(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナスカス属に属する微生物を培養し、培養物中から抗酸化物質を採取することを特徴とする抗酸化物質の製造法。
【請求項２】
抗酸化物質の採取を抽出により行う請求項第１項記載の抗酸化物質の製造法。
【請求項３】
抽出を極性の高い溶媒により行う請求項第２項記載の抗酸化物質の製造法。
【請求項４】
モナスカス属に属する微生物の培養物またはその抽出物に含まれる抗酸化物質を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項５】
モナスカス属に属する微生物の培養物またはその抽出物に含まれる抗酸化物質を有効成分とする肝障害予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はモナスカス属に属する微生物からの抗酸化物質の製造法、当該抗酸化物質を有効成分とする抗酸化剤および肝障害予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品中に存在する油脂や脂質が、酸素、光、熱等の影響を受けて変質、劣化する現象（酸化現象は）は一般に良く知られているが、この現象は食品中の油脂のみにとどまらず、生体中の油脂についても起こり、疾病や老化の原因となることが近年知られてきた。
【０００３】
このような酸化現象を防止するものとして、従来、植物、微生物、海産物等の天然物中から抽出された抗酸化物質や、化学合成により得られる抗酸化物質が抗酸化剤として利用されている。
例えば、ブチルヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）等が抗酸化剤として利用されており、例えばこのうちビタミンＣは、畜肉加工品、果実、野菜加工品、飲料、水産加工品、ワイン、漬物等の食品の添加物や、医薬や、化粧品の配合成分として利用されている。
【０００４】
しかし、これらの抗酸化物質にもそれぞれ問題があり、更に新しい抗酸化物質の提供が求められていた。
例えば、化学合成により得られる抗酸化物質の代表的存在であるＢＨＡには、発癌性の問題が指摘されており、現在では煮干し分野のみしか利用されていないという問題があった。 また、ビタミン類等天然物由来の抗酸化物質は、資源的な面から量産するには限界があるものも多いという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、安全性が高く、抗酸化剤として有利に利用できる抗酸化物質を工業的に量産できる方法の開発が求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、天然物中に存在する抗酸化物質について検索を行っていたところ、紅麹菌として知られる微生物の中には極めて抗酸化性の高い物質を産生するものがあることを見出し、当該物質の分離取得に成功した。
【０００７】
すなわち、本発明の第一の目的は、モナスカス属に属する微生物の培養物中から抗酸化物質を抽出することを特徴とする抗酸化物質の製造法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、モナスカス属に属する微生物を培養物またはその抽出物に存在する抗酸化物質を有効成分とする抗酸化剤および肝障害予防・治療剤を提供することである。
【０００８】
本発明において利用されるモナスカス属に属する微生物としては、モナスカス・アンカ（Monascus anka）、モナスカス・ルーバー（M. ruber）、モナスカス・ビトレウス（M. vitreus）、モナスカス・ルビギノサス（M.rubiginosus）、モナスカス・アルビダス（M. albidus）、モナスカス・パープレウス（M. purpureus）、モナスカス・ピロサス（M. pilosus）等が挙げられる。
【０００９】
これらの微生物の培養は、麹製造の常法に従って行なえば良い。  すなわち、麹製造のデンプン質原料として、例えば、精白米、玄米、麦、粟、コウリヤン、ソバ、トウモロコシ、大豆、小豆などの各種の穀類や、それらの糠、フスマ、胚芽、モミガラ等の１種または２種以上あるいは更に、これに各種の炭素源、窒素源、無機質、ビタミン等を加えたものを用い、固体麹法（バラ麹法、併麹法）、液状麹法等の公知方法によって培養すれば良い。一般には２０〜４０℃程度の温度で培養すれば良い。
【００１０】
培養期間は、モナスカス属微生物の場合は１週間程度でも良いが、好ましくは十日間程度以上、例えば２〜３週間程度とすれば良い。
【００１１】
上記のようにして得られる培養物は、固体培養の場合はこれを乾燥したそのままのものでも、また、液体培養の場合は培養物から菌体を除去した培養液でも抗酸化剤として利用できるが、好ましくは培養物中から抗酸化物質を抽出等の手段により取り出し、これを有効成分として抗酸化剤を得ることが好ましい。
【００１２】
培養物から抗酸化物質を抽出するには、培養物を粉砕した後、これに適当な溶媒を加え、十分に浸漬、撹拌した後、遠心分離等により固液を分離すれば良い。
【００１３】
抗酸化物質の抽出に用いられる溶媒としては、極性の高い溶媒、例えば、水、緩衝液の他、メタノール、エタノール、アセトン等や、これらと水の混合溶媒が利用できる。
【００１４】
得られた抽出物中の抗酸化物質の存在の確認は、チオバルビタール酸反応（ＴＢＡ法）によって行っても良いが、ラジカル消去作用を用いる方法により行うことがより好ましい。
【００１５】
斯くして得られた抗酸化物質を含む抽出液は、そのままでも抗酸化剤として用いられるが、一般には、これを濃縮した溶液ないしは乾燥粉末を常法にしたがって公知の担体と組合せ抗酸化剤とすることが好ましい。
濃縮を行う場合は、蒸発濃縮法等によれば良い。 また、乾燥粉末を得る場合は、凍結乾燥法や、スプレードライヤーを用いる方法によれば良い。
なお、本発明の抗酸化性物質は熱に安定であるため、０〜１００℃程度の範囲の各種の濃縮、乾燥方法を利用することができる。
【００１６】
以上のようにして得られる抗酸化剤は、後記実施例に示すように優れた抗酸化性を有するものであり、しかも古くから食品、酒類等の製造に広く利用されている麹菌から得たものであるため、安全性が高いものである。
【００１７】
従って、油脂の酸化防止を目的として、例えば、畜肉加工品、マーガリン等の油脂製品、果実、野菜加工品、飲料、水産加工品、ワイン、漬物、味噌、醤油等の食品に添加される他、化粧品等に添加することができる。
【００１８】
また、上記のごとくして得られる抗酸化物質は、生体中の酸化障害により生じると考えられる疾病、例えば、肝障害、脳神経疾患、肺疾患、循環器疾患等を予防、治療する医薬や、皮膚の老化を予防する化粧品の配合成分としても利用できる。 上記抗酸化物質を医薬として使用する場合には、適当な精製手段を単独または組み合わせて抗酸化物質の純度を挙げた後、公知の薬学的に許容される担体と組合せ、経口用または非経口用の製剤とすれば良い。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等になんら制約されるものではない。
【００２０】
実 施 例  １
紅麹菌（モナスカス属微生物）よりの抗酸化物質の製造：
（１）使用菌株
後記表１に示す紅麹菌を使用した。
（２）製麹および麹抽出物の製造
試験紅麹菌をＰＧＡ培地*のスラントに接種し、３０℃で７日間培養を行い、前培養物を得る。
【００２１】
* ＰＧＡ培地：
（ 組  成 ）
ポテト                      ２００ｇ
グルコース                    ２０ｇ
イースト・エクストラクト        ２ｇ
蒸留水                    １０００ｍｌ
ｐＨ                    ５.６
（ 製  法 ）
ポテトは皮をむき、さいの目に切り規定の半量の水で十分煮えるまで煮沸し、濾過する。 その濾液に蒸留水を加えて規定量にする。
【００２２】
米を一昼夜水に浸漬後、約１時間水を切る。この浸漬米５０ｇを２００ｍｌ容三角フラスコに取り分け、１２１℃で２０分間オートクレーブにかける。 オートクレーブ後、三角フラスコ内の蒸し米を約２５℃に冷ます。 次に、前培養物に滅菌水を５ｍｌ加え、エーゼで胞子をかき取り胞子懸濁液を作成した。 この胞子懸濁液の全てを先の蒸し米に無菌的に接種し、３０℃で１４日間培養する。
なお、培養期間中は、接種米を時々攪拌する。
【００２３】
得られた米麹を凍結乾燥した後、サンプルミルで粉砕し、米麹粉末とした。 この粉末１ｇに対し、４ｍｌの割合の０.０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７.４）緩衝液を加え、３７℃で６０分間振盪した。 次いで、冷却し、４℃で３０分間遠心分離（１２,０００ｒｐｍ）し、得られた上清を麹抽出物とした。
【００２４】
（３）抗酸化作用
上記（２）で得られた麹抽出物の抗酸化作用を、ＤＰＰＨ（１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカルの消去作用により調べた。
反応液としては、１００μＭ ＤＰＰＨのエタノール液 １ｍｌにエタノール １ｍｌ、０.０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７.４）緩衝液 ０.９５ｍｌ、抽出液 ５０μｌを加えて３ｍｌとした物を用い、抽出液添加３０秒後の５１７ｎｍの吸光度を測定した。
【００２５】
ラジカル消去作用は、１００μＭ ＤＰＰＨの吸光度を１００％としたときの各抽出物存在下の吸光度率として求め、抗酸化作用は、この吸光度率が５０％以下を＋＋＋、７０％までを＋＋、８０％までを＋とした。なお、抽出液のみの吸光度をブランクとして差し引いた。
この結果を、抽出物の色と共に表１に示す。
【００２６】
0003683010.tif 000002
【００２７】
実 施 例  ２
麹菌よりの抗酸化物質による肝障害改善作用：
モナスカス属に属する菌の産生する抗酸化物質の肝障害改善作用を、四塩化炭素の薬剤毒性軽減作用により調べた。
【００２８】
（１）製麹および麹抽出物の製造
モナスカス属に属する菌としてモナスカス・アンカ ＩＦＯ ６０８５を用い、実施例１と同様にして得られた米麹粉末を原料とした。 この粉末１ｇに対し、４ｍｌの割合の０.０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７.４）緩衝液を加え、３７℃で６０分間振盪した。 次いで、４℃まで冷却し、同温で３０分間遠心分離（１２,０００ｒｐｍ）し、得られた上清を麹抽出物とした。
【００２９】
（２）薬剤毒性軽減作用
１群４匹の雄性ＳＤ系ラット３群を実験動物として用いた。 ３群の実験動物のうち、１群は本発明群とし、四塩化炭素を腹腔内投与する４８時間前および２４時間前にフェノバルビタールナトリウムを７.５ｍｇ／１００ｇづつ腹腔内投与し、また１２時間前および１時間前には前記米麹抽出物を０.４ｍｌ／１００ｇづつ腹腔内投与した。 一方、他の１群は、四塩化炭素の腹腔内投与４８時間前および２４時間前にフェノバルビタールナトリウムを７.５ｍｇ／１００ｇづつのみを腹腔内投与した比較群、別の１群は四塩化炭素を投与しない対照群とした。 四塩化炭素は、３０％トウモロコシ油溶液として０.０８ｍｌ／１００ｇづつ腹腔内投与した。
【００３０】
四塩化炭素投与１時間後に実験動物を屠殺し、実験動物の肝臓を１.１５％塩化カリウム液で灌流した後、摘出し、肝臓１ｇ当り２ｍｌの１.１５％塩化カリウム液を加えてホモジナイズした。 得られたホモジネートを冷却し、１２,０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、上清を濾過し、４℃で、６０分間、３５,０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００３１】
得られた上清は、サイトゾール画分とし、また、沈澱物は、０.１５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で再懸濁洗浄後、更に前記条件で遠心分離し、沈澱物をミクロソーム画分とした。
【００３２】
これらの画分を用いて、グルタチオン（ＧＳＨ）量、ミクロソーム脂質過酸化物（ＴＢＡＲＳ）量、サイトゾールグルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴｃ）活性およびアニリン・ハイドロオキシダーゼ（ＡＮ）活性を測定した。
これらの結果を表３および表４に示す。
【００３３】
0003683010.tif 000003
【００３４】
0003683010.tif 000004
【００３５】
この結果から明らかなように、本発明の抗酸化物質は、四塩化炭素の毒性を軽減する作用があり、特に、ＧＳＨ量の減少の軽減に対する作用が大きかった。
従って、本発明の抗酸化物質は、肝障害の、治療や予防あるいは軽減に有効である。
【００３６】
実 施 例  ３
紅麹菌よりの抗酸化物質による脂質過酸化反応の抑制作用：
モナスカス属に属する菌の産生する抗酸化物質の脂質過酸化反応の抑制作用を次の方法で調べた。
（１）使用菌株および麹抽出物の製造
実施例２と同じ菌株を用い、同じ方法で得た麹抽出物を用いた。
【００３７】
（２）測定法
ラット肝より定法によりミクロソームを調製し、このミクロソームに種々の濃度の麹抽出物を作用させた後、過酸化水素（１ｍＭ）による脂質過酸化反応が抑制されるかどうかをＴＢＡ（thiobarbituric  acid）法で測定した。
この結果、図１に示すように麹抽出物の濃度に依存して、ミクロソーム脂質過酸化物（ＴＢＡＲＳ）量が低下し、過酸化水素で誘起される脂質の過酸化反応を抑制することがわかった。
【００３８】
実 施 例  ４
麹菌よりの抗酸化物質による肝毒性軽減作用：
モナスカス属に属する菌の産生する抗酸化物質の肝毒性軽減作用を、アセトアミノフェン肝障害およびガラクトサミン肝障害に対する軽減作用により調べた。
【００３９】
（１）製麹および麹抽出物の製造
実施例２と同じ菌株を用い、次のようにして紅麹抽出物を得た。 まず、乾燥紅麹５ｇに蒸留水２５ｍｌを加え、３７℃で６０分間培養した。 この培養物を４℃で３０分間、１２,０００ｒｐｍの遠心分離にかけ、上清と沈澱物に分けた。 沈澱物は更に蒸留水２５ｍｌを加え、再度３７℃で６０分間培養し、前記と同一の条件で遠心分離し、上清を得た。 この上清と最初に得た上清を合わせ、濃縮して紅麹抽出物１.７ｇを得た。
【００４０】
次いで、この紅麹抽出物をセファデックスＧ−７５カラムクロマトグラフィー（カラム；φ２.６×７９ｃｍ（４２０ｍｌ）, 溶媒； 蒸留水, 分画；４００ドロップ（１３ｍｌ）／チューブ）に付し、ＤＰＰＨラジカルの消去作用を持つ分画番号２８−３３を集め、これを濃縮して紅麹抽出分画物１.４８ｇを得た。この紅麹抽出分画物を２０ｍｌの蒸留水に溶解し、更にこれを３０倍に希釈して紅麹分画物溶液とした。
【００４１】
（２）アセトアミノフェン肝障害軽減作用
１群３匹の雄性ＳＤ系ラット３群を実験動物として用いた。 ３群の実験動物のうち、１群は本発明群とし、アセトアミノフェンを腹腔内投与する２４時間前に３−メチルコランスレンを２５ｍｇ／ｋｇづつ腹腔内投与し、また１２時間前および１時間前には前記紅麹分画物溶液を０.４ｍｌ／１００ｇづつ腹腔内投与した。 一方、他の１群は、アセトアミノフェンの腹腔内投与２４時間前に３−メチルコランスレンを２５ｍｇ／ｋｇづつのみを腹腔内投与した比較群、別の１群はアセトアミノフェンを投与しない対照群とした。 アセトアミノフェンの投与量は、１８０ｍｇ／ｋｇとした。
【００４２】
アセトアミノフェンの投与３時間後にラットを断頭により殺し、切り口より血液を採取した。 次いで、ラットの肝臓を１.１５％塩化カリウム液で灌流した後、摘出し、２倍量の同塩化カリウム溶液を加えてホモジナイズ後、１２,０００ｒｐｍで３０分間４℃にて遠心した。 得られた上清を３５,０００ｒｐｍで６０分間遠心し、上清をサイトゾール、沈殿をミクロソームとした。 ミクロソームはさらに０.１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で２回遠心したものを使用した。
【００４３】
（３）ガラクトサミン肝障害軽減作用
アセトアミノフェン１８０ｍｇ／ｋｇに代えてガラクトサミン４００ｍｇ／ｋｇを投与し、血液および肝臓の採取を２４時間後とする以外は上記（２）と同様にしてガラクトサミンによる肝毒性を調べた。
【００４４】
（４）肝毒性の測定
常法に従い、血清中のトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性、肝サイトゾールおよびミクロソームのＧＳＴ活性、肝ホモジネート中のグルタチオン（ＧＳＨ）量を測定した。
アセトアミノフェンを投与した場合の血清中のＧＳＴおよびＧＯＴを表５、サイトゾールおよびミクロソーム中のＧＳＴおよび肝ホモジュネート中のＧＳＨを表６に、ガラクトサミンを投与した場合の血清中のＧＳＴおよびＧＯＴを表７、サイトゾールおよびミクロソーム中のＧＳＴおよび肝ホモジュネート中のＧＳＨを表８にそれぞれ示す。
【００４５】
0003683010.tif 000005
【００４６】
0003683010.tif 000006
【００４７】
0003683010.tif 000007
【００４８】
0003683010.tif 000008
【００４９】
表５および表７に示すように、肝毒性を表す血清ＧＯＴ、ＧＳＴ活性は、アセトアミノフェン、ガラクトサミン投与によって増加するが（比較群）、この増加は、紅麹分画物溶液の前投与で抑制された（本発明群）。 また表８に示すように、ガラクトサミンの投与によりグルタチオン量は減少したが、紅麹分画物溶液の投与によりコントロールレベルに回復した。
【００５０】
肝毒性は血中逸脱酵素であるＧＯＴ、ＧＳＴの上昇を指標とし、それらの値が高い程、肝障害の程度は大きく、これらの値が減少すれば肝障害が抑制されたことを示すとされている。 そして、上記表５および表７に示すように、アセトアミノフェンまたはガラクトサミン投与によるこれら酵素の上昇は、いづれも紅麹分画物溶液により抑制された。 また、ガラクトサミンで試験した場合は、紅麹分画物溶液の前投与により血清ＧＳＴ値はほぼ正常レベルに戻っており、また、グルタチオンも正常レベルに回復している。
【００５１】
肝グルタチオンは体内の還元剤として作用し、このレベルが低いことは酸化ストレスを受けたことを示すとされるので、アセトアミノフェンやガラクトサミンにより強い酸化ストレスをひき起こすが、紅麹分画物溶液を前投与することにより、グルタチオン量を増し、これら薬剤による酸化ストレス性の肝障害を抑えるものと解される。
また、ガラクトサミンによる肝障害は肝炎のモデルとして用いられており、本酸化物質は抗肝炎作用を有することを示している。
このように、紅麹抽出成分は強い肝保護効果を有するものであり、肝障害予防・治療剤として有用であることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】
本発明方法によれば、優れた抗酸化性と安全性を有する抗酸化物質が得られる。 また、その原料も微生物を利用するものであるため、量産することが容易なものである。
そして、得られた抗酸化物質は通常の抗酸化作用の他、過酸化脂質や薬物等の原因による肝障害を抑制する作用をも有するので、食品添加用あるいは化粧品配合成分用の抗酸化剤の他、いわゆる肝保護薬、肝炎治療剤等の肝障害予防・治療剤としても有利に利用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  麹抽出物の濃度とミクロソーム脂質過酸化物量の関係を示す図面。
以    上
【図１】
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