(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンを測定するにあたり、蛋白質を一種または数種の蛋白質分解酵素によりペプチドに分解し、得られたペプチドを還元剤により化学修飾を行った後分解処理することにより、アスパラギン及びグルタミンをアスパラギン酸及びグルタミン酸として定量することを特徴とする、アスパラギン及びグルタミンの測定方法。
【請求項２】
蛋白質分解酵素及び還元剤を組み合わせてなる、アスパラギン及びグルタミンの測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの測定方法に関する。詳しくは、目的とする蛋白質を蛋白質分解酵素によりペプチドに分解し、得られたペプチドを還元剤によって化学修飾した後分解処理することによりアスパラギン及びグルタミンをアスパラギン酸及びグルタミン酸として定量することを特徴とする、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの測定方法に関する。さらに本発明は、該方法を利用した、蛋白質分解酵素及び還元剤を組み合わせてなる、アスパラギン及びグルタミンの測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界には数多くの蛋白質が存在する。蛋白質は生物がその生命活動を維持するためには必要不可欠であり、アミノ酸がペプチド結合によって連結したポリペプチド鎖からなる。生物は、アミノ酸を材料に蛋白質を合成する能力を有している。現在までに、多数の蛋白質が同定され特徴付けがなされてきた。蛋白質の特徴は、種々の化学物質との反応性、種々の溶媒への溶解性、分子量、沈降係数、等電点、アミノ酸組成、アミノ酸配列順序（一次構造）、α−ヘリックス、β−構造及びランダムコイルからなる二次構造、これらの二次構造が空間的に折りたたまれた三次構造、これらの単位がサブユニットとして複数集合した四次構造など多くの特性で表されている。このうちアミノ酸組成は、蛋白質の最も基本的な特性の一つであり、化学物質の元素組成式と同様な意味で用いられる。蛋白質のアミノ酸組成からは、その蛋白質の塩基性、酸性、疎水性などを推定することができる。また、動物は他の生物が合成した蛋白質を摂取することにより、自己の蛋白質を構築するが、摂取する蛋白質のアミノ酸組成は、その蛋白質の栄養価を評価するためになくてはならない指標となっている。
【０００３】
一方、蛋白質の正確なアミノ酸組成は、その一次構造が決定されて初めて確定されるものであるが、現在、ある蛋白質の一定量を加水分解してアミノ酸に分解し、生成した各アミノ酸の量を測定することによって求めたアミノ酸のモル比、あるいは蛋白質１分子当たりの個数が通常暫定的に用いられている。蛋白質を加水分解してアミノ酸に分解する方法としては、酸による加水分解法、アルカリによる加水分解法、複数の蛋白質分解酵素を用いた酵素分解法などがある。しかしながら、酸及びアルカリを用いた加水分解法では、酸及びアルカリに不安定なアミノ酸は破壊され定量できず、また、蛋白質分解酵素を用いた酵素分解法では、蛋白質によっては完全にアミノ酸に分解することが困難であるなどの問題点がある。特に、酸及びアルカリを用いる加水分解法においては、蛋白質を構成するアミノ酸のうち、アミド基を有するアミノ酸であるアスパラギン、グルタミンは、そのアミド基が加水分解を受け、各々アスパラギン酸、グルタミン酸となり、元来蛋白質を構成しているアスパラギン酸、グルタミン酸と区別して定量することはできない。従って、現在までは蛋白質のアミノ酸組成のうち、アスパラギンとアスパラギン酸、及びグルタミンとグルタミン酸は、各々それらの合計値としてアスパラギン酸及びグルタミン酸量で表されてきた。しかしながら、アスパラギン酸及びグルタミン酸はともに、側鎖にカルボキシル基を持つアミノ酸であり、アスパラギン及びグルタミンはともに、側鎖にアミド基を持つアミノ酸であるというように、全く異なる性質を有するものである。即ち、より正確なアミノ酸組成を求めるためには、これらのアミノ酸を別個に定量する必要性がある。
【０００４】
蛋白質中のアスパラギン及びグルタミンを別個に定量しようとする試みは、P.E.Wilcox（Methods Enzymol., Vol.11, pp65-76(1967) ）で報告されている。この方法は、乾燥した蛋白質を脱水メタノール中に懸濁し、これに無水酢酸を加えることによって、蛋白質中のカルボキシル基をエステル化して乾燥し、まずエステル化した蛋白質を得る。このエステル化した蛋白質を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で水素化ホウ素リチウムを用いて還元反応を行い、エステル化した蛋白質中のカルボキシル基を一級アルコール基に導く。次に、反応に用いた過剰の試薬を除去して蛋白質を取り出し乾燥し、更に、これを酸を用いた加水分解によってアミノ酸に分解して、生成したアミノ酸を測定するという方法を用いている。この方法では、アスパラギン酸及びグルタミン酸は、各々対応する有機酸誘導体に、アスパラギン及びグルタミンは、各々アスパラギン酸及びグルタミン酸として定量される。しかしながら、この方法は非常に複雑な操作と長時間を要し、なおかつ各反応における副反応の進行があり、定量性の点でも大きな問題点を有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蛋白質中のアスパラギン及びグルタミンの、簡便且つ精度の高い分別測定法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の状況に鑑み鋭意研究の結果、蛋白質を限定された特異性を有する蛋白質分解酵素で処理しペプチドとした後、得られたペプチドを還元剤により化学修飾することにより、蛋白質中のアスパラギンとグルタミンのみを、各々アスパラギン酸とグルタミン酸として別々に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
まず、目的とする蛋白質を蛋白質分解酵素によってペプチドに分解する。この時用いる蛋白質分解酵素は、限定された基質特異性を有する蛋白質分解酵素を用いる。具体的には、特定のアミノ酸残基のカルボキシ末端側を切断する特異性を有するものを使用する。この時、特定のアミノ酸残基がアスパラギン及びグルタミンであるものは、酵素分解によって得られるペプチドのカルボキシ末端がアスパラギンあるいはグルタミンとなり、次に行う還元剤による化学修飾反応によって、アスパラギン及びグルタミンのカルボキシル基が修飾を受け、最終的にアスパラギン酸及びグルタミン酸として定量することが不可能となることから不適当である。好ましくは、化学修飾反応の反応性を高めるため、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシ末端側を切断する特異性を有するものを使用する。更に好ましくは、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシ末端側を切断する特異性を有するものと、アスパラギン及びグルタミン以外の特定のアミノ酸残基のカルボキシ末端側を切断する特異性を有するものを組み合わせて使用する。好ましくは、酵素分解によって得られるペプチドの平均鎖長が２〜１５、特に好ましくは、２〜５となる様な一種または数種の蛋白質分解酵素を用いる。例えば、グルタミン酸のカルボキシル末端側を切断する特異性を有する酵素としてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）由来のＶ８プロテアーゼ、及びアスパラギン及びグルタミン以外の特定のアミノ酸残基のカルボキシ末端側を切断する特異性を有する酵素として牛膵臓由来のトリプシンの組み合わせが挙げられる。酵素反応は、用いる酵素に適する温度及びｐＨで実施することが可能であるが、緩衝液中にて実施する場合は、次に行う化学修飾反応の妨害とならないように、除去し易い揮発性の緩衝液を用いることが望ましい。
【０００８】
酵素処理によりペプチドとした試料は、凍結乾燥及び減圧乾燥等の適当な乾燥手段を用いて乾燥する。乾燥した試料の適当量を反応容器にとり、反応容器中にとった試料の量を出発蛋白質試料の量に換算して、出発蛋白質試料の量１ｍｇに対して、０．０１〜５０ｍｌ、好ましくは１〜４ｍｌの純水に溶解または懸濁し、これにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた純水の量に対して０．１〜１．２倍容量、好ましくは０．２〜０．６倍容量加え、激しく撹拌した後、直ちに減圧下で純水及びＴＦＡを留去し、試料を充分乾燥する。更に、これに還元剤を適当量加え、化学修飾反応を行う。このとき用いる還元剤は特に限定されないが、特に好ましくはジボランを用いる。０．１〜２Ｍ、好ましくは１Ｍのジボラン−ＴＨＦ溶液を、反応容器中に採取した試料の量を出発蛋白質試料の量に換算して、出発蛋白質試料の量１ｍｇに対して、０．１〜２０ｍｌ、好ましくは４〜８ｍｌ加え、窒素などの不活性ガス気流下など、酸素ガスを極力除去した環境で還元反応を行う。
【０００９】
還元反応は、撹拌下、好ましくは−２０〜４０℃、特に好ましくは−１５〜０℃にて、５分〜６時間、特に好ましくは１〜３時間行う。この還元反応により、ペプチド鎖中のカルボキシル基は一級アルコール基に修飾される。即ち、ペプチド鎖中のアスパラギン酸及びグルタミン酸はアミノアルコールへと変換され、蛋白質のアミノ酸組成分析に通常用いられる酸を用いた加水分解法により、もはやアスパラギン酸及びグルタミン酸として生成せず、アミノアルコールとして生成するようになる。反応の停止は、反応容器中の過剰の還元剤を分解することにより行う。この際の分解方法は、用いた還元剤によって適当な方法が選択されるが、特にジボランの分解には、分解反応によって揮発性で容易に除去可能なホウ酸メチルと水素を生成するメタノールを用いるのが有利である。具体的には、反応容器中に水素ガスの気泡が発生しなくなるまで、静かにメタノールを添加することによって行う。反応液を、減圧下にて溶媒を留去して、乾燥した修飾蛋白質試料を得る。
【００１０】
得られた適当量の修飾蛋白質試料を、蛋白質のアミノ酸組成分析に通常用いられる酸を用いた加水分解法によりアミノ酸に分解し、生成するアスパラギン酸及びグルタミン酸量を測定することにより、出発蛋白質試料中のアスパラギン及びグルタミン量を求める。例えば、充分に乾燥した修飾蛋白質試料１ｍｇをガラス製試験管にとり定沸点塩酸を１ｍｌ加え、減圧操作あるいは不活性ガスのバブリングなどにより試験管内の酸素を充分脱気した後封管し、１１０℃で２４時間加水分解を行う。加水分解した試料中のアスパラギン酸及びグルタミン酸量は、アミノ酸分析計などを用いて測定することができる。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１２】
【実施例１】
卵白リゾチーム中のアスパラギン及びグルタミン量の測定
精製卵白リゾチーム（生化学工業社製）０．９ｍｇを１０ｍｌ容のガラス製試験管にとり、これを３ｍｌの１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加えて溶解し、これに１８μｇ/ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）由来のＶ８プロテアーゼ（生化学工業社製）溶液を１ｍｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。反応後、反応液を凍結乾燥により乾燥し、純水２ｍｌに溶解した後、ＴＦＡを１ｍｌ加えて、激しく撹拌し、直ちに減圧下、純水とＴＦＡを留去し乾燥した。これに、１Ｍジボラン−ＴＨＦ溶液を６ｍｌ加え、窒素ガス気流下、撹拌しながら、−１０℃で１時間、還元反応を行った。反応液に、メタノール約１ｍｌを静かに加えて反応を停止し、減圧下、溶媒を留去、乾燥した。これに、定沸点塩酸１ｍｌを加え、減圧脱気後、封管し、１１０℃で２４時間加水分解を行い、加水分解物中のアスパラギン酸及びグルタミン酸含量はアミノ酸分析計によって測定した。尚、対照として卵白リゾチームを含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し測定結果を補正し、アスパラギン酸量及びグルタミン酸量をそれぞれアスパラギン量及びグルタミン量とした。卵白リゾチーム０．９ｍｇ中のアスパラギン及びグルタミン含量の理論値及び測定結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
0003667809.tif 000002
表１に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致していた。これは、本発明の方法によって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの含量が正確に測定できたことを意味している。
【００１５】
【実施例２】
酸化型インスリンＢ鎖中のアスパラギン及びグルタミン量の測定
酸化型インスリンＢ鎖（シグマ社製）９μｇを０．５ｍｌ容のガラス製試験管にとり、これを３０μｌの１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加えて溶解し、これに１８μｇ/ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）由来のＶ８プロテアーゼ（生化学工業社製）溶液を１０μｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。反応後、反応液を凍結乾燥により乾燥し純水２５μｌに溶解した後、ＴＦＡを１０μｌ加えて激しく撹拌し、直ちに減圧下で純水とＴＦＡを留去し乾燥した。これに１Ｍジボラン−ＴＨＦ溶液を６０μｌ加え、窒素ガス気流下、撹拌しながら−１０℃で２時間還元反応を行った。反応液にメタノール約１０μｌを静かに加えて反応を停止し、減圧下で溶媒を留去し乾燥した。これを気相法により、１１０℃で２４時間塩酸加水分解を行い、加水分解物中のアスパラギン酸及びグルタミン酸含量をアミノ酸分析計によって測定した。尚、対照として酸化型インスリンＢ鎖を含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し測定結果を補正し、アスパラギン酸量及びグルタミン酸量をそれぞれアスパラギン量及びグルタミン量とした。酸化型インスリンＢ鎖９μｇ中のアスパラギン及びグルタミン含量の理論値及び測定結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
0003667809.tif 000003
【００１７】
表２に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致していた。これは、微量の試料を用いた場合にも、本発明の方法によって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの含量が正確に測定できたことを意味している。
【００１８】
【実施例３】
牛乳β−ラクトグロブリンＡ中のアスパラギン及びグルタミン量の測定
牛乳β−ラクトグロブリンＡ（シグマ社製）９μｇを０．５ｍｌ容のガラス製試験管にとり、これを３０μｌの１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加えて溶解し、これに１８μｇ/ ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）由来のＶ８プロテアーゼ（生化学工業社製）溶液を１０μｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。更に、５μｌの１ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）を加え、１８μｇ／ｍｌの牛膵臓由来のトリプシン（ベーリンガー・マンハイム社製）溶液を１０μｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。反応後、反応液を凍結乾燥により乾燥し純水２５μｌに溶解した後、ＴＦＡを１０μｌ加えて激しく撹拌し、直ちに減圧下で純水とＴＦＡを留去し乾燥した。これに１Ｍジボラン−ＴＨＦ溶液を６０μｌ加え、窒素ガス気流下、撹拌しながら−１０℃で２時間還元反応を行った。反応液にメタノール約１０μｌを静かに加えて反応を停止し、減圧下、溶媒を留去し乾燥した。これを気相法により、１１０℃で２４時間塩酸加水分解を行い、加水分解物中のアスパラギン酸及びグルタミン酸含量をアミノ酸分析計によって測定した。尚、対照として牛乳β−ラクトグロブリンＡを含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し測定結果を補正し、アスパラギン酸量及びグルタミン酸量をそれぞれアスパラギン量及びグルタミン量とした。牛乳β−ラクトグロブリンＡ９μｇ中のアスパラギン及びグルタミン含量の理論値及び測定結果を表３に示す。
【００１９】
【表３】
0003667809.tif 000004
【００２０】
表３に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致していた。即ち、微量の試料を用いた場合にも、本発明の方法によって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの含量が正確に測定できたことを意味している。
【００２１】
【実施例４】
牛乳β−カゼイン中のアスパラギン及びグルタミン量の測定
牛乳β−カゼイン（シグマ社製）９０μｇを５．０ｍｌ容のガラス製試験管にとり、これを３００μｌの１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加えて溶解し、これに１８μｇ/ ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）由来のＶ８プロテアーゼ（生化学工業社製）溶液を１００μｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。更に、５０μｌの１ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）を加え、１８μｇ／ｍｌの牛膵臓由来のトリプシン（ベーリンガー・マンハイム社製）溶液を１００μｌ加えて、３７℃で２４時間保温して酵素反応を行った。反応後、反応液を凍結乾燥により乾燥し純水２５０μｌに溶解した後、ＴＦＡを１００μｌ加えて激しく撹拌し、直ちに減圧下で純水とＴＦＡを留去し乾燥した。これに１Ｍジボラン−ＴＨＦ溶液を６００μｌ加え、窒素ガス気流下、撹拌しながら−１０℃で２時間還元反応を行った。反応液にメタノール約１００μｌを静かに加えて反応を停止し、減圧下、溶媒を留去し乾燥した。これに定沸点塩酸０．２ｍｌを加え、減圧脱気後封管し、１１０℃で２４時間加水分解を行い、加水分解物中のアスパラギン酸及びグルタミン酸含量をアミノ酸分析計によって測定した。尚、対照として牛乳β−カゼインを含まないものを用いて、全く同様の操作を行い空試験を実施し測定結果を補正し、アスパラギン酸量及びグルタミン酸量をそれぞれアスパラギン量及びグルタミン量とした。牛乳β−カゼイン９０μｇ中のアスパラギン及びグルタミン含量の理論値及び測定結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
0003667809.tif 000005
【００２３】
表４に示したように、理論値と測定値は非常に良く一致していた。即ち、本発明の方法によって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミン含量が正確に測定できたことを意味している。
【００２４】
0003667809.tif 000006
以上の構成による蛋白質中のアスパラギン及びグルタミンの測定用試薬キットによって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンを測定したところ、簡便且つ精度良く測定することができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によって、蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンの簡便且つ精度の良い測定法が提供される。即ち、従来まで通常用いられてきた酸あるいはアルカリ加水分解法によるアミノ酸組成分析では、アスパラギン酸とアスパラギン、及びグルタミン酸とグルタミンは、各々それらの合計値がアスパラギン酸とグルタミン酸としてのみ測定可能であったが、本発明により、蛋白質を酵素分解によってペプチドまで分解した後、還元剤を用いて化学修飾した後分解処理することにより、アスパラギン及びグルタミンをアスパラギン酸及びグルタミン酸として測定することを可能にする。又、該方法を利用した測定用試薬キットが提供されることにより、簡便且つ精度良く蛋白質中の構成アミノ酸として含まれるアスパラギン及びグルタミンが測定できる。本発明により、簡便に且つ精度良く、蛋白質のより正確なアミノ酸組成について情報を得ることができる。