(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド結合で連結されたメチオニルを含む第１の開裂可能な結合およびエステルを含む第２の開裂可能な結合を有する固相合成に適するタイプの固相担体であって、第１の結合と第２の結合とが順次開裂可能である上記固相担体。
【請求項２】
ペプチド結合で連結されたメチオニルを含む第１の選択的に開裂可能な結合および８．５よりも高いｐＨにおいて開裂し得るエステルを含む第２の開裂可能な結合を有する固相合成に適するタイプの固相担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
１．発明の分野
本発明は、固相ペプチド合成において使用するためのエステル結合リンケージ（特に、イミノジ酢酸エステル結合リンケージ）に基づくリンカーに関するものである。より詳細には、本発明は、固相担体上に残存するジケトピペラジンまたは他の環状構造の形成により、比較的温和な条件下で、そして２回目の開裂では高ｐＨのより厳しい条件下で、固相担体からペプチドを切り離すことができる開裂可能なリンカーに関する。本発明はさらに、環状生成物の形成により開裂されるリンカーを含め、多重開裂可能リンカーを用いて製造された固相担体に向けられる。１つのこのような第２リンカーはヒドロキシメチル安息香酸のエステル、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基により形成されるエステルである。
【０００２】
【従来の技術】
２．発明の背景
ペプチド合成用の多くの固相樹脂ならびにハンドルは、FieldsおよびNoble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214に記載されるように、当業界で入手可能である。有用であるためには、ハンドルはペプチド合成の反応条件に対して安定でなければならないが、合成が完了したときには、固相担体からのペプチドの開裂を可能にするものである必要がある。
【０００３】
選択的に開裂可能なリンカーはあまり一般的でないが、かなり有用である。これらのリンカーはハンドルとしての役目を果たすことができ、また、他のリンカーに結合させることもできる。こうしたリンカーのいくつかの有用な特徴は、それらがペプチドの開裂と関連した強酸性条件、例えばフッ化水素（ＨＦ）またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中ではなく、ハンドルと関連した一層温和な条件下、例えば弱塩基性または弱酸性条件下で開裂できる点にある。
【０００４】
紫外線感光性リンカー、例えばＯＮｂ (BaranyおよびAlbericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942) が使用されている。他の開裂可能リンカーは水素化分解または光分解を必要とする。その他の感光性（光開裂可能）リンカーの例は、Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58) 、Hammerら (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45)、および Kreib-Cordonierら (1990, Peptides - Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshall編集, pp. 895-897)によって記述されている。
【０００５】
Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149)は Asp-Pro結合を開裂するためにギ酸水溶液を用いた。この手法は Geysen pin 合成法と共にＴ細胞の抗原決定基を同定するのに使用された (Vander Zee ら, 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47) 。しかし、ギ酸によるペプチドの処理は、とりわけ処理したペプチドを生物学的アッセイで使用することになっている場合には、望ましくない。
【０００６】
塩基性条件下で開裂できる他の可能性のあるリンカーグループには、ｐ-（ヒドロキシメチル）安息香酸 (Athertonら, 1981, J. Chem. Soc. Perkin I: 538-546)、およびヒドロキシ酢酸 (Baleaux ら, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28)が含まれる。Geysenら (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33)は、ジケトピペラジンの二環誘導体を生じさせるプロリンのカルボキシ末端エステルへの求核攻撃によるペプチドの切り離しを報告した。しかし、Geysenらによって記述された「ジケトピペラジン」法はＣ末端にジケトピペラジン部分を保有するペプチドを生じさせる (Brayら, 1991, J. Org. Chem. 56:6659-6671) 。これは好ましくない状態である。なんとなれば、複素環部分が放出されたペプチドの結合活性または生物学的活性に影響を及ぼすことがあるからである。国際特許公開 WO 90/09395 (Geysen, 1990年８月23日発行) には、複素環が固体担体上に残存するようにジペプチド開裂可能リンカーを配向させることが提案されている。
【０００７】
さらに、最近になって、固相担体に結合された１０6 〜１０7またはそれ以上のペプチドからなるライブラリー（固相担体の各粒子が１つのペプチド種を含む）の作製を可能とする技法が開発された（国際特許公開 WO 92/00091、1992年１月９日発行）。かかるライブラリーは、各ペプチド種をその活性について１より多いアッセイで試験するか、または、ペプチドを混合物として試験して、その後更なる試験のために陽性混合物から全部の樹脂粒子を分離することができるように、ペプチド種を固相担体から実質的に等モル量で順次開裂する場合に有利に使用される。また、これらのライブラリーは、固相担体から放出されたとき目的の活性を示すペプチドの配列を決定するための、固相担体上に存在する等モル量の各ペプチドを提供する。
【０００８】
【非特許文献１】
ブレイら (Bray et al.) 著、「ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）」、（米国）、1991年、56巻、p.6659-6671
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、当業界には、実質的に構造が変化してないペプチド、特にジケトピペラジン部分が結合されていないペプチドを生成する開裂可能なリンカーの必要性が存在している。さらに、生物学的試験に適合しうる溶液にペプチドを放出させる必要性が存在している。
【００１０】
その上、それぞれのリンカーの開裂が他のリンカーの開裂から独立していて、すなわち他のリンカーの開裂に対して直交(orthogonal)していて、固体担体から等モル比で同じまたは異なるペプチド種を順次開裂しうる、多重開裂可能リンカーの必要性が当業界に存在している。
【００１１】
本出願で引用した参考文献は、どれも「従来技術」として利用することを容認されたものと受けとるべきでない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
３．発明の概要
本発明は、固相ペプチド合成用のエステル結合リンケージに基づくリンカー、特にイミノジ酢酸リンカーに関するものである。かかるリンカーは固相担体からのペプチドの放出をもたらす。本発明のある態様においては、エステル結合が固相担体上に残存するジケトピペラジンまたは他の環状構造の形成を伴って開裂される。エステル結合の開裂により放出されたペプチドは、Ｃ末端にカルボキシヒドロキシアルキルアミド基を含むことができる。別の態様において、エステル結合は比較的強い塩基性条件下で開裂される。好ましくは、イミノジ酢酸基の縦列 (tandem) 配置により、両タイプのエステル結合が生じる。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、リンカーはイミノジ酢酸（ＩＤＡ）である。ＩＤＡのカルボン酸部分はペプチドとのエステル結合を形成することができ、多重開裂を提供しうる。１回目の開裂反応はジケトピペラジンの形成を伴う内部求核攻撃によって起こる。この反応は、ＩＤＡのイミノ基に結合されたアミノ酸の遊離アミンの攻撃により、約６．０以上のｐＨ、好ましくは７．０以上で起こる。遊離アミンはエステルの１つを攻撃する。また、カルボン酸の１つに結合されたアミノ酸-エステル上のイミノ基がエステルに対して求核試薬として作用することができる。より好ましくは、ＩＤＡのイミノ基が第２のＩＤＡのカルボン酸により形成されたエステルを攻撃する。この第２ＩＤＡは第１ＩＤＡのカルボン酸に第２ＩＤＡのイミノ基とのアミド結合により結合されている。
【００１４】
２回目の開裂反応は外部求核攻撃により、例えば比較的強塩基性の条件下での加水分解により起こり得る。
【００１５】
本発明はさらに、少なくとも１つのリンカーが固相担体に結合された環状構造（例：ジケトピペラジン）の形成を伴って開裂される、２以上の開裂可能リンカーを含んでなる固相担体に向けられる。リンカーは、開裂の際に、ジケトピペラジンが放出ペプチドに結合されるようなリンカーをさらに含み得る。別の実施態様において、エステル結合リンケージはヒドロキシメチル安息香酸のような反応性カルボン酸に対するものであってよい。本発明の多重開裂可能リンカーの実施態様において、固相担体に結合させることができるその他の開裂可能リンカーとして、光開裂性リンカーおよび酸開裂性リンカーが挙げられるが、これらに限らない。固相担体はさらに従来のハンドルを含んでいてもよい。
【００１６】
本発明はさらに、それぞれの開裂工程でただ１つのリンカーが開裂されかつペプチドの部分が放出されるように、複数のリンカーを順次開裂していく方法に向けられる。本発明の開裂可能なリンカーはペプタイド又は他の化合物の生物学的又は結合アッセイに用いられる。また、結合される化合物は1993年５月27日付けの米国特許出願第068,327 号（参考としてここに組み込まれる）に記載されるようなコーディング分子であり得る。イミノジ酢酸リンカーは、放出されるペプチドがジケトピペラジン部分を含まないので、これらのタイプのアッセイに特に有利である。
【００１７】
リンカーとしてのイミノジ酢酸（ＩＤＡ）の使用は、ジケトピペラジンを形成するジペプチドリンカーにまさる利点を有している。ＩＤＡはかなり安価な試薬である。さらに、下記の実施例で示すように、ＩＤＡ-ＩＤＡリンカーは、７より低いｐＨでさえも、ペプチドの放出を伴って急速な環化を受ける。実施例では、この放出が約ｐＨ６．５で起こる。
【００１８】
本発明の他の利点は、ジペプチドジケトピペラジンリンカーの放出速度を適当なアミノ酸の組合せを選択することによって制御し得る点にあり、かくして対象の生物学的アッセイに応じて速いまたは遅い放出が可能となる。本発明の更なる利点は、生物学的試験に適合しうる溶液にペプチドを放出し得る点にある。
【００１９】
別の態様において、本発明はさらに、ペプチドのような薬剤のin vivo 放出を提供する。本発明の開裂可能リンカーに特有の利点は、薬剤の希望する放出速度に応じて、開裂速度を制御できることであり、放出された薬剤にはジケトピペラジン部分が結合されていないだろう。こうした放出可能薬剤は経口投与が好ましく、その場合、開裂後にジケトピペラジンまたは他の環状部分を結合している不活性固体担体は排泄され得る。
【００２０】
本発明の更なる利点は、順次（すなわち直交的に）開裂され得る多重開裂可能リンカーが提供される点である。
【００２１】
3.1.  略号
本明細書中で用いる略号はIUPAC-IUB 生化学命名委員会の勧告に準拠したものである (Eur. J. Biochem. 1984, 138:9) 。アミノ酸の記号はＬ-配置を表す。その他の略号は次のとおりである：
AA        アミノ酸
AcOH      酢酸
Alloc     アリルオキシカルボニル
Boc       ブチルオキシカルボニル
But       t-ブチル
Bzl       ベンジル
Ddz       2-(3,5-ジメトキシフェニル) プロピルオキシカルボニル
DIC       N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA      N,N'-ジイソプロピルエチルアミン
DCM       ジクロロメタン
DKP       ジケトピペラジン
DMAP      4-ジメチルアミノピリジン
DMF       N,N-ジメチルホルムアミド
EDT       1,2-エタンジチオール
HOBt      1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
IDA       イミノジ酢酸
Npys      2-ニトロピリジルスルフェニル
PA, PAO   プロパニルアミン（またはアミド）エステル
PAOH      プロパノールアミン（またはアミド）
RP-HPLC   逆相高性能液体クロマトグラフィー
SPPS      固相ペプチド合成
TFA       トリフルオロ酢酸
TG        TentaGel（樹脂）
Ｚ        ベンジルオキシカルボニル
【００２２】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については本明細書末尾を参照されたい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
5.発明の詳細な説明
本発明は固相ペプチド合成におけるエステル結合リンケージに基づくリンカーに関するもの、とりわけ、イミノジ酢酸リンカーについてのものである。このようなリンカーは固相担体からのペプチドの開裂に用いられる。本発明の一つの態様においては、エステル結合は、固相担体上に残る環状化合物、例えばジケトピペラジン(DKP) を形成する内部求核試薬による求核攻撃によって開裂する。エステル結合の開裂の結果遊離するペプチドはＣ末端ヒドロキシアルキルアミド基、例えばメタノールアミド、エタノールアミド、またはプロパノールアミドを含むことができる。更なる実施態様において、エステル結合は外部の求核試薬（塩基性の条件下で）によって開裂する。好ましい態様においては、リンカーがＩＤＡ-ＩＤＡであるとき、二つのエステル結合開裂可能なリンケージがある。一つはDKP形成を経由した開裂であり、もう一方は高pH条件下での処理である。
【００２４】
本発明は、さらに、開裂可能なリンカーを二つ以上含む固相担体に関するものである。ここで少なくとも一つのリンカーはペプチドとのエステル結合リンケージを有している。望ましくは、そのようなリンカーがＩＤＡであり、より望ましいのはＩＤＡ-ＩＤＡである。もう一方のリンカーは環状構造の形成によって開裂される。その環状構造は例えばジケトピペラジンであり、固相担体に結合しているか、または、遊離するペプチドに結合している。環状化合物形成によって開裂されるリンカーの求核性基は直交的に保護されうる。直交的保護基を順次除去することによって、段階的放出がおこなわれる。別の実施態様においては、エステル結合のリンケージは反応性のあるカルボン酸、例えばヒドロキシメチル安息香酸との間に作りうる。本発明の多重開裂可能リンカーの実施態様において固相担体に結合しうるものとしてあげられている他の開裂可能なリンカーは、光開裂性リンカーや酸開裂性リンカーを含むがそれらに限定されるものではない。固相担体には、さらに、伝統的に用いられてきた結合のためのハンドル(handle)を含む。
【００２５】
本発明は、さらに、多重リンカーを順次開裂させる方法に関するものであり、その方法によって各開裂段階で一個のリンカーのみが開裂し、等モルのペプチド画分が遊離する。
【００２６】
特定の実施態様においては、後述のとおり、ペプチドの放出は弱塩基性条件下で急速な環状構造、例えばジケトピペラジンの形成によって内部の求核試薬によりエステル結合が開裂することに基づいている。内部の求核試薬としてはＩＤＡリンカーのイミノ官能基が好ましい。それはＩＤＡの分岐酢酸基のうちの一つに結合された分子中のα-カルボン酸のどれかにより形成されたエステル結合を攻撃する。一つの態様においては、そのカルボン酸エステルとはアミノ酸のα-カルボキシル基である。好ましくはＩＤＡのカルボキシル基である。他の実施態様においては、ＩＤＡのイミノ基に結合している任意の分子の遊離α-アミノ基は、ＩＤＡのカルボニル基のうちの一つとの間で形成されているエステルを攻撃する。一つの態様においては、α-アミンはアミノ酸の一部である。特定の実施態様においては、後述のとおり、そのアミノ酸はグリシンである。
【００２７】
更なる実施態様においては、放出は希水酸化ナトリウムまたはアンモニアのメタノール溶液による処理、あるいはアンモニアガスに暴露することによってなされる。
【００２８】
さらに別の実施態様においては、両方のリンケージが用いられている。別の実施態様においては、両リンケージは単一のリンカー上にある。好ましくはそのリンカーはＩＤＡ-ＩＤＡである。
【００２９】
さらにまた別の実施態様において５つのレベルの開裂能を有する異なるリンカーが用いられており、それらはエステルリンケージリンカーを含む。
【００３０】
ここで用いられているアルキルという用語はＣ1からＣ10のアルカン、アルケン及びアルキン（すなわち飽和及び不飽和炭化水素）を含むがそれらに限定されない。例えば、アルキル基としてはメチル、エチル、エテニル、プロピル、プロペニル、プロピニル、などを用いうる。ここで用いられているアルキルという用語は直鎖のもの、分岐したもの及び環状アルキルを含む。
【００３１】
ここで用いられている「開裂可能なリンカー」とは比較的穏和な条件下において開裂されうる結合を有することを特徴とするスペーサー分子として定義される。リンカーは固相担体とまたは固相担体上のハンドルと結合する官能基を一つ持っている。そのリンカーはまた、そのリンカーと結合しうる適当な官能基を持っているアミノ酸、ペプチドあるいは何らかの有機化合物と結合体を作りうる第２の官能基を持っている。本発明のリンカーは第３の官能基を持ちうる。それは求核性の基であり、それがエステル結合を攻撃し開裂させる。そのリンカーはペプチドの合成が完了した後、開裂させる。
【００３２】
ここで用いられている「固相担体」という用語は特別なタイプの担体を意味しない。多種類の担体が利用可能であり、当業界において通常用いられているものである。固相担体としてはシリカゲル、樹脂類、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、木綿、プラスチックのビーズ、アルミナゲル、多糖類が含まれる。適当な固相担体はその最終目的及び合成プロトコールに対する適性によって選択される。例えばペプチド合成に対しては、その固相担体としてp-メチルベンズヒドリルアミン(pMBHA) 樹脂(Peptides International, Louisville, KY)、ポリスチレン(例えばPAM-resin,  Bachem Inc.やPeninsula Laboratoriesから入手) 、ポリ (ジメチルアクリルアミド) グラフト重合スチレン-ジビニルベンゼン共重合体 (例えばPOLYHIPE (登録商標)resin, Aminotech, Canada より入手）、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratories より入手) 、ポリエチレングリコールグラフト重合ポリスチレン樹脂(TentaGel(登録商標), Rapp Polymere, Tubingen, Germany)、ポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch, California より入手) 、またはセファロース(Pharmacia, Sweden) を用いうる。
【００３３】
一つの実施態様においては、固相担体はin vivo 用としても適するものとすることが出来る。すなわち、その担体はペプチドまたは他の生理活性物質の直接適用のための運搬体または担体として用いうる(例えばTentaGel(登録商標), Rapp Polymere, Tubingen, Germany)。特定の実施態様においては、固相担体は味が良く、経口的に摂取可能とすることが出来る。
【００３４】
「ペプチド」という用語はここではその最も広義な意味で用いられており、２つまたはそれ以上のアミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド疑似体のサブユニットからなる化合物を意味している。サブユニット間はペプチド結合でつなぐことが出来る。ここで用いられている「アミノ酸」という用語は天然及び／または非天然であるか、あるいは合成のアミノ酸 (グリシン、及びD,L の光学異性体を含む) 、アミノ酸類縁体及びペプチド疑似体を含む。ここで用いられているペプチド疑似体とは、ペプチドの化学的構造は有さないもののペプチド類似の特性を有する化合物をいう。ペプチドに特別な性質を持たせるためにD-アミノ酸、D-とL-アミノ酸との組み合わせ、及び「デザインされた」アミノ酸 (例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸及びNα-メチルアミノ酸など)からペプチドを構成しうる。さらにある特定のアミノ酸を特定のカプリング段階で用いることにより、α-ヘリックス、β-ターン、β-シート、γ-ターン及び環状ペプチドを作りうる。
【００３５】
5.1  リンカー
エステル結合リンケージに基づく選択的に開裂可能なリンカーは求核攻撃に対して感受性を有するということによって特徴づけられる。リンカーはイミノジ酢酸であることが好ましい。
【００３６】
本発明はさらに、特定のエステル結合の求核攻撃に対する感受性を増加させたり減少させるための方法についても提供している。それらの方法とは求核試薬の求核性を変える、エステルのカルボニルへの接近し易さを変える、及び環化反応において求核攻撃がエステルのカルボニルに加えられる場合には環化傾向を変えることを含むがそれらに限定されたものではない。これらのパラメーターを変えることにより、本発明では放出反応のpH、放出速度、放出されるペプチドの量のコントロールを提供している。
【００３７】
議論を明確にするため、本発明は下記の分節において(i)ジケトピペラジン形成リンカー(内部求核性基を含み、環状構造を形成し、その構造は開裂後も固相担体に結合した形で残るリンカー)及び(ii)ヒドロキシメチル安息香酸、グルタミン酸、またはアスパラギン酸リンカー(外部求核攻撃によってのみ開裂しうるリンカー)について実施例を用いて説明する。しかしながらこの原理は他のエステルリンケージに基づくリンカーにも同様に適用可能である。
【００３８】
5.1.1 中性pHで開裂可能なエステルリンカー
一つの実施態様においては、本発明のリンカーはジケトピペラジン、それは固相担体上に残るものであるが、その形成に際してペプチドアルコールを放出する。そのようなリンカーをここでは「ジケトピペラジン(DKP)リンカー」と呼ぶ。本発明は部分的には次の知見に基づくものである。つまり、脂肪族アルコールアミンと結合したペプチドでは、アミン基はペプチドのC末端のカルボキシル基とアミド結合を形成しており、アルコール基はエステル結合で環化可能なリンカーに結合しているが、そのペプチドは穏和な条件下でリンカーから開裂されうるという知見である。リンカー上の求核性基の脱保護後に遊離の求核性基はエステル結合を攻撃でき、固相担体に結合した形の環状化合物、例えばジケトピペラジン、を形成し、ペプチドを放出する。
【００３９】
イミノジ酢酸をジケトピペラジン形成に関与するα-アミノ酸と考えることにより、新規な二重開裂可能リンカーのデザインが考えられる。次の種々の理由によりイミノジ酢酸は二重開裂可能リンカーのキイ化合物として適当である。すなわち(i)カルボキシル基から見てイミノ基はα-位置にある、(ii)２つのカルボキシル基は化学的に同等である、(iii)N-置換アミノ酸の一種として実際的には他のいかなるα-アミノ酸とでもDKP形成を経て環化されやすい、(iv)対掌性でない、(v)価格は十分競争力がある。一般にＩＤＡをベースとするリンカーを構築するには３つのヴァリエーションがある。それらは図式的にはジペプチドでＡａａ-ＩＤＡ，ＩＤＡ-ＡａａまたはＩＤＡ-ＩＤＡと示しうる。ここでAaaとは任意のα-アミノ酸であって、DKP形成を経て環化しやすいものが好ましい。ジペプチド内でのＩＤＡの位置については重要でないと思われる。このことはアミノ酸の他の組み合わせ、例えばGlu-ProやPro-Gluではそうではないことは後述するとおりである。
【００４０】
特定の実施態様においては、後述のとおり、リンカーはＩＤＡであり、それのカルボキシル基のうちの一方は固相担体との結合に使われ、他方はペプチドのアルコール誘導体との結合に使われる。そしてアミノ酸のアミンはイミノ基と結合し求核試薬として働きうる。後述のとおり、別の実施態様においては、リンカーはＩＤＡでその一方のカルボキシルは固相担体と結合し、他方のカルボキシルはアミノ酸と結合している。イミノ酸のα-カルボニルはエステル形成に使われ、ＩＤＡのイミノ基はエステルを攻撃しうる。より好ましい実施態様においては、分岐ＩＤＡリンカーは、(1)遊離のイミノ基、それはDKP形成のためのエステルの求核攻撃に参加しうる、および(2)環化反応によって開裂しうるエステル結合を少なくとも一個と加水分解によって開裂しうるエステル結合を一個、提供する。
【００４１】
別の実施態様においては、後述のとおり、リンカーはジペプチドでグルタミン酸- プロリンの配列を有する。また、別の実施態様においては、後述のとおり、リンカーはジペプチドでプロリン-グルタミン酸の配列を有する。さらにまた別の実施態様においては、リンカーはジペプチドでリジン-プロリンの配列を有する。開裂反応においてはジペプチドのN末端のアミノ基が求核試薬として働く。一般的に、いかなる種類のジペプチドもその中に固相担体と結合する官能基を側鎖に持っているという条件で使用可能である。特定の実施態様においては、後述のとおり、グルタミン酸のγ-グルタミル基は固相担体との結合に用いられる。その他の側鎖で固相担体との結合に適しているものはアスパラギン酸の側鎖及びリジンの無水コハク酸誘導体化ε-アミノ基であるがそれらに限定されるものではない。
【００４２】
ジケトピペラジンリンカーの求核性基は合成過程及びペプチド開裂前は保護されている。本発明の一つの実施態様においては、開裂反応は求核性基の脱保護の程度によってコントロールされうる。特定の実施態様においては、求核性基はイミノジ酢酸のイミノ基またはジペプチドリンカーのα-アミノ基であり、保護基はBoc, Fmoc, Alloc, Npys,Zまたは修飾Z基である。当業界で良く知られているとおり、保護基は各種の異なった条件で除去可能であり、それらの条件での除去が望ましい場合には用いうる。例えば、Boc保護基はTFAで除去され、Fmoc保護基は塩基性条件下で除去され、Alloc保護基は水素化分解で除去され、Npys保護基は還元条件、例えば遊離の-SH基での処理により除去され、Z保護基は臭化水素または酢酸中で、あるいは水素化分解により除去される。
【００４３】
多重リンカーを用いている実施態様においては、異なる条件で放出される二種のジケトピペラジンタイプのリンカーが用いられた。相異なるリンカーは保護基も異なっており、例えば一つのリンカーにBoc、他方にNpysまたはAllocといった保護基であり、これによりそれぞれの脱保護過程の後に開裂しうる。
【００４４】
求核性基は脱保護後、エステルのカルボニルと反応し、ペプチドを放出する。しかし、この求核攻撃の速度は緩衝液のpH,求核試薬の求核性及び形成される環のサイズとタイプに左右される。例えば、酸性pH条件下では求核試薬の電子はルイス酸と相互作用する。求核試薬がアミンの場合には、アミンは陽子を受容することとなる。これらの条件下では求核攻撃は起こらないかまたは非常に遅いであろう。従って、合理的な時間の範囲内でペプチドを放出させるためには、ジケトピペラジンリンカーには悪くとも微酸性(pH 6-7)、好ましくは中性(pH 7)あるいは微塩基性(pH 7より塩基性）条件が必要である。pHの調整はペプチドの放出速度を制御する一つの方法である。特定の実施態様においては、リンカーがＩＤＡ-ＩＤＡ、Gly-IDA及びGlu-Proの場合、ペプチドはpH8.5で急速に放出される。別の実施態様において、ペプチドは8.5より高いpHで放出される。
【００４５】
リンカーが環状構造を形成する可能性は環の原子数に大いに依存している。五員環または六員環を形成するような環化反応が好ましく、そのうちで六員環がより好ましい。四員環またはそれ以下のもの、あるいは七員環またはそれ以上のものは好ましくない。
【００４６】
開裂の速度は求核試薬の固有の求核性にも依存している。さらに引き続き隣接する官能基によって影響を受ける。リンカーがジペプチドである例においては、求核性ペプチドの側鎖によってα-アミノ基の相対的な求核性は第一義的に決定される。例えばS-メチルシステインは、その側鎖のイオウ原子の誘導作用によってアミノ基の求核性を増強させる。他方、このアミノ酸の酸化型(スルホキシドまたはスルホン)はアミノ基の求核性を著しく減少させる。
【００４７】
さらに実施態様においては、開裂速度はエステルのカルボニルの接近し易さによって決定される。例として、大きな基、例えば第二又は第三アリール又はアルキル基(へテロアリル又はヘテロアルキル基を含む）であるがそれらに限定されるわけではない、その大きな基がエステルのカルボニルの近傍にある場合、求核試薬のカルボニルへの攻撃は立体障害を受ける。一つの実施態様においては、カルボニルと結合した酸素原子の隣のC１位置にメチル、エチル、プロピルなどの基が存在している場合、エステルカルボニルへの接近は妨害される。他方、エステルカルボニルの近傍の大きな基を取り除くことにより、反応速度を高めることができる。
【００４８】
更なる実施態様においては、反応速度はリンカーが環化する傾向を変えることにより影響を受ける。プロリン残基をリンカーの2番目の位置(C末端)に置くことにより開裂速度は速くなる。何らかの特別な理論に当てはめようというわけではないが、開裂速度の増加は環化傾向の増加に対応している。他方、リンカーの第1番目の位置(N末端)にプロリンを置くことにより開裂速度は遅くなる。特別な例として、後述するごとく、Glu-ProリンカーはpH8.5において急速に開裂を起こすが、Pro-GluリンカーはこのpH条件では非常に開裂が遅い。別の実施態様においては、リンカーはD-アミノ酸、それは容易に環化するものとして知られているが、そのD-アミノ酸を含有するものである。さらに立体効果が環化の可能性を決定することも知られている。例えばアミノ末端にグリシンを持つペプチドはアミノ末端にバリンを持つペプチドと比較すると非常に速く環化するが、そのバリンを持つペプチドもN末端に立体障害の大きいアミノイソ酪酸を持つペプチドと比べると環化は速い。
【００４９】
当業者であれば前述の事柄を教えられれば容易にわかることであるが、本発明のジケトピペラジンリンカーは、カルボニルとの反応のためにエステルカルボニルの近傍に環化により求核試薬を配しうるいかなるリンカーをも包含するものである。このような戦略は望ましいものである。なぜならばそれは各リンカーの内部に求核性基を含んでおり、過剰の遊離の求核試薬を必要としないからである。ＩＤＡリンカーは特に望ましい。
【００５０】
一つの実施態様においては、リンカーはカルボキシル基(例えばアミノ酸又は何らかのカルボン酸)と短鎖(C1からC6)のアミノアルコールとのエステル形成によって合成される。その後、アミン基を標準的なペプチド合成法を用いてペプチド鎖の第1番目のアミノ酸のカルボキシル基と結合させる。別の実施態様においては、セリンまたはトレオニンの側鎖がアルコールとして働き、アミノアルコール誘導体の必要性をなくする。
【００５１】
5.1.2.  より高いｐＨで開裂し得るエステルリンカー
さらにもう１つの具体例として、本発明のリンカーは、例えばヒドロキシルイオンまたはアンモニアのような遊離の求核試薬によって開裂されるエステル結合を有することができる。特定の例として、リンカーはイミノ基がカルボキシル基に結合していて求核攻撃に対してフリーではないＩＤＡであり得る。もう１つの例として、リンカーは（プロパノールアミンのアミノ基がペプチドのＣ-末端のカルボキシル基に結合した）グルタミン酸-プロパノールアミンでも良い。リンカーとして適当な他の酸としては、ｐ-（ヒドロキシメチル）安息香酸、アスパラギン酸、及びヒドロキシ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。アミノアルコールの代わりに、（エステル結合の形成によって）そのＯＨ基を置換したセリン、ホモセリン及びトレオニンの誘導体を用いることができる。
【００５２】
エステル結合は強塩基処理によって開裂できる。例えば、この結合は０．１％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）処理によって開裂できる。もう１つの実施態様としては、この結合はアルコール、好ましくはメタノール中のアンモニア処理、または気体アンモニアへの暴露によって開裂できる。後者の系の特に良い点は、開裂の後、中性のｐＨで開裂されたペプチドを残して、アンモニア及びアルコールを蒸発させることができることである。
【００５３】
5.1.3.  遊離カルボキシル基を有する化合物の放出
先の実施態様において、ＩＤＡに基づく二重開裂可能リンカーからの化合物の放出によって、これに結合したGly-HOPAを含有する化合物を得ることができる。ある場合には、グリシンのヒドロキシプロピルアミドのない、すなわち、遊離のカルボキシル基を有する化合物の放出が望ましいことから、第二のエステル結合を組み込んだ修飾ＩＤＡ-ＩＤＡリンカーが提供される。ヒドロキシ酸、例えばｐ-ヒドロキシメチル安息香酸、セリンまたはコハク酸の３-ヒドロキシプロピルアミドをＩＤＡ-ＩＤＡリンカーの双方のアームに結合させることによって、リンカーの中にエステル結合を導入する。ｐＨ８における１回目の放出の間に、ＤＫＰが形成し、ヒドロキシ酸リンカーを有する化合物が溶液中に放出される。次いで濾過によってビーズを溶液から分離し、ＮａＯＨのような強塩基の添加によってｐＨを約１３にする。エステルの加水開裂に十分な時間、典型的には約３０分間のインキュベーションの後、生物学的なスクリーニングアッセイに適したｐＨになるように塩基を中和する。従って、先に記載したように、２回目の放出はＮａＯＨの使用によって行われ、第二のエステル結合の存在のために、遊離のカルボキシル基を有する目的の化合物を直接得ることができる。
【００５４】
遊離のカルボキシル基を有する化合物を生成するこの実施態様のリンカーの一般的な構造は次のとおりである：
【００５５】
【化１】
0003672558.tif 000002
式中、遊離のカルボキシル基は固相担体に結合されるものであり、Ｒは２個のヒドロキシル基を連結する炭素またはヘテロ炭素骨格である（例えば、R=-(CH2)3-O-CO(CH2) 2-CO-Gly-NH-(CH2) 3-）。本発明の目的のために必須のエステル結合は、放出されるペプチドまたは他の試験化合物に最も近いエステル結合である。
【００５６】
モデルリンカーでの１回目と２回目の放出の化学は図８に例示してある。
【００５７】
５．２．多重開裂可能なリンカー
本発明の好ましい態様として、固相担体からペプチドを順次放出させるために、エステル結合に基づくリンカーを他の既知の開裂可能なリンカーと組み合わせることがある。こうした多重開裂可能リンカーは以前に記載されている（国際特許公開No.WO92/00091）。エステル結合に基づく開裂可能なリンカーは他の選択的に開裂可能なリンカーと組み合わせて好ましいリンカーを提供する。特定の実施態様として、高いｐＨで開裂可能なジケトピペラジンリンカーとエステル結合リンカーを共に固相担体上で組み合わせる。
【００５８】
当業者であれば容易に認識し得るように、数種の異なる開裂可能なリンカーを固相担体に結合させるための多くの方法がある。標準的な化学的な縮合反応の技術、例えばリンカーの活性化カルボニルと固相担体上の遊離のアミンまたは他の求核試薬との反応を用いて、リンカーを固相担体に結合させることが好ましい。１個より多くのリンカーを結合させるためには、固相担体または固相担体に結合したハンドルを、分岐したリジン基で更に誘導体化するのが好ましい。分岐及び更に他のリンカーとの結合を続けるために、リジンの２個のアミノ基のそれぞれの保護基を選択的に除去し、特定のリンカーまたはもう１つのリジンと結合させることができる。もう１つの実施態様として、リンカーの濃度が求核試薬の濃度の部分となるようにリンカーを反応させることができる。こうして、次のリンカーに結合するための遊離の求核性基を残して、それぞれのリンカーを固相担体に非-定量的に結合させることができる。
【００５９】
本発明に従って、エステル結合リンケージに基づくリンカーに加え、多くの異なるリンカーを１つの固相担体上に結合させることができる。こうしたリンカーとしては、酸-感受性、塩基-感受性、求核試薬-感受性、求電子試薬-感受性、光感受性、酸化感受性または還元感受性のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。光感受性（光開裂可能な）リンカーの例は、Barany及びAlbericio（1985, J.Am.Chem.Soc. 107:4936-4942）、Wang（1976, J.Org.Chem. 41:32-58）、Hammerら（1990, Int.J.Pept.Protein Res. 36:31-45）及びKreib-Cordonierら（1990, in Peptides-Chemistry,Structure and Biology, Rivier and Marshall, eds., pp.895-897）に見られる。Landen（1977, Methods Enzym. 47:145-149）はAsp-Pro結合を開裂するためのギ酸水溶液の利用について記載している。塩基性条件下で開裂可能な他のリンカーの候補としては、ｐ-（ヒドロキシメチル）安息香酸（Athertonら, 1981, J.Chem.Soc.Perkin I:538-546 ）及びヒドロキシ酢酸（Baleaux ら, 1986, Int.J.Pept.Protein Res. 28:22-28）がある。Geysenら（1990, J.Immunol.Methods 134:23-33）はジケトピペラジンの作用機序によるペプチドの開裂を報告した。従って本発明ではGeysenらによって記載されたジケトピペラジン放出機序と組み合わせて用いる“逆”ジケトピペラジンリンカーを提供する。種々のジケトピペラジンリンカーの求核性基を遮断するために種々の遮断基を用いるのが好ましい。酵素は酵素開裂、例えばペプチドに対するプロテアーゼ開裂、オリゴヌクレオチドに対するエンドヌクレアーゼ開裂に対して感受性があるか、または基質である配列を有するリンカーを特異的に開裂することができる。ある場合には、樹脂の１０〜５０％を開裂可能なリンカーで置換し、残りの５０〜９０％を開裂不可能なリンカーで置換して誘導体化し、リンカーを開裂した後に、配列決定のために十分なペプチドを確実に残すことができる。開裂可能なリンカーに加え、種々の標準的なリンカー、すなわち、標準的な開裂条件、例えば、５０％ＴＦＡまたはＴＦで開裂できるものを、固相担体にオリゴマーを結合させるために用いることができる。こうしたリンカーの例として、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、７-アミノヘプタン酸、及び８-アミノカプリル酸が挙げられる。Fmoc-アミノカプロン酸はBachem California社から市場に出され、利用できる。更に他の実施態様として、リンカーには更に１個以上のβ-アラニンをスペーサーとして含有させることができる。本発明の多重リンカーの実施態様におけるこれらの標準的なリンカーによって、その後の配列決定のために固相担体上にペプチドを保持することができる。
【００６０】
好ましい実施態様において、セーフティー・キャッチハンドル（safety-catch handle）を用いることができる（Patek and Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-4参照）。こうしたハンドルは式（Ｉ）：
【００６１】
【化２】
0003672558.tif 000003
［式中ａ＝１から３、Ｘ1は［Ｓ］Ｒ1またはＸ1はＺ、Ｘ1基は第一のベンゼン環のオルトまたはパラの位置にあり、Ｒ1はアルキル基であり、そして
式中ｂ＝０から３、Ｘ2は［Ｓ］Ｒ2、Ｘ2基は第二のベンゼン環のオルトまたはパラの位置にあり、Ｒ2はアルキル基であり；そして
式中、Ｘ1がＺでなければ、Ｘ1で占められていないいずれかの位置においてＺはＲ3、ＯＲ3または［Ｓ］Ｒ3であり、Ｒ3は固相担体に結合するための反応性官能基を含有するアルキル基であり、またＸ1がＺであれば、Ｚはオルトまたはパラの位置において［Ｓ］Ｒ3であり；そして
式中ｃ＝０または１でｄ＝０または１、ＹはＯＲ4、Ｒ4はアルキル基であり；そして
式中［Ｓ］は-Ｓ-、-ＳＯ-または-ＳＯ2-であり；そして
式中ＤはＨ、保護基またはＮα-保護アシルである。ここで用いる“アルキル”とはＣ1からＣ10である。］
の置換ベンズヒドリルアミンである。セーフティー・キャッチハンドルは記載された通りに合成することができる（Patek and Lebl, 上記）。例えば、ヒドロキシまたはメルカプトベンゾフェノンをフッ化物イオンの存在下でアルカンカルボン酸のω-ハロエステルと反応させることができる。ベンゾフェノンのカルボニル基を次いで慣例的な合成法、例えばヒドロキシルアミンと反応させてオキシムを生成させ、続いて例えば亜鉛で還元させてベンズヒドリルアミンを生成させるか、または例えばギ酸アンモニウムと反応させる還元的アミノ化によってアミンに変換させる。あるいはまた、ベンゾフェノンはアルコールに還元し、Ｎα-保護アミノ酸アミドでアミド化することができる。
【００６２】
5.2.1.  エステル結合及びメチオニン結合の開裂を利用する二重開裂可能リンカー
セレクチド（Selectide）技術を用いたスクリーニング組合せライブラリー（Screening combinatorial libraries）は、ビーズ上の結合アッセイまたは放出可能なアッセイのいずれかを用いて実施することができる。スクリーニングの２つの方法を組み合わせること、すなわち、ビーズ上の結合アッセイを用いてリガンドについてライブラリーをスクリーニングし、次いで溶液中の潜在的なリガンドの結合を確かめることが望ましいかも知れない。ビーズ上の結合アッセイの間の偶発的な放出を避けるために、第5.1.2.節に記載したように、高いｐＨでの放出に適し、ｐＨ８．５またはそれより下では安定なエステル結合をメチオニン含有リンカーと共に組み合わせたリンカーが提供させる。メチオニンのカルボキシ末端と第二のアミノ酸とのペプチド結合は、臭化シアンによって、ホモセリンラクトンの生成を伴いながら選択的に開裂することができる。
【００６３】
メチオニン含有リンカーの更に他の応用は、こうした分析がビーズからの化合物の開裂を必要とすることから、質量分析装置による対象化合物の分析である。
【００６４】
このタイプのリンカーの１つの例は、固相担体に連結されるジカルボン酸、例えばグルタミン酸にメチオニンを結合することによって例示される。エステル含有リンケージはグルタミン酸の第二のカルボキシル基とヒドロキシプロピルアミンとの反応によってアミド結合を形成することにより得られる。ヒドロキシプロピルアミンのヒドロキシル基に結合する最初のアミノ酸として特に好ましいものはβ-Ａｌａであり、その存在によって、ジペプチドに遊離のアミノ部分がある場合に、合成の段階でＤＫＰの生成が阻害される。メチオニン含有リンカーの構築を実施例７に示す。
【００６５】
５．３．ペプチド合成のためのリンカーの使用
本発明のリンカーは、ペプチド合成のためペプチド鎖を固相担体に結合させるのに非常に適している。リンカーは適切な官能基（例えばカルボン酸）を介して任意のアミノ樹脂のアルキル基にに結合させることができる。樹脂上のアミンへのカルボン酸官能基の結合は、ペプチド合成に一般的に用いられている任意の技法、例えば、ＯＰｆｐ、ＨＯＢｔまたは他の活性化エステルの調製、カルボジイミドの存在下における縮合、等により進めることができる。本発明に使用するのに適切な固相担体は上に論じられている。
【００６６】
固相ペプチド合成法は当分野の技術において周知である。簡単に述べると、Ｎα-保護アミノ酸はα-カルボキシルの位置で活性化されて、形成されつつあるペプチド-リンカー-固相担体の脱保護Ｎαに結合される。この結合反応は、当業者に良く知られている技法により達成することができる（例えば、Stewart およびYoung, 1984, Solid Phase Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields およびNoble, 1990,「９-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸を用いた固相ペプチド合成」, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214; Geysen ら，1987, J. Immunol. Methods, 102:259-274参照)。結合、脱保護、および固相担体からのペプチドの最終的開裂の化学は、一般にはｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）または９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）である、αＮ-保護基の選択に依存する。
【００６７】
本発明のリンカーを使用するペプチド合成の好ましい態様においては、結合の完全性をアッセイしなければならない。結合の完全性をアッセイする方法は、当分野の技術において周知である。もし結合が完全でないならば、例えば（ａ）より高濃度の活性化アミノ酸、または異なる活性化作用機構を用いる；（ｂ）異なるまたは付加的溶剤を添加する；あるいは（ｃ）カオトロピック塩を添加する、等によって第２の結合により反応を完成させなければならない (KlisおよびStewart, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivierおよび Marshall 編、ESCOM Publishers, pp.904-906参照)。
【００６８】
５．４．放出可能リンカーを用いた生活性アッセイ
エステル結合リンケージに基づく本発明の開裂可能リンカーは、結合アッセイおよび生物アッセイに有用である。上記リンカー由来のペプチドの一部を放出させることができ、その活性をin situ で検出することができる。次に、興味のあるペプチドを放出した固相担体が得られる。そして、国際特許公開第WO92/00091号に記述されている方法で、この担体上に残っているペプチドの配列を決定することができる。または、本発明のジケトピペラジンリンカーを、Geysenら(1990, J. Immunol. Methods 134:23-33)によって記述されているような従来の方法で使用することができる。これは、開裂反応の速度を制御しうる、および放出されたペプチドが結合したジケトピペラジン部分を持たない、という利点を有する。
【００６９】
放出速度を制御する能力は、ペプチドの長期的な緩慢な放出の効果をアッセイする生物アッセイに使用できる。
【００７０】
５．４．１．ランダムペプチドライブラリー
本発明の好ましい態様において、開裂可能リンカーに基づくエステル結合リンケージは、1992年1 月9 日に公開された国際特許公開第WO92/00091号に記載のランダムペプチドライブラリーと共に使用することができる。
【００７１】
本発明は、受容体分子と結合するペプチドリガンドの同定を可能とする。ここで用いる「受容体分子(acceptor molecule)」という用語は、ペプチドリガンドに結合する任意の物質をいう。受容体分子は抗体、受容体、またはウイルス、等を含むが、これらだけに限定されない生物的巨大分子でありうる。さらに、受容体分子はタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、薬剤、金属、または小さい分子、等を含むが、これらだけに限定されない化合物でありうる。
【００７２】
本発明のペプチドライブラリーは可能性として多数の異なる受容体分子と相互作用できる。特異的受容体分子が結合する特定のペプチド種を同定することにより、興味のあるペプチド種を物理的に単離することが可能である。
【００７３】
受容体分子との相互作用は、受容体の天然のリガンドを標識する競合的結合アッセイにより検出することができる。または、例えば、放射性トレーサー元素の組み込み等によりペプチドを標識し、そして標識化ペプチドの受容体分子への結合を直接検出することができる。
【００７４】
本発明はさらに、合成由来の残存毒性分子を除去するために、処理（例えば、中和ならびに溶剤、滅菌水および培地を用いた過度の洗浄）されたライブラリー由来のペプチドの生物活性を調べるためのアッセイを提供する。アッセイしうる生物活性は、毒性および死滅、刺激および増殖促進、ならびに生理的変化である。
【００７５】
本発明によれば、ライブラリーのペプチドを、本発明のジケトピペラジンリンカーを用いて固相担体（本明細書では「ビーズ」とも言う）から選択的に開裂することができる。ある態様において、ビーズはペプチドの１画分のみが選択的に開裂されるように調製される。ジケトピペラジンリンカーの求核試薬は脱保護され、ペプチドの１画分の開裂が起こるようにライブラリーは穏やかな塩基性条件（例えばｐＨ７より大きい）に暴露される。ある態様においては、ライブラリーは１０〜９０％のペプチドが放出されるように処理される。より好ましい態様においては、２５〜５０％のペプチドが放出される。全ペプチドが開裂可能な場合は、上に記述するように開裂反応の速度に作用し、また塩基の濃度および塩基を用いる処理時間を調節することにより、非定量的な開裂をもたらすことができる。開裂をもたらすための処理の後、ライブラリーを所望のアッセイに生物的に適合させるため、中和または緩衝液の添加等により、さらに処理することができる。実際、ライブラリーのすべてのペプチドが開裂可能リンカーまたは結合によって固相に結合される場合、当業者は部分開裂のための適切な開裂条件を容易に決定することができるであろう。当業者はさらに、放出されたペプチドの相対濃度は開裂条件を変えることによって影響されうることを理解するだろう。
【００７６】
ライブラリーのビーズは固定化されているので、特定ペプチドの濃度勾配が現れる。高濃度のペプチドは、それが放出されたビーズの付近に見いだされる。したがって、ビーズの近くに見いだされる興味のある生物活性の証拠は、ビーズの同定および単離、ならびにペプチドの配列決定および他の特徴付けを可能とする。部分開裂後、ビーズ上には配列決定および他の特徴付けに十分な量のペプチドが残っているので、ペプチドの同定が可能である。他の態様において、マイクロタイターウエルを用いてビーズを分配し（例えばビーズ１０個／ウエル）、そしてあるパーセントのペプチドを放出させ、生物活性についてアッセイすることができる。これによって起こりうる拡散の問題が消去される。以下に記述するように、連続アッセイのため、ペプチドの異なる画分を異なる開裂可能リンカーを介して固相担体又はビーズに結合することができる。これらの実施例において、「ビーズ」という用語は固相担体をさす。
【００７７】
以下の実施例は生物アッセイがどのように実施されうるかを説明するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【００７８】
（ｉ）単細胞懸濁物の細胞集団を、ランダムペプチドライブラリーを含有する液体培地または半固体マトリックス上に重層させる。１つの態様において、この手順は１ウエルあたり１個またはそれ以上のビーズおよび細胞懸濁物を含有する９６ウエルのマイクロウエル組織培養プレートを用いて実施される。別の態様においては、それぞれの室(chamber)を作り出すため、バリヤー（障壁）マトリックスまたは「クッキーカッター(cookie cutter)」が細胞懸濁物およびライブラリーのビーズに適用される。各ビーズ上のある割合のペプチドは開裂可能リンカーと結合される。配列決定に十分な量のペプチドがまだビーズに結合されて残るが、生物的効果をもたらすのに十分なペプチドが放出されうる。細胞培養物は溶液であってもよいし、それ自体が半固体マトリックスであってもよい。適切なインキュベーション期間の後、例えばコロニーの同定等により、細胞集団の成長又は増殖について検査する。別の態様において、テトラゾリウム塩ＭＴＴ（３-（４，５-ジメチル-チアゾール-２-イル）-２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を添加することができる(Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; NiksおよびOtto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151)。生存可能な細胞のミトコンドリアに見いだされるコハク酸デヒドロゲナーゼは、ＭＴＴをホルマザンブルーに変換する。したがって、濃縮された青色は代謝的に活性な細胞を示すものであろう。さらに別な態様においては、放射性標識の組み込み (例えばトリチウムを導入したチミジン等)をアッセイして細胞の増殖を示すことができる。同様に、35Ｓ-メチオニンを組み込むことによって、タンパク質合成を示すことができる。次に、細胞増殖を刺激または抑制したペプチドを放出するビーズを回収し、配列決定する。そして次に、同定されたペプチド配列を、インジケーター（indicator)細胞型に対して確認的な培養物を用いて溶液中で再試験する。
【００７９】
（ii）上記（ｉ）のさらなる態様において、あるライブラリーのビーズを各ウエルが約１０個のビーズを含有するようにマイクロタイターウエルに分配する。ビーズを液相に懸濁する。配列決定に十分な量のペプチドがビーズ上に残るが、生物的効果をもたらすのに十分なペプチドが各ビーズから放出される。放出されたペプチドを含有する上清はレプリカプレート(replicate plate)に移してもよいし、またはビーズと共にウエルに残してもよい。生物活性（例えば細胞系の成長又は増殖）が確認される。生物活性を有するウエル由来のビーズを配列決定し、そして各配列を調製し、どの配列が生物活性を示したのかを決定するために試験する。
【００８０】
（iii）上記（ii）のさらなる態様において、約１／３のペプチドが第１工程で、約１／３が第２工程で放出され、残りの１／３がビーズ上に残るように、ペプチドをビーズに結合させる。連続放出は２つの異なる開裂可能リンカーの使用によって、または各工程でペプチドの一部のみを放出するように開裂剤を制限することによって、もたらしうる。後者のためには、化学的または酵素的開裂剤への注意深く時間を計った暴露によっても部分開裂が達成可能であるが、光学開裂性リンカーの制御された照射が好ましい。連続的に開裂可能なペプチドのライブラリーを調製し、各ウエルが約５０以上、好ましくは約５０〜約１０００個のビーズを含有するようにマイクロタイタープレートのウエルに分配する。約１／３のペプチドを開裂するようにビーズを処理する。反復アッセイにより生物活性について上清をアッセイする。次に、生物活性を示すウエル由来のビーズを懸濁し、各ウエルが約１〜１０個のビーズを含有するようにマイクロタイタープレートのウエルに分配する。約１／３のペプチドを放出するようにビーズを処理し、上清を生物活性についてアッセイする。生物活性を示すウエル由来のビーズを単離し、結合しているペプチドを配列決定する。１個以上のビーズが見いだされた場合は、同定された配列のすべてを調製し、生物活性についてそれぞれ試験する。この２工程連続生物アッセイは、ペプチドの非常に大きいライブラリーを特異的生物活性についてスクリーニングするための効率的で強力な方法を提供する。
【００８１】
（iv）半固体マトリックス（例えばアガロースゲル）に固定化された単細胞懸濁物を加えることによって、サイトカイン放出の刺激をアッセイすることができる。本発明のペプチドがサイトカイン（例えばリンホカイン、増殖因子、ホルモン、等）を放出する場合は、インジケーター細胞系の活性により、サイトカインの存在を検出することができる。インジケーター細胞系を用いた特異的アッセイは、上記(i)に記述したように行なうことができる。別の態様においては、刺激された細胞によって放出されたサイトカインをニトロセルロース等の膜上にブロットし、そしてサイトカインをイムノアッセイまたは受容体結合アッセイにより検出することができる。
【００８２】
（ｖ）別の態様において、ペプチドの毒性を観察することができる。ペプチドライブラリーに重層させた、例えば、形質転換された細胞系または癌細胞系の非増殖ゾーンまたはプラークは細胞毒性活性を示すであろう。ある特定の様相において、半固体マトリックス中の２つの細胞集団の一方を他方の上に重層させることができる。このようにして、標的細胞に特異的であるがそれ以外の細胞(bystander cell)に対しては毒性でない細胞毒性ペプチドが同定できるであろう。このようなアッセイにより、化学治療剤として使用されるペプチドを迅速に同定することができるであろう。
【００８３】
（vi）生理的な変化もまたアッセイすることができる。ある態様において、心筋細胞懸濁物をライブラリーの上に重層させる。ペプチドによって刺激された細胞の「収縮(beating)」を観察することができる。別の態様では、適切な基質〔上記(i)のＭＴＴ等の色原体、発蛍光団、または化学発光物質、等〕が得られるならば、特定の酵素活性の増大を検出することによって、特定酵素のアップレギュレーションをアッセイすることができる。または、酵素のアップレギュレーションを免疫学的アッセイによって検出することができる。さらに別の態様において、組織学的技法はライブラリーのペプチドによってもたらされた生理的または形態的変化を示すことができる。
【００８４】
（vii）本発明は、分極化細胞( 例えば、基底外側の面および管腔面を有する細胞）に関してライブラリー中のペプチドの活性をアッセイする方法を提供する。分極細胞培養物は、管腔に一致する半透膜を用いて調製することができる。ライブラリーを半固体マトリックス中の管腔面または基底外側面に加える。本発明のペプチドの種々の効果、例えば分極輸送、増殖、細胞内コミュニケーション、等がアッセイできる。特に、ペプチドを放射性標識または発蛍光団等を用いて標識することにより、輸送可能(transportable)なペプチドを同定することができる。当分野の技術において、特異的に吸収可能な分子が長年必要とされてきた。特に、そのような分子は上皮の管腔表面から基底外側表面への輸送が望まれる、医薬品の経口または経鼻投与において有用であろう。
【００８５】
当業者はさらに、組織培養において短期間であれ長期間であれ維持しうる任意の細胞を、生物アッセイに使用できることを理解するであろう。ここに用いる「細胞」という用語は、原核細胞(例えば細菌) および真核細胞である酵母、カビ、および真菌を含むことが意図される。培養で維持された一次細胞または系が使用できる。さらに、出願人らはウイルスを用いて細胞を感染または形質転換させることにより、ウイルスに関する生物アッセイが達成できると考える。非制限的な例として、トランスフェクトされた大腸菌のコロニー（これは感染すると透明なプラークを形成しない）を同定することにより、λバクテリオファージの溶原活性を抑制するペプチドの能力をアッセイすることができる。
【００８６】
複数のペプチドのランダムライブラリーのあるペプチド、または単一ペプチドの活性をアッセイするための本発明の方法は上記の例に限定されない。出願人らは、任意のアッセイ系が、ここに開示する本発明を取り入れるために変更しうると考える。出願人らは、それらは本発明の範囲内にあると考える。
５．５．開裂可能リンカーの医薬的使用
エステル結合リンケージに基づく選択的開裂可能リンカーは、薬剤を in vivoで放出するために使用できる。ある態様において、放出される薬剤はペプチドである。しかし、エステル結合を介してリンカーに結合可能な任意の医薬的に活性な物質は、in vivo 放出のためリンカーに結合させることができる。さらに、本発明は本発明のジケトピペラジンリンカーの放出速度を制御することを提供するので、本発明は興味のある分子の所望の放出速度によって、放出速度を変化させることを可能とする。
【００８７】
さらに、本発明は放出される実体の遊離アルコール形態の放出を提供し、かつジケトピペラジンを固相担体( これは例えば経口投与後に排泄される) 上に保持するので、本発明は薬剤に結合したジケトピペラジン部分によって損なわれていない適切な薬剤を放出する。
【００８８】
以下の実施例に言及しながら本発明をさらに説明する。これらは例証のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００８９】
【実施例】
６．実施例：固体担体からペプチド二段階放出させるためのイミノジ酢酸系リンカー
ペプチドの限定された部分の溶液中への二段階の独立放出を可能とするリンカーを含有する開裂可能なイミノジ酢酸（IDA）を経て高分子担体上でペプチドを合成した。ペプチドはリンカーにFmoc-Gly-プロパノールアミド（PAOH）のエステル結合を介して結合した。このエステル結合は二つの独特の機構、すなわち（1）DKP形成をもたらす内部求核物の求核攻撃により、および（2）アルカリ加水分解により開裂可能であった。両リンカーから放出したペプチドは同一のカルボキシ末端（ヒドロキシプロピルアミド、本実施例では、-PAOH）を含有した。最も適当なリンカーはIDA-IDAジペプチドモチーフを含有し、ペプチドがカルボキシ末端IDA 上で合成されているか、または各IDAが１ペプチドを含んだ。
【００９０】
モデルペプチドであるLeuエンケファリンの合成と放出を説明する。この実例のIDAリンカーは二段階放出を提供し、溶液中の所与の受容体との相互作用のためにペプチドを選抜することができるので、特に数百万のペプチドからなる「ペプチドライブラリー」の試験に有用である。
【００９１】
通常のペプチドはここに示されるスキームと式でＮ末端からＣ末端への方向で記載し、矢印（<-）は逆（Ｃ末端からＮ末端への）方向を示す。
【００９２】
６．１．材料と方法
アミノ酸誘導体はケンタッキー州のAdvanced ChemTechから購入し、精製せずに用いた。DCC、DIEAは、Aldrich（ミルウォーキー州）から入手した；  HOBTおよびBOPはPropeptide（フランス、SNPEバート・レ・ペチット）から入手した。TLCは、前もって被覆されたシリカゲルＧプレートWhatman（英国、ケント）シリカゲルUV254を用いて上記の溶媒系により実施した。融点はKoflerブロックを用いて決定し、その補正は行なわなかった。1H NMRスペクトルはGeneral Electric QE 300 Instrumentを用いて記録した。全てのスペクトルは溶媒としてCDCl3またはCD3SOCD3のいずれかを用いて、テトラメチルシラン（δ）に対するppmで報告する。UV/VIS吸収スペクトルはHewlett-Packard HP8452A Diode-Array分光光度計で1 cmの石英キュベットを用いて記録した。分析用HPLCはVydac（0.46 x 250 mm, 5μm,流速 1 ml/min）C18カラムを用い、分離用HPLCはVydac（10 x 250 mm, 10 μm,流速 3 ml/min）C18カラムを用いて、モジュラーSpectra Physicsシステムで実施した。
【００９３】
６．１．１．IDAリンカーの調製
tert.ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸（Boc-IDA）（1）
1 N NaOH（225 ml）およびジオキサン（200 ml）中のイミノジ酢酸30.0 g（225 mmol）の溶液を撹拌し、氷-水浴中で冷却した。ジ-tert-ブチルピロカルボネート（53.9 g, 247 mmol）を幾つかに分けて添加し、撹拌を室温で１時間続けた。ジオキサンを減圧下に蒸発させ、酢酸エチル層（100 ml）で覆い、飽和KHSO4溶液を用いてpH 2〜3まで酸性にした。水性相は酢酸エチル（3 x 150 ml）で抽出した。酢酸エチル抽出物を一緒にして、水（100ml）で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下に蒸発した。生成物を酢酸エチルと石油エーテルの溶媒混合物から結晶化した。収量 47.0 g（90 %）。
【００９４】
tert.ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸無水物（2）
ジクロロメタン（280 ml）とDMF（5 ml）の混合物中のBoc-IDA（10.0 g, 43 mmol）の溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（9.76 g, 47.3 mmol）を加えた。２時間の撹拌後、ジシクロヘキシルウレアを４℃（冷蔵庫中）で結晶化した。副生成物は濾別し、減圧下の濃縮後に残留ジシクロへキシルウレアの結晶化を繰り返した。濾液を蒸発乾固し、酢酸エチルと石油エーテルの溶媒混合物から結晶化した。収量 5.7 g（62 %）; 1H-NMR(300 MHz,DMSO-d6, 25℃) δ: 1.42(s, 9H, BOC), 4.38(s, 4H, CH2)。
【００９５】
Boc-N(CH2COOH)-CH2-CO-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（3）
DMF（3 ml）中のtert-ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸無水物（0.62 g, 2.8 mmol）の溶液にDMF（10 ml）中のPro-O(CH2)3NH<-Gly<-Fmoc（0.76 g, 1.7 mmol）を加えた。このアミノ成分は対応するトリフルオロアセテートから以下の通り調製した。TFA、Pro-O(CH2)3NH<-Gly<-Fmocを酢酸エチルに溶解し、1 Mの水性塩酸中に抽出した。次にこの水性相を飽和Na2CO3溶液を加えてpH 9に調節し、すぐにクロロホルムで５℃にて抽出した。MgSO4上で乾燥後、溶媒を蒸発乾固した。反応混合物を６時間撹拌し、次に蒸発乾固した。残留物をメタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加えて析出させて、残存するBoc-IDA無水物を除去した。得られた粗製生成物は酢酸エチルと石油エーテルの溶媒混合物から結晶化した。収量 0.63 g（57 %）。
0003672558.tif 000004
【００９６】
Boc-N(CH2-COOH)-CH2COO(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（4）
Boc-IDA（4.66 g, 20 mmol）を50 mlのDCM:DMF（10:1）混合物に溶解し、DIC（3.14 ml, 20 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌し、Fmoc-Gly-OPA（7.08 g, 20 mmol）とジメチルアミノピリジン（0.48 g, 2 mmol）の溶液を加え、反応混合物を一晩撹拌した。DMFとDCMを減圧下に蒸発させ、油状残留物を100 mlのAcOEtに溶解し、水、5%水性HCl、水そして飽和NaHCO3溶液で３回抽出した。NaHCO3抽出物を一緒にして、水性HClで酸性とし、生成物を３回AcOEt中に抽出させ、AcOEt抽出物を一緒にして飽和NaCl溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、AcOEtを減圧下に乾燥した。収量 6.2 g（55 %）、TLCの単一スポット、Rf 0.37。NMRは予想されたシグナルを示した。
【００９７】
HN(CH2-CO-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)2, HCl （5）
30 ml DMF中のFmoc-Gly-PAOH（7.08 g, 20 mmol）溶液をBoc-IDA（2.33 g, 10 mmol）の溶液に加え、HOBt（2.7 g, 20 mmol）、および30 ml DMF中のDIC（3.14 ml, 20 mmol）およびジメチルアミノピリジン（0.48 g, 4 mmol）を加え、反応混合物を室温で５時間撹拌した。DMFを減圧下に蒸発させ、油状残留物を100 mlのAcOEtに溶解し、濾過し、水、5%水性HCl、水、飽和NaHCO3溶液、水および飽和NaCl水溶液で３回抽出した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、AcOEtを減圧下に蒸発した。収量 7.2 g（80 %）の脆い気泡体、Rf 0.55（Rf 0.37と0.62の二種類の不純物を含有）。生成物を30 ml DCMに溶解し、30 mlのTFAを加え、反応混合物を 30分間室温に保った。DCMとTFAを減圧下に蒸発させ、油状残留物をAcOEtに溶解し、水および飽和NaHCO3溶液で３回洗浄した。Na2CO3溶液による抽出後、３層が形成された。生成物を含む一番下の層を分離し、5 % HClとともに振盪することで酸性とし、クロロホルムに溶解し、無水MgSO4を用いて乾燥し、濃縮して小量とし、これを大過剰のエーテル中に注いだ。析出物を集め、エーテルで洗浄し、乾燥した。収量 5.4 g（64 %）の脆い気泡体、TLC 上に単一スポット、Rf 0.28 (CHCl3:MeOH:AcOH（90:9:1）);
0003672558.tif 000005
0003672558.tif 000006
【００９８】
Boc-N(CH2-COOH)-CH2-CON(CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)2 (6)
Boc-IDA（2.33 g, 10 mmol）を50 molのDCM:DMF（10:1）に溶解し、DIC（1.57 ml, 10 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌した。次に50 ml DMF中のHN(CH2-CO-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc) 2.HCl（5）（8.4 g, 10 mmol）の溶液を加え、pHをDIEAにより約８とし、反応混合物を室温で１時間撹拌した。DMFとDCMを減圧下に蒸発させ、油状残留物を100 mlのAcOEtに溶解し、水、5%水性HCl、水および飽和NaHCO3溶液で３回抽出した。NaHCO3抽出物を一緒にし、水性HClで酸性にした。生成物をAcOEt中に３回抽出し、無水MgSO4を用いて乾燥し、AcOEtを減圧下に蒸発させた。油状残留物をエーテル中ですり砕き、生成物を結晶化した。収量6.8 g(67 %); TLC上の単一スポット、Rf 0.28 (CHCl3:MeOH:AcOH (90:9:1));
0003672558.tif 000007
【００９９】
６．１．２．固相合成の通常のプロトコール
テンタゲル（置換0.23ミリ当量NH2/g）を以下の通常のプロトコールを用いる固相合成に供した。
0003672558.tif 000008
Fmocの放出は、ピペリジン溶液および一緒にした洗浄物の吸光度（302 nm）を測定することで定量した。
【０１００】
Boc-IDA(Fmoc-Trp-Gly-PAO<-Pro)-TG （7）
テンタゲル（0.2 g,置換0.23ミリ当量NH2/g）をDCM、DMF中で前膨潤させた（ポリプロピレンフリットを備えた5 mlのプラスチックシリンジ）。DMF（2 ml）、BOP（0.066 g, 0.15 mmol）、HOBT（0.025 g, 0.15 mmol）およびDIEA（0.026 ml, 0.15 mmol ）中のリンカーBoc-IDA(Fmoc-Gly-PAO<-Pro)OH（0.1 g, 0.15 mmol）を通常のプロトコールにしたがってテンタゲルに結合させた。Fmocの脱保護後、BOP（0.061 g, 0.138 mmol）、HOBT（0.019 g, 0.138 mmol）およびDIEA（0.024 ml, 0.138 mmol）により活性化したDMF（2 ml）中のFmoc-Trp（0.059 g, 0.138 mmol）をグリシンカルボキシレートに結合させた。
【０１０１】
Boc-Gly-IDA(Fmoc-Trp-Gly<-PAO)-TG （8）
BOP（0.015 g, 0.035 mmol）、HOBT（0.05 g, 0.035 mmol）およびDIEA（0.006 ml, 0.035 mmol）により活性化したDMF（1 ml）中のBoc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH（0.019 g, 0.035 mmol）をテンタゲル（0.05 g, 置換0.23ミリ当量NH2/g）に既に（7）について記載した方法により結合させた。Boc基除去、およびDMF（1ml）中でBOP（0.015 g, 0.035 mmol）、HOBT（0.005 g, 0.035 mmol）およびDIEA（0.006 ml, 0.035 mmol）により活性化したBoc-Gly（0.006 g, 0.035 mmol）の接続後、Fmoc基を除去し、そしてBOP（0.015 g, 0.035 mmol）、HOBT（0.005 g, 0.0335 mmol）およびDIEA（0.006 ml, 0.035 mmol）により活性化したDMF（1 ml）中のFmoc-Trp（0.015 g, 0.035 mmol）をBoc-Gly-IDA-(H-Gly-PAO)-TGに結合させた。
【０１０２】
異なるペプチドを開裂可能な各アームに有する二重開裂可能なリンカー樹脂構築物Ｉ（9）の合成
【０１０３】
【化３】
0003672558.tif 000009
BOP（0.021 g, 0.045 mmol）、HOBT（0.006 g, 0.045 mmol）およびDIEA（0.009 ml, 0.045 mmol）により活性化したBoc-Lys（Fmoc）（0.023 g, 0.045 mmol）をテンタゲル（20 mg,置換0.23ミリ当量NH2/g）に結合させた。Boc基を除去後、Boc-Lys(Fmoc)と同じように活性化したBoc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH（4）（0.025 g, 0.045 mmol）をLys (Fmoc)-TGに結合させた。Fmoc基を除去することで、BOP（0.040 g, 0.090 mmol）、HOBT（0.012 g, 0.090 mmol）およびDIEA（0.016 ml, 0.090 mmol）の存在下にFmoc-Val（0.031 g, 0.090 mmol）のカップリングができた。イミノジ酢酸のBoc基を除去し、通常のプロトコールに記載されたように中和した後、Boc-Lys(Fmoc)と同様に活性化したBoc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OH（3）（0.030 g, 0.45 mmol）を結合させた。最終的なFmoc脱保護後にFmoc-Trp（0.019 g, 0.045 mmol）（上記に記載のBOP活性化）のカップリングを行なった。
【０１０４】
異なるペプチドを開裂可能な各アームに有する二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物II（10）の合成
【０１０５】
【化４】
0003672558.tif 000010
第２アームのカップリングでBoc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OHの代りにBoc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH（4）（0.023 g, 0.042 mmol ）、BOP（0.019 g, 0.042 mmol）、HOBT（0.006 g, 0.042 mmol）およびDIEA（0.007 ml, 0.042 mmol）を用いた以外はリンカーＩについて記載したプロトコールを用いてテンタゲル（0.060 g,置換0.23ミリ当量NH2/g）を固相合成に供した。この後にBoc脱保護、次にBoc-Trpカップリングを行なった。
【０１０６】
Boc-N[CH2-CON(CH2-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc]-CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（11）
BOP（0.44 g, 1 mmol）、HOBT（0.135 g, 1 mmol）およびDIEA（0.175 ml, 1 mmol）を用いて、Boc-N(CH2-COOH)-CH2-COO-(CH2)3 -NH<-Gly<-Fmoc（4）（0.57 g, 1 mmol）をLys (Fmoc)-TG（2 g, 0.2 mmol NH2/g）に結合させた（通常のプロトコールによるペプチド樹脂（9）を参照されたい）。Boc基を脱保護し、第２アーム（再度化合物（4））を同じ方法により結合させた。
【０１０７】
Boc-N(CH2-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH2-CON(CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)2（12）
Boc-N(CH2-COOH)-CH2-CON(CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)2（6）（1.2 g, 1 mmol）を、BOP（0.44 g, 1 mmol）、HOBt（0.135 g, 1 mmol）およびDIEA（0.175 ml, 1 mmol）の存在下にLys(Fmoc)-TG（2 g, 0.2 mmol NH2/g）に結合させた（通常のプロトコールによるペプチド樹脂化合物（9）のプロトコールを参照されたい）。
【０１０８】
Boc-N(CH2-CO-TG)-CH2-CON(CH2-COO-(CH2)3-NH<-Gly<-CO-(CH2)3-CO-NH-(CH2)3-O<-Gly<-Trp<-Fmoc)2 （13）
リンカーは以下のように作った。Boc-N(CH2-COOH)-CH2-CON(CH2-COO-(CH2) 3-NH<-Gly<-Fmoc) 2（リンカー6）をTGに結合させ、Fmoc基を除去し、その樹脂をDMF(５モル過剰量）中で２時間無水コハク酸と反応させた。該樹脂をDMFで５回洗浄した後、樹脂上のカルボキシル基をHBTU/DIEAにより活性化し、３モル過剰量のHOPAを加えた。その反応を一晩進行させ、樹脂をDMFで５回洗浄し、カップリングを同じ条件下で繰り返し、樹脂をDMFで５回洗浄した。
【０１０９】
モデル化合物は以下のように作った。Fmoc-GlyをDIC/HOBTにより前活性化し、リンカーを有する前記樹脂に５モル過剰量で加え、DMAPを触媒としてエステル化した。一晩の反応後、樹脂をDMFで５回洗浄し、Fmoc基を除去し、DIC/HOBTにより活性化したFmoc-Trpを３モル過剰量で結合させた。樹脂をDMFで５回洗浄し、Fmoc基を切断し、樹脂をDMFとDCMで洗浄し、リンカーからBoc基を混合物Ｋにより切断した。樹脂をTFA、DCM、MeOHで洗浄し、乾燥した。
【０１１０】
リンカーＶからのコントロール放出：  第１の放出の操作はリンカーIVからのコントロール放出で記載した操作と基本的に同じであった（下記の第6.2節を参照されたい）。第１の放出したTrp-Gly-O-(CH2)3-NH-CO-(CH2)3CO-NH-(CH2) 3-OHからの生成物の構造はMSにより確認された。次にこの溶液を2N NaOHでアルカリ性とし、30分後にpHを1N HClで約５にし、生成物Trp-Gly-OHの構造を再びMSにより確認した。第２の放出を上記と同じ方法で行い、生成物を定量し、その構造をMSにより確認した。
【０１１１】
６．１．３  二重開裂可能なLEUエンケファリンの合成
Leuエンケファリンペプチド(YGGFL)を標準的なFmoc tBuプロトコールを用いて二重開裂可能なリンカーIVのアーム上に合成した。
【０１１２】
６．１．４  Trp-Gly-PAOHコントロール放出
Fmoc基を二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物から通常のプロトコールにしたがって除去し、BOP化学により活性化したFmoc-Trpを全ての３アームに結合させた。DMFによる洗浄後、Fmoc基とBoc基を通常のプロトコールにしたがって順に外した。脱保護ペプチド-樹脂をDCM（10回）、MeOH（5回）で洗浄し、一晩乾燥／凍結乾燥した。乾燥ペプチド-樹脂（約5 mg）を重炭酸緩衝液（pH 8.3）で３時間処理した。Trp-Gly-PAOHの放出はTrpの吸光度（280nm）の測定により定量した。樹脂を水で完全に洗浄し、0.5% NaOHとともに２時間インキュベートした。溶液中の脱離したTrp-Gly-PAOHの吸光度を280 nmで読み取った。
【０１１３】
６．１．５．ペプチド脱離の動力学
ペプチド-樹脂（5 mg）を、走査型UV光度計（Hewlett-Packard, HP 1050 HPUV）のキュベット中でpH 8.3の撹拌緩衝溶液（100mM重炭酸緩衝液）に加えた。４秒の間隔を用いて、200〜500 nmのUVスペクトルの多数の走査を得て、Trp-Gly-PAOH脱離の動力学を追った。
【０１１４】
６．２．結果
tert-ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸（Boc-IDA）から始めて、Boc-IDA-Pro-OPA<-Gly<-Fmocを、Pro-OPA<-Gly<-Fmocの求核攻撃によるBoc-IDA無水物の開環により調製した。Boc-IDA-OPA<-Gly<-Fmocは、HOPA<-Gly<-Fmocの求核攻撃によるBoc-IDA無水物の開環により調製した。この反応をスキーム１に示す。
【０１１５】
モデルペプチド-樹脂構築物（7）を組み立て、脱保護後にモデルジペプチドを放出させ、動力学を追った。ペプチドTrp-Gly-PAOH脱離の反応動力学を図１に示す。
【０１１６】
二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物Ｉを以下に示す。
【０１１７】
【化５】
0003672558.tif 000011
【０１１８】
二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物Ｉ
【０１１９】
【化６】
0003672558.tif 000012
このリンカーは二つの異なるアームを用いて作り、これらのアームは、それらの上に合成された異なるモデルペプチドを有することによって異なるものである。pH 8.3での放出の反応動力学を図２に示す。第１の放出はpH 8.5で起こり（図2A）、第２の放出はpH 13.2で起こる（図2B）。
【０１２０】
【化７】
0003672558.tif 000013
a: 50%ピペリジン/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: 緩衝液 pH 8.5
放出がヘキサヒドロピロロ（1,2-a）ピラジン-1,4-ジオン（HHPPD）の発生を伴う反応機構を上記スキーム２に示す。放出したペプチドのHPLC分析により、上記機構に加えて、予期されないことであったが複素環形成の第２の機構が存在することが明らかとなった。環状IDA-IDAジケトピペラジンの形成は環状HHPPD形成よりも速いことが示された。従って、（複素環形成による）第１の放出中、アルカリ加水分解によって放出すると予想されたIDAアームからのペプチドはアルカリ加水分解の代わりにpH 8.3で放出した。プロリンアームからのペプチドはpH 13.2で放出することが可能であった。
【０１２１】
Ｉによる結果から、第２のIDA系リンカーIIを設計し、合成した。このリンカーは以下の通りである。
【０１２２】
二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物II（8）
【０１２３】
【化８】
0003672558.tif 000014
このリンカーの利点は、各枝は構造が同じでありながら、それぞれが独特の機構によりペプチドを脱離することにある。この反応機構をスキーム３に示す。
【０１２４】
【化９】
0003672558.tif 000015
a: 50%ピペリジン/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: 緩衝液 pH 8.5
リンカー構造をBoc-Glyを省くことによりさらに単純化すると、以下に示すもう１つの二重開裂可能なリンカー（III）が導かれる。
二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物III
【０１２５】
【化１０】
0003672558.tif 000016
この構造的スキームを変更すると、以下に示されるさらに別の二重開裂可能なリンカー（IV）の設計が得られる。
【０１２６】
二重開裂可能なリンカー-樹脂構築物IV
【０１２７】
【化１１】
0003672558.tif 000017
【０１２８】
表１に多様なリンカーからのペプチドの放出を要約する。
【表１】
0003672558.tif 000018
【０１２９】
Boc-IDA(H-Trp-Gly-PAO)-TG（6 mg）をDMF中の20 %ピペリジンで処理して、この弱塩基の存在下におけるその安定性を試験した。Fmoc-Trp-Gly-PAOHの放出はピペリジン放出溶液の吸光度（302 nm）を測定することで定量した。エステル結合の安定性を表２に示す。
【０１３０】
【表２】
時間                  放出ペプチド（％）
０．５                  ０．２６
１                      ０．６５
３                      １．０１
５                      １．１０
３６                    ３．７
Leuエンケファリンは二重開裂可能なリンク構築物IVから二段階で放出された。pH 8.3での第１の放出により樹脂１グラムあたり65 mmolのペプチドが生じた。pH 13.2での第２の放出により62 mmol/gのペプチドが生じた。分析用HPLCは両方の放出ペプチドに関して同じピークを示した。両方の放出ペプチドの純度は98
%を超えるものであった。
【０１３１】
６．３．考察： IDA-IDAモチーフに基づくリンカー
ジペプチドモチーフIDA-IDAは二重開裂可能なリンカーを設計するために特に適することがわかった。IDA-IDAジペプチドは３カルボキシル基（アミノ末端IDA上の１つの基とカルボキシル末端上の２つの基）を与えるので、該ジペプチドはDKPを形成する傾向がある。二重開裂可能なリンカーを構築するには２カルボキシル基が誘導化とその後のペプチド構築のために必要である。二つのFmoc-Gly-PAOHをカルボキシル基に結合させるには二つの可能な方法がある。二つのFmoc-Gly-PAOHがカルボキシ末端IDAの両カルボキシルに結合させるか（リンカーIV）、または各IDAが一つのFmoc-Gly-PAを有する（リンカーIII）。どの場合でも、リンカーを固体担体に［例えば、エドマン分解による配列決定のために用いることのできる非放出性ペプチドの第３のコピーの合成のために余分な１アミノ基を提供するLysを介して］接続させるのに役立つ一つのフリーのカルボキシル基がある。
【０１３２】
全リンカーIVは溶液中で合成される。Boc-IDAの両カルボキシル基はDICとHOBtにより活性化され、触媒のジメチルアミノピリジンの存在下にFmoc-Gly-PAと反応させた。TFAによりBoc保護基を除去した後、フリーの塩基を用いてBoc-IDAの前形成環状無水物を開環した。この場合、両方のFmoc-Gly-PAは化学的に区別できず、第１ペプチドは、環化および２アームのいずれかのアームからのDKP形成を経て切断される。形成されたDKPは一つの窒素上にペプチドの第２コピーを有する。
【０１３３】
リンカーIIIは二つの同じ構成ブロックからなるものとみなすことができる。Boc-IDA無水物を調製し、Fmoc-Gly-PAにより開環して、一置換Boc-IDAを得た。固体担体に対するこの生成物のカップリング、Boc基の除去および同じBoc-IDA誘導体の繰り返しのカップリングの結果、所望のリンカーIIIを合成した。これらの二つの同じ構成ブロックを一緒にして組み立てると、それらのエステルの完全に異なる反応性が得られる。Boc保護基の除去とpHの調整後、IDA-IDAジペプチドはDKPをほとんど瞬時に形成し、環化反応で反応したアームからペプチドを放出する。このペプチドからの放出の反応速度論はpH 4.0（図4A）、pH 6.5（図4B）、pH 8.3（図4C）において測定した。二段階放出（pH 8.5、次にpH 13.2）を図4Dに示す。第２アームはアルカリ加水分解により放出されるペプチドを保持していた。
【０１３４】
この種類のリンカーも二段階放出の各々で異なるペプチドを放出する可能性を提供する。リンカーの各アームのペプチド鎖延長部分を別々に脱保護することにより、異なるペプチドの合成を行なうことができる。第１アームのカップリング後、Fmoc基を除去し、第１段階で放出を意図するペプチド（DKP形成）を合成する（そのアミノ末端はBoc保護の手法により保護されている）。しかし、IDAのイミノ基は、さらに第１ペプチドの側鎖保護に影響を与えずに円滑な開裂を可能とする、酸に対してさらに不安定な基（DdzまたはBpoc等）よって保護する必要がある。IDAからDdz/Bpoc基を除去した後、第２アームを結合し、Fmoc基を除去し、第２ペプチドをGlyのフリーのアミノ基上で組み立てる。
【０１３５】
７．実施例：メチオニンを含有するリンカー
γ-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)メチオニルグルタミン酸-TG （14）
メチオニンを含有するリンカーの構造を以下に示す。
【０１３６】
【化１２】
0003672558.tif 000019
テンタゲル上でのリンカーの組み立て：
Fmoc-Glu（OtBu）をDIC/HOBtにより活性化し、TG（樹脂１グラムあたり0.2 mmolのアミノ基）に３モル過剰量で結合させた。Fmoc基を切断し、樹脂をDMFで５回洗浄し、Fmoc-Metを結合させた。TFAにさらすことでtBuを除去した。樹脂をDMFで５回洗浄した後、樹脂上のカルボキシ基をHBTU/DIEAにより活性化し、３モル過剰量のHOPAを加えた。その後、Fmoc基を除去し、DIC/HOBT活性化とDMAPによる触媒反応によりFmoc-β-Alaを樹脂上のアミノ基とヒドロキシ基の両方に一晩結合させ、対称の無水物を介して再度結合させた。樹脂をDMFで洗浄した後、Fmoc基を除去し、脱保護後の溶液の吸光度を測定してFmoc放出を定量した。0.38 mmol/gのFmoc放出は、β-Alaのほとんど定量的なカップリングを示した。
【０１３７】
このリンカーは前記のようにペンタぺプチドの固相合成に用いた。生成物は両アームから切断し、その純度を分析用HPLCで決定し、その構造はMSにより確認した。
【０１３８】
８．実施例：エステル結合を有するさらに開裂性のあるリンカー
機器
融点はKoflerブロックを用いて決定し、その補正は行なわなかった。1H NMRスペクトルはGeneral Electric QE 300 Instrumentを用いて記録した。全てのスペクトルは溶媒としてCDCl3またはCD3SOCD3のいずれかを用いて、テトラメチルシラン（δ）に対するppmで報告する。UV/VIS吸収スペクトルはHewlett-Packard HP8452A Diode-Array分光光度計により1 cmの石英キュベットを用いて記録した。アミノ酸分析はD-500（米国Durrum社）システムを用いて行なった。分析用HPLCはVydac（0.46 x 250 mm, 5μm,流速 1 ml/min）C18カラムを用い、分取HPLCはVydac（10x 250 mm, 10μm,流速 3 ml/min）C18カラムを用いて、モジュラーSpectra Physicsシステムで実施した。
【０１３９】
一般的方法
フラッシュクロマトグラフィーはMerckシリカゲル60（40〜63μm）を用いて行なった。薄層クロマトグラフィーはSilufol UV 254（チェコスロバキア、カバリア）またはMerck DC-Alufolien Kieselgel 60を用いて行なった。分取薄層クロマトグラフィーはWhatman Silica gel 60Aプレート（1 mm厚）を用いて行なった。スポットは蛍光消光によるか、または希釈エタノール性ニンヒドリン溶液の噴霧により検出した。反応溶液はロータリーエバポレーター（2.0〜2.6 kPaで）を用いて濃縮した。
【０１４０】
材料
他に示さない限り、市販の品質の溶媒をさらに精製することなく用いた。テンタゲル（TG）樹脂（0.21 mmol/g）はRapp-Polymere（Tubingen）から入手した。保護アミノ酸はBachem（Torrance, California）、Advanced ChemTech（Louisville, Kentucky）またはPropeptide（Vert-le-Petit, France ）から得た。
【０１４１】
Ddz-Gly-NH-(CH2)3-OH （15）
DMF（120 ml）中のDdz-Gly（そのシクロヘキシルアンモニウム塩（15 g, 37.8 mmol）を、0.5 N KHSO4およびEtOAcの混合物中に水性層がCongo pH = 3の酸性になるまで溶解し、そして抽出することにより放出させたもの）の溶液にDIC（6.49 ml, 41.6 mmol）、HOBt（5.11 g, 37.8 mmol）および1-アミノ-3-プロパノール（2.89 ml, 37.8 mmol）を加えた。室温で一晩の撹拌後、反応混合物を蒸発乾固した。残留物をEtOAcに溶解し、0.5 N KHSO4により０℃で抽出し、次に飽和NaHCO3水溶液と食塩水により抽出し、MgSO4を用いて乾燥し、蒸発させた。生成物をEtOACに溶解し、石油エーテルにより析出させた。収量： 9.8 g（73 %）、TLC上で均一： Rf = 0.34（溶媒系1; DCM:MeOH:AcOH 90:4:1）。
0003672558.tif 000020
【０１４２】
Z-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Ddz （16）
DCM（50 ml）中のZ-Pro（1.13 g, 4.5 mmol）溶液にDIC（0.77 ml, 4.94 mmol）、DMAP（0.092 g, 0.75 mmol）およびDdz-Gly-NH-(CH2)3-OH（1.59 g, 4.6 mmol）を加えた。一晩の撹拌後、溶液を化合物15と同じように処理した。収量： 2.42g（92 %）、TLC上で均一（溶媒系1）。
【０１４３】
Boc-Glu(OBz1)-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Ddz （17）
化合物2（15.1 g, 25.8 mmol）をDMF（150 ml）に溶解し、無水Na2CO3（0.05 g）を加え、該化合物を5 % Pd/C触媒（2.8 g）を用いて常圧で激しい撹拌をしながら６時間（TLCでモニターしつつ）水素化した。溶液を一枚のCeliteで濾過した。すぐに濾液を、in situで調製した活性エステルBoc-Glu(OBzl)OBt［DMF（40 ml）中のBoc-Glu(OBzl)-OH（8.7 g, 25.8 mmol）、HOBt（3.49g, 25.8 mmol）、DIC（4.43 ml, 28.4 mmol）］とのカップリングに用いた。反応混合物を一晩撹拌し、次に化合物15と同じように処理した。生成物をEtOAc-PE（酢酸エチル-石油エーテル）の溶媒混合物から析出させて、16 g（80 %）の表題化合物を得た。Rf = 0.81（溶媒系1）。
【０１４４】
Boc-Glu-Pro-O-(CH2)3-NH<Gly<-Ddz （18）
化合物3（16 g, 20.8 mmol）をDMF（210 ml）に溶解し、5 % Pd/C触媒を用いて水素化し、化合物17と同じ方法で処理した。DMF蒸発後の残留物をEtOAc-PEの混合物中で析出させた。収量： 13.3 g（94 %）; Rf = 0.37。
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【０１４５】
Fmoc-Gly-NH-(CH2)3-OH （19）
DMF（900 ml）中のFmoc-Gly（59.4 g, 200 mmol）の溶液にDIC（31.2 ml, 200 mmol）およびHOBt（27.0 g, 200 mmol）を加えた。30分間撹拌した後、1-アミノ-3-プロパノール（16.1 ml, 210 mmol）を加え、反応混合物を４時間撹拌した。混合物を蒸発乾固し、残留物を沸騰EtOAcに溶解し、一晩結晶化した。再結晶化後、生成物を冷EtOAc、PEにより洗浄した。収量： 62 g（91 %）。
【０１４６】
Fmoc-Glu(OBut)-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（20）
DMF:DCM（1:1, 100 ml）の溶媒混合物中のFmoc-Glu(OBut)-OH（10.6 g, 24.9 mmol）の溶液にDIC（4.28 ml, 27.4 mmol）、Fmoc-Gly-NH-(CH2)3-OH（8.5 g, 24.9 mmol）およびDMAP（0.31 g, 2.49 mmol）を加えた。一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させて、残留物をEtOAcに溶解し、1 M HCl、10 % NaHCO3、食塩水で抽出し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。生成物をEtOAc-PEから結晶化した（17.5 g, 94 %）、Rf = 0.64（溶媒系1）。
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【０１４７】
Fmoc-Glu-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（21）
化合物6（2.0 g, 2.67 mmol）をTFA-H2O（95:5）に溶解し、反応混合物を１時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固した後、これを４回トルエンとともに蒸発させた。粗製生成物をEtOAc-PEから２回結晶化して1.6 g（87 %）の精製生成物を得た。Rf = 0.38（溶媒系1）。
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【０１４８】
Fmoc-Glu(O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)-Obut（22）
DMF:DCM混合物（1:1, 1200 ml）に溶解させたFmoc-Glu-OBut（25.0 g, 58.7 mmol）をDIC（10.1 ml, 64.6 mmol）とDMAP（0.71 g, 5.8 mmol）の存在下にFmoc-Gly-NH-(CH2)3-OH（22.0 g, 64.6 mmol）に一晩結合させ、反応混合物を化合物20について記載した方法で処理した。EtOAc-PEからの結晶化で34.2 g（78 %）の生成物を得た。Rf = 0.70（溶媒系1）。
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【０１４９】
Fmoc-Glu(O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc)-OH（23）
化合物22（33.0 g, 44.1 mmol）のtertブチル保護基を化合物21について記載した方法で切断した。同じ処理により26.3 g（86%）の収量を得た。
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【０１５０】
Boc-Glu(Fmoc-Lys-テンタゲル)-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Ddz（ジケトピペラジン形成により放出可能なリンカー-樹脂構築物）
テンタゲル（0.1 g,置換0.23ミリ当量NH2/g）を以下のプロトコールを用いる固相合成に供した。
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【０１５１】
モデルジペプチド合成とペプチド樹脂構築物からのコントロール放出： Glu(H-Trp-Gly-Lys-テンタゲル)-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Gly<-Trp.2HCl
ジペプチドの合成は以下のプロトコールを用いた。
0003672558.tif 000028
【０１５２】
ペプチド-樹脂（4 mg）を、走査型UV分光計（Hewlett-Packard, HP1050 (HPUV)）のキュベット中でpH 8.5の撹拌緩衝溶液（100 mmolの重炭酸塩緩衝液）に加えた。３秒の間隔を用いて、200〜500 nmのUVスペクトルの多数の走査を得て、フリーのTrp-Gly-Gly-NH-(CH2)3-OHの放出の速度論を追った（図５）。0.17 mmol/g（理論値0.19 mmol/g）の最大放出が得られた。
【０１５３】
Fmoc-Glu(Fmoc-Lys-テンタゲル)-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（加水分解により放出可能なリンカー-樹脂構築物）
二重開裂可能なリンカー（化合物21）の第２アームをFmoc-Lys-TGに上記の固相合成の類似プロトコールを用いて結合させた。モデルジペプチド（Gly-Trp-Glu(Gly-Trp-Lys-テンタゲル)-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Trp<-Gly）も同じプロトコールを用いて合成した。EDCリンカーの第２アームの安定性をチェックするために、このアームの安定性を第１放出の条件下で調べた。ペプチド-樹脂（3 mg）をUV分光光度計のキュベット中でpH 8.5の撹拌緩衝溶液に加え、３秒間の走査により、このエステル結合の安定性を測定した（図６）。ペプチドの大放出は観察されなかった。この試験からpH 8.5での第２アームが安定であることがわかった。
【０１５４】
コントロール放出は、最初の放出について記載した方法で0.3% NaOH溶液を用いて（UV分光計によりその速度論を追いつつ）行なった（図７）。0.18 mmol/g（理論値0.19 mmol/g）の放出が得られた。
【０１５５】
多重開裂可能なリンカー：
【０１５６】
【化１３】
0003672558.tif 000029
【０１５７】
テンタゲル（20.0 g, 置換0.23ミリ当量NH2/g）を以下のプロトコールを用いる固相合成に供した。
0003672558.tif 000030
【０１５８】
第２の多重開裂可能なリンカーフォーマット：
【０１５９】
【化１４】
0003672558.tif 000031
【０１６０】
テンタゲル（20.0 g, 置換0.23ミリ当量NH2/g）を以下のプロトコールを用いる固相合成に供した。
0003672558.tif 000032
【０１６１】
H-Glu(OBzl)-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（24）
Boc-Glu(OBzl)（10 mmol, 3.37 g）を50 mlのDMFに溶解し、HOBt（10 mmol, 1.53 g）と4-ジメチルアミノピリジン（3 mmol, 0.36 g）の存在下にDIC（10 mmol, 1.58 ml）により活性化した。Fmoc-Gly-NH-(CH2)3-OH（10 mmol, 3.54 g）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。DMFを減圧下に蒸発させて、反応混合物をエーテルで抽出し、油状残留物を蒸発させた。TFA（50 ml）を加え、溶液を60分間撹拌し、TFAを蒸発させ、油状残留物をエーテル中ですり砕き、蒸発乾固した。粗生成物をAcOEtに溶解し、3 %水性HClで抽出し（３回）、水性抽出物を一緒にしてAcOEtで洗浄し、飽和NaHCO3溶液で中和した。生成物をAcOEtで３回抽出し、抽出物を無水MgSO4で乾燥し、AcOEtを蒸発させた。収量： 5.5 g（93 %）。シリカゲルプレートによるTLCは１つのUV吸収スポット、Rf 0.40 (CHCl3:MeOH:ACOH (90:9:1))を示した。
【０１６２】
リンカーＩ： Boc-Pro-Glu-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（25）
H-Glu(OBzl)-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（9.3 mmol, 5.5 g）を、10 %のDMSを含有するTFA（50 ml）で一晩処理した。TFAを蒸発させ、反応混合物をPE（３回）およびエーテル（３回）中ですり砕き、蒸発乾固した。Boc-Pro（3.3 mmol, 0.71 g）をDMF（20 ml）に溶解し、HOBt（3.3 mmol, 0.49 g）の存在下にDIC（3.3 mmol, 0.52 ml ）によって活性化し、H-Glu-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（3.3 mmol, 1.6 g）を加えた。pHをDIEA（湿潤紙）で８に調整し、反応混合物を一晩撹拌した。DMFを減圧下に蒸発させて、油状生成物をAcOEtに溶解し、NaHCO3溶液で抽出した（５回）。抽出物を一緒にし、AcOEtで抽出し、10 %水性HClで酸性とし、生成物をAcOEt中に抽出し（３回）、水で洗浄し（３回）、MgSO4で乾燥し、AcOEtを蒸発させた。収量： 1.0 g（16 %）の気泡生成物。シリカゲルプレートによるTLCは１つのUV吸収スポット、Rf 0.60 (CHCl3:MeOH:ACOH (90:9:1))を示した。
0003672558.tif 000033
0003672558.tif 000034
【０１６３】
H-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（26）
Boc-Pro（10 mmol, 2.15 g）をDMF（50 ml）に溶解し、HOBt（10 mmol, 1.53 g）と4-ジメチルアミノピリジン（3 mmol, 0.36g）の存在下にDIC（10 mmol, 1.58 ml）により活性化した。Fmoc-Gly-NH-(CH2)3-OH（10 mmol, 3.54 g）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。DMFを減圧下に蒸発させて、油状残留物をAcOEtに溶解し、析出物を濾過した。AcOEt溶液を3 %水性HCl（３回）、水、飽和NaHCO3溶液および水で抽出した。この溶液をMgSO4で乾燥し、AcOEtを蒸発乾固した（4.2 g）。TFA（50 ml）を加え、溶液を60分間撹拌し、TFAを蒸発させた。油状残留物をトルエンで抽出（３回）し、生成物をAcOEtに溶解し、エーテルで析出させた。収量： 1.4 g（31 %）。シリカゲルプレートによるTLCは１つのUV吸収スポット、Rf 0.10 (CHCl3:MeOH:ACOH (90:9:1))を示した。
【０１６４】
リンカーII： Z-Glu-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（27）
Z-Glu(OtBu)（20 mmol, 6.74 g）をDMF（50 ml）に溶解し、HOBt（20 mmol, 3.06 g）の存在下にDIC（20 mmol, 3.12 ml）により活性化し、H-Pro-O-(CH2)3-NH<-Gly<-Fmoc（26 mmol, 12 g ）を加えた。pHをDIEA（湿潤紙）で８に調整し、反応混合物を一晩撹拌した。DMFを減圧下に蒸発させて、油状生成物をAcOEtに溶解し、NaHCO3溶液（３回）、水、3 %水性HCl（３回）そして水で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥し、AcOEtを蒸発させた。油状残留物（8.1 g）をDCM（20 ml）に溶解し、TFA（100 ml）を加えた。60分後、反応混合物を蒸発し、油状残留物をトルエンとともに蒸発し（３回）、AcOEtに溶解した。生成物を飽和NaHCO3溶液中に抽出し（５回）、抽出物を一緒にして、AcOEtで洗浄し、KHSO4溶液で酸性にした。生成物をAcOEt中に抽出し（３回）、水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、AcOEtを蒸発した。収量 4.3 g（30 %）の気泡生成物。シリカゲルプレートによるTLCは１つのUV吸収スポット、Rf 0.50 (CHCl3:MeOH:ACOH (90:9:1))を示した。
0003672558.tif 000035
【０１６５】
テンタゲルへのリンカーIおよびIIの結合
テンタゲル（1 g,置換0.23ミリ当量NH2/g）をDMF中で前膨潤させた（ポリプロピレンフリットを備えた10 mlのプラスチックシリンジ）。DMF（2 ml）中のリンカー（0.5 mmol）溶液にHOBt（0.5 mmol, 75 mg）およびDIC（0.5 mmol, 80μl）を加え、その溶液をTG含有シリンジに移した。一晩のカップリング後、該樹脂をDMFで洗浄し（５回）、Fmoc基をDMF中の50 %ピペリジンによる10分間の処理によって除去した。Fmoc放出はピペリジン溶液および一緒にした洗浄物の吸光度（302 nm）を測定することにより定量した。
【０１６６】
コントロール放出の反応
DMF溶液中のFmoc-TrpをHOBtの存在下にDICにより活性化し、３モル過剰量でTG上のリンカーに結合させた。DMFによる洗浄後、Fmoc基をDMF中の50 %ピペリジンにより10分間除去し、樹脂をDMFで洗浄した。一緒にした洗浄物を含有するピペリジン溶液の吸光度を302 nmで読み取り、Fmocの放出を定量した。樹脂をDCMで洗浄し（５回）、異なるスカベンジャーを含有するTFAで処理し（表１を参照）、DCM、MeOHで洗浄し、乾燥した。試料（約10 mg）をpH 8.5の水性緩衝液で一晩処理し、溶液の吸光度を280 nmで読み取り、樹脂を水で洗浄し、水性NaOH（0.5 %）を加えた。４時間後、その吸光度を280 nmで読み取り、Trpを含有するペプチドの量を計算した。
【０１６７】
【表３】
リンカーからのTrp含有ペプチドの放出（mmol/g）
リンカー   Fmoc放出     TFA処理       pH 8.5   pH 13
(I)         0.195    試薬K, 2時間     0.070    0.106(II)        0.089        無           0.004    0.080
(II)        0.089    試薬K, 2時間     0.012    0.067
(II)        0.089    DMS/TFA, 2時間   0.049    0.033
(II)        0.089    TA/TFA, 2時間    0.045    0.039
(II) 0.089    DMS/TFA, 18時間  0.072           
TFA,トリフルオロ酢酸; 試薬K, 82.5 % TFA, 5 %チオアニソール, 5 %クレゾール, 5 %水, 2.5 %エタンジチオール; DMS,ジメチルスルフィド; TA, チオアニソール。
【０１６８】
表３は、Boc保護基で保護されたジケトピペラジンリンカーを、95 % TFAを含有する試薬Ｋで処理すると脱保護されることを示している。しかし、リンカーはさらに遅く切断されるPro-Gluの組合せであるために、わずかに約28 %のトリプトファンラベルが放出しただけである。対照的に、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）保護基で保護されたリンカーは、より速く切断されるGlu-Proリンカーを用いたとしてもpHによる切断を受け易くはなかった。しかし、ある種の「漏出」(leakage) が存在するために、Ｚブロック基は利用可能でありながらも、開裂可能な直交するリンカーのためのBoc保護基との組合せでは理想的ではなかった。水素化分解により除去される別の基（Alloc等）がBocとの組合せにはより良い選択であり得る。ある種のＺ誘導体も有用であり得る。
【０１６９】
ここに記載の特定の実施態様は本発明の一面のわずかに単一の記載を意図するものであるために、本発明はそれら実施態様によりその範囲が限定されるべきものではなく、機能的に等しい微生物は本発明の範囲に含まれるものである。実際、ここに示され、説明されたものに加えて本発明の多様な改良がこれまでの記載と添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そうした改良は添付の請求の範囲に入るものと意図されるものである。
【０１７０】
多様な文献をここに挙げたが、その開示内容は参照させることによりそれら全てをここに編入する。
【０１７１】
【発明の効果】
本発明によれば、実質的に構造が変化してないペプチド、特にジケトピペラジン部分が結合されていないペプチドを生成する開裂可能なリンカーを提供することができる。また本発明によれば、生物学的試験に適合しうる溶液にペプチドを放出させることができる。さらにまた本発明によれば、それぞれのリンカーの開裂が他のリンカーの開裂から独立していて、すなわち他のリンカーの開裂に対して直交していて、固体担体から等モル比で同じまたは異なるペプチド種を順次開裂しうる、多重開裂可能リンカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  pH 8.3でのＩＤＡリンカーからのペプチド Trp-Gly-プロパノールアミド (PAOH) の放出の反応速度論。時間に対する280 nm（トリプトファン）での吸光度。リンカーはIDA-Pro-OPA<-Gly <-Trp <-Fmoc（化合物７）であった。
【図２】図2A-B．  リンカー-樹脂構築物Ｉからのペプチド Trp-Gly- PAOHの放出の反応速度論。
図2A．  pH 8.3での１回目の放出。
図2B．  pH 13.2 での２回目の放出。
【図３】  pH 8.3でのリンカー構築物IIからのペプチド Trp-Gly-PAOH の放出の速度論。ＩＤＡのアームの１つと共に形成されたペプチドエステルに対する、第１のＩＤＡのイミノ基へのアミド結合により結合されたGly のα-アミノ基の攻撃により放出が起こる。
【図４】図4A-D．  pH 4.0（図4A）、6.5 （図4B）および8.5 （図4C）で測定したＩＤＡ-ＩＤＡ戦略を用いる二重開裂可能リンカーからのペプチド Trp-Gly-PAOH の放出の速度論。
図4D．  それぞれpH 8.5およびpH 13.2 での１回目および２回目の放出の速度論。
【図５】図5A-B．  ペプチド Trp-Gly-Gly-プロパノールアミドの放出。ペプチドはジケトピペラジンリンカーを用いて固相担体に結合させた。溶液の吸光度（トリプトファンおよびアミド結合）を時間の関数としてモニターした。
図5A．  ２時間以内のほぼ定量的なペプチド放出を示す、放出ペプチドの吸光度対時間プロフィール。
図5B．  放出ペプチドの時間分解吸光度スペクトル。スペクトルが同一であることに注意されたい。これは時間経過に伴う吸光度の増加が人為的なものではなく、放出されたペプチドにより生じたことを示す。
【図６】  pH 8.46 でのグルタメートリンカーの安定性試験。吸光度対時間のプロットは7.5 時間にわたりペプチドの放出が実質的になかったことを示す。
【図７】図7A-B．  グルタメートリンカーにより固相担体に結合されたペプチドの放出。このペプチド-リンカーの組合せはすでにpH 8.5の溶液（ペプチドの放出を生じなかった）で処理したものであった。ペプチド-リンカー結合体を NaOH(pH 13.2)で処理し、Gly-Trp-Gly PAOHの放出を分光光度計でモニターした。
図7A．  １時間以内の吸光度の増加およびほぼ定量的な放出を示す吸光度対時間のプロット。
図7B．  放出ペプチドの時間分解吸光度スペクトル。スペクトルが同一であることに注意されたい。これは時間経過に伴う吸光度の増加が人為的なものではなく、放出されたペプチドにより生じたことを示す。
【図８】遊離のカルボキシル基を有するペプチドが放出されるような、２つのエステル結合を有するリンカーからのペプチドの２段階放出。pH 8.0での１回目の放出およびpH 12 での２回目の放出とエステルの加水分解。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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