(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列からなるペプチドであり、イノシトールテトラキスホスフェート、イノシトールペンタキスホスフェート又はイノシトールヘキサキスホスフェートに対して結合性を有するペプチド。
Gly-Lys-Arg-Ｘ１-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Ｘ２-Ｘ３-Lys-Lys
（式中、Ｘ１はLeu又はIle、Ｘ２はThr又はSer、Ｘ３はIle又はValを示す)
【請求項２】
ペプチドが、シナプトタグミンＩ又はＩＩのＣ２Ｂドメインを構成するペプチドである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載されるペプチドを用いることを特徴とするイノシトールポリリン酸様物質又はイノシトールポリリン酸拮抗物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載されるペプチドを有効成分として含有するイノシトールポリリン酸阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はイノシトール（以下、Ｉｎｓと称する）ポリリン酸に対して結合性を有するペプチドに関する。より詳細には、特定のアミノ酸配列を有するペプチドからなるイノシトールポリリン酸結合性ペプチド及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞はホルモン、神経伝達物質、成長因子等の細胞外の情報（ファーストメッセンジャー）に反応して、的確な細胞応答を示す機構をもっている。細胞外情報のあるものは、生理的な作用によって細胞膜上の受容体（Ｇ蛋白連関型）を活性化して、次いでエフェクターであるホスホリパーゼ（ＰＬＣ）を活性化してホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の代謝回転を促進する。
Ｉｎｓ １，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ３）は、このＰＩ代謝回転で産生される細胞内で情報を伝える物質(セカンドメッセンジャー)の一つである。ＩＰ３シグナルは細胞内のカルシウム貯蔵部位（小胞体等）に存在するＩＰ３受容体に作用してカルシウムの放出を誘導し、細胞質内のカルシウムの一過性の上昇を導き、種々のカルシウム依存性の蛋白質や酵素等の機能を調節して多様な細胞応答を誘導する。
上記のＩＰ３受容体は既に、マウスやラットの小脳から単離されており特にプルキンエ細胞においてその存在の豊富さが報告されている。
【０００３】
本発明者等も上記ＩＰ３受容体について研究を続けており、マウスの小脳におけるｃＤＮＡのクローニングやその一次構造を決定し、その作用を明らかにしてきた。更に、この精製した当該蛋白質を平面二重膜やリポソーム上で再構成することによってＩＰ３感受性のカルシウムチャンネルの機能について検討を重ねてきている。
このＩＰ３は急速に代謝され、リン酸が一つ脱離することによって、Ｉｎｓ １，４−ビスホスフェート或いは一つのリン酸が付加されＩｎｓ １，３，４，５−テトラキスホスフェート（ＩＰ４）に代謝される。
また、このリン酸化反応に関与する酵素としてはＩｎｓＰ３ ３−キナーゼが関与している。
これらホスホイノシチドカスケードの種々の代謝物について、細胞伝達におけるセカンドメッセンジャーとして働いているという仮説は下記の論文に示されているが、上記ＩＰ３以外は直接的な証明はなされていなかった（Nature 341, 197-205, 1989)。
とりわけ上述のＩＰ４に関してはカルシウムの細胞内への流入を介するホメオスタシスや種々の細胞内のカルシウムのプールの調節に関与しているという仮説が提出されているが、ＩＰ４に対する特異的な受容体がまだ見出されていないためＩＰ４の機能については未だ詳細なことは分かっていない。
【０００４】
一連の研究の中で、１９９１年にブタの小脳からＩＰ４の高親和性の結合蛋白質の可溶化及び精製が報告され、Theibertらはラットの小脳から２種のＩＰ４結合蛋白質を単離したと報告している(Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 3165-3169, 1991)。しかしながら、それらの報告の中においては、そのＩＰ４結合蛋白質の生理的機能については全く不明であった。
同様に、Ｉｎｓ １，２，３，４，５，６−ヘキサキスホスフェート（ＩＰ６）結合蛋白質も２つのグループより報告されており、そのアミノ酸の部分配列としてクラスリンアッセンブリー蛋白質であるＡＰ２であることが明らかにされている。このＡＰ２はおそらくはシナプス小胞のエンドサイトーシスやリサイクルの経路に関与する蛋白質と考えられている(Biochme. Biopys. Res. Common., 187, 158-163, 1992; Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 8976-8980, 1992)。
【０００５】
一方、シナプス伝達は、神経終末から神経伝達物質が遊離することによって引き起こされる。神経伝達物質の遊離はシナプス小胞膜とシナプス前膜との融合を伴ういわゆる開口放出によって行われると考えられているが、その分子機構はほとんど明らかにされていない。
この開口放出に関与する蛋白質としてシナプトタグミン(synaptotagmin)がある。上記蛋白質は元々、シナプス小胞膜蛋白質として１９８１年に同定された蛋白質であるが、分子量からｐ６５蛋白質としても知られている(J. Cell Biol., 91, 257-269, 1981)。モノクローナル抗体を用いて調べた結果、本蛋白質は中枢から末梢にわたる広い範囲の神経細胞と副腎髄質細胞や脳下垂体細胞等のある種の内分泌細胞にのみ特異的に見出された。更に細胞分画法や電子顕微鏡観察の結果、この蛋白質は神経においてはシナプス小胞膜や細胞膜の一部に局在することが明らかになっている。
１９９０年には、ラットのｃＤＮＡライブラリーから本蛋白質のｃＤＮＡがクローニングされ、その一次構造が明らかになっている(Nature 345, 260-263, 1990)。このとき、この蛋白質がシナプス小胞をシナプス前膜へ結合させる役割をもっているのではとの仮説が提唱されている。
【０００６】
シナプトタグミンの分子構造は分子中に１ヶ所の膜貫通部分を有し、アミノ基側がシナプス小胞内もしくは細胞外に露出している。この部分には糖鎖が結合しており、アミノ酸配列は動物種間で大きく異なっている。
細胞質側の部分には、プロテイン キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性制御部位であるＣ２ドメインと相同な２回の繰返し構造がある。このドメインは動物種間で極めて良く保持されており、Ｃａ／ホスホリピッドの結合能力がある。このなかでもＣ２Ｂドメインは、従来良く研究されているＣ２Ａドメインと異なり、未だ特徴が良く判明していない。すなわち、上記Ｃａ／ホスホリピッドの結合についてはシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインでしか知られていない。またＰＫＣやＣａ／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩによってリン酸化されうるアミノ酸配列が見出されている。
細胞質側のアミノ酸配列は進化の過程で非常に良く保存されており、シナプス機能におけるこの部分の重要性を示唆している(J. Biol. Chem., 266, 263, 1991; Neuron 6, 993-1007, 1991; J. Biol. Chem., 266, 13548-13552, 1991)。また、ラットには２種類、シビレエイでは３種の異なる遺伝子にてコードされるアイソフォームがあることが明らかにされた。脳内のシナプトタグミンの発現分布はアイソフォーム間で異なっており、その生理的意味は未だ不明であるが、細胞膜蛋白質であるニューレキシン(neurexin)、シンタキシン(syntaxin)やＮ型のカルシウムチャネルと相互作用をしてシナプス小胞と細胞膜との結合や融合に関与する蛋白質と考えられている(Neuron 6, 993-1007, 1991; J. Biol. Chem., 266, 13548, 1991; Science 256, 1820-1823, 1992)。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、イノシトールポリリン酸は細胞内におけるセカンドメッセンジャーとして重要な役割をはたしている。ＩＰ３はその受容体が明らかにされており、その結果ＩＰ３の作用はかなり明らかになっている。しかし、ＩＰ４、Ｉｎｓ １，３，４，５，６−ペンタキスホスフェート（ＩＰ５）、ＩＰ６等のイノシトールポリリン酸については受容体又は結合蛋白が見出されていない。そのため、ＩＰ４等のイノシトールポリリン酸の作用・機能は十分に解明されていない。従って、ＩＰ４等のイノシトールポリリン酸に特異的に結合する蛋白の探索が多くの研究者により行われている。かかる蛋白が見出されれば、ＩＰ４等のイノシトールポリリン酸の作用・機能の解明に利用できるとともに、医薬品、診断薬等として有用であり、さらにカルシウム阻害剤、神経伝達物質、ホルモン放出制御物質等のスクリーニングに利用することができる。
【０００８】
かかる問題から、本発明者等は、ＩＰ４の結合蛋白質を鋭意研究した結果、この蛋白質が上述のシナプトタグミンと同一であることを見出し、またＩＰ５及びＩＰ６も本蛋白質と結合することを見出し、既存の蛋白質であるシナプトタグミンが種々のポリイノシトール類の結合蛋白質であることを見出した。
更に、本発明者等は、シナプトタグミンにおけるＩＰ４の結合サイトについて検討した結果、ＩＰ４はシナプトタグミンのＣ２Ｂドメインに結合すること；更に詳細には結合サイトはＣ２Ｂドメインの中の特定のアミノ酸配列を有する部分であることを見出した。また、この結合はシナプトタグミンＩ及びＩＩに特異的であり、上述したＣ２Ｂドメインと同様なドメインを有する蛋白質であるＰＫＣαやｒａｂｐｈｉｌｉｎ等はＩＰ４に結合しないことも併せて見出した。
本発明は上記の知見に基づいてなされたもので、本発明の目的はＩＰ４、ＩＰ５、ＩＰ６等のイノシトールポリリン酸に結合し得るポリペプチド、当該ペプチドを用いたスクリーニング法及び当該ペプチドを含有する薬剤を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解消するためになされた本発明は、
(a)下記の式（１）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、イノシトールテトラキスホスフェート、イノシトールペンタキスホスフェート又はイノシトールヘキサキスホスフェート（以下、便宜上、これらをイノシトールポリリン酸と称する）に対して結合性を有するペプチド；
Gly-Lys-Arg-Ｘ１-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Ｘ２-Ｘ３-Lys-Lys      （１）
（式中、Ｘ１はLeu又はIle、Ｘ２はThr又はSer、Ｘ３はIle又はValを示す)
(b)ペプチドが、シナプトタグミンＩ又はＩＩのＣ２Ｂドメインを構成するペプチドである上記(a)記載のペプチド；
(c)上記(a)又は(b)に記載されるペプチドを用いることを特徴とするイノシトールポリリン酸様物質又はイノシトールポリリン酸拮抗物質のスクリーニング方法；
(d)上記(a)又は(b)に記載されるペプチドを有効成分として含有するイノシトールポリリン酸阻害剤；
である。
【００１０】
本発明のペプチドは、イノシトールポリリン酸に対して結合性を有し、且つ前記式（１）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる。前述のように、本発明者らは、イノシトールポリリン酸に対する結合蛋白を探索してきたが、後記実施例に示されるように、当該結合蛋白はシナプトタグミンであることが判明した。そして、更に検討を重ねた結果、イノシトールポリリン酸との結合部位は、シナプトタグミンのＣ２Ｂドメインにあり、より詳細には前記式（１）で示されるペプチド部分であることが明らかになった。即ち、前記式（１）のアミノ酸配列からなるペプチドは、イノシトールポリリン酸と結合することができる。
【００１１】
上記の前記式（１）のアミノ酸配列からなるペプチドは、固相合成法などの慣用のペプチド合成法により調製できる。また、当該ペプチドを含有する天然物から得ることもでき、かかる天然ペプチドとしては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イカ、シビレ エイ、ショウジョウバエ、線虫などのシナプトタグミンＩ及びＩＩ、これらのシナプトタグミン類のＣ２Ｂドメイン等を例示することができる。
また、上記の目的とするペプチドをコードするＤＮＡを調製し、適当な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで適当な宿主（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞等）を形質転換し、次いで形質転換体を培養し、その培養上清（及び培養細胞を破砕した後の上清）を、常法に準じて精製することにより目的とするペプチドを得ることもできる。
なお、本発明のペプチドは、糖鎖を含有していてもよい。
【００１２】
本発明のペプチドは、イノシトールポリリン酸に対して結合性を有する。従って、本発明のペプチドを用いることにより、イノシトールポリリン酸と類似した生理活性を有する物質又はイノシトールポリリン酸と拮抗する物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、［3Ｈ］などで標識したイノシトールポリリン酸の存在下、試験物質と本発明のペプチドを反応させ（競合反応法）、本発明ペプチドへの標識イノシトールポリリン酸の結合量が減少すれば、試験物質はイノシトールポリリン酸と類似の生理活性を有する物質であることが推察される。前述のように、イノシトールポリリン酸は細胞内で受容体と結合し、カルシウムの放出、神経伝達物質の放出、ホルモンや酵素の調節などの作用を果たしていると推定される。従って、本発明のスクリーニング法によれば、細胞内におけるカルシウム放出物質、神経伝達物質放出物質などのスクリーニングを行うことができる。
【００１３】
また、本発明のペプチドはイノシトールポリリン酸と結合することから、イノシトールポリリン酸の阻害剤として作用する。本発明のイノシトールポリリン酸阻害剤はかかる作用を利用したもので、本発明のペプチドを有効成分として含有することからなるイノシトールポリリン酸阻害剤である。イノシトールポリリン酸は、上述の作用を有すると考えられるので、本発明のイノシトールポリリン酸阻害剤は、カルシウム阻害剤、神経伝達物質放出阻害剤、ホルモン遊離阻害剤などとして利用することができる。
上記の阻害剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）で投与し得るが、一般的には有効成分である本発明ペプチドのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、本発明ペプチドを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。
製剤中の本発明ペプチド含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１４】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、または凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
本発明の阻害剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整される。
【００１５】
なお、本発明のペプチドは、イノシトールポリリン酸の測定（定量又は定性）試薬、慣用の不溶性担体に本発明のペプチドを固定化したアフィニティー担体等とすることによりイノシトールポリリン酸の精製試薬などとしても利用することができる。
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明者等は、ホスホイノシチドカスケードが小脳の機能に大変密接な働きをもっていることから、小脳を用いてＩＰ４結合蛋白質の精製単離を行った。すなわち、ＩＰ３受容体がプルキンエ細胞に豊富にあること、同様にＩｎｓＰ３ ３キナーゼも同様にプルキンエ細胞に局在化していることから、これらの細胞においてはＩＰ４も生成していることが推察された。
また、従来の報告においては、イノシトールリン酸の結合活性が比較的高くみられていることから、プルキンエ細胞の神経的な機能においてポリイノシトールホスフェートの関与が強く示唆されている。
【００１７】
そこで、本発明者等は、まず界面活性剤にて可溶化を行った。この操作によってＩＰ４結合能に影響を与えるＩＰ３受容体、イノシトールポリホスフェイトホスファターゼやキナーゼ類が抽出されるが、これらの蛋白質はヘパリンアガロースクロマトグラフィーにて除去した。すなわち、ホスファターゼやキナーゼ類は流出液中もしくは０．５Ｍの画分に除去され、ＩＰ３受容体は０．５Ｍ  ＮａＣｌ中へ除去される。従来報告のあったＩＰ４結合蛋白質の精製法との違いはおそらく界面活性剤の種類の違い、ヘパリンアガロースゲルの挙動の違い、イオン交換カラムの違いによるものである。
このとき若干のＩＰ４活性が流出液中に見られたが、これはおそらくＩＰ４結合蛋白質の重合体によるものと考えられた。
【００１８】
次にイオン交換クロマトグラフィーＤＥ−５２にて残る夾雑物を除去した。このとき、目的とする蛋白の他に低分子化合物が残ったため二回目のゲル濾過にて除去した。各クロマトグラフィーにおける溶出パターンを図１に示す。
最後のＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂによる分離をした後、目的画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、分子量１４０ｋと６５ｋの蛋白質のバンドが得られた（図２参照）。またＣＢＢ染色をしたところ、目的とするＩＰ４結合活性の強度と非常に良く一致した。２回目のゲル濾過のとき、界面活性剤の存在下で１４０ｋを示したことから、この分子量の蛋白質は６５ｋの蛋白質の二量体と考えられた。
以上述べてきたように、本発明者等はマウスの小脳１５０ｇから０．４５ｍｇの目的とするＩＰ４の結合蛋白質を単離することに成功した。
【００１９】
こうして得られた蛋白質のアミノ酸配列を決定するために、本発明者等は以下の方法を用いた。すなわち、１４０ｋと６５ｋの蛋白質をＰＶＤＦ膜に移しかえ、０．０５％のＳＤＳ存在下にてリジルエンドペプチダーゼにて加水分解を行った。次に残ったペプチドを逆相クロマトグラフィーにて分離した。
この結果、１４０ｋの蛋白質はマイナー蛋白であったにもかかわらず、この１４０ｋ由来のペプチドがこの分離においては多く回収された。こうして得られた１４０ｋ由来のペプチドの内、７種についてアミノ酸配列を決定し、SWISS PROTデータベースを用いて検索したところ、ラットのシナプトタグミンＩＩのアミノ酸配列と完全に一致した（図３参照）。
従来技術にて述べたように、シナプトタグミンは前シナプスにおけるシナプス小胞の結合と融合に役割を果たす蛋白質であると考えられている(Science 259, 780-785, 1993； Neuron 6, 665-677, 1991)。ネイティブのラットのシナプトタグミンは二重体を形成し、前シナプス蛋白質と高分子量の複合体を形成することが知られている。
【００２０】
また、ｃＤＮＡ解析によれば、２種のシナプトタグミン（Ｉ，ＩＩ）の存在が知られており、ＲＮＡブロッティング分析では異なった分布が知られている(J. Biol. Chem., 266, 13548-13552, 1991)。すなわち、シナプトタグミンＩＩは脳内においては系統的に古い部分に存在する。例えば、脊髄、脳幹、小脳等である。一方、シナプトタグミンＩは比較的新しい領域、すなわち、大脳皮質や海馬などに存在する。本発明においては、シナプトタグミンＩＩしか得られなかったのは、上述のように小脳においてはシナプトタグミンＩＩの方が大部分を示すことに他ならない。
【００２１】
本発明者等は、さらに上述のごとく得られた蛋白質がラットシナプトタグミンＩＩであることを、以下の方法にて証明した。
通常の方法にて合成したラットシナプトタグミンＩＩのｃ末端（４０９−４２２）とＰＫＣの調節領域と相同性のあるＣ２ドメインに相当するペプチドに対する抗体で、本発明の界面活性剤にて抽出されたサンプル及び最終段階にて得られたサンプルとをウエスタンブロット法によって試験したところ、それぞれ１４０ｋ及び６５ｋの蛋白質が反応しクロスリアクトした（図４参照）。
また、Ｃ２Ａの抗体により用量依存的にＩＰ４結合活性をもつ蛋白質は免疫沈降した（図５参照）。
これらのことをもって、本発明者等は上述のように、精製純化した蛋白質はまさにマウスのシナプトタグミンＩＩであることを見出した。
【００２２】
次に本発明者等は、この精製したＩＰ４結合蛋白／シナプトタグミンの特徴を調べるために以下の方法を用いた。
まず、常法に基づき、ＩＰ４結合に対するｐＨ依存性を研究した（図６参照）。４．８μＭの非標識のＩＰ４の存在下では、標識したＩＰ４の最大結合能はおよそｐＨ５．０あたりに見られている。
【００２３】
精製したサンプルにおける標識化したＩＰ４の非標識のＩＰ４による置換をｐＨ５．０、６．２、７．４で行ったところ、ｐＨ６．２のとき３０ｎＭで、ｐＨ７．４のとき４０ｎＭで、ｐＨ５．０のとき１７０ｎＭで約半減した。スカッチャド分析（Scatchard analysis）を行った結果、ＫｄはｐＨ６．２及び７．４のとき約３０ｎＭであり、ｐＨ５．０のとき１６０ｎＭであった（図７参照）。ＢｍａｘはｐＨ６．２、７．４、５．０のとき、それぞれ２．７ｐｍｏｌ、２．４ｐｍｏｌ、３５ｐｍｏｌ／蛋白であった。Ｈｉｌｌ係数はそれぞれのｐＨには依存しないで、ほぼ１．０であった。
【００２４】
次に、ＩＰ４結合部位における特異性を種々のイノシトール誘導体を用いることによって検討した。その結果を図８に示す。図示したとおり、ＩＰ５は高い強度にて標識したＩＰ４の結合を置換した。この置換能力の強さはＩＰ４に比較して強かった。
イノシトール ３，４，５，６−テトラキスホスフェートやイノシトール ヘキサキスホスフェートは、１００ｎＭでＩＰ４の結合を約半分抑制した。
しかし、イノシトール ヘキサキスホスフェートの場合には置換曲線の勾配は比較的鋭く、併せて１０ｎＭで標識ＩＰ４の結合を増加させた。また、３００ｎＭのとき、ＩＰ４と同様に強い標識したＩＰ４結合の抑制が見られた。
このことはアロステリックな影響を示していた。他の用いたイノシトールの誘導体では比較的親和性が低かった。
以上のように、本発明者等はマウスの小脳から高親和性のＩＰ４結合蛋白質の単離精製に成功し、その結合蛋白質であることの確認及び特徴づけを行った。
【００２５】
次に、本発明者等は、上記ＩＰ４が結合蛋白質のどの部分と結合し、ドメインの機能がいかなるものか研究した。
まず、ＩＰ４結合ドメインを知るためにマウスＩＰ４結合蛋白／シナプトタグミン（ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ）のｃＤＮＡのクローニングを行った。マウスの小脳のｃＤＮＡライブラリーから、前述した部分アミノ酸配列に相当するＰＣＲプライマーによって作成したｃＤＮＡを用いることによってスクリーニングした。
一つの翻訳部分を含んだｃＤＮＡの配列は５つの重複するクローンによって決定した。こうして得られたマウスのＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩの塩基配列を配列番号１に示す。また、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示すが、予想されるように、前述したＩＰ４結合蛋白質の配列と同一であった。イニシエーションコドンも公知のＫｏｚａｋ配列と同一であった。ラットのシナプトタグミンＩＩと比較すると４種のアミノ酸配列がＮ末にて異なっているのみであった。すなわち、１２番目のＩｌｅがＡｓｎ、２７番目がＡｌａからＶａｌ、３９番がＴｈｒからＰｒｏ、５２番目がＡｓｐからＧｌｕへ変化していた。３’の非翻訳領域はラットのｃＤＮＡでも同一であり、ＴＧジヌクレオチドの繰返し構造を含んでいた。
【００２６】
次に、遺伝子発現ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩの結合活性を確認するために、以下の実験を行った。
こうして得られたｃＤＮＡをもつ発現プラスミドを作成し、通常のＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。こうして発現させた細胞のホモジェネートは通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後抗ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ抗体にてイムノブロット分析を行った（図９Ａ参照）。その結果、分子量約６０ｋであり、小脳から得たＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩに比較して若干低かったが、これは糖鎖の違いに帰するものである。この発現化した蛋白質を次に可溶化して、ヘパリンアガロースカラムにて部分純化した。こうして精製したＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩを、前述した方法でＩＰ４活性を調べたところ、小脳由来のＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩと同一であった（図９Ｂ参照）。
【００２７】
次に、ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩのＩＰ４結合ドメインを解析するために、膜貫通領域を除いたＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩとＧＳＴの融合蛋白を発現した。ＩＰ４結合能をマップした結果、Ｃ２Ｂドメインのアミノ酸番号３１５−３４６（ＩＨＬＭＱＮＧＫＲＬＫＫＫＫＴＴＶＫＫＫＴＬＮＰＹＦＮＥＳＦＳＦ；即ちIle-His-Leu-Met-Gln-Asn-Gly-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Thr-Val-Lys-Lys-Lys-Thr-Leu-Asn-Pro-Tyr-Phe-Asn-Glu-Ser-Phe-Ser-Phe-）が結合に重要であることが判明した（図１０参照）。しかも、その領域はリジンリッチであることが判明した。また、驚くべきことに、この結合領域は、イカ シナプトタグミンのＰｅｐ２ペプチドと極めて似ていることが明らかとなった（Nature 363, 163-165, 1993)。
更に、シナプトタグミンのＣ２Ａドメイン、ＰＫＣα及びrabphilin 3AのＣ２ドメインのアミノ酸配列並びにこれらのドメインとＩＰ４との結合性を詳細に検討した結果、ＩＰ４の結合部位は上記配列の内のＧＫＲＬＫＫＫＫＴＴＶＫＫ（即ち、Gly-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Thr-Val-Lys-Lys-）部位であることが明らかになった。そして、マウス以外の動物のシナプトタグミンＣ２Ｂドメインについても検討した結果、前記式（１）で示されるペプチド部分がＩＰ４との結合に不可欠であることが判明した。
【００２８】
また、精製ＧＳＴ−ｆに対するＩＰ４結合のスカッチャド分析をしたところ、Ｋｄは１６５ｎＭ、Ｂｍａｘは３．８ｐｍｏｌ／μｇ蛋白であった（図１１Ａ参照）。このＫｄ値は、精製した小脳由来ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩより高いことも分かった。また、そのＩＰ４に対する親和性の低さはＧＳＴとの融合に起因すると予想される。
当該ＧＳＴ−ｓｙｔ ＩＩ−Ｃ２Ｂに対するＩＰ４結合能を比較すると、Ｉｎｓ １，２，３，４，５，６−Ｐ６（ＩＰ６）＞Ｉｎｓ １，３，４，５，６−Ｐ５（ＩＰ５）＞Ｉｎｓ １，３，４，５−Ｐ４（ＩＰ４）＞Ｉｎｓ ２，４，５−Ｐ３＞Ｉｎｓ １，４，５−Ｐ３（ＩＰ３）＞Ｉｎｓ １，４−Ｐ２であった（図１１Ｂ参照）。つまり、ＩＰ６及びＩＰ５はＩＰ４に競合的であった。これらのことか、ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩのＣ２ＢドメインはＩＰ４だけでなく、ＩＰ６及びＩＰ５とも結合することが判明した。
【００２９】
精製小脳由来ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩに対しても、ＩＰ６を除いて同様の結果が得られた。また、ヘパリンはＩＰ４のＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩへの結合阻害を示すが、ＧＳＴ−ｓｙｔ ＩＩ−Ｃ２Ｂでも同様であった。
Ｃ２ドメインは、シナプトタグミンＩ、ＰＫＣαやｒａｂｐｈｉｌｉｎ  ３Ａにも存在することが知られている(Mol. Cell Biol., 13, 2061-2068)。そこで、Ｃ２Ｂドメインに対するＩＰ４結合が、ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩにユニークであるかどうかを確認したところ、ＩＰ４の結合はシナプトタグミンＩ及びＩＩのＣ２Ｂドメインに特異的であることが判明した（図１２参照）。
【００３０】
最近、シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインが、Ｃａ2+依存性ホスホリピッド結合に十分であるとの報告があった。シナプトタグミンのＣ２Ｂドメインも同様であると考えられるが、その詳細は不明である。シナプトタグミンのＣ２Ｂドメインに対するイノシトールホスフェートとホスホリピッド結合の関係を明らかにすべく、ＧＳＴ融合蛋白でホスホリピッド結合試験を実施した（図１４参照）。その結果、ＧＳＴ−ｓｙｔ Ｉ−Ｃ２ＡとＧＳＴ−ｓｙｔ ＩＩ−Ｃ２ＡはＣａ2+依存的にリポソーム（１：１（Ｗ／Ｗ）ホスファチジルセリン：ホスファチジルエタノールアミン）に結合したが、ＧＳＴ−ｓｙｔ Ｉ−Ｃ２ＢとＧＳＴ−ｓｙｔ ＩＩ−Ｃ２ＢはＣａ2+非依存的に結合することが判明した。また、ＧＳＴ−ｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３Ａ（ｒｐｈ）−Ｃ２ＡはＣａ2+依存性にホスホリピッド結合活性を有するが、ＧＳＴ−ｒｐｈ−Ｃ２Ｂは、Ｃａ2+存在下でも結合しないことが判明した。すなわち、シナプトタグミンやｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３ＡのＣ２Ａドメインは、ＰＫＣαのＣ２ドメインにその機能が類似してＣａ2+依存性であるが、Ｃ２Ｂドメインは異なることが示唆される。
ＧＳＴ−ｓｙｔ ＩＩ−Ｃ２Ｂの３２７番目のアミノ酸をリジンからグルタミンに変えるとホスホリピッド結合活性が失われるが、ＩＰ４結合活性は５０％維持された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、イノシトールポリリン酸と結合するペプチドが提供される。本発明ペプチドはイノシトールポリリン酸と特異的に結合するので、イノシトールポリリン酸の作用・機能を研究する際の試薬やイノシトールポリリン酸の精製試薬として有用である。また、上記ペプチドを用いる本発明のスクリーニング法によれば、イノシトールポリリン酸と同様な生理活性を有する物質又はイノシトールポリリン酸と拮抗する物質のスクリーニングが可能となる。更に、上記ペプチドを有効成分として含有する本発明のイノシトールポリリン酸阻害剤によれば、イノシトールポリリン酸の作用を阻害することができるので、カルシウム阻害剤、神経伝達物質放出阻害剤、ホルモン遊離阻害剤などとして有用である。
このように、本発明のペプチドは、イノシトールポリリン酸の作用を研究する上での試薬や精製試薬、イノシトールポリリン酸様物質のスクリーニング試薬、イノシトールポリリン酸が関与する各種疾患の診断試薬、治療（予防）用薬剤などとして広く利用することができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
▲１▼ＩＰ４結合蛋白（ＩＰ４ＢＰ）の精製
ｄｄＹマウス由来小脳１５０ｇを９容量の緩衝液［０．３２Ｍ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニル フルオリド)、１０μＭ ロイペプチン、１０μＭ ペプスタチン、１ｍＭ ２−ＭＥ、５ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．４］と混合し、ポッターホモゲナイザーでホモゲナイズした。ホモゲネートは、２℃、1000×gで５分間遠心し、ペレットは同条件で洗浄した。上清及び洗浄液を合わせ、２℃、１０万ｇで６０分間遠心し、Ｐ３＋Ｐ４膜画分を沈殿させた。
【００３３】
膜画分を緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μＭ ロイペプチン、１０μＭ ペプスタチンＡ、１ｍＭ ２−ＭＥ、５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０）で懸濁し、２０％（ｗ／ｗ）トリトン Ｘ−１００を加え蛋白濃度を３．０ｍｇ／ｍｌ、トリトン Ｘ−１００濃度を１％に調製した。更にその１０万ｇ遠心上清をヘパリン−アガロースカラム（２×１３．７ｃｍ）にアプライした。なお、当該カラムは、０．２％トリトン Ｘ−１００、１０％ グリセロール、１０μＭ ペプスタチンＡ、１０μＭ ロイペプチン、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ２−ＭＥ、５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０（緩衝液１と称する）に０．２５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で予め平衡化したものである。次に、カラムを０．２５Ｍ ＮａＣｌ／緩衝液１及び０．５Ｍ ＮａＣｌ／緩衝液１で洗浄し、ＩＰ４ＢＰを３０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ／緩衝液１で溶出した。
【００３４】
更に、溶出画分を濃縮し、セファロースカラムＣＬ−６Ｂ（１．０×６０ｃｍ、０．２Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ／緩衝液１で平衡化）にアプライし、ＩＰ４ＢＰ画分を回収した（図１ａ参照）。なお、回収した画分は、図中にバーを付して示した（図ｂ及びｃにおいても同様）。
回収した画分を、１ｍＭ ＥＤＴＡ／緩衝液１に対して透析し、次いでＤＥ５２カラム（１．０×７．６ｃｍ）にアプライした。ＩＰ４ＢＰ画分を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液１を用い、０−０．３Ｍ ＮａＣｌグラディエントで溶出した（図１ｂ参照）。
更に、溶出画分を、再度セファロースＣＬ−６Ｂでリクロマトすることにより精製し（図１ｃ参照）、精製物を−８０℃で保存した。また、当該精製工程における回収率等を表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
実施例２
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
上記の精製工程におけるＩＰ４ＢＰ画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．７５−１２．５％のグラディエントゲルによるLaemmli法）に供した。なお、ゲル染色にはＣＢＢを用いた。その結果を図２Ａに示す。図において、レーンｂ：界面活性剤による可溶化画分８０μｇ；レーンｃ：ヘパリンアガロース画分３０μｇ；レーンｄ：セファロースＣＬ−６Ｂ画分１０μｇ；レーンｅ：ＤＥ−５２画分２μｇ；レーンｆ：セファロースＣＬ−６Ｂリクロマト画分２μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。なお、レーンａは分子量マーカー(×１０3）であり、２００：ミオシン；１１６：β−ガラクトシダーゼ；９２：ホスホリラーゼ；６６：ウシ血清アルブミン；４５：オボアルブミンを示す。
また、図２Ｂに、セファロースＣＬ−６Ｂリクロマトの６３〜８１画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＩＰ４ＢＰの分子量測定値は、１４０Ｋ及び６５Ｋであった（図２Ｃ参照）。また、１４０Ｋ分子は６５Ｋ分子の２量体であることも判明した。
【００３７】
実施例３
［3Ｈ］ＩＰ４結合性の測定
ＩＰ４結合測定は、ＰＥＧ沈殿法によった(Maeda, N. ENBO. J., 9, 61-67, 1990)。クロマト各画分測定は、［3Ｈ］ＩＰ４を各画分５０μｌに９．６ｎＭになるように添加した。そのサンプルは、０℃で１０分間インキュベート、２μｌのウシ−ガンマーグロブリン（５０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、５０μｌの３０％ＰＥＧ６０００／５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）をサンプルに加え、０℃で５分間インキュベートした。次に、１万ｇ遠心上清を除去し、沈殿を５００μｌのSOLVABLEに溶解させた。ラジオアクティビティは、液体シンチレーション試薬として５ｍｌのアクアゾルＩＩ(Aquasol II)を加えて測定した。非特異結合は１０μＭの非ラベルＩＰ４存在下で測定した。
更に、生化学的性状解析のために、別のＩＰ４結合測定法も用いた。１０μｌ［3Ｈ］ＩＰ４（最終濃度４．８ｎＭ）、１０μｌガンマーグロブリン（最終濃度５０μｇ）、１０μｌの０．５Ｍグッド緩衝液、１０μｌのイノシトールリン酸液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４で希釈）、サンプル及び蒸留水で全１００μｌに調整した。０℃で１０分インキュベートした後、３０％ＰＥＧ溶液を１００μｌ加え、上記のように測定した。
【００３８】
実施例４
ＩＰ４ＢＰペプチドの同定
実施例１で得た精製ＩＰ４ＢＰ（約０．３ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．７５−１２．５％のグラディエントゲル）に供し、分離した蛋白をＰＶＤＦ膜にトランスファーして１４０Ｋと６５Ｋ蛋白相当バンドをブロットから切り出し、０．５ｍＭ ＮａＯＨ処理し、microfuge-tube中で還元、アルキル化した。２％アセトニトリルで洗浄後、膜片をリジルエンドペプチダーゼで２４時間、３７℃で処理した。その濃度は、７．５％アセトニトリルと０．０５％ＳＤＳを含む１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）の３００μｌ中で、ＩＰ４ＢＰが１／５０モル濃度になるように調整した。膜片は１万ｇで５分間遠心して除去し、上清を凍結乾燥後、０．１％ＴＦＡに溶解しＨＰＬＣカラム[Waters 600E、Ｃ８(μBONDASPHERE 300A Waters)、カラム形状０．３９×１５ｃｍ]にアプライした。０−３０％ ２−プロパノール／アセトニトリル（７：３）（含０．１％ＴＦＡ）のグラディエントを４５ｍｌ以上になるように実施した（０．５ｍｌ／分）。ペプチドピークは２１５ｎｍでモニターし回収した（図３Ａ参照）。図に示されるように、１４０Ｋが６５Ｋの２量体であることが確認された。
次いで、１４０Ｋの主ピーク（図３Ａに示した、１−７の７つのピーク）を１００μｌ以下に濃縮し、ガス−フェーズ シークエンサー(Applied Biosystem)に供し、それぞれのアミノ酸配列を決定した。各ペプチドフラグメントのアミノ酸配列をラット由来シナプトタグミンＩＩ配列と比較した（図３Ｂ参照）。その結果、当該アミノ酸配列は、ラット由来シナプトタグミンＩＩ配列と一致した。
【００３９】
実施例５
シナプトタグミンＩＩのＣ２Ａドメイン及びＣ末端領域ペプチドに対する抗体の作製
(1)  ラット由来シナプトタグミンＩＩのＣ２Ａドメイン（アミノ酸配列番号：１３９−２６７）とグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴと称する）の融合蛋白を大腸菌で発現させて精製した（Smithらの方法による；Gene 67, 31-40, 1988)。即ち、ラット由来シナプトタグミンＩＩのＣ２ＡドメインをコードするｃＤＮＡを常法に準じてＰＣＲ法により増幅・調製し、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターにサブクローニングし、融合蛋白を大腸菌ＪＭ１０９で発現させた。菌体をソニケーションし、トリトン Ｘ−１００で最終濃度が１％になるように処理した。更に、１万ｇ遠心上清をグルタチオン−セファロースＣＬ−６Ｂによるアフィニティカラムに付し、当該融合蛋白を精製した。
精製品は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析確認後、リン酸緩衝液（生理食塩含）に透析し、ニュージーランドホワイトウサギの背中に皮下注した。なお、蛋白溶液１ｍｇ／ｍｌとフロイントコンプリートアジュバント１ｍｌを混合し免疫した。また、２種間後にブースターした後、常法に準じて抗体を得た。
【００４０】
(2)  ラット由来シナプトタグミンＩＩのＣ末端領域ペプチド（アミノ酸配列番号：４０９−４２２）のアミノ末端にシステインを付加し、ウシ血清アルブミンに結合させた。当該アルブミンは、フリーのスルヒドリル基と反応し得るマレイミド基を有するヘテロビファンクショナル−クロスリンカーに結合したものである(sulfo-SMCC-cBSA)。５ｍｇのＣ末端ペプチドと５ｍｇのsulfo-SMCC-cBSAを、１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含）中で混合し、室温で３時間撹拌させながら反応させた。未反応物はセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過で除去した（０．０８３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ条件下）。ペプチド−ｃＢＳＡ複合体を含有するボイド画分を、アジュバントとして水酸化アルミニウムを用い、上記と同様にニュージーランドホワイトウサギに免疫し、常法に準じて抗体を得た。
【００４１】
実施例６
イムノブロット法及び免疫沈降法による分析
(1)イムノブロット法
実施例１における可溶化画分（粗精製蛋白）及びセファロースＣＬ−６Ｂリクロマト画分（精製蛋白）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３．７５−１２．５％のLaemmli系）に供し、蛋白をＰＶＤＦ膜にトランスファーした後、上記の抗体と反応させた。その結果を図４に示す。同図において、レーンａは可溶化上清５０μｇ；レーンｂはセファロースＣＬ−６Ｂリクロマト画分３μｇであり、アミノブラックで染色したもの（Ａ）、Ｃ２Ａ領域に対する抗体で反応させたもの（Ｂ）、Ｃ末端領域に対する抗体で反応させたもの（Ｃ）、コントロール抗体で反応させたもの（Ｄ）を示す。なお、検出に用いるペルオキシダーゼ活性は、Vectastain ABCキットでＤＡＢ染色を行った。
図に示されるように、ラット由来シナプトタグミンＩＩのＣ末端アミノ酸配列（４０９−４２２）及びＣ２Ａ領域（１３９−２６７）に対する抗体は、１４０Ｋ及び６５Ｋの何れとも反応することが判明した。
【００４２】
(2)免疫沈降法
抗Ｃ２Ａ抗体１０μｌ（抗体濃度はＩｇＧとして、２、５、１０μｇ／１０μｌ・５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ。また、当該抗体はAmersham製プロテインＡカラムで精製したもの）を精製ＩＰ４ＢＰ（０．３５μｇ）に添加し、０．１Ｍ ＮａＣｌを含むＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）緩衝液中で室温３０分間インキュベートした。次に、同緩衝液で懸濁させたプロテインＡ−セファロースＣＬ−６Ｂ懸濁液３０μｌ（プロテインＡパウダー０．３ｍｇ）を加え、当該チューブを４℃で３０分間ゆるやかに振盪させた。更に、プロテインＡ−セファロースＣＬ−６Ｂ粒子を１万ｇ遠心することにより沈殿させ、上清２５μｌの残存［3Ｈ］ＩＰ４結合活性を前述のＰＥＧ沈降法で測定した。なお、コントロール実験はウサギ免疫前のＩｇＧ画分を用いて同様に実施した。その結果を、図５に示す。同図において、○は抗Ｃ２Ａ抗体を、●はコントロール抗体を示す。また、％阻害（▲）は、コントロールＩｇＧでの活性から抗Ｃ２Ａ抗体での活性を差し引いた残存活性を示す。
図に示されるように、抗Ｃ２Ａ抗体は用量依存的に精製ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合活性を低下させた。
上記(1)及び(2)この結果は、実施例４に示した部分アミノ酸配列の分析結果とあわせて、マウス由来精製ＩＰ４ＢＰは、明きらかにマウス由来シナプトタグミンであることを説得せしめる。
【００４３】
実施例７
精製ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合活性の性状解析
精製ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合におけるｐＨ依存性を図６に示した。結合活性は、４．８ｎＭ［3Ｈ］ＩＰ４と０．３５μｇの精製蛋白を５０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ４．５−６．７；○）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２−７．６；□）、５０ｍＭ Ｅｐｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３−８．３；△）緩衝液で検討した。非特異的結合は４．８μＭのラベルＩＰ４存在下で測定した。サンプルは、０℃で１０分間インキュベートし、結合はＰＥＧ沈降法により測定した。その結果、至適ｐＨは５．０であることが判明した。
【００４４】
次に、精製ＩＰ４ＢＰに対する［3Ｈ］ＩＰ４の結合の飽和性について検討した（図７参照）。結合測定には、０．３５μｇの精製蛋白でｐＨ６．２（△）及びｐＨ７．４（○）、あるいは０．１μｇの精製蛋白でｐＨ５．０（□）、４．８ｎＭ ［3Ｈ］ＩＰ４、各種濃度のコールドＩＰ４、及び５０μｇガンマグロブリンを、１００μｌの５０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２及び７．４）下で使用した。サンプルは、０℃で１０分間インキュベートし、結合はＰＥＧ沈降法により測定した。
その結果、結合のHalf-maximal reductionは、ｐＨ６．２では３０ｎＭ、ｐＨ７．４では４０ｎＭ、ｐＨ５．０では１７０ｎＭであった。また、スカッチャード分析では、シングル結合であることを示し、ｐＨ６．２と７．４ではＫｄ値が３０ｎＭ、ｐＨ５．０では、１６０ｎＭ、Ｂｍａｘは、ｐＨ６．２で２．７ｐｍｏｌ、ｐＨ７．４で２．４ｐｍｏｌ、ｐＨ５．０で３５ｐｍｏｌ／μｇ蛋白であることが判明した。
【００４５】
次に、ＩＰ４結合サイトの特異性を、５種類のイノシトールポリリン酸を加えることによって検討した。精製蛋白０．３５μｇを種々の濃度のＩＰ３（▲）、ＩＰ４（●）、Ｉｎｓ ３，４，５，６−Ｐ４（○）、ＩＰ５（■）及びＩＰ６（□）の存在下で、４．８ｎＭ［3Ｈ］ＩＰ４とインキュベートした。結合測定はＰＥＧ沈降法で実施した。その結果を図８に示す。図に示されるように、ＩＰ５はＩＰ４よりも［3Ｈ］ＩＰ４を強く置換した。Ｉｎｓ ３，４，５，６−Ｐ４とＩＰ６は、１００ｎＭでＩＰ４の結合を半分抑制した。しかし、ＩＰ６の場合には、置換曲線の勾配は比較的鋭く、また１０ｎＭで［3Ｈ］ＩＰ４の結合を増加させた。また、３００ｎＭの時、ＩＰ４と同様に［3Ｈ］ＩＰ４の結合を強く抑制した。このことは、［3Ｈ］ＩＰ４結合におけるＩＰ６のアロステリック様効果を意味する。他のイノシトール誘導体では親和性は低かった。
【００４６】
実施例８
マウスＩＰ４ＢＰの遺伝子クローニング
実施例４で決定した、ＩＰ４ＢＰの一部アミノ酸配列Ｋ−３ペプチド（ＶＰＹＱＥＬＧ；即ち、Val-Pro-Tyr-Gln-Glu-Leu-Gly）及びＫ−２ペプチド（ＩＨＬＭＱ；即ち、Ile-His-Leu-Met-Gln）に相当する５’ＧＴＩＣＣＩＴＡ（ＴＣ）ＣＡ（ＡＧ）ＧＡ（ＡＧ）（ＴＣ）ＴＩＧＧ３’及び５’（ＴＣ）ＴＧＣＡＴＩＡ（ＡＧ）（ＡＧ）ＴＧ（ＡＧＴ）ＡＴ３’をＰＣＲのプライマーとして合成した。全ＲＮＡはChomczynskiとSacchiの方法(Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987)によりマウス小脳より調製し、またポリ（Ａ）+ＲＮＡはoligotex-dT30（日本ロシュ）により選択した。
【００４７】
ＰＣＲ増幅はＡＭＶ逆転写酵素で３５サイクル行い、９４℃２分間変性し、４８℃でアニーリング、７２℃３分間鎖伸長を行った。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動とGeneclean II kit(Biol 01)で抽出し、マウス小脳由来ｃＤＮＡライブラリーからの２×１０6プラークをスクリーニングするのに用いた。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、２×ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、32Ｐ−ラベルプローブ（５×１０5ｃｐｍ／ｍｌ）で４２℃１２時間の条件で実施した。ハイブリダイズフィルターは０．１×ＳＣＣと０．１％ＳＤＳで４２℃にて２回洗浄した。５つの陽性クローンを選択し、それらのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）(Stratagene)にクローン化した。さらに、そのクローンを、BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit(Takara Shuzo)で配列決定をした。５つの重複するクローンからシングルオープンリーディングフレームを含む全ＤＮＡ配列を決定した。当該塩基配列を配列番号１に示す。また、その配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。この配列は、前述の部分アミノ酸配列と一致した。配列番号１において、実線を付した部分が既に決定された部分アミノ酸配列を示す。
【００４８】
実施例９
ＩＰ４ＢＰの発現と機能確認
ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合活性を確認するために発現プラスミド（ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ）を調製し、ＣＯＳ７にトランスフェクトし、形質転換体を培養することにより、発現ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ（ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ）を調製した。
即ち、ｐＥＦ−ＢＯＳ(Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990)をXbaIで消化し、クレノーフラグメントで平滑化し、NotIリンカーを結合させた。NotIリンカーを結合させた全ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ ｃＤＮＡ（１−１５９０塩基対）を、ｐＥＦ−ＢＯＳのNotIサイトに挿入した。生成したプラスミド（ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ）は、ヒトＥＦ１−αプロモーターとヒトＧ−ＣＳＦポリアデニル化配列の間に全長のＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩｃＤＮＡを有する。
ＤＥＡＥ−デキストラン法を用い、プラスミドｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ及び対照としてのｐＥＦ−ＢＯＳをＣＯＳ７にトランスフェクトした。トランスフェクト後、４８時間培養した。
【００４９】
培養後、細胞をホモゲナイズし、ホモゲネートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＩＰ４ＢＰ抗体でイムノブロットした。その結果を図９Ａに示す。同図において、レーン１はコントロール（ｐＥＦ−ＢＯＳトランスフェクトＣＯＳ７のヘパリン結合画分）、レーン２はｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ、レーン３はマウス小脳ミクロゾーマル画分を示す。
図に示されるように、イムノリアクティブバンドは、ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰでトランスフェクトした細胞では検出されるが、コントロール細胞では検出されなかった。検出されたバンドは６０Ｋと低分子量であった。この分子量は、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した小脳由来ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩと同一であることから、上記の分子量の相違は糖鎖の違いによることが証明された。
また、コントロール（ｐＥＦ−ＢＯＳトランスフェクトＣＯＳ７のヘパリン結合画分）、ヘパリン-アガロースで部分精製したｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ及び小脳由来ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ(各５．５μｇ)の［3Ｈ］ＩＰ４結合を比較した。その結果を図９Ｂに示した。図に示されるように、ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩのＩＰ４結合活性は小脳由来のものと比べて遜色なかった。
【００５０】
実施例１０
ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合領域同定
ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合領域を同定するために、膜貫通領域を除いたＩＰ４ＢＰとＧＳＴの融合蛋白を９種類作製した。
即ち、ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩの種々のドメインをコードするｃＤＮＡ（図１０Ａ参照）をＰＣＲ法で増殖した。増殖したフラグメントは、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩの種々のドメインとＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白の調製は文献（Gene 67, 31-40, 1988)記載の方法に準じて行い、大腸菌ＪＭ１０９で発現させた。次いで、生成融合蛋白を、グルタチオン-セファロース ４Ｂ(Pharmacia)クロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５１】
９種類の融合蛋白において、ＧＳＴに結合させたドメインの違いは図１０Ａのようにマップされる。また、９種類の融合蛋白をＧＳＴ−ａ〜ＧＳＴ−ｉで表し、例えば、ＧＳＴ−ａはＧＳＴとドメインａとの融合蛋白を示す。
これらの融合蛋白のＩＰ４結合性を、前述の方法で試験した。その結果を図１０Ｂに示す。
図に示されるように、ＩＰ４結合活性はＣ２Ｂ領域の中央部に存在することが判明した。そのアミノ酸配列は、アミノ酸番号３１５−３４６のＩＨＬＭＱＮＧＫＲＬＫＫＫＫＴＴＶＫＫＫＴＬＮＰＹＦＮＥＳＦＳＦ、即ち、下記式（２）に相当した。
Ile-His-Leu-Met-Gln-Asn-Gly-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Thr-Val-  Lys-Lys-Lys-Thr-Leu-Asn-Pro-Tyr-Phe-Asn-Glu-Ser-Phe-Ser-Phe-    （２）
この領域はリジンリッチであり、マイナスにチャージしたＩＰ４の結合に重要であると推測される。
なお、他のリジンリッチ領域、例えばＣ２Ａ領域或いはカゼインキナーゼＩＩの内在性ポリリジン刺激シグナルは、ＩＰ４結合活性は示さなかった。また、このＩＰ４結合領域はイカシナプトタグミンのＰｅｐ２０ペプチド（ＩＫＫＫＫＴＴＶＫＫＣＴＬＮＰＹＹＮＥＳＦ；即ち、Ile-Lys-Lys-Lys-Lys-Thr-Thr-Val-Lys-Lys-Cys-Thr-Leu-Asn-Pro-Tyr-Tyr-Asn-Glu-Ser-Phe）に相当することも判明した。また、このペプチドを、イカ巨大シナプス前終末に注入すると、神経伝達物質の放出が可逆的に抑制されることが示された。
【００５２】
実施例１１
ＧＳＴ−ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合性質
精製ＧＳＴ−ｆ（ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂ）に対するＩＰ４結合のスカチャード分析を行った。その結果を図１１Ａに示す。この結果から、Ｋｄは１６５ｎＭ、Ｂｍａｘは３．８ｐｍｏｌ／μｇ蛋白であった。このＫｄ値は、小脳由来ＩＰ４ＢＰ（Ｋｄ＝４０ｎＭ）よりも４倍も高い値を示した。当該ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂはアフィニティが低いが、その理由は、ＧＳＴと融合蛋白を形成しているためと推定される。
【００５３】
当該ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂに対する各種イノシトールポリリン酸の結合脳を測定した。その結果を図１１Ｂに示す。図に示されるように、結合能は、Ｉｎｓ−１，２，３，４，５，６−Ｐ６（ＩＰ６）＞Ｉｎｓ−１，３，４，５，６−Ｐ５（ＩＰ５）＞Ｉｎｓ−１，３，４，５−Ｐ４（ＩＰ４）＞Ｉｎｓ−２、４，５−Ｐ３＞Ｉｎｓ−１、４，５−Ｐ３（ＩＰ３）＞Ｉｎｓ−１，４−Ｐ２であった。つまり、Ｉｎｓ−１，２、３，４，５，６−Ｐ６とＩｎｓ−１，３，４，５，６−Ｐ５はＩｎｓ−１，３，４，５−Ｐ４より効果的な競合物質であった。このことから、ＩＰ４ＢＰ／ｓｔｙ ＩＩのＣ２Ｂ領域は、ＩＰ４だけでなくＩＰ５及びＩＰ６にも結合することを示している。
精製小脳由来ＩＰ４ＢＰ／ｓｔｙ ＩＩに対しても、ＩＰ６を除いて同様の結果が得られた。また、ヘパリンはＩＰ４のＩＰ４ＢＰ／ｓｔｙ ＩＩへの結合阻害を示すが、ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂでも同様であった。
【００５４】
実施例１２
ＩＰ４の結合部位についての検討
Ｃ２ドメインはシナプトタグミンＩ、ＰＫＣαやｒａｂｐｈｉｌｉｎ  ３Ａにも存在することが知られている(Rose John et al. Gene 74, 465-471, 1988）。そこで、Ｃ２Ｂドメインに対するＩＰ４結合が、ＩＰ４ＢＰ／ｓｔｙ ＩＩにユニークであるかどうかを確認した。即ち、実施例１０に記載した方法に準じて、シナプトタグミンＩ、ｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３Ａ（ｒｐｈ）及びＰＫＣαの蛋白とＧＳＴとの融合蛋白を調製し、ＩＰ４結合能を測定した。その結果を図１２に示す。なお、同図において、例えば、ＧＳＴ−ＳＴＩ−Ｃ２Ａは、ＧＳＴとシナプトタグミンＣ２Ａドメインとの融合蛋白を意味する。
図に示されるように、ＩＰ４の結合はシナプトタグミンＩ、ＩＩのＣ２Ｂドメインに特異的であることが判明した。
そこで、種々の生物由来シナプトタグミンＣ２Ｂドメインの前記式（２）に相当するアミノ酸配列を比較した（図１３参照）。そして、ＩＰ４の結合部位は、ＧＫＲ（Ｌ／Ｉ）ＫＫＫＫＴ（Ｔ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）ＫＫ、即ち前記式（１）に存在すると推察された。
即ち、図１３の配列において、Ｃ末端側の配列はよく保存されており、シナプトタグミンＣ２Ａドメインでも見られる配列であるが、シナプトタグミンＣ２ＡドメインはＩＰ４に結合しないこと；ＰＫＣα及びｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３ＡのＣ２ドメインもＩＰ４には結合しないが、これらのドメインには上記式（１）のアミノ酸配列が存在しないことなどから、式（１）で示されるペプチドがＩＰ４の結合部位であると判断した。
【００５５】
実施例１３
Ｃ２ドメインのホスホリピッド結合性質
シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインがあれば、Ｃａ2+依存性ホスホリピドの結合に十分であるとの報告があるが、その詳細は不明である。シナプトタグミンのＣ２Ｂドメインに対するイノシトールホスフェートとホスホリピド結合の関係を明らかにすべく、ＧＳＴ融合蛋白でホスホリピド結合試験を実施した。
即ち、リポソーム（ホスファチジルセリン／ホスファチジルエタノールアミン（１：１、ｗ／ｗ））とＧＳＴ融合蛋白を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、室温で１５分間インキュベートした。１２００ｇで１０分間遠心後、ペレット（ホスホリピド結合画分）と上清（非結合画分）を分画した。次に、両画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果を図１４に示す。同図において、レーン１：上清−Ｃａ2+、レーン２：ペレット−Ｃａ2+、レーン３：上清＋１ｍＭ Ｃａ2+、レーン４：ペレット＋Ｃａ2+；ａ）ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ａ、ｂ）ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂ、ｃ）ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂ（３２７番目のＬｙｓをＧｌｎに）、ｄ）ＧＳＴ−ＳＴＩ−Ｃ２Ａ、ｅ）ＧＳＴ−ＳＴＩ−Ｃ２Ｂ、ｆ）ＧＳＴ−Ｃ２Ａ＋Ｃ２Ｂ、ｇ）ＧＳＴ−ｒｐｈ−Ｃ２Ａ、ｈ）ＧＳＴ−ｒｐｈ−Ｃ２Ｂ、ｉ）ＧＳＴを示す。
【００５６】
つまり、ＧＳＴ−ＳＴＩ−Ｃ２ＡとＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ａは、Ｃａ2+依存性にリポソーム（１：１（ｗ／ｗ）ホスファチジルセリン：ホスファチジルエタノールアミン）に結合したが、ＧＳＴ−ＳＴＩ−Ｃ２ＢとＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２ＢはＣａ2+非依存性に結合することが判明した。また、ＧＳＴ−ｒａｂｐｈｉｌｉｎ３Ａ（ｒｐｈ）−Ｃ２ＡはＣａ2+依存性にホスホリピド結合活性を有するが、ＧＳＴ−ｒｐｈ−Ｃ２ＢはＣａ2+存在下でも結合しないことが判明した。すなわち、シナプトタグミンやｒａｂｐｈｉｌｉｎ３ＡのＣ２Ａドメインは、ＰＫＣαのＣ２ドメインにその機能が類似してＣａ2+依存性であるが、Ｃ２Ｂドメインは異なることが示唆される。ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂの３２７番目のアミノ酸をリジンからグルタミンに変えるとホスホリピド結合活性は失われるが、ＩＰ４結合活性は５０％維持された。すなわち、ＩＰ４とホスファチジルセリンはＣ２Ｂドメインの似た領域に結合するものの、認識サイトは若干異なることが判明した。
【００５７】
【配列表】
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【００５８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各クロマトグラフィーによるＩＰ４ＢＰの精製工程を示す図である。
【図２】ＩＰ４ＢＰ精製工程における各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図（Ａ，Ｂ）である。なお、ＣはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による分子量の測定を示す図である。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＩＰ４ＢＰ（１４０ｋ及び６５ｋ）のリジルエンドペプチダーゼ分解物のＨＰＬＣ分析を示す図（Ａ）、及び分離した画分（１−７）のアミノ酸配列とラットシナプトタグミンＩＩのアミノ酸配列の比較を示す図（Ｂ）である。図Ａにおいて、（ａ）は１４０ｋの分解物、（ｂ）は６５ｋ分解物を示す。
【図４】粗及び精製ＩＰ４ＢＰのイムノブロット分析の結果を示す図である。図において、ａは粗ＩＰ４ＢＰ、ｂは精製ＩＰ４ＢＰを示す。また、Ａはアミノブラックで染色したもの、ＢはシナプトタグミンＣ２Ａ領域に対する抗体で反応させたもの、ＣはシナプトタグミンＣ末端領域に対する抗体で反応させたもの、Ｄはコントロール抗体で反応させたものを示す。
【図５】抗体存在下におけるＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合特性を示す図である。図において、○はシナプトタグミンＣ２Ａ領域に対する抗体の存在下、●はコントロール抗体存在下を示す。
【図６】ＩＰ４ＢＰのＩＰ４結合に対するｐＨ依存性を示す図である。
【図７】ＩＰ４ＢＰに対する［3Ｈ］ＩＰ４の結合の飽和性及びスカッチャド分析を示す図である。
【図８】ＩＰ４ＢＰと種々のイノシトールポリリン酸との結合特性を示す図である。図において、▲はＩＰ３、●はＩＰ４、○はＩｎｓ ３，４，５，６−Ｐ４、■はＩＰ５、□はＩＰ６を示す。
【図９】遺伝子組換技術により発現したＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ（ｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ）のイムノブロット分析の結果（Ａ）、及び［3Ｈ］ＩＰ４結合能（Ｂ）を示す図である。
なお、図Ａにおいて、レーン１はコントロール、レーン２はｐＥＦ−ＩＰ４ＢＰ／ｓｙｔ ＩＩ、レーン３はマウス小脳ミクロゾーマル画分を示す。
【図１０】実施例１０で調製した、ＧＳＴと各種シナプトタグミンドメインとの融合蛋白において、ＧＳＴに結合させたシナプトタグミンドメインの位置を示す図（Ａ）、及び当該融合蛋白のＩＰ４結合能を示す図（Ｂ）である。
【図１１】融合蛋白ＧＳＴ−ＳＴＩＩ−Ｃ２Ｂのスカッチャド分析の結果を示す図（Ａ）、及び種々のイノシトールポリリン酸との結合能を示す図（Ｂ）である。
【図１２】ＧＳＴと種々のＣ２ドメインとの融合蛋白のＩＰ４結合能を示す図である。
【図１３】種々の生物由来シナプトタグミンＣ２Ｂドメインの式（２）相当領域のアミノ酸配列を比較した図である。図において、ＭＩＩはマウスシナプトタグミンＩＩ、ＭＩはマウスシナプトタグミンＩ、ＨＩはヒトシナプトタグミンＩ、ＢＩはウシシナプトタグミンＩ、ＲＡはシビレ エイ シナプトタグミンＡ、ＲＢはシビレエイ シナプトタグミンＢ、ＳＩはイカシナプトタグミンＩ、ＤＩはショウジョウバエ シナプトタグミンＩ、ＣＩは線虫シナプトタグミンＩを示す。
【図１４】ＧＳＴ−各種Ｃ２ドメイン融合蛋白についてのホスホリピッド結合性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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