(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤タンパク質の調製物の溶液を熱交換器において、＋６５℃〜８０℃の加熱温度、各２秒の加熱および冷却時間、０.１〜２０秒の滞留時間で間接加熱することより成り、該タンパク質の性質に悪影響を与えず前記タンパク質の調製物中のウイルスを不活化する方法。
【請求項２】
滞留時間が０.５〜５秒である請求項１記載の方法。
【請求項３】
組織トロンボプラスチンの溶液が加熱される請求項１または２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はタンパク質調製物中のウイルスの不活化方法に関する。これを行うためにはタンパク質調製物の溶液を短時間加熱する。
【０００２】
本発明におけるタンパク質とは胎盤タンパク質、血漿タンパク質、細胞培養または微生物発酵で得られるタンパク質を意味する。このタイプのタンパク質の一例は組織トロンボプラスチンである。
【０００３】
プロトロンビン時間の迅速測定に用いられる試薬は活性成分として組織トロンボプラスチンを含有する。プロトロンビン時間は凝血障害診断における重要なスクリーニング試験である。
【０００４】
さらに、組織トロンボプラスチンをＦ ＶIIIバイパス剤として療法的に用いることが血友病の阻害剤治療として示唆されている。この用途には、調製物のウイルス安全性が必要不可欠の前提要件である。しかしながら、使用者の健康保持を考えると、組織トロンボプラスチンを診断助剤として用いる場合もウイルス安全性が要求される。
【０００５】
現在、プロトロンビン時間試薬調製用組織トロンボプラスチンは通常哺乳動物の脳または胎盤から採取される。このタイプの調製物の場合、ヒト起原の調製物についてはＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどのウイルスの、あるいはウシの場合にＢＳＥを引き起こす原因体による汚染を原則として排除できない。このことは、組織トロンボプラスチン調製物におけるウイルス不活化方法が極めて重要であることを意味している。
【０００６】
今日になるまで、確立された方法（洗剤、次亜塩素酸塩、ＵＶ／ガンマ線照射など）によるウイルス不活化の試みは調製物の感度が高いために失敗している。特に、低温殺菌や乾熱の企みはことごとく不成功に終っている。
【０００７】
驚くべきことに、例えばChem. -Ing. -Tech. 62. 486〜487 (1990)、（ドイツ特許出願第３９ ０５ ０６６号に開示された装置で短時間加熱すると、組織トロンボプラスチンの性質は悪影響を受けず、他方でウイルスが完全に不活化されることがわかった。既知のウイルス不活化方法（低温殺菌、“乾熱”）では、加熱は通常少くとも１分間行われるが数時間行われるのが普通である。
【０００８】
本発明は胎盤タンパク質、血漿タンパク質または細胞培養でまたは微生物的に調製されたタンパク質よりなる群よりのタンパク質の調製物の溶液を短時間加熱することより成る前記タンパク質の調製物中のウイルスの不活化方法に関する。
【０００９】
加熱は熱交換器における間接加熱により行われる。適当な熱交換器は所望の任意の構造タイプのもの、例えばプレート型交換器または管型交換器であってよい。
【００１０】
独特許出願３９ ０５ ０６６に開示されているような熱交換器は、熱伝達係数が高い一方で滞留時間を短くそして壁温を低くできるので特に適している。
【００１１】
この熱交換器は、間にスペーサを配設した積み重ねた金属箔より成り、該金属箔は対向面の各々に少くとも２個の開口を設けた金属カード（card）で構成され、スペーサはカードを積み重ねたときに開口が管状通路を形成するように前記金属カードと一致する織布（fabric）カードで構成され、該織布カードの取囲みリムおよび開口の一部を取囲む織布の環状域にはシーリング剤が充填され、そして織布カードの列および管状通路においてシーリング剤を有するおよび有しない開口が交互となっている熱交換モジュールである。
【００１２】
加熱温度は＋４５℃〜＋９５℃であってよいが、好ましくは＋６５℃〜８０℃である。
【００１３】
給入された液体を最少時間で特定の加熱温度に加熱後再び同じ時間で冷却するために、加熱が行われる装置に加熱媒体と冷却媒体の各々のためのコネクタを設けておくのが便利である。
【００１４】
熱交換器の構造設計は、溶液に対する加熱温度と加熱媒体の温度の差が最小となり、その結果得られる壁温が低くなるために製品に対する損傷が最小となるようなものとすべきである。
【００１５】
加熱および／または冷却時間は、３０秒以下、好ましくは５秒以下とすべきである。ドウエル時間（dwell time）は０.１〜２０秒であってよいが好ましくは０.５〜５秒である。
【００１６】
タンパク質調製物は、例えば、組織トロンボプラスチン含有療法剤、または組織トロンボプラスチン含有診断剤、例えばプロトロンビン時間試薬であってよい。
【００１７】
以下の実施例では、Behringmerke AG社のヒト胎盤由来組織トロンボプラスチン含有プロトロンビン時間試薬であるRThromborel Ｓの例による短時間加熱によるウイルス不活化を示すが、これは本発明を限定するものではない。不活化の成功度を調べた。４５℃以上、好ましくは６５℃以上の加熱温度で、完全なウイルスの不活化が認められた。短時間加熱された試薬の診断特性を未処理RThromborel Ｓのそれらと比較した。少くとも７５℃の加熱温度まではこれらの性質に不利な変化はみられなかった。
【００１８】
【実施例】
短時間加熱の手順
このために２個の熱交換器（図１のＷ １.１およびＷ １.２）を市販の限外濾過カセットホルダーに本質的に相当する普通の固定具に取り付けた。それら熱交換器はモジュール構造を有しそして、特別に作られたスペーサプレートにより相互を離間した。
【００１９】
これによりそれら熱交換器を、給入液体が２秒以内に特定の加熱温度に加熱された後、同じ時間で再び冷却されるように接続することが可能となった。このために、加熱媒体および冷却媒体の各々のためのコネクタを装置に設けた。前記加熱温度におけるドウエル時間は約１.５秒とした。
【００２０】
本プロセスを開始する前に製品例の全システムに水を流しそして該システムを運転温度まで加熱した。このために、ポンプＰ１（図１）が所要の加熱温度に達するまでシステムを通して加熱媒体を輸送した。それを次に水から、加熱されるべき溶液に変え、また対照試験では次いでポンプＰ２に切り換えてウイルスの懸濁液を定量給入した。加熱前、および２０または４８秒の実験的に測定された最少試験時間の後に、サンプルを採取した。
【００２１】
ウイルス不活化の結果（表１）
対照として、組織トロンボプラスチンの溶液を室温でシステムに通した。結果は、無コート耐熱性ポリオウイルスについてのすべての試験において１０の５乗以上のウイルス不活化が達成されたことを示している。ヘルペスウイルスＨＳＶ−１の場合も同じく不活化は完全であった。
【００２２】
二つの異なる初期力価（約３.５および５.０）について不活化を調べたがいずれの場合も完全であった。これに対し、対照実験では、ウイルス不活化は検出不可ないし低度にすぎなかった。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
短時間加熱組織トロンボプラスチンと、未処理組織トロンボプラスチンとの比較
RThromborel Ｓを前記システムにおいて、ウイルス懸濁液を定量給入せずに各種温度で短時間加熱した。未処理物質を対照として用いた。すべての調製物は凍結乾燥しそして再構成してから等容の蒸留水中で試験した。以下に示す結果は代表的バッチについて得られたものであった。
【００２５】
標準プロット（図２）を作成するために、Behringwerke AG社の標準ヒト血漿を希釈せずに、そして等張塩化ナリトウム溶液で希釈してサンプルとして用いた。サンプル（１００μｌ）と試薬（２００μｌ）を混合しそして血餅形成時間をSchnitger & Gross凝固計で測定した。加熱および未処理RThromborel Ｓの標準プロットは本質的に同じあった。
【００２６】
プロトロンビン時間試薬の感度をＩＳＩ(international sensitivity index；国際感度指数）により表わす。健常人および経口による血液凝固阻止を受けている対象者からの血漿について測定した。加熱および未処理RThromborel ＳのＩＳＩ値は標準トロンボプラスチンと比較しても区別がつかなかった（表２）。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
凝固因子II、Ｖ、ＶIIおよびＸに対する加熱および未処理RThromborel Ｓの感度を特徴付けるために、標準ヒト血漿をBehringwerke AG社からの適当な凝固因子欠乏血漿と混合し、関連因子の活性を正常の５〜１００％に調節した。それら混合物（１００μｌ）の血餅形成時間を２００μｌの加熱または未処理RThromborel Ｓ添加後にSchnitger & Gross凝固計で測定した。血餅形成時間は、図３および図４において、それぞれ、正常に対する％としての因子IIおよびＦ VII含量に対してプロットされている。これにより試験された因子に対する感度は対照と同程度に良好であることがわかった。因子Ｖおよび因子Ｘに対する感度（図示せず）は測定精度内で区別不可能であった。
【００２９】
以上、本発明を詳細に説明したが、本発明はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すことができる。
１）  胎盤タンパク質、血漿タンパク質または細胞培養または微生物的に調製されたタンパク質より成る群よりのタンパク質の調製物の溶液を短時間加熱することより成る前記タンパク質の調製物中のウイルスの不活化方法。
２）  組織トロンボプラスチンの溶液が加熱される前項１記載の方法。
３）  加熱が熱交換器において間接加熱で行われる前項１記載の方法。
【００３０】
４）  加熱が、間にスペーサを配設した積み重ねた金属箔より成り、該金属箔は対向面の各々に少くとも２個の開口を設けた金属カードで構成され、スペーサはカードを積み重ねたときに開口が環状通路を形成するように前記金属カードと一致する織布カードで構成され、該織布カードの取囲みリムおよび開口の一部を取囲む織布の環状域にはシーリング剤が充填されそして織布カードの列および管状通路においてシーリング剤を有するおよび有しない開口が交互となっている熱交換モジュールにおいて行われる前項１記載の方法。
【００３１】
５）  加熱温度が＋４５℃〜＋９５℃、好ましくは＋６５℃〜８０℃である前項１記載の方法。
６）  加熱または冷却時間が３０秒以下、好ましくは５秒以下である前項１記載の方法。
７）  滞留時間が０.１〜２０、好ましくは０.５〜５秒である前項１記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による短時間加熱を試験するためのシステムである。
【図２】  Thromborel Ｓの短時間加熱例の標準プロットを示している。
【図３】  Thromborel Ｓの短時間加熱例のＦ II感度を示している。
【図４】  Thromborel Ｓの短時間加熱例のＦ VII感度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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