(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス属糸状菌を澱粉を含有する原料と共に培養して得られる培養物へ、サッカロミセス属酵母を添加し、発酵させて得られる微生物培養物を含有する血管内皮細胞活性化剤。
【請求項２】
微生物培養物が、酵母発酵液より不溶性物質を除去したものを濃縮して得られる物質である請求項１記載の血管内皮細胞活性化剤。
【請求項３】
アスペルギルス属糸状菌がアスペルギルス・オリザである請求項１記載の血管内皮細胞活性化剤。
【請求項４】
サッカロミセス属酵母がサッカロミセス・セレビシェである請求項１記載の血管内皮細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は血管内皮細胞活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管内皮細胞活性化因子としては、細胞の生存を維持し、増殖を促進する上皮成長因子（ＥＧＦ）などの細胞増殖因子およびハイドロコーチゾン等のホルモンが知られている（A.Knedler and R.G.Ham, In vitro cellular & DevelopmentalBiology、23巻第481〜491頁、1987年）。血管内皮細胞活性化因子は、血管内皮細胞のイン・ビトロにおける培養に必要である。また、血管障害を改善するための医薬品等の原料としても有用である。
しかし、細胞増殖因子は極めて高価である。また、ホルモン類をイン・ビボで投与すると生体内のホルモンバランスを狂わせる危険がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価にかつ大量に供給し得る、安全性の高い血管内皮細胞活性化物質を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus)属糸状菌を澱粉を主成分とする原料と共に培養した後、さらにサッカロミセス(Saccharomyces)属酵母を添加して発酵させ、得られる微生物培養物を含有する血管内皮細胞活性化剤を提供する。
【０００５】
本発明において、培養のための澱粉を主成分とする原料としては、米、麦、トウモロコシ、大豆等の各種穀物および上記穀物または植物を原料として製造される澱粉類が好適に用いられる。穀物および澱粉類は固体状であっても液体状であってもよい。穀物および澱粉類は、加熱、蒸煮して含有される澱粉をα化しておくのが好ましい。
【０００６】
本発明の血管内皮細胞活性化剤を得るには、まず原料にアスペルギルス属の糸状菌を接種して培養する。本発明に用いるアスペルギルス属糸状菌としては、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)およびアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)などが挙げられる。特にアスペルギルス・オリザが好適に用いられる。アスペルギルス属糸状菌は日本微生物株保存連盟（ＪＦＣＣ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などから入手し得る他、各種麹としても市販されている。
【０００７】
アスペルギルス属糸状菌の接種量は、原料１ｋｇ当たり種菌又は種培養物を０.０１〜１０ｇとするのが好ましい。培養は５〜５０℃にて１〜５日間行う。
【０００８】
アスペルギルス属糸状菌の培養により得られる培養物へサッカロミセス属酵母を添加してさらに発酵させる。本発明に用いるサッカロミセス属酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・エリプソイデウス(Saccharomyces ellipsoideus)などが挙げられる。特に好適に用いられるのはサッカロミセス・セレビシェである。サッカロミセス属酵母はＪＦＣＣ、ＡＴＣＣなどより入手し得る。
【０００９】
サッカロミセス属酵母の添加量は、アスペルギルス属糸状菌の培養物１ｋｇ当たり種菌または種培養物を０.０１〜１０ｇとするのが好ましい。サッカロミセス属酵母は上述の培養物へ直接接種しても、上述の培養物へ穀物、澱粉、水等を添加したものへ接種してもよい。サッカロミセス属酵母の接種時に添加する穀物および澱粉としては、上述の原料として挙げたものがいずれも好適に用いられる。穀物、又は澱粉を添加する場合、アスペルギルス属糸状菌の培養物の２０倍以内、水を添加する場合には該培養物の１０倍以内とするのが好ましい。
【００１０】
サッカロミセス属酵母による発酵に際し、澱粉質の糖化を促進するため必要に応じて、各種アミラーゼを添加するのが好ましい。アミラーゼとしては微生物、植物由来のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ等が好適に用いられる。
【００１１】
サッカロミセス属酵母による発酵はｐＨ３〜７の酸性条件下で行う。培地のｐＨを調整するためには、乳酸、酢酸等の有機酸、塩酸等の鉱酸および苛性ソーダ等が好適に用いられる。また、必要に応じて鉄、亜鉛、銅、マグネシウム、カリウムなどのイオン、リン酸塩および各種ビタミン等の微量成分を添加してもよい。発酵は５〜４０℃の温度にて２〜３０日間行う。
【００１２】
得られるサッカロミセス属酵母の培養物より不溶物を除去する。不溶物の除去は、発酵液、もしくはこれに適当な量の水あるいは緩衝液を適宜添加混合したものを、濾過、遠心分離等して常法により行えば良い。また、発酵液にはアルコール分が含有されているため、更に濃縮してアルコール分を除くことが好ましい。更に濃縮する場合には、減圧濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等、常法に従えばよい。
【００１３】
本発明の血管内皮細胞活性化剤は、外科的または内科的な血管障害を改善するための医薬品や医薬部外品の原材料として使用し得る。また、化粧品に配合することにより表皮組織の代謝を改善し、肌に潤いを与えることが可能となる。さらに、血管内皮細胞培養のための培地への添加剤としても有用である。
【００１４】
実施例１
白米１００ｇを炊飯器にて蒸し、室温まで冷却した後アスペルギルス・オリザの固体培養品（米麹）０.１ｇを接種し、３０〜４０℃で２日間固体培養した。
得られた培養物に水６５０ｍｌ、乳酸１ｇ、炊飯器により蒸した白米４００ｇを混合し、サッカロミセス・セレビシェの培養液０.５ｍｌを接種して約２０℃で２０日間静置培養を行った。
得られた発酵液をガーゼで濾過し、濾液を遠心分離して不溶物を除いた。
培養物をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、褐色粘稠な濃縮物を４０ｇ得た。
【００１５】
実施例２
実施例１と同様にして、アスペルギルス・オリザを培養した。
得られた培養物に水６５０ｍｌ、蒸した白米と小麦１：１の混合物４００ｇを混合した後、サッカロミセス・セレビシェの培養液を１ｍｌ接種し、約２０℃で２５日間静置培養した。得られた培養物を実施例１と同様に濾過、遠心分離により不溶物を除き、５５０ｇの培養物を得た。
【００１６】
ヒト血管内皮細胞の増殖に対する効果
実施例１および２で得た培養物のヒト血管内皮細胞の増殖に対する効果を調べた。
細胞：ヒト血管内皮細胞（臍帯静脈由来：倉敷紡績社）
培地：ＭＣＤＢ１０７（極東製薬工業社）にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコーチゾン（１０μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）および牛脳抽出物（０.４％）を添加した無血清培地。
【００１７】
上記培地へ実施例１で得た濃縮物を０〜０.０１％（ｖ／ｖ）添加した培地を用いてヒト血管内皮細胞を培養した。培養は、コラーゲンでコーティングした細胞培養用６ウエルプレートへ各濃度の濃縮物を含有する培地を満たし、各ウエルにヒト血管内皮細胞２５００個／ｃｍ2となるように植え込んだ。プレートを３７℃、５％ＣＯ2存在下で７日間培養した後、生細胞数を調べた。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0003683602.tif 000002
【００１９】
また、実施例２で得られた培養物を０.０１％の濃度で培地へ添加し、上記と同様にして細胞培養を行ったところ、細胞の増殖が無添加群の１.６倍となった。
実施例３
上述の無血清培地へ、表２に示す各群の成分をそれぞれ添加した。
【００２０】
【表２】
0003683602.tif 000003
【００２１】
【表３】
0003683602.tif 000004
【００２２】
各群は、実施例１により得られた本発明の培養濃縮物に含まれると予想される成分を分類したものであり、添加量は、実施例１の培養濃縮物を０.１％添加した場合とほぼ同じ濃度となる量である。調製した培地を用いてヒト血管内皮細胞を実施例１と同様の方法によって培養した。結果を以下の表に示す。
【００２３】
【表４】
0003683602.tif 000005
【００２４】
表より、本発明の培養濃縮物に含まれる各成分を別個に添加しても血管内皮細胞の増殖には何等影響を及ぼさなかった。従って、本発明の培養濃縮物を含有する血管内皮細胞活性化剤の効果が、既知の単独成分に起因するものではないことは明らかである。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、安価で大量の血管内皮細胞活性化剤を得ることが可能である。本発明の血管内皮細胞活性化剤は、医薬、化粧品等の原料として有用である。