(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化１に示すアミノ酸配列において、酵素活性を保持する範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列を有する組換え型マルトース・トレハロース変換酵素（但し、部分アミノ酸配列として、セリン−トレオニン−バリン−ロイシン−グリシン−グルタミン酸−グルタミン酸−プロリン−グルタミン酸−トリプトファン−フェニルアラニン−アルギニン−トレオニン−アラニン−バリン−フェニルアラニン−チロシン−グルタミン酸を有するものを除く）。
【化１】
0003650632.tif 000016
【請求項２】
化１に示すアミノ酸配列を有するマルトース・トレハロース変換酵素又は請求項１に記載の組換え型マルトース・トレハロース変換酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記の化２に示す塩基配列又はコードする酵素の活性を保持する範囲で化２の塩基配列における塩基の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加した塩基配列若しくはそれらに相補的な塩基配列を有する請求項２に記載のＤＮＡ。
【化２】
0003650632.tif 000017
【請求項４】
遺伝子コードの縮重に基づき、化１のアミノ酸配列を変えることなく、化２の塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項２又は３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
ピメロバクター属の微生物に由来する請求項２乃至４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２乃至５のいずれかに記載のＤＮＡと、自律増殖可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項７】
自律増殖可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）である請求項６に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項９】
宿主が大腸菌である請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取してなる組換え型マルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
【請求項１１】
培養物中の組換え型マルトース・トレハロース変換酵素を遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項１０に記載の組換え型マルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、マルトースをトレハロースに変換する新規な組換え型酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなかった。
【０００３】
これまでの製造方法は、主として微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにもみられるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、培養物中に含まれるトレハロースが高々１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者らがマルトースを直接トレハロースに変換する酵素につき鋭意検索したところ、特願平５−１９９９７１号明細書に開示したように、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８を始めとする種々の微生物がマルトースに作用してトレハロースを生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することを見出した。このことは、大量且つ廉価に入手し得るマルトースを原料にトレハロースが製造できることを意味しており、斯かる酵素を利用することにより、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、上記微生物は酵素の産生能が充分でなく、トレハロースを大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、マルトースに作用してトレハロースを生成する酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、マルトースに作用してトレハロースを生成する酵素を創製することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、その創製された組換え型酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００９】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
【００１０】
この発明のさらに別の目的は、斯かる形質転換体を利用した組換え型酵素の製造方法を提供することにある。
【００１１】
この発明のさらに別の目的は、組換え型酵素により、マルトースをトレハロースに変換する方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、下記の理化学的性質を有する組換え型酵素により解決するものである。
（１）  作用
マルトースに作用させると、トレハロースを生成する。
トレハロースに作用させると、マルトースを生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量値約５７，０００乃至６７，０００ダルトンを示す。
（３）  等電点
等電点電気泳動法により測定すると、約４．１乃至５．１に等電点を示す。
【００１３】
この発明は、前記第二の課題を、斯かる組換え型酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１４】
この発明は、前記第三の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１５】
この発明は、前記第四の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１６】
この発明は、前記第五の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取してなる組換え型酵素の製造方法により解決するものである。
【００１７】
この発明は、前記第六の課題を、マルトースに上記組換え型酵素を作用させてトレハロースを生成させる工程を含んでなるマルトースの酵素的変換方法により解決するものである。
【００１８】
【作用】
この発明の組換え型酵素は、マルトースに作用させると、トレハロースを生成する。
【００１９】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、得られる組換えＤＮＡを、通常、この発明の組換え型酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させ得る適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、この発明の組換え型酵素の産生を発現する。
【００２０】
この発明の組換えＤＮＡは、通常、この発明の組換え型酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させ得る適宜宿主に導入して形質転換体とし、この形質転換体を培養することにより、この発明の組換え型酵素の産生を発現する。
【００２１】
この発明の形質転換体は、培養すると、この発明の組換え型酵素を産生する。
【００２２】
この発明の組換え型酵素は、この発明の製造方法により、比較的容易に所望量を製造することができる。
【００２３】
この発明の酵素的変換方法により、マルトースを比較的容易にトレハロースに変換することができる。
【００２４】
次に、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８が産生する酵素の理化学的性質を解明すべく行った実験について説明する。
【００２５】
【実験例１  精製酵素の調製】
【００２６】
【実験例１−１  酵素の産生】
５００ｍｌ容フラスコに２．０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二カリウム、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．２）を１００ｍｌずつとり、１１５℃で３０分間加熱して滅菌し、冷却後、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８を植菌し、２７℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。次に、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の新鮮な培地を２０ｌずつとり、同様に滅菌し、２７℃まで冷却後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）ずつ植菌し、培地のｐＨを６．０乃至８．０に保ちつつ、２７℃で約４０時間通気攪拌培養した。
【００２７】
培養終了後、培養物の酵素活性を測定したところ、約０．５５単位／ｍｌの酵素が産生していた。培養物の一部をとり、遠心分離して上清を回収し、酵素活性を測定したところ、約０．０５単位／ｍｌの酵素活性が認められた。さらに、分離した菌体に５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えてもとの培養物と同液量にした後、酵素活性を測定したところ、約０．５単位／ｍｌの酵素活性が認められた。
【００２８】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトースを２０％（ｗ／ｖ）含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍｌとり、適宜濃度に希釈した酵素液を１ｍｌ加え、２５℃で６０分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）で反応物を１１倍希釈し、その希釈した反応物を０．４ｍｌとり、これにトレハラーゼを１単位／ｍｌ含む溶液を０．１ｍｌ加え、４５℃で１２０分間インキュベート後、反応物中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。同時に、１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素液とトレハラーゼ液を用いる系を設け、上記と同様に処置して対照とする。このようにして求めたグルコース量から反応により生成したトレハロースの量を推定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義する。
【００２９】
【実験例１−２  酵素の精製】
実験例１−１で調製した培養物を遠心分離し、得られた菌体（湿重量約０．５ｋｇ）を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浮遊させ、常法により破砕後、遠心分離して粗酵素液約４．５ｌを得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるように加え、４℃で４時間静置して塩析した後、遠心分離して上清を採取した。この上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え、４℃で一夜静置後、遠心分離により沈澱部を採取し、少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析した。透析内液を遠心分離して採取した上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．４Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離して上清を採取した。この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、１Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『モノＱ  ＨＲ５／５』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液より酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素の比活性は約１７単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約４６単位であった。
【００３０】
常法により、この精製酵素を７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動したところ、ゲル上には酵素活性を伴う実質的に単一のバンドが観察され、精製酵素が極めて高純度であることが窺われた。
【００３１】
【実験例２  酵素の理化学的性質】
【００３２】
【実験例２−１  作用】
基質としてマルトース又はトレハロースを５％（ｗ／ｖ）含む水溶液に実験例１−２で調製した精製酵素を基質固形分１グラム当たり２単位加え、２０℃、ｐＨ７．０で２４時間インキュベートした。反応物の糖組成を調べるべく、反応物を真空乾燥し、ピリジンに溶解し、常法によりトリメチルシリル化後、ガスクロマトグラフィーに供した。ガスクロマトグラフ装置は島津製作所製『ＧＣ−１６Ａ型』を、カラムはステンレス製円筒管（内径３ｍｍ、長さ２ｍ）に充填したジー・エル・サイエンス製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を、検出器は水素炎イオン方式のものを、そして、キャリアーガスに窒素ガス（流量４０ｍｌ／分）を使用し、カラムオーブン温度を１６０乃至３２０℃（昇温速度７．５℃／分）に設定した。下記の表１に反応物の糖組成を示す。
【００３３】
【表１】
0003650632.tif 000002
【００３４】
表１に見られるように、精製酵素は、マルトースを基質にすると、トレハロースとグルコースをそれぞれ約７３％又は約５％生成し、一方、トレハロースを基質にすると、マルトースとグルコースをそれぞれを約１７％又は約３％生成した。これらの事実は、精製酵素にマルトース及びトレハロースをそれぞれトレハロース又はマルトースに変換する作用のあること、さらには、僅かながら、マルトース分子中のα−１，４結合やトレハロース分子中のα，α−１，１結合を加水分解する作用のあることを示唆している。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規な作用機序を辿るものと推定される。
【００３５】
【実験例２−２  分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、精製酵素は、分子量約５７，０００乃至６７，０００ダルトンに相当する位置に酵素活性を伴う実質的に単一なバンドを示した。なお、このときの分子量マーカーは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００３６】
【実験例２−３  等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、精製酵素は約４．１乃至５．１に等電点を示した。
【００３７】
【実験例２−４  至適温度】
常法により、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間反応させる条件で試験したところ、図１に示すように、精製酵素は２０℃付近に至適温度を示した。
【００３８】
【実験例２−５  至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する１０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で６０分間反応させる条件で試験したところ、図２に示すように、精製酵素はｐＨ７．０乃至８．０付近に至適ｐＨを示した。
【００３９】
【実験例２−６  熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３に示すように、精製酵素は３０℃付近まで安定であった。
【００４０】
【実験例２−７  ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図４に示すように、精製酵素はｐＨ６．０乃至９．０付近まで安定であった。
【００４１】
【実験例２−８  Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、パーキン・エルマー製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４２】
【実験例２−９  部分アミノ酸配列】
実験例１で調製した精製酵素を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２８％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約４６分後に溶出したペプチド断片を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片は配列表における配列番号２に示す部分アミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４３】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成５年６月３日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『微工研条寄４３１５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１５）』で寄託されている。同じ特許出願人による特願平５−１９９９７１号明細書には、本微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００４４】
そこで、本発明者が、実験例２−８及び実験例２−９で明らかにしたＮ末端アミノ酸配列及び部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８の染色体ＤＮＡを鋭意検索したところ、下記の化３に示す５´末端からの塩基配列を有する約１，７００塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、同微生物が産生する酵素は５６８個のアミノ酸からなり、下記の化４に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４５】
【化３】
0003650632.tif 000003
【００４６】
【化４】
0003650632.tif 000004
【００４７】
化３及び化４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１）  供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。一方、その精製酵素をプロテアーゼで部分加水分解し、加水分解物からペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２）  別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分消化し、消化物から約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３）  大腸菌にこの組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４）  形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００４８】
次の実験例３及び４では、上記（２）乃至（４）を具体的に説明するが、これら実験例で用いる手法自体は斯界において慣用のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００４９】
【実験例３】
ピメロバクター・スピーシーズＲ４８由来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製
【００５０】
【実験例３−１  染色体ＤＮＡの調製】
ピメロバクター・スピーシーズＲ４８をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、冷却後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５１】
【実験例３−２  組換えＤＮＡ  ｐＢＲＭ８と形質転換体ＢＲＭ８の調製】
実験例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ  ３Ａを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分消化した後、蔗糖密度勾配超遠心法により消化物から約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）を１μｇとり、制限酵素Ｂａｍ  ＨＩにより完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４  ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置してＤＮＡ断片に連結した。得られた組換えＤＮＡに同上製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で一時間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５２】
このようにして得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを５０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された約６，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定した。別途、実験例２−８で明らかにしたＮ末端アミノ酸配列における第６乃至１１番目のＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅで表わされる配列に基づき下記の化５に示す塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体32Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換株のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した５種類の形質転換体を選択した。
【００５３】
【化５】
0003650632.tif 000005
【００５４】
常法により、これら５種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、それらに実験例２−９で明らかにした部分アミノ酸配列における第５乃至１０番目のＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａで表わされる配列に基づき化学合成した下記の化６に示す塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３乃至５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＲＭ８』、『ＢＲＭ８』と命名した。
【００５５】
【化６】
0003650632.tif 000006
【００５６】
この形質転換体ＢＲＭ８をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ  ｐＢＲＭ８は約７，６００塩基対からなり、図５に示すように、当該酵素をコードする約１，７００塩基対からなるＤＮＡが制限酵素Ｓｍａ  Ｉによる切断部位の下流に連結していた。
【００５７】
【実験例３−３  形質転換体ＢＲＭ８による組換え型酵素の産生】
５００ｍｌ容フラスコに２．０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％  （ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二カリウム、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．２）を１００ｍｌずつとり、１１５℃で３０分間加熱して滅菌し、冷却し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた後、実験例３−２で得た形質転換体ＢＲＭ８を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去した後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約８５０単位の酵素が産生していた。
【００５８】
対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又はピメロバクター・スピーシーズＲ４８をアンピシリン無含有の上記と同一組成の液体培地に植菌し、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８の場合、培養温度２７℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約４１０単位と、形質転換体ＢＲＭ８と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００５９】
その後、形質転換体ＢＲＭ８が産生した酵素を実験例１−２と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量５７，０００乃至６７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約４．１乃至５．１に等電点を示すなど、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８由来の酵素とほぼ同じ理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６０】
【実験例４】
相補鎖ＤＮＡの調製並びにその塩基配列及びアミノ酸配列の決定
実験例３−２で得た組換えＤＮＡ  ｐＢＲＭ８を２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した下記の化７に示す塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオトレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６１】
【化７】
0003650632.tif 000007
【００６２】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ  ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６３】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号３に示す約１，７００塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号３に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と実験例２−８又は実験例２−９で明らかにしたＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、実験例２−８のＮ末端アミノ酸配列は配列番号３における第１乃至２０番目の配列に、また、実験例２−９の部分アミノ酸配列は配列番号３における第１８３乃至１９３番目の配列に一致した。これは、当該酵素が化４に示すアミノ酸配列を有するものであり、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８においては、当該酵素が化３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６４】
以上説明したように、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する酵素は、本発明者が長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この酵素を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその製造方法、用途につき、具体的に説明する。
【００６５】
この発明でいう組換え型酵素とは、組換えＤＮＡ技術により創製され、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する酵素全般を意味する。この発明の組換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、化４に示すＮ末端からのアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。化４のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の酵素作用を実質的に変えることなく、化４のアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの、化４のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体を産生することがある。斯かる変異体も、それがマルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換するかぎり、当然、この発明の組換え型酵素に包含される。
【００６６】
この発明による組換え型酵素は、特定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、化３に示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。
【００６７】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、ピメロバクター・スピーシーズＲ４８を始めとするピメロバクター属の微生物が挙げられ、その菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１日乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、化３に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、化４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００６８】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律増殖可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種類以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
【００６９】
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００７０】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、マルトース又はトレハロースを含む栄養培地で培養し、それぞれ、トレハロース又はマルトースを生成するものを選択すればよい。
【００７１】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２０乃至５０℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、瀘過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合わせて適用すればよい。
【００７２】
前述のとおり、この発明の組換え型酵素は、マルトース及びトレハロースに作用して、それぞれトレハロース又はマルトースを生成するという、従来の酵素に見られない、独特の作用を有する。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念もなく飲食物を甘味付けできるという大きな利点がある。当該酵素のこの性質を利用することにより、従来、還元性故に敬遠されがちであったマルトースを還元性を有さず、扱い易く、付加価値の高いトレハロースに変換できることとなる。
【００７３】
斯かる変換方法につきさらに説明すると、この発明によるマルトースの酵素的変換方法でいうマルトースとは、通常、マルトースを含んでなる糖組成物を意味し、この発明の組換え型酵素が作用してトレハロースを生成し得るかぎり、その原料、製造方法は問わない。大量のトレハロースを効率的に製造するには、マルトース含量の高い糖組成物を使用するのが望ましく、通常、固形分当たり約７０％以上、望ましくは、約８０％以上のものが使用される。斯かる糖組成物は斯界における通常一般の方法により得ることができ、例えば、特公昭５６−１１４３７号公報や特公昭５６−１７０７８号公報に開示されている、糊化澱粉又は液化澱粉にβ−アミラーゼを作用させ、生成したマルトースを分別沈澱や透析手段により分離する方法や、特公昭４７−１３０８９号公報や特公昭５４−３９３８号公報に開示されている、糊化澱粉又は液化澱粉にβ−アミラーゼとイソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を作用させる方法を採用することができる。
【００７４】
この発明による酵素的変換方法においては、マルトースを含む水性媒体にこの発明の組換え型酵素の有効量を共存せしめ、水性媒体を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量のトレハロースが生成するまで反応させる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の低基質濃度下でも進行するけれども、この発明の変換方法を大規模に実施する場合には、より高濃度の約２％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、約５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨは組換え型酵素が失活することなくマルトースに効率的に作用するレベルに設定され、温度は３０℃付近まで、望ましくは、約４乃至３０℃に、また、ｐＨは約６乃至９、望ましくは、約７乃至８の範囲に設定される。組換え型酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設定する。この発明の酵素的変換方法により、マルトースは効率的にトレハロースに変換され、その変換率は約８０％以上にも達することがある。
【００７５】
この発明の変換方法により得られた反応物はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精製する。すなわち、瀘過、遠心分離などにより反応物から不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とする。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的にトレハロースのみからなる製品を得るには、上記シロップ状物にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質を分離するための種々のクロマトグラフィー、酵母による発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種又は２種以上を適用する。大量に反応物を処理するには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は疑似移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であり、これらの方法によるときには、従来、大量入手が難しかったトレハロース含量が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。
【００７６】
斯くして得られるトレハロース及びトレハロースを含む糖組成物は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例えば、飲食物一般、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として極めて有用である。
【００７７】
以下、２〜３の実施例により、この発明による組換え型酵素の製造方法とマルトースの酵素的変換方法を具体的に説明する。
【００７８】
【実施例Ａ−１  組換え型酵素の製造】
５００ｍｌ容三角フラスコに２．０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二カリウム、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．２）を１００ｍｌずつとり、１１５℃で３０分間加熱して滅菌し、冷却し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた後、実験例３−２で得た形質転換体ＢＲＭ８を植菌し、回転振盪下、３７℃で２４時間種培養した。次に、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の新鮮な液体培地を１８ｌずつとり、同様に滅菌後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）ずつ接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して約８８０単位の組換え型酵素が産生していた。この上清を実験例１−２の方法により精製したところ、比活性約３４単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を約１６０単位／ｍｌ含む水溶液が約５ｍｌ得られた。
【００７９】
【実施例Ｂ−１  組換え型酵素によるトレハロースシロップ状物の製造】
馬鈴薯澱粉を濃度１０％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、懸濁液をｐＨ５．５に調整後、ナガセ生化学工業製α−アミラーゼ剤『スピターゼＨＳ』を澱粉固形分１グラム当たり２単位加え、９５℃で加熱して澱粉を糊化・液化した。液化液を１２０℃で２０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５０℃に急冷後、ｐＨを５．０に調整し、澱粉固形分１グラム当たり、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を５００単位、ナガセ生化学工業製β−アミラーゼ剤を２０単位加え、５０℃で２４時間反応させて、固形分当たり、マルトースを約９２％含む糖液を得た。糖液を１００℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、温度１０℃に冷却後、ｐＨ７．０に調整し、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を澱粉固形分１グラム当たり１単位加え、９６時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を原料澱粉固形分当たり約９５％の収率で得た。
【００８０】
トレハロースを固形分当たり約６９％含有する本品は、還元力がＤＥ１８．２と低く、しかも、温和な甘味や適度の粘度・保湿性を有していることから、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に配合使用できる。
【００８１】
【実施例Ｂ−２  組換え型酵素によるトレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−１の方法で得た反応物をｐＨ５．０に調整し、ナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を固形分１グラム当たり１０単位加えて５０℃で２４時間作用させた。新たに得られた反応物を加熱して酵素を失活させ、常法により脱色し、脱塩・精製した後、トレハロース含量を高めるべく、東京有機化学工業製ナトリウム型カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』（架橋度４％）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。すなわち、水に懸濁したイオン交換樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製円筒管４本に充填した後、円筒管を直列に連結して全カラム長を２０ｍとした。カラム内温度を６０℃に維持しつつ、上記反応物をカラムに対して約５％（ｖ／ｖ）負荷し、次に、６０℃の温水をＳＶ０．１５で通液して分画し、トレハロース含有の高い画分を採取した。この画分を常法により濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース粉状物を原料固形分当たり約５５％の収率で得た。
【００８２】
トレハロースを固形分当たり約９７％含有する本品は、還元力が極めて低く、甘味もまろやかであることから、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００８３】
【実施例Ｂ−３  組換え型酵素による結晶性トレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−２の方法により得たトレハロース含量の高い画分を、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約７０％（ｗ／ｗ）に濃縮した。濃縮物を助晶機にとり、撹拌しつつ徐冷して晶出率約４５％のマスキットを得た。次に、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔上部から下方に向かって送風しつつ、マスキットを噴霧乾燥乾塔の上部に設けたノズルより約１５０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で噴霧乾燥塔の下方に向かって噴霧する一方、噴霧乾燥塔底部に設けた金網コンベア上に捕集した結晶性粉末を、コンベア下部より約４５℃の温風を送風しつつ、噴霧乾燥塔外に徐々に搬出した。その後、結晶性粉末を熟成塔に充填し、温風気流中で１０時間熟成し、結晶化と乾燥を完了した。このようにして、トレハロース含水結晶の粉末を原料固形分当たり約９０％の収率で得た。
【００８４】
本品は実質的に吸湿性を示さず、取扱いも容易であり、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００８５】
【実施例Ｂ−４  組換え型酵素による無水結晶性トレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−２の方法で得たトレハロース含量の高い画分を実施例Ｂ−３と同様にして精製した後、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰めて水分含量約３．０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を得た。このシロップ状物を助晶機に移し、種晶として無水結晶トレハロースを固形分当たり約１％（ｗ／ｗ）加え、撹拌下、１２０℃で助晶後、アルミ製バットに取り出した。この状態のまま、１００℃で６時間熟成して得られたブロック状物を切削機で粉砕し、流動乾燥して、水分含量約０．３％（ｗ／ｗ）の無水結晶トレハロース粉状物を原料固形分当たり約８５％の収率で得た。
【００８６】
強力な脱水作用を有する本品は、飲食物、化粧品、医薬品又はその製造原料若しくは加工中間物の脱水剤として、さらには、上品な甘味を有する白色粉末甘味剤として飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００８７】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、マルトース及びトレハロースに作用して、それぞれトレハロース又はマルトースを生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により、斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。この発明の組換え型酵素を使用する変換方法により、マルトースは極めて効率的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトースからなる糖組成物に変換される。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物一般を甘味付けできる実益がある。くわえて、この発明の組換え型酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、食品等への配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使用し得るものである。
【００８８】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【００８９】
【配列表】
0003650632.tif 000008
0003650632.tif 000009
【００９０】
0003650632.tif 000010
【００９１】
0003650632.tif 000011
0003650632.tif 000012
0003650632.tif 000013
0003650632.tif 000014
0003650632.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】ピメロバクター・スピーシーズＲ４８が産生する酵素の至適温度を示す図である。
【図２】ピメロバクター・スピーシーズＲ４８が産生する酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】ピメロバクター・スピーシーズＲ４８が産生する酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】ピメロバクター・スピーシーズＲ４８が産生する酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＲＭ８の構造を示す図である。
【図１】
0003650632.tif 000018
【図２】
0003650632.tif 000019
【図３】
0003650632.tif 000020
【図４】
0003650632.tif 000021
【図５】
0003650632.tif 000022