(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
【請求項３】
配列番号６のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかの蛋白質ネクチン−３をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列を有する請求項４のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３の塩基配列を有する請求項４のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号５の塩基配列を有する請求項４のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４から７のいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかの蛋白質ネクチン−３に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）を介した細胞接着結合に関与する新規な蛋白質ネクチン−３と、これらの蛋白質を取得、利用するための遺伝子工学材料等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしている。なかでも細胞の接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ：ＡＪ）は、組織の整合性を維持するのに欠くことのできない役割を担っている。このような機構的役割に加えて、ＡＪは細胞増殖や組織の形態形成のコントロールに関わっているという証拠が増えてきている。また、多くのＦ−アクチン結合タンパク質がアクチン細胞骨格を接着分子に連結するリンカーの役目を果たしていることが明らかにされてきている。しかしながらＡＪの分子的な理解は不十分であり、どのような分子がアクチン細胞骨格を細胞膜に結合させているかは明らかではなかった。
【０００３】
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、「ニューラビン」（ｎｅｕｒａｂｉｎ）と命名して既に特許出願している（特開平１０−２７６７８４号公報）。さらにこの出願の発明者等は、新規のＦ−アクチン結合タンパク質ｌ−アファディン（ａｆａｄｉｎ）と、このｌ−アファディンと結合する蛋白質ポンシンをそれぞれ単離し、特許出願している（ｌ−アファディン：特開平１１−８９５７２号公報、ポンシン：特願平１１−１７４６８７号）。そしてさらに、この出願の発明者等は、カドヘリンを介したＡＪ形成に対してアファディンとともに機能する新規な蛋白質としてネクチン（ｎｅｃｔｉｎ）−１α、−１βおよびネクチン−２α、−２δを特定している（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９）。これらのネクチン−１、２は、Ｃａ２＋非依存性の免疫グロブリン様接着分子であり、アファディンおよびポンシンとともに、ＡＪ形成に１つの系として作用することを見出している（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ４：５７３−５８１，  １９９９：Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
細胞接着の分子機構を解明することは、例えば、癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性があり、癌腫の悪性度の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。そして、そのなような解明のためには、細胞接着に関与する分子の全貌を明らかにする必要がある。
【０００５】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、細胞−細胞間接着結合に関与する新規な蛋白質を提供することを課題としている。
【０００６】
また、この発明は、この蛋白質を遺伝子工学的に生産するための材料を提供することも課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決するものとしてい、以下の(1)から(9)の発明を提供する。
(1)  配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
(2)  配列番号４のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
(3)  配列番号６のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン−３。
(4)  前記発明(1)から(3)のいずれかの蛋白質ネクチン−３をコードするポリヌクレオチド。
(5)  配列番号１の塩基配列を有する前記発明(4)のポリヌクレオチド。
(6)  配列番号３の塩基配列を有する前記発明(4)のポリヌクレオチド。
(7)  配列番号５の塩基配列を有する前記発明(4)のポリヌクレオチド。
(8)  前記発明(4)から(7)のいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
(9)  前記発明(1)から(3)のいずれかの蛋白質ネクチン−３に対する抗体。
【０００８】
発明（１）〜（３）の蛋白質ネクチン−３は、マウス由来の蛋白質であって、発明（４）のポリヌクレオチド（ゲノム遺伝子）から発現される３種類のスプライシングバリアントである（以下、それぞれネクチン−３α、ネクチン−３β、ネクチン−３γと記載する）。また、発明（４）のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡからは、それぞれ発明（５）〜（７）のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）が合成される。なお、この発明のネクチン−３は、ネクチン−１およびネクチン−２と同様に、全ての哺乳動物に共通して存在する蛋白質であることから、前記発明（１）から（３）の蛋白質ネクチン−３、およびこれらをコードするポリヌクレオチドはマウス由来のものに限定されるものではない。
【０００９】
以下、前記の各発明について実施の形態を詳しく説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明（１）のマウス蛋白質ネクチン−３αは、配列番号１に塩基配列を示した１６５０ｂｐのｃＤＮＡ（発明（５）のポリヌクレオチド）にコードされた蛋白質であり、配列番号２に示した５４９のアミノ酸配列を有している。また、このネクチン−３αの全ｃＤＮＡは、配列番号７に示した２１７８ｂｐの塩基配列を有している。
【００１１】
発明（２）のネクチン−３βは、配列番号３に塩基配列を示した１５３３ｂｐのｃＤＮＡ（発明（６）のポリヌクレオチド）にコードされた蛋白質であり、配列番号４に示した５１０のアミノ酸配列を有している。
【００１２】
発明（３）のネクチン−３γは、配列番号５に塩基配列を示した１３１７ｂｐのｃＤＮＡ（発明（７）のポリヌクレオチド）にコードされた蛋白質であり、配列番号６に示した４３８のアミノ酸配列を有している。
【００１３】
これらの蛋白質ネクチン−３は公知の方法により、マウスやその他の哺乳動物組織から単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは発明（５）〜（７）によって提供されるポリヌクレオチドを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってネクチン−３を取得する場合には、発明（５）〜（７）のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また各ポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば（発明（８））、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ポリヌクレオチドがコードするネクチン−３を大量に発現させることができる。
【００１４】
この発明の蛋白質ネクチン−３を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のポリヌクレオチドを挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ポリヌクレオチドがコードしているネクチン−３を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。
【００１５】
この発明の蛋白質ネクチン−３を動物細胞で発現させる場合には、この発明のポリヌクレオチドを、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入すれば、この発明の蛋白質ネクチン−３を動物細胞内で発現できる。
【００１６】
以上のとおり方法によって得られるマウス蛋白質ネクチン−３は、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００１７】
発明（１）〜（３）の蛋白質ネクチン−３には、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片もまた抗体を作製するための抗原として用いることができる。
【００１８】
発明（４）のポリヌクレオチドは、前記の蛋白質ネクチン−３α、βおよびγをコードする哺乳動物のゲノム遺伝子であって、例えば、発明（５）〜（７）のポリヌクレオチドまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリー等から単離することができる。
【００１９】
発明（５）〜（７）のポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５で表される塩基配列を有することを特徴とするｃＤＮＡであり、前記ネクチン−３α、βおよびγをそれぞれコードしている。これらのポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウスやその他の哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のポリヌクレオチドと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００２０】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号１、３または５において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌクレオチドもこの発明に含まれる。
【００２１】
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされている蛋白質も、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２２】
発明（５）〜（７）のポリヌクレオチドには、配列番号１、３または５で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのアンチセンス鎖からなるポリヌクレオチドも含まれる。
【００２３】
発明（９）の抗体は、蛋白質ネクチン−３それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２４】
以下、この発明のネクチン−３の構造とその機能確認について行った実験結果を説明する。
１．方法
１．１  マウス・ネクチン−３ｃＤＮＡの分子クローニング
ＥＳＴデータベースから、ネクチン−１および−２に類似しているが、同一ではない３種類のマウスＥＳＴクローン（ＡＩ１４２８１６０，  ＡＡ４９２６３３，  ＡＡ４９７８８７）をマウス脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＰＣＲ増幅した。これらｃＤＮＡ混合物をプローブとして用いてマウスｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をスクリーニングし、全長ｃＤＮＡを得た。塩基配列の決定は、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ  ３７３）を用いて行った。
１．２  ネクチン−３発現ベクターの構築
ベクターｐＣＡＧＩＰｕｒｏ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）、ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ＦＬＡＧ、ｐＧＥＸ−ＫＧ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９２：２６２−２６７，  １９９１）、ｐＭａｌ−Ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）およびｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍｓｐ−Ｆｃ（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９）を用いて以下のネクチン−３発現ベクターを構築した。なお、ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ＦＬＡＧは、ｐｒｅｐｒｏ−ｔｒｙｐｓｉｎシグナルペプチドとｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．）のＦＬＡＧエピトープをｐＣＡＧＩＰｕｒｏにサブクローニングすることによって作成した。
（ａ）ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ｎｅｃｔｉｎ−３α：配列番号２の１−５４９（全長）
（ｂ）ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ＦＬＡＧ−ｎｅｃｔｉｎ−３α：配列番号２の５６−５４９
（ｃ）ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ：配列番号２の４３３−５４９（細胞質領域）（ｄ）ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ−ΔＣ：配列番号２の４３３−５４５（Ｃ端４アミノ酸残基の  欠失）
（ｅ）ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３γ−ＣＰ：配列番号６の３９７−４３８（細胞質領域）
（ｆ）ｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍｓｐ−Ｆｃ−ｎａｃｔｉｎ−３α−ＥＸ：配列番号２の５６−４００（細胞外領域）
１．３  形質転換体細胞の構築
Ｌ細胞（京都大学より入手）を１０％ウシ胎児血清含有のＤＭＥＭ培地で培養し、形質転換Ｌ細胞を作成した。全長ヒト・ネクチン−１αを発現するＬ細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）または全長マウス・ネクチン−２αを発現するＬ細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）は、それぞれ文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）に記載の方法で作成した。全長マウス・ネクチン−３αを発現するＬ細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）は、組換え体ベクターｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ｎｅｃｔｉｎ−３αを用いて作成した。ネクチン−１αとＦＬＡＧ−ネクチン−３αを共に発現する細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−１α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）、またはネクチン−２αとＦＬＡＧ−ネクチン−３αを共に発現する細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−２α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）は、それぞれ、細胞株（ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ  ｃｅｌｌｓおよびｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ  ｃｅｌｌｓ）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ＦＬＡＧ−ｎｅｃｔｉｎ−３αをトランスフェクションすることによって作成した。各細胞株は、１日培養後、培地を交換し、５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）によって選択した。
１．４  抗体の作成
ネクチン−３αに対するウサギ抗血清（ポリクローナル抗体）を、ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰを抗原として作成した。ネクチン−３に対するラットモノクローナル抗体は、ネクチン−３αの細胞外領域とＩｇＧ  Ｆｃとの融合蛋白質を抗原として作成した。ウサギ抗ネクチン−１αポリクローナル抗体は文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９）に記載の方法で作成した。また、ネクチン−１αのアミノ酸位置４５０−４６８に対応する合成ペプチドを抗原としてウサギ抗ネクチン−１αポリクローナル抗体を文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９）に記載の方法により作成した。さらに、ラット抗ネクチン−２モノクローナル抗体を文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３５：３７４−３８４，  １９９７）に記載の方法で、また、マウス・モノクローナルおよびウサギ・ポリクローナル抗ｌ−アファディン抗体を文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３９：５１７−５２８，  １９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：１６０９−１６１８，  １９９９）に記載の方法で作成した。ラット抗Ｅ−カドヘリンモノクローナル抗体は竹市博士（京都大学）から供与された。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体はＥａｓｔｍａｎ  Ｃｏｄａｋより購入した。
１．５  その他の方法
細胞凝集アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）は、文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）に記載の方法に従って行った。また、２種類のＬ細胞株間での混合細胞凝集アッセイは、文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０３：１７１−１８７，  １９８６）の記載に従い、一方のＬ細胞株をＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）によって事前標識して行った。
【００２５】
化学的交叉結合（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）は、文献（Ｂｌｏｏｄ  ９２：４６０２−４６１１，  １９９８、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）に記載の方法に従って行った。免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）は、文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）に記載の方法に従って行った。培養細胞の免疫蛍光顕微鏡観察は、文献（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３９：５１７−５２８、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）に記載の方法に従って行った。蛋白質濃度の測定は、文献（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：２４８−２５４，  １９７６）の記載に従って、ウシ血清アルブミンを対照とする方法により行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは文献（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５，  １９７０）の記載に従って行った。
【００２６】
また、アフィニティークロマトグラフィーは以下のとおりに行った。アファディンＰＤＺドメインのＭＢＰ融合蛋白質はａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ  ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）に固定化した。ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰおよびＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ−ΔＣはそれぞれアフィニティービーズに固定化した。これらのビーズをＰＢＳ（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有）で十分に洗浄した後、ＰＢＳ（２０  ｍＭ  ｍａｌｔｏｓｅ，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有）により溶出した。
２．結果
２．１  ネクチン−３ｃＤＮＡのクローニングとその特徴
マウスｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡクローンは、配列番号７の塩基配列を有しており、１６４７ｂｐからなる翻訳領域（配列番号１）に５４９アミノ酸配列（配列番号２）からなる蛋白質（推定分子量６０，５８０）をコードしていた。また、このクローンは前記ＥＳＴクローンを全て含んでいた。この蛋白質をネクチンー３αと命名した。
【００２７】
このネクチン−３αのアミノ酸配列は、Ｎ端疎水性シグナルペプチド（配列番号２の位置１−５５）および膜貫通領域（配列番号２の位置４０５−４２１）を有していた。また、Ｎ結合型グリコシル化は位置７３、８３、１２５、１８６、２２２および３３１に見られた。また、このネクチン−３は、細胞外領域に３つのＩｇ様ドメインを含んでおり、細胞質領域にはＣ端保存モチーフを有していた（表１）。
【００２８】
【表１】
0003623710.tif 000002
【００２９】
以上のとおりのネクチン−３αの構造的な特徴は、ネクチン−１α、−１β、−２αおよび−２δと類似している。ホモロジーの程度は領域によって異なるが、ネクチン−３αの細胞外領域のアミノ酸配列は、ネクチン−１およびネクチンー２とそれぞれ３５．９％および３０．７％同一であった。
【００３０】
また、ネクチン−３αを単離する過程で、２つのスプライシングバリアント（ネクチン−３βおよび−３γ）が見出された。ネクチン−３βのｃＤＮＡ（翻訳領域）は１５３３ｂｐの塩基配列（配列番号３）を有しており、５１０のアミノ酸配列（配列番号４）からなる蛋白質（推定分子量５５，８０８）をコードしている。このネクチン−３βの細胞外領域（配列番号４の位置１−３５７）はネクチン−３αのそれと同一であるが、膜貫通領域および細胞質領域（配列番号４の位置３５８−５１０）はネクチン−３αとは異なっている。しかし、ネクチン−３βはＣ端保存モチーフを有していた（表１）。
【００３１】
ネクチン−３γのｃＤＮＡ（翻訳領域）は１３１７ｂｐの塩基配列（配列番号５）を有しており、４３８のアミノ酸配列（配列番号６）からなる蛋白質（推定分子量４７，２５９）をコードしている。このネクチンー３γの細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域はネクチン−３βと同一であるが、ネクチン−３γはＣ端保存モチーフを欠失している（表１）。
【００３２】
図１は、以上のネクチン−３α、−３βおよび−３γのアミノ酸配列（１文字記号）の比較図である。
【００３３】
なお、以下の実験では主としてネクチン−３αを対象とする。その理由は、様々な組織を対象としたノーザンブロット分析の結果、ネクチン−３αが主要なスプライシングバリアントであることが確認されたからである（図８、Ｂ１−Ｂ３参照）。
２．２  ネクチン−３αのｔｒａｎｓ  Ｈｏｍｏ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎと        ｃｉｃ  Ｈｏｍｏ−ｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ  ｃｅｌｌｓおよびｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ  ｃｅｌｌｓを用いた研究により、ネクチン−１αおよびネクチンー２αが細胞−細胞接着活性（ｔｒａｎｓ  Ｈｏｍｏ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を示すことが確認されている（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）。そこで先ず、ネクチン−３αが同様の活性を有するか否かを調べた。抗ネクチン−３ポリクローナル抗体は、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓの発現産物について、分子量約１００  ｋＤａの２つの蛋白質バンドを認識した（図２Ａ、図３）。これらは、グリコシル化等の翻訳後修飾の違いによるものと考えられる。また、これらの分子量は、アミノ酸配列から推定される分子量とも異なるが、これもまたグリコシル化の相違によるものと考えられる。さらに、各細胞株におけるネクチン−１α、−２αおよび−３αの発現レベルは同等であった（データ示さず）。
【００３４】
次に、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓを用いてネクチン−３αの細胞凝集活性を調べた。その結果、ネクチン−３αは経時的に細胞凝集活性を示した（図２Ｂ、Ｃ１、Ｃ２）。この活性はＥＤＴＡ添加によって影響されないことから（データ示さず）、ネクチン−３αの細胞−細胞接着活性はＣａ２＋非依存性であることが確認された。以上の結果から、ネクチン−３αは、ネクチン−１α、−２αおよび−２δと同様（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３５：３７４−３８４，  １９９７、  Ｂｌｏｏｄ  ９２：４６０２−４６１１，  １９９８、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）のＣａ２＋非依存性のホモフィリックＣＡＭ（細胞接着分子）であることが確認された。
【００３５】
ネクチン−１αおよび−２αはｃｉｓ  ｈｏｍｏ−ｄｉｍｅｒを形成することが知られているので（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：６１３−６１８，  ２０００）、ネクチン−３αについても同様に活性について調べた。細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓを単一細胞に分離し、細胞表面クロスリンカーＢＳ３と共にインキュベートし、抗ネクチン−３αポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。その結果、２量体に対応する分子量約２００〜２２０  ｋＤａのバンドが確認された（図３）。また、より高分子量のバンドも検出された。この交叉結合は単一細胞懸濁により行ったので、このダイマーやオリゴマーはｔｒａｎｓ  ｈｏｍｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎよりもｃｉｓ  ｈｏｍｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎによるものである可能性が高い。
２．３  ネクチン−３αとネクチン−１αまたは−２αとの        ｔｒａｎｓ  Ｈｅｔｅｒｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
ネクチンファミリーの各メンバーがヘテロフィリックな細胞−細胞接着活性（ｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を示すか否かを調べるため、混合細胞凝集アッセイを行った。ＤｉＩ標識された細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓが非標識ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと混合された場合には、常に、標識細胞だけか、または非標識細胞だけが凝集し（図４Ａ１−Ａ３）、両方のＬ細胞株からなる凝集塊はほとんど検出されなかった。一方、ＤｉＩ標識された細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ−ｃｅｌｌｓが非標識細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと混合された場合には、標識細胞と非標識細胞とからなる凝集塊が観察された（図４Ｂ１−Ｂ３）。このことは、ネクチン−３αがネクチン−１αとｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを形成することを示している。また、同様の結果が、ネクチン−３αとネクチン−２αについても得られた（図４Ｃ１−Ｃ３）。
【００３６】
さらにこの結果を確認するため、免疫蛍光顕微鏡観察を行った。細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを共培養した場合には、ネクチン−１αとネクチン−２αは、それぞれのＬ細胞株の細胞−細胞接触部位に局在していた（図５Ａ１−Ａ３）が、ネクチンー１αおよびネクチン−２αは２つのＬ細胞株同士の接触部位には検出されなかった。一方、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを共培養した場合には、ネクチン−３αとネクチン−１αは、２つのＬ細胞株同士の接触部位に共存していた（図５Ｂ１−Ｂ３）。同様の結果は、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを共培養した場合にも観察された（図５Ｃ１−Ｃ３）。これらの結果から、ネクチン−３αはネクチン−１αおよび−２αとｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを形成するが、ネクチン−１αと−２αはそのような相互作用を示さないことが確認された。
【００３７】
次に、ネクチンファミリーの各メンバーが、ｔｒａｎｓ  ｈｏｍｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを形成するか、あるいはｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを形成するかを調べるため、混合細胞凝集アッセイを用いて２種類の細胞凝集を分析した。４細胞凝集の結果と同様に、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを混合した場合には、ホモ型の２細胞凝集が形成された（図６Ａ）。これに対して、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを混合した場合にはヘテロ型の２細胞凝集が形成され、ホモ型の細胞凝集はほとんど観察されなかった（図６Ｂ）。同様の結果は、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−３α−Ｌ−ｃｅｌｌｓと細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ−ｃｅｌｌｓとを混合した場合にも観察された（図６Ｃ）。以上の結果から、ネクチン−３αとネクチン−１αまたは−２αとのｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの親和性は、ネクチン−１α、−２αまたは−３αのｔｒａｎｓ  ｈｏｍｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの親和性より明らかに強いことが確認された。
２．４  ネクチンー３αとネクチン−１αまたは−２αとのｃｉｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒ形成
ネクチンー３αがネクチン−１αまたは−２αとｃｉｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒを形成するか否かを調べるため、細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓおよび細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓを用いて、ＦＬＡＧ−ネクチン−３αをそれぞれ細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α−Ｌ  ｃｅｌｌｓおよび細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α−Ｌ  ｃｅｌｌｓで発現させた。その結果、ＦＬＡＧ−ネクチン−３αは、ネクチン−１αまたは−２αのｃｉｓ  ｄｉｍｅｒのサイズを変えなかった（図７Ａ１およびＡ２）。細胞株ｎｅｃｔｉｎ−１α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓに細胞表面交叉結合を行い、次いで抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行うと、ネクチン−１αは上清中に回収され、ＦＬＡＧ−ネクチン−３αとは共免疫沈降しなかった（図７Ｂ１）。同様の結果は細胞株ｎｅｃｔｉｎ−２α／３α−Ｌ  ｃｅｌｌｓにおいても得られた（図７Ｂ２）。以上の結果から、ネクチン−３αは、ネクチン−１αまたは−２αとはｃｉｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒを形成しないことが確認された。
２．５  ネクチンー３αの組織分布および細胞内局在
以前の報告（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２８０７−２８１３，  １９９２、Ｇｅｎｅ  １５５：２６１−２６５，  １９９５、Ｇｅｎｅ  １５９：２６７−２７２，  １９９５）と同様に、ノーザンブロット分析の結果からは、ネクチン−１は脳で優性に発現しており、ネクチン−２は全身性に発現していた（図８Ａ１およびＡ２）。ネクチン−３の３種類のスプライシングバリアントに共通な翻訳領域をプローブとして用いたノーザンブロット分析では、様々な組織において幾つかのｍＲＮＡバンドが検出された（図８Ａ３）。そこで、各バリアントの組織分布を調べるために、各バリアントに特異的なｃＤＮＡプローブを用いた。ネクチン−３αは約５．２−ｋｂ、３．８−ｋｂ、３．３−ｋｂおよび２．７−ｋｂのｍＲＮＡバンドを示し、これらは精巣で有意に発現し、他の組織（心臓、脳、肺、肝臓および腎臓）では僅かに発現していた（図８Ｂ１）。ネクチン−３βは約５．２−ｋｂおよび３．３−ｋｂのｍＲＮＡバンドを示し、これらは精巣で発現していた（図８Ｂ２）。ネクチン−３γは精巣において約３．３−ｋｂのｍＲＮＡバンドを示し、肺、肝臓および腎臓において２．１−ｋｂのｍＲＮＡバンドを示した（図８Ｂ３）。
【００３８】
次に、ネクチン−３αの細胞内局在を調べるため、抗ネクチン−３αポリクローナル抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡観察を行った。ネクチン−３αは、マウス小腸吸収上皮の接着複合体領域にネクチン−２と共存していた（図９）。以上の結果から、ネクチン−２と同様に（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：５３９−５４９，  １９９９）、ネクチン−３αもまたカドヘリン性細胞−細胞ＡＪｓに局在していることが示唆された。
２．６  ネクチン−３とアファディンとの直接結合
ネクチン−３αがアファディンと直接に結合するか否かを調べるため、アフィニティークロマトグラフイーを行った。ネクチン−３αの細胞質領域のＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ）は、ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ  ｂｅａｄｓに固定化されたＭＢＰ−ａｆａｄｉｎ−ＰＤＺ（アファディンのＰＤＺ領域とのＭＢＰ融合蛋白質）に結合した（図１０）。ネクチン−３αのアファディンへの結合の化学量論は約１：１であった。これに対して、細胞質領域のＣ端４アミノ酸残基を欠失したネクチンー３αとのＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ−ΔＣ）は結合しなかった。同じく、Ｃ端の保存モチーフを欠失しているネクチン−３γの細胞質領域とのＧＳＴ融合蛋白質もアフィニティービーズとは結合しなかった。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ネクチン−１および−２と同一の蛋白質ファミリーに属する新規蛋白質ネクチン−３が提供される。この蛋白質は、細胞結合の分子機構の全容を解明するための重要な情報を提供するばかりか、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やその予防・治療法、治療薬等の開発に有用である。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ネクチン−３α、−２βおよび−３γのアミノ酸配列の比較図である。背景黒領域は３つのバリアントでの共通配列、背景灰色領域はネクチン−３βと−３γでの共通配列、下線はシグナルペプチド、２重下線は膜貫通領域、星印はアスパラギンのグリコシル化部位を示す。
【図２】ネクチン−３αのｔｒａｎｓ  ｈｏｍｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｕｉｏｎを確認した結果である。（Ａ）はネクチン−３αの発現レベルであり、細胞の溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに展開し、抗ネクチン−３αポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析した。（Ｂ）は細胞凝集活性であり、○は親Ｌ細胞株、●はネクチン−３α発現Ｌ細胞株である。（Ｃ）は細胞凝集活性であり、Ｃ１は親Ｌ細胞株、Ｃ２はネクチン−２α発現Ｌ細胞株である。バーは１００μｍを示す。
【図３】ネクチン−３αのｃｉｓ  ｈｏｍｏ−ｄｉｍｅｒ形成を確認した結果である。ネクチン−３α発現細胞をＢＳ３の存在下かたは非存在下でインキュベートし、各細胞溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに展開し、抗ネクチン−３αポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析した。矢印は単量体、矢頭は２量体を示す。
【図４】混合細胞凝集活性を調べた結果である。Ａ１−Ａ３は標識化ネクチン−１α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−２αは発現Ｌ細胞株；Ｂ１−Ｂ３は標識化ネクチン−３α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−１α発現Ｌ細胞株；Ｃ１−Ｃ３は標識化ネクチン−３α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−２α発現Ｌ細胞株；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１は干渉コントラスト顕微鏡画像；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２は蛍光顕微鏡画像；Ａ３、Ｂ３、Ｃ３は統計分析の結果である。バーは４０μｍを示す。
【図５】２種類のＬ細胞株の共培養の免疫蛍光顕微鏡画像である。Ａ１−Ａ３はネクチン−１α発現Ｌ細胞株と−２α発現Ｌ細胞株；Ｂ１−Ｂ３はネクチン−３α発現Ｌ細胞株と−１α発現Ｌ細胞株；Ｃ１−Ｃ３はネクチン−３α発現Ｌ細胞株と−２α発現Ｌ細胞株；Ａ１、Ｂ２はネクチン−１α；Ａ２、Ｃ２はネクチン−２α；Ｂ１はネクチン−３α（モノクローナル抗体）；Ｃ１はネクチン−３α（ポリクローナル抗体）；Ａ３、Ｂ３、Ｃ３は併用染色である。バーは１０μｍを示す。
【図６】ｔｒａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｉｔｅｒａｃｔｉｏｎの親和性を確認した結果であり、２細胞凝集の組成（標識化細胞と陽標識化細胞）を定量的に分析した。Ａは標識化ネクチン−１α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−２α発現Ｌ細胞株；Ｂは標識化ネクチン−３α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−１α発現Ｌ細胞株；Ｃは標識化ネクチン−３α発現Ｌ細胞株と非標識化ネクチン−２α発現Ｌ細胞株である。
【図７】ネクチン−３αとネクチン−１αまたは−２αとのｃｉｓ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒ形成を調べた結果である。Ａはｃｉｓ  ｄｉｍｅｒ形成の比較である。Ａ１はネクチン−１α発現Ｌ細胞株（レーン１）と−１α／３α発現Ｌ細胞株（レーン２）；Ａ２はネクチン−２α発現Ｌ細胞株（レーン１）と−２α／３α発現Ｌ細胞株（レーン２）である。Ｂは免疫沈降の結果であり、Ｂ１はネクチン−１α／３α発現Ｌ細胞株、Ｂ２はネクチン−２α／３α発現Ｌ細胞株、レーン１は細胞抽出物、レーン２は上清、レーン３は沈殿物である。矢印は単量体、矢頭は２量体である。
【図８】ネクチン−３の組織分布を調べた結果である。Ａはネクチン−１、−２および−３のノーザンブロット分析の結果であり、Ａ１はネクチン−１；Ａ２はネクチン−２；Ａ３はネクチン−３である。Ｂはネクチン−３α、−３βおよび−３γのノーザンブロット分析の結果であり、Ｂ１はネクチン−３α、Ｂ２はネクチン−３β、Ｂ３はネクチン−３γである。レーン１は心臓、レーン２は脳、レーン３は脾臓、レーン４は肺、レーン５は肝臓、レーン６は骨格筋、レーン７は腎臓、レーン８は精巣である。
【図９】マウス小腸吸収上皮におけるネクチン−３αの細胞内局在を調べた結果である。Ａはネクチン−３α；Ｂはネクチン−２；Ｃは併用である。星印は小腸の内部空間を示す。バーは１０μｍである。
【図１０】アファディンとネクチン−３αとの直接的な結合を調べた結果である。矢印は融合蛋白質ＧＳＴ−ｎｅｃｔｉｎ−３α−ＣＰ、矢頭は融合蛋白質ＭＢＰ−ａｆａｄｉｎ−ＰＤＺを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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