(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞の増殖を誘導する分離されたポリペプチドであって、上記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列もしくはその相補形と６０℃にて１−３時間、０．１−１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖＳＤＳの高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、分離されたポリペプチド。
【請求項２】
血管内皮細胞の増殖を誘導する分離されたポリペプチドであって、上記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、分離されたポリペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列もしくはその相補形と６０℃にて１−３時間、０．１−１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖＳＤＳの高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の分離されたポリペプチド。
【請求項４】
上記ポリペプチドが大グリア細胞増殖を誘導する能力を有する、請求項１−３のいずれか１項記載の分離されたポリペプチド。
【請求項５】
上記ポリペプチドがヒト由来のものである、請求項１−４記載のいずれか１項記載の分離されたポリペプチド。
【請求項６】
血管内皮細胞の増殖を誘導する能力を示す分離されたポリペプチドであって、上記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列、またはそれらの部分、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列もしくはその相補形と６０℃にて１−３時間、０．１−１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖＳＤＳの高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む、分離されたポリペプチド。
【請求項７】
血管内皮細胞の増殖を誘導する能力を示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列の一部に対応する分離されたポリペプチドフラグメント。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列もしくはその相補形と６０℃にて１−３時間、０．１−１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖＳＤＳの高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、上記ヌクレオチド配列から血管内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドが発現される、分離された核酸分子。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項８記載の分離された核酸分子。
【請求項１０】
血管内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドをコードする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列を含む、分離された核酸分子。
【請求項１１】
上記ポリペプチドが大グリア細胞増殖を誘導する能力を有する、請求項９または１０記載の分離された核酸分子。
【請求項１２】
上記核酸分子がヒト由来のものである、請求項８−１１のいずれか１項記載の分離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって、上記ポリペプチドをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されたヌクレオチド配列もしくはその相補形と６０℃にて１−３時間、０．１−１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖＳＤＳの高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を、上記ポリペプチドの合成に効果的な条件下で適当な宿主細胞によって発現させ、上記ポリペプチドを分離することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、および１またはそれ以上の医薬的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳動物（人を除く）における大グリア細胞増殖の誘導方法であって、上記方法が、上記哺乳動物に、請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するのに適切な期間および条件下で行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
哺乳動物（人を除く）におけるニューロンの生存および／または増殖を促進する方法であって、上記方法が、上記哺乳動物に、請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するのに適切な期間および条件下で行われることを特徴とする方法。
【請求項１７】
有効成分として、請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を含む、哺乳動物における大グリア細胞を増殖するための医薬組成物。
【請求項１８】
有効成分として、請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を含む、哺乳動物におけるニューロンの生存および／または増殖を促進するための医薬組成物。
【請求項１９】
請求項８−１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項８−１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２１】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項８−１２のいずれか１項に記載の核酸分子でコードされたポリペプチドに対する分離された中和抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に血管内皮成長因子様特性を有する単離分子およびそれをコードする遺伝子配列に関する。この分子は脈管構造および／または血管の透過性の増大または低減を要する症状の、ある領域の処置、予防および診断に有用である。本発明の分子はまた主要かつ中枢ニューロンの有用なエフェクターであり、大グリア細胞の増殖を誘導し得る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
血管内皮成長因子（vascular endothorial growth factor、以下「ＶＥＧＦ」という）は、血管作動性透過因子ともいうが、内皮組織を特異的に活性化するホモ２量体グリコプロテインと共有結合して分泌される（Sengerら、１９９３年）。ある領域の機能はＶＥＧＦに起因するものであり、そのかかわりあいは黄体の形成(Yanら、１９９３年)および胎盤発達(Sharkeyら、１９９４年)を含む正常な脈管形成、血管透過性の制御(Sengerら、１９９３年)、炎症性の脈管形成（Sunderkotterら、１９９４年）および自家移植（Dissenら、１９９４年）、腫瘍助長脈管形成（Folkman ＆ Shing、１９９２年）、リューマチ性関節炎(Kochら、１９９４年)および糖尿病性網膜症（Folkman & Shing）などのヒトの疾患である。
【０００３】
従って、ＶＥＧＦはＶＥＧＦまたはその作用に基づく治療、予防および診断の研究の有力な価値ある標的となる重要な分子である。また、ＶＥＧＦの代わりとしてまたはＶＥＧＦと関連させて使用する同族体または他の関連分子を確認する必要性が存在する。
【０００４】
この発明の糸口となる研究において、発明者らは多数の内分泌新形成タイプＩ感受性遺伝子（multiple endocrine neoplasia type I：ＭＥＮ１）を追及していた。驚くべきことに、発明者らはＭＥＮ１遺伝子の候補としては除外していた遺伝子配列が、それにもかかわらずＶＥＧＦとある類似性を有する新規な成長因子であることを発見した。さらに、本発明の成長因子は主要かつ中枢ニューロンのエフェクター分子である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の１つの態様は、アミノ酸配列：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％類似しており；
（ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも５％非類似である
を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を含む。
【０００６】
本発明の他の態様は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約１５％類似しているが、少なくとも５％非類似であり；
（ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示す
を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を提供する。
【０００７】
本発明の関連した態様は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を有し；
（ii）下記の特性：
(a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力
(b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力
(c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度
の増大を誘導する能力
を示す；を含む生物学的に分離されたタンパク様分子を含む。
【０００８】
「生物学的に分離された」とは、分子が生物学的資源から少なくとも１工程の精製が行われたことをいう。好ましくは、また、組成物中の他の化合物に対して組成物が、重量で測定された分子の少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは約６５％、なお好ましくは少なくとも約８０−９０％またはそれ以上の活性または他の有用な手段を含むという生物学的に純粋な意味であることをいう。最も好ましくは分子が配列的に純粋であることをいう。
【０００９】
本明細書中で著者により引用された刊行物の書誌学的詳細については明細書の末尾にすべて記載した。本明細書中のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は書誌学的記載のつぎに定義した。
【００１０】
この明細書を通して、特に断らない限り、「含む（comprise、comprisesまたはcomprising）」とは当該要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の包含をいい、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の排除をいうものではないと理解されるべきである。
【００１１】
本発明の他の好ましい態様は組換え体の分子を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のこの態様によれば、
アミノ酸配列：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％類似しており；
（ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも５％非類似である
を含む組換え分子を提供する。
【００１３】
本発明の関連する態様は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を有し；
（ii）少なくとも１つＶＥＧＦと共通の性質を示す
を有する組換え分子である。
【００１４】
本発明のさらに関連する態様は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性を有し；
（ii）少なくとも１つの下記の特性：
(a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力
(b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力
(c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度
の増大を誘導する能力
を示す；を有する組換え分子を含む。
【００１５】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に少なくとも約１５％のアミノ酸類似性を有するが、少なくとも約５％非類似性であるタンパク質性分子をコードしているゲノムまたは部分的ゲノムクローンを含む。
【００１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列はヒトＶＥＧＦに対応する(以下、「ＶＥＧＦ１６５」という)。従って、本発明の分子はＶＥＧＦ様であるか、またはＶＥＧＦの同族体であるが、ＶＥＧＦのアミノ酸配列に類似しているが、同一ではないアミノ酸配列を含む。本発明はヒトＶＥＧＦ様分子を用いて例示することができるが、これは本発明が、同族体分子であり、家畜類（例えば、羊、豚、馬および牛）、愛玩動物（例えば、犬および猫）および実験動物（例えば、マウス、ラツト、家兎およびモルモット）などの哺乳動物ならびに鳥類（例えば、家きん類）などの非哺乳動物、魚および爬虫類などの非哺乳動物からのコード配列を含むものとして理解されねばならない。最も好ましい具体例では、ＶＥＧＦ様分子は、ヒト由来のものであり、染色体１１ｑ１３に位置する遺伝子によってコードされている。本発明は従って、当該ＶＥＧＦ様分子をコードするゲノム配列またはその部分に及ぶ。
【００１７】
好ましくは、類似性のパーセントが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分の少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、よりさらに好ましくは少なくとも約６０−７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０−９５％である。
【００１８】
特に好ましい具体例において、本発明のＶＥＧＦ様分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれらの部分、フラグメント、誘導体または類似体である。特に好ましい類似性は約１９−２０％および２９−３０％である。ここに引用された誘導体もまたスプライス変異体を含む。従って、本発明はＳＯＭ１７５のスプライス変異体に及ぶ。本発明に含まれるスプライス変異体の例としてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０の少なくとも１つに実質的に記載されたアミノ酸配列を有する変異体、またはそれらの突然変異体もしくは誘導体、またはそれらのさらなるスプライス変異体を含むがこれに限られない。
【００１９】
他の具体例は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その全部または部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約５％非類似である）を有し；
（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す；
を有する組換分子を提供する。
【００２０】
他の具体例は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約５％非類似である）を有し；
（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す；
を有する組換分子を提供する。
【００２１】
他の具体例は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約５％非類似である）を有し；
（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す；
を有する組換分子を提供する。
【００２２】
他の具体例は、下記の特徴：
（i）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０に実質的に記載されたアミノ酸配列または、その全部またはその部分に少なくとも約１５％の類似性（ただし、上記アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載のアミノ酸配列の全部または部分に少なくとも約５％非類似である）を有し；
（ii）少なくとも１つのＶＥＧＦと共通の生物学的性質を示す；
を有する組換分子を提供する。
【００２３】
上記のＶＥＧＦの性質は、
(a)血管内皮細胞の増殖を誘導する能力；
(b)受容体のflt-1／flk-1族と相互作用する能力；
(c)細胞移動、細胞生存および／またはアルカリホスファターゼの細胞内濃度
の増大を誘導する能力；
の少なくとも１つを含む。
【００２４】
本発明によれば、類似性は好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％およびさらに好ましくは少なくとも約６５％の類似性である。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４に記載のアミノ酸配列の一部または、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０に記載のアミノ酸配列などのそのスプライス変異体またはそれらの化学的均等物を含む。本発明の生物学的に分離されたまたは組換分子は天然にグリコシル化されたものであってもよく、またはそれが分離されまたは合成された細胞により変化する変異グリコシル化形態を含んでいてもよい。例えば、もし、原核細胞中に組換手段によつて産生されたならば、分子は非グリコシル化のものである。分子は全長であってもよく、または一部を切り取ったかまたは誘導された形態であってもよい。
【００２６】
さらに本発明の他の態様はここに記載のＶＥＧＦ様分子をコードする核酸分子を含む。さらに具体的には、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に実質的に記載されたヌクレオチドの配列、またはその全部または分子に少なくとも１５％の類似性を有するヌクレオチド配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載の逆相補性のヌクレオチド配列に低いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（ただし、核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載のヌクレオチド配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが、３０％の非類似性を有する）を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載のヌクレオチドはまた「ＳＯＭ１７５」ともいう。好ましくは、非類似の％は約３５％、より好ましくは約３９％およびさらに好ましくは約４０−５０％である。
【００２７】
ストリンジェントの程度を定義する目的で、簡略化のために、Sambrook et al (1989)の９.４７−９.５１頁を引用することができ、ここに引用して明細書の記載とし、そこに記載の洗浄工程を高いストリンジェントな条件とみなす。低いストリンジェントな条件とは、この明細書では、４−６Ｘ ＳＳＣ／０.１−０.５％ w/v ＳＤＳ、３７−４５℃にて２−３時間と定義される。ハイブリダイズにおける核酸の資源および濃度により異なるが、≧４５℃にて１−４Ｘ ＳＳＣ／０.２５−０.５％ w/v ＳＤＳ、２−３時間のこの明細書でみなされる中程度のストリンジェントな条件、または６０℃にて０.１−１Ｘ ＳＳＣ／０.１％ w/v ＳＤＳ、１−３時間のこの明細書でみなされる高いストリンジェントな条件などの別のストリンジェントな条件を採用することもできる。
【００２８】
さらに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に少なくとも１５％のヌクレオチド配列の相同性を有する、上記ＶＥＧＦ様分子をコードする核酸分子を含む。好ましい相同性の程度は少なくとも約４０％、より好ましくは約６０−７０％である。
【００２９】
本発明はさらに、ヒトＶＥＧＦのマウス相同体（ここでは「ｍＶＲＦ」という）を含む。ヒトＶＥＧＦと比較してｍＶＲＦは約８５％の同一性を有し、ヒトＶＥＧＦと比較して全コード領域にわたって９２％のアミノ酸残基の保存率を有する。ｍＶＲＦは、実質的に図９に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされている。
【００３０】
本発明のＶＥＧＦ様分子は、単独またはＶＥＧＦなどの他の分子と組み合わせてある領域の治療および／または診断への適用に有用である。本発明は従って、ＶＥＧＦ様分子、その部分、フラグメント、誘導体、相同体または類似体とともに１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物に及ぶ。さらに、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に記載の核酸配列またはそれに少なくとも約１５％、より好ましくは約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０−７０％の類似性を有するが、それに少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは約３９％の非類似性を有するベクター、およびこれを含む宿主に及ぶ。さらに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に基づくリボザイムおよびアンチセンス分子ならびにＶＥＧＦ様分子の中和抗体に及ぶ。このような分子は、例えば、腫瘍の脈管形成または血管新生に至るＶＥＧＦ様遺伝子の過剰発現の効果を改善するのに有効である。
【００３１】
本発明の他の態様は哺乳動物における大グリア細胞増殖を誘導する方法であって、上記方法が、下記の特徴：
(i)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み;
（ii）少なくとも１つ血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共通の性質を示す
を有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物に投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するのに十分な期間および条件であることを特徴とする方法である。
【００３２】
好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３またはＳＥＱ ＩＤＮＯ:６に記載のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物における神経の生存および／または増殖を促進する方法であって、上記方法が下記の特徴：
(i)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に記載の配列に少なくとも約１５％の類似性を有するが、少なくとも約５％の非類似性を有するアミノ酸配列を含み;
(ii)少なくとも１つ血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)と共通の性質を示す
を有する組換タンパク質性分子の有効量を上記哺乳動物に投与し、上記投与が大グリア細胞の増殖を誘導するのに十分な期間および条件であることを特徴とする方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、組換タンパク質性分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３またはＳＥＱ ＩＤＮＯ:６に記載のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明はまた、診断剤として有用なＶＥＧＦ様分子に対す抗体またはＶＥＧＦ様分子をコードする遺伝子に対する核酸プローブを含む。
【００３６】
本発明はさらに下記の図面および／または実施例によって説明されるが、これに限定されるものではない。
【表１】
0003683778.tif 000002
【００３７】
【実施例】
実施例 １
ヒトcＤＮＡクローン
ヒト胎児脳ライブラリー(λzapII、Ｓtratagene)をコスミドＤ１１Ｓ７５０(Ｌarssonら、１９９２)でスクリーニングすることにより、最初のＳＯＭ１７５ cＤＮＡを単離した。プラスミドを「インビボ」において切断して、一本鎖の１.１kbのcＤＮＡを得た。上述のＳＯＭ１７５挿入断片をプローブとして使用して、３つの独立したＳＯＭ１７５ cＤＮＡクローンもまた、ヒト胎児脾臓ライブラリー(Ｓtratagene、Ｕnizap)から分離した。３つのクローンを得た：ＳＯＭ１７５−４Ａ、−５Ａ、および−６Ａ。ＳＯＭ１７５−５Ａは、エクソン４が欠けている、選択的スプライシングされたクローン(ＳＯＭ１７５−e４)である。ライブラリーの製造業者(Ｓtratagene)により推奨されるハイブリダイゼーション条件とランダム感作ＳＯＭ１７５の挿入断片とを使用して、これらのライブラリーのスクリーニングを行った。２つの部分的なヒトＳＯＭ１７５ cＤＮＡもまた、λＧＴ１１ヒト黒色腫セルライン Ａ２０５８ライブラリー(Ｃlontech)から分離した。ＣhurchおよびＧilbert、１９８４に記載のハイブリダイゼーション条件を使用して、cＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。各々の場合において、ＳＯＭ１７５から誘導されたＰＣＲ産物(１８ｆ−７００ｒ)のランダム感作により、プローブを発生させた。
【００３８】
マウスcＤＮＡクローン
再びヒトＳＯＭ１７５を使用して、マウス新生児全脳cＤＮＡライブラリー(Ｕnizap、Ｓtratagene)をスクリーニングした。４つの非キメラクローンを分離した：Ｍ１７５−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ。クローンは全て部分的なcＤＮＡであって、Ｍ１７５−Ｃは幾つかのイントロンを含んでいた。これらのcＤＮＡのうち３つは、エクソン６が欠けていた。
Ｍ１と呼ばれる別のクローンは完全に配列決定されており、完全なオープンリーディングフレーム＋５'utrの一部と３'utr全体を含むことが分かった。
【００３９】
実施例 ２
ＤＮＡ配列分析
cＤＮＡクローン(ＳＯＭ１７５)の全体配列をまとめて、その対応するアミノ酸配列と共に図２に示す。ＭＡＰプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン大学)を使用して、この配列をオープンリーディングフレームに関してスクリーニングした。６７２bpの一本鎖のオープンリーディングフレームが観察された(図２を参照)。５'非翻訳化配列は殆ど無いようである(２bp)。３'非翻訳化領域は、ポリアデニル化シグナルおよびポリＡ尾部が含まれることから完全であるらしい。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、データーベース相同性調査を行った(ＮＣＢＩで操作する、米国)。この分析は、幾つかの哺乳動物型のＶＥＧＦに対する相同性を明らかにした(図３を参照)。ＢＥＳＴＦＩＴプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン大学；図４および５を参照)を使用して、ＳＯＭ１７５とヒトＶＥＧＦ１６５との間の相同性の程度を測定した。ＢＥＳＴＦＩＴ分析を使用して、ヌクレオチドの相同性は６９.７％であると推定され、またタンパク質の相同性は少なくとも３３.３％の同一性と５２.５％の保存性と推定された。ヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴ分析では、ヒト発現配列タグ ＥＳＴ０６３０２(Ａdamsら、１９９３)にほぼ完全に対応することが明らかになった。
【００４０】
これらのデータは、ＳＯＭ１７５がＶＥＧＦに対して構造上の類似性を有する成長因子をコードすることを示す。両方の遺伝子が同じような位置に開始および停止コドンを示し、また不連続の相同性の固まりをもっている。二量化に関与すると考えられている８つのシステイン全て、さらにはまた多数の他のＶＥＧＦ残基は保存されている。これらの残基は、システイン−４７、プロリン−７０、システイン−７２、バリン−７４、アルギニン−７７、システイン−７８、グリシン−８０、システイン−８１、システイン−８２、システイン−８９、プロリン−９１、システイン−１２２、およびシステイン−１２４であって、図６に示す。ＶＥＧＦとＳＯＭ１７５遺伝子産物との間の構造上の保存があれば、それらが両方とも機能上の類似性を有することもまた可能となる。ＳＯＭ１７５は、ＶＥＧＦと幾つかの性質を共有するが、それ自身の独自の性質を有するＶＥＧＦ様分子をコードすることが提唱される。ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を図１に示す。
【００４１】
実施例 ３
Ｃlustal法、ＭegＡlignソフトウェア、ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシンを使用して、ＶＥＧＦ１６５ファミリーとＳＯＭ１７５ファミリー(タンパク質)との間の類似性および相違性のパーセントを分析した。結果を表２.１および２.２に示す。選択的にスプライシングされた型のＳＯＭ１７５を、ＳＯＭ１７５−e６(エクソン６が全て欠失している)；ＳＯＭ１７５−e６並びに７(エクソン６と７が全て欠失している)；およびＳＯＭ１７５−e４(エクソン４が全て欠失している)と略す。スプライシングされた型のＳＯＭ１７５を図７に示す。イントロン／エクソンの境界を示すＳＯＭ１７５のゲノムマップを図８ａおよび図８ｂに示す。
【００４２】
【表２】
0003683778.tif 000003
【００４３】
【表３】
0003683778.tif 000004
【００４４】
【表４】
0003683778.tif 000005
【００４５】
【表５】
0003683778.tif 000006
【００４６】
実施例 ４
ＳＯＭ１７５の機能を測定するためのバイオアッセイ
ＳＯＭ１７５が内皮細胞機能、脈管形成、および創傷治癒に対してＶＥＧＦと同様の活性を有するかどうかを評価するためにアッセイを行う。受容体結合分布試験の結果に基づいて他のアッセイを行う。
【００４７】
内皮細胞機能のアッセイ
内皮細胞増殖。ＦerraraおよびＨenzel（１９８９）およびＧospodarowiczら（１９８９）に記載の内皮細胞成長アッセイ。
【００４８】
脈管透過性アッセイ。モルモットでのマイルス(Ｍiles)試験を利用するこのアッセイは、ＭilesおよびＭiles（１９５２）に記載と同様に行う。
【００４９】
細胞接着アッセイ。ポリモルフの内皮細胞への接着に対するＳＯＭ１７５の影響を分析する。
【００５０】
走化性。これは、標準的なボイデン(Ｂoyden)チャンバー走化性アッセイを使用して行う。
【００５１】
プラスミノーゲンアクチベータアッセイ。ＳＯＭ１７５の添加によるプラスミノーゲンアクチベータおよびプラスミノーゲンアクチベータ阻害物質産生に関して、内皮細胞を試験する(Ｐepperら（１９９１）)。
【００５２】
内皮細胞移動アッセイ。内皮細胞を刺激して、移動させ管を形成させるＳＯＭ１７５の能力を、Ｍontesanoら（１９８６）に記載と同様にしてアッセイする。
【００５３】
脈管形成アッセイ
雛の漿尿膜での脈管形成応答のＳＯＭ１７５誘導を、Ｌeungら（１９８９）に記載と同様にして評価する。
【００５４】
次のアッセイを使用して、ＳＯＭ１７５の潜在的神経栄養作用を評価する。
【００５５】
軸索外殖アッセイおよび遺伝子誘導(ＰＣ１２細胞)
ＰＣ１２細胞(クロム親和性細胞腫セルライン)は、ＮＧＦおよび他の神経栄養因子に応答し、初期並びに後期遺伝子の誘導、および神経の伸長を含む交感神経ニューロンの特性を発達させる。これらの細胞をＳＯＭ１７５に暴露して、それらの応答をモニターする(Ｄrinkwaterら（１９９１）；およびＤrinkwaterら（１９９３）)。
【００５６】
末梢神経系(ＰＮＳ)由来の培養されたニューロン
次のＰＮＳニューロンの初代培養物をＳＯＭ１７５に暴露して、幾つかの応答に関してモニターする：
−神経冠および背根神経節由来の感覚ニューロン、
−交感神経系神経節由来の交感神経ニューロン、
−節状神経節由来のプラコード(placode)誘導感覚ニューロン、
−脊髄由来の運動ニューロン。
そのアッセイは、Ｓuterら（１９９２）およびＭarinouら（１９９２）に記載されている。
【００５７】
インビトロにおける応答が観察された場合には、取込みおよび逆行性輸送などの性質に関するインビボにおけるアッセイを、Ｈendryら（１９９２）に記載と同様にして行う。
【００５８】
神経再生(ＰＮＳ)
ＳＯＭ１７５の神経栄養効果が観察された場合には、軸索を切断した感覚ニューロン、交感神経ニューロン、および運動ニューロンの再生におけるその可能な役割を、Ｏttoら（１９８９）；Ｙipら（１９８４）；およびＨendryら（１９７６）の方法により分析する。
【００５９】
ＣＮＳニューロンに対するＳＯＭ１７５の作用
中枢神経系ニューロンの生存を増進するＳＯＭ１７５の能力を、Ｈaggら（１９９２）；Ｗilliamsら（１９８６）；Ｈefti（１９８６）；およびＫromer（１９８７）に記載と同様にして分析する。
【００６０】
創傷治癒
創傷治癒を支えるＳＯＭ１７５の能力を、Ｓchillingら（１９５９）に記載され、Ｈuntら（１９６７）により利用いるのと同様にして、利用できる最も臨床的に適切なモデルで試験する。
【００６１】
造血系
造血系の特異的な細胞集団に対して、様々なインビトロおよびインビボ・アッセイが可能であり、また以下に概略を述べる。
【００６２】
幹細胞
マウス
ＦＡＣＳ−精製細胞を使用して、様々な新規のインビトロ・マウス幹細胞アッセイが開発されている。
【００６３】
（ａ）再増殖する幹細胞
致死量を照射したマウスの骨髄を再増殖することができる細胞があって、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−kit＋表現型を有する。試験物質を、これらの細胞に対して単独で、または複数の因子との同時インキュベーションにより試験した後、３Ｈ チミジンの取込みにより、細胞増殖を測定する。
【００６４】
（ｂ）後期幹細胞
比較的僅かな骨髄再増殖能しか有していないが、Ｄ１３ ＣＦＵ−Ｓを発生させることができる細胞がある。これらの細胞は、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−kit＋表現型を有する。試験物質をこれらの細胞と共に一定時間インキュベートし、致死量を照射したレシピエントに注射して、Ｄ１３脾臓コロニーの数を数える。
【００６５】
（ｃ）前駆体に富む細胞
インビトロにおいて単一の成長因子に応答する細胞があって、Ｌin−、Ｒhｈｉ、Ｌy−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−kit−表現型を有する。このアッセイは、ＳＯＭ１７５が造血前駆体細胞に直接作用することができるかどうかを示すで。試験物質をこれらの細胞と共に寒天培養でインキュベートして、７−１４日後にコロニーの数を数える。
【００６６】
アテローム性動脈硬化症
平滑筋細胞は、収縮状態から合成状態へのそれらの表現型の変えながら、アテローム性動脈硬化症の発生または開始において重要な役割を果す。マクロファージ、内皮細胞、Ｔリンパ球、および血小板は全て、平滑筋細胞の成長および表現型修飾に影響を及ぼすことにより、アテローム性動脈硬化症プラークの発生において重要な役割を果す。多細胞環境での平滑筋細胞の増殖率および表現型修飾を測定するインビトロにおけるアッセイを使用して、平滑筋細胞に対するＳＯＭ１７５の効果を評価する。そのシステムは、様々な細胞の種類をカバーガラスの両側に播種する、変型ローズ(Ｒose)チャンバーを使用する。
【００６７】
骨に対するＳＯＭ１７５の効果
骨芽細胞の増殖を調節するＳＯＭ１７５の能力を、Ｌoweら（１９９１）に記載と同様にしてアッセイする。骨吸収に対する幾つかの効果を、Ｌoweら（１９９１）に記載と同様にしてアッセイする。細胞内分子における骨芽細胞移動および変化に対する効果(例えば、cＡＭＰの蓄積、アルカリ性ホスファターゼ濃度)を、Ｍidyら（１９９４）に記載と同様にして分析する。
【００６８】
骨格筋細胞に対する効果
筋原細胞の増殖および筋管の発達に対するＳＯＭ１７５の効果は、Ｅwtonら（１９８０）により、またＧospodarowiczら（１９７６）に記載と同様にして測定することができる。
【００６９】
実施例 ５
マウスＶＥＧＦ ＤＮＡのクローニング
cＤＮＡの単離
マウスＶＲＦ(mＶＲＦ)クローンを、λ Ｚap新生全脳cＤＮＡライブラリー(Ｓtratagene)から選択した。上記のhＶＲＦ cＤＮＡ(pＳＯＭ１７５)からＰＣＲにより発生した、６８２bpの３２Ｐ−標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより、高密度フィルター(５×１０４pfu／プレート)から得られた一次ファージを同定した。ＣhurchおよびＧilbert（１９８４）に記載と同様の条件下、ハイブリダイゼーションおよびナイロン膜(Ｈybond−Ｎ)のストリンジェント洗浄を６５℃で行った。陽性のプラークを採取し、精製し、インビボにおいて切断して、pＢluescript ＳＫ−中にcＤＮＡクローンを含む細菌コロニーを産生させた。
【００７０】
ゲノムクローンの単離
ゲノムクローンを、λ Ｆix IIベクター(Ｓtratagene)にクローン化したマウス菌株ＳＶ／１２９ライブラリーから単離した。高密度フィルター(５×１０４pfu／フィルター)を、mＶＲＦ cＤＮＡのヌクレオチド２３３−７９８領域のＰＣＲ増幅により創生させた、５６３bpの３２Ｐ−標識化プローブでスクリーニングした(図９を参照)。陽性のクローンをプラグして(plugged)、４００−８００pfuを含むフィルターで再びスクリーニングした。ＱＩＡＧＥＮ λキットを使用して、またはＺnＣl２精製(Ｓantos、１９９１)により、大量のファージ調製物を製造した。
【００７１】
ヌクレオチド配列決定および分析
様々なベクターに基づいたプライマーおよび内部プライマーを、製造業者の使用説明書に従って、Ａpplied Ｂiosystems Ｉncorporated(ＡＢＩ)の色素ターミネーター配列決定キットと共に使用して、cＤＮＡを両方の鎖に関して配列決定した。配列をＡＢＩの３７３Ａ型 自動化ＤＮＡシークエンサーで分析した。ＢＥＳＴＦＩＴプログラム(ＧＣＧ、ウィスコンシン)を使用して、ペプチドの相同性アラインメントを行った。
【００７２】
イントロン／エクソンの境界の同定
ゲノムＤＮＡまたはmＶＲＦ ゲノムλクローンをテンプレートとして用いるＰＣＲを使用して、エクソンの境界およびフランキング領域の同定を行った。イントロンを同定するためにＰＣＲで使用するプライマーは、hＶＲＦ配列から誘導し、また可能性のあるヒト−マウス配列のミスマッチを考慮して、推定されるＴmより低い５−１０℃のアニーリング温度を使用した。ＰＣＲ産物を全て、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分けして、ＱＩＡ急速スピンカラム(Ｑiagen)を使用して精製したゲルとイントロン／エクソンの境界とを、これらの産物から直接配列決定した。加えて、幾つかのスプライス部位を、サブクローン化したＭＶＲＦのゲノムフラグメントから配列決定した。cＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列を比較することにより、イントロン／エクソンの境界を同定した。
【００７３】
ノーザン分析
ＣhomczynskiおよびＳacchi（１９８７）の方法を使用して、全ての細胞ＲＮＡを新鮮な正常成熟マウス組織(脳、腎臓、肝臓、筋肉)のパネルから調製した。合計２０μgのＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜(Ｈybond−Ｎ、Ａmersham)に移して、標準的な条件下(ＣhurchおよびＧilbert、１９８４)にハイブリダイズさせた。フィルターを６５℃の０.１×ＳＳＣ(２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮaＣl／０.３Ｍ クエン酸三ナトリウム)、０.１％ ＳＤＳ中で洗浄して、増感紙を用いるＸ線フィルムに−７０℃で１−３日間暴露した。
【００７４】
mＶＲＦ cＤＮＡの特性決定
マウスcＤＮＡライブラリーをhＶＲＦ cＤＮＡクローンでスクリーニングすることにより、マウスＶＲＦ相同体を分離した。０.８−１.５kbと様々なサイズの５つのクローンを回収して、配列決定した。cＤＮＡ配列決定によれば、オープンリーディングフレーム全体(スプライス型によって、６２１bpまたは５６４bp、下記参照)を含む全長１０４１bpのcＤＮＡ配列、および３'ＵＴＲ(３７９bp)、さらにはまた１６３bpの５'ＵＴＲである(図９)。
【００７５】
予想される開始コドンは、hＶＲＦにおける開始コドンの位置に一致した。フレームＡＴＧ以外の他のコドンは−４７の位置にあって、２つの終止コドンは推定上の開始コドンと共に上流(各々、−９並びに−３３の位置)およびフレーム内で観察された。
【００７６】
予想されるhＶＲＦのＮ末端シグナルペプチドは、８１％の同一性(１７／２１アミノ酸)でmＶＲＦに存在すると思われる。mＶＲＦ内でのペプチド切断は、残基２１の後で起こるものと思われる(図１０)。これらのデータは、成熟mＶＲＦが分泌され、また従って、恐らく成長因子として機能し得ることを示す。
【００７７】
hＶＲＦに関しては、２つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)が、ライブラリースクリーニングにより分離されたcＤＮＡにおいて検出された。５つのクローンのうち４つは、選択的にスプライシングされて、hＶＲＦのエクソン６に相同である１０１bpのフラグメントに欠けることが判明した。mＶＲＦの２つの異性体(isoform)の予想されるペプチド配列を決定して、対応するヒト異性体と整列化した(図１０)。
【００７８】
メッセージをコードするmＶＲＦ１８６は、エクソン７の末端に向かって、＋６２２の位置で終わるコード配列を有する６２１bpのＯＲＦを含む。より小さなメッセージをコードするmＶＲＦ１６７は、実際には、１０１bpのエクソン６からのスプライシングに起因するフレームシフトと、エクソン８の始まりに近い、＋６６６の位置での終止コドン(ＴＧＡ)の導入により、＋６２２のＴＡＧ部位の下流で終止する(図９)。
【００７９】
mＶＲＦ１８６タンパク質は、ＶＥＧＦのアミノ部分および中心部分に対して強い相同性を有するが、カルボキシル末端は全く違って、アラニンに富む。mＶＲＦ１６７は、これらの類似性を有しており、mＶＥＧＦの右からＣ末端までの相同性も維持している(図１１)。hＶＲＦ１６７に対するmＶＲＦ１６７の全体にわたる相同性は各々、８５％の同一性と９２％の類似性であった(図１０)。同様に、mＶＲＦ１６７とmＶＥＧＦとの間の相同性(Ｂreierら、１９９２)は各々、４９％の同一性と７１％の保存的アミノ酸置換であった(図１１)。
【００８０】
模範的な脊椎動物のポリアデニル化シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)(Ｂirnstielら、１９８６)は、mＶＲＦ cＤＮＡには存在していなかったが、しかし、ぴったりと一致する配列 ＧＡＴＡＡＡが、マウスとヒトの両方のＶＲＦ cＤＮＡにおいて同じような位置に存在する。hＶＲＦとは対照的に、mＶＲＦは、ＡＣジヌクレオチドの反復を３'ＵＴＲのいちばん端の３'末端(ヌクレオチドの９９８〜１０１１の位置、図９)に含むことが判明した。この反復領域の多様性は、７〜１１にわたるジヌクレオチド数の、幾つかのmＶＲＦ cＤＮＡの間で観察された。
【００８１】
mＶＲＦのゲノム特性決定
対応するhＶＲＦの境界に相同な配列に隣接するプライマーを使用して、イントロン／エクソンの境界（表３）をマップした。mＶＲＦのイントロンＩ、III、IV、およびVI(表３、図１２)は、hＶＲＦの介在配列より小さかった。完全なゲノム配列は、mＶＲＦの増幅したイントロンとクローン化したゲノム部分を配列決定することにより、mＶＲＦの５'ＵＴＲから最も大きな介在領域(２.２kb)であるイントロンVIまでにまとめられていた。mＶＲＦとhＶＲＦとの間にはゲノム構造において１つだけ大きな相違があって、それは、mＶＲＦのエクソン７／イントロンVIの境界が、cＤＮＡ配列との関係でさらに１０bp下流にあることであり、従って、mＶＲＦにおけるエクソン７は、hＶＲＦにおいて対応するエクソンより１０bp長い。
【００８２】
エクソン６および７は、ヒト相同体で見受けられることが分かっているように、mＶＲＦで隣接している。mＶＲＦとhＶＲＦのエクソン６の間の強い配列相同性(図１０)は、この配列が保持されたイントロン配列ではないが、どちらかといえばＶＲＦ１８６異性体(isoform)の機能部分をコードすることを示す。
【００８３】
一般的なイントロン／エクソンの構造は、ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーの様々なメンバー(ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、hＶＲＦ)の間で保存され、また従って、mＶＲＦ遺伝子のゲノム組織全体がこれらの遺伝子に大変似ていることは驚くべきことではない(図１２)。
【００８４】
先の比較マッピング試験は、染色体１１q１３遺伝子座上のヒト複合内分泌腺新生物タイプ１疾患部を取り囲む領域が、マウス染色体１９の近位セグメントとシンテニック(syntenic)であることを示している(Ｒochelleら、１９９２)。発明者らは、hＶＲＦ遺伝子を１kbのヒトＭＥＮｌ遺伝子座内にマップしていることから(上記参照)、多分、マウスＶＲＦ遺伝子は、染色体１９のセントロメア付近にマップされるであろう。
【００８５】
mＶＲＦの発現試験
成人マウス組織(筋肉、心臓、肺、および肝臓)由来のＲＮＡのノーザン分析は、発現が偏在するらしく、約１.３kbの大きさの主要なバンドとして存在することを示した(図１４)。これは、２.０および５.５kbの２つの主要なバンドが試験した全ての組織で同定されているという、hＶＲＦの場合に観察されるパターンとは幾分異なっている。１.３kbのマウスメッセージは、恐らく、より短いヒト転写物に対応するであろうし、またその大きさの変化は、多分、各々の５'ＵＴＲの長さにおける相違によるものであろう。
【００８６】
実施例 ６
分娩前および分娩後のマウスにおけるマウスＶＥＧＦの発現
動物
妊娠期の同じマウス(ｎ＝４)および若年の成熟マウス(ｎ＝２)(Ｃ５７近交系、ＡＬＡＢ、スウェーデン)を二酸化炭素で屠殺し、関連のある組織を採取して、チャック(chuck)上で凍結した。さらに使用するまで、組織を−７０℃で保存した。２つの妊娠年齢をこの試験に使用した；胚日数８(Ｅ８)、１４、およびＥ１７。
【００８７】
in situハイブリダイゼーション組織化学
前記(Ｄagerlindら、１９９２)と同様にして、in situハイブリダイゼーションを行った。簡単に言えば、横切片(１４μm)を低温槽(Ｍicrom、独国)中で切断し、プローブ−オン(Ｐrobe−Ｏn)スライド(Ｆisher Ｓcientific、米国)上で解凍して、使用するまで、光を遮断しシールされた箱の中に−７０℃で保存した。mＶＲＦをコードするmＲＮＡに相補的な合成の４２−merのオリゴヌクレオチドの配列は、
ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＧＴ
ＧＣＡＴＡＡＡＣＧ［配列番号１１］(nt １２０−１６１に相補的である)および
ＡＧＴＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＣＣＡＴＧ
ＣＴＣＡＧＡＧＧＣ［配列番号１２］(nt １６２−２０３に相補的である)であった。２つの選択的なスプライス型を検出するために、オリゴヌクレオチド
ＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ
ＧＣＴＧＧ［配列番号１３］(nt ｘｘｘ−ｘｘｘに相補的である)および
ＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡ
ＣＡＧＣＡＣＴ［配列番号１４］を使用した。プローブは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(ＩＢＩ、米国)を使用して、デオキシアデノシン−α[チオ]トリホスフェート[３５Ｓ](ＮＥＮ、米国)で７−１０×１０８cpm／μgの比放射能まで３'末端を標識して、前処理することなく、切片に４２℃で１６−１８時間ハイブリダイズさせた。そのハイブリダイゼーション混合物は、以下のものを含んでいた：５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、４×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣlおよび０.０１５Ｍ クエン酸ナトリウム)、１×Ｄenhardt溶液(各々、０.０２％ ポリビニルピロリドン、ＢＳＡ、およびフィコール)、１％ ｖ／ｖ サルコシル(Ｎ−ラウロイルサルコシン；Ｓigma)、０.０２Ｍ リン酸緩衝液(pＨ ７.０)、１０％ ｗ／ｖ 硫酸デキストラン(Ｐharmacia、スウェーデン)、２５０μg／ml 酵母tＲＮＡ(Ｓigma)、５００μg／ml 切断して熱変性させたサケ精子ＤＮＡ(Ｓigma)、および２００mＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ；ＬＫＢ、スウェーデン)。対照切片では、そのハイブリダイゼーション混合物に２０倍過剰の非標識化プローブを添加することにより、両方のプローブの特異性を調べた。加えて、隣接した切片を、異なった発現パターンを与える、この試験には関係のないプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて、その切片を５５℃の１×ＳＳＣ中で数回洗浄し、エタノール中で脱水して、ＮＴＢ２核トラックエマルション(Ｋodak、米国)に浸漬した。３−５週間後、その切片をＤ−１９展開剤(Ｋodak、米国)中で展開して、カバーグラスをかけた。いくつかの場合には、エマルションに浸漬する前に、切片をオートラジオグラフフィルム(β−マックスオートラジオグラフフィルム、Ａmersham Ｌtd、英国)と対置させた。
【００８８】
４つの異なったプローブは、試験した全ての組織において同一のハイブリダイゼーションパターンを与えた。マウスＶＲＦ発現は、Ｅ８胚において既に検出されており、ニューロン管にもっともよく対応するであろう構造に対して、陽性のシグナルが記録された。Ｅ１４マウス胚の縦切片では、最も強いハイブリダイゼーションシグナルが心臓に、および神経系、特に大脳皮質において存在していた(図１４Ａ)。低レベルの発現は、全ての他の組織において存在していた。妊娠後期Ｅ１７では、高いmＶＲＦ mＲＮＡシグナルは、心臓および首の後ろ並びに周りにある褐色脂肪組織に限られていた(図１４Ｂ)。明らかに陽性のハイブリダイゼーションシグナルが脊髄の灰白質において、および舌において存在していた(図１４Ｂ)。大脳皮質での発現は、１４日目に比べて明らかに減少した。例えば、筋肉におけるＥ１４胚で見られる弱いバックグラウンド発現は、この妊娠年齢で減少した。強いmＶＲＦ mＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルは、若年の成熟マウスにおける心臓に対して、および褐色脂肪においてのみ存在していた(図１４Ｃ)。心臓上のシグナルは、乳頭筋を含め、心室壁全体にわたって均一に分布していた(図１４Ｄ)。過剰の冷プローブとハイブリダイズした心臓組織の切片では、バックグラウンドシグナルの特異的な標識化は全く記録されなかった(図１４Ｅ)。
【００８９】
心臓とは別に、mＶＲＦ mＲＮＡシグナルは、形態学的には、褐色脂肪に似ている胸郭の外側にある、ある組織全体に存在していた。これは、同じ領域で強い染色を示す、ズダン黒対比染色で確認された(図１５Ａおよび１５Ｂ)。成熟マウス脊髄の横切片では、mＶＲＦプローブは、灰白質に対してニューロン染色パターンを与えた(図１５Ｃ)。トルイジンでの対比染色(図１５Ｄ)は、前角における運動ニューロン(図１５Ｃおよび１５Ｄ)、後角の深部における、および中心管の周りの介在ニューロン(図１５Ｃ)の大部分が、mＶＲＦ mＲＮＡに陽性であることを示した。
【００９０】
実施例 ７
ヒナの感覚ニューロンに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５タンパク質の効果Ｎurcombeら（１９９２）の方法を使用して、胚８日目のニワトリのヒナの感覚ニューロンに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５タンパク質の効果を測定した。試験ウェル当たり２０００細胞を使用して、ニューロンの試験を４８時間目に計数した。３Ｈ−チミジン計数を使用して結果を得た。ＮＧＦを陽性の対照として、また様々な濃度のＶＥＧＦ、ヘパリンの存在下におけるＶＥＧＦ、およびヘパリンと５μＭ ５'−フルオロウラシル(５ＦＵ)の存在下におけるＶＥＧＦを使用して、ニューロンの生存のパーセント、神経外殖、および平均の神経の長さ(μm)を測定した。５ＦＵは神経膠細胞を殺す。
【００９１】
結果を図１６に示す。その結果は、ＶＥＧＦがニューロンの生存を増進するのに有効であるが、これには、神経膠細胞の存在が必要であることを示す。図１７は、３種類の雛の神経膠に対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５の効果の結果を示す。試験した神経膠は、ＣＮＳ神経膠、末梢神経膠、およびＣＮＳ希突起神経膠細胞であった。全ての培養において、ヘパリンを１０μg／mlとして使用して、試験を２４時間目に計数した。ウェル毎に２０００細胞を使用して、結果を３Ｈ−チミジン計数で測定した。その結果は、ヒナの中枢および末梢ニューロンの場合には、大神経膠細胞が著しく刺激されて、ヘパリンの存在下においてＳＯＭ１７５により増殖したが、ヒナの希突起神経膠細胞は分裂速度は無視できるほどの増加であったことを示す。
【００９２】
実施例 ８
マウス一次および中枢ニューロンに対するＳＯＭ１７５タンパク質の効果
実施例７での結果は、ＶＥＧＦ異性体が、大神経膠細胞の作用によって、ヒナの一次および中枢ニューロンに対する効果を有していたことを示す。同様の実験をマウス細胞で繰返した。
【００９３】
培養条件
「Ｍethods in Ｎeurosciences（第２巻）：Ｃell Ｃulture」 Ｐ.Ｍ.Ｃonn編、Ａcademic Ｐress、サンディエゴ、１９９０、大神経膠細胞に関しては３３−４６頁、希突起神経膠細胞に関しては５６−７４頁、および中枢ニューロンに関しては８７−１０２頁に記載されている方法に従って、全てのインビトロにおける実験のためにニューロンおよび神経膠細胞を調製して、培養した。
ポリ−Ｌ−オルニチン(０.１mg／ml、１時間)で被覆した２４ウェルの培養クラスター(Ｎunc)に、細胞を２,０００細胞／ウェルの密度で塗布した。培養してから４８時間後、十分確立された方法(Ｍarutaら、１９９３)を使用して、ニューロンを逆相光(inverted phase light)の下にウェル中で計数し、以下のようにして、神経膠細胞を[３Ｈ]チミジンの取込みで評価して、細胞分裂速度をモニターした。ことわらなければ、ヘパリン(１０μg／ml、低分子量画分、Ｓigma Ｃhemical Ｃorp.)は常時、培地中に存在していた。ニューロン培養物に５mＭ ５−フルオロ−２−デオキシウリジン(Ｓigma)を補って、バックグラウンドの神経膠細胞増殖を抑制した。
【００９４】
神経膠細胞増殖に関する３Ｈ−チミジン取込みアッセイ
細胞を、標準的な培地中、０.１mＣi／mlの保存濃度から３Ｈ−チミジン(比放射能 １０３μＣi／ug)で１４時間パルスして、最終的に２０μl／ウェルのインキューベート容量になった。ウェルの内容物を収集して、ニトロセルロース紙(Ｔitertek、Ｆlow)に吸収させた。トリプシン／ベルセン(versene)(ＣＳＬ Ｌimited、ビクトリア、オーストラリア)と共に５分間インキュベーションすることにより、残りの付着細胞を取り除いた。この手順を２回行った。最初に蒸留水を、次いでメタノールを使用して、ニトロセルロースディスクを標準的なＴitertek 収集装置(Ｆlow)で洗浄した。そのニトロセルロースディスクを乾燥させ、シンチレーション液(５％ ｖ／ｖ Ｔriton−Ｘを含む)を添加して、そのディスクをシンチレーションカウンターで計数した。
【００９５】
最大活性は、マウス大神経膠細胞培養物でのエクソン６が欠けているＳＯＭ１７５(ＳＯＭΔＸ６)の製剤で見られ、ヘパリンと共に投与した場合には、それらの増殖に対して重要な刺激があった(図１６)。わずかな刺激が希突起神経膠細胞の増殖に与えられ(図１７)、また単離された前脳ニューロンの生存応答の極僅かに認められる増強作用が与えられた(図１８)。各々の点に対する３つのグラフ全てに関する標準偏差は８％未満であった。
【００９６】
神経膠細胞の増殖を増進することにより、ニューロンの生存率を維持することができる。さらにまた、ＳＯＭΔＸ６は、大神経膠細胞の良好な誘導物質であって、中枢神経系の内皮細胞での大神経膠細胞の終末球の形成と共に発現され得る。
【００９７】
当業者は、ここに記載する本発明が、具体的に記載したもの以外にも変化および変更が可能であることが分かるであろう。本発明には、そのような変化および変更が全て含まれることが理解されるべきである。本発明にはまた、本明細書中に言及した、または示した工程、特徴、組成物、および化合物も全て個々に、または総合的に含まれ、および該工程または特徴のいずれか２つまたはそれ以上の、幾つか、および全ての組み合わせもまた含まれる。
【００９８】
【表６】
0003683778.tif 000007
大文字および小文字は各々、エクソン配列およびイントロン配列を示す。
*は、エクソン１の５'末端がまだ決定されていないことを示す。
【００９９】
参考文献
【表７】
0003683778.tif 000008
【０１００】
【表８】
0003683778.tif 000009
【０１０１】
【表９】
0003683778.tif 000010
【０１０２】
【配列表】
【０１０３】
配列番号１の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：６４９塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：ＤＮＡ
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B) 存在位置：17...589
(xi) 配列：SEQ ID NO.1：
【化１】
0003683778.tif 000011
【０１０４】
配列番号２の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：１９１アミノ酸
(B) 型：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：SEQ ID NO.2：
【化２】
0003683778.tif 000012
【０１０５】
配列番号３の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：１０９４塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：ＤＮＡ
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B) 存在位置：3..624
(xi) 配列：SEQ ID NO.3：
【化３】
0003683778.tif 000013
【化４】
0003683778.tif 000014
【０１０６】
配列番号４の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：２０７アミノ酸
(B) 型：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：SEQ ID NO.4：
【化５】
0003683778.tif 000015
【０１０７】
配列番号５の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：９９３塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：ＤＮＡ
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B) 存在位置：3..566
(xi) 配列：SEQ ID NO.5：
【化６】
0003683778.tif 000016
【化７】
0003683778.tif 000017
【０１０８】
配列番号６の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：１８８アミノ酸
(B) 型：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：SEQ ID NO.6：
【化８】
0003683778.tif 000018
【０１０９】
配列番号７の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：８５８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：ＤＮＡ
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B) 存在位置：3..431
(xi) 配列：SEQ ID NO.7：
【化９】
0003683778.tif 000019
【０１１０】
配列番号８の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：１４３アミノ酸
(B) 型：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：SEQ ID NO.8：
【化１０】
0003683778.tif 000020
【０１１１】
配列番号９の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：９１０塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：ＤＮＡ
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号：ＣＤＳ
(B) 存在位置：3..305
(xi) 配列：SEQ ID NO.9：
【化１１】
0003683778.tif 000021
【０１１２】
配列番号１０の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：１０１アミノ酸
(B) 型：アミノ酸
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：タンパク質
(xi) 配列：SEQ ID NO.10：
【化１２】
0003683778.tif 000022
【０１１３】
配列番号１１の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：４２塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi) 配列：SEQ ID NO.11：
【化１３】
0003683778.tif 000023
【０１１４】
配列番号１２の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：４２塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi) 配列：SEQ ID NO.12：
【化１４】
0003683778.tif 000024
【０１１５】
配列番号１３の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：３８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi) 配列：SEQ ID NO.13：
【化１５】
0003683778.tif 000025
【０１１６】
配列番号１４の情報：
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：４０塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：１本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi) 配列：SEQ ID NO.14：
【化１６】
0003683778.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］
【図１ｉ】  ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］
【図１ｉｉ】  ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］
【図１ｉｉｉ】  ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］
【図１ｉｖ】  ＶＥＧＦ１６５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２］
【図２】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｉ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｉｉ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｉｉｉ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｉｖ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｖ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図２ｖｉ】  ＳＯＭ１７５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３］および対応するアミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４］
【図３】  ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡＳＴ検索の結果
【図３ｉ】  ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡＳＴ検索の結果
【図３ｉｉ】  ＳＯＭ１７５タンパク質配列によるＢＬＡＳＴ検索の結果
【図４】  ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列
【図４ｉ】  ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列
【図４ｉｉ】  ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列
【図４ｉｉｉ】  ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列
【図４ｉｖ】  ＶＥＧＦ cＤＮＡおよびＳＯＭ１７５ cＤＮＡのＢＥＳＴＦＩＴ配列
【図５】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｉ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｉｉ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｉｉｉ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｉｖ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｖ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図５ｖｉ】    ＳＯＭ１７５およびヌクレオチドレベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図６】    ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図６ｉ】    ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図６ｉｉ】    ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図６ｉｉｉ】    ＳＯＭ１７５およびアミノ酸レベルのスプライス変異体とＶＥＧＦ１６５の複数の配列
【図７】    ＳＯＭ１７５およびそのスブライス変異体の図式表現
【図８ａ】  エクソン／イントロン地図を示すヒトＳＯＭ１７５ゲノム構造の図式表現
【図８ｂ】  エクソン／イントロン境界を示すヒトＳＯＭ１７５ゲノム構造の図式表現
【図９】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。
【図９ｉ】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。
【図９ｉｉ】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。
【図９ｉｉｉ】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。
【図９ｉｖ】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンから誘導されたヌクレオチドおよび推定ペプチド配列。ヌクレオチドの番号は左側に記載され、開始コドンのＡから始まる。アミノ酸の番号は右側に記載され、推定シグナルペプチドが除去された後、予測成熟タンパク質の最初の残基から始まる。別にスプライスされた領域は２重下線で示し、各ｍＲＮＡから得られたペプチド配列が含まれている。主要なポリアデニル化の標識は太字で示されている。ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８６の開始および終止コドンは下線で示され、３' ＵＴＲ中の多形のＡＣの反復は破線で囲って示した。イントロン／エクソンの境界の位置は矢印で示した。
【図１０】  ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性体のＢＥＳＴＦＩＴ配列  Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈＶＲＦ１６７；  Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と異なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；  アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナルペプチド開裂部位を示す。
【図１０ｉ】  ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性体のＢＥＳＴＦＩＴ配列  Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈＶＲＦ１６７；  Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と異なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；  アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナルペプチド開裂部位を示す。
【図１０ｉｉ】  ヒトおよびマウスＶＲＦタンパク質異性体のＢＥＳＴＦＩＴ配列  Ａ：ｍＶＲＦ１６７およびｈＶＲＦ１６７；  Ｂ：配列が各１６７アミノ酸異性体と異なる点からのｍＶＲＦ１８６およびｈＶＲＦ１８６；  アミノ酸の同一性は縦棒で示し、保存アミノ酸は黒点で示した。矢印はヒトおよびマウスＶＲＦの予測シグナルペプチド開裂部位を示す。
【図１１】  ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８（Breier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦＩＴ配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載した。
【図１１ｉ】  ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８（Breier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦＩＴ配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載した。
【図１１ｉｉ】  ｍＶＲＦ１６７およびｍＶＲＦ１８８（Breier ら、１９９２年）ペプチド配列のＢＥＳＴＦＩＴ配列。矢印はｍＶＥＧＦのシグナルペプチド開裂部位を示す。同一のアミノ酸は縦棒で示し、保存的置換は黒点で示した。アミノ酸の番号は図９の方法で記載した。
【図１２】  ＶＲＦ（マウスとヒトの相同体のイントロン／エクソン構造はほぼ同一であるから、一般的なＶＲＦ遺伝子を示した）とヒトＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ／ＰＤＧＦ遺伝子族の他の構成員との遺伝子構造の比較。エクソンは四角で示した。タンパク質コード領域および非翻訳領域は内部を埋めた四角または白ぬきの四角で示した。ＶＲＦの斜線領域はＶＲＦ１８６異性体の別のスプライシングによって形成された追加的３' ＵＴＲ配列を示す。各遺伝子の別の主要なスプライス生成物を示した。
【図１３】  ｍＶＲＦ cＤＮＡクローンとハイブリダイズした種々の成熟マウス組織(表示した)からの全ＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラム。主要な１.３ｋｂの転写はすべての試料から検出された。
【図１４】  マウスにおけるｍＶＲＦおよびｍＲＮＡの発現パターンを示すフィルムオートラジオグラフ(Ａ−Ｃ)および暗視野照明顕微鏡写真(Ｄ−Ｅ)。Ｅ１４マウス胎芽（Ａ）において、陽性のシグナルが現れている心臓(Ｈａ)および大脳皮質(Ｃｘ)に見られる。バックグランドの低いシグナルが他の組織の断面に存在する。Ｅ１７胎芽(Ｂ)において、心臓(Ｈａ)は強いハイブリダイズのシグナルのためにはっきりと見える。同じ位の強さのシグナルが背中および胸郭付近の茶色の脂肪組織(Ｆa)に存在する。中程度のハイブリダイゼーションのシグナルが脊髄(ＳＣ)および舌(Ｔ)に存在する。バックグラウンドシグナルはＥ１４胎芽と比較して調整した。若年マウス(Ｃ-Ｄ)では、陽性のシグナルは心臓(Ｈａ)および胸郭付近の脂肪組織(Ｆａ)に見られ、一方、例えば、肺(Ｌｕ)はラベルされていない。心臓のハイブリダイゼーションシグナルは乳頭筋肉を含む左心室全体に平等に分布している(Ｄ)。過剰の冷プローブとハイブリダイズさせたＥ１７心臓には、陽性のシグナルは存在しなかった(Ｅ)。尺度＝０.５ｍｍ(Ａ)、１.２ｍｍ(Ｂ)、１ｍｍ(Ｃ)、０.３ｍｍ（Ｄ）、０.１ｍｍ(Ｅ)
【図１５】  マウス脂肪組織(Ａ−Ｂ)および脊髄(ＣおよびＤ)におけるｍＶＲＦｍＲＮＡ発現を示す暗−(ＡおよびＣ)および明−(ＢおよびＤ)視野顕微鏡写真。ズタンブラック染色部分の強い標識によって示されているように（Ｂ）、強いハイブリダイズシグナルが脂肪に存在する（Ａ）。弱いシグナルがまた骨格筋(Ａ−Ｂ中Ｍ)に存在する。成熟脊髄(Ｃ)には、ｍＶＲＦプローブは灰白質にニューロンの発色パターンを示す。ｍＶＲＦｍＲＮＡに対して強い陽性を示す腹側灰白柱(Ｄ)中の運動ニューロン、背側灰白柱の深部および中央管付近の介在ニューロンを示すトルイジン対比染色。尺度＝０.１ｍｍ(Ａ)、０.１ｍｍ(Ｂ)、０.２５ｍｍ(Ｃ)、０.０１５ｍｍ(Ｄ)。
【図１６】  生存％、神経成長％および平均神経の長さ（μｍ）で測定された、胎芽８日令ヒナ感覚神経に対するＶＥＧＦの作用。
【図１７】  ニワトリのヒナのグリアに対するＶＥＧＦおよびＳＯＭ１７５の作用。ＣＮＳグリア、末梢グリアおよびＣＮＳ乏突起膠細胞が試験された。
【図１８】  マウス大グリア細胞に対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作用
■３Ｈ（cpm）
１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール
２．ＳＯＭ△Ｘ６＊      １ng／ml
３．ＳＯＭ△Ｘ６      １０ng／ml
４．ＳＯＭ△Ｘ６    １００ng／ml
５．ＳＯＭ△Ｘ６  １０００ng／ml
６．ＳＯＭ△Ｘ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
７．ＳＯＭＸ６＊＊    １ng／ml
８．ＳＯＭＸ６      １０ng／ml
９．ＳＯＭＸ６    １００ng／ml
10．ＳＯＭＸ６    １００ng／ml
11．ＳＯＭＸ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。
＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。
【図１９】  マウス乏突起神経膠細胞に対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作用
■３Ｈ（cpm）
１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール
２．ＳＯＭ△Ｘ６＊      １ng／ml
３．ＳＯＭ△Ｘ６      １０ng／ml
４．ＳＯＭ△Ｘ６    １００ng／ml
５．ＳＯＭ△Ｘ６  １０００ng／ml
６．ＳＯＭ△Ｘ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
７．ＳＯＭＸ６＊＊    １ng／ml
８．ＳＯＭＸ６      １０ng／ml
９．ＳＯＭＸ６    １００ng／ml
10．ＳＯＭＸ６  １０００ng／ml
11．ＳＯＭＸ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。
＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。
【図２０】  マウス前脳ニューロンに対する種々のＳＯＭ１７５タンパク質の作用
■生存率％
１．ＦＧＦ−２（１０ng／ml）陽性コントロール
２．ＳＯＭ△Ｘ６＊      １ng／ml
３．ＳＯＭ△Ｘ６      １０ng／ml
４．ＳＯＭ△Ｘ６    １００ng／ml
５．ＳＯＭ△Ｘ６    １００ng／ml
６．ＳＯＭ△Ｘ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
７．ＳＯＭＸ６＊＊    １ng／ml
８．ＳＯＭＸ６      １０ng／ml
９．ＳＯＭＸ６    １００ng／ml
10．ＳＯＭＸ６  １０００ng／ml
11．ＳＯＭＸ６  １０００ng／ml  ヘパリンなし
＊：エクソン６を欠くＳＯＭ１７５を意味する。
＊＊：ＳＯＭ１７５を意味する。
【図１】
0003683778.tif 000027
【図１ｉ】
0003683778.tif 000028
【図１ｉｉ】
0003683778.tif 000029
【図１ｉｉｉ】
0003683778.tif 000030
【図１ｉｖ】
0003683778.tif 000031
【図２】
0003683778.tif 000032
【図２ｉ】
0003683778.tif 000033
【図２ｉｉ】
0003683778.tif 000034
【図２ｉｉｉ】
0003683778.tif 000035
【図２ｉｖ】
0003683778.tif 000036
【図２ｖ】
0003683778.tif 000037
【図２ｖｉ】
0003683778.tif 000038
【図３】
0003683778.tif 000039
【図３ｉ】
0003683778.tif 000040
【図３ｉｉ】
0003683778.tif 000041
【図４】
0003683778.tif 000042
【図４ｉ】
0003683778.tif 000043
【図４ｉｉ】
0003683778.tif 000044
【図４ｉｉｉ】
0003683778.tif 000045
【図４ｉｖ】
0003683778.tif 000046
【図５】
0003683778.tif 000047
【図５ｉ】
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【図５ｉｉ】
0003683778.tif 000049
【図５ｉｉｉ】
0003683778.tif 000050
【図５ｉｖ】
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【図５ｖ】
0003683778.tif 000052
【図５ｖｉ】
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【図６】
0003683778.tif 000054
【図６ｉ】
0003683778.tif 000055
【図６ｉｉ】
0003683778.tif 000056
【図６ｉｉｉ】
0003683778.tif 000057
【図７】
0003683778.tif 000058
【図８ａ】
0003683778.tif 000059
【図８ｂ】
0003683778.tif 000060
【図９】
0003683778.tif 000061
【図９ｉ】
0003683778.tif 000062
【図９ｉｉ】
0003683778.tif 000063
【図９ｉｉｉ】
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【図９ｉｖ】
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【図１０】
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【図１０ｉ】
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【図１０ｉｉ】
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【図１１】
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【図１１ｉ】
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【図１１ｉｉ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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