(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
三成分複合体の形態の、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣの安定化組成物の調製法であって、
プロテアーゼ阻害剤およびＣａ２＋および／またはＭｇ２＋イオンの存在下、三成分複合体の形態の、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをヒトの心臓または動物の心臓から抽出して、一の抽出物を得る工程、
その抽出物をｐＨが５．５ないし６．５の希釈緩衝液（プロテアーゼ阻害剤、ウシアルブミン、ウシ胎仔血清または正常ヒト血清およびＣａ２＋および／またはＭｇ２＋イオンを含有する希釈緩衝液）で希釈し、一の水溶液を安定化組成物とする工程、および
当該水溶液を乾燥させ、当該組成物を粉末としてもよい工程
を含む、方法。
【請求項２】
三成分複合体の形態の、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣの安定化組成物の調製法であって、
プロテアーゼ阻害剤およびＣａ２＋および／またはＭｇ２＋イオンの存在下、三成分複合体の形態の、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをヒトの心臓または動物の心臓から抽出して、一の抽出物を得る工程、
その抽出物をＣａ２＋および／またはＭｇ２＋イオンを含有する透析緩衝液に透析させて、一の透析抽出物を得る工程、
その透析抽出物をｐＨが５．５ないし６．５の希釈緩衝液（プロテアーゼ阻害剤、ウシアルブミン、ウシ胎仔血清または正常ヒト血清およびＣａ２＋および／またはＭｇ２＋イオンを含有する希釈緩衝液）で希釈し、一の水溶液を安定化組成物とする工程、および
当該水溶液を乾燥させ、当該組成物を粉末としてもよい工程
を含む、方法。
【請求項３】
透析緩衝液のｐＨが５．５ないし６．５である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｉ−Ｔ−Ｃ三成分複合体が０．０１ｎｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、Ｃａ２＋濃度が１０μＭと１００ｍＭの間にある、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ウシアルブミン、ウシ胎仔血清または正常ヒト血清が０．２ないし２重量％の濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
正常ヒト血清が１０重量％の濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｉ−Ｔ−Ｃ三成分複合体が０．０１ｎｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、Ｃａ２＋濃度が１０μＭと１００ｍＭの間にある、請求項２記載の方法。
【請求項８】
ウシアルブミン、ウシ胎仔血清または正常ヒト血清が０．２ないし２重量％の濃度で存在する、請求項２記載の方法。
【請求項９】
正常ヒト血清が１０重量％の濃度で存在する、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトまたは動物の血清または血漿中の心臓および／または骨格トロポニンのアッセイを意図されたイムノアッセイにおいて、標準および／または対照として供する能力を有するトロポニンの安定組成物、およびかかる組成物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロポニンはトロポニンＩ、ＴおよびＣの３つのタンパク質からなる筋原線維タンパク質であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシンおよびアクチンと相互作用することにより、Ｃa2+イオンによる筋収縮の調節に寄与することができる。より正確には、神経インパルスが筋肉の運動終板に達すると、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知られている。次いで、Ｃa2+が細胞質ゾル中へ遊離し、トロポニンＣと結合し、それによりトロポニンＩおよびトロポニンＣの間の相互作用が増強され、その結果として、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体のコンフォーメーションに変化が起こる。次いで、アクチン−ミオシン相互作用部位の遊離が起こり、筋肉の収縮運動を起こさせる。
【０００３】
心筋における心筋梗塞の間または骨格筋の場合には長期身体活動の間に筋肉が損傷を受けると、かくして遊離した収縮性タンパク質が多少速やかに血流中に現れる。
【０００４】
かくして、最近、心筋梗塞の初期診断のためのトロポニンのアッセイは、サーキュレーション（Ｃirculation）第８３巻、第９０２−９１２頁におけるトロポニンＴのアッセイ、および、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａm. Ｈeart Ｊ.）第１１０巻、第１３３３−４４頁（１９８７年）およびモレキュラー・イムノロジー（Ｍolecular Ｉmmunology）第２９巻（２）、第２７１−２７８頁（１９９２年）におけるトロポニンＩのアッセイのどちらも推奨されてきた。同様に、心筋梗塞後の血栓崩壊治療の成功を測定するための心臓トロポニンＴのアッセイがブリティッシュ・ハート・ジャーナル（Ｂr Ｈeart Ｊ）第７１巻、第２４２−２４８頁（１９９４年）において提案されており、同様に、筋肉損傷を測定するための骨格トロポニンＩのアッセイも提案されている［アメリカン・アソシエイション・フォー・クリニカル・ケミストリー（Ａmerican Ａssociation forＣlinical Ｃhemistry）、第４６回ナショナル・ミーティング（Ｎational Ｍeeting）、ニューオーリンズ、１９９４年７月１７−２１日の抄録番号３５］。現在、種々の心臓および骨格トロポニンのアッセイがヒトおよび動物の病理学の診断のための非常に有用な方法であることは、注目すべきである。
【０００５】
生物分析学研究室で行われるイムノアッセイは、該アッセイに必要な試薬（いわゆる抗体、標識化試薬またはそうでなければ視覚化試薬、および希釈溶液）に加えて、研究試料の条件と同様の条件下で用いられる場合に結果の計算のための参照および／または陽性対照として供するであろう測定されるべき化合物の標準を供給するための製造業者を必要とすることがよく知られている。
【０００６】
測定されるべき化合物の標準および／または対照を入手するために、該精製化合物を凍結乾燥形態（該化合物が使用前に使用者によって溶解される溶媒が付属している）で、またはすぐ使用できる形態で使用することができる。
【０００７】
生物学的試薬は不安定であるので、凍結乾燥物から調製された標準または対照溶液は、１回分ずつ冷凍され、−８０℃で保存される。さらにまた、これらの溶液は、プロテアーゼ阻害剤または抗菌剤がそれらに添加されていたとしても、＋４℃では数時間以上は安定ではないことが判明した。従って、このことにより、使用者は、使用時にそれらの検量用溶液を調製せざるを得ない。
【０００８】
イムノアッセイのためのトロポニンＩまたはＴの安定組成物であって、該組成物がトロポニンＣと混合されたトロポニンＩまたはトロポニンＴをより詳細にはトロポニンＩまたはＴの等量あたり１ないし１０モル等量のトロポニンＣの割合で含有する水溶液およびＣaＣl2からなると特徴付けされた組成物を開示する番号ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開された特許出願は、従来技術において知られている。この技術により、トロポニンＩまたはＴの希釈標準溶液を＋４℃で数日間保存することが多少可能になる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、一方では、＋４℃で数日間安定である標準または対照溶液を得ることを可能にし、他方では、製造コストおよび使用コストの両面において多くの利点を有する。それは、事実上、１つまたはいくつかのパラメーターの同時または同時ではないアッセイのための該溶液の簡便な使用を可能にする。本発明者は、驚くべきことに、混合されたトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣによって形成される三成分複合体が溶液中で安定であること、ならびに、これにより得られた、特異性および感受性が精製された成分の溶液と比較して変化しないままであるトロポニンの安定溶液を、１つ以上のトロポニンの所望により同時のイン・ビトロでの診断試験において標準および／または対照として使用できることを示した。
【００１０】
本発明の主題は、水溶液の状態でトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三成分複合体の形態で含有するトロポニンの安定組成物である。
【００１１】
トロポニンＩ、ＴおよびＣはヒトまたは動物起源のものであり、より詳細には、心臓および／または筋肉起源のものであってもよい。
トロポニンＩ、ＴおよびＣは、心臓または筋肉の摩砕調製物の抽出物または予め精製された３種類のトロポニンＩ、ＴおよびＣの混合物のいずれかから得られる。
製造コストの理由で、心臓または筋肉の粗抽出物から本発明のトロポニンＩ、ＴおよびＣの安定組成物を製造することが当然好ましい。
３種類のトロポニンの混合物の起源に依存して、組成物中で多少量変化のある該トロポニンを得ることが可能である。好ましくは、本発明による溶液は、形成されたＩ−Ｔ−Ｃ三成分複合体の最大量を得るために、等モル量のトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣを含有する。
【００１２】
このＩ−Ｔ−Ｃ三成分複合体は、本発明によるトロポニン組成物の安定性の基礎である。さらにまた、トロポニンの製造方法に従って、タンパク質をさらにお互いに安定化させ合うために、二価の陽イオン、より詳細には、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムを添加してもよい。
【００１３】
本発明による溶液中のトロポニンＩ、ＴおよびＣの濃度は、一般にイムノアッセイで使用される濃度に対応する。すなわち、０.０１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは、０.１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
有利な変法によると、本発明による安定組成物は、好ましくは、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体の１０2〜５×１０6重量倍に等しい、１００μｍ〜１００ｍＭのＣaＣl2またはＭgＣl2濃度を含有する。さらに好ましくは、本発明による組成物は、２ｍＭ ＣaＣl2を含有する。
【００１４】
もう一つの好ましい変法によると、本発明による安定組成物は、０.２〜２％、好ましくは０.４〜２％の比率でタンパク質負荷（protein loading）を含有する。このタンパク質負荷は、例えば、ウシアルブミン、ウシ胎児血清または正常ヒト血清のものである。さらに好ましくは、１０％の濃度で存在する正常ヒト血清が組成物中で使用され、それは０.８％のオーダーのタンパク質負荷に対応する。
【００１５】
好ましくは、本発明による安定組成物は、ｐＨ５.５〜６.５に、さらに好ましくはｐＨ６±０.１に緩衝化されている。
使用されるかもしれない緩衝剤は、例えば、イミダゾール緩衝溶液、リン酸カリウム緩衝溶液またはコハク酸ナトリウム緩衝溶液である。０.１Ｍコハク酸ナトリウム緩衝溶液を使用することが好ましいであろう。
【００１６】
本発明の主題は、所望により０.２ないし２％のタンパク質負荷および塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含有していてもよい、好ましくは凍結乾燥形態の、トロポニンの粉末状安定組成物でもある。
【００１７】
本発明による組成物は、トロポニンＩ、トロポニンＴもしくはトロポニンＣ、またはトロポニンＩ、ＴおよびＣのうちの２もしくは３種類についてのイン・ビトロでの検量および／または対照診断試験のために有用である。
【００１８】
本発明の主題は、
ヒトまたは動物の心臓または筋肉の摩砕調製物からのトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣの抽出を行い（ここで、該抽出は、プロテアーゼ阻害剤および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムの存在下で行われる）、
所望により、上記で得られた抽出物を、有利にはｐＨ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムからなる緩衝液に対して透析し、
適切な濃度のトロポニンＩ、Ｔおよび／またはＣを得るために、上記で得られたトロポニンＩ、ＴおよびＣの溶液を、有利にはｐＨ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムからなる緩衝液において希釈するか、または、
精製された等モル量のトロポニンＩ、ＴおよびＣを、有利にはｐＨ５.５ないし６.５の、タンパク質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムからなる緩衝液中で混合すること
からなるトロポニンの安定組成物の製造方法でもある。
【００１９】
本発明に記載した方法による心臓または筋肉の摩砕調製物からの抽出により、安定組成物を得ることができ、心臓トロポニンＩまたは心臓トロポニンＴのごとき分析物をアッセイするために使用してもよく、あるいは、同じ組成物について、例えば、心臓トロポニンＩおよび心臓トロポニンＴのごとき２つの分析物をアッセイするために使用してもよい。
【００２０】
以下に、本発明の具体例および比較安定性試験の結果を記載する。
【００２１】
【実施例】
本発明によるトロポニンの安定組成物の製造方法を以下の実施例に示す。これらの実施例において、濃度は、得られた溶液の最終濃度によって表す。
【００２２】
安定組成物の製造に用いるプロトコールの前に、以下の緩衝液を調製する：
抽出緩衝液：
９Ｍ  尿素
７５ｍＭ  トリス−ＨＣl、ｐＨ８
１ｍＭ  ＣaＣl2
６０ｍＭ  β−メルカプトエタノール
プロテアーゼ阻害剤
透析緩衝液：
０.１Ｍ  コハク酸ナトリウム、ｐＨ６
２ｍＭ  ＣaＣl2
プロテアーゼ阻害剤
希釈緩衝液：
０.１Ｍ  コハク酸ナトリウム、ｐＨ６
正常ヒト血清（ＮＨＳ）、１０％
２ｍＭ  ＣaＣl2
プロテアーゼ阻害剤。
【００２３】
上記の３つの緩衝液中で用いたプロテアーゼ阻害剤は、例えば、ＳＢＴＩ（シグマ（Ｓigma）社、Ｔ９００３）、ＴＬＣＫ（シグマ社、Ｔ７２５４）、ペプスタチンＡ（シグマ社、Ｐ４２６５）、ＰＭＳＦおよびアンチカテプシンから選択されたものであってよい。
【００２４】
心臓または筋肉からの抽出を行うために用いられる方法は、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａmerican Ｈeart Ｊournal）、クリニカル・インベスティゲーションズ（Ｃlinical Ｉnvestigations）、１９８７年６月、第１１３巻、第６号「カルディアック−スペシフィック・トロポニン−Ｉ・ラジオイムノアッセイ・イン・ジ・ディアグノシス・オブ・アキュート・マイオカルディアル・インファークション（Ｃardiac-specific ｔroponin-Ｉ radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction）」、第１３３４頁にさらに詳細に開示されている。
【００２５】
実施例１：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製
トロポニンＩ、Ｔ、Ｃの混合物を、上記抽出緩衝液３０ｍｌ中のヒト心臓の摩砕調製物１グラムから抽出する。混合物を棒磁石を用いて１５分間撹拌し、１０,０００ｇで２０分間遠心する（＋１０℃で）。上清を回収し、透析緩衝液に対して２時間、次いで、緩衝液を交換して＋４℃で一晩透析する。次いで、得られた溶液を希釈緩衝液で１／５０に希釈する。
濃度６３ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２６】
実施例２：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製
実施例１に記載したと同様のプロトコールを用いるが、上清は、抽出後に透析しない。
濃度８２ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２７】
実施例３：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製
実施例１と同様のプロトコールを用いるが、抽出、透析および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ  ＭgＣl2を添加する。
濃度３１ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２８】
実施例４：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製
実施例２に記載したと同様のプロトコールを用いるが、抽出および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ  ＭgＣl2を添加する。濃度４６ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２９】
実施例５：精製したトロポニンからのトロポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製
濃度１０μｇ／ｍｌのトロポニンＩ溶液１０μｌ、濃度１０μｇ／ｍｌのトロポニンＣ溶液１０μｌおよび濃度５μｇ／ｍｌのトロポニンＴ溶液２０μｌを、１０％正常ヒト血漿およびＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ２２２μｇを含有するコハク酸ナトリウム（０.１Ｍ、ＰＨ６）を含有する緩衝液９６０μｌ中に導入する。これらの操作は、例えば孔径０.２２μｍのフィルターを通過させることなどによって滅菌されたトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣ溶液を用いて無菌環境下で行うことが好ましい。
得られた、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩ、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンＴおよび１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンＣを有する溶液を用いて、貯蔵緩衝液（最終濃度１％になるように抗菌剤を添加した希釈緩衝液）で０.１ないし５０ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩの一連の希釈物を調製する。同じシリーズをトロポニンＴおよびＣについて調製してもよい。
【００３０】
精製したトロポニンの組成物を用いて比較安定性試験を行うために、実施例１〜４において調製した組成物を以下の様式：
溶液の形態で貯蔵されるであろうシリーズについて、無菌条件下、滅菌ナルゲン（ＮalgeneR）バイアル中に、
凍結乾燥されるであろうシリーズについて、無菌条件下、滅菌ガラスバイアル中に
分配する。
【００３１】
本発明によるトロポニンの安定組成物は、上記文献に開示されたプロトコール［アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａmerican Ｈeart Ｊournal）、クリニカル・インベスティゲーションズ（Ｃlinical Ｉnvestigations）、１９８７年６月、第１１３巻、第６号「カルディアック−スペシフィック・トロポニン−Ｉ・ラジオイムノアッセイ・イン・ザ・ディアグノシス・オブ・アキュート・マイオカルディアル・インファークション（Ｃardiac-specific troponin-Ｉ radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction）」、第１３３４頁］を用いて、ヒト由来の筋肉または動物由来の心臓もしくは筋肉から製造してもよい。
【００３２】
比較安定性試験の実施：
実施例１〜４に記載した濃縮溶液から、１ｎｇ／ｍｌオーダーのトロポニンＩ濃度を含有するトロポニン溶液を調製する。このために、該溶液を貯蔵緩衝液（最終濃度１％になるようにカーソン（ＫathonR）を添加した希釈緩衝液）で適当に希釈する。ハース（Ｈaas）社によって販売されている抗菌剤であるカーソンは、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（１.５％）からなる。
【００３３】
各実施例について、液体および凍結乾燥物のバイアルが利用可能である。
凍結乾燥物のバイアルは、再構成後に安定性をモニターするために、再水和される。０日（Ｄ０）は、再水和された日に対応する。表１において、これらのバイアルをＬyoph. liq.と記す。
液体のバイアルは、４℃で保存され、安定性についてモニターされる。０日（Ｄ０）は、調製日に対応する。表２において、これらのバイアルをＬiq.と記す。
【００３４】
定性的対照は、正常ヒト血清中の精製トロポニンＩからなる凍結乾燥参照物で行われる（表１において「参照」と記す）。この参照は必要なときに調製され、使用される。
【００３５】
各試験において、調製されたシリーズのポイントを、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開された特許出願において調製されたもののごとき凍結乾燥トロポニンＩシリーズについて測定する（トロポニンＩおよびＣaＣl2の等量当たり５モル等量のトロポニンＣ）。比較方法によって、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開された特許出願において記載された発明に従って調製された液体トロポニンＩの溶液を４℃で安定性についてモニターする。表１および２において、この比較溶液を「ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４」と記す。
【００３６】
表１および２は、各々、上記参照組成物と比較した、凍結乾燥形態および液体形態での本発明組成物の安定性についての結果を示す（濃度測定値は、ｎｇ／ｍｌで示す）。
【００３７】
本方法によるトロポニンのアッセイは、特許出願ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４に開示されている。
測定した溶液の初期濃度が同じではないことに注意するべきである。結果として、安定性に関する結論に達するためには、同じ溶液についてずっと観察された濃度の変動を考慮した。
【００３８】
【表１】
0003672672.tif 000002
【００３９】
【表２】
0003672672.tif 000003
【００４０】
実施された試験の結果により、本発明による実施例１〜４の組成物が、１ヶ月（Ｄ＋３０）で、対照のＦＲ−２,７０１,９５４と比較して高い安定性を示すことが判明する。従って、本発明組成物は、すべて、４℃で数時間のみの安定性を示す精製トロポニンＩの標準組成物と比較してより安定である。これらの結果は、本発明のＩ−Ｔ−Ｃトロポニン組成物が増強された安定性を示し、かくして、ヒトまたは動物の血清または血漿における心臓および／または骨格トロポニン（類）をアッセイするために意図されたイムノアッセイにおいて、標準および／または対照として使用できる。