(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ｈ−Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ−ＮＨ2
で表わされる構造をもつ合成ポリペプチドとインスリン受容体との結合体からなる活性化インスリン受容体。
【請求項２】
インスリン受容体タンパク質又はインスリン受容体を発現させた培養細胞に、式
Ｈ−Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ−ＮＨ2
で表わされる構造をもつ合成ポリペプチドを作用させることを特徴とする活性化インスリン受容体の製造方法。
【請求項３】
式
Ｈ−Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ−ＮＨ2
で表わされる構造をもつ合成ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、合成ポリペプチドとの結合によって活性化された新規なインスリン受容体、その製造方法及びそれに用いる合成ペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
増殖因子受容体の１種であるインスリン受容体は、細胞の分化・増殖や代謝の調節を行うタンパク質であり、リガンドであるホルモンの結合により活性化され、自己リン酸化や基質タンパク質のリン酸化を行い、下流へと情報伝達する機能を有するものであり、薬品開発のターゲットとして種々の活性化誘導体が研究されてきたが、これまで知られている多くのものは、ホルモンの結合部位に作用して活性を示すものであり、ホルモンが結合できない受容体に作用して活性を示すものは知られていなかった。
【０００３】
ところで、増殖因子受容体は、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメイン、すなわち細胞膜中に埋入されたドメインから構成される膜タンパク質であり、ホルモンの結合により活性化されて細胞内ドメインのインスリン部位が活性化され、チロシンの残基のリン酸化を行い、細胞内に情報を伝達することが知られている。
【０００４】
また、細胞外ドメインはホルモンの結合部位であり、受容体の活性化における役割が解明されつつあるが、膜貫通ドメインの機能については、まだその活性化の際の役割は全く知られていない。すなわち、これまで膜貫通ドメインについては、癌遺伝子産物であるＮｅｕタンパク質において、その一部を変異させることによりＮｅｕの恒常的な活性化と悪性転換能が向上すること、変異させたＮｅｕの膜貫通ドメインはα‐ヘリックスのホモ二量体を形成すること、変異Ｎｅｕタンパク質は、ホルモンなしでも細胞表面で凝集していることなどが、またインスリン受容体においてもＥｒｂＢ受容体の膜貫通ドメインと置換することによりインスリンなしでもチロシンリン酸化が確認され、それを発現させた細胞においては、ＥｒｂＢ置換体ではチロシンリン酸化は起らないが、ＥｒｂＢの変異体の配列を膜貫通ドメインに導入することにより、はじめてインスリンなしでもリン酸化が起ることがそれぞれ実験的に知られているにすぎない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホルモンなしでもリン酸化を行いうる機能をもつ、活性化されたインスリン受容体を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インスリン受容体の活性化について種々研究を重ねた結果、インスリン受容体の膜貫通ドメインの配列をもつ合成ペプチドを結合させることにより、インスリンなしでもリン酸化を行いうる機能を与えうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、式
Ｈ−Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ−ＮＨ2
で表わされる構造をもつ合成ポリペプチドとインスリン受容体との結合体からなる活性化インスリン受容体及びインスリン受容体タンパク質又はインスリン受容体を発現させた培養細胞に、上記の合成ポリペプチドを作用させることを特徴とする活性化インスリン受容体の製造方法及びそれに用いる上記の構造をもつ新規な合成ポリペプチドを提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、インスリン受容体の膜貫通ドメインに含まれる配列をもつ合成ポリペプチドを用いることが必要であるが、このようなものとしては、配列表配列番号１に示すアミノ酸配列をもつ合成ペプチド（以下ＩＲ−ＴＭペプチドという）がある。この合成ペプチドは、文献未載の新規化合物であり、ペプチド合成の際に用いられるそれ自体公知のＦｍｏｃ−固相法に従い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を原料として用いて合成することができる。ここで、Ｆｍｏｃは、９‐フルフレニルメチルオキシカルボニル基、ｔＢｕは、ｔ‐ブチルオキシカルボニル基、Ｐｂｆは、２，２，４，６，７‐ペンタメチルジヒドロベンゾフラン‐５‐スルホニル基の略称である。
【０００９】
このようにして得たＩＲ−ＴＭペプチドを、例えば可溶化したインスリン受容体タンパク質に作用させることにより、活性化したインスリン受容体を得ることができる。この際のインスリン受容体の活性は、ＩＲ−ＴＭぺプチドの濃度に依存し、その最大活性は、インスリンによる活性化の場合の約１／３である。
【００１０】
次に、血小板由来成長因子受容体、癌遺伝子Ｎｅｕ産物の受容体及び神経成長因子受容体の膜貫通ドメインに含まれる配列をもつ合成ペプチドを製造し、これらを用いてインスリン受容体との結合体を形成させ、前記と同様にしてその活性を調べたところ、いずれもリン酸化は認められず、インスリン受容体の活性化はインスリン受容体の膜貫通ドメインに含まれる配列をもつ合成ペプチドの特異的な作用であることが分った。
【００１１】
次に、インスリン受容体を発現させたチャイニーズハムスター卵巣（以下ＣＨＯと略す）の細胞にＩＲ−ＴＭペプチドを作用させたところ、インスリン受容体のチロシンリン酸化が認められた。また、基質タンパク質ＩＲＳ−１のリン酸化と、さらにその先で情報伝達に関与しているＭＡＰＫの活性化も認められたことから、ＩＲ−ＴＭペプチドがインスリン受容体と結合して、インスリン同様の情報伝達をひき起こすことが分った。
【００１２】
さらに、インスリンが結合できず、したがって活性化されない変異インスリン受容体（Ｓ３２３Ｌ）に対してＩＲ−ＴＭペプチドを作用させた場合でも、活性化インスリン受容体を形成することから、このものは糖尿病の治療に用いられることが分った。
【００１３】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
実施例１
カルボキシ末端アミド体合成用樹脂［ノババイオケム社製，商品名「ノバシン（ＮｏｖａＳｙｎ）」ＴＧＲ樹脂］を用い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を、５０質量％ピペリジンによる脱保護基工程とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）‐１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）法による縮合工程を順次繰り返すことにより、配列表配列番号１のポリペプチドを合成した。
次いで、上記の樹脂をＴＦＡ／チオアニゾール／エタンジチオール／ｍ‐クレゾール／水（４０／２／１／２／２）で処理して、脱保護基及び脱樹脂を行うことにより、粗ペプチドを得た。
次に、この粗ペプチドを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０カラムを用いたゲルろ過とニトリルカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【００１５】
実施例２
実施例１で得た合成ポリペプチド１０μＭを、ＷＧＡアガロースで精製したインスリン受容体タンパク質及び１０μｇを含むＨＥＰＥＳ緩衝液に加え、２５℃において１５分間反応させることにより、活性化インスリン受容体を得た。
次いで、このようにして得た活性化インスリン受容体と基質ペプチド（ＧｌｙとＴｙｒとを４：１のモル比で含む）と反応させ、基質のリン酸化を定量することにより、リン酸化能力を測定した。この結果を活性化しないインスリン受容体の場合（Ｎｏｎｅ）と比較した棒グラフとして図１に示した。
【００１６】
比較例１
実施例１と同様にしてＩＧＦ１（インスリン様成長因子）受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の膜貫通ドメインの配列をもつポリペプチド（配列表配列番号２）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通ドメインの配列をもつポリペプチド（配列表配列番号３）、癌遺伝子Ｎｅｕの産物（Ｎｅｕ）の膜貫通ドメインの配列をもつポリペプチド（配列表配列番号４）及び神経成長因子受容体（ＴｒＫ−Ａ）の膜貫通ドメインの配列をもつポリペプチド（配列表配列番号５）を合成した。
【００１７】
比較例２
上記の各合成ポリペプチドを実施例２と同様にしてインスリン受容体と反応させたのち、実施例２と同様にしてリン酸化能力を測定した。この結果を図１に示す。
この図から、インスリン受容体の膜貫通ドメインの配列をもつ合成ポリペプチドとインスリン受容体との結合体のみが活性化されることが分る。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によると、ホルモンなしでもリン酸化活性を有する新規なインスリン受容体及びそれに用いる新規な合成ポリペプチドが提供される。
【００１９】
【配列表】
0003658620.tif 000002
0003658620.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  活性化インスリン受容体タンパク質のリン酸化能力を示すグラフ。
【図１】
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