(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルスゲノムの可欠領域にマレック病ウイルスからのＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスがＴＲＯＶＡＣであることを特徴とする組換えポックスウイルス。
【請求項２】
前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの構造タンパク質をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
前記ＤＮＡがマレック病ウイルスの糖タンパク質をコードすることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢまたは糖タンパク質ｇＤをコードすることを特徴とする請求の範囲第３項記載の組換えポックスウイルス。
【請求項５】
ワクチンを接種した宿主動物に免疫応答を誘発するワクチンであって、担体と、ポックスウイルスゲノムの可欠領域にマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢまたは糖タンパク質ｇＤをコードするＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスとを含み、前記ポックスウイルスがＴＲＯＶＡＣであることを特徴とするワクチン。
【請求項６】
前記宿主動物がニワトリであることを特徴とする請求の範囲第５項記載のワクチン。
【請求項７】
動物（ヒトを除く）においてマレック病に対する防御免疫を誘発する方法において、担体と、ポックスウイルスゲノムの可欠領域にマレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＤをコードするＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスとを含むワクチンを前記動物に投与する工程を含み、前記ポックスウイルスがＴＲＯＶＡＣであることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記動物がニワトリであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
前記ワクチン投与されるニワトリが生後初日のニワトリであることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンが皮下投与されることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は修飾ポックスウイルスおよびその製造方法並びに使用方法に関するものである。本発明はさらに詳しくは、そのウイルスがマレック病ウイルス（ＭＤＶ）遺伝子の遺伝子産生物を発現させる組換えポックスウイルス、およびＭＤＶ感染に対して防御免疫を与えるワクチンに関するものである。
本出願において、いくつかの出版物を引用している。これらの参照文献の完全な引用は、請求の範囲の直前で明細書の終りに記載してある。これらの参照文献は本発明が関連する従来技術である。
発明の背景
ワクシニアウイルスおよび最近では他のポックスウイルスが、異種遺伝子の挿入および発現に使用されている。異種遺伝子を生感染ポックスウイルスに挿入する基本技術の例としては、供与体プラスミド中に異種遺伝要素を側腹に有する（flanking）ポックスＤＮＡ配列とレスキュー（rescuing）ポックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換えが挙げられる（ピッチーニ等、1987）。
具体的には、組換えポックスウイルスは従来技術で知られており、米国特許第4,603,112号に記載されているワクシニアウイルスの合成組換え体の産生方法と同様な２段階で構成される。この特許をここに引用する。
第１に、ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス源からの読取り枠を、ポックスウイルスのＤＮＡの切片と相同のＤＮＡが挿入されるＥ．ｃｏｌｉプラスミド構成物中に配する。別々に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに連結する。プロモーター−遺伝子結合が、可欠座を含有するポックスＤＮＡの領域を側腹に有するＤＮＡ配列と相同のＤＮＡにより両端の側腹にあるように、プロモーター−遺伝子結合をプラスミド構成物中に配置する。産生したプラスミド構成物を次いでＥ．ｃｏｌｉバクテリア内での成長により増幅し（クレウェル、1972）、単離した（クレウェル等、1969；マニアチス等、1982）。
第２に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離したプラスミドをポックスウイルスとともに細胞培養体（例えば、ニワトリ胚胎繊維芽細胞）中にトランスフェクションする。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとそれぞれのウイルスゲノムとの間の組換えによって、ゲノムの可欠領域において、異種ＤＮＡ配列の存在により修飾されたポックスウイルスが得られる。「異種」ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からなるＤＮＡを意味し、これは外因性ＤＮＡを配置するゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコード化する。
遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間のＤＮＡの相同切片の交換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡの役割を果たしている。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の切片である。
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新しいウイルスゲノムの複製または製造中に自然に行なわれている。したがって、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルスまたは遺伝子構成物に共感染した（co-infected）宿主細胞中で行なわれるウイルス複製サイクル中に行なわれている。第１のゲノムからのＤＮＡの切片は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムのＤＮＡと相同である第２の共感染ウイルスのゲノムの切片を構成する際に相互に交換可能に用いられる。
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの切片間にも行なわれ得る。そのような切片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分に挿入される抗原決定基のための遺伝子コード化または遺伝子マーカーの第１の切片内に存在することを除いて、別のゲノムの切片と相同の第１のゲノムからのものである場合、組換えがまだ行なわれ得、その組換えの産生物は、その組換えウイルスゲノム中の遺伝子または前記遺伝子マーカーの存在により検出可能である。
修飾感染ウイルスによる挿入（inserted）ＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるのには２つの条件を満たす必要がある。第１に、修飾ウイルスが生存可能であるように、挿入はウイルスの可欠領域中に行なわれなければならない。挿入ＤＮＡを発現するための第２の条件は、挿入ＤＮＡに対して適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現すべきＤＮＡ配列より上流に位置するように配置しなければならない。
弱毒ベクターは、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株からの６つの可欠領域を順次欠失することにより発生させた。これらの領域は、ウイルス毒性における役割を有しているタンパク質をコード化することが知られている。欠失される領域は、ｔｋ遺伝子、出血性遺伝子、Ａ型封入遺伝子、血球凝集素遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素の巨大サブユニット並びに以前に定義したＣ７ＬからＫ１Ｌまでの配列である（パーカス等、1990）。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株中のこれらの遺伝子の配列およびゲノム位置は以前に定義している（ゲーベル等、1990ａ、ｂ）。産生した弱毒ワクシニア菌株をＮＹＶＡＣと称する。
ワクシニアウイルス組換え体を産生する技術は、より宿主範囲が制限されたポックスウイルスの系統群の他のものにまで最近広がってきた。
鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）は好ましくは家きん病原体からの抗原を発現するベクターとして産生されている。毒性鳥インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換え体中に発現された（テイラー等、1988ａ）。組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、相同または非相同の毒性インフルエンザウイルス抗原投与のいずれかに対して防御する免疫応答が誘発された（テイラー等、1988ａ）。さらに、ニューカッスル病ウイルスの毒性菌株の表面糖タンパク質（融合および血球凝集素）がＦＰＶベクター中に発現され、防御免疫応答を誘発することが示されている（テイラー等、1990；エドバウアー等、1990；バースネル等、1990ａ、ｂ）。
ＦＰＶはポックスウイルス科のアビポックス属の原型ウイルスである。このウイルスは、生弱毒ワクチンの使用により1920年代以来じょうずにコントロールされている、家きんにおける経済的に重要な病気の原因である。アビポックスウイルスの複製は鳥類に限定されており（エスポシト、1991）、このウイルスがヒトを含む非鳥類において増殖感染することについての報告はどの文献にもない。このような宿主の限定は、ウイルスの他の種への伝染に対して固有の安全障壁を与え、それによってＦＰＶを家きんのワクチンベクターとして使用することが有用性を有するものとなる。
マレック病は、ヘルペスウイルスＭＤＶの感染により生じたニワトリのリンパ増殖（lymphoproliferative）病である。この病気は、以下の部位１つ以上の単核浸透により特徴付けられる；末梢神経、生殖腺、虹彩、様々な内臓、筋肉および皮膚（カルネックおよびウィッター、1991）。関連のある３つの血清型がある；（1）腫瘍遺伝子ＭＤＶを含有する血清型１、（2）非腫瘍遺伝子ＭＤＶを含有する血清型２、および（3）密接に関連した七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を含有する血清型３。
シャトがＭＤＶの生物学を考察した（1987）。ＭＤＶの感染の様式は鳥間の直接的な接触または間接的な接触によるものであり、空気伝染経路によりウイルスを広げさせる。最初の接触後、ウイルス感染の３つの段階が明らかである。第１段階は初期の細胞溶解性の感染として定義される。この段階中は、結果として細胞を含まないウイルスを放出する増殖感染が羽胞上皮（ＦＦＥ）中に生じる。同時に、非増殖複製がリンパ器官中に生じる。この段階において、増殖制限感染として定義されるＤＮＡ複製が生じ、ＭＤＶ抗原が発現されるが、産生されたウイルス粒子は非被覆（non-enveloped）であり、したがって、非感染性である（カルネックおよびウィッター、1991）。増殖制限感染の結果、マクロファージと顆粒球の浸透および脾臓腫脹（splenic enlargement）に導かれる細網細胞の増生を伴ってＢリンパ球が壞死する（ペイン等、1976）。結果として、Ｔ細胞が活性化され、ＭＨＣクラスII（Ia）抗原を発現する（シャト、1987）。休止Ｔ細胞ではなく、活性化されたＴ細胞は、ＭＤＶによる感染に感受性を有するようになる（カルネック等、1984、1985）。したがって、初期細胞溶解感染に関連する一過性免疫抑制はおそらく、脾臓およびのう（bursa）におけるＢ細胞の溶菌感染によるものである（シャト、1987）。
この段階に続いて、感染した鳥は潜伏感染として定義される第２段階に進む。感染Ｔ細胞内にウイルスゲノムは存在するが、この感染Ｔ細胞はウイルス抗原もウイルス粒子も産生しない。潜伏感染は、鳥の最初の感染から約６日後に確立される。
第３段階および最終段階は、第２細胞溶解感染、免疫抑制および腫瘍形成により特徴付けられる。この種の感染は、毒性血清型１ウイルスによりのみ生じる。第２の細胞溶解感染はＦＦＥにおいて生じ、これは感染細胞を含まないウイルスが産生される唯一の区域である。腫瘍形成におけるこの炎症感染の重要性は明らかではないが、潜在感染したリンパ球は、幼若化を経験するＦＦＥに引き付けられると考えられている。このことは腫瘍細胞中へのトランスフォーメーションのための必要条件となっている。さらに、非感染リンパ球は、腫瘍細胞に細胞溶解的に感染またはトランスフォーメーションする感染部位に引き付けられる（シャト、1987）。永久的な免疫抑制はしばしばこの時点で明らかとなる。潜在感染からの変化はまた、内臓器、神経、筋肉および皮膚における腫瘍形成により特徴付けられる（ペイン等、1976；ペイン、1985）。腫瘍細胞は今では多くのＭＤＶ抗原を発現する。
ワクチンを使用する以前は、ＭＤＶは、家きん工業にとって経済的に重要な病気を構成した。現在のワクチンには３種類のものがある：（1）非常に弱毒化した血清型１ウイルス、（2）天然の無毒性血清型２ウイルス、または（3）血清学的に関連したＨＶＴウイルス。最も効果的で最も広く用いられるのは、尾崎等により開発されたＨＶＴワクチンである（1970）。現在のワクチン接種の戦略には、ワクチンの不適切な取扱い、母性抗体と関連ストレスによる干渉および同時感染によって発生した問題がある。さらに、ＨＶＴによる免疫化のみでは防御しない非常に毒性の強いＭＤＶ菌株が出現したことにより、ワクチンに多くの血清型を含むことになった（カルネックおよびウィッターにより調査された、1991）。
ＭＤＶ単離体は、リンパ球のためのプレディレクション（predilection）に基づいてガンマヘルペスウイルスとして分類されている。しかしながら、近年では、ＭＤＶのゲノム構成を理解することに著しい努力が費される、ガンマヘルペスウイルスよりもアルファヘルペスウイルスとより遺伝的に相同性があることが明らかである（ロス等、1989、1991）。この手法を用いて、免疫応答を誘発するのに重要な多くの抗原を同定してきた。これらの抗原の中には、ＨＳＶ１  ｇＢ相同体（homolog）およびＨＳＶ  ｇＤ相同体がある。ＨＳＶ１  ｇＢ相同体はロス等により同定された（1989）。他のヘルペスウイルス病において、ｇＢ糖タンパク質は、液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答を誘発し、防御免疫を与えることが示されている（カンチス等、1987；マーチオリ等、1987；グオ等、1990）。ＭＤＶ感染細胞においては、Ｂ抗原は、100ｋＤ、60ｋＤおよび49ｋＤの分子量を有する糖タンパク質の複合体である（カルネックおよびウィッター、1991）。抗原は感染細胞の表面上と細胞室中に位置し（加藤および平井、1985）、中和抗体を誘発すると考えられる（小野等、1985）。同様に、ＨＳＶ−１  ｇＤのＭＤＶ相同体はロスおよびビンス（1991）並びにロス等（1991）により同定された。ＨＳＶ  ｇＤは、ＨＳＶ感染に対する効果的な免疫原であることが示されている（パオレッティ等、1984；クレマー等、1985）。
ＭＤＶに対する現在のワクチン接種の戦略はきわめて成功しているが、現在のＨＶＴワクチンにより適切には制御されない非常に毒性の強いＭＤＶ菌株が出現したことによって、ワクチン中の毒性の強い菌株の多数の免疫原を含有して広い免疫応答を付与し得ることが分かる。
したがって、ＭＤＶ感染に対する防御免疫を供し、かつＭＤＶの多数の免疫原が発現され得る組換え体を元としたワクチン、およびＭＤＶ組換えポックスウイルスを提供することが、現在の技術状態より優れた非常に望ましい進歩である。
発明の目的
したがって本発明の目的は、ＭＤＶの遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルスを提供すること、並びにそのような組換えポックスウイルスを製造する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、ＭＤＶ暗号配列、特に、ポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイルスベクターまたは鶏痘ウイルスベクター中の、抗原的に適切なＭＤＶからの糖タンパク質をコード化する配列のクローニングおよび発現を提供することにある。
本発明の別の目的は、ＭＤＶ中和抗体およびＭＤＶ感染に対する防御免疫を誘発できるワクチンを提供することにある。
本発明のこれらと他の目的並びに利点は以下の内容を検討した後には容易に明らかとなる。
発明の構成
ある実施態様において、本発明は、ポックスウイルスゲノムの可欠領域中にＭＤＶからのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウイルスに関するものである。ポックスウイルスは好ましくはワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスのようなアビポックスウイルスである。
本発明によると、組換えポックスウイルスは異種ＭＤＶ遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、異種ＤＮＡは、ＭＤＶからの構造タンパク質、特に抗原的に適切な糖タンパク質をコード化する。好ましくは、複数のＭＤＶ糖タンパク質は組換えポックスウイルスにより宿主中で共発現される。
別の実施態様において、本発明は、ワクチンを接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンであって、その可欠領域中にＭＤＶからのＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスおよび担体を含むワクチンに関するものである。好ましくは、ＤＮＡはＭＤＶ構造タンパク質、特にＭＤＶ糖タンパク質を発現する。複数のＭＤＶ糖タンパク質は好ましくは宿主中で共感染される。本発明のワクチンに使用するポックスウイルスは好ましくは、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスのようなアビポックスウイルスである。
【図面の簡単な説明】
添付した図面を参照して、本発明をより理解する。
第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６０の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示している。
第２図は、出血性領域を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４８６の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示している。
第３図は、ＡＴＩ領域を欠失するためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示している。
第４図は、血球凝集素遺伝子を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示している。
第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失するためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示している。
第６図は、大型サブユニットであるリボヌクレオチド  レダクターゼを欠失するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を模式的に示している。
第７図は、対照群（接種または接触により抗原投与した）およびワクチン接種した群（ｖＦＰ１０８によりワクチン接種し、接触により抗原投与した）についてのある期間に亘るニワトリの死亡率をプロットしたグラフ。
発明の詳細な説明
本発明は、ポックスウイルスゲノムの可欠領域にＭＤＶからのＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウイルスに関するものである。組換えポックスウイルスは異種ＭＤＶ遺伝子の遺伝子産生物を発現する。特に、ＭＤＶ構造タンパク質をコード化するＭＤＶ遺伝子を単離し、特徴付け、ＮＹＶＡＣ（ワクシニアウイルス）組換え体およびＴＲＯＶＡＣ（鶏痘ウイルス）組換え体に挿入した。
細胞系統およびウイルス菌株
ＦＰＶ指定（designated）ＦＰ−１の菌株について前述している（テイラー等、1988ａ、ｂ）。その菌株は、初生ひなのワクチン接種に有用な弱毒ワクチン菌株である。親ウイルスであるデュベット菌株は、フランス国、リヨンのローン  メリュークスから得た。ウイルス遺伝子学により得られたウイルスに４連続のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体を第１ＣＥＦ細胞中でさらに増幅し、ＴＲＯＶＡＣと称する保存ウイルス（stock virus）を産生した。
ＴＲＯＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣベースの組換え体についての組換え試験、プラーク検定および増幅の全ては、ＳＰＦ起源の生後10日から11日の感染幼虫包蔵卵から産生した第１ＣＥＦ単層中で行なった。
ＭＤＶ配列のレスキューとして使用したワクシニアウイルス菌株はＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）であった。ＮＹＶＡＣは、ウイルスの毒性および宿主範囲の制限を決定する際に用いられる18の読取り枠が欠失したことによりコペンハーゲン菌株から由来したワクシニアウイルスの非常に弱毒化された菌株である。組換え体のプラーク選択およびウイルス増幅はウサギの腎臓細胞で行なった（ＲＫ１３、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３７）。
プラスミドｐＭＤＶ５１７およびｐＵＣ１３ｇＢは、菌株ＲＢ１ＢからのＭＤＶ  ｇＤおよびｇＢ糖タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有している。プラスミドｐＵＣ１３ｇＢは、ＭＤＶのゲノムＤＮＡの3.9ｋｂのＤＮＡ断片を含有している（菌株ＲＢ１Ｂ）。ＭＤＶｇＢ遺伝子を含有している断片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片としてｐＵＣ１３中に挿入する。挿入した断片の配列はロス等の文献（1989）中に記載されている。プラスミドｐＭＤＶ５１７は、ＭＤＶのゲノムＤＮＡの5.2ｋｂのＤＮＡ断片を含有している（菌株ＲＢ１Ｂ）。ＭＤＶｇＤ遺伝子を含有している断片をｐＵＣ１３のＥｃｏＲＩ部位に挿入する。断片の配列はロス等の文献（1991）に記載されている。
実施例１−弱毒ワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ
新しいワクシニアワクチン菌株を開発するために、既知のまたは潜在的な毒性因子をコード化するゲノムの６つの可欠領域を欠失することにより、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を修飾した。連続的欠失を以下詳細に記載する。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌクレオチド位置の全ての命名は、ゲーベル等（1990ａ、ｂ）に報告された用語法に基づいている。
異種遺伝子の挿入のための受容座として欠失座を作成した。
ＮＹＶＡＣ中で連続的に欠失した領域を以下に列記する。省略型および欠失領域の読取り枠の名称（ゲーベル等、1990ａ、ｂ）並びに記載した欠失による全ての欠失を含有するワクシニア組換え体（ｖＰ）の名称もまた列記する。
（1）  チミジンキナーゼ遺伝子
（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖｐ４１０；
（2）  出血領域
（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（3）  Ａ型封入体領域
（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（4）  血球凝集素遺伝子
（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（5）  宿主範囲遺伝子領域
（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
（6）  大型サブユニット、リボヌクレオチド  レダクターゼ
（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを標準方法により構成し、スクリーニングし、成長させた（マニアチス等、1982；パーカス等、1985；ピッチーニ等、1987）。制限エンドヌクレアーゼを、メアリーランド州、ゲイサースバーグのギブコ／ＢＲＬ；マサチューセッツ州、ビバーリーのニュー  イングランド  バイオラボ；およびインディアナ州、インディアナポリスのベーリンガー  マイハイム  バイオケミカルから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片をベーリンガー  マイハイム  バイオケミカルから得た。ＢＡＬ−３１  エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４  ＤＮＡリガーゼをニュー  イングランド  バイオラボから得た。各々の供給元による指定にそって試薬を用いた。
前述したようにバイオサーチ８７５０または応用バイオシステムス３８０Ｂ  ＤＮＡシンセサイザーを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを調製した（パーカス等、1989）。前述したように（グオ等、1989）シーケナーゼ（タボア等、1987）を用いてジデオキシ鎖終止法（サンガー等、1977）によりＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキン  エルマー  セタスＤＮＡサーマル  サイクラー中で注文合成オリゴヌクレオチド  プライマーおよびジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（コネチカット州、ノルウォークのパーキン  エルマー  セタス）を用いて、配列確認のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断と続いてのＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる制限切断および合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドから過剰のＤＮＡ配列を欠失した。
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養条件および起源は前述してある（グオ等、1989）。組換え、ニトロセルロース  フィルタのその場での雑種形成およびＢ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウイルスの産生は以前に記載している（パニカリ等、1982；パーカス等、1989）。
チミジン  キナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６０の構成
第１図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６はｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ（位置83,359−88,377）を含有している。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＵＣ８中にＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左側からの1.7ｋｂ断片をクローニングし、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置83,855−84,385）の完全な遺伝子を含有している。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内に含まれており、終止コドンはＳｓｐＩ部位内に含まれている。転写の方向は第１図の矢印により示している。
左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４４７から0.8ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を単離して、次いでＮｌａＩＩＩで切断し、0.5ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列認識番号１／配列認識番号２）
0003706130.tif 000002
を、0.5ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩ断片と連結してＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミド中にクローニングし、プラスミドｐＳＤ４４９を産生した。
ワクシニア右側フランキングアームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内のＳｓｐＩ（部分的）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、2.9ｋｂのベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列認識番号３／配列認識番号４）
0003706130.tif 000003
に連結し、ｐＳＤ４５９を産生した。
左側フランキングアームと右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、0.5ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を産生した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２の供与体プラスミドとして用いた。テンプレートとしてＭＰＳＹＮ４５（配列認識番号３）およびプライマーとして補体２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド  ＭＰＳＹＮ４７（配列認識番号５）（５′ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣ３′）を用いたプライマー延長により、32Ｐ標識プローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０をプラーク雑種形成により同定した。
出血性流域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４８６の構成
ここで第２図を参照する。プラスミドｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置160,744−173,351）を含有している。ｐＳＤ４２２はｐＵＣ８中にクローニングされた、右側に接触したワクシニアＳａｌＩ断片、ＳａｌＩ  Ｊ（位置173,351−182,746）を含有している。出血性領域であるｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置172,549−173,552）の欠失したプラスミドを構成するために、ｐＳＤ４１９を左側フランキングアームの供給源として用い、ｐＳＤ４２２を右側フランキングアームの供給源として用いた。ｕ領域の転写方向は第２図の矢印により示している。
好ましくない配列をｐＳＤ４１９から除去するために、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとして連結し、プラスミドｐＳＤ４７６を産生することにより、ＮｃｏＩ部位（位置172,253）の左側の配列を除去した。ｐＳＤ４２２をＢ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａＩにより切断し、右側に0.3ｋｂのＮｒｕＩで切断することにより、ワクシニア右側フランキングアームを得た。この0.3ｋｂ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した3.4ｋｂのＨｉｎｃＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生した。ｐＳＤ４７７中でワクシニアｕ領域が部分的に欠失した位置を三角形により示している。ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒ暗号配列を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩで切断することにより除去し、生成したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列認識番号６／配列認識番号７）
0003706130.tif 000004
と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９はＢａｍＨＩ部位の後に開始コドン（下線）を含有している。ｕプロモーターのコントロール下でＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座にＥ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼを配するために、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.2ｋｂのＢａｍＨＩ断片（シャピラ等、1983）をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧを産生した。ワクシニアウイルスｖＰ４１０による組換えのための供与体プラスミドとしてｐＳＤ４７９ＢＧを用いた。色素基質Ｘ−ｇａｌの存在下で組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３をブループラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失しており、ベータ−ガラクトシダーゼにより置き換えられている。
ｖＰ５３３からベータ−ガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠失接合部に開始コドンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に、上述したｐＳＤ４７７からのＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列認識番号８／配列認識番号９）
0003706130.tif 000005
と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生した。次に、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとし、連結してプラスミドｐＳＤ４７８Ｅ-を産生することにより、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩ部位を破壊した。ｐＳＤ４７８Ｅ-をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列認識番号１０／配列認識番号１１）
0003706130.tif 000006
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生した。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３による組換えのために供与体プラスミドとしてｐＳＤ４８６を用いて、ｖＰ５５３を産生した。ｖＰ５５３はＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）を欠失するためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成
ここで第３図を参照する。ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側の好ましくないＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４１４をワクシニア配列内のＸｂａＩ（位置137,079）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとし、連結してプラスミドｐＳＤ４８３を産生した。Ａ２６Ｌ領域の右側の好ましくないワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置140,665およびｐＵＣ／ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を産生した。Ａ２６Ｌ暗号領域を除去するために、ｐＳＤ４８４を、Ａ２６Ｌ  ＯＲＦ（位置139,004）からわずかに上流のＮｄｅＩ（部分的）およびＡ２６Ｌ  ＯＲＦからわずかに下流のＨｐａＩ（位置137,889）で切断した。5.2ｋｂのベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列認識番号１２／配列認識番号１３）
0003706130.tif 000007
と連結し、Ａ２６Ｌの上流の領域を再構成し、Ａ２６Ｌ  ＯＲＦを、上述した制限部位ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域で置き換えた。産生したプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中のＢａｌＩＩとＥｃｏＲＩ部位は固有のものではないので、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ（位置140,136）で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとして連結することにより、プラスミドｐＳＤ４８３（上述）からＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を除去した。生成したプラスミドをｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ  ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９からの1.8ｋｂのＣｌａＩ（位置137,198）／ＥｃｏＲＶ（位置139,048）断片を、ｐＳＤ４８５からのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を含有する対応0.7ｋｂポリリンカーと置き換えて、ｐＳＤ４９２を産生した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩは固有のものである。
ワクシニア１１ｋＤａのプロモーターのコントロール下で（バーソレット等、1985；パーカス等、1990）Ｅ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.3ｋｂのＢｇｌＩＩカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。レスキューウイルスｖＰ５５３による組換えにプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いた。Ａ２６Ｌ欠失領域にベータ−ガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１をＸ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベータ−ガラクトシダーゼ配列を除去するためのプラスミドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列認識番号１４）
0003706130.tif 000008
を用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠失した。産生したプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６Ｌ  ＯＲＦを含有するワクシニアＤＮＡ包含位置［137,889−138,937］を欠失する。ベータ−ガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ５８１とｐＭＰ４９４Δとの間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が産生され、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成
ここで第４図を参照する。ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限断片（位置160,744−173,351）はＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ／Ｂ接合部（位置162,539）と交差している。ｐＳＤ４１９はｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図の矢印により示す。ｐＳＤ４１９をワクシニア配列内とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、続いて連結することにより、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｂから誘導したワクシニア配列を除去した。生成したプラスミドｐＳＤ４５６は、0.4ｋｂのワクシニア配列を左側と右側の側腹にそれぞれ有するＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを含有している。ｐＳＤ４５６をＡ５６Ｒ暗号配列から上流のＲｓａＩ（部分的；位置161,090）およびこの遺伝子の末端近くのＥａｇＩ（位置162,054）で切断することによりＡ５６Ｒ暗号配列を除去した。ｐＳＤ４５６から3.6ｋｂのＲｓａＩ／ＥａｇＩベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列認識番号１５）、ＭＰＳＹＮ６２（配列認識番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列認識番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１（配列認識番号１８）
0003706130.tif 000009
と連結し、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦを上述したポリリンカー領域と置き換えた。産生したプラスミドはｐＳＤ４６６である。ｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は、位置［161,185−162,053］を含有している。ｐＳＤ４６６中の欠失部位は第４図の三角形により示している。
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターのコントロール下で（バーソレット等、1985；グオ等、1989）Ｅ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼを含有している3.2ｋｂのＢａｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的）（シャピラ等、1983）をｐＳＤ４６６のＢａｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８による組換えに用いた。Ａ５６Ｒが欠失している部位にベータ−ガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８をＸ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベータ−ガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０８から欠失した。ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとして連結したことにより、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位がｐＵＣ／ワクシニア接合部から除去されていることを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えの結果として、組換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３を得た。ｖＰ７２３は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失するためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成
ここで第５図を参照する。ｐＭＰＣＳＫ１Δの構成に、以下のワクシニアクローンを用いた。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵＣ１８にクローニングされたＫｐｎＩ  Ｆである。ｐＳＤ４３５をＳｐｈＩで切断し、再連結してｐＳＤ４５１を形成した。ｐＳＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ中のＳｐｈＩ部位（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列は除去されている（パーカス等、1990）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍである。
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターを欠失するための基質を用意するために、以下のようにＥ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼを最初にワクシニアＭ２Ｌ欠失座（グオ等、1990）に挿入した。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中のＢｇｌＩＩ（位置28,212）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢａｍＨＩで切断し、連結してプラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。ｐＭＰ４０９Ｂを固有のＳｐｈＩ部位（位置27,416）で切断した。合成オリゴヌクレオチド
0003706130.tif 000010
を用いた突然変異誘発（グオ等、1990；マンデッキ、1986）によりＭ２Ｌ暗号配列を除去した。生成したプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上述したようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された固有のＢｇｌＩＩ部位を含有している。１１ｋＤａのプロモーターのコントロール下で（バーソレット等、1985）Ｅ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼを含有する3.2ｋｂのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩカセットを、ＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄに挿入した。レスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３による組換えのための供与体プラスミドとして、生成したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオ等、1990）を用いた。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベータ−ガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠失したプラスミドをＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８中に組み入れて、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとした。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ配列からなる左フランキングアームを、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置18,628）で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドとし、ＢｇｌＩＩ（位置19,706）で切断することにより得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ配列からなる右フランキングアームを、ｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置29,062）およびＥｃｏＲＶ（位置29,778）で切断することにより得た。生成したプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置19,706）とＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置29,062）との間のワクシニア配列が欠失している。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列が欠失している部位を第５図に三角形により示している。
ワクシニア欠失接合部で過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置18,811；19,655）で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼで処理し、これに合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列認識番号２０）
0003706130.tif 000011
を用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）を施した。生成したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含しているワクシニア配列位置18,805−29,108が欠失している。ワクシニア組換え体ｖＰ７８４を含有するベータ−ガラクトシダーゼとｐＭＰＣＳＫ１Δとの間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られた。ｖＰ８０４は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
大型サブユニットであるリボヌクレオチド  レダクターゼ（Ｉ４Ｌ）を欠失するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構成
ここで第６図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉ（位置63,875−70,367）を含有している。ｐＳＤ４０５をワクシニア配列内のＥｃｏＲＶ（位置67,933）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳｍａＩで切断し、連結してプラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構成に用いた全てのワクシニア制限断片の供給源としてｐＳＤ５１８を用いた。
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置67,371−65,059におよんでいる。Ｉ４Ｌの転写方向を第６図の矢印により示す。Ｉ４Ｌ暗号配列の部分が欠失したベクタープラスミド断片を得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置65,381）およびＨｐａＩ（位置67,001）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドとした。この4.8ｋｂのベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーターのコントロール下で（バーソレット等、1985；パーカス等、1990）Ｅ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する3.2ｋｂのＳｍａＩカセット（シャピラ等、1983）と連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを形成した。ワクシニアウイルスｖＰ８０４による組換えのための供与体プラスミドとしてｐＳＤ５２４ＫＢＧを用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子が部分的に欠失した位置にベータ−ガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
ｖＰ８５５からＩ４Ｌ  ＯＲＦの残りの部分およびベータ−ガラクトシダーゼを欠失するために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構成した。以下に記載するように、左右のワクシニアフランキングアームを別々にｐＵＣ８中に組み入れ、模式的に第６図に示した。
左側ワクシニアフランキングアームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列認識番号２１／配列認識番号２２）
0003706130.tif 000012
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩで切断し、2.7ｋｂのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置64,459）／ＲｓａＩ（位置64,994）で切断し、0.5ｋｂの断片を単離した。２つの断片を共に連結して、ｐＳＤ５３７を形成した。ｐＳＤ５３７は、Ｉ４Ｌ暗号配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有している。
右側ワクシニアフランキングアームを受容するベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列認識番号２３／配列認識番号２４）
0003706130.tif 000013
と連結して、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、2.7ｋｂのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をワクシニア配列内のＲｓａＩ（位置67,436）およびワクシニア／ｐＵＣ接合部でのＥｃｏＲＩにより切断し、0.6ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結して、Ｉ４Ｌ暗号配列の右側の完全なワクシニアフランキングアームを含有しているｐＳＤ５３８を形成した。
右側ワクシニアフランキングアームをｐＳＤ５３８からの0.6ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープラスミド中に連結した。生成したプラスミドｐＳＤ５３９において、全てｐＵＣのバックグランドで左右それぞれの側腹に0.6ｋｂのワクシニアＤＮＡを有するポリリンカー領域によりＩ４Ｌ  ＯＲＦ（位置65,047−67,386）を置き換えた。ワクシニア配列内の欠失部位を第６図において三角形により示す。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分におけるベース−ガラクトシダーゼ配列の組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５中のベータ−ガラクトシダーゼ配列による可能性のある組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットをｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１中に移動した。このｐＲＣ１１は、全てのベータ−ガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域により置き換えたｐＵＣの誘導体である（コリナス等、1990）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、1.2ｋｂの断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（2.35ｋｂ）に連結し、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベータ−ガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ８５５との間の組換えの結果として、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られた。ｖＰ８６６は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断と続いてのアガロースゲル上の電気泳動により分析した。制限模様は予期したものであった。テンプレートとしてのｖＰ８６６および上述した６つの欠失座を側腹に有する（flanking）プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケ等、1988）により、予期したサイズのＤＮＡ断片を産生した。欠失接合部の区域の周りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであることを確認した。上述したような６つの作成欠失部を含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６を、ワクシニアワクチン菌株「ＮＹＶＡＣ」と称した。
実施例２−プラスミドの構成
Ｆ８座での鶏痘挿入プラスミドの構成
プラスミドｐＲＷ７３１．１５はＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローニングした10ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含有している。ヌクレオチド配列を3660ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖について決定した。この配列は以下のとおりである（配列認識番号２５）
0003706130.tif 000014
0003706130.tif 000015
0003706130.tif 000016
Ｆ８と称した読取り枠の制限をこの配列内で決定した。位置496で読取り枠は開始し、位置1887で終止する。以下に記載するように、位置780から位置1927までの欠失部を作成した。
プラスミドｐＲＷ７６１は、2429ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで切断し、ＳｓｐＩで部分的に切断した。3700ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドを単離し、アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列認識番号２６）およびＪＣＡ０１８（配列認識番号２７）
0003706130.tif 000017
と連結した。
この連結により生成したプラスミドをｐＪＣＡ００２と称した。
アニールしかつキナーゼした（kinased）オリゴヌクレオチドＣＥ２０５（配列認識番号２８）およびＣＥ２０６（配列認識番号２９）
0003706130.tif 000018
をｐＪＣＡ００２のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入してｐＣＥ７２を形成することにより、追加のクローニング部位をｐＪＣＡ００２中に含有させた。
挿入プラスミド中にＦＰＶフランキングアームの長さを延長するために、プラスミドｐＪＣＡ０２１を構成した。ＰＲＷ７３１．１５（前述した）からの4900ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐブルースクリプトＳＳ  Ｋ+（カリフォルニア州、ラジョラのストラタジェネ）のＳｍａＩ部位およびＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＪＣＡ０２１を得た。次いでｐＣＥ７２からのＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩまでの断片をｐＪＣＡ０２１のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に連結することによりｐＣＥＮ１００を産生した。
ＭＤＶ  ｇＢ配列をＴＲＯＶＡＣ中に挿入するためのプラスミドの構成
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生した３つの断片が挿入プラスミドの構成に必要であった。反応１により、ＭＤＶ  ｇＢ遺伝子の５′末端を有する正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置中に融合したワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有した断片を生成した。この反応のために、前述したＨ６プロモーター（テイラー等、1988ａ、ｂ；グオ等、1989）を含有するプラスミドｐＲＷ８２５を、テンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＲＷ２９７（配列認識番号３０）およびＲＷ２９８（配列認識番号３１）
0003706130.tif 000019
をプライマーとして用いた。
反応２により、ＴＴＴＴＴＴＴ配列がＴＡＴＴＣＴＴに変えられて初期終止の可能性のないＭＤＶ  ｇＢ遺伝子の５′末端を含有する断片を産生した（ユエンおよびモス、1987）。産生した断片の３′末端を、反応３において産生した断片の５′末端と重複させた。反応２において、ＭＤＶ  ｇＢ暗号配列を含有するプラスミドｐＵＣ１３ｇＢをテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＲＷ２９９（配列認識番号３２）およびＲＷ３００（配列認識番号３３）
0003706130.tif 000020
をプライマーとして用いた。
反応３により、ＭＤＶ  ｇＢ遺伝子の３′末端を定義する断片を産生し、ｐＵＣ１３ｇＢに含まれた非暗号配列を除去した。プラスミドｐＵＣｇＢをこの反応のテンプレートとして用い、ＲＷ３０１（配列認識番号３４）およびＲＷ３０２（配列認識番号３５）
0003706130.tif 000021
をプライマーとして用いた。
これらの３つのＰＣＲ反応の産生物を集積し、第４のＰＣＲにおいて、プライマーＲＷ２９７（配列認識番号３０）およびＲＷ３０２（配列認識番号３５）のテンプレートとして用いた。最終的な1250ｂｐのＰＣＲ産生物を単離し、ＨｉｎｃＩＩで切断し、ＨｉｎｃＩＩで切断したプラスミドｐＣＥＮ１００中に挿入してｐＲＷ８７１を誘導した。Ｆ８への挿入を指示してるＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡを含有するｐＣＥＮ１００の誘導について上述している。プラスミドｐＲＷ８７１を部分的にＸｂａＩで切断し、線状産生物を単離し、ＡｆｌＩＩで再切断して、7.7ｋｂｐの断片を単離した。プラスミドｐＵＣ１３ｇＢをＡｆｌＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｇＢ暗号領域を含有する、生成した2140ｂｐの断片をｐＲＷ８７１から誘導された7.7ｋｂｐの断片中に挿入した。生成したプラスミドｐＲＷ８７８をＴＲＯＶＡＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え中でレスキューウイルスとして用いて、組換え体ｖＦＰ１０８を誘導した。
ＭＤＶ  ｇＢをワクシニアウイルス中に挿入するためのプラスミドの構成
前述したｐＲＷ８７８をＨｉｎｃＩＩで切断し、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＭＤＶ  ｇＢ暗号配列を含有する2.8ｋｂｐの断片を、ワクシニア挿入プラスミドｐＳＤ５５３ＶＣのＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＲＷ８７９を誘導した。プラスミドｐＳＤ５５３ＶＣは、パーカス等（1989）により記載された宿主範囲選択システムを用いた挿入プラスミドである。このプラスミドにおいて、ワクシニアウイルスＫ１Ｌ遺伝子およびポリリンカー領域はフランキングコペンハーゲンワクシニアアーム内に位置しており、ゲーベル等（1990ａ、ｂ）により記載されたＡＴＩ領域（読取り枠Ａ２５ＬおよびＡ２６Ｌ）を置換した。全領域はｐＵＣ８ベクター中にあり、挿入部位は翻訳停止コドンおよび転写停止信号の側腹にある。プラスミドｐＲＷ８７９をＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えにおけるレスキューウイルスとして用い、マレックｇＢ遺伝子を発現する組換え体ｖＰ９３５を誘導した。
ＭＤＶ  ｇＤをワクシニアウイルス中に挿入するためのプラスミドの構成
４つのＰＣＲ反応を用いて挿入プラスミドを産生した。反応１において、プラスミドをｐＲＷ８８０をテンプレートとして用いて、ＭＤＶ  ｇＤ遺伝子の開始ＡＴＧを重複させるプロモーターのＡＴＧによりＭＤＶ  ｇＤ５′配列に連結したワクシニアウイルスＨ６プロモーター配列を含有する断片を誘導した。プラスミドｐＲＷ８８０は、Ｆ１６挿入座中の非関連遺伝子に連結した、前述のＨ６プロモーター配列を含有している。この反応に用いたプライマーはＲＷ３８９（配列認識番号３６）およびＲＷ３９０（配列認識番号３７）
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であった。
第２および第３のＰＣＲ反応において、ｐＭＤＶ５１７をテンプレートとして用いた。プラスミドｐＭＤＶ５１７は、ｐＵＣ１３のＥｃｏＲＩで挿入されたＭＤＶ  ｇＤ遺伝子を含有する5.2ｋｂのＤＮＡ断片を含有している。反応の目的は、２つの内部ＴＴＴＴＴＮＴ信号を変更して未熟終止の可能性をなくすことにあった（ユエンおよびモス、1987）。第２の反応において、オリゴヌクレオチドＲＷ３８６（配列認識番号３８）およびＲＷ３９１（配列認識番号３９）
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をプライマーとして用いて、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴをＴＴＣＴＴＣＴＴＴに変更した。
第３の反応において、オリゴヌクレオチドＲＷ３８７（配列認識番号４０）およびＲＷ３８８（配列認識番号４１）
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を用いて、配列ＴＴＴＴＴＴＴＧＴを配列ＣＴＴＣＴＴＣＧＴに変更した。
３つのＰＣＲ反応の産生物を集積し、第４のＰＣＲ反応のためにＲＷ３９０（配列認識番号３７）およびＲＷ３９１（配列認識番号３９）により活性化した。最終的なＰＣＲ反応の産生物をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｈ６プロモーターの３′末端およびＭＤＶ  ｇＤ暗号配列を含有する1.2ｋｂｐの断片を得た。プラスミドｐＲＷ８８０（以下に記載する誘導）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し（非関連遺伝子を除去してＨ６プロモーターの５′末端を残す）、最終ＰＣＲ産生物の切断後に得た1.2ｋｐ断片と連結した。次いで生成したプラスミドｐＲＷ８９３をＮｏｔＩで切断し、以前に記載したｐＳＤ５３３ＶＣのＳｍａＩ部位に挿入されたＨ６プロモーテッド（promoted）ＭＤＶ  ｇＤ遺伝子を含有する1.4ｋｂｐ断片を放出してｐＲＷ８９４を産生した。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えにおいてレスキューウイルスとしてプラスミドｐＲＷ８９４を用いて、マレックｇＤ遺伝子を発現する組換え体ｖＰ１００５を産生した。
Ｆ１６座での鶏痘挿入プラスミドの構成
プラスミドｐＦＰ２３Ｋ−１は、タータグリア等（1990）に記載された10.5ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ鶏痘ＤＮＡ断片を含有している。以下のプライマーＲＷ２６４（配列認識番号４２）、ＲＷ２６５（配列認識番号４３）、ＲＷ２６６（配列認識番号４４）およびＲＷ２６７（配列認識番号４５）
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を用いたＰＣＲ反応のために、テンプレートとしてプラスミドｐＦＰ２３Ｋ−１を用いた。
プライマーＲＷ２６４およびＲＷ２６７は第１の反応を活性化した。プライマーＲＷ２６５およびＲＷ２６６は第２の反応を活性化した。ＲＷ２６６、ＲＷ２６７および第１および第２の反応による２つの産生物を最終ＰＣＲのために結合した。テンプレート上のプライマーの指向（orientation）は以下のとおりである：
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プライマーＲＷ２６６は、ＮｄｅＩ部位を有する10.5ｋｂｐの配列内の位置9883から始まる。ＲＷ２６５およびＲＷ２６４の５′末端は重複し、互いに逆の補体である。ＲＷ２６５およびＲＷ２６４は、位置10,054ｂｐでのＡを、挿入部位ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含有する61ｂｐにより置き換える。翻訳終止コドンおよび転写停止信号は、挿入部位を側腹に有する。ＲＷ２６７の５′末端は、ＥｃｏＲＩ部位で始まる位置10,229ｂｐにある。
第３および最終ＰＣＲ産生物をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＲＷ１７５のＮｄｅＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、ｐＲＷ８６４を産生した。プラスミドｐＲＷ７１５はＰｖｕＩＩで切断されたプラスミドｐＵＣ９である。ＥｃｏＲＩリンカーを300ｂｐのＰｖｕＩＩ断片の位置に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子を挿入するために、プラスミドｐＡＭＩＢＧを用いた。プラスミドｐＡＭＩＢＧは、１１Ｋワクシニアウイルスプロモーター（パオレッティ等、1984）の前述したＢａｍＨＩ部位３′に挿入されたｐＭＣ１８７１（カサダバン等、1983）からのＬａｃＺ  ＢａｍＨＩ断片を含有している。プラスミドｐＡＭＩＢＧをＢａｍＨＩで部分的に切断し、線状産生物を単離してＰｓｔＩで切断した。１１Ｋ  プロモートした（promoted）ＬａｃＺ遺伝子を含有するＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をブラントエンドとし、ｐＲＷ８６４（上述）のＳｍａＩ部位中に連結した。産生したプラスミドをｐＲＷ８６７Ａと称した。
プラスミドｐＲＷ８６６は、タータグリア等（1990）に記載された10.5ｋｂｐの鶏痘ＤＮＡ断片を含有しているプラスミドｐＦＰ２３Ｋ−１のサブクローンである。ｐＦＰ２３Ｋ−１からの7.3ｋｂｐのＮａｅＩからＮｄｅＩまでの鶏痘断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位とＮｄｅＩ部位の間に挿入することにより、プラスミドｐＲＷ８６６を構成した。プラスミドｐｒｗ８６６は２つのＦｓｐＩ部位を含有している；１つはｐＵＣ中にあり、位置1955ｂｐでのもう１つはＦ１６と称する遺伝子間挿入部位を定義している。ＦｓｐＩ挿入座は、ＡＴＧを含有しているいかなる読取り枠をも妨害しない。ｐＲＷ８６６をＦｓｐＩで部分的に切断して得た線状産生物を単離し、１１ＫプロモートしたＬａｃＺ遺伝子を含有するｐＲＷ８６７Ａからの3.3ｋｂｐのＮｏｔＩ断片に連結した。この操作により、ブラントエンドとしたＬａｃＺ遺伝子断片をＦｓｐＩ遺伝子間挿入部位中に挿入してプラスミドｐＲＷ８６８を産生できた。ｐＲＷ８６８中のＬａｃＺ遺伝子を、ＳｍａＩ部位、ＢａｍＨＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、ｐＲＷ８６４の発生に用いた翻訳停止配列および転写終止配列を側腹に有する61ｂｐ断片（前述）と置き換えた。この置換の結果として、プラスミドｐＲＷ８１３が得られた。プラスミドｐＲＷ８９４の最初の構成にテンプレートとして用いたプラスミドｐＲＷ８８０は、Ｆ１６挿入座のＳｍａＩ部位のＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有している。
実施例３−ＭＤＶ糖タンパク質を発現するポックスウイルスベースの組換え体の発生
前述したプラスミドを、前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いることにより、ＮＹＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣ感染細胞中にトランスフェクションした（パニカリおよびパオレッティ、1982；ピッチーニ等、1987）。陽性プラークを特定のＭＤＶ放射線標識化プローブに対する雑種形成に基づいて選択し、この陽性プラークについて純粋な固体群が達成されるまで連続してプラーク精製を行なった。各々のＩＶＲからの代表的なプラークを増幅し、保存ウイルスを確立した。
テイラー等（1990）に記載されたようにニワトリ３９２番と称する多クローン性ニワトリ抗−ＭＤＶ血清を用いて間接免疫蛍光法を行なった。
テイラー等（1990）に記載されたように上述した試薬を用いてイムノプレシピテーション反応を行なった。
ＭＤＶ糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体
プラスミドｐＲＷ８７９のトランスフェクションにより、ＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ９３５が発生した。免疫蛍光法分析により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面上に発現されることが示された。ニワトリからの同一の免疫血清を用いたイムノプレシピテーションにより、110ｋＤａ、64ｋＤａおよび48ｋＤａのおおよその分子量を有する３つの主要発現産生物の存在が検出された。これらのサイズはＭＤＶ  ｇＢ遺伝子の予期した産生物に対応している。
プラスミドｐＲＷ８９４のトランスフェクションによりＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ１００５が発生した。プラークのイムノスクリーン検定（immunoscreen assay）により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面に発現されることが示された。イムノプレシピテーション分析により、処理した糖タンパク質を示す45ｋＤａ（タンパク質の前駆体形状に対応する）および65ｋＤａのおおよその分子量を有する２つの産生物の産生が示された。
ｇＢ糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ組換え体
プラスミドｐＲＷ８７８のトランスフェクションにより、組換え体ｖＦＰ１０８が発生した。免疫蛍光法分析により、ＭＤＶ免疫血清により認識されたタンパク質が感染細胞表面上に発現されることが示された。ニワトリからの同一の免疫血清を用いたイムノプレシピテーション分析により、110ｋＤａ、64ｋＤａおよび48ｋＤａのおおよその分子量を有する３つの主要発現産生物の存在が検出された。
実施例４−ニワトリの免疫化と続いての抗原投与
生後25日のＳＰＦのニワトリの群に、１回の投与量が4.0ｌｏｇ10ｐｆｕのＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ  ｇＢ（ｖＦＰ１０８）を皮下経路で接種した。10羽のニワトリは接種しないままにした。接種から14日後、10羽の接種していない対照を含むニワトリに、事前に100％が死に至ることを確認したＪＭＶ腫瘍細胞系の希釈物を腹腔内接種により抗原投与し、生存したニワトリを評価した。
防御の結果を表１に示す。
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第２の実験において、アイソレータ中でふ化し、ＭＤＶ、七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）および他のアビアン病原に対する母性抗体を有さない20羽のロードアイランドレッドひな鳥に、生後初日に6.3ｌｏｇ10ｐｆｕの鶏痘組換え体ｖＦＰ１０８を筋肉内ワクチン接種した。接種から７日後、接触感染によりひな鳥にＭＤＶを抗原投与した。ワクチン接種したひな鳥と、15日前に3.0ｌｏｇ10ｐｆｕのＭＤＶのＲＢ１−Ｂ菌株を接種した８羽のニワトリと混合することにより接触感染を行なった。同一のふ化から由来した20羽のワクチン接種しないひな鳥の第２の群を対照として用いた。また上述したような接触によりこれらにＭＤＶの抗原投与を行なった。２つの群を、高水準安全室中の別々のかごに保持した。20羽のワクチン接種しないひな鳥の第３の群には、3.0ｌｏｇ10ｐｆｕのＲＢ１−Ｂを接種することにより抗原投与し、別室に保持した。この群は、２つの方法による抗原投与の効果を比較する実験のために採用した。
ひな鳥を毎日観察し、死んだひな鳥について内臓器および末梢神経における大きなマレック病の病巣について試験した。大きなマレック病の病巣が明らかではない場合には、組織実験のために組織細胞を採取した。
鶏痘組換え体によりワクチン接種した群の２羽のひな鳥は、おそらくは鶏痘による眼感染の症候群を示し、ＭＤＶ感染ひな鳥との接触から２日以内に死んだ。それらは実験から除外し、表２および第７図に示した致死結果には含めない。
結果により、鶏痘組換え体によるワクチン接種が致死を著しく遅らせたことが分かる。ワクチン接種した群とワクチン接種しなかった群（接触抗原投与）における死亡の平均時間は、それぞれ56日と35日であった。スチューデントのｔ検体を用いたデータのログトランスフォーメーションの分析により示されたように、差は著しかった（Ｐ＜0.005）。
19週の延長期間後、２つの群における合計の致死は、カイ二乗検定により示したように著しくは異ならなかった。しかしながら、ワクチン接種後６から７週間目に、致死率は、対照ではほぼ100％であり、ワクチン接種したひな鳥では10％であるように著しく異なった。ブロイラーのニワトリは通常生後６から７週間で市場に送られることに注意すべきである。
接触感染による抗原投与は接種による抗原投与と比較して効果的であったことが第７図から分かる。２つの群の合計致死は同様であり、累積致死曲線の傾斜は約２週間遅れた後（接触感染）同様になった。これはおそらくは、感染を確立するのに必要な時間を示すものであろう。
ワクチン接種した群は、同一の室に保持されたワクチン接種しなかった群により放たれたＭＤＶに暴露され続けたことに注意すべきである。
結論として、初生日にワクチン接種され、２つの異なる方法によるＭＤＶを抗原投与した、遺伝的に感受性のあるニワトリを使用する厳しい条件下で、防御免疫原としてのＭＤＶ  ｇＢの重要性示された。
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結果は、家きん工業におけるＭＤＶに対するワクチン接種のためのＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ組換え体の潜在能力を示している。鶏痘ウイルスの制限宿主範囲により、組換え体の非アビアン種へのトランスミッションに対する固有の安全バリアが得られる。全体のウイルスというよりもむしろＭＤＶの抗原領域を使用すれば、生ヘルペスウイルスを環境に導入する必要性がなくなる。大量の異種遺伝情報を含むＴＲＯＶＡＣの能力により、血清型の範囲から多くの抗原決定基を含むことを考慮すべきである。
実施例５−ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶの比較効能（ｖＦＰ１０８およびＨＶＴ）
以前の実験において、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）のＭＤＶ抗原投与に対して防御する能力を２つの方法により評価した。第１の実験において、初生のＳＰＦのニワトリに40ｌｏｇ10ｐｆｕのｖＦＰ１０８を皮下経路で首すじにワクチン接種した。接種から14日後にニワトリに腹腔内でＪＭＶ腫瘍細胞系を接種することにより抗原投与し、44％のニワトリが抗原投与に対して生存した。第２の実験において、初生のＳＰＦのニワトリに、6.3ｌｏｇ10ｐｆｕのｖＦＰ１０８を筋肉内経路によりワクチン接種した。接種から７日後、ワクチン接種したニワトリとワクチン接種しなかったニワトリに、ＭＤＶ菌株ＲＢ１８に感染したニワトリによる接触感染によって抗原投与した。ワクチン接種から６から７週間後に、90％のワクチン接種したニワトリが抗原投与に対して生存した。
最も一般的に用いられるＭＤＶワクチンは、血清学的にＭＤＶに関連する七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）ワクチンである。この実施例はＨＶＴおよびＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）の比較効能を示している。
生後20日のＳＰＦニワトリに、皮下経路により3.8ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）を首すじに接種した。20羽のニワトリに皮下経路で3.0ｌｏｇ10ｐｆｕの細胞関連ＨＶＴワクチンを接種した。10羽のニワトリは接種しないままにした。接種から５日後、ワクチン接種したニワトリと対照のニワトリに、ＲＢ１Ｂ抗原投与ウイルスを腹腔内接種により抗原投与した。検死した49日までの期間に亘りニワトリを観察し、マレック病に典型的な病巣について試験した。抗原投与の結果を表３に示す。
結果は、ワクチン接種をせずに抗原投与した対照の90％が感染のために死亡したことが分かる。ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）をワクチン接種したニワトリは、75％の生存率を示し、ＨＶＴワクチンを接種したニワトリは85％の生存率を示した。この結果は、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶ（ｖＦＰ１０８）ワクチンにより与えられた防御は細胞関連ＨＶＴに匹敵したことを示している。したがって、ＴＲＯＶＡＣ−ＭＤＶは効果的なワクチンである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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