(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなり、神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合するラット蛋白質ｐ３１０３。
【請求項２】
請求項１のラット蛋白質ｐ３１０３をコードするラット遺伝子。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合するラット蛋白質ｐ３１０３。
【請求項４】
請求項２のラット遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項１または請求項３のラットタンパク質ｐ３１０３に対する抗体。
【請求項７】
配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、非ラット哺乳動物の神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合する非ラット哺乳動物蛋白質をコードする非ラット哺乳動物ｃＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７の非ラット哺乳動物ｃＤＮＡの発現産物であって、非ラット哺乳動物の神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合する非ラット哺乳動物蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、神経シナプス結合後部の構成分子ＳＡＰＡＰに特異的に結合する蛋白質ｐ３１０３に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用な新規の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある細胞接着とそれに引き続く細胞間の情報交換を支える細胞間結合の成立、さらにその細胞間結合を通じて受け渡しされる情報に基づいて引き起こされる細胞の分化といった一連の生命現象の時系制御が極めて重要である。
【０００３】
多細胞生物に認められる細胞間結合には多くの共通性が存在するが、一方で、細胞の種類による特異性も存在し、とくに神経シナプス結合は他の細胞間結合とは大きく異なる特徴を有している。第一に、神経シナプス結合は極性を有し、その前部と後部では構造が著しく異なる。前シナプス膜は神経伝達物質の放出に関わる構造を有するのに対し、後シナプス膜はｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  （ＰＳＤ）  と呼ばれる特異な細胞骨格構造を有している（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ３，  ７３２−７３７，  １９９３；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０，  ２６４−２６８，  １９９７  ）。第二には、神経シナプス結合は一度成立した後にも神経刺激伝達に伴い結合の性状の変化（可塑性）を示すということである。この可塑性は、記憶・学習のメカニズムの基本を成す現象であると考えられており、正に神経シナプス結合を他の細胞間結合から際立たせる特徴である。可塑性のメカニズムの詳細は未だ明らかでないが、神経シナプス結合の前部に依存する前シナプス可塑性と、後部に依存する後シナプス可塑性の存在が知られている。いずれにしても神経シナプス結合の特徴的な構造が深く関与していることが予測され、この構造の解明が可塑性のメカニズム、さらには記憶・学習のメカニズム解明に必須であると考えられている。
【０００４】
効果的な神経伝達のためには、後シナプス膜において神経伝達物質受容体が正確な位置に存在することが必要であり、そのためにＰＳＤｓが重要な役割を果たしている。最近の研究から、ＰＳＤｓにおいて様々な受容体の蓄積とクラスタリングに機能する幾つかの分子が同定されている。例えば、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０とそのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）はＮＭＤＡ受容体およびＳｈａｋｅｒ  型Ｋ＋  チャネルに結合し（例えば、Ｎｅｕｒｏｎ  ９，  ９２９−９４２，  １９９３  ）、またＧＲＩＰおよびＨｏｍｅｒはＡＭＰＡ受容体と代謝性グルタミン酸受容体にそれぞれ結合する（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，  ２７９−２８４，  １９９７；  Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，  ２８４−２８８，  １９９７）ことが知られている。これら分子の共通の特徴は、それらが、蛋白質−蛋白質相互作用のためのモジュールＰＤＺドメインを有するということである（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２０，  １０２−１０３，  １９９５；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２０，  ３５０，  １９９５；  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ６，  １３８５−１３８８，  １９９６；  Ｎｅｕｒｏｎ  １７，  ５７５−５７８，  １９９６）。
【０００５】
ＰＤＺドメインは最初、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０の約９０アミノ酸の繰り返しとして見出され、その後、３つの蛋白質［ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ  ）のｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ  腫瘍抑制蛋白質Ｄｌｇ−Ａ、ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ蛋白質ＺＯ−１）に含まれることからＰＤＺと命名された（Ｎｅｕｒｏｎ  ９，  ９２９−９４２，  １９９２；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  ４５８０−４５８３，  １９９３；  Ｃｅｌｌ  ６６，  ４５１−４６４，  １９９１；  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２１，  ４９１−５０２，  ；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９０，  ７８３４−７８３８，  １９９３  ）。このＰＤＺドメインは様々な蛋白質のＣ末端配列に結合する。すなわち、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０の第１および第２のＰＤＺドメインはＮＭＤＡ受容体およびＳｈａｋｅｒ  型Ｋ＋  チャネルと結合する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，  １７３７−１７４０，  １９９５；  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，  ８５−８８，  １９９５  ）。第３のＰＤＺドメインはニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｓ  ）と呼ばれる神経細胞接着分子の細胞質ドメインと結合する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，  １５１１−１５１５，  １９９７）。また、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０はＮ末端のディサルフィド結合を介してホモダイマーを形成する（Ｎｅｕｒｏｎ  １８，  ８０３−８１４，  １９９７）。
【０００６】
ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０は、ＰＤＺドメインの他に１つのＳＨ３ドメインと１つのグアニル酸キナーゼ（ＧＫ）ドメインを有している。ＳＨ３ドメインはｓｒｃチロシンキナーゼのシグナル伝達モジュールとして規定されていたが、その後他の多くの蛋白質でも同定されている（Ｃｅｌｌ  ８０，  ２３７−２４８，  １９９５）。ただし、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０におけるＳＨ３ドメインの機能は不明である。ＧＫドメインは酵母グアニル酸キナーゼと相同であり、様々な膜関連蛋白質に存在する。これらの蛋白質は特定の膜構造を維持していると考えられており、膜関連グアニル酸キナーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＭＡＧＵＫ）と命名されている（Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ４４，  ８５−８９，  １９９３；  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ６，  ３８２−３８４，  １９９６）。
【０００７】
近年、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０のＧＫドメインと相互作用する分子が３つの研究グループによって同定され、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと命名されている（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３６，  ６６９−６７８，  １９９７；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １１９４３−１１９５１，  １９９７；  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，  ４１５−４２４，  １９９７；  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １７，  ５６８７−５６９６，  １９９７  ）。これらの分子のうち、ＳＡＰＡＰ（１，２）はこの出願の発明者らが見出した分子であり、既に特許出願している（特願平９−１１７１４  、９−１１７１５  ）。またこの出願の発明者らは、ＨＥＫ２９３  細胞においては、このＳＡＰＡＰが細胞膜と強固に結合し、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０を細胞膜に移行させることを見出してもいる（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １１９４３−１１９５１，  １９９７  ）。
【０００８】
そしてさらにこの出願の発明者等は、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与するＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する分子を見出している。このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰ結合分子はＭＡＧＵＫの構造を有し、Ｎ末端のＧＫドメインと２つのＷＷドメインおよび５つのＰＤＺドメインを有し、ＧＫドメインを介してＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに結合し、ＰＤＺドメインを介してＮＭＤＡ受容体およびニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｅ  ）に結合する。そして、この蛋白質はシナプス結合の受容体および細胞接着蛋白質を統合させることから、Ｓ−ＳＣＡＭ（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ）と命名され、既に特許出願されている（特願平１０−３０２２３９  号）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者らおよびその他の研究グループから提出された様々な知見により、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤがＰＳＤ形成における中核的な蛋白質であることが明らかにされている。そして、このＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤ−９５  およびＳ−ＳＣＡＭという２つの  ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎをＰＳＤに固定していることも示されている。しかしながら、ＰＳＤ形成の全貌を解明するためには、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと結合するさらに別の新規分子を特定することが不可欠である。
【００１０】
また、このような分子の同定とその機能の解明は、ヒトの記憶・学習といった高次脳機能の理解に大きな前進をもたらすばかりか、この分子あるいはこの分子の活性、作用に影響する様々な物質、化合物等は、中枢神経系の機能的または構造的障害を原因とする様々な神経疾患の原因解明、並びにそれら疾患の診断、予防および治療法等の開発に大きく寄与するものと期待される。
【００１１】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する重要な役割を果たしているＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する未知分子を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有するラット蛋白質ｐ３１０３を提供する。
この出願はまた、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するラット蛋白質ｐ３１０３を提供する。
【００１３】
この出願はさらに、前記のラット蛋白質ｐ３１０３をコードするラット遺伝子と、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
またこの出願は、前記のｃＤＮＡまたはＤＮＡ断片を保有する組換えベクターと、前記のラット蛋白質ｐ３１０３に対する抗体を提供する。
【００１４】
さらにまた、この出願は、配列番号１と相同のアミノ酸配列を有し、前記のラット蛋白質ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質、この動物性蛋白質をコードする動物遺伝子、およびこの動物遺伝子のｃＤＮＡを提供する。
この発明によって提供される蛋白質ｐ３１０３は、ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法を用いてＳＡＰＡＰ１との相互作用分子を探索した結果単離された新規分子であり、ＳＨ３ドメインおよびＰＤＺドメインを有する神経特異的なおよび蛋白質分子である。
【００１５】
なお、コンピューターによるホモロジー検索の結果、これらの蛋白質は新規蛋白質であることが確認されている。
以下、この発明の蛋白質ｐ３１０３について実施の形態を詳しく説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明のラット蛋白質ｐ３１０３は、配列番号２に塩基配列を示したｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号１のアミノ酸配列を有している。  そして、このアミノ酸配列には、ＳＨ３ドメイン（アミノ酸番号５５４−６１３）およびＰＤＺドメイン（アミノ酸番号６５４−７４９）が含まれている。
【００１７】
また、ノザン解析の結果、図１に示したように、この蛋白質はラットの脳でのみ発現していることが確認されている。
この蛋白質ｐ３１０３は公知の方法、すなわちラットの脳から単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってｐ３１０３を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするｐ３１０３を大量に発現させることができる。
【００１８】
この発明の蛋白質ｐ３１０３を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ｃＤＮＡがコードしているｐ３１０３を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードするタンパク質部分のみを取得することもできる。
【００１９】
この発明のラット蛋白質ｐ３１０３を動物細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）  付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入すれば、この発明のＨ３７タンパク質を動物細胞内で発現できる。
以上のとおり方法によって得られるラット蛋白質ｐ３１０３は、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００２０】
この発明の遺伝子は、上記の蛋白質ｐ３１０３をコードするラットの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーをスクリーニングから単離することができる。
【００２１】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有することを特徴とするものであり、この発明の前記蛋白質ｐ３１０３をコードしている。この発明の蛋白質ｐ３１０３は少なくともラットの脳組織で発現しているので、配列番号２の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００２２】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれる。
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされているタンパク質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２３】
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明の蛋白質ｐ３１０３に対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２４】
この発明の動物遺伝子は、ラット以外の哺乳動物の遺伝子であって、前記のラット蛋白質ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子は、例えば、この発明のｃＤＮＡをプローブとして様々な動物種のｃＤＮＡライブラリーから相同のｃＤＮＡを単離し、さらにこのｃＤＮＡをプローブとしてゲノムライブラリーから単離することができる。また、このｃＤＮＡを微生物、動物細胞または植物細胞等で発現させることにより、ｐ３１０３と同一の機能を有する動物性蛋白質を得ることができる。
【００２５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の蛋白質ｐ３１０３は神経シナプス結合後部におけるＰＳＤ形成に重要な役割を果たしている蛋白質ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する新規な蛋白質であり、この蛋白質はヒトをはじめとする動物の神経系の発生や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用である。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ３１０３の組織分布を調べたノーザンブロット分析の結果である。
【図１】
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