(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子、および吸収促進剤としてポリオキシエチレンアルキルエーテル系またはポリオキシエチレンポリプロピレンアルキルエーテル系の非イオン性界面活性剤を含有する経粘膜投与剤。
【請求項２】
吸収促進剤が、ポリオキシエチレン（４．２）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２１）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（７）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、およびポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１つの界面活性剤である、請求項１に記載の経粘膜投与剤。
【請求項３】
経粘膜投与剤が経肺投与剤である、請求項１または２に記載の経粘膜投与剤。
【請求項４】
経粘膜投与剤が経鼻投与剤である、請求項１または２に記載の経粘膜投与剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、ヒトＧ−ＣＳＦと略記する）を有効成分として含有する経粘膜投与用製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトＧ−ＣＳＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系において顆粒球の前駆細胞に働き顆粒球への分化増殖を促す機能を有している液性の造血因子（例えば、Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ．ａｌ：Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１．１８５，（１９７３）等参照〕として知られている。さらに最近では、ヒトＧ−ＣＳＦの機能として好中球のプールからの血管内への遊出促進、遊走能亢進、好中球生存期間の延長および好中球活性化（貪食、殺菌能亢進）などが知られている。
【０００３】
現在、ヒトＧ−ＣＳＦは、骨髄移植（ＢＭＴ）の際、および癌化学療法時の好中球減少症、種々の骨髄性血液疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および感染症の治療に際し、静脈内投与および皮下投与が行われている。これ等疾患はいずれも重篤であり、しかも連日の投与による治療を必要とすることから、注射の投与による苦痛をなくすため、非−非経口投与（Ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ルートの開発が望まれている。
【０００４】
今までに薬理的に活性なペプチド及び蛋白質の経口投与による生物学的利用能の検討が試みられているが、胃腸管に存在する蛋白質分解酵素の作用により、一般の薬物に比べて低いことが知られている。このため蛋白質分解酵素の活性が胃腸管に比べて低いことが期待される鼻粘膜、口腔粘膜、直腸粘膜、膣粘膜、眼粘膜および肺粘膜等を介した投与ルートの研究が注目されている。中でも蛋白質の経鼻からの透過性については、投与方法の容易さ、胃腸管よりも蛋白質分解酵素活性が低いこと、肝初回通過効果の回避の可能性のあること、あるいは投与後循環血中に比較的速やかに出現するという幾つかの有利さから多くの研究報告がある（Ｙ．Ｗ．Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ；ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ，４（２）：６７−１９４（１９８７））。
【０００５】
インスリン、インターフェロン、カルシトニンなどについては経鼻投与が検討され、特許出願もされている（特開昭６３−１１５８２１号、特開昭６２−２０７２２６号及び特開昭６１−１２６０３４号参照）。
【０００６】
ヒトＧ−ＣＳＦの経鼻投与については、東らがセンダイウイルスによる局所感染に対するヒトＧ−ＣＳＦの防御効果を検討している（東ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、７：２２９−２３３（１９８９））。しかしながら、本発明とは異なりを目的とし、吸収率をあげるために吸収促進剤を用いているものではない。
【０００７】
なお、インターフェロン、カルシトニンなどについては、経肺投与が検討され、特許出願（特開昭６３−５１８６８号および特開昭６０−１６１９２４号）されているが、ヒトＧ−ＣＳＦの経肺投与についての報告は現在のところなされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする問題点】
経鼻投与では、分子量が約１，０００以下の蛋白質はそのままで良好に吸収されるが、それ以上の分子量のものはそのままでは粘膜透過しないと言われている（Ｃ．ＭｃＭａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７６（７）：５３５−５４０（１９８７））。これに対して、ヒトＧ−ＣＳＦの分子量は２０，０００前後であるため、粘膜を通して投与することは困難であるとされていた。したがって各粘膜からの吸収率をあげるための簡便な方法およびすぐれた吸収促進剤の開発が望まれていた。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトＧ−ＣＳＦの吸収を促進させ、かつ実用に供し得る経粘膜投与形態について鋭意研究を重ねた結果、ある種のポリオキシエチレンアルキルエーテル系及びポリオキシエチレンポリプロピレンアルキルエーテル系の非イオン性界面活性剤を吸収促進剤としてヒトＧ−ＣＳＦ経鼻投与剤に添加したところ速やかに吸収されることを見い出した。また、吸収促進剤を用いずにヒトＧ−ＣＳＦを経肺投与したところ意外にも良好に吸収され、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系非イオン性界面活性剤を吸収促進剤として添加したところさらに速やかに吸収され、各々の粘膜にヒトＧ−ＣＳＦ単独でも、吸収促進剤を添加しても局所および全身作用として有用であることを見出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ヒトＧ−ＣＳＦを有効成分として含有する経粘膜剤、ヒトＧ−ＣＳＦおよび吸収促進剤を含有する経粘膜剤または、ヒトＧ−ＣＳＦと、吸収促進剤としてポリオキシエチレン（４．２）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２１）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（７）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１つの界面活性剤とを含有する経粘膜投与用製剤に関するものである。
【００１１】
本発明で用いられるヒトＧ−ＣＳＦは純度の高いヒトＧ−ＣＳＦであればその由来が制限されるものではなく、例えば人の生体試料から抽出、分離、精製したもの、ヒトＧ−ＣＳＦ産生細胞を培養し、その培養上清から単離したもの、細胞融合法を用いてヒトＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマを形成しそれから取得したもの、遺伝子組換えによって、大腸菌、動物細胞等の宿主を形質転換して得た形質転換体から産生せしめ単離精製したもの、又は天然のヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に化学修飾を施したもの等のいずれも使用することができる。
【００１２】
本発明に供せられうるヒトＧ−ＣＳＦの例としては、下記のアミノ酸配列であらわされるヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドまたはこれと糖鎖部を有する糖蛋白質を挙げることができる。
【００１３】
(Met)n  Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu
Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
Gln Glu Lys Leu (Val Ser Glu)m  Cys Ala Thr
Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu
Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro
Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu
Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu
Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr
Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met
Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met
Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala
Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His
Leu Ala Gln Pro （但しｍは０または１を表し、
ｎは０または１を表す）
さらに、上記アミノ酸配列の一部を別のアミノ酸を付加し又は置換して改変したもの、アミノ酸配列の一部を欠損させたもの、またはアミノ酸配列に高分子化合物等の化合物を結合させて化学修飾したもの等のヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド類も本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
上記のヒトＧ−ＣＳＦは例えば、本出願人が先に出願した特開昭６１−２２７５２６号、特開昭６２−２３６４９７号、特開昭６２−２３６４８８号の各明細書に記載の方法によって製造することができる。また、その他の方法としてＧ−ＣＳＦ産生細胞と自己増殖能を有する悪性腫瘍とを細胞融合して得られるハイブリドーマをマイトジェンの存在または非存在下で培養することによって得ることもできる。これらの方法で得たヒトＧ−ＣＳＦは全て本発明に含まれる。
【００１５】
得られたヒトＧ−ＣＳＦ含有液は必要により公知の手段でさらに精製、濃縮した後、ミリポアフィルター等で無菌濾過して凍結保存とするかまたは凍結乾燥、真空乾燥などの手段により水分を除去して保存することができる。
【００１６】
本発明の吸収促進剤としては、ポリオキシエチレン（ＰＯＥと略記する）（４．２）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（１０）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（２１）ラウリルエーテル、ＰＯＥ（７）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１０）オレイルエーテル、およびＰＯＥ（２０）オレイルエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレンアルキルエーテル系非イオン性界面活性剤、またはＰＯＥ（１０）ノニルフェニルエーテルおよび、ＰＯＥ（１０）オクチルフェニルエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤またはＰＯＥ（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン系非イオン性界面活性剤）（日本エマルジョン社製又は、日光ケミカルズ社製）のうち１または２以上の界面活性剤が用いられる。
【００１７】
そして、上記界面活性剤のうちＨＬＢが１０以上であるもの、または、それらの２以上の組み合せによりＨＬＢが１０以上になるような混合物を用いることにより、望ましい効果が得られる。
【００１８】
この製剤が適用可能な粘膜としては、鼻腔、口腔、眼、肺、子宮、膣、直腸などの粘膜が考えられ、全身または局所でのヒトＧ−ＣＳＦの作用が期待できる部位が望ましい。
【００１９】
投与剤形は、ヒトＧ−ＣＳＦまたはヒトＧ−ＣＳＦおよび上記の界面活性剤を粘膜に適用できる水などの液体希釈剤に溶解あるいは懸濁して水性溶液もしくはヒドロゲル（徐放性ゲルにしても良い）とするか、またはガス状の媒体に分散させエアゾール、噴霧スプレーとするか、または、粉末状の担体中に希釈して微粉末製剤とするか、または、軟膏剤または、クリーム剤とすることができる。更に、坐薬のような固形剤にすることもできる。
【００２０】
液体希釈剤としては注射用水またはリン酸、炭酸などの無機酸の緩衝液または酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−リン酸、酒石酸などの有機酸の緩衝液またはアミノ酸の溶液または、生理的食塩水などが用いられ、ｐＨ３〜８の範囲での適用が可能である。
【００２１】
また、本発明の製剤には適宜、安定化剤、増粘剤、溶解補助剤、保存剤、増量剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、ゲル化剤などを含有していてもよい。また、本発明の非イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を安定化剤（吸着防止剤など）分散剤に用いることもできる。さらに肺に適用する場合は、気管支拡張剤または肺表面活性物質などを用いることによりさらに効果が期待される。
【００２２】
本発明をさらに有効に利用する方法として、製剤の粘度を上げる技術（特開昭６１−１０６５０９号）、付着粒子をつくる技術または、粘膜刺激を緩和する技術を適用することも可能である。
【００２３】
投与形態は、各々の粘膜に適した投与形態を用いることができる。たとえば鼻腔に適用する場合は、滴下容器、または鼻腔用エアゾールアプリケーターなどを用いて鼻腔内に滴下あるいは噴霧投与する方法が適している。また、肺に適用する場合は、ネブライザーまたは吸入用エアゾールアプリケーターなどを用いて吸入する方法が適している。
【００２４】
本発明の製剤におけるヒトＧ−ＣＳＦの投与量は対象の患者の病状を配慮して決めることができるが、通常成人一人１回当り０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲から適宜選択される。
【００２５】
界面活性剤の含量は、製剤全容量の０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の量が用いられる。
【００２６】
以下本発明を実験例（薬理効果）および実施例（製剤例）をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
実験例１（経鼻吸収）
ＳＤ系雄性ラット（２５０〜３５０ｇ）を麻酔下マイクロピペットを用いて下記のヒトＧ−ＣＳＦ調製液を外鼻孔より投与し、投与後４８時間にわたり、尾静脈より採血を行い総白血球数を測定し、その変化を観察した。
【００２８】
薬理学的利用率（利用率）は白血球増加率を指標とし皮下投与（１０μｇ／ｋｇ）後４８時間の血中白血球増加率時間曲線下の面積（ＡＵＣ）を１００％とし、経鼻投与（１００μｇ／ｋｇ）後４８時間のＡＵＣ増加量を求め次式より算出した。さらに、吸収促進剤の効果を、無添加（対照）の利用率を１００％としてその増加率を算出した。結果を表１に示した。
【００２９】
0003655645.tif 000002
ｉｎ：経鼻投与
ｓｃ：皮下投与
Ｃｏｎｔ：生理的食塩水経鼻投与
調製液
遺伝子組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）に表１の吸収促進剤を加え、ｐＨ６．５、比浸透圧（対生理食塩水）を１、ｒｈＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｍｌおよび吸収促進剤を１０ｍｇ／ｍｌ（１．０％）となるように調製して経鼻投与剤を得た。
【００３０】
0003655645.tif 000003
実験例２（経肺吸収）
ＳＤ系雄性ラット（２５０〜３５０ｇ）を麻酔下で首頸部を切開後、気管を露出し、ポリエチレンチューブ（ＰＥ２４０：ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー）を気管支内部にカニューレを施した。下記のヒトＧ−ＣＳＦ調製液をＰＥ２４０より細いポリエチレンチューブ（ＰＥ５０：ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー社製）を用い、シリンジに接続後肺に投与した。生物学的利用率（利用率）を算出する目的でラットに皮下投与を行った。投与後、経時的に外腸骨動脈より採血し、得られた血漿からＧ−ＣＳＦ濃度をＥＩＡ法を用いて８時間までの血中濃度を測定した。生物学的利用率（利用率）はＧ−ＣＳＦの血中濃度を指標とし、皮下投与（１００μｇ／ｋｇ）後８時間の血中Ｇ−ＣＳＦ濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ）を１００％とし、経肺投与（１００μｇ／ｋｇ）後８時間のＡＵＣを求め、次式より算出した。さらに吸収促進剤の効果は無添加経肺投与の利用率を１００％としてその増加率を算出した。
【００３１】
0003655645.tif 000004
ｉｐ：経肺投与
ｓｃ：皮下投与
調製液
遺伝子組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）に吸収促進剤を加え、ｐＨ６．５、比浸透圧（対生理食塩水）を１、ｒｈＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｍｌおよび吸収促進剤を１０ｍｇ／ｍｌ（１．０％）となるように調製して経肺投与剤を得た。
【００３２】
0003655645.tif 000005
実験例３（経肺吸収）
ＳＤ系雄性ラット（２５０〜３５０ｇ）を麻酔下で首頸部を切開後、気管を露出し２６Ｇの注射針を接続したシリンジを用いて気管支内部に直接ヒトＧ−ＣＳＦ調製液を注入した。投与後４８時間（１０μｇ／ｋｇ）或いは７２時間（５０、１００、２００μｇ／ｋｇ）に亘り尾静脈より採血を行い、総白血球数を測定しその変化を観察した。投与経路による薬理学的利用能を比較する目的で、同様のヒトＧ−ＣＳＦ調製液を皮下並びに静脈内投与した。各投与経路における白血球増加率（投与前の白血球数を基準とする）は、投与後４８時間（１０μｇ／ｋｇ）或いは７２時間（５０、１００、２００μｇ／ｋｇ）の血中白血球増加率時間曲線下の面積（ＡＵＣ：％・ｈｒ）を算出し、比較した。遺伝子組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）の投与量は、投与経路によらず１０、５０、１００及び２００μｇ／ｋｇである。
【００３３】
0003655645.tif 000006
〔実施例１〕
遺伝子組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテルの最終濃度がそれぞれ５００μｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液で調製することによりｐＨ６．５、比浸透圧（対生理的食塩水）１の経鼻投与および経肺投与製剤が得られる。
【００３４】
〔実施例２〕
遺伝子組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルの最終濃度がそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液で調製することによりｐＨ６．５、比浸透圧（対生理食塩水）１の経鼻投与製剤が得られる。
【００３５】
〔実施例３〕
遺伝子組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテルの最終濃度がそれぞれ５００μｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液で調製することによりｐＨ６．５、比浸透圧（対生理食塩水）１の経鼻投与製剤が得られる。
【００３６】
【発明の効果】
ヒトＧ−ＣＳＦを単独投与することによりまたはヒトＧ−ＣＳＦに特定の非イオン性界面活性剤を配合することにより、優れた吸収性を持つ経粘膜投与剤が得られ、これによって、ヒトＧ−ＣＳＦの投与を容易かつ効率的に行うことならびに局所および全身においても効果が発揮され、適応する疾患に応じた広い治療領域で使用することが可能になる。