(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-グルロン酸のオリゴマーまたはポリマーおよび適当な薬理剤学的担体を含有してなる、白血球由来のサイトカイン産生抑制用の薬用組成物であって、L-グルロン酸残基のオリゴマーまたはポリマーが、９０％のL-グルロン酸および１０％のD-マンヌロン酸残基を含有し、１０〜６０の重合度をもつ、薬用組成物。
【請求項２】
L-グルロン酸残基のオリゴマーまたはポリマーが、α1-4結合したL-グルロン酸を含有する、請求項１に記載の薬用組成物。
【請求項３】
α1-4結合したL-グルロン酸のオリゴマーまたはポリマーが、４．３６Åの繰り返し距離をもつグルコウロナン(glucouronan)の、ジアキシアルに結合したウロン酸ポリマーを含有してなる、請求項１に記載の薬用組成物。
【請求項４】
敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症および中毒性ショック症候群の治療および緩和用の薬用組成物の製造に使用する、α1-4結合したL-グルロン酸のオリゴマーまたはポリマーの使用方法。
【請求項５】
白血球由来のサイトカイン産生抑制用の薬用組成物の製造に使用する、α1-4結合したL-グルロン酸のオリゴマーまたはポリマーの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生化学及び免疫学の分野に関するものであり、免疫学的な反応の抑制のための生物学的物質に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ヒトおよび哺乳類におけるインターロイキン−１（IL-1）、インターロイキン−６および腫瘍壊死因子の産生阻害に関するものである。さらに、本発明は、特定の疾患および炎症状態を阻止または緩和するために、サイトカインの産生を阻害する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および課題】
動物体内のリンパ球又は白血球細胞には、B-細胞とT-細胞の２種類がある。B-細胞は、侵入しようとしている生物に結合する免疫グロブリンの形で抗体を産生するが、T-細胞は、B-細胞を促進又は抑制する原因となるリンフォカイン又はサイトカインを産生する。抗原又は有糸分裂促進因子との接触のみならず、リンフォカイン又はサイトカインとして知られている一定の因子の有無に正常なリンパ球の増殖が左右されることは周知のことである。
免疫学における重要な食細胞は、多形核白血球（例えば好虫球）および単核食細胞（例えば単核細胞（monocytes）およびマクロファージ）である。食細胞の機能低下は、再発性化膿性感染（recurrent pyogenic infection）の原因となる。化膿性感染をなくすために、好虫球および単核細胞は、感染源に向かって動くことにより化学走性因子に反応し、そこでこれらは微生物を摂取し殺す。
さらに詳しくは、多形核白血球および単核細胞の主な機能は、細菌や他の伝染性の物質を食作用により殺すことである。これらの細胞による摂取の最初の段階および特定の物質の消化は、通常化学走性によって細胞および粒子を運ぶプロセスを包含する。この反応は、感染に対する宿主の防衛の重要な部分である。移動する割合が多くなること、およびこれらの細胞の活性が高まることは、宿主の障害または侵入の場所での炎症により発現する。
正常なリンパ球の成長は、抗原物質またはマイトジェンとの接触ばかりでなく、リンフォカインまたはサイトカインとして知られる特定の因子の存在にも依存することは周知のことである。
【０００３】
既知のリンフォカインとしては、IL-2、B-細胞因子、マクロファージ活性化因子（MAF)、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3) 、インターロイキン-6、コロニー形成刺激因子（CSF)、腫瘍壊死因子（TNF)およびγインターフェロンを包含する。これらの因子のすべては、白血球から分泌され、集合的にサイトカインとして知られている。
単核細胞は、LPS(リポ多糖類）のような様々な因子により刺激され、TNF 、IL-1及びIL-6など、一定のサイトカインを産生すると考えられる。LPS には多糖類とリピドＡ部分が含まれている。β1-3 グルカンの様な多糖類が、単核細胞のサイトカイン産生を刺激することが報告されている。特定のサイトカイン刺激物質は、我々の米国同時係属出願、出願番号07/676,103に記載されている（発明の名称は、“ジエクアトリアル結合したβ1-4ポリウロン酸およびサイトカイン刺激のためのその使用”）。
【０００４】
本発明は概してサイトカイン、特に生物学的に活性な哺乳類のIL-1、IL-6及びTNF の刺激に関するものである。IL-1は、免疫原性及び外傷性の刺激に反応して、マクロファージ及び他の一定の細胞により放出されるポリペプチドの仲間に与えられた名称であって、傷害及び感染に対する宿主の反応開始に本来の役割がある。このようなサイトカインは複雑な生物学的活性スペクトルを示す。特にIL-1は、IL-2放出誘導による胸腺細胞の増殖を惹起することができ、またＢリンパ球の増殖及び成熟を刺激することができる基本的な免疫刺激信号である。加えてIL-1は、プロスタグランジン産生、発熱及び創傷治癒の促進と関連がある。
最近では、IL-1およびIL-6共に敗血症性ショックの重要なメディエーターとして関係するとされている（Ohssonら、Nature 348、 550-557、1990年；Starnesら、J. Immunol. 145、 4185-4191、1990年）。
IL-1および他の白血球由来のサイトカインの中では、白血球付着の促進および好虫球化学走性の抑制を行うものがあり、これらはともに、疾患および炎症症候群に直接機能する。
ＴＮＦは、炎症応答時、身体の様々な細胞および組織に対して様々な広範囲の効果を有することが示されている。ＴＮＦは、敗血症性ショックの病原のメディエーターとして考えられてきた（Waage, A、A. HalstensenおよびT. Espevik、“Association between tumor necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal desease"（血清中の腫瘍壊死因子と髄膜炎菌の疾患をもつ患者の致命的な結果との間の関係）、Lancet:355、1987年）。つまり、ＴＮＦの産生を選択的に抑制する能力は、非常に望ましいことである。ＴＮＦの産生を選択的に抑制できる薬剤は、炎症および変性疾患を制限するための治療に有用である。
激しい炎症の刺激に反応する白血球は、刺激付近の内皮に接着することを含み、複雑な様々な事象を包含する。サイトカインの抑制は、敗血症ショックおよび成人呼吸窮迫症候群のような状態に見られる炎症の程度を減少させると期待できる。
【０００５】
IL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来サイトカインの抑制は、炎症に加え、組織拒絶や特定の自己免疫障害の原因となる免疫刺激を含むこれらの条件の多くを、制御し、減少させ、緩和するのに有益である。しかしながら、最適な免疫刺激およびその抑制のための組成物の構造的な要求については、ほとんど知られていない。所望するIL-１およびＴＮＦの活性や他の白血球由来のサイトカインの活性を抑制する度合や、抑制が生体外で検出され得る容易さを考慮すると、抑制が生体内の投与に適当である、IL-1、ＴＮＦおよび他のサイトカインの抑制のための当該技術における要求がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、当該技術におけるこれらの要求を達成する助けとなるものである。これは、IL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来のサイトカインによりもたらされる、あるいは介在する条件を緩和するのに有効に使用され得る化合物の分類を行うことによるものである。この化合物は、生体内および生体外の試験によって示されるように、低濃度のメディエーターでさえ、サイトカイン産生を顕著に抑制するものである。
さらに詳しくは、本発明は、α1-4結合したL-グルロン酸（本明細書においては、しばしばG-ブロックとよぶ）を哺乳類に投与することによる、哺乳類におけるIL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来のサイトカインの産生を抑制する方法を提供するものである。
β1-4結合したD-マンヌロン酸は、生体外における強力なサイトカインインデューサであり、これは単核細胞からのＴＮＦ−α産生の刺激に関して、ＬＰＳ（これもまた強力なサイトカインインデューサである）と、β1-4結合したマンヌロン酸残基との間に類似性がある。α1-4結合したL-グルロン酸のブロックは、β1-3結合したグルカンではなく、β1-4結合したD-マンヌロン酸残基およびＬＰＳにより、サイトカイン刺激活性を抑制した。このように、α1-4結合したL-グルロン酸のような多糖類は、サイトカイン誘導に効果のあるＬＰＳおよびβ1-4結合したD-マンヌロン酸を抑制するために使用することができる。
【０００７】
図１は、poly-M（○）、LPS(△) 、SG（☆）、C60XY （□）及びキトサン（◇）で刺激された単核細胞からのTNF-αの産生を示すグラフである。無刺激の単核細胞からのTNF-αの産生は0.1 ng/ml 未満であった。
図２は、分子量が異なるpoly-M（ａ）及びキトサン（ｂ）のサンプルで刺激された単核細胞からのTNF-αの産生を示すグラフである。無刺激の単核細胞からのTNF-αの産生は0.08 ng/ml未満であった。
図３は、G-ブロックを添加せずに（△）または添加して（黒三角）ＬＰＳで刺激した単核細胞からのＴＮＦ−α産生を示すグラフである。無刺激の単核細胞及びG-ブロック１mg/ml で刺激した単核細胞からのサイトカイン産生は、0.1 ng/ml未満であった。
図４は、G-ブロック１mg/ml を添加せずに（□) 又は添加して（黒四角) M-ブロックで刺激した単核細胞からのTNF-α（ａ），IL-6（ｂ）及びIL-1（ｃ）産生抑制を示すグラフである。無刺激の単核細胞及びG-ブロック１mg/ml で刺激した単核細胞からのサイトカイン産生は、0.01 ng/ml未満であった。
図５は、本発明に使用した様々な多糖類の構造の一部の図解である。
図６は、Ｇ−ブロックおよびＬＰＳ過剰の存在下、単核細胞に結合するpoly-Mのフロー血球計算ヒストグラムを示すグラフである。poly-Mの結合は、poly-Mに特異的なFITCをラベルしたモノクローナル抗体（我々が開発した2G8）を用いることにより定量した。増加している螢光は、単核細胞に結合した増加したpoly-Mを表している。
【０００８】
ここで用いる様に、“白血球由来のサイトカイン”という用語及び表現には、広い意味が与えられている。特に、ここで用いる“白血球”という用語は、哺乳類の顆粒球系及びリンパ球系細胞を意味する。白血球細胞の例としては、好中球のような多形核白血球、単核細胞やマクロファージのような単核食細胞及びリンパ球がある。
ここで用いる”サイトカイン”という用語は、白血球の分泌産物、特に抗体に接触した後に、白血球により放出される非抗体蛋白を意味し、免疫反応の細胞内メディエーターとして作用する。本発明の範囲内のサイトカインの例としては、走化性因子、リンパ球複製促進因子、リンパ球複製抑制因子、マクロファージの付着力に影響を及ぼす因子、マクロファージによる酵素分泌に影響を及ぼす因子、酸素、スーパーオキシド、過酸化水素並びに水酸基など、酸化剤の分泌を引き起こす因子がある。
【０００９】
IL-1および他の白血球由来のサイトカインの産生を抑制するための本発明の化合物の能力を、以下に示し且つ記述する。
要約すると、本発明方法に使用される本発明の化合物は、多形核白血球のような食細胞におけるIL-1や腫瘍壊死因子のような白血球由来のサイトカインの産生を調節することができる。この化合物は、刺激された食細胞の脱顆粒に対するサイトカインの効果を調節することができる。これらの化合物によるIL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来のサイトカインの示された抑制は、少なくとも以下で述べる特定の部分および状態に、臨床的に有効であることが暗示される。
IL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来のサイトカインは、広く多様な哺乳類の病気にかかわりあってきたので、本発明の応用範囲も同様に広い。IL-1、IL-6、ＴＮＦおよび他の白血球由来のサイトカインの抑制により治療または緩和される病気を以下に示す。敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、中毒性ショック症候群。
【００１０】
材料と方法
多糖類
Grasdalen らが先に記述（“A  p.m.r. studie of composition and sequence of uronate residue in alginate （アルギン酸塩におけるウロン酸残基の配置及び連続に関する陽子磁気共鳴研究）”; Carbohydr Res 1979; 68:23)したように、本発明で使用した様々な多糖類の重合度（DPn）およびモノマー組成や連続的配置も、Bruker 400 WM 分光計を用いて1H−核磁気共鳴分光学で解析した（Grasdalen H 。1983年。High-field 1H-n.m.r. spectroscopy of alginate: sequencial structure and linkage conformation.(アルギン酸塩の高磁場1H−核磁気共鳴分光学。連続構造及び結合配座。)Carbohydr Res 118:255参照）。
Haugらの記述（"Correlation between chemical structure and physical properties of alginates（アルギン酸塩の化学構造と物理学的特性との相関関係）" Acta chem scand 1967:21:768)に従って、Ascophyllim nodosum の子実体の細胞内物質から、D-マンヌロン酸(D-ManA)を95% 以上含有するM-ブロックを分離した。M-ブロックはDPn = 30-35 であった。
Haugらが記述した方法（"Studies on the sequence of uronic acid residue in alginic acid.（アルギン酸におけるウロン酸残基の連続に関する研究）1987: 21:691）で、L-guluronic acidを90% 以上含有し、DPn = 25-30 のG-ブロック(L-GulA)を藻類から分離した。
【００１１】
以前に記載されたように(Skjak-Braek G., Grasdalen H., B.Larsen. 1986 年。Monomer sequence and acetylation pattern in some bacterial alginates.(細菌アルギン酸塩のモノマー連続及びアセチル化パターン。)Carbohyd. Res., 154:239) 、低温で増殖したPseudomonas aeruginosa DE 127 の液体培地から、高分子量のホモポリマーβ1-4 結合D-ManA（poly-M) を分離した。Mark-Howink Sakurada関係（Harding S., Varum K.M., Stokke B.T., O.Smidsrod.。1990年。Molecular weight determination of polysaccharide.（多糖類の分子量決定） Advancees in Carbohydrate Chemistry. Vol.1. JAI Press. 、印刷中) を用いて、固有の粘度測定により平均分子量(Mw)を推定した。粘度自動希釈装置が付いたUbbelohde 懸濁毛細管粘度計（Scott-Gerate) には、20℃の塩化ナトリウム水溶液（0.1 M)を用いた。この高分子量poly-Mから、 pＨ5.4 、100 ℃で10〜120 分間、部分的加水分解を行い、鎖の長さが異なるサンプルを作った。
【００１２】
セルロースC-6 位を酸化して調製したβ1-4 結合したグルクロン酸（D-GLcA)(C60X）(Painter T.J., Cesaro A., Delben F., S.Paoletti.。1985年。New glucuronnoglucan obtained by oxidation of amylose at position 6.（アミロース６位の酸化により得られた新しいグルクロノグルカン）Carabohydr. Res., 140:61) は、イタリア TriesteのA.Cesaro博士から提供された。粘度測定法により分子量(Mw)を60、000 と推定した。電位差滴定法により、酸化度（94%)を測定した。
【００１３】
エビの殻からキチンを分離し(Hacman R.H. 1954 年。Studies on chitin. 1. Enzymic degradation of chitin and chitin esters.( キチンに関する研究１。キチン及びキチンエステルの酵素的分解) 、ハンマーミルで粉砕し、0.5 mmのふるいを通過させた。均質条件下でのキチンのN-脱アセチル化にはSannanらの技法を用いた(Sannan T., Kurita K., Y.Iwakura. 1976年。Studies on chitin. 2. Effect of Deacetylation on Solubility.（キチンに関する研究２．脱アセチル化が溶解度に及ぼす影響。) Macromol. Chem. 177:3589) 。高磁界核磁気共鳴分光法（Varum K.M., Anthonsen M.W., Grasdalen H., O.Smidsrod.1990 年。N.m.r. Spectroscopy of Partially N-deacetylated Chitins(Chitosans)1. Determination of the Degree of  N-deacetylation and Distribution of N-acetyl Groups. （部分的にN-脱アセチル化したキチン（キトサン) の核磁気共鳴分光法１．N-脱アセチル化度の測定及びN-アセチル基の分布。）Carabohydr. Res., 印刷中）により脱アセチル化度(40%) を測定した。雰囲気温度で一晩、穏やかに振りながらキトサンを酢酸（2% w/v) に溶解した。既知量（10〜100 mg) の亜硝酸ナトリウム固体を各溶液に加えて分子量の異なるキトサンを作り、室温で一晩、暗い場所に保存し、最終的に水酸化ナトリウムで中和した。分解したキトサンを、水酸化ホウ素ナトリウム（250 mg) で定型的に還元した。塩酸で本溶液の pＨを5.0 に調整して0.2 M 食塩及び蒸留水で透析し、最終的に凍結乾燥した。これでキトサンは水に容易に溶ける塩酸塩に変わった。SM 11736  酢酸セルロース膜を用いて、Knauer Membrane Osmometer でキトサン溶液の浸透圧を測定し、平均分子量（Mw) を求めた。0.1 〜0.8%（w/v)のキトサン濃度を用いた。
分子量が384,000 (Mw)の、各第３モノマーにβ1-6 結合したグリコピラノース残基を１つ有するβ1-3 結合したD-グルコース、スクレログルカン(SG)は、ノルウェー、トロンドハイムにあるトロンドハイム大学、NTH 、物理学研究所のB.T.Stokke博士から提供された。
本実験には、大腸菌由来のLPS (Sigma)(菌株026:B6) を使用した。
LAL 検定法（Kabi vitrum 、スウェーデン、ストックホルム) により、異なる多糖類中の内毒素混入を測定した。内毒素レベルは下記の通りであった。
C60XY 1 μl 中に40pg含有
キトサン１mg中に1.3pg 含有
SG１mg中に72pg含有
【００１４】
単核細胞培養
Boyum (Boyum AM.1976年、Separation of monocytes and lymphocytes.（単核細胞及びリンパ球の分離）Scan. J.Immunol., 5:9)の記述に従って、ヒトＡ+ 血液軟層（ノルウェー、トロンドハイム大学、血液銀行) から単核細胞を分離した。1%グルタミン、40μg/mlガラマイシン及びＡ+ 血清（ノルウェー、トロンドハイム大学、血液銀行) を含むRPMI 1640 (Gibco、英国ペーズリー) を含有する完全培地で、24ウェル培養平板中の単核細胞（Costar、合衆国マサチュセッチュ州ケンブリッジ) を培養した。
異なる多糖類及びLPS をリン酸緩衝食塩水に溶解し、0.2 μm のフィルター（Nuclepore 、カリフォルニアー州プレザントン) で無菌濾過した。多糖類及びLPS 溶液を完全培地中で希釈し、上澄を採収する16〜24時間前に単核細胞に加えた。多糖類及びLPS を加える前に、単核細胞の一部を組み換え型(r) ヒトIFN-γ(rIFN-γ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ、Genentech 社) と共に30分間、予めインキュベートした。
【００１５】
単核細胞由来の上澄中のTNF-α検定法
記述（Espevik T., J.Nissen-Meyer。1986年。A Highly sensitive cell line, WEHI 164 clone 13, for measureing cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocyte. （ヒト単核細胞由来の細胞傷害性因子／腫瘍壊死因子測定用の、高度に敏感な細胞株WEHI 164  クローン 13 。)J. Immunol. Methods, 95:99)に従って、線維肉腫細胞株WEHI 164  クローン13に対する細胞傷害作用によりTNF-α活性を求めた。標準として、 rTNF-α（ rTNF-α（ヒト）及び rMuTNF-α、Genentech)の希釈液が含まれていた。本検定法のTNF-α特異性は、記録されている活性（データは示さず) を完全に相殺する、rTNF- αに対する２つのモノクローナル抗体を使用することにより証明された。三重の測定値のng/ml ±標準誤差で結果が表された。
【００１６】
単核細胞由来の上澄中のIL-1検定法
２段階検定でIL-1活性を求めた。Gaering らが記述した様に（Gaering A.J.H., Bird C.R., Bristow A., Poole S., R.Thorpe.。1987年。"A simple sensitive bioassay for Interleukin-1 which is unresponsive to 103 U/ml of Interleukin-2. (103 U/ml  のインターロイキン-1に対して感度の鈍い、簡単で高感度のインターロイキン-1バイオアッセイ)" J.Immunol. Methods, 99:7)、第１段階では、ヒトIL-1に反応して高濃度のインターロイキン-2（IL-2) を産生するマウス胸腺細胞 EL4 NOB-1細胞株を必要とする。標準として、rIL-1 β（Glaxo,  スイス、ジュネーブ) の希釈液が含まれていた。37℃、5%二酸化炭素圧で24時間インキュベートした後、上澄100 μl を96ウェルの複製ミクロプレートに移した。Mosmann,T.（Mosmann,T.R., Cherwinski H., Bond M,W., Giedlin M.A., R.L.Coffman. 1986 年。Two types of murine helper T cell clone. 1. Definition according to profiles of lymphokine  activities and secreted proteins. （２種類のネズミヘルパーＴ細胞クローン。１．リンフォカイン活性及び分泌蛋白の概要による定義）。J. Immunol.,136:2348) が記述した様に、本検定法の第２段階では、IL-2依存性のマウスＴ細胞株 HT-2 を必要とする。HT-2懸濁液（1.5 x 105 細胞/ml)100 μl を各ウェルに加え、さらに24時間インキュベートした。rIL-1b及びrIL-1aに対するポリクローナル抗体（スイス、ジュネーブ、Glaxo のA. Shaw 博士から贈られた) でIL-1活性は完全に相殺された（データは示さず) 。結果は、三重の測定値のng±標準誤差として示された。
【００１７】
単核細胞由来の上澄中のIL-6検定法
Aarden らの記述（Aarden L.A., De Groot E.R., Schaap O.L., P.M.Lansdrop. 1987年。Production of hybridoma growth factor by monocytes. （単核細胞によるハイブリドーマ増殖因子の産生）。Eur. J. Immunol., 17:1411)に従って、IL-6依存性マウスハイブリドーマ細胞株B.13.29 クローン９により、IL-6活性を求めた。標準として、上澄及びrIL-6 (Brakenhoff J.P.J., De Groot E.R., Evers R.F., Pannekoekh H., L.A.Aarden.1987年。Molecular cloning and expression of hybridoma growth factor in Escherichia coli . （大腸菌におけるハイブリドーマ増殖因子の分子クローニング及び増殖因子。) J.Immunol., 139:4116) の希釈液を細胞（5 x 104 個) とともに96ウェルのミクロプレートで72時間インキュベートした。このプレートを採収し、IL-6活性を比色定量法で測定した( 以下参照) 。rIL-6 に対するポリクローナル抗体（ベルギーGlent 大学、W.Fiers 博士から贈られた) でIL-6活性を完全に相殺した（データは示さず) 。結果は、三重の測定値のng±標準誤差として示された。
【００１８】
MTT-検定（3-(4,5- ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5- ジフェニルテトラゾリウムブロマイド):
Mosmann (Mosmann T. 1983年。Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay.(細胞の増殖及び生存の迅速な比色検定法: 増殖及び細胞傷害検定への応用) 。J. Immunol. Methods, 65:55) の記述に従い、テトラゾリウム塩を使用することにより、増殖及び生存の比色定量検定法で、TNF-α、IL-1及びIL-6の検定における生存能力を求めた。
【００１９】
結果
藻類Ascophyllum nodosumから分離されたβ1-4結合したD-ManA（M-ブロック）は、ヒト単核細胞を刺激して、ＴＮＦ−α、IL-1およびIL-6を産生した（Otterlei M. Ostgaar K. Skajak-Baek G. Smidsrod O. and T. Espevik、1991年、Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate.（アルギン酸塩で刺激される、ヒト単核細胞からのサイトカイン産生の誘導）J. Immunotherapy、印刷中）。我々の同時係属出願において、我々は、Pseudomonas aeruginosaからβ1-4 結合したD-ManA（poly-M）のポリマーを分離し、そのTNF-α誘導能を他のβ1-4 及びβ1-3 結合した多糖類と比較した。図１は、poly-Mのサイトカイン（TNF）産生誘導能は、LPS とほぼ等しい強さで、それぞれβ1-3 結合D-グルコース（SG) の約100 倍、C-6 位が酸化されたセルロース（C60XY)の500 倍、キトサンの10,000倍であることを示している。
他のポリウロン酸とは対照的に、α1-4L-GulA（G-ブロック）は、ＴＮＦ−α、IL-1またはIL-6を産生する単核細胞を刺激しないことが我々により以前に発見されている（Otterlei M. Ostgaar K. Skajak-Baek G. Smidsrod O. and T. Espevik、1991年、Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate.（アルギン酸塩で刺激される、ヒト単核細胞からのサイトカイン産生の誘導）J. Immunotherapy、印刷中）。従って、G-ブロックがM-ブロックのサイトカイン誘導能力を抑制するかどうかの問題を検討した。図４ａ、ｂおよびｃは、１mg／mlのG-ブロックを、異なる濃度のM-ブロックに添加すると、単核細胞からのＴＮＦ−α、IL-6およびIL-1の産生を抑制することを示している。サイトカイン産生の抑制は、５：１のG-およびM-ブロックのモル比で、９７％を超えるものであった（図４ａ、ｂ、ｃ）。
【００２０】
次に、G-ブロックにより誘導されたＴＮＦ−α産生の抑制の特異性を試験した。単核細胞は、１mg／mlのG-ブロックの存在下または不存在下、１０μg／mlのpoly-MまたはＳＧで刺激された。図２から判るように、G-ブロックは、ＳＧにより誘導されたＴＮＦ−αの産生を抑制しなかったが、poly-Mで誘導したＴＮＦ−α産生は、５８％まで抑制した。この結果は、G-ブロックにより介在されるＴＮＦ−αの抑制は、非特異的な毒性によるものではないことを示している。さらに、G-ブロックは、C60XYからのＴＮＦ−α産生を、９０％を超えて抑制した（データは示さず）。
【００２１】
ＬＰＳ分子は、ＴＮＦ−α刺激活性に含まれる多糖類部分を含む（Mannel D.N. およびW. Folk、1989年、Optimal Induction of Tumor Necrosis Factor Production in Human Monocytes Requires Complete S-Form Lippopolysaccharide（ヒト単核細胞における腫瘍壊死因子の最適に誘導される産生は、完全なＳ形のリポポリサッカライドを必要とする）、Infection and Immunity、57(7)：1953年）。従って、G-ブロックがＬＰＳで刺激した単核細胞からのＴＮＦ−αの産生を抑制するかできるかどうかの問題を検討した。図３は、１mg／mlのG-ブロックを、異なる濃度のＬＰＳに添加すると、単核細胞によるＴＮＦ−α産生を減少させることを示している。この抑制は、ＬＰＳの低濃度でより有効であり、０.０１μg／mlで、９０％を超えるまでになった。このように、G-ブロックは数種の多糖類およびＬＰＳのＴＮＦ−α刺激活性を抑制することができる。
【００２２】
興味あることに、G-ブロックの添加は、ＳＧではなく、M-ブロック、poly-MおよびC60XYで刺激した単核細胞からのサイトカイン産生を抑制した。サイトカイン放出において、G-ブロックが誘導した減少は、低濃度のM-ブロックが低くなるほど強調され、競合した抑制が見られた。とくに理論を決定付ける訳ではないが、一つの可能性のある説明としては、G-ブロックで誘導されたサイトカインの抑制は、poly-M、M-ブロック、C60XYおよびG-ブロックすべてが単核細胞表面上の共通の多糖類レセプタに結合することである。さらに、poly-MとM-ブロックとの唯一の構造上の違いは、ホモポリマーD-ManA鎖の長さである（図５）。M-ブロックの場合、この鎖は、L-GulA残基（５％）により分割され、連続的なD-ManA残基数が平均５〜７個となる。M-ブロックにおける大部分のグリコシド結合は、ジ−エクアトリアル結合で、完全に伸ばした形のモノマーの長さは５.１７Åである（Atkins E.D.T、Mackie E.E. およびF.E. Smolko、1970年、Crystalline structure of alginic acid.（アルギン酸の結晶構造）Nature 225:626）が、D-ManAがD-ManAの代わりにL-GulAと結合すると、グリコシド結合はエクアトリアル−アキシアル（eq-ax）となる（図５）。eq-ax結合のモノマー間の長さは、di-aq結合より短い。D-ManAおよびL-GulAは、ほぼ同じ構造をもつ（C-5付近の立体配置のみが異なる）ため、M-ブロックとG-ブロックのサイトカイン産生刺激能の大きな差は、ホモポリマー構造の一部として順応する立体配座の違いが原因に違いない（図５）。
【００２３】
G-ブロックは主として、eq-ax 結合よりさらに短い（4.36Å) ジ−アキシアル（di-ax)グリコシド結合を有する（Atkins E.D.T., Mackie E.E., F.E.Smolko. 1970年。Crystalline structure of alginic acid.（アルギン酸の結晶構造。）Nature 225:626) 。G-ブロックは、L-GulAとD-ManAとの間にeq-ax 結合も幾らか含有する（１０％）。G-ブロックは、M-ブロック、C60XY 及びpoly-Mより小型であるが、その鎖は全て固体状で二つ折りのらせん軸を持ち、統計的機械的計算は、この結合の立体配座も溶液中では稠密であることを示した（Smidsrod O., Haug A.,S.Whittington. 1972年。The Molecular basis for some physical properties of polyuronides. （ポリウロニドの物理的特質に関する分子的根拠。)Acta Chem. Scand. 26:2563; Smidsrod O., Glover R.M.,S.G.Whittington. 1973年。The relative extension of alginate having different chemical compositions.（異なる化学組成を有するアルギン酸塩の相対的填充性。）Carabohydr. Res.27:107) 。
【００２４】
多糖類構造の検討を基にすると、M-ブロック、poly-MおよびG-ブロックは、共通して単核細胞上の多糖類レセプタに結合することが可能であるといえる。この結果は、G-ブロックが、poly-Mの単核細胞への結合を抑制することを示すデータと組み合わせることにより強調される（図６）。なぜG-ブロックがＳＧで誘導したＴＮＦ−αの産生を抑制しないのか、その理由としては、この多糖類の構造によるものであると考えられる。ＳＧ（β1-3結合したD-Glc）は、軸に沿った１.８mmの６残基を含み、繰り返し単位をもつ分子量約５万の３重のヘリックス構造を有するものである（Kojima T.、 Tanaka K.、 Itoh WおよびT. Yanaki、1986年、Molecular Weight Dependence of the Antitumor Activity of Scizophyllan（ジゾフィランの抗腫瘍活性の分子依存性、Agric. Biol. Chem.、50(1):231；Bluhm T.L.、Deslaudes I.、Marchesean R.T.、Perez S.およびM. Rinando、1982年、Solid state and solution conformation of scleroglucan.（スクレログルカンの固体状態および溶液形状）、Carbohydr. Res. 1:117）。従ってＳＧは、β1-4およびα1-4結合した多糖類からの異なる立体構造を有し、同様のレセプタに結合できないであろう。
【００２５】
さらにG-ブロックは、単核細胞からＬＰＳで誘導したＴＮＦ−αの産生を抑制しないことが見られた。一つの可能性のある説明としては、この効果は、ＬＰＳの多糖類部分は、ＬＰＳの単核細胞への結合に必要であり、多糖類部分はG-ブロックに類似しているということである。ＬＰＳおよびG-ブロックが、共通のレセプタを分け合うという事実は、poly-Mの単核細胞への結合を測定することにより実証される。これらの組み合わされた試験は、ＬＰＳおよびG-ブロックが単核細胞へのpoly-Mの結合を抑制することを示している（図６）。ＴＮＦ−αは、グラム陰性感染によりもたらされる敗血症性ショックのメディエーターであることが示された（Exley A.R.、 Cohen J.、 Buurman W.、 Lumley J.、 Hanson G.、 Aulalih J.M.、 Bodmer M.、 Stephens S.、 Riddel A.およびM. Perry、1990年、Monoclonal antibody to TNF-α in severe septic shock.（激しい敗血症性ショックにおけるTNF-αに対するモノクローナル抗体；Waage A.、 Halstensen A.およびT.Espevik、1987年、“Association between tumor necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal desease"（血清中の腫瘍壊死因子と髄膜炎菌の疾患をもつ患者の致命的な結果との間の関係）、Lancet:355）。従って、ＬＰＳのＴＮＦ−α産生能力を抑制する、決定された多糖類の同定は、グラム陰性敗血症性ショックの治療に重要なものである。
【００２６】
薬用組成物は、単独又は適当な薬理剤学的担体又は補助剤との混合剤として、患者への投与に適した方法で調剤した、L-グルロン酸のオリゴマーまたはポリマーを含有する。
非経口的調剤品として全身療法用組成物を調製することが特に望ましいが、経口投与のような他の投与形式も考えられる。
本発明の組成物の適当な非経口製剤は、無毒で不活性な液体担体又は希釈液を含有する注射液の注射である。
本発明の化合物の適当な経口製剤は、無毒で不活性な固体の担体、希釈剤又はその他の容認できる添加物を含有する錠剤又はカプセル剤である。
本製剤は不活性又は薬理学的に活性な添加物を含有することができる。さらに、薬剤を保存および／または定するために通常使用される物質、浸透圧を変えるための塩、並びに緩衝液及び他の添加物が存在してもよい。
本製剤の投与量は、適応症、使用様式及び投与経路によって変えることができる。敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症および中毒性ショック症候群の炎症病原の影響の治療または緩和に必要な、平均的な成人患者の全身療法は、非経口投与で約0.1-100 mg/kg 体重/ 注射となる。
【００２７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】多糖類で刺激された単核細胞からのTNF-αの産生を示すグラフである。
【図２】分子量が異なるサンプルで刺激された単核細胞からのTNF-αの産生を示すグラフである。
【図３】  G-ブロックを添加せずにまたは添加して、ＬＰＳで刺激した単核細胞からのＴＮＦ−α産生を示すグラフである。
【図４】  G-ブロックを添加せずにまたは添加して、 M-ブロックで刺激した単核細胞からのTNF-α、IL-6およびIL-1産生抑制を示すグラフである。
【図５】本発明に使用した様々な多糖類の構造の一部を示す図である。
【図６】  G-ブロックおよびＬＰＳ過剰の存在下、単核細胞に結合するpoly-Mのフロー血球計算ヒストグラムを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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