(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】  キメラｍＲＮＡ分子を作製するための、下記のｉ）、ii）、iii)及び（iv）を含む配列を有するＤＮＡの転写と、ポリペプチドを作製するための、上記キメラｍＲＮＡ分子の翻訳とによる、ポリペプチドの製造方法：
（ｉ）プロモーター
（ii）ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列又はその一部分の配列に相補的な    翻訳増強配列（但し、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ  ４の５′‐非翻訳リーダー    配列を除く）、
(iii)開始コドン、及び
（iv）プロモーターのコントロール下にある、上記ポリペプチドをエンコードするコー    ド配列
但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するＲＮＡウイルスに非相同であり、上記プロモーター、翻訳増強配列、開始コドン及びコード配列間の関係は、ＤＮＡの転写でキメラｍＲＮＡ分子が作製される関係であり、その翻訳は翻訳増強配列に相当するその部分によって、該部分を欠く相当するｍＲＮＡ分子に比べて増強される。
【請求項２】  ＤＮＡが転写エンハンサー配列をも含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列が植物ウイルス由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列又はその一部分である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列がアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ  ４由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】  ＤＮＡが、微生物又は細胞培養物の細胞中に組込まれている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】  下記のｉ）、ii）及びiii)を含む配列を有するキメラｍＲＮＡ分子の翻訳によるポリペプチドの製造方法：
（ｉ）ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー又はその一部分である翻訳増強配列（但    し、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ  ４の５′‐非翻訳リーダー配列を除く）、
（ii）開始コドン、及び
(iii）上記ポリペプチドをエンコードするコード配列
但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するＲＮＡウイルスに非相同であり、上記翻訳増強配列、開始コドン及びコード配列間の関係は、キメラｍＲＮＡ分子の翻訳が翻訳増強配列によって、該配列を欠く相当するキメラｍＲＮＡ分子に比べて増強される関係である。
【請求項８】  キメラｍＲＮＡが相補的ＤＮＡ由来である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列が植物ウイルス由来である、請求項７又８に記載の方法。
【請求項１０】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列又はその一部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列がアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ  ４由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】  ５′キャップが、翻訳増強配列の上流にあるキメラｍＲＮＡにつけられている、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーに関する。
【０００２】
真核生物及び原核生物が翻訳を開始するメカニズムは、一部共通の特徴を有しているが、他の点では異なっていることが知られている。真核生物のメッセージは機能上モノシストロニック（monocistronic ）であって、翻訳は５′末端で始まり、この末端におけるキャップ構造（ｍ７Ｇ５′ｐｐｐ５′Ｇ．．．）の存在によって促進される〔シャトキン，セル，第９巻，第６４５頁，１９７６年（Shatkin, Cell, 9, 645 (1976)〕。原核生物のメッセージはポリシストロニック（polycistronic)であって、５′末端以外の部位で開始しうるが、キャップの存在は翻訳促進に繋がらない。真核生物及び原核生物は双方ともコドンＡＵＧで翻訳を開始するが、但し原核生物はＧＵＧを利用することもできる。双方における翻訳は、開始コドン近くのある配列によって促進される。原核生物の場合には、それは所謂シャイン‐ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列（開始コドンより上流のプリンに富む３〜１０ヌクレオチドの領域）である。真核生物の場合には、それは（ＡＵＧ開始コドンのＡが＋１と表示される場合に）−３位のプリン及び＋４位のＧ残基であるが、更に効果的なチューニング（tuning）のためには他の配列も加わる必要がある。これはスキャニング（scanning）モデルの“緩和”バージョン（"relaxed" version ）の一部であり〔コザック，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第８５７頁，１９８４年（kozak, Nucleic Acids Research, 12, 857 (1984))〕、それによって４０Ｓリボソームサブユニットが真核生物ｍＲＮＡの５′末端で結合し、モデルの要求を満たす最初のＡＵＧと出会うまで、即ち６０Ｓサブユニットが４０Ｓサブユニットと結合してタンパク質合成が始まる時点まで、配列をスキャニングし続ける。この点については、下記コザックの文献を参考にすることができる：セル，第１５巻，第１１０９頁，１９７８年；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第９巻，第５２３３頁，１９８１年；及びセル，第４４巻，第２８３頁，１９８６年。
【０００３】
開始コドンの中及び近辺で必要なこれらの配列以外に、翻訳を複製の面で促進させることが知られた他のｍＲＮＡ領域は存在しない。
真核生物の転写において、“エンハンサー”領域として知られる配列は転写促進を図ることができる。
ＲＮＡウイルスは、正もしくは負の一重鎖ＲＮＡ又は二重鎖ＲＮＡを含んでいる。ＲＮＡウイルス群としては、大多数の植物ウイルス（９０％以上）、一部の動物ウイルス及び数種のバクテリオファージがある。
【０００４】
ＲＮＡウイルスの中で最も広く研究されたものの１つは、タバコモザイクウイルス（以後ＴＭＶと称される）である。ＴＭＶの完全ヌクレオチド配列が知られている〔ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス  ＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年（Goelet et al., Proceeding of National Academy of Science USA, 79, 5818(1982)）〕。ＴＭＶ  ＲＮＡの５′領域は鎖長７０ヌクレオチドのＲＮアーゼＴ１耐性断片として１９６５年に始めて単離されたが〔マンドリー，ツァイトシュリフト・フュール・フェレルブングスレーレ，第９７巻，第２８１頁，１９６５年（ Mundry, Zeitschrift fur Vererbungslehre, 97, 281 (1965) ）〕、内部Ｇ残基を有していなかった〔マンデレル，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第２４３巻，第３６７１頁（Mandeles, Journal of Biological Chemistry, 243，3671）〕。この領域〔以後、オメガと称される；マンデレス，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Molecular Biological Chemistry ），第２４３巻，第３６７１頁〕は配列決定され〔リチャーズら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第８４巻，第５１３頁，１９７８年（Richards et al., European Journal of Biochemistry, 84, 513 (1978)）〕、小麦麦芽リボソームと二重（disome）開始複合体を形成することが示された。１つのリボソームは、１２６キロドルトン（ＫＤａ）のタンパク質コード領域のＡＵＧ開始部位を占めており、第二のものは上流リーダー配列と結合している〔フィリポウィクズ（Filipowicz）及びヘッニ（Haenni），プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第３１１１頁，１９７９年；コナルスカら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第１１４巻，第２２１頁，１９８１年（Konarska et al., European Journal of Biochemistry, 114, 221 (1981) ）〕。リボソーム会合におけるオメガの役割を支持するもう１つの最近の証拠は、ウィルソン（Wilson）及び共同研究者の脱外被（uncoating ）／遺伝子発現データからきている〔ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー，第６６巻，第１２０１頁，１９８５年(Journal of General Virology，66, 1201 (1985) ）及びＵＣＬＡシンポジウム，第５４巻，第１５９頁，１９８７年(UCLA Symposium, 54, 159(1987)）で差違検討されている〕。ＴＭＶ粒子が５′末端へのリボソームの結合及び３′末端方向へのそれらの翻訳移動によって脱外被されていることは、様々なインビトロ翻訳系で観察された。
【０００５】
ＲＮＡウイルスの５′領域はｍＲＮＡの翻訳エンハンサーとして機能することが、ここに発見されたのである。
第一面として、本発明はウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）を含むｍＲＮＡを提供するが、このｍＲＮＡはリーダー配列を供与するウイルスに由来しない下流配列も含んでいる。
【０００６】
第二面として、本発明はウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的なＤＮＡ配列を提供する。
【０００７】
第三面として、本発明は、プロモーター、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を含んでいるＤＮＡ配列を提供する。本発明はこのようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターをも提供する。
【０００８】
第四面として、本発明は、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）における、ＲＮＡとしての又は相補的ＤＮＡとしての、即ち５′‐リーダーＲＮＡがｍＲＮＡと接続している場合のｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーとしての用途を提供する。
【０００９】
配列決定されたほとんどのＲＮＡウイルスは、５′‐リーダー配列、即ち最初の開始コドンまでの（但し、それを含まない）５′末端における配列を含んでいる。いずれのＲＮＡウイルスからの適切な５′‐リーダー配列も、本発明の翻訳エンハンサーとして使用可能である。
【００１０】
前記のように、ＴＭＶの５′‐リーダー配列＋ＡＵＧ開始コドンはオメガとして知られており、かつそのヌクレオチド配列も公知であるため（リチャーズら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第８４巻，第５１３頁，１９７８年）、ｃＤＮＡは合成することができる。ＴＭＶのオメガプライム（Ω′，図１参照）配列は、本発明の好ましい翻訳エンハンサーを表わしている。
【００１１】
下記のような他のＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列による翻訳増強に関する情報も利用可能である：
カブ黄斑モザイクウイルスゲノムＲＮＡ（フィリポウィクズ及びヘッニ，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第３１１１頁，１９７９年）、ブロウム（brome)モザイクウイルスＲＮＡ３、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年）；ラウス肉腫ウイルス〔ジェイ・エル・ダーリックス（J.L. Darlix)ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１０巻，第５１８３頁，１９８２年〕。
【００１２】
いずれの具体的ケースにおいても、翻訳エンハンサーとしての機能が調節されるもののそれが損われないような方法で天然５′‐リーダー配列を変えることは、ほぼ確実に可能であろう。このような変異体は本明細書において“誘導体”と呼ばれているが、天然配列の誘導体及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を構成している。天然５′‐リーダー配列（又は誘導体配列）の一部のみが翻訳増強を起こすために必要とされるケースもあるであろう。配列のこのような一部は本明細書において“部分”と呼ばれているが、天然配列もしくはその誘導体の部分及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を形成している。
【００１３】
いずれの具体的ケースにおいても、ＲＮＡウイルスの５′‐リーダーのヌクレオチド配列の決定は、公知かつ易利用性の技術を用いる当業者の技術的範囲内にあるべきである。同様に、翻訳増強のために必要な天然５′‐リーダー配列の一部及び修正もしくは削除されうる配列の同定（即ち、天然配列の誘導体及び部分の同定）は、ルーチン的実験により決定されうる問題である。
【００１４】
ＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）は、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて適切なｍＲＮＡの上流にそれらを結合させることによって、それ自体を本発明の翻訳エンハンサーとして使用することができる。５′‐リーダー配列は下流ｍＲＮＡの開始コドンのすぐ隣であってもよいし、又は介在配列によってそれから離されていてもよい。しかしながら、相補的ＤＮＡの形で５′‐リーダー配列を用いることが好ましい。ｃＤＮＡは望ましいいかなる方法でも得ることができる。しかしながら、問題の５′‐リーダー配列の比較的短い鎖長を考慮すれば、ｃＤＮＡを化学的に合成することが通常最も好都合であろう。ｃＤＮＡは通常発現ベクターに組込まれる。発現ベクターは、ベクター中に含まれているそれらのＤＮＡ配列を発現させることができ、かつそのＤＮＡ配列がそれらの発現を行なわせうる他の配列と作働可能に結合せしめられているのであれば、いかなるベクターであってもよい。発現ベクターは、プロモーター、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでの（但しそれを含まない）ＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を有するＤＮＡ配列を通常含んでいる。オープン読取枠は通常重要な１種以上のタンパク質についてコードしている。発現ベクターは、ＤＮＡ配列が転写及び翻訳により発現される宿主細胞中に安定的に又は一時的に直接組込まれる。安定的発現の場合には、ベクターはエピソームとして又は染色体ＤＮＡの必須部分として宿主中で複製可能でなければならない。又は、発現ベクターはインビトロで転写させることができ、その際にはＲＮＡが一時的発現のために細胞中に直接組込まれる。
【００１５】
本発明の翻訳エンハンサーは、ｍＲＮＡの翻訳能力を高めることが望まれるいかなる状況下においても使用可能である。しかしながら、エンハンサーの効果はそれが存在しなければ不十分にしか翻訳されないｍＲＮＡの場合において最も著しいことに留意すべきである。したがって、本発明のキャップもしくはエンハンサー又は双方の付加は翻訳を促進させることになる。既にキャップを有しているｍＲＮＡの場合であっても、本発明のエンハンサーの効果はなお存在している。
【００１６】
本発明の翻訳エンハンサーは、例えば植物細胞、細菌及び動物細胞のような多数の異なるタイプの発現系において有効であるが、但し特定のエンハンサーは他の系よりむしろ１つの系とより適合するようである。例えばインビトロ試験時におけるＴＭＶのオメガ配列はウサギ網状赤血球溶解物系の場合よりも小麦麦芽系及び大腸菌（Escherichia coli）の場合により大きな増強性を示すようであるが、翻訳の増強自体は３種すべての系で観察される。特定のエンハンサーと特定の発現系との適合性は、通常当業者の技術的範囲内に十分属する事項であろう。
【００１７】
一般的に、本発明の翻訳エンハンサーは、農業を含む商業面に対する生物又は細胞系の価値がその天然遺伝子又は人工産生遺伝子の１つの発現レベルによって決定される場合であれば、いずれにおいても利点を生かしつつ用いることができる。
(i)   遺伝子工学生物又は細胞系で商業的に有用なタンパク質の産生に際して。
(ii)  酵素で触媒される中間代謝産物の産生速度が特定酵素の合成速度を増加させることによって高められうるような発酵に際して。
(iii) ウイルス感染の影響がウイルス弱毒体との前接触によって抑制させることができ、かつ保護を付与する成分の産生レベルを増加させることにより保護レベルを高めることが有利であるようなウイルス交差保護に際して。例えば植物は、ウイルス外被（coat）タンパク質についてコードするＴＭＶ  ＲＮＡ部分のｃＤＮＡコピーを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium ）遺伝子工学株にそれらを接触させることによってＴＭＶ感染から保護することができる。植物ゲノムに挿入された細菌ｃＤＮＡは、ウイルス自体による感染から植物を保護する外被タンパク質を連続的に発現する。
(iv)  除草剤耐性等の性質が植物の中間代謝の人工的修正によって付与されるような植物の遺伝子工学に際して。
(v)   例えば、部分的クローンの発現産物に対する抗体を産生させることが望まれている場合における、遺伝子の部分的クローンの発現に際して。
【００１８】
本発明は下記実験操作によって更に詳細に説明されている。
実  験
ｍＲＮＡ
本発明の態様のキメラｍＲＮＡを、図１で示されているように、下記方法で産生した。
ＴＭＶ  ＲＮＡブルガレ（vulgare ）株の配列を用いて（ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年）、１２６ｋＤａオープン読取枠のＡＵＧ開始コドンの上流において５′キャップ（ｍ７Ｇｐｐｐ及び隣接Ｇ残基）を含まない６７塩基配列に対して相補的なＤＮＡ配列を含む８１塩基オリゴヌクレオチドを合成した。この配列はオメガプライムと呼ばれている。ＨｉｎｄIII部位をこのオリゴヌクレオチドの５′末端に組込み、かつＳａｌＩ部位を３′末端に組込んだ。オメガプライム配列の３′末端における１３塩基及びＳａｌＩ部位を含む２０塩基の第二オリゴヌクレオチドを、第二鎖合成用のプライマー（primer）として合成した。アニーリング（annealing ）後、第二鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて完了させた。
【００１９】
得られた二重鎖８１ｂｐ断片をＨｉｎｄIII／ＳａｌＩで消化させて一重鎖付着端をもつ７７ｂｐ断片を作成し、ｐＵＣ１９の対応部位に挿入した。合成の結果ＴＭＶのオメガプライム配列が正しい向きをしているという事実は、ジデオキシ鎖ターミネーション法〔サンガ（Sanger）ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７４巻，第５４６３頁，１９７７年〕を用いた配列分析によって立証された。次いで、ＴＭＶのオメガプライムを含む断片をプラスミドｐＪII１のＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ部位に組込み、ｐＪII１０１を得た。ｐＪII１は、ＢａｍＨＩ断片としてのアセンブリー（assembly）配列のＴＭＶ源をｐＳＰ６４の対応部位に挿入し〔メルトン（Melton），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第７０３５頁，１９８４年〕、かつＳｍａＩ部位をＢｇｌII部位に変えることにより〔スリートら，バイオロジー，第１５５巻，第２９９頁，１９８６年（Sleat et al., Virology, 155, 299 (1986) ）〕得られる。
【００２０】
Ｔｎ９のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含むｐＣＭ１から７７９ｂｐＳａｌＩ末端断片〔クローズ及びロドリゲス，ジーン，第２０巻，第３０５頁，１９８２年（Close and Rodriguez, Gene, 20, 305 (1982) ）〕をｐＪII１及びｐＪII１０１のＳａｌＩ部位に組込み、それぞれｐＪII２及びｐＪII１０２を得た。Ｔｎ５のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（ＮＰＴII）を含むｐＫＮＲ‐Ｈからの１．２ｋｂ  ＢｇｌII／ＳａｌＩ断片〔ギャリーら，ジャーナル・オブ・バイテリオロジー，第１６１巻，第１０３４頁，１９８５年(Gallie et al., Journal of Bacteriology, 161, 1034 (1985)）〕をクレノウ断片でブラント末端化し、ｐＪII１及びｐＪII１０１のＡｃｃＩ部位に組込み、それぞれｐＪII３及びｐＪII１０３を得た。ＣＡＴ及びＮＰＴII双方の正確な配向性は制限断片分析によって立証された。
【００２１】
ｐＪII２及びｐＪII１０２をＢｇｌIIでかつｐＪII３及びｐＪII１０３をＥｃｏＲＩで直鎖化後、各々のＲＮＡ転写体をＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼの使用により産生した。各々のキャップ体も、キャップ転写体の対応的産生を確保するＧｐｐｐＧ及びＳＰ６ポリメラーゼの反応条件を用いて産生した。キャップ及び非キャップ反応からのＲＮＡ並びにオメガ配列をもつ又はもたない構造体に関する同量産生は、ホルムアルデヒド‐アガロースゲルを変性させることによって立証された。
【００２２】
同量の様々なＣＡＴ含有転写体及びＮＰＴII含有転写体を標準的反応条件下でウサギ網状赤血球溶解物（ＭＤＬ）、小麦麦芽Ｓ‐３０（ＷＧ）及び大腸菌Ｓ‐３０のインビトロ翻訳系に加えた。得られたポリペプチド産物を35Ｓ‐メチオニンで標識した。
【００２３】
図２及び図３は、ＭＤＬ（図２，トラック１〜１１）、ＷＧ（図２，トラック１２〜２２）及び大腸菌（図３）からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析について示している。図２において、鋳型添加物は：トラック１及び１２がＨ２Ｏ（内在性翻訳）；トラック２及び１３がＢａｌII直鎖化ｐＪII１０２ＤＮＡ；トラック３及び１４がＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック４及び１５がオメガプライム‐ＣＡＴＲＮＡ；トラック５及び１６が５′キャップ‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック６及び１７が５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック７及び１８がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪII１０３ＤＮＡ；トラック８及び１９がＮＰＴII  ＲＮＡ；トラック９及び２０がオメガプライム‐ＮＰＴII  ＲＮＡ；トラック１０及び２１が５′キャップ‐ＮＰＴII  ＲＮＡ；トラック１１及び２２が５′キャップ‐オメガプライム‐ＮＰＴII  ＲＮＡであった。14Ｃ標識マーカータンパク質〔アメルシャム・インターナショナル社（Amersham International, plc ）〕はトラックＭに加えた。キロドルトン（ｋＤａ）としてのそれらの各々の大きさは左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートラジオグラフィーに付した。図３において、鋳型添加物は：トラック１がＨ２Ｏ（内在性翻訳）：トラック２がＢｇｌII直鎖化ｐＪII１０２  ＤＮＡ；トラック３がＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ‐ＣＡＴＲＮＡ；トラック６が５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック７がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪII１０３  ＤＮＡ；トラック８がＮＰＴII  ＲＮＡ；トラック９がオメガプライム‐ＮＰＴII  ＤＮＡ；トラック１０が５′キャップ‐ＮＰＴII  ＲＮＡ；トラック１１が５′キャップ‐オメガプライム‐ＮＰＴII  ＲＮＡであった。14Ｃ標識マーカータンパク質はトラックＭに加え、それらの大きさ（ｋＤａ）は左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートラジオグラフィーに付した。大腸菌Ｓ‐３０系は転写活性系であるが、天然大腸菌ＲＮＡポリメラーゼはＳＰ６プロモーターを認識しえないことに留意すべきである。
【００２４】
下記第１表はオメガプライム配列の促進効果について示している。図２及び図３に示されたゲルからゾーンを取出し、翻訳産物の各バンドにおける放射能を測定し、オメガプライム配列を含まないＲＮＡからの放射能に対して各々の場合データを標準化した。この方法でデータを表現すると、キャップ単独による何らかの促進効果は除かれ、オメガプライム配列の促進効果のみが示される。
【００２５】
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【００２６】
考  察
ＴＭＶのオメガプライム領域の存在は、キャップ又は非キャップ状態でＣＡＴ又はＮＰＴII配列を含む転写体の発現を促進させる。促進は翻訳効率の悪いＮＰＴII転写体の場合に最も著しい。このように、ＮＰＴII遺伝子を含むＴｎ５断片は、ＮＰＴII遺伝子のＡＵＧ開始コドンのすぐ上流に更にＡＵＧを有している。しかも“コザック則（Kozak rule）”（これに関するコザックの論文参照）によれば、ＮＰＴII開始コドン近辺の領域は翻訳開始能の乏しいシグナルを構成していることを示唆する。ＷＧ及びＭＤＬの場合（図２，第８列及び第１９列）で観察されるように、キャップ又はオメガプライムのないＮＰＴII転写体はほとんど機能していない。キャップ又はオメガプライムの付加は翻訳を改善するが、オメガプライムの存在はキャップ単独の存在よりも優れた促進効果を有している。大腸菌翻訳メカニズムは、キャップ依存性ではないものの、オメガプライム配列の存在によって著しく促進される（図３，第４、６、９及び１１列）。大腸菌の場合において、ＣＡＴ又はＮＰＴII  ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加してもその翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップＣＡＴ又はＮＰＴII  ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると著しく増強された。
【００２７】
ＣＡＴ遺伝子ｍＲＮＡは、たとえキャップ又はオメガプライム配列を有していない場合であっても、真核生物系においてはより効果的に機能する。５′末端から最初のＡＵＧはＣＡＴの開始コドンであって、開始コドン中の及びその近辺の配列は“コザック則”に十分合致している。このことは、更に著しく低いｍＲＮＡ濃度が利用可能な35Ｓ‐メチオニンプールの消費を妨ぐために必要とされるＭＤＬ系の場合に最も明らかである。その際に驚くべきことではないが、ＣＡＴ  ｍＲＮＡにおけるオメガプライム配列の存在は促進的でなかった。ＭＤＬはＷＧほどキャップ依存的でないと考えられるが、しかしながら、ＮＰＴII転写体上におけるキャップの存在はわずかに促進効果を有しており（図２，第８列及び第１０列）、一方ＣＡＴ転写体上におけるその存在はさほど効果がなかった（図２，第３列及び第５列）。ＣＡＴ  ｍＲＮＡ単独ではＷＧ系において著しく低い活性しかなかった。結論として、キャップもしくはオメガプライム配列の存在又は双方の存在は非常に促進的であった（図２，第１４〜１７列）。ＷＧにおいて、ＮＰＴII  ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加しても（図２，第２０列及び第２２列）、その翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップ又は非キャップＮＰＴII  ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると（図２，第１９列及び第２１列）著しく増強された。
【００２８】
したがって、オメガプライム配列の存在は真核生物系（ＭＤＬ及びＷＧ）及び原核生物系双方において翻訳を増強する。このことはＴＭＶ粒子の脱外被能と一致し、ＲＮＡは真核生物又は原核生物の翻訳メカニズムによって翻訳される。オメガプライム配列は、キャップ単独の存在の場合よりも転写体の発現に関して通常高い促進効果を有している。しかも、オメガプライム配列は、例えば原核生物系及びある程度ＭＤＬ系において、キャッピング（capping ）では効果のない条件下で翻訳を増強する。
【００２９】
継続実験操作
ＣＡＴ  ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構造体を前記と同様の方法で作成したが、最初の合成ＤＮＡ配列は必要なＲＮＡを生じうるように選択しておいた。図４に示されているように、５つの欠失体（Δ１〜Δ５と表記されている）、１つのＡ→Ｃトランスバージョン体（transversion）及び１つの〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換体（substitution）があった。
【００３０】
ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含む別のキメラＲＮＡ構造体を、ＴＭＶ（Ｕ１，ブルガレ（vulgare ）又は普通株）以外の下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて同様の方法で作成した：ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単離物）、カブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３（ＢＭＶ３）、ラウス肉腫ウイルス部分リーダー（ＲＳＶ）及びアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ＡｌＭＶ４）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図は図５〜図９にそれぞれ示されている。
【００３１】
ＲＮＡ構造体の他の１組を同様の方法で製造したが、但しＣＡＴの代わりに大腸菌リポーター遺伝子β‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いた。用いられたリーダー配列は、ポリリンカー（比較目的用）もしくはＵ１オメガ（即ち、ＴＭＶからのオメガプライム）又はオメガプライムの誘導体もしくは部分、及び前記のような他のウイルスのリーダーであった。ＧＵＳ遺伝子は、人工的に“良好な”コザックの配列関係（context ）（第９表参照）又は天然の“悪い”コザックの配列関係において  ｐＲＡＪ２３５／２４０からのＳａｌＩ断片として用いた〔ジェファーソン（Jefferson ）ら，プロシーディンクギ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年〕。リーダー配列及び制限部位地図は図１０〜図１３に示されている。リポーター遺伝子の発現は、ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年に記載されているような螢光測定法により調べた。
【００３２】
前記３つのインビトロ翻訳系に加えて、下記２つのインビボ系を用いたゼノパス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞の微量注入及びタバコ〔ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum ）のキサンチ（Xanthi）種〕葉肉原形質体のエレクトロポレーション（electroporation)。それぞれの操作は下記のとおりであった：
各合成ＳＰ６  ｍＲＮＡ（又はそれらの対応ＤＮＡ鋳型）２ｎｇを標準的方法〔コルマン・エー，ハーメス・ビー・デー及びヒギンズ・エス・ジェイ（編集），転写及び翻訳：実用的アプローチ，ＩＲＬプレス，オックスフォード，第２７１頁，１９８４年（Colman A. In Hames, B.D. and Higgins, S.J.(eds.), Transcription and Translation : A practical Approach, IRL Press,Oxford, 271 (1984)）〕に従い３０のバッチ中の第６期のＸ．ラエビス卵母細胞の細胞質に微量注入した。卵母細胞を修正バース塩水（Modified Barths´ Saline, MBS）中で１８時間インキュベートし、しかる後蒸留水で簡単に洗浄した。ゼノパス卵母細胞の抽出物は、１０ｍＭ  ＤＴＴ（１７μリットル／卵母細胞）含有のｐＨ７．４の０．２５ＭトリスＨＣｌ中に各サンプルを再懸濁し、しかる後１５秒間超音波処理することによって調製した。不溶性物質を１５分間の微量遠心分離によって除去し、卵母細胞と同数得られた抽出物画分を公表された方法でＣＡＴ又はＧＵＳ活性について分析した（ＣＡＴ：ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１５巻，第３２５７頁，１９８７年）；ＧＵＳ：ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）。
【００３３】
葉肉原形質体をＮ．タバクム（キサンチ種）の葉から分離し、０．７Ｍマンニトール中で保存した。原形質体（１０6 ）を６０ｘｇで３分間遠心分離し、ＲＮＡ（８μｇ）含有の氷冷０．７Ｍマンニトール１ml中に再懸濁し、エレクトロポレーション用セルに移し、セルに５０ｎＦコンデンサーを取付けることによって単一電圧パルス（２．５ｋＶ／cm）を加えた。パルスは速い立上り時間（１μｓ以下）を有しかつ半減時間約５μｓの指数減衰性を有していた。エレクトロポレーション処理原形質体を０〜４℃で１０分間保存した。０．７Ｍマンニトール１０mlを加え、原形質体を６０ｘｇで３分間の遠心分離によって回収した。次いで原形質体を培地中に再懸濁し、９cm径ペトリ皿中２５℃で２１時間インキュベートした。
【００３４】
エレクトロポレーション処理原形質体の各サンプルを、ＣＡＴアッセイの場合には２ｍＭロイペプチン及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有のｐＨ７．４のの０．２５ＭトリスＨＣｌ又はＧＵＳアッセイの場合には１０ｍＭ  ２‐メルカプトエタノール含有のｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム１５０μリットル中で沈降させ、再懸濁し、超音波処理した。抽出物を室温又は４℃において１０，０００ｘｇで１０分間微量遠心分離した。
【００３５】
図１４は、エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ  ＲＮＡの発現に関してのオメガプライムの効果について示している。各原スポットは５×１０4 の生存原形質体に相当する抽出物を含んでいた。各サンプルに関する基質（14Ｃ‐クロラムフェニコール）からそのモノアセチル化体（左側に表示）への変換率（％）はトラックの上部に示されている。エレクトロポレーション処理ＲＮＡ又は標準は：トラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラック２がＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック３がオメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック４が５′キャップ‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック６がトラック１の同量抽出物に加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック７が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを２日間オートラジオグラフィーに付した後、除去し、モノアセチル化産物（３‐Ａｃ／１‐Ａｃ）に相当する14Ｃ標識スポット中の放射能について測定したが、変換率％データは抽出物中の関連ＣＡＴ活性を表わしている。オメガプライム（＋／５′キャップ）はＣＡＴ  ＲＮＡ発現に関して最も促進的であった。
【００３６】
図１５は、Ｘ．ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップＣＡＴ  ＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果について示している。同量の各ＣＡＴ  ＲＮＡ構造体又は直鎖ＤＮＡ鋳型（２ｎｇ）を完全に卵母細胞１個当たりで注入した。同量の卵母細胞抽出物（０．３×細胞に相当する）を他に言及のない限り各ケースにおいて分析した。14Ｃ‐クロラムフェニコールからそのモノアセチル化体への変換体（％）は各トラックの上部に示されている。トラック５及び６において、ジアセチル化体への変換率（％）は＊で示されている。微量注入されたＲＮＡ又は標準は：トラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラック２がＢｇｌII直鎖化ｐＪII１０２；トラック３がＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック６が５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ  ＲＮＡ；トラック７が２０倍希釈抽出物であること以外はトラック５と同様；トラック８が２０倍希釈されていること以外はトラック６と同様；トラック９がトラック１の同量抽出物に加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック１０が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを室温で１８時間オートラジオグラフィーに付した後、関連14Ｃ標識スポットを取出してカウントした。
【００３７】
下記表は更に得られた結果について示している。
0003658654.tif 000003
【００３８】
上記結果は、オメガプライムがＣＡＴの翻訳を促進させることを示している。欠失体１〜５は、この効果を完全に消失させることなく低下させている。同様のことがＡ→Ｃトランスバージョン体にもあてはまる。〔Ｕ〕ｎ置換体は、あるとしてもほとんど効果をもっていない。
【００３９】
0003658654.tif 000004
【００４０】
前記結果は、ＴＭＶ  Ｕ１由来オメガプライムがこの系においてＣＡＴ  ＲＮＡの翻訳を促進することを示している。ＴＭＶトマト株オメガプライムも同様であるが、但しやや劣っている。他のウイルスリーダーはさほど又は全く効果がなく、ＴＹＭＶリーダーは阻害的であるかもしれない。
【００４１】
第４表
小麦麦芽無細胞系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのインビトロ翻訳に関する５′キャップのある又はない様々な５′非翻訳リーダー配列の効果（下記結果は、ＣＡＴ  ｍＲＮＡ単独よりも何倍促進的であるかを示すため、未修正ＣＡＴ  ｍＲＮＡリーダー配列を１．０として標準化された）
付加されたＲＮＡ                        非キャップ体  キャップ体
ＣＡＴ                                      １．０      １．０
オメガプライムＣＡＴ                        ２．８      ３．７
Δ１‐ＣＡＴ                                １．２      ０．６
Δ２‐ＣＡＴ                                ２．０      １．８
Δ３‐ＣＡＴ                                １．５      １．３
Δ４‐ＣＡＴ                                ３．０      １．５
Δ５‐ＣＡＴ                                １．５      ０．７
Ａ→Ｃトランスバージョン‐ＣＡＴ            ３．３      ２．９
〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換‐ＣＡＴ          ２．１      ３．４
ＴＭＶ  トマト株オメガプライム‐ＣＡＴ      １．７      ３．０
ＴＹＭＶ‐ＣＡＴ                            ０．３      ３．０
ＢＭＶ３‐ＣＡＴ                            １．４      ２．８
ＲＳＶ‐ＣＡＴ                              ０．６      ２．５
ＡｌＭＶ４‐ＣＡＴ                          ２．１      ２．３
注：これらの数値は、ＣＡＴメッセージの５′末端の様々な配列の付加によって生じる翻訳の促進率を比較したものである。翻訳はキャップのある又はキャップのないメッセージに関して行なわれた。各欄は（第２表及び第３表のように）独立したゲルから切除回収された放射性ＣＡＴタンパク質の収率を示している。各バンドを切出し、カウントし、かつｍＲＮＡが未修正ＣＡＴメッセージであるバンドに対して標準化した。
前記結果は、オメガプライムが５′キャップの存在又は非存在下でこの系において促進させることを示している。他のウイルスリーダー配列及びオメガプライムの誘導体もしくは部分は翻訳を様々な程度に増強させるが、但しオメガプライム自体よりも有意に優れているケースはまれである。
【００４２】
第５表
大腸菌無細胞系中でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのインビトロ翻訳に関する、すべて５′キャップ構造以外の様々な非翻訳リーダー配列の効果
付加されたＲＮＡ                    非キャップ体
ＣＡＴ                                  １．０
オメガプライムＣＡＴ                    ９．０
Δ１‐ＣＡＴ                            ３．３
Δ２‐ＣＡＴ                            ２．５
Δ３‐ＣＡＴ                            ６．３
Δ４‐ＣＡＴ                            ４．２
Δ５‐ＣＡＴ                            ３．８
Ａ→Ｃトランスバージョン  ＣＡＴ        ４．１
〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換  ＣＡＴ      １．９
ＴＭＶ  トマト株オメガ  ＣＡＴ          ６．６
ＴＹＭＶ  ＣＡＴ                        ０．２
ＢＭＶ３  ＣＡＴ                        ３．７
ＲＳＶ  ＣＡＴ                          １．５
ＡｌＭＶ４  ＣＡＴ                      １．４
上記結果は、オメガプライム、その誘導体の一部及びトマト株オメガプライムが翻訳を最大に促進させることを示している。他の配列も大半は、但し異なる程度で促進させる。大腸菌は翻訳のために５′キャップを要しない。
【００４３】
0003658654.tif 000005
0003658654.tif 000006
【００４４】
すべてのｍＲＮＡ構造体を８μｇ／mlでエレクトロポレーション処理し、洗浄された原形質体を（ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１５巻，第３２５７頁，１９８７年）記載のように２０時間インキュベートした。
【００４５】
“悪い”コザック構造体（２３５）リーダーの配列は下記のとおりである：
【化１】
0003658654.tif 000007
【００４６】
ポリリンカー中へのオメガプライムの挿入は下記のとおりである：
【化２】
0003658654.tif 000008
【００４７】
＊この箇所におけるオメガプライムは下記のとおりである：
【化３】
0003658654.tif 000009
及び欠失オメガプライム誘導体等がしかるべく後に続く。
【００４８】
子牛プレプロキモシン又はチキンプレリゾチームをコードするメッセンジャーＲＮＡを、ＴＭＶ５′末端配列（オメガプライム）を付加させて又はさせないでインビトロ合成した。ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球（ＭＤＬ）、小麦麦芽（ＷＧ）又は大腸菌（ＥＣ）由来の系でインビトロ翻訳させた。
【００４９】
プラスミドｐＪII６及びｐＪII７（図１６）をプラスミドｐＳＴ６４ＣＴ、ｐＳＰ６４ＬＴ〔スリート（Sleat)ら，バイロロジー，第１５５巻，第２９９頁，１９８６年〕及びｐＪII１０１の成分を用いて作成した。ｐＪII６及びｐＪII７は、Ｍ１３  ｍｐ１１由来ポリリンカー配列に隣接するバクテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む転写プラスミドｐＳＰ６４〔メルトン（Melton) ，１９８４年〕の誘導体である。ｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴのプレプロキモシン及びプレリゾチームコード領域をそれぞれＨｉｎｄIII断片として取出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でブラント末端化し、ｐＪII１０１のＨｉｎｃII部位に組込んでクローニングし、それぞれｐＪII１０６及びｐＪII１０７を得た（図１６）。これらの構造体は、５′末端オメガプライム配列をもつメッセンジャー（messenger-sense ）プレプロキモシン及びプレリゾチーム転写体の合成を指示させるために用いた。親プラスミドｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴはオメガプライムのないｍＲＮＡの合成のための鋳型であった。
【００５０】
結果は下記第７表に示されている。
0003658654.tif 000010
【００５１】
前記方法と同様の方法で、様々なキメラＲＮＡ構造体を、ＮＰＴIIコード領域、及びオメガプライム、２つのタンデム（tandem）オメガプライム領域、長鎖（７７塩基）“ジャンク（junk) ”リーダー（ポリリンカー）配列もしくは中央オメガプライムと一緒の“ジャンク”を用いて作成した。構造体は図１７に示されており、結果は下記第８表に示されている。
【００５２】
【表１】
0003658654.tif 000011
【００５３】
これは、ランダムポリリンカー配列が８０Ｓリボソーム系においてオメガプライムの代わりにならず、原核生物（７０Ｓ）系でのみわずかに代わりになることを示している。２つのタンデムオメガプライムのみが７０Ｓ発現に寄与する（例えば、オメガプライムの単一コピー）。
【００５４】
β‐グルクロニダーゼｍＲＮＡ（ＧＵＳ  ｍＲＮＡ）の発現に対するオメガプライムの効果に関して第６表（前掲）に掲示されたデータを更に拡張するために、別の一連の構造体として開始コドン（ＡＵＧ）近辺の配列関係が修正されたＧＵＳ遺伝子を用いた。下記の“良好な配列関係”をもつリーダー：
【００５５】
【化４】
0003658654.tif 000012
を含むプラスミドｐＲＡＪ２７５は、ＧＵＳのこのバージョンのための供給源であった。オメガプライム及び様々な他のリーダー構造体を前記のようにＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ部位に挿入した。ｐＲＡＪ２７５構造体の詳細は下記のとおりである：
【００５６】
ｐＲＡＪ２７５はｐＲＡＪ２５５の誘導体であって（ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）、ここにおいてＧＵＳの５′配列は連続的（progressive ）ＢＡＬ３１削除によって除去され、コザック〔ミクロバイオロジー・レビューズ，第４７巻，第１頁，１９８３年（microbiology Reviews, 47, 1 (1983) ）〕により規定された“コンセンサス（consensus ）”翻訳イニシエーターを構成していた合成オリゴヌクレオチドで置き換えられている。このプラスミドはイニシエーターＡＴＧコドンに位置する特有のＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を有しており、その周囲配列関係はＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣである。イニシエータ近辺の配列関係は所定量のｍＲＮＡの翻訳産物レベルに関して十分な効果を発揮しうることが、インビトロ及びインビボ双方で示された。この構造はこの効果を最大化させるために調整された。それはｐＵＣ１９におけるＳａｌＩ‐ＥｃｏＲＩ断片として与えられた。
【００５７】
５′キャップ又は非キャップ転写体を前記のようにタバコ原形質体中にエレクトロポレーションし、ＧＵＳ発現レベルを抽出物中で測定した。
非キャップＲＮＡもＭＤＬまたはＷＧ無細胞翻訳系に加え、合成されたＧＵＳタンパク質レベルは図２及び図３（第１表）のように放射性ゲルバンドを切取ってカウントすることによって測定した。結果は第９表に示されている。
【００５８】
【表２】
0003658654.tif 000013
【００５９】
【表３】
0003658654.tif 000014
【００６０】
ＲＮＡ構造体の別の１組を、大腸菌リポーター遺伝子β‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及び更に誘導トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーターを用いて、前記と同様の方法により作成した。Ｔｒｐプロモーターはファルマシア社（Pharmacia Ltd.）から購入し、制限エンドヌクレアーゼ消化、補充、サブクローニング等の慣用的技術により修正し、３′‐ＨｉｎｄIII部位（図１８）及びブラント５′末端を作出した。次いで、この二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片をＳＰ６プロモーター（インビボの大腸菌中では作働しない）及び重要な５′‐リーダー構造の間で様々なリーダー‐リポーター（ＧＵＳ）遺伝子プラスミド中に挿入した。
【００６１】
得られたプラスミドＤＮＡは標準的方法によりコンピテント（competent ）大腸菌細胞を形質転換させるために用いたが、Ｔｒｐプロモーターは現場で誘導されて、キメラリーダー‐リポーターｍＲＮＡを産出した。転写開始点はＨｉｎｄIII部位（ＡＡＧＣＴＴ）中のＧに対応する。
【００６２】
形質転換された大腸菌細胞中における転写体の発現は、分光測定法により調べた（ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）。結果（第１０表）は、ＧＵＳ発現がオメガプライムの存在により及びある程度オメガプライムの他のリーダー配列もしくは誘導体により、コザック配列関係の“良好な”又は“悪い”構造体のいずれかからインビボで増強されたことを示している。
【００６３】
0003658654.tif 000015
【００６４】
結  論
オメガプライムは、現場でＴｒｐプロモーターを用いた場合に、プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌中でのＧＵＳ  ＲＮＡのインビボ発現を増強する。継続実験は超らせん二重鎖ｐＵＣ１９  ＤＮＡを用いて行なわれたが、これはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼターミネーター〔アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）由来〕及びそれらの中間にＣＡＴ  ＤＮＡ（●，塗りつぶし三角）もしくはオメガプライムＣＡＴ  ＤＮＡ（○，△）のいずれかを有するように修正されている。
【００６５】
構造体（図１９）は二元ベクター系から作成したが〔ベバン（Bevan ），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第８７１１頁，１９８４年〕、その場合においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮｏｓターミネーターをＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩ部位で切除し、プラスミドｐＵＣ１９に挿入することによってｐＵＣ３５Ｓ  Ｎｏｓを得た。
【００６６】
構造体ｐＵＣ３５ＳＣＡＴＮｏｓ及びｐＵＣ３５ＳオメガプライムＣＡＴＮｏｓは、ＣＡＴ又はオメガプライムＣＡＴをそれぞれＢａｍＨＩ部位でプラスミド中に挿入することによって作成した。
【００６７】
様々な量のプラスミドＤＮＡ（μｇ／ml）を前記のように原形質体にエレクトロポレーション処理し、細胞を２５℃で６時間（○，●）又は２６時間インキュベートし、溶離させて、（前記のような）ＣＡＴアッセイを行なった。
【００６８】
図２０に示された結果は、図示された１００〜１５０μｇの超らせんプラスミドＤＮＡの注入をうけた細胞はオメガプライムが構造体中に存在している場合（△，○）にＣＡＴ発現を増強させていた（２倍）ことを示している。
【００６９】
これらの結果は、安定的形質転換原性（transgenic）植物中での遺伝子発現がプロモーター（インビボ転写用）及び翻訳オープン読取枠の間へのオメガプライム配列の挿入によって同様に増強されるであろうということを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の態様のキメラｍＲＮＡを産生する方法を示す。
【図２】ＭＤＬ（トラック１〜１１）及びＷＧ（トラック１２〜２２）からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３】大腸菌からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図４】ＣＡＴ  ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構造体を作成する方法を示す。
【図５】ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成した：ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単離物）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図６】ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成した：カブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図７】ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成した：ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３（ＢＭＶ３）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図８】ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成した：ラウス肉腫ウイルス部分リーダー（ＲＳＶ）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図９】ＣＡＴ  ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成した：アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ＡｌＭＶ４）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図１０】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１１】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１２】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１３】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１４】エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ  ＲＮＡの発現に関してのオメガプライムの効果について示す。
【図１５】Ｘ．ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップＣＡＴ  ＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果について示す。
【図１６】プラスミドｐＪII６及びｐＪII７を示す。
【図１７】様々なキメラＲＮＡ構造体を示す。
【図１８】３′‐ＨｉｎｄIII部位を示す。
【図１９】構造体ｐＵＣ３５Ｓ  Ｎｏｓを示す。
【図２０】ＣＡＴアッセイの結果を示す。
【図１】
0003658654.tif 000016
【図２】
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【図３】
0003658654.tif 000018
【図４】
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【図５】
0003658654.tif 000020
【図６】
0003658654.tif 000021
【図７】
0003658654.tif 000022
【図８】
0003658654.tif 000023
【図９】
0003658654.tif 000024
【図１０】
0003658654.tif 000025
【図１１】
0003658654.tif 000026
【図１２】
0003658654.tif 000027
【図１３】
0003658654.tif 000028
【図１４】
0003658654.tif 000029
【図１５】
0003658654.tif 000030
【図１６】
0003658654.tif 000031
【図１７】
0003658654.tif 000032
【図１８】
0003658654.tif 000033
【図１９】
0003658654.tif 000034
【図２０】
0003658654.tif 000035