(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン合成促進効果を有するフェニトインを有効成分として含んでなる肌のしわ予防及び低減のための局所用組成物。
【請求項２】
フェニトインを組成物全体重量に対して０．００００１〜３０．００重量％含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物がクリーム、軟膏、ローション、スキントニック、ゲル、パック、貼布剤または微細注射針が装着されたパッチ型投与器具の剤形に製剤化されたものである請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚吸収のための剤形であるクリーム、軟膏、ローション、スキントニック、ゲル、パック、貼付剤、パッチ型投与器具などの経皮吸収製剤の通常の成分にコラーゲン合成促進効果を有する有効成分として、フェニトイン(Phenytoin)、バルプロ酸(Valproic acid)、サイクロスポリンＡ(Cyclosporin A)、ニフェジピン(Nifedipine)、ジルチアゼム(Diltiazem)、塩酸ベラパミル(Verapamil HCl)及びアモルジピン(Amoldipine)の中から選ばれた１種または２種以上を有効成分として含んでなる肌のしわ予防及び低減のための局所用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌の老化は、例えば加齢などの内的要因と環境的な要因の両方によって進展する。加齢により、首すじしわ、眉間のしわ、額のしわ、目じりの細かいしわ、鼻の側部から口角にかけてのしわ、目の周りの細かいしわ、唇の下や顔全体にできる細かいしわなど、肌にしわが表れる。加齢に伴うしわの発生は個人差があるものの、一般に２０代の初めに発生し、年齢と共に増加する。年をとるにつれ皮膚の真皮層に存在するコラーゲンの量が減少し、弾性繊維にも変化が生じて、結果として皮膚の弛緩による微細なしわができる。一方、コラーゲンは皮膚の繊維芽細胞によって生成される主要な基質タンパク質であって細胞外マトリックスに存在する。これは、生体タンパク質総重量の３０％を占める大事なタンパク質であって堅固な３重螺旋構造を有している。コラーゲンの機能としては皮膚の機械的堅固性、細胞の結束を支える結合組織の耐久性及び組織の結束性、細胞増殖及び細胞の分化の誘導などが知られている。また、コラーゲンは肌の老化の外的な原因になる紫外線の暴露によっても破壊され、紫外線によるダメージは紫外線に暴露された時間の蓄積に比例することと知られている。紫外線は膠原繊維を変成させ皮膚にしわを発生させ、弾力性を低下させる。その他環境的な要因としては風、熱、たばこなどが皮膚の老化を促進させることが知られている。
このようにコラーゲンは肌の老化と密接に相関する。真皮内のコラーゲンの量は加齢及び紫外線照射により減少する。コラーゲンは２０才から８０才までで６５％減少する。このようなコラゲンの減少は皮膚を薄くするだけではなく、肌のしわ形成に密接に関係している。
【０００３】
しわの予防及び低減のための広範な研究がなされ、コラーゲンの重要な機能が解明された。研究はまた、皮膚内コラーゲンの合成が活性化されると、真皮マトリックスの成分が増加し、しわ低減、弾性増強、皮膚強化などの効果があることを解明した。その結果、保湿効果を有するコラーゲンを用いて、コラーゲンを配合した化粧品が開発された。しかしながら、このような化粧品はコラーゲンを皮膚表面に塗布するために、高分子量のコラーゲンの経皮吸収が少ないため、保湿作用が僅かなものである。そのため、これらの使用は皮膚の外観における本質的な機能改善をもたらすことができなかった。先行技術において、コラーゲン合成を促進する物質としてレチノイン酸、ＴＧＦ-β、動物胎盤由来のタンパク質(ＪＰ８-２３１３７０)、ベツリン酸(ＪＰ８-２０８４２４)、クロレラ抽出物(ＪＰ９-４０５２３、ＪＰ１０-３６２８３)などが開示されている。レチノイド酸の場合は不安定であり、皮膚適用時刺激、発赤などの安全性の問題によって使用量の制限がある。クロレラ抽出物を含む上記のその他の物質については、コラーゲン合成の促進効果が微弱なので、これらは肌の外観を殆んど改善しない。最近、コラーゲン合成を促進することによるしわを治療する幾つかの新しい方法が導入された。これらの例としては、超音波治療、皮膚スケーリング、レーザー剥皮術、ボツリヌス毒素の注射、レスチレン注射などがある。しかしながら、これらの方法は、費用対効果及び持続性の点で不都合である。従って、コラーゲン合成を促進する効果の高い薬剤の研究及び開発が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、コラーゲン合成促進効果が高く、肌のしわ予防や低減に優れた効果のある薬剤の開発とこれを有効成分として含んでなる、肌のしわ予防及び低減のための局所用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らはコラーゲン合成促進効果を有する化合物を開発すべく研究を重ねた結果、抗痙攣剤、免疫抑制剤、カルシウムチャネル阻害剤として既に知られている、フェニトイン(Phenytoin)、バルプロ酸 (Valproic acid)、サイクロスポリンＡ(Cyclosporin A)、ニフェジピン(Nifedipine)、ジルチアゼム(Diltiazem)、塩酸ベラパミル(Verapamil HCl)及びアモルジピン(Amoldipine)がヒト由来繊維芽細胞中で極めて強いコラーゲン合成促進効果を有することを見出した。さらに、ラットやマウスの皮膚に塗布すると、これらの化合物はしわの強い抑制及び低減効果を示し、しわのような肌の老化の兆候に対する抑制及び予防効果を立証した。従って、本発明はコラーゲン合成促進効果を有する有効成分としてフェニトイン、バルプロ酸 、サイクロスポリン、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル又はアモルジピンを含んでなる組成物に関する。
【０００６】
フェニトインとバルプロ酸は抗痙攣剤であって、癇疾時に痙攣を抑制するために広く使われる薬物であり、コラーゲン合成に対する報告がなされている(ＵＳＰ５６８６４８９、Minerva Stomatol.,１９９８ Sep,４７(９):３８７〜９８)。サイクロスポリンＡは免疫抑制剤であって臓器移植などの施術後組織拒否反応を抑制するために既に広く使用されており、コラーゲン合成に対する報告がある(J．Periodontol.,２００１Jul,７２(７):９２１〜３１)。ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンはカルシウムチャネル阻害剤として既に使用されており、コラーゲン合成に対する報告もまたなされている(J.Periodontol.,２００１ Aug,７２(８):１０７８〜８３;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,１９９６ May２８,９３(１１):５４７８〜８２;J.Urol.１９９６ Dec,１５６(６):２０６７〜７２)。しかしながら、上記の薬剤が、本発明におけるが如く、肌のしわを予防や低減するために皮膚に適用される局所用薬剤としての使用については全く開示がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る肌のしわ予防及び低減のための局所用組成物について、実験例及び実施例をを用いて詳細に説明する。
【０００８】
実験例１  繊維芽細胞中での本発明の有効成分のコラーゲン生成促進効果
本発明の有効成分の細胞レベルにおける繊維芽細胞中のコラーゲン生成促進効果を検討するために、各有効成分をヒト由来の繊維芽細胞の培養液に添加した。生合成されたコラーゲンをマルテンス(Martens、Gut.１９９２、３３、１６６４〜１６７０)法の変法により測定し、各有効成分の効果を調べた。実験の詳細なプロトコールは以下の通りである。
【０００９】
人由来繊維芽細胞を２４ウェルプレートに分注し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中で２４時間培養した後リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。この細胞を、最終濃度が１０−８〜１０−５Ｍのフェニトイン(Phenytoin)、バルプロ酸(Valproic acid)、サイクロスポリンＡ(Cyclosporin A)、ニフェジピン(Nifedipine)、ジルチアゼム(Diltiazem)、塩酸ベラパミル(Verapamil HCl)又はアモルジピン(Amoldipine)の存在下に１％ＦＢＳを含有する培地で培養した。１時間培養した後、各ウェルに３Ｈ−プロリンを１０μＣｉ添加し、次いで２４時間最終培養した。培養終了後、各群の細胞を採取し、培養液をそれぞれ２つの分画に分けた。一方の分画をコラゲナーゼ処理した。全ての分画にトリクロロ酢酸を加えてタンパク質を沈澱させた。コラーゲナーゼ感受性蛋白中の放射活性を測定し、コラゲナーゼ処理しなかった他の分画のものと比較した。放射活性の差はその化合物の促進効果に起因する。対照群として用意した、有効成分を含有しない試料のコラーゲン生成量を１００％とした。結果を表１に示す。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
表１に示されるように、試験群の各有効成分は、本発明の有効成分を含有しない対照群に比べて化合物の濃度が増加するに伴って、最小１８２．４２％から最大３８１．５４％まで用量依存的にコラーゲン生成促進効果を有している。このことは本発明の有効成分が優れたコラーゲン合成促進効果を有していることを示している。
【００１２】
実験例２  ラット皮膚におけるコラーゲン生成の促進
本発明の有効成分であるフェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びモルジピンを適用したときの動物の皮膚におけるコラーゲン生成促進効果を調べた。Mard L DaCosta らが提案した方法(Surgery,１９９８、１２３: ２８７〜２９３)の変法を用い、生成したコラーゲンを測定した。
【００１３】
要約すると、５週齢の雄性ＳＤラットを５匹ずつの群に分けた。ラットはそろぞれ腹部中央にに１ｃｍの切り込みを入れ、１００ｍｇのＰＶＡスポンジ(Unipoint Ind．社製)をそこに挿入した。  縫合した後、試験群に対して、試験すべき各有効成分を１０日間毎日２００μｌずつＰＶＡスポンジを埋め込んだ部位に塗布した。剖検して、ＰＶＡスポンジをヒドロキシプロリン定量のために摘出した。ＰＶＡスポンジに４ｍｌの６Ｎ ＨＣｌを加え、１３０℃で３時間加水分解させた後、完全に乾燥させた。メタノール５０μｌを加え、塩酸が除去されるまで１１０℃で培養した。１．２ｍｌの５０％イソプロパノールを加えて残存している沈澱物を溶解した。２００μｌのクロラミン−Ｔ(ｐ−トルエンスルホンクロルアミドナトリウム三水和物)溶液を攪拌下に加え、１０分間静置した。１．２ｍｌのエールリッヒ試薬を加えて混合した後、５０℃で９０分間培養した。反応液を室温まで冷却して、５５８ｎｍにおける吸光度を測定した。ヒドロキシプロリンの標準溶液を、１ｍｇのヒドロキシプロリンを１ｍｌのＨＣｌに溶解し、０、０．２、０．４、０．８、１ｍｇ/２５μｌ ６Ｎ ＨＣｌの濃度になるよう稀釈して調製した。この標準溶液を１３０℃で３時間加水分解させた。溶媒だけを塗布した対照群のヒドロキシプロリン値を１００％とした場合の該ヒドロキシプロリンの測定値を表２に示す。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
表２に示されるように、有効成分はラット皮膚中のコラーゲン生成を増加させ、本発明の有効成分を適用しない対照群に比べて増加率は最小１２２．４４％から最大１８５．８８％までであった。
【００１６】
実験例３  ヘアーレスマウスにおけるしわ形成抑制効果
本発明の有効有効成分であるフェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンのヘアーレスマウスにおけるしわ形成抑制効果を調べた。
【００１７】
６週齢のヘアーレスマウスを１０匹ずつ２１の試験群と３つの対照群に分けた。試験群にはそれぞれの化合物が１０−８〜１０−３Ｍになるように皮膚に塗布した。コントロール群には有効成分を含有しない溶媒だけを塗布した。試験法の詳細なプロトコールは以下の通りである。ヘアーレスマウスに擬似太陽光を２ＭＥＤ(最小紅斑照射量の２倍)で１週間に３日、１２週間照射してしわを形成させた。それぞれの有効成分または溶媒のみを、１日２回（特に照射日は、照射前３０分と照射後３０分）１００μｌずつ最初の照射日から１０週間塗布した。しわ形成抑制の程度を測定した。測定は肉眼と写真撮影を通して視覚観察で行った。それぞれの化合物の処理群（試験群）のしわ抑制の程度は、対照群(０点)と比べて、抑制なし(０点)、僅かに抑制(１点)、中程度の抑制(２点)、高度の抑制(３点)の４段階で判定し、対応する動物数を数えた。データを表３ａ〜表３ｃに示す。
【００１８】
【表３−ａ】
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【００１９】
【表３−ｂ】
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【００２０】
【表３−ｃ】
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【００２１】
表３ａから表３ｃに示されるように、有効成分の場合はヘアーレスマウスの約８０％以上が高い程度でしわ形成が抑制された。このことは本発明の有効成分がしわ形成抑制に優れた効果を有していることを立証している。
【００２２】
実験例４  ヘアーレスマウスにおけるしわ低減効果
６週齢のヘアーレスマウスにおける光で誘発されたしわに対する、本発明の有効成分であるフェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンの低減効果を調べた。
【００２３】
マウスを１０匹ずつ１５の試験群と三つのの対照群に分けた。試験群については、マウスにそれぞれの有効成分を１０−８〜１０−３Ｍになるようにして皮膚に塗布した。対照群にはマウスに有効成分を含有しない溶媒のみを塗布した。試験法は次の通りである。ヘアーレスマウスに擬似太陽光を用いて２ＭＥＤ(最小紅斑照射量の２倍)で１週間に３日１０週間照射してしわを形成させた。それぞれの有効成分又は溶媒のみを１日２回１００μｌずつ６週間塗布した。しわの減少の程度を測定した。測定は化合物を塗布した部位を肉眼で視覚的に観察することによって行い、次いでその部位を写真撮影した。化合物処理群（試験群）のしわ低減の程度を対照群のそれと比較して、なし(０点)、やや改善(１点)、中等度の改善(２点)、高度の改善(３点)の４段階で判定し、対応する動物数を数えた。データを表４ａ〜表４ｃに示した。
【００２４】
【表４−ａ】
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【００２５】
【表４−ｂ】
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【００２６】
【表４−ｃ】
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【００２７】
表４ａから表４ｃに示されるように、有効成分の場合はヘアーレスマウスの約８０％以上において、光照射により形成されたしわに対し、高いレベルでの低減効果が認められた。このことは本発明の有効成分がしわの低減に優れた効果を有することを示している。
【００２８】
本発明の有効成分を用いてヒト由来繊維芽細胞、ラット及びマウスにおけるコラーゲン合成促進効果を評価した結果は、１０−８〜１０−３Ｍの濃度のフェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンが、それぞれ優れたコラーゲン合成促進効果を有していること示している。
【００２９】
本発明に係る有効成分を含んでなる局所用組成物は例えば、クリーム、軟膏、ローション、スキントニック、ゲル、パック、これらのエアロゾールタイプ、貼布剤、微細注射針が装着されたパッチ型投与器具など皮膚に適用させ得る種々の剤形のものを含む。本発明の組成物を特にクリーム、軟膏、パックの剤形に調製し、人の皮膚に塗布してしわの減少を評価したところ、しわの密度を顕著に減少させる効果があることが判った。
【００３０】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づき説明する。これらの実施例は単に説明を目的に示されており、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことに留意されたい。
【００３１】
本発明の有効成分を含有する種々の剤形製剤の調製
本発明に従い、各々の有効成分とその他の補助成分を使用して次の表５から１１に示す組成で皮膚に適用する局所製剤を製造した。本発明では、何れも皮膚に局所的に適用し得る、軟膏、クリーム、パック、エッセンス、皮膚柔軟剤、栄養乳液、貼布剤及び微細注射針が装着されたパッチ型投与器具を製造した。ここではフェニトイン及びサイクロスポリンＡを有効成分として使用した製剤のみを調製したが、これらの例は、剤形及び有効成分を限定するものではない。
【００３２】
【表５】
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【００３３】
【表６】
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【００３４】
【表７】
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【００３５】
【表８】
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【００３６】
【表９】
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【００３７】
【表１０】
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【００３８】
【表１１】
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【００３９】
微細注射針が装着されたパッチ型器具に関しては、パッチ器具の主要部をなす薬剤のための溶媒貯蔵槽は、フェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンのような薬物がそこに浸透してくるのを抑えて、投与器具全体を守るために高分子支持体から成っている。薬物の溶媒としては水、ポリエチレングリコール、トランスキトル（trnscutol）、あるいはエタノールでよく、これは貯蔵槽の中に入っている。高分子支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、不織布又は綿布が利用できる。上で述べた薬物はこの貯蔵槽の下部に粉末状に分散されている。パッチ型器具は、更に微細注射針の支持体と多数の微細注射針を具えていることを特徴とする、薬剤を経皮的に投与するための器具である。微細注射針の支持体は、セルロース系、ポリプロピレン、フルオロカーボン、ポリカーボネートのような高分子ゲルからなり、皮膚接着後溶媒の放出によって澎潤する性質を有している。微細注射針は微細注射針の支持体に垂直に固定分布されていて、皮膚と接触するようになっている。更に詳細には、注射針支持体に単位面積(ｃｍ２)当たり１０〜５０個の微細注射針が取付けられており、その各々には直径が１〜１０００μｍの、薬剤が通過できる通路を有し、針は外部に長さが０．０１〜３ｍｍになるよう固定されている。この器具は下部に、器具を皮膚に接着させる機能を有する接着層を有しており、この接着層はポリアクリレートやポリブテンのような物質で出来ている。接着層は皮膚への悪影響がなく、溶媒によって溶解されないことに留意すべきである。更には、溶媒によって接着性が減少しないことが必要である。最後に、接着層には使用時除去しやすい保護フィルムが付着されているが、これは薬剤の漏れを防止し接着剤を保護する役割を果たす。
【００４０】
本発明の有効成分を含有する微細注射針が装着されたパッチ型器具の製造
比較例１
３％ゼラチン溶液１ｇを皮膚微細注射針(１５個/ｃｍ２)が垂直に固定された布に注ぎ凍結乾燥機で真空乾燥した。このようにして比較マトリックスを得た。
【実施例１】
【００４１】
３％ゼラチン溶液１ｇに０．００１％のフェニトインを添加し、その中に均一に分散させた。この溶液を微細注射針(１５針/ｃｍ２)が垂直に固定した布に注ぎ凍結乾燥機で真空乾燥した。このようにしてフェニトイン分散マトリックスを得た。
【実施例２】
【００４２】
３％ゼラチン溶液１ｇに０．００１％のサイクロスポリンＡを添加し均一に分散させた。この溶液を布に微細注射針(１５個/ｃｍ２)が垂直に固定した布に注ぎ凍結乾燥機で真空乾燥した。こうしてサイクロスポリンＡ分散マトリックスを得た。
【００４３】
本発明の有効成分よりなる組成物による皮膚老化に対する予防及び治療効果の評価
上記の比較例及び前記表５から１１に挙げた実施例を含む実施例で調製された製剤について、肌のしわ低減効果を評価するために３５〜６０才の女性を対象にした。７６０名の女性を２０名ずつ３８群に分けた。それぞれの実施例と比較例を顔面部に１日２回３ヶ月間塗布した(表７のパックの場合は塗布してから３０分後に取り除いた)。しわの低減の程度の評価は３ヶ月後のしわの観察及び映像分析によって決定した。観察はしわ低減及び弾力増強に関してそれぞれの組成物の塗布前と比較して、低減なし、やや低減、中等度の低減、高度の低減の４段階に区分づけして、対応する人数を数えた。データを表１２に示す。しわの映像分析による評価は実験が始まる前キサントプレン（Xantopren：Bayer社製）を用いて目の右下の部位のレプリカ(replica)を取った。また、実験終了直後、同一部位でもう一つののレプリカを取った。これらのレプリカを映像分析した。二次元分析でしわの密度を測定した。測定値は実験前のしわ密度に対する減少率で示した。結果を表１３に示す。
【００４４】
【表１２】
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【００４５】
【表１３】
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【００４６】
表１２に示されるように、本発明に係る実施例ではしわの低減及び皮膚の弾力増強に対し優れたの効果をもたらす。特に、８０％以上が高いレベルの改善効果を示した。表１３に示されるように、本発明の有効成分を含んでなる実施例を塗布した場合、しわの密度が実験前と比べて約３７〜５０％ほど顕著に減少する。そして、微細注射針が装着されたパッチ型投与器具を適用したときも、実施例１と実施例２は、それぞれ７０％及び６０％としわの密度を有意に減少させたことを示し、実施例は、比較例よりも優れている（９８％）ことも示している（データは示されていない）。
【００４７】
上記実験結果は本発明の有効成分をクリーム、軟膏、ローション、スキントニック、ゲル、パック、貼付剤、微細注射針が装着されたパッチ型器具の形で皮膚に局所適用した場合には、内的または外的要因によってできたしわが極めて効果的に低減されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
上記の記載から明らかなように、本発明は、フェニトイン、バルプロ酸、サイクロスポリンＡ、ニフェジピン、ジルチアゼム、塩酸ベラパミル及びアモルジピンの中から選ばれた１種又は２種又はそれ以上をコラーゲン合成促進効果を有する有効成分として含んでなり、肌のしわのような皮膚の老化の抑制、低減及び防止に優れた効果を示す、局所用組成物を提供するものである。
本発明の好ましい実施態様は、説明のために開示されているものであり、当業者であれば、請求項に記載の本発明の範囲と精神を逸脱することなしに種々の改良、付加及び置換が可能であろう。