(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen）にＤＳＭ寄託番号ＡＣＣ２０５１号として寄託された、ウシアデノウイルス（ＢＡＶ）１、３、４、５、６、７および８型、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ）３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス１および４型、ウマヘルペスウイルス１型、粘膜病ウイルス株Ｕｇ５９、またはウシパルボウイルス株Hadenの複製を支持する性質を有する胎仔ウシ卵巣からなる永久細胞系。
【請求項２】
ウイルス抗原の製造のために請求項１に記載の細胞系を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウシ卵巣細胞系（ＦＲＯｖ）、その製造方法およびウイルス複製のためのその使用に関する。
【０００２】
蛋白質およびウイルス抗原の産生には生存する細胞が要求される。この目的には所望の蛋白質またはウイルス抗原の産生に適していることを条件に現在の技術水準では二倍体細胞株または永久細胞系が使用される。二倍体細胞株は一般に、永久細胞系の場合よりも大部分の種類のウイルスに対して感染しやすいことも知られている。この理由から、それらは多重のウイルス型の複製にとくに適している。
【０００３】
しかしながら二倍体細胞株に比較して、永久細胞系にはそれらの成育が無限である、すなわちそれらは不死化されているという利点がある。継代数が増加してもこのような永久細胞系の場合には二倍体細胞株で起こるような細胞の分化がないので、細胞および抗原複製に関して一定の性質を示す。二倍体細胞株では寿命（継代数）が限られているのに加えてこれらの株のさらに重大な欠点は、二倍体細胞株を調製するための臓器が適当な量で、また必ずしも決まった時点で、入手できないことである。しかも出発材料すなわち臓器は潜在的に汚染されている（ウイルス、マイコプラズマおよび細菌）可能性があり、その結果、至適な再現性のある抗原の産生は保証されない。細胞株に伴う問題の複雑性のためウイルスおよびウイルス抗原の産生に、またそれらの検定（力価滴定）に、永久細胞系を使用する努力がなされつつあるということは理解できるところである。
【０００４】
ウシから誘導される永久細胞系もまた既に確立していて、たとえばＭＤＢＫ、ＤＢＫ、Ａｕｂｅｃｋ（ウシ腎臓細胞）または胚甲状腺細胞がある。しかしながら、これらの細胞系の欠点には、数種のウイルス型、たとえばＩＢＲ、ＰＩ３、またはＢＡＶの１型もしくは２型の複製しか支持しないこと、あるいは外因性物質で汚染されている疑いがあって市販用の抗原の製造に使用するには適当でないことがある。
【０００５】
本発明はウシ胎仔卵巣から誘導される永久細胞系に関し、この細胞系は驚くべきことに多重のウイルス型、たとえば、ウシアデノウイルス（ＢＡＶ）：１、３、４、５、６、７および８型；パラインフルエンザウイルス（ＰＩ）：３型；ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）；ウシヘルペスウイルス：１および４型；ウマヘルペスウイルス：１型；粘膜病ウイルス：株Ｕｇ５９、ならびにウシパルボウイルス：株Ｈａｄｅｎの複製を支持する。この細胞系はウイルス抗原の製造およびウイルスの検出の両者に適当である。
【０００６】
ウシ胎仔卵巣細胞系（ＦＲＯｖ）の確立
出発点：
１９９０年１１月１４日、Ｍａｒｂｕｒｇ屠殺所においてＦｒｉｅｓｉａｎ種ウシの約７カ月齢胎仔から滅菌条件下に卵巣を摘出した。卵巣を細分化し、室温でトリプシンを用いて単一細胞に分散させた。トリプシン処理完了後、細胞懸濁液を遠心分離し、沈殿した細胞をイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）に再懸濁し（洗浄）、ついでもう一度遠心分離した。
【０００７】
細胞培養：
遠心分離して洗浄した細胞沈殿物を、１：３００の割合で、
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に取り、Ｔ５０フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒから、商品番号６９０、１６０）中に播いた。
【０００８】
３５継代までの細胞培養
ＦＲＯｖ細胞をＥＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＮＳＰ中３５継代まで培養した。過密増殖が達成されたのち、培養液を１：５にスプリットした（約４〜６日）。細胞継代時に、培養体は混合細胞型（線維芽細胞および多面形細胞）からより均一な多面形細胞型に変化する。
【０００９】
３５継代以降の細胞培養
ＦＲＯｖ細胞をさらに３つの異なる方法で（ブランチＡ、ＢおよびＣ）でさらに継代培養した。
【００１０】
ＦＲＯｖ細胞のブランチＡはＥＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋（ＮＳＰ）とともに５６回まで継代培養した。スプリット比は１：５〜１：７であった。
５５回継代培養した細胞をＤＳＭ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ドイツ微生物および培養細胞収集機関）にＤＳＭ寄託番号ＡＣＣ２０５１号として寄託された。
５６回継代培養以降はアイソザイムパターンを用いて種同定試験を実施した。結果：種、ウシ。
【００１１】
３５回継代培養から、ブランチＢは、ＥＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ＋２．５％ウマ血清＋ＮＳＰを用いて複製させた。４５回目と５１回目の継代培養ＦＲＯｖ細胞は液体窒素中で凍結した。現在、ブランチＢのＦＲＯｖ細胞は１０５回目の継代培養中である。スプリット比は１：５〜１：１０であった。
【００１２】
ＦＲＯｖ細胞のブランチＣは、液体窒素中で細胞を凍結したのちのブランチＢの５１回継代培養細胞から確立された。細胞懸濁液を解凍して細胞を４回継代培養した。５５回目の継代培養を用いてマスター細胞株（ＭＣＳ）を確立した。
この目的には、細胞懸濁液を１．８×１０６細胞／ｍｌに調整し、テフロンアンプル中に１．０ｍｌまで充填し、これを液体窒素中に保存した。ＭＣＳは無菌性について、またマイコプラズマおよび異種ウイルスの不存在について試験した。
結果：ＭＣＳは無菌で、また、マイコプラズマおよび異種ウイルスを含まない。
【００１３】
ＭＣＳを凍結後８日目に、一つのアンプルを液体窒素から取り出し、解凍し、２５０ｍｌの培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒより、商品番号６４５８１７０）中の培養培地に播き、３７℃でさらに継代培養した。ブランチＣのＦＲＯｖ細胞はＥＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ＋２．５％ウマ血清＋ＮＳＰ中で培養した。
【００１４】
本明細書に記載したＦＲＯｖ細胞の培養は一例として示したものである。この細胞の他の認定されている培地（たとえばＤＭＥＭまたはＴＣＭ１９９）中、また様々な血清（ウシ血清、ウシ新生仔血清またはヒツジ血清）を１〜１０％の間で使用しての培養も同様に可能である。
【００１５】
ＦＲＯｖ細胞（ブランチＢ）におけるウイルス複製の試験
６９回継代培養以降はＦＲＯｖ細胞系、ブランチＢについて以下のウイルス型に対する感受性を試験した。
ウシアデノウイルス：１、３、４、５、６、７および８型
パラインフルエンザウイルス：３型
ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）
ウシヘルペスウイルス：１および４型
ウマヘルペスウイルス：１型
粘膜病ウイルス（ＭＤＶ）：株Ｕｇ５９
ウシパルボウイルス：株Ｈａｄｅｎ
【００１６】
実施例１
過密に増殖した培養ＦＲＯｖ細胞（Ｔ５０フラスコ、Ｇｒｅｉｎｅｒより）を、血清培地を除去するためにＥＭＥＭ＋ＮＳＰ  に変更した。培養細胞に上記ウイルス型を無血清培地中で感染させた。ウシパルボウイルスの場合にはそれが７０〜８０％増殖した後に感染させた。この感染実験では非感染培養体３検体を対照として使用した。
【００１７】
３〜１０日後、感染培養体はウイルスの型に応じて、ウイルス特異的な細胞変性作用を示した。ウイルスの複製はＦＲＯｖ細胞中で起こっていた。他方、非感染対照培養体は無傷の不変細胞ローンを示した。
【００１８】
実施例２
ＦＲＯｖ細胞系の様々な継代数におけるウイルス合成をモニタリングするために、以下の表に掲げた継代数のＦＲＯｖ細胞をＢＶＤ株Ｕｇ５９で感染させた。感染の操作は実施例１の場合と同様である。以下の表に結果を示す。
【表１】
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【００１９】
比較のために、ＢＶＤ株Ｕｇ５９のウイルス複製を二倍体ＦＲＬｕ４５細胞中でモニタリングして、以下に掲げる値が得られた。
【表２】
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結果の要約：２つの表の結果から明らかなように、産生されたＢＶＤ抗原の量（感染性）は２つの細胞系で匹敵するものであった。
【００２０】
実施例３
ＦＲＯｖ細胞のウイルスに対する感受性を試験するために、ＢＶＤ株Ｕｇ５９ウイルスクロップをＦＲＬｕ４５細胞およびＦＲＯｖ細胞中、比較様式で滴定した。感染力価は二重滴定によって測定した。
【表３】
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要約：これらの比較実験から明らかなように、ＢＶＤウイルスの検出に対し、ＦＲＯｖ細胞系はＦＲＬｕ４５細胞よりわずかに感受性は低いがそれは有意ではない。