(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003621099.tif 000008
を有するオリゴペプチドから成る群から選択されるオリゴペプチド。
【請求項２】
式：
0003621099.tif 000009
を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
式：
0003621099.tif 000010
を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
式：
0003621099.tif 000011
を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
式：
0003621099.tif 000012
を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。
【請求項６】
式：
0003621099.tif 000013
を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
骨芽細胞または線維芽細胞形成の刺激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の刺激のための薬理組成物であって、式：
0003621099.tif 000014
を有するオリゴペプチドから成る群から選択されるオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物。
【請求項８】
生物学的試料から、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、200〜1000の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、生化学的に純粋なオリゴペプチドは、式：
0003621099.tif 000015
を有するオリゴペプチドから成る群から選択され、
（ａ）該生物学的試料から、分子量3000未満のペプチドを除き；媒体を残し、
（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下にインキュベートして、該骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ぺプチドをクロマトグラフ法により分離する方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、分子量3000未満のペプチドを、3000MWのカットオフを持つ限外濾過により除く請求の範囲８に記載の方法。
【請求項１０】
該プロテアーゼ阻害剤が、Ｅ−64、ロイペプチンまたはPMSF、もしくはそれらの混合物である請求の範囲８または９記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）において、免疫反応性骨原性成長ペプチドをHPLCにより分離する請求の範囲８〜10のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、骨芽細胞および線維芽細胞に対する刺激活性を有する骨原性成長オリゴペプチドに関する。
発明の背景
再生性骨髄は、遠い骨格部位における骨原性応答を誘起し、この活性は治癒組織による循環へ遊離される因子により媒介されることが分かっている［バブ（Bab,I.）ら（1985）Calcif.Tissue Int.37:551;フォルデス（Foldes,J.）ら（1989）J.Bone Min.Res.４:643;アインホーン（Einhorn,T.A.）ら（1990）J.Bone Joint Surg.Am.72:1374;ガツィット（Gazit D.）ら（1990）Endocrinology 126:2607;ミュラー（Mueller,M.）ら（1991）J.Bone Min.Res.６:401］。これら因子の１つである14−アミノ酸骨原性成長ポリペプチド（ヒストンH4のＣ−末端と同一）は、最近同定された［バブら（1992）EMBO J.11:1867;ヨーロッパ特許出願89201608.0および90301862.0］。式Tyr−Gly−Phe−Gly−GlyのヒストンH4フラグメントは、カルチェンコ（Kharchenko,E.P.）ら（1989）Vopr.Med.Khim.35（２）:106−９およびカルチェンコら（1987）Biull.Eksp.Biol.Med.103（４）:418−20に開示されている。このペプチドは、鎮痛およびオピオイド活性を示した。
合成14−マー骨原性成長ポリペプチド（sOGP）（天然分子と同じ構造）は、イン・ビトロでの骨芽細胞および線維芽細胞の増殖の強力な刺激剤であることが分かっている。この合成ポリペプチドは、骨芽細胞アルカリホスファターゼ活性も刺激する。ラットにイン・ビボ注射した場合、非常に少ない投与量で、合成骨原性成長ポリペプチドは、骨形成および小柱骨マスを増加させる。
他のポリペプチド成長調節物質、例えば成長ホルモンおよびインシュリン様成長因子の場合の様に［ヒンツ（Hintz,R.L.）（1990）Horm.Res.33:105］、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質（OGPBP）は、蛋白質分解劣化から骨原性成長ポリペプチドを保護することができる［バブら（1992）EMBO J.11:1867］。
骨原性成長ポリペプチドのＣ−末端変性類縁体、例えば［Cys15（NEM）］OGP−NH2は、OGPBPに結合する。変性類縁体は、細胞増殖のOGP刺激に関与せず、ある種のアンチ−OGP抗体と反応しない［イスラエル特許第101747号］。これらポリペプチド類縁体は、OGPBPとの複合体からOGPを放出させるのに使用することができる。もし競合反応が予め細胞を培養した組織培養培地中またはペプチダーゼ活性をもつ生物学的液体で起こるなら、放出されたOGPは、該ペプチダーゼ活性に起因する蛋白質分解劣化を受けることになる。しかしながら、蛋白質分解劣化により生じる短鎖ペプチドがOGP活性を保持している可能性はある。
OGP分子は、効果的な経口投与には大きすぎるので、OGP生物学的活性を保持する６個またはそれ以下のアミノ酸残基のオリゴペプチドを発見することは治療上有用である。このような短鎖オリゴペプチドは、種々の病的状態、特に骨組織の喪失を伴う症状の経口または他の全身処置に適している安定な薬剤へ変性することができるかもしれない。加えて、そのようなオリゴペプチドの同定は、なおOGP活性を保持する最小アミノ酸配列の決定に向けての必須のステップであり、これにより、更なる医薬設計への基礎が提供されるであろう。
本発明は、そのような天然または合成の骨原性活性オリゴペプチドに関する。
本明細書において、以下の略語を使用する：
OGP:骨原性成長ポリペプチド
OGPBP:骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質
irOGP:免疫反応性OGP
sOGP:合成OGP
発明の概要
本発明は、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、200〜2000の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドに関する。
好ましい本発明のオリゴペプチドは、アミノ酸配列:Tyr−Gly−Phe−His−Glyまたはアミノ酸配列:Gly−Phe−Gly−Glyを含む。特に好ましいのは、５つのＣ−末端アミノ酸残基が該アミノ酸配列の５つまたは４つのアミノ酸残基であるオリゴペプチドである。
また本発明は、生物学的試料から骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量3000未満のペプチドを除き；（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下にインキュベートして、該骨原性成長ポリペプチド結合蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法、およびこの方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対して刺激活性を持つ生化学的に純粋なペプチドに関する。
更に、本発明は、骨芽細胞または線維芽細胞の形成およびその後の骨形成を刺激する薬理組成物であって、治療有効量の本発明のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ROS17/2.8およびMC3T3 E1骨芽細胞ならびにNIH3T3線維芽細胞による定常および全irOGPの産生を示す。測定期間中、細胞は、４％BSAを含む化学的に規定された培地中で成長された。irOGP決定の為の培地部分は、BSA含有培地を添加した直後（「０」時間）および指示した時間後に採取する。定常および全irOGPは、先に記載した通り［バブら、EMBO J.11:1867;イスラエル特許第101747号］決定した。
図２は、MC3T3 E1細胞を用い上記図１について記載したように調製した24時間組織培養培地からのirOGPの精製方法を示すフローチャートである。分子量3000未満のペプチドは、希釈／遠心サイクルを３回繰り返して分離した。次に保持物を［Cys15（NEM）］OGP−NH2と共にインキュベートし、遠心した。濾液を採取し、irOGPを［Cys15（NEM）］OGP−NH2から逆相HPLCを用いて分離し、さらに図３に示したように精製した。図３に見られるピーク中の精製irOGPは、自動化エダム分裂によるアミノ酸配列決定に付し、図４に示す増殖活性試験に付した。
図３は、逆相バイダックC4カラムを用いたirOGPおよび［Cys15（NEM）］OGP−NH2のHPLC分離（Ａ）；並びにメルクC18逆相カラムを用いた２つのirOGPピークのHPLC分離（Ｂ）を示す。破線および実線は、それぞれ吸光度および免疫反応性を示す。
図４は、OGP（10−14）（Ａ）およびOGP（10−14）His13（Ｂ）（それぞれ図３のＢ−１およびＢ−２ピークから回収）の、インビトロにおける骨芽細胞MC3T3 E1に対する効果を示す。破線−正sOGPコントロールの効果。データは、３培地の平均±SEMである。
図５は、合成OGP（10−14）
0003621099.tif 000002
およびOGP（10−14）His13（▲−▲−▲）の、インビトロにおける骨芽細胞MC3T3 E1（Ａ）および線維芽細胞NIH3T3（Ｂ）に対する効果を示す。細胞培養物は、図１および４と同様にセットされ、攻撃された。正sOGPコントロール（□−□−□）参照。データは、処理物のBSAのみのコントロールに対する比、T/C比として示され、３培地の平均±SEMである。
図６は、合成Ac−Met0OGP（10−14）の、インビトロにおける骨芽細胞MC3T3 E1（Ａ）および線維芽細胞NIH3T3（Ｂ）に対する効果を示す。細胞培養物は、図１および４と同様にセットされ、攻撃された。破線−正sOGPコントロールの効果。データは、BSAのみのコントロールに対する処理物の比（T/C比）として示され、３培地の平均±SEMである。
発明の詳細な説明
OGPは、イン・ビトロにおいて骨芽細胞および線維芽細胞の増殖およびアルカリホスファターゼ活性を刺激し、イン・ビボでラットに投与された場合骨形成と小柱骨マスを増加させることが示された、再生性骨髄から単離される14−残基ポリペプチドである。OGPのアミノ酸配列は、以下の通りである：
Ala−Leu−Lys−Arg−Gln−Gly−Arg−Thr−Leu−Tyr−Gly−Phe−Gly−Gly合成OGPは、同じアミノ酸配列および生物学的活性を有し、標準的な固相法により調製される。先に記載したように、異なる生物学的液体中で、OGPはOGPBPと複合体を形成すること、およびＣ−末端領域で変性されたsOGP類縁体は、OGP−OGPBP複合体から全irOGPを競争的に遊離させるのに使用することができることが見い出されてた。
本発明者らは、もし競合反応が予め細胞を培養した組織培養培地中またはペプチダーゼ活性をもつ生物学的液体で起こるなら、OGP−OGPBPから放出されたOGPは、該ペプチダーゼ活性による蛋白質分解劣化を受けることになることを見い出した。驚くべきことに、本発明者らは、該競合反応培地中に存在することが見い出された短いオリゴペプチドが、骨芽および線維芽細胞に対する刺激活性、従って骨形成に対する刺激活性を保持していることを見い出した。
従って、本発明は、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、200〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドに関する。
特に例示できるオリゴペプチドには、６個またはそれ以上のアミノ酸、好ましくは６〜10のアミノ酸を有するオリゴペプチドが包含される。特に例示できる他のオリゴペプチドは、３個または４個のアミノ酸を有するオリゴペプチド、およびペンタマーTyr−Gly−Phe−Gly−Glyを除く５個のアミノ酸を有するオリゴペプチドである。
本発明の好ましいオリゴペプチドは、アミノ酸配列:Tyr−Gly−Phe−His−Glyを含んでなる。特に好ましいのは、５個のＣ−末端アミノ酸残基が該アミノ酸配列の５個アミノ酸残基であるオリゴペプチドである。最も好ましいのは、式:Tyr−Gly−Phe−His−Glyを有するペンタペプチドである。他の好ましいオリゴペプチドは、テトラペプチドGly−Phe−Gly−Glyである。
本発明はまた、生物学的試料から骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量3000未満のペプチドを除き；（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下にインキュベートして、該骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法に関する。
分子量30000未満のペプチドは、例えば3000MWのカットオフを持つ限外濾過により除去することができる。プロテアーゼ阻害剤は、市販されている阻害剤、例えばＥ−64、ロイペプチド（Leupeptide）もしくはPMSFまたはこれらの混合物などであってよい。免疫反応性骨原性成長ペプチドの工程（ｃ）での分離は、使用可能なHPLC法により行うことができる。本発明の特定の態様は、実施例に記載されている。
本発明の方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を有する生化学的に純粋なペプチドも本発明の範囲の内にある。好ましいそのようなペプチドは、アミノ酸配列:Tyr−Gly−Phe−Gly−Glyまたはアミノ酸配列:Tyr−Gly−Phe−His−Glyを含んでなる生化学的に純粋なペプチドである。
また本発明の範囲に含まれるのは、式:Ac−Met−Tyr−Gly−Phe−Gly−Glyを持つヘキサペプチドおよび式:Gly−Phe−Gly−Glyを持つテトラペプチドである。
後記実施例に示すように、本発明のオリゴペプチドは、単離法により得られたものであれ合成されたものであれ、骨芽細胞および線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、従って、非常に大きい治療価値を有する。そこで、本発明は、骨芽細胞または線維芽細胞の形成を刺激する薬理組成物であって、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ、200〜2000の分子量を有するオリゴペプチドの治療有効量および薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物に関する。
本発明の好ましい薬理組成物は、アミノ酸配列Tyr−Gly−Phe−His−Gly、Tyr−Gly−Phe−Gly−Gly、Gly−Phe−Gly−Glyまたはそれらの混合物を含んでなるオリゴペプチドの治療有効量、および薬理学的に許容される担体を含んでなる。
本発明の薬理組成物は、骨芽細胞および／または線維芽細胞の刺激、ならびに種々の病的状態、例えばオステオポローシス（またはあらゆる病因のオステオペニア）、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充、または促進された骨形成が要求される他の状態における促進された骨形成に対して有用である。
本発明のポリペプチドの治療投与量の大きさは、患者の群（年令、性別など）、処置されるべき症状および使用されるポリペプチドの性質、並びに投与経路にもちろん依存する。どのような場合でも、治療投与量は、関与する医師によって決定される。
哺乳類、特にヒトに対して、本発明のポリペプチドの有効量を投与するために、適当な投与経路が採用され得る。静脈または経口投与が好ましい。
本発明の薬理組成物は、投与単位形に調製することができる。投与形は、持続放出器具も包含する。組成物は、薬剤学の分野で周知のいかなる方法によっても調製することができる。
本発明の薬理組成物は、活性成分として、本発明のオリゴペプチドまたはそのようなオリゴペプチドの混合物を、薬理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤、および必要により他の治療成分中に含んでいる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、採用された用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝塩などの生理学的に許容される緩衝剤、より一般的にはこの技術分野で既知のすべての担体、賦形剤および安定剤を包含する。
実施例
実施例１−組織培養培地からのペンタペプチドの精製およびキャラクタリゼーション物質
組織培地成分は、バイオロジカル・インダストリーズ（Biological Industries）［イスラエル、ベイト・ヘメク（Beit Haemek）］から購入した。培養容器は、ヌンク（Nunk）［デンマーク、ロスキルデ（Roskilde）］から入手した。ウシ血清アルブミン（BSA）、プロテアーゼ阻害剤およびＮ−エチルマレイミド（NEM）は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）［ミズリー、セント・ルイス］から入手した（カタログ番号Ａ−7030）。セントリコン（Centricon）−３マイクロコンセントレイターは、アミコン社（Amicon Inc.）［マサチューセッツ、ビバリー（Beverly）］から購入した。ｔ−Boc−GlyOCH2−Pam樹脂、Ｎ−Box保護アミノ酸誘導体、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリフルオロ酢酸（TFA）、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）およびジクロロメタン（DCM）は、アプライド・バイオシテムズ社（Applied Biosystems Inc.）［カルフォルニア、フォスター・シティ（Foster City）から入手した。フッ化水素（HF）は、マセソン（Mathesohn）［ニュジャジー、セカクス（Secacus）］から購入した。Boc−３−Ｉ−Tyr（BZ1）−OHは、バケム（Bachem）［カリフォルニア、トランス（Torrance）］から、ｐ−クレゾールは、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Co.）［ウイスコンシン、ミルオーキー（Milwaukee）］から、およびセファデックス（Sephadex）G15Fは、ファルマシア［スウェーデン、ウプサラ（Uppsala）］から入手した。C18逆相カラムおよびアセトニトリルは、メルク社（E.Merk）［ドイツ、ダルムシュタット（Darmstadt）］から購入した。C4逆相カラムは、ザ・セパレイション・グループ（The Separation Group）（カリフォルニア、ヘスパリア（Hesparia）］から購入した。
方法
組織培養培地中でのirOGPの蓄積の測定
ROS17/2.8またはMC3T3 E1骨芽細胞またはNIH 3T3線維芽細胞を、10％胎児ウシ血清（FCS）を添加したα−ミニマル・エッセンシャル・メディアム（Minimal Essential Medium）に保持し、週に２回継代培養した。実験用の細胞は、集密での維持培地から誘導した。実験のため、細胞を１×104細胞/cm2で25cm2組織培養フラスコに接種した。培地をCO2空気中37℃で培養した。最初の46時間、培地に、10％FCSおよび0.2％ヌクレオシド／リボヌクレオシドを補充し、続いて、血清不存在条件での２時間の飢餓期間を設けた。続いて、血清不含有培地を、４％BSA含有培地8mlに替えた。irOGP決定の為の培地部分0.5mlを、BSA含有培地添加直後（「０」時間）、並びにそれから12、24、36および48時間後に採取した。これら培地部分について、従来の上記方法［バブら（1992）EMBO J.11:1867;イスラエル特許第101747号］により、定常状態および全irOGPを決定した。
irOGPおよびOGPBPの分離
図２は、irOGPおよびOGPBPの分離方法を図式的に示す図である。飢餓期間から24時間後に採取した培地サンプル3.75mlを、等量のリン酸緩衝塩溶液（PBS）により希釈した（1:1）。希釈した培地を、マルチプルセントリコン−３マイクロコンセントレイター［アミコン社、マサチューセッツ、ビバリー］により、5000×ｇで1.5時間遠心した。分子量3000より小さいポリペプチドは、希釈剤としてpH7.0の165nM酢酸アンモニウム中の1mMナトリウムアジドを用いて希釈／遠心サイクルを３回繰り返すことにより、保持物から洗い去った。各マイクロコンセントレイターにおいて許容される最小保持容積は250μｌであった。OGP−OGPBP複合体からirOGPを遊離させる為、1:1希釈保持物を、先に記載［イスラエル特許第101747号］の通りに調製した450nmol/ml［Cys15（NEM）］OGP−NH2を用いて、50μME−64、50μＭロイペプチンおよび500μMPMSFを含む165nM酢酸アンモニウム中、37℃で30分間インキュベートし、再遠心した。
irOGPおよび［Cys15（NEM）］OGP−NH2の分離
マイクロコンセントレイション工程により得た濾液を、最終容積600μｌまで部分的に蒸発した。濾液のirOGP含有量は0.31nmolであった。濾液を３つの等しい部分に分けた。これら試料液体それぞれの中のirOGPを、逆相バイダック（Vydac）プロテインC4カラムを用いたHPLCにより、流速1ml/min.においてアセトニトリル傾斜ラン:3ml 12％アセトニトリル；および30ml 12〜19％アセトニトリルを用いて、［Cys15（NEM）］OGP−NH2から分離した。
２つのirOGPピークの分離
C4カラムから回収された主irOGPピークを含む0.5mlフラクションをプールし、最終容積400μｌまで部分的に蒸発した。このピークのirOGP含有量は0.26nmolであった。濾液を２つの等しい部分に分けた。各部分のirOGPを、流速1ml/min.においてアセトニトリル傾斜ラン:3ml 14％アセトニトリルおよび30ml 14〜19％アセトニトリルを用いた逆相C18カラムでのHPLCに付した。
アミノ酸配列の決定
C18カラムから回収された２つのirOGPピーク中の蛋白質を、アプライド・バイオシステムズから提供されたプログラムおよび試薬を用いた同社の470Aシークエンサーによる自動化ペプチド配列分析に付した。遊離されたアミノ酸誘導体を、オンラインHPLSシステムにより同定した。
結果
図１は、実験した３つの細胞系全てにおいて、飢餓および化学的に規定した培地への暴露から24時間後に、全irOGPがピークに達していることを示している。この時間は、培地の集密状態に一致する。次の24時間では、全irOGPが約50％減少した。定常状態irOGPは、全検出期間中、ほぼ直線的に増加した。これらの結果は、間質細胞がirOGPおよびOGPBPを産生することを示している。irOGPおよび／またはOGPBPの合成速度は、培地が集密状態に達した時から減少する。
MCT3 E1細胞からの24時間培養培地を、繰り返し希釈／遠心サイクルにかけて、末結合irOGPおよび分子量3000未満の他の蛋白質を除いた（図２）。このようにすると、全irOGPのたった0.96％しか捨てられなかった。残部のirOGPは、OGP−OGPBP複合体の形で残り、その高分子量の故に保持物中に含まれていた（表Ａ）。［Cys15（NEM）］OGP−NH2のHPLC分離により、３つの主要吸光度ピークができた。これらピークのうちの大きいものは、19.5〜23.5分の保持時間で溶出された。この保持時間は、同じ条件下で別に溶出した［Cys15（NEM）］OGP−NH2の保持時間と同様であった。このピークは、OGP免疫反応性を示さなかった。他のピークは共に、相互にごく部分的に別れており、高いirOGP含有量を示し（図1A）、培養培地中に存在する全irOGPの11.5％であった（表Ａ）。irOGPにおけるこの減少のほとんどは、ペプチダーゼ阻害剤の存在にも拘わらず、置換反応中のペプチダーゼ活性に起因していると考えられる。これらirOGPピークの分離を促進する為、それぞれのフラクション（保持時間11〜12.5分）をプールし、第２のHPLC工程に付した。その結果、２つのはっきり別れた吸光度ピークが現れ、両者は高いirOGP含有量を示した（図1B）。これらピークを、Ｂ−１およびＢ−２と呼ぶ。
0003621099.tif 000003
保持時間23.5〜24分および25〜25.5分で溶出されたそれぞれのフラクションをプールした。プールしたフラクションの一部を、MC3T3 E1細胞アッセイにおける増殖効果を試験する為に用いた。アミノ酸配列決定により、ピークＢ−１は、OGPのＣ−末端領域（残基10〜14）と同一のペンタペプチドを含んでいることが分かった。ピークＢ−２は、OGPのGly13がHisにより置換された類似のペンタペプチドを含んでいた（表Ｂ）。
0003621099.tif 000004
MC3T3 E1細胞アッセイ中のそれぞれのピークの増殖活性は、10-13Mにピークを持つポジティブsOGPのピークと同一であった（図４）。
実施例２−合成ペンタペプチドの活性
ペプチド合成
本発明の合成ペプチドを、メリフィールド（Merifield）の固相法［メリフィールド（1969）Adv.Enzymol.32:221］により、アプライド・バイオシテムズモデル430A自動化ペプチドシンセサイザー（アプライド・バイオシテムズ社。カリフォルニア、フォスター・シティ）を用いて調製した。ペプチド遊離酸の場合、合成は0.5mmolt−BOC−Gly−PAM樹脂（１％架橋。0.61ミリ当量/g）について行った。アミド化テトラペプチドについては、ｔ−BOC−Gly−MBHA樹脂（１％架橋。0.66ミリ当量/g）を用いた。アミノ酸誘導体は、α−アミノ官能基において、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）基により保護した。チロシン側鎖の保護は、Ｚによる。アミノ酸誘導体を、ヘイジメア（Hagemaier,H.）およびフランク（Frank,H.）のDCC−メディエイテッド・パーフォームド・シンメトリカル・アンハイドライド（DCC−mediated performed symmetrical anhydride）法によりカップリングした［ホップ−ザイラーズ（Hoppe−Seyler's）Z.（1972）Physiol.Chem.353:1973］。各アミノ酸残基のカップリングを２回繰り返した。ブロックされたアミノ末端の脱保護は、DCM中の25％TFAにより処理して行った。アニソール4mlおよび液体HF36mlの混合物を０℃で75分間使用するHF法により、側鎖を脱保護し、ペプチドを樹脂から切断した。粗合成ペプチドは、ウォターズμボンドパーク（Waters μ BondPark,登録商標）C18カラム（1.9×15.0cm）を備えたメルク−ヒタチ（Merk−Hitachi）655A−11HPLC装置により精製した。カートリッジには、流速6.0ml/min.で、TFAを含む直線傾斜のアセトニトリル（表Ｃ）をポンプで送った。
BH−OGP（11−14）（BH＝ボルトン−ハンタ（Bolton−Hunter））は、ミシェロット（Michelot,R.）らの方法［ミシェロットら（1980）Biochem.Biophys.Res.Comm.95:491−498］により、３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを精製OGP（11−14）と反応させて得た。
0003621099.tif 000005
表Ｄに、本明細書で使用した名称とペプチドのアミノ酸配列の対応を示す。
0003621099.tif 000006
結果
MC3T3 E1およびNIH3T3細胞アッセイにおける各ペンタペプチドの増殖効果は、sOGP正コントロールと同様であった。それぞれのピーク活性は、ペプチド濃度10-13および10-11〜10-10Mにあった（図５）。
実施例３−ヘキサペプチドの増殖効果
Ac−Met゜［OGP（10−14）］のヘキサペプチドを、代謝および結合研究にAc−［35S］Met［OGP（10−14）］を用いることの可能性を試験する為に、調製した。
結果
Ac−Met゜［OGP（10−14）］は、sOGP正コントロールの場合と非常に類似し、それぞれペプチド濃度10-13および10-11Mにおいてピークを持つように、MC3T3 E1およびNIH3T3細胞を刺激した（図６）。
実施例４−テトラ−、トリ−およびジ−ペプチドの増殖効果
５種のテトラペプチド全ては、それぞれ10-13および10-11Mのペプチド濃度にピークを持って、MC3T3 E1およびNIH3T3細胞に対する用量依存性を有していた。各細胞系におけるBH−OGP（11−14）ピーク効果の強さは、最高であり、sOGP正コントロールの強さと同等であった。OGP（11−14）、OGP（10−13）およびOGP（10−12）のピーク活性は、中間的な値を示した。OGP（11−14）NH2は、最も低いピーク効果を示した。OGP（12−14）、OGP（11−13）、OGP（13−14）およびOGP（11−12）は、MC3T3 E1およびNIH3T3細胞に対して影響を与えなかった（表Ｅ）。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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