(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有し、分子量が２０kDaであり且つ、等電点が１０．２であり、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacteium）属、エンペドバクター（Empedobacter）属、スフインゴバクテリウム（Sphingobacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属及びミロイデス（Myroides）属のうちのいずれかに由来するものであることを特徴とする酵素。
【請求項２】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（式中Ｚは、ベンジルオキシカルボニル基を意味する。）を唯一の窒素源として含有する培地に生育可能なクリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacteium）属、エンペドバクター（Empedobacter）属、スフインゴバクテリウム（Sphingobacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属及びミロイデス（Myroides）属のうちのいずれかに由来する細菌であり、かつＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（式中Ｚは、ベンジルオキシカルボニル基を意味する。）からアンモニア遊離活性を有する細菌を培養して得られる培養液から単離される酵素であって、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有し、分子量が２０kDaであり且つ、等電点が１０．２である酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列表の配列番号１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列表の配列番号５又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号５又は請求項１１に記載のポリヌクレオチドに９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項７から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターを導入させた形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５記載の形質転換体を培養し、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有し、分子量が２０kDaであり且つ、等電点が１０．２である酵素を生産せしめ、培養物より当該酵素を採取することを特徴とする当該酵素の製造法。
【請求項１７】
請求項１５記載の形質転換体を培養し、該培養物から採取される、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有し、分子量が２０kDaであり且つ、等電点が１０．２である組換えポリペプチド。
【請求項１８】
蛋白質及び／又はペプチドに、請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種を作用させることを特徴とする蛋白質及び／又はペプチドの修飾法。
【請求項１９】
請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種を有効成分としてなる蛋白質及び／又はペプチドの修飾用組成物。
【請求項２０】
請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種を植物性、動物性蛋白質及び／又はペプチドに作用させ、当該蛋白質及び／又はペプチドの機能性を改善する方法。
【請求項２１】
請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種を植物性、動物性蛋白質及び／又はペプチドを含む食品に作用させ、当該食品の機能性を改善する方法。
【請求項２２】
請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種を植物性、動物性蛋白質及び／又はペプチドを含有する粗原料に作用させ、当該原料から蛋白質及び／又はペプチドの抽出効率を改善する方法。
【請求項２３】
請求項１〜２の何れか記載の酵素、請求項３〜６の何れか記載のポリペプチド又は請求項１７記載の組換えポリペプチドの少なくとも１種によりトランスグルタミナーゼの反応を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な酵素、即ち蛋白質中の側鎖アミド基に作用して、側鎖カルボキシル基とアンモニアを遊離する作用を有する新規な酵素及びその製造法に関する。更に詳細には、シトファガレス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ）或いはアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分類される細菌、より詳細にはクリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属に属し、蛋白質中のアミド基を脱アミドする性質を有する酵素生産能を有する菌株を培地に培養し、該酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取することを特徴とする蛋白質中のアミド基を脱アミドする性質を有する酵素の製造法に関する。更に本発明は、蛋白質中のアミド基に直接作用する新規な酵素を用いた蛋白質の修飾方法に関する。更に、本発明は、蛋白質中のアミド基を脱アミドする性質を有する酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを導入した形質転換体、及び形質転換体を培地に培養し、該酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取することを特徴とする蛋白質のアミド基を脱アミドする性質を有する酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミナーゼ／アスパラギナーゼはグルタミン／アスパラギンを水解してグルタミン酸／アスパラギン酸とアンモニアにする酵素であり、これが動植物及び微生物から得られることはよく知られている。しかし、この酵素は遊離のグルタミン／アスパラギンに特異的に作用する酵素であり、ペプチド中のグルタミン／アスパラギンを脱アミドすることはできない。ましてペプチドより分子量の大きな蛋白質中のグルタミン／アスパラギンのγ／β−アミド基を脱アミドすることはできない。
【０００３】
また、ペプチド状態に存在するアミド基に作用する酵素としては、トランスグルタミナーゼがある。この酵素はペプチド結合グルタミンのアミド基をアシル供与体、一級アミンのアミノ基をアシル受容体として、蛋白質にアミン化合物の共有結合的導入や、蛋白質中のグルタミンとリジン両残基間でのε‐（γ‐グルタミル）リジン‐ペプチド結合による架橋形成を触媒する。反応系にアミンやリジンが存在しない或いはブロックされている場合には水がアシル受容体になり、ペプチド中のグルタミン残基が脱アミドされグルタミン酸となることが知られているが、この酵素は上述のように本来アシル転移酵素であるため、通常の蛋白質に作用させると架橋反応が起こり、蛋白質を脱アミド化する反応は生ぜず、本発明の酵素とは異なる。
【０００４】
また、ペプチド中に結合するグルタミンに作用して脱アミドする酵素についてはバチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来の酵素、Ｐｅｐｔｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  Ｉ及びＰｅｐｔｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ＩＩが知られている。前者は、ペプチドのＣ末端に位置するグルタミン残基に作用し、後者はペプチド中のグルタミン残基に作用することが知られている．しかしながら、これらの酵素は高分子蛋白質には作用せず、低分子ペプチドにのみ作用する酵素である  ［Ｍ．  Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｈ．  Ｈａｙａｓｈｉｄａ，  Ｅ．  Ｎａｋａｎｏ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １０巻，  １２２２−１２２９（１９７１）］。
【０００５】
これらの酵素（ＰｅｐｔｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅＩ及びＩＩ）を、低分子ペプチドでなく高分子の蛋白質に作用させる試みが、複数の研究によってなされてきたが、それらの酵素が高分子蛋白質に実質的に作用せず、蛋白質加水分解ペプチドにしか作用しないことが明らかにされている．具体的には、Ｇｉｌｌらは、乳カゼインとホェイ蛋白質に対して、ｎａｔｉｖｅな状態ばかりでなく、変性後においても、ＰｅｐｔｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅＩ及びＩＩいずれも作用しないことを報告している。彼らは、またそれらの蛋白質の加水分解物に対する作用性を検討した結果、Ｐｅｐｔｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ＩＩのみ作用したが、分子量５０００以下のペプチドにしか作用しないことを報告している（Ｂ．  Ｐ．  Ｇｉｌｌ，  Ａ．  Ｊ．  Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｅｙ，  Ｐ．  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｈｅａｄｏｎ，  Ｉｒ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９巻，  ３３−４１（１９８５））。大豆蛋白質を用いて同様の検討が、Ｈａｍａｄａらによって行われたが、Ｇｉｌｌらの結果との一致を見ている。即ち、大豆ペプチド（Ｐｅｐｔｏｎｅ）に対する脱アミド率が２４．４−４７．７％に対し、大豆蛋白質に対しては実質的に作用しないこと（０．４−０．８％）が報告されている（Ｊ．  Ｓ．  Ｈａｍａｄａ，Ｆ．  Ｆ．  Ｓｈｉｈ，  Ａ．  Ｗ．  Ｆｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｅ．  ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５３巻，  ２号，  ６７１−６７２（１９８８））。
【０００６】
植物の種子中に蛋白質を脱アミドする酵素の存在の可能性が報告されている（Ｉ．Ａ．  Ｖａｉｎｔｒａｕｂ，  ｌ．  Ｖ．  Ｋｏｔｏｖａ，  Ｒ．  Ｓｈａｒａ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，  ３０２巻，  １６９−１７１  （１９９２））。しかしながら、この報告においては、部分精製品を用いて蛋白質からアンモニアの遊離を観察しているが、以下に述べる理由により、本発明に開示される酵素の存在を証明するものではないことは明らかである。即ち、部分精製品を用いている点、プロテアーゼ活性が存在しないことが確認されていない点、反応後の基質蛋白質の分子量変化が生じていないことが確認されていない点により、一つの酵素の作用ではなく複数の酵素、例えばプロテアーゼ、ペプチダーゼにより蛋白質から遊離したアミノ酸、グルタミン／アスパラギンがグルタミナーゼ／アスパラギナーゼにより脱アミド化されアンモニアが遊離されている可能性、或いは同様にして生じたグルタミン含有低分子ペプチドがペプチドグルタミナーゼ様酵素により脱アミドされている可能性が残されている。或いはまたプロテアーゼの複反応により脱アミドされている可能性も否定できない。とりわけ、上記の報告中において、用いられた部分製製品中に遊離のグルタミンに作用してアンモニアを遊離するグルタミナーゼ活性が存在することが明記されていることは特記すべきである。
このように、高分子蛋白質作用して脱アミド反応を触媒する酵素について、単一蛋白質まで精製し、更に遺伝子を単利し発現させることにより、その存在を証明した報告はこれまでになかった。
【０００７】
一般に蛋白質中のグルタミン及びアスパラギン残基を脱アミド化し、カルボキシル基を生じさせると、その蛋白質の負電荷が増加し、その結果等電点の低下、水和力が増加する。さらに静電反撥力の上昇による蛋白質間の相互作用の低下、すなわち会合性の低下がもたらされる。これらの変化により蛋白質の可溶性、水分散性は大きく増大する。また蛋白質の負電荷の増加は、その蛋白質の折りたたみをほぐし、高次構造を変化させ、分子内部に埋もれていた疎水性領域を分子表面に露出させる。したがって脱アミド化蛋白質は、両親媒性を有し理想的な界面活性剤となり、蛋白質の乳化力、乳化安定性、起泡性、泡沫安定性が大きく向上する。
【０００８】
このように、蛋白質の脱アミド化は、蛋白質の様々な機能特性の向上をもたらし、その蛋白質の用途は飛躍的に増大させる  （例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｆｏｏｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｄ．Ｃｈａｔｎａｇａｒ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ｅｄｓ．，  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２，  ｐ．３７）。
【０００９】
この為、蛋白質を脱アミド化する方法は、古くより盛んに研究され多くの方法が考えられてきた。蛋白質を化学的に脱アミド化させる方法としては、高温条件下での温和な酸または温和なアルカリ処理法などがあった。一般に蛋白質中のグルタミン及びアスパラギン残基のアミド基は、酸或いは塩基により加水分解される。しかしながらこの反応は非特異的であり、強酸、強アルカリ条件下では、ペプチド結合の切断も伴う。また蛋白質の変性も伴い、その蛋白質の機能性を損なう結果となる。
【００１０】
そこでこれらの望ましくない反応を制限するため種々工夫されて、温和な酸処理  （例えば、Ｊ．Ｗ．  Ｆｉｎｌｅｙ，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ４０，  １２８３，  １９７５；  Ｃ．Ｗ．  Ｗｕ，  Ｓ．  Ｎａｋａｉ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｄ．  Ｐｏｗｉｅ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２４，  ５０４，  １９７６など）や温和なアルカリ処理  （例えば、Ａ．  Ｄｉｌｏｌｌｏ，  Ｉ．  Ａｌｌｉ，  Ｃ．  Ｂｉｌｏａｒｄｅｒｓ，  Ｎ．  Ｂａｒｔｈａｋｕｒ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４１．  ２４，  １９９３など）が考案された。また、酸としてドデシル硫酸ナトリウム（Ｆ．Ｆ．  Ｓｈｉｈ  ａｎｄ  Ａ．  Ｋａｌｍａｒ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ３５，  ６７２，  １９８７）や陽イオン交換樹脂（Ｆ．  Ｆ．  Ｓｈｉｈ，  Ｊ．ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  ５２，  １５２９，  １９８７）などを触媒として用いたり、或いはまた低水分下での高温処理法（Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｔ．Ｃ．  Ｌｅｅ，  ａｎｄ  Ｃ．−Ｔ．  Ｈｏ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４１，  １８４０，  １９９３）なども試みられてきた。
【００１１】
しかしながら、いずれの方法でもペプチド結合の切断を完全に制限することは困難であった。ペプチド結合の切断は、脱アミド化により期待される蛋白質の機能性の向上を阻害するばかりでなく、苦味の生成ももたらし好ましくない。また酸処理法に比べて効率のよいアルカリ処理法では、アミノ酸のラセミ化や毒性の疑いのあるリジノアラニンが生ずる欠点もあった。
【００１２】
一方、上述の化学法の問題点を克服するため、蛋白質の酵素的脱アミド化法もいくつか試みられてきた。高ｐＨ（ｐＨ１０）条件下でのプロテアーゼ処理法（Ａ．  Ｋａｔｏ，  Ａ．  Ｔａｎａｋａ，  Ｎ．  Ｍａｔｓｕｄｏｍｉ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ３５，  ２２４，  １９８７）、トランスグルタミナーゼ法（Ｍ．  Ｍｏｔｏｋｉ，  Ｋ．  Ｓｅｇｕｒｏ，  Ａ．  Ｎｉｏ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｔａｋｉｎａｍｉ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５０，  ３０２５，  １９８６）、ペプチドグルタミナーゼ法（Ｊ．Ｓ．  Ｈａｍａｄａ，  ａｎｄ  Ｗ．Ｅ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  ５４，  ５９８，  １９８９）の三つの方法が考えられてきたが、いずれも欠点があった。
【００１３】
まずプロテアーゼ法では、その本来の反応であるペプチド結合の切断はさけられなかった。ペプチド結合の切断が好ましくないことは上述の通りである。
【００１４】
またトランスグルタミナーゼ法では、その本来の反応であるグルタミンとリジン間でのイソペプチド結合の形成による架橋反応を押さえるためには、予めリジン残基のε−アミノ基を化学的に保護しておく必要があった。脱アミド化蛋白質を食品用などに供する場合は、可逆的保護基であるシトラコニル基などで保護しておいた後、グルタミンを脱アミドさせ、その後保護基をはずし、さらに遊離したシトラコニル酸と脱アミド化蛋白質を分離しなければならなかった。これらの過程は製造コストを大きく増大させ、実用化にほど遠いものであるのは明らかである。
【００１５】
一方、ペプチドグルタミナーゼ法では、本酵素が蛋白質にはほとんど作用せず、低分子ペプチドにのみ作用する酵素であるため、生の蛋白質に作用させることができず、蛋白質加水分解物を用いる必要があった。
【００１６】
このように本来酵素法においては、酵素の持つ高い基質特異性に由来する反応選択性が、化学的、物理的方法を凌ぐ最大の利点の一つであるが、蛋白質を脱アミド化する目的においては、副反応が伴わず、また高分子蛋白質に作用して脱アミド化する為のふさわしい酵素が存在しなかったため、実用化されていなかったのが現状である。
【００１７】
この様に、蛋白質の脱アミド化は大きな機能性向上をもたらす優れた修飾法であるにもかかわらず、従来の化学法、酵素法いずれの方法でも欠点があり、実用化は進んでいなかった。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
よって、本発明者らは蛋白質に結合した状態にあるアミド基に直接作用して脱アミドする酵素の給源を安価な微生物に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、本発明者らが土壌中より新たに分離したクリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する新菌株が、蛋白質中に結合するアミド基に直接作用し、ペプチドの結合及び蛋白質の架橋を伴わず、脱アミドする作用を有する酵素を生産することを見いだし、本発明を完成した。本明細書においては上述の作用を有する酵素を蛋白質脱アミド酵素と称する。
【００１９】
更に本発明者らは、タイプカルチャーよりクリセオバクテリウム属に属する菌株をランダムに選択してその菌株による蛋白質脱アミド酵素の生産について検討した。その結果、すべての菌株にその生産性が確認され、その他の菌株、例えばフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属及びスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属にもその生産が確認された。これらの菌株は何れもシトファガレス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ）或いはアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分類される細菌であり、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｉｕｍ）属及びミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属は何れもフラボバクテリアチェ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に分類される細菌である。
【００２０】
さらに、本発明者らは、蛋白質脱アミド酵素を単離、精製し、該蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定し、さらに、該遺伝子を含有するベクターを導入した形質転換体を用いて蛋白質脱アミド酵素を製造することが可能であることを確認した。
【００２１】
すなわち、本発明は、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物を用いて蛋白質脱アミド酵素を生産する方法、蛋白質脱アミド酵素を用いた蛋白質の修飾方法、蛋白質脱アミド酵素を有効成分として含有する蛋白質の修飾用組成物、蛋白質脱アミド酵素を用いた蛋白質の機能性を改善する方法、蛋白質脱アミド酵素を用いた食品の機能性を改善する方法、蛋白質脱アミド酵素を用いた蛋白質及び／又はペプチドの抽出効率を改善する方法、および、蛋白質脱アミド酵素を用いたトランスグルタミナーゼの反応を制御する方法に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、蛋白質脱アミド酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを導入した形質転換体、および、該形質転換体を培地に培養し、蛋白質脱アミド酵素を生産せしめ、培養物より蛋白質脱アミド酵素を採取することを特徴とする蛋白質脱アミド酵素の製造法に関する。
【００２３】
本発明の蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質中の少なくともアスパラギン残基及びグルタミン残基のアミド基に有効であるが、特にその作用部位は、それらに限定されるものではなく、他のアミノ酸残基に結合したアミド基に対しても有効であってもよい。尚、本願明細書において蛋白質とは、蛋白質単体に限定されるものではなく、糖、脂質等との複合蛋白質等であってもよい。そして、その蛋白質の分子量は、特に限定されないが、通常、５０００（５０残基）以上、好ましくは１０，０００〜２，０００，０００の範囲である。
【００２４】
また、本発明の蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質以外にもアミド基を有するペプチドやそれらの誘導体等に対しても脱アミド化に用いることができる。ペプチドとしては、通常、アミノ酸残基数が２〜５０のものが挙げられ、用途としては、栄養改善剤等に用いられているものに好適である。
即ち、本発明の蛋白質脱アミド酵素は、ポリペプチドを含むジペプチド以上から高分子の蛋白質まで基質とすることができる。なお、本願明細書の「ポリペプチド」という用語は、蛋白質を含む。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質脱アミド酵素を生産する微生物は、例えば以下のようにしてスクリーニングすることができる。即ち、土壌の懸濁液を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを唯一の窒素源として含有する分離用液体培地に接種することにより集積培養を行い、その培養液を同様の分離用平板寒天培地に塗布して、生育したコロニーを選択して拾う。これらの菌株を適当な液体培地で培養して、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙからアンモニア遊離活性を有する菌株を選択することができる。
【００２６】
このようにして選択された菌株について、更にカゼインを基質としてアンモニア遊離活性を指標として蛋白質脱アミド酵素産生微生物をスクリーニングすることができる。
【００２７】
このようにしてスクリーニングされた菌株は、バージー著のマニュアル・オブ・デターミネテイブ・バクテリオロジーに従ってクリセオバクテリウム属と同定された。更にクリセオバクテリウム属のタイプカルチャーよりランダムに選択した菌株についても上述と同様の検定法により蛋白質脱アミド酵素が生産されていることを確認した。より具体的な菌種としては例えば、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０、クリセオバクテリウム・インドロゲネス（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１４９４４、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ１２５３５、クリセオバクテリウム・バラスチナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｌｕｓｔｉｎｕｍ）ＩＦＯ１５０５３、クリセオバクテリウム・インドルセティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｔｈｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２７９５０）、クリセオバクテリウム・スコフサルナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｏｐｈｔｈａｌｎｕｍ  ＣＣＭ４１０９）等が挙げられる。
【００２８】
また、その他の微生物についても同様なスクリーニングを行ったところ、フラボバクテリウム属、より具体的な菌種としては例えばフラボバクテリウム・アクアティレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｌｅ）ＩＦＯ１５０５２、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、より具体的な菌種としては例えばエンペドバクター・ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓ）ＩＦＯ１４９４３、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、より具体的な菌種としては例えばスフィンゴバクテリウム・スピリチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）ＩＦＯ１４９４８、スフィンゴバクテリウム・ヘパリナム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ１２０１７、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、より具体的な菌種としては例えばアウレオバクテリウム・エステロアロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｄｕｍ）ＩＦＯ３７５１およびミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属、より具体的な菌種としてはミロイデス・オドラタス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ）ＩＦＯ１４９４５の菌株にも蛋白質脱アミド酵素の生産が確認された。
【００２９】
尚、この酵素は、蛋白質のグルタミン残基とリジン残基の間でのイソペプチド形成を触媒する活性すなわちトランスグルタミナーゼ活性を有しておらず、既知のトランスグルタミナーゼとは区別される。また蛋白質のペプチド結合を加水分解する活性すなわちプロテアーゼ活性も有しておらず既知のプロテアーゼとも区別される。
【００３０】
上述した各菌株を用いて蛋白質脱アミド酵素を製造するための菌株の培養法としては液体培養、固体培養の何れでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養としては例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３１】
使用できる培地としては、蛋白質脱アミド酵素を生産する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
【００３２】
培地のｐＨは例えば約３〜１０、好ましくは約７〜８程度に調製し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜３７℃程度で、１〜２０日間、好ましくは３〜１２日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００３３】
得られた培養液から蛋白質脱アミド酵素を通常の手段で単離し、本発明の蛋白質脱アミド酵素を得ことができる。例えば培養液から、蛋白質脱アミド酵素を単離精製するには、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わせ、常法により処理して、精製した蛋白質脱アミド酵素を得ることができる。
【００３４】
更に、より具体的に本発明を詳述する。即ち、蛋白質脱アミド酵素を生産する菌株として、上述したクリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０を使用し、液体培地で培養し、当該酵素の産生と該酵素の精製、酵素の諸性質について検討した。
【００３５】
新鮮なスラントから１白金耳の菌をとり、下記のラクトース培地で３０℃、２〜７日間振盪培養し、その後遠心上清を得る。
0003609648.tif 000002
培養経過を図１に示した。
【００３６】
酵素の精製方法は、培養終了後、培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を粗酵素液として得、ＵＦ濃縮（ＳＥＰ−００１３）、塩析、フェニールセファロース、セファシールＳ−１００により処理し酵素を精製した。精製の工程を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0003609648.tif 000003
【００３８】
尚、酵素活性の測定は以下のように従い、基質としてＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ及びカゼインを使用した。
【００３９】
活性測定方法：１０ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌに酵素溶液１０μｌを添加して、３７℃、６０分間インキュベートした後、１２％トリクロロ酢酸溶液１００μｌを加えて反応を停止する。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、上清について以下のようにＦ−ｋｉｔ  ａｍｍｏｎｉａ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて測定する（Ａ１）。別に酵素溶液の代わりに水を用いて同様にして測定する（Ａ２）。
【００４０】
Ｆ−ｋｉｔ  ａｍｍｏｎｉａ  １００μｌ  試薬２に上清１０μｌと水１９０μｌを加え室温で５分間放置後１００μｌを用いての３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μＩに、１．０μｌの試薬３（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残りの２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。
上記条件下で１分間あたり１μｍｏｌのアンモニアを遊離する酵素量を１単位とし、以下の式に従って求める。
ｕ／ｍｌ＝１．７６×［Ａ１（Ｅ１−Ｅ２）−Ａ２（Ｅ１−Ｅ２）］
基質として１０ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙに代えて１％カゼイン（ハーマステイン、メルク社製）を用いて同様にして活性を求め、蛋白質に結合するアミド基に作用することを確認する。この時同時に反応停止後の遠心上清について２８０  ｎｍの吸光度を測定することによりプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はこの条件下で１ＯＤユニット上昇させる酵素量を１単位とした。
基質として１０ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙに代えて１０ｍＭグルタミンを用いて同様にして、グルタミナーゼ活性を測定した。
【００４１】
また、トランスグルタミナーゼ活性は、基質としてＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを用いた以下に示すヒドロキシサム酸法で測定した。
0003609648.tif 000004
上記溶液の１：１：１の混合液を試薬Ｂとする。
酵素液の０．０５ｍｌに試薬Ａ  ０．５ｍｌを加えて混合し、３７℃で１０分間反応後、試薬Ｂ  ０．５ｍｌを加えて反応停止とＦｅ錯体の形成を行った後、５２５ｎｍの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差により生成されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とした。
【００４２】
尚、蛋白質の定量はＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ピアース社製）により、牛血清アルブミンを標準蛋白質として用いて定量した。
【００４３】
▲１▼分子量の測定：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で２０ｋＤａであった。
【００４４】
▲２▼至適ｐＨの測定：各ｐＨの（１０ｍＭのＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む）１００μｌ［４０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３〜１２）］を３７℃で５分間予熱後、０．３２μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液１０μｌを加え、３７℃で６０分間反応し、酵素活性を測定した。その結果を図２に示す。
【００４５】
▲３▼至適温度の測定：基質溶液（１０ｍＭのＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含む）１００μｌ  ［１７６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）］に１．２１μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液１０μｌを添加して、各温度で６０分間反応し、酵素活性を測定した。その結果を図３に示す。
【００４６】
▲４▼ｐＨ安定性の測定：０．７５μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液２２μｌ［４０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３〜１２）］を３０℃で１８時間処理する。その後残存する酵素活性を測定した。その結果を図４に示す。
【００４７】
▲５▼温度安定性の測定：１．７６μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液４３μｌ［５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］を１０分間、各温度で放置した後、残存する酵素活性を測定した。その結果を図５に示す。
【００４８】
▲６▼基質特異性：基質として各種蛋白質（１％）溶液を用い、それらの溶液１００μｌに蛋白質脱アミド酵素溶液１０μｌ（１０ｍＵ）を加え混合後、３７℃で１８時間反応させた。対照として、酵素液の代わりに水を添加し同様に処理し、遊離したアンモニアの量を測定した。酵素添加の場合の遊離アンモニア量から水添加の場合の遊離アンモニア量を差し引いた結果を表２に示す。また、反応終了後の混合液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、対照と比較したところ、蛋白質の高分子化及び蛋白質の低分子化は観察されなかった。このことは本酵素が既知のトランスグルタミナーゼやプロテーゼとは区別される新規な酵素であることを意味する。
【００４９】
【表２】
0003609648.tif 000005
【００５０】
▲７▼等電点の測定：アンフォラインを用いた等電点集積（６００Ｖ、４℃、４８時間通電）により測定したところ、本酵素の等電点は１０．２であった。
【００５１】
次いで、本発明である上記の蛋白質脱アミド酵素を用いた蛋白質の修飾方法について詳述する。
【００５２】
各種蛋白質に本発明の蛋白質脱アミド酵素を作用させる。蛋白質としては上記酵素の作用を受けるものであればいかなるものであってもよく、例えば、植物性蛋白質であれば豆類、穀類由来の蛋白質、動物性蛋白質であればカゼイン、β−ラクトグロブリンなどの乳蛋白、オボアルブミンなどの卵蛋白、ミオシン、アクチンなどの肉蛋白、血清アルブミンなどの血液蛋白、ゼラチン、コラーゲンなどの腱蛋白質があげられる。また、酸、アルカリなどによる化学的、あるいはプロテアーゼなどによる酵素的部分分解蛋白質や、各種試薬による化学修飾蛋白質や、合成ペプチドであってもよい。
【００５３】
これら基質蛋白質は、溶液またはスラリーあるいはペースト状態で反応に供されるが、その濃度は特に限定されるものではなく、目的の脱アミド化蛋白質の望まれる性状、状態によって適宜選択される。またこの基質蛋白質の溶液またはスラリーあるいはペーストは、水溶液に限らず油脂とのエマルジョンであってもよく、さらに必要に応じて塩類、糖類、蛋白質、香料、保湿剤、着色料などが添加されたものであってもよい。
【００５４】
反応条件として、酵素量、反応の時間、温度、反応溶液のｐＨなども特に限定されるものではないが通常、蛋白質１ｇに対し、０．１〜１００ユニット、好ましくは１〜１０ユニット、反応温度は通常、５〜８０℃、好ましくは２０〜６０℃、反応溶液のｐＨは通常、２〜１０、好ましくは４〜８で１０秒〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間反応させる。また、これらの条件は、使用する酵素の純度や基質蛋白質の種類、純度などに応じて適宜変更して行うことができる。また、これらの反応条件は、以下に記載する様々な本発明酵素の用途においても同様である、
【００５５】
このように本発明の蛋白質脱アミド酵素を各種蛋白質に作用させることにより、蛋白質中のアミド基を直接脱アミドすることができる。その結果、生じた脱アミド化蛋白質は、負電荷の増加に伴い、ｐＩの低下、水和力の上昇、静電反発力の上昇がもたらされる。更に蛋白質の高次構造の変化により、表面疎水性の上昇がもたらされる。これらの効果により、可溶性・分散性の向上、起泡性・泡沫安定性の向上、乳化性・乳化安定性の向上など、蛋白質の機能性の改善がもたらされる。
【００５６】
このように機能性が改善された蛋白質は、主として食品分野での用途が大きく拡大する。多くの植物性蛋白質は、特に通常の食品のｐＨ範囲である弱酸性において、可溶性、分散性、乳化性などの機能性が乏しいため、多くの食品例えばコーヒー・ホワイトナー、ジュースなどの酸性飲料、ドレッシング、マヨネーズ、クリームなどへの使用が制限されていた。しかしながら、例えば小麦グルテンなどの植物性難溶解性蛋白質を本発明により脱アミド化することにより、可溶性、分散性が増大し、これまで使用に適さなかったこれらの食品への使用が可能となり、また分散性の高い天ぷら粉としても使用できる。
【００５７】
また、製パン・製菓におけるドウの改質のためにも本酵素が使用できる。例えばグルテン含量が高いドウは伸展性が低く、ドウのハンドリング性や機械特性に問題があり、また出来上がったパンの体積や品質にも問題があった。グルテンを本酵素により脱アミド化することにより、伸展性が向上し、これらの問題を改善することが出来る。また脱アミド化グルテンが乳化剤としての効果も示し、日持ち性、ソフトネスなどの製パン特性も向上する。さらに脱アミド化グルテンを含むドウは、可塑性が低く伸展性に優れているため、クラッカー、ピスケット、クッキー、ピザや或いはパイのクラストの製造にふさわしく、これらの製造にも本酵素が使用できる。この用途のためには、小麦粉、水等からなるドウの全量に対して、本発明の酵素を通常、０．０１〜１００００ユニット、好ましくは０．１〜１５０ユニット、通常の方法によって混合する。
【００５８】
またさらに、食品中の蛋白質に起因するアレルギー、不耐症或いは遺伝的疾患などの原因となる蛋白質を本酵素による処理によって、その毒性、アレルゲン性を除去、低減化することが出来る。食物アレルギーの場合、一般にアレルゲンペプチドは疎水性が高いものが多い。本酵素処理により親水性ペプチドに変換されることによりアレルゲン性の除去、低下がなされる。とりわけ、小麦グルテン由来のアレルゲンに見られるように、アレルゲンペプチド中にグルタミン残基を含有する場合は大きな効果がもたらされる。
【００５９】
またさらに、蛋白質を本酵素により脱アミド化することにより、蛋白質のミネラル感受性を低下させ、蛋白質・ミネラル溶液中の可溶性ミネラル含量を高め、ミネラルの人体への吸収性を高めることが出来る。一般に食品中のカルシウムの人体への吸収性は、カルシウムを有機酸やカゼインホスホペプチドを用いて可溶化させると向上することはよく知られている。同じメカニズムにより、本酵素により蛋白質を脱アミド化させることにより、多量のカルルシムを可溶化させることが可能である。この脱アミド化蛋白質を用いて、高ミネラル（例えばカルシウム）含有飲料や、ミネラル（例えばカルシウム）の吸収促進剤を製造することもできる。
【００６０】
さらに、アミノ酸系調味料（動物性蛋白質の加水分解物（ＨＡＰ），  植物性蛋白質の加水分解物（ＨＶＰ））或いは味噌・醤油製造においては、苦味の低下、プロテアーゼの蛋白質分解率の向上、グルタミン酸含量の増強などの効果がもたらされる。一般に苦味の原因は疎水性ペプチドに由来することは周知のとおりであり、脱アミドにより苦味ペプチドの低減化がもたらされる。Ｎ末端にグルタミン酸を有するペプチドは苦味のマスキング効果を有することも知られている。また脱アミド化により、原料蛋白質の一次構造、高次構造が変化するため、その蛋白質のプロテアーゼ感受性を高めることもできる。結果、酵素的ＨＡＰ、ＨＶＰ製造において問題の一つであった低分解率を改善することも出来る。また一方、ＨＡＰ、ＨＶＰ製造においては、ピログルタミン酸生成によるグルタミン酸含量の低下が問題であった。このピログルタミン酸は遊離のグルタミンの分子内環状化により生成するものであるが、原料蛋白質を脱アミド化しておくことによりこれを防ぐことが出来、結果としてグルタミン酸含量の増強がもたらされる。
【００６１】
またさらにトランスグルタミナーゼの反応制御剤としても使用できる。トランスグルタミナーゼは、蛋白質の改質剤すなわち架橋用酵素として食品分野をはじめ産業用に広く利用されている。トランスグルタミナーゼの蛋白質架橋反応により蛋白質のゲル化物を得ることや蛋白質の機能性を向上させることを目的とするのであるが、それぞれの用途、目的に応じた架橋度や機能性を有する産物を得ること、すなわち反応を適当な時点で停止させるなど架橋反応を制御することは困難であった。特に食品用蛋白質の改質の場合、ＥＤＴＡや塩化アンモニウムあるいはＳＨ試薬など一般に知られているトランスグルタミナーゼ阻害剤を添加することは好ましくなかった。
【００６２】
本発明による蛋白質脱アミド酵素をトランスグルタミナーゼの反応中適当な時点で添加する事により、トランスグルタミナーゼ反応を停止させることが可能である。つまり基質蛋白質中のトランスグルタミナーゼ反応のターゲットであるグルタミン残基を、蛋白質脱アミド酵素によりグルタミン酸残基に変換することにより、トランスグルタミナーゼ反応を停止させることが出来る。
【００６３】
この場合、蛋白質脱アミド酵素の基質である蛋白質中のグルタミン残基との親和性が、トランスグルタミナーゼのそれより高いことが必要であるが、後者の反応においては、グルタミン残基の他にリジン残基のε−アミノ基が必要であるのに対し、前者の場合グルタミン残基の他には反応環境中豊富に存在する水を必要とするだけであるので、一般に蛋白質脱アミド酵素の反応の方がトランスグルタミナーゼの反応に先行することが推定できる。もちろん、予め基質蛋白質を蛋白質脱アミド酵素により適当に処理して、所望のグルタミン残基をグルタミン酸残基に変換しておいた後トランスグルタミナーゼ反応に供すれば、所望の架橋度の蛋白質改質物、蛋白質ゲル化物を得ることが出来る。
【００６４】
またさらに蛋白質の機能改変用すなわち蛋白質工学用試薬としても使用できる。基質蛋白質が酵素である場合は、その酵素の酵素化学的、物理化学的性質を改変する事が出来る。例えば酵素蛋白質を本酵素により脱アミドすることにより、酵素蛋白質の等電点が低下しｐＨ安定性を改変することが出来る。また、活性部位の構造や電気的環境を変化させることにより、その酵素の基質親和性、基質特異性、反応速度、ｐＨ依存性、温度依存性、温度安定性などを改変することが出来る。
【００６５】
さらに蛋白質のアミド含量定量用試薬、蛋白質の可溶化用試薬など蛋白質分析・研究用試薬としても使用できる。
【００６６】
またさらに穀類、豆類蛋白質の抽出・濃縮効率の向上などに利用できる。一般に小麦、大豆など穀類や豆類の蛋白質は水に不溶性の蛋白質が多く、蛋白質を抽出することは容易ではないが、小麦粉や大豆粉の縣濁液を本酵素で処理し蛋白質を可溶化することにより、蛋白質を容易に抽出することが出来、また高含量の蛋白質単離物を得ることが出来る。
【００６７】
大豆蛋白質の場合、一般に、脱脂大豆粉またはフレーク（蛋白質含量約５０％）から蛋白質を抽出する際には、まず熱処理やエタノール処理或いはｐＨ４．５付近の等電点処理により蛋白質を不溶化させた後、可溶性の多糖を除いて蛋白質含量約７０％の大豆蛋白質濃縮物（コンセントレート）が得られる。さらに高純度の蛋白質が望まれる場合は、大豆粉や濃縮物を希釈アルカリに縣濁・溶解し蛋白質を溶解させ不溶性の物質を除いて調整される。このものは大豆蛋白質単離物（アイソレート）と呼ばれ蛋白質を約９０％含む。これらの大豆蛋白質製品は、大豆蛋白質の乳化性、ゲル化特性、保水性等の機能性や高栄養価を利用して、ハム・ソーセージや乳児用食品をはじめ様々な食品に利用されている。
【００６８】
これらの大豆蛋白質製品を製造する際に本酵素を利用すれば、蛋白質の溶解性の向上により収率の向上ばかりでなくより高濃度の蛋白質製品を製造することが出来る。さらにこのようにして得られた蛋白質製品は、脱アミド化されているため機能性に優れている。従って、畜肉、魚肉製品、麺類など種々の食品に使用した場合優れた効果を示し、また新しいテクスチャーや機能を有する食品の製造が可能となる。
【００６９】
以下、本発明の蛋白質脱アミド酵素、蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを導入した形質転換体、および、該形質転換体を培地に培養し、蛋白質脱アミド酵素を生産せしめ、培養物より蛋白質脱アミド酵素を採取することを特徴とする蛋白質脱アミド酵素の製造法についてさらに説明する。
【００７０】
本発明の蛋白質脱アミド酵素としては、上述した蛋白質脱アミド酵素の製造法で得られるすべての蛋白質脱アミド酵素が含まれるが、特に、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、さらに、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましい。
【００７１】
本発明の蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子としては、該蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子をあげることができる。本発明の蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子としては以下のようなヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
【００７２】
下記（ａ）〜（ｇ）から選択されるヌクレオチドからなり、かつ、蛋白質中のアミド基を脱アミドする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するヌクレオチド、
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている塩基配列を有するヌクレオチド、
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のヌクレオチドに相同性を有するヌクレオチド、
（ｇ）上記（ａ）〜（ｆ）の少なくともいずれか１つに記載のヌクレオチドに縮重するヌクレオチド。
【００７３】
本発明の蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子は、上述した蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の蛋白質脱アミド酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
【００７４】
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製した蛋白質脱アミド酵素を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第  ２５６巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン−シーケンサ４７６Ａ、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製等〕に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００７５】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、蛋白質脱アミド酵素遺伝子をクローニングする。一般的に、  ＰＣＲを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
【００７６】
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、モレキュラー  クローニング、ア  ラボラトリー  マニュアル〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔ  ．マニアティス（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ）他著、コールド  スプリング  ハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ）、１９８９年発行〕に記載の方法を用いることができる。
【００７７】
また、  ＰＣＲ法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。
まず、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡ  を鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて  ＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。ＰＣＲ  法は、ＰＣＲ  テクノロジー〔ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ＨＡ編集、ストックトンプレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅  ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に蛋白質脱アミド酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の蛋白質脱アミド酵素遺伝子の一部を取得することができる。もちろん得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって蛋白質脱アミド酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００７８】
下記の実施例２６ではクリセオバクテリウム・グレウム  ＪＣＭ２４１０を用い、ＰＣＲ法を利用して、蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子を決定した。クリセオバクテリウム・グレウム  ＪＣＭ２４１０由来の蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子の全塩基配列は、配列番号５に記載したものであり、これによってコードされるアミノ酸配列は配列番号６に記載したものであると決定された。なお、配列番号６に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号５に記載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００７９】
配列番号６に記載のアミノ酸配列や配列番号５に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる（参考文献：Ｇｅｎｅ，  ６０（１），  １１５−１２７  （１９８７））。
また、本発明の蛋白質脱アミド酵素遺伝子は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドや該ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ヌクレオチドに相同性を有するヌクレオチド、及び該ヌクレオチドに縮重するヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドが蛋白質脱アミド酵素活性を有する限り本発明に含まれる。
【００８０】
ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち  ０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００  〕及び  １００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ  を含む６×ＳＳＣ  （１×ＳＳＣ  は、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ  、０．０１５  Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０  ）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００８１】
クリセオバクテリウム・グレウム  ＪＣＭ２４１０を用いて全塩基配列が明らかにされた蛋白質脱アミド酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他の蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡ  ライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列表５の蛋白質脱アミド酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ  を選別することができる。
【００８２】
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物から得たゲノムＤＮＡ  ライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ  、  ０．５％ＳＤＳ  、５×デンハルツ、１００  μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ  を含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ  中、室温で１０分間、０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ  中、室温で１０分間、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ  中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ  を検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００８３】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列から  ＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いて  ＰＣＲ反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００８４】
得られた遺伝子が目的の蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の蛋白質脱アミド酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造及び相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、蛋白質脱アミド酵素活性を測定することにより、目的の蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
【００８５】
本発明の蛋白質脱アミド酵素遺伝子を用いて、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。
まず、目的の蛋白質脱アミド酵素遺伝子を含むベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
【００８６】
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属等の細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属等の酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等の糸状菌が挙げられる．動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる．
【００８７】
発現の確認や発現産物の確認は、蛋白質脱アミド酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、蛋白質脱アミド酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００８８】
形質転換体の培養物から蛋白質脱アミド酵素を精製するには上述のように、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
【００８９】
また、本発明により蛋白質脱アミド酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然の蛋白質脱アミド酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、蛋白質脱アミド酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質が少し異なった蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら蛋白質脱アミド酵素を製造することが可能となる。
【００９０】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、  ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第７９巻、第１４０８〜１４１２頁（１９８２）〕、生化学的方法として、〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６４巻、第３１３  〜３１９  頁（１９８８）〕、  ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えて  ＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ）、第２２４  巻、第３４７  〜３５３  頁（１９９５）〕等を用いることができる。
【００９１】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド  デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ）法、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル  バイオケミストリー、第  ２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン、第  １０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）〕、ｄｕｔ  （ｄＵＴＰａｓｅ  ）とｕｎｇ  （ウラシルＤＮＡ  グリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８２巻、第４８８  〜４９２  頁（１９８５）〕、  ＤＮＡポリメラーゼ及び  ＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド  デュアル  アンバー（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ  ：ＯＤＡ  ）法、ジーン、第  １５２巻、第２７１  〜２７５  頁（１９９５）、特開平７−２８９２６２号公報〕、  ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平  ８−７０８７４号公報）、  ＤＮＡ鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平８−１４０６８５号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いた  ＰＣＲによる方法（ＵＳＰ５，５１２，４６３）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖  ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いた  ＰＣＲによる方法〔ジーン、第  １０３巻、第７３〜７７頁（１９９１）〕、アンバー変異を利用した  ＰＣＲによる方法〔国際公開ＷＯ９８／０２５３５号公報〕等を用いることができる。
【００９２】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド  デュプレックス法を用いた  Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｇ（宝酒造社製）、クンケル法を用いた  Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｋ（宝酒造社製）、ＯＤＡ  法を用いたＭｕｔａｎ  （登録商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  （宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ）由来  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕等を用いることができ、また、  ＰＣＲ法を利用するキットとして、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）、Ｍｕｔａｎ  （登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  （宝酒造社製）等を用いることができる。
【００９３】
このように、本発明により、蛋白質脱アミド酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。
なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。
【００９４】
以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において％はＷ／Ｖ％で示した。
【００９５】
【実施例】
実施例１
クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０を前述したラクトース培地で、３０℃、６日間振盪培養した。その培養経過を図１に示す。
【００９６】
実施例２
実施例１と同様にしてクリセオバクテリウム・インドロゲネス（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）  ＩＦＯ１４９４４、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ１２５３５、クリセオバクテリウム・バラスチナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｌｕｓｔｉｎｕｍ）ＩＦＯ１５０５３についての培養経過を図６〜８に示す。
【００９７】
実施例３
実施例１と同様にしてフラボバクテリウム・アクアティレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｌｅ）ＩＦＯ１５０５２について培養した。培養液中の蛋白質脱アミド酵素活性を表３に示す。
【００９８】
実施例４
実施例１と同様にしてエンペドバクター  ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓ）ＩＦＯ１４９４３について培養した。培養液中の蛋白質脱アミド酵素活性を表３に示す。
【００９９】
実施例５
実施例１と同様にしてスフィンゴバクテリウム・スピリチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）ＩＦＯ１４９４８、スフィンゴバクテリウム・ヘパリナム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ１２０１７について培養した。培養液中の蛋白質脱アミド酵素活性を表３に示す。
【０１００】
実施例６
実施例１と同様にしてアウレオバクテリウム・アステロアロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｄｕｍ）ＩＦＯ３７５１について培養した。培養液中の蛋白質脱アミド酵素活性を表３に示す。
【０１０１】
実施例７
実施例１と同様にしてミロイデス・オドラタス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ）ＩＦＯ１４９４５について培養した。培養液中の蛋白質脱アミド酵素活性を表３に示す
【０１０２】
【表３】
0003609648.tif 000006
【０１０３】
実施例１〜７において何れの菌株にも蛋白質脱アミド酵素の生産が確認された。
【０１０４】
実施例８
ラクトース培地に代え、以下の培地を用いて同様にして培養したところ、実施例１〜５に用いた何れの菌株にも蛋白質脱アミド酵素の生産が確認された
0003609648.tif 000007
【０１０５】
実施例９
実施例１で得られた、２４時間培養液を４℃、１２０００  ｒｐｍ（２２２００×ｇ）、１５分間の遠心分離により菌体を除去し、得られた遠心上清を、限外濾過（ＵＦ）膜（ＳＥＰ−００１３、旭化成製）により約１７倍に濃縮後、２．０Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に対し４℃で一晩透析した。生じた沈殿物を４℃、１００００  ｒｐｍ（１２３００×ｇ）、１５分間の遠心分離により除いた後、得られた遠心上清を、２．０Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したフェニルセファロース  ＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）に供し、２．０Ｍから０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により吸着した蛋白質を溶離させた。
【０１０６】
蛋白質脱アミド活性画分を集め、限外濾過膜で濃縮後、０．６Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファクリルＳ−１００カラムに供して、同緩衝液で溶離した。蛋白質脱アミド活性画分を集め、限外濾過膜で濃縮後、蒸留水に対して透析して、蛋白質脱アミド酵素溶液を得た。
【０１０７】
図９に精製工程における各ステップのサンプルを１０〜２０％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したパターンを示す。このように本精製酵素標品  （レーン５）はＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量２０ｋＤａの単一蛋白質であることが判る。
【０１０８】
上述の測定法（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質とする方法とカゼインを基質とする方法）で活性を測定したところ１８．８単位／ｍｌ（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質）、１４．０単位／ｍｌ（カゼインを基質）の酵素標品が得られた。また、トランスグルタミナーゼ活性及びプロテアーゼ活性は検出されなかった。従って、図１における培養液中のプロテアーゼ活性は上記精製工程で完全に除去されていることがわかる。又、本酵素標品には遊離のグルタミンに作用するグルタミナーゼ活性も検出されなかった。
【０１０９】
実施例１０
実施例９と同様にして、実施例２〜７で得られた培養液を精製した。その結果、各々表４に示すような活性が得られた。得られた蛋白質脱アミド酵素にはトランスグルタミナーゼ活性及びプロテアーゼ活性は検出されなかった。従って、培養液中のプロテアーゼ活性は上記精製工程で完全に除去されていることがわかる。
【０１１０】
【表４】
0003609648.tif 000008
【０１１１】
実施例１１  脱アミド化グルテンの調製
小麦グルテン１ｇを１００ｍｌの１７６ｍＭ  燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）に縣濁し、５Ｕの蛋白質脱アミド酵素を添加して、３７℃で２０時間振とう反応させた。この時のアンモニア又はアンモニウムの遊離パターンを図１０に示す。このように、対照として行った酵素無添加の反応に対し、酵素添加の反応においては、反応時間の進行と共にアンモニアが遊離し脱アミド反応が生じていることが判る。反応後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥して脱アミド化グルテン粉末を得た。
【０１１２】
得られた脱アミド化グルテンの脱アミド化率は３７．４％であった。なお、脱アミド化率は、反応終了後に遊離したアンモニアを定量し、小麦グルテンの総アミド含量に対する百分率として表した。蛋白質の総アミド含量は、蛋白質（１％ｗ／ｖ）を２Ｎ塩酸中１００℃で２時間加水分解し、遊離したアンモニアを定量して求めた。
【０１１３】
実施例１２  脱アミド化グルテンの機能性（溶解性、分散性）の向上
実施例１１で得た脱アミド化グルテン粉末及び対照実験で得た酵素未処理グルテン粉末２．０ｍｇを１．０ｍｌのｐＨ３から１２までの４０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液に縣濁、溶解させ室温で３０分間振とう後、さらに３０分間室温に静置した。ここでｐＨを測定後、２４℃で１０分間、３０００ｒｐｍ（７６０×ｇ）の低速で遠心分離し、得られた上清中の蛋白質含量をＢＣＡ法で測定し、上清中の蛋白質の含量を分散性の指標とした（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｎａｌｉｔｙ，  ｐ２５，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｍ．Ｈａｌｌ，  Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＆  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９６）。
【０１１４】
さらにこの上清を２４℃で３０分間、１４０００ｒｐｍ（１６０００×ｇ）の高速で遠心分離し、得られた上清を０．４５μｍの膜で濾過し、濾液中の蛋白質含量をＢＣＡ法で測定した。この濾液中の蛋白質含量を溶解性の指標とした（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｎａｌｉｔｙ，  ｐ４７−５５，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｍ．Ｈａｌｌ，  Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＆  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９６）。
【０１１５】
結果、図１１及び図１２に示すように、脱アミド化グルテンは酵素未処理グルテンに比べて、ｐＨ４．２付近からｐＨ１２付近までの広範囲において、分散性も溶解性も著しく向上していることが判る。
【０１１６】
実施例１３  脱アミド化グルテンを用いたコーヒー・ホワイトナーの製造
実施例１１に準じて製造した５ｇの脱アミド化グルテン、２ｇのコーン・シロップ２ｇ、０．４  ｇのポリソルベート６０、５１ｇの水を混ぜ合わせ４０℃に加熱後、０．３  ｇの燐酸二カリウムを加え８０℃まで加熱した。この混合液に、溶融状態の部分水添ココナッツ油６ｇと０．２ｇのモノグリセリドを添加し８０℃で２０分間放置した後、２１１ｋｇ／ｃｍ２でホモゲナイズし、冷却して脱アミド化グルテンを含有するコーヒー・ホワイトナーを製造した。この産物は、安定なエマルジョン状態を示し、またコーヒーに添加した場合に良好な分散・溶解性、口当たりを示した。
【０１１７】
実施例１４  天ぷら粉の製造
小麦粉１００ｇを１Ｌの水に縣濁し、  １０ユニットの蛋白質脱アミド酵素を添加して、３７℃で２０時間振とう反応処理後、遠心分離により脱水し、熱乾燥して脱アミド処理した小麦粉を得た。この小麦粉５０ｇを水６０ｍｌで溶き、天ぷら用の衣液とした。大正エビ（約２５ｇ）に打ち粉をしてこの衣液をつけて１７０〜１８０℃の菜種／大豆調合油で３分間フライした。また、蛋白質脱アミド酵素処理を行わない小麦粉を用いて同様にしてフライした。蛋白質脱アミド酵素処理を行った小麦粉は衣液を調整する際においてその分散性が優れ、得られたフライの衣の堅さ、衣のサクミなどの食感、外観、風味において非常に優れていた。
【０１１８】
実施例１５  プレミックスの製造
実施例１４に従って調整した蛋白質脱アミド酵素処理小麦粉を用いて以下のような組成のホットケーキ用プレミックスを調製した。
蛋白質脱アミド酵素処理小麦粉      ７２．０％
砂糖                              ２０．０％
膨剤（炭酸水素ナトリウム）          １．５％
油脂                                ３．０％
食塩                                １．０％
グルコノデルタラクトン              ２．０％
香料                                ０．５％
上記のプレミックス２００ｇをボールに入れこれに牛乳１５０ｍｌ、全卵５０ｇを添加して撹拌混合してホットケーキ用生地を調製した。対照に未処理の小麦粉を用いて同様に調製した。得られた生地１００ｇを１６０℃のホットプレート上に円形に流し、表を４分、裏を２分焼成してホットケーキを調製した。
【０１１９】
生地のハンドリング、ホットケーキのソフト感、口どけ感、しっとり感についてパネラーにより判定した。その結果、蛋白質脱アミド酵素処理小麦粉を用いた場合はすべての点で対照に比べて優れていた。
【０１２０】
実施例１６  製パン生地の調製
以下に示す配合でノータイム法によりワンローフ食パンを製造した。
0003609648.tif 000009
【０１２１】
上記配合を基本とし、蛋白質脱アミド酵素添加（７．５単位／小麦粉１ｋｇ）群と酵素無添加（対照）群を調製し比較した。
【０１２２】
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【０１２３】
蛋白質脱アミド酵素添加群は生地のハンドリングが良好となり、生地の伸展性の向上、焼成パンのソフトネスの向上にも効果が見られた。
【０１２４】
実施例１７  ビスケット生地の調製
実施例１４に従って調整した蛋白質脱アミド酵素処理小麦粉を用いて以下のような組成でビスケット用生地を調製した。
【０１２５】
蛋白質脱アミド酵素処理小麦粉      １００ｇ
ショートニング                      １６ｇ
砂糖                                ５０ｇ
重炭酸ナトリウム                  ０．８１ｇ
重酒石酸カリウム                  ０．５ｇ
水                                  １６ｇ
卵                                ２ｇ
【０１２６】
混合、成形、焼成（１８０〜２２０℃）を常法に従って行い、ハードビスケットを調製した。生地のハンドリング、伸展性の向上が顕著であり、得られたビスケットの食感も優れたものであった。
【０１２７】
実施例１８  脱アミド化カゼインの調製
ミルクカゼイン１ｇを１００ｍｌの１７６ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）に縣濁し、５ユニットの蛋白質脱アミド酵素を添加して、３７℃で２０時間振とう反応させた。この時のアンモニア又はアンモニウムの遊離パターンを図１３に示す。このように、対照として行った酵素無添加の反応に対し、酵素添加の反応においては、反応時間の進行と共にアンモニアが遊離し脱アミド反応が生じていることが判る。反応後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥して脱アミド化カゼイン粉末を得た。
【０１２８】
得られた脱アミド化カゼインの脱アミド化率は４０．９％であった。なお、脱アミド化率は、反応終了後に溶液中に遊離したアンモニア又はアンモニウムを定量し、カゼインの総アミド含量に対する百分率として表した。蛋白質の総アミド含量は、蛋白質（１％ｗ／ｖ）を２Ｎ塩酸中１００℃で２時間加水分解し、遊離したアンモニアを定量して求めた。
又、図１４にこの脱アミド化カゼインを酵素未処理カゼインと共に１０〜２０％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したパターンを示す。脱アミド化カゼイン（レーン２）その分子量が変化していないこと、即ち分解も架橋高分子化も生じていないことが判る。ここで脱アミド化カゼインのバンドがわずかに高分子側にシフトしていることが観察されるが、これは脱アミド化により蛋白質の負電荷が増加したため同じ負電荷を持つＳＤＳとの結合が静電反発力により減少し、その結果全体の負電荷が脱アミド化されていないカゼインに比べ小さくなった結果、電気泳動での移動度が減少したためと考えられる。
【０１２９】
実施例１９  脱アミド化カゼインのカルシウム溶解性の向上
実施例１８で得た脱アミド化カゼイン粉末及び対照実験で得た酵素未処理カゼイン粉末２．０ｍｇを０〜３０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）に縣濁、溶解させ室温で３０分間振とう後、さらに３０分間室温に静置した。この液を２４℃で１０分間、３０００ｒｐｍ（７６０×ｇ）の低速で遠心分離し、上清をさらに２４℃で３０分間、１４０００ｒｐｍ（１６０００×ｇ）の高速で遠心分離し、得られた上清を０．４５μｍの膜で濾過し、濾液中の蛋白質含量をＢＣＡ法で測定した。この濾液中の蛋白質含量をカルシウム溶解性の指標とした。
【０１３０】
結果、図１５に示すように、脱アミド化カゼインは、酵素未処理カゼインに比べて、高濃度カルシウム存在下においても高い溶解性を示し、顕著にカルシウム溶解性が向上していることが判る。
【０１３１】
実施例２０  酵素分解調味液の製造
グルテン４５ｇに１５％食塩水１５０ｍｌを加え、蛋白質脱アミド酵素５０ユニット、グルタミナーゼＦ１００（天野製薬製）０．１％及びプロテアーゼＭ（天野製薬製）０．７５％を加え、４５℃で３〜４日間反応した。反応後９０℃で２０分間加熱し、酵素分解調味液を調製した。対照として蛋白質脱アミド酵素を加えないで同様に操作して調製した調味液と比較して分解率、分解速度がともに向上し、得られた調味液の苦味成分の生成が少なく良好な調味液を製造することができた。
【０１３２】
実施例２１  大豆蛋白質の濃縮・回収方法並びに脱アミド化大豆蛋白質の製造
大豆粉１００ｇを１Ｌの水に縣濁・溶解し、攪拌しながらｐＨを６．５に調整し、５００ユニットの蛋白質脱アミド酵素を添加して室温で２時間攪拌を続けた。反応後ｐＨを８に調整し１時間攪拌後、室温で１００００ｒｐｍ（１２３００×ｇ）、３０分間の遠心分離により不要物を除いた。得られた上清から蛋白質を回収するため、８０℃で３０分間熱処理を施したのち、１００００ｒｐｍ（１２３００×ｇ）、３０分間の遠心分離により生じた沈殿物を回収し、乾燥させて蛋白質粉末を得た。この蛋白質標品は、９５％の蛋白質含量を有し、大豆粉からの収率も約４０％と高いものであった。
【０１３３】
実施例２２  脱アミド化大豆蛋白質を用いたソーセージの製造
実施例２１に従って製造した脱アミド化大豆蛋白質を、撹拌、押出、圧延を繰り返して行うことにより、凝固処理を行う。得られた大豆蛋白の凝固物と原料肉及び各種香辛料を以下の配合に練合したのち、常法に従ってケーシングに充填して、ソーセージを調製した。得られた製品は非常に食感に優れたものであった。
【０１３４】
ブタ肩肉            ５００ｇ
ウシもも肉          ５００ｇ
ブタ挽脂肪          １００ｇ
凝固物              １００ｇ
食塩                  ２５ｇ
硝石                ３ｇ
砂糖                ５ｇ
味の素              ３ｇ
ホワイトペパー      ３ｇ
ナッツメッグ        ４ｇ
シナモン            ０．５ｇ
タマネギ汁          ５ｇ
【０１３５】
実施例２３  トランスグルタミナーゼ反応制御剤としての利用
１０％カゼインを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）２５μｌに、０．０１２５ユニットのＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ由来のトランスグルタミナーゼ（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５３巻１０号、２６１３−２６１７頁、１９８９年に従って調製）を含む溶液１２．５μｌを添加し攪拌後、３７℃で静置反応させた。一時間後、０．０１８８ユニットの蛋白質脱アミド酵素を含む溶液１２．５μｌを添加し攪拌後、さらに３７℃に静置した。反応中、１，２，４，２４時間後に反応液の一部を分取して２〜１５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。対照実験として蛋白質脱アミド酵素溶液の代わりに水を添加したものも行った。
【０１３６】
その結果を図１６に示し、図１６の各レーンのサンプルは以下の表５に示す。
【０１３７】
【表５】
0003609648.tif 000011
【０１３８】
結果、図１６の様に、蛋白質脱アミド酵素を添加しなかった対照の反応では、時間の経過と共に蛋白質の架橋反応による高分子化が観察され、０時間で観察されたカゼイン単量体のバンドが減少、消滅していくのに対し、蛋白質脱アミド酵素を添加した反応では、添加後も添加時点のパターン（レーン７）から変化していないことが判る。このことは、トランスグルタミナーゼの架橋高分子化反応が蛋白質脱アミド酵素の添加によって停止したことを表す。
【０１３９】
実施例１８で得た脱アミド化カゼイン１０％を含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５μｌに、０．０１２５ユニットのＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ由来のトランスグルタミナーゼを含む溶液１２．５μｌを添加し攪拌後、３７℃で静置反応させた。反応中、１、２、４、２４時間後に反応液の一部を分取して２〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。対照実験として脱アミド化カゼインの代わりに未処理のカゼインを用いたものも行った。
その結果を図１７に示し、図１７の各レーンのサンプルは以下の表６に示す。
【表６】
0003609648.tif 000012
結果、図１７のように、酵素未処理カゼインを用いた対照の反応では、時間の経過と共に蛋白質の架橋反応による高分子化が観察され、０時間で観察されたカゼイン単量体のバンドが減少、消滅していくのに対し、脱アミド化カゼインを用いた反応では、０時間のバンド（レーン１）から反応後も変化していないことが判る。このことは、蛋白質脱アミド酵素により脱アミド化された蛋白質は、トランスグルタミナーゼの基質となり得ないことを示す。
【０１４０】
実施例２４  トランスグルタミナーゼと蛋白質脱アミド酵素によるプリン様食品の製造
市販牛乳を減圧濃縮により濃縮し、この濃縮液１００ｍｌに砂糖５ｇを添加溶解し、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ由来のトランスグルタミナーゼを１ユニット加え、５５℃でインキュベートした。適当なゲルが生成された時点で蛋白質脱アミド酵素を１．５ユニット加え攪拌してトランスグルタミナーゼ反応を停止させた後冷却した。結果、望ましい柔らかさのプリン様食品を製造することが出来た。
【０１４１】
実施例２５
脱アミド化カゼインの機能性（溶解性、分解性）の向上
実施例１８で得た脱アミド化カゼイン粉末及び対照実験で得た酵素未処理カゼイン粉末を用いて、実施例１２と同様の操作を行い脱アミド化カゼインの溶解性、分酸性を調べた。
結果、図１８に示すように、脱アミド化カゼイン酵素未処理カゼインに比べて、特に通常の食品のｐＨ域であるｐＨ４付近から５付近において、分散性も溶解性も著しく向上していることが判る。
【０１４２】
以下に実施例を用いて、本発明をさらに説明する。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に従って行った。
【０１４３】
実施例２６    クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）  ＪＣＭ２４１０由来の蛋白質脱アミド酵素をコードする遺伝子の単離
ａ）染色体ＤＮＡの単離
”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｕｎｉｔ  ２．４  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９４）に従って、１００ｍｌ  のカルチャーから、１９０μｇ／ｍｌの濃度の染色体ＤＮＡを、３．３ｍｌ得た。
【０１４４】
ｂ）部分アミノ酸配列の決定
実施例９で得られた蛋白質脱アミド酵素の精製標品を、プロテイン・シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に供し、配列番号１に示す２０残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、実施例９で得られた蛋白質脱アミド酵素の精製標品を過ギ酸により還元・アルキル化した後、トリプシンによる分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分の一つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号２に示す２０残基の内部アミノ酸配列を決定した。
【０１４５】
配列番号１：
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ
配列番号２：
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
【０１４６】
ｃ）ＰＣＲによるＤＮＡプローブの作成
Ｎ末端領域アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、以下の２種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【０１４７】
配列番号３
センス・プライマー：
５’−（ＴＡ）（ＣＧ）ＩＧＴＩＡＴ（ＴＣＡ）ＣＣＩＧＡ（ＴＣ）（ＣＴ）Ｔ（ＴＣＡＧ）ＡＣ−３’
配列番号４
アンチセンス・プライマー：
５’−Ａ（ＡＧ）（ＴＣＡＧ）ＡＣ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＴＴ（ＴＣＡＧ）ＧＴ（ＡＧ）ＴＴ（ＴＣＡＧ）ＡＣ−３’
【０１４８】
これらのプライマーとクリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）  ＪＣＭ２４１０の染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、Ｏｍｎｉｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ社）を用いてＰＣＲ反応を行なった。
0003609648.tif 000013
【０１４９】
得られた約０．４８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。本ＤＮＡ断片を全長遺伝子クローニングのためのＤＮＡプローブとした。
【０１５０】
ｄ）遺伝子ライブラリーの作成
クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）  ＪＣＭ２４１０の染色体ＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、Ｅｃｏ  ＲＩ分解物中にプローブＤＮＡとハイブリダイズする約３．７  ｋｂのシングルバンドが確認された。この約３．７  ｋｂのＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作成した。上記ａ）で調製した染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで分解し、得られた分解物をＥｃｏＲＩ処理したλＺＡＰＩＩ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ベクターにライゲーションし、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ｇｏｌｄ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてパッケージングし遺伝子ライブラリーを得た。
【０１５１】
ｅ）遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記ｃ）で得た０．４８  ｋｂのＤＮＡ断片をＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と３２Ｐ−α−ｄＣＴＰを用いてラベルした。これをＤＮＡプローブとして、ｄ）で得た遺伝子ライブラリーをプラーク・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られた陽性プラークからファージを回収した後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のインストラクションに従い、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｉｃｉｓｉｏｎ法により、約３．７  ｋｂ  Ｅｃｏ  ＲＩ断片を含むプラスミドｐ７Ｔ−１を得た。
【０１５２】
ｆ）塩基配列の決定
プラスミドｐ７Ｔ−１の塩基配列を定法に従って決定した。蛋白質脱アミド酵素をコードする塩基配列を配列番号５に示す。また配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号６に示す。このアミノ酸配列中には、  ｂ）で決定したＮ末端領域アミノ酸配列（配列番号１）および内部アミノ酸配列（配列番号２）が見出された。
【０１５３】
0003609648.tif 000014
【０１５４】
0003609648.tif 000015
【０１５５】
この遺伝子のオープンリーディングフレームを配列番号１１に示す。配列番号１２に示すように、全体が３１９アミノ酸残基のＰｒｅｐｒｏ体としてコードされており、うちＮ−末端の１３４残基（下記配列番号１１の下線部）がＰｒｅｐｒｏ領域、残りの１８５残基が成熟体に対応する（配列番号６を参照）。
Ｐｒｅｐｒｏ領域１３４残基のうち、Ｎ−末端の２１残基がシグナル配列の特徴を有しているためＰｒｅ領域と推定され、残りの１１３残基がＰｒｏ領域と推定される。
本発明は蛋白質脱アミド化活性を有するポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、蛋白質脱アミド化活性を有するポリペプチドからなる更に長いポリペプチド（例えば、Ｐｒｅｐｒｏ体やＰｒｏ体等）やそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
【０１５６】
0003609648.tif 000016
0003609648.tif 000017
【０１５７】
0003609648.tif 000018
【０１５８】
実施例２７    蛋白質脱アミド酵素の大腸菌での生産
ａ）蛋白質脱アミド酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築
Ｎ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をもとに、以下の２種のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【０１５９】
配列番号７
センス・プライマー：
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＣ−３’
配列番号８
アンチセンス・プライマー：
５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣ−３’
【０１６０】
これらのプライマーと蛋白質脱アミド酵素遺伝子を有するプラスミドｐ７Ｔ−１を鋳型として、以下の条件下、Ｏｍｎｉｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  （Ｈｙｂａｉｄ  社）を用いてＰＣＲ反応を行なった。
0003609648.tif 000019
【０１６１】
0003609648.tif 000020
【０１６２】
得られた約０．５７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した後、本プラスミドから  ＥｃｏＲＩ処理により約０．５７  ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を大腸菌での発現ベクターｐＧＥＸ−１λＴ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＥＸ−１λＴが有するグルタチオンＳトランスフェラーゼのコードＤＮＡのＣ末端に蛋白質脱アミド酵素のコードＤＮＡを同方向に連結した。
得られた蛋白質脱アミド酵素の大腸菌での発現プラスミドｐＮ７−７は、ｔａｃプロモーターの制御下でグルタチオンＳトランスフェラーゼと蛋白質脱アミド酵素の融合蛋白質を発現させることが出来、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ処理により融合蛋白質から蛋白質脱アミド酵素を切り出すことが出来る。
【０１６３】
ｂ）蛋白質脱アミド酵素の大腸菌での発現
発現プラスミドｐＮ７−７を大腸菌ＢＬ２１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に導入し形質転換体を得た。また対照として発現ベクターｐＧＥＸ−１λＴを有する大腸菌ＢＬ２１の形質転換体も得た。これらの形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で３７℃、  ２００ｒｐｍで培養して得た対数増殖期（ＯＤ６００＝０．９￣１．０）の細胞に終濃度０．１  ｍＭのＩＰＴＧを添加後さらに４時間同条件で培養し集菌した。菌体を培養液の１／１０量の５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、  ｐＨ８．０／２  ｍＭ    ＥＤＴＡに縣濁し、終濃度０．１  ｍｇ／ｍｌのＥｇｇ  ｗｈｉｔｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅと終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、３０℃で１５  ｍｉｎ放置後、温和な超音波処理（１０  ｓｅｃ．  Ｏｎ  ａｎｄ  ３０  ｓｅｃ．  Ｏｆｆを３  ｃｙｃｌｅｓ）で粘凋なＤＮＡを揃断しＣｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔを得た。このＣｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ  １００μｌに、４μｌのＴｈｒｏｍｂｉｎ（１Ｕ／μｌ−９  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、  ｐＨ６．５／１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加し、室温に１６時間放置し、Ｔｒｏｍｂｉｎ処理Ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔを得た。また４μｌの緩衝液（９  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、  ｐＨ６．５／１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加し、同様の反応を行ったものをＴｒｏｍｂｉｎ処理の対照とした。
【０１６４】
得られたサンプルについて、蛋白質脱アミド酵素活性の測定を行った結果を以下の表に示す。
【０１６５】
【表７】
0003609648.tif 000021
【０１６６】
この様に、蛋白質脱アミド酵素発現プラスミドｐＮ７−７を有する大腸菌は、蛋白質脱アミド活性を発現していることが判る。一方、対照とした発現ベクターｐＧＥＸ−１λＴを有する大腸菌には蛋白質脱アミド活性の発現は観察されなかった。また、これらのサンプルを１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、蛋白質脱アミド酵素に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ解析を行った。その結果、サンプル１中にはグルタチオンＳトランスフェラーゼと蛋白質脱アミド酵素の融合蛋白質を考えられる分子量約４３ｋＤａの位置に抗体と反応するバンドが検出され、サンプル２中には、この分子量約４３ｋＤａのバンドの他に蛋白質脱アミド酵素の分子量約２０ｋＤａの位置にバンドが検出された。一方、サンプル３、４中には抗体と反応するバンドは何も検出されなかった。これらの結果より、本発明で得られた蛋白質脱アミド酵素遺伝子を用いて、組換え蛋白質脱アミド酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認された。
【０１６７】
実施例２８    蛋白質脱アミド酵素の糸状菌での発現
ａ）蛋白質脱アミド酵素の糸状菌での発現カセットの構築
Ｎ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をもとに、以下の２種のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機（アプライド・システム社）により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【０１６８】
配列番号９
センス・プライマー：
５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＣ−３’
配列番号１０
アンチセンス・プライマー：
５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣ−３’
【０１６９】
これらのプライマーと蛋白質脱アミド酵素遺伝子を有するプラスミドｐ７Ｔ−１を鋳型として、実施例２７と同様にしてＰＣＲ反応を行った。得られた約０．５７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した後、本プラスミドからＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ処理により約０．５７  ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を糸状菌での発現カセット構築ベクターｐＹ４’（特開平７−１２３９８７）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＤ５’を得た。このプラスミドにはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ由来のモノ及びジアシルグリセロールリパーゼと蛋白質脱アミド酵素の融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する。さらにモノ及びジアシルグリセロールリパーゼと蛋白質脱アミド酵素の接合部に存在する不必要な塩基配列（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’、これは蛋白質脱アミド酵素遺伝子を連結するために導入したＳａｌＩ部位に相当する）を部位特異的変異により欠失させ、プラスミドｐＤ５を得た。このプラスミドは、モノ及びジアシルグリセロールリパーゼのＣ末端部位のプロセッシング部位（Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列、それぞれＣ末端から３番目及び２番目）の直後に蛋白質脱アミド酵素が連結された融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する。またこの融合蛋白質は、その上流と下流にあるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ由来のモノ及びジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーターとターミネーターの制御によって糸状菌や酵母で発現される。また、発現された融合蛋白質は宿主のもつプロテアーゼによってＬｙｓ−Ａｒｇ部位で切断され、蛋白質脱アミド酵素を切り出すことが可能である（特開平７−１２３９８７）。
【０１７０】
ｂ）蛋白質脱アミド酵素のＰｅｎｉｃｉｌｌｕｉｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉでの発現
上記ａ）で得られたプラスミドｐＤ５を、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉの形質転換プラスミドｐＨ１と共にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎによりＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ  Ｕ−１５０株に導入した。対照としてｐＨ１のみによる形質転換体も得た。得られた形質転換体を培養し、培養ろ液中の蛋白質脱アミド酵素活性を測定したところ、プラスミドｐＤ５を導入した形質転換体において１０．３  ｍＵ／ｍｌ（基質：Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）の蛋白質脱アミド酵素の生産が確認された。一方、ｐＨ１のみによる形質転換体の培養ろ液中には活性は検出されなかった。尚、プラスミドｐＨ１及び形質転換法は特開平７−１２３９８７に詳細が記載されている。
【０１７１】
実施例２９  蛋白質脱アミド酵素のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅでの発現
実施例２８  ａ）で得られたプラスミドｐＤ５を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの形質転換プラスミドｐＮ３と共にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎによりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＡＯ１．１株  （Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９）に導入した。対照としてｐＮ３のみによる形質転換体も得た。得られた形質転換体を培養し、培養ろ液中の蛋白質脱アミド酵素活性を測定したところ、プラスミドｐＤ５を導入した形質転換体において４．５１  ｍＵ／ｍｌ（基質：Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）の蛋白質脱アミド酵素の生産が確認された。一方、ｐＮ３のみによる形質転換体の培養ろ液中には活性は検出されなかった。尚、プラスミドｐＮ３及び形質転換法は特開平７−１２３９８７に詳細が記載されている。
実施例２８及び２９の結果より、本発明で得られた蛋白質脱アミド酵素遺伝子を用いて、組換え蛋白質脱アミド酵素を糸状菌を用いて製造出来ることが確認された。
【０１７２】
【発明の効果】
蛋白質中のグルタミンに作用して脱アミド反応を触媒する新規な酵素として、微生物より初めて見い出され、本酵素は広い応用範囲が期待される。
また、本発明により、蛋白質脱アミドの一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。
【０１７３】
【配列表】
0003609648.tif 000022
0003609648.tif 000023
0003609648.tif 000024
0003609648.tif 000025
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0003609648.tif 000027
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0003609648.tif 000029
0003609648.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【図１】クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０のラクトース培地での培養経過を示す図である。
【符号の説明】
□はｐＨ変動を示し、×は培養液の６６０ｎｍの吸光度（濁度）変動を示し、△はカゼインを基質としたときのプロテアーゼ活性の変動を示し、●はＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示し、黒三角はカゼインを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示す。
【図２】クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０より得られた蛋白質脱アミド酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０より得られた蛋白質脱アミド酵素の至適温度を示す図である。
【図４】クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０より得られた蛋白質脱アミド酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０より得られた蛋白質脱アミド酵素の温度安定性を示す図である。
【図６】クリセオバクテリウム・インドロゲネス（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）  ＩＦＯ１４９４４のラクトース培地での培養経過を示す図である。
【符号の説明】
□はｐＨ変動を示し、×は培養液の６６０ｎｍの吸光度（濁度）変動を示し、△はカゼインを基質としたときのプロテアーゼ活性の変動を示し、●はＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示し、黒三角はカゼインを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示す。
【図７】クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ１２５３５のラクトース培地での培養経過を示す図である。
【符号の説明】
□はｐＨ変動を示し、×は培養液の６６０ｎｍの吸光度（濁度）変動を示し、△はカゼインを基質としたときのプロテアーゼ活性の変動を示し、●はＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示し、黒三角はカゼインを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示す。
【図８】クリセオバクテリウム・バラスチナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｌｕｓｔｉｎｕｍ）ＩＦＯ１５０５３のラクトース培地での培養経過を示す図である。
【符号の説明】
□はｐＨ変動を示し、×は培養液の６６０ｎｍの吸光度（濁度）変動を示し、△はカゼインを基質としたときのプロテアーゼ活性の変動を示し、●はＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示し、黒三角はカゼインを基質としたときの蛋白質脱アミド酵素活性の変動を示す。
【図９】実施例９の精製蛋白質脱アミド酵素及び精製の各ステップのサンプルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】実施例１１のアンモニア又はアンモニウムの遊離パターンを示す図である。
【符号の説明】
△は蛋白質脱アミド酵素を添加した場合の結果を示し、黒三角はブランクの結果を示す。
【図１１】実施例１２の脱アミド化グルテンの分散性を示す図である。
【符号の説明】
黒四角は蛋白質脱アミド酵素処理したグルテンの結果を示し、●は未処理の結果を示す。
【図１２】実施例１２の脱アミド化グルテンの溶解性を示す図である。
【符号の説明】
黒四角は蛋白質脱アミド酵素処理したグルテンの結果を示し、●は未処理の結果を示す。
【図１３】実施例１８のアンモニア又はアンモニウムの遊離パターンを示す図である。
【符号の説明】
○は蛋白質脱アミド酵素を添加した場合の結果を示し、●はブランクの結果を示す。
【図１４】実施例１８の脱アミド化カゼインのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】実施例１９の脱アミド化カゼインのカルシウム溶解性を示す図である。
【符号の説明】
黒四角は蛋白質脱アミド酵素処理したカゼインの結果を示し、●は未処理の結果を示す。
【図１６】実施例２３のトランスグルタミナーゼ反応中に蛋白質脱アミド酵素を添加した場合のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１７】実施例２３の脱アミド化カゼインをトランスグルタミナーゼで処理した場合のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１８】実施例２５の脱アミド化カゼインの分酸性及び溶解性を示す図である。
【符号の説明】
黒四角は蛋白質脱アミド酵素処理したカゼインの結果を示し、●は未処理の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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