(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス・セレビシエに属し、アミノ酸の取り込に関与する遺伝子の変異としてｇａｐ１及びａｐｆ１（ｓｈｒ３）の変異を有する酵母変異株ＭＡ２５０４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４０７号）。
【請求項２】
サッカロミセス・セレビシエに属し、アミノ酸の取り込に関与する遺伝子の変異としてｇａｐ１及びｃａｎ１の変異を有する酵母変異株ＭＡ２６０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４０８号）。
【請求項３】
酵母を用いて酒類を製造する方法において、請求項１又は２に記載の酵母変異株を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
【請求項４】
前記酒類が、ワイン又は麦芽アルコール飲料である請求項３に記載の酒類の製造方法。
【請求項５】
ブドウ果汁にワイン酵母株を酒母として接種して発酵するワインの製造方法において、請求項１又は２に記載の酵母変異株を用いることを特徴とするワインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酒類の製造に用いる酵母に関し、また、酵母を用いた酒類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、アミノ酸はワインをはじめとする酒類の呈味成分の一つであり、品質を左右する重要な要素であると考えられている。そのため、製造される酒類中のアミノ酸含有量をコントロールすることが酒類の製造において重要である。
【０００３】
しかしながら、例えば、ワインの製造においては、製造されるワイン中のアミノ酸の大部分はブドウ果汁からの移行によるが、ブドウ果汁中のアミノ酸の多くは酵母の栄養源として発酵中に消費されるために、ワイン中のアミノ酸含有量をコントロールすることは極めて困難である。
【０００４】
我が国で生産されるブドウの代表的品種である甲州種ブドウから製造されるワインは比較的平板な味であり、アミノ酸をはじめとする窒素化合物の含有量が少ないことがその原因の一つと考えられている。従って、甲州ワインは、平板な味を補うために糖分を残した甘口のワインが主流で、辛口のワインを製造する場合にはシュール・リー法、すなわち、ワインと澱を接触することにより酵母の自己消化からアミノ酸等の成分を溶出させてワインにボディー感を与える方法が採用されている(K. Ariizumi et al.: Am. J. Enol. Vitic., vol.45, pp.312, 1994)。しかし、シュール・リー法は、ワインと澱の接触期間が長期にわたり、さらには酵母の自己消化によるワイン中のアミノ酸の増加量は必ずしも多いとは言えないという問題がある。また、昨今、酒質の多様化が求められており、それに応じるためにも、製造される酒類中のアミノ酸含有量をコントロールできる新たな酒類の製造方法の開発が望まれる。
【０００５】
ところで、酵母が細胞外に存在するアミノ酸を栄養源として利用するためにアミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。かかるアミノ酸の取込みを行なう酵素として、基質特異性の異なる多くのアミノ酸透過酵素、例えば、GAP1遺伝子にコードされるgeneral amino acid permeaseやCAN1遺伝子にコードされるarginine permeaseをはじめとする多くのアミノ酸透過酵素が存在することが明らかにされている(B. Andre: Yeast, vol.11, pp.1575, 1995, B. Nelissen et al.: FEBS Letters, vol.377, pp.232, 1995, M. Grenson: In De Pont, J. J. H. H. M. (ed.), Molecular Aspects of Transport Proteins, Chapter 7, "Amino acid transporters in yeast; structure, function and regulation", Elsevier, Amsterdam, pp.219, 1992,他)。
【０００６】
これまでに、酵母のアミノ酸透過酵素に関与する遺伝子に変異を付与した変異株の取得方法や該変異のアミノ酸の取込みに及ぼす影響についても数多くの報告がある。例えば、gap1変異株はD-アミノ酸に耐性を示す菌株の中から取得でき、シトルリンをはじめとする多くのアミノ酸の取込みが抑制されることが知られている(J. Rytka: J. Bacteriol., vol.121, pp.562, 1975)。また、can1変異株はアルギニンのアナログであるL-カナバニンに耐性を示す菌株の中から取得でき、アルギニンの取込みが抑制されることが知られている(M. Grenson et al.: Biochim. Biophys. Acta, vol.127, pp.325, 1966, M. Grenson, Molecular Aspects of Transport Proteins, Chapter7, "Amino acid transporters in yeast: structure, function and regulation, Elsevier Science Publishers, 1992他)。また、apf1変異株はプロリンのアナログであるL-アゼチジン-2-カルボキシレートあるいは3,4-ジヒドロ-DL-プロリンに耐性を示す菌株の中から取得でき、プロリンの取込みが抑制されること、及び種々のアミノ酸透過酵素の活性が抑制されることが知られており、さらに、gap1とapf1の二重変異を有する酵母においては、グルタミン酸をはじめとする多くのアミノ酸を単一窒素源として生育できないことが知られている(M. Grenson and C. Hennaut: J. Bacteriol., vol.105, pp.477, 1971, P. F. Lasko and M. C. Brandriss: J. Bacteriol., vol.148, pp.241, 1981)。
【０００７】
なお、SHR3遺伝子は小胞体からのアミノ酸透過酵素のプロセシングと輸送に不可欠なタンパク質をコードし、shr3とapf1変異は互いに相補しない対立遺伝子であることが報告されている（P. O. Ljungdahl et al.: Cell, vol.71, pp.463, 1992, J. Horak and A. Kotyk: Biochemistry and Molecular Biology International, vol. 29, pp. 907, 1993）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、酒類の製造、特にワインの製造において、酒類の重要な呈未成分の一つであるアミノ酸含有量を改善する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アミノ酸の取り込みに関与する遺伝子に二重の変異、特にはgap1及びapf1(shr3)あるいはgap1及びcan1に変異を有する、サッカロミセス属（好ましくはサッカロミセス・セレビシエ）に属する酒類製造用酵母変異株に関する。
【００１０】
本発明はまた、サッカロミセス・セレビシエに属し、アミノ酸の取り込みに関与する遺伝子の変異として、gap1及びapf1(shr3)の変異を有する酵母変異株MA2504株（FERM P-１７４０７号）に関する。
【００１１】
本発明はまた、サッカロミセス・セレビシエに属し、アミノ酸の取り込みに関与する遺伝子の変異として、gap1及びcan1の変異を有する酵母変異株MA2601株（FERM P-１７４０８号）に関する。
【００１２】
本発明はまた、上記酒類製造用酵母変異株を用いた、酒類｛好ましくはワイン又は麦芽アルコール飲料（例えばビール、発泡酒）｝の製造方法に関し、特には、製造される酒類中のアミノ酸含有量が改善された酒類の製造方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、上記酒類製造用酵母変異株を用いたワインの製造方法に関し、特には、製造されるワイン中のアミノ酸含有量が改善されたワインの製造方法に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、サッカロミセス属に属し、アミノ酸取込みに関与する遺伝子に二重の変異を付与した酵母変異株、特にはgap1及びapf1あるいはgap1及びcan1の二重変異を付与した酵母変異株に関する。
【００１５】
本発明はまた、上記二重変異を付与した酵母変異株を酒母として接種し、発酵を行なうことを特徴とするアミノ酸含有量が改善された酒類、特にはワインの製造方法に関する。
【００１６】
本発明に用いられる酵母はサッカロミセス属に属する酵母であり、例えば、The Yeasts A Taxonomic Study, 4th ed. C. P. Kurtzman and J. W. Fell (ed.), Elsewier (1998)に従って分類されるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バイアナス（Saccharomyces bayanus）、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）等に属するワイン酵母及び／又はビール酵母が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエに属する酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエOC-2、W3、Prise de Mousse等のワイン酵母を挙げることができる。
【００１７】
酵母の変異方法としては、紫外線照射等の物理的方法あるいは変異剤（例えば、エチルメタンサルフォネート等の溶液）に懸濁させる化学的方法があり、既知の方法が適宜使用できる。
【００１８】
変異株の選抜方法について説明する。gap1変異株は、酵母に変異を誘発した後、D-アミノ酸、例えば、D-ヒスチジンに耐性を示す菌株の中から取得できる。すなわち、D-ヒスチジン耐性を示す変異株から、シトルリンを単一窒素源として添加した最少培地（グルコース0.5%、ディフコ社製バクト・イーストナイトロジェンベース（アミノ酸と硫酸アンモニウムを含まない）0.17%、寒天2%）（％＝w/v％）に生育できないこと、及び既知のgap1変異の菌株を用いた相補試験において、相補能がない株を選抜することにより取得できる。can1変異株はアルギニンのアナログであるL-カナバニン耐性を示す菌株の中から取得でき、既知のcan1変異の菌株を用いた相補試験において、相補能がない株を選抜することにより取得できる。apf1変異株は、プロリンのアナログであるL-アゼチジン-2-カルボキシレートあるいは3,4-ジヒドロ-DL-プロリンに耐性を示す菌株の中から取得でき、β-2-チエニル-DL-アラニンに耐性を示し、プロリンを単一窒素源として添加した培地に生育できず、かつ既知のapf1変異の菌株を用いた相補試験において、相補能がない株を選抜することにより取得できる。
【００１９】
次に、このようにして取得した変異株から、二重変異の菌株を取得するためには、再度の変異処理による方法あるいは変異株間で交雑株を取得して、交雑株由来の単胞子株の中から選抜する方法を用いることができる。再度の変異処理から目的の変異株を選抜する際には、前記の方法が使用できる。例えば、gap1及びapf1の変異を有する変異株は、すでにgap1変異を有する株を用いて再度変異処理を行い、上記のapf1変異株を得るための方法を行えば良い。交雑により二重変異株を得る方法においては、交雑株は、酵母の接合型や倍数性を考慮して適宜、胞子-胞子、胞子-細胞あるいは細胞-細胞間での接合により取得でき、McClaryらの培地（酢酸ナトリウム0.82%，グルコース0.1%，酵母エキス0.25%，塩化カリウム0.18%，寒天2%）（％＝w/v％）で子嚢胞子形成を誘導した後に胞子を分離、コロニーを形成させて単胞子株を得、目的とする変異株を選択するのに適した前記の方法を組み合わせることにより目的の変異株を選抜できる。
【００２０】
本発明の変異酵母は、酒類、例えば、ワイン、麦芽アルコール飲料（例えばビール、発泡酒）等の製造に好適に使用でき、特に、ワインの製造に好ましく用いられる。
【００２１】
本発明においてワインを製造するには、取得した酵母変異株を酒母として用い、通常行われているワインの製造法と同様の方法、例えば、葡萄酒醸造法（山梨県工業技術センター編）に記載の方法でワインを製造できる。
【００２２】
また、本発明においてワイン以外の酒類を製造するには、取得した酵母変異株を用い、通常行われている酒類の製造法と同様の方法、例えば、"Technology Brewing and Malting", Kunze著, VLB, 1996年；"Die Bierbrauerei, Band I,II",（第７版）, Narziss著, Enke, 1992年；「麦酒醸造学」松山茂助著、東洋経済新報社、1969年に記載の方法でビールを製造できる。
【００２３】
本発明の酵母変異株を使用する酒類の製造では、アミノ酸の取込みが抑制されていることから安定的にアミノ酸含有量が改善された酒類の製造が可能となる。また、本発明の酵母変異株を使用するワインの製造では、アミノ酸の取込みが抑制されていることから安定的に、さらには、従来のシュール・リー法の如くワインと澱の接触を必要とせずに短期間でアミノ酸含有量が改善されたワインの製造が可能である。
【００２４】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）  二重酵母変異株の取得
ワイン酵母として、ホモタリック、2倍体で、高い子嚢胞子形成率と発芽率を示すサッカロミセス・セレビシエOC-2(IAM4274)を親株として用いた。McClaryらの培地（酢酸ナトリウム0.82%，グルコース0.1%，酵母エキス0.25%，塩化カリウム0.18%，寒天2%）（％＝w/v％）に接種して子嚢胞子の形成を誘導させ、子嚢壁溶解酵素（商品名：ザイモリエース20T、生化学工業製）250ppmを含むりん酸緩衝液（pH7.5）中で子嚢壁を溶解の後に滅菌水で洗浄し、りん酸緩衝液（pH8.0）を加えて胞子懸濁液4.6mlを得た。これに、40w/v%グルコース溶液0.25ml及びエチルメタンサルフォネート0.15mlを添加して30℃で80分間変異処理を行ない、等量の10w/v%チオ硫酸ナトリウム溶液を加えて変異処理を停止した後に滅菌水で洗浄し、滅菌水に懸濁して変異処理胞子懸濁液とした。
【００２６】
変異処理胞子懸濁液をD-ヒスチジン10mM及びプロリン0.1w/v%を含む最少培地（グルコース0.5%、イーストナイトロジェンベース（アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない）0.17%、寒天2%）（％＝w/v％）に塗布して3〜7日間培養後に生育するコロニーの中から、シトルリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められず、かつ、既知のgap1変異を有する菌株、例えば2512c-2A(agap1)株を用いた相補試験において、D-ヒスチジン耐性及びシトルリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められない性質を示す、すなわち、相補能がない株（MA1007株）をgap1変異株として選抜した。
【００２７】
同様に、L-アゼチジン-2-カルボキシレート0.5mM及び尿素0.1w/v%を含む最少培地に生育するコロニーの中から、β-2-チエニル-DL-アラニン(100mg/l)および尿素0.1w/v%を含む最少培地に生育し、プロリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められず、かつ、既知のapf1変異を有する菌株、例えば、30967c(apf1ura3)を用いた相補試験において、L-アゼチジン-2-カルボキシレート耐性及びプロリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められない性質を示す、すなわち、相補能がない株（MA1325株）をapf1変異株として選抜した。
【００２８】
また、L-カナバニン40mg/l及び硫酸アンモニウム0.5w/v%を含む最少培地に生育するコロニーの中から、既知のcan1変異を有する菌株、例えばAH-22(a leu2-3,112his4can1)を用いた相補試験において、L-カナバニン耐性を示す、すなわち、相補能がない株（MA1205株）をcan1変異株として選抜した。
【００２９】
次に、MA1007株とMA1325株のそれぞれの株を用いて、McClaryらの培地で子嚢胞子を形成し、前記と同様にしてザイモリエースで子嚢壁を溶解させた後に、ミクロマニピュレータを用いて胞子-胞子間で有性交雑を行い、得られた交雑株由来の単胞子株の表現型及び相補性試験から、gap1とapf1の二重変異を有する株（MA2504株）を取得した。本菌株は平成１１年６月１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はFERM P-１７４０７である。また、同様の方法により、MA1007株とMA1205株から、gap1とcan1の二重変異を有する株（MA2601株）を取得した。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年６月１日付けで寄託されており、その受託番号はFERM P-１７４０８である。
【００３０】
上記に示した手順を説明のため、図１にフローチャートとして記す。
【００３１】
上記の如くして取得した変異株について、各種アミノ酸を単一窒素源として添加した最少培地における生育について検討した。結果を、表1に示す。gap1変異のMA1007株はシトルリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められず、apf1変異のMA1325株はプロリンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められなかったが、両株ともにグルタミン酸あるいはアラニンを単一窒素源とする最少培地に生育が可能であった。しかし、gap1とapf1二重変異のMA2504株では、シトルリン、プロリンだけでなくグルタミン酸、アラニンを単一窒素源とする最少培地においても生育が認められなかった。一方、can1変異のMA1205株はアルギニンを単一窒素源とする最少培地に生育が可能であったが、gap1とcan1二重変異のMA2601株ではアルギニンを単一窒素源とする最少培地に生育が認められず、これらの二重変異を付与することにより特定のアミノ酸の取込みが抑制され、生育ができなくなることが示された。
【００３２】
【表１】
0003676943.tif 000002
【００３３】
（実施例２）  ワインの製造試験
実施例１において取得した二重変異を有するMA2504株及びMA2601株並びにこれらの親株であるサッカロミセス・セレビシエOC-2を使用し、グラニュー糖にて糖度を23度に調整した甲州種ブドウ果汁を原料として常法によりワイン製造を実施した。製造されたワインの一般成分分析結果を表2に示す。MA2504株及びMA2601株の発酵速度は、親株に比較してやや遅くなったが、アルコール濃度、エキス分、総酸、pH、有機酸組成の分析値に大きな差は認められなかった。また、アミノ酸分析結果を表3に示す。親株により製造したワインはそのアミノ酸の大部分がプロリンであったが、MA2504株により製造したワインは、プロリン含有量が多く、さらには、アスパラギン酸、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン及びヒスチジンのアミノ酸も多く含まれ、総アミノ酸量は親株により製造したワインの約1.9倍であった。MA2601株により製造したワインは、プロリン含有量がやや少なくなったが、アルギニンが果汁中の含有量と同程度含まれており、総アミノ酸量は親株により製造したワインの約1.3倍であった。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
【表３】
0003676943.tif 000004
【００３６】
上記の如くして製造されたワインについて、ワイナリーの熟練した7名のパネラーにより官能試験を行った。その結果、MA2504株及びMA2601株により製造したワインは親株により製造したワインに比較して味に厚みがあるとの評価が得られた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、酵母によるアミノ酸の取込みを抑制して、安定的にアミノ酸含有量が改善された酒類、特にはワインを製造できる方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の酵母変異株を得る工程の好適な実施形態を示すフローチャートである。
【図１】
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