(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素を標識した抗体と、無色透明の金属コロイド粒子とが、非特異吸着により結合していることを特徴とする標識抗体粒子。
【請求項２】
色素が蛍光色素であることを特徴とする請求項１記載の標識抗体粒子。
【請求項３】
抗体１分子に対する色素の結合数が１〜２０であることを特徴とする請求項１記載の標識抗体粒子。
【請求項４】
抗体が、生体内物質、細菌、ウイルス、医薬品あるいは乱用薬物に対して結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体あるいは抗血清であることを特徴とする請求項１記載の標識抗体粒子。
【請求項５】
生体内物質が、タンパク質、脂質、糖類あるいは核酸類であることを特徴とする請求項４記載の標識抗体粒子。
【請求項６】
タンパク質が、ホルモンであることを特徴とする請求項５記載の標識抗体粒子。
【請求項７】
ホルモンが、絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモンあるいは副腎脂質刺激ホルモンであることを特徴とする請求項６記載の標識抗体粒子。
【請求項８】
移動相及び固相を備え、前記移動相には、測定対象物に対して同時に結合することのできる２種類の抗体のうち一方の抗体が、色素により標識され、非特異吸着により、無色透明の金属コロイド粒子に結合された標識抗体粒子を含み、前記固相には、前記２種類の抗体のうち他方の抗体が、担体に固定化されており、測定対象物を含む試料が前記移動相から前記固相に流れるように前記移動相及び前記固相が設けられている、前記試料中の前記測定対象物を定量するための測定装置。
【請求項９】
ｈＣＧあるいはＬＨ測定において、そのｈＣＧあるいはＬＨに特異的に結合する２種類の抗体を用いて免疫クロマトグラフィ及びサンドイッチ法を利用し、移動相として請求項1記載の標識抗体粒子を用い、固定相としてもう一方の抗体を白色の担体に固定化し、ｈＣＧあるいはＬＨを含む試料を展開することにより固定化部で標識抗体粒子がｈＣＧあるいはＬＨを介して結合することによりｈＣＧあるいはＬＨを定量することを特徴とする測定装置。
【請求項１０】
２種類以上のタンパク質測定において、それぞれのタンパク質に特異的に結合するそれぞれタンパク質に対して２種類の抗体を用いて免疫クロマトグラフィ及びサンドイッチ法を利用し、移動相として色の異なった２種類以上の色素を用いて作製した請求項1記載の標識抗体粒子２種類以上を用い、固定相としてそれぞれもう一方の抗体を白色の担体に固定化し、２種類以上のタンパク質を含む試料を展開することにより固定化部でそれぞれの標識抗体粒子がそれぞれのタンパク質を介して結合することにより２種類以上のタンパク質を定量することを特徴とする同時測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中の測定対象物を測定あるいは検出する手段として利用することができ、特に環境、食品及び医療の分野に有用な標識抗体粒子およびそれを用いた測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の抗体を利用した測定方法あるいは測定装置において、抗体を標識する方法として、色素あるいは酵素を用いるか金属コロイド粒子、ラッテクス粒子、染料ゾル粒子あるいは金属酸化物コロイド粒子を用いることが知られていた。
【０００３】
また、近年盛んに利用されている測定原理として免疫クロマトグラフィ法がある。この免疫クロマトグラフィ法では、標識物として金属コロイドである金コロイドあるいは、ブルーラッテクス粒子がよく使用されている。金コロイドは、赤味がかった色をしており、ブルーラッテクスは青色をしている。これら測定装置は、簡便性を重視して作製されており、それぞれの標識粒子の色により一般の人でも容易に可視的に検出できるようになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように従来のものは可視的に検出することが重要視されており、その点、色の配色も判定度を向上させるためには重要である。
【０００５】
従来の方法では、上記以外の粒子を使用してもより鮮やかな色の持った粒子を作製することは困難であり、また多色を揃えることも困難なことであった。
【０００６】
さらに酸化物あるいはラッテクスに含しんさせる染料の種類を変えることにより色の異なった粒子を作製することは理論的に可能であるが、粒子をコロイド状にし、さらには抗体を容易にその表面に結合させることは困難であった。
【０００７】
その結果として、種々の測定対象物を同時に測定することもできなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する手段として、粒子材料を変更することなく、抗体に結合させる色素の種類を任意に変えて抗体に結合させ、その抗体と、無色透明の金属コロイド粒子とが、非特異吸着により結合していることにより、判定度の向上に貢献できる色を持った標識抗体粒子を容易に作製することができる。
【０００９】
この標識抗体粒子を使用した測定方法及び測定装置は、判定度の向上が期待できる。
【００１０】
さらには、任意の２種類以上の色素を使用することにより２種類以上の標識抗体粒子を容易に作製することができ、それらを利用することにより種々の測定対象物を同時に測定することもできる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
抗体のアミノ基と結合できる官能基を有しており任意の吸光色を有している色素（蛍光色素）を利用する。一般的な吸光色として橙色（490nm付近）、赤色（550nm付近）、青色（600nm付近）を利用し、それぞれに対応する色素も多く存在している。タンパク質との結合効率の面から官能基としては、サクシミドあるいはイソチオシアネート基が望ましい。
【００１２】
抗体１分子に対する色素の結合数は、任意に変えることが可能であり、なるべく多く結合させることができる。しかし、多く結合させると抗体の性能（親和性、溶解性等）を低下させる恐れがあるため、結合数は１〜２０までが望ましい。色素を抗体に結合する際、上記官能基を有する場合には室温で数時間で結合することができる。その後、未反応色素をゲル濾過あるいは透析により容易に取り除くことができる。
【００１３】
色素標識抗体を結合することのできる粒子（金属コロイド、ラッテクス粒子、染料ゾル粒子、金属酸化物コロイド等）は多く存在している。測定装置の構成によりどの粒子が最適を選定しなければならない。色素の色調を損なわない粒子が最も適している。その点から、粒子は無色透明あるいはそれに限りなく近いもの、あるいは白色のものを利用する。特に望ましいのは、無色透明な粒子である。通常の方法と同様に粒子と上記色素標識抗体を非特異吸着により結合する。ブロキング剤としては常法通り牛血清アルブミンを使用する。未反応の色素標識抗体を遠心分離あるいは透析により除去・精製する。
【００１４】
一つの方法として、最初に抗体を上記方法により選定した粒子に結合させた後、上記色素標識法により色素を標識する。その後、未反応色素を透析あるいは遠心分離により除去・精製する。
【００１５】
いずれの方法により作製した標識抗体粒子は、その後、安定を保つために凍結乾燥して固体状態で保存するかあるいは測定装置構築のため濾紙に含浸した後に凍結乾燥して保存する。
【００１６】
色素標識抗体粒子を利用して多くの測定原理と多くの測定対象物の組み合わせが存在する。
【００１７】
その中でも今回発明した標識抗体粒子を最大限活用できる測定原理は、免疫クロマトグラフィである。この方法は、可視的に（目視で）簡便に測定対象物を検出することができため、色素標識物である標識抗体粒子を利用する方法としては最適である。
【００１８】
今回発明した標識抗体粒子を免疫クロマト法に導入することにより多くの測定対象物を測定することができる。特に、免疫測定項目の大多数を占めているタンパク質を半定量的に測定するには、免疫クロマト法とサンドイッチ法を利用することが最も容易な方法であると考えられる。
【００１９】
サンドイッチ法を導入した免疫クロマトは、測定対象物に対して同時に結合することのできる２種類の抗体が必要であり、一方を標識し移動相として使用し、他方を担体に固定化し固相として使用する。この標識抗体として今回発明した標識抗体粒子を使用する。
【００２０】
図１に示すように標識抗体粒子含浸濾紙を抗体固定化部の上流側に装着する。さらに上流側から測定対象物を含む試料液を添加し、クロマトにより標識抗体粒子と測定対象物が反応しながら流れる。固定化部まで到達すること測定対象物を介してサンドイッチ状態で標識抗体粒子は停止する。そのため、抗体固定化部が呈色する。
【００２１】
さらに、この原理を応用して同時に２種類以上の測定対象物を測定することができる。
【００２２】
この場合、上記の免疫クロマトとの相違点は、標識抗体粒子含浸濾紙中には、２種類以上の色素標識粒子が混在していること、および抗体固定化部は、２カ所以上存在していることである（図1）。
【００２３】
さらに、具体的に上記発明の一例として、２種類の蛍光色素及び白金コロイドを利用してｈＣＧ、ＬＨを同時に測定できる測定装置を用いた測定方法について記述する。
【００２４】
（ＴＲＩＴＣ標識抗ｈＣＧβ抗体の作製）
ETRAMETHYLRHODAMINE-5-(and-6-)-ISOTHIOCYANATE（TRITC、Mw=444、吸収極大：約550nm）1.48mgを100μｌのDMFに溶解した（3.33*10-6モル、抗体比50倍当量）。この液を10mg/ml抗hCGβモノクローナル抗体液（6.67*10-8モル）に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【００２５】
反応後、SephadexG-25カラム（サイズ：400*20ｍｍ、平衡バッファ：PBS、流速：2ml/分）をかけ、タンパク質分画のみを集めた。
【００２６】
この分画を紫外線・可視光線スペクル分析を行った結果、抗体１個あたりに10.5個のTRITCが結合していた（抗hCGβ-TRITC）。
【００２７】
（ＴＲＩＴＣ標識抗ｈＣＧβ抗体白金コロイド粒子の作製）
.2M K2CO3で白金コロイド溶液のpHを7.0に調節した。250μg抗 hCGβ-TRITCを含む抗体液を100ml白金コロイド溶液に添加した。その後、室温で10分間放置した後、10g/l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClを含む2.0ml溶液(pH 7.0)を添加した。室温で1時間放置した後、遠心分離した（12,000rpm、10分間）。
【００２８】
沈澱物を10g/l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClと0.1g/l thiomersalを含む2.0ml溶液(pH 7.0)で懸濁した。この操作を2回繰り返した後、最終的に遠心分離後1％BSAを含むPBS2.0MLで懸濁して保存した。
【００２９】
（ＦＩＴＣ標識抗ＬＨβ抗体の作製）
LUORESCENCEIN-5-ISOTHIOCYANATE（FITC、Mw=389、吸収極大：約500nm）1.30mgを100μｌのDMFに溶解した（3.33*10-6モル、抗体比50倍当量）。
【００３０】
この液を10mg/ml抗LHβモノクローナル抗体液（6.67*10-8モル）に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【００３１】
反応後、SephadexG-25カラム（サイズ：400*20ｍｍ、平衡バッファ：PBS、流速：2ml/分）をかけ、タンパク質分画のみを集めた。
【００３２】
この分画を紫外線・可視光線スペクル分析を行った結果、抗体１個あたりに12個のFITCが結合していた（抗LHβ-FITC）。
【００３３】
（ＦＩＴＣ標識抗ＬＨβ抗体白金コロイド粒子の作製）
.2M K2CO3で白金コロイド溶液のpHを7.0に調節した。250μg抗 LHβ-FITCを含む抗体液を100ml白金コロイド溶液に添加した。その後、室温で10分間放置した後、10g/l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClを含む2.0ml溶液(pH 7.0)を添加した。室温で1時間放置した後、遠心分離した（12,000rpm、10分間）。
【００３４】
沈澱物を10g/l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClと0.1g/l thiomersalを含む2.0ml溶液(pH 7.0)で懸濁した。この操作を2回繰り返した後、最終的に遠心分離後1％BSAを含むPBS2.0MLで懸濁して保存した。
【００３５】
（ｈＣＧ・ＬＨ同時測定）
ここで作製した抗hCGβ-TRITC白金コロイド溶液及び抗LHβ-FITC白金コロイド溶液を100μlずつ混合した。この混合液をガラス繊維濾紙（ワットマン社製、F075-14、サイズ：50*10mm）に含浸させ、凍結乾燥した。この含浸濾紙を5mm使用して移動相として使用した。
【００３６】
固定相としては、ニトロセルロース（ミリポア社製、孔径5μm、サイズ：16*9mm）に抗ｈＣＧポリクローナル抗体及び抗ＬＨポリクローナル抗体それぞれ5mg/mlを1μlずつ別の場所に固定化した（図1）。
【００３７】
一例として、それぞれの濃度のｈＣＧ及びＬＨを使用した（100IU/L〜100000IU/L）。
【００３８】
その後、呈色ラインをデンシトメータ（島津製、ＣＳ-9000、500・550nmにおける反射吸収度測定）で測定した（図2）。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように本発明は、任意の色を持つ標識抗体粒子及びそれを利用した測定装置及び同時測定装置を得ることができた。
【００４０】
また、本発明の標識抗体粒子を利用することにより高性能な環境測定装置、食品管理測定装置及び医療診断装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の標識抗体粒子を用いたｈＣＧ、ＬＨ同時測定装置の概略図
【図２】本発明の標識抗体粒子を用いたｈＣＧ、ＬＨ同時測定装置を用いて、ｈＣＧ、ＬＨを同時に測定した結果を示すグラフ図
【図１】
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【図２】
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