(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質に対する抗体または抗原が担持された凝集可能な不溶性担体を濃度０．２〜１０ｍｇ／ｍｌで含有する凝集反応試薬が、内部が減圧され、少なくとも観察部分が透明である外径５〜３０ｍｍで高さが２０〜１５０ｍｍの試験管形状の容器に収容されており、かつ、前記不溶性担体は、平均粒径０．０５〜１．０μｍのラテックス粒子であることを特徴とする免疫反応測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、免疫反応測定用試薬キットに関し、さらに詳しくは、測定対象物質に対する抗体または抗原が担持された不溶性担体の凝集の程度を検出することにより免疫反応を測定可能な免疫反応測定用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、血液や尿などの体液中のタンパク質や脂質等、例えば、梅毒抗体、Ｂ型肝炎ウイルス、癌胎児性抗原、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ−反応性蛋白質、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体、リウマチ因子、抗ストレプトリジン−Ｏ等の免疫学的に抗原または抗体に属する物質（以下、「測定対象物質」という）の測定に、ラテックス担体のような不溶性担体に測定対象物質に対応する抗体または抗原を担持させ、免疫反応による該担体の凝集の程度を検出することにより免疫反応を測定可能な免疫反応測定用試薬が一般的に使用されている。
【０００３】
従来、このような担体の凝集を検出して測定対象物質を測定する試薬においては、通常、反応液中の不溶性担体の凝集の程度を、肉眼で判定する方法と反応液に光を照射してその散乱光または透過光を光学的に検出する方法がある（例えば、特開平２−２３８３６０号公報）。
【０００４】
上記の不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する方法は、試料中の測定対象物質の存在の有無や、測定対象物質の半定量のために使用されるが、その測定操作の簡便さから病院のベッドサイド等でよく利用されている。
【０００５】
上記の測定方法は、ラテックス担体のような不溶性担体に測定対象物質に対応する抗体または抗原を担持させた反応試薬と、患者の血清や尿等の検体溶液とを凝集判定プレート上で混合させ、その凝集を観察する方法である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記の測定方法においては、患者からの検体溶液をピペット等により人手によって凝集判定プレート上に採取するため、検査従事者への感染の危険があった。また凝集判定プレートによる判定は見にくく検査従事者により判定結果に差が出やすいという問題点もあった。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、検査従事者への感染の危険が少なく、また凝集判定が容易な免疫反応測定用試薬キットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明で使用される不溶性担体としては、従来から、測定対象物質に対する抗体または抗原が担持された不溶性担体の凝集により免疫反応測定を行うために使用されてきた担体はいずれも使用可能であり、例えば、無機物質粉末、有機高分子物質粉末、微生物、血球、細胞膜片などが挙げられる。無機物質としては、金、チタン、鉄、ニッケル等の金属；アルミナ、チタニア等の金属酸化物；シリカ等が挙げられる。有機高分子としては、特に限定されないが、例えば、スチレン重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。特に、これらの重合体粉末を水に均一に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。該ラテックス粒子の平均粒径は、０．０５〜１．０μｍが好ましく特に０．０５〜０．５μｍが好ましい。
【０００８】
本発明で使用される凝集反応試薬の製造方法としては、従来から使用されてきた方法が使用でき、例えば、まず、不溶性担体が分散された懸濁液中で該不溶性担体に測定対象物質に対する抗体または抗原を担持させる。この担持には、公知の物理的吸着法または化学的結合法が使用される。
【０００９】
抗体を担持させる場合、抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が好適に使用される。これらの抗体は、通常、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の抗体精製手段を適宜組み合わせて精製される。抗体の種類としては、例えば、ＩｇＧやＩｇＭ等の免疫グロブリンが挙げられ、必要に応じてＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂとなされてもよい。
抗原を担持させる場合、抗原の種類としては、特に限定されず、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質等が測定目的に応じて使用される。
【００１０】
上記試薬中に存在させる、該抗体または抗原が担持された不溶性担体の濃度は、上記懸濁液中０．２〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、より好ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌである。該不溶性担体の濃度が低くなると、測定範囲が狭くなり、高くなると凝集して免疫反応を阻害し易くなる。
【００１１】
上記試薬中には、さらに、必要に応じて公知の免疫反応促進物質を加えてもよい。免疫反応促進物質としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子物質が挙げられる。
【００１２】
本発明で使用される内部が減圧され、少なくとも観察部分が透明である容器の本体の材質としては、プラスチックスまたはガラスが用いられる。プラスチックスとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、変性天然樹脂のいずれもが用いられ得る。
【００１３】
熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ−４−メチルペンテン−１、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体、ポリビニルアルコールアセタール化物、ポリビニルアルコールブチラール化物等が挙げられる。
【００１４】
熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等が挙げられる。
【００１５】
変性天然樹脂としては、例えば、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、、酢酸酪酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等が挙げられる。
【００１６】
本発明で使用される容器には、その内部を減圧に維持するために栓体を必要とする。栓体の材質としては、ガスバリヤー性の高いものが好ましく、例えば、ブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等が挙げられる。
【００１７】
本発明の免疫反応測定用試薬キットの減圧の程度は、常圧の検体溶液と該試薬キットが連通されたときに、該試薬キット中に常圧の検体溶液が吸入され得る程度の圧力であればよく、その圧力は、吸入しようとする検体溶液の量によって決められる。すなわち、吸入しようとする検体溶液の量が多ければ多いほど減圧の程度を大きくする。
【００１８】
本発明の免疫反応測定用試薬キットの製造方法の一例を挙げると、内部を減圧にすることが可能であり、少なくとも観察部分が透明である容器に、前記の凝集反応試薬を加え、容器を所定の減圧状態にした後、該容器に栓をすることによって製造する。
【００１９】
上記の容器としては、例えば、一端が開口し他端が閉塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、栓体によって密閉可能なものが好ましい。該有底管体としては、例えば、試験管形状のものが挙げられ、そのサイズとしては、外径が５〜３０ｍｍ、高さ２０〜１５０ｍｍ程度が好ましい。
【００２１】
本発明の免疫反応測定用試薬キットによって検体中の測定対象物質を測定するには、検体溶液の容器と該試薬キットを連通させ該試薬キット中に検体溶液を吸入させる。次いで、該試薬キットを振盪して検体と凝集反応試薬を混合させて、検体中の測定対象物質と反応試薬を免疫反応させる。免疫反応終了後、反応試薬の凝集を肉眼で観察することにより免疫反応の程度を判定する。
【００２２】
上記の検体溶液の容器と該試薬キットを連通させる方法としては、例えば、検体溶液の容器を注射針付きの注射筒としておき、該注射針を免疫反応測定用試薬キットの容器の栓体に突き刺す方法が挙げられる。
【００２３】
上記の免疫反応におけるｐＨは、５〜１０が好ましく、より好ましくは６〜８である。免疫反応時のｐＨを上記のように調整するには、反応試薬、検体溶液または反応試薬と検体溶液の両方の溶媒もしくは分散媒を適当なｐＨの緩衝液にしておけばよい。この緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。免疫反応温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは２０〜４０℃である。凝集反応時間は、２０秒〜３０分が好ましく、より好ましくは１〜１５分である。
【００２４】
本発明の免疫反応測定用試薬キットによって測定することのできる検体は、抗原や抗体などの免疫学的に活性な物質を含有する試料、特に生体試料（例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液などの体液、尿、便、汗などの排泄物、又は組織の抽出物など）である。
【００２５】
本発明の免疫反応測定用試薬によって測定することのできる測定対象物質は、通常、免疫学的に抗原または抗体に属するあらゆる物質が包含される。例えば、リウマチ因子（ＲＦ）、アルファフェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン−フィブリン分解物（ＦＤＰ）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アンチトロンビンIII(ＡＴ III) 、梅毒抗体、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体などのタンパク質またはポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ステロイド、多糖類、脂質等が挙げられる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を具体的に説明するために、その実施例を示す。
以下の実施例および比較例においては、次の試薬を用いた。
ＰＢＳ（リン酸−食塩緩衝液）：リン酸１ナトリウム（２水和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）および塩化ナトリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．０２Ｍ、０．１５Ｍ、ｐＨが７．２となるように精製水を加えて調製した。
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ：ＰＢＳに試薬特級牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した。
【００２７】
実施例１
リウマチ因子測定用試薬キットの製造とリウマチ因子の測定
（１）ヒトＩｇＧのラテックスへの担持
ヒトＩｇＧ分画（生化学工業社製）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．２３μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０％、積水化学工業社製）５００μｌを添加し室温で１時間攪拌した。次に、１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、得られた沈澱物を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し洗浄した。これを２回繰り返した後、遠心分離で得られた沈澱を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁しヒトＩｇＧ担持ラテックスを作製した。
【００２８】
（２）リウマチ因子測定用試薬キットの製造
上記（１）で得られたヒトＩｇＧ担持ラテックス１００μｌをポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌ試験管（１２．６φ×７５ｍｍ）に注入し、管径に合うブチルゴム製の栓体を試験管の開口部に軽く載せた後（開口部を密栓しないように載せた）、減圧にできる容器内に置き１００μｌ以上吸引できるように３６０ｍｍＨｇに減圧したところで、試験管の開口部を密栓して、リウマチ因子測定用試薬キットを製造した。
【００２９】
（３）リウマチ因子の測定
１０倍、２０倍、４０倍および８０倍に希釈したリウマチ因子陽性ヒト血清（希釈をしないもののリウマチ因子濃度１５００ＩＵ／ｍｌ）、また対照として日立化成工業社製のリウマチ因子測定キット「セラテスタムＲＦ」にて測定した結果リウマチ因子が３０ＩＵ／ｍｌ以下であった正常ヒト血清を、注射針の付いた１ｍｌの注射筒にそれぞれ取り、その注射針を、上記（２）で得られたリウマチ因子測定用試薬キットのブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、血清検体を該キット中に採取した。なお、この際、一定量の血清検体を採取するために、１００μｌ採取されたことを重量増加により確認した（血清の比重を１．０２として計算）。
【００３０】
次いで、該キットを転倒混和し血清検体とヒトＩｇＧ担持ラテックスを混合した。転倒混和３０、６０、９０および１２０秒後にラテックスの凝集状態を観察し、結果を表１に示した。なお、この測定は、リウマチ因子陽性ヒト血清３種類（それぞれをリウマチ因子陽性ヒト血清Ａ、Ｂ、Ｃとする）および正常ヒト血清３種類（それぞれを正常ヒト血清Ａ、Ｂ、Ｃとする）について行った。なお、表１（および後述の表２）における、記号の意味は以下の通りである。
◎：凝集が強い。
○：凝集が分かる。
△：弱い凝集が分かる。
×：凝集していない。
【００３１】
実施例２
実施例１の工程（２）において、ヒトＩｇＧ担持ラテックスをポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌ試験管（１２．６φ×７５ｍｍ）に注入したことの代わりに、ガラス製の４ｍｌ試験管（１２φ×７５ｍｍ）に注入したことの他は、実施例１と同様にしてリウマチ因子測定用試薬キットを製造し、実施例１と同様にしてリウマチ因子の測定を行い、結果を表１に示した。
【００３２】
比較例１
実施例１の工程（１）で得られたヒトＩｇＧ担持ラテックス１００μｌと、実施例１の工程（３）で調製した血清検体の１００μｌを、凝集判定板（積水化学工業社製）上に採り、混合、攪拌し反応させた。攪拌開始の３０、６０、９０および１２０秒後にラテックスの凝集状態を観察し、結果を表１に示した。
【００３３】
実施例３
ヒトのＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）測定用試薬キットの製造とＣＲＰの測定
（１）抗ＣＲＰ抗体のラテックスへの担持
抗ＣＲＰ抗体（コスモバイオ社製）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．３０μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０％、積水化学工業社製）５００μｌを添加し室温で１時間攪拌した。次に、１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、得られた沈澱物を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し洗浄した。これを２回繰り返した後、遠心分離で得られた沈澱を１０ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し抗ＣＲＰ抗体担持ラテックスを作製した。
【００３４】
（２）ＣＲＰ測定用試薬キットの製造
上記（１）で得られた抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス１００μｌをポリエチレンテレフタレート製の７ｍｌ試験管（１４φ×１００ｍｍ）に注入し、管径に合うブチルゴム製の栓体を試験管の開口部に軽く載せた後（開口部を密栓しないように載せた）、減圧にできる容器内に置き１００μｌ以上吸引できるように３６０ｍｍＨｇに減圧したところで、試験管の開口部を密栓して、ＣＲＰ測定用試薬キットを製造した。
【００３５】
（３）ＣＲＰの測定
１０倍、２０倍、４０倍および８０倍に希釈したＣＲＰ陽性ヒト血清（希釈しないもののＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄｌ）、また対照として日立化成工業社製のＣＲＰ測定キット「セラテスタムＣＲＰ」にて測定した結果ＣＲＰが０．５ｍｇ／ｄｌ以下であった正常ヒト血清を、注射針の付いた１ｍｌの注射筒にそれぞれ取り、上記（２）で得られたＣＲＰ測定用試薬キットのブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、血清検体を該キット中に採取した。なお、この際、一定量の血清検体を採取するために、１００μｌ採取されたことを重量増加により確認した（血清の比重を１．０２として計算）。
【００３６】
次いで、該キットを転倒混和し血清検体と抗ＣＲＰ抗体担持ラテックスを混合した。転倒混和３０、６０および９０秒後にラテックスの凝集状態を観察し、結果を表２に示した。なお、この測定は、ＣＲＰ陽性ヒト血清３種類（それぞれをＣＲＰ陽性ヒト血清Ｄ、Ｅ、Ｆとする）および正常ヒト血清３種類（それぞれを正常ヒト血清Ｄ、Ｅ、Ｆとする）について行った。
【００３７】
実施例４
実施例３の工程（２）において、抗ＣＲＰ抗体担持ラテックスをポリエチレンテレフタレート製の７ｍｌ試験管（１４φ×１００ｍｍ）に注入したことの代わりに、ガラス製の試験管（１３φ×９０ｍｍ）に注入したことの他は、実施例３と同様にしてＣＲＰ測定用試薬キットを製造し、実施例３と同様にしてＣＲＰの測定を行い、結果を表２に示した。
【００３８】
比較例２
実施例３の工程（１）で得られた抗ＣＲＰ抗体担持ラテックス１００μｌと、実施例３の工程（３）で調製した血清検体の１００μｌを、凝集判定板（積水化学工業社製）上に採り、混合、攪拌し反応させた。攪拌開始の３０、６０および９０秒後にラテックスの凝集状態を観察し、結果を表２に示した。
【００３９】
【表１】
0003657015.tif 000002
【００４０】
【表２】
0003657015.tif 000003
【００４１】
【発明の効果】
本発明の免疫反応測定用試薬キットの構成は前記した通りであり、本発明のキットによると、検査従事者への感染の危険が少なく、また凝集判定が容易である。