(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域と、該ＤＮＡの転写産物により調節を受ける、ｃａｍオペロン中のオペレーター／プロモーター領域と、該オペレーター／プロモーター領域の下流に挿入され、該オペレーター／プロモーター領域の制御を受ける遺伝子であって、その発現を検出することができるレポーター遺伝子とを含む組換えベクター。
【請求項４】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする前記ＤＮＡ領域及び前記オペレーター／プロモーター領域を含むＤＮＡ領域である、配列表の配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ領域を含む請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ構造遺伝子群である請求項３又は４記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記ルシフェラーゼ構造遺伝子群は、ルシフェラーゼ構造遺伝子Ｃ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＥから成る請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】
下記に示す構造を有する組換えベクターＦ６である請求項６記載の組換えベクター。
【化１】
0003655692.tif 000007
【請求項８】
請求項３ないし７のいずれか１項に記載の組換えベクターにより形質転換され、前記レポーター遺伝子の発現により、＋カンファー、２−メチルイソボルネオール及びボルネオールを検出することができる微生物。
【請求項９】
大腸菌である請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
大腸菌変異株ＤＨ５α−Ｆ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３６６）である請求項９記載の微生物。
【請求項１１】
＋カンファー、２−メチルイソボルネオール及びボルネオールから成る群より選ばれる臭気物質の少なくともいずれかを含むかもしれない被検試料を、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の微生物と接触させ、前記レポーター遺伝子の発現により前記臭気物質を検出することから成る臭気物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カンファーオペロン中のリプレッサー遺伝子（以下、「ＣａｍＲ」ということがある）を突然変異誘発剤で処理することにより得られた新規なＤＮＡ、それを含む組換えベクター、それを含む微生物及び該微生物から成る臭気センサー及び該微生物を用いた臭気の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水道水の異臭味の被害は平成２年に２１００万人を超え、中でもカビ臭は近畿、関東地方を中心に多大の不快感を与え、おいしい水供給の観点から解決に急を要する大きな問題になっている。カビ臭原因物質として二環性モノテルペンである２−メチルイソボルネオール（２−ＭＩＢ）と二環性セスキテルペンであるジェオスミン(geosmin) が同定されており、これらのカビ臭物質は藍藻類（藍菌：Cyanobacteria)又は放線菌のある種によって産生される。
【０００３】
これらのカビ臭物質は、活性炭処理、オゾン処理、生物処理等の高度処理の単独又は組合せによりほぼ除去可能である。従って、カビ臭物質を検出することができれば、消費者に飲料水を供給する前に処理を施してカビ臭物質を除去することが可能になり、カビ臭による不快感の被害を防ぐことができる。
【０００４】
カビ臭物質は、ガスクロマトグラフィー等により検出可能であるが、これらの方法は煩雑な操作と精密な機器を必要とし、コストもかかり、多数の試料を検査する場合には不向きである。より簡便にカビ臭物質を検出する方法は知られていない。
【０００５】
本願発明者らは、先にシュードモナス・プチダのＣａｍオペロン中のＣａｍＲ及びオペレーター／プロモーター領域（以下、「ｏｐ領域」ということがある）の下流にレポーター遺伝子を結合した組換えベクターで形質転換した大腸菌を用いてカビ臭物質を検出する方法を発明し、特許出願した（特願平７−８０７１７号）。Cam オペロンはCamphor （カンファー：樟脳）を唯一の炭素源として生育可能な、シュードモナス・プチダのような土壌微生物由来の遺伝子群でありカンファー分解における初期段階に働いている遺伝子群である。本願発明者らはこの遺伝子群がカンファーに化学的構造が良く似た上水道においてかび臭物質と認められている2ーMethylisoborneol (2-MIB)も分解することを明らかにした。さらにcam オペロンの中にあって遺伝子発現を制御している領域であるcamR抑制遺伝子とオペレーター、プロモーター（o/p ）部位の下流に海洋性発光微生物由来の発光遺伝子群であるlux オペロンを連結した組換えplasmid DNA 分子pLC ８７を作製しこれを大腸菌DH５αに導入した組換え微生物を作製し、上記のように特許出願した（特願平７−８０７１７号）。この微生物の培養液にカンファーや2-MIB を添加するとその添加した量に応じた発光強度が得らる。発光強度は発光測定装置（ルミノメーター）やＸ−線写真フィルム等によって測定する。これは知りうる限り初めて特定の臭気性物質を定量することができる微生物バイオセンサーである。（以下臭気バイオセンサー）臭気バイオセンサーは2-MIB の濃度の測定に適用できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
先に特許出願した上記大腸菌ＤＨ５α＋ｐＬＣ８７は、カンファー、２−ＭＩＢ及びボルネオール等の臭気物質を検出することができる。これらの臭気物質をさらに高感度に検出することができる微生物が得られれば、より高感度な検出が可能であるので望ましい。
【０００７】
従って、本発明の目的は、高感度に臭気物質を検出することができる臭気センサーとして利用できる微生物、その形質転換に用いられる組換えベクター及び該組換えベクター中に含まれる新規な変異ＣａｍＲ遺伝子ＤＮＡを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、ｐＬＣ８７中の、ＣａｍＲ及びＣａｍオペロン中のｏｐ領域を含むＥｃｏＲＩ断片を突然変異誘発剤で処理し、得られた変異ＤＮＡ断片を、ｐＬＣ８７の構築と同様にして、レポーター遺伝子を含む組換えベクターに挿入し、得られた組換えベクターで形質転換した大腸菌について、上記臭気物質の検出感度が親株である大腸菌ＤＨ５α＋ｐＬＣ８７（生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４８１８として寄託、（以下、「野生株」ということがある））よりも有意に高くなっているものをスクリーニングした結果、所望の変異株が得られた。さらに、該変異株中に含まれる組換えベクター中のＣａｍＲ遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるリプレッサーのアミノ酸配列を決定し、野生株のものと比較したところ、Ｎ末端から９０番目のチロシンがシステインに変異していることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域と、該ＤＮＡの転写産物により調節を受ける、ｃａｍオペロン中のオペレーター／プロモーター領域と、該オペレーター／プロモーター領域の下流に挿入され、該オペレーター／プロモーター領域の制御を受ける遺伝子であって、その発現を検出することができるレポーター遺伝子とを含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の組換えベクターにより形質転換され、前記レポーター遺伝子の発現により、＋カンファー、２−メチルイソボルネオール及びボルネオールを検出することができる微生物を提供する。さらに、本発明は、＋カンファー、２−メチルイソボルネオール及びボルネオールから成る群より選ばれる臭気物質の少なくともいずれかを含むかもしれない被検試料を、上記本発明の微生物と接触させ、前記レポーター遺伝子の発現により前記臭気物質を検出することから成る臭気物質の検出方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、下記実施例に詳述したように、上記野生株に含まれる組換えベクターｐＬＣ８７中のＥｃｏＲＩ断片を突然変異誘発剤で処理することにより作出された新規なＤＮＡであり、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするものである。本発明のＤＮＡは、野生株のｃａｍＲ遺伝子が突然変異したものであり、それがコードするアミノ酸配列を、野生株のｃａｍＲ遺伝子がコードするアミノ酸配列と比較すると、Ｎ末端から９０番目のチロシンがシステインに突然変異したものである。この突然変異の故に、下記実施例で具体的に示されるように、＋カンファー、２−メチルイソボルネオール及びボルネオールとの親和性（ひいては検出感度）が有意に高められた。下記実施例で得られたＤＮＡの具体的な塩基配列を配列表の配列番号２に示す。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、配列番号２中に示されているアミノ酸配列とは同じものである。
【００１１】
本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された大腸菌ＤＨ５α−Ｆ６株が生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３６６の受託番号で寄託されているので、該変異株から常法により容易に調製することができる。あるいは、配列番号２には、その塩基配列が明記されているので、この情報に基づき、野生株のＤＮＡをもとに常法である部位特異的変異法を駆使して本発明のＤＮＡを得ることもできる。
【００１２】
本発明の組換えベクターは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域と、該ＤＮＡの転写産物により調節を受ける、ｃａｍオペロン中のｏｐ領域と、該op領域の下流に挿入され、該領域の制御を受ける遺伝子であって、その発現を検出することができレポーター遺伝子とを含むものである。
【００１３】
ここで、レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に限定されないが、発現が視覚的に検出することができるものが簡便で好ましい。このようなレポーター遺伝子の例として、ルシフェラーゼ遺伝子群及びβ−ガラクトシダーゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
ルシフェラーゼは、アルデヒドとＦＭＮＨ2 と酸素からカルボン酸とＦＭＮと水と光を生じる反応を触媒する酵素である。生物発光を行う海洋細菌ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri)のルシフェラーゼは、ルシフェラーゼオペロン（ｌｕｘオペロン）により生産される。ｌｕｘオペロンは、単一のプロモーターにより制御されるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ）を含み、さらに調節遺伝子であるｌｕｘＲ及びｌｕｘＩを含む。ｌｕｘＡ及びＢはそれぞれ、ルシフェラーゼのサブユニットα及びβをコードしており、ｌｕｘＣ、Ｄ及びＥはアルデヒドを合成する脂肪酸リダクターゼをコードしている。従って、ｌｕｘＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを含む微生物は、発光系全体を含んでいるため、基質であるアルデヒドを与えなくても発光することができる。従って、上記ｏｐ領域の下流にルシフェラーゼ構造遺伝子群を挿入すれば、発光の有無に基づき上記臭気物質を検出することができる。
【００１５】
β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）は、β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）のグリコシド結合を加水分解する酵素である。基質であるＸ−ｇａｌはβ−ｇａｌによって加水分解されると青色を呈する。従って、β−ｇａｌをレポーター遺伝子として用いた場合、β−ｇａｌ遺伝子が誘導されればＸ−ｇａｌ存在下において青色になり抑制されれば白色となる。作製した組換えベクターにおいてレポーター遺伝子としてβ−ｇａｌを使用して構築したｐＣＲＢ９５を保有する大腸菌をＸ−ｇａｌと誘導物質としてカンファーや２−ＭＩＢを塗沫した寒天培地に画線し１６〜２０時間培養を続けコロニーを形成させるとｃａｍＲプロモーターの誘導が高くなりｃａｍＲが発現している状態を白色のコロニーとして観察することができる。コントロールの誘導物質を添加しないものは青色である。この場合カビ臭物質の有無により、青色になったり白色になったりするので上記臭物質を検出することができる。
【００１６】
レポーター遺伝子は、ｏｐ領域の制御を受けるように挿入されている必要がある。これは、ｏｐ領域の下流に、それほど距離を置かずに、かつ、他のプロモーターを介在させることなく挿入することにより達成することができる。より確実には、下記参考例において具体的に示されるように、ｃａｍＤの中の５’末端に比較的近い部位でｃａｍＤを切断し、この切断部位にフレームを合わせてレポーター遺伝子を挿入することにより行うことができる。下記参考例には、この操作をＰＣＲを用いて確実に行う方法が記載されている。
【００１７】
本発明の組換えベクターは、宿主細胞の中でレポーター遺伝子を発現するものであるから、通常のクローニングベクターと同様に複製開始点を有する。また、選択のために、薬剤耐性のような選択マーカーを有することが好ましい。このようなクローニングベクターはこの分野において周知であり、数多くのものが市販されている。本発明の組換えベクターは、このような市販のクローニングベクターに、上記ＣａｍＲ領域及びｏｐ領域並びにレポーター遺伝子を組み込むことにより作製することができる。
【００１８】
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ構造遺伝子群を含む、下記実施例において作製した本発明の組換えベクターであるＦ６の遺伝子地図が図１に示されている。また、上記のように、Ｆ６を含む大腸菌ＤＨ５α−Ｆ６が生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３６６である。
【００１９】
本発明の組換えベクターで微生物を形質転換することにより、臭気物質のセンサーとして利用可能な微生物を得ることができる。微生物としては、例えば大腸菌を例示することができるが、本遺伝子が発現可能である宿主−ベクター系が確立されている他のあらゆる微生物を宿主として利用することができる。例えば、宿主が大腸菌の場合には、大腸菌用のクローニングベクターに、上記ＣａｍＲ領域及びｏｐ領域並びにレポーター遺伝子を挿入し、得られた組換えベクターで大腸菌を形質転換する。形質転換の操作自体はこの分野において周知である。
【００２０】
本発明の微生物は、臭気物質の有無により、レポーター遺伝子の発現量が変化するので、臭気物質のセンサーとして用いることができる。すなわち、臭気物質の存在下で本発明の微生物を培養すると、レポーター遺伝子の発現量に変化が見られるので、臭気物質を検出することができる。例えば、上記Ｆ６で形質転換した大腸菌を用いる場合には、カビ臭物質を含むか否かを調べるべき試料の存在下で、通常の条件で該大腸菌を培養し、ルミノメーターで培養液の発光強度を測定することにより、試料中のカビ臭物質を検出することができる。培養は通常の大腸菌培養法に従う。培養温度は、宿主微生物が生育可能な温度範囲であり、例えば、Ｆ６を保有する大腸菌の場合には１５℃〜３０℃程度が好ましい。また、発光強度は、培養液中のカビ臭物質の濃度に依存して変化するので、既知濃度の臭気物質を含む標準液を用いて検量線を作成しておけば、臭気物質を定量することも可能である。あるいは、被検試料を含む固体培地上で、形質転換体を培養してコロニーを形成させ、発光コロニーによりＸ線フィルムを露光させることによっても臭気物質を検出することができる。この場合も、Ｘ線フィルムの露光強度に基づき、被検試料中の臭気物質を定量することが可能である。
【００２１】
本発明の組換えベクターは、臭気物質である＋カンファー、２−ＭＩＢ及びボルネオールの検出感度が野生株に含まれるｐＬＣ８７よりも高い。従って、本発明の組換えベクターで形質転換された本発明の微生物を用いることにより、これらの臭気物質を高感度に検出することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を、実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、特に明示がない限り、個々の操作は全て、Sambrook, T et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harborの記載に従って行った。
【００２３】
参考例    組換えベクターｐＣＲＢ９５及びｐＬＣ８７の作製
ｃａｍオペロンが挿入されているプラスミドであるｐＪＰ３９をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ｃａｍＲ、ｏｐ領域、ｃａｍＤ及びｃａｍＣの一部を含むＤＮＡ断片を切り出し、アガロースゲル電気泳動により該断片を回収した。一方、市販の大腸菌用クローニングベクターであるｐＵＣ１１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した。これと、上記のＤＮＡ断片とをライゲーションし、組換えベクターｐＵＣ１１９＋ｃａｍＲＤＣを得た。
【００２４】
次いで、得られたｐＵＣ１１９＋ｃａｍＲＤＣを変性し、ＲＶプライマー（配列：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）とＮｃｏＩ導入プライマー（配列：５’−ＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＧＴＴＣＴＴ−３’）とをハイブリダイズさせ、市販のＰＣＲキットを用いた常法によりＰＣＲで増幅した。この操作により、ＲＶプライマーとＮｃｏＩ導入プライマーに挟まれる領域、すなわち、ｃａｍＲの上流域、ｃａｍＲ全域、ｏｐ領域全域及びｃａｍＤの上流側の一部を含むＤＮＡ断片が増幅された。なお、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの性質により、３’末端にＡが付加されるので、増幅されたＤＮＡ断片は図示のように両端にＡを有する。一方、市販の大腸菌用クローニングベクターであるｐＵＣ１１９をＳｍａＩで切断後、Ｔを付加してＴ−ベクターを作製し、これを上記ＰＣＲ増幅断片とライゲーションしてｐＵＣ１１９＋ｃａｍＲNcoIを作製した。
【００２５】
ｐＵＣ１１９＋ｃａｍＲNcoIをＥｃｏＲＩとＮｃｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により、ｃａｍＲとｏｐ領域を含むＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片を回収した。一方、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を含むプラスミドであるｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造株式会社より市販）を、ＮａｅＩ及びＮｃｏＩで消化し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＮａｅＩ断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。この断片を、上記ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片と互いのＮｃｏＩ部位を接合させてライゲートし、ｃａｍＲ、ｏｐ領域、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＮａｅＩ断片を得た。一方、市販の大腸菌用クローニングベクターであるｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、これと上記ＥｃｏＲＩ−ＮａｅＩ断片とをライゲートすることにより、組換えベクターであるｐＣＲＢ９５を得た。次いで、常法である塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株をｐＣＲＢ９５で形質転換し、大腸菌ＤＨ５α＋ｐＣＲＢ９５を得た。
【００２６】
得られたｐＣＲＢ９５をＥｃｏＲＩで消化し、ｃａｍＲ及びｏｐ領域を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。一方、ルシフェラーゼ構造遺伝子群であるｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ及びｌｕｘＥを含むプラスミドｐＵＣＤ６１５（Rogowsky, P. et al (1987), J. Bacteriol. 169:5101-5102) をＥｃｏＲＩで切断し、該切断部位に、上記ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を挿入し、組換えベクターｐＬＣ８７を得た。
【００２７】
次いで、常法である塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株をｐＬＣ８７で形質転換した。得られた形質転換体（ＤＨ５α＋ｐＬＣ８７）は、上記のように生命工学工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８１８）。
【００２８】
実施例１    大腸菌ＤＨ５α−Ｆ６株の構築
上記参考例で得られた組換えベクターｐＬＣ８７をＥｃｏＲＩで消化し、ｃａｍＲ及びｏｐ領域を含むＥｃｏＲＩ断片を回収した。これを市販のベクターであるpBluescript II KS-（東洋紡社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。なお、挿入方向が順方向のものｃａｍＲ−ｆ及び逆方向のものｃａｍＲ−ｒの両方を作製した。得られた組換えベクターをpKS+camR-f及びpKS+camR-rと命名した（図２参照）。
【００２９】
pKS+camR-f及びpKS+camR-rで大腸菌XL1-blueを形質転換し、大腸菌pBluescript II KS-＋camR-f及び大腸菌pBluescript II KS-+camR-r を得た。これらの形質転換株の中に含まれるcamR-f及びcamR-rを、ヘルパーファージ（宝酒造製））を用いた方法により一本鎖DNA に調製した。この一本鎖DNA を直接変異原性物質として知られている亜硝酸ナトリウム溶液に混合し室温で１０分〜６０分インキュベートして変異を導入した。これにより100 塩基に１〜数個の塩基置換などの変異の導入が見込まれる。変異を導入した一本鎖DNA を逆転写酵素を用いて再び２本鎖化した。これを制限酵素EcoRI で切断後同じ酵素で切断したpUC119プラスミドベクター（宝酒造製）に組み込み大腸菌に形質転換して第一次変異株ライブラリーを作製した。次に第一次変異株ライブラリーよりプラスミドを調製しこれをEcoRI で切断し、変異を導入した断片を回収した。回収した断片を発光遺伝子群lux オペロンの導入されているpUCD615 プラスミドベクター（Rogowsky, P.M., Close,T.J., Chimera,J.A., Show, J.J., and Kado,C.I. : Regulation of the vir Gene of Agrobacterium tumefaciens  Plasmid pTiC58,J. Bacteriol.,  pp.5101-5112 (1987) ）に組み込み大腸菌に形質転換して第二次変異株ライブラリーを作製した。この第二次変異株ライブラリーより有用な変異株の選択を行った（図３〜図５参照）。
【００３０】
微生物による臭気物質の感知試験は次のようにして行った。-85 ℃でグリセロール溶液（濃度30％グリセロール）に保存しておいた微生物を５０μg/mlのAmp(アンピシリン）入り1XLB平板培地に白金耳で画線し37℃一晩培養する。単一のコロニーを白金耳でかき取りAmp 入り1XLB液体培地に植菌し37℃、16〜20時間振とう培養した。培養液200 μl をM9最小培地20mlに植え継ぎ培養温度が37,30,25,20,15℃などで140rpmでOD600nm が0.2 になるまで培養を続ける。ジメチルスルホキサイドに溶解した種々の濃度の臭気物質を添加し30〜60分おきに培養液300 μl を96穴のマイクロプレートに分取し、発光測定装置（ルミノメーター : ML3000:ダイナテック社) を使用してエンハンスドフラッシュモードで発光強度を測定する。
【００３１】
以上の操作を各工程毎に以下に詳述する。
【００３２】
(1) ランダム変異の導入
(i) １本鎖DNA （single strand(SS) DNA)の調製
１）−85  ℃グリセロールストックにしておいた大腸菌XL1-blue ( pBluescript II KS- （TOYOBO社製）+camR-f)または大腸菌XL1-blue ( pBluescript II KS-+camR-r )を5 mlのアンピシリン入り２ x YT 培地（バクトトリプトン 16 g 、 バクト酵母エキス 10 g 、NaCl  5 g /ｌ）に白金耳で植え一晩前培養する。
２） 100 ml のアンピシリン入り  2 x YT培地 100 ml に前培養液 1 ml を植え継ぎ 37 ℃で培養する。菌の増殖度 OD600＝0.1 になったらヘルパーファージM13 KO7 （宝酒造製）（1012 pfu / ml ) を 40 μl 加え３７℃１時間振とう培養する。
３）培地中の終濃度が 70 μg / mlになるようにカナマイシンを加える。その後 37 ℃で一晩振とう培養する。
４）培養液を 50 ml容遠心管 2本にに移し15,000 rpm, 4 ℃, 10分, 遠心する。
５）上清を取りもう一度同じ操作を繰り返し大腸菌をよく除く。
６）２本の 50 ml容遠心管に分けそれぞれに 25 mlの PEG溶液（２０％ポリエチレングリコール6,000, 2.5 M NaCl ) を加えよく混合する。その後室温で 30 分放置する。
７）15,000 rpm, 室温, 5 分, 遠心する。
８）上清を捨て、沈殿物を5 mlのTEに懸濁する。5 mlの水飽和フェノールを加えよく混合する。
９）15,000 rpm, 室温, ３分, 遠心する。
１０）水層を取りフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25 : 24 : 1)を加えよく混合する。
１１）9), 10) の操作をもう２回繰り返す。
１２）４M 酢酸アンモニウム ( pH 8.0 ) 800 μl とイソプロピルアルコール 10 mlを加えてよく混合する。その後氷中で 5分放置する。
１３）15,000 rpm, 4 ℃, 5 分, 遠心する。
１４）沈殿物に - 20 ℃, 80 %エタノールを 400μl 加えリンスする。
１５）15,000 rpm, 4 ℃, 3 分, 遠心する。
１６）14),15) をもう一度繰り返す。
１７）沈殿物を 100μl の TE に溶かす。分光光度計によって濃度を測定する。
【００３３】
(ii)ランダム変異の導入
１）マイクロチューブに1M酢酸ナトリウム ( pH 4.3 ) 25μl , 2M亜硝酸ナトリウム 50 μl,一本鎖 DNA 40 μg,  H2O で 100μl に調整する。室温で 10 分または 60 分インキュベートする。
２）2.5 M 酢酸ナトリウム ( pH 7.0 ) を加え反応を停止させる。
３）200 μl のH2O と1ml のエタノールを加えよく混合する。氷中に5 分静置する。
４）15,000 rpm, 4 ℃, 15分, 遠心する。
５）沈殿物を100 μl のTEに溶かす。
６）10μl の3 M 酢酸ナトリウム (pH5.2)と 220μl のエタノールを加えよく混合する。
７）15,000 rpm, 4 ℃, 15分, 遠心する。
８）沈殿物に - 20 ℃, 80 %エタノールを 400μl 加えリンスする。
９）15,000 rpm, 4 ℃, 3 分, 遠心する。
１０）8),9) をもう一度繰り返す。
１１）沈殿物を 11 μl の TE に溶かす。1 μl を電気泳動して濃度を見積もる。
【００３４】
(iii) 逆転写酵素を用いた２本鎖DNA の調製
１）マイクロチューブに7mM TrisHCl (pH7.5) , 10μg  KS プライマー (5'-TCGAGGTCGACGGTATC -3') , 50 mM NaCl,7mM MgCl2,  2 mM DTT (dithiothreitol), ≒40μg の変異を導入した１本鎖DNA を加えH2O で100 μl に調整する。
２）40℃で15分インキュベートしプライマーをアニールさせる。 69 unit逆転写酵素AMV ( Avian Myeloblastosis Virus (Gibco BRL 社製) )  ,1.25 m M dNTPs (デオキシアデノシン３リン酸、デオキシチミン３リン酸、デオキシグアノシン３リン酸、デオキシシトシン３リン酸）を加え37℃, 60分反応させる。
３）200 μl の H2Oを加える。次に300 μl のフェノール :クロロホルム (1:1)を加えよく混合する。その後 37 ℃で 5分加温する。
４）15,000 rpm, 室温, ３分, 遠心する。
５）上清を取り3),4) を繰り返す。
６）上清に30μl の3 M 酢酸ナトリウム (pH5.2)と 660μl のエタノールを加えよく混合する。
７）15,000 rpm, 4 ℃, 15分, 遠心する。
８）沈殿物に - 20 ℃, 80 %エタノールを 400μl 加えリンスする。
９）15,000 rpm, 4 ℃, 3 分, 遠心する。
１０）7),8) をもう一度繰り返す。
１１）沈殿物を 80 μl の H20に溶かす。
１２）制限酵素EcoRI で切断する。
１３）アガロースゲル電気泳動し目的の断片を回収する。
１４）プラスミドpUC119をEcoRI で切断した上でアルカリンフォスファターゼによって脱リン酸化したベクターに回収した断片をライゲーションする。
【００３５】
(iv)変異株ライブラリーの作製
１）変異を導入した後にpUC119に組込んだプラスミドの集団を大腸菌XL1-blueに形質転換した。これを第一次変異株ライブラリーとする。
２）第一次変異株ライブラリーよりプラスミドを調製し、これをEcoRI で切断し変異を導入した断片をアガロースゲル電気泳動して回収した。回収した断片を発光遺伝子群lux オペロンの導入されているpUCD615 プラスミドベクター（上掲) に組み込み大腸菌DH５α（Sambrook、J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. : Molecular Cloning 2nd Edition. Cold Spring Harbor laboratry Press.(1989)）に形質転換して第二次変異株ライブラリーを作製した。この第二次変異株ライブラリーより以下の方法に従い有効な変異株の選択を行った。
【００３６】
(2)   有用変異株の選択
変異株ライブラリーからのクローンの選択は次のような方法によって行った。
１. -85 ℃にグリセロールを添加して保存しておいたライブラリーを氷中で融解しこれの100 μl をあらかじめマイクロチューブに分注しておいた１xLB （終濃度50μg/mlになるようにアンピシリンとカナマイシンを添加）液体培地900 μl で培養液を数千でるように１０-1〜１０-4, １０-5等に希釈する。１xLB （終濃度50μg/mlになるようにアンピシリンとカナマイシンを添加）プレートにそれぞれの希釈したチューブ200 μl ずつまき３７℃で一晩培養する。
２. 単一のコロニーを1 グループあたり５０個ずつ裏面に区画番号のついたプレートに滅菌した爪楊枝で植え３７℃で一晩培養する。その後プレートは次の操作まで４℃で保存する。
３. ４８穴のマイクロプレートに１xLB （終濃度50μg/mlになるようにアンピシリンとカナマイシンを添加）液体培地を１mlずつ分注する。２本ぶんだけマイクロチューブ 700μl 同様培地を入れ準備する。２. の菌を爪楊枝で取りそれぞれ１セット５０個を２セット行う。振とう機のばねでプレートを固定し900 から1000rpm レシプロ振とうしながら３７℃で一晩培養する。
４. 区画に番号をふり110 ℃15分オートクレーブ滅菌したナイロンメンブランフィルターを新しい１xLB （終濃度50μg/mlになるようにアンピシリンとカナマイシンを添加）プレートに載せる。これを５０枚準備する。４）の菌液を10μl ずつ番号の位置にブロットする。37℃で８時間程度培養する。
５.  500mMに誘導物質（臭気物質）を調整する。（ただし2-MIB 、ジェオスミンは２０mg／ml）新しい１xLB （終濃度50μg/mlになるようにアンピシリンとカナマイシンを添加）プレートに誘導物質を100 μl ずつ塗抹する。菌を増殖させたフィルターを誘導物質を塗ったプレートに移す。暗所、室温で１時間培養する。この間にフィルターを貼るろ紙を用意する。
６. ただちにフィルターをろ紙にテープで貼りラップでおおい暗所でＸー線フィルムを載せカセットに入れ１０分インキュベートする。その後ただちに現像する。
【００３７】
(3) 結果
スクリーニングした大腸菌変異株のうち、＋カンファー、２−ＭＩＢ及びボルネオールに対する感度が野生株よりも有意に優れた変異株が得られ、大腸菌ＤＨ５α−Ｆ６株（以下、単に「Ｆ６株」）と命名した。これらの臭気物質について得られたＦ６株の発光強度を野生株と比較して図６に示す。また、２−ＭＩＢを段階希釈した試料を用いて行った同様な実験の結果を図７に示す。図７に示されるように、Ｆ６株は２−ＭＩＢを１０ｎｇ／μｌまで定量でき、これは野生株の約１０倍の感度である。なお、上記のように、Ｆ６株は生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３６６の受託番号で寄託されている。
【００３８】
(4) Ｆ６株の解析
Ｆ６株に含まれる、上記のように構築した組換えベクター（本明細書において、この組換えベクターを「組換えベクターＦ６」ということがある）をＥｃｏＲＩで消化し、ｃａｍＲを含む上記ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、常法によりその塩基配列を決定した。決定された塩基配列及び該塩基配列によりコードされる推定アミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。配列番号３中の、ｃａｍＲ部分を抜き出して配列番号２に示す。さらに、配列番号２中のアミノ酸配列を抜き出して配列番号１に示す。なお、配列番号３に示されるように、ｃａｍＲの開始コドンはＧＴＧであり、該開始コドンによりコードされるアミノ酸はメチオニンである。ＧＴＧが開始コドンとして用いられることは微生物において希にあることであり、ｃａｍＲの開始コドンがＧＴＧであることは文献においても確認されている（H Aramaki et al., Biochimie (1994) 76, 63-70）。
【００３９】
Ｆ６株のｃａｍＲによりコードされるリプレッサーは、野生株のｃａｍＲ遺伝子がコードするリプレッサーのアミノ酸配列と比較すると、Ｎ末端から９０番目のチロシンがシステインに突然変異したものであった。なお、Ｆ６株の塩基配列決定した上記ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列と、野生株の当該塩基配列の相同性を図８及び図９に示す。なお、図８及び図９において、上段が野生株、下段がＦ６株の塩基配列である。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、先に開発されたものよりも高感度に臭気物質を検出することができる臭気センサーとして利用できる微生物、その形質転換に用いられる組換えベクター及び該組換えベクター中に含まれる新規な変異ＣａｍＲ遺伝子ＤＮＡが提供された。本発明は、例えば上水道のカビ臭の検出等に大いに貢献するものと期待される。
【００４１】
【配列表】
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【００４２】
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【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組換えベクターの１実施例であるＦ６の遺伝子地図である。
【図２】本発明の微生物の１実施例である大腸菌Ｆ６株の構築工程を示す図である。
【図３】図２の工程の続きの工程を示す図である。
【図４】図３の工程の続きの工程を示す図である。
【図５】図４の工程の続きの工程を示す図である。
【図６】本発明の微生物の１実施例であるＦ６株と野生株の各種臭気物質についての発光強度を示す図である。
【図７】本発明の微生物の１実施例であるＦ６株を用いて段階希釈した２−ＭＩＢを定量した結果を示す図である。
【図８】本発明の組換えベクターの１実施例であるＦ６中の、突然変異誘発処理を施したＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を野生型と比較して示す図である。
【図９】図８の続きを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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