(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ，ｉｎｔ）遺伝子領域及び宿主染色体への組み込み部位（ａｔｔＰ領域）と、乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性遺伝子領域と、大腸菌(Escherichia coli)で機能する複製開始領域と、クローニング部位とを備えたラクトバチルス・カゼイ菌用ベクターを用いて、ラクトバチルス・カゼイ菌の染色体上へ、Ａ領域とＢ領域とＣ領域とからなる外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）（但し、Ａ領域及びＣ領域は、外来遺伝子の切断末端を含む領域を示し、Ｂ領域は外来遺伝子中の両切断の間の任意の重複部分の配列を示す）を組込む方法であって、
１  導入を目的とする外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）のＣ領域を除いた第１の部分配列（Ａ−Ｂ）と、外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）のＡ領域を除いた第２の部分配列（Ｂ−Ｃ）とを、前記ベクター中のａｔｔＰ領域の両側に配置したベクターを得る行程と、
２  これをラクトバチルス・カゼイ菌の染色体へ組込み、形質転換体を得る行程と、
３  しかる後に、相同組換え機構により、前記部位特異的組換え酵素領域と薬剤耐性領域と複製開始領域とを含む不要遺伝子部分が除去された形質転換体を選択する工程と
を備えたことを特徴とする染色体への外来遺伝子の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は宿主染色体への外来遺伝子の導入方法に関するものであり、詳しくは、溶原性のベクターを用いて染色体への外来遺伝子の導入を行う際に、導入の時点では必要であるが外来遺伝子の発現と保持には不要であるベクター由来の不要遺伝子部分を、最終的に除くための導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラスミドを用いて外来遺伝子を宿主細胞内に導入することは大腸菌を始めとして種々の微生物において行われている。宿主細胞内でのより安定な外来遺伝子の特性を得るため、溶原ファージを利用して、外来遺伝子を宿主染色体上に組込む試みも行われている。
【０００３】
本発明者らは、先に、ラクトバチラス・カゼイ（Lactobacillus casei ；以下、「Ｌ．カゼイ」と記す）の溶原ファージφＦＳＷ由来の組み込み機構を応用するＬ．カゼイ菌用ベクターｐＭＳＫ７４２を提案し、これを用いるＬ．カゼイ菌の染色体上への外来遺伝子の組み込み方法を示した（特願平８−１８４２６６号）。
【０００４】
しかし、このＬ．カゼイ菌用ベクターｐＭＳＫ７４２に限らず、溶原ファージを利用した方法では、目的とする外来遺伝子だけでなく、導入後には不要となる遺伝子配列も同時に導入される。例えば、上記Ｌ．カゼイ菌用ベクターでは、組み込み機構の機能に必要である部位特異的組換え酵素（ｉｎｔ）遺伝子領域、組込み体の選択の際に必要である薬剤耐性遺伝子領域、また、大腸菌で機能する複製開始領域などが、同時に宿主染色体上に組み込まれるが、これらの部分は、遺伝子導入後には機能的には不要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これらの遺伝子導入後には機能的に不要になる部分は、その後の形質転換体の利用という観点では障害になる場合もあり、最終的に外来遺伝子以外のベクター等に由来する不要部分を除く方法の開発が課題であった。
【０００６】
本発明者は、このような観点のもと鋭意研究を行った結果、宿主細胞に導入する時点で、溶原ファージを利用したベクターへの外来遺伝子の組み込みを工夫することにより、外来遺伝子以外のベクター等に由来する不要遺伝子を除去することができることを確認して、本発明に至った。
【０００７】
本発明では、外来遺伝子以外のベクター等に由来する不要遺伝子を除去することのできる染色体への外来遺伝子の導入方法を得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明では、溶原ファージの特性を有するベクターを用いて宿主染色体上に外来遺伝子を組込む方法であって、
導入を目的とする外来遺伝子の一方の末端領域が削除された第１の部分配列と、他方の末端領域が削除されて第１の部分配列の一部と重複する領域を持った第２の部分配列とを、溶原ファージの組込み部位（ａｔｔＰ部位）の両側に各々配置したベクターを得て、
このベクターを宿主染色体上に組込んだ後に、第１の部分配列と第２の部分配列との重複する領域の相同組換え機構によりベクターに由来する不要遺伝子部分が除去された形質転換体を選択する方法である。
【０００９】
本発明における溶原ファージの特性を利用したベクターとは、宿主細胞に導入した際に、宿主染色体上に組込まれる機能を有するベクターを指す。即ち、宿主細胞の染色体上の組込み部位（ａｔｔＢ領域）に対して組換えを起こす組込み部位（ａｔｔＰ領域）を有するものであればよい。このようなベクターによって外来遺伝子を宿主染色体に組込んだものは、外来遺伝子と共にベクターに由来する遺伝子をも組み込まれる。
【００１０】
このため、導入を目的とする外来遺伝子の一方の末端領域が削除された第１の部分配列と、他方の末端領域が削除されて第１の部分配列の一部と重複する領域を持った第２の部分配列とを、溶原ファージの組込み部位（ａｔｔＰ部位）の両側に各々配置したベクターを得て、このベクターを宿主染色体上に組込み、相同組換えを促す。
【００１１】
これら第１の部分配列と第２の部分配列とは、共に削除側の配列が重複する領域を備えればよい。この重複する領域については、短ければ組込まれた後の相同組換えの頻度が低下するので、相同組換えによって不要遺伝子が切除されることがない。また、逆に重複する領域を長くして、例えば外来遺伝子の末端領域を切除しないで第１の部分配列及び第２の部分配列を全く同じものとしても、相同組換えは発現する。しかし、外来遺伝子の発現を一種のマーカーにする場合には、ベクターに由来する不要遺伝子部分が除去された形質転換体を選択することができなくなる可能性がある。従って、重複する領域の下限は、相同組換え機構が充分な頻度で行われる長さ以上であればよい。また、重複する領域の長さの上限は相同組換えに関してはないが、外来遺伝子の発現を一種のマーカーにする場合には、末端領域が切除された部分配列で外来遺伝子が発現しない長さ以下であればよい。
【００１２】
また、第１の部分配列及び第２の部分配列の配置の方向については、重複する領域によって相同組換えが行われ、行われた後に、本来の外来遺伝子となるような方向に配置される。即ち、第１及び第２の部分配列の方向を同じ方向にし、尚且、機構溶原ファージの組込み部位（ａｔｔＰ部位）の両側に外来遺伝子のＮ，Ｃ末端部の各々側が組込み部位側になるように配置される。
【００１３】
また、本発明で言う「外来遺伝子」とは、必ずしも導入しようとする宿主菌以外の菌に由来するものを意味するのではなく、同菌種由来のものや、同じ菌株でも例えばプラスミド上の遺伝子を染色体上へ導入することも含まれる。また、複数の蛋白情報の結合体としての遺伝子群であってもよい（例えば、複数のサブユニットからなる酵素全体の遺伝子）。
【００１４】
ベクターに由来する不要遺伝子部分が除去された形質転換体を選択するには、ベクター由来の薬剤耐性形質が失われたことをマーカーにすることもできるが、前述のように、組込みを目的とする外来遺伝子の発現を確認して、これを一種のマーカーにして行うのが、最も簡略である。即ち、本発明の方法においては、ベクターに由来する不要遺伝子が除去された場合とは、外来遺伝子が相同組換えを起こして本来の外来遺伝子の状態になった場合である。従って、外来遺伝子の発現を一種のマーカーにして、選択する。
【００１５】
具体的な本発明としては、Ｌ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ，ｉｎｔ）遺伝子領域及び宿主染色体への組み込み部位（ａｔｔＰ領域）と、乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性遺伝子領域と、大腸菌(Escherichia coli)で機能する複製開始領域と、クローニング部位とを備えたＬ．カゼイ菌用ベクターを用いて、Ｌ．カゼイ菌の染色体上へ、Ａ領域とＢ領域とＣ領域とからなる外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）（但し、Ａ領域及びＣ領域は、外来遺伝子の切断末端を含む領域を示し、Ｂ領域は外来遺伝子中の両切断の間の任意の重複部分の配列を示す）を組込む方法であって、
▲１▼導入を目的とする外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）のＣ領域を除いた第１の部分配列（Ａ−Ｂ）と、外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）のＡ領域を除いた第２の部分配列（Ｂ−Ｃ）とを、前記ベクター中のａｔｔＰ領域の両側に配置したベクターを得る行程と、
▲２▼これをＬ．カゼイ菌の染色体へ組込み、形質転換体を得る行程と、
▲３▼しかる後に、相同組換え機構により、前記部位特異的組換え酵素領域と薬剤耐性領域と複製開始領域とを含む不要遺伝子部分が除去された形質転換体を選択する工程と
を備えた方法があげられる。
【００１６】
尚、本発明の染色体への外来遺伝子の導入方法は、溶原ファージの特性を利用したベクターと宿主菌との組合わせがあれば、如何なる微生物に対しても適用できる方法である。従って、本発明は、後述するＬ．カゼイ菌用ベクターを用いるＬ．カゼイへの外来遺伝子の導入に限ることがないのは言うまでもない。具体的には、ラクトコッカス・ラクチスのφＬＣ３ファージ、ラクトバチルス・ガッセリのφａｄｈファージ、ラクトバチルス・デルブルッキー・subp・ブルガリスのｍｖ４ファージ、エッシェリキア・コリとλファージ、ＨＫ２２ファージ、φ８０ファージ、Ｐ４ファージ、１８６ファージ等との組合わせ、等を利用したベクターで応用が可能である（参照；L.Dupontら，J.Bacteriol.177:586-595(1995) ）。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明者は、溶原ファージの特性を利用したベクター等に由来する外来遺伝子以外の不要遺伝子を除去することのできる染色体への外来遺伝子の導入方法を得るために、鋭意研究を行った結果、導入を目的とする外来遺伝子をベクターに組み込む際に、そのまま組み込むのでなく、外来遺伝子の任意の中間配列の部分が重複するような、２つの部分配列に分割し、これを、ａｔｔＰ配列の両側に組み込むことにより、その後、自然発生的な相同組換え機構により、相当の確率で、Ａ−ＢとＢ−Ｃに挟まれた部分が脱離して、結果としてＡ−Ｂ−Ｃの配列が染色体に組み込まれたものとしての、宿主形質転換体が得られることを確認して、本発明を完成した。
【００１８】
即ち、導入を目的とする外来遺伝子を例えばＡ−Ｂ−Ｃ（この時、ＡおよびＣは切断末端を含む領域を示し、Ｂは中間配列部分の任意の重複部分を示す）としたとき、Ａ−Ｂ−Ｃの部分配列である第１の部分配列Ａ−Ｂと第２の部分配列Ｂ−Ｃ（Ａ−ＢとＢ−Ｃは配列Ｂの部分で重複する部分を有するものである）とを、ベクターのａｔｔＰ領域の両側に配置して宿主の染色体へ形質転換することにより、その後、自然発生的な相同組換え機構により、相当の確率で、Ａ−ＢとＢ−Ｃに挟まれた部分が脱離して、結果としてＡ−Ｂ−Ｃの配列が染色体に組み込まれる。
【００１９】
まず、本発明の方法では、例えば外来遺伝子の導入方法に用いるＬ．カゼイ菌用のベクターは、本発明者による特許出願（特願平８−１８４２６６号）に開示されているものが使用できる。即ち、Ｌ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来のｉｎｔ領域及びａｔｔＰ領域と、乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性遺伝子領域と、大腸菌(Escherichia coli)で機能する複製開始領域と、適当なクローニング部位とを備えたＬ．カゼイ菌用ベクターである。
【００２０】
具体的には、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０１８株由来の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ、ｉｎｔ）領域及び宿主染色体への組み込み部位（ａｔｔＰ領域）と、乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性遺伝子領域と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能する複製開始領域と、クローニング部位とを備えたものである。
【００２１】
さらに詳しくは、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０１８株由来の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ、ｉｎｔ）遺伝子領域及び宿主染色体への組み込み部位（ａｔｔＰ領域）と、エンテロコッカス・フェカリス由来の大腸菌と乳酸菌の両方で機能するエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子と、大腸菌由来の複製開始領域とを備えたことを確認ずみである。
【００２２】
また、導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、後述する実施例においては、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子を使用した。この外来遺伝子を２つの部分配列として、ベクターのａｔｔＰ領域の両側に組み込む方法は、ベクターの有する制限酵素部位を利用して、また、導入しようとする遺伝子の有する制限酵素部位等を検討したうえで任意に設計することができるが、前記一般式において重複するＢ配列部分は、その後の相同組換え機構を誘導するために、十分な長さは必要である（好ましくは２００〜１０００塩基、更に好ましくは４００〜６００塩基程度）。
【００２３】
後述する実施例においては、いったん、ａｔｔＰ領域の両側に、Ａ−Ｂ−Ｃに対応するものとしてのＣｍ耐性遺伝子を導入し、しかる後に、余分な部分を除去することにより、結果として、Ａ−ＢおよびＢ−Ｃの部分配列が目的どおり導入された形になるよう、操作を行ったが、もちろん方法はこの方法に限定されるものではない。
【００２４】
ベクターｐＭＳＫ７４２へ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｃを導入した遺伝子導入用ベクターは、Ｌ．カゼイ菌へ形質転換することにより、染色体への組み込みを行う。ｐＭＳＫ７４２が有するＥｍ耐性遺伝子を指標に、形質転換体の選択を行い、目的どおり染色体への組み込みが行われたものを獲得する。この作出されたベクターには、ｐＭＳＫ７４２由来のｉｎｔ領域や、Ｅｍ耐性遺伝子領域などが含まれたままであり、また、導入を目的としたＣｍ遺伝子も２つに分割されて完全な状態で組み込まれていない。
【００２５】
ここで得られた形質転換体をＥｍ耐性およびＣｍ耐性を指標に継代培養していくと、相当の確率（１０-3）で、Ｃｍ耐性を発現する株が得られ、またこのものは、Ｅｍ感受性（Ｅｍ耐性を失った）となっていた。このものは、導入したＡ−Ｂ部分とＢ−Ｃ部分の間で、相同組換えが起こり、Ａ−ＢとＢ−Ｃの間の部分が除かれたものであり、この確率は、通常のＥｍ耐性株が突然変異によりＥｍ耐性を失う確率より十分に高く、期待した機構により、外来遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃの導入および、ベクター由来の不要部分が除去が行われたものである。
以下実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。
【００２６】
【実施例】
１．材料と方法
(1-1) 使用菌株とプラスミド
Lactobacillus casei YlT9029(FERM BP-1366, φFSW 非溶原菌）はヤクルト中央研究所で保存のものを用いた。Eschirihia coli JM109 は組換えプラスミド作製の宿主として用いた。φFSW 由来の integrase遺伝子と attＰ、大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域ori177、Enterococcus faecalis のプラスミドｐＡＭβ1 由来のＥｍ耐性遺伝子を持つＬ．カゼイ菌用ベクターｐＭＳＫ７４２は特願平８−１８４２６６号で示した。尚、このベクターｐＭＳＫ７４２は、生工研菌寄第１５６９５号として、生命工学研究所に平成０８年０６月２０日付けで寄託されている。Staphylococcus aureus のプラスミドpC194 （S.Horinouchi & B.Weisblum. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J.Bacteriol.150:815-825，1982）は田中暉夫博士より分与された。
【００２７】
(1-2) 培地
YlT9029はＭＲＳ培地(Difco,USA) またはＩＬＳ培地を用いて37℃で好気条件で生育させた（液体培地では静置）。プラスミドpC194 のＣｍ耐性遺伝子によるＣｍ耐性の発現は誘導的なので、Ｃｍ耐性遺伝子保持菌に耐性を発現させるため 0.5μg/mlのＣｍ（Ｃｍ感受性株でもＣｍ耐性株と同様に生育する濃度）を耐性、非耐性にかかわらず常に加えた。必要な場合は20μg/mlのＥｍ（Ｅｍ感受性株は生育できない濃度）または2.5 μg/mlのＣｍ（Ｃｍ感受性株は生育できない濃度）を加えた。E. coli JM109 の生育にはLB培地を用い、必要な場合は500 μg/mlのＥｍを加えた。
【００２８】
(1-3) ＤＮＡの調製と操作及び形質転換法
基本的ＤＮＡ操作は文献（J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis. Molecular cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989）を参照して行い、L. casei YlT9029とE. coli との形質転換法は特願平８−１８４２６６号に記した操作により行った。また、ＰＣＲ反応はToyobo社のK0D polymeraseと、同社buffer shystem #l とを用い、MJ Research 社製ＤＮＡEngine PTC-200を使って、98℃l5秒60℃5 秒74℃30秒を30回繰り返した。使用プライマーは20マー以上のものを適宜合成した。
【００２９】
(1-4) ＤＮＡ塩基配列の決定とその解析
YIT9029形質転換体における染色体構造はＰＣＲ法を用いて調べた。ＰＣＲ産物は、 Pharmacia社製 Micro SpinTM S-400 HRカラムにより精製した。プライマーは、17マー以上のものを適宜合成した。反応はABI PRISMTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PerkinElmer社製) を用い、373S DNA Sequencerによって行った。塩基配列の解析にはソウトウェア開発社製GENETYX ver.9.0 とGENETYX -CD バイオデータベースソフトウエアver.29.0を用いた。
【００３０】
(1-5) 安定性試験
被検菌であるYlT9029 派生体を2.5 μg/mlのＣｍを加えたＩＬＳで一晩培養後の培養液を0.5 μg/mlのＣｍを加えたＩＬＳに10-5希釈し37℃で静置培養後、24時間ごとに0.5 μg/mlのＣｍを加えたＩＬＳに10-3希釈して同様に継代培養を続けた。各希釈時に2.5 μg/mlのＣｍを加えたＩＬＳプレート( 選択プレート) 、および0.5 μg/mlのＣｍを加えたＩＳＬ（非選択プレート）を用いて生菌数を測定した。世代数はlog2（各時生菌数×希釈率/ 初発生菌数）で計算した。
【００３１】
２．外来遺伝子の導入方法の概要
例えば、特願平８−１８４２６６号で報告したYlT9029 のファージφFSW の持つプロファージ組込み用の部位特異的組換え酵素 integraseを用いた染色体組込み型ベクターｐＭＳＫ７４２によって得られた形質転換体は、目的遺伝子に加えて、ベクタープラスミドの大腸菌における増殖用のプラスミドＤＮＡ複製開始領域（異種由来）、組込みの際必要であった選択用Ｅｍ耐性遺伝子（異種由来）、及び integrase遺伝子( 同種由来）を持っている。これら三領域は組込みまでの一連の操作では必要だが目的遺伝子のYlT9029 細胞内での安定的保持には不要と考えられた。そこで、ベクター由来の前述の異種由来の遺伝子領域を取り除くことを目的とした。
【００３２】
染色体上に導入したい目的の外来遺伝子（Ａ−Ｂ−Ｃ）を各々の末端を切除した第１の部分配列（Ａ−Ｂ）と第２の部分配列（Ｂ−Ｃ）とを attＰ領域の両側に配置したベクターを作出し、これを宿主菌となるＬ．カゼイ菌の染色体に組込み後、相同組換えによる不要遺伝子領域の欠失を目的としてプラスミドの作成を試みた。
【００３３】
図１は本発明の染色体への外来遺伝子の導入方法の一実施例の工程の概要を示す説明図である。計画と手順の詳細を図１のａ〜ｄ図と共に説明する。
▲１▼  ａ図に示す通り、ベクタープラスミド上でファージゲノム上の部位特異的組換え領域 attＰの両側に目的遺伝子（群）のＮ末端部を欠損した第２の部分配列（Ｂ−Ｃ）とＣ末端部を欠損した第１の部分配列（Ａ−Ｂ）を同方向に配置し、両欠損遺伝子に対して attＰの反対側に除くべき領域として、Ｅｍ耐性遺伝子（Ｅｍ）、大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域（ｏｒｉ）、および integrase遺伝子（ｉｎｔ）を配置する。
【００３４】
▲２▼  このプラスミドのＤＮＡをYlT9029 の細胞に導入し、 integraseによる attＰと attＢ間の部位特異的組換えによりYlT9029 染色体上へプラスミドが組込まれた株を、Ｅｍ耐性を指標として選択する。ｂ図に示す通り、形質転換体の染色体上では attＬ〜Ｃ末端欠損目的遺伝子（群）（Ａ−Ｂ）〜大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域（ｏｒｉ）〜Ｅｍ耐性遺伝子（Ｅｍ）〜 integrase遺伝子（ｉｎｔ）〜Ｎ末端欠損目的遺伝子（群）（Ｂ−Ｃ）〜 attＲの順に並ぶと期待される。
【００３５】
▲３▼  ２つの欠損目的遺伝子（群）に共通なＢ領域は相同なので、得られた形質転換体の一部では細胞が本来持っている相同組換え機構によって二つのＢ領域に挟まれた部分が欠失する可能性が考えられる（ｃ図）。その場合、欠失体染色体上のＤＮＡ導入部分では、 attＬ〜完全な目的遺伝子（群）（Ａ−Ｂ−Ｃ）〜 attＲの順に並び、欠失体の表現型はＥｍ感受性かつＡＢＣ+ となると考えられる（ｄ図）。すなわち、この欠失体上では異種由来等の不要遺伝子を除くことができる。
【００３６】
３．Ｃｍ耐性遺伝子の組み込み
Ｃｍ耐性遺伝子（ＣＡＴ）をモデル遺伝子（目的遺伝子）とした、後の欠失を期待する組込み型プラスミドを実際に作製した。
【００３７】
YIT9029 染色体上に組込ませる目的遺伝子として、同株および大腸菌における発現と選択性、遺伝子中の制限酵素切断点、遺伝子の長さ等を考慮して、S. aureus のプラスミドpC194 由来のＣｍ耐性遺伝子を選んだ。この構造遺伝子は216 アミノ酸をコードし、Ｎ末端から９アミノ酸相当のところに制限酵素MunI切断点が、Ｃ末端から４２アミノ酸相当のところに制限酵素VspI切断点がある。
【００３８】
図２に従って目的とする組込み型プラスミドを作製した。まず完全なＣｍ遺伝子（ＣＡＴ）を attＰのそれぞれの側に挿入した２種類のプラスミドｐＭＳＫ７５５とｐＭＳＫ７５１とを作出した。
【００３９】
具体的には、ＰＣＲを用いて両末端がBstXI 切断点で構造遺伝子Ｎ末端側の BstXI切断点のすぐ内側にMunI切断点を設けたpC194 のＣｍ耐性遺伝子を含むフラグメントを増幅してBstXI で切断し、ｐＭＳＫ７４２ダイマーＤＮＡのSacI部分分解物と連結してｐＭＳＫ７５３を得た。同様に構造遺伝子Ｎ末端側の末端にNheI切断点、Ｃ末端側の末端にXbaI切断点を設けたpC194 のＣｍ耐性遺伝子を含むフラグメントを増幅して NheI とXbaIで切断し、ｐＭＳＫ７４２ＤＮＡのXbaI完全分解物と連結してｐＭＳＫ７５１を得た。これら２つのプラスミドは、Ｃｍ遺伝子（ＣＡＴ）のほかに、Ｅｍ耐性遺伝子（Ｅｍ）、大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域（ｏｒｉ）、及び integrase遺伝子（ｉｎｔ）を有する。
【００４０】
それぞれのプラスミドを用いてYlT9029 を形質転換したところその頻度は103/μg・ＤＮＡ以上であり、形質転換体においては attＰと attＢを介して各プラスミドが染色体に組込まれていることと、Ｅｍ耐性と同時にＣｍ耐性が発現していることを確認した。即ち、2.5 μ/ml の濃度のＣｍを培地に加えるとＣｍ耐性遺伝子保持株は生育でき親株は生育できなかった。
【００４１】
次にそれぞれのプラスミドｐＭＳＫ７５３及びｐＭＳＫ７５１のＣｍ耐性遺伝子を欠損させた。具体的には、ｐＭＳＫ７５３ＤＮＡのMunI部分分解物と、ｐＭＳＫ７５１ＤＮＡのXbaIとVspI分解産物からそれぞれｐＭＳＫ７６０とｐＭＳＫ７５６を得た。これらのプラスミドのYIT9029 形質転換体はＣｍ2.5 μ/ml 感受性となっていた。
【００４２】
続いてｐＭＳＫ７６０とｐＭＳＫ７５６の両ＤＮＡをBssHIIとScaIでそれぞれ切断し、おのおのの欠損Ｃｍ遺伝子を持つ方のフラグメント同士を選んで連結することにより、目的とするプラスミドｐＭＳＫ７６１を得た。ｐＭＳＫ７６１の構造を図３に示す。二つの欠損遺伝子に共通する相同部分の長さは４９４塩基、 attＰを経由しない側での両欠損Ｃｍ遺伝子の距離は３５４５塩基であった。
【００４３】
４．形質転換体の獲得及びＣｍ発現株の選択
３．で得られたｐＭＳＫ７６１のYlT9029 染色体組込みと不要遺伝子の除去を行った。ｐＭＳＫ７６１を用いてYIT9029 を形質転換したところ、ｐＭＳＫ７５５と変わらぬ頻度でＥｍ耐性形質転換体を得ることができ、すべてＣｍ2.5 μg/mlには感受性であった。
【００４４】
このＥｍ耐性Ｃｍ感受性株を0.5 μg/mlのＣｍ( 非選択的かつ誘導的な濃度) を加えたＭＲＳ培地で約４０世代分裂するように培養した後、Ｃｍ2.5 μg/mlを含む培地で選択すると、10-3の頻度で耐性株が分離された。調べたＣｍ耐性株１６株について全てはＥｍ感受性になっていた。
【００４５】
一方、 欠損Ｃｍ遺伝子を一つしか持たないｐＭＳＫ７５６やｐＭＳＫ７６０の形質転換体からはl0-5の頻度でＣｍ2.5 μg/ml耐性株が分離され、調べた16株について全てはＥｍ耐性のままであった。この10-5の頻度は、YlT9029 におけるＣｍ2.5 μg /ml 自然耐性変異株の分離頻度と変わらない。
【００４６】
これらの結果は、ｐＭＳＫ７６１のＤＮＡが染色体に組込まれた形質転換体の一部では、細胞内の自発的相同組換えが二つの欠損Ｃｍ耐性遺伝子内の相同領域で起き、完全長のＣｍ遺伝子が生じて耐性を発現すると共に、Ｅｍ耐性遺伝子を含む領域が除かれたことを示している。
【００４７】
このことは、得られたＥｍ感受性Ｃｍ耐性株染色体の構造を、ＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列を解析することによっても支持された。すなわち、i) attＬ〜完全長のＣｍ耐性遺伝子〜 attＲの順に並んでいた、ii) 大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域〜Ｅｍ耐性遺伝子〜 integrase遺伝子は存在しなかった、の２点が明かとなった。
【００４８】
４．染色体組込み型形質転換体の安定性
ｐＭＳＫ７６１形質転換体より得られたＥｍ感受性Ｃｍ耐性欠失体（integrase 遺伝子欠失型）２株の表現型の安定度を、非選択培地での継代後の薬剤耐性株の割合を、選択、非選択プレート上でコロニー形成数を測定することにより調べた。その結果、図４に示すようにいずれの組み込み体も導入された薬剤耐性の形質がYIT9029 形質転換体中で約５０世代間１００％保持された。尚、溶原ファージ特性を有しないプラスミドを導入した形質転換株の場合は、約５０世代分裂後の薬剤耐性を示す株は５％程度である。
【００４９】
更に、ｐＭＳＫ７６１形質転換体由来のＥｍ感受性Ｃｍ耐性欠失体の約５０世代分裂後の細胞由来のコロニー１００個づつについて個別の液体培養により検討すると、すべて薬剤耐性を保持していた。以上の結果から、φFSW の integraseによる染色体へ組込みは、目的遺伝子の安定的保持のため非常に有効であることは明白である。この期間においては integrase遺伝子の有無は安定度に影響しなかった。
【００５０】
以上のように、YIT9029 のファージφFSW のintcgrase を利用した染色体組込み型ベクターにおいて、染色体上に導入したい目的遺伝子をベクター上へ挿入する際に構造上の工夫を加えた。その結果、染色体組込み後に細胞内の自発的相同組換えによって、最終育種株から、異種由来のＥｍ耐性遺伝子と大腸菌用プラスミドＤＮＡ複製開始領域、および同種由来の integrase遺伝子を除くことができた。
【００５１】
また、表現型の安定度を調べたところ、この染色体組込み型ベクターを用いたφFSW の integraseによる attＰと attＢの間の部位特異的組み換えによって導入された形質は非選択的条件のもとYIT9029 形質転換体中で少なくとも約５０世代間細胞分裂させても全く安定であった。この期間においては integrase遺伝子の有無は安定度に差は見いだせなかった。
【００５２】
以上のことから、ここで示したφFSW の integraseを利用した染色体組込みと、その後の不要遺伝子の除去は、YIT9029 株における安定で安全、かつ目的遺伝子の種類によっては最終育種株が組換え体でない遺伝子工学的な育種を可能とすることが明かとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、外来遺伝子以外のベクター等に由来する不要遺伝子を除去することのできる染色体への外来遺伝子の導入方法を得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の染色体への外来遺伝子の導入方法の一実施例の工程の概要を示す説明図である。
【図２】プラスミドｐＭＳＫ７４２からのプラスミドｐＭＳＫ７６１の作成経路を示す説明図である。
【図３】図２で得られたプラスミドｐＭＳＫ７６１の構造を示す説明図である。
【図４】ｐＭＳＫ７６１形質転換により得られた染色体組込み型形質転換体の安定性試験の結果を示す線図である。縦軸は薬剤耐性株の割合、横軸は世代数を示す。
【図１】
0003677125.tif 000002
【図２】
0003677125.tif 000003
【図３】
0003677125.tif 000004
【図４】
0003677125.tif 000005