(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の分析物を測定するための検定法であって：
吸湿性マトリックス上の標的位置に一定量のサンプルを適用する工程、ここで、そのマトリックスが、上記分析物の存在下、上記マトリックス中で光学的に検出可能なシグナルの時間−依存性生成を開始させる１以上の乾燥された試薬を含み；
上記液体サンプルの適用から生じる上記標的位置を横切る電気抵抗の変化を計測する工程；
電気抵抗の低下が最初に計測されるときに計時サイクルを開始する工程；及び
上記計時サイクルの間に、上記マトリックス中の上記の光学的に検出可能なシグナルの生成を計測する工程、
を含み、ここで、前記シグナルの生成が、予め選択された時間経過にわたり複数の時間点において検出される、
前記検定法。
【請求項２】
前記サンプル容量が、３μｌ〜50μｌである、請求項１に記載の検定法。
【請求項３】
前記サンプルが、患者のサンプルである、請求項１に記載の検定法。
【請求項４】
前記患者のサンプルが、血液である、請求項３に記載の検定法。
【請求項５】
前記分析物が、酵素であり、そして試薬が、その酵素へ晒された後に光学的に検出可能な変化を作り出す酵素基質を含む、請求項１に記載の検定法。
【請求項６】
前記光学的に検出可能な変化が、蛍光、発光、又は色の変化である、請求項５に記載の検定法。
【請求項７】
前記分析物が、血液凝固経路の成分であり、そして基質が、その成分による活性化の間に検出可能なシグナルを作り出す、請求項１に記載の検定法。
【請求項８】
吸湿性マトリックスの温度を37℃に制御することをさらに含む、請求項１に記載の検定法。
【請求項９】
標的位置を横切る電気抵抗をモニタリングし、それにより液体サンプルの損失を検出することができる、ことをさらに含む、請求項１に記載の検定法。
【請求項１０】
酵素を含むと疑われる液体サンプルが、時間にわたり光学的に検出可能なシグナルの生成をもたらす吸湿性マトリックス−含有試薬に適用されるタイプの改良された酵素検定法であって、その改良が、その液体サンプルの適用から生じるマトリックス内の電気抵抗における変化を測定する工程、及びその電気抵抗の変化が最初に測定された後に上記シグナルの生成を検出する工程を含み、ここで、前記シグナルの生成が、電気抵抗における変化が最初に検出されるときに始まる予め選択された時間経過にわたる複数の時間点において検出される、
前記検定法。
【請求項１１】
電気抵抗が、液体サンプルが適用されるスポットのいずれかの側上に吸湿性マトリックスに固定された一対の電極を接触させることにより測定される、請求項10に記載の改良された検定法。
【請求項１２】
前記電気抵抗が、液体サンプルが検定手順の間に失われていないことを確認するために連続的にモニターされる、請求項10に記載の改良された検定法。
【請求項１３】
吸湿性マトリックス；
液体サンプルにより湿らせられたとき、そのサンプル中に存在する分析物との光学的に検出可能な化学的反応を開始させるマトリックス内に存在する１以上の乾燥された試薬；及び
そのマトリックスのサンプル標的位置の近くの１対の隔離された電極であって、その標的位置への液体サンプルの適用がそれらの電極の間の電気抵抗を低下させるであろうように配置されている電極、
を含むテスト物品。
【請求項１４】
前記隔離された電極が、吸湿性マトリックスに固定され、そして標的位置の向かい合う側上でそのマトリックスの表面の少なくとも一部に電気的に接触している、請求項13に記載のテスト物品。
【請求項１５】
前記電極が、接着剤によりマトリックス表面に付着されている金属ホイル・ストリップである、請求項14に記載のテスト物品。
【請求項１６】
前記隔離された電極の間の隙間が、0.1mm〜2mmのレンジ内の幅をもち、それによりその電極が、マトリックスからのサンプルの蒸発を抑制する、請求項13に記載のテスト物品。
【請求項１７】
電極と反対の膜の表面に付着された透明支持要素をさらに含む、請求項16に記載のテスト物品。
【請求項１８】
前記吸湿性マトリックスが、血液凝固経路を妨害しない親水性の非膨潤性材料から成る、請求項13に記載のテスト物品。
【請求項１９】
前記試薬が、血液凝固開始剤及び血液凝固経路の成分による活性化の間に検出可能なシグナルを作り出す基質を含む、請求項18に記載のテスト物品。
【請求項２０】
前記血液凝固経路成分がトロンビンであり、そして基質がリポーター分子に共有結合により結合したペプチドであり、そのトロンビンがそのペプチドに結合し、そしてそのリポーター分子を解裂させて、検出可能なシグナルを作り出す、請求項19に記載のテスト物品。
【請求項２１】
前記検出可能なシグナルが蛍光である、請求項20に記載のテスト物品。
【請求項２２】
吸湿性マトリックス；
液体サンプルにより湿らせられたとき、そのサンプル中に存在する酵素分析物との光学的に検出可能な酵素的反応を開始させる基質内に分散されている１以上の乾燥された試薬；及び
それらの間でサンプル標的位置を定めるためにマトリックスの表面に付着された１対の隔離された金属ストリップであって、それにより、その標的位置への液体サンプルの適用がそれらの金属ストリップの間の電気抵抗を低下させるであろうような金属ストリップ、を含むテスト物品。
【請求項２３】
前記金属ホイル・ストリップが、接着剤によりマトリックス表面に付着されている、請求項22に記載のテスト物品。
【請求項２４】
前記隔離された金属ホイル・ストリップの間の隙間が、0.1mm〜2mmのレンジ内の幅をもち、それによりそれらのストリップが、マトリックスからのサンプルの蒸発を抑制する、請求項22に記載のテスト物品。
【請求項２５】
前記金属ホイル・ストリップと反対の膜の表面に付着された透明支持要素をさらに含む、請求項24に記載のテスト物品。
【請求項２６】
前記吸湿性マトリックスが、血液凝固経路を妨害しない親水性の非膨潤性材料から成る、請求項22に記載のテスト物品。
【請求項２７】
前記試薬が、血液凝固開始剤及び血液凝固経路の成分による活性化の間に検出可能なスグナルを作り出す基質を含む、請求項26に記載のテスト物品。
【請求項２８】
前記血液凝固経路成分がトロンビンであり、そして基質がリポーター分子に共有結合により結合したペプチドであり、そのトロンビンがそのペプチドに結合し、そしてそのリポーター分子を解裂させて、検出可能なシグナルを作り出す、請求項27に記載のテスト物品。
【請求項２９】
前記検出可能なシグナルが蛍光である、請求項28に記載のテスト物品。
【請求項３０】
テスト物品を受容する支持台、ここで、そのテスト物品上の反応ゾーンが監視位置に置かれており；
その反応ゾーンの領域内でそのテスト物品を加熱するための支持台に付着されたヒーター；
そのテスト物品を横切る電気抵抗を検出するための支持台に付着された手段；及び
監視位置に置かれるときその反応ゾーンを光学的に監視するために支持台に付着された手段、
を含む検出ユニット。
【請求項３１】
ヒーター、電気抵抗検出手段、及び光学監視手段の中の少なくとも１をデジタル・コントローラーに接続するためのインプット／アウトプット・インターフェースをさらに含む、請求項30に記載の検出ユニット。
【請求項３２】
前記ヒーターが上部の加熱された表面及び下部の加熱された表面を含み、それらの表面が反応ゾーンの周りでテスト物品の上及び下側に接触するように置かれている、請求項30に記載の検出ユニット。
【請求項３３】
前記電気抵抗検出手段がテスト物品が支持台内に置かれるとき反応ゾーンの反対側上でテスト物品に接触する一対の隔離されたプレートを含む、請求項30に記載の検出ユニット。
【請求項３４】
前記光学的監視手段が、反応ゾーンに光を照射する光源及びその反応ゾーンからの光を検出する光検出器を含む、請求項30に記載の検出ユニット。
【請求項３５】
前記光源が特定の反応生成物内に蛍光を誘導するように選択された波長において光を照射し、そして光検出器がその蛍光波長における光を検出する、請求項34に記載の検出ユニット。
【請求項３６】
テスト物品との組み合わせにおける使用のための検出ユニットであって：
（ａ）吸湿性マトリックス；
（ｂ）液体サンプルにより湿らせられたとき、そのサンプル中に存在する分析物との光学的に検出可能な化学的反応を開始させるマトリックス内に存在する１以上の乾燥された試薬；
（ｃ）そのマトリックスのサンプル標的位置の近くの１対の隔離された金属ストリップであって、その標的位置への液体サンプルの適用がそれらの電極の間の電気抵抗を低下させるであろうように配置されている、金属ストリップ、
を含み；
ここで、この検出ユニットが：
テスト物品を受容する支持台、ここで、そのテスト物品上の反応ゾーンが監視位置に置かれており；
その反応ゾーンの領域内でそのテスト物品を加熱するための支持台に付着されたヒーター；
そのテスト物品を横切る電気抵抗を検出するための支持台に付着された手段；及び
監視位置に置かれるときその反応ゾーンを光学的に監視するために支持台に付着された手段、
を含む検出ユニット。
【請求項３７】
ヒーター、電気抵抗検出手段、及び光学監視手段の中の少なくとも１をデジタル・コントローラーに接続するためのインプット／アウトプット・インターフェースをさらに含む、請求項36に記載の検出ユニット。
【請求項３８】
前記ヒーターが、一対の金属プレート及びそれらのプレートを加熱するための手段を含んで成り、それらのプレートがテスト物品上の金属ストリップに接触し、そしてその金属ストリップが反応ゾーンに熱を伝達する、請求項36に記載の検出ユニット。
【請求項３９】
前記電気抵抗検出手段がヒーターを含む同一金属プレートを含み、それにより、電気抵抗がテスト物品上の金属ストリップの間に隙間を横切って測定される、請求項36に記載の検出ユニット。
【請求項４０】
前記光学的監視手段が、反応ゾーンに光を照射する光源及びその反応ゾーンからの光を検出する光検出器を含む、請求項36に記載の検出ユニット。
【請求項４１】
前記光源が、特定の反応生成物内に蛍光を誘導するように選択された波長において光を照射し、そして光検出器がその蛍光波長における光を検出する、請求項40に記載の検出ユニット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、一般的に、液体サンプル中の分析物を検出するための方法及び装置に関する。より特に、本発明は、その検定の時間と温度の両方が制御される場合に酵素及び酵素経路の成分を検出するための検定法に関する。
酵素及び酵素経路は、医薬において重要な役割を演じ、そして多くの臨床テストの対象である。単一酵素についてのテストの例は、アミラーゼ、クレアチン・キナーゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、アスパルテート・アミノトランスフェラーゼ、ストレプトキナーゼ、及びトロンビンについてのテストを含む。酵素経路についてのテストの例は、プロトロンビン時間テスト、及び活性化部分的トロンボプラスチン時間テストを含む。これらの後者のテストは、その外因性及び内因性血液凝固系に関連する酵素経路を測定する。
酵素反応を含むテストは、技術的に要求の厳しいものである傾向にある。酵素及び酵素経路は、典型的には、問題の酵素又は酵素経路が特定の酵素基質をその生成物に変換する速度を測定することにより、検定される。このような速度測定は、正確なテスト計時（timing）を要求する。なぜなら、計時の誤りは、酵素又は酵素経路内の成分の計算された量における誤りに直接的に翻訳されるからである。
温度制御も、決定的である。なぜなら、ほとんどの酵素は、温度の関数として劇的に変化する反応速度をもつからである。典型的には、より高い温度は、より高い反応速度を作り出し、そしてより低い温度は、より低い反応速度を作り出す。多数の温度感受性の酵素段階から成る酵素経路は、そのカスケード効果の結果として、しばしば非常に温度感受性である。
これらの技術的要求にために、ほとんどの酵素及び酵素経路のテストは、その性能が一般的に臨床実験に限定されながら、複雑である傾向にある。このような集中テストは、滅多に起こらない、又は日常的な医学的症状のために適切であることができるけれども、頻繁に起こる又は緊急の医学的テストのために規則的に病院又はクリニックに訪れることは、ほとんど許容できない。従って、酵素及び酵素経路の測定のために不慣れなユーザーにより行われることができる便利且つ簡単なテストの必要性が存在する。
様々な単純化された”テスト−ストリップ（test−strip）”検定法が、半−熟練及び未熟ユーザーが分析物、例えば、尿、血液、及び他の患者サンプル中の妊娠ホルモン、コレステロール、及びグルコースを検出することを可能にするために開発されてきた。これらのテスト・ストリップ検定法は、検出がテスト時間又は温度において微小な揺らぎをもって変動しない場合に非酵素的分析物により最も有用である。先に討議したように、酵素的反応は、ほとんど許容性がなく、そして家庭又は他の非臨床環境における使用についてそれらを非好適にするこれらの変数に対してより正確な制御を要求する。
LifeScan Inc.,Milpitas,Californiaから入手可能な血液グルコース分析を行うための１つのこのようなテスト・ストリップは、適用された血液中のグルコース・レベルに応答して発色反応を作り出す含浸された試薬をもつポリアミド膜に１滴の血液を適用することに頼っている。このような単純化された低コスト・テストは、”しばしば、家庭テスト（home tests）”といわれ、非−プロフェショナルな環境において広い採用を許容するであろう値段及び単純性のレベルをそれらが達成しているという事実を意味している。
これらの理由のために、やっかいな分析物、例えば、様々な患者のサンプル、例えば、血液、尿、等の中の酵素及び酵素経路の成分を検出するための単純化された検定法、テスト物品、及びテスト装置を提供することが望ましいであろう。特に、テスト物品及びテスト装置は、好ましくは、サンプルがテスト物品に適用されるやいなや開始される自動計時サイクルを許容する、単純化された検定プロトコールを許容べきである。また、テスト物品及びテスト装置は、場合により、好ましくは、ユーザーのアクセスを限定する熱チャンバー又は他の構造物内にそのテスト物品を包み込む必要性を伴わずに、その物品上のテスト領域の正確な温度制御を提供することを容易にしなければならない。検定法、テスト物品、及びテスト装置は、小サンプル容量、特に、小さな血液容量、例えば、単一の血液の滴により容易に使用されることができなければならない。テスト物品は、さらに、特に、非常に小さなサンプル容量を使用するとき、蒸発又は他の手段によりそのテスト物品からその患者のサンプルの損失を抑制しなければならない。テスト物品及びテスト装置は、そしてさらに、そのテスト物品内のサンプルの存在のモニタリングを提供し、そして過剰量のサンプルが損失したときに、そのユーザーに注意を与えなければならない。このようなテスト物品及びテスト装置は、好ましくは、比較的低コストにおいて生産可能であり、製造するのが容易であり且つ使用するのが容易でなけらばならない。
2.背景技術の説明
吸収性マトリックス内での基質の可視の又は検出可能な生成物への酵素的変換に基く分析物の存在を検出する検定装置は、米国特許第5,059,525号；第5,059,394号；第4,256,693号；第4,935,346号；第3,791,933号；及び第3,663,374号中に記載されている。サンプル適用を検出するための手段をもつ分析装置は、米国特許第5,049,487号及び第4,420,566号中に記載されている。この'487特許は、細孔性マトリックスを湿らせることにより生じる反射率における変化を検出することにより引き金を引かれる計時回路について記載している。この'566特許は、液体サンプルが分析に先立ってスライドに適用されたことを確認するための光の吸収の測定について記載している。分析テストの基質の温度を制御するための装置は、米国特許第4,720,372号；第4,219,529号；及び第4,038,030号中に記載されている。イオン選択性電極を含んで成る分析テスト基質は、米国特許第4,171,246号及び第4,053,381号中に記載されている。
発明の要約
本発明に従って、計時検定、特に、温度制御下での計時酵素的検定を行うための装置及び検定法を提供する。本装置は、テストされている液体サンプルを受容するテスト物品と、そのテスト物品を收納し、そして場合により、時間にわたりそのサンプル中の分析物の存在から生じるそのテスト物品内の変化を測定する検出ユニットとの、両方を含む。この観察された変化は、これ故、そのサンプル中に存在する分析物の存在（及び普通には量）に関係付けられることができる。このような装置は、上記検出ユニット内に存在するテスト物品へのサンプルの適用が計時サイクル（timing cycle）を開始させ、そしてそのテスト物品内の観察された変化が次にサンプルの適用に対する時間の関数として検出されることができる場合に、単純化された検定プロトコール及び形式の遂行を許容する。
本テスト物品は、その中に存在する１以上の乾燥試薬をもつ吸湿性の（bibulous）マトリックスを含んで成る。これらの試薬は、そのマトリックスに適用された液体サンプル中の分析物の存在中で検出可能なシグナルを作り出すように選択される。隔離電極の対をそのマトリックス上の標的位置のいずれかの側上に置けば、その標的位置への液体サンプルの適用がそれらの電極の間の電気的な抵抗を低下させるであろう。この方法で、その抵抗の低下がその検出ユニット内の計時サイクルを開始させながら、最初のサンプル適用は、それらの電極を横切る抵抗をモニタリングすることにより検出されることができる。あるいは、それらの電極の間の電気抵抗におけるその後の上昇は、特に小さなサンプル容量が使用されるとき、サンプルが、蒸発され、又は他の方法で、比較的冗長なテスト・プロトコールにより特定の問題であることができるその標的位置から失われるということを示すことができる。
本テスト物品は、さらに液体サンプルの蒸発損失を減少するように設計されることができる。隔離された電極は、好ましくは、それらの間の狭い隙間だけを残すように形作られることができるであろうし、そしてそのマトリックス表面（単数又は複数）の残りの部分は、他の材料によりカバーされることができるであろう。普通には、その残りのカバーの少なくとも１部は、以下、より詳細に記載するような検定プロトコールの間にそのテスト物品のマトリックスの光学的評価を許容するために透明であるであろう。このようなデザインにより、（サンプルを受容するための標的位置を定める）電極の間の狭い隙間だけがカバーされずに残るであろうし、このように、液体サンプルの適用を許容するが、その後のその吸湿性マトリックスからの有意な蒸発を防止するであろう。
本発明のテスト物品のための好ましい構築物は、上記吸湿性マトリックスを定める比較的薄い膜、上記電極を定め且つ上記膜の上表面全体を実質的にカバーする隔離された一対の金属ホイル・ストリップ、及び透明な層又は支持、例えば、上記膜の底表面をカバーする透明なプラスチック・ストリップを、含んで成るであろう。このようなテスト物品は、隣接する電極の間の隙間を通してその膜の上へのサンプルの適用を許容し、そしてさらにその透明の底を通してその膜を光学的に見ることをも許容する。
本発明の検出ユニットは、そのテスト物品上の反応ゾーンがその検出ユニット内の見える位置に置かれるように、そのテスト物品を収納するための支持台を含むであろう。この検出ユニットは、さらに、そのテスト物品がその支持台上の場所内にあるとき、そのテスト物品を横切る上記電気抵抗を測定するための手段を含む。普通には、この抵抗検出手段は、（その標的位置又はその付近に位置する）反応ゾーンのいずれかの側の上の吸湿性マトリックスに接する一対のプレート又はプローブを含むであろし、好ましくは、先に記載した電極に接する一対のプレートを含んで成るであろう。
しかしながら、この検出ユニットは、別個の電極を含まないテスト物品と共に機能するようにデザインされることができるであろう。特に、この検出ユニットは、その膜表面の上の隔離された位置を直接的にプローブするようにデザインされることができる。このようなデザインは一般的にほとんど好まれないが、それは、本発明の広い範囲内にあると考えられる。
この検出ユニットは、さらに、その反応ゾーンの付近のテスト物品を加熱するためのヒーターを含んで成るであろう。例示的な態様においては、このヒーターは、そのテスト物品の上の標的位置のいずれかの側の上の金属ホイル電極に接する加熱されたプレートを含むであろう。この金属ホイル電極は、その故に、サンプル適用のための標的ゾーンをブロッキング又は妨害せずに、その検出ユニットの加熱された金属プレートから直接的にその標的位置及び反応ゾーンまで熱を伝達することができる。
この検出ユニットは、さらに、典型的には、そのテスト物品の透明層を通して、その反応ゾーン内の光学変化を検出するための光学的監視手段を含む。例示的な態様においては、この光学的監手段は、その反応ゾーンに対して光照射する光源及びその反応ゾーンから放射又は反射された光を検出する光学検出器を含んで成る。
本発明の方法に従えば、その吸湿性マトリックスが、検出可能なシグナルの時間−依存性生産を分析物の存在中で開始させる１以上の乾燥試薬を含んで成る場合に、液体サンプルの容量が、吸湿性、マトリックス上の標的位置に適用される。そのサンプルが適用される正確な時刻は、そのマトリックス上の標的位置を横切る電気抵抗における変化を測定することにより測定されることができる。その検出シグナルの生産が、その後、その抵抗変化が最初に検出された後に１回以上測定される。この方法で、その検出可能なシグマルの時間−依存性生産が、時間にわたり注意深くモニターされ、そしてその液体サンプル中に分析物の量における存在に正確に関連付けられることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の原理に従って構築されたテスト物品の例示的な態様の拡大図である。
図２は、検出ユニット内に存在する図１中のテスト物品を示す略図である。
図３は、液体サンプル中の分析物との接触の間のテスト物品の電気的及び光学的性質を示す例示的グラフである。
図４は、実験セクションの実施例において使用したテスト物品及び検出ユニットを例示する。
図５は、図４中に示したテスト物品及び検出ユニットを使用した実験からの結果である。本実験においては、プロトロンビン時間の変化による27血液サンプルからの結果を、標準対照装置から得られたプロトロンビン時間と比較した。
特定の態様の説明
本発明に係る検定法は、液体であるか又は液化されるとができる事実上いずれかのタイプの生物学又は他のサンプル中の多種多様な可溶性分析物を検出するのに有用である。本方法及び装置は、患者試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳液、髄液、眼レンズ液（涙）、唾液（saliva）、唾液（sputum）、精液、子宮頸粘膜、削ったもの、綿棒で集めたサンプル、等と共にそれらの最大の用途があるであろうが、物質が酵素的、免疫学的、及び類似の技術を使用して検出されることができる場合に、食品、環境、産業、及び他のサンプルと共に用途があることもできるであろう。本発明の方法及び装置は、特に、典型的には、約３μｌ〜50μｌ、普通には、５μｌ〜30μｌのレンジ内の容量をもつ非常に少ない液体サンプル中で分析物を検出するのに有用であるが、より多いサンプルをもっての使用にも好適であろう。特に、本発明の方法及び装置は、典型的には、単一滴の血液を含んで成る非常に少ない血液サンプルを分析するのに有用であろうし、未熟又は半熟練者を使用して、しばしば、自己−投与されるであろう。
また、本発明の方法及び装置は、そのマトリックスへ適用されたサンプル中の分析物が、（マトリックス内で最初は乾燥されている）基質を光学的に検出可能な生成物、例えば、着色、発光、又は蛍光生成物に酵素的に変換することを、開始させ、調節し、又は他の方法でそれに影響を及ぼす場合に、吸湿性マトリックス内で酵素的検定を行うために特に好適である。本発明は、その液体サンプルがそのテスト物品に最初に適用される瞬間に、計時サイクルの開始に基づきこのような酵素反応の非常に正確なタイミングを提供する。本テスト物品及び検出ユニットは、そのテスト物品の正確な温度制御をさらに提供することができ、これはさらに、そのテスト結果の正確さを保証する。
本発明に係る検定法は、そのサンプルが適用される吸湿性マトリックスの一部を横切る電気抵抗を測定することによりテスト物品へのサンプル添加の感知を提供する。この吸湿性マトリックス及びその中に存在するすべての試薬は最初に乾燥状態にあるため、サンプル添加に先立つその吸湿性マトリックスの抵抗は、それが適用されるマトリックスのその部分を横切る電気抵抗を直ちに低下させ、そのように計時サイクルの開始のためのマーカー又は引き金を提供するであろう。酵素的反応の場合においては、光学的に検出可能な生成物の調製は、一定の時間がかかるであろうし、そして普通には、サンプル中に存在する分析物の量（並びに他の要因、例えば、温度）に高く依存する。本検出ユニット内に又はその組み合わせにおいて制御回路構成要素を提供することにより、時間にわたりそのテスト物品内に蓄積する光学的に検出可能な生成物の量を、正確に測定することができる。１以上のこのようなデータ点、普通には、多数のこのようなデータ点に基づき、そのサンプル中に最初に存在する分析物の量をその後に正確に計算することができる。
本発明の検出ユニットは、液体サンプルが適用されるテスト物品のその部分を横切る抵抗をモニタリングし且つ測定するための手段を含んで成るであろう。この抵抗検出回路構成要素は、計時回路構成要素に接続されるであろうし、これは、今度は、好適な計算手段に接続されるであろう。便利には、この検出ユニットは、デジタル・コントローラー、普通には、マイクロプロセサーであって、一般用途のパーソナル・コンピュータの形態にあることができるものに接続するためのインターフェースを含むことができる。この方法で、本発明の装置の計時及び分析的機能のほとんどが、上記デジタル・コントローラー内で行われることができ、この特殊な検出及びサンプル調整機能が本発明の特殊な装置により行われる。
これから図１を参照して、本発明の原理に従って構築された例示的テスト物品（10）を記載する。このテスト物品（10）は、典型的には平らな膜の形態にある吸湿性マトリックス構造物（12）；典型的には透明なストリップの形態にある支持構造物（14）；及び典型的には隙間（20）により分離された一対の隔離電極（18）を含んで成る電極構造物（16）、を含む。この膜（12）、支持構造物（14）、及び電極構造物（16）は、例えば、図示するように、接着層（22）及び（24）により一緒にラミネートされるであろう。この接着層（22）及び（24）は、支持構造物（14）を通してのその膜（12）を見ること、並びにその電極構造物（16）内の隙間（20）を通してその膜へのサンプルの適用、を可能にする中央孔（26）及び（28）を含むであろう。好ましくは、上記電極構造物（16）は、その電極（18）内に形成された追加のスロット（30）を含むであろうし、これらのスロットは、上記テスト物品（10）上の液体サンプルの適用のための標的位置を定める。
上記吸湿性マトリックス（12）は、液体を吸収することができ、そして乾燥形態において、所望の検定を行うのに必要な試薬（単数又は複数）を含むことができる材料から成るであろう。多種多様の吸湿性マトリックス材料であって、紙、メチル・セルロース、細孔性ポリマー、等を含むものが、使用されることができるであろう。吸湿性マトリックス（12）の寸法は、上記の必要な試薬を可溶化し、そしてそれが上記の支持構造物（14）を通して見ることができるであろうようにそのマトリックスの下側にその検出可能な反応生成物を運搬することを許容するという両方のための液体サンプルにより、そのマトリックスの少なくとも１部が飽和されることができるようなのでなければならない。
少しの血液サンプルが分析される場合の好ましい態様においては、この吸湿性マトリックス（12）は、血液細胞、特に赤血球（erythrocytes）を排除しながら血液血漿及びタンパク質の侵入を許容する細孔寸法をもつ親水性（吸湿性）の、非膨潤性ポリマー・マトリックス材料から成る細孔膜構造物であろう。この膜は、ミクロン（μｍ）のオーダー上の幅をもつチャンネルの曲がりくねった（torturous）ネットワークから成るフォーム−様構造をもつ単一の連続ポリマー材料から成らなければならない。チャンネルの曲がりくねったネットワークは、そのチャンネルの空空間により占有される”空隙容量”が全膜容量の適当なパーセンテージ、典型的には10％以上であるように、”密充填（densely packed）”されている。全ての反応化学、及びその後のシグナル生成は、その空隙容量内で生じるので、高い空隙容量が、強いシグナルを作り出すために望ましい。チャンネルの曲がりくねったネットワークは、過度に真っ直ぐで且つ直線の孔、（例えば、核孔（nucleopore）膜により得られた短い、直線孔）が望ましい。なぜなら、より長い平均チャンネル長さが、反応化学が生じるところの膜のゾーンとその膜の表面上に残った過剰のサンプルとの間の増加した隔離を作り出す傾向にあるからである。これは、適用されたサンプル容量における変化に対してより小さな感度をその装置に与えることを助ける。
血液凝固検定の特定の場合においては、上記の細孔性膜構造物（12）は、その細孔性マトリックスの内部へ侵入する血液血漿中の凝固を誘導し、そしてその血液の凝固能力の指標としての検出可能なシグナルを作り出すのに必要な試薬を含浸されるであろう。本発明に特に不可欠なのは、上記細孔性膜（12）のポリマー・マトリックス材料が誘導されている血液凝固経路を実質的に妨害しないことである。特に、このポリマー・マトリックス材料は、表面効果、相互作用、及び人工産物であって、血液凝固を誘導し又はその開始された経路の成分、例えば、酵素を失活させることができるであろうものを含んではならない。血液凝固経路の不所望の開始は、偽陽性測定を導くことができ、一方、酵素失活は、偽陰性測定を導くことができるであろう。それ故、重要なのは、そのポリマー・マトリックス材料が、その膜内で生じる血液凝固反応に対する促進又は軽減効果を全くもたないということである。膜が血液凝固テストにおける使用に許容され得るかどうかを決定するために存在することができる基準は、同時係属中の出願逐次番号07/874,667（この開示の全てを、引用により本明細書中に取り込む。）中に詳細に述べられている。血液凝固検定を行うための特に好ましいポリマー・マトリックス材料は、Filterite−Memtec,9690 Deeveco Road,Suite 7,Timonium,Maryland 21093から入手可能な0.45μｍの不斉ポリスルホン膜材料Catalog No.BTS−25である。サンプル適用標的位置スロット（30）の下にある吸湿性マトリックス（12）の領域は、その反応ゾーンであるであろう。この領域内で、マトリックス（12）が最初に湿らされ、そしてそこで、検出可能な反応生成物の生産をもたらす実際の化学反応が生じる。先に記載したような非常に少ないサンプルをもって使用されるとき、その反応ゾーンは、典型的には比較的小さく、しばしば、直径1cm以下、たまには、0.5cm未満であるであろう。サンプルにより湿らされないマトリックス（12）の残りの領域は、化学的反応を経験しないであろうし、そして可視性反応生成物を蓄積しないであろう。
本発明に従って検定を行うのに必要な化学的試薬は、吸湿性マトリックス（12）内に含浸されるであろうし、そしてそれへの液体サンオプの適用により再構成されるであろう。本発明の好ましい酵素的検定のためには、試薬は、酵素との相互作用の結果として、光学的に検出可能な生成物、典型的には蛍光体、発光体、又は着色生成物、に変換される酵素基質を、含むであろう。この酵素は、所望の分析物であること又はその分析物に関連付けされることができ、又はその酵素は、その液体サンプルに添加されることができ、そしてその酵素による検出可能な生成物の生産が、そのサンプル中の分析物の存在により調節され又は他の方法で影響を受ける。この基質は、例えば、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、等の場合においては、天然の検出可能な生成物を生産する天然の酵素基質であることができ、又は基質基、例えば、多糖類又はペプチドを含んで成る合成基質であってリポーター分子、例えば、発色性の、化学発光性の、又は蛍光性の分子に解裂可能な状態で結合するものであることができる。サンプル中の酵素の存在又は活性は、上記リンカーの解裂をもたらし、これは、上記リポーター分子の光学的特徴における変化を引き起こす。様々な有用な基質が、Haughland,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes in Reseach Chemicals,Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon,（この開示の全てを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。
血液凝固検定の例示的なケースにおいては、必要な試薬は、外因性又は内因性血液凝固経路のいずれかにおいて前選択事件又は段階を開始させる血液凝固開始剤及びその血液凝固経路のその後の段階において作り出される成分により活性化される基質を含む。バッファーも、その血液凝固経路に適したレンジ内のテストpHを維持するために提供されるであろうし、そして付随的な試薬は、血液血漿がその膜に侵入するとき様々なテスト成分のクロマトグラフィー的分離を減少させる流れ調節剤、その血液凝固経路の化学的反応を持続させ又は強化する補因子、安定性強化剤、及びそのテスト物品の光学的特徴を強化する含量を含む。典型的には、これらの試薬は、そのポリマー・マトリックス材料の全部又は一部に適用される１以上の水溶液と併合されるであろう。このマトリックス材料は、次に乾燥され又は凍結乾燥されて（そして場合により，ハンドル（14）の上に載せられて）、その中に非共有結合的に吸着された試薬をもつテスト物品を形成する。幾つかの場合においては、上記試薬の中の少なくとも幾つかを共有結合により付着させることが可能であるが、共有結合による付着は、普通には必要でないであろう。特定の血液凝固阻害剤、基質、バッファー、血液凝固補因子、及び液体調節剤は、出願逐次番号07/874,667（この開示全体を先に引用により本明細書中に取り込んだ。）中に記載されている。
支持構造物（14）は、様々な形態を呈することができる。この支持構造物（14）は、主に、テスト物品（10）の残りの成分のための物理的な支持として作用するように意図され、そして光学的に透明であり、好ましくは、その検定プロトコールに対して問題の光の波長において完全に透明である。本発明の好ましい態様においては、この支持構造物（14）は、吸湿性膜（12）からのサンプルの損失の防止における水分バリアとしても作用するであろう。好適な支持構造物（14）は、透明なプラスチック、例えば、ポリスチレンであって、本発明の方法の段階においてテスト物品（10）の操作を許容するためのハンドルとして役立つのに十分に厚く且つ硬いものから成ることができる。約2cm〜10cmのレンジ内の長さ、約0.5cm〜2cmのレンジ内の幅、及び約0.1cm〜0.5cmのレンジ内の厚さをもつポリスチレン・ストリップが許容できることが見いだされている。
電極構造物（16）は、主に、吸湿性マトリックス（12）の反応ゾーンを横切る電気抵抗の測定を容易にすることを意図されている。本発明の方法が、直接的に、すなわち、中間の接触電極を提供する必要性を伴わずに、その吸湿性マトリックスに接する電気抵抗プローブを使用することができるであろうことが理解されるであろう。しかしながら、本発明の好ましいテスト物品（10）は、以下、より詳細に記載するように、検出ユニットを使用して電気抵抗測定を容易にするために、好適な電極構造物を提供する。
この電極構造物（16）は、好ましくは、それかのサンプル液体の蒸発及び他の損失を抑制するためのその吸湿性マトリックス（12）のためのカバーとしても役立つ。従って、この電極構造物（16）は、一般的に、その吸湿性マトリックス（12）の露出表面の大部分をカバーするであろうし、典型的には、それらの間に小さな隙間（20）及びスロット（30）だけを残すであろう。
便利には、上記電極構造物（16）の両方の電極半分（18）は、導電性材料、普通には金属ホイルから全て成るであろう。金属ホイルの使用は、以下、検出ユニットとの関連で、より詳細に記載するように、吸湿性マトリックス（12）の反応ゾーンへの熱伝達を強化するためにも働く。しかしながら、個々の電極（18）は電気的に導性の材料から全て構成される必要はなく、そして実際、吸湿性マトリックス（12）から検出ユニットによりプローブされ又は接続されることができる位置まで明確な導電性経路を定めることだけが必要とされることが理解されるであろう。
さらに、本発明のテスト物品は、吸湿性マトリックス（12）をサンドイッチする電極（16）と支持構造物（14）をもつ構造に限定されないということをさらに理解すべきである。本発明に係るテスト物品は、それらの電極が電気抵抗測定機構、例えば、本発明の検出ユニットにより提供されるものとの相互接続を容易にする場合に、１対の隔離電極が吸湿性マトリックス上のサンプル標的位置のいずれかの側に提供されるということだけを、要求する。
接着層（22）、（24）は、いずれかの好適な材料から成ることができ、典型的には、両面テープ、例えば、3M Corporation,Minneapolis,Minnesotaから入手可能なものである。
これから、図２を参照して、検出ユニット（32）を図により説明する。検出ユニット（32）は、テスト物品がその検出ユニット内に挿入されたとき、そのテスト物品（10）の電極（18）と接触するプレート（34）を含む。この接触プレート（34）は、標的位置のスロット（30）の下のマトリックス（12）内の反応ゾーンを横切る電気抵抗の測定におけるプローブとして作用する。プレート（34）は、（図示しない）デジタル・コントロール・ユニット又はマイクロプロセッサーに好適な出力を提供するために慣用の電気抵抗モニタリング回路構成要素に接続されるであろう。
本発明の好ましい態様においては、プレート（34）は、典型的には、慣用の電気抵抗ヒーターにより、加熱されるであろう。例えば、プレート（34）は、その表面上又はその中に埋め込まれた加熱コイルをもつことができる。この加熱コイルは、今度は、慣用の電源（35）に接続されることができるであろうし、熱は、慣用の制御回路構成要素により又は別個のコンピュータ又は他のデジタル・コントローラーにより制御される。プレート（34）により提供された熱は、金属電極プレート（18）により、そのマトリックス（12）に、その反応ゾーンと少なくとも部分的に重なる領域に、伝達されるであろう。
検出ユニット（32）は、さらに、そのテスト物品（10）がそのユニット内に置かれるとき、反応ゾーンを光学的に見るための装置（40）を含む。この光学装置は、反射率、蛍光、又は発光をモニターすることができる。本例においては、蛍光装置（40）を説明する。この蛍光装置（40）は、図示するように、光源（42）及びノッチ・フィルター（44）であって透明支持構造物（14）を通してテスト物品（10）の反応ゾーン上に落ちる光線（46）を一緒になって提供するものを含む。反射され又は放出された光（48）は、第二のノッチ・フィルター（50）を通過し、フィルターを通った光が検出器（52）により検出される。血液凝固検定の例示的な場合においては、検出は、普通には、蛍光に基くものであるであろうし、ここでは、光線（46）が励起波長において提供され、そして光線（48）が知られた放出波長において放出される。
簡単に言えば、本発明に係る検定法は、テスト物品（10）の電極構造物（16）上の標的位置（30）を通して液体サンプルを適用することにより行われることができる。この液体サンプルは、標的位置内の隙間（20）及び他のスロットを通して吸湿性マトリックス（12）内の反応ゾーン中に流れるであろう。サンプル中の分析物の存在は、マトリックス（12）内の検出可能な反応生成物の生産に影響を与え又はそれを調節し、最終的にそのマトリックスの下表面上に光学的に検出可能な変化を提供するであろう。光学的に活性な反応生成物の生産は、膜（12）の反応ゾーン上に透明な支持（14）を通して光線（46）を照射することにより観察されることができる。存在する蛍光物質は、光検出器（52）により最終的に検出される蛍光波長における光を放出するであろう。時間にわたり検出されたシグナルの量は、そのサンプル中に存在する分析物の量に依存するであろう。
図３は、検定の経過の間に典型的に生じる抵抗及び光学的特徴における変化を説明している。液体サンプルの適用の前、電極隙間を横切る抵抗は非常に高い。これに反し、その光学シグナル（ここでは蛍光として示す）は低い。時刻０におけるサンプルの適用において、抵抗における瞬時の降下がある。これに反して、酵素基質の適当な量が反応膜内で検出可能な生成物に変換されるまでその光学シグナルにおける対応の変化は全くない。時間の経過とともに、その試薬ストリップ上の電極接点を横切る抵抗が、そのストリップの乾燥のために上昇することができる。先に討議したように、この装置は、その抵抗測定があまりに高くなる場合に十分に湿っていないので特定サンプルを拒絶するように選ばれることができる。
以下の実施例を、限定のためにではなく、説明のために提供する。
実験
一般的方法論
装置：
観察をプロトタイプ装置を使用して行った。この光学装置は、25ナノメータのバンド幅をもつ550ナノメーター・フィルター（S25−550−A,Corion Corporation,Holliston,MA）の下に載せられたSiemens BPW−34B光検出器を含んでいた。試料を、25ナノメーターのバンド幅をもつ500ナノメーター・フィルター（Corion Corporation,S25−500−Ａ）を通してフィルターされた出力をもってMini−MagliteTMLM3A001光電球（Mag Instrument Inc.,Ontario,CA）により照射された。光検出器からの出力を（Joseph Car,Howard Samms ＆ CompanyによりIC User Casebook,1988の89頁に記載された）装備増幅器により増幅され、デジタル変換器に12ビットアナログによりデジタル化され、そしてIBM互換性パーソナル・コンピューター上に記録された。温度制御を、図４中に示すように、加熱された試薬台（50）内に試薬ストリップを置くことにより達成した。この台（50）は、その中央にテスト・ストリップ（10）をもつ上部ヒーター及び下部ヒーターを含んでいた。スロット（52）は、その台へのストリップ（10）の挿入及び除去を容易にするために、そしてその上からの容易なサンプル接近を提供するために、上部台内に提供された。この台は、並列に接続された８つの200オーム1/4ワットのレジスターにより加熱された。下部ヒーターのために。４つのレジスターを薄い回路盤（54）上に載せ、そして光学孔として0.5"直径孔（58）をもつ0.015"厚のアルミニウム・プレート（56）を加熱するために使用した。上部ヒーターのために、４つのレジスターを回路盤（60）上に載せ、そして２つの別個の、且つ電気的に単離された0.015"厚のアルミニウム・プレート（62）を加熱するために使用した。回路盤（60）は、さらに、試薬ストリップの孔（30）へのサンプルの容易な適用を可能にするためにその中に0.45"×1.5"開口（52）をもっていた。
図２及び図４の両方の中に示すように、その台の上部ヒーター上のアルミニウム・プレート（62）は、テスト・ストリップ・ホイル表面の電極の向かい合う側に密接していた。この台の比較的厚いアルミニウム・プレートは、レジスターから発散する熱を均一に分配するために作用し、そしてそのテスト・ストリップのホイル表面への良好な熱の流れを助けた。上記メーターのアルミニウム・プレートと上記テスト・ストリップのホイル電極の間の密接も、そのストリップの液体検出センサーの状態を検出するために使用された電気回路を形成するために使用された。
温度は、Acculex RTDR−２温度感知レジスター（Keithley MetraByte Instruments Corp.,Taunton MA）を介して上記台をモニタリングすることにより調節された。液体センサー及び温度センサーを構築するために使用された電極は、Dascon−1 Manual,copyright 1983,by Metrabyte Corporation,Taunton,MAの55及び62頁に記載された標準的な抵抗モニタリング回路である。別段の定めなき限り、温度を、IBM互換性パーソナル・コンピュータによりモニターされたフィードバック制御プログラムにより37℃において維持した。このコンピュータ・システムは、温度が37℃以下に降下したときに、６ボルトの電源を使用して熱にエネルギーを与えるスイッチング回路を制御した。使用において、試薬ストリップは、サンプルが適用される前に最小60秒の間37℃まで前平衡に供された。
Boc−Val−Pro−Arg−ローダミン110の調製
５グラムのBoc−Val−Pro−PH（カタログＡ−2480）をBachem Bioscience,Inc.,Philadelphia PAから購入した。これを、米国特許第4,557,862号及び米国特許第4,640,893号中のMangel,et.al.の方法に従って（Boc−Val−Pro−Arg）２−Rhodamine 110を作るために（CBZ−Arg）２−Rhodamine−110上に結合した。これは、ここに開示する例示的プロトロンビン時間検定におけるトロンビン生産を検出するために使用した酵素基質を形成した。
フォト−エッチされた電極孔の調製
以下の形状の反復シリーズから成るエッチング・パターンを調製した:1は、図１上の（20）として示すような0.625"長さ、0.015"幅の電極隙間、及び２は、図１上の（30）として示すような0.185"長さ、0.007"幅の液体孔であって、その電極隙間の中心上に十字の形状において配置され、それぞれのスリットが他のスリットから60゜の角度により分けられている。このパターンは、慣用のフォト−エッチング技術を使用してAccutech,Inc.,San Fernando,CAにより1mil厚のアルミニウム・ホイル上にエッチされた。孔は、0.500"×0.500"四角の形状にトリムされ、この孔は、この四角の中央に中心をもっていた。
コートされた膜の調製：
コートされた膜を、一般的に同時係属中の出願逐次番号07/874,667中に記載されているように調製した。
20mlのバイアル中で、小さなマグネチック・スターラーを使用して、以下の：
6ml 0.2M HEPES pH7.4;
2ml H2O;
1ml 100mM CaCl2;及び
500mg Sigmaポリ・ビニル・アルコールＰ−8136
を併合し、そしてそのPVAが全て溶解するまで約２時間攪拌した。
１グラムのSigmaプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミンＡ−3292を添加し、そしてその混合物を、それが全て溶解するまで約２時間攪拌に供した。4.5倍濃縮Dade−Ｃトロンボプラスチン（Baxter B4216−20、Baxter Healthcare Corporation,Miami,FL）の溶液を、トロンボプラスチンの公称4mlの容器に880μｌのH2Oを添加することにより調製した。1mlのこの濃縮（4.5倍）Dade−Ｃトロンボプラスチンをそのディップに添加し、そして10分間攪拌した。50％イソプロパノール、50％H2O中に溶解した蛍光トロンビン基質の1mlの濃縮（4mg/ml）溶液を次に添加し、そして得られた混合物を10分間攪拌した。
膜浸液（ディップ（dip））：
BTS−25 0.45μｍ不斉ポリスルホン膜（Memtec/Filterite Corporation,Timonium MD）の大き細孔側（鈍い側（dull side））を新たなディップにより素早くコートし、そして過剰のディップを穏やかに搾り出した。このコートされた膜を15分間50℃において機械対流オーブン内で直ちに乾燥させた。この膜を次に使用まで冷（４℃）条件下で乾燥剤と共に保存した。
膜ストリップの調製：
試薬支持層（14）、図１は、10mil厚の透明スチレンから構成されていた。様々な層を、3M Corporationにより製造された0.5"幅の3M 415両面接着テープにより一緒に保持した。これらのストリップを手で組み立てるために、２つの初歩的アセンブリーを最初に作った。第一のアセンブリーは、上記両面接着テープ内に前もって孔を開けられ0.500"離れて配置された0.25"直径の孔のシリーズから成っていた。この接着テープ（24）、図１を次に、それぞれ0.500"離れた１連の反復孔を含む一定の長さのホイルに適用した。接着テープの非存在中その反復孔構造を無傷で維持するために使用した過剰のホイルを、次にトリムして除去して、１つの側上に接着剤をもつ”孔テープ”アセンブリーを、そして他の側上に電極孔の反復シリーズを作り出した。これを、デリケートな電極孔構造を無傷に維持するために平らに維持した。
3M 415テープによりラミネートされた透明スチレンのストリップ及び0.5"幅の処理反応膜の一定の長さから成る第二の初歩的アセンブリーを作った。その反応膜への接着剤の移動及び保存の間のその可能性のある有害な効果を回避するために、一連の0.25"孔を、その最終ストリップ（22）、図１上の”反応ゾーン”の直下にあったテープのセクション内で0.500"おきにパンチした。従って、その反応ゾーン内のコートされた膜は、金属ホイルの孔カバーを除きいずれの材料とも直に接触しなかった。上記２つの初歩的アセンブリーを次に光箱の助けをにより芯を合わせ、そして一緒にラミネートした。この最終的アセンブリー上に反復サブユニットを次にテストのために個々のストリップに切断した。
上記試薬、及び先に記載したメーターを、その後以下の実験を行うために使用した。
実験1:
生物学的液体の添加の間の抵抗降下：試薬ストリップを先の方法に従って調製した。これらのストリップを横切る抵抗を時間の関数としてモニターした。血液の添加の前、電極接点を横切る抵抗は有効に無限大（＞100メガ・オーム）であった。血液の添加の間、その抵抗は、約30キロ・オームに直ちに降下した。
実験2:
抵抗の読みによる不十分サンプルの検出。先の方法に従って調製した試薬ストリップに、それぞれ、1.0、2.0、3.0、及び4.0μｌの全血を与えた。６分間の反応時間の後、様々なストリップの対応抵抗測定値は：
サンプル・サイズ 抵抗
1.0μｌ                          2.5メガ・オーム
2.0μｌ                          400キロ・オーム
3.0μｌ                           60キロ・オーム
4.0μｌ                           40キロ・オーム
であった。
従って、不十分サンプルは、抵抗における実質的な増加により検出されることができた。
実験3:
低湿度における反応速度に対する金属ホイルの効果：金属ホイルを省いたストリップを調製し、そして低い周囲湿度環境におけるSigma血液凝固対照Ｉ、II及びIII血漿及びテスト計時の手動開始をもって研究した。表面カバーの非存在中、より低い蛍光強度が顕出され、そしてレベルＩ及びレベルIII（遅延化された、及び非常に遅延化されたPT時間対照）のための反応速度が有意に遅延された。
実験4:
低い湿度における反応速度に対する透明試薬支持内の孔の効果：金属ホイルを含むが、さらにその膜上の反応ゾーンの直下の透明支持内に置かれた0.25"直径の孔を含むストリップを調製した。これらを、低周囲湿度環境における血液凝固対照Ｉ、II及びIII血漿（Ｃ−7916、Ｃ−8916及びＣ−9916、Sigma Chemical Company,St.Louis MO）をもって研究した。表面カバーの非存在中、より低い蛍光強度が顕出し、そしてレベルII及びレベルIII（遅延化された、及び非常に遅延化されたPT時間対照）のための反応速度が有意に遅延された。
実験5:
試薬の温度平衡に対する金属ホイル・カバーの効果：それらがそのメーターに適用される前、そのテスト・サンプルを様々な異なる開始温度（典型的には15−30℃）にあることができる。正確な結果を与えるため、テスト物品は、可能な限り速くこれらの異なるサンプルをその同一反応温度（典型的には37℃）に平衡化されなければならない。この実験は、速く平衡化する様々なサンプルにおいて。金属ホイル・カバー対非−金属プラスチックカバーの相対的な効果を測定した。
この実験において、一連のテスト物品を、1mil厚アルミニウム・カバー、又は5mil厚透明スチレン・カバーのいずれかをもって調整した。これらは、メーター第内に置かれ、そして37℃に平衡化された。10μｌの数滴の水（４℃）を次に適用し、そしてその温度を非接触赤外温度計（Ｃ−1600メーター、Linear Laboratories Company,Fremont,CA）によりモニターした。アルミニウム・ホイル及び透明スチレンの両方を黒に平らにペイントして（Model 2529マーカー、Testor Corp.,Rockford IL）、その赤外線のついての等価な条件を提供した。得られた温度は：
適用後の時間（秒） ホイル温度 プラスチック温度
１              33             20
５              35             23
10              37             26
15              37             28
30              37             33
45              37             37
であった。
結果は、上記ホイル・カバーが、上記プラスチック・カバーが平衡化するよりも速く所望の温度に上記サンプルを平衡化したことを示している。
実験6:
メーター・ハッチによらない蛍光検定の実施：以下の実験において、メーターを、15秒毎に短くその光源を回し、そしてその蛍光値を記録することにより蛍光測定を行うようにプログラムした。しかしながら、そのメーター自体の光源が点灯する直前に、そのメーターは、”背景”値をも記録した。この背景値は、次にそれぞれの蛍光測定値から差し引かれた。
狭いスプリットをもつ非−光透過性カバー、例えば、先に討議した金属ホイル配置が使用されたとき、その装置は、外部の光−−例えば、正常な室の光、又は間接的な太陽光の存在又は非存在に顕著に非感受性であった。これは、そのストリップ上の金属ホイル・カバーによる周囲光の大きな減衰、本実験において使用されたRhodamine 110蛍光剤の高い蛍光効率及び量、及びここで使用した背景差引アルゴリズムを含む要因の組み合わせに帰せられる。
実験7:
臨床的研究:Coumadinにより処理されていた20患者を含む27患者からの静脈血を採血し、クエン酸塩中に保存した。各患者からの全血の10μｌサンプルを、先に記載したようにその装置上で走らせた。。蛍光測定を６分間15秒ごとに行った。半最大に達する蛍光強度に必要な時間（T50％）を、MLA Electra 750血液凝固メーター上で測定するときその対照プロトロンビン時間に対してプロットした。回帰分析をMicrosoft Excel 4.0ソフトウェアを使用して行った。
そのT50％レベルをその対照装置と関連付ける最適多項式は、
（補正された）プロトロンビン時間
＝1.93＋0.079＊T50％
であることが見いだされた。相関係数（R2）は0.92であった。この実験からの結果を図５中に示す。これらの結果は、この形態が良好な良好な臨床的結果を与えることができるということを示している。
これまで、本発明を説明及び実施例の目的をもっていくぶん詳細に記載してきたが、特定の変更及び修正が添付クレームの範囲内で行われ得ることは明らかであろう。
【図１】
0003618745.tif 000002
【図２】
0003618745.tif 000003
【図３】
0003618745.tif 000004
【図４】
0003618745.tif 000005
【図５】
0003618745.tif 000006