(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のループ領域配列と結合する複数のFn3β鎖領域を含んで成るフィブロネクチンIII型（Fn3）ポリペプチドモノボディであって、該モノボディーのループ領域の１つまたはそれ以上が、野生型（図２）ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の２〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の２〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の２〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手（SBP）に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成する、ことを特徴とするモノボディー。
【請求項２】
少なくとも１つのループ領域が特異的結合相手（SBP）と結合し、10-6モル／リッターより低い解離定数を有する、ポリペプチド:SBP複合体を形成することができる請求項１のモノボディー。
【請求項３】
少なくとも１つのループが、kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数（kcat）および非触媒速度定数（kuncat）で遷移状態類似化合物（TSAC）の加水分解を触媒できる請求項１のモノボディー。
【請求項４】
１つまたはそれより多くのループ域配列が以下のアミノ酸残基を含む請求項１のモノボディー：
ｉ）ABループ中の15〜16;
ii）BCループ中の22〜30;
iii）CDループ中の39〜45;
iv）DEループ中の51〜55;
ｖ）EFループ中の60〜66;及び
vi）FGループ中の76〜87。
【請求項５】
モノボディーのループ領域配列が、少なくとも２アミノ酸残基が欠失または置換することにより野生型Fn3ループ配列から変異したものである請求項１のモノボディー。
【請求項６】
モノボディーのループ領域配列が、３〜25個のアミノ酸残基が挿入されることにより野生型Fn3ループ配列から変異したものである請求項１のモノボディー。
【請求項７】
請求項１のポリペプチドモノボディーをコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項７の核酸分子と作用可能な状態で連結されている発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項９】
発現ベクターがM13ファージを基本とするプラスミドである請求項８の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つのループ領域がユニーク制限酵素部位を含んでいる複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードするDNA配列を用意し；
ｂ）ユニーク制限酵素部位でDNA配列を切断し；
ｃ）特異的結合相手または遷移状態類似化合物に結合可能なペプチドをコードしていることが知られているDNA断片を、上記制限酵素部位に挿入して、挿入体及び（ａ）のDNA配列を含むDNA分子を得；
ｄ）DNA分子を発現してポリペプチドモノボディーを得る；
を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載のフィブロネクチンIII型（Fn3）ポリペプチドモノボディー調製方法。
【請求項１２】
以下の工程：
（ａ）少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードする複製可能なDNA配列を用意し；
（ｂ）少なくとも１つのプライマーがDNAに挿入された修飾核酸配列を含み、ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）条件下にハイブリダイズ可能な程度に既知ループ配列に十分相補的であるPCRプライマーを調製し；
（ｃ）上記（ａ）のDNA配列と（ｂ）のプライマーを利用してポリメラーゼチェインリアクションを実施し；
（ｄ）上記（ｃ）の反応産物をアニーリングし、そして伸長してDNA産物を得；そして
（ｅ）上記（ｄ）のDNAによりコードされたポリペプチドモノボディーを発現させる；
ことを含んで成る、請求項１〜６の何れか１項に記載のフィブロネクチンIII型（Fn3）ポリペプチドモノボディーの調製方法。
【請求項１３】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つのループ領域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ領域と結合する複数のFn3β鎖ドメインをコードする複製可能なDNA配列を用意し；
ｂ）少なくとも１のループ領域に部位特異的突然変異誘導を行い、挿入変異を含むDNA配列を生成せしめ、そして
ｃ）上記挿入変異を含むDNA配列によりコードされたポリペプチドモノボディーを発現せしめる；
ことを含んで成る、請求項１〜６の何れか１項に記載のフィブロネクチンIII型（Fn3）ポリペプチドモノボディー調製方法。
【請求項１４】
（１）複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列をコードした複製可能なDNA、及び（２）請求項11〜13のいずれか１項に記載の工程を記載した指示書、を含む、請求項11〜13のいずれか１項に記載の方法を実施するキット。
【請求項１５】
それぞれが複数のループ領域を含む核酸種を複数含むFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型（variegnted）核酸ライブラリーであって、該核酸種が複数のループ領域配列に結合したFn3β鎖ドメイン配列をコードし、該モノボディーのループ領域の１つまたはそれ以上が、野生型（図２）ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の２〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の２〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の２〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手（SBP）に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成する、ことを特徴とするライブラリー。
【請求項１６】
１つまたはそれより多くのループ領域が：
ｉ）残基15〜16のABアミノ酸ループ；
ii）残基22〜30のBCアミノ酸ループ；
iii）残基39〜45のCDアミノ酸ループ；
iv）残基51〜55のDEアミノ酸ループ；
ｖ）残基60〜66のDFアミノ酸ループ；及び
vi）残基76〜87のFGアミノ酸ループ；をコードする請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項１７】
前記ループ領域配列が、少なくとも２アミノ酸の欠損または置換により野生型Fn3ループ域配列から変異している請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項１８】
前記モノボディーループ配列が、３〜25アミノ酸残基の挿入により野生型Fn3ループ領域配列から変異している請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項１９】
６〜75の核酸塩基を含むモザイク核酸配列が前記核酸種のループ領域のいずれかの１つに挿入さている請求項15のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２０】
前記モザイク配列が、システインをコードするコドンを含むグループから選択される１つまたはそれより多くのコドン、または停止コドンを避けるように構築された請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２１】
前記モザイク型核酸配列がBCループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２２】
前記モザイク型核酸配列がDEループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２３】
前記モザイク型核酸配列がFGループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２４】
前記モザイク型核酸配列がABループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２５】
前記モザイク型核酸配列がCDループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２６】
前記モザイク型核酸配列がEFループ内に位置する請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリー。
【請求項２７】
請求項15に記載のモザイク型核酸ライブラリーに由来するペプチドディスプレーライブラリー。
【請求項２８】
前記ペプチドがバクテリオファージまたはウイルスの表面上に提示される請求項27に記載のペプチドディスプレーライブラリー。
【請求項２９】
前記バクテリオファージがM13またはfdである請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリー。
【請求項３０】
特異的結合相手（SBP）と結合して、ポリペプチド:SＢＰ複合体の解離定数が10-6モル／リッターより小さいポリペプチド:SＢＰ複合体を形成することができるポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法において、
ａ）請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリーを用意し；
ｂ）上記（ａ）のペプチドディスプレーライブラリーを、固定されたまたは分離可能なSBPと接触せしめ；
ｃ）遊離ペプチドから、ペプチド:SBP複合体を分離し；
ｄ）上記（ｃ）の分離されたペプチドを複製して、多様性が低められ、さらにSBPを結合できる提示ペプチドが濃縮されていることで区別される新規ペプチドディスプレーライブラリーを得；
ｅ）上記（ｄ）の新規ライブラリーに対し工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を繰り返し；そして
ｆ）上記（ｄ）由来のある種の提示ペプチドのコード領域の核酸配列を決定し、SBPと結合しうるペプチドの配列を推定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３１】
それぞれが複数のループ領域を有する核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーの調製方法であって、該核酸種が複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列を複数コードし、該モノボディーのループ領域の１つまたはそれ以上が、野生型（図２）ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の２〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の２〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の２〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手（SBP）に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成し：
ａ）決定済み配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し；
ｂ）ポリペプチドを特異的結合相手（SBP）と接触せしめ、ポリペプチド:SBP複合体の解離定数が10-6モル／リッターより小さいポリペプチド:SBP複合体を形成せしめ；
ｃ）核磁気共鳴スペクトロスコピーまたはＸ線結晶学によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し；そして
ｄ）上記（ｃ）に提供された情報よりSBPへの結合が改善される１またはそれより多くのポリペプチドを生ずる核酸配列中の位置をモザイク化する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３２】
kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数（kcat）と非触媒速度定数（kuncat）で遷移状態類似化合物（TSAC）の加水分解を触媒できるポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法において、
ａ）請求項28に記載のペプチドディスプレーライブラリーを調製し；
ｂ）上記（ａ）に記載のペプチドディスプレーライブラリーを、固定されたまたは分離可能な、化学反応の近似分子遷移状態を示している遷移状態類似化合物（TSAC）と接触せしめ；
ｃ）ペプチド:TSAC複合体を遊離ペプチドから分離し；
ｄ）上記（ｃ）の分離されたペプチドを複製し、多様性が低められ、さらにTSACを結合できる提示ペプチドが濃縮されていることで区別される新規ペプチドディスプレーライブラリーを得；
ｅ）上記（ｄ）の新規ライブラリーに対し工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を繰り返し；そして
ｆ）上記（ｄ）由来の種の提示ペプチドのコード領域の核酸配列を決定し、SBPと結合しうるペプチドの配列を推定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３３】
それぞれが複数のループ領域を有する核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーの調製方法であって、該核酸種は複数のループ領域配列と結合するFn3β鎖ドメイン配列を複数コードし、該モノボディーのループ領域の１つまたはそれ以上が、野生型（図２）ループ領域に比べて、当該ループ領域配列中の２〜12個のアミノ酸の欠失、当該ループ配列中の２〜25個のアミノ酸の挿入、または当該ループ配列中の２〜数個のアミノ酸の置換により変異したものであり、そして当該モノボディーは特異的結合手（SBP）に結合してポリペプチド:SBP複合体を形成し；
ａ）ポリペプチドが、kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数（kcat）と非触媒速度定数（kuncat）で遷移状態類似化合物（TSAC）の加水分解を触媒できるものである、決定済み配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し；
ｂ）上記ペプチドを、固定されたまたは分離可能な、化学反応の近似分子遷移状態を表す遷移状態類似化合物（TSAC）と接触せしめ；
ｃ）核磁気共鳴スペクトロスコピーまたはＸ線結晶学によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し；そして
ｄ）上記（ｃ）に提供された情報よりTSACの結合製または安定性が改善される１またはそれ以上のポリペプチドを生ずる核酸配列中の位置をモザイク化する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３４】
特異的結合相手（SBP）と結合し、ポリペプチド：特異的結合手（SBP）複合体の解離定数が10-6モル／リッターより小さいポリペプチド:SBP複合体を形成できるポリペプチドのアミノ酸配列を特定することを目的とする請求項28のペプチドディスプレーライブラリーを含むキット。
【請求項３５】
kcat/kuncatの比が10より大きくなる様な触媒速度定数（kcat）と非触媒速度定数（kuncat）で遷移状態類似化合物の加水分解を触媒できるポリペプチドのアミノ酸配列を特定することを目的とする請求項28のペプチドディスプレーライブラリーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般にコンビネーション化学及び組み換え体DNAの両方を利用した分子生物学的方法による、結合性であり触媒性であるポリペプチドの製造及び選別の分野に関する。具体的には、本発明はそのループ領域の１またはそれ以上が変更されたフィブロネクチンIII型（Fn3）の分子骨格（scaffolding）をコードする核酸及びそれに由来するポリペプチドの両者のライブラリーの作成に関する。本発明はまた、例えば各種分子構造（抗体結合部位の様な）へ結合できるループ域が移殖されたFn3骨格（scaffolding）を含むポリペプチド、すなわち“人工ミニ−抗体”または“モノボディー”（monobody）に関する。
発明の背景
抗体の構造
通常、抗体（Ab）は２本の同一の免疫グロブリン（Ig）重鎖及び２本の同一の軽鎖より成る４量構造体である。Abの重鎖と軽鎖は異なる領域を含む。軽鎖はそれぞれ１可変領域（VL）と１不変領域（CL）を含むが、重鎖はそれぞれ１の可変領域（VH）と３または４の不変領域（CH）を含む（Alzariら、1988）。各領域は〜110アミノ酸残基より成り、２枚のβシートが相互に包み合って折り込まれて特徴的なβサンドイッチ構造、免疫グロブリンフォールドになっている。VH及びVL領域はそれぞれ、その領域の一端部でβシートと連結しているループまたは折れ曲がり部である３カ所の相補性決定領域（CDR1〜３）を有している（図1:A,C）。一般に軽鎖および重鎖の可変領域は共に抗原特異性に関係しているが、個々の鎖の特異性への関係の強さは必ずしも同じではない。抗体分子は６カ所のループ（CDRs）を無作化し利用することで、多数の分子と結合するよう発展してきた。しかし、たとえ最終結果が比較的小さなペプチドドリガンドであっても、抗体の大きさ及び６カ所のループの複雑さが設計上の大きなハードルになっている。
抗体の亜構造
Absの機能構造体は、蛋白質解析及び組み換え法により調製することができる。これらには、１つの鎖間ジスルフィド結合により連結した重鎖のVH−CH1領域と軽鎖のVL−CL1領域を含むFab断片と、VH及びVL域だけを含むFv断片とがある。1VH域が十分な親和性をもつこともある（Wardら、1989）。特定の単量体κ軽鎖が同源性（cognate）抗原に対し特異的に結合することも示されている（L.Masatら、1994）。時として、分離された軽鎖または重鎖が抗原結合活性を保持することが知られている（Wardら、1989）。これらの抗体断片は、その大きさ、低い溶解性または立体構造安定性の低さからNMRスペクトル法による構造解析には適していない。
別の機能構造体は、ペプチドリンカーにより共有結合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変域を含む単鎖Fv（scFv）である（Ｓ−zHuら、1996）。これら小（Mr25,000）蛋白は一般に単ペプチド中の抗原に対する特異性と親和性を保持しており、より大きな抗原特異的分子の簡便な構成単位を提供することができる。各種腫瘍抗原に反応性であるscFvを利用した異種移植無胸腺マウスに於ける成体分布研究をいくつかのグループが報告しており、その中で腫瘍の特異的な分布が観察されている。しかし、循環血液中でのscFvの寿命は短いことから、scFvsへの腫瘍細胞の暴露は限られており、取り込みのレベルも限られている。結果として、無傷抗体の場合には投与量の30〜40％ID/gが腫瘍内に局在し、60〜70％ID/gに達すこともあるのに対し、動物研究に於ける腫瘍のscFvs取り込みは１〜５％ID/gにすぎない。
“ミニボディー（Minibody）”と称される小蛋白骨格は、IgVHの一部を鋳型として利用して設計される（Pessiら、1993）。インターロイキン６に対し高い親和性（解離定数（Kd）〜10-7M）ミニボディーが、CDR1とCDR2に相当するループを無作為化し、それからファージディスプレー法を利用して突然変異を選別することで特定されている（Martinら、1994）。これらの実験は、Ab機能のエッセンスをより小さなシステムに転移可能であることを示している。しかし、ミニボディーはVH域の低溶解性を引き継いでいる（Bianchiら、1994）。
ラクダ（Camelus dromedarius）では、血清由来のIgG様物質を解析するとしばしば可変軽鎖域を欠損していることが報告されており、抗体特異性及び親和性がVH域（3CDRループ）だけに由来することもあることが示唆されている。最近、DaviesとRiechmannは高い親和性（Kd−10−7M）および特異性を持つ“ラクダ化"VHドメインはCDR3だけを無作為化し作成できることを報告している。溶解性を改善し、非特異的結合を抑制するために、３種類の突然変異がフレームワーク域に導入された（Davies ＆ Riechmann,1995）。しかし、VHsの溶解性と安定性の改善にラクダ化が一般的に利用できるかはまだ明らかではない。
別の“ミニボディー”に“ダイアボディー（diabody）”がある。ダイアボディーは小さな二価の二重特異性抗体断片であり、即ちこれらは２カ所の抗原結合部位を持っている。該断片は同一ポリペプチド鎖上に重鎖可変域（VH）と軽鎖可変域（VL）が結合したものである（VH−VL）。ダイアボディーはFab断片と同等の大きさである。同一鎖上の２つの領域間を対合させるには短すぎるリンカーを利用し、該領域を別の鎖の相補的な領域と対合させ、２抗原結合部位を作り出す。これら２量体抗体断片または“ダイアボディー”は２価であり、二重特異的である。P.Holligerら、PNAS 90:6444−6448（1993）。
モノクローナル抗体技術の発達により、複合体及び／または遊離状態にあるAb断片の3D構造の多くはＸ−線結晶学により解明されてきた（Websterら、1994;Wilson ＆ Stanfield,1994）。Ab構造の解析から、６つあるCDRsのうちの５つはペプチド主鎖の立体構造の数が限られており、従っていわゆるカノニカル構造を利用してCDRsの主鎖構造を推測することができる（Lesk ＆ Tramontano,1992;Reesら、1994）。さらに分析からは、VH域のCDR3（VH−CDR3）が通常最も広い接触面積を有していること、そしてその立体構造がカノニカル構造を特定するには多様性に富むことも示された;VH−CDR3はまた長さも多様であることが知られている（Wuら、1993）。従って、Ab−抗原インターフェイスの結合域の構造について実験的に決定することがまだ求められている。
遊離状態または複合体状態間の結晶構造の比較からは、複数のタイプの立体構造の再配置が示されている。これらの中には側鎖の再配置、断片の移動、VH−CDR3の大規模な再配置及びHVとVL域の相対位置の変化がある（Wilson ＆ Stanfield,1993）。遊離状態では、特に結合によりよって大きく立体構造が変化するCDRsはフレキシブルであると推測される。Ｘ−線結晶学は分子のフレキシブルな部分を調べるには不適であるため、液体状態に於ける構造研究は抗原結合部位の立体構造の動的な像を提供しない。
抗体−結合部位を模倣する
CDRペプチドと有機CDRの模倣体が作られている（Dougallら、1994）。CDPペプチドは短く、典型的には抗体のCDRループのアミノ酸配列に相当する環状のペプチドである。CDRループは抗体−抗原相互作用に関与している。有機CDR模倣体は、例えば小有機化合物の様な骨格に結合するCDループに対応するペプチドである。
CDRペプチド及び有機CDR模倣体はある程度の結合親和性を保持していることが知られている（Smyth ＆ von Itzstein,1994）。しかし、予想される様にこれらは小さすぎ、またフレキシブル過ぎて完全に親和性と特異性を保つことはできない。マウスCDRsは親和性を失うことなくヒトIgフレームワーク上に移植されている（Jonesら、1986;Riechmannら、1988）が、この“ヒト化”によっても上記の液体研究に特有の問題を解決されていない。
Abの天然選択プロセスの模倣
免疫系では、特定のAbsが大きなライブラリーより選択され増幅される（親和性成熟）。このプロセスは組み替え体ライブラリー技術を利用してin vitroで再現することができる。バックテリオファージ表面へ上手くAb断片を表現させることで、きわめて多数のCDR変異体を作成し、スクリーニングすることができる（McCaffertyら、1990;Barbasら、1992;Winterら、1994）。上記技術によりFabs及びFvs（並びにその誘導体）の数を増加させることができ、構造研究の豊富な材料が提供される。コンビネーショナル技術はAb模倣体と組み合わせることができる。
蛋白骨格として機能できる蛋白ドメインの多くはファージカプシド蛋白質と融合した形で発現される。Clackson ＆ Wells、Trends Biotechnol.12:173−184（1994）のレビュー。さらに、これらの蛋白域のいくつかは既に牛膵臓トリプシン阻害剤（Robertsら、PNAS89:2429−2433（1992））、ヒト成長ホルモン（Lowmanら、Biochemistry 30:10832−10838（1991））、Vernturiniら、Protein Peptide Letters1:70−75（1994））、及びブドウ球菌（Streptococcus）IgG結合域（O'Neilら、Techniques in Protein Chemistry V（Crabb、Ｌ、編集）pp。517−524、Academic Press.San Diego（1994））を含む無策為ペプチド配列を提示するための骨格体として利用されておいる。これら骨格体は１個の無作為化されたループまたは領域を提示する。
研究者は繊維状ファージM13の代表的な骨格体として、小さな74アミノ酸のα−アミラーゼ阻害剤であるテンダミスタット（Tendamistat）を利用している（McConnellとHoess,1995）。テンダミスタットはストレプトマイセス・テンダエ（Streptomyces tendae）由来のβシート蛋白である。この蛋白は、その大きさが小さいこと、安定性、高解像度NMRやＸ−線構造データが利用できることなどペプチド骨格体として魅力的な特徴を有している。テンダミスタット全体のトポロジーは免疫グロブリンのトポロジーに似ており、２枚のβシートが一繋がりのループによって結合している。免疫グロブリンと異なり、テンダミスタットのβシートは１本ではなく２本のジスルフィド結合により結合している。免疫グロブリンに見られるCDRループとの類似性より、テンダミスタットのループも同様の機能を果たし、in vitro突然変異により容易に無作為化できると考えられる。
しかし、テンダミスタットはストレプトマイセス・テンダエに由来している。このことはテンダミスタットがヒトでは抗原性を有しているが、そのオキサが小さいためにその抗原性を減じているか、または阻害している可能性がある。また、テンダミスタットの安定性は不明である。さらに、テンダミスタットの安定性は２本のジスルフィド結合の存在に拠ると報告されている。しかし、ジスルフィド結合は還元状態下に破壊される様な分子では明らかに不利であり、有益な蛋白構造を持たせるためには適切に形成させる必要がある。さらにテンダミスタットのループの大きさは比較的小さいため、骨格内に合致できるインサートの大きさに制限がある。さらに、新しく合成されたペプチド中に正確にジスルフィド結合を形成することは容易ではないことが知られている。蛋白質が、最も一般的な蛋白過剰発現の宿主細菌である大腸菌の細胞質空間に発現される場合、通常ジスルフィド結合は形成されず、特に大量の人工分子を調整することを困難にしている。
上記のように、各種の治療、診断および触媒応用を目的とした、小さい、単鎖型人工抗体が現在も求められている。
発明の要約
本発明は、複数のループ域配列と結合する複数のFn3−β鎖域配列を提供する。Fn3ポリペプチドのモノボディーループ域配列の１つあるはそれ以上が、対応する野生型のFn3のループ域配列について少なくとも２個のアミノ酸が欠損し、あるいは挿入し、または置換することで変異する。モノボディーのβ鎖域は、野生型Fn3の対応アミノ酸配列に対し少なくとも約50％の全アミノ酸配列相同性を有している。好ましくは、モノボディーのループ域の１つ、またはそれ以上が次のアミノ酸残基を含む：
ｉ）ABループに包含される15〜16;
ii）BCループに包含される22〜30;
iii）CDループに包含される39〜45;
iv）DEループに包含される51〜55;
ｖ）EFループに包含される60〜66;及び
vi）FGループに包含される76〜87。
本発明はまた、本発明のFn3ポリペプチドモノボディーをコードする核酸分子、ならびに該核酸分子を含む発現ベクター、及び該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、Fn3ポリペプチドモノボディーを調整する方法を提供する。本方法は、複数のループ域配列と連結する複数のfn3β鎖域配列をコードするDNA配列にあって、該配列の少なくとも１つのループが特有の制限酵素部位を含むものも提供する。該DNA配列は特定制限酵素部位で切断される。前もって選択されたDNA断片は特定の結合相手（SBP）と結合できるペプチド、または遷移状態アナログ化合物（TSAC）をコードする。前もって選択されたDNA断片をDNA配列中に挿入することで、挿入部を有するポリペプチドモノボディーをコードするDNA分子を得る。続いてDNA分子を発現し、ポリペプチドモノボディーを得る。
さらに、少なくともその内の１つのループ域のヌクレオチド配列が、既知である複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードする、複製可能なDNA配列を提供することを含むFn3ポリペプチドモノボディーの調整方法を提供する。PCR条件下にハイブリダイズ可能な程度に既知ループ配列に対し十分に相補的であり、その少なくとも一つがDNA配列中に挿入される修飾核酸配列を含んでいるポリメラーゼチェインリアクション（PCR）プライマーを提供し、または調整する。次に、PCRの反応産物を発現し、ポリペプチドモノボディーを得る。
本発明はさらにFn3ポリペプチドモノボディーを調整する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つのループ域のヌクレオチド配列が既知である複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードする複製可能なDNA配列を提供することを含む。少なくとも１ループ域に部位特異的突然変異を実施し、挿入変異体を作る。次に、得られた挿入変異を含むDNAを発現する。
さらに、野生型Fn3中の対応するループ域より少なくとも２個のアミノ酸が欠損し、または挿入され、あるいは置換されることで１つまたはそれ以上のモノボディーループ域配列が変異した複数のループ域配列と結合する、複数のFn3β鎖域配列をコードする複数の核酸種を含むFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーを提供するが、該モノボディーβ鎖域は野生型Fn3のβ鎖域配列の対応アミノ酸配列に対し少なくとも50％の全アミノ酸配列相同性を有している。さらに本発明は、本発明の変異核酸ライブラリーに由来するペプチド提示ライブラリーも提供する。おそらく、ペプチド提示ライブラリーのペプチドはバクテリオファージ、例えばM13バクテリオファージまたはfdバクテリオファージ、またはウイルスの表面に提示されるだろう。
本発明はまた、特定の結合相手（SBP）と結合してポリペプチド:SSP複合体を形成し、該ポリペプチド:SBP複合体の解離定数が10-6モル／リッターより小さいポリペプチド分子のアミノ酸配列を特定する方法を提供する。該方法は次の工程を含む：
ａ）本発明のペプチド提示ライブラリーを用意し；
ｂ）上記（ａ）のペプチド提示ライブラリーを固定した、または分離可能なSBPと接触せしめ；
ｃ）ペプチド:SBP複合体の遊離型ペプチドから分離し；
ｄ）分離したペプチドを複製することで、多様性の低い、SBPと結合できる提示ペプチドに富んだ（ａ）のライブラリーとは異なる新ペプチド提示ライブラリーを得：
ｅ）必要に応じて、（ｄ）の新たなライブラリーについて工程（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を繰り返し；そして
ｆ）上記（ｄ）の種の提示ペプチドをコードする領域の核酸配列を決定し、それによりSBPと結合できるペプチド配列を演繹する。
本発明はまた、複数のループ域をそれぞれ含む核酸種を複数有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーを調製する方法にあって、該核酸種が複数のループ域配列と結合する複数のFn3β鎖域配列をコードし、該ループ域配列の１またはそれ以上が野生型Fn3中の対応ループ配列より少なくとも２アミノ酸が欠失、挿入、または置換され変異したものである、次の工程を含む方法を提供する。
ａ）主要な配列を有するFn3ポリペプチドモノボディーを調製し；
ｂ）ポリペプチドを特異的結合相手（SBP）と接触させ、その解離定数が10-6モル／リッターより小さい、ポリペプチド:SSP複合体を形成せしめ；
ｃ）該磁気共鳴またはＸ−線結晶法によりポリペプチド:SBP複合体の結合構造を決定し；そして
ｄ）上記（ｃ）より提供される情報より、SBPへの結合が改良された１またはそれ以上のポリペプチドを生ずる核酸配列部位へのモザイク処理を行い、モザイク型核酸ライブラリーを調製する。
さらにkcat/kuncatが10以上である触媒速度定数kcat及び非触媒速度定数kuncatの化学反応を触媒できるポリペプチド分子のアミノ酸配列の特定方法を提供する。本法は次の工程を含む：
ａ）発明のペプチド提示ライブラリーを用意し、
ｂ）上記（ａ）のペプチド提示ライブラリーと、化学反応の近似分子遷移状態を表す固定された、または分離可能な遷移状態類似化合物（TSAC）を接触せしめ、
ｃ）遊離ペプチドからペプチド:TSAC複合体を分離し；
ｄ）上記（ｃ）で分離されたペプチドを複製し、多様性が低く、かつTSACに結合することができる提示ペプチドが豊富であることで（ａ）のものと区別される新ペプチド提示ライブラリーを得；
ｅ）必要に応じて（ｄ）の新規ライブラリーについて工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を繰り返し；そして
ｆ）上記（ｄ）から１種の提示ペプチドをコードする領域の核酸配列を特定し、それからペプチド配列を演繹する。
本発明はまた、それぞれが複数のループ域を含む核酸種を有するFn3ポリペプチドモノボディーをコードするモザイク型核酸ライブラリーにあって、該核酸種が複数のループ域配列と結合するFn3β鎖域配列を複数含み、前記ループ域配列の１つまたはそれ以上が野生型Fn3中の対応するループ域配列より少なくとも２個のアミノ酸が欠失し、または挿入され、あるいは置換され変異したものであり、さらに前記モノボディーβ鎖域配列が野生型Fn3のβ鎖域配列の対応アミノ酸配列に対し少なくとも50％の前アミノ酸配列相同性を有しているものである、以下の工程を含む方法；
ａ）前もって定められ配列を有し、そのポリペプチドがkcat/kuncatが10以上である触媒速度定数kcat及び非触媒速度定数kuncatの化学反応を触媒しうるものであるFn3ポリペプチドモノボディーを調製し；
ｂ）化学反応の近似分子遷移状態を表す固定された、または分離可能な遷移状態類似化合物（TSAC）にポリペプチドを接触せしめ；
ｃ）核時期共鳴またはＸ−線血漿学によりポリペプチド:TSAC複合体の結合構造を決定し；そして
ｄ）上記（ｃ）より提供された情報を基にし核酸配列中の問題位置をモザイク化したモザイク型核酸ライブラリーを調製し、TSACへの結合性とTSCの安定性を改良した１つまたはそれ以上のポリペプチドを得る。
本発明はまた本発明の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。本発明はさらに、本発明の方法のいずれかによるキットを利用し調製される、または特定される成分、例えばポリペプチドを提供する。
アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質の記載には次の略称が使用されている;Ala、またはＡ、アラニン;Arg,またはアルギニン;AsnまたはN,アスパラギン、Asp,またはＤ、アスパラギン酸;CysorC、システイン;Gln、またはＱ、グルタミン;GluまたはＥ、グルタミン酸;Gly,またはＧ、グリシン;His,またはＨ、ヒスチジン;Ile、またはＩ、イソロイシン;Leu、またはL,ロイシン;Lys、またはＫ、リジン;Met、またはM,メチオニン;Phe,またはF.フェニルアラニン;Pro,またはP,プロリン;Ser,またはＳ、セリン;ThrまたはＴ、スレオニン;Trp、またはW,トリプトファン;Tyr、またはＹ、チロシン;Val、またはＶ、バリン。
核酸、DNAまたはRNAの記載では次の略称が使用されている;A、アデノシン;T,チミジン;G,グアノシン;C,シトシン。
図の簡単な説明
図1.抗ライソゾーム免疫グロブリンD1.3（A,C;Bhatら、1994）及びヒトフィブロネクチンの第10III型ドメイン（B,D;Mainら、1992）のVHドメインのβ鎖及びループトポロジー（A,B）とMOLSCRIPT例（C,D;Kraulis,1991）。相補的決定域の位置（CDR、超可変域）及びインテグリン−結合Arg−Gly−Asp（RGD）配列が示されている。
図2.合成Fn3遺伝子のアミノ酸配列と制限酵素部位。残基番号はMianら（1992）に従った。デザインされた制限酵素部位をアミノ酸配列の上に示した。β鎖については下線を引いた。続くクローニング用にＮ−末端“mq"配列を発現ベクターに加えた。His−タグ（Novagen）融合蛋白はさらに上記Fn3配列の前に追加配列、MGSSHHHHHHSSGLVORGSHを有している。
図3.A,25℃および90℃に於ける野生型Fn3のFar UV CDスペクトラ。Fn3（50μＭ）は酢酸ナトリウム（50mM、pH4.6）に溶解した。B,215nmでモニターしたFn3の熱変性。温度は１℃／分の割合で上げた。
図4.A,ライソゾーム（HFL）と抗−ニワトリ卵−白色ライソゾーム（抗−HEL）抗体D.3（Bhatら、1994）のFv断片の複合体の結晶構造のＣαトレース。HELと接触するVH CDR3残基99〜102の側鎖も示されている。B,D1.3VHの残基番号に対しプロットしたD1.3 VH−HELとVH−VLが相互作用するそれぞれの残基の接触面領域、表面領域及び二次構造はDSSPプログラム（KabshおよびSander,1983）を用いて決定した。Ｃ及びD,D1.3 VH（Ｃ）及びFn3（Ｄ）のＦ鎖−ループ−Ｇ鎖成分のβシート構造の模式図。四角はβ鎖内の残基を示し、○は鎖内にない残基を示す。かげ線の四角は側鎖が明らかに埋没している残基を示している。破線は水素結合を示す。
図5.DNA及びアミノ酸配列を示すデザインされたFn3遺伝子。アミノ酸番号はMainら（1992）に従った。コンビネーショナルライブラリー中に無作為化された２つのループは四角で囲った。
図6.プラスミドpAS45のマップ。プラスミドpAS45はヒス・タグ−Fn3の発現ベクターである。
図7.プラスミドpAS25のマップ。プラスミドpAS25はFn3の発現ベクターである。
図8.プラスミドpAS38のマップ。プラスミドpAS38はFn3の表面提示用のファージミドベクターである。
図9.（ユビキチン−１）ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を利用した濃縮クローンのリガンド特異的結合の特徴。マイクロタイタープレートウエルをユビキチンでコートし（１μg/ウエル;"リガンド（＋））、続いてBSAでブロックした。およそ1010コロニー形成単位（cfu）を含むファージのTBS液をウエルに加え、TBSで洗浄した。結合したファージを抗ファージ抗体−POD標識体（Pharmacia）と、基質としてTurbo−TMB（Pierce）を用いて検出した。吸光度をMolecular Devices SPECTRAmax 250マイクロタイタープレート分光光度計を用いて測定した。コントロールには固定リガンド無しのウエルを利用した。２−１及び２−２は、それぞれ遊離型リガンドならびに酸によりライブラリー２より溶出された濃縮クローンを示す。４−１および４−２はそれぞれ、遊離型リガンドおよび酸でライブラリー４より溶出された濃縮クローンを示す。
図10.（ユビキチン−２）濃縮クローンの競合ファージELISA。まず、リガンドコートしたウエルへ結合させる前に、およそ1010コロニーcfuのファージを含むファージ液を遊離ユビキチンと４℃、１時間反応した。細胞を洗浄し、上記と同様にしてファージを検出した。
図11.ユビキチン結合モノボディー411の競合ファージELISA。実験条件はユビキチンに関する上記に同じである。ELISAは結合液中に遊離ユビキチンが存在する条件で実施した。実験は同一クローンの異なる４調整体で実施した。
図12.（フルオロセイン−１）４種類のクローン、pLB25.1、pLB25.4、pLB24.1及びpLB24.3のファージELISA。実験条件は上記ユビキチン−１に同じである。
図13.（フルオロセイン−２）４種類のクローンのファージELISA。実験条件は上記ユビキチン−２に同じである。
図14.蛍光−結合モノボディーLB25.5の1H,15H−HSQスペクトラム。およぼ20μＭ蛋白を100mMの塩化ナトリウムを含む10mm酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）に溶解した。スペクトラムはVarian Unity INOVA 600NMRスペクトロメーターで30℃で集めた。
図15.標的ユビキチンに対するUbi4−Fn3の結合反応の特徴。
（ａ）ユビキチンに対するUbi4−Fn3結合のファージELISA分析。ユビキチンでコートしたウエルへのUbi4−ファージの結合を測定した。コントロール実験はユビキチンを含まないウエルを利用し実施した。
（ｂ）Ubi4−Fn3の競合ファージELISA。Ubi4−Fn3−ファージを指定濃度のユビキチン液と前反応し、続いてユビキチンでコートしたウエルでファージELISA検出を行う。
（ｃ）Ubi4クローン特異性を試験する競合ファージELISA。Ubi4ファージを250μg/mlの蛋白液と前反応し、続いて（ｂ）同様にファージELISAを行う。
（ｄ）遊離蛋白を利用したELISA
図16.Ubi4−Fn3（塗りつぶし）及び野生型Fn3（中空）の平衡折り畳み曲線。四角はTBS（NaCl（150mM）を含むTris HCl緩衝液（50mM,pH7.5）中で測定したデータを示す。丸はNaCl（300mM）を含むGly HCl緩衝液（20mM,pH3.3）中で測定したデータを示す。曲線は２状態モデルに基づく遷移曲線に最も良い適合を示した。遷移を特徴付けるパラメータは表７にまとめた。
図17.（ａ）［15N］−Ubi4−Ｋ  Fn3の1H,15N−HSQCスペクトラム。（ｂ）。残基番号に対しプロットした1H（ｂ）および15N（ｃ）の化学シフトの差（δwild-type−δUbi4）。Ubi4−Ｋ欠損が無い場合の残基82〜84（塗りつぶしの丸で示した）の値。中抜き丸はUbi4−Ｋ蛋白中の変異残基を示す。β鎖の位置は矢印で示した。
発明の詳細な説明
過去10年間、免疫系はde novo触媒の豊富な源として活用されてきた。触媒抗体は化学選択性、鏡像異性体選択性、大きな速度加速脳、及び化学反応の新規経路開発能を持つことが示されている。多くの場合、抗体は遷移状態類似（TSA）ハプテンに対し惹起されている。これらTSAハプテンは、反応体と生産物の間の反応経路に短時間（約半減期10-13s）に出現するエネルギー的に不安定な遷移状態種の構造を模した安定な低分子量化合物である。抗TSA抗体は天然酵素と同様に選択的に結合して遷移状態を安定化し、それにより反応体から産生物までの経路を簡便にする。即ち、結合により抗体が実際の遷移状態のエネルギーを低下し、反応速度を上げる。これら触媒を遷移状態の幾何学的及び静電気的な機構に結合し、不利益な電荷を中和し、エントロピーバリアーを克服して、反応体の立体電気的機構を指示する反応経路をコントロールできる様にコントロールできる。この方法によれば非常に不向きな反応も触媒することができる（Jandaら、1997）。さらに、多くの場合触媒は天然または人工酵素が得られていない反応について作成されている。
特定機能を得る為のコンビネーショナル化学システムが成功するか否かはライブラリーの大きさ及び、そのメンバーへの接近能に依存している。まず反応遷移状態を模したハプテンに対する動物に作らせた抗体をハプテンに対する結合に関しスクリーニングし、続いて触媒活性に関しスクリーニングすることが極めて多い。改良法ではファージの抗体ライブラリーより触媒を直接選択し、それを利用して化学と複製に連結することができる。
抗体断片のライブラリーは、無作為化した抗体遺伝子をファージのコート蛋白をコードする遺伝子に加えることで繊維ファージウイルスの表面に作ることができる。次に各ファージはその表面に１種類の抗体断片のコピーを複数発現し提示する。各ファージは表面に提示した抗体断片とその断片をコードするDNAの両方を有しており、標的に結合する抗体断片は付属のDNAを増幅することで特定することができる。
免疫化学では化学的反応性が可能な限り小さい物質を抗原として利用する。多くの場合、最終的な抗体は無傷の構造体と相互作用することが望まれる。反応性免疫では、コンセプトは全く逆である。誘導プロセスに於ける抗体分子への結合ににより、化学反応が生じるほと強く反応性である化合物を免疫する。その後、これと同じ化学反応が触媒現象のメカニズムの一部となる。場合によっては、それ自体物質ではない化学反応により免疫することがある。反応性免疫源は、メカニズムを阻害する代わりにメカニズムを誘導するという逆の形で利用されること除けばｍ酵素学者が利用するメカニズムに基づく阻害剤に類似のものであると考えられる。
人工触媒抗体は多くの様々な応用について、大きな産業的な可能性を有している。触媒抗体に基づく産物はプロドラッグの活性化やコカインの不活化といった治療応用のプロトタイプ実験や、バイオセンサー及び有機合成といった非治療応用に利用され、成功している。
触媒抗体は非触媒性抗体に比べより触媒的であり、低用量で使用でき、またその作用が通常可逆的であることから（例えばペプチド結合は結合するよりもむしろ切断する）、理論的には非触媒性抗体に比べて治療薬としてより魅力的である。治療に於いては、精製された触媒抗体を直接患者に投与し、あるいは適当なハプテンで免疫化して患者自身の触媒抗体応答を惹起することができる。触媒抗体はまた臨床診断の道具とし、あるいはファインケミカルの合成に於ける部位特異的または立体特異的触媒としても利用できる。
1.Fn3ループの変異およびFn3へのAbループの移殖
CDR移植用の理想的な骨格は溶解性に優れ安定している。それは構造解析に十分な小ささを持ち、かつ複数のCDRsを調節するのに十分な大きさを持ち、高い結合性及び／または特異性を得ている。
既存非Ab蛋白のフレームワーク上に人工Abシステムを構築する新しい方法が開発された。このAb骨格を最小化するという方法の利点は、不要のAbs特性を引き継がずにすむことである。フイブロネクチンIII型域（Fn3）が骨格として利用されている。フィブロネクチンは細胞外基質の形成と細胞−細胞相互作用で重要な役割を果たす巨大分子である；それは３つの型（I,II及びIII）の小ドメインの多数の繰り返しより成っている（Baronら、1991）。Fn3それ自体は免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）の大サブファミリー（Fn3ファミリーまたはｓ−型Igファミリー）の代表例である。Fn3ファミリーには細胞接着分子、細胞表面のホルモン及びサイトカインのレセプター、シャペロン、及び炭水化物結合ドメインを含んでいる（Bork ＆ Doolittle,1992;Jones、1993;Borkら、1994;Campbell ＆ Spitzfaden、1994;Harpez ＆ Chothia、1994）。
最近、結晶学研究より転写因子NF−kBのDNA結合域の構造もFn3溝に密接に関係していることが示された（Ghoshら、1995;Mullerら、1995）。これら蛋白質は全て特異的分子認識に関与しており、多くの場合リガンド結合部位は表面ループにより形成されていることから、Fn3骨格は結合特異的結合蛋白の優れたフレームワークであることが示唆されている。Fn3の3D構造はNMR（Mainら、1992）及びＸ線結晶学（Leahyら、1992;Dickinsonら、1994）により決定されている。Fn3のβ鎖が９個ではなく７個である以外、その構造はAbのVH域の構造に似たβサンドイッチとして最も良く表現される（図１）。Fn3のそれぞれの末端には３個のループがある;BC,DE及びFGループの位置はそれぞれVH域のCDR1,2及び３に対応する（図1C、Ｄ）。
Fn3は小さく（〜95残基）、単量体であり、可溶性で安定している。これはジスルフィド結合を持たない数少ないIgSfのメンバーの一つである;VHは鎖間ジスルフィド結合（図1A）を持ち、還元状態での安定性は低い。Fn3は大腸菌で発現されている（Aukhilら、1993）。さらにヒトフィブロネクチンには17個のFn3域が存在しており、安定性と折りたたみにとりしばしば重要である保存的残基に関する重要な情報を提供している（例えば配列のアライメント、Mainら、1992とDickinsonら、1994参照）。配列解析から、BC及びFGループには大きな多様性が認められており、これらループが安定性には重要でないことが示唆されている。NMR研究からは、FGループが非常にフレキシブルであることが示されている：この柔軟性は第10Fn3がArg−Gly−Asp（RFD）モチーフを介してα５β１インテグリンに特異的に結合することと密接に関係している。ヒト成長ホルモン−レセプター複合体の結晶構造（de Vosら、1992）では、レセプターの第2Fn3域がFG及びBCループを介してホルモンと相互作用しており、この２個のループを利用して結合部位が形成される可能性が示唆されている。
フィブロネクチンの第10III型モジュールは免疫グロブリン域の同モジュールと似た折りたたみを有しており、７本のβ鎖より形成され、相互に包み合う２枚の逆平行のβシートを持つ（Mainら、1992）。II型モジュールの構造は２枚の逆平行βシートのサンドイッチを形成する７本のβ鎖より成り、１方のシートが３本（ABE）、もう一方のシートが４本（C'CFG）の鎖を含んでいる（Williamsら、1988）。３本鎖のβシートはGlu−９−Thr−14−（Ａ）、Ser−17−Asp−23（Ｂ）及びThr−56−Ser−60（Ｅ）の残基を含む。保存残基の大部分は疎水性核を形成し、核のＮ−末端とＣ−末端に向かってそれぞれ不変型の疎水性残基、Trp−22とTry−68が配されている。β鎖は柔軟性に劣ることから、その上に機能的なフレキシブルループが形成される堅牢なフレームワークを提供すると考えられている。トポロジーは免疫グロブリンＣ域のトポロジーに似ている。
遺伝子の構築および突然変異誘導
ヒトフィブロネクチンの第10Fn3の合成遺伝子（図２）は、突然変異誘導を容易にするために好都合である制限酵素を含み、高レベルの蛋白発現のため特異的コドンを利用する形に設計された（Gribskovら、1984）。
この遺伝子を次の様にして組み立てた：（１）遺伝子配列を設計された制限酵素部部位を境にして５つの部分に分割した（図２）；（２）各部分について、反対鎖をコードし、−15塩基が相補的に重なり合うオリゴヌクレオチドの対を合成した；（３）２本のオリゴヌクレオチドをアニールし、１本鎖の領域をDNAポリメラーゼのクレノー断片（Klenow fragment）を利用して満たした；（４）２本鎖オリゴヌクレオチドを、断片の末端にある制限酵素部位を利用してpET3aベクター（Novagen）にクローニングし、その配列をメーカーより提供されたジデオキシターミネーション法をもちいてApplied Biosystems DNAシークエンサーにより確認した；（５）全遺伝子（プラスミドpAS25）（図７）が得られるまで工程２−４を繰り返した。
この方法は１ステップポリメラーゼチェインリアクション（PCR）法（Sandhuら、1992）に比べると遺伝子組立に時間を要するが、遺伝子に変異が起こることが無い。変異はTaqポリメラーゼによる忠実度の低い複製により導入されると考えられており、時間のかかる遺伝子編集が必要となる。遺伝子はまたpET15b（Vovagen）ベクター（pEW1）にもクローニングした。両ベクターはバクテリオファージT7プロモーターのコントロールの下にFn3遺伝子を発現した（Studlerら、1990）;pAS25は96−残基のFn3蛋白だけを発現したが、pEW1はポリヒスチジンペプチド（His・タグ）との融合蛋白としてFn3を発現した。組み換え体DNA操作は特記無い限りMolecular Cloning（Sambrookら、1989）に従い実施した。
突然変異はカセット突然変異法またはオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法（Deng ＆ Nickolff）のいずれかを用いてFn3遺伝子に導入した。カセット突然変異法は上記の遺伝子構築と同一手順にて行った；新規配列をコードする２本鎖DNA断片を発現ベクター（pAS25及び／またはpEW1）内にクローン化した。新たに合成した鎖（変異をコーディングしている）と遺伝子合成に用いるオリゴヌクレオチドを組み合わせることで、多くの変異体を作成することができる。得られた遺伝子の配列を決定し、変異誘導反応により設計した変異が導入され、それ以外の変異が導入されていないことを確認した。
抗体CDRsを持つFn3変異体の設計および合成
移殖のために２個の候補ループ（FG及びBC）を特定した。結晶構造が既知である抗体を調べ、Fn3に移殖されるループの供給源候補を探した。抗ニワトリ卵ライソゾーム（HEL）抗体D1.3（Bhatら,1994）をCDRループ源に選んだ。選択理由は：（１）遊離状態および複合状態に於ける高い解像度の結晶構造が得られる（図4A;Bhatら、1994）、（２）結合反応に関する熱力学データが得られる（Telloら、1993）、（３）D1.3がAb構造解析とAb工学の模範として利用されている（Verhoeyenら、1988;McCaffertyら、1990）。（４）部位特異的変異誘導実験から、重鎖（VH−CDR−３）のCDR3の親和性への関与がその他のCDRsに比べて大きいことが示されている（Hawkinsら、1993）；及び（５）結合アッセイの実施が容易である。本試験の目的は、安定性を大きく損なうことなくD1.3のVH−CDR3をFn3骨格上に移すことである。
D1.3構造（図４）の分析より、VH−CDR3はより長いことが判明したが、ニワトリ卵白ライソゾーム（HEL）に直接接するのは残基99〜102（“RDYR"）だけであることが示された（図4B）。またD1.3 VH−CDR3の鎖ＦとＧの間の曲がりは（図4C）、Fn3のFGループ（図4D）に比べて短いことも明らかになった。従って、D1.3のRDYR（99〜102）を核に利用し変異配列を設計し、様々な境界とループの長さのものを作成した（表１）。より短いループがD1.3 CDR3の立体構造をより模しており、従って親和性がより高いが、同時にFn3との野生型相互作用が排除されることで安定性が大きく低下すると考えられる。
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下線はβ鎖中の残基を示す。太文字は置換した残基を示す。
さらに、VH8と名付けられた抗HEL単独VH域（Wardら、1989）を鋳型に選択した。VH8はライブラリースクリーニングより選択されたものであり、VL域を欠いているがその長いVH−CDR3に拠ると思われる27nMのHELに対する親和性を有している（表１）。従って、そのVH−CDR3はFn3に移された。ループが長いと親和性が高くなり、野生型のFn3のループ長に近いため、Fn3フレームワーク上有利であると考えられる。VH8の3D構造は知られておらず、従ってVH8 CDR3の配列はD1.3 VH−CDR3の配列に合わせ並べた;2つのループを設計した（表１）。
変異体構築および産生
部位特異的変異誘導実験を実施し、設計した配列を得た。２種類の変異体Fn3s,D1.3−１及びD1.3−４（表１）を得、両変異体を可溶性His・タグ融合蛋白として発現した。D1.3−４を精製し、His・タグ蛋白をトロンビン分解して除いた。D1.3−４はpH7.2に於いて少なくとも1mMまで可溶性であった。サンプル調整中及びNMRデータ取得中に蛋白の凝集は認められなかった。
蛋白発現および精製
大腸菌（E.coli）BL21（DE3）（Novagen）を野生型または変異体の遺伝子を含む発現ベクター（pAS25、pEW1およびその誘導体）で形質転換した。細胞をM9最小培地及びアンピシリン（200μg/ml）入りバクトトリプトン（Difco）を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び／または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。２リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃で揺すった。OD（600nm）が１になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（PTG）を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加３時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
His・タグ無しのFn3は次の様にして精製した。細胞をエチレンジアミン３酢酸（EDTA;1mM）とフェニルメチルスルフォニルフロライド（1mM）を含むTris（50mM、pH7.6）5ml/（ｇ細胞）に懸濁した。HELを最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間超音波処理した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿を遠心分離し回収した。沈殿を５〜10mlの酢酸ナトリウムに溶解し（50mM、pH4.6）、不溶物を遠心分離により除いた。溶液を酢酸ナトリウムバッファーで平衡化したセファアルクリル（Sephacryl）S100HRカラム（Pharmacia）にかけた。Fn3を含む分画を酢酸ナトリウム（50mM、pH4.6）で平衡化したリソース（Resource）Ｓカラム（Pharmacia）にかけ、塩化ナトリウムの直線勾配（０〜0.5M）で溶出した。操作手順は表面電荷特性の異なる変異体産物の精製に合わせて調製できる。
His・タグ付きのFn3は次の様にして精製した。Trisバッファーの代わりに塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー（50mM、pH7.6）を使用した以外は上記同様にして細胞分画を調整した。溶液をニッケルを前負荷し、リン酸バッファーで平衡化したハイタラップ（Hi−Trap）カラム（Pharmacia）にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、His・タグ−Fn3を50mM EDTAを含むリン酸緩衝液で溶出した。His・タグ−Fn3を含む分画を酢酸ナトリウムを集め、セファアクリルS100−HRカラムにかけて、純度の非常に高い蛋白を得た。Novagen社提供のプロトコールに従いトロンビンで融合蛋白を処理し、His・タグ蛋白を切り離した。上記プロトコールに従いリソースＳカラムを用いて、Fn3をHis・タグペプチドとトロンビンから分離した。
検討した野生型および２種類の変異体の蛋白は可溶性蛋白として発現していた。変異体が封入体（不溶性凝集体）として発現されている場合は、まず低温（即ち25〜30℃）で可溶性蛋白として発現されているか調べた。発現できない場合には、封入体を低速遠心分離で集めてから上記同様にして細胞を融解した。沈殿をバッファーで洗浄し、超音波処理して遠心分離した。封入体は塩酸グアニジン（GdnCl、6M）を含むリン酸バッファー（50mM、pH7.6）中で可溶可し、Hi−Trapキレートカラムにかけた。蛋白をGdnClと50mM EDTAを含むバッファーで溶出した。
変異体Fn3,D1.3−４のコンホーメーション
His・タグS1.3−４融合蛋白の1H  NMRスペクトラは野生型のそれに極めて似ており、変異体が野生型と同様の立体構造に折りたたまれていることが示唆された。His・タグを除いた後のD1.3−４のスペクトラは、大きなスペクトラムの分散を示した。アミドプロトンの分散が大きく（７〜9.5ppm）とダウンフィールド（5.0〜6.5ppm）Ｃαプロトンの数が多いことがβシート蛋白の特徴である（Wuthrich,1986）。
D1.3−４の2D NOESYスペクトラムはさらに立体構造の保存を示す証拠を提供した。スペクトラムの一部は、アップフィールドメチルプロトン（＜0.5ppm）とメチル−メチレンプロトンの間に相互作用があることを示した。Val 72γメチル共鳴吸収は野生型のスペクトラム（−0.07及び0.37ppm;（Baronら、1992））では良く分離していた。D1.3−４スペクトラムには２種類のメチルプロトンに対応する共鳴吸収が存在した（−0.07と0.44ppm）。これら２つの吸収共鳴間の交叉ピーク及びその他の保存された交叉ピークより、D1.3−４スペクトラム中のこれら２つの共鳴吸収がVa172のものと極めて近似していること、さらにその他のメチルプロトンが野生型Fn3とほぼ同一環境内にあることが示された。２種類のスペクトル間の微細な違いは変異による微細な構造攪乱によるものである。Val72はＦ鎖上にあり、そこでFn3の中心疎水性核を形成している（Mainら、1992）。その位置はFGループの変異残基から４残基しか離れていない（表１）。D1.3−４はループ内に７つの変異と、３個の欠失を持つにもかかわらず（全残基の10％以上；図12、表２）、その3D構造が視覚的には野生型のそれに同じであることから、この結果は注目に値する。従って、この結果はFGループがFn3分子の折りたたみ及び安定性に大きく関与しておらず、従ってFGループだけを変異できることを強く支持している。
0003614866.tif 000003
制限酵素部位には下線を付した。Ｎ及びＫはそれぞれA,T,G及びＣの当モル混合体ならびにＧとＴの当モル混合体を意味する。
構造および安定性測定
Absの構造は、定量法（例えばDSSP（Kabsch ＆ Sander、1983）およびPDBfit（D.McRee、The Scripps Research Institute））ならびにコンピューターグラフィクッス（例えば、Quanta（Molecular Simulations）及びWhat if（G.Vriend,European Molecular Biology Laboratory））を利用し解析し、AbsのFn3の鎖−ループ−鎖構造を積み重ねた。
温度および化学変性で誘導された巻き戻し（unfolding）反応を測定しFnAbsの安定性を決定した（Paceら、1989）。温度−誘導巻き戻し反応は円二色性（CD）施光計を用いて測定した。サンプルの温度をゆっくり上げながら222及び215nmの楕円率を測定した。サンプル濃度は10ないし50μＭを使用した。巻き戻しのベースラインが決定されたら、温度を下げて巻き戻し反応が可逆的であることを確かめた。巻き戻しの自由エネルギーは、データを２状態遷移式に当てはめ決定した（Becktel ＆ Schellman、1987;Paceら、1989）。マッキントッシュコンピューター上でプログラムIgor（WaveMetrics）を利用し非線形最小二乗法を行った。
選択した２種類の変異体Fn3sの構造及び安定性を調べた；第１の変異体はD1.3−４（表２）であり、第２変異体はAS40と呼ばれる変異体で、BCループ内に４つの変異を含んでいる（A26V27T28V29）→TQRQ）。AS40は上記のBCループライブラリーより無作為に選別された。両変異体は大腸菌の中で可溶性蛋白を発現し、少なくとも1mMまで濃縮され、NMR試験が可能であった。
両変異体の温度変性の中間点はおよそ69℃であり、野生型のそれはおよそ79℃であった。この結果は、２本の表面ループの拡大変異はFn3安定性を大きく低下させないことを示しており、従って両ループ内に多くの変異を誘導することが可能であることが示唆された。
安定性は塩化グアニジン（GdnCl）−及び尿素−誘導巻き戻し反応でも決定した。予備巻き戻し曲線をモーター駆動注射器を装着した蛍光光度計を利用して記録した;GndClまたは尿素をキュベット内の蛋白溶液に連続的に加えた。予備巻き戻し曲線に基づき、様々な濃度の変性物を含む分離サンプルを調整し、サンプルが測定温度に最低１時間平衡化した後、蛍光（290nm励起、300〜400nm発光）またはCD（222及び215nmの楕円率）を測定した。曲線は最小二乗法を利用して２状態モデル（Santoro ＆ Bolen,1988;Koideら、1993）に適合した。必要に応じてプロトン濃度の変化を補正した。
温度巻き戻し反応の可逆性が確立された後、巻き戻し反応をMicroad MC−２ディファレンシャルスキャニングカロリーメーター（DSC）を利用して測定した。セル（−1.3ml）にFnAb液（0.1−1mM）を満たし、温度をゆっくり上げながら△Cp（＝△H/△Ｔ）を記録した。遷移曲線をMirocal社提供のOriginソフトウエアーに適用し、Tm（巻き戻し中間点）、巻き戻し△Ｈ及び巻き戻しの△Ｇを決定した。
熱的巻き戻し
Fn3の温度誘導巻き戻し実験を円二色施光法（CD）分光計を用いて実施し、二次構造の変化をモニターした。未変性Fn3のCDスペクトラムは222nm付近にFn3の主要β鎖構造（Perczelら、1992）に一致する弱いピークを示し（図3A）た。80〜90℃に協調的巻き戻し遷移が観察され、Fn3の安定性が高いことが明瞭に示された（図3B）。巻き戻しの自由エネルギーは遷移後のベースラインを欠いたことから決定できなかった。本結果はヒトフィブロネクチンの第１  Fn3域の高い安定性（Litvinovichら、1992）と一致し、Fn3域の安定性が一般に高いことを示唆している。
結合アッセイ
FnAbsの結合反応を、等温滴定カロリーメーター（ITC）と蛍光分光計を用いて定量的に調べた。
結合の円たるピーの変化はMicrocal Omega ITC（Wisemanら、1989）を用いて測定した。サンプルセル（〜1.3ml）をFnAb液で満たし（≦100μＭ、Kdによって変えた）、リファレンスセルは蒸留水で満たした；ベースラインが安定するまでシステムを設定温度で平衡化した；リンガンド液（≦2mM）５〜20μｌをモーター駆動式注射器を利用して短時間に注入し、平衡化した（４分）；注入を繰り返し、注入毎に熱発生／吸収を測定した。リガンド濃度の関数として観察された熱変化より、△ＨとKdを決定した（Wisemanら、1989）。結合反応の△Ｇと△Ｓは、直接測定したこの２変数から演繹した。理論曲線からの変動を検証し、特異的（複数部位）結合について調べた。セル内のリガンドを交換し、FnAbで滴定した実験も行った。その結果、ITCだけが△Ｈの直接測定値を提供し、これによって結合エネルギーへのエンタルピーとエントロピーの関与が評価できたこと、それによりITCを利用してD1.3Abの結合反応のモニターに成功した（Telloら、1993;Bhatら、1994）ことを強調しなければならない。
内因性蛍光をモニターし、ITCによるKd決定が難しいμＭ以下のKdとの結合反応を測定した。Fn3−変異液（≦10μＭ）をリガンド液（≦100μＭ）で滴定しながらTrp蛍光（〜290nm励起、300〜350nm発光）とTyr蛍光（〜260nm励起、〜303nm発光）をモニターした。反応のKdは生体分子結合式に非線形最小二乗法を適用して決定した。二次結合部位の存在はスキャッチャード（Scatchard）分析から調べた。全ての結合アッセイで、対象のFnAbsの代わりに野生型Fn3（または無関係なFnAbs）を利用するコントロール実験を実施した。
II.高親和性と特異性FAbsによるFn3変異体の作成
特異的リガンドに結合するFnAbsを選択するためにライブラリースクリーニングを行った。これは上記のモデルする方法を補完するものである。コンビネーショナルスクリーニングの利点は、特異的変異体誘導（“合理的設計”）法では不可能な多数の変異体を（≧108）容易に作り、スクリーニングできる点である。ファージディスプレー法（Smith,1985;O'Neil ＆ Hoess,1995）を利用し効果的にスクリーニングした。Fn3をファージのコート蛋白（p III）に融合し、繊維状ファージの表面に提示させた。これらファージはFn3融合蛋白をコードする遺伝子を含んだ単鎖DNAゲノムを取り込んでいる。Fn3の特定領域のアミノ酸配列を核酸配列を変性して無作為化し、ライブラリーを構築した。所望の結合能を持つFn3変異体を提示するファージをin vitroで選別し、回収して増幅した。選択したクローンのアミノ酸配列は、選択したファージのFn3遺伝子の配列を決定して容易に特定することができる。Smith（Smith ＆ Scott,1993）のプロトコールに若干の改良を加え実施した。
目的は小蛋白リガンドに対し高い親和性を持つFnAbsを作成することである。HEL及びブドウ球菌蛋白ＧのB1域（以後、蛋白Ｇと称する）をリガンドとして利用した。その構造はNMRスペクトロスコピー（Gronenbornら、1991）により、４本鎖βシートに対し螺旋状に折り込まれたものであることが決定されている。得られたFnAb−蛋白Ｇ複合体（〜150残基）は、直接NMR法の範囲内にある、今日までに作られた最も小さい蛋白−蛋白複合体の一つである。両成分が小さいこと、安定性と溶解性に優れていること、さらに安定型同位元素（13Cおよび15N、以下蛋白Ｇについては以下参照）により安定して標識できることが、本複合体は蛋白−蛋白相互作用のNMR研究の理想モデルシステムにしている。
Fn3のループの交換の成功（変異体D1.3−４）は、全体のたたみ込みを失うことなく少なくとも10個の残基を変異することができる。これに基づき、FGループの残基だけを無作為化したライブラリーをまず構築した。BCループのループ交換実験の結果を得た後、変異部位を延ばし、BCループ及びその他の部位を含むようにした。
Fn3ファージ提示システムの構築
M13ファージを基本とする発現ベクターpASM1を以下の様にして構築した:OmpTの単一ペプチドをコーディングするオリゴヌクレオチドをFn3遺伝子の5'端にクローン化した;M13p IIIのＣ−末端域をコーディングする遺伝子断片を、PCRを用いてM13mp18の野生型遺伝子III遺伝子より調整し（Coreyら、1993）、OmpT−Fn3遺伝子の3'末端に挿入した；スペーサー配列をFn3とp IIIの間に挿入した。得られた断片（OOmpT−Fn2−p III）を、融合遺伝子がlacプロモーター下にコントロールされるM13mp18のマルチクローニングサイト内にクローン化した。このシステムはFn3−p III融合蛋白ならびに野生型p III蛋白を産生する。野生型p IIIの共発現は融合p III蛋白の数を減少させ、それによりファージ感染性を増大することが期待される（Coreyら、1993）（５コピーのp IIIがファージ粒子上に存在する）。さらに、強固に結合する蛋白を選別する為には、マルチ結合部位のキレート作用は５コピー全ての融合p IIIに比べて小さくなければならないことから（Bassら、1990）、融合p III蛋白の数はより少ない方が有利である。このシステムでセリンプロテアーゼトリプシンの提示に成功している（Coreyら、1993）。ファージ粒子を第２ポリエチレングリコール沈殿と酸沈殿で精製する以外標準的な方法（Sambrookら、1989）に従い、ファージを作成し、大腸菌K91kanを利用して精製した（Smith ＆ Scott,1993）。
融合ファージ上へのFn3提示の成功はフィブロネクチンに対するAbを利用したELISAにより確認されており、このシステムを利用してライブラリーが構築できることが明瞭に示された。
fUSE5を用いた別のシステム（Pamley ＆ Smith,1988）も利用できる。Fn3遺伝子を、Fn3遺伝子PCRの5'−及び3'−末端に導入されたSfil制限酵素部位を利用してfUSE5に挿入する。このシステムはファージ表面に融合p III蛋白（５コピーまで）だけを提示する。ファージを上記の様にして作成し、精製する（Smith ＆ Scott,1993）。このシステムを利用し多くの蛋白及びその正常体がを提示されてきた。fUSE5の利点はその低い毒性である。これは宿主内での複製型（RF）のコピー数が少ないためであり、そのためライブラリー構築のためのRFを十分量調整することを難しくしている（Smith ＆ Scott,1993）。
ライブラリーの構築
最初のライブラリーはFGループ（図4D）内の７つの残基（77〜83）を無作為化し、MBファージの表面にFn3域を提示させたものを構築した。無作為化は変性ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し実施できる。二重鎖ヌクレオチドは、１本の鎖の変異部位に、ＮがA,T,G及びＣの等モル混合体であり、ＫがＧおよびＴの等モル混合体である（NNK）６（NNG）配列をもつ以外遺伝子合成（上記）と同様のプロトコールにより調整される。残基83の（NNK）コドンは、Sac I制限酵素部位の保存に必要である（図２）。（NNK）コドンは20種類全てのアミノ酸をコードしているが、NNGコドンは14種類をコードしている。従って、このライブラリーは〜109の別々の配列を含んでいる。二重鎖ヌクレオチドを野生型ファージベクター、pASM1内に連結し、エレクトロポレーションを利用し大腸菌XL1ブルー（Stratagene）に形質転換しレイブラリーを作成した。XL1ブルーはlac Iq表現形を有しており、即ちlac誘導体の無い状態ではFn3−p III融合蛋白の発現を抑制する。同様にして最初のライブラリーを継代し、有害なFn3−p IIIクローンに対する選別を避ける。K91kanをもつファージを宿主として継代し、無作為化したFn3−p III融合蛋白を提示するファージを調整した。K91kanはlac Iqを有していないことから、融合蛋白の産生を抑制しない。BCループ（残基26〜20）を無作為化した別のライブラリーも作成した。
提示されたFnAbの選別
バイオパンニングプロトコール（Smith ＆ Scott、1993）を利用してFn3ファージライブラリーをスクリーニングした；リガンドはビオチンかされており、強いビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用しリガンドをストレプトアビジンをコートした皿に固定した。実験は室温で行った（〜22℃）。ライブラリーからの最初のファージ回収を行うためい、10μｇのビオチンかリガンドをストレプトアビジンをコートしたポリスチレン皿（35mm,Falcon1008）に固定し、続いてファージ液（〜1011pfu（プラーク形成単位）を加えた。この皿を適当なバッファー（典型的にはTBST、Tris−HCl（50mM、pH7.5）mNaCl（150mM）及びTween20（0.5％））で洗浄した後、結合したファージを以下の条件の一つまたはその組み合わせにより溶出した；低pH、遊離型リガンドの添加、尿素（6Mまで）、抗蛋白GFnAbsの場合トロンビンによる蛋白Ｇ−ビオチンリンカーの開裂。回収されたファージを、K91kanを宿主として利用する標準的プロトコールにより増幅した（Sambrookら、1989）。選択プロセスを３〜５回繰り返し陽性クローンを濃縮した。２回目からリガンド量を漸次減らし（〜１μｇまで）、皿に移す前にビオチン化したリガンドをファージ液と混合した（G.P.Smith、私信）。最終回後、10〜20クローンを採取し、そのDNA配列を決定した。クローンのリガンドの親和性をまずファージELISA法で測定した（以下参照）。
Fn3フレームワークのリガンドへの強い結合を抑制するために（バックグランド結合）、野生型Fn3をバッファー中に競合体として加えることができる。さらに、無関係な蛋白（例えばウシ血清アルブミン、チトクロームｃおよびRNaseA）を競合体として利用し、より特異的なFnAbsを選別した。
結合アッセイ
ファージへのFnAbsの結合親和性はファージELISA法（Liら、1995）を利用して半定量的に調べた。マイクロタイタープレート（Nunc）のウエルをリガンド蛋白でコートし（あるいはストレプトアビジンでコートし、続いてビオチン化リガンドを結合する）、Blotto液（Pierce）でブロックした。１つのプラーク（M13）／コロニー（fUSE5）に由来するファージ（〜1010pfu）精製体を各ウエルに加え、一晩４℃で反応した。ウエルを適当なバッファー（上記）で洗浄した後、抗M13Ab（ウサギ、Sigma）と抗−ウサギIg−パーオキシダーゼ標識体（Pierce）あるいは抗M13Ab−パーオキシダーゼ標識体（Pharmacia）を利用した標準的なELISA法により、結合ファージを検出した。発色アッセイはTMB（3,3',5,5'−テトラメチルベンジディン、Pierce）を利用して行った。免疫グロブリンに対する蛋白Ｇの親和性が高いことが特殊な問題を提示する:Absは検出に利用できない。従って、抗−蛋白GFnAbsを検出するために、融合ファージをウエル内に固定し、続いてビオチン化蛋白Ｇ、さらにストレプトアビジン−パーオキシダーゼ標識体を利用して結合を測定した。
可溶性FnAbsの産生
ファージELISAを利用して変異体Fn3sを予備的に調べた後、変異体遺伝子を発現ベクターpEW1にサブクローニングした。変異体蛋白はHis・タグ融合体蛋白として産生し、精製し、その立体構造、安定性とリガンド親和性を調べた。
即ちFn3は結合蛋白を操作するため応用できる単量体免疫グロブリン様骨格（scaffold）の４番目の例である。新規結合蛋白の選別の成功は、ミニボディー、テンダミスタットおよび“ラクダ化”（camelized）免疫グロブリンVH域骨格にも左右されてきた（Martinら、1994;Davies ＆ Riechmann,1995;McMoneell ＆ HOess,1995）。Fn3骨格はこれらシステムについても有益である。Bianchiらは、身のボディーの安定性は2.5kcal/molであり、Ubi4−Ｋに比べて有意に低い。これまでにミニボディーの構造上の特徴は詳細報告されている。テンダミスタットとVH域はジスルフィド結合を含んでおり、従って正確にたたみ込まれた蛋白を調整することは困難である。DaviesとRiechmannは、彼らのラクダ化したVH域の収量が1mg/リッター培養体以下であると報告している（Davies ＆ Riechmann,1996）。
即ち、Fn3フレームワークは分子認識骨格として利用できる。そのサイズが小さいこと、安定であること、構造が良く特徴付けされていることが、Fn3を魅力的なシステムにしている。広範囲のリガンド結合に関与する天然蛋白にFn3が広く存在しており、様々なクラスの標的に対しFn3を基本とした結合蛋白を作成することができる。
以下の実施例より本発明を例示するが、もとよりこれに限定されるものではない。
実施例１．Fn3遺伝子の構築
フィブロネクチンの第10Fn3の合成遺伝子が、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸残基1416〜1509（Kornblihttら、1985）とその３次元構造（Mainら、1992）を基に設計された。遺伝子を加工し、突然変異誘導に便利な制限酵素部位を導入し、高レベル蛋白発現を目的にいわゆる“好適コドン”（Gribskovら、1984）を利用した。更に、しばしばNMRスペクトラムを崩すＮ−末端メチオニンの部分的修飾を避けるために、グルタミン残基をＮ−末端メチオニンの後ろに導入した（Smithら、1994）。化学薬品は特記しない限り分析級またはそれ以上であり、Sigma Chmeical Company及びJ.T.Baker社より購入した。組み換え体DNAの操作は、特記ない限り“分子クローニング（Molecular Cloning"（Sambrookら、1989）の記述に従い実施した。カスタムオリゴヌクレオチドはOperon Technologiesより購入した。制限酵素および修飾酵素はNew England Biolabsより購入した。
遺伝子は次の方法により組み立てた。まず、遺伝子配列（図５）を制限酵素部位を設計された境界部分の５カ所に挿入した：断片１、Ndel−Pst I（オリゴヌクレオチドFN1F及びFN1R（表２）；断片２、Pst I−EcoR I（FN2F及びFN2R）１断片３、EcoR I−Sal I（FN3F及びFN3R）；断片4,Sal I−Sac I（FN4F及びFN4R）；断片５、Sac I−BamH I（FN5F及びFN5R）。第二に、各断片について、反対の鎖をコードし、およそ15塩基が相補的に重なり合うオリゴヌクレオチド対を合成した。これらオリゴヌクレオチドはFN1F−FN5Rと命名し、表２に示した。３番目に、それぞれの対（例えばFN1FとFN1R）をアニールし、DNAポリメラーゼのクレノー断片を利用して単鎖部分を充足した。４番目に、２本鎖オリゴヌクレオチドを断片末端に対応する制限酵素を処理して消化し、該断片に使用したものと同一制限酵素で処理されたpBlueScriptSKプラスミド（Stratagene）にクローン化した。挿入断片のDNA配列は、Applied Biosystems DNAシークエンサー及びメーカー提供のジデオキシターミネーションプロトコールを利用し配列を決定し、確認した。最後に全配列が得られるまで上記工程２〜４を繰り返した。
遺伝子はpET3a及びpET15b（Novagen）ベクター（それぞれpAS45及びpAS25）内にクローン化した。プラスミドの地図を図６および７に示す。これらプラスミドを含む大腸菌BL21（DE3）（Novagen）はバクテリオファージT7プロモーターのコントロール下にFn3遺伝子を発現した（Studierら、1990）;pAS24は96−残基Fn3蛋白だけを発現したが、pSA45はポリ−ヒスチジンペプチドとの融合蛋白（His・タグ）の形でFn3を発現した。大腸菌で高レベルに発現されたFn3蛋白とその誘導体は、CBBで染色したSDS−PAGE上に強い染色バンドとして検出された。
モノボディーの結合反応は、精製可溶性モノボディーを利用し、蛍光分光計を用いて定量的に調べた。
内因性の蛍光をモニターし、結合反応を測定した。Trp蛍光（〜260nm励起、〜303nm発行）をFn3−変異体液（≦100μＭ）をリガンド液で滴定しながらモニターした。リガンドが蛍光体（例えばフルオロセイン）の場合、リガンドからの蛍光を利用することができる。成体分子結合式に非線形最小２乗法を適合し、反応のKdを決定した。
内因性蛍光を利用して結合反応をモニターできない場合には、モノボディーを蛍光−NHS（Pierce）で標識し、蛍光変更を利用して結合反応をモニターする（Brukeら、1996）。
実施例II．Fn3遺伝子内への制限酵素導入修飾
アミノ酸配列Fn3を変化させることなく、合成Fn3遺伝子内に制限酵素部位を導入した。制限酵素部位を選択することで、長い（＞60塩基）オリゴヌクレオチドを合成することなく遺伝子構築体を完成させ、カセット変異誘導法（即ち、断片を変異を含む別の合成断片と交換する）により２つのループ域を変異（無作為化も含む）させることができる。さらに、大部分の制限酵素部位はファージディスプレー用ベクターに特異的である形で選択された。特異的制限酵素部位は、より長い配列スペースを提供するためにすでに選択されているモノボディークローンを組み合わせることを可能にする。
実施例III．M13ファージディスプレーライブラリーの構築
ファージディスプレー用ベクター、pAS38（その地図については図８参照）は次のようにして構築した。OmpTの単一ペプチドをコードするpET12aXbal−BamH I断片をFn3遺伝子の5'端にクローン化された。Fn3遺伝子のＣ−末端域（FN5F及びFN5Rオリゴヌクレオチドより、表２参照）を、バクテリオファージM13のp III蛋白との融合蛋白を作成するためのMlu I部位とリンカー配列を同友するFN5F及びFN5R'オリゴヌクレオチド（表２）を含む新規断片で置換した。M13p IIIのＣ−末端域をコードする遺伝子断片を、PCRを利用してM13mpの野生型遺伝子IIIから調整し（Coreyら、1993）、Mlu I及びHInd III部位を利用してOmpT−Fn3融合遺伝子の3'末端に該断片を挿入された。
ファージ粒子を第２ポリエチレングリコール沈殿により精製した以外は通常の方法に従い（Sambrookら1989）ファージを作成し、ヘルパーファージM13K07を利用して精製した。融合ファージ上へのFn3の提示の成功は、フィブロネクチンに対する抗体（Sigma）及び特性の抗FN3抗体（Cocadico Biologicals、PA,USA）を利用したELISAにより確認した（Harlow ＆ Lane、1988）
実施例IV．ABループにループモザイクを含むライブラリー
ABループ中にモザイクを有する核酸ファージディスプレーライブラリーを次の方法により調整した。無作為化は変性した核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し行った。モザイク化する残基をFn3のＸ−線およびNMR構造を検討して決めた（それぞれの蛋白データバンク受付番号、1FNAおよび1TIF）。モザイク化した残基用のNNKを含むオリゴヌクレオチド（Ｎ及びＫはそれぞれA,T,GとＣの等モル混合体及びＧとＴの当モル混合体を意味する）を合成した（例えば表２のオリゴヌクレオチドBC3、FG2、FG3およびFG4を参照せよ）。NNK混合体は20種類全てのアミノ酸と１つの停止コドン（TAG）をコードしている。しかしTAGは大腸菌XL−１ブルーでは抑制されている。ぱS38の単鎖DNA（およびその誘導体）は通常の方法により調整される（Sambrookら、1989）。
部位特異的変異誘発は、Muta−Geneキット（BioRad）を利用した発表方法により実施される（例えばKunkel、1985参照）。ライブラリーは大腸菌XL−１ブルーエレクトロポレーション反応細胞（200μl;Stratagene）にBTXエレクトロセルマニュピレーターECM3951mmギャップキュベットを利用し、プラスミドDNA1μｇをエレクトロポレーションして構築される。形質転換された細胞の一部をアンピシリン（100μg.ml）を含むLB−寒天プレートに播いて形質転換効率を決定した。典型的には１μｇのDNAで３×108形質転換細胞が得られ、従ってライブラリーには108ないし109の独立クローンが含まれる。ファージミッド粒子は前記に従い調整した。
実施例Ｖ．BC,CD,DE,EF、またはFGループ中のループモザイク
BCループに５つのモザイク残基（残基番号26〜30）と、FGループ中に５つのモザイク残基を有する核酸ファージディスプレーライブラリーを実施例IV記載の方法を用いて調整した。CD,DEまたはEFループ中にモザイクを有するその他の核酸ファージディスプレーライブラリーも同様の方法により調整できる。
実施例VI．FGおよびBCループ中のループモザイク
FGループ中に７つのモザイク残基（残基番号78〜84）を有し、BCループ中に５つのモザイク残基（残基番号26〜30）有する核酸ファージディスプレーライブラリーを調整した。BCループ中にモザイクは表１記載のBC3オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘導（Kunkelら）し、調整した。FGループ中のモザイクは、出発材料としてBCループライブラリーを利用した部位特異的変異導入法により調整し、その結果BCループとFGループの両方にモザイクを含むライブラリーを得た。オリゴヌクレオチドFG2はモザイク残基78〜84を、オリゴヌクレオチドFG4はモザイク残基77〜81を有し、かつ残基82〜84を欠失している。
FGループ中に５つのモザイク残基を持ち、FGループ中の３残基が欠失しているものと、BCループ中に５つのモザイク残基（残基26〜30）を有する核酸ファージディスプレーライブラリーを調整した。Mainら（1992）のNMR研究によれば、FGループは短いほど柔軟性に富んでいる（リガンド結合によりフレキシブルなループがより堅くなるため、エントロピーの消失が予想される）ことが示されている。さらに、他のFn3域はさらに短いFGループを持っている（例えば配列アラインメント、Dickinsonら（1994）の図12参照））。
無作為化は変性ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを利用し実施した（BCループをモザイク化にはオリゴヌクレオチドBC3、FGループのモザイク化はFG2及びFG4）。
部位特異的変異誘導は発表された方法により実施した（例えばKunkel、1985参照）。ライブラリーは大腸菌XL−１ブルー（Stratagene）を形質転換し構築した。典型的にはライブラリーは108ないし109の独立クローンを含む。ライブラリー２はBCループ内に５モザイク残基を、さらにBCおよびFGループ中に７モザイク残基を含んでいる。ライブラリー４はBCループおよびFGループ内にれぞれに５モザイク残基を含み、FGループの長さは３残基だけ短い。
実施例VII．ループモザイクにより構築したfdファージディスプレーライブラリー
遺伝子ベクターとしてfdファージを利用し、ファージディスプレーライブラリーを構築した。Fn3遺伝子を、Fn3遺伝子PCRの5'−及び3'−末端に導入されたSfil制限酵素部位を利用してfUSE5に挿入した（Parmley ＆ Smith,1988）。このファージの発現により、fdファージ表面上に融合p III蛋白が提示された。Fn3ループ内のモザイクは、上記の部位特異的変異誘導法、またはM13ファー時内に構築されたFn3ライブラリーをfUS5ベクター内にサブクローニングし導入された。
実施例VIII．その他のファージディスプレーライブラリー
T7ファージライブラリー（Novagen,Madison,WI）および細菌繊毛発現システム（Invitrogen）もFn3遺伝子の発現に有用である。
実施例IX．巨大分子構造に結合するポリペプチドの単離
ファージディスプレーモノボディーはBarbasと共同研究者のプロトコール（Rosenblum ＆ Barbas,1995）に従い選択した。略記すると、炭酸ナトリウムバッファー（100mM、pH8.5）中のおよそ１μｇの標的分子（“抗原”）を気密容器内で一晩４℃で反応してマイクロタイタープレート（Maxisorp,Nunc）のウエル内に固定した。この液を除いた後、プレートを３％BSA（Sigma、フラクションIV）のTBS液と37℃で１時間反応し、ウエルをブロックした。およそ1012コロニー形成単位のファージミドを含むファージミドライブラリー液（50μｌ）を各ウエル中に37℃で１時間吸着させた。続いて植えるを適当なバッファー（典型的にはTBST、50mM  Tris−HCl（pH7.5）、150mM NaClおよび0.5％Tween20）で３回（１操作について１回）洗浄した。結合したファー時は酸性液（通常は0.1Mグリシン−HCl,pH2.2;50μｌ）で溶出し、回収したファージはすぐに３μｌのTris液で中和した。あるいは、ウエルを抗原（１〜10μＭ）を含むTBS50μｌと反応して、結合したファージを溶出した。回収したファージはXL1ブルー細胞を宿主細胞として使用する標準的な方法を利用し、増幅した（Sambrookら）。選別を５〜６回繰り返し陽性クローンを濃縮した。最終選別回の後、個々のクローンを取り出し、その結合親和性とDNA配列を決定した。
ファージ表面のモノボディーの結合親和性はファージELISA技術（Liら、1995）を用いて決定した。マイクロタイタープレート（Nunc）のウエルを抗原でコートし、BSAでブロックした。単一コロニーに由来する精製ファージ（108〜1011cfu）を各ウエルに加え、２時間、37℃で反応した。ウエルを適当なバッファー（上記参照）で洗浄した後、結合したファージを抗M13Ab（ウサギ、Sigma）と抗−ウサギIg−パーオキシダーゼ標識体（Pierce）を利用した標準的なELISA法により検出した。発色アッセイはTurbo−TMB（3,3',5,5'−テトラメチルベンジディン、Pierce）を基質として利用し行った。
ファージ表面にあるモノボディーの結合親和性を、競合ELISA法（Djavadi−Ohanianceら、1996）を利用してさらに調べた。本実験では、ファージ液が各種濃度のリガンドを含む以外は上記同様にしてファージELISAを行った。ファージ液はマイクロタイタープレートウエル内に固定したリガンドに結合させる前に４℃で１時間反応した。ファージが提示したモノボディーの親和性は、遊離型リガンドの濃縮を挙げた時のELISAシグナルの減少より見積もった。
ファージELISAを利用してファージ表面上に提示されたモノボディーを予備調査した後、陽性クローンの遺伝子を発現ベクターpSA45にサブクローニングした。大腸菌BL21（DE3）（Novagen）を発現ベクター（pAS45およびその誘導体）により形質転換した。細胞はM9最小培地、及びアンピシリン（200μg/ml）入りバクトトリプトン（Difco）を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び／または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。２リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃でおよそ140rpmで振蘯した。OD（600nm）が１になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（PTG）を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加３時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
Fn3およびHis・タグ付きモノボディーは次の様にして精製した。細胞を1mMのフェニルメチルスルフォニルフロライドを含む50mM Tris（pH7.6）の5ml/（ｇ細胞）に懸濁した。HEL（Sigma、3X結晶化）を最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間、３回超音波処理して細胞を破壊した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿をSS−34ローターを用いてSorvalRC−2B遠心分離器で15,000rpm遠心分離し回収した。濃塩化ナトリウムを最終濃度0.5Mになるよう溶液に加えた。次にこの溶液を塩化ニッケル（0.1M,1ml）を前負荷し、0.5M塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（50mM,pH8.0）で平衡化したハイタラップ（Hi−Trap）カラム（Pharmacia）にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、0.5Mイミダゾルを含むTrisバッファー（50mM、pH8.0）で結合蛋白を溶出した。必要に応じてNovagen社（Madison,WI）提供のプロトコールに従いトロンビンで融合蛋白を処理し、His・タグ−蛋白を切り離した。酢酸ナトリウムバッファー（20mM、pH5.0）中の塩化ナトリウム直線勾配（０〜0.5M）を利用し、リソースＳカラムによりFn3をHis・タグペプチドとトロンビンより分離した。
少量の可溶性モノボディーは次の様にして調整した。pAS38誘導体を含むXL−１細胞（Fn3−p III融合蛋白をコードするプラスミド）を37℃で激しく攪拌しながらOD（600nm）がほぼ１になるまでLB培地中で増殖させた;IPTGを最終濃度1mMになるように培地に加え、細胞をさらに37℃で一晩増殖させた。遠心分離により細胞を培地から除き、上清をリガンドでコートしたマイクロタイターウエルに加えた。pAS38およびその誘導体を含むXL−１ブルー細胞はFN3−p III融合蛋白を発現するが、大腸菌の蛋白分解活性によりFn3とp III域の間が切断され可溶性蛋白質も産生される。（Rosenblum ＆ Barbas、1995）。リガンドに対するモノボディーの結合はFn3に対する特注抗体（Cocalico Biologicals,Reamstown,PAより購入）を利用した標準的ELISAにより試験した。通常の浸透圧ショック法を利用し、大腸菌の細胞周辺腔より得た可溶性モノボディーも利用できる。
実施例Ｘ．ユビキチン結合モノボディー
ユビキチンは真核生物の分解経路に関与する小蛋白（76残基）である。単一ドメイン球状蛋白である。酵母ユビキチンはSigma Chemical Companyより販売されており、精製なしに利用した。
実施例VI記載のライブラリー３および４を利用し、ユビキチン−結合モノボディーを選別した。ユビキチン（50μｌ重炭酸ナトリウムバッファー中に１μｇ（100mM,pH8.5）をマイクロタイタープレートウエルに固定し、続いてBSA（TBSの３％液）でブロックした。パンニングは上記同様に実施した。最初の２回は、１ウエル当たりユビキチン１μｇを固定し、結合したファージを酸性液で溶出した。３回目から６回目まではウエル当たり0.1μｇのユビキチンを固定し、ファー時を酸性液または10μＭユビキチンを含むTBSで溶出した。
選別したクローンの結合を、ポリクローナルモード、即ちクローン個々に分離する前に調べた。これらの結果は図９に示した。競合ELISA実験では、固定されたユビキチンへのユビキチン結合は30μＭ以下の可溶性ユビキチンによりほぼ完全に阻害された（図10参照）。ユビキチン結合モノボディーのBC及びFGループの配列は表３に示した。
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最も濃縮されたクローンである411クローンを、ファージELISAを用いて調べた。411クローンは溶液中およそ10μＭのユビキチン存在下に選択結合と阻害を示した。
実施例XI．小分子固定法
標的分子を下記に従いマイクロタイタープレートのウエル（Maxisorp,Nunc）に固定し、さらにウエルをBSAでブロックした。下記キャリアー蛋白の利用に加え、標的分子のビオチン標識体も作成できる。続いてビオチン化リガンドをストレプトアビジンでコートしておいたマイクロタイタープレートのウエルに固定化した。
下記キャリアー蛋白の利用に加え、標識分子とビオチンの標識体を作成し、ビオチン化リガンドを前もってストレプトアビジンでコートしておいたマイクロタイタープレートウエルに固定することもできる（Smith及びScott,1993）。
小分子は牛血清アルブミン（BSA,Sigma）の様なキャリアー蛋白で標識し、またマクロタイタープレートウエルに能動的に吸着させることができるだろう。あるいは、化学的標識方法を利用することもできる。さらに、マイクロタイタープレート以外の固相支持体も容易に利用することができる。
実施例XII．フルオロセイン結合モノボディー
フルオロセインはコンビネーショナルライブラリーからの抗体選別の標的として利用されている（Barbasら、1992）。NHS−フルオロセインはPeirceより得、メーカーの支持に従い使用してBSA（Sigma）標識体を調整した。モル比およそ17（フルオロセイン）対１（BSA）の２タイプのフルオロセイン−BSA標識体を調整した。
選別工程を５〜６回繰り返し、陽性クローンを濃縮した。本実験では、リガンドをコートしたウエルに加える前に、ファージライブラリーを蛋白混合体（BSA、チトクロームＣ（Sigma、ウマ）及びRNaseA（Sigma、ウシ）、各1mg/ml）と室温で30分間反応した。結合したファージは酸溶出の代わりに10μＭの可溶性フルオロセインを含むTBSで溶出した。最終回後、個々のクローンを取り上げ、その親和性（下記参照）及びDNA配列を決定した。
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選別されたクローンの結合親和性の予備的検討をファージELISAおよび競合ファージELISAを利用し実施した（図12（フルオロセイン−１）及び図13（フルオロセイン−２）参照）。試験した４クローンはリガンドコートしたウエルとの特異的結合を示し、またその結合反応は可溶性フルオロセインにより阻害された（図13参照）。
実施例XIII．ジゴキシゲニン結合モノボディー
ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチル−カルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−NHS（Boehringer Mannheim）を用いて、ジゴキシゲニン−BSA標識体を調整した。ジゴキシゲニン−BSA標識体をマイクロタイタープレートウエルに固定し、パンニングに使用した。パンニングを５ないし６回繰り返し、結合クローンを濃縮した。ジゴキシゲニンは水溶液中への溶解性が低く、結合ファージは酸性液を用いてウエルより溶出した。実施例XIV参照。
実施例XIV．TSAC（遷移状態類似化合物）結合モノボディー
炭酸エステル加水分解モノボディーを次のようにして選別した。炭酸エステル加水分解の遷移状態類似体、４−ニトロフェニルフォスフォネートを既報のArbuzov反応（JacobsとSchultz,1987）により合成した。次にフォスフォネートをキャリアー蛋白、BSAとカルボジイミドを用いて結合し、続いて良く透析した（JacobsとSchultz,1987）。ハプテン−BSA標識体をマイクロタイタープレートのウエル内に固定し、モノボディー選別を上記に従い実施した。選別されたモノボディーの触媒活性を４−ニトロフェニルカーボネートを基質に利用し試験した。
触媒性モノボディー作成に有用な他のハプテンはH.Suzuki（1994）及びN.R.Thomas（1994）にまとめられている。
実施例XV．Fn3のNMR解析及び酵母分泌Fn3と大腸菌分泌Fn3の比較
核磁気共鳴（NMR）実験を行い、FnAbと標的分子、例えばフルオロセインに対するモノボディー、ユビキチン、RNaseAならびにジゴキシゲニン可溶性誘導体との間の接触面を特定した。次に、この情報を利用してモノボディーの親和性と特異性を改良した。精製したモノボディーサンプルはNMRスペクトロスコピー用に、YM−３メンブレン付きAmicon限外濾過セルを利用し適当なバッファーに溶解された。バッファーは90％H2O・10％D2O（蒸留等級、Isotec）または100％D2Oで作成した。これらからの強いシグナルは重水素化化合物（例えばアセテート）を用いて排除した。
NMR実験は４つのRFチャンネルとパルスフィールド勾配能を持ったトリプルリソーナンスプローブが装着されたVarian Unity INOVA 600スペクトロメーターを用いて行った。NMRスペクトラムはFelix（Molecular Simulations）、umrPipe、PIPP及びCAPP（Garrettら、1991;Delaglioら、1995）といった処理プログラムをUNIXワークステーション上で利用し、解析した。配列特異的リソーナンスアサインメントは、トリプルリソーナンス実験のセットを利用した良く確立された方法に従い実施した（CBCA（CO）NH及びHNC ACB）（Gresiek ＆ Bax,1992;Wittenkind ＆ Mueller,1993）。
およそ５オングストロームより近い1H核の間で核オーバーハウザー効果（NOE）が観察され、これによりプロトン間の距離に関する情報が得られた。一連のダブル−及びトリプルリソーナンス実験（表5;これら技術の最近のレビューについては、Bax ＆ Gresiek、1993およびKay,1995を参照）を行い、距離（即ちNOE）及び二面角（Ｊ−カップリング）束縛を集めた。同位元素濾過実験を行い、結合リガンドのアサインメントを決定し、リガンド内おおびFnAbとリガンド間の距離束縛を得た。配列特異的リソーナンスアサインメント及びNOEピークアサインメントの詳細は別所に詳しく記載されている（Clone ＆ Gronenborn、1991;Pascal、ら1994b;Metzlerら、1996）。
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モノボディーに関する主骨格1H,15Nおよび13Cリソーナンスアサインメントを野生型Fn13のそれと比較し、変異体に於ける構造変化を調べた。これらのデータにより変異体が全体構造を保っていることを確認した後、実験のNOEデータを利用して構造の微調整を行った。モノボディーの構造の違いは微小であると推測されることから、野生型の構造をアミノ酸配列改良後の初期モデルとして利用することができる。相互作用分子モデリングにより野生型の構造に変異を導入し、次にQuanta（Molecular Simulations）の様な分子モデリングプログラムを利用してこの構造のエネルギーを最小化する。液体構造を、プログラムＸ−PLOR（Brunger,1992）で動態シュミレートアニーリング（Nilgesら、1988）のサイクルを利用して位上げる。典型的には、50の構造のアンサンブルを計算する。仕上がった構造の有効性は、無作為に作った初期構造の少数例についてYASAPプロトコールに従いＸ−PLORで計算して確認した（Nilgesら、1991）。モノボディー−リガンド複合体の構造は、まず分子内NOEsを利用し両成分を別々に仕上げ、次に分子間NOEsにより両者を結合して計算する。
例えば、フルオロセイン結合モノボディーLB25.5の1H,15N−HSQCスペクトラムを図14に示す。このスペクトラムは良好な分散を示しており（ピークが広がっている）、LB25.5が球状の立体構造に折り込まれていることが示唆される。さらに、このスペクトラムは野生型Fn3のスペクトラムに似ており、LB25.5の全体構造がFn3に似ていることが示されている。これらの結果は、リガンド結合モノボディーがFn3骨格の球状の折りたたみを変化させることなく得ることができるこをと示している。
同位元素標識FnAbと非標識リガンド間に複合体を形成させて化学シフト攪乱実験を行った。化学シフトは極めて核環境に敏感であることから、複合体の形成は通常境界面のアミノ酸残基のリソーナンスに本質的な化学シフト変化をもたらす。同位元素編集NMR実験（2D HSQCおよび3D CBCA（CO）NH）を用いて、複合体の標識成分、即ちモノボディー内で攪乱されたリソーナンスを特定する。長期間の立体構造変化によるアーチファクトの可能性を常に考慮しなければならないが、連続面上に集合した残基について見られる大きな差の大部分は直接接触に由来すると考えられる（Chenら、1993;Groneborn ＆ Clore,1993）。
相互作用面をマッピングする別の方法は、水素化アミド交換（HX）実験を利用するものである。核アミドプロトンのHX速度を15N標識モノボディーについて、遊離型及びリガンドとの複合体の両方に関し測定する。リガンド結合は結果として２蛋白間の海面に於けるモノボディー残基のアミドHX速度を低下させることが予想され、これにより結合面を特定できる。複合体に於けるモノボディーのHX速度は、D2Oへの複合体を移した後様々な時間でHXを起こし測定する；複合体はpHを下げて解離し、アミドのHXが遅くなる低pHでのHSQCスペクトラムを記録する。Fn3は低pHで安定かつ可溶性であることから、本実験の条件を満たしている。
実施例XVI．ユビキチン特異的Fn3−ディスプレーシステムの構築と分析
Fn3−ディスプレーシステムを設計し、合成し、ユビキチン結合クローンを単離し、これらクローンの中の主要なFn3変異体を生物物理的に特徴付けした。
Fn3の遺伝子構築とファージディスプレーは実施例Ｉおよび上記同様に行った。Fn3−ファージIII融合蛋白はファージミド−ディスプレーベクターより発現させたが、野生型p IIIを含めたM13ファージのその他成分はヘルパーファージ（Bassら、1990）を用いて作成した。即ち、本システムにより作られるファージはその表面上に提示されるFn3は１コピー以下でなければならない。ファージのFn3の表面提示は抗Fn3抗体を利用したELISAで検出した。Fn3p III融合ベクターを含むファージだけが抗体と反応した。
ファージ表面へのFn3提示を確認した後、Fn3のファージディスプレーライブラリーを実施例III同様に構築した。無作為化配列をBCおよびFGループに導入した。第１ライブラリーでは、FGループの５個の残基（77〜81）が無作為化され、３個の残基（82〜84）が欠失した。この欠失はFGループをフレキシブルにして、結合親和性を改善することを目的としている。BCループでも標的分子との接触面を大きくするこをと目的に５個の残基（26〜30）が無作為化された。従って、得られたライブラリーには、BCおよびFGループそれぞれについて無作為化された５個の残基が含まれている（表６）。このライブラリーはおよそ108の独立したクローンを含んでいた。
ライブラリースクリーニング
ユビキチンを標的分子としたライブラリースクリーニングを行った。各パンニング回毎に、Fn3ファージをユビキチンコート表面に吸着させ、結合ファージを可溶化ユビキチンで競合的に溶出した。回収率は第２回の4.3×10-7から第５回4.5×10-6に改善した。５回のパンニングの後、個々のクローンのアミノ酸配列を決定した（表６）。
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Fn3変異体濃縮ループではUbi4と命名されたクローンが優越していた。従って、以後の研究はUbi4クローンに集中して行った。Ubi4はBCループ内の４カ所の変異（BCループのArg30は保存されていた）とFGループ内の５カ所の変異と３カ所の欠失を含んでいた。従って、残基のUbi4では野生株配列の13％（94中12）が変化してた。
図15はUbi4のファージELISA分析の結果を示す。Ubi4ファージは標的分子、ユビキチンを有意な親和性をもって結合するが、野生型Fn3域を提示しているファージ、または分子を提示していないファージはユビキチンに対し検出可能な結合を示さなかった（図15a）。さらに、Ubi4ファージはユビキチンコーティングしていないコントロール表面に対するバックグランド結合についても若干高いレベルを示した。競合ELISA実験より、結合反応のIC50（結合の50％を阻害する遊離リガンドの濃度）がおよそ５μＭであることを示した（図15b）。BSA、ウシリボヌクレアーゼＡおよびチトクロームＣはUbi4−ユビキチン結合反応を阻害せず（図15c）、Ubi4のユビキチンへの結合反応が特異的結合の結果であることを示した。
変異Fn3蛋白の特徴
発現システムは１リッター培地当たり50〜100mgのFn3蛋白を産生した。同様のレベルの蛋白発現がUbi4クローンや他の変異Fn3蛋白について観察された。
Ubi4−Fn3は独立蛋白として発現された。Ubi4の大部分は大腸菌内に可溶性蛋白として発現されたが、その溶解性は野生型Fn3に比べ明瞭に低下していた。Ubi4は低pHでは−20μＭまで溶解したが、中性pHではその溶解性は大きく低下した。この溶解度はNMRスペクトロスコピーまたはＸ線結晶学による詳細な構造解析にっとては不十分であった。
Ｃ末端に溶化性テールであるGKKGKを加えてUbi4の溶化性を改善した。Ubi4−Fn3遺伝子をPCRを利用して発現ベクターであるpAS45にサブクローニングした。この段階でＣ−末端可溶化タグでるCKKCKを導入した。大腸菌BL21（DE3）（Novagen）を発現ベクター（pAS45およびその誘導体）により形質転換した。細胞はM9最小培地、及びアンピシリン（200μg/ml）入りバクトトリプトン（Difco）を添加したM9培地で培養した。放射性同位元素で標識するために、15N NH4Cl及び／または13Cグルコースで非標識成分を置き換えた。２リッターのバッフルフラスコ中の500mlの培地に10mlの一晩培養した培養体を接種し、37℃でおよそ140rpmで振蘯した。OD（600nm）が１になった時、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（PTG）を最終濃度1mMになるよう加え蛋白発現を開始した。細胞をIPTG添加３時間後に遠心分離して集め、使用するまで−70℃に凍結保存した。
蛋白は次の様にして精製した。細胞を1mMのフェニルメチルスルフォニルフロライドを含む50mM Tris（pH7.6）の5ml/（ｇ細胞）に懸濁した。HEL（Sigma、3X結晶化）を最終濃度0.5mg/mlになるよう加えた。溶液を30分間、37℃で反応させた後、氷上で30秒間、３回超音波処理して細胞を破壊した。細胞破壊物を遠心分離して除いた。硫安を溶液に加えて、沈殿をSS−34ローターを用いてSorvalRC−2B遠心分離器で15,000rpm遠心分離し回収した。濃塩化ナトリウムを最終濃度0.5Mになるよう溶液に加えた。次にこの溶液を塩化ニッケル（0.1M,1ml）を前負荷し、0.5M塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（50mM、pH8.0）で平衡化したハイタラップ（Hi−Trap）カラム（Pharmacia）にかけた。カラムをバッファーで洗浄した後、500mMイミダゾルを含むバッファーでヒスタグ−Fn3を溶出した。蛋白はさらに、酢酸ナトリウムバッファー（20mM,pH5.0）中の塩化ナトリウム直線勾配を利用したリソースＳカラム（Pharmacia）を用いて精製した。
GKKGKテールにより、Ubi4蛋白の溶解性は低pHで1mM以上、中性pHで〜50μＭまで増加した。従って、以後の分析はＣ−末端延長したUbi4で行った（以後Ubi4−Ｋと称する）。ミニボディーの溶解性はＮ−またはＣ末端テールに３個のLys残基を負荷することで有意に改良されと報告されている（Bianchiら、1994）。蛋白Popの例では、非構造Ｃ末端テールが溶解性の維持に重要である（Smithら、1995）。
Ubi4蛋白のオリゴ化状態を分子篩いカラムを用いて決定した。野生型Fn3蛋白は低および中性pHでは単量体である。しかし、Ubi4−Ｋ蛋白のピークは野生型に比べ広く、やせIg他蛋白の後に溶出された。このことは、Ubi4−Ｋがカラム材料と相互作用しており、Ubi4のオリゴ化の決定には分子篩いカラムクロマトグラフィーを利用できないことを示している。NMR研究より、本蛋白は低pHでは単量体であることが示唆されている。
Ubi4−Ｋ蛋白はELISAの判定では、ユビキチンに対する結合親和性を保持している（図15d）。しかし、バイオセンサー（Affinity Sensors,Cambridge,UK）を用いた解離定数決定の試みは、センサーマトリックスへのUbi4−Ｋ−Fn3のバックグランド結合が高いことから失敗した。このマトリクッスは主にデキストランからできており、我々のUbi4−Ｋが分子篩いカラムの架橋デキストランと相互作用したという観察結果に一致した。
実施例XVII．モノボディーの安定性測定
塩酸グアニジン（GuHCl）誘導巻き戻しと再折りたたみ反応をトリプトファンの蛍光を測定して追った。実験はモーター駆動式注射器（Hamilton Co）を装備Spectronic  AB−２分光蛍光光度計を利用して行った。キュベット温度は30℃に保った。分光蛍光光度計と注射器は自作インターフェイスを用いて同一コンピューターで制御されている。このシステムは自動的にCuHCl滴定後のスペクトラムを連続記録する。実験は５μＭの蛋白を含む1.5mlのバッファー液より開始した。GuHClを含むバッファー液を注入した後（50または100μｌ）遅れて（３〜５分）発光スペクトラム（300〜400nm:励起、290nm）を記録した。この作業を溶液量がキュベットの容積（3ml）に達するまで繰り返した。蛍光強度を、別の実験で求めたイソ蛍光点に於ける強度に対する比として標準化した。巻き戻し曲線を非線形最小２乗法を用いて２状態モデルに当てはめた（Sanoro ＆ Bolen,1988）。遅延時間（注入からスペクトラム測定開始まで）２分と10分で行った実験間に有意な差は認められなかったことから、巻き戻し／再折りたたみ反応は、それぞれの濃度において採用した遅延時間内に平衡状態近くに達していたことが示唆された。
Ubi4−Ｋの立体構造安定性を、上記のGuHCl−誘導巻き戻し法を利用し測定した。測定は２組の条件で行った：第１はUbi4−Ｋが高い溶解性にあるpH3.3,300mM塩化ナトリウム存在下で、第２はライブラリースクリーニングに使用したTBS中である。いずれの条件に於いても、巻き戻し反応は可逆的であり、我々は凝集または不可逆的巻き戻しの兆候を観察しなかった。図16は、Ｎ−末端に（his）６タグとＣ−末端に可溶化タグを持つUbi4−Ｋと野生型Fn3の巻き戻しの遷移を示す。野生型Fn3の安定性はこれらタグの付加によっても大きな影響を受けなかった。巻き戻し遷移を特徴つけるパラメータを表７に挙げた。
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△Goは変性剤存在下での巻き戻しの自由エネルギーである;mGはGuHCl濃度への巻き戻しの自由エネルギーへの依存度である。溶液条件については図４脚注を参照。
２つのループ誘導された変異は、野生型Fn3に対してUbi4−Ｋの安定性を明瞭に低下させたが、Ubi4の安定性はなお“典型的”な球状蛋白の安定性に相当した。野生型およびUbi4−Ｋ蛋白の安定性はpH7.5よりpH3.3でより高いことにも注意すべきである。
Ubi4蛋白は野生型Fn3に比べて溶解性を明らかに低下したが、溶解性テールを付加することで溶解性は改善された。２つの変異ループの違いは野生型蛋白とUbi4蛋白との間の差だけであることから、これらループが溶解性低下の原因でなければならない。この時点では、Ubi4−Ｋの凝集がループ間の相互作用に拠るものか、あるいはループとFn3骨格の不変域間の相互作用によるものであるかは不明である。
Ubi4−Ｋ蛋白はFn3の球状のたたみ込みを保持していることから、試験した２ループ内の多くの変異がこの骨格により調節できることを示している。Ubi4−Ｋ蛋白の安定性は野生型Fn3蛋白に比べて低いが、Ubi4蛋白は依然として小球状蛋白と同等の立体構造安定性を有している。骨格の球状折りたたみに影響することなく変異を導入する上で、極めて安定している領域を骨格に利用することが有利であることは明確である。さらに、GuHClで誘導したUbi4蛋白の巻き戻しはほぼ完全に可逆的である。これによってFn3変異体が封入体の様な誤った形に折りこまれた場合でも、正確に折り込んだ蛋白を調整できる。
ライブラリーのスクリーニングに使用した条件でUbi4が適度に安定であることは、Fn3変異体がファージ表面でたたみ込まれていることを示している。このことは、Fn3クローンは変性した形ではなく、たたみ込まれた形状での結合親和性により選別されることを示唆している。Dickinsonらは、BCループ内のVal29およびArg30がFn3を安定化していると提案している。val29は疎水性核と接触し、Arg30はGly52とVal75と水素結合を形成する。Ubi4−Fn3では、Val29はArgに置換されているが、Arg30は保存されている。FGループはライブラリーの中でも変異した。このループは野生型構造の中ではフレキシブルであり、ヒトFn3領域での長さは様々である（Mainら、1992）。これらの観察より、FGループ中の変異は安定性に対しそれほど影響しないことが示唆される。さらも。Fn3のＮ−末端テールはBCおよびFGループにより形成される分子表面と隣接しており（図１及び17）、また明瞭な構造を形成しない。Ｎ−末端テールの変異は安定性に対し強い有害作用を及ぼさないと考えられる。従って、Ｎ−末端テール中の残基はさらなる変異導入に適した部位であろう。
実施例XVIII．Ubi4−Fn3のNMRスペクトロスコピー
Ubi4−Fn3をNaCl（300mM）を含む［2H］−Gly HClバッファー（20mM,pH3.3）に、Amicon限外濾過ユニットを利用し溶解した。最終濃度は1mMであった。NMR実験はパルスフィールド勾配能を持ったトリプルリソーナンスプローブが装着されたVarian Unity INOVA 600スペクトロメーターを用いて行った。プローブ温度は30℃にセットした。HSQC,TOCSY−HSQCおよびNOESY−HSQCスペクトラムは公開された方法により記録した（Kayら、1992;Zhangら、1994）。NMRスペクトラムはUNIXワークステーション上でNMR pipeとNMR Viewソフトウエアー（Hohnson ＆ Blevins,1994;Delaglioら、1995）用い処理した。配列特異的リソーナンスアサインメントは通常の方法で作成した（Wuthrich,1986;Clore ＆ Gronenborn,1991）。野生型Fn3に関するアサインメント（Baronら、1992）は酢酸ナトリウムバッファー（50mM,pH4.6）中に溶解した15N−標識蛋白を用いて、30℃で確認した。
Ubi4−Ｋの３次元構造は異核分子NMRスペクトロスコピー法により調べた。高品質のスペクトラムが、低pHで15N−標識Ubi4の1mM液について得られた（図17a）。Ubir4−Ｋのアミドピークの線幅は野生型Fn3のそれと同様であっり、Ubi4−Ｋが検討条件下では単量体であることが示唆された。主骨格1Hおよび15N核に対する完璧なアサインメントは、His残基列がＮ−末端（His）６タグであること以外は通常の1H,15N二重リソーナンス法を利用し実施された。Ｎ−末端のMet残基を含むマイナー種に由来すると思われる弱いピークが数個HSQCスペクトラムに認められた。マススペクトロスコピー分析からは、大部分のUbi4−ＫがＮ−末端にMet残基を含まないことが示された。図17は、Ubi4−Ｋと野生型Fn3間の1HNおよび15N化学シフトの違いを示している。変異したBCおよびFGループの中およびその近傍以外では、化学シフトの差は極めて小さい。これらの結果は、２つのループに多くの変異があるにも関わらずUbi4−ＫがFn3の球状たたみ込みを保持していること明瞭に示している。２つの変異ループに近接したＮ−末端域にある数個のアミノ酸もまた、上記２蛋白の間で明瞭な化学的な違いを有している。TBS中、50μＭのUbi4−ＫサンプルについてはHSQCスペクトラムも記録した。スペクトラムは低pHで採取したものに類似しており、Ubi4の球状立体構造がpH7.5ないし3.3の間で維持されていることが示された。
上記詳細な説明および実施例は、理解を明瞭にするただけのものである。もとよりこれにより理解が限定されるものではない。本発明は開示および記載した説明に限定されるものではなく、当業者にとって明らかな変更はクレームにより規定される発明の範囲内である。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図４Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５Ａ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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