(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中におけるＩＬ−１２を検出する方法であって、
（ａ）ＩＬ−１２が媒介する活性を生じさせる細胞を準備する工程と、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞によるＩＬ−１２が媒介する活性を阻害するのに有効である所定量のＩＬ−１２のｐ４０サブユニットと、所定量の試料との存在下でインキュベートする工程と、
（ｃ）前記活性を検出する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２】
ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットがヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）前記活性を、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットが不存在の場合に前記細胞において生ずる活性と比較する工程を更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、前記所定量のＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを、前記所定量の試料を添加するのと同時に、あるいは添加した後加える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中におけるＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを検出する方法であって、
（ａ）ＩＬ−１２が媒介する活性を生じさせる細胞を準備する工程と、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞によるＩＬ−１２が媒介する活性を誘導するのに有効である所定量のＩＬ−１２と、所定量の試料との存在下でインキュベートする工程と、
（ｃ）前記活性を検出する工程と
を含んでなる方法。
【請求項６】
ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットがヒト由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）前記活性を、試料が不存在の場合に前記細胞において生ずる活性と比較する工程を更に含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、前記所定量のＩＬ−１２を、前記所定量の試料を添加するのと同時に、あるいは添加した後加える、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
天然または組み換えのＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを含んでなる、ＩＬ−１２が媒介する活性の阻害剤。
【請求項１０】
ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットがヒト由来である、請求項９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
天然または組み換えのＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを含んでなる、ＩＬ−１２が媒介する活性の調節異常と関連した病状の診断剤であって、ＩＬ−１２が媒介する活性の調節異常と関連した病状が、全身性紅斑性狼瘡、Wegener 症候群またはリューマチ性関節炎などの自己免疫疾患、細菌またはウィルス感染、およびある種の固形腫瘍または白血病から選択される、診断剤。
【請求項１２】
ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットがヒト由来である、請求項１１に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
産業上の利用分野
本発明は、インターロイキン12のｐ40サブユニットを含んでなる医薬品に関する。この医薬は、免疫系の調節異常に関連した疾患の治療に特に有用である。
【０００２】
従来の技術
免疫反応は、種々のＴ細胞集団によって維持されている。免疫反応の型に応じ、１型のＴヘルパー細胞（ＴＨ１）または２型のＴヘルパー細胞（ＴＨ２）のいずれかによってＴ細胞の介助が優先的に提供される。今日まで知られている限り、ＴＨ１細胞は、異なるサイトカインを生成する点でＴＨ２細胞とは特に異なっている。
【０００３】
Dunn et al. (J. Immunol. 142:3847 ff,1989)は、早くも１９８９年にＴＨ１クローンを補助細胞およびＩＬ−２の存在下で培養すると、ＴＨ１クローンがガンマ−ＩＦＮを生成することを証明した。Germann et al. (Eur. J. Immunol., 8:1857-1862, 1991)は、ＴＨ１細胞によるガンマ−ＩＦＮの合成には可溶性の媒介物質が必要なことを証明した。Germann 等がＴＳＦと命名した媒介物質は、ネズミＩＬ−12と同一であるということが比較研究によって明らかにされた。最近、Mengel et al.(Eur. J. Immunol., 22:3173-3178,1992)も同様に、活性化したマウスＢ細胞リンパ腫ラインＡ−２０の上清において、Ｔ細胞におけるガンマ−ＩＦＮの生成を促進する可溶性因子について報告した。MengelによってＡ−２０の上清で説明されたこの可溶性因子は、Wolf, S.F. et al.(J. Immunol., 156:3074, 1991)によっていわゆる「ヒトナチュラルキラー細胞促進因子」（ＮＫＳＦ：human natural killer cell stimulatory factor）と機能的に比較され、ヒトＩＬ−12のネズミ類似体であると考えられている。ＩＬ−12およびＮＫＳＦは同一である可能性があるが、両方ともガンマ−ＩＦＮの合成を促進することが知られている。ＩＬ−12（ＮＫＳＦに対応）の機能は、天然ではガンマ−ＩＦＮの生成促進には限られない。中でも、ＩＬ−12（ＮＫＳＦに対応）は、ナチュラルキラー細胞（いわゆるＮＫまたはＬＧＬ細胞）の機能およびＩｇＥの生成にも影響を及ぼし、ＩＬ−12によって誘発される休止抹梢単核細胞の増殖を増加させる。
【０００４】
ＩＬ−12は、ｐ35およびｐ40と称される２種類の異なるサブユニットからなることも知られている（Podlasky,F.J.et.al.(1991)Arch.Biochem. Biophys. Vol. 294, No.1,pp.230-237 ）。またネズミＩＬ−12も、ほとんど同一の構造を有することがわかった（Schoehaunt D. S. et al.(1992) J. Immunol. Vol. 148,No. 11, pp3433-3440）。ＩＬ−12のｐ40−サブユニット自体には、ＩＬ−12に特異的な生物活性は何もないが、このｐ40サブユニットは、完全なＩＬ−12分子の生物活性にとって大変重要なものであることが明らかになっている。ｐ40サブユニットは、ＩＬ−12レセプター細胞と直接に相互作用すると考えられている。
【０００５】
一連の出版物によれば、サイトカイン生成およびサイトカイン効果の調節異常は、急性および慢性の免疫系疾患およびその後遺症を引き起こす場合がある。従って、サイトカインが媒介する活性に影響を与えることが、治療へのアプローチの第一歩である。
【０００６】
【発明の概要】
従って、本発明は、ＩＬ−12が媒介する活性の調節異常に関連した病状の治療に有利に用いることのできる医薬品を利用可能にするという目的に基づいている。
【０００７】
意外にも、ＩＬ−12のｐ40サブユニットを用いてＩＬ−12が媒介する活性を阻害することができることが判った。このことによって、前記の調節メカニズムへの干渉によって治療効果を挙げることができる。
【０００８】
従って、本発明は、天然または組換えの、場合によっては修飾した哺乳類ＩＬ−12のｐ40サブユニットを含んでなる医薬品に関する。本発明の範囲内において、修飾したｐ40サブユニットは、ｐ40の活性部分または変体であり、動物モデル（マウス）またはイン・ビトロで、例えば例に示した方法によって、活性を証明することができる。
【０００９】
本発明の好ましい態様は、ヒト由来のｐ40サブユニットを含んでなる医薬品に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、哺乳類ＩＬ−12の天然または組み換えｐ40サブユニットであって、好ましくはヒト由来の組織または細胞から得たものを含んでなる診断薬に関する。
【００１１】
更に本発明は、天然または組み換えの、場合によっては修飾した哺乳類、好ましくはヒト由来のＩＬ−12のｐ40サブユニットの使用であって、ＩＬ−12が媒介する活性の調節異常に関連した病状、例えば全身性紅斑性狼瘡、Wegener 症候群またはリューマチ性関節炎などの自己免疫疾患、細菌またはウィルス感染、およびある種の固形腫瘍または白血病、の治療に用いる医薬品の製造への使用に関する。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、天然または組み換えの、場合によっては修飾した哺乳類ＩＬ−12ｐ40サブユニットの使用であって、体液、例えばヒト体液中でのＩＬ−12の検出法における使用に関する。この方法は、ＩＬ−12活性がｐ40により特異的に阻害されることに基づいており、例えば実施例１または２と同様に、用いられるＩＬ−12が分析を行う試料に由来しており、ｐ40を所定量加えるようにすることができる。
【００１３】
前記の総ての方法は、天然または組み換えのヒト由来のｐ40を利用する好ましい方法である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、ＩＬ−12ｐ40サブユニットの検出に用いるＩＬ−12を含んでなる診断薬に関する。この診断薬は、例えば実施例１および２と同様の方法で、使用されるｐ40阻害剤活性が分析される試料に由来し、ＩＬ−12を所定量加えるようにして用いることができる。
【００１５】
【発明の具体的説明】
更に、本発明を実施例および特許請求の範囲によって説明する。
【００１６】
ＩＬ−12およびｐ40の単離
組み換えネズミＩＬ−12およびｍＩＬ−12のｐ40サブユニットを単離するため、ｍＲＮＡを標準的手法（Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T., (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) を用いてマウス脾臓細胞から単離した後、二本鎖ｃＤＮＡに転換した。Schoenhaut et al.(Schoenhaut, D., Chua, A.O., Wolitzky, A.G., Quinn, P.M.,Dwyer, C.M.,McComas, W., Familletti, P.C., Gately, M.K., Gubler, U.(1992). J. Immunol. 148, 3433）によって報告されたプライマーを用いて、およびこの出版物に示された実験条件に従ってＰＣＲを行ったところ、約８００塩基対のフラグメントが生成した。
【００１７】
このＰＣＲフラグメントを、標準的手法（Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)によって配列決定した。この結果、実験的に決定したｃＤＮＡの配列が、ネズミｐ40サブユニットについて公表された配列と同一であることが判った。ｐ35サブユニットのＰＣＲフラグメントを単離し、同様の方法によって配列決定を行った。下記の生物学的活性が実際にＩＬ−12および／またはｐ40サブユニットに由来することを確認する目的で、ＰＣＲフラグメントを、個々にまたは組み合わせてベクターｐＡＢｓｔｏｐにクローニングし、標準的方法を用いてＢＨＫ−２１細胞で安定に発現させた（Zettlmeibl G., Wirth, M., Hauser, G., Kupper, H.A. (1988)Behring Inst. Mitteilungen (Communications) 82, 26 ）。
【００１８】
生物学的に活性なｍＩＬ−12および生物学的に活性なｍＩＬ−12のｐ40サブユニットの両方を、トランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞の培養上清から単離することができた。
【００１９】
ネズミＢ−細胞リンパ腫ラインＡ−２０(American Type Culture Collection,ATCC TIB208)の上清であってMengle et al. （上記参照）の報告した方法に従って活性化したものを、天然ＩＬ−12の入手源として用いた。Ａ−20上清中のMengelによって報告された可溶性媒介物質は、ＮＫＳＦと機能的に比較され、ヒトＩＬ−12のネズミアナログであると認められている。Germann et al.（上記参照）によって報告された方法によって調製され、活性化された脾臓細胞調製物は、天然ＩＬ−12の別の入手源であった。比較研究の結果、Germann et al.によって報告されたＴＳＦはｍＩＬ−12と同一であることが明らかになった。
【００２０】
ネズミＩＬ−12のｐ40サブユニットを分泌するハイブリドーマ細胞を単離することができ、これをこのサブユニットの天然入手源として用いた。このハイブリドーマ細胞を調製するため、１〜１０×１０６のネズミＴ細胞を同系の単球（１×１０５／ｍｌ）および組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養したものを、雌性ラット（Lewis strain, Zentralinstitut fur Versuchstierkunde （実験動物学中央研究所）, Hannover）に、ＣＦＡ（完全フロインドアジュバンド）と共に皮下注射した。それぞれの場合に、２週間の間隔を置いて更に２回免疫化を行い、この場合には同量の細胞を腹腔内注射した。最後の注射の３日後にこの動物を屠殺し、その脾臓細胞をネズミミエローマ細胞系ＳＰ２／ＦＯ細胞と、Koehler およびMilsteinの既知の標準的方法（Nature 256, p. 495ff; 1975）によって融合させた。成長しているハイブリドーマ細胞を標準的方法によって選択した。実施例１に示した実験と同様に行った研究では、単離したハイブリドーマの中の１個の上清が、ガンマ−インターフェロンの放出を阻害できることを証明した。Kobayashi et al.（Kobayashi,M.; Fritz, L.,Ryan,M., Hewick,R.M., Clar, S.C., Chan, S., Loudon,R., Sherman, F., Perussia, B., Trinchieri, G.(1989) J. Exp. Med. 170, 827）によって公表された方法に従って、分泌されたタンパク質を、このハイブリドーマ細胞の培養上清から精製した。逆相ＨＰＬＣ処理による精製後、単離されたタンパク質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画したところ、主要なタンパク質バンドが、約４０〜４５ｋＤの領域に見つかった。配列を比較したところ、この単離されたタンパク質はネズミＩＬ−12のｐ40サブユニットと同一であることが確認された。
【００２１】
最後に本医薬品を、それ自体は当業者には既知の方法によって製造する。このＩＬ−12ｐ40サブユニット（＝活性化合物）を、有効濃度で、そのまままたは好適な薬学的添加剤若しくは補助物質並びに生理学上許容可能な溶媒と組み合わせて用いる。
【００２２】
【実施例】
実施例１ ＩＬ−12によって誘発されるガンマ−ＩＦＮ放出のｐ40／ＩＬ−12による阻害
ガンマ−ＩＦＮの放出を誘導するため、ＢＡＬＢ／ｃネズミの脾臓細胞５×１０６個を、組み換えまたは天然の所定濃度のｍＩＬ−12およびＩＬ−２の存在下または非存在下で、４８時間培養した。４８時間培養した後に、上清を脾臓細胞から採取し、細胞を含まなくなるまで遠心分離した。上清中のガンマ−ＩＦＮを市販のＥＬＩＳＡ系（e.g.IntertestTM-gamma, Mouse IFN-gamma ELISA kit, Genzyme ）によって測定した。この活性化脾臓細胞の培養上清由来のガンマ−ＩＦＮは、組み換えネズミガンマ−ＩＦＮ（Genzyme)との比較によって定量した。典型的な実験を図に示す。データから明らかなように、ＩＬ−12によるネズミ脾臓細胞の培養は、用量依存的な様式で、＞５ｎｇ／ｍｌのガンマ−インターフェロンの放出を導く。しかしながら、この脾臓細胞を培養開始時に組み換えネズミｐ40／ＩＬ−12またはｍＩＬ−12の天然ｐ40サブユニットを含むハイブリドーマ上清と共に予備インキュベートし、その後ｍＩＬ−12によって刺激すると、ガンマ−ＩＮＦのＩＬ−12依存性の合成は少なくとも５０％まで抑制された。本実施例では、組み換えｐ40／ＩＬ−12およびｍＩＬ−12の天然ｐ40サブユニットを含むハイブリドーマ上清の両方が、ＩＬ−12によって誘導されるガンマ−ＩＮＦの合成を阻害できることを証明している。
【００２３】
実施例２  ＩＬ−12によって誘導されるＮＫ細胞の活性のｐ40／ＩＬ−12による阻害
Ｃ５７ＢＬ６マウスの脾臓細胞を、血清を含まないIscove培地にて、細胞濃度５−１０×１０６細胞／ｍｌ、２４ウェルのCostarプレートで３７℃で１８時間培養した。この脾臓細胞を、様々な濃度の組み換えまたは天然ネズミＩＬ−12と共に培養した。１８時間後に細胞を採取し、生存細胞の数をトリパンブルー染色法によって測定し、細胞溶解活性を５時間の51Ｃｒ放出試験で測定した。ＹＡＣ−１細胞(ATCC TIB160) を標的細胞として用いた。標的細胞を51Ｃｒで標識し、51Ｃｒ放出試験を標準の方法（Schoenhaut, D.S. et al.(1992). J. Immunol. Vol. 148,pp.3433-3440）によって行った。エフェクター細胞と標的細胞の比は、典型的には１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１であった。特異的細胞溶解の％は、（実験群の溶菌％−自発的溶菌％）：（最大溶菌％−自発的溶菌％）×１００として計算した。ＩＬ−12と共に予備インキュベートしたＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞によって、特異的な細胞溶解を出発コントロールと比較して少なくとも５倍に増加することができた（比率５０：１）。しかしながら、同じ培養条件下で、この脾臓細胞を場合によって組み換えまたは天然のマウスｐ40／ＩＬ−12と共に予備インキュベートすると、このＩＬ−12依存性の細胞溶解は、少なくとも５０％までに抑制された。
【図面の簡単な説明】
【図１】γ−インターフェロンの生産のｍｌＬ−１２による刺激。
【図１】
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