(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表わされる新規化合物  Ｆ−１０４６３ａ  ：
【化１】
0003623266.tif 000003
【請求項２】
Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ属に属するＦ−１０４６３ａ生産菌を培養し、その培養物よりＦ−１０４６３ａを採取することを特徴とする  Ｆ−１０４６３ａ  の製造法。
【請求項３】
Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ属に属する  Ｆ−１０４６３ａ  生産菌が  Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ（Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ  ＳＡＮＫ１３８９２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４９１）である、請求項２に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、スフィンゴミエリナーゼを阻害し各種医薬として有用な新規化合物Ｆ−１０４６３ａおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−１β（以下、「ＩＬ−１β」という。）の生物作用は多様であり、一般には生体の恒常性維持に必須な生体物質と考えられている。ところが、ＩＬ−１βの産生調節機能に異常が発生し、ＩＬ−１βが過剰に生産されると、種々の疾患の原因となる。また、腫瘍壊死因子−α（以下、「ＴＮＦ−α」という。）はある種の腫瘍細胞やウイルス感染細胞を死滅させたり、顆粒球の抗細菌性作用を増強させる等の作用を有するが、ＴＮＦ−αも過剰に生産された場合には、幾つかの疾患の主要な病因となる。
【０００３】
この二つのサイトカインは全く異なる遺伝子の産物で、その構造に類似性はなく、各々に対応した独自の受容体を有するが、それらの標的細胞、生物活性には重複する点が多い。例えば、両サイトカインは生体内に入ったエンドトキシン（ＬＰＳ）によって起こる敗血症性ショックの主要原因であり〔Ｔｒａｃｙ  Ｋ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３４，  ４７０  （１９８６）、Ｔｒａｃｅｙ  Ｋ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），  ３３０，  ６６２  （１９８７）〕、その他、肉芽腫〔Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３４，  ３５８  （１９８５）〕、髄膜炎菌髄膜炎やマラリア感染〔Ｃｕｒｆｓ  Ｊ．Ｈ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １７２，  １２８７  （１９９０）〕等、外来性の微生物、寄生虫及びウイルス等に由来する感染症に密接に関係する。この様な急性期炎症反応に於ける主要な各段階、即ち、局所への炎症細胞の浸潤〔Ｇａｍｂｌｅ  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  ８６６７  （１９８５）  、宮坂    昌之ら  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ    免疫’９１，  ５７    中外医学社  （１９９１）  〕、発熱〔Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  Ｃ．Ａ．  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ，  １４，  １    （１９８７）  〕、急性期蛋白の誘導〔Ｐｅｒｉｍｕｔｔｅｒ  Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ７８，１３４９  （１９８６）  〕、プロスタノイド、特にＰＧＥ２    産生の促進に〔Ｄａｙｅｒ  Ｊ．−Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １６２，  ２１６３  （１９８５）  、Ｔｕｒｉｎｓｋｙ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６２，  Ｅ４７６    （１９９２）、Ｂａｌｌｏｕ  Ｌ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７，  ２００４４    （１９９２）〕、両サイトカインは積極的な役割を担っている。
【０００４】
また、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは慢性の炎症疾患、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）発症及び進展に関与し、滑膜組織に於けるリンパ球浸潤の活性化、滑膜細胞の増殖促進、及び軟骨細胞の破壊、破骨細胞の活性化による骨吸収の促進作用を示す〔Ｍｉｚｅｌ  Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８，  ２４７４  （１９８０）  、Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，  ３１，  ４８０    （１９８８）、Ａｒｅｎｄ  Ｗ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ  Ｊ．−Ｍ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．，  ３３，  ３０５  （１９９０）〕。その他、同じリウマチ性疾患である膠原病〔Ｔａｎａｋａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４３，  １５８４  （１９８９）  〕、全身性血管炎を主体とする川崎病〔Ｌｅｕｎｇ  Ｄ．Ｙ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １６４，  １９５８  （１９８６）〕、肉芽腫とそれに続く線維症に伴う慢性炎症にも関わることが知られている〔Ｌｅ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｖｉｌｃｅｋ  Ｊ．  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５６，  ２３４  （１９８７）  〕。現在、慢性炎症性疾患の治療剤として使用されているグルココルチコイドは、その作用一部がこれらサイトカインの産生抑制にあることが知られているが〔Ｌｅｗ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０，  １８９５    （１９８８）  〕、グルココルチコイドは、その多様な生理作用により種々の危篤な副作用を誘起する不利を併せ持つ。
【０００５】
さらに、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは単球の血管内皮細胞への接着、内皮下への遊走〔Ｐｏｂｅｒ  Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３７，  １８９３  （１９８６）、Ｎｅｌｋｅｎ  Ｎ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ８８，  １１２１  （１９９１）  〕、血管平滑筋細胞の内膜での異常増殖を促進する等〔Ｒａｉｎｅｓ  Ｅ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，  ３９３  （１９８９）〕、粥状動脈硬化の発症、進展に関与する。
【０００６】
また、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは、血小板活性化因子（ＰＡＦ）の産生促進、組織因子の内皮細胞膜表面への誘導、トロンボモジュリンプロテインＣの減少、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１の産生抑制をきたし、全体として血小板凝集と血液凝固を招来して血栓形成の原因となる〔Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ  Ｍ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８３，  ４５３３  （１９８６）  、Ｌｅ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｖｉｌｃｅｋ  Ｊ．  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５６，  ２３４  （１９８７）  、佐藤    靖史    現代医療，  ２３，  ３１６３  （１９９１）  〕。
【０００７】
インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）では、その発症に至る過程に潜在的、慢性的、自己免疫的な炎症が膵島、特に膵β細胞に起こっているが、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αはそれに関与する〔Ｎｅｒｕｐ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．，  １１，  １６  （１９８８）  。一方、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に際しても、ＴＮＦ−αは脂肪細胞での産生を介して筋肉、肝細胞に作用し、インスリン抵抗性を発揮することに関与する〔Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  Ｂ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  ６８２３  （１９９３）〕。
【０００８】
糸球体腎炎発症の主体を成すメサンギウム細胞の増殖と基質の増生にＩＬ−１βとＴＮＦ−αは深く関与する〔Ｗｅｒｂｅｒ  Ｈ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８，  ３２０７  （１９８７）  、Ｂａｕｄ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，  ４１，  ６００  （１９９２）〕。
【０００９】
ＩＬ−１βやＴＮＦ−αはＴ細胞からのＩＬー２産生やその分泌、その受容体発現を促し、また、その他の免疫細胞に作用してその働きを高めることで免疫能を賦活化する〔Ｇｉｌｌｉｓ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｍｉｚｅｌ  Ｓ．Ｂ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８，  １１３３  （１９８１）、Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８，  １７８６  （１９８７）〕。この作用により両サイトカインは、例えば移植の際に生じる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）発症の一因となる。
【００１０】
ＴＮＦ−αは、慢性の感染症やガン患者に於いて脂肪細胞のリポプロテインリパーゼ活性を抑制して食欲不振を引き起こすことにより、極度の体重減少・消耗を引き起こし（ｃａｃｈｅｘｉａ）、そのためＴＮＦ−αはカケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ  ）と呼ばれている〔Ｂｅｕｔｌｅｒ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），  ３１６，  ５５２  （１９８５）  〕。
【００１１】
ＴＮＦ−αは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）感染細胞において、染色体内に挿入されたＨＩＶのウイルスゲノム末端：ＬＴＲ：からの転写を転写因子ＮＦ−κＢを介して活性化させ、ＨＩＶの増殖をこう進させる〔Ｎａｂｅｌ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２６，  ７１１  （１９８７）  、Ｓｃｈｒｅｃｋ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １０，  ２２４７  （１９９１）  〕。
【００１２】
その他、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αの過剰生産に基づく疾患として、劇症肝炎〔Ｍｕｔｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ＩＩ，  ７２  （１９８８）  〕、喘息、特発性肺線維症〔Ｋｅｌｌｅｙ  Ｊ．  Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，  １４１（３），  ７６５  （１９９０）〕、ＡＲＤＳ（ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ）〔Ｍｉｌｌａｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ＩＩ，  ７１２  （１９８９）〕等の呼吸器系疾患、自己免疫性甲状腺疾患〔江口    勝美ら    最新医学からのアプローチ１    サイトカインから，  メジカルビュー社，  ３８  （１９９１）  〕、ライム病〔Ｈａｂｉｃｈｔ  Ｇ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３４，  ３１４７  （１９８５）〕、アルツハイマー病〔Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｗ．Ｓ．Ｔ．  ａｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ７６１１  （１９８９）〕、クローン病〔八木田    旭邦    医学のあゆみ，  １４７，  ３７５  （１９８８）  〕、中毒ショック症候群〔Ｉｋｅｊｉｍａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ７３，  １３１２  （１９８４）  〕、骨粗しょう症〔Ｐａｃｉｆｉｃｉ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ２３９８  （１９８９）  〕、痛風〔Ｄｉ  Ｇｉｏｖｉｎｅ  Ｆ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８，  ３２１３  （１９８７）  〕、急性骨髄性白血病〔Ｓａｋａｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １６６，  １５８７  （１９８７）〕、子宮内膜炎〔Ｒｏｍｅｒｏ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｒｃｏｌ．  １６０，  １１１７  （１９８９）〕などが挙げられる。
【００１３】
スフィンゴミエリナーゼは、生体内の細胞膜系および核内に含まれるコリン含有脂質の一つであるスフィンゴミエリンを基質として、このものをセラミドとホスホリルコリンに分解する酵素である。本酵素は、当初は酸性域に至適ｐＨを有するリソソームの水解酵素の一つとして見い出されたが、最近では中性域に至適ｐＨを有する同酵素活性がミクロソーム画分、形質膜にも見い出されており〔Ａｌｌａｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，  ６９３，  ５３  （１９８２）  、Ｔ−Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｋｏｊｉｍａ  Ｋ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ９９，  １８０３  （１９８６）、これらの諸酵素が生体内のスフィンゴミエリンの代謝に実際的に関与しているものと考えられる。
【００１４】
上記反応の生成物の一つセラミドは更にセラミダーゼにより加水分解され、脂肪酸とスフィンゴシンを生じる。そして、スフィンゴミエリンが哺乳動物体内で代謝されて、セラミドさらにスフィンゴシンとなることは  ｉｎ  ｖｉｖｏ  の実験で確かめられている〔Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｐ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｅ．Ｐ．  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ９，  ５８  （１９６８）〕。スフィンゴミエリンの分解産物であるこのセラミドやスフィンゴシンは、細胞の増殖・分化、及び、それらに密接に関連をもつ情報伝達の制御機構に関与していることが示され〔小島清秀と小泉恵子    蛋白質    核酸    酵素，  ３６，  ６２９  （１９９１）〕、この反応経路はスフィンゴミエリン経路と呼ばれている。
【００１５】
ＩＬ−１βやＴＮＦ−αが標的細胞の受容体に結合し、その後、細胞内にてシグナル伝達がされるときに、このスフィンゴミエリン経路が関与していることが示されている〔Ｄｒｅｓｓｌｅｒ  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５５，  １７１５  （１９９２）、Ｍａｔｈｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５９，  ５１９  （１９９３）  〕。
【００１６】
従って、スフィンゴミエリナーゼ活性の阻害物質によりこれらＴＮＦαやＩＬ１βのシグナル伝達を遮断することができ、これらサイトカインが関与する病態を改善することができる。
【００１７】
一方、スフィンゴミエリナーゼの反応物がシクロオキシゲナーゼを活性化し、これを介してＰＧＥ２産生を促進していることが示されている（Ｂａｌｌｏｕ  Ｌ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７，  ２００４４，  （１９９２））。
【００１８】
また、スフィンゴミエリナーゼ反応そのものが、粥状動脈硬化の発症に関わるＬＤＬや変性ＬＤＬの末梢細胞内への取り込みを促進し、コレステロール・エステル合成及びその細胞内蓄積を増加させ〔Ｓｔｅｉｎ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ．，  １１２６，  ２９１  （１９９２）、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  Ｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  ３４０１  （１９９３）〕、本病態の進展に関わることが予想されている。
【００１９】
さらに、スフィンゴミエリナーゼの活性化は腎臓の近位尿細管に於いてジヌソイド側の頂端膜内にあるスフィンゴミエリン含量を減らし、Ｎａ依存性に機能するリン酸や糖の取り込みを減少させる〔Ｖｒｔｏｖｓｎｉｋ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．，  ４１，  ９８３（１９９２）〕。
【００２０】
また、ＨＩＶに感染したＣＥＭ細胞でセラミドの量が亢進していることが示され［Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ  Ｐ．Ｐ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １８７，  ２０９  （１９９２）］  、生体内のＨＩＶ感染細胞でスフィンゴミエリナーゼが活性化していることが示されている。
【００２１】
以上の事実から、スフィンゴミエリナーゼに対する特異的な阻害物質は、抗ＨＩＶ剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治療薬として使用できる。
【００２２】
しかしながら、スフィンゴミエリナーゼに対して特異的かつ強力な阻害物質は現在まで見い出されていない。
【００２３】
従来、ＩＬ−１β作用を特異的に阻害する物質としては、可溶性ＩＬ−１レセプターやＩＬ−１レセプターアンタゴニストが見いだされ、これらを用いての敗血症性ショック患者やＲＡ患者での症状改善がみられている。
【００２４】
また、ＴＮＦ−α作用を特異的に阻害する可溶性ＴＮＦ受容体、抗ＴＮＦ抗体を用いての、エンドトキシンショックや急性ＧＨＶＤなどを対象とした臨床試験が実施され、その有効性が観察されている〔Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｊ．−Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｓｔ，  １０１，  ８１０  （１９９２）  、Ｈｅｒｖｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ７９，  ３３６２  （１９９２）〕。
【００２５】
しかし、これらは何れもペプチド性もしくは高分子量の物質であるため、薬剤としての体内への吸収性や血中での安定性等に於いて欠点を有する。かかる観点より、スフィンゴミエリナーゼに対して特異的な阻害活性を有する、低分子生理活性物質が望まれていた。
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは微生物代謝産物中よりスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を有する物質を検索し、枯死した草本の茎より分離した  Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ    属に属するＤａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ（Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ  株の培養液中にスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を有する新規化合物Ｆ−１０４６３ａが生産されることを見出し、本発明を完成した。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明の  Ｆ−１０４６３ａ  は下記の構造式および性状を有する。
【００２８】
構造式
【００２９】
【化２】
0003623266.tif 000002
【００３０】
物理化学的性状
１）    性質；無色油状物質、
２）    溶解性；メタノール、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒に可溶、水に不溶
３）    呈色試験；５０％  硫酸、ヨウ素に陽性。
【００３１】
４）    分子式；  Ｃ２９Ｈ４３ＮＯ５
５）    分子量；４８５  （高分解能ＦＡＢＭＳ  法により  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ４８６．３１９９  （測定値）  ）（計算値：４８６．３２０４）
６）    比旋光度；［  α］    ＋６４．４４  （ｃ  ０．０９  ｉｎ  ＭｅＯＨ）
７）    紫外線吸収スペクトル；（メタノール中）３００  ｎｍ（  ε４１５００）
８）    赤外線吸収スペクトル；（クロロホルム中）
３４１０，  １６５５，  １６０８，  １５０８  ｃｍ−１
９）    １Ｈ−  核磁気共鳴スペクトル；（  重メタノール中：ＰＰＭ，  ＴＭＳ  基準）
７．１５（ｍ，  ２Ｈ），  ６．５３（ｄｄ，  Ｊ＝１４．９，  １０．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．２５（ｄｄ，  Ｊ＝１４．９，  １１．１Ｈｚ，  １Ｈ），６．１５（ｄｄ，  Ｊ＝１５．１，  １０．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．０７（ｄｄ，  Ｊ＝９．８，  １．６Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．８９（ｄ，  Ｊ＝１４．８Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．７０（ｄｄ，  １５．１，  ８．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８（ＨＤＯ  のシグナルの下に隠れている、  １Ｈ），  ４．０５（ｍ，  １Ｈ），    ３．６７（ｄ，  Ｊ＝３．９Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５９（ｍ，  １Ｈ），  ３．５２（ｄｄ，  Ｊ＝１０．９，  ５．１Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４５（ｄｄ，  Ｊ＝１０．９，  ５．８Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．３５（ｍ，  １Ｈ），  ２．２７（ｍ，  １Ｈ），２．０８（ｄｄ，  Ｊ＝１４．７，  ３．６Ｈｚ，  １Ｈ），  １．８９（ｍ，  ２Ｈ），  １．７９（ｄｄ，  １３．１，  ７．１Ｈｚ，  １Ｈ），１．５９（ｍ，  １Ｈ），  １．５４（ｄ，  Ｊ＝１．３Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．３３（ｍ，  ２Ｈ），  １．１９（ｍ，  １Ｈ），〜１．１（ｍ，  １Ｈ），  １．００（ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ，  ３Ｈ），  ０．９１（ｄ，  Ｊ＝６．６Ｈｚ，  ３Ｈ），  ０．８６（ｔ，  Ｊ＝７．４Ｈｚ，  ３Ｈ），  ０．８３（ｄ，  Ｊ＝６．５Ｈｚ，  ３Ｈ）
１０）  １３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；（  重メタノール中：ＰＰＭ，  重メタノール基準）
２００．１（ｓ），１６９．０（ｓ），１４６．６（ｄ），１４６．４（ｄ），１４２．９（ｄ），１４１．９（ｄ），１３４．７（ｄ），１３４．０（ｓ）
１３２．５（ｄ），１３０．４（ｄ），１２９．９（ｄ），１２４．３（ｄ），７８．０（ｓ），６６．１（ｔ），５８．７（ｄ），５０．１（ｔ），
４９．８（ｄ），４８．５（ｄ），４５．７（ｔ），４０．３（ｔ），３６．７（ｄ），３５．９（ｄ），３２．２（ｔ），３０．０（ｄ），２２．４（ｑ）
２２．０（ｑ），２０．４（ｑ），１６．９（ｑ），１３．０（ｑ）
１１）  高速液体クロマトグラフグラフィー
保持時間：５．６５  分
カラム：  ナカライテスク製コスモシール  ５  Ｃ１８−ＡＲ，  ４．６φＸ１５０ｍｍ
溶媒：  ７０％  アセトニトリル−  水
流速：  １ｍｌ／ｍｌ
検出：  ＵＶ  ２１０ｎｍ
生産菌
本発明において用いられる  Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  属に属する菌株としては、例えば  Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ（Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ  ＳＡＮＫ１３８９２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４９１  ）  を挙げることができ、この菌株の菌学的性状は次のとおりである。
【００３２】
ＳＡＮＫ１３８９２  は、１９９１年５  月、青森県において採集された枯死した草本の茎から分離したものである。
【００３３】
子嚢盤は直径最大で０．２ｍｍ  の無柄の平坦な円盤状で、灰橙色〜黄色を呈する。子嚢盤の周縁に毛を有し、縁は盛り上がらない。托外皮層は多角菌組織様を呈し、淡褐色で薄膜の細胞よりなる。托髄層は密に絡み合って外壁とやや平行な菌糸よりなり、絡み合い菌組織を呈する。毛は托外皮層の最外層の細胞より生じて真直ぐに伸長し、円筒形であり、薄膜、多数の隔壁を有し、最大長２００  μｍ  、太さ３．５  μｍ  である。その先端はほとんど鈍頭である。表面はほとんど平滑で、樹脂状の不定形物質が散在・付着する。子嚢はクランプより生じ、円筒形、８  胞子性で、大きさ５８−６６  ｘ  ５−６．５  μｍ  である。その先端はメルツァー試薬にて青変する。側糸は細い槍型であり、    大きさ７４．５−１００  ｘ  ３．５−４μｍ  、子嚢より約２０μｍ  上に伸長する。子嚢胞子は桿形から紡錘形、単細胞、無色であり、大きさ１８−２６．５  ｘ  ２．５−５  μｍ  である。
【００３４】
ＰＤＡ上の生育は、２３℃、１０日で  １．５  ｃｍ  に達する。表面は淡澄色〜澄白色を呈し、コロニー中央部にてやや盛り上がる。気菌糸の発達はあまり旺盛でなく、絡み合って菌糸束を形成する。表面は粉状となる。裏面は、淡澄色〜澄白色を呈する。さらに培養を継続することによって、より濃色となる。分生子は観察されない。
【００３５】
以上のような菌学的特徴から、本菌に該当するものを検索したところ、Ｏｔａｎｉ（１９６７）  Ｎｏｔｅｓ  ｏｎ  ｓｏｍｅ  ｃｕｐ  ｆｕｎｇｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙａｌｏｓｃｙｐｈａｃｅａｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｈｏｋｋａｉｄｏ，Ｊａｐａｎ．  Ｔｒａｎｓ．Ｍｙｃｏｌ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐａｎ  ８：３３−４２．に記載されているＤａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ  （Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ（ダシスキファス・モリシムス・ラッシュ・デニス）に一致した。よって本菌をＤａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ  （Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓと同定し、Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ  （Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ  ＳＡＮＫ１３８９２    と命名した。本菌は、１９９３年１２月１０日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４９１  が付された。
【００３６】
培養法及び精製法
本発明の新菌株を分離するに際し使用される分離培地としては炭素源、窒素源、無機イオンおよび有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれば合成または天然培地の何れでも使用可能である。Ｆ−１０４６３ａは  ＳＡＮＫ１３８９２    株を適当な培地で培養し、それから採取することによって得られる。栄養源としては、従来、真菌類の培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、シュクロース、澱粉、グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油などが使用できる。また、窒素源としては大豆粉、コーンスチープリカー、イーストエキス、麦芽エキス、ジャガイモ、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用しうる。このほか必要に応じて炭酸カルシウム、リン酸塩等の無機塩類を添加するほか、菌株の発育を助け、Ｆ−１０４６３ａの生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。培養法としては、一般の抗生物質を生産する方法と同じく液体培養法、特に深部培養法が最も適している。培養は、好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は１５ー３０℃であるが、多くの場合２３℃付近で培養する。Ｆ−１０４６３ａの生産は、振盪培養で通常５−８  日で最高値に達する。
【００３７】
培養終了後、培養液中の菌体あるいはロ液に存在するＦ−１０４６３ａを培養液の容量程度のアセトン、アセトニトリルのような有機溶媒を添加し混合することにより抽出する。抽出物中に存在する固形部分を珪藻土をろ過操作助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液または上清中に存在するＦ−１０４６３ａを、スフィンゴミエリナーゼ阻害活性を指標にして、その物理化学的性状を利用し抽出精製する。例えば、この抽出液中に存在するＦ−１０４６３ａは、まず濃縮操作で混在する有機溶媒を除去した後に、水と混和しない有機溶剤、例えばｎーブタノール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独または、それらの組み合わせにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰー１０、ＨＰー２０、ＣＨＰー２０Ｐ、ＨＰー５０（三菱化成（株）製）等を使用する事ができる。Ｆ−１０４６３ａを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＦ−１０４６３ａを吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水などを用いて溶出させることにより得られる。このようにして得られたＦ−１０４６３ａは、更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィ、セファデックスＧ−２５（ファルマシア製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィ、および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ等で精製することが出来る。
【００３８】
スフィンゴミエリナーゼ阻害活性は以下の方法で測定できる（  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０，  ４５６  （１９７９））。
【００３９】
即ち、先ず、基質溶液として１０μｌの［Ｎ−メチル−１４Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と２００μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグマ社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍトリスー塩酸（ｐＨ７．  ５）、４０μｌの１０％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、２０μｌの０．  ５Ｍ  ＭｇＣｌ２  、及び１．  ２４ｍｌのＨ２  Ｏを加えて４８℃、３０分のインキュベーションを行い、プローブ型超音波破砕装置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理を施し、［１４Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル系を作成した。
【００４０】
スフィンゴミエリナーゼ反応は、この様にして用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを混合し、ウイスターイマミチ系雄性ラット脳のミクロソーム画分（２５、０００×ｇ〜１００、０００×ｇ、蛋白質濃度３〜４ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを酵素溶液として加えて３７℃、４０分インキュベーションすることにより行った。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施し、得られた水層１５０μｌを３ｍｌのピコフローＴＭ４０（パッカードジャパン株式会社）と混合して反応物である［１４Ｃ］ホスフォリルコリン量を液体シンチレーションカウンターで測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、この測定値からスフィンゴミエリナーゼ反応に必要なＭｇＣｌ２  を除いた場合での測定値を差し引いた値として計算される。
【００４１】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４２】
実施例１．  Ｆ−１０４６３ａ物質の精製
（１）  培養
Ｄａｓｙｓｃｙｐｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓｓｉｍｕｓ（Ｌａｓｃｈ）  Ｄｅｎｎｉｓ  ＳＡＮＫ１３８９２  株を無菌的に、滅菌した後述の組成の培養培地１００  ｍｌ  を含む５００  ｍｌ  の三角フラスコ（種フラスコ）に接種した。次いでこれを５日間、２００ｒｐｍ  のロータリー振とう機で前培養を行った。
【００４３】
【表１】
培地組成
グリセロール                    ５０ｇ
ジャガイモ                                          ５０ｇ
イ−スト・イクストラクト        ５ｇ
マルト・イクストラクト                    ５ｇ
消泡剤（ＣＢ−４４２）                ０．２ｇ
イオン交換水                  １０００ｍｌ
ｐＨ    無調整
本培養は以下のように行った。滅菌した上述の組成の培養培地１００  ｍｌ  を含む５００  ｍｌ  の三角フラスコ  １５  本に種培養液をそれぞれ５ｍｌ入れ、２３℃で７日間、２００ｒｐｍ  のロータリー振とう機で培養を行った。
【００４４】
（２）スフィンゴミエリナーゼ阻害活性の測定法
スフィンゴミエリナーゼの酵素標品の調製は、基本的には  Ｇａｔｔ  Ｓ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６８，  ２３５  （１９７６））の方法に従って行った。すなわち、スフィンゴミエリナーゼの酵素源としてラット脳を用い、先ず、以下の様にそのミクロソーム画分を調製した。１０匹のウイスターイマミチ系雄性ラット（９週齢）を頚動脈放血後、全脳を摘出した。迅速に、小脳を除去後、予め４℃に冷却したバッファーＡ（０．  ２５Ｍ    蔗糖、１ｍＭ    ＥＤＴＡ、１ｍＭ    ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ）、０．  １ｍＭ    ロイペプチン、５ｍＭ    トリスー塩酸緩衝液、ｐＨ７．  ４）１３０ｍｌを加え、４℃条件下、ポッターのホモジナイザーを用いて脳細胞の破砕を行った。次に、得られた細胞破砕液を４℃条件下、７００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、その上清を更に、４℃条件下、２５、０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。最後に、得られた上清を４℃条件下、１００、０００×ｇで６０分間の超遠心分離を行い、その沈澱物をミクロソーム画分とした。尚、この画分はスフィンゴミエリナーゼの活性測定時まで液体窒素下で凍結保存し、使用時にバッファーＡで蛋白質濃度３〜４ｍｇ／ｍｌ程度になる様に調製した。
【００４５】
スフィンゴミエリナーゼ活性は混合ミセル系を使って、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ  Ｋ．Ｙ．    と  Ｙａｚａｋｉ  Ｐ．Ｊ．    の方法（Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０，  ４５６  （１９７９））を参考にして、以下の様に測定した。即ち、先ず、混合した１０μｌの［Ｎ−メチル−１４Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と２００μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグマ社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍトリスー塩酸（ｐＨ７．  ５）、４０μｌの１０％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、２０μｌの０．  ５Ｍ  ＭｇＣｌ２、及び１．  ２４ｍｌの  Ｈ２Ｏを加えて４８℃、３０分のインキュベーションを行った。そして、プローブ型超音波破砕装置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理を施し、［１４Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル系を作成した。
【００４６】
スフィンゴミエリナーゼ反応は、この様にして用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを混合し、先に供述した酵素溶液４０μｌを加えて３７℃、４０分インキュベーションすることにより行った。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施し、得られた水層１５０μｌを３ｍｌのピコフローＴＭ４０（パッカードジャパン株式会社）と混合して反応物である［１４Ｃ］ホスフォリルコリン量を液体シンチレーションカウンターで測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、この測定値からスフィンゴミエリナーゼ反応に必要なＭｇＣｌ２  を除いた場合での測定値を差し引いた値として計算される。
【００４７】
この方法で測定した、スフィンゴミエリナーゼ反応を  ５０％    阻害するのに必要な  Ｆ−１０４６３ａ  の濃度は  ２０  μｇ／ｍｌであった。
【００４８】
（３）  単離
三角フラスコ  １５  本分の培養液を  ６Ｎ  塩酸で  ｐＨ  ３  に調整し、続いて  ３０００  回転、１０    分、遠心分離を行った。得られた菌体に  ８０％    アセトンを  ５００  ｍｌ  加え、１  時間攪拌した。この混合物を  ３０００  回転、１０    分、遠心分離を行い、上清を減圧濃縮してアセトンを除去した。次にこれを等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して褐色の油状物を  ４３０  ｍｇ  得た。このうち  ４００ｍｇ    を少量の塩化メチレンーメタノール、１００：１  の溶媒に溶解し、同じ溶媒で平衡化した８０ｍｌ    のシリカゲルカラムにチャージした。このカラムを  ２４０ｍｌ    の    塩化メチレンーメタノール、１００：１  の溶媒で溶出し、さらに  ２４０  ｍｌ  の  ５０：１，  ２０：１  及び  １０：１  の溶媒で溶出し、それぞれの溶出液を分画した。酵素阻害活性は  ２０：１  の分画に認められたのでこの分画を濃縮し、７８ｍｇ    の褐色の油状物質を得た。これを少量のメタノールに溶解し、以下のように調製用  ＨＰＬＣ  で精製した。すなわち、約  ２０ｍｇ  ずつ、７０％  アセトニトリル水溶液で平衡化した  ＨＰＬＣ  カラム（ナカライテスク製コスモシル５Ｃ１８−ＡＲ，  ２０  φＸ２５０ｍｍ）にチャージし、同じ溶媒で  １０ｍｌ／ｍｉｎ．    の流速で展開した。２１０  ｎｍ    の吸収を検出し、約  ３０  分にでるピークを分取した。分取した溶液を減圧濃縮し、２２ｍｇ    の  Ｆ−１０４６３ａ  物質を得た。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の新規化合物  Ｆ−１０４６３ａ  は、抗ＨＩＶ剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治療薬として使用できる。