(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤と、タンパク質の存在下に変色するタンパク質誤差指示薬との試薬系で含浸された吸収性担体を含む、尿中タンパク質を検出するための試験片であって、カチオン感受性剤としての酒石酸を、尿中に有意量のタンパク質が存在しなくてもタンパク質誤差指示薬が変色するレベルにまで試薬のpHが高まることを防ぐことができる量で、非カチオン感受性緩衝剤と組み合わせて使用することを特徴とし、
ここで、
酒石酸の量は、５０〜７５０mMの酒石酸濃度を有する、酒石酸と非カチオン感受性緩衝剤の両方を含む溶液に試験片を浸漬したのち吸収性担体に残る残渣の量であり、
非カチオン感受性緩衝剤の量は、酒石酸と非カチオン感受性緩衝剤との比率が２５mM：７００mM〜２００mM：１００mMである溶液に試験片を浸漬したのち吸収性担体に残る残渣の量である、試験片。
【請求項２】
タンパク質誤差指示薬がテトラブロモフェノールブルーまたは５′，５″−ジニトロ−３，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレインである、請求項１記載の試験片。
【請求項３】
吸収性担体がろ紙である、請求項１記載の試験片。
【請求項４】
タンパク質誤差指示薬の量が、０．１〜５．０mMの指示薬濃度を有する指示薬の溶液に試験片を浸漬し、溶剤を乾燥させたのち試験片中に残る残渣の量である、請求項１記載の試験片。
【請求項５】
酒石酸濃度が５００〜６００mMである、請求項１記載の試験片。
【請求項６】
比率が１５０mM：４７５mMである、請求項１記載の試験片。
【請求項７】
酒石酸がジプロトン化されている、請求項１記載の試験片。
【請求項８】
酒石酸がモノプロトン化されている、請求項１記載の試験片。
【請求項９】
試薬系にバックグラウンド染料が含まれている、請求項１記載の試験片。
【請求項１０】
バックグラウンド染料が、pHまたは光に対して感受性のない染料から選択される、請求項９記載の試験片。
【請求項１１】
バックグラウンド染料がメチルレッド、ＦＤ＆Ｃレッド＃３またはアシッドレッド＃４０である、請求項９記載の試験片。
【請求項１２】
尿を、請求項１〜１１いずれか１項記載の試験片と接触させる工程を含む、尿中タンパク質の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質誤差指示薬および緩衝剤を含む試験片の使用による、尿中タンパク質の検出に関する。より詳細には、本発明は、通常の緩衝剤系と組み合わせて使用されると、この方法で高比重（ＳＧ）の尿をタンパク質含量に関して試験する場合に見られる、結果をゆがめる効果を緩和するように働く、本明細書では「カチオン感受性（ｓｅｎｓｉｎｇ）緩衝剤」と呼ぶ特定の緩衝剤の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿試料中のタンパク質の存在の測定は、腎臓および循環系ならびに中枢神経系に影響するいくつかの病状の診断において重要である。尿中タンパク質を定性的かつ定量的に測定することがしばしば必要である。これは、糖尿病および腎臓疾患の診断に特に当てはまる。糖尿病に関与する支配的な尿タンパク質は、分析においてもっとも一般的に探求されるタンパク質であるアルブミンである。
【０００３】
尿中タンパク質の存在を測定するための種々の方法が公知であり、そのもっとも簡便なものは、タンパク質誤差指示薬および緩衝剤を含浸させた吸収性試験片を少量の尿で湿らせることを含む。タンパク質誤差指示薬は、タンパク質の存在下で置換されて検出可能な変色を示すイオン性基を含有するｐＨ指示薬である。これは、ｐＨ変化の影響のもとで指示薬が受けるであろうものと同じ変色である。したがって、ｐＨの増大が、タンパク質が存在しないときにも、指示薬の変色をもたらし、それにより、偽陽性の結果をもたらすおそれがあるため、緩衝剤を試験片に含めてそのようなｐＨの増大を避けることが重要である。
【０００４】
偽陽性の結果を出す傾向は、高ＳＧ尿の試験に関して特に問題である。理由は、高ＳＧ尿中の緩衝物質の存在が試験片中の緩衝剤を圧倒し、それによってｐＨの変化を許容する結果、試験される尿試料中にタンパク質が存在しなくても、タンパク質の存在を示す指示薬を変色させてしまうからである。尿中の第一の緩衝成分はリン酸塩（リン酸イオン）であり、続いてクエン酸塩（クエン酸イオン）、尿酸、酢酸塩（酢酸イオン）、グリシンおよびアンモニウムである。この種の偽陽性は、当然、可能な限り避けなければならない。そのような偽陽性の状況の例は、タンパク質誤差指示薬が、３．７を超えるｐＨで黄色から青に変わるテトラブロモフェノールブルー（ＴＢＰＢ）である場合の尿アルブミンの試験である。もう一種の一般的な指示薬ＤＩＤＮＴＢは、２．１を超えるｐＨで無色から青に変色する。従来技術の緩衝剤を使用すると、高ＳＧ尿、すなわち通常は５〜８のｐＨを有し、高いｐＨを維持するよう作用する緩衝物質を含有し、それにより、試薬系のｐＨを３．７を超えるレベルに高めてしまう高ＳＧ尿の添加が変色をもたらし、その結果、尿試料中のタンパク質の偽陽性の読取りを招く。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
特開平３−３５５０４４号公報には、高ＳＧ尿中タンパク質に関する偽陽性の応答の傾向を減らすためのカリウム塩の使用が記載されている。この出願明細書の５頁には機構が不明であると述べられているが、この系は、尿中の主成分が非反応性のカチオン感受性緩衝物質であるとしても、カリウムイオンが尿中のカチオン感受性成分と結合するという原理に基づいて作用する可能性がある。挙げられているカリウム塩の一つはクエン酸カリウムである。この引用例はまた、緩衝剤としてのクエン酸ナトリウムおよびクエン酸の使用を述べている。米国特許第５，２７９，７９０号明細書の実施例１５には、タンパク質誤差指示薬とクエン酸カリウム緩衝剤との混合物で紙片を含浸する工程を含む尿タンパク質試験片の調製方法が記載されている。クエン酸は、大部分のアニオン性緩衝剤と同様に、金属カチオンの存在下で陽子をいくらか放出し、それにより、そのようなカチオンの存在下でｐＨを下げる能力を有している。しかし、カチオン感受性緩衝剤が尿タンパク質検出法に利益をもたらすためには、緩衝剤は、尿中に見いだされる、カリウムの場合で最大１４０ｍＭ、ナトリウムの場合で最大２５０ｍＭに達する正常な生理範囲のカチオンにさらされたとき、試薬ｐＨを下げるのに十分な陽子を放出しなければならない。この現象に貢献する、尿中に通常存在する他のカチオンは、カルシウム、マグネシウムおよびアンモニウムである。クエン酸は、これらのカチオン濃度においてｐＨを有意に下げるのに十分な陽子放出能力を有していない。最高の尿緩衝能力は３５ｍｅｑ／ｐＨ単位である。タンパク質誤差指示薬試験は、このレベルの緩衝能力に抵抗性があるべきである。高いｐＨ（８〜９）および高い緩衝能力をもつ尿は、クエン酸塩で緩衝された試薬のｐＨを最大で０．５単位も移すことができる。ＮａとＫとを合わせたカチオン感受能力は０．５単位よりも大きいはずである。高ＳＧ尿の緩衝能力による試薬ｐＨの０．５の増大は、緩衝剤のカチオン感受能力による試薬ｐＨの０．５の減少によって相殺される。正味の結果、高ＳＧ尿による試薬ｐＨの増大はほとんどないかまったくない。ＮａカチオンとＫカチオンとを合わせた感受性は、酒石酸の場合で０．７１であり、クエン酸塩の場合ではわずか０．２５であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、尿中タンパク質を検出するための試験片に対する改善であって、試験片が、緩衝剤と、タンパク質の存在下で変色するタンパク質誤差指示薬との試薬系で含浸された吸収性担体を含む。改善は緩衝剤系の使用を含み、この緩衝剤系は、通常の緩衝剤と、尿中に存在する緩衝物質の存在下で、尿中に有意量のタンパク質が存在しなくてもタンパク質誤差指示薬が変色してしまうレベルにまで試薬のｐＨが高まることを防ぐのに十分な陽子を放出することができるようにする量のカチオン感受性緩衝剤としての酒石酸とを組み合わせたものを含む。
【０００７】
本発明によると、酒石酸を含有する分析試験片を調製することにより、尿中タンパク質を測定するための、高ＳＧ尿中に通常見いだされる緩衝物質に対して有意に増大した抵抗を有する試験片を得ることができることが見いだされた。より具体的には、本発明は、高ＳＧ尿中タンパク質を検出するための信頼しうる簡便で正確な方法を臨床医に提供する。
【０００８】
本発明の一つの態様は、尿中タンパク質を検出するための分析試験片であって、好適なタンパク質誤差指示薬と、酒石酸を含む緩衝剤系とで含浸された吸収性担体を含む試験片に関する。好適なタンパク質誤差指示薬には、前記したものならびに引用例として本明細書に含める米国特許第５，２７９，７９０号明細書に開示されたメロシアニンおよびニトロもしくはニトロソ置換された多ハロゲン化フェノールスルホンフタレインがある。他の好適なタンパク質誤差指示薬には、クマシーブリリアントブルー、ファストグリーンＦＣＦ、ライトグリーンＳＦ、ピロガロールレッドおよびピロカテコールバイオレットがある。試験片の吸収性担体は、ろ紙であることが好ましい。吸収性担体として有用である他の材料には、フェルト、多孔質セラミック片および紡織もしくは艶消しのガラス繊維、例えば米国特許第３，８４６，２４７号明細書に記載されたものがある。同様に適したものは、木、布、スポンジ材料および粘土質、例えば米国特許第３，５５２，９２８号明細書に記載されたものがある。あるいはまた、吸収性担体は、非孔質物質、例えばポリマー膜またはガラスであってもよい。試験片を調製する際、試験片を、タンパク質誤差指示薬と、緩衝剤としての酒石酸との溶液で含浸する。タンパク質の存在下で検出可能な変色を示すのに十分な誤差指示薬を含有する試験片が得られる限り、誤差指示薬の濃度は決定的ではない。酒石酸の濃度は、尿と接触すると、尿中に通常存在する緩衝物質の存在下で、尿中に有意量のタンパク質が存在しなくてもタンパク質誤差指示薬が変色してしまうレベルにまで系のｐＨが高まることを防ぐのに十分な陽子を放出するよう、十分に高いものであるべきである。通常、浸漬溶液中５０〜７５０ｍＭ（好ましくは５００〜６００ｍＭ）の酒石酸濃度が、吸収性材料の浸漬および乾燥の後で必要濃度を含有する試験片を提供する。酒石酸のカチオン感受能力が、それを通常の緩衝剤よりも効果的にする。通常の緩衝剤は、溶液のｐＨが緩衝剤のｐＫａ  に近いとき、陽子の放出によってその緩衝能力を示し、緩衝剤の塩基性形態と酸性形態との平衡が式（１）のように起こる。
【０００９】
（１）  ＨＡ＝Ｈ＋  ＋Ａ−
【００１０】
他方、酒石酸は、カチオンを感受することによりその緩衝活性を発揮する。すなわち、溶液中のカチオンの存在において陽子が放出されたとき、緩衝剤の酸性形態とカチオンとの平衡が式（２）のように起こる。
【００１１】
（２）  ＨＡ＋Ｍ＋  ＝Ｈ＋  ＋ＡＭ
【００１２】
これは、酒石酸を一つ以上の典型的な緩衝剤と組み合わせて使用すると、酒石酸が存在しない場合に使用するであろうよりも少ない緩衝剤を使用するだけで必要な緩衝能力が達成されるような、より強力な緩衝作用を提供する。同様に、溶液中のタンパク質誤差指示薬の濃度は通常、０．１〜５．０ｍＭの範囲である。
【００１３】
試験片はまた、通常は、変色速度およびタンパク質誤差指示薬の用量応答の両方を増大させる、約４００〜２５，０００の分子量を有するポリマーである色増強性ポリマーで含浸することもできる。好ましい色増強性ポリマーには、ポリプロピレングリコール類、ポリカーボネート類、ポリビニルエーテル類およびポリエチレンオキシド類がある。
【００１４】
タンパク質誤差指示薬／酒石酸は、吸収性担体に適用し、試験片形態で使用することが好ましいが、尿を溶液と直接接触させる湿式系を使用してもよい。このような湿式系は通常、タンパク質誤差指示薬を０．１〜５．０ｍＭ（好ましくは０．６〜１．０ｍＭ）の濃度で含有し、酒石酸を５０〜７５０ｍＭ（好ましくは５００〜６００ｍＭ）の濃度で含有する。
【００１５】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【００１６】
実施例Ｉ（緩衝剤ｐＫａ  と陽子放出との関係）
カチオンを加えた際の陽子の放出をシュウ酸によって実証した。この実験では、カチオンはテトラメチルグアニジンであった。このカチオンは、尿中で通常に見られるものではないが、シュウ酸塩（シュウ酸イオン）の応答を高め、ひいては、陽子の放出とカチオン濃度との関係をより容易に示すことができるため、これを選択した。データを表１に示す。
【００１７】
【表１】
0003621209.tif 000002
【００１８】
シュウ酸塩（シュウ酸イオン）のｐＫａ  は、第一のカルボキシル基については１．２７であり、第二のカルボキシル基については４．２９である。各カルボキシル基について等しい数のカチオンが存在するならば、陽子の放出は止まる。アルカリおよびアルカリ土類金属ならびに第四級アンモニウム塩もまた、各カルボキシル基について等しい数のカチオンが存在するまで、陽子の放出をもたらした。
【００１９】
実施例ＩＩ（緩衝剤とタンパク質指示薬染料との関係）
タンパク質試薬紙は、タンパク質の存在におけるｐＨ指示薬の誤差を利用することによるタンパク質の検出に依存する。この検定の原理は、タンパク質の存在においては、指示薬染料が変色するｐＨがより低くなり、一定のｐＨで色を出現させるということにある。染料は、タンパク質が存在しないときの発色を防ぐのに十分に低く、かつ、タンパク質の存在下で変色するのに十分に高い一定のｐＨに緩衝される。例えば、ＴＢＰＢ染料に基づくタンパク質試験ではｐＨ３．７に緩衝され、ＤＩＤＮＴＢ染料に基づく試験ではｐＨ２．１に緩衝される。
【００２０】
通常の緩衝剤がタンパク質検出方法に利益を与えるためには、緩衝剤は、タンパク質試験のｐＨの範囲にｐＫａ  を有しなければならない。ＤＩＤＮＴＢ染料に基づくタンパク質試薬を用いて、１．８０〜３．０の範囲のｐＫａ  をもつ一連の緩衝剤を試験した（表３を参照）。高ＳＧ尿に浸漬されたのち、すべての緩衝剤は緩衝能力を示し、試薬を０．７ｐＨ単位内に維持した。緩衝能力は個々の緩衝剤に依存し、酒石酸を用いた場合に最高の緩衝能力が実証され、マレイン酸を用いた場合に最低の緩衝能力が見られた。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
酒石酸は最小のｐＨ変化しか示さないため、酒石酸が本実施例に選択した緩衝剤である。この変化は、タンパク質が存在しないときの変色を防ぐのに十分に低いため、重要である。カチオンを加えた際の陽子の放出は、初期ｐＨ値が緩衝剤のｐＫａ  よりも低いかその付近にある溶液においてしか見られなかった。カチオン応答を得るためには、緩衝剤が部分的または完全にプロトン化されていなければならない。必要な酒石酸塩（酒石酸イオン）の濃度は、当然、そのプロトン化の程度に依存する。完全に脱プロトン化された緩衝剤は応答を示さないであろう。したがって、試験ｐＨと緩衝剤ｐＫａ  との関係は、緩衝剤が、試薬のｐＨに近いかそれよりも高いｐＫａ  を有することを必要とする。表３の緩衝剤はすべては適切な条件にある。すなわち、ｐＫａ  値が、カチオン感受のための試薬のｐＨよりも高いかそれに近い１．８〜３．０であり、ＤＩＤＮＴＢ染料を使用するタンパク質試験の場合にはｐＨが２．１である。
【００２３】
緩衝剤は通常、それらのｐＫａ  が、緩衝されるｐＨの近くにあるとき、すなわち、緩衝能力が最大である場合に最高に作用する。しかし、表３から判断することができるように、試験ｐＨの１ｐＨ単位内の同様なｐＫａ  を有する緩衝剤の群は、大幅に異なる有効性を有している。「有効性」とは、配合物を、タンパク質を含まない高ＳＧ尿と接触させたのちの最小のｐＨ変化と定義する。酒石酸塩（酒石酸イオン）によるｐＨ変化はわずか０．１４であったが、他の緩衝剤は、０．２２〜０．６１のｐＨ変化を示した。使用した緩衝剤はすべて、緩衝能力にとって許容可能なｐＫａ  値を有するため、この差は、緩衝剤のカチオン感受能力を調べることによって説明することができる。試薬ｐＨにおける変化は、緩衝能力とカチオン感受作用とを合わせた効果を表す。
【００２４】
酒石酸を含有するタンパク質試薬の改善された緩衝能力は、ＫＣｌの溶液がタンパク質試薬のｐＨを下げたという発見によって説明することができる（表３を参照）。ベタイン緩衝剤を含有するタンパク質試薬は応答せず、クエン酸塩緩衝剤はわずかな反応性を示した。したがって、ベタインおよびクエン酸塩（クエン酸イオン）はカチオン感受性ではないということがわかる。酒石酸塩（酒石酸イオン）にさらした場合、０．６３単位のｐＨ低下があったが、ベタインおよびクエン酸塩（クエン酸イオン）は、カチオン感受性緩衝剤として作用することができないことから、実質的にｐＨ低下を示さなかった。表２に示すように、カチオン感受能力の違いが、同様な挙動を示すものと予想される緩衝剤どうしの緩衝能力における差を説明づける。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
大部分のアニオン性の緩衝剤は、カチオンに対して陽子をいくらか放出する。しかし、カチオン感受性緩衝剤が尿タンパク質検出方法に利益を与えるためには、緩衝剤が、正常な生理範囲においてカチオンにさらされたとき、試薬ｐＨを下げるのに十分な陽子を放出しなければならない。酒石酸は、高ＳＧ尿に典型的な濃度のＫＣｌ（１４０ｍＭ）にさらされたとき、０．６ｐＨ単位の低下を示した。１４０ｍＭカリウムを含有する高ＳＧ臨床尿に浸漬したのちの１．８０の試薬ｐＨの低下および４１ｍＭカリウムを含有する臨床尿に浸漬したのちの２．２８の試薬ｐＨにより、酒石酸緩衝剤のカチオン感受能力がさらに実証された。
【００２７】
本発明に有用であるカチオン感受性剤は、試薬ｐＨに近いかそれを超えるｐＫａ  をもち、正常な生理範囲で尿中のカチオンに応答し、尿の緩衝能力を相殺することができるｐＨの低下をもたらすものに限定される。酒石酸だけがこれらの性質を示すことがわかった。
【００２８】
実施例ＩＩＩ
酒石酸（カチオン感受性剤として）および典型的な緩衝剤（クエン酸）を別々および組み合わせて試験する実験を実施した。試験は、実施例１に記載したタンパク質試薬を使用して実施し、その際、試薬試験片を水および高ＳＧ尿に浸漬したのちの試薬ｐＨを面ＰＭ電極およびｐＨ計を使用して測定した。水と高ＳＧ尿とのｐＨの差を試薬ｐＨの変化として以下に示す。
【００２９】
この実験の結果を表４にまとめる。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
表４から、カチオン感受性剤としての１５０ｍＭ酒石酸を、非カチオン感受性緩衝剤、例えば４７５ｍＭクエン酸と組み合わせたものが、それらいずれかの単独よりも有効であると判断することができる。１５０ｍＭ酒石酸の４７５ｍＭクエン酸への添加が、６２５ｍＭクエン酸よりも優れたＳＧ抵抗をもたらすということは予想外である。１５０ｍＭの酒石酸濃度は、この実験に使用したもののような高ＳＧ尿に対して効果的に緩衝するには低過ぎる。したがって、ｐＨを制御するにあたり、酒石酸の緩衝能力に依存するのではなく、カチオン感受活性が、典型的な緩衝剤と合わされたときの酒石酸のｐＨ制御における優れた性能への要点であると理解することができる。
【００３２】
より高濃度の緩衝剤はタンパク質応答を減らす可能性があるため、酒石酸と典型的な非カチオン感受性緩衝剤とを、いずれかを単独で使用する場合よりも少なめの量で組み合わせた場合の能力は重要である。タンパク質応答の減少は、病的なタンパク質レベルが検出されないことを意味する。この改善は、非カチオン感受性緩衝剤をクエン酸に限定しない。理由は、他の緩衝剤、例えばベタイン、リン酸、マレイン酸、ジグリコール酸およびシトラコン酸が同様な結果を提供すると予想されるからである。
【００３３】
酒石酸を非カチオン感受性緩衝剤と組み合わせて使用するとき、酒石酸と緩衝剤とのモル比は、典型的には２５ｍＭ：７００ｍＭ〜２００ｍＭ：１００ｍＭであり、好ましくは約１５０ｍＭ：４７５ｍＭである。酒石酸のカチオン感受活性は、非カチオン感受性緩衝剤が存在しなくとも働くが、典型的な緩衝剤は、溶液中に存在するカチオンから独立して陽子を放出するため、このような緩衝剤を酒石酸と組み合わせて使用することが好ましい。これが、塩含量の低い尿における緩衝を可能にし、試薬のｐＨを、カチオン感受性酒石酸が効果を発しうる範囲に近づける。
【００３４】
実施例ＩＶ（タンパク質試薬例の調製手順）
本発明の改良されたタンパク質試薬は、ろ紙を連続２回飽和させるによって調製することができる。第一の飽和は、酒石酸および緩衝剤、例えばクエン酸ならびにバックグラウンド染料、例えばキナルジンレッドを含有する混合物の水溶液を用いて行う。水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を用いてこの液をｐＨ２．１に調節する。第二の飽和は、タンパク質指示薬染料、例えばＤＩＤＮＴＢおよびポリ（ビニルメチルエーテル）であるＬｕｔａｎｏｌ  Ｍ４０  のようなポリマーを含有する混合物のトルエン溶液を用いて行う。機能、好適濃度および使用可能な濃度の範囲を表５にまとめる。混合溶液を使用して、試験片材料、例えばろ紙、例えばＡｈｌｓｔｒｏｍ  ２０４または２３７  を飽和させ、そこで、ろ紙を、第一の飽和ののち９５℃で５分間乾燥させ、第二の飽和ののち８５℃で５分間乾燥させる。得られた乾燥試薬を試薬試験片に加工し、それらを目視的に試験した。
【００３５】
【表５】
0003621209.tif 000006
【００３６】
実施例Ｖ（緩衝剤とバックグラウンド染料との関係）
試薬配合物は、しばしば、バックグラウンド染料を使用して、試験レベル間のより明確な目視的区別を達成する。例えば、淡い青は赤のバックグラウンドのもとでは白に対して容易に検出されないため、無色から青に遷移する染料指示薬としてのＤＩＤＮＴＢに基づくタンパク質試験は、正常なレベルのタンパク質の検出を覆い隠して試験の感度を下げるために、色の遷移をピンクから青に変えるための赤のバックグラウンド染料を必要とする。バックグラウンド染料は、尿成分に対して不活性であるべきであり、一定の応答を提供すべきである。不活性染料とバックグラウンド染料との違いは、表６に示すように、不活性のメチルレッドを反応性のキナルジンレッドに比較することによって実証することができる。
【００３７】
キナルジンレッドはｐＨおよび光に対して感受性である。その色の遷移は、ｐＨ１．４での無色から、ｐＨが３．４に増大するにつれ、異なる赤の色相を形成し、ｐＨ３．４で吸光度が最大になる。２．１のキナルジンレッドｐＫａ  は、ＤＩＤＮＴＢ染料に基づくタンパク質試験のｐＨである。
【００３８】
【表６】
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【００３９】
メチルレッドはｐＨまたは光のいずれに対しても感受性ではない。キナルジンレッド染料に影響する照明条件にさらしたのちでも、反応性における変化は見られなかった。メチルレッドの色の遷移は、ｐＨ４．２での赤からｐＨ６．４での黄色である。メチルレッド（ｐＫａ  ５．２）が、ｐＨによるバックグラウンド色の変化を防いだため、これが好ましい染料である。他の不活性染料、例えばＦＤ＆Ｃレッド＃３およびアシッドレッド＃４０を使用することもできる。
【００４０】
実施例ＶＩ
表２に掲載した緩衝剤のカチオン感受能力を測定し、以下の表７にまとめる。
【００４１】
【表７】
0003621209.tif 000008
【００４２】
この実験は、１４１ｍＭ  ＫＣｌまたは２５０ｍＭ  ＮａＣｌを加えたのちの５００ｍＭ緩衝溶液のｐＨの変化を測定した。これらの濃度を、最高の尿値、すなわち、ヒトの尿に予想される最高の生理的濃度とみなした。表７のデータは、酒石酸が、試験した緩衝剤のカチオンに対してもっとも応答性であることを実証する。表３のデータは、製造した乾燥試薬を使用し、同様に試験することによって作成した。試験した他の緩衝剤は、カチオンの感受には有用でなかった。シュウ酸塩はカチオン応答を示す（表１）が、この応答は、本発明に使用するには不十分である。