(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低められた腎毒性を有するアプロチニン類似体であって、低められた実効正電荷を付与せしめるために、位置12−18及び34−39と定義された、プロテアーゼ結合部位、以外の、少なくとも１個の正荷電アミノ酸残基が除去されたか又は中性もしくは負荷電アミノ酸残基に置き換えられたか、及び／あるいは少なくとも１個の負荷電アミノ酸残基が挿入又は付加されたか、及び／あるいは少なくとも１個の中性アミノ酸残基が負荷電アミノ酸残基に置き換えられており、アプロチニン（１−58;42Ser）、アプロチニン（３−58）、アプロチニン（３−58;42Ser）、DeArg−１−アプロチニン、アプロチニン（52Glu）、Met−アプロチニン（52Glu）、アプロチニン（23Asp）及びアプロチニン（22Leu＋24Asp）を除くアプロチニン類似体。
【請求項２】
一般式Ｉを有する請求項１に記載のアプロチニン類似体：
【化１】
0003614850.tif 000045
（ここで、
R1は、Arg−Pro,Glu−Pro,Asp−Pro,Ala−Pro,Ile−Pro,Thr−Pro,His−Pro,Leu−Pro,Gly−Pro及びSer−Proより成る群から選ばれるジペプチド、Pro又は水素であり、
R2はTyr,Glu,Asp,Ser,Thr,Ala及びValより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R3はArg,Glu,Asp,Leu,Ser,Ala,Gln及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R4はAsn,Glu及びAspより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R5はLys,Glu,Asp,Thr,Val,Ala,Ser,Phe,Gln及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R6はGln,Glu,Asp,Val及びAlaより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R7はAla,Asp,Glu及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R8はLys,Glu,Asp,Asn,Ser,Thr及びAlaより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R9はArg,Glu,Asp,Ser,Asn,Leu,Gly,Gln,Met及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R10はAsn,Glu及びAspより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R11はLys,Glu,Asp,Leu,Tyr,Ala,Val,Thr,Ser,Pro,His及びIleより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、そして
R12はArg,Glu,Asp,Gln,Ala,Asn,His,Gly,Ser及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基である）。
【請求項３】
１又は複数個の負荷電又は中性アミノ酸残基を含有するペプチドが前記アプロチニン分子のＮ−末端に付加されている、請求項１に記載のアプロチニン類似体。
【請求項４】
１又は複数個の負荷電又は中性アミノ酸残基を含有するペプチドが前記アプロチニン分子のＣ−末端に付加されている、請求項１に記載のアプロチニン類似体。
【請求項５】
低められた腎毒性を有するアプロチニン類似体であって、低められた実効正電荷を付与せしめるために、位置12−18及び34−39と定義された、プロテアーゼ結合部位、以外の、少なくとも１個の正荷電アミノ酸残基が除去されたか又は中性もしくは負荷電アミノ酸残基に置き換えられたか、及び／あるいは少なくとも１個の負荷電アミノ酸残基が挿入又は付加されたか、及び／あるいは少なくとも１個の中性アミノ酸残基が負荷電アミノ酸残基に置き換えられており、前記プロテアーゼ結合部位以外の改質に加えて、前記プロテアーゼ結合部位における１又は複数個のアミノ酸の、それぞれ、１又は複数個の他のアミノ酸による置き換えにより改質されており、
ヒトアプロチニン（15Arg＋17Arg＋18Ile＋39X＋52Glu）、ここで、Ｘ＝Arg又はLys、
アプロチニン（15X＋52Glu）、ここで、Ｘ＝Val,Arg,IleまたはLeu、
アプロチニン（３−58;17Ala＋19X＋42Y）、ここで、Ｘ＝IleでＹ＝Ser又はＸ＝GluでＹ＝ArgもしくはSer、
アプロチニン（３−58;15Arg＋42Ser）、
アプロチニン（15Arg＋17X＋42Ser）、ここで、Ｘ＝Ala又はArg、
アプロチニン（17Ala＋19Glu）、
アプロチニン（15X＋17Leu＋39Y＋52Glu）、ここで、Ｘ＝Val又はLeuで、Ｙ＝Arg又はGlu、
Met−アプロチニン（15X＋52Glu）、ここで、Ｘ＝Val,Ile及びLeu、
アプロチニン（17Lys＋18Met＋29Phe＋31Glu＋39Lys＋42Ser＋46Arg）、
（Glp−１）アプロチニン（18Met＋32Pro＋42Ser）及び
アプロチニン類似体であって、位置17のArgがThr又はProで置き換えられ、位置29のLeuがAsp又はAsnで置き換えられ、位置42のArgがSerにより置き換えられ、位置46のLysがArgにより置き換えられた類似体を除くアプロチニン類似体。
【請求項６】
一般式IIを有する請求項５に記載のアプロチニン類似体：
【化２】
0003614850.tif 000046
（ここでR1−R12は請求項２記載の通りであり、
R13はLys,Arg,Glu,Leu,Met,Tyr及びPheより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R14はAla及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R15はArg,Ala,Gly,Lys,Leu,Met,Phe,Tyr,Ile及びAsnより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R16はIle,Met,Leu,Phe,Thr及びGluより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R17はIle,Leu,Lys,Gln,Glu,Ser,Arg,Thr及びAsnより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R18はVal,Thr,Leu,Ser,Tyr,Gln,His,Pro,Phe,Asn,Ile及びLysより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R19はGly,Thr及びSerより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、そして
R20はGln,Lys,Met,Asn,Leu,Gly及びGluより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
アミノ酸残基R1−R12の少なくとも１つ、及びアミノ酸残基R13−R20の少なくとも１つは天然アプロチニンの対応のアミノ酸残基と異なることを条件とする）。
【請求項７】
R1がGlu−Pro,R5がGlu,R8がGlu,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R9,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項８】
R1がGlu−Pro,R9がGlu,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項９】
R9がGlu,R11がGlu、そしてR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１０】
R2がSer,R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R8がAsn,R12がGlu,そしてR1,R3,R7,R9,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１１】
R2がSer,R3がLeu,R7がGly,R8がAsn,R9がGly,R10がGlu,R11がTyr、そしてR1,R4,R5,R6及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１２】
R1が水素、R9がSer,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１３】
R1が水素、R9がSer,R11がAla、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１４】
R1が水素、R2がSer,R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R8がAsn,R12がGlu、そしてR3,R7,R9,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１５】
R1が水素、R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R12がGlu、そしてR2,R3,R7,R8,R9,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１６】
R1が水素、R2がSer,R7がGly,R8がAsn,R9がGly,R12がGlu、そしてR3,R4,R5,R6,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１７】
R1が水素、R9がSer,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１８】
R1が水素、R9がGlu,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項１９】
R1が水素、R5がGlu,R9がSer,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項２０】
R1が水素、R5がGlu,R9がGlu,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである、請求項２に記載のアプロチニン類似体。
【請求項２１】
請求項１−20のいづれか１項に記載のアプロチニン類似体をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体。
【請求項２２】
請求項21に記載のDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項２３】
請求項22に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２４】
請求項23に記載の細胞を、前記アプロチニン類似体の発現をもたらす条件のもとで培養し、次いでこの培養物から得られる類似体を回収することを含んで成る、請求項１−20のいづれか１項に記載のアプロチニン類似体を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はアプロチニン類似体、この類似体を製造する方法、及び医薬品の調製におけるその利用に関する。
発明の背景
アプロチニン（牛膵臓トリプシンインヒビター、BPTIとしても知られている（はいくつかの牛器官及び組織、例えばリンパ節、膵臓、肺、耳下腺、脾臓及び肝臓に存在している塩基性タンパク質である。これは以下のアミノ酸残基を有する58個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。
0003614850.tif 000002
このアミノ酸鎖はCys（５）とCys（55）,Cys（14）とCys（38）及びCys（30）とCys（51）の間でそれぞれ形成されている三つのジスルフィド架橋により架橋している。
アプロチニンの等電点はかなり高い（約pI10.5）。これは主として正に荷電しているアミノ酸のリジン及びアルギニンの相対的に高い含有量に原因する。アプロチニン分子の三次元構造は非常にコンパクトであり、高温、又は酸、アルカリもしくは有機溶剤による変性に対して、又はタンパク質分解に対して非常に安定である（B.Kassell,Meth.Enzym. 19,1970、頁844−852を参照のこと）。
アプロチニンはトリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害することで知られ、そして急性膵臓炎、種々のショック症候状態、線溶亢進出血及び心筋梗塞の処置において治療的に利用されている（例えばJ.E.Trapnellら、Brit.J.Surg. 61,1974、頁177;J.McMichenら、Circulatory shock ９,1982、頁107;L.M.Auerら、Acta Neurochir. 49,1979、頁207;G.Sher,Am J.Obstet.Gynecol. 129,1977、頁164;及びB.Schneider,Artzneim.−Forsch. 26,1976、頁1606）を参照のこと。高投与量におけるアプロチニンの投与は心肺バイパス手術を含む心臓外科に関連する血液の損失を有意に低める（例えばB.P.Bidstrupら、J.Thorac.Cardiovasc.Surg. 97,1989、頁364−372;W.van Oeverenら、Ann.Thorac.Surg. 44,1987、頁640−645）を参照のこと。
いくつかのアプロチニン類似体が知られており、例えば米国特許第4,595,674号は、Lys（15）がGly,Ala,Val,Leu,Ile,Met,Arg,L−α−酪酸、Ｌ−ノルバリン、Ｌ−ノルロイシン、デヒドロアラニン又はＬ−ホモセリンに置き換えられているアプロチニン類似体及び誘導体を開示している。EP238993号は、Lys（15）がArg,Val,Ile,Leu,Phe,Gly,Ser,Trp,Tyr又はAlaに置き換えられており、そして更にMet（52）がGlu,Val,Leu,Thr又はSerにより置き代えられているアプロチニン類似体を開示している。EP307592号は位置15,16,17,18,34,39及び52における１又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸残基に置き換えられているアプロチニン類似体を開示する。WO 89/01968号は酵母においてアプロチニン又はアプロチニン類似体を生産する方法を開示しており、そして特にＮ−末端にて１又は２個のアミノ酸残基を欠失し、且つLys（41）及び／又はArg（42）が別のアミノ酸残基、特にSerに置き換えられている類似体を開示している。EP339942号は、位置1,2,12−19,38,41及び42における１又は複数のアミノ酸が欠失しているか、又は別のアミノ酸残基に置き換えられているアプロチニン類似体を開示する。これらの文献の中に詳細されているアミノ酸置換はアプロチニンのプロテアーゼ阻害プロフィールを変更する目的でこのアプロチニン分子のプロテアーゼ結合領域において主として見い出されるが、ただしEP238993号に関するMet（52）の置換並びにWO 89/01968号に関するLys（41）及び／又はArg（42）の置換は、E. コリ（E. coli）及び酵母それぞれにおけるアプロチニンの生産の促進のために実施されている。EP339942はプロテアーゼ結合特性を変えることに注目して、１又は複数の位置12−19において改質されたアプロチニン類似体を開示している。これらの類似体は更に、Ｎ−末端にて１又は２個のアミノ酸残基を欠き、更に／又はLys（41）及び／もくしはArg（42）が別の残基に置き換えられていることがある。
発明の原理
動物又は人ボランティアにおけるアプロチニンの静脈注射の後に、このインヒビターの血漿レベルは細胞外流体における分散に原因してやや急速に減少し、その後腎臓において蓄積することが既に述べられている（I.Trautscholdらの
0003614850.tif 000003
Pathogenese,Diagnostik,Klinik und Therapie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas,Schattauer,Stuttgart,1964、頁289;E.Habermannら、Med.Welt 24（29）,1973、頁1163−1167;H.Fritzら、Hoppe−Seylers Z.Physiol.Chem. 350,1969、頁1541−1550;及びH.Kallerら、Eur.J.Drug Metab.Pharmacokin. ２,1978、頁79−85）。糸球濾過に続いて、アプロチニンはほぼ定量的に近位小管細胞（proximal tubulas cell）の刷子縁膜に結合する。次にアプロチニンは微小吸水細胞小胞及び食細胞の中に再吸収され、次いでファゴリソソームの中で非常にゆっくりと分解される。このタイプの輸送は一般のペプチドに関する代表例と考えられる（M.JustとE.Habermann,Navnyn−Scmiedebergs Arch.Pharmacol. 280,1973、頁161−176;M.Just,Navnyn−Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 287,1975、頁85−95）。
アプロチニンの投与後の目視及び組織病理学的検査は、比較的大量のアプロチニンの繰り返し注射後のラット、ウサギ及びイヌの腎臓組織において変化を示す
0003614850.tif 000004
アプロチニン関して観察される腎毒性（とりわけ病巣の症状において現われる）は、腎臓の近位小管細胞におけるアプロチニンの蓄積に原因しうる。この腎毒性は臨床目的、特に大量のこのインヒビターの投与を必要とするとき（例えば心肺バイパス手術）にとってアプロチニンを不適切なものとする。
従って、天然アプロチニンと比べて低い腎毒性を有するアプロチニン類似体を作ることについてかなりの感心がもたられている。
発明の概要
本発明は低められた腎毒性を有するアプロチニン類似体に関連し、ここで、低められた実効正電荷を提供するために、プロテアーゼ結合部位以外の少なくとも１個の正荷電アミノ酸残基を除去するか、又は中性もしくは負荷電アミノ酸残基に置き換えるか、及び／あるいは少なくとも１個の電荷電アミノ酸残基を挿入又は付加するか、及び／あるいは少なくとも１個の中性アミノ酸残基を負荷電アミノ酸残基に置き換え、更に／あるいはここで、低められた安定性を提供するためには、１もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失させるか、付加するか、又は別の１もしくは複数個のアミノ酸残基に置き換える。
本明細書において、「低められた実効正電荷」とは、天然アプロチニン（これは＋６の実効正電荷を有する）よりも低い実効正電荷を有する類似体、及び実効正電荷を有さない又は実効負電荷を有するものを含んでいることが理解される。アプロチニンの実効電荷はpHに従って変わることに注目すべきであり、従って「実効正電荷」、「実効負電荷」「正荷電」又は「負荷電」なる語は、中性pHでのこの分子の電荷について用いている。
「プロテアーゼ結合部位」なる語は、プロテアーゼ阻害にとって重要であるアミノ酸残基、即ち、酵素活性部位のアミノ酸残基又はその近くに結合することによってプロテアーゼと密接に接触するアミノ酸残基を意味すること意図する。これは一般に位置12−18及び34−39におけるアミノ酸残基を含むと現状理解されている（そして本明細書ではそのように定義する）（H.FritzとG.Wunderer,Artzneim.−Forsch. 33（１）,1983、頁484を参照のこと）。本発明の類似体のプロテアーゼ阻害プロフィールが天然アプロチニンのそれと比べて実質的に変わることを避けるだけのために、このプロテアーゼ結合部位以外のアミノ酸残基を除去、挿入又は変換することが好ましい。
低められた実効正電荷を有するアプロチニン類似体は天然アプロチニンよりも有意に低い腎毒性を有することが驚くべきことに発見された。この低い腎毒性の一つの理由は、低い実効正電荷を有するアプロチニン類似体は近位小管の表層（刷子縁膜）に対する低い結合親和力を有し、従って尿において大量に排せつされうるからである。この解釈は、天然アプロチニンほど塩基性でない化学修飾アプロチニン誘導体（テトラマレオイル−及びペンタマレオイル誘導体）が単離化刷子縁画分に結合せず、尿において大量に排せつされることを報告しているH.Fritzら（前述）の発見と一致している。
他方、この化学修飾アプロチニンはアプロチニン及びその他の天然タンパク質とは、それがあらゆる天然高分子において見い出されないアミノ酸の誘導体を含むことで大きく相違する。従って、この化学修飾誘導体が腎臓に蓄積しないのが、低められた実効正電荷以外のこの修飾誘導体の変化した性質に原因しうるとの可能性を無視するべきでない。
その他のペプチドは、正電荷アミノ酸を含む及び／又は実効正電荷を有するにもかかわらず、低い親和力及び容量で刷子縁に結合することが見い出されている。このことは、アプロチニンの実効正電荷が、近位小管細胞におけるアプロチニンの結合及び蓄積にとっての唯一の説ではないことを示唆する。（M.Justら、1st.Sym.Physiol.,Prop.Pharmacol.Ration.:Kininogenases,Schattauer,Stuttgart 1973頁1163−1167）。
更に、低められた熱的安定性を有するアプロチニン類似体は天然アプロチニンほど腎組織に蓄積しないことが驚くべきことに見い出された。前記した通り、アプロチニンの三次元構造は非常にコンパクトであり、このことはこのインヒビターを変性及びタンパク質分解に対して非常に安定にする。従って、腎臓におけるアプロチニンの蓄積はインヒビターの異常な安定性の結果でもありうる。それ故、アプロチニン分子における１又は複数のアミノ酸残基の置換は、天然分子に比べて低められた安定性を有するアプロチニン類似体の形成をもたらしうる可能性がある。本明細書において、「低められた安定性」とは、選別目的のために、約４〜10のpHの水性溶液におけるこの類似体の低められた熱的安定性として表現する。かかる低められた安定性のインビボ効果はこの類似体が分解、例えばタンパク質分解をより受け易くすることがあり、近位小管からのこの類似体の迅速な消失をもたらす。
本発明の類似体の低められた腎毒性は、この分子の低められた実効正電荷と低められた安定性との組合せによるものと現状考えられている。
天然アプロチニンの投与により発生する腎臓への損傷の寄与原因は、アプロチニンが糸球膜上に、この膜表層の負荷電構造に対する親和力に基づいて蓄積することにありうる。このことは拡大した孔径の糸球をもたらし、その結果として大きめの分子、例えばアルブミンに対する高められた浸透性をもたらすことがあり、換言するならば腎臓のタンパク質過剰負荷をもたらしうる。本発明のアプロチニン類似体は天然アプロチニンよりも弱い、糸球膜の孔径に対する損傷作用を有し、その理由はこの膜における負荷電構造に対する低められた親和力にある。
更に、あるケースにおいてアプロチニンの投与はアナフィラキシー応答をもたらすことが観察されている。このアナフィラキシー応答は、アプロチニンの実効正電荷により生ずることがあるヒスタミンの放出に関連すると仮定されている。従って、天然アプロチニンの投与関連すると推定されているこのアナフィラキシー応答は、本発明のアプロチニン類似体の投与によっては低められる又はなくなることさえもあると考えられる。
発明の詳細な説明
本発明に関して、プロテアーゼ結合部位以外の任意の正荷電アミノ酸残基を、負荷電アミノ酸残基GluもしくはAspにより、又は任意の中性アミノ酸残基Ala,Cys,Phe,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Pro,Glu,Ser,Thr,Val,TrpもしくはTyhにより置き換えることがある。しかしながら不活性な類似体、又は分子の所望されない折りたたみにより生ずる不適切な三次元構造を有する類似体を回避するため、その他のプロテアーゼインヒビターの対応の位置における、又は天然アプロチニンと高い程度の相同性を示すより大きな構造ドメインにおけるアミノ酸残基と同じ置換を選択することが好ましい。換言すれば、アミノ酸残基の置換の選択は、アプロチニンと相同である分子の分析に基づくことが好ましい。実効正電荷の低下直接寄与するアミノ酸残基に付随して、それ自体は実効正電荷の低下をもたらさないが、適切な三次元構造を有する活性な類似体を提供するのに必要とされうる１又は複数のその他のアミノ酸の置換を行うことがあることに注目すべきである。
従って、より詳しい観点において、本発明は一般式Ｉを有するアプロチニン類似体に関する：
0003614850.tif 000005
（ここで、
R1は、Arg−Pro,Glu−Pro,Asp−Pro,Ala−Pro,Ile−Pro,Thr−Pro,His−Pro,Leu−Pro,Gly−Pro及びSer−Proより成る群から選ばれるジペプチド、Pro又はペプチド結合であり、
R2はTyr,Glu,Asp,Ser,Thr,Ala及びValより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R3は、Arg,Glu,Asp,Leu,Ser,Ala,Gln及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R4はAsn,Glu及びAspより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R5はLys,Glu,Asp,Thr,Val,Ala,Ser,Phe,Gln及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R6はGln,Glu,Asp,Val及びAlaより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R7はAla,Asp,Glu及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R8はLys,Glu,Asp,Asn,Ser,Thr及びAlaより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R9はArg,Glu,Asp,Ser,Asn,Leu,Gly,Gln,Met及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R10はAsn,Glu及びAspより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R11はLys,Glu,Asp,Leu,Tyr,Ala,Val,Thr,Ser,Pro,His及びIleより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、そして
R12はArg,Glu,Asp,Gln,Ala,Asn,His,Gly,Ser及びThrより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
ここでアミノ酸残基R1−R12の少なくとも１つは天然アプロチニンの対応のアミノ酸残基と異なることを条件とする）。
アプロチニン分子におけるこのような内在置換とは別に、実効正電荷の必須の低下を提供するために、このアプロチニン分子のＮ−又はＣ−末端１又は複数個の負荷電アミノ酸残基（即ち、Glu又はAsp）を含むペプチドを付加することも可能でありうる。この分子の安定性の低下を提供するために、この分子のＮ−又はＣ−末端に１又は複数個の中性アミノ酸残基を付加することも可能でありうる。かかる付加は天然アプロチニン分子に対して行うか、又は前記したその他の改質に加えて行うことができる。
腎毒性を引き下げるのとは別に、このアプロチニン類似体のプロテアーゼ阻害特性を変えることが所望される場合、この類似体をそのプロテアーゼ結合部位において更に改質させることが可能である。例えば、アプロチニン（１−58,Val15）は顆粒球エラスターゼに対する相対的に高い特異性及びコラゲナーゼへの阻害作用を示し、アプロチニン（１−58,Ala15）はエラスターゼに対する弱い作用も有し、そしてアプロチニン（１−58,Gly15）はめざましい抗トリプシン活性を示し、且つ驚くべきことにカリクレインをも阻害することが既に示されている。（H.R.WenzelとH.Tschesche,Angew.Chem.Internat.編 20,1981、頁295を参照のこと）。更に、プロテアーゼ結合部位における１又は複数の正荷電アミノ酸を中性又は負荷電アミノ酸によって置換することにより実効正電荷を引き下げることに付随して、アプロチニンの阻害作用を改質させることが可能である。
従って、本発明は更に一般式IIを有するアプロチニン類似体に関する：
0003614850.tif 000006
（ここでR1−R12は前記した通りであり、
R13はLys,Arg,Glu,Leu,Met,Tyr及びPheより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R14はAla及びGlyより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R15はArg,Ala,Gly,Lys,Leu,Met,Phe,Tyr,Ile及びAsnより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R16はIle,Met,Leu,Phe,Thr及びGluより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R17はIle,Leu,Lys,Gln,Glu,Ser,Arg,Thr及びAsnより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R18はVal,Thr,Leu,Ser,Tyr,Gln,His,Pro,Phe,Asn,Ile及びLysより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
R19はGly,Thr及びSerより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、そして
R20はGln,Lys,Met,Asn,Leu,Gly及びGluより成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
アミノ酸残基R1−R12の少なくとも１つ及びアミノ酸残基R13−R20の少なくとも１つは天然アプロチニンの対応のアミノ酸残基と異なることを条件とする）。
現状好ましい一般式（Ｉ）のアプロチニン類似体の例は、R1がGlu−Pro,R5がGlu,R8がGlu,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R9,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がGlu−Pro,R9がGlu,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR9がGlu,R11がGlu、そしてR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR2がSer,R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R8がAsn,R12がGlu、そしてR1,R3,R7,R9,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR2がSer,R3がLeu,R7がGly,R8がAsn,R9がGly,R10がGln,R11がTyr、そしてR1,R4,R5,R6及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R9がSer,R11がGlu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R9がSer,R11がAla、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR12が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R2がSer,R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R8がAsn,R12がGlu、そしてR3,R7,R9,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R4がAsp,R5がThr,R6がGlu,R13がGlu、そしてR2,R3,R7,R8,R9,R10,及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R2がSer,R7がGly,R8がAsn,R9がGly,R12がGlu、そしてR3,R4,R5,R6,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R9がSer,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R9がGlu,R12がglu、そしてR2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R5がGlu,R9がSer,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体；又はR1がペプチド結合、R5がGlu,R9がGlu,R12がGlu、そしてR2,R3,R4,R6,R7,R8,R10及びR11が天然アプロチニン配列と同じである類似体である。
他の観点において本発明は、本発明に関するアプロチニン類似体をコードするDNA構造体に関する。本発明のDNA構造体は確立されている標準的な方法、例えばS.L.BeaucageとM.H.CaruthersのTetrahedron Letters 22,1981、頁1859−1869に詳細のホスホアミジット法又はMatthesら、EMBO Journal 3,1984、頁801−805に詳細の方法により合成的に調製されうる。ホスホアミジット法に従うと、例えば自動DNA合成装置でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニールし、リゲートし、そして適切なベクターの中にクローンする。
他方、よく知られている手順に従い、天然アプロチニンをコードするゲノム又はcDNA（例えば合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーンすることにより得られる）を用い、そして例えば相同性組換えにとって所望されるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発によって、アミノ酸置換を導入することを所望する部位に対応する１又は複数の部位にて改質させることが可能である。
更なる他の観点において本発明は、本発明のDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクターに関する。この組換え発現ベクターは、任意の組換え手順に好適にかけることのできる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞に通常依存するであろう。従って、このベクターは自己複製型ベクター、即ち、染色体外物として存在しているベクターであって、その複製が染色体複製と独立しているもの、例えばプラスミドでありうる。他方、このベクターは宿主細胞の中に導入したときに、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と共に複製するものでありうる。
ベクターの中で、本発明のアプロチニン類似体をコードするDNA配列は適切なプロモーター配列と作動連結しているべきである。このプロモーターは選んだ宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そしてこれはこの宿主細胞と同族又は外来性のいづれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。哺乳動物において本発明のアプロチニン類似体をコードするDNAの転写を誘発する適切なプロモーターの例はSV40プロモーター（Subramaniら、Mol.Cell Biol. １,1981、頁854−864）,MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、（Palmiterら、Science 222,1983、頁809−814）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞における利用にとって適切なプロモーターは、酵母解糖系遺伝子（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255,1980、頁12073−12080;Alber and Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen. １,1982、頁419−434）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngらの、Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals（Hollaenderら編）Plenum Press、ニューヨーク、1982）に由来するプロモーター又はTPI1（米国第4,599,311号）もしくはADH2−4C（Russellら、Nature 304,1983、頁652−654）プロモーターである。糸状菌類宿主細胞における利用に適切なプロモーターはADH3プロモーター（McKnightら、The EMBO J. ４.1985、頁2093−2099）又はtpiＡプロモーターである。
本発明のアプロチニン類似体をコードするDNA配列は、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Pamiterら前掲）又は（菌類宿主のための）TPI1（AlberとKawasaki前掲）又はADH3（McKnightら前掲）プロモーターと作動連結していることもある。ベクターは、例えばポリアデニル化シグナル（例えばSV40又はアデノウィルス5ELb領域に由来）、転写エンハンサーシグナル（例えばSV40エンハンサー）及び転写エンハンサー配列（例えばアデノウィルスVA RNAをコードするもの）のような因子を更に含んで成りうる。
本発明の組換え発現ベクターは問題の宿主細胞においてベクターを複製させるDNA配列を更に含んで成りうる。かかる配列の例は、（この宿主細胞が哺乳動物のときは）SV40複製起点、又は（この宿主細胞が酵母細胞のときは）酵母プラスミド２μ複製遺伝子RED1−３及び複製起点である。このベクターは更に選択マーカー、例えば宿主細胞における欠陥を補填する物質の遺伝子、例えばジヒドロホレート  リダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子、又は薬剤、例えばネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセートに対する耐性を授けるもの、又はシゾサッカロイマシス ポンペ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（P.R.Rusell,Gene 40,1985、頁125−130に詳細）を含んで成りうる。
本発明のアプロチニン類似体をコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーターのそれぞれをリゲートすること、並びに複製にとって必須な情報を含む適当なベクターの中にそれらを挿入することのために用いた手順は当業者によく知られている（例えばSanbrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989を参照のこと）。
本発明の発現ベクターを導入する宿主細胞は、本発明のアプロチニン類似体を生産することのできる任意の細胞であってよく、そして好ましくは真核細胞、例えば哺乳動物、酵母又は菌類の細胞である。
本発明に関して宿主細胞として利用する酵母生物は、培養によって大量の本発明のアプロチニン類似体を生産する任意の酵母生物でありうる。適切な酵母生物の例は酵母の種、サッカロマイシス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイシス クルイベリ（Saccharomyces Kluyveri）又はサッカロマイシス ウバルム（Saccharomyces uvarum）の株である。酵母細胞の形質転換は例えば本質的に知られている手法における、プロトプラストの形成、それに続く形質転換によって行なわれうる。
適切な哺乳動物細胞の例はCOS（ATCC CRL 1650）,BHK（ATCC CRL 1632,ATCC CCL 10）又はCHO（ATCC CCL 61）細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトさせ、そしてこの細胞に導入したDNA配列を発現させる方法は例えばKaufmanとSharp,J.Mol.Biol. 159,1982、頁601−621;SouthernとBerg,J.Mol.Appl.Genet. １,1982、頁327−341;Loyterら、Proc.Nat..Acad.Sci.USA 79,1982、頁422−426;Wiglerら、Cell 14,1978、頁725;CorsaroとPearson,Somatic Cell Genetics ７,1981、頁603,Grahamとvander Eb,Virology 52,1973、頁456;及びNeumannら、EMBO J. １.1982、頁841−845に詳細されている。
他方、菌類細胞を本発明の宿主細胞として利用できる。適切な菌類細胞の例は、糸状菌類、例えばアスペルギルス種（Aspergillus spp.）又はニューロスポラ種（Neurospora spp.）、特にアスペルギルス オリザ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）の株の細胞である。
タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の利用は例えばEP272,277号に詳細されている。
本発明は更に、本発明に関するアプロチニン類似体の製造方法に関連し、この方法は該アプロチニン類似体の発現をもたらす条件のもとで前記の細胞を培養し、次いで生ずる類似体をこの培養物から回収することを含んで成る。
細胞を培養するのに用いる培地は、宿主細胞の選択に依存して、哺乳動物細胞又は酵母生物を増殖するのに適当な任意の常用の培地でよい。このアプロチニン類似体はこの宿主細胞によりこの増殖培地へと分泌されることがあり、従って遠心もしくは濾過から細胞を分離し、この上清駅もしくは濾液のタンパク質成分を塩、例えば硫酸アンモニウムによって沈殿させ、種々のクロマトグラフィー工程、例えばイオン交換クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィーにより精製すること等を含む常用の手順によってそれより回収できる。
本発明は更に、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に本発明のアプロチニン類似体を含んで成る薬品製剤に関する。本発明の製剤において、このアプロチニン類似体は薬品製剤を製剤化する確立された任意の方法、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,1985に詳細の方法により製剤化されうる。この製剤は典型的には全身注射又は点滴に適する形態であってよく、そして無菌水又は等張の食塩もしくはグルコース溶液と共に製剤化されうる。
更なる観点において、本発明は天然アプロチニンと比べて低められた腎毒性を有する医薬品、及び／又は天然アプロチニンを受けた者と比べて、投与によって低められた率のアナフィラキシー反応をもたらす医薬品の製造のための本発明のアプロチニン類似体の利用に関する。
前記した通り、臨床的投与量に近い投与量で投与された天然アプロチニンは腎臓に有害な作用を及ぼすことを示すことが認められている。この作用はアプロチニン分子の異常に高い安定性及び比較的高い実効正電荷により生じうる。従って本発明のアプロチニン類似体は天然アプロチニンについて提案されている治療用途、特に大量のアプロチニン投与量の利用が必須である用途に関する利用に好都合であると考えられる。本発明のアプロチニン類似体の用途は、ヒトセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ及びカラプシンＧを阻害する結果として示され、それには急性膵臓炎、炎症、血小板減少症、血小板機能の保護、器官の保護、創傷治癒、ショック（肺ショックを含む）及び線溶亢進出血を包含する症状が含まれる（ただしこれらに限定されない）。高い投与量のアプロチニンは心肺バイパス手術の最中及び後に指示される；従って本アプロチニン類似体のより低い腎毒性はこの用途、そしておそらく血液の（大量の）損失を包括するその他の手術にとって特に注目すべきであり、その理由はこの類似体の低めの実効正電荷に基づいて、アナフィラキシー応答を生じめる危険性が低められる可能性があるからである。
【図面の簡単な説明】
本発明を添付した図面を参照しながら以下の実施例において更に説明するが、ここで
図１はオリゴヌクレオチド配列からの合成アプロチニン遺伝子の構造を示し；
図２はプラスミドpKFN−1503の構造を示し；
図３は異なる実効電荷及び熱安定性を有するアプロチニン類似体の投与後の尿及び腎臓中の阻害活性を示すグラフであり；
図４は異なる実効電荷を有するアプロチニン類似体の投与後３時間経過後の尿中の阻害活性を示し；
図５は異なる熱安定性を有するアプロチニン類似体の投与後３時間経過後の腎臓中の阻害活性を示し；そして
図６は異なる熱安定性を有するアプロチニン類似体の投与後の腎臓中の阻害活性の蓄積を示す。蓄積指数は３時間後の阻害活性を１時間後の阻害活性で割って計算した。
本発明を以下の実施例において更に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
酵母株からの〔Glu 1,Glu 26,Glu 41,Glu 46〕−アプロチニンの作製
〔Glu 1,Glu 26,Glu 41,Glu 46〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションによって作製した。これらのオリゴヌクレオチドは、孔径のコントロールされたガラス支持体上で、ホスホラミジット化学を利用して、自動DNA合成装置で合成した（Beaucage,S.L.とCaruthers,M.H.Tetrahedron Letters 22，（1981）1959−1869）。
以下の10種のオリゴヌクレオチドを合成した。
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５種の二重鎖Ａ−Ｅを図１に示す通り上記の10種のオリゴヌクレオチドから形成した。
20pmolの各二重鎖Ａ−Ｅを、対応の５′−リン酸化オリゴヌクレオチドの組から、90℃で５分間熱し、次いで75分かけて室温に冷やすことによって形成した。この５種の二重鎖をT4 DNAリガーゼと混ぜ合わせて処理した。この合成遺伝子は、２％のアガロースゲル上でのこのリゲーション混合物の電気泳動を経て203bpのバンドとして単離された。得られた合成遺伝子を図１に示す。
この合成遺伝子をpLaC212spx3由来の209bpのEcoR I−Nco Iフラグメント及びプラスミドpTZ 19Rの2.8kbのEcoR I−Xba Iフラグメントにリゲートさせた（Mead,D.A.,Szczensa−Skorupa,E.とKamper,B.,Prot.Engin.１（1986）67−74）。プラスミドpLaC212spx3は国際特許出願PCT/DK88/00147号の実施例３に詳細されている。
pLaC212spx3由来の209bpのEcoR I−Nco Iフラグメントは合成酵母リーダーペプチドをコードする。
このリゲーション混合物はコンピテントE. コリ株（r-,m+）に形質転換させるのに用い、アンピシリン耐性について選択した。DNAシーケンシング（Sanger,F.,Micklen,S.,とCoulson,A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（1977）5463−5467）は、得られるコロニー由来のプラスミドが〔Glu 1,Glu 26,Glu 41,Glu 46〕−アプロチニンについての適切なDNA配列を含むことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1503を更なる利用のために選んだ。プラスミドpKFN−1503の構造を図２に示す。
pKFN−1503をEcoR I及びXba Iにより切断し、次いでこの412bpのフラグメントをpMT636に由来する9.5kbのNco I−Xba Iフラグメント及びpMT636に由来する1.4kbのNco I−EcoR Iフラグメントにリゲートし、プラスミドpKFN−1508が得られた（図３を参照のこと）。プラスミドpMT636は国際特許出願PCT/DK88/00138号に詳細されている。
pMT636は、シゾサッカロマイセス ポンベTPI遺伝子（POT）（Russell.P.R.,Gene 40（1985）125−130）、S. セレビジエ  トリオセホスフェートイソメラーゼプロモーター及びターミネーター、TPIP及びTPIT（Alber,T.,とKawasaki,G. J.Mol.Appl.Gen. １（1982）,419−434）を含む、E. コリ−S. セレビジエ  シャトルベクターである。プラスミドpKNF−1508は以下の配列を有する：
TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu（Arg leu Glu Lys Arg〔Glu 1,Glu 26,Glu 41,Glu 46〕−アプロチニン−TPIT（ここでLaC212spx3シグナル−リーダーは、国際特許出願PCT/DK88/00147号に詳細の合成酵母リーダーである）。pKFN−1503及びpKFN−1503由来の412bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.1に示す。
S. セレビジエ株MT663（E2−7B XE11−36a/α,tpi/tpi,pep 4−3/pep 4−３）をYPGaL（１％のBacto酵母抽出物、２％のBactoペプトン、２％のガラクトース、１％のラクトース）上で、600nmにて0.6のO.D.となるまで増殖させた。
100mlの培養物を遠心により集め、10mlの水で洗い、再遠心し、次いで1.2Mのソルビトール、25mMのNa2EDTA pH＝8.0及び6.7mg/mlのジチオトレイトールを含む溶液10mlに再懸濁した。この懸濁物を30℃で15分間インキュベートし、遠心し、そしてその細胞を1.2Mのソルビトール、10mMのNa2EDTA,0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8及び2mgのNovozym（商標）234を含む溶液10mlに再懸濁した。この懸濁物を30℃で30分インキュベートし、遠心により細胞を集め、1.2Mのソルビトール及びCAS（1.2Mのソルビトール、10mMのCaCl2,10mMのトリスHCl（トリス＝（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH7.5）10mlの中で洗い、次でCAS2mlに再懸濁した。形質転換のため、0.1mlのCAS−再懸濁化細胞を約１μｇのプラスミドpKFN−1508と混ぜ、次いで室温で15分間放置した。1mlの（20％のポリエチレングリコール4000、20mMのCaCl2,10mMのCaCl2,10mMのトリスHCl,pH＝7.5）を加え、そしてこの混合物を室温で更に30分間放置した。この混合物を遠心し、次いでそのペレットを0.1mlのSOS（1.2Mのソルビトール、33容量％のYPD,6.7mMのCaCl2,14μg/mlのロイシン）に再懸濁し、そして30℃で２時間インキュベートした。次にこの懸濁物を遠心し、そしてこのペレット1.2Mのソルビトール0.5mlに再懸濁した。次いで6mlのトップアガー（1.2Mのソルビトールと2.5％のアガーを含むShermanらのSC培地（Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Habor Laboratory（1982））を52℃で加え、そしてこの懸濁物を同じアガー固形化ソルビトール含有培地を含むプレートの上に注いだ。
30℃で３日後に形質転換コロニーを拾い、再単離し、そして液体培養を開始するのに用いた。かかる形質転換体の１つ、KFN−1512を更なる特徴付けのために選んだ。
酵母株KFN−1512をYPD培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン（Difco Laboratoriesより）及び６％のグルコース）上で増殖させた。この株の200mlの培養物を250rpmで30℃にて３日間震盪して600nmでのO.D.を約20にした。遠心後、この上清液をFPLCイオン交換クロマトグラフィーにより分析した。この酵母上清液を0.22μｍのMelley GVフィルターユニットで濾過し、そしてその1mlを20mMのギ酸、pH3.7で平衡にしたMono S陽イオン交換カラム（0.5×5cm）に適用した。平衡緩衝液で洗浄後、このカラムを平衡緩衝液中の線状NaCl勾配（0.1M）により溶離させた。トリプシンインヒビター活性は、吸光度アッセイ（kassel,B.,Methods Enzymol. 19（1970）,844−852）そして更には
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による280nmでの吸収積分により、溶離した画分において定量した。
毒性試験のための材料を得るため、酵母株KFN−1512を大量スケールで増殖させた。アプロチニン類似体はイオン交換クロマトグラフィーと逆相HPLCとの組合せによって精製した。
実施例２
酵母株KFN−1514からの〔Glu 1,Glu 42,Glu 46〕アプロチニンの生産
〔Glu 1,Glu 42,Glu 46〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を、実施例１に記載の通りに10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションにより作製した。
合成酵母リーダーペプチドに枠内で融合した合成遺伝子を含むpTZ19R由来のプラスミドpKFN−1505を実施例１に記載の通りに合成した。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナルリーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg〔Glu 1,Glu 42,Glu 46〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1510が得られた。
pKFN−1505及びpKFN−1510由来の412bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.3に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1510を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1514が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1514の培養、上清液中における〔Glu 1,Glu 42,Glu 46〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例３
酵母株KFN−1544からの〔Glu 42,Glu 46〕−アプロチニンの生産
pKFN−1505由来の〔Glu 42,Glu 46〕−アプロチニンをコードする144bpのAva II−Xba Iフラグメントを、プラスミドpKFN−1000由来のアプロチニン（12−58）をコードする対応のDNAフラグメントと交換するために用い、プラスミドpKFN−1528を得た。プラスミドpKFN−1000は国際特許出願公開番号WO 90/10075の実施例４に詳細されている。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg〔Glu 42,Glu 46〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1541が得られた。
pKFN−1528及びpKFN−1541由来の412bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.5に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1541を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1544が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1544の培養、上清液中における〔Glu 42,Glu 46〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例４
酵母株KFN−1545からの〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 53〕アプロチニンの生産
〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 54〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を、実施例１に記載の通りに10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションにより作製した。
合成酵母リーダーペプチドに枠内で融合した合成遺伝子を含むpTZ19R由来のプラスミドpKFN−1530を実施例１に記載の通りに合成した。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 52〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1532が得られた。
pKFN−1530及びpKFN−1532由来の412bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.7に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1532を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1545が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1545の培養、上清液中における〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例５
酵母株KFN−1547からの〔Ser 10,Leu 20,Gly 40,Asn 41,Glu 44,Tyr 46〕アプロチニンの生産
〔Ser 10,Leu 20,Gly 40,Asn 41,Gly42,Glu 44,Tyr 46〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を、実施例１に記載の通りに10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションにより作製した。
合成酵母リーダーペプチドに枠内で融合した合成遺伝子を含むpTZ19R由来のプラスミドpKFN−1534を実施例１に記載の通りに合成した。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg〔Ser 10,Leu 20,Gly 40,Asn 41,Gly42,Glu 44,Tyr 46〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1537が得られた。
pKFN−1534及びpKFN−1537由来の412bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.9に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1537を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1547が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1547の培養、上清液中における〔Ser 10,Leu 20,Gly 40,Asn 41,Gly42,Gln 44,Tyr 46〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例６
酵母株KFN−1661からのDes−Arg 1,Des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 46〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306に由来する1.4kbのAha II−Sty Iフラグメントと1.8kbのAha II−Sal Iフラグメントを以下の２種の合成オリゴヌクレオチドより成る二重鎖にリゲートさせた：
0003614850.tif 000009
プラスミドpKFN−306は、des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42〕−アプロチニンに関する合成遺伝子と枠内で融合したサッカロマイシスセレビジエ交配因子アルファ−１  シグナル−リーダー（１−85）遺伝子を含む502bpのEcoR I−Xba Iインサートを有するpTZ19R由来のプラスミドである。プラスミドpKFN−306の構造はWO 89/01968に詳細されている。
このリゲーション混合物をコンピテントE.コリ株（r-,m+）に形質転換させるの用い、アンピシリン耐性について選択した。DNAシーケンシング（Sanger,F.,Micklen,S.,とCoulsen,A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74（1977）5463−5467）は、得られるコロニー由来のプラスミドがdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 46〕アプロチニンについての適切なDNAを含むことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1629を更なる利用のために用いた。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 46〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1656が得られた。
pKFN−1629及びpKFN−1656由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.11に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1656を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1660が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1660の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 46〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例７
酵母株KFN−1661からのDes−Arg 1,Des−Pro 2−〔Ser 42,Ala 46〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306に由来する1.4kbのAha II−Sty Iフラグメントと1.8kbのAha II−Sal Iフラグメントを以下の２種の合成オリゴヌクレオチドより成る二重鎖にリゲートさせた：
0003614850.tif 000010
プラスミドpKFN−306は、des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42〕−アプロチニンに関する合成遺伝子と枠内で融合したサッカロマイシスセレビジエ交配因子アルファ−１  シグナル−リーダー（１−85）遺伝子を含む502bpのEcoR I−Xba Iインサートを有するpTZ19R由来のプラスミドである。プラスミドpKFN−306の構造はWO 89/01968に詳細されている。
このリゲーション混合物はコンピテントE.コリ株（r-,m+）に形質転換させるの用い、アンピシリン耐性について選択した。DNAシーケンシング（Sanger,F.,Micklen,S.,とCoulsen,A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74（1977）5463−5467）は、得られるコロニー由来のプラスミドがdes−Arg 1,Pro 2−〔Ser 42,Glu 46〕アプロチニンについての適切なDNAを含むことを示した。
１つのプラスミドpKFN−1631を更なる利用のために用いた。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Ala 46〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1657が得られた。  pKFN−1631及びpKFN−1657由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.13に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1657を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1661が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1661の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Ala 46〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例８
酵母株KFN−1735からのDes−Arg 1,Des−Pro 2−〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 53〕−アプロチニンの生産
des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,glu 31,Asn 41,glu 53〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を、実施例１に記載の通りに10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションにより作製した。
合成酵母リーダーペプチドに枠内で融合した合成遺伝子を含むpTZ19R由来のプラスミドpKFN−1707を実施例１に記載の通りに合成した。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1709が得られた。
pKFN−1707及びpKFN−1709由来の406bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.15に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1709を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1735が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1661の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Asp 24,Thr 26,Glu 31,Asn 41,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例９
酵母株KFN−1737からのdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Asp 24,Thr 26,Glu 31,Glu 53〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306（実施例５参照）由来の1.8kbのAha II−Xba Iフラグメント及び1.4kbのAha II−Ava IIフラグメントを、〔Asp 24,Thr 26,Glu 31,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成した141bpのAha II−Xba Iフラグメントにリゲートした。
得られるpTZ19R由来のプラスミドはpKFN−1711である。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Asp 24,Thr 26,Glu 31,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1713が得られた。
pKFN−1711及びpKFN−1713由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.17に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1737を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1713が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1737の培養、上清液中におけるdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Asp 24,Thr 26,Glu 31,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例10
酵母株KFN−1739からのdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Gly 40,Asn 41,Gly 42,Glu 53〕−アプロチニンの生産
des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Gly 40,Asn 41,Gly 42,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成遺伝子を、実施例１に記載の通りに10種のオリゴヌクレオチドからリゲーションにより作製した。
合成酵母リーダーペプチドに枠内で融合した合成遺伝子を含むpTZ19R由来のプラスミドpKFN−1715を実施例１に記載の通りに合成した。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−Glu Arg Leu Glu Lys Arg−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 10,Gly 40,Asn 41,Gly42,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1718が得られた。
pKFN−1715及びpKFN−1718由来の406bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.19に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1718を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1739が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1739の培養、上清液中におけるdes−Arg1,Pro2−〔Ser 10,Gly 40,Asn 41,Gly 42,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例11
酵母株KFN−1742からのdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306（実施例５参照）由来の1.8kbのAha II−Xba Iフラグメント及び1.4kbのAha II−Ava IIフラグメントを、〔Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成した141bpのAha II−Xba Iフラグメントにリゲートした。
得られるpTZ19R由来のプラスミドはpKFN−1721である。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1724が得られた。
pKFN−1721及びpKFN−1724由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.21に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1724を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1742が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1742の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例12
酵母株KFN−1752からのdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306（実施例５参照）由来の1.8kbのAha II−Xba Iフラグメント及び1.4kbのAha II−Ava IIフラグメントを、〔Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成した141bpのAha II−Xba Iフラグメントにリゲートした。
得られるpTZ19R由来のプラスミドはpKFN−1762である。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Glu 42,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1765が得られた。
pKFN−1762及びpKFN−1765由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.23に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1752を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1752が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1752の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例13
酵母株KFN−1755からのdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Glu 26,Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306（実施例５参照）由来の1.8kbのAha II−Xba Iフラグメント及び1.4kbのAha II−Ava IIフラグメントを、〔Glu 26,Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成した141bpのAha II−Xba Iフラグメントにリゲートした。
得られるpTZ19R由来のプラスミドはpKFN−1768である。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Glu 26,Ser 42,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1770が得られた。
pKFN−1768及びpKFN−1770由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.25に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1770を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1755が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1755の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Glu 26,Ser 42,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例14
酵母株KFN−1756からのdes−Arg 1−des−Pro 2−〔Glu 26,Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンの生産
共にプラスミドpKFN−306（実施例５参照）由来の1.8kbのAha II−Xba Iフラグメント及び1.4kbのAha II−Ava IIフラグメントを、〔Glu 26,Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンをコードする合成した141bpのAha II−Xba Iフラグメントにリゲートした。
得られるpTZ19R由来のプラスミドはpKFN−1771である。
実施例１の手順に続き、次の構造、TPIP−MFα１シグナル−リーダー（１−85）−des−Arg 1,des−Pro 2−〔Glu 26,Glu 42,Glu 53〕−アプロチニン−TPITを含む酵母発現プラスミドpKFN−1773が得られた。
pKFN−1771及びpKFN−1773由来の502bpのEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を配列表No.27に示す。
前記の通りにプラスミドpKFN−1773を酵母株MT663に形質転換させ、酵母株KFN−1756が得られた。
YPD−培地中での形質転換化株KFN−1756の培養、上清液中におけるdes−Arg 1,des−Pro 2−〔Ser 42,Glu 42,Glu 53〕−アプロチニンの分析、及び毒性試験のための材料の作製は前記の通りに行った。
実施例15
ウィスター（Wistar）ラットへの一回の静脈内投与によるアプロチニン類似体の毒性スクリーニング
材料
組換えアプロチニン（１−58）と比べて低い実効正電荷及び熱安定性を有する以下のアプロチニン類似体を毒性スクリーニングした:KFN−1512,KFN−1514,KFN−1544,KFN−1545,KFN−1547,KFN−1660及びKFN−1661の毒性の観点から身受けられるその主要な特徴を表１に示した。組換えアプロチニンについてのデーターを比較のために示す。変性温度は生物学的安定性の指標として示す。
0003614850.tif 000011
計画
各類似体のスクリーニングの１日目に、２匹の雄と２匹の雌ラットのグループに33,100,300又は900mgの類似体／体重kgを受容させた。この２つの類似する構成コントロールグループに生理食塩水又はpH約4.5に塩酸で酸性化した生理食塩水を受容させた。この後者の溶液は媒体として働く。投与容量は全てのケースのいて10ml/体重kgとした。ラットを７日間にわたって観察し、そして８日目に殺した。解剖時に腎臓を秤量し、そして組織病理学のために準備した。応答変動を表２の頭に示す。
結果
個々のスクリーニングの結果を表２にまとめる。組換えアプロチニンについてのデーターは比較のために含ませた（投与量:11−300mg/kg）。KFN−1512は最上投与量（900mg/kg）に必要なほどに溶解することができなかった。
一匹の動物が900mgのKNF−1545/kgで死んだ。この他に死亡は認められなかった。
KFN−1512,KFN−1544,KFN−1545及びKFN−1660の投与後（300mg/体重kg）に腎臓の組織病理学的変化は認められなかった。更に、900mg/体重kgのKFN−1514,KFN−1517及びKFN−1661の投与後に腎臓の組織病理学的変化は認められなかった。従って全ての類似体は、アプロチニンに関する11mg/kgと比べて、300mg/kg以上の組織病理学的腎臓変化に関連する毒性作用を有してなかった。その他の応答変動に関しては、この類似体はアプロチニンと同等又はそれより優れていた。
0003614850.tif 000012
結論
ウィスターラットにおける一回投与静脈内スクリーニングにより評価したアプロチニン類似体の毒性プロフィールは、アプロチニンの毒性プロフィールと比べて数段改善されていた。全てのアプロチニン類似体は300mg/kg以上の非腎毒性作用レベルを有していた。KFN−1514は最上投与量に相当する、900mg/kgの総合的な非腎毒性作用を有していた。
実施例16
組換えアプロチニンとアプロチニン類似体の消失及び分散
材料
組換え真性アプロチニンと実施例１−７に従って生産した類似体を0.9％のNaClに溶かして１μl/ラットｇの投与容量を獲得できるようにした。注射溶液の濃度は、方法の章に示す方法により分析したコントロールである。
方法
体重200−300gの雌ウィスターラットを用いた。アプロチニン及び類似体を２つの異なるモデル、１）麻酔ラット及び２）麻酔していないラットにおいて試験した。
麻酔ラット
ラットを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によって麻酔にかけた。頸動脈及び頸静脈を露出させ、そしてポリエチレンカテーテル（PE−50,Intramedic）をカニューレ挿入した。頸動カテーテルを3.8mlの0.9％NaCl/hの点滴のためにパーフューザー（Braun）に連結し、次いで血圧トランデューサーに連結した。血圧の変化をチャートレコーダー（Kipp ＆ Zonen,BD9）を用いて記録した。類似体を頸静カテーテルを介して15秒間にわたってボーラス投与した。
頸動カテーテルより血液サンプルを、この投与後3,10,20,40及び60分にて採取した。このサンプル（0.45ml）を、50μｌの0.13Mにクエン酸ナトリウムを含む3mlの試験管に入れ、そして遠心した。分析まで血漿を−20℃で保存した。投与して60分後、過剰量のペントバルビタールナトリウムの投与によりラットを殺し、次いで腎臓及び肝臓を取り出し、秤量し、そして−80℃で保存した。
麻酔していないラット
類似体の投与の前に2mlの蒸留H2Oの経口投与を行った。静脈カテーテル（Venflon 22G,Viggo−Spectramed,Helsingborg、スウェーデン）を用い、類似体を尾の血管にボーラス注射として静脈内的に付与した。投与後、このカテーテルを0.9％NaCl0.5mlでフラッシュし、そして取外した。尾からの出血を避けるこめにこの注射部位にばんそうこうを貼った。
次に、排尿を集めるためにラットを代謝ケージの中に移した。
３時間後、このケージの中にCO2/O2（9/1）を導入することによりラットを殺し、そしてその腎臓及び肝臓を取り出し、次いで分析するまで−80℃で保存した。CO2の導入の間、このラットの膀胱は空となり、その後このラットを取り出し、代謝ケージも0.9％のNaClですすいで全部で25mlの尿−NaCl容量を得た。
ホモジネート品の調製
１個の腎臓（約1g）及び約2gの肝臓組織を別々の10mlのプラスチック製試験管に入れ、そして0.9％のNaCl2mlを加えた。この組織を強力超音波プロセッサー（モデルVC50,solics ＆ Materials Inc.タンビュリーCT、米国）を用いて５分間ホモジナイズした。この腎臓と肝臓ホモジネート品を次に食塩水で希釈し、それぞれ10−25と4mlの全容量を得た。
分析方法
血漿、肝臓ホモジネート品及び注射溶液中のアプロチニン及び類似体のレベルをCobas Fara II（Roche）で光学的に測定した。簡単に述べると、血漿、ホモジネート品又は注射溶液を酸で沈殿させ、アプロチニン以外のカリクレインインヒビターを除去した。サンプル中のカリクレイン阻害活性をブタ膵臓由来のカリクレイン（Sigma K3627）及び色素基質S2266（Kabi）を用いて測定した。
腎臓ホモジネート品及び尿におけるレベルは同じ方法であるが、ただし希釈ホモジネート品及び尿中の固有のカリクレイン阻害活性は無視できるので、沈殿工程を省いた方法で測定した。
各媒体における各類似体のための別々の標準曲線を用いた。
試験計画
14の麻酔グループ及び14の麻酔していないグループのラットを試験した。各ラットに、体重kg当り1.56μmole（約10mg）の投与量を投与した。28のグループの基底データーを表IIIに示す。
0003614850.tif 000013
統計学的評価
Spearmanの等級合計相関試験を統計学的評価のために用いた。
0003614850.tif 000014
結果
腎臓及び尿中の類似体
１及び３時間後の腎臓中並びに３時間後の尿中の全含有量を図３及び表IVに示す。
類似体同志でかなりの相違が認められた。
アプロチニンに関して、投与して１時間後の腎臓中の含有量は投与量の約20％であり、そして３時間後にはその含有量は40％以上に上昇した。尿におけるアプロチニンの排せつはほとんどなかった。
３時間における尿中への排せつが類似体の実効電荷と関連するかを調べるため、これらの数字間の相関の程度を計算した。
尿中の含有量は類似体の実効電荷と大いに相関することが認められた（図４参照）。
0003614850.tif 000015
類似体の安定性
腎臓組織中の類似体の安定性を調べるため、14匹の麻酔ラットからの１個の腎臓（各グループから１個）を２つに同じ重さで分けた。一方の断片は37℃で、そして他方の断片は４℃で保存した。４時間後、この組織をホモジナイズし、そして類似体の含有量を測定した。安定指数は、37℃で保存した断片中の含有量を、４℃で保存した断片中の含有量で割った値として定義した。安定指数を表VIに示し、ｒアプロチニン、KFN1514,KFN1544が、例えばあまり安定でないと認められるKFN1660と比べ、最も安定のようであることが示された。
類似体の安定性はその変性温度の測定によっても調べた。この変性温度は、投与後３時間の腎臓組織中の含有量（図５）及び蓄積指数（図６）と大いに相関したが、尿排泄せつとは相関していなかった。
これらのデーターは、尿中の排せつにとって実効電荷は重要でありうるが、腎臓における濃度及び蓄積においてはあまり重要でないことを示唆する。他方、腎臓蓄積は腎臓組織における類似体の変性温度及び安定性に関連するようである。
しかしながら、投与後１時間にて測定した際の腎臓組織における濃度は分解又は再分散に基づいて変動するようである。従って、投与して例えば10分後に測定した濃度は実効電荷に相関することが考えられる。
所見
以下の所見が成立した：
１）試験した全ての類似体が腎臓により取り込まれたが、種々の程度に変動した。腎臓における蓄積は腎臓の組織中の熱安定性及び安定性に関連するが、分子の実効電荷には関連しない。
２）尿における排せつは類似体の実効電荷に関連するが、安定性には関連しない。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ビョーアーン  ゾーレン  エリク
ノリス  キールド
ダイネス  ビゴ
ノエルスコフ−ラウリトセン  リーフ
クリステンセン  ニールス  ディール
ブレゲンカールド  クラウス
（ii）発明の名称：アプロチニン類似体
（iii）配列の数:29
（iv）連絡先：
（Ａ）宛先：ノボ  ノルディスク  A/S
（Ｂ）通り：ノボ  アレ
（Ｃ）市：バグスバード
（Ｅ）国  デンマーク
（Ｆ）郵便番号:2880
（ｖ）コンピューター読み取り方式：
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC  コンパチブル
（Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン  リリース＃1.0、バージョン＃1.25
（vi）現出願人データー：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願データー：
（Ａ）出願番号:DK2361/90
（Ｂ）出願日:1990年10月１日
（vii）先の出願のデーター：
（Ａ）出願番号:DK1181/91
（Ｂ）出願日:1991年６月12日
（viii）代理人／代理店情報
（Ａ）名称：サルソエーマドセン，バージット
（Ｃ）参照／処理番号:3465.204−WO
（iv）通信情報：
（Ａ）電話：（212）867−0123
（Ｂ）ファックス：（212）867−0298
（Ｃ）テレックス：
（２）配列NO:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:418塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:236..409
（xi）配列の詳細：配列NO:1:
0003614850.tif 000016
（２）配列NO:2に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:111アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:2:
0003614850.tif 000017
（２）配列NO:3に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:418塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:236..409
（xi）配列の詳細：配列NO:3:
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（２）配列NO:4に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:111アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:4:
0003614850.tif 000019
（２）配列NO:5に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:418塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:236..409
（xi）配列の詳細：配列NO:5:
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（２）配列NO:6に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:111アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:6:
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（２）配列NO:7に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:418塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:77..409
（xi）配列の詳細：配列NO:7:
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（２）配列NO:8に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:111アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:8:
0003614850.tif 000023
（２）配列NO:9に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:418塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:77..409
（xi）配列の詳細：配列NO:9:
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（２）配列NO:10に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:111アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:10:
0003614850.tif 000025
（２）配列NO:11に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..409
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:11:
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（２）配列NO:12に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:12:
0003614850.tif 000027
（２）配列NO:13に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:13:
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（２）配列NO:14に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:14:
0003614850.tif 000029
（２）配列NO:15に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:412塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..403
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:236..403
（xi）配列の詳細：配列NO:15:
0003614850.tif 000030
（２）配列NO:16に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:109アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:16:
0003614850.tif 000031
（２）配列NO:17に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:17:
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（２）配列NO:18に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:18:
0003614850.tif 000033
（２）配列NO:19に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:412塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..403
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..235
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:236..403
（xi）配列の詳細：配列NO:19:
0003614850.tif 000034
（２）配列NO:20に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:109アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:20:
0003614850.tif 000035
（２）配列NO:21に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:21:
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（２）配列NO:22に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:22:
0003614850.tif 000037
（２）配列NO:23に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:23:
0003614850.tif 000038
（２）配列NO:24に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:24:
0003614850.tif 000039
（２）配列NO:25に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:25:
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（２）配列NO:26に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:26:
0003614850.tif 000041
（２）配列NO:27に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:508塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:77..499
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sig−ペプチド
（Ｂ）位置:77..331
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:mat−ペプチド
（Ｂ）位置:332..499
（xi）配列の詳細：配列NO:27:
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（２）配列NO:28に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:141アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:28:
0003614850.tif 000043
（２）配列NO:29に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:58アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：配列NO:29:
0003614850.tif 000044
【図１】
0003614850.tif 000047
【図２】
0003614850.tif 000048
【図３】
0003614850.tif 000049
【図４】
0003614850.tif 000050
【図５】
0003614850.tif 000051
【図６】
0003614850.tif 000052