(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＡ
【化１】
0003676388.tif 000036
で表されるオリゴヌクレオチド類似体およびその生理学的に許容しうる塩。
上記式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルまたは式II
【化２】
0003676388.tif 000037
で表される基であり；
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはＮＨ2であり；
Ｂはヌクレオチド化学における慣用の塩基であり；
ａはオキシまたはメチレンであり；
ｄ、ｅ、ｆは互いに独立していて、０〜５０の整数であり；
ｉは１〜１０の整数であり；
ｒは０または１の整数であり（但しｒが０である場合にはＶはＹ′でありそしてｉが１より大きい場合にはｒは１である）；
Ｗはオキソ、セレンオキソまたはチオキソであり；
Ｖはオキシ、チオまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり；
Ｙ′はオキシ、チオ、イミノ、(ＣＨ2)mまたはＶ(ＣＨ2)mであり、ここでｍは１〜１８の整数であり；
Ｘはヒドロキシルまたはメルカプトであり；
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ11の基であり、ここで
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ（ＣＨ2)c〕d−ＮＲ12Ｒ12（ここでｃは２〜６の整数であり、ｄは０〜６の整数でありそしてそれぞれのＲ12は独立していて、水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである）であり、
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、またはＮＲ3Ｒ4の場合にはＲ3およびそれらを担持している窒素原子と一緒になって５〜６−員の複素環式環を示し、該環はさらにＯ、Ｓ、Ｎから成る群より選択される別のヘテロ原子を含有することができ、
ｐは１〜１００の整数であり、
ｑは０〜１８の整数であり，
Ｒ11は水素または以下からなる群より選択される官能基：ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ13、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ12またはハロゲン（ここでＲ12はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、そしてＲ13はＣ1〜Ｃ6−アルキルである）であり；
Ｓは式III
【化３】
0003676388.tif 000038
で表される基であり、ここで
ｇ′は０または１の整数であり、
ｈは０〜１０の整数であり、
ＧはＣ1〜Ｃ12−アルキレン（ここでアルキレンは場合によりハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルカルボニルオキシ、Ｃ6〜Ｃ14−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキルまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルコキシにより置換されうる）、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−ジ−Ｃ1〜Ｃ8−アルキレン、Ｃ6〜Ｃ18−アリーレン、式（ＣＨ2ＣＨ2Ｖ)αＣＨ2ＣＨ2もしくは(ＣＨ2Ｖ)αＣＨ2（ここでαは１〜１１の整数である）の基、式
【化４】
0003676388.tif 000039
（ここでβは１〜６の整数である）の単位または式
【化５】
0003676388.tif 000040
の基であり；
Ｚ＝Ｚ′はヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ、−Ｏ−(ＣＨ2)b−ＮＲ12Ｒ13（ここでｂは１〜６の整数であり、そしてＲ12はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、Ｒ13はＣ1〜Ｃ6−アルキルであるか、またはＲ12およびＲ13はそれらを担持している窒素原子と一緒になって３〜６員環を形成する）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ（ここでアリールはヘテロアリールを包含し、アリールはカルボキシル、アミノ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキルアミノ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノから成る群より選択される１、２または３個の同一または相異なる基によって場合により置換されている）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルメルカプト、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、式IIIの基（ここで３′リン酸基においてＺはＯＨでない）であるか、またはＺ＝Ｚ′（３′リン酸基におけるＺを除く）は分子内吸収を促進するかまたはＤＮＡプローブ用標識として役立つかまたはオリゴヌクレオチド類似体の標的核酸へのハイブリッド形成中に該標的核酸を結合、架橋または分裂により攻撃する基であり；
２′−および３′−位の曲線括弧はＲ2および隣接ホスホリル残基が３′−および２′−位で反対方向に位置することも可能であることを示しており、そして各ヌクレオチドはＤ−またはＬ−配置で存在することができ、塩基Ｂはα−またはβ−位にあることができる。
【請求項２】
塩基Ｂがβ−位にあり、ヌクレオチドがＤ−配置で存在し、Ｒ2が２′−位にありそしてａがオキシである請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項３】
Ｒ1が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたは式IIの基であり；
Ｒ2が水素またはヒドロキシルであり；
ｄ、ｅおよびｆが５〜１５の整数であり；
ｉが１〜３の整数であり；
ｍが１〜６の整数であり；
Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3であり、ここで
Ｒ3がＣ1〜Ｃ8−アルキルまたはメトキシエチルでありそしてＢ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｙ′、ＸおよびＺが前述の意味を有する、請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項４】
Ｖ、ＹおよびＹ′がオキシの意味を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項５】
Ｗがオキソの意味を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項６】
Ｕがヒドロキシルの意味を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項７】
Ｒ1が水素である請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項８】
請求項１記載の式ＩＡのオリゴヌクレオチド類似体の製造において、
ａ）  第１反応サイクルにおいて３′(２′)−末端リン（Ｖ）基および遊離５′−ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するヌクレオチド単位を、３′(２′)位にリン（III）またはリン（Ｖ）基またはその活性誘導体を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、またはスペーサー基の導入を可能にする試薬と反応させ、次のサイクルにおいて３′(２′)−または５′−末端リン（III）またはリン（Ｖ）基またはその活性誘導体を有するヌクレオチド単位を、５′−または３′(２′)−末端遊離ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、または
ｂ）  工程(ａ)の手法でヌクレオチド単位の代わりにヌクレオチドフラグメントを用いてオリゴヌクレオチド類似体を構成し、
そして上記（ａ）または（ｂ）によって得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基保護のために一時的に導入した保護基を除去し、こうして得られた式ＩＡのオリゴヌクレオチド類似体を、適切な場合にはその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる前記の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類似体からなる核酸検出用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は物理学、生物学および薬理学上の有用な性質を有する新規オリゴヌクレオチド類似体およびその製造方法に関する。それらの適用は遺伝子発現の阻止剤（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）として、核酸検出用プローブとしておよび分子生物学での補助剤としてのそれらの使用に関する。オリゴヌクレオチドは現在ますます、遺伝子発現阻止剤として使用されている（G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochimica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸フラグメントであって、その塩基配列は、阻止されるべきｍＲＮＡに対して相補的である。これらの標的ｍＲＮＡは細胞、ウイルスまたはその他の病原性由来からなることができる。適当な細胞標的配列は例えば受容体、酵素、免疫調整剤、イオンチャンネルまたは腫瘍遺伝子の配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたウイルス複製の阻止は例えばＲＳＶ（Rous sarcomaウイルス）、ＨＳＶ−１および−２（ヘルペスシンプレックスウイルス型ＩおよびII）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）およびインフルエンザウイルスについて記載されている。これに関してはウイルス性核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチドが用いられている。逆に、センスオリゴヌクレオチドの配列は該オリゴヌクレオチドが、核酸結合タンパク質または核酸プロセシング酵素を結合（“捕獲”）しそしてそれ故にそれらの生物活性を阻止するように設計されている（Helene, 1990）。ここで例として挙げることができるウイルス性標的は逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよびトランスアクチベータタンパク質である。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは一般にそれらの標的としてＤＮＡを有していて、該ＤＮＡに結合した後にトリプルヘリックス構造を形成する。一般にｍＲＮＡのプロセシング（切り継ぎ等）およびそのタンパク質への翻訳はアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻止されるが、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはＤＮＡの転写または複製を阻止する（Helene et al., 1990, Uhlmann and Peyman, 1990）。しかしまた第１ハイブリッド形成においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて各一本鎖核酸を結合させて二本鎖にし、次いでそれを第２ハイブリッド形成においてトリプレックス形成オリゴヌクレオチドを用いてトリプレックス構造にすることも可能である。この場合には、アンチセンスおよびトリプレックス結合領域が２種の別個のオリゴヌクレオチド中にまたは１種のオリゴヌクレオチド中のいずれかに含有されうる。リボヌクレアーゼ活性によって標的ＲＮＡを分解する、いわゆるリボザイム（J.J. Rossi and N. Sarver, TIBTECH 8, 179 (1990)）は合成オリゴヌクレオチドのさらに別の適用を示す。
【０００２】
適当に標識された核酸フラグメントはＤＮＡ診断検査において、検出すべき核酸に対する特異的ハイブリッド形成のためのいわゆるＤＮＡプローブとして用いられる。ここでは好ましくは放射性でない標識を用いて、新しい二本鎖の特異的形成が行われる。このようにして遺伝的ないし悪性疾患、およびウイルスまたはその他の病原体によって惹起される疾患を発見することができる。
【０００３】
天然産の形態でのオリゴヌクレオチドは、多くの前記適用に関してほとんどまたは全く適していない。それらはその特異的要件に適するように化学的に修飾されなければならない。オリゴヌクレオチドが生物系で例えばウイルス複製阻止のために用いられることができるには、それらは下記の前提条件をみたさなければならない。
【０００４】
１．  それらはインビボ条件下で、すなわち血清中で並びに細胞内で十分に高度の安定性を有していなければならない。
２．  それらは細胞膜および核膜を通過することができなければならない。
３．  それらは阻止効果を発揮させるために生理学的条件下において塩基特異的手法で標的核酸に結合しなければならない。
【０００５】
上記の前提条件はＤＮＡプローブの場合には必須ではないが、しかしこれらのオリゴヌクレオチドは例えば蛍光、化学ルミネッセンス、比色定量法または特異的染色によって検出可能な手法で誘導されなければならない（Beck and Koester, Anal. Chem. 62, 2258 (1990)）。
【０００６】
オリゴヌクレオチドの化学変化（chemical alteration）は通常、ホスフェートバックボーン、リボース単位またはヌクレオチド塩基を適当な手法で変えることによって行われる（Cohen, 1989; Uhlmann and Peyman, 1990）。頻繁に用いられるさらに別の手法は、５′−ヒドロキシル基を適当なホスホリル化試薬と反応させることによるオリゴヌクレオチド５′−複合体の製造方法である。単に５′−末端で修飾されるオリゴヌクレオチドは、血清中で分解されるという点で不利である。他方、インターヌクレオチドホスフェート基の全てが変更される場合には、該オリゴヌクレオチドの性質が著しく変わることがよくある。例えば、メチルホスフェートオリゴヌクレオチドの水性媒体中における溶解度が減少し、それに伴ってそれらのハイブリッド形成能力も減少する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは非特異的作用を有し、そのために例えばホモオリゴマーはまたウイルスに対して活性でもある。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に単一極性を有し、通常それはＲＮＡへのハイブリッド形成中にアンチパラレル性を示す（表１；Ａ参照）。ある場合例えばα−ヌクレオシド単位から成るオリゴヌクレオチドでは、極性がパラレルであることも可能である（表１；Ｂ）。一般には配列によるが、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはプリンに富んだ核酸の鎖に関してパラレル（表１；Ｃ）またはアンチパラレル配向で、二本鎖核酸に対してハイブリッド形成が可能である。このためには塩基対合モティーフＴ・ＡＴ、Ｇ・ＧＣ、Ｃ+・ＧＣ、Ｇ・ＴＡ、ＣMe・ＧＣ、Ａ・ＡＴおよびＣPi・ＧＣが主として用いられる。ここでＣ+はプロトン化されたシトシン残基であり、ＣMeは５−メチルシトシン残基であり、ＣPiはプソイドイソシトシン残基でありそして“・”はフーグスティーン（Hoogsteen）型または逆フーグスティーン（reverse-Hoogsteen）型塩基対合である。しかし、これらのフーグスティーン型塩基対合の使用は二本鎖核酸のプリンに富んだ領域に限られている。
【０００８】
プリンに富んだ標的配列に関するトリプレックス形成オリゴヌクレオチドの可変性を増大させるために、可変極性を有するオリゴヌクレオチドが製造された。該オリゴヌクレオチドは（５′５′）−鎖の変化（表１；Ｅ）または(３′３′)−鎖の変化（これらの変化は場合により互い違いであることができる（表１；Ｆ））のために、各場合において反対の鎖のプリンに富んだ領域を結合させることができる（Ono et al., Biochemistry (1991) 30, 9914）。（３′５′）−スペーサーが組み込まれる場合には極性保持下での鎖の変化が可能である。
【０００９】
さらに、（５′５′）−ループ（表１；Ｇ）または（３′５′）−もしくは（２′５′）−ループを用いると特殊アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造することが可能であり、そこでは１つの領域がワトソン−クリック（Watson-Crick）型塩基対合によって核酸の一本鎖を認識しそして第２領域がフーグスティーン型塩基対合によって、ワトソン−クリック型塩基対合から生ずる核酸の二本鎖を認識する。従って、このようなアンチセンス／トリプレックスオリゴヌクレオチド類似体を用いると一本鎖核酸上でのトリプレックス形成が可能である。同様にして、ＤＮＡ結合タンパク質を配列特異的手法で結合させる二本鎖センスオリゴヌクレオチドが分子内ワトソン−クリック型塩基対合により製造されうる（表１；Ｉ）。
【００１０】
最後に、５′−末端に５′５′−スペーサーを含有するオリゴヌクレオチドが製造されうる。これらのオリゴヌクレオチド類似体中において、両方の３′(２′)−末端は有利なことにホスホリル基を含有することができる。
【００１１】
【表１】
0003676388.tif 000002
【００１２】
【表２】
0003676388.tif 000003
【００１３】
今まで知られておりかつ表１のＣ〜Ｉに示された操作原則に従うオリゴヌクレオチド類似体は一般に３′−末端にヒドロキシル基を有し、そのためにそれらは血清中で分解され、大部分は膜を容易に通過せず、単に５′−末端で容易に誘導されるだけである。
【００１４】
従って、本発明の目的は一本鎖および二本鎖の核酸に対する特異的ハイブリッド形成性質、増大された血清安定性、良好な溶解性および比活性を有するオリゴヌクレオチド類似体を製造することである。
【００１５】
本発明は下記の式ＩＡおよび式ＩＢ
【化７】
0003676388.tif 000004
【００１６】
【化８】
0003676388.tif 000005
で表されるオリゴヌクレオチド類似体およびその生理学的に許容しうる塩に関する。
【００１７】
上記式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルまたは式II
【化９】
0003676388.tif 000006
で表される基であり；
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはＮＨ2であり；
【００１８】
Ｂはヌクレオチド化学における慣用の塩基例えば天然塩基例えばアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンまたは非天然塩基例えばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシンであり；
ａはオキシまたはメチレンであり；
ｄ、ｅ、ｆは互いに独立していて、０〜５０好ましくは５〜１５の整数であり；
ｉは１〜１０好ましくは１〜３の整数であり；
ｒは０または１の整数であり（但しｒが０である場合にはＶはＹ′でありそしてｉが１より大きい場合にはｒは１である）；
Ｗはオキソ、セレンオキソまたはチオキソであり；
Ｖはオキシ、チオまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり；
Ｙ′はオキシ、チオ、イミノ、(ＣＨ2)mまたはＶ(ＣＨ2)mであり、ここでｍは１〜１８好ましくは１〜６の整数であり；
【００１９】
Ｘはヒドロキシルまたはメルカプトであり；
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ11の基であり、ここで
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ（ＣＨ2)c〕d−ＮＲ12Ｒ12（ここでｃは２〜６の整数であり、ｄは０〜６の整数でありそしてそれぞれのＲ12は独立していて、水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル好ましくはメトキシエチルである）であり、
【００２０】
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル特に好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、またはＮＲ3Ｒ4の場合にはＲ3およびそれらを担持している窒素原子と一緒になって５〜６−員の複素環式環を示し、該環はさらにＯ、Ｓ、Ｎから成る群より選択される別のヘテロ原子を含有することができ、
ｐは１〜１００好ましくは３〜２０特に好ましくは３〜８の整数であり、
ｑは０〜１８好ましくは０〜１５の整数であり，
Ｒ11は水素または官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ13、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ12（ここでＲ12はＣ1〜Ｃ4−アルキル好ましくはメチルである）またはハロゲンであり；
【００２１】
Ｓは式III
【化１０】
0003676388.tif 000007
で表される基であり、ここで
ｇおよびｇ′は０または１の整数であり、
ｈは０〜１０の整数であり、
【００２２】
ＧはＣ1〜Ｃ12−アルキレン特にＣ2〜Ｃ4−アルキレン（ここでアルキレンは場合によりハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルカルボニルオキシ、Ｃ6〜Ｃ14−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ18−アルキルまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルコキシにより置換されうる）、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−ジ−Ｃ1〜Ｃ8−アルキレン、Ｃ6〜Ｃ18−アリーレン、式（ＣＨ2ＣＨ2Ｖ)αＣＨ2ＣＨ2もしくは(ＣＨ2Ｖ)αＣＨ2(ここでαは１〜１１好ましくは１〜５の整数である）の基、式
【化１１】
0003676388.tif 000008
（ここでβは１〜６の整数である）の単位または式
【化１２】
0003676388.tif 000009
の基であり；
【００２３】
Ｚ＝Ｚ′はヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ好ましくはＣ6〜Ｃ18−アルコキシ、−Ｏ−(ＣＨ2)b−ＮＲ12Ｒ13（ここでｂは１〜６の整数であり、そしてＲ13はＣ1〜Ｃ6−アルキルであるか、またはＲ12およびＲ13はそれらを担持している窒素原子と一緒になって３〜６員環を形成する）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル好ましくは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ好ましくは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ（ここでアリールはヘテロアリールを包含し、アリールはカルボキシル、アミノ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキルアミノ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノから成る群より選択される１、２または３個の同一または相異なる基によって場合により置換されている）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルメルカプト、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、式IIIの基または分子内吸収を好むかまたはＤＮＡプローブ用ラベルとして役立つかまたはオリゴヌクレオチド類似体の標的核酸へのハイブリッド形成中に該標的核酸を結合、架橋または分裂により攻撃する基であり；
【００２４】
２′−および３′−位の曲線括弧はＲ2および隣接ホスホリル残基が３′−および２′−位で反対方向に位置することも可能であることを示しており、そして各ヌクレオチドはＤ−またはＬ−配置で存在することができ、塩基Ｂはα−またはβ−位にあることができる。
【００２５】
好ましいのは式ＩＡおよびＩＢにおいて、塩基Ｂがβ−位にあり、ヌクレオチドがＤ−配置で存在し、Ｒ2が２′−位にありそしてａがオキシであるオリゴヌクレオチド類似体である。
【００２６】
特に好ましいのは式ＩＡおよびＩＢにおいて、
Ｒ1が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル特にメチル、または式IIの基であり；
Ｒ2が水素またはヒドロキシル特に水素であり；
ｄ、ｅおよびｆが５〜１５の整数であり；
ｉが１〜３の整数であり；
ｍが１〜６の整数特に１であり；
Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3、特にヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、ここで
Ｒ3がＣ1〜Ｃ8−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキルまたはメトキシエチルでありそしてＢ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｙ′、ＸおよびＺが前述の意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。
【００２７】
式ＩＡおよびＩＢにおいてＶ、Ｙ′およびＹがオキシの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体が特に好ましい。さらに特に好ましいのは、式ＩＡおよびＩＢにおいてＶ、Ｙ、Ｙ′およびＷがオキシまたはオキソの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。極めて特に好ましいのは式ＩＡおよびＩＢにおいてＶ、Ｙ、Ｙ′、ＷおよびＵがオキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。さらに、式ＩＡおよびＩＢにおいてＲ1が水素であるオリゴヌクレオチド類似体も好ましい。特に好ましいのは式ＩＡおよびＩＢにおいてＵ、Ｖ，Ｗ、Ｘ、Ｙ′およびＹがオキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を有しそしてＲ1が水素であるオリゴヌクレオチド類似体である。極めて特に好ましいのはｒが０であり、ＶがＹ′と同じでありそしてＲ1が式IIの意味を有する式ＩＡのオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
繰返し生ずる残基例えばＲ2、Ｂ、ａ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｇ′、ｈ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｙ′、Ｕ、Ｒ3、Ｒ4、ｐ、ｑ、ＧおよびＺは互いに独立していて、同一または相異なる意味を有する。すなわち、例えばそれぞれのＶは互いに独立していて、オキシ、チオまたはイミノである。ハロゲンはフッ素、塩素または臭素であるのが好ましい。ヘテロアリールは環系に１個または２個のＮ原子および／または１個のＳまたはＯ原子を含有する単環式または二環式（Ｃ3〜Ｃ9）−ヘテロ芳香族の基を意味するものと解される。
【００２９】
細胞内吸収を促進させる基の例としては種々の脂肪親和性基例えば−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（ここでｘは６〜１８の整数である）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（ここでｎおよびｍは互いに独立していて３〜１２の整数である）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3および−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3およびまたステロイド残基例えばコレステリル、天然担体系例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル，Ｎ−アルコキシ）−アミノアントラキノンを利用する複合体および対応する受容体のペプチドとマンノースとの複合体がある。ここで該ペプチドは受容体仲介によってオリゴヌクレオチドのエンドサイト−シスを行い、その例としてはＥＧＦ（表皮成長因子）、ブラジキニンおよびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）がある。標識基は例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フルオレセイン誘導体またはクマリン誘導体の蛍光基または例えばアクリジン誘導体の化学ルミネセンス基並びにＥＬＩＳＡにより検出可能なジゴキシゲニン系、ビオチン／アビジン系により検出可能なビオチン基または検出可能レポーター基を用いてその後に誘導体を合成させる官能基含有リンカーアーム例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネセンスプローブを形成させるアミノアルキルリンカーを意味するものと解される。代表的な標識基は下記のとおりである。
【００３０】
【化１３】
0003676388.tif 000010
【００３１】
核酸に結合するか、または挿入および／または分裂または架橋を行うオリゴヌクレオチド類似体は例えばアクリジン、プソラレン、フェナンスリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリール複合体を含有する。代表的な挿入ないし架橋を行う残基は下記のとおりである。
【００３２】
【化１４】
0003676388.tif 000011
【００３３】
【化１５】
0003676388.tif 000012
【００３４】
モルホリニルおよびイミダゾリジニル基はＮＲ3Ｒ4基の例として挙げることができる。ここでＲ3およびＲ4はそれらを担持している窒素原子と一緒になって５〜６員の複素環式環を形成し、それはさらに別のヘテロ原子を含有する。
【００３５】
本発明はα−およびβ−Ｄ−またはＬ−リボフラノシド、α−およびβ−Ｄ−またはＬ−デオキシリボフラノシドおよび対応する炭素環式５員環類似体に限定されるのではなくて、その他の糖成分例えば環の拡張したおよび環の縮小した糖、非環状糖誘導体または別の型の適当な糖誘導体から成るオリゴヌクレオチド類似体についてもまた有効である。さらに本発明は例として式ＩＡおよびＩＢに記載されているホスフェート基の誘導体に限定されるのではなくて、さらにまた知られているジホスホ誘導体にも関する。
【００３６】
式ＩＡのオリゴヌクレオチド類似体は１個以上の５′５′−スペーサー（５′５′Ｓ）および場合によりさらに１個以上の３′３′−スペーサー(３′３′Ｓ)または２′２′−スペーサーを有し、それぞれは極性の変化をもたらす。式ＩＢのオリゴヌクレオチド類似体は３′５′−スペーサー（３′５′Ｓ）または（２′５′Ｓ）を有し、それは極性に影響を及ぼさないが、しかしオリゴヌクレオチド類似体の逆折りたたみ（backfolding）または鎖の変化を可能にする。
【００３７】
Ｓの例としてはプロパン−１,３−ジオールホスフェート、２−ベンジル−および２−オクタデシル−オキシプロパン−１,３−ジオールホスフェート、トリエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールホスフェートがあり、それらは場合によりさらに反復されうる。複素環式塩基およびフェニレンジアルキレン基を有していないヌクレオチド類似体はＳ特に（３′３′Ｓ）のさらに別の好ましい態様である。位相数学的理由のために、一般的には（５′５′Ｓ）が（３′３′Ｓ）より長い。すなわち、（５′５′Ｓ）は多くて２０〜４５好ましくは２４〜３６個の非分枝状連鎖を有するが、一方（３′３′Ｓ）は単に５〜１５好ましくは６〜１０個の非分子状連鎖を有するだけであって、鎖の変化がなされるものと想定される。他方、例えば核酸の一本鎖上にトリプレックスを形成させるにはＳを利用してオリゴヌクレオチド類似体を逆折りたたみ処理する。Ｓの長さは２〜８好ましくは４〜５個のヌクレオチド単位に相当するのが有利である。ここでは例としてペンタ（２−ベンジルオキシ−１,３−プロパンジオール）ヘキサホスフェートおよびヘキサ（プロパン−１,３−ジオール）ペンタホスフェートを挙げることができ、それぞれは（５′５′Ｓ）または（３′５′Ｓ）連鎖をもたらすことができる。
【００３８】
生物学的オリゴヌクレオチドの合成に関して、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体の製造は、場合により自動合成装置を用いて溶液中または好ましくは固相で実施される。
【００３９】
３′−末端にホスフェートまたはホスフェートエステル基を有するオリゴヌクレオチドの固相合成は、カルテルス（M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)）の標準的なホスホルアミダイト化学によっては可能ではない。その理由は第１ヌクレオチド単位が３′−ヒドロキシル基を介して固形支持体に結合され、そのために該合成からは３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドが常に生成するからである。固形法に基づく種々の手法が今までに記載されているが、しかしそれらの手法は全て面倒であって、例えばホスフェートエステルまたはアルキルホスホネートのような誘導体を製造するのに用いることができない場合が多い（R. Eritja et al., Tetrahedron Lett. 32, 1511 (1991); P. Kumar et al., Tetrahedron Lett. 32, 967 (1991)；W.T. Markiewicz and T.K. Wyrzykiewicz, Phosphorus, Sulfur and Silicon 51/52, 374 (1990); E. Felder et al., Tetrahedron Lett. 25, 3967 (1984); R. Lohrmann and J. Ruth, DNA 3, 122 (1984)）。
【００４０】
本発明は式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体の製造方法に関する。それは
ａ）  第１反応サイクルにおいて３′(２′)−末端リン（Ｖ）基および遊離５′−ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するヌクレオチド単位を、３′(２′)位にリン（III）またはリン（Ｖ）基またはその活性誘導体を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、またはスペーサー基の導入を可能にする試薬と反応させ、次のサイクルにおいて３′(２′)−または５′−末端リン（III）またはリン（Ｖ）基またはその活性誘導体を有するヌクレオチド単位を、５′−または３′(２′)−末端遊離ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、または
ｂ）  同様の手法で各フラグメントを用いてオリゴヌクレオチド類似体を構成し、
そして上記（ａ）または（ｂ）によって得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基保護のために一時的に導入された保護基を除去し、こうして得られた式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体を、適切な場合にはその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる。
【００４１】
固相合成での出発成分としては式IV
Ｄ−Ｘ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−Ａ−Ｔ    (IV)
で表される固形支持体が用いられる。上記式中、Ａはリンカーアームであって、それは例えばジカルボン酸、ジオール、アルキルアミン、ジカルボン酸モノアルキルアミド、酸アミドまたは式
−Ｏ−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＲ)Ｏ−
(ここでＲは水素であるか、または場合により−ＣＮによって置換されているＣ1〜Ｃ6−アルキル好ましくはメチルまたは２−シアノエチルである）を有するホスフェートの残基であり、Ｔは固体支持体であって、例えばＣＰＧ(controlled pore glass）、シリカゲルまたは有機樹脂例えばポリスチレン（ＰＳ）またはＰＳとポリエチレングリコール（ＰＯＥ）とのグラフトコポリマーのような物質から成り、側鎖が官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ハロゲンまたはＣＯＯＨによって修飾されており、ＤはリンカーアームＡおよびＸ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−基（ここでｘは０、１または２でありそしてＸ′はオキシまたはチオである）を分解せずに除去されうる保護基（Bioorg, Chem. 14 (1986) 274〜325参照）例えば４−メトキシテトラヒドロピラニルおよびジメトキシトリチル好ましくはジメトキシトリチルである。
【００４２】
固形支持体Ｔを化学結合（アミド、とりわけエステル）により硫黄含有基に結合させるリンカーアームＡ（Damka et al., Nucleic Acids Res. 18, 3813 (1990)参照）はコハク酸残基（Ｏ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ(Ｏ)−)、シュウ酸残基（Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｃ(Ｏ)−)、アルキルアミン好ましくはＬＣＡＡ（長鎖アルキルアミン）またはポリエチレングリコールが好ましい。コハク酸残基が特に好ましい。特別な場合には、例えばアンモニアによる長い処理に耐えない置換基との組合せではより不安定なリンカー例えばオキサリルリンカーが有利である。式IVa-cの固形支持体の製造は実施例１に記載されている。
【００４３】
【表３】
0003676388.tif 000013
【００４４】
固相合成はホスフェートトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはホスホルアミダイト法好ましくはホスホルアミダイト法によって実施することができる（E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14, 274 (1986)参照）。保護基Ｄは常にまず最初にメチレンクロリド中の酸例えばトリフルオロ酢酸によって式IVの支持体から除去される。ホスホルアミダイト法の場合には、こうして得られた式IV′
ＨＸ′−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−Ａ−Ｔ     (IV′)
（式中、ｘ、Ｘ′、ＡおよびＴは前述の意味を有する）の支持体を弱酸例えばテトラゾールの存在下において式Ｖ
【化１６】
0003676388.tif 000014
（式中、
Ｂ′はＢであって、Ｂに存在するいずれものＮＨ2基は保護されることが可能であり；
Ｒは穏和な条件下で除去されうる保護基例えば４−メトキシテトラヒドロピラニルまたはジメトキシトリチルであり；
Ｒ2は水素、アルコキシ、ハロゲンまたは保護されたヒドロキシルもしくはアミノ基でありそして
Ｒ5およびＲ6は互いに独立してＣ1〜Ｃ12−アルキルであるか、または両残基が一緒になって５〜６員環を形成し；
Ｙ″はオキシ、チオまたは(ＣＨ2)mでありそして
ａ、ｍ、ＶおよびＺは前述の意味を有する）のヌクレオシドホスホルアミダイトと縮合させる。
【００４５】
引続き、こうして得られた支持体をそれ自体知られた手法でヨウ素水(Ｗ＝Ｏ)またはＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）または元素状硫黄（Ｗ＝Ｓ）またはセレン（Ｗ＝Ｓｅ）を用いて酸化して式VII
【化１７】
0003676388.tif 000015
（式中、Ｒ、Ｖ、Ｂ′、Ｒ2′、Ｚ、Ｘ′、Ｗ、Ｙ″、ＡおよびＴは前述の意味を有する）の誘導された支持体にする。式VIIa
【化１８】
0003676388.tif 000016
の支持体を製造するのが好ましい。
【００４６】
式Ｖのホスホルアミダイトは例えば、式VI
【化１９】
0003676388.tif 000017
（式中、Ｒ7およびＲ8はＲ5およびＲ6に等しく、ａ、Ｒ、Ｖ、Ｂ′、Ｒ2′、Ｙ″、Ｒ5およびＲ6は前述の意味を有する）のビスアミダイトから、Ｚがアルコキシまたはアルキルメルカプトである場合には、テトラゾール触媒作用を利用して対応するアルコールまたはチオアルコールとの反応（実施例２、方法Ａ）により得ることができる（J.E. Marugg et al., Tetrahedron Lett. 127, 2271 (1986)参照）。好ましいビスアミダイトは式VIa
【化２０】
0003676388.tif 000018
で表されるものである。
【００４７】
このようにして例えば下記の式VIIIa-mのアミダイトが製造された。
【化２１】
0003676388.tif 000019
〔式中、
Ｒ5およびＲ6は前述の意味を有し、Ｚは下記ａ）〜ｍ）
ａ）  Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3、
ｂ）  Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、
ｃ）  Ｏ−ｎ−Ｃ6Ｈ13、
ｄ）  Ｏ−ｎ−Ｃ18Ｈ37、
【００４８】
【化２２】
0003676388.tif 000020
ｇ〜ｋ）  式IIIの残基であって、その際
ｇ）の場合はｐ＝３およびｑ＝０、
ｈ）の場合はｐ＝４およびｑ＝９、
ｉ）の場合はｐ＝５およびｑ＝４そして
ｋ）の場合はｐ＝８およびｑ＝１３、
ｌ）  ＣＨ3
【化２３】
0003676388.tif 000021
の意味を有しそして
Ｂ′はａ）、ｃ）およびｄ）の場合にはＣｙｔi-Buであり、
ｂ）およびｌ）の場合にはＴｈｙでありそして
ｅ）〜ｋ）およびｍ）の場合にはＣｙｔBzである〕。
【００４９】
支持体を取り込ませるための別法は式IX
【化２４】
0003676388.tif 000022
〔式中、Ｒ9およびＲ10は互いに独立していて、Ｃｌ、ＮＲ5Ｒ6、ＮＲ7Ｒ8、Ｚ″またはＵ′であり、Ｕ′はＣ1〜Ｃ4−アルキルまたは保護基として存在するヒドロキシル基であり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は前述の意味を有し、Ｚ″＝Ｚであるが、但しヒドロキシル、メルカプトおよびＳｅＨは保護された誘導体例えばＹ″−Ｇ′−Ｘ′−ＤＭＴｒ（ここでＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｘ′−Ｙ′′′＝オキシまたはチオでありそしてＧ′は（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)αＣＨ2ＣＨ2またはＣＨ2ＣＨ(ＯＲ′)ＣＨ2であって、ここでのＲ′はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ14−アリールまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルでありそしてαは１〜１１の整数である）としてまたはＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＮ、Ｏ−ＣＨ3、Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−Ｄまたは
【００５０】
【化２５】
0003676388.tif 000023
として存在しなければならない〕のホスフィチル化試薬を式Ｘ
【化２６】
0003676388.tif 000024
（式中、Ｖ、Ｂ′、Ｒ2′およびＲは前述の意味を有しそしてＹ′′′はオキシまたはチオである）で表される遊離３′(２′)−基を有するヌクレオシドと反応させ、次いで得られた化合物を縮合剤例えばテトラゾール（Ｒ9、Ｒ10＝ＮＲ5Ｒ6またはＮＲ7Ｒ8の場合）またはジイソプロピルアミン(Ｒ9、Ｒ10＝Ｃｌの場合)の存在下で式IV′の支持体上に縮合させることからなる。その後ヨウ素水または硫黄またはセレンで酸化すると式VIIaの化合物になる。ここで保護基Ｒを除去することができそしてオリゴヌクレオチド合成が知られた手法で続けられる。合成の終りには各保護基が、得られた支持体結合のオリゴヌクレオチド類似体から知られた手法で除去され、次いで本発明による式ＩＡまたはＩＢのオリゴヌクレオチド類似体が支持体から分裂される。
【００５１】
合成が最終サイクルにおいて式Ｖの単位を用いて終結された場合には、５′−ヒドロキシル基および３′(２′)−末端にリン含有共役を有する式ＩＡまたはＩＢ（Ｒ1＝Ｈ）のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。他方、例えば式IX（ここでＲ9＝Ｚ″）で表されるホスホリル化試薬が最後の縮合工程で用いられる場合には、３′(２′)−および５′−末端の両方においてリン含有置換分を有する、Ｒ1＝式IIである式ＩＡまたはＩＢのオリゴヌクレオチド類似体が該合成から得られる。
【００５２】
例えば、３′(２′)−末端ホスホルアミデート基を有するオリゴヌクレオチドの製造は、酸化がJaeger et al., Biochemistry 27, 7237 (1988)に記載のようにヨウ素／Ｈ2ＮＲ3またはＨＮＲ3Ｒ4（ここでＲ3およびＲ4は前述の意味を有する）を用いて遂行される場合には、テトラゾールの存在下において式IV′の支持体をモノマーのメトキシホスホルアミダイトと反応させることによって可能である。
【００５３】
ある場合（Ｚ＝ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、Ｏ、ＳまたはＳｅ）には、基Ｚの導入もまたＨ−ホスホネート法によって遂行される。そこでは式XI
【化２７】
0003676388.tif 000025
（式中、Ｒ、Ｖ、ａ、Ｂ′、Ｙ′、Ｘ′およびＷは前述の意味を有する）のヌクレオシドホスフェートを式IV′の支持体と反応させることによって最初に生成される式VII′
【化２８】
0003676388.tif 000026
のＨ−ホスホネートジエステルを酸化的ホスホルアミド化に付す(B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27, 5575 (1986)参照）。こうして３′−末端コレステリル基を有するオリゴヌクレオチドが例えば、四塩化炭素の存在下においてコレステリルオキシカルボニルアミノアルキルアミンを用いて製造されうる。
【００５４】
また、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体の製造はトリエステル法を用いても可能であり、そこでは式IV′を有する支持体の基ＨＸ′が縮合剤例えばアリールスルホニルクロリドおよび求核触媒例えばテトラゾールの存在下で式XII
【化２９】
0003676388.tif 000027
（式中、Ｒ、Ｖ、ａ、Ｂ′、Ｒ2′、Ｙ′、Ｚ、Ｗ、Ｘ′および曲線状括弧は前述の意味を有する）の保護されたホスフェートジエステルと反応する。３′５′(２′５′)方向に成長するオリゴヌクレオチド鎖の極性を逆転させる一つの可能性は、該成長鎖の遊離５′−ヒドロキシルまたは５′−チオール基を式XIIIの単位例えば式XIIIaまたはXIIIb
【化３０】
0003676388.tif 000028
(XIIIa)：Ｕ′＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、Ｂ″＝Ｂ′
(XIIIb)：Ｕ′＝ＣＨ3、Ｂ″＝Ｈ
の３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシド ５′−ホスホルアミダイトと反応させることによる。
【００５５】
酸化が引続きヨウ素水または硫黄を用いて遂行される場合には、(５′５′Ｓ)はそれぞれホスフェート（ＰＯ4-）またはホスホロチオエート（ＰＯ3Ｓ-）基の意味を有する。３′(２′)−末端で保護基を除去した後に、オリゴヌクレオチド鎖は必要により、式XIII
【化３１】
0003676388.tif 000029
〔式中、Ｕ′はＵの意味を有するが、但しＵ′はＮＨＲ3またはＮＲ3Ｒ4ではなく、ヒドロキシル、メルカプトおよびＳｅＨは保護された誘導体（例えば前記誘導体、Ｚ″を参照されたい）として存在しそしてＲ5、Ｒ6、Ｙ′′′、Ｖ、Ｒ、ａ、Ｒ2′およびＢ′は前述の意味を有する〕の単位との連続結合によって５′３′−方向に拡大されうる。単位XIIIの合成は例えばSeliger et al. (Nucleosides, Nucleotides 10 (1991), 469）に記載のようにして遂行される。それ以上の反転が遂行されない場合には、式ＩＡ（ここでｒは０である）のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。
【００５６】
極性は変化していないが、それにもかかわらず（３′５′Ｓ）が鎖の逆折りたたみを促進する式ＩＢのオリゴヌクレオチド類似体を製造するには、オリゴヌクレオチド鎖の合成が、２官能価のために多数回、縮合されることも可能な下記式XIVの単位を用いて必要な個所で延長される。
【００５７】
【化３２】
0003676388.tif 000030
【００５８】
【表４】
0003676388.tif 000031
【００５９】
例えば、（３′５′Ｓ）−ループは式XIVbの単位との反復好ましくは４〜５回の連続結合によって導入されうる。次いで該合成は前記のように３′５′−方向で継続される。
【００６０】
二本鎖の核酸好ましくはＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド類似体のハイブリッド形成に関連して一本鎖の変化が求められる場合には、５′５′−スペーサーはより大きな長さでなければならない。例えば、トリエチレングルコールジホスフェートは鎖上の所望位置に混入されることができ、それは式XIVaの単位との２回反復結合によって３′５′−方向に１回以上好ましくは２回集められている。極性を変えるためには、該合成を式XIIIのヌクレオチド単位を用いて５′３′方向に引続き継続させる。再生された、極性の逆転が必要とされる場合には、３′３′−スペーサーが意図する個所に導入され、引続き３′５′−方向での鎖の合成がヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトによる縮合によって継続される。３′３′−スペーサーの１つの例はプロパン−１,３−ジオールジホスフェート基の導入であって、該基は式XIVdの単位との結合によって導入されうる。
【００６１】
オリゴヌクレオチド合成がスルフィド（ｘ＝０）またはスルフィニル(ｘ＝１)支持体を用いて遂行される場合には、これらの基は終りにそれ自体知られている手法で〔Funakoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 6982〕酸化されてスルホニル基になり、塩基好ましくはアンモニアで容易に分解されうる。
【００６２】
塩基Ｂ′のアミノ保護基の性質およびリンカーアームＡの構成はそれぞれの場合、置換基Ｚの性質による。その理由は該置換基Ｚは合成が一旦完了したら、容易に除去可能でなければならないからである。例えば、オリゴヌクレオチド３′−ホスフェートイソプロピルエステル（Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）を製造するには、Ｂ＝ＡｄｅおよびＣｙｔの場合にはベンゾイル（Ｂｚ）保護基を使用することができそしてＢ＝Ｇｕａの場合にはイソブチリル（ｉ−Ｂｕ）保護基を使用することができる。他方、オリゴヌクレオチド３′−メチルホスホネートエステル（Ｚ＝ＣＨ3）またはエチルエステル（Ｚ＝Ｏ−Ｃ2Ｈ5）を合成するには、Ｂ＝ＡｄｅおよびＧｕａの場合およびＢ＝Ｃｙｔの場合のそれぞれについて比較的不安定なフェノキシアセチル（ＰＡＣ）およびイソブチリル保護基が使用される。
【００６３】
多くの複合体はさらに別の官能基を有するが、それらは式ＶおよびXIIIのモノマー単位中への混入前に適当な手法で保護されなければならない。例えば、フルロレセインのカルボキシル基はアルキルエステルとして保護されなければならない。プソラレンでは、アミド基がＮ−Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）−保護された化合物として存在しうる。ヒドロキシル基はアシル化またはシリル化（ｔ−ブチルジメチルシリル）によって副反応から保護されうる。またアミノ基はトリフルオロアセチル保護された形態で存在しうる。異例な場合だが、複合体が極めて不安定であるためにオリゴヌクレオチド合成中の保護基除去の条件下で分解してしまうこともある。このような場合には１つの官能基を有するリンカーアーム例えばＺ＝ＨＮ−(ＣＨ2)x−ＮＨ−Ｆｍｏｃ（ここでｘは２〜１２好ましくは４〜６の整数である）を１つだけ式Ｖのモノマー中に混入させるのが好都合である。オリゴヌクレオチド中へ混入しそして好ましくはアンモニアで保護基を除去した後に、遊離アミノ基は活性エステルに結合されうる。該手法で例えば、塩基不安定性アクリジニウムエステルが製造された。
【００６４】
合成されたオリゴヌクレオチド誘導体の特性化は電気噴霧イオン化質量分光測定（electro-spray ionization mass spectrometry）によってなされる(Stults and Masters, Rapid Commun. Mass. Spectr. 5 (1991) 350参照）。
【００６５】
本発明による式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体は血清中での安定性および知られているエキソヌクレアーゼに対する安定性について試験した。
意外なことに、本発明により未修飾オリゴヌクレオチドと比較して式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体は全て、それらのハイブリッド形成作用が僅かだけ影響されるけれども、血清ヌクレアーゼに対して顕著に増大された安定性を有するということが見出された。
【００６６】
未修飾オリゴヌクレオチドは胎児牛血清中、約２時間の半減期を有するが、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体の全ては約１６時間十分に安定である。さらに、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体はヘビ毒液ホスホジエステラーゼに対して安定である。未修飾オリゴヌクレオチドはヘビ毒液ホスホジエステラーゼによって３′−末端からおよび脾臓ホスホジエステラーゼによって５′−末端からエキソヌクレオ分解的に（exonucleolytically）分解される。
【００６７】
相補的一本鎖ヌクレオチド配列で、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体はワトソン−クリック型塩基対によって安定な二本鎖ハイブリッドを形成しそしてワトソン−クリック型およびフーグスティーン型塩基対によって安定なトリプレックス構造を形成するが、一方それらはフーグスティーン塩基対によって二本鎖核酸を有する三重らせんを形成し、その場合にはスペーサー(５′５′Ｓ)および（３′３′Ｓ）が鎖の変化を可能にしている。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を用いると核酸の生物学的機能の調節または抑圧例えば細胞遺伝子並びに腫瘍遺伝子またはウイルス性ゲノム機能の発現の抑圧が可能である。従って、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体はウイルス感染症または癌の治療または予防に用いることができる。
【００６８】
本発明によるオリゴヌクレオチドの活性をＨＳＶ−１ウイルス複製の阻止に基づいて調べた。
【００６９】
【化３３】
0003676388.tif 000032
【００７０】
【化３４】
0003676388.tif 000033
【００７１】
自然配列すなわち３′−誘導化および５′５′−スペーサーを有してしない配列形態では、選択配列Ｉは血清中で迅速に分解し易いために細胞培養中においてＨＳＶ−１に対して不活性である。他方、式ＩＡの３′−誘導されたオリゴヌクレオチド類似体例えば配列ＩＡ−２（実施例４ｂ）はＨＳＶ−１複製を阻止する。該配列Ｉは原則を説明するために任意の１つの例を示しているにすぎない。該配列ＩはＨＳＶ−１のトランスアクチベータ（transactivator）タンパク質Ｖｍｗ６５のｍＲＮＡに対して割り当てられる。配列IIおよびIIIはＨＳＶ−１のＩＥ ４／５プレカーサーｍＲＮＡ（ＩＥ＝immediate early；即時型）のスプライス−アクセプター領域に対して割り当てられそしてまたＨＳＶ−１複製を特異的に阻止する。配列IVで表される、両３′−末端がプソラレンで修飾された式ＩＡ−４のオリゴヌクレオチド（実施例４ｅ）は、ＨＳＶ−１のゲノムの複製の由来(oriL)を認識し、それの複製をトリプレックス形成によって阻止する。プソラレン複合体の抗ウイルス活性はＵＶ線での照射によって有意に増大されうる。ＨＳＶ−１ゲノムは１６０,０００の塩基を有していて、当然、ウイルス複製阻止のために種々の効力を有する無数の選択可能な標的配列を提供する。該ヌクレオチド配列を変えることによって、いずれかその他のウイルス、バクテリアまたは他の病原体に対して治療原則が適用されうる。他の病原体に適用させるための唯一の先行必要要件は、これらの病原体の生活環に必須である遺伝子が知られていることである。該遺伝子の配列は極めて多様にわたり、いわゆる遺伝子データベースに寄託されている。また、その機能が抑圧されるべきである腫瘍遺伝子および他の細胞遺伝子の場合にも同様のことが云える。その他の細胞遺伝子の例としては酵素、受容体、イオンチャンネル、免疫調整剤、成長因子およびその他の調節タンパク質をコード化する遺伝子を挙げることができる。配列Ｖは例えば、アルツハイマー病における斑形成アミロイドタンパク質の前駆体タンパク質の発現に原因すると考えられているＡＰＰ７７０遺伝子プロモータに対して割り当てられる。センスオリゴヌクレオチドとして、配列VIはアデノウイルスＥ１ｂのＳＰ１結合領域を擬似しそして、式ＩＢ−２で表される３′５′−スペーサー含有の３′−修飾オリゴヌクレオチド類似体がＥ１ｂの転写を阻止する。腫瘍遺伝子の例としてはａｂｌ、ｎｅｕ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｏｓ、ｅｒｂＢ、ｅｔｓ、ｊｕｎ、ｐ５３，ｓｒｃおよびｒｅｌがある。
【００７２】
文献で知られている、３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチド誘導体と比較すると、式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体からなる、核酸特にＤＮＡ用プローブは一方ではヌクレアーゼ安定性が増大されるという利点を有し、他方ではオリゴヌクレオチドの両末端で同一または相異なるマーカーを受容することが可能である。相異なるマーカー基が１つのオリゴヌクレオチド内で選択的に活性化されうることは（二重標識）有利である。また２官能性誘導化を用いて一方の末端に１つの標識をそして他方の末端に別の官能（例えばアフィニティー標識）を導入することもできる。このためには例えば、アビジンまたはストレプトアビジンを認識するビオチンをオリゴヌクレオチドの一方の３′−末端に混入させ、一方アクリジニウムエステル化学ルミネセンス標識をアルキルアミノリンカーを介して他方の３′−末端に結合させることができる。
【００７３】
さらに、本発明によるオリゴヌクレオチド類似体の浸透作用は多くの場合、特に脂肪親和性基が導入される際には未修飾オリゴヌクレオチドの場合よりも有利である。本発明による式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド類似体の増大した血清安定性、それらの改善された細胞浸透性、それらの改善された結合アフィニティー、修飾(アルキル化、架橋)によって標的配列を選択的に破壊することができるそれらの能力およびＤＮＡ診断検査でのそれらの改善された検出能力は、未修飾オリゴヌクレオチドと比較した場合により高い生物活性の形態で表される。
【００７４】
本発明によるオリゴヌクレオチド類似体の前述した診断、予防および治療上の適用は代表例の単なる１つの選択であり、それ故に該類似体の使用はそれらに限定されるものではない。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は例えばバイオテクノロジーおよび分子生物学の補助剤として用いてもよい。
【００７５】
さらに本発明は式ＩＡおよび／またはＩＢの化合物またはそれらの生理学的に許容しうる塩の１種以上の有効量を、適切な場合には生理学的に許容しうる補助剤および／または賦形剤および／またはその他の知られている活性物質を含有する製剤並びに、活性物質が賦形剤および可能な場合にはさらに別の補助剤、添加剤または活性物質と一緒になって適当な剤形に変換される該製剤の製造方法に関する。投与は静脈内、局所または鼻腔内投与が好ましい。
【００７６】
【実施例】
実施例１：式IVの支持体の製造
ａ）  アミノプロピル−ＣＰＧをビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVaの支持体の製造
ビス−（２−ヒドロキシエチル）スルホンのジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）モノエーテル４.５６ｇ（１０mmol）を２回にわたって無水ピリジン中に取り入れ次いで濃縮することによって乾燥し、無水ピリジン２５ml中に溶解し、次にＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）１.７８ｇ（１４mmol）および無水コハク酸１.４ｇ（１４mmol）を加え、この混合物を室温で３時間撹拌する。反応の完了後に混合物を濃縮し、残留物を３回にわたってトルエン中に取り入れ次いで濃縮してピリジンを除去し、次にメチレンクロリド２２０ml中に取り入れる。有機相を１０％クエン酸（１１０ml）で洗浄し次に３回水１１０mlで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し次いで濃縮する。得られた固形残留物を真空乾燥する（５.６４ｇ）。このスクシネート１.６７ｇ（３mmol）を２回にわたって無水ピリジン中に取り入れ次いで濃縮し、無水ピリジン０.６５mlとテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６mlとの混合物中に溶解する。次に無水ＴＨＦ ２.１ml中に溶解したｐ−ニトロフェノール４２０mg（３mmol）およびＤＣＣ ６８７mg（ジシクロヘキシルカルボジイミド、３.３mmol）の溶液を加え、混合物を室温で２時間撹拌する。反応が完了したら、沈殿したジシクロヘキシル尿素を遠心分離により除去する。沈殿物を無水エーテル１ml中に懸濁し、再び遠心分離にかける。Fluka社製のアミノプロピル−ＣＰＧ支持体（５００Å、アミノ基のｇ当たり１００μmol）１.５ｇを無水ＤＭＦ １.８mlとトリエチルアミン３５０μｌとの混合物中に懸濁し、前記沈殿物から傾瀉させたニトロフェニルスクシネートエステルの合一溶液を加え、混合物を室温で１６時間振とうする。固形支持体を完全に分離し、遮断試薬（無水酢酸／２,６−ルチジン／ＤＭＡＰ；それぞれＴＨＦ中で０.２５Ｍ）３mlとともに室温で１時間振とうして反応性基を遮断する。誘導化されたＣＰＧ支持体を吸引濾去し、メタノール、ＴＨＦ、メチレンクロリドおよびエーテルで洗浄し次いで４０℃で真空乾燥する。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVaの支持体のローディング（loading）は３８μmol／ｇである。
【００７７】
ｂ）  TentaGelR（R＝Rapp社(Tuebingen）の登録商標）をビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVbの支持体の製造
２５μmol／ｇのアミノ基を有するＰＳ／ＰＯＥコポリマーであるアミノ型TentaGel樹脂１００mgをＤＭＦ ３６０μｌとトリエチルアミン７０μｌとの混合物中に懸濁し、ｐ−ニトロフェニルスクシネートエステル(製造は実施例１ａ参照)４００μmolを加え、混合物を室温で１６時間振とうする。次いで実施例１ａ）に記載のように後処理する。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVbのTentaGel樹脂の取り込み（loading）は９８μmol／ｇである。
【００７８】
ｃ）  TentaGel（ヒドロキシ型）を式IX（Z″＝DMTr-O-CH2CH2-S-CH2CH2-O-；R9＝N(i-C3H7)2; R10＝O-CH2CH2CN）のホスフィチル化試薬と反応させることによる支持体IVcの製造
TentaGel樹脂５０mgをアセトニトリル中２２℃においてテトラゾール２５当量の存在下で式IX（Z″＝DMTr-O-CH2CH2-S-CH2CH2-O; R9＝N(i-C3H7)2; R10＝O-CH2CH2CN）のホスフィチル化試薬１０当量と反応させる。ヨウ素水（ＴＨＦ／水／ピリジン；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ中のヨウ素１.３ｇ）で酸化した後に、実施例１ａに記載のようにして後処理を行う。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVcの支持体のローディングは２４７μmol／ｇである。
【００７９】
実施例２：式VIIIで表される、保護されたヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトの製造
ａ）  VIIIa（B′＝CytiBu、 Ｚ＝O-CH2CH3、R5＝R6＝i-C3H7）の製造
式VI（B′＝CytiBu、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）で表されるヌクレオシド３′−ホスホロビスアミダイトを２回にわたって無水アセトニトリル２０ml中に取り入れ次いで濃縮し、次に無水アセトニトリル２０ml中に溶解する。無水アセトニトリル５ml中に溶解したエタノール２.４mmolおよび昇華されたテトラゾール１.２mmolの溶液を１５分で滴加する。さらに２.５時間撹拌した後に、混合物をメチレンクロリド７５mlで希釈し、有機相を５％炭酸水素ナトリウム溶液５０mlで抽出する。水溶液をメチレンクロリド５０mlで２回洗浄し、合一した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し次いで真空中で濃縮する。残留物をシリカゲル上でメチレンクロリド／ｎ−ヘプタン／トリエチルアミン（４５：４５：１０；ｖ：ｖ：ｖ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製する。目的のジアステレオマー物質０.７ｇが、薄層クロマトグラフィーによれば純粋である化合物（31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１４６.７、１４７.５ppm）として得られる。痕跡量の対応するビス−エチルホスファイトが副生成物として単離される(31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１３９.３ppm）。
【００８０】
ｂ）  VIIIb（B′＝Thy、 Ｚ＝O-i-C3H7、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
この製造は、無水メチレンクロリド１０ml中でテトラゾール（０.５mmol）の存在下において式Ｘ(B′＝Thy(β−位)；Ｒ＝DMTr、 Ｖ＝Ｏ、ａ＝Ｏ、 Y″＝Ｏ; ２mmol）の５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを式IX(Z″＝O-i-C3H7、 R9＝R10＝N(i-C3H7)2；４mmol）のビスアミダイトでホスフィチル化することによって遂行される。混合物は実施例２ａに記載のようにして後処理する（31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１４５.０４ppm、 １４５.６６ppm）。
【００８１】
ｃ）  VIIIc（B′＝CytiBu、 Ｚ＝O-n-C6H13、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytiBu、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でｎ−ヘキサノール１当量と反応させることによって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.１ppm、 １４８.５ppm）。
【００８２】
ｄ）  VIIId（B′＝CytiBu、 Ｚ＝O-n-C18H37、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytiBu、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのｎ−オクタデカノール１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４７.２ppm、 １４７.９ppm）。
【００８３】
ｅ）  VIIIe(B′＝CytBz、 Ｚ＝３−ピリジルプロパン−３−オキシ、R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7、 R2′＝Ｈ)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用での３−ピリジン（プロパン−３−オール）１当量との反応によって得られる。この場合にはカラムクロマトグラフィーによりジアステレオマー２種を分離することが可能であった（31Ｐ−ＮＭＲジアステレオマー１：１４７.７ppm、 ジアステレオマー２：１４８.２ppm）。
【００８４】
ｆ）  VIIIf(B′＝CytBz、 Ｚ＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ、R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのｐ−ニトロフェニルエタン−２−オール１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.１ppm、 １４８.６ppm）。
ｇ）  VIIIg（B′＝CytBz、 Ｚ＝-(OCH2CH2)3OCH3、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのトリエチレングリコールモノメチルエーテル１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.５ppm、 １４８.９ppm）。
【００８５】
ｈ）  VIIIh（B′＝CytBz、 Ｚ＝-(OCH2CH2)4O(CH2)9CH3、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのテトラエチレングリコールモノデシルエーテル１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、１４８.８ppm）。
【００８６】
ｉ）  VIIIｉ（B′＝CytBz、 Ｚ＝-(OCH2CH2)5O(CH2)4CH3、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのペンタエチレングリコールモノペンチルエーテル１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、 １４８.９ppm）。
【００８７】
ｋ）  VIIIk（B′＝CytBz、 Ｚ＝-(OCH2CH2)8O(CH2)13CH3、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのオクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、１４８.８ppm）。
【００８８】
ｌ） VIIIp（B′＝Thy、 Ｚ＝CH3、 R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ｂと類似の方法で５′−Ｏ−ジメトキシトルチルチミジンから式IX（Z″＝CH3、 R9＝Cl、 R10＝N(i-C3H7)2）の試薬ホスフィチル化で得られ、この場合にはテトラゾールの代りにジイソプロピルエチルアミン２当量を用いて触媒作用がもたらされる（31Ｐ−ＮＭＲ １２０.６ppm、 １２１.０ppm）。
【００８９】
ｍ）  VIIIm（B′＝CytBz、 Ｚ＝アクリジン−９−（ブチル−４−オキシ）−、R5＝R6＝i-C3H7）の製造
実施例２ａと類似の方法で式VIa（B′＝CytBz、 R5＝R6＝R7＝R8＝i-C3H7）のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用での９−（４−ヒドロキシブチル）アクリジン１当量との反応によって得られる（31Ｐ−ＮＭＲ １４６.７ppm、 １４７.４ppm）。
【００９０】
実施例３：式VIIで表される支持体結合ヌクレオチドの製造
ａ）  方法Ａ：式VIIIbのヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトを結合させることによる式VIIa−１の支持体の製造
ビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテル０.２μmolを結合させた実施例１ａからの支持体７.５mgを３％トリクロロ酢酸で処理してＤＭＴｒ保護基を除去し、アセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリル中でテトラゾール（１０μmol）の存在下において式VIIIb（B′＝Thy、 Ｚ＝O-i-C3H7、 R5＝R6＝i-C3H7）のヌクレオシド３′−ホスホルアミダイト２μmolと反応させる。反応時間は２.５分である。次にヨウ素（Ｗ＝Ｏの場合；ＴＨＦ／水／ピリジン；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ中におけるヨウ素１.３ｇ）での酸化を行う。
【００９１】
ｂ）  方法Ｂ：式IXのホスフィチル化試薬を介した反応による式VIIIa−２の支持体の製造
式IX（Z″＝ｎ−オクチル、R9＝R10＝Cl；１当量）のホスフィチル化試薬を無水アセトニトリルまたはメチレンクロリド中でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１.２当量の存在下において−７８℃で式Ｘのヌクレオシド（５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン１当量、B″＝β−位、Ｙ′′′＝Ｏ）と反応させて対応するヌクレオシド−３′−Ｏ−ｎ−オクチルホスホンモノクロリドを得る。保護基Ｄ＝ＤＭＴｒを除去するために、式IVaの支持体を方法Ａに記載のように処理し、アセトニトリルで洗浄し次にＤＩＰＥＡの存在下において反応系中で製造されたヌクレオシド−３′−Ｏ−ｎ−オクチルホスホンモノクロリドの過剰量と反応させる。ヨウ素水で酸化後に式VIIa−２で表される支持体結合ヌクレオチドが得られ、それはその後のオリゴヌクレオチド合成に利用されうる。
【００９２】
実施例４：式ＩＡおよびＩＢのオリゴヌクレオチド（モノマーはそれぞれの場合においてβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドである）の製造
ａ）  式ＩＡ−１（R1＝R2＝H、 Ｚ＝O-i-C3H7、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ、 Ｂ＝Thy、 ｅ＝８、 ｆ＝ｒ＝０、 ｉ＝１）のオリゴヌクレオチドの製造
T(5′5′p)TpTpTpTpTpTpTpTpTp-(O-i-C3H7)
実施例３ａから得られた支持体VIIa−１（B′＝Thy、 Ｗ＝Ｏ、 Ｚ＝O-i-C3H7）０.２μmolを下記の試薬で順次処理する。
１．  無水アセトニトリル、
２．  ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸、
３．  無水アセトニトリル、
４．  無水アセトニトリル０.１５ml中におけるβ−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３′−ホスファイト−ジイソプロピルアミダイト４μmolおよびテトラゾール２５μmol、
５．  アセトニトリル、
６．  ４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリジンを有するＴＨＦ中の２０％無水酢酸、
７．  アセトニトリル、
８．  ヨウ素（ＴＨＦ／水／ピリジン；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ中の１.３ｇ）。
【００９３】
以下、１反応サイクルと称する前記工程１〜８を７回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。次の第９反応サイクルにおいては工程４での縮合のために５′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトの代りに式XIIIa（Ｂ′＝Ｔｈｙ)の逆３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシド５′−ホスホルアミダイトが用いられる。合成完了後に、ジメトキシトリチル基の除去を工程１〜３に記載のようにして行う。オリゴヌクレオチドを支持体から分裂し、同時にβ−シアノエチル基をアンモニアでの１.５時間の処理によって除去する。該オリゴヌクレオチドはアミノ保護基を含有していないので、アンモニアによるこれ以上の処理は全く必要ない。５′−末端に（５′５′）−インターヌクレオチド結合を含有するイソプロピルデカチミジレート３′−ホスフェートの得られた粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより精製する。
【００９４】
ｂ）  式ＩＡ−２（R2＝Ｈ、 Ｚ＝O-i-C3H7、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ；ｅ＝19、 ｆ＝ｒ＝０、 ｉ＝１；R1＝式II、 ここでＺ＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシおよびZ′＝OH)のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ(ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ−pC(5′5′p)GpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCpTp-O-i-C3H7)
実施例４ａと類似の方法で、モノマー中に種々のヌクレオシド塩基を用いて合成を行う。合成工程１〜８において、モノマーは一般にβ−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヌクレオシド−３′−ホスファイト−ジアルキルアミドとして用いられ、その際アデニン（Ａｄｅ）、シトシン（Ｃｙｔ）またはグアニン（Ｇｕａ）のアミノ基は適当な保護基で保護されている。本実施例ではＮ6−ベンゾイル−Ａｄｅ（ＡｄｅBz）、Ｎ4−ベンゾイル−Ｃｙｔ（ＣｙｔBz）およびＮ2−イソブチリル−Ｇｕａ（ＧｕａiBu）が用いられる。鎖の構築は実施例４ａに記載のようにして、式VIIa−１（B′＝Thy、 Ｗ＝Ｏ、 Ｚ＝O-i-C3H7）の支持体から出発しそして前記配列に従って対応する各モノマー上で縮合することにより行われる。第２０反応サイクルでは式XIIIa（B′＝ＣｙｔBz）のモノマーが縮合のために用いられる。３′−Ｏ−ＤＭＴｒ基を除去後に、遊離３′−ヒドロキシル基を式IX（R9＝N(i-C3H7)2、 R10＝Z″＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ)のビス−（ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ）−ホスホロジイソプロピルアミドでホスフィチル化し、引続きヨウ素水で酸化する。しかし、各アミノ保護基および２つのｐ−ニトロフェニルエチル基のうちの１つを除去するために、さらにアンモニアによる処理（５０℃で１６時間）を行う。
【００９５】
ｃ）  式ＩＢ−１（R1＝R2＝Ｈ、 Ｚ＝n-C8H17、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ、 ｉ＝１、 ｄ＝９、 ｅ＝16）のオリゴヌクレオチドの製造
【化３５】
0003676388.tif 000034
d(GpGpTpGpGpTpGpGpTpT(3′5′S)TpTpCpCpTpCpCpTpGpCpGpGpGpApApGpGp-n-C8H17
実施例３Ｂに記載のと類似の方法で製造される式VIIa−２(B′＝GuaPAC、 Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝n-C8H17）の支持体から出発して、鎖の構築を実施例４ｂのようにして実施する。しかし、合成の終りに分裂するのがより容易である比較的不安定なアミノ保護基Ｎ6−フェノキシアセチル−Ａｄｅ（ＡｄｅPAC）、Ｎ4−イソブチリル−Ｃｙｔ（ＣｙｔiBu）、Ｎ2−フェノキシアセチル−Ｇｕａ（ＧｕａPAC）は、塩基不安定である置換分（ここではZ=n-C8H17の場合）を製造するのに使用するのが有利である。第１６反応サイクル後に式XIVbの試薬を用いて５つのサイクルを実施して必要とされる（３′５′）−スペーサーを導入する。次に実施例４ａに記載のようにして残りの１０個のヌクレオチド単位を混入させる。濃アンモニアを用いて支持体からの分裂を行い（室温で１.５時間）、次にエチレンジアミン／エタノール／水（５：４：１；ｖ：ｖ：ｖ）で６時間処理して塩基のアミノ基を遊離させる。
【００９６】
ｄ）  式ＩＡ−３(R1＝式II、 R2＝Ｈ、 Ｚ＝O-i-C3H7、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Z′＝Ｏ、 ｅ＝16、ｆ＝９、 ｉ＝１、 ｒ＝０）のオリゴヌクレオチドの製造
(5′5′S)=p〔(CH2CH2O)2CH2CH2p〕2
d(i-C3H7-O-pGGTGGTGGTT(5′5′S)TTCCTCCTGCGGGAAGGp-O-i-C3H7)
合成は最初は実施例４ｂに記載のようにして、支持体VIIa−３（B′＝GuaiBu、Ｗ＝Ｏ、 Ｚ＝O-i-C3H7）から出発して行う。第１６反応サイクルの後に、式XIVaの試薬を用いて２つのサイクルを実施して５′５′−スペーサーを導入する。その後の１０個のサイクル中に、縮合のために式XIIIaのモノマー部分を用いる。添加すべき最後のＧヌクレオチドの３′−Ｏ−ＤＭＴｒ保護基を除去した後に、遊離３′−ヒドロキシル基を式IX（R9＝N(i-C3H7)2、 R10＝OCH2CH2CN、 Z″＝O-i-C3H7）のシアノエチルオキシ−ｉ−プロピルオキシホスホルアミダイトでホスフィチル化し次にヨウ素水で酸化する。
【００９７】
ｅ）  式ＩＡ−４(R2＝Ｈ、 Ｚ＝“プソラレン”、 ａ＝Ｕ−Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ、 ｅ＝13、 ｆ＝15、 ｉ＝１、 ｒ＝０、 R1＝式II、 ここでZ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
d(3′−“プソラレン−pGpGpTpGpTpTpTpGpGpGpGpGpTpTpGpG(5′5′S)GpTpTpGpGpGpGpT2pTpGpTpGpTpGp−“プソラレン”）
(5′5′S)＝p3′(G)5′-pMe-(CH2)3-pMe-5′(G)3′p
【化３６】
0003676388.tif 000035
合成は実施例４ｃに記載のようにして、式IIa−４（B′＝GuaPAC、 Ｚ＝“プソラレン”、Ｗ＝Ｏ）の支持体から出発して行う。該支持体はあらかじめ実施例２ａと類似の方法でビスアミダイトVIa−３（B′＝GuaPAC、 R5＝R8＝i-C3H7）から“プソラレン”−Ｈとの反応によって得た式VIII（B′＝GuaPAC、 Ｚ＝“プソラレン”、R5＝R6＝i-C3H7）のモノマーから、実施例３ａと類似の方法で製造された（U. Pieles and U. Englich, Nucleic Acids Research (1989) 17, 285参照）。第１３反応サイクルの後に、第１４サイクルでは結合用に式XVのモノマーを用い、第１５サイクルでは式XIVcのモノマーをそして第１６サイクルでは式XIIIbのモノマーを用いる。次の１６個のサイクルでは式XIIIaの単位を縮合用に再び用いる。３′−Ｏ−ＤＭＴｒ基を除去した後に、遊離３′−ヒドロキシル基を式IX（R9＝N(i-C3H7)2、 R10＝OCH2CH2CN、 Z″＝“プソラレン”）のプソラレンホスホルアミダイトでホスフィチル化し次いでヨウ素水で酸化する。保護基をアンモニアで除去した後に、式ＩＡ−４のオリゴヌクレオチドが得られる。
【００９８】
ｆ）  式ＩＡ−５（R1＝R2＝Ｈ、 Ｚ＝n-C8H17、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ、 ｄ＝12、 ｅ＝ｆ＝７、 ｉ＝ｒ＝１)のオリゴヌクレオチドの製造
d(TpTpGpTpGpTpTpTpGpTpGpTpT(3′3′S)TpGpTpTpTpTpGpG(5′5′S)GpGpTpGpGpGpGpGp-n-C8H17)
(3′3′S)＝p(CH2CH2CH2)p    (5′5′S)＝実施例４ｅの場合と同じ
製造は実施例４ｃと類似の方法で行われるが、しかし第７反応サイクルの後に１つのサイクルを式XV、XIVcおよびXIIIbの単位のそれぞれを記載された配列で順次に用いて実施することにより（５′５′Ｓ）を導入する。次の８個のサイクルでは式IIIaのヌクレオシド５′−ホスホルアミダイトを用いる。次のサイクルにおいて（３′３′Ｓ）の混入が、結合工程で式XIVdのモノマーを用いて行われる。残りの１３個のサイクルが最初の７個のサイクルの場合のようにヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトを用いて実施される。その後の操作は実施例４ｃに記載のとおりである。
【００９９】
ｇ）  式ＩＡ−６(R1＝式II、R2＝Ｈ、 Ｚ＝“フルオレセイン"、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Z′＝Ｏ、 ｅ＝13、 ｆ＝15、 ｉ＝１、 ｒ＝０）のオリゴヌクレオチドの製造
d(3′−“フルオレセイン"−pGpGpTpGpTpTpTpGpGpGpGpGpTpTpGpG(5′5′S)GpTpTpGpGpGpGpTpTpGpTpGpTpGp−“フルオレセイン”)
合成は実施例４ｅと類似の方法で、式VIIa−５（B′＝GuaPAC、 Ｚ＝“フルオレセイン"、 Ｗ＝Ｏ）の支持体から出発して行われる。該支持体は、あらかじめ実施例２ａと類似の方法でビスアミダイト(VIa)(B′＝GuaPAC、 R5＝R8＝i-C3H7）から“フルオレセイン”−Ｈとの反応によって得られた式VIII（B′＝GuaPAC、Ｚ＝“フルオレセイン"、 R5＝R6＝i-C3H7）のモノマーから、実施例３ａと類似の方法で製造された（Schubert et al., Nucleic Acids Research (1991) 18, 3427参照）。３′−Ｏ−ＤＭＴｒ基を除去した後に遊離３′−ヒドロキシル基を式IX（R9＝N(i-C3H7)2、R10＝OCH2CH2CN、 Z″＝“フルオレセイン"）のフルオレセインホスホルアミダイトでホスフィチル化し次にヨウ素水で酸化する。保護基をアンモニアで除去した後に、式ＩＡ−６のオリゴヌクレオチドが得られる。
【０１００】
ｈ）  式ＩＢ−２（R1＝R2＝Ｈ、 Ｚ＝O-(CH2CH2O)8(CH2)3、 ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Y′＝Ｏ、 ｄ＝ｅ＝15、 ｉ＝１）のオリゴヌクレオチドの製造
(3′5′S)＝p(CH2CH2CH2p)4
d(GpGpGpCpGpGpGpGpCpTpTpApApApGpG(3′5′S)CpCpTpTpTpApApGpCpCpCpCpGpCpCpCp-O-(CH2CH2O)8(CH2)13CH3)
実施例３ａに記載のようにして、式VIIIkのアミダイトを用いて製造した式VIIa−６（B′＝CytBz、 Ｗ＝Ｏ、 Ｚ＝-O-(CH2CH2O)8(CH2)13CH3)の支持体から出発して、オリゴヌクレオチド合成は最初に実施例４ｂと類似の方法で行われる。第１５反応サイクルの後に、式XIVdの単位を用いて４個のサイクルを実施する。残りの１６個のヌクレオチドは、５′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトを用いて実施例４ｂのように混入する。
【０１０１】
実施例５：ヌクレアーゼ安定性の試験
検査するオリゴヌクレオチド１０mmolをＲＰＭＩ培地中の２０％胎児牛血清４５０μｌおよび２回蒸留した水５０ml中に溶解し、３７℃でインキュベートする。次にゲル電気泳動用の１０μｌ試料およびＨＰＬＣ用の２０μｌ試料を、直後並びに１、２、４、７および２４時間後に取り出し、各場合にそれぞれホルムアミド５μｌまたは１０μｌと混合して反応を停止させ次いで９５℃で５分間加熱する。ゲル電気泳動の場合には試料を１５％ポリアクリルアミドゲル(２％ビス)上に取り込み、約３,０００ボルト時間流す。バンドを銀染色によって視覚化する。ＨＰＬＣ分析の場合には試料をＧｅｎ−Ｐａｋ Ｆａｘ ＨＰＬＣカラム（Waters／Millipore社製）上に注入し、バッファーＢ中の５〜５０％バッファーＡ（バッファーＡ：１０mAリン酸二水素ナトリウム、アセトニトリル／水 １：４（ｖ：ｖ）中の０.１Ｍ ＮａＣｌ pH６.８；バッファーＢ：１.５Ｍ ＮａＣｌ以外はＡと同じ）を用いて毎分１mlでクロマトグラフィー処理する。
【０１０２】
実施例６：抗ウイルス活性
本発明化合物の抗ウイルス活性をインビトロ実験で試験する。このためには、本発明化合物をマイクロタイタープレート中のヘラ（HeLa）細胞およびベロ（Vero）細胞の細胞培養に種々の希釈度で加える。３時間後に、これらの培養物にヒトの病原体である種々のウイルス（例えばヘルペスウイルスＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、オルソミクソウイルスインフルエンザＡ２、ピコルナウイルスライノウイルス２）を感染させる。感染後４８〜７２時間後に治療成功を細胞変性作用に基づいて、顕微鏡でおよびニュートラルレッド吸収の光学的測定（フィンターカラーテスト）で決定する（Finter, N.B. in “Interferons", N.B. Finter et al., North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1966）。感染細胞の半分が細胞変性作用を全く示さない最小濃度を最小阻止濃度（ＭＩＣ）であるとみなす。