(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒中に含まれている過酸化水素を測定する方法において、
過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液と、逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定する
過酸化水素の測定方法。
【請求項２】
有機溶媒中に含まれている過酸化水素をフローインジェクション分析により測定する方法において、
フローセルを備えた発光検出器に、過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液と、逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液とを注入し、フローセル中で試料溶液と試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定する
過酸化水素の測定方法。
【請求項３】
有機溶媒中に含まれている過酸化水素をフローインジェクション分析により連続的に測定する方法において、
フローセルを備えた発光検出器に、過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液を注入してフローセルを通過させ、次に逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液を注入して前記フローセルを通過させて、フローセル中で試料溶液と試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定し、さらに前記試料溶液の注入、試薬溶液の注入および光の測定を順次繰り返す
過酸化水素の測定方法。
【請求項４】
最初の試料溶液の注入を行う前に、逆ミセルの内水相に塩基を含む逆ミセル溶液からなる塩基溶液を予め注入してフローセルを通過させておく請求項３記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項５】
塩基溶液が、逆ミセルの内水相に炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムを含む逆ミセル溶液である請求項４記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項６】
キャリヤーを用いて塩基溶液、試料溶液および試薬溶液を搬送し、フローセルを通過させる請求項３ないし５のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項７】
キャリヤーがトルエンである請求項６記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項８】
試料溶液が、極性の低い有機溶媒中に過酸化水素が含まれている有機溶媒溶液である請求項１ないし７のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項９】
極性の低い有機溶媒がトルエン、シクロヘキサンまたはこれらの混合液である請求項８記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項１０】
試薬溶液が、シクロヘキサン、ヘキサノールおよび塩化セチルトリメチルアンモニウムから形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものである請求項１ないし９のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項１１】
試薬溶液が、クロロホルム、シクロヘキサンおよび塩化セチルトリメチルアンモニウムから形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものである請求項１ないし９のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
【請求項１２】
塩基が炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムである請求項１０または１１記載の過酸化水素の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を逆ミセルメディア化学発光法により測定する過酸化水素の測定方法、特にフローインジェクション分析（ＦＩＡ）により測定する過酸化水素の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、有機溶媒中に含まれている過酸化水素は、有機溶媒溶液中の過酸化水素を水などを用いて一旦有機溶媒相から水相に抽出した後、この水相に含まれている過酸化水素を、化学発光を利用したＦＩＡ法、または酸素に変換して測定する電気化学的方法などの方法により測定している。
【０００３】
しかし、従来の方法には次のような問題点がある。
１）抽出操作に時間を要するので、迅速に測定を行うことができない。特に、化学発光の迅速性が失われる。
２）抽出には複雑で高価な装置が必要であるので、コスト高になる。
３）有機溶媒が多種類で、かつ溶媒濃度が変動する場合、過酸化水素の抽出率が変動するので、高感度での定量を行うことができないほか、定量値の信頼性が低下する。
４）有機溶媒が多種類で、かつ溶媒濃度が変動する場合、水相に溶解する溶媒濃度も変動し、測定時の妨害因子となる。このため、高感度での定量を行うことができないほか、ノイズやベースラインが変動するので、定量値の信頼性が低下する。
【０００４】
このため、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく直接測定することができ、しかも低コストで、高感度、高信頼性の測定が可能な過酸化水素の測定方法が要望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく直接かつ迅速に測定することができ、しかも低コストで、高感度、高信頼性の測定が可能な過酸化水素の測定方法を提案することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の過酸化水素の測定方法である。
（１）有機溶媒中に含まれている過酸化水素を測定する方法において、
過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液と、逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定する
過酸化水素の測定方法。
（２）有機溶媒中に含まれている過酸化水素をフローインジェクション分析により測定する方法において、
フローセルを備えた発光検出器に、過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液と、逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液とを注入し、フローセル中で試料溶液と試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定する
過酸化水素の測定方法。
（３）有機溶媒中に含まれている過酸化水素をフローインジェクション分析により連続的に測定する方法において、
フローセルを備えた発光検出器に、過酸化水素を含む有機溶媒からなる試料溶液を注入してフローセルを通過させ、次に逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液からなる試薬溶液を注入して前記フローセルを通過させて、フローセル中で試料溶液と試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定し、さらに前記試料溶液の注入、試薬溶液の注入および光の測定を順次繰り返す
過酸化水素の測定方法。
（４）最初の試料溶液の注入を行う前に、逆ミセルの内水相に塩基を含む逆ミセル溶液からなる塩基溶液を予め注入してフローセルを通過させておく上記（３）記載の過酸化水素の測定方法。
（５）塩基溶液が、逆ミセルの内水相に炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムを含む逆ミセル溶液である上記（４）記載の過酸化水素の測定方法。
（６）キャリヤーを用いて塩基溶液、試料溶液および試薬溶液を搬送し、フローセルを通過させる上記（３）ないし（５）のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
（７）キャリヤーがトルエンである上記（６）記載の過酸化水素の測定方法。
（８）試料溶液が、極性の低い有機溶媒中に過酸化水素が含まれている有機溶媒溶液である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
（９）極性の低い有機溶媒がトルエン、シクロヘキサンまたはこれらの混合液である上記（８）記載の過酸化水素の測定方法。
（１０）試薬溶液が、シクロヘキサン、ヘキサノールおよび塩化セチルトリメチルアンモニウムから形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
（１１)試薬溶液が、クロロホルム、シクロヘキサンおよび塩化セチルトリメチルアンモニウムから形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の過酸化水素の測定方法。
（１２）塩基が炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムである上記（１０）または（１１）記載の過酸化水素の測定方法。
【０００７】
本発明の方法において測定の対象となる過酸化水素は有機溶媒中に含まれている過酸化水素であり、過酸化水素を含む有機溶媒が試料溶液として用いられる。試料溶液の有機溶媒としては、好ましくは極性の低い有機溶媒、具体的にはトルエン、オルトキシレン、ベンゼン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンまたはこれらの混合液などがあげられる。また、化学発光の発光強度は低下するが、極性を少し有する有機溶媒、具体的にはジエチルエーテル、クロロホルム、テトラヒドロフランまたはこれらの混合液などもあげられる。さらに化学発光の発光強度はかなり低下するが、極性が比較的高い有機溶媒、具体的にはジクロロメタン、アセトン、エタノールまたはこれらの混合液などもあげられる。上記極性が比較的高い有機溶媒に過酸化水素が含まれている場合は、化学発光の強度はかなり低下するが、過酸化水素を含まない対照（ブランク）に比べると発光強度は大きいので、過酸化水素の測定は可能である。
【０００８】
試料溶液中の過酸化水素の濃度は１．２×１０-7Ｍ〜３×１０-5Ｍ、好ましくは２．４×１０-7Ｍ〜０．６×１０-5Ｍであるのが望ましい。測定しようとする試料溶液の過酸化水素濃度が高い場合は、上記範囲になるように前記有機溶媒で希釈して試料溶液とすることができる。
【０００９】
本発明の方法で用いる試薬溶液は、逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセル溶液である。逆ミセルは、公知の方法により形成させることができ、例えば極性の極めて低い有機溶媒中に、僅かの水を界面活性剤を用いて分散ないし可溶化させることによって形成させることができる。具体的には、界面活性剤を含む有機溶媒に、少量の塩基性ルミノール水溶液を分散させることにより形成させることができる。
【００１０】
逆ミセルの形成に使用される極性の極めて低い有機溶媒（以下、バルク有機溶媒という場合もある）としては、クロロホルム、シクロヘキサンおよびこれらの混合液などがあげられる。これらの中ではクロロホルムとシクロヘキサンとの容積比が６：５の混合液、またはシクロヘキサンが好ましい。
【００１１】
逆ミセルの形成に使用される界面活性剤としては、塩化セチルトリメチルアンモニウム（以下、ＣＴＡＣと略記する場合がある）、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤などがあげられる。またヘキサノールまたはそれ以上の鎖長を有するアルコールなどを補助界面活性剤として使用することもできる。
【００１２】
逆ミセルの構造は、図１に模式的に示されているように、界面活性剤の極性基が逆ミセル内側の内水相（ウォータプール）に向けられ、界面活性剤の疎水基が外側のバルク溶媒（一般的に有機相、バルク有機相と称されることもある）に向けられた構造を有している。
【００１３】
本発明において試薬溶液として用いる逆ミセルの内水相には、ルミノール（luminol）および塩基が含まれている。ルミノールの濃度は、界面活性剤を含むバルク有機溶媒に逆ミセルの内水相として分散させる塩基性ルミノール水溶液中の濃度として０．０１Ｍ〜０．０４Ｍ、好ましくは０．０２Ｍ前後であるのが望ましい。
【００１４】
逆ミセルの内水相に含まれる塩基としては、水酸化物イオンを供給できるものが制限なく使用できるが、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムが好ましく、特にバルク有機溶媒としてクロロホルムとシクロヘキサンとの混合液を用いる場合は炭酸ナトリウムが好ましく、ヘキサノールを含むヘキサンを用いる場合は水酸化ナトリウムが好ましい。
試薬溶液の塩基の濃度は、界面活性剤を含むバルク有機溶媒に逆ミセルの内水相として分散させる塩基性ルミノール水溶液中の濃度として０．６Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．８Ｍ前後であるのが望ましい。
【００１５】
本発明で用いる試薬溶液の具体的なものとしては、シクロヘキサンをバルク溶媒とし、ヘキサノールを補助界面活性剤として含み、塩化セチルトリメチルアンモニウムを界面活性剤として形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものがあげられる。このようなシクロヘキサンをバルク溶媒とする試薬溶液を用いた場合、試料溶液中の過酸化水素の検出限界は１．２×１０-7Ｍ程度である。
【００１６】
また別の試薬溶液として、クロロホルムとシクロヘキサンとの混合液、例えば容積比が６：５の混合液をバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウムを界面活性剤として形成される逆ミセル溶液であり、この逆ミセル溶液中の逆ミセルの内水相にルミノールおよび塩基を含むものがあげられる。このようなクロロホルムとシクロヘキサンとの混合液をバルク溶媒とする試薬溶液を用いた場合、試薬溶液中の過酸化水素の検出限界は２．５×１０-7Ｍ程度である。
【００１７】
本発明の方法では、このような逆ミセルを反応場として用いて化学発光を進行させる。化学発光は、ルミノールが水酸化物イオンの存在下に過酸化水素と反応して３−アミノフタレート（3-amimophthalate）に酸化されることにより生じる。この反応は図２に示されている。
【００１８】
本発明の方法で用いる塩基溶液は、逆ミセルの内水相に炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムなどの水酸化物イオンを供給できる塩基を含む逆ミセル溶液である。すなわち、前記試薬溶液において、ルミノールを含有していない逆ミセル溶液である。
【００１９】
塩基溶液の塩基の濃度は、界面活性剤を含むバルク有機溶媒に逆ミセルの内水相として分散させる塩基水溶液中の濃度として０．６Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．８Ｍ前後であるのが望ましい。
【００２０】
本発明の方法は、前記試料溶液と試薬溶液とを接触させ、このとき化学発光する光を測定することにより、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく、直接測定することができる。本発明の方法は、発光強度により、過酸化水素濃度を定量することができる。例えば、予め既知濃度の過酸化水素溶液の発光強度を測定し、検量線を作成しておくことにより、試料溶液の過酸化水素濃度を定量することができる。また過酸化水素の有無を判定することもできる。
【００２１】
試料溶液と試薬溶液との接触方法は特に限定されず、
１）試料溶液と試薬溶液とを同一反応容器内で単純に混合する方法、
２）二液混合型のフローセルを備えた発光検出器に試料溶液および試薬溶液を注入し、フローセル内で両者を混合するフローインジェクション分析（ＦＩＡ）法、
３）非混合型のフローセルを備えた発光検出器に試料溶液および試薬溶液を順次注入し、フローセルにおいて両者を接触させるフローインジェクション分析（ＦＩＡ）法
などがあげられる。
【００２２】
上記２）のＦＩＡ法による接触方法の場合、フローセル内で試料溶液と試薬溶液との二液が単純に混合される。
上記３）のＦＩＡ法による接触方法の場合、試料溶液をフローセルを通過させ、フローセルの壁面に試料溶液が付着している状態で、試薬溶液を通過させることにより、フローセルの壁面または壁面付近で試料溶液と試薬溶液とが接触する。
【００２３】
ＦＩＡ法では、試料溶液と試薬溶液とをフローセルを備えた発光検出器に注入し、フローセルにおいて両者を接触させ、このとき化学発光する発光強度を発光検出器で測定することができる。
【００２４】
本発明の方法において、試料溶液と試薬溶液を接触させる際の温度は１０〜３０℃、好ましくは室温（２０〜２５℃）であるのが望ましい。化学発光は、試料溶液と試薬溶液とが接触するのとほぼ同時に生じる。
【００２５】
ＦＩＡ法を採用した場合を例にあげて、本発明を具体的に説明する。ＦＩＡ法では、試料溶液と試薬溶液とをフローセルを備えた発光検出器に注入し、フローセルにおいて両者を接触させるが、試料溶液と試薬溶液とは別々の流路から注入する（以下、別々の流路から注入するシステムを２流路のシステムという）こともできるし、同一の流路から注入する（以下、同一の流路から注入するシステムを１流路のシステムという）こともできる。フローセルにおいて両者が接触すると、化学発光が生じるので、この光の光量または強度を発光検出器で測定することにより過酸化水素を測定することができる。またこの操作を繰り返して行うことにより、試料溶液中の過酸化水素を連続的に測定することもできる。
試料溶液および試薬溶液の搬送はキャリヤーを用いて行うこともできる。キャリヤーとしては、トルエンが好ましい。クロロベンゼンを使用することもできるが、シクロヘキサンでは化学発光しない。
【００２６】
１流路のシステムの場合、フローセルを通過させる順序は、塩基溶液、試料溶液、試薬溶液の順序である。ただし、塩基溶液は測定の最初の１回目だけ通液する。複数の試料溶液を測定する場合、フローセルを通過させる順序は、塩基溶液、試料溶液、試薬溶液、試料溶液、試薬溶液の順序であり、以降試料溶液、試薬溶液をこの順序で通過させる操作を繰り返す。これにより、連続的に測定することができる。順序を逆にして試薬溶液、試料溶液の順序で通液すると、両者が接触しても化学発光しない。
【００２７】
２流路のシステムの場合、測定を続けるとバックグランド発光の上昇が観察されるが、この場合は流路およびフローセルを、内水相に塩基を含む逆ミセル溶液またはエタノールなどで洗浄することによりバックグランド発光を低下させることができ、測定を続けることができる。
【００２８】
【発明の効果】
以上のように、本発明の請求項１の過酸化水素の測定方法は、内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセルを化学発光の反応場として用いているので、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく直接かつ迅速に測定することができ、しかも低コストで、高感度、高信頼性の測定を行うことができる。
【００２９】
本発明の請求項２の過酸化水素の測定方法は、内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセルを化学発光の反応場として用い、しかも試料溶液および試薬溶液をフローセル内で接触させてフローインジェクション分析により測定しているので、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく直接かつ迅速に測定することができ、しかも低コストで、高感度、高信頼性の測定を行うことができる。
【００３０】
本発明の請求項３の過酸化水素の測定方法は、内水相にルミノールおよび塩基を含む逆ミセルを化学発光の反応場として用い、しかも試料溶液および試薬溶液を同一フローセル内を順次通過させてフローインジェクション分析により測定する操作を繰り返して行うので、有機溶媒中に含まれている過酸化水素を水相に抽出することなく直接かつ迅速に測定することができ、しかも低コストで、高感度、高信頼性の測定ができるとともに、簡単に連続測定測定することができる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例を図面を用いて説明する。図３および図４はいずれもＦＩＡ法により過酸化水素を測定する場合のフローであり、図３は試料溶液および試薬溶液を別々の流路から注入する２流路のシステムにより測定する場合のフロー、図４は試料溶液および試薬溶液を同一の流路から注入する１流路のシステムにより測定する場合のフローである。
【００３２】
図３において、１はキャリヤー送液用のプランジャーポンプ、２はインジェクションバルブ、３は発光検出器であり、これらが流路４によりシリーズに接続されている。流路４には試薬溶液注入用の流路５が接続しており、試薬溶液の注入がインジェクションバルブ２により制御できるように構成されている。発光検出器３内には混合型のフローセルが設けられているが、図示は省略されている。流路５には試薬溶液貯留槽からの流路が接続しているが、図示は省略されている。７は試料溶液送液用のプランジャーポンプ、８は流路、９は排液路である。
【００３３】
図３のフローでは、２つの流路を用いて試料溶液と試薬溶液とを二液混合型のフローセル内において単純に混合する方法で両者を接触させ、過酸化水素を測定する。このフローでは、まずプランジャーポンプ１を駆動して、流路４にキャリヤーを一定の流速で注入し、発光検出器３内のフローセルを通過させ、前処理を行う。また同時に、プランジャーポンプ７を駆動して、流路８に試料溶液を一定の流速で注入し、発光検出器３内のフローセルを通過させ、このときキャリヤーと混合する。測定中は、流路８の試料溶液および流路４のキャリヤーは同時に連続して流し続けている。フローセルを通過したキャリヤーおよび試料溶液は排液路９から排出する。
【００３４】
次に、流路５に試薬溶液が注入できるようにインジェクションバルブ２を切り替え、試薬溶液の一定量を流路５に注入する。その後、再びインジェクションバルブ２を切り替え、一定の流速で送液しているキャリヤーの流路４に注入し、キャリヤーを送液することにより試薬溶液を搬送し、試薬溶液を発光検出器３内に注入する。これにより、試薬溶液は流路８から同時に連続して流れ込んでくる試料溶液と二液混合型のフローセル内で単純に混合され、両者が接触する。このとき化学発光する発光強度を発光検出器３で測定する。測定が終了した試薬溶液と試料溶液との混合液は排液路９から排出する。
【００３５】
測定したい試料溶液が複数ある場合は、上記操作を繰り返して行うことにより、連続的に測定することができる。ただし、測定を続けるとバックグランド発光の上昇が観察されるが、この場合は流路およびフローセルを洗浄することによりバックグランド発光を低下させることができ、その後測定を続けることができる。
【００３６】
図４のフローでは、１つの流路を用いて試料溶液および試薬溶液を非混合型のフローセルに注入して測定する。すなわち、プランジャーポンプ１を駆動して、流路４にキャリヤーを一定の流速で注入し、発光検出器３内のフローセルを通過させ、前処理を行う。フローセルを通過したキャリヤーは排液路９から排出する。次に、流路５に塩基溶液が注入できるようにインジェクションバルブ２を切り替え、塩基溶液の一定量を流路５に注入する。その後、再びインジェクションバルブ２を切り替え、キャリヤーを一定の流速で流路４に注入し、キャリヤーを送液することにより塩基溶液を搬送し、塩基溶液を発光検出器３内に注入し、フローセルを通過させる。フローセルを通過した塩基溶液は排液路９から排出する。
【００３７】
塩基溶液の一定量がフローセルを通過すると、続いて搬送用に注入したキャリヤーがフローセルを通過するので、塩基溶液がフローセル中に貯留することはないが、塩基溶液がキャリヤーにより完全に洗い流されることはなく、フローセルの壁面には塩基溶液の一部が付着した状態にある。このような塩基溶液の通液は測定の最初に１回だけ行う。塩基溶液の代わりに試薬溶液を使用することもできるが、コスト高になる。
【００３８】
次に、プランジャーポンプ１を駆動して、流路４に試料溶液の一定量を注入した後、キャリヤーを一定の速度で注入し、キャリヤーを送液することにより試料溶液を搬送し、試料溶液を発光検出器３内に注入し、フローセルを通過させる。フローセルを通過した試料溶液は排液路９から排出する。この場合も上記塩基溶液の場合と同様に、フローセルの壁面には試料溶液の一部が付着した状態にある。この試料溶液の一定量の注入においては、上記の塩基溶液と同様な操作で流路５を用いて、キャリヤーの流路４に注入することもできる。
【００３９】
次に、流路５に試薬溶液が注入できるようにインジェクションバルブ２を切り替え、試薬溶液の一定量を流路５に注入する。その後、再びインジェクションバルブ２を切り替えた後、キャリヤーを一定の流速で流路４に注入し、キャリヤーを送液することにより試薬溶液を搬送し、試薬溶液を発光検出器３内に注入し、フローセルを通過させる。これにより、フローセルの壁面に付着していた試料溶液と試薬溶液とが接触する。ことのき化学発光する発光強度を発光検出器３で測定する。
【００４０】
測定したい試料溶液が複数ある場合は、上記操作を繰り返して行うことにより、連続的に測定することができる。図４の場合は、図３の場合とは異なり、試料溶液はキャリヤーを送液することにより搬送し、フローセルの壁面に付着させる試料溶液は試薬溶液との接触によって容易に洗浄させる程度の一定量のみであるので、測定を続けてもバックグランド発光の上昇が観察されず、複数の試料溶液の定量を連続的に行うことができる。
【００４１】
【実施例】
次に本発明の実施例について説明する。試料溶液、試薬溶液および塩基溶液としては次のものを使用した。
【００４２】
●第１の試料溶液
０．２Ｍ濃度で過酸化水素を含むアセトン溶液を調製した。次にこの過酸化水素含有アセトン溶液１．５ｍｌをトルエン５００ｍｌで希釈した。さらにこの希釈溶液１．０ｍｌをトルエン５０ｍｌで希釈して、１．２×１０-5Ｍ濃度で過酸化水素を含むトルエン溶液を調製し、これを第１の試料溶液とした。
●第２の試料溶液
トルエンの代わりにシクロヘキサンを用いた以外は上記第１の試料溶液と同様に、１．２×１０-5Ｍ濃度で過酸化水素を含むシクロヘキサン溶液を調製し、これを第２の試料溶液とした。
【００４３】
●第１の試薬溶液
１−ヘキサノールを補助界面活性剤として０．２６Ｍの濃度で含むシクロヘキサン５０ｍｌに、３．３ミリモルの塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を添加してよく混合し、界面活性剤含有有機溶媒を調製した。これとは別に、ルミノール０．５ミリモルおよび炭酸ナトリウム５ミリモルを水２５ｍｌに溶解し、塩基性ルミノール水溶液を調製した。次に前記界面活性剤含有有機溶媒５０ｍｌに前記塩基性ルミノール水溶液１ｍｌを、室温（２０〜２５℃）で、約５分間激しく振り混ぜる操作を行って、逆ミセル溶液を調製した。この逆ミセル溶液中のＣＴＡＣと水の濃度比（Ｒ＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）は１８である。
こうして１−ヘキサノールを補助界面活性剤として含むシクロヘキサンをバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を界面活性剤とし、逆ミセルの内水相に０．０２Ｍ濃度のルミノールおよび０．２Ｍ濃度の炭酸ナトリウム水溶液を含む逆ミセル溶液からなる第１の試薬溶液を得た。
【００４４】
●第２の試薬溶液
５ミリモルの炭酸ナトリウムの代わりに２０ミリモルの水酸化ナトリウムを用いた以外は上記第１の試薬溶液と同様に逆ミセル溶液を調製した。ただし、この場合の振り混ぜ操作は１〜２分間程度とした。
こうして１−ヘキサノールを補助界面活性剤として含むシクロヘキサンをバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を界面活性剤とし、逆ミセルの内水相に０．０２Ｍ濃度のルミノールおよび０．８Ｍ濃度の水酸化ナトリウム水溶液を含む逆ミセル溶液からなる第２の試薬溶液を得た。
【００４５】
●第３の試薬溶液
６：５（ｖ／ｖ）クロロホルム−シクロヘキサン５０ｍｌに、３．７ミリモルの塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を添加してよく混合し、界面活性剤含有有機溶媒を調製した。これとは別に、ルミノール０．５ミリモルおよび炭酸ナトリウム２０ミリモルを水２５ｍｌに溶解し、塩基性ルミノール水溶液を調製した。次に前記界面活性剤含有有機溶媒５０ｍｌに前記塩基性ルミノール水溶液１ｍｌを、室温（２０〜２５℃）で、４〜５分間振り混ぜる操作を行って、逆ミセル溶液を調製した。この逆ミセル溶液中のＣＴＡＣと水の濃度比（Ｒ＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）は１５である。
こうしてクロロホルム−シクロヘキサンをバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を界面活性剤とし、逆ミセルの内水相に０．０２Ｍ濃度のルミノールおよび０．８Ｍ濃度の炭酸ナトリウム水溶液を含む逆ミセル溶液からなる第３の試薬溶液を得た。
【００４６】
●第４の試薬溶液
炭酸ナトリウムの代わりに水酸化ナトリウムを用いた以外は上記第３の試薬溶液と同様に逆ミセル溶液を調製した。ただし、この場合の振り混ぜ操作は１〜２分間程度とした。
こうしてクロロホルム−シクロヘキサンをバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を界面活性剤とし、逆ミセルの内水相に０．０２Ｍ濃度のルミノールおよび０．８Ｍ濃度の水酸化ナトリウム水溶液を含む逆ミセル溶液からなる第４の試薬溶液を得た。
【００４７】
●第１の塩基溶液
６：５（ｖ／ｖ）クロロホルム−シクロヘキサン５０ｍｌに、３．７ミリモルの塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を添加してよく混合し、界面活性剤含有有機溶媒を調製した。これとは別に、炭酸ナトリウム２０ミリモルを水２５ｍｌに溶解し、炭酸ナトリウム水溶液を調製した。次に前記界面活性剤含有有機溶媒５０ｍｌに前記炭酸ナトリウム水溶液１ｍｌを、室温（２０〜２５℃）で、４〜５分間振り混ぜる操作を行って、逆ミセル溶液を調製した。この逆ミセル溶液中のＣＴＡＣと水の濃度比（Ｒ＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）は１５である。
こうしてクロロホルム−シクロヘキサンをバルク溶媒とし、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を界面活性剤とし、逆ミセルの内水相に０．８Ｍ濃度の炭酸ナトリウム水溶液を含む逆ミセル溶液からなる第１の塩基溶液を得た。
【００４８】
●第１の発光検出器
ガラス製のフローセルを備えている発光検出器を使用した。
（株）マイクロテック・ニチオン製、ルミフローＬＦ−８００（商標）
【００４９】
実施例１
試料溶液として前記第１の試料溶液、試薬溶液として前記第２の試薬溶液、キャリヤーとしてトルエンを用いて、図３のフローでトルエン中の過酸化水素を定量した。
すなわち、流路８に試料溶液を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で送液し、発光検出器３内のフローセルを通過させ、同時に流路４に１ｍｌ／ｍｉｎの流速でキャリヤーを送液し、流路５に試薬溶液１００μｌを注入した後、そのキャリヤーを搬送して発光検出器３内のフローセルを通過させた。試薬溶液がフローセルを通過した際に、流路８から連続的に流れ込んでくる試料溶液と混合され、これにより生じた化学発光の発光強度を前記発光検出器３で測定した。
【００５０】
その後、試料溶液を注入して測定を続けると、バックグランド発光の上昇が観測された。これは、フローセルのガラス表面にルミノール試薬か過酸化水素が吸着するために起こるのではないかと考えられた。このため、以下の実施例において図４のフローで試験した。
【００５１】
実施例２
試料溶液として前記第１の試料溶液、試薬溶液として前記第３の試薬溶液、塩基溶液として前記第１の塩基溶液、キャリヤーとしてトルエンを用いて、図４のフローでトルエン中の過酸化水素を定量した。
すなわち、流路５に塩基溶液１００μｌを注入した後、２ｍｌ／ｍｉｎの流速のキャリヤーで発光検出器３内のガラス製のフローセルを通過させ、次に流路４に試料溶液１００μｌを注入した後、２ｍｌ／ｍｉｎの流速のキャリヤーで発光検出器３内のフローセルを通過させ、次に流路５に試薬溶液１００μｌを注入した後、２ｍｌ／ｍｉｎの流速のキャリヤーで発光検出器３内のフローセルを通過させた。試薬溶液がフローセルを通過さた際に生じた化学発光の発光強度を前記発光検出器３で測定した。注入順序を図５に示す。
【００５２】
その後、試料溶液および試薬溶液を順次、交互に注入して測定を続けた。この場合も、発光シグナルが連続的に得られた。結果を図６に示す。
このように発光が連続して得られるのは、試薬溶液中に含まれている逆ミセル中の塩基が、次の過酸化水素の吸着のためのセル表面の処理に寄与しているからであると考えられる。
【００５３】
比較例１
実施例２において、試料溶液と試薬溶液の注入順序を逆の順序に変更し、試薬溶液、試料溶液の順序で注入した以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は得られなかった。注入順序を図５に示す。
【００５４】
比較例２
実施例２において、塩基溶液の注入を行わなかった以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は得られなかった。注入順序を図５に示す。
【００５５】
参考例１
実施例２において、第３の試薬溶液の代わりに０．０２Ｍ濃度のルミノール水溶液１００μｌを用いた以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は１回だけ得られたが、その後繰り返し発光シグナルを得ることはできなかった。注入順序を図７に示す。
【００５６】
参考例２
実施例２において、第１の塩基溶液の代わりに０．８Ｍ濃度の炭酸ナトリウム水溶液１００μｌを用いた以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は得られなかった。注入順序を図７に示す。
【００５７】
参考例３
実施例２において、第１の塩基溶液の代わりに０．８Ｍ濃度の炭酸ナトリウム水溶液１００μｌを用い、第３の試薬溶液の代わりに０．０２Ｍ濃度のルミノール水溶液１００μｌを用いた以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は得られなかった。注入順序を図７に示す。
【００５８】
以上の結果から、吸着−逆ミセルメディア化学発光について、図８に模式的に示す機構が仮定される。まず、塩基を含む塩化セチルトリメチルアンモニウム逆ミセルがフローセルのガラス表面に吸着して、セル表面を被覆する。このような表面処理がなされた状態のところへ、次に注入されたトルエン中の過酸化水素が取り込まれ、ガラス表面に留まる。
【００５９】
その後に注入された逆ミセル中のルミノールがこのミクロ反応場に入り、発光が起こる。このルミノールはおそらくほとんど吸着されないものと思われる。
また界面活性剤がない場合、すなわち水溶液の状態で吸着している場合は、トルエンは表面に接触しにくくなり、過酸化水素がミクロ反応場に取り込まれにくくなると推測される。
【００６０】
実施例３
実施例２において、試料溶液として第１の試料溶液代わりに第２の試料溶液（シクロヘキサン溶液）を用いた以外は実施例２と同様行った。その結果、発光が得られた。その後、試料溶液および試薬溶液を順次、交互に注入して測定を続けた。この場合も、発光シグナルが連続的に得られた。
【００６１】
参考例４
実施例２において、キャリヤーとしてトルエンの代わりにシクロヘキサンを用いた以外は実施例２と同様行った。その結果、発光は得られなかった。
【００６２】
実施例４
塩基として炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムを用い、これらの濃度を段階的に変え、図４の１流路のシステムで発光強度を測定した。すなわち、前記第３の試薬溶液において炭酸ナトリウムの濃度が０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍ、１．０Ｍである試薬溶液を用いて行った。また前記第４の試薬溶液において水酸化ナトリウムの濃度が０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍ、１．０Ｍである試薬溶液を用いて行った。他の条件は、試薬溶液中のルミノール濃度が前記第３および前記第４の試薬溶液と同様に逆ミセルの内水相中の濃度として０．０２Ｍ、Ｒ（＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）が１５、試料溶液中の過酸化水素濃度が前記第１の試料溶液と同様に１．２×１０-5Ｍである。結果を図９に示す。
【００６３】
図９の結果から、クロロホルム−シクロヘキサンをバルク溶媒とした場合、炭酸ナトリウムを用いた前記第３の試薬溶液の方が前記第４の試薬溶液より強い発光が得られることがわかる。
【００６４】
実施例５
試薬溶液に用いる有機溶媒として、クロロホルム−シクロヘキサンまたはシクロヘキサンを用い、試料溶液中の過酸化水素濃度を段階的に変え、図４の１流路のシステムで発光強度を測定した。すなわち、前記第３の試薬溶液（６：５（ｖ／ｖ）クロロホルム−シクロヘキサン、逆ミセルの内水相に０．８Ｍ濃度の炭酸ナトリウム）を用い、また試料溶液として２．５×１０-7Ｍ、１．２×１０-6Ｍ、および２．５×１０-6Ｍ濃度の過酸化水素を含むトルエン溶液を用いて行った。
【００６５】
また前記第１の試薬溶液（シクロヘキサン／１−ヘキサノール（０．２６Ｍ））、逆ミセルの内水相に０．２Ｍ濃度の炭酸ナトリウム）を用い、また試料溶液として１．３×１０-6Ｍ、２．６×１０-6Ｍ、５．２×１０-6Ｍ、１．３×１０-5Ｍおよび２．６×１０-5Ｍ濃度の過酸化水素を含むトルエン溶液を用いて行った。他の条件は、試薬溶液中のルミノール濃度およびＲ（＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）がそれぞれ前記第１および前記第３の試薬溶液と同じである。結果を図１０に示す。
【００６６】
図１０の結果から、塩基として炭酸ナトリウムを用いた場合、検出限界は、クロロホルム−シクロヘキサン混合系の前記第３の試薬溶液の方が１０-7Ｍ程度と低いのに対し、シクロヘキサン系の前記第１の試薬溶液は１０-6Ｍ程度と高いが、直線範囲は広くなることがわかる。
【００６７】
実施例６
前記第２の試薬溶液（シクロヘキサン／１−ヘキサノール（０．２６Ｍ））、逆ミセルの内水相に０．８Ｍ濃度の水酸化ナトリウム）を用い、また試料溶液として１．２×１０-7Ｍ、２．４×１０-7Ｍ、６．０×１０-7Ｍ、１．２×１０-6Ｍ、２．０×１０-6Ｍ、４．０×１０-6Ｍおよび６．０×１０-6Ｍ濃度の過酸化水素を含むトルエン溶液を用いて行った。他の条件は、試薬溶液中のルミノール濃度およびＲ（＝［Ｈ2Ｏ］／［ＣＴＡＣ］）が前記第２の試薬溶液と同じである。結果を図１１に示す。
【００６８】
図１１の結果から、シクロヘキサン系での検出限界が、塩基として水酸化ナトリウムを用いた前記第２の試薬溶液は１０-7Ｍ程度となり、炭酸ナトリウムを用いた前記第１の試薬溶液より低くなることがわかる。
【００６９】
以上の結果から、従来の方法、例えば有機溶媒中の過酸化水素を一旦水溶液に抽出し、その後電気化学的に定量する方法（感度１０-4Ｍ程度）に比べて、本発明の方法は明らかに高感度で迅速性であると言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】逆ミセルの構造の模式図である。
【図２】逆ミセルで生じる化学発光の反応を示す図である。
【図３】ＦＩＡ法により過酸化水素を測定する実施例のフローであり、試料溶液および試薬溶液を別々の流路から注入する２流路のシステムにより測定する実施例のフローである。
【図４】ＦＩＡ法により過酸化水素を測定する実施例のフローであり、試料溶液および試薬溶液を同一の流路から注入する１流路のシステムにより測定する実施例のフローである。
【図５】実施例２、比較例１および比較例２における試料溶液および試薬溶液の注入順序を示す図である。
【図６】実施例２の結果を示すグラフであり、化学発光シグナルのプロフィール（形状）を示している。縦軸はレコーダー上で得られた化学発光強度であり、その数値は任意である。
【図７】参考例１〜３における試料溶液および試薬溶液の種類および注入順序を示す図である。
【図８】本発明の方法における化学発光の原理を模式的示す説明図である。
【図９】実施例４の結果を示すグラフである。縦軸の数値は任意である。
【図１０】実施例５の結果を示すグラフである。縦軸の数値は任意である。
【図１１】実施例６の結果を示すグラフである。縦軸の数値は任意である。
【符号の説明】
１、７  プランジャーポンプ
２  インジェクションバルブ
３  発光検出器
４、５、８  流路
９  排液路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003671724.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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