(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素学的性質を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼ：
（１）作用
マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのマルトースとリン酸を生成する；
（２）基質特異性
マルトースに特異的に作用する；
（３）至適温度
マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す；
（４）熱安定性
１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５分間処理後に無処理の約８０％の活性を有する；
（５）至適ｐＨ
６．０〜７．０；
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ５．５〜８．０で安定；
（７）分子量
ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万〜１９万。
【請求項２】
下記の酵素学的性質を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼ：
（１）作用
マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのマルトースとリン酸を生成する；
（２）基質特異性
マルトースに特異的に作用する；
（３）至適温度
マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す；
（４）熱安定性
１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５分間処理後に無処理の約８０％の活性を有する；
（５）至適ｐＨ
６．０〜７．０；
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ５．５〜８．０で安定；
（７）分子量
ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万〜１９万；
（８）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する；
（９）等電点
４．７〜５．１；
（１０）阻害剤
ＨｇＣｌ２で著しく活性が阻害される。
【請求項３】
バチルス属に属し、請求項１または２記載の耐熱性マルトースホスホリラーゼを産生する能力を有する細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取することを特徴とする耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造方法。
【請求項４】
バチルスｓｐ・ＲＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０４４）もしくは請求項１または２記載の耐熱性マルトースホスホリラーゼを産生する能力を有するその突然変異体。
【請求項５】
バチルスｓｐ・ＭＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０４５）もしくは請求項１または２記載の耐熱性マルトースホスホリラーゼを産生する能力を有するその突然変異体。
【請求項６】
請求項１または２記載の耐熱性マルトースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応させることを特徴とするβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２記載の耐熱性マルトースホスホリラーゼ、およびバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５６７）によって産生され、下記（１）〜（４）の酵素学的性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応させることを特徴とするトレハースの製造方法：
（１）至適温度
トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示す；
（２）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以上の活性を有する；
（３）至適ｐＨ
６．５〜７．５；
（４）ｐＨ安定性
ｐＨ６．０〜８．０で安定。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な熱安定性に優れたマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、およびその使用方法に関するものであり、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が産生する高い熱安定性を有する新規なマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、および該酵素を用いるβ−グルコース−１−リン酸またはトレハロースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質である。
従来、トレハロースを調製する方法としては、酵母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌による発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られている。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非常に高価であるため食品用途には利用することができなかった。
【０００３】
一方、安価にトレハロースを調製する有効な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを用いた同時反応法がある（特公昭６３−６０９９８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じる反応を利用したもので、安価な原料であるマルトースに両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成するというものである。
【０００４】
これまでに知られているマルトースホスホリラーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（特開平１−９１７７８）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＤＭＳ２００５４、ＮＣＩＢ８８３６、８５６１、８５６２、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＭＳ２０１７４、微工研菌寄第４６２８号、ラクトバチルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ラクトバチルス・フエルメンテユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＭＳ２００５２、ストレプトコックスｓｐｅｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）微工研菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研菌寄第４６２６号、微工研菌寄第４６２７号（特公昭６０−５４０３６）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）ＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増刊号），２８，１９９５；Ｏｙｏ  Ｔｏｓｈｉｔｓｕ  Ｋａｇａｋｕ，４２（１），１９〜２５，１９９５）が生産するものが挙げられる。
【０００５】
これらの内、酵素の理化学的性質について詳細に調べられているのはラクトバチルス・ブレビスＡＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（特開平１−９１７７８）、およびプレシオモナスＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増刊号），２８，１９９５）が生産するものだけである。これらの酵素の熱安定性は、いずれも４０℃以下と低く、これらの酵素を用いてトレハロース製造を行った場合、反応温度が低いため製造工程での雑菌汚染の可能性が高いといった問題があり、工業的製造条件で利用するのは困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
トレハロースを安価に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはマルトースを原料としてマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考えられる。
一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くすることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有利である。
このように高温での酵素反応でトレハロースの製造を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述のラクトバチルス属およびプレシオモナス属起源のマルトースホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。
従って、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは高い熱安定性を有し、マルトースからグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成する耐熱性マルトースホスホリラーゼを自然界より探索した結果、好熱性バチルス属細菌が上記目的にかなう酵素をよく生産することを見出し、本発明を完成した。
そして、このような菌株を液体培養することにより耐熱性マルトースホスホリラーゼを生産させ、これを必要に即して精製、純化或いは固定化することにより、トレハロースの製造に利用することができることを見出した。すなわち、本発明は、新規な耐熱性マルトースホスホリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素の製造に使用する菌、および該酵素を用いるβ−グルコース−１−リン酸およびトレハロースの製造方法を提供するものである。
【０００８】
本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼの性質は以下の通りである。耐熱性マルトースホスホリラーゼとしては実施例１で得たバチルスｓｐ．ＲＫ−１より調製したものを使用した。
なお、マルトースホスホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２W/V ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該測定値から反応液中の生成グルコース量を測定した。生成したグルコースの量から、１分間に１μｍｏｌのマルトースを加リン酸分解する酵素量を求め、これを１単位とした。
またホスホリラーゼであることを確認するため反応終了後の反応液を陰イオン交換カラムで分離後、示差屈折計を検出手段とする高速液体クロマトグラフィーによりβ−グルコース−１−リン酸を定量した。
【０００９】
（１）作用
式（１）で示すように、マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等モルのマルトースとリン酸を生成する。
【００１０】
【化１】
0003691875.tif 000002
【００１１】
（２）基質特異性
トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、スクロース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシド等を基質として加リン酸分解反応を行ったところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほとんど認められなかった（表１）。
（３）至適温度
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたところ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。
（４）熱安定性
１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、残存活性を測定したところ、６０℃、１５分間処理で無処理の８０％以上の活性を示した（図２）。
【００１２】
（５）至適ｐＨ
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）または２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６．０〜７．０であった（図３）。
（６）ｐＨ安定性
１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）と１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ５．５〜８．０で安定であった（図４）。
（７）分子量
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア  バイオテク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万であった。
また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は７．５万〜９．５万であった。
上記ゲルろ過クロマトグラフィーとＳＤＳゲル電気泳動の結果より、本酵素は通常２量体を形成しているものと考えられる。
（８）失活
１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。
（９）等電点
精製酵素をＭｏｎｏ  Ｐ  ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア  バイオテク（株））による等電点クロマトグラフィーにかけ、展開緩衝液で活性が溶出された画分のｐＨから、等電点は４．７〜５．１であった。
（１０）阻害剤
１ｍＭのＨｇＣｌ2 で９９％、ＺｎＳＯ4 で３７％の活性阻害が見られた（表２）。
【００１３】
本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼおよび従来公知の微生物由来のマルトースホスホリラーゼの酵素学的性質を比較して表３および表４に示す。表３および表４から明らかなように、本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼは、既知のマルトースホスホリラーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
【００１４】
本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼは耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取することによって製造される。
製造に使用される微生物としてはバチルス属に属し、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。具体的には、本発明者らが茨城県の土壌より分離したＲＫ−１株、および千葉県の土壌より分離したＭＫ−１株が挙げられる。
これらの菌株の菌学的性質は表５に示す通りである。これらの性質より、「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」ＶＯＬ２（１９８６）に基づき、両菌株ともバチルス属に属する細菌であると同定したが、種については、これまでに報告されたものと性状が一致せず、新規な種であると判断した。すなわち、上記バージェース・マニュアルによると、バチルス属の菌で増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致するものは、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）およびバチルス・リッケンフォリミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。しかし、バチルス・リッケンフォリミスはｐＨ５．７および７％ＮａＣｌで増殖する、プロピオン酸塩、クエン酸塩を利用する、ゼラチンを液化するといった性質を示すためＲＫ−１株とは異なると判断できる。また、バチルス・コアギュランスはｐＨ５．７で増殖し、５％ＮａＣｌで増殖しないことからＲＫ−１株と異なると判断できる。また、増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致するＭＫ−１株も、上記の点のいくつか等においてバチルス・コアギュランスおよびバチルス・リッケンフォリミスと異なる。両菌株とも５５℃の温度で増殖可能であったため、好熱性細菌であり、それぞれバチルスｓｐ．ＲＫ−１、バチルスｓｐ．ＭＫ−１と命名した。これらＲＫ−１株およびＭＫ−１株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれＦＥＲＭ  Ｐ１５０４４およびＦＥＲＭ  Ｐ１５０４５として寄託されている。
【００１５】
本発明で使用する微生物は野性株に限らず、野性株例えば上記野性株を紫外線、エックス線、放射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル  メタンスルホネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株も、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する限り使用できる。
【００１６】
本発明に使用する栄養培地としては炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、グルコース、フラクトース、糖  、デンプン、デキストリン、グリセリン等の炭水化物等が用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物が用いられる。
【００１７】
窒素源としてはペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用できる。
無機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用する。
【００１８】
次に本発明においては培地中にマルトースをマルトースホスホリラーゼの誘導物質として存在せしめることなしに、耐熱性マルトースホスホリラーゼを生産することが可能であるが、マルトースの存在によって、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成量を増加せしめることができる場合がある。
【００１９】
培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法が最も適している。培養温度は３０〜６０℃の範囲で行うことができるが、５０〜５５℃が好適である。ｐＨは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件によって変わってくるが、通常１５〜４８時間程度であり、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。
【００２０】
このようにして得られた培養物から本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取するには、まず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分画する。耐熱性マルトースホスホリラーゼは前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等の周知の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことにより、耐熱性マルトースホスホリラーゼの濃縮或いは精製標品を得ることができる。本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示す。
【００２１】
本発明は、また、ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応させることを特徴とするβ−グルコース−１−リン酸の製造方法に関する。
この場合に用いられる耐熱性マルトースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６０℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６０℃のいずれかの温度で、特に６０℃で、１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも（１）〜（６）、または少なくとも（１）〜（７）の性質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素であっても、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であってもよい。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性マルトースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記のような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００２２】
マルトースとしてはマルトースまたはマルトース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いることができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（もしくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくはナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２３】
酵素の使用量については、特に制限ないが、マルトース１ｇに対し、０．１〜５０単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが適当である。リン酸および／またはリン酸塩はマルトースに対して、特に制限ないが、０．１〜１０倍モル、好ましくは０．５〜２倍モル使用するのが適当である。なお、緩衝液がリン酸（塩）を含有する緩衝液、例えばリン酸カリウム・クエン酸緩衝液の場合には系中のリン酸およびリン酸塩の総量が上記範囲であればよい。
上記反応は雑菌汚染を避けると共に収率を上げるため５５〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃、さらに好ましくは６０〜６５℃でおこなう。ｐＨは一般に４．５〜８．０、好ましくは５．０〜６．０で行うのが適当である。さらに具体的には、温度５５〜６０℃ではｐＨ４．５〜５．０で、温度６０〜６５℃ではｐＨ５．０〜５．５で、温度６５〜７０℃ではｐＨ５．５〜６．５で行うのが、雑菌汚染の防止上さらに好ましい。上記条件下で十分なβ−グルコース−１−リン酸の生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常１〜１４４時間で終了する。
【００２４】
反応終了後、反応液の加熱による酵素の失活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、β−グルコース−１−リン酸を得ることができる。
【００２５】
本発明は、また、ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホスホリラ−ゼ、および耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法に関する。
上記において耐熱性マルトースホスホリラーゼとしては、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方法におけると同様のものを用いることができる。耐熱性トレハロースホスホリラーゼとしては、上記反応温度のいずれかで、および上記ｐＨ範囲のいずれかで、耐熱性マルトースホスホリラーゼの助力の下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩からトレハロースを産生し得るものであればよい。しかしながら、好適には、ｐＨ６．０の緩衝液中で５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好ましくは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを用いることができる。かかる性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼの例として、本発明者らによって見出されたバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５６７）が産生する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを挙げることができる。この耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造例を実施例４（粗酵素）および参考例１（精製酵素）に示す。この精製酵素の至適温度、熱安定性、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は以下の通りである。
【００２６】
（１）至適温度
４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたところ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図６）。
（２）熱安定性
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、残存活性を測定したところ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性を示した（図７）。
（３）至適ｐＨ
２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適ｐＨは６．５〜７．５であった（図８）。
（４）ｐＨ安定性
１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図９）。
【００２７】
耐熱性トレハロースホスホリラーゼは耐熱性マルトースホスホリラーゼと同様、精製酵素であっても粗酵素であってもよく、これらの精製酵素、粗酵素は耐熱性マルトースホスホリラーゼの場合と同様にして得ることができる。
マルトース、リン酸もしくはリン酸塩、および水性媒体としては、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方法におけると同様のものを用いることができる。
【００２８】
酵素の使用量については、特に制限ないが、マルトース１ｇに対して、各酵素とも、０．１〜５０単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが適当である。また、耐熱性マルトースホスホリラーゼと耐熱性トレハロースホスホリラーゼとの使用比率は特に制限ないが、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、好ましくは１：２〜２：１が適当である。
なお、トレハロースホスホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％トレハロース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またトレハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リン酸分解する酵素量を１単位とした。
【００２９】
耐熱性マルトースホスホリラーゼと耐熱性トレハロースホスホリラーゼはマルトースに対して同時に添加して反応を行ってもよく、マルトースにまず耐熱性マルトースホスホリラーゼを作用させ、ついで耐熱性トレハロースホスホリラーゼを添加して反応を行ってもよい。耐熱性トレハロースホスホリラーゼを後から添加する場合、添加時期については特に制限ないが、効率上、β−グルコース−１−リン酸の生成が最大になる時点までには添加するのが好ましい。
リン酸もしくはリン酸塩はマルトースに対して、特に制限はないが、０．００１〜１倍モル、好ましくは０．００５〜０．５倍モル使用するのが適当である。
反応温度、反応ｐＨ、反応時間はβ−グルコース−１−リン酸の製造の場合と同様にして行うことができる。反応終了後のトレハロースの単離・精製は活性炭処理、イオン交換処理、エタノール晶出処理等の手段を適宜組み合わせて行うことができる。
【００３０】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０４４）による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。
（培養）
酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌したものに、バチルスｓｐ．ＲＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃にて１６時間振盪培養したものを種培養液とした。
容量５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組成の培地約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０に保持しながら１８時間通気攪拌培養した。
【００３１】
（粗酵素の調製）
培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を除去し、上清に硫安を４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、濃縮後約３００単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。
（イオン交換クロマトグラフィー）
１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩後、さらに、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００３２】
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
０．２ＭＮａＣｌを溶解した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム（ファルマシア  バイオテク（株））に、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩した。
（等電点クロマトグラフィー）
２５ｍＭビス・トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）によって平衡化したＭｏｎｏＰ  ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア  バイオテク（株））に、上記部分精製酵素液を添加し、ｐＨ４．０に調整した展開緩衝液（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）（ファルマシア  バイオテク（株））で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩した。
（ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）
上記精製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色してタンパク質のバンドを調べたところ、一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認できた。
【００３３】
（マルトースホスホリラーゼの確認）
上記精製酵素液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％マルトース０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分反応後、１０分間の煮沸によって反応を停止させた。
次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて、反応液中のグルコース量を測定した。
また、反応停止液の一部を陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー〔ＴＳＫｇｅｌ  ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））〕でβ−グルコース−１−リン酸を検出し、定量した。その結果、反応停止液中のグルコース含量とβ−グルコース−１リン酸含有量は等しく、精製酵素はマルトースホスホリラーゼであることが確認された。
【００３４】
実施例２
バチルスｓｐ．ＭＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０４５）による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造は以下のようにして行った。
酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バチルスｓｐ．ＭＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃で１６時間振盪培養したものを種培養液とした。
容量５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組成の培地約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０に保持しながら４８時間通気攪拌培養した。
培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を分離した。この菌体を洗浄後、１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、超音波処理によって細胞を破砕し、遠心分離によって固形分を除去して粗酵素液２０ｍｌを調製した。この粗酵素液は約１０単位／ｍｌのマルトースホスホリラーゼ活性を有していた。
【００３５】
実施例３
実施例１で調製した耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗酵素液（硫安分画段階のもの）を用いて、基質のマルトースに作用させβ−グルコース−１−リン酸の生産を試みた。
反応液はマルトース濃度３０w/v ％、酵素１０u/g 、リン酸濃度０．５Ｍ、ｐＨ６．０となるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調整し、６０℃で４時間反応を行った。反応の停止は１０分間１００℃に加熱して行った。反応終了後、反応液の一部を陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー〔ＴＳＫｇｅｌ  ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））〕に付して、β−グルコース−１−リン酸の定量を行ったところ、β−グルコース−１−リン酸が４．６w/v ％生成していた。
反応液をイオン交換カラムＴＳＫｇｅｌ  ＳＡＸ（２００×５５ｍｍφ）（東ソー（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．０）、流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎの条件でクロマトグラム分離し、β−グルコース−１−リン酸画分を分取した。この溶液を２０％ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整した後、２倍容量のエタノールを加え０〜４℃に２４時間放置して、沈澱してくるβ−グルコース−１−リン酸２ナトリウム塩を遠心分離により回収した。その結果、収率９０％で純度９５％以上のβ−グルコース−１−リン酸２ナトリウム塩を得た。
【００３６】
実施例４
（耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）
肉エキス０．１２w/v ％、ポリペプトン０．４w/v ％、ＮａＣｌ  ０．２w/v％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５６７）を１白金耳植菌し、５５℃で１６時間振盪培養したものを種培養液とした。
容量５Ｌのファーメンターに、酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、トレハロース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．０）約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０に保持しながら４０時間通気攪拌培養した。
培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を分離し、上清に硫安を８０％飽和になるように溶解し、析出したタンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、濃縮後、トレハロースホスホリラーゼ活性約２２０単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。
【００３７】
（マルトースからトレハロースの生成反応）
このようにして調製した耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液と実施例１で調製した耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗酵素（硫安分画段階のもの）を用いて、基質のマルトースに作用させトレハロースへ変換させた。
すなわち、表６に示す、マルトース濃度（２０または３０ｗ／ｗ％）、リン酸濃度（５〜３００ｍＭ）、各酵素量（１〜１０単位／ｇ）（各酵素は同じ単位量使用した）、温度・ｐＨ・時間条件で酵素反応を行った。なお、ｐＨ調整は酢酸緩衝液で行った。
反応の停止は１０分間１００℃に加熱して行った。反応終了後、各反応液を、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））、溶離液アセトニトリル／水（７８／２４）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））を検出手段とする高速液体クロマトグラフィーに付して、各反応液の糖組成を定量した。
また、β−グルコース−１−リン酸は反応液を、実施例１と同様の陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに付すことにより定量した。結果を表６に示す。
反応温度６０〜７０℃、ｐＨ５．０〜６．０の反応条件で１８〜６５％の収率でマルトースがトレハロースに変換された。
【００３８】
実施例５
（トレハロース含有糖液、トレハロース高含有糖液及びその粉末の製造）
コーンスターチにα−アミラーゼを作用させた澱粉液化液に枝切り酵素（天野製薬（株）販売／プルラナーゼ「アマノ」）とβ−アミラーゼ（長瀬産業（株）販売／β−アミラーゼ）を作用させて調製したマルトース高含有糖液（固形分３０w/w ％、固形分当たりのマルトース純度８０％）に、実施例１で調製したバチルスｓｐ．ＲＫ−１の耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗酵素液（硫安分画段階のもの）と実施例４で調製したバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１の耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液をそれぞれ固形分１ｇ当たり１０単位になるように加え、さらに、リン酸濃度１０ｍＭになるようにリン酸カリウムを加えて、６０℃、ｐＨ５．０で７２時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。
【００３９】
この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩した後、濃度約７０％まで濃縮し、トレハロース含有糖液を得た。この糖液を実施例４と同様に高速液体クロマトグラフィーによって分析したチャートを図５に示す。固形分当たりの割合（w/w)はグルコース１．５％、トレハロース６４．５％、マルトース１８．０％、マルトトリオース１１．２％、その他マルトオリゴ糖４．８％であった。
また、前記反応液に固形分１ｇ当たり１単位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業販売／グルコアミラーゼ）を加え、５５℃で８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩した後、濃度約５０％まで濃縮し、ナトリウム型イオン交換カラムで分離を行い、トレハロース画分を分取した。この分取した糖液を濃縮し、固形分７０％で固形分当たり９２％のトレハロースを含有するトレハロース高含有糖液を得た。
さらに、このトレハロース高含有糖液を濃縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得ることができた。
【００４０】
参考例１
バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。
（培養）
ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、マルトース１w/v ％（ｐＨ７．０）からなる、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌した液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気振盪培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
【００４１】
（粗酵素の調製）
分離した培養液に硫安を４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。
（イオン交換クロマトグラフィー）
１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５カラム容量の０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌの上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮、脱塩後、さらに、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００４２】
（疎水クロマトグラフィー）
４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸アンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮、脱塩を行った。
（吸着クロマトグラフィー）
０．３ｍＭとなるようにＣａＣｌ2 を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡＸ  ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃度、脱塩を行った。
【００４３】
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
０．２ＭとなるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア  バイオテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩を行った。
（ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）
上記精製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認できた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によって提供されるマルトースホスホリラーゼは耐熱性を有し、マルトースおよびリン酸からβ−グルコース−１−リン酸を生成する。この酵素、またはこの酵素およびトレハロースホスホリラーゼを用いて、マルトースおよびリン酸から、それぞれβ−グルコース−１−リン酸またはトレハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利に製造することができる。
【００４５】
【表１】
0003691875.tif 000003
【００４６】
【表２】
0003691875.tif 000004
【００４７】
【表３】
0003691875.tif 000005
【００４８】
【表４】
0003691875.tif 000006
【００４９】
【表５】
0003691875.tif 000007
【００５０】
【表６】
0003691875.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図２】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラーゼの熱安定性を示す。
【図３】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラーゼの至適ｐＨを示す。
【図４】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す。
【図５】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼ、および耐熱性トレハロースホスホリラーゼをマルトース高含有糖液に作用させて得られたトレハロース含有糖液を高速液体クロマトグラフィーにより分析したチャートを示す（実施例５）。
【図６】マルトースとリン酸もしくはリン酸塩との反応によるトレハロースの製造に使用し得る、バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図７】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安定性を示す。
【図８】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適ｐＨを示す。
【図９】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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