(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ−蛋白連関受容体のアゴニストによる活性化を定量するアッセイ方法であって、蛍光イメージングプレートリーダーの使用に基づき、
（ａ）薬物抵抗性マーカーから選択され、HEK293-G α15から選択される少なくとも１種の適当な選択因子を有する細胞系を発生させ、この場合、上記細胞系はＧ α15から選択される乱交雑Ｇ蛋白を発現させ、ついで選択されたＧ−連関受容体をコードするcDNAを上記細胞系にトランスフェクトすることにより上記細胞系中に上記Ｇ−連関受容体を共発現させ、
（ｂ）共発現した細胞を適当なメジウム中で増殖させ、
（ｃ）上記細胞をほぼ１日プレーティングし、
（ｄ）プレーティングされた細胞に、この目的に適量の蛍光染料を負荷し、
（ｅ）染料負荷細胞を、ほぼ室温から約３７℃までの温度で適切な期間インキュベートし、
（ｆ）プレートを適切な緩衝液で洗浄して過剰の染料を除去し、除去された緩衝液の容量を同様の容量の新鮮な緩衝液で置換し、
（ｇ）約３０℃〜約３７℃でインキュベートし、
（ｈ）約３０℃〜約３７℃の一定の温度条件下にアゴニストを添加し、
（ｉ）約３０℃〜約３７℃の一定の温度条件下に、蛍光イメージングプレートリーダー内で蛍光の発光を測定し、それにより、選択された受容体の活性化レベルをアゴニスト化合物により定量することからなる、上記の方法。
【請求項２】
Ｇ−連関受容体はドーパミンまたはヒスタミン受容体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｇ−連関受容体はD2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A、および5HT2A受容体からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｇ−連関受容体はドーパミンD3受容体である請求項１記載の方法。
【請求項５】
薬物抵抗性マーカーから選択される選択因子はピューロマイシン−抵抗性マーカーである請求項１記載の方法。
【請求項６】
薬物抵抗性マーカーから選択される選択因子はブラストシジン−抵抗性マーカーである請求項１記載の方法。
【請求項７】
蛍光染料はFluo-3（登録商標）またはFluo-4（登録商標）である請求項１記載の方法。
【請求項８】
プレーティングされた細胞は約１２,０００〜約３０,０００細胞／cm2の密度を有する請求項１記載の方法。
【請求項９】
インキュベーション工程（ｅ）は約１時間行う請求項１記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーション工程（ｇ）は約１５分〜約６０分間行う請求項１記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーション工程（ｇ）は約３０分間行う請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、ある種のアゴニスト活性化受容体の新規な、高スループットの機能性アッセイに関する。
【０００２】
【発明の背景】
本発明のアッセイはある種の神経受容体、たとえばα2A、H1、5HT1A、5HT2A、D2およびD3受容体の活性化に関連する広範多様な疾患の治療に効果的な化合物を選択するのに有用である。このような受容体の機能をモジュレートする分子は様々な精神疾患に対してする潜在的な治療剤である。このような分子の発見にはリガンド結合アッセイが用いられたが、受容体リガンドとしてのそれらの機能性を決定するためのアッセイの方が時にはより多くの情報を提供する。これらの受容体の活性化に関する高スループットな機能的アッセイの開発が望まれてきた。
【０００３】
本発明のアッセイ方法は、このような受容体のアゴニスト活性化を測定するために高い温度とこれに組合わされた蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR364）を使用する。たとえば、本発明は、D3ドーパミン受容体、Ｇ−蛋白のGi／Goサブタイプを活性化し、辺縁系領域たとえば中隔および扁桃において優先的に発現し、認識、動機付けおよび情緒の調節に重要であると考えられるＧ蛋白共役受容体（GPCR）の改良されたアッセイ方法に関する。D3受容体は、本発明の方法によってアッセイされる他の受容体と同様に、サイクリックAMPの産生、有糸分裂誘発およびc-fos発現を含む数種のシグナリング経路に共役していることが示されている。これらのシグナルのアッセイには、このような受容体リガンドの機能の定量が使用されてきたが、これらのアッセイのスループットは限られている。蛍光イメージングプレートリーダーシステム（FLIPR）と組合わされた、乱交雑（promiscuous）、キメラＧ蛋白の使用は、受容体活性化の測定を使用でき単一プラットフォーム機能性アッセイの開発を可能にするものである。したがって本発明は、特定の受容体および乱交雑Ｇ蛋白の両者を安定に発現する細胞系、たとえばこのようなリガンドの機能性を定量するために、HEL293-Gα15細胞系およびFLIPR384測定システムの両者を安定に発現する細胞系を用いてD3受容体を含むある種の受容体のための一般的な新規機能性アッセイを提供する。従来のFLIPR法と異なり、本発明によって提供されるアッセイ方法は、受容体の温度依存性アゴニスト誘導活性化によるものであり、従来のアッセイ方法に比較してシグナルの有意な増強を提供する。
【０００４】
【発明の開示】
したがって本発明は、Ｇ−蛋白連関受容体たとえば神経受容体のアゴニスト化合物による活性化を定量するアッセイ方法であって、上記方法は蛍光イメージングプレートリーダーの使用に基づき、
（ａ）薬物抵抗性マーカーから選択され、HEK293-G α15から選択される少なくとも１種の適当な選択因子を有する細胞系を発生させ、この場合、上記細胞系はＧ α15から選択される乱交雑Ｇ蛋白を発現させ、ついで選択されたＧ−連関受容体をコードするcDNAを上記細胞系にトランスフェクトすることにより上記細胞系中に上記Ｇ−連関受容体を共発現させ、
（ｂ）共発現した細胞を適当なメジウム中で増殖させ、
（ｃ）上記細胞をほぼ１日プレーティングし、
（ｄ）プレーティングされた細胞に、この目的に適量の蛍光染料を負荷し、
（ｅ）染料負荷細胞を、ほぼ室温から約３７℃までの温度で適切な期間インキュベートし、
（ｆ）プレートを適切な緩衝液で洗浄して過剰の染料を除去し、除去された緩衝液の容量を同様の容量の新鮮な緩衝液で置換し、
（ｇ）約３０℃〜約３７℃でインキュベートし、
（ｈ）約３０℃〜約３７℃の一定の温度条件下にアゴニストを添加し、
（ｉ）約３０℃〜約３７℃の一定の温度条件下に、蛍光イメージングプレートリーダー内で蛍光の発光を測定し、それにより、選択された受容体の活性化レベルをアゴニスト化合物により定量することからなる方法を提供する。
【０００５】
本発明の一実施態様においては、Ｇ−連関受容体はドーパミンまたはヒスタミン受容体である。他の実施態様においては、Ｇ−連関受容体はD2、D3、α1A、α2A、M1、H1、5HT1A、および5HT2A受容体からなる群より選択される。他の実施態様においては、上記Ｇ−連関受容体はドーパミンD3受容体である。
【０００６】
本発明の他の実施態様においては、薬物抵抗性マーカーから選択される選択因はピューロマイシン−抵抗性マーカーである。さらに本発明の他の実施態様においては、薬物抵抗性マーカーから選択される選択因子はブラストシジン-抵抗性マーカーである。
【０００７】
本発明の実施に使用される好ましい蛍光染料はFluo-3（登録商標）またはFluo-4（登録商標）である。好ましくは、プレーティングされた細胞は約12,000〜約30,000細胞／cm2の密度を有する。
【０００８】
本発明の他の実施態様においては、インキュベーション工程（ｇ）は約１５分〜約６０分間行われ。好ましくは、上記インキュベーション工程（ｇ）は約３０分間行われる。
【０００９】
添付図面において：
図１は、ドーパミンD3受容体のアゴニスト依存性活性化に対する温度の影響を示す。
図２はD3−特異的アンタゴニスト、GR218231によるドーパミン依存性の細胞内カルシウム放出の３７℃および２５℃（挿入図）におけるアンタゴニズムを示す。細胞内貯蔵部からのドーパミン誘導Ca2+放出はFLIPRでモニターした。
図３は[35S]-GTPγS結合アッセイによって測定したD3受容体仲介Ｇ蛋白活性化のアゴニスト刺激を示す。実験は示されたように２５℃、３０℃、および３７℃で実施した。各温度における受容体の密度（Bmax）を示す。
図４にはFLIPRによって測定したヒスタミンH1、5HT1A、5HT2A、ドーパミンD2、α−アドレナリン1A、α−アドレナリン2AおよびムスカリンM1受容体のアゴニスト依存性活性化に対する温度の影響を示す。結果は３７℃および２５℃における測定について示す。
【００１０】
【発明の詳述】
添付の図面に例示されるように、本発明は受容体および乱交雑Ｇ蛋白Ｇ α15の両者を安定に発現する細胞系を用いるか、または細胞内に存在するＧ蛋白サブユニットを使用するアッセイ方法を提供する。アゴニスト誘導細胞内Ca2+の放出は蛍光イメージングプレートリーダーの使用によりモニターした。アッセイを２５℃で実施する従来のFLIPR−ベースのアッセイ方法とは対照的に、アゴニスト誘導応答の大きさは、アッセイをより高い温度、好ましくは３７℃で行うことにより劇的に増強された。FLIPRアッセイで定量したアゴニスト活性化のEC50は他の機能性受容体アッセイで定量した結果よりも高くが、アンタゴニストによる阻害の機能性Kiは同様である。[35S]-GTPγS結合アッセイ、他の機能性アッセイにおいては、受容体のアゴニスト誘導活性化も温度の上昇により増強された。上昇させた温度は、この方法が適用された受容体のBmax には影響せず、また受容体発現細胞内でイオノフォアおよび内因性プリン受容体により誘導される細胞内Ca2+の放出には影響しない。
【００１１】
特定の受容体を活性化する薬理学的に有用な化合物は、本発明のアッセイ方法を用いて見出すことができるであろう。本発明のアッセイ方法を用いて選択される化合物の薬理学的な用途には、たとえば、このような化合物のドーパミン受容体を活性化する能力によって同定されるヒト対象における不安、うつ状態および他の精神状態の症状における緩和がある。
【００１２】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって例示するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００１３】
実施例
FLIPR384を用いるHEK細胞についてのD3プロトコール
細胞系の説明
Ｇ α15を安定的に発現するHEK293-G α15.D3 細胞系は、Ｇαを発現するHEK293細胞系にD3 cDNAをトランスフェクトすることにより発生させた。D3受容体の発現は選択因子たとえばピューロマイシンおよびブラストシジンの存在下に維持される。この細胞系は典型的な組織培養処理フラスコにわずかにしか付着しない。強力に付着する表現型は、細胞をMatrigel（Becton Dickinson, 血清を含まないDMEMで１：200に希釈）でコーティングしたフラスコ上で増殖させる。
【００１４】
細胞の負荷は次のように行われる。
（ａ）３８４ウエルプレート中５０μL／ウエルに20,000個の細胞またはポリＤリジンでコーティングした９６ウエルプレート中60,000細胞／ウエルをプレーティングする。プレートを３７℃のインキュベーター中に戻す。
（ｂ）１６〜２４時間後に増殖メジウムを除去し、ついで増殖メジウムをカルシウム感受性蛍光染料、fluo-4（４μM）および活性トランスポート阻害剤、プロベネシド（2.5mM）の存在下に血清を含まないメジウムで置換し、
（ｃ）プレートを３７℃で１時間インキュベートし、
（ｄ）メジウムを吸引し、プレートを緩衝液（３回、プロベネシド2.5mMを含むHEPES−緩衝食塩水）で洗浄して過剰の染料を除去し、
（ｅ）プレートを３７℃で１５〜４５分間インキュベートし、
（ｆ）３７℃のインキュベーター内で１５分間、薬物を負荷したプレートを予熱し、
（ｇ）アッセイをFLIPR中にセットアップし、蛍光レベルを９０秒の期間にわたって連続的にモニターする。
【００１５】
アゴニスト／アンタゴニストの添加（15μL容量）はベースラインの記録２０秒後に９６または３８４ウエルのすべてに同時に実施した。アンタゴニストによる前処理時間は１５分とした。
【００１６】
方法
FLIPRアッセイ
Ｄ３受容体を安定に発現するHEK293-Gα15細胞系を、FLIPR−ベースの方法を用いるCa2+−ベースのアッセイを開発するために用いた。アッセイの前に、細胞をポリ−ＤリジンでコーティングしたFLIPRプレート中に１６〜２４時間プレーティングした。細胞に細胞染料−メジウム溶液（メジウム−11mL, 染料−４μM Fluo-4 AM, プルロニック（登録商標）酸−22μL, プロベネシド−260mM溶液110μL）を１時間３７℃において負荷した。アッセイ緩衝液（NaCl−0.145M, グルコース−0.01M, KCl−0.005M, MgSO4−0.001M, HEPES−0.01MおよびCaCl2 0.002M）により、Skatron Embla（登録商標）プレート洗浄器中でプレートを洗浄し、実験開始前にそれぞれ２５℃および３７℃で３０分間安定化させた。アンタゴニストはアゴニスト添加前１５分に加えた。蛍光の強度は、それぞれ４８８nmおよび５２０nmの励起および発光波長を用いて測定した。データは４回の反復実験の測定値の平均±S.D.として示した。
【００１７】
GTPγS結合アッセイ
ヒトD3受容体を発現しているCHO細胞を、T175フラスコ中DMEMおよび１０％ウシ胎児血清を含有するメジウムで培養した。細胞を２０mM Hepes／１０mM EDTAでフラスコから脱着し、22 1/2ゲージの針で破壊した。４０,０００×ｇで遠心分離したのち、膜を２０mM Hepes／０.１mM EDTAに再懸濁し、再び遠心分離した。膜をアッセイ緩衝液（20mM Hepes, 100mM NaCl, 10mM MgCl2）に再懸濁し、氷上で１０分間１μM GDPとインキュベートした。試験化合物を次のようにアッセイした。すなわち、膜および試験化合物を２５℃、３０℃および３７℃で２０分間プレインキュベートし、ついで氷上で１５分間インキュベートした。非特異的結合を定義するため、一部のウエルに１０μMのGTPγSを加えた。反応を開始させるために、[35S]-GTPγSを最終濃度０.１nMで加えた。アッセイプレートを２５℃、３０℃および３７℃で３０分間インキュベートした。ついで、小麦胚芽アグルチニン（WGA）SPAビーズをアッセイに添加し（１mg／ウエル）、アッセイプレートをプラットフォーム上室温で３０分間振盪した。プレートをテーブルトップ遠心分離器で５分間回転させ、Wallac Microbetaカウンターでカウントした。データは４重の測定値の平均±S.D.として示した。
【００１８】
D3 FLIPRアッセイのためのアッセイ緩衝液
HEPES食塩水緩衝液は、化合物希釈液の作成およびプレートの洗浄に使用し、
0003676774.tif 000002
を含有する。
【００１９】
「Fluo-3またはFluo-4, AM染料」は、５０μgのバイアル中２２μLのDMSOを溶解して調製する。
【００２０】
「細胞メジウム溶液」 細胞は染料負荷のためにこの溶液とインキュベートした。
血清を含まないDMEM                11mL
染料溶液                           0.022mL
２％プロニック（登録商標）酸       0.022mL
プロベネシド溶液                   0.110mL
【００２１】
放射性リガンド結合アッセイ
D3受容体を発現しているCHO細胞を、２０mLのアッセイ緩衝液（50mM Tris, 120mL NaCl, ５mM KCl, ２mM CaCl2, ５mM MgSO4, pH 7.4）中ポリトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートを４℃、20,000RPMで１０分間ずつ２回遠心分離した。ペレットをアッセイ緩衝液中５.０mg／mLの濃度に再懸濁した。スキャチャード分析を、最終容量２５０μL中様々な濃度の [3H] 7-OH-DPATでセットアップした。プレートを２５℃で６０分間、３０℃で３０分間および３７℃で１５分間インキュベートした。GF／Bフィルター（予め0.5％PEI中に２時間浸漬し、乾燥した）を通して氷冷５０mM Tris緩衝液pH ７.４によりSkatronハーベスター中に急速にろ過して反応を停止させた。フィルターをβカウンター中、Betaplate Scintを用いてカウントした。
【００２２】
結果
D3アゴニスト刺激細胞内Ca2+応答は温度感受性である：FLIPRアッセイ
図１は、D3受容体を安定に発現しているHEK293-Gα15細胞系から放出されたアゴニスト刺激細胞内Ca2+の放出を示す。アッセイは示された濃度のドーパミンおよび7-OH-DPATの存在下に実施し、アゴニスト誘導Ca2+放出をFLIPRで定量した。
【００２３】
３７℃では、２５℃の場合に比較して、蛍光シグナルに劇的な温度依存性の上昇が認められる。7-OH-DPATは選択的なD3アゴニストであるから、このアゴニスト仲介応答はD3受容体特異的である。アッセイは迅速で、再現性があり、高感度であり、したがって、D3アゴニストを検出するスループットの高いスクリーニングに有用である。
【００２４】
図２は、FLIPRによってモニターしたドーパミン誘導Ca2+の放出に対するD3特異的アンタゴニスト、GR 218231の作用を示す。３７℃および２５℃（挿入図）において１００nMのドーパミンを添加する前に、D3受容体を安定に発現しているHEK293-G α15細胞系を、指示された濃度のGR218231と１５分間プレインキュベートした。ドーパミン誘導FLIPR応答はD3によって仲介される。両温度で類似の機能性IC50値が観察され、温度の上昇はアンタゴニストの結合に影響しないことが示唆される。GR218231の機能性Kiは文献記載の値に類似し、このアッセイはD3アンタゴニストの機能性Kiの定量に使用できることが示唆される。
【００２５】
D3受容体アゴニストによるＧ−蛋白の活性化：[35S]-GTPγS結合アッセイ
図３はD3受容体のアゴニスト仲介活性化の温度依存性作用が、[35S]-GTPγSアッセイ、他のD3機能性アッセイでも認められることを示す。Ｇ−蛋白に結合する[35S]-GTPγSの量はアゴニスト活性化の測定値である。各温度におけるD3結合部位のBmaxを挿入図に表にした。FLIPRにおける観察に類似し、アゴニスト誘導シグナルは上昇させた温度における方が高かったが、作用はそれほど顕著ではない。上昇させた温度は、膜プレパレーションにおけるD3のBmaxには影響しないように思われる。
【００２６】
アゴニストEC50およびアゴニスト機能性Kiの要約
表１には、様々な温度においてFLIPRおよび [35S]-GTPγSアッセイにより定量されたアゴニストおよびアンタゴニスト値の比較を示す。FLIPR対GTPγSアッセイにおけるドーパミンのEC50には１０倍の上昇が認められ、これは用いた２種の異なる細胞系の機能であると思われる。GTPγSアッセイに用いたCHO-D3細胞系は内因性Ｇ蛋白を利用するが、FLIPRアッセイで用いられたHEK293細胞系はGα15を利用する。２つのアッセイで定量されたアンタゴニストの機能性Ki値は類似し、FLIPRアッセイがD3アンタゴニストの機能性Kiの測定に使用できることが示唆される。
【００２７】
【表１】
0003676774.tif 000003
【００２８】
温度依存性細胞内カルシウムの放出は多くのGPCRで観察値される
表２はD3Gα15細胞においてFLIPRアッセイによって測定される細胞内Ca2+の放出を示す。EC50またはそれ以上の濃度を使用した。ドーパミン（100nM）、ATP（12.5mM）、イオノマイシン（10mM）。３７℃での５分および１５分のプレインキュベーションにおけるFLIPRシグナルの上昇（百分率）を示す。
【００２９】
【表２】
0003676774.tif 000004
【００３０】
高められた温度においてD3アゴニストによるアゴニスト応答は上昇するが、ATP（内因性プリン受容体を介して）およびイオノマイシン（イオノフォア）により誘導される応答は３７℃での長期間のプレインキュベーションによって影響されなかった。上述の結果は、Ｇ−蛋白共役受容体（GPCR）の温度依存性活性化がD3については認められるが、プリン受容体では認められず、Ca2+の細胞内放出は温度の上昇によって影響されなかった。理論に拘泥するわけではないが、アゴニスト応答の増強はＧ−蛋白へのD3受容体のカップリングに関連し、多くのGPCR活性化の一般的機構として拡張されるものと考えられる。
【００３１】
図４（Ａ〜Ｈ）は、様々なGPCR、すなわちα−アドレナリン1A、α−アドレナリン2A、ヒスタミンH1、5HT1A、5HT2A、ドーパミンD2およびムスカリンM1に対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。このGPCRのサブセット内では、アゴニスト依存性応答の大きさは、これらのGPCRの大部分（＞７０％）について高められた温度で上昇した。これらの受容体のすべては、細胞（GqまたはGi）内に存在するＧ蛋白サブユニットを介する細胞内Ca2+の放出を活性化する。これらのデータは上に同定された現象が多くのGPCRで観察され、温度を上昇させたアッセイの実施はアゴニスト−依存性応答のよりよい検出を可能にする証拠を提供するものである。
【００３２】
したがって本発明は、様々な受容体についてFLIPR−ベースの、新規な、迅速な、再現性のある機能性アッセイを提供する。細胞内カルシウム放出（FLIPR）およびGPCR活性化（GTPγS結合）を測定する機能性アッセイでは、２５℃の場合に比べて３７℃におけるシグナルの上昇が証明される。両機能性アッセイで得られるアンタゴニストの機能性Ki値は温度の上昇によって影響されない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ドーパミン依存性活性化（蛍光強度）に対する温度の影響を示す。
【図１Ｂ】  7-OH-DPAT依存性活性化（蛍光強度）に対する温度の影響を示す。
【図２】  D3−特異的アンタゴニスト、GR218231によるドーパミン依存性の細胞内カルシウム放出の３７℃および２５℃（挿入図）におけるアンタゴニズムを示す。細胞内貯蔵部からのドーパミン誘導Ca2+放出はFLIPRでモニターした。
【図３】  [35S]-GTPγS結合アッセイによって測定したD3受容体仲介Ｇ蛋白活性化のアゴニスト刺激を示す。実験は指示したように２５℃、３０℃、および３７℃で実施した。挿入図は各温度における受容体の密度（Bmax）を示す。
【図４Ａ】α−アドレナリン1Aに対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｂ】α−アドレナリン2Aに対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｃ】ヒスタミンH1に対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｄ】  5HT1Aに対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｅ】  5HT2Aに対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｆ】ドーパミンD2に対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｇ】ムスカリンM1に対するFLIPRにおけるアゴニスト依存性活性化を示す。
【図４Ｈ】４Ａ〜４Ｇの結果のEC50値ならびに蛍光測定値を示す。
【図１Ａ】
0003676774.tif 000005
【図１Ｂ】
0003676774.tif 000006
【図２】
0003676774.tif 000007
【図３】
0003676774.tif 000008
【図４Ａ】
0003676774.tif 000009
【図４Ｂ】
0003676774.tif 000010
【図４Ｃ】
0003676774.tif 000011
【図４Ｄ】
0003676774.tif 000012
【図４Ｅ】
0003676774.tif 000013
【図４Ｆ】
0003676774.tif 000014
【図４Ｇ】
0003676774.tif 000015
【図４Ｈ】
0003676774.tif 000016