(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）を抗原として使用して、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるヒトＴＰＯタンパク質と免疫反応性を有する抗体を製造する方法：
（ａ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち、１位〜２３１位、１位〜２１１位、１位〜１９１位、１位〜１７１位、１位〜１６３位、１位〜１５７位、１位〜１５６位、１位〜１５５位、１位〜１５４位、１位〜１５１位及び７位〜１６３位のアミノ酸配列から選ばれるタンパク質
（ｃ）上記（ａ）〜（ｂ）のタンパク質の−２位にメチオニン残基、かつ−１位にリジン残基を付加した誘導体、−１位にメチオニン残基を付加した誘導体、又は−１位にグリシン残基を付加した誘導体
（ｄ）以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかのペプチド
（ｉ）ＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱ；
（ｉｉ）ＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤ；
（ｉｉｉ）ＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡ；
（ｉｖ）ＮＥＬＰＮＲＴＳＧＬＬＥＴＮＦＴＡＳＡ；
（ｖ）ＳＬＰＰＮＬＱＰＧＹＳＰＳＰＴＨＰＰＴＧＱＹＴ；
（ｖｉ）ＰＳＡＰＴＰＴＰＴＳＰＬＬＮＴＳＹＴＨＳＱＮＬＳＱＥＧ。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
本発明は巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、又は生体内で特異的に血小板の産生を剌激、または増強する活性を有する新規タンパク質、及びそのようなタンパク質の用途に関する。
【従来の技術】
巨核球は主に骨髄中で観察される、多核で細胞質が豊富な大型の細胞であり、血小板を産生する。巨核球の源は骨髄中の多能性幹細胞である。多能性幹細胞がある程度分化して、巨核球系だけに方向付けられた巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）となり、さらに増殖・分化して巨核球となる。巨核球はさらに核の倍数性の増加（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、細胞質の成熟（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を遂げて、最終的に無核の細胞質断片である血小板を血液循環へ放出する。１個の成熟した巨核球から平均して２０００〜４０００個の血小板が生成される。血小板の産生機序については不明な点が多いが、巨核球は骨髄の静脈洞の内皮下に局在しており、その細胞質が、内皮を貫通して、静脈洞内壁にひも状の突起を出し、血小板を放出すると考えられている。
このような巨核球造血、および血小板産生に関して、特異的な産生調節機構の存在が示唆されてきた。健常人や正常な動物では、有効な血小板数が維持されているが、例えば、正常な動物へ抗血小板抗体を投与すると、短時間で急激に血小板だけが減少し、その後増加し始め、さらに一過性に正常値を越えるが、最終的には再び正常値に戻ることが知られている。また、臨床においても、赤血球数や白血球数が正常であるにもかかわらず、血小板数の低下（血小板減少症）や血小板増加症に陥ることが分かっている。しかしながら、現在までのところ、そのような産生機構を担う特異的な調節因子（例えば、赤血球産生におけるエリスロポイエチンのような存在）の単離、同定は成功していない。
血小板の最も重要な機能は、止血機構における止血栓の形成である。血小板減少により、止血機構が正常に作働しなくなると、出血傾向を示す。癌の放射線療法や化学療法では、骨髄抑制による血小板減少症は致命的な合併症であり、そのような癌患者には出血傾向を防ぐための血小板輸血が施される。また、血小板輸血は骨髄移植を受けた患者や再生不良性貧血の患者にも施される。
そのような血小板輸血のための血小板は、健常な血液提供者の血液から血小板フェレーシスによって調製されるが、輸血用血小板は貯蔵寿命が短く、細菌感染による汚染の可能性がある。また患者をヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）または各種の肝炎ウィルスの様な危険なウィルスにさらしたり、患者に輸血血小板表面の組織適合性抗原（ＨＬＡ）に対する抗体を誘導したり、あるいは輸血用血小板に混入するリンパ球により移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こしたりする危険性がある。
従って、血小板減少症患者で、内在性の血小板産生を刺激し、同時に血小板輸血依存を減らすことができれば、極めて有益である。また、癌の放射線療法や化学療法を受けている患者で、血小板減少を是正または防止することができれば、それらの治療を一層安全にし、治療の集中度を高めることが可能となり、さらに一層の制癌効果が期待できるであろう。
そのような理由から、巨核球および血小板の産生調節に関与する特異的な調節因子の分離、同定のための数多くの研究が熱心に行なわれてきた。試験管内の研究によれば、巨核球系細胞の増殖・分化の過程に関与する調節因子は次の二つに大別されると考えられている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１０巻、１０１−１０４頁、（１９８２）を参照）。巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）はＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進する調節因子であり、実験上、半固形の培養液中で巨核球からなる集塊（コロニー）の形成を誘導する活性を有する。もう一つの調節因子は、巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−Ｐｏｔ）、巨核球刺激因子、血小板生成刺激因子などと呼ばれ、主にＣＦＵ−ＭＫ以降の分化段階の巨核球に働き、分化・成熟を促進させる。実験上では、しばしばＭｅｇ−ＣＳＦ  活性を増幅する活性として検出される。また、実験的に血小板減少症にした動物の血小板減少期の血清や血漿を別の正常動物に注入すると、血小板が増加することから、生体内で血小板増加作用を有する体液性因子の存在が考えられており、スロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）と呼ばれる。
近年遺伝子がクローニングされたサイトカインのいくつかについて、試験管内での巨核球系細胞への作用および血小板増加作用が調べられている。ヒトＩＬ−３はヒト巨核球コロニーの形成を刺激し（Ｂｒｕｎｏら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、３７１−３７７頁、（１９８８））、少なくともサルでは血小板数の増加をもたらす（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１８２０−頁、（１９８８））。しかし、ＩＬ−３はすべての造血細胞の増殖、分化に影響を及ぼす因子であり、巨核球造血、および血小板産生の特異的調節因子とは区別することができる。ヒトＩＬ−６はＭｅｇ−ＣＳＦ活性は示さないが、未熟な巨核球に作用して成熟巨核球への分化を促進する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１８巻、６９−頁、（１９９０））。マウスやサルにおいて、血小板増加作用を示し、骨髄巨核球の大きさ、および核の倍数性を増加させるが、体重の減少や急性期蛋白質の誘導などの副作用も認められている（Ａｓａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻、１６０２−１６０５頁、（１９９０）；Ｓｔａｈｌら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、１４６７−１４７５頁、（１９９１））。ヒトＩＬ−１１もＭｅｇ−ＣＳＦ活性は示さず、Ｍｅｇ−Ｐｏｔ活性を発揮し、マウスを用いて血小板増加作用が報告されている（Ｎｅｂｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、９０１−９０８頁、（１９９３））。また、ヒトＬＩＦはサルにおいて、有意に血小板数を増加させるが（Ｍａｙｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、８１巻、３２２６−３２３３頁、（１９９３））、試験管内での巨核球への作用は微弱である（Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５３巻、３０５−３１２頁、（１９９２））。
これらのサイトカインには血小板増加因子としての臨床応用の可能性が期待されているが、巨核球系だけに特異的に作用するものではなく、また、副作用も認められる。従って、臨床においては、より副作用が少ない、巨核球−血小板系に特異的な血小板増加因子が待望されている。
古くから血小板減少症のヒトや動物の血清、血漿、尿あるいはある種のヒト培養細胞株の上清中に、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−Ｐｏｔ、あるいはＴＰＯ活性の存在が報告されているが、このような因子が単独で、あるいは複数存在して活性が発揮されるのか、また既知因子との異同など、ほとんど未解明のままである。ヒト生体由来の因子について、Ｈｏｆｆｍａｎらは血小板の減少に加え、骨髄巨核球の減少した再生不良性貧血や、無巨核球性血小板減少性紫斑病の患者の血清の中に、健常人のそれに比べて、有意に高いＭｅｇ−ＣＳＦ活性を見いだし（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３０５巻、５３３−５３８頁、（１９８１））、Ｍａｚｕｒらはさらに、再生不良性貧血患者の血清中のこのＭｅｇ−ＣＳＦ活性はＩＬ−３あるいはＧＭ−ＣＳＦとは異なることを示した（Ｍａｚｕｒら、Ｂｌｏｏｄ）７６巻、２９０−２９７頁、（１９９０））。類似のＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、集中的に化学療法を施した癌患者や骨髄移植を施した患者の血清中にも検出されている（Ｍａｚｕｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１２巻、６２４−６２８頁、（１９８４）；ｄｅ  ＡｌａｒｃｏｎとＳｃｈｍｉｅｄｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓ．、２１５巻、３３５−３４０頁、（１９８６））。Ｈｏｆｆｍａｎらは、骨髄巨核球低形成の血小板減少症患者の血漿から、見かけの分子量４６０００を有するＭｅｇ−ＣＳＦを精製したと報告したが（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７５巻、１１７４−１１８２頁、（１９８５））、その後の研究で精製標品の純度がアミノ酸配列を決定するには不十分であることが判明している（Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ）７４巻、１１９６−１２１２頁、（１９８９））。類似の血小板減少症患者由来の血漿、あるいは特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者の尿から、マウスでの７５ｓｅ−セレノメチオニン（７５Ｓｅ−ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）の新生血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性が部分精製され、血漿由来の活性については見かけの分子量４００００を有することが示されている（Ｇｒｏｓｓｉら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ）７２巻、２９１−２９５頁、（１９８７）  ：Ｖａｎｎｕｃｃｈｉら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ）２巻、２３６−２４０頁、（１９８８））。
再生不良性貧血や重症のＩＴＰ患者の尿中にも、Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性やＴＰＯ様活性が検出されている（Ｋａｗａｋｉｔａら、Ｂｒ．  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、４８巻、６０９−６１５頁、（１９８１）；Ｋａｗａｋｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ）６１巻、５５６−５６０頁、（１９８３））。さらに、Ｋａｗａｋｉｔａらは、再生不良性貧血患者の尿抽出物に含まれるＭｅｇ−ＣＳＦ活性は、解離条件下のゲル濾過で見かけの分子量４５０００を有することを報告している（Ｋａｗａｋｉｔａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、６２巻、７１５−７２２頁、（１９８６））。Ｅｒｉｋｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒらも、同様の試料からのＭｅｇ−ＣＳＦの精製を報告しているが、その構造は明らかにされていない（Ｅｒｉｋｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒら、  “Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ；ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ″ｅｄ．  ｂｙ  Ｍｕｒｐｈｙ、ＡｌｐｈａＭｅｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄａｙｔｏｎ、Ｏｈｉｏ）２０４−２２０頁、（１９９２））。Ｔｕｒｎｅｒらは、骨髄移植を施行された患者の尿からＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有する巨核球刺激因子（ＭＳＦ）を精製し、その遺伝子をクローニングした（Ｔｕｒｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、７８巻、１１０６頁２７９ａ、  （１９９１）  （ａｂｓｔｒ．、ｓｕｐｐｌ．  １））。このＭＳＦは、分子量２８０００から３５０００を有するタンパク質の二量体である。この因子が、これまで血小板減少症患者の血清や血漿中に検出されてきたＭｅｇ−ＣＳＦと同じ因子か否か、また生体内において血小板増加作用を有するか否かは不明である。また、ヒト胎児腎臓由来細胞株（ＨＥＫ細胞）の培養上清から分子量３２０００のＴＰＯ様活性が精製され、様々な性状が調べられているが、いまだにその構造は明らかにされていない（ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１０６巻、１６２−１７４頁、（１９８５）；ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、７巻、１３９−１５５頁、（１９８９））。
一方で、別の研究者により、このＨＥＫ細胞のならし培養液中に存在する、試験管内での巨核球の成熟を促進する主要な活性は、この細胞が産生する既知サイトカイン、即ち、ＩＬ−６とＥＰＯに依るという報告もある（Ｗｉｔｈｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５巻、３３６２−３７２頁、（１９９２））。
動物由来の因子について、Ｅｖａｔｔらは、抗血小板抗体を注入したウサギの血小板減少期の血漿中にウサギおよびマウスにおいて７５ｓｅ−セレノメチオニンの新生血小板への取り込みを促進させるＴＰＯ様活性を報告している（Ｅｖａｔｔら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８３巻、３６４−３７１頁、（１９７４））。その他にも１９６０年代から１９７０年代にかけて類似の報告がいくつも見られる（例えば、Ｏｄｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１０８巻、４２８−４３１頁、（１９６１）  ；ＥｖａｔｔとＬｅｖｉｎ．．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４８巻、１６１５−１６２６頁、（１９６９）；Ｈａｒｋｅｒ、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２１８巻、１３７６−１３８０頁、（１９７０）  ；ＳｈｒｅｉｎｅｒとＬｅｖｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４９巻、１７０９−１７１３頁、（１９７０）；Ｐｅｎｉｎｇｔｏｎ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．、１巻、６０６−６０８頁、（１９７０））。Ｅｖａｔｔら、およびＨｉｌｌとＬｅｖｉｎは、抗血小板抗体投与により誘導した血小板減少期のウサギの血漿から、ＴＰＯ様活性を部分精製し（Ｅｖａｔｔら、Ｂｌｏｏｄ、５４巻、３７７−３８８頁、（１９７９）；ＨｉｌｌとＬｅｖｉｎ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１４巻、７５２−７５９頁、（１９８６））、その後さらに、試験管内において巨核球の分化、成熟を促進させる活性、即ちＭｅｇ−Ｐｏｔ活性を指標にしてこの因子の精製を進め、ゲル濾過上で見かけの分子量４００００〜４６０００を有することを明らかにしたが、完全精製には至っていない（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、２６２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻、３５４−３６０頁、（１９９２））。抗血小板抗体投与で誘導した重症の急性血小板減少症のウサギの血漿中にはＩＬ−６活性が検出されないことから、このＴＰＯ様活性はＩＬ−６とは異なる分子によって担われていることが示されている（Ｈｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、８０巻、３４６−３５１頁、（１９９２））。
ＴａｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇも、同様のウサギの血漿、あるいはＨＥＫ細胞の培養上清から、巨核球系のラット培養細胞株において血小板第４因子の産生を刺激する見かけの分子量１５０００を有する因子を精製したが、その構造は明らかにされていない（ＴａｙｒｉｅｎとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻、３２６２−３２６８頁、（１９８７））。
また、Ｎａｋｅｆｆは、抗血小板抗体投与により血小板減少にしたマウスの血清中にＭｅｇ−ＣＳＦ活性を見いだしている（Ｎａｋｅｆｆ、“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ”ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｌｅｄｎｅｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１１１−１２３頁、（１９７７））。
一方、同様の処置で血小板減少にしたウサギの血漿中には、試験管内において、巨核球の成熟を促進したり（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、２６２−２６７頁、（１９８８）；Ｈｉｌｌら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻、９０３−９０７頁、（１９８９））、巨核球の血小板への形態変化（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４６−１０５２頁、（１９８７））を刺激する活性は検出されているが、Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性は認められていない。このような違いが何に起因するのか、理由は不明である。
Ｍｉｕｒａらは、亜致死線量の放射線を全身照射したラットの血小板減少期の血漿中にＭｅｇ−ＣＳＦ活性を検出し（Ｍｉｕｒａら、Ｂｌｏｏｄ、６３巻、１０６０−１０６６頁、（１９８４））、この活性が血小板輸血によって減少しないことから、生体内でのＭｅｇ−ＣＳＦ活性の誘導には、血小板の減少ではなく、巨核球の減少が必要であるとしている（Ｍｉｕｒａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１６巻、１３９−１４４頁、（１９８８））。ＭａｚｕｒとＳｏｕｔｈは、放射線照射により再生不良性貧血にしたイヌの血清中にＭｅｇ−ＣＳＦ活性を検出し、ゲル濾過上で見かけの分子量１７５０００を有することを報告している（ＭａｚｕｒとＳｏｕｔｈ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１３巻、１１６４−１１７２頁、（１９８５））。その他に、血清、血漿、あるいは尿に由来する因子が、Ｓｔｒａｎｅｖａら（Ｓｔｒａｎｅｖａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５巻、６５７−６６３頁、（１９８７））などによっても報告されている。
このように、血小板減少症のヒトや動物の生体試料の中に、巨核球造血、および血小板生成を促進する因子の存在が確認されているにもかかわらず、現在までにそのような因子の単離、生化学的ならびに生物学的な同定、および特性決定は、天然の供給源、例えば血液や尿の中にそのような因子が極端に微量でしか存在しないために成功していない。
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、および／又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、または増強する活性（ＴＰＯ活性）を有するタンパク質（ＴＰＯ）を天然の供給源から単離・同定し、更にはそのようなタンパク質をコードする遺伝子を単離することによって組換えＤＮＡ技術を用いて、該タンパク質を均質に大量生産する手段を提供することにある。それが可能となれば、現在採用されている血小板輸血にとって代わるか、頻度を減らすことができ、あるいは血小板障害の治療および診断にも使うことができる。
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする新規ＤＮＡ  （以下、「本発明のＤＮＡ」と言う）が提供される。本発明のＤＮＡとしては、配列番号１６に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡがある。本発明のＤＮＡには、配列番号１６に示されたアミノ酸配列および、ＴＰＯ活性を保持する限りにおいてそのアミノ酸配列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されているもの、即ち、ＴＰＯ誘導体をコードするＤＮＡが含まれる。
別の言い方をすれば、本発明のＤＮＡとしては、アミノ酸配列が実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。ここで言う、「実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列」とは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列」に加えて、「ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番号１６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入および／または付加などがあるアミノ酸配列」を含むものである。
なお、ここで言う「アミノ酸配列をコードするＤＮＡ」とは縮重関係にあるすベての塩基配列を有するＤＮＡを意味している。
更に、本発明のＤＮＡは、ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡであって、以下（ａ）〜（ｃ）から選ばれるＤＮＡを包含する。
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号６に示されたＤＮＡまたはそれらの相補鎖
（ｂ）  （ａ）のＤＮＡまたはその断片と（厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）、（ｂ）のＤＮＡとハイブリッド形成しうるＤＮＡ。
また、別の言い方をすれば、本発明のＤＮＡは以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかに示されたＤＮＡも包含する。
（ａ）大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５６５）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、または大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴ１−２３１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５６４）に組込まれているＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）ＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、（ａ）のＤＮＡまたはその断片と（厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ。
ここで“厳格な”ハイブリダイゼーション条件という表現は、縮重配列の、および／または単一配列のオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）を用いることにより行う、本発明においてＤＮＡのＰＣＲ増幅をとりあげた一連の実施例において使用されるものである。
例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，    １９８９）の第１１章および第１４章、あるいは、Ａｕｓｕｂｅｌら編  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３）のユニット２．１０を参照のこと。
本発明のＤＮＡとしては配列番号１６に示されたアミノ酸配列のうち、１位から１６３位のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、かつＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
このようなＤＮＡは、制限酵素による切断部位の供与、および／または、発現を容易にするような発現ベクター構築のための開始部、終止部または中間部へのＤＮＡの付加的供与を含むことができる。また、非哺乳類宿主を選択する場合には、それにおける発現に好ましいコドン（優先コドン）を組み込んでも良い。
本発明のＤＮＡとしては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞などからｍＲＮＡを調製した後、既知の方法で作製されたｃＤＮＡライブラリーから、既知の方法によってスクリーニングすることによって得られたｃＤＮＡがある。この場合のｍＲＮＡの供給源としては、ラット肝臓細胞由来の細胞株ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、ラット肝臓、腎臓、脳、小腸、ヒト肝臓等が挙げられる。
また、本発明のＤＮＡとしては、ヒトをはじめとする哺乳動物細胞から既知の方法で作製されたゲノムライブラリーから既知の方法でスクリーニングされたゲノムＤＮＡであってもよい。この場合のゲノムＤＮＡの供給源としては、ヒト、ラット、マウス等の染色体ＤＮＡが挙げられる。
また、このようにして得られた、ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを周知の部位特異的突然変異法を用いて修飾することによって、一部のアミノ酸配列が改変されたもの、即ちＴＰＯ誘導体をコードするＤＮＡを得ることができる。
また、本明細書中で開示されたＴＰＯ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列／塩基配列に基づいて、その一部のアミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡは、その一部または全部を化学合成することによっても当業者が容易に得ることができる。
本発明のＤＮＡは、種々の遺伝子組換え技術によってＴＰＯ活性を有するタンパク質を大量生産するために有用な物質である。
更に、本発明のＤＮΛは、ＴＰＯの関連タンパク質をコードする遺伝子、並びに他の哺乳動物のＴＰＯのｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを単離する場合に標識化プローブとして用いるのに適した物質である。また、ヒトおよび他の哺乳類種における遺伝子療法において有用である。本発明のＤＮＡは、大量のＴＰＯおよびＴＰＯ生産のための真核宿主として用いることができるトランスジェニック哺乳類種の開発に有用である（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２２２、８０９−８１４、（１９８３））。
また、本発明によれば、上記ＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し、産生されたＴＰＯ活性を有するタンパク質を分離・精製することを特徴とするＴＰＯ活性を有するタンパク質の製造方法が提供される。
この場合の宿主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｘ６３．６．５．３．細胞、Ｃ−１２７細胞、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ヒト由来細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）等があげられる。酵母の例としては、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等があげられる。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）等があげられる。
これらの宿主細胞を形質転換させるために用いられるベクターには、大腸菌用としてｐＫＣ３０  （Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  Ｈ．ａｎｄ  Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ、  ２９２、１２８−１３２、１９８１）、ｐＴｒｃ９９Ａ  （Ａｍａｎｎ  Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ６、６９、３０１−３１５、１９８８）等があげられる。
哺乳動物細胞用としてはｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１、３２７−３４１、１９８２）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら；Ｇｅｎｅ、１０８、１９３−２００、１９９１）、あるいはｐｃＤＬ−ＳＲ  α２９６  （Ｔａｋｅｂｅら；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８、４６６−４７２、１９８８）等がある。酵母用としてはｐＧ−１（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．Ｒ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４１、９６５−９６７、１９８８）等がある。蚕細胞用としては、組み換えウイルス作製用トランスファーベクターｐＡｃ３７３（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  ６、４７−５５、１９８８）等がある。
これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。
複製起点として、哺乳動物細胞用ベクターには、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のもの等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のもの等を用いることができる。酵母用としては２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のもの等を用いることができる。
遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物細胞用ベクターには、ウイルス由来であるレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０由来のもの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、ＥＦ１−α）等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバクテリオファージλ由来のものや、ｔｒｐ、ｌｐｐ、  ｌａｃ、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。パン酵母用としてはＡＤＨ、ＰＨ０５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＭＡＦ  αプロモーター、メタノール資化性酵母についてはＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。蚕細胞用ベクターとしては核多角体病ウイルス由来のもの等を用いることができる。
選択マーカーとして、哺乳動物細胞用ベクターには、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。酵母用としてはＬｅｕ２、Ｔｒｐｌ、Ｕｒａ３遺伝子等を用いることができる。
以上の様な宿主−ベクター系を用いてＴＰＯ活性を有するタンパク質を得るためには、上記ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡ体により、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養し、さらに細胞内あるいは培養液から該ポリペプチドを分離・精製すればよい。これらに用いられる手段・方法は公知のものを組み合わせて行なうことができる。
宿主を用いて発現させる場合に、その発現産物のＮ末端をより確実に均一化するため、本来のシグナル配列を改変したり、他のタンパク質のシグナル配列を用いてもよい。また、Ｎ末端およびその近傍のアミノ酸残基を改変（置換、あるいは付加）することに（例えば、大腸菌を用いて発現させる場合にメチオニン残基に加え、リジン残基を加えるなど）よっても、Ｎ末端を均一化することが可能である。
また、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＴＰＯとをトロンビン認識ペプチドを介した融合タンパク質として適当な宿主にて発現させ、単離した後、その融合タンパク質をトロンビン処理することにより、ＧＳＴ部分を除去し、−１位にグリシン残基が付加されたＧｌｙ−１ＴＰＯタンパク質を得ることができる。
本発明のＴＰＯ活性を有する新規タンパク質（以下、「本発明のタンパク質」と言う）としては、配列番号１６に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質がある。また、本発明にはＴＰＯ活性を保持する限り、その一部のアミノ酸配列が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されたもの、即ちＴＰＯ誘導体も含まれる。
別の言い方をすれば、本発明のタンパク質としては、アミノ酸配列が実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列であるようなタンパク質が含まれる。ここで言う、「実質的に配列番号１６に示されたアミノ酸配列」とは、「配列番号１６に示されたアミノ酸配列」に加えて、「ＴＰＯ活性を保持する限りにおいて、配列番号１６に示されたアミノ酸配列の一部に置換、欠失、挿入および／または付加などがあるアミノ酸配列」を含むものである。
本発明のタンパク質としては、配列番号１６に示されたアミノ酸配列の７位から１５１位のアミノ酸配列を含み、かつＴＰＯ活性を有するタンパク質も含まれる。
より具体的には、配列番号６に示されたアミノ酸配列のうち、１位から２３１位、１位から２１１位、１位〜１９１位、１位〜１７１位、１位〜１６３位、１位〜１５７位、１位〜１５６位、１位〜１５５位、１位〜１５４位、１位〜１５３位、１位〜１５１位及び７位〜１６３位からなるヒトＴＰＯタンパク質が本発明のタンパク質として挙げられる。
更には、上記７位から１５１位の配列内部または外部に、ＴＰＯ活性を損なわない範囲で、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有しているタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
本発明のＴＰＯ誘導体の他の例としては、例えば、アミノ酸の改変（置換、欠失、挿入および／または付加）を行うことによって安定性や体内での持続性の向上を図ったもの、糖鎖の付加する１つ以上の潜在的部位を欠失または付加して変化させたもの、１つ以上のシステイン残基を欠失させるか、またはシステインを他のアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはセリン残基）で置換したものなどが挙げられる。
一般にタンパク質の熱力学的安定性を向上させる方法として、プロリン残基の導入とグリシン残基の除去が有効であることが理論的に示されている。（Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，６６６３−６６６７．１９８７）。そこで、安定性の向上を目的としたＴＰＯ誘導体を設計する場合、プロリン残基を導入したＴＰＯ誘導体およびグリシン残基を除去したＴＰＯ誘導体を考えることができる。
ヒトＴＰＯへのプロリン残基の導入部位の選定には、例えば、このものに高い相同性を有する他の生物種由来のＴＰＯ（マウスＴＰＯ：Ｓｉ  Ｌｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ３６９巻、５６５−５６８頁、（１９９４）、イヌＴＰＯ：Ｔ．Ｄ．  Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｃｅｌｌ  ７７巻、１１１７−１２４頁、（１９９４））のアミノ酸配列を利用することができる。
例えば、ヒト型とラット型のアミノ酸配列（配列番号１５）を比較し、ヒト型ではプロリンではないがラット型ではプロリンを有する部位、あるいは、ヒト型ではグリシンだがラット型ではグリシン以外のアミノ酸を有する部位を選ぶことができる。
例えばこのような部位として、配列番号１６に示されたヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、９位のロイシン残基、８２位のグリシン残基、１４６位のグリシン残基、１４８位のセリン残基などが挙げられ、それらのグリシン残基を他のアミノ酸残基に置換した誘導体や、セリン残基をプロリン残基に置換した誘導体などが考えられる。
また、一般にタンパク質は、疎水性アミノ酸を内側に、親水性アミノ酸を外側に立体構造が形成されることから、タンパク質表面に存在するアミノ酸をより親水性の高い荷電性アミノ酸に置換することによってタンパク質の溶解性の向上を期待することができる。ヒトＴＰＯの場合でも、このような観点から誘導体を設計することができる。例えば、１４位のリジン残基、５２位のリジン残基、５９位のリジン残基、１１５位のグルタミン残基、１１９位のトレオニン残基、１３８位のリジン残基をそれぞれアルギニン残基に置換したものなどが挙げられる。
更には、ＴＰＯとアミノ酸配列における類似性が指摘されているＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）において、一次構造上４番目に位置するヘリックス（Ｄヘリックス）を予測し、正電荷を導入したところ、生物活性の向上が認められている（特開平３−７２８８５）ことから、ＴＰＯについてもそのアミノ酸配列からＤヘリックスを予測し、ＴＰＯ誘導体を設計することができる。
一般にタンパク質のＤヘリックスの予測には、例えば、金久らによる二次構造予測プログラムＩＤＥＡＳ（金久、ＩＤＥＡＳ  ｕｓｅｒ′ｓ  ｍａｎｕａｌ）等が使用できる。
次に、Ｄヘリックスが位置すると予測された領域で、外側に位置するアミノ酸を推定し、正電荷を導入する候補となるアミノ酸残基を選定する。このような候補の選定は、例えば、目的領域の車輪モデル（ＳｈｉｆｆｅｒとＥｄｍｕｎｄｓｏｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７，１２１−１３５．１９６７）を作成することにより可能である。
ヒトＴＰＯの場合、Ｄヘリックスの位置は１２６番目から１４２番目の領域と予測されるが、この領域で選定されるアミノ酸残基として例えば、１２９位のロイシン残基、１３３位のヒスチジン残基、１４３位のメチオニン残基等が挙げられる。従って、これらのアミノ酸残基をアルギニン残基、あるいはリジン残基に置換して正電荷を導入するような誘導体が考えられる。
本発明のＴＰＯ誘導体をより具体的に例示すれば、少なくとも、ヒトＴＰＯの１位のセリン残基がアラニン残基に、かつ３位のアラニン残基がバリン残基に置換されたタンパク質、２５位のアルギニン残基がアスパラギン残基に置換されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基がトレオニン残基に置換されたタンパク質、２５位のアルギニン残基がアスパラギン残基に、かつ２３１位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されたタンパク質、更にこれらのタンパク質のＣ末端にＴｈｒＳｅｒｌｌｅＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＧｌｙＶａｌＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓのポリペプチドが付加されたタンパク質を挙げることができる。
更には、少なくとも、３３位のヒスチジン残基が欠失したタンパク質、１１６位のグリシン残基が欠失したタンパク質、１１７位のアルギニン残基が欠失したタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にトレオニン残基が挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にアラニン残基が挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質、３３位のヒスチジン残基と３４位のプロリン残基の間にグリシン残基が挿入され、かつ３８位のプロリン残基がセリン残基に置換されたタンパク質、１１６位のグリシン残基と１１７位のアルギニン残基の間にアスパラギン残基が挿入されたタンパク質、１１６位のグリシン残基と１１７位のアルギニン残基の間にアラニン残基が挿入されたタンパク質、１１６位のグリシン残基と１１７位のアルギニン残基の間にグリシン残基が挿入されたタンパク質を挙げることができる。
また、少なくとも、１２９位のロイシン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク質、１３３位のヒスチジン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク質、１４３位のメチオニン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク質、８２位のグリシン残基がロイシン残基に置換されたタンパク質、１４６位のグリシン残基がロイシン残基に置換されたタンパク質、１４８位のセリン残基がプロリン残基に置換されたタンパク質、５９位のリジン残基がアルギニン残基に置換されたタンパク質、１１５位のグルタミンがアルギニン残基に置換されたタンパク質が挙げられる。
また、本発明のＴＰＯタンパク質としては、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯ、および前述の誘導体の−２位にメチオニン残基、かつ−１位にリジン残基が付加されたタンパク質、−１位にメチオニン残基が付加されたタンパク質も含まれる。
好ましくは、本発明のタンパク質は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または化学合成により得られるＤＮＡを含む組換えベクターで、形質転換された宿主細胞から分離・精製して得られたものであることを特徴とする。
宿主として、細菌（例えば、大腸菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、ＴＰＯ活性を有するタンパク質のＮ末端側に開始メチオニン残基の付加されたタンパク質が得られるが、このようなタンパク質も本発明に含まれる。また、用いる宿主によっては、産生されるＴＰＯ活性を有するタンパク質はグリコシル化されている場合もあるし、あるいはグリコシル化されていない場合もあるがいずれも、本発明のタンパク質に含まれる。
また、本発明のタンパク質としては、天然の供給源（例えば、ＴＰＯ活性を含むならし培地、またはヒト尿、血清、血漿）から精製および単離されたＴＰＯ活性を有する天然のタンパク質も含まれる。
また、本発明によれば、そのような天然の供給源からＴＰＯを精製する方法を包含する。そのような精製法としては、一般にタンパク質の精製に用いる工程（イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、後述の実施例から推定しうるＴＰＯの物理化学的な性質を利用して組み合わせることのできる方法も本発明に含まれる。さらには、ＴＰＯを認識することのできる抗体を用いた抗体カラムをも用いることができる。また、ＴＰＯはＭｐ１のリガンドであることが判明したことから（ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻５３３−５３８頁（１９９４）、Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｃｅｌｌ  ７７巻  １１１７−１１２４頁（１９９４）、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９巻  ５６５−５６８頁  （１９９４））、Ｍｐ１を活性化ゲルにカップリングさせることでアフィニティーゲルカラムを調製し、これを利用することによってもＴＰＯを精製することができる。より具体的には、Ｍｐ１の細胞外領域（Ｍｐ１−Ｘ）をＣＨＯ細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産・調製し、調製されたＭｐ１−Ｘカラムが挙げられる（前述のＢａｒｔｌｅｙら（１９９４））。
本発明は更に、ＴＰＯのヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの蛋白質コード鎖と相補的なＤＮＡの部分によってコードされる種類のタンパク質、即ちＴｒａｍｏｎｔａｎｏら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２、５０４９−５０５９（１９８４））が記載したような“相補的逆方向蛋白質”を含む。
本発明には、固体組織および血液または尿のような液体試料中のＴＰＯまたはその受容体保有細胞の検出および定量に有用な試薬を提供するために、検出可能なマーカー物質で標識（例えば１２５Ｉで放射能標識するか、またはビオチニル化する）された本発明のタンパク質も含まれる。
ビオチニル化された本発明のタンパク質は、自己骨髄移植において骨髄から巨核芽球性細胞を除去するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用である。更には、自己または同種異系骨髄移植の場合に自己または同種異系巨核球系細胞を濃縮するために固定化ストレプトアビジンと結合する場合に有用である。リシン、ジフテリア毒素のような毒素とＴＰＯとの毒素結合体、および放射性同位元素は、抗癌療法に対して、または骨髄移植のコンディショニング養生法として有用である。
また、本発明は、検出可能マーカー（例えば放射能標識、またはビオチンのような非同位元素標識）で標識される場合や、染色体地図におけるヒトＴＰＯ遺伝子位置および／または任意の関連遺伝子ファミリーの位置を突き止めるためのハイブリダイゼーション法に用いるのに有用な核酸物質も提供する。それらは、ＤＮＡレベルでヒトＴＰＯ遺伝子障害を確認するためにも有用であって、隣接遺伝子およびそれらの障害を確認するための遺伝子マーカーとしても用いられる。
さらに、本発明には、有用で好適な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに治療上有効量の本発明のタンパク質を含有する医薬組成物も含まれる。本明細書中で用いる“治療上有効量”という用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提供する量を示す。このような組成物は、液体であるか、あるいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であって、種々のｐＨ、およびイオン強度から成る緩衝剤（例えばトリス−塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトール）を配合した製剤が含まれる。また、蛋白質に対するポリエチレングリコールのような重合体との共有結合、金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト中への当該物質の取り込みを包含する。このような組成物は、ＴＰＯの物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスに影響を及ぼすと思われるので、組成物の選択は、ＴＰＯ活性を有する蛋白質の物理的および化学的特性による。さらに、重合体（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）と、組織特異的受容体、配位子または抗原に対する抗体に結合するか、あるいは組織特異的受容体の配位子に結合するＴＰＯとで被覆される粒状組成物も本発明に包含される。本発明の組成物の別の剤形としては、非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々の投与経路のため、粒状形態、保護被膜、プロテアーゼ阻害剤、または吸収促進剤を配合する。
本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、活性成分として通常０．０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日数回程度投与することができる。
本発明のタンパク質を含有する医薬組成物は、活性成分として後述のＭ−０７ｅアッセイにおける相対活性量通常２５，０００〜５００，０００，０００／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日一回〜数回、１週間に１〜７日間程度投与することができる。
更に本発明は、本発明のタンパク質に加えてＥＰＯ、  Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、  Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、  ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＳＣＦのような因子の１つ以上を付加的造血因子として含有する組成物を包含する。
本発明のタンパク質は、単独あるいは他の付加的造血因子との組み合わせても、多数の血小板減少症の治療に有用である。他の付加的造血因子としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、  Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＳＣＦを挙げることができる。
本発明によれば、本発明のタンパク質を有効成分とし、制ガン剤や免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるいは骨髄移植（ＢＭＴ）における血小板減少症の治療剤が提供される。更に、血小板障害、例えば、血小板産生障害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とし、本発明のタンパク質で治療可能な多数の疾患が存在する。例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進するために用いることができる。また、ＴＰＯ産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、特発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症などがあり、このような患者の血小板回復促進にも有用である。更に、外科手術前にＴＰＯを投与して自分の血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用血小板として用いる（自己血小板輸血）への用途としても有用である。
さらに本発明のタンパク質の別の用途は、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた障害の処置である。ＴＰＯは、そのような患者で新しい“無傷の”血小板の放出を促進するのに用いることができる。
本発明はさらにＴＰＯに特異的に結合する抗体、およびそれを得るための抗原を提供する。本発明のタンパク質または抗原決定基を有する該タンパク質の部分断片が抗原として使い得る。そのような抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の双方、および既知の方法によって作製したキメラ抗体、即ち“組換え”抗体などを含む。種々の抗原決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を一般に含有する慣用的抗体（ポリクローナル）製剤に対比して、モノクローナル抗体は各々、抗原上の単一抗原決定基に対する抗体である。ＴＰＯに対する特異抗体は、抗原−抗体反応を用いる診断および分析的アッセイ法の選択性および特異性を改良したり、ＴＰＯを分離・精製するのに有用である。さらに、それらは、血清からＴＰＯを中和または除去するのに用いられる。モノクローナル抗体の利点は、それらが、他の免疫グロブリンが混入していない培地中でハイブリドーマ細胞によって合成され得ることである。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養上清から、またはマウスにハイブリドーマ細胞を腹腔内接種することによって誘導される腹水から調製される。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが最初に記載したハィブリドーマ技術（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、５１１−５１９  （１９７６））は、多数の特異抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を保有するハイブリッド細胞系を生成するために広く用い得る。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
（Ａ）ラットＴＰＯの精製〜ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析〜ラット精製ＴＰＯの生物学的特性の分析
本発明者らは、まずラットＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化促進活性を有するタンパク質（ラットＴＰＯ）の精製を試みた。本精製では、種々の天然の供給源の選択、更には、クロマトグラフィー担体の選択、分離手段の選択など、精製の組立について数々の試行錯誤を繰り返した。その結果、本発明者らは、Ｘ線、あるいはγ線照射により誘導した血小板減少症ラットの血漿より、後述の＜参考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイに基づくＴＰＯ活性を指標として、ＴＰＯ活性を有するタンパク質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した＜実施例１〜２＞。
また、その血漿由来ラットＴＰＯの生物学的特性について試験した＜実施例３＞。
なお、精製から、精製されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列の決定までの概要は以下の通りである。
（１）  Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラット約１１００匹分の血漿を集め、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、更にレクチンクロマトグラフィー（ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ）のステップまで進め、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分を得た。
（２）次に、このＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分を色素吸着アフィニティークロマトグラフィー（ＴＳＫ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨ）、疎水相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ／ＬＳ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ）までの処理を実施した。このＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲにおいては、ＴＰＯ活性は４つのピーク（分子量の大きいものから、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）に分かれたので、ＴＰＯ活性画分Ｆ２とＦ３とをそれぞれ濃縮し、高分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３として、それぞれ個別に次の精製ステップに進めた。
（３）低分子ＴＰＯ標品Ｆ３を分取逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ）、逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ）、更に逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｃ１）で分離した。得られたＴＰＯ活性画分を、ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、電気泳動ゲルからＴＰＯ活性の抽出を行ったところ、非還元下で見かけ上分子量約１７０００〜１９０００のバンドにＴＰＯ活性が存在することが確認できた。
（４）そこで、全てのＴＰＯ活性画分を非還元下でＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜上タンパク質の系統的な限定酵素分解によるペプチド断片化を実施し、ラットＴＰＯタンパク質の部分アミノ酸配列を決定することができた（２つの断片のアミノ酸配列情報を基にラットＴＰＯの遺伝子クローニングを実施した。）。
（５）  一方、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲからの高分子ＴＰＯ標品Ｆ２についても、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３と同様に精製を進め、最終ステップの逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｃ１）で得られたＴＰＯ活性画分をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ＴＰＯ活性の抽出を行った。活性を調べてみると、Ｆ３由来のＴＰＯと同じく、非還元下で見かけ上分子量約１７０００〜２２０００のバンドにＴＰＯ活性が存在することが確認できた。
（Ｂ）ラットＴＰＯ産生細胞の特定化〜ｍＲＮＡの調製〜ラットｃＤＮＡライブラリーの構築
精製したラットＴＰＯは血漿由来であるため、ｃＤＮＡクローニングのためには、ｍＲＮＡの供給源となる臓器あるいは細胞を選抜する必要があった。そこでラット血漿由来ＴＰＯの生化学的性質と生物学的性質に基づいて、種々の臓器、あるいは細胞の培養上清中のＴＰＯ活性をスクリーニングした。その結果、ラット肝臓細胞由来の細胞株であるＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、ＨＴＣ細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞の培養上清中、並びにラットの初代肝臓細胞の培養上清中にもラット血漿由来ＴＰＯとほぼ同等のＴＰＯ活性を見いだした＜実施例４＞。
一方、サル細胞（ＣＯＳ１細胞）でのｃＤＮＡ発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを、２種類の発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ並びにｐＥＦＢＯＳを組み合わせて構築した＜実施例５＞。このベクターの構築によりインサートの組み込みに使用できる多種類のクローニング部位を持つ、発現効率の高いベクターを用いてｃＤＮＡをクローニングすることが容易となった。
ｃＤＮＡライブラリーの構築には上記の発現ベクターの他にｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等が主に使用される。
本発明者らは、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を培養し、グアニジンチオシアナート溶液を加えてホモジナイズ後、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全ＲＮＡを得た＜実施例６＞。
ＲＮＡの調製は熱フェノール法や酸性グアニジンフェノールクロロホルム法等でも行なうことが出来る。
この全ＲＮＡからオリゴｄＴ固定化ラテックス粒子によりポリ  （Ａ）＋ＲＮＡを精製した後、制限酵素ＮｏｔＩ切断配列を付加したオリゴｄＴをプライマーとして逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅ  Ｈ  およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、２本鎖ｃＤＮＡを得た。得られた２本鎖のｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ  リンカーを付加し、これを実施例５で構築したｃＤＮＡ発現ベクターｐＥＦ１８ＳをＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ  で切断したものとつなぎ合わせて、コンピテントな大腸菌ＤＨ５株を形質転換させ、ｃＤＮＡライブラリーを構築した＜実施例７＞。
（Ｃ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クローニング）
ラット血漿より精製したラットＴＰＯの部分アミノ酸配列をもとに、その配列をコードすると考えられるＤＮＡ配列を予測し、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）に使用する縮重プライマーを合成した。使用するプライマーは、本発明で用いたプライマー以外の位置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。また、イノシンを使わず縮重度の高いプライマーを用いることも出来る。更に、ラットにおいて使用頻度の高いコドンを使用して縮重度を減らしたプライマーを設計することも出来る（ＷａｄａらＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８、２３６７〜２４１１、１９９０参照）。
先に作製したｃＤＮＡライブラリー全体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施したところ約３３０ｂｐのバンドが検出され、塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯの遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片（Ａ１断片）であることが分かった＜実施例８＞。
（Ｄ）ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング〜ラットＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確認
先に構築したｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンずつのプールに分け、それらのうち１００プールからプラスミドＤＮＡを抽出した。これらＤＮＡを鋳型とし、Ａ１断片の塩基配列をもとに新たに合成したプライマーを使用してＰＣＲを行なったところ、１００プール中３プールに特異的と考えられるバンドが検出された。そこで、これらのうち１プールを選び、このプールをさらに約９００クローンずつのサブプールに分け、それらのうち１００プールについて同様のＰＣＲを行なったところ、３サブプールでバンドが検出された。これらのうち１プールを選択し、更に、４０クローンずつのサブプールに分け、最終的には１クローンづつ同様のＰＣＲによる選別を行なった結果、ラットＴＰＯ遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αを持つクローンの単離に成功した＜実施例９〜１０＞。
このｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、ラット血漿中より精製し部分的に決定したアミノ酸配列をコードしていることが明らかとなり、ラットＴＰＯ遺伝子であると考えられた＜実施例１０＞。
上記のようにして得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。この結果、得られたｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αはラットＴＰＯをコードしているｃＤＮＡを担持していることが確認できた＜実施例１１＞。
（Ｅ）ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出
ラット体内におけるＴＰＯｍＲＮＡの発現組織をＰＣＲによって解析し、脳、肝臓、小腸、並びに腎臓において特異的な発現を検出した＜実施例１２＞。
（Ｆ）ヒトｃＤＮＡライブラリーの構築
実施例４および１２の結果より、ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローニングのための出発組織として肝臓を選択した。そこで、市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲＮＡより、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ベクターにはラットのライブラリーと同様にｐＥＦ１８Ｓを用い、ラットの場合と同じ操作でｃＤＮＡを合成し制限酵素ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ部位を利用した方向性を持ったライブラリーとした。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの数は約１２０万個であった＜実施例１３＞。
（Ｇ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クローニング）
ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αに担持されたラットＴＰＯをコードするｃＤＮＡの塩基配列をもとに、数種類のＰＣＲ用プライマーを合成した。市販の正常ヒト肝臓由来のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施したところ、６２０ｂｐ前後のバンドが観察された。塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯと約８６％の相同性を有するＤＮＡ断片であることが明らかとなり、ヒトＴＰＯをコードする遺伝子の一部であると考えられた＜実施例１４＞。
（Ｈ）ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確認
先に調製したヒトｃＤＮＡライブラリーを増幅し、約１０万クローンずつのプールに分割し、９０個のプールからプラスミドを抽出した。これらのＤＮＡを鋳型とし、実施例１４で得られたヒト−ＴＰＯ断片の塩基配列を基に新たに合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なったところ、３個のプールでバンドが観察された。
これらより１個のプールを選択し、５０００個のクローンを１プールとするサブプールに分け、それらのうちの９０プールよりプラスミドＤＮＡを精製した。これらを鋳型として同様のＰＣＲを実施したところ、５個のサブプールでバンドが検出された。そこで、これらより１プールを選び２５０個のクローンを１プールとするサブプールに更に分割し、それらのうちの９０プールよりプラスミドＤＮＡを精製し再度ＰＣＲによる検出を行なったところ、３個のプールでバンドが観察された。そこで、このうち１プールを選び、３０個のクローンを１プールとするサブプールに分割し、それらのうちの９０プールからプラスミドＤＮＡを精製しＰＣＲを実施した結果、３個のプールでバンドが観察された。これらのうち１プールより９０個のコロニーを拾い、プラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲを実施することで最終的にクローンＨＬ３４を得た＜実施例１５＞。
このクローンが持つプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、ラットＴＰＯの塩基配列と約８４％程度の相同性を持つｃＤＮＡを担持していることが明らかとなった＜実施例１６＞。
このクローンのプラスミドＤＮＡを精製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出され、このクローンが持つプラスミドＤＮＡはヒトＴＰＯをコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持していることが確認された＜実施例１７＞。
しかしながら、このｃＤＮＡ断片は終止コドンが無く、また、ポリＡ尾部様配列を３’端に持っており、これはクローニングの際の人工産物であると考えられた。そこで、ポリＡ尾部様配列直前までのアミノ酸をコードする発現ベクターを構築し、ＣＯＳ１細胞での発現を行なったところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された＜実施例１８＞。
完全長ｃＤＮＡの構造を解析するためにＰＣＲを利用しヒトＴＰＯ３’末端側のＤＮＡ断片を得た。
この断片の塩基配列を決定したところ、実施例１５で得たクローンＨＬ３４のｃＤＮＡとオーバーラップすることがわかり、オープンリーディングフレームも延び全体で３５３個のアミノ酸からなる蛋白質をコードすることが予想された。すなわちヒトＴＰＯタンパク質は２１個のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが示唆された＜実施例１９＞。
ヒトＴＰＯのｃＤＮＡクローニングは、上記のようなクローニング法以外にも、ｐＵＣ系やｐＢＲ系のプラスミドベクター、λ系のファージベクター等を使用して構築したライブラリーを利用し、ラットＴＰＯｃＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイションあるいはプラークハイブリダイゼイションによっても行なうことができる。縮重プローブの設計にあたっては、縮重の度合いを減少させるためにイノシンを使うこともできる。ＴＰＯ活性を特異的に、また感度良く検出できるアッセイ法が利用できる場合には、本発明で用いた様な発現ライブラリーを使用した発現クローニングも行なうことができる。
しかしながら、実施例１５で記載するように正常ヒト肝臓においてはヒトＴＰＯをコードするＲＮＡの含量は著しく低いと考えられるため（この実施例から算出される含量は３００万個に１個の割合であった）、合成したオリゴヌクレオチドプローブやラットやヒトＴＰＯのｃＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼイションによるスクリーニング方法では、処理するクローンやプラークの数が膨大なものになり、また、ハイブリダイゼイションの感度や特異性がＰＣＲ法に及ばないため困難を極めることが予想される。実際に本発明者らも実施例１３において作製した正常ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー２００万クローンについて、ラットＴＰＯｃＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイションを実施したが、ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンを得ることは出来なかった。
（Ｉ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡライブラリーの再構築
実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は不完全なｃＤＮＡを含むクローンであると考えられたため、完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡを得る目的で、市販の正常ヒト肝臓由来のポリ  （Ａ）＋ＲＮＡを用いてヒトＴＰＯｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を構築し直した。大腸菌株ＤＨ５に導入し作製したライブラリーのクローンの数は約１００万個であった。＜実施例２０＞
（Ｊ）コロニーハイブリダイゼーションによるヒトＴＰＯｃＤＮＡの再スクリーニング〜ヒトＴＰＯｃＤＮＡのシークエンス〜発現確認
実施例１４で得られた部分長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）、および実施例１９において推定された完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）をもとに、ＰＣＲ用プライマーを合成した。
実施例２０で構築したｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）を３つのプール（＃１〜３）に分割し、それぞれのプールよりプラスミドＤＮＡを調製し、これらのＤＮＡを鋳型として合成したプライマーを用いてＰＣＲを実施した。＃３のプール由来のＤＮＡを用いた場合に予想される大きさのＤＮＡが増幅されたため、＃３のプールを１５０００個づつのサブプールに分割し、先の合成プライマーでＰＣＲを実施したところ、９０プール中６プールで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらより１個のプールを選択し、１０００個のクローンを１プールとするサブプールに分け、プラスミドＤＮＡを調製しＰＣＲを行ったが、ＤＮＡの増幅は観察されなかった。これは、求めるクローンの増殖が他のクローンより遅いためにプラスミドＤＮＡの回収率が悪くなったことが原因と考えられた。
そこで、＃３のプールに戻り、ＬＢプレート１枚あたり４１００個のコロニーとなるようにクローンをまき、１００枚のプレート、並びにそれぞれのレプリカプレートを作製した。プレートのコロニーから抽出したＤＮＡについて先と同様にＰＣＲを行ったところ、１００プール中１プールでバンドの増幅が観察された。このプールのプレートより２枚のレプリカフィルターを作製し、放射標識プローブ（プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片）を用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、陽性シグナルが１個観察されたため、元のプレートよりコロニーを拾い、ＬＢプレートにまき直して得られたコロニー５０個よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲを実施することにより、最終的にクローンｐＨＴＦ１を得た。＜実施例２１＞
このようにＤＮＡクローンのスクリーニングにおいては、ハイブリダイゼイション、ＰＣＲ）発現クローニング等が主に用いられるが、これらを適宜組み合わせてスクリーニングの効率、感度を上昇させる、あるいは、労力を低減させることができる。
ここで得られたクローンｐＨＴＦ１の塩基配列を決定したところ、オープンリーディングフレームが存在し、このオープンリーディングフレームにコードされると考えられるタンパク質のアミノ酸配列は、実施例１９で推定されたヒトＴＰＯのアミノ酸配列（配列番号６）と完全に一致した。塩基配列は配列番号６とは３箇所で異なっていたが、アミノ酸の変換は起こさなかった。これによりヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが確認できた。＜実施例２２＞
上記のようにして得られたクローンｐＨＴＦ１よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。＜実施例２３＞
（Ｋ）プラークハイブリダイゼーションによるヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのスクリーニング〜ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのシークエンス〜発現確認
東北大学遺伝子実験施設  山本徳男教授より頂いたヒトゲノミックライブラリーより、ＮＺＹＭプレート１枚あたり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレート、並びにそれぞれのレプリカフィルターを作製した。クローンｐＨＴＦ１に含まれるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２５）をＰＣＲで増幅後精製し３２Ｐ標識したものをプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーションを行った。その結果、１３個の陽性シグナルが検出されたため、それぞれ元のプレートよりプラークを拾い、ＮＺＹプレート１枚あたり１０００プラークとなるようにまき直して、それぞれより作製したレプリカフィルターについて再度プラークハイブリダイゼーションを実施した。その結果、１３組すべてのフィルターで陽性シグナルが検出されたため、プラークを単離し、ファージＤＮＡを調製し、１３クローンそれぞれについてヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによりチェックした。
１３クローン中５クローンは、ｃＤＮＡから予想されるコーディング領域を全て含んでいると考えられたため、１クローン（λＨＧＴ１）を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ解析（用いたプローブは先と同じ）を行った。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合に約１０ｋｂｐの単一バンドが観察されたので、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後アガロースゲルで泳動し、１０ｋｂｐのバンドを切り出して精製し、クローニングベクターｐＵＣ１３にサブクローニングし、最終的にクローンｐＨＧＴ１を得た。＜実施例２４＞
このクローンの塩基配列を決定したところ、担持されている染色体ＤＮＡは、配列番号６に示したヒトＴＰＯタンパク質のコーディング領域をすべて含み、その領域に関しては塩基配列は完全に一致した。また、エクソンに相当する領域は４つのイントロンで分断されており、実施例２１で取得したクローンｐＨＴＦ１に担持されている完全長のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列とは３箇所で異なることが判明した。最終的に選択された５クローンのうち残りの４クローンについても塩基配列の決定を行ったところ、２箇所はクローンｐＨＧＴ１と一致し、残りの１箇所については２クローンがｐＨＧＴ１と一致し、もう２クローンｐＨＴＦ１と一致していた。＜実施例２５＞
上記のようにして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ１のＥｃｏＲＩ断片を発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥを調製し、ＣＯＳ１細胞にトランスフェクションしたところ、その培養上清中にＴＰＯ活性を検出することができた。＜実施例２６＞
（Ｌ）ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製〜ＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
実施例１８並びに２２の結果よりヒトＴＰＯタンパク質はその活性発現に全長のアミノ酸を必要としないことが予想された。そこでヒトＴＰＯタンパク質の活性発現に必要な領域を解析する目的で、実施例１８で得たクローンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーでＰＣＲを行うことにより、ヒトＴＰＯタンパク質のＣ末端側を欠失させた発現プラスミド、即ち、アミノ酸１−２１１位、１−１９１位、１−１７１位、および１−１６３位をコードする欠失誘導体のプラスミドＤＮＡを得た。得られたそれぞれのプラスミドＤＮＡをＣＯＳ１細胞へトランスフェクションしたところ、いずれの培養上清中においてもＴＰＯ活性が検出された。＜実施例２７＞
ＴＰＯ活性を担う領域をさらに詳細に検討するために、Ｃ末側より１５１番目のアミノ酸まで順次欠失させた誘導体並びに、Ｎ末側６、７、１２番目のアミノ酸まで欠失させた誘導体を作製し、ＣＯＳ１細胞で発現させ活性を検出したところ、Ｎ末側では７番目のアミノ酸まで欠失させた場合に、Ｃ末側では１５１番目のアミノ酸まで欠失させた場合に活性が検出できなくなった。＜実施例２８、２９＞
このように得られたｃＤＮＡをもとに誘導体（欠失、置換、挿入、付加等）を作製することにより、本来のタンパク質の活性を担う改変型タンパク質を得ることができる。この場合に用いる手法としては、ＰＣＲ法、Ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法、化学合成法等がある。
（Ｍ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜精製
配列番号６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ動物細胞用発現プラスミド、ｐＨＴＰ１を構築した。＜実施例３０＞
このｐＨＴＰ１のＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、ＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築した。＜実施例３１＞
このベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし選択を行った結果、染色体中にヒトＴＰＯをコードする発現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。この細胞クローンを培養したところ培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例３２＞
実施例３２において、ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ  ＭＴＸ耐性）を大量培養した＜実施例５５＞。
その培養上清１００ＬからヒトＴＰＯを精製した。＜実施例５６＞
また、別法により実施例５５で得られた培養上清からＴＰＯを精製した。＜実施例５７＞
（Ｎ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＸ６３．６．５．３．細胞での発現〜活性確認
実施例３０で調製されたプラスミド、ｐＢＬＴＥＮのＴＰＯｃＤＮＡ領域を用い、Ｘ６３．６．５．３細胞用発現ベクター、ＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１を構築した。＜実施例３３＞
このベクターをＸ６３．６．５．３細胞にトランスフェクションしたところ、染色体中にヒトＴＰＯをコードする発現ベクターを組み込んだ、形質転換細胞が得られた。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例３４＞
（Ｏ）ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現〜精製〜分子量測定、生物学的特性
実施例３０で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションし発現させた培養上清を大量（合計約４０１）に調製した。＜実施例３５＞
実施例３５の方法で調製された発現ベクター、ｐＨＴＰ１由来ＴＰＯを含むＣＯＳ１細胞無血清培養上清約７１から、ＴＰＯの精製を行った。疎水相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換カラム、ＷＧＡカラム、逆相カラムの各段階を経て、高活性のＴＰＯを得ることができた。＜実施例３６＞
このようにＣＯＳ１細胞培養上清より部分精製されたＴＰＯについて、分子量測定、および生物学的特性の分析を行った。＜実施例３７、３８＞
（Ｐ）ヒトＴＰＯの大腸菌における発現
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４位）の融合タンパク質（「ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）」）の大腸菌発現用ベクター、ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）を構築した。この際のヒトＴＰＯｃＤＮＡの塩基配列の一部（５’側およそ半分の領域）は大腸菌優先コドンに変換した。＜実施例３９＞
ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕後、沈殿画分に含まれるＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の可溶化を行った。次に、ＴＰＯの巻き戻し（リフォールディング）条件の検討、精製条件の検討（グルタチオンアフィニティーカラム、陽イオン交換カラム等）、トロンビン消化によるＧＳＴ蛋白質領域の  切断などの段階を組み合わせた結果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含む蛋白質が部分精製できた。この蛋白質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認できた。＜実施例４０、４１＞
また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）の１位のＳｅｒ残基をＡｌａ残基に、かつ３位のＡｌａ残基をＶａｌ残基に変換し、さらに−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈ６Ｔ（１−１６３）」と称す）の大腸菌発現用ベクター、ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を構築した。このベクターが担持するヒトＴＰＯｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸（１−１６３）の塩基配列は全て大腸菌での優先コドンに変換した。＜実施例４２＞
ｈ６Ｔ（１−１６３）を大腸菌で発現させ、菌体を破砕後、沈殿画分に含まれるｈ６Ｔ（１−１６３）の可溶化を検討、リフォールディング条件の検討を実施した結果、設計通りのＴＰＯのアミノ酸配列を含むタンパク質が部分精製できた。このタンパク質はラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてＴＰＯ活性を有することが確認できた。＜実施例４３、４４＞
さらに、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ（アミノ酸１−１６３）の−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−１６３）」と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６３）を構築した。ｈＭＫＴ（１−１６３）を実施例４３と同様に大腸菌で発現させ、得られた発現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、設計通りのアミノ酸配列を含むことが確認できた。＜実施例５２＞
また、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２位）の−１位にＬｙｓ残基、−２位にＭｅｔ残基を付加した変異型ヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＭＫＴ（１−３３２）」と称す）の大腸菌発現用ベクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−３３２）を構築した。ｈＭＫＴ（１−３３２）を実施例４２と同様に大腸菌で発現させ、後述の実施例４５で作製した抗ヒトＴＰＯペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングにより発現を確認した。＜実施例６６＞
（Ｑ）抗ＴＰＯペプチド抗体の作製〜抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製
実施例１０にて判明されているラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、３箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポリクローナル抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これらの抗体がラット及びヒトＴＰＯを認識することを確認した。また、配列番号６（もしくは配列番号７）に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、６箇所の部分領域に相当するペプチドを合成し、ウサギポリクロナール抗ＴＰＯペプチド抗体を作製した。これらの抗体がヒトＴＰＯを認識することを確認した。＜実施例４５＞
ＴＰＯに対して結合親和性を持つような分子、即ち、抗ＴＰＯ抗体、ＴＰＯ受容体などをカラム坦体に結合させ、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによりＴＰＯを精製する方法が考えられる。そこでまず実施例４５で得られた抗ＴＰＯペプチド抗体をゲル坦体に結合させた抗ＴＰＯ抗体カラムを調製した。＜実施例４６＞
（Ｒ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの抗ＴＰＯペプチド抗体カラムを用いた精製〜分子量測定、生物学的特性
発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした培養上清を材料として部分精製ＴＰＯを得て、これを抗ＴＰＯ抗体カラムにかけた。吸着画分にＴＰＯ活性を有することが確認できたので、これをさらに逆相カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、その分子量と生物学的活性を調べた。＜実施例４７＞
（Ｓ）ＣＯＳ１細胞で発現させたヒトＴＰＯの部分精製標品の活性確認
実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、すなわち、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来で、ＣａｐｃｅｌｌＰａｋ  Ｃ１  ３００Ａカラムの段階まで精製されたＴＰＯの生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板増加作用を有することがわかった。＜実施例４８＞
また、発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料にし、陽イオン交換カラムで得られた粗精製ＴＰＯ画分の生物学的活性を調べた結果、生体内において血小板増加作用を有することがわかった。＜実施例４９＞
（Ｔ）ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞での発現〜活性確認
ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯ染色体発現ベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯを構築した。＜実施例５０＞
このベクターをＣＨＯ細胞に導入したところ、染色体中にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを担持する発現ベクターが組み込まれた形質転換細胞が得られた。この細胞を培養したところ、培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例５１＞
（Ｕ）大腸菌で発現させた変異型ヒトＴＰＯの部分精製〜活性確認
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯについて、塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディング操作を行い、ここで得たｈ６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板増加作用を有することを確認した。＜実施例５３＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯについて、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディング操作を行い、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製したｈ６Ｔ（１−１６３）が、生体内において血小板増加作用を有することを確認した。＜実施例５４＞
また、更に別法を用いて、変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のリフォールディング〜精製を行った。＜実施例６０、６１＞
（Ｖ）ヒトＴＰＯｃＤＮＡの昆虫細胞での発現〜活性確認
ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウィルスを作製し＜実施例５８＞、昆虫細胞Ｓｆ２１で発現させ、培養上清中の活性を確認した。＜実施例５９＞
（Ｗ）ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３位）のＣＨＯ細胞での発現〜精製
配列番号６に示したヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、１−１６３位のアミノ酸配列を有するヒトＴＰＯタンパク質（「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞発現用ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３を構築した。発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞株を大量培養し、その培養上清からｈＴＰＯ１６３を精製した。＜実施例６２〜６５＞
（Ｘ）ヒトＴＰＯ誘導体の作成
ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基がＡｓｎ残基に、２３１位のＧｌｕ残基がＬｙｓ残基にそれぞれ置換され、更にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘導体（「Ｎ３／ＴＰＯ」と称す）、および３３位のＨｉｓ残基がＴｈｒ残基に置換され、更にＣ末端に付加的ペプチドを有する誘導体（「Ｏ９／ＴＰＯ」と称す）をコードするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６７＞
ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴＰＯ１６３のアミノ酸の一部を欠失させた誘導体をコードするプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清中にＴＰＯ活性が検出された。＜実施例６８＞
ｈ６Ｔ（１−１６３）を鋳型として、大腸菌を用いてＴＰＯ誘導体を作製し、そのＴＰＯ活性を確認した。＜実施例７７＞
（Ｙ）ＴＰＯによる薬理作用
実施例５６で得られたヒトＴＰＯの静脈内投与、並びに皮下投与による正常マウスにおける血小板増加作用を確認した。＜実施例６９、７０＞
また、実施例５６で得られたヒトＴＰＯが、制ガン剤投与による血小板減少の阻止効果および血小板減少からの血小板数回復促進効果、更にはＢＭＴ（骨髄移植）施行後、並びに放射線照射後の血小板数の回復促進効果を有することを確認した。＜実施例７１〜７４＞
また、実施例６５で得られたヒトＴＰＯの正常マウスにおける血小板増加作用、および制ガン剤投与による血小板減少からの血小板数回復促進効果を確認した。＜実施例７５、７６＞
（Ｚ）ヒトＴＰＯ製剤の調製
ヒトＴＰＯを有効成分とする製剤の調製例を示した。＜製剤実施例１〜９＞
なお、本発明において用いたＴＰＯ活性の測定方法（ｉｎｖｉｔｒｏアッセイ系）を＜参考例＞として以下に説明する。
＜参考例＞
Ａ．ラット巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）アッセイ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ）系（液体培養系）
巨核球は、エネルギー依存性に細胞外のセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）を取り込んで、濃染顆粒に蓄積する（Ｆｅｄｏｒｋｏ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３６巻、３１０−３２０頁、（１９７７））。この現象は、少なくともＣＦＵ−ＭＫと認識可能な巨核球の間の分化段階に位置する小型で単核のアセチルコリン陽性細胞においてすでに認められ（ＢｒｉｃｋｅｒとＺｕｃｋｅｒｍａｎ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１２巻、６７２−６７５頁、（１９８４））、その後、巨核球サイズの増大に応じてｓｅｒｏｔｏｎｉｎの取り込み量が増加する（ＳｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６１５頁、（１９８１））。しかも、骨髄細胞の中では巨核球系細胞だけに特異的である（ＳｃｈｉｃｋとＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、９８巻、６０７−６１５頁、（１９８１））ことが知られている。本アッセイ系は、高度に濃縮されたラットＣＦＵ−ＭＫ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋  ＣＦＵ−ＭＫ画分；後述）を被検検体の存在下に培養し、巨核球の増殖・分化を１４Ｃ−セロトニン（１４Ｃ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｓｕｌｐｈａｔｅ：１４Ｃ−５ＨＴ））の取り込みを指標とした測定法である。
本アッセイ系の利点は、用いる細胞に含まれるＣＦＵ−ＭＫの割合が極めて高く（後述の「アッセイ方法」参照）、これに反して混入するＴＰＯの標的細胞以外の細胞が少ないので、混入細胞による間接的影響（例えば、本因子以外の何らかの物質が混入細胞に作用してＭｅｇ−ＣＳＦ活性を誘導させたり、混入細胞が本因子と協同作用する何らかの因子を産生したりするなど）を軽減することができ、また、１つのウエルの中で培養する全細胞数が少なくてすむために、比較的長い期間良好な培養環境を維持することができることにある。さらに、培養期間中に活性標品によってＣＦＵ−ＭＫから生成した数多くのサイズの大きい成熟巨核球を位相差顕微鏡下に観察することができ、活性の有無や程度を定性的に判定できることも利点である。この定性判定の結果は１４Ｃ−セロトニンの取り込みによる定量結果と良く対応している。従って、定性判定を併用することにより、定量結果の信頼性を高めることができる。
「アッセイ方法」
まず、アッセイに用いる高度に濃縮されたラットＣＦＵ−ＭＫ（「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分」）を既に報告している方法（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｅｘｐ，Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻、８５５〜８６１頁、（１９９２年））を若干改良した方法に従って調製した。その概略は次のとおりである。
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（♂、８〜１２週齢）の大腿骨、および脛骨を摘出し、常法に従い、骨髄細胞浮遊液を調製する。骨髄細胞浮遊液の調製には、ＬｅｖｉｎｅとＦｅｄｏｒｋｏが報告した巨核球分離用媒体（ＬｅｖｉｎｅとＦｅｄｏｒｋｏ、  Ｂｌｏｏｄ）５０巻、７１３−７２５頁、（１９７７））を若干改良した媒体（１３．６ｍＭクエン酸三ナトリウム、１１．１ｍＭグルコース、１ｍＭアデノシン、１ｍＭテオフィリン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ７．２５）、０．５％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）  （Ｐａｔｈ−０−Ｃｙｔｅ４  ；生化学工業）、およびＣａ２＋とＭｇ２＋を含まないＨａｎｋｓ平衡塩類溶液からなる溶液：以下、ＨＡＴＣＨ溶液と略す）を用いる。骨髄細胞浮遊液を、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨＡＴＣＨ溶液で希釈して調製したＰｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配溶液（密度；１．０５０ｇ／ｍｌ／１．０６３ｇ／ｍｌ／１．０８２ｇ／ｍｌ）の上に重層し、２０℃にて、４００×ｇで２０分間遠心する。遠心後、密度１．０６３ｇ／ｍｌと１．０８２ｇ／ｍｌの界面に集まった細胞を回収する。細胞を洗滌後、１０％ウシ胎仔血清（以下ＦＣＳと略す）を含むＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培養液（以下ＩＭＤＭ培養液と略す）で浮遊させ、直径１００ｍｍの組織培養用プラスティックディッシュに入れて、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で１時間培養する。培養後、非付着性細胞画分を回収し、再び直径１００ｍｍのプラスティックディッシュに入れ、さらに３７℃で１時間培養した後、非付着性細胞画分を集める。回収した細胞をＨＡＴＣＨ溶液に再浮遊させ、予めマウスモノクローナル抗ラット血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体であるＰ５５抗体（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ，、５９巻、９４１−９５３頁、（１９９０））を吸着させておいた細菌検査用１００ｍｍペトリディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ１００５；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に入れ、室温で１時間静置する。その後、非吸着細胞をＨＡＴＣＨ溶液で十分に洗滌、除去した後、固相化Ｐ５５抗体に吸着した細胞をピペッティングにてはがし、回収する。通常、ラット１匹から３〜４×１０５個の細胞が得られる。得られた細胞画分にはラットＣＦＵ−ＭＫが高度に濃縮されており（以下、「ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分」と言う）、後述するコロニーアッセイ系における飽和濃度のラットＩＬ−３存在下の検定により通常５〜１０％程度のＣＦＵ−ＭＫが含まれることが分かっている。なお、上記Ｐ５５抗体を産生するハイブリドーマ（ｐ５５細胞）は、１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５６３として寄託されている。
次に、得られたＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液で再浮遊させ、組織培養用９６ウエル平底プレートヘ１ウエル当たり１０４個の細胞が入るように分配し、さらにＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析した標準品（後に詳述する）や、被検検体を加え、最終培養液量を２００μｌ／ウエルにする。プレートを炭酸ガス培養器に入れ、３７℃で４日間培養する。４日目の培養終了３時間前に１ウエル当たり０．１μＣｉ（３．７ＫＢｑ）の１４Ｃ−セロトニンを添加し、引き続き３７℃で培養する。培養終了後、プレートを１０００ｒｐｍにて、３分間遠心し、上清を吸引除去する。続いて、０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを１ウエル当たり２００μｌ加えて遠心し、上清を吸引除去し、細胞を洗滌する。この洗滌操作をもう一度繰り返す。得られた細胞ペレットへ２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１ウエル当たり２００μｌ加え、プレートをプレートミキサーで５〜１０分程度振蕩し、細胞を十分に溶解する。得られた細胞溶解液のうちの１５０μｌを市販のカップ状の固体シンチレーター（Ｒｅａｄｙ  Ｃａｐ  ；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）の中へ移し、一晩５０℃の乾燥器中に静置して、乾固させる。翌日、Ｒｅａｄｙｃａｐをガラスバイアルに入れ、液体シンチレーションカウンターにて１４Ｃの放射活性を測定する。
なお、上述の細胞溶解液中のアセチルコリンエステラーゼ活性をＩｓｈｉｂａｓｈｉとＢｕｒｓｔｅｉｎの方法（ＩｓｈｉｂａｓｈｉとＢｕｒｓｔｅｉｎ、  Ｂｌｏｏｄ）６７巻、１５１２−１５１４頁、（１９８６））に従って測定しても、１４Ｃ−セロトニンの取り込みによる定量結果と極めて類似した結果が得られる。
「標準品」
まず、標準品の作製に用いる血小板減少症ラット血漿を以下の方法で調製した。
７〜８週齢のＷｉｓｔａｒ系正常ラット（♂）へ、前述したＰ５５抗体を１回の投与量を０．５ｍｇとして、約２４時間間隔で２回、静脈注射し、２回目の投与の約２４時間後の血小板減少期にエーテル麻酔下に開腹し、予め抗凝固剤として１ｍｌの３．８％（ｖ／ｖ）クエン酸三ナトリウム溶液を吸い上げておいた１０ｍｌ用注射筒を用いて腹大動脈から採血した。血液をプラスティック製の遠心チューブに移し、１２００×ｇで、１０分間遠心し、血漿画分を回収した。この血漿画分を再度１２００×ｇで、１０分間遠心し、遠心後、細胞や血小板などからなるペレットを吸い上げないように十分に気をつけながら血漿画分を回収し、プールした（以下、このようにして得られた血漿を「ＴＲＰ」と言う）。
続いて、ＴＲＰから実施例１に記載する方法に従って調製したＣａ処理ＴＲＰ（標準品Ｃ）、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラム活性画分（標準品Ｗ）、あるいはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ／ＬＳカラム活性画分（標準品Ｐ）を、十分量のＩＭＤＭ培養液に対して徹底的に透析し、活性検定用の標準品とした。
なお、実施例１に示したラットＴＰＯ精製過程においては、初期は標準品Ｃを用いたが、途中から標準品Ｗ、さらにその後は標準品Ｐを用いた。恣意的に標準品Ｃの活性を１と定義し、それを基に標準品ｗおよび標準品Ｐの相対活性を求めた。被検検体の相対活性の求め方は、標準品と被検検体との用量反応曲線を描き、被検検体の活性が標準品Ｃの活性のｎ倍であったとき、その検体の相対活性をｎとした。
Ｂ．コロニーアッセイ系
骨髄細胞を半固型の培養液中で被検検体の存在下に培養し、ＣＦＵ−ＭＫが増殖・分化して形成される巨核球コロニーの数を算定することによりＭｅｇ−ＣＳＦ活性を測定するアッセイ法である。
「アッセイ法」
（ａ）ラット非分離骨髄細胞などを用いる場合
ラット非分離骨髄細胞、前記Ａ．のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫの分離・濃縮操作の各段階で得られる細胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ２−メルカプトエタノール、０．３％の寒天（ＡＧＡＲ  ＮＯＢＬＥ、ＤＩＦＣＯ  社製）を含む最終液量１ｍｌのＩＭＤＭ培養液を直径３５ｍｍの組織培養用プラスチックディッシュに入れて室温で固化させた後、炭酸ガス培養器中にて３７℃で培養する。通常、１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を、非分離骨髄細胞、Ｐｅｒｃｏｌｌ遠心分離段階およびプラスティックディッシュ付着性細胞除去段階の細胞、およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分で、それぞれ、２〜４×１０５、２〜５×１０４、０．５〜２×１０３個とする。６〜７日目に寒天ゲルをディッシュから取り出してスライドガラス（７６ｍｍ×５２ｍｍ）に受け、孔径５０μｍのナイロンメッシュ、続いて濾紙をのせて水分を吸収し、それらを除いてから室温で十分に乾燥させる。５０℃のホットプレート上で５分間熱固定した後、Ｊａｃｋｓｏｎの方法（Ｊａｃｋｓｏｎ、  Ｂｌｏｏｄ、４２巻、４１３−４２１頁、（１９７３））に従って調製したアセチルコリンエステラーゼ染色液に２〜４時間浸し、巨核球が十分に染色されているのを確認してから取りだして水洗し、乾燥後Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン液にて３０秒間、後染色を施し、水洗、風乾させる。アセチルコリンエステラーゼ陽性の巨核球３個以上から成る集塊を一つのコロニーとして巨核球コロニー数を算定する。
（ｂ）マウスの非分離骨髄細胞を用いる場合
１つのディッシュ当たりのまき込み細胞数を２〜４×１０５個として、上記（ａ）と同様の方法で行なうことができる。
（ｃ）ヒト骨髄細胞やヒト腑帯血細胞を用いる場合
ヒト骨髄細胞やヒト腑帯血細胞をそのまま用いることもできるが、以下のようにそれらから濃縮したＣＦＵ−ＭＫ画分を用いることができる。
まず骨髄液、あるいは腑帯血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学社製）上に重層し、遠心後、界面に集まった白血球画分を回収する。この細胞画分から、ビオチン化したヒトの細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１９）に対するビオチン化したモノクローナル抗体が結合する細胞を、アビジンを結合させた磁気ビーズを用いて除去する。この磁気ビーズ法で除去できる細胞は、主にＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、および一部の顆粒球である。残った細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ３４抗体、およびＰＥ標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、続いてセルソーター（例えば、ＥＬＩＴＥ  ；ＣＯＵＬＴＥＲ  社製）を用いて、ＣＤ３４陽性、かつＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞画分を回収する。この画分にＣＦＵ−ＭＫが濃縮されている（ＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分と略す）。ヒトのコロニーアッセイは、上記のラットの骨髄細胞を用いたコロニーアッセイとほぼ同様の方法で行なうが、１つのプラスティックディッシュ当たりのＣＤ３４＋ＤＲ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分のまき込み数を３〜５×１０３個とし、１０％ＦＣＳの代わりに１２．５％ヒトＡＢ血漿と１２．５％ＦＣＳの混合物を用いる。また、巨核球コロニーを形成させるまでの培養期間は１２日間から１４日間である。ヒト巨核球の検出には、巨核球の表面抗原であるヒトＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するマウスモノクローナル抗体を用いたアルカリフォスファターゼ−抗アルカリフオスファターゼ抗体法で巨核球を免疫染色し（例えば、Ｔｅｒａｍｕｒａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  １６巻、８４３−８４８頁、（１９８８））、３個以上の巨核球からなるコロニーを巨核球コロニーとして算定する。
Ｃ．ヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ系（Ｍ−０７ｅアッセイ）
ヒト巨核芽球性細胞株であるＭ−０７ｅ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−２などに応答して増殖する細胞株であることが知られているが（Ａｖａｎｚｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４５巻、４５８−４６４頁、（１９９０）、Ｋｉｓｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ）７巻、）、ＴＰＯにも応答することが判明し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系の代替アッセイ法として使うことができる。
「アッセイ法」
ＧＭ−ＣＳＦ存在下に継代培養しているＭ−０７ｅ細胞を回収し、十分に洗滌後、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に再浮遊させる。組織培養用９６ウエル平底プレートヘ１ウエル当たりの細胞数が１０４個になるようにＭ−０７ｅ細胞を入れ、さらに標準品、および被検検体を加えて、最終液量を２００μｌ／ウエルにする。プレートを５％炭酸ガス培養器に入れ、３７℃で、３日間培養する。３日目の培養終了４時間前に１μＣｉ（３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、培養終了後、セルハーベスターで細胞をガラス繊維フィルター上に集め、３Ｈの放射活性を液体シンチレーションカウンター（例えば、ベータプレート；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社製）にて測定する。
なお、Ｍ−０７ｅアッセイにおける相対活性量の定義は、前述Ａ．のラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおける定義と同じである。
Ｄ．マウスプロＢ細胞株を用いたアッセイ系（Ｂａ／Ｆ３アッセイ）
マウスプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３やＩＬ−４などに応答して増殖する細胞株であることが知られている（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ、４１巻、７２７−７３４頁）。
その亜株であるＢＦ−ＴＥ２２細胞はＩＬ−３やＩＬ−４ばかりでなくＴＰＯに応答し、細胞増殖する事が判明し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイやヒト巨核芽球性細胞株を用いたアッセイ（Ｍ−０７ｅアッセイ）の代替アッセイ法として用いることができる。このアッセイ系の概要は以下の通りである。まず、１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３存在下に継代培養しているＢＦ−ＴＥ２２細胞を回収し、イスコフ改変ＤＭＥ培地（ＩＭＤＭ；ＧＩＢＣＯ  社）で３回洗浄したのちに、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地に再懸濁させる。次に、組織培養用９６ウエル平底プレートに１ウエルあたり細胞数が１ｘ１０４個になるように細胞を接種し、さらにＴＰＯ標準品あるいは被検検体を加えて、最終液量を２００ｍｌ／ウエルとなるようにし、プレートを５％炭酸ガス培養器中で２−３日間培養する。２または３日目の培養終了４時間前に１ｍＣｉ  （３７ＫＢｑ）／ウエルの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、さらに培養を継続する。培養終了後、セルハーベスターを用いて細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、細胞に取り込まれた３Ｈの放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定する。本アッセイ系ではＴＰＯ活性を含まない被検検体では、細胞はほぼ死滅し３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅをほとんど取り込まないのに対し、ＴＰＯ活性を含む被検検体では、細胞はＴＰＯ濃度依存的に活発な増殖を示し３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込みが認められる。また、本アッセイは、Ｍ−０７ｅアッセイやＣＦＵ−ＭＫアッセイとパラレルな結果を示す。
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
＜実施例１−１＞
抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯ精製
「抗血小板抗体投与による血小板減少症ラットの血漿の調製」
前述の＜参考例＞Ａ．ラット巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−ＭＫ）アッセイ系に記載の方法でラット約１０００匹分のＴＲＰを調製し、精製の供給源とした。
「ＴＲＰからのラットＴＰＯの精製」
当初、ＴＲＰ中のＴＰＯ含有量は多くとも３００万分の１程度であろうとの推定に基づき、ラット約１０００匹分のＴＲＰを材料に精製を進めた結果、１ｐｍｏｌｅ弱のラットＴＰＯの部分精製標品を得た。次にこの標品の部分アミノ酸配列の分析を試行し、３種の部分アミノ酸配列の結果を得た。これらは肝臓でつくられるセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＰＩ）のアミノ酸配列と一致しているか、類似したものであった。従って、ＴＰＯがセリンプロテアーゼインヒビターと類似した構造をもつものであるという可能性、及びＴＰＯ以外の混入タンパク質由来の配列である可能性のいずれについても否定はできなかった。
これらの不確定な配列をもとにラットｃＤＮＡライブラリーからのＴＰＯ遺伝子クローニングを実施したが、結局、候補遺伝子を得ることはできなかった。これは、分析した標品の純度と量に不足があったためと考え、あらためて鋭意研究を重ねることとなった。アミノ酸配列分析のために必要な最終精製標品を得るため、次の実施例１−２に述べる精製を行った。尚、特筆すべきことは、本実施例１−２による結果より、ＴＲＰあるいはＸＲＰ（後述）に存在するＴＰＯ量は、驚くべきことに全血漿蛋白質の１億分の１から１０億分の１と推定され、これを精製することが通常は極めて困難であるほど、微量の含有量であることが判明した。
＜実施例１−２＞
Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの血漿からのラットＴＰＯの精製
「Ｘ線、あるいはγ線照射による血小板減少症ラットの血漿の調製」
亜致死線量（６〜７Ｇｙ）のＸ線、あるいはγ線を７〜８週齢のＷｉｓｔａｒ系正常ラット（♂）へ全身照射し、血小板減少期の１４日目に採血し、前述のＴＲＰと同様の操作で血漿画分を調製した（以下、この血漿を「ＸＲＰ」と言う。）。
ここでは、合計してラット約１１００匹分のＸＲＰ  （約８Ｌ）を精製の供給源とした。
「ＸＲＰからのラットＴＰＯの精製」
ラット約１１００匹分の血漿の総蛋白質量は４９３０００ｍｇにも達するため、一度に処理することができなかった。そこで、以下に述べる精製ステップのうち、（１）〜（４）では約１００匹ずつ１１のロットに分けて実施した。次いで（５）〜（７）では６つのバッチに分けて実施した。（８）以降は約１１００匹分から粗精製されたものをまとめて実施した。
このうち、あるひとつのロット（ＸＷ９）、バッチ（ＸＢ６）における精製例を代表として説明のために挙げ、併せて精製の各ステップについて述べる。
尚、精製の全ステップに於いて、ＴＰＯ活性は前述の＜参考例＞に記載したラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系を用いて測定した。
逆相クロマトグラフィーを室温で実施した以外は、特に記載しない限り４℃で精製を行った。
また、蛋白質の定量は、クーマジー色素結合法（ＰＩＥＲＣＥ社製試薬、カタログ番号２３２３６Ｘ）、または、ビシンコニン酸法（ＰＩＥＲＣＥ社製試薬、カタログ番号２３２２５）を用いて実施した。
精製の概要を、表１に示した。
【表１】
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（１）ラット血漿の塩化カルシウム処理・遠心処理・蛋白質分解酵素阻害剤処理  −８０℃で保存した約１００匹分のＸＲＰ（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．８ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４０６８６ｍｇ）を解凍し、ポリプロピレン製遠心チューブ（ナルゲン社製）に移した。これに各々最終濃度１００ｍＭになるように塩化カルシウム粉末を加え、４℃で一晩静置した。次に８０００ＲＰＭで６０分遠心後、上清を回収した。ＴＰＯ活性を含むこの上清（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４０７４０ｍｇ）に、最終濃度１ｍＭの蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ（ｐ−アミノジフェニルメタンスルホニルフルオリド  塩酸塩、和光純薬工業、カタログ番号０１０−１０３９３）を加え、次に述べるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムによるバッファー交換のステップへ進めた。
このようにして、約１００匹分ごとにひとつのロットにまとめ、塩化カルシウム・ｐ−ＡＰＭＳＦ処理し、合計１１ロット、約１１００匹分のＸＲＰ（総体積８１８４ｍｌ）総蛋白質量４９３００７ｍｇ）の処理を繰り返し、それぞれＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムへ進めた。
（２）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５＜バッファー交換＞
（１）で得られた塩化カルシウム処理後の上清（７４２ｍｌ，蛋白濃度５４．９ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量４０７４０ｍｇ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８で予め平衡化してあったＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−００３３−０３；直径１１．３ｃｍ、ベッド高４７ｃｍ）に流速４０〜７０ｍｌ／ｍｉｎで添加し、蛋白質が溶出してくるまでの１３００ｍｌを捨てた。次に、紫外吸収が立ち上がってきた時点から、電気伝導度が５００μＳ／ｃｍに達するまでを集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８溶液に置換されたＴＰＯ活性を含む蛋白質画分（１３７７ｍｌ，蛋白濃度２７．５６ｍｇ／ｍｌ）を回収した。ＴＰＯ活性画分の総蛋白質量は、３７８８２ｍｇ、このステップでの蛋白収量は、９３％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、２．３であった。
このようにして、全ロットについてそれぞれＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを実施した結果、合計すると、総体積  ２１１１７ｍｌ、総蛋白質量  ４８０３０６ｍｇ、平均相対活性  １．８、相対活性量  ８６４６００のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分を得た。
（３）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ＜強陰イオン交換クロマトグラフィー＞
（２）で得られたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ＭのＴＰＯ活性画分（１３７５ｍｌ，蛋白濃度２７．５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３７８４１ｍｇ、相対活性２．３）を流速４０ｍｌ／ｍｉｎで、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号１７−０５１０−０１；直径  ５ｃｍ、ベッド高  ２７ｃｍ）に添加し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で素通る画分Ｆ１（３９４９ｍｌ，蛋白濃度０．９８ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量３８７０ｍｇ，相対活性０）を溶出した。
次に、１７５ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８緩衝液に換えて、ＴＰＯ活性画分Ｆ２（４３７５ｍｌ，蛋白濃度５．３６ｍｇ／ｍｌ）を溶出した。
最後に、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８緩衝液で、Ｆ３（１２２１ｍｌ，蛋白濃度３．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４７８３ｍｇ，相対活性３．８）を溶出した。ＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、２３４４０ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白収量は、６１．９％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、６．８に上昇した。
このようにして、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５のＴＰＯ活性画分の全ロットをＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦにかけた結果、合計すると総体積  ３５８４２ｍｌ、総蛋白質量  ３１４３８４ｍｇ、平均相対活性  ８．６、相対活性量  ２７０４０００のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。
（４）小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）−Ａｇａｒｏｓｅ＜レクチンアフィニティークロマトグラフィー＞
（３）で得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（７）ＴＰＯ活性画分Ｆ２を３回に分けて、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ  （ホーネン社製、カタログ番号８００２７３；直径  ５ｃｍ、ベッド高  ２２．５ｃｍ）に流速５ｍｌ／ｍｉｎで添加し、ダルベッコ氏リン酸等張緩衝液（ＤＰＢＳ）で素通る画分Ｆ１（９３３６ｍｌ，蛋白濃度２．３０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２１４０７ｍｇ，相対活性６．９）を得た。
次に、０．２ＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、ナカライ社製、カタログ番号００５−２０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）０．０２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２緩衝液により溶出されたプールを、限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２９９３ｍｌ，蛋白濃度０．３７６ｍｇ／ｍｌ）を得た。
このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は、１１２５ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白収量は、４．８％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、１０１に上昇した。ここで得られたＦ２は−８０℃で保存した。
このようにして、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全ロットについて、繰り返しＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅにかけた結果、総体積  ３３０９４ｍｌ、総蛋白質量  １５０３０ｍｇ、平均相対活性  １３２、相対活性量  １９８７０００のＷＧＡ−ＡｇａｒｏｓｅのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。
（５）ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０  ＭＨ＜色素吸着アフィニティークロマトグラフィー＞
（４）で得られた、合計２１５匹分のＸＲＰから出発したロットＸＷ８のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分とロットＸＷ９のＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２をバッチＸＢ６としてまとめた（５９７４ｍｌ，蛋白濃度０．３８８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量２３１９ｍｇ、相対活性１５０）。
この体積５９７４ｍｌに対し、０．８５ｍｏｌｅｓのＮａＣｌ（２９６．７６ｇ）を加え、最終濃度０．８２２Ｍ  ＮａＣｌ，６１３２ｍｌの溶液とした後、ＩＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ７．２で予め平衡化してあったＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０  ＭＨカラム（トーソー社製、カタログ番号０８７０５  ；直径  ５ｃｍ、ベッド高  ２３ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍｉｎで添加した。
添加終了後、流速１０ｍｌ／ｍｉｎにて、２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  １ＭＮａＣｌ，  ｐＨ７．２で溶出される素通り（約８４７０ｍｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（５４３ｍｌ，蛋白濃度２．０５ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１１１２ｍｇ，相対活性３１）を得た。
次に、溶出液を２Ｍ  ＮａＳＣＮにかえ、溶出されたＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２７ｍｌ，蛋白濃度０．４４７ｍｇ／ｍｌ）を得た。
このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は６３８ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白収量は２７．５％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、１５００に上昇した。
このようにして、ＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、各々ＴＳＫ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨにかけた結果、総体積  １０６５５ｍｌ、総蛋白質量４２３６ｍｇ、平均相対活性  ９０５、相対活性量  ３８３４０００のＴＳＫ−ｇｅｌΛＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。
（６）Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ／ＬＳ＜疎水相互作用クロマトグラフィー＞
（５）で得られたＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ６５０ＭＨのＴＰＯ活性画分Ｆ２（１４２４ｍｌ，蛋白濃度０．４４７ｍｇ／ｍｌ）総蛋白質量６３８ｍｇ）相対活性１５００）の体積１４２４ｍｌに対し、１．５ｍｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（２８２．２ｇ）の粉末を加え、最終濃度１．３５ＭＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ，  １５８１ｍｌの溶液とした。
これを１．５Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ，  ５０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ７．２で予め平衡化してあったＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（Ｌｏｗ  Ｓｕｂ）カラム（ファルマシアバイオテク社製、カタログ番号１７−０９６５−０５；直径  ５ｃｍ、ベッド高  １０ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍｉｎにて添加し、添加終了後、溶出液を０．８Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ，  ３６ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａ｛ｅにかえ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎにて溶出される画分（約３１６０ｍｌ）までを集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、Ｆ１（４８５ｍｌ，蛋白濃度０．１９４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９４．２ｍｇ，相対活性０）を得た。
次に、溶出液を２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２にかえ、溶出されたＴＰＯ活性画分Ｆ２（約３５００ｍｌ）を得た。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製、オメガウルトラセット分子量８０００カット）で濃縮し、一旦サンプリングした。この段階のＴＰＯ活性画分Ｆ２（２２０ｍｌ）の蛋白濃度は１．４５ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量３１９ｍｇ）このステップでのＦ２の蛋白収量は、５０．０％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、１２３０であった。
このようにして、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨのＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、繰り返しＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ／ＬＳにかけた結果、総体積  １９６６ｍｌ、総蛋白質量  ２７６２ｍｇ、平均相対活性  ８４７、相対活性量  ２３３９０００のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ／ＬＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２を得た。
（７）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ＜ゲル濾過クロマトグラフィー＞
（６）で得られたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ／ＬＳ（７）ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２１７ｍｌ，蛋白濃度１．４５ｍｇ／ｍｌ）総蛋白質量３１５ｍｇ、相対活性１２３０）に、１４４．８ｍｌの５ＭＮａＣｌ溶液を加えて３６２ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌとした後、さらに限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で約５０ｍｌまで濃縮した。
これに８Ｍ尿素を等量体積（５０ｍｌ）加え、最終濃度１Ｍ  ＮａＣｌ、４Ｍ尿素の溶液約１００ｍｌにした。さらに約８０ｍｌまで濃縮し、最終的に８８．７８ｍｌのサンプルにし、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０５８４−０１；直径  ７．５ｃｍ、ベッド高  １００ｃｍ）に、注入した。
その後３ｍｌ／ｍｉｎの流速にてＤＰＢＳで展開し、ボイド体積（１２００ｍｌ）以降４５ｍｌずつ６０本のポリプロピレン製チューブに集めた。この溶出パターンを図１に示した。２本ごとにアッセイにかけ、残りは１１００匹分の全てのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲのプロセスを終えるまで、−８５℃にて凍結保存した。アッセイの結果よりＸＢ６では以下のようにフラクションをまとめた（図１）。
（Ｆ１）チューブ番号  １〜１５（ボイド体積付近の分子量９４０００以上の画分）
（Ｆ２）チューブ番号  １６〜２６（分子量９４０００〜３３０００）
（Ｆ３）チューブ番号  ２７〜４４（分子量３３０００〜３０００）
（Ｆ４）チューブ番号  ４５〜５５（分子量３０００以下）
このようにして、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ／ＬＳで得たＴＰＯ活性画分Ｆ２の全バッチについて、各々Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ    Ｓ−２００ＨＲにかけ、それぞれのフラクションについてアッセイを行ない、−８５℃にて凍結保存をした。すべてのバッチについてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ終了後、次の逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ）を実施する直前に解凍をし、限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で濃縮し、下記の２つの標品を得た。以下、このＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮標品を「高分子ＴＰＯ標品Ｆ２」、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲのＴＰＯ活性画分Ｆ３の濃縮標品を「低分子ＴＰＯ標品Ｆ３」と言う。ここで述べる高分子ＴＰＯ標品Ｆ２、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３とは便宜上、ゲル濾過クロマトグラフィーで溶出位置の異なった画分をまとめたものを称するのであって、必ずしも真の分子量を表現したものではない。
【表２】
0003635142.tif 000003
以降、低分子ＴＰＯ標品Ｆ３と高分子ＴＰＯ標品Ｆ２とをそれぞれ次の精製ステップに進めた。
以下（８）〜（１１）に低分子ＴＰＯ標品Ｆ３の精製の各ステップについて述べる。
（８）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆相クロマトグラフィー＞
（７）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３（総蛋白質量５０．３ｍｇ，蛋白濃度０．１８４ｍｇ／ｍｌ，相対活性２００００，相対活性量１００７０００、総体積２７４ｍｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））および展開溶媒Ｂ（０．０２５％  ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加え、最終体積５０８．６３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２０％、ＴＦＡ濃度０．０１２％、蛋白濃度０．０９８９ｍｇ／ｍｌに調製した。ここで不溶物の発生があったので、これを遠心し、上清のみを２５４．３ｍｌ  （２５．２ｍｇ）ずつ２回に分けて、予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ番号Ａ−ＰＲＲＰ−３３−０３−１５  ；直径  ３ｃｍ、ベッド高  ７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで添加した。沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳ  （３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォナート；同仁化学研究所製、カタログ番号７５６２１−０３−３）を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５を２０ｍｌ加えて可溶化し、合わせてカラムに送り込んだ。
サンプルを添加した後、約５０ｍｌの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、まず素通り画分を集めた。次に展開プログラム（１２０分の３０％Ｂ〜４５％Ｂの直線濃度勾配）を開始して、１０ｍｌずつ合計３６本のフラクションをポリプロピレン製チューブに集め取った。これを繰り返して同じチューブに集めたため、最終的に２０ｍｌずつ、合計３６本フラクションとなった。素通り画分はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製：ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で２０ｍｌまで濃縮した。
素通り画分及びチューブ番号１〜３６の各２０ｍｌのフラクションより０．１ｍｌ取り、２０μｌの５％ＢＳＡを添加後遠心エバポレーションで乾固し、最終的に０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号１７〜２７（プロパノール濃度で３６．０〜４３．０％の範囲）にＴＰＯの活性があり、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰに進める直前まで−８５℃で保存した。低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２
総体積                ２２０ｍｌ
蛋白濃度        ０．０１３０ｍｇ／ｍｌ
総蛋白質量          ２．８５ｍｇ
相対活性            １３００００
相対活性量          ３７１０００
（９）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマトグラフィー＞
（８）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち２１４．９ｍｌ（総蛋白質量２．７９ｍｇ，蛋白濃度０．０１３０ｍｇ／ｍｌ，相対活性１３００００，相対活性量３６３００）に、５０％グリセロールを０．６ｍｌ加え、１．８ｍｌまで濃縮した。最終的に体積５ｍｌで、プロパノール濃度は２０％以下、グリセロールは約６％であった。
これを５回（各回の注入蛋白質量０．５５５ｍｇ，体積１ｍｌ）に分けて実施した。毎回ごとに、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ）展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、１５％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径  ６ｍｍ、ベッド高  ２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注入した。
注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で展開した。最後の回に、蛋白を含まない同じ組成の溶液１ｍｌを注入、展開し、カラム内に残存するＴＰＯ活性の回収を行った。合計６回分同じポリプロピレン製チューブに集めたため、各フラクションは、７．２ｍｌずつ４４本となった。
このうち３０μｌ  （２４０分の１フラクション）を取り２０μｌの５％ＢＳＡを加え、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に０．２４ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号２８〜３３（プロパノール濃度で３７．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活性があったため、これを低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。
低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ
総体積            ４３．２０ｍｌ
蛋白濃度      ０．００８６３ｍｇ／ｍｌ
総蛋白質量        ０．３７３ｍｇ
相対活性            ８０００００
相対活性量          ２９８４００
（１０）Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａ＜最終の逆相クロマトグラフィー＞    （９）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活性画分ＦＡ４３．２０ｍｌのうち４３．１２ｍｌ（総蛋白質量０．３７２ｍｇ，蛋白濃度０．００８６３ｍｇ／ｍｌ，相対活性８０００００，相対活性量２９７６００）に、０．２ｍｌの５０％グリセロールを加え、０．１ｍｌのグリセロール溶液となるまで濃縮した。
これに展開溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）：展開溶媒Ｂ（０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）＝８５；１５  （１５％Ｂ）の溶液２ｍｌを加えて、最終的に、体積２．１ｍｌ）プロパノール濃度が約１４％、グリセロールが約４．８％、蛋白濃度０．１７７ｍｇ／ｍｌのサンプルに調製した。これを１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａ  （資生堂製、カタログ番号Ｃ１  ＴＹＰＥ；ＳＧ３００Ａ；直径  ４．６ｍｍ、ベッド高  ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６ｍｌずつ集めた。
各フラクションから、３μｌ  （２００分の１フラクション）を取り２０μｌの５％ＢＳＡを加え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に置換し、オリジナル体積から７５倍希釈したものをアッセイにかけた。
各フラクションから、電気泳動のために１μｌ  （６００分の１フラクション）を取り、遠心エバポレーションし、還元剤を含まないＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファーを１０μｌ加え、９５℃で５分処理した。これを１５−２５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動し、２Ｄ−銀染色試薬・「第一」銀染色キット（第一化学薬品社製、カタログ番号１６７９９７、以下「銀染色キット」と言う）で染色した。分子量マーカーには「第一」・ＩＩＩ低分子量マーカー（第一化学薬品社製、カタログ番号１８１０６１、以下「ＤＰＣＩＩＩ」と言う）を用いた。
以上の分析の結果、チューブ番号３５〜４３（プロパノール濃度で３０．０〜３２．５％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうちチューブ番号３６〜４２（プロパノール濃度で３０．５〜３２．０％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。以上の結果を図２に示した。
蛋白質量をクロマトグラムから推定し、アッセイの結果と合わせて評価すると、総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６００となった。ＴＰＯ活性画分チューブ番号３６〜４２のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが存在することが明らかとなった。しかもこのバンドの分子量は、見かけ上、即ち還元状態での標準分子量蛋白に対し、１７０００〜１９０００の位置にあり、ＴＰＯの候補となる有力なバンドであることがわかった。
（１１）電気泳動ゲルからのＴＰＯ活性の抽出＜１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
ＴＰＯ活性画分ＦＡの分析例
（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＴＰＯ活性画分ＦＡ  ４２００μｌ（総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６００）の内、５．５μｌ  （７６４分の１フラクション）を活性抽出のため、２．５μｌ  （１６８０分の１フラクション）を銀染色のためにそれぞれサンプルチューブに取り、遠心エバポレーションし、還元剤不含のＳＤＳゲル電気泳動サンプルバッファー１０μｌを加え、３７℃１時間処理後、室温で１８時間放置することによりＳＤＳ化した。
分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社１６１−０３０５）、及びＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。これらのサンプルを常法（Ｌａｅｍｍｌｉ）Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０−６８５頁、（１９７０））に従って、マイクロスラブゲルを用いた１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を４℃にて実施した。泳動終了後、直ちに銀染色に付す部分をナイフで切断し固定液に入れ、銀染色キットを用いて銀染色した。
一方、活性を切り出すべき部分を、分子量の全域に渡って、ナイフを用いて幅１．５〜２．５ｍｍの３４本のゲルにスライスし、小林の方法（小林幹彦、生化学、第５９巻、第９号（１９８７））を改良した方法でゲルの破砕を行った。微細な断片に破砕されたゲルに各々０．３ｍｌの抽出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％ＢＳＡ）を加え、４℃で６時間振とうし、抽出を行った。
次に最終濃度２０ｍＭの５００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８を加え、４℃で１時間振とうし、沈殿したＳＤＳを除くためウルトラフリーＣ３ＧＶ  ０．２２μｍフィルター付濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３  ＯＧＶ  ０Ｓ）に移し、１０００ｘｇ（４０００ＲＰＭ）で１５分間遠心し、濾液を回収した。これをウルトラフリーＣ３−ＬＧＣ分子量１００００カット限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦＣ３  ＬＧＣ  ００）に移し３０００ｘｇ（７０００ＲＰＭ）で遠心した。濃縮液が約５０μｌに達した時点で、３００μｌの２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２のバッファーを加え、再び限外濾過を行った。
これを２回繰り返し、残存するＳＤＳを除去した。さらにアッセイ培養液に対し同様な操作を繰り返し、最終的に３００μｌに調製した。これを滅菌し、ＴＰＯ活性を測定した。
このような実験の結果、銀染色で明瞭に検出できた蛋白質は、ＤＰＣＩＩＩマーカーに対し、見かけ上の分子量約１７０００〜１９０００、  １４０００、１１０００の３種であった。
Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１カラムのＴＰＯ活性画分の電気泳動で、活性の強さと、染色されたバンドの濃さが相関する見かけ上の分子量が約１７０００〜１９０００のバンドが観察できたが、本実験においてもＴＰＯ活性が検出された見かけ上の分子量は約１７０００〜１９０００であった。以上の結果を図３に示した。
以上の結果、ＴＰＯ活性を示す蛋白質は、最終的に電気泳動ゲル上で確認可能なまでにＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａカラムの活性画分中に精製されたと確認できた。
このサンプルを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（非還元下）して銀染色されたバンドの濃さから、全ＴＰＯ活性画分中の見かけ上の分子量約１７０００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約１．７μｇであった。
以下（１２）〜（１５）に高分子ＴＰＯ標品Ｆ２の精製の各ステップについて述べる。
（１２）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ＜逆相クロマトグラフィー＞
（７）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２（総蛋白質量２５７ｍｇ，蛋白濃度０．８９４ｍｇ／ｍｌ，相対活性７８４０，相対活性量２０１５０００、総体積２８７ｍｌ）に展開溶媒Ａ（０．０２５％  ＴＦＡ）およびサンプルの３分の１容の９５．８ｍｌの展開溶媒Ｂ（０．０２５％  ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加え、最終体積３８３ｍｌ、最終プロパノール濃度約２５％、ＴＦＡ濃度０．００６％、蛋白濃度０．６７１ｍｇ／ｍｌとした。ここで不溶物の発生があったので、遠心後の上清のみを６２．３ｍｌ（４２．８ｍｇ）ずつ６回に分けて、予め３０％Ｂで平衡化してあったＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社製、カタログ番号Ａ−ＰＲＲＰ−３３−０３−１５；直径  ３ｃｍ、ベッド高  ７．５ｃｍ）カラムに流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。沈殿物は５ｍＭのＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５を１０ｍｌ加えて可溶化できたので、合わせてカラムに送り込んだ。
それぞれサンプルを注入した後、約５０ｍｌの溶媒（展開溶媒Ａ：展開溶媒Ｂ＝３：１）を通液し、素通り画分を集めた後、展開プログラム（１２０分の３０％Ｂから４５％Ｂの直線濃度勾配）を開始し、１５ｍｌずつ合計２４本のフラクションをポリプロピレン製チューブに集め取った。１回目から６回目まで同じ様に繰り返し、最終的に９０ｍｌずつのフラクションが２４本となった。素通り画分とチューブ番号１はそのまま限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）で９０ｍｌまで濃縮した。
素通りを含むチューブ番号１から２４までのフラクションより０．３ｍｌ取り、１０μｌの５％ＢＳＡを添加後遠心エバポレーションで乾固し、最終的に０．３ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号１０〜１５（プロパノール濃度で３４．０〜３９．５％の範囲）にＴＰＯの活性があり、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。次のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰに進める直前まで、−８５℃で保存した。
高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２
総体積                ５４０ｍｌ
蛋白濃度          ０．０２１ｍｇ／ｍｌ
総蛋白質量          １１．４ｍｇ
相対活性            ２２７０００
相対活性量        ２５８８０００
（１３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ＜ＣＨＡＰＳ存在下でのゲル濾過クロマトグラフィー＞
（１２）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち、５３８．２ｍｌ（総蛋白質量１１．３ｍｇ，蛋白濃度０．０２１ｍｇ／ｍｌ，相対活性２２７０００，相対活性量２５６５０００）に５０％グリセロールを０．６ｍｌ添加後、遠心エバポレーション濃縮した。次に、６ｍｌの２０ｍＭ  ＣＨＡＰＳを加えた。さらに、１８ｍｌの２０ｍＭ  ＣＨＡＰＳを加え攪拌し、４℃に移し、４１時間後に最初のサンプルをＨｉＬｏａｄ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−１０７０−０１；直径  ２．６ｃｍ、ベッド高  ６０ｃｍ）カラムに注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含むＤＰＢＳで展開した。一回に４ｍｌ（蛋白濃度０．４６６ｍｇ／ｍｌ，蛋白質量１．８６ｍｇ）のサンプルをカラムに注入した。
６回目に分けてカラムで展開し、全てのＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのＴＰＯ活性画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムで分取した。フラクションは５ｍｌずつ６回分、即ち合計３０ｍｌのフラクションが４５本となった。
それぞれのフラクションより０．１ｍｌ取り、１０μｌの５％ＢＳＡを添加後、遠心エバポレーションで乾固し、最終的に０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に溶解し、アッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号１３〜３１（分子量で７８０００〜３０００の範囲）にＴＰＯの活性があったため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２とした。
高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２
総体積                  ５４０ｍｌ
蛋白濃度        ０．００２１６ｍｇ／ｍｌ
総蛋白質量            １．１７ｍｇ
相対活性            １７５００００
相対活性量          ２０４１０００
（１４）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ＜逆相クロマトグラフィー＞
（１３）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（分子量７８０００〜３０００）５４０ｍｌのうち、５１３．２ｍｌ（総蛋白質量１．１１ｍｇ，蛋白濃度０．００２１６ｍｇ／ｍｌ，相対活性１７５００００，相対活性量１９４３０００）に１０分の１容の展開液Ｂ（０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）を加えた後、展開溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）と展開液Ｂを用いて１５％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ  （ＹＭＣ社製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径  ６ｍｍ、ベッド高  ２５０ｍｍ）カラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまでの６５分の直線濃度勾配で展開した。
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰカラムに進めるにあたり、全インプットサンプルの２０分の１をまずパイロット的に進め、活性が良好に回収できることを確認できた。そこで、残りの２０分の１９を２回に分けて分取した。つまり合計３回の展開をおこなった。計３回分で分取された各フラクションを同じポリプロピレン製チューブ４４本に集めたので、合計３．６ｍｌずつとなった。
このうち５μｌ  （７２０分の１フラクション）を取り、最終的に０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に置換した。アッセイの結果、チューブ番号２４〜３０（プロパノール濃度で３６．０〜４２．０％の範囲）に極めて強いＴＰＯの活性があったため、これを高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰのメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。
高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇのＴＰＯ活性画分ＦＡ
総体積            ２５．２０ｍｌ
蛋白濃度        ０．０２４６ｍｇ／ｍｌ
総蛋白質量        ０．６２０ｍｇ
相対活性            ７０００００
相対活性量          ４３４０００
（１５）Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａ＜最終の逆相クロマトグラフィー＞
（１４）で得られた高分子ＴＰＯ標品Ｆ２由来のＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰのＴＰＯ活性画分ＦＡ２５．２０ｍｌのうち、２４．６６ｍｌ（総蛋白質量０．６０６ｍｇ，蛋白濃度０．０２４６ｍｇ／ｍｌ，相対活性７０００００，相対活性量４２４０００）に、０．４ｍｌの５０％グリセロールを加え、遠心エバポレーションで濃縮した。
最終的に、プロパノール濃度は数％、グリセロールは１０％、蛋白濃度０．３０３ｍｇ／ｍｌの２ｍｌのサンプルとなった。展開溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）、展開溶媒Ｂ（０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノール）を用いて、１５％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１３００Ａ（資生堂  カタログ番号Ｃ１  ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径  ４．６ｍｍ、ベッド高  ２５０ｍｍ）カラムに注入し、２７％Ｂから３８％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで展開し、ポリプロピレン製チューブ７２本に０．６ｍｌずつ集めた。
各フラクションから、０．７５μｌ  （８００分の１フラクション）を取り、２０μｌの５％ＢＳＡを加え、最終的に２２５μｌのＩＭＤＭアッセイ培養液に置換し、オリジナル体積から３００倍希釈したものをアッセイにかけた。
各フラクションから、電気泳動のために２μｌ  （３００分の１フラクション）を取り、遠心エバポレーションし、１０μｌの還元剤を含まないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファーを加え、９５℃で５分処理した。これを１５〜２５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動し、銀染色キットで染色した。分子量マーカーにはＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。
以上の分析の結果、チューブ番号３３〜３９（プロパノール濃度で２９．５〜３１．５％の範囲）に明らかにＴＰＯの活性があった。このうち、チューブ番号３４〜３９（プロパノール濃度で３０．０〜３１．５％の範囲）をメインのＴＰＯ活性画分ＦＡとした。メインのＴＰＯ活性画分のＳＤＳゲル電気泳動像を調べてみると、（１０）に述べた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３から出発したものと同じく見かけ上１７０００〜２２０００の分子量範囲に、活性の強さと、染色された濃さが相関するバンドが存在することが明らかとなった。
＜実施例２＞
ラット精製ＴＰＯの部分アミノ酸配列の分析
岩松の方法（岩松ら、新基礎生化学実験法、第４巻、３３〜８４頁（丸善刊）；岩松明彦、生化学、第６３巻、第２号、１３９−１４３頁、（１９９１）  ；Ａｋｉｈｉｒｏ  Ｉｗａｍａｓｔｕ、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第１３巻、１４２−１４７頁、（１９９２））により、実施例１の（１０）で得られたＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００ＡカラムのＴＰＯ画分ＦＡ中のラットＴＰＯ候補タンパク質のアミノ酸配列の分析を行った。即ち、サンプルをＳＤＳゲル電気泳動し、電気的にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜上の蛋白質を還元Ｓ−アルキル化した後、系統的、段階的に３種のプロテアーゼで限定酵素分解し、ペプチドフラグメント化し、これを逆相クロマトグラフィーで分離精製し、得られたペプチドを高感度アミノ酸配列決定法により分析した。以下にその詳細を述べる。
低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来のＣａｐｃｅｌｌ  ＰａｋＣ１  ３００ＡのＴＰＯ画分ＦＡのＴＰＯ候補蛋白質の分析例
（１）Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００ＡカラムのＴＰＯ画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）の濃縮
実施例１の（１０）で得られた低分子ＴＰＯ標品Ｆ３由来の、ＣａｐｃｅｌｌＰａｋ  Ｃ１３００ＡカラムのＴＰＯ活性画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）４２００μｌ（総蛋白質量３９．６μｇ，蛋白濃度９．４μｇ／ｍｌ，相対活性４８９００００，相対活性量１９３６００）のうち、４１５１μｌ（全フラクションの９８．８％）をアミノ酸配列のための分析に進めた。クロマトグラムから推定される蛋白質量は３９．１μｇであるが、このうちＳＤＳゲル電気泳動で銀染色された見かけ上の分子量約１７０００〜１９０００のＴＰＯ候補蛋白質の量は、約１．６μｇであった。
このサンプルにグリセロールを添加し、遠心エバポレーションで濃縮し、５μｌのグリセロール溶液とした。これに還元剤を含まないＳＤＳ電気泳動サンプルバッファー、及びｐＨを調整するために１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８を加え、最終的に、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１．１％ＳＤＳ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０２％ＢＰＢ，３０％グリセロールを含む約２５μｌのサンプルにした。
このサンプルを過度に加熱することなく十分にＳＤＳ化するために、まず室温に１４時間置き、次に６０℃で５分処理した。
（２）電気泳動
常法に従って、マイクロスラブゲル（４．０％アクリルアミド濃縮ゲル、１５％アクリルアミド分離ゲル）を調製し、ＳＤＳゲル電気泳動を室温下で１２．５ｍＡ）次いで１７．５ｍＡの一定電流にて２時間かけて実施した。分子量マーカーには、プレステインド・ローレンジマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社１６１−０３０５）、及びＤＰＣＩＩＩマーカーを用いた。泳動終了後直ちＰＶＤＦ膜に転写した（次項）。
また、分析に付したサンプルの一部を、非還元のまま、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元化し、１５〜２５％ポリアクリルアミドプレキャストゲル（第一化学薬品社製；マルチゲル１５／２５、カタログ番号２１１０７２）で電気泳動した。これを銀染色キットを用いて銀染色したところ、ＴＰＯと期待されたバンドは、還元下において分子量約１９０００であり、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００ＡカラムでのＴＰＯ活性画分中のＴＰＯ候補蛋白質の純度が、数％程度であることが確認できた。また非還元・還元それぞれの移動度が異なるため、分子内部に少なくとも一つ以上のＳ−Ｓ結合を持つことが示唆された。
（３）ＰＶＤＦ膜へのエレクトロブロット法による転写・バンドの検出
セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転写装置モデルＫＳ−８４６０）を用いて、常法に従い、１６０ｍＡ（１１〜１７Ｖ）の一定電流で１時間かけてＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｏＢｌｏｔｔ、カタログ番号４００９９４）に転写を行った。陽極液に、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ，２０％メタノール，ｐＨ１０．４、転写膜液に、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％メタノール，ｐＨ１０．４、陰極液に、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ４０ｍＭアミノカプロン酸，２０％メタノール，ｐＨ１０．４を用いた。
転写された膜をポンソーＳ染色液（１００ｍ１中０．１ｇのポンソーＳと１ｍ１の酢酸を含む）で染色したところ、複数のバンドが染色され、この中にＴＰＯと期待された分子量約１９０００のバンドを確認することができた。これを切り出し、ペプチドの断片化に進めた。（次項）
（４）ペプチドフラグメント化とペプチドマッピング・アミノ酸配列分析
ＰＶＤＦ膜上に転写・還元Ｓ−アルキル化されたＴＰＯ候補蛋白質の断片化を系統的に行うために、次の三つのプロテアーゼにより、段階的に限定的酵素分解を行った。
一次消化  リシルエンドペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ  ｍ４９７−１、和光純薬工業製、カタログ番号１２９−０２５４１）二次消化  エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号１０５４５８９）
三次消化  トリプシン−ＴＰＣＫ  （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製、カタログ番号３７４０）
各々の酵素消化で得られたペプチド断片を回収し、展開溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ）展開溶媒Ｂに０．０２％ＴＦＡを含むイソプロパノール：アセトニトリル＝７：３の混液を用いて、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  Ｃ１８逆相カラム（和光純薬工業製；直径２，０ｍｍ）長さ１５０ｍｍ）で、カラム温度３０℃、流速０．２５ｍｌ／分、１％Ｂから５０％Ｂを３０分の直線濃度勾配にて展開することによりマッピング（図４）し、得られたペプチドフラグメントを回収した。それぞれのペプチドフラグメントを気相アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−２）にてエドマン分解後、順次回収されたＮ末端のＰＴＨアミノ酸を、アイソクラティック溶出法によるＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーにて同定を行った。この結果を次にまとめた。
一次消化  リシルエンドペプチダーゼによるペプチド断片のアミノ酸配列
フラグメント名  アミノ酸配列
【表３】
0003635142.tif 000004
【表４】
0003635142.tif 000005
【表５】
0003635142.tif 000006
以上の配列のうち、（）付きで示したものは、系統的酵素消化から演鐸推定しうるアミノ酸残基である。
（５）得られたアミノ酸配列の類似性分析＜ホモロジーサーチ＞
得られたアミノ酸配列が、すでに報告されている既知の蛋白質に含まれているかどうか、あるいは、類似配列をもつ蛋白質があるかどうかについて、配列解析ソフトウエアであるマックベクター（Ｋｏｄａｋ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。既知蛋白質あるいは既知遺伝子の情報は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６データベース（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）１９９３年８月１５日発行）を利用した。これに含まれる各種データベースは以下の通りである。
Ｅｎｔｒｅｚ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６データベース
ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ，Ａｕｇｕｓｔ  １５，  １９９３（Ｒｅｌｅａｓｅ７８．０）ＥＭＢＬ，Ｊｕｌｙ  １５，１９９３（Ｒｅｌｅａｓｅ３５．０  ｐｌｕｓ  ｕｐｄａｔｅｓ）ＤＤＢＪ，Ｊｕｌｙ  １５，１９９３
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ，Ａｐｒｉｌ，１９９３（Ｒｅｌｅａｓｅ  ２５．０）
ＰＩＲ，Ｊｕｎｅ  ３０，１９９３（Ｒｅｌｅａｓｅ  ３７，０）
ＰＤＢ，Ａｐｒｉｌ，１９９３
ＰＲＦ，Ｍａｙ，１９９３
ｄｂＥＳＴ，Ｊｕｌｙ  １５，１９９３（Ｒｅｌｅａｓｅ  １．１０）
Ｕ．Ｓ．ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｐａｔｅｎｔｓ（一部）
この結果、ＡＰ１２の配列（Ｋ）ＤＳＦＬＡＤＶＫは、ラットのＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ  （ＣＢＧ）ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［ＰＩＲデータベース登録番号  Ａ４００６６；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｏｎｄ：“Ｒａｔ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ；ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｕｎｄｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．”  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．．  （１９８９），３，４２０−４２６，］の内部配列ＫＤＳＦＬＡＤＶＫと完全一致した。
さらによく調べてみると、ＡＰ３の配列（Ｋ）ＸＹＹＥＳＺ（（ＸはＡ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｑのどれか）、（ＺはＥまたはＫ））と類似性の高いＫＱＹＹＥＳＥという配列が、ラットＣＢＧのアミノ酸配列に含まれていることが判明した。これらのＡＰ１２、ＡＰ３に相当する配列はラットＣＢＧでは連続しており、ＫＤＳＦＬＡＤＶＫＱＹＹＥＳＥという内部アミノ酸配列に相当する。
しかしながら、ＡＰ１２、ＡＰ３以外のフラグメントのアミノ酸配列に関しては、類似性を考慮すべき既知の蛋白質や遺伝子は見つからなかった。
＜実施例３＞
血小板減少症ラット血漿由来ＴＰＯの生物学的特性分析
（１）  ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系（液体培養系）において
代表例として、血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品（実施例１の（８）に記載したＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰカラムＴＰＯ活性画分Ｆ２）を用いた場合の用量反応曲線を図５に示した。培養を経時的に顕微鏡下で観察したところ、日を追って巨核球の分化、成熟の進行、即ち細胞サイズの増大が認められ、おそらく、細胞の増加も起こっていることと思われた。特に顕著な変化として、培養最終日の４日目に数多くの巨核球による突起形成が認められた（培養３日目ではほとんど認められない）。この突起形成は、ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＬｅｖｅｎとＹｅｅ、  Ｂｌｏｏｄ、６９巻、１０４６−１０５２頁、（１９８７））、あるいは、ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （Ｔｏｐｐら、Ｂｌｏｏｄ７、７６巻、９１２−９２４頁、（１９９０））などと呼ばれ、巨核球からさらに分化の進んだ血小板の前駆構造体であり、現在までのところｉｎｖｉｔｒｏで観察できる巨核球分化の最終形態と考えられている。ＴＰＯ標品単独でこのような形態変化が高い頻度で認められたことから、本因子は単独でＣＦＵ−ＭＫの増殖・分化を促進し、成熟巨核球を生成させ、さらに最終的に血小板産生まで進行させる可能性が考えられる。
（２）  コロニーアッセイ系において
血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品について、ラットの非分離骨髄細胞、分離・濃縮各段階の細胞、あるいはＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫ画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ラット血漿由来のＴＰＯは、巨核球コロニーを形成させた。ＴＰＯによって形成される巨核球コロニーと他の既知サイトカイン、即ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、あるいはヒトＥＰＯによって形成される巨核球コロニーを比較すると、ＴＰＯによって形成される巨核球コロニーには、個々のコロニーを構成する巨核球数は少ないが、各々の巨核球のサィズが大きい、即ち成熟度が進んでいるという特徴がある。さらに、他の細胞系統のコロニーはほとんど形成されず、ＴＰＯが示すＭｅｇ−ＣＳＦ活性は巨核球特異的な活性と考えられる。これらのことから、ＴＰＯは、本コロニーアッセイ系においてＭｅｇ−ＣＳＦ活性を発揮する他の既知サイトカイン、即ち、ラットＩＬ−３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、あるいはヒトＥＰＯとは、生物学的特性を異にし、ユニークなＭｅｇ−ＣＳＦ活性を発揮することが明白となった。
ヒト骨髄細胞、あるいはヒト瞬帯血細胞由来のＣＤ３４＋ＤＲ＋細胞画分に対しても血小板減少症ラット血漿からのＴＰＯ部分精製標品はＭｅｇ−ＣＳＦ活性を示し、有意な数のヒト巨核球コロニーを形成させた。このことは本因子に種特異性のないことを示している。
＜実施例４＞
ラットＴＰＯ産生細胞の特定化
（１）  ラットＴＰＯ産生臓器の探索
まず、ラットＴＰＯの部分アミノ酸配列に基づくラットＴＰＯ遺伝子のクローニング、あるいは発現クローニングのためのｍＲＮＡ供給源を確保する目的で、ラットＴＰＯ産生臓器の探索、特定化を行った。当初、Ｐ５５抗体投与により血小板減少症にしたラットから経時的に骨髄、肺、肝臓、脾臓を摘出し、その細胞（肺、肝臓の場合は臓器切片）の培養上清を採取し、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて上清中の活性を評価したが、明確な結果は得られなかった。続いて、ラットにおける肝臓とＴＰＯ産生との関連性を示唆する報告（Ｓｉｅｍｅｎｓｍａら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８６巻、８１７−８３３頁、（１９７５））を考慮して、Ｐ５５抗体投与により血小板減少症にしたラットの肝臓からコラゲナーゼかん流法にて調製した肝細胞を培養し、その上清からＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに吸着した画分をＶｙｄａｃ  ｐｈｅｎｙｌ逆相カラムに展開したところ、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にてラット血漿由来ＴＰＯ活性と同じ位置に極めて類似した活性が認められた。正常ラット肝細胞の培養上清からも弱いながらも活性が認められた。これらの結果から、肝臓がＴＰＯ産生臓器の１つである可能性が強く示唆された。
（２）  ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニング
上記の結果を基に、ラットＴＰＯ産生細胞株のスクリーニングを行った。まず、２０種類のラット肝臓由来細胞株をそれぞれの継代培養用の培養液中でほぼコンフルエントになるまで培養した後、培養液に含まれる血清を５％ＦＣＳに統一したそれぞれの培養液で置換して、さらに３日間培養を継続し、それぞれの培養上清を採取した。その上清を（１）に記した方法で部分精製して、ＴＰＯ産生の有無を調べたところ、３種類のラット肝実質細胞由来細胞株、即ち、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６０２、Ｂｅｃｋｅｒら、“Ｏｎｃｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ″  ｅｄ．ｂｙ  Ｆｉｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＹ、２５９−２７０頁、（１９７６）、大日本製薬より購入）、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５４８、Ｐｉｔｏｔら、Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．、１３巻、２２９−２４５頁、（１９６４）、大日本製薬より購入）、およびＨＴＣ細胞（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、５６巻、２９６−３０３頁、（１９６６）、大日本製薬より購入）から明らかにＴＰＯ活性の産生が確認された。
（３）  ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、およびＨＴＣ細胞が産生するＴＰＯ活性の詳細な分析
これらの３種類のラット細胞株から分泌されるＴＰＯ活性と平行して精製を進めていたラット血漿由来のＴＰＯ活性を、生化学的性質と生物学的性質の両面からさらに詳細に比較検討した。
ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を１０％ＦＣＳを含むａｌｐｈａ−ＭＥＭ（−）培養液に浮遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用培養プラスティックフラスコに１×１０６個／フラスコになるように入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞を１０％ＦＣＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培養液（グルコース４．５ｇ／ｌ含有）（以下、ＤＭＥＭ培養液）に浮遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用プラスティックフラスコに５×１０５個／フラスコになるように入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。また、ＨＴＣ細胞を５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に浮遊させて、底面積１７５ｃｍ２の組織培養用プラスティックフラスコに２．５×１０５個／フラスコになるように入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日間培養した後、５％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に置き換え、さらに３日間培養し、上清を回収した。
このようにして得た３種類の細胞株の培養上清それぞれ２リットルから、実施例１−２に記載したＸＲＰからのＴＰＯの精製法に従って、細胞株由来ＴＰＯの部分精製を行った。以下に概略を述べる。
まず、限外濾過器により培養上清を約６倍に濃縮した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファー交換した。溶出液をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに添加し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗滌後、吸着画分を１７５ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出した。この画分をＷＧＡ−Ａｇａｒｏｓｅカラムに添加し、ＰＢＳで洗った後、吸着画分を０．２Ｍ  ＧｌｃＮＡｃと０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭＮａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）により溶出した。この溶出液をＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨカラムに添加し、ＩＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）で洗った後、２ＭＮａＳＣＮにより溶出した。これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ／ＬＳカラムに添加し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｌｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ）を含む５０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｐＨ７．２）、次いで０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含む３６ｍＭＮａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅで洗った後、２０ｍＭＮａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）により溶出した。この吸着画分を、濃縮後、逆相ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎＣ４カラム（Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ社製  カタログ番号２１４ＴＰ５１０１５；直径１ｃｍ、ベッド高１５ｃｍ）で分画した。展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０，０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、予めカラムを２０％Ｂで平衡化し、サンプルを注入後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで２０％Ｂから４０％Ｂまで９０分の直線濃度勾配により溶出した。この結果、どの細胞株由来のＴＰＯ活性も、３０％から４３％濃度の１−プロパノールで溶出された。
各精製段階の標品をラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細胞株由来のＴＰＯ活性はいずれもＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と極めて類似した挙動を示した（実施例１−２を参照）（表６に、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での各段階における相対比活性、活性収率などを記載）。さらに、最終段階の逆相カラムからの溶出画分をラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定した結果、３種類の細胞株由来のＴＰＯ活性とＸＲＰ由来のＴＰＯ活性は同じピーク位置に溶出されていた。この逆相カラムの活性画分を中心に、ラットＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ＣＦＵ−ＭＫの分離・濃縮過程の付着細胞除去段階で得られる非付着性細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、いずれもラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での活性の溶出パターンにほぼ一致して巨核球コロニーの形成が認められ（表７）、また、ＸＲＰ由来のＴＰＯ活性と同様に、３種類の細胞株由来の活性はいずれも専ら巨核球コロニーを形成させ、他の系統のコロニーはほとんど形成させなかった。
実施例１−２に記載した方法に従って、プールした逆相カラムの活性画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルから蛋白質を抽出して、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系にて活性測定したところ、ＸＲＰ由来のＴＰＯは見かけの分子量１７０００〜２２０００、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量３３０００〜３９０００、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量３１０００〜３８０００、ＨＴＣ細胞由来のＴＰＯは見かけの分子量１７０００〜２２０００、および分子量２８０００〜３５０００を有していた。
以上のように、ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、およびＨＴＣ細胞が産生するＴＰＯ活性は、ＸＲＰ由来のＴＰＯと比べて、見かけ上の分子量の点で生化学的性質を若干異にするものの、生物学的性質において同等であることが明らかとなった。本発明において、ここで特筆すべきことは、血液中に存在するＴＰＯ活性を持つ分子が、産生細胞において、あるいは産生細胞から分泌後に、分子内の特定な、あるいは不特定な位置で切断されたものである可能性を示唆する。また、ＴＰＯ遺伝子（ｍＲＮＡやｃＤＮＡ）においても様々な長さのものが存在する可能性をも示したものである。
【表６】
0003635142.tif 000007
【表７】
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＜実施例５＞
ｃＤＮＡライブラリー作製用発現ベクター（ｐＥＦ１８Ｓ）の構築
ベクターへのｃＤＮＡ断片の組み込みが容易で、クローニングしたｃＤＮＡの発現効率が高いベクターを作製し、ＴＰＯｃＤＮＡのクロニングと発現に備えた。すなわち、発現効率が高いプロモーターとして知られるエロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）のプロモーターを、扱いやすい発現ベクターｐＭＥ１８ＳのＳＲαプロモーターと入れ替え、発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを構築した（図６参照）。エロンゲーションファクター１αのプロモーターは発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８、５３２２、１９９０）１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで部分的に消化した後、２％アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製；Ｗｉｌｌｉｓら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、  ９、９２−９９、１９９０の方法にもとづいたもので、多孔性シリカベースのマトリックスを利用した吸着により選択的にＤＮＡを精製するキット）を用いて精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇを同様にＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した５０ｎｇの発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、８９５７−８９６１、１９９３）につなぎこんだ。宿主菌にはコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉＤＨ５（東洋紡績社製；Ｈａｎａｈａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、５５７−５８０、１９８３の方法の変法により作製したコンピテントな宿主菌）を用い、得られたコロニー１２個をランダムに選びプラスミドＤＮＡを精製し、それらＤＮＡの制限酵素での消化パターンにより目的のプラスミド（ｐＥＦ１８Ｓ）を含む１０クローンの中から１個を選択し、大量にプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
すなわち、上記のようにして得られたクローンｐＭＥ１８Ｓを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、  ０．５％Ｂａｃｌｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．５％ｌｙｓｏｚｙｍｅ）溶液に懸濁し、８ｍ１の０．２ＮＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノール−クロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。
最後に、ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。このＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで完全に消化後、０．８％のアガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）で泳動し、ベクター断片を回収後プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製しおよそ５５μｇのプラスミドＤＮＡを得た。このＤＮＡを以下のｃＤＮＡライブラリー作製に使用した。
＜実施例６＞
ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞からのｍＲＮＡの精製
実施例４のコロニーアッセイの結果より比較的活性の高かったＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞をラットＴＰＯｃＤＮＡクローニングの材料に選び以下の実験に供した。
全ＲＮＡの単離は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を直径９０ｍｍのシャーレ１５枚に完全に密に増殖させた後、シャーレから培養液を除き、１枚のシャーレ当り０．８ｍｌの５Ｍグアニジン溶液（５Ｍグアニジンチオシアナート、５ｍＭクエン酸ナトリウム  （ｐＨ７．０）、０．１Ｍβ−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル硫酸ナトリウム）を加え、よく懸濁した後１本のチューブに混合液を集め、グアニジン溶液を加えて全量を２０ｍｌとした。この細胞が壊れて粘稠になった混合液は、１８Ｇさらに２１Ｇの注射針を装填した２０ｍｌ容の注射器を用い、粘性がほとんどなくなるまでおよそ２０回吸入排出を繰り返した。ベックマン社製ＳＷ２８ローターに合うポリアロマー製の遠心チューブに１８ｍｌの５．７Ｍ  ＣｓＣｌ−０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）をクッションとして先に加えておき、チューブがほぼ満たされるように上述の混合液約２０ｍｌを層が乱れないように静かに重層した。このようにして調製された遠心チューブを２０℃で２５０００ｒ．ｐ．ｍ．、２０時間遠心した後、得られたペレットを少量の８０％エタノールを用いて２回洗浄した。ペレットはＴＥ溶液に溶解せしめ、フェノール−クロロホルム（１：１）にて抽出後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加えてエタノール沈殿を行い全ＲＮＡを得た（約１０８個の細胞より全ＲＮＡ約２．５ｍｇを得た）。
全ＲＮＡからのポリ  （Ａ）＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（Ｓｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製；ラテックス粒子の表面にオリゴｄＴが共有結合で固定してあり、ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ精製に使われるオリゴｄＴカラムと同様にポリ  （Ａ）＋ＲＮＡの精製ができる）を用いて行った。全ＲＮＡ約５００μｇより２０μｇのポリ  （Ａ）＋ＲＮＡを得た。
＜実施例７＞
ラットｃＤＮＡライブラリーの構築
実施例５で得られた５μｇのポリ  （Ａ）＋ＲＮＡからＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、２、１６１−１７０、１９８２、の変法によるｃＤＮＡ合成法のキット）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＯＯＬＢＯＸ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；ＮｏｔＩ配列を含むｃＤＮＡ合成のためのプライマー：  ５′−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ（Ｔ）１８−３′並びにＥｃｏＲＩ配列付加用アダプター：５′−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−３′および５′−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−３′のセット）を用いて、５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏｔＩ認識部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは１．２μｇの予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓ（実施例５参照）と連結させ、８．４ｍｌのコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  （東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、５．３×１０５個の形質転換体が得られた。＜実施例８＞
ＰＣＲ法によるラットＴＰ０ｃＤＮＡ断片の取得（クローニング）
実施例７で作製したＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライブラリー５３万クローンを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体からＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１００  （ＤＩＡＧＥＮ社製；ＤＮＡ精製用シリカゲルベースの陰イオン交換カラム）を用いてＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライブラリープラスミドを精製し、約２００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。
実施例２に記載のペプチド断片ＡＰ８のアミノ酸配列に対応する２種類のアンチセンスヌクレオチドプライマーＡＰ８−１Ｒ，ＡＰ８−２Ｒ、及びｃＤＮＡライブラリー作製に用いた図６に示したプラスミドベクターｐＥＦ１８Ｓのヒトエロンゲーションファクター１αの第１イントロンに対応するセンスヌクレオチドプライマーＥＦ１α−１，ＥＦ１α−２を合成した。合成にはアプライドバイオシステムズ社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（β−シアノエチルアミダイト法にもとづく合成機）を使用し、同社製の合成ＤＮＡ精製用ＯＰＣカラム（逆相シリカゲルを充填したカラムでトリチル基を持つ合成ＤＮＡを精製するカラム）を用いて精製した。精製した合成ＤＮＡはＴＥ溶液に５０μＭとなるように溶解し、使用時まで−２０℃に保存した。以下用いる合成オリゴヌクレオチドは全て同様に合成並びに精製して使用した。
プライマーＡＰ８−１Ｒ，ＡＰ８−２Ｒは、連続した１７個のヌクレオチドからなる混合型プライマーであり、タカハシらの研究にあるようにデオキシイノシンを使用した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）８２，１９３１−１９３５（１９８５））。
プライマーＥＦ１α−１，ＥＦ１α−２は、Ｕｅｔｓｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６４，５７９１−５７９８（１９８９）にあるゲノム配列の１４９１−１５１２、１５１３−１５３２に相当する塩基配列を基にして合成したそれぞれ２１、２０個のヌクレオチドからなるプライマーである。合成したプライマーの配列を表８に示す。
【表８】
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ＭｃＡ−ＲＨ８９９４ｃＤＮＡライブラリープラスミド３μｇを鋳型とし、ＡＰ８−１Ｒ（５００ｐｍｏｌ）、ＥＦ１  α−１（１００ｐｍｏｌ）をプライマーとして、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造社製；ＰＣＲ用耐熱性Ｔａｑいポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰのセット）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製；ＰＣＲ用反応機）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。増幅されたＤＮＡ断片の特異性を上げるために、得られたＰＣＲ反応液１μｌを鋳型とし、ＥＦ１α−２（１００ｐｍｏｌ）、ＡＰ８−２Ｒ（５００ｐｍｏｌ）をプライマーとして、同様に１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。
ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である約３３０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いてｐＣＲＴＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；ＰＣＲ産物ＴＡクローニング用ベクター：ＰＣＲに使用する耐熱性ポリメラーゼが末端トランスフェラーゼ活性を有するために、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの３’末端にデオキシアデニル酸を１個付加する性質を利用し、５’−ｄＴ突出末端を持つベクターｐＣＲＴＭＩＩにそのままサブクローニングする方法）ベクターにサブクローンした。任意に選択した２８クローンについてＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ１００（ＤＩＡＧＥＮ社製）を使用してプラスミドＤＮＡを精製し、これをＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製；ＰＣＲを利用した、蛍光色素で行なうジデオキシ法：Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７、１９７７）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサー（蛍光シークエンサー）によりシークエンスし、各クローンの塩基配列を決定した。
得られたＤＮＡ断片の中で、ＡＰ８のアミノ酸のＮ末端側３個（Ｉｌｅ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）  −Ｖａｌ−ＰｒｏをＡＰ８−２Ｒのプライマーに隣接してコードするものを選択し、全長をシークエンスしたところ、２６ｌｂｐを有するｃＤＮＡを含んでいた。
このｃＤＮＡ断片の１７３〜１７５の塩基配列はメチオニンをコードするものでありコーディングのフレームはＡＰ８のアミノ酸のフレームと一致した。またこの配列の前後はＫｏｚａｋの配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ，４４，２８３−２９２、１９８６）に適合することから翻訳の開始部位と推定され、ラットＴＰＯタンパク質のＮ末部分をコードするｃＤＮＡ断片と考えられた。このｃＤＮＡ断片をＡ１と命名した。ベクターの配列を除いたＡ１断片の塩基配列およびそれから演鐸されるアミノ酸配列を配列表（配列番号１）に示した。
＜実施例９＞
ＰＣＲ法によるラットＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング
前述のｃＤＮＡライブラリーを約１万クローンづつのプールに分け、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．０；アルカリＳＤＳ法：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９］  ：の変法にもとづくプラスミドＤＮＡ自動抽出機）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。その１／３０量を鋳型としてフラグメントＡ１をもとに設計した２種の合成オリゴヌクレオチド
５’  ＣＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧ３’  （配列番号１の配列の１−１７のセンス配列；ＣＧＡＧはアダプターの配列）および
５’  ＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧ３’  （配列番号１の配列の２１２−２３２のアンチセンス配列）
をプライマーとして合成・精製し、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）によりＰＣＲ反応（９４℃で３０秒間の変性条件、６６℃で３０秒間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応）を行った結果、１００プール中３プールに２３６ｂｐの特異的バンドが検出された。このうちの１プールを約９００クローンづつのプールに分けプラスミドＤＮＡを抽出し、同様のＰＣＲ反応を行ったところ、１００プール中３プールにバンドが検出された。さらにこのうちの１プールを４０クローンづつのプールに分け、同様の選別を行なった結果１００プール中３プールで特異的と考えられるバンドが観察された。これらのうち１プールを選び５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート（１５％アガーを含むＬＢ培地）上に蒔き、出現した１つ１つのコロニーについてプラスミドＤＮＡを抽出し同様のＰＣＲ反応を行った結果、１００クローン中２クローンで陽性バンドを検出した。
＜実施例１０＞
ラットＴＰ０ｃＤＮＡのシークエンス
プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。
実施例９で最終的に得られた２個のクローンを５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、実施例５と同様に精製し、最終的に約３００μｇのプラスミドＤＮＡを得た。
ここで得られたプラスミドＤＮＡをＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、実施例８と同様にシークエンスし、ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。その結果、２個のクローンの塩基配列は完全に一致し同一のクローンであることが明かとなった。この中から１クローンを選び該ｃＤＮＡを担持したプラスミドクローンをｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αと命名した。塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示した。
配列表（配列番号２）に示す配列の特徴は顕著である。１７２ｂｐの５’非翻訳領域後の配列は、メチオニンに始まる２１個のタンパク質から成る分泌のためのシグナル配列と推定される、疎水性に富むアミノ酸をコードしている。このタンパク質は１２６個のアミノ酸残基を有し、停止コドン（ＴＡＡ）の後に１０２２塩基の３’非翻訳配列及びポリＡ尾部の多数のアデニンが続く。このタンパク質中には、実施例２で解析された部分アミノ酸配列ＡＰ８に対応する配列のみが含まれていた（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１２）。Ｎ−グリコシル化のための配列部位は存在しない。また、３’非翻訳配列末端近くの１６２４〜１６２９の塩基配列は、コンセンサス配列とは異なるが、潜在的ポリアデニル化配列と考えられる。
大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αは１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５６５として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８３として寄託した。
＜実施例１１＞
ラットＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｏｍｐａｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８巻、７５７５−７５７８頁、（１９８１）  ；Ｌｕｔｈｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１巻、１２９５−１３０８頁、（１９８３））に若干の改変を加えた以下の方法に従い実施した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に浮遊させたＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）を直径１００ｍｍの組織培養用プラスティックシャーレに入れ、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で約４０％コンフルエントになるまで培養した。一方、５００μｇ／ｍｌ（７）ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社）、８０μＭのクロロキン（シグマ社）、８％（ｖ／ｖ）のＨＢＳ  （２１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１）及び９％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（コラボレイティブ社）を含む４ｍｌのＤＭＥＭ培養液に３０μｌのＨＢＳに溶解したプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２α（１０μｇ）を混和し、トランスフェクション直前にＤＭＥＭ培養液で２度洗浄した上記のＣＯＳ１細胞に添加した後、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で５時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しＤＭＥＭ培養液でシャーレを２度洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液を１５ｍｌ加え、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で３日ないしは５日間培養し、培養上清を回収した。
得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図７）、また、ラットＴＰＯの場合と同様に培養４日目に多数のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ形成が認められた。一方、インサートを含まないプラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活性は検出されなかった（図７）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中に用量依存的にＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められ、インサートを含まないプラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αがＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を担持していることが確認された。
次に、このＴＰＯ活性の血小板増加作用を調べるため、部分精製品を調製した。
調製過程でのＴＰＯ活性測定には、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系を用いた。まず、プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞を、０．２ｍｇのＢＳＡを含む無血清培養液で３日間培養し、約５．８Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養上清に、ｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭ加え、０．２２μｍの濾過フィルターで通過する濾液をとった。この体積５７９３ｍｌ（蛋白質濃度０．２２９ｍｇ／ｍｌ）総蛋白質量１３２６ｍｇ、相対活性１０００、相対活性量１３２６０８０）に対し１０００ｍｌ当り０．８５ｍｏｌｅｓのＮａＣｌ（合計２８８ｇ）を加え、最終濃度０．８２２Ｍ  ＮａＣｌ，５８４９ｍｌの溶液とした後、１Ｍ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．２で予め平衡化してあったＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨカラム（トーソー社製、カタログ番号０８７０５  ；直径５ｃｍ、ベッド高  ６ｃｍ）に、流速７ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、２０ｍＭＮａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  １Ｍ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．２で溶出される素通り（約７９００ｍｌ）を集め、これを限外濾過ユニット（フィルトロン社・オメガウルトラセット  分子量８０００カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（４６０ｍｌ，蛋白質濃度２．１１ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量９７３ｍｇ，相対活性１６．３）を得た。次に、溶出液を２Ｍ  ＮａＳＣＮにかえ、溶出されたＴＳＫ−ｇｅｌ  ＡＦ−ＢＬＵＥ  ６５０ＭＨ吸着ＴＰＯ活性画分Ｆ２（２８４０ｍｌ）を限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径７６ｍｍ）を用いて、６．８１ｍｌまで濃縮した。このＴＰＯ活性画分Ｆ２の総蛋白質量は１２．５ｍｇ、このステップでのＦ２の蛋白質収量は０．６２％であった。また、ＴＰＯの相対活性は、２４０であった。次に、ＨｉＬｏａｄ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−１０７１−０１；直径  ２，６ｃｍ、ベッド高  ６０ｃｍ）カラムに注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｎａ  Ａｃｅｔａｔｅ，  ｐＨ５．５で展開した。展開開始後に溶出した１９４ｍｌから２６０ｍｌまでの範囲の画分にＴＰＯ活性が確認できた。そこで、これをまとめて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇのＴＰＯ活性画分Ｆ２（６６ｍｌ，蛋白質濃度０．１１２ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７．４１ｍｇ，相対活性１４２８６０、相対活性量１０５８６００）とした。次に、展開溶媒Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ  Ａｃｅｔａｔｅ，  ｐＨ５．５）および展開溶媒Ｂ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｐｈａｔｅ，ｐＨ７．２）を用意し、１００％Ａで平衡化した強陽イオン交換カラムのＲＥＳＯＵＲＣＥＳ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−１１７８−０１：直径  ０．６４ｃｍ、ベッド高  ３ｃｍ）カラムに、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、注入した。次いで、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで、４０分かけて１００％Ａから１００％Ｂまでの直線濃度勾配にて展開した。アッセイの結果、広い範囲（５％Ｂから３２％Ｂの範囲）にＴＰＯ活性が溶出されていることが分かった。このＴＰＯ活性画分をまとめて、限外濾過ユニット（アミコン社製；ＹＭ３膜、直径２５ｍｍ）で濃縮し、ＲＥＳＯＵＲＣＥＳのＴＰＯ活性画分Ｆ２（１．６５ｍｌ，蛋白質濃度４．７４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７．８２ｍｇ，相対活性７１４００、相対活性量５５８６００）を得ることができた。
得られた標品は純粋なＴＰＯ標品ではなかったが、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系において、十分に高い活性が確認されたので、マウスへの投与実験を実施した。即ち、投与前日に血小板数を測定しておいたＩＣＲ系マウス（９週齢；♂）の皮下へ、ＴＰＯ部分精製品（４７４μｇ（１００μｌ）／マウス／日）、対照としてＢＳＡ  （２００μｇ（１００μｌ）／マウス／日）、あるいは対照としてＴＰＯ部分精製品が溶解されている緩衝液と同じ組成の緩衝液（１００μｌ／マウス／日）を５日間連日投与し、６日目に心臓より採血して血小板数を測定した（Ｆ８００；東亜医用電子）。ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは投与前に比べて平均して約２．１４倍の血小板数の増加を認めた。また、投与群の間で比較すると、ＴＰＯ部分精製品投与マウスでは、ＢＳＡ投与マウスに比べて約１．７４倍、あるいは緩衝液のみを投与したマウスに比べて約１．９０倍の血小板数の増加を認めた。この結果から、ＴＰＯが生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。なお、ＴＰＯ部分精製品投与マウスにおいて、マウスの急性期蛋白質の１種であるｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＡＰ）の増加が認められなかったことから、ＴＰＯは急性期蛋白質の誘導に関してＩＬ−６やＩＬ−１１とは性格を異にすることが強く示唆された。
＜実施例１２＞
ラット各種組織でのＴＰＯｍＲＮＡの検出
ラットＴＰＯｍＲＮＡがラット体内においてどの組織で発現しているかを確認するために、ラットの各種組織よりＲＮＡを抽出した。実施例１に記載されているものと同様にＸ線照射を行なった１１日目ないし１４日目のラット６匹より各種組織（脳、胸腺、肺、肝臓、心臓、脾臓、小腸、腎臓、精巣および骨髄細胞）を摘出し速やかに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡの抽出にはＲＮＡ単離用試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）を使用した。凍結した組織の重量に応じた量のＩＳＯＧＥＮ試薬を加え、ホモジナイザー（ヒスコトロン；日音医理科器械製作所：ＮＳ−６０）により、組織が完全に破砕されるまで（およそ１００００ＲＰＭで４５〜６０秒）処理した後、全ＲＮＡ抽出操作を行なった（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらのＡｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｃｈｒｏｌｏｌｏｒｍ法にもとづく抽出法：Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６−１５９、１９８７を参照）。その結果、それぞれの組織より１．１ｍｇ〜５．６ｍｇの全ＲＮＡが得られた。
全ＲＮＡからポリ  （Ａ）＋ＲＮＡの精製はＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０（Ｓｕｐｅｒ）（日本合成ゴム／日本ロッシュ社製）を用いて行い全ＲＮＡ約５００μｇより２０ｐｇのポリ  （Ａ）＋ＲＮＡを得た。
得られた各種組織のポリ  （Ａ）＋ＲＮＡそれぞれ１μｇよりランダムプラィマーを使用してｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ  １μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分間加温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅランダムプライマー（宝酒造社製）、１０Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩライフテクノロジー社製逆転写酵素）となるようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた後−２０℃で使用時まで保存した。
実施例１０で得られたラットＴＰＯのｃＤＮＡ配列より新たにＰＣＲ用プライマーを合成した。合成したプライマーの配列は以下の通り。
ｒＴＰＯ−Ｉ：５’−ＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ−３’  （配列番号２の３４７〜３６７）
ｒＴＰＯ−Ｎ：５’−ＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣ−３’  （配列番号２の１００５〜１０２５に対応するアンチセンス）
合成したｃＤＮＡ反応液のそれぞれ０．１容を鋳型に用いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ−Ｉ、ｒＴＰＯ−Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。
ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、５７℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ増幅されたバンドを観察したところ、脳、肝臓、小腸並びに腎臓で特異的と考えられるバンドが観察された。この結果より、発現量の多少は判断できないがラットにおいてはこれらの組織でＴＰＯｍＲＮＡが発現していると考えられた。人においても同様な発現様式を示すことが示唆されるが実施例４の結果と合わせて考えると、肝臓がヒトＴＰＯｃＤＮＡ取得のための出発材料としては適当であると判断された。
＜実施例１３＞
ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
実施例１２の結果より、肝臓をヒトＴＰＯｃＤＮＡクローニングのための材料に選び、市販の正常ヒト肝臓由来ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらのＡｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ＰｈｅｎｏｌＣｈｒｏｌｏｆｏｒｍ法にもとづいて抽出したもの）５μｇを用い実施例７と同様にＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）およびＤＩＲＥＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＯＯＬＢＯＸ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用して、５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏｔＩ認識部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは１．２μｇの予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、８．４ｍｌのコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  （東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、１．２×１０６個の形質転換体が得られた。
＜実施例１４＞
ＰＣＲによるヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片の取得（クローニング）
市販の正常ヒト肝臓由来ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｇよりランダムプライマーを使用してｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ  １μｇを１０μｌの滅菌水に溶かし７０℃で１５分間加温後急冷し、７５ｐｍｏｌｅランダムプライマー（宝酒造社製）、１０Ｕ  ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ベーリンガーマンハイム社製）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（ライフテクノロジー社製）となるようにそれぞれの試薬を加え（全量２０μｌ）、３７℃で１時間保温した。反応液を７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させた後−２０℃で使用時まで保存した。
ラットＴＰＯｃＤＮＡ配列（配列番号２）よりＰＣＲ用プライマーを合成した。プライマーの配列は以下の通り。
ｒＴＰＯ−ＡＩＮ：５’−ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２の１７３〜１９３）
ｒＴＰＯ−Ｎ    ：５’−ＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号２の１００５〜１０２５に対応するアンチセンス）
合成したｃＤＮＡ反応液の０．１容を鋳型に用いここで合成したプライマー（ｒＴＰＯ−ＡＩＮ、ｒＴＰＯ−Ｎ）をそれぞれ１μＭ使用してＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μ１の容量でＰＣＲ反応（９５℃で２分間加熱後、９５℃で１分間の変性条件、４０℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。
ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である約６２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製  した。この精製したＤＮＡ断片をＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  ＳｅｑｕｅｎｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩基配列を決定した。
プラィマー部分を除く塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配列表（配列番号３）に示した。
このＤＮＡ断片はプライマー配列を除くと５８０ｂｐの長さを有し、ラットｃＤＮＡ塩基配列との比較を行なった結果、８６％の相同性を持つことが明かとなり、ヒトＴＰＯｃＤＮＡの一部をコードするＤＮＡ断片であると考えられた。
＜実施例１５＞
ＰＣＲ法によるヒトＴＰＯｃＤＮＡのスクリーニング
配列表−配列番号３をもとにヒトＴＰＯに対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。
ｈＴＰＯ−Ｉ：５’−ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’  （配列番号３の６０−８０）
ｈＴＰＯ−Ｊ：５’−ＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣ−３’  （配列番号３の４７９−４９９に対応するアンチセンス）
実施例１３において構築したヒトｃＤＮＡライブラリーを増幅し約１０万個のクローンを１個の集団とするプールに分割し、５０μｇ／ｍｌ（７）Ａｍｐｉｃｉｌｉｎを含む１ｍｌのＬＢ培地中で一夜培養した後、プラスミド自動分離装置ＰＩ−１００（倉敷紡績社製、ＶＥＲ−３．０）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはＴＥ溶液に溶解した。
抽出したＤＮＡの５％を鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ、ｈＴＰＯ−Ｊ）をそれぞれ１μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｌｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により２０μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った結果、９０プール中３プールで特異的と考えられるバンドが検出された。これらのうち１プールを選び、約５０００クローンづつのプールに分け９０プールよりプラスミドＤＮＡを精製し、再度同一の条件でＰＣＲを実施した。その結果、５個のプールでバンドが検出された。これらより１プールを選択し２５０個のクローンを１プールとするサブプールに分け、９０プールについてプラスミドＤＮＡを抽出した。これらについて同様にＰＣＲを行なった処、３個のプールでバンドが観察された。
これらより１プールを選択し３０個のクローンを１プールとしてサブプールを作り、９０プールからプラスミドＤＮＡを精製しＰＣＲを実施した結果３個のプールでバンドが観察された。これらのうち１プールを選び５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢプレート上にまき、９０個のコロニーについて同様にプラスミドＤＮＡを抽出しＰＣＲによる確認を行なった結果、最終的にクローンＨＬ３４を得た。
＜実施例１６＞
ヒトＴＰＯｃＤＮΛのシークエンス
プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）］に記載されているようにして実施した。
クローンＨＬ３４を５０μｇ／ｍｌ（７）Ａｍｐｉｃｉｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノールークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、  ７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡ  ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４を得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長の塩基配列を決定した。塩基配列およびそれから演鐸されるアミノ酸配列を配列表（配列番号４）に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは配列番号３の配列をもとに合成したプライマー並びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。
その結果、得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４は８６１塩基対のｃＤＮＡ断片を含み、実施例２で分析されたラットＴＰＯの部分アミノ酸配列ＡＰ８（配列番号４：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／ＴＰ３（配列番号４：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、２５塩基目から始まるオープンリーディングフレームをコードしていると考えられたが、終止コドンは無く３’端には７６塩基からなるポリＡ尾部様配列を持っていた。ポリＡ尾部様配列直前までの２５３個のアミノ酸配列はラットＴＰＯｃＤＮＡのもの（配列番号２の１４７残基のアミノ酸配列部分）と比較すると８４％の相同性を持っておりラットＴＰＯに対応するヒトのｃＤＮＡの一部をコードするＤＮＡ断片と考えられた。終止コドンが無く３’端にポリＡ尾部様配列を持っていたことから、このクローンは完全なｃＤＮＡを反映するものではなく、ｃＤＮＡライブラリー作製時の人工産物であることが示唆された。
＜実施例１７＞
ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８−ＨＬ３４のＣＯＳ  １細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培養上清を回収した。
得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められ（図８）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成が観察された。一方、インサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった（図８）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においてもｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これらの結果から、ｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４がＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ｃＤＮＡ断片を担持していることが判明した。また、ヒトＴＰＯがラットにも作用する（種特異性がない）ことも明らかとなった。
＜実施例１８＞
ヒトＴＰＯ欠失型ｃＤＮＡの発現〜活性確認
実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃＤＮＡは、その３’側にポリＡ尾部様の連続するアデニン配列を持っていたが、この配列はラットＴＰＯｃＤＮＡには観られず実験上の人工産物である可能性が示唆された。そこで、このポリＡ尾部様の連続するアデニン配列を欠失させたｃＤＮＡを作製し、発現させた蛋白質がＴＰＯとしての活性を示すか検討した。欠失体の作製にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用プライマーの配列を表９に示す。それぞれの５’端には制限酵素認識配列を付加してある（ｈＴＰＯ５にはＥｃｏＲＩ、ｈＴＰＯ３にはＮｏｔＩ並びに２つのストップコドンＴＡＡＴＧＡを付加した）。
【表９】
0003635142.tif 000010
実施例１６で得られたプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ５、ｈＴＰＯ３）各１０μＭを使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で１５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。得られた約８００ｂｐのバンドを制限酵素ＥｃｏＲｌ並びにＮｏｔｌで消化後精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした。得られた形質転換体より約８００ｂｐのＤＮＡ断片を含むクローンを５個選択しプラスミドＤＮＡを大量調製した（方法は実施例５参照）。それぞれのプラスミドについては、ＰＣＲで増幅した部分の約８００ｂｐ全領域に関して塩基配列の決定を行ない実施例１６で解析した塩基配列（配列番号４の１−７８０）と完全に一致していることを確認した。
このプラスミドクローンをｐＨＴ１−２３１と命名した。大腸菌ＤＨ５に担持されたべクターｐＨＴ１−２３１は１９９４年２月１４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５６４として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国  食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８２として寄託した。
得られたプラスミドのＣＯＳ１細胞での発現は実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日ないし５日後に培養上清を回収した。
得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清ではＴＰＯ活性が認められ（図９）、また、培養４日目に多数の巨核球による突起形成が観察された。一方、ｃＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった（図９）。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においてもｐＨＴ１−２３１をトランスフェクションして発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にのみＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。これらの結果から、ｐＨＴ１−２３１に含まれるｃＤＮＡ断片はＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
＜実施例１９＞
ＰＣＲによるヒトＴＰＯＣ末側領域のクローニング
実施例１５で得られたクローンＨＬ３４のヒトＴＰＯｃＤＮＡはその３’末端にポリＡ尾部様配列を持っており、３’部分は不完全なクローンであることが示唆された。そこで、ＰＣＲにより完全長の３’領域を取得することを試みた。実施例１６で決定した塩基配列よりＰＣＲ用５’側プライマーを４種類合成した。
【表１０】
0003635142.tif 000011
また、３’側プライマーとしてはポリＡ部分直後からの増幅を期待して３’端にミックスのヌクレオチドを４ベース含む以下のプライマーを合成した。また、ミックス部分を含まないアンカープライマーも合成した。
【表１１】
0003635142.tif 000012
実施例１４と同様にヒト正常肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｇよりｃＤＮＡの１本鎖目を合成した。ただし、プライマーとしてはオリゴｄＴプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに添付のものを０．５μｇ）を使用した。ｃＤＮＡ合成の反応液の０．１容を鋳型として１回目のＰＣＲを実施した。ＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）並びに、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｈ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の後に、９６℃１分間／４８℃１分間／７２℃１分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。１回目の反応液の０．１容を鋳型として２回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｋ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の後に、９６℃１分間／６３℃１分間／７２℃１分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。２回目の反応液の０．１容を鋳型として３回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｎ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の後に、９６℃１分間／６３℃１分間／７２℃１分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。３回目の反応液の０．１容を鋳型として４回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ｍｉｘ（１０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の後に、９６℃１分間／６３℃１分間／７２℃１分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。４回目の反応液の０．１容を鋳型として５回目のＰＣＲを行なった。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｏ（２０μＭ）及びｈＴＰＯ３ａｎｃｈｏｒ（２０μＭ）を使用し５０μｌの容量で反応を行なった（９６℃２分間の後に、９６℃１分間／５８℃１分間／７２℃１分間を１０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。ここで得られた反応液を、２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、このＰＣＲ反応の主要産物である約６００ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。この精製したＤＮＡ断片をＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより直接シークエンスし塩基配列を決定した。塩基配列およびそれから演鐸されるアミノ酸配列を配列表（配列番号５）に示した。
このＤＮＡ断片はプライマーｈＴＰＯ−Ｏに始まる１３０個のアミノ酸をコードする塩基配列を持っており、さらに３’側に１８０塩基以上の配列が続いていた（５７７塩基目以降は解読できなかった）。このＤＮＡ断片にコードされるグリシンに始まる３０個のアミノ酸配列は配列番号４で記載したアミノ酸番号２０３〜２３２のアミノ酸配列と一致した。同時に１番から９４番目までの塩基配列も配列番号４の６９２〜７８５のものと一致していた。
実施例１７のｃＤＮＡ断片の解析及び本例のＰＣＲ増幅断片の解析の結果より、配列番号６に記載するように、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなると推定される。
なお、配列番号６に示されたヒトＴＰＯタンパク質の成熟タンパク質部分に相当するアミノ酸配列を配列番号１６として示した。
＜実施例２０＞
ヒト正常肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーの再構築
実施例１５で得られたクローンＨＬ３４は、オープンリーディングフレームに終止コドンを持たず、その３’末端にポリＡ尾部様配列を持っておりｃＤＮＡ合成の際の人工産物であることが考えられたため、新たに市販の正常ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）５μｇを用い、ｃＤＮＡライブラリーを構築し直した。ｃＤＮＡの合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｌａｍｂｄａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ  λＣｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ並びにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−（ともにＬＩＦＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を使用した。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡを熱変性後、Ｋｉｔに付属のＮｏｔＩ配列付きオリゴｄＴをプライマーとして含む２０μｌの反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３／７５ｍＭＫＣｌ／３ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  ＤＴＴ／１ｍＭ  ｄＮＴＰ／２００ＵＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−）に加え、３７℃で６０分間保温した。ｃＤＮＡの２本鎖目を合成（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２５０  μＭ  ｄＮＴＰｓ）５ｍＭ  ＤＴＴ、４０Ｕ  Ｅ，ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ、２Ｕ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ）Ｉ０Ｕ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを含む１５０μｌの反応液中で１６℃２時間保温）後、１０Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍａｒａｓｅを加えさらに１６℃で５分間保温した。反応液を６５℃で１０分間加熱後等量のフェノール−クロロホルムで１回抽出し、Ｓ１ｚｅＳｅｐＴＭ  ４００ｓｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに付属の低分子量ＤＮＡ除去用スパンカラム）により４００ｂｐより小さいｃＤＮＡを除いた。このサンプルにＥｃｏＲＩ  Ａｄａｐｔｏｒ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに付属のもの）を付加後制限酵素ＮｏｔＩで消化したものを、再度ＳｉｚｅＳｅｐＴＭ  ４００  ｓｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎにかけ、低分子量のＤＮＡを除去した。これによって得られた、５’端にＥｃｏＲＩ、３’端にＮｏｔＩ認識配列を持つ２本鎖ｃＤＮＡはそれぞれ１．３μｇであり、予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓと連結させ、９．２ｍｌのコンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  （東洋紡績社製）を形質転換した。その結果、得られたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ｈＴＰＯ−Ｆ１）は１．０×１０６個の形質転換体を含むものであった。
＜実施例２１＞
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーｈＴＰＯ−Ｆ１からのＴＰＯｃＤＮＡクローンのスクリーニング
配列表−配列番号３及び６をもとにヒトＴＰＯｃＤＮＡに対応するＰＣＲ用プライマーを合成した。配列は以下の通り。
ｈＴＰＯ−Ｉ  ：５’−ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号３の６０−８０）
ｈＴＰＯ−ＫＵ：５’−ＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号６の９０１−９２１に対応するアンチセンス）
実施例２０において構築したヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ−ｈＴＰＯ−Ｆ１（１．０×１０６個）を３つのプール（＃１〜３）に分割し凍結保存した。それぞれのプールよりプラスミドＤＮＡを調製し、その１％を鋳型として、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ−ＫＵ）各１μＭを用いてＰＣＲを行なった。
ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造社製）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μ１の容量でＰＣＲ（９５℃で１分間の変性条件、５９℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３５回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った結果、＃３のプール由来のプラスミドＤＮＡを用いた場合に予想される大きさのＤＮＡが増幅された。そこで、この＃３のプールを１５０００個のサブプールに分割し、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む１ｍｌ（７）ＬＢ培地中で１夜培養した後、プラスミド自動分離装置ＰＩ−１００を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはＴＥ溶液に溶解し、その５％を鋳型としてＰＣＲを実施した（使用したプライマー、反応条件は上記と同一である）。その結果、９０プール中６プールで予想される大きさのＤＮＡが増幅された。これらのうち１プールを選択し１０００個のクローンを１つの集団とするサブプールに分割し、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製しＰＣＲを行なったがＤＮＡの増幅は観察されなかった。一連のＰＣＲで増幅されるＤＮＡの電気泳動上のバンドの濃さは、サブプールを細かくして行くに連れ、薄くなってきた。そのため、求めるクローンの増殖が良くないためプラスミドＤＮＡの回収が悪く、ＰＣＲによる増幅が弱くなり最終的に増幅されなくなったことが考えられた。そこで＃３のプールに戻り、コロニーハイブリダイゼイションによるスクリーニングを行なうことにした。
＃３のプールより、１５ｃｍのＬＢプレートあたり４１００個のコロニーとなるようにクローンをまき、１００枚のプレートを作製した。それぞれのプレートについて１枚づつレプリカプレートを作製し、それらのうち片方のプレートを３７℃でさらに６時間培養してからコロニーを回収しプラスミドＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡについて上記と同様のＰＣＲを実施したところ、１００プール中１プールで予想される大きさのバンドの増幅が観察された。そこでこのプールのプレートより２枚のレプリカフィルターを作製した（ＰＡＬＬ社製  ＢＩＯＤＹＮＥＴＭＡ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＭＥＭＢＲＡＮＥを使用）。フィルターの変性は１０％ＳＤＳ１０分間、０．５Ｎ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １０分間、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）／１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １０分間行ない、３０分間風乾後８０℃の真空オーブン中で１時間ベーキングした。ベーキングしたフィルターは６×ＳＳＣ  （２０ＸＳＳＣは１１中に１７５．３ｇＮａＣｌ、８８．２ｇを含みｐＨ７．０の溶液）／１％ＳＤＳで軽く洗浄後、プレハイブリダイゼイションを行なった。反応液の組成は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、  ５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは５００ｍｌ中に５ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ、５ｇｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、５ｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖを含む溶液）、１％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むもので、３０ｍｌの溶液中で４２℃３０分間振盪しながら保温した。プレハイブリダイゼイションを行なった後、同組成のハイブリダイゼイション溶液３０ｍｌと交換後、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社製）で放射標識したプローブ（プラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片：配列番号４の５’末端から４５８塩基目までを精製し、ランダムプライマー法で標識したもの；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６−１３、１９８３に記載の方法を利用したアマシャム社製キットＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを使用）を加え、４２℃で２０時間振盪しながら保温した。フィルターは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で４２℃３０分間洗浄後、さらに０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で４２℃３０分間洗浄した。フィルターを増強スクリーン及びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、陽性と考えられるシグナルが１個観察された。そこで、もとのプレートよりシグナル周辺のコロニーをかきとり、１０ｃｍのＬＢプレートにまきなおした。得られたコロニー５０個を培養しＤＮＡを調製後プライマーｈＴＰＯ−Ｉ及びｈＴＰＯ−ＫＵを用いてＰＣＲを実施した（条件等は上記と同一）。その結果、１クローンのみ予想通りのバンドが増幅された。このクローンをｐＨＴＦ１と命名した。
＜実施例２２＞
ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のシークエンス
プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているようにして実施した。クローンｐＨＴＦ１を５０μｇ／ｍｌ（７）Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２ＮＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮＡｓｅ処理、フェノールークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＴＦ１を得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ΛＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長の塩基配列を決定した。塩基配列およびそれから演鐸されるアミノ酸配列を配列表（配列番号７）に示した。塩基配列決定に必要なプライマーは配列番号６の配列をもとに合成したプライマー並びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。
その結果、得られたクローンｐＨＴＦ１は１７２１塩基対のｃＤＮＡ断片からなり、実施例２で分析されたアミノ酸配列ＡＰ８（配列番号７：アミノ酸番号１〜１２）及びＴＰ２／ＴＰ３（配列番号７：アミノ酸番号１５７〜１６２）と相同性の高い配列が確認された。このＤＮＡ断片は、１０１塩基目までの５’ノンコーディング領域に続く、１０２〜１０４塩基目にコードされるメチオニンに始まり１１５８〜１１６０塩基目にコードされるグリシンまで続く３５３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームをコードしていると考えられ、それに続く停止コドン（ＴＡＡ）以降の３’  ノンコーディング領域を５３１塩基と３０個のポリＡ尾部配列を持っていた。このオープンリーディングフレームにコードされると考えられるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号６に記載の、ヒトＴＰＯの予想されるアミノ酸配列と完全に一致した。塩基配列は配列番号６の配列より５’側で７７塩基分、３’側のポリＡ尾部配列直前までの領域で３４７塩基分長いｃＤＮＡをコードしていた。また塩基配列は、配列番号６と３箇所で異なっていた。異なる塩基配列は配列番号７のＡ（８４塩基目）が配列番号６ではＣ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。２番目の塩基（７４０塩基目）のみ、タンパク質のコーディング領域内の変異であったが、スレオニンの３番目のコドンであり、アミノ酸の変換は起こさなかった。この塩基配列の置換が何に起因するのかはこの時点では明らかでなかったが、得られたクローンｐＨＴＦ１の解析より、ヒトＴＰＯタンパク質は２１残基のシグナル配列を含む３５３個のアミノ酸からなることが確認できた。シグナル配列を除いたタンパク質の推定分子量は３５４６６であった。
大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＴＦ１は１９９４年３月２４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６１７として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国  食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８５として寄託した。
＜実施例２３＞
ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
得られたクローンｐＨＴＦ１のＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。
得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清では用量依存的にＴＰＯ活性が認められたが、ｃＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１培養上清では活性が認められなかった（図１０ａ）。類似の結果は、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴＦ１を発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた（図１０ｂ）。
これらの結果から、ｐＨＴＦ１に含まれるｃＤＮＡはＴＰＯ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが明確になった。
＜実施例２４＞
ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニング
ヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのクローニングを行なった。クローニングに使用したゲノミックライブラリーは東北大学  遺伝子実験施設山本徳男教授よりいただいた（Ｓａｋａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２１７３−２１８２、１９９４に記載のライブラリーで、ヒト染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによって部分分解したものをＳｔａｔａｇｅｎｅ社製ファージベクターＬａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位につないで構築したライブラリー）。このライブラリーよりヒトＴＰＯｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを実施したが、用いた手法はすべて本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。大腸菌ＬＥ３９２を宿主菌として、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート（１ｌ中に１０ｇ  ＮＺａｍｉｎｅ、  ５ｇ  ＮａＣｌ、５ｇ  ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅ  ｘｔｒａｃｔ、  ２ｇ  ＭｇＣｌ４  ７Ｈ２Ｏ、１５％  ａｇａｒを含むｐＨ７．０のもの）１枚あたり３万個となるようにファージをまき、１８枚のプレートを作製した。それぞれのプレートより各２枚のレプリカフィルターを作製した（ＰＡＬＬ社製  ＢＩＯＤＹＮＥＴＭ  Ａ  ＴＲＡＮＳＦＥＲＭＥＭＢＲＡＮＥを使用）。フィルターの変性は０．５Ｎ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ１０分間、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １０分間行ない、３０分間風乾し８０℃の真空オーブン中で１．５時間ベーキングした。プレハイブリダイゼイションは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、  ５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５００ｍｌの溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ  （宝酒造社製；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６−１３、１９８３に記載のランダムプライマー法を利用したＤＮＡ標識キット）を用いて３２Ｐ標識したものを用いた。ＰＣＲに使用したプライマーの配列は以下の通り。
ｈＴＰＯ−Ｉ：５’−ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’  （配列番号７の１７８−１９８）
ｈＴＰＯ−Ｎ：５’−ＡＧＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＡＴＡＣＴＧＴＣＣ−３’  （配列番号７の１００５−１０２５に対応するアンチセンス）
ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイションと同じ組成の溶液を５００ｍｌ使用し、放射標識したプローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ３回洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及びＸ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲ５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、１３個の陽性シグナルが得られた。もとのプレートより１３個の陽性シグナル周辺のプラークを拾い上げ、１５ｃｍのＮＺＹＭプレート１枚あたり１０００プラークとなるようにまき直した。それぞれのプレートから各２枚のレプリカフィルターを作製し、上記と同じ条件でハイブリダイゼイションを実施した。その結果、１３組全てのフィルターで陽性シグナルが検出された。各プートより１個づつプラークを単離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のＰｌａｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ法でファージＤＮＡを調製した。１３クローンのファージＤＮＡについてｃＤＮＡのコーディング領域を含んでいるかどうかをＰＣＲによってチェックした。チェックに使用したプライマーの配列は以下の通り。
ｈＴＰＯ−Ｌ：５’−ＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’  （配列番号６の１−２１）
ｈＴＰＯ−Ｆ：５’−ＡＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴ−３’  （配列番号６の１２７−１４７に対応するアンチセンス）
ｈＴＰＯ−Ｐ：５’−ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧ−３’  （配列番号６の５０３−５２３）
ｈＴＰＯ−Ｖ：５’−ＡＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡ−３’  （配列番号６の１０７０−１０９０に対応するアンチセンス）
これらのプライマーの組み合わせにてＰＣＲを実施したところ、１３クローンのうち５クローンはｃＤＮＡから予測されるアミノ酸のコーディング領域を全て含んでいると考えられた。これら５クローンに含まれる染色体ＤＮＡの長さは約２０ｋｂｐとそろっており、予備的に検討した制限酵素解析でもほぼ同一のパターンを示した。そこでこれらのクローンのうち１個（クローンλＨＧＴ１）を選択し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析を行なった。すなわち、クローンλＨＧＴ１のＤＮＡ各１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、０．８％アガロースゲルで泳動後、ＰＡＬＬ社製  ＢＩＯＤＹＮＥＴＭ  Ａ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＭＥＭＢＲＡＮＥに転写した。フィルターは３０分間風乾後８０℃の真空オーブン中で２時間ベーキングした。プレハイブリダイゼイションは５０％ホノレムアミド、５×ＳＳＣ、  ５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’  ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む５０ｍｌの溶液中で４２℃１時間行なった。プローブはヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片（配列番号７の塩基配列番号１７８−１０２５）をＰＣＲで増幅後精製したものをＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ  （宝酒造社製）を使用して３２Ｐ標識したものを用いた。ハイブリダイゼイションはプレハイブリダイゼイションと同じ組成の溶液を５０ｍｌ使用し、放射標識したプローブを加え４２℃で２０時間行なった。フィルターは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中室温で５分間づつ３回洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃１時間の洗浄を行なったのち、増強スクリーン及びＸ−ＯＭＡＴＴＭＡＲ５フィルム（イーストマンコダック社製）により−７０℃１６時間オートラジオグラフィーを行なった。その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合に約１０ｋｂｐの単一のバンドが観察された。そこで、クローンλＨＧＴＩのＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後０．８％アガロースゲルで泳動し、１０ｋｂｐのバンドを切り出して、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様にＨｉｎｄＩＩＩで消化したクローニングベクタ−ｐＵＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用した）。
得られたクローンのうち、１０ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むクローンを選択しｐＨＧＴ１と命名した。
ファージクローンλＨＧＴ１のおおまかな制限酵素地図を図１１に示す。
＜実施例２５＞
ヒトＴＰＯ染色体クローンｐＨＧＴ１のシークエンス
ｐＨＧＴ１クローンを培養しプラスミドＤＮＡの精製を行なった。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。クローンｐＨＧＴ１を５０μｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む５０ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、遠心分離により得た菌体を４ｍｌのＴＥＧ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液に懸濁し、８ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液を加えてよく懸濁する。さらに３Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／５Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ溶液を６ｍｌ加えてよく懸濁した後遠心し、上清を得る。上清はフェノールークロロホルム（１：１）処理後、等量のイソプロパノールを加えて遠心し、ペレットを得た。ペレットはＴＥ溶液に溶解後、ＲＮａｓｅ処理、フェノールークロロホルム（１：１）処理を施し、エタノール沈殿を行なう。ペレットを再度ＴＥ溶液に溶解し、ＮａＣｌ、ポリエチレングリコール３０００をそれぞれ０．６３Ｍ、７．５％になるように加えて遠心する。最後に、ペレットはＴＥ溶液に溶解後エタノール沈殿を行なう。これにより約３００μｇのプラスミドＤＮＡｐＨＧＴ１を得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、ｃＤＮＡの塩基配列から予想される、タンパク質コーディング領域周辺の塩基配列を決定した。塩基配列およびそれから演鐸されるアミノ酸配列を配列表（配列番号８）に示した。
塩基配列決定に必要なプライマーは実施例２２で使用した、ｃＤＮＡの塩基配列解析に用いたもの並びに、それらのプライマーによるシークエンス反応で解析された内部配列をもとに設計した合成プライマーを使用した。
その結果、プラスミドクローンｐＨＧＴ１が担持する染色体ＤＮＡは、配列番号６で予想されたアミノ酸のコーディング領域を全て含みその領域に関しては、塩基配列は完全に一致していた。また、アミノ酸をコードするエクソンに相当する領域は４つのイントロンによって分断されており、イントロンの長さは５’側から順に２３１ｂｐ、  ２８６ｂｐ、１９３２ｂｐ、２３６ｂｐであった。配列番号７に記載のｃＤＮＡ塩基配列とは３箇所で異なっていた。異なる塩基配列は実施例２２で記載した箇所（配列番号６と７の相違点）と同一であり、配列番号７のＡ（８４塩基目）がＣ、Ａ（７４０塩基目）がＴ、Ｇ（１１９８塩基目）がＡであった。すなわち、実施例２１で取得したヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンｐＨＴＦ１の塩基配列は、ヒト染色体の塩基配列と３箇所で異なることが明かとなった。そこで、この塩基配列の変異が本来の配列を反映するものであるか解析するために、スクリーニングで最終的に選択された５個の染色体ＤＮＡクローンのうち、塩基配列を決定していない残りの４クローンについて、配列の決定を行なった。配列の解析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のＰｌａｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ法で調製したファージＤＮＡを使用した直接塩基配列決定法で行なった。反応には上記３箇所の塩基配列変異点を解析できる位置の実施例２２で合成したシークエンスプライマー並びに、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスした。その結果、４個全てのクローンで配列番号７の８４塩基目がＣ、７４０塩基目がＴであり、配列番号７のｃＤＮＡとは異なり、配列番号６のものと一致した。１１９８塩基目についてはＧのクローンが２個、Ａのクローンが２個であった。すなわち、染色体ＤＮＡ本来の塩基配列が２種類あることが明かとなった。この配列の違いが相同染色体に由来するものか、複数存在する遺伝子に由来するものかは、現時点では不明である。また、購入したＣｌｏｎｔｅｃｈ社製ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡがＣａｕｃａｓｉａｎ由来であるのに対し、染色体ＤＮＡの由来が日本人であることから、塩基配列の変異は人種の違いに起因する可能性も示唆される。
大腸菌ＤＨ５に担持されたベクターｐＨＧＴ１は１９９４年３月２４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６１６として寄託した。これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国  食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９４００８４として寄託した。
＜実施例２６＞
ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＯＳ１細胞での発現と活性確認
サブクローニングして得られたプラスミドクローンｐＨＧＴ１には、インサート部分に３箇所、ベクター内に１箇所、合計４箇所のＥｃｏＲＩ認識配列が存在するが、インサート内の一番５’側のＥｃｏＲＩ認識配列とベクター内のＥｃｏＲＩ認識配列にはさまれる約４．３ｋｂｐのＤＮＡ断片に、ヒトＴＰＯタンパク質のコーディング領域が全て含まれることが、塩基配列の解析から明らかになった。そこで、この断片をＥｃｏＲＩ処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにつなぎ、４個のヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４を得た（前述の図１１）。これらのプラスミドＤＮＡを調製し発現実験を行なった。プラスミドＤＮＡの精製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）］に記載されているようにして実施し、約２５０μｇのプラスミドＤＮＡを得た。
得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥ＃１−４のＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。
得られた培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中に用量依存的にＴＰＯ活性が認められ、一方、ＤＮＡインサートを含まない発現プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清では活性が認められなかった。クローン＃１〜４のいずれでもほぼ同様の結果が得られたが、代表例としてｐＥＦＨＧＴＥ＃１における結果を図１２ａに示した。また、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても、ｐＥＦＨＧＴＥを発現させたＣＯＳ１細胞培養上清にて用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。代表例として、ｐＥＦＨＧＴＥ＃１における結果を図１２ｂに示した。
これらの結果より、得られたクローンｐＥＦＨＧＴＥが担持するＤＮＡはヒトＴＰＯの機能的染色体ＤＮＡであることが、明らかとなった。
＜実施例２７＞
ヒトＴＰＯ欠失誘導体の作製とＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
実施例１８の結果より、ヒトＴＰＯは完全長でなくても活性を発現しうることが明かとなったが、その活性発現に必要な領域を解析する目的で、欠失誘導体の作製並びに発現を行なった。実施例１８で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−２３１をもとにＣ末端側から順次２０個のアミノ酸を欠失させた発現プラスミド並びにＴＰ２／３の直後（１６３番目）までのアミノ酸を含む発現プラスミドを作製した。作製にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は以下の通り。
ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’
（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ配列を付加したもの；表９に記載のものと同一）
ｈＴＰＯ−Ｓ：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴ−３’（配列番号４の５５５−５７６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−４：５’  −ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧ−３’  （配列番号４の５７６−６００のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１７１をコードする欠失誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−３０：５’  −ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＴＣ−３’  （配列番号４の６３６−６６０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１９１をコードする欠失誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−２：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＴ−３’  （配列番号４の６９６−７２０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体作製用）
実施例１８で得たクローンｐＨＴ１−２３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−２、−３、−４、−Ｓを３’側として使用）をそれぞれ１０μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（９５℃で１分間の変性条件、６６℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ４個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９月に記載されているようにして実施した。一連の操作によってアミノ酸１−１６３をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１６３＃１−５）、アミノ酸１−１７１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１７１＃１−４）、アミノ酸１−１９１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−１９１＃１−４）、アミノ酸１−２１１をコードする欠失誘導体（ｐＨＴ１−２１１＃１−４）のプラスミドＤＮＡを得た。
精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長にわたり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮΛ配列を持つことを確認した。
得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した。その結果、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的にＴＰＯ活性を認めた。代表例としてｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、およびｐＨＴ１−１７１＃２における結果を図１３ａに、ｐＨＴ１−１６３＃２における結果を図１３ｂに示した。類似の結果は、Ｍ−０７ｅアッセイ系においても得られ、ｐＨＴ１−２１１、ｐＨＴ１−１９１、ｐＨＴ１−１７１、およびｐＨＴ１−１６３を発現させたいずれのＣＯＳ１細胞培養上清でも用量依存的に有意なＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性を認めた。代表例として、ｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、およびｐＨＴ１−１６３＃２における結果を図１４に示した。
これらの結果より、ヒトＴＰＯタンパク質を構成するアミノ酸３５３個（２１個のシグナル配列を含む）のうち、１６４位のアルギニン以降のアミノ酸を欠失させても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性が保持されることが明らかとなり、１６４位のアルギニンより前に、ＴＰＯ活性発現のために必須な領域が含まれていることが示唆された。
＜実施例２８＞
ヒトＴＰＯ  Ｃ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行なう目的で、実施例２７で得られた欠失体よりもさらにＣ末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を発現しうるかどうか検討した。実施例１６で得たプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４をもとに、１６３番目のセリンを基準にＣ末端側から順次ァミノ酸を欠失させた発現プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りである。
ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’
（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ配列を付加したもの；表９に記載のものと同一）
ｈＴＰＯ−１５０：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴ−３’
（配列番号４の５１４−５３７のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加：アミノ酸１−１５０をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５１：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡ−３’
（配列番号４の５１８−５４０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１５１をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５３：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣ−３’
（配列番号４の５２６−５４６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１５３をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５４：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡ−３’
（配列番号４の５２９−５４９のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１５４をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５５：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴ−３’
（配列番号４の５３２−５５２のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加：アミノ酸１−１５５をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５６：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧ−３’
（配列番号４の５３５−５５５のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加：アミノ酸１−１５６をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１５７：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡ−３’
（配列番号４の５３８−５５８のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１５７をコードする欠失体作製用）。
実施例１６で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５を５’側として使用、ｈＴＰＯ−１５０、−１５１、−１５３、−１５４、−１５５、−１５６、−１５７を３’側として使用）をそれぞれ１０μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で１分間の変性条件、６６℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で２０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲで得られたバンドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、それぞれのＰＣＲ反応の予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ予想される長さのインサートを含むクローンをそれぞれ３個ないし５個づつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。一連の操作によって配列番号４において、アミノ酸番号１−１５０をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５０＃２１、２２、２５）、アミノ酸番号１−１５１をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５１＃１６、１７、１８）、アミノ酸番号１−１５３をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５３＃１−５）、アミノ酸番号１−１５４をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５４＃１−５）、アミノ酸番号１−１５５をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５５＃１−５）、アミノ酸番号１−１５６をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５６＃１−５）、アミノ酸番号１−１５７をコードする欠失体（ｐＨＴ１−１５７＃１−５）のプラスミドＤＮＡを得た。
精製したプラスミドＤＮＡ  ｐＨＴ１−１５０＃２１、２２、２５並びにｐＨＴ１−１５１＃１６、１７、１８についてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、全長にわたり塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰ０ｃＤＮＡ配列を持つことを確認した。
得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、１５１位のアミノ酸であるシステインを含む、それぞれアミノ酸１−１５１位、１−１５３位、１−１５４位、１−１５５位、１−１５６位、１−１５７位からなるＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中には用量依存的にＴＰＯ活性が検出された。しかしながら、１５１個目のシステインまでを欠失させたアミノ酸１−１５０位のＣ末側欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中にはＴＰＯ活性が検出されなかった。
＜実施例２９＞
ヒトＴＰＯ  Ｎ末側欠失体の作製とＣＯＳ１細胞での発現〜活性確認
ヒトＴＰＯ蛋白質の活性発現に必須な領域の解析を行なう目的で、実施例２８で得られた欠失体をもとに、Ｎ末側アミノ酸を欠失させた誘導体を作製しＴＰＯ活性を発現しうるかどうか検討した。実施例１８で得たプラスミドクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４並びに、実施例２７で得たプラスミドクローンｐＨＴ１−１６３をもとに、シグナル配列に続くＮ末端側アミノ酸を欠失させた発現プラスミドを構築した。構築にはＰＣＲを利用した。ＰＣＲ用に作製したプライマーの配列は、次の通りである。
ｈＴＰＯ−５：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’
（配列番号４の１−２１にＥｃｏＲＩ配列を付加したもの；表９に記載のものと同一）
ｈＴＰＯ３：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧＴＡＴＣＣ−３’
（配列番号４の７５７−７８０のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−２３１をコードする欠失体作製用に合成したものと同一）
ｈＴＰＯ−Ｓ：５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴ−３’
（配列番号４の５５５−５７６のアンチセンス；２個の終止コドンＴＡＡＴＧＡ及びＮｏｔＩ配列を付加；アミノ酸１−１６３をコードする欠失体作製用）
ｈＴＰＯ−１３：５’−ＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧ−３’
（配列番号４の１２４−１７３；アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−１３Ｒ：５’−ＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’
（配列番号４の６４−８７並びに１２４−１４８のアンチセンス；アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−７：５’−ＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣ−３’
（配列番号４の１０６−１５４；アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−７Ｒ：５’−ＴＴＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’
（配列番号４の６４−８７並びに１０６−１２９のアンチセンス：アミノ酸番号１−６を失する誘導体作製用）
ｈＴＰＯ−８：５’−ＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡ−３’
（配列番号４の１０９−１５７；アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体作製用）ｈＴＰＯ−８Ｒ：５’−ＣＡＧＴＴＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＣＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧ−３’
（配列番号４の６４−８７並びに１０９−１３２のアンチセンス：アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体作製用）。
（１）アミノ酸番号１−１２を欠失する誘導体（ｐＨＴ１３−２３１）作製
実施例１８で得たクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−１３及びｈＴＰＯ３を組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−１３Ｒを組で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。
合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３を使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現べクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを４５個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−２３１をコードする蛋白質のうち１−１２を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ１３−２３１）のプラスミドＤＮＡを得た。これらについてｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ３のプライマーを用いたＰＣＲを行ない、４５クローンのうち８クローンで予想される大きさ程度のインサートが確認された。それらのうち３クローンついてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、１クローンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計通りのＴＰ０ｃＤＮＡ配列を持っクローンｐＨＴ１３−２３１＃３が得られた。
（２）アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製
上記（１）の欠失誘導体作製においては、ＴＰＯ蛋白質のＣ末端を２３１番目のアミノ酸として設計したが、Ｃ末端側はさらに欠失させてもＴＰＯ活性を発現しうることが確認されたため、今回の欠失体作製にあたってはＣ末端を１６３番目のアミノ酸までとして設計した。下記（３）においても同様に１６３番目のアミノ酸をＣ末端として設計した。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−１６３のプラスミドＤＮＡＩ．４μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−７及びｈＴＰＯ−Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−７Ｒを組で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲＲｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔｗｉｔ  ｈＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。
合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３をコードする蛋白質のうち１−６を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ７−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これらのクローンにつてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含むことが確認された。これらのクローンより３個を選択し、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つ２個のクローンｐＨＴ７−１６３＃４、＃２９が得られた。
（３）アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６３）作製
アミノ酸番号１−７を欠失する誘導体（ｐＨＴ８−１６３）の作製方法は上記、アミノ酸番号１−６を欠失する誘導体（ｐＨＴ７−１６３）の作製と本質的には同様の方法で行なった。実施例２７で得たクローンｐＨＴ１−１６３のプラスミドＤＮＡ１．４μｇを鋳型として使用し、合成したプライマー（ｈＴＰＯ−８及びｈＴＰＯ−Ｓを組で使用：ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−８Ｒを組で使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６５℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。それぞれのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、各々予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。この溶液各１μｌを鋳型として用い２回目のＰＣＲを実施した。
合成したプライマー（ｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓを使用）をそれぞれ５μＭ使ってＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ反応（９５℃で５分間変性後、９５℃で１分間の変性条件、６０℃で１分間のアニール条件、７２℃で１分間の合成条件で３０回の反応を行い、さらに７分間７２℃でインキュベート）を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた電気泳動にかけ、予想される大きさの主要なＤＮＡ断片を分離し、プレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）で精製し、１５μｌのＴＥバッファーに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、等量のフェノール／クロロホルムで１回抽出後エタノール沈殿を行なった。遠心で得られた沈殿を１５μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素処理した発現べクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌としては東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用）。得られた形質転換体のうち、予想される長さのインサートを含むクローンを３０個選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。配列番号４において、アミノ酸番号１−１６３をコードする蛋白質のうち１−７を欠失する欠失誘導体（ｐＨＴ８−１６３）のプラスミドＤＮＡを得た。これらのクローンについてはｈＴＰＯ−５並びにｈＴＰＯ−Ｓをプライマーとして用いたＰＣＲを実施し、全てのクローンで予想される大きさ程度のインサートを含むことが確認された。これらのクローンより３個を選択し、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、２クローンで、予想通りの欠失が起こって起こっており、またその他の部分も含めて全長にわたり塩基配列の置換等がなく、設計通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つ２個のクローンｐＨＴ８−１６３＃３３、＃４８が得られた。
（４）欠失誘導体のＣＯＳ１細胞での発現とＴＰＯ活性の確認
得られたそれぞれの欠失体クローンのＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行なった。すなわちプラスミドＤＮＡ各１０μｇを使用しクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行ない、３日後に培養上清を回収した。培養上清をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイ系で評価した。
その結果、アミノ酸７−１６３位の欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中に弱いながらも用量依存的にＴＰＯ活性を認めた。一方、アミノ酸８−１６３位、１３−２３１位の欠失誘導体をコードするクローンをトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞培養上清中にはＴＰＯ活性が認められなかった。
＜実施例３０＞
ヒトＴＰＯ完全長ｃＤＮＡプラスミド（ｐＨＴＰ１）の作製
配列番号６のように予想されたヒトＴＰＯｃＤＮＡのアミノ酸コーディング領域を全て持つ、動物細胞発現べクターの構築を行なった。
ＰＣＲによりヒトＴＰＯｃＤＮＡコーディング領域を全てカバーするＤＮＡ断片を以下の様に作製した。
用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。
ｈＴＰＯ−Ｉ：５’−ＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’
（配列番号６の１０５〜１２５）
ＳＡ：５’−ＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣ−３’
（配列番号６の７４５〜７６５に対応するアンチセンス）
ｈＴＰＯ−Ｐ：５’−ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧ−３’
（配列番号６の５０３〜５２３）
ｈＴＰＯ−ＫＯ：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴ−３’
（配列番号６の１０６６〜１０８６に対応するアンチセンス配列に制限酵素ＮｏｔＩの認識配列並びにＧＡＧＡＧＡ配列を付加したもの）。
実施例１６で得られたクローンｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４の３００ｎｇを鋳型として１回目のＰＣＲを行なった。プライマ−ｈＴＰＯ−Ｉ並びにＳＡ各０．５μＭを用い、Ｖｅｎｔ  ＲＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）１ユニットを使用して反応（９６℃１分間、６２℃１分間、７２℃１分間という反応を３０サイクル行なった後７２℃７分間）を行なった。反応溶液の組成は以下の通り。最終濃度で１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２００μＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ。
市販のヒト正常肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μｇを７０℃で１０分間加熱後氷上で急冷し、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５００μＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ、２５ｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、１０ユニットＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ベーリンガーマンハイム社製）、２００ユニットＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を加え、３７℃で１時間保温しｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ反応液の２０分の１量を鋳型として使用して２回目のＰＣＲを行なった。プライマーｈＴＰＯ−Ｐ並びにｈＴＰＯ−ＫＯ各２．５μＭ、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて反応（９５℃１分間、５８℃１分間、７２℃１分間の反応を３０サイクル）を行なった。
２回のＰＣＲ溶液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれ予想された大きさの主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。それぞれの精製量のうち各２０分の１量を鋳型として３回目のＰＣＲを実施した。Ｖｅｎｔ  ＲＴＭ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）１ユニットを使用して反応（９６℃２分間加熱後、９６℃２分間、７２℃２分間、という反応を３サイクル行なった後７２℃７分間）を行なった。この反応液にそれぞれ１μＭとなるようにｈＴＰＯ−Ｉ並びにｈＴＰＯ−ＫＯを加えた後、９６℃２分間の加熱を行ない、そののち９６℃１分間、６２℃１分間、７２℃１分間の反応を２５サイクル行なったあと７２℃でさらに７分間反応させた。反応液を等量の水飽和フェノールークロロホルムで１回抽出後、さらに等量のクロロホルムで１回抽出したのち、エタノール沈殿（０．３Ｍ酢酸ナトリウム、０．５μｌベーリンガーマンハイム社製グリコーゲン、２．５倍量エタノール存在下）を行なってＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ並びにＮｏｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、予想された大きさの主要なバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製したのち、予め同様に制限酵素ＢａｍＨＩ並びにＮｏｔＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋べクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結後、コンピテントハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーより４クローンを選びプラスミドＤＮＡを調製した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりシークエンスし、ＢａｍＨＩからＮｏｔＩにかけての領域に塩基配列の置換がなく、予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持つことが確認できたクローンｐＢＬＴＰを得た。
ｐＢＬＴＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、高分子量のバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した。同様にｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４も制限酵素処理し４５０ｂｐのバンドを精製した。それぞれのＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎしコンピテントハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのインサートを含むクローンｐＢＬＴＥＮを得た。
得られたｐＢＬＴＥＮを制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キット（バイオラッド社製）を用いて精製した後、同様に制限酵素処理した発現ベクタ−ｐＥＦ１８Ｓに連結しコンピテントハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＨＴＰ１を得た。このクローンのプラスミドＤＮＡを大量に調製し以下の実験に使用した。プラスミドＤＮＡの調製は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載されているようにして実施した。
＜実施例３１＞
ＣＨＯ細胞用組換えベクター、ｐＤＥＦ２Ｏ２−ｈＴＰＯ−Ｐ１の構築
マウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含むプラスミドｐＭＧ１、１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含む断片（約２．５ｋｂｐ）を回収した。回収した断片を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｎｏｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰからなる反応液２５μｌ中に溶解し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２単位を加え、室温で３０分間反応させ、ＤＮＡの末端を平滑化した。
次いで、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿後、１０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液１０μｌに溶解した。次に、得られたマウスＤＨＦＲミニ遺伝子を含む断片と動物細胞用発現ベクターｐＥＦ１８Ｓを制限酵素Ｓｍａｌで処理した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で脱リン酸化してえられたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２を得た。
次に、このベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅｌで処理し、アガロースゲル電気泳動で大きい方のベクターフラグメントを回収したのち、このフラグメントとヒトＴＰＯｃＤＮΛ（Ｐ１クローン）を含むプラスミドｐＨＴＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅｌで処理して得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡ（Ｐ１クローン）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１得た。このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯｃＤＮＡが接続されている。
＜実施例３２＞
ＣＨＯ細胞でのヒトＴＰＯの発現
ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ、ファルマシア社製）によって形質転換した。すなわち、実施例３１で調製したｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１プラスミド１０μｇにバッファーＡ：１２０μｌおよびＨ２Ｏ：１２０μｌを加え混合したのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液にバッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したのち、室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレートに滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＭ−０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのアッセイ系においても活性が認められた。培養上清中にヒトＴＰＯ活性の認められたものについては新しいプレートあるいはウエルに２５ｎＭのメソトレキセートを含む選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行することによりメソトレキセートに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行った。
なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＨＴＰ１とｐＭＧ１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによっても行うことができる。
プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１１）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８８として寄託されている。
これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国  食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９６００２３として寄託されている。
＜実施例３３＞
Ｘ６３．６．５．３．細胞用組換えベクター、ＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰＯ−Ｐ１の構築
動物細胞用発現ベクターＢＭＣＧＳｎｅｏ１μｇを制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで処理した後、アガロースゲル電気ゲル電気泳動し、ベクターＤＮＡ部分を回収した。次いで得られたＤＮＡ断片とヒトＴＰＯｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＬＴＥＮを制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで処理して得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡ（Ｐ１クローン）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、発現プラスミドＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰ０−Ｐ１を得た。この発現プラスミドはサイトメガロウイルス初期プロモーター、ウサギβグロビン遺伝子由来のイントロンおよびポリアデニル部位ヒトβグロビン遺伝子の一部、ウシパピローマウイルス１遺伝子の６９％、チミジンキナーゼプロモーターおよびポリアデニル部位、ホスホトランスフェラーゼＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ＡｍｐＲ）を含みサイトメガロウイルスプロモーター下流にヒトＴＰＯｃＤＮＡが接続されている。
＜実施例３４＞
Ｘ６３．６．５．３．細胞での発現
Ｘ６３．６．５．３．細胞は１０％牛胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ  ｍｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌ  （ＤＭＥ）培地中で培養増殖させ、これをエレクトロポレーション法によって形質転換した。
すなわち、実施例３３で調製したＢＭＣＧＳｎｅｏ−ｈＴＰ０−Ｐ１プラスミド２０μｇを１０７個の細胞を含むＤＭＥ培地７５０μｌに加え、エレクトロポレーション用の４ｍｍギャップのキュベットにセットし、４℃で１０分間放置した。このキュベットをエレクトロポレーション装置（ＢＴＸ６００、ＢＴＸ社製）にセットし、３８０Ｖ）２５ｍＦ、２４オングストロームの条件で遺伝子導入した。遺伝子導入後、キュべットを再び４℃で１５分間放置したのち、細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥで一回洗浄した。次に細胞を５０ｍｌの１０％牛胎児血清を含むＤＭＥに懸濁し、９６ウエルプレート５枚に分割したのち、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。その後、培養液を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社）、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥに交換し、以後３日ごとに培地交換した。細胞が増殖してきたウエルについてはその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＣＦＵ−ＭＫアッセイ、Ｍ−０７ｅアッセイ及びＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定したところ、いずれのアッセイ系においても活性が認められた。培養上清中にヒトＴＰＯ活性の認められたものについては耐性の細胞を増殖させて、２回クローニングを行い、ヒトＴＰＯ産生細胞株を樹立した。
＜実施例３５＞
ヒトＴＰＯのＣＯＳ１細胞での大量発現
ＣＯＳ１細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に記載のクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法で実施した。ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）をコラーゲンコート処理した１７５ｃｍ２の培養フラスコ中で、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含むＩＭＤＭを用いて、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で約１００％コンフルエントになるまで培養した。培養フラスコのコラーゲンコート処理は、１ｍＭ  ＨＣｌで０．３ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液（イワキ社製Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ｔｙｐｅＩ−Ｃ）を１７５ｃｍ２の培養フラスコあたり２５ｍｌ加え、室温で１時間放置後コラーゲン溶液を回収し、２０〜５０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄することで行なった。トランスフェクションは１７５ｃｍ２の培養フラスコ１枚あたり、２５０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社）、６０μＭのクロロキン（シグマ社）、および１０％（ｖ／ｖ）のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（コラボレイティブ社）を含む２０ｍｌのＩＭＤＭ溶液に５００μｌのＨＢＳに溶解したプラスミドｐＨＴＰ１（４０μｇ）を混和し、トランスフェクション直前にＩＭＤＭで１回洗浄した上記のＣＯＳ１細胞に添加した後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で３時間培養した。その後、培養上清を吸引除去しＩＭＤＭで１回洗浄した後、５０ｍｌの無血清培地を添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベーター内で培養し、５日後に培養上清を回収した。１回の操作には１７５ｃｍ２の培養フラスコ１００から２６０枚を使用し、５〜１３１の培養上清を回収した。無血清培地の組成は、５μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（シグマ社製）、５μｇ／ｍｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（シグマ社製）、１０μＭ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（和光純薬）、２５ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（シグマ社製）、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ（ニチレイ社製脂肪酸フリー高純度ウシアルブミン）を含むＩＭＤＭである。
＜実施例３６＞
ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰ１，Ｐ１クローン由来）の精製と活性確認
ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰ１由来）の活性と精製の実施例を以下に述べる。ＴＰＯの血小板増加作用を調べるため、部分精製品をまず調製し、かつ高純度のＴＰＯ標品を得るための精製を行った。以下の調製過程でのＴＰＯ活性測定には、Ｍ−０７ｅアッセイ系を主に用いたが、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系においても同様のＴＰＯ活性が示された。またこれらのアッセイに際し、最終濃度０．０２〜０．０５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を標品に添加した。
まず、プラスミドｐＨＴＰ１を大橋、須藤の方法（Ｈｉｄｅｙａ  Ｏｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｄａｓｈｉ  Ｓｕｄｏ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（４），７５８−７５９，１９９４）を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞を、１０００ｍｌ当たり０．２ｇのＢＳＡ、５ｍｇの牛インシュリン、５ｍｇのヒトトランスフェリンを含みかつ、０．０２ｍＭのモノエタノールアミン、２５ｎＭのＳｏｄｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｔｅを含む無血清ＩＭＤＭ培養液で５日間、５％炭酸ガス培養器中にて３７℃で培養し、約７Ｌの無血清培養上清を得た。その無血清培養上清に、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ及びＰｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｍｅｒｋ社製、カタログ番号２４８３９）を最終濃度約１ｍＭ加え、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット分子量８０００カット、またはミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット  分子量１００００カット）で約１０倍濃縮し、体積７２３ｍｌ（蛋白質濃度３．３８ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量２４４５ｍｇ、相対活性４３０００、相対活性量１０５１０００００）に対し１０００ｍｌ当り１．６ｍｏｌｅｓのＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（合計２８８ｇ）を加え、最終濃度１．５Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅを含む８０４ｍｌの溶液とした後、１．２５Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）で予め平衡化してあったＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カタログ番号１５６−００８０；直径５ｃｍ、ベッド高  ９ｃｍ）に、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１．２５ＭＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）で溶出された素通り画分Ｆ１（２３８４ｍｌ，蛋白質濃度０．８６４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２０６１ｍｇ，相対活性６０００）を得た。
次に、溶出液を２０ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８にかえ、溶出された画分Ｆ２（１０９２ｍｌ，蛋白質濃度０．７７６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量８４７ｍｇ，相対活性１５００００）を集めた。
さらに、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラム  Ｆ２（１０８１ｍｌ）を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）で予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；直径  ３ｃｍ、ベッド高  １０ｃｍ）カラムに注入し、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに１１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（２２６２ｍｌ，蛋白質濃度０．２７０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６１０ｍｇ，相対活性３００００）を得た。次に、溶出液を４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（８５６ｍｌ，蛋白質濃度０．１８９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１６２ｍｇ，相対活性３０００００）を集めた。次に、溶出液を１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）にかえ、溶出された画分Ｆ３（３７０ｍｌ，蛋白質濃度０．０３４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１２．６ｍｇ，相対活性１５００００）を集めた。
さらに、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（８４５ｍｌ）に、最終濃度約１０％の１−プロパノールを加え、４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）で予め平衡化したＬＡ−ＷＧＡカラム（ホーネン社製、カタログ番号ＷＧ−００７；直径  ２ｃｍ、ベッド高  １４ｃｍ）カラムに注入し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）と１−プロパノールの混液（９：１）で溶出されたものをまとめた画分Ｆ１（６４．４ｍｌ，蛋白質濃度０．０１７８ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１．１５ｍｇ，相対活性１７２２０）を得た。次に、溶出液を０．４Ｍ  ＧｌｃＮａｃ，１０％１−プロパノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）にかえ、溶出された画分Ｆ２（４５ｍｌ，蛋白質濃度０．０１０４ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量０．４７０ｍｇ，相対活性６７５０００）を集めた。
そこで、ＬＡ−ＷＧＡカラムにおいて主たるＴＰＯ活性画分Ｆ２（３４０ｍｌ）に、最終濃度約０．００５％のＴＦＡを加えた後、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰ（ＹＭＣ社製、カタログ番号ＡＰ−５１３；直径  ６ｍｍ、ベッド高  ２５０ｍｍ）カラムにて展開した。即ち、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用い、１５％Ｂで平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰカラムに、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、１５％Ｂから２５％Ｂにプロパノール濃度を上げ、さらに２５％Ｂから５０％Ｂまで６５分の直線濃度勾配で展開し、１．５ｍｌ（２．５ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。
それぞれ０．５μｌ（３０００分の１フラクション）を取りＨＳＡを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡを含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号２４〜３０（プロパノール濃度で３５．０〜４２．０％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約６３００００〜４８０００００）があったため、ＴＰＯ活性画分ＦＡ（１３．５ｍｌ）とした。
そこでさらに、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰで得られたＦＡを、展開溶媒Ａに０，１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用いたＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａ  （資生堂製、カタログ番号Ｃ１ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径  ４．６ｍｍ、ベッド高  １５０ｍｍに加え、直径  ４．６ｍｍ、ベッド高  ３５ｍｍのプレカラムを接続したもの）カラムにて展開した。即ち、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ−ＡＰで得られたＦＡの一部（８，９ｍｌ）をとり、０．３ｍｌのグリセロールを添加後、遠心エバポレーションで濃縮後、約２．５ｍｌの１０％Ｂ液を加え、２０％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａカラムに流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、２０％Ｂにて５分溶出した後、２０％Ｂから４０％Ｂまで５０分の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ（２．５ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。
それぞれ１μｌ（１０００分の１フラクション）を取りＨＳＡを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０５％ＨＳＡを含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号２０〜２３（プロパノール濃度で２８．５〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの活性（相対活性約３００００００〜２２５０００００）を示す高活性標品を得ることができた。
＜実施例３７＞
ＣＯＳ１細胞で発現したヒトＴＰＯの分子量測定
ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）の分子量は、糖鎖が付加された結果、ペプチド鎖の大きさから推定しうる分子量よりも大きいことが考えられた。そこでまず、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１、Ｆ１クローン由来）を含む培養上清から部分精製ＴＰＯ画分を以下のように調製した。即ち、展開溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））および展開溶媒Ｂ（０．０５％  ＴＦＡを含む１−プロパノール）を用いて、２５％Ｂで予め平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社、カタログ番号Ａ−ＰＲＲＰ−３３−４６−２５；直径  ０．４６ｃｍ、ベッド高  １５ｃｍ）カラムに、培養上清０．３ｍｌを注入し、流速０，４ｍｌ／ｍｉｎで５分２５％Ｂを通液した後、５０分間の２５％Ｂから５０％Ｂまでの直線濃度勾配にて分画した。ＴＰＯ活性は３４．５％〜４３．５％１−プロパノールの範囲に溶出され、これを遠心エバポレーションで乾固し、部分精製標品を得た。
次に、実施例１に述べた非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから蛋白質抽出操作後、Ｍ−０７ｅアッセイ系にてＴＰＯ活性を調べ、あるいは実施例４５に述べるウエスターン分析により、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する分子量を測定した。この結果、見かけ上の分子量約６９０００〜９４０００の広い範囲にＴＰＯ活性が存在し、分子量の不均一性を確認できた。さらにこれと同様にして、Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（ジェンザイム社製、カタログ番号１４７２−００）によるＮ結合型糖鎖切断後のＴＰＯについて、還元処理されたＤＰＣＩＩＩマーカーに対する見かけ上の分子量を調べてみると、３６０００〜４００００となり、ペプチド鎖の大きさから推定しうる分子量約３５０００よりもなおも大きいことが判明し、Ｏ結合型糖鎖をも含むことが強く示唆された。
これらと同様、ＣＯＳ１細胞で発現したヒト完全長ＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＰＩ、Ｐ１クローン由来）の見かけ上の分子量についても調べたところ、６３０００〜８３０００であった。
＜実施例３８＞ヒトＴＰＯの生物学的特性
主に発現プラスミドｐＨＴＦ１をＣＯＳ１細胞へトランスフェクションして得られたＴＰＯ活性を含有する培養上清を用いて、ヒトＴＰＯのヒト、およびラット血液系細胞に対する作用を調べた。
ヒト臍帯血から調製したＣＤ３４＋、ＤＲ＋細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴ１−２３１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を１０％添加した条件下で、６０００個のＣＤ３４＋、ＤＲ＋細胞から平均１１．５個の巨核球コロニーが形成された。ヒト抹消血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いた比重遠心法にて得られた白血球画分からプラスティック付着性細胞を除去し、さらにＳＢＡ（ダイズアグルチニン）に親和性を有する細胞をＡＩＳマイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法にて除去し、最終的にＡＩＳマイクロセレクターＣＤ３４（旭メディカル株）を用いたパニング法にてＣＤ３４＋細胞画分を得た。この細胞画分にヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清）を添加し、１０日間液体培養したところ、サイズの大きいＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞の選択的増殖が認められ、さらにこのＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞では核の倍数性（ｐｌｏｉｄｙ）が増加していた。このことから、ヒトＴＰＯがヒト巨核球系前駆細胞に特異的に作用し、その増殖・分化を促進することが強く示唆された。
ラット骨髄細胞から分離・精製したＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞画分、及びＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞画分を得る前段階のプラスティック非付着性細胞画分を用いたコロニーアッセイ系で検定したところ、ヒトＴＰＯにより有意な数の巨核球コロニーが形成された。例えば、発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を２０％添加した条件下で、培養５日目に１０００個のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞から平均３４．５個の巨核球コロニー、また２００００個のプラスティック非付着性細胞から平均２８．５個の巨核球コロニーが形成された。さらに、プラスチック非付着細胞画分には巨核球系以外の様々な系統の前駆細胞が存在するが、ヒトＴＰＯの添加では巨核球コロニーしか形成されず、ヒトＴＰＯが巨核球系前駆細胞に特異的に作用することが強く示唆された。また、ラット骨髄由来のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩ  ａ＋細胞画分をヒトＴＰＯ（発現プラスミドｐＨＴＦ１をトランスフェクション、発現させたＣＯＳ１細胞培養上清を２０％添加）の存在下に３〜５日間液体培養し、核の倍数性（ｐｌｏｉｄｙ）を調べたところ、培養５日目に明らかにｐｌｏｉｄｙが増加していた。
＜実施例３９＞
グルタチォン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とヒトＴＰＯ  （アミノ酸１−１７４）の融合タンパク質（以下、この融合タンパク質を「ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）」と称す）の大腸菌発現用ベクターの構築
大腸菌でのヒトＴＰＯの発現を容易にするために、ヒトＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工遺伝子を作製した。なお、このＤＮＡ塩基配列は大腸菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ＡＴＧ）を−１の位置に有する。
表１２に示した１−１２の合成オリゴヌクレオチドを作製し、２−１１の合成オリゴヌクレオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により１ｍＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ  Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリゴヌクレオチドを６本の二本鎖ＤＮＡにするために１及び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１１及び１２それぞれの組み合わせの一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。，５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液中でアニールした。次に１及び２；３及び４；５及び６の三組の二本鎖ＤＮＡと、７及び８；９及び１０；１１及び１２の三組の二本鎖ＤＮＡをそれぞれＴ４リガーゼ（ライフテクノロジー社製）を用いて反応し、更にこれら二種の反応液を同様にしてＴ４リガーゼを用いて反応した。このライゲーション反応で得られたＤＮＡをＢａｍＨＩ  （べーリンガーマンハイム社製）で消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、約３９０−４００ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、Ｘｂａｌ，ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。得られたクローンのうち、表１３に示したヒトＴＰＯをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工遺伝子をもつクローンを、塩基配列の解析により選択し、これをｐＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）とした。表１３のコーディング鎖のＤＮＡ配列を配列表（配列番号９）に示した。
【表１２】
0003635142.tif 000013
【表１３】
0003635142.tif 000014
ヒト正常肝臓由来ポリ  （Ａ）＋ＲＮＡ１μｇよりｃＤＮＡの１本鎖目をオリゴｄＴプライマーをプライマーとして合成し、ｃＤＮＡ合成の反応液の０．１容を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーにはｈＴＰＯ−Ｃ及びｈＴＰＯ−こ（ＥｃｏＲＩ）を使用し、１００μｌの容量で反応を行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分間／５８℃１分間／７２℃１分間を３０サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約６００ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。正しいヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンを、塩基配列の解析により選択し、ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４−３３２）とした。ここで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りである。
ｈＴＰＯ−Ｃ：５’−ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡ−３’
（ｐＨＴＦ１クローンの３２９−３４９）
ｈＴＰ０−こ（ＥｃｏＲＩ）：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴ−３’
（ｐＨＴＦ１クローンの１１４３−１１６３に対応するアンチセンスにＥｃｏＲＩ配列を付加）。
ｐＵＣ１８（ＢＥ）（１２４−３３２）をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約６００ｂｐの大きさのヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側フラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８（ＸＢ）（１−１２３）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンをｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３２）とした。
ヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側の種々のデリーションコンストラクトを作製し、それを発現させインビトロのヒトＴＰＯ活性の測定を行った実施例より、ヒトＴＰＯアミノ酸１−１６３はヒトＴＰＯ活性を保持することが明らかになったので、このぺプチド断片を含んだ発現ベクターを構築することにした。ここでは、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の発現を行った。
ｐＨＴＦ１クローンの６８１−６８６（アミノ酸１７３−１７４）に相当する塩基配列は、制限酵素Ｓａｃｌにより認識されるので、この制限酵素認識部位を利用して２本の合成オリゴヌクレオチドにより終止コドンを導入した。具体的には、２本の合成オリゴヌクレオチドＳＳＥ１，ＳＳＥ２を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭＮａＣｌの溶液中でアニールし、ここで得られた二本鎖ＤＮＡを、ＳａｃＩ，ＥｃｏＲＩで消化してヒトＴＰＯｃＤＮＡのＣ末端側約４８０ｂｐを除いたｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３２）にＤＮＡ  ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて導入し、クローンｐＵＣ１８（ＸＳ）（１−１７４）を得ることができた（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。ここで用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を表１４に示した。
【表１４】
0003635142.tif 000015
ｐＵＣ１８（ＸＳ）（１−１７４）をＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトＴＰＯアミノ酸１−１７４をコードする約６００ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ＋  （ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）とした。さらに、これと同様にしてｐＢＬ（ＸＳ）（１−１７４）をＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ヒトＴＰＯアミノ酸１−１７４をコードする約５５０ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップーＡ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ５３６（特表示昭６０−５０１９８８）にクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７４）とした。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク発現ベクターであるｐＧＥＸ−２Ｔ  （ファルマシア社製）によって、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を発現させるために、次のことを行った。ｐＣＦＭ５３６／ｈＴ（１−１７４）を鋳型として、２本のＰＣＲ用プライマーＧＥＸ１，ＧＥＸ３を用いてＰＣＲを行った（９６℃２分間の後に、９５℃１分間／４１℃１分間／７２℃１分間を２２サイクル反応し、さらに７２℃７分間）。これによって得られた、ヒトＴＰＯをコードする断片をＮａｅＩとＥｃｏＲＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約５５０ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩ，Ｓｍａｌで消化したｐＧＥＸ−２Ｔにクローニングし（宿主はＥ，ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用した）、正しいヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）を、塩基配列の解析により選択し、これをＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）発現用の形質転換体とした。ここで用いたＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りである。
ＧＥＸ１：５′−ＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣ−３′（配列番号１０の２１−３９にＮａｅＩ配列を付加）
ＧＥＸ３：５′−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＡＧＴＧＴ−３′（配列番号１０の５２３−５４９のアンチセンス）。
またこの発現プラスミドは、ＧＳＴタンパクに続いてトロンビン認識配列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードする配列を含んでいる。トロンビン認識配列、及びヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１７４）をコードする配列を配列表（配列番号１０）に示した。
＜実施例４０＞
ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の大腸菌での発現
実施例３９で得られた形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに３７℃で一晩振盪培養し、この培養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ６００が０．７−０．８に至るまで３７℃で振盪培養した。次いで最終濃度が、０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間振盪培養して、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の発現を誘導した。
＜実施例４１＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）の精製と活性確認
ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）生産組換体凍結菌体５．９ｇに水１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により、ＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を沈殿画分に回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。次に、回収されたＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を含む沈殿画分に水５ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を６ｍｌ、１０Ｍ尿素１２０ｍｌ、水１６ｍｌを加えた。室温にて５分間攪拌可溶化後、溶液を４等分し、各々、以下のとおり（１）〜（４）の４種の操作を行った。
（１）２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を回収し、これに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１）陽イオン交換カラムにＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を溶出させた。溶出液１２９ｍｌに２．６ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えて、ｐＨを８．１にした後、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０７５６−０１）カラムに添加しＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５でＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を溶出させた。溶出液にトロンビン３７ＮＩＨ  Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置した後、ＰＢＳで１０倍希釈し、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに添加し切断されたＧＳＴを吸着させ、非吸着画分にＴＰＯ（１−１７４）を回収した。回収した非吸着画分を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で３倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。
（２）（１）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０存在下で行った。
（３）２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈した。これに還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを加えて、各々、最終濃度５ｍＭ及び０．５ｍＭとし、４℃で一晩静置した。遠心分離により、上清中にＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を回収し、これに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で２倍希釈した後、酢酸を用いてｐＨ５．５に調整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換樹脂にＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を吸着させた。同樹脂を２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した後、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いてＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）を溶出させた。溶出液に１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えてｐＨを約８とし、トロンビン３２０ＮＩＨ  Ｕｎｉｔを加えて室温で４時間静置した後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。
（４）（３）の操作を全て０．１％ポリソルベート８０存在下で行った。
（１）〜（４）の操作で得られたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフィーの塩化ナトリウム濃度約２００ｍＭから４００ｍＭで溶出された画分を、各々、ＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、容量依存的にＴＰＯ活性を認めた。同画分を還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、この画分の主タンパク質バンドの一つとして分子量１９Ｋダルトンのバンドが検出された（純度１−２０％）。このバンドについて実施例１に記載された方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行なった結果、このｐＧＥＸ−２Ｔ／ｈＴ（１−１７４）由来の融合蛋白質として発現されるべきＴＰＯの配列を含むことが確認できた。
＜実施例４２＞
アミノ酸１（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、アミノ酸３（Ａｌａ→Ｖａｌ）に変換したヒトＴＰＯ  （アミノ酸１−１６３）の大腸菌用発現べクターの構築
実施例３９で作製したｐＵＣ１８（ＸＥ）（１−３３２）をＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化後、２％のアガロースゲルで泳動し、ヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２をコードする約１０００ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）。ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＸＥ）（１−３３２）とした。
次にこのクローンｐＢＬ（ＸＥ）（１−３３２）のＢａｍＨＩ認識配列からアミノ酸１６３（３６６−４８９）までを大腸菌優先コドンに変更することとした。表に示した１３−２０の合成オリゴヌクレオチドを作成し、１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて０．１ｍＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ  Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。さらに１／１０量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐ７．５），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸した後、放置することにより２本鎖ＤＮＡとした。次に１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８の三組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、これを鋳型として１９及び２０の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。これによって得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、約１３０ｂｐの断片をプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｄＩＩＩで消化したｐＢＬ（ＸＥ）（１−３３２）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用した）。得られたクローンのうち表１５に示した塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択し、これをｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）とした。
【表１５】
0003635142.tif 000016
さらに、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）の発現量を増すこと、またＮ末端のプロテアーゼによる分解を防ぐことを目的として、ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）の１位のアミノ酸をＳｅｒ→Ａｌａに、３位のアミノ酸をＡｌａ→Ｖａｌに変換し、更に−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔをコードするような変異型ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）  （以下、このようなタンパク質を「ｈ６Ｔ（１−１６３）」と称す）を発現させるための発現ベクターの構築を行った。表に示した４種の合成オリゴヌクレオチドを作製し、２−９、３−３の合成オリゴヌクレオチドをＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）により１ｍＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭＭｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。これらの合成オリゴヌクレオチドを２本の二本鎖ＤＮＡにするために１−９及び２−９；３−３及び４−３それぞれの組み合わせの一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液中でアニールした。次に１−９及び２−９；３−３及び４−３の二組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ  ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて反応した。このライゲーション反応で得られたＤＮＡを、ＸｂａＩ，ＮｒｕＩで消化したｐＢＬ（ＸＨ）（１−１６３）にサブクローニングし、塩基配列の解析により表１６に示した合成オリゴヌクレオチドにより正しく置換されたクローンを選択し（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを使用した）、これをｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）とした。
【表１６】
0003635142.tif 000017
ｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）をＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−１６３をコードする約５００ｂｐの大きさのフラグメントを回収してプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットで精製し、ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ５３６（特表昭６０−５０１９８８）にクローニングした（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９９３３）で予め形質転換されたＥ，ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用した）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）とし、この発現ベクターを有する大腸菌株を変異型のヒトＴＰＯ、すなわちｈ６Ｔ（１−１６３）発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、配列表（配列番号１１）に示されたＤＮＡ配列を含んでいる。
＜実施例４３＞
ｈ６Ｔ（１−１６３）の大腸菌での発現
発現プラスミドｐＣＦＭ５３６の発現制御は、λＰＬプロモーターによるが、これ自体が、ｃｌ８５７リプレッサー遺伝子の制御下にある。＜実施例４２＞で得られた形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに３０℃で一晩振盪培養し、この培養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ６００が１．０−１．２に至るまで３０℃で振盪培養した。次いで最終温度が、４２℃になるように６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培地を添加し、さらに３時間４２℃で振盪培養してｈ６Ｔ（１−１６３）の発現を誘導した。
＜実施例４４＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来ｈ６Ｔ（１−１６３）の精製と活性確認
ｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体３．６ｇに水１０ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分に水７ｍｌを加えてけん濁した後、攪拌しながら１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を３ｍｌを加えた後、尿素（終濃度８Ｍ）、塩酸グアニジン（終濃度６Ｍ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度２％）を各々加えて室温にて５−２０分間攪拌して可溶化した。これを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、４℃中にて一晩でタンパク質の巻き戻し（リフオールディング）操作を行なった。この際に、空気酸化の他、添加物としてグルタチオン及び硫酸銅を各々添加した。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を回収した。各々の回収画分について還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、どの方法に於ても、この画分の主タンパク質バンドとして分子量約１８Ｋダルトンのバンドが検出された（純度３０−４０％）。このバンドについて実施例１に記載された方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写しＮ末端シークエンス分析を行なった結果、このｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来の変異型ＴＰＯとして発現されるべきＴＰＯの配列を含むことが確認できた。
各々の画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫ系で評価した結果、全ての画分に於て容量依存的にＴＰＯ活性を認めた。
＜実施例４５＞
抗ＴＰＯペプチド抗体の作製と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ→ウエスターン分析によるＴＰＯの検出
抗ＴＰＯ抗体が作製できれば、免疫学的手法によりＴＰＯの蛋白質を検出することができる。そこで、最初に判明したラットＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原として適していると考えられた３カ所の領域（表１７に示す）を選び、Ｔａｍ  （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１９８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅ  ＡｎｔｉｇｅｎＰｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把に免疫した結果、これらの抗血清を得ることができた。合成ペプチド抗原に含まれるアミノ酸配列
【表１７】
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次いで、これらの抗血清のうち、まず抗ＲＴ１ペプチド、抗ＲＴ２ペプチド抗体について、プロテインＡカラム（ＰＲＯＳＥＰ−Ａ；Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ社製、カタログ番号８４２７）を用いて、ＩｇＧ画分（それぞれ２３４４ｍｇ、１９２０ｍｇ）を得、これらのうちそれぞれ５４ｍｇ、３２ｍｇをとり活性型ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＩＩ、ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号２１３３６）とカップリングすることにより、ビオチン化した。。実施例１に述べた方法と同様に、組み換え体ＴＰＯを含む標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいは、ニトロセルロース膜にエレクトロブロティングし、定法によりこれらのビオチン化抗体を一次抗体として用いてウェスタン分析を行った。
即ち、ブロッティング後の膜を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ）で５分洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分２回洗浄後、ブロッキング剤（ＢｌｏｃｋＡｃｅ、大日本製薬社製、カタログ番号ｕｋ−Ｂ２５）で６０分処理した。次に１０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化抗ＴＰＯぺプチド抗体、０．０５％ＢＳＡ、１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅを含むＴＴＢＳ溶液で６０分後処理後、ＴＴＢＳで５分２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号Ａ１０８）を１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ、ＴＴＢＳ溶液で５０００倍希釈したものを含む溶液で３０分処理し、５分２回のＴＴＢＳ洗浄、５分間のＴＢＳ洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カタログ番号１７０−６４３２）により発色させた。以上のウエスタン分析は室温にて実施した。
この結果、ＣＯＳ１細胞で発現した各種組み換えラットＴＰＯのみならず、ＣＯＳ１細胞及び大腸菌で発現した各種組み換えヒトＴＰＯ（具体的には、これまでの実施例に述べたＣＯＳ１細胞で発現したプラスミドｐＨＴＰ１あるいはプラスミドｐＨＴＦ１由来ヒトＴＰＯとそのＮ結合型糖鎖切断後のＴＰＯ、大腸菌で発現したＧＳＴ−ＴＰＯ（１−１７４）及びそのトロンビン消化後のＴＰＯ、大腸菌で発現した変異型ＴＰＯであるｈ６Ｔ（１−１６３））をも認識することができた。そして、これら各種組み換えヒトＴＰＯの分析に用いることが可能となった。
以上の手法と同様にして、抗ヒトＴＰＯぺプチド抗体の作製が可能であることが示された。これらの手法で得た抗体により、ウェスタン分析のみならず、抗体カラムによるＴＰＯの精製をはじめ、通常考えられる抗体を用いたあらゆる免疫学的手法への応用が可能となる。
また、配列番号６に示されるヒトＴＰＯのアミノ酸配列のうち、比較的抗原として適していると考えられた６カ所の領域（表１９に示す）を選び、Ｔａｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５４０９−５４１３，１９８８）の方法により４本鎖のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）型のペプチドを合成し、１００μｇずつ８回にわたってそれぞれウサギ２把に免疫した。
表１９で示された各ペプチド領域のＣ末端にシステイン残基を結合させた１本鎖ペプチドを別途合成し、これを試験抗原として酵素免疫測定法を用いて抗体価を調べたところ、いずれの血清についても抗体価の上昇が確認されたので、これらを抗血清とした。
抗体は、１種の抗原ペプチドにつきウサギ抗血清２把ずっ免疫したため、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、これら由来するウサギの個体ごとに区別して、抗ＨＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体の様に称する。
以下に抗ＨＴ１−１ペプチド抗体についての精製を例として示す。
まず、システイン残基を結合したＨＴ１の１本鎖ペプチド３０ｍｇを１２ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号４４８９５）に結合させた。即ち、ゲル体積の６倍容のカップリングバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ）５ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ  ｐＨ８．５）で平衡化したゲルに、抗原の含まれるペプチド溶液を１５分間カップリングさせた。次に３０分間静置した後、ゲル体積の３倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。次に０．０５Ｍ  Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ−ＨＣｌを含むカップリングバッファーを、１ｍｌ／ｍｌゲルの割合で添加し、１５分間未反応基をブロックした。次に３０分間静置した後、ゲル体積の８倍容のカップリングバッファーでゲルを洗浄した。以上のカップリングは室温で行った。このようにして、抗原領域を含むペプチドをカップリング効率２８．３％にてゲルに共有結合させ、１ｍｌゲル当たりに結合したペプチドが０．８ｍｇである抗原ペプチド抗原カラムを調製した。次に、全採血後の抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を含む抗血清７８．４ｍｌのうち７６．７ｍｌ（蛋白質量３６２０ｍｇ）を予め１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した抗原カラムに添加し、さらに同緩衝液で洗浄後１０５．９ｍｌの素通り画分（蛋白質量３６８０ｍｇ）を得た。次に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で吸着画分を溶出し、ただちに２１．１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．９）を加えて中和後、限外濾過（アミコン社製ＹＭ３０膜）にて濃縮し、１１．２ｍｌ（蛋白質量７７．７ｍｇ）の１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）の溶液中に精製された抗ＨＴ１−１ペプチド抗体を得ることができた。
同様にして、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体（６０．０ｍｇ）、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体（１８．８ｍｇ）、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体（８．２ｍｇ）などを得ることができた。抗ＨＴ３〜６ペプチド抗体も同様にして得ることができる。
アフィニティ精製した抗ＨＴ１−１ペプチド抗体、抗ＨＴ１−２ペプチド抗体、抗ＨＴ２−１ペプチド抗体、抗ＨＴ２−２ペプチド抗体をそれぞれ３ｍｇをとり活性型ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＩＩ、ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号２１３３６）とカップリングすることにより、ビオチン化した。
【表１９】
0003635142.tif 000019
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から部分精製された組換えヒトＴＰＯ標品を定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＰＶＤＦあるいはニトロセルロース膜にエレクトロブロテイングし、上述の抗ＲＴペプチド抗体の場合と同様にウェスタン分析を行ったところ、それぞれの精製された抗体により、ヒトＴＰＯが認識、検出されることが確認できた。＜実施例４６＞
抗ＴＰＯペプチド抗体カラムの調製
実施例４５で得られた抗ラットＴＰＯペプチド抗体は、ラット及びヒトＴＰＯを認識することができたため、抗ＲＴＩペプチド抗体、抗ＲＴ２ペプチド抗体の免疫グロブリン（ＩｇＧ）画分を以下のようにして、クロマトグラフィー坦体に結合させ、抗ＴＰＯペプチド抗体カラムを作製した。材料となった抗体は、それぞれの抗原ペプチドにっきウサギ抗血清２把ずつから由来し、それぞれのウサギごとに抗体を分けて調製した。具体的には、抗ＲＴ１ペプチド抗体では、それぞれ、抗ＲＴ１−１ペプチド抗体と抗ＲＴ１−２ぺプチド抗体と称し、抗ＲＴ２ペプチド抗体では、抗ＲＴ２−１ペプチド抗体と抗ＲＴ２−２ペプチド抗体と称す。これらを別々にして抗体カラムを調製したため、抗ＲＴ１ペプチド抗体カラムは２種（それぞれ抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラムと称す）、抗ＲＴ２ペプチド抗体カラムは２種（それぞれ抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラムと称す）、さらに抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を混合してゲルにカップリングした抗体カラム（抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラム）、の５種類を調製した。
各々の抗体を５ｍｇ／ｍｌ（抗ＲＴ１＋２ｍｉｘ抗体カラムでは抗ＲＴ１−２ペプチド抗体と抗ＲＴ２−１ペプチド抗体を等量混合した２．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含む５０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液とし、これを２．３１ｍｌとり、１．５４ｍ体積の膨潤したホルミル活性化ゲル（Ｆｏｒｍｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ、チッソ株式会社製）と合わせ、４℃で２時間カップリング反応させた。次いで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の還元剤溶液（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｂｏｒａｎｅ（ＴＭＡＢ）、生化学工業製、カタログ番号６８０２４６）を１．１ｍｌ加え、さらに６時間カップリング反応させた後、遠心分離によりゲル部分のみを回収した。これに１０ｍｌの精製水を加え、遠心分離でゲル部分のみの回収といった操作を４回繰り返し、未反応の抗体を取り除いた。次に４．６ｍｌのブロッキング緩衝液（０．２Ｍ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ  ｅｔｈａｎｏｌ  ａｍｉｎｅ（ｐＨ７．０））と１，１ｍｌの還元剤溶液を加え、４℃で２時間以上処理することにより、未反応のゲルの活性基をブロックした。最後にゲルを遠心分離を用いて精製水、ＤＰＢＳで洗浄し、小カラムチューブに充填し、３Ｍチオシアン酸カリウム溶液、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）溶液で洗浄後、再度ＤＰＢＳで再平衡化して保存した。
抗ＲＴ１−１抗体カラム、抗ＲＴ１−２抗体カラム、抗ＲＴ２−１抗体カラム、抗ＲＴ２−２抗体カラム、抗ＲＴ１−２＋２−１混合抗体カラムの５種類それぞれの抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルでは、各ＩｇＧ画分のカップリング効率は順に９７．４％、９５．４％、９８．４％、９８．３％、９９．４％に達した。また、それぞれのゲル体積当たりにカップリングしたＩｇＧ画分量は、５．６ｍｇ／ｍｌゲル、５．８ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、５．７ｍｇ／ｍｌゲル、２．９ｍｇ／ｍｌゲルであった。従って、抗体の由来や抗原の違いによって、カップリング効率やカップリング量に大きな差がないことが確認できたため、これらの抗体カラムを利用して、以下、実施例４７に示す実験を行った。
＜実施例４７＞
発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来ＴＰＯの抗ＴＰＯ抗体カラム→逆相カラムクロマトグラフィーでの精製〜生物学的活性の確認
以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、実施例３５の培養上清由来ＴＰＯの部分精製標品（ＴＰＯが回収された主たる画分ではない画分、即ち、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラムの素通り画分Ｆ１と、Ｆ２の後に２０ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ５．８でカラム洗浄し溶出したＦ３、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムのＦ１とＦ３をまとめてＴＰＯサブプール画分（５４６３．７９ｍｌ，蛋白質濃度０．４９０ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量２６７６ｍｇ，相対活性１２１００，相対活性量３２３８００００）とし、限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット  分子量８０００カット）でまず濃縮し、さらに溶媒をＤＰＢＳに置換し、小体積になってからはＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット（アミコン社製）を用いて最終的に１２０．２ｍｌの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ溶液にした。次に実施例４６で調製した５種類の抗ＴＰＯペプチド抗体ゲルを全て混合し、１本の抗体カラム（直径１．６ｃｍ，ベッド高４．８ｃｍ，抗ＲＴ１＋２混合抗体カラムと称す）にまとめ、室温にて流速０．０３３ｍｌ／ｍｉｎでＴＰＯサブプール画分を添加した。添加終了後、ＤＰＢＳで溶出液の紫外線吸収が十分下がるまでを集め、さらにＹＭ−１０膜付き限外濾過ユニット（アミコン社製）で濃縮した素通り画分Ｆ１（８２．６２ｍｌ，蛋白質濃度１４．３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１１８４ｍｇ，相対活性６７５００，相対活性量７９９０００００）を集めた。次に酸性溶離液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５））で溶出されるカラム吸着画分Ｆ２（９２．９７ｍｌ，蛋白質濃度０．１２ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１１．１ｍｇ，相対活性２５７１００，相対活性量２８６００００）を溶出した。素通り画分Ｆ１には相当量のＴＰＯ活性があったが、抗体カラムに吸着したＴＰＯについては約２０倍の相対活性の上昇が認められたため、さらに精製を行った。即ち、展開溶媒Ａに０．１％ＴＦＡ、展開溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡを含む１−プロパノールを用いたＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａ（資生堂製、カタログ番号Ｃ１  ＴＹＰＥ：ＳＧ３００Ａ；直径４．６ｍｍ、ベッド高１５０ｍｍに加え、直径４．６ｍｍ）ベッド高３５ｍｍのプレカラムを接続したもの）カラムにて、抗体カラムで得られたＦ２に１０分の１体積の展開溶媒Ｂを加え、２０％Ｂで平衡化したＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａカラムに流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入終了後、２０％Ｂにて５分溶出した後、２０％Ｂから４０％Ｂまで５０分の直線濃度勾配で展開し、１ｍｌ（２．５ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。
それぞれ２μｌ（５００分の１フラクション）を取りＨＳＡを加え、限外濾過濃縮し、最終的に０．０２％ＨＳＡを含む０．２５ｍｌのＩＭＤＭアッセイ培養液溶液とし、これをアッセイにかけ、ＴＰＯ活性画分を特定した。この結果、チューブ番号２０〜２３（プロパノール濃度で２８．５〜３２．５％の範囲）に強いＴＰＯの活性を示す標品を得ることができた。またこれらの標品を＜実施例４５＞に述べた方法によりウエスターン分析をしたところ、ＤＰＣＩＩＩ分子量マーカーに対し、還元下において見かけ上の分子量が６００００〜７００００のＴＰＯが確かに存在し、これとは別に、３２０００〜４３０００、２００００〜３００００の分子量をもっ分子も存在していることが判明した。
＜実施例４８＞
発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた培養上清由来で、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１  ３００Ａカラムの段階まで精製されたＴＰＯの生物学的活性の確認
実施例３６で精製されたＴＰＯ活性画分、即ちＣａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１３００Ａカラムのチューブ番号２０〜２３（プロパノール濃度で２８．５〜３２．５％の範囲）までを集め、０．２１ｍｌのグリセロールを添加後遠心エバポレーションで濃縮した。これに６Ｍ塩酸グアニジン溶液０．２１ｍｌを加えたものをＤＰＢＳで１ｍｌに希釈後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＮＡＰ−１０，ファルマシア  バイオテック社製、カタログ番号１７−０８５４−０１）で０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液に置換し、さらに１．１ｍｌの０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳを加えて、最終的にＴＰＯ活性画分ＦＡ（２．６ｍｌ）を調製した。この標品の生物学的ＴＰＯ活性をについて調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量８７４００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．４２倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．２３倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。
＜実施例４９＞
発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた、培養上清３３Ｌを出発材料にし、陽イオン交換カラムで得た粗精製ＴＰＯ画分の生物学的活性の確認
（１）以下の精製サンプルの評価のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ方法は、Ｍ−０７ｅアッセイ系を用いた。実施例３６で記載された方法と同様にして、３３Ｌの発現ベクターｐＨＴＰ１をＣＯＳ１細胞にトランスフェクションして得られた無血清培養上清を得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット  分子量１００００カット）で約１０倍濃縮し、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦを最終濃度約１ｍＭ加え、体積２０１８ｍｌ（蛋白質濃度３．２２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６５０２ｍｇ、相対活性６６０００、相対活性量４２９１０００００）を得た。次に、限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット  分子量３００００カット）で濃縮工程を繰り返し、分子量３００００以上の画分（体積１１９０ｍｌ）蛋白質濃度２．５４ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３０２０ｍｇ、相対活性８２５００、相対活性量２４９００００００）と、分子量３００００以下の画分（体積２９７５ｍｌ、蛋白質濃度０．４７１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量１４０２ｍｇ、相対活性４５００、相対活性量６３１００００）を得ることができた。分子量３００００以下の画分にＴＰＯ活性が存在することは、ＴＰＯの動物細胞での発現・分泌の過程において、最終的に培養上清中に、低分子化したＴＰＯが含まれている可能性を示す。一方、分子量３００００以上の画分をさらに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）に置換し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）で予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；直径２．６ｃｍ、ベッド高２９ｃｍ）カラムに注入し、流速５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）で洗浄溶出した。次に展開溶媒Ａに２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）、展開溶媒Ａ中に１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液を展開溶媒Ｂとして用い、流速３ｍｌ／ｍｉｎで０％Ｂから５０％Ｂまで２１５分間、さらに５０％Ｂから１００％Ｂまで２０分の直線濃度勾配で展開し、３０ｍｌ（１０ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。これらの一部を取り、Ｍ−０７ｅアッセイ系で活性の分布を調べたところ、広範囲にわたりＴＰＯ活性が溶出されたことが判明した。そこで素通りを含め、５０ｍＭ以下のＮａＣｌで溶出された画分をＦ１、ＴＰＯの主画分として５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌで溶出された画分をＦ２としてまとめた。Ｆ１は体積１９５１ｍｌ（蛋白質濃度２．０５ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量３９９４ｍｇ、相対活性１３５００、相対活性量５３９０００００）、Ｆ２は体積６４９．８ｍｌ（蛋白質濃度１．１１ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量７２１ｍｇ、相対活性２６８０００、相対活性量１９３００００００）であった。
（２）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｆ２の生物学的活性の確認  （１）で分取したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗのＦ２を２．５ｍｌ取り、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＮＡＰ−２５，ファルマシア  バイオテック社製、カタログ番号１７−０８５２−−０１）で０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ溶液３．５ｍｌに置換し、このサンプル（蛋白質濃度１．４６ｍｇ／ｍｌ）の生物学的ＴＰＯ活性について調べるために、ｉｎｖｉｖｏアッセイを行った。即ち、１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス（８週齢）に、活性画分１００μ１（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量３１５０を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、０．０１％ＨＳＡを含むＤＰＢＳ１００μｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．２９倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．１２倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．０５，Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結果から、動物細胞で生産された上記のヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。
＜実施例５０＞
ヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡのＣＨＯ細胞用組換え発現ベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯの構築
ベクターｐＤＥＦ２０２を制限酵素ＫｐｎｌとＳｐｅｌで処理し、アガロースゲル電気泳動で小さい方のマウスＤＨＦＲミニ遺伝子とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むフラグメントを回収したのち、このフラグメントとヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡを含むプラスミドｐＥＦＨＧＴＥを制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩで処理しＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む領域を除去したべクターＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰＯを得た。このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡが接続されている。
＜実施例５１＞
ＣＨＯ細胞によるヒトＴＰＯ染色体ＤＮＡの発現
ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをリン酸カルシウム法（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ）ファルマシア社製）によって形質転換した。すなわち、実施例５０で調製したｐＤＥＦ２０２−ｇｈＴＰ０プラスミド１０μｇにバッファーＡ：１２０μｌおよびＨ２０：１２０μｌを加え混合したのち、室温で１０分間放置した。つぎに、この溶液にバッファーＢ：１２０μｌを加え、再度混合したのち、室温で３０分間放置した。このＤＮＡ溶液をプレートに滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてその培養上清中のヒトＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイを用いて測定した結果、ヒトＴＰＯ活性が認められた。
なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦＨＧＴＥとｐＭＧ１を同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによっても行うことができる。
＜実施例５２＞
−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）（以下、このタンパク質を「ｈＭＫＴ（１−１６３）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築〜発現・発現の確認
配列番号６のアミノ酸配列（１−１６３位）の−１位にＬｙｓ）−２位にＭｅｔが付加されたタンパク質を発現するため、実施例４２と同様にして、以下の表１８に示した１−１３、２−１３、３−３、４−３の合成オリゴヌクレオチドを用いて、ｈＭＫＴ（１−１６３）の大腸菌用発現べクターｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６３）を構築した。
【表１８】
0003635142.tif 000020
この発現プラスミドは、配列表（配列番号１２）に示されたＤＮＡ配列を含んでいる。さらに、実施例４３と同様にして、ｈＭＫＴ（１−１６３）の発現を誘導した。
ここで得られた発現タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った結果、発現されるべきｈＭＫＴ（１−１６３）のアミノ酸配列を含むことが確認できた。
＜実施例５３＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）の塩酸グアニジンとグルタチオンを用いたリフォールディング〜精製〜生物学的活性の確認実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体１．２ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去する。回収されたｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終４ｍｌとした。攪拌しながら１ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、２０ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて５分間攪拌して可溶化した。これを２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５で１０倍希釈し、５ｍＭ還元型グルタチオンと０．５ｍＭの酸化型グルタチオンを加えて攪拌し溶かした後、４℃中にて一晩静置した。遠心分離により、上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を回収した。得られた上清のうち１６０ｍｌをＹＭ１０限外濾過膜（アミコン社製）を用いて濃縮し、ＤＰＢＳにて緩衝液を置換して最終容量３．４ｍｌとした（蛋白濃度２．１８ｍｇ／ｍｌ）。この画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した結果、強いＴＰＯの活性（相対活性５８０００）を示した。
上記の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてｉｎ ｖｉｖｏアッセィを行った。１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス（７週齢）に、活性画分１７０μｌ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での相対活性量２２０００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１群６匹の同様のマウスにＤＰＢＳ１７０ｐｌを同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日、終了３日後に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了翌日において投与前と比較して平均で２．１５倍の血小板の増加を認め、また投与終了３日後においてもその効果は持続しており２．１３倍の高値を維持した。投与終了翌日及び３日後のいずれの日においても、血小板数は、それぞれの日の対照群のそれと比較して１．７３倍、１．８０倍と高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．００１，Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。
この結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。
＜実施例５４＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯＮｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディング〜精製〜生物学的活性の確認
実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体０．６ｇに水３ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に３．１ｍｌの水を加えて懸濁した後、０．１９ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、１１．２５μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、３８μｌの０．５ＭＥＤＴＡ、０．３８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて４０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に水４ｍｌを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３．８ｍｌを加え懸濁した後、攪拌しながら０．２ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８と１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。これに５μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（１−１６３）を含む上清画分を回収した後、上清５ｍｌに５ｍｌの水、１０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７加えた後、２．６ｇのＤｏｗｅｘ  １−ｘ４，２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｆｏｒｍイオン交換樹脂を加え、９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、遠心分離によって上清を回収した。得られた上清を２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラムに添加し、同緩衝液中でＮａＣｌ濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系で評価した結果、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフイーのＮａＣｌ濃度約１００ｍＭ付近で溶出された画分に強いＴＰＯの活性（相対活性約１９００００００）を示した。この画分をウルトラフリーＣＬ分画分子量５０００限外濾過ユニット（ミリポア社製、型番ＵＦＣ４ＬＣＣ２５）を用いて１．６倍濃縮した（２．５ｍｌ、蛋白濃度２５μｇ／ｍｌ）。同画分を還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ＴＰＯのバンドが主バンドとして検出された（純度７０−８０％）。
上記の方法により調製したＴＰＯ活性画分についてｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行った。１群４匹のＩＣＲ系雄性マウス（８週齢）に、活性画分１００μｌ（ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系での相対活性量４７５００を含む）を１日１回、５日間連日皮下投与した。対照として、１００ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７１００μｌ．を同様のスケジュールで皮下投与した。採血は、投与開始直前及び投与終了翌日に眼底より行い、血球測定装置（東亜医用電子製、Ｆ８００）を用いて血小板数を測定した。ＴＰＯ投与群では、投与終了後において投与前と比較して平均で１．７３倍の血小板の増加を認め、対照群の血小板数と比較しても１．５９倍の高値を示し、両者の間に有意差（ｐ＜０．０１，Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）を認めた。この結果から、大腸菌より生産され、上記の方法で調製したヒトＴＰＯが、生体内において血小板増加作用を有することが明らかとなった。
＜実施例５５＞
ＣＨＯ細胞の大量培養
実施例３２にぉぃてヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰ０−Ｐ１をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ２８−３０細胞、２５ｎＭ  ＭＴＸ耐性）の大量培養は以下のようにして実施した。細胞を２５ｎＭ  ＭＴＸおよび１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を用いて培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００ｍｌの同培地を含むＦａｌｃｏｎ社製ローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ３０００）に１×１０７個の細胞を接種し、３７℃で１ｒｐｍの回転速度で３日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍｌのＰＢＳで細胞培養表面をリンスしたのち、２５ｎＭ  ＭＴＸおよび１０％ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル５００本分実施し、培養上清１００Ｌを得た。
＜実施例５６＞
ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製
（１）実施例５５より無血清培養上清約１００Ｌを得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。これを限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＴＫペリコンカセット  分子量３００００カット）で濃縮かつ溶媒を精製水に置換し、蛋白質分解酵素阻害剤であるｐ−ＡＰＭＳＦ（和光純薬社製）を最終濃度１ｍＭ及びＰｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ  （Ｍｅｒｋ社製）を最終濃度０．３５ｍＭ加え、体積３６２８ｍｌ（蛋白質濃度１．６０ｍｇ／ｍｌ）総蛋白質量５８０５ｍｇ、相対活性１２３００００、相対活性量７１４９００００００）の分子量３００００以上の画分を得た。この画分を実施例４５で述べたウエスターン分析で調べたところ、分子量６６０００〜１０００００の範囲にＴＰＯ蛋白質が存在することが明らかとなった。さらによく調べてみると、これとは別に、より低分子のＴＰＯをも含まれていることが判明した。
分子量３００００以下の限外濾液はこれとは別に限外濾過ユニット（ミリポア社製・ＰＬＧＣペリコンカセット  分子量１００００カット）で濃縮したところ、体積１９０１ｍｌ（蛋白質濃度０．３６ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６８４ｍｇ、相対活性２４５５００、相対活性量１６７９０００００）であったため、低分子化したＴＰＯ分子が培養工程において生じたことが確認された。
次に、分子量３００００以上の画分３６１４ｍｌに７６４ｇの硫酸アンモニウム、及び１４４．５ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、最終濃度１．４１Ｍ硫酸アンモニウム、１７．７ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む４０８９ｍｌの溶液とし、生じた不溶物を遠心分離後可溶物を得た。
これを１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で予め平衡化してあったＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カタログ番号１５６−００８０；直径５ｃｍ、ベッド高  ２４．５ｃｍ）に、流速約２５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット  分子量８０００カット）で濃縮し、素通り画分Ｆ１（４４５５ｍｌ，蛋白質濃度０．４００ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１７８０ｍｇ，相対活性１８３１０００）を得た。
次に、溶出液を２０ｍＭ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ６．０にかえ、溶出されたものを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット  分子量８０００カット）で濃縮し、画分Ｆ２（１４５７ｍｌ，蛋白質濃度０．９６９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１４１１ｍｇ，相対活性１７１５０００）を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、このＦ２には分子量６６０００〜１０００００の蛋白質が存在することが確認された。さらにウエスターン分析により、この蛋白質がＴＰＯであることが明らかとなった。
次に、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラム  Ｆ２（１４４３ｍｌ）を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア  バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；直径  ５ｃｍ、ベッド高  １２ｃｍ）カラムに注入し、流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ１（３００７ｍｌ，蛋白質濃度０．２２６ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量６７９ｍｇ，相対活性８８８３０）を得た。次に、溶出液を７５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）にかえ、溶出された画分Ｆ２（９３１ｍｌ，蛋白質濃度０．７６３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量７１０ｍｇ，相対活性５５５８０００）を集めた。これを限外濾過ユニット（フィルトロン社製・オメガウルトラセット  分子量８０００カット、及びアミコン社製ＹＭ３膜）で２０２ｍｌまで濃縮した。
次に、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮液（１９７ｍｌ）をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０５８４−０５；直径  ７．５ｃｍ、ベッド高  １００ｃｍ）に注入し、流速３ｍｌ／ｍｉｎでゲル濾過を行った。溶離液体積１２００〜１７８５ｍｌ、１７８５〜２０１０ｍｌ、２０１０〜２２８０ｍｌ、２２８０〜３０００ｍｌの各範囲をまとめ、それぞれ画分Ｆ１（５８５ｍｌ，蛋白質濃度１．００ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量５８９ｍｇ，相対活性４１１８０００）、画分Ｆ２（２２５ｍｌ，蛋白質濃度０．２６３／ｍｌ，総蛋白質量５９．２ｍｇ，相対活性２５０９０００）、画分Ｆ３（２７０ｍｌ，蛋白質濃度０．１１９／ｍｌ，総蛋白質量３２．１ｍｇ，相対活性２５３５０００）、画分Ｆ４（７２０ｍｌ，  蛋白質濃度０．０４６７／ｍｌ，  総蛋白質量３３．６ｍｇ，相対活性１１５５０００）を得た。
このように、分画されたＴＰＯ活性はゲル濾過法での分子量範囲が広いことが判明したため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスターン分析を実施したところ、Ｆ１ではほとんどが分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯであったのに対し、Ｆ２、Ｆ３ではそれぞれ分子量３２０００〜６００００、分子量３２０００〜４２０００のＴＰＯ分子種が存在していた。いずれの分子量のＴＰＯ分子も全てＴＰＯ活性をもっていた。
なお、分子量６６０００〜１０００００のＴＰＯ分子についてＮ末端アミノ酸配列分析を実施したところ、ヒトＴＰＯ遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認できた。
また、分子量６６０００〜１０００００（７）ＴＰＯ分子について、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、カタログ番号１４７２−００）、ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ナカライテスク社製、カタログ番号２４２−２９  ＳＰ）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ：生化学工業製、カタログ番号１００４５３）、およびＯ−グリコシダーゼ（Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、カタログ番号１３４７１０１）の糖鎖切断酵素を単独あるいは組み合わせて酵素消化実験を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、ＴＰＯのポリペプチド部分は理論値から推定される分子量約３６０００であり、Ｎ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖の両方を持つ糖タンパク質であることが判明した。＜実施例５７＞
ヒトＴＰＯ産生ＣＨＯ細胞株からヒトＴＰＯの精製
（１）実施例５５と同様にして得られたＣＨＯ細胞無血清培養上清１Ｌに２１１．４ｇの硫酸アンモニウムを加え、０．２μｍフイルター（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号１２９９２）で濾過し、予め１．２Ｍ硫酸アンモニウム，２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化しておいたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，カタログ番号１５６−００８１，直径５０ｍｍ、ベッド高９０ｍｍ）に流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）４５０ｍｌで溶出した。この溶出液をＶｙｄａｃ  逆相Ｃ４カラム（Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ社製、カタログ番号２１４ＢＴＰ５４，直径４．６ｍｍ，ベッド高２５０ｍｍ）に流速０．７５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、１５分間５％エタノールを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．４）（展開溶媒Ａ）で洗浄後、展開溶媒Ａから１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．４）を含む９４％エタノール（展開溶媒Ｂ）まで６６分間の直線グラジエントで溶出した。このクロマトグラムを図１５に示した。ＴＰＯと思われる分子量約６５０００−１０００００の分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、サンプル添加後の保持時間６８−７２分付近の画分に得ることができ、単一なバンドであることが確認できた（図１６参照）。さらにウエスターン分析により、このタンパク質がＴＰＯであることを確認した。
このサンプルの一部を取り、Ｎ末端アミノ酸分析を行った結果、ヒトＴＰＯ遺伝子でコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含むことが確認できた。
＜実施例５８＞
ヒトＴＰＯの昆虫細胞での発現用組換えウイルスの作製
実施例３０で作製したｐＨＴＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ並びにＮｏｔＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１２００ｂｐのバンドをプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットを用いて精製した後、同様に制限酵素処理したトランスファーベクターｐＶＬ１３９３（インビトローゲン社製）に連結しコンピテントハイＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを調製し、ヒトＴＰＯｃＤＮＡのコーディング領域を全て含むクローンｐＶＬ１３９３／ｈＴＰＯを得た。このクローンのプラスミドＤＮＡをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているようにして調製し、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファーミンゲン社製）を用いて昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトローゲン社製）にトランスフェクション後、Ｓｆ−９００培地（ライフテクノロジー社製）中で２７℃で４日間培養し、そのウイルスを含んだ上清を回収した。この上清を１０９〜１０５倍に希釈してその１ｍｌを用いて、３５ｍｍ径のシャーレ中で約７×１０５個のＳｆ２１細胞に２７℃で１時間感染させた。上清を抜きとりＳｆ−９００培地を含む１％アガロースを流し込みアガロースが固まった後、加湿下で２７℃で６日間培養した。ここで形成されたシングルプラークをピックアップし、２００μｌのＳｆ−９００培地中でウイルスを溶出させた。このウイルスクローンを２４ウエルプレート中でＳｆ２１細胞に感染させウイルスの増幅を行った。得られたシングルプラーク由来のウイルス液の一部をフェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈殿してウイルスＤＮＡを回収した。このウイルスＤＮＡを鋳型としてヒトＴＰＯｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、特異的なＤＮＡ断片が増幅されるか否かにより、ヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを選択した。ここで得られたヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを含む上清を用いてＳｆ２１細胞に感染させ、さらにウイルスの増幅を行った。
＜実施例５９＞
Ｓｆ２１昆虫細胞でのヒトＴＰＯの発現と活性確認
１７５ｃｍ２の培養フラスコ中に、Ｓｆ２１細胞を約８０％コンフルエントになるまで培養し、実施例５８で作製したヒトＴＰＯｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを２７℃で１時間感染させた後、Ｓｆ−９００培地中で２７℃で４日間培養し、その上清を回収した。得られた培養上清をＮＡＰＴＭ−５カラム（ファルマシア社製）を用いてＩＭＤＭ培養液に置換し、これをラットＣＦＵ−ＭＫアッセイ系及びＭ−０７ｅアッセイ系にかけたところ、用量依存的に有意なＴＰＯ活性及びＭ−０７ｅ細胞増殖促進活性が認められた。また、実施例４５に記載したのと同様のウエスタン分析により、Ｓｆ２１細胞で発現した組み換えヒトＴＰＯが確認された。
＜実施例６０＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと硫酸銅を用いたリフォールディング法とリフォールディング〜精製
実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体３０ｇに水３００ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機（１００００ｐｓｉ、Ｒａｎｎｉｅ  Ｈｉｇｈ  ＰｒｅｓｓｕｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に９０ｍｌの水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を１５０ｍｌにした後、９ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、５４０μｌの１ＭＤＴＴ、１．８ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ、１８ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に１８０ｍｌの５ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収した。得られた沈殿画分に水３００ｍｌを加え懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を５７０ｍ１にした後、攪拌しながら３０ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８と１５０ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを加えて室温にて２０分間攪拌して可溶化した。これに７５０μｌの１％硫酸銅を加え、室温にて一晩（約２０時間）攪拌した。遠心分離によりｈ６Ｔ（１−１６３）を含む上清画分を回収した後、上清７５０ｍｌに７５０ｍｌの水、１５００ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７加えた後、撹拌しながら３ｍｌのポリソルベート８０（日光ケミカルズ）を加えた。同溶液に６００ｇのＤｏｗｅｘ  １−ｘ４，２０−５０ｍｅｓｈ，ｃｈｌｏｒｉｄｅｆｏｒｍイオン交換樹脂を加え、室温にて９０分間撹拌した。グラスフィルターを用いてイオン交換樹脂非吸着画分を回収した後、７５０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．７でイオン交換樹脂を洗浄した。イオン交換樹脂非吸着画分と洗浄液を合わせた溶液に２Ｎ水酸化ナトリウム加えてｐＨを９．２に調整し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（内径５ｃｍ  ｘ  １０ｃｍ）に添加し、非吸着画分を回収した。塩酸を用いて得られた非吸着画分のｐＨを７．２に調整し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍ  ｘ  １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセルパック５μｍ３００Ａ  Ｃ１カラム（内径２．１ｃｍｘ  ５ｃｍ  ｘ  ２本、資生堂）に添加した後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なった。溶出液について還元剤非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によって、３画分に分画し、各々について０．１％トリフルオロ酢酸を用いて３倍希釈した後、上記の逆相ＨＰＬＣカラムに添加し、同様の方法で再クロマトグラフィーを行なった。得られたＴＰＯ３画分を逆相Ｈ��ＬＣの溶出順にＦｒ．Ｓ−ａ、Ｆｒ．Ｓ−ｂ、  Ｆｒ，Ｓ−ｃ  （図１７参照）として還元剤非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、１９Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、１８Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｓ−ｃ）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参照）。各々についてアミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白質量は、各々、０．６４ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ａ）１．８１ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、３．４９ｍｇ（Ｆｒ．Ｓ−ｃ）であった。各画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約１６２００００（Ｆｒ．Ｓ−ａ）、相対活性約２３５０００００（Ｆｒ．Ｓ−ｂ）、相対活性約７４６００００００（Ｆｒ．Ｓ−ｃ）のＴＰＯ活性を示した。
＜実施例６１＞
大腸菌で発現した、ヒトＴＰＯ塩基配列をコードするクローンｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）由来変異型ヒトＴＰＯ）ｈ６Ｔ（１−１６３）の塩酸グアニジンとシステインーシスチンを用いたリフォールディング〜精製
実施例４３で調製されたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体凍結菌体５０ｇに水５００ｍｌを加えてけん濁し、高圧破砕機（１００００ｐｓｉ、Ｒａｎｎｉｅ  Ｈｉｇｈ  ＰｒｅｓｓｕｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で菌体を破砕した後、遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿画分に水を加えて懸濁し、さらに撹拌しながら水を加えて液量を２５０ｍｌにした後、１５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２、９００μｌの１ＭＤＴＴ、３ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ、３０ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウムを攪拌しながら加え、室温にて３０分間攪拌した。遠心分離により沈殿画分を回収し、大部分の混在蛋白質、菌体成分等を除去した。沈殿に３００ｍｌの５ｍＭＤＴＴを加えてけん濁した後、遠心分離によってｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分を回収した。回収されたｈ６Ｔ（１−１６３）を含む沈殿画分に水を加えてけん濁し、最終１０４ｍ１とした。攪拌しながら２０ｍｌの１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えた後、３７６ｍｌの８Ｍ塩酸グアニジンを加えて室温にて１０分間攪拌して可溶化した。これに撹拌しながら２５００ｍｌの０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加え、さらに１Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を２０００ｍｌ加えた後、５ｍＭシステインと０  ５ｍＭシスチンを加えて攪拌し溶かした。４℃中にて一晩静置した後、遠心分離によって上清中にｈ６Ｔ（１−１６３）を回収した。得られた上清をプレップスケールＵＦカートリッジＰＬＤＣ限外濾過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２にて緩衝液を置換して最終容量約１０００ｍＬとした。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．２で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（内径５ｃｍ  ｘ１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行ない、塩化ナトリウム濃度２０ｍＭから１５０ｍＭ付近までの塩濃度で溶出された画分２４０ｍＬを回収した。得られた画分を２０ｍＭＴＴｉｓ緩衝液ｐＨ７．２で４倍に希釈して９６０ｍＬとし、酢酸を用いてｐＨを７．２に調整した。これを０．１％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（内径５ｃｍｘ  １０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度０Ｍから５００ｍＭまでの直線濃度勾配法によって溶出を行なった。溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析を行い、ＴＰＯ溶出画分を集めた。ＴＰＯ溶出画分にトリフルオロ酢酸を０．１％になる様に加え、カプセルパック５μｍ３００ＡＣ１カラム（内径２．１ｃｍ  ｘ  ５ｃｍ  ｘ  ２本、資生堂）に添加した後、０．１％トリフルオロ酢酸中で１−プロパノール濃度を上昇させる直線濃度勾配溶離法によって逆相ＨＰＬＣを行なった。溶出液について還元剤非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果及び逆相ＨＰＬＣでの溶出位置によって２画分に分画した。得られたＴＰＯ溶出２画分を逆相ＨＰＬＣの溶出順にＦｒ．Ｇ−ａ、Ｆｒ．Ｇ−ｄ（図��７参照）として各々について還元剤非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、各々、分子量１８Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、３２Ｋダルトン（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）付近に単一のバンドとして検出された（図１８参照）。また、還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果、どちらの画分も分子量２０Ｋダルトン付近に単一のバンドとして検出された。各々にっいてアミノ酸組成分析を行った結果、得られたアミノ酸組成はシークエンス情報からの理論値とほぼ一致し，またＮ末端アミノ酸配列分析の結果、予想される配列のみが得られた。またアミノ酸分析の結果から得られた各画分の蛋白質量は、各々、２．５６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、１．１６ｍｇ（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）であった。各画分をＩＭＤＭ培養液に対して十分に透析後、Ｍ−０７ｅアッセイを行った結果、相対活性約３９６００００（Ｆｒ．Ｇ−ａ）、相対活性約７７６００００（Ｆｒ．Ｇ−ｄ）のＴＰＯ活性を示した。
＜実施例６２＞
部分長ヒトＴＰＯ（アミノ酸１−１６３）  （以下、このタンパク質を「ｈＴＰＯ１６３」と称す）のＣＨＯ細胞用組換えベクター、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３の構築  実施例３１で得られたべクターｐＤＥＦ２０２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で大きい方のべクターフラグメントを回収したのち、このフラグメントと−２１から１６３位のアミノ酸までをコードするｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡ  （配列表  配列番号１３参照）を含むプラスミドｐＥＦ１８Ｓ−ｈＴＰ０１６３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理して得られたｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡとをＴ  ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現べクターｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３を得た。このプラスミドはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位、マウスＤＨＦＲミニ遺伝子、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、ヒトエロンゲーションファクター１−アルファプロモーター下流にｈＴＰＯ１６３ｃＤＮＡが接続されている。
＜実施例６３＞
ＣＨＯ細胞によるｈＴＰＯ１６３の発現
ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；７７巻４２１６頁、１９８０）を６ｃｍ径のプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％牛胎児血清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法（生化学工業社製）によって形質転換した。
すなわち、実施例６２で調製したｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３プラスミド１０μｇに０．３Ｍ  ＮａＣｌ２４０μｌを加え混合したのち、トランスフェクタム２０μｌとＨ２Ｏ２２０μｌとの混合液を加え、再度混合した。このＤＮＡ溶液をプレートに滴下したのち、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。プレートから培地を除去し、α−ＭＥＭ（−）にて２回洗浄後、１０％ジメチルスルフォオキシド含有α−ＭＥＭ（−）を添加し、室温で２分間処理した。次いで、１０％透析牛胎児血清含有非選択培地（前出α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン添加）を添加して２日間培養したのち、１０％透析牛胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、ヒポキサンチン、チミジン無添加）での選択をおこなった。選択は細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径プレート１枚あたりを、１０ｃｍ径プレート５枚あるいは２４ウエルプレート２０枚に分割したのち、２日ごとに選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行する事により実施した。細胞が増殖してきたプレートあるいはウエルについてはその培養上清中のＴＰＯ活性をＢａ／Ｆ３アッセイ法を用いて測定したところ、ＴＰＯ活性が認められた。培養上清中にＴＰＯ活性の認められたものについては新しいプレートあるいはウエルに２５ｎＭのメソトレキセートを含む選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行することによりメソトレキセートに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行った。
なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＥＦ１８Ｓ−ｈＴＰＯ１６３とｐＭＧＩを同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによっても行うことができる。
プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１１）は１９９５年１月３１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８９として寄託されている。
これはまた、１９９５年３月２２日付で中華民国  食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に受託番号９６００２４として寄託されている。
＜実施例６４＞
ＣＨＯ細胞の大量培養
実施例６３においてｈＴＰＯ１６３発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られたｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ１０９細胞、０ｎＭ  ＭＴＸ耐性）の大量培養は以下のようにして実施した。細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を用いて培養増殖させた。この細胞をトリプシン溶液を用いて剥離したのち、２００ｍｌの同培地を含むＦａｌｃｏｎ社製ローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ３０００）に１０００万個の細胞を接種し、３７℃で１ｒｐｍの回転速度で３日間培養した。３日後、培養液を吸引除去し、１００ｍｌのＰＢＳで細胞培養表面をリンスしたのち、１０％ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を２００ｍｌ加え、３７℃、１ｒｐｍの回転速度で７日間培養し、７日後その培養上清を回収し、次の精製操作の出発材料にした。上記の操作をローラーボトル３００本分実施し、無血清培養上清６０Ｌを得た。
＜実施例６５＞
ｈＴＰＯ１６３産生ＣＨＯ細胞株からｈＴＰＯ１６３の精製
（１）実施例６４より得られた無血清培養上清６０Ｌを得て、０．２２μｍの濾過フィルターの濾液をとった。さらに限外濾過ユニット（フィルトロン社製・分子量１００００カット）を用いて濃縮画分（６００ｍｌ、蛋白質濃度１１．２ｍｇ／ｍｌ、総蛋白質量６４３０ｍｇ）を得た。この画分を抗ＨＴ１ペプチド抗体を用いてウエスターン分析で調べたところ、見かけの分子量２００００〜２６０００の範囲に発現されたｈＴＰ０１６３蛋白質が存在することが明らかとなった。
この濃縮培養上清５７３ｍｌを流速約２０ｍｌ／ｍｉｎにて、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化してあったＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−００３２−０２；直径１０ｃｍ、ベッド高３０ｃｍ）にて処理することにより、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）溶液となった蛋白質画分Ｆ１（９３８ｍｌ，蛋白質濃度４．９ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量４５９４ｍｇ）を得た。このＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅカラム蛋白質画分９２９ｍｌを、予め１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２９−０１；直径５ｃｍ、ベッド高  １２ｃｍ）カラムに流速１５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、さらに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、次いで１０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出されたものまでをまとめ、画分Ｆ１（１６０８ｍｌ，蛋白質濃度２．１３ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量３４２６ｍｇ）を得た。次に、溶出液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中に７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５％エタノールを含む緩衝液にかえ、溶出されたｈＴＰＯ１６３の主たる溶出画分Ｆ２（６５１ｍｌ，蛋白質濃度１．６７ｍｇ／ｍｌ，総蛋白質量１０８７ｍｇ）を集めた。
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムのＴＰＯ活性画分Ｆ２のうち２００ｍｌをとり、エタノール及び精製水を加え、最終エタノール濃度４５％の溶液３００ｍｌを調製した。ここでエタノール添加の結果生じた不溶物を遠心分離により取り除いた後、展開溶媒Ａ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７））、展開溶媒Ｂ（９０％エタノールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７））を用意し、予め５０％Ｂ液にて平衡化したＳＯＵＲＣＥ  １５ＲＰＣカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０７２７−０２；直径２ｃｍ、ベッド高２０ｃｍ）に流速２ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後、カラム非吸着物質がほぼ溶出するまで４５％Ｂ液にて洗浄した後、流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎにし、まず５分間５０％Ｂ）次いで５０％Ｂから１００％Ｂまで１４０分の直線濃度勾配の後、１００％Ｂ液にて３５分間展開した。この間５分（７．５ｍｌ）ごとに集められた溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターン分析にかけ、ｈＴＰ０１６３の溶出範囲を調べたところ、エタノール濃度６６％〜８７％の範囲に見かけの分子量約２００００から２６０００の高度に精製されたｈＴＰ０１６３が溶出されていることが判明した。これらのｈＴＰＯ１６３のうち分子量の高いものほどより早く逆相カラムから溶出したことから、糖鎖がより多く結合したｈＴＰＯ１６３分子ほど親水性が増していることが示唆された。
ＳＯＵＲＣＥ  １５ＲＰＣカラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分（エタノール濃度６８％〜８６．５％の範囲に溶出したｈＴＰＯ１６３画分９０ｍｌ）のうち、８８．８ｍｌにＣＨＡＰＳを添加後、限外濾過法（アミコン社製、ＹＭ−３膜付き限外濾過ユニット）により濃縮、洗浄を行い、最終的に約５％エタノール、４ｍＭＣＨＡＰＳを含む２．５ｍｌの濃縮標品とした。この標品を予め１０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−１０７０−０１；直径２．６ｃｍ）ベッド高６０ｃｍ）に流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後６０分後から、６ｍｌ（４分）ごとに溶出画分を集めたところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管番号１６番以降の画分にｈＴＰＯ１６３が溶出しはじめ、少なくとも３１番目までの広い範囲にｈＴＰＯ１６３が溶出していることを確認した。これは、ゲルろ過の標準分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；カタログ番号１５１−１９０１及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製インシュリン；カタログ番号４０７６９６の混合物）に対して、分子量約４４０００から６０００の範囲に相当する。しかもこれらのｈＴＰ０１６３は糖がより多く付加された分子量の大きいものから順に溶出していると考えられた。試験管番号１６〜３１（溶出体積１８０〜２７６ｍｌ）の溶出範囲にあるすべてのｈＴＰＯ１６３の分子種をまとめたものとして画分ＦＡを調製した。画分ＦＡとは別に、試験管番号１６〜１８（溶出体積１８０〜１９８ｍｌ）、試験管番号１９〜２４（溶出体積１９８〜２３４ｍｌ）、試験管番号２５〜３１（溶出体積２３４〜２７６ｍｌ）の各々の一部をとり、それぞれ画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬとした。つまり画分ＦＡは、実質的に画分ＦＨ、ＦＭ、ＦＬを合わせたものとなる。以上、図１９に示す。
（２）次に（１）で述べたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムのｈＴＰＯ１６３溶出画分ＦＨ）ＦＭ）ＦＬ及びＦＡについて詳細に述べる。このようにして得られたｈＴＰＯ１６３のＮ末端側のアミノ酸配列を実施例１に述べた方法と同様にして調べたところ、Ｎ末端のセリンの大部分は同定不能であったことより、Ｎ末端のセリンにＯ結合型糖鎖が付加されていることが強く示唆された。また、Ｎ末端のセリンに続く配列は遺伝子配列から期待されたアミノ酸配列であることが確認できた。アミノ酸組成分析（ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法、ウォターズ社）の結果、ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３蛋白質（糖鎖を含まないペプチド部分）の濃度がそれぞれ１０．２ｎｇ／ｍｌ、６．２ｎｇ／ｍｌ、０．８４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌであった。これらの画分１００ｎｇをマルチゲル１５／２５（第一化学薬品社製１５〜２５％プレキャストポリアクリルアミドゲル）を用いて非還元条件或いはＤＴＴにより還元後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し銀染色（第一化学薬品社製）したところ、それぞれ極めて高純度なｈＴＰＯ１６３標品であることが確認できた。還元条件下においてはＤＰＣＩＩＩ分子量マーカー（第一化学薬品社製）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの分子量はそれぞれ２４０００〜２１５００、２３０００〜２１０００、２３０００〜２０５００、２３５００〜２０５００であった（図２０を参照）。またウエスターン分析により還元条件下においてはビオチン標識ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｂｉｏｔｙｎｙｌａｔｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ：カタログ番号１６１−０３１９）を標準として算出されたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡのｈＴＰＯ１６３の見かけの分子量はそれぞれ２６０００〜２２０００、２５５００〜２２０００、２６０００〜２１０００、２６０００〜２１０００であった。ＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの分子量の不均一性は、付加されたＯ結合型糖鎖の不均一性によることと推定できる。そこでＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分をノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ナカライテスク社製、カタログ番号２４２−２９  ＳＰ）で酵素消化し、ＤＴＴで還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、いずれの画分も見かけの分子量が１９０００付近となったことから、ｈＴＰＯ１６３蛋白質に付加された糖鎖のシアル酸の量の不均一性が確認されたのと同時に、ここで得られたｈＴＰＯ１６３が糖蛋白質としてＣＨＯ細胞で発現されたものであることが明らかとなった。
（３）（２）で得られたＦＨ、ＦＭ、ＦＬ及びＦＡの各画分をＭ−０７ｅアッセイ系でｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を調べたところ、相対比活性は１ｍｇｈＴＰＯ１６３蛋白質（糖鎖重量を含まないペプチド部分の重量）当たり、それぞれ５１１００００００、７７５００００００、１１５０００００００、７１５００００００であった。
＜実施例６６＞
−１位にＬｙｓ、−２位にＭｅｔが付加されたヒトＴＰＯ（アミノ酸１−３３２）（以下「ｈＭＫＴ（１−３３２）」と称す）の大腸菌用発現ベクターの構築及び発現
ヒトＴＰＯ全長アミノ酸を大腸菌で発現させるためアミノ酸１６４以降のアミノ酸３３２までの使用コドンを以下に述べるように大腸菌優先コドンに変更した。表２０に示した２１−４０の合成オリゴヌクレオチドを作成した。
【表２０】
0003635142.tif 000021
２１及び２２；２３及び２４；２５及び２６；２７及び２８；２９及び３０；３１及び３２；３３及び３４；３５及び３６；３７及び３８；３９および４０の合成オリゴヌクレオチドを同チューブ中でＴ４キナーゼ（ファルマシア社製）を用いて０．１ｍＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ  Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，５０  ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅの溶液中でリン酸化した。さらに１／１０量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液を加え、水浴中で３分間煮沸した後、放置することにより二本鎖ＤＮＡとした。次に２１及び２２；２３及び２４（組合わせＡ）、２５及び２６：２７及び２８；２９及び３０（組合わせＢ）、３１及び３２；３３及び３４（組合わせＣ）、３５及び３６；３７及び３８；３９及び４０（組合わせＤ）の四組の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結後、さらに（組合わせＡ）及び（組合わせＢ）、（組合わせＣ）及び（組合わせＤ）をそれぞれ同様に連結し、得られた反応液を連結１及び連結２とした。これらの反応液を鋳型として、連結１については４１および４２、連結２については４３及び４４の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。連結１のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物についてはＳａｃｌ，ＥｃｏＲＶ、連結２のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物についてはＥｃｏＲＶ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化後２％のアガロースゲルで泳動し、それぞれ約２４０ｂｐ及び２５０ｂｐの断片をプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットにより回収した。これら二本の断片ををＳａｃｌとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ＋（ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５を使用した）。得られたクローンのうち表２１に示した塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択し、ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＳＨ）（１７４−３３２）とした。
【表２１】
0003635142.tif 000022
次に実施例４２で作成したｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）を鋳型とし、以下の４５及び４６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ここで得られたＰＣＲ産物についてはＢａｍＨＩ，Ｓａｃｌで消化後６％のポリアクリルアミドゲルで泳動し、約１６０ｂｐの断片をゲルより回収した。またｐＢＬ（ＳＨ）（１７４−３３２）をＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約４８０ｂｐの断片をプレップ−Ａ−ジーンＤＮＡ精製キットにより回収し、これら二本の断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ＋  （ストラタジーン社製）にサブクローニングした（宿主はＥ．ｃｏｌｉＤＨ５を使用した）。
４５：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧ−３’
４６：５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’
得られたクローンのうち表２２に示した塩基配列を有するものをシークエンシングにより選択し、ここで得られたクローンをｐＢＬ（ＢＨ）（１２３−３３２）とした。
【表２２】
0003635142.tif 000023
実施例４２で作成したｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−１６３）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＬ（ＢＨ）（１２３−３３２）を同じ制限酵素で消化して得られた約６４０ｂｐの断片を連結してクローンｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−３３４）を作成した。さらに実施例５２で作成したＰＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−１６３）をＸｂａｌ，Ｓｆｉｌで消化して得られた約２７０ｂｐの断片を、同じ制限酵素で消化したｐＢＬ（ＸＨ）ｈ６Ｔ（１−３３４）に連結してクローンｐＢＬ（ＸＨ）ｈＭＫＴ（１−３３４）を作成した。ｐＢＬ（ＸＨ）ｈＭＫＴ（１−３３４）をＸｂａｌ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、変異型のヒトＴＰＯアミノ酸１−３３２をコードする約１０４０ｂｐの大きさのフラグメントを回収して精製後、Ｘｂａｌ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＦＭ５３６  （特表昭６０−５０１９８８）にクローニングした（宿主はｐＭＷ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９９３３）で予め形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用した）。ここで得られたクローンをｐＣＦＭ５３６／ｈＭＫＴ（１−３３２）とし、この発現ベクターを有する大腸菌株を変異型のｈＭＫＴ（１−３３２）タンパク発現用の形質転換体とした。この発現プラスミドは、配列表（配列番号１４）に示されたＤＮＡ配列を含んでいる。
ここで得られた形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地６０ｍｌに３０℃で一晩振盪培養し、この培養液２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１０００ｍｌに加えて、ＯＤはＡ６００が１．０−１．２に至るまで３０℃で振盪培養した。次いで最終温度が、４２℃になるように６５℃の約３３０ｍｌＬＢ培地を添加し、さらに３時間４２℃で振盪培養して変異型のヒトＴＰＯ、ｈＭＫＴ（１−３３２）タンパクの発現を誘導した。
この培養菌体を直接サンプルとして用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには第一化学社製のマルチゲル１５／２５を用い、泳動後にクマシーブルー染色を行ったところｈＭＫＴ（１−３３２）タンパク質の発現を誘導したものに関しては、分子量約３５ｋＤのところに発現誘導に特異的なタンパク質が検出された。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングし、実施例４５で作製した抗ＨＴ１ペプチド抗体と反応させ発色させたところ、分子量約３５ｋＤのところにバンドが検出されたことから、ｈＭＫＴ（１−３３２）の発現が確認された。
＜実施例６７＞
ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での発現〜活性確認
ヒトＴＰＯのアミノ酸の一部を置換した誘導体が活性を有するかどうかを以下のとおり検討した。
本実施例で用いた動物細胞発現ベクターｐＳＭＴ２０１は以下のように作製した。まず、マウスエリスロポエチンレセプタ−ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＸＭ−ｍＥＰ０Ｒｎ（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｏｒ癌研究所Ｄ’Ａｎｄｒｅａ博士より入手、Ｃｅｌｌ．５７巻、２７７−２８５頁（１９８９））を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動しマウスエリスロポエチンレセプターｃＤＮＡ部分を除くｐＸＭベクター断片を回収した。次に回収したｐＸＭ発現ベクターに種々のクローニング用制限酵素部位を導入するための２本の合成オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機を用いて作製した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す。
プライマー１：
0003635142.tif 000024
プライマー２：
0003635142.tif 000025
この２本のオリゴヌクレオチドを混合し、アニーリングさせ２本鎖オリゴヌクレオチドとした後、上記で回収したｐＸＭベクター断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させ、発現ベクターｐＤＭＴ２０１を得た。次にこの発現ベクターｐＤＭＴ２０１に含まれるマウスＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを除去するためにｐＤＭＴ２０１ベクター及びｐＥＦ１８Ｓベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＨｐａＩで処理後アガロースゲル電気泳動し、ｐＤＭＴ２０１ベクターＤＮＡ由来の大きい方の断片とｐＥＦ１８ＳベクターＤＮＡ由来の小さい方の断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合させることにより発現ベクターｐＳＭＴ２０１を得た。このベクターは、図２１に示したとおりＳＶ４０の複製開始領域およびエンハンサー配列、アデノウィルス主要後期プロモーター配列、アデノウィルストリパータイトリーダー配列、スプライス信号配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル部位配列、アデノウィルスＶＡＲＮＡ遺伝子配列、ｐＵＣ１８の複製開始領域、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐｒ）を含み、目的とする遺伝子を連結するための制限酵素配列として、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、およびＮｏｔＩ部位を有する。実施例３０で示した完全長ヒトＴＰＯｃＤＮＡを含むｐＨＴＰ１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩを用いて酵素消化し得られた完全長ヒトＴＰＯｃＤＮＡ断片を、同様に制限酵素消化したベクターｐＳＭＴ２０１にサブクローニングすることによりプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯを得た。
以上のようにして得たプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯを鋳型にして、まず誘導体作製用の鋳型となるプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅを以下のように作製した。
βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅではヒトＴＰＯの５’非翻訳側に、Ａｎｎｗｅｉｌｅｒらの方法に従いウサギのβ−グロビンリーダー配列の付加を試みた（Ａｎｎｗｅｉｌｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１９巻、３７５０頁）。まず以下に示す化学合成した２本のＤＮＡ鎖、そしてベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化した断片とをライゲーションすることによりリーダー配列が挿入されたベクターβＧＬ／ｐＢｌｕｅを作製した。
0003635142.tif 000026
ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。
0003635142.tif 000027
（配列番号７の１０２−１２２にＳｍａＩ配列を付加したもの）
ｅｎｄ：５’−ＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号７の１１４０−１１６０のアンチセンス、ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ配列を付加）  ＰＣＲはプラスミドｐＳＭＴ２０１−ｈＴＰＯ  ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ１０μＭ使って実施した。ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を２０サイクル）を行った。ＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２回行った後１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。これを制限酵素ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌ（７）ＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化したベクターβＧＬ／ｐＢｌｕｅにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用）。得られた形質転換体のうち２０クローン選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。βＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅをコードするプラスミドは全長にわたり塩基配列の置換がなく予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持っことを確認した。さらにβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢ１ｕｅを制限酵素ＢｇＩＩＩＮＳｐｅＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶解し、同様に制限酵素消化したベクターｐＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用）。本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されている方法に従い、形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。得られた発現ベクターｐＳＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯは、図２１に示したｐＳＭＴ２０１ベクターのスプライス信号配列の下流にある制限酵素配列ＢｇｌＩＩ／ＳｐｅＩ部位にβ−グロビンリーダー配列及びヒトＴＰＯｃＤＮＡが接続された構造を有している。このｐＳＭＴ／βＧＬ−ＴＰＯベクターをＣＯＳ７細胞へのトランスフェクション実験に用いた。
ヒトＴＰＯ置換誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏらの方法に従った（Ｉｔｏら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６７−７０頁  １９９１年）。ここでは、ヒトＴＰＯの２５位のＡｒｇ残基をＡｓｎ残基に置換した誘導体、並びに３３位のＨｉｓ残基をＴｈｒ残基に置換した誘導体の作製を試みた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。
Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３’（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＴ７プロモ一タ一領域に対応）
ΔＢｇＩＩＩ  ：５’−ＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＣ−３’（制限酵素ＢｇＩＩＩ認識配列置換用）  ｅｎｄ  ：５’−ＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号７の１１４０−１１６０のアンチセンス、ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ配列を付加）Ｎ３：５’−ＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号７のＡｒｇ２５→Ａｓｎ）
０９：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡ−３’（配列番号７のＨｉｓ３３→Ｔｈｒ）  第１段階のＰＣＲはプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅ  ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ１０μＭ使って実施した（プライマーの組み合わせは［１］ΔＢｇＩＩＩとｅｎｄ、［２］Ｔ７とＮ３、［３］Ｔ７と０９）。ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲ（９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル）を行った。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行った後１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。このＰＣＲ産物を２種類１μｌずつ用いて第２段階のＰＣＲを行った。鋳型の組み合わせは［１］と［２］のＰＣＲ産物、［１］と［３］のＰＣＲ産物である。用いたプライマーはすべてＴ７とｅｎｄの組み合わせである。９４℃で１０分間インキュベートした後ＴａＫａＲａ  Ｔａｑを加え、９４°Ｃ１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に５ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１μｌ）０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加え３７℃で３０分間保温しＴａｑを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し２０μｌの滅菌水に溶解した。これを制限酵素ＢｇＩＩＩ、ＳｐｅＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌのＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現ベクターｐＳＭＴ２０１にサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用）。得られた形質転換体のうち、それぞれ２クローンずつ選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑＤｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。
［１］と［３］のＰＣＲ産物に由来するプラスミドには意図したアミノ酸置換［Ｈｉｓ３３（ＣＡＣ）→Ｔｈｒ（ＡＣＣ）］をもち、かつＣ末端（Ｇｌｙ３３２）に以下のアミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置換誘導体（０９／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡが含まれていることが確認された。
一方、［１］と［２］のＰＣＲ産物に由来するプラスミドは意図したアミノ酸置換［Ａｒｇ２５（ＡＧＡ）→Ａｓｎ（ＡＡＣ）］以外に更に１カ所のアミノ酸置換［Ｇｌｕ２３１（ＧＡＡ）→Ｌｙｓ（ＡＡＡ）］もち、かつＣ末端（Ｇ１ｙ３３２）に以下のアミノ酸配列からなるペプチドが付加されたＴＰＯ置換誘導体（Ｎ３／ＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡを含んでいることが判明した。
ペプチド：
ＴＳＩＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＶＨＨＨＨＨＨ
得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例３５に従いクロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法で行った。すなわちプラスミドＤＮＡ４０μｇを使用し、トランスフェクション５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をセントリコン−３０（アミコン社製）で２０倍に濃縮しＭ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、ヒトＴＰＯ置換誘導体Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図２２参照）。
＜実施例６８＞
ヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体の作製とＣＯＳ７細胞での発現〜活性確認
ｈＴＰＯ１６３にアミノ酸を挿入した誘導体またはｈＴＰＯ１６３からアミノ酸を欠失した誘導体が活性を有するかどうか検討した。作製した誘導体は配列番号１３の旧ｓ３３欠失体（ｄＨ３３）、Ｇｌｙ１１６欠失体（ｄＧ１１６）、Ａｒｇ１１７欠失体（ｄＲ１１７）、Ｈｉｓ３３とＰｒｏ３４の間へのＴｈｒ挿入体（Ｔ３３’）、Ａｌａ挿入体（Ａ３３’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ３３’）およびＧｌｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＡｓｎ挿入体（Ｎ１１６’）、Ａｌａ挿入体（Ａ１１６’）、Ｇｌｙ挿入体（Ｇ１１６’）である。これらのうちＴ３３’、Ｎ１１６’はそれぞれムチン型糖鎖、Ａｓｎ結合型糖鎖の導入を意図した誘導体である。
誘導体の作製にはＰＣＲを利用し、Ｉｔｏらの方法に従った（Ｉｔｏら、Ｇｅｎｅ、１０２巻、６７−７０頁、１９９１）。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は以下の通り。
ｄＨ３３：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡ−３’（配列番号７の旧ｓ３３欠失体作製用）
Ｔ３３’：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号７の旧ｓ３３とＰｒｏ３４の間へのＴｈｒ挿入体作製用）
Ａ３３’：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号７のＨｉｓ３３とＰｒｏ３４の間へのＡｌａ挿入体作製用）
Ｇ３３’：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号７の旧ｓ３３とＰｒｏ３４の間へのＧｌｙ挿入体作製用）
ｄＧ１１６：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号７のＧｌｙ１１６欠失体作製用）
ｄＲ１１７：５’−ＧＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号７のＡｒｇ１１７欠失体作製用）
Ｎ１１６’：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号７のＧＩｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＡｓｎ挿入体作製用）
Ａ１１６：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号７のＧｌｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＡｌａ挿入体作製用）
Ｇ１１６’：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号７のＧＩｙ１１６とＡｒｇ１１７の間へのＧｌｙ挿入体作製用）
ｄＲＩ：５’−ＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡ−３’（制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列置換用）Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３’（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＴ７プロモーター領域に対応）
ｅｎｄＮｏｔＩ：５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧ−３’（配列番号７の６３３−６５３のアンチセンス、終止コドンとＮｏｔＩ認識配列を付加）
第１段階のＰＣＲは実施例６７で作製したプラスミドβＧＬ−ＴＰＯ／ｐＢｌｕｅ  ＤＮＡ１ｎｇを鋳型として使用し、合成したプライマーをそれぞれ１０ｐＭ使って実施した。プライマーの組み合わせは［１］ｄＲＩとｅｎｄＮｏｔＩ、［２］Ｔ７と変異導入プライマー（ｄＨ３３，Ａ３３’，Ｇ３３’，Ｔ３３’，ｄＧ１１６，ｄＲ１１７，Ａ１１６’，Ｇ１１６’，Ｎ１１６’）である。ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  （ＭＪＲｅｓｅｒｃｈ社製）により１００μｌの容量でＰＣＲを行った。［１］の反応は、９４℃１分間、４５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、４５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル。［２］の反応は、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を１７サイクル。それぞれのＰＣＲ産物をクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を２度行った後１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。
次に、［１］と［２］のＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌずつ用いて第２段階のＰＣＲを行った。用いたプライマーはすべてＴ７とｅｎｄＮｏｔＩの組み合わせである。９４℃で１０分間インキュベートした後ＴａＫａＲａ  Ｔａｑを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間を３サイクル、続けて９４℃４５秒間、５５℃１分間、７２℃１分間を９サイクル行った。それぞれのＰＣＲ産物に５ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１μｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ、２０％ＳＤＳを２μｌ加え３７℃で３０分間保温しＴａｑを失活させた後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し２０ｐｌの滅菌水に溶解した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１０μｌ（７）ＴＥバッファーに溶解後、同様に制限酵素消化しアルカリホスファターゼ（仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム社製）処理した発現べクターｐＥＦ１８Ｓにサブクローニングした（宿主菌は東洋紡績社製コンピテント・ハイＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用）。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。方法は本質的にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されているようにして実施した。精製したプラスミドＤＮＡについてはＴａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、アプライドバイオシステムズ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサーにより塩基配列の確認を行った。その結果、ｄＨ３３、Ａ３３’、Ｔ３３’、ｄＧ１１６、ｄＲ１１７、Ａ１１６’、Ｇ１１６’、Ｎ１１６’をコードするプラスミドは全長にわたり意図した部位以外に塩基配列の置換がなく予想通りのＴＰＯｃＤＮＡ配列を持っことを確認した。また、Ｇ３３’では意図した部位以外に１カ所のアミノ酸置換をもたらす塩基置換［Ｐｒｏ３８（ＣＣＴ）→Ｓｅｒ（ＴＣＴ）］が認められた。
得られたそれぞれのクローンのＣＯＳ７細胞へのトランスフェクションは、実施例１１に従って行った。すなわちプラスミドＤＮＡ１０μｇを使用し、クロロキン処理を含むＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたトランスフェクションを行い、４−５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をＭ−０７ｅアッセイ系で評価した。その結果、アミノ酸挿入・欠失誘導体をコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞培養上清中に、いずれも用量依存的にＴＰＯ活性が検出された（図２３参照）。ＴＰＯ誘導体をコードするｃＤＮＡを含まない発現プラスミドｐＥＦ１８ＳをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞培養上清には活性が認められなかった。
＜実施例６９＞
ＴＰＯによる血小板増加作用
あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した正常な８週齢のＩＣＲ系雄性マウス２０匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロールーｉＶ群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で静脈内に投与し、他の１群（ＴＰＯ−ｉｖ群）には実施例５６で得られたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗのヒトＴＰＯ活性画分Ｆ２の濃縮液をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア・バイオテク社製、カタログ番号１７−０８５２−０２）でＰＢＳに置換し、さらにＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量２１１，９００を含む）を１日１回５日間連続で静脈内に投与した。また、別の１群（コントロール−ｓｃ群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与し、他の１群（ＴＰＯ−ｓｃ群）にはＴＰＯ−ｉｖ群と同様に１００μｌを１日１回５日間連続で皮下に投与した。
投与開始後６、８、１０、１３、１５日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。
血小板数の推移を図２４に示した。
すなわち、コントロールーｉｖ群では血小板数は最も増加した６日目においても投与前と比較して４４％の増加であり、コントロール−ｓｃ群では最も増加した８日目において４７％増加が観察されたにすぎなかった。その一方で、ＴＰＯ−ｉｖ群では６日目には投与前と比較して１７７％の増加がみられ、その後も増加を続け１０日目には４６９％という最大の増加が観察された。また、ＴＰＯ−ｓｃ群では６日目にすでに３４７％の増加が見られ、８日後には最大の４９３％の増加が観察された。
以上の結果より、ヒトＴＰＯは種差、投与ルートに関係なく血小板の増加作用を有することが確認された。
＜実施例７０＞
ＴＰＯによる血小板増加作用
あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した正常な１１週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ系雄性マウス１６匹を無作為に４群に分けた。そのうちの１群（コントロール群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。他の１群（ＴＰＯ−１群）には実施例５６で得られたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲのヒトＴＰＯ活性画分Ｆ１をＮＡＰ−２５でＰＢＳに置換し、さらにＰＢＳで希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量８３，０００を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。別の１群（ＴＰＯ−２群）にはＴＰＯ−１群で投与したＴＰＯ活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量４１，５００を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。また最後の１群（ＴＰＯ−３群）にはＴＰＯ−２群で投与したＴＰＯ活性画分をさらにＰＢＳで２倍に希釈したもののうち１００μｌ（Ｍ−Ｏ７ｅアッセイ系での相対活性量２０，７５０を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。
投与開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。
血小板数の推移を図２５に示した。
すなわち、コントロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始８日目に最大となるような血小板数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。すなわち、ＴＰＯ−１群では、６日目に既に約２００％の増加が見られ、８日目には約２７０％にまで増加した。その後減少したが、１２日目においても約６５の増加が見られコントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１：ダネットの多重比較検定：Ｄｕｎｎｅｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）が認められた。ＴＰＯ−２群においても同様に増加が見られたが、増加作用はＴＰＯ−１群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約１４０％、約１６０％の増加を認めた。また、１２日目にはコントロール群とほぼ同様のレベルにまで減少した。ＴＰＯ−３群における増加作用はＴＰＯ−２群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目には約１１０％の増加が見られており、コントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１）も認められた。
以上の結果より、ヒトＴＰＯは、マウスの系統に関係なく血小板数を増加させること、またその作用には用量依存性があることが確認された。
＜実施例７１＞
ＴＰＯによる制がん剤投与による血小板減少症阻止効果
８週齢のＩＣＲ雄性マウス３０匹に５−ＦＵを２００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々１５匹の２群に分け、その翌日（Ｄａｙ１）より一方の群（コントロール群）には１００μｌのＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。またもう一方の群（ＴＰＯ群）には、実施例６９で用いたヒトＴＰＯ活性画分Ｆ２１００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量２１１，９００を含む）を１日１回５日間連続で皮下に投与した。
投与開始後Ｄａｙ４、６、８にそれぞれの群より各々５匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。
血小板数の推移を図２６に示した。
すなわち、コントロール群では５−ＦＵ投与後血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ６には最低値（５−ＦＵ投与前値の約２８％）に達したが、Ｄａｙ８には減少の反動で約１．３倍にまで増加した。ＴＰＯ群においても５−ＦＵ投与後血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ６には最低値（５−ＦＵ投与前値の約５２％）に達したがＤａｙ４と６の血小板数にほとんど差はなく、また、Ｄａｙ６においてはコントロール群に比して有意（ｐ＜０．０５：ダネットの多重比較検定）に高値を維持した。Ｄａｙ８においては、５−ＦＵ投与前値の約２００％にまで増加した。
以上の結果より、ヒトＴＰＯには、制がん剤による血小板減少を阻止する効果があることが確認された。
＜実施例７２＞
ＴＰＯによる血小板減少症治療効果
７週齢のＩＣＲ雄性マウス３６匹に塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々１８匹の２群に分け、その翌日（Ｄａｙｌ）より一方の群（コントロール群）には２００μｌのＰＢＳを１日２回連日皮下投与し、またもう一方の群（ＴＰＯ群）には、実施例７０で用いたＴＰＯ活性画分Ｆ１にＰＢＳで希釈せずに０．０４％の割合でＴｗｅｅｎ−８０を添加したもの２００μｌ（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量３６０，０００を含む）を１日２回連日皮下投与した。
投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分け、それぞれをＤａｙ５、１２に採血する群、Ｄａｙ８、１４に採血する群そしてＤａｙ１０に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。
血小板数の推移を図２７に示した。
すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ８〜１０で最低（各々ＡＣＮＵ投与前値の約２９％）となり、Ｄａｙ１２に約４９％、Ｄａｙ１４に約７４％に回復したにすぎなかった。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ５にはＡＣＮＵ投与前値の約３８％にまで減少した。その後は増加に転じ、ＡＣＮＵ投与前値に比してＤａｙ８では約６３％にまで回復し、Ｄａｙ１０以降はＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数を示し、Ｄａｙ１２では約３００％、Ｄａｙ１４では約４００％にまで増加した。
以上のように、コントロール群では減少の過程にあるＤａｙ８〜１０において既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１０で既にＡＣＮＵ投与前値以上の血小板数まで増加していることから、ヒトＴＰＯは制ガン剤により惹起される血小板減少からの回復を促進する効果を有することが確認された。
なお、実施例７１の結果を併せてもヒトＴＰＯには制ガン剤の種類に関係なく血小板数の減少を阻止する効果および血小板減少からの回復を促進する効果を有することが期待される。
＜実施例７３＞
ＴＰＯによるＢＭＴ施行後の血小板減少症治療効果
７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系の雄性マウス４８匹に１０Ｇｙの放射線を全身照射した後、同系のマウスの骨髄細胞１×１０６個を直ちに静脈内投与した。そこで無作為に２群に分け、翌日（Ｄａｙ１）より一方の群（コントロール群）にはＰＢＳを、他方の群（ＴＰＯ群）には実施例７０で用いたＴＰＯ活性画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量４４，０００を含む）をそれぞれ１日１回１００μｌずつ２０日間連日で皮下投与した。
投与開始後Ｄａｙ５、１０、１４、２１にそれぞれの群より各々６匹のマウスを無作為に抽出し、眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。
血小板数の推移を図２８に示した。
すなわち、いずれの群においてもＢＭＴ施行後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ１０に最低（ＢＭＴ施行前の約３％）となった。その後は徐々に回復し、Ｄａｙ１４にはコントロール群で約１１％、ＴＰＯ群で約１３％となった。Ｄａｙ２１にはコントロール群では３７％に回復したにすぎなかったが、ＴＰＯ群では約６５％にまで回復し有意な回復促進効果が認められた。
以上の結果より、実施例５６で精製されたヒトＴＰＯには、ＢＭＴ施行後の血小板数の回復を促進する効果があることが確認された。
＜実施例７４＞
ＴＰＯによる放射線照射後の血小板減少症治療効果
８週齢のＩＣＲ系の雄性マウス３６匹に５ＧｙのＸ線を全身照射した後、無作為に２群に分け、翌日（Ｄａｙ１）より一方の群（コントロール群）にはＰＢＳを、他方の群（ＴＰＯ群）には実施例７０で用いたＴＰＯ活性画分Ｆ１（Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量１，４４０，０００を含む）をそれぞれ１日１回３日間連日で皮下投与し、翌日よりＭ−０７ｅアッセイ系での相対活性量３６０，０００を１日１回７日間連日で皮下投与した。投与開始後各々の群でマウスを無作為に３群に分け、それぞれをＤａｙ４、１１、２１に採血する群、Ｄａｙ７、１３に採血する群そしてＤａｙ９、１５に採血する群とした。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。図２９に血小板数の推移を示した。
すなわち、コントロール群ではＸ線照射後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ９で最低（Ｘ線照射前値の約２４％）となり、Ｄａｙ１１に約３８％、Ｄａｙ１３に約６７％に回復し、Ｄａｙ１５にＸ線照射前値にまで回復した。一方ＴＰＯ群では、Ｄａｙ７にはＸ線照射前値の約２４％にまで減少した。その後は増加に転じ、ｘ線照射前値に比してＤａｙ９では約８２％にまで回復し、Ｄａｙ１１以降はＸ線照射前値以上の血小板数を示し、Ｄａｙ２１までその傾向は維持された。
以上のように、コントロール群では減少の過程にあるＤａｙ９において既にＴＰＯ群では増加に転じており、Ｄａｙ１１で既にＸ線照射前値以上の血小板数まで増加し、その後も高値を維持した。一方、コントロール群ではＸ線照射前値以上の血小板数まで回復するために１５日を要している。この結果より、実施例５６で精製されたヒトＴＰＯは放射線照射後の血小板減少からの回復期間を短縮することが認められ、放射線照射後の血小板減少症治療効果が認められた。
＜実施例７５＞
ｈＴＰＯ１６３による血小板増加作用
あらかじめ眼窩静脈より採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した正常なＣ３Ｈ／ＨｅＮ系雄性マウス１５匹を無作為に４群（コントロール群、Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分けた。１群（コントロール群）には０．１％のマウス血清を含むＰＢＳを１日１回５日間連続で皮下に投与した。Ａ群には、実施例６５で得られたＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗのＴＰＯ活性画分Ｆ２を０．１％のマウス血清を含むＰＢＳで希釈しｈＴＰＯ１６３を１日あたり、Ｍ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約４０，０００，０００／ｋｇ体重、Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系での相対活性量として約８，０００，０００／ｋｇ体重、そしてＣ群にも同様にＭ−０７ｅアッセイ系としての相対活性量として約１，６００，０００／ｋｇ体重の割合で５日間連続で皮下に投与した。
投与開始後６、８、１０、１２日目にそれぞれのマウスの眼窩静脈より経日的に採血し、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｆ−８００）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図３０に示した。
すなわち、コントロール群では血小板数にほとんど変動が見られなかった。ＴＰＯ投与群では、いずれの群においても投与開始８日目に最大となるような血小板数の増加が認められた。また、各投与群の間には用量依存性が認められた。すなわち、Ａ群では、６日目に約８８％、８日目に約１００％の増加が見られ、１０日目においても約９７％の増加を維持し、いずれもコントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１：ダネットの多重比較検定）が認められた。Ｂ群においても同様に増加が見られたが、増加作用はＡ群には及ばないものの６、８日目にはそれぞれ約６５％、約８４％の増加を認め、コントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１もしくはｐ＜０．０５：ダネットの多重比較検定）が認められた。Ｃ群における増加作用はＢ群よりもさらに弱かったが、最高値に達した８日目には約３１％の増加が見られた。
以上の結果より、実施例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３には、血小板数を増加させること、またその作用には用量依存性があることが確認された。
＜実施例７６＞
ｈＴＰＯ１６３による血小板減少症治療効果
８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ雄性マウス１００匹に塩酸ニムスチン（ＡＣＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内投与した後、無作為に各々２５匹の４群（コントロール，Ａ，Ｂ，Ｃ群）に分け、その翌日（Ｄａｙ１）よりコントロール群にはＰＢＳを５ｍｌ／ｋｇ体重の割合で１日１回連日皮下投与し、Ａ群には実施例６５で得られたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗのＴＰＯ活性画分Ｆ２をＰＢＳで希釈し、ｈＴＰＯ１６３をＭ−０７ｅアッセィ系における相対活性量として約１６，０００，０００／ｋｇ体重の割合で１日１回連日皮下投与した。Ｂ群には同様にＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約４８，０００，０００／ｋｇ体重の割合で、またＣ群にはＭ−０７ｅアッセイ系における相対活性量として約１６０，０００，０００／ｋｇ体重の割合で１日１回連日皮下投与した。
投与開始後各々の群でマウスを無作為に５群に分け、それぞれをＤａｙ５、８、１０、１２そして１４に採血した。採血は眼窩静脈より行い、マイクロセルカウンター（東亜医用電子製、Ｅ−２５００）にて血小板数を測定した。血小板数の推移を図３１に示した。
すなわち、コントロール群ではＡＣＮＵ投与後に血小板数は経日的に減少し、Ｄａｙ８〜１０で最低（ＡＣＮＵ投与前値の約１５〜１６％）となり、Ｄａｙ１２に約２８％、Ｄａｙ１４に約５１％に回復したにすぎなかった。一方Ａ群では、Ｄａｙ８にはＡＣＮＵ投与前値の約２５％にまで減少したが、その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０には約３４％に、Ｄａｙ１２には約８９％に、そしてＤａｙ１４にはＡＣＮＵ投与前値以上にまで回復した。
Ｂ群では、Ｄａｙ８にはＡＣＮＵ投与前値の約２３％にまで減少したが、その後は増加に転じ、Ｄａｙ１０にはすでに約６４％にまで回復し、Ｄａｙ１４にはＡＣＮＵ投与前値以上にまで回復した。また、Ｃ群においても同様にＤａｙ１０以降に増加に転じ、Ｄａｙ１２以降にはＡＣＮＵ投与前以上にまで回復した。
以上のように、いずれの群においても血小板数の最低値はＤａｙ８に観察されたが、ヒトＴＰＯ投与群ではコントロール群に比して減少が緩やかであり、最低値の底上げが見られた。また、コントロール群ではＤａｙ１０においても血小板数の回復はほとんど見られなかったが、ヒトＴＰＯ投与群ではＤａｙ１０には程度の差はあるが全ての群で血小板数の回復が観察され、５０μｇ／ｋｇ投与群ではＤａｙ１２にはすでにＡＣＮＵ投与前置以上にまで回復した。コントロール群ではＤａｙ１４においてもＡＣＮＵ投与前置の約５１％に回復したにすぎなかったことと比較すると、参考例２で生産されたｈＴＰＯ１６３は、血小板減少からの回復を促進する効果を有することが明らかとなった。以上、実施例６５で精製されたｈＴＰＯ１６３は制ガン剤により惹起される血小板減少症に対する治療効果が認められた。
＜実施例７７＞
ヒトＴＰＯ誘導体の大腸菌における作製
大腸菌で発現されるＴＰＯの生物活性、安定性、および溶解性の向上を試みて、ＴＰＯ誘導体を設計し、作製した。作製した誘導体は、配列番号１１のＬｅｕ１２９のＡｒｇ置換体（Ｌ１２９Ｒ）、Ｈｉｓ１３３のＡｒｇ置換体（Ｈ１３３Ｒ）、Ｍｅｔ１４３のＡｒｇ置換体（Ｍ１４３Ｒ）、Ｇｌｙ８２のＬｅｕ置換体（Ｇ８２Ｌ）、Ｇｌｙ１４６のＬｅｕ置換体（Ｇ１４６Ｌ）、Ｓｅｒ１４８のＰｒｏ置換体（Ｓ１４８Ｐ）、Ｌｙｓ５９のＡｒｇ置換体（Ｋ５９Ｒ）およびＧｌｎ１１５のＡｒｇ置換体（Ｑ１１５Ｒ）である。
ＴＰＯ誘導体作製のための鋳型としては、実施例４２に記載のｈ６Ｔ（１−１６３）を用い、変異導入のため以下に示すオリゴＤＮＡを合成した。
Ｌ１２９Ｒ；５’−ＡＴＣＴＴＣ  ＣＧＴ  ＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴ−３’（配列番号１１のＬｅｕ１２９のＡｒｇ置換体作製用）
Ｈ１３３Ｒ；５’−ＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＧＴ  ＣＴＧＣＴＧＣＧＴ−３’（配列番号１１のＨｉｓ１３３のＡｒｇ置換体作製用）
Ｍ１４３Ｒ；５’−ＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴ  ＣＴＧＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１１のＭｅｔ１４３のＡｒｇ置換体作製用）
Ｇ８２Ｌ；５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧ  ＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴ−３’（配列番号１１のＧｌｙ８２のＬｅｕ置換体作製用）
Ｇ１４６Ｌ：５’−ＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧ  ＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＴ−３’（配列番号１１のＧｌｙ１４６のＬｅｕ置換体作製用）
Ｓ１４８Ｐ  ；５’−ＧＴＴＧＧＣＧＧＴＣＣＧ  ＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧ−３’（配列番号１１のＳｅｒ１４８のＰｒｏ置換体作製用）
Ｋ５９Ｒ；５’−ＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＣ  ＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１１のＬｙｓ５９のＡｒｇ置換体作製用）
Ｑ１１５Ｒ：５’−ＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴ  ＧＧＣＣＧＴＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１１のＧｌｎ１１５のＡｒｇ置換体作製用）
以下に示す変異プラスミドはすべてＳｃｕｌｐｔｏｒインビトロミュータジェネシスキツト（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて作製した。
実施例４２に記載のプラスミドｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）から得られるＸｂａ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−  （東洋紡績社製）のＸｂａ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位間に挿入して、プラスミドｐＳＫＴＰＯを作製した。プラスミドｐＳＫＴＰＯは大腸菌ＪＭ１０９に保持させた。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（宝酒造社製）を用いてｐＳＫＴＰＯから一本鎖ＤＮＡを調整し、上記の変異用合成オリゴＤＮＡを用いて、キットに添付のプロトコールに従い、変異プラスミドを作製した。得られた候補プラスミドについて挿入断片の塩基配列を決定し、目的とする部位が変異されていることを確認した。
上記で作製したすべてのｐＳＫＴＰＯの誘導体よりＸｂａ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を抽出し、プラスミドｐＣＦＭ５３６のＸｂａ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位間に挿入した後、大腸菌２６１に形質転換し、目的とするＴＰＯ誘導体を発現させる形質転換体を完成させた。
目的とするＴＰＯ誘導体をコードする遺伝子を含む形質転換体の培養は、実施例４３に従って実施した。得られたｈ６Ｔ（１−１６３）生産組換体の凍結菌体（約３ｇ）に、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８，５）を約３０ｍＬ加え、懸濁した後、氷冷下１分間の間隔をおいて１分間のソニケーション（超音波破砕機を使用）を５回行なった。破砕した菌体を遠心チューブに移し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレットを集めた。
このペレットに、８Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）約３０ｍＬを加えて懸濁し、さらに約５０ｍｇのＤＴＴを加え、室温にて１〜２時間攪拌し、蛋白質試料を還元した。還元後、２Ｍ塩酸溶液を用いて試料のｐＨを５に調整し、４℃に放置した。還元した蛋白質試料を、３０％グリセロール、３Ｍ尿素、３ｍＭシスタミン、１ｍＭＬ−システインを含む１０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５、約１．５Ｌ）に対して希釈した。
希釈は、室温で一晩かけて実施した。希釈後の試料溶液を室温で２日間攪拌し、試料蛋白質を充分に酸化した後、８０００ｒｐｍで４５分間遠心し、不溶物を除去した。遠心後の上澄みを６Ｍリン酸を用いてｐＨ６．８に調整し、イオン交換水で２倍に希釈した後、不溶物をフィルターペーパー（東洋濾紙製、＃２、直径９０ｍｍ）２枚を用いてろ過した。ろ液をイオン交換樹脂（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）のカラム（２．６ｘ１０ｃｍ）に吸着させた後、１５％グリセロール、１Ｍ尿素を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）約４００ｍＬで洗った後、１５％グリセロールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）約３００ｍＬでカラムを平衡化した。目的試料の溶出には、１５％グリセロールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液から０．５Ｍ食塩を含む同緩衝液までの直線濃度勾配を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行なった。カラムからの蛋白質の溶出を２８０ｎｍにおける紫外吸収で追跡し、目的蛋白質を含むフラクションを集めた（約３０〜４０ｍＬ）。このフラクションを遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて約２ｍＬに濃縮した後、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて精製した。この時、カラムにはＷａｔｅｒｓ社製μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ４（３．９ｘ１５０ｍｍ）を用い、蛋白質の溶出には、０．０５％ＴＦＡ溶液である溶離液Ａと、７０％２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ，  ３０％ＣＨ３ＣＮおよび０．０２％ＴＦＡを含む溶離液Ｂを用い、Ｂ溶離液の濃度を４０分間で１％から１００％まで変化させ、目的蛋白質を溶出させた。ＴＰＯ誘導体は、この条件では、いずれも約３０分の位置に溶出された。
精製されたＴＰＯ誘導体の活性測定を行なうため、溶出された誘導体を集め、２Ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に対して２日間透析した後、遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮し、Ｍ−０７ｅアッセイに供した。調製された各ＴＰＯ誘導体は、いずれも対照として用いたｈ６Ｔ（１−１６３）と同様の生物活性を示した（図３２、図３３参照）。
以下、製剤例を示す。
＜製剤実施例１＞
実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例２＞
実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例３＞
実施例５６で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍ１バイアル瓶に充填し注射剤とした。
＜製剤実施例４＞
実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例５＞
実施例５６で得られたｈＴＰＯ１６３画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例６＞
実施例６５で得られたｈＴＰＯ１６３画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍ１バイアル瓶に充填し注射剤とした。
＜製剤実施例７＞
参考例実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌処理した後−２０℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例８＞
実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。
＜製剤実施例９＞
実施例５７で得られたヒトＴＰＯ画分を濃縮し、これを無菌濾過した後１０ｍｌバイアル瓶に充填し注射剤とした。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
セルライン：ＭｃＡ−ＲＨ８９９４
配列：
0003635142.tif 000028
0003635142.tif 000029
配列番号：２
配列の長さ：１６６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
セルライン：ＭｃＡ−ＲＨ８９９４
配列：
0003635142.tif 000030
0003635142.tif 000031
0003635142.tif 000032
配列番号：３
配列の長さ：５８０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000033
0003635142.tif 000034
配列番号：４
配列の長さ：８６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000035
0003635142.tif 000036
配列番号：５
配列の長さ：５７６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000037
0003635142.tif 000038
配列番号：６
配列の長さ：１２６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000039
0003635142.tif 000040
0003635142.tif 000041
0003635142.tif 000042
配列番号：７
配列の長さ：１７２１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000043
0003635142.tif 000044
0003635142.tif 000045
0003635142.tif 000046
配列番号：８
配列の長さ：４５０６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
配列：
0003635142.tif 000047
0003635142.tif 000048
0003635142.tif 000049
0003635142.tif 000050
0003635142.tif 000051
0003635142.tif 000052
配列番号：９
配列の長さ：４１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列：
0003635142.tif 000053
配列番号：１０
配列の長さ：５４９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列：
0003635142.tif 000054
0003635142.tif 000055
0003635142.tif 000056
配列番号：１１
配列の長さ：５３５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
起源：ヒト（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
0003635142.tif 000057
0003635142.tif 000058
配列番号：１２
配列の長さ：５３５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
起源：ヒト（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
0003635142.tif 000059
0003635142.tif 000060
0003635142.tif 000061
配列番号：１３
配列の長さ：５５５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：ホモ  サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
組織の種類：肝臓
配列：
0003635142.tif 000062
0003635142.tif 000063
配列番号：１４
配列の長さ：１０４３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
起源：ヒト（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）
0003635142.tif 000064
0003635142.tif 000065
0003635142.tif 000066
0003635142.tif 000067
配列番号：１５
配列の長さ：３２６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
配列：
0003635142.tif 000068
0003635142.tif 000069
配列番号：１６
配列の長さ：３３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
配列：
0003635142.tif 000070
0003635142.tif 000071
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＲＰからのラットＴＰＯ精製における、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲカラム）のクロマトグラム及びラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製における逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃｌ  ３００Ａカラム）のクロマトグラム、及びラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図３】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製における逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃｌ  ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡ（チューブ番号３６〜４２）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真、及びラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図４】ＸＲＰ由来のラット低分子ＴＰＯ標品精製における逆相クロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃｌ  ３００Ａカラム）のＴＰＯ活性画分ＦＡの、３段階消化によるペプチドマップを示すグラフ。
【図５】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるラット血漿由来ＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図６】発現ベクターｐＥＦ１８Ｓの構築を示す概念図。
【図７】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥＦ１８Ｓ−Ａ２αを導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図８】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥＦ１８Ｓ−ＨＬ３４を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図９】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨＴ１−２３１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１０ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨＴＦ１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１０ｂ】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＨＴＦ１を導入・発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１１】ファージクローンλＨＧＴ１の制限酵素地図の概略。（図中、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ：Ｓａｌ  Ｉを示す。）
【図１２ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＥＦＨＧＴＥを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１２ｂ】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＥＦＨＧＴＥを導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１３ａ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおける、およびｐＨＴ１−２１１＃１、およびｐＨＴ１−１９１＃１、およびｐＨＴ１−１７１＃２を導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１３ｂ】ラットＣＦＵ−ＭＫアッセイにおけるｐＨＴ１−１６３＃２を導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１４】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるｐＨＴ１−２１１＃１、ｐＨＴ１−１９１＃１、ｐＨＴ１−１７１＃２、およびｐＨＴ１−１６３＃２を導入・発現させたＣＯＳ１細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１５】ｐＤＥＦ２Ｏ２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清からのヒトＴＰＯ精製における、逆相クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラム）のクロマトグラム。
【図１６】ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１を導入・発現させたＣＨＯ細胞の培養上清から精製されたヒトＴＰＯのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真。
【図１７】ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導入・発現させた大腸菌からのヒトＴＰＯの精製における、逆相クロマトグラフィーのクロマトグラム。
【図１８】ｐＣＦＭ５３６／ｈ６Ｔ（１−１６３）を導入・発現させた大腸菌から分離・精製された変異型ヒトＴＰＯ、ｈ６Ｔ（１−１６３）のＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真。
【図１９】ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の精製におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムでのｈＴＰＯ１６３の溶出。蛋白質は２２０ｎｍの紫外吸収で測定した。
【図２０】ヒトＴＰＯ発現プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ１６３をＣＨＯ細胞にトランスフェクションして得られた培養上清を出発材料にしたｈＴＰＯ１６３の精製において、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムで得られたｈＴＰＯ１６３標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真。各ｈＴＰＯ１６３は銀染色された。
【図２１】発現ベクターｐＳＭＴ２０１の構造を示す図。
【図２２】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるβＧＬ−ＴＰＯ、Ｎ３／ＴＰＯ、０９／ＴＰＯを導入・発現させたＣＯＳ７細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２３】Ｍ−０７ｅアッセイにおけるヒトＴＰＯ挿入・欠失誘導体を導入・発現させたＣＯＳ７細胞培養上清中のＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図２４】ヒトＴＰＯを正常マウスに静脈内投与、または皮下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２５】ヒトＴＰＯを正常マウスに投与量を変えて皮下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２６】マウスに制ガン剤（５−ＦＵ）を投与した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２７】マウスに制ガン剤（ＡＣＮＵ）を投与した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２８】マウスにＢＭＴ（骨髄移植）を施行した後にヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図２９】放射線照射後のマウスにヒトＴＰＯを投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図３０】ｈＴＰＯ１６３を正常マウスに皮下投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図３１】マウスに制ガン剤（ＡＣＮＵ）を投与した後にｈＴＰＯ１６３を投与した場合の血小板数の推移を示すグラフ。
【図３２】大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（Ｈ１３３Ｒ、Ｓ１４８Ｐ、Ｑ１１５Ｒ）のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図３３】大腸菌で発現されたヒトＴＰＯ誘導体（Ｍ１４３Ｒ、Ｌ１２９Ｒ、Ｇ８２Ｌ、Ｇ１４６Ｌ、Ｋ５９Ｒ）のＭ−０７ｅアッセイにおけるＴＰＯ活性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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