(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある基質に作用する酵素を用いる方法であって、前記酵素の活性が向上する方法において、前記方法が、ヒドロラーゼ類、リアーゼ類、イソメラーゼ類及びリガーゼ類から成る群から選択される少なくとも１種の酵素を、前記ある基質と接触させ、かつ、前記接触の少なくとも一部分の期間中に、前記少なくとも１種の酵素を、キセノン、アルゴン、ネオン、クリプトン及びそれらの混合物から成る群から選択される希ガスから本質的になるガスと、２０℃ないし６０℃の温度及び１０-2気圧から２気圧までの圧力において接触させることを含む方法。
【請求項２】
ある基質に作用する酵素を用いる方法であって、前記酵素の活性が向上する方法において、前記方法が、ヒドロラーゼ類、リアーゼ類、イソメラーゼ類及びリガーゼ類から成る群から選択される少なくとも１種の酵素を、前記ある基質と接触させ、かつ、前記接触の少なくとも一部分の期間中に、前記少なくとも１種の酵素を、キセノン、アルゴン、ネオン、クリプトン及びそれらの混合物から成る群から選択される希ガスから本質的になるガスと、０℃ないし６５℃の温度及び１０-2気圧から２気圧までの圧力において接触させることを含む方法。
【請求項３】
前記ガスが、前記希ガスの混合物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の酵素が、溶液中、固相形態、分散液中又は有機マトリックス中にある請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の酵素を前記ある基質と接触させる全ての期間中、前記少なくとも１種の酵素を前記ガスと接触させる請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、ヒドロラーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、リアーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、イソメラーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、リガーゼである請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
この発明は、希ガスによって酵素活性を調節する方法に関する。
【０００２】
【背景の説明】
希ガスであるヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒａ）の、他の原子との化学結合に参加する能力は非常に限られたものである。一般に、クリプトン、キセノンおよびラドンのみがフッ素および酸素のような他の原子と反応するが、それにより形成された化合物は爆発的に不安定である。 F.A.Cotton および G.Wilkinsonによる Advanced Inorganic Chemistry （ Wiley、第３版）を参照。しかしながら、一般に希ガスは化学的に不活性ではあるものの、キセノンが、麻酔のような生理学的効果を現わすことが知られている。他の生理学的効果も、窒素のような他の不活性ガスについて観察されており、窒素は、例えば、深海ダイビングにおいて非常に高い圧力の下で用いられる場合には昏睡状態を引き起こすことが知られている。
【０００３】
Schreiner に対する米国特許第 3,183,171号には、アルゴンおよび他の不活性ガスが真菌の成長速度に影響を与え得ること、およびアルゴンが魚および海産物の保存性を改善することが報告されている。Schvester に対する米国特許第 4,946,326号、JP 52105232 、JP 80002271 、JP 77027699 。しかしながら、これらの観察に対する根本的な理解の欠如が、それらの結果の解釈を、不可能ではないとしたならば、困難にしていることは明らかである。その上、これらの研究に、酸素を含む多くのガスの混合物が用いられたという事実が、そのような観察の意義を不明瞭なものにしている。さらに、これらの研究の幾つかは、高圧および凍結温度で行なわれている。そのような高圧では、観察された結果が、細胞成分および酵素自身の圧力損傷によるものであったことが考えられる。
【０００４】
例えば、Schreiner は、1964ないし1966年に、深海ダイビング、潜水艦および航空宇宙機のための適切な閉じ込め大気の開発に関する研究における不活性ガスの、特に麻酔効果に関する生理学的効果を文書にしている。この研究の結果は、３本の報告にまとめられており、それぞれ、海軍省海軍研究所（the office of Naval Research, Department of the Navy）に宛てて作成された「技術報告．アルゴン、ヘリウムおよび希ガス類の生理学的効果」との題目がつけられている。Contract Nonr 4115（00）、NR： 102-597。この研究の最後の３本の概要および要約は、公開された。
【０００５】
要約の１つである「不活性ガス相互作用および酵素的に活性なタンパク質に対する効果」 Fed.Proc.26：650 （1967）では、局部的な昇圧で、希ガスおよび他の不活性ガスが、生来のままの動物（昏睡状態）および微生物並びに哺乳動物細胞系（成長阻害）において生理学的効果を生じるという観察を改めて記述している。
【０００６】
第２の要約である「化学的に不活性なガスの生物学的活性についての可能な分子機構」In：Intern. Congr. Physiol.Sci. 、23rd、Tokyo では、種々のレベルの細胞性器官で、高圧で、不活性ガスが生物学的活性を示すという観察を改めて記述している。
【０００７】
また、希ガスの一般的な生物学的効果の概要が Schreinerにより公開されており、その中では、彼の初期の研究の主要な結果が再録されている。「ヘリウム−キセノン系元素の一般的な生物学的効果」 Fed. Proc. 27：872-878 （1986）。
【０００８】
しかしながら、1969年、Behnkeらが Schreinerの主要な結論に反駁した。Behnkeらは、Schreiner によって初期に報告された効果は再現性がなく、静水圧力からそれ単独で起こる、すなわち、酵素に対する希ガスの効果は見られないと結論付けた。「高圧での、不活性ガスによる影響を受けた酵素- 触媒反応」 J. Food
Ｓｃｉ．  ３４：370-375 。
【０００９】
基本的に、Schreiner の研究は、化学的に不活性なガスは細胞部位に対して酸素分子と競合し、酸素置換は不活性ガス濃度に対する酸素の割合に依存するという仮説に基づいていた。この仮説は、亜酸化窒素を用いて観察される、最も重大な観測された効果としてはいまだ示されておらず（抑制効果のみが観察されている）、酸素分圧から独立していることが見出された。その上、観測された抑制は、亜酸化窒素添加大気当りわずか 1.9％であった。
【００１０】
Schreiner の初期の研究に反駁するために、Behnkeらは、酵素に対する静水圧力の効果を独立に試験し、Schreiner によって得られた結果を再現しようと試みた。Behnkeらは、キモトリプシン、インベルタ−ゼおよびチロシナ−ゼのわずかな抑制が観察されるのに必要な圧力を越えて窒素またはアルゴンのガス圧を上昇させても、Schreiner の発見とは正反対に、抑圧のさらなる増加は起こらないことを見出した。
【００１１】
Behnkeらの発見は、圧力が安定する際に解放される単純な初期静水抑制（initial hydrostatic inhibition）によって説明することができる。明らかに、この発見は、Schreiner によって提唱された化学的なＯ2 ／不活性ガス相互依存では説明することができない。Behnkeらは、高圧不活性ガスは、酵素を物理的に変えることによるよりも、酸素利用率を減少させることにより、非流体（すなわち、ゼラチン）系においてチロシナ−ゼを抑制すると結論付けた。この結論は、Schreiner の発見と真っ向から対立する。
【００１２】
Behnkeらの反駁に加えて、Schreiner によって報告された結果は、同様に他の理由により、不可能というわけではないのであれば、説明が困難である。
【００１３】
第１に、全ての分析は非常に高い圧力で行われており、静水圧効果の制御が行なわれていない。
【００１４】
第２に、多くの場合、種々の希ガスの間にも、また希ガスと窒素との間にも重要な差異は見出されていない。
【００１５】
第３に、酵素の純度が用いられたように、これらの研究時においては、作用および抑制の酵素モ−ドについての知識は非常に貧しいものであった。酵素活性を混乱させることがなく、または異なるガスの有効性を評価するに十分な程度の解像性で測定が行なわれたことが確実であるとすることは不可能である。さらに、作用のどのモ−ドも、無試験の仮説としてしか説明することができない。
【００１６】
第４に、種々のガスの間の溶解度の相違は制御されておらず、結果において考慮もされていない。
【００１７】
第５に、全ての試験は、１気圧の空気に加えて高圧の不活性ガスを用いて行なわれており、酸素圧力の制御が不十分である。
【００１８】
第６に、報告されたガスの効果は全て抑制のみである。
【００１９】
第７に、作業の全ての手順が十分に記述されていないだけではなく、実験的に制御されていない可能性がある。さらに、酵素反応開始後の長い遅滞がそれに続く反応の全工程を妨げ、その結果、最も高い可読性の変化率の損失を招いている。
【００２０】
第８に、報告されたデ−タの範囲は少数の観察に基づく高い可変性を有しており、このため重要性が排除されている。
【００２１】
第９に、観察された抑制のレベルは、高圧においてさえ非常に小さい。
【００２２】
第10に、酵素濃度への依存を報告する研究では、有意な使用に耐える図面が報告されていない。
【００２３】
第11に、低圧、すなわち＜２気圧での不活性ガスの抑制能力の研究は、全て、実際のデ−タではなく、高圧での測定から補外されたラインに基づいて主張されている。
【００２４】
最後に、これは繰り返す価値のあることであるが、Behnkeらの結果は、幾つかの決定的な点において、Schreiner によって報告された結果を明らかに否定する。その主たるものは、高圧効果が小さく、Schreiner によっては制御されていない静水効果がそれらの研究における間違った結論の主な原因となっている点である。
【００２５】
加えて、キセノン、亜酸化窒素およびハロタンが微粒子シアリダ−ゼの活性を増強することがSandhoffらにより、FEBS Letters、62巻、 3号（1976年 3月）に報告されてはいるが、これらの結果は、この研究に用いられた酵素の純度が非常に低いために疑問であり、おそらく粒子中のオキシダ−ゼの抑制によるものであろう。
【００２６】
以下は、上記特許および刊行物をまとめ、およびそれらに関連する他のものに言及するために示すものである。
【００２７】
Behnkeら（1969）は、酵素触媒反応は高圧で不活性ガスにより影響を受けることを開示する。J. Food. Sci. 34：370-375 。
【００２８】
Schreiner ら（1967）は、酵素的に活性なタンパク質に対する不活性ガスの相互作用および効果を記述している。Abstract No.2209. Fed. Proc. 26 ：650 。
【００２９】
Schreiner, H.R. 1964、技術報告（Technical Report）には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの生理学的効果が記述されている。Contract Nonr 4115（00）、NR：102-597 。海軍研究所、ワシントン D.C.
Schreiner, H.R. 1965、技術報告（Technical Report）には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの生理学的効果が記述されている。Contract Nonr 4115（00）、NR：102-597 。海軍研究所、ワシントン D.C.
Schreiner, H.R. 1966、技術報告（Technical Report）には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの生理学的効果が記述されている。Contract Nonr 4115（00）、NR：102-597 。海軍研究所、ワシントン D.C.
上述の研究は、いずれも、処理ガスが酵素活性部位と相互作用することを示す、実験に基づく結論ではないことは重要である。
【００３０】
それにもかかわらず、現時点では、酵素活性が幾つかの方法で抑制されることが知られている。例えば、多くの酵素は、それらの通常の基質と構造的に関連する特定の毒によって抑制されることがある。代わりに、多くの異なる試薬が、標的酵素の特定の不活性化剤であることが知られている。一般に、これらの試薬は、酵素の活性部位に化学修飾を施して触媒活性の損失、活性部位指向性の非可逆的不活性化または親和性標識を誘発する。C.Walsh による「酵素反応機構（Enzymatic Reaction Mechanisms ）」（W.H. Freeman＆Co., 1979 ）を参照。代わりに、特定の多酵素配列（multi-enzyme sequence ）が、調節またはアロステリック酵素として知られている酵素によって調節されることが知られている。A.L. Leninger 、Bioenergetics （Benjamin／Cummings Publishing Co. 、1973）を参照。  しかしながら、酵素活性の調節へのより簡単なアプロ−チが予測可能かつ制御可能な方法でなされたならば、非常に好都合であろう。さらに、酵素活性を、予測可能かつ制御可能な方法で選択的に抑制もしくは増強する手段が見出されたならば、非常に好都合であろう。
【００３１】
【発明の概要】
したがって、この発明は、単純かつ簡便な方式で酵素活性を調節する方法を提供することを目的とする。
【００３２】
また、この発明は、標的酵素を不活性化するよう構造的に設計された試薬を用いることなく、酵素活性を調節する方法を提供することをも目的とする。
【００３３】
また、この発明は、通常の酵素基質と構造的に関連する酵素毒（enzyme poisons）を用いることなく、酵素活性を調節する方法を提供することをも目的とする。
【００３４】
さらに、この発明は、最適相対酵素基質濃度を移行させる方法を提供し、物理パラメ−タに関して最適の反応条件を修飾することを目的とする。
【００３５】
上述の目的および以下の記述からより明確になるであろう事項は、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスを含有するガスと接触させることを必要とする酵素活性の調節方法により与えられる。
【００３６】
【好ましい態様の詳細な説明】
この発明によると、驚くべきことに、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスを含むガスと接触させることにより、制御された予測可能な方式で酵素活性を調節できることが見出された。さらに驚くべきことに、希ガスは、低圧でさえ、かつ広い温度範囲にわたって、酵素に対する有意の効果を有することが見出された。
【００３７】
実際、この発明は、幾つかの理由により全く驚くべきものである。第１に、この発明によると、酵素の調節を低圧で行なうことが可能である。しかしながら、より高い圧力を用いることもできる。第２に、例えば、窒素、酸素、二酸化炭素、一酸化炭素および亜酸化窒素のような他のガスを含む希ガスの混合物を用いて優れた結果を得ることも可能である。一般に、この発明における希ガスに加えてガス混合物中にいかなるガスを用いることもできる。しかしながら、最も典型的には、そのような他のガスには酸素、窒素および二酸化炭素が含まれる。
【００３８】
ここで用いられる「希ガス」という用語は、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンまたはラドンの群からのいかなるガスをも意味するものである。しかしながら、一般に、ネオン、クリプトンまたはキセノンを用いることが好ましい。これは、単に、ヘリウムの溶解度が低く、かつ適用系からの逸脱速度が大きく、およびラドンは放射活性を有し危険であるためである。
【００３９】
この発明によると、単一の純粋な希ガスを用いることができ、また希ガスの混合物を用いることもできる。例えば、全ガス容量を基にした容量％でＫｒ約90％およびＸｅ10％の組成を有する、安価な製造プラント分離流ガス（offstream gas ）を用いることが好都合である。しかしながら、例えば、１種もしくはそれ以上の希ガスと、窒素、六フッ化硫黄、酸化炭素（carbon oxygen ）もしくは酸素のような他のガスとの混合物を用いることもできる。
【００４０】
この発明によると、酵素活性に対する１種もしくはそれ以上の希ガスの効果は、水溶液もしくは有機溶液、分散液、懸濁液またはゲルのような他のタイプのマトリックス中で観察されることが見出された。さらに、調節された酵素は、支持体に結合されても結合されなくてもよい。希ガスそれ自体は、溶液中にあっても、大気中にあっても、あるいは結合されていてもよい。
【００４１】
この発明は、Joint Commission on Biochemical Nomenclature of the International Union of Biochemistry and International Union of Pure and Applied Chemistry によって分類された６種の酵素クラスの全てを表わす酵素群が、低い圧力においてさえ、純粋な希ガスもしくはそれらの混合物または他のガスとの混合物とさせ接触させることにより、それらの活性が再現可能に増強もしくは抑制されるという基本的な発見に基づくものである。
【００４２】
この発明によると、この発明のガスおよびガス混合物は、酵素活性に対する速度論的および熱力学的制御の両方に作用する。すなわち、いまや酵素反応の速度および収量の両者を制御することが可能になったのである。
【００４３】
反応混合物におけるこの発明のガスおよびガス混合物の溶解度はガスおよびガス混合物の測定される効果に影響を及ぼすが、溶解度が効果を全て決定するわけではない。効果は、大きくは分極率、イオン性（ionicity）、ファン・デル・ワ−ルス力および原子半径のような分子効果によるものである。一般に、この発明によると、温度を上昇させることは、溶解度を減少させるために利用可能なガスを制限し、効果を減少させる。しかしながら、この効果の減少は、昇温に伴う分極の増加によって相殺される。このため、約30℃以上の温度で、ガスおよびガス混合物の増大した分極率は、ガスおよびガス混合物の効果として、溶解度特性よりも著しい影響を有する。
【００４４】
一般に、標準温度および圧力（ＳＴＰ）より上で希ガスおよび希ガス混合物のモル濃度を増加させることにより、酵素に対する観測される効果は増大する。さらに、効果はガス分子と酵素との相互作用に基づくように思われ、これは他のガスの添加とは独立しており、しかし他のガスの添加により改善され強化され得るものである。特に、希ガスの混合物は純粋な希ガスと同様の方式で振るまい、数種のガスの混合物は単一の希ガスを用いて観測された効果を模倣し、反対にし、または改良する。
【００４５】
加えて、この発明によると、特定の希ガスもしくはそれらの混合物が酵素活性を温度の関数として抑制または増強し得ることが見出された。
【００４６】
さらにまた、この発明によると、一般に、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］および［Ｓ］の適当な条件の下で、全ての酵素がこの発明による各希ガスにより特異的に抑制され得ることが見出された。
【００４７】
この発明は、酵素が用いられるいかなる用途における酵素活性の調節にも用いることができる。例えば、この発明は、ペニシリンのような抗生物質の生産；エタノ−ルおよび酢酸の生産；診断キットの製造；ビ−ル、ワインおよびチ−ズのような発酵生成物の製造；および大規模な酵素的変換一般に有利に用いることができる。
【００４８】
上述のように、この発明は酵素の活性の調節に有利に用いることができるものであって、酵素は６種の識別された酵素カテゴリ−のいずれからのものであってもよい。以下の例は説明のために示すものであり、限定することを意図するものではない。
【００４９】
特に、この発明は、例えば、デヒドロゲナ−ゼ、オキシダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、ヒドロキシダ−ゼおよびオキシゲナ−ゼを含むオキシドレダクタ−ゼの調節に有利に用いることができる。オキシドレダクタ−ゼの例としては、特に、チロシナ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ、アセトインデヒドロゲナ−ゼ、タウリンデヒドロゲナ−ゼ、オクトパインデヒドロゲナ−ゼ、アゾベンゼンレダクタ−ゼ、アセトインドキシルオキシダ−ゼ、ハイポタウリンデヒドロゲナ−ゼ、シュ−ドモナスシトクロ−ムオキシダ−ゼ、3-ヒドロキシアントラニレ−トオキシダ−ゼ、クロリドペルオキシダ−ゼ、シトクロ−ムＣ3 ヒドロゲナ−ゼ、メリオテ−ト 3- モノオキシゲナ−ゼ、ＣＤＰ-4- ケト-6- デオキシデグルコ−スレダクタ−ゼおよびルブレドキシンＮａＤ+ レダクタ−ゼおよびクロレ−トレダクタ−ゼを挙げることができる。しかしながら、いかなるオキシドレダクタ−ゼ類酵素であっても使用することができる。
【００５０】
この発明によって調節し得る酵素の第２のカテゴリ−は、トランスフェラ−ゼである。トランスフェラ−ゼの例としては、特に、カルノシン N- メチルトランスフェラ−ゼ、3-オキソアシルアシル担体タンパクシンセタ−ゼ、ラミナリボ−スホスホリラ−ゼ、ガラクト−ス 6- スルファリラ−ゼ、ジヨ−ドチロシンアミノトランスフェラ−ゼ、セドヘプチロキナ−ゼおよびサイコシンスルファロトランスフェラ−ゼ、8-グルタミルトランスペプチダ−ゼおよびアスパルテ−トアミノトランスフェラ−ゼを挙げることができる。しかしながら、いかなるトランスフェラ−ゼであっても使用することができる。
【００５１】
この発明によって調節し得る酵素の第３のカテゴリ−は、エステラ−ゼ、ホスファタ−ゼ、グリコシダ−ゼおよびペプチダ−ゼを含むヒドロラ−ゼである。
【００５２】
ヒドロラ−ゼの例としては、特に、ジヒドロクマリンヒドロラ−ゼ、β-D- グルコシダ−ゼ、α- グルコシダ−ゼ、リボソホモシステイナ−ゼ、アシルムラミルアラニンカルボキシペプチダ−ゼ、ウレイドスクシナ−ゼ、フロレチンヒドロラ−ゼおよび2-ハロ酸デハロゲナ−ゼを挙げることができる。しかしながら、どのようなヒドロラ−ゼであっても用いることができる。
【００５３】
この発明によって調節することができる酵素の第４のカテゴリ−は、例えば、デカルボキシラ−ゼ、アルドラ−ゼおよびデヒドラタ−ゼを含むリア−ゼである。リア−ゼの例としては、特に、フェニルアラニンアンモニアリア−ゼ、クエン酸シンセタ−ゼ、メチルグリコキシルシンセタ−ゼ、ウレイドグリコレ−トリア−ゼ、アリインリア−ゼ、コリスメ−トシンセタ−ゼおよびアルキル水銀リア−ゼを挙げることができる。しかしながら、いかなるリア−ゼであっても用いることができる。
【００５４】
この発明によって調節することができる酵素の第５のカテゴリ−は、例えば、ラセマ−ゼ、エピメラ−ゼ、シス- トランスイソメラ−ゼ、分子内オキシドレダクタ−ゼおよび分子内トランスフェラ−ゼを含むイソメラ−ゼである。言及し得る例としては、特に、グルコ−スホスフェ−トイソメラ−ゼ、ＵＤＰアラビノ−ス 4- エピメラ−ゼ、マレイルアセトアセテ−トイソメラ−ゼ、コリスメ−トムタ−ゼおよびムコネ−トシクロイソメラ−ゼを挙げることができる。しかしながら、いかなるイソメラ−ゼであっても用いることができる。
【００５５】
この発明によって調節することができる酵素の第６のカテゴリ−は、例えば、アミノ酸- ＲＮＡリガ−ゼ、酸- チオ−ルリガ−ゼ、アミドシンセタ−ゼ、ペプチドシンセタ−ゼおよびシクロリガ−ゼを含むリガ−ゼである。特に、アセチルコリンシンセタ−ゼ、セリル-2- ＲＮＡシンセタ−ゼ、カルノシンシンセタ−ゼおよびメチルクロトニルＣｏＡカルボキシラ−ゼを挙げることができる。しかしながら、いかなるリガ−ゼであっても用いることができる。
【００５６】
この発明は、一般に、酵素活性の調節方法を提供するものであるが、さらに幾つかの特定の方法をも提供する。
【００５７】
第１に、この発明は、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる酵素活性の増強方法をも提供する。
【００５８】
第２に、この発明は、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる酵素活性の抑制方法をも提供する。
【００５９】
第３に、この発明は、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、１種もしくはそれ以上の酵素の最適ｐＨおよび／または温度を移行させる方法を提供する。
【００６０】
第４に、この発明は、１種もしくはそれ以上のオキシドレダクタ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、オキシドレダクタ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法を提供する。
【００６１】
第５に、この発明は、１種もしくはそれ以上のヒドロラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、ヒドロラ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供する。
【００６２】
第６に、この発明は、１種もしくはそれ以上のリア−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、リア−ゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供する。
【００６３】
第７に、この発明は、１種もしくはそれ以上のイソメラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、イソメラ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供する。
【００６４】
第８に、この発明は、１種もしくはそれ以上のリガ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、リガーゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供する。
【００６５】
第９に、この発明は、１種もしくはそれ以上のトランスフェラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、トランスフェラ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供する。
【００６６】
第10に、この発明は、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることによる、最適相対酵素- 基質濃度を変化させる方法をも提供する。
【００６７】
第11に、この発明は、２種もしくはそれ以上の酵素の混合物における１種の酵素を選択的に調節する方法をも提供する。
【００６８】
これは重要なことであるが、６種の一般的な酵素のカテゴリ−の各々から上に列挙した酵素の例は、単に説明のために挙げたものであり、限定を意図するものではない。この発明に従うと、この発明によるガスおよびガス混合物を用いて、いかなる酵素であっても調節することができる。例えば、M. Dixonおよび E.C.Webb による「酵素（Enzymes ）」第３版（Academic Press）に記載されるいかなる酵素であっても、この発明によって調節することができる。
【００６９】
上述のように、一般に、１種もしくはそれ以上の希ガスを含むガスは、単一で純粋な希ガスであっても、または希ガスの混合物であってもよい。また、このガスは、１種もしくはそれ以上の希ガスと上述の他のガスとの混合物であってもよい。
【００７０】
酵素はいかなる形態であってもよい。例えば、調節された酵素は、水溶液、水系もしくは有機溶液中にあってもよい。酵素は、ゲルのような他のマトリックス中にあってもよい。また、酵素は非結合もしくは結合形態であってもよく、植物および他の組織のような細胞もしくは生細胞中の結合形態であってさえよい。
【００７１】
例えば、結合酵素の調節にこの発明を用いる場合には、多くのタイプの用途に用いることができる。例えば、結合酵素は、バッチリアクタ−、連続フロ−撹拌タンクリアクタ−、充填床リアクタ−のようなカラムリアクタ−、または流動床リアクタ−にさえ用いることができる。
【００７２】
さらに、酵素抽出および精製のコストが禁止的であり、またはその本来の環境から除去するときに酵素が不安定である場合には、細胞内での結合酵素の使用は好都合である。例えば、Ｌ−シトルリンはシュ−ドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の固定細胞を用いて調製することができ、ウロカニン酸はアクロモバクタ・リキジウム（Achromobacter liquidium ）の固定細胞を用いて調製することができる。
【００７３】
さらに、この発明は、グルコ−スオキシダ−ゼを用いるグルコ−スの測定に用いられる電極のような酵素電極に伴う酵素活性の調節にも用いることができる。
【００７４】
この発明は、制御可能かつ予測可能な方式での酵素活性の調節が望ましい場合に有利に用いることができる。
【００７５】
この発明をさらに記述するために、酵素の６種の基本的なクラスの各々をより詳細に記載する。
Ｉ．オキシドレダクタ−ゼ
一般に、オキシドレダクタ−ゼ類酵素は希ガスによって強く抑制される。しかしながら、抑制の量は１種の希ガスから他に、および１種の希ガス混合物から他に変化する。
【００７６】
キセノンは、オキシドレドクタ−ゼ反応の速度に対して最も高い効果を示し、反応の最終平衡を低下させる。他の希ガスは、全て、それらの溶解度および分子特性の両者に依存して、より軽い程度に反応速度を抑制し、かつ反応の最終平衡を低下させる。クリプトンは、キセノンよりもいくらか軽い効果を有し、アルゴンは低温で非常に活性である。したがって、この発明に従い、周囲温度もしくは冷却温度のいずれを用いるかに依存して、オキシドレダクタ−ゼ活性を最適化するために異なるガス混合物を用いることができる。
【００７７】
１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を用いることにより、用いられる適格なガスもしくは混合物、基質、温度およびガス圧に依存して、種々のオキシドレダクタ−ゼ抑制が得られる。
II．トランスフェラ−ゼ
一般に、トランスフェラ−ゼ類酵素は抑制される。例えば、希ガスもしくはそれらの混合物により、アミノトランスフェラ−ゼは抑制され、トランスペプチダ−ゼは抑制される。
【００７８】
一般に、クリプトンは最も高い抑制または効果を示すが、トランスフェラ−ゼのサブクラスに依存するいくらかの変動を伴う。反対に、ネオンは、用いられるトランスフェラ−ゼのサブクラスに依存して、最も低い抑制および増強効果の両者を示す。
III ．ヒドロラ−ゼ
一般に、全てのヒドロラ−ゼ類は、希ガスもしくはそれらの混合物によって強く増強される。
【００７９】
クリプトンが最も低い増強効果を示すのに対して、キセノンが最も高い増強効果を示すことは注目される。
【００８０】
しかしながら、所望であれば、ヒドロラ−ゼも抑制することができる。
IV．リア−ゼ
一般に、リア−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの混合物により強くもしくは穏やかに増強される。しかしながら、いくつかのガスは、次善の条件の下ではリア−ゼ酵素活性を抑制する。
【００８１】
アルゴンが最も低い増強効果を示すのに対して、キセノンは最も高い増強効果を示す。
Ｖ．イソメラ−ゼ
一般に、イソメラ−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの混合物により強くまたは穏やかに増強される。
【００８２】
しかしながら、アルゴンおよびそれを含有する混合物は、高温では誘発されて酵素活性を抑制し得る。
VI．リガ−ゼ（シンセタ−ゼ）
一般に、リガ−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの混合物により強く増強される。
【００８３】
この発明による、１種もしくはそれ以上の希ガスの酵素活性に対する効果を測定する際に用いられるプロトコルを明確にするために、以下に典型的かつ例示的な実験プロトコルを記述する。
一般的なプロトコル
溶液の調製：  酵素（ユニット／ｍｌ）および基質（μｇ／ｍｌ）を適当な緩衝液（酵素の最適ｐＨおよびモル濃度）中に希釈することにより最適Ｗ／Ｖ溶液を調製する。この溶液は、活性の損失を避けるために、直ちにガス実験に用いられる。種々の酵素および基質濃度並びに阻害剤を用いることができる。物理パラメ−タは要求に応じて変化する。
【００８４】
分光分析装置：  実験は、温度制御され、ＩＢＭ  ＰＳ／２  ３０パ−ソナル・コンピュ−タに接続されたパ−キン・エルマ−・ラムダ６ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器を用いて実行する。ＩＢＭには２種のソフトウェア・パッケ−ジ（スペクトルの記録および観察のためのＰＥＣＳＳまたはＵＶＤＭ、速度論的研究のための改良ＥＮＺＦＩＴＴＥＲおよびＧｒａｆｉｔ）をロ−ドする。
【００８５】
全域スペクトル：  最終反応混合物の他に、酵素および基質種の全域スペクトルを取ることにより、酵素反応をリアルタイムで追跡するのに適切な波長を決定することができる（主吸収ピ−クに相当する波長）。吸収剤種は測定してブランクとする。種々の色原体物質を用いることができ、特定の環境下では、色原体反応を研究する酵素反応と一緒にすることができる。
【００８６】
希釈系列：  ガス実験を進行させるための最適酵素／基質比を見出すために、希釈系列を実行する。反応を最適条件で実行し、次いで最適範囲を超え（superoptimal）、かつ下回る（suboptimal）範囲の基質で行ない、その後、種々の抑制剤で行なう。
【００８７】
シリコ−ン密封キュベットの調製：  1 ｃｍの光透過性のアクリル製もしくは水晶製キュベットをシリコ−ンラバ−・シ−ラ−で塞ぐ。このシリコ−ンを、気密キュベットを得るために、48時間硬化させる。キュベットを空気でパ−ジしてＧＣ／ＭＳで測定される化学的なガス汚染物質を除去し、漏れの試験を行なう。
【００８８】
試料の調製：  気密シリンジを用いて、キュベットに基質溶液 2ｍｌを充填する。気密血清バイアルを酵素および溶媒で充填する。このキュベットおよび血清バイアル中で、注入の間隔を 1時間あけて十分なガスを連続的に泡立て、ガスの平衡を最大にする。適切なガスを充填する前に、全てのシリンジおよびデッド・スペ−スをパ−ジする。使用するガスの量は、必要とする溶液を飽和するに十分な量であることを測定する。
【００８９】
コントロ−ル：  Ｔ、Ｐ、他のガス、空気の漏れ、材料、ガスの変性および試薬の品質、ｐＨを含む、妨害となる可能性のある全てのパラメ−タを制御する。意味を持つまで繰り返しを行なう。
【００９０】
分光分析タイム・ドライブ、反応速度、および速度論的分析：  実行の40分前に、キュベットおよび血清バイアルをガスで飽和させる。空気との接触を避けるために、ガス充填シリンジを用いて酵素溶液 0.5ｍｌを回収する。酵素 0.5ｍｌをシリンジで同時に注入して、試料に共通の開始時間を生じせしめる。７種のガス（空気、Ｏ2 、Ｎ2 、Ｎｅ、Ａｒ、Ｋｒ、Ｘｅ）を、種々の温度（ 0ないし60℃）で実行する。大気に対する反応の速度または最終平衡における変化を記録する。添加した酸素、および脱酸素化との比較も行なう。いくつかの試料は加圧下で調製する。
完全な実験プロトコル
完全な実験においては、最適ｐＨおよび緩衝塩濃度の酵素を、溶液中において 5倍濃度の塩基、 1気圧（飽和溶液）、10％および50％飽和、並びに 1.5および 2気圧および少なくとも１つのより高い圧力の希ガス、並びに 1および 2気圧で全ガスの10％、20％および50％に相当する追加の酸素と反応させる。このときの各々の温度は 0ないし65℃で 5℃ずつ上昇し、Ｎ2 、Ｏ2 、Ａｒ、Ｎｅ、Ｋｒ、Ｘｅ、空気および特別な場合には他のガスを用い、並びに上述のガスのデシル混合物を用い、加えて、酵素を静水制御下で非常に高い圧力にさらす。コントロ−ルも、減圧により溶液を排除した後実行する。反応は、走査分光分析器において、リアルタイムに熱量測定により監視し、その信号を数学的に処理して速度および収量の差異を得る。試料数は一定であり、結果の有意性を確実にするに十分なものである。全てのパラメ−タは独立に制御および測定され、時折より複雑な実験が行なわれる。
【００９１】
デ−タは、各試料キュベットについて１つのリアルタイム生成物形成プロット（標準速度曲線）の形で得られる。これは、標準の手順で上書き（オ−バ−レイ）され、各 6ないし12のキュベット実験について１つのオ−バ−レイをなしている。そのようなオ−バ−レイを添付する。これらの曲線および全ての機器パタメ−タを構築するＸ−Ｙデ−タ・ポイント表も作成する。これらのデ−タをさらに変形して、曲線間の差異、収量間の差異、速度間の差異、もしくは他の論理的な比較を計算してもよい。これらは、いくつかの独立したソフトウェア・プログラムを用いて計算する。これらのプログラムは、単純もしくは複雑な普通の数学的表現、線形もしくは非線形回帰曲線近似、log-標準変換、酵素的速度の計算（Michaelis-Menten、Eadie-Hofstee 、Lineweaver-Burk ）、および多変量解析を利用している。
【００９２】
この発明をより完全に記述するために、以下の例を参照するが、これらの例は単に説明のために提示されたものであり、限定を意図するものではない。
クラスＩ．オキシドレダクタ−ゼ（ＥＣ１）
0003655322.tif 000002
上記結果は、特に温度および基質濃度に依存する。
クラスII．トランスフェラ−ゼ（ＥＣ２）
0003655322.tif 000003
クラスIII ．ヒドロラ−ゼ（ＥＣ３）
0003655322.tif 000004
上記結果は、温度、基質濃度、および基質のタイプに依存する。異なる競合基質を添加すると、キセノンを用いて、 200％までの増強が得られた。
クラスIV．リア−ゼ（ＥＣ４）
例  ６
結果は、温度および［Ｅ／Ｓ］に従って変化し得る。
【００９３】
0003655322.tif 000005
クラスＶ．イソメラ−ゼ（ＥＣ５）
0003655322.tif 000006
「ストレス」は、非最適基質濃度または温度の条件を示す。
クラスVI．リガ−ゼ（シンセタ−ゼ）（ＥＣ６）
これらの酵素は増強されるが変動が大きく、非常に活性部位特異性である。
【００９４】
観測最大増強  対  観測最大抑制（温度依存性）：
0003655322.tif 000007
一般に、高温では抑制が起こる。低温では増強が起こる。窒素は、最適温度を越える温度以外では、通常希ガスよりも効果が非常に小さい。我々は、希ガスは、反応にとって他の点では次善である条件の下で、この反応を最適の収量および速度の方向に増強していると見ている。我々は、混合ガスは、使用するガスに依存する最適条件の下で起こると考えている。
【００９５】
さらに例を参照してこの発明を説明するが、以下の例は説明を目的とするものであって、限定することを意図するものではない。
チロシナ−ゼ触媒反応：
チロシナ−ゼ（モノフェノ−ル、ジヒドロキシフェニルアラニン：酸素オキシドレダクタ−ゼ；ＥＣ 1.14.18.1）は、オルトジフェノ−ルからオルトキノンへの反応を触媒するモノフェノ−ルモノオキシゲナ−ゼである。
【００９６】
チロシナ−ゼは、果物のブロ−イング（browing ）および食料品の腐敗に重要である。
実験プロトコル
１）溶液調製：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.85、酵素に最適なｐＨ）において、酵素（ユニット／ｍｌ）および基質（μｇ／ｍｌ）を希釈して10％Ｗ／Ｖ溶液を調製する。この溶液を冷蔵庫（ 0 - 5℃）に保存し、活性の損失を避けるために 2、 3日以内にガス実験に使用する。
【００９７】
２）分光分析装置：実験は、ＩＢＭ  ＰＳ／２  ３０パ−ソナル・コンピュ−タに接続されたパ−キン・エルマ−・ラムダ６ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器を用いて実行する。このＩＢＭ機には、２種のソフトウェア・パッケ−ジ（スペクトルを記録および観察するためのＰＥＣＳＳ、速度論的研究のためのＥＮＺＦＩＴＴＥＲ）がロ−ドされている。
【００９８】
３）全域スペクトル：Ｅ、Ｓ、およびＥ＋Ｓの全域スペクトルをとることにより、酵素反応を追跡するのに適した波長を決定することができる（主吸収ピ−クに相当する波長）。
【００９９】
４）希釈系列：ガス実験の進行に最適な［Ｅ］／［Ｓ］比を見出すために、希釈系列Ｅ対Ｓ、およびＳ対Ｅを実行する。吸光度の読取りに従い、２つのブランク（緩衝液＋Ｅもしくは緩衝液＋Ｓ）のうちの最良のものを選ぶ。
【０１００】
５）シリコ−ン密封キュベットの作製：アクリル製ディスポ−ザブル・キュベット（ 1ｃｍ、光透過性）を透明シリコ−ン・ラバ−・シ−ラ−で塞ぐ。気密キュベットを得るために、このシリコ−ンを48時間硬化させる。
【０１０１】
６）実行試料の調製：アクリル製キュベットに、気密シリンジを用いて、基質溶液 2ｍｌを充填する。気密血清バイアルに酵素を充填する。キュベットおよびバイアル内で、注入の間隔を 1時間あけて、3 ×10ｃｃのガスを連続的に泡立てる。これは、ガスの平衡を最大にしつつ死容積の10×置換を行なうことを意味する。適切なガスを充填する前に、全てのシリンジおよびデッド・スペ−スをパ−ジする。 3回目の10ｃｃ注入の後、キュベットおよびバイアルを、 2本のシリンジに適切なガスを充填した状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放置する。
【０１０２】
７）コントロ−ル：Ｔ、Ｐ、他のガス、空気漏れ、材料、ガスの変性および試薬の品質、ｐＨを含む妨げとなる可能性のある全てのパタメ−タを制御する。意味を有するまで繰り返しを行なう。
【０１０３】
８）分光分析の実行：実行の前40分に、キュベットおよびバイアルを10ｃｃのガスで充填する。空気との接触を避けるために、ガス充填シリンジを用いて酵素溶液 0.5ｍｌを補う。共通の開始時間ｔ0 を生じせしめるために、酵素 0.5ｍｌをシリンジで試料に同時に注入する。７種のガス（空気、Ｏ2 、Ｎ2 、Ｎｅ、Ａｒ、Ｋｒ、Ｘｅ）を、各々５種の温度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）で実行する。対大気との反応の速度および最終平衡における変化を記録する。
２．試薬
0003655322.tif 000008
・チロシナ−ゼ・ユニット定義： 1ユニットは、L-チロシンを用いて、ｐＨ       6.5、25℃で、 1分当りＡ280 を 0.001増加させる。反応容積 3ｍｌ。
【０１０４】
0003655322.tif 000009
0003655322.tif 000010
５．機器および機材：
5.1.  機器：
自動移送熱電5-セルホルダ（ 5×5 試料および参照セルホルダ、モデルＣ005-0515）を備えたパ−キン・エルマ−・ラムダ  ６  ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器（狭バンド幅分光分析器）
パ−キン・エルマ−・ラムダ・アクセサリ・インタ−フェイス（モデルＣ691-0000）
パ−キン・エルマ−・デジタル・コントロ−ラ（モデルＣ 570-0701 ）
パ−キン・エルマ−温度プログラマ（モデルＣ 570-0710 ）
ＩＢＭ  ＰＳ／２  ３０  パ−ソナル・コンピュ−タ
エプソン  ＥＸ800 プリンタ
ソフトウェア：
・ＩＢＭ  ＤＯＳ（ディスク・オペレ−ティング・システム・バ−ジョン        3.30、Boca Raton、FL）
・ＰＥＣＳＳ（パ−キン・エルマ−・コンピュ−タライズド・スペクトロスコピ・ソフトウェア、Norwalk 、CT）
・ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（非線形回帰デ−タ分析プログラム、
Elsevier-BIOSOFT、Cambridge 、UK）
・ＰＩＺＡＺＺ  ＰＬＵＳ（プリント拡張ソフトウェア、APTEC 、Pepperell 、MA）
メトラ−  ＡＥ100 はかり：
・計量範囲： 0〜 109ｇ
・可読性： 0.1ｇ
バ−ンステッド（Barnstead ） NANOpure II  カ−トリッジ脱イオン・システム
ト−キョ−・リカキカイ社  マイクロ・チュ−ビング・ポンプＭＰ-3（パ−キン・エルマ−水冷セル用）
5.2.  機材
100、 200ｍｌメスフラスコ
ＦＩＳＨＥＲブランドのアクリル製キュベット（標準タイプ／メタクリレ−ト／ＵＶグレ−ド／使い捨て）： 1ｃｍ  光透過性、溶液 3ｍｌ保持可能な角型キュベット
100％シリコン・ラバ−・シ−ラ−（透明）
3ｍｌゴム栓付血清バイアル
1／100 ｍｌ目盛の 1ｍｌ（1 ml in 1/100 ml）使い捨て血清用ピペット
1／100 ｃｃ目盛の 1ｍｌ使い捨てツベルクリン・シリンジ
1／5 ｃｃ目盛の10ｃｃ使い捨てシリンジ
20Ｇ  １ 1/2”使い捨て針
６．技法の開発
6.1.  初期観測
チロシナ−ゼ、L-チロシンおよび酵素反応の最終生成物を用いて全域走査（ 900-190ｎｍ）を実行した。
0003655322.tif 000011
6.1.3.  主吸収ピ−クの決定：
この目的のために、グラフィック・カ−ソル（Homeキ−）を用いた。
【０１０５】
チロシナ−ゼ： 275ｎｍに吸収ピ−ク（タンパク）
L-チロシン： 275ｎｍに吸収ピ−ク
反応の最終生成物： 480ｎｍおよび 305ｎｍに吸収ピ−ク
6.1.4.  反応の追跡に適した波長の決定
３つの全域スペクトルのオ−バ−レイ（図５）から、 480または 305ｎｍのいずれかにおいて、L-チロシンの酵素的酸化還元の観測を最適に行ない得ることが示唆される。
0003655322.tif 000012
時間駆動（timedrive ）は、セル・プログラマ（ＣＰＲＧ）の命令を用いて実行した。この命令は、セル 5個までの時間駆動デ−タを同時に記録する。
【０１０６】
0003655322.tif 000013
結論：
最適条件は、［Ｅ］／［Ｓ］（ 100μｇ／ｍｌ）／（ 100μｇ／ｍｌ）で、吸光度の変化を 305ｎｍで観測するものである。
6.2.  予備実験
6.2.1.  試料および参照の調製：
キセノン飽和試料（サンプリング手順を参照）
空気試料： 1ｍｌピペットを用いて、アクリル製キュベットを 2ｍｌの基質              T-3754で充填し、プラスチックキャップで蓋をする。この手順は、後に、プラスチックキャップの使用からシリコ−ン密封キュベットの使用に変わった。大きな差異は見出せなかった。
【０１０７】
参照（ブランク）：プラスチックキャップで蓋をしたアクリル製キュベット
・B1： 2ｍｌ T-3754 （ 100μｇ／ｍｌ）＋ 0.5ｍｌリン酸Ｎａ緩衝液
・B2： 2ｍｌリン酸Ｎａ緩衝液＋ 0.5ｍｌ T-7755 （ 100μｇ／ｍｌ）
6.2.2.   305ｎｍでの時間駆動
ブランクＢ１：
・空気試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0114．ＳＰ
・キセノン試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0115．ＳＰ
ブランクＢ２：
・空気試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0116．ＳＰ
・キセノン試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0117．ＳＰ
L-チロシン・ブランク（Ｂ１）は吸光度の読取値を下げることが見出される。このため、チロシナ−ゼ・ブランクを用いる実験（Ｂ２）を優位に用いる。
【０１０８】
これら４つの時間駆動は、キセノンに対して最適な抑制曲線を示す。後記の実行（6.3.7.および 7.2. ）に関しては、L-チロシン溶液は時間と共に減衰し、これが吸光度の読取値の減損を引き起こす。
6.3.  技法の開発：
6.3.1.  工程１：シリコ−ン密封キュベットの作製
アクリル製の使い捨てキュベットを透明シリコン・ラバ−・シ−ラ−で塞ぐ。シリコ−ンは24時間乾燥させる。24時間後、気密アクリル製キュベットが得られる。これらは、水中で泡立ちについて試験する。
6.3.2.  工程２：基質サンプリング手順
シリコ−ン密封アクリル製キュベットに、 1ｃｃシリンジ（ 1／100 ｃｃ目盛）
を用いて、基質 2ｍｌを充填する。
【０１０９】
正確にサンプリングするために、シリンジをタップして空気を除去する（これは、基質溶液容積の妨げとなる）。
【０１１０】
充填したキュベットを冷蔵庫（0-5 ℃）内に保存する。
【０１１１】
ブランクＢ１（ 2ｍｌ T-3754 ＋ 0.5ｍｌリン酸ナトリウム緩衝液）を、プラスチックで栓をしたキュベット中に調製する。これは、後に、シリコ−ン密封キュベットの使用に変更になる。
6.3.3.  工程３：酵素サンプリング手順
血清バイアルに、 1ｍｌピペット（ 1／100 ｍｌ目盛）を用いて、酵素 2ｍｌを充填し、ゴム栓で蓋をし、アルミニウム・キャップでクリンプシ−ル（crimp-sealed）する。血清バイアルは気密になる。
【０１１２】
充填した血清バイアルを冷蔵庫（ 0-5℃）内に保存する。
6.3.4.  工程４：ガス飽和手順（アルゴン、クリプトン、ネオン、酸素、キセノン）
注入の間隔を 1時間あけて、シリコ−ン密封キュベットおよび血清バイアル（T-3754、T-7755）中で、 3×10ｃｃのガスを連続的に泡立てる。これは、ガスの平衡を最大にしながら死容積を10×置換することを意味する。
【０１１３】
適正なガスを充填する前に、全てのシリンジおよびデッド・スペ−スをパ−ジする。 3回目の10ｃｃの注入の後、シリコ−ン密封キュベットおよび血清バイアルを、 2本の10ｃｃシリンジに適正なガスを充填した状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放置する。
6.3.5.  注：
空気試料（酵素および基質の両者）にはいかなる泡立ても行なわない。アクリル製キュベットは正規のビニルキャップ（非気密性）で塞がれている。この手順は、後に、シリコ−ン密封キュベットの使用に変更される。密封した上での空気泡立て処理との多数の比較では、２つの方法の間に差異は見られない。
6.3.6.  工程５：分光分析の実行
ａ．シリコ−ン密封キュベット、血清バイアルおよびプラスチックのキャップをしたキュベットを冷蔵庫から取り出す。この手順は、後に変更される（7.1.5.参照）。
【０１１４】
ｂ．シリコ−ン密封キュベットおよび血清バイアルにガス10ｃｃを充填し、 2本の10ｃｃシリンジの下で、室温（26℃）で放置した。
【０１１５】
ｃ．キュベットをセルホルダに置き、10分間、セルホルダと温度を平衡にする。
【０１１６】
ｄ． 1ｃｃシリンジに適正なガスを充填し、血清バイアルから酵素 0.5ｍｌを回収するのに用いる。これは、酵素のサンプリングの間にバイアル中に空気が混入することを防ぐためである。
【０１１７】
ｅ．実行：
キュベットへの逐次的な酵素の 0.5ｍｌシリンジ注入を、セル５ないしセル１に可能なかぎり素早く行なう（遅延Ｘ＝ 2秒）。この手順は、後に、同時注入に変更される。
0003655322.tif 000014
0003655322.tif 000015
0003655322.tif 000016
0003655322.tif 000017
7.3.  結果の図示
時間駆動オ−バ−レイ／温度  −  添付
時間駆動オ−バ−レイ／ガス  −  添付
７．最終手順：
7.1.  最終実験プロトコル：
7.1.1.  工程１：シリコ−ン密封キュベットの作製
酵素抑制を妨げ得る酢酸蒸気を除去するために、シリコ−ンを48時間硬化させる以外は、6.3.1.と同じである。これは、検定により確認される。
7.1.2.  工程２：基質サンプリング手順
6.3.2.と同じ。
【０１１８】
ガス飽和工程（7.1.4.）を行なわないこと以外は（シリコ−ン密封キュベット内で）同様の手順に従い、ブランクＢ２（リン酸ナトリウム緩衝液 2ｍｌ＋ T-7755  0.5ｍｌ）を調製する。
【０１１９】
コントロ−ルのチェックでは、作業吸収領域内にはいかなるガスの吸収も見出されない。
7.1.3.  工程３：酵素サンプリング手順
6.3.3.と同様。
7.1.4.  工程４：ガス飽和手順（空気、アルゴン、クリプトン、ネオン、窒素、酸素、キセノン）
3×10ｃｃのガスを、各ガス注入の間隔を20分（ 0-5℃で）あけて、シリコ−ン密封キュベットおよび血清バイアル（T-3754、T-7755）内で泡立てる。
【０１２０】
３回目の10ｃｃ注入の後、キュベットおよび血清バイアルを、２本の10ｃｃシリンジに適正なガスを充填した状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放置する。
7.1.5.  工程５：分光分析の実行
ａ．実験の実行の40分前に、シリコ−ン密封キュベットを冷蔵庫から取り出し、
２本の10ｃｃシリンジの下で、ガス10ｃｃを充填して室温（26℃）に放置する。
【０１２１】
ｂ．実験の実行の25分前に、血清バイアルを冷蔵庫から取り出し、２本の10ｃｃシリンジの下で、ガス10ｃｃを充填して冷蔵庫に戻す。
【０１２２】
ｃ．実行の15分前に、シリコ−ン密封キュベットから10ｃｃシリンジ（および針）を取り除く。このキュベットをセルホルダに置き、10分間でセルホルダと温度平衡にする。
【０１２３】
ｄ．実行の 5分前に、 1ｃｃシリンジにガスを充填し、血清バイアル内の酵素溶液 0.5ｍｌを回収する。これは、酵素のサンプリングの間にバイアル内に空気が混入することを防ぐためである。
【０１２４】
ｅ．実行：
シリコ−ン密封キュベットをセルホルダから手短に取り外し、タップしてキュベットをウォ−ミンアップしている間に形成され得る気泡（これは特に30および35℃で真実である）を静め、セルホルダに戻す。
【０１２５】
酵素の 0.5ｍｌシリンジ注入を同時に行ない、試料に共通の開始時間ｔ0 を生じせしめる。
0003655322.tif 000018
0003655322.tif 000019
0003655322.tif 000020
0003655322.tif 000021
7.3.  結果の図示：
時間駆動オ−バ−レイ／温度  −  添付
時間駆動オ−バ−レイ／ガス  −  添付
7.4 酵素速度論：エンズフィッタ−(ENZFITTER)
チロシナーゼ-L- チロシン反応から得られた結果から、次の結論が導かれる。
【０１２６】
キセノンは、著しく、チロシナーゼ-L- チロシン反応の速度を阻害し、最終平衡を下降させる。さらに、その他の希ガスは、全て、それらの溶解性および分子特性の両方に従って、より少ない程度で、この反応の速度を阻害し、最終平衡を下降させる。クリプトンは、通常、キセノンと同様でより少ない効果を有し、一方、アルゴンは、驚くべきことに低温で活性である。
【０１２７】
さらに、酸素消耗の効果は、窒素を使用することにより制御できる。アルゴンと比較した場合に、窒素は、活性部位相互作用のための物理的能力が損なわれることがわかる。アルゴンは、窒素と比較してより活性であることは明らかである。
このことは、その他の酵素にも当てはまることも同様に明らかである。
【０１２８】
溶解性の差としてだけ、観察された阻害の割合、活性部位相互作用または誘導されたたんぱく質の構造変化が起こることを説明できる。
【０１２９】
酵素速度論は、以下に含まれている。
【０１３０】
高圧試験：
試験は、２気圧または３気圧でリアルタイムに既に溶液に飽和させた後、または、１リットルシリンダ中で１時間〜２４時間３０．６気圧および１００気圧で加圧した後に、試験ガスの添加により加圧された圧力セル中で行われた。
【０１３１】
次の試験手順を用いた。
0003655322.tif 000022
【０１３２】
0003655322.tif 000023
【０１３３】
0003655322.tif 000024
【０１３４】
0003655322.tif 000025
【０１３５】
0003655322.tif 000026
コントロール：  コントロールＡ：酵素は加圧せずガスシリンダ中に配置しない。
【０１３６】
コントロールＢ：酵素は加圧せずガスシリンダ１に配置する。
【０１３７】
ガス１（空気）のためのコントロール
コントロールＣ：酵素は加圧せずガスシリンダ２に配置する。
【０１３８】
0003655322.tif 000027
【０１３９】
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【０１４０】
0003655322.tif 000029
【０１４１】
0003655322.tif 000030
【０１４２】
シリンダをドックに移し、適当なガスを注入し、30.6atm までゆっくりと加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。
【０１４３】
ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混合液において                TDrive/CPRG を行う。
【０１４４】
酵素１、ガス１、圧力１、繰り返し１
酵素１、ガス２、圧力１、繰り返し１
シリンダをドックに戻し、適当なガスを用いて100atmまで再び加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。
【０１４５】
ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリンダから別々のビーカーに移し、直ちに酵素／基質混合液においてTDrive/CPRG を行う。
【０１４６】
酵素１、ガス１、圧力２、繰り返し１
酵素１、ガス２、圧力２、繰り返し１
β−グルコシダーゼ：
豊富な量の脱イオン水(D.I.H2 O)でシリンダを濯ぐ。次いで、
シリンダを第２の酵素溶液（グルコシダーゼ）で濯ぐ。酵素溶液の試料100ml を、２つの使い捨てガスシリンダに夫々入れる。
【０１４７】
夫々のシリンダ中の酵素を数分間振とうし、次いで、コントロ
ールＢおよびコントロールＣのために試料５mlを取る。
【０１４８】
シリンダをドックに移し、適当なガスを注入し、30.6atm までゆっくりと加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験
室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。
【０１４９】
ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混合液において                TDrive/CPRG を行う。
【０１５０】
酵素２、ガス１、圧力１、繰り返し１
酵素２、ガス２、圧力１、繰り返し１
シリンダをドックに戻し、適当なガスを用いて100atmまで再び加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。
【０１５１】
ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリンダから別々のビーカーに移し、直ちに酵素／基質混合液においてTDrive/CPRG を行う。
【０１５２】
酵素２、ガス１、圧力２、繰り返し１
酵素２、ガス２、圧力２、繰り返し１
0003655322.tif 000031
0003655322.tif 000032
【０１５３】
0003655322.tif 000033
コントロール：  コントロールＡ：酵素は加圧せずガスシリンダ中に配置しない。
【０１５４】
コントロールＢ：酵素は加圧せずガスシリンダ１に配置する。
【０１５５】
ガス１（空気）のためのコントロール
コントロールＣ：酵素は加圧せずガスシリンダ２に配置する。
【０１５６】
ガス２（Ｎ2 ）のためのコントロール
0003655322.tif 000034
【０１５７】
0003655322.tif 000035
。
【０１５８】
シリンダをドックに移し、適当なガスを注入する。ヘッドスペース／残渣のガスを加圧することにより取り除き、ガスシリンダを数回減圧する。30.6atm までゆっくりと加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、40psi にゆっくりと減圧する。
【０１５９】
ガス中に保ちながら、酵素約5ml を各シリンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混合液においてTDrive/                 CPRGを行う。  酵素１、ガス１、圧力１、繰り返し２
酵素１、ガス２、圧力１、繰り返し２
酵素１、ガス２、圧力２、繰り返し２
0003655322.tif 000036
溶液Ｃがまだ使用可能である場合には観察を試みる。
【０１６０】
0003655322.tif 000037
0003655322.tif 000038
【０１６１】
0003655322.tif 000039
60psi に加圧し、振とうし、上側を下に向け、圧力を解放してシリンダから液体を流出させた。この手順をリン酸ナトリウム緩衝液50ccで繰り返した。これらのシリンダを、上述のように３回加圧して、シリンダから液体を全て除去した。
【０１６２】
酵素の注入：シリンダを再び減圧下に置き、減圧を利用してシリンダに酵素を吸い込ませて、酵素をチロシン溶液60ccを注入した。シリンダの圧力を解放し、シリンダを再び10回加圧してシリンダからＯ2 を除去した。
【０１６３】
最終加圧：シリンダ１（空気）および２（Ｎ2 ）を対応するガスで30.6atm まで加圧した。シリンダ３をＸｅで１atm まで加圧し、次いでＮ2 で30.6atm まで加圧し、Ｘｅを保護した。
【０１６４】
タイムテーブル：シリンダを4/24/91 のpm 1:00 に30atm に加圧した。4/25/91 に分光光度計を異なる試験のために５℃で使用したために、この分光光度計が２５℃に置いて使用できる場合にはその日の終りにシリンダを試験することを決定した。
【０１６５】
試料の採取は、加圧後２８時間で行われた。スペクトル／ガスの実行は、直ちに、これらの試料について行われた。
【０１６６】
0003655322.tif 000040
0003655322.tif 000041
0003655322.tif 000042
【０１６７】
0003655322.tif 000043
【０１６８】
0003655322.tif 000044
【０１６２】
0003655322.tif 000045
【０１６３】
溶液Ｃ：Ｌ−チロシン  リン酸ナトリウム緩衝溶液（50μg/ml）
T-3754 10mg を、リン酸ナトリウム緩衝液200ml （25℃でpH                  6.8 ）に希釈した。
【０１６４】
溶液Ｅ：β−Ｄ−グルコピラノサイド  リン酸ナトリウム緩衝溶液（ 100μg/mL）
N-7006 25mg を、リン酸ナトリウム緩衝液250ml （25℃でpH                  6.8 ）に希釈した。
【０１６５】
溶液Ｆ：β−Ｄ−グルコシダーゼ  リン酸ナトリウム緩衝溶液                pH 6.8 (25℃)( 2.18 単位/ml ）
G-4511 24mg を、リン酸ナトリウム緩衝液242ml （25℃でpH                  6.8 ）に希釈した。
方      法：      セル搬送体を分光光度計から取り外し、固定されたセルを取り付けた。
【０１６６】
アクリルキュベットを、まず、青いシリコンフプラグ、針を取り付け、次いで、通常の全ての提案されているシリコンを用いてキュベットの頭頂部及ぶ側面部を被覆する (siliconing) ことにより作製した。これらを使用前４８時間放置して硬化ささせた。シリコンが硬化した場合に、キュベットを、垂直に次いでプラグの周囲にストラピングテープでくくった。
【０１６７】
試料の調製：4/29/91
キュベットを、２気圧試験のために両方の酵素で満たした。
【０１６８】
各キュベットに、適当なガス10 x 10cc を注入し、実行する前１５分間冷凍した。
【０１６９】
血清用バイアルを、対応する酵素 5ccで満たし、実行する前に適当なガス10 x 10cc を注入した、
分光光度計を各ガスの連続流を全ての時間において各スペクトルに供給できるように設定した。100  psimax ゲージを取り付けてキュベット圧力を示し、開閉弁を取り付けて、２番目の繰り返しの間に参照セルを加圧することを可能にした。ボール弁をシリンダ／ハウスラインとゲージの間に取り付け、ガス流を、分光光度計において直接制御できるようにした。チェック弁を各ラインに配置し、バック圧力がハウスラインまたはガスシリンダの汚染を起こさないことを保証した。キュベットは全部の実行の間、２つの針を保持した。これらの針の一つは、ガスラインに取り付けられ、一方、２番目の針は、酵素を誘導し、
その後塞ぐために使用された。組立部品がかさばっているために、分光光度計の取り付けられたドアは使用できないので取り外した。４層薄膜ブラックフェルトカバ−を各スペクトルのために作製し、システムに入る光量を最小にした。
【０１７０】
キュベットが分光光度計の中の温度が平衡になる間、両方の針は、まだ取付けられている10ccシリンジと共に、キュベットに残された。酵素を誘導するよりも前に、ガスラインを針に取り付けると同時にシリンジの一つを取り外した。これにより、少量のガス流がラインを通過すると同時に酸素の汚損がないことが保証された。針は、液面の上に残されていた。２番目のシリンジを取り外して、キュベットを通るガス流を一定にした。
【０１７１】
酵素は、１ccシリンジを用いて、２番目の針を通して注入された。この針は、その後に塞がれ、キュベットは加圧され、実行が開始した。
【０１７２】
4/29/91
2 atm
参照は加圧しなかった。
【０１７３】
0003655322.tif 000046
0003655322.tif 000047
方  法：
トライアル１で述べたように、ガスを連続的に流すため、分光光度計を組み立てた。固定セルホルダーの代わりにセル運搬装置を設け、フィッシャーサーキュレーター、およびデジタルコントローラー用いて温度を一定に保つことができるようにした。適切に光を遮断する目的で、黒色のフェルトカバーを続けて使用した。
【０１７４】
各酵素に対し、上記４種類のガス全てを用いて加圧せずにガスを供給した。各キュベットを対応するガス１０×１０ｃｃで満たし、更に１５分間冷却した。これらキュベットを分光光度計内に備え、このときキュベットをガスで満たすのに使用した２本の針を取り除いた。次に、２０Ｇｌｌ／２の針が装着された１ｃｃシリンジを用いて、前記キュベット内に酵素を導入した。シリンジの針は、シリコーンプラグを通してキュベット内に入れたが、液中には浸さなかった。この酵素の導入は、加圧ガスを流した場合と同様であることが確認された。
【０１７５】
血清バイアルを、操作に先立って、相応の酵素５ｃｃで満たし、更に適切なガス１０×１０ｃｃで満たした。
キュベット：
チロシナーゼ：この酵素には、ブルーシリコーン、一般用シリコーン、およびストラッピングテープを有するキュベットを使用した。
【０１７６】
グルコシダーゼ：この酵素には、ブルーシリコーンのみを有するキュベットを使用した。
【０１７７】
全てのキュベットについて、使用前に３２ｐｓｉまで圧力テストを行った。
0003655322.tif 000048
ブランク：
チロシナーゼ      ：溶液Ａ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ａ  ０．５ｍＬ
試料：
チロシナーゼ      ：溶液Ｃ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ｆ  ０．５ｍＬ
ファイル：４／３０／９１
チロシナーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ１ＲＳＧ１…４．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ１Ｇ１…４．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ７Ｅ１Ｐ１Ｇ１…４．ＳＰ
グルコシダーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ２ＲＳＧ１…４．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ１Ｇ１…４．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ７Ｅ２Ｐ１Ｇ１…４．ＳＰ
備考：
発明者らは、今後の圧力テストにはブルーシリコーンプラグを有するキュバレットを用いることを決定した。一般用シリコーンおよびストラッピングテープを用いると、ブルーシリコーンをキュバレットを用いた場合のガスの密閉の完全性が損なわれるようである。
0003655322.tif 000049
試料の調製：
４／２９／９１に調製した溶液を使用する。
方  法：
４／３０／９１のトライアル２と同様の方法で、本トライアルを行った。
0003655322.tif 000050
ブランク：
チロシナーゼ      ：溶液Ａ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ａ  ０．５ｍＬ
試料：
チロシナーゼ      ：溶液Ｃ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ｆ  ０．５ｍＬ
ファイル：５／１／９１
チロシナーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ１ＲＳＧ１…４．ＳＰ
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ７Ｅ１ＲＳＧ１…４．ＳＰ
３気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ２Ｇ１…４．ＳＰ
３気圧（参考  加圧せず）：Ｙ７Ｅ１Ｐ２Ｇ１…４．ＳＰ
グルコシダーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ２ＲＳＧ１…４．ＳＰ
３気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ２Ｇ１…４．ＳＰ
（新しいブランクを使用）
３気圧（参考  加圧せず）：Ｙ７Ｅ２Ｐ２Ｇ１…４．ＳＰ
0003655322.tif 000051
溶液Ｂ：リン酸ナトリウム緩衝液（２２８Ｕ／ｍｌ）中チロシアナーゼ溶液
Ｔ−７７５５  ７．１ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン酸ナトリウム緩衝液１２０ｍＬに希釈
溶液Ｃ：リン酸ナトリウム緩衝液中Ｌ- チロシン５０ｐｇ／ｍＬの溶液
Ｔ−３７５４  １０ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン酸ナトリウム緩衝液２００ｍＬに希釈
溶液Ｅ：リン酸ナトリウム緩衝液中β- Ｄ- グルコピラノサイド１００μｇ／ｍＬの溶液
Ｎ−７００６  １２．５ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン酸ナトリウム緩衝液１２５ｍＬに希釈
溶液Ｆ：リン酸ナトリウム緩衝液中β- Ｄ- グルコシダーゼの溶液
Ｇ−４５１１  １２ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン酸ナトリウム緩衝液１２１ｍＬに希釈
方  法：
下記の２点を除き、トライアル２および３と同様の方法で、本トライアルを行った。即ち、酵素をキュバレット内に注入した後シリンジの針を液中に浸し、また多量の一般的なシリコーンを前記針の周辺に配し、ガスがキュバレットから漏れ出るのを防止した。
0003655322.tif 000052
ブランク：
チロシナーゼ      ：溶液Ａ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ａ  ０．５ｍＬ
試料：
チロシナーゼ      ：溶液Ｃ  ２ｍＬ＋溶液Ｂ  ０．５ｍＬ
β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ  ２ｍＬ＋溶液Ｆ  ０．５ｍＬ
ファイル：５／１／９１
ＴＤｒｉｖｅにより、液中に浸された針が吸収に関して問題を引き起こさないことを調べる。
【０１７８】
ＴＤｒｉｖｅ：４０ｐｔｓ，１６秒間隔，３０５ｎｍ：
ＴＹＲＯＮＥＥ１．ＳＰ
ＴＤｒｉｖｅ：４０ｐｔｓ，１６秒間隔，４００ｎｍ：
ＧＬＵＣＮＥＥ１．ＳＰ
チロシナーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ１ＳＲＧ５…８．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ１Ｇ５…８．ＳＰ
グルコシダーゼ：
ガス供給（加圧せず）    ：Ｙ６Ｅ２ＳＲＧ５…８．ＳＰ
２気圧（参考  加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ２Ｇ５…８．ＳＰ
備考：
針が光路に入った場合、液面上へ移動させた。この操作は室内の光を消した状態で行われ、その間、分光光度計の作動箇所にフェルトカバーが掛けられた。
結  果
結果を、空気１気圧に比較したガスの阻害％／加圧後の空気１気圧に比較したガスの阻害％として示した。
0003655322.tif 000053
相対的な効果の変化が非常に大きい。例えば、キセノンについては７５％である。この結果より、圧力のみがチロシアニンを顕著に阻害しているとが明らかである。
0003655322.tif 000054
上記の結果より明らかなように、従来技術で報告された希ガスによるヒドロラーゼおよび他の酵素の阻害は、静水効果によるものである。
酸素添加実験：
チロシナーゼに酸素を加えることにより、窒素の効果が完全に低減された。一方、酸素を加えることによって希ガスの効果はあまり低減されなかった。この理由は、希ガスが溶液からの単なる酸素の競争的な置換に加えて、分子の特性により酵素に影響を及ぼしているからである。この結果より、希ガスの効果と窒素の効果が明らかに区別される。また、酸素を少量加えることはチロシナーゼの活性を僅かに強めるが（酸素を必要とする反応に対して期待されるように）、更に酸素を加えても、付加的な効果は全く得られない。このように、酸素の圧力と酵素の活性との間に完全な線形性があるという報告は、酸素が極限条件にある場合のみについて示されるものであり、全般には該当しない。
【０１７９】
空気に酸素を加えることにより、チロシナーゼの活性が最高６％大きくなった。
【０１８０】
キセノン飽和溶液に酸素を飽和量まで加えると、キセノンの効果は、８５％の阻害から５０％の阻害まで変化した。
【０１８１】
アルゴン飽和溶液に対して上述したように酸素を加えると、アルゴンの効果は８２％の阻害から１２％の阻害まで変化する。
【０１８２】
窒素飽和溶液に対して上述したように酸素を加えると、窒素の効果は完全になくなり、８４％の阻害から阻害０％の状態になる。
【０１８３】
グルコシダーゼの反応に対して酸素を加えた場合、酸素の独立した反応について期待されるような効果は見られない。酸素を加えても、どの希ガスの酵素に対する作用についても効果が得られないことは、希ガスの酵素に対する効果が希ガスの分子の特性に因ることを重ねて示している。
ガス混合物の実験
希ガスと窒素および酸素の混合物に加え、クリプトンとキセノンとの混合物、続いてアルゴンと、キセノンおよびクリプトンのいずれかとの混合物について、テストを行った。
【０１８４】
抑制VS．エアーコントロールとして表わされるチロシナーゼに対する結果。
【０１８５】
0003655322.tif 000055
同様の結果がベータグルコシダーゼでも得られた。ここで、増強が全ての混合物に対して観測された。そして、これらは、Ｘｅ、Ｋｒ、又は、Ａｒに対するのと同じ大きさであり、混合ガスから純粋のガスまでの密接さに依存している。
【０１８６】
0003655322.tif 000056
１単位は、Ｌ−チロシンを含む反応混合物３ｍＬ中、２５℃、ｐＨ６．５で１分当たり０−００１のＡ280 の増加を起こすであろう。
【０１８７】
チロシナーゼ活性：３８７０  U/mg  固体
７．１mg  固体＝＝＞２７，４４０単位
０℃以下で乾燥して保存した。
【０１８８】
0003655322.tif 000057
アーモンドより
単位の定義：
１単位は３７℃、ｐＨ５で１分当たりサリシンから１μmol のグルコースを遊離するであろう。
【０１８９】
活性：２２U/mg固体
１２mg個体＝＝＞２６４単位
０−５℃で、乾燥して保存した。
【０１９０】
0003655322.tif 000058
0003655322.tif 000059
方法：
4/17/91 ：溶液を調製、キュベットがガス漏れしないことを確認した後、空気でキュベットを浄化し、キュベットを満たし凍結する。酵素血清バイアルを調製し、ガスバイアルを調製する。
【０１９１】
4/18/91 ：ガス混合物の調製：１２０ｃｃの血清バイアルがガスを供給して混合するのに用いられる。これらのバイアルは１気圧のアルゴンがバイアル中に維持されるように吸引して浄化する。バイアルはこの方法で２０秒間浄化する。バイアルは針を通して開放しわずかな加圧下に置く。これを１２０ｃｃのアルゴンとみなす。次にアルゴンの必要量と（Ｘｅ又はＫｒ）と混合されるガスは３０ｃｃのシリンジと針を用いバイアルに導入される。
【０１９２】
0003655322.tif 000060
トライアル１：  我々は、１つのバイアルのガス混合物を用い、８×１０ｃｃのバイアル外のガスを用いて酵素にガスを供給した。我々は第２のバイアルのガス混合物を用い、８×１０ｃｃのバイアル外のガスを用いてキュベット／基質にガスを供給した。アルゴンとキセノンをガスシリンダーから補給した。
【０１９３】
0003655322.tif 000061
0003655322.tif 000062
トライアル１の結果：
我々は、チロシナーゼのラン中に、空気が混入することを見い出した。そして、同様のことがグルコシダーゼの実行に対しても正しいことが推測された。我々が１のバイアルから８×１０ｃｃのガス混合物を補給できないことを我々は明確にした。従って、我々は、ガス処理するためのキュベット当たり、２つのバイアルのガス混合物および、キュベット／バイアル当たり１０×１０ｃｃを補給できる酵素当たり２つのガス混合物を調製することに決めた。
トライアル２：
キュベット当たり２つのバイアルのガス混合物と、酵素当たり２つのバイアルのガス混合物を用いて第二のランにガスを供給した。次に、最後の２つのガス混合物（１０％と５０％）を供給し続けた。
【０１９４】
0003655322.tif 000063
0003655322.tif 000064
トライアル２の結果：
チロシナーゼは予期したような分離を与えた。従って、我々は、新しいガスの供給法が適当であると仮定し、この方法でガスを供給し続けた。グルコシダーゼは、大きな分離を示さなかった。従って、時間制限により、我々は、１０％から５０％のガス混合物を特別に
チロシナーゼに集中した。
【０１９５】
0003655322.tif 000065
上述したようにＡｒ／Ｘｅ混合物を調製し、１０％と５０％混
合物で２回の反復を行った。
【０１９６】
0003655322.tif 000066
結果：
Ａｒ／Ｘｅでの結果は、我々がＡｒ／Ｋｒで得た結果より良いように思われる。我々は１０％および５０％を用いて両混合物の反復を続ける。時間の許すかぎり、我々は０．１％、１％および５％の両ガス混合物をチロシナーゼについてのみ、このように反復すつもりである。4/19/91 ：
チロシナーゼは一方の分光器でＡｒ／Ｘｅを２反復し、他の分光器で
Ａｒ／Ｋｒを反復した。
【０１９７】
0003655322.tif 000067
0003655322.tif 000068
時間の許す限り：
我々は以下をランできたのみであった。
【０１９８】
0003655322.tif 000069
従って、本発明は一般に、一以上の貴ガスまたはそれらの混合物を含むガスに、
一以上の酵素を接触させることによって、酵素活性を調節する方法を提供する。
【０１９９】
本発明に従えば、調節された酵素は、単一な酵素、単離された酵素、または、複数の酵素からなる混合物であり得る。例えば、本発明に従えば、酵素の混合物は一以上の酵素の活性を選択的に抑制し、一以上の酵素の活性を増強することによって調節することができる。
【０２００】
更に、酵素の活性は、本発明に従えば、液体窒素の沸点（約−２００℃）から約１２０℃の温度範囲で調節することができる。
【０２０１】
本発明に従えば、どの酵素もこの貴ガスを用いて調節することができる。しかし、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］および［Ｓ］の条件を適切に選ぶことによって、本発明の全ての貴ガスで全ての酵素を選択的に抑制することができる。更に、本明細書の開示及びガイドラインを利用することによって、興味ある独特な酵素システムまたは混合酵素システムの何に対しても、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］および［Ｓ］を最適なレベルに決定することは、当業者の技術範囲である。
【０２０２】
次に、この明細書の図面について、より詳細に説明する。
【０２０３】
図１は、ｐＨ６．８５での、チロシナーゼ２．５ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）対リン酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌの吸光スペクトルを示している。
【０２０４】
図２は、ｐＨ６．８５での、Ｌ−チロシン２．５ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）対リン酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌの吸光スペクトルを示している。
【０２０５】
図３は、指示された濃度及びｐＨでの、チロシシナーゼ及びＬ−チロシンを省いたＬ−チロシンの吸光スペクトルを示す。
【０２０６】
図４は、種々の濃度のチロシナーゼ（４０，６０，８０及び１００μｇ／μｌ）
との反応ランの結果を重ね合わせ示したもので、直接的な線型一次チロシナーゼ依存性を示している。
【０２０７】
図５は、指示された濃度およびｐＨを用いた、等量のキセノン（ｗ／ｗ）によるチロシナーゼの阻害を示している。
【０２０８】
図６は、２６℃でのキセノンによるチロシナーゼの極めて大きい阻害を示しており、大略次のように見積もられている；面積空気ラン曲線＝11217 μ，キセノン＝3037μ，トータル＝14254 μ，％トータル面積空気＝78.69 ％，キセノン＝21.31 ，キセノントータル面積＝空気面積の27.08 ％，キセノンによる空気速度の阻害＝72.92 ％。この阻害の比率は他の通常の酵素阻害剤に比較して著しく大きい。
【０２０９】
図７は、次のことを示している。即ち、１５℃において、アルゴンはチロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応の平衡を僅かに阻害するにすぎず、キセノンは小さいが顕著な阻害効果を示し、またネオン及びクリプトンは強い効果を示す。酸素および空気は略同様な効果を示す。
【０２１０】
図８は、次のことを示している。即ち、２０℃において、キセノンはチロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応を極めて強く阻害する一方、他のガスであるキセノン及びアルゴンは全て効果的な阻害剤である。
【０２１１】
図９は、酸素がチロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応に対して温和な阻害効果しかもたないことを示している。
【０２１２】
図１０は、２０℃における、チロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応のアルゴンによる強い阻害を示し、またクリプトンも略同様の効果を有することを示している。しかし、示された他のガスもまた効果的な阻害剤である。
【０２１３】
図１１は、酸素が、２５℃のチロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応に対して僅かな阻害効果しかもたないことを示している。
【０２１４】
図１２は、３０℃でのチロシナーゼ活性に対する、ネオン、アルゴン、クリプトン及びキセノンの阻害効果を示している。
【０２１５】
図１３は、３０℃でのチロシナーゼ活性に対する酸素の阻害効果を示している。
【０２１６】
図１４は、直接的に酸素溶解度の差に帰結する速度変化を示す、空気中でのチロシナーゼ−Ｌ−チロシン標準反応ランを示している。空気の代わりに酸素を用いて得られる曲線は同一である。
【０２１７】
図１５は、温度依存性であるネオンを用いた阻害効果を示している。
【０２１８】
図１６は、クリプトンのチロシナーゼ阻害能力と温度との間の、直接的な逆の（負の）関係を示している。
【０２１９】
図１７は、キセノンが他のガスよりも良好に、チロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応の平行を阻害することを示している。ｂｙｔはクリプトン及びアルゴンと同様、この反応の速度のみを減少させる。更に、曲線形状は高度に変化し、これは不思議にもチロシネートとの直接的な活性部位相互作用を示唆する。キセノンは温度と逆に相互作用し、２０℃と２５℃の間に効果の動的遷移を有する。
【０２２０】
図１８は、２０℃において、アルゴン、キセノン及びネオンが全て劇的にチロシナーゼ活性を阻害するのに対して、クリプトンの効果は少ないことを示している。窒素もまた、該反応を極めて良く阻害するが、酸素は少ない効果しか示さない。
【０２２１】
図１９は、２５℃において、アルゴン及び窒素が他の希ガスよりも低レベルで阻害するのに対し、酸素は反応を増大させることを示している。クリプトン−キセノン曲線対とネオン−アルゴン曲線対との間の曲線形状の小さな差は、相対的に良く似たファン・デル・ワールス排斥および酸素稀釈の効果によるものである。
【０２２２】
図２０は、３０℃において、酸素は溶解度が低下するため、もはやチロシナーゼ活性を増大しないことを示している。他のガスも全て効果的ではあるが、キセノンは他のガスよりも極めて良好に反応を阻害する。
【０２２３】
図２１は、２０℃と２５℃の間で活性遷移が起こる、ネオンによるチロシナーゼ活性の阻害を示している。
【０２２４】
図２２は、アルゴンによるチロシナーゼ活性の阻害を示しており、これは２０℃におけるアルゴンによる阻害はネオンによる阻害よりも良好であるが、２５℃での阻害はネオンよりも小さいことを示す。これらの差は、溶解度／酸素拡散能に直接帰結すると思われる。
【０２２５】
図２３は、２０℃と２５℃の間で活性遷移が起こる、クリプトンによるチロシナーゼ活性の阻害を示している。これは、ガスと酵素活性部位との間に直接の相互作用があることの強力な証拠を与える。
【０２２６】
図２４は、キセノンによるチロシナーゼ活性の阻害において、少なくとも二つの活性遷移が存在することを示している。第一の活性遷移は２５℃と３０℃の間にあり、第二の活性遷移は３０℃と３５℃の間にある。２０℃と２５℃の間に、第三の活性遷移が存在するかもしれない。これらの遷移は、ガスと酵素活性部位都の間に直接の相互作用が存在することの強力な証拠を提供する。
【０２２７】
図２５は、純粋に、酸素を溶液から置換することを含む溶解度メカニズムによるチロシナーゼの阻害を示している。空気は、期待された溶解（駆動された速度パターン）を示す一方、酸素は３０℃で飽和する。
【０２２８】
図２６は、窒素によるチロシナーゼ活性の阻害を示している。窒素は、酸素を溶液から置換することを含む溶解度メカニズムによってのみ酵素を阻害することができるが、チロシナーゼ活性の阻害においては効果的である。遷移極大は２０℃の後に観察される。窒素曲線と希ガス曲線との間の相違は、潜在的な活性部位阻害を表している。殆どの場合において、これらの相違は、夫々のガスについて少なくとも一つの温度で顕著である。
【０２２９】
図２７は、２０℃と２５℃の間のキセノン活性における大きな相違を示している。これは、酵素活性部位光学温度(enzyme active site optical temperature)に対応している。
【０２３０】
図２８は、クリプトン、キセノン、アルゴン、窒素およびネオンによるグルコースオキシダーゼの阻害を示している。
【０２３１】
図２９は、クリプトン、キセノン、アルゴン、並びにクリプトン及びキセノン混合物による、α−グルタミルトランスペプチダーゼの阻害を示している。
【０２３２】
図３０は、クリプトン、キセノン、アルゴン、並びにクリプトン及びキセノン混合物による、アスパルテート・アミノトランスフェラーゼの阻害を示している。
【０２３３】
図３１は、ＳＦ6 、アルゴン、窒素、ネオン及び酸素によるα−Ｄ−グルコシダーゼの阻害を示している。
【０２３４】
図３２は、ネオン、酸素および窒素による、フェニルアラニン・アンモニア−ライゼートの増強を示している。
【０２３５】
図３３は、キセノン及びクリプトンによるサイトレートシンターゼの増強、並びにアルゴンによるその阻害を示している。
【０２３６】
図３４は、１０℃における、キセノン、クリプトン、アルゴン、並びにクリプトン及びキセノン混合物によるホスホグルコースイソメラーゼの増強を示している。
【０２３７】
図３５は、２５℃における、ネオン及び窒素によるホスホグルコースイソメラーゼの増強、および酸素によるその阻害理論を示している。
【０２３８】
図３６は、２５℃における、クリプトン、並びにクリプトン及びキセノン混合物によるＳ−アセチルＣｏＡシンセターゼの増強を示している。
【０２３９】
図３７は、１００気圧での、β−グルコシダーゼに対する空気および窒素の阻害効果を示している。この効果は、単に、高圧による酵素の損傷によるものである。
【０２４０】
図３８は、３０気圧での、β−グルコシダーゼに対する空気および窒素の阻害効果を示している。この効果は、単に、高圧による酵素の損傷によるものである。
【０２４１】
図３９は、３０気圧での、チロシナーゼ活性に対する空気、キセノンおよび窒素の阻害効果を示している。この効果は、高圧による酵素の損傷によるものである。
【０２４２】
図４０は、１００気圧での、チロシナーゼに対する空気、キセノン及び窒素の阻害効果を示している。この効果は、高圧による酵素の損傷によるものである。
【０２４３】
図４１は、β−Ｄ−グルコシダーゼ活性について例示したように、酵素−基質濃度が希ガスによる増強または阻害の結果に影響することを示している。Ｓ1 ，Ｓ2 及びＳ3 は、増大する三つの異なった基質濃度を表している。この結果は、酵素および／または基質のコストを低減し、或いは現在は不可能である反応に適合するように現在のバイオ技術プロセスを変形し得ることを意味するから、有利である。
【０２４４】
図４２は、例えば１０℃においてラクテートデヒドロゲナーゼを増強し、次いで阻害するキセノン及びネオンの夫々異なった効果を示している。これは、選択されるガスに応じて、所定の酵素を増強または阻害し得ることを意味するので、有利である。
【０２４５】
図４３は、高温でも、本発明の効果が観察されることを示している。明らかに、６０℃において、α−グルコシダーゼ活性はアルゴン、窒素およびキセノンによって増強され、クリプトンによって阻害される。明瞭なように、この酵素に関して、アルゴンは６０℃における強力な増強剤である。
【０２４６】
図４４は、２５℃において、固定化形態のβ−グルコイシダーゼの酵素活性を増大させるキセノンの効果を示している。
【０２４７】
上記のように、本発明に従えば、酵素活性は液体窒素温度（約−２００℃）の低温から約１２０℃の広範な温度領域に亘って調節され得る。更に、使用されるガスまたはガス混合物の圧力は、約１０-8大気圧の超高真空のような低圧から約１００大気圧までの間である。しかし、もっと低い圧力または高い圧力を用いるのが望ましいかもしれない。しかしながら、一般的には、約１０-3〜約３大気圧のガス圧力が用いられ、約１０-2〜約２大気圧のガス圧力が最も普通に用いられる。
【０２４８】
上記のように、本発明は選択される酵素および酵素の形態に拘らず、有効である。以下の例は、固定化酵素の酵素活性の調節における本発明の有効性を例示するために与えられる。
【０２４９】
プロトコール：固定化酵素
理論        ：遊離の又は固定化された酵素の何れに対しても、同じガスが奏効する。
【０２５０】
0003655322.tif 000070
単位定義：
１単位は、37℃且つｐＨ5.0 において、サリシン(salicin) から１分当り１．０μmol のグルコースを放出する。
【０２５１】
0003655322.tif 000071
【０２５２】
0003655322.tif 000072
【０２５３】
我々は簡単な水和（溶液が出現するまで）を行った。
【０２５４】
0003655322.tif 000073
更に、本発明、及びそれにより得られた効果を例示するために速度論的解析を行った。
【０２５５】
速度論的解析
以前に例示した吸光度曲線のデータは、収量及び速度の両見地から、異なるガス雰囲気下での酵素活性の相違を示している。収量は、平衡に達した後、比較曲線の差によって、及び正式な線形化及び計算を通して計算される。これらはまた速度計算にも必要である。速度の差は商業的に入手可能なコンピュータープログラムを用いて計算される（ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ，ＧＲＡＦＩＴ，ＥＮＺＰＡＣＫ，ＰＥＡＫＦＩＴ）。これは、初期のｕｖ／ｖｉｓ吸光度データ曲線（これらの例においては検出力曲線）を直線（検出力曲線の線形回帰）に変換するものである。
これらの線は、その勾配が概算的に速度であり、Ｙ−切片が概算的に収量である数式として表わしてもよい。これらのデータは、ミカエリスメンテン或いは他の標準的な生化学的相関（グラフによって或いは数学的に表される）を引き出すために処理されてもよく、そこから速度及び収量を正確に引き出すことができる。
【０２５６】
図４５は、５つの異なる基質濃度におけるエアの下でのβ−グルコシダーゼに対するｕｖ／ｖｉｓ吸光度検出力曲線を示している。
【０２５７】
表１は、Ｖｍａｘ及びＫｍのミカエリスメンテン酵素速度論的計算、及び各反応速度を示している。Ｖｍａｘは限界速度、Ｋｍはミカエリスメンテン定数である。
【０２５８】
図４６及び表２は図４５及び表１と同様であるが、キセノンの反応に対するものを示している。キセノンに対するＶｍａｘ及びＫｍの方が大きいことが容易に明らかである。
【０２５９】
図４７、表３、図４８及び表４は上記エア及びキセノンガスの反応に対する検出力曲線の速度についての線形回帰一次変換を示しており、Ｘｅ／エア速度相関が上記と同じ比率であるミカエリスメンテンデータに対する近似値を示している。
【０２６０】
図４９、図５０及び表５はこのランで研究されたすべてのガスに対する、同様の速度近似一次線形回帰を示している。この場合、検出力曲線解析において、キセノンのみが重要な増強を示しているが、線形化は明らかに他のガスが反応を増強することを示している。
【０２６１】
図５１、表６、図５２、及び表７は、エア及びキセノンガスに対する検出力曲線として表された１のチロシナーゼの実験の最初の１６０秒のデータを示している。線形化された速度の回帰は、キセノンがチロシナーゼ活性を強力に阻害することを示しており、示されたミカエリスメンテンの計算は、これを実証している。
【０２６２】
【表１】
0003655322.tif 000074
残りのデータセットは、上に示したように図面にグラフとして表されている。
【０２６３】
【表２】
0003655322.tif 000075
【０２６４】
【表３】
0003655322.tif 000076
【０２６５】
【表４】
0003655322.tif 000077
【０２６６】
【表５】
0003655322.tif 000078
【０２６７】
【表６】
0003655322.tif 000079
【０２６８】
【表７】
0003655322.tif 000080
このように、本発明はいずれの酵素の酵素活性も、いずれかの形で制御する方法を提供する。更にこの制御は、広範な温度及び示された圧力範囲に渡って生じ得るものである。
【０２６９】
前述したように、本発明の制御された１以上の酵素は、例えば、水溶性又は有機性溶液、固定化されて、分散されて、或いはゲル等のいずれかのタイプの有機マトリックスであってもよい。このような溶液、固定化された酵素、分散液、或いは有機マトリックスは当業者に既知のものである。
【０２７０】
更に、本発明によれば、酵素の混合物は、その中に含まれる１或いはそれ以上の酵素を阻害することによって、或いはその中に含まれる１或いはそれ以上の酵素を増強することによって制御してもよい。また、混合物中の１またはそれ以上の酵素を阻害し、かつその中に含まれる１又はそれ以上の他の酵素を増強することによって制御することも可能である。
【０２７１】
更に、関心のあるいずれかの特定の酵素システム或いは混合酵素システムに対して、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］及び［Ｓ］の最適なレベルを決定するために、上記の本開示及びガイドラインを利用することは、当該分野においてよく知られている。
【０２７２】
例えば、酵素を購入したときに、関心のあるいずれかの特定の酵素システム或いは混合酵素システムに対して、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］及び［Ｓ］の最適な状態を、よく知られた参考マニュアルを用いることによって確かめることができる。例えばシグマケミカルカンパニーの１９９０及び１９９１のカタログ及び、Ｄｉｘｏｎ及びＷｅｂｂによるＥｎｚｙｍｅｓ、第３版（Ｗｉｌｅｙ、１９７９）を見てみよう。この文献から、当業者は本開示を用いることにより、本発明による所望の効果を得るために、ガスの最適混合物、温度及び圧力を確かめることができる。
【０２７３】
本発明の記載に関して、本発明の意図及び範囲を逸脱することなく、上記例に対して多くの変化及び変形がなされ得ることは当業者において明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】チロシナ−ゼの吸収スペクトルを示す図。
【図２】Ｌ−チロシンの吸収スペクトルを示す図。
【図３】Ｌ−チロシンをブランクとしたチロシナ−ゼおよびＬ−チロシンの吸収スペクトルを示す図。
【図４】チロシナ−ゼの濃度を変えて行なった反応の結果のオ−バ−レイを示す図であり、各結果は直接線形１次チロシナ−ゼ濃度依存を示す図。
【図５】等Ｗ／Ｗでのキセノンによるチロシナ−ゼの抑制を示す図。
【図６】  26℃でのキセノンによるチロシナ−ゼの非常に大きい抑制を示す図。
【図７】  15℃でアルゴンがチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の平衡をわずかに抑制し、キセノンは小さくはあるが有意の抑制効果を有し、ネオンおよびクリプトンは大きな抑制効果を表わすことを示す図。
【図８】  20℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対するキセノン、クリプトン、ネオンおよびアルゴンの抑制効果を示す図。
【図９】酸素が、20℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対する増強効果を有していないことを示す図。
【図１０】  25℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対するネオン、アルゴン、クリプトンおよびキセノンの抑制効果を示す図。
【図１１】酸素が、25℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対する増強効果を有していないことを示す図。
【図１２】  30℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対するネオン、アルゴン、クリプトンおよびキセノンの抑制効果を示す図。
【図１３】酸素が、30℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対する増強効果を有していないことを示す図。
【図１４】空気中における種々の温度での標準実行を示し、速度変化が直接酸素溶解度の差異に起因することを示す図。
【図１５】明確な温度依存性を示す、チロシナ−ゼ- L-チロシンに対するネオンの抑制効果を示す図。
【図１６】クリプトンのチロシナ−ゼ抑制能と温度との間の直接的逆（否定的）関係を示す図。
【図１７】温度とは逆に相互作用する、ネオンによるチロシナ−ゼ- L-チロシンの平衡の抑制を示す図。
【図１８】  20℃において、アルゴン、キセノンおよびネオンの各々がチロシナ−ゼ- L-チロシン反応を劇的に抑制するのに対して、酸素は反応を増強しないことを示し、クリプトンは窒素よりも小さい抑制効果を有することを示す図。
【図１９】  25℃において、アルゴンおよび窒素は希ガスよりも少ない程度にチロシナ−ゼ- L-チロシンを抑制し、酸素は反応を増強することを示す図。
【図２０】  30℃においては、溶解度の減少のために、酸素がもはやチロシナ−ゼ- L-チロシン反応を抑制しないことを示す図。
【図２１】種々の温度における、ネオンによるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示し、20℃および25℃の間での移行を示す図。
【図２２】種々の温度における、アルゴンによるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。
【図２３】種々の温度における、クリプトンによるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。
【図２４】種々の温度における、キセノンによるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。
【図２５】純粋に、溶液からの酸素の除去を含む溶解度機構によるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。
【図２６】窒素によるチロシナ−ゼ活性の抑制を示す図。
【図２７】  20℃と25℃との間でのキセノン活性の大きな差異を示す図。
【図２８】クリプトン、キセノン、アルゴン、窒素およびネオンによるグルコ−スオキシダ−ゼの抑制を示す図。
【図２９】クリプトン、キセノン、アルゴンおよびケトンとキセノンとの混合物による、α- グルタミルトランスペプチタ−ゼの抑制を示す図。
【図３０】クリプトン、キセノン、アルゴンおよびクリプトンとキセノンとの混合物によるアスパルテ−トアミノトランスフェラ−ゼの抑制を示す図。
【図３１】窒素、ネオンおよび酸素によるα-D- グルコシダ−ゼの増強を示す図。
【図３２】ネオン、酸素および窒素によるフェニルアラニンアンモニアリア−ゼの増強を示す図。
【図３３】キセノンおよびクリプトンによるクエン酸シンセタ−ゼの増強、並びにアルゴンによるそれらの抑制を示す図。
【図３４】  10℃での、キセノン、クリプトン、アルゴンおよびクリプトンとキセノンとの混合物によるホスホグルコ−スイソメラ−ゼの増強を示す図。
【図３５】  25℃での、ネオンおよび窒素によるホスホグルコ−ズイソメラ−ゼの増強、並びに酸素によるそれらの抑制を示す図。
【図３６】  25℃での、クリプトンおよびクリプトンとキセノンとの混合物によるＳ- アセチルＣｏＡシンセタ−ゼの増強を示す図。
【図３７】   100気圧、25℃での、β- グルコシダ−ゼに対する空気および窒素の抑制効果を示す図。
【図３８】  30気圧における、β- グルコシダ−ゼに対する空気および窒素の抑制効果を示す図。
【図３９】  30気圧における、β- グルコシダ−ゼに対する空気、キセノンおよび窒素の抑制効果を示す図。
【図４０】   100気圧における、チロシナ−ゼに対する空気、キセノンおよび窒素の抑制効果を示す図。
【図４１】酵素- 基質濃度が希ガス増強／抑制の結果に影響を与えることを示す図。
【図４２】例えば、10℃で、各々ラクテ−トデヒドロゲナ−ゼを増強し、次いで抑制する、キセノンとネオンとの異なる効果を示す図。
【図４３】例え60℃であっても、希ガスが酵素に対する増強もしくは抑制効果を表わすことを示す図。
【図４４】固相形態にあるβ- グルコシダ−ゼの増強におけるキセノンの効果を示す図。
【図４５】５種の異なる基質濃度における、空気存在下での、β- グルコシダ−ゼに対するＵＶ／ＶＩＳ吸光度出力曲線を示す図。
【図４６】５種の異なる基質濃度における、キセノン存在下での、β- グルコシダ−ゼに対するＵＶ／ＶＩＳ吸光度出力曲線を示す図。
【図４７】β- グルコシダ−ゼ -空気供給反応の１次出力曲線回帰速度線形変換（first-order power curve regression rate linear transformation ）を示す図。
【図４８】β- グルコシダ−ゼ -キセノン供給反応の１次出力曲線回帰速度線形変換を示す図。
【図４９】この実行において研究された全てのガスに対する１次速度近似回帰線形化（first-order rate approximation regression linearization ）を示す図。
【図５０】この実行において研究された全てのガスに対する１次速度近似回帰線形化を示す図。
【図５１】空気供給に対する出力曲線として表現されるチロシナ−ゼ単一の実験における最初の 160秒のデ−タを示す図。
【図５２】キセノン供給に対する出力曲線として表現されるチロシナ−ゼ単一の実験における最初の 160秒のデ−タを示す図。
【図１】
0003655322.tif 000081
【図２】
0003655322.tif 000082
【図３】
0003655322.tif 000083
【図４】
0003655322.tif 000084
【図５】
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【図６】
0003655322.tif 000086
【図７】
0003655322.tif 000087
【図８】
0003655322.tif 000088
【図９】
0003655322.tif 000089
【図１０】
0003655322.tif 000090
【図１１】
0003655322.tif 000091
【図１２】
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【図１３】
0003655322.tif 000093
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
0003655322.tif 000097
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0003655322.tif 000101
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
0003655322.tif 000120
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
0003655322.tif 000124
【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
0003655322.tif 000128
【図４９】
0003655322.tif 000129
【図５０】
0003655322.tif 000130
【図５１】
0003655322.tif 000131
【図５２】
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