(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ）のコロイド懸濁液の型の薬剤組成物であって、油より構成される油層よりなり、
該油は、植物油、鉱物油、またはベンジルベンゾエートおよび高級脂肪酸のグリセリドよりなる群から選択される油状化合物であり、該油は、その中に溶解された界面活性剤およびその中に懸濁された直径が５００ナノメートル未満である複数のナノカプセルを含有し、
該ナノカプセルは、水の中の、治療薬として活性のある物質と界面活性剤との溶液または懸濁液（ｐＨは１と７の間である）よりなる水層をカプセル化し、
該ナノカプセルの壁は、ポリ（アルキル２−シアノアクリレート）（ここでアルキルラジカルは１から６個の炭素原子を有する）から形成され、
該組成物のすべての成分は、薬剤として許容される物質から選択される、
上記薬剤組成物。
【請求項２】
治療薬として活性のある物質は、ポリペプチドまたはポリサッカライドである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
治療薬として活性のある物質は、カルシトニン、ソマトスタチン、インスリンまたはヘパリンである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
水層は、１ｍｌあたり１００μｌから１０００μｌのエタノールをさらに含有する請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
水層は、１ｍｌあたり２００μｌから５００μｌのエタノールを含有する請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の薬剤組成物を調製する方法であって、
ａ）水の中の、治療薬として活性のある物質と界面活性剤との溶液または懸濁液（そのｐＨは１と７の間である）よりなる水層を調製し、
ｂ）該水層を、植物油、鉱物油、またはベンジルベンゾエートおよび高級脂肪酸のグリセリドよりなる群から選択される油状化合物である油であって、その中に溶解された界面活性剤を含有する油よりなる油層に、攪拌しながらゆっくり加えて、油中水型エマルジョンを作成し、
ｃ）該油中水型エマルジョンに、溶媒なしでそのまま、少なくとも１つのアルキル２−シアノアクリレート（ここでアルキルラジカルは１から６個の炭素原子を有する）を加えて、加えたアルキル２−シアノアクリレートを重合するのに充分な時間、周囲温度でアルキル２−シアノアクリレートを重合させ、および本方法の生成物として直径が５００ナノメートル未満であって、水層をカプセル化しているナノカプセルの油層中の懸濁液を回収し、
該組成物のすべての成分は、薬剤として許容される物質から選択される、
ことを含む上記方法。
【請求項７】
水層と油層の容積比は、１：１００から２０：１００の間である請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
水層と油層の容積比は、５：１００から１５：１００の間である請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
水層中の界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、エチレンオキサイドとプロピレングリコールの混合誘導体、そしてポリオキシエチレングリコールよりなる群から選択される請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
水層中の界面活性剤の濃度は、水層の容量に対して０．１重量％から１０重量％である請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
油層中の界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルと胆汁酸の可溶性の塩よりなる群から選択される請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
油層中の界面活性剤の濃度は、油層の容量に対して０．１重量％から２０重量％である請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
油層中の界面活性剤の濃度は、油層の容量に対して０．１重量％から２０重量％である請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
アルキル２−シアノアクリレートの重合は、３時間から８時間行われる請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
治療薬として活性のある物質は、カルシトニン、ソマトスタチン、インスリンまたはヘパリンである請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
水層は、１ｍｌ当たり１００μｌから１０００μｌのエタノールをさらに含有する請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
水層の界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムである請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
水層中の界面活性剤の濃度は、水層の容量に対して０．１重量％から１０重量％である請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
油層中の界面活性剤は、ソルビタンモノオレエートである請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規の薬剤組成物に関し、さらに詳しくは治療薬として活性のある物質の溶液または懸濁液をカプセル化している、油層中のポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）ナノカプセルのコロイド懸濁液の型の経口投与用の薬剤組成物に関する。本発明はまた、そのような組成物の調製法に関する。
薬剤を含有する水層をカプセル化しているカプセルの型の薬剤組成物は既に知られている。
【０００２】
例えばドイツ特許出願第３３４１００１号は、少なくとも３％の薬剤または他の生物活性のある物質を含有する水性または親水性内部層をカプセル化する、平均直径が２００から９００ナノメートルのナノ粒子およびナノカプセルを開示している。ナノカプセルの壁は生物分解が可能な、例えばアルキル２−シアノアクリレートのようなモノマーの重合により作成される。ナノカプセルを調製するためには、内部の親水性層（例えば薬剤の溶液を含有する水またはアルカリ性化メタノール）と、水と混合しない有機溶媒（例えばクロロホルム、トルエンまたはイソオクタン）よりなり界面活性剤を含有する外部の疎水性層よりなり、あらかじめ調製されたエマルジョンに、無水クロロホルム中のモノマーの溶液を加える。このドイツ特許出願第３３４１００１号の実施例１では、内部の層はメチレンブルーの水溶液であり、外部の層はクロロホルムとトルエンの混合物であり、生物分解が可能なモノマーはメチル２−シアノアクリレートである。重合の後ナノカプセルは外部の層から分離される：この目的のために、すべての好ましくない有機溶媒を除去するために、得られたナノカプセルは遠心分離され、次に十分洗浄して凍結乾燥される。こうして得られた粉末は、治療への使用の面から投与に適した組成物にするために、最後に再調製される。
【０００３】
日本の特許出願第６１５２１／８５号は、生体適合性のあるポリマー（例えばアルブミン、デキストラン、ゼラチンまたはコラーゲン）の水溶液中に溶解または懸濁された薬剤を含有する水層をカプセル化する、粒子径が１から５００マイクロメートルのマイクロカプセルを開示している。これらのマイクロカプセルは、わずかに水溶性の有機溶媒に水層を加えて調製した油中水型のエマルジョン（随時界面活性剤を含有する）に、溶媒に溶解していないアルキル２−シアノアクリレート（ここでアルキルラジカルは１から８個の炭素原子を有する）を攪拌しながら加えることにより調製される。２つの層の界面でアルキル２−シアノアクリレートが重合した後、マイクロカプセルは単離される。このために低沸騰性炭化水素溶媒（例えば石油エーテルまたはｎ−ヘキサン）で、有機溶媒中のマイクロカプセルの懸濁液を希釈し、次にメンブランフィルターでろ過する。フィルター残渣を同じ溶媒で十分に洗浄して、４０℃で減圧下で乾燥し、残存する微量の有機溶媒および水を除去する。こうして得られた薬剤調製物は、生体適合性のあるポリマーの水溶液中に溶解または懸濁されている薬剤をカプセル化するマイクロカプセルの型である。この調製物は注射投与用であり、治療への使用の面から再調製しなければならない。さらに詳しくはこの日本特許出願の実施例では、有機溶媒は綿実油であり、生体適合性のあるポリマーはウシ血清アルブミンであり、そして薬剤は制ガン剤である。この日本特許出願は注射溶液のみ開示しており、経口投与に適した薬剤組成物については記載していない。
【０００４】
前記の方法により調製された薬剤組成物はいくつかの重要な欠点がある。
【０００５】
まず、胃腸管を介して治療薬として活性のある物質が満足に吸収されるためには、そのような物質はできるだけ小さいことが好ましいことは、公知である。これが、直径が１マイクロメートル未満の粒子が経口投与に適した薬剤組成物の調製に最も適している理由である。しかしこの日本特許出願第６１５２１／８５号に記載の方法で調製されたマイクロカプセルは、いつも粒子径は１マイクロメートルより大きく、一般的に１から５００マイクロメートルである。
【０００６】
第２に、カプセルの調製に典型的に必要なその溶媒（イソオクタン、アルカリ性化メタノール、クロロホルム、トルエンおよび石油エーテル）は、その毒性が高いため薬剤として許容されない。従ってこうして調製されたカプセルは調製後直接投与できない。このため微量の治療上適合しない溶媒を除去するために、メンブランフィルターまたは限外ろ過によるろ過とその後の完全な精製などによる、カプセルの分離を含む微妙な追加の工程が必要である。精製後、カプセルは簡単に投与できるように十分に再調製しなければならない。
【０００７】
第３に、前記の日本特許出願のような場合には、カプセルの調製に高分子（例えばウシ血清アルブミンまたはデキストラン）の存在が必要である。しかし動物起源であるそのような高分子は、好ましくない免疫反応を引き起こすことがあり、デキストランに引き起こされるアナフラキシーショックは重大であり、公知である。
【０００８】
経口投与は薬剤投与の好ましい経路であり、注射は一般的に痛みがあり患者に嫌われており、薬剤活性のある物質をカプセル化する微小なカプセルでは薬剤の担体として用いた場合（特に非経口投与で）有望な結果がでているため、水層中に治療薬として活性のある物質の溶液または懸濁液をカプセル化するが、公知の薬剤組成物の前記のような欠点のない、微小なカプセルの型の薬剤組成物を（特に経口投与用に）提供することは、大いに興味がある。
【０００９】
おもに胃の中で分解される薬剤（例えばペプチド構造の薬剤）の場合には、確かに微小なカプセルの型のこの種の投与は必要である。
【００１０】
特に微小なカプセルは生物分解が可能な物質から作成されるべきであり、胃腸管中で満足に吸収されるには十分に小さいことが必要であり、同時にカプセルは重要な量の薬剤活性のある物質をカプセル化するべきである。さらにもしそのような組成物が生産直後に単離、精製および再調製する必要もなく、投与に適しているなら、これは大きな技術の簡素化であり大きな利点を有する。
【００１１】
我々は、これらすべての目的を十分満たす、ナノカプセル型の新規の薬剤組成物を見いだした。すなわち本発明において、その中に溶解された界面活性剤を含有し、直径が５００ナノメートル未満である複数のナノカプセルがその中に懸濁された油より基本的に構成される油層よりなる、ナノカプセルのコロイド懸濁液の型の薬剤組成物が提供され、このナノカプセルは基本的に、水の中の治療薬として活性のある物質と界面活性剤の溶液または懸濁液（ｐＨは１と７の間である）よりなる水層をカプセル化し、ナノカプセルの壁はポリ（アルキル２−シアノアクリレート）（ここでアルキルラジカルは１から６個の炭素原子を有する）から形成される。
【００１２】
別の面において本発明は、以下の工程よりなる薬剤組成物の調製法を与える：
ａ）基本的に水の中の治療薬として活性のある物質と界面活性剤の溶液または懸濁液（そのｐＨは１と７の間である）よりなる水層を調製し；
ｂ）基本的に油とその中に溶解された界面活性剤よりなる油層に、上記水層を攪拌しながらゆっくり加えて、油中水型のエマルジョンを作成し；
ｃ）該油中水型エマルジョンに、溶媒なしでそのまま少なくとも１つのアルキル２−シアノアクリレート（ここでアルキルラジカルは１から６個の炭素原子を有する）を加えて、加えたアルキル２−シアノアクリレートを重合するのに充分な時間、周囲温度でアルキル２−シアノアクリレートを重合させて、本方法の生成物として直径が５００ナノメートル未満で水層をカプセル化しているナノカプセルの、油層中の懸濁液を回収する。
【００１３】
本発明の薬剤組成物の油層は基本的に、溶解された界面活性剤を含有する中性の薬剤として許容される油よりなる。上記油は植物油、鉱物油、または水に不溶性の油状の化合物（例えばベンジルベンゾエート、またはＣ6 からＣ18高級脂肪酸のグリセリド）である。後者のうち好んで使用されるのは、ミグリオール（ＭＩＧＬＹＯＬ）（例えばミグリオール８１２）であり、これは鎖長は基本的に約８から１０個の炭素原子よりなる、飽和脂肪酸トリグリセリドの混合物から作成される中性油である。
【００１４】
本発明の薬剤組成物のナノカプセルの中心部の空洞に含有される水層は、基本的に水溶性または水不溶性の治療薬として活性のある物質の溶液または懸濁液よりなり、界面活性剤も含有する。この水層は、ナノカプセルの壁を強固にする作用を有する、ある量のエタノールを含有するのが好ましい。水層に加えられるエタノールの量は、水層１ｍｌ当たり１００μｌから１０００μｌであり、さらに好ましくは水層１ｍｌ当たり２００μｌから５００μｌである。
【００１５】
本発明の方法では、水層のｐＨは薬剤として許容される酸または適当な緩衝液により１から７に調整され、例えば酢酸緩衝液によりｐＨ４．３に調整される。ｐＨが７を越える場合、得られるカプセルの直径は５００ナノメートルより大きくなり、１マイクロメートルより大きくなることもある。
【００１６】
水層と油層の容積比は、好ましくは１：１００から２０：１００の間であり、さらに好ましくは５：１００から１５：１００の間である。
【００１７】
本発明の薬剤組成物に使用される界面活性剤は、薬剤として許容される界面活性剤である。これらには天然の界面活性剤（例えばデオキシコール酸または他の胆汁酸塩またはそれらの誘導体）、および合成界面活性剤がある。後者の例としては、陰イオン性型（例えばラウリル硫酸ナトリウムまたはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム）、陽イオン性型（例えば４級アンモニウム塩）、または非イオン性型（例えばソルビタンまたはポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、例えばスパン８０、またはエチレンオキサイドとプロピレングリコールの混合誘導体、例えばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８）が使用される。
【００１８】
本発明のナノカプセルが５００ナノメートル未満の直径、そして好ましくは８０ナノメートルより大きい直径を有することを確保するために、界面活性剤は水層と油層に同時に存在しなければならないことを、我々は適切な実験により見いだした。
【００１９】
界面活性剤はそれぞれ、内部の水層または外部の油層を構成する適当な液体中に溶解される。例えば水層においては、適当な界面活性剤にはラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、エチレンオキサイドとプロピレングリコールの混合誘導体、またはポリオキシエチレングリコールがあり、好ましくはラウリル硫酸ナトリウムである。油層においては、界面活性剤にはソルビタン脂肪酸エステルまたは胆汁酸の可溶性の塩、そして好ましくはソルビタンモノオレエート（スパン８０）またはデオキシコール酸がある。
【００２０】
水層中の界面活性剤の濃度は一般的に、水層の容量当たり０．１重量％から１０重量％であり、好ましくは３重量％から５重量％である。
【００２１】
油層中の界面活性剤の濃度は一般的に、油層の容量当たり０．１重量％から２０重量％であり、好ましくは５重量％から１５重量％である。
【００２２】
本発明の薬剤組成物中の懸濁液のナノカプセルの壁は、少なくとも１つのアルキル２−シアノアクリレート（ここでアルキルラジカルは直鎖または分岐鎖のラジカルであり、１から６個の炭素原子を有する）のミセル重合により得られる生物分解が可能なポリ（アルキル２−シアノアクリレート）から作成される。本発明に最も適したポリ（アルキル２−シアノアクリレート）は、ｎ−ブチル２−シアノアクリレートとｎ−ヘキシル２−シアノアクリレートのミセル重合により得られる。ナノカプセルの壁がアルキル２−シアノアクリレートのポリマーまたはコポリマー（共重合体）よりなるのであれば、アルキル２−シアノアクリレートは単独または混合物中で使用することができる。
【００２３】
アルキル２−シアノアクリレートは、溶媒なしでそのまま重合媒体に加えられる。本発明ではこの重合は、好ましくは３から８時間周囲温度で行われる。
【００２４】
本発明の薬剤組成物とともに使用される治療薬として活性のある物質は、ナノカプセルの中心部の空洞に存在する水層に含有される。水に溶解するものおよび水にはわずかしか溶解しないものを含む任意の薬剤が、これらの組成物中で使用できる。本発明の新規の組成物は、ポリペプチド（カルシトニン、ソマトスタチン、インスリンまたはヘパリン）をカプセル化するのに特に適している。これらの薬剤は経口投与の後、胃腸管に存在する蛋白分解酵素により急速に分解されることは公知である。
【００２５】
これに反して、本発明の組成物は活性成分をカプセル化しているため、同じ経路で投与された場合、有意の薬剤活性を示す。
【００２６】
本発明の薬剤組成物および前述したその調製法は、先行技術に対して以下のような大きな利点を有する：
−  得られるナノカプセルの直径は５００ナノメートル未満、好ましくは８０から４５０ナノメートルであり、その結果小腸粘膜を介する吸収はきわめて良好である；
−  ナノカプセルは周囲温度および４℃で少なくとも１８カ月以上のすばらしい物理的安定性を有している；
−  ナノカプセルおよび薬剤組成物の調製中に有機溶媒が完全に存在しないことから、微量の治療上適合性のない溶媒を除去するためのナノカプセルの面倒な分離や精製が不要である；
−  動物起源の高分子（例えばアルブミンまたはデキストラン）が存在しないことから、好ましくない免疫反応（例えばアナフラキシーショック）の危険性がない；
−  すべての成分（油、水、界面活性剤）は薬剤として許容される物質から選択されているため、本発明の方法ではその無毒性が保証されているすぐ使える薬剤組成物が形成される。すなわち得られる組成物は、ナノカプセルの適当な媒体中であらかじめ単離、精製および再分散する必要もなく、直接経口経路で（またはおそらく筋肉内にも）投与することができる。さらに本発明の組成物は、経口投与のためにゼラチンカプセル中で直接使用することができる；
−  薬剤組成物は簡単で、すぐ工業的スケールに変換できる方法で調製される。
【００２７】
以下の実施例は本発明を例示するのみであり、決してこれを限定するものではない。実施例１から５と８は、特に水層をカプセル化するナノカプセルの油中の懸濁液の調製法に関し、実施例６、７および９から１６は、治療薬として活性のある物質をカプセル化するナノカプセルの型の薬剤組成物を例示する。
【００２８】
こうして得られる薬剤調製物の物理的安定性は、数カ月の保存の後の２つの異なる層（水層と油層）の外観の欠如の直接の観察、および油中に分散されたナノカプセルの平均サイズを適当な間隔で測定することにより求められる。ナノカプセルの平均サイズはコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）モデルＮ４ＭＤサブミクロン粒子アナライザーにより測定した。
【００２９】
実施例１
５重量％／容量のラウリル硫酸ナトリウムを含有する１ｍｌのｐＨ４．３の酢酸水溶液緩衝液（緩衝液組成：氷酢酸２ｇ、酢酸ナトリウム２ｇ、塩化ナトリウム７．５ｇ、無機成分を除去した水で１リットルにする）を、１５重量％／容量のソルビタンモノオレエート（スパン８０）を含有する１０ｍｌのミグリオール８１２（Ｃ8 からＣ10の飽和脂肪酸トリグリセリドの混合物よりなる中性油）に、激しく攪拌しながら（１２００ｒｐｍ）周囲温度でゆっくり加える。懸濁液を同じ条件下で１５分間攪拌し、次に１００μｌのｎ−ブチル２−シアノアクリレートを加えて、２４０分間モノマーを重合させる。こうして、水層をカプセル化し平均直径が２５５ナノメートルのナノカプセルの油中の懸濁液が得られる。
【００３０】
これらのナノカプセルは通常の温度および４℃で少なくとも１８カ月保存しても、サイズに有意な変動は示さない。
【００３１】
実施例２
ナノカプセルは実施例１に記載の方法を用いて調製されるが、酢酸水溶液緩衝液の代わりにｐＨ７のリン酸水溶液緩衝液を使用する（緩衝液組成：ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏの０．２モル溶液を３９ｍｌ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏの０．２モル溶液を６１ｍｌそして蒸留水１００ｍｌ）。
【００３２】
得られる水層をカプセル化しているナノカプセルは平均サイズが４２２ナノメートルである。
【００３３】
実施例３
実施例１と同じ条件を使用したが、水層はさらに懸濁した０．２５ｍｇの水不溶性着色剤（ＦＤＣブルー２ＨＴ  アルミニウムレーク（ＡｌｕｍｉｎｉｕｍＬａｋｅ）、ｃｅｒｔ  ｎ゜ＡＡ２０４１、コロルコン（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ））を含有する。
【００３４】
こうして得られるナノカプセルは着色剤の水性懸濁液をカプセル化し、平均サイズ２４６ナノメートルを有する。
【００３５】
実施例４
実施例１と同じ条件を使用したが、今度は油層はミグリオール８２９（油はＣ8 からＣ10の飽和脂肪酸トリグリセリドと１５から２０％のコハク酸の混合物よりなる）である。
【００３６】
こうして得られる水層をカプセル化しているナノカプセルは平均サイズ２４６ナノメートルを有する。
【００３７】
実施例５
実施例１の方法に従いナノカプセルを調製するが、ｎ−ブチル２−シアノアクリレートの代わりにｎ−ヘキシル２−シアノアクリレートを使用し、８時間重合させた。
【００３８】
こうして得られる水層をカプセル化しているナノカプセルは平均サイズ２１３ナノメートルを有する。これらのナノカプセルの物理的安定性は極めて優れており、通常の温度で少なくとも１２カ月保存しても、サイズに有意な変動は示さない。
【００３９】
実施例６
実施例の方法を使用したが、水層は１１００ＩＵのカルシトニンも含有する。
こうして得られるナノカプセルは平均径１７７ナノメートルを有し、そこに含有される水層はカルシトニンを含有する。
これらのナノカプセルの物理的安定性は極めて優れており、周囲温度または４℃で少なくとも１２カ月保存しても、サイズに有意な変動は示さない。
【００４０】
実施例７
実施例１の方法に従いナノカプセルを調製しするしたが、ｎ−ブチル２−シアノアクリレートの代わりにｎ−ヘキシル２−シアノアクリレートを使用し、水層は１１００ＩＵのカルシトニンをさらに含む。４時間重合させると、得られる水層は中に薬剤を含有しており、平均サイズ２１１ナノメートルのナノカプセルが得られる。これらのナノカプセルの物理的安定性は極めて優れており、通常の温度および４℃で少なくとも１１カ月保存しても、サイズに有意な変動は示さない。
【００４１】
実施例８
実施例１の方法を使用したが、水層は４００μｌのエタノールを含有する。
【００４２】
４時間の重合の後、水層をカプセル化しており、平均サイズが２１１ナノメートルのナノカプセルが得られる。これらのナノカプセルの物理的安定性は極めて優れており、周囲温度または４℃で少なくとも１２カ月保存しても、サイズに有意な変動は示さない。
【００４３】
小量のエタノールをカプセル化しているこれらのナノカプセルは、実施例１で調製したエタノールを含有しないナノカプセルより壁がより強固である。
【００４４】
この壁の強度は遠心分離試験により測定され、この方法ではナノカプセルの油中の懸濁液は２０，０００ｒｐｍで２時間遠心分離される。本例で調製されたナノカプセルは、この試験で損傷を受けることなく耐えることができる。
【００４５】
実施例９
実施例８の方法を用いて、水層は水中のメチレンブルーの０．０２５重量％／容量の溶液であるナノカプセルが調製される。こうして得られるナノカプセルは平均サイズ２０５ナノメートルを有する。カプセル化された着色剤の割合は９８．３％に達する。
【００４６】
実施例１０
実施例８の方法を用いて、水層は３００ＵＳＰ単位のヘパリンを含むナノカプセルが調製される。こうして得られるナノカプセルは平均サイズ１３７ナノメートルを有する。
【００４７】
実施例１１
実施例８の方法を用いて、水層は０．９ｍｇのソマトスタチンを含むナノカプセルが調製される。こうして得られるナノカプセルは平均サイズ２０１ナノメートルを有する。
【００４８】
実施例１２
実施例８の方法を用いて、水層は１１，０００ＩＵのカルシトニンを含むナノカプセルが調製される。この調製物中の懸濁液のナノカプセルは平均サイズ２１１ナノメートルを有する。
混合物中０．０２モルのデオキシコール酸を得るために、ミグリオール８１２に分散されたデオキシコール酸が添加される。
【００４９】
実施例１３
実施例１２の方法を用いるが、水層は１１０，０００ＩＵのカルシトニンを含む。こうして得られるナノカプセルは平均サイズ２２５ナノメートルである。
【００５０】
実施例１４
本例の目的は、異なる経路（経口、十二指腸、回腸および静脈）でラットに投与された、異なるカルシトニン調製物の効果を比較することである。
【００５１】
カルシトニンの投与に対する生体の生理的応答は、血液中の自由に循環しているカルシトニンのレベルの低下により証明される。
【００５２】
実施例１３のカルシトニンをカプセル化しているナノカプセルの懸濁液を、フェノバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した雄のウィスターラット（体重：２００±２０ｇ）に、経口投与、十二指腸投与または回腸投与により、１匹当たり２０ＩＵのカルシトニンの投与量で与える。
【００５３】
比較のため対照ラットに、同じ量のカルシトニンを水溶液として静脈投与する。
【００５４】
尾静脈から一定時間間隔で血液試料を採取する。凝固させ血液を遠心分離（６，０００ｒｐｍで２×１０分）した後、血清を希釈し、原子吸光スペクトル装置でカルシウムを定量する。
【００５５】
各投与方法の測定結果を、時間の関数として血清中のカルシウムの比率を示すグラフを描く。経口投与、十二指腸投与または回腸投与に対応する曲線の下の面積を計算し、静脈投与の結果（これは最大の活性を与え、任意に１００％活性とする）から得られる面積と比較する。
【００５６】
これらの試験の結果は、カルシトニン調製物が動物に投与（経口投与、または直接十二指腸投与または回腸投与）された４時間後に、カルシトニンの同じ投与量の静脈投与による効果の７３％に対応する、血清カルシウムレベルの低下がすべての場合に見られることを示す。従って本発明の薬剤組成物の経口投与により得られる活性は、より熟練を要する十二指腸投与または回腸投与と同程度である。
【００５７】
実施例１５
実施例１の方法を用いるが、ｐＨ４．３の酢酸水溶液緩衝液の代わりに、ｐＨ３．６の酢酸水溶液緩衝液（緩衝液組成：０．２モルの氷酢酸４６．３ｍｌ、０．２モルの酢酸ナトリウム溶液３．７ｍｌ、そして蒸留水５０ｍｌ）を使用する。さらに水層はまた、７８０ＩＵのウシ亜鉛−インスリンと２００μｌのエタノールを含有する。
こうして得られるナノカプセルは水層をカプセル化し、平均サイズ２６０ナノメートルを有する。
【００５８】
実施例１６  ナノカプセルの剛性に対するエタノールの影響
水層中のエタノールが存在または欠如している場合のナノカプセルの壁の剛性に対する実施例８の観察結果を、本例で実施する試験で確認する。
【００５９】
実施例１４に記載の試験条件を用いて、実施例１２で調製された組成物（４００μｌのエタノールと０．０２モルのデオキシコール酸を含有する）と、実施例１２の方法に従うがエタノールを含まない条件下で調製した組成物を、ラットに経口投与する。得られる結果は実施例１４のように、水溶液中の同量のカルシトニンの静脈注射により得られる結果と比較する。
【００６０】
得られた結果を表１に示す。この表のカラム３は４時間後の血清カルシウム濃度の低下の割合を示す。
【表１】
0003688731.tif 000002
【００６１】
この表は、エタノールを含まない組成物は４時間後に血清カルシウムレベルの７％の低下を引き起こすのみであるが、アルコールを含有する組成物は４８％の低下を引き起こすことを示す。
【００６２】
この差は、エタノールを含まないナノカプセルは壁が弱いという事実により説明される。従って胃を通過するとき多量のナノカプセルが破裂し、相当量のカルシトニンが放出され、蛋白分解酵素により消化される。すなわち小腸には小量のカルシトニンしか届かず、ここで再吸収され、より弱い生理的応答が引き起こされる。
【００６３】
実施例１７（比較）
実施例８の方法を用いて、水層が１ｍｌ当たり５０，１００，１５０および３００ｍｇに相当する増加する量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ｎ゜Ａ−８０２２、シグマ（Ｓｉｇｍａ）が販売している）を含有するナノカプセルを調製する。
【００６４】
実施例１２の方法を用いて、水層が３００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するナノカプセルを調製する。
すべての場合に、得られる調製物は、異なる平均サイズを有する２つのカプセル集団を含有する。
【００６５】
表２は、これらのカプセルの平均サイズと、水層中のウシ血清アルブミンの関数として得られる２つのカプセル集団のそれぞれの割合を示す。
【表２】
0003688731.tif 000003
【００６６】
表２の結果は、水層中にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような生物ポリマーが存在する（日本特許出願第６１５２１／８５号に記載されているように）場合、得られる組成物は平均サイズが５００ナノメートル未満を有するナノカプセルの均一な集団を含有しないため、本発明とは異なることを示す。水層中のウシ血清アルブミンの濃度が上昇するとナノカプセルの割合が減少し、この量が水層１ｍｌ当たり３００ｍｇのＢＳＡに等しい場合実質的にゼロになる。