(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの膜蛋白質のエクトドメインを、天然の、オリゴメリックな形態で得る方法であって、
−蛋白質−分離酵素のための認識配列を表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を、所望の蛋白質エクトドメインを含む蛋白質をコードする遺伝子に挿入し、そこから発現される蛋白質の場合、該核酸配列を膜内外領域の開始前第１及び第50のアミノ酸によって限定される領域に対応する遺伝子の領域に挿入し、及び
−この方法によって得られた遺伝子変異体を、真核細胞内で発現させ、及び
−所望の蛋白質エクトドメインを含むこれらの真核細胞又はそれらの部分を、酵素的消化にかけて、及び
−所望の蛋白質エクトドメインをその混合物から単離する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
プロテアーゼ又は糖脂質アンカーの前記認識配列が、認識され且つ分離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
得られるオリゴメリックなウイルスの膜蛋白質エクトドメインが、HIVのenv−糖蛋白質のエクトドメインであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
−該認識配列が、以下の一般式：
−（Ｇ−Ｐ−Ｘ）ｎ−
（但し、ｎは１より大きい全ての数であり、Ｘは、遺伝暗号によって決定される20種アミノ酸の１つである）であり、
−該消化に使用される酵素が、コラゲナーゼであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一般式におけるｎが３であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記消化に使用される酵素がバクテリアのコラゲナーゼであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該認識配列を、アミノ酸645及び673によって限定されるHIVのenv−糖蛋白質の領域に挿入することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記認識配列を、アミノ酸656及び663によって限定されるHIVのenv−糖蛋白質の領域に挿入することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該認識配列を、アミノ酸659及び660の間のHIVのenv−糖蛋白質に挿入することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
該酵素的消化後の混合物から該所望の蛋白質エクトドメインを精製するのに使用するバッファーが、１から200mMの濃度のボレートを含んでいることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記バッファーが30から100mMの濃度のボレートを含んでいることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質への認識配列の挿入のために適当な領域を同定し、調査する該蛋白質の配列に対応して合成した短く重複したペプチド類を、この蛋白質に対して免疫されたほ乳類の血清と混合し、この血清中に含まれる抗体と反応するペプチド類が、認識配列の挿入に適している調査された蛋白質中の領域を示すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
調査する該蛋白質の配列に対応して合成した短く重複したペプチド類を、陽性のヒトのHIV血清と混合することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
合成されたペプチドが、５から30のアミノ酸の長さを示すことを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記合成されたペプチドが、12から16のアミノ酸の長さを示すことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
天然の、オリゴメリックな、グリコシル化された形態で存在し、HIVenv糖蛋白質のドメインgp120、HIVenv糖蛋白質のドメインgp41の、131から165アミノ酸長のアミノ末端断片、及び任意に請求項４による酵素的消化後に残った認識配列の断片で構成されていることを特徴とする、HIVのenv糖蛋白質の単離されたエクトドメイン。
【請求項１７】
４量体の形態で存在していることを特徴とする、請求項16に記載の単離されたエクトドメイン。
【請求項１８】
単量体の形態が、約140kDの電気泳動の移動度を有することを特徴とする請求項16又は17のいずれかに記載の単離されたエクトドメイン。
【請求項１９】
前記131から165アミノ酸長のアミノ末端断片が、148アミノ酸長のアミノ末端断片であることを特徴とする、請求項16から18のいずれかに記載の単離されたエクトドメイン。
【請求項２０】
これらの蛋白質ドメインに対するポロクローナル又はモノクローナル抗体を得るために請求項16から19のいずれかに記載のHIVのenv糖蛋白質の単離されたエクトドメインを使用する方法。
【請求項２１】
これらの蛋白質ドメインを結晶化させるために請求項16から19のいずれかに記載のHIVのenv糖蛋白質の単離されたエクトドメインを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウイルスの膜蛋白質の天然（native）のドメイン、特にAIDS（後天性免疫不全症候群）を引き起こす病原体である、ヒト免疫不全ウイルス（immunodeficiency virus）HIVの表面蛋白質gp160の天然エクトドメイン（native ectodomains）の獲得方法、及びこの方法によって得られる天然蛋白質ドメインそのもの並びにワクチンとしてのそれらの使用、特に、HIVに対するワクチンとしてのヒト免疫不全ウイルスHIVの表面蛋白質gp160の天然エクトドメインの使用に関する。酵素的切断部位として、特にコラーゲン分割（”切断”）部位として機能する、得られた蛋白質ドメインへの認識配列の挿入及びコラゲナーゼそれ自体における認識配列の挿入における適切な部位の決定方法は、また、ウイルスの膜蛋白質の天然ドメインの獲得方法の要素である。
発明の一般的な背景
ウイルス性疾患の予防における証明された方法は、免疫化、ウイルスに対する身体の予防接種である。初期の時代には、天然痘やポリオ等の伝染性流行において起こるウイルス性疾患は、しばしば、予防接種によってチェックすることが可能であった。そのようなウイルスに対する活動免疫化を獲得するためには、身体は、より正確には免疫系はウイルスの抗原にさらされる。これは、例えば、不活化した若しくは弱毒化したウイルス又はその部分、例えば、ウイルス蛋白を注射することによって、起こすことができる。ヒトの免疫系は、基本的には、２種の異なる部分的なシステムからなる、即ち細胞性免疫応答（Ｔ細胞）及び体液性免疫応答（Ｂ細胞、抗体）である。ウイルスの再感染の場合、Ｂ細胞によって伝達される体液性免疫応答は、最も重要な防御機構を示す。
身体の免疫系は、抗原を認識し結合する特異的な抗体の形成と共に抗原に反応し、それによってウイルスは、このようにその不活化が開始される。加えて、いわゆる”記憶細胞”が形成される、それは、”それらの”ウイルス又は”それらの抗原”での後の感染において、活性化され、大量の抗原−特異的抗体を合成するために、非常に迅速に免疫系を刺激する特別なリンパ球である。このようにして、免疫系は、もし対応抗原によって以前に直面していない時よりも、有意により速くウイルス攻撃に反応することができる。
しかしながら、予防接種における弱毒化したウイルスの使用は、使用したウイルスが体内で再度有毒になり、ウイルス疾患が起こることを除くことができない限り、問題がある。この理由から、好ましくは、免疫源としてウイルスの単離された蛋白質を使用するのがよい。このため、ウイルスの表面蛋白質を使用するのが最適である、なぜならば、それは、通常は容易に体液性の免疫学的応答に影響をうけやすいからである。理想的には、一部分の表面蛋白質、即ち、ウイルスの表面上外部に局在している部分、いわゆる、エクトドメインが使用される。なぜなら、完全なウイルスの場合、この部分のみが、抗体に接近できるからである。しかしながら、ウイルスに対する予防接種に使用される、可能な限り天然の形態を有するように、蛋白質ドメインの産生には注意を払うべきである、なぜなら、さもなくば、ウイルスとともに天然の蛋白質を認識しない抗体が形成され、それをもって、中和に効果がないという危険がある。抗体によってそれらの三次元構造に基づき認識されるそのような分子類（molecules）又は分子部分（molecule parts）は、形態的又は構造的エピトープと呼ばれ、それらのアミノ酸配列によって認識されるものは、配列的エピトープと呼ばれる。配列的エピトープはほとんどなく、ほとんどの抗原性エピトープは、構造的であり、それは、対応する抗体によって認識されるために、ポリペプチド鎖の正しい三次元の折りたたみ（folding）を示さなければならないことが、徐々に明らかになってきている。”天然（native）”とは、この文書の中では、使用する蛋白質ドメインの特定の構造が、ウイルス上又はウイルス中自然に発生する対応する蛋白質の範囲の構造と同一又は殆ど同一であることを意味する。必要ならば、これは、蛋白質ドメインのオリゴマー化（oligomery）及び／又はグリコシル化の存在も含む。これにおいて、重要な基準は、単離されたネイティブなウイルス蛋白質ドメインに対して形成される抗体もまた、ウイルス及びウイルス中の対応するネイティブな蛋白質を認識し結合するという事実である。
レトロウイルスであるヒト免疫不全ウイルスHIVは、今日、重要な問題を有している。AIDSの原因として1984年に同定されて以来、このウイルスに対してもワクチンを作成する多大な努力がなされた。最近、HIVに非常に近縁の、弱毒化したSIVウイルス（サル（simian）免疫不全ウイルス）でうまくサルを免疫化するのに成功し、弱毒化したHIVを用いて、HIVに対して、ヒトをうまく免疫化できるのではないかという仮定が許される。ワクチンとしての弱毒化したウイルスによって必然的に伴われる問題は既に記載した。AIDSのような致命的な疾患の場合、弱毒化したウイルスが再度有毒になるという危険性は、たとえ、それが、小さくても、受け入れることができない。この点については、コッフ，ダブリュ．シー．及びホス，ディ．エフ．（Koff,W.C.and Hoth,D.F.）文献”サイエンス（science）”、241,426−432（1988）も参照。
この理由から、抗原として、特有の蛋白質、特にウイルスの表面蛋白質、いわゆるgp160又はenv−糖蛋白質又はそのフラグメントを用いることに、HIVワクチンについての研究の大部分が集中している。（一般的な調査は、文献”スペクトラム  デル  ヴィッセンシャフト（Spektrum der Wissenschaft）,12,134−142（1988）”中ティー．エイチ．マシューら（T.H.Matthewa et al.）による記事"AIDS−ワクチン（AIDS−Impfstoffe）”によって提供されている。）
アミノ酸配列が知られている（ラトナーら（Ratner et al,）,"ネイチャー（Nature）",313,277−284（1985））HIVのenv−糖蛋白質は、高くグリコシル化された前躯体蛋白質gp160として宿主細胞中合成され、続いて、ゴルジ体中２種のドメインgp120及びgp41に処理される。ウイルス膜表面上外部に局在しているgp120ドメインは、細胞レセプターCD4への結合の原因であり、gp120も前躯体蛋白質gp160も共に、高い親和力（affinity）を有しながら、このCD4レセプターに結合する。膜内外ドメインを示すGp41は、ウイルスの細胞への侵入におけるウイルスと細胞膜との融合において、おそらく、gp41のアミノ末端上に位置する”融合蛋白質”と宿主細胞膜の脂質二重層との相互作用によって、関係する。
HIVワクチンの開発において、env糖蛋白質の外部分のみを使用するアプローチは、非常に将来有望であるように思われる。これは、既に述べたように、外部に露出している糖蛋白質部分が、最も容易に体液性の免疫応答の影響を受けやすいという考察に基づいており、それゆえ、このエクトドメインは、最も将来有望である。
HIV表面蛋白質のエクトドメインの獲得は、種々の方法がある。例えば、それは、ウイルスのコーティングから、機械的、化学的又は酵素学的方法によって”切り出（cut off）”される。それによって、蛋白質が、変性され、その結果、天然表面蛋白質及びそれによりウイルスを認識する抗体の形成がほとんどできない又は全くできないという結果になるという危険性は高い。
ロベイら（Robey et al.）（"Proc.Natl.Acad.Sci.USA"83,7023−7027（1986））は、例えば、相当に強い界面活性剤トリトン（Triton）X100を用いてHIV−感染細胞の表面から蛋白質を取り除くことによって、gp120を得ている。たとえ、著者が、”天然gp120"の製造といっても、この方法によって得られたgp120が実際に天然のオリゴメリックな形態かどうかは、使用した界面活性剤及び精製方法に照らして疑わしい。
遺伝子技術の方法は、ストップコドンはgp41遺伝子の開始直前のいわば”理論的開裂部位”として挿入されることを含んでいる。適当な細胞内での遺伝子の発現の間に、ストップコドンの位置は、表面蛋白質のエクトドメインのカルボキシ末端の位置を決定し、即ち表面蛋白質の外の部分であるgp120のみが合成される。しかしながら、この方法によって合成されると、gp120はモノマーとして存在し、それは、ウイルス上の天然の状態に相当しない。なぜならば、env糖蛋白質は、大抵の天然形態中のウイルス糖蛋白質のように、オリゴマーとして存在するからである。しばしば、これらの蛋白質は三量体である。HIV−１−env糖蛋白質について、天然の形態においては、それは四量体であることが、最近示された（スチャワラー  エムら（Schawaller M.et al,）”ヴァイロロジー（Virology）",172,367−369（1989）。これによると、なぜ単量体のgp120が、適当な抗体に帰さないのか及びそれと共にワクチンとして利用するには不十分であることが示されている。gp120を、envを発現させることによって組み換えワクシニアウイルスで感染させた細胞から合成するという本発明者の実験でも、gp120はオリゴメリックな形態を安定な状態で形成されていないことが示された。この試験結果は、gp41は、オリゴマー化をとるために、env糖蛋白質の生合成中存在しなけらばならないことを示している。このオリゴマー化の原因であるgp41のドメインは、おそらくgp41の129アミノ末端アミノ酸の中に局在している（イエール  ピー．エル．ら（Earl,P.L,et al.）"Proc.Natl.Acad.Sci.",87,648−652（1990））。
gp41は天然のgp160の合成において明らかに非常に重要であるので、安定な形態で完全なgp160を産生するように実験がなされてきた。バレットら（Barret et al.）（”エイズ  リサーチ  アンド  ヒューマン  レトロウイルスイズ（AIDS Research and Human Retroviruses）"5,（２）,159−170（1989））は、例えば、真核細胞中env遺伝子を発現させ続いて精製することによってgp160を得ている。しかしながら、界面活性剤の使用に加えて、強力なカオトロピック（chaotrop）作用を有し蛋白質を変性させるチオシアン酸カリウムも使用している。その著者の文献によると、gp160の純粋な製造は、以下の理由によって多くの問題を抱えていることを示していた：
上述したように、gp160は、膜蛋白質である。膜からこの蛋白質を溶解させるために、界面活性剤が、必要である。単離されたgp160分子は、界面活性剤不存在下では凝集するので、それらは、また必要である。しかしながら、界面活性剤は、その分子の変化をもたらす。界面活性剤を伴うgp160は、未処理の蛋白質に比べてプロテアーゼ切断パターンの変化がみられることが示された。例えば、蛋白質を予防接種の目的で患者に注射しようとする時遅くとも必要である、溶液から界面活性剤を取り除くと、そのオリゴマーは、モノマーに分解する。述べたような理由のために、天然の形態で純粋なgp160を産生できるような機会は、非常にわずかであるようにみえる。
env糖蛋白質の単離されたエクトドメインを基に、HIVに対するワクチンを開発するこれまでの全ての方法が、共通に有している本質的な欠点は、おそらくこのように、免疫源として使用される蛋白質が、天然で且つオリゴマーの形態で存在していなかったという最も確からしい事実であろう。これは、著者によって示され、ELISAによって決定された力価が、非常に高く（およそ1/100,000）及び一方、中和試験で測定された力価が極めて低い（しばしば1/1000よりかなり小）という事実から明らかである。これにより、各例で使用された抗原は、このように強い免疫原性の作用を示し、非常に多くの抗体がそれに対して形成されたが、これらの抗体は、ほとんど又は全く天然の蛋白質及びそれによりウイルスを認識していないことが示唆される。
中和試験における低い力価は、天然の抗原を認識する抗体が、非常に低い力価で存在していることを示している。しかしながら、低い力価の抗体は、しばしば、ウイルスの伝染力の上昇をまねく（プラブハカーら（Prabhakar et al,.）、ネイチャー（Nature）、290,590,（1981））。言い換えれば、宿主を感染から保護する代わりに、ウイルス特異的免疫グロブリンによって、伝染力が増加される。この例示として、ワクチンは、結果として、所望の効果の反対の効果を有する。記載した問題が、また、膜結合蛋白質と共に表面膜を含む他のすべてのウイルスの場合にもあてはまる。
ワクチンとしての使用に加えて、天然蛋白質及び蛋白質ドメインもまた、免疫療法剤として又は診断の目的で使用される。診断については、抗原及びそれらに対して向けられた抗体が使用される。
本発明の基礎をなす技術的な問題は、ウイルスの膜蛋白質の天然ドメイン、特に、例えば、免疫療法又は診断の目的ワクチンとして使用することができるヒト免疫不全ウイルスのenv糖蛋白質gp160の天然のエクトドメインを得る方法を提供することである。この問題は、例えば、蛋白質−分裂酵素（protein−splitting enzyme）、特にコラゲナーゼ類の認識配列の、例えばHIV−env糖蛋白質gp160のようなウイルスの膜蛋白質への挿入のために適当な部位を同定する方法及び適当なコラゲナーゼ分裂部位を利用する方法を提供することも含んでいる。
この問題は、天然の形態でウイルスの膜蛋白質のドメインを得る方法を利用することによって解決され、その方法は、
−認識配列を示すアミノ酸配列、特にプロテアーゼ又は糖脂質アンカーをコードする核酸配列を、所望の蛋白質ドメインを含む蛋白質をコードする遺伝子に、適当な位置で挿入し、及び
−この方法によって得られた遺伝子変異体を、真核細胞内で発現させ、及び
−所望の蛋白質ドメインを含むこれらの真核細胞又はそれらの部分を、酵素的消化（digestion）にかけて、好ましくは、挿入された認識配列を認識し且つ切断するプロテアーゼによって、酵素的消化にかけて、及び
−所望の蛋白質ドメインをその混合物から得る
ことを特徴とする。
一般的にいえば、これは、最初に、蛋白質切断酵素、特にプロテアーゼ又は糖脂質アンカーの認識配列を示す核酸配列を、適当な位置で、初期の形態（例えば、gp160）をコードする遺伝子に最初に挿入し、蛋白質ドメインの前駆体蛋白質を得ることを意味している。適当な真核細胞によって該蛋白質の合成が終了した後、それは、挿入された認識配列で、対応する酵素により開裂し、続いて所望の蛋白質ドメインが精製される。HIV  env糖蛋白質gp160を、オリゴメリックな前駆体蛋白質として使用する時は、特に、単量体が約140kDの電気泳動移動度を示し以下に様にgp140と呼ばれる、四量体の糖蛋白質がこの方法から得られる。
それゆえ、本発明は、完全な蛋白質を最初に合成する考えに基づいている、なぜならば、それは、この方法によってのみ天然でオリゴメリックな形態で合成され、更に、完全な合成後、特定の位置で酵素学的に所望の蛋白質ドメインを分離することができるからである。対応した遺伝子は、上記のような方法で処理され、完成した蛋白質は、蛋白質分裂酵素又は糖脂質アンカーの認識配列として適する追加のアミノ酸配列を含有している。この追加の配列は、天然の蛋白質の構造を変化させない。所望の蛋白質ドメインが、この認識配列上での、完全な蛋白質の酵素的分離によって、天然で且つオリゴメリックな構造で得られる。その性質によると、この認識配列は、プロテアーゼによって認識され且つ分離されるアミノ酸配列である；しかしながら、それは、また、脂質アンカーにおける認識配列でもあり、その際、目的とする分離は、同様にリパーゼによっても可能である（これに関しては、フェルグソン、エム．エー．ジェイ．（Ferguson M.A.J.）,"Ann.Rev.Biochem.",57,285−320（1988）参照）。
本発明の方法の第１段階は、認識配列の挿入に適した蛋白質の領域を、まず同定することである。これは、”ペプスキャン（Pepscan）”と呼ばれる方法によって起こる。その後、例えばEcoR Iのようなエンドヌクレアーゼにおける認識配列を、所望のアミノ酸配列をコードする配列−蛋白質中の認識配列−に挿入される同定された蛋白質範囲に対応する遺伝子配列中に作る。EcoR Iの代わりに他のエンドヌクレアーゼが使用できる；しかしながら、他の類似の認識配列がこのエンドヌクレアーゼの認識配列の近い付近に存在してはならない、なぜならば、さもなくばそのクローニング効率が減少するからである。この方法によって得られる遺伝子は、ベクター、例えば、挿入された認識配列を含む完全な蛋白質をその後合成する適当な真核細胞に形質移入された（”導入された（introduced）”）プラスミドに挿入される。この方法によって、完全な蛋白質が、天然でオリゴメリック且つグリコシル化された形態で得られる。その後、所望のドメインは、挿入された認識配列で蛋白質を切断する適当な酵素によって蛋白質の残りから分離する。所望の蛋白質ドメインが、続いて、適当な精製方法、たとえば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は勾配遠心分離などによって、精製される。使用する分裂（”蛋白質分解”）酵素に関しては、その適合の基準は、それが、該アミノ酸配列によって分裂（”切断（cleavage）”）位置を認識する事実である。この条件は、バクテリアのコラゲナーゼ、また、まばらな植物性の（vegetable）コラゲナーゼ及び血液凝固因子Xaが適する。
本発明の好ましい態様としては、該前駆体蛋白質の天然のプロセッシング配列は、収率を上げるために破壊される。これは、例えば、プロセッシング配列において、１又は２以上のアミノ酸を交換することによって起こる。HIV  gp160の場合、前駆体蛋白質は個々のドメイン（HIVにおいては、gp41とgp120）に分割されない結果となる。
前駆体蛋白質は、該細胞の粗面小胞体（RER）中で合成される。該蛋白質は、加工されない、即ち、ゴルジ体の中でこのように細胞表面上に輸送されるまで、個々のドメインに分割されない。もし、前駆体蛋白質のプロセッシング配列が、破壊されると、膜の製造時にRERにまだ存在している前駆体蛋白質の量だけでなく、既に細胞表面輸送された加工されていない前駆体蛋白質も、加えて、得られる。
本発明のより好ましい態様としては、真核細胞への変異遺伝子の導入は、プラスミドによってではなく、組み換えウイルス、特に組み換えワクシニアウイルスによって起こる。ベクターとして組み換えワクシニアウイルスを使用すると、非常に多くの量の所望のウイルスの蛋白質のドメインを産生する点で、有利である。特別の遺伝子の変異体が例えば、ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入される。そのような組み換えの可能性は、約1/1000〜1/10,000なので、組み換え後の組み換えウイルスを選択することが有利である。これは、例えば、HTK細胞中、突然変異因子ブロモデオキシウリジンを使用することによって起こすことができる。野生型ワクシニアウイルス（TK+）のみ、この突然変異誘発性のヌクレオチド誘導体を該DNAに挿入し、組み換えウイルス（TK-）の量は、既に２つの選択後約90％である。レイトプロモーター（late promoter）、例えば、強力なワクシニアプロモーターである牛痘160Kプロモーターを使用すると、高い蛋白質の収率が得られる（パテル  ディー．ディー．ら（Patel D.D.et al.）"Proc.Natl.Acad.Sci.USA",85,9431−9435（1988））。真核細胞の細胞質中の遺伝子の発現において、ベクターとしてワクシニアウイルスを使用する調査は、モス  ビー（Moss B.）（”サイエンス（Science）",252,1662−1667（1988））によって提供されている。
本発明の方法に関して、更に明細書では、本発明に関する認識配列及び本発明の天然蛋白質ドメイン及びそれらの使用が、従属項の主題を構成している。
全く一般的な方法で上記に概略を述べた本発明は、HIVのenv糖蛋白質の構造の調査の間になされた；しかしながら、それは、エンベロープ膜を構成するすべてのウイルスの場合に、原則として使用できる。env糖蛋白質のエクトドメインの結晶化実験においては、疎水的な膜内外ドメインがない、天然でオリゴメリックな形態でエクトドメインを産生することが必要である。しかしながら、タイプＩのウイルス糖蛋白質のオリゴマー化の過程は、おそらく、生合成中、この疎水的な構内外ドメインの存在の機能である。更に、ポリペプチド鎖の折りたたみ（folding）は、ポリペプチド鎖が合成の間、膜に結合しているという事実に影響を受けているようである。env糖蛋白質のエクトドメインを、天然な形態で得るために、完全な変異体env糖蛋白質が、env遺伝子へのコラゲナーゼ分裂位置をコードする配列の挿入後、最初にCOS細胞中で合成され、その後、所望のエクトドメインがバクテリアコラゲナーゼによって合成された全蛋白質から分離され、続いて精製される。
コラゲナーゼ分裂位置、認識配列、の挿入における蛋白質中の適当な位置を同定することは、それゆえ、大きな問題であることが判明した。該蛋白質において、認識配列が挿入でき、該蛋白質が成功して分裂されるような領域は非常に小さいことが判明した。そのような適当な位置を純粋に経験に基づいて決定をする中で、所望の蛋白質分解性の分離が可能である位置を見つけるために、gp41の所望の領域中異なった位置に認識配列を挿入して30種以上の異なるenv遺伝子変異体を産生しなければならなかった。
以下に使用している、HIV  env糖蛋白質のアミノ酸及びHIV  env遺伝子の塩基の番号付けは、ラトナーによって提供された番号付けを参照する（ラトナー（Ratner et al.,），ネイチャー（Nature）,313,277−284（1985））。
env糖蛋白質の正確で特別な構造は、知られていない。プロテアーゼ分解位置が、理論的に挿入されている該蛋白質の領域の構造を、以下に描いている（図１も参照）。
もし、gp41の疎水性のプロフィールから始めると、膜内外領域の第１のアミノ酸は、本発明者の意見としては、Trp678である。しかしながら、gp41の膜内外領域の正確な位置について、専門家は、一致していない。ボログネシ  ピー．ディー．（Bolognesi,P.D.）（"Mol.Biol.Med.",7,1−15（1990））は、例えば、gp160の膜内外領域はアミノ酸691からアミノ酸712にわたると仮定している。位置、611、616、624及び637に位置したgp41の４種の保護されたグリコシル化位置は、エクトドメイン中、膜内外ドメインのアミノ末端でなければならないことは明らかである。更に、精製されたgp120とgp160の調製物でのUV円偏光二色性測定から、gp41の二次構造について、結論された。これらの測定によって、gp120は殆ど専ら、βー折り紙構造（β−pleated−sheet stracture）からなり、一方、gp160は、約30％がα−ヘリックス領域を示していることが、判明した。このことは、gp41の二次構造が、本質的にはα−ヘリックスであることを示唆している。加えて、異なるHIV株のenv遺伝子の配列分析から、Pro609と膜内外領域（Trp678）間のgp41における領域もまた、α−ヘリックス構造を有していることが結論できる。この仮説は更に、調査したPro609とTrp678間のHIV株のいずれも、α−ヘリックス構造を遮るであろうプロリンを有していないという事実によって支持されている。もし、本発明者及び他の者の結果もまた、より広く包含するならば、即ち、HIVenv糖蛋白質が四量体であると結論つけると、４種の長い両親媒性（amphiphatische）のα−ヘリックスが絡み合ったヘリックスの構造を形成し（超ラセン（coiled−coil））、サブユニットの特殊な疎水性領域が、それによってgp41のオリゴメリックな構造が安定するようにお互い相互作用すると想像できる。このモデルにおいて、親水性アミノ酸側鎖（hydrophilic amino−acid side chains）は、４量体のヘリックスの外に局在しており、異なるアミノ酸が、異なる株において存在している。
以前名付けた仮説に基づいて、アミノ酸637の最後のグリコシル化位置と膜内外ドメインのはじまりの間の領域を、膜内外の領域の始まりが予測されているところに従って、とにかく40から53個のアミノ酸長のセクションを認識配列の挿入のために選択した。認識配列の機能性において、本質的には、それは、対応する分裂酵素に容易に影響されなければならない。
認識配列の挿入における適当な位置の局在化は、本質的には分裂酵素における対応する蛋白質領域の接近性に依存するというこの認識に基づいて、クレーム４−７の主題を構成している方法である、認識配列のための適当な挿入位置の同定について、新規な方法を開発した。
蛋白質に対する抗体は、該蛋白質の外部に局在し、免疫系の細胞にこのように影響を受ける構造に対してのみ形成でき、その影響性は、また、機能性の認識配列の重要な基準であるから、認識配列の挿入のための蛋白質中の適当な領域は、これらのエピトープが、特定の蛋白質で免疫後形成される抗体に対して同定されることで特定される。ピー．ホーラル（P.Horal）及び共同研究者らは、HIV−１−env糖蛋白質gp41のどの領域に対して抗体が完全に形成されるか調査するためにいわゆる”ペプスキャン”法を使用した（ピー．ホーラルら（P.Horal et al.），文献"J.Virol.",65,2718−2723（1991）中参照。）。この方法は、本発明においては、認識配列のための蛋白質中の適当な領域の同定において、ホーラルらとは、異なって使用されている。このため、原則として、該蛋白質の小さなフラグメントを、ほ乳類を完全な蛋白質で免役することによって得られた抗体と共に混合した。実際としては、該蛋白質は、フラグメントに分解されず、むしろ、簡単のために、長さ５から30、特に12から16アミノ酸の蛋白質配列に一致して重複しているペプチドを合成した。これらのペプチドは、HIV−１−陽性患者由来の血清と複合する。この血清中に存在する抗体は、天然蛋白質の場合、表面に接近して局在し、認識配列の挿入位置の可能性を示すそれらのペプチドと反応する。この方法によって、数個のアミノ酸の領域まで、使用したペプチドの長さに従って認識配列の挿入に、該蛋白質中の最も適した部分を同定することができる。正確に最適な位置を見つけるために、以前同定した領域中の認識配列において最適な位置を正確に位置づけるために必要であるだけの、多くの蛋白質変異体を産生し、且つ試験した。HIV−１のenv糖蛋白質の場合、コラゲナーゼ分裂位置の挿入に最も適した位置は、Leu659とLeu660の間に局在している（図２参照）。遺伝子配列と、蛋白質配列の共直線性に基づいて、これは、env遺伝子のヌクレオチドＡ  7778及びＴ  7779に対応する。この位置から始まって、コラゲナーゼ分裂位置の挿入は、Ｃ末端とＮ末端の方向に、各々17アミノ酸の範囲で同様に可能である；距離が増加するに従って、分裂産物及びそれと共に所望の蛋白質ドメインの収率が減少することを考慮しなければならない。
適当な分裂位置の構造を決定することによって、更に問題が提起された。ポリペプチド配列を特異的に分裂するプロテアーゼはむしろほとんどない。特異性の高いプロテアーゼの例としては、バクテリアの、まばらな（sporadicslly）、また、植物のコラゲナーゼ類又は血液凝固因子Xaがある。また、糖脂質アンカーの認識配列が、原則としては、適当である。複雑な問題は、例えばDNA制限エンドヌクレアーゼと異なる殆どのエンドヌクレアーゼが、分裂位置の認識において、基質の配列だけでなく、特定の二次又は三次構造にも依存しなければならないが、それらが知られていないという事実である。更に、認識配列は、その大きさによって有意に影響されることから完全な蛋白質の構造を除外するために、大きすぎてはならない。
一般の形態の、短く、コラーゲン様（collagen−like）配列
−（Ｇ−Ｐ−Ｘ）ｎ−
（但し、ｎ＞１、特に３であり、Ｘは、遺伝暗号によって決定される20種アミノ酸の１つである）が、認識配列として最も適している（請求項４）。
同様の配列が、ドイツ特許出願DE37 31 874中に示唆されているが、融合蛋白質の一部分としてである。本発明と対比して、出願DE37 31 874中の目的は、発酵過程において特に小さな蛋白質及びペプチドを産生することである。しかしながら、ちょうど特に、そのようなペプチドが、細胞中、蛋白質分解的分解に増強した形で露出しており、該ペプチドが、バクテリアのアミノ酸配列及びコラーゲン様配列と共に、より大きな融合蛋白質の一部分として、バクテリアの宿主細胞中で合成され、続いてバクテリアのコラゲナーゼによって分裂されることが示唆される。
述べたコラーゲン様配列を用いて、三種の異なるHIV−１−env遺伝子変異体（E3CA、E3CB、E3CC）が、産生され、その発現産物が、特異的に所望の方法でバクテリアのコラゲナーゼによって、分離することができる。これらの変異体を用いて、env糖蛋白質のエクトドメインを、水溶性で、オリゴメリックな、特にそのモノマーが電気移動度で約140kDを示し、それ故gp140と呼ばれている四量体の糖蛋白質として得ることができる。これらの蛋白質は、ドメインgp120と、ドメインgp41の一部分からなる（請求項11から14）。それらは、もはや、膜内外ドメインを示さないので、糖蛋白質の天然の構造を変えることができる強力な界面活性剤は、完全なgp160の精製と異なり、これらの糖蛋白質の精製のために、全く必要ない。gp140がオリゴメリックな構造を有しているという事実についての明らかな証拠は、一方は、沈殿分析からの結果であり（図4;これに関しては、イエール  ピー．エル．ら（Earl,P.L.et al.）"Proc.Natl.Acad.Sci.USA",87,648−652（1990）も参照。）、他方は、架橋（cross−linking）実験（この方法学に関しては、スチャワラー  エムら（Schawaller M.et al,）”ヴァイロロジー（Virology）",172,367−369（1989）参照。）からの結果である。env遺伝子変異体E3CAを使用してオリゴメリックなgp140を得ることを、図１から４と共に、以下の実施態様中に詳細に説明する：
図１は、ウイルスの表面膜中の膜内外ドメインを有するHIVenv糖蛋白質の略図を示す。番号は、ラトナーら（Ratner et al.,），ネイチャー（Nature）,313,277−284（1985）の命名に従ってアミノ酸の位置を示す。ドメインgp41はアミノ酸512で始まるが、しかしながらそのような略図中位置を示すことは困難である。
図２は、BH10クローンの野生型env遺伝子（E1（WT））及び種々の変異体の産生物のアミノ酸配列一部分を示す。野生型env産生物に対比して変異体中の変化は、下線を引いている。
図３は、異なる濃度のバクテリアコラゲナーゼによる野生型env−及びE3CAenv蛋白質の特異的分裂を示す。得られた産生物を、６％SDSポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動分離後のイムノブロッティング、続いて、抗gp120ポリクローナルウサギ血清による検出によって分析した。その後、放射的に標識された、抗ウサギイムノグロブリンの二次抗体（アマシャム（Amersham）IM134）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。
図４は、野生型及びE3CA変異体の膜のコラゲナーゼ消化の産物の沈降分析を示す。コラゲナーゼ濃度:200mU/ml、37℃、３時間。得られた産物は、10mMヘペス（HEPES）、pH7.8、150mM NaCl中、５から20％のショ糖勾配を行って、層をなし、SW41ローター（ベックマン（Beckmann））中、35,000rpm、５℃で16時間遠心した。10種のフラクションを、チューブの底から収穫（harvest）し、イムノブロッティングで分析した。
env遺伝子変異体、E3CA、E3CB、E3CCの構築を図２に示し、その中で、野生型のenv遺伝子（E1）の配列を、膜内外領域（transmembrane domain）及び膜内外領域に対しアミノ末端に位置している領域を示した。エンドヌクレアーゼEcoR Iの単独の切断位置を、蛋白質中Leuが、Pheに置換する結果となる点突然変異（point mutation）によってLeu659をコードする位置に作成する。それによって得られた産物は、env遺伝子変異体E3である。この新しいEcoR I切断位置に、以下のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入した（アミノ酸配列の省略形については、例えば、エー．エル．レーニンジャー（A.L.Lehninger）、ビオヘミー（Biochemie）ヴィシーエイチ−ヴァーラグワインハイム（VCH−Verlag Weinheim）1987を参照）。
0003658690.tif 000002
この、13アミノ酸長の配列は、コラゲナーゼ認識及び分裂位置を示す。この挿入での産物をE3CAと命名した。この配列をコードする39塩基対長のオリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステム社（Applied Biosystems company）のDNA合成装置で合成した。env遺伝子変異体の産生及び発現ベクター内でのそれらのクローニングについては、ティー．マニアティスら（T.Maniatis et al.）、モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（N.Y.）、アメリカ合衆国（USA）（1982）も参照。
env遺伝子変異体の構築
a:プロセッシング配列の破壊
収率を上げるために、まず最初に、env遺伝子産物の天然のプロセッシング配列を破壊した。プラスミドpVB4（ボッシュ  ヴイ及びポウリタ  エム（Bosch,V and Pawlita,M）、"J.Virol"、64,2337−2344（1990））中、アデノシン7334をシトシンに置き換え（Ａ  7334  Ｃ）、その結果、蛋白質中、アルギニン511がセリンで置換された（Arg  511  Ser）。
この方法で変化したプラスミドpVB4を、その後、プロテアーゼ分裂位置を含むE3CAプラスミドと結合させた（以下のc:参照）。これに対し、pVB4の5'−末端（Sal I/Hind IIIフラグメント）を、E3CAプラスミド（HInd III/Xho Iフラグメント）の3'−末端と結合させ（ligate）、ｐ−ブルースクリプト（ｐ−bluescript）にクローン化させた。
b:部位−直接的突然変異誘発（Site−directed mutagenesis）
BH10env由来の遺伝子（Sal I/Xho IフラグメントをM13ベクターにクローン化した。BH10クローンに関しては、ラトナーら（Ratner et al.,），ネイチャー（Nature）,313,277−284（1985）を参照。EcoR I認識配列の産生の突然変異誘発については、オリゴヌクレオチドMAN  59:
0003658690.tif 000003
を用いて、ティー  クンケルら（t.Kunkel et al.）（"Meth.Enzymol",154,367−382（1987））に従って行った。
突然変異誘発された塩基Ａ  7781Cをアスタリスクでマークし、EcoR I認識部位を太くしている（bolded）。番号は、env遺伝子産物中の対応するアミノ酸の位置を示している。
その確認を、シークエンシングによって行った。この方法で得られたenv遺伝子変異体を、E3（BH10,A7781C）と、名付ける。
c:相補的なオリゴヌクレオチドの挿入
ブルースクリプト（bluescript）pks＋内に含まれるEcoR I認識配列を、EcoR Iによる開裂、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント（Klenow fragment））による充填及びリガーゼによる末端の結合によって、破壊した。その後、envE3を、ブルースクリプトpks＋内にサブクローン化した。そして、E3をEcoR Iで直線化しアガロースゲルを経て精製した。
コラゲナーゼ分裂部位をコードする配列39ヌクレオチド長の挿入をE3のEcoR I認識部位：
0003658690.tif 000004
に行った。
この方法によって得られた変異体を、E3CAと命名する。更に２種の変異体を、相補的なオリゴヌクレオチド配列Man83及びMan84（E3CB）並びにMan85及びMan86（E3CC）を用いて、産生した。これらのオリゴヌクレオチドを以下に示す：
0003658690.tif 000005
E3中のEcoR I認識部位への相補的なオリゴヌクレオチドの挿入のために、オリゴヌクレオチドを150mM  NaCl,TE（10mMトリス（Tris）,0.1mM EDTA,pH8）中（1:1,モル：モル）中で混合した。該混合物を、そして、95℃で２時間加熱し、その後30分間室温まで冷却した。その後、直線化されたE3（PKS＋）と大過剰の特定のオリゴヌクレオチド対とともに、リガーゼ反応を行った。この方法によって産生されたプラスミドを、大腸菌（Escherichia Coli）DH5中に形質転換し、シークエンシングによって分析した。新しい組み換えプラスミドの収率は、90％を越えている。
d:発現ベクターpSVLへのクローニング：
env遺伝子を発現するために、それらを発現ベクターpSVL（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）にクローン化した（pSVL中固有のBamH I認識部位は事前に削除されている。）。pSVLを、Xho Iで直線化し、env遺伝子をSal I/Xho Iフラグメントとしてサブクローン化した（BH  10  クローン）。そのenv遺伝子を、SV40レイトプロモーター（late promoter）の制御下においた。
種々の遺伝子を含む発現ベクターの産生の更なる可能性は、いわゆるPCR（ポリメラーゼ鎖反応）構築による。この方法論の概略は、ジョーンズ  ディー．エイチ．ら（Jones,D.H.）、”ネイチャー（Nature）",344,793−794（1990）にある。
env遺伝子変異体E3CB及びE3CCを、以下の理由により製造した：α−ヘリックス内でのコラゲナーゼ切断部位の配列が機能性に影響を有している合理的な可能性がある。α−ヘリックス中、３個のアミノ酸が１つのヘリックスの完全な回転（revolution）を概ね構成しているので、α−ヘリックス内のコラゲナーゼ分裂部位の配列は、それぞれ１個のアミノ酸アラニン（E3CB）及び２個のアミノ酸アラニン（E3CC）を挿入することによって、約120゜と240゜、それぞれシフトされていた。しかしながら、この方法によって得られた変異体E3CB及びE3CCは、E3CA変異体と同じく陽性の結果を導いた。
種々のenv遺伝子の発現をCOS7細胞中で行った。COS7細胞は、線維芽細胞であるが；原則的には、全ての真核細胞が、例えば、CV1細胞、酵母細胞、昆虫細胞（サマーズ，エム．ディー．（Summers,M.D.）及びスミス，ジー．イー．（Smith,G.E.）：ア  マニュアル  オブ  メソッズ  フォー  バキュロウイルス  ベクターズ  アンド  インセクト  セル  カルチャー  プロシージャーズ（A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture procedure）、テキサス  アグリカルチュアル  エクスペリメント  ステイション（Texas Agricultural Experiment Station）、公報（Bulletin）No.1555（1988））などが、代わりに使用できる。該COS7細胞を、pSVLプラスミドと共に、エレクトロポレーションによって形質転換し、続いて、完全成長培地（complete growth medium）（グラツマンワイ．ら（Gluzman Y.et al.）、”セル（Cell）”、23,175−182（1981））中48時間インキュベートした。その後、該細胞を収穫し、該env蛋白質を分析した。全ての現行の方法が、発現ベクターと共に細胞の形質転換に使用されたが、本例においては、エレクトロポレーションの収率は、特に、10〜50％と、良い成功率であった。
エレクトロポレーション
対数増殖期の約107（2x106−5x107）個のCOS7細胞を、トリプシン分解（tripsinate）し、DMEM（ダルベッコー修飾イーグルズ培地（Dulbecco Modified Eagles'Medium））で洗浄した。エレクトロポレーションのために、DMEM中、細胞を５−30μｇのpSVLと混合し、バイオラッドジーンパルサー（BioRad Gene Pulser）（室温;800μl;250V;500μF;0.4cm細胞中エレクトロポレーションを行った。
コラゲナーゼ分裂が、所望の成功を導いているかどうか、即ち、変異体E3CAのコラゲナーゼ処理後、env糖蛋白質（gp140）の天然のエクトドメインが抽出されるかどうか分析するために、ショ糖密度遠心による低張性の細胞溶解の後、膜調製物（membrane preparation）を製造した（スチャワラー  エムら（Schawaller M.et al,）”ヴァイロロジー（Virology）",172,367−369（1989））。
膜調製物の精製（cleaning）：
膜調製物を数回洗浄し、HEPES緩衝生理食塩水（buffered saline）（HBS:10mM HEPES pH7.8;150mM NaCl）：＋1/10 vol.10xHBS,＋1/100 vol.1M CaCl2,＋1/5 vol.20％  β−Ｄ−オクチルグルコシドに、37℃で溶解させる。その後ポッター（Potter）と共に処理。37℃で数時間インキュベート。100,000xg、37℃で、30分間遠心。得られた上清を、クロストリジウム  ヒストリチクム（Clostridium histolyticum）由来の精製したコラゲナーゼ（EC3.4.24.3）（シグマ（Sigma）C0773,ダイセンホフェン（deisenhofen））を、1.2から333mU/mlの濃度で、プロテアーゼ消化にかけた。
コラゲナーゼ消化：
コラゲナーゼ消化を、以下のバッファー中３時間37℃で行った：
300  mM  NaCl
20  mM  HEPES（ヒドロキシエチルピペラジン  エタン  スルホン酸（sulfonic acid））,pH7.8
10  mM  CaCl2
50  μＭ  ZnCl2
４  ％  β−Ｄ−オクチルグルコシド
以下のプロテアーゼインヒビターを、非特異的な蛋白質分解を最小限に抑えるために、このバッファーに加えることができる。
１  μＭ  E64（システインプロテアーゼインヒビター）
１  μＭ  ペプスタチンＡ（pepestatine A）（アスパルチル（aspartyl）プロテアーゼインヒビター）
１  mM  PMSF（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）（セリンプロテアーゼインヒビター）
β−Ｄ−オクチルグルコシドの代わりに、CHAPS又はDOC（デオキシコレート）の様な、他の穏やかな界面活性剤も使用することができる。膜蛋白質上の種々の界面活性剤の作用については、ウォマック，エム．ディー．ら（Womack,M.D.et al.）,"Biochim.Biophys.Acta",733,210−215（1983）も参照。
最適なコラゲナーゼ濃度は、50から250mU/m1（３時間、37℃）であり、より高い濃度では、非特異的な消化産物が、より強い態様で発生し、所望の産物、即ち、140kD糖蛋白質の収率が、低くなる。
140kD  env糖蛋白質（gp140）の精製
a:レンチルレクチンアフィニティクロマトグラフィー
蛋白質溶解したフラクションを、蒸留水にて1:1に希釈し、レンチルレクチンセファロース4Bカラム（ファルマシア（Pharmacia）17−0444−0'）にかけた。該混合物を５カラム容量のHBS、２％β−Ｄ−オクチルグルコシドで洗浄し、その後、５カラム容量のHBS、そして５カラム容量の10mM  HEPES（pH7.8）,50mM  NaClで洗浄した。その後、該混合物を、10mM  HEPES、50mM  NaCl中、500−1000mM  α−Ｄ−メチルマンノシドで溶出した（任意に37℃に暖めて）。レンチルレクチンアフィニティクロマトグラフィーに関しては、ハイマン、エム．ジェイ．ら（Hayman M.J.et al.,）”フェブスレターズ（FEBS Letters）",29（２）,185−188（1973）も参照。
該溶出物を、その後、濃縮した。現時点で、gp140は、約50−70％の純度で存在している。
b:Mono  Ｑ  EPLC:  a:からの溶出物を、10mM  BTP（ビス−トリスプロパン）、50mM  H3BO4、pH8.2中に溶解させ、Mono  QHR  5/5カラム（ファルマシア）にかけた。該蛋白質の濃度が、それによって約1mg/mlになった。カラムを40分間、0.5−1ml/分、UVモニター280nm、SDS  PAGE  クマシー及び／又は  ウエスタンブロットによる分析で、30−600  mMのNaClグラジエントによって溶出した。該gp140のenv蛋白質は、約400mM  NaClで溶出する。Gp140は、約80〜90％の純度で存在する。該バッファーへのH3BO4（ボレート（borate））の添加が、該糖蛋白質の凝集を妨げる点で有利である。H3BO4による糖蛋白質の凝集の妨害は、おそらく糖蛋白質内のよくある近接のヒドロキシ基の複合に基づいている。
c:ショ糖密度遠心：  b:からの約1mlの溶出物を、HBS（10mM  HEPES,pH7.8;150mM  NaCl）中作成された５−20％ショ糖グラジエント上にロードし、SW41ローター（ベックマン）中、35,000  rpm、16時間５℃で遠心した。その後、10個の分画を（底から上に）取り除いた。フラクション５中、gp140が90−95％の純度であった。分析は、SDS  PAGE  及び／又は  ウエスタンブロットによって行った。遠心中バッファー内にCaイオンは全く含まれないので、HEPESバッファーの代わりに、リン酸バッファーを使用することもできる。
蛋白質分解産物を、SDS−PAGE（ラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）及び続いて、gp120及びgp160を共に認識する、gp120に直接対するポリクローナルウサギ血清を用いるイムノブロッティングによって、分析した。
図３におけるイムノブロット（ウエスタンブロット）によって、野生型env遺伝子（クローンBH10）及び変異体E3CAが、ほぼ同量のgp160を発現していることが判る。もしプロセッシング配列が、完全であれば、明らかに、ゴルジ体中で起こる、gp160からgp120とgp41への蛋白質プロセッシング過程が、野生型env及び変異体env蛋白質の場合と同じように起こっている。バクテリアのコラゲナーゼでの処理後、E3CAenv蛋白質は、野生型env蛋白質の消化においては見つけられない、その単量体の形態が、約140kDの電気泳動の移動度を示す、新規な消化産物になった。この消化産物は、env糖蛋白質の所望の天然エクトドメインである。新規な消化産物の電気泳動の移動度は、gp120の場合よりも幾分140kDの方が小さく、コラゲナーゼ分裂部位が、ドメインgp41の領域中完全な蛋白質gp160のアミノ酸659に挿入されたという事実の結果である。ドメインgp120は、アミノ酸アルギニン511で終わっている（図１も参照。）。該新規に産生された、HIV−１−env糖蛋白質の天然のエクトドメイン、gp140は、完全なドメインgp120、ドメインgp41の148アミノ酸長の部分的な断片及びコラゲナーゼ切断後のコラーゲン−様配列（collagen−like sequence）の断片からなる。該糖蛋白質のＣ−末端を形成するこの最後に名付けられた断片は、確かに本発明の糖蛋白質中外来のもの（foreign body）のタイプであるが、その機能を妨げない。それは除去されるが、完全にする必要はない。
野生型のenv−及びE3CAenv蛋白質のgp120の電気泳動の移動度は、コラゲナーゼ処理によって、変化しない。これにより、変異体E3CA中に挿入されたコラゲナーゼ分裂部位が、バクテリアのコラゲナーゼによって、特異的に認識され且つ分裂されたことが判る。
変異体E3CA中に挿入されたコラゲナーゼ分裂部位が、バクテリアのコラゲナーゼによって、特異的に認識され且つ分裂された事実の異なる証明が、コラゲナーゼ分裂産物の沈降分析の結果から得られる（図４）。野生型遺伝子又はE3CA−env遺伝子を発現するCOS7細胞の膜調製物を４％β−Ｄ−オクチルグリコシドで抽出し、上記のようにコラゲナーゼで消化した。得られた消化産物を、界面活性剤を含まない10mM  HEPES,pH7.8;150mM  NaCl中作成された５％−20％ショ糖グラジエントでの、SW41ローター（ベックマン）中、35,000  rpm、16時間での、ショ糖密度遠心によって遠心した。その後、全10個の分画を取り除き、env蛋白質の内容について、SDS−PAGE及びイムノブロッティングによって試験した。両例において、フラクション７及び８中に再度gp120が認められ、該フラクションは、7Sの沈降係数で、単量体のgp120に対応する。これに対比して、E3CA変異体の場合にのみ起こり、野生型の場合には起こらない、140kDの消化産物が、再度11Sの沈降係数に対応するフラクション５中に認められた。
好ましい態様としては、組み換えワクシニアウイルス（VV）は、発現ベクターとして使用される。この組み換えワクシニアウイルスの構築は、以下の態様の実施例に詳細に記載している。
ワクシニアシャトルプラスミド（vaccinia shuttle plasmid）p2100を、出発材料として使用した（パテル  ディー．ディー．ら（Patel D.D.et al.）"Proc.Natl.Acad.Sci.USA",85,9431−9435（1988））。バクテリアの起源及び耐性遺伝子に加えて、それは以下の遺伝子フラグメントを含んでいる。
0003658690.tif 000006
Tk−Ｌ＝チミジンキナーゼ遺伝子の左腕（left arm）
Tk−Ｒ＝チミジンキナーゼ遺伝子の右腕（right arm）
牛痘  160K＝プロモーター／エンハンサー配列
MCS＝多重（multiple）クローニング部位
２重鎖のオリゴヌクレオチドのクローニングによって、3'からプロモーターへ、Lac  Ｏ配列、24bpのパリンドロームが挿入され、該MCSが数種の特定のエンドヌクレアーゼ認識部位によって広げられた。Lac  Ｏ配列は、大腸菌内での転写を最小限に抑制するために必要である。
特定のenv遺伝子（野生型又は変異体:plsプラスミド由来）を、新しい制限部位にクローニングした（例えば、E3CA）（方法論については、チャクラバーティ  エスら（Chakrabarti S.et al.）"Molec.Cell Biol.",5,3403−3409（1985））。
以下の構築物が得られた：
0003658690.tif 000007
組み換えワクシニアウイルスの産生のために、プラスミドを制限分析及び部分的シークエンシングによって分析した。プラスミドを、エレクトロポレーションによってCV1細胞に形質移入し（”形質転換”、”導入”）し（COS−７細胞での条件は、態様の最初の実施例を参照）、野生型VV（コペンハーゲン（copenhagen）株（感染多重度（MOI）＜１））に感染させた。env遺伝子を発現させることができる組み換えVVを、該VVのチミジンキナーゼ遺伝子を有する、該プラスミドのチミジンキナーゼ遺伝子中、約1/1000−1/10000の可能性で、ホモロガスな組み換えによって産生させた。それらは、表現型的に、TK-であるので、それらは、HTK細胞中の5'−ブロモデオキシウリジン（BdUR）選択によって、陽性的に選択される。BdUR/HTK-選択の２巡及びCV1細胞からの続く”プラークイング（plaqueing）”（プラークの同定と組み換えVVの除去）は、約50−90％の、1ml培養物のウエスタンブロットにより同定できるenv−発現プラーク（VVenv）を生じる。別のプラークイングでは、envを発現することができる所望の組み換えワクシニアウイルスが得られる。
ウイルス膜蛋白質ドメインの使用
本発明によるウイルス膜蛋白質の天然ドメインは、ウイルスに対するワクチンとして使用することができる。この目的で、好ましくは、適当なアジュバントとともに患者に投与するのがよい。しかしながら、また含まれている例えばHEPES等の他のバッファー成分を、事前に取り除かねばならない。これは、例えば、リン酸バッファー中生理学的溶液の通常の塩に対して透析することによって、行うことができる。
更に、ウイルス膜蛋白質の天然ドメインは、免疫療法に使用することができる。
天然のウイルスの蛋白質ドメインは、診断の目的にもまた、適している。その一つとして、例えば特定の抗体を証明するためのイムノアッセイの抗原として提供することができ、また、ウイルスを直接証明するために提供することができるモノクローナル及びポロクローナル抗体類等の抗体を得るために使用することもできる。
追加の重要な精製の目的として、ウイルスの膜蛋白質の天然ドメインは、結晶化での使用である。もし、該蛋白質が、結晶性の形態で存在しているのなら、３次元構造が決定される。これは特に興味のあることである、なぜならば、これによって、バインディングポケットの正確な構造を明らかにすることができるからである。もし、この構造が知られると、おそらく、このバインディングポケットに正確に適合する非常に小さな分子である、インヒビターを構築し、また、それと共に、宿主細胞のレセプターであるCD4分子への該ウイルスの蛋白質の結合を阻害することが可能であろう。
【図１】
0003658690.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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