(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉをエンコードし、ここで、該タンパク質のアレルゲンが、全て第20図に示されるCyn d  I.18、Cyn d  I.CD1及びCyn d  I.2/３から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含んで成る、単離された核酸。
【請求項２】
式：
L1NYX
式中L1は０〜300ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn d  Ｉのリーダー配列をエンコードするヌクレオチドを含み、Ｎは600までのヌクレオチドからなる核酸配列であり、前記核酸配列は成熟Cyn d  Ｉのアミノ末端部分をエンコードするヌクレオチドを含有し、Ｙは第１図に示すクローン２、第２図に示すクローン18、第15図に示すクローン３、第16図に示すクローン22または第17図に示すクローン２３の核酸配列部分であり、そしてＸは０〜600ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn d  Ｉの３′未翻訳部分のヌクレオチドを含有し、そしてL1およびＸは０であることができる、
を有するギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉをエンコードする単離された核酸。
【請求項３】
式：
L1NYX
式中L1は０〜300ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn d  Ｉのリーダー配列をエンコードするヌクレオチドを含み、Ｎは600までのヌクレオチドからなる核酸配列であり、前記核酸配列は成熟Cyn d  Ｉのアミノ末端部分をエンコードするヌクレオチドを含有し、Ｙは第１図に示すクローン２、第２図に示すクローン18、第15図に示すクローン３、第16図に示すクローン22または第17図に示すクローン２３の核酸配列部分であり、そしてＸは０〜600ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn d  Ｉの３′未翻訳部分のヌクレオチドを含有し、そしてＮの核酸配列はＹの核酸配列の５′末端とオーバーラップせず、そしてL1およびＸは０であることができる、
を有する請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
L1が第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド１〜106、または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド１〜103により表される核酸配列である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜244により表される核酸配列または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜243により表される核酸配列であり、Ｙが第２図に示すクローン18のヌクレオチド１〜603により表される核酸配列であり、そしてＸの核酸配列が第２図に示すクローン18のヌクレオチド604〜775を含有する、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜247により表される核酸配列または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜246により表される核酸配列であり、Ｙが第16図に示すクローン22のヌクレオチド１〜594により表される核酸配列であり、そしてＸの核酸配列が第16図に示すクローン22のヌクレオチド595〜802を含有する、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項７】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜246により表される核酸配列または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜245により表される核酸配列であり、Ｙが第17図に示すクローン23のヌクレオチド１〜595により表される核酸配列であり、そしてＸの核酸配列が第17図に示すクローン23のヌクレオチド596〜832を含有する、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項８】
L1が第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド41〜106、または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド28〜103により表される核酸配列からなる、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項９】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜244または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜243により表される核酸配列であり、Ｙが第２図に示すクローン18のヌクレオチド１〜603により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜247または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜246により表される核酸配列であり、Ｙが第16図に示すクローン22のヌクレオチド１〜594により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜246または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜245により表される核酸配列であり、Ｙが第17図に示すクローン23のヌクレオチド１〜595により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
L1が０であり、Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜244または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜243により表される核酸配列であり、Ｙが第２図に示すクローン18のヌクレオチド１〜603により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
L1が０であり、Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜247または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜246により表される核酸配列であり、Ｙが第16図に示すクローン22のヌクレオチド１〜594により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
L1が０であり、Ｎが第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド107〜246または第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド104〜245により表される核酸配列であり、Ｙが第17図に示すクローン23のヌクレオチド１〜595により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
Ｙが第１図に示すクローン２のヌクレオチド１〜438により表される核酸配列である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
Ｙが第15図に示すクローン３のヌクレオチド１〜417により表される核酸配列であり、そしてＸが第15図に示すクローン３のヌクレオチド418〜594により表される核酸配列である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
L1が０であり、Ｙが第１図に示すクローン２のヌクレオチド１〜438により表される核酸配列であり、そしてＸが０である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
L1が０であり、Ｙが第15図に示すクローン３のヌクレオチド１〜417により表される核酸配列である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
第18図に示すクローンCD1の核酸配列を含んで成る、ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉをエンコードする、単離された核酸。
【請求項２０】
第20図に示す成熟Cyn d  I.CD1のアミノ酸配列を含んで成る、ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉをエンコードする、単離された核酸。
【請求項２１】
第20図に示すCyn d  I.2/3（全長）のアミノ酸配列を含んで成る、ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉをエンコードする、単離された核酸。
【請求項２２】
請求項１、２、３、19または21に記載の核酸配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１、２、３、19または20に記載の核酸配列によりエンコードされるタンパク質またはペプチドを発現するように形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１、２、３、19または20に記載の核酸配列によりエンコードされる、単離されたギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉ。
【請求項２５】
第20図に示すCyn d  I.18のアミノ酸１〜246、第20図に示すCyn d  I.CD1のアミノ酸１〜246および第20図に示すCyn d  I.2/3（全長）のアミノ酸１〜24４、から成る群から選ばれるアミノ酸により表されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉ。
【請求項２６】
請求項25に記載の単離されたギョウギシバのタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉ、および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項２７】
個体から得られた血液試料と、請求項25に記載の単離されたタンパク質のアレルゲンとを、血液成分と前記タンパク質のアレルゲンとの結合のために適当な条件下で組み合わせ、そしてこのような結合が起こる程度を測定することを含んでなる、ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉに対する感受性を前記個体において検出する方法。
【請求項２８】
Ｔ細胞の機能、血液の中に存在する抗体と前記タンパク質との結合、またはそれらの組み合わせを評価することによって結合が起こる程度を測定する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
個体においてアレルギーの応答を生成するために十分な量の請求項25に記載のギョウギシバの花粉のアレルゲンCyn d  Ｉを、前記個体に投与し、そして前記ギョウギシバの花粉のアレルゲンに対する前記個体におけるアレルギーの応答の発生を測定することを含んでなる、ギョウギシバの花粉のアレルゲンに対する個体の感受性を決定する方法。
【請求項３０】
請求項１又は２に記載の核酸で形質転換された宿主細胞を、細胞とギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉを含有する培地との混合物を生成するのに適当な培地の中で培養し；そして、前記混合物を精製して実質的に純粋なCyn d  Ｉを生成することを含んでなる、ギョウギシバの花粉のタンパク質のアレルゲンCyn d  Ｉの製造方法。
【請求項３１】
全て第20図に示されるCyn d  I.18のアミノ酸５−246、10−246、20−246、25−246、Cyn d  I.CD1のアミノ酸５−246、10−246、20−246、25−246およびCyn d  I.2/3（全長）のアミノ酸５−244、10−244、20−244、25−244からなる群から選ばれるアミノ酸からなる、ギョウギシバの花粉のアレルゲンCyn d  Ｉの単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ギョウギシバ（Bermuda  grass）（Cynodon dactylon）は、世界、ことに熱帯および亜熱帯の気候の多数の地域における花粉のアレルゲンの重要な源である。これらのアレルゲンは、ある数の手段により研究されてきており、これらの手段は次のものを包含する:IgEのイムノブロッティング（Ford  D.およびBaldo、B.A.、J.Allergy  Clin.Immunol.79:711−720（1987）;Shen  H.D.ら、Clin.Allergy  18:401−409（1988）、カラムクロマトグラフィー（Orren、A.およびDowdle、S.Afr.Med.J.51:586（1977）;Matthiesenら、J.Allergy  Clin.Immunol.81:266（Ab）（1988））、および免疫電気泳動（Matthiesenら、前掲、1988）。
ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルゲンの主要なアレルゲンは30〜34kDの範囲の分子量（MW）をもつタンパク質として同定され、このタンパク質はギョウギシバ（Bermuda  grass）に対してアレルギー性の個体の76％より多くの血清からのIgEに結合し（FordおよびBaldo（1987）前掲;Shenら（1988）前掲、そしてCynd Iと表示された（KahnおよびMarsh、（1986）Mol.Immnol.23:1281−1288;Marshら（1988）Ann.Allergy、60:499−504、Matthiesenら、前掲）。Cyn ｄ  ＩはアレルゲンのグループＩの族の１構成員であり（KahnおよびMarsh、（1986）前掲、これらのアレルゲンは多数の分類学的に関係するイネ科植物、例えば、ライグラス（Lolp I）、ナカハグサ（Poa ｐ  Ｉ）およびチモシー（Phl ｐ  Ｉ）（Standringら、1987  Intl.Arch.Allergy  and  Aplied.Immunol.83:96−103;EschおよびKlapper、（1987）、J.Allergy  Clin.Immunol.79:489−495;MatthiesenおよびLowenstein（1991）Clin.Exp.Allrgy、21、209−320の中に見いだされる。しかしながら、ギョウギシバ（Bermuda  grass）のアレルゲンは、他のイネ科植物のアレルゲンと制限された抗体の交差反応性を示す。（Marchら、前掲、Bersteinら（1976）J.Allergy  Clin.Immunol.57:141−152。ある数の研究は、Cyn ｄ  Ｉが密接関係するイネ科植物のグループＩの相同体と異なることを示した（MatthiesenおよびLowenstein（1991）前掲。Cyn ｄ  ＩのＮ−末端における最初の27アミノ酸が決定された（（Matthiesenら、1988、前掲;Matthiesenら（1990）Eptopes  of  Atopic  Allergens、Brussel、UCB  Institute  of  Allergu、９−13;Singhら、Monographs  in  Allergy、（1990）、28:101−120;MatthiesenおよびLowenstein、（1991）、前掲）。
環境におけるギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルゲンの存在は多数の個体において花粉症および季節的ぜん息を引き起こし、そして西欧社会に著しい社会経済的衝撃を有し続けている。抗ヒスタミン剤およびステロイド類を包含する薬物の入手可能なスペクトルはアレルギー性疾患の処置において改善をもたらしたが、長期間の使用に関連する不都合な副作用を事実上有する。これらの問題のために、アレルギー性疾患の免疫治療における関心が再びもたれるようになった。免疫治療はアレルゲン抽出物を注射して患者をアレルギー反応に対して脱感作することを必要とする（Bousquet、J.およびMichel、F.B.（1989）Allergy  and  Clin  Immol.News  1:7−10。不都合なことには、アレルゲンとして使用される花粉調製物は多価でありそして品質が劣る。結局、粗製の抽出物が高い濃度で頻繁に使用され、そしてアナフィラキシーを包含する潜在的に致死的な全身性反応を誘発することがある。クローニングした遺伝子、その断片またはアレルゲンの配列に基づく合成ペプチドから発現された生産物は、品質をコントロールし、特性決定しかつ標準化することができ、そして最適にはIgEと結合しないので、治療のために安全な媒質を提供する。
発明の要約
本発明はシノドン・ダクチロン（Cynodon  dactylon）種の主要なタンパク質のアレルゲン（Cyn ｄ  Ｉ）、または少なくとも１つのその断片をコードする核酸配列またはこのような核酸配列の機能的同等体を提供する。本発明は、また、このような核酸配列からなる発現ベクターおよびそれらで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明は、さらに、単離された組換え的、化学的または合成的に生産されたCyn ｄ  Ｉまたはその断片を提供する。単離されたCyn ｄ  Ｉまたはその断片は、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルゲンに対する個体における感受性を診断および処置するために有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、クローン２（C2）と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードするヌクレオチド配列およびCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第２図は、クローン18（C18）と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードする部分的ヌクレオチド配列およびCynd Iの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第３図は、クローン２および18の核酸配列の比較を示す。
第４図は、クローン２および18の推定されたアミノ酸配列の比較を示す。
第５図は、Cyn ｄ  Ｉをコードする７クローン：クローン18（C18）、クローン22（C22）、クローン23（C23）クローン２（C2）、クローン３（C3）、クローン21（C21）、およびクローン33（C33）の推定されたアミノ酸配列の比較を示す。
第６図は、クローン14a1と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードする部分的ヌクレオチド配列およびCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第７図は、クローン14c1と表示するcDNAクローンから誘導された部分的および推定された部分的アミノ酸配列ををコードする部分的ヌクレオチド配列を示す。
第８図は、クローン14a1および14c1の複合体から予測されたCyn ｄ  I.14と表示するCyn ｄ  Ｉの部分的アミノ酸配列を示す。
第９図は、Cyn ｄ  I.18と表示するCyn ｄ  Ｉの予測された全長のアミノ酸配列を示す。
第10図は、Cyn ｄ  I.2/3と表示するCyn ｄ  Ｉの予測された部分的アミノ酸配列を示す。
第11a図は、ロトフォー（Rotofor）上のこれらのタンパク質の主要な調製用等電点電気泳動（IEF）により得られたタンパク質画分のSDS−PAGEによる分離を示す。
第11b図は、MAb3.2でスクリーニングした単離されたタンパク質のウェスタンブロットを示す。
第12a図は、粗製の花粉抽出物からプールした画分10〜13のロトフォー（Rotofor）上の再分画により得られたタンパク質画分のSDS−PAGEにより分離を示す。
第12b図は、粗製の花粉抽出物からプールした画分15〜20のロトフォー（Rotofor）上の再分画により得られたタンパク質画分のSDS−PAGEにより分離を示す。
第13図は、SDS−PAGEにより分離しそしてギョウギシバ（Bermuda  grass）のアレルギー性の個体の血清からのIgEでプロービングした天然のCyn ｄ  I aおよびCyn ｄ  I bのウェスタンブロットを示す。
第14図は、Cyn ｄ  Ｉλgt11ライブラリーからのcDNAへのMAbの1D1、3A3、3C2および4D2の結合を示す。オーバーレイ上の数はcDNAクローンの数に対応する。
第15図は、クローン３と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードする部分的ヌクレオチド配列およびCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第16図は、クローン22と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードする部分的ヌクレオチド配列およびCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第17図は、クローン23と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉをコードする部分的ヌクレオチド配列およびCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列を示す。
第18図は、CD1と表示する全長のcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を示す。
第19図は、KAT−39−１と表示するcDNAクローンから誘導されたCyn ｄ  Ｉの部分的ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列を示す。
第20図は、Cyn ｄ  I.18、Cyn ｄ  I.CD1およびCyn ｄ  I.2/3（全長）と表示するCyn ｄ  Ｉ成熟タンパク質の予測された全長のアミノ酸配列の比較を示す。
発明の詳細な記述
本発明は、Cyn ｄ  Ｉ、すなわち、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉の中に見いだされる主要なアレルゲンをコードする、核酸配列、またはその機能的同等体を提供する。Cyn ｄ  Ｉは密接に関係するアレルゲンの族であるように思われる。ここにおいて定義するように、「アレルゲンの族」は機能およびアミノ酸配列において関係するが、別々の遺伝子座における遺伝子によりエンコードされるタンパク質である。各族の構成員は、ヌクレオチドの変動が所定の遺伝子座において起こることができる多形性を有することができる。核酸配列の多形性はアミノ酸の多形性を生ずることがあるが、これはアミノ酸をエンコードするヌクレオチドのコードが縮重するとき常には当てはまらない。Cyn ｄ  Ｉをコードする核酸配列は、天然のアレルの変動のために、個々のギョウギシバ（Bermuda  grass）の植物の間で変化することがある。任意のおよびすべてのこのようなヌクレオチドの変動および生ずるアミノ酸の多形性は本発明の範囲内に包含される。
クローン２と表示するcDNAクローンから誘導された、Cyn ｄ  Ｉをコードする部分的核酸配列は、第１図に示す配列を有する。第１図に示すCyn ｄ  Ｉをコードする部分的核酸配列は435塩基からなる。３′−非翻訳領域は塩基436において開始し、そして塩基662に延長する。クローン２（C2）によりエンコードされるCyn ｄ  Ｉの推定された部分的アミノ酸配列は、また、第１図に示されている。
第２図は、クローン18（C18）と表示する第2cDNAクローンについての部分的核酸配列および推定されたアミノ酸配列を示す。第２図に示すCyn ｄ  Ｉをコードする核酸配列は、200の推定されたアミノ酸をエンコードする600のヌクレオチドからなる。３′−非翻訳領域は塩基601において開始し、そして塩基775に延長する。
第３図に示すように、クローン２およびクローン18についてのコーディング配列は明瞭に相同的であるが、３′−非翻訳領域は非常にいっそう分岐している。これが示唆するように、クローン２および18はCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の別々の構成員をエンコードすることができる。
第４図に示すように、クローン２およびクローン18によりエンコードされる推定されたアミノ酸配列は88.2％の相同性（84.1％の同一性）を有する。２つのクローンから推定された143アミノ酸のオーバーラップの中に22アミノ酸の差が存在し、それらのうちの６は保存的置換でありそして16は非保存的置換である。クローン18によりエンコードされる部分的タンパク質は、クローン２によりエンコードされる部分的タンパク質によりカルボキシ末端において２アミノ酸だけ長い（第４図）。アミノ酸の相同性はPCGENE（インテリジェネティクス［Intelligenetics］、カリフォルニア州マウンテンビュー）の中に含有されるソフトウェアを使用して実証された。
実施例１に記載するCyn ｄ  Ｉライブラリーから誘導された７つのcDNAクローンによりエンコードされる推定されたアミノ酸配列の比較は、第５図に示されている。C2、C3、C21、C22、C23およびC33と表示するこれらのcDNAクローンによりエンコードされるアミノ酸配列は、Cyn ｄ  I cDNAライブラリーから誘導された最長のクローンであるクローン18（C18）によりエンコードされる推定されたアミノ酸配列と整列させて示されている。第５図および第６図に示すように、クローン18、22、23、21および33によりエンコードされるアミノ酸配列のオーバーラップする部分は同一である。これが示唆するように、クローン18、22、23、21および23は同一のCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の構成員の例である。しかしながら、クローン22および23はクローン18より短いアミノ酸であり、そして異なる３′−非翻訳領域を有する（第２図、第16図および第17図）。これはクローン22および23がCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の別々の構成員を表すことを示唆するであろう。あるいは、それらは同一の族構成員の異なるようにスプライスされた形態を表すことがある。
第５図に示すように、クローン２および３によりエンコードされる推定されたアミノ酸配列の間にわずかに５つのアミノ酸が存在する。したがって、クローン２および３はCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の構成員の多形性を表すことがあり、このCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の構成員はクローン18、21および33が属するCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の構成員と異なる。クローン２および３がCyn ｄ  Ｉ遺伝子族の構成員の多形性を事実表すと仮定すると、第10図に示すCyn ｄ  I.2/3と表示するCyn ｄ  Ｉの予測された部分的アミノ酸配列はクローン２および３によりエンコードされるアミノ酸配列から発生させることができる。
第６図は、cDNAクローン14a1のヌクレオチド配列およびその推定されたアミノ酸配列を示す。このクローンは実施例２に記載するようにPCRから単離され、そしてそれがエンコードするアミノ酸配列はクローン18により部分的にエンコードされるCyn ｄ  Ｉ族の構成員のアミノ部分に相当する。クローン14a1の３′末端とクローン18の５′末端との間の19ヌクレオチドのオーバーラップが存在する。実施例２に記載するように、クローン14a1をPCRにおいてクローン18の非コーディング鎖配列に基づくオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して増幅した。クローン14a1のヌクレオチド41〜43によりエンコードされるメチオニンは、翻訳されたタンパク質の第１アミノ酸を表すと推定される。これはクローン14a1のヌクレオチド11〜13におけるインフレームの終止コドン後にエンコードされる第１メチオニンであり、タンパク質の翻訳の開始がクローン14a1のヌクレオチド41〜43によりエンコードされるメチオニンの５′で起こらないことを示す。推定上のイニシエイターのメチオニンを取り囲むヌクレオチド配列は、植物におけるタンパク質の開始のためのコンセンサス配列５′AACAATGGC−３′（Lutckeら、1987、EMBO  J.6:43−48）と78％合致する。成熟Cyn ｄ  Ｉタンパク質のＮ−末端の開始（第６図においてアミノ酸１により示される）の前に22アミノ酸のリーダー配列が存在し、成熟Cyn ｄ  Ｉタンパク質のＮ−末端（最初の27アミノ酸）はすでに同定された（Matthiesenら、1988、J.Allergy  Clin.Immunol.81:226Shingら、1990、Monogr.Allergy、28:101−120;Matthiesenら、1991、J.Allergy  Clin.Immunol.88:763−774）。
第７図は、cDNAクローン14c1のヌクレオチド配列およびその推定されたアミノ酸配列を示す。このクローンは、また、実施例２に記載するようにPCRから単離され、そしてそれをエンコードするアミノ酸配列はクローン18により部分的にエンコードされるCyn ｄ  Ｉ族の構成員のアミノ部分に相当する。このクローンはクローン14a1と相同性であるが、成熟チロシンホスファターゼの配列においてクローン14a1と１アミノ酸の差を有する（成熟Cyn ｄ  ＩチロシンホスファターゼのＮ−末端は第７図においてアミノ酸１により示されている）。クローン14c1は、追加の４アミノ酸をエンコードする12個のヌクレオチドのインサートを含む、クローン14a1と異なる７アミノ酸をエンコードするリーダー配列においてヌクレオチドの差を有する。これらのクローンの潜在的多形性を含む14a1および14clの複合配列は、第８図に示すCyn ｄ  I.14で表示する。
クローン14a1および14c1の配列は、Cyn ｄ  Ｉをエンコードする予測される全長の核酸配列の発生において有用である。Cyn ｄ  Ｉをエンコードする予測される全長のヌクレオチド配列は、式：
L1NYX
から誘導することができ、式中L1は０〜300ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn ｄ  Ｉタンパク質のリーダー配列をエンコードするヌクレオチドを含みそして、また、５′−非翻訳領域のヌクレオチドを含むことができ、Ｎは600までのヌクレオチドからなる核酸配列であり、そして成熟Cyn ｄ  Ｉのアミノ末端部分をエンコードするヌクレオチドを含み、Ｙはクローン２、クローン18、クローン３、クローン22またはクローン23あるいは成熟Cyn ｄ  Ｉタンパク質をエンコードするそれらのクローンの任意の多形性の形態の核酸配列の部分であり、そしてＸは０〜600ヌクレオチドの核酸配列であり、前記核酸配列はCyn ｄ  Ｉの３′未翻訳部分のヌクレオチドを含む。例えば、L1はクローン14a1の５′−非翻訳領域を含む第６図に示すクローン14a1のヌクレオチド１〜106ならびにCyn ｄ  Ｉのリーダー配列をエンコードするクローン14a1のヌクレオチド（第６図に示すヌクレオチド41〜106）により表される核酸配列を含むことができる。L1は、また、クローン14c1の５′−非翻訳領域を含む第７図に示すクローン14c1のヌクレオチド１〜103ならびにCyn ｄ  Ｉのリーダー配列をエンコードするクローン14c1のヌクレオチド（第７図に示すヌクレオチド28〜103）により表される核酸配列を含むことができる。L1は、また、Cyn ｄ  Ｉのリーダー配列部分のみをエンコードするクローン14a1のヌクレオチド（第６図に示すヌクレオチド41〜106）またはCyn ｄ  Ｉのリーダー配列部分のみをエンコードするクローン14c1のヌクレオチド（第７図に示すヌクレオチド28〜103）またはそれらの任意の多形性の形態を含む核酸配列であることができる。１つが成熟Cyn ｄ  Ｉをエンコードする核酸配列を発生しているとき、L1は０でありかつＸが０でありそして式は単にNYである。Ｎは好ましくは全長または成熟のCyn ｄ  Ｉタンパク質をエンコードする核酸配列である。
第９図に示すCyn ｄ  I.18と表示するCyn ｄ  Ｉについて予測される全長のアミノ酸配列は、Cyn ｄ  I.14と表示する第８図に示すアミノ酸配列を第５図に示すクローン18のアミノ酸残基53〜246と合同することによって発生させることができる。成熟タンパク質の予測される複合体は、この場合において、第９図に示すCyn ｄ  I.18のアミノ酸１〜246からなり、翻訳後の変更なしにほぼ26.7kDaの予測された分子量を有するであろう。本明細書において使用するとき、「成熟」Cyn ｄ  Ｉタンパク質はCyn ｄ  Ｉタンパク質のリーダー部分のアミノ酸配列を含まない。本明細書において論ずるすべての適用可能な図面において多形性または潜在的多形性は上付きおよび下付きで示す。
実施例３に記載しかつ第18図に示すように、PCRを使用して全長のクローンを発生させた。クローン14a1のヌクレオチド107〜125（第６図）およびクローン18のヌクレオチド604〜621（第２図）に基づくオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、第18図に示しそしてクローンCD1と表示する全長のクローンをPCRから発生させた。クローンCD1の推定されたアミノ酸配列は、２アミノ酸配列を除外して、前述したようにかつ第９図に示すように、Cyn ｄ  I.18と表示するCyn ｄ  Ｉタンパク質の族の構成員の予測される複合体の全長のアミノ酸配列に相当する。第18図および第20図に示すクローンCD1の推定されたアミノ酸配列を、Cyn ｄ  I.CD1と表示する。Cyn ｄ  I.CD1は、第９図に示すCyn ｄ  I.18により表される予測される複合配列と実質的に同一のCyn ｄ  Ｉタンパク質である。クローンCD1のcDNAインサートからなるベクターで形質転換された宿主細胞は、ATCCに受託番号 受託された。
Cyn ｄ  I.2/3（全長）と表示する他の予測された複合体の全長のアミノ酸配列を第20図に示す。この配列の一部分は、クローン２（第１図）のヌクレオチド178〜206（クローン３（第15図）の対応するヌクレオチド配列と同一である）およびクローン14a1（第６図）のヌクレオチド107〜130と本質的に同一のヌクレオチドに基づくオリゴヌクレオチドのプライマーを使用してPCRから発生させたCyn ｄ  Ｉクローンから推定される。このクローンをクローンKAT−39−１と表示する。クローンKAT−39−１の推定されたアミノ酸配列は、第10図に示すCyn ｄ  I.2/3の予測された部分的アミノ酸配列の一部分とオーバーラップするCyn ｄ  Ｉの部分的アミノ酸配列を表す。したがって、クローンKAT−39−１の核酸配列および推定されたアミノ酸配列をCyn ｄ  I.2/3の核酸配列および推定されたアミノ酸配列と組み合わせることによって形成される複合配列は、第20図に示すCyn ｄ  I.2/3（全長）と表示する予測されたCyn ｄ  Ｉタンパク質の族の構成員の複合体の核酸配列および推定されたアミノ酸配列を表す。第20図は、Cyn ｄ  I.18およびCyn ｄ  I.2/3（全長）と表示する複合配列のアミノ酸配列、およびCyn ｄ  I.CD1と表示する全長のcDNAクローン、CD1、から推定された全長のアミノ酸配列の比較を示す。
前述のCyn ｄ  Ｉタンパク質のアレルゲンをエンコードする核酸を、シノドン・ダクチロン（Cynodon dactylon）植物のいずれかの部分から得ることができる。Cyn ｄ  Ｉをエンコードする核酸はゲノムDNAから得ることができる。Cyn ｄ  Ｉをコードする核酸は、ここに開示する方法または遺伝子の単離およびクローニングの他の適当な技術を使用して得ることができる。
Cyn ｄ  Ｉの断片をコードする核酸配列の断片は、また、本発明の範囲内である。本発明の範囲内の断片は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて免疫応答、例えば、最小量のIgEの刺激;IgGおよびIgM抗体の産生の誘導；またはＴ細胞の応答、例えば、増殖の誘導および／またはリンホカインの分泌および／またはＴ細胞のアネルギーの誘発、を誘導するCyn ｄ  Ｉの部分をコードする断片を包含する。Cyn ｄ  Ｉの前述の断片は、ここにおいて抗原性断片と呼ぶ。本発明の範囲内の断片は、また、Cyn ｄ  Ｉと交差反応性であるアレルゲンを検出するためのスクリーニングのプロトコールにおいて使用するための他の植物種からの核酸とハイブリダイゼーションすることができる断片を包含する。本明細書において使用するとき、Cyn ｄ  Ｉをコードする核酸配列の断片は、Cyn ｄ  Ｉおよび／または成熟Cyn ｄ  Ｉの全体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ない塩基を有するヌクレオチド配列を呼ぶ。一般に、Cyn ｄ  Ｉの１または２以上の断片をコードする核酸配列は、成熟タンパク質をコードする塩基から選択されるであろうが、ある場合において、本発明の核酸配列のリーダー配列部分からの１または２以上の断片のすべてまたは一部分を選択することが望ましい。本発明の核酸配列は、また、リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位およびCyn ｄ  Ｉまたはその断片のクローニング、発現または精製に有用な他の配列を含有することができる。
本発明は、発現ベクターおよび本発明の核酸配列を発現するように形質転換された宿主細胞を提供する。Cyn ｄ  Ｉをコードする核酸、または少なくとも１つのその断片は、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．coli）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母菌、または哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）の中で発現することができる。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調整要素は、Sambrookら、Molecular  C1oning:A  Laboratory  Manua1、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）の中に見いだすことができる。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー、および他の発現要素は当業者に知られている。哺乳動物、酵母菌または昆虫の細胞の中の発現は、組換え物質の部分的または完全なグリコシル化および鎖間または鎖内に導く。酵母菌の中の発現に適当なベクターは、YepSec1（Baldariら（1987）EMBO  J.6:229−234）;pMFa（KurjanおよびHerskowitz（1982）Cell  30:933−943）;JRY88（Schultzら（1987）Gene  54:113−123）およびpYES2（インビトロゲン・コーポレーション［Invitrogen  Corporation］、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。これらのベクターは自由に入手可能である。バキュロウイルスおよび哺乳動物の発現系は、また、入手可能である。例えば、バキュロウイルス系は昆虫細胞の中の発現のために商業的に入手可能である（ファールミンゲン［PharMingen］、カリフォルニア州サンディエゴ）が、pMSGベクターは哺乳動物細胞の中の発現のために商業的に入手可能である（ファーマシア［Pharmacia］、ニュージャージイ州ピスカタェイ）。
大腸菌（E.coli）の中の発現のために、適当な発現ベクターは、なかでも、pTRC（Amannら（1988）Gene  69:301−315;pGEX（アムラド・コーポレーション［Amrad  Corporation］、オーストラリア国メルボルン）;pMAL（N.E.バイオラブス［Biolabs］マサチュセッツ州ベベリイ））;pRIT5（ファーマシア、ニュージャージイ州ピスカタェイ）;pET−11d（ノバゲン［Novagen］、ウイスコンシン州マディソン）Jammeelら（1990）J.Virol.64:3963−3966;およびpSEM（Knappら（1990）Bio  Techniques  8:3963−3966）を包含する。例えば、pTRCおよびpET−11dの使用は、非融合タンパク質の発現に導くであろう。pMAL、pRIT5、pSEMおよびpGEXの使用は、マルトースＥ結合性タンパク質（pMAL）、プロテインＡ（pRIT5）、切頭β−ガラクトシダーゼ（PSEM）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（pGEX）に融合したアレルゲンの発現に導くであろう。Cyn ｄ  Ｉ、その１または２以上の断片が融合タンパク質として発現されるとき、キャリヤータンパク質とCyn ｄ  Ｉまたはその断片との間の融合接合に酵素の切断部位を導入することはとくに有利である。次いで、Cyn ｄ  Ｉまたはその断片は酵素部位における酵素的切断およびタンパク質およびペプチドの精製の普通の技術を使用する生化学的精製によりフラビンタンパク質から回収することができる。適当な酵素的切断部位は、血液凝固因子Xaまたはトロンビンについての部位を包含し、これらの部位について切断に適当な酵素およびプロトコールが、例えば、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma  Chemical  Company）、ミゾリー州セントルイスおよびN.E.バイオラブス（Biolabs）、マサチュセッツ州ベベリイから商業的に入手可能である。異なるベクターは、また、例えば、IPTGの誘発（PRTC、Amannら（1988）前掲;pET−11d、ノバゲン［Novagen］ウイスコンシン州マディソン）または温度の誘発（pRIT5、ファーマシア［Pharmacia］、ニュージャージイ州ピスカタェイ）をもつ構成的または誘発性発現を可能とする、異なるプロモーター領域を有する。また、組換え的に発現されたタンパク質を分解する変更された能力を有する、異なる大腸菌（E.coli）宿主の中で組換えCynd Iを発現させることが適当であることがある（例えば、米国特許第4,758,512号）。あるいは、大腸菌（E.coli）により優先的に利用されるコドンを使用するように核酸配列を変更することは有利であり、ここでこのような核酸の変更は発現されたタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えないであろう。
宿主細胞は、普通の技術、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロポレイションを使用して本発明の核酸配列を発現するように形質転換することができる。宿主細胞の形質転換に適当な方法は、Sambrookら、前掲、および他の実験室用テキストの中に見いだすことができる。本発明の核酸配列は、また、標準の技術を使用して合成することができる。
本発明は、また、工程：Cyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片をエンコードするDNA配列で形質転換された宿主細胞を適当な培地の中で培養して、細胞とCyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片を含有する培地との混合物を生成し；そして前記混合物を精製して実質的に純粋なCyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片を生成する；ことを含んでなる精製されたCyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片を生産する方法を提供する。Cyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、宿主細胞に適当な培地の中で培養する。Cyn ｄ  Ｉのタンパク質およびペプチドは、ペプチドおよびタンパク質の精製についてこの分野において知られている技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびCyn ｄ  Ｉまたはその断片に対して特異的な抗体を使用する免疫精製を使用して、細胞培地、宿主細胞または両者から精製することができる。用語単離されたおよび精製されたは、ここにおいて互換的に使用し、そして組み換えDNA技術、または化学的前駆体により生産したとき細胞物質または培地を実質的に含有しないか、あるいは化学的に合成したとき、他の化学物質を実質的に含有しない、ペプチド、タンパク質、タンパク質断片、および核酸配列を呼ぶ。したがって、本発明の単離されたペプチドは組み換えDNA技術により生産されるか、あるいは化学的に合成され、そして細胞物質、培地、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。
本発明の他の態様は、Cyn ｄ  Ｉのすべてまたは一部分をエンコードするDNA配列で形質転換された宿主細胞の中で合成された、あるいは化学的に合成されたCyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片、および本発明の核酸配列で形質転換された宿主細胞の中で生産された、あるいは化学的合成された、精製されたCyn ｄ  Ｉタンパク質または少なくとも１つのその断片からなる調製物を提供する。本発明の好ましい態様において、Cyn ｄ  Ｉタンパク質は少なくとも成熟Cyn ｄ  Ｉタンパク質で形質転換された宿主細胞の中で生産される。
Cyn ｄ  Ｉの断片は、例えば、ペプチドをコードする本発明の核酸配列の対応する断片から合成された、あるいはこの分野において知られている技術を使用して化学的に合成されたペプチドをスクリーニングすることによって、得ることができる。アレルゲンのペプチド断片は、ペプチドのオーバーラップをもたない所望の長さの断片の選抜によるか、あるいは組換え的または合成的に生産することができる所望の長さのオーバーラップする断片の選抜により得ることができる。断片を試験して抗原性（例えば、免疫応答を誘発する断片の能力）を決定することができる。このような断片は、ここにおいて抗原性断片と呼ぶ。Ｔ細胞の応答、例えば、刺激（すなわち、増殖またはリンホカインの分泌）を誘導することができそして／またはＴ細胞のアネルギーを誘発することができるCyn ｄ  Ｉタンパク質のアレルゲンの断片は、とくに望ましい。免疫グロブリンＥ（IgE）に結合しないか、あるいは断片を誘導するタンパク質のアレルゲンより実質的に少ない程度にIgEに結合するCyn ｄ  Ｉの断片は、また、とくに望ましい。標準の免疫治療の主要な合併症は、全身性反応、例えば、アナフィラキシーである。免疫グロブリンＥは、マスト細胞または好塩基性細胞上のIgEへの抗原の結合および交差反応およびメディエイター（例えば、ヒスタミン、セロトニン、エオシノフィル、化学走性因子）の解放から生ずるアナフィラキシー反応のメディエイターである。こうして、アナフィラキシーは、IgEと結合しない断片の使用により回避することができるか、あるいは断片がIgEに結合する場合、このような結合はマスト細胞または好塩基性細胞からのメディエイター（例えば、ヒスタミンなど）の解放を生ずる。さらに、最小のIgE刺激活性を有する断片は、治療的効果のためにとくに望ましい。最小のIgE刺激活性は、全ギョウギシバ（Bermuda  grass）のタンパク質のアレルゲンにより刺激されたIgEの生産量より少ないIgE刺激活性を呼ぶ。本発明の好ましい断片は、次のものを包含するが、これらに限定されない：第20図に示すCyn ｄ  I.18のアミノ酸５〜246、10〜246、20〜246および25〜246から誘導された断片；および第20図に示すCyn ｄ  I.CD1のアミノ酸５〜246、10〜246、20〜246および25〜246から誘導された断片；第20図に示すCyn ｄ  I.2/3（全長）のアミノ酸５〜244、10〜244、20〜244および25〜244から誘導された断片。
Cyn ｄ  Ｉおよびその好ましい抗原性断片は、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体に投与したとき、アレルゲンに対する個体のアレルギーの応答を変更することができ、そして好ましくはアレルゲンに対する個体のＢ細胞、Ｔ細胞の応答またはＢ細胞およびＴ細胞の両者の応答を変更することができる。ここにおいて使用するとき、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のタンパク質のアレルゲン、例えば、Cyn ｄ  Ｉに対して感受性の個体のアレルギーの応答の変更は、標準的臨床的手順（参照、例えば、Varneyら、British  Medical  Journal  302:265−269））により決定して、アレルゲンに対する非応答性または症状の減少、例えば、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉が誘発するぜん息の症状の減少として定義される。本明細書において言及するとき、症状の減少は、本発明のタンパク質またはペプチドを使用する処置の養生法後、アレルゲンに対する個体のアレルギーの応答における症状の減少を包含する。この症状の減少は、主観的に決定することができる（すなわち、患者はアレルゲンへの暴露のときいっそうより快適に感ずる）か、あるいは臨床的に、例えば、標準の試験を使用して決定することができる。Cyn ｄ  Ｉまたはその断片へのIgEの結合についての初期のスクリーニングは、実験室の動物またはヒトのボランティアについての引っ掻き試験または皮内の皮膚試験によるか、あるいはin  vitro系、例えば、RAST（ラジオアレルゴソーベント試験［radioallergosorbent  test］）、RAST阻止、ELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ（RIA）、またはヒスタミン解放により実施することができる。
Ｔ細胞刺激活性を有し、そして少なくとも１つのＴ細胞のエピトープからなる本発明の抗原性断片は、とくに望ましい。Ｔ細胞のエピトープは、アレルギーの臨床的症状の原因となるタンパク質のアレルゲンに対する免疫応答の阻止または永続に関係すると信じられる。これらのＴ細胞のエピトープは、抗原提示細胞の表面上の適当なHLA分子に結合し、そして関係するＴ細胞の下位集団を刺激することによって、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて初期の事象を誘発すると考えられる。これらの事象はＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所的炎症反応、部位への追加の免疫細胞のレクリートメント、および抗体産生に導くＢ細胞のカスケードの活性化に導く。これらの抗体の１つのアイソタイプであるIgEは、アレルギー性症状の発生に対して基本的に重要であり、そしてその生産は事象のカスケードにおいて、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて、分泌されるリンホカインの性質により、初期に影響を受ける。Ｔ細胞のエピトープはＴ細胞のレセプターによる認識の基本的要素または最小の単位であり、ここでこのエピトープはレセプターの認識に対して必須のアミノ酸からなり、そしてタンパク質のアミノ酸配列において隣接および／または非隣接であることができる。Ｔ細胞のエピトープのアミノ酸配列をまねかつタンパク質のアレルゲンに対するアレルギーの応答を変更するアミノ酸配列は、本発明の範囲内である。
少なくとも１つのＴ細胞のエピトープからなる本発明のCyn ｄ  Ｉまたは抗原性断片への患者の暴露は、患者がタンパク質のアレルゲンに対して非応答性となりかつこのような暴露のとき免疫応答の刺激に参加しないように、適当なＴ細胞の下位集団を耐性とするか、あるいはアネルギー化することができる。さらに、少なくとも１つのＴ細胞のエピトープからなる本発明のCyn ｄ  Ｉまたは抗原性断片の投与は、天然に見いだされるタンパク質のアレルゲンまたはその一部分への暴露と比較して、リンホカインの分泌のプロフィルを変更することができる（例えば、IL−４の減少および／またはIL−２の増加を生ずる）。さらに、Cyn ｄ  Ｉまたはこのような抗原性断片への暴露は、通常アレルゲンに対する応答に参加するＴ細胞の下位集団に影響を及ぼすことができ、こうしてこれらのＴ細胞はアレルゲンへの通常の暴露の１または２以上の部位（例えば、鼻粘膜、皮膚、および肺）から離れて断片の治療的投与の１または２以上の部位に向かって引き付けられる。Ｔ細胞の下位集団のこの再分布は、アレルゲンへの通常の暴露部位における普通の応答を刺激する個体の免疫系の能力を軽減または減少することができる。
Cyn ｄ  Ｉおよびそれから誘導された断片または部分（ペプチド）は、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対するアレルギーの応答を診断、処置および予防する方法において使用することができる。こうして、本発明は、分離されたCyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤からなる治療用組成物を提供する。Cyn ｄ  Ｉまたは少なくとも１つのその断片は、好ましくは、タンパク質のアレルゲンまたはその断片を発現するように形質転換された細胞の中で生産されるか、あるいは合成的に製造される。脱感作すべき個体への本発明の治療用組成物の投与は、既知の技術を使用して実施することができる。Cyn ｄ  Ｉまたはその断片は、例えば、適当な希釈剤、担体および／またはアジュバントと組み合わせて個体に投与することができる。製剤学的に許容されうる希釈剤は、生理的食塩水または水性緩衝液を包含する。製剤学的に許容されうる担体は、ポリエチレングリコール（Wieら（1981）Intl.Arch.Allergy  and  Aplied.Immunol.64:84−99）およびリポソーム（Strejanら（1984）J.Neuroimmunol.7:27）を包含する。Ｔ細胞のアネルギーを誘発する目的で、治療用組成物は好ましくは非免疫原性の形態で投与し、例えば、それはアジュバントを含有しない。このような組成物は、一般に、注射（皮下または静脈内など）、経口的投与、吸入、経皮的適用または経直腸的投与経直腸的により投与されるであろう。本発明の治療用組成物は、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体に処置の養生法において、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対する個体の感受性を減少する（すなわち、アレルギーの応答を減少する）ために有効な投与量および時間にわたって投与される。治療用組成物の有効量は、因子、例えば、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対する個体の感受性の程度、年令、性別、および個体の体重、およびギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルゲンまたはその断片が個体における抗原性応答を引き出す能力に従い変化するであろう。
Cyn ｄ  ＩをコードするcDNA（またはそれを転写したmRNA）またはその一部分を使用して、任意の種々のまたは型の植物の中の同様な配列を同定し、こうして、タンパク質のアレルゲンのcDNAまたはmRNAまたはその一部分にハイブリダイゼーションするために十分な相同性を有する配列を同定するか、あるいは「選抜する」ために使用することができる。例えば、本発明のcDNAは温帯のイネ科植物、例えば、ライグラス、ナカハグサ、チモシーおよびカモガヤからのDNA、および他のイネ科植物、例えば、バヒア・グラス（Bahia  grass）からのDNAに低いストリンジェンシーの条件下にハイブリダイゼーションすることができる。十分な相同性（一般に40％より大きい）を有する配列を、ここに記載する方法を使用する他の評価のために選択することができる。あるいは、高いストリンジェンシーの条件を使用することができる。この方法において、本発明のDNAを使用して、他の型の植物、好ましくは関係する族、属、または種において、Cyn ｄ  Ｉのアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする配列を同定することができ、こうして他の種におけるアレルゲンを同定することができる。こうして、本発明はギョウギシバ（Bermuda  grass）のアレルゲンCyn ｄ  Ｉばかりでなく、かつまた本発明のDNAにハイブリダイゼーションするDNAによりエンコードされる他のアレルゲンを包含する。本発明は、さらに、ロリウム（Lolium）属からのタンパク質のアレルゲンまたはそれらの断片排除する、分離されたアレルゲンまたはそれらの断片を包含し、これらは、例えば、抗体の交差反応性、またはタンパク質のアレルゲンまたはそれらの断片が本発明のCyn ｄ  Ｉまたは断片に対して特異的な抗体に結合できる他の免疫学的アッセイによるか、あるいは分離された抗原性タンパク質またはそれらの断片が本発明のタンパク質およびペプチドに対して特異的なＴ細胞を刺激できるＴ細胞の交差反応性により、Cyn ｄ  Ｉまたはその断片に免疫学的に関係づけられる。本発明は、また、Cyn ｄ  Ｉと73％より大きい相同性を有するか、あるいはCyn ｄ  Ｉと90％より大きい相同性を有するタンパク質のアレルゲンまたはそれらの断片を包含する。
本発明のcDNAによりエンコードされるタンパク質またはペプチドは、例えば、「精製された」アレルゲンを使用することができる。このような精製されたアレルゲンは、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対する感受性の診断および処置のために主要な試薬であるアレルゲン抽出物の標準化において有用である。さらに、Cyn ｄ  Ｉの核酸配列に基づくタンパク質またはそれらの断片を使用することによって、抗ペプチド抗血清、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を標準の方法により作ることができる。これらの血清またはポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、アレルゲン抽出物を標準化するために使用することができる、または天然または組換えのタンパク質のアレルゲンの精製において使用することができる。
Cyn ｄ  Ｉおよび合成的または組換え的に生産され、分離されたその抗原性断片を使用することによって、首尾一貫した、よく定められた組成および生物学的活性の調製物を作り、そして治療的目的のために投与することができる（例えば、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性のアレルギーの応答を変更するために。このようなペプチドまたはタンパク質の投与は、例えば、Cyn ｄ  Ｉに対するＢ細胞の応答、Cyn ｄ  Ｉに対するＴ細胞の応答または両者の応答を変更することができる。また、単離されたペプチドを使用して、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルギーの免疫治療のメカニズムを研究し、そして免疫治療において有用な修飾された誘導体または類似体をデザインすることができる。
溶解度を増加し、治療的または予防的効能、または安定性（例えば、ex  vivoの貯蔵寿命、およびin  vivoのタンパク質分解的分解に対する抵抗）を増強するような目的で、Cyn ｄ  Ｉまたはその断片の構造を修飾することができる。アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸の置換、欠失により変更されて、免疫原性を減少したおよび／またはアレルギー性を減少した、あるいは同一の目的である成分を添加した、修飾されたCyn ｄ  Ｉまたは修飾されたその断片を生産することができる。例えば、Ｔ細胞のエピトープの機能に対して必須のアミノ酸残基を既知の技術（例えば、各残基の置換およびＴ細胞の反応性の存在または不存在の測定）により決定することができる。必須であることが示された残基を修飾すること（例えば、その存在がＴ細胞の反応性を増強することが示された他のアミノ酸との置換）ができ、ならびにＴ細胞の反応性に要求されない残基を変更する（例えば、その組み込みがＴ細胞の反応性を増強するが、関係するMHCへの結合を減少しない他のアミノ酸と置換することによって）ことができる。安定性および／または反応性を増強するために、Cyn ｄ  Ｉまたはその断片を、また、修飾して１または２以上の多形性を天然のアレルの変異型から得られるタンパク質のアレルゲンのアミノ酸配列の中に組み込むことができる。さらに、Ｄ−アミノ酸、非天然のアミノ酸または非アミノ酸類似体を置換または付加して、本発明の範囲内の修飾されたタンパク質または断片を生成することができる。さらに、Cyn ｄ  Ｉまたはその断片をA.セホン（Sehon）および共同研究者ら（Wieら、前掲）のポリエチレングリコール（PEG）法により修飾して、PEGと接合したペプチドを生成することができる。Cyn ｄ  Ｉまたはその断片の修飾は、また、還元／アルキル化（Tarr:Methods  of  Protein  Microcharacterization、J.E.Silver編、Humana  Press、ニュージャージイ州クリフトン、pp.155−194（1986））；アシル化（Tarr、前掲）；エステル化（Tarr、前掲）；適当な担体への化学的カップリング（MishellおよびShiigi編、Selected  Methods  in  Cellular  Immunology、WH  Freeman、カリフォルニア州サンフランシスコ（1981）；米国特許第4,939,239号）；または温和なホルマリン処理（Marsh、International  Archieves  of  Allergy  and  Applied  Immunology  41:199−215（1971））を包含する。
Cyn ｄ  Ｉまたはその断片をエンコードするDNAの部位特異的突然変異誘発を使用して、構造を修飾することができる。このような方法は、PCR（Hoら、Gene  77:51−59（1989））または突然変異した遺伝子の全体の合成（Hostomsky、Z.ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.161:1056−1063（1989））を包含することができる。細菌の発現を増強するために、前述の方法を他の手順と組み合わせて使用して、ペプチドをエンコードするDNA構成体の中の植物のコドンを大腸菌（Ｅ．coli）の中で優先的に使用されるものに交換することができる。
現在入手可能な構造の情報を使用して、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体に十分な量で投与したとき、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対する個体の応答を変更するCynd Iのペプチドをデザインすることができる。これは、例えば、Cyn ｄ  Ｉの構造を検査し、そしてギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の応答に影響を及ぼす能力について検査すべきペプチドを生産し（発現系を介してあるいは合成的に）そして細胞により認識される適当なＢまたはＴ細胞のエピトープを選抜することによって実施することができる。本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体は、また、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のアレルゲンに対する感受性を検出または診断するために使用することができる。例えば、これは次のようにして実施することができる：ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対する感受性について評価すべき個体からの血液または血液生産物を、Cyn ｄ  Ｉの分離された抗原性断片、または分離されたCyn ｄ  Ｉと、血液の中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と１または２以上の断片またはタンパク質との結合のために適当な条件下に組み合わせ、そしてこのような結合が起こる程度を決定する。
現在、また、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体においてアレルギーの応答を誘発するCyn ｄ  Ｉの能力をブロックまたは阻害することができる因子または薬物をデザインすることが可能である。このような因子は、例えば、それらが関係する抗Cyn ｄ  Ｉ−IgEに結合し、こうしてIgE−アレルゲンの結合および引き続くマスト細胞の脱顆粒化を防止するような方法で、デザインすることができる。あるいは、このような因子は免疫系の細胞の成分に結合し、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対するアレルギーの応答の抑制または脱感作を生させることができる。この非限定的例は、本発明のcDNA/タンパク質構造体に基づく、適当なＢおよびＴ細胞のエピトープのペプチド、またはそれらの修飾体を使用して、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に対するアレルギーの応答を抑制することである。これは、ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉に感受性の個体からの血液成分を使用するin  vitroの研究において、ＢおよびＴ細胞の機能に影響を与えるＴ細胞のエピトープのペプチドの構造を定めることによって実施することができる。
本発明の任意の態様において使用するDNAは、本明細書に記載するようにして得られたcDNAであることができるか、あるいは本明細書において表した配列のすべてまたは一部分を有する任意のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等体であることができる。このようなオリゴヌクレオチド配列は、既知の技術により、化学的または機械的に生成することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的同等体は、その配列（または対応する配列の部分）がハイブリダイゼーションする相補的オリゴヌクレオチド、核酸配列に対して相補的な配列（または対応する配列の部分）に対してハイブリダイゼーションすることができもの、および／または配列（または対応する配列の部分）によりエンコードされる生産物の同一の機能的特性を有する生産物（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）をエンコードするものである。機能的同等体が１つまたは両者の基準を満足しなくてはならないかどうかは、その用途に依存するであろう（例えば、それをオリゴプローブとしてのみ使用する場合、それは第１の基準のみを満足する必要があり、そしてそれをCynd Iの生産に使用すべきとき、それは第２の基準のみを満足する必要がある。）
下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例１
タンパク質の配列決定およびMAbの生産のためのCynd Iの分離花粉の抽出物の調製
ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉を、グリーア・ラボラトリーズ（Greer  Laboratories）、米国ノースカロライナ州レノイア、から購入した。ロトフォー（Rotofor）上に負荷した可溶性タンパク質のを調製するために、5gのギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉を10mlの10mMのリン酸塩緩衝液（PBS）とともに４℃において１時間震盪することによって３回抽出した。各抽出後、この混合物を遠心（2500rpm、10分）し、そして上澄み液を集めた。３回の抽出後、上澄み液をプールし、そして3mmのワットマン（Whatman）フィルターを通して濾過した。
調製用等電点電気泳動（IEF）
ロトフォー（Rotofor）（バイオラド［Biorad］、カリフォルニア州リッチモンド）における調製用IEFは、Eganら（1988）Analyt.Biochem.172、488−494に詳細に記載されている。簡単に述べると、5mlの両性電解質の溶液（Bio−lyte、pH範囲３〜10;40％）を花粉抽出物に添加し、そして体積を蒸留水で50mlに調節した。この混合物をロトフォー（Rotofor）セルの中に負荷し、そして４℃および12Wの一定電力において泳動した。４時間後、20画分を集め、そしてそれらのpHを決定した。問題のタンパク質を含有する画分をSDS−PAGE後イムノブロット上でMAb3.2で同定した。このMAbは精製したLolp Iに対してレイズしたが、ギョウギシバ（Bermuda  grass）を包含する９つの他のイネ科植物からのグループ１の相同体と交差反応することが発見された（KahnおよびMarsh、1986、Mol.Immnol.23、1281−1288）。問題のタンパク質を含有する画分をプールし、そして試料を2.5時間フォーカシングした以外、上と同一の条件下にロトフォー（Rotofor）の中で再分画した。各画分のpHを決定した。
SDS−PAGEおよびウェスタンブロッティング
ロトフォー（Rotofor）の画分の中のタンパク質を、還元性条件下に、10〜15％の勾配のSDS−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分割した。電気泳動のための条件は、本質的にSinghおよびKnox、Int.Archs  Appl.Immun.78:300−304（1985）に記載されているようなものであった。ファーマシア（Pharmacia）からの低い分子量（MW）の標準を使用して、分子量（MW）を決定した。ポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を、クーマッシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie  Brilliant  Blue）R250を使用して可視化した。
タンパク質を、Towbinら（1979）;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76、4350−4354;に従い、120mAおよび４℃において一夜ニトロセルロース（シュレイヘル・アンド・シュエル［Schleicher  ＆  Schuell］、0.45μｍ）に移した。タンパク質を移した後、粉末状ミルク［TBS（トリス緩衝化生理的食塩水:150mM  NaCl/10mM  トリスHCl、pH7.5）中の10％］中でウェスタンブロットのインキュベーションにより、非特異的結合部位をブロックした。
調製用IEFにより得られた画分のSDS−PAGEにより分割において、Cyn ｄ  Ｉは６〜10のpH範囲で画分10〜20の中にフォーカシングすることが明らかにされた。これらの画分はMAb3.2と結合した31〜32kDのタンパク質を含有した。MAb3.2と結合した画分10〜13（32kD）の中のタンパク質は、画分15〜20（31kD）中のものよりわずかに高いMWを有した（第11a図〜第11b図）。中間の画分14はMAb3.2と結合した両者のタンパク質を含有した。これらのタンパク質をCyn ｄ  I a（32kD）およびCyn ｄ  I b（31kD）と表示した。
Cyn ｄ  I aを含有する第11a図の画分10〜13をプールし、そして再分画した。Cyn ｄ  I bは第12a図のすべての画分の中に見いだされたが、画分13〜20のタンパク質成分より卓越した（第12a図）。これらの画分はpH6.5;Cyn ｄ  I aのp Iの指示を有した。
第11a図の画分15〜20をプールし、そして再分画してCyn ｄ  I bを精製した。Cyn ｄ  I bは第12b図のすべての画分中の見いだされたが、画分１〜12のタンパク質のプロフィルより卓越した（第12b図）。これらの画分はpH7.4;Cyn ｄ  I bのp Iの指示を有した。
イムノブロット分析
ウェスタンブロットをMAb3.2またはアレルギー性個体の血清の中でインキュベーションした。MAb3.2を0.5％のBSAを含有するPBS中で1:1000に希釈した。MAbの結合を、SinghおよびKnox（1985）前掲に記載されているように、ペルオキシダーゼ標識化抗マウスIg抗体（ダコパッツ・コーポレーション［Dakopatts  Corporation）、米国カリフォルニア州カーピンテリア）の溶液中のインキュベーションおよび引き続く酵素基質の添加により可視化した。ヒト血清を0.5％のBSAを含有する150mMのPBS中で1:4に希釈した。IgEの結合を125I標識化抗ヒトIgE（カレスタッド［Kallestad）（PBS/BSA中で1:6に希釈した）中のブロットのインキュベーションおよび引き続くオートラジオグラフィーにより可視化した。精製したCyn ｄ  I aおよびI bを、アレルギー性個体の血清からのIgEに結合するそれらの能力について評価した（第13図）。両者の画分をギョウギシバ（Bermuda  grass）アレルギー性個体の血清からのIgEに結合した。
NH2−末端のアミノ酸の配列決定
Cyn ｄ  Ｉタンパク質のCyn ｄ  I aおよびCyn ｄ  I bを、前述したように、分離し、そして転移緩衝液（Wardら、1990）（３［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）として10mM  CAPS  10％メタノール（pH11.0）を使用して二フッ化ポリビニリデン（PVDF）膜（ミリポア［Millipore］、米国マサチュセッツ州ベッドフォード）上に電気転移し、次いでクーマッシー・ブリリアント・ブルーR250で染色することによって可視化し、メタノール酢酸水（50:10:40、v/v/v）中で脱染し、そして脱イオン水でよく洗浄した。両者のCynd I aおよびCyn ｄ  I bタンパク質のNH2−末端のアミノ酸配列を、Wardら（1990）により記載されているようにして決定した。
ロトフォー（Rotofor）により分離されたCyn ｄ  Ｉタンパク質を、また、逆相HPLCにより精製し、そして31kDのタンパク質のNH2−末端のアミノ酸配列を決定した。
２つのCyn ｄ  Ｉ成分はそれらのNH2−末端領域において小さいアミノ酸配列の変動を示し、そしてCyn ｄ  ＩとライグラスからのLolp Iとの間に相同性が存在する（表１）。
0003618342.tif 000002
MAbの生産およびスクリーニング
Balb/Cマウスを50μｇのCyn ｄ  Ｉ（ロトフォー［Rotofor］上で分離された、バイオ−ラド［Biorad］、カリフォルニア州リッチモンド）で腹腔内免疫化することによって、抗Cyn ｄ  ＩのMAbを得た。RIBI（RIBIイムノケム（Immunochem）、米国モンタナ州ハミルトン）を、４回の免疫化の第１においてアジュバントとして使用した。残りの腹腔内免疫化は生理的食塩水の中であった。ハイブリドーマの融合および成長は、本質的にHarlowおよびLane、1988、Antibodies:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratoryに記載されている通りであった。単一の細胞のクローニングは制限希釈によった。ハイブリドーマ生産性抗Cynd I抗体は、ELISAアッセイにより同定した。CAPS緩衝液（6.67mM  NaCO3  35mM  NaHCO3  pH9.6）中で希釈した30μｇのギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉の抽出物で、ELISAプレートを一夜被覆した。次いで、ウェルをTPBS（0.1％のツイーン20を含有するPBS）で３回洗浄し、そして１％のBSAを含有するPBS（PBS/BSA）で30分間ブロックした。100μｌの一次抗体を各ウェルに添加し、そして60分間インキュベーションし、次いで洗浄し（上のように）そしてβ−gal標識化抗マウスIg（PBS/BSA中の1/250希釈、60分）中でインキュベーションした。洗浄後、200μｌの蛍光性基質の４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（MUG）を各ウェルに添加し、そして37℃において30分間インキュベーションした。次いで、プレートをフルオロカウント（fluoroCount）96フルオロメーター（ファーマシア［Pharmacia］）で読んだ。
この方法により陽性であった抗体を3A2、4D2、1D1および3C2と表示し、そしてSDS−PAGEにより分割したギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のタンパク質のウェスタンブロット上のCyn ｄ  Ｉへの結合について試験した。
cDNAライブラリーおよび免疫学的スクリーニング
本質的にHerrinおよびMichaels（1984）に記載されているようにグリール・ラボラトリーズ（Greer  Laboratories）米国ノースカロライナ州レノイル、から購入したギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉から、ポリ（Ａ＋）mRNAを分離した。cDNAをファーマシア（Pharmacia）cDNA合成既知の技術を使用して合成し、そしてベクターのラムダ−gt11のEcoR I部位の中にクローニングした。プレートしたcDNAライブラリーをIPTGで含浸したニトロセルロースのフィルターでオーバーレイすることによって、ファージのプラークからの組換えタンパク質をニトロセルロースのフィルターに移した。次いで、これらのフィルターを抗Cynd I  MAbの混合物中でインキュベーションした。組換えタンパク質へのMAbの結合を前述したように可視化した。抗Cyn ｄ  Ｉ  MAbと結合したプラーク生成タンパク質を単離し、そして精製した。
cDNAクローンの単離
ギョウギシバ（Bermuda  grass）の花粉のcDNAを、前述したように、最初に主としてMAb3.2を含有する抗Cynd Iハイブリドーマの上澄み液の混合物でスクリーニングし、そして30の陽性のcDNAをプラーク精製した。次いで、これらのクローンを抗Cyn ｄ  Ｉ  MAb3A2、4D2、3C2および1D1への結合について試験した。第１ラウンドのスクリーニング後に選抜したすべてのクローンは、MAb3A2に対して特異的な組換え融合タンパク質を生産した。MAbへのクローンの結合を第14図に示し、そして表２に要約した。ここで分離されたcDNAクローンは組換え融合タンパク質に対して示されたMAbの結合に基づいてCyn ｄ  Ｉをエンコードすると、結論される。MAb1D1は他のMAbよりも非常に高いバックグラウンドの結合を有し、その結合を非常にいっそう主観的とした。
0003618342.tif 000003
cDNAクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
クローン２、３、18、21、22、23および33（表２参照）を、それらの抗体親和性に基づくそれ以上の研究のために選択した。クローン２、３、18、21、22、23および33をファージから分離し、そしてpGEM−4Z（プロメガ［Promega］）またはブルースクリプト（Bluescript）（ストラタジーン［Stratagene］）ベクターの中にサブクローニングした。T7ポリメラーゼ（ファーマシア）を使用して連鎖停止法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.（1977）、74:5460−5463）により実施した二本鎖配列決定により、DNA配列を決定した。これらのクローンのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を第１図（クローン２）、第２図（クローン18）、第15図（クローン３）、第16図（クローン22）および第17図（クローン23）に示す。
配列決定したすべてのクローンは、とくにオープンリーディングフレーム（ORF）において、互いとの相同性を示す。さらに、配列決定したすべてのクローンとLolp I、すなわち、主要なライグラスのアレルゲンとの間の有意なヌクレオチド配列の相同性が存在する。しかしながら、配列決定したクローンはヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列の相同性に基づいて３つのグループに分割した、クローン２に最も類似する配列をもつもの（すなわち、クローン３）、クローン18に最も類似する配列をもつもの（すなわち、クローン21および33）、およびクローン22に最も類似する配列をもつもの（すなわち、クローン23）。クローン18および２のORFによりエンコードされる推定されたアミノ酸配列を、Lolp Iの推定されたアミノ酸配列と比較した（Perezら、1991、前掲;Griffithら、1991、前掲）（第６図）。Lolp Iとクローン18との間に67％およびLolp Iとクローン２との間に72％のアミノ酸の相同性が存在する。クローン２および18の推定されたアミノ酸配列は、互いに83％の同一性（87％の相同性）を有する。
実施例２
Cynd Iの５′末端のクローニング
二本鎖cDNAを、ほぼ４μｇの花粉RNA（グリール・ラボラトリーズ、米国ノースカロライナ州レノイル）から、cDNA合成システムプラスキット（BRL、米国マリイランド州ベセスダ）を使用して合成した。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、cDNAをT4DNAポリメラーゼ（プロメガ、米国ウイスコンシン州マディソン）で平滑末端とし、そしてエタノール沈殿し、自己アニーリングした、AT,5′−GGGTCTAGAGGTACCGTCCGATC−GATCATT−３′，およびAL,5′−ｐ−AATGATCGATGCT−３′、すなわち、変更されたアンカード（Anchored）PCR（Marshら、1986;RouxおよびDhanarajan、1990;Rafnarら、1991）反応において使用のためのオリゴヌクレオチド、に結合した。１μｇのオリゴヌクレオチドAP、５′−GGGTCTAGAGGTACCGTCCG−３′，およびCD−5,5′−GATGTGCTCGTAGTTCTT−３′、すなわち、アミノ酸配列KNYEHIに相当するCynd Iの非コーディング鎖配列に基づくオリゴヌクレオチドのプライマー、の各々でリンカー結合したcDNA（20μｌの反応からの５μｌ）から、Cynd Iのアミノ末端をエンコードするcDNAを増幅した。10μｌの10×種々のdNTP含有緩衝液、１μｇの各プライマー、cDNA、0.5μｌのアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼを含有する反応混合物中で、ジーン・アンプ（Gene  Amp）DNA増幅キット（パーキン・エルマー・セツス［Perkin  Elmer  Cetus］、米国コネチカット州ノーウォーク）を使用して、MJリサーチ・インコーポレーテッド（Reseach,Inc.）（米国マサチュセッツ州ケンブリッジ）からのプログラム可能なコントローラーの中で、一次ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施し、そして蒸留水で100μｌにした。25ラウンドの増幅は、94℃における１分間の変性、65℃において1.5分間の鋳型へのプライマーのアニーリング、および72℃において２分間の連鎖延長から成っていた。次いで、この一次増幅の５％（５μｌ）を、１μｇの各CD−4,5′−GGGGATCCGAGGCCGT−CCTTGAAG−３′、アミノ酸IFKDGLに相当する非コーディング鎖配列に基づくCD−５に関してネスチングしたCynd Iのオリゴヌクレオチドのプライマー、およびAPを使用する二次増幅において、上のようにして、使用した。すべてのオリゴヌクレオチドはリサーチ・ジェネティックス・インコーポレーテッド（Research  Genetics,Inc.）（アラバマ州ハンツビレ）により合成された。オリゴヌクレオチドのプライマーAP、ATおよびALは従来記載された（Rafnarら、1991;Morgensternら、1991;Rogersら、1991）。CD−４の最初の８ヌクレオチドを添加して、クローニングの目的のBamH I制限部位をつくった。
増幅されたDNAを順次のクロロホルム、フェノール、およびクロロホルムの抽出により回収し、次いで−20℃において0.5体積の7.5酢酸アンモニウムおよび1.5体積のイソプロパノールで沈澱させた。沈澱および70％エタノールで洗浄後、DNAを15μｌの反応混合物中でXba IおよびBamH Iで同時に消化し、そして調製用３％シープラーク（SeaPlaque）の低融点のアガロースゲル（FMCコーポレーション、米国メイン州ロックランド）を通して電気泳動させた。適当なサイズのDNAのバンドを臭化エチジウム（EtBr）の染色により可視化し、切除し、そしてセクエナーゼ（Sequenase）キット（U.S.バイオケミカルス、米国オハイオ州クレブランド）を使用するジデオキシDNA配列決定（Sangerら、（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:5460−5463）のために適当に消化したM13mp19の中に結合した。２つのクローン14a1および14c1がこのライゲーションから得られ、完全に配列決定され、そしてインフレームのイニシエイターのメチオニンを含有することが発見された。14a1配列のヌクレオチド28〜30によりエンコードされるメチオニン（第６図）は、最も好ましくは、開始コドンを表す。なぜなら、取り囲む配列は共通の植物配列５′−AACAATGGC−３′（Lutckeら、（1987）EMBO  J.6:43−48）と密接に合致し、そしてちょうど上流にインフレームの終止コドンが存在するからである。14c1（第７図）は２つの潜在的なインフレームのメチオニンを含有したが、ヌクレオチド27−29によりエンコードされるメチオニンはイニシエイターのメチオニンである最もある。なぜなら、取り囲む配列は、ヌクレオチド42〜45によりエンコードされるメチオニンより、コンセンサス植物配列５′−AACAATGGC−３′（Lutckeら、前掲）と密接に合致からである（78％対56％の合致）。さらに、配列の対応するヌクレオチド27〜29はクローン14alのそれと同一である。クローン14a1およびクローン14c1の両者の配列は、最長のCyn ｄ  Ｉクローン、すなわち、クローン18との17ヌクレオチドのオーバーラップを有した。成熟Cynd Iのアミノ末端、クローン14a1によりエンコードされるNH2−AIGDKPGPNITATGNKWLEAKATFYGおよびクローン14clによりエンコードされるNH2−AIGDKPGPNITATGSKWLEAKATFYG−は、Cyn ｄ  Ｉについて従来発表された２つのタンパク質配列:NH2−AMGDKPGP?ITATYGDKWLDAKATFYG（Matthiesenら1988,前掲Matthiesenら,1990,前掲Matthiesenら,1991,前掲）およびNH2−AIGDKPGPKITATY??KWLEAKAT（Singhら,1990,前掲）．と比較することによって同定することができた。これにより、クローン14a1および14c1は、それぞれ、22および26アミノ酸のリーダー配列を有することが示された。これらのリーダー配列を切断すると、Cyn ｄ  Ｉタンパク質の成熟形態が得られるであろう。第９図に示すようにCyn ｄ  I.14の配列をクローン18にそれらのオーバーラップにおいて結合することによって、Cyn ｄ  I.18と表示するCyn d  Ｉの潜在的な全長のアミノ酸配列（第９図）をつくった。両者の場合において、Cyn ｄ  Ｉの成熟形態は、26.7kDaの計算分子量をもつ246アミノ酸であると予測される。
実施例３
ChomczynskiおよびSacchi（1987）Analyt.Biochem.162:156−159のチオシアン酸グアニジニウム法の変法を使用して、シノドン・ダクチロン（Cynodon  dactylon）の花粉からRNAを分離した。9mlのチオシアン酸グアニジニウム緩衝液（0.05％トリスHCl［pH7.0］、0.05体積のβ−メルカプトエタノール、0.1容量％のナトリウムラウロイルサルコシン）を使用して液体窒素中で、花粉を粉砕した。次いで花粉の溶液をフェノール（10ml）とともに10分間震盪し、その後10mlのクロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、そしてこの混合物をさらに20分間震盪した。この混合物を7,000×ｇで25分間遠心し、そして水性相を集めた。
水性相をフェニル：クロロホルム：イソアミルアルコール25:24:1で再抽出し、次いで界面が明瞭になるまで2,000×ｇで遠心した。次いで水性相を3mlのCsClクッション（5.7M  EDTA;密度＝1.71g/ml）を下に配置したクイックシールの超遠心管の中にデカンテーションし、そしてベックマン（Beckman）Ti70.1ローター（Beckman  L8−70超遠心機；ベックマン・インスツルメンツ（Beckman  Instruments）、カリフォルニア州フラートン）中の遠心した（20時間、40,000rpm、20℃）。遠心後、ペレットの中のRNAを0.005％SDSの中に再懸濁させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、そして−20℃において一夜沈澱させた。
製造業者の使用説明書に従いファーマシア（Pharmacia）mRNA精製キットを使用して、ポリA+RNAを分離した。
0.8μｇのmRNAを70℃に0.5μｇのオリゴ−dTプライマー（ファーマシア、ニュージャージイ州ピスカタェイ）とともに加熱することによって、第１鎖cDNAを調製した。mRNAを氷上で冷却した後、５×第１鎖結合および25UのRNアシンリボヌクレアーゼ阻害剤を添加した。次いで、この混合物を42℃に１時間加熱した。最終の反応条件は、25μｌの最終体積の50mMトリスHCl、pH8.3、50mM  KCl、10mM  MgCl2、0.5mMスペルミジン、10mM  DTT、4mMピロリン酸ナトリウム、1mM各dATP、dCTP、dGTPおよびTTP、25U  RNアシンリボヌクレアーゼ阻害剤および15μAMV逆転写酵素／μgRNA（プロメガcDNA合成キット、プロメガ、ウイスコンシン州マディソン）であった。Cyn ｄ  ＩをエンコードするcDNA配列を、パーキン−エルマー・セツス（Perkin−Elmer  Cetus）の遺伝子増幅キット（U.S.バイオケミカルス、オハイオ州クレブランド）を使用して増幅した。５μｌ（25％）の第１鎖cDNA合成生産物を10×緩衝液と混合して2mM  MgCl2、50mM  KCl、10mMトリス−HCl、１μｇのオリゴヌクレオチドのプライマーCD15′Ｎ、５′−GGGAATTCGCCATCGGCG−ACAAG−CCAG−３′、１μｇのオリゴヌクレオチドのプライマーCDI3′B18,5′−CCCTGCAGATG−GAGGATCATCGTCTC−３′0.2mM  dNTPおよび2.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（ファーマシア、ニュージャージイ州ピスカタェイ）の最終緩衝液濃度にした。CD15′Ｎのヌクレオチド１〜８を添加して、クローニングの目的のためのEcoR Iエンドヌクレアーゼ制限部位をつくったが、ヌクレオチド９〜27はCyn ｄ  Ｉのアミノ酸１〜６（AIGDKP）をエンコードする第６図におけるクローン14a1のヌクレオチド107〜125に相当する（表１、第８図および第９図）。CD13′B18のヌクレオチド１〜８を添加して、クローニングの目的のためのPst Iエンドヌクレアーゼ制限部位をつくったが、ヌクレオチド９〜26はクローン18のヌクレオチド604〜621に対して相補的な非コーディング鎖配列に相当する（第２図）。
PCRをパーキン−エルマー・セツス（Perkin−Elmer  Cetus）サーマル・サイクラー（Perkin−Elmer、コネチカット州ノーウォーク）の中で実施し、そして５サイクルの変性（94℃、１分）、アニーリング（45℃、1.5分）および延長（72℃、３分）および引き続く20サイクルの変性（94℃、１分）、アニーリング（55℃、1.5分）および延長（72℃、３分）から成っていた。最終の延長反応は72℃において10分間実施した。増幅した生産物をフェノール抽出、クロロホルム抽出、次いで−20℃において0.5体積の7.5Mの酢酸アンモニウムおよび1.5体積のイソプロパノールを使用する沈澱により回収した。反応生産物をDNAポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端とし、次いでEcoR Iで切断し、そしてEcoR IおよびHinc IIで消化したブルースクリプト（Bluescript）ベクターの中にクローニングした。クローンCD1をジデオキシ連鎖停止法（Sanger、前掲）により、実施例１に記載するように、配列決定し、そして第18図に示すCyn ｄ  Ｉのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を含有することが発見された。
実施例４
二本鎖cDNAを調製し、そして実施例２に記載するように一次PCR反応においてオリゴヌクレオチドのプライマーCD−13およびCD−15を使用して増幅した。CD−13は配列５′−TTTCTAGAGCCATCGGCGACAAGCCAGGG−CCC−３′を有したが、ヌクレオチド14はＣまたはＧであったであろう。CD−13のヌクレオチド１〜８を加えて、クローニングの目的のためのXho I制限部位をつくった。残りのヌクレオチドはアミノ酸Ala（Ile/Met）−GlyAspLysProGlyProをエンコードし、ここでアミノ酸２はIleまたはMetであったであろう。（Cynd I aおよびCyn ｄ  I bのアミノ酸１〜８（表１）。CD−15は配列5'−GCGTACTTCACGAGCAGCGCCAG−GTAATT−3'を有し、これはアミノ酸AsnTyrLeuAlaLeuLeuValLysAla（第５図におけるクローン２（C2）およびクローン３（C3）の番号を付したアミノ酸159〜168）をエンコードするコーディング鎖配列に対して相補的な非コーディング鎖配列に相当した。一次反応の５％を二次PCRにおいて、実施例２に記載するように、オリゴヌクレオチドのプライマーCD−13およびCD−16を使用して増幅した。CD−16は配列5'−TTGAATTCGACACGGCGGAACTGCAGCAT−3'を有し、ここでヌクレオチド12はＧまたはＡであったであろう。CD−16のヌクレオチド１〜８を加えて、クローニングの目的のためのEcoR I制限部位をつくった。ヌクレオチド９〜29は、アミノ酸MetLeuGlnPheArgArgVal（第５図においてC2およびC3の番号を付したアミノ酸132〜138）をエンコードするコーディング鎖配列に対して相補的な非コーディング鎖配列に相当する。
PCR増幅を実施例２に記載するように実施した。増幅した生産物を回収し、適当に消化し、そして実施例２に記載するような配列決定のためにpUCの中に結合した。Cyn ｄ  Ｉクローンとして同定される配列を有するKAT−39−１と表示するクローンが単離された。KAT−39−１のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を第19図に示す。このクローンはCyn ｄ  ＩのクローンC2およびC3の伸長である。オリゴヌクレオチドCD−15およびCD−16は、Cyn ｄ  ＩクローンC18およびその相同体中の対応するをもつ単一の不一致をそれらの３′末端を有する。したがって、クローンC2またはC3のみか、あるいは密接な族の構成員が増幅されるであろう。Cyn ｄ  I.2/3（全長）と表示するKAT−39−１およびCyn ｄ  I.2/3の複合配列は、Cyn ｄ  I.CD1およびCyn ｄ  I.18と比較して第20図に示されている。
本発明をその好ましい態様を参照して説明したが、他の態様は同一の結果を達成することができる。本発明に対する変化および変更は当業者にとおて明らかであり、そしてすべてのこのような変更および本発明の真の精神および範囲に入る同等の態様は添付する請求の範囲の中に包含されることを意図する。
【図１】
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【図１ｃ】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図５ｂ】
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【図５ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１９】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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