(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体の表面抗原から誘導される多糖であって、その反復単位が少なくとも１個の不安定な化学的官能基、即ち、多糖を超音波を使用する断片化又は酸性又は塩基性加水分解による解重合にかけたとき、抗原性を減少させる変性を受ける官能基を含有している多糖を、上記不安定な官能基を含有する反復単位の構造を保持しながら解重合することによりオリゴ糖を製造する方法において、(i)上記の多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、ついで、(ii)かく得られたオリゴ糖を回収することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
酸化−還元解重合反応をアスコルビン酸又は過酸化水素である酸化−還元剤の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化−還元解重合反応を鉄又は銅塩の存在下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸化−還元解重合反応を３〜8.5のpHで行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
酸化−還元解重合反応を４〜60℃の温度で行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記の不安定な化学的官能基は、リン酸塩基、アセチル基及びピルビン酸塩基から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗原多糖は、病原体バクテリアから誘導されたカプセル状多糖である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記病原体バクテリアはスタフィロコカス属、ストレプトコカス属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エシエリシア属、ナイセリア属及びハエモフィルス属から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
得られたオリゴ糖は、４〜500個のグリコシド単位を含有している、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程(ii)で得られたオリゴ糖を複合体パートナー又は担体とカップルさせて、オリゴ糖を複合体の形で得るか又は担体と結合させる工程(iii)を更に行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれかに記載の方法によって得られた解重合生成物。
【請求項１２】
請求項11に記載の解重合生成物の少なくとも一つを活性成分として含有する、個体の免疫防御性を強化するための医薬組成物。
【請求項１３】
予防接種を行うための、請求項12に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は病原体（pathogenic agent）から得られる抗原多糖（antigenic polysaccharide）から誘導されたオリゴ糖、その製造方法、及び、特に、そのワクチン製剤（vaccinal agent）としての使用に関する。
バクテリア及び酵母のごときカビ（fungi）はその表面構造中に多糖を含有している。即ち、大部分のバクテリアは、多かれ少なかれ強固にバクテリアに結合しているが、厳密にいえば、包膜（envelope）ではない多糖質の滲出物（exudate）で被覆されている。この滲出物は莢膜（capsule）又は糖衣（glycocalyx）と呼ばれている。更に、グラム陰性バクテリアの外膜（outer membrane）は、特に、リポ多糖（LPS）からなる。最後に、多糖はカビの細胞壁（wall）にも存在する。これらの多糖は、実際には、感染哺乳動物において免疫応答（immunological response）を誘発する表面抗原（surface antigen）である。
かかる多糖は、その構成成分と結合が明確に規定されている（define）、かつ、各々、考慮しているカビ又はバクテリア種の特性である反復単位に基づいて形成されている。これらの反復単位はエピトープ（epitope）、即ち、抗原性決定構造体（antigenicitydetermining structures）を含有している。例示として、莢膜状（capsular）多糖又はリポ多糖から得られる種々の形式の反復単位が図１に示されている。反復単位は、しばしば、例えば、分子の骨格中又は分岐した位置中に存在するホスフェート官能基並びに０−アセチル基及びピルビン酸基（pyruvate group）のごとき非常に不安定な（labile）官能基を含有している。
多糖は、実際には、一つの分子から他の分子へと変動し得る量のグリコシド単位を含有する重合体分子の組合せからなる。従って、多糖は平均分子量のみによる分子量によって記載し得る。ホモ多糖の場合にはグリコシド単位は単糖である。ヘテロ多糖の場合にはグリコシド単位は一定の方法で連結された構成成分の鎖を形成している。
多糖の平均分子量に関して、これはゲル濾過（gel filtration）によって決定し得る。この場合、分子量はGranath等によりJ.Chrom.(1967)28:69に記載の方法に従って、溶離定数（elution constant）（KD）又はデキストラン当量（dextran equivalent）（DEq）で表される；この方法は以下のごとく要約し得る：
多糖溶液を、構成成分をその分子量に従って分離する拡散−排除ゲルクロマトグラフィー（exclusion-diffusion gel chromatography）カラム上で分析する。この種のゲルは例えばセファデックス（Sephadex）（Pharmacia）、バイオ−ゲル（Bio-Gel）（Bio-Rad）、フラクトゲル（Fractogel）（東洋ソーダ）、セファロース（Sepharose）（Pharmacia）及びセファリル（Sephacryl）（Pharmacia）の商品名で商業的に入手される。ゲルの分画（fractionation）の領域は、分析すべき分子母集団（molecular population）内で表される分子量の範囲に適合させるべきであることは明らかである。例えば、ゲル濾過カラム  セファロース2BCL、4BCL及び6BCLは、デキストラン当量で測定して、それぞれ、20,000,000〜100,000；5,000,000〜20,000及び1,000,000〜10,000の分画の領域を有する。一般的には、塩溶液、例えば、0.2M塩化ナトリウム溶液が溶離剤として使用される。溶離定数は下記の式：
Ve−Vo
Vt−Vo
［式中のVeは、考慮されている溶液（preparation）の溶離容量（elution vilume）であり、Vtはカラムの全容量であり、Voはカラムの死容量（dead volume）である］に基づいて計算される。
例えば、図2a及び2bは、それぞれ、セファロース4BCLカラム上でのサルモネラ  チフィ（Salmonella typhi）及びストレプトコカス  プニュウモニアエ（Streptococcus pneumoniae）1型の多糖の溶離図（elution profile）を示している。従って、S.チフィの多糖はセファロース4BCL上では最大分子量を決定し得ない重合体からなる。同様に、S.プニュウモニアエ1型の多糖は分子量が0〜0.45のKDの範囲で変動する重合体から本質的になる。定義により、多糖の平均溶離定数は溶離図のスロープの接線（tangent）の交差点において；又は、概略的には、溶離図の頂点において決定される。従って、図2a及び2bにおいて示される多糖の平均溶離定数は、それぞれ、0及び0.04である。
デキストランを使用して作成した検量線（calibration series）に基づいて、溶離定数をDEqで表わされる分子量に変換し得る。例えば、図3は検量線の一例を示す。
病原体、例えば、バクテリア又はカビの表面抗原である多糖は、その抗原性（antigenicity）のために、ワクチン剤として良好な候補者である。実際に、多糖抽出物からなるワクチンは成人においては効果があることが証明されている。しかしながら、このことは小児については適用されない。この重要な問題を排除するために、多糖を蛋白質に共有結合させ、それによって、かく得られる分子にT−依存特性（T-dependent character）を付与し、その免疫原性（immunogenicity）を増大させることが提案され、成功している。
多糖に基づくワクチンとしては、従来、ネイセリア  メニンギチジス（Neisseria meningitidis）A,C,Y又はW135群、ストレプトコカス  プニュウモニアエ、ハエモフィルス  インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）B型及びサルモネラ  チフィによって惹起される感染に対するワクチンがある。
病原体の抗原多糖は免疫原（immunogen）として潜在的に有利なものであるが、数百万デキストラン当量という大きさであり得る、その大きな分子量のために、その使用が困難である。特に、これを複合体（conjugate）の形、即ち、蛋白質とカップルさせた形で使用することを希望する場合には、解決することが困難な技術的な問題に遭遇する。カップリング工程中に、ゲル又は凝集物質が形成され、このことが、複合体を濾過により殺菌することを困難にしている。
この問題を排除するために、多糖の大きさを減少させ、その取扱いを容易にすることが既に提案されている。この目的のために種々の開裂（分解）（cleavage）方法が提案されている。即ち、例えば、これらの方法は超音波による断片化（フラグメント化）（fragmentation）又は酸性、塩基性又は酵素媒体中でのアルカリ性加水分解による断片化である。しかしながら、これらの断片化は全く満足し得ないものである。実際に、これらの方法においては抗原特異性（antigen specificity）に必要な化学的官能基が失われることにより、特徴的なエピトープが全体的に或いは部分的に破壊される。
例えば、S.チフィ又はN.メニンギチジスA群の莢膜状多糖の酸性又はアルカリ性加水分解により、多糖の抗原特異性に必要なアセチル基が除去される。更に、アルカリ性加水分解によって得られた断片の正確な再アセチル化（reacetylation）は、不可能ではないにしても、極めて困難である。
更に、アルカリ性加水分解による断片化法については、比較的均一な寸法の断片を得ることは必ずしも可能ではなく、一方、医薬の製造においては一定なかつ標準化された均一な製品が要求される。
超音波による断片化においては、例えば、H．インフルエンザエB型の多糖の末端ホスフェート基が超音波処理により失われることが示されている。このことにより、多糖鎖の分岐した位置にあるホスフェート基がかかる処理中に除去される恐れが生じ得る。
更に、超音波を使用することにより比較的均一な大きさの断片を得ることができるが、超音波法により十分に小さい寸法の断片を製造するためには非常に長い処理時間を必要とし、これにより他の不利益、即ち，装置の急速な劣化を生じ得る。その効率は限定されており、工業的な規模での超音波の適用は回避すべきである。
最後に、多糖の酵素解重合の使用は適当な酵素が知られている多糖に限定される。しかしながら、この重大な不利益は酵素のその基質（substrate）に対する高度の特異性に固有のもの（inherent）である。
従って、ワクチンの分野においては、重要な技術的なかつ経済的な進歩は、従来の方法の種々の不利益をもはや生ずるこのない解重合法を提供し得るものでなければならない。換言すれば、特に、有利な性質を組合せて有する、抗原多糖の解重合法を提供し得ることが必要である；その理由は下記の通りである：
−この方法は減少した数のグリコシド単位を有するオリゴ多糖であって、しかも、断片されるべき多糖の少なくとも1個のエピトープの必須の構造決定因子（structural determinant）を保存しているオリゴ多糖を得ることを可能にする。
−この方法は意図する任意の抗原多糖構造体に使用し得る。
−この方法は十分に均一な寸法の断片を得ることを可能にする。
−この方法は安価でありかつその使用が極めて簡単である。
驚くべきことに、今般、これらの目的は酸化−還元解重合反応によって達成されることが見出だされた。
今日まで、英語においては、しばしば、ORDの略号で記載されるこの方法は、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン及びDNAを断片化するために、かつ、本発明によって達成される目的とは全く異なる目的のために使用されていた。その目的は例えば生成物の粘度を低下させること、或いは、ヘパリンのごとき線状分子の場合には異なる抗凝集活性（anticoagulant activity）を有することが知られている、寸法のより小さい断片を得ることであった。勿論、この方法を適用した物質は免疫学的に重要なものではないので、得られた断片の反復単位の結合性（integrity）の研究は行われなかった。
更に、ORD反応はホスフェート基を破壊する（destructive）か又は炭水化物環の炭素−炭素結合の開裂（cleavage）により炭水化物環を破壊すると記載している多数の公知刊行物、例えば、K.Uchida,Carbohydrate Research,(1988)173：89-99;H．Uchiyama,Journal of Biological Chemistry,(1990)265：7753-7759；S.W.Green,The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry  IB；Academic Press(1980);1132；A.Herp,The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry  IB；Academic Press(1980):1276；Kochetkov等，Radiation Chemistry of Carbohydrates，Pergammon Press,Oxford,(1979)が存在する。
この分野の従来の状態から受ける全体的な印象は、ORD反応は一般的に破壊的（destructive）であると認識されていたということである。
従って、所望の目的、即ちエピトープの保存という目的のために、ORD反応は例えばアルカリ加水分解又は超音波処理を使用する方法より良好であり得るということを示唆するものは存在しなかった。
従って、本発明以前においては、個体（individual）の免疫防御性（immune defence）を強化することを可能にする活性化剤としてオリゴ糖を製剤中で使用することを可能にするために、特徴的な反復単位構造が保存されているオリゴ糖をそれぞれの多糖の酸化−還元断片により得ることが可能であることは明らかにされていなかったことである。
今般、原料多糖の抗原決定基の少なくとも1個が保存されているオリゴ糖を得るのにORD法を使用し得ることが発見された。
更に、酸化−還元解重合法は、抗原多糖に適用した場合には、ORD反応は多糖を不規則な方法で開裂せる遊離基生成反応であるという事実にも拘らず、寸法の均一性の観点から完全に満足し得る断片を好ましい条件下で製造することを可能にすることが認められた。
従って、本発明によれば、病原体の表面抗原から誘導される多糖であって、その反復単位が少なくとも１個の不安定な化学的官能基、即ち、多糖を超音波を使用する断片化又は酸性又は塩基性加水分解による解重合にかけたとき、抗原性を減少させる変性を受ける官能基を含有している多糖を、上記不安定な官能基を含有する反復単位の構造を保持しながら解重合することによりオリゴ糖を製造する方法において、(i)上記の多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、ついで、(ii)かく得られたオリゴ糖を回収することを特徴とするオリゴ糖の製造方法が提供される。
“オリゴ糖”は分子の組合せを意味すると理解される；各分子は原料多糖と比較して、減少した数のグリコシド単位を有しており、例えば、４〜500個のグリコシド単位を含有している。
オリゴ糖の平均分子量は多糖について前記した規則に従って定義される。一般的には、本発明のオリゴ糖は0.3〜0.9、特に、0.4〜0.8、例えば、0.6〜0.7の、セファロース4BCLカラム上での平均溶離定数を有し得る。換言すれば、かかるオリゴ糖は200,000〜2,000DEq、特に150,000〜10,000DEq、特に60,000〜30,000DEqの平均分子量を有する。
本発明の好ましい要旨によれば、抗原多糖は、カビ（Fungus）並びに、特に、スタフィロコカス（Staphylococcus）属、ストレプトコカス（Streptococcus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、サルモネラ（Salmonella）属、エシエリシア（Escherichia）属、ネイセリア（Neisseria）属、シゲラ（Shigella）属及びハエモフィルス（Haemophilus）属のグラム陰性又はグラム陽性バクテリアであり得る病原体から得られる表面抗原である。
バクテリア性病原体（bacterial pathogenic agent）は、例えば、ストレプトコカス  プニュウモニアエ、ネイセリア  メニンギチジス、サルモネラ  チフィ又はハエモフィルス  インフルエンザエである。
カビ性病原体（fungal pathogenic agent）は酵母、又は、特に、カンジダ（Candida）属、クリプトコカス（Cryptococcus）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、リポミセス（Lipomyces）属、リンコクラジエラ（Rhincocladiella）属及びロードトルラ（Rhodotorula）属から選ばれ得る。
本発明の目的のためには、酸化−還元反応は、特に、チオール、例えば、グルタチオン、システイン；酸素；ヒドロキノン；多価金属のイオン、例えば、鉄及び銅のイオン；アスコルビン酸、過酸化水素；から選ばれ得る酸化−還元系の少なくとも1種の存在下で行われる；最後の二つが好ましい．
反応の活動性（kinetics）に影響する種々の実験パラメーター（生成物濃度、pH、温度、反応時間）は、原料多糖の特性、選択された酸化−還元系及び取得することを希望する断片の平均寸法に従って当業者により容易に決定し得る。これらの断片が特にワクチンを目的とする場合には、適当な平均寸法を有する断片、即ち、良好な抗原性を保存しているかつ、適当な場合には、複合体の使用に適合する寸法を有する断片、例えば、前記で定義した大きさの程度を有する断片が得られるように種々のパラメーターを調節するために当業者により特に注意が払われるであろう。一般的には、最適な反応条件は日常試験により決定し得る。しかしながら、指針として、良好な結果を得ることを可能にする実験値は後記の実施例において特定されている。
本発明の方法に使用されるべき多糖は既知の方法、特に、アルコール又はセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを用いる沈殿又はゲル濾過により抽出し、精製し得る。これらの方法についの文献としては、特に、R.I.Whistler,Method in Carbohydrate Chemistry,(1965)I:3-62を参照し得る。
多糖は5mg/mlの濃度の水溶液の形で調製することが有利である。有利な濃度は0.5〜50mg/ml、特に、0.5〜10mg/mlの範囲で変動させ得る。かかる水溶液を出発原料として使用し得る。
上記で定義した酸化−還元系は全部を一回で、又は、連続的な又は非連続的な方法で、かつ、酸化−還元系：多糖の最終重量比が0.01〜10、特に、0.1〜5、例えば、0.1〜1になる量で、多糖溶液（polysaccharide preparation）に添加される。
本発明の方法は3〜8.5、特に、3〜6.5のpHで使用し得る。同様に、反応媒体の温度は臨界的ではない；この温度は4〜60℃、特に、18〜40℃の間で変動し得る。
多糖の所望の断片化を達成するのに必要な時間は、特別な場合を除いて、一般的には、30分〜1時間である；例えば、S.チフィの多糖Viについては、反応時間は実質的により長い。反応時間は取得することを希望する断片の寸法に従って調節し得る。
特別な態様においては、0.5〜50mg/ml、特に、0.5〜10mg/mlの濃度を有する多糖の水溶液に、最終濃度が0.01〜25mg/ml、特に、0.1〜10mg/mlになるまでの量のアスコルビン酸を添加する。酸素は反応媒体中に本来溶解している量で十分である；もし不十分な場合には、反応媒体に酸素を更に吹込むことができる。反応を促進させるために、本発明の方法を種々の酸化状態の金属、例えば、鉄又は銅の可溶性塩の存在下で行い得る。金属塩は1μM〜100mM、特に、1〜10mMの濃度で添加し得る。
上記した態様の更に別の態様によれば、アスコルビン酸を過酸化水素で置換することができ、この過酸化水素は、場合により金属塩の存在下、0.1〜100mM、特に、0.5〜10mMまでの濃度で添加し得る。
多糖をORD解重合反応にかけることにより調製されたオリゴ糖は、このオリゴ糖を断片化により誘導するのに使用された多糖の平均溶離定数より低い平均溶離定数を有する分子の組合せからなる（この平均溶離定数の比較は明らかに同一のクロマトグラフィーカラムを使用して行われたものである）。オリゴ糖は慣用の方法、例えば、適当な沈殿剤、例えば、アセトン又はアルコールによる沈殿、適当な分離限界（separation threshold）を有する膜上での濾過、排除−拡散又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離し得る。ついで平均溶離定数に等しいか又はこれに近い溶離定数を有する分子を含有するある種のオリゴ糖フラクションだけを使用するために選択を行い得る。
本発明のオリゴ糖は、特に哺乳動物におけるオリゴ糖の免疫原性を増大させることのできる複合体（conjugate）を形成させるために、場合により、ペプチド又は蛋白質系の化合物又は他の有機重合体、例えば、ポリアクリレートと共有結合によりカップルさせ得る。複合体のパートナーは、特に、バクテリア蛋白質、例えば、トキシン、対応するアナトキシン又はマルチマー状（multimeric）トキシンのサブユニット並びに膜蛋白質、マルチマー状膜蛋白質のサブユニット又は細胞質蛋白質であり得る。例えば、ペルツシス（Pertussis）トキシン、コレラ（cholera）トキシン、テタナス（Tetanus）トキシン及びジフテリアトキシンが挙げられる。これらの蛋白質は元のバクテリアから抽出するか又は組換え法（recombinant route）により得ることができる。
ワクチンとして使用し得る複合体を得るためのオリゴ糖と複合体パートナーとの共有結合によるカップリング反応は慣用の方法を使用して行い得る。例えば、複合体パートナーの官能基と反応し得る官能基をオリゴ糖上に形成させ得る。二官能性カップリング剤をオリゴ糖と反応させ、ついで複合体パートナーと反応させるか、又はこの逆のことを行い得る。これらの種々のカップリング方法を検討するためには、特に、J.M.Cruse，R.E.Lewis,Jr.編、Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger(1989)10：48に掲載のConjugates Vaccinesと題するW.E.Dick及びM.Beurretの報文が参照される。更に、酸化−還元断片化法においては、特に、Ｓ.プニュウモニアエ6B型及び19F型、H.インフルエンザエ及びN.メニンギチジスA群の多糖から誘導されたオリゴ糖中に還元性基が導入される。従って、このことは、還元的アミノ化複合技術を使用することを可能にする。
本発明のオリゴ糖の免疫原性は担体リポソームを使用し、これにオリゴ糖を共有結合させることによっても増大させ得る。免疫原性は例えばシクロデキストリン、リポソーム及びISCOMSのごとき、イオン力又は疎水性力（hydrophobic force）による組込み（incorporation）によりオリゴ糖を保持するベクターによっても増大させ得る。
従って、本発明は種々の形、特に、複合体の形、担体リポソームとカップルさせた形又はベクター中に組込まれた形で提供されるオリゴ糖に関する。本発明の好ましい要旨によれば、オリゴ糖は複合体の形である。
本発明のオリゴ糖は、例えば、病原体によって誘発される感染、例えば、バクテリア感染又は真菌症（mycosis）の影響を排除又は減少させるために、哺乳動物、特に、ヒトの個体（individual）の免疫防御性（immune defence）を強化させるのに特に有用である。種々の抗原多糖から誘導される本発明のオリゴ糖の混合物並びに本発明のオリゴ糖と、本発明のオリゴ糖以外の活性成分との混合物も有用である。かかる混合物は多価ワクチン（polyvalent vaccine）を調製するのに適当である。
従って、本発明によれば、更に
−本発明のオリゴ糖の少なくとも１種を活性成分として含有する医薬組成物。この医薬組成物は特にワクチンである；
−本発明のオリゴ糖の治療における使用；
−個体の免疫防御性を強化させる方法、例えば、予防接種方法（vaccination）であって、本発明のオリゴ糖の少なくとも１種をかかる処置、例えば予防接種を必要とする対象者（subject）に治療の観点から十分な量投与することからなる、個体の免疫防御性の強化方法；
−個体の免疫防御性を強化させるための医薬組成物中における活性成分としての本発明のオリゴ糖の使用；
−(i)原料多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、(ii)所望ならば、得られたオリゴ糖を複合体パートナー又はリポソームとカップルさせるか、又は、上記のオリゴ糖をリポソーム、ISCOMS又はシクロデキストリン中に組込み、ついで、(iii)得られた生成物を適当な医薬の形にする、前記医薬組成物の製造方法；
が提供される。
好ましい医薬組成物は少なくとも１種のオリゴ糖を複合体の形で含有している。
本発明の医薬組成物は慣用の方法で調製し得る。特に、本発明のオリゴ糖を薬学的に許容される稀釈剤又は担体、例えば、発熱物質を含有していない（pyrogen-free）生理的食塩溶液と組合せる。更に、本発明の医薬組成物は緩衝液、保存剤又は安定化剤、補助薬及び適当な場合には凍結乾燥賦形剤のごとき慣用の成分を含有し得る。本発明のオリゴ糖は稀釈剤、担体又は前記したごとき成分の存在下で保存される、別法として、稀釈剤、担体又は成分は使用直前に添加し得る。
従って、本発明によれば、更に、
a)活性成分としての本発明のオリゴ糖の少なくとも１種から本質的になる医薬組成物；
b)薬学的に許容される稀釈剤又は担体、緩衝力（buffering power）を有する化合物、保存剤又は安定化剤及び補助薬から選ばれた少なくとも１種の成分からなる組成物；
c)上記a)及びb)の組成物の、例えば混合物の形での同時的投与（concomitant administration）のための取扱説明書（instructions）；
を含有するキット（kit）が提供される。
本発明の医薬組成物は任意の慣用の経路、特に、例えば注射可能な懸濁液の形で、皮下、筋肉内又は静脈内と投与するか又は経口投与し得る。投与は単一投与により、又は、ある時間間隔の後に一回又は数回反復して行い得る。適当な投与量は種々のパラメーター、例えば処置を受ける個体又は投与方法によって変動する。しかしながら、良好な結果は1〜200μｇのオリゴ糖を約0.5mlの容量で単位投与することにより得られ得る。
本発明を以下の実施例によりかつ図１〜４を参照して詳細に示す。
図１はS.プニュウモニアエ14型(a)、1型(b)、S.チフィ(c)、S.プニュウモニアエ6B型(d)、H.インフルエンザエB型(e)、S.プニュウモニアエ19F型(f)、N.メニンギチジスA群(g)、S.プニュウモニアエ18C型(h)、23F型(i)、クレブシエラ  オザエナエ（Klebsiella ozaenae）血清型（selotype）K4(j)、シゲラ  フレクスネリ（Shigella flexheri）血清型1b(k)及びクリプトコカス  ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）菌株98(l)の莢膜状（capsular）多糖の反復単位の式を表わす。(a)は中性多糖に相当すること、(b)及び(c)は多糖鎖中にウロン酸を含有する多糖に相当すること、(d)〜(i)はリン酸化（phosphorylated）多糖に相当すること、(j)及び(k)は、それぞれ、アニオン性又は中性のリポ多糖に相当すること及び(l)はアニオン性カビ多糖に相当することが観察され得る。
図2a及び2bはセファロース4BCLカラム上でのｓ．チフィ(2a)及びS.プニュウモニアエ1型(2d)の溶離図を表わす。クロマトグラフィーの条件は下記の通りである：5mg/mlの多糖溶液2mlを、予め0.2M NaClを用いて平衡化したセファロースカラム上に負荷する。溶離は0.2M NaClを用いて42ml/hの速度で行われる。光学濃度を206nmで測定することにより溶離図を自動的に分析する。図2a及び2bにおいてカラムの死容量は76.56mlであり、全容量は201.84mlである。
図3はデキストランについての500,000〜20,000の検量線である。
図4aおよび4bはｓ．チフィ(4a)及びS.プニュウモニアエ1型(4b)の酸化−還元断片化により得られたオリゴ糖の、セファロース4BCLカラム上での溶離図である。クロマトグラフィーの条件は図2について述べたものと同一である。
実施例  １：
アスコルビン酸の存在下でのＳ．チフィの多糖Viの断片化。
Prog.Immunobiol.Standard.(1972)5：485に記載のGotschlich等の方法に従って得られた多糖Viの乾燥粉末を、発熱物質を含まない水（pyrogen-free water）に1mg/mlの量で溶解させた。この多糖の平均分子量（MW）はセファロース4BCLカラム上での零のKDに相当する。
37℃に予熱したこの溶液500mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO4および10mMのFeSO4を含有する水溶液12.5mlを2時間にに亘って、連続的にゆっくり添加した；最終アスコルビン酸濃度は0.44mg/mlに相当する。かく得られた反応溶液のpHは約pH4であった。穏やかに攪拌しながら37℃で約3時間（反応剤の添加時間を含む）反応を行った。
ついで反応混合物を3K限外濾過膜（カットオッフ：3キロダルトン）上で濾過した。残留物（retentate）を0.5M NaCl溶液で一回洗浄しついで水で2回洗浄した。残留物を約100mlの水に溶解しついで凍結乾燥して保存した。
開裂（cleavage）の水準は、セファロース4BCLゲル上での濾過によって得られた曲線（図4a）の積算（integration）により計算して、95％程度である。更に、かく得られるオリゴ糖の平均MWをGranath等の方法（前記参照）により決定した。平均溶離定数として表される平均MWは0.6程度であり、これは60,000DEqのMWと等量である（デキストランを参照として使用）。
NMR（核磁気共鳴）スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位に特有の構造は断片化後においても保持されていることを明らかに示した。特に、分岐した官能基、又は、糖（sugar）は多糖骨格から失われていなかった。
多糖Viの反復単位に特有の化学的官能基は比色分析法（colorimetric assay）により分析した。分岐した位置の０−アセチル基はBiol.Chem.(1949)188：249に記載のHestrinの方法により検定し、線状構造体のポリ酸（polyacid）はClin.J.Microbiol.(1988)28：719に記載のStone等の方法により検定した。検定は非断片化多糖Viと形成されたオリゴ糖とについて平行的に行った。
多糖とオリゴ糖とについて測定した［０−アセチル］/［ポリ酸］比は同一であった。このことは多糖の断片化法が移動し易い０−アセチル基の全てを保存することを可能にしていることを示している。
実施例  ２：
過酸化水素（H2O2）の存在下でのＳ．チフィの多糖Viの断片化。
Gotschlich等の方法（前記参照）に従って得られた多糖Viの乾燥粉末を、0.2Mリン酸塩緩衝液pH7.5に0.4mg/mlの量で溶解させた。この多糖のMWはセファロース4BCLカラム上で測定して、零のKDに相当する。
37℃に予熱したこの溶液100mlに、0.3mg/mlのH2O2を含有する水溶液11ml及び2.6mg/mlのCuSO4溶液1.1mlを穏やかに攪拌しながらゆっくり添加した。穏やかに攪拌しながら37℃で約1時間反応を行った。
反応時間を1時間の代わりに2時間としたこと以外、同一の条件下で実験を繰返した。
両者の場合に、かく得られたオリゴ糖を回収し、実施例１と同様に精製した。
同様に、かく得られたオリゴ糖の特性を実施例１に記載の方法で測定した。その結果は下記の通りである：
−両者の場合において、多糖Viの開裂の水準は100％である。
−1時間および2時間後に形成されたオリゴ糖の平均MWは、それぞれ、0.7及び0.8のKDに相当する；これは、30,000及び10,000DEqと等量である。
−両者の場合において、反復単位の構造に変化は認められなかった。
実施例  ３：
N.メニンギチジスA群の多糖の断片化。
Gotschlich等の方法（前記参照）に従って得られたN.メニンギチジスA群の多糖の乾燥粉末を、0.2Mリン酸塩緩衝液pH7.5に1mg/mlの量又は5mg/mlの量で溶解させた。この多糖の平均MWはセファロース4BCLカラム上で測定して、0.15のKDに相当する。
1mg/ml及び5mg/mlの溶液を37℃に予熱した。
3a)1mg/mlの溶液100mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO4及び10mMのFeSO4を含有する反応溶液0.75mlを添加した。攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。ついで、上記反応溶液0.75mlを再び添加した；かくして、0.26mg/mlの最終アスコルビン酸濃度が得られた。反応を同一の条件下で更に1時間30分行った。
3d)5mg/mlの溶液100mlに、100mMのアスコルビン酸、10mMのCuSO4及び10mMのFeSO4を含有する反応溶液1.5mlを添加した；最終アスコルビン酸濃度は0.26mg/mlに等しかった。攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。
3a)及び3b)で得られたオリゴ糖を実施例１に記載したごとき方法で回収し、精製した。同様に、実施例１に記載したごとき方法で分析を行った。両方の場合に、開裂の水準は100％であり、NMRにより分析した場合に、反復単位の構造の劣化は認められなかった。3a)で得られたオリゴ糖の平均MWは0.7のKD（30,000DEqと等量）に相当し、3d)で得られたオリゴ糖の平均MWは0.4のKD（110,000DEqと等量）に相当した。
これらの結果は、全体として、実験条件（多糖及び反応性酸化−還元剤濃度並びに反応剤の添加方法及び反応時間）を変化させることにより、実質的に異なる平均MWを有するオリゴ糖が得られるが、100％の開裂水準は保持されることを示している。
最後に、この実施例と実施例２は、この断片化は中性に近いpHで行われているので、断片化は酸化−還元によるものであって、酸又はアルカリ加水分解によるものではないことを実際に示している。
実施例  ４：
S.プニュウモニアエ1型及び19F型の多糖及びH.インフルエンザエB型の多糖の緩衝媒体中での断片化。
1982年6月18日発行のフランス特許出願FR 2,495,939号に記載の方法で得られたS.プニュウモニアエ1型及び19F型の多糖及びGotschlich等の方法（前記参照）に従って得られたH.インフルエンザエB型の多糖を使用して、実施例３（3a及び3b）を繰返した；
その結果は下記の通りである：
0003676803.tif 000002
NMR（核磁気共鳴）スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位に特有の構造は断片化後においても保存されていることを明らかに示していた。
実施例  ５：
N.メニンギチジスA群の多糖及びS.プニュウモニアエ1型、14型、18C型、19F型及び23F型の多糖の非緩衝媒体中での断片化。
(i)5mg/mlの濃度の多糖溶液を発熱物質を含まない水中で調製したこと、(ii)反応溶液の全てを2.5mg/mlの最終濃度になるまで一回で添加したこと及び(iii)反応を1時間だけ行ったこと以外、実施例３及び４に記載の方法で多糖溶液の調製と反応を行った。
得られたオリゴ糖を実施例１に記載の方法で回収し、精製した。その特性を実施例１に記載の方法で調べた。多糖の各々についての開裂水準は100％であり、反復単位の構造の劣化は認められなかった。この最後の点は比色分析によっても示された：ヘキソースの分析はAnal.Chem.(1953)25：1650に記載のScott等の方法により、ヘキソースアミンの分析はAnal.Biochem.(1965)15:167に記載のGatt等の方法により、ラムノースの分析はJ.Biol.Chem.(1948)175：595に記載のDische等の方法により、そして、ホスフェートの分析はAnal.Chem.(1956)28:1756に記載のChen等の方法により行った。S.プニュウモニアエ14型の多糖と、断片化によりこれから誘導されるオリゴ糖の場合には、［ヘキソース］/［ヘキソースアミン］比は実質的に同一であった。このことは、S.プニュウモニアエ18C型及び23F型の場合における、それぞれ、［ラムノース］/［ヘキソース］比及び［ホスフェート］/［ヘキソース］比についてもあてはまった。
オリゴ糖のNMRスペクトル分析によっては反復単位の不均一性を示す信号は検出されず、オリゴ糖は変化していない（intact）反復単位からなることを示していた。
最後に、オリゴ糖の平均MWに関しては、その結果は下記の通りである：
0003676803.tif 000003
実施例  ６：
S.チフィのオリゴ糖Vi/コレラトキシンのBサブユニット複合体の調製。
6a)オリゴ糖Vi中へのNH2基の導入
実施例１で得られたオリゴ糖Viの凍結乾燥生成物をリン酸塩緩衝液pH8に10mg/mlの量で溶解した。この溶液にジアミノヘキサンとNaCNBH2とを、各々、最終濃度が12.5mg/mlになるまでを溶解して添加した。室温で6日間反応を行った。ついで、反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥させた。Anal.Biochem.(1975)64:284に記載のShnyder等の方法に従って分析を行って、NH2基が実際に導入されたことを確認した。同様に、Hestrinの分析方法により０−アセチル基が依然として保存されていることが示された。
6b)反応性官能基の導入
6a)で得られた凍結乾燥生成物を40mg/mlの量で溶解させた。この溶液20mlに、ジメチルスルホキシド（DMSO）中のジスクシンイミジルスベレート（disuccinimydyl suberate）（DSS）の40mg/mlの溶液80mlを添加した。室温で1時間反応を行った。ついで、生成物をDMSO/ジオキサン混合物中で沈殿させた。
6c)複合
6b)で得られた沈殿を0.5M NaCl溶液中に40mg/mlの量で溶解させた。これと平行的に、0.2Mリン酸塩緩衝液pH6.5中の、コレラトキシンのBサブユニットの10mg/mlの溶液を調製した（Tayot等，Eur.J.Biochem.(1981)113:249参照）。
かく調製した二つの溶液を混合した。オリゴ糖/蛋白質重量比は約1であった。室温で15時間反応を行った。
6d)精製
ついで、混合物を分離限界（separation threshold）が5・104ダルトンの膜を取付けた限外濾過ミニカートリッジ（Millipore）上で濾過して、カップルしていない蛋白質とオリゴ糖を除去した。残留物を0.3M NaClで洗浄しついで、滅菌濾過を行った後、NaCl 1/1000、メルチオレート（merthiolate）1/10,000中に200μg/mlの量で、４℃で保存した。
実施例  ７：
オリゴ糖/テタナス  アナトキシン複合体の調製
実施例５においてS.プニュウモニアエ14C型及び23F型の多糖から得たオリゴ糖及び実施例１においてS.チフィの多糖Viから得たオリゴ糖を複合させた；操作は実施例６に述べた方法と同様に行い、コレラトキシンのBサブユニットの代わりに、J.Bact.(1954)67:671に記載のMueller及びMillerの方法に従って調製したテタナス  アナトキシンを使用した。
S.プニュウモニアエから得られた複合体を250μg/mlの量で保存した。
実施例  ８：
複合体の免疫原性の例証
OF1マウス（IFFA Credo）を8個のバッチに分割した。バッチからの各マウスに実施例６及び７で調製した溶液の一つを0.5mlを投与するか、又は、これと平行して、対応する天然多糖0.5mlを投与した。注射は皮下に行った。これらの注射を14後に繰返した。これと平行して、対照には生理的食塩水だけを投与した。
最初の注射から14日及び28日後に、第１の血液試料を採取し、抗多糖抗体（anti-polysaccharide antibody）IgGをELISA法によって滴定した（滴定プレートには非断片化多糖を被覆した）。14日及び28日後の抗体水準は複合体が免疫原性（immunogenic）であることを示した。上記複合体の各々において、抗体水準は対応する天然多糖によって誘発されるものより高かった。更に、T-依存性抗原の特徴である反発効果（rebound effect）も認められた。
実施例  ９：
活性成分として複合体を含有するワクチン製剤組成物。
実施例７で得られたS.チフィのオリゴ糖Vi/テタナス  アナトキシン複合体を、ヒトの皮下に注射するための、0.5mlのワクチン投与剤に製剤した。単位投与剤当りの組成は下記の通りである：
0003676803.tif 000004
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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