(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプトン、ダイズペプトン、プロテオーゼペプトン、消化血清末、酵母エキス、肉エキス、肝臓エキス末、ブドウ糖、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、溶性デンプン、Ｌ−システイン塩酸塩及びチオグリコール酸ナトリウムを組成の成分とするブロス、血清、抗菌剤、及び寒天を含有してなる、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の培養検査に使用するための検体輸送用培地。
【請求項２】
検体が胃生検材料である請求項１記載の検体輸送用培地。 
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ）  培養検査のために胃生検材料中の本菌を安定に保存・輸送せしめる検体輸送用培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、胃炎の病因、消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍等）の病因に関与するＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  を検出するための胃生検材料の輸送用培地としては、キャリーブレア培地、ハンクス液、ケンキポーター、およびＴＣＳポーターなどが用いられてきた。しかしながら、この胃生検材料中のＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  は乾燥に極めて弱く、微好気条件（Ｏ２  ：５％、ＣＯ２  ：１０％、Ｎ２  ：８５％）でのみ生育する特殊な菌であり、生検材料を採取後、これらの培地で保存する場合であっても、死滅しやすいため冷蔵（６℃±２℃）で保存し、２〜５時間以内に培養検査を実施することが望ましいとされている。分離培養検査の開始までの時間的経過により当該菌体の検出が著しく低下するため検体採取後、速やかに検体を輸送し培養検査を実施する必要がある。
【０００３】
速やかな培養検査の実施が可能な院内付属の細菌検査ではこのような輸送上の問題点は少ないと考えられるが、近年の院内検査の外注化傾向の増大化に伴い、生検材料中のＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  の安定な保存・輸送法の確立が強く望まれてきた。
【０００４】
一方、培養検査によらないＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  感染症の新しい検査法として、ＰＣＲ法による本菌の特異的ＤＮＡの検出、ウレアーゼ試験および抗体検査等が開発されて臨床に応用されつつある。しかしながら、このような培養検査によらないＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  の検出法は培養検査法に比べて時間的な制約はゆるやかなものの、１）各疾患におけるＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  分離菌株の起因性の解明、２）薬剤感受性試験による耐性菌出現チェック、３）治療後の除菌の判定（定量培養を含む）、４）院内感染を含めた疫学データの収集、といった目的に対しては無力であり、これらの目的を達成するには高精度かつ安定な培養法による分離菌株の収集法の確立が不可欠と考えられる。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、生検材料を安定して保存・輸送できる検体輸送用培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために検体の安定な輸送用培地の研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は、
（１）  ペプトン、ダイズペプトン、プロテオーゼペプトン、消化血清末、酵母エキス、肉エキス、肝臓エキス末、ブドウ糖、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、溶性デンプン、Ｌ−システイン塩酸塩及びチオグリコール酸ナトリウムを組成の成分とするブロス、血清、抗菌剤、及び寒天を含有してなる、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の培養検査に使用するための検体輸送用培地、並びに
（２）  検体が胃生検材料である前記（１）記載の検体輸送用培地、に関する。
【０００８】
本発明における嫌気性Ｇブロスは、（株）日研生物医学研究所製のものであり、その組成は以下の通りである。
0003612095.tif 000002
その配合量は培地１０００ｍｌあたり５０〜６５ｇであり、好ましくは５５〜６２ｇである。この範囲未満では還元剤の効果低下により発育不良となる傾向があり、この範囲を超えると発育促進剤が過剰となり、逆に発育不良となる傾向がある。
本発明においては、この嫌気性Ｇブロスと実質的に同等の組成からなる酸化還元電位（Ｅｈ）の低い（＋０．１〜−０．２）ブロスであれば、嫌気性Ｇブロスに代えて用いることができる。
【０００９】
本発明における血清は特に限定されるものではなく、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の血清が挙げられる。その配合量は培地１０００ｍｌあたり４０〜７０ｍｌであり、好ましくは４５〜６０ｍｌである。この範囲未満では発育促進効果が低下し、発育不良となる傾向があり、この範囲を超えると血清中の殺菌性物質が増加し、発育不良となる傾向がある。
【００１０】
本発明におけるスキローサプリメントは、抗菌剤の配合された雑菌の発育抑制剤であり、（株）日研生物医学研究所製のものである。スキローサプリメントは、培地１０００ｍｌあたり５〜１５ｍｌ、特に８〜１２ｍｌ配合するのが好ましい。この範囲未満ではＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  以外の雑菌の発育を抑制しにくくなる傾向があり、この範囲を超えても配合量に見合った効果は得られない。本発明においては、雑菌の発育抑制の点から抗菌剤を適宜配合するのが好ましく、スキローサプリメントに代えて雑菌の発育抑制作用をもつ抗菌剤をそのまま配合してもよい。
【００１１】
本発明における寒天の添加は微好気性菌の発育に適した酸化還元電位（Ｅｈ）の維持と培地中央部付近に挿入した胃生検材料の保持のためである。そのため、寒天の量は特に限定されるものではないが、半流動状を示すことが好ましいため、培地１０００ｍｌあたり３〜６ｇ程度がよい。
【００１２】
本発明の培地の溶媒は特に限定されるものではなく、精製水、蒸留水が挙げられる。
【００１３】
以上より、本発明の培地の各成分の組み合わせは次のように例示される。培地１０００ｍｌあたり、嫌気性Ｇブロス５０〜６５ｇ、血清４０〜７０ｍｌ、スキローサプリメント５〜１５ｍｌ及び寒天３〜６ｇとなり、嫌気性Ｇブロス５５〜６２ｇ、血清４５〜６０ｍｌ、スキローサプリメント８〜１２ｍｌ及び寒天３〜６ｇの組み合わせがより好ましい。
【００１４】
本発明に用いられる検体は特に限定されるものではなく、胃を含む各消化管粘膜の生検材料が挙げられ、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  を有する生検材料の使用に適している。
【００１５】
なお、本発明の培地は冷蔵保存（６℃±２℃）で約２ヶ月間は安定で、そのまま使用することができる。使用法は、採取した生検材料を直ちに培地中央部付近まで挿入して接種し、冷蔵条件下で保存、輸送する。後述の実施例で示されるように検体を接種して４８時間を経過しても安定してＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  の検出が可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、製造例、実施例、比較例、参考例及び対照例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
製造例１
嫌気性Ｇブロス（（株）日研生物医学研究所製）              ５９ｇ
寒天                                                        ５ｇ
ウマ血清                                                  ５０ｍｌ
スキローサプリメント（（株）日研生物医学研究所）          １０ｍｌ
上記成分のうち、嫌気性Ｇブロスと寒天をフラスコに入れ、精製水１０００ｍｌを加え、沸騰水中で加温溶解後、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）したのち、急冷し、約５０℃に保ち、凝固を防いだ。ここに残りのウマ血清、スキローサプリメントを無菌的に加え、よく攪拌後、ガラス製小試験管に３ｍｌづつ分注し、流動性を有する本発明の培地を得た。
【００１７】
実施例１
Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  標準株ＡＴＣＣ４３５０４と臨床分離株１株を試験用菌株とし、それぞれ１０６  ＣＦＵ／Ｓｗａｂ（綿棒）相当の菌量に調整したものを検体とした。これらの検体を本発明の培地に接種し、４℃および室温（２５℃前後）条件下で保存した。そして接種直後、２日後の菌量を測定することにより当該培地の保存性を評価した。表１に結果を示す。
【００１８】
【表１】
0003612095.tif 000003
【００１９】
保存性の評価は次のように行った。所定の時間が経過した時点でＳｗａｂを取り出し、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  分離用平板培地の一端にＳｗａｂの表面全体を塗布し、常法どおり滅菌白金耳を用い、画線培養を微好気環境下で３５℃、７日間実施した。培養後の発育菌量を＋〜３＋まで半定量的にグレーディングすることにより評価した。また、微好気条件はアネロパック（キャンピロ）（（株）三菱ガス化学製）を使用することによって設定した。
【００２０】
比較例１〜６
実施例１における培地の代わりに、ケンキポーター（クリニカルサプライ、比較例１）、ＴＣＳポーター（クリニカルサプライ、比較例２）、キャリーブレア（栄研、比較例３）、Ｈａｎｋｓ液（日水、比較例４）、マイコプラズマＨａｎｋｓ液（日水、比較例５）、及びキープメディウム（日研、比較例６）を培地として用いた以外、実施例１と同様に実験を行った。その結果を表１に示す。
【００２１】
表１に示すように、４℃では本発明の培地は２日後までは菌量変化がなく、生菌として回収が可能であった。一方、室温条件下ではいずれの培地でも、２日後には生菌を認め得なかった。  以上のことから、４℃保存下における本発明の培地でのＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  の保存性は他の従来品と比べて顕著に優れていることが明らかになった。
【００２２】
参考例１
同一患者の同一部位から採取した胃生検材料を２分し、それぞれをキャリーブレア培地に接種し、４℃にて保存・輸送し２施設間（Ｇ施設、Ｓ施設）でＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  検出の比較を行った。検出の方法は胃生検材料を取り出し、マイクロホモジナイザーで均質化し、ここに減菌生理食塩水５０μｌを加え、よく混和したものを画線培養の出発材料とし、上記と同様の方法で行った。２施設間での相違点は検体採取から分離培養を行うまでの時間経過のみで、Ｇ施設では１〜３時間であったのに対し、Ｓ施設は２０〜２４時間であった。なお、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  検出（分離用平板培地、微好気環境下、培養日数等）に関わる諸条件は２施設間で全く同一とした。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
その結果、表２に示すとおり、Ｇ施設では９検体中、５検体よりＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  を検出できたのに対し、Ｓ施設では１例も検出しえなかった。以上の結果から従来法の常用培地の一種とされるキャリーブレア培地を用いる場合は、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  の保存性が極めて悪く、検体採取後は可及的速やかに分離培養を行う必要があることが判明した。
【００２５】
実施例２
５人の患者の異なる２ヶ所から胃生検材料を採取し、計１０検体とした。それぞれの検体を３分し、それぞれを製造例１で得た本発明の培地に接種し、４℃にて保存した。保存時間１時間後、２４時間後、４８時間後に参考例１と同様に検体を前処理し、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  分離用平板培地に画線培養し、３５℃、７日間微好気条件下で培養した。培養終了後、菌体の発育菌量を調べた。表３にその結果を示す。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
対照例１
実施例２における検体のうち、２４時間後と４８時間後の時点でそれぞれウレアーゼ試験を行った。ここでウレアーゼ試験は次のように実施した。
ＭＲウレアキット（（株）特殊免疫研究所製）を用い、基質試液の調製は使用説明書どおり実施した。均質化した各検体２５μｌを基質チューブに接種し、室温に静置した。判定は３０分後と１８時間後に色調の変化を読み取り、いずれかで黄から赤ないしピンクに変化した場合を陽性とした。試験の結果を表３に示す。
【００２８】
表３より、実施例２の結果と対照例１の結果はよく一致することが明らかになった。また、参考例１では、キャリーブレア培地を用いた場合、２０〜２４時間後では菌体を検出できなかったのに対し、本発明の培地を用いた場合、４８時間後であっても精度よく検出できることが分かった。したがって、本発明の培地は従来のものより非常に優れた検体輸送用培地であることが分かった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の検体輸送用培地を用いると、検体接種後、２４〜４８時間経過した場合でも、生菌数の減少をきたすことなく高精度にＨ．  ｐｙｌｏｒｉ  を検出することができる。このことから、今後、消化性潰瘍における病原因子の解明、再発の予知等に大きく貢献できるものと考えられる。