(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の発熱性を検査する方法であって、該物質はヒトの組織、体液又は細胞に接触した時に発熱を生じ、前記方法は、前記物質を全血試料と接触させる工程、及び生成し得る内因性発熱物を生成させる条件下で前記全血試料を温置する工程を含み、該全血試料は血液の凝固を遅延又は抑制する成分としてクエン酸塩及びヘパリンを含有し、この手法により温置された全血試料についてサイトカインの生成を調べることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記全血試料が希釈剤を含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記希釈剤が培養媒体又は生理食塩水であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インターロイキン１、インターロイキン６、ＴＮＦ及び／又はプロスタグランジンＥ2の生成を調べることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質の発熱性検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
物質が人体の組織、体液又は細胞に接触した時に、その物質自体に発熱性があることにより、あるいはその物質が発熱性成分を含んでいることにより、発熱することは良く知られている。そのような潜在的危険性を有する物質としては、特に血液代剤や血液交換剤のような、吸入、注射又は注入される製品等の医薬品、ディスパージョンのような異なる物理相のプラスチック、化粧品、膜あるいは義歯のような医療用具がある。栄養剤でさえ発熱性を示す可能性がある。
【０００３】
人体の組織、細胞又は体液との接触によって発熱作用を起こす物質は、通常、その物質が有する発熱性部分による潜在的内因性起源とは別の、外因性の発熱作用を起こす物質として定義される。この意味で、後述する説明では、本発明の発熱性検査方法の対象として、「外因性発熱性物質」又は「外因性発熱作用を有する物質」で表される物質が用いられる。
【０００４】
発熱性検査の必要性は広く認識されている。安全性を確認し、汚染されている可能性のあるロットを特定するために、動物実験による継続的な個別検査が法的に求められている。
【０００５】
発熱を起こす物質の中で最も良く説明されているのは、グラム陰性微生物の細菌壁から出る内毒素：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（リポ多糖類：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  ＬＰＳ）である（Ｍｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．（１９９３），  １７．  ２３７−２６９；  Ｔｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １９９４，１９，  ２０９−２３２；  Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，８，１−１０；  Ｚｅｉｓｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，２８，１０６−１０９）。したがって、一般的に兎を用いて行われる動物実験を、直接内毒素試験（リムルス試験：Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｓｓａｙ，  ＬＡＬ）に置き換えることは自明であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような試験には必然的に制約がある。すなわち、潜在的発熱物として内毒素しか検出されず、同様に発熱を起こし得る白血球：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ等のその他の刺激物が検出されない。また、上記試験は、血液又は血液成分中に存在する、内毒素と結合する成分により妨害を受ける（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９９１，１１８，１８６−１９３；  Ｅｍａｎｃｉｐａｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０，１９９２，５９６−６０１；  Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，１９９３，１４，１２５−１２９）。内毒素と結合する成分の中には、リムルス試験においてリポ多糖類の検出を阻止する一方で、その反対に、主な発熱性反応である白血球との反応を強化する。血液製品の発熱性検査は必然的に極めて頻繁に行われるケースである。一方、リムルス試験は極めて感度が高く、その製品の品質に対応しない不純物により誤って陽性の結果となり易い（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，１９９０，１１０，３３２−３４０）。
【０００７】
一方、兎を用いた動物実験もまた問題がある。刺激に対する免疫反応（発熱反応）は、動物種により非常に大きい違いがある。兎が他の哺乳類あるいは人を代表するか否かは不明である。なぜなら、内毒素の感度は様々な種において１００００もの因子によって異なることが知られているからである。他の発熱性成分については、そのような比較できる検討がなされていない。
【０００８】
本発明の目的は、広範囲にわたる種々の物質の発熱性を検出することができる方法を提供することにある。この方法は簡単且つ低コストで行える。他の利点は特に後述する適用例により明らかとなる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題の解決手段は特許請求の範囲の記載により明らかとなる。
【００１０】
本願の請求項１記載の発明は、物質の発熱性を検査する方法であって、該物質はヒトの組織、体液又は細胞に接触した時に発熱を生じ、前記方法は、前記物質を全血試料と接触させる工程、及び生成し得る内因性発熱物を生成させる条件下で前記全血試料を温置する工程を含み、該全血試料は血液の凝固を遅延又は抑制する成分を含有し、この手法により温置された全血試料について内因性発熱物の生成を調べることを特徴とする、前記方法を提供する。
【００１１】
本願の請求項２記載の発明は、前記全血試料が希釈剤を含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法を提供する。
【００１２】
本願の請求項３記載の発明は、前記希釈剤が培養媒体又は生理食塩水であることを特徴とする、請求項２に記載の方法を提供する。
【００１３】
本願の請求項４記載の発明は、インターロイキン１、インターロイキン６、ＴＮＦ及び／又はプロスタグランジンＥ2の生成を調べることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法の利点は、特に生物学系の使用により、人体を発熱物に曝した場合の評価と関係付けることができる点にある。測定するパラメーターは内因性の発熱物である。これらは発熱反応を仲介する免疫系のメッセンジャー物質であり、発熱物が認識された生体のメッセージを示すものである。この種の物質は、シトキン：ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、細胞群刺激因子：ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓあるいは成長因子：ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓが含まれる。
【００１８】
最も重要で有名な内因性発熱物は、タンパク質インターレウキン−１：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）及びインターレウキン−６：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、さらにプロスタグランジンＥ2：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ2（ＰＧＥ2）のような低分子量の脂質媒介物質：Ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓがある。例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６又はＴＮＦの日常試験としては、酵素結合免疫吸着剤試験：ＥＬＩＳＡ  （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、ＰＧＥ2の日常試験としては酵素免疫試験：ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）がある。
【００１９】
発熱物の検出のため、血液から分離された白血球も生物系を代表し得る。しかし、このようなほとんどの分離方法は物質の日常試験としては手が掛かりすぎる。したがって、この目的のためには、健康な人から得られた鮮血のように、単体成分を分離しない人あるいは動物の血液を使用する方が試験を容易に行える。血液中の白血球は自然な構成体及び環境中に存在しており、発熱物の発熱作用に影響を与え得る全ての漿液成分が存在している。
【００２０】
特に利点となるのは、本発明における反応に影響を与えたり失敗させたりすることなく、最終濃度０．３８％のクエン酸塩：Ｃｉｔｒａｔｅ又はヘパリン：Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ）のような血液の凝固を遅延又は抑制する成分を、培養期間中に血液に添加することができることである。
【００２１】
血液を例えば細胞培養媒体で希釈したり、生理食塩水で初期濃度の２０％まで希釈するのが有用であることがわかっている。実験機器などの器材や、抗血栓剤：ａｎｔｉ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓや希薄剤などの添加物は、発熱を起こさないものである必要があることは言うまでもない。培養中は、ペニシリン：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ストレプトマイシン：ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、クロランファニコル：ｃｈｌｏｒａｍｐｈａｎｉｃｏｌ、アンホテリシン：ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎあるいはこれらの組合わせなどの予防用の抗生物質も存在させることができ、これにより関係する汚染が排除される必要がある。
【００２２】
内因性発熱物が遊離する例としては、グラム陰性又はグラム陽性細菌の細菌壁から遊離される前記４つの内因性発熱物がある。本発明の方法は内毒素に対して非常に感度が高く、例えばｐｇ／ｍｌの量で内因性発熱物を遊離させることができ、その血液の提供者にも依存しない。陽性対照（陽性コントロール）としては、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞壁から遊離した内毒素又はリポテイコイル酸：ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｌ  ａｃｉｄを用いることができる。陰性対照（陰性コントロール）としては、発熱物を含まない生理食塩水が使用される。
【００２３】
内毒素に誘発される血液からの内因性発熱物の遊離の時間経過を検出するために、７人の健康な血液提供者の血液を細胞培養媒体で１対５に希釈し、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳにより刺激した（図１）。３７℃での培養後、市販のＥＬＩＳＡを用いて全ての因子を検出した（データは平均値±平均標準誤差（ＳＥＭ）である。）。一方、刺激しない血液はこれらのどの因子も遊離しなかった。検出されたＩＬ−１βの量は、６時間後にプラトー（高原状態）に達した。検出されたＰＧＥ2の濃度は、培養２４時間経過後まで継続的に増加した。また、ＩＬ−６のＬＰＳによる誘発量も同様に増加した（図示してはいないが、４時間後、１０時間後及び２４時間後に測定した。）。これらの因子とは異なり、ＴＮＦの遊離はＬＰＳによる刺激後に約１２時間で最大となった。２４時間後も大部分のＴＮＦが検出できたので、この時間を基準培養時間として選択した。
【００２４】
グラム陰性成分の内毒素とグラム陽性成分のリポテイコイル酸により誘発された、人の血液中の内因性発熱物の生成の前記刺激物の濃度依存性を検査するために、５人の健康な血液提供者の血液を１対５に希釈し、それぞれ濃縮状態の内毒素（ＬＰＳ）又はリポテイコイル酸（ＬＴＡ）の存在下で２４時間培養した。ＥＬＩＳＡによりシトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を検出し、データを平均値±ＳＥＭで示した（図２）。実際には、最も低濃度すなわち１ｐｇ／ｍｌの内毒素で内因性発熱物がかなり生成したが、ＬＰＳ及びＬＴＡの溶剤は何の効果も与えなかった。これらのデータは、人の血液が極めて感度良く反応し、ＬＰＳ及びＬＴＡに濃度依存することを示している。
【００２５】
また、上記以外の免疫刺激物は、上記方法により内因性発熱物の誘発物質として検出できる。例として、熱殺菌されたグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒ．））又はその成分（Ｍｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、リポテイコイル酸：Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＴＡ）、腸毒素：Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ、ストレプトリジンＯ：Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ（ＳＬＯ））は同様な反応を誘発した（図３）。また、植物成分である植物性血球凝集素：Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ又はホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌｅｓｔｅｒなどの他の免疫刺激物も内因的発熱物の遊離を誘発した。
【００２６】
本発明の方法は、種々の利点を有している。この利点は、外因的発熱物に曝した後に内因性発熱物が生成する人体の基本反応に基づく。無処理の血液中には、外因性発熱物と白血球との相互作用に必要な全ての血液成分が存在している（例えばＬＰＳ結合タンパク質ＬＢＰ、殺菌性浸透性が高められたタンパク質ＢＰＩ、可溶性のＣＤ１４、Ｄｅｆｅｎｓｉｎｅｓなど）。血液中では、人又は動物の細胞は自然な構成体及び環境の中で存在している。分離された白血球のような人工体の準備あるいは細胞線：ｃｅｌｌｓ  ｌｉｎｅｓの脱分化はこの方法では行われない。本方法は極めて感度が高く、例えばｐｇ量のＬＰＳを検出する。さらに、内毒素以外の広範囲にわたる潜在的発熱物も検出される。このシステムはまた、生体外又は生体内における薬学的解熱効果も検出することが可能である。
【００２７】
本方法は、例えば人又は動物の解熱治療の効果のチェックにも適している。解熱剤、この場合は１錠のアスピリン（５００ｍｇ）を時間０時に服用した３人の健康な協力者から採血した。血液を外因性発熱物、例えば１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで生体内的に刺激したところ、誘発性ＰＧＥ2量は急速に減少し、数時間後にはコントロール値に達した（図４）。このＰＧＥ2量はＥＩＡにより検出された（中間値±ＳＥＭ）。
【００２８】
【実施例】
健康な血液提供者の血液のクエン酸塩を、採血直後に細胞培養液ＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，  Ｂｅｒｌｉｎ）により１対５に希釈した。カルシウム再沈着による凝固を防止するためにヘパリンを添加した（最終濃度：２  ＩＥ／ｍｌ］（ＬｉｑｕｅｍｉｎR，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，  Ｇｒｅｎｚａｃｈ−Ｗｈｙｌｅｎ）。刺激を同時に添加するか、又は細胞培養媒体に既に存在させた。次に示す物質を次に示す最大濃度で用いた：ヒツジ流産菌：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉからのＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからの腸毒素Ａ  （ＳＥＡ）及び腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）（１μｇ／ｍｌ）、黄色ブドウ球菌からのリポテイコイル酸（ＬＴＡ）（１０μｇ／ｍｌ）、熱殺菌された黄色ブドウ球菌（０．００１％細胞ｖ／ｖ）、化膿連鎖球菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓによるストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）（２．５単位／ｍｌ）、ムラミルジペプチド：Ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＤＰ）（１０μｇ／ｍｌ）、植物性血球凝集素：ＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＭ（ＰＨＡ）（１５μｇ／ｍｌ）及びホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌｅｓｔｅｒ（ＰＭＡ）（１００ｎＭ）。ＭＤＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を除くすべての刺激物はＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）から調達したものものである。蓋のないポリプロピレン反応びん（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  Ｈａｍｂｕｒｇ）を用い、３７℃で５％の二酸化炭素のもとで、基準培養時間として２４時間の培養を行った（Ｗｉｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９１，１３９，  ２３３−２４０）。遠心分離（３００００ｇ、１分）後、細胞の無い上澄みを除去し、シトキン及びプロスタグランジンが検出されるまで−８０℃で保管した。
【００２９】
遊離された媒介物質：Ｍｅｄｉａｔｏｒは市販のＥＬＩＳＡで測定された。すなわちＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ．  Ｂｉｅｒｍａｎｎ，  Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ）の試験体：Ａｓｓａｙｓにより試験され、ＰＧＥ2はＣａｙｍａｎ（ＳＰＩ−Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の試験体が使用された。
【００３０】
【発明の効果】
以上説明した通り本発明によれば、広範囲にわたる種々の物質の発熱性を簡単且つ低コストで検査することができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】人の血液中における内毒素（ＬＰＳ）誘発による内因性発熱物の生成の経時変化を示すグラフである。
【図２】人の血液中における内毒素（ＬＰＳ）及びリポテイコイル酸（ＬＴＡ）誘発による内因性発熱物の生成の前記刺激物濃度に対する依存性を示すグラフである。
【図３】種々の刺激物による人の血液中における内因性発熱物の生成を示すグラフである。
【図４】アスピリンを服用した人の血液中における内毒素（ＬＰＳ）誘発によるＰＧＥ2の生成を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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