臓AADCの最大阻害を達成するベンセラジドの投与量は、その他のデータと完全に一致する3mg/kgベンセラジドであった(Da  Prada等、1987、Eur.  Neurol.27,9-20)。人において通常使用されるL-ドーパ/ベンセラジドの割合(4:1)を確かめるために、使用されたL-ドーパの投与量を12mg/kgで設定した。
【００３６】
L-ドーパ(12mg/kg)プラスベンセラジド(3mg/kg)投与30分前に、レスバラトールを経口的に非麻酔ラットへ与えたとき、脳においてL-ドーパ、ドーパミン、及びアミン代謝産物の組織レベルにおける顕著な増加であった(表１)。L-ドーパの血漿レベルにおける増加(図5)と腎臓におけるL-ドーパ及びドーパミンの組織レベルにおける増加(表1)は、これらの効果を達成した。レスバラトールのAADC阻害効果は、L-ドーパの有用性を向上させるのに大きく関与しない可能性がある。第一に、テストレスバラトールを与えたラットの腎臓のおけるドーパミンレベルは、相当するコントロール(L-ドーパプラスベンセラジドを与えたラット)より大きかった。第二に、肝臓及び腎臓AADC活性(肝臓、48％減少、腎臓38％減少)での30mg/kgのレスバラトールの阻害効果は、ベンセラジドに対して観察されたものよりかなり低かった(図4)。
【００３７】
一つにまとめて考えると、上述したデータは、L−ドーパ腎臓細胞外トランスファー阻害剤は、血漿におけるL−ドーパのより高いレベルを生じ、脳へのその有用性を向上させることを証明する。
【００３８】
【表１】
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表１  担体(0.5％カルボキシメチルセルロース、4ml/kg)、L-ドーパ(L,12mg/kg)、L-ドーパ(L,12mg/kg)プラスベンセラジド(B,3mg/kg)、及びレスバラトール（R）プラスL-ドーパ（L,１２mg/kg）プラスベンセラジド(B,3mg/kg)の投与後の脳及び腎臓におけるL-3,4ジヒドロキシフェニルアラニン（L-ドーパ）、ドーパミン(DA)、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、ホモバニリン酸（HVA）のレベル(ｎg/gで)。L-ドーパ＋ベンセラジドの30分前にレスバラトールを投与して、ラットをL-ドーパ+ベンセラジド投与60分後ラットを忌避した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、6分間37℃で2.5μMの物質（L-ドーパ）でインキュベートしたLLC-PK1細胞でのL−ドーパの蓄積におけるテスト化合物の影響を示すグラフである。
【図２】  図２は、6分間37℃で25μMの基底外側の細胞境界から適用された物質（L-ドーパ）でインキュベートしたLLC-PK1細胞でのL−ドーパの先端の流量(図2a)と細胞蓄積(図2b)におけるテスト化合物の影響を示すグラフである。
【図３】  図３は、6分間37℃で250μMの物質（L-ドーパ）でインキュベートしたLLC-PK1細胞でのL−ドーパのデカルボキシル化におけるテスト化合物の影響を示すグラフである。
【図４】  図４は、体積最大状態で（５ｍML−ドーパ、15分インキュベート）測定された脳、肝臓、腎臓芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼ（AADC）活性でのベンセラジドの増加フェニルベンゾピラン誘導体、トランス-スチルベン誘導体、又は3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6−トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン（フロリジン）から選択される阻害剤濃度の影響を示すグラフである。
【図５】  L-ドーパ(12mg／kg)と、ベンセラジド(3mg／kg)とレスバラトールを与えられたネズミの血漿におけるL-ドーパのレベルでのレスバラトールの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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