(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質合成活性を有し、且つ胚芽抽出物から該胚芽抽出物に混入する胚乳成分及び分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去されている調製済み無細胞タンパク質合成用植物胚芽抽出液。
【請求項２】
分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質が、透析によって除去され得るものである、請求の範囲１記載の植物胚芽抽出液。
【請求項３】
分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質が、排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜を用いた透析によって除去され得るものである、請求の範囲２記載の植物胚芽抽出液。
【請求項４】
不溶性物質を実質的に含まない請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液。
【請求項５】
植物胚芽抽出液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の植物胚芽抽出液。
【請求項６】
タンパク質合成活性を有する植物胚芽抽出液から、該植物胚芽抽出物に混入する胚乳成分を除去すること及び分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質を除去することをタンパク質合成前に行うことを特徴とする無細胞タンパク質合成用植物胚芽抽出液の製造方法。
【請求項７】
植物胚芽抽出液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする請求の範囲６に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質合成活性を有する細胞抽出液から分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質を排除することにおいて、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造方法。
【請求項９】
分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質が、透析によって除去され得るものである、請求の範囲６〜８のいずれか１に記載の方法。
【請求項１０】
分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質が、排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜を用いた透析によって除去され得るものである、請求の範囲９記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質合成阻害物質の排除が、翻訳鋳型を除く無細胞タンパク質合成に必須の成分を含む溶液中で行われることを特徴とする請求の範囲６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質合成に必須の成分が、無細胞タンパク質合成反応を行い得る濃度で溶液中に含められていることを特徴とする請求の範囲１１記載の方法。
【請求項１３】
請求の範囲６〜１２のいずれか１項に記載の方法によって製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液。
【請求項１４】
請求の範囲１〜５又は１３のいずれか１項に記載の抽出液を用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項１５】
少なくとも請求の範囲１〜５又は１３のいずれか１項に記載の抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質合成反応活性の促進された無細胞タンパク質合成に用いられる細胞抽出液、およびその製造方法等に関するものである。
背景技術
タンパク質を自由自在に合成する技術を開発することは、生命科学やバイオテクノロジー分野のみならず、ナノマシーンの設計や、ニューラルコンピューター等工学分野における分子素子の開発に大きく貢献することが期待される。現在、タンパク質の合成にはクローン化したＤＮＡを生細胞に導入する遺伝子工学的手法が広く利用されているが、この方法で生産可能な外来性タンパク質は宿主の生命維持機構をくぐり抜けられる分子種に限られてしまう。一方、有機合成技術の進展によって自動合成機が普及し、数十個のアミノ酸から成るペプチドを合成することは日常的となっているが、分子量のより大きなタンパク質を化学的に合成することは収率や副反応等の限界から現在においてもきわめて困難である。さらに欧米では、生体をそのまま利用する従来型のタンパク質生産や新規分子探索方法に対する倫理的な批判が強く、国際的な規制がさらに厳しくなる懸念もある。
このような問題点を打破する新しいタンパク質合成法として、化学的手法を取り入れ、生物体の優れた特性を最大限に利用しようとする、無細胞タンパク質合成法を挙げることができる。この方法は、生体の遺伝情報の翻訳系を人工容器内に取り揃え、設計・合成した核酸を鋳型として、非天然型をも含む望みのアミノ酸を取り込むことのできる系を再構築するというものである。このシステムでは、生命体の制約を受けることがないので、合成可能なタンパク質分子種を殆ど無限大にまで広げることが期待できる。
無細胞タンパク質合成系については、すり潰した細胞液にタンパク質合成能が残存することが４０年前に報告されて以来、種々の方法が開発され、大腸菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球由来の細胞抽出液はタンパク質合成等に現在も広く利用されている。無細胞系における翻訳速度はｉｎ  ｖｉｖｏとほぼ同等で、１０ペプチド結合／秒であり高速性および翻訳の正確性にも優れた反応特性を発揮するものの、いずれの無細胞系においても合成持続時間が短く、得られる収量は反応容量１ｍｌ当り数μｇ乃至数十μｇで生細胞の１／１００から１／１０００程度と極端に低く、タンパク質の合成法としては実用的でなかった。
従来の無細胞タンパク質合成系の最大の欠点は、合成効率がきわめて低いことであるが、この原因について正面から研究されたことはなかった。細胞を物理的に破砕し、人工の緩衝液で調製した細胞抽出液中の活性が少々低いのは生化学分野ではごく常識のことであったからである。
先に発明者らは、これまでのリボソーム不活性化毒素の研究から得た知見をもとに、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系に見られる極端なタンパク質合成活性の低下現象が対病原微生物防御機構として本来細胞にプログラムされた自己リボソームの不活性化機構（細胞自殺機構）のスイッチが、胚芽破砕が引き金となって起動することに起因することを明らかにしている（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４（２０００））。そして、トリチン活性などを胚芽組織から排除する新規方法で調製したコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成反応が長時間に渡って高いタンパク質合成特性を発揮するようになることを実証した（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４（２０００）、特開２０００−２３６８９６号公報）。
しかしながら、このような方法により調製されたコムギ胚芽抽出液でも、他の阻害因子の影響により目的とするタンパク質（例えば転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質等）によっては必ずしも十分な収量が得られない等の問題があった。
また、従来の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、タンパク質合成に必要なアミノ酸、エネルギー源やイオン等を含む溶液を添加するとその保存性に問題が生じていた。そのため細胞抽出液とエネルギー源等を含む溶液は別々に提供されており、実験者はそれらを実験の都度に翻訳鋳型とともに混合する必要があった。またその操作は低温で行う必要があること等から実験操作全体が煩雑となり、しばしばタンパク質合成の失敗の原因となっていた。さらにこのような無細胞タンパク質合成反応用試薬の提供方法は、多数の遺伝子からのタンパク質の網羅的合成には不向きであり、将来のロボット化に向けてこのような煩雑さといった欠点は解消しなければならない最大の課題であった。
発明の開示
本発明は、無細胞タンパク質合成反応において、その工程の煩雑さ、あるいは目的とするタンパク質合成活性の低さを改善するために、タンパク質合成活性の促進された細胞抽出液を提供すること、さらにはコムギ胚芽無細胞タンパク質合成に当たって反応混液の調製を必要とせず、目的とする翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）を添加するだけで、遺伝子産物の機能・構造の解析のための網羅的タンパク質合成や大量合成を簡便且つ効率的に可能とする保存性の高い細胞抽出液（すなわち、レディーメイド型細胞抽出液）を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コムギ胚芽抽出液を排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトン程度の再生セルロース膜を用い、透析を行うことによって、該抽出液から低分子物質を取り除いたところ、該細胞抽出液のタンパク質合成活性が著しく促進されることを見出した。さらに、当該低分子物質の透析法による排除を、無細胞タンパク質合成に必要な成分のうち翻訳鋳型を除く全てを含む溶液中で行ったところ、処理後の細胞抽出液は、従来の細胞抽出液よりもタンパク質合成活性が促進されていた。またこれを−８０℃で４週間保存した後にもそのタンパク質合成活性は低下することがなかったため、これをレディーメイド型細胞抽出液として用い得ることが判った。
本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、本発明によれば、
（１）タンパク質合成活性を有し、且つ低分子のタンパク質合成阻害物質を含まないことを特徴とする、細胞抽出液、
（２）低分子のタンパク質合成阻害物質が、排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜を用いた透析によって除去され得るものである、上記（１）記載の細胞抽出液、
（３）低分子のタンパク質合成阻害物質が分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質である、上記（１）記載の細胞抽出液、
（４）不溶性物質を実質的に含まない上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞抽出液、
（５）細胞抽出液がコムギ胚芽抽出液であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の細胞抽出液、
（６）タンパク質合成活性を有する細胞抽出液から低分子のタンパク質合成阻害物質を排除することを特徴とする無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造方法、
（７）低分子のタンパク質合成阻害物質が、排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜を用いた透析によって除去され得るものである、上記（６）記載の方法、
（８）低分子タンパク質合成阻害物質が分子量１４，０００ダルトン以下のタンパク質合成阻害物質である、上記（６）記載の方法、
（９）細胞抽出液がコムギ胚芽抽出液であることを特徴とする上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法、
（１０）タンパク質合成阻害物質の排除が、透析により行われることを特徴とする上記（６）〜（９）のいずれか１項に記載の方法、
（１１）タンパク質合成阻害物質の排除が、少なくとも高エネルギーリン酸化合物を含む溶液中で行われることを特徴とする上記（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法、
（１２）タンパク質合成阻害物質の排除が、翻訳鋳型を除く無細胞タンパク質合成に必須の成分を含む溶液中で行われることを特徴とする上記（６）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法、
（１３）タンパク質合成に必須の成分が、無細胞タンパク質合成反応を行い得る濃度で溶液中に含められていることを特徴とする上記（１２）記載の方法、
（１４）上記（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法によって製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、
（１５）上記（１）〜（５）、および（１４）のいずれか１項に記載の細胞抽出液を用いることを特徴とするタンパク質合成方法、
（１６）少なくとも上記（１）〜（５）、および（１４）のいずれか１項に記載の細胞抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成を行うためのキット、
（１７）上記（１５）に記載の方法または上記（１６）に記載のキットを用いることによって取得されたタンパク質、
が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、コムギ胚芽抽出液の透析による不溶性物質の生成と、ＡＴＰによるその阻止作用を示す図である。
図２は、ＡＴＰの非存在、存在下における透析膜内の可溶性タンパク質と不溶性タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分析結果を示す電気泳動像である。
図３は、ＡＴＰの非存在下、または存在下で透析を行って得られた細胞抽出液（透析処理後）のタンパク質合成活性を示す図である。
図４は、透析によって生成した不溶性物質中の核酸成分、特にＲＮＡの定量、定性分析結果を示すグラフ、および電気泳動像である。
図５は、透析処理後の不溶性物質中の核酸成分（ＲＮＡ）の定量と、可溶性画分のタンパク質合成活性を示す図である。
図６は、バッチ法による安定化成分の添加のタンパク質合成活性に与える効果を示す図である。
図７は、細胞抽出液を透析処理することによるタンパク質合成促進効果の温度依存性を示す図である。
図８は、コムギ胚芽に含まれる、セファデックスＧ２５カラムにより分画される物質のタンパク質合成阻害作用を示す図である。
図９は、レディーメイド型のコムギ胚芽由来細胞抽出液の性能を示す図、および電気泳動像である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）無細胞タンパク質合成を阻害する低分子物質の排除
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の調製に用いられる細胞抽出液としては、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成能を有するものであれば如何なるものであってもよい。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、およびその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明における無細胞タンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写／翻訳系のいずれをも含む。
本発明に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。
市販の細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳTM（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液を用いることが好ましく、植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物のものが好ましい。本発明の細胞抽出液としては、このうちコムギ胚芽抽出液を用いたものが好適である。
コムギ胚芽抽出液の作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）、あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０等に記載の方法を用いることができるが、以下にさらに詳細に説明する。
通常、胚芽の部分は非常に小さいので胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。具体的には、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水または水溶液もしくは界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、胚乳成分の除去に十分且つ胚芽成分のタンパク質合成活性に悪影響を及ぼさない濃度で使用され得るが、例えば０．５％の濃度で使用することができる。水または水溶液による洗浄処理および界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
本発明においては、上記のように植物種子を粉砕して得られた粉砕物から植物胚芽を選別した後洗浄して得られた無傷（発芽能を有する）の胚芽を（好ましくは抽出溶媒の存在下に）細分化した後、得られるコムギ胚芽抽出液を分離し、更に精製することにより無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出液を得る。
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよび／またはチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのがより好ましい。
細分化の方法としては、摩砕、圧砕等粉砕方法として従来公知の方法を採用することができるが、本発明者が開発した衝撃または切断により胚芽を細分化する方法（特願２００２−０２３１３９）が好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕または圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、好ましくは１０℃以下で操作が可能な範囲内、特に好ましくは４℃程度が適当である。
このように衝撃または切断により胚芽を細分化することにより、胚芽の細胞核や細胞壁を全て破壊してしまうのではなく、少なくともその一部は破壊されることなく残る。即ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在するタンパク質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
このような方法によれば、従来の植物胚芽を粉砕する工程と粉砕された植物胚芽と抽出溶媒とを混合してコムギ胚芽抽出液を得る工程とを同時に一つの工程として行うことができるため効率的にコムギ胚芽抽出液を得ることができる。上記の方法を、以下、「ブレンダー法」と称することがある。
このような植物胚芽の細分化、特に衝撃または切断による細分化は、抽出溶媒の存在下に行うことが好ましいが、細分化した後に抽出溶媒を添加することもできる。
次いで、遠心分離等によりコムギ胚芽抽出液を回収し、ゲルろ過等により精製することによりコムギ胚芽抽出液を得ることができる。ゲルろ過としては、例えば予め適当な溶液で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるもの（例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトールまたはＬ型アミノ酸を含む溶媒）を採用すればよい。
好ましくはこのようにして得られた細胞抽出液は、ＲＮａｓｅ活性およびホスファターゼ活性が極めて低減されたものである。
ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入の可能性のある微生物が除去可能なものであれば特に制限はないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子のサイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔTM等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、次に混入の可能性のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。
このようにして得られた細胞抽出液は、原料細胞自身が含有するまたは保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いたコムギ胚芽抽出液のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
このような細胞抽出液は、上記の好ましい細分化方法を用いた場合でも低分子のタンパク質合成阻害物質（以下、これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）をある程度含有しているため、細胞抽出液の構成成分から、これら低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画排除する。排除されるべき物質（低分子合成阻害物質）の分子量は、細胞抽出液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子よりも小さいものであればよいが、後述するように当該低分子合成阻害物質を排除するのにどの様な方法を用いるかによって変わり得る。例えば排除分子量が１２，０００〜１４，０００ダルトン程度の再生セルロース膜を用いた透析によって低分子合成阻害物質を排除する場合には、当該透析により排除される物質の分子量であって、具体的には分子量５０，０００〜１４，０００ダルトン以下、好ましくは１４，０００ダルトン以下が例示される。
低分子合成阻害物質の細胞抽出液からの排除方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。本発明において低分子合成阻害物質を「含まない」とは、上記した種々の方法によって低分子合成阻害物質を排除する処理を行ったのと同程度にまで、該低分子合成阻害物質が含まれていないことを意味し、排除されたか否かは、得られる細胞抽出液のそのタンパク質合成活性の高さでもって確認することができる。
透析による方法（透析法）が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。以下、透析法を用いる場合を例に詳細に説明する。
透析に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００ダルトンの排除分子量を有するものが挙げられる、具体的には排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｓａｌｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ製）や、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＴＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の上記細胞抽出液を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
（２）不溶性物質の生成阻害（細胞抽出液の安定化）
低分子合成阻害物質の排除を行う際、細胞抽出液に不溶性物質が生成される場合には、これを阻害する（以下、これを「細胞抽出液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出液（以下、これを「処理後細胞抽出液」と称することがある）のタンパク質合成活性が高まる。ここで不溶性物質とは、低分子合成阻害物質の排除工程にある細胞抽出液を適当な条件、具体的には遠心分離やろ過等、特に１０，０００〜８０，０００×ｇ、好ましくは３０，０００×ｇ程度、５〜６０分間、好ましくは２０分間程度の遠心分離によって沈殿として回収される物質である。
細胞抽出液の安定化の具体的な方法としては、上記（１）に記載した低分子合成阻害物質の排除を行う際に、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等を含む溶液中で行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、および２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
これらの成分（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液中で低分子合成阻害物質の排除を行う場合は、細胞抽出液に予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子合成阻害物質の排除工程に供してもよい。低分子合成阻害物質の排除に透析法を用いる場合は、細胞抽出液だけでなく透析外液にも安定化成分を添加して透析を行い低分子合成阻害物質の排除を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
安定化成分の添加量、および安定化処理時間としては、細胞抽出液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量および種類を種々に変えて安定化成分を細胞抽出液に添加し、適当な時間の後に低分子合成阻害物質の排除工程を行い、取得された処理後細胞抽出液を遠心分離等の方法で可溶性画分と不溶性画分に分離し、そのうちの不溶性物質の生成が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行い、タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上記の選択方法において、低分子合成阻害物質の排除工程として透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出液中の不溶性物質の量や、得られた細胞抽出液のタンパク質合成活性等により選択する方法も挙げられる。安定化処理した細胞抽出液に含まれる不溶性物質の量としては、低減されていることが好ましい。
本発明の細胞抽出液において、不溶性物質を「実質的に含まない」とは、上記した種々の方法によって低分子合成阻害物質を排除する処理を行った細胞抽出液と同程度にまで、不溶性物質が除去されていることを意味し、排除されているか否かは、得られる細胞抽出液のそのタンパク質合成活性の高さでもって確認することができる。
このようにして選択された細胞抽出液の安定化条件の例として、具体的には、（１）に記載したブレンダー法を用いて調製したコムギ胚芽抽出液で、透析法により低分子合成阻害物質の排除工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出液、および透析外液中に、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、タンパク質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
細胞抽出液への安定化成分の添加方法は、特に制限はなく、低分子合成阻害物質の排除工程の前に添加しこれを適当時間インキュベートして安定化を行った後、低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよいし、安定化成分を添加した細胞抽出液、および／または安定化成分を添加した該排除工程に用いるための緩衝液を用いて低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよい。
本発明の細胞抽出液、好ましくは透析処理後の細胞抽出液、特に好ましくは、不溶性物質を実質的に含まない細胞抽出液は、いずれの状態でも保存可能であるが、特に低温、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下で保存し得る。また凍結乾燥状態による保存も特に好ましい。後述するが、レディーメイド型の細胞抽出液の場合、凍結乾燥状態で保存し、用時、溶解して翻訳鋳型を添加するだけでタンパク質合成を実施することが可能となるのでより好適な態様である。
（３）無細胞タンパク質合成
かくして取得された低分子合成阻害物質が排除された細胞抽出液は、これをそれぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入し、タンパク質合成を行うことができる。タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、該細胞抽出液に無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＷＯ００／６８４１２）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）等を用いることができる。
このうち、バッチ法ではタンパク質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸やエネルギー源の連続、または不連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。ここで、上記（１）に記載のブレンダー法によりコムギ胚芽抽出液を調製した場合にはｔＲＮＡを充分に含んでいるため通常これを添加する必要が無い。
バッチ法によりタンパク質合成を行う場合には、例えば翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後に翻訳鋳型を添加してインキュベートすること等により行うことができる。コムギ胚芽抽出液を用いた場合、上記プレインキュベートは１０〜４０℃で５〜１０分間、インキュベートは同じく１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で行う。反応時間は、反応が停止するまでの時間であるが、バッチ法では通常１０分〜７時間程度である。
透析法によりタンパク質合成を行う場合には、合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、タンパク質合成を行う。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製：透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製：１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
透析外液としては、上記合成反応液から翻訳鋳型を除いたものが用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度、および時間は用いるタンパク質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で１０分〜１２日間行うことができる。
重層法を用いてタンパク質合成を行う場合には、合成反応液を適当な容易に入れ、該溶液上に、上記透析法に記載した透析外液を界面を乱さないように重層することによりタンパク質合成を行う。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応相とする。容器としては、例えばマイクロタイタープレート等が挙げられる。この反応相の上層に上記透析法に記載した透析外液（供給相）を界面を乱さないように重層して反応を行う。
両相の界面は必ずしも重層によって水平面状に形成させる必要はなく、両相を含む混合液を遠心分離することによって、水平面を形成することも可能である。両相の円形界面の直径が７ｍｍの場合、反応相と供給相の容量比は１：４〜１：８が適当であるが、１：５が好適である。両相からなる界面面積は大きいほど拡散による物質交換率が高く、タンパク質合成効率が上昇する。従って、両相の容量比は、両相の界面面積によって変化する。合成反応は静置条件下で、反応温度、および時間は用いるタンパク質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては１０〜４０℃で、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で、通常１０〜１７時間行うことができる。また、大腸菌抽出液を用いる場合、反応温度は３０〜３７℃が適当である。
不連続ゲルろ過法を用いてタンパク質合成を行う場合には、合成反応液により合成反応を行い、合成反応が停止した時点で、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を供給し、合成物や分解物を排出することによりタンパク質合成を行う。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応を行う。容器としては、例えばマイクロプレート等が挙げられる。この反応下では、例えば容量の４８％容のコムギ胚芽抽出液を含む反応液の場合には反応１時間で合成反応は完全に停止する。このことは、アミノ酸のタンパク質への取りこみ測定やショ糖密度勾配遠心法によるポリリボソーム解析（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００））により確認することができる。
合成反応の停止した上記反応溶液を、予め上記透析法に記載の透析外液と同様の組成の供給液により平衡化したゲルろ過カラムに通す。このろ過溶液を再度適当な反応温度に保温することにより、合成反応が再開し、タンパク質合成は数時間に渡って進行する。以下、この反応とゲルろ過操作を繰り返す。反応温度、および時間は用いるタンパク質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては２６℃で約１時間ごとにゲルろ過を繰り返すのが好ましい。
かくして得られたタンパク質は、それ自体既知の方法により確認することができる。具体的には例えば、アミノ酸のタンパク質への取りこみ測定や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色、オートラジオグラフィー法（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００））等を用いることができる。
また、かくして得られる反応液には、目的タンパク質が高濃度に含まれているので、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過等のそれ自体既知の分離、精製法により、該反応液から目的タンパク質を容易に取得することができる。
（４）無細胞タンパク質合成用レディーメイド型細胞抽出液
上記（１）、あるいは（２）の低分子合成阻害物質の排除工程、および該工程における細胞抽出液の安定化工程を、無細胞タンパク質合成に必要な成分のうち翻訳鋳型以外の全てを含む溶液中で行うことによりレディーメイド型細胞抽出液を作製することができる。無細胞タンパク質合成に必要な成分のうち翻訳鋳型以外の全てとは、使用する細胞抽出液の由来によっても異なり、また、本発明の無細胞タンパク質合成が無細胞翻訳系であるのか、あるいは無細胞転写／翻訳系であるのかによっても異なる。コムギ胚芽の無細胞翻訳系の場合には、基質となるアミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰおよびＧＴＰ）を少なくとも含み、無細胞転写／翻訳系の場合には上記成分に加え、基質となる核酸、ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。具体的には、コムギ胚芽の無細胞翻訳系の場合には、好ましくは、基質となるアミノ酸、エネルギー源に加え、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等のうちの１つ以上がさらに含まれる。具体的な濃度としては、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭが好ましい。その他の各成分についても当分野で通常用いられる濃度で含められる。ここで、細胞抽出液として上記（１）に記載したブレンダー法により調製したコムギ胚芽抽出液を用いる場合には、通常ｔＲＮＡの添加は必要無い。
（５）試薬、およびキット
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、好ましくは処理後細胞抽出液、およびレディーメイド型細胞抽出液は、これを含む無細胞タンパク質合成反応用キットとして提供することができる。本発明のキットには、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液あるいは処理後細胞抽出液の場合には、これ以外に該タンパク質合成系に必須のあるいは適した成分、具体的には基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｒＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等や、界面活性剤、ＲＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール用翻訳鋳型核酸、翻訳鋳型を作製するためのベクター、反応容器等が含まれる。また、レディーメイド型細胞抽出液の場合には、上記のタンパク質合成系に必須の、あるいは適した成分は全て含まれているため、それ以外のものを含む。しかし、これら全ての試薬類を含む必要はなく、無細胞タンパク質合成に用い得るキットであれば如何なる試薬の組み合わせのものでもよい。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産チホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製：Ｒｏｔｏｒ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｌｌ  ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に粉砕した。篩で発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光および／または透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたものまたは基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｍ2となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、ベージュ色のベルトを取り付け、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、濃緑色のベルトに取り替えて、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ：ナカライ・テクトニクス社製）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得、以下の操作を４℃で行った。
洗浄した胚芽湿重量に対して２倍容量の抽出溶媒（８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．８、２００ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、８ｍＭジチオスレイトール、（各０．６ｍＭの２０種類のＬ型アミノ酸を添加しておいてもよい））を加え、ワーリングブレンダーを用い、５，０００〜２０，０００ｒｐｍで３０秒間ずつ３回の胚芽の限定破砕を行った。このホモジネートから、高速遠心機を用いた３０，０００×ｇ、３０分間の遠心により得られる遠心上清を再度同様な条件で遠心し、上清を取得した。本試料は、−８０℃以下の長期保存で活性の低下は見られなかった。取得した上清をポアサイズが０．２μｍのフィルター（ニューステラデイスク２５：倉敷紡績社製）を通し、ろ過滅菌と混入微細塵芥の除去を行った。
次に、このろ液をあらかじめ溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８，１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭジチオスレイトール、各０．３ｍＭの２０種類Ｌ型アミノ酸混液（タンパク質の合成目的に応じて、アミノ酸を添加しなくてもよいし、標識アミノ酸であってもよい））で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク）でゲルろ過を行った。得られたろ液を、再度３０，０００×ｇ、３０分間遠心し、回収した上清の濃度を、Ａ２６０ｎｍが９０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．４〜１．６）となるように調整した後、下記の透析処理やタンパク質合成反応に用いるまで、−８０℃以下で保存した。
実施例２ コムギ胚芽抽出液からの低分子物質の排除とタンパク質合成反応活性の解析
（１）透析膜による分画
実施例１で調製したコムギ胚芽抽出液は、タンパク質合成に必要な因子（ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、翻訳開始因子、ペプチド鎖伸長因子、翻訳終結因子等）と、それ以外の分子、特にタンパク質合成を特異的、または非特異的に阻害する物質を含んでいるので、これを分子量の違いを利用して画分し、タンパク質合成阻害物質を排除したコムギ抽出液を調製することを試みた。
分画には透析膜を用いた。透析膜は排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。この排除分子量はタンパク質合成に必要な因子を通さず、それ以下の分子量を有する分子を画分し得るものとして選択した。
透析に供するコムギ胚芽抽出液は、抽出液１として、タンパク質合成反応に用いる液から、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸を含まないもの（全容量の２／３容のコムギ胚芽抽出液（実施例１で調製したもの）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭジチオスレイトール、０．３８０ｍＭスペルミジン、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）、また抽出液２として、抽出液１に１．２ｍＭのＡＴＰを添加したものを調製した。
透析は、上記のそれぞれの抽出液と、胚芽抽出液を含まない以外は全て同組成の溶液を透析外液として抽出液の５０倍量を用い、２６℃、または４℃で１２時間静置して行った。これらの透析内液（抽出液）から経時的に試料を取り出し、以下のとおり、タンパク質合成活性と抽出液の安定性を計るものとして遠心による沈殿量を解析した。また、透析膜により排除された成分についても解析した。
（２）抽出液の安定性の解析
（１）で透析を行っている抽出液から１時間ごとに１２時間まで試料を取り出し、これを２０，０００×ｇ、２０分間の遠心分離を行った。ここで上清として得られる可溶性画分と沈殿として得られる不溶性画分のそれぞれに含まれるタンパク質量を雄ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード法により測定した結果を図１に示す。図１の（Ａ）は上記抽出液１（ＡＴＰ無し）によるものであり、（Ｂ）は抽出液２（ＡＴＰ添加）によるものである。また■で表されるグラフは可溶性画分内のタンパク質量を、また●で表されるグラフは不溶性画分内のタンパク質量を示す。タンパク質量は、抽出液１ｍｌ当たりのものである。
図１に示されるように、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸を含まない抽出液１においては、透析開始２時間後に急激な可溶性タンパク質の低下が観察され、その後ほぼ一定値に達し、透析開始１２時間後の濃度は開始時の７７．５％であった。不溶性タンパク質の量は逆に増加していることから、この可溶性タンパク質濃度の減少は、主に透析中に生じたタンパク質の不溶化に起因していることがわかった。また、ＡＴＰを添加した抽出液２においては、可溶性タンパク質濃度の低下曲線からその減少速度は穏やかで、不溶化するタンパク質の割合は低く、１２時間後においても８５．３％が可溶性タンパク質として存在していた。これらの結果より、ＡＴＰの添加により透析中のコムギ胚芽抽出液の不溶化が抑えられ、該液の安定性が高まったといえる。
（３）ＡＴＰ非添加の透析によって生じた不溶性タンパク質、および可溶性タンパク質の分析
上記（２）で取得した可溶性、および不溶性画分のうち、透析６時間、および１２時間のものをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した結果を図２に示す。図中（Ａ）は透析内液の試料を、また（Ｂ）は透析外液の試料をそれぞれ用いた結果を示す。左端のカラムは分子量マーカーであり、その右側は透析を行う前の抽出液を試料としたもの、またＡＴＰ添加−が抽出液１を、＋が抽出液２を試料としたものを示す。さらに上記（２）の遠心分離により得られた分画は、上清と沈殿として示している。
図から明らかなように、ＡＴＰ非存在下と存在下で可溶性タンパク質（上清）成分に顕著な差は認められないが、不溶性画分（沈殿）においては著しい差異が見られた。ＡＴＰ非存在下に生じた不溶性タンパク質中には、分子量５０，０００前後のタンパク質バンドが複数みられるものの、ＡＴＰ存在下のそれにはＣＢＢ陽性のタンパク質バンドが検出されなかった。
透析外液のタンパク質については、透析外液を取得後１０％トリクロロ酢酸によって沈殿回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。この結果（図２（Ｂ））より１２時間後の透析外液中に、ゲルの先端部に泳動される分子量１４，０００前後の微量の低分子が検出された。
また、雄ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として、デンシトメーター法で算出した透析外液中のタンパク質量は、透析試料容量１ｍｌ当たり７μｇ（ＡＴＰ存在下）と２３μｇ（ＡＴＰ非存在下）であり、上記（１）で行った透析によって排除されるタンパク質は、質量ともに両透析条件で有意義な差異は認められなかった。透析前後における可溶性タンパク質量の差は、両実験ともに、不溶性タンパク質と透析膜外に排除されたタンパク質量の和よりも大きいことから、透析中にタンパク質の膜への吸着があることを示している。しかし透析前後のタンパク質バンドの電気泳動パターンに差が見られない（未透析試料と上清タンパク質のバンドを比較）ことから考えて、用いた透析膜が特定のタンパク質分子種を特異的に吸着したものではないことがわかる。
（４）透析後のコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成活性の測定
上記（２）に記載した透析を０、２、４、６、１２時間行ったコムギ胚芽抽出液をそれぞれタンパク質合成に用いた。連続式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成の方法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０；Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，５５９−５６４）に従って、一部改変して行った。すなわち、透析膜中に上記透析で調製されたコムギ胚芽抽出物含有液６μｌを含む蛋白質合成用反応液２５μｌ（それぞれ最終濃度で、２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．３ｍＭ  Ｌ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、０．５μｇ／ｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および翻訳鋳型ｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）１μｇ）を入れ、反応溶液の１０倍容量の透析外液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．００５％ＮａＮ3）に対しての透析系で、反応は２６℃で４８時間行った。透析膜は、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，  ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをフェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Ｎｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により精製して用いた。
反応終了後の合成反応液中のタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離とクマシーブリリアントブルーによる染色法と定量法は遠藤らの論文（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４（２０００））に記載した方法によった。ＧＦＰ活性はＴｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０  Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用い添付の手技に従って蛍光強度から定量した。これらの結果を図３に示す。
図から明らかなように、ＡＴＰ存在下の透析によって得たコムギ胚芽抽出液試料（白捧グラフ）は、透析時間が長くなるにしたがってタンパク質合成が促進され、透析１２時間では未透析（黒捧グラフ）のそれの２３６％に達した。一方、ＡＴＰ非存在下で透析したもの（斜線棒グラフ）は、タンパク質合成活性が著しく低下し、透析１２時間では未透析のそれの３７．５％まで低下することが判った。
以上の結果より、低分子合成阻害物質を除外したコムギ胚芽抽出液を用いることによりタンパク質合成活性は著しく上昇するが、低分子合成阻害物質の除外を透析によると、溶液の不溶化によりタンパク質合成活性の低下減少が起こること、またその溶液の不溶化はＡＴＰを添加することにより防止でき、不溶化を防止して透析を行った場合にはタンパク質合成活性が促進されることが判った。次に、透析内液の不溶化現象の機作を分子レベルで理解する第一歩としてコムギ胚芽抽出液成分の内のタンパク質合成の主要因子であるＲＮＡに着目し、不溶性画分の成分を解析した。
実施例３ 不溶性画分の解析
上記実施例２（２）で得られた不溶性画分からＳＤＳ−フェノール法により核酸を抽出した。このＲＮＡの抽出法、定量法、およびゲル電気泳動による分析は、進藤らの論文（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０（１９９２））に記載した方法を用いた。この結果を図４に示す。核酸量は紫外線吸収値（Ａ２６０ｎｍ）により測定している。図から明らかなように、ＡＴＰ存在下の透析により得られたコムギ胚芽抽出液を用いたもの（図４Ａ、■で示すグラフ）には、微量の核酸しか検出されないものの、ＡＴＰ非存在下の透析により得られたコムギ胚芽抽出液を用いたもの（図４Ａ、●で示すグラフ）では、高濃度の核酸が含まれていた。この核酸を含む溶液の不溶化は、透析開始４時間まで続くことから、２時間より先は一定値を示した（図１Ａ参照）タンパク質の不溶化のカイネチックスとは異なるものであると言える。
さらに、透析６時間後のコムギ胚芽抽出液から生じた不溶性物質から抽出した紫外部吸収物質をアガロースゲル電気泳動で分析したところ、この物質の主要成分がエチジウムブロマイド染色陽性で、マーカーバンドとの移動度からｔＲＮＡであることを確認した（図４Ｂ、レーン（−））。これらの事実から、ＡＴＰ非存在下の透析によってタンパク質合成活性が著しく低下する現象は、何らかの機作によってｔＲＮＡを含む不溶性物質が生成し，コムギ胚芽抽出液中のｔＲＮＡの濃度の特異的な低下に起因するものであると説明できる。未透析試料１ｍｌ中には１０Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ程度のｔＲＮＡが含まれており、８％未満のｔＲＮＡの不溶性物質への移行によって、タンパク質合成が３０％低下（６時間透析、図３）するという事実などを考え合わせると、この不溶性物質に含まれるｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の特定のコドンを認識する特異な分子種である可能性がある。いずれにしても、ＡＴＰはｔＲＮＡを含むこのような不溶性物質生成反応において、不溶化防止剤として機能していることが実験結果から確かめられた（＋ＡＴＰレーン）。細胞内のｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡは遊離の状態で存在しているのではなく、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、５ＳｒＲＮＡや一部のリボソームタンパク質との複合体構造を形成していることが報告されている（Ｍ．Ｍｉｒａｎｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７，２８１−２８９（１９８５）；Ｋ．Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１０３７−１０４４（１９９１））。これらの報告を考え合わせてさらに考察すると、ここに示した実験結果は、それらの複合体形成にＡＴＰが関わっているということを示唆している。そこで、この透析時におけるコムギ胚芽抽出液の不溶化防止・タンパク質合成活性の活性化効果がＡＴＰにのみ特異的な現象か否かについて以下に検討した。
実施例４ コムギ胚芽抽出液からの透析膜による低分子物質の排除における不溶性物質生成防止因子（抽出液の安定性誘導因子）、およびタンパク質合成不活化阻害因子の検討
（１）抽出液の安定性誘導因子の解析
実施例２（１）で行った透析法で、透析中の不溶性物質の生成を防止する作用がＡＴＰに特異的なものであるかを解析するために、抽出液３として、実施例２（１）に記載した抽出液１に０．２５ｍＭ  ＧＴＰを添加したもの、抽出液４として、抽出液１に２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）を添加したもの、また抽出液５として、抽出液１に１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）を添加したものを調製した。
これらの抽出液を用いて、実施例２（１）に記載の方法と同様にして透析を６時間行い、さらに実施例３と同様にして不溶性画分中の核酸の分析を行った。この結果を図５（Ａ）に示す。図から明らかなように透析６時間後におけるコムギ胚芽抽出液中の核酸（ｔＲＮＡ）の不溶化の防止に対するＧＴＰ添加の結果（＋（ＧＴＰ））は、ＡＴＰのそれ（＋（ＡＴＰ））とほぼ同等であり、ＡＴＰとＧＴＰに比べると低いもののアミノ酸（＋ＡＡｓ））にもその効果があることが判った。
（２）透析後のコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成活性の測定
上記実施例４（１）で得られたコムギ胚芽抽出液を、実施例２（３）と同様にしてＧＦＰｍＲＮＡを鋳型としたタンパク質合成を行い、蛍光強度から同様にして合成蛋白質量を測定した。この結果を図５（Ｂ）に示す。ＧＴＰ（＋（ＧＴＰ））は不溶化防止効果とほぼ一致して、タンパク質合成をＡＴＰ（＋（ＡＴＰ））とほぼ同等に促進することが判った。しかし、アミノ酸（＋（ＡＡｓ））は一定のｔＲＮＡ不溶化防止効果を示すものの、タンパク質合成の活性促進効果はほとんど認められなかった。また、この実験から、ＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類のアミノ酸の共存下で透析したコムギ胚芽抽出液の不溶性物質（ｔＲＮＡ）量が最も低く（図５（Ａ）（＋ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＡＡｓ））、同時にタンパク質合成活性が最も高い（図５（Ｂ）（＋（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＡＡｓ））が判った。また、透析を１２時間行ったものでも不溶性物質（ｔＲＮＡ）の生成は検出されなかった（図４Ｃ）。
以上の結果は、ｔＲＮＡの不溶化にはＡＴＰの他、ＧＴＰ、アミノ酸も関わっていることを示すと同時に、これらの不溶化防止効果が透析によるタンパク質合成促進化効果の直接的な原因ではないことをも示している。また、コムギ胚芽抽出液の透析によるタンパク質合成促進化の効果は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類アミノ酸の共存下に行うことが最も有効であることが明らかになった。
比較例１ ＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類アミノ酸共存下で静置する操作のタンパク質合成活性への効果の検討
実施例４に示したＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類アミノ酸の共存下の透析により得られたコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成活性促進の効果が、単にＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類アミノ酸の共存下で静置する操作によるものではないことを確認するために以下の実験を行った。
実施例４（１）に記載した抽出液５（コムギ胚芽抽出液にタンパク質合成に必要な全ての因子を添加したもの：１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）を添加）を透析と同条件である２６℃で、６時間にわたり静置した後、実施例２（３）と同様にしてＧＦＰｍＲＮＡを鋳型としたタンパク質合成を行い、蛍光強度から同様にして合成タンパク質量を測定した。この結果を図６に示す。図中、●で示されるグラフは上記操作を行った抽出液の結果を示し、○で示されるグラフは上記操作を行っていないもの（従来法）の結果を示す。図から明らかなように、上記操作によっては、タンパク質合成の促進効果は認められず、むしろタンパク質合成活性の低下がみられた。このことは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸共存下の透析によるタンパク質合成活性の促進は、単にこれらの共存下で静置したことによる効果ではなく、透析膜による低分子物質の除外に起因していると言える。
上記操作のタンパク質合成活性に与える効果については、既に、コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成反応が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸等のタンパク質合成に必要な成分の存在下に、バッチ反応法による３０℃、３０分間静置する操作を行うことによって、タンパク質合成量を著しく高めることができることが報告されている（Ｙ．Ｓｈｕｉｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４，５４８−５５２，（１９９７））。彼らはその結果を基に、このＡＴＰ、ＧＴＰ、およびアミノ酸の効果が、（ｉ）開始因子２・ＧＴＰ・アミノアシルｔＲＮＡ三重複合体（ｅＩＦ−２・ＧＴＰ・ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ）の生成・蓄積、および（ｉｉ）４３Ｓ前開始複合体（４３Ｓ  ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の生成・蓄積に起因すると解釈した。上記実施例で示した結果は、ＡＴＰ、あるいはＧＴＰ単独の存在下においても長時間の透析がタンパク質合成活性を促進させることを実証した。タンパク質合成反応開始段階における４３Ｓ前開始複合体形成反応にはＧＴＰを必要とするが、ＡＴＰは必要としないことが知られている。本実験で示したＡＴＰ単独存在下における透析操作がタンパク質合成活性を促進する事実から考えて、我々の得た知見は既報（Ｙ．Ｓｈｕｉｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４，５４８−５５２，（１９９７））のものとは異なった機作によることを示唆している。
実施例５ タンパク質合成活性の透析時温度依存性の検討
実施例２（４）、また実施例４（２）で確認したコムギ胚芽抽出液の透析によるタンパク質合成活性の促進効果について、その温度依存性について解析した。実施例４（１）に記載した抽出液５（コムギ胚芽抽出液にタンパク質合成に必要な全ての因子を添加したもの：１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）を添加）を６時間、２６℃と４℃で透析した後、実施例２（３）と同様にしてＧＦＰｍＲＮＡを鋳型としたタンパク質合成を行い、蛍光強度から同様にして合成タンパク質量を測定した。また、上記比較例と同様に単に抽出液５を４℃で６時間静置したものもコントロール実験として行った。これらの結果を図７に示す。
コントロールの４℃の静置による操作により得られたコムギ胚芽抽出液の結果（●−●）に比べて４℃の透析によっても（○−○）、２６℃のそれ（□−□）も約２倍のタンパク質合成活性を保持するに至っている。さらに、透析時の温度は４℃でも２６℃と同程度もしくはそれ以上の促進効果を与えることを示している。これらの知見は、ＡＴＰ等の存在下にコムギ胚芽抽出液を長時間透析した場合に見られるタンパク質合成活性の促進現象には、生化学的反応ではなく、透析膜の物理的効果（低分子合成阻害物質の除外）が直接的に関与していることが判る。
すなわち、タンパク質合成活性の促進現象は、コムギ胚芽抽出液中には低分子性の翻訳阻害もしくは非特異的な妨害物質が存在しており、透析処理によってこれらが翻訳因子群から排除されることに起因していることが証明された。他方、ＡＴＰ等の非存在下、４℃における透析を行うと不溶性物質が生成する。このことは、４℃においてもＡＴＰ等が翻訳因子の安定化、特に長時間の安定化に重要であることを示している。
ＡＴＰの存在下でコムギ胚芽抽出物を長時間透析した場合におけるタンパク質合成活性の促進効果はどのような原理に基づいて生ずるのであろうか。本発明者は上記の実施例で、（ｉ）ＡＴＰの存在下と非存在下の透析によって得られる可溶性のコムギ胚芽抽出物のタンパク質分子種に顕著な差異が見られないこと（図２Ａに示した結果）や、（ｉｉ）４℃の透析によってもタンパク質合成活性の促進効果が確認できること（図７）を示した。これらの知見は、コムギ胚芽抽出液には低分子性の翻訳反応の阻害または妨害物質が存在していることを示唆している。
実施例６ 低分子合成阻害物質のタンパク質合成活性への影響の解析
実施例１に記載した３０，０００×ｇの遠心上清として得られるコムギ胚芽抽出液中には、未同定物質も含めた多種類の低分子物質が存在している。実際、黄色を呈する高濃度の低分子物質が含まれていることが目視によっても確認することができる。通常、アミノ酸やヌクレオチド類などの低分子物質を排除する目的で遠心上清のゲルろ過操作を行った。しかし、既報のいずれの方法（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００），９７，５５９−５６４、特開２０００−２３６８９６号公報等）においても、そのような低分子物質を完全に排除することを目的とした積極的な試みはなされていない。すなわち、そのような観点から低分子画分中のタンパク質合成阻害作用を調べた研究はなされていないのである。そこで、この可能性を検討する目的で以下の実験を行った。
すなわち、実施例１と同様にワーリングブレンダーで限定破砕したコムギ胚芽試料４００μｌを３０，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清を４ｍｌ容量のセファデックスＧ２５カラムでゲルろ過を行い、カラムに保持された低分子画分（分子量５，０００以下の物質を含む）を溶出し再度同様にゲルろ過操作を行い、分画した黄色い低分子物質画分を得た。これを凍結乾燥後、４０μｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６に溶解し、バッチ方式無細胞タンパク質合成系（反応総容量８０μｌ）に添加した。
すなわち、あらかじめ実施例２（１）に記載の方法と同様にしてＡＴＰ存在下に１２時間透析しておいたコムギ胚芽抽出液を含むタンパク質合成溶液（ＧＦＰｍＲＮＡを鋳型として）を用いて、低分子物質のタンパク質合成に対する影響をバッチ反応法によって調べた。反応溶液の調製および反応方法は既報（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４（２０００））に従って、これを一部改変して行った。反応溶液としては、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）を含む溶液を用いた。実施例２（４）に記載のＧＦＰｍＲＮＡとして、６０μｇ／ｍｌ添加し、２６℃で合成反応を行った。
この結果を図８に示す。図の横軸は添加した黄色い低分子画分の容量である。タンパク質合成活性は２６℃、２時間に［14Ｃ］−ロイシンのタンパク質へ取り込まれた放射能カウントから測定した。ここでは、反応液５μｌ中のタンパク質に取り込まれた放射能カウントが３６００ｄｐｍを１００％とした。
図８に示されるように、この黄色物質を含む低分子物質画分の添加量に応じて、タンパク質合成が強く阻害されることが判る。すなわち、阻害機作は不明であるがタンパク質合成活性阻害因子がコムギ胚芽抽出液に含まれる低分子画分に存在することが明らかとなった。ここで得た知見と、上記のタンパク質合成活性促進現象などの実験結果を考え合わせると以下のように説明が成り立つ。すなわち、不溶化防止剤としてのＡＴＰ等の存在下にコムギ胚芽抽出液を透析することによって、低分子性のタンパク質合成阻害因子が透析膜を介してこれから排除される結果としてタンパク質合成活性が上昇する、というものである。この考え方に立つと透析過程におけるＡＴＰ、ＧＴＰ、２０種類アミノ酸による不溶化防止効果（ｔＲＮＡの不溶化）と、透析によるタンパク質合成促進効果が独立した現象であることが説明可能となる。
コムギ胚芽抽出液からの低分子のタンパク質合成阻害物質の排除機構に関しては、透析外液への移行のみでなく、透析膜への吸着による排除もあげられる。ここで示したタンパク質合成阻害物質は、セファデックスＧ２５カラムの吸着画分に含まれ、また、排除分子量５０，０００ダルトンのスペクトラ／ポア６もしくは排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜によって排除される物質も含まれるため、分子量１４，０００ダルトン程度よりも小さい物質であると考えられる。
実施例７ 鋳型以外のタンパク質合成に必要な成分を全て含有したコムギ胚芽抽出液の検討
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成反応液はキット化された種々の製品が既に販売されている。しかし、これらのすべての製品はコムギ胚芽抽出液とアミノ酸、エネルギー源やイオン等を含む溶液が別々の容器に収められており、タンパク質合成反応に当たってはその都度にそれらの成分を目的に合わせて鋳型とともに混合する必要があった。これらの混合操作は０〜４℃程度の低温で行う必要があること等から煩雑であり、合成反応の失敗の原因となってきた。さらにこのようなタンパク質合成反応キットの構成では、多数の遺伝子からのタンパク質の網羅的合成には不向きであり、将来の全自動ロボット化に向けてこのような煩雑なプロセスは解決しなければならない最大の課題の一つであった。
実施例４（１）に記載した抽出液５は、コムギ胚芽抽出物に加えてＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸を含むものであり、これらの共存下で透析を行うことによって、従来よりも遥かに高いタンパク質合成能が高まったコムギ胚芽抽出液を調製することができた（図５Ｂ）。このことから、透析に先だってそれぞれの構成成分の濃度をコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の至適濃度に合わせておいた試料を用いれば、透析後にその溶液にｍＲＮＡを添加する操作だけで、無細胞タンパク質合成を簡便に実施することが出来るはずである。
実施例１の方法によって取得された３種類のロットのコムギ胚芽抽出液を実施例４（１）に記載した抽出液５の組成に調製し、これを用いて実施例２（１）に記載の方法により１２時間の透析を行った。この抽出液を用いて実施例２（４）に記載の方法と同様にしてＧＦＰｍＲＮＡを鋳型として、透析膜を用いる連続法によって、透析、未透析のコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成活性を測定した。この結果を図９に示す。図９Ａはタンパク質合成反応４８時間後の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示したが、矢印が示すクマシーブリリアントブルー染色バンドが生産物のＧＦＰである。Ａ、Ｂ、Ｃのいずれのロットの抽出液を用いても、透析処理したコムギ胚芽抽出液（透析処理（＋））を用いて合成されたＧＦＰ量が、透析処理していないコムギ胚芽抽出液（透析処理（−））と比べて明らかに増大していることが分かる。精製ＧＦＰ標品を基準としてデンシトメーターによって算出した反応液１ｍｌ当たりのタンパク質合成量を図９Ｂのグラフに示した。透析処理（■−■）したものでは未透析処理のそれ（●−●）に比べて、ほぼ２倍の合成能をもつことが分かる。さらにＧＦＰのもつ蛍光強度から合成産物の活性を測定した結果、透析処理（□−□）、未処理（○−○）のコムギ胚芽抽出液ともに、同様の比酵素活性を与える性能を保持していることが確認できた。すなわち、本透析操作によって、合成産物の高次構造体化能が低下することはないことを示している。
さらに、このようにして調製した高機能のコムギ胚芽抽出液を−８０℃で４週間以上保存した後において、同様のタンパク質合成活性の解析を行ったところ、調製直後のものと比べて該活性の低下は見られなかった。また、透析処理、および連続方式タンパク質合成に用いる透析膜として、排除分子量５０，０００ダルトンのスペクトラ／ポア６の代わりに、排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトンの再生セルロース膜を用いてもほぼ同様の実験結果を得ることができた。
産業上の利用可能性
本発明により無細胞タンパク質合成系に用いられる細胞抽出液から低分子のタンパク質合成阻害物質が排除され、タンパク質合成活性が促進された細胞抽出液を取得することができる。また、細胞抽出液から低分子阻害物質を排除する工程を、タンパク質合成に必要な成分のうち翻訳鋳型を除く全ての存在下で行うことによりレディーメイド型細胞抽出液が提供される。
本出願は、日本で出願された特願２００２−２３１４１を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
0003675804.tif 000002
【図２】
0003675804.tif 000003
【図３】
0003675804.tif 000004
【図４】
0003675804.tif 000005
【図５】
0003675804.tif 000006
【図６】
0003675804.tif 000007
【図７】
0003675804.tif 000008
【図８】
0003675804.tif 000009
【図９】
0003675804.tif 000010