(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光物質標識体を用いる被検物質の測定において、遮光剤を加えることおよび／または化学発光物質標識プローブの標識比活性を減弱させることによって、化学発光量を減弱させることを特徴とする測定方法。
【請求項２】
遮光剤を加えることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
遮光剤として色素および／または墨汁を用いることを特徴とする請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
化学発光物質標識プローブの標識比活性を減弱させることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項５】
化学発光物質標識プローブに非標識プローブを加えて標識比活性を減弱させることを特徴とする請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
非標識プローブの量が、標識プローブ１に対して10〜103の範囲である請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
非標識プローブを加える前に、遮光剤を添加して、化学発光量を減弱させ、かつバックグラウンドのノイズレベルを低下させる請求項５に記載の測定方法。
【請求項８】
遮光剤が色素及び墨汁からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項７記載の測定方法。
【請求項９】
非標識プローブを加えた後に、遮光剤をさらに添加して、化学発光量を減弱させ、かつバックグラウンドのノイズレベルを低下させる請求項５に記載の測定方法。
【請求項１０】
遮光剤が色素及び墨汁からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項９記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、化学発光物質標識体を使った被検物質の測定方法に関する。詳しくは、化学発光量を減弱させることにより測定範囲を広げる測定方法に関する。
背景技術
検体溶液中の被検物質を測定する方法のひとつに、化学発光物質で標識したプローブを用いる方法がある。この方法は、化学発光量を測定することにより被検物質量を高感度に測定できるものとして広く用いられている。しかし、被検物質量が適量の場合はよいが、被検物質が多量に存在する場合（例えばPCR法等の遺伝子増幅法により多量のコピーが産生される場合）、化学発光量が測定機器の測定限界を越えてしまうため、正確な測定ができないという問題点があった。従来、このような測定限界を越える検体については、検体溶液を希釈後、再測定を行ってきた。この操作は非常に繁雑であり、特に遺伝子増幅法を用いて増幅を行った検体は、希釈操作によって増幅産物のコンタミネーションが起こり得るため、細心の注意が必要となり、さらに繁雑さを増していた。検体の希釈をせずに測定範囲を広げるには、測定機器の改良を待たざるを得なかった。
本発明者らは、測定限界を越える検体を測定する際に、検体の希釈といった繁雑な作業や測定機器の改良をしなくても、化学発光量を減弱させることにより上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
発明の開示
本発明は、化学発光物質標識体を用いる被検物質の測定において、化学発光量を減弱させることを特徴とする測定方法である。さらに、本発明は、遮光剤を加えることおよび／または化学発光物質標識プローブの標識比活性を減弱させることを特徴とする測定方法を提供するものである。
ここで、化学発光物質標識体を用いる被検物質の測定とは、例えば、被検物質を化学発光物質標識体と反応させ、その結合体の化学発光量を測定し、被検物質を検出または定量することをいう。
【図面の簡単な説明】
図１は、血清中のHBVテンプレートの定量的増幅・検出に対するフェノールレッド添加の効果を示したものである。
図２は、血清中のHBVテンプレートの定量的増幅・検出に対する非標識プローブ添加の効果を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
（１）遮光剤を加えて化学発光量を減弱させる場合
本発明において、用いる遮光剤は、化学発光に対して遮光効果のあるものであれば何でもよく、例えば色素、墨汁（墨滴、墨清等）等があげられる。色素の例としては、クリスタルバイオレット、プロモフェノールブルー、カルミン酸、クロロフェノールレッド、ヘマトキシン、ブロモフェノールパープル、ブロモフェノールレッド、ロソリン酸、フェノールレッド、クレゾールレッド、メタクレゾールレッド等があげられる。
遮光剤として色素を使用する場合、化学発光測定時での色素濃度は用いる色素によって異なるが、0.01％〜10％、好ましくは0.01％〜１％の範囲で添加することが可能である。また、遮光剤として墨汁を使用する場合、化学発光測定時での墨汁量は、被検液量に対して0.01％〜50％、好ましくは１％〜20％の範囲で添加することが可能である。遮光剤は、化学発光測定前ならいつでも添加でき、被検物質と標識プローブの反応前または反応後のどちらに添加してもよい。
（２）化学発光物質標識プローブの標識比活性を減弱させて化学発光量を減弱させる場合
本発明において、標識プローブの標識比活性を減弱させるには、標識を行っていない非標識プローブを標識プローブに加えることにより行う。非標識プローブの量は、標識プローブ１に対して0.1〜105、好ましくは10〜103の範囲で添加することが可能である。
（３）（１）法と（２）法を組み合わせる場合
本発明において、遮光剤を加える方法および化学発光物質標識プローブの標識比活性を減弱させる方法は、併用することができる。その際の使用条件は、上述の範囲となる。
本発明の測定方法を用いると、被検溶液中の被検物質が多量に存在して測定限界を越えてしまう場合でも、化学発光量を正確に測定することができる。例えば、微生物や細胞の遺伝情報（DNAあるいはRNA）を遺伝子増幅法にて増幅した産物についても、容易に被検物質を検出、定量できる。この作用は、後記実施例１〜実施例４により確認できる。
また、遮光剤を加える方法においては、陽性シグナルの減弱のみならず、バックグラウンド（ノイズ）レベルの減弱も認められる。このため、化学発光量の減弱により強陽性シグナルの量的測定が可能となるのみならず、バックグラウンド（ノイズ）レベルの低下により、低陽性シグナルの判別をすることも可能である。つまり、遮光剤の添加により低陽性検体の測定に何ら影響を与えることなく強陽性検体の測定が可能であるといえる。この作用は、後記実施例１〜実施例３により確認できる。
本発明を用いて化学発光量を減弱させることにより、強陽性検体あるいは測定限界を越える検体の検出、定量が可能になる。特に、遮光剤を加える方法においては、バックグラウンド（ノイズ）レベルも低下することから、低陽性検体の測定に何ら影響を与えることなく強陽性検体の測定が可能であるといえる。したがって、本発明の方法は、検体の希釈や測定機器の改良をすることなしに測定範囲を広げることができる、優れたものであるということができる。
実施例
以下、本発明をさらに詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれらの記載によって何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（方法）
HBV−DNA配列（Galibert,F.,Mandart,E.,Fitioussi,F.,Tiollais,P.and Charnay,P.Nature 281,646−650（1979）．）を含むヒト血清５μｌ（増幅あたり50〜5000コピー数）をアルカリ性溶液（pH13）20μｌと混合し、97℃、５分間加熱した。室温にて10分間放冷後、溶液を緩衝液にて中和した。２種類のプライマーを加え、室温にてアニーリングさせた後、DNAおよびRNAポリメラーゼを添加し、37℃にて遺伝子増幅反応（特表平４−500759号記載の方法を使用）を行った。増幅産物とアクリジウムエステルにて標識したプローブを60℃にてハイブリダイゼーションした後、HPA法（Arnold JR,L.J.,Hammond,P.W.,Wiese,W.A.and Nelson,N.C.Clinical Chemistry 35,1588−1594（1988）．）にて増幅産物の検出を行った。化学発光の測定による増幅産物の検出を行う際に、フェノールレッド添加の効果を検討した。化学発光測定用の被検液にフェノールレッドを0.05％を添加して化学発光量を測定し、フェノールレッドを添加していない被検液の測定結果と比較した。結果を図１に示す。
（考察）
図１から明らかなように、フェノールレッド非添加検体では、500GE（ゲノム等量）/AMP付近でほぼ測定限界（飽和値）に達し、それ以上の量では化学発光値の直線性は失われている。一方、フェノールレッド添加検体では、5000GE/AMPにおいても化学発光値の直線性は保たれている。したがって、フェノールレッドを添加することにより、500GE/AMP以上の測定が可能になったといえる。また、フェノールレッド非添加検体に対して、フェノールレッド添加検体では、バックグラウンド（ノイズ）レベル（DNA量＝０）が大きく低下したため、低陽性検体（50GE/AMP付近）の測定が可能であった。つまり、フェノールレッドの添加により低陽性検体の測定に何ら影響を与えることなく強陽性検体の測定が可能になったといえる。
［実施例２］
（方法）
実施例１と同様に遺伝子増幅した増幅産物の検出時に、種々の量のフェノールレッドを添加し、効果を検討した。化学発光測定用の被検液にフェノールレッド0.025〜0.2％を添加して化学発光量を測定し、フェノールレッドを添加していない被検液の測定結果と比較した。結果を表１に示す。
【表１】0003628332.tif 000002
（考察）
表１から明らかなように、フェノールレッドの添加量依存的に、陽性検体の化学発光量の減弱および陰性検体の化学発光量（バックグラウンド）の減弱が認められた。したがって、フェノールレッド濃度の広い範囲において本法が利用できることが示された。
［実施例３］
（方法）
フェノールレッドのかわりに市販品墨汁を用いて実施例２と同様に試験した。化学発光測定用の被検液に対して墨汁を容量にして1.25〜10％添加して化学発光量を測定し、墨汁を添加していない被検液の測定結果と比較した。結果を表２に示す。
【表２】0003628332.tif 000003
（考察）
表２から明らかなように、墨汁の添加量依存的に、陽性検体の化学発光量の減弱および陰性検体の化学発光量（バックグラウンド）の減弱が認められた。したがって、墨汁濃度の広い範囲において本法が利用できることが示された。
［実施例４］
（方法）
実施例１と同様に遺伝子増幅反応を行った。増幅産物とアクリジウムエステルにて標識したプローブを60℃にてハイブリダイゼーションする際、種々の量の非標識プローブを添加した。添加量は、標識プローブ１に対して非標識プローブ10〜1000の割合とした。ハイブリダイゼーション後、HPA法にて検体の化学発光量を測定し、非標識プローブを添加していない被検液の測定結果と比較した。結果を図２に示す。
（考察）
図２から明らかなように、非標識プローブ非添加検体では、500〜5000GE/AMP付近でほぼ測定限界（飽和値）に達し、それ以上の量では化学発光値の直線性は失われている。一方、非標識プローブ添加検体では、非標識プローブの添加量依存的に化学発光量の減弱が認められ、標識プローブに対する非標識プローブの添加量が1:100以上では500000GE/AMP付近においても測定可能であることが示された。したがって、非標識プローブを添加することにより、500〜500000GE/AMP以上の測定が可能になったといえる。
【図１】
0003628332.tif 000004
【図２】
0003628332.tif 000005