(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。
（１）作用：
（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒ（式中、Ｒはペプチド鎖を示す）を受容体として、グアノシンジホスフェート−フコースから、受容体の最もペプチド鎖に近いＧｌｕＮＡｃの６位の水酸基にフコースを転移し、（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒを生成する。
（２）至適ｐＨ：約７．５
（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である。
（４）至適温度：約３０〜３７℃
（５）阻害または活性化：活性の発現に、２価金属を要求せず、また、５ｍＭＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されない。
（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
【請求項２】
ヒト細胞培養液から精製された請求項１記載のヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
ヒト細胞培養液がヒト胃癌細胞無血清培養液である請求項２記載のヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はヒト由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼに関し、特にアスパラギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）の根幹部のＡｓｎに結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に、α１→６結合でもって、グアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）−フコースからフコースを転移する酵素であって、糖鎖の修飾や合成などの糖鎖工学および／または癌などの疾病の診断に有用なヒト由来の新規なα１→６フコシルトランスフェラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高等生物由来の糖蛋白質、糖脂質等の複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能に関する関心が高まっており、その研究が盛んに行われている。糖鎖は糖加水分解酵素及び糖転移酵素の作用により形成されるが、その中でも糖転移酵素が寄与するところが大きい。
糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素である。その受容体糖鎖構造に対する特異性は、厳密であり、通常、一つのグリコシド結合は対応する一つの転移酵素によって形成される。それ故、糖転移酵素は複合糖質の糖鎖部分の構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合成、天然の糖鎖構造の修飾に利用されている。
また、糖鎖の人工的な改変による複合糖質あるいは細胞の性質の改変への利用が期待されている。これらのことから、基質特性の明らかな種々の糖転移酵素の開発が望まれている。
【０００３】
α１→６フコシルトランスフェラーゼは、細胞内小器官のゴルジ体に存在する酵素であり、アスパラギン結合型糖鎖のプロセッシングを制御する酵素のうちの一つであると考えられる重要な酵素である。該酵素をアスパラギン結合型糖鎖に作用させることで、その制御機構の解明、糖鎖構造形成の制御等に役立つと考えられる。
【０００４】
また、肝臓癌や嚢胞性線維症などのいくつかの疾病におけるα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の上昇、該酵素反応生成物の割合の増加が知られており、該酵素の診断用途としての早急なる開発が望まれている。
【０００５】
α１→６フコシルトランスフェラーゼは、各種動物の体液あるは臓器中、各種動物の培養細胞に活性は検出されているものの、精製された酵素標品としては、ブタの脳から精製されたα１→６フコシルトランスフェラーゼについては、平成７年年度第68回日本生化学会大会にて既に発表されている。
しかし、ヒト由来のものは未だ、ヒト嚢胞性線維症細胞破砕物［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー  (Journal of Biological Chemistry) 、第 266巻、第21572 〜21577 頁(1991)］由来の酵素が知られているが、この酵素は膜結合型酵素として得られ、さらに細胞の培養に牛血清を必要とすることから、酵素の精製が困難なうえ、出発材料となる細胞を培養するのに莫大な費用がかかることから、該酵素標品を安定して供給することは事実上困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は糖鎖構造解析、糖鎖工学用試薬や診断薬として、安定して供給可能なヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために、種々検討した結果、ヒト細胞培養液からα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を精製し、酵素学的性質を解明して、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有するヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼである。
（１）作用：
（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒ（式中、Ｒはペプチド鎖を示す）を受容体として、グアノシンジホスフェート−フコースから、受容体の最もペプチド鎖に近いＧｌｕＮＡｃの６位の水酸基にフコースを転移し、（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒを生成する。
（２）至適ｐＨ：約７．５
（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である。
（４）至適温度：約３０〜３７℃
（５）阻害または活性化：活性の発現に、２価金属を要求せず、また、５ｍＭＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されない。
（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
【０００９】
【発明の実施態様】
本発明の酵素の精製出発材料としては、α１→６フコシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト細胞培養液であればいかなるものでもよい。α１→６フコシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞の具体例としては、例えばヒト膵臓癌細胞、ヒト胃癌細胞、ヒト骨髄腫細胞等が挙げられる。
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは膜結合型酵素として細胞膜に存在するが、タンパク質分解酵素によって酵素活性に影響のない部位で切断されることにより可溶型酵素として培養液中に放出されるので、細胞の破砕、酵素の可溶化などの煩雑な操作なしに培養液を粗酵素液として用いることができる。また、無血清培養可能な細胞を用いることで、高純度の粗酵素液を安価に得ることができる。培養液を濃縮、脱塩した後、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどにより夾雑する他のトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ活性のない精製酵素標品を得ることができる。
【００１０】
本発明では、例えばヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５の無血清培養液を限外濾過膜で濾過濃縮、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび０．１％ＣＨＡＰＳ〔３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォネート〕を含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝液交換を行い、粗酵素液をすることができる。
【００１１】
さらに、この酵素液をＱ−セファロース、ＧＤＰ−ヘキサノールアミンセファロース、（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃ−アスパラギンセファロース等のカラムクロマトグラフィーに供し、活性画分を集めて、本発明のフコシルトランスフェラーゼを精製することができる。
【００１２】
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼの酵素化学的性質は、次のとおりである。
（１）作用：
（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒ（式中、Ｒはペプチド鎖を示す）を受容体として、グアノシンジホスフェート−フコースから、受容体の最もペプチド鎖に近いＧｌｕＮＡｃの６位の水酸基にフコースを転移し、（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１─２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１─４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｕｃＮＡｃ−Ｒを生成する。
【００１３】
（２）酵素活性の測定
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の測定は、次のようにして行った。すなわち、糖鎖末端のアスパラギンを４−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミン〔ＰＡＢＡ：−ＮＨ2 （ＣＨ2 ）4 −ＮＨ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ〕で蛍光標識した下記化１で示される化合物を酵素活性の測定基質として用いた。該基質を用いることにより、フコースのα１→６結合で転移した酵素反応の生成物の高速液体クロマトグラフィーによる蛍光検出が可能となる。
【００１４】
【化１】
0003726355.tif 000002
【００１５】
具体的な測定方法を以下に述べる。上記化１で示される受容体蛍光標識基質６２．５μＭおよび供与体基質（ＧＤＰ−フコース）６２５μＭを含む２５０ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ７．０、４０μｌに、酵素液１０μｌを加えて混合し、３７℃で１時間反応させた。５分間の煮沸により反応を停止させた後、反応液を高速液体クロマトグラフィーに供し、生成物のピークを蛍光検出器で定量する。
酵素量１単位は、この条件下で、１分間に１ｐｍｏｌｅのＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ〔ＲはＡｓｎ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）4 −ＰＡ、ＰＡは２−ピリジルアミノ基を意味する。〕を生じるものとした。
【００１６】
（３）至適ｐＨ
本発明の酵素の至適ｐＨは図１の曲線で表されるごとく、ｐＨ約７．０〜７．５付近に高い活性を有している。図１において、ｐＨ４．５〜７．５は５００ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を、ｐＨ７．０〜９．０は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（白丸）を用いて測定を行った。
【００１７】
（４）ｐＨ安定性
本発明の酵素のｐＨ安定性は図２に示すように、ｐＨ約４〜１０であり、特にｐＨ５〜９の間において安定である。測定に用いた緩衝液はｐＨ３．５〜５．５は５０ｍＭ酢酸緩衝液（黒三角）を、ｐＨ５．５〜７．５は５０ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を、ｐＨ７．５〜９．０は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（白丸）を、ｐＨ９．０〜１１．５は炭酸水素ナトリウム緩衝液（白三角）を用いた。本発明の酵素を各緩衝液中で、それぞれのｐＨにおいて、４℃、５時間処理した後の残存活性の測定を行った。
なお、図１は本発明により得られるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼのｐＨ（横軸）と相対活性（％、縦軸）の関係を示すグラフ、図２はｐＨ（横軸）と残存活性（％、縦軸）との活性を示すグラフである。
【００１８】
（５）至適温度
本発明の酵素の至適温度は図３に示すように、約３７℃付近であり、また、２０〜４０℃の範囲で使用可能である。凍結品は−２０℃で少なくとも数カ月安定である。
【００１９】
（６）２価金属イオン要求性
多くの糖転移酵素はその活性にマグネシウム、マンガンなどの２価金属を必要とするが、本発明の酵素は２価金属非存在下あるいはキレート剤であるＥＤＴＡ存在下で十分な活性を示し、２価金属イオン要求性を示さない。
【００２０】
（７）分子量
本発明の酵素の精製標品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０，０００のところに単一バンドを示す。
【００２１】
（８）形態
本発明の酵素は、本来、膜結合型酵素として細胞膜に存在するが、これまでに報告がなされているブタα１→６フコシルトランスフェラーゼおよびヒト嚢胞生繊維症細胞のα１→６フコシルトランスフェラーゼとは異なり、培養細胞中のタンパク質分解酵素によって酵素活性に影響のない部位で切断されることにより培養液中に放出されるため、取扱いの容易な可溶型酵素として存在する。
上記性質から見て、本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、至適ｐＨ、金属要求性、分子量の点で、従来のヒト嚢胞性繊維症細胞由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼ（至適ｐＨ６．５、分子量３４，０００および３９，０００）とは明らかに相違する新規な酵素である。
【００２２】
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼを利用して、下記事項を解明することができる。
（１）アスパラギン結合型糖鎖に新たにフコースを導入し、糖鎖構造を人工的に改変することができる。そのことによって、細胞装置や複合糖質の糖鎖のプロセッシング制御機構の解明及び糖鎖の役割を解明することができる。
（２）本発明の酵素活性を測定することにより、種々の疾病の診断を行うことができる。
（３）本発明の酵素により誘導される抗体を用いることにより、種々の疾病の診断を行うことができる。
【００２３】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
（１）ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５無血清培養液からの粗酵素液の調製
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５を亜セレン酸ナトリウム及びカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地＝１：１の無血清培地にて、３７℃、二酸化炭素濃度５％の条件で培養を行った。得られた無血清培養液１００リットルを限外濾過により２リットルに濃縮し、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび０．１％ＣＨＡＰＳ〔３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォネート〕を含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝液交換を行い、粗酵素液とした。さらに、この粗酵素液をＱ−セファロース、ＧＤＰヘキサノールアミンセファロース、（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンセファロース等のカラムクロマトグラフィーに供し、活性画分を集めて本発明のフコシルトランスフェラーゼを精製することができた。
【００２４】
（２）酵素の調製
上記（１）によって得た粗酵素抽出液を以下の精製に用いた。５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び０．１％ＣＨＡＰＳを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したＱ−セファロースのカラムに供した。カラムをその５倍容量の同一の緩衝液で洗浄した後、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出してきた活性画分を集めた。活性画分を限外濾過膜にて濃縮し、５ｍＭ２−メルカプトエタノール及び０．７％ＣＨＡＰＳを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝液交換をを行った後、同緩衝液で平衡化したＧＤＰヘキサノールアミンセファロースのカラムに供した。溶出は０〜０．５ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配によって行った。
０．１５〜０．３Ｍの活性画分を集めて限外濾過膜で濃縮し、脱塩を行った後、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび０．７％ＣＨＡＰＳを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化した（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンセファロースのカラムに供した。溶出は０〜０．５ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配によって行った。
０．２〜０．５Ｍの活性画分を集めて限外濾過膜で濃縮し、脱塩を行うことにより、α１→６フコシルトランスフェラーゼを得ることができた。
得られたα１→６フコシルトランスフェラーゼ画分は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量６０，０００の位置に単一バンドを示し、他のトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼなどの活性はなく、精製酵素標品は糖鎖研究用試薬として十分使用可能であった。
【００２５】
本発明の酵素の至適ｐＨを緩衝液のｐＨを変化させたて求めた結果を図１に示す。該酵素はｐＨ７．０〜７．５付近に高い活性を示した。図中、黒丸はメス緩衝液を使用した場合、白丸はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合を示す。
本発明の酵素のｐＨ安定性についても、同様に検討した。図２は該酵素を各緩衝液中でそれぞれのｐＨにおいて、４℃、５時間処理した後の残存活性を示しているが、該酵素はｐＨ４〜１０で比較的安定であり、特にｐＨ５〜９の間においてより良好な安定性を示した。図中、黒三角は酢酸緩衝液、黒丸はメス緩衝液、白丸はトリス−塩酸緩衝液および白三角は炭酸水素ナトリウム緩衝液を使用した場合を示す。
本発明の酵素の至適温度は、図３に示すように３７℃付近に認められた。また、２０〜４０℃の範囲で十分な作用を保持すると考えられた。また、凍結品は−２０℃で少なくとも数ケ月間は安定にその活性を保持した。
また、本発明の酵素は２価金属イオン非存在下でも十分な活性を示した。さらに、キレート剤であるＥＤＴＡ５ｍＭの存在下でも十分な活性を示したことから、２価金属イオンの要求性は示さないと結論した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のヒト由来α１→６フコシルトランスフェラーゼは、公知のヒトα１→６フコシルトランスフェラーゼとは、理化学的性質が種々の点で大きく異なり、より生理学的条件に近い反応至適条件で作用を示す。したがって、本発明により、糖鎖の修飾や合成などの糖鎖工学および／または癌などの疾病の診断に、有用な新規なα１→６フコシルトランスフェラーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼの至適ｐＨを示す。
【図２】本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼのｐＨ安定性を示す。
【図３】本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼの至適温度を示す。
【図１】
0003726355.tif 000003
【図２】
0003726355.tif 000004
【図３】
0003726355.tif 000005