(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得た細胞、組織又は体液の試料中の前立腺癌の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料中のＰＳＧ（前立腺特異遺伝子）濃度を測定するが、但し、ＰＳＧは配列番号１、５、６又は７のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含み；そして
（ｂ）測定したＰＳＧ濃度を、対照から得た細胞、組織又は体液の試料中のＰＳＧ濃度と比較し、対照のＰＳＧ濃度に対する患者試料中の測定されたＰＳＧ濃度の上昇が前立腺癌の存在と関連していること
を含む方法。
【請求項２】
患者から得た細胞、組織又は体液の試料中の転移性前立腺癌を検出する方法であって、
（ａ）試料中のＰＳＧ濃度を測定するが、但し、ＰＳＧは配列番号１、５、６又は７のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含み；そして
（ｂ）測定したＰＳＧ濃度を、対照から得た細胞、組織又は体液の試料中のＰＳＧ濃度と比較し、対照のＰＳＧ濃度に対する患者試料中の測定されたＰＳＧ濃度の上昇が転移した癌と関連していること
を含む方法。
【請求項３】
前立腺癌に罹っている患者から得た細胞、組織又は体液の試料において前立腺癌の病期を監視する方法であって、
（ａ）前立腺癌に罹っている患者から得た上記試料中のＰＳＧ濃度を測定するが、但し、ＰＳＧは配列番号１、５、６又は７のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含み；そして
（ｂ）上記の測定されたＰＳＧ濃度を、対照の細胞、組織又は体液からの試料中のＰＳＧ濃度と比較し、ここで、測定されたＰＳＧ濃度の対照ＰＳＧ濃度に対する上昇が進行する癌と関連し、測定されたＰＳＧ濃度の対照ＰＳＧ濃度に対する減少が退行中又は緩解した癌と関連するものであること
を含む方法。
【請求項４】
患者から得た細胞、組織又は体液の試料中において前立腺癌の転移の開始をモニターする方法であって、
（ａ）転移したことが知られていない前立腺癌をもつ患者から得た細胞、組織又は体液の試料中のＰＳＧ濃度を定期的に測定するが、但し、ＰＳＧは配列番号１、５、６又は７のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含み；そして
（ｂ）上記の測定されたＰＳＧ濃度を、正常な細胞、組織または体液中のＰＳＧ濃度と比較し、ここで、患者から得た試料中の定期的に測定されたＰＳＧ濃度の何れか一つの対照ＰＳＧ濃度に対する上昇が転移した癌と関連すること
を含む方法。
【請求項５】
前立腺癌に罹っている患者から得た細胞、組織又は体液の試料において前立腺癌の病期の変化をモニターする方法であって、
（ａ）前立腺癌をもつ患者から得た細胞、組織又は体液の試料においてＰＳＧ濃度を定期的に測定するが、但し、ＰＳＧは配列番号１、５、６又は７のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含み；そして
（ｂ）上記の測定されたＰＳＧ濃度を、対照の同じ細胞、組織又は体液からの試料中のＰＳＧ濃度と比較するが、対照のＰＳＧ濃度に対する定期的に測定したＰＳＧ濃度の何れか一つにおける上昇が病期の進行している癌と関連し、対照のＰＳＧ濃度に対する定期的に測定したＰＳＧ濃度の何れか一つにおける減少が病期の退行又は緩解した癌と関連すること
を含む方法。
【請求項６】
ＰＳＧが配列番号１を含む請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、一つには、がん、特に前立腺がんの検出、診断、モニター、病期決定、及び予後予測のための新規に開発されたアッセイに関する。
発明の背景
前立腺がんは皮膚がんに次いで成人男性に多い悪性疾患であり、米国ではますます広がりつつある健康問題となっている。１９９６年に米国で４１，４００人がこの疾患が原因で死亡したと推定されており、同じ集団で前立腺がんは肺がんに次ぐ第二位の死因であることが示されている。がんがまだ前立腺内に限局している時期に早期診断及び処置がなされれば、治癒の機会は著しく向上する。
【０００２】
各個人に対する治療法の決定は、その人に存在する前立腺がんの病期と関連している。前立腺がんの拡散に関する一般的分類は米国泌尿器科学協会（ＡＵＡ）(American Urological Association)が開発した。ＡＵＡ分類は、前立腺腫瘍をＡ〜Ｄの四つの病期に分類している。前立腺内の顕微鏡的がんであるＡ期は、さらにＡ１及びＡ２期に細分類されている。Ａ１亜期は前立腺内の一部位に限局された良く分化したがんである。処置は、一般的に、観察、根治前立腺摘出、又は放射線である。Ａ２亜期は前立腺内の複数部位で中等度ないし不良に分化したがんである。処置は根治前立腺摘出又は放射線である。前立腺内の触知可能な塊であるＢ期は、さらにＢ１及びＢ２期に細分類されている。Ｂ１亜期では、がんは前立腺の一葉に小結節を形成する。Ｂ２亜期では、大結節又は複数の結節を形成する、又は前立腺の両葉に発生する。Ｂ１及びＢ２亜期両方の処置は根治前立腺摘出又は放射線のいずれかである。Ｃ期は大部分又は全前立腺を巻き込む大きながん塊で、さらに２期に細分類される。Ｃ１亜期では、がんは前立腺を越えて拡大している可能性のある連続塊を形成する。Ｃ２亜期では、がんは周辺組織を浸潤する連続塊を形成する。これら二つの亜期の処置は薬物使用を伴う又は伴わない放射線である。第４期は転移がんで、これも２期に細分類されている。Ｄ１亜期では、がんは骨盤リンパ節に現れる。Ｄ２亜期では、がんはリンパ節を越えた組織を巻き込む。これら二つの亜期の処置はがんと疼痛に対処する全身薬物投与である。
【０００３】
しかしながら、現在の前立腺がんの病期決定法には限界がある。最初にＡ２、Ｂ、又はＣと分類された前立腺がんの実に５０％は実際は転移性のＤ期である。転移の発見は、転移がんを有する患者は予後が不良で、限局がんの患者とは著しく異なる療法が必要となるので重要である。限局性及び転移性の前立腺がん患者の５年生存率は、それぞれ９３％及び２９％である。
【０００４】
そこで、ヒトにおけるがんについて、そのようながんが転移しているか否かを判定する病期決定のため、及びヒトにおけるがんの進行をモニターするための高感度の方法に対する大きな需要がある。
【０００５】
本発明では、がん、特に前立腺がんの検出、診断、モニター、病期決定及び予後予測を七種（７）の前立腺特異遺伝子（ＰＳＧ）によって行う方法を提供する。７種のＰＳＧｓは、特に、配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現された天然タンパクを指す。あるいは、ここで使用している７種のＰＳＧｓとは、配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされた天然ｍＲＮＡｓ、又は配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の濃度を意味する。
【０００６】
本発明の他の目的、特徴、利点及び態様は以下の記述から当業者には明白となろう。しかしながら、以下の記述及び特定の実施例は、本発明の好適な実施の形態を示すものではあるが、説明だけを目的として提供されたものであることは理解されるべきである。開示されている本発明の範囲内で多様な変形が可能であることは、以下の記述並びに本開示の他の部分を読むことにより当業者には容易に明らかであろう。
発明の要約
これらの点、そして他の目的に向け、患者における前立腺がんの存在を診断する方法を提供するのが本発明の一つの目的である。該方法は、患者の細胞、組織又は体液試料中のＰＳＧ濃度を測定し、測定したＰＳＧ濃度を対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。対照のＰＳＧ濃度に対する患者の測定ＰＳＧ濃度の上昇は前立腺がんと関連する。
【０００７】
本発明の別の目的は、患者における転移前立腺がんの診断法を提供することである。該方法は、患者の細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度を測定し、測定したＰＳＧ濃度を対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。対照のＰＳＧ濃度に対する患者の測定ＰＳＧ濃度の上昇は転移したがんと関連する。
【０００８】
本発明の別の目的は、患者における前立腺がんの病期決定法を提供することである。該方法は、前立腺がんを持つ患者を識別し、患者から得た細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度を測定し、測定したＰＳＧ濃度を対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。対照のＰＳＧ濃度に対する患者の測定ＰＳＧ濃度の上昇は進行中のがんと関連する可能性があり、対照に対する患者の測定ＰＳＧ濃度の減少又は等価は退行中又は寛解したがんと関連する可能性がある。
【０００９】
本発明の別の目的は、患者における前立腺がんの転移の開始をモニターする方法を提供することである。該方法は、転移したことが知られていない前立腺がんを持つ患者を識別し、患者から得た細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度を定期的に測定し、測定したＰＳＧ濃度を対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。対照のＰＳＧ濃度に対する測定ＰＳＧ濃度の上昇は転移したがんと関連する。
【００１０】
更に本発明の別の目的は、患者における前立腺がんの病期の変化をモニターする方法を提供することである。該方法は、前立腺がんを持つ患者を識別し、患者から得た細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度を定期的に測定し、測定したＰＳＧ濃度を対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。対照のＰＳＧ濃度に対する測定ＰＳＧ濃度の上昇は進行中のがんと関連し、対照のＰＳＧ濃度に対する測定ＰＳＧ濃度の減少は退行中又は寛解したがんと関連する。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴、利点及び態様は以下の記述から当業者には明白となろう。しかしながら、以下の記述及び特定の実施例は、本発明の好適な実施の形態を示すものではあるが、説明だけを目的として提供されたものであることは理解されるべきである。開示されている本発明の範囲内で多様な変形が可能であることは、以下の記述並びに本開示の他の部分を読むことにより当業者には容易に明らかであろう。
発明の記述
本発明は、患者の測定ＰＳＧ濃度を対照のＰＳＧ濃度と比較することによる、がんの検出、診断、モニター、病期決定、及び予後予測のための定量及び定性的診断アッセイ並びに診断方法に関する。本明細書中で使用している“ＰＳＧ濃度”とは、配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現された天然タンパク質の濃度を意味する。あるいは、ここで使用している“ＰＳＧ濃度”とは、配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされた天然ｍＲＮＡｓの濃度、又は配列番号１、２、３、４、５、６又は７のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の濃度を意味する。そのような濃度は、好ましくは細胞、組織及び／又は体液の少なくとも一つで測定し、ＰＳＧの正常及び異常濃度の判定も含む。従って、例えば、対照の体液、細胞、又は組織試料と比較してＰＳＧタンパク質の過剰発現を診断する本発明による診断アッセイは、前立腺がんを含むがんの存在を診断するのに使用できる。本発明の方法においては７種のＰＳＧｓのうちのいずれかを単独で測定しても、全部一緒に測定しても、７種のＰＳＧｓを様々に組み合わせて測定してもよい。
【００１２】
“対照”とは、がんのないヒト患者及び／又は患者の非がん性試料を意味するが、ここでは正常ヒト対照としての意味も持つ。転移を診断又はモニターする方法においては、対照は、信頼できる方法によって転移していない前立腺がんを持つと判定されたヒト患者からの試料を含むこともできる。
【００１３】
本発明の全ての方法は、場合によりＰＳＧ以外の他のがんマーカーの濃度の測定を含んでもよい。本発明に有用なＰＳＧ以外の他のがんマーカーは、検査されるがんによって異なり、また当業者には周知である。例えば、ＰＳＧの上昇だけでなくＰＳＡの上昇を同時に検査することも本発明の範囲内であり、検査されるがんが転移しているか転移の開始が起こっているかをより高い確度で提供することになると考えられる。
診断アッセイ
本発明は、前立腺がんの存在を、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織又は体液中のＰＳＧ濃度と比較した細胞、組織又は体液中のＰＳＧ濃度の変化を分析することによって診断する方法を提供する。正常ヒト対照に対する患者のＰＳＧ濃度の上昇は前立腺がんの存在と関連する。本発明を制限するのではないが、通常、定量的診断アッセイに関し、検査された患者にがんがあることを示す陽性の結果は、ＰＳＧなどのがんマーカーの細胞、組織、又は体液中濃度が、正常ヒト対照の好ましくは同じ細胞、組織、又は体液中濃度より少なくとも２倍高い、最も好ましくは少なくとも５倍高いというものである。
【００１４】
本発明はまた、まだ転移していない前立腺がんを持つ患者における転移性前立腺がんについてその転移の開始を診断する方法も提供する。本発明の方法において、転移しているかもしれない（しかし転移したことがこれまでに知られていない）前立腺がんを持つことが疑われるヒトがん患者を識別する。これは、当業者に公知の多様な手段によって達成される。例えば、前立腺がんの場合、患者は通常、従来の検出法の結果前立腺がんと診断される。
【００１５】
本発明では、細胞、組織、又は体液中のＰＳＧの存在を測定することが、転移していない前立腺がんと転移した前立腺がんを区別するのに特に有用である。
現存の技術では転移した前立腺がんと転移していない前立腺がんを区別するのは困難であるのに、適正な処置の選択はそのような知識に依存することが多い。
【００１６】
本発明においては、このような細胞、組織、又は体液中で測定されるがんマーカー濃度はＰＳＧｓであり、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度と比較される。つまり、観察しているがんマーカーが血清中のＰＳＧであれば、この濃度は、好ましくは、正常ヒト対照の血清中のＰＳＧ濃度と比較される。正常ヒト対照と比べた場合の患者のＰＳＧの上昇は転移した前立腺がんと関連する。
【００１７】
本発明を制限するのではないが、通常、定量的診断アッセイに関し、検査又はモニターされている患者のがんが転移したことを示す陽性の結果は、ＰＳＧなどのがんマーカーの細胞、組織、又は体液中濃度が、正常患者の好ましくは同じ細胞、組織、又は体液中濃度より少なくとも２倍高い、最も好ましくは少なくとも５倍高いというものである。
病期決定
本発明はヒト患者における前立腺がんの病期決定法も提供する。
【００１８】
該方法は、そのようながんを有するヒト患者を識別し、そのような患者から得た細胞、組織、又は体液試料をＰＳＧについて分析することを含む。次に、当該方法は、そのような細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度を、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度と比較する。正常ヒト対照に対する患者のＰＳＧ濃度の上昇は進行中のがんと関連し、ＰＳＧ濃度の減少は退行中又は寛解したがんと関連する。
モニタリング
さらに提供されるのは、前立腺がんを持つヒトにおけるがんの転移の開始をモニターする方法である。該方法は、転移したことが知られていないそのようながんを持つヒト患者を識別し、そのような患者から得た細胞、組織、又は体液試料をＰＳＧについて定期的に分析し、そのような細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度を正常ヒト対照の好ましくは同じ種類の細胞、組織、又は体液試料中のＰＳＧ濃度と比較することを含む。正常ヒト対照に対する患者のＰＳＧ濃度の上昇は転移したがんと関連する。
【００１９】
本発明によってさらに提供されるのは、前立腺がんを持つ患者におけるがんの病期の変化をモニターする方法である。該方法は、そのようながんを有するヒト患者を識別し、そのような患者から得た細胞、組織、又は体液試料をＰＳＧについて定期的に分析し、そのような細胞、組織、又は体液中のＰＳＧ濃度を好ましくは同じ患者のＰＳＧ濃度と比較することを含む。
【００２０】
そのような患者の転移の開始についてのモニタリングは、定期的、好ましくは年４回実施する。しかしながら、がん、特定の患者、及びがんの病期によって頻度がこれより多い場合も少ない場合もあり得る。
アッセイ技術
宿主から得た試料中の遺伝子発現量、例えば本発明のＰＳＧを測定するのに使用できるアッセイ技術は当業者には周知である。そのようなアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、免疫組織化学法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法、競合−結合検定法、ウェスタンブロット分析法及びＥＬＩＳＡ法などである。中でもＥＬＩＳＡｓは生物学的液体中の遺伝子発現タンパク質の診断にしばしば好まれている。ＥＬＩＳＡ法はまず、市販の供給源から容易に入手できるとまではいかないが、ＰＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクロナール抗体を用意することを含む。さらに、ＰＳＧに特異的に結合するレポーター抗体を用意するのが一般的である。レポーター抗体は、放射性、蛍光又は酵素的試薬のような検出可能な試薬、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素又はアルカリホスファターゼに結合する。
【００２１】
ＥＬＩＳＡを実施するには、ＰＳＧに特異的な抗体を、抗体と結合する保持体、例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。次に、皿上に遊離タンパク質結合部位があればそれを全てウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質でインキュベートすることにより覆う。次に、分析する試料を皿の中でインキュベートすると、この間にＰＳＧはポリスチレン皿に結合している特異的抗体に結合する。結合しなかった試料は緩衝液で洗い流す。ＰＳＧに特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するレポーター抗体を皿に入れると、結果としてレポーター抗体とＰＳＧに結合している全てのモノクロナール抗体との結合がもたらされる。次に結合しなかったレポーター抗体を洗い流す。次に、比色基質を含むペルオキシダーゼ活性用試薬を皿に加える。ＰＳＧ抗体に結合した固定化ペルオキシダーゼは着色した反応生成物を生成する。所定時間中に発色した色量は試料中に存在するＰＳＧタンパク質の量と比例する。定量的結果は、通常標準曲線を参照することによって得られる。
【００２２】
競合検定法も使用できる。ＰＳＧに特異的な抗体を保持体に結合させ、標識したＰＳＧと宿主から取り出した試料を保持体上に流す。すると、保持体に結合した標識の検出量は試料中のＰＳＧの量と相関しうる。
【００２３】
核酸法を使用して前立腺がんマーカーとしてのＰＳＧ  ｍＲＮＡを検出することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及び核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence based amplification)（ＮＡＳＡＢＡ）を利用して悪性細胞を検出し、様々な悪性疾患の診断及びモニタリングをすることができる。例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、数千の他のｍＲＮＡ種の複合混合物中から特定のｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに使用できる有力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、ｍＲＮＡ種を最初に逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する。次にｃＤＮＡを標準ＰＣＲ反応で行うように増幅する。ＲＴ−ＰＣＲはこうして増幅により単一のｍＲＮＡ種の存在を明らかにすることができる。従って、ｍＲＮＡがそれを産生する細胞に非常に特異的であれば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して特定の細胞種の存在を識別することができる。
【００２４】
保持体上にアレイ化されたクローン又はオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成（すなわち格子化、gridding）は、遺伝子の発現の検出及びその発現量の定量の両方に使用できる。この手法では、ＰＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡを基質に固定化する。基質は任意の適切な種類でよく、例えばガラス、ニトロセルロース、ナイロン又はプラスチックであるが、これらに限定されない。ＰＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部を基質に結合させ、次いで被検体でインキュベートする。被検体は問題としている組織から単離したＲＮＡ又はＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーであり得る。
【００２５】
基質に結合したＤＮＡと被検体間のハイブリッド形成は、いくつかの手段によって検出及び定量化できる。例えば、被検体の放射性標識又は蛍光標識、又はハイブリッド検出用に設計された二次分子などの手段であるが、これらに限定されない。遺伝子発現量の定量は、被検体からの信号の強度を公知標準から決定された強度と比較することによって実施できる。標準は、標的遺伝子のインビトロ転写（無細胞転写）、収量の定量、次いでその物質を用いた標準曲線の作成によって得ることができる。
【００２６】
上記試験は、多様な患者の細胞、体液及び／又は例えば組織生検及び剖検材料由来の組織抽出物（ホモジネート又は可溶化組織）から得た試料について実施できる。本発明で有用な体液は、血液、尿、唾液、又は他の任意の体分泌物又はそれらの誘導体などである。血液は、全血、血漿、血清、又は任意の血液誘導体を含むことができる。
実施例
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は、特定の実施の形態を参照することにより本発明を説明することだけを目的として提供される。これらの例示は、本発明のある特定の態様を示してはいるが、制限を表現したり、開示されている発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＰＳＧｓ
検索を実施し、カリフォルニア州パロアルトのＩｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社より入手できるＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースの一部として以下の検索ツールを用いてＰＳＧｓを同定した。
【００２７】
１．ライブラリー比較（一つのライブラリーをもう一つのライブラリーと比較する）により、腫瘍中に発現され、正常組織中に無い又は低濃度で発現されたクローンの同定が可能である。
【００２８】
２．サブセッティングはライブラリー比較と類似するが、これによりライブラリーのプールに発現され、ライブラリーの第二のプールに無い又は低濃度で発現されたクローンの同定が可能である。
【００２９】
３．転写画像化は単一ライブラリー又はライブラリーのプール中の全クローンを存在量に基づいて掲載する。次に、各クローンを電子ノーザンを用いて検査し、それらの構成要素ＥＳＴｓの組織源を決定することができる。
【００３０】
４．タンパク質機能：Ｉｎｃｙｔｅは、潜在的タンパク質機能を有するＥＳＴｓのサブセットを公知タンパク質との相同性に基づいて識別した。このデータベースに含まれるいくつかの例は転写因子及びプロテアーゼなどである。このデータベースの中で構成要素ＥＳＴｓが疾患特異性を示したクローンを検索することによっていくつかのリード遺伝子を同定した。
【００３１】
電子サブトラクション、転写画像化及びタンパク質機能検索を用いて、構成要素ＥＳＴｓが特定の腫瘍由来のライブラリーにだけ又はそのライブラリーに高頻度でみられたクローンを同定した。各候補クローンについては各ＥＳＴの起源をチェックすることにより詳細に検査した。
【００３２】
【表１】
0003677210.tif 000002
【００３３】
実施例２：配列番号１；クローンＩＤ＃１５５０４２６；遺伝子ＩＤ＃２４４６７３（プロ１０１）の測定
本実施例は、別途詳細を記載しない限り当業者に周知であり日常業務である標準技術を用いて実施する。以下の実施例にある日常的な分子生物学的技術は、標準実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版；ニューヨーク、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のように実施する。
遺伝子発現の相対的定量
蛍光タックマン(Taqman)プローブを用いるリアルタイムの定量的ＰＣＲは、タックＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用する定量的検出システムである。この方法は、５’レポーター色素と下流の３’クエンチャー(quencher)色素で標識された内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（タックマン）を使用する。ＰＣＲの間にタックＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性によりレポーターが放出され、その蛍光がモデル７７００配列検出システム（米国カリフォルニア州フォスターシティ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のレーザー検出器によって検出できる。
【００３４】
内因性コントロールの増幅を用いて反応に添加する試料ＲＮＡの量を標準化し、逆転写酵素（ＲＴ）効率を正規化する。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又は１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかをこの内因性コントロールとして使用する。試験した全試料間の相対的定量を算出するには、一つの試料の標的ＲＮＡ量を比較結果の基準として用いる（キャリブレーター）。“キャリブレーター”に対する相対的定量化は、標準曲線法又は比較法を用いて得られる（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム）。
【００３５】
正常及び腫瘍組織中のプロ１０１（配列番号１）の組織分布と量を評価するために、腫瘍及び対応(matched)正常隣接組織、並びに非対応の腫瘍及び正常組織から総ＲＮＡを抽出した。次に、逆転写酵素を用いて第一のｃＤＮＡ鎖を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応をプライマーとプロ１０１（配列番号１）に特異的なタックマンプローブを用いて実施した。結果はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出器を用いて得た。無名数はキャリブレーターと比較したプロ１０１（配列番号１）の相対的発現量である。
【００３６】
以下の表２に、腎臓（キャリブレーター）と比較した１２種の正常組織中のプロ１０１（配列番号１）の相対的発現量として、無名数を示す。これらのＲＮＡ試料は異なる個人の特定組織から得た試料をプールすることによって作られた。
【００３７】
【表２】
0003677210.tif 000003
【００３８】
表２の相対的発現量によれば、ＰＳＧプロ１０１（配列番号１）ｍＲＮＡの発現は、分析した他の１１種の正常組織プールと比べて正常前立腺のプールで２０倍以上も高いことが示されている。これらの結果は、ＰＳＧのｍＲＮＡ発現が前立腺に非常に特異的であることを示している。
【００３９】
表２に示されている組織は異なる個人から得た試料のプールと対応する。以下の表３に示す組織は個人から得たがプールされていない。従って、表２に示すｍＲＮＡ発現量は表３に示す値とは直接比較することができない。
【００４０】
表３の無名数は、腎臓（キャリブレーター）と比較した６０組の対応（マッチング）試料中のプロ１０１（配列番号１）の相対的発現量である。各対応組は、特定組織のがん試料と、同じ個人の同じ組織の正常隣接試料を含む。３個の非対応卵巣腫瘍、３個の非対応正常卵巣、１個の非対応乳房腫瘍及び１個の非対応正常乳腺の結果も示す。
【００４１】
【表３】
0003677210.tif 000004
【００４２】
【表４】
0003677210.tif 000005
【００４３】
１４種の異なる組織を代表する表３の１２８個の試料中、高い発現量は一貫して前立腺組織にみられる。これらの結果は、表２に示した正常試料で得られた組織特異性の結果を裏付けるものである。表２及び表３は、１８種類のヒト組織から採取した合計１４０個の試料を表す。前立腺を除く１３種類の異なる組織を代表する６８個の試料からはプロ１０１ｍＲＮＡは検出されなかった（表３）。４種類の組織（胃、小腸、腎臓及び精巣）では、試験した個人のどの試料についてもプロ１０１（配列番号１）ｍＲＮＡは検出されなかった（表３）。このＰＳＧの発現はプールした正常試料中の精巣で検出された（表２）。表３の前立腺がん試料中のメジアン発現量は１６６．５単位である。卵巣４（正常）を除くと、表３の１個の試料、肝臓２（がん）だけがこの値の１０％を超える。
【００４４】
前立腺腫瘍試料と、同じ個人の正常隣接組織中のｍＲＮＡ発現量の比較も表３に示されている。ＰＳＧプロ１０１（配列番号１）は、対応する正常隣接組織と比べた場合に１３個中９個（６９％）の前立腺がん組織（前立腺１、２、３、４、５、６、８、１０及び１３）で高濃度に発現されている。このＰＳＧの発現量は２個の試料（前立腺９及び１２）で前立腺腫瘍のほうが正常隣接組織よりも低い。等価の発現量が２個の対応試料（前立腺７及び１１）で検出された。診断マーカーのＰＳＡ及びＰＬＡ２をコードする遺伝子に関する以前のｍＲＮＡ発現分析によれば、対応する正常隣接組織と比べて４０％〜８０％の腫瘍試料中でｍＲＮＡの高発現がみられた。対応する正常隣接組織と比べて腫瘍試料中に高発現が観察されるのは、膀胱３、結腸４、肝臓２、膵臓２、子宮内膜５、並びに乳房１、２及び３である。正常隣接試料中に高発現が観察されるのは、結腸５、肺２、肺３、肝臓１、子宮内膜１及び子宮４である。しかしながら検出量はほとんどの場合、異なる組織間で同規模であり、ほとんどの前立腺組織中にみられる量よりも低い。
【００４５】
高度の組織特異性、加えて、正常隣接組織と比べた場合、試験した１３個の前立腺腫瘍試料中９個にみられるｍＲＮＡの過剰発現は、ＰＳＧのプロ１０１（配列番号１）が、ｍＲＮＡを用いる前立腺がん検出のための良好な診断マーカーとなることを確信させる。
【配列表】
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