(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成し、以下の理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼＲ。
基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としてはトレハロースに作用し、二糖合成反応においては、糖供与体としてα−D −グルコース  １−リン酸に、糖受容体としてD −グルコースに作用する
至適pH：pH５．０から６．０（４５℃）
pH安定性：３０℃でそれぞれのpHで１時間処理したとき
pH３．５から１２．５の範囲で安定
至適温度：４５から５０℃（pH６．５）
温度安定性：pH５．５、３０分間処理したとき４２．５℃以下で安定
分子量：２００，０００〜２８０，０００ダルトン（ＧＰＣによる）
【請求項２】
リゾプス（Rhizopus）属の菌株によって生産されトレハロースと無機リン酸またはその塩に作用して、α−D −グルコース  １−リン酸とD−グルコースを生成し、およびα−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成する請求項１に記載のトレハロースホスホリラーゼＲ。
【請求項３】
リゾプス（Rhizopus）属に属する菌株がリゾプス  アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus）種の菌株である請求項２に記載のトレハロースホスホリラーゼＲ。
【請求項４】
リゾプス  アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus）種の菌株がリゾプス  アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus）ＩＦＯ  ３１９８９株である請求項３記載のトレハロースホスホリラーゼＲ。
【請求項５】
炭素源、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地にリゾプス（Rhizopus）属に属するトレハロースホスホリラーゼＲ生産株を培養しトレハロースホスホリラーゼＲを産生せしめ、次いで培養物からトレハロースホスホリラーゼＲを回収することからなる請求項１〜４のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼＲの調製法。
【請求項６】
α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成し、以下の理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼＣ。
基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としてはトレハロースに作用し、二糖合成反応においては、糖供与体としてα−D −グルコース  １−リン酸に、糖受容体としてD −グルコースに作用する
至適pH：pH５．０から６．０（４５℃）
pH安定性：３０℃でそれぞれのpHで１時間処理したとき
pH３．５から１２．５の範囲で安定
至適温度：４５から５０℃（pH６．５）
温度安定性：pH６．５、３０分間処理したとき５５℃以下で安定
分子量：３００，０００〜４００，０００ダルトン（ＧＰＣによる）
【請求項７】
カエトミウム（Chaetomium）属の菌株によって生産されトレハロースと無機リン酸またはその塩に作用して、α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースを生成し、およびα−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成する請求項６に記載のトレハロースホスホリラーゼＣ。
【請求項８】
カエトミウム（Chaetomium）属の菌株がカエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）種の菌株である請求項７記載のトレハロースホスホリラーゼＣ。
【請求項９】
カエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）種の菌株がカエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）ＩＦＯ  ９６７９株である請求項８記載のトレハロースホスホリラーゼＣ。
【請求項１０】
炭素源、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地にカエトミウム（Chaetomium）属に属するトレハロースホスホリラーゼＣ生産株を培養してトレハロースホスホリラーゼＣを産生せしめ、次いで培養物からトレハロースホスホリラーゼＣを回収することからなる請求項６〜９のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼＣの調製法。
【請求項１１】
請求項５又は１０に記載の方法により調製されたトレハロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でα−D −グルコース  １−リン酸とグルコースを反応させ、水性媒体中にトレハロースを産生せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１２】
請求項５又は１０に記載の方法により調製されたトレハロースホスホリラーゼとスクロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、グルコース、無機リン酸および／またはその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを産生せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１３】
請求項５又は１０に記載の方法により調製されたトレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびグルコースイソメラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、無機リン酸および／またはその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを産生せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１４】
請求項５又は１０に記載の方法により調製されたトレハロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でトレハロースと無機リン酸および／またはその塩からα−D −グルコース  １−リン酸を生成せしめ、これを回収することよりなるα−D −グルコース  １−リン酸の製造法。
【請求項１５】
請求項１〜４、及び６〜９のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でα−D −グルコース  １−リン酸とグルコースを反応させ、水性媒体中にトレハロースを生成せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１６】
請求項１〜４、及び６〜９のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼとスクロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、グルコース、無機リン酸および／またはその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを製造せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１７】
請求項１〜４、及び６〜９のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびグルコースイソメラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、無機リン酸および／またはその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを生成せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの製造法。
【請求項１８】
請求項１〜４、及び６〜９のいずれかに記載のトレハロースホスホリラーゼからなる酵素源の存在下、トレハロースと無機リン酸および／またはその塩からα−D −グルコース  １−リン酸を生成せしめ、これを回収することよりなるα−D −グルコース  １−リン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、トレハロースホスホリラーゼの製造方法およびその利用、新規なトレハロースホスホリラーゼ、特に温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼおよびその製造方法およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２(Enzyme Nomenclature1992、Academic Press )に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグレナグラシリス(Euglena gracilis）由来のＥＣ  ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告されている。また、フラムリナ  ベルチペス (Flammulina velutipes)より得られる酵素がα−グルコース  １−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるトレハロースホスホリラーゼとして報告されている（FEMS Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988))。
しかし、上記文献に記載されているフラムリナ  ベルチペス (Flammulina velutipes)由来のトレハロースホスホリラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。この酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安定性が低いためと考えられる。従って、その酵素としての性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいいがたい。また、α−グルコース  １−リン酸とグルコースからのトレハロースの生産性も満足できるものではない。
エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２ (Enzyme Nomenclature 1992、Academic Press) に記載されているＥＣ  ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼは、β−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成するトレハロースホスホリラーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述のような現状に鑑み、α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供することを課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラーゼの調製方法、さらにこれらトレハロースホスホリラーゼを用いたトレハロース、α−D −グルコース  １−リン酸の製造方法を提供することを課題とする。
本発明は各種の糸状菌からα-D- グルコース  1-リン酸とD-グルコースからトレハロースを生産する酵素を見いだしたことによりなされたものであり、β−D −グルコース  １ーリン酸とD −グルコースとからトレハロースを生産する上記公知の酵素とは明らかに基質特異性が異なりまったく別種の酵素である。以下、本発明において述べるトレハロースホスホリラーゼとは、α−D −グルコース１−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成することができる酵素である。
すなわち、本発明は、第一に、従来トレハロースホスホリラーゼの産生が知られていない微生物によるトレハロースホスホリラーゼの調製方法に関するものである。第二に、温度安定性に優れ、より高温で反応する二つの新規トレハロースホスホリラーゼに関するものである。第三に、トレハロースホスホリラーゼ生産微生物により調製されたトレハロースホスホリラーゼまたは温度安定性に優れた新規トレハロースホスホリラーゼを利用してトレハロースあるいはα−D −グルコース  １−リン酸を製造する製造方法に関するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースから温度安定性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリラーゼ生産微生物を求め鋭意研究した結果、アクレモニウム（Acremonium）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアスクス（Thermoasucus）属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミセス（Tyromyces)属に属する微生物を培養することにより、これら微生物がトレハロースホスホリラーゼを生産することを新たに見いだした。また、これら微生物の培養物から得られるトレハロースホスホリラーゼは、温度安定性に優れていることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、従来トレハロースホスホリラーゼを生産することが知られていない微生物によるトレハロースホスホリラーゼの製造方法に関するものである。具体的にはアクレモニウム（Acremonium）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアスクス（Thermoasucus）属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミセス（Tyromyces)属に属しトレハロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からトレハロースホスホリラーゼを採取することからなるトレハロースホスホリラーゼの製造法である。
【０００６】
また、本発明は、従来知られているトレハロースホスホリラーゼより、高温で反応する新規トレハロースホスホリラーゼに関するものであり、また、他の発明は、リゾプス（Rhizopus）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属する微生物を培養し、培養物から新規トレハロースホスホリラーゼを採取することからなるトレハロースホスホリラーゼの製造法である。
【０００７】
また本発明は上記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性に優れた新規トレハロースホスホリラーゼを用い、α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを製造するトレハロースの製造法に関するものである。また、本発明は上記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性に優れた新規トレハロースホスホリラーゼを用いトレハロースからα−D −グルコース  １−リン酸を製造するα−D −グルコース  １−リン酸の製造法に関するものである。
【０００８】
以下本発明を具体的に説明する。
本発明において使用する微生物は、アクレモニウム（Acremonium）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアスクス（Thermoasucus）属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミセス（Tyromyces)属に属し、トレハロースホスホリラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。また、これらトレハロースホスホリラーゼ生産菌由来のトレハロースホスホリラーゼｃＤＮＡを異種の微生物の発現ベクターに組み込み、異種の微生物にこれらトレハロースホスホリラーゼを発現できるように改良した菌株を利用することもできる。
【０００９】
具体的なトレハロースホスホリラーゼ生産菌としては、アクレモニウム  アラバメンセ（Acremonium alabamense）ＩＦＯ  ３２２４１、ビソチラミス  ニベア（Byssochlamys nivea)ＩＦＯ  ３０５６９、セルコスポーラ  ベチコラ（Cercospora beticola）ＩＦＯ  ７３９８、カエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）ＩＦＯ  ９６７９、グロメレラ  シングラタ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ７４７８、フミコラ  グリセア（Humicola grisea）ＩＦＯ  ９８５４、ミセリオフィソーラ  サーモフィラ（Myceliophthora thermophila)ＩＦＯ  ３１８４３、リゾムコール  プシルス（Rhizomucor pusillus）ＩＦＯ  ４５７９、リゾムコール  ミエヘイ (Rhizomucor miehei) ＩＦＯ  ９７４０、リゾプス  キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ  ３０４９９、リゾプス  キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ  ４７６８、リゾプス  キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ  ４７３７、リゾプス  アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus)ＩＦＯ  ３１９８９ 、リゾプス  ミクロスポルス（Rhizopus microsporus)ＩＦＯ  ３１９８８、ロゼリニア  ネカトリクス（Rosellinia necatrix）ＩＦＯ  ５９５４、スクレロチニア  スクレオチオルム(Sclerotinia sclerotiorum) ＩＦＯ  ４８７６、スポリジオボルス  ジョンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ  ６９０３、ステリグマトミセス  ハロフィルス(Sterigmatomyces halophilus）ＩＦＯ  １４８８、サーモアスクス  オウランチアクス (Thermoasucus aurantiacus)ＩＦＯ  ３１６９３、チエラビア  テレストリス(Thielavia terrestris）ＩＦＯ  ９７３２、チエラビア  アレナリア(Thielavia arenaria）ＩＦＯ  ３１０６０およびチロミセス  パルストリス(Tyromyces palustris)ＩＦＯ  ３０３３９等の菌株を使用することができる。
【００１０】
また、本発明により得られたリゾプス（Rhizopus）属由来のトレハロースホスホリラーゼ（以下、「トレハロースホスホリラーゼＲ」と呼称する）は、次の理化学的性質を有する。
１．作用：α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在下トレハロースに作用してα−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースを生成する。
２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としてはトレハロースに作用する。二糖合成反応においては、糖供与体としてα−D −グルコース  １−リン酸に、糖受容体としてD −グルコースに作用する。
３．至適作用pH：
トレハロース合成反応（４５℃）
最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から６．７
４．pH安定性：
トレハロース合成反応：３．５から１２．５  （３０℃、１時間）
５．至適反応温度：
トレハロース合成反応（pH５．５）
最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４２．５から５０℃
６．温度安定性：
トレハロース合成反応：４２．５℃、３０分にて安定（pH６．５）
７．分子量：２００，０００〜２８０，０００ダルトン（ＧＰＣによる）
【００１１】
また、本発明により得られたカエトミウム（Chaetomium）属由来のトレハロースホスホリラーゼ（以下「トレハロースホスホリラーゼＣ」と呼称する）は、次の理化学的性質を有する。
１．作用：α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在下トレハロースに作用してα−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースを生成する。
２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としてはトレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与体としてα−D −グルコース  １−リン酸に、糖受容体としてD −グルコースに作用する。
３．至適作用pH：
トレハロース合成反応（４５℃）
最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から６．７
４．pH安定性：
トレハロース合成反応：３．５から１２．５  （３０℃、１時間）
５．至適反応温度：
トレハロース合成反応（pH５．５）
最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４５から５０℃
６．温度安定性：
トレハロース合成反応：５５℃、３０分にて安定（pH６．５）
７．分子量：３００，０００〜４００，０００ダルトン（ＧＰＣによる）
【００１２】
α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成することができる上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従来報告がなく本発明において、初めて報告される。
【００１３】
また、本発明者らは、リゾプス（Rhizopus）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属する微生物がこれら新規なトレハロースホスホリラーゼを生産することを見いだした。本菌属中にこのような酵素が存在することは従来知られていない。該新規トレハロースホスホリラーゼを生産する微生物は、リゾプス（Rhizopus）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属し、トレハロースホスホリラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。また、本発明においては上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼを生産することができる任意の微生物を使用することもできる。
【００１４】
本発明の新規トレハロースホスホリラーゼはまた、上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼ、またはその修飾されたトレハロースホスホリリーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿主に挿入し、そしてその宿主を培養することにより製造することができる。
【００１５】
また、本発明においては、上記理化学的性質を持った新規トレハロースホスホリラーゼと免疫化学的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用することもできる。本発明における免疫化学的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリラーゼとは、公知のオクテロニー(Ouchterlony) 二重免疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８６、東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるいは部分融合するような沈降線を与えるトレハロースホスホリラーゼである。
【００１６】
上記新規トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび上記理化学的性質を持ち温度安定性に優れた新規トレハロースホスホリラーゼによるトレハロースあるいはα−D −グルコース  １−リン酸の製造法については従来知られていない。
【００１７】
次に、本発明において用いる微生物を培養する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、グリセロール、スターチ、廃糖蜜などの一般的に使用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロースを適宜用いてもよい。
【００１８】
窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さらに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属塩を使用することができる。他に種々の界面活性剤を消泡剤として使用することもできる。
【００１９】
培養は、培養温度約２０から７０℃、好ましくは２５から６０℃、培地の初発pHは４．０から９．０、好ましくは５．０から８．０として、液体振とう培養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等により好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培養等により行なわれる。
【００２０】
酵素源からのトレハロースホスホリラーゼの調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にあるので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレハロースホスホリラーゼの分離精製は、次のようにして行うことができる。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出する方法は、培養終了後の培養菌体を遠心分離し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当量の緩衝液に懸濁し、従来から行われている超音波による菌体破砕、ワーリングブレンダーTM（ダイナミック社、ＵＳＡ）による菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕などがある。破砕した後不溶物を分離除去して得られる液を粗酵素液とする。粗酵素液はそのままトレハロースまたはα−D −グルコース  １−リン酸の製造に用いることもできるが、さらに分離、精製して用いることもできる。
【００２１】
粗酵素液の分離、精製法としては、硫安沈澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイドロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このようにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いてもよいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルアミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生体触媒として用いることもできる。
【００２２】
酵素の活性は、以下により求めた。すなわちトレハロース１０．８g 、グルタチオン８６０mg、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．２mgを５７ mM リン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に溶解し精製水で全量を１００mlとした溶液１４００μｌ、２０mMＮＡＤＰ+ 水溶液１００μｌ、２６ mM 塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．３４ mM グルコース  １，６−二リン酸水溶液１００μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml水溶液１００μｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml水溶液１００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合し、５０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm の吸光度によって経時的に測定する。この条件下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を１単位とする。
【００２３】
本発明のトレハロースホスホリラーゼを利用して、α−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースからトレハロースを製造するためには、α−D −グルコース  １−リン酸５mMから４M 、好ましくは５０mMから３M 、D −グルコース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質D −グルコース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２４】
本発明のトレハロースホスホリラーゼを利用して、スクロースとD −グルコースからトレハロースを製造するためには、スクロース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３M 、D −グルコース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよび無機リン酸および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２５】
本発明のトレハロースホスホリラーゼを利用して、スクロースからトレハロースを製造するためには、スクロース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼおよび無機リン酸および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。グルコースイソメラーゼは基質スクロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。これらの酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２６】
スクロースホスホリラーゼは公知の酵素であり、スクロースと無機リン酸および／またはその塩からα−グルコース  １−リン酸とフラクトースを生成する酵素であればいかなる起源の酵素でも用いることができる。市販品を用いる他、これら酵素を生産する微生物を培養して得たものを用いることもできる。具体的には、ロイコノストック  メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、シュードモナス  サッカロフィラ(Pseudomonas saccharophila)等の微生物によって生産されるスクロースホスホリラーゼを用いることができる。
【００２７】
グルコースイソメラーゼは、フラクトースからグルコースを生成する酵素であればいかなる起源の酵素でも用いることができる。市販品を用いる他、これら酵素を生産する微生物を培養して得たものを用いることもできる。具体的には、ストレプトミセス（Streptomyces）、アースロバクター（Arthrobacter）等の微生物によって生産されるグルコースイソメラーゼを用いることができる。
【００２８】
本発明のトレハロースホスホリラーゼ酵素を利用して、トレハロースからα−D −グルコース  １−リン酸を製造するためには、トレハロースを５mMから３M 、好ましくは５０mMから２M 、無機リン酸およびその塩５mMから３M 、好ましくは５０mMから２M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５〜８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質トレハロース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２９】
本発明の方法において使用する無機リン酸および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸およびその塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液の形態で用いる。
【００３０】
本発明の酵素を用いてトレハロースあるいは無機リン酸を定量することができる。反応式１に示すようにトレハロースと無機リンから本発明により調製したトレハロースホスホリラーゼによりα−D −グルコース  １−リン酸とグルコースを生成させる。
【００３１】
【化１】
0003635133.tif 000002
【００３２】
さらに、反応式２、反応式３に示すようにホスホグルコムターゼ（EC 2.7.5.1、酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８２年による、以下同じ）およびD −グルコース−６−リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.49)を組み合わせる。つまり反応式１に示す反応によって生成したα−D −グルコース  １−リン酸を反応式２に示す反応によってD −グルコース  ６−リン酸に変換し、このD −グルコース  ６−リン酸を反応式３に示す反応によって６−ホスホ−D −グルコン酸に変換する。この反応式３に示す反応は、補酵素を必要とし、ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ をそれぞれＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨに変換する。このＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの生成を３４０nmにおける吸光度の増加を測定することによりトレハロースあるいは無機リン酸を測定することができる。
【００３３】
【化２】
0003635133.tif 000003
【００３４】
【化３】
0003635133.tif 000004
【００３５】
さらに、反応式１で生成したグルコースを、ムタロターゼ（EC 5.1.3.3）、グルコースオキシダーゼ（EC 1.1.3.4）およびペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7)を組み合わせる公知の方法により測定し、トレハロースあるいは無機リン酸を測定することもできる。
【００３６】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
【実施例１】
ポテト−スクロース培地１０００mlに酵母エキス１g とリン酸二水素ナトリウム０．５g を加え溶解し、pHを５．６に調整した。この水溶液１００mlを３００ ml 三角フラスコに分注し滅菌し（１２０℃、１５分間）種培養培地を調製した。滅菌後、リゾプス  キネンシス (Rhizopus chinensis)ＩＦＯ−３０４９９株を接種し、２５℃、４日間往復振とう培養（１３０ｒｐｍ）し種培養とした。トレハロース３０g 、リン酸二水素ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g を精製水にて溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調整し、培地を調製した。この培地１００mlを３００ml三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、この培地に前記調製した種培養液５ ml を接種し、２８℃、１７０ｒｐｍにて３日間培養を行った。
【００３８】
培養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０% グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心により上清液２８６mlを得た。この粗酵素液を２０ mM トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６５０Ｃ（トーソー社）イオン交換カラム（５０ ml)に通し、１６０mlの同じ緩衝液にて洗浄後２０ mM トリス緩衝液（３００ml) と０．５M 塩化カリウム含有２０ mM トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線濃度勾配溶出を行った。酵素活性画分は１２１mlであった。この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパールTM（トーソー社）カラム（２５ml) に通した。このカラムを７０mlの３０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液（４００ml) を用いて直線濃度勾配溶出を行った。１０mlづつ分取した結果、フラクション２６〜３９に酵素活性が検出された。酵素活性画分は１５０mlであった。ホローファイバー限外濾過濃縮装置により濃縮し、部分精製酵素液３．６mlを得た。この部分精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ１．７単位／ml、６．１単位であった。
【００３９】
【実施例２】
表１から選ばれた一菌株を、ＹＭ培地（デフコ）にて種培養し種菌とした。酵母エキス６g 、麦芽エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース１０g およびトレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、pHを６．２に調整し培地を調製した。この培地１００mlを３００ ml 三角フラスコに入れ滅菌し、種菌を接種し、表１に示す培養温度、培養期間にて培養を行った。このようにして得た培養液から菌体を集め、２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心により粗酵素を調製した。各菌株の粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性を表１に示す。
【００４０】
【表１】
0003635133.tif 000005
【００４１】
【実施例３】
酵母エキス１０g 、バクト−ペプトン２０g 、トレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、pHを６．０に調整した。この培地１００mlを３００ ml 三角フラスコに分注し、滅菌した。滅菌後、この培地二本にスポリジオボルス  ジョンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ  ６９０３あるいはステリグマトミセス  ハロフィルス(Sterigmatomyces halophilus）ＩＦＯ１４８８株を接種し２５℃、２日間振とう培養した。培養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、超高速振動破砕装置（マイケル社）にて１５分間細胞破砕を行い、遠心分離により不溶物を分離し上清液をそれぞれ２０、３４mlを得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性はスポリジオボルス  ジョンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ  ６９０３株では０．４６単位／ml、９．３単位、ステリグマトミセス  ハロフィラス(Sterigmatomyces halophilus) ＩＦＯ１４８８株では０．１４、４．６単位であった。
【００４２】
【実施例４】
チロミセス  パルストリス(Tyromyces palustris)ＩＦＯ  ３０３３９株をＹＭ培地にて種培養した。酵母エキス７．５g 、麦芽エキス２g 、リン酸一カリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．５g 、グルコース４０g を１０００mlに溶解し、pHを５．５に調整した培地を３００ ml 三角フラスコに１００mlづつ分注し滅菌した。この滅菌した三角フラスコ２本に前記種培養を接種し、２５℃、７日間振とう培養した。培養後実施例１と同様にして、粗酵素液を調製した。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は０．１６単位／ml、７．３単位であった。
【００４３】
【実施例５】
表２の菌株群から選ばれた各菌株を以下のように、培養、粗酵素調製、部分精製酵素調製を行い、部分精製酵素液を得た。各菌株をグルコース１０g 、トレハロース２０g 、酵母エキス２０g 、リン酸一カリウム２g 、リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシウム７水和物０．２g を１０００mlの精製水に溶解しpHを６．３に調製した。この培地を３００ ml 三角フラスコに１００mlづつ分注し、滅菌した。この１０本の培地に、酵母エキス６g 、麦芽エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース５g 、トレハロース２０g からなる種培養培地（pH６．２）にて各菌株を種培養した種培養を接種し、表２に示す培養温度、培養期間で培養を行った。
培養後、実施例１と同様な方法にて粗酵素液を調製した。その粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ酵素活性、総活性を表２に示した。また、この粗酵素液をＤＥＡＥ−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィー、ブチル−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィーにより部分精製し、さらにホローファイバーを用いた限外濾過により濃縮し、部分精製酵素液を得た。この部分精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性を表２に示す。活性はすべて５０℃で測定した。
【００４４】
【表２】
0003635133.tif 000006
【００４５】
【実施例６】
グロメレラ  シングラータ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ  ７４７８株をＹＭ培地（デフコ）にて２８℃、４日間振とう培養した。酵母エキス２０g 、リン酸一ナトリウム０．５g 、塩化カリウム１g 、硫酸マグネシウム７水和物０．２g およびトレハロース３０g を１０００mlに溶解し、pHを６．３に調整し培地を調製した。この培地に種培養を接種し、２８℃、４日間振とう培養を行った。培養後、実施例１と同様に、菌体を遠心により集菌、洗浄し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）により菌体破砕を行い、遠心により上清を粗酵素液として得た。グロメレラ  シングラータ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ  ７４７８株由来の粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ０．０１４単位／ml、１．５単位であった。
【００４６】
【実施例７】
ポテト−スクロース培地１０００mlに酵母エキス１g とリン酸水素ナトリウム０．５g を加えpH５．６に調整し種培養培地を調製した。この培地１００mlを３００ml三角フラスコに分注し滅菌した（１２０℃、１５分間）。滅菌後、カエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermopholum）ＩＦＯ  ９６７９株を接種し、３５℃、６日間往復振とう培養（１５０ｒｐｍ）し、種培養とした。培養は、トレハロース３０g 、リン酸水素一ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g を精製水にて溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調整した。この本培養培地１００mlを３００ ml 三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、前培養液５mlを接種し、３５℃、１５０ｒｐｍにて６日間培養を行った。
【００４７】
培養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、菌体を２０mMトリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心分離により不溶物を除き上清液２７５mlを得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性は  ０．０５単位／ml、総活性１４単位であった。この粗酵素液を２０mMトリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６５０Ｃ（５０ml）イオン交換カラムに通し、１６０mlの同じ緩衝液にて洗浄後２０mMトリス緩衝液（３００ml）と０．５Ｍ塩化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml）を用いて直線濃度勾配溶出により酵素活性画分２１５mlを得た。この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０mMトリス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパールTM（２５ml）カラムに通した。このカラムを３０％飽和硫安含有トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和硫安含有トリス緩衝液（４００ml）を用いて直線濃度勾配溶出を行った。９．７mlの分画を行った結果、フラクション３１〜４６に酵素活性が検出され、酵素活性画分１５４mlを得た。ホローファイバー限外濾過濃縮装置により濃縮し、部分精製酵素液３．６mlを得た。この部分精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ３．１単位／ml、１１単位であった。活性画分を２０ mM リン酸緩衝液で平衡化したＴＳＫ gelTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ×３００mm、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより精製を行った。ＵＶ２８０nmで検出すると９．５分に１本のピークが見られた。このピークが活性ピークであった。この時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持時間から分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約３８０，０００であった。
【００４８】
【実施例８】
リゾプス  アザイゴスポルス（Rhizopus azygosporus)ＩＦＯ  ３１９８９株を酵母エキス６g 、麦芽エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース５g 、トレハロース２０g からなる種培養培地（pH６．２）にて種培養を行った。酵母エキス２０g 、グルコース１０g 、トレハロース２０g 、リン酸一カリウム  4 ２g 、リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシウム７水和物０．２g を精製水１０００mlに溶解し、pH６．２に調整し培地を作製した。この培地１００mlを３００ml三角フラスコに入れ滅菌し、種培養を各３ ml 接種し、２７．５℃、７日間培養をおこなった。
【００４９】
培養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心分離により不溶物を除き上清液３８５ ml を得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性は０．５６単位／ml、総活性２１７単位であった。活性測定は反応温度を５０℃で行った以外は前記の方法に準じた。
【００５０】
この粗酵素液を２０ mM トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６５０Ｃ（５０ml) イオン交換カラムに通し、１６０ ml の同じ緩衝液にて洗浄後２０ mM トリス緩衝液（３００ml) と０．５M 塩化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線濃度勾配溶出により酵素活性画分を１３０ ml を得た。この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパールTM（２５ml）カラムに通した。このカラムを３０％飽和硫安含有トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和硫安含有トリス緩衝液（４００ml) を用いて直線濃度勾配溶出を行った。酵素活性画分１０３mlを得た。この活性画分を透析しスーパーＱ  トヨパールTMカラムによりさらに精製し、活性１２単位／ml、総活性１１３単位の部分精製酵素液を得た。この酵素液を２０ mM リン酸緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ×３００mm、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製を行った。ＵＶ２８０nmで検出すると１０．３分に１本のピークが見られた。このピークが活性ピークであった。この時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持時間から分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約２３０，０００であった。
【００５１】
【実施例９】
実施例７および８により得られた精製酵素を用いて酵素の基質特異性、至適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性を調べた。トレハロースの定量は以下の方法により行なった。
【００５２】
トレハロースの定量法：
反応液をポリアミンカラム（ＹＭＣ  ＰａｃｋTM  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ II ４．６mmφ×２５０mm、ＹＭＣ社製）、溶離液アセトニトリル：水＝７０：３０、流速１ml／分、カラム温度３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求めた。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時間は１５．７分であった。
【００５３】
トレハロースホスホリラーゼＣおよびトレハロースホスホリラーゼＲ
［基質特異性］
加リン酸分解反応：
本酵素を用いて各種糖類の加リン酸分解反応を行なった。トレハロースからはα−D −グルコース  １−リン酸とD −グルコースが生成した。
二糖合成反応：
本酵素を用いて各種単糖とα−D −グルコース  １−リン酸による二糖合成反応を行なった。D-グルコース以外のL −グルコース、D −ガラクトース、D −マンノース、D −キシロース、D −フラクトース、D −ソルビトール、D −マンニトール、D −フコースは反応しなかった。
【００５４】
［至適pH］
緩衝液として酢酸緩衝液（pH３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用いた。各pHにおいて４５℃、１２時間反応を行ない生成したトレハロース量を上述の方法により定量し酵素活性を求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣおよびＲの至適pH範囲をそれぞれ図１および２に示す。
【００５５】
［pH安定性］
緩衝液として酢酸緩衝液（pH３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用いた。各トレハロースホスホリラーゼを各pHに、３０℃、１時間放置した。放置後、４５℃、１２時間反応させ生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し各pHにおける酵素活性を求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣおよびＲのｐＨ安定性の範囲をそれぞれ図３および４に示す。
【００５６】
［至適温度］
ＭＥＳ緩衝液（pH５．５）を用い、温度３０℃から５５℃の所望の温度で５時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣおよびＲの至適温度範囲をそれぞれ図５に示す。
【００５７】
［温度安定性］
トレハロースホスホリラーゼを２０ mM リン酸緩衝液（pH７．０）中、温度４２．５℃から５５℃の所望の温度に３０分間放置した。放置後、４５℃、５時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣ、Ｒの温度安定性の範囲をそれぞれ図６に示す。
【００５８】
【実施例１０】
実施例７、８により得た部分精製酵素を用いてα−D −グルコース  １−リン酸とグルコースからトレハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコース１−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００ mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および部分精製酵素４単位／mlを用いて、トレハロース合成反応を各温度で、２４時間行った。その結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0003635133.tif 000007
【００６０】
【実施例１１】
実施例７、８により得た部分精製酵素を用いてトレハロースと無機リン酸からα−D −グルコース  １−リン酸の生成の検討を行った。トレハロース１００mM、１００ mM リン酸緩衝液（pH７．０）および部分精製酵素４単位／mlを用いて、α−D −グルコース  １−リン酸の生成反応を４５℃、２４時間行った。その結果、カエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）ＩＦＯ９６７９株およびリゾプス  アザイゴスポルス(Rhizopus  azygosporus) ＩＦＯ３１９８９株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵素において、それぞれ６０mM、５４mMのα−D −グルコース  １−リン酸が生成した。α−D −グルコース  １−リン酸の定量は以下の方法により行った。
【００６１】
α−D −グルコース  １−リン酸の定量法：
０．５M リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、１．０M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μｌ、１４．８ mM ＮＡＤＰ+ 水溶液５０μｌ、２６ mM 塩化マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４ mM α−D −グルコース  １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml水溶液２５μｌ（０．７８単位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm で吸光度測定しα−D −グルコース  １−リン酸量とした。
【００６２】
【実施例１２】
実施例５により得た部分精製酵素を用いてα−D −グルコース  １−リン酸とグルコースからトレハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコース  １−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００ mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および実施例５により得た部分生成酵素４単位／mlを用いて、トレハロース合成反応を各温度、２４時間行った。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
0003635133.tif 000008
【００６４】
【実施例１３】
実施例７により得たカエトミウム  サーモフィルム（Chaetomium thermophilum) ＩＦＯ  ９６７９株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵素、実施例５により得たアクレモニウム  アラバメンセ (Acremonium alabamense) ＩＦＯ  ３２２４１およびチエラビア  アレナリア(Thielavia arenaria) ＩＦＯ３１０６０株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵素を用いてトレハロース合成反応を行った。３３０ mM グルコース、３３０ mM スクロース、２００ mM ＭＥＳ緩衝液、２０ mM リン酸緩衝液および各トレハロースホスホリラーゼ酵素液１単位／ml、市販のスクロースホスホリラーゼ（シグマ社）１単位／mlからなる反応組成液を表５に示す反応温度および反応ｐＨにて反応させた。反応時間２０および３０時間後のトレハロース生成量を表５に示す。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
【発明の効果】
本発明により、従来トレハロースホスホリラーゼの生産が知られていない微生物によるトレハロースホスホリラーゼの調製法が提供される。また、従来のトレハロースホスホリラーゼと比較して高い温度で反応できる新規なトレハロースホスホリラーゼが提供される。また、カエトミウム（Chaetomium）属またはリゾプス (Rhizopus) 属に属する微生物を培養することにより該新規トレハロースホスホリラーゼの調製法が提供される。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを利用したα−D −グルコース  １−リン酸およびトレハロースの製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明トレハロースホスホリラーゼＣの至適pH範囲を示すグラフである。
【図２】本発明トレハロースホスホリラーゼＲの至適pH範囲を示すグラフである。
【図３】本発明トレハロースホスホリラーゼＣのpH安定性範囲を示すグラフである。
【図４】本発明トレハロースホスホリラーゼＲのpH安定性範囲を示すグラフである。
【図５】本発明トレハロースホスホリラーゼＣおよびトレハロースホスホリラーゼＲの至適反応温度範囲を示すグラフである。
【図６】本発明トレハロースホスホリラーゼＣおよびトレハロースホスホリラーゼＲの温度安定性範囲を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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