(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療または免疫原性処置のため身体の組織に直接投与するための医薬であって、
非統合性でかつ非感染性であり、かつ身体内に所望の治療効果または免疫原性効果を生じさせる遺伝子生産物を作動的にコードする配列を有する、ポリヌクレオチド、および
カチオン脂質物質からなり、
前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化されており、かつ
病気の治療または身体における免疫応答の誘導のため使用される、医薬。
【請求項２】
前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種と組合された正に荷電した脂質種からなる、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記遺伝子生産物が疾病治療物質である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記遺伝子生産物がガン治療物質である、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
前記遺伝子生産物がインターフェロンである、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
前記遺伝子生産物がインターロイキン−２である、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
治療または免疫原性処置のため哺乳動物の身体の組織に直接投与するための医薬であって、
哺乳動物の細胞において治療ポリペプチドの合成を誘導するポリヌクレオチドおよびトランスフェクションを促進するカチオン脂質物質を有効成分として含み、
前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化されており、
前記ポリヌクレオチドは、前記治療ポリペプチドが必要な前記哺乳動物の組織にインビボで直接導入されるとき、前記哺乳動物の細胞に組込まれ、かつ、前記治療ポリペプチドは必要な治療効果をもたらすのに十分な量で発現される、医薬。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドは、プロモーターと結合して前記治療ポリペプチドを作動的にコードするＤＮＡプラスミドおよびメッセンジャーＲＮＡからなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ  ＬＴＲ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス長末端反復（ＭＰＳＶ  ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０前初期プロモーター（ＳＶ４０  ＩＥＰ）、メタロチオネインプロモーターおよびヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ  ＩＥＰ）からなる群より選択されるものである、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記組織が筋肉である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１５】
前記筋肉は骨格筋である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記組織が皮膚である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１７】
前記組織が血液である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１８】
前記組織が体腔内のものである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドは注射により前記組織に導入される、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２０】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２１】
前記治療ポリペプチドは前記組織の細胞によって生産される、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２２】
前記治療ポリペプチドは、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫調節因子および抗体からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２３】
前記治療ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子、神経成長因子、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）およびエリトロポエチンからなる群より選択されるものである、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２４】
前記治療ポリペプチドはインターロイキン−２である、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
前記治療ポリペプチドは免疫をもたらすポリペプチドであり、かつ前記治療効果は免疫原性の効果である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項２６】
前記免疫をもたらすポリペプチドは、ウイルスタンパク質および腫瘍関連ポリペプチドからなる群より選択されるものである、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
前記ウイルスタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質およびヘルペスウイルスタンパク質からなる群より選択されるものである、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
前記免疫原性の効果は、体液性のものであり、かつ抗体の生産をもたらすものである、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２９】
前記免疫原性の効果は、細胞性のものであり、かつ細胞障害性Ｔ細胞の生産をもたらすものである、請求項２５に記載の医薬。
【請求項３０】
前記免疫をもたらすポリペプチドまたはそのフラグメントは、クラスＩ主要組織適合性分子、クラスＩＩ主要組織適合性分子、およびクラスＩ主要組織適合性分子とクラスＩＩ主要組織適合性分子の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の分子と共に、前記哺乳動物の細胞膜に運ばれるものである、請求項２５に記載の医薬。
【請求項３１】
前記ポリペプチドの生産は疾病の治療をもたらすものである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項３２】
前記疾病はガンである、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
前記カチオン脂質は、第四級アンモニウム基および６〜３０の炭素を有する１つまたは２つの飽和もしくは不飽和アルキル基を有するものである、請求項１１に記載の医薬。
【請求項３４】
前記カチオン脂質は、
式Ａ）
【化１】
0003683798.tif 000012
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、同じかまたは異なり、かつＣ6〜Ｃ22アルキルまたはＣ6〜Ｃ22アルケニルであり、
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、かつ水素、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、アリール、Ｃ7〜Ｃ11アラルキルであり、または、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の２つまたは３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリノを形成することができ、
ｎは１〜８であり、かつ
Ｘは製薬的に許容される陰イオンである）、および
式Ｂ）
【化２】
0003683798.tif 000013
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、同じかまたは異なり、かつＣ5〜Ｃ21アルキルまたはＣ5〜Ｃ21アルケニルであり、
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、かつ水素、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、アリール、Ｃ7〜Ｃ11アラルキルであり、または、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の２つまたは３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリノを形成することができ、
ｎは１〜８であり、かつ
Ｘは製薬的に許容される陰イオンである）
からなる群より選択される式を有するものである、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
前記カチオン脂質は、Ｎ−（２，３−ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））ｐｒｏｐ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）からなる群より選択されるものである、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
少なくとも１種の中性脂質をさらに含むものであり、
前記中性脂質と前記カチオン脂質は０％：１００％〜７５％：２５％の比率で混合されている、請求項１１に記載の医薬。
【請求項３７】
前記カチオン脂質と前記中性脂質とのモル比は１：１である、請求項３６に記載の医薬。
【請求項３８】
前記中性脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群より選択されるものである、請求項３６に記載の医薬。
【請求項３９】
前記カチオン脂質は、Ｎ−（２，３−ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））ｐｒｏｐ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）からなる群より選択されるものであり、かつ
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群より選択される少なくとも１種の中性脂質をさらに含むものである、請求項１１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本発明はポリペプチドの制御された発現を達成するために、脊椎動物内に裸のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を導入することに関する。これは、遺伝子治療、ワクチン投与および生体内細胞に対しポリペプチドを投与する必要があるいかなる治療の状況においても役立つものである。
【０００２】
遺伝子治療における現在の研究は、ＤＮＡが患者のゲノム内に組込まれる、「永久の」治癒に焦点がおかれている。ウイルスのベクターは、患者の細胞を形質転換させかつＤＮＡをゲノム内に導入するための手段として現在最も頻繁に使用される手段である。間接的な方法においては、新しい遺伝子情報を保持するウイルスベクターが、身体から取り出された標的細胞に感染させるために使用され、かつこれらの細胞はその後再移植される。出生後の動物への直接の生体内遺伝子移植については、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡおよびウイルス外膜受容体タンパク質を含むプロテオリポソームに包含されたＤＮＡの処方物が報告されている（Nicolau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 80: 1068-1072（1983）; Kaneda et al., Science 243:375-378（1989）; Mannino et al., Biotechniques 6:682-690（1988）。また肯定的な結果がリン酸カルシウム共沈ＤＮＡと共に記述されている（Benvenisty and Reshef Proc. Natl. Acad Sci USA 83:9551-9555（1986））。
【０００３】
遺伝子治療の医療への応用および組換型レトロウイルスベクターの利用は、安全性への配慮から遅れている。細胞のゲノム内へ外因性ＤＮＡを導入することでＤＮＡに障害を引起こしかつ悪性疾患の素因となり得る、受容細胞の遺伝子の変化を引起こし得る。これらの潜在的な問題を回避する方法は、遺伝子治療を安全でかつ有効なものにするうえで重要な利益を有するものと考えられる。
【０００４】
免疫原性タンパク質を用いてワクチン投与を行なうことで多くの疾病の発生を根絶しまたは低減してきたが、免疫原として、他の病原体および症状と関連するタンパク質を使用することには大きな困難が存在している。多くのタンパク質抗原は本来免疫原性のものではない。むしろ、それらは免疫系が働く態様から、ワクチンとしては効果的ではない。
【０００５】
脊椎動物の免疫系は幾つかの相互作用的要素から構成される。最もよく特徴が表われかつ最も重要な部分は体液性および細胞性（細胞溶解性の）ブランチである。体液性免疫は、体液内に分泌しかつ直接的に抗原を認識するタンパク質、すなわち抗体を含む。細胞系は、対照的に、外来の抗原を作り出している他の細胞を認識しかつこれらを殺す特別な細胞に依存している。この基本的機能の違いが免疫防御の２つの異なる戦略を反映している。体液性免疫は主に動物にとって外因性のものである抗原に向けられ、一方細胞系は動物内で活発に合成される抗原に応答する。
【０００６】
体液性免疫のエフェクタである抗体分子は特殊なＢリンパ細胞、すなわち抗原に応答するＢ細胞により分泌される。抗体は抗原に結合および直接的にこれを不活性化し（抗体を中和し）または抗原を破壊するために免疫系の他の細胞を活性化することが可能である。
【０００７】
細胞の免疫認識は特殊なクラスのリンパ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞により行なわれる。これらの細胞は抗原全体を認識しないが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質に結合した標的細胞の表面上に現われる、抗原の分解したペプチドフラグメントに応答する。本質的にすべての核のある細胞はクラスＩ分子を有している。細胞内で生産されるタンパク質は正常な細胞の代謝の一環として連続的にペプチドに分解されると考えられている。これらのフラグメントはＭＨＣ分子に結合しかつ細胞の表面に輸送される。こうして、細胞の免疫系は常に身体のすべての細胞に生産されるタンパク質のスペクトルを常にモニターしかつ外来の抗原を生産するいかなる細胞をも除去すべく平衡を保っている。
【０００８】
ワクチン投与は動物を抗原に応答させる準備のプロセスである。ワクチン投与は、免疫認識よりもより複雑でかつＢ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を巻き込むのみならず、他のタイプのリンパ細胞をも巻き込む。ワクチン投与の間、抗原を認識する細胞（Ｂ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）はクローン増殖する。加えて、抗原に特異的な補助細胞（ヘルパーＴ細胞）の数もまた増大する。ワクチン投与はまた抗原を加工しかつ２つの経路のうちの１つを刺激し得る形でそれを提示し得る特殊化された抗原提示細胞をも巻き込む。
【０００９】
ワクチン投与は、ルイ・パスツール（LOUIS PASTEUR）の時代からほとんど変化していない。外来の抗原が動物内に導入され、これが表面免疫グロブリンに結合することにより特異的Ｂ細胞を活性化する。これはまた抗原プロセシング細胞によっても吸収され、分解されかつクラスＩＩＭＨＣ分子に結合するこれら細胞の表面上にフラグメントとなって現われる。クラスＩＩ分子に結合するペプチドはヘルパークラスＴ細胞を刺激することが可能である。ヘルパーＴ細胞および活性化されたＢ細胞の双方が活性な体液性免疫を生成させるのに必要である。細胞性免疫は類似するも、あまりよく理解されていないメカニズムにより刺激を受けると考えられている。
【００１０】
こうして、２つの異なりかつ顕著な抗原処理の経路は、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合した外因性抗原を生産し、それらはＴヘルパー細胞を刺激し、同様に分解され、クラスＩＭＨＣ分子に結合し、細胞傷害性クラスのＴ細胞により認識される内因性タンパク質を生産する。
【００１１】
ＭＨＣ分子の分布においてはほとんどまたは全く違いが存在しない。本質的にすべての核を有する細胞はクラスＩ分子を発現し、一方クラスＩＩＭＨＣタンパク質は幾つかのタイプのリンパ細胞に制限される。
【００１２】
通常のワクチン投与方法によれば常にヒトの免疫反応がもたらされることになる。これらはまた細胞傷害性免疫をももたらす。体液系は病原体からの引き続いて起こる攻撃からワクチンを投与されたヒトを保護しかつもし病原体がその生存期間内に細胞外の段階を経るならば、細胞内感染が広がることを防止することができるが、しかし、細胞内の病原体を除去するためには相対的にあまり有効ではない。細胞傷害性免疫は感染した細胞を除去することにより体液系を補う。したがって、有効なワクチン投与により双方のタイプの免疫が活性化されるはずである。
【００１３】
細胞傷害性Ｔ細胞の応答はウイルス等の細胞内病原体および悪性の細胞を除去するために必要である。十分な応答を確保するために、クラスＩ分子と関連して十分な濃度で外因的に投与された抗原を提供することは困難であることがわかっている。このことが、腫瘍に特異的な抗原（たとえば乳癌または結腸癌の細胞に対する）、および免疫原性が弱いウイルスタンパク質（たとえばＨＩＶ，ヘルペス，非−Ａ型および非−Ｂ型肝炎，ＣＭＶおよびＥＢＶ）に対するワクチンの開発を著しく妨げてきた。
【００１４】
抗体が感染性の増大を示すようなウイルス等の因子に対して免疫処置を行なうには、細胞性免疫応答だけを与えることが望ましいと考えられる。またこのような応答を慢性および潜伏しているウイルス感染ならびに悪性細胞に対して与えることも有益であると考えられる。
【００１５】
合成ペプチドワクチンの使用はこれらの問題を解決することにはならない。というのもペプチドは、組織適合分子と容易に結合せず、血清半減期が短く、急速に分解され、あるいは抗原提示単球およびマクロファージに対して特定的に局在化しないからである。最良の場合でもすべての外因的に投与された抗原は抗原提示マクロファージに結びつく自己タンパク質の母集団と競合しなければならない。
【００１６】
ヘルペスウイルス、非−Ａおよび非−Ｂ型肝炎、ＨＩＶその他からの免疫原性に乏しいウイルスタンパク質に対し、免疫反応を引き出すために多くの努力がなされてきた。これらの病原体を生体外で増殖させることは困難でありかつまた危険なものである。上記のとおり、ウイルスによりコードされるタンパク質に対応する合成ペプチドワクチンが作られてきたが、これらは決定的な落とし穴を伴うものであった。他のウイルスからタンパク質を発現させるためにワクシニアウイルスベクターを使用する試みもなされてきた。しかしながら、結果は満足のいくものではなかった。というのも（ａ）組換型ワクシニアウイルスは既に免疫のあるヒトの循環から急速に排除されかつ（ｂ）複雑なウイルス抗原の投与は「抗原競合」として知られる現象を誘因し得るからである。そこにおいて、免疫原性の弱いウイルスの部分は免疫反応を引き出すことができず、というのもそれらは投与された抗原のうち他より潜在能力のある領域に負けてしまうからである。
【００１７】
タンパク質またはペプチドワクチンに関するもう１つの大きな問題は、強い免疫反応をもたらすための努力として抗原の注射を繰返し行なう場合に発生し得る過敏反応である。この現象においては抗原に応答して形成されたＩｇＥ抗体が激しいかつ時には死に至るアレルギー反応を引き起こす。
【００１８】
したがって、この種のタンパク質またはポリペプチドに対して安全でかつ有効な免疫応答を引き起こすための方法が必要とされている。そのうえ、細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘因し、過敏症および血清中の物質のタンパク質分解を回避しかつ単球およびマクロファージへの物質の局在化を容易にするために、これらの抗原を細胞表面上のクラスＩ組織適合抗原に結合する方法が非常に必要とされている。
【００１９】
治療用ペプチドの投与は数多くの疾病状態に有効である。このようなペプチドには、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子、およびインターフェロン等のリンホカイン、神経成長因子、表皮増殖因子およびヒト成長ホルモン等の成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリトロポエチン、インスリン、カルシトニン、チミジンキナーゼなどが含まれる。そのうえ、（リシン、ジフテリア毒素またはコブラの毒液因子等の）毒性ペプチドを疾病のあるまたは新生物細胞に選択的に配達することにより大きな治療上の利益がもたらされ得る。現在のペプチドデリバリーシステムには、機能的細胞表面受容体を細胞膜に有効に組込むことができないこと、および標的細胞内へまたはこれに対して治療に必要な量のペプチドを配達するために、大量のペプチドを全身的に投薬することの必要性（これは結果として望ましくない全身の副作用をもたらす）を含む重大な問題が存在している。
【００２０】
遺伝子治療、免疫化および細胞への治療用ペプチドのデリバリーに伴う上記の問題に本発明は取組むものである。
【００２１】
【発明の要約】
本発明は、インビボで脊椎動物の細胞の内部に医薬または免疫原性のポリペプチドを配達するための方法を提供し、この方法は製薬的に許容される注射可能な担体およびポリペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを含む調製物を細胞を含む組織の間質的空間へ導入するステップを含み、これにより裸のポリヌクレオチドが細胞の内部に取込まれかつ脊椎動物に対して免疫原性または薬理学的効果をもたらすものである。またインビボで筋肉細胞にポリヌクレオチドを導入するための方法も提供され、これは製薬的に許容される担体内に裸のポリヌクレオチドを含む組成物を提供するステップ、その組成物をインビボで脊椎動物の筋肉組織に接触させ、これによりポリヌクレオチドが組織の筋肉細胞に導入されるステップとを含む。このポリヌクレオチドはアンチセンスポリヌクレオチドでもよい。代替的には、このポリヌクレオチドは脊椎動物に対し治療を施す接触ステップの後に筋肉細胞により発現される治療用のペプチドをコードしてもよい。同様に、接触ステップの後に筋肉細胞により発現されかつ免疫反応を発生して、それにより脊椎動物に免疫処置を行なう免疫原性ペプチドをコードしてもよい。
【００２２】
本発明の１つの特に魅力的な局面は、脊椎動物に対するポリペプチドの長期にわたる投与を行なうための方法であって、この方法は脊椎動物の組織内に、ポリペプチドを作動的にコードする裸のＤＮＡ配列を間質的に導入し、これにより組織の細胞が少なくとも１カ月または少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月にわたってポリペプチドを生産するというステップを含む。本発明の具体例において、ポリペプチドを生産する細胞は筋肉細胞等の非増殖性の細胞である。
【００２３】
本発明に従うもう１つの方法は、脊椎動物におけるポリペプチドの一過性の発現を得るための方法であり、この方法はポリペプチドを作動的にコードする裸のｍＲＮＡ配列を間質的に脊椎動物の組織内に導入し、これによりその組織の細胞が約２０日未満、通常は約１０日未満、およびしばしば３日または５日未満にわたってポリペプチドを生産するというステップを含む。本発明の方法の多くに関しては、固形の組織への投与が好まれる。
【００２４】
本発明の１つの重要な局面は、筋ジストロフィーの治療のための方法であり、筋ジストロフィーを患う動物の筋肉細胞内へ、インビボで、製薬的に許容される注射可能な担体において、ジストロフィンを作動的にコードするポリヌクレオチドを含む組成物の治療上有効な量を導入し、これによりポリヌクレオチドが細胞内に取込まれかつジストロフィンが生体内で生産されるというステップを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドでありかつその組成物は筋肉組織の間質に導入される。
【００２５】
本発明はまたここに記載された方法すべてにおいて使用が考慮される医薬製品を含む。たとえば、生物学的に活性のポリヌクレオチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを含む医薬製品がある。該ポリヌクレオチドは容器内に、生理学的に許容される投与可能な形で含まれ、さらに医薬製品は、薬物の生産、使用または販売を規制する政府の省庁により規定された形で該容器に付随する注意書を有し、その注意書はヒトまたは動物への投与のためのポリヌクレオチドのその形態に関してその省庁が承認したということを表わすものである。このような注意書は、たとえば米国食品医薬品局により承認された処方薬のためのラベルまたは承認された製品挿入物でもよい。
【００２６】
もう１つの具体例において、本発明は医薬製品を提供し、この製品は、組織の細胞にポリペプチドを発現させるため組織内へ間質的に導入するのに適した生理学的に許容される注射可能な担体内の溶液中の生物学的に活性なペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドと、その溶液を収容する容器と、この容器に付随する注意書とを含み、その注意書は薬物の製造、使用または販売を規制する政府の省庁により規定された形式のものであり、その注意書は、ヒトまたは動物に投与するためのポリヌクレオチド溶液の製造、使用または販売に関してその省庁が承認を与えたということを反映する。そのペプチドは免疫原性のものとすることができ、その溶液の投与は、ヒトまたは動物に対するワクチン処置の役割を果たし得る。同様に、ペプチドは治療用にもなり得、ポリペプチドに関し治療の必要な脊椎動物に、この溶液を投与することにより治療上の効果がもたらされる。
【００２７】
本発明はまた医薬製品を提供し、この製品は、組織の細胞にポリヌクレオチドの取込みを引き起こさせかつ治療効果をもたらすため、組織内へ間質的に導入するのに適した生理的に許容される注射可能な担体における溶液での裸のアンチセンスポリヌクレオチドと、その溶液を収める容器と、薬物の製造、使用または販売を管轄する政府の省庁により規定される形式での容器に添付された注意書とを含み、その注意書はヒトまたは動物への投与のためのポリヌクレオチドの溶液の製造、使用、または販売に関してその省庁が承認したということを反映するものである。
【００２８】
本発明の１つの特に重要な局面は、減菌した、製薬的に許容される担体と、ジストロフィンを作動的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチドと、担体およびポリヌクレオチドを無菌状態で収める容器とを含む、筋ジストロフィー治療のための医薬製品に関する。
【００２９】
好ましくは、このポリヌクレオチドはＤＮＡである。
もう１つの側面から、本発明は脊椎動物に生物学的に活性のポリペプチドを供給するうえで使用される医薬製品を含み、この製品はポリヌクレオチドを作動的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチド、無菌状態で担体とポリヌクレオチドとを収める容器、およびこの容器に付随して、この容器から組織の間質的空間へポリヌクレオチドを移すことを可能にし、これにより組織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現するための手段を含むものである。このような移すことを可能にするための手段には針等により突き刺すことが可能な従来の隔壁を含み得る。代替的には、その容器が注射器の場合には、その手段は注射器のプランジャーまたは注射器に取付けられた針を含むと考えられ得る。本発明で使用される容器は、通常１またはそれ以上の単位用量を提供するために少なくとも１、好ましくは少なくとも５または１０、より好ましくは少なくとも５０または１００マイクログラムのポリヌクレオチドを有することになる。多くの用途に関して、この容器は少なくとも５００マイクログラムまたは１ミリグラムを有することになり、しばしば少なくとも５０または１００ミリグラムのポリヌクレオチドを含有することになるであろう。
【００３０】
本発明のもう１つの局面は、脊椎動物に免疫処置を行なううえでの使用のための医薬製品を提供し、この製品は、免疫原性ポリペプチドを作動的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリペプチドと、無菌状態でこのポリヌクレオチドを収める封止された容器と、この容器に付随して、容器から組織の間質的空間にポリヌクレオチドを移すことを可能にし、これによりその組織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現させるための手段とを含む。
【００３１】
本発明のもう１つの局面は、組織を含む細胞にポリペプチドを生産させるために間質的に組織内に導入するための医薬調製物において生理学的に活性のポリペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを使用することである。その医薬とは、たとえば筋肉組織内への導入により筋肉細胞がポリペプチドを生産するためのものでもよい。また、ペプチドがジストロフィンでありかつ医薬が筋ジストロフィーの治療のためのものである場合のような使用も考えられる。
【００３２】
本発明に従うもう１つの用途は、脊椎動物の細胞内でのポリヌクレオチドの翻訳を抑制するために脊椎動物の組織内に間質的に導入するための医薬調製物において裸のアンチセンスポリヌクレオチドを使用することである。
【００３３】
ポリヌクレオチドが導入される組織は持続性非分裂細胞であり得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ配列のいずれでもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、それ自体は非複製性であるが、プラスミドに挿入されているＤＮＡ配列とすることができる。該プラスミドは、さらにレプリケーターを含む。ＤＮＡは宿主細胞ゲノム内へ組込まれないように作られた配列でもよい。ポリヌクレオチドの配列は、細胞内に含有されるかもしくはそこから分泌されるかのいずれかのポリペプチドをコードするものでもよく、またはペプチドの分泌を誘導する配列を含み得る。
【００３４】
ＤＮＡ配列はまたプロモータ配列を含み得る。１つの好ましい具体例においては、ＤＮＡ配列は予め定められた細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を可能にする細胞特異的プロモータを含む。ＤＮＡはまたＤＮＡを転写するためのポリメラーゼをコードし、かつポリメラーゼのための認識部位を含み得、注射可能な調製物は初回量のポリメラーゼを含み得る。
【００３５】
多くの場合、ポリペプチドの配達が一過性のものとなるようにポリヌクレオチドの翻訳が限定された期間において行なわれることが好まれる。このポリペプチドは、有利に治療用ポリペプチドとすることができ、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、特に細胞表面の受容体、成長因子または他の調節因子等の調節タンパク質、または生きた脊椎動物の細胞に配達することを所望されかつこれに関し対応するＤＮＡまたはｍＲＮＡが得られ得る他のいかなるタンパク質またはペプチドをも含み得る。
【００３６】
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは筋肉組織内に導入され、他の具体例において、ポリヌクレオチドは皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓または血液の組織内へ組込まれる。調製物は様々なルートにより脊椎動物に注射され、その経路は皮内、皮下、くも膜下もしくは静脈であり得、あるいは身体の腔内でもよい。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは筋肉内に注射される。他の具体例において、ポリヌクレオチドを含む調製物は皮膚内に圧入される。吸入と同様、経皮的投与についても考慮される。
【００３７】
１つの好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはＤＮＡを転写するためのポリメラーゼとポリペプチドの双方をコードするＤＮＡであり、かつＤＮＡはポリメラーゼのための認識部位を含み、かつ注射可能な調製物はさらに初回量のポリメラーゼを細胞内に提供するための手段を含む。ポリメラーゼの初回量はＤＮＡと共に物理的に存在し得る。一方、それをコードするｍＲＮＡを含むことにより与えることができ、そのｍＲＮＡは細胞により翻訳される。本発明の具体例において、ＤＮＡは好ましくはプラスミドである。好ましくは、ポリメラーゼはファージＴ７ポリメラーゼであり、かつその認識部位は配列のＴ７複製起点である。
【００３８】
本発明のもう１つの局面に従い、脊椎動物における特定のポリペプチドの欠陥またはその欠如に関連する疾病を治療するための方法が提供され、この方法は特定のポリペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを含む製薬的に許容される注射可能な担体を含む注射可能な調製物を得るステップと、注射可能な調製物を脊椎動物に導入しかつそのポリヌクレオチドが細胞内へ組込まれることを可能にするステップを含み、そこではポリペプチドがポリヌクレオチドの翻訳生産物として形成されかつそれによりポリヌクレオチドの欠陥または欠如が補われる。好ましい具体例において、この調製物は筋肉組織内へ導入されかつこの方法は反復して適用される。この方法は欠陥またはその欠如が遺伝的欠陥によるものである場合に有利に適用される。ポリヌクレオチドは好ましくは非複製性ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列はまた、複製起点を含むプラスミドベクター内へ組込まれ得る。
【００３９】
好ましい一具体例において、ポリヌクレオチドは非分泌性のポリペプチドをコードし、かつポリペプチドは原位置にとどまる。この具体例によれば、ポリヌクレオチドがポリペプチド：ジストロフィンをコードする場合、デュシェーヌ症候群（Duchennes's syndrome）のための治療法を提供し、一方、ポリヌクレオチドがポリペプチド：フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする場合には、この方法はフェニルケトン尿症のための治療法を含む。もう１つの好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、細胞により分泌されかつ脊椎動物の循環内へ解き放たれるポリペプチドをコードし、特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはヒトの成長ホルモンをコードする。
【００４０】
この方法のもう１つの好ましい具体例において、高コレステロール血症のための治療法が提供され、コレステロールホメオスタシスに関連する受容体をコードするポリヌクレオチドが肝細胞内に導入され、該受容体が細胞により発現される。
【００４１】
本発明のもう１つの局面に従い、脊椎動物に免疫処置を施すための方法が提供され、この方法は免疫原性翻訳生産物をコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む調製物を得るステップと、脊椎動物にその調製物を導入するステップとを含み、そこでは、ポリヌクレオチドの翻訳生産物が脊椎動物の細胞により形成され、これが免疫原に対する免疫反応を引き出す。この方法のもう１つの具体例において、注射可能な調製物は、免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む製薬的に許容される担体を含み、脊椎動物への該調製物の導入の際には、このポリヌクレオチドが脊椎動物の細胞内に組込まれ、そこで、そのポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産物が形成され、これが免疫原に対する免疫反応を引き起こす。
【００４２】
他の具体例において、調製物は、脊椎動物から得られかつインビトロでポリヌクレオチドによりトランスフェクションされた１つまたは２つ以上の細胞を含み、これによりポリヌクレオチドは細胞内に組込まれ、そこにおいてポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産物が形成され、これにより、その調製物を脊椎動物へ導入すると、免疫原に対する免疫反応が引き起こされる。本発明の任意の具体例において、免疫原性生産物は細胞により分泌され得、あるいは主要組織適合抗原のコンテクストにおいて脊椎動物の細胞により提示され得、これにより免疫原に対する免疫反応が引起こされる。この方法は、脊椎動物からの非分裂性分化細胞を使用して行なうことが可能で、その細胞は血液サンプルから得られるリンパ球とすることができる。一方、分裂可能な部分的に分化した繊維芽細胞を使用して行なうこともできる。好ましい具体例において、この方法は、免疫原性翻訳生産物をコードするポリヌクレオチドを筋肉組織内に組込むことにより行なわれる。
【００４３】
免疫処置のために使用されるポリヌクレオチドは好ましくはｍＲＮＡ配列であるが、非複製性ＤＮＡ配列も使用され得る。ポリヌクレオチドは注射可能な担体のみを使用して身体の組織内に導入することができる。脊椎動物から得られた細胞の生体外トランスフェクションが行なわれる方法では、リポソーム調製物が好ましい。
【００４４】
担体は好ましくはスクロース溶液によりもたらされるような等浸透圧、低浸透圧または若干高浸透圧のものでありかつ比較的低いイオン強度を有する。調製物はさらにポリペプチドの形態でまたはポリヌクレオチドとしてリポソーム内に組込まれるサイトカインの源を有利に含み得る。
【００４５】
この方法は体液性免疫反応、細胞性免疫反応、またはこれらの組合わさったものを選択的に引起こすために使用され得る。細胞がクラスＩの主要組織適合複合体を発現しかつ免疫原性ペプチドがクラスＩ複合体のコンテキストで提示される具体例においては、免疫反応は細胞性のものでありかつ細胞傷害性Ｔ細胞の生産を含む。
【００４６】
このような具体例の１つにおいて、免疫原性ペプチドはウイルスと結合し、クラスＩ抗原のコンテキストで提示されかつウイルスに感染した細胞を破壊する能力がある細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞反応もまた、ポリヌクレオチドが体液性エピトープを欠く切り詰められたウイルス抗原をコードする場合の方法に従いもたらされ得る。
【００４７】
これらのうちもう１つの具体例において、免疫原性ペプチドは腫瘍と結合し、クラスＩ抗原のコンテキストで提示されかつ腫瘍細胞を破壊する能力がある細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。注射可能な調製物が、動物から採取されインビトロでトランスフェクトされたクラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合抗原を発現する細胞を含むさらにもう１つの具体例において、免疫反応は体液性および細胞性の両方であり、抗体および細胞傷害性Ｔ細胞の生産を含む。
【００４８】
もう１つの具体例において、脊椎動物に免疫処置を施す方法が提供され、この方法は、免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む正に荷電されたリポソームを得るステップと、脊椎動物にそのリポソームを導入するステップとを含み、それによりそのリポソームが単球、マクロファージまたは他の細胞に組込まれ、そこで、ポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産物が形成されかつその生産物が主要組織適合複合体のコンテキストにおいて細胞により処理されかつ提示され、それにより免疫原に対する免疫反応が引起こされる。ここでも、ポリヌクレオチドは好ましくはｍＲＮＡであるが、ＤＮＡが使用されてもよい。そして先程と同様、この方法は注射可能な担体中のポリヌクレオチドのみを使用して、リポソーム抜きで実施されてもよい。
【００４９】
本発明はまた、ポリペプチドと、ＤＮＡを転写するためのポリメラーゼとをコードするＤＮＡの使用をも包含し、かつＤＮＡはポリメラーゼのための認識部位を含む。ポリメラーゼの初回量は調製物の中にそれをコードするｍＲＮＡを含むことにより提供され、そのｍＲＮＡは細胞により翻訳される。そのｍＲＮＡには、細胞におけるその分解を遅延させる手段を設けることが好ましい。これには、ｍＲＮＡをキャッピングすること、ｍＲＮＡを環状化すること、またはｍＲＮＡの５′末端を化学的にブロックすることを含み得る。本発明で使用されるＤＮＡは線状ＤＮＡの形態でもよいしまたはプラスミドでもよい。エピソームのＤＮＡも考えられる。１つの好ましいポリメラーゼとしてはファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼがありかつ好ましい認識部位としてはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがある。
【００５０】
【発明のより詳細な説明】
本発明の実施には、脊椎動物の細胞内へ組込まれるポリペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチドを得ることが必要である。ポリヌクレオチドは、プロモータ等の標的細胞による発現のために必要なすべての遺伝子情報を有している場合にポリペプチドを作動的にコードする。これらのポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に注入可能な物質を配達する任意の方法によって、たとえば筋肉または皮膚等の組織の間質的空間内へ注射することにより、循環系または自身のキャビティ内への導入、または吸入もしくは吹込み等により脊椎動物に対して投与され得る。裸のポリヌクレオチドは注射されるかまたは他の態様では製薬的に許容される液体の担体で動物に配達される。すべての適用に関し、この液体の担体は水または部分的に水であり、無菌の、パイロジェンを含まない水を含む。調製物のｐＨは適当に調節されかつ緩衝される。
【００５１】
リポソームの使用を必要とする本発明の具体例において、たとえば、ポリヌクレオチドがリポソームと結合される場合、リポソーム、好ましくはカチオン性のまたはプラスに荷電されたリポソームを成形するための材料が必要であり、かつリポソームの調製物がこれらの材料から作られることが必要である。リポソームの材料が準備できれば、ポリヌクレオチドは、免疫を施す因子として使用するためインビトロで細胞をトランスフェクトするのに有利に使用することができ、あるいは、リポソームが食細胞により取込まれ得る体の部位へポリヌクレオチドを投与するのに有利に使用することができる。
【００５２】
ポリヌクレオチドの材料
本発明の方法に従い使用される裸のポリヌクレオチドの材料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列または治療上有益な用途を有するポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。これらのポリヌクレオチドの配列は、細胞内への侵入を容易にするために作用するいかなる配達用媒介物をも伴っていないという意味で「裸」であり、たとえばそのようなポリヌクレオチドの配列は、ウイルスの配列、特に遺伝情報を運び得るいかなるウイルス粒子をも伴っていない。それらは、トランスフェクションを促進するいかなる物質、たとえばリポソームの製剤、リポフェクチン等の荷電した脂質またはＣａＰＯ4等の沈殿剤を同様に伴っておらず、これらに対して裸である。
【００５３】
これらの方法において使用されるＤＮＡの配列は宿主細胞のゲノム内に統合しない配列が可能である。これらは非複製性のＤＮＡ配列か、またはゲノム−統合能力に欠けるように遺伝子操作により作られた特異的な複製配列でもよい。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドの配列は、細胞により取込まれた後に治療的な効果を有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。それら自身が治療用であるポリヌクレオチドの例としてはアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ，アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、または欠陥のあるまたは不良の内因性の分子を置換するｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡをコードするＤＮＡがある。本発明のポリヌクレオチドはまた治療用ポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドは大きさに関わりなくかつグリコシル化しているかどうかに関わりなくポリヌクレオチドの何らかの翻訳生産物であると理解される。治療用ポリペプチドは、主要な例として、動物における欠陥のあるまたは欠失のある種を補うことができるポリペプチド、または毒性の効果を通じて身体から有害な細胞を制限または除去する役割を果たすものを含む。
【００５５】
本発明により提供される治療用ポリヌクレオチドはまた体液性または細胞性反応またはその双方を引起こす内因性の免疫原として作用し得る免疫供与ポリペプチドをコードし得る。本発明に従い使用されるポリヌクレオチドはまた抗体をコードし得る。この点に関して、「抗体」という用語は、任意のクラスの免疫グロブリン全体、二重または多重の抗原特異性もしくはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントを包含する。「抗体」の意味に含まれるものとしてはこの他にこのようなフラグメントの接合体、および、たとえば米国特許第4,704,692号に記載されるようないわゆる抗原結合タンパク質（単鎖抗体）があり、この特許の内容はここに引用により援用される。
【００５６】
したがって、抗体の可変領域をコードする分離されたポリヌクレオチドを本発明に従い導入することができ、これは処置を受けた対象が生体の原位置で抗体を生産することを可能にする。抗体をコードするポリヌクレオチドを得ることに関する代表的な方法に関しては、Ward et al. Nature, 341：544-546（1989）；Gillies et al., Biotechnol. 7：799-804（1989）；およびNakatani et al., loc, cit, 805-810（1989）を参照のこと。抗体の方は、たとえば病原体に伴う表面抗原に結合することにより治療的効果を奏すると考えられる。一方、コードされる抗体として、たとえば米国特許第4,699,880号に記載されるような抗イディオタイプ抗体（他の抗体と結合する抗体）が可能である。このような抗イディオタイプ抗体は、治療を受ける個体において内生的抗体または外来の抗体と結合することが可能で、それによりたとえば自己免疫疾患が原因の免疫反応に関連する病的状態を改善したりまたはこれを防止することができる。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチド配列は好ましくは治療のまたは免疫原性のポリペプチドをコードし、かつこれらの配列はこれらポリペプチドの発現を制御する調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列と共同して使用され得る。この調節タンパク質は、その転写を調節するようにゲノムのＤＮＡに結合することにより作用することができ、一方、メッセンジャーＲＮＡに結合してその安定性または翻訳効率を増加させたりまたは減少させたりすることができる。
【００５８】
インビボの細胞に配達されるポリヌクレオチド材料は様々な形式をとることが可能で、かつ本発明は何か特定のポリペプチドまたはポリペプチドの群をコードする何か特定のポリヌクレオチドに限定されるわけではない。遺伝子のフラグメントのみを含んでもよいし、複数のポリペプチド配列をコードしてもよいし、付加的に認識およびプロモータ配列を含んでもよい。多数の生理学的に活性のペプチドおよび抗原または免疫原をコードする遺伝子を含むプラスミドが文献で報告されており、当業者により容易に入手可能である。
【００５９】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、様々な脊椎動物系においての使用に適するプロモータがよく知られている。たとえば、マウスの系における使用に適当な強いプロモータには、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４０  ＩＥＰ、およびメタロチオネインプロモータが含まれる。これに対し、ヒトにおいてはＣＭＶ  ＩＥＰ等のプロモータが有利に使用され得る。すべての形態のＤＮＡで、それが複製性または非複製性であるにかかわらず、ゲノムに統合されずかつ発現可能であるものは本発明により考慮される方法の範囲内にある。
【００６０】
自動化された核酸合成装置が入手可能であるので、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方とも、ヌクレオチド配列が知られているとき直接的に、あるいはＰＣＲクローニングおよび醗酵の組合せにより合成され得る。そのうえ、所望のポリペプチドの配列が知られている場合には、ポリヌクレオチドのための適当なコード配列が推定され得る。
【００６１】
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、対応するＤＮＡからインビトロで容易に準備することが可能である。たとえば、従来技術では、ファージＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３またはＴ７を利用して、個々のリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを調製する。Ｔ７複製起点等の適切なファージプロモータを、転写されるべき遺伝子のすぐ上流のテンプレートＤＮＡに配置する。このような態様でＴ７を利用するシステムがよく知られており、かつ文献にも記載され、たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology, §3.8（VOL.1 1988）等に記載されている。
【００６２】
本発明において使用されるｍＲＮＡを入手するための特に好ましい方法が例２〜５に示されている。一般的に、しかしながら、当該技術の一般的な技術者により容易に製作され得るｐＸＧＢプラスミドまたは任意の類似のプラスミドを本発明を実施するうえでほぼ無制限な数のｃＤＮＡと共に使用できることは明らかなはずである。このようなプラスミドは、５′非翻訳領域、３′非翻訳領域およびポリＡトラクトのためのテンプレートが続く必要なＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを有利に含み得る。これら５′領域と３′領域の間に、任意の必要なｃＤＮＡをプラスミドに挿入することを容易にする特有の制限部位が存在すべきである。そこで、必要な遺伝子を含有するプラスミドをクローン化した後、ポリアデニル化領域において切断することによりプラスミドを線状化し、インビトロで転写してｍＲＮＡ転写物を形成する。これら転写物は好ましくは例５で示されるような５′キャップを設けられる。代替的には、５′キャップを必要としないＥＭＣ等の５′非翻訳配列が使用され得る。
【００６３】
上記がｍＲＮＡを準備するための好ましい方法を表わしている一方、多くの代替的方法がさらに存在することは当業者に明らかである。たとえば、ｍＲＮＡは市販のヌクレオチド合成装置により準備され得る。代替的には、環状形のｍＲＮＡが準備され得る。抗エキソヌクレアーゼＲＮＡたとえば環状ｍＲＮＡ，化学的にブロックされたｍＲＮＡおよび５′キャップを有するｍＲＮＡ等が好ましく、というのはそれらが生体内においてより長い半減期を有するからである。
【００６４】
特に、１つの好ましいｍＲＮＡには、興味の遺伝子に先行してポリオウイルスの５′非翻訳領域がある自己環状化ｍＲＮＡがある。この環状ｍＲＮＡが極度に長い半減期を有し（Harland & Misher, Development 102：837-852（1988））かつポリオウイルス５′非翻訳領域が通常の５′キャップなしでｍＲＮＡの翻訳を促進することができる（Pelletier & Sonnenberg, Nature 334：320-325（1988）ここに引用により援用する）ことが実証されている。
【００６５】
この材料は、自己スプライシング性でありかつ環状の「ラリアット」（投げ輪）ｍＲＮＡを生成させるＤＮＡテンプレートから、Been & Cech, Cell 47：206-216（1986）（ここに引用により援用する）の方法を利用して調製され得る。我々は、このテンプレートをMniatis, T. et al. MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, New York（1982）の方法に従い、興味の遺伝子のすぐ上流にポリオウイルスの５′非翻訳領域を含めることにより修飾した。
【００６６】
加えて、本発明はＲＮＡｓｅ（ＲＮアーゼまたはリボヌクレアーゼ）によるアクセスを防止する目的で５′および／または３′末端で化学的にブロックされたｍＲＮＡの使用を含む（この酵素（ＲＮＡｓｅ）はエキソヌクレアーゼであり、したがって鎖の真ん中でＲＮＡを分割することはない）。このような化学的ブロックによりインビボでのＲＮＡの半減期を実質的に延ばすことができる。ＲＮＡを修飾するために使用することができる２つの試薬がClonetech Lanoratories, Inc., Palo Alto, Californiaから入手可能であり、これらはC2 Amino Modifier（カタログ番号５２０４−１）と、Amino-7-dUTP（カタログ番号Ｋ１０２２−１）である。これらの材料はＲＮＡに反応性の基を付加する。これらの試薬のいずれかを興味のＲＮＡ分子に導入した後、適切な反応性の置換基を製造者の指示に従いＲＮＡに連結することができる。十分な大きさを有する基を付加することによりＲＮＡｓｅによる化学的に修飾されたＲＮＡへのアクセスが防止され得る。
【００６７】
一過性の遺伝子治療
過去に提案された遺伝子治療と異なり、本発明の１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチドの合成が一過性の性質のものである点である。（我々はこれを可逆的遺伝子治療またはＴＧＴと呼ぶ）。本発明に従いｍＲＮＡを導入すると、その効果は一般的には約１日持続することになる。また過去に提案された遺伝子治療と顕著に異なる点は、ｍＲＮＡはタンパク質の合成を誘導するために核に浸透する必要がなく、したがってｍＲＮＡは遺伝を担う性質を有している必要がないことである。
【００６８】
しかしながら、幾つかの状況においては、宿主の生体のゲノム内へ外因的ポリ核酸を組込むことなしに効果がより持続することが望まれる。このような効果を奏するために、本発明の好ましい具体例は、細胞内へ特異的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入するステップを設ける。我々が発見したところによると、本発明の方法に従えば、非複製性ＤＮＡ配列を細胞内に導入し、所望のポリペプチドを約６ヵ月までの期間にわたって生成させることが可能であり、さらに我々の観察では、当該ＤＮＡ配列が細胞のゲノムに統合されていることを示す証拠は見出されていない。一方、さらに長期にわたる効果が、内部にＤＮＡ配列を挿入されたベクタープラスミドによって細胞にＤＮＡ配列を導入することにより達成され得る。好ましくは、プラスミドはさらにレプリケーターを含む。このようなプラスミドは当業者には周知であり、たとえば、レプリケーターｐＭＢ１を有するプラスミドｐＢＲ３２２またはレプリケーターＣｏｌＥ１を有するプラスミドｐＭＫ１６がそれである（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York（1988）§II：1.5.2.）。
【００６９】
例１および１３に記載されるような筋肉細胞内へ導入されたＤＮＡおよびｍＲＮＡの発現過程の研究結果から、ＤＮＡ発現よりも持続時間は短いが、ｍＲＮＡの発現はより急速であることが示された。迅速でかつ長く持続する遺伝子の発現は、ＤＮＡと、たとえばファージポリメラーゼＴ７、Ｔ３およびＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼとを含むリポソームの調製物を細胞内に投与することにより達成され得る。リポソームはまた、実際の酵素自体を含むかまたはその酵素をコードするｍＲＮＡを含むことにより、適当なＲＮＡポリメラーゼの開始源を含む。リポソームが生体内に導入される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの開始源が細胞へ配達される。ＲＮＡポリメラーゼは導入されたＤＮＡ上のプロモータを認識して双方の遺伝子を転写し、結果としてより多くのＲＮＡポリメラーゼおよび所望のポリペプチドを含む翻訳生産物を生じさせる。これらの材料の生産は、導入されたＤＮＡ（通常プラスミドの形態である）が分解するまで継続する。この態様で、インビボでの所望のポリペプチドの生産が２〜３時間で達成され、１ヵ月またはそれ以上の期間にわたって継続され得る。
【００７０】
遺伝病の治療に限定されるわけではないが、本発明の方法はしたがって失われたまたは欠陥のある遺伝子の配達および機能的発現を要する治療法に適用することができる。
【００７１】
ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺および結合組織の組織を含む動物の身体組織の間質的空間に配達され得る。組織の間質的空間とは、生体組織の細網繊維の間、管もしくは室の壁の弾性繊維の間、線維組織のコラーゲン繊維の間の細胞間液状ムコ多糖マトリクス、あるいは筋肉細胞を収める結合組織内のまたは骨小腔の同様のマトリクスを含む。これは同様に、循環系のプラズマおよびリンパ管チャネルのリンパ液により占められる空間である。筋肉組織の間質的空間への配達は以下の理由により好まれる。ポリヌクレオチドは、筋肉細胞を含む組織への注射により都合よく配達することができる。分化した持続して非分裂の細胞にポリヌクレオチドを配達し、発現させることが好ましいが、配達および発現を、分化していないあるいは完全に分化していない細胞、たとえば血液の幹細胞または皮膚の繊維芽細胞において行ってもよい。我々の発見によれば、インビボの筋肉細胞は特にポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現する能力に優れている。この能力は、多核細胞、筋小胞体および横行管状系を含む、筋肉の特異的組織構造に起因するものかもしれない。ポリヌクレオチドは横行管状系を介し筋肉に入ることが可能で、この系は細胞外体液を含みかつ筋肉細胞の奥深く延びている。ポリヌクレオチドが損傷を受けた筋肉細胞に入りそれからその細胞が回復するということも可能である。
【００７２】
筋肉はまた、数多くの治療上の用途においてポリヌクレオチドの配達および発現のための場所として有利に使用することができる。というのも、動物は比較的大きな筋肉の塊を有しており、それは皮膚を介する直接的注射により都合よくアクセスされ、この理由から比較的多量のポリヌクレオチドを複数回の注射により筋肉に与えることが可能で、長期間にわたって治療を延長するために繰返し注射を行なうことが簡単にでき、特別の熟練または装置なしに安全に行うことができるからである。
【００７３】
一連の一般的戦略において、ポリヌクレオチドを注射しかつ発現させるための場所として筋肉組織を使用することが可能であるが、これは典型的な例であり、これに限定されるものではない。第１に、欠陥のあるまたは欠損のある遺伝子生産物に関連する筋肉の障害は、非分泌遺伝子生産物をコードするポリヌクレオチドを疾病のある筋肉組織内に導入することにより治療され得る。第２の戦略として、遺伝子生産物の欠如による他の生体または組織の障害およびその結果としての循環する毒性代謝物の蓄積は、筋肉組織に特定の治療用ポリペプチドを導入することにより治療することができ、そこにおいて、非分泌遺伝子生産物が発現され、循環する代謝物を浄化する。第３の戦略として、分泌可能な治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを筋肉組織に注射することができ、そこから、ポリペプチドは循環系に放出され、代謝の標的を探すようになる。この使用は例１８の、筋肉内へ注射された成長ホルモン遺伝子の発現において示される。ある種のＤＮＡセグメントは分泌を命令する「信号」としての役割を果たすことが知られており、（Wickner, W. T. and H. F. Lodish, Science 230：400-407（1985））、これらは有利に使用され得る。さらに、免疫化の戦略として、筋肉細胞に免疫原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを注射してもよく、これらのペプチドは、免疫原に対し選択された免疫反応を誘発するよう主要組織適合複合体の抗原のコンテキストにおいて筋肉細胞により提示されることになる。
【００７４】
筋肉以外で、注射されるポリヌクレオチドをより低い効率で取込みかつ発現させる他の組織は、それでもある種の条件下で治療用ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生産するために注射場所として有利に使用され得る。そのような条件の１つが、たとえばコレステロールホメオスタシスと関連する肝細胞の細胞表面受容体等の特異のタイプの細胞と共同して存在しなければ有効でないポリペプチドを与えるポリヌクレオチドの使用である（Brown and Goldstein, Science 232：34-47（1986））。この適用において、またたとえば酵素またはホルモンが遺伝子生産物であるような場合の多くの他の適用においては、価値ある治療結果をもたらすために、高いレベルの発現を達成する必要がない。
【００７５】
ＴＧＴの１つの応用は筋ジストロフィの治療におけるものである。筋ジストロフィの遺伝子的根拠はちょうど解かれ始めたところである。デュシェーヌ／ベッカー（Duchenne/Becker）筋ジストロフィに関連する遺伝子は近年クローン化され、ジストロフィン（dystrophin）と呼ばれる比較的大きなタンパク質をコードする。レトロウイルスのベクターはそれほど有用ではないようであり、なぜならそれらはジストロフィンのための比較的大きなサイズのｃＤＮＡ（約１３ｋｂ）を収容することができないからである。ごく最近の報告された研究は筋芽細胞を移植することに集中しているが、この方策の利用性は依然としてはっきりしないままである。明らかに、魅力的な方策はデュシェーヌを有する患者の筋肉の中においてジストロフィン遺伝子を直接発現させることであるだろう。ほとんどの患者が呼吸不全で死ぬので、呼吸に関与する筋肉が第１の目標になるであろう。
【００７６】
別の応用は嚢胞性線維病の治療においてである。嚢胞性線維病に対する遺伝子が最近同定された（Goodfellow, P. Nature, 341（6238）：102-3（Sept.14,1989）；Rommens, J. et al. Science, 245（4922）：1059-1065（September 8, 1989）；Beardsley, T. et al. Scientific American, 261（5）：28-30（1989））。徴候の著しい改善は、適当な肺細胞内の機能不全タンパク質の発現によって達成可能であるはずである。気管支の上皮細胞は適当な目標とする肺細胞であるはずである。また、それらは遺伝子の肺への点滴注入に続く遺伝子移植に利用しやすいであろう。嚢胞性線維病は常染色体の劣性障害であるので、肺の徴候を顕著に改善するには嚢胞性線維病遺伝子産物の通常のレベルのわずか５％程度を達成すればよいであろう。
【００７７】
中間代謝の生化学的遺伝子欠陥もまたＴＧＴによって治療され得る。これらの病気はフェニルケトン尿症、ガラクトース血症、カエデシロップ病、ホモシスチン尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、およびアデノシンデアミナーゼ欠乏症を含む。これらの障害のほとんどにおける病気の原因は、循環毒性代謝物のフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のモデルに適合する。すなわち、酵素遮断のために、体に対して毒性のある生化学物質が体液に蓄積される。これらの障害はいくつかの理由から遺伝子療法に理想的である。第一に、患者が顕著に改善するよう循環する毒性代謝物質を顕著に十分取除くためには、酵素活性の通常のレベルのわずか５％程度を達成すればよいと考えられるからである。第二に、移植される遺伝子は、様々な組織において最もよく発現され得るであろうし、さらに毒性の生化学物質を取除くことができるであろうからである。
【００７８】
可逆的遺伝子療法はまた、細胞室内または核内のタンパク質発現を必要とする治療法において使用され得る。幾つかのタンパク質は核ＤＮＡにおける特定のプロモータ領域に結合することによって転写を制御することができるということが知られている。他のタンパク質はＲＮＡに結合し、その分解、核からの輸送、または翻訳効率を制御する。このクラスのタンパク質は活性のために細胞内に配達されねばならない。組換転写または翻訳制御のタンパク質の細胞外の配達は、生物学的活性をもたらさないと考えられるが、ＴＧＴによるＤＮＡまたはＲＮＡの機能的配達は活性であるであろう。ＴＧＴから恩恵を被るであろうこの型の代表的なタンパク質はＮＥＦ、ＴＡＴ、ステロイド受容体およびレチノイド受容体を含む。
【００７９】
遺伝子療法は、ＡＩＤＳ患者のＨＩＶ感染に対する抵抗を増加するための対策において使用され得る。ＡＩＤＳ抵抗性遺伝子、たとえば、ＮＥＦ遺伝子または溶解性ＣＤ４遺伝子のような出芽を防ぐものをＡＩＤＳ患者のＴ細胞に導入することにより、その患者のＴ細胞はそれほど活性なＡＩＤＳウイルスを生産することができなくなるであろうし、こうして免疫系の細胞をうまく調節し、Ｔ細胞依存性の免疫応答を装備する能力を改善する。かくして、本発明に従い、ＡＩＤＳ患者自身のＴ細胞群が患者の血液から分離される。これら細胞は、次にインビトロでトランスフェクトされ、それから患者の血液に再導入される。ウイルス抵抗性細胞は通常の細胞に対して選択的な利点を有し、結局、患者のリンパ系を再増殖させる。マクロファージまたは他の標的細胞に対するＤＮＡの全身性のデリバリーは、体外の治療法に加えて使用され得る。この方法によりマクロファージ貯蔵器におけるウイルスを全滅させることは予想されないであろうが、それはＴ細胞のレベルを増加し、かつ患者の免疫応答を改善する。
【００８０】
ここに示された全身性の方法のすべてにおいて、効果的なＤＮＡまたはｍＲＮＡの用量は、通常、約０．０５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲で、通常約０．００５〜５ｍｇ／ｋｇであるだろう。しかしながら、理解されるであろうように、この用量はＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードされるペプチドおよび使用される特定のペプチドの活性に従って当業者には明白な態様で変化するであろう。アデノシンデアミナーゼのマウスまたはヒトへの配達について、たとえば、適当なレベルの翻訳物は、約０．５ないし５ｍｇ／ｋｇのＤＮＡまたはｍＲＮＡの用量で達成される。例１０を参照されたい。この情報から、活性の知られた他のペプチドに対する用量が容易に決定され得る。
【００８１】
重要なタンパク質の欠乏に起因する病気は、これらのタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを分化した細胞に導入することによって適当に治療されてもよい。神経成長因子および繊維芽細胞成長因子のような様々な成長因子がアルツハイマー病の動物モデルにおいて生存するニューロンの細胞に影響を及ぼすことが示されている。年をとったラットのモデルでは、ＮＧＦ注入がコリン作動系ニューロンの損失を後退させた。房脳弓外傷のラットにおいては、遺伝子的に修飾された線維芽細胞からのＮＧＦ注入または分泌もまたコリン作動系機能の損失を防いだ。コリン作動系活性はアルツハイマー病を有する患者において減少する。成長因子を発現する導入された遺伝子の脳内での発現は、特定のニューロン群の機能の損失を後退させることができる。
【００８２】
アルツハイマー病の治療における本発明に従い、ニューロン成長因子のための遺伝子の、頭蓋腔を覆う細胞へのトランスフェクションによるＤＮＡまたはｍＲＮＡの導入が使用され得る。特に、本発明は三次元挿入装置の使用を介する実質組織中への約１０μｇないし約１００μｇのＤＮＡまたはｍＲＮＡの頭蓋内注射によってこの病気を治療する。具体的に、注射は内側隔壁におけるコリン作動系ニューロンを目標とする。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ注射は、５′キャップされた３′ポリアデニル化ｍＲＮＡについて１日ないし３日置きに、環状ｍＲＮＡについて１週間ないし２１日置きに、ＤＮＡについて３０日ないし６０日置きに繰返される。本発明に従ってＤＮＡの注射もまた意図される。ＤＮＡは対応する量で注射されるが、しかし、注射の頻度は非常に減少されるであろう。エピソームのＤＮＡは、たとえば、数ヵ月にわたり活性であり得るだろうし、再注射は患者の顕著な症候の緩解に応じて必要となるにすぎないであろう。
【００８３】
さらに、神経伝達物質合成に寄与する酵素を、導入遺伝子から発現させることができる。たとえば、アセチルコリントランスフェラーゼに対する遺伝子を、特定領域の脳細胞（ニューロンまたはグリア）内で、アセチルコリンレベルを増やしかつ脳機能を改善するために発現させることができるであろう。
【００８４】
ドーパミン、ノルエピエフリン、およびＧＡＢＡのような他の神経伝達物質の合成に関わる重要な酵素はクローン化されておりかつ入手可能である。これらの重要な酵素は、脳の局在化領域の中へ遺伝子移植によって局所的に増加され得るであろう。これらおよびその他の神経伝達物質の生産が増加すれば、局在化された神経伝達物質機能の操作、そして、神経伝達物質機能の障害が重大な役割を果たす広い範囲の脳の病気に、広く有効であろう。具体的には、これらの病気は、精神分裂症および躁鬱病およびパーキンソン病を含むことができるであろう。パーキンソン病を有する患者は、脳幹神経節内におけるドーパミン合成物の欠如ゆえの次第に無能化する運動性制御に苦しむということはよく認められていることである。ドーパミン合成のための律速段階は、酵素、チロシンヒドロキシラーゼによるチロシンからＬ−ＤＯＰＡへの変換である。Ｌ−ＤＯＰＡは、それから汎存酵素、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼによってドーパミンに変換される。それゆえＬ−ＤＯＰＡでのよく確立された療法は効果的である（少なくとも最初の数年の治療のためには）。遺伝子療法は、チロシンヒドロキシラーゼおよび可能であればＤＯＰＡデカルボキシラーゼに対する遺伝子を発現させることによって同様の薬理学的効果をもたらすことができるであろう。チロシンはＣＮＳ内で容易に利用可能である。
【００８５】
アルファ−１−抗トリプシン欠乏症の遺伝子型は、肝臓および肺の両方の疾患をもたらし得る。肝臓疾患は、それほどよく起こらないが、異常タンパク質の蓄積によって引起こされ、遺伝子療法にそれほど馴染みやすくはないだろう。しかしながら、肺合併病には、肺内のアルファ−１−抗トリプシンの発現を増加させることを適用しやすいであろう。これは、無能化しかつ最終的には致命的な気腫ができるのを妨げるはずである。
【００８６】
アルファ−１−抗トリプシン欠乏症はまたタバコ喫煙者においても起こり、なぜならタバコ喫煙がアルファ−１−抗トリプシン活性を減少させ、そして気腫をもたらすようセリンプロテアーゼ活性を減少させるからである。さらに、ある最近のデータはタバコ喫煙の抗トリプシン効果を大動脈の動脈瘤に結びつけている。動脈瘤もまた、アルファ−１−抗トリプシンの血液レベルを上昇させることによって防ぐことができ、なぜならこれが動脈瘤を導くプロテアーゼ活性を減少させるであろうからである。
【００８７】
肺の変性疾患を有する患者もまた、疾患の肺組織において蓄積する傾向がある他の毒性代謝物を取除くことができる酵素の発現から利益を得ることができる。スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼはこれらの問題を改善するためにＴＧＴによって配達することができるであろう。
【００８８】
ＴＧＴは細胞表面受容体の配達を必要とする治療法において使用され得る。遺伝子の機能的な生体内配達のための原理体系を解読する必要がないということが議論され得るであろう。結局、タンパク質の合成および大規模生産のための確立された技術があり、タンパク質は遺伝子発現の最終産物である。この論理は多くのタンパク質分子に適用され、それらは細胞外で作用するか、あるいは細胞表面受容体と相互作用するものであり、たとえば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、成長ホルモン、インスリン、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）などである。しかしながら、機能的受容体に対し適当な配向でその標的細胞のプラズマ膜に挿入されるべき組換細胞表面受容体を適切に配達することに伴う薬剤配達の問題は、今まで手に負えないもののようであった。
【００８９】
細胞表面受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが本発明に従って細胞内に配達されるとき、生成するタンパク質は効果的にかつ機能的に標的細胞表面上に発現され得る。組換細胞表面受容体の機能的な配達の問題が依然として解決されないままであるならば、この療法の問題を解決する唯一の方法は遺伝子配達を介するものであろう。遺伝子発現の核または細胞質制御のための同様の論理が、ＲＮＡ転写を制御する（増加または減少）ためにＤＮＡに結合される核制御因子に適用され、さらに翻訳効率または分解を増加または減少させるためにＲＮＡに結合する細胞質制御因子に適用される。この態様でＴＧＴは嚢胞性線維病、筋ジストロフィおよび高コレステロール血症の治療のための療法を提供することができるであろう。
【００９０】
血液におけるコレステロールの上昇したレベルは、本発明に従いＬＤＬ表面受容体をコードするｍＲＮＡを肝細胞に供給することによって減少させることができる。ＬＤＬが上昇した患者の肝臓においてこの受容体の生産をわずかに上昇させることは著しい療法上の利益を有する。組換タンパク質の全身投与に基づく療法は本発明と比べものにならない。なぜなら、ただ単に組換タンパク質を投与することでは、標的細胞のプラズマ膜の中に受容体を入れることができないであろうからである。受容体はその生物学的効果を及ぼすために膜の中に適切に挿入されなければならない。受容体発現のレベルを調節することは通常必ずしも必要ではないが、より多くの発現があるとより良い。これは、本発明において使用するためのｍＲＮＡの調製に必要な分子生物学を単純化する。たとえば、ＬＤＬ受容体遺伝子を含む脂質／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体を調製し、反復的なＩ．Ｖ．注射によって患者に供給することができる。脂質複合体は肝臓により主として摂取されるであろう。複合体の幾つかは肝細胞によって摂取されるであろう。肝臓におけるＬＤＬ受容体のレベルは注射の回数が増えるにつれ次第に増加するであろう。より高い肝臓ＬＤＬ受容体レベルはＬＤＬおよびコレステロールの低下をもたらすであろう。効果的なｍＲＮＡの用量は、通常、約０．１ないし約５ｍｇ／ｋｇになるであろう。
【００９１】
ＴＧＴの他の有益な応用例には、ＨＩＶウイルスに感染した患者のマクロファージにチミジンキナーゼ遺伝子を導入することがある。チミジンキナーゼ遺伝子のマクロファージ貯蔵器への導入は、それらの細胞がＡＺＴをリン酸化することをより可能にするであろう。これは、それらのＡＺＴ療法に対する抵抗を克服し、ＡＺＴがマクロファージにおけるＨＩＶ保有体を全滅することができるようにする。チミジンキナーゼ遺伝子を含む脂質／ＤＮＡ複合体を調製し、静脈注射を繰り返すことにより患者に投与することができる。脂質複合体はマクロファージ貯蔵器によって主に摂取され、マクロファージにおけるチミジンキナーゼレベルの上昇をもたらすであろう。これは、ＡＺＴ抵抗性細胞をＡＺＴで治療しやすくする。チミジンキナーゼ療法はまた、ＨＴＬＶ  ＩＩＩプロモータの制御下にチミジンキナーゼ遺伝子をおくことによって集中させることができる。この戦略によれば、チミジンキナーゼは、ＨＩＶウイルスによる細胞の感染およびプロモータを活性化するｔａｔタンパク質の製造時にのみ合成されるはずである。類似の療法により、同じＨＴＬＶ  ＩＩＩプロモータの制御下でジフテリアトキシンに対する遺伝子を細胞に供給することができ、致命的な結果をＨＩＶ感染の後にのみ細胞内に起こすことができる。
【００９２】
これらのＡＩＤＳ患者は、ＴＧＴ法に従ってマクロファージにインターフェロン遺伝子を供給することによっても治療され得るであろう。マクロファージで局部的に集中してインターフェロン生産のレベルが増加すれば、マクロファージはＨＩＶ感染に対してより抵抗性になり得る。インターフェロンのレベルが局所的に高い間は、全身的なレベルは低いままであり、それにより組換インターフェロン投与後に観察されるような全身性の毒性効果を避けることができる。インターフェロン遺伝子を含む脂質／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体を、調製し、静脈注射を繰り返すことにより患者に投与することができる。脂質複合体はマクロファージ貯蔵器によって主に取込まれ、マクロファージにおいてインターフェロンの局部的に集中したレベルの上昇をもたらすであろう。これは、ＨＩＶ感染に対するマクロファージの感受性を低くする。
【００９３】
ＤＮＡテンプレート上のジフテリアトキシン遺伝子に癌細胞において当該遺伝子の発現を集中させるための組織特異的エンハンサを供給することにより、ＴＧＴを使用して様々な癌が治療され得る。ジフテリアトキシンの細胞内発現は細胞を殺す。これらのプロモータは、組織特異的なものとすることができ、たとえば膵臓癌に対し膵臓特異的プロモータを使用することができる。膵臓細胞に配達された機能的ジフテリアトキシン遺伝子は膵臓全体を全滅させ得るだろう。この戦略は膵臓癌患者のための治療として使用し得るであろう。患者は膵臓なしで生存するのに克服できないような困難を伴うことはないだろう。組織特異的エンハンサは、ジフテリアトキシンの発現が膵臓細胞のみにおいて起こることを確実にするであろう。組織特異的エンハンサの制御下でジフテリアトキシン遺伝子を含むＤＮＡ／脂質複合体を、膵臓に血液を送るカニューレ挿入された動脈の中に直接導入することができる。注入は膵臓組織を全滅させるのに必要な時間、所定の投与計画に基づき行なわれるであろう。リシンまたはコブラの毒液因子またはエンテロトキシンに対する遺伝子のようなジフテリアトキシン以外の他の致命的な遺伝子が同様の効果で用いられるであろう。
【００９４】
また、癌細胞のような周期の早い（早く分裂する）細胞だけを殺すであろう細胞周期特異的なプロモータを使用することによって癌を治療することもできるであろう。細胞周期特異的な抹殺はまた、サイクルを繰り返す細胞においてのみ安定しているキラータンパク質（たとえば、Ｓ期の間だけ安定なヒストンｍＲＮＡ）をコードするｍＲＮＡを設計することによって達成されるであろう。また、胎児の肝臓細胞において、かつより胎児の状態へ脱分化した胚芽腫細胞においてのみ発現されるアルファ−フェトプロテインの使用のような発生上特異的なプロモータを使用することもできるであろう。
【００９５】
ある種の癌の癌特性を抑制する網膜芽腫遺伝子（およびその仲間の他のもの）のような遺伝子の移植によって特殊化された癌もまた治療することができるであろう。
【００９６】
ＴＧＴ戦略はペプチドの制御され持続される配達を提供するために使用され得る。従来の薬剤および組換タンパク質薬剤は徐放デバイスから利益を得ることができる。徐放デバイスの目的はより長い期間にわたり薬剤を配達することであり、そのため必要とされる服用の回数が減少される。これは、患者の便利さおよびコンプライアンスにおいて改善をもたらす。徐放を達成することを意図された様々な種類の技術が現われている。
【００９７】
ＴＧＴは治療ペプチドの制御された配達を得るために使用され得る。制御された発現は細胞特異的プロモータを含む適当なプロモータを使用することによって得ることができる。本発明によって配達される適当なペプチドは、たとえば、成長ホルモン、インスリン、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯなどを含む。特定の用途に依存して、選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ構造物が、注射された細胞から、全身性循環に遺伝子生産物を分泌させるように設計することができる。
【００９８】
ＴＧＴはまた、治療ポリペプチドまたはペプチドの制御された配達を含み、それは、細胞において発現されるべきポリヌクレオチドと共に、転写および翻訳のプロセスを制御する調節タンパク質をコードする付加的なポリヌクレオチドを含ませることによって達成される。これらのポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現について促進制御または抑制制御のどちらかをするように作用し、核内においてかまたは細胞質内におけるタンパク質翻訳事象を制御することによってのどちらかでそれらの効果を及ぼすものを含む。
【００９９】
Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、ＴＧＴのより長い持続期間の効果を得るために関心のある遺伝子と共に使用することができる。エプスタインバールウイルスに対する複製起点領域から得られるようなエピソームのＤＮＡを使用することができ、同様に、哺乳類細胞において機能的に活性であり、好ましくはヒトの細胞において活性である、他の複製起点からのものも使用することができる。これは、レトロウイルスベクターに共通する好ましくない統合事象の危険を冒すことなく、多くの細胞分裂の後、細胞から発現を得る方法である。それ自身のプロモータ制御下にあるカルシトニン遺伝子を肝臓または皮膚のような所定の部位に機能的に導入することができれば、カルシトニンの放出を制御することができるであろう。高カルシウム血症を有する癌患者はこの療法が適用され得るグループであるだろう。
【０１００】
ＴＧＴを使用する他の遺伝子療法は、ポリペプチドに翻訳されることなく、治療効果を有するポリヌクレオチドの使用を含むことができる。たとえば、ＴＧＴは特定の遺伝子の発現を止めるためのアンチセンスポリヌクレオチドの配達において使用され得る。従来のアンチセンス方法論は有効性が乏しいという欠点を有し、それは部分的には、配達されるオリゴヌクレオチド配列が短すぎるからである。しかしながら、ＴＧＴでは十分な長さのアンチセンス配列が短いオリゴマーと同様に容易に配達され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、内因性のヌクレオチド配列へそれら自身がハイブリダイズする（それによってその転写または翻訳を妨げる）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。その代わりに、アンチセンスＤＮＡは内因性の配列にハイブリダイズするＲＮＡをコードして、翻訳を妨げてもよい。この特質におけるＴＧＴの他の使用は、その存在が病理状態を引起こす欠陥性のまたは不完全な内因性ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡを置き替えるためにｔＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを配達することを含む。
【０１０１】
細胞特異的プロモータはまた、標的細胞にのみ遺伝子の発現を許容するために使用され得る。たとえば、ある遺伝子は腫瘍の特定の型においてのみ成人において高度にプロモートされる。同様に、特殊化された組織、たとえば、目の水晶体組織のようなもののための組織特異的プロモータも同定されており、異種の発現系において使用されている。
【０１０２】
上述した療法以外に、本発明の方法は牛乳の生産を増加するため家畜動物に、または食肉のために育成されている動物の筋肉塊に、ポリヌクレオチドを配達するために使用され得る。
【０１０３】
ＤＮＡおよびｍＲＮＡワクチン
本発明の方法に従って、発現可能なＤＮＡおよびｍＲＮＡはそこでポリヌクレオチド翻訳産物を形成するために細胞に配達され得る。もし核酸が適切な制御配列を含むのであれば、それらはコードされたタンパク質の比較的多量の合成を誘導する。細胞に配達されるＤＮＡおよびｍＲＮＡが免疫ペプチドをコードするとき、本発明の方法は、細胞内ウイルスを含む感染因子あるいは腫瘍細胞に対し、改善されたより効果的な免疫を達成するために適用することができる。
【０１０４】
すべての脊椎動物の免疫系は同様に作用するので、上述した用途は哺乳類および鳥類および魚類を含むすべての脊椎動物系において実現され得る。
【０１０５】
本発明の方法は、インビボで動物の細胞にポリヌクレオチドを直接注射することにより、あるいは、ある動物の細胞にインビトロでトランスフェクションした後当該細胞をその動物の体内に再導入することにより、適用され得る。ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、または血球を含む動物の体の様々な細胞に配達され得る。ポリヌクレオチドのインビボでの直接的配達は、筋肉または皮膚の細胞に対するものが好ましい。ポリヌクレオチドは注射器を使用して筋肉または皮膚に注射されてもよい。それらはまたワクチンガンを使用して筋肉または皮膚に配達されてもよい。
【０１０６】
ある応用において、特にインビトロでのトランスフェクションでカチオン性脂質が細胞のトランスフェクションを容易にするために使用できることが最近示されてきた。カチオン性脂質に基づくトランスフェクション技術は、他の方法より好ましく、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはエレクトロポレーション（電気穿孔）法より効率的でかつ便利であり、また、前述のように、レトロウイルス仲介のトランスフェクションは、癌遺伝子の活性化または他の好ましくない結果を生じさせる宿主細胞ゲノムへの統合事象をもたらし得る。カチオン性脂質の技術がメッセンジャーＲＮＡで効果的であるということは、本方法に対するさらなる利点であり、なぜならＲＮＡは細胞内ヌクレアーゼにより迅速に代謝され、ホストゲノムに統合されないからである。高レベルの可逆性発現をもたらすトランスフェクション系は、安定して形質転換されたクローンの選択および増殖を必要とする他の方法より好ましい。なぜなら望ましい最初の標的細胞の多くは培養において迅速に分裂しないからである。
【０１０７】
カチオン性リポソームを用いて高い効率で細胞をトランスフェクトする能力は免疫化のための他の方法を提供する。抗原のための遺伝子は動物から取出された細胞に導入される。ここで抗原を発現するトランスフェクトされた細胞は、動物に再注入され、免疫系は、（ここで）内因性の抗原に応答し得る。このプロセスは、リンパ細胞をさらに刺激するためのアジュバントまたはリンフォカインのどちらかを一緒に注射することにより促進することができるであろう。
【０１０８】
抗原のための遺伝子を含む核酸を用いたワクチン処置もまた、細胞の免疫応答を特に目標とする方法となり得る。分泌されるタンパク質を発現する細胞は、通常の抗原処理経路に入り、体液性と細胞毒性の応答の両方を生ずるであろう。分泌されないタンパク質に対する応答はより選択的である。クラスＩ  ＭＨＣ分子だけを発現する細胞において合成された分泌されないタンパク質は、細胞毒性のワクチンのみを生産することが予期される。クラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方を有する細胞において同じ抗原が発現されると、細胞障害性およびヘルパーＴ細胞の両方を刺激することにより、より強力な応答が生じ得る。免疫応答の強化はまた、抗原のための遺伝子を抗原のペプチドフラグメントと共に注入することによって可能となり得る。抗原は、細胞の免疫系にクラスＩ  ＭＨＣ分子を介して提示され、一方ペプチドはヘルパーＴ細胞を刺激するためにクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を介して提示される。いずれの場合でも、この方法は以前可能でなかった方法で免疫応答を刺激し調節する方法を提供する。
【０１０９】
サブユニットワクチンの主たる不利な点は、糖タンパク抗原は抗原を作るために使用される組換発現系において正確に修飾されることがほとんどないということである。糖タンパク質抗原のための遺伝子を導入すれば、病原体タンパク質と同様に、タンパク質生産物が同じ種および細胞において合成され、修飾されかつ処理されることが保証されるであろう。こうして、ヒトウイルス糖タンパク質のための遺伝子の発現は、糖残基の正しい補足を含むであろう。これは重要であり、なぜなら幾つかのウイルス系における中和抗体の本質的な成分が炭水化物エピトープに向けられるということが示されているからである。
【０１１０】
免疫応答のための候補である任意の適当な抗原は、体液性のものであろうと細胞性のものであろうと、核酸形において使用され得る。細胞源は、個体から取られた繊維芽細胞とすることができ、これは、クラスＩ  ＭＨＣ分子のみを発現する便利な細胞源を提供する。その代わりに、末梢血細胞を迅速に全血から分離して、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質の両方を含む細胞源を提供することができる。それらはさらに、もし必要であれば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞またはマクロファージ／単球細胞に分別することができる。骨髄細胞はそれほど分化されていないリンパ細胞の源を提供し得る。すべての場合において、細胞は、抗原のための遺伝子を含むＤＮＡでか、またはその遺伝子から転写された適当にキャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、化学的に修飾されたＲＮＡ、または５′キャッピングを必要としないＲＮＡのいずれかでトランスフェクトされるであろう。トランスフェクトするヌクレオチドの選択は、必要な発現の持続期間に依存し得る。ワクチン接種の目的のためには、ｍＲＮＡトランスフェクションにおいて起こるように、免疫原性ペプチドの可逆的発現が好ましい。トランスフェクトされた細胞は動物に注射され、発現されたタンパク質は処理され、通常の細胞の経路により免疫系に与えられる。
【０１１１】
このような方策はマウスのモデル系において細胞毒性免疫を生ずるために使用されてきた。細胞株、悪性の持続的に成長する細胞はＤＮＡで安定して形質転換され得る。細胞が動物に注射されたとき、それらは発現された抗原に対する細胞性免疫を誘導する。カチオン性脂質配達系は、患者から取られた通常の悪性でない細胞にまでこの方策を拡張することを可能にするであろう。
【０１１２】
細胞性免疫を目標とするこの方策に対する幾つかの応用がある。第１のものは、必要とされる抗体が知られているウイルスに対するワクチン接種、または促進されるウイルス感染に対するワクチン接種である。ここで適用し得る２つの対策がある。免疫化の間、細胞性経路を特に目標とすることができ、こうして促進抗体を排除する。一方、感染性を促進する体液性エピトームを排除する切り詰められた抗原の遺伝子でワクチン接種することができる。
【０１１３】
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのワクチン療法を使用すれば、抗原性の弱い腫瘍に対する効果的な細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発する手段を同様に提供することができるであろう。我々は、たとえば、もし細胞の内側で既に処理された型でｍＲＮＡによって腫瘍特異的抗原が発現され、細胞表面上のクラスＩ分子に直接組込まれるならば、細胞障害性Ｔ細胞応答が引出されるであろうことを提案する。
【０１１４】
第２の応用は、この方策が潜伏ウイルス感染を治療するための方法を提供するということである。幾つかのウイルス（たとえば、Ｂ型肝炎、ＨＩＶおよびヘルペスＢウイルス群）は、ウイルスが細胞内で非活性または部分的に活性な型で維持される潜伏感染を確立し得る。このような感染を治療する方法はほとんどない。しかしながら、潜伏ウイルスタンパク質に対抗する細胞溶解の免疫を誘導することによって、潜伏感染した細胞は標的とされ、排除されるであろう。
【０１１５】
この方策の関連のある応用は、慢性の病原体感染の治療に対してである。ゆっくり複製され、かつ細胞から細胞へ直接広がる病原体の多数の例がある。これらの感染は慢性であり、幾つかの場合は数年または数十年続く。これらの例は緩慢なウイルス（たとえばビスナ）、スクレーピー因子およびＨＩＶである。病原体のタンパク質に対する細胞性応答を誘導することによって感染した細胞を排除することができる。
【０１１６】
また、この方策は悪性疾患の治療に対しても適用可能であり得る。悪性状態に対して特異的であるタンパク質に対する細胞性免疫応答を開始するワクチン接種は、もし活性化された癌遺伝子、胎児性抗原、または活性化マーカーであれば、これらの細胞の排除を結果としてもたらすであろう。
【０１１７】
ＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチンの使用は、かくして、通常乏しい免疫応答しか引出さないあるウイルスタンパク質および癌特異的抗原の免疫原性を大いに強化する。ｍＲＮＡワクチン法は、ヘルペスウイルス、非Ａ型、非Ｂ型肝炎、およびＨＩＶからの不十分な免疫原性のウイルスタンパク質に対抗する細胞障害性Ｔ細胞免疫の誘起に適用可能であるはずで、また、それはこれらのウイルスのインビトロ増殖に伴う危険および困難をとり除くであろう。ウイルス被覆タンパク質のような細胞表面抗原（たとえば、ＨＩＶｇｐ１２０）に関し、抗原は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のコンテクストにおいて標的細胞の表面に発現され、それはより適当な強力でかつ現実的な免疫応答をもたらすことが予期されるであろう。弱毒化ウイルスワクチンでしばしば観察されるより有効な免疫応答をもたらすのはこの因子である。ＴＧＴによる単一抗原遺伝子の配達は、不適当な弱毒化ゆえに低頻度の疾患をもたらし得る弱毒化ウイルスより遥かに安全である。
【０１１８】
ワクチン開発段階の間に活用され得るＴＧＴのさらに他の利点がある。ワクチン開発に伴う困難の１つは、最適な免疫応答のため、抗原の異なった構造的変形物をスクリーニングする必要があるということである。もし変形物が組換源から誘導されれば、抗原性について試験され得る前に、通常タンパク質を発現させ、純化しなければならない。これは骨の折れ、かつ時間のかかるプロセスである。インビトロ突然変異誘発では、所定の抗原の多数のクローンを得、かつ配列決定することが可能である。もしこれらの抗原がＴＧＴによるＤＮＡまたはＲＮＡレベルで抗原性に対してスクリーニングされ得るならば、ワクチン開発プログラムはより早く進行され得るであろう。
【０１１９】
また、ＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチンの場合、タンパク質抗原は、決して直接血清抗体に晒されないが、ｍＲＮＡの翻訳に続き、トランスフェクトされた細胞自身によって常に生産される。これゆえ、アナフィラキシーは問題とならないはずである。こうして、本発明は患者がアレルギー反応の恐れなく、繰返し免疫化されることを可能にする。本発明のＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチンの使用はこのような免疫化を可能にする。
【０１２０】
抗原の免疫原性をさらに強化するようにこの技術を修飾し得る態様は、容易に想像し得る。Ｔ細胞免疫化は、マクロファージまたは他の細胞表面上のクラスＩおよびクラスＩＩ組織適合抗原の密度を増加することによって、および／または、リンパ球増殖をプロモートするサイトカインを放出するトランスフェクトされた細胞を誘発することによって増大され得る。この目的のために、抗原のためのｍＲＮＡを含む同じリポソームにインターフェロンまたはインターロイキン−１をコードする他のｍＲＮＡ種を組込んでもよい。これらのサイトカインはマクロファージ活性化を強化することが知られている。それらの全身的な使用は副作用ゆえに阻止されてきた。しかしながら、ｍＲＮＡに、抗原に対するｍＲＮＡと共に包含されるときには、それらは抗原を協同で発現する細胞によってのみ発現されるはずである。この状況下で、Ｔ細胞免疫性の誘導は大いに強化され得る。
【０１２１】
治療処方物
ポリヌクレオチド塩：ここに記述された製薬的に許容されるポリヌクレオチドの塩の投与は、本発明の範囲内に含まれる。このような塩は有機塩基および無機塩基を含む製薬的に許容される非毒性塩基から調製されてもよい。塩はナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む無機塩基から誘導される。塩は、１級、２級および３級アミンの塩、塩基性アミノ酸等を含む製薬的に許容される非毒性の有機塩基から誘導される。医薬としての塩についての役に立つ議論として、その開示がここに引用され援用される、Ｓ．Ｍ．バージ（Berge）他のJournal of Pharmaceutical Sciences 66：1-19，1977年を参照されたい。
【０１２２】
好ましい配達の方法である注射のためのポリヌクレオチドは、単位用量形態のアンプルで、あるいは複用量の容器で準備することができる。ポリヌクレオチドは、油性のまたは好ましくは水性の賦形剤において、懸濁液、溶液、または乳剤のような形で存在してもよい。その代わりとして、ポリヌクレオチド塩は、投与のときに無菌の、パイロジェンを含まない水のような適当な賦形剤で再形成するために凍結乾燥された形であってもよい。液体および再形成されるべき凍結乾燥された形の両方とも、注射される溶液のｐＨを適当に調整するのに必要な量の、作用物質、好ましくは緩衝剤を含むであろう。任意の非経口の用途のため、特にもし処方物が静脈に投与されるべきであれば、溶質の総濃度は製剤が等張、低張、または弱く高張であるように制御されるべきである。糖のような非イオン材料は、張度を調整するために好ましく、かつスクロースは特に好ましい。これらの形のいずれも、でんぷんまたは糖、グリセロールまたは塩化ナトリウム水溶液のような適当な処方の作用物質をさらに含んでもよい。１単位用量の組成物は、液体であろうと固体であろうと、０．１％から９９％のポリヌクレオチド材料を含んでもよい。
【０１２３】
使用の前にポリヌクレオチドが包装される単位用量アンプルまたは複用量容器には、医薬として有効な用量または有効な用量の倍数について適当な量のポリヌクレオチドまたは溶液を封入した密封容器がある。ポリヌクレオチドは無菌の処方物として包装され、密封容器は使用まで処方物の無菌性を保つよう設計される。
【０１２４】
ポリヌクレオチドが包装されている容器にはラベルが貼られ、そのラベルは政府機関、たとえば食品医薬品局（the Food and Drug Administration）によって規定された形式において注意書を有し、その注意書は、ヒトへの投与のためのその中のポリヌクレオチド材料の製造、使用、または販売の連邦法（Federal law）の下でのその機関による承認を反映するものである。
【０１２５】
連邦法は、ヒトの治療における薬事的な作用物質の使用は連邦政府の機関によって承認されることを要求する。施行に対する責任は食品医薬品局の責任であり、それは２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．３０１−３９２において詳細に示されているこのような承認を確実にするための適当な規制を公布する。動物の組織から作られる製品を含む生物学的材料に対する規制は４２Ｕ．Ｓ．Ｃ．２６２の下で規定される。同様の承認が大抵の外国によっても要求される。規制は国によって違うが、個々の手続は当業者によく知られている。
【０１２６】
用量および投与の方法
投与されるべき用量は、治療されている被験者の状態および大きさならびに治療の頻度および投与の方法に大きく依存する。用量および頻度を含む療法を継続するための養生法は、最初の応答および臨床判断によって導かれてもよい。組織の間質空間の中への注射する非経口法が好ましいが、しかしエアロゾル処方物の吸入のような他の非経口法が、たとえば、鼻、喉、気管支組織または肺の粘膜へのような特定の投与において必要とされるかもしれない。
【０１２７】
好ましいプロトコルでは、水性担体中に裸のポリヌクレオチドを含む処方物は、部位毎に１０μｌから約１ｍｌの量で組織に注射される。処方物におけるポリヌクレオチドの濃度は約０．１μｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌである。
【０１２８】
ＴＧＴの調節
ＤＮＡに基づく遺伝子移植プロトコルが、転写のための適当なシグナル（プロモータ、エンハンサ）およびｍＲＮＡ転写を処理するための適当なシグナル（スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル）を必要とするように、ｍＲＮＡに基づくＴＧＴも、トランスフェクされたｍＲＮＡの安定性を強化するであろう要素と共に、効率的でかつ正確な翻訳のために適当な構造および配列要素を必要とする。
【０１２９】
一般的に、翻訳効率は、ＲＮＡの５′非コード領域または非翻訳領域（５′ＵＴＲ）における特定の配列要素によって制御されることが発見されている。正の配列モチーフは翻訳開始共通配列（ＧＣＣ）AＣＣＡＴＧＧ（Kozak, Nucleic Acids Res.15 : 8125（1987））および５G７メチルＧｐｐｐＧキャップ構造（Drummond et al. Nucleic Acids Res.13 : 7375（1985））を含む。負の要素は分子５′ＵＴＲステムループ（stem-loop）構造（Muesing et al. Cell 48 : 691（1987））およびＡＵＧ配列または５′ＵＴＲにおける適当なＡＵＧによって先行される短いオープンリーディングクレーム（Kozak,上記，Rao et al. Mol and Cell. Biol. 8 : 284（1988））を含む。さらに、ベータグロブリン５′ＵＴＲのような所定の配列モチーフは、（異種５′ＵＴＲに隣接して置かれるとき）知られていない機構によって翻訳を強化するように作用し得る。環境シグナルに応答して真核生物の翻訳効率を制御する特定の５′ＵＴＲ配列の例もまたある。これらは、ヒトフェリチン５′ＵＴＲ（Hentze et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 6730（1987））およびショウジョウバエｈｓｐ7０５′ＵＴＲ（Klemenz et al., EMBO Journal 4 : 2053（1985））を含む。さらに、通常のキャップ依存性翻訳および翻訳制御を迂回し、ウイルスまたはキメラのｍＲＮＡの能率的な翻訳を仲介することができるウイルス５′ＵＴＲ配列がある（Dolph et al., J. of Virol.62 : 2059（1988））、Pelletier and Sonnenberg, Nature 334, 320（1988））。したがって、ｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルは、関心のあるタンパク質に対するコード配列に隣接する適当な５′ＵＴＲ翻訳要素を含む。
【０１３０】
翻訳関係に加えて、ｍＲＮＡ安定性が、ｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルの開発の間、考慮されねばならない。一般的な意見として、キャッピングおよび３′ポリアデニル化は真核性ｍＲＮＡ安定性の主たる正の決定因子であり（Drummond, 上記，Ross, Mol. Biol. Med. 5,1（1988））、ｍＲＮＡの５′および３′末端を分解から保護するよう機能する。一方、真核生物のｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす調節要素もまた明らかにされてきており、したがってｍＲＮＡ  ＴＧＴプロトコルの開発において考慮されねばならない。これらのうち最も注目に値しかつ明らかにされているものは、多くの短い半減期のｍＲＮＡにおいて発見されたウリジンの多い３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）デスタビライザー（destabilizer）配列である（Shaw and Kamen Cell 46 : 659（1986））。しかしながら、それらがｍＲＮＡ脱安定化をもたらす唯一の配列モチーフでないという証拠がある（Kabnick and Housman, Mol. and Cell. Biol. 8 : 3244（1988））。さらに、環境刺激に応答して細胞性ｍＲＮＡの半減期を調節する特異的調節配列もまた明らかにされている。これらは、ビテロゲニンｍＲＮＡ安定性のエストロゲンにより仲介される調節（Brock And Shapiro. Cell 34 : 207（1983））、特異的３′ＵＴＲモチーフに起因するトランスフェリン受容体ｍＲＮＡの安定性の鉄依存性調節（Mullner and Kuhn, Cell 53 : 815（1988））、カゼインｍＲＮＡの安定性のプロラクチンにより仲介される制御（Guyette et al., Cell 17 : 1013（1989））、多数の刺激に対応するフィブロネクチンｍＲＮＡの安定性の調節（Dean et al., J. Cell. Biol. 106 : 2159（1988））、およびヒストンｍＲＮＡ安定性の制御（Graves et al., Cell 48 : 615（1987））を含む。さらに、正常な真核生物のｍＲＮＡ翻訳制御を迂回するウイルスＲＮＡ配列が案出されたように、同様に、あるウイルスＲＮＡ配列は３′ポリアデニル化なしに安定性を与えることができるようである（McGrae and Woodland, Eur. J. of Biochem. 116 : 467（1981））。例２１に従いＥＭＣのような幾つかの５′はキャップなしで機能することが知られている。安定性調節要素のこの例外もまたｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルを開発する際に注意深く考慮されねばならず、ｍＲＮＡ治療の効果を調節するのに使用され得る。
【０１３１】
リポソーム形成材料
リポソームを形成する科学は今ではよく開発されている。リポソームは単一層または多重層の小胞であり、親油性の材料で形成された膜部分および内部の水性部分を有する。水性部分は本発明において標的細胞に配達されるべきポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。
【０１３２】
ここで使用されるリポソーム形成材料は四級アンモニウム基のようなカチオン性基、および約６ないし約３０の炭素原子を有する飽和または不飽和のアルキル基のような１つまたはそれ以上の親油性基を有することが好ましい。適当な材料の１つの群はヨーロッパ特許公開番号第0187702号において記述される。これらの材料は次の式を有する。
【０１３３】
【化３】
0003683798.tif 000002
【０１３４】
式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なり、６〜２２の炭素原子のアルキルまたはアルケニルであり、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、水素、１〜８炭素のアルキル、アリール、７〜１１炭素のアラルキルであり、あるいはＲ3、Ｒ4およびＲ5の２つまたは３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリノを形成し、ｎは１〜８であり、かつＸは製薬的に許容されるハロゲンのような陰イオンである。これらの化合物は上で示された特許出願において詳しく書かれているように準備されてもよいし、その代わりにとして少なくともそれらの化合物のうちの１つ、Ｎ−（２，３−ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−ｐｒｏｐ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）が、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）（ＢＲＬ），ゲティスバーグ（Gaithersburg），メリーランド州（Maryland）20877，アメリカ合衆国（ＵＳＡ）より市販されている。
【０１３５】
これらの４級アンモニウムジエーテル化合物は、しかしながら、幾つかの欠点を有する。エーテル結合ゆえに、それらは生体内で容易に代謝されない。長期間の治療が意図されているとき、これらの材料が組織に蓄積し、究極的には脂質蓄積疾患および毒性副作用の結果をもたらす可能性がある。したがって、本発明における使用のための組成物の好ましいクラスは次の式を有するものである。
【０１３６】
【化４】
0003683798.tif 000003
【０１３７】
式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なり、５〜２１の炭素原子のアルキルまたはアルケニルであり、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は同じかまたは異なり、水素、１〜８炭素のアルキル、アリール、７〜１１炭素のアラルキルであり、あるいはＲ3、Ｒ4、およびＲ5の２つまたは３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはモルホリノを形成し、ｎは１〜８であり、かつＸはハロゲンのような製薬的に許容される陰イオンである。これらの化合物はカルボン酸およびアルキルハロゲン化物を含む求核置換のような従来の技術を使用して、エステル交換、または酸もしくは酸ハロゲン化物を用いるアルコールの縮合により調製されてもよい。
【０１３８】
さらに、多くの適当なリポソーム形成カチオン性脂質化合物が文献に記述されている。たとえば、L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27 : 3917-3925（1988）; H. Eibl. et al., Biophysical Chemistry 10 : 261-271（1979）を参照されたい。
【０１３９】
リポソームの調製
本発明において使用するための適当なリポソームは商業的に入手可能である。たとえば、ＤＯＴＭＡリポソームはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ゲティスバーグ、メリーランド州からリポフェクチン（Lipofectin）の商標で入手可能である。
【０１４０】
その代わりとして、容易に入手可能な、または前述の形のあらたに合成された開始材料からリポソームを調製することができる。ＤＯＴＡＰリポソームの調製は例６に詳細に記述されている。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献において説明され、たとえば、P. Felgner, et al., Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 84 : 7413-7417を参照されたい。同様の方法が他のカチオン性脂質材料からリポソームを調製するのに使用され得る。さらに、従来のリポソーム形成材料が負の電荷または中性の電荷を有するリポソームを調製するのに使用され得る。このような材料はホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン等を含む。これらの材料もまた有利に、０％〜約７５％の割合でＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡ開始材料と混合され得る。
【０１４１】
従来の方法が他の非カチオン性リポソームを調製するのに使用され得る。これらのリポソームはカチオン性リポソームと同様に容易に細胞壁と融合するものではない。しかしながら、それは生体内でマクロファージによって摂取され、したがってポリヌクレオチドのこれらの細胞への配達のため特に効果的である。たとえば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＧＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）がコレステロールの添加と共にまたは添加なしで、従来のリポソームを作るのに様々な組合せで使用され得る。こうして、たとえば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞が音波処理バイアルの中への窒素ガスの流れの下でＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各々５０ｍｇを乾燥することによって準備され得る。サンプルは真空ポンプ下に一晩置かれ、かつ脱イオン水で次の日、水和される。サンプルはそれからキャップされたバイアルで、水浴（bath）が１５℃で循環される間最大に設定される倒置されたカップ（バス型）プローブを備えたヒートシステムモデル３５０ソニケータを使用し、２時間音波処理される。一方、負に荷電した小胞が、多重層小胞を生産するために音波処理なしで、または別々のサイズの単一層小胞を生産するためにヌクレオポア（nucleopore）膜を介する射出によって、調製され得る。他の方法が当業者に知られ、かつ利用可能である。
【０１４２】
本発明は以下に与えられた２３の例を使用して詳細に説明されるが、しかしながら、記述される方法は、ここで記述されるように広く適用可能であり、かつそれらの例によって制限されるように意図されていない。
【０１４３】
例１：リポソームを形成するＤＯＴＡＰの調製
カチオン性リポソーム形成材料１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）がL. Stamatatos, et al.（上記）またはH. Eibl, et al.（上記）によって報告されているように調製される。
【０１４４】
端的には、Stamatatos, et al.は１ｍｍｏｌの３−ブロモ−１，２−プロパンジオール（アルドリッチ（Aldrich））が、５ｍｍｏｌの乾燥ピリジンを含む乾燥した、アルコールを含まないジエチルエーテル（２０ｍｌ）において３ｍｍｏｌのオレイルクロリド（オレイン酸およびオキサロイルクロリドから新たに調製された）で２０℃で４８時間アシル化されたということを報告している。ピリジニウムヒドロクロリドの沈殿物がフィルタ除去され、かつ濾液は窒素下で濃縮され、かつ１０ｍｌヘキサンにおいて再溶解される。ヘキサン溶液は、ｐＨ３．０の等しい量の１：１メタノール／０．１Ｎ水性ＮＣＯＯＮａで３回、１：１メタノール／０．１Ｎ水性ＮａＯＨで３回、および１％の水性ＮａＣｌで１回洗われた。粗３−ブロモ−１，２−ビス−（オレオイルオキシ）プロパンは、それから２５℃で乾燥したジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）における１５％のトリメチルアミンの溶液で封じられた管において７２時間攪拌された。この反応の生成物はクロロホルム（２００ｍｌ）で溶解され、それは１：１メタノール／１００ｍＭ水性ＨＣＯＯＮａ、ｐＨ３．０で繰返し洗われ、それから真空で淡黄色のオイルを生ずるように蒸発させられた。この材料は、シリシック酸（Bio-Sil A, Bio-Rad Laboratories）のカラム上で精製され、クロロホルム中０〜１５％グラジエントのメタノールで溶出され、９〜１０％メタノールにおいて純粋な型で所望の産物をもたらす。精製された産物は無色で、５０：１５：５：５：２のＣＨＣｌ3／アセトン／ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ3ＣＯＯＨ／Ｈ2Ｏで展開された薄層クロマトグラフィープレート（シリカゲルＧ）上の０．４のＲfで移動する粘性油であった。
【０１４５】
例２：関心のある任意の遺伝子のためのＤＮＡテンプレートを作るためのプラスミドの調製
所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生産のための適当なテンプレートＤＮＡは標準の組換ＤＮＡ方法論に従って調製することができる。以前に報告されているように（P. Kreig, et al., Nucleic Acids Res. 12 : 7057-7070（1984））、５′キャップはｍＲＮＡの翻訳を容易にする。さらに、３′フランキング領域およびポリＡ尾部はインビボでのｍＲＮＡの半減期を増加すると考えられている。
【０１４６】
ベクターｐＳＰ６４Ｔをクローン化する容易に入手可能なＳＰ６は、β−グロビンからの５′および３′フランキング領域、効率的に翻訳されるｍＲＮＡを与える。このプラスミドの構成はKreig, et al.（上記）によって詳細にされ、かつここに引用により援用される。開始コドンを含む任意のｃＤＮＡがこのプラスミドに導入され得、そして、得られるテンプレートＤＮＡからｍＲＮＡが調製され得る。この特定のプラスミドは、関心のあるポリペプチドをコードする任意の必要なｃＤＮＡを挿入するためにＢｇｌＩＩで切断され得る。
【０１４７】
線状化し、それからインビボでＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写するとき、良い結果をｐＳＰ６４Ｔで得ることができるが、我々はファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼと共にｐＳＰ６４Ｔのアフリカツメガエルβ−グロビンフランキング配列を使用することを好む。これらのフランキング配列は小さな（約１５０ｂｐ）Hind III-Eco RI フラグメントとしてｐＳＰ６４Ｔから精製される。これらの配列は、それから、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりｐＩＢＩ３１（インターナショナル・バイオテクロノジーズ・インコーポレイティッド（International Biotechnologies, Inc.）ニューヘブン（Newhaven）コネチカット州（Connecticut）06535）から入手可能）からの精製された線状のHind III-Eco RI フラグメント（約２．９Ｋｂｐ）の中へ挿入される。得られたプラスミド、ｐＸＢＧと命名は、配向についてスクリーニングされ、かつE. coliにトランスフォームされる。これらのプラスミドは、２つのアフリカツメガエルβ−グロビン配列の間に位置するユニークなBgl II 制限部位において関心のある任意の遺伝子を受けいれるように適合する。
【０１４８】
例３：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするプラスミドの調製
外因性ポリヌクレオチドのインビボ発現を明らかにする便利なマーカー遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡＴである。アフリカツメガエルβ−グロビン５′および３′配列によって隣接されるＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドｐＳＰ−ＣＡＴは、ＣＡＴ遺伝子をｐＳＰ６４ＴのＢｇＩＩＩ部位に加えることによって調製された。我々はｐＳＶ２−ＣＡＴ（Accession No.37155 the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,から入手可能）からの小さいＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態でＣＡＴ遺伝子を使用した。しかしながら、ＣＡＴ遺伝子は一般的に分子生物学において使用されるものであり、数多くのソースから入手可能である。ＣＡＴ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびＢｇＩＩＩ−開裂ｐＳＰ６４Ｔの双方は、平滑末端を形成するためにクレノウ（Klenow）フラグメントとともにインキュベートされ、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで結合されｐＳＰ−ＣＡＴを形成した。
【０１４９】
小さいＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがそれから生成され精製された。このフラグメントはｐＳＰ６４Ｔの５′および３′β−グロビンフランキング配列の間にＣＡＴ遺伝子を含む。ｐＩＢＩ３１（International Biotechnologies, Inc.）はＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとで開裂され、長い線状の配列が精製された。このフラグメントはそれからＣＡＴ−遺伝子含有配列と合わされ、フラグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼで結合され、ｐＴ７ＣＡＴ  Ａｎで表わされるプラスミドを形成した。クローンはＸｇａｌとアンシピリン耐性を用いるβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて選択される。
【０１５０】
例４：精製されたＤＮＡテンプレートの調製
例３からのプラスミドＤＮＡは、ＲＮＡｓｅがない場合を除いて、細菌性ＲＮＡを取り除くために２ＣｓＣｌスピンを使用してマニアティス（Maniatis）（上述）により増殖させて調製する。特定的には、例３からのｐＴ７ＣＡＴ  Ａｎを含むE.coliをアンピリシン含有ＬＢ培地で増殖させた。細胞はそれからＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５遠心分離機（E.I. DuPont, Burbank, California 91510）において１０分間５０００ｒｐｍで遠心することによってペレット化され、冷ＴＥ，ｐＨ８．０に再懸濁され、再び、５０００ｒｐｍ．で１０分間遠心分離され、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス（Tris）−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび４０ｍｇ／ｍｌリゾチームの溶液に再懸濁された。ときどき倒置しながら５〜１０分間インキュベーションした後、１％ＳＤＳを含む０．２  Ｎ  ＮａＯＨが加えられ、０℃で１０分経過後３Ｍ酢酸カリウムおよび２Ｍ酢酸が続いた。さらに１０分後、材料は再び６０００ｒｐｍで遠心分離され、その上澄みはピペットで取除かれた。ペレットはそれから０．６容量のイソプロパノール（−２０℃）に混合され、混ぜられ、かつ１５分間−２０℃で保存された。それから材料はＨＢ４揺動バケットロータ装置（DuPont、上述）において、２０分間１０，０００ｒｐｍで再び遠心分離され、その後上澄みは取除かれ、ペレットは７０％ＥｔＯＨで洗われるとともに室温で乾燥された。次に、ペレットは３．５  ｍｌ  ＴＥに再懸濁され、それに続いて３．４ｇ  ＣｓＣｌおよび３５０μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＥｔＢｒが加えられた。得られた材料をクイックシールチューブに入れ、チューブを鉱油で上部まで満たした。チューブはＶＴｉＳＯ遠心分離機（Beckmam Instruments, Pasadena, California, 91051）において８０，０００ｒｐｍで３．５時間遠心された。バンドは取除かれ、材料は再び遠心分離されて、０．９５ｇ  ＣｓＣｌ／ｍｌおよびＴＥ中０．１ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌ  ＥｔＢｒ／ｍｌで容量を補った。バンドに３容量のＴＥを加えて、上層がきれいになるまで上層を捨てた後、ＥｔＢｒは、等しい容量のＴＥ飽和Ｎ−ブタノールで抽出された。次に、２．５容量のＥｔＯＨが加えられ、材料は−２０℃で２時間沈殿された。得られたＤＮＡ沈殿物は、インビトロでのｍＲＮＡの調製のためのＤＮＡテンプレートとして使用される。
【０１５１】
例５：トランスフェクションのためのｍＲＮＡの調製
例４からのＤＮＡは、ポリＡ尾部の下流で５倍過剰のＰｓｔＩで線状にされた。線状にされたＤＮＡはそれから２回のフェノール／クロロホルム抽出で精製され、それに続いて２回のクロロホルム抽出が行なわれた。ＤＮＡはそれからＮａＯＡｃ（０．３Ｍ）および２容量のＥｔＯＨを用いて沈殿された。ペレットはＤＥＰ−処理された脱イオン水中、約１ｍｇ／ｍｌに再懸濁された。
【０１５２】
次に、転写緩衝液が調製され、これは４００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴおよび４０ｍＭスペルミジンを含む。それから、以下の材料が室温で順に１容量のＤＥＰ−処理された水に加えられた。上で調製された１容量のＴ７転写緩衝液、１ｍＭ濃度までのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＰ、ｒＧＴＰ０．５ｍＭ濃度、７ｍｅＧ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ  キャップ類縁体（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, 01951）０．５ｍＭ濃度、上で調製された線状化ＤＮＡテンプレート０．５ｍｇ／ｍｌ濃度、ＲＮＡｓｉｎ（Promega, Madison, Wisconsin）２０００Ｕ／ｍｌ濃度、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（N.E.Biolabs）４０００Ｕ／ｍｌ濃度。
【０１５３】
この混合物は３７℃で１時間インキュベートされた。混合物のくもりが増えることによって転写反応が成功したことがわかった。
【０１５４】
ｍＲＮＡの生成に続いて、使用されるＤＮＡテンプレートのマイクログラムあたり２ＵのＲＱ１  ＤＮＡｓｅ（Promega）が加えられ、１５分間テンプレートを消化させた。それからＲＮＡはクロロホルム／フェノールで２回抽出されるとともに、クロロホルムで２回抽出された。上澄みは２容量のＥｔＯＨ中０．３ＭのＮａＯＡｃで沈殿され、ペレットは５００μｌの転写生産物あたり１００μｌのＤＥＰ−処理された脱イオン水に再懸濁された。この溶液をＲＮＡｓｅ−フリーセファデックス（Sephadex）Ｇ５０カラム（Boehringer Mannheim #100411）に通した。得られたｍＲＮＡはインビボでの脊椎動物のトランスフェクションに使用するのに十分純粋であった。
【０１５５】
例６：リポソームの調製
数多くのリポソーム調製方法は本発明の実施において有利に使用され得る。１つの特に好ましいリポソームは以下のようにＤＯＴＡＰから作られる。
【０１５６】
１ｍｌクロロホルム中１０ｍｇジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および１０ｍｇＤＯＴＡＰ（例１より）の溶液を、窒素の流れの下で蒸発乾固させ、残留溶媒を一夜真空下で除去する。リポソームは脂質を脱イオン水（２ｍｌ）に再懸濁し、閉じたバイアルにおいて透明になるまで超音波処理することにより調製される。これらの調製物は少なくとも６か月間安定している。
【０１５７】
ポリヌクレオチド複合体は、０．４ｍｇ／ｍｌの０．５ｍｌポリヌクレオチド溶液（たとえば例５から）を一定に静かに攪拌しながら、注射器によって、２０ｍｇ／ｍｌの超音波処理されたＤＯＴＭＡ／ＰＥまたはＤＯＴＡＰ／ＰＥリポソーム０．５ｍｌ溶液に、ゆっくり加え、室温で混ぜることによって調製された。この方法により、ポリヌクレオチドをインビボで細胞に自発的に配達する正に荷電した複合体が得られる。正に荷電したリポソームのヌクレオチドに対する割合を様々に変えたものを、任意の特定の状態において特定の必要性に合うよう使用することができる。一方、フェルグナ（Felgner）他（上述）によって報告されるように、材料を混合してリポソーム／ポリヌクレオチド複合体を自発的に形成する前に、ヘペス（Hepes）緩衝生理食塩水（１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ；２０  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）でポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を希釈することは有利であるかもしれない。多くの例で、しかしながら、生理食塩水の代わりに低いイオン強度を有する溶液（スクロースのような）を使用することは好ましいと考えられる。特に、かかる溶液はポリヌクレオチド／脂質複合体の沈殿を最小限にすることによってポリヌクレオチドの細胞への配達を容易にすると考えられる。
【０１５８】
例７：ネズミにリポソーム的および非リポソーム的に導入されたｍＲＮＡの生体内発現
クロラムファニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするｍＲＮＡがインビボで細胞をトランスフェクトする能力および続いて起こるＣＡＴタンパク質の発現は、示されるように調製された以下の処方物各々０．２００ｍｌを、ブレブを形成するネズミの腹筋に直接注射することによって明らかにされた。各処方物の６つの反復試験区がテストされた。１２〜１４時間後、注射されたおよそ０．１〜０．２グラムの重さの腹筋のセグメントが切除され、切り刻まれ、以下の成分、２００ｍＭトリス、ｐＨ７．６；２ｍＭ  ＭｇＣｌ2；および０．１％トリトン（Triron）Ｘ−１００界面活性剤を有する２００μｌの水性処方物とともに１．５ｍｌ使い捨て乳鉢（Kontes, Morton Grove, Illinois）の中に置かれた。乳鉢の中身はそれから使い捨て乳棒で１分間磨り潰された。乳鉢はそれから（パラフィルム（Parafilm）で）覆われ、１リットルパール（Parr）細胞粉砕器ボンベ（Parr Instrument Company, Moline, Illinois）に置かれるとともに、４℃の窒素で６気圧に押圧された。３０分後、圧力は組織を粉砕して粗溶解産物を生成させるために速やかに解放された。溶解産物はそれから１０分間１３，０００ｒｐｍ、４℃でマイクロ遠心分離機で遠心分離された。上澄みはそれから別の容器に移され分析されるまで−２０℃で保存された。
【０１５９】
次に溶解産物は薄層クロマトグラフィによってＣＡＴタンパク質の存在について検定された。まず、各サンプルの７５μｌ（上で調製された上澄み）が５μｌＣ14クロラムフェニコール（Amersham）、２０μｌの４ｍＭアセチルＣｏＡおよび５０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ７．８とともに３７℃で２時間インキュベートされた。その後、２０μｌの４ｍＭアセチルＣｏＡが加えられ、その混合物は再び３７℃で２時間インキュベートされた。得られた溶液は１ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出され、その有機相は取除かれ、真空遠心分離機（SpeedVac, Savant Co.）で凍結乾燥された。ペレットは２０μｌＥｔＯＡｃに再懸濁され、シリカゲル薄層クロマトグラフィプレート上にスポットされた。プレートは９５％クロロホルム／５％メタノールで４５分間展開され、乾燥されかつ放射性ルミネセンスインジケータ（Enhance Spray Surface Radiography, New England Nuclear Corp.）を噴霧された。次いでプレートはコダック（Kodak）ＸＡＲ５フィルムでサンドイッチされ、−７０℃で一夜感光させた。そのフィルムは、製造業者の指示に従って現像された。以下の結果が得られた。
【０１６０】
【表１】
0003683798.tif 000004
【０１６１】
Ｏｐｔｉｍｅｍ：血清フリー培地（Gibco Laboratories, Life Technologies, Inc, Grand Island, N.Y. 14072）
ＤＯＴＭＡ：（Lipofectinブランド；Bathesda Research Labs, Gaithersburg, MD）
ＣＡＴ  ＲＮＡ：例５からのもの
すべての処方物はＤＥＰＣ処理されたＲＮＡｓｅフリー水（International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535）において調製した。
【０１６２】
例８：ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質を生産するためのマウスへのｍＲＮＡワクチン投与
ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むリポソーム処方物は、例１〜５に従って調製される。ただし、ｇｐ１２０（The Aids Research and Reagent Program, National Institute of Allergy And Infections Disease, Rockville, MD 20852からのｐＩＩＩｅｎｖ３−１）のための遺伝子は、例４の方法でプラスミドｐＸＢＧに挿入される。例６に従って調製された、１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのｇｐ１２０ｍＲＮＡおよび５００μｇ／μｌの１；１ＤＯＴＡＰ／ＰＥを含む処方物の２００μｌが、１日に３回マウスの尾の静脈に注射される。最後の注射の後約１２〜１４時間で、筋肉のセグメントが注射部位から取り出され、例７に従って細胞溶解産物として調製される。ＨＩＶ特異的タンパク質ｇｐ１２０は例７の方法に従って溶解産物中に同定される。
【０１６３】
ｍＲＮＡをワクチン投与されたマウスの血清に存在するｇｐ１２０抗体がＨＩＶ感染を防御する能力は、ＨＴ４−６Ｃプラーク還元検定によって以下のように測定される。
【０１６４】
ＨＴ４−６Ｃ細胞（ＣＤ４＋ヒーラ（Hela）細胞）はＤｒ．ブルースチェイスブロ（Burce Chesebro）（Rocky Mountain National Lab, Montana）から入手され、ＲＰＭＩ培地（BRL,Gaithersburg,MD）の培養で増殖される。細胞の集団はそれからバッチに分割される。バッチの中のいくつかはＨＩＶのおよそ１０5〜１０6感染単位をおよそ１０7のＨＴ４−６Ｃ細胞に加えることによってＨＩＶに感染させる。他のバッチはＨＩＶとｇｐ１２０ｍＲＮＡをワクチン投与されたマウスからのおよそ５０μｌの血清の双方を加えることによって、ＨＩＶ感染に対するｇｐ１２０免疫血清の防御効果をテストされる。３日間のインキュベーションの後、すべてのバッチの細胞は洗われ、固定され、クリスタルバイオレットで染色され、プラークの数が数えられる。ｇｐ１２０免疫血清の防御効果は、ＨＩＶだけで処理されたバッチ中の数と比較して、ｇｐ１２０ｍＲＮＡワクチン投与されたマウス血清およびＨＩＶの双方で処理された細胞のバッチにおけるプラーク数の減少として、測定される。
【０１６５】
例９：ＨＩＶ投与が続くＮＥＦｍＲＮＡを用いたヒト幹細胞保有ＳＣＩＤマウスへのｍＲＮＡワクチン投与
重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス（Molecular Biology Institute, （MBI）, La Jolla, CA 92037））が、モジエル（Mosier）（Mosier他，Nature 335:256（1988））の方法に従って、成人ヒト末梢血リンパ球を腹腔へ注射することによって再構築された。次にＨＩＶ−１の４００〜４０００感染単位の腹腔内注射が行われた。マウスは密封されたグローブボックスの中でＰ３レベル動物封じ込め設備の中で維持された。
【０１６６】
ＨＩＶの場合、プラスミド（the NIAID, Rockville, MD 20852からのpGM92）の形態のｎｅｆ遺伝子を獲得し、プラスミドからｎｅｆ遺伝子を取出し、ｐＸＢＧプラスミドにｎｅｆ遺伝子を転写のために挿入し、例２〜例５に述べられたように転写生産物ｎｅｆｍＲＮＡを精製することによって、ｎｅｆタンパク質をコードするｍＲＮＡを調製した。次いでｎｅｆｍＲＮＡは例６に従う処方物に組込まれた。２００μｇ／ｍｌのＮＥＦ  ＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（ＲＮＡ／リポソーム複合体形態における）を含む１０％スクロース溶液２００マイクロリットルの尾の静脈注射が実験動物に毎日行なわれる一方で、対照動物は２００μｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームを含むＲＮＡ／リポソーム複合体を同じように注射された。注射後２、４および８週間で、生検標本が注射されたリンパ器官から採取され、免疫組織化学のために調製された。同じ時点で、血液サンプルが採取され、ＥＬＩＳＡキット（Abbott Labs, Chicago, LL）によるｐ２４レベルおよび例８のプラーク検定によるウイルス力価を検定された。ＨＩＶ−１に対する免疫染色が、ＨＩＶに感染した患者からのポリクローナル血清を使って説明されるように（Namikawa他，Science 242:1684（1988））行なわれた。陽性の細胞が数えられ、高倍率フィールド（４００ｘ）あたりの感染細胞の数が測定された。これらの検定を使って、陽性の染色細胞数の少なくとも２倍減少が８週間で観察され、力価およびｐ２４発現は少なくとも５０％低減された。同時にこれらの結果は（生体内）治療の穏やかな抗ウイルス性効果を示す。
【０１６７】
１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのｎｅｆｍＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥを含む処方物２００μｌが、ヒト幹細胞含有ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に１日に３回注射される。免疫化に続いて、マウスはＨＩＶウイルスの有効量での感染によってテストされる。血液のサンプルが定期的に尾の静脈から取出され、ＥＬＩＳＡキット検定（Abbott Labs, Chicago, IL）により特徴的なＨＩＶタンパク質ｐ２４の生成がモニターされる。
【０１６８】
例１０：生体内ｍＲＮＡトランスフェクションによってマウスヘアデノシンデアミナーゼを与える方法
ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子のｃＤＮＡに対する全長配列は、クローンＡＤＡ２１１（Adrian, G. 他  Mol.Cell Biol.4:1712（1984））の１，３００ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩフラグメントから得られる。それは平滑末端にされ、ＢｇＩＩＩリンカーに結合され、それからＢｇＩＩＩで消化される。修飾されたフラグメントはｐＸＢＧのＢｇＩＩＩ部位に挿入される。ＡＤＡのｍＲＮＡは例２〜例５に従って転写されるとともに精製され、精製されたＡＤＡｍＲＮＡは例６に従って処方物の中に組込まれる。バルブ（Balb）３Ｔ３マウスは、１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのＡＤＡｍＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むこの処方物２００μｌを尾の静脈に直接注射される。
【０１６９】
マウスの肝臓、皮膚および筋肉の組織中のヒトＡＤＡの存在は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）法によって確認される。組織抽出物は非変性ゲル上でｐＨ４および５の間で等電点電気泳動された。ゲルはそれからヴァレリオ（Valerio），D他, Gene 31:137-143（1984）によって報告されるように原位置でのＡＤＡ活性について染色された。
【０１７０】
ヒトおよび非ヒトＡＤＡの予備分離は、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって実行される。タンパク質は０．０５Ｍから０．５Ｍ  ＫＣｌに至る直線勾配での２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）でファーマシア（Pharmacia）（Piscataway, NJ）モノク（MonoQ）カラム（ＨＲ５／５）上で分画される。フラクション内でのＡＤＡの活性は、イノシンに変換される14Ｃ−アデノシン（Amersham, Chicago, IL）を用いてフラクションを反応させることによって測定される。薄層クロマトグラフィー（０．１Ｍ  ＮａＰｉ  ｐＨ６．８飽和硫酸アンモニウム：ｎ−プロピルアルコール／１００：６０：２）は、基質アデノシンから放射性イノシンを分離するために使用される。
【０１７１】
例１１：マウスの筋肉に直接注射された純粋ＲＮＡおよびＤＮＡの生体内発現マウスの四頭筋に、１００μｇのｐＲＳＶＣＡＴ  ＤＮＡプラスミドか１００μｇのβｇＣＡＴβｇＡｎ  ＲＮＡのどちらかを注射し、注射部位の筋肉組織を後にＣＡＴ活性についてテストした。
【０１７２】
生後５〜６週間の雌および雄バルブ（Ｂａｌｂ）／Ｃマウスは０．３ｍｌの２．５％アベルチン（Avertin）で腹腔内注射によって麻酔された。１．５ｃｍ切開が前大腿部で行なわれ、四頭筋は直接視覚化された。ＤＮＡおよびＲＮＡは筋肉の末梢挿入部位から膝の中におよそ０．５ｃｍでかつ約０．２ｃｍの深さで１分間にわたって２７ゲージ針を通して１ｃｃ注射器中０．１ｍｌの溶液で注射された。縫合部が将来の位置確認のために注射部位上に置かれ、皮膚はそれからステンレススチールのクリップで閉じられた。
【０１７３】
３Ｔ３マウス繊維芽細胞はまた、これらの細胞について述べられた最適の条件（Malone, R. 他，Rroc. Nat'1. Acad. Sci. USA 86:6077-6081（1989））下で、３ｍｌのオプティメム（Opti-Mem）（商標）（Gibco）中リポフェクチン（Lopofectin）（商標）（BRL）６０μｇと複合された２０μｇのＤＮＡまたはＲＮＡとともにインビトロでトランスフェクトされた。同じ繊維芽細胞はまた、アウスベル（Ausubel）他（Eds）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New Yok（1989）に述べられる方法に従って燐酸カルシウムを使用してトランスフェクトされた。
【０１７４】
pRSVCAT DNAプラスミドおよびβｇＣＡＴβｇＡｎ  ＲＮＡは、先行する例に述べられるように調製された。ＲＮＡは５′および３′β−グロビン非翻訳配列および３′ポリ−Ａ領域によって隣接されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）コード配列からなった。
【０１７５】
全四頭筋を切除し、その筋肉を２００μｌの溶解溶液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．１％トリトン（Triton）Ｘ）を含む１．５ｍｌミクロチューブの中に切り刻み、１分間プラスチック乳棒（Kontes）ですり潰すことによって、筋肉抽出物が調製された。筋肉細胞の完全な粉砕を確実にするために、筋肉組織はそれから１５分間４℃でボンベ（Parr）の中で６００ｐｓｉのＮ2下に置かれた後、圧力は開放された。
【０１７６】
繊維芽細胞はプレートからトリプシン分解された後同様に処理され、血清とともに培地の中に取入れられ、ＰＢＳで２回洗われ、最終細胞ペレットは２００μｌの溶解溶液の中に懸濁された。７５μｌの筋肉および繊維芽細胞抽出物は、Ｃ14−クロラムフェニコールとともに２時間反応混合物をインキュベートすることによってＣＡＴ活性について検定され、それに続いて例７にすべて示されるように抽出および薄層クロマトグラフィーが行なわれた。
【０１７７】
図１は注射された四頭筋の抽出物内のＣＡＴ活性を示す２つの別個の実験からのオートラジオグラムを含む。レーン数はオートラジオグラムの一番上に示され、％クロラムフェニコール変換率は底に示される。サンプルの位置づけは以下のとおりである。
レーン１および１３：対照繊維芽細胞
レーン２および１４：５％スクロースのみを注射された筋肉
レーン３および１５：０．００５単位の非注射、精製ＣＡＴ標準
レーン４および１６：０．０５単位の精製ＣＡＴ（Sigma）
レーン５〜８：５％スクロース中１００μｇのβｇＣＡＴβｇＡｎ  ＲＮＡを注射された筋肉
レーン１１、１２および１７〜２０：５％スクロース中１００μｇのｐＲＳＶＣＡＴ  ＤＮＡを注射された筋肉
レーン９および１０：６０μｇのＤＯＴＭＡとともに７０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞（１０6）に脂質導入（リポフェクション）された２０μｇのβｇＣＡＴβｇＡｎ  ＲＮＡ
レーン２１、２２：６０μｇのＤＯＴＭＡとともに５０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞にリポフェクションされた２０μｇのｐＲＳＶＣＡＴ
レーン２３、２４：５０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞中にリポフェクションされた２０μｇのｐＲＳＶＣＡＴ燐酸カルシウム。
【０１７８】
ＣＡＴ活性は注射後１８時間で４ヵ所のＲＮＡ注射部位すべてにおいて容易に検出され、かつ注射後４８時間で６ヵ所のＤＮＡ注射部位すべてで検出された。４ヵ所のＲＮＡ注射部位の２ヵ所（図１、レーン６および８）からの抽出物ならびに６ヵ所のＤＮＡ注射部位の２ヵ所（図１、レーン１１および２０）からの抽出物は、最適の条件下においてインビトロで一時的にトランスフェクトされた繊維芽細部から得られたＣＡＴ活性のレベル（図１、レーン９、１０、２１−２４）に匹敵するＣＡＴ活性のレベルを含んだ。筋肉で発現されたＣＡＴ活性の平均総量は、ＲＮＡ注射に対して９６０ｐｇ、ＤＮＡ注射に対して１１６ｐｇであった。異なる筋肉部位から回収されたＣＡＴ活性の変動はおそらく、注射および抽出技術に由来する変動である。なぜなら純粋ＣＡＴ蛋白質またはｐＲＳＶＣＡＴでトランスフェクトされた繊維芽細胞を筋肉部位に注射し、ただちにＣＡＴ活性の測定のために切除したとき、顕著な変動が観察されたからである。ＣＡＴ活性はまた、ＲＮＡまたはＤＮＡ  ＣＡＴベクターを注射された腹筋からも回収され、他の筋肉類がポリヌクレオチドを取込みかつ発現することが可能であることを示した。
【０１７９】
例１２：マウスの筋肉に直接注射された純粋ＤＮＡの生体内発現の部位
注射された筋肉の遺伝子発現の部位は、注射に関してE. coli  β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するｐＲＳＶＬａｃ−Ｚ  ＤＮＡベクター（P. NortonおよびJ. Coffin Molec. Cell Biol. 5:281-290（1985））を利用し、E. coliのβ−ガラクトシダーゼ活性について筋肉細胞の原位置での細胞化学染色を観察することによって測定された。マウスの四頭筋は前の例で説明されたように露出された。四頭筋に２０％スクロース中ｐＲＳＶＬＡＣ−Ｚ  ＤＮＡ１００μｇを一回注射した。７日後個々の四頭筋がそのまま全部取り出され、５つおきの１５μｍ切片がβ−ガラクトシダーゼ活性について組織化学的に染色された。
【０１８０】
筋肉生検は液体Ｎ2−冷却イソペンタンの中で凍結された。１５μｍ連続切片はクライオスタットを使用してスライスされ、すぐにゼラチン化スライド上に置かれた。スライドは１０分間ＰＢＳ中１．５％グルタルアルデヒドで固定され、β−ガラクトシダーゼ活性のために４時間染色された（J. Price他  Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:156-160（1987））。筋肉はエオシンにより対比染色された。
【０１８１】
撮影された切片（図２）は以下のとおりである。
（Ａ）：２０％スクロースのみを含む溶液を注射された対照筋肉の切片。倍率６０×。
（Ｂ）（Ｃ）および（Ｄ）：ｐＲＳＶＬａｃＺを注射された筋肉の切片。それぞれ倍率２５×、１６０×および４００×。
（Ｅ）：ｐＲＳＶＬａｃＺを注射された他の筋肉の縦方向の切片。倍率１６０×。
（Ｆ）（Ｇ）および（Ｈ）：０．６ｍｍ離れた同じ筋肉の一連の切片。
【０１８２】
全四頭筋を含むおよそ４０００細胞のうちの６０の筋肉細胞（１．５％）および注射領域内の細胞のおよそ１０〜３０％が、青色に染色された（図２Ｂ、ＣおよびＤ）。２０％スクロース溶液のみを注射された対照筋肉は、バックグラウンド染色を示さなかった（図２Ａ）。いくつかの個々の筋肉細胞内での陽性のβ−ガラクトシダーゼ染色は、一連の切片について少なくとも１．２ｍｍの深さであり（図２Ｆ、ＧおよびＨ）、それは、複数核へのトランスフェクションの結果であるか、あるいは１つの核から発現される細胞質蛋白質が筋肉細胞内に広く分配される能力のどちらかであり得る。縦方向切片はまた、少なくとも４００μｍにわたる筋肉細胞内のβ−ガラクトシダーゼ染色を示した（図２Ｅ）。青色の濃い細胞に隣接する細胞の中に、弱い青色染色がしばしばその境界領域に現われた。これは、反応したＸ−ｇａｌ生成物が沈殿する前に拡散した組織化学的β−ガラクトシダーゼ染色の産物である可能性が高い。
【０１８３】
同様の結果が線状ＤＮＡを使って得られる。
例１３：マウスの筋肉に注射されたＲＮＡおよびＤＮＡの用量作用効果
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＬＵＣ）を使った実験により、注射された筋肉から抽出された総ルシフェラーゼに対する用量レベルおよび時間のパラメータの効果を調査した。
【０１８４】
ＲＮＡおよびＤＮＡベクターが調製され、マウスの四頭筋に前に説明されたように注射された。全四頭筋の筋肉抽出物は、溶解緩衝液が１００ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１％トリトンＸであることを除いては、例１１に説明されたように調製された。２００μｌ抽出物のうちの８７．５μｌがＬＫＢ１２５１蛍光計を使用してルシフェラーゼ活性について分析された（J. de Wet 他 Molec. Cell Biol. 7:725-737（1987））。精製されたホタルルシフェラーゼ（Analytical Luminescence Laboratory）によって対照筋肉抽出物で生成された光単位を測定することによって確立された標準曲線を使用し、光単位をルシフェラーゼのピコグラム（ｐｇ）に変換した。注射の前のＲＮＡおよびＤＮＡの調製物は何の汚染ルシフェラーゼ活性も含まなかった。２０％スクロースを注射された対照筋肉は何ら検出可能なルシフェラーゼ活性を有しなかった。上述の実験はすべて２〜３回行なわれ、特にＤＮＡについて４０日より長いものが３回行なわれた。
【０１８５】
図３Ａ〜３Ｃは以下の結果を示している。
３（Ａ）２０％スクロース中、種々の量のβｇＬＵＣβｇＡｎ  ＲＮＡを注射した後１８時間で測定されたルシフェラーゼ活性、および２０％スクロース中、種々の量のｐＲＳＶＬを注射した後４日で測定されたルシフェラーゼ活性。
【０１８６】
３（Ｂ）βｇＬＵＣＢｇＡｎ  ＲＮＡ２０μｇを１００万の３Ｔ３繊維芽細胞（Malone, R. 他  Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 86:6077-6081（1989））中にリポフェクトした後、および２０％スクロース中１００μｇのβγΛΥ  βｇ  Ａｎ  ＲＮＡを四頭筋に注射した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【０１８７】
３（Ｃ）ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡを筋肉に注射した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【０１８８】
Ａ．遺伝子発現のレベル
用量作用効果は、四頭筋に様々な量のβｇＬｕｃβｇＡｎ  ＲＮＡまたはＤＮＡ  ｐＲＳＶＬ構造物を注射した際に観察された（図３Ａ）。１０倍多いＤＮＡを注射すると、ＤＮＡ１０μｇ注射の後の３３ｐｇルシフェラーゼからＤＮＡ１００μｇ注射後の３２０ｐｇルシフェラーゼへとおよそ１０倍のルシフェラーゼ活性増加という結果が得られた。１０倍多いＲＮＡの注射はまた、およそ１０倍多いルシフェラーゼを生み出した。６０ｍｍ皿における１００万の３Ｔ３マウス繊維芽細胞は、オプティメム（Opti-MEM）（Gibco）３ｍｌ中リポフェクチン（Lipofectin）（Bethesda Research Labs）６０μｇと複合されたＤＮＡまたはＲＮＡ２０μｇを用いてリポフェクトされた。２日後、細胞はルシフェラーゼ活性について検定され、４つの別個のプレートからの結果は平均された。繊維芽細胞にトランスフェクトされたｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ２０μｇは、合計でルシフェラーゼ１２０ｐｇ（６ｐｇルシフェラーゼ／μｇＤＮＡ）を生み出す一方で、筋肉に注射された２５μｇは平均１１６ｐｇのルシフェラーゼ（４．６ｐｇルシフェラーゼ／μｇＤＮＡ：図３Ａ）を生み出した。ＲＮＡベクターからの発現は、注射された筋肉におけるよりトランスフェクトされた繊維芽細胞においておよそ７倍効果的であった。繊維芽細胞にトランスフェクトされた２０μｇのβｇＬｕｃβｇＡｎ  ＲＮＡは、合計で４５０ｐｇのルシフェラーゼを生み出し、一方で筋肉に注射された２５μｇは７４ｐｇのルシフェラーゼを生み出した（図３Ａおよび３Ｂ）。配達されたＤＮＡの量に基づいて、ＤＮＡベクターからの発現の効率は、トランスフェクトされた繊維芽細胞および注射された筋肉の双方で同様であった。
【０１８９】
Ｂ．発現の時間経過
時間経過もまた調査された（図３Ｂおよび３Ｃ）。ルシフェラーゼ活性は、２５μｇのβｇＬｕｃβｇＡｎ  ＲＮＡまたは１００μｇのｐＲＳＶＬ  ＤＮＡが注射された後、様々な時間で検定された。ＲＮＡ注射の後、平均ルシフェラーゼ活性は１８時間で最大量の７４ｐｇに達し、それから６０時間で急速に減少して２ｐｇになった。トランスフェクトされた繊維芽細胞において、ルシフェラーゼ活性は８時間で最大であった。筋肉へのＤＮＡ注射に続いて、相当量のルシフェラーゼが少なくとも６０日間存在した。
【０１９０】
図３Ｂのデータは、ルシフェラーゼ蛋白質および生体外ＲＮＡ転写が筋肉内で２４時間より少ない半減期を有することを示す。したがって、６０日間のルシフェラーゼ活性の持続性は、ルシフェラーゼ蛋白質の安定性または生体内ＲＮＡ転写の安定性のためではないようである。
【０１９１】
例１４：サザンブロット分析によって測定された注射の後の筋肉中のＤＮＡの持続性
筋肉ＤＮＡの調製物は、対照である非注射の四頭筋、または２０％スクロース中ｐＲＳＶＬ１００μｇを注射した３０日後の四頭筋から、得られた。同じ動物からの２つの全四頭筋がプールされ、液体Ｎ2中で切り刻まれ、乳鉢と乳棒を使ってすり潰された。全細胞性ＤＮＡとＨＩＲＴ上澄が調製された（F. M. Ausubel 他（Eds）Current Protocols in Moleculor Biology, John Wiley, New York（1987））。１５μｇの全細胞性ＤＮＡまたは１００μｌのＨＩＲＴ上澄からの１０μｌが消化され、１．０％アガロースゲル上で精製され、「バキュブロット（vacublot）」装置（ＬＫＢ）を使ってニトラン（Nytran）（商標）（SchleicherおよびSchuell, New York）に移され、マルチプライマー32Ｐ−ルシフェラーゼプローブ（ｐＲＳＶＬのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌ  フラグメント）とハイブリッド形成された。一夜のハイブリダイゼーションに続いて、膜の最終洗浄が６８℃で０．５％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用いて行なわれた。コダックＸＡＲ５フィルムに−７５℃で４５時間感光させた。
【０１９２】
図４は以下のようなサンプルパターンを有するサザンブロットのオートラジオグラムである。
レーン１：０．０５ｎｇの非消化ｐＲＳＶＬプラスミド
レーン２：０．０５ｎｇのＢａｍＨｌ消化ｐＲＳＶＬ
レーン３：ブランク
レーン４：対照筋肉からのＨＩＲＴ上澄のＢａｍＨｌ消化物
レーン５：対照である非注射の筋肉からの細胞性ＤＮＡのＢａｍＨｌ消化物
レーン６、７：ｐＲＳＶＬが注射された筋肉の２つの異なるプールからのＨＩＲＴ上澄のＢａｍＨｌ消化物
レーン８、９：ｐＲＳＶＬが注射された筋肉の２つの異なるプールからの細胞性ＤＮＡのＢａｍＨｌ消化物
レーン１０：ＢａｍＨｌおよびＤｐｎｌで消化された細胞性ＤＮＡ（レーン９と同一）
レーン１１：ＢａｍＨｌおよびＭｂｏｌで消化された細胞性ＤＮＡ（レーン９におけるのと同一）
レーン１２：ＢｇＩＩＩで消化された細胞性ＤＮＡ
レーン１３：ＢｇＩＩＩで消化されたＨＩＲＴ上澄
（サイズマーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ）は左に示される）。
【０１９３】
筋肉ＤＮＡのサザンブロット分析は、外来のｐＲＳＶＬ  ＤＮＡが少なくとも３０日間（図４、レーン６〜９）筋肉組織内に存在し、かつ注射後２日および１５日に筋肉に存在するＤＮＡのレベルに類似することを示している。ＢａｍＨｌ（これは一回ｐＲＳＶＬを切断する。図４、レーン６〜９）で消化された筋肉ＤＮＡにおいて、線状にされたｐＲＳＶＬに対応する５．６ｋｂバンドの存在（図４、レーン２）は、ＤＮＡが環状の染色体外の形態か、染色体に組込まれたプラスミドの大きな縦列反復のどちらかで存在することを示唆する。ＢｇＩＩＩ（これはｐＲＳＶＬを切断しない）で消化された筋肉ＤＮＡにおいて、１０ｋｂより小さく（図４、レーン１２および１３）かつプラスミドｐＲＳＶＬの開いた環の形態と同じ大きさでのバンドの存在（図４、レーン１）は、ＤＮＡが開いた環の形態で染色体外に存在することを示唆する。ＨＩＲＴ上澄におけるｐＲＳＶＬ  ＤＮＡの出現（図４、レーン６、７および１３）およびＨＩＲＴ上澄での形質転換の後アンピシリン耐性にされた細菌におけるｐＲＳＶＬ  ＤＮＡの出現はまた、ＤＮＡが統合されずに存在することを示唆する。外因性ＤＮＡの大半は染色体外に存在するようであるが、低レベルの染色体への統合を決定的には除外することはできない。小滴（ブロッブ）の過度の露光は、ランダムな部位で統合されるプラスミドＤＮＡを表わすであろう１０ｋｂより大きいハイブリッド形成したＤＮＡのスポットを明らかにしなかった。ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡの感受性は筋肉についてＤｐｎＩ消化（図４、レーン１０）に対してであり、Ｍｂｏｌ消化に対しては抵抗性であること（図４、レーン１１）は、ＤＮＡが筋肉細胞内で複製されなかったことを示唆する。
【０１９４】
例１５：マウスの筋肉に直接移植された純粋ＤＮＡの生体内発現
ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡはエタノール中で沈殿され乾燥された。そのペレットは鋭い鉗子で拾い上げられ、先行する例で述べられたように様々な筋肉群の中に入れられた。５日後筋肉は例１３で述べられたようにルシフェラーゼ活性について分析された。ＤＮＡは以下のような様々な筋肉群で効率的に発現された。
【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
例１６：肺への直接的遺伝子配達：ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＣＬ複合体または純粋蛋白質の気管内注射
リポフェクチン（Lipofectin）（商標）と複合されたＤＮＡルシフェラーゼベクター（ｐＲＳＶＬ）が、２０％スクロース（２匹のラット）または５％スクロース（６匹のラット）のどちらかでラット気管内に注射された。注射の２日後、ラットの肺は７つの部分、ＬＵＬ、ＬＬＬ、ＲＵＬ、ＲＭＬ、ＲＬＬ、ＡＬ（以下のように規定される）および気管に分割された。ネズミの肺は左主気管支から分かれた１つの大きな左肺を有するという点でヒトの肺と異なっている。この研究のために左の肺は、左上部部分（ＬＵＬ）と左下部部分（ＬＬＬ）とに半分に切断された。右肺は４つの葉、右頭蓋葉（ＲＵＬ）、右中葉（ＲＭＬ）、右低葉（ＲＬＬ）および附属葉（ＡＬ）を含む。これらの肺を２００μｌの溶解溶液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．１％トリトンＸ）を含む別個の１．５ｍｌミクロチューブに切り刻み、１分間プラスチックの乳棒（Kontes）で肺をすり潰すことによって抽出物が調製された。肺細胞の完全な粉砕を確実にするために、肺組織は次いで１５分間４℃でパール（Parr）ボンベの中で６００ｐｓｉのＮ2下に置かれた後、圧力開放された。ルシフェラーゼ検定は約３５０μｌの全容量の中から８７．５μｌの肺抽出物について行なわれた。
【０１９７】
【表３】
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【０１９８】
モック：この値は食道に０．３ｍｌの２０％スクロース中２５μｇのＤＮＡを摂取した動物に対する値である（水のみを含むサンプルは２２．５ｌ．ｕ．を生じる）。
【０１９９】
２５μｇＤＮＡ単独：２０％スクロース０．３ｍｌ中２５μｇのｐＰＧＫＬｕｃを気管内注射により摂取した別の動物を表わす。
【０２００】
２５μｇＤＮＡ／ＣＬ：５％スクロース０．３ｍｌ中リポフェクチン（Lipofectin）と複合された２５μｇのｐＰＧＫＬｕｃを気管内注射により摂取した別の動物を表わす。
【０２０１】
注射の２日後、上述の動物は殺され、肺抽出物が調製された。
Ｌｕｃ蛋白質１０4ｌ．ｕ．：精製されたホタルルシフェラーゼ（Sigma）の３０，０００光単位（ｌ．ｕ．）の等量を摂取し、それからすぐに殺された動物を表わす。
【０２０２】
２５μｇＤＮＡ単独および２５μｇＤＮＡ／ＣＬ群の動物でのルシフェラーゼ活性は、モック動物での活性よりも大きくなかった。しかしながら、２５０μｇＤＮＡ単独の動物では、対照肺またはブランクに対し、小さいがしかし確実に上昇したｌ．ｕ．活性が示された（アンダーラインされたもの）。同一の抽出物に対する二重検定によりその結果は確かなものとなった。ＬＫＢ１２５１蛍光計を使っての実験は、これらの値がバックグラウンドを超えただけではあるが、真のルシフェラーゼ活性を示すことを明らかにしている。
【０２０３】
例１７：ＤＮＡ処方物を直接注射されたマウス肝臓中のルシフェラーゼ活性
ＤＮＡルシフェラーゼ発現ベクターｐＰＧＫＬｕｃが、マウスの左肝臓葉の下部に肝臓内（ＩＨ）注射された。ｐＰＧＫＬｕｃＤＮＡは、それ自体を（２０％スクロース１．０ｍｌ中４５０μｇのＤＮＡ）注射されるか、またはリポフェクチン（Lipofectin）（５％スクロース１．０ｍｌ中５０μｇのＤＮＡ＋１５０μｇのリポフェクチン）と複合されて注射された。注射の３日後、左肝臓葉は２つの部分（葉が注射された下部部分と注射部位から離れた葉の上部部分）に分割されるとともに、先行する例に述べられたようにルシフェラーゼ活性について検定された。
【０２０４】
【表４】
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【０２０５】
純粋なｐＰＧＫＬｕｃ注射を摂取した3匹の動物のうちの２匹、およびｐＰＧＫＬｕｃ＋リポフェクチン注射を摂取した3匹の動物のうちの２匹は、バックグラウンドを著しく超えるルシフェラーゼ活性を有した（アンダーラインのもの）。直接注射された肝臓葉の下部部分は、注射部位から離れた上部部分より大量のルシフェラーゼ活性を有した。同様の結果がｐＲＳＶＣＡＴ  ＤＮＡ発現ベクターおよびＣＡＴ検定を用いて得られた。ルシフェラーゼ活性は、ｐＰＧＫＬｕｃ（＋および−リポフェクチン）の類似の調製物をラットの門脈循環に注射した３日後において検出されなかった。
【０２０６】
例１８：肝臓および筋肉に注射された成長ホルモン遺伝子の発現
マウスの肝臓と筋肉の両方にｐＸＧＨ５（メタロチオネインプロモータ成長ホルモン融合遺伝子）（Selden Richard他，Molec. Cell Biol. 6：3173 - 3179（1986））を注射した。マウスは７６ｍＭの硫酸亜鉛水上に置かれた。その後動物は採血され、血清はニコルス（Nichols）ＧＨキット（Kit）を使用して成長ホルモンについて分析された。
【０２０７】
Ａ．２匹のマウスに５％スクロース中リポフェクチン６０μｇ／ｍｌと複合された２０μｇのｐＸＧＨ５遺伝子を注射した。この溶液１ｍｌが肝臓に注射され、腹側および背側の腹筋には７つの部位に２回０．１ｍｌが注射された。２日後、動物は採血された。１匹の動物の血清はバックグラウンドレベルのままであったが、他方の血清は０．７５ｎｇ／ｍｌの成長ホルモンを含んだ。
【０２０８】
Ｂ．３匹のマウスに５％スクロース中１ｍｇ／ｍｌのｐＸＧＨ５を０．１ｍｌ注射し、四頭筋に２回、ハムストリング筋に１回、胸筋に１回、小多角骨筋１回、２日に分けて注射した。結果は以下のとおりであった。
【０２０９】
【表５】
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【０２１０】
例１９：免疫ペプチドのための遺伝子を直接注射されたマウス内での抗体生成マウスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータによって駆動されるｇｐ−１２０遺伝子からなる２０μｇのプラスミド構造物を注射された。ＤＮＡは例１１に述べられた方法に従ってマウスの四頭筋に注射された。マウス５（図５Ａ）は、四頭筋に等張スクロース液中２０μｇのプラスミドＤＮＡを注射された。マウス２（図５Ｂ）は、スクロース溶液単独を注射された。血液サンプルが、注射の前（０日目）に図５に示された時間に採られ、注射後４０日を過ぎるまで採られた。各サンプルからの血清は、連続的に希釈され、抗原として酵母の中に作られる組換型ｇｐ−１２０蛋白質を使って、抗体検出のための標準ＥＬＩＳＡ法検定で検定された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の双方は、図５に示されるように検出された。この研究は遺伝子はそのシグナル配列を保持し、蛋白質は細胞から効率的に放出されることを示す。
【０２１１】
例２０：免疫ペプチドのための遺伝子をトランスフェクトされた細胞を注射されたマウスにおける抗体生成
細胞株ＢＡＬＢ／Ｃ  Ｃ１．７（ＴＩＢ８０）を、ザ・アメリカン・タイプ・ティシュ・カルチャ・コレクション（the American Type Tissue Culture Collection）から得た。これらの細胞は例１９に述べられたｇｐ−１２０遺伝子構造物でトランスフェクトされた。０．７５ｍｌオプティメム（OptiMEM）（Gibco. Inc.）に対して６．１μｇのＤＮＡが加えられた。また、３０μｇの量の陽イオンリポソーム（７０：３０のモル比でＤＯＴＭＡとコレステロールを含む）が、他の０．７５ｍｌオプティメム（OptiMEM）に加えられた。混合物は合わされ、２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を含む１．５ｍｌのオプティメムが加えられた。この溶液は８０％の集密細胞（プレート当りおよそ１００万の総細胞）を含む６０ｍｍプラスチックペトリ皿に注がれた。リポフェクション後３．２時間で、細胞はトリプシンおよびＥＤＴＡ処理でプレートから剥され、オプティメム（OptiMEM）で洗われるとともに１０％胎仔ウシ血清を含む０．１ｍｌオプティメム（OptiMEM）に再懸濁された。これらの細胞はマウスに注射された（ＩＰ）。マウスＩ２（図６Ａ）はトランスフェクト細胞を注射された。マウスＩ１（図６Ａ）には同一数の非トランスフェクト細胞を接種した。血液のサンプルは注射の前（０日目）に取られ、さらに図６に示される時間に取られた。血清サンプルは先行する例のように処理された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の双方が図６に示されるように検出された。
【０２１２】
例２１：インビトロで細胞にトランスフェクトされたＤＮＡの直接翻訳に対する無キャップ５′配列の使用
２つの異なったＤＮＡテンプレートが構成され、その両者はE. coli β−ガラクトシダーゼによりレポートされる遺伝子を発現するＲＮＡの合成をコードする。コザック（Kozak）コンセンサス配列を含むＬａｃ−Ｚ遺伝子がｐβＧＬｕｃβＧＡnテンプレートのルシフェラーゼコード配列の代わりに挿入され、ｐβＧＬａｃＺβＧＡnテンプレートを形成した。ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnテンプレートはｐβＧＬａｃＺβＧＡnの５′β−グロビン非翻訳配列を脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの５８８ｂｐ  ＥｃｏＲｌ／Ｎｃｏｌフラグメント（Parks,G.他，J.Virology 60：376-384（１９８６）中のｐＥ５ＬＶＰＯ）で置換えることによって作られた。これらのＥＭＣ５′非翻訳配列は、網状赤血球溶解産物中インビトロで効率的な翻訳を開始できることが以前に示されていた。我々はこれらの配列もまた培養において繊維芽細胞中にトランスフェクトされたとき効率的な翻訳を誘導できることを明らかにした。青色細胞のパーセンテージは、キャップされたｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡでトランスフェクトされた細胞より、キャップされていないｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の方がわずかに大きかった。非キャップまたはキャップのいずれのｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡを用いたトランスフェクションも、キャップされたβＧＬａｃＺβＧＡnＲＮＡを用いたトランスフェクションより多い数の陽性のβ−ガラクトシダーゼ細胞を産出した。このＥＭＣ５′非翻訳配列は、ワクシニア−Ｔ７ポリメラーゼベクターの成分として、非キャップｍＲＮＡの翻訳を４〜７倍増加できることが最近示されている（Elroy-Stain，O. 他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：6126-6130（1989））。これらのＥＭＣ配列は従って、非キャップメッセンジャーからの効率的な翻訳を誘導できる能力を有する。
【０２１３】
例２２：トランスフェクトされた細胞培養物におけるＴ７ポリメラーゼ転写
ＳＶ４０プロモータ（Dunn, J.他，Gene 65:259（1988））からＴ７ポリメラーゼを発現するＳＶ４０−Ｔ７ポリメラーゼプラスミドを、培養において３Ｔ３繊維芽細胞中に、ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnテンプレートＤＮＡとともにリポフェクションし、Ｔ７ポリメラーゼ転写がプラスミドを介して起こり得ることを明らかにした。次ぎの２つの異なるＳＶ４０−Ｔ７ポリメラーゼ発現ベクターが使用された。
【０２１４】
（ａ）ｐＳＶ−Ｇｌ−Ａ：細胞質に向けられるＴ７ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するｐＡＲ３１２６−ＳＶ４０プロモータ。
【０２１５】
（ｂ）ｐＳＶＮＵ−Ｇｌ−Ａ：細胞質に向けられるＴ７ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するｐＡＲ３１３２−ＳＶ４０プロモータ。
【０２１６】
これらの２つのプラスミドの各々は、１：３および３：１の割合で、ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnとともに、３Ｔ３細胞の６０ｍｍプレート中にリポフェクションされた。青色のβ−ガラクトシダーゼ細胞の数が数えられ、以下に示されるように記録された。
【０２１７】
【表６】
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【０２１８】
例２３：メッセンジャーＲＮＡの制御された注入後の脳におけるルシフェラーゼの発現
２匹の成熟したマウスと１匹の生まれたてのマウスに、例１７に従って調製された５′キャップを含むβｇＬｕｃβｇＡn  ｍＲＮＡを注射した。成熟したマウスにおいて、注射は２０％スクロース中３．６μｇ/μｌのｍＲＮＡの保存溶液から行い、注射量は５μｌであり、左右の頭頂皮質の各々に２回の注射が行なわれ、したがって、マウス１匹につき４回の注射が行なわれた。組織は、注射後１８時間で検定され、例１３に従って２００μｌの脳ホモジェネートを使用し、パール（Parr）ボンベで粉砕し、８７．５μｌを検定に使用した。結果は以下のとおりである。
【０２１９】
【表７】
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【０２２０】
生まれたてのマウスは両側前脳に１μｌのβｇＬｕｃβＧＡn（３．６μｇ／μｌ：２０％スクロース）を注射され、組織は同様に処理され分析された。
【０２２１】
【表８】
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【０２２２】
例２４：インビボでのジストロフィーマウス筋肉におけるジストロフィンの機能的発現
ラウス肉腫（Rous Sarcoma）ウイルスのプロモータの制御下でジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが、完全なジストロフィンコード領域およびＳＶ４０ポリを含むＸｐ２１プラスミドから調製された。セグメントはクンケル（Kunkel）とその同僚によってクローン化されたものである（Brumeister M., Monaco AP, Gillard EF, van Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H.,デュシェーヌ（Duchenne）筋ジストロフィー遺伝子を含む、ヒトＸｐ２１の１０メガベースフィジカルマップ，Genomics 1988年４月２日(3)：189-202：Hoffman, EPおよびKunkel, Duchenne's/Becher  筋ジストロフィーのＬＭジストロフィンの異常。Neuron第２巻，1019-1029（1989）：Koenig M., Monaco AP, Kunkel LM.,ジストロフィンの完全な列は棒状のサイトスケルタル（cito-skeletal）蛋白質を予測する。Cell 1988年４月22日，53，(2)：219-26）。１００μｌの燐酸塩緩衝塩類溶液中２００μｇのプラスミドがジストロフィン遺伝子生産物が欠ける突然変異マウス系（ＭＤＸマウス：Jackson Labs）の四頭筋に注射された。機能的ジストロフィンの発現は、クンケル（Kunkel）から入手した同じ抗ジストロフィン抗体（蛍光２次抗体を有する抗−６０ｋｄ抗体）を使用するWatkinis他によって説明された手順に従って、免疫組織化学により注射後７日間モニターされた。ジストロフィーマウスのジストロフィン遺伝子生産物の機能的発現は、注射された動物からの四頭筋の切片において観察される蛍光パターンを、正常な動物で観察される蛍光パターンと比較することによって検出された。（Watkins S.C., Hoffman E.P., Slayter H.S., Kinkel L.M.）、筋原繊維におけるジストロフィンの免疫電子顕微鏡的位置測定（Nature 1988年６月30日：333（6176:863-6）。正常なジストロフィンの発現は、筋肉繊維のプラズマ膜下に局在化されるので、四頭筋の切片は細胞を取囲む蛍光パターンを与える。加えて、ジストロフィンの発現はアフィニティ精製された抗−６０ｋｄ抗体を使用するウェスタンブロット分析によって定量化された。
【０２２３】
例２５：デュシェーヌ筋ジストロフィーの患者の筋肉への修正ジストロフィン遺伝子の直接投与
筋ジストロフィーの患者は、１００μｌの燐酸緩衝生理食塩水中に機能的ジストロフィン遺伝子（前の例を参照）を含むプラスミド２００μｇを複数回注射される。軽い麻酔下にある間に、患者は手術をすることなく直接皮膚を介して骨格筋塊全体に５ｃｍ間隔で注射される。患者の回復は痙攣緊張および最大随意収縮をモニターすることによって評価された。加えて、注射された領域からの３００〜５００の筋肉細胞の生検が、組織学試験、筋肉構造の観察およびデュシェーヌ筋ジストロフィーの患者にないジストロフィンの存在の生化学分析のために採取される。肋骨ケージおよび横隔膜を動かす肋間筋を含む呼吸筋は、筋ジストロフィー患者において特に重要な障害筋肉類である。肋間筋は、他の骨格筋類が可能であるように、皮膚を介する注射によって到達可能である。横隔膜は、プラスミドＤＮＡの直接注射のため筋肉を露出させる外科的手法によってアクセス可能である。
【０２２４】
開示された発明の様々な修正、改良および応用があり、それは当業者に明らかであろうし、本発明の応用はかかる具体例をカバーすることを意図するものとする。本発明を好ましい具体例に関連して説明してきたが、本発明の全範囲は特許請求の範囲に基づいて定められるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  マウスの筋肉におけるＣＡＴ遺伝子の発現を示すクロマトグラフィー研究のオートラジオグラムからなる。
【図２】  ｐＲＳＶＬａｃ−Ｚ  ＤＮＡベクターを注射した後のベータ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色された筋肉組織の顕微鏡写真からなる。
【図３】  βｇＬｕｃＢｇＡnの筋肉への注射の後の筋肉におけるルシフェラーゼの活性に関するデータを提示する。
【図４】  ｐＲＳＶＬを注射した筋肉からの抽出液を分析した後のサザンブロットのオートラジオグラムを提示する。
【図５】  免疫原性ペプチドのための遺伝子の注射の後のマウスにおける抗体の生産を示すグラフを含む。
【図６】  免疫原性ペプチドのための遺伝子をトランスフェクションされたマウス細胞の注射の後の、マウスにおける抗体の生産を示すグラフからなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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