(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のリポ蛋白分画中のコレステロールを測定する際に、非イオン界面活性剤を選択して他のリポ蛋白分画を消去した後、前記非イオン界面活性剤とは異なる非イオン界面活性剤を用いて特定のリポ蛋白分画中のコレステロールを測定する方法。
【請求項２】
他のリポ蛋白分画が高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白分画であり、選択される非イオン界面活性剤がアシルポリオキシエチレンソルビタンエステルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定のリポ蛋白分画が高比重リポ蛋白分画であり、異なる非イオン界面活性剤がアルキルポリオキシエチレンエーテルである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１に記載の測定する方法に使用される試薬を含むコレステロール測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）分画中のコレステロール（以下「ＨＤＬコレステロール」ともいう。）の定量方法及び定量用試薬キットに関し、とりわけ臨床検査の分野において、血清などの生体試料中のＨＤＬコレステロールの定量方法、及びＨＤＬコレステロール定量用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のリポ蛋白はその比重により、カイロミクロン（比重＜１．００６）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ，比重１．００６〜１．０１９）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ，比重１．０１９〜１．０６３）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ，比重１．０６３〜１．２１）などに分類され、これらのリポ蛋白の代謝に影響を与える疾患についての研究が進められてきた。中でもＨＤＬについては、その分画中の成分であるコレステロールが虚血性心疾患に密接に関係するとの１９７７年のＦｒａｍｉｎｇｈａｍの報告以来、急速に研究が進んでいる。
【０００３】
従来、ＨＤＬコレステロールの定量は沈殿分画法、超遠心法、電気泳動法などにより分離されたＨＤＬ分画について、その成分であるコレステロールが公知の方法にて測定されている。臨床検査での測定では、沈殿分画法がよく行われている。これは沈殿剤を用いてＨＤＬ以外のリポ蛋白分画を沈殿させ、それを遠心分離してＨＤＬ分画を得る。このときの沈殿剤としては、ポリアニオンと２価のカチオンとの組み合わせが良く用いられる。このようなポリアニオンにはポリエチレングリコール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などがあり、また２価のカチオンとしてはＭｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｌｉ、Ｎｉなどが知られている。
【０００４】
次に、遠心分離により得られたＨＤＬ分画中のコレステロールを定量する公知の方法としては、酵素反応による測定が良く用いられる。なかでも、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）を用い、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と色原体とを組み合わせて可視部領域で吸光度を測定する方法が良く知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の沈殿剤を用いる方法で、ＨＤＬ分画を分離するには、遠心分離の操作が必要となるため、臨床検査の日常業務で効率化のための自動分析装置を用いる場合には、直接利用できないという制約があった。そのためＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定するには支障があった。
【０００６】
本発明は、上述の課題を解決し、ＨＤＬコレステロールを効率良く測定することを目的とし、とりわけ臨床検査において自動分析装置を用いて測定できる有用な方法及びそのための試薬キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究した結果、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させる界面活性剤と、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレスレロールに対する酵素による作用を抑制させる界面活性剤とを用いることにより、ＨＤＬ分画中のコレステロールが測定できることを見い出した。そして、さらに研究を重ねた結果、上述の目的が達成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させて得られる反応生成物を反応系外に導き、次に界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する酵素による作用を抑制させるとともに、ＨＤＬコレステロールに酵素を作用させて反応を進行させることを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量方法に関するものである。
【０００９】
また、本発明は、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試薬とからなることを特徴とするＨＤＬコレステロール定量用試薬キットに関するものである。
【００１０】
本発明の試薬キットにおける、コレステロールに作用する酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）などが例示される。リポ蛋白分画中には、コレステロールの他にコレステロールエステルも含まれているので、通常、コレステロールエステルを加水分解させてコレステロールに変換させるために、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）をコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）と共存させる。
【００１１】
本発明の試薬キットにおける第１試薬中の酵素は、例えばＣＥの場合には、１単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌ、ＣＯの場合には、０．５単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌとなるように配合するが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１２】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画であるＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンなどに含まれるコレステロールに対して、上記酵素を優先的に作用させる界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常Ｃｎ  ソルビタンＥｘ  と略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するものであれば全て用いることができる。具体的な商品名としては、Ｔｗｅｅｎ  ２１（Ｃ１２ソルビタンＥ４  ）、Ｔｗｅｅｎ  ８１（Ｃ１２ソルビタンＥ５  ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｃ１２ソルビタンＥ２０）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（Ｃ１６ソルビタンＥ２０）、Ｔｗｅｅｎ  ６０（Ｃ１８ソルビタンＥ２０）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｃ１８：１ソルビタンＥ２０）、Ｅｍａｓｏｌ４１３０（Ｃ１８ソルビタンＥｘ  ）、Ｔｗｅｅｎ  ８５（Ｃ１７：１ソルビタンＥ２０）などが例示される。
【００１３】
本発明の試薬キットにおける第１試薬中の界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．０５ｗ／ｖ％となるように配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１４】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに対する上記酵素の作用を抑制させる界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常Ｃｎ  Ｅｘ  と略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するものであれば全て用いることができる。具体的な商品名としては、Ａｔｌａｓ  Ｇ２１２７（Ｃ１２Ｅ８  ）、Ｂｒｉｊ３６Ｔ（Ｃ１２Ｅ１０）、Ｎｏｐａｌｃａｌ６−Ｌ（Ｃ１２Ｅ１４）、Ｂｒｉｊ３５（Ｃ１２Ｅ２３）、Ｅｍｕｌｏｇｐｈｅｎｅ  ＢＣ７２０（Ｃ１２Ｅ９．８  ）、ＳｔｅｒｏｘＡＪ１００（Ｃ１３Ｅ９．５  ）、Ｂｒｉｊ５６（Ｃ１６Ｅ１０）、Ｂｒｉｊ５８（Ｃ１６Ｅ２０）、Ｂｒｉｊ７６（Ｃ１８Ｅ１０）、Ｂｒｉｊ９６（Ｃ１８：１Ｅ１０）、Ｂｒｉｊ７８（Ｃ１８Ｅ２０）、Ｂｒｉｊ９８（Ｃ１８：１Ｅ２９）などが例示される。
【００１５】
本発明の試薬キットにおける第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５ｗ／ｖ％〜２ｗ／ｖ％となり、また第１試薬中に配合される界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルよりも高濃度となるように配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１６】
本発明の定量方法では、まずコレステロールに作用する酵素と、上記界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルと、試料とを混合させる。すると、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルの存在により、反応液中に含まれる酵素が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに優先的に作用する。
【００１７】
酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合には、酵素の作用によりコレステロールの反応生成物として過酸化水素が生成する。本発明の定量方法においては、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを反応系に混在させる前に、生成した反応生成物を反応系外に導く必要があり、例えば色原体が用いられる。色原体は、ニトロ基、アゾ基、カルボニル基、エチレン結合、シアン基などの発色団を含み、水酸基、アミノ基などの助色団を含まない有機化合物である。本発明において用いられ得る色原体としては、単独では発色能力が弱いが、上記助色団を含む有機化合物が共存することにより、発色能力が増強されるものが好ましい。反応生成物が過酸化水素である場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム塩（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などの色原体と過酸化水素とを反応させて、無色の複合体を形成させ、過酸化水素を反応系外に導くことができる。
【００１８】
通常、ＰＯＤは、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌ、色原体の濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％とするが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１９】
次に、反応液中に、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを混在させることによって、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対して、酵素の作用が抑制されるとともに、酵素がＨＤＬコレステロールに対して作用し、酵素の作用によりコレステロールの反応が進行する。
【００２０】
酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合には、この反応により過酸化水素が生成される。この過酸化水素は、ＰＯＤの存在下で、例えば４−アミノアンチピリンなどの助色団を含む有機化合物（０．００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．０５ｗ／ｖ％）と、色原体とを縮合反応させ、キノン色素を生成させる。なお、色原体としては、上述のＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどを挙げることができる。このキノン色素を比色測定することによって、ＨＤＬコレステロールが測定できる。比色測定は既知の方法により行うことができ、例えば自動分析装置を用いて行うことができる。
【００２１】
本発明方法における各反応、即ち第２試薬を反応系に混在させる前または混在させた後の各反応は、それぞれ通常、室温下で、１分間〜１０分間、好ましくは３分間〜７分間行なわれるが、特にこの条件に限定されるものではない。
【００２２】
本発明のＨＤＬコレステロール定量用試薬キットは、前述の界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試薬とからなる。
【００２３】
第１試薬中の酵素には、例えばＣＥ、ＣＯなどを挙げることができる。また第１試薬中には、酵素の他に、通常例えば、酵素ＰＯＤ、さらにＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどの色原体が配合され得るが、これらの色原体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどは配合されない。
【００２４】
これに対して、第２試薬中には、当該界面活性剤の他に、通常、色原体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどが配合される。
【００２５】
なお、本発明の試薬キットは、遅くともＨＤＬコレステロールの定量測定時において、このように第１及び第２の二種類の試薬に分かれていれば良い。従って、一般に試薬キットとしての形態は、安定性などを考慮して三種類以上の試薬に分けておき、測定のため使用時において上記の第１及び第２の二種類の試薬に調製するようなものでも良い。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
〔実施例１〕
界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルとして商品名がＴｗｅｅｎ８５、また界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルとして商品名がＢｒｉｊ９８の界面活性剤をそれぞれ使用して、次の第１及び第２試薬を準備した。
【００２８】
〈第１試薬〉
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１２ｍｇ／ｍｌのＨＤＡＯＳ、０．６単位／ｍｌのＰＯＤ、１０単位／ｍｌのＣＯ、１０単位／ｍｌのＣＥ、０．０１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８５
【００２９】
〈第２試薬〉
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピリン、１．５ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ９８
【００３０】
日立７１７０型自動分析装置を用いて、試料４μｌに第１試薬２５０μｌを加え、５分後に第２試薬５０μｌを加え、５分後に波長６００ｎｍ／７００ｎｍで測定した。試料としてＨＤＬコレステロール濃度が１５０ｍｇ／ｄｌの血清を１０段階に希釈したものを用いたところ、表１に示すように、良好な直線性が得られた。
【００３１】
【表１】
0003614514.tif 000002
【００３２】
この実施例においては、第１試薬を添加した後に、遠心分離などの煩雑な操作を必要とせず、試料中に第２試薬を添加するだけで、試料中のＨＤＬコレステロールの量に対応して生成されたキノン色素の比色測定が行なわれる。
【００３３】
〔実施例２〕
実施例１と同様の試薬を用いて、同様に日立７１７０型自動分析装置で２０例のヒト血清を試料として測定し、標準液の測定からＨＤＬコレステロール値を求めた。そして同じ試料について市販製品〔商品名：ＨＤＬ−コレス（ＰＧ）、国際試薬社製〕を用いて測定した値と比較した。その結果、表２に示すように、良好な相関性が得られた。
【００３４】
【表２】
0003614514.tif 000003
【００３５】
【発明の効果】
本発明のＨＤＬコレステロールの定量方法によれば、従来、沈殿分画法において必要とされていた遠心分離の操作が不要となるので、操作が簡略化され、多数の試料を短時間で、かつ容易に処理できる。しかも２種類の試薬を用いる方法に応用できるので、汎用型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能となり、ＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定することができる。また、試料を取り扱う上で、試料に直接手を触れる機会が著しく減少するので、ウイルス感染の危険性も減少する。さらに、微量の試料に対しても測定可能であるので、小児や老人など採血量に制限がある場合でも測定が可能となる。従って、本発明方法は、臨床検査の分野において極めて有用であり、臨床検査の日常業務における作業効率の向上に貢献することができる。
【００３６】
また、本発明のＨＤＬコレステロール定量用試薬キットは、本発明方法を実施するための試薬キットとしての効果を奏する。