(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス蛋白質ＨＳＰ４７遺伝子の転写を制御するプロモーターの転写活性を増強するポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストレス蛋白質ＨＳＰ４７遺伝子の転写を制御するプロモーターが、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７遺伝子の転写開始点から上流２８０塩基対までに存するプロモーターである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、転写開始点から上流−２８０ｂｐまでの領域及び第１イントロン中の９３ｂｐを欠損させてなるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の発現を制御し得るプロモーター、及び、その塩基配列又はそれにハイブリダイズし得る塩基配列を有するポリヌクレオチドに関する。本発明のプロモーターにより、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御することができ、共発現するコラーゲンの発現を同時に制御することができる。したがって、本発明は、肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾患を治療するためのストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性の制御、及び、これらのポリヌクレオチド若しくはその相補鎖からなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
小胞体に局在するストレス蛋白質ＨＳＰ４７は、コラーゲンに特異性をもち、細胞内におけるプロコラーゲンのプロセシングおよび分泌を助けているコラーゲン特異的分子シャペロンである。
【０００３】
ＨＳＰ４７はｃＤＮＡクローニングの結果、そのアミノ酸配列からセリン型プロテアーゼ阻害剤のファミリーであるセルピンファミリー（ｓｅｒｐｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）に属する蛋白質であることが明らかになった。通常、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）の蛋白質は、分泌されて細胞外でプロテアーゼ阻害剤として機能するが、ＨＳＰ４７はＣ末端にＲＤＥＬ（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）からなる小胞体保持シグナルを持っており、このためＨＳＰ４７は小胞体に局在している。
【０００４】
一方、小胞体に局在する蛋白質は、そのＣ末端にＫＤＥＬ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）配列をもつことが知られており、その配列が、シスゴルジに存在するＫＤＥＬ受容体にトラップされて、ゴルジから小胞体への逆行輸送の系に乗って戻ってくる、すなわち、小胞体とゴルジのあいだをシャトルのように往復することによって、結果的には小胞体に局在していると考えられてきた。
【０００６】
ＨＳＰ４７はそのＫＤＥＬ配列の代わりに、ＲＤＥＬ配列をもったものだと考えられる。事実、ＨＳＰ４７のＣ末端から、遺伝子工学的にＲＤＥＬ配列を切り出してやると、そのような変異ＨＳＰ４７は、もはや小胞体の中に留まることができず、細胞外に分泌されてしまった。
【０００７】
ＨＳＰ４７は、合成途中のプロコラーゲンに結合することが確かめられた。このことは、第１にポリゾーム分画をとってきて、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈降すると、さまざまの長さの新生プロコラーゲンが共沈降してくる。第２に、きわめて短時間だけ［35Ｓ］メチオニンでラベルした細胞を、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈降し、非還元下に電気泳動すると、１本鎖プロコラーゲンの位置に沈降バンドが見られたことから明にされた。
【０００８】
これらは、ＨＳＰ４７が合成途上の１本鎖プロコラーゲンに結合していることを示しているが、一方、ＨＳＰ４７は３本鎖プロコラーゲンにも結合できる。これは、上記の後者の実験で、１本鎖バンドだけでなく、３本鎖の位置にも共沈降するバンドが検出されるからである。
【０００９】
即ち、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７は、プロコラーゲンのα鎖が合成されながら小胞体に挿入されると同時に結合し、２本のα１鎖と１本のα２鎖が３本鎖を形成した後も、それらの３本鎖プロコラーゲンに結合していると考えられる。
【００１０】
プロコラーゲンの小胞体内での３本鎖形成はＣ末端から始まる。Ｃ末端まで合成が完了してはじめて、３本鎖形成が起こるのである。逆に言えば、Ｃ末端までポリペプチドが合成されるまでは、それまでに合成されたα鎖は、それ自身あるいは他のα鎖とフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）したり、凝集したりしては困るわけである。それを防ぐためのなんらかの機構をそなえているものと思われる。ＨＳＰ４７は、そのようなα鎖のホールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）／凝集阻止に分子シャペロンとして関わっている。
【００１１】
ＨＳＰ４７は３本鎖プロコラーゲンに結合したまま、小胞体からシスゴルジまで輸送され、そこでプロコラーゲンから解離して、ＨＳＰ４７自身はＫＤＥＬ受容体に結合して、小胞体へ運び戻され、解離したプロコラーゲンはゴルジ体を順次通過して、細胞表面へ分泌されるのである。
【００１２】
また、ＨＳＰ４７は、前述した正常下でのプロコラーゲンのプロセシングに関わる機能の他に、ストレス蛋白質としてストレス下におけるコラーゲンの品質管理の機構をも持っている。すなわち、熱ストレスなどによってプロコラーゲンに異常が生じると、そのような異常コラーゲンが細胞外マトリックスに蓄積するのを防ぐため、分泌を阻害する機構を備えている。これがいわゆる品質管理機構（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ機構）である。
【００１３】
ところで、コラーゲンの３本鎖形成を阻害する物質として、α，α′−ジピリジルという試薬がある。α，α′−ジピリジルは、鉄のキレート剤であり、これによってプロコラーゲン上のリジン、プロリンのヒドロキシル化が阻害され、Ｏ−グリコシレーションができなくなって、プロコラーゲンの３本鎖形成が抑えられるのである。この試薬で細胞を処理し、そのあとで細胞を放射性のメチオニンでパルスラベルし、さらに種々の時間チェイスしたあと、細胞抽出液を抗ＨＳＰ４７抗体、抗コラーゲン抗体で免疫沈降すると、無処理の細胞では、コラーゲンは６０分後にはほぼすべて細胞外に分泌されてしまうが、α，α′−ジピリジルで処理した細胞では、２時間経ってもなおほとんどすべてのプロコラーゲンは細胞内に留まっていることが確認された。
【００１４】
このとき、抗ＨＳＰ４７抗体で免疫沈降し、ＨＳＰ４７と共沈降してくるプロコラーゲンの量を調べると、正常細胞では６０分後にはすべてＨＳＰ４７から解離していたものが、α，α′−ジピリジルで処理した細胞では、２時間経ってもやはりＨＳＰ４７に結合したままであることが明らかにされている。
これは、３本鎖形成ができなくなったような異常なプロコラーゲンに対して、ＨＳＰ４７はいつまでも結合し続けて、それらが細胞外に分泌されるのを防いでいる、すなわち品質管理機構を担っているからである。
【００１５】
さらに、ＨＳＰ４７は、上に述べたようにコラーゲンに特異性をもった分子シャペロンであると考えることができる。一方、ＨＳＰ４７の著しい特徴は、それが機能的にコラーゲンと密接な関係をもっているだけでなく、その発現自体もまた、コラーゲンと厳密な相関をもっている点にある。
すなわち、コラーゲンを多量に合成している細胞では、ＨＳＰ４７も多く合成され、逆にコラーゲンを合成していない細胞では、ＨＳＰ４７もまったく合成されていない。
【００１６】
例えば、細胞の悪性転換（癌化）によってコラーゲン合成が低下すると、ＨＳＰ４７も同程度に抑制される。また、マウスのテラトカルチノーマ細胞であるＦ９細胞をレチノイン酸などで分化を誘導すると、ＩＶ型コラーゲンなどの著しい誘導が見られるが、その時ＨＳＰ４７も劇的に誘導される。
このような機能面だけでなく、発現においても、分子シャベロンがその基質と相関している（永田、「蛋白質  核酸  酵素」、第４１巻第７号、第８８８頁、１９９６年）。
上に述べたようなＨＳＰ４７とコラーゲンとの共発現から、病的な状態においてコラーゲン合成が異常に昂進しているとき、ＨＳＰ４７も同時に発現の昂進が見られるのではないかと考えた。これを確かめるため、ラットに四塩化炭素を投与し、実験的肝硬変モデルを作成した。
【００１７】
ラットに四塩化炭素を投与し、２週目から１２週目まで肝臓を採取する。肝の切片をアザン染色すると、コラーゲン繊維は青く染色されるが、正常肝では血管壁を除いてコラーゲンの染色は見られない。四塩化炭素を与えて、４週目くらいからコラーゲン繊維の沈着が見られはじめ、１２週目になると、明らかな偽小葉形成が見られて、肝硬変症状を呈する。
このような肝からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析によって、ＨＳＰ４７およびコラーゲンのｍＲＮＡ量を測定した。正常ラットでは、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡも、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲンのｍＲＮＡもいずれもほとんど検出されなかった。これに対して、四塩化炭素を投与すると、コラーゲンｍＲＮＡの蓄積が増大するとともに、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡも顕著に蓄積しているのが観察された。ともに、投与２週間目からすでに顕著に誘導されていた。病理標本から肝硬変の進行程度を５段階に分けて評価し、そのような病状の進行とＨＳＰ４７、コラーゲンのｍＲＮＡ誘導との相関をとると、きわめて高い相関係数を示し、これらが病状と相関している現象であることを示した。
【００１８】
ＨＳＰ４７を産生しているのが、肝実質細胞なのか、それとも肝組織に存在する別の細胞であるのかを調べるため、肝標本をＨＳＰ４７およびＩ型コラーゲンに対するアンチセンスを用いたインシトウハイブリッド形成法（ｉｎ  ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によって調べた。その結果、コラーゲンｍＲＮＡを発現している細胞がまた、ＨＳＰ４７ｍＲＮＡを発現していることが確かめられた。コラーゲンを産生しているのは伊東細胞であることが知られているので、伊東細胞のマーカーであるデスミンに対する抗体を用いて、インシトウハイブリッド形成法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と免疫染色を同じ細胞に対して試みたところ、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡを産生しているのは伊東細胞であることがわかった（永田、環境科学総合研究所年報、第１５巻、第１３頁、１９９６年）。
【００１９】
このように、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７は、特に臨床的な観点から、肝硬変、腎繊維化など体内において繊維化を伴った病変と密接な関係をもち、繊維化に伴って、コラーゲンの蓄積とともに、ＨＳＰ４７も急激に合成される。肝硬変などの繊維化は、現在肝移植などの方法以外には治療の手段がなく、なんらかの方法でコラーゲンの合成、蓄積を抑えることができれば、これらの疾患の治療に大きな進歩が期待される。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＨＳＰ４７の転写調節（活性化）領域を明らかにし、それに基づいてＨＳＰ４７の合成を制御し、繊維化の治療に役立てるためのものである。具体的には、この転写活性化領域を用いることによって、それに結合する転写因子の探索を行なうことができる。さらに、転写因子と本転写活性化領域との相互作用を調節することによって、繊維化を初めとするコラーゲン蓄積による病態の治療方法及び治療剤を提供するものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、転写開始点から上流２８０ｂｐ及び第１イントロン中の約１００ｂｐを含む領域からなるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性化領域に関する。ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御することにより、共発現するコラーゲンの発現を同時に制御することができる。したがって、本発明は、肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾患を治療するためのストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性の制御に関する。
【００２２】
本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける第１イントロン中の塩基配列であって、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはひとつ以上の塩基が欠損、付加、置換してなる塩基配列、又は、その塩基配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、特にＤＮＡに関する。
また、本発明は、これらのポリヌクレオチド又はその相補鎖からなる医薬組成物、特にコラーゲンの蓄積による疾患の予防治療剤である医薬組成物に関する。本発明の好ましい医薬組成物としては、肝硬変の予防治療剤が挙げられる。
さらに、本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、第１イントロン中の配列番号１に示される塩基配列を欠損させてなる当該蛋白質の発現を制御し得るプロモーター、及び、さらに、転写開始点から上流２８０ｂｐを欠損させてなる前記プロモーターに関する。
また、本発明は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のゲノムＤＮＡにおける、第１イントロン中の配列番号１に示される塩基配列を欠損させることによるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御する方法、及び、さらに、転写開始点から上流２８０ｂｐを欠損させてなるストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御する方法に関する。
【００２３】
まず、本発明者は、ＨＳＰ４７の発現制御が転写レベルであることから、コラーゲンとの共発現に関わるＤＮＡ上のシスのエレメントを同定する目的でプロモーター解析を行った。
マウスのゲノムライブラリーから、ＨＳＰ４７の全遺伝子をクローニングした（図１）。ＨＳＰ４７をコードする遺伝子は、第I、第II、第III、第IV、第Ｖ、及び、第VIの６つのエクソンからなり、翻訳開始コドンは第III エクソンにあることがわかった。
【００２４】
第１エクソンから上流約１．７ｋｂのプロモーター部分の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。後述するように、この配列の１３７３の位置（ＳａｃII）からの約２８０ｂｐ（ＣＣＧＣＧＧＡＡ・・・・ＡＧＴＧＡＧＣＴＧ）がプロモーターとして重要な配列であることがわかった。
また、第１エクソン領域から第３エクソン領域までの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。約２００ｂｐまでの領域が第１エクソン領域であり、１２５０ｂｐ付近に第２エクソン領域があり、約３６００ｂｐ付近からが第３エクソン領域である。後述する第１イントロン領域の９３ｂｐの塩基配列（配列番号１参照）は、この配列番号３で示されるポリヌクレオチドの８３６から９２８ｂｐまでの配列である。
【００２５】
そして、このマウスのゲノムライブラリーからのプロモーター領域を、転写開始点から上流５．５Ｋｂまでをクローニングし、このプロモーター領域のどの塩基配列がＨＳＰ４７の転写調節に関わっているかを、ルシフェラーゼアッセイによって調べた。これは、コラーゲンを産生している細胞では共発現の機構が機能しており、ベースの転写活性が高いだろうと仮定して、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしてプロモーター上流領域のルシフェラーゼを行うことにした。このアッセイはコラーゲンを産生するマウスの繊維芽細胞Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３を用いて行われた。
【００２６】
その結果、転写開始点から上流２８０ｂｐまでの領域をもてば、基本的な転写活性には十分であることが明らかになった（図２）。プロモーター領域を上流５．５Ｋｂまでのばしてもベースの転写活性は変わらなかった。
しかし、この領域だけでは、コラーゲンとの共発現を支えることはできず、コラーゲンを作っている細胞においても、コラーゲン非産生細胞においても活性の変化はなかった。
【００２７】
次に、下流イントロンを含むプロモーター領域で同様なルシフェラーゼアッセイを行った。即ち、この２８０ｂｐの下流に、第１イントロンを含む領域をつないだところ、イントロン部を含むプロモーター領域では、それを含まないものに比べて４〜６倍のベースの転写活性が認められた。また、コラーゲンを産生しないヒトの２９３細胞で同様な実験を行ったところ、イントロンの有無でベースの転写活性は変わらなかった。
このことにより、コラーゲンとの共発現を支えているのは、（２８０ｂｐ＋第１イントロン）の領域であることがわかった（図３参照）。即ち、ＨＳＰ４７遺伝子のイントロン領域にコラーゲンとの共発現に関わるシスのエレメントが存在することが判明した。
【００２８】
第１イントロンは、約３ｋｂときわめて長いため、そのなかでどの領域が重要なのかを、種々の欠損変異を作ることによって調べた。その結果、第１イントロンのＢｓｔＸＩ−ＳｆｉＩの間のフラグメントが重要であることがわかった。この部分をさらに細かく調べ、最終的に図４で示されるＢＳ１４及びＢＳ１８の２つの欠損変異ではＨＳＰ４７の転写活性化能が見られないことが判明した。すなわち、この２つの領域が、上流２８０ｂｐとともにコラーゲンの共発現に重要であることが明らかになった（図４）。ＢＳＩ４およびＢＳ１８を含む約１００ｂｐ（配列番号１参照）を上流２８０ｂｐのプロモーターとつないだところ（ＢＳ２１）、それだけでＨＳＰ４７の転写を活性化するのに必要十分であることがわかった。
【００２９】
これらの実験で使用した組換えベクターの地図を図５及び６に示す。図５は、発現ベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃに転写開始点の上流−２８０ｂｐからなるプロモーターを組み込んだ遺伝子地図（Ｌｕｃ２８０）を示す。また、図６は、発現ベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃに転写開始点の上流−２８０ｂｐ及び第１イントロン領域からなるプロモーターを組み込んだ遺伝子地図（Ｌｕｃ２８０（III)）を示す。
【００３０】
即ち、図４のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１８領域の活性を制御することにより、コラーゲン産生細胞のコラーゲンの発現を制御できることがわかった。したがって、肝硬変などのコラーゲンの蓄積による各種疾患は、疾患部位の細胞のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１８領域の活性をなくすことにより、病態部位におけるコラーゲンの産生を抑制させ、疾患の予防治療を行うことが可能となる。
本発明のコラーゲンの蓄積による疾患の予防治療剤としては、図４のＢＳ−１４領域又はＢＳ−１８領域をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドを使用することもできる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を配列表に示す。配列表中の塩基の記号として使用されている「Ｈ」はＡ、Ｃ又はＴを示し、「Ｋ」はＧ又はＴを示し、「Ｍ」はＡ又はＣを示し、「Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを示し、「Ｒ」はＡ又はＧを示し、「Ｓ」はＣ又はＧを示し、「Ｖ」はＡ、Ｃ又はＧを示し、「Ｗ」はＡ又はＴを示し、「Ｙ」はＣ又はＴを示す。
【００３２】
【実施例】
つぎに実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実施例１  （マウスのゲノムＤＮＡのクローニング）
マウスＨＳＰ４７のｃＤＮＡ（Ｆ２）をプローブとして、マウス肝より調整したゲノムライブラリー（クロンテック社より購入）を、コロニーハイブリダイゼイション法によりスクリーニングした。その結果、１．２ｋｂのゲノムクローンを得た。これをプローブにしてさらに遺伝子の全長を釣るべくスクリーニングを行ない、最初１１個のクローンを得たが、そのうち２個は同じものであったので、独立した１０個のクローンを得たことになった。
最終的にもっとも長く、ＨＳＰ４７の全長をコードしているクローン  ４を得ることができた。クローン  ４は、約１５ｋｂからなる遺伝子であった。この遺伝子について、制限酵素地図（図１参照）を作成し、さらに通常の方法によりＤＮＡシーケンサーによって遺伝子の配列を決定した。過去のデータに基づいて、得られていたｃＤＮＡの配列をもとに、エクソン、イントロン構造を決定し、最終的に図１に示したようなゲノム地図を作成した。
【００３４】
実施例２  （上流領域を用いたルシフェラーゼアッセイ）
ルシフェラーゼアッセイは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写開始点の上流２８０ｂｐ（第１エクソンの転写開始点より下流３８ｂｐも含む、以下同じ）の下流にレポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子をつなぎ、クロンテック社より購入したｐＧＬ２ｃｏｎｔｒｏｌのクローニング部位に挿入した。対照としてＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のプロモーターを持つｐＧＬ２ｃｏｎｔｒｏｌ（クロンテック社）を用いた（図中に、「ＧＬ２−ｃｏｎｔｒｏｌ」で示す。）また、実施対象群間の導入効率を補正するために、βガラクトシダーゼ遺伝子をレポーターとして、βアクチンのプロモーターの下流につないだものを同時に細胞に導入した。
細胞への導入は、直径３５ｍｍの培養皿に７万個の細胞を植え込み、翌日調べたいプロモーター遺伝子および補正用のβガラクトシダーゼ遺伝子を同時にリン酸カルシウム法で細胞に導入する。４時間後に培養液を交換し、４８時間培養した後に細胞を回収し、凍結−融解によって細胞を壊した後、一定量（１０μｌ）の細胞抽出液を用いて、ルシフェラーゼの活性測定、βガラクトシダーゼ活性を行なった。補正はβガラクトシダーゼ活性を一定にすることによって行なった。ルシフェラーゼの活性測定には、基質としてピッカジーン（東洋インキ社製）１００ｕｌを混合して、混合直後より、ルミノメーターで発光を測定して活性とした。βガラクトシダーゼ活性測定には、基質としてＯＮＰＧ（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を用い、細胞抽出液と混合後、３７℃で３０分保温後、４２０ｎｍの吸光度を測定して活性とした。
また、第１イントロンを含むプロモーター活性を調べる場合には、転写開始点の上流２８０ｂｐの下流に、翻訳開始コドンの前までの第１イントロン全体（１．５ｋｂ）をつないで、その下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだものを用いた。
【００３５】
実施例３  （第１イントロンを含む場合のルシフェラーゼアッセイ）
マウスＢａｌｂ細胞、およびヒト２９３細胞をそれぞれ実施例２と同様の方法によって細胞に導入、同様に酵素活性を測定する。結果を図３に示す。
【００３６】
実施例４  （第１イントロンの一部を欠損させた場合のルシフェラーゼアッセイ）
マウスＢａｌｂ細胞、およびヒト２９３細胞をそれぞれ実施例２と同様の方法によって細胞に導入、同様に酵素活性を測定する。結果を図４に示す。
【００３７】
実施例５
図５に示す発現ベクターは、ＳａｃＩ・ＥａｇＩの５．５ｋｂをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングし、次に、これをＳａｃＩで切った後低濃度のＡｒａＩで部分切断して−５．５ｋｂ（ＳａｃＩ）から＋３８ｋｂ（ＡｒａＩ）までを得た。これをｐＧＬ２−ｂａｓｉｃのＳａｃＩ・ＸｈｏＩサイトに挿入してＬＵＣ５．５を作製した。ＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断して末端平衡処理をしてつなげ。ＬＵＣ２８０（図５）を作製した。
【００３８】
実施例６
図６に示す発現ベクターは、翻訳開始点直前にＳａｌＩサイトをＰＣＲで導入して−５．５ｋｂ（ＳａｌＩ）〜＋３５８３ｋｂ（ＳｏｌＩＩ）のフラグメントを作り塩基配列を確認した。これをＧＬ２−ｂａｓｉｃのＳａｃＩ・ＳｏｌＩサイトに挿入してＬＵＣ５．５（ＩＩＩ）を作製した。ＸｈｏＩとＳａｃＩＩで切断し、末端平衡処理をしてつなげＬＵＣ２８０（ＩＩＩ）（図６）を製造した。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、コラーゲンと共発現するストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写活性を制御できるポリヌクレオチド領域を提供するものであり、これによりコラーゲンの蓄積による各種疾患、例えば、肝硬変などの病態の予防治療を有効に行うことが可能となる。
【００４０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：９３
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
由来：マウスゲノム
配列：
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配列番号：２
配列の長さ：１６５９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
由来：マウスゲノム
配列
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0003688883.tif 000004
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配列番号：３
配列の長さ：４２７０
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
由来：マウスゲノム
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７のマウスゲノムの遺伝子地図を示すものである。
【図２】図２は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の第１イントロンの上流５．５Ｋｂをプロモーターとした場合のルシフェラーゼアッセイの結果を示すものである。
【図３】図３は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の転写開始点から上流２８０ｂｐ及び第１イントロン領域を含むプロモーターを用いた場合のルシフェラーゼアッセイの結果を示すものである。
【図４】図４は、ストレス蛋白質ＨＳＰ４７の第１イントロン領域の一部の塩基配列を欠損させたプロモーターを用いた場合のルシフェラーゼアッセイの結果を示すものである。
【図５】図５は、第１エクソン領域の上流２８０ｂｐまでのプロモーターを組み込んだ発現ベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃを示す。
【図６】図６は、第１エクソン領域の上流２８０ｂｐ及び第１イントロン領域までのプロモーターを組み込んだ発現ベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃを示す。
【図１】
0003688883.tif 000012
【図２】
0003688883.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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