(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリチル酸に対する耐性を有し、Ｄ−パント酸合成能を有するエシェリヒア属に属する微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、Ｄ−パント酸またはその塩の製造法。
【請求項２】
α−ケトイソ吉草酸に対する耐性、α−ケト酪酸に対する耐性、α−アミノ酪酸に対する耐性、β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する耐性、及びＯ−メチルスレオニンに対する耐性から選ばれる少なくとも１つの耐性を有する微生物を用いる、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
サリチル酸に対する耐性を有しＤ−パントテン酸合成能を有するエシェリヒア属に属する微生物をβ−アラニンと接触させることを特徴とする、Ｄ−パントテン酸またはその塩の製造法。
【請求項４】
α−ケトイソ吉草酸に対する耐性、α−ケト酪酸に対する耐性、α−アミノ酪酸に対する耐性、β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する耐性、及びＯ−メチルスレオニンに対する耐性から選ばれる少なくとも１つの耐性を有する微生物を用いる、請求項３記載の製造法。
【請求項５】
パントテン酸生合成系遺伝子領域もしくはその一部、および／または分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域もしくはその一部を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドにて形質転換せしめた微生物を用いる、請求項１〜４記載の製造法。
【請求項６】
エシェリヒア・コリを用いる、請求項１〜５記載の製造法。
【請求項７】
サリチル酸に対する耐性を有し、パントテン酸またはそれらの塩の生合成系遺伝子領域またはその一部を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドにて形質転換せしめたＤ−パントテン酸またはパント酸合成能を有する、エシェリヒア属に属する微生物。
【請求項８】
プラスミドが、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ又はｐａｎＤがコードするパントテン酸またはその塩の生合成系遺伝子領域を有する、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
エシェリヒア・コリ814/pFV31株（IFO 15374）（FERM BP 4401）及びエシェリヒア・コリ5069/pFV31株（IFO 15526）（FERM BP 4395）からなる群より選択されるものである、請求項７記載の微生物。
【請求項１０】
請求項３記載の方法により製造されたＤ−パントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩の水溶液を、アニオン透過膜として塩素イオンは通すがパントテン酸イオンは通さないアニオン透過膜を用い、電極液として硝酸カルシウム水溶液を用いて、電気透析することを特徴とするＤ−パントテン酸カルシウムの精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤ−パント酸および／またはＤ−パントテン酸（またはその塩）の新規な製造方法、精製法およびその生産菌およびパントテン酸生合成系遺伝子領域またはその一部を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドに関する。パントテン酸は、ビタミンとして有用な物質であり、Ｄ−パント酸はパントテン酸やＣｏＡの重要な合成中間体として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−パントテン酸（またはその塩）はビタミンとして重要な物質であるが、従来の製造法としては、（１）ＤＬ−パントラクトンを光学分割して得られるＤ−パントラクトンとβ−アラニン（またはその塩）をメタノール中で化学的に縮合させる方法や（２）微生物あるいは酵素を用いて、Ｄ−パントテン酸エステルを加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法やＤＬ−パントテン酸エステルのＤ体のみを選択的に加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法（特開平1-228487、特開平1-228488）、（３）微生物の休止菌体またはその酵素に、パント酸カリウム塩とβ−アラニンとＡＴＰをトリス緩衝液中で接触させてパントテン酸を得る方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第１９８巻、２３頁、（１９５２）と第１７６回アメリカン・ ケミカル・ソサイエティー・ナショナル・ミーティング要旨集（abstracts of Papers,176th American Chemical Society National meeting）、マイクロバイアル・アンド・バイオケミカル・テクノロジー部門（Division of microbial and biochemical technology）、４８番、（１９７８）などに記載〕、などが知られている。
Ｄ−パント酸および／またはＤ−パントラクトンの従来の製造法としては化学的に合成されたＤＬ−パントラクトンを（４）キニーネ、ブルシンなどの分割剤を使用し、光学分割する方法、（５）特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを分解し、Ｄ−パントラクトンのみを取得する方法（特公昭47-19745）、（６）特定の微生物を用いて、ＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンのみを酸化し、ケトパントラクトンに導き、更にこのものを不斉還元する事によってＤ−パントラクトンを得る方法（特開昭61-293386）、（７）化学的に合成されたケトパントラクトンを特定の微生物を用いて不斉還元してＤ−パントラクトンを得る方法（特公昭61-14797）、（８）特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−体を選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パントラクトンを得る方法（特開昭57-152895および特開昭62-294092）、（９）特定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＤ−体を選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パント酸を得る方法（特公平3-65198）などが知られている。
また、パントテン酸の塩を採取する方法に関しては、晶出前に塩化カルシウムを添加してパントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩として高収率かつ高純度に晶出させる方法（米国特許2,957,025(Jonathan O.Brooks 1960年10月18日出願)や特公昭４７−４９５７１など）は知られているが、この得られた複塩から 塩化カルシウムを除去し高収率でパントテン酸カルシウムを得る方法はいまだ知られておらず、この複塩を最終製品として扱っているのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
工業的にＤ−パントテン酸（以下、その塩も含む）を製造するに当たり、（１）の方法は原料となるＤＬ−パントラクトンの合成に煩雑な工程を要するのみならず、その光学分割には煩雑かつ、困難な工程を伴っていた。（２）の方法はＤＬ−パントラクトンからＤ−パントテン酸エステルやＤＬ−パントテン酸エステルを製造する工程を要するという欠点がある。（３）の方法は高価なＡＴＰやトリス緩衝液を使用する点で不利であり生成したパントテン酸の量も微量で、しかも高価なＤ−パント酸（またはその塩）を原料として用いた場合、実用的でない。
また、Ｄ−パント酸および／またはＤ−パントラクトンの製造法のほとんどは、合成に煩雑な工程を要するＤＬ−パントラクトンを出発原料としている欠点を有するのみならず、（４）の方法は、高価な分割剤を使用し、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でないなどの欠点を有し、（５）の方法はＤＬ−パントラクトンの半分量が損失量となるという欠点を有している。（６）、（７）、（８）、（９）の方法は使用する微生物の性質上、あるいはパントラクトン（またはパント酸）の性質上、培養液中に光学純度１００％でＤ−体のみ製造するのは非常に困難である。また、（４）、（８）、（９）の方法は、残ったＬ−体を回収、ラセミ化再利用する事を前提としているため、さらに煩雑な工程が増える事になる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｄ−パントテン酸の工業的に有利なより効率的な製造法につき鋭意検討した結果、微生物をβ-アラニンを添加した培地にて培養すれば、Ｄ− パントテン酸が生成することを見いだした。また、サリチル酸に耐性を有する菌株を培養する事によってＤ−パント酸を蓄積せしめ得ること、また、β-アラニ ンを添加した培地にて培養することにより、Ｄ−パントテン酸がより高濃度生成すること、さらに、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸、α−アミノ酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸及び／又はＯ−メチルスレオニンに対する耐性を付与することによってＤ−パント酸、または／およびＤ−パントテン酸の生成量が増大することを見いだした。一方、遺伝子組換え技術の菌株の育種への利用の研究を重ねた結果、パントテン酸生合成系遺伝子の組み込まれたプラスミドを用いて形質転換せしめた菌株が、培地中にパントテン酸またはＤ−パント酸（または／およびＤ−パントラクトン）をさらに高濃度蓄積することを見いだし、さらに検討を重ね本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、〔I〕サリチル酸に対する耐性を有し、Ｄ−パント酸合成能を有するエンテロバクテリアシー科に属する微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パント酸またはその塩の製造法、
〔II〕α−ケトイソ吉草酸に対する耐性，α−ケト酪酸に対する耐性，α−アミノ酪酸に対する耐性，β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する耐性及びＯ−メチルスレオニンに対する耐性から選ばれる少くとも１つの耐性を有する微生物を用いる前記（Ｉ）記載の製造法、
〔III〕β−アラニンの存在下サリチル酸に対する耐性を有しＤ−パントテン酸合成能を有するエンテロバクテリアシー科に属する微生物をβ−アラニンと接触させることを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の製造法、
〔IV〕α−ケトイソ吉草酸に対する耐性，α−ケト酪酸に対する耐性，α−アミノ酪酸に対する耐性，β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する耐性及びＯ−メチルスレオニンに対する耐性から選ばれる少くとも１つの耐性を有する微生物を用いる前記（III）記載の製造法及び
〔V〕パントテン酸生合成系遺伝子領域（またはその一部）または／及び分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域（またはその一部）を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドにて形質転換せしめた微生物を用いる前記（Ｉ）〜（IV）記載の製造法に関する。又、本発明はこれらの製造法に用いる形質転換微生物、形質転換微生物を得るためのプラスミド及び目的化合物の精製単離法を提供する。
本発明は原料としてＤＬ−パント酸やパントラクトン等を用いる必要がなく、光学純度１００％のＤ−体が得られ、また、Ｌ−体を回収、ラセミ化再利用する工程が省けるなど工業的に実施する上での多くの長所を有する。
【０００６】
以下本発明を詳細に説明する。
尚、本発明においてＤ−パント酸，Ｄ−パントテン酸及びβ−アラニンはその塩であってもよく、本明細書の記載においてＤ−パント酸，Ｄ−パントテン酸及びβ−アラニンと称する場合、遊離体のみならずその塩も含む。Ｄ−パント酸，Ｄ−パントテン酸，β−アラニンの塩としては、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩が挙げられる。いずれもカルシウム塩，ナトリウム塩，カリウム塩が好ましい。
本発明におけるＤ−パントテン酸及びＤ−パント酸合成法は、微生物の有するパントテン酸合成能及びＤ−パント酸合成能を利用し、グルコースなどの種々の炭素源からＤ−パント酸を生合成せしめ、これを培地中に蓄積させるか、培地中にβ-アラニンを添加する等してβ−アラニンと微生物を接触させることにより β−アラニンとＤ−パント酸とを微生物によって縮合せしめることによりＤ−パントテン酸を生成させることを特徴とするものである。本発明に用いられる微生物としては、β−アラニンの存在下にＤ−パントテン酸合成能を有する微生物やＤ−パント酸合成能を有する微生物をそれぞれ用いることができる。とりわけ実用面からエンテロバクテリアシー科の微生物が好適であり、例えばシトロバクター属、シゲラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、サルモネラ属及びエシェリヒア属に属する菌があげられる。本発明に用いられるより好ましい菌株の具体例としてはエシェリヒア属菌が挙げられ、その具体例としてはエシェリヒア・コリＫ−１２（ＩＦＯ３３０１）、エシェリヒア・コリ（ＩＦＯ３５４７）など、財団法人発酵研究所発行の「リスト・オブ・カルチャーズ（List of cultures）、第８版、１９８８」に掲載されているようなエシェリヒア・コリの公知菌株およびこれらに由来する菌株が挙げられる。
【０００７】
本発明者らは、エシェリヒア属等の微生物を用いて糖類などの炭素源から直接醗酵法により、更に効率的にかつ経済的にＤ−パント酸を製造する方法を開発すべく研究を行った結果、サリチル酸に対する耐性を付与した微生物の中に大量のＤ−パント酸を生産する能力を有する菌株があることを見いだし、さらにこのような微生物を炭素源を含む培地中でβ-アラニンと接触させることによって大量 のＤ−パントテン酸を蓄積せしめることが可能であることを見出した。
これに加えて本発明者らは、これらのサリチル酸耐性株にα−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸，α−アミノ酪酸，β−ヒドロキシアスパラギン酸及び／又はＯ−メチルスレオニンに対する耐性を付与することによってより高濃度の生成がなされることを見出した。
本発明の方法に使用される変異株としては、例えばエンテロバクテリアシー科の微生物が挙げられ、とりわけエシェリヒア属に属し、Ｄ−パント酸又はＤ−パントテン酸を生産する能力を有する微生物が好ましい。具体的には、サリチル酸に対する耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ５７１４（ＩＦＯ  １５３６８）、サリチル酸、かつα−ケトイソ吉草酸に耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ５２５（ＩＦＯ  １５３６９）、サリチル酸、かつα−ケトイソ吉草酸、かつα−ケト酪酸に耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ８１４（ＩＦＯ  １５３７０）、サリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸かつα−アミノ酪酸に耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ５２１、サリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸かつβ−ヒドロキシアスパラギン酸に対する耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ２２１及びサリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸かつＯ−メチルスレオニンに耐性を有するエシェリヒア・コリ  ＦＶ６０５１、エシェリヒア・コリ  ＦＶ５０６９が挙げられる。
【０００８】
本発明に使用される変異株ＦＶ５７１４はエシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７を親株とし、これに通常の変異誘導処理、例えば紫外線照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学薬剤処理を施した後、親株が生育できないような濃度のサリチル酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ５２５も同様にＦＶ５７１４を親株として親株が生育できないような濃度のα−ケトイソ吉草酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ８１４はＦＶ５２５を親株として親株が生育できないような濃度のα−ケト酪酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ５２１はＦＶ８１４を親株として親株が生育できないような濃度のα−アミノ酪酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ２２１はＦＶ８１４を親株として親株が生育できないような濃度のβ−ヒドロキシアスパラギン酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ６０５１はＦＶ２２１を親株として親株が生育できないような濃度のＯ−メチルスレオニンを含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。ＦＶ５０６９はＦＶ６０５１を親株として親株が生育できないような濃度のα−ケト酪酸を含有する寒天平板培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離することによって得られる。
なお、最終的に本発明の目的にかなう菌株を得るには、サリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸、α−アミノ酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸、Ｏ−メチルスレオニンといった薬剤への耐性の付与の順番は問題とならない。また、α−ケトイソ吉草酸、α−アミノ酪酸及びＯ−メチルスレオニンは４−アザロイシン、４−チアイソロイシン、ノルバリン等の公知の分岐鎖アミノ酸アナログに代替し得る。
【０００９】
以下の実験例にて上記の菌株のサリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸、α−アミノ酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸あるいはＯ−メチルスレオニンに対する耐性度を示す。
【実験例】
〔表１〕に示す組成（以下、特にことわりのない限り“％”は“w／v％”を示す）の培地を１２１℃で１０分間加熱殺菌した後、〔表２〕，〔表３〕に示す濃度となるようにサリチル酸、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト酪酸、α−アミノ酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸あるいはＯ−メチルスレオニンを別途フィルター除菌して添加し、直径９ｃｍの滅菌シャーレに分注した。これらの寒天培地に、最小培地で２４時間培養した〔表２〕，〔表３〕に記載するエシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７、ＦＶ５７１４、ＦＶ５２５、ＦＶ８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２１、ＦＶ６０５１、ＦＶ５０６９から選ばれる菌株の培養液をそれぞれ０．１ｍｌずつ塗布し３７℃にて３０時間培養を行った。生育度を〔表２〕，〔表３〕に示す。
尚、〔表２〕，〔表３〕において、各記号は次の意味を有する。
＋＋ 生育非常に良好；  ＋ 生育良好；  ± 生育不良；  − 生育せず
一方、本発明者らは上述のようなＤ−パントテン酸製造法を応用し、特定の科の微生物の染色体より得たパントテン酸生合成系遺伝子領域もしくはその一部の遺伝子領域が組み込まれているベクターを含有している微生物が高濃度でＤ−パント酸または／およびＤ−パントテン酸を蓄積することを見いだした。
ここで言うパントテン酸生合成系遺伝子とは panB, panC, panD遺伝子を指し、それぞれKetopantoate hydroxymethyltransferase, Pantothenate synthase, Aspartate-α-decarboxylase の各酵素に対応する遺伝子である。
このようなＤＮＡの供与菌の例としては、パントテン酸生産能を有する前記微生物が挙げられが、とりわけエシェリヒア属菌が挙げられる。その具体例としてはエシェリヒア・コリＫ−１２（ＩＦＯ３３０１）、エシェリヒア・コリ（ＩＦＯ３５４７）など、財団法人発酵研究所発行の「リスト・オブ・カルチャーズ（List of cultures）、第８版、１９８８」に掲載されている公知菌株が挙げられる。あるいは前述のエシェリヒア・コリＦＶ５７１４，ＦＶ５２５，ＦＶ８１４，ＦＶ５２１，ＦＶ２２１，ＦＶ６０５１，ＦＶ５０６９等の変異株を用いればさらに効果的である。
【００１０】
パントテン酸生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する方法としては、例えば、エイチ・サイトー及びケイ・ミウラ、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（H.Saito and K.Miura,Biochim.Biophys.Acta）、７２、６１９（１９６３）の方法またはそれに準じる方法等公知方法によりまず、供与菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いでこれを制限酵素 EcoRIを用いて切断する方法などが挙げられる。次に、この様にして得られたパントテン酸生合成系遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片は、ベクターＤＮＡに挿入される。
本発明に使用されるベクターＤＮＡは、受容菌で増殖し得るものの中から適宜選択できる。受容菌で増殖可能なプラスミドとしては、例えば pSC101〔プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.）、７０、３２４０（１９７３）〕、pBR322〔ジーン（Gene），４，１２１，（１９７８）〕などがあげられるが、とくに限定されるものではなく、新たに分離されたり合成されたりしたベクターＤＮＡであっても本発明の目的を達成し得るものであれば用いることが出来る。
これらのプラスミドベクターにパントテン酸生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入するには、ティー・マニアティスら、「モレキュラー  クローニング」（T.Maniatis et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,東大出版会、１９８２年）などに記載された公知の方法又はそれに準じる方法に従い行うことができる。
パントテン酸生合成系遺伝子が組み込まれたプラスミドベクターを受容菌へ導入する場合には、例えば〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.biol.），５３，１５９（１９７９）〕などに記載されているような公知の 形質転換法又はそれに準じる方法が採用できる。該受容菌の具体例としてはエシェリヒア・コリ  Ｃ６００株〔バクテリオロジー・レビュー（Bacteriol.Rev.）３６、５２５（１９７２）〕〕などの公知菌株が挙げられる。
【００１１】
形質転換株の中からパントテン酸生合成系遺伝子が挿入されているプラスミドが導入された形質転換株を選択するには、例えばＤＮＡ受容菌としてパントテン酸要求株を用い、形質転換によってパントテン酸を含有しない培地に生育し得る様になった菌株を選択すれば良い。又、プラスミドＤＮＡのマーカーの性質を合わせ持つ菌株を選別できるような培地を用いればより選別が容易である。この様にして得られたパントテン酸生合成系遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡは、その保有株から抽出し他の受容菌に導入したり、あるいは、抽出された組換えＤＮＡからパントテン酸生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製後、これを他のベクタープラスミドに連結して用いることが出来る。この様にして得られた形質転換株の例として、以下のような株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ3547/pFV31株（IFO  １５３７１）
エシェリヒア・コリ5714/pFV31株（IFO  １５３７２）
エシェリヒア・コリ 525/pFV31株（IFO  １５３７３）
エシェリヒア・コリ 814/pFV31株（IFO  １５３７４，FERM BP ４４０１）
エシェリヒア・コリ 521/pFV31株
エシェリヒア・コリ 221/pFV31株（IFO  １５５２４）
エシェリヒア・コリ6051/pFV31株（IFO  １５５２５）
エシェリヒア・コリ5069/pFV31株（IFO  １５５２６，FERM BP ４３９５）
上記のエシェリヒア・コリ3547/pFV31株はエシェリヒア・コリＦＶ５２５株由来のパントテン酸生合成系遺伝子が挿入されているプラスミドｐＦＶ３１をＩＦＯ３５４７株に導入した株であり、エシェリヒア・コリ5714/pFV31株はｐＦＶ３１をＦＶ５７１４株に導入した株、エシェリヒア・コリ525/pFV31株はｐＦＶ３ １をＦＶ５２５株に導入した株、エシェリヒア・コリ814/pFV31株はｐＦＶ３１ をＦＶ８１４株に導入した株である。エシェリヒア・コリ521/pFV31株はｐＦＶ３１をＦＶ５２１株に導入した株、エシェリヒア・コリ221/pFV31株はｐＦＶ３ １をＦＶ２２１株に導入した株、エシェリヒア・コリ6051/pFV31株はｐＦＶ３１をＦＶ６０５１株に導入した株、エシェリヒア・コリ5069/pFV31株はｐＦＶ５０６９株に導入した株である。
なお、本明細書においてＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）への寄託番号を、また、ＦＥＲＭ  ＢＰ−番号はブタペスト条約の下での工業技術院微生物工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号を表す。
【００１２】
以上の様にして得られた菌株を培養するには通常の静置培養法、振とう培養法（回転振とう培養法等）あるいは通気撹拌培養法などにより連続的あるいは間欠的に行うことができる。用いる培地は使用する微生物の生育し得る通常の組成のものでよく、炭素源には炭水化物、油脂、脂肪酸、有機酸あるいはアルコール類の中から資化し得るものを適宜選択し、単独あるいは混合して使用される。又窒素源には、例えばペプトン、大豆粉綿実粉、コーン・スティープ・リカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、尿素などの有機窒素源の他硫安、塩安、硝安、燐安などの無機窒素源が必要に応じて適宜混合してまたは単独で用いられる。また、燐源として燐酸１カリウム、燐酸２カリウムを用いるのが好都合である。培地には炭素源、窒素源、燐源の他生育に必要な金属塩（例、硫酸マグネシウム）、アミノ酸、ビタミンなどの生育必須因子や生育促進物質を通常添加しても良い。培養中のｐＨ及び泡の管理の目的で、塩基性物質例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸カルシウムなどを適宜添加することができ、又消泡剤の添加も有効である。上記は培養途上に適宜添加しても良い。さらに環境を好気状態にする目的で、酸素を通気するのも有効である。培養の温度は通常１５℃から４５℃、好ましくは２５℃から４０℃で培養するのが有利である。また、培養の時間は実質的にパントテン酸および／またはパント酸の蓄積量が最大になるまで行われるが、通常６時間から１２０時間の培養で目的を達することができる。
本発明によりＤ−パントテン酸を製造する際に原料物質であるβ−アラニンを当該菌体に接触させる方法として、菌株の培養開始前や培養途上の適当な時期に原料物質を添加する方法、あるいは菌体処理物に原料物質を適当な時期に添加する方法を用いることができる。菌体処理物とは、菌を培養して得られる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー、ポリアクリルアミドゲルまたはκ−カラギーナン包括固定化菌体などを言う。原料物質は水などの適当な溶剤の溶液または懸濁液として、あるいは粉末状として、一時あるいは一定時間にわたり連続的にまたは間欠的に添加される。
【００１３】
添加するβ−アラニンの濃度としては培地に添加する場合、微生物の生産能力に応じてβ−アラニンを添加するのが好ましいが、経済性を考慮すれば通常０．１〜５ｗ/ｖ％より好ましくは０．５〜３ｗ/ｖ％の濃度で添加するのがよい。
上記のような培養物あるいは反応物からＤ−パントテン酸またはその塩を単離する場合の採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例えば、培養液から菌体を除いた後、イオン交換樹脂処理、活性炭などを用いる吸着剤処理、晶析、塩析、電気透析などの公知操作を単独または適宜組み合わせてＤ−パントテン酸またはその塩を単離することができる。
なお、Ｄ−パントテン酸の遊離体が上記反応によって得られた場合は、常法によって塩に、また、Ｄ−パントテン酸の塩が反応によって得られた場合は、常法によりその遊離体へとそれぞれ変換することができる。
例えば、パントテン酸カルシウムは以下の方法によって単離することができる。
パントテン酸またはその塩を含有する培養液から菌体を除いた液を、カチオンを除去する目的でカチオン交換樹脂（例えば、ダイヤイオンＰＫ−２１６（Ｈ型）、ＰＫ−２２８（Ｈ型）（三菱化成製））のカラムに通し、次に無機アニオンおよびパントテン酸より酸性度の強い有機酸を除去する目的でアニオン交換樹脂（たとえば、ダイヤイオンＰＡ−４１２（ＯＨ型），ＷＡ−３０（ＯＨ型）（三菱化成製））のカラムに通す。この処理液（ｐＨ３±１）に水酸化カルシウムを添加し、ｐＨを中性付近（ｐＨ７±２）に調整した後、活性炭（例えば、白鷺Ａ（武田薬品製））を添加し、ろ過する。このろ液を濃縮し、適当量の低級アルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール）を添加した後、種晶を添加し、Ｄ−パントテン酸カルシウム結晶を晶出させ、この結晶を分離、乾燥することにより、Ｄ−パントテン酸カルシウム結晶を得ることができる。このＤ−パントテン酸カルシウム結晶の晶出収率が不十分な場合は、米国特許2,957,025(Jonathan O.Brooks 1960年10月18日出願)や特公昭４７−４９５７１の方法に 準じて、晶出前に塩化カルシウムを適宜添加することによって、Ｄ−パントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩を高収率かつ高純度で晶出させることもできる。ここで添加する塩化カルシウムは、無水、二水塩、六水塩のいずれの結晶でもよいが、無水、二水塩が好ましい。塩化カルシウムの添加量はパントテン酸カルシウムに対して、モル比で０．２〜５倍量、好ましくは１〜３倍量がよい。このパントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩に関しては、米国特許2,957,025(Jonathan O.Brooks 1960年10月18日出願)に、非吸湿性であり、かつ飼料添加 物として有効であることが記載されており、英国特許933,669に、錠剤中でパン トテン酸カルシウムより安定であることが記載されている。
【００１４】
このようにして得られたＤ−パントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩から塩化カルシウムを除去してＤ−パントテン酸カルシウムを高収率で得る方法は未だかつて報告はない。本発明者らはこの目的を完成させる種々の方法を鋭意検討した結果、極めて効率的な電気透析法を考案した。すなわち、アニオン透過膜として塩素イオンは通すがパントテン酸は通さないアニオン透過膜（例、一価選択性透過膜ネオセプタＡＣＳ（徳山曹達製））を用い、電極液として硝酸カルシウム水溶液を用いた電気透析をすることによって、Ｄ−パントテン酸カルシウム・塩化カルシウム複塩の水溶液から塩化カルシウムを効率的に除去できることを見出した。この複塩を水に溶解する時の濃度は任意の濃度でかまわないが、通常１％（ｗ／ｖ）から６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で溶解すればよい。この電気透析処理で得られたＤ−パントテン酸カルシウム水溶液を、スプレー乾燥法などの慣用方法に付すことによって、Ｄ−パントテン酸カルシウムの粉末を得ることができる。
このような方法により、培養液からＤ−パントテン酸カルシウムを効率よく単離することができる。
Ｄ−パント酸の分離方法としては、たとえば培養液から菌体を除いた後、硫酸または塩酸でｐＨ１〜２とし、パント酸の閉環体であるパントラクトンに導き、溶媒（酢酸イソプロピル、酢酸エチルなど）にて抽出後、濃縮および晶出の操作により結晶を得ることができる。なお、得られたパントラクトンは水酸化ナトリウムなどを加えることによって容易にパント酸へ戻すことができる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明の内容をより具体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内容を例示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
なお、Ｄ−パントテン酸の定量は高速液体クロマトグラフィ−法〔カラム：島津ＳＣＲ１０１Ｈ(7.9mmφ*30cm) ；  移動層：０．００８Ｎ硫酸；  流量：０．８ml/min；検出：示差屈折計〕および／または微生物学的定量法（Bioassey）〔被検菌：ラクトバチルス・プランタラム（Lactbacillus plantarum）IFO 3070；培地：市販パントテン酸定量用培地（ＤＩＦＣＯ製）〕で行った。またパント酸の定量、および光学純度の測定は培養液より遠心分離により菌体を除いた後、上清液に６Ｎ−塩酸を加え、８０℃湯浴中にてにて１５分間加熱（この操作により平衡状態で存在するパント酸はパントラクトンに変換される。）後、酢酸エチルで抽出し、高速液体クロマトグラフィー法〔カラム：SUMICHIRAL OA-1200；移動層：n-ヘキサン／1,2-ジクロロエタン／エタノール=90/8/2；流量：１．０ml/min；検出：ＵＶ〕にて行った。
【００１６】
実施例１
〔表４〕に示す組成からなる滅菌第一シード培地２０ｍｌを含む２００ｍｌ容三角フラスコにエシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７株、ＦＶ５７１４（ＩＦＯ  １５３６８）株、ＦＶ５２５（ＩＦＯ  １５３６９）株、ＦＶ８１４（ＩＦＯ  １５３７０）株及びＦＶ５２１株をそれぞれ斜面培地からおのおの一白金耳量接種して、３０℃で２０時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この第一シード培養物１ｍｌを、〔表５〕に示す組成からなる滅菌培地２０ｍｌをふくむ２００ｍｌ容ひだ付き三角フラスコに移植し、３８℃にて２０時間培養した。ここで５４％グルコース水溶液を各フラスコに２．５ｍｌ添加し、更に培養を２４時間継続した。培養終了後のパント酸及びその光学純度およびパントテン酸蓄積量を〔表６〕に示す。
【００１７】
実施例２
〔表４〕に示す組成からなる滅菌第一シード培地２０ｍｌを含む２００ｍｌ容三角フラスコにエシェリヒア・コリＦＶ２２１株およびＦＶ６０５１、ＦＶ５０６９株を斜面培地からおのおの一白金耳量接種して、３０℃で２０時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この第一シード培養物２ｍｌを、〔表７〕に示す組成からなる滅菌培地４０ｍｌをふくむ２００ｍｌ容ひだ付き三角フラスコに移植し、３８℃にて２０時間培養した。ここで５４％グルコース水溶液を各フラスコに５ｍｌ添加し、更に培養を２４時間継続した。培養終了後のパント酸及びその光学純度およびパントテン酸蓄積量を〔表８〕に示す。
【００１８】
実施例３
ｉ）染色体ＤＮＡの調製
Ｄ−パントテン酸の生成能を有するエシェリヒア・コリＦＶ５２５株を１リットルのＬ培地（バクト・トリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％）に接種し、３７℃で一夜培養し、得られた菌体からフェノールを用いるサイトーらの方法（Biochim.Biophys.acta.72,619(1963)）によって最終 ３．３ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
ii）染色体ＤＮＡのベクタープラスミドｐＭＷ１１８への挿入
以後の実験における実験操作の方法は、とくに断りのないかぎりティー・マニアティスら、「モレキュラー  クローニング」（東大出版会発行、１９８２年）に記載の方法に従った。
上記 i)項で得た染色体ＤＮＡ１０μｇとｐＭＷ１１８（ニッポンジーン製） を制限酵素 Eco RI（ニッポンジーン製）を用いてそれぞれ切断した後、両者を 混合してＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（ニッポンジーン製）によって連結させた。
iii）パントテン酸生合成系遺伝子のクローニング
形質転換には、コンピテントセル法を用いた。すなわち、エシェリヒア・コリＣ６００株からニトロソグアニジン変異処理によって誘導したＤ−パントテン酸要求株Ａ４Ｃ株（ＩＦＯ  １５２５１，ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６７７）を用いてコンピテントセルを調製し、その懸濁液に上記 ii）項で作製したプラスミドＤＮ Ａを加えて取り込ませ、形質転換を行わせた。次にこの形質転換株を含む懸濁液をアンピシリン・ナトリウム塩５０μｇ／ｍｌを含むＭ−９寒天培地（燐酸水素２ナトリウム０．６％、燐酸２水素カリウム０．３％、塩化アンモニウム０．１％、塩化ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム１ｍＭ，塩化カルシウム０．１ｍＭ，グルコース０．５％、ビタミンＢ1１０μｇ／ｍｌ、トレオニン５０ μｇ／ｍｌ，ロイシン５０μｇ／ｍｌ、及び寒天１．５％  ｐＨ７．２）の平板培地上に塗布して３７℃にて２日間培養した。平板培地上に生じたコロニーからアンピシリン耐性、およびＤ−パントテン酸生成能を有する形質転換株を得た。エシェリヒア・コリＦＶ５２５株染色体ＤＮＡ由来の挿入断片を持つプラスミドで形質転換されたＡ４Ｃ株をＡ４Ｃ／pFV31株と命名した（ＩＦＯ１５３６７）。
【００１９】
iv）形質転換株からのプラスミド抽出
形質転換株エシェリヒア・コリ  A4C/pFV31株の培養液１リットルより最終的 にそれぞれ６００μｇのプラスミドを得、ｐＦＶ３１と命名した。
v)プラスミドｐＦＶ３１の解析
ｐＦＶ３１を種々の制限酵素で切断し、ラムダファージのＤＮＡ（ニッポンジーン製）Hind III  分解物の分子量を基準にするアガロースゲル電気泳動のパターンから〔図１〕に示すような制限酵素切断地図を得た。ｐＦＶ３１はｐＭＷ１１８の EcoRIサイトに約２．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドであった。
vi)再形質転換
ｐＦＶ３１上にパントテン酸生合成系遺伝子が存在することを確認するために、上記プラスミドＤＮＡを用いて、エシェリヒア・コリＣ６００株からニトロソグアニジン変異処理によって誘導したα−ケトパント酸要求株Ａ１Ｂ、β−アラニン要求株Ａ１７Ｄ株およびパントテン酸要求株Ａ４Ｃ株を再度形質転換した。形質転換株はいずれも上記のＭ−９寒天培地で生育可能となり、ｐＦＶ３１上には Ketopantoate hydroxymethyltransferase、Aspartate-α-Decarboxylase、Pantothenate Synthase  遺伝子が存在することが確認された。  さらに、形質転換株のパントテン酸生成能に及ぼす影響を確認するためにｐＦＶ３１を用いてエシェリヒア・コリ  ＩＦＯ３５４７株、ＦＶ５７１４、ＦＶ５２５、ＦＶ８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２１、ＦＶ６０５１及びＦＶ５０６９を形質転換した。得られた形質転換株をそれぞれエシェリヒア・コリ3547/pFV31株、5714/pFV31株、525/pFV31株、814/pFV31株、521/pFV31株、221/pFV31株、6051/pFV31株、5069/pFV31株と命名した。
【００２０】
実施例４
〔表４〕に示す組成の液体培地をオートクレーブ中１２１℃で１５分間加熱滅菌し、２００ｍｌ容三角フラスコに２０ｍｌずつ分注した。ここに斜面培地から、実施例３の vi)で得られたエシェリヒア・コリ3547/pFV31株、5714/pFV31株、525/pFV31株、814/pFV31株、521/pFV31株をそれぞれ１白金耳量接種し、３０℃で２０時間、２２０rpmで回転振とう培養した。このシード培養物１ｍｌを〔表４〕に示す組成の培地２０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容ひだ付き三角フラスコ中で３８℃にて２０時間培養した。ここで５４％グルコース水溶液を各フラスコに２．５ｍｌずつ添加し、更に培養を２４時間継続した。培養終了後のパント酸およびその光学純度およびパントテン酸蓄積量を〔表９〕に示す。
【００２１】
実施例５
〔表４〕に示す組成の液体培地をオートクレーブ中１２１℃で１５分間加熱滅菌し、２００ｍｌ容三角フラスコに２０ｍｌずつ分注した。ここに斜面培地から、実施例３の vi)で得られたエシェリヒア・コリ221/pFV31株、6051/pFV31株、5069/pFV31株をそれぞれ１白金耳量接種し、３０℃で２０時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。このシード培養物２ｍｌを〔表７〕に示す組成の培地４０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容ひだ付き三角フラスコ中で３８℃にて２０時間培養した。ここで５４％グルコース水溶液を各フラスコに５ｍｌずつ添加し、更に培養を２４時間継続した。培養終了後のパント酸およびその光学純度およびパントテン酸蓄積量を〔表１０〕に示す。
【００２２】
実施例６
〔表４〕に示す組成からなる滅菌第一シード培地２０ｍｌを含む２００ｍｌ容三角フラスコにエシェリヒア・コリ814/pFV31株を斜面培地から一白金耳量接種して、３０℃で２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この第一シード培養物２０ｍｌを、同じ組成の滅菌第二シード培地２００ｍｌを含む１０００ｍｌ容三角フラスコに移植し、３０℃にて２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この第２シード培養物１２５ｍｌをグルコース２５０ｇ、コーン・スチープ・リカー１２．５ｇ、硫酸アンモニウム３７．５ｇ、燐酸１カリウム１．２５ｇ、燐酸２カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、炭酸カルシウム７５ｇ、β−アラニン３３ｇ（ｐＨ７．０）を含む滅菌培地２．３リットルを含む５リットル容ジャーファーメンターに移植し、３８℃で通気（0.8Vol/Vol/Min）撹拌（800rpm）培養を開始した。培養開始後１６時間目から６２時間目にかけて、グルコースを濃度が２−３％に保てるよう連続的に添加した。６８時間培養を行った結果、最終液量２．５リットルとなり、Ｄ−パントテン酸生成量は３８．５ｇ／リットルであった。
【００２３】
実施例７
実施例６で得られた発酵液のうち２．０リットル（Ｄ−パントテン酸を７７．０ｇ含有）を加熱（８０℃、１０分）後、ろ過して菌体および不溶物を除き、洗浄液と合わせた２．４リットルを、ダイヤイオンＰＫ−２１６（Ｈ型）を６００ｍｌ充填したカラムに通過させ、次にダイヤイオンＰＡ−４１２（ＯＨ型）３４０ｍｌ充填したカラムに通過させ、水押し出し液と合わせて４．１リットルの処理液（ｐＨ３．２）を得た。この処理液に水酸化カルシウムを加え、ｐＨを６．８に調整した後、活性炭（白鷺Ａ）５ｇを添加し、ろ過した。ろ液と洗浄液とをあわせた４．２リットルの液は、７５．１ｇのＤ−パントテン酸を含有しており、この数値から計算するとＤ−パントテン酸カルシウムとして８２．０ｇ含有している。この液を晶出原料液とする。
この晶出原料液４．２リットルのうち２．１リットル（Ｄ−パントテン酸カルシウムとして４１．０ｇ含有）を、Ｄ−パントテン酸カルシウムとして約４３％（ｗ／ｗ）となるまで減圧濃縮した。これにメタノールを４１０ｍｌ添加後、種晶０．５ｇを加え、３０℃で５時間ゆっくりとかくはんした。その後、５℃で１４時間放置した後、結晶をろ過、乾燥した。得られた結晶の重量は６．３ｇ、結晶純度は９８．５％であった。
【００２４】
実施例８
実施例７で得られた晶出原料液４．２リットルのうちの２．１リットル（Ｄ−パントテン酸カルシウムとして４１．０ｇ含有）を、Ｄ−パントテン酸カルシウムとして約４３％（ｗ／ｗ）となるまで減圧濃縮した。これにメタノールを１００ｍｌ添加し、よく混合した後、塩化カルシウム２水塩３７．９４ｇを溶解したメタノール液３１０ｍｌを添加し、種晶０．５ｇを添加して、５０℃で５時間ゆっくりとかくはんした後、結晶をろ過、乾燥した。得られた結晶の重量は４１．９５ｇで、Ｄ−パントテン酸  ７４．３％（ｗ／ｗ）、Ｃａ  １３．６％（ｗ／ｗ）、Ｃｌ  １２．１％（ｗ／ｗ）の組成であった。このことから、この結晶は、Ｄ−パントテン酸カルシウムと塩化カルシウムのモル比が１：１の複塩である。
この複塩４０ｇを約２リットルの水に溶解し、電気透析機〔ＴＳ−２−１０型（徳山曹達）；カチオン透過膜：ネオセプタＣＭ−１；アニオン透過膜：ネオセプタＡＣＳ；電極液：０．２Ｎ硝酸カルシウム水溶液；流速：０．３リットル／分；電圧：１０Ｖ〕を用いて、電気透析をした。その結果、塩化カルシウムが系外へ除去され、Ｄ−パントテン酸とカルシウムのモル比が２：１であるＤ−パントテン酸カルシウム水溶液（ｐＨ７．０）が得られた。このＤ−パントテン酸カルシウム水溶液を、濃度が約５０％（ｗ／ｗ）になるまで減圧濃縮した後、スプレー乾燥機で噴霧乾燥することにより、Ｄ−パントテン酸カルシウムの粉末３４．０ｇを得た。この粉末のＤ−パントテン酸カルシウムとしての純度は９９．８％（ｗ／ｗ）、〔α〕D＝＋２８．１（ｃ＝５、Ｈ2０）であった。
【００２５】
実施例９
〔表４〕に示す組成からなる滅菌第一シード培地２０ｍｌを含む２００ｍｌ容三角フラスコにエシェリヒア・コリ  5069/pFV31株を斜面培地から一白金耳量接種して、３０℃で２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。この第一シード培養物２０ｍｌを、同じ組成の滅菌第二シード培地２００ｍｌを含む１０００ｍｌ容三角フラスコに移植し、３０℃にて２４時間、２２０ｒｐｍで回転振とう培養した。 この第２シード培養物７５ｍｌをグルコース７５ｇ、コーン・スチープ・リカー３０ｇ、硫酸アンモニウム２２．５ｇ、燐酸１カリウム０．７５ｇ、燐酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、炭酸カルシウム４５ｇ、ビタミンＢ1０．７５ｍｇ、β−アラニン１５ｇ（ｐＨ７．０）を含む滅菌培地１．３５リットルを含む３リットル容ジャーファーメンターに移植し、３８℃で通気（0.8Vol/Vol/Min）撹拌（700rpm）培養を開始した。培養開始後１５、２７、３８．５時間目にグルコースを濃度が５％になるように間欠的に添加した。また培養開始後２７、４６．５時間目に１％濃度に相当するβ−アラニンを添加した。さらに培養開始後３０、５０時間目に０．７５ｍｇのビタミンＢ1を添加した。７２時間培養を行った結果、最終液量１．５８リットルとなり、Ｄ−パントテン酸生成量は６５．４ｇ／リットルであった。
【００２６】
【表１】
0003710497.tif 000002
【表２】
0003710497.tif 000003
【表３】
0003710497.tif 000004
【表４】
0003710497.tif 000005
【表５】
0003710497.tif 000006
【表６】
0003710497.tif 000007
【表７】
0003710497.tif 000008
【表８】
0003710497.tif 000009
【表９】
0003710497.tif 000010
【表１０】
0003710497.tif 000011
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＬ−パント酸やＤＬ−パントラクトン等を原料として用いることなく微生物学的に直接Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸またはそれらの塩が効率的に得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は実施例２で得たプラスミドｐＦＶ３１の制限酵素切断地図を示す。
【符号の説明】
Ｅ  はＥｃｏＲI
ＥＶはＥｃｏＲＶ
Ｐ  はＰｖｕII
Ｂ  はＢｇｌII
【図１】
0003710497.tif 000012