(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の高分子を含む溶液からウイルスを除去する濾過方法であって、該溶液をウイルス濾過することを含み、該溶液の総塩含量が０．６Ｍから該溶液の飽和状態までの範囲であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
溶液の総塩含量が０．６〜２．５Ｍの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶液の総塩含量が０．６〜２．０Ｍの範囲であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びその組合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
高分子が、タンパク質、多糖類、ポリペプチド及びその組合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
高分子がIX因子であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
高分子がγ−グロブリンであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
高分子がアルブミンであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
高分子がアンチトロンビンIIIであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
高分子が組換えVIII因子の欠失誘導体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
IX因子、γ−グロブリン、アルブミン、アンチトロンビンIII、組換えVIII因子の欠失誘導体及びその組合わせからなる群から選択される少なくとも１種の高分子を含む溶液からウイルスを除去する濾過方法であって、該溶液ウイルス濾過することを含み、該溶液の総塩含量が０．６〜２．５Ｍの範囲であることを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
溶液の総塩含量が０．６〜２．０Ｍの範囲であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びその組合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は少なくとも１種の高分子を含む溶液をウイルス濾過する方法に関し、該方法は、溶液の総塩含量を約０．２Ｍ〜関係塩による該溶液の飽和状態の範囲として行う。本発明の方法は、主として、タンパク質、多糖類及びポリペプチドをウイルス濾過する際に、滞留時間及び溶液の希釈度を低減させ且つ収率を最適化する。ウイルス含量の減少率は、総塩含量が低い場合、少なくとも慣用法を用いた場合と同程度である。本発明は、いわゆる「デッドエンド」法を用いることによりウイルス濾過を容易にし、それによって、一般に用いられている接線(ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ)ウイルス濾過法に比べていくつかの処理上及び経済上の利点が得られる。血漿タンパク質のIX因子をウイルス濾過する場合、本発明に従って溶液の塩含量を増大させると、ウイルス濾過段階で得られる収率が約７０％から９５％以上にまで増大する。
発明の背景
ヒトに投薬するための種々のタンパク質製剤のウイルス汚染問題は、近年ますます注目を浴びるようになっている。例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及び／又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）で汚染された血液タンパク質に関する論文が時折発表されている。これらの論文に歩調を合わせて、数カ国の関係当局が、タンパク質製剤からの潜在的ウイルス汚染物質の除去に関する要件を厳しくしている。
現在の慣用法では、化学添加剤、主として溶媒及び界面活性剤を用いるか、及び／又はウイルスを高温に暴露することによりウイルスを不活化している。前者の方法は、脂質エンベロープを有するウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＨＩＶに対してのみ機能するという欠点を有している。後者の方法は、多くのタンパク質が効率的な汚染ウイルスの除去に必要な温度では熱不安定性であるという欠点がある。
ＵＳ−Ａ−４，４７３，４９４号（米国陸軍省長官に譲渡された）は、亜鉛イオンを用いて無ストローマ、ノンヘム、無タンパク質ヘモグロビンを産生させて、亜鉛イオン結合不溶性ヘモグロビン複合体の沈殿を促進し、次いで、濾液流媒質から亜鉛−ヘモグロビン複合体を膜限外濾過する方法を開示している。ヘモグロビンからウイルスが除去されると称する唯一の段階における塩の総含量は０．０５Ｍ以下、即ち、一般的な総塩含量である。
ＥＰ−Ａ−０３０７３７３号（Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏに譲渡された）は、１００，０００Ｄａのカットオフを有する限外濾過膜を用いた、流体形態の生物学的物質からのウイルス及び／又は他の汚染物質の除去に関する。好ましい生物学的物質はヒト成長ホルモンである。ＥＰ−Ａ−０３０７３７３号の実施例では、ウイルス濾過段階における塩の総含量は、０．０１〜０．１０Ｍ（ＮＨ4ＣＯ3）の範囲、即ち、一般的な総塩含量である。
従って、種々のタイプの高分子、主としてタンパク質、及び種々のタイプのウイルスに適用し得る有効なウイルス除去法が要望されている。
発明の説明
本発明の目的は、高分子を含む溶液をウイルス濾過する際の滞留時間を著しく短縮させることである。
本発明の別の目的は、高分子を含む溶液をウイルス濾過する際の液体量を著しく減少させることである。
本発明の別の目的は、高分子を含む溶液の効率的なウイルス濾過に必要とされるフィルター面積を小さくすることである。
本発明のさらに別の目的は、ウイルス濾過段階における高分子の収率を約９０％以上にすることである。
本発明のさらに別の目的は、流量を増大させ且つ処理時間を短縮し得るように、ウイルスフィルター表面上で生起される重合を減少させることである。
上記及び他の目的は、少なくとも１種の高分子を含む溶液をウイルス濾過する方法に関する本発明により達成され、該方法は、溶液の総塩含量を０．２Ｍ〜関係塩による該溶液の飽和状態の範囲として行う。
このように、本発明者は、溶液の塩含量を増大させることにより、公知の方法よりはるかに効果的にウイルス濾過を実施し得ることを見出した。この発見は驚くべきものである。というのは、これまでは、タンパク質のウイルス濾過の際に、タンパク質濃度、流量及びｐＨのみがその処理に影響を与えると考えられていたからである。
塩濃度を高めると濾過作用が促進されるということは、タンパク質が収縮し、それによってタンパク質がフィルターの細孔をより容易に通過し得るからであると考えられる。また、高分子同士及び／又は高分子とフィルター膜物質との相互作用が減少するからとも考えられる。さらに、多くの疎水基を有するタンパク質は塩濃度の増大に大きく影響されるからとも考えられる。
高分子の分子量即ち相対分子質量がフィルター膜の細孔径に近づけば近づくほど、本発明はより効果的になる。汚染物質と製品の大きさ及び／又は分子量の差が大きくなる、即ち製品中の高分子汚染物質の濃度が増大するにつれ、本発明の有効性も高くなる。
さらに本発明により、所望製品からの特定の画分の分離が容易になる。例えば、製品を構成するタンパク質から好ましくないタンパク質を分離することができる。
本発明に従って高塩含量を用いると、いわゆる「デッドエンド」濾過法を用いることも可能になる。この好ましい実施態様は、一般に適用されている、特に約５〜３０ｎｍの細孔径を有する慣用の接線濾過法よりいくつかの点で有利である。例えば、必要とされる装置及び操作方法がはるかに簡単であり、そのために費用も安くなる。「デッドエンド」濾過法を用いれば、高分子の損失も少なくなり、処理時間が短縮され、フィルターを通過する高分子の透過性も増大し、且つフィルター上の高分子の概して一定の濃度及び一定の膜圧を得ることもできる。デッドエンド濾過法が有する別の利点は、実験室規模から大量生産規模に至るウイルス濾過法の規模の拡大がかなり容易になるということである。
本発明を実施する際の溶液の総塩含量は、０．３〜３．０Ｍの範囲が適当であり、好ましくは、０．４〜２．５Ｍの範囲、より好ましくは、０．６〜２．０Ｍの範囲である。溶液の総塩含量は０．８〜１．５Ｍの範囲が特に好ましい。
必要なら、許容し得る任意の塩を添加して溶液の総塩含量を調整してもよい。例えば、可溶性無機塩、可溶性有機塩又はそのような塩の組合わせを用いることもできる。いわゆるホフマイスター系列に従って高い塩析効果を示す塩を用いると、重要な処理上の利点が得られると思われる。Ｓ．Ｇｌａｓｓｔｏｎｅ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｃｏ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，第２版、１９４６年４月、１２５４−１２５９ページを参照されたい。そのような高い塩析効果を有するアニオンの最も重要な例は、クエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩及びリン酸塩である。本発明の実施の際に有利に用い得るカチオンは、一価のカチオン、例えば、ナトリウム、カリウム及びアンモニウム、並びに二価のカチオン、例えば、カルシウムである。塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウム又はその組合わせは、医薬上許容し得る添加剤によって得られる利点のために、本発明の特に好ましい塩である。また、濾過法を２段階以上で実施する際には、１種以上の塩を順次添加することも考えられる。
ウイルス濾過には、約５〜約１０ｍｇ／ｍｌ溶液の範囲のタンパク質濃度がしばしば推奨される。驚くべきことには、本発明を適用すると、ウイルスフィルターを介して約１０〜約２０ｍｇ／ｍｌの高タンパク質濃度を有する溶液を有利に処理し得ることが見出された。
溶液の温度は、０℃〜関係タンパク質の変性温度の範囲内でなければならない。溶液の温度は１０〜５０℃の範囲が適当であり、２０〜３５℃の範囲が好ましい。
本発明の実施の際には、溶液のｐＨは、約３〜約９の範囲でなければならず、４〜８の範囲が適当である。タンパク質溶液のｐＨは、関係タンパク質の等電点に近すぎてはならない。例えば、γ−グロブリンの場合、ｐＨが６．８よりも５．５の場合の方がよい結果が得られる。
本発明において、溶液とは、少なくとも５０重量％の水と、場合によって、１種以上の溶液、例えば、メタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルとを含む溶液を指す。
多くの異なるタイプの高分子を含む溶液をウイルス濾過する場合、本発明を用いて処理手順を最適化することができる。そのような分子の例としては、タンパク質、多糖類及びポリペプチド又はその組合わせがある。高分子の起源は本発明の使用には無関係である。従って、高分子は植物界由来であっても動物界由来であってもよく、最初から工業的な方法によって製造されたものであってもよい。しかし、高分子はヒト若しくは動物由来のもの又は遺伝子操作によるもの（組換え体）が適当である。
本発明に特に適切なタンパク質は、VIII因子、IX因子、アンチトロンビンIII、γ−グロブリン、アルブミン、ストレプトキナーゼ、アポリポタンパク質及び成長ホルモンである。
特に好ましいIX因子製品は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎにより製造されるＮａｎｏｔｉｖ▲R▼である。該製品が有する利点は、濾過前のその比活性が極めて微細な構造を有するフィルターを使用し得るほど高いことである。このために、ウイルス濃度を極めて低レベルに低減させ得るとともに、濾過法自体が極めて高速になり且つ高収率が得られる。
VIII因子の好ましいタイプは、組換えにより製造されたVIII因子製品の欠失誘導体である。特に好ましいVIII因子製品は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎにより製造されているｒ−VIIIＳＱである。該製品の１つの利点は、組換えにより製造された製品の分子が天然のVIII因子分子の不活性中間部分を欠失していることである。このために、該分子の平均分子量は１７０，０００になる。この大きさの分子は、かならり量のウイルスを除去し得るようなフィルターを用いた濾過に特に適している。
好ましいアポリポタンパク質には、アポリポタンパク質ＡＩ(Ａｐｏ ＡＩ)、アポリポタンパク質ＡII(Ａｐｏ ＡII)、アポリポタンパク質ＡIV(Ａｐｏ ＡIV)、アポリポタンパク質Ｅ(Ａｐｏ Ｅ)及びその変異体又は混合物が含まれる。異性体には、Ａｐｏ ＡＩ、Ａｐｏ II、Ａｐｏ IV及びＡｐｏ Ｅのプレフォーム、断片、及び切断、延長又は突然変異形態が含まれる。少なくとも１個のアルギニン基がシステイン基で置換された突然変異形態が特に好ましい。そのような突然変異形態の１つは、Ａｐｏ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ(Ａｐｏ Ａ−ＩＭ)であり、これもＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎにより組換えＤＮＡ技術を用いて製造されている。
本発明の特に好ましい多糖類は、グリコサミノグリカン及び細菌の多糖類である。グリコサミノグリカンの例としては、ヘパリン、ヘパリン断片、ヘパリン誘導体、硫酸ヘパラン及びヒアルロン酸がある。特に好ましいグリコサミノグリカン群は、約１０，０００まで、好ましくは２，０００〜８，０００の範囲の平均分子量を有する低分子量ヘパリンからなる。
本発明によれば、特に適当なポリペプチドは、生物活性ポリペプチド、例えば、哺乳動物細胞中で産生された組換えヒト成長ホルモンである。
従って、本発明を用いて、例えば、タンパク質、多糖類及びポリペプチドを含む溶液のウイルス濾過法を最適化し得る。しかし、これから、タンパク質、より特定的にはヒト生体中に天然に産生するタンパク質を含む溶液に関して本発明を説明する。
タンパク質溶液中に存在し得るこれらのウイルスは一般にタンパク質自体よりはるかに大きい。従って、該ウイルスは、その大きさに応じて例えば濾過により除去し得ると考えられる。
本発明により効率的に除去し得るウイルスは、約３５０ｎｍより小さいサイズを有し得る。除去し得るウイルスのサイズは、２００ｎｍより小さいものが適当であり、１５０ｎｍより小さいものが好ましい。一般に、除去し得るウイルスは、約２０ｎｍより大きい、即ち、ほぼパルボウイルスと同じ大きさである。
本発明は主として、高分子が目的物質である場合に、高分子からウイルスを除去することを企図している。しかし、高分子から目的物質であるウイルスを分離するために本発明の方法を用いることも本発明の範囲内に包含される。１つの例は、試薬として用いるためのパルボウイルス及びワクチンとして用いるためのパルボウイルスの精製法であり、例えば、タンパク質及び多糖類は本発明の方法により除去し得る。
ウイルス濾過は通常、接線濾過法又はいわゆる「デッドエンド」濾過法を用いて行う。接線ウイルス濾過法では、タンパク質溶液を一定の流速で保持側に送り込むと同時に、別ポンプで吸引してフィルターを介してタンパク質溶液を汲み上げる。保持側で所定の量が得られたら、保持側に緩衝液を加える。必要なら、この手順を数回繰り返し、残留タンパク質の主要部分をフィルターに通しながら、保持側でウイルスを保持する。そのような方法はダイアフィルトレーションと称されている。通常、フィルターは、各実験の後で廃棄してウイルスの移動を回避する。
いわゆる「デッドエンド」ウイルス濾過法の場合、接線ウイルス濾過法と同じウイルスフィルターを用いてもよいが、周辺機器及び操作手順は、接線ウイルス濾過法の場合よりはるかに簡単で且つ費用も安い。従って、原則として、「デッドエンド」濾過法は、濾過する前に、圧力容器中に高分子含有溶液を装入する段階、及び窒素（ガス）が適当である圧力源を用いてウイルスフィルターを介して溶液を加圧する段階を含む。
一般的なフィルターの細度は、通常、細孔径、又は分子がフィルターに捕捉される近似分子量（相対分子質量）、いわゆるカットオフとして示される。本発明において、ウイルスフィルターは、約１，０００，０００のカットオフを有し、５００，０００のカットオフを有するのが適当である。小さいウイルスを除去するには、ウイルスフィルターが、２００，０００、好ましくは１００，０００のカットオフを有していなければならない。ウイルスを最大に減少させるためには、ウイルスフィルターは、ウイルス濾過される高分子よりわずかに大きいカットオフを有していなければならない。
ウイルスフィルターは当業界では公知であり、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ及び日本のＡｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．などにより製造されている。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、関係タンパク質の大きさに応じて、２種の異なる膜を有するフィルターを製造している。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、約７０，０００までの分子量、即ち相対分子質量を有するタンパク質用のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／７０、約１８０，０００までの分子量を有するタンパク質用のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／１８０などを製造している。後者のフィルターは、例えば、モノクローナル抗体に用い得る。Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙは、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）３５フィルター及びＰｌａｎｏｖａ（商標）１５フィルターなどを製造しており、後者のフィルターはポリオウイルスのような小さいウイルスの除去に用いられている。
上記のように、フィルターの選択は、関係タンパク質の大きさなどに依存する。IX因子、アンチトロンビンIII、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)及びＡｐｏ Ａ−ＩＭ(二量体)は全て、おおよそ６０，０００〜７０，０００の分子量を有しており、例えばＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／７０を選択するのが適当である。γ−グロブリンは約１８０，０００の分子量を有しており、例えば、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／１８０を選択するのが適当である。後者のフィルターは、上記のような、約１７０，０００の分子量を有する組換えにより製造されたVIII因子製品、ｒ−VIIIＳＱの場合に用いるのにも適当である。
タンパク質溶液が濾過前に高純度を有している場合にも微細構造フィルターを選択し得ると考えられる。同様に、最終製品中のウイルス含量が極めて低いタンパク質溶液を製造する場合にも微細構造フィルターを用いる必要がある。従って、ウイルス濃度を極めて低いレベルに低減させ得るためには、極めて微細な構造を有するフィルター、例えば、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／７０が必要である。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／１８０を用いても、ウイルス濃度をそのような低レベルに低減させることはできない。
濾過段階の有効性又は効力は、フィルターにかけるタンパク質溶液の純度に影響される。この点で、濾過前に高比活性を有していれば、濾過段階で高収率が得られる。例えば、IX因子を含む溶液を濾過する際に、好ましい実施態様を適用すると、濾過段階でのタンパク質収率を約７０％から９５％以上に増大させ得ることが判明した。しかし、本発明の実施の際には、比活性が低い溶液を用いた場合でさえ、９０％を超えるタンパク質収率を得ることができる。
本発明により、エンベロープに入っていない極めて小さなウイルス、例えばパルボウイルスの含量を、３ｌｏｇ以上、適当には４ｌｏｇ以上、好ましくは５ｌｏｇ以上減少させ得る。減少率は接線法を用いても非常に良好であるが、本発明を適用する場合には、「デッドエンド」法を用いると減少率がさらに高くなる。
本発明によれば、ウイルス濾過はタンパク質製造の最終段階で実施するのが好ましい。というのは、濾過前に高比活性を有することにより、濾過段階で高いタンパク質収率が得られるからである。本発明は、最終精製段階として適用し、場合によってその後で、例えば、最終製品のタンパク質濃度、塩含量又はｐＨを調整する段階を実施するのが好ましい。ＵＦ−膜を用いる後続のダイアフィルトレーション段階を適用して、ウイルス濾過中には処理上又は経済上有利ではあっても最終製品に含まれていてはならない塩を除去してもよい。すぐ投与し得る状態のタンパク質溶液は、通常、生理的溶液、例えば、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７）と、１種以上の安定剤、例えば、サッカロース又はアミノ酸との組合わせを含む。ウイルス濾過法は、中間処理段階を含むか又は含まない２段階以上で実施してもよい。
本発明は、脂質エンベロープを有するウイルス及び脂質エンベロープを有さないウイルスのどちらの含量をも効率的に減少させる。脂質エンベロープを有さないウイルスの例には、比較的小型のウイルスである、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス及びパルボウイルスが含まれる。脂質エンベロープを有するウイルスの例としては、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)が挙げられる。
以下に、例示のための非限定的実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
実験セクション
先ず、タンパク質ふるい係数又はタンパク質透過係数を種々の濾液流量で測定する実験を行った。ふるい係数又はタンパク質透過係数は、Ｐ／Ｒ〔ここで、Ｐは２８０ｎｍでの吸収（Ａ280）により測定された透過側（濾液側）でのタンパク質濃度であり、Ｒは２８０ｎｍでの吸収（Ａ280）により測定された保持側（Ｒ）でのタンパク質濃度である〕として与えられる。次いで、フィルター上で重合の不在下での最高のふるい係数が得られる濾液流量を選択した。数種の高分子を用いて収率の最適化も行った。
実施例１
タンパク質ふるい特性、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす２種の塩含量の効果を示すために、高分子としてIX因子を用いて実験を行った。IX因子を含む市販溶液、Ｎａｎｏｔｉｖ▲R▼は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから得た。IX因子を含む溶液はヒト血漿から得たものであり、濾過する前にアニオン交換、化学的ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー及びカチオン交換の順序で処理しておいた。該溶液を各段階の間に、但し、化学的ウイルス不活化段階とアフィニティークロマトグラフ段階の間を除いて、限外濾過した。
実験条件：
装入するタンパク質溶液の純度：高純度、
緩衝液：０．１４４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００５５Ｍ クエン酸ナトリウム、
総塩含量：約０．１５Ｍ、
タンパク質濃度：０．５〜１．０Ａ280単位、
タンパク質溶液のｐＨ：７、
実験温度：室温（約２３℃）、
ウイルス分離用フィルター：Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／７０、
濾過法：接線法、
フィルター面積：１／３ｆｔ2、
保持流量：４１Ｌ／時、
ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ ５０４、
膜間圧：０．２〜０．３バール。
0003676370.tif 000002
タンパク質ふるい係数を測定して、２０．８ｍｌ／分という最適濾液流量を得た。
0003676370.tif 000003
装入タンパク質溶液１容量単位当たり約１容量単位の希釈度（１＋１）でのダイアフィルトレーションにより、約９０％の収率を得た。
実施例２
実施例１で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、この場合、緩衝液は１．０Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなり、総塩含量は約１．０Ｍであった。
0003676370.tif 000004
このタンパク質ふるい係数を測定して、２４．３ｍｌ／分という最適濾液流量を得た。
0003676370.tif 000005
装入溶液１容量単位当たり約０.３容量単位の希釈度(１＋０．３)でのダイアフィルトレーションにより、＞９５％の収率を得た。
実施例３
実施例１及び２に開示された実験によって達成されたウイルス除去効果をウイルス実験により測定した。該実験は脂質エンベロープを有していない２０〜１５ｎｍの大きさのパルボウイルスで行った。原則として、そのようなウイルスを用いる実験は、公知ウイルスのうちで最小のものであることから、「最悪のケース」に分類される。
それぞれ、０．１４４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００５５Ｍ クエン酸ナトリウム（実験１）及び１．０Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１Ｍ クエン酸ナトリウム(実験２)の塩含量のIX因子含有溶液にパルボウイルスを加えた。次いで、溶液を実施例１及び２に従ってウイルス濾過した。ウイルス濾過の前と後にパルボウイルスについて溶液を分析した。
0003676370.tif 000006
この結果は、実施例１及び２によるウイルス濾過が１処理段階におけるウイルス減少法に関して関係当局により設定された要件を満たすことを示している。さらに、本発明に従って高塩含量を用いると、少なくとも公知方法と同程度に効率的にウイルスが除去される。
実施例４
実施例１で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、装入するタンパク質溶液は実施例１のものほど純粋ではなかった。
装入するタンパク質溶液１容量単位当たり約３容量単位の希釈度（１＋３）によるダイアフィルトレーションにより、約６５％の収率を得た。
実施例５
実施例２で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、装入するタンパク質溶液は実施例２のものほど純粋ではなかった。
装入するタンパク質溶液１容量単位当たり約３容量単位の希釈度（１＋３）によるダイアフィルトレーションにより、約８９％の収率を得た。IX因子：Ｃの収率は８７％であった。
実施例６
タンパク質ふるい係数、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす４種の塩含量の効果を示すために、高分子としてIX因子を用いて実験を行ったが、他の実験条件は一定であった。用いたＮａｎｏｔｉｖ▲R▼溶液は、実施例１に用いたものと同種のものであった。適用した実験条件は実施例１に適用したものと同じであった。
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表５〜表８から、IX因子溶液をウイルス濾過する際の処理条件において、本発明により、低塩含量を用いた公知方法に比べて著しい改良が得られることを明らかである。
実施例７
タンパク質ふるい係数、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす３種の異なる塩の効果を示すために、高分子としてIX因子を用いて実験を行ったが、他の実験条件は一定であった。用いたＮａｎｏｔｉｖ▲R▼溶液は、実施例１に用いたものと同種のものであった。適用した実験条件は実施例１に適用したものと同じであった。
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表９〜表１１から、多くの異なる塩を用いて本発明を有利に実施し得ることが明らかであろう。さらに、ホフマイスター系列に従って高い塩析効果を有する塩（ジヒドロリン酸カリウム）を用いると、低い塩析効果を有する塩（塩化バリウム）に比べてタンパク質ふるい係数が増大することもわかる。
実施例８
タンパク質ふるい係数、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす塩含量の効果を示すために、高分子としてγ−グロブリンを用いて実験を行った。γ−グロブリンを含む溶液は、血漿から得た市販製品、Ｇａｍｍｏｎａｔｉｖ▲R▼(Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ製造)であった。該γ−グロブリン溶液は、濾過前に、最初にコーン分画、次いでクロマトグラフィー段階で精製しておいた。
適用した実験条件は実施例１で適用したものと同じであったが、但し、ウイルス除去フィルターは、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／１８０であり、溶液のｐＨは６．８、タンパク質濃度は２．５〜５．０Ａ280単位であった。緩衝液は、２．２％ アルブミン＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２Ｍ ＮａＡｃ＋０．０７５Ｍ グリシンからなるものであった。総塩含量：０．１７Ｍ。
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タンパク質ふるい係数を測定して、２０．８ｍｌ／分という最適濾液流量を得た。
実施例９
実施例８で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、この場合、緩衝液は、２．２ アルブミン＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２Ｍ ＮａＡｃ＋０．０７５Ｍ グリシンからなるものであった。総塩含量：約１．０Ｍ。
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タンパク質ふるい係数を測定して、２０．８ｍｌ／分という最適濾液流量を得た。
濾液流量２０．８ｍｌ／分及び１０分までの滞留時間での収率を最適化すると、６０〜６８％のＰ／Ｒ率が得られた。
装入タンパク質溶液１容量単位当たり約１容量単位の希釈度（１＋１）でのダイアフィルトレーションにより、９０％の収率を得た。
実施例１０
実施例８で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、この場合、溶液のｐＨは５．５であった。
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実施例１１
実施例１０で適用したものと同じ条件を適用したが、但し、この場合、緩衝液は、２．２％ アルブミン＋１．０Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２Ｍ ＮａＡｃ＋０．０７５Ｍ グリシンからなるものであった。総塩含量：約１．０Ｍ。
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実施例１２
タンパク質ふるい係数、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす塩含量の効果を示すために、高分子としてアルブミンを用いて実験を行った。血漿から得たヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む４％溶液は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから得た。該アルブミン含有溶液は、濾過前に、組み合わされたコーン分画及びクロマトグラフィー段階で精製しておいた。
適用した実験条件は、実施例１で適用したものと同じであったが、但し、タンパク質濃度は約１０Ａ280単位であった。緩衝液は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２Ｍ ＮａＡｃからなるものであり、総塩含量は０．１７Ｍであった。
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タンパク質ふるい係数を測定して、２０．８ｍｌ／分という最適濾液流量を得た。
実施例１３
適用した実験条件は、実施例１２で適用したものと同じであったが、但し、この場合、緩衝液は、１．０Ｍ ＮａＣｌ＋０．０２Ｍ ＮａＡｃからなるものであり、総塩含量は約１．０Ｍであった。
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装入タンパク質溶液１容量単位当たり約１容量単位の希釈度（１＋１）でのダイアフィルトレーションにより、８５％の収率を得た。
実施例１４
タンパク質ふるい係数、ダイアフィルトレーション容量及び収率に及ぼす保持流量の効果を示すために、高分子としてIX因子を用いて実験を行ったが、他の実験条件は一定であった。用いた市販のＮａｎｏｔｉｖ▲R▼溶液は、実施例１で用いた溶液と同種のものであった。適用した条件は実施例１で適用したものと同じであったが、但し、この場合、緩衝液は、１Ｍ ＮａＣｌ＋６．４ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０からなるものであった。
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保持流量が少なくなるにつれ、フィルターを介したタンパク質透過率が高くなる。
実施例１５
希釈度、収率、タンパク質ふるい係数及び処理時間に及ぼすウイルス濾過法のタイプの効果を示すために、高塩含量を有する溶液中、高分子としてIX因子を用いて実験を行ったが、他の実験条件は実質的に一定であった。Ｎａｎｏｔｉｖ▲R▼溶液を含む適用実験条件は、実施例１で適用したものと同様であったが、但し、以下の点が異なる：
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「デッドエンド」法を用いてIX因子をウイルス濾過すると、希釈度が低下し、処理時間が短縮され、高い収率及びタンパク質透過性が得られる。
実施例１６
「デッドエンド」法に従ってウイルス濾過した場合に、収率及びタンパク質ふるい係数に及ぼす塩含量の効果を示すために、高分子としてIX因子を用いて実験を行ったが、他の実験条件は一定であった。いずれの場合も、緩衝液は、ＮａＣｌのほかに、６．４ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む。Ｎａｎｏｔｉｖ▲R▼溶液を含む適用条件は、実施例１で適用したものと同じであったが、但し、以下の点が異なる：
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１＋０．０７の希釈度を用い、ウイルスフィルター上で８３％の総収率を得た。処理時間は２６４ ｋＩＵ IX因子／時であった。
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１＋０．０７の希釈度を用い、ウイルスフィルターで６３％の総収率を得た。処理時間は１９４ ｋＩＵ IX因子／時であった。
実施例１７
希釈度、収率、タンパク質ふるい係数及び処理時間に及ぼすこのタイプのウイルス濾過法の効果を示すために、塩含量の低い溶液中、高分子としてアンチトロンビン（ＡＴIII）を用いて実験を行ったが、他の条件は実質的に一定であった。用いた市販のＡＴｅｎａｔｉｖ▲R▼溶液は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから得た。いずれの場合も、緩衝液は、０．１２Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含んでいた。適用した条件は、実施例１で適用したものと同じであったが、但し、以下の点が異なる：
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「デッドエンド」法を適用してＡＴ IIIをウイルス濾過すると、希釈度が低下し、タンパク質の透過性が高められ且つ処理時間が短縮される。
実施例１８
接線法に従ってウイルス濾過した場合、収率及びタンパク質透過性（ふるい係数）に及ぼす塩含量の効果を示すために、高分子としてアンチトロンビン（ＡＴIII）を用いて実験を行ったが、他の実験条件は一定であった。全ての実験において、緩衝液は、ＮａＣｌのほかに、１ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含んでいた。ＡＴｅｎａｔｉｖ▲R▼溶液を含む適用条件は、実施例１７で適用したものと同じであったが、但し、保持流量は全ての実験において２０Ｌ／時であった。
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ＡＴIIIに関しては、塩含量を高くするとタンパク質の透過性が向上する。
実施例１９
希釈度、収率、タンパク質ふるい係数及び処理時間に及ぼすウイルス濾過法のタイプの効果を示すために、塩含量の高い溶液中、高分子としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて実験を行ったが、他の実験条件は実質的に一定であった。用いたＨＳＡ溶液は、実施例１２で用いた溶液と同種のものであった。全ての実験において、緩衝液は、１．０Ｍ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ＝７．４）を含んでいた。適用した条件は、実施例１で適用したものと同じであったが、但し、以下の点が異なる：
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１＋０．７２の希釈度を用い、ウイルスフィルター上で８５％の総収率を得た。処理時間は４６１５ｍｇ ＨＳＡ／時であった。
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「デッドエンド」法を適用してＨＳＡをウイルス濾過すると、希釈度が低下し、収率及びタンパク質の透過性が高くなり、且つ処理時間が短縮される。
実施例２０
希釈度、収率、タンパク質ふるい係数及び処理時間に及ぼすこのタイプのウイルス濾過法の効果を示すために、塩含量の高い溶液中、高分子としてγ−グロブリンを用いて実験を行ったが、他の実験条件は実質的に一定であった。用いたγ−グロブリン溶液は、実施例８に用いた溶液と同種のものであった。全ての実験において、緩衝液は、１．０Ｍ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ 酢酸ナトリウム＋０．０７５Ｍグリシン（ｐＨ＝５．５）を含んでいた。適用した条件は、実施例１で適用したものと同じであったが、但し、以下の点が異なる：
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１＋０．１２の希釈度を用い、ウイルスフィルター上で９４％の総収率を得た。処理時間は２７９０ｍｇ γ−グロブリン／時であった。
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「デッドエンド」法を用いてγ−グロブリンをウイルス濾過すると、希釈度が低下し、収率及びタンパク質の透過性が高められ、且つ処理時間が短縮される。
実施例２１
上記実施例のもの（１／３ｆｔ2）より実質的に大きいフィルター面積（１０ｆｔ2）を用いることにより、本発明を大量生産規模で適用し得ることを実証するために、高分子としてアンチトロンビンを用いて実験を行った。アンチトロンビン（ＡＴ III）、ＡＴｅｎａｔｉｖ▲R▼を含む市販溶液は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから得た。
実験条件：
緩衝液：１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ リン酸ナトリウム、
総塩含量：約１．０Ｍ、
タンパク質濃度：９．２ Ａ280単位、
タンパク質溶液のｐＨ：７．４、
ウイルス濾過前のタンパク質溶液の量：２０．８ｋｇ、
ウイルス分離用フィルター：Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）／７０、
濾過法：デッドエンド法、
フィルター面積：１０ｆｔ2、
保持流量：０Ｌ／時
濾液流量緩衝液：２０Ｌ／時、
膜間圧：０．３バール。
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この実施例から、本発明によるアンチトロンビンのウイルス濾過は、大量生産規模で適用しても優れた結果をもたらし得ることが明らかである。
実施例２２
実施例１５で開示された実験により得られたウイルス除去効果を、ウイルス実験により測定したが、但し、高塩含量を用いた。ウイルス濾過法は「デッドエンド」法であった。実験は、実施例３の場合と同様にパルボウイルスで行った。IX因子、１．０Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１Ｍ クエン酸ナトリウム（実験１）を含む溶液にパルボウイルスを加えた。ウイルス濾過の前と後に、パルボウイルスに関して溶液を分析した。
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この結果は、デッドエンド法を用い、実施例１５に従ってウイルス濾過すると、１処理段階でのウイルス減少法に関して関係当局により設定された要件を満たすことを示している。さらに、本発明に従って高塩含量を用いると、少なくとも公知方法と同程度に効果的にウイルスが除去される。