(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、（ｉ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の第１配列、（ｉｉ）該第１配列が作動可能に結合した異種ポリペチドをコードするＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の第２配列の順で前記各配列を含むＤＮＡセグメントであって、該ＤＮＡセグメントを含有するベクターの宿主酵母細胞内での発現により前記異種ポリペプチドが産生され、但し前記第１配列は下記ヌクレオチド配列の核酸番号１〜７７１から成り、且つ前記第２配列は下記ヌクレオチド配列の核酸番号１８４８〜２７６０から成ることを特徴とする、前記ＤＮＡセグメント。
0003696236.tif 000012
0003696236.tif 000013
0003696236.tif 000014
【請求項２】
前記（ｉｉ）のＤＮＡ配列の５’末端に結合させた前記ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を更に含む請求項１に記載のＤＮＡセグメントであって、該ＤＮＡセグメントを含有するベクターを宿主酵母細胞内で発現させると前記Ｎ末端の１１個のアミノ酸残基と前記異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドが産生され、但し該ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残基は請求項１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１１から成る、前記ＤＮＡセグメント。
【請求項３】
前記Ｎ末端の１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列が請求項１に記載のヌクレオチド配列の核酸番号７７４〜８０６からなる、請求項２に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項４】
前記宿主酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項５】
前記異種ポリペプチドがスーパーオキシドジスムターゼである請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項６】
前記異種ポリペプチドが肝炎デルタ抗原である請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項７】
酵母中で異種ポリペプチドを発現し得る発現ベクターであって、（ａ）請求項１に記載のＤＮＡセグメント、および(ｂ)酵母複製起点を含む発現ベクター。
【請求項８】
酵母中でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残基と異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現し得る発現ベクターであって、（ａ）請求項２に記載のＤＮＡセグメント、および（ｂ）酵母複製起点を含む発現ベクター。
【請求項９】
前記ＤＮＡセグメント内の前記Ｎ末端の１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列が請求項１に記載のヌクレオチド配列の核酸番号７７４〜８０６からなる、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれか一項に記載の発現ベクターを用いて形質転換された酵母宿主細胞。
【請求項１１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１０に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１２】
酵母中で異種ポリペプチドを生産する方法であって、該方法は、ベクター中の請求項１に記載のＤＮＡセグメントを導入するステップを含み、それによって前記ベクターが酵母細胞によって複製され且つ保有され、前記異種ポリペプチドをコードする遺伝子がソルビトールによる誘導で発現される、前記方法。
【請求項１３】
酵母中でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残基と異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを生産する方法であって、該方法は、ベクター中の請求項２に記載のＤＮＡセグメントを導入するステップを含み、それによって前記ベクターが酵母細胞によって複製され且つ保有され、前記ポリペプチドをコードする遺伝子がソルビトールによる誘導で発現される、前記方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡセグメント内の前記Ｎ末端の１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列が請求項１に記載のヌクレオチド配列の核酸番号７７４〜８０６からなる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、酵母宿主系を用いる組み換えＤＮＡ技術に係わる。本発明は特に、酵母における外来タンパク質の発現を促進し得る酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のヌクレオチド配列または断片に係わる。
発明の背景
組み換えＤＮＡ技術の発達は、酵母における外来遺伝子のクローン化及び発現を可能にした。哺乳類その他の外来ポリペプチド発現のための宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母を用いると、より普通に用いられる大腸菌などの原核宿主には欠けている利点が得られる。例えば、酵母はグリコシル化可能であるが、原核宿主は可能でない。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝システムは、遺伝子発現の制御のための原理も含めて良く解明されている。加えて、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは通常、食品医薬品局によって認可されている。
酵母宿主系の多大の実用的かつ経済的有用性は、転写を導く様々なプロモーター領域、転写を終結させる様々な配列、及び他の調節配列の同定によって酵母発現を最大限に実現する試みを刺激した。例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼは、酵母において様々な遺伝子の相当レベルの発現達成を可能にするうえできわめて有用な、ただ１個の強力なプロモーターを有することが確認されている［Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，  ｐｐ．７１７−７２２（１９８１）］。米国特許第５，１３９，９３６号には、外来遺伝子と、酵母ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ１）調節領域と、前記外来遺伝子の発現を増加させる位置に有るプロモーターとを含むクローニングベクターが開示されている。米国特許第５，０８９，３９８号には、酵母における外来ポリペプチドの発現の制御にグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のプロモーター領域を用いることが開示されている。即ち、酵母において様々な遺伝子の相当レベルの発現達成を可能にする宿主系の提供は可能である。
発明の概要
本発明によれば、意外にも、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ（“ＳＤＨ”）遺伝子に由来するプロモーター、ターミネーター及び他の幾つかの調節領域を発現ベクターに挿入することによって酵母における外来ポリペプチドの収量を著しく増大させ得ることが判明した。
本発明は特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離したＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）を提供し、このＤＮＡ断片は、該断片と異種ポリペプチドをコードする遺伝子とがベクターにおいて作動可能に連結され、このベクターが宿主酵母細胞によって複製及び保持される場合、前記異種ポリペプチドの産生増加に有用である。上記ＤＮＡ断片の機能的に活性な部分は、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調節配列の制御下にある。
本発明はまた、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の酵母における発現を可能にする発現ベクターを提供する。本発明のベクターは特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調節配列と、酵母複製系との制御下に有るＤＮＡ配列を含む。
本発明の一具体例によれば、酵母において異種ポリペプチドはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの、ソルビトールによって誘導されるソルビトールデヒドロゲナーゼの遺伝子に由来する調節ヌクレオチド断片の導入によって発現され、その際前記ヌクレオチド断片と異種ポリペプチドをコードする遺伝子とがベクターにおいて作動可能に連結され、このベクターが酵母細胞によって複製及び保持され、誘導条件下にポリペプチドが発現される。
本発明の別の具体例によれば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調節配列と、酵母複製系との制御下に有るＤＮＡ配列を含む発現ベクターでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが形質転換される。
本発明は更に、第１図の配列を含むＤＮＡ分子またはその縮重均等物も提供し、前記ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドは酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼの生物学的活性を有する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから実質的に精製単離した活性なソルビトールデヒドロゲナーゼも提供する。
加えて本発明は、アッセイ試薬と、異種ポリペプチドを試薬として、または試薬の調製に、即ち該ポリペプチドに対する抗体の産生などに用いる、当業者に公知の様々なアッセイ方法の改良形態とを提供する。ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写配列、翻訳開始配列及び終結調節配列の制御下に有るＤＮＡ挿入配列を含むクローニングベクターで形質転換した酵母細胞に、異種ポリペプチドを産生させる。試験試料において幾つかの特異的結合対の存在を検出するのに用いる試験キットも提供し、この試験キットは、少なくとも１種のＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的な結合要素を収容した容器を含む。
【図面の簡単な説明】
第１図はソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を読み取り枠の翻訳と共に示す説明図である。核酸番号１〜７７１は転写調節単位を示している。核酸番号１８４６〜２７５９は転写終結単位を示している。
第図２はプラスミドｐＸＳ３、ｐＸＳ４、ｐＸＳ４リンカーの構築の概略的説明図である。これらのベクターは、ＳＤＨ遺伝子のプロモーター配列とターミネーター配列とに挟まれた多クローン化部位を有する。ｐＸＳ２、ｐＸＳ３及びｐＸＳ４においてポリペプチドは非融合分子として発現される。
第３図は肝炎デルタ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｔｉｇｅｎ）をコードする遺伝子を含むｐＸＳ３の構築の概略的説明図である。
第４図はｐＸＳ３デルタを導入した形質転換体における肝炎デルタ抗原発現のウェスタンブロット分析の説明図である。ｐＸＳ３を導入した形質転換体から得た細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン１において電気泳動に掛けた。ｐＸＳ３デルタを導入した２個の異なる形質転換体から得た溶解物をレーン２、３に適用した。分析は、肝炎デルタ抗原に対する抗体を含有するヒト血清を用いるウェスタンブロット分析によって行なった。
第５図はｐＸＳ２−ＳＯＤ及びｐＸＳ４リンカーＳＯＤの構築の概略的説明図である。
第６図はｐＸＳ２−ＳＯＤで形質転換した酵母における非融合ヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド発現の説明図である。ヒトＳＯＤポリペプチドの発現を、クーマシーブルーでの染色により視覚的に測定した。レーン１は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手した高分子タンパク質マーカーを含有する。レーン２、３は、ｐＸＳ４及びｐＸＳ２−ＳＯＤをそれぞれ導入した８０００−８Ｂ形質転換体からの抽出物を含有する。
第７図はｐＸＳ４リンカーＳＯＤを導入した形質転換体における融合ヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の説明図である。ゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン２は、酵母発現ベクターｐＸＳ４リンカーを導入した形質転換体からの抽出物を含有する。レーン３、４では、ｐＸＳ４リンカーに挿入されたヒトＳＯＤ遺伝子を有する２個の異なる形質転換体を電気泳動に掛けた。レーン１には、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手した高分子基準タンパク質を適用した。
発明の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中に用いた次の語の定義を示す。
ソルビトールデヒドロゲナーゼの“生物学的活性”という語は、基質としてのソルビトールに対して選択的酸化特異性を有するポリペプチドを意味する。
“ＤＮＡ発現ベクター”とは、自律的要素であって、そのゲノムに付加的なＤＮＡ配列が挿入された後宿主において該宿主の染色体から独立に複製可能な要素のことであるる。
“遺伝子”とは、その一部が特定のポリペプチドまたはＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片のことである。
“異種ポリペプチド”とは、通常は酵母生物によって産生されたり、酵母生物の生存に必要とされたりしないタンパク質のことである。この語は、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡを発現媒体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｈｉｃｌｅ）に、組み換えＤＮＡ技術を用いて機能的に挿入し、その後この媒体を用いて酵母生物宿主を形質転換することを意図する。ＤＮＡの機能的挿入とは、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに、後段に定義するプロモーター系の制御下に挿入することである。本発明による異種ポリペプチドには、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）等のホルモン；リンフォカイン；スーパーオキシドジスムターゼ、クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素；ヒト線維芽細胞等のインターフェロン；口蹄疫抗原、インフルエンザ抗原ポリペプチド、肝炎デルタ抗原、Ｂ型肝炎核抗原、肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎Ｅ抗原、ヒト免疫不全ウイルス１及び２（ＨＩＶ１及び２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１及び２等のウイルス抗原または免疫原；並びにレニン、ヒト血清アルブミン、ヒトインシュリン、ヒトインシュリン様成長因子−１、様々な糖タンパク質といった他の様々なポリペプチドが非限定的に含まれる。本発明による異種ポリペプチドは、情緒障害を治療及び／または予防するワクチン等の医薬組成物中に用い得る。
“プロモーター”とは、通常遺伝子の開始コドンに最も近く位置する５′領域として説明されるＤＮＡ配列である。プロモーター領域において、隣接遺伝子の転写または発現が開始される。この部位のことを転写開始部位と呼称する。プロモーター領域には、作動可能に連結された１種以上の任意の構造遺伝子の発現に対して制御要素（ｃｏｎｔｒｏｌ）として相互作用するヌクレオチド配列が存在し得る。
“作動可能に連結”という語は、構造遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現開始に対してプロモーターが及ぼす制御を意味する。
“転写開始部位”とは、プロモーターのＤＮＡ配列で、そこにＲＮＡポリメラーゼが結合し、それによって５′から３′方向へ連続するコドンの転写を開始するＤＮＡ配列のことである。
“転写ターミネーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる、転写領域の末端に位置するＤＮＡ配列のことである。
Ｂ．酵母発現ベクター
本発明によれば、特定のＤＮＡ断片を、酵母ゲノムにとって外来性である遺伝子に連結してＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの改質株に導入し、それによって前記株に、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調節配列の制御下にポリペプチドを産生させる。発現は、新規な組み換えＤＮＡ発現ベクターでＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換することによって実現する。
本発明は特に、（ｉ）酵母選択的マーカー、（ii）酵母複製起点、並びに（iii）ただ１個の制限部位に関して、該部位に挿入されたポリペプチドコーディング配列の発現が実現し得るように配置されたＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の酵母プロモーター及びターミネーター配列を含む酵母発現ベクターを提供する。特に、非融合ベクターカセット、及びソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ末端残基に由来する１１個のアミノ酸を含む融合ベクターカセットを構築した。上記両カセットを、選択マーカーとしての酵母ＴＲＰ１遺伝子と２μｍ複製起点とを有する３０コピー酵母プラスミドに挿入した。ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドを上記１１アミノ酸と融合させると、融合ポリペプチドの発現は非融合ポリペプチドに比較して数倍高レベルとなる。加えて、多コピープラスミドにおいて発現させた場合、融合相手としてのソルビトールデヒドロゲナーゼを伴った異種ポリペプチドの発現レベルは、ソルビトールデヒドロゲナーゼ自体の発現レベルより数倍高い。上記のようなポリペプチドは、天然生物から製造した溶解物より安全でかつ費用効果が高いアッセイ試薬をもたらす。
ベクターの構築には、当業者に公知である任意の酵母複製起点を用い得る。例えば、本発明は天然酵母プラスミド２μｍの複製領域について説明している。上記プラスミドは、直ちに検出可能な表現型を与えないという点で潜在型（ｃｒｙｐｔｉｃ）であり、細胞１個当たり約１００のコピー数で存在する。
本発明のＳＤＨプロモーターは好ましくは、ＳＤＨ遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、後のｍＲＮＡの翻訳とのためのシグナルを含む酵母ゲノム由来の約７７１塩基対の配列である。このＤＮＡ断片中にソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする配列は存在しないが、この断片は外来遺伝子の発現を導き得、調節はＳＤＨ遺伝子のためのモードを踏襲する。
本発明のＳＤＨターミネーターは好ましくは、ポリＡ付加部位ＡＡＴＡＡＡを含む約９１３ヌクレオチドの配列である。
本発明は、酵母からの融合または非融合ポリペプチドの発現を実現する。遺伝子の５′末端部においてコーディング配列内にただ１個の制限部位ＸｂａＩが存在する。この部位にＤＮＡ配列を挿入すると、挿入したＤＮＡがコードするアミノ酸と融合した、ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１アミノ酸を含むハイブリッドタンパク質が産生される。高レベルのソルビトールデヒドロゲナーゼ発現を実現し得る上記配列に含まれた遺伝情報が融合タンパク質の発現レベルを上昇させる。
本発明の酵母株は、毒性が低く、かつその遺伝特性が良く知られているために用いられる通常の実験酵母株のＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。この株は大規模培養が容易である。ＤＮＡ断片を含む本発明の組み換えＤＮＡ物質は、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調節配列の制御下にあり、調節を変更する酵母突然変異体等を非限定的に含めた形質転換可能な任意の酵母細胞においてポリペプチド産物を発現させるのに用いられる。
大部分の酵母は、通常の実験培地と当業者に公知の方法とを用いて比較的一律の条件下に培養し得る。当業者は認識していようが、酵母の増殖要件として典型的なものには、炭素及びエネルギーを供給する有機炭素化合物、ポリペプチド及び核酸の合成のための有機または無機窒素、様々な無機質、並びにビタミンの混合物が含まれる。このような増殖要件を満たすのが酵母窒素塩基（ＹＮＢ）であり、これは、幾つかの微量元素、ビタミン、増殖を刺激する痕跡量のアミノ酸、並びに主要な無機質であるリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを含有する化学的に定義された培地である。窒素源は硫酸アンモニウムとする。炭素源は所望のものを約０．５〜約３％の濃度で添加する。培地のｐＨ範囲は普通約３．０〜約８．０、好ましくは約４．５〜約６．５とする。
本明細書中に述べた遺伝子操作法によって調製した微生物の一例として、現在Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤに寄託中の培養物を示す。それらは次のように確認される。
受託番号 ；株 ；1992年 寄託
受託番号 ；株 ；1992年 寄託
受託番号 ；株 ；1992年 寄託
Ｃ．アッセイ方式
本発明は、個体から得た標本中に抗原または抗体を検出する、従来より優れた方法を提供し、この方法で用いる組み換え抗原は酵母においてベクターにより融合または非融合ポリペプチドとして発現され、この組み換え抗原の発現は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増加させるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のＤＮＡ断片の制御下に有る。
本発明は、ＳＤＨ発現異種ポリペプチド、または該ポリペプチドに特異的な結合要素を含有するアッセイ試薬を提供する。好ましくは、ＳＤＨ発現異種ポリペプチドは酵素であり得る。最も好ましくは、ＳＤＨ発現異種ポリペプチドはスーパーオキシドジスムターゼであり得る。本発明のアッセイ試薬は、当業者に公知であるいかなる診断アッセイにも用い得る。アッセイは好ましくはイムノアッセイとして行なうが、本発明は免疫反応アッセイに限定されない。特異的な結合要素を用いるものであればいずれのアッセイも実行可能である。本明細書中に用いた“特異的な結合要素”という語は、特異的結合対の構成要素を意味する。即ち、一方が他方に化学的または物理的手段により特異的に結合する２種の異なる分子のことである。従って、通常のイムノアッセイの抗原と抗体との特異的結合対に加えて他の特異的結合対として、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列同士、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害物質と酵素等を挙げることができる。そのうえ、特異的結合対は本来の特異的結合要素の類似体、例えば分析対象（ａｎａｌｙｔｅ）類似体も構成要素とし得る。免疫反応性の特異的結合要素には、抗原、抗原フラグメント；モノクローナル及びポリクローナル両方の抗体及び抗体フラグメント；並びに組み換えＤＮＡ法によって形成されるものを含めたこれらの複合体が含まれる。
本明細書中に用いた“分析対象”という語は、試験試料中に存在し得る検出するべき物質を意味する。分析対象は、当該物質に関して天然産の特異的結合要素（抗体など）が存在するか、または特異的結合要素を製造することが可能である任意物質とし得る。即ち、分析対象とは、アッセイにおいて１種以上の特異的結合要素と結合し得る物質である。“分析対象”には任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、及びこれらの組み合わせも含まれる。特異的結合対の構成要素として、“分析対象”は天然産の特異的結合相手(対の片割れ)によって、即ちビタミンＢ12測定の場合であれば捕捉及び／または指示試薬中に内因子タンパク質を用い、炭水化物測定の場合であれば捕捉及び／または指示試薬中にレクチンを用いるなどして検出し得る。分析対象には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与されるものも違法な目的で投与されるものも含めた薬物、細菌、ウイルス、及びこれらの物質のうちのいずれかの代謝産物や、これらの物質のうちのいずれかに対する抗体が含まれ得る。
“固相”（“固体支持体”）は当業者に公知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、帯磁ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子等を含む。“固相”は重要でなく、当業者によって選択可能である。即ち、ラテックス粒子、微粒子、帯磁または非帯磁ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、及びヒツジ赤血球のいずれもが適当例である。固相上にペプチドを固定する適当方法には、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合による相互作用等を生起させることが含まれる。本明細書中に用いた“固相”という語は、不溶性であるか、または後からの反応によって不溶性とし得る任意物質を意味する。固相の選択は、捕捉試薬を引き付け、かつ固定するその固有の能力に従って行ない得る。あるいは他の場合には、固相に、捕捉試薬を引き付け、かつ固定する能力を有する付加的なレセプターを保持させ得る。付加的なレセプターには、捕捉試薬それ自体か、または捕捉試薬に結合した荷重物質と反対に荷電された荷電物質が含まれ得る。更に別の変形例として、レセプター分子は固相上に固定される（固相と結合する）、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定する能力を有する任意の特異的結合要素であり得る。レセプター分子は、アッセイ実施の前または最中に捕捉試薬を固相物質に間接的に結合させることを可能にする。即ち固相は、プラスチック、誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）プラスチック、帯磁または非帯磁金属、試験管のガラスまたはシリコン面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者に公知の他の形態であり得る。
試験試料は哺乳動物の、１種以上の当該分析対象を含有し得るか、または含有すると考えられ得る全血、または赤血球、リンパ球もしくはリンパ球サブセット調製物を含めた白血球、血小板、血清及び血漿を含めた全血成分；腹水；唾液；便；髄液；尿；痰；気管吸引物及び他の身体成分などの生物学的流体とし得る。試験試料を培養液上清、または培養細胞の懸濁液とすることも可能である。本発明によりその体液を抗原分析対象または抗体分析対象に関してアッセイし得る哺乳動物には、ヒト及び霊長類、並びに前記分析対象を保有すると考えられる他の哺乳動物が含まれる。非生物学的流体試料を用い得ることも予期される。
本発明のアッセイ試薬は、各分析対象に特異的な結合要素に接合したラベルを含有する指示試薬を包含する。各指示試薬は検出可能なシグナルを、試験試料中の分析対象の量に関連するレベルで発生する。好ましい一具体例において各指示試薬には、異なる分析対象に特異的な結合要素を含有させる一方で、検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物（ラベル）は同じものを接合する。通常、指示試薬は固相物質に捕捉されてから検出または測定される。本発明では、ＳＤＨ発現ポリペプチドが１種以上の指示試薬の１種以上の成分を包含する。本発明の実施においては異なるシグナル発生化合物を用い得ることが予期される。即ち、例えば各指示試薬毎に異なる蛍光化合物をシグナル発生化合物として用い、異なる波長の読み取りによって検出を確認することが可能である。あるいはまた、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）またはフェナントリジニウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍ）化合物などの短命化学発光化合物と、ジオキセタンなどの長命化学発光化合物とを用いれば、異なる分析対象に関して異なる時点にシグナルを発生させることができる。異なる時点にシグナルを発生し得る２種以上の化学発光化合物の使用を詳述した方法が、本明細書に参考として含まれる、本出願と同じ出願人が出願した米国特許同時係属出願第６３６，０３８号の主題となっている。アクリジニウム及びフェナントリジニウム化合物は、本明細書に参考として含まれる、本出願と同じ出願人が１９８９年６月２３日付で出願した米国特許同時係属出願第０７／２７１，７６３号に開示されている。
指示試薬中の特異的結合要素は、特異的結合対を構成する抗原または抗体要素とする以外にも、ビオチンまたはアビジン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列の一方、エフェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子または酵素、酵素阻害物質または酵素等を含めた、任意の特異的結合対の一方の構成要素とし得る。免疫反応性の特異的結合要素は、抗体、抗原、またはサンドイッチアッセイでのように分析対象に結合し得るか、競合アッセイでのように捕捉試薬に結合し得るか、または間接アッセイでのように補助的な特異的結合要素に結合し得る抗体−抗原複合体であり得る。抗体を用いる場合はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体、これらの混合物、または抗体と他の特異的結合要素との混合物を用い得る。上記のような抗体の調製、及びそれらの抗体の特異的結合要素としての使用への適性の詳細は当業者に良く知られている。
本発明によって製造した異種ポリペプチドを、指示試薬の、外的手段によって検出できる測定可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物（ラベル）とすることができる。考えられる様々なシグナル発生化合物（ラベル）には、色原体；酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ-ガラクトシダーゼなどの触媒が含まれる。特定ラベルの選択は重要でないが、それ自体でか、または1種以上の付加的物質との関係においてシグナルを発生し得る物質とする。ラベルまたは特異的結合要素を変更することによって、様々に異なる指示試薬を製造し得る。特に、他の様々なイムノアッセイ方式の測定が本発明により可能となる。上記イムノアッセイ系方式には、競合法、サンドイッチ法及びイムノメトリック法が非限定的に含まれる。このようなイムノアッセイ系は通常、免疫グロブリン、即ち全抗体または抗体フラグメントが試験試料由来の特異的分析対象に結合する能力に依存し、ラベルまたは検出可能部分と結合させた本発明の抗体またはそのフラグメントを含有させた標識試薬を用いて結合の程度を測定する。検出可能なラベルには、酵素、放射性ラベル、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光体、有色粒子及び有色微粒子、並びにアミノメチルフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノリルアミノフルオレセン、及び同様の蛍光誘導体などの蛍光化合物が非限定的に含まれる。本明細書中に述べたように、試験試料は天然産の、または人工的に製造した液体もしくはその抽出物とし得、それらには全血、血清、血漿、尿、便、唾液、髄液、脳組織等といった生物学的試験試料が非限定的に含まれる。加えて、試験試料を試験試料の抽出物とするか、またはその誘導体のうちのいずれかとすることも可能である。
イムノアッセイのために走査プローブ顕微鏡測定法（ＳＰＭ）を用いることも、本発明によって製造したＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的な結合要素を容易に適応させ得る一技術である。走査プローブ顕微鏡測定法、特に原子力顕微鏡測定法では、捕捉相、例えば少なくとも１種の本発明のＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的な結合要素を固相に付着させ、固相表面に存在し得る特異的結合要素複合体を走査プローブ顕微鏡を用いて検出する。走査トンネル顕微鏡測定法を用いれば、多くのイムノアッセイ系において抗原−抗体複合体の検出に通常用いなければならないラベルの必要性が無くなる。このような系は、本明細書に参考として含まれる、本出願と同じ出願人による係属中の米国特許出願第６６２，１４７号に開示されている。
ＳＰＭを用いての特異的結合反応の監視は様々な方法で実施し得る。一具体例では、特異的結合相手の一方の結合要素(本発明のモノクローナル抗体である分析対象特異的な物質)を走査に適した表面に付着させる。分析対象特異的な物質の付着は当業者に公知の方法に従い、プラスチックまたは金属表面を具えた固相を含む試験片への吸着によって実現し得る。または、特異的結合相手（分析対象特異的な物質）を誘導体化プラスチック、金属、ケイ素またはガラス製の固相を含む試験片に共有結合により付着させる方法を用いることも可能である。共有結合付着法は当業者に公知であり、特異的結合相手を試験片に不可逆的に連結する様々な手段を含む。試験片がケイ素またはガラスである場合は、特異的結合相手を付着させる前に表面を活性化しなければならない。トリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）及び（３−メルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）などの活性シラン化合物を用いてアミノ、ビニル及びチオールなどの反応基をそれぞれ導入し得る。このようにして活性化した表面は特異的結合相手を直接連結するのに用い得（アミノまたはチオールの場合）、あるいはまた活性化した表面をグルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ（スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）などの連結剤と更に反応させ、それによって該表面から結合相手を分離することが可能である。ビニル基は酸化して共有結合付着手段とし得る。ビニル基を、特異的結合相手のために多数の付着点を用意し得る、ポリアクリル酸など様々なポリマーの重合のための固定部（ａｎｃｈｏｒ）として用いることも可能である。アミノ面を様々な分子量の酸化デキストランと反応させれば、異なる寸法及び能力の親水性連結剤を得ることができる。酸化可能なデキストランの例には、（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪから入手可能な）Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−４０（分子量４０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）や（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから入手可能な）Ｆｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン）が含まれる。また、いずれも本出願と同じ出願人によって出願され、かつ本明細書に参考として含まれる係属中の１９８８年１月２９日付米国特許出願第１５０，２７８号及び１９８９年７月７日付米国特許出願第３７５，０２９号に開示された技術及び化学作用を用いることにより、特異的結合相手��試験片の表面に固定するのに高分子電解質の相互作用を用い得る。好ましい付着方法は共有結合を利用するものである。特異的結合要素を付着させた後、試験片表面を血清、タンパク質または他の結合阻止剤で更に処理することにより非特異的結合を最小限に留め得る。試験片表面を製造場所または使用地点で走査して、該表面がアッセイ目的に適していることを確認することも可能である。走査過程が試験片の特異的結合特性を変化させるとは考えられない。
Ｄ．精製方法
本発明によって製造したアッセイ試薬は、該アッセイ試薬を定型カラム内などに配置した固体支持物質に固定して試験試料と接触させることによって、抗体など特異的結合対の構成要素を単離及び精製するのに用い得る。特異的結合対の構成要素は固定したアッセイ試薬から、アッセイ試薬と特異的結合対の構成要素との相互結合作用を妨げる諸条件下に回収可能である。例えば、上記相互結合作用はｐＨ値の上昇もしくは下降によって、または尿素、グアニジニウム、塩酸、ドデシル硫酸ナトリウム等のタンパク質変性剤の使用によって妨げられ得る。
Ｅ．試験キット
本発明は、試験試料中に特異的結合対の構成要素の存在を検出するのに用いる試験キットも付加的に提供し、この試験キットは、本発明により製造した少なくとも１種のＳＤＨ発現異種ポリペプチドを収容した容器を含む。
異種ポリペプチドは融合または非融合タンパク質として製造し得る。本発明により開示した発現ベクターはＳＤＨ異種ポリペプチド融合体を高レベルで発現し得る。実施例７に、ＳＤＨ融合ポリペプチドとしてのスーパーオキシドジスムターゼの発現を説明する。
試験キットは、必要な試薬を、試薬同士の適合性が許せば組成物または混合物として保持する１個以上の容器の組み合わせとして市販包装形態で提供される。当然ながら、試験キットは緩衝液、稀釈剤、標準溶液等、当業者に公知であり、かつ販売上の、また使用者の立場から望ましい場合も有る他の物質を含み得ると理解されるべきである。
本発明を、以下の実施例によって非限定的に詳述する。
実施例
一般方法
制限エンドヌレアーゼ消化、ＤＮＡ連結及び他のＤＮＡ操作方法には、プラスミドＤＮＡ調製、ニックトランスレーションによるＤＮＡ標識、及びＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ.Ｙ.（１９８２）に記載のごときＥ.Ｃｏｌｉ形質転換といった標準方法を使用した。酵母の形質転換はＰｅｒｃｉｖａｌら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：３９１（１９８７）に従って行った。酵母操作に使用した一般方法はＳｈｅｒｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ.Ｙ.（１９８３）に記載されている。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ及び制限酵素は供給者（ＢＲＬ）指示に従って使用した。
試薬及び酵素
細菌及び酵母増殖用培地はＤｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎから購入した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａは、制限酵素、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの販売者である。Ｚｙｍｏｌａｓｅ ６０ＴはＭｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｌｋｈａｒｔ，Ｉｎｄｉａｎａから購入した。ニックトランスレーションキット及び他のニックトランスレーション用試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから得た。λｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーにおいて発現を検出する試薬はＢｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）はＢＲＬから購入した。
宿主細胞培養物、ＤＮＡ源、ベクター
Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＴＢ１はＪＭ８３の誘導体（ＢＲＬ）である。酵母株８０００−８Ｂ（寄託番号＊＊＊＊）はＤｒ．Ｅ.Ｔ.Ｙｏｕｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎによって提供された。Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ８０００−８Ｂ ＬＡＧ−（寄託番号＊＊＊＊）は、炭素源として２％ソルビトールを含むＹＮＢ最少プレート上での増殖を選択することにより、自然突然変異体として単離された。この突然変異体は、ソルビトール培地で増殖させたときに異常な遅滞期を示すことがない。突然変異体を更に特性分析するとａ／ａ二倍体であることが判った。
Ｅ.ｃｏｌｉベクターｐＵＣ１８はＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。λｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーはＤｒ．Ｍ.Ｓｎｙｄｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。酵母ベクターｐＭＷ５（寄託番号＊＊＊＊）及びｐＭＡＣ５６１とも称されるｐｙＣＤＥ１はＤｒ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｄ．Ｈａｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から得た。プラスミドｐＷＭ５１０（寄託番号＊＊＊＊）はＤｒ．Ｗｌｏｄｅｋ  Ｍａｎｄｅｃｋｉ（Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から得た。
実施例１
Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂにおけるソルビトールデヒドロゲナーゼ活性の単離
（Ｄｒ．Ｅ.Ｔ.Ｙｏｕｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから得た）Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、唯一の炭素源として２％ソルビトールまたはマンニトールのいずれかを含む１％酵母抽出物及び２％ペプトン（“ＹＥＰ”）培地中３０℃で飽和するまで増殖させた。遠心によって細胞をペレット化し、１ｍＬの水で洗浄し、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７.４，１ｍＭ ＰＭＳＦ及び２５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（以降は抽出緩衝液と記す）５００ｍＬ中に再懸濁させた。酸洗浄したガラスビーズを用いて懸濁液を撹拌することにより、顕微鏡で細胞破壊が見られるまで細胞を破壊した。次いで細胞抽出物のソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：２１４−２１６（１９８０）に記載のごとくアッセイし、Ｆｏｗｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ.，５０：６３５−６４５（１９７２）に記載のごとく、但しエタノールに代えて０.２ｍｌの２０％ソルビトールを使用し、酵素活性に対して染色した。非変性ゲル上で電気泳動すると、ソルビトールを含む培地中で増殖させたＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂの抽出物のみが、青色に染色されたソルビトールデヒドロゲナーゼ活性バンドを生成した。マンニトール増殖培養物由来の抽出物を含む同様のゲルでは、染色されたバンドは見られなかった。ソルビトールデヒドロゲナーゼのおおよその分子量を決定するため、活性染色バンドに含まれるポリペプチドを非変性ゲルから抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて再度電気泳動した。ソルビトール誘導細胞中にのみ、見掛けの分子量が４０,０００ダルトンの唯一のバンドが存在した。
実施例２
ソルビトールデヒドロゲナーゼに対する抗体の生産
ステップ１：抗体生産用抗原の調製
Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、２％ソルビトールを含むＹＥＰ培地２５０ｍｌ中３０℃で飽和するまで増殖させた。Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して細胞ペレットを（上記実施例１に記載の）抽出緩衝液４０ｍＬ中に再懸濁させ、製造業者推奨に従って細胞を破壊することにより、大量の抽出物を製造した。抽出物を、０.０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ  ｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，５％β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（以降は「試料緩衝液」と記す）と混合し、３分間煮沸し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に４０ｍｌ／レーンの量で添加した。ゲルを、２５％イソプロパノール，１０％酢酸，０.５％クマーシーブルー中で５分間染色し、５％メタノール及び７％酢酸中で２０分間脱色した。分子量約４０,０００ダルトンのタンパク質を含むゲル部分を使用してウサギを免疫した。Ｗｈｉｔｅら，Ｃｅｌｌ，３９：１６３−１７１（１９８４）に記載の方法に従って抗血清を調製した。ウサギを約５０μｇのタンパク質で免疫し、次いで５０μｇ／ウサギの用量で追加免疫した。前回の追加免疫後１４日間おきに次の５０μｇの追加免疫を行った。
ステップ２：抗体の単離及び特性分析
ウェスターンブロット分析を使用してウサギの免疫応答をモニターした。Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、２％グルコース、マンニトールまたはソルビトールのいずれかを含むＹＥＰ培地中で増殖させた。実施例１にごとく細胞抽出物を調製し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び非変性ゲルにおいて電気泳動した。ゲルをニトロセルロース上に電気ブロットし、“ＴＢＳ”（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.１）中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミルクを用いてブロックし、最初の追加免疫後に得たウサギ抗血清の１：１００,０００希釈物と一緒にインキュベートした。フィルターを、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで２回洗浄し、次いでＴＢＳで２回洗浄した。次いでフィルターをＢｉｏＲａｄヤギ抗ウサギＨＲＰ結合第２抗体と一緒にインキュベートし、洗浄し、製造業者推奨に従って染色した（ＢｉｏＲａｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｂｌｏｔキット）。ＢＲＬ前染色高分子量タンパク質マーカーによって判定したところ、分子量約４０,０００ダルトンの免疫反応性バンドは、ソルビトール増殖細胞の抽出物を含むレーンにのみ現れた。免疫反応性バンドは、ゲル上のソルビトールデヒドロゲナーゼ活性に対応する位置に認められた。
実施例３
Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離
ステップ１：Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンｌＳ３０及びｌＳ３２の単離
Ｄｒ．Ｍ.Ｓｎｙｄｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得たｌｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーから、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離した。Ｓｙｎｄｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ.，１５４：１０７０１２８（１９８４）に記載の抗体プローブ法を使用し、クローンｌＳ３０及びｌＳ３２を単離した。（Ｄｒ．Ｍ.Ｓｎｙｄｅｒから得た）Ｅ.ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０を、５０ｍｇ／ｍＬアンピシリン及び０.２％マルトースを含むルリアブロス中３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心によって回収し、ペレットを０.４倍容の１０ｍＭ ＭｇＳＯ4中に再懸濁させた。１０5個のファージ粒子を含むｌｇｔ１１ライブラリーのアリコートを２００ｍＬの調製Ｙ１０９０細胞と混合した。混合物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、ファージを吸収させた。ＬＢトップアガロース（６.５ｍＬ）を各試料に加え、５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上に塗り広げた。ファージプラークがかろうじて見えるようになるまで（約３〜４時間）プレートを４２℃でインキュベートした。プレートに、１０ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＢＲＬ）中に予め浸漬したニトロセルロースディスクを重層し、３７℃で一晩インキュベートした。次いでフィルターをプレートから注意して持ち上げ、０.０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール及び５％Ｂ−ＭＥの溶液を含むペトリ皿中に浮遊させた。２分間インキュベートした後、フィルターをＴＢＳで３回洗浄した。次いでフィルターをブロッキング溶液（ＴＢＳ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミルク）と一緒に室温で１時間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、フィルターを、ブロッキング溶液で１：１００に希釈したウサギ抗血清溶液と４℃で一晩反応させた。次いでフィルターを洗浄し、ＢｉｏＲａｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｂｌｏｔ Ｋｉｔに記載のごとくアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体と一緒にインキュベートした。製造業者推奨に従って洗浄及び染色を実施した。陽性プラークを青色プラークとして可視化すると、スクリーニングした６×１０5個のファージから合計８つの陽性プラークが得られた。（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ.Ｙ.（１９８２）に記載のごとく）プラークを４回精製した後、５つのλクローンλＳ３０、λＳ３１、λＳ３２、λＳ３５及びλＳ３６の特性を更に分析した。
ステップ２：ｐＳ３０及びｐＳ３２の構築
上述のごとく単離した５つのλクローン由来の挿入物をプラスミドベクターｐＵＣ１８中にサブクローニングした。Ｈｅｌｍｓら，ＤＮＡ ４（１）：３９−４９（１９８５）に記載の方法に従い、クローンλＳ３０、λＳ３１、λＳ３２、λＳ３５及びλＳ３６からファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１８（ＢＲＬ）に連結し、Ｅ.ｃｏｌｉ株ＴＢ１中に形質転換した。形質転換混合物のアリコートを、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載の標準方法を使用してアンピシリン及びＸ−Ｇａｌ（ＢＲＬ）を含むＬＢプレート上で平板培養した。幾つかの白色コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ消化によって分析した。λｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーは共通酵母ゲノムＤＮＡから構築されていたので、一部のλクローン中のＥｃｏＲＩ挿入物は内部ＥｃｏＲＩ制限部位を有していた。従って５つのλクローン由来のＥｃｏＥＩ挿入物のサブクローニングから８つのｐＵＣ１８サブクローンが得られた。ＥｃｏＲＩフラグメントのサイズは０.５〜４.５キロベースであった。
これらのサブクローンの関連を示すため、ｐＳ３０の４.５ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物を使用し、サザンハイブリダイゼーションによって８つのサブクローンをプローブした。ｐＳ３０及びｐＳ３２がｐＳ３０挿入物にハイブリダイズし、これら２つのクローンが相互に関連があることが判った。クローンｐＳ３０及びｐＳ３２を次なる分析に選択し、交換可能であると見なした。ｐＳ３０及びｐＳ３２中のＥｃｏＲＩ挿入物はそれぞれ４.５ｋｂ及び３.０ｋｂであった。
ステップ３：ｐＳ３０においてコードされるソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の同定
炭素源として２％グルコース、ソルビトールまたはマンニトールのいずれかを含むＹＥＰ培地中で株８０００−８Ｂを対数増殖期まで増殖させた。Ｄｅｎｉｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.，６（１１）：４０２６−４０３０（１９８６）に記載の方法に従って細胞ペレットから全ＲＮＡを調製した。細胞ペレットをＲＮＡ抽出緩衝液（０.１Ｍ ＮａＣｌ，０.１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１％ＳＤＳ）中でガラスビーズを用いて破壊した。フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの混合物を用いてポリペプチドを抽出してから、ＲＮＡを水性懸濁液から沈殿させた。３種の異なる培養物由来の全ＲＮＡ １０μｇを、Ｍａｎｉａｔｉｓらに記載のごとく１.５％アガロースホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ＲＮＡを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ指示マニュアルに記載のごとくＨｙｂｏｎｄ−Ｎ紙上にブロットし、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎ Ｋｉｔを使用し、プラスミドｐＳ３０及びｐＰＹＫを用いてニックトランスレーションによって放射性プローブを作製した。Ｄ.Ｏｌｓｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）から得たプラスミドｐＰＹＫは、高基底レベルで構成的に発現される酵母解糖性タンパク質ピルビン酸キナーゼのコーディング配列を含む。従ってプラスミドｐＰＹＫは、種々の糖質と一緒に増殖させた培養物中に作製された特異的ｍＲＮＡ転写物（〜１.７ｋｂ）にハイブリダイズするはずである。ｐＰＹＫプローブが３種全ての培養物において発現された特異的〜１.７ｋｂメッセージにハイブリダイズしたノーザンブロットハイブリダイゼーション実験の結果から、ＲＮＡ調製は完全であると推定された。ＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）（ＢＲＬ）を使用してｍＲＮＡ転写物のサイズを決定した。
ステップ４：酵母由来のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の配列決定
クローンｐＳ３０及びｐＳ３２を使用してソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の完全ＤＮＡ配列を生成した。まず一部重複ゲノムクローン（ｐＳ３０及びｐＳ３２）の特異的フラグメントの５′末端を標識し、それらをＭａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ化学分解することにより、配列データを得た。このデータから、ゲノムクローンｐＳ３２由来の３つのＨｉｎｄIIIフラグメントのクローニングを可能にするより詳細な制限マップ情報を得た。約０.５、０.７及び１.５ｋｂのフラグメントをｍｐ１１（Ｍ１３クローニング／配列ベクター）中にサブクローニングした。チェーンターミネーター法を使用して各サブクローン化フラグメントの完全配列データを得た。「遺伝子ウォーキング（ｇｅｎｅ Ｗａｌｋｉｎｇ）」用の慣用ＤＮＡプライマーを使用し、サブクローン化フラグメント全体の配列を逆方向で決定した。ＤＮＡ配列決定反応産物を８Ｍ尿素及び６％または４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準オートラジオグラフィーフィルムを使用して画像化した。該遺伝子の配列を図１に示す。ＤＮＡ配列の分析から、３５７アミノ酸ポリペプチドをコードする読み枠（ＯＲＦ）が明らかとなった。酵母酵素の推定アミノ酸配列を公知のヒツジ肝酵素配列と比較すると、２つのポリペプチド間において全体で６０.８４％のアミノ酸相同が明らかとなった。更に、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドの推定アミノ酸配列では、ヒツジ肝ＳＤＨの２２残基のうち１９が厳正に保存されていた。
実施例４
酵母発現ベクターｐｘＳ２、ｐｘＳ３、ｐｘＳ４及びｐｘＳ４リンカーの構築
（Ｄｒ．Ｂ.Ｄ.Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから得た）酵母プラスミドｐＭＷ５へのＳＤＨ遺伝子のプロモーター／ターミネーター及び調節配列の組込みを以下に記述する。
プラスミドｐＷＭ５１０をまずＴａｑＩで消化し、次いでクレノウポリメラーゼで処理し、ブラント末端を有するＤＮＡを生成した。再連結したプラスミドをＥ.ｃｏｌｉ ＴＢ１中に形質転換し、失活化ＴａｑＩ部位を有するｐＷＭ５１０の存在についてクローンを分析した。プラスミド上に唯一のＰｓｔＩ部位を与えるべく、構築物（ｐＷＭ５１０ΔＴａｑ）を含む形質転換体由来のＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理し、次いでクローンポリメラーゼで処理し、ＰｓｔＩリンカー（ＢＲＬ）をブラント末端化ＤＮＡに連結した。
ＳＤＨ遺伝子の５′プロモーター及びコーディング配列の０.５ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント含有部分をｐＳ３２から切り出し、実施例３のごとく調製し、ｐＷＭ５１０ΔＴａｑＩ ＰｓｔリンカーのＰｓｔＩ部位に連結し、プラスミドｐＡＳ１を形成した。
ＴａｑＩ／ＳｓｐＩを用いて別々に分析し、ＰｓｔＩフラグメントを適正な向きで含むクローンを同定した。１４３ｂｐ ＴａｑＩ／ＰｓｔＩフラグメントを合成アダプターＤＮＡで置き換えるため、ｐＡＳ１をＴａｑＩ及びＳｓｐＩで消化した。唯一のＳｓｐＩ部位はｐＷＭ５１０ＤＮＡ配列上のＰｓｔＩ部位の下流に存在した。アダプターＤＮＡは、５′ジメトキシトリチルヌクレオシドβ−シアノエチルホスホルアミダイトを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ａによって合成した４つの別個のオリゴヌクレオチドから組立てた。４つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＡＳＩのＴａｑＩ／ＳｓｐＩ部位に連結した。アダプターＤＮＡの配列を以下に示す。
0003696236.tif 000002
唯一のクローニング部位ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩのほかに、アダプターＤＮＡの３′末端には唯一のＮｒｕＩ部位が含まれていた。連結ＤＮＡを含む形質転換体を、ＮｒｕＩ及びＰｓｔＩを用いてミニプレップＤＮＡを分析することによりアダプター分子の存在について分析した。プラスミドｐＡＳ２はアダプターＤＮＡを有するとして同定された。
別の実験で、ＳＤＨ遺伝子を含む３ｋｂ ＥｃｏＲＩ酵母ＤＮＡフラグメントをｐＳ３２から切り取り、ｐＷＭ５１０ΔＴａｑのＥｃｏＲＩ部位に連結した。唯一のクローニング部位を備えたアダプターＤＮＡを含むＰｓｔＩ／ＮｒｕＩフラグメントをｐＡＳ２から得、ｐＷＭ５１０ΔＴａｑＳ３２のＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ部位に挿入した。この操作は、ＮｃｏＩ部位をクレノウポリメラーゼで処理したから行った。１.５、２ｋｂフラグメントを遊離したミニプレップＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限分析から、アダプターＤＮＡを備えたプラスミドｐＡＳ３を含む形質転換体が同定された。ＳＤＨ遺伝子由来のプロモーター、ターミネーター及び調節配列を備えたＳＤＨ発現カセットを含むＥｃｏＲＩフラグメントを酵母プラスミドｐＭＷ５のＥｃｏＲＩ部位に移入した。ｐＭＷ５は予め操作して唯一のＢａｍＨＩ部位を除去しておいた。幾つかの単離体由来のＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限分析することにより、ＳＤＨカセットを含む形質転換体を同定した。プラスミドｐＸＳ２及びｐＸＳ３は適正な２ｋｂ挿入物を有した。プラスミドｐＸＳ２は、ＸｈｏＩで消化することにより判定すると、２つのＳＤＨ発現カセットを含むことが更に判った。唯一のＳａｌＩ部位を含む酵母発現プラスミドを構築するため、ｐＸＳ３用のＥｃｏＲＩフラグメントを切り取り、酵母プラスミドｐＭＷ５ΔＢａｍΔＳａｌ（ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位を失活化すべく再操作したｐＭＷ５）に連結した。幾つかの形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析することにより、唯一のＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ部位を備えたプラスミドｐｘＳ４を含むクローンを同定した。
ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端アミノ酸のプロモーター／ターミネーター及びコーディング配列を含むＳＤＨ発現カセットを含むｐＸＳ４リンカーの構築を図２に示す。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ３４０Ａ合成装置によって２つのオリゴヌクレオチドを前述のごとく合成した。２つのオリゴヌクレオチドは、アニーリングし、ｐｘＳ４のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ部位に連結すると、ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１アミノ酸のコーディング配列を含むＳＤＨ発現カセットとなるはずである。この構築物においてはイニシエーターＡＴＧコドンにあるＮｃｏＩ部位も破壊されていた。アダプターＤＮＡは唯一のＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩクローニング部位を与える。アダプターＤＮＡ配列を以下に示す。
0003696236.tif 000003
プラスミドＤＮＡ ｐｘＳ４をＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化し、数倍過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレオチドに連結し、Ｅ.ｃｏｌｉ ＴＢ１中に形質転換した。アンピシリンを５０ｍｇ／リットルの濃度で含むＬＢプレート上で形質転換体を単離した。幾つかの形質転換体由来のＤＮＡを精製し、ＮｃｏＩで制限した。ＮｃｏＩ部位を持たないプラスミドを含む単離物からプラスミドＤＮＡを抽出した。ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩそれぞれの消化物により、単離物はアダプターＤＮＡを含むことが確認された。このプラスミドをｐｘＳ４リンカーと命名した。
実施例５
発現ベクターｐｘＳ３を使用した酵母中での肝炎デルタ抗原の発現
ステップ１：ｐｘＳ３Δの構築
肝炎デルタ抗原をコードするＤＮＡを、（Ｄｒ．Ｊ.Ｔａｙｌｏｒ，Ｆｏｘ，Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａから得た）ｐＧＢ４−Ｖ５から得た。デルタ抗原配列の大部分を含む６００塩基対のＳｓｔII／ＳａｌＩフラグメントをまずｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｓｔII／ＳａｌＩ部位にサブクローニングした（図３）。ＳｓｔII及びＳａｌＩを用いてプラスミドＤＮＡを制限分析することにより、６００塩基対フラグメントを含む形質転換体を同定した。クローンｐＢＳΔは、適正な挿入物を有するとして同定された。
デルタ抗原遺伝子のＳｓｔII／ＳａｌＩフラグメントにはないＮ末端の９つのアミノ酸残基をコードする合成アダプターＤＮＡをｐＢＳΔのＳｓｔＩ／ＳｓｔII部位に連結した。アダプターＤＮＡの配列を以下に示す。
0003696236.tif 000004
ＮｃｏＩを用いて制限分析することによりプラスミドｐＢＳΔを含むクローンを同定し、次いでＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントをｐｘＳ３のＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位に挿入した。まず、このフラグメントのＳａｌＩ末端をクレノウポリメラーゼを用いてブラント末端化した。ＥｃｏＲＩを用いてプラスミドＤＮＡを制限分析し、デルタ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含むクローンを同定した。デルタ抗原遺伝子中の診断ＥｃｏＲＩ部位を使用し、ｐｘＳ３Δのアイデンティティを確認した。
ステップ２：ｐｘＳ３Δ（またはｐｘＳ３デルタ）由来の肝炎デルタ抗原を発現するＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂ ＬＡＧのウェスターンブロット分析
上述のごときＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂ ＬＡＧを、Ｐｅｒｃｉｖａｌら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：３９１（１９８７）に記載のごとくコンピテントにし、ｐｘＳ３Δを用いて形質転換し、ＹＮＢ最少ＴＲＰプレート上で形質転換体を単離及び精製した。個々の形質転換体を選択下のＹＮＢ最少培地中で増殖させた。炭素源及びＳＤＨプロモーター誘導物質（inducer）を与えるべく、２％ソルビトールを添加した。細胞を３０℃で４８時間増殖させた。細胞ペレットを蒸留水中で洗浄し、溶解用緩衝液（０.０５Ｍ ＰＫＯ4,ｐＨ７.４，１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁させた。ガラスビーズを用いて細胞を９０秒間破壊することにより細胞溶解物を調製した。肝炎デルタ抗原の発現をウェスターンブロット分析によって判定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した抽出物のウェスターンブロット分析による肝炎デルタ抗原発現の検出を図４に示す。肝炎デルタ抗原を発現する形質転換体の抽出物を含むレーン２と３のみで、強力な免疫反応性バンドが明示された。このデータは結果的に、プラスミドｐｘＳ３から肝炎データ抗原が産生されたことを示している。
実施例６
８０００−８Ｂ ＬＡＧにおいてヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドを発現するためのｐｘＳ２の使用
ステップ１：ｐｘＳ２−ＳＯＤの構築
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするＤＮＡ源は（Ｊ.Ｏｓｔｂｅｒｇ，Ｍ.Ｋｌａｓｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから得た）ｐＳＯＤであった。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３４０合成装置を使用して７つの別個のオリゴヌクレオチドを合成し、それらをＭａｎｄｅｃｋｉら，Ｇｅｎｅ，９４：１０３（１９９０）によって記載されているＦｏｋ １法を使用してＳＯＤ遺伝子中に組込んだ。制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩを使用してｐＳＯＤからヒトＳＯＤ遺伝子を含む０.５ｋｂフラグメントを切り出した。クレノウポリメラーゼを使用し、ＢａｍＨＩによって生成された付着末端をブラント末端化した。フラグメントをｐｘＳ２のＮｃｏＩ及びＳｍａＩ部位に連結し、連結反応物をＥ.ｃｏｌｉ株ＴＢ１中に形質転換した。幾つかの異なる形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡを制限分析することによりＳＯＤ遺伝子を含む形質転換体を同定した。続いてＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶを用いて分析し、ＳＯＤ遺伝子挿入物を適正な向きで含むプラスミドを同定した。プラスミドｐｘＳ２−ＳＯＤがＳＯＤ遺伝子を含むとして同定された（図５）。
ステップ２：ｐｘＳ２−ＳＯＤを用いて形質転換した８０００−８Ｂ ＬＡＧにおけるヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
前述のごとく調製したＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂ ＬＡＧ中にプラスミドｐｘＳ４及びｐｘＳ２−ＳＯＤを形質転換した。トリプトファンを含まない培地中で形質転換体を単離した。ｐｘＳ４、ｐｘＳ２−ＳＯＤの個々の単離物を、２％ソルビトール，０.５％グルコース，２５ｍＭ ＣｕＳＯ4，２５ｍＭ ＺｎＳＯ4を含むＹＮＢ液体培地１０ｍｌ中に接種した。飽和培養物の２００μＬアリコートを、２％ソルビトール，０.３％グルコース，２５ｍＭ ＣｕＳＯ4，２５ｍＭ ＺｎＳＯ4を含むＹＮＢ液体培地２５ｍｌ中に接種し、３０℃でインキュベートした。かかる培養物１０ｍＬから得た細胞溶解物を前述のごとく更に処理した。未融合のスーパーオキシドジスムターゼのＳＤＳ分析を図６に示す。この結果から、優勢なポリペプチドバンドは２０キロダルトンポリペプチドとして移動したものであることが判る。ゲルのデンシトメーター分析からは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドの発現は全可溶性酵母ポリペプチドの６％を占めていたことが判った。
実施例７
酵母発現ベクターｐＸＳ４リンカー由来のヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ポリペプチドの発現
ステップ１：ｐＸＳ４リンカーＳＯＤの構築
化学的に合成されたスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子はＪ.Ｏｓｔｂｅｒｇ及びＭ.Ｋｌａｓｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって与えられた。クローンｐＳ３０は、酵母ＳＤＨ遺伝子全体をコードする〜４.５ｋｂの酵母ゲノムフラグメントを含む。ＳＤＨ遺伝子の約２／３を含むｐＳ３０由来のＮｃｏＩフラグメントを、化学合成ヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＯＤの唯一のＮｃｏＩ部位に挿入した。ＰｓｔＩによる制限分析を使用し、スーパーオキシドジスムターゼポリペプチドとヒトＳＯＤの融合体をコードするクローン＃６８を同定した。このプラスミドを、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のＤＮＡ源として使用した。
クローン＃６８由来の０.５ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、クレノウポリメラーゼで処理して付着末端を充填した。このフラグメントを、ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩ部位をクレノウポリメラーゼで予めブラント末端化しておいてｐＸＳ４リンカーに連結した。幾つかの候補クローン由来のＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いた制限分析によってＳＯＤ遺伝子の存在を検査した。クローンｐＸＳ４リンカーＳＯＤはＳＯＤ遺伝子を適正な向きで含んでいた。
ステップ２：ｐＸＳ４リンカーＳＯＤを用いて形質転換した酵母株８０００−８Ｂ ＬＡＧにおけるヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドの発現の分析
Ｐｅｒｃｉｖａｌら，前出の形質転換方法を使用し、ｐＸＳ４リンカー及びｐＸＳ４リンカーＳＯＤを８０００−８Ｂ ＬＡＧ中に導入した。プラスミドを選択するトリプトファン選択下で形質転換体を単離した。個々の形質転換体を、トリプトファンを含まないＹＮＢ最少培地において精製した。
２種の異なるプラスミドを含む形質転換体を、２％ソルビトール及び各々２５ｍＭのＣｕＳＯ4及びＺｎＳＯ4を含むＹＮＢ液体培地１０ｍＬ中でトリプトファン選択下で増殖させた。細胞を３０℃で４８時間インキュベートした。細胞ペレットを３ｍＬの蒸留水で洗浄し、０.５ｍＬ抽出緩衝液（０.０５Ｍ ＫＰＯ4 ｐＨ７.４，２ｍＭ β−メルカプト−エタノール，１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、ガラスビーズと共に２分間撹拌した。等容積の抽出物を溶解用緩衝液と混合し、３分間煮沸し、抽出物のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した。データを図７に示す。このデータから、優勢なポリペプチドバンドは分子量２０キロダルトンに移動したものであることが判る。ゲル走査から、ヒトＳＯＤポリペプチドを酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドとの融合体として発現する８０００−８Ｂ  ＬＡＧにおいて１５％程度の発現レベルが得られたことが判った。
本発明の実施態様は他のタイプの異種ポリペプチドにも適用可能であり、限定的なものではなく、実施例であることは当業者には理解されよう。従って本明細書は、本発明を記載の特定の実施態様に制限するものではなく、上述の及び請求の範囲に記載の本発明の主題及び思想内にある全ての均等物を含むものとする。
配列表
配列番号１：
配列の長さ：2774
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
ハイポセティカル：NO
アンチセンス：NO
起源：
生物名：SACCHAROMYCES CEREVISIAE
株名：800B
配列の特徴：
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：788..1856
配列：
0003696236.tif 000005
0003696236.tif 000006
0003696236.tif 000007
配列番号２：
配列の長さ：356
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003696236.tif 000008
0003696236.tif 000009
配列番号３：
配列の長さ：162
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列：
0003696236.tif 000010
配列番号４：
配列の長さ：45
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
ヒポセティカル：YES
起源：
生物名：SACCHAROMYCES CEREVISIAE
配列：
0003696236.tif 000011
【図１】
0003696236.tif 000015
0003696236.tif 000016
0003696236.tif 000017
【図２】
0003696236.tif 000018
0003696236.tif 000019
0003696236.tif 000020
【図３】
0003696236.tif 000021
0003696236.tif 000022
【図４】
0003696236.tif 000023
【図５】
0003696236.tif 000024
0003696236.tif 000025
【図６】
0003696236.tif 000026
【図７】
0003696236.tif 000027