(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
核酸が配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸を含む請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
核酸が配列番号４６のヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
核酸が、発現制御配列と操作により関連している請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項５の組換えＤＮＡ分子で形質転換又はトランスフェクトされた単細胞宿主。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を発現させる方法であって、請求項６の単細胞宿主を、適切な細胞培地において、単細胞宿主によるタンパク質又はペプチドの発現が提供される条件下で培養することを含む方法。
【請求項８】
更に、ペプチド又はタンパク質を精製する工程を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸が、発現制御配列と操作により関連している請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項９の組換えＤＮＡ分子で形質転換又はトランスフェクトされた単細胞宿主。
【請求項１１】
配列番号４７のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を発現させる方法であって、請求項１０の単細胞宿主を、適切な細胞培地において、単細胞宿主によるタンパク質又はペプチドの発現が提供される条件下で培養することを含む方法。
【請求項１２】
更に、ペプチド又はタンパク質を精製する工程を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号２及び４７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質と反応性の抗体。
【請求項１４】
配列番号４７のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
本発明をもたらした研究は米国政府助成番号R01-AI27913により一部支持された。政府は本発明に或る種の権利を有し得る。
継続情報
本発明は1994年５月18日に出願された共同未決米国特許出願第08/245,511号の一部継続出願であり、これは1993年９月１日に出願された共同未決米国特許出願第08/116,541号の一部継続出願であり、これらの出願の夫々が参考として本明細書にそのまま含まれ、そして本件出願人は35 U.S.C. §120に従って両方の出願の出願日の利益を主張する。
発明の分野
本発明は細菌輸出タンパク質、及びこのようなタンパク質をコードする遺伝子の同定に関する。また、本発明はこのようなタンパク質を使用して細菌感染からの保護を与える無菌体ワクチン、並びに診断及び受動免疫療法に使用するためのこのようなタンパク質の抗体に関する。
発明の背景
細菌中の輸出タンパク質は、多くの種々の必須の細胞機能、例えば、運動性、シグナル伝達、巨大分子輸送及び構築、並びに必須栄養の獲得に関与する。病因細菌につき、多くの輸出タンパク質は、アドヘジンとして機能してコロニー形成し、こうして宿主を感染し、または毒素として機能して細菌を宿主の免疫系に対し保護する毒力決定基である（概説につき、Hoepelman及びTuomanen, 1992, Infect.Immun. 60:1729-33を参照のこと）。
18世紀におけるJennerによる痘瘡ワクチンの開発以来、予防接種が感染性微生物に対する兵器車中の重要な武器であった。抗生物質の導入前に、予防接種はウイルスまたは細菌感染に対し集団を保護するための主要な希望であった。20世紀初期における抗生物質の出現により、細菌感染に対する予防接種は大して重要にならなかった。しかしながら、感染性細菌の抗生物質耐性株の最近の暴動が抗細菌ワクチンの重要性の再確認をもたらした。
抗細菌ワクチンの一つの可能性は死滅細菌または弱毒化細菌の使用である。しかしながら、不完全な死滅または弱毒化のための毒力への死滅細菌または弱毒化細菌の反転の可能性及び汚染物質としての毒性成分の混入を含む、全細胞ワクチンの幾つかの欠点がある。
他のワクチン別型は細菌炭水化物カプセルで免疫感作することである。現在、ストレプトコッカス  ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)に対するワクチンはこの細菌の23の最も普通な血清型のカプセルを含む接合体を使用する。これらのワクチンは、Ｔ細胞免疫応答を誘発できないことのために、病因感染を最も受けやすい個体、即ち、幼児、老人、及び免疫悪化した個体では有効ではない。最近の研究は、このワクチンがこれらの個体につきわずかに50％の保護であることを示していた(Shapiroら，1991, N.Engl.Med. 325:1453-60)。
全細菌ワクチンの別型は、抗原が細菌表面タンパク質を含む無菌体ワクチンまたはサブユニットワクチンである。これらのワクチンは全細菌ワクチンまたはカプセルをベースとするワクチンの欠点を潜在的に解決し得る。更に、細菌毒力に対する輸出タンパク質の重要性を考慮すると、これらのタンパク質は治療介入に重要な標的である。細菌の全ての株に対し保護するワクチン中の使用につき細菌の特別な種の全ての株の共通な抗原に相当するタンパク質が特に重要である。しかしながら、現在まで、グラム陽性細菌の少数の輸出タンパク質のみが同定されていたにすぎず、これらのいずれもが細菌の特別な種に共通の抗原に相当しない。
E.coli中の輸出タンパク質の遺伝子分析に関する戦略が、機能性シグナル配列を欠くアルカリ性ホスファターゼ(phoA)のトランケート遺伝子への翻訳融合の記載後に示唆された(Hoffman及びWright, 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:5107-5111)。この研究において、酵素活性が異種シグナル配列のコード領域とphoAの間の遺伝子融合を有する株中で容易に検出され、これは細胞質膜を横切るトランスロケーションが酵素活性に必要とされることを示した。続いて、修飾トランスポゾン、TnphoAが構築されて翻訳遺伝子融合の迅速なスクリーニングを容易にした(Manoil及びBeckwith, 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:8129-8133)。これらの強力な手段が改良され、エシェリキア  コリ(Escherichia coli)(Guitierrezら，1987, J.Mol.Biol. 195:289-297)、ビブリオ  コレラ(Vibrio cholera)(Taylorら，1989, J.Bacteriol. 171:1870-1878)、ボルデテラ  ペルツシス(Bordetella pertussis)(Finnら，1991, Infect Immun. 59:3273-9; Knapp及びMekalanos, 1988, J.Bacteriol. 170:5059-5066)及びレジュネラ  ニューモフィラ(Legionella pneumophila)(Albanoら，1992, Mol.Microbiol. 6:1829-39)の如き多くのグラム陰性病原体に使用されて輸出タンパク質の同定及び特性決定から多くの情報を生じた。β−ラクタマーゼの遺伝子のトランケート形態への遺伝子融合に基く同様の戦略が同じ目的に使用されていた(Broome-Smithら，1990, Mol.Microbiol. 4:1637-1644)。また、輸出タンパク質のトポロジーをマッピングするための直接の戦略がphoAへの“サンドイッチ”遺伝子融合に基いて開発されていた(Ehrmannら，1990, 87:7574-7578)。
種々の理由のために、グラム陽性生物中の輸出タンパク質の遺伝子スクリーンとしての遺伝子融合の使用は制限された成功をした。アルカリ性ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ及びａ−アラーゼの遺伝子への二つまたは三つの部分翻訳融合を生じるプラスミドベクターがバチルス  スブチリス(Bacillus subtilis)及びラクトコッカス  ラクチ(Lactococcus lacti)につき設計されていた(Payne及びJackson, 1991, J.Bacteriol. 173:2278-82; Perezら，1992, Mol.Gen.Genet. 234:401-11; Smithら，1987, J.Bacteriol. 169:3321-3328; Smithら，1988, Gene 70:351-361)。phoAとスタフィロコッカス  アウレウス(Staphylococcus aureus)からのプロテインＡ(spa)の遺伝子の間の遺伝子融合がこのタンパク質の細胞局在化を決定するのに使用されていた(Schneewindら，1992, Cell. 70:267-81)。しかしながら、この研究において、アルカリ性ホスファターゼの酵素活性が報告されなかった。
また、幾つかのストレプトコッカス種における突然変異誘発戦略が幾つかの理由のために制限されていた。グラム陰性細菌を研究するのに主要な手段であるトランスポゾンと同様の有効なトランスポゾンがストレプトコッカスにつき開発されていなかった。非複製プラスミドベクターによる挿入重複突然変異誘発がストレプトコッカス  ニューモニアエに関する成功した別法であった(Chen及びMorrison, 1988, Gene. 64:155-164; Morrisonら，1984, J.Bacteriol. 159:870)。この戦略が幾つかのニューモコッカスの遺伝子の突然変異誘発、単離及びクローニングをもたらした（Alloingら，1989, Gene. 76:363-8; Berryら，1992, Microb.Pathog. 12:87-93; Hui及びMorrison, 1991, J.Bacteriol. 173:372-81; Lacks及びGreenberg, 1991, Gene. 104:11-7; Laibleら，1989, Mol.Microbiol. 3:1337-48; Martinら，1992, J.Bacteriol. 174:4517-23; McDanielら，1987, J.Exp.Med. 165:381-94; Prudhommeら，1989, J.Bacteriol. 171:5332-8; Prudhommeら，1991, J.Bacteriol. 173:7196-203; Puyetら，1989, J.Bacteriol. 171:2278-2286; Puyetら，1990, J.Mol.Biol. 213:727-38; Radnisら，1990, J.Bacteriol. 172:3669-74; Sicardら，1992, J.Bacteriol. 174:2412-5; Stassiら，1981, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:7028-7032; Tomaszら，1988, J.Bacteriol. 170:5931-5934; Yotherら，1992, J.Bacteriol. 174:610-8）。
ワクチンにつき魅力的な標的であり得る輸出ニューモコッカスタンパク質に関する研究において、ニューモコッカス表面プロテインＡ(PspA)が注目される（上記のYotherら，1992の文献を参照のこと）。PspAは、それが現在の全てのニューモコッカス中に見られるのでS.ニューモニアエワクチンの候補であることが報告されていた。その精製タンパク質がマウスに保護免疫を誘発するのに使用でき、そしてそのタンパク質の抗体がマウスに受動免疫を与える(Talkingtonら，1992, Microb.Pathog. 13:343-355)。しかしながら、PspAはそのタンパク質のＮ末端半分中で株間の抗原変異性を示し、そのタンパク質が免疫原エピトープ及び保護誘発エピトープを含む（上記のYotherら，1992の文献）。このタンパク質はS.ニューモニアエの全ての株に共通の抗原に相当せず、それ故、最適のワクチン候補ではない。
最近、PhoAを含む見掛け融合タンパク質がグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の種に輸出された(Pearce及びMasure, 1992, Abstr. Gen.Meet.Am.Soc.Microbiol. 92:127, abstract D-188)。この抄録はE.coli及びS.ニューモニアの両方中で発現できるシャトルベクター中のシグナル配列を欠いているE.coli phoA遺伝子及びプロモーターの上流のニューモコッカスＤＮＡの挿入を報告し、そして原形質膜を横切る輸出タンパク質のトランスロケーションのための同様の経路が細菌の両方の種につき見られなければならないことを示唆する。
最近の研究は、幾つかの細菌種中の遺伝子移入が個々の細胞間のシグナル応答機構に頼ることを示していた。接合プラスミド移入はアグロバクテリウム  ツミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)中でホモセリンラクトンにより媒介され(Zhangら，1993, Science 362:446-448)、またエンテロコッカス  ファエカリス(Enterococcus faecalis)中で小さい分泌ポリペプチドにより媒介される（概説につき、Clewell, 1993, Cell 73:9-12を参照のこと）。S.ニューモニア(Tomasz, 1965, Nature 208:155-159; Tomasz, 1966, J.Bacteriol. 91:1050-61; Tomasz及びMosser, 1966, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:58-66)及びストレプトコッカス  サングイス(Streptococcus sanguis)(Leonard及びCole, 1972, J.Bacteriol. 110:273-280; Pakulaら，1962, Acta Microbiol. Pol. 11:205-222; Pakula及びWalczak, 1963, J.Gen.Microbiol. 31:125-133)中で形質転換を誘発する低分子量のペプチドアクチベーターが記載されていた。胞子形成及び形質転換の両方を調節するペプチドアクチベーターがB.スブチリスにつき記載されていた(Grossman及びLosick, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4369-73)。更に、遺伝学的証拠は、ペプチドパーミアーゼがE.ファエカリス(Ruhfelら，1993, J.Bacteriol. 175:5253-59; Tanimotoら，1993, J.Bacteriol. 175:5260-64)及びB.スブチリス(Rudnerら，1991, J.Bacteriol. 173:1388-98)の両方中でこれらのプロセスを媒介しているかもしれないことを示唆する。
S.ニューモニア中で、形質転換は生理学上特定される“コンピテント”状態中にプログラミングされたイベントとして起こる。密度依存性様式で未知のシグナルにより誘発されて、細胞は対数増殖の開始である5 x 106〜1-2 x 107 cfu/mlの応答能の単一波を示す（上記のTomasz, 1966の文献）。誘発により、応答脳関連タンパク質の特異な組が発現され(Morrison及びBaker, 1979, Nature 282:215-217)、形質転換関連遺伝子の全面的な調節を示唆する。コンピテント細菌は外在性ＤＮＡを結合、輸送し、同種である場合に、これがレシピエント細胞のゲノムに組換えによりとり込まれる。１回または２回の細胞分裂中に、細菌は最早応答能のないものになる。誘導につき、応答能の不活化が未知の機構により起こる。
本明細書中の文献の引用は、このようなものが本発明の従来技術であることの許可と見なされるべきではない。
発明の要約
本発明はグラム陽性細菌中の輸出タンパク質をコードする遺伝子、及びこのような遺伝子によりコードされたタンパク質に関する。特に、本発明はグラム陽性細菌付着関連タンパク質、好ましくはアドヘジン、毒力決定基、毒素、または主要抗原(immunodominant)タンパク質をコードする遺伝子の単離を提供し、こうして遺伝子及びそれによりコードされたタンパク質を提供する。別の局面において、輸出タンパク質はグラム陽性細菌の種の多くの株または全ての株に共通の抗原であってもよく、そしてそれは細菌の密接に関連した種からの同種タンパク質に抗原上関連していてもよい。また、本発明は細菌の特別な株に抗原上特異であるタンパク質の同定を意図している。輸出タンパク質はグラム陽性細菌の種の全ての株に共通のアドヘジンであることが好ましい。
更に、本発明は、輸出付着関連タンパク質をコードする遺伝子、または被験者中の遺伝子の誘導発現を誘導できるプロモーターと操作により会合されたグラム陽性細菌の種の多くの株に共通の抗原である輸出タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含むことを特徴とする動物被験者をグラム陽性細菌による感染から保護するためのワクチンに関する。
別の局面において、本発明は免疫原量の輸出付着関連タンパク質、毒力決定基、毒素、またはグラム陽性細菌の主要抗原タンパク質、または免疫原量の輸出タンパク質（これはグラム陽性細菌の種の多くの株に共通の抗原である）、及びアジュバントを含むことを特徴とする動物被験者をグラム陽性細菌による感染から保護するためのワクチンに関する。このようなワクチンは細菌の一種以上の株からの一種以上の細菌カプセルに共有結合で接合されたタンパク質を含むことが好ましい。細菌の種の全ての共通の株からのカプセルがワクチン中に含まれることが更に好ましい。
また、そのタンパク質は、以下に詳しく記載されるように、適当な動物を免疫感作してポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するのに使用し得る。こうして更に、本発明はグラム陽性細菌の輸出タンパク質と反応性の抗体に関する。このような抗体はイムノアッセイに使用されて細菌の特別な株または種による感染を診断し得る。こうして、株特異性輸出タンパク質はその株による感染の診断のための株特異性抗体を産生するのに使用し得る。また、共通の抗原が細菌のその種による感染の診断のための抗体を調製するのに使用し得る。特別な局面において、細菌の種はS.ニューモニアエである。また、これらの抗体は受動免疫感作に使用されてグラム陽性細菌による感染を治療し得る。
こうして、本発明の目的はグラム陽性細菌の輸出タンパク質をコードする遺伝子を提供することである。このような遺伝子は、付着関連タンパク質、毒力決定基、毒素、または免疫原性である主要抗原タンパク質をコードすることが好ましい。このような遺伝子の産物が特に魅力的なワクチン候補であるので、そのタンパク質はグラム陽性細菌の種の多くの株に共通の抗原であることが好ましい。
本発明の別の目的はグラム陽性細菌に対する無菌体ワクチンを提供することであり、こうして全死滅細菌ワクチンまたは生菌ワクチン及びカプセルワクチンの欠点を解消する。
本発明の別の目的は、ヘルパーＴ細胞免疫応答を誘発するカプセルワクチンを提供することである。
本発明の更に別の目的はグラム陽性細菌による感染の診断を提供することである。
本発明の別の目的はグラム陽性細菌感染、特に抗生物質耐性細菌による感染の受動免疫療法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
図１．S.ニューモニア中の輸出タンパク質の突然変異及び遺伝子同定に設計されたPhoA融合ベクターの構築。（A）phoAのトランケート形態を含むpPHO7の2.6kBフラグメントをpJDC9のSmaI部位またはBamHI部位に挿入して夫々pHRM100及びpHRM104を産生した。TIT2は転写ターミネーターであり、矢印は遺伝子配向を示す。(B)遺伝子融合にカップリングされた挿入重複突然変異誘発の機構。PhoA活性は、インフレーム(in-frame)であり、かつ輸出タンパク質をコードする遺伝子の下流である内部遺伝子フラグメントのクローニングに依存する。S.ニューモニアエへの形質転換は標的フラグメントの重複及びその後の遺伝子分断をもたらす。
図２．S.ニューモニアエ中のPhoA融合の検出及びトリプシン感受性。R6x（レーン１；親株）：SPRU98（レーン２）；SPRU97（レーン３）；及びSPRU96（レーン４）からの全細胞溶解産物（50μgのタンパク質）を8-25％のSDSポリアクリルアミドゲルに適用した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗PhoA抗体で探査した。抗原−抗体複合体を適当なペルオキシダーゼ接合二次抗体による増進ケミルミネセンスにより検出した。SPRU96及び97は染色体中にランダムに組込まれたプラスミドpHRM100及びpHRM104を含む。分子量標準物質が左に示される。株SPRU98からの全細菌を37℃で10分間50μg/mlのトリプシンで処理し（レーン５）、または処理しなかった（レーン６）。両方の試料を40倍のモル過剰の大豆トリプシンインヒビターで処理した。全細胞溶解産物（50μgのタンパク質）を上記のようにしてPhoAに免疫反応性物質につき探査した。分子量標準物質が左に示される。
図３．細菌をジスルフィド酸化剤の存在下で増殖する時、PhoA融合産物は一層安定である。SPRU98の培養物を600μMの２−ヒドロキシエチルジスルフィド（レーン１）、10μMのDsbA（レーン２）の存在下で、または添加しないで（レーン３）増殖させた。全細胞溶解産物（50μgのタンパク質）を8-25％のSDSポリアクリルアミドゲルに適用した。次いでタンパク質を図２に記載されたようにして抗PhoA抗体で免疫反応性物質につき探査した。
図４．PhoA+ニューモコッカス変異体から回収された遺伝子座の誘導アミノ酸配列。S.ニューモニアエの９種のPhoA+株（表１を参照のこと）から回収されたプラスミドの夫々をE.coliに形質転換し、400〜700の塩基対インサートを有していた。phoAの5'末端にプライマーを使用して、phoAの直ぐ上流のニューモコッカスＤＮＡの約200〜500の塩基対を夫々のプラスミドから配列決定し、PhoAを含むイン−フレームコード領域を樹立した。融合からの誘導アミノ酸配列がExp1（配列番号２）、Exp2（配列番号24）、Exp3（配列番号６）、Exp4（配列番号８）、Exp5（配列番号10）、Exp6（配列番号12）、Exp7（配列番号14)、Exp8（配列番号16)、及びExp9a（配列番号18）につき示される。Exp9からのインサートの5'末端からの誘導配列がまたExp9b（配列番号20）に示される。
図５．PhoA+変異体から回収されたExp遺伝子座からの誘導アミノ酸配列の配列整列。夫々のインサートに関する最高のスコアリングマッチ(scoring match)が示される。夫々の整列に関する同一性％（％ID）及び類似性％（％SIM）が右に示される。(A)Exp1（配列番号２）及びS.ニューモニアエからのAmiA（配列番号23）（Alloingら，1990, Mol.Microbiol. 4:633-44)。B)Exp2（配列番号24）及びS.ニューモニアエからのPonA（配列番号24）(Martinら，1992, J.Bacteriol. 174:4517-23)。C)Exp3（配列番号25）及びN.ゴノールヘアエ(gonorrhoeae)（配列番号26）(Tahaら，1988, EMBO J. 7:4367-4378)。PilB中の保存ヒスチジン(H408)はExp3中に存在しないが、アスパラギン(N124)により置換されている。D)Exp4（配列番号27）及びトマトからのCD4B（配列番号28）(Gottesmanら，1990, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:3513-7)。E)Exp5（配列番号29）及びB.スブチリスからのPtsG（配列番号30）(Gonzy-Treboulら，1991, Mol.Microbiol. 5:1241-1294)。F)Exp6（配列番号31）及びB.スブチリスからのGlpD（配列番号32）(Holmbergら，1990, J.Gen.Microbiol. 136-2367-2375)。G)Exp7（配列番号33）及びS.チフィムリウム(typhimurium)からのMgtB（配列番号34）(Snavelyら，1991, J.Biol.Chem. 266:815-823)。自己リン酸化に必要とされる保存アスパラギン酸(D554)がまたExp7(D37)中に存在する。H)Exp8（配列番号35）及びB.ペルツシスからのCyaB（配列番号36）（Glaserら，1988, Mol.Microbiol. 2:1930; Glaserら，1988, EMBO J. 7:3997-4004)。I)Exp9及びE.coliからのDeaD(Tooneら，1991, J.Bacteriol. 173:3291-3302)。Exp9からの上部配列（配列番号37）が回収されたプラスミドインサートの5'末端から誘導され、DeaD 135-220（配列番号38）と比較される。Exp9からの下部配列（配列番号20）がphoAから丁度上流の回収プラスミドインサートの3'末端から誘導され、DeaD 265-342（配列番号39）と比較される。保存DEAD配列が強調される。
図６．Exp9-PhoA融合の細胞下の局在化。SPRU17の膜フラクション（レーン１）及び細胞質フラクション（レーン２）（夫々の試料につき50μgのタンパク質）を10-15％のSDSポリアクリルアミドゲルに適用した。タンパク質をニトロセルロースに移し、抗PhoA抗体で探査した。分子量標準物質が左に示される。
図７．ウサギの肺胞型II細胞への型2AII（■）またはカプセル化されていない(uncapsulated)R6（○）ニューモコッカスの付着。付着アッセイを下記の実施例２に記載されたようにして行った。
図８．ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)へのニューモコッカス変異体の付着の滴定。試験した変異体株が表１にリストされる。exp1、株SPRU98（●）；exp2、株SPRU64（○）；exp3、株SPRU40（■）；exp10、
0003722834.tif 000002
及びamiA、株SPRU121（◆）の突然変異は付着する変異体株の能力の低下をもたらした。株R6（■）は野生型S.ニューモニアエである。
図９．肺型II細胞へのニューモコッカス変異体の付着。輸出遺伝子突然変異及び株表示は図８につき記載されたとおりである。
図10．SPRU25変異体、exp10から回収された遺伝子座のヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列。ヌクレオチド配列は図４及び下記の実施例１に記載されたようにして得られた。
図11．plpAのヌクレオチド配列（配列番号46）及び誘導タンパク質配列（配列番号47）。リポタンパク質修飾コンセンサス配列は、開裂が起こるシステイン残基の上にアステリスクで強調される。コード領域から下流に、潜在的rho非依存性転写ターミネーターが強調される。SPRU58中のLeu197及びSPRU98中のAsp492におけるPhoA融合の位置が示される（ゲンバンク受理番号：指定される予定）。
図12．ペプチド結合タンパク質の配列分析。Ａ；PlpA（配列番号47）及びAmiA（配列番号48）の配列整列。同じ残基がボックスにされる。Ｂ；異なる細菌種：PlpA、S.ニューモニアエ（この研究）；AmiA、S.ニューモニアエのパーミアーゼからの基質結合タンパク質に関する配列整列。amiAにつき報告された配列(Alloingら，1990, Mol.Microbiol. 4:633-644)が配列決定の誤りのために今変更され、修正された配列が今ゲンバンクにある。SpoOKA、B.スブチリス(Peregoら，1991, Mol.Microbiol. 5:173-185; Rudnerら，1991, J.Bacteriol. 173:1388-98); HbpA、H.インフルエンザ(Hansonら，1992, Infect.Immun. 60:2257-66); DciAE、B.スブチリス(Mathiopoulosら，1991, Mol.Microbiol. 5:1903-13)；OppA（Ec)、E.coli（Kashiwagiら，1990, J.Biol.Chem. 265:8387-91); TraC、E.ファエカリス(Tanimotoら，1993, J.Bacteriol. 175:5260-64); DppA、E.coli(Abouhamadら，1991, Mol.Microbiol. 5:1035-47); PrgZ、E.ファエカリス(Ruhfelら，1993, J.Bacteriol. 175:5253-59); OppA(St)S.チフィムリウム(Hilesら，1987, J.Mol.Biol. 195:125-142)及びSarA、S.ゴルドニイ。誘導アミノ酸配列がMACAWソフトウェアパッケージ(Schulerら,1993, Proteins Struct.Funct.Genet. 9:180-190)とともに整列された。黒のボックス及び陰影付きのボックスは1.3 x 10-7以下の確立値でもって高度の配列類似性の領域を表し、データベース中の全ての配列の長さから誘導された空間の有効サイズが研究された。
図13．PlpA-PhoAの細胞下の局在化及び標識。上部パネル：SPRU98(PhoA+、pHRM104::plpA)からの細胞下のフラクション（50μgの全タンパク質）を8-25％のSDSポリアクリルアミドゲルに適用し、ニトロセルロース膜に移し、抗PhoA抗血清で探査した。結合抗体をペルオキシダーゼ接合二次抗体で検出し、増進ケミルミネセンスで視覚化した。レーンはＡ、培養上澄み；Ｂ、膜；Ｃ、細胞質；及びＤ、細胞壁である。下部パネル：［3H］パルミチン酸を含む既知組成の培地中で増殖された細菌からの全細胞溶解産物の抗PhoA免疫沈殿を8-25％のSDSポリアクリルアミドゲルに適用し、ニトロセルロース膜に移し、オートラジオグラフィーにかけた。レーンはＥ、親株R6x;Ｆ、SPRU100(PhoA+、pHRM104::zzz);及びＧ、SPRU98(PhoA+、pHRM104::plpA)である。矢印は免疫沈殿したPlpA-PhoA融合タンパク質に相当する93kDaバンドをマークする。
図14．ニューモコッカスペプチドパーミアーゼのノーザン分析。SPRU107(pJDC9::plpA)（レーンＡ及びＣ）及びR6x（レーンＢ及びＤ）から調製したＲＮＡ（10μg）をplpA（レーンＡ及びＢ）またはamiA（レーンＣ及びＤ）からのＤＮＡプローブにハイブリッドを形成した。分子量が示される。
図15．ニューモコッカスパーミアーゼ変異体の形質転換効率。plpAまたはamiA中に損傷を含む示された染色体遺伝子構築物を含む種々の株を形質転換効率の目安としての染色体ストレプトマイシン耐性マーカーのとり込みにつき分析した。夫々の株の形質転換効率が親株、R6x（これは形質転換可能な細胞の全集団中で0.3％のStrr形質転換体を通常生じる）の％として表される。示された値は平均の標準偏差でもって少なくとも三つのデータ点の平均である。結果は三つの別々の場合に行われたアッセイの代表である。Ｅはベクターによりコードされたエリスロマイシン耐性である。
図16．ニューモコッカスパーミアーゼ変異体の応答能プロフィール。形質転換可能な細胞の％をR6x n、SPRU107 l（pJDC::plpA)、及びSPRU114 s(pJDC9::amiA)につき早期対数増殖中に比ODで測定した。結果は三つの別々の実験を表す。
図17．応答能調節されたrec遺伝子座の発現に関するplpA中の突然変異の効果。アルカリ性ホスファターゼ活性を、正常な応答能サイクルを生じるニューモコッカスの対数増殖中にSPRU100、ｎ（PhoA+、pHRM104::exp10）及びSPRU156、ｓ（PhoA+、pHRM104::exp10；pWG5::plpA）につき測定した。夫々の値はデータ点の10％を越えない平均の標準偏差でもって二つのデータ点の平均である。これらの結果は三つの独立の実験を表す。
図18．種々のクローニング操作から生じた組換えプラスミド及びplpAの物理的地図。接頭辞pHを有するプラスミドはPhoAベクターpHRM104中にインサートを含み、一方、接頭辞pJを有するプラスミドはベクターpJDC9中にインサートを含む。殆どのプラスミドを組込んだプラスミドpJplp1による“染色体歩行”によりつくった。プラスミドpJplp9をオリゴヌクレオチドlipo1及びP1による“ホモロジークローニング”によりつくった。詳細につき実験操作を参照のこと。制限エンドヌクレアーゼ部位が示される：Ｈ（HindIII）、Hc（Hinc II）、Ｅ（EcoRI）、Ｋ（KpnI）、Ｐ（PstI）、Ｒ（EcoRV）、Sau（SauIIIa）、Ｓ（SphI）。
図19．型II肺細胞へのR6野生型（□）及びPad1変異体（■）ニューモコッカスの付着。このアッセイを実施例２に記載されたようにして行った。
図20．(A)抗PhoA抗血清によるウェスタン分析により検出されたPad1-PhoA融合の細胞下の局在化。細胞を膜成分（レーンA-C）及び細胞質成分（レーンD-F）に分離した。レーンＡ，Ｄ--R6野生型（親）細胞；Ｂ，Ｅ--Pad1変異体細胞；Ｃ，Ｆ--Pad1b変異体細胞。（B）ウェスタン分析による全細菌の抗体による細菌溶解産物の探査。レーンＡ、Ｂ及びＣは（A）に相当する。Pad1変異体はR6細菌中に見られる17kDa免疫原性膜関連タンパク質を欠いている。
図21．酢酸塩の存在下また不在下で増殖させたR6細菌及びPad1変異体の付着。酢酸塩中の増殖はPad1付着欠陥を修正する。
図22．酢酸塩の存在下または不在下のPad1変異体及びR6細菌の増殖。Pad1変異体を０％（○）、0.1％（◇）及び0.5％（□）の酢酸塩の存在下でS.ニューモニアエの既知組成を増殖培地中で増殖させた。R6を０％（田）及び0.5％（△）の存在下で増殖させた。
図23．poxBとも称されるPad1のヌクレオチド配列（配列番号55）及び演繹アミノ酸配列（配列番号56）。推定リボソーム結合部位、-10部位、及び-35部位が強調され、開始コドンが標識される。
発明の詳細な説明
本発明によれば、当業者に知られている通常の分子生物学技術、微生物学技術、及び組換えＤＮＡ技術が使用し得る。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch ＆Maniatis，“分子クローニング：実験マニュアル”，第２編(1989)コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク（本明細書中、“Sambrookら，1989”）；“ＤＮＡクローニング：実際のアプローチ”，Ｉ巻及びII巻(D.N.Glover編集1985)；“オリゴヌクレオチド合成”(M.J.Gait編集1984)；“核酸ハイブリダイゼーション”［B.D.Hames ＆S.J.Higgins編集(1985)］；“転写及び翻訳”［B.D.Hames ＆S.J.Higgins編集(1984)］；“動物細胞培養”［R.I.Freshney編集(1986)］；“固定化された細胞及び酵素”［IRLプレス，(1986)］；B.Perbal，“分子クローニングに関する実用的な手引き”(1984)を参照のこと。
それ故、本明細書に現れる場合、下記の用語は以下に示された定義を有するべきである。
“レプリコン”は、生体内のＤＮＡ複製の自律単位として機能し、即ち、それ自体の制御のもとに複製できるあらゆる遺伝子要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
“ベクター”は、結合セグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが結合し得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドである。
“ウイルスベクター”という用語は組換え核酸を含むウイルスを表し、それによりそのウイルスは組換え核酸を細胞に導入することができ、即ち、ウイルスは細胞を形質転換し得る。本発明によれば、このようなベクターは、本明細書に記載されるように、核酸をベースとするワクチンの送出に使用し得る。
細胞は、外在性または異種のＤＮＡが細胞内に導入された場合にこのようなＤＮＡにより“形質転換”された。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込まれ（共有結合され）てもよく、またはそのようにされなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類の細胞中で、形質転換ＤＮＡはプラスミドの如きエピソーム要素で維持されてもよい。“クローン”は有糸分裂により単一細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。
“核酸分子”は一本鎖形態または二本鎖らせんのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；“ＲＮＡ分子”）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシリアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；“ＤＮＡ分子”）のリン酸エステルポリマー形態を表す。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡらせん、ＤＮＡ−ＲＮＡらせん及びＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語はその分子の一次構造及び二次構造のみを表し、それを特別な三次形態に限定しない。こうして、この用語は、とりわけ、直線状または環状のＤＮＡ分子中に見られる二本鎖ＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体を含む。特別な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を説明する際に、配列がＤＮＡの転写されなかったストランド（即ち、ｍＲＮＡに相同の配列を有するストランド）に沿って5'から3'の方向でのみ配列を示す通常の慣例に従って本明細書に記載し得る。“組換えＤＮＡ分子”は分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度及び溶液イオン強度の適当な条件下でその他の核酸分子にアニールし得る場合に、その他の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに“ハイブリッドを形成し得る”（Sambrookら，1989の上記文献を参照のこと）。温度及びイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの“ストリンジェンシー”を決定する。ハイブリダイゼーションは、二つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基対の間の不適正塩基対合が可能である。核酸をハイブリッドを形成するのに適したストリンジェンシーは当業界で公知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。ハイブリッドを形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約10のヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも約15のヌクレオチドであることが更に好ましい。
ＤＮＡ“コード配列”は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に生体内でポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は5'（アミノ）末端にある開始コドン及び3'（カルボキシル）末端にある翻訳終止コドンにより決められる。コード配列として、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、そして更に合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。コード配列が真核生物細胞中の発現に意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列は通常コード配列に3'に配置されるであろう。
転写調節配列及び翻訳調節配列は宿主細胞中でコード配列の発現を与えるＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、等である。真核生物細胞中で、ポリアデニル化シグナルは調節配列である。
“プロモーター配列”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合でき、かつ下流（3'方向）のコード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を特定する目的のために、プロモーター配列はその3'末端で転写開始部位により境界を定められ、そして上流（5'方向）に延びてバックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の数の塩基または要素を含む。プロモーター配列中に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1によるマッピングにより都合よく特定される）が見られるだけでなく、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。真核生物プロモーターは通常ではないがしばしば“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含むであろう。
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれがコード配列によりコードされたタンパク質に翻訳される時に、コード配列は細胞中の転写調節配列及び翻訳調節配列の“制御下”にある。
“シグナル配列”はコード配列の前に含まれ得る。この配列はポリペプチドのＮ末端のシグナルペプチドをコードし、これが宿主細胞を誘導してポリペプチドを細胞表面にトランスロケーションし、またはポリペプチドを培地に分泌し、そしてこのシグナルペプチドが輸出後に細胞により選択的に分解される。シグナル配列は原核生物及び真核生物に自生の種々のタンパク質と関連して見られる。
本明細書で使用される“輸出タンパク質”という用語は、シグナル配列を含み、こうして細胞膜と関連して見られ、またはその外部に見られるタンパク質を表す。こうして、分泌タンパク質、細胞膜内タンパク質、表面タンパク質、等が輸出タンパク質のクラスに入る。本明細書で使用される“表面タンパク質”という用語は、例えば、抗体と結合するために、細胞表面で接近可能であるタンパク質を表すことが特に意図されている。
“付着関連タンパク質”は、内皮細胞または肺細胞の如き標的細胞への細菌の付着に直接または間接に関与するタンパク質である。“付着関連タンパク質”という用語は、その他の機能活性、例えば、運動性、シグナル伝達、細胞壁構築、または巨大分子輸送を有し得るタンパク質を含む。“アドヘジン”は付着に直接関与し、こうして別の細胞への付着または接着に或る程度影響する細菌の如き細胞の表面に見られる付着関連タンパク質である。真核細胞への付着を促進し、即ち、細菌毒力に関与するグラム陽性細菌のアドヘジンが本発明に特に重要である。アドヘジンは、付着を促進するのに有効であるために、表面タンパク質であるべきであり、即ち、細胞の表面で接近可能であるべきである。また、接近可能性は抗原性を決定するのに重要である。アドヘジンに対し抗体を誘発するワクチンは、接近可能な抗原決定基に結合し、付着に直接干渉し、こうして感染を防止する抗体を与えることができる。本発明のアドヘジンはアドヘジンのみまたはグラム陽性細菌の付着媒介物質である必要はなく、その用語は付着活性（比較的強いか、または比較的弱いかを問わない）を或る程度示すあらゆるタンパク質を意図している。
“毒力決定基”は感染宿主内の細菌生存に必要とされるあらゆる細菌産物である。こうして、毒力決定基の中和が細菌の毒力を低下し得るので、毒力決定基はまた魅力的なワクチン候補である。
“毒素”は感染宿主を積極的に損傷するあらゆる細菌産物である。こうして、細菌毒素はそれらの毒性を中和するための免疫応答に重要な標的である。
分子が免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体と特異的に相互作用できる場合、それは“抗原性”である。抗原性ポリペプチドは少なくとも約５、好ましくは少なくとも約10のアミノ酸を含む。分子の抗原性部分は抗体またはＴ細胞受容体認識に免疫優性であるその部分であってもよく、またはそれは抗原性部分を免疫感作のためにキャリヤー分子に接合することによりその分子に対し抗体を産生するのに使用される部分であってもよい。抗原性である分子はそれ自体免疫原性である必要はなく、即ち、キャリヤーなしに免疫応答を誘発できる必要はない。
“Ａ”（この場合、“Ａ”は単一タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター、等である）を含む組成物は、組成物中少なくとも約75重量％のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター（Ａ及びＢが属する種のカテゴリーに依存して）が“Ａ”である場合に、実質的に“Ｂ”（この場合、“Ｂ”は一種以上の汚染タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター、等を含む）を含まない。“Ａ”は組成物中Ａ＋Ｂ種の少なくとも約90重量％を構成することが好ましく、少なくとも約99重量％を構成することが最も好ましい。また、実質的に汚染物質を含まない組成物は、関係する種の活性または特性を有する単一の分子量の種のみを含むことが好ましい。
“医薬上許される”という表現は、生理学上寛容性であり、ヒトに投与される時にアレルギー反応または同様の好ましくない反応、例えば、胃の不調、めまい等を生じない分子その物及び組成物を表す。本明細書に使用される“医薬上許される“という用語は、連邦政府または州政府の規制当局により認可され、または米国薬局方もしくは動物、更に特別にはヒトにおける使用に一般に認められているその他の薬局方にリストされていることを意味することが好ましい。“キャリヤー”という用語は、その化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを表す。このような医薬キャリヤーは無菌液体、例えば、水及び石油、動物源、植物源または合成源の油を含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であってもよい。水または食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液が、特に注射液用のキャリヤーとして使用されることが好ましい。
“アジュバント”という用語は抗原に対する免疫応答を増進する化合物または混合物を表す。アジュバントは抗原を徐々に放出する組織デポー剤として利用でき、そしてまた免疫応答を非特異的に増進するリンパ系アクチベーターとして利用できる(Hoodら，Immunology，第２編，1984，ベンジャミン／カミングス：メンロ  パーク，カリフォルニア，384頁）。しばしば、アジュバントの不在下の抗原単独による一次抗原投与は体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発しなであろう。アジュバントとして、完全フロントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG（カルメット・ゲランウシ型結核菌）及びコリネバクテリウム  パルブム(Corynebacterium parvum)が挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントは医薬上許されることが好ましい。
本発明の主たる局面において、本発明はグラム陽性細菌中の輸出タンパク質をコードする遺伝子の同定及び単離に関する。輸出タンパク質は未知の機能または既知の機能のタンパク質であってもよい。本明細書中、全てのこのような輸出タンパク質は、未知の機能または既知の機能を問わないで、“Exp”（exported  proteinにつき）と称され、またこのようなタンパク質をコードする遺伝子が“exp”遺伝子と称される。特に、本発明はグラム陽性細菌付着関連タンパク質、好ましくはアドヘジン、毒力決定基、毒素及び免疫優性抗原をコードする遺伝子の単離を提供する。好ましくは、輸出タンパク質はグラム陽性の種の全ての株に共通の抗原であってもよく、またはそれは細菌の密接に関連する種と同種のタンパク質に抗原的に関連していてもよい。また、本発明は細菌の特別な株に抗原的に特異であるタンパク質の同定を意図している。輸出タンパク質はグラム陽性細菌の種、特にS.ニューモニアエの全ての株に共通のアドヘジンであることが好ましい。
特に、本発明はS.ニューモニアエの種々の輸出タンパク質（下記の表１を参照のこと）に関するものであり、これらの幾つかがアドヘジンとしての活性を示す。特別な実施態様において、本発明は下記の輸出タンパク質の遺伝子フラグメントを提供する。タンパク質のパーミアーゼファミリーに関連することが明らかであり、それ故、驚くことに付着と関連するタンパク質であるExp1（配列番号２）（Plp1と称されるその完全長配列（配列番号47）がまた提供される）（夫々、exp1（配列番号１）及びPlp1（配列番号46）によりコードされる）;exp2（配列番号４）によりコードされるExp2（配列番号３）（その核酸配列はponAと同一であり、これはペニシリン結合タンパク質1A(Martinら，1992, J.Bacteriol. 174:4517-4523)をコードし、かつこれは予期しないことに付着と関連する）; exp3（配列番号５）によりコードされるExp3（配列番号６）（これは付着と関連する）;exp4（配列番号７）によりコードされるExp4（配列番号８）（これは付着と関連する）;exp5（配列番号９）によりコードされるExp5（配列番号10）;exp6（配列番号11）によりコードされるExp6（配列番号12）;exp7（配列番号13）によりコードされるExp7（配列番号14）;exp8（配列番号15）によりコードされるExp8（配列番号16）；exp9（夫々、配列番号17及び19）によりコードされるExp9（夫々、配列番号18及び20）;exp10（配列番号21）によりコードされるExp10（配列番号22）;pad1（配列番号55）によりコードされるPad1（配列番号56）（これはピルベートオキシダーゼ同族体である）。Exp1-9タンパク質が同定された変異体細菌の株表示が表１に開示される。Exp10が同定された変異体の株表示はSPRU25である。また、本件出願人は、AmiAタンパク質をコードするami遺伝子が突然変異された変異体S.ニューモニアエ(SPRU121)を単離し、そしてこれが付着関連タンパク質であること、こうして、このタンパク質がワクチン中に使用されて抗付着関連タンパク質免疫応答を誘発し得ることを最初に実証した。
輸出タンパク質をコードする遺伝子が一旦単離されると、それらは生体内の核酸をベースとするワクチンとして直接使用し得る。また、これらの遺伝子のヌクレオチド配列はグラム陽性細菌の特別な株または種による感染の診断のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のためのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを調製するのに使用し得る。
また、単離された遺伝子によりコードされたタンパク質は発現され、そして輸出タンパク質が得られた細菌の株に対する保護のためのワクチンを調製するのに使用し得る。輸出タンパク質が付着関連タンパク質、例えば、アドヘジンである場合、それは特に魅力的なワクチン候補である。何となれば、免疫が宿主細胞に付着し、こうして感染し、即ち、宿主生物中でコロニーを形成し、生存する細菌の能力に干渉し得るからである。輸出タンパク質が毒力決定基である場合、免疫が毒力に干渉し得る。輸出タンパク質が毒素である場合、免疫が毒素に干渉し得る。輸出タンパク質は細菌の特別な種の全てまたは殆ど全ての株に共通の抗原であることが更に好ましく、こうしてその種の全てまたは殆ど全ての株に対するワクチンの理想的な候補である。特別な実施態様において、細菌の種はS.ニューモニアエである。
また、タンパク質は、以下に詳細に記載されるように、適当な動物を免疫感作してポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するのに使用し得る。このような抗体はイムノアッセイに使用されて細菌の特別な株または種による感染を診断し得る。こうして、株特異性輸出タンパク質はその株による感染の診断のための株特異性抗体を産生するのに使用し得る。また、共通の抗原が細菌のその種による感染の診断のための抗体を調製するのに使用し得る。特別な実施態様において、細菌の種はS.ニューモニアエである。
更に別の実施態様において、Expがアドヘジンである場合、その可溶性タンパク質は感染を患っていると疑われている患者に投与されて細菌の付着を抑制し得る。
輸出タンパク質の遺伝子の単離
本発明は輸出グラム陽性細菌抗原、特に輸出アドヘジンをコードする完全長遺伝子を得るのに使用し得る幾つかの遺伝子フラグメントを提供する。
更に、本発明は細菌から輸出された時にのみ機能性である指示薬タンパク質をコードするベクター、例えば、本明細書に記載されたphoAベクターを使用して輸出ニューモコッカスタンパク質をコードする遺伝子につきスクリーニングする方法を提供する。例えば、phoAのトランケート形態がニューモコッカスシャトルベクター、例えば、ベクターpJDC9(Chen及びMorrison, 1988, Gene 64:155-164)に入れられる。特異な制限部位、例えば、SmaIまたはBamHIを含むクローニング部位がphoAの5'に直ちに配置されて輸出タンパク質をコードし得るＤＮＡの挿入を可能にすることができる。ベクター中のクローニング部位は二つの制限部位により隣接されてインサートの容易な同定を促進することが好ましい。特別な実施態様において、制限部位はKpnI部位であるが、あらゆる制限エンドヌクレアーゼが使用し得る。Expをコードする遺伝子フラグメントは細菌のまわりのブルー染色に基いて選択され、これはphoA酵素の輸出の指標である。exp-phoA融合遺伝子はE.coli中で発現し得るが、プロモーター融合がこの場合に必要とされてもよい。グラム陽性生物のゲノムに組込まれた時、exp-phoA融合遺伝子は重複突然変異誘発に関与する翻訳融合であり、グラム陽性細菌中で発現される。特別な実施態様において、ニューモコッカス輸出タンパク質がこの技術で同定され、これは組込み前にベクター中の内部遺伝子フラグメントのクローニングを必要とする。
更に別の実施態様において、輸出付着関連タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングは、それが通常付着する一次細胞または細胞系へのグラム陽性細菌の付着性の損失につき試験することによりphoA陽性形質転換体につき行い得る。このような付着アッセイはあらゆる真核生物細胞系につき行い得る。好ましくは、ヒトの感染が重要である場合、細胞または細胞系がヒト起源に由来し、または特別な試験管内アッセイにおいてヒト細胞のように挙動することが実証された。好適な細胞及び細胞系として、内皮細胞、肺細胞、白血球、頬細胞、アデノイド細胞、皮膚細胞、結膜細胞、腺毛細胞、及び感染臓器に代表的なその他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。下記の実施例で実証されるように、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)系（これはクロネチクス（サンジエゴ、CA）から入手し得る）が使用し得る。下記の別の実施例において、肺型II肺胞細胞（これは実施例２に記載されたようにして調製でき、または受理番号ATCC A549としてATCCから入手し得る細胞系として得られる）が使用される。また、血液から得られたヒト単球由来マクロファージへの付着が試験し得る。特に、S.ニューモニアエに関するその他の標的細胞は頬内皮細胞の如き口咽頭細胞(Anderssonら，1988, Microb.Pathogen. 4:267-278; 1983, J.Exp.Med. 158:559-570; 1981, Infect.Immun. 32:311-317)である。
一般に、当業界で知られているあらゆる付着アッセイがExpの突然変異誘発のための付着性の損失を実証するのに使用し得る。一つのこのようなアッセイは以下のとおりである。付着性が分析される細胞が４〜８日にわたって培養され(Wright及びSilverstein, 1982, J.Exp.Med. 156:1149-1164)、次いで付着アッセイの24時間前にテラサキ皿に移されて集密単層の形成を可能にする(Geelenら，1993, Infect.Immun. 61:1538-1543)。細菌がフルオレセイン(Geelenらの上記文献)で標識され、5 x 107cfu/mlの濃度に調節され、少なくとも６個のウェルに５μlの容積で添加される。37℃で30分間のインキュベーション後に、プレートが洗浄され、PBS/グルタルアルデヒド2.5％で固定される。付着された細菌が蛍光顕微鏡、例えば、エピフルオレセンスを備えたニコンジアフォト倒立顕微鏡を使用して目視により数えられる。
二つの機構、細胞壁タンパク質及びアドヘジンタンパク質が標的細胞へのグラム陽性細菌、特にS.ニューモニアエの付着性を決定するので、付着を抑制する輸出タンパク質への突然変異が細胞壁合成に関与するタンパク質またはアドヘジンへの突然変異のいずれであるかを区別することが重要であるかもしれない。前者の突然変異は付着に間接的に影響するようであり、一方、後者の突然変異は付着に直接に影響するようである。下記のアッセイが、突然変異タンパク質がアドヘジンであるか否かを区別するのに使用し得る。（1）マクロファージへの付着は主として輸出タンパク質により媒介されるので、マクロファージに関する付着アッセイは、突然変異がアドヘジンへのものであるか否かを直ちに示すであろう。（2）突然変異が付着に間接的に関与するタンパク質へのものである場合、細菌細胞壁が付着アッセイに別々に添加される場合には付着に関して最小の効果があり、またアドヘジンで突然変異された変異体に添加される場合には付着の更なる抑制があるであろう。（3）突然変異が付着に間接的に関与するタンパク質へのものである場合、トリプシンの如きプロテアーゼによる細菌の前処理は付着の更なる抑制を生じるが、突然変異タンパク質がアドヘジンである場合には効果を有しないであろう。（4）完全長exp遺伝子が一旦単離されると、推定アドヘジンがE.coliまたはその他の細胞型中で発現でき、または精製された推定アドヘジンは細菌、赤血球もしくはアガロースビーズの如き異なる担体と共有結合により会合でき、そして介在性付着に対するアドヘジンの能力が評価し得る。（5）突然変異が細胞壁構造に変化を生じたかどうか（これは付着に間接的に関与するタンパク質への突然変異の指標である）を測定するための通常の技術、特にHPLCフィンガープリンティングを使用して、変異体の細胞壁構造を評価し得る。
別の実施態様において、本発明は輸出毒力決定基をコードする遺伝子の同定を提供する。一般に、毒力決定基は、動物モデルにおいて変異体株を毒力につき試験することにより、例えば、その株で感染された動物のLD50の評価により同定し得る。LD50の増加は毒力の損失の指標であり、それ故、毒力に必要とされる遺伝子座で生じた突然変異の指標である。
また、本発明は、細菌の種の全てもしくは多くの株、または細菌の密接に関連する種に共通の抗原であるExpの同定を提供する。これはExp（その調製が以下に詳しく記載される）に特異性の抗体を使用して容易に行われる。その特別な株及びその種の全てまたは多くのその他の株、もしくは密接に関連する種に対する抗体の能力は、Expが共通の抗原であることを実証する。この抗体アッセイが特に好ましい。何となれば、共通の抗原であるExpが魅力的なワクチン候補であるので、それが免疫学上一層妥当であるからである。
一般に、本発明はまた演繹アミノ酸またはヌクレオチド配列の相同性を既知のタンパク質のアミノ酸配列、またはそのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と比較することによるexp遺伝子により生じたタンパク質の機能的性質の同定を提供する。
あらゆるグラム陽性細菌細胞がexp遺伝子の分子クローニングの核酸起源として潜在的に利用できる。核酸配列はストレプトコッカス、バチルス、ミコバクテリウム、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、及びその他のグラム陽性細菌起源、等から単離し得る。そのＤＮＡは化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはゲノムＤＮＡのクローニングにより、クローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー”）、または所望の細胞から精製されたそのフラグメントから当業界で知られている通常の技術により得られてもよい（例えば、Sambrookら、1989の上記文献；Glover, D.M.（編集），1985, DNAクローニング：実用的なアプローチ，MRLプレス社，オクスフォード，U.K.Ｉ巻，II巻を参照のこと）。起源がどのようなものであろうとも、その遺伝子は遺伝子の伝播に適したベクターに分子クローニングされるべきである。
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメントが生成され、その幾つかが所望の遺伝子をコードするであろう。ＤＮＡは種々の制限酵素を使用して特定の部位で開裂されてもよい。また、マンガンの存在下でＤＮＡseを使用してＤＮＡを断片化してもよく、またはＤＮＡは、例えば、音波処理により物理的に剪断し得る。次いで直線状ＤＮＡフラグメントが、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない通常の技術によりサイズに応じて分離し得る。
ＤＮＡフラグメントが一旦生成されると、所望のexp遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグメントの同定が幾つかの方法で行い得る。例えば、或る量のexp遺伝子の一部またはそのフラグメントが入手でき、精製、標識し得る場合、生成されたＤＮＡフラグメントは標識プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングし得る(Benton及びDavis, 1977, Science 196:180; Grunstein及びHogness, 1975, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72:3961)。プローブに対しかなりの相同性を有するこれらのＤＮＡフラグメントがハイブリッドを形成するであろう。本発明はニューモコッカス輸出タンパク質のハイブリダイゼーションプローブとして使用し得るＤＮＡフラグメントの特定の例を提供する。これらのＤＮＡプローブは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19または21に関してベースとし得る。また、本発明のスクリーニング技術はプローブとして使用するための付加的なexp遺伝子フラグメントを単離するのに使用し得る。
また、一つ以上の制限酵素消化及び既知の制限地図（このようなものが利用できる場合）に従って予測されたフラグメントサイズとのフラグメントサイズの比較により適当なフラグメントを同定することが可能である。更なる選択が遺伝子の性質に基いて行い得る。
上記のように、遺伝子の存在はその発現産物の物理的性質、化学的性質、または免疫学的性質に基くアッセイにより検出し得る。例えば、ＤＮＡクローンは、特別なExpにつき知られているような（または、付着関連タンパク質の場合、知られていない）、同様または同一の電気泳動移動度、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、タンパク質分解活性、抗原性、または機能的性質、特に付着活性を有するタンパク質を生じる。下記の特別な実施態様において、付着を媒介するニューモコッカスExpタンパク質の能力が、タンパク質が突然変異される時の付着の抑制により実証される。その他の種、例えば、E.coli中のExpの発現は、expがアドヘジンをコードするか否かを直接に実証し得る。
expゲノムＤＮＡを単離する別法として、Expをコードする既知配列から遺伝子配列それ自体を化学合成することが挙げられるが、これに限定されない。例えば、exp遺伝子のＤＮＡクローニングが変性オリゴヌクレオチドを使用するPCRによりグラム陽性細菌から単離し得る。その他の方法が可能であり、本発明の範囲内である。
次いで、同定され、単離された遺伝子が適当なクローニングベクターに挿入し得る。当業界で知られている多数のベクター−宿主系が使用し得る。可能なベクターとして、プラスミドまたは修飾ウイルスが挙げられるが、これらに限定されないが、ベクター系は使用した宿主細胞と適合性である必要がある。本発明の好ましい局面において、expコード配列がE.coliクローニングベクターに挿入される。ベクターのその他の例として、λ誘導体の如きバクテリオファージ、またはプラスミド、例えば、pBR322誘導体もしくはpUCプラスミド誘導体、例えば、pGEXベクター、pmal-c、pFLAG、等が挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡフラグメントを相補付着末端を有するクローニングベクターにつなぐことにより行い得る。しかしながら、ＤＮＡを断片化するのに使用される相補制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端が酵素により修飾されてもよい。また、所望されるあらゆる部位がヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端につなぐことにより生じ得る。これらのつながれたリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。組換え分子が形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、等により宿主細胞に導入でき、その結果、遺伝子配列の多くのコピーがつくられる。
別法において、所望の遺伝子は“ショットガン”アプローチにおいて好適なクローニングベクター中への挿入後に同定され、単離し得る。例えば、サイズ分別による所望の遺伝子の濃縮がクローニングベクター中への挿入前に行い得る。
特定の実施態様において、単離されたexp遺伝子または合成ＤＮＡ配列をとり込む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換が遺伝子の多重コピーの発生を可能にする。こうして、遺伝子は形質転換体を増殖させ、組換えＤＮＡ分子を形質転換体から単離し、そして必要な場合に、挿入遺伝子を単離された組換えＤＮＡから回収することにより多量に得られてもよい。
また、本発明はExpと同じ機能活性を有するExpの類縁体及び誘導体をコードする遺伝子を含むベクターに関する。Expに関連する誘導体及び類縁体の生産及び使用は本発明の範囲内である。特別な実施態様において、誘導体または類縁体は機能活性であり、即ち、完全長の野生型Expと関連する一つ以上の機能活性を示すことができる。一例として、このような誘導体または類縁体はアドヘジン活性を示す。
特に、Exp誘導体はコード核酸配列を機能上均等な分子を与える置換、付加または欠失により変性することによりつくることができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、exp遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列が本発明の実施に使用し得る。これらとして、配列内の同じアミノ酸残基をコードし、こうしてサイレント変化を生じる異なるコドンの置換により変性されるexp遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されない。同様に、本発明のExp誘導体として、機能上均等なアミノ酸残基が配列中で残基に代えて使用されて保存アミノ酸置換を生じる変性配列を含むExpのアミノ酸配列の全部または一部を一次アミノ酸配列として含む誘導体が挙げられるが、これに限定されない。例えば、配列中の一つ以上のアミノ酸残基が同様の極性の別のアミノ酸により置換でき、これが機能上均等物として作用して、サイレント変化を生じる。配列中のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスのその他の員から選択し得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電された（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電された（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
本発明のExp誘導体及び類縁体をコードする遺伝子は当業界で知られている種々の方法により生産し得る。それらの生産をもたらす操作は遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで行い得る。例えば、クローン化されたexp遺伝子配列は当業界で知られている多数の戦略のいずれかにより修飾し得る(Sambrookら，1989の上記文献）。その配列は一種以上の制限エンドヌクレアーゼで適当な部位で開裂され、続いて所望により更に酵素修飾され、単離され、試験管内で連結し得る。Expの誘導体または類縁体をコードする遺伝子の生産において、修飾遺伝子がexp遺伝子と同じ翻訳読み取り枠内に残り、所望の活性がコードされる遺伝子領域中で翻訳終止シグナルにより中断されないことを確実にするように注意が払われるべきである。
更に、exp核酸配列は試験管内または生体内で突然変異されて翻訳配列、開始配列、及び／または終止配列を生じ、かつ／または破壊し、またはコード領域の変化を生じ、かつ／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、または既存のものを破壊して、更なる試験管内修飾を促進することができる。試験管内の部位誘導突然変異誘発(Hutchinson, C.ら，1978, J.Biol.Chem. 253:6551; Zoller及びSmith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphantら，1986, Gene 44:177; Hutchinsonら，1986, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:710)、TAB（商標）リンカー（ファーマシア）の使用、等を含むが、これらに限定されない、当業界で知られている突然変異誘発のあらゆる技術が使用し得る。PCR技術が部位誘導突然変異誘発に好ましい(Higuchi, 1989, “ＤＮＡを操作するためのPCRの使用”，PCR技術：ＤＮＡ増幅の原理及び応用，H.Erlich編集，ストックトン  プレス，６章，61-70頁を参照のこと）。
輸出タンパク質の発現
Exp、またはその機能活性フラグメントもしくはその他の誘導体をコードする遺伝子が適当な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入し得る。また、発現ベクターは複製開始点を含むことが好ましい。また、必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは自生exp遺伝子及び／またはその隣接領域により供給し得る。種々の宿主−ベクター系がタンパク質コード配列を発現するのに使用し得る。しかしながら、細菌発現系が天然コンホメーションの更に高い可能性を有するタンパク質の高レベルの発現を与えるのに使用される。潜在的な宿主−ベクター系として、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、等）で感染された哺乳類細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母の如き微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素はそれらの強さ及び特異性において変化する。使用される宿主−ベクター系に応じて、幾つかの適当な転写要素及び翻訳要素のいずれか一つが使用し得る。
Exp（シグナル配列を含む）のペリプラズム形態が、エシェリキア  コリ  ペリプラズムへのタンパク質の輸出のために、またはバチルス  スブチリスをベースとする発現系中で生産されることが好ましい。ペリプラズムへの輸出は発現されたタンパク質の適当な折りたたみを促進し得る。
ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入につき前記された方法のいずれかが適当な転写／翻訳調節配列及びタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するのに使用し得る。これらの方法として、試験管内の組換えＤＮＡ技術及び合成技術並びに生体内組換え（遺伝子組換え）が挙げられる。
輸出タンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、第二核酸配列により調節されてもよく、その結果、輸出タンパク質またはペプチドが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現される。例えば、輸出タンパク質の発現は当業界で知られているプロモーター／エンハンサー要素により調節し得るが、これらの調節要素は発現に選ばれた宿主中で機能性である必要がある。細菌中の発現につき、細菌プロモーターが必要とされる。exp遺伝子を含むベクターが一時的な発現のために被験者に直接注射される場合には、組織特異性プロモーターを含む、真核ウイルスプロモーターまたは真核生物プロモーターが好ましく、以下に詳しく記載されるように、細菌感染に対する異種の保護をもたらす。exp遺伝子発現を調節するのに使用し得るプロモーターとして、SV40早期プロモーター領域(Benoist及びChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端リピート中に含まれたプロモーター(Yamamotoら，1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら，1981, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら，1982, Nature 296:39-42)、β−ラクタマーゼプロモーターの如き原核生物発現ベクター(Villa-Kamaroffら，1978, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75:3727-3731)、またはtacプロモーター(DeBoerら，1983, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80:21-25)；また、“組換え細菌からの有益なタンパク質”Scientific American, 1980, 242:74-94を参照のこと；及び下記の動物転写調節領域（これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物中で使用された）：膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域(Swiftら，1984, Cell 38:639-646; Ornitzら，1986, Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)、膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子調節領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedlら，1984, Cell 38:647-658; Adamesら，1985, Nature 318:533-538; Alexanderら，1987, Mol.Cell.Biol. 7:1436-1444)、精巣細胞、乳房細胞、リンパ細胞及びマスト細胞中で活性であるマウス乳腫瘍ウイルス調節領域(Lederら，1986, Cell 45:485-495)、肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkertら，1987, Genes and Devel, 1:268-276)、肝臓中で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子調節領域(Krumlaufら，1985, Mol.Cell.Biol. 5:1639-1648; Hammerら，1987, Science 235:53-58)、肝臓中で活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域(Kelseyら，1987, Genes and Devel. 1:161-171)、ミエロイド細胞中で活性であるβ−グロビン遺伝子調節領域(Mogramら，1985, Nature 315:338-340; Kolliasら，1986, Cell 46:89-94)、脳中の乏突起神経膠細胞中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readheadら，1987, Cell 48:703-712)、骨格筋中で活性であるミオシンＬ鎖−２遺伝子調節領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)、及び視床下部中で活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域(Masonら，1986, Science 234:1372-1378)が挙げられるが、これらに限定されない。
exp遺伝子インサートを含む発現ベクターは４つの一般的なアプローチ：（a）所望のプラスミドＤＮＡまたは特定のｍＲＮＡのPCR増幅、（b）核酸ハイブリダイゼーション、（c）“マーカー”遺伝子機能の存在または不在、及び（d）挿入配列の発現により同定し得る。第一のアプローチにおいて、核酸はラジオヌクレオチドのとり込みによるPCRにより増幅され、または臭化エチジウムで染色されて増幅産物の検出を与え得る。第二のアプローチにおいて、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は挿入exp遺伝子に相同である配列を含むプローブを使用して核酸ハイブリダイゼーションにより検出し得る。第三のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系がベクター中の外来遺伝子の挿入により生じた或る“マーカー”遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、PhoA活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の咬合体形成、等）の存在または不在に基いて同定され、選択し得る。exp遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入される場合、expインサートを含む組換え体がマーカー遺伝子機能の不在により同定し得る。第四のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは組換え体により発現されたexp遺伝子産物の活性につき分析することにより同定し得る。このようなアッセイは、例えば、試験管内アッセイ系におけるexp遺伝子産物の物理的性質または機能的性質、例えば、標的細胞への付着または輸出タンパク質の抗体による結合を基礎とし得る。
適当な宿主系及び増殖条件が一旦確立されると、組換え発現ベクターが所定の量で増殖、調製し得る。先に説明されたように、使用し得る発現ベクターとして、下記のベクターまたはそれらの誘導体：ヒトまたは動物ウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えば、バキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、λ）、並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター、等の二三のものが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの選択は、例えば、原核生物細胞もしくは真核生物細胞中のタンパク質の発現のため、または核酸をベースとするワクチンとしてのベクターの所望の使用に依存するであろう。
加えて、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾し、処理する宿主細胞株が選択し得る。或るプロモーターからの発現が或るインデューサーの存在下で高められ得る。こうして、遺伝子操作された輸出タンパク質の発現が調節し得る。更に、異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳及び後翻訳のプロセシング及び修飾（例えば、シグナル配列の開裂）に特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞系または宿主系が発現された外来タンパク質の所望の修飾及びプロセシングを確実にするように選択し得る。異なるベクター／宿主発現系は異なる程度にタンパク質分解開裂の如きプロセシング反応に影響し得る。
輸出タンパク質の抗体の調製
本発明によれば、組換えExp、及びそのフラグメントまたはその他の誘導体もしくは類縁体、或いは以上のものを発現する細胞が免疫原として使用されてExpを認識する抗体を産生し得る。このような抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
当業界で知られている種々の操作が組換えExpまたはその誘導体もしくは類縁体のポリクローナル抗体の産生に使用し得る。抗体の産生につき、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、等が挙げられるが、これらに限定されない）が、組換えExp、またはその誘導体（例えば、フラグメント）による注射により免疫感作し得る。一つの実施態様において、組換えExpまたはそのフラグメントが免疫原キャリヤー、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に接合し得る。種々のアジュバント（フロイント（完全及び不完全）、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG（カルメット・ゲランウシ型結核菌）及びコリネバクテリウム  パルブムが挙げられるが、これらに限定されない）が宿主種に応じて免疫応答を増大するのに使用し得る。
Expまたはその類縁体に対して誘導されるモノクローナル抗体の調製につき、培養中の連続細胞系による抗体の産生を与えるあらゆる技術が使用し得る。これらとして、Kohler及びMilstein(1975, Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983, Immunology Today 4:72)、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，モノクローナル抗体及び癌療法，アランR.リス社，77-96頁）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の付加的な実施態様において、モノクローナル抗体が最近の技術(PCT/US 90/02545)を使用して無胚芽動物中で産生し得る。本発明によれば、ヒト抗体が使用されてもよく、ヒトハイブリドーマ(Coteら，1983, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80:2026-2030)を使用することにより、またはヒトＢ細胞を試験管内でEBVウイルスで形質転換することにより(Coleら，1985，モノクローナル抗体及び癌療法，アランR.リス社，77-96頁）得られる。実際に、本発明によれば、適当な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にExpに特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる“キメラ抗体”の産生のために開発された技術(Morrisonら，1984, J.Bacteriol. 159-870; Neubergerら，1984, Nature 312:604-608; Takedaら，1985, Nature 314:452-454)が使用し得る。このような抗体は本発明の範囲内である。このようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体が受動免疫療法（以下に記載される）に使用するのに好ましい。何となれば、ヒト抗体またはヒト化抗体は異種抗体よりも免疫応答、特にアレルギー反応をそれ自体で誘発しそうもないからである。
本発明によれば、一本鎖抗体の産生につき記載された技術（米国特許第4,946,778号）がExp特異性一本鎖抗体を産生するのに採用し得る。本発明の付加的な実施態様はFab発現ライブラリーの構築につき記載された技術(Huseら，1989, Science 246:1275-1281)を使用してExpまたはその誘導体、もしくは類縁体に対し所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の技術により産生し得る。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により産生し得るF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより産生し得るFab'フラグメント、及び抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより産生し得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは当業界で知られている技術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えば、コロイド金標識、酵素標識または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ、等により行い得る。一つの実施態様において、抗体結合が一次抗体で標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、一次抗体が一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。更に別の実施態様において、二次抗体が標識される。結合をイムノアッセイで検出するための多くの手段が当業界で知られており、本発明の範囲内である。例えば、Expの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含むExpフラグメントに結合する産生物につき生じたハイブリドーマを分析し得る。細菌の特別な株からのExpに特異性の抗体の選択につき、細菌のその特別な株へのポジチブな結合及びExpの別の株への結合の欠如に基いて選択し得る。特別な細菌の全てまたは多くの株、または細菌の密接に関連した種に共通の抗原であるExpに特異性の抗体を選択するために、その特別な株そしてその種の全てまたは多くの株、または密接に関連した種への結合に基いて選択し得る。
以上の抗体が、Expの局在化及び活性に関して当業界で知られている方法、例えば、ウェスタンブロッティング、Expの画像形成、適当な生理学的試料中のそのレベルを測定すること、等に使用し得る。
予防接種及び受動免疫療法
グラム陽性細胞に対し活性な免疫は、免疫原量の輸出タンパク質、またはその抗原性誘導体もしくはフラグメント、及びアジュバントによる免疫感作（予防接種）により誘発でき、この場合、輸出タンパク質、またはその抗原性誘導体もしくはフラグメントはワクチンの抗原成分である。タンパク質はグラム陽性細菌の一種以上の種の一つ以上の炭水化物カプセルに接合されることが好ましい。炭水化物へのタンパク質の共有結合接合は当業界で公知である。一般に、接合はカルボジイミド縮合反応により進行し得る。
輸出タンパク質単独、または一つ以上のカプセルに接合された輸出タンパク質は、細菌感染を生じることができず、また本発明のタンパク質による予防接種により誘発された活性免疫は即時の免疫応答及び免疫記憶の両方をもたらすことができ、こうして細菌による感染に対し長期の保護を与えることができる。本発明の輸出タンパク質、またはその抗原性フラグメントは、アジュバントと混合して調製されてワクチンを調製し得る。ワクチンの抗原成分として使用される輸出タンパク質、またはその誘導体もしくはフラグメントはアドヘジンであることが好ましい。ワクチンの抗原成分として使用される輸出タンパク質、またはその誘導体もしくはフラグメントは、グラム陽性細菌の種の全てまたは多くの株に共通の抗原、または細菌の密接に関連する種に共通の抗原であることが更に好ましい。ワクチンの抗原成分は共通の抗原であるアドヘジンであることが最も好ましい。
アジュバントの選択は予防接種すべき被験者に依存する。医薬上許されるアジュバントが使用されることが好ましい。例えば、ヒト用のワクチンは、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントを含む、油または炭化水素エマルジョンアジュバントを避けるべきである。ヒト用に適したアジュバントの一例はミョウバン（アルミナゲル）である。しかしながら、動物用ワクチンはヒト用に適しないアジュバントを含んでいてもよい。
抗原及びアジュバントを含む従来のワクチンの別型は、被験者の組織の細胞による抗原の発現のために被験者の組織中への抗原をコードするＤＮＡの直接の生体内導入を伴う。このようなワクチンが本明細書中“核酸をベースとするワクチン”と称される。exp遺伝子は定義によりシグナル配列を含むので、組織の細胞中の遺伝子の発現は輸出タンパク質の膜関連の分泌をもたらす。また、発現ベクターが操作されてexpシグナル配列に代えて自己シグナル配列を含むことができる。例えば、裸のＤＮＡベクター（例えば、Ulmerら，1993, Science 259:1745-1749を参照のこと）、ＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Wuら，1992, J.Biol.Chem. 267:963-967; Wu及びWu, 1988, J.Biol.Chem. 263:14621-14624; Hartmutら，カナダ特許出願第2,012,311号（1990年３月13日に出願)）、または所望のexp遺伝子を含むウイルスベクターが組織中に注射し得る。好適なウイルスベクターとして、アンフォトロピック(amphotropic)宿主範囲で細胞中にパッケージされるレトロウイルス(Miller, 1990, Human Gene Ther. 1:5-14; Ausubelら，分子生物学における現行のプロトコル，§９を参照のこと）、及び弱毒化または欠損ＤＮＡウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)（例えば、Kaplittら，1991, Molec.Cell.Neurosci. 2:320-330を参照のこと）、乳頭腫ウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、アデノウイルス（例えば、Stratford- Perricaudetら，1992, J.Clin.Invest. 90:626-630を参照のこと）、アデノ関連性ウイルス(AVV)（例えば、Samulskiら，1987, J.Virol. 61:3096-3101; Samulskiら，1989, J.Virol. 63:3822-3828を参照のこと）、等が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス遺伝子を完全に、またはほぼ完全に欠いている欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後に感性性ではない。
本発明の核酸をベースとするワクチンを含むベクターが、当業界で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Wuら，1992, J.Biol.Chem. 267:963-967; Wu及びWu，1988, J.Biol.Chem. 263:14621-14624; Hartmutら，カナダ特許出願第2,012,311号（1990年３月15日に出願）を参照のこと）により所望の宿主に導入し得る。
本発明のワクチン、即ち、Exp抗原またはその抗原性誘導体もしくはフラグメントを含むワクチン、またはexp核酸ワクチンは、筋肉内、腹腔内、静脈内、等を含むが、これらに限定されない非経口経路により投与し得る。予防接種の所望の結果は抗原、それにより病因生物に対する免疫応答を解明することであるので、リンパ組織、例えば、リンパ節または脾臓への直接の投与、またはウイルスベクターのターゲッティングもしくは選択による間接の投与が行われることが好ましい。免疫細胞が絶えず複製しているので、それらはレトロウイルスをベースとする核酸ワクチンに理想的な標的である。何となれば、レトロウイルスは細胞を複製することを必要とするからである。
受動免疫は、抗血清、ポリクローナル抗体、またはグラム陽性細菌の中和モノクローナル抗体を患者に投与することによりグラム陽性細菌による感染を患うことが疑われている動物に与えられ得る。受動免疫は長期の保護を与えないが、それは予防接種されなかった被験者の細菌感染の治療に有益な手段であり得る。受動免疫はグラム陽性細菌の抗生物質耐性株の措置に特に重要である。何となれば、その他の療法が利用できないからである。受動免疫療法のために投与される抗体は自己抗体であることが好ましい。例えば、被験者がヒトである場合、抗体に対する免疫応答の可能性を最小にするために、抗体はヒト起源のものであり、または“ヒト化”されたものであることが好ましい。
受動免疫と同様の療法は、その標的細胞への細菌の付着を抑制するのに充分な量の輸出タンパク質アドヘジンの投与である。必要とされる量は通常の技術を使用して当業者により決定し得る。
本発明の活性ワクチンまたは受動ワクチン、またはアドヘジンの投与はグラム陽性細菌の感染から動物被験者を保護するのに使用し得る。こうして、本発明のワクチンは、鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、及びペット、哺乳類、好ましくはヒトに使用し得るが、本発明のワクチンは家畜動物（イヌ及びネコ）、牧畜動物（ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、等）、げっ歯類、及び家畜化されていない動物を含むが、これらに限定されないその他の哺乳類種における使用につき意図されている。
グラム陽性細菌感染の診断
グラム陽性からの輸出タンパク質に対し産生し得る本発明の抗体は、グラム陽性微生物による感染の診断に有益な試薬である。現在、グラム陽性細菌による感染の診断は困難である。本発明によれば、グラム陽性細菌による感染を有していると疑われている被験者からの試料中のグラム陽性細菌の存在は、試料中または試料からの細菌への輸出タンパク質の抗体の結合を検出することにより検出し得る。本発明の一つの局面において、抗体は特異な株または細菌の限られた数の種に特異性であり、こうしてその特別な一種以上の株による感染の診断を可能にし得る。また、抗体は細菌の多くの株または全ての種に特異性であり、こうしてその種による感染の診断を可能にし得る。
グラム陽性細菌による感染の診断は、所望に応じて、当業界で知られているあらゆるイムノアッセイフォーマットを使用し得る。多くの可能なイムノアッセイフォーマットが“輸出タンパク質の抗体の調製”と題する項目に記載される。抗体は、例えば、酵素、蛍光体、発色団、放射性同位元素、色素、コロイド金、ラテックス粒子、及びケミルミネセンス剤の如き標識で試験管内検出のために標識し得る。また、抗体は、例えば、放射性同位元素（好ましくは、テクネチウムまたはヨウ素）、磁気共鳴シフト試薬（例えば、ガドリニウム及びマンガン）、または放射線不透過試薬で生体内検出のために標識し得る。
また、本発明の核酸及びその配列はグラム陽性細菌による感染の診断に使用し得る。例えば、exp遺伝子またはそのハイブリダイゼーション可能なフラグメントはグラム陽性細菌による感染を潜伏していると疑われた被験者からの試料とのin situハイブリダイゼーションに使用し得る。別の実施態様において、グラム陽性細菌の特定の遺伝子セグメントが本発明のexp遺伝子をベースとするプローブを用いてPCR増幅を使用して同定し得る。本発明の一つの局面において、プローブまたはPCRプライマーによるハイブリダイゼーションはストリンジェント条件下で、または特異な株もしくはその細菌の限られた数の株、またはその両方に特異性の配列を用いて行うことができ、こうして特別な一種以上の株による感染の診断を可能にする。また、ハイブリダイゼーションはそれ程ストリンジェントではない条件下で行うことができ、またはその配列は細菌のいずれかまたは全部の株中で相同性であってもよく、こうしてその種による感染の診断を可能にする。
本発明が、その開発及び実証において従われた構築及び操作の詳細を示す下記の例示の記載に鑑みて更に良く理解されるであろう。
実施例１：ストレプトコッカス  ニューモニアエ中の輸出タンパク質の遺伝子同定
ストレプトコッカス  ニューモニアエ中の輸出タンパク質を突然変異し、遺伝子同定するための戦略を開発した。突然変異誘発の技術をphoAへの遺伝子融合とカップリングさせて、本発明者らはS.ニューモニアエからの輸出タンパク質の突然変異及び遺伝子同定のための手段を開発した。ベクターをつくり、アルカリ性ホスファターゼ(PhoA)への翻訳遺伝子融合につきエシェリキア  コリ及びS.ニューモニアエ中のニューモコッカスＤＮＡをスクリーニングするのに使用した。この研究において、輸出タンパク質をコードする幾つかの遺伝子座の同定を報告する。原核生物からのその他の遺伝子から誘導された配列との類似性により、これらの遺伝子座はシグナル伝達、巨大分子輸送及び構築に役割を果たし、細胞内の化学浸透圧バランス及び栄養獲得を維持するタンパク質をおそらくコードする。
25種のPhoA+ニューモコッカス変異体を単離し、これらの変異体の８種からの遺伝子座は既知の輸出タンパク質または膜関連タンパク質との類似性を示した。同族体は、１］タンパク質依存性ペプチドパーミアーゼ、２］ペニシリン結合タンパク質、３］Clpプロテアーゼ、４］２成分センサーレギュレーター、５］ホスホエノールピルベート：炭水化物ホスホトランスフェラーゼパーミアーゼ、６］膜関連デヒドロゲナーゼ、７］Ｐ型（E1E2型）カチオン輸送ATPase、８］細菌毒素のRTXクラスのトランスロケーションを担うABCトランスポーターであることがわかった。予期しないことに、一種のPhoA+変異体はATP依存性ＲＮＡヘリカーゼのD-E-A-Dタンパク質ファミリーの員への融合を含んでおり、これらのタンパク質の輸出を示唆する。
物質及び方法
株及び培地
これらの研究に使用したS.ニューモニアエの親株はR6xであり、これはカプセル化されなかったロックフェラー大学の株R36A(Tiraby及びFox, 1973, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 70:3541-3545)の誘導体である。使用したE.coli株はDH5α（これはF-f80dlacZΔ(lacZYA ΔM15)lacU169 recA1 endA1 hsdR17(r K-m k+)supE44 1-thy-1 gyrA reLA1（ベセスダ  リサーチ  ラボラトリーズ）である）；CC118（これはΔ(ara leu)7697 ΔlacX74 araD139 phoA20 galE galK thi rpsE rpoB argE recA1(Manoil及びBeckwith, 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:8129-8133)である）；S1179（これはF-ΔlacU169 dam3 rpsL（Brown, 1987, Cell. 49:825-33）である）；及びJCB607（これはDsbA（rna met pBJ41 pMS 421）の生産のための発現ベクターを含む）（Bardwellら，1991, Cell. 67:581-589）であった。S.ニューモニアエの株及びこの研究において生じたそれらの関係する特性を表１にリストする。
0003722834.tif 000003
0003722834.tif 000004
誘導アミノ酸配列をPhoA+変異体から回収したプラスミドから決定した。
タンパク質データベースをBLASTアルゴリズムで検索することにより同族体を同定した。整列につき図５を参照のこと。
S.ニューモニアエをヒツジ血液(TSAB)で３％（容積／容積）の最終濃度まで補給したトリプシン大豆寒天でルーチンで塗布した。また、培養物を酵母エキスで補給した液体半合成カゼイン加水分解産物培地(C+Y培地)(Lacks及びHotchkiss, 1960, Biochem.Biophys.Acta. 39:508-517)中で増殖させた。或る場合には、S.ニューモニアエを酵母で５％(w/v)の最終濃度まで補給したトッド  ヘウィットブロース（THBY)中で増殖させた。示される場合、S.ニューモニアエを600μMの濃度のジスルフィド酸化剤２−ヒドロキシエチルジスルフィド（これは増殖に必要とされる最小阻止濃度の５倍未満である）の存在下でC+Y中で増殖させた。E.coliを液体培地または固体ルリアーベルタニ(LB)培地中で増殖させた。プラスミドベクターによるE.coliの選択を500μg/mlの濃度のエリスロマイシン(erm)で行った。染色体に組込まれたプラスミドを含むS.ニューモニアエの選択及び管理につき、細菌を0.5〜１μg/mlのermの存在下で増殖させた。
S.ニューモニアエの形質転換を以下のようにして行った。細菌を37℃でC+Y培地中で増殖させ、試料を0.07〜0.15のO.D.620で10分間隔で除去し、10％のグリセロール中で-70℃で貯蔵した。試料を氷の上で解凍し、ＤＮＡ（最終濃度、１μg/ml）を添加し、その後37℃で90分間インキュベートした。形質転換体を適当な抗生物質を含むTSABによる選択により同定した。
組換えＤＮＡ技術
プラスミドpHRM100及びpHRM104（図１）をpJCD9（Chen及びMorrison, 1988, Gene, 64:155-164）中の相当する部位へのpPH07の2.6kBのSmaIフラグメントまたはBamHIフラグメント（これらはphoAのトランケート遺伝子を含む）（Guitierrez及びDevedjian, 1989, Nacleic Acid Res. 17:3999）の挿入により構築した。phoAから上流のpHRM100に特異なSmaIクローニング部位及びpHRM104に特異なBamHIクローニング部位を重複部位の選択的欠失により生じた。
S.ニューモニアエからの染色体ＤＮＡを下記の操作により調製した。細胞を0.5μg/mlのermを含む10mlのTHBYまたはC+Y中で0.7のO.D.620まで増殖させた。細胞を遠心分離により単離し、500μlのTES（0.1Mのトリス-HCl、pH7.5;0.15MのNaCl、0.1Mのエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)）中で１回洗浄した。上澄みを捨て、ペレットを新しいTES500μl中で再度懸濁させた。細菌を１％（容積／容積）のデオキシコレート50μlの添加により溶解した。溶解産物を37℃で10分間にわたってRNase(2μg)そしてプロナーゼ(400ng)と共に連続してインキュベートした。この溶液を等容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)で３回抽出し、続いて等容積のクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1)で１回抽出した。ＤＮＡを２倍容の冷エタノールの添加により沈殿させ、70％のエタノールで１回洗浄し、10mMのトリス-HCl、pH8.0、1mMのEDTA中に再度懸濁させた。或る場合には、細菌400mlに適合するようにこのプロトコルを調節した。
ニューモコッカスＤＮＡを含むプラスミドライブラリーをS.ニューモニアエ中の挿入重複突然変異誘発のためにE.coli中のpHRM100及びpHRM104でつくった。S.ニューモニアエからの染色体ＤＮＡを18時間にわたってAluIもしくはRsaIで消化し、または1.5時間にわたってSauIIIaで消化した。このＤＮＡを0.7％のアガロースゲルでサイズ分別し、400〜600塩基対フラグメントを抽出し、ガラスビーズ(BIO 101社、ラ  ジョラ、CA)を用いて製造業者の指示に従って精製した。ＤＮＡをインサート対ベクターの比6:1で４℃で18時間にわたって夫々pHRM100またはpHRM104のSmaI部位またはBamHI部位につないだ。連結混合物をE.coli株S1179またはPhoA-株CC118に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、キアゲンミジ  プラスミド調製系（キアゲン社、チャツワース、CA）を製造業者の指示に従って使用してこれらのライブラリーから得た。
S.ニューモニアエ中の突然変異誘発戦略はプラスミド組込み後にインサート重複を伴った（図1b）。この重複のために、ニューモコッカスＤＮＡの染色体製剤を汚染したそのインサートを含む組込みプラスミドの低頻度の切除があった。それ故、ニューモコッカスインサートを含む組込みプラスミドをコンピテントE.coliへのこれらの切除されたプラスミドの直接の形質転換によりS.ニューモニアエから容易に回収した。
phoAとamiAの遺伝子融合を生じるために、amiAの600塩基対フラグメントを正プライマー及び逆プライマー：
5'AAAGGATCCATGAARAARAAYMGHGTNTTY3'（配列番号40）
及び
5'TTTGGATCCGTTGGTTTAGCAAAATCGCTT3'（配列番号41）
（式中、R=A/G、Y=T/C、M=C/A、H=T/C/AかつN=G/A/T/C）
を夫々使用してS.ニューモニアエからの染色体ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応により得た。ＤＮＡの増幅を、染色体ＤＮＡ50ng、２mMの正プライマー、１mMの逆プライマー及び2.5UのAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ（パーキン  エルマー、ノーウォーク、CT）、dNTP並びに製造業者により提供された緩衝液を用いて行った。増幅（30ラウンド）を、下記の操作を使用して行った。変性につき94℃で１分間、伸長につき75℃で２分間、そして更アニーリングにつき45℃で１分間。600塩基対フラグメントを得、BamHIで消化し、pHRM104の相当する部位につないだ。この混合物をE.coliに形質転換し、インサートを含むベクターを含む単一組換えクローンを同定した。融合接合部を横切るインフレームコード配列を配列分析により確認した。このクローンからのプラスミドＤＮＡをS.ニューモニアエに形質転換し、形質転換体をコロニーリフトアッセイによりPhoA活性につきスクリーニングして融合タンパク質の生産及び輸出を確認した。
ＤＮＡ配列決定
オリゴヌクレオチド(5'AATATCGCCCTGAGC3'（配列番号42）、及び5'ATCACGCAGAGCGGCAG3'（配列番号43）)をpHRM100及びpHRM104へのニューモコッカスインサートの融合接合部にわたる配列決定のために設計した。二本鎖配列分析を、シーケナーゼ  バージョン2.0DNA配列決定キット（米国バイオケミカル社、クレーブランド、オハイオ）を製造業者の指示に従って使用してジデオキシ連鎖終結方法(Sangerら，1977, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74:5463-5467)によりプラスミドＤＮＡに対し行った。ジメチルスルホキシド（１％容積／容積）をアニーリング工程及び伸長工程に添加した。
アルカリ性ホスファターゼ活性
アルカリ性ホスファターゼが幾つかのグラム陽性生物、例えば、エンテロコッカス  ファエカリス（Rothschildら，1991，“ストレプトコッカス、ラクトコッカス、及びエンテロコッカスの遺伝学及び分子生物学”，Dunnyら，微生物学のワシントンD.C.米国協会，45-48頁）及びB.スブチリス(Chesnutら，1991, Mol.Microbiol.5:2181-90; Hulettら，1991, J.Biol.Chem. 266:1077-84; Sugaharaら，1991, J.Bacteriol. 173-1824-6)において特性決定されていたとしても、S.ニューモニアエ中のこの酵素につき何も知られていない。S.ニューモニアエの親株と関連するPhoA活性を以下に記載されるアッセイにおいて色素産生基質で測定し、公称の結果を得た。それ故、S.ニューモニアエ中の融合タンパク質の発現によるPhoA活性の検出を低バックグラウンドまたはネガチブバックグラウンドで行った。
E.coli中のニューモコッカス誘導PhoA融合をスクリーニングするために、プラスミドライブラリーをPhoA-株CC118中でスクリーニングした。形質転換体を色素産生基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート(XP)40〜80μg/miで補充したLB培地に塗布した。青色コロニーが15〜24時間で発生し、PhoA活性を示した。個々のコロニーを新しいLB/XPプレートでストリーク精製して青色表現型を確認した。
S.ニューモニアエのPhoA+変異体をスクリーニングするために、個々のコロニーを既に記載された操作(Knapp及びMekalanos, 1988, J.Bacteriol. 170:5059-5066)に適したXPを用いてコロニーリフトアッセイにおいてスクリーニングした。個々の２日目の古いコロニーをニトロセルロースフィルター(HAHY、ミリポア、ベッドフォード、MA)に移し、２〜５分間空気乾燥させた。フィルターをNo.3濾紙（ワットマン社、クリフトン、NJ）の上にコロニー面を上にして置き、0.14MのNaCl中で予備ソーキングし、37℃で10分間インキュベートした。これを１回繰り返し、次いで膜を1Mのトリス-HCl、pH8.0中で予備ソーキングした新しい濾紙に移し、37℃で10分間インキュベートした。最後に、膜を200μg/mlのXPと共に1Mのトリス-HCl、pH8.0中で予備ソーキングした新しい濾紙に移し、37℃でインキュベートした。青色コロニーはPhoA+変異体を示し、10分間〜18時間で検出された。コロニーをフィルターから直接に、または最初のプレートから採取した。コロニーをTSABプレートでストリーク精製した後、青色表現型をその後のコロニーリフトアッセイにおいて再度確認した。
S.ニューモニアエの株中で発現されたPhoA活性を指数増殖培養物から測定した。培養物10mlからの細菌を遠心分離により単離し、食塩水中で１回洗浄し、１Mのトリス-HCl、pH8.0 １ml中で再度懸濁させた。活性を既に記載されたアッセイ(Brickman及びBeckwith, 1975, Mol.Biol. 96:307-316; Guitierrezら，1987, J.Mol.Biol. 195:289-297）においてｐ−ニトロフェノールホスフェートの加水分解により測定した。全タンパク質をクーマシーブルー色素(Bradford, 1976, Anal.Biochem.72:248-254)で溶解細菌につき測定した。
DsbAの精製
DsbAを、相当する遺伝子(Bardwellら，1991, Cell. 67:581-589)を含む発現ベクターを含むE.coli株(JCB607)からほぼ均一になるまで精製した。簡単に言えば、新しい一夜培養物２mlをLB培地400mlに添加し、37℃で２時間増殖させた。培養物を３mMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)に調節し、更に２時間増殖させた。細菌を遠心分離により単離し、６mlの100mMのトリス-HCl、pH7.6、５mMのEDTA及び0.5Mの蔗糖中で再度懸濁させた。この懸濁液を氷の上で10分間インキュベートし、細胞を遠心分離により単離した。細菌を６mLの５mMのMgCl2中で再度懸濁させ、氷の上で10分間インキュベートした。上澄みを遠心分離後に単離した。この物質はSDSポリアクリルアミドゲルで21kDaの見掛けMrを有する主要なクーマシーブルー染色バンドを含み、これはDsbAのバンドと同一であり、約95％の純度であると判断した（データは示されない）。
細胞下の分別
ニューモコッカスを既に記載された技術(Hakenbeckら，1986，抗菌剤及び化学療法30:553-558)の改良により細胞下のフラクションに分離した。簡単に言えば、細菌をC+Y培地10ml中で0.6のO.D.620まで増殖させ、17,000xgで10分間の遠心分離により単離した。細胞ペレットを250μlのTEP（25mMのトリス-HCl、pH8.0、１mMのEDTA、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド）中で再度懸濁させた。懸濁液を15秒間のバーストで合計４分間音波処理した。細菌の99％より多くが、目視検査により明らかにされたように破壊された。細胞デブリを遠心分離(17,000xgで10分間)により除去した。細菌膜及び細胞質内容物をベックマンエアーフュージ中で98,000xgで４時間にわたって遠心分離により分離した。この最終工程からの上澄みは細胞質フラクションを含み、一方、ペレットは細菌膜を含んでいた。夫々のフラクションからの試料をタンパク質含量につき評価し、その後のゲル電気泳動のためにSDS試料中に溶解した。
融合タンパク質の免疫学的検出
全細菌溶解産物及び細胞下のフラクションをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、タンパク質をファストシステム（ファーマシアLKB、アップスラ  スウェーデン）を製造業者の指示に従って使用してニトロセルロース膜（イモビロン、ミリポア、ベッドフォード、MA）に移した。膜を1:1000の希釈でポリクローナル抗PhoA抗体（５プライム−３プライム、ボウルダー、CO）で、1:1000の希釈でペルオキシダーゼ接合二次抗体で探査した。免疫反応性バンドを過酸化水素及びジアミノベンジジンまたはアメーシャム（アーリントン  ハイツ、IL）から購入した薬品による増進ケミルミネセンスにより検出した。
結果及び検討
リポータープラスミド及びニューモコッカスライブラリーの構築
S.ニューモニアエ中の輸出タンパク質につき挿入重複突然変異誘発により遺伝子スクリーニングするために、phoAのトランケート形態(Guitierrez及びDevedjian, 1989, Nucleic Acid Res. 17:3999)をニューモコッカスシャトルベクターpJDC9(図1a)(Chen及びMorrison, 1988, Gene. 64:155:164)に入れた。２種のベクターをphoAへの特異なSmaI(pHRM100)または特異なBamHI(pHRM104)クローニング部位5'でつくった。夫々のベクター中のクローニング部位はインサートの容易な同定を促進するための二つのKpnI部位により隣接されている。
有効な挿入重複突然変異誘発は組込みの前にベクター中の内部遺伝子フラグメントのクローニングを必要とする（図1b）。それ故、プラスミドライブラリーをニューモコッカスＤＮＡの400〜600塩基対インサートでE.coli中でつくった。約2,600の個々のクローンに相当する幾つかのライブラリーをE.coliまたはS.ニューモニアエ中のphoAへの翻訳融合につきスクリーニングした。
E.coli中のニューモコッカスphoA融合の同定
1,100の独立クローンに相当するニューモコッカスライブラリーをPhoA- E.coli株CC118中でスクリーニングした場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート(XP)を含む培地に塗布した時、55のコロニーが青色の表現型を示した。クローニングベクターpHRM100及びpHRM104はphoAから上流の固有のプロモーターを含まないので、これらのプラスミドから誘導された融合タンパク質はプロモーター、翻訳開始部位及び機能シグナル配列を含むニューモコッカスＤＮＡから生成されたはずである。これらのプラスミドのうちの二つからのインサートのＤＮＡ配列分析は推定プロモーター、リボソーム結合部位及びphoAのコード配列とインフレームである48アミノ酸及び52アミノ酸をコードする配列を示した。これらのコード配列は原核生物シグナル配列に特徴的な特徴、例えば、塩基性Ｎ末端領域、中央の疎水性コアー及び極性のＣ末端領域を有する(von Heijne, 1990, J.Memb.Biol. 115:195-201)（表２）。
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推定開裂部位を、“-3，-1規則”(von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4683-4690）に基いてこのような部位を同定するように設計されたアルゴリズムで両配列中で同定した。S.ニューモニアエへのこれらのプラスミドの形質転換及び組込みは、コロニーリフトアッセイにおいて青色のコロニーを生じる形質転換を与え、夫々がSDSポリアクリルアミドゲルで55kDaの見掛けMrを有する抗PhoA免疫反応性融合タンパク質を生産した（データは示されない）。これらの結果は、PhoAに融合されたS.ニューモニアエからの異種シグナル配列がE.coli及びS.ニューモニアエの両方中で活性であり、おそらく同様の分泌経路を使用することを明らかに示す。
輸出ニューモコッカスタンパク質へのPhoA融合
AmiAは、小さいペプチドの輸送を担う細菌パーミアーゼのファミリーの代表的なニューモコッカスである(Alloingら，1989, Gene. 76:363-8; Alloingら，1990, Mol.Microbiol. 4:633-44; Gilsonら，1988, EMBO J. 7:3971-3974)。AmiAはシグナル配列を含み、そしてＮ末端システインに共有結合された脂質部分により細菌膜に結合された輸出リポタンパク質であるべきである(Gilsonら，1988, EMBO J. 7:3971-3974)。本発明者らはphoAにコドン169でインフレーム融合されたamiAの5'コード領域を含むニューモコッカス変異体(SPRU121)を遺伝子操作した。この変異体のコロニーはXPに露出された時に青色の表現型を生じ、これはハイブリッドタンパク質が輸出されたことを示唆する。67kDaの予想Mrを有する免疫反応性ポリペプチドを全細胞溶解産物のウェスタン分析により確認した（データは示されない）。
S.ニューモニアエ中のPhoA融合の同定
E.coli及びS.ニューモニアエの両方中のニューモコッカスＤＮＡから誘導されたPhoA融合の検出により促されて、本発明者らはPhoAベクターpHRM100及びpHRM104のランダム染色体挿入を含むニューモコッカス形質転換体のライブラリーをつくった。1,500のクローンのバンクから、XPを用いるコロニーリフトアッセイにおいて青色の表現型を示す75の変異体を単離した。S.ニューモニアエは内在性アミダーゼ(LytA)のために静止増殖中に自然に溶解するので、本発明者らは、変異体の幾つかの青色の表現型が細胞溶解の結果であり、生存細胞からの融合タンパク質の輸出のためではないことを気にかけた。SPRU22、42、75、81、及び98を含む10種のランダム青色変異体からのＤＮＡをlytAマイナスバックグラウンドに形質転換し、全てが依然として青色の表現型を示した（データは示されない）。
変異体の一種（SPRU98)はXPで青色の表現型を示し、93kDaの抗PhoA免疫反応性ポリペプチド（図２；レーン２）を発現した。PhoAのコード領域は49kDaの分子量を有するポリペプチドを生じるようであるので、本発明者らは融合タンパク質が44kDaの分子量を有するポリペプチドに相当するコード領域から生産されていたと結論し得る。対照的に、ランダムに挿入されたベクターを含み、XPに露出された時に青色ではなかった変異体SPRU96及び97は、免疫反応性物質を生産しなかった（図２；レーン３、４）。SPRU98からの融合タンパク質は、全細菌が低濃度のトリプシンに露出された時にタンパク質分解され、これは細胞外の位置を示唆した（図２；レーン５）。全細胞と関連するアルカリ性ホスファターゼ活性の直接測定がこの結果と一致した。親株及びランダムに組込まれたプラスミドを含むPhoA-変異体(SPRU97)と較べて、SPRU98に関して３〜４倍大きい酵素活性があった（表３）。要約すると、これらの結果は、輸出タンパク質へのPhoA融合がS.ニューモニアエの細胞質膜を横切ってトランスロケーションされたことを示唆する。
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ジスルフィド酸化剤がS.ニューモニアエ中のPhoA融合の酵素活性を増大する
E.coli中で、PhoA活性は細胞質膜を横切るタンパク質トランスロケーション、Zn2+のとり込み、ジスルフィド結合形成及び二量化を必要とする。この活性化プロセス後に、酵素は高度にプロテアーゼ耐性である(Roberts及びChlebowski, 1984)。最近、二つのグループが単一遺伝子座、dsbA(Bardwellら，1991, Cell.67:581-589)、及びppfA(Kamitaniら，1992, EMBO J. 11:57-67)を同定し、これはジスルフィドオキシド還元酵素をコードし、これはPhoA中のジスルフィド結合の形成を促進する。また、同様の遺伝子座がV.コレラエ(cholerae)中で同定された(Peek及びTaylor, 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. 89:6210-6214)。dsbA中の突然変異はPhoA活性を著しく低下し、そのタンパク質プロテアーゼを試験管内及び生体内の両方で感受性にした(Bardwellら，1991, Cell. 67:581-589; Kamitaniら，1992, EMBO J. 11:57-67)。S.ニューモニアエ中のPhoA融合と関連する酵素活性は図２に示されたPhoA融合のプロテアーゼ感受性のためにE.coli中の融合で得られた値（データは示されない）よりも通常10倍低かったので、本発明者らはDsbAまたは強いジスルフィド酸化剤の添加がジスルフィド結合形成を促進し、酵素活性を増大し、タンパク質分解を遅延すると仮定した。
93kDaのMrを有するPhoA融合タンパク質を生産するSPRU98を10μMのDsbAまたは600μMの強いジスルフィド酸化剤である２−ヒドロキシエチルジスルフィドの存在下で増殖させた。両方の条件下で、酵素活性は少なくとも２倍増大された（表４）。
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対照と較べて、これらの２種の化合物の存在下で増大された量の免疫反応性タンパク質がまた検出された（図３）。これは増大されたタンパク質安定性及び固有のタンパク質分解の耐性を示唆した。これらの化合物により運ばれた酵素活性の程度の増加のみがあったので、本発明者らは、S.ニューモニアエ中に不在であるPhoAの正確な折りたたみに必要とされるその他の因子があり得ることを提案する。グラム陽性生物B.スブチリス(Chesnutら，1991, Mol.Microbiol. 5:2181-90; Hulettら，1991, J.Biol.Chem. 266:1077-84; Sugaharaら，1991, J.Bacteriol. 173:1824-6)及びエンテロコッカス  ファエカリス中で同定されたその他のアルカリ性ホスファターゼイソ酵素の誘導配列が唯一のシステイン残基を含み、またはそれを含まないことが注目される。これは、これらの分子内または分子間のジスルフィドの正確な折りたたみのためのオキシド−還元酵素系の存在が良く特定されたペリプラズムを含む幾つかのグラム陰性生物の特異な性質であり得ることを示唆し得る。
S.ニューモニアエからのPhoA融合の配列分析による輸出タンパク質の同定
ニューモコッカスインサートを含むプラスミドを、XPで青色の表現型を示す48のニューモコッカス変異体からE.coli中で回収した。KnpIによるこれらのプラスミドの消化は親ベクターからニューモコッカスインサートを切開する。インサートのサイズは全て約400〜900塩基対であった。48のインサートの予備配列分析は21の異なる配列を明らかにし、こうして変異体の幾つかの間の同胞関係を実証する。PhoAとインフレームの50〜200アミノ酸に相当する長いコード領域がインサートの殆どにつき樹立され、そのうちの９種が図４に示される。BLASTアルゴリズム(Altschulら，1990, J.Mol.Biol. 215:403-410)を使用して、誘導タンパク質配列をバイオテクノロジー情報国立センター（ワシントンD.C.）にある非多重複タンパク質データベースの最新バージョンに寄託された配列に対する類似性につき分析した。これらの９種のインサートからの配列（図４）は８種の既知の輸出タンパク質または膜関連タンパク質のファミリーに対し類似性を有するコード領域を明らかにした（図５）。既知の機能を有しない潜在的な読み取り枠に相当する遺伝子によりコードされたこれらのタンパク質が、異なる遺伝子座を記載するために接頭辞exp(exported protein、輸出タンパク質)と表示される。
データベース中の配列に対するその他のインサートからの誘導配列間の類似性は検出されなかった。全ての９種のインサートの配列はこの出願の出願日の後にゲンバンク（受理番号：指定される予定）で入手可能にされるであろう。
Exp1はグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の両方中の小さいペプチドの輸送を担うパーミアーゼのファミリーに対し類似性を示した（図5A）。同定された読み取り枠はS.ニューモニアエからの輸出タンパク質、AmiA(Alloingら，1990, Mol.Microbiol. 4:633-44)に対し最大の類似性を示した。ami遺伝子座はアミノプテリンに耐性の自然変異体中で最初に特性決定された(Sicard, 1964, Genetics. 50:31-44; Sicard及びEphrussi-Taylor, 1965)。その野生型対立遺伝子は小さい分岐アミノ酸の分子内輪送を担い得る(Sicard, 1964)。Exp1はAmiAとは明らかに異なり、同細菌中に存在するパーミアーゼのファミリーの関連する員に相当する。E.coliは少なくとも３種のペプチドパーミアーゼを有し、一方、B.スブチリスは少なくとも２種のペプチドパーミアーゼを有する（概説につき、Higginsら，1990, J.Bioengen.Biomembranes. 22:571-92を参照のこと）。B.スブチリスからの相似遺伝子座SpoOK中の突然変異は胞子形成を抑制し、自然コンピテント細胞中の形質転換効率を著しく低下する(Peregoら，1991, Mol.Microbiol. 5:173-85; Rudnerら，1991, J.Bacteriol)。最近の結果は、exp1中の突然変異がまたS.ニューモニアエ中の形質転換効率を低下し、一方、amiA中の突然変異がそうしないことを示した。それ故、２種の異なるグラム陽性細菌からの２種の異なるペプチドパーミアーゼはこれらの自然コンピテント細菌中の形質転換のプロセスに影響する。
exp2のＤＮＡ配列及び誘導タンパク質配列の両方はペニシリン結合タンパク質1A(PBP1a)(Martinら，1992a, J.Bacteriol. 174:4517-23)をコードするponA（塩基対1821-2055）と同一であった（図5B）。このタンパク質は、ムレイン生合成における後の工程を触媒作用するペニシリン相互作用セリンＤ，Ｄ−ペプチダーゼのファミリーに属する。PBP1aはニューモコッカス膜製剤からルーチンで単離され、一般に輸出タンパク質と考えられている(Hakenbeckら，1991, J.Infect.Dis.164:313-9; Hakenbeckら，1986, Antimicorbil Agents and Chemotherapy. 30:553-558; Martinら，1992, Embo J. 11:3831-6)。E.coli中で、PBP1a及びPBP1bの両方の欠失は細胞に致命的であるが、いずれかの遺伝子が欠失される場合には、細菌は補償できる(Yousifら，1985, J.Gen.Microbiol. 131:2839-2845)。SPRU42のペプチドグリカンプロフィールを親株と比較してPBP1aへの遺伝子融合が酵素機能を変えるかどうかを測定することは重要であるようである。
Exp3はN.ゴノールホエアエ(gonorrhoeae)からのPilB（図5C）(Tahaら，1988, EMBO J. 7:4367-4378)に対しかなりの配列類似性を示した。PilBのＣ末端ドメインに相当する類似性の二つの領域があった。類似性を示さないExp3の25アミノ酸とPilBの37アミノ酸の短いギャップがあった。これはこれらの２種のタンパク質につきモジュール構造機能関係を示唆する。この結果と一致して、PhoA-PilBハイブリッドはN.ゴノールホエアエの膜フラクションに局在化され(Tahaら，1991, Mol.Microbiol 5:137-48)、これは膜トランスロケーションを示した。
PilA及びPilBはピリン遺伝子発現を調節する２成分センサーレギュレーターのファミリーの員であること、そしてPilBはタンパク質のＣ末端領域中にキナーゼ活性を含む保存トランスミッター領域を有するトランスメンブランセンサーであることが示唆されていた(Tahaら，1991, Mol.Microbiol 5:137-48; Tahaら，1992, J.Bacteriol. 174:5978-81)。このファミリーに特徴的である自己リン酸化に必要とされるPilB中の保存ヒスチジン残基(H408)はExp3中に存在しない。ピリンはS.ニューモニアエにつき同定されなかったので、Exp3による遺伝子調節につき異なる標的部位が推定されるようである。
Exp4で同定されたコード領域は、それが真核生物及び原核生物の両方に見られるClpタンパク質の汎存ファミリーに類似することを示唆する（図5D）（概説につき、Squires及びSquires, 1992, J.Bacteriol. 174:1081-1085を参照のこと）。Exp4はトマトからの同族体CD4B（Gottesmanら，1990, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:3513-7）に最も似ているが、またかなりの類似性がE.coliからのClpA及びClpBに対し注目された。これらのタンパク質はタンパク質分解のレギュレーター(Gottesmanら，1990, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:3513-7)または分子カペロン(Squires及びSquires, 1992, J.Bacteriol. 174:1081-1085)として機能することが提案されていた。Clpタンパク質の一つの普遍的な特徴は膜トランスロケーションを示す長いリーダー配列である(Squires及びSquires, 1992，上記文献，J.Bacteriol. 174:1081-1085)。実際に、植物ClpCは葉緑体にトランスロケーションされる(Moare, 1989, Ph.D.thesis.ウィスコンシン大学，マジソン)。その他のClpタンパク質の細胞下の局在化につき殆ど知られていないとしても、本発明者らの結果は細菌膜を横切るニューモコッカス同族体のトランスロケーションを示唆する。
Exp5はグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方中に見られるホスホエノールピルベート：炭水化物ホスホトランスフェラーゼパーミアーゼのファミリーの員であるB.スブチリスからのPstG(Gonzy-Treboulら，1991, Mol.Microbiol. 5:1241-1249)に対し類似性を示した（概説につき、Saier及びReizer, 1992, J.Bacteriol. 174:1433-1448を参照のこと）（図5E）。これらのパーミアーゼは幾つかのトランスロケーションされたドメインを有するポリトピック膜タンパク質である。
Exp6から回収されたインサートの分析は、幾つかの原核生物種からのグリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに対し類似性を有するコード領域を明らかにした（図5F）。それはB.スブチリスからのGlpD（Holmbergら，1990, J.Gen.Microbiol. 136:2367-2375）に最も似ている。この酵素は細胞膜内タンパク質であるシトクロムオキシダーゼと複合体を形成する膜関連フラボタンパク質である。グリセロール−３−ホスフェートをジヒドロキシアセトンホスフェートに変換し、そしてその後解糖経路に入るためにグリセルアルデヒド−３−ホスフェートに変換することの他に、この酵素はその後の輸送のために電子をシトクロムオキシダーゼに送出する。これらのデヒドロゲナーゼは非特異的疎水性相互作用により細胞質膜の内表面に結合されることが提案されていた(Halderら，1982, Biochemistry. 21:4590-4606; Kolandら，1984, Biochemistry. 23:445-453;Woodら，1984, Biochem.J. 222:519-534)。また、デヒドロゲナーゼとデヒドロゲナーゼを細胞質膜に固定するのに利用できるシトクロムの間に特定かつ飽和可能な数の結合部位があることが提案されていた。ここに報告されたデータは、S.ニューモニアエ中で、デヒドロゲナーゼのセグメントが細菌の外表面にトランスロケーションされることを示唆する(Kung及びHenning, 1972, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 69:925-929)。触媒ドメインのトランスロケーションは確かに酵素機能を変化しないようである。再生された膜内外の小胞中で、デヒドロゲナーゼが小胞のいずれかの側に添加された時に、シトクロムへの電子移入が起こった(Halderら，1982, Biochemistry. 21:4590-4606)。
Exp7の誘導配列の分析は陽イオン、例えば、Ca2+、Mg2+、Ｋ+、Na+、及びＨ+の輸送を担う原核生物及び真核生物の両方のＰ型（E1E2型）陽イオン輸送ATPaseのファミリーに対し類似性を示した（図5G）。これらのATPaseは幾つかのトランスロケーションされたドメインを有する固有の膜タンパク質である。例がE.ファエカリス(Soliozら，1987, J.Biol.Chem. 262:7358-7362)、サルモネラチフィムリウム(Snavelyら，1991, J.Biol.Chem. 266:815-823)、E.coli(Hesseら，1984, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:4746-4750)、ノイロスポラ  クラッサ(Addison, 1986, J.Biol.Chem. 26:14896-14901; Hagerら，1986, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:7693-7697)、サッカロミセス  セラビジアエ(Rudolphら，1989, Cell. 58:133-145)及びウサギの骨格筋の筋小胞体(Brandiら，1986, Cell. 44:597-607; Serranoら，1986, Nature. 689-693)中で同定された。Exp7はS.チフィムリウムからのMgtBに最も似ており、これはMg2+の輸送を担う三つの遺伝子座のうちの一つである(Snavelyら，1991, J.Biol.Chem. 266:815-823)。同定された領域は高度に保存されたアスパルチル残基を含み、これはATP依存性自己リン酸化の部位である。MgtBに対する類似性に基いて、Exp7中の融合はおそらくタンパク質のＣ末端領域中で起こった。MgtBのトランスメンブランループに予想されるモデルは、この領域が細胞質表面にあることを示唆した(Snavelyら，1991, J.Biol.Chem. 266:815-823)。Exp7へのPhoA融合に関するデータは、細胞質表面におけるこの領域の位置がS.ニューモニアエの場合にはないことを示唆する。
Exp8はトランスポーターのATP結合カセット(ABC)スーパーファミリーとも称されるトラフィックATPaseのファミリー（これらは原核生物及び真核生物の両方に見られる(Ames及びLecar, 1992, Faseb J. 6:2660-6に概説されている）に対し類似性を示す（図5H）。Exp8はα−ヘモリシンの如き細菌RTXタンパク質（これらはグラム陰性生物及びグラム陽性生物の両方に見られる真核生物細胞毒素である(Welch, 1991, Mol.Microbiol. 5:521-528に概説されている)）のトランスロケーションを担うトランスメンブランタンパク質に最も似ている。Exp8を含む融合タンパク質はボルデテラ  ペルツシス中のcyaオペロンの成分であるCyaB(Glaserら，1988, Mol.Microbiol. 2:19-30; Glaserら，1988, EMBO J. 7:3997-4004)に最も似ている。この遺伝子座はまた細菌毒素のRTXファミリーの員であるアデニレートシクラーゼ毒素を生じる。また、S.ニューモニアエ中のcomA遺伝子座はこのファミリーの員であることは注目するまでもない(Hui及びMorrison, 1991, J.Bacteriol. 173:372-81)。
回収されたインサートの二つの領域からのexp9の誘導配列が図４に示される。この配列の分析は、Exp9がATP依存性ＲＮＡヘリカーゼのD-E-A-Dタンパク質ファミリー（概説につき、Schmid及びLinder, 1992, Mol.Microbiol. 6:282-292を参照のこと）の員であることを明らかにした。それはE.coliからのDEADに最も似ている（図5I）(Tooneら，1991, J.Bacteriol. 173:3291-3302)。多数のヘリカーゼが多くの異なる生物から同定されていた。少なくとも５種の異なる同族体がE.coli中で同定されていた(Kalmanら，1991, The New Biologist 3:886-895)。これらのタンパク質のホールマーク(hallmark)はATP結合ドメインのＢモチーフ中の保存DEAD配列である(Walkerら，1982, EMBO J. 1:945-951)。DEAD配列がexp9からのインサートの5'末端からの誘導配列中で同定された。
二つの研究は、E.coli中の異なる同族体がリボソーム構築に影響することにより翻訳に役割を果たし得ることを示唆していた(Nishiら，1988, Nature. 336: 496-498; Tooneら，1991, J.Bacteriol. 173:3291-3302)。公表された研究はこれらのタンパク質の輸出または膜関連のいずれも報告していなかった。それ故、この融合を宿しているPhoA+変異体を同定することは驚くべきであった。細胞下の分別は細菌の膜フラクションと関連した多数の融合タンパク質を明らかに示すが（図６）、これは融合タンパク質のみに観察された異常であり得る。
最近、B.スブチリス中のcomFがDEAD配列を含む同様のＲＮＡ／ＤＮＡヘリカーゼを含むことが示された(Londono−Vallejo及びDubnau, Mol.Microbiol.)。この遺伝子座中の突然変異は細菌形質転換を欠損にする。その後の研究はヘリカーゼが膜関連タンパク質であることを示し、そしてそれが形質転換中にＤＮＡの輸送に役割を果たし得ることが示唆された(D.Dubnau、個人的な文通)。予備実験はExp9-PhoA融合を発現する変異体の形質転換可能性に大きな差を示さなかった。膜と関連するヘリカーゼのクラスがある場合、Exp9は輸出すべきと予定されたポリペプチドの翻訳に関与し得ることを考察する気にさせられる。
結言すると、この実施例は既知の輸出タンパク質の同族体をコードするS.ニューモニアエ中の幾つかの遺伝子座を成功して突然変異させ、同定した技術の開発を実証する。同定された遺伝子座の大半は、細胞質膜で、または細菌の外部で起こる幾つかの異なるプロセスに役割を果たす輸出タンパク質をコードすることが本発明者らの結果から明らかである。その他の生物中のPhoA突然変異誘発の使用につき、S.ニューモニアエ中のこの技術に関して注目されることが推奨される。同定された遺伝子座の全てが輸出タンパク質をコードし得るとは限らない。細胞溶解の如き幾つかの因子のために、幾つかの偽陽性が生じ得ることが確かに可能である。以下の実施例において実証されるように、推定の変異体輸出タンパク質の機能活性を実証するための付加的なアッセイが行い得る。
これらの結果を考慮して、現在同定された遺伝子座の大半は輸出タンパク質をコードし、その幾つかがシグナル伝達、タンパク質トランスロケーション、細胞壁生合成、栄養獲得または化学浸透圧バランスの維持に役割を果たす。
実施例２：幾つかの輸出タンパク質の突然変異が付着性に影響する
この実施例において、肺細胞に付着するカプセル化されたニューモコッカス及びカプセル化されなかったニューモコッカスの能力を測定した。結果は、両方の型のニューモコッカスが混合肺細胞及びII型肺細胞に付着するが、II型細胞への付着が優先されたことを示す。また、結果は、型２のカプセル化された株がカプセル化されなかった変異体よりわずかに大きい付着能を有することを示唆する。
また、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)及び肺型II細胞に付着する突然変異S.ニューモニアエ株の能力に関する輸出タンパク質の突然変異の効果を分析した。結果は、輸出タンパク質の幾つかがHUVECもしくは肺細胞、またはその両方へのS.ニューモニアエの付着に直接または間接の役割を有することを実証した。
物質及び方法
ウサギからの混合肺胞細胞及び型II肺胞細胞の調製
Dobbs及びMason(1979, J.Clin.Invest. 63:378-387)により記載されたようにして、肺をウサギから除去し、細断し、コラゲナーゼ、エステラーゼ及びDNaseで37℃で60分間にわたって消化した。大きな片をガーゼフィルターで除去し、細胞をペレットにし、２回洗浄した。混合肺細胞を、0.5％のアルブミンを補給したカルシウム含有緩衝液20ml中に104/mlの密度で再度懸濁させた。肺胞型II細胞を、その懸濁液を16.5g％で10mlから35g％で10mlまでのアルブミン勾配で層形成することにより混合肺細胞懸濁から精製し、1200rpmで４℃で20分間遠心分離した。勾配の上部26mlを捨て、次の12ml中の細胞を回収し、洗浄し、104の細胞／mlの濃度に調節した。細胞の生存率はトリパンブルー排除により測定して90％より大きく、そして電子顕微鏡で調べた時に細胞の80％より多くが型II細胞に典型的なオスミウム酸親性のラメラ体を含んでいた。
混合肺胞細胞及び型II肺胞細胞による付着性アッセイ
約103または109の型II（カプセル化された）ニューモコッカスまたはR6（カプセル化されなかった）ニューモコッカスを１mlの容積中で37℃で30分間にわたって104の肺細胞に添加した。肺細胞を６ラウンドの洗浄、270 x gで５分間の遠心分離により非付着細菌から分離した。最終細胞ペレットに付着した細菌を塗布及びグラム染色により数えた。
HUVEC及び型II肺胞細胞付着性アッセイ
HUVEC（クロネチクス、サンジエゴ、カリフォルニア）及び型II肺胞細胞系（ATCC受理番号A549）を４〜８日培養し、次いでテラサキ皿に移し、24時間後に付着性アッセイを行って集密単層の形成を可能にした(Geelenら，1993, Infect.Immun. 61:1538-1543)。細菌をフルオレセイン（Geelenらの上記文献）で標識し、５ x 107cfu/mlの濃度、または105、106及び107cfu/mlの濃度に調節し、少なくとも６のウェルに５μlの容積で添加した。37℃で30分間のインキュベーション後に、プレートを洗浄し、PBS/グルタルアルデヒド2.5％で固定した。付着した細菌を、エピフルオレセンスを備えたニコンジアフォト倒立顕微鏡を使用して目視で数えた。
変異体株SPRU25
R6の付加的な変異体株、SPRU25を上記の実施例１に記載されたようにしてつくった。
結果及び検討
混合肺細胞へのカプセル化された型２ニューモコッカス及びカプセル化されなかったR6ニューモコッカスの付着性（データは示されない）は精製された型II細胞への付着性よりも夫々の接種物で一貫して１−２log小さかった。これは、型II細胞が細菌に好ましい標的であることを示した。型II細胞に関する濃度曲線が図７に示される。一貫しているが、統計上有意ではない差がカプセル化された株とカプセル化されなかった株の間で観察され、これは型II株がカプセル化されなかった変異体よりもわずかに大きい付着能を有し得ることを示唆する。
変異体株（表１）を、HUVEC及び型II細胞に付着する能力につき試験した。株SPRU98、SPRU42、SPRU40、SPRU25及びSPRU121はR6野生型と比較して低下された付着活性を有することがわかった。その他の株の付着性は輸出タンパク質の突然変異により殆ど影響されなかった（データは示されない）。
細菌を105、106及び107cfu/mlに滴定し、HUVEC（図８）及び型II細胞（図９）に付着する能力につき試験した。最低濃度で、付着した細菌の数は付着性欠損変異体とR6の間で比較的同じであった。106cfu/ml、更に顕著には107cfu/mlで、HUVEC及び肺型II細胞の両方への変異体による結合の間の差は有意から顕著まで変化した。
株SPRU98、SPRU42、及びSPRU40の輸出タンパク質の同族体は上記の実施例１に説明されている。SPRU21はamiA遺伝子座の突然変異に相当する。この実験の結果は、AmiA輸出タンパク質が付着に関与していることの予期しない証拠を与える。SPRU25はexp10の突然変異により実施例１に記載されたようにして生じた株である。この輸出タンパク質の核酸配列（配列番号21）またはアミノ酸配列（配列番号22）に相同性を有する遺伝子またはタンパク質が見られなかった。exp10ヌクレオチド及びExp10アミノ酸配列の同定部分が図10に示される。
これらの結果は、細胞への細菌の付着に役割を果たすS.ニューモニアエの輸出タンパク質が同定し得ることを明らかに示す。
実施例３：ペプチドパーミアーゼが形質転換を調節する
この実施例は、親株よりも一貫して10倍少なく形質転換した変異体であるExp1の配列及び機能の更なる解明に関する。変化された遺伝子座の完全配列分析及び再生はplpA（permease like protein、パーミアーゼ様タンパク質）と改名された遺伝子を明らかにし、この遺伝子はペプチド輸送を担う細菌パーミアーゼのファミリーに属する推定の基質結合タンパク質をコードする。この遺伝子の誘導アミノ酸配列は、ニューモコッカスからのペプチド結合タンパク質同族体であるAmiAに80％似ており、またバチルス  スブチリス中の形質転換及び胞子形成のプロセスの調節要素であるSpoOKAに230アミノ酸で50％似ている。アルカリ性ホスファターゼ(PhoA)へのPlpA融合は膜関連しており、そしておそらく膜アンカーとして利用できる［3H］パルミチン酸で標識されることが示された。形質転換のプロセスにおけるplpA決定基及びami決定基の役割を特定するように設計された実験は、１］plpA中に欠損を有する変異体が90％より大きく形質転換欠損であり、一方、ami変異体が形質転換効率の４倍までの増加を示し、２］親株と比較して、ami変異体中の応答能の開始が対数増殖中に早く起こり、一方、その開始はplpA変異体中で遅延され、３］plpA突然変異が応答能調節された遺伝子座の発現を減少することを示した。パーミアーゼ変異体は特定のリガンドを結合しないようであるので、おそらく基質−パーミアーゼ相互作用が形質転換のプロセスを調節するものと考えられる。
この実施例は突然変異の分析によりこれらの２種のペプチドパーミアーゼが応答能の誘発だけでなく形質転換効率に異なる効果を有することを実証する。それ故、本発明者らは、ペプチドパーミアーゼが基質結合及びその後の輸送またはシグナリングによりニューモコッカス中の形質転換のプロセスを媒介すること、そしてこれらの基質が応答能の調節に関与し得ることを提案する。
物質及び方法
株及び培地  この実施例で使用したS.ニューモニアエの株は実施例１、特に表１に記載されている。表５はこの研究に使用したその他のニューモコッカス株をリストし、それらの関連の特徴を要約する。使用したエシェリキア  コリ株は実施例１に記載されている。
0003722834.tif 000008
S.ニューモニアエ塗布条件及び培養条件は実施例１に記載されている。標識研究のために、培養物をいずれかに(Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29)記載されたようにして調製された既知組成の培地(CDEN）中で増殖させた。E.coliを適当な場合に500μg/mlのエリスロマイシンまたは100μg/mlのアンピシリンで補給した液体ルリア−ベルタニ培地または固体TSA培地中で増殖させた。染色体に組込まれたプラスミドを含むニューモコッカスの選択及び管理のために、細菌を0.5μg/mlのエリスロマイシンの存在下で増殖させた。
PhoA+ライブラリー及び突然変異誘発  PhoA融合を発現するニューモコッカス変異体のライブラリーを、非複製ニューモコッカスE.coliシャトルベクターpHRM100またはpHRM104による挿入不活化によりつくった。ニューモコッカスE.coliシャトルベクターpJDC9を、phoA融合を生じないで遺伝子不活化に使用した。突然変異誘発に使用したプラスミド構築物が図７に示される。これらの操作の詳細が実施例１に記載されている。
ニューモコッカス形質転換  形質転換効率の低下につき多数の変異体をスクリーニングするために、単一コロニーを、液体培地250μl及びニューモコッカスのストレプトマイシン耐性株からの染色体ＤＮＡ（最終濃度１μg/ml）(Str rＤＮＡ）を含む96ウェルミクロタイタプレートに移した。37℃で16時間のインキュベーション後に、試料５μlを抗生物質を含み、また抗生物質を含まない固体培地に塗布して形質転換効率を測定した。対照株は約105のStr r形質転換体／mlを生産し、一方、形質転換欠損候補は104未満のStr r形質転換体／mlを生産した。
パーミアーゼ変異体を更に特定された形質転換アッセイで評価した（図15）。細菌の培養原液をStr rＤＮＡを含むC+Y培地中約106cfu/mlの細胞密度に希釈した。この溶液を96ウェルミクロタイタプレート中でアリコート250μlに分配し、細菌を37℃で５時間にわたって約0.6のOD620まで増殖させた。全細菌及びStr r形質転換体を、抗生物質を含み、また抗生物質を含まない固体培地への培養液の連続希釈により測定した。形質転換効率をStr r形質転換体／細菌の合計数の比率（％）として計算し、親株、R6xと比較した。
形質転換を評価する応答能プロフィールを液体培地中で増殖させた培養物から生じた。細菌の原液を新しいC+Y培地中約106cfu/mlの細胞密度に希釈し、37℃で増殖させた。試料(500μl)を所定の時間間隔で抜取り、凍結し、-70℃で10％のグリセロール中で貯蔵した。これらの試料を氷の上で解凍し、次いで30℃で30分間にわたってStr rＤＮＡと共にインキュベートした。DNAaseを10μg/mlの最終濃度まで添加して更なるＤＮＡ摂取を停止し、培養物を更に1.5時間にわたって37℃に移して抗生物質耐性の発現を可能にした。形質転換効率を上記のようにして計算した。
組換えＤＮＡ技術  プラスミドミニ調製、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結反応、E.coliへの形質転換及びゲル電気泳動を含む通常のＤＮＡ技術は通常のプロトコル(Sambrookら,1989,上記文献)に従った。クローニング実験に使用した制限フラグメントを、ガラスビーズ（バイオ101）またはフェノール抽出を使用してアガロースゲルから単離した。大規模なプラスミド調製を、製造業者（キアゲン）の指示に従ってアフィニティーカラムを使用して調製した。
二本鎖ＤＮＡ配列決定を、［ａ−35S］-dATP（ニューイングランドヌクレアー）及びシケナーゼバージョン2.0キット（米国バイオケミカル社）を製造業者の指示に従って使用してサンガー方法(Sangerら，1977, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-67)により行った。ジメチルスルホキシド（１％v/v）をアニーリング工程及び伸長工程に添加した。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、ジーンアンプキット（パーキン  エルマー  セタス）を使用して行った。オリゴヌクレオチドをオリゴスEtc.社により合成し、またはロックフェラー大学でタンパク質配列決定設備で合成した。
PlpA-PhoAの生体内標識  ニューモコッカスの凍結保存株を新しいＣDEN培地4ml中に再度懸濁させ、37℃で0.35のOD620まで増殖させた。夫々の培養物に［９，10-3H］パルミチン酸（ニューイングランドヌクレアー）100μCiを補給し、更に30分間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、食塩加リン酸緩衝液(PBS)中で３回洗浄した。最終細胞ペレットを溶解緩衝液(PBS;DNAse、10μg/ml; RNAse 10μg/ml; ５％［v/v］デオキシコレート）50μl中に再度懸濁させ、37℃で10分間インキュベートした。PlpA-PhoA融合タンパク質を免疫沈殿させるために、細胞溶解産物をセファロース(5'3'社)に接合した抗PhoA抗体20μlと共に４℃で１時間インキュベートした。その懸濁液を等容積のPBSで３回洗浄し、100μlの50mMのトリス-HCl、pH7.8、0.5mMの二カリウムエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)で１回洗浄した。最終上澄みを捨て、その樹脂をSDS試料緩衝液30μl中で再度懸濁させ、５分間沸騰させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにかけた。
細胞下の分別  ニューモコッカスを既に記載された技術(Hakenbeckら，1986, Antimicrob.Agents Chemother. 30:553-8)により細胞下の成分に分別した。簡単に言えば、細菌を400mlのC+Y培地中で0.6のOD620まで増殖させ、17,000gで10分間の遠心分離により単離した。細胞ペレットを合計容積２mlのTEPI(25mMのトリス-HCl、pH8.0、１mMのEDTA、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、20μg/mlのロイペプチン及び20μg/mlのアプロチニン）中で再度懸濁させた。洗浄したガラスビーズの半分の容積を添加し、細胞が顕微鏡検査により実証されるように破壊されるまでその混合物を４℃で15〜20分間攪拌した。その懸濁液を焼成ガラスロートによる濾過によりガラスビーズから分離した。ビーズを更に５mlのTEPIで洗浄した。合わせた溶液を500gで５分間遠心分離して細胞壁物質、細菌膜及び細胞質内容物から細胞デブリを分離した。次いで上澄みを29,000gで15分間回転させた。ペレットは細胞壁フラクションを含み、一方、上澄みを370,000gで２時間にわたって別の遠心分離にかけた。この操作からの上澄みは細胞質フラクションを含み、一方、ペレットは細菌膜を含んでいた。夫々のフラクションからの試料をタンパク質含量につき評価し、その後のゲル電気泳動のためにSDS試料に溶解した。PlaA-PhoA融合タンパク質を抗PhoA抗血清(5'3'社)で検出し、実施例１に記載されるようにして増進ケミルミネセンスにより間接的に視覚化した。
plpAの回収及び配列決定  図18はplpA及び種々のサブクローンのフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。pHRM104にクローン化されたフラグメントを含むプラスミドは接頭辞Ｈを有し、一方、pJDC9にクローン化されたものは接頭辞Ｊを有する。組込まれたプラスミドpHplp1及びpHplp10を、ＤＮＡの染色体製剤を汚染する自然切除されたプラスミドのE.coliへの形質転換によりSPRU98及びSPRU58から夫々単離した。“染色体歩行”を使用してplpAの殆ど及びその下流領域を単離した。pHplp1からの500bpインサートをKpnIによりpJDC9にクローン化してpJplp1を生産し、これを逆にニューモコッカスにシャトルしてSPRU107を生産した。SPRU107からの染色体ＤＮＡを、そのベクターを１回切断するが、もとのフラグメント中では切断しない種々の制限エンドヌクレアーゼで消化した。そのＤＮＡをベクターにつき選択したE.coliに再度つないで形質転換した。この操作を使用して、PstIはpJplp2を生産し、HindIIIはpJplp3を生産し、これらの両方がpJplp1中のもとのフラグメントの3'領域を190bpだけ延長し、一方、SphIは付加的な3.8kbを含むpJplp4を生産した。pJDC9へのpJplp4の900bp内部フラグメントのサブクローニングはplpAの3'末端から下流の630bpを含むプラスミドpJplp5を生じた。更に450bpをEcoRIを使用してもとのフラグメントから上流で単離した(pJplp6)。pJplp6の730bpの内部フラグメントをpJDC9にクローン化してpJplp7を得、またpJplp6の200bp EcoRI/PstI内部フラグメントをpJDC9の適当な部位にクローン化してpJplp8を生産した。
plpAのもとのフラグメントの上流の領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において染色体ＤＮＡを含む変性した特定のオリゴヌクレオチドを使用して“同族体クローニング”により得た。変性オリゴヌクレオチド、lipo1、（GCC GGA TCC GGW GTW CTT GCW GCW TCG(式中、ＷはA+Tである)（配列番号49）はAmiA(Alloingら，1990, Mol.Microbiol. 4:633-44)中に存在するリポタンパク質前駆体コンセンサスモチーフ及びS.ゴルドニイからのペプチドパーミアーゼ結合タンパク質同族体であるSarA(Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8)をベースとしていた。特定のオリゴヌクレオチド、P1、(TAC AAG AGA CTA CTT GGA TCC)（配列番号50）はpJplp6の5'末端に相補性であった。高度に相同のamiA遺伝子の増幅を防止するために、分断amiAを有するSPRU114からの染色体ＤＮＡを使用した。その染色体ＤＮＡを最初にXhoIで消化して短い鋳型を得た。PCR条件は変性のための94℃で30秒間、アニーリングのための40℃で30秒間そして伸長のための72℃で１分間の40サイクルであった。600bp生成物を得、ゲル精製し、BamHIで消化し、ブルースクリプトKS（ストラタゲン）にクローン化してpBSplp9を得た。次いでBamHI消化フラグメントをpJDC9にサブクローン化してpJplp9を生産した。このプラスミドをニューモコッカスに形質転換してSPRU122を得た。
アルカリ性ホスファターゼに融合した応答能調節遺伝子を含むplpA変異体の産生  pBSplp9からの600bp BamHIフラグメントをSauIIIa消化pWG5(Lacksら，1991, gENE 104:11-17)につないでpWplp9を生じた。このプラスミドを、phoAに融合された、応答能調節rec遺伝子座からの遺伝子、exp10を含むSPRU100に形質転換してSPRU156を生じた。染色体へのベクターの正確な組込みをPCRにより確認した。アルカリ性ホスファターゼ活性を、2.5mg/mlの最終基質濃度（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、シグマ）を用いた以外は実施例１に記載されたようにして測定した。次式を使用して活性単位を計算した。
0003722834.tif 000009
ami変異体の産生  PCR及び制限エンドヌクレアーゼ消化により得られたamiの内部フラグメントを適当なシャトルベクターにつなぎ、ニューモコッカスに形質転換して種々のami変異体を生産した。amiAとphoAの遺伝子融合の構築は実施例１に先に記載されたとおりであり、SPRU121を得た。トランケートamiAを得るために、オリゴヌクレオチドami1（ACC GGA TCC TGC CAA CAA GCC TAA ATA TTC）（配列番号51）及びami2（TTT GGA TCC GTT GGT TTA GCA AAA TCG CTT）（配列番号52）を使用してamiAの5'末端に720bp生産物をつくった。このフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し（これらはamiAのコード領域内にある）、相当する500bpフラグメントをpJDC9にクローン化した。得られたプラスミドpJamiAをニューモコッカスに形質転換してSPRU114を生産した。amiCを不活化するために、オリゴヌクレオチドamiC1（CTA TAC CTT GGT TCC TCG）（配列番号53）及びamiC2（TTT GGA TTC GGA ATT TCA CGA GTA GC）（配列番号54）（これらはamiCの内部である）を使用してPCRを使用して300bp生産物をつくった。得られたフラグメントをBamHIで消化し、pJDC9にクローン化してプラスミド、pJamiC1を生産し、これをニューモコッカスに形質転換してSPRU148を生産した。
ノーザン分析  ＲＮＡをSimpsonら(1993, FEMS Microbiol.Lett. 108:93-98)から採用した操作に従って調製した。細菌をC+Y培地、pH8.0中で0.2のOD620まで増幅させた。遠心分離(12,000g、15分間、４℃)後に、細胞ペレットを1/40の容積の溶解緩衝液（０．１％のデオキシコレート、８％の蔗糖、70mMのジチオスレイトール）中で再度懸濁させた。SDSを0.1％まで添加し、その懸濁液を37℃で10分間インキュベートした。細胞デブリを除去し、等容積の冷却した4Mの塩化リチウムを上澄みに添加した。その混合懸濁液を氷の上に一夜放置し、次いで18,500gで４℃で30分間遠心分離した。ＲＮＡを含むペレットを1.2mlの冷酢酸ナトリウム液(100mM、pH7.0)及び0.5％のSDS中に再度懸濁させ、等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)で３回、そして等容積のクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)で１回抽出した。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、無菌水中で再度懸濁させた。収率及び純度をスペクトロフォトメトリーにより測定して培養液80mlから300μgのＲＮＡの典型的な収量を得た。
ＲＮＡの試料を1.2％のアガロース／6.6％のホルムアルデヒドゲル(Rosen及びVilla-Komaroff, 1990, Focus 12:23-24)中の電気泳動により分離した。ゲルを水中ですすぎ、ＲＮＡをキャピラリーブロッティング(Sambrookら，1989の上記文献)によりニトロセルロースフィルター（シュライヒ・アンド・シュエル）に移した。プレハイブリダイゼーションは0.2％のデンハルツ（1xデンハルツは１％のフィコール、１％のポリビニルピロリドン、１％のウシ血清アルブミンである）、0.1％のSDS、3 x SSC(1 x SSCは150mMのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウムである)、10mMのHEPES、18μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ及び10μg/mlの酵母ｔＲＮＡ中で65℃で穏やかに攪拌しながら４時間にわたるものであった。plpA転写産物を検出するのに使用したＤＮＡプローブはpJplp9からの480bp HindIII-BamHIフラグメントであった。amiA転写産物の検出のために、ＤＮＡプローブはオリゴヌクレオチドami1及びami2（先に記載された）でつくった720bp PCR産物であった。ＤＮＡフラグメントをニック翻訳系（ニューイングランド  ヌクレアー）を使用して［a−32P］-dCTPで標識した。ハイブリダイゼーションは65℃で一夜にわたるものであった。ハイブリダイゼーション洗浄液は室温で30分間の2 x SSC、0.5％のSDS、続いて65℃で1 x SSC、0.5 x SSC及び0.2 x SSC（全てが0.5％のSDSを含む）中の3 x 30分間の洗浄であった。
結果
ペプチドパーミアーゼ中に欠損を有する形質転換欠損変異体の同定  上記の実施例１に記載されたようにして、形質転換のプロセスに関与する変異体中の輸出タンパク質を同定するために、30種のPhoA+変異体を形質転換効率の低下につき評価した。多数の変異体をスクリーニングするように設計したアッセイにおいて、親株(R6x)へのストレプトマイシン耐性(Strr)のための染色体突然変異の形質転換は約105cfu/mlのStrr形質転換体を生産した。PhoA+変異体であるSPRU98は一貫してStrr形質転換体の数の90％低下(104cfu/ml)を示した。親R6xへのPhoA+突然変異の形質転換はPhoA+及び形質転換欠損の両方である株を生産し、これは遺伝子融合により生じた突然変異が形質転換の欠損に関係することを実証した。SPRU98の増殖速度は親株と同じであり、これは形質転換欠損表現型が生物の増殖に関係したプリオトロピック(pliotropic)効果のためではないことを示唆した（データは示されない）。SPRU98中の突然変異遺伝子座の回収及び同定はplpA(パーミアーゼ様タンパク質)（図11、配列番号46）を明らかにし、これはexp1に相当する。plpAの誘導アミノ酸配列（配列番号47）は細菌パーミアーゼと関連する基質結合タンパク質（概説につき、Tam及びSaier, 1993, Microbiol.Rev. 57:320-346を参照のこと）に対し広範囲の類似性を示し、AmiAに対し最大の類似性を示した(60％の配列同一性)（図12A;配列番号48）。細菌ペプチドパーミアーゼのファミリーからの結合タンパク質を含むPlpAの配列は、このファミリーの全ての員に共通の機能モチーフを示唆する配列類似性の幾つかのブロックを明らかにした（図12B）。
ペプチドパーミアーゼの殆どの例は、輸出基質結合タンパク質、並びに二つの細胞膜内タンパク質及び細胞質膜を横切る基質輸送を担う二つの膜関連タンパク質をコードする５つの遺伝子からなる遺伝子構造を有する（概説につき、Higgins,1992, Annu.Rev.Cell.Biol. 8:67-113; Tam及びSaier, 1993の上記文献を参照のこと）。plpAの直ぐに下流の630bpそしてplpAの下流の領域3.3kbの配列分析は、これらの輸送要素の同族体であるコード配列を明らかにしなかった（データは示されない）。それ故、PlpAが基質輸送にカップリングされる場合、それは異なる対立遺伝子の産物により起こり得る。これは優先しないものではない。サルモネラ  チフィムリウム中で、hisJ遺伝子及びargT遺伝子は高度に類似するペリプラズム結合タンパク質Ｊ及びLAOをコードする。これらのタンパク質の両方がそれらの基質を同じ膜関連成分に送出する(Higgins及びAmes, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6038-42)。同様に、エシェリキア  コリのペリプラズム結合タンパク質LS-BP及びLIV-BP（これらはロイシン及び分岐鎖アミノ酸を輸送する）がまた膜関連成分の同じ組を使用する(Landick及びOxender, 1985, J.Biol.Chem.260:8257-61）。
本発明者らはおそらくE.coli中の発現タンパク質の毒性のためにplpAの5'末端を回収できなかった。amiA及びmalX(Alloingら，1989の上記文献; Martinら，1989, Gene 80:227-238)の如きその他のニューモコッカスパーミアーゼの遺伝子のクローニングにおいて同様の困難に出会った。plpA及びamiAの誘導配列の配列類似性に基いて、その遺伝子の5'末端の51bp以外の全てをクローン化した。
PlpAの膜局在化及び後翻訳共有結合修飾  PlpA及びAmiAの両方は、細菌中のリポタンパク質の後翻訳脂質修飾のための用法指示モチーフであるＮ末端中にLYZCyz（Ｙ＝Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｑ、Ｔ：  Ｚ＝Ｇ、Ａ：  ｙ＝Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｆ：  ｚ＝Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｗ、Ｅ）コンセンサス配列を含む(Gilsonら，1988, EMBO J. 7:3971-74; Yamaguchiら，1988, Cell 53:423-32)。グラム陽性生物中で、この修飾はこれらのポリペプチドを細胞質膜に固定するのに利用できる(Gilsonら，1988の上記文献）。このコンセンサス配列を含むパーミアーゼ基質結合タンパク質の特別な例として、ストレプトコッカス  ゴルドニイからのSarA(Jenkinson, 1992, Infect.Immun. 60:1225-8)、B.スブチリスからのSpoOKA(Peregoら，1991, Mol.Microbiol. 5:173-185; Rudnerら，1991, J.Bacteriol. 173:13388-98)、E.ファエカリスからのTraC及びPrgZ(Ruhfelら，1993, J.Bacteriol. 175:5253-59; Tanimotoら，1993, J.Bacteriol. 175:5260-64)及びS.ニューモニアエからのMalX（Gilsonら，1988の上記文献）が挙げられる。
この提案を支持して、図13はPlpA-PhoAタンパク質が輸出され、主として細胞質膜と関連することを示す。また、少量が細胞壁フラクション及び培養上澄み中に検出され、これはPlpA一部が膜から放出され得ることを示唆する。これはまたB.スブチリスからのペプチド質結合タンパク質OppA（SpoOKA）について見られ、この場合、OppAは初期に細胞と関連しているが、次第に増加する部分が増殖中に放出される(Peregoら，1991の上記文献)。こうして、PlpA及びOppAは、グラム陽性細菌中のその他のリポタンパク質につき提案されたように、放出可能な形態で細胞の外部に存在し得る(Nielsen及びLampen, 1982, J.Bacteriol. 152:315-322)。これらのフラクション中の融合タンパク質の存在は外来タンパク質のプロセシングではなく自生分子の位置を反映しないことは認められなくないが、これはありそうにない。何となれば、その他の膜関連PhoA融合は細胞質膜としっかりと関連しているからである。
最後に、PlpA-PhoA融合タンパク質に相当する［3H］パルミチン酸標識93kDaタンパク質をplpA-phoA遺伝子構築物を含むSPRU98から免疫沈殿させた（図13、下のパネル）。対照的に、同様に標識されたタンパク質は親対照または特定されないPhoA融合を含むSPRU100中で検出されなかった。これはPlpAの生体内の後翻訳脂質修飾を実証する。
plpA及びamiAの転写分析  2.2kbの転写産物をR6x細胞からのＲＮＡ製剤中のplpA及びamiAに特異性のプローブで検出した（図14）。これは両方の遺伝子のコード領域にサイズが似ている。plpA及びamiAのプローブ間の交差ハイブリダイゼーションの可能性を排除するために、高ストレンジェンシー洗浄をハイブリダイゼーション後に行った（実験操作を参照のこと）。また、plpA中のプラスミド挿入を含む変異体SPRU107から調製されたＲＮＡをamiA及びplpAで探査した時に、プローブの特異性が実証された。amiA転写産物は2.2kbで残り、一方、plpA転写産物は2.6kbにシフトした。SPRU107中で、plpAはpJDC9によりbp1474で分断される。plpA転写産物は完全長転写産物(1.7kb)よりも520bp小さく、pJDC9からの付加的な800bpが約2.5kbの転写産物を生じ、これは検出された2.6kb転写産物に似ている。
plpAのサイズに相当する単一転写産物は、plpAがオペロンの一部ではないことを示唆する。これは、ペプチドパーミアーゼと普通に関連する輸送要素をコードする遺伝子の同族体を明らかにしなかったplpAの下流の配列分析により確認される（データは示されない）。また、潜在的なrho非依存性転写ターミネーターがplpAの翻訳終止コドンから21bp下流で同定された（図11）。
PlpAパーミアーゼ及びAmiAパーミアーゼ中の突然変異が形質転換のプロセスに異なる効果を有する。応答能中のパーミアーゼの効果を測定するために、本発明者らはplpAまたはami中に欠損を有する変異体の形質転換効率を評価した。このアッセイにおいて、細菌の株を完全応答能サイクルにより選択可能なマーカーで形質転換し、続いて外殖し、次いで抗生物質マーカーをとり込んだ細胞の選択のために塗布した。こうして、結果は応答能中の形質転換細胞の合計数の目安である。PlpAのトランケート融合またはPhoA融合を生じた変異体は形質転換効率で２〜10倍の減少を示した（図15）。PlpAのAsp492で分断を有する変異体中、PhoAの存在(SPRU98)または不在（SPRU107)は形質転換効率の90％減少に影響しなかった。一方、Asp192でトランケートPlpAを生じる変異体(SPRU122)は形質転換効率の90％減少を示し、一方、SUPU58中では、Leu197におけるPhoAへの融合は親表現型を部分的に回復した。この構築物において、PhoAはキメラの三次構造に寄与し、こうしてその基質を結合するその能力に影響することにより機能性を運ぶことが可能である。
対照的に、ami中に欠損を有する変異体は形質転換熟練である。PhoAの存在(SPRU121)または不在（SPRU114)下でPro191でトランケートされたAmiAを生じた変異体は形質転換効率の適度の増加を示した（図15）。更に、AmiC中の分断（Ile126)を有する変異体SPRU148は形質転換効率の４倍の増加を示した。この変異体において、本発明者らは、AmiAが生産され、こうしてその基質を結合できるものと推定する。それ故、amiC変異体で観察された増加は、amiによりコードされた輸送複合体による基質輸送がAmiAによる基質結合に加えて形質転換を調節し得ることを示唆する。最後に、PlpA及びAmiAが高度に関連した構造（60％の配列同一性）であるとしても、形質転換効率に関してplpA突然変異及びami突然変異で観察された異なる効果は、基質特異性がこれらの相違を運ぶことを示唆する。
形質転換は対数増殖中の早期の応答能の単一波中に起こる（図16）。それ故、このプロセスの調節は応答能の開始（曲線中のシフト）を調節することにより、または応答能誘導遺伝子の発現を変化することにより起こって、成功して形質転換された細胞の数の変化をもたらし得る。パーミアーゼが形質転換のプロセスを調節するかどうかを測定するために、本発明者らはパーミアーゼ変異体の応答能プロフィールを親株と比較した。この分析は応答能サイクル中の増殖の種々の段階で細胞の集団中の形質転換細胞の数を測定する。図16は0.12のOD620で0.26％の最大形質転換効率を有する親株(R6x)に関する応答能の単一波を示す。これは約107cfu/mlの細胞密度に相当する。plpA変異体(SPRU107)は更に高い細胞密度でわずかに0.06％の最大形質転換効率を有する形質転換の同様の波を受けた。対照的に、amiA変異体(SPRU114)は0.75％の最大形質転換効率でもって倍加時間よりも長く持続する形質転換の波を受けた。SPRU114中の応答能サイクルの開始は0.03のOD620までに開始する早期の細胞密度で起こった。このデータから、本発明者らは、両パーミアーゼ中の突然変異が形質転換のプロセスに二重の効果を有し、応答能サイクルの誘発に影響するとともに、成功した形質転換体の数を調節するものと結論する。
plpA中の突然変異は応答能調節遺伝子座の発現の減少を生じる。ニューモコッカス中のrec遺伝子座（これは遺伝子形質転換に必要とされる）は二つの遺伝子、exp10及びrecAを有する。翻訳exp10-phoA遺伝子融合による結果は応答能の誘発により酵素活性の10倍の増加を実証し、これが応答能調節遺伝子座であることを実証する。ペプチドパーミアーゼがこの応答能誘発遺伝子座の発現に直接影響するかどうかを測定するために、本発明者らはplpA中のnul1突然変異及びexp10-phoA遺伝子融合を有する変異体(SPRU156)を構築した。増殖中にアルカリ性ホスファターゼ活性を測定することにより、本発明者らは、同系内の株(SPRU100)と比較して、plpA突然変異を有する変異体がexp10-phoA遺伝子融合の発現のほぼ２倍の減少を示すことを示した（図17）。それ故、これらの結果は、少なくともplpAが形質転換に必要とされる応答能調節遺伝子の発現を担うシグナリングカスケードに直接影響することを示す。
検討
新たに同定された輸出タンパク質Exp1は本明細書中plpAと改名された遺伝子決定基によりコードされる。この遺伝子座は、ami遺伝子座と共に、S.ニューモニアエ中の形質転換のプロセスを調節する。両遺伝子座は小さいペプチドの輸送を担う細菌パーミアーゼの成長ファミリーの員である高度に類似するペプチド結合タンパク質(PlpA、AmiA)をコードする（図12B）。これらのペプチド結合タンパク質の例は幾つかの細菌中の遺伝子移入のプロセスと関連していた。B.スブチリス中で、ペプチドパーミアーゼと相同の成分を含むオペロンの第一遺伝子であるspoOKAの不活化は、形質転換効率の低下だけでなく、胞子形成の静止を生じた(Peregoら，1991の上記文献; Rudner, 1991の上記文献)。SpoOKAの基質は知られていない。B.スブチリスは胞子形成に必要とされる少なくとも一種の細胞外分化因子を生産し(Grossman及びLosick, 1988の上記文献)、そしてこの輸送系が応答能及び胞子形成に必要とされ得るこの細胞外ペプチド因子を検知することに関与し得ることが提案されていた。
E.ファエカリス中の幾つかのプラスミドの接合移入は小さい細胞外ペプチドフェロモンにより調節される。最近の遺伝子分析は２種のプラスミドコード遺伝子、prgZ及びtraCを同定しており、その誘導生産物はペプチド結合タンパク質に相同である。実験の証拠は、これらのタンパク質がペプチドフェロモンを結合し、こうして接合を調節するシグナルを媒介し得ることを示唆する(Ruhfelら，1993の上記文献; Tanimotoら，1993の上記文献)。膜輸送要素の不在はprgZ決定基、traC決定基及びplpA決定基の間で共通の特徴であり、これは輸送がシグナル伝達に必要とされないこと、または異なる対立遺伝子が輸送に必要とされることを暗示する。
plpA及びami中の突然変異は形質転換効率の減少または増加を夫々生じる。加えて、これらの遺伝子座中の突然変異は成長段階特異性のコンピテント状態の誘発に影響する。親株と比較して、ami中の突然変異は応答能の早期開始を誘発し、一方、plpA中の突然変異はこの誘発を遅延する。更に、応答能調節遺伝子座への翻訳融合は、plpA中の突然変異が形質転換のプロセスに必要とされる遺伝子の発現に直接影響することを示した。応答能の誘発が細胞密度の関数として起こること(Tomasz, 1966, J.Bacteriol. 91:1050-61)を考慮すると、これらのパーミアーゼがシグナリング分子の結合及び／または輸送を媒介することにより応答能の細胞密度依存性誘発を調節する調節要素として利用できることを提案することは妥当である。その他の細菌中パーミアーゼの推定基質である小さいペプチドまたは細胞外のニューモコッカスアクチベータタンパク質はおそらくこれらのパーミアーゼのリガンドの候補である。サルモネラ  チフィムリウム及びエシェリキアコリのペプチドパーミアーゼ欠損変異体は放出された細胞壁ペプチドを培地に循環できないので、これらのパーミアーゼは細胞壁ペプチドを結合し、輸送することが提案されていた(Goodell及びHiggins, 1987, J.Bacteriol. 169:3861-65; Park, 1993, J.Bacteriol. 175:7-11)。こうして細胞壁ペプチドはおそらく候補である。最近の遺伝子学的証拠は、２価の陽イオン(Ni2+)輸送がまたE.coli中でペプチドパーミアーゼ機能にカップリングされることを示唆する(Navarroら，1993, Mol.Microbiol. 9:1181-91)。また、細胞内輸送にカップリングされた細胞外のCa2+は形質転換に影響し得ることが示されていた(Trombe, 1993, J.Gen.Microbiol. 139:433-439; Trombeら，1992, J.Gen.Microbiol. 138:77-84)。それ故、ペプチドパーミアーゼ介在性２価陽イオン輸送はまた細胞内シグナリング及びその後の形質転換の調節に関する実行できるモデルである。
実施例４
ピルベートオキソダーゼ同族体が付着性を調節する
この実施例はピルベートオキシダーゼ同族体をコードするExp変異体の単離及び配列決定を記載する。この新規なタンパク質は真核生物細胞への細菌付着を調節する。
鼻咽頭の内皮細胞への細菌付着は粘膜表面のコロニー形成及び感染の要件と認識される。ニューモコッカス細胞壁及び細菌表面のタンパク質は真核生物細胞への付着を媒介する。ニューモコッカスが真核生物細胞の表面で認識する分子決定基は複雑な糖、特に、GlcNAcβ1-3GalまたはGalNAcβ1-4Gal炭水化物部分である。
上記の実施例１に記載されたような変異体を、鼻咽頭中の細胞への付着を反映する血球凝集アッセイにおいて、型II肺細胞(T2LC)、ヒト内皮細胞(HUVEC)、及びGlcNAcβ1-3Gal糖受容体への結合の損失につきスクリーニングした。
92の独立の変異体のうちの一種（Pad1(pneumococcal  adherence 1)と称される）が、記載されたようなノイラミニダーゼ処理ウシ赤血球(Anderssonら，実施例２を参照のこと)につきGlcNAcβ1-3Gal糖受容体を血球凝集できないことを示した。続いて、この変異体はPoxBと改名された。ノイラミニダーゼ処理ウシ赤血球の血球凝集は鼻咽頭中の細胞への付着を反映する。pad1を不活化する親株の誘導された突然変異誘発は、血球凝集の損失がこの遺伝子座に関連することを再確認した。
また、この変異体は、図19に示されるように、T2LC及びHUVECへの付着性の70％より大きい減少を示した。
突然変異した遺伝子座pad1の回収及び再生はアセトヒドロキシ酸シンターゼ−ピルベートオキシダーゼファミリーの酵素に配列類似性を有する1.8kbの読み取り枠を明らかにした。特に、pad1は組換えpoxと51％の配列類似性を共有し、またpoxBと32％の配列類似性を共有する。親株中の遺伝子座の標的遺伝子分断は、この遺伝子座における突然変異が全ての三つのアッセイにおいて付着性の損失の原因であることを示した。
Pad1-PhoA融合を発現する変異体の細胞下の分別は、そのタンパク質が膜及び細胞質に局在化することを示した(図20A)。親株及び変異体株中の抗原性表面成分の比較は、Pad1に相当しない17kDaポリペプチドの損失を示した(図20B)。
これらの結果は、Pad1がおそらく細菌アドヘジンの発現を調節することにより多数の細胞型へのニューモコッカス付着に影響することを示す。
Pad1変異体は既知組成の培地中の増殖のために酢酸塩を必要とした（図21及び22）。酢酸塩中の増殖は肺細胞及び内皮細胞の両方への細菌の付着性を回復した。
pad1プロモーター領域に関するヌクレオチド配列情報は推定-35部位、-10taatat配列、リボソーム結合部位、及び翻訳開始部位を示す(図23)(配列番号55)。また、この領域の演繹タンパク質翻訳が示される(図23)(配列番号56)。
本発明はその他の形態で具体化でき、または本発明の精神もしくはその必須の特徴から逸脱しないでその他の方法で実施し得る。それ故、この開示は全ての点で限定ではなく例示と考えられるべきであり、本発明の範囲は請求の範囲により示され、また均等物の意味及び範囲内にある全ての変化がその中に含まれることが意図されている。
また、ヌクレオチドにつき示された全ての塩基対サイズ及びタンパク質に関する全ての分子量情報は概算であり、説明の目的で使用されることが理解されるべきである。
種々の文献がこの明細書中に引用され、それらの夫々が参考としてそのまま本明細書に含まれる。
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：ロックフェラー大学、H.ロバート  ピアス博士、バーバラJ.ツオマネン、エライン
（ii）発明の名称：細菌輸出タンパク質及びそれらをベースとする無菌体ワクチン
（iii）配列の数：56
（iv）通信住所
（A）受取人：クラウバー＆ジャクソン
（B）通り：ハッケンサック  アベニュー411
（C）都市：ハッケンサック
（D）州：ニュージャージー
（E）国：米国
（F）郵便番号：07601
（v）コンピュータ読取り可能形態：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換機
（C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリーズ#1.0、バージョン#1.25
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：WO指定される予定
（B）出願日：1994年９月１日
（C）分類：
（vii）先行出願データ：
（A）出願番号：US 08/245,511
（B）出願日：1994年５月18日
（vii）先行出願データ：
（A）出願番号：US 08/116,541
（B）出願日：1994年９月１日
（viii）代理人情報：
（A）名称：ジャクソンEsp.、デビッドA.
（B）登録番号：26,742
（C）参照／事件簿番号：600-1-069 PCT
（ix）連絡先情報：
（A）電話番号：201 487-5800
（B）テレファックス番号：201 343-1684
（C）テレックス番号：133521
（２）配列番号１の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：490塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU98
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..490
（xi）配列の記載：配列番号１
0003722834.tif 000010
（２）配列番号２の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：163アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２
0003722834.tif 000011
（２）配列番号３の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：960塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU42
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..960
（xi）配列の記載：配列番号３
0003722834.tif 000012
0003722834.tif 000013
（２）配列番号４の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：320アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号４
0003722834.tif 000014
（２）配列番号５の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：520塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU40
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..519
（xi）配列の記載：配列番号５
0003722834.tif 000015
（２）配列番号６の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：173アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号６
0003722834.tif 000016
（２）配列番号７の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：282塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU39
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..281
（xi）配列の記載：配列番号７
0003722834.tif 000017
（２）配列番号８の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：93アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号８
0003722834.tif 000018
（２）配列番号９の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：327塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU87
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..326
（xi）配列の記載：配列番号９
0003722834.tif 000019
（２）配列番号10の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：108アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号10
0003722834.tif 000020
（２）配列番号11の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：417塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU24
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..416
（xi）配列の記載：配列番号11
0003722834.tif 000021
（２）配列番号12の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：138アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号12
0003722834.tif 000022
（２）配列番号13の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：246塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU75
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..245
（xi）配列の記載：配列番号13
0003722834.tif 000023
（２）配列番号14の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：81アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号14
0003722834.tif 000024
（２）配列番号15の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：292塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU81
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..290
（xi）配列の記載：配列番号15
0003722834.tif 000025
（２）配列番号16の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：96アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号16
0003722834.tif 000026
（２）配列番号17の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：342塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU17
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..341
（xi）配列の記載：配列番号17
0003722834.tif 000027
（２）配列番号18の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：113アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号18
0003722834.tif 000028
（２）配列番号19の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：235塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU17
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..234
（xi）配列の記載：配列番号19
0003722834.tif 000029
（２）配列番号20の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：78アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号20
0003722834.tif 000030
（２）配列番号21の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：251塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU25
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：補体(2..250)
（xi）配列の記載：配列番号21
0003722834.tif 000031
（２）配列番号22の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：83アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号22
0003722834.tif 000032
（２）配列番号23の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：163アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号23
0003722834.tif 000033
（２）配列番号24の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：77アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU42
（xi）配列の記載：配列番号24
0003722834.tif 000034
（２）配列番号25の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：173アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU40
（xi）配列の記載：配列番号25
0003722834.tif 000035
（２）配列番号26の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：175アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ネイセリア  ゴノールヘアエ
（xi）配列の記載：配列番号26
0003722834.tif 000036
（２）配列番号27の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：69アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU39
（xi）配列の記載：配列番号27
0003722834.tif 000037
（２）配列番号28の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：69アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：リコペルシコン  エスクレンタム（トマト）
（xi）配列の記載：配列番号28
0003722834.tif 000038
（２）配列番号29の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：98アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU87
（xi）配列の記載：配列番号29
0003722834.tif 000039
（２）配列番号30の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：97アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：バチルス  スブチリス
（xi）配列の記載：配列番号30
0003722834.tif 000040
（２）配列番号31の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：69アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU24
（xi）配列の記載：配列番号31
0003722834.tif 000041
（２）配列番号32の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：69アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：バチルス  スブチリス
（xi）配列の記載：配列番号32
0003722834.tif 000042
（２）配列番号33の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：41アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU75
（xi）配列の記載：配列番号33
0003722834.tif 000043
（２）配列番号34の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：41アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  チフィムリウム
（xi）配列の記載：配列番号34
0003722834.tif 000044
（２）配列番号35の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：72アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU81
（xi）配列の記載：配列番号35
0003722834.tif 000045
（２）配列番号36の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：73アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ボルデテラ  ペルツシス
（xi）配列の記載：配列番号36
0003722834.tif 000046
（２）配列番号37の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：86アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU17
（xi）配列の記載：配列番号37
0003722834.tif 000047
（２）配列番号38の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：86アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリキア  コリ
（xi）配列の記載：配列番号38
0003722834.tif 000048
（２）配列番号39の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：78アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリキア  コリ
（xi）配列の記載：配列番号39
0003722834.tif 000049
（２）配列番号40の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号40
0003722834.tif 000050
（２）配列番号41の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号41
0003722834.tif 000051
（２）配列番号42の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：15塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号42
0003722834.tif 000052
（２）配列番号43の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：17塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号43
0003722834.tif 000053
（２）配列番号44の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：52アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号44
0003722834.tif 000054
（２）配列番号45の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：56アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（v）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（xi）配列の記載：配列番号45
0003722834.tif 000055
（２）配列番号46の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：2019塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：SPRU98
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号46
0003722834.tif 000056
0003722834.tif 000057
0003722834.tif 000058
0003722834.tif 000059
（２）配列番号47の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：643アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号47
0003722834.tif 000060
0003722834.tif 000061
0003722834.tif 000062
（２）配列番号48の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：642アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：amiA
（ｘ）刊行物情報：
（A）著者：アロイングら
（C）文献名：Mol.Microbiol.
（D）巻：４
（F）頁：633-644
（G）日付：1990
注：その文献は配列の誤りを含む。以下に示された正しい配列がゲンバンクから得られる。
（xi）配列の記載：配列番号48
0003722834.tif 000063
0003722834.tif 000064
（２）配列番号49の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号49
0003722834.tif 000065
（２）配列番号50の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号50
0003722834.tif 000066
（２）配列番号51の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号51
0003722834.tif 000067
（２）配列番号52の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号52
0003722834.tif 000068
（２）配列番号53の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号53
0003722834.tif 000069
（２）配列番号54の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1932
（xi）配列の記載：配列番号54
0003722834.tif 000070
（２）配列番号55の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：1929塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ストレプトコッカス  ニューモニアエ
（B）株名：R6
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：pad1(poxB)
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：154..1929
（xi）配列の記載：配列番号55
0003722834.tif 000071
0003722834.tif 000072
0003722834.tif 000073
（２）配列番号56の情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：591アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号56：
0003722834.tif 000074
0003722834.tif 000075
【図１Ａ】
0003722834.tif 000076
【図１Ｂ】
0003722834.tif 000077
【図２】
0003722834.tif 000078
【図３】
0003722834.tif 000079
【図４】
0003722834.tif 000080
【図５】
0003722834.tif 000081
0003722834.tif 000082
【図６】
0003722834.tif 000083
【図７】
0003722834.tif 000084
【図８】
0003722834.tif 000085
【図９】
0003722834.tif 000086
【図１０】
0003722834.tif 000087
【図１１Ａ】
0003722834.tif 000088
【図１１Ｂ】
0003722834.tif 000089
【図１１Ｃ】
0003722834.tif 000090
【図１１Ｄ】
0003722834.tif 000091
【図１２Ａ】
0003722834.tif 000092
【図１２Ｂ】
0003722834.tif 000093
【図１３】
0003722834.tif 000094
【図１４】
0003722834.tif 000095
【図１５】
0003722834.tif 000096
【図１６】
0003722834.tif 000097
【図１７】
0003722834.tif 000098
【図１８】
0003722834.tif 000099
【図１９Ａ】
0003722834.tif 000100
【図１９Ｂ】
0003722834.tif 000101
【図２０】
0003722834.tif 000102
【図２１】
0003722834.tif 000103
【図２２】
0003722834.tif 000104
【図２３Ａ】
0003722834.tif 000105
【図２３Ｂ】
0003722834.tif 000106
【図２３Ｃ】
0003722834.tif 000107
【図２３Ｄ】
0003722834.tif 000108