(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
増幅確率の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係と前記照合対象となる微生物についての前記対応関係とに基づいて、前記識別対象となる微生物および前記照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を求めるステップと、
前記相関関係における相関係数を算出し、前記算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備えたことを特徴とする微生物識別方法。
【請求項２】
前記バンドの位置に関する情報は、前記電気泳動像上での所定の基準位置とバンドとの間の距離で表されることを特徴とする請求項１記載の微生物識別方法。
【請求項３】
前記バンドの位置に関する情報は、当該バンドに含まれるＤＮＡ断片のサイズで表されることを特徴とする請求項１記載の微生物識別方法。
【請求項４】
前記バンドの強度に関する情報は、前記電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、前記画像データの階調分布に基づいて算出されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項５】
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係は、各プライマーごとに各バンドの位置に関する情報と各バンドの強度に関する情報との対応を示すことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項６】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項７】
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項８】
前記電気泳動像のバンドを検出するステップは、前記電気泳動像において前記参照用ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片または前記ＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づくしきい値を設定し、前記電気泳動像において前記しきい値以上の発光強度を有するバンドを選択するステップを含むことを特徴とする請求項７記載の微生物識別方法。
【請求項９】
前記データベースには複数種類の微生物についての前記対応関係が記憶されたことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物識別方法。
【請求項１０】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データ変換手段により得られた前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、
前記複数のプライマーと前記バンド情報検出手段により検出された前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について作成された前記対応関係と前記照合対象となる微生物についての前記対応関係とに基づいて、前記識別対象となる微生物および前記照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を作成する相関関係作成手段と、
前記相関関係作成手段により作成された相関関係における相関係数を算出し、前記算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備えたことを特徴とする微生物識別装置。
【請求項１１】
識別対象となる微生物を識別する微生物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、
前記微生物識別プログラムは、
増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出する処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係と前記照合対象となる微生物についての前記対応関係とに基づいて、前記識別対象となる微生物および前記照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を求める処理と、
前記相関関係における相関係数を算出し、前記算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより前記識別対象となる微生物を識別する処理とを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする微生物識別プログラムを記録した記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物識別方法、微生物識別装置、微生物識別用データベースの作成方法および微生物識別プログラムを記録した記録媒体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭等から排出される有機系廃棄物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解することにより肥料が作成される。
【０００３】
このような生ゴミ処理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）において、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。
【０００４】
しかしながら、より良質な肥料を作成するためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御するためにも必要である。また、作成された肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の情報を知ることも重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、微生物群の情報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難しい細菌については調べることが困難であった。
【０００６】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うにはＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００７】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００８】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ    ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）  法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【０００９】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより微生物の状態を分析することが可能となる。
【００１０】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物との対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から微生物群を構成する微生物を識別することはできない。
【００１１】
本発明の目的は、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生物識別方法、微生物識別装置、微生物識別用データベースの作成方法および微生物識別プログラムを記録した記録媒体を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
第１の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、増幅確率の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係と照合対象となる微生物についての対応関係とに基づいて、識別対象となる微生物および照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を求めるステップと、相関関係における相関係数を算出し、算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより識別対象となる微生物を識別するステップとを含むものである。
【００１３】
本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００１４】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００１５】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００１６】
ここで、この微生物識別方法においては、増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００１７】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００１８】
バンドの位置に関する情報は、電気泳動像上での所定の基準位置とバンドとの間の距離で表されてもよい。あるいは、バンドの位置に関する情報は、当該バンドに含まれるＤＮＡ断片のサイズで表されてもよい。
【００１９】
バンドの強度に関する情報は、電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、画像データの階調分布に基づいて算出されてもよい。
【００２０】
複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係は、各プライマーごとに各バンドの位置に関する情報と各バンドの強度に関する情報との対応を示してもよい。
【００２３】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００２４】
この場合、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
【００２５】
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正をするステップとをさらに備えてもよい。
【００２６】
この場合、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像に対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データの階調を補正することにより、電気泳動像におけるバンドの発光強度の正確な比較が可能となる。
【００２７】
電気泳動像のバンドを検出するステップは、電気泳動像において参照用ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片またはＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づくしきい値を設定し、電気泳動像においてしきい値以上の発光強度を有するバンドを選択するステップを含んでもよい。
【００２８】
この場合、発光強度がしきい値未満であるバンドは増幅効率が低く再現性の低いＤＮＡ断片のバンドである。また、発光強度がしきい値以上であるバンドは増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のバンドである。したがって、しきい値以上の発光強度を有するバンドを選択することにより、増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のみを分析することが可能になる。それにより、識別結果の信頼性が向上する。
【００２９】
データベースには複数種類の微生物についての対応関係が記憶されてもよい。これにより、識別対象となる種々の微生物を識別することができる。
【００３０】
第２の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データ変換手段により得られた画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、複数のプライマーとバンド情報検出手段により検出されたバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について作成された対応関係と照合対象となる微生物についての対応関係とに基づいて、識別対象となる微生物および照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成された相関関係における相関係数を算出し、算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備えたものである。
【００３１】
本発明に係る微生物識別装置によれば、第１の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【００３２】
特に、微生物群を識別対象として用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００３３】
一方、単一の微生物を識別対象として用いる場合においては、識別対象となる微生物とデータベースの照合対象となる微生物との多型を検出することも可能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生物を見いだすこともできる。
【００３４】
この微生物識別装置においては、増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００３５】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００３６】
第３の発明に係るコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、微生物識別プログラムは、増幅確率の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出する処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係と照合対象となる微生物についての対応関係とに基づいて、識別対象となる微生物および照合対象となる微生物についてほぼ等しい位置にあるバンドの強度の相関関係を求める処理と、相関関係における相関係数を算出し、算出された相関係数が予め定められたしきい値よりも大きいか否かに基づいて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定することにより識別対象となる微生物を識別する処理とを、コンピュータに実行させるものである。
【００３７】
本発明に係る微生物識別プログラムを記録した記録媒体によれば、第１の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る微生物識別装置を示す図である。
【００４３】
図１に示すように、微生物識別装置は、ＳＳＣ−  ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４および結果表示手段５からなる。
【００４４】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベース格納部４はハードディスク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等からなる。
【００４５】
なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはＳｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎのことであり、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００４６】
図２は、図１の微生物識別装置を用いた微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【００４７】
図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。
【００４８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２  および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【００４９】
なお、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【００５０】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【００５１】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては増幅確率の異なる複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。例えば、この場合においては４６種類のプライマーを用いるので、異なるプライマーを含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、４６種類のＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【００５２】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【００５３】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【００５４】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生物のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入する可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由来のものであることが確認できる。
【００５５】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、４６種類のプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【００５６】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【００５７】
図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成される。
【００５８】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、前述の増幅確率の異なるプライマーをそれぞれ含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【００５９】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【００６０】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物または微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【００６１】
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【００６２】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【００６３】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【００６４】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。
第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【００６５】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【００６６】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【００６７】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【００６８】
図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧの塩基配列（配列番号１４）を有するプライマーを用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【００６９】
図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【００７０】
最初に、図５（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【００７１】
次に、図５（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【００７２】
続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【００７３】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【００７４】
図６に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【００７５】
その後、図７に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【００７６】
図７に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【００７７】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【００７８】
その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【００７９】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【００８０】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来のものであることが確認できる。
【００８１】
続いて、図２に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて電気泳動像の各バンドを検出する（ステップＳ３）。
【００８２】
ところで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【００８３】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の画像データの画像補正を行う（ステップＳ４）。
【００８４】
図８は画像補正の工程の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、画像データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ増幅断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する（ステップＳ４−１）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。
【００８５】
なお、ここでの発光強度とは、発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【００８６】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【００８７】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する。このようにして、電気泳動像の画像データの階調補正を行う（ステップＳ４−２）。
【００８８】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【００８９】
続いて、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいてしきい値を設定し、しきい値未満の発光強度のバンドを削除する（ステップＳ４−３）。これにより、増幅効率が低く再現性の低いバンドを除去することができる。このようにして得られた増幅効率が高く再現性の高いバンドを分析することにより、信頼性の高いデータが得られる。
【００９０】
図９は、上記のような画像補正を行った後の電気泳動像の画像データの例を示す図である。図９において、Ｌａｎｅ１，１０は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像のデータを示している。また、Ｌａｎｅ２〜９は、配列番号１〜８のプライマーにおける電気泳動像のデータを示している。なお、配列番号９〜４６の各プライマーについても、図９に示すような電気泳動のデータがそれぞれ得られる。
【００９１】
続いて、図２に示すように、各プライマーにおけるバンドの位置とＤＮＡサイズマーカにおけるバンドの位置とを比較することにより、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対数）に変換して測定する。さらに、各位置のバンドについて、バンド強度（バンドの発光強度）を測定する（ステップＳ５）。ここでのバンド強度とは、バンドの発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【００９２】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【００９３】
さらに、解析用コンピュータ３を用いて、上記で得られた各プライマーにおけるバンド位置およびバンド強度のデータをまとめ、バンドデータの一欄を作成する（ステップＳ６）。
【００９４】
通常、ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、種類の異なる複数のプライマーを用いて複数のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲの結果、各プライマーにつき１つの電気泳動像が得られる。この場合においては４６種類のプライマーを用いているので、４６種類の電気泳動像が得られる。
【００９５】
例えば、前述の図９のように１枚の写真に８種類のプライマーの電気泳動像を示す場合においては、合計６枚の写真に４６種類のプライマーの電気泳動像が示される。したがって、各写真について画像データが得られる。
【００９６】
ここで、図１の微生物識別装置の解析用コンピュータ３においては、このような複数枚の写真にわたって示された４６種類のプライマーのバンドのデータを集め、１つのデータにまとめることが可能である。それにより、サンプルの微生物に関するＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータの一欄を作成することができる。
【００９７】
解析用コンピュータ３により作成されたバンドデータの一欄には、プライマー名（配列番号）、サイズで表したバンド位置およびバンド強度が記載される。作成されたバンドデータの一欄を表１に示す。
【００９８】
【表１】
0003628232.tif 000002
【００９９】
なお、表１のプライマー名の項目においては、例えば、配列番号１のプライマーがＰｒ１と記載される。
【０１００】
上記においては、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズで表示する場合について説明したが、後述の実施例において説明するように、バンドの位置をバンドサイズで表示するのではなく、実測した距離に基づいて表示してもよい。この場合、バンドデータの一欄のバンド位置の項目には、例えば実測した距離の比が記載される。
【０１０１】
また、上記においては、バンド強度としてバンドの発光強度分布のピークの高さを測定する場合について説明したが、バンド強度として、バンドの発光強度分布の面積（容量）を測定してもよい。バンドの発光強度分布の面積はバンドに含まれるＤＮＡの含有量に対応するので、発光強度分布の面積をバンド強度として用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１０２】
さらに、バンド検出、画像補正およびバンド位置・バンド強度の測定を行う順番は、上記に限定されるものではなく、必要に応じて逆転する場合もある。
【０１０３】
続いて、図２に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物のデータ（表１）に基づいて、データベース格納部４（図１）のデータベースに登録されている複数の微生物のデータをサーチし、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの複数の微生物の配列番号１〜４６のプライマーＰｒ１〜４６に関するバンドデータとを比較する。さらに、サンプルの微生物およびデータベースの複数の微生物の各々における相関係数を求め、得られた相関係数に基づいてデータベースからサンプルの微生物に該当する微生物を検索する（ステップＳ７）。
【０１０４】
以下に、データベース検索（ステップＳ７）の詳細について、順を追って説明する。
【０１０５】
▲１▼サンプルの微生物およびデータベースの微生物における同一のプライマーの同一位置のバンドの検索
図１に示すように、微生物識別装置のデータベース格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−ＰＣＲのデータ、例えば電気泳動像の画像データやバンドデータの一欄が登録されている。なお、データベースに登録されているバンドデータの一欄の構成は、上記において作成したサンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）の構成と同様である。
【０１０６】
例えば、表２は、データベースに登録されている微生物Ａのバンドデータの一欄を示すものである。なお、この微生物Ａは細菌である。
【０１０７】
【表２】
0003628232.tif 000003
【０１０８】
このようなデータベースに登録されている複数の微生物のバンドデータの一欄から、サンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）に基づいて、同一のプライマーにおける同一位置のバンドを検索する。
【０１０９】
なお、この検索において、データベースの微生物のバンドの位置がサンプルの微生物のバンドの位置からある範囲内でずれて存在する場合、両者は同一位置のバンドであるとみなす。この同一位置のバンドとみなす範囲は、実験の誤差に基づいて決定されるものであり、必要に応じて変更する。
【０１１０】
例えば、図１０に示すように、サンプルの微生物のバンドデータ（表１）に基づいてデータベースの微生物Ａのバンドデータ（表２）をサーチした場合には、図中の矢印で示したバンドが同一プライマーにおける同一位置のバンドとして検索される。
【０１１１】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、このような同一プライマーにおける同一位置のバンドの検索を行う。
【０１１２】
▲２▼サンプルの微生物のデータとデータベースの微生物のデータとを比較するための表の作成
次に、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの微生物のバンドデータとを１つにまとめ、サンプルの微生物およびデータベースの微生物について、各プライマーＰｒ１〜４６における全てのバンドの位置（サイズ）および強度のデータの一欄を作成する。
【０１１３】
例えば、表３は、サンプルの微生物のデータ（表１）と、データベースの微生物Ａのデータ（表２）とをまとめてバンドデータ一欄を作成したものである。
【０１１４】
【表３】
0003628232.tif 000004
【０１１５】
表３に示すように、上記▲１▼の工程において検索したサンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける同一プライマーの同一位置のバンド（図１０の矢印で示したバンド）に関しては、表中のバンドサイズの項目に、サンプルの微生物のバンドサイズが記載される。
【０１１６】
また、例えばプライマーＰｒ１のサイズ１２９８のバンドのように、サンプルの微生物には存在するがデータベースの微生物Ａには存在しないバンドに関しては、データベースの微生物Ａのバンド強度を０とする。一方、例えばプライマーＰｒ２のサイズ３４３２のバンドのように、データベースの微生物Ａには存在するがサンプルの微生物には存在しないバンドに関しては、サンプルの微生物のバンド強度を０とする。
【０１１７】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物についても、それぞれ表３に示すようなバンドデータの一欄を作成する。
【０１１８】
▲３▼サンプルの微生物およびデータベースの微生物における相関係数の計算
ここでは、上記において作成したバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドにおけるサンプルの微生物およびデータベースの微生物のバンド強度を比較し、両者の相関関係を調べる。
【０１１９】
例えば、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおけるバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドについてサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較すると、図１１に示すような相関関係が得られる。図１１においては、横軸にサンプルの微生物のバンド強度をとり、縦軸にデータベースの微生物Ａのバンド強度をとっている。なお、図１１においては全てのバンドに関するプロットを行っていないが、実際には全てのバンドに関してプロットを行って相関関係を調べる。
【０１２０】
このようにサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較することにより、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける相関係数を計算する。
【０１２１】
また、データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、上記と同様の比較を行ってサンプルの微生物との相関関係を調べ、相関係数をそれぞれ計算する。なお、このような相関係数の計算は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行う。
【０１２２】
ここで、相関係数の計算方法は、計算に用いるデータのとり方により、図１２（ａ）〜（ｃ）に示す３つの方法が上げられる。以下に、３つの方法を説明する。
【０１２３】
（ａ）サンプルの微生物およびデータベースの微生物の全データを用いた相関係数の計算方法
図１２（ａ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度およびデータベースの微生物のバンド強度のデータを０のデータも含め全て用いて相関係数を計算するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを含め、全てのプロットを考慮して相関係数を求めるものである。
【０１２４】
ここで、サンプルが複数の微生物の混合物である場合にこの方法を適用すると、サンプルとデータベースの所定の微生物との間に相関関係があっても、計算により求められた相関係数は小さな値となる。したがって、この（ａ）の方法は、サンプルが単一の微生物の場合に適用することが好ましい。
【０１２５】
（ｂ）サンプルの微生物とデータベースの微生物との両方に存在するバンドのデータのみを用いた相関係数の計算方法
図１２（ｂ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度のデータおよびデータベースの微生物のバンド強度のデータにおいて、０のデータを全て除いて相関係数を計算するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを考慮せず、これ以外のプロットを考慮して相関係数を計算するものである。
【０１２６】
上記の（ａ）の方法において前述したように、サンプルが複数の微生物の混合物である場合には、データベースの微生物のバンド強度が０であるデータを除いた方が、高い相関係数が得られるので好ましい。また、ＰＣＲ反応においては何らかの原因で現れるべきバンドが現れないケースがあり、この場合においては、サンプルの微生物のバンド強度が０であるデータ除いた方が高い相関係数が得られるので好ましい。
【０１２７】
（ｃ）データベースの微生物に存在するバンドのデータを全て用いた相関係数の計算方法
図１２（ｃ）に示すように、この方法は、０のデータを含むサンプルの微生物のデータと、０のデータを含まないデータベースの微生物のデータとを用いて相関係数を計算するものである。すなわち、相関図における横軸上のプロットを考慮せず、縦軸上のプロットを含むこれ以外のプロットを考慮して相関係数を計算するものである。
【０１２８】
例えば、サンプルが複数の微生物の混合である場合には、サンプルを構成する微生物の種類を確認するために、０のデータも含めサンプルの微生物のバンドデータを全て用いて相関係数を計算すべきである。その理由は、データベースの微生物のバンドのうち数本のバンドのみがサンプルの微生物のバンドと一致し、さらにたまたまそれらのバンドが良好な相関関係を示す場合においては、サンプルの０のデータを考慮しない上記の（ｂ）の方法により相関係数を計算すると、相関関係のあるバンドが数本であるにも係わらず実質よりも高い値の相関係数が求められるからである。これに対して、このような場合に（ｃ）の方法を用いると、サンプルの微生物の０のデータを考慮するので、（ｂ）の方法を用いた場合ほど相関係数が高くならない。
【０１２９】
▲４▼検索のためのしきい値の設定
上記のようにして、サンプルの微生物とデータベースに登録されている複数の微生物の各々との相関係数を計算した後、求めた相関係数に関してしきい値を設定する。このしきい値に基づいて、相関係数がしきい値よりも高いものを検索すべき微生物として選択する。
【０１３０】
しきい値は０．２〜０．６の範囲、好ましくは０．２５〜０．３５の範囲の数値とする。しきい値が高いほど検索の正確性が高くなる。一方、しきい値を低くすると、可能性のある微生物をデータベースから広く検索することが可能となる。
【０１３１】
最後に、図２に示すように、結果表示手段５（図１）により、しきい値より高い値を示した微生物の名称を相関係数の高い順に検索結果として表示する（ステップＳ８）。
【０１３２】
なお、必要に応じて以下の工程（ステップＳ９）を設けてもよい。
例えば、図２に示すように、画像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。この工程においては、検索結果として表示された微生物がサンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプルを構成する微生物の１つであることを以下のような方法により確認する。
【０１３３】
例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行ってもよい。また、図１１に示すようなサンプルの微生物のバンド強度と検索された微生物のバンド強度との相関図を表示することにより、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法により、検索結果の確認を行うことが可能となる。
【０１３４】
また、データベースへの登録工程を設けてもよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いてデータ検索を行った結果、データベースに同じ微生物が存在しないことが明らかとなった場合に、このサンプルの微生物に関するデータを新たにデータベース格納部４のデータベースに登録するものである。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広がる。
【０１３５】
また、パラメータ等を変更して再び検索を行う工程を設けてもよい。この工程においては、例えば、データベース検索（ステップＳ７）の▲１▼の工程において説明した同一位置のバンドと見なすバンド位置の範囲や、データベース検索（ステップＳ７）の▲４▼の工程において説明した検索のためのしきい値の設定を変更し、再検索を行う。あるいは、データベース検索（ステップＳ７）▲３▼の工程において説明した相関係数の計算方法を変更し、再検索を行う。それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結果を得ることができる。
【０１３６】
さらに、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドの一欄を作成してこれを表示する工程を設けてもよい。この工程においては、検索された微生物のバンドとは一致しなかったサンプルの微生物のバンド（不一致バンド）の一欄を作成して表示する。
【０１３７】
ここで、サンプルに単一の微生物を用いて１種類の微生物が検索された場合においては、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドが、サンプルの微生物と検索された微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の混合物である場合、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドは、データベース４に登録されていない微生物のバンドである可能性が高い。このように、不一致バンドはサンプルの微生物に関する重要な情報となり得るので、データとして残すことが好ましい。
【０１３８】
以上のような本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合においても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【０１３９】
特に、微生物群をサンプルとして用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【０１４０】
一方、単一の微生物をサンプルとして用いる場合においては、サンプルの微生物とデータベースの微生物との多型を検出することも可能となる。また、サンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともできる。
【０１４１】
ここで、この微生物識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うことができる。
【０１４２】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０１４３】
例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または土壌中の微生物を同定することができる。また、この結果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えることにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な肥料を作製することができる。
【０１４４】
さらに、このような微生物識別方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取した土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度により、汚染状態が示唆される。
【０１４５】
図１３は図１の解析用コンピュータ３として用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【０１４６】
図１３のパーソナルコンピュータは、ＣＰＵ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置３８０を備える。
【０１４７】
ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力するために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラムが記憶される。
【０１４８】
記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処理を行う微生物識別プログラムが記録されている。
【０１４９】
スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳動イメージ入力部２として働く。
【０１５０】
外部記憶装置３８０は、ハードディスク装置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベースを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡＭ３５０上で実行する。
【０１５１】
なお、微生物識別プログラムを記録する記録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハードディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。また、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体に相当する。
【０１５２】
本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメージ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コンピュータ３がバンド検出手段、バンド情報検出手段、対応関係作成手段、相関関係作成手段および識別手段を構成する。
【０１５３】
なお、データベース格納部４に格納されるデータベースは、照合対象となる微生物について図２のステップＳ１〜Ｓ６の処理を行うことにより作成される。
【０１５４】
【実施例】
実施例においては、まず生ゴミ処理機から単離した６種類の細菌の各々についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行い、得られたデータをデータベースに登録した。
【０１５５】
次に、データベースの作成に用いた６種類の細菌と同一の細菌をサンプルとして用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により再度ＤＮＡ分析を行った。このサンプルの分析データに基づいて、上記で作成したデータベースからサンプルの細菌の種類を検索し、サンプルの細菌と検索された細菌とが一致するか調べた。以下に詳細を説明する。
【０１５６】
１．データベースの作成
▲１▼生ゴミ処理機の運転方法
家庭用生ゴミ処理機である三洋電機株式会社製ＳＮＳ−Ｔ１（外形寸法：５８０×４５０×７９５ｍｍ）を用い、この生ゴミ処理機に取り付けられている排水口へエアポンプおよび空気量調整器を接続する改良を加えた。この生ゴミ処理機を温度変化の小さい実験室に設置した。
【０１５７】
生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として２５ｋｇ（含水率７０％）の木質チップ（平均粒度１．５ｍｍの杉材）を入れた。処理槽内に野菜４５０ｇ、果物３００ｇ、魚４０ｇ、肉３０ｇおよび米飯１８０ｇからなる１ｋｇの生ゴミを１日に１回ずつ週５回投入し、生ゴミの投入後、生ゴミ処理機の攪拌羽根で処理槽内を攪拌した。
【０１５８】
処理槽内の木質チップの含水率を３５〜４５％に調節することにより良好な処理状態を保った。エアポンプからの通気の量を空気量調整器で調整することにより含水率の微調整を行った。
【０１５９】
▲２▼生ゴミ処理細菌の単離
細菌培養用の寒天培地を５種類作成した。細菌培養用の各寒天培地の組成を以下の表４〜表８に示す。
【０１６０】
【表４】
0003628232.tif 000005
【０１６１】
【表５】
0003628232.tif 000006
【０１６２】
【表６】
0003628232.tif 000007
【０１６３】
【表７】
0003628232.tif 000008
【０１６４】
【表８】
0003628232.tif 000009
【０１６５】
生ゴミ処理機を運転してから４９０日目の処理槽内の木質チップを１０ｇ採取し、滅菌した０．８５％食塩水を９０ｍＬ加えて細菌が木質チップから十分に遊離するまで懸濁した。その懸濁液をさらに１０−６に希釈し、希釈した懸濁液の１００μＬを各寒天培地上に均一に接種した。３日間、３７℃で培養後、すべてのコロニーを新しい寒天培地に移し替えることで細菌の単離を行った。
【０１６６】
単離したコロニーのうち種類の異なる６つの細菌をＳＳＣ−ＰＣＲ用のサンプルとした。単離した細菌はそれぞれＮｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３，Ｎｏ．７００４  であり、細菌Ｎｏ．１０２８  およびＮｏ．１０３０  は表４に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．２００１  は表５に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．４００４  は表６に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．５０６３  は表７に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．７００４  は表８に示す組成の培地を用いてそれぞれ単離した。
【０１６７】
各細菌の染色体ＤＮＡはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）  の２．４．１  〜２．４．２  に記載の“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”の方法に従って調製した。
【０１６８】
▲３▼生ゴミ処理機から単離した６種類の細菌のＤＮＡ分析
ここでは、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０を用いて、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法により、各細菌について分析を行った。
【０１６９】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、以下の表９に示す４６種類のプライマー（配列番号１〜４６）を用いた。
【０１７０】
【表９】
0003628232.tif 000010
【０１７１】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表１０に示す。
【０１７２】
【表１０】
0003628232.tif 000011
【０１７３】
表１０において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉｓは、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  の略である。ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ（２−−デオキシアデノシン−５−−三燐酸）、ｄＣＴＰ（２−−デオキシシチジン−  ５−−  三燐酸）  、ｄＧＴＰ（２−−デオキシグアノシン−５−−三燐酸）  、ｄＴＴＰ（２−−デオキシチミジン−５−−三燐酸）  の等濃度混合溶液である。反応溶液量は２０μＬとした。
【０１７４】
ここでは、６種類の細菌の各々について、プライマーとして配列番号１〜４６の各プライマーをそれぞれ含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１４のプライマーとこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１４のプライマーを含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調製した。
【０１７５】
次に、上記のようにして調製した４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の４６個の孔部５１にそれぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂにネガティブコントロールおよびポジティブコントロールをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行った。
【０１７６】
ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表１１に示す。
【０１７７】
【表１１】
0003628232.tif 000012
【０１７８】
続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの５μＬを１．５％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドの位置を測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０１７９】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をポラロイドカメラまたはＣＣＤカメラで撮影した。
【０１８０】
なお、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールおよび４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を電気泳動させる際には、１枚のアガロースゲルにおいて８種類の試料を同時に電気泳動させ、各アガロースゲルごとに撮影を行った。このようにして、計６枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜６）を得た。この場合、各アガロースゲルの両端部においては、ＤＮＡサイズマーカを電気泳動させている。
【０１８１】
６枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜６）をスキャナでコンピュータに取込んだ後、電気泳動像の画像データから、ソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ  ）を用いて、ＤＮＡサイズマーカのバンド、各プライマーにおけるバンド、ポジティブコントロールにおけるバンドおよびネガティブコントロールにおけるバンドを検出した。
【０１８２】
ここでは、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが検出されなかった。このことから、現れたバンドはサンプルとして用いた細菌由来のものであることが確認できた。
【０１８３】
なお、この場合においては行っていないが、次のような画像補正の工程をさらに行ってもよい。画像補正として、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することが考えられる。例えば、測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０１８４】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行うことも考えられる。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０１８５】
さらに、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの２００ｂｐのバンドの発光強度の２分の１の発光強度をしきい値として定め、各プライマーにおけるバンドのうち発光強度がしきい値よりも小さなバンドを削除することも考えられる。このようにして発光強度が小さなバンドを削除することにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおいて再現性の低いバンドが削除することができる。それにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおける再現性の向上が図られ、得られたデータの信頼性を向上させることができる。
【０１８６】
▲４▼バンド強度とバンド位置の測定
上記で用いたＤＮＡサイズマーカは、電気泳動によりバンドサイズ（塩基対の数）の異なる１４本のバンドに分離される。この１４本のバンドのサイズは、大きいものから１００００、８０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、８００、６００、４００および２００ｂｐである。なお、この場合においては１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行っているため、１００００ｂｐのバンドと８０００ｂｐのバンドとは分離しない。したがって、１３本のバンドが現れる。１３本のバンド間の間隔は均一ではなく、サイズが大きいバンド程、バンド間の間隔が小さくなる。
【０１８７】
ところで、各プライマーにおけるバンドの位置を表示する方法として、ＤＮＡサイズマーカのバンドの位置と各プライマーにおけるバンドの位置とを比較することにより各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）に変換して表示する方法がある。しかしながら、この方法においては、以下のような問題が生じる。
【０１８８】
例えば、２００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが４０ｂｐ異なる。これに対して、５０００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが１０００ｂｐ異なる。このように、５０００ｂｐ付近では１ｍｍが１０００ｂｐに相当するのに対して、２００ｂｐ付近では１ｍｍが４０ｂｐに相当する。また、スキャナで取り込んだ電気泳動像の画像データの解像度はせいぜいサブｍｍである。
【０１８９】
以上のことから、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）で表示する場合には、バンドサイズの大きなもの程誤差が大きくなる。したがって、この場合においては、バンドサイズによって誤差の大きさを変える必要がでてくる。
【０１９０】
以上のことから、各プライマーにおいて得られたバンドの位置を、バンドサイズで表示するのではなく、泳動距離方向の実測値に基づいて表示する方が、バンド位置の誤差が一定の大きさになるので好ましい。
【０１９１】
なお、電気泳動においては、泳動時間や泳動時の温度で泳動距離が変化する。このため、電気泳動における泳動距離方向の実測値に基づいてバンドの位置を表示するためには、規格化を行う必要がある。以下に、規格化の方法を示す。
【０１９２】
なお、ここでは、規格化を行うために新たにＤＮＡサイズマーカを電気泳動させ、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を撮影した１２枚の電気泳動写真を別途用意した。
【０１９３】
まず、この１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドを基準とし、このバンドから他の１２本のバンドまでの距離を測定した。その結果を表１２に示す。
【０１９４】
【表１２】
0003628232.tif 000013
【０１９５】
なお、この場合においては、前述のように、８０００ｂｐのバンドと１００００ｂｐのバンドとが分離しないため、８０００−１００００ｂｐの１つのバンドとして処理している。また、この場合においては１０００ｂｐのバンドの実測距離を０．００とし、１０００ｂｐよりもサイズの小さなバンドの実測距離を負の値で表している。
【０１９６】
次に、１２枚の写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離を１とし、これを基準として他のバンドの位置の規格化を行った。
【０１９７】
例えば、Ｎｏ．１の写真のデータにおいては、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離が１．６６ｃｍである。したがって、この値１．６６で他のバンドの実測距離の値を割り、それぞれのバンドの位置の規格化を行った。この操作を他のＮｏ．２〜Ｎｏ．１２の写真のデータについても行った。その結果を表１３に示す。
【０１９８】
【表１３】
0003628232.tif 000014
【０１９９】
さらに、表１３に示すように、各サイズのバンドについて、１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）のデータにおける平均を求めた。以上のようにして、ＤＮＡサイズマーカにおいて１０００ｂｐのバンドの位置を基準として他のバンドの相対的な位置（比）を求めた。
【０２００】
さらに、上記で得られた値を見やすくするため、基準とした１０００ｂｐのバンドの位置を１０００とし、１０００ｂｐからの相対的な距離が１．００である８０００〜１００００ｂｐのバンドの位置を２０００とした。以下、これに基づいて、他のバンドについてもバンド位置を導き出した。このようにして、ＤＮＡサイズマーカの１３本のバンドについて、バンド位置（基準値）を求めた。その結果を表１４に示す。
【０２０１】
【表１４】
0003628232.tif 000015
【０２０２】
なお、上記においては、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの位置を基準とするとともに８０００−１０００００ｂｐのバンドの位置を１とする規格化の方法について説明したが、規格化の方法はこれ以外であってもよい。
【０２０３】
次に、上記のようにして得られたＤＮＡサイズマーカのバンド位置（基準値）に基づいて、６種類の細菌の各々について、４６種類のプライマーの各々におけるバンドの位置およびバンド強度を測定した。さらに、測定により得られたデータをまとめ、細菌ごとにバンドデータの一欄を作成した。この場合においては、バンドの発光分布のピークの高さをバンド強度とした。
【０２０４】
なお、前述のようにこの場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による階調補正は行わず、また、発光強度がしきい値より小さいバンドの削除を行わなかった。
【０２０５】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定には、前述のソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ  ）を用いた。また、６枚の電気泳動写真の画像データのバンド位置およびバンド強度のデータを集計して一欄を作成する工程には、本発明者がＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃで作成したソフトウェアを用いた。
【０２０６】
例えば表１５〜１７は、細菌Ｎｏ．２００１  に関するバンドデータの一欄を示したものである。
【０２０７】
【表１５】
0003628232.tif 000016
【０２０８】
【表１６】
0003628232.tif 000017
【０２０９】
【表１７】
0003628232.tif 000018
【０２１０】
他の５種類の細菌Ｎｏ．１０２８  ，Ｎｏ．１０３０  ，Ｎｏ．４００４  ，Ｎｏ．５０６３  ，Ｎｏ．７００４  についても、このようなバンドデータの一欄を作成した。
【０２１１】
▲５▼細菌のバンドデータ一欄のデータベースへの登録
上記の表１５〜１７に示すＮｏ．２００１  のバンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。同様にして、他の５種類の細菌Ｎｏ．１０２８  ，Ｎｏ．１０３０  ，Ｎｏ．４００４  ，Ｎｏ．５０６３  ，Ｎｏ．７００４  についても、バンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。
【０２１２】
２．単離した６種類の単一細菌の各々をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、単一細菌をサンプルとした場合の検索をテストするために、上記のデータベースの作成時に単離した細菌Ｎｏ．１０２８，  Ｎｏ．１０３０，  Ｎｏ．４０００，  Ｎｏ．５０６３，  Ｎｏ．７００４，  Ｎｏ．２００１の各々について前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行い、得られたサンプルのデータに基づいて、上記で作成したデータベースから検索を行った。
【０２１３】
なお、この場合のＤＮＡの分析方法およびバンド強度・バンド位置の測定方法に関しては、データベースの作成時の▲３▼および▲４▼の工程において前述した通りである。この場合においても、前述のソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ  ）および本発明者が作成したソフトウェアを用いた。
【０２１４】
この場合においては、サンプルの６種類の細菌の各々についてバンドデータの一欄を作成した後、作成したサンプルの各細菌のバンドデータと予めデータベースに登録した６種類の細菌のバンドデータとを比較し、相関係数を求めた。
【０２１５】
なお、相関係数の計算は、本発明者がＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃで作成したソフトウェアを用いて行った。また、この場合のパラメータは、バンド位置の誤差（同一位置のバンドとみなすバンド位置の範囲）を±４３とし、相関係数のしきい値を０．３０とした。また、相関係数の計算方法は、図１２（ｃ）に示す方法を用いた。上記のようにして相関係数を計算したところ、表１８に示す結果が得られた。
【０２１６】
【表１８】
0003628232.tif 000019
【０２１７】
表１８に示すように、６種類の単一細菌をサンプルとして用いた場合には、サンプルの細菌をそれぞれデータベースから検索することが可能であった。
【０２１８】
また、表１８の解析結果から、以下のことが明らかとなった。すなわち、サンプルが単一細菌であることがわかっている場合には、相関係数のしきい値を０．６程度に設定することにより、サンプルの細菌をデータベースから確実に検索することが可能となる。一方、種類の異なる細菌間の相関係数は、細菌Ｎｏ．５０６３  をサンプルとした場合の細菌Ｎｏ．４００４  との相関係数が０．２５２と最も高く、これ以外は相関係数が低い。このことから、しきい値を０．３以上に設定することにより、誤ったものを検索しないことがわかった。
【０２１９】
さらに、サンプルとして用いた細菌Ｎｏ．２００１  のバンドデータと、データベースに登録した細菌Ｎｏ．２００１  のバンドデータとの相関状態を相関図により確かめた。その結果を図１４に示す。なお、図１４中の直線は、相関係数が１となる場合、すなわち両者のデータが一致する場合を指定している。
【０２２０】
図１４に示すように、サンプルとして用いた細菌Ｎｏ．２００１  のバンドデータと、データベースに登録した細菌Ｎｏ．２００１  のバンドデータとの間には、非常に良好な相関関係があることがわかる。このように、図１４のような相関図を示すことにより、両者の良好な相関関係を視覚的に確認することができる。
【０２２１】
３．複数の細菌の混合物をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、複数の細菌の混合物をサンプルとした場合の検索をテストするために、５種類の細菌（Ｎｏ．１０２８，    Ｎｏ．１０３０，    Ｎｏ．４００４，    Ｎｏ．５０６３，    Ｎｏ．７００４）を含むサンプル１と、２種類の細菌（Ｎｏ．１０２８，    Ｎｏ．１０３０）を含むサンプル２とを用意した。各サンプル１，２を用いて前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を行い、得られたサンプル１，２のデータに基づいて、上記で作成したデータベースから検索を行った。
【０２２２】
なお、サンプル１を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行う場合には、５種類の細菌の染色体ＤＮＡをそれぞれ濃度１μｇ／Ｌずつ含むＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を調製した。また、サンプル２を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行う場合には、２種類の細菌の染色体ＤＮＡをそれぞれ濃度１μｇ／Ｌずつ含むＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を調製した。
【０２２３】
ここでは、上記のＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液の調製方法以外は、データベースの作成時の▲３▼および▲４▼の工程において前述した方法と同様の方法を用いた。また、この場合においても、前述のソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ  ）および本発明者が作成したソフトウェアを用いた。
【０２２４】
この場合においては、各サンプル１およびサンプル２についてバンドデータの一欄を作成した。その後、ここで作成したサンプル１およびサンプル２のバンドデータと、予めデータベースに登録した６種類の細菌のバンドデータとを比較し、相関係数を求めた。
【０２２５】
なお、相関係数の計算は、前述の本発明者が作成したソフトウェアを用いて行った。また、この場合のパラメータは、バンド位置の誤差（同一位置のバンドとみなすバンド位置の範囲）を±４３とし、相関係数のしきい値を０．３０とした。また、相関係数の計算方法は、図１２（ｃ）に示す方法を用いた。上記のようにして相関係数を計算したところ、表１９に示す結果が得られた。
【０２２６】
【表１９】
0003628232.tif 000020
【０２２７】
表１９に示すように、５種類の細菌を含むサンプル１においては、混合した５種類の細菌のうち、４種類の細菌Ｎｏ．１０２８，  Ｎｏ．１０３０，  Ｎｏ．４００４，  Ｎｏ．７００４がデータベースから検索された。なお、この場合においては、しきい値を０．３０に設定したため、サンプル１に含まれる細菌Ｎｏ．５０６３  は検索にかからなかった。このことから、サンプル１に関しては、０．３というしきい値が細菌Ｎｏ．５０６３  にとって高いことが明らかとなった。
【０２２８】
一方、２種類の細菌を混合したサンプル２においては、混合した２種類の細菌Ｎｏ．１０２８，  Ｎｏ．１０３０がデータベースから検索された。さらに、この場合においては、サンプル２に含まれない細菌Ｎｏ．５０６３  が検索にかかった。このことから、サンプル２に関しては、０．３というしきい値が細菌Ｎｏ．５０６３  に対して低いことが明らかとなった。
【０２２９】
以上の解析結果から、検索のしきい値を高め、例えば０．３５に設定した場合においては、サンプルに含まれる細菌を確実に検索することが可能であることが示された。一方、検索のしきい値を低め、例えば０．２５に設定した場合においては、サンプルに含まれる可能性のある細菌を広く検索することが可能であることが示された。
【０２３０】
【配列表】
0003628232.tif 000021
0003628232.tif 000022
0003628232.tif 000023
0003628232.tif 000024
0003628232.tif 000025
0003628232.tif 000026
0003628232.tif 000027
0003628232.tif 000028
0003628232.tif 000029
0003628232.tif 000030
0003628232.tif 000031
0003628232.tif 000032
0003628232.tif 000033
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図８】図２の微生物識別方法に用いる画像処理法の一例を示すフローチャートである。
【図９】図８の画像処理法を用いて処理を行った電気泳動像の画像データである。
【図１０】サンプルの微生物のバンドデータおよびデータベースのバンドデータにおける同一プライマーの同一位置のバンドの検索方法を示す図である。
【図１１】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との相関関係を示す図である。
【図１２】相関係数の計算方法を示す図である。
【図１３】図１の解析用コンピュータとして用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【図１４】実施例におけるサンプルの細菌Ｎｏ．２００１  のバンド強度とデータベースの細菌Ｎｏ．２００１  のバンド強度との相関関係を示す図である。
【符号の説明】
１  ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置
２  電気泳動イメージ入力部
３  解析用コンピュータ
４  データベース格納部
５  経過表示手段
１１  ＤＮＡ
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ  一本鎖
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ  二本鎖
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ  プライマー
５０  支持プレート
５１，５１ａ，５１ｂ  孔部
【図１】
0003628232.tif 000034
【図２】
0003628232.tif 000035
【図３】
0003628232.tif 000036
【図４】
0003628232.tif 000037
【図５】
0003628232.tif 000038
【図６】
0003628232.tif 000039
【図７】
0003628232.tif 000040
【図８】
0003628232.tif 000041
【図９】
0003628232.tif 000042
【図１０】
0003628232.tif 000043
【図１１】
0003628232.tif 000044
【図１２】
0003628232.tif 000045
【図１３】
0003628232.tif 000046
【図１４】
0003628232.tif 000047