(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者より血液を抽出した後、末梢血２μｌをｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎと接合させた抗血色素抗体で０．６％の食塩水において常温で１５分間染色する段階と；
前記ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎと接合させた抗血色素抗体で０．６％の食塩水において常温で１５分間染色した後、洗浄せずに３ｍｌの食塩水を添加する段階と；
前記３ｍｌの食塩水を添加し流細胞分析機で分析する段階で損傷された赤血球数と赤血球が以前に破損したものかまたは、最近破損したものであるかも区別できるようになされる段階と、
を有することを特徴とする溶血性貧血検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微細脈管病性貧血のように壊れた赤血球が血中に存在する場合、生理食塩水よりも貯蔵液において抗血色素を利用して損傷した赤血球を検出する流細胞測定法を実施して溶血性貧血の迅速な診断のみならず、患者に重要な壊れた赤血球と重要でない古い壊れた赤血球とを区別できるようにした溶血性貧血検査方法（Diagnostic Method of Hemolytic Anemia）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の赤血球検査方法は血液を抽出してガラス板に塗抹した後、染色して顕微鏡で観察してきたが、この時赤血球が円形でなくして、歪んだものがある場合これと壊れた赤血球との鑑別が難しく、壊れた赤血球であるとしても患者においては重要な最近破損したものか否かを明確な判断ができず、溶血性貧血の診断及び治療にかなりの難しさを有していた。
つまり、末梢血液内の壊れた赤血球の存在は微細血管病性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）の最も重要な徴候であるばかりでなく、播種性血管内の凝固症のような血管内の溶血と関連した他の多くの疾病においても重要な徴候である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このような壊れた赤血球の存在を確認するために利用される唯一の方法は、血液を塗抹した後Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙ染色して顕微鏡で検査する方法にして、これは壊れた赤血球の定量的分析のための唯一の方法であった。しかしながら、この方法は労働集約的であって手間が多くかかり歪んだ正常赤血球と壊れた赤血球とを区別しにくく、たまには脾臓除去手術を受けた患者が溶血のような重要な臨床的症状の無い壊れた赤血球の増加症等の際だった異形赤血球増加症が現れる場合もある。
【０００４】
従って、末梢血液内の壊れた赤血球検査及び定量化を迅速に成し得る新たな方法の開発が必要となり、臨床的重要性を有する新たに生成された壊れた赤血球と、臨床的重要性の無い古い壊れた赤血球とを区別できるとすればさらに好ましいことであろう。
血管の溶血症の場合には球状赤血球症と卵型赤血球症等の異形赤血球増加症が頻繁に関連している。自家免疫性溶血性貧血症において用いられる抗グロブリンテストのような各々の疾病のための特別な実験室検査法が利用可能なものの、血管外溶血症の初期診断は極めて難しい問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明はこのような問題点を解決するために発明されたものにして、患者より血液を抽出した後、末梢血２μｌ をＰＥと接合させた抗血色素の抗体で０．６％の食塩水で常温下で１５分間染色した後、洗浄せずに３ｍｌの食塩水を添加して流細胞分析機で分析する検査方法であって、本発明の流細胞分析法は洗浄またはlysing step が不要となり、結果は２０分以内に容易に得ることができる。
【０００６】
従って、血液塗抹における壊れた赤血球の数を数えることはかなりの手間が掛かり、たまには歪んだ赤血球との区別が難しかったものの、本実験の簡便で迅速な方法を用いることにより、壊れた赤血球等損傷した赤血球の正確な測定が可能であるばかりでなく、抗血色素抗体を用いた流細胞分析機により、新たに生成された損傷赤血球のみを検出する迅速かつ、正確な溶血性貧血検査方法を新たに提示できるようにしたものである。
【０００７】
以下に本発明の実施例を詳細に説明すると下記の通りである。患者より血液を抽出した後、末梢血２μｌ をＰＥと接合させた抗血色素の抗体で０．６％の食塩水で常温下で１５分間染色する段階と；前記染色後洗浄せずに３ｍｌの食塩水を添加する段階と；前記３ｍｌの食塩水を添加し流細胞分析機で分析する段階とを有する溶血性貧血検査方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
このように成される検査方法を実施するために先ず貧血患者７０名、微細血管病性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）患者４２名、マラリア患者８名、球状赤血球症患者８名（遺伝的球状赤血球症患者３名、自家免疫性溶血性貧血症患者３名、原因不明の球状赤血球症患者２名）、卵型赤血球症患者２名、脾臓除去手術を受けた患者６名、鉄分欠乏症貧血（ＩＤＡ）患者４名と対象群として健康な成人血小板提供者１０７名を対象に実験を行った。
【０００９】
ＭＡＨＡ患者４２名の内４０名が急性または慢性白血病患者であって彼等の内１９名が骨髄移植（ＢＭＴ）を受けた。
前記脾臓除去手術を受けた患者６名の内４名が原因不明血小板減少性紫班病（ＩＴＰ）のため、１５日乃至５年前に脾臓除去手術を受け、残りの２名の患者は慢性骨髄性白血病により巨大脾腫大のため２か月乃至３年前に脾臓除去手術を受けた。
さらに、遺伝的球状赤血球症患者３名全てが父母及び兄弟等のサンプルも調査した。
前記患者等は浸透圧詭弱性検査結果０．５２〜０．６２％の塩化ナトリウム溶液（Ｃ）で溶血開始が現れた。
前記マラリア患者全員はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘにより感染した。
本発明の実験では赤血球計算のためＥＤＴＡで抗凝固させた血液サンプルを採取した後４時間以内に使用し、分析前には常温（１８〜２０℃）で保管した。
前記サンプル患者に基づき本発明で行った実験を詳細に調べて見ることにする。
【００１０】
流細胞分析機を利用した損傷赤血球分析
患者より抽出した損傷赤血球は生理食塩水では抗血色素抗体で染色されなかった。損傷赤血球の血色素が損傷した膜を通じて抗血色素抗体に露出され得る適正食塩水濃度を見出だすため、ＭＡＨＡ患者１０名と正常人１０名から末梢血液を採取して０．２％〜２．０％の範囲内で濃度別に抗血色素抗体（デンマーク、ＤａｋｏＡ／Ｓ  ）で染色した。その結果ＭＡＨＡ患者のサンプルと正常人のサンプルとを区別し得る適正濃度は０．６％の食塩水として現れた。
【００１１】
本発明では試薬の安定性検査のため、正常人５名とＭＡＨＡ患者５名のサンプルを０．６％の食塩水と混ぜた直後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後に抗体で染色した。この時、抗体はｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）  で標識し、保存剤として０．１％のゼラチン、ペンタクロロフェノールと共に、燐酸塩緩衝食塩水で希釈され抗体塩基溶液の浸透圧は３１６ｍＯｓｍ／ｋｇであった。抗血色素抗体５μｌを夫々の食塩水５０μｌと混合した。
前記抗体混合物の浸透圧は０．６％の食塩水２１３ｍＯｓｍ／ｋｇであった。残りのサンプル等は抗体と０．６％の食塩水混合物を用いて実験した。さらに末梢血液２μｌをこの抗体−食塩水混合物に添加して常温で１５分間放置した。
前記末梢血液２μｌをこの抗体−食塩水混合物に添加して常温で１５分間放置した状態で洗浄せずに食塩水３ｍｌを直ぐに添加した。
この時、蛍光物質をＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ソフトウェアを用いて、流細胞分析機（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）  で分析した。さらに、ＣａｌｉＢＲＩＴＥＴＭ  器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏでｎ）で流細胞分析機を１週間に２回ずつチェックしＡｕｔｏｃａｍｐソフトウェアで１か月に１回ずつチェックした。
【００１２】
本発明で流細胞分析機通路の器具セッティングは線形モードであって、前方散乱（ＦＳＣ）閾値は５２であり、２０，０００個の細胞が分析貯蔵された。壊れた赤血球の一部が無損傷赤血球より小さいものと予想されたため、無損傷赤血球及び血小板全体を含むｌａｒｇｅ  ｇａｔｅを使用した。
前記全てのサンプル等はやはり標識のため同形対象群抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏでｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色され、標識等は同形対象群の血清を用いてセッティングされ、この方法の精度を評価するために正常サンプル２個、ＭＡＨＡサンプル２個を１０回分析した。
【００１３】
赤血球形態の顕微鏡検査
前記全てのサンプルより血液塗抹を制作し、空気中で乾燥した後、Ｗｒｉｇｈｔ染色を実施して２名の病理専門医が検査した。１，０００倍顕微鏡の視野で観察される平均赤血球数が略２００  個であるため本研究では１，０００倍視野で観察される壊れた赤血球数を数えた後２で割った値を壊れた赤血球％に使用した。
以上のような流細胞分析機を利用した損傷赤血球分析及び赤血球形態の顕微鏡検査の統計を調べて見るに、全ての統計数値は独立標本Ｔ−ｔｅｓｔで分析された。
従って、抗血色素標識された赤血球の比率と顕微鏡検査による壊れた赤血球数の相関関係を評価するためにピアソン相関分析で計算した。有意性検査はＳＰＳＳを利用したＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｓｉｇｎｅｄ  Ｒａｎｋｓ  ｔｅｓｔで行った。
【００１４】
食塩水濃度別流細胞分析機検査結果
食塩水濃度別流細胞分析機の検査では０．２％の食塩水で正常人と患者等の赤血球５０％以上の抗血色素で染色され、食塩水の濃度が０．６％までは食塩水濃度が増加するに従い染色された赤血球比率が減少した。
前記０．６％の食塩水ではＭＡＨＡサンプルだけが染色された赤血球が１％以上であり、正常人サンプルは全て１％未満であった。これより高い食塩水濃度（０．７〜２．０％）では正常人やＭＡＨＡ患者サンプル全て抗血色素で染色されなかった。
【００１５】
０．６％食塩水で流細胞分析機の検査結果
前記夫々のグループで染色された赤血球の比率を表１に示す。
【表１】
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【００１６】
本発明で試薬は１週間までは安定であって、染色された赤血球の比率が減少せず、分散係数は１５．０％であった。正常人の染色された赤血球の比率は０．５５±０．２３％であって、１０７名中７名だけが染色された赤血球の比率が１％以上のものとして示された。
ＭＡＨＡ患者の染色された赤血球の比率は正常人より有意的に高く、（２．９５±２．９５％、Ｐ＝０．０００）、４２名中１名だけが染色された赤血球の比率が１％以下のものとして示された。この時、壊れた赤血球の数は  ３．１±１．８％であり、抗血色素により染色された赤血球の比率と相関関係があった（ｒ＝０．６３７，Ｐ＝０．０００）。マラリア患者の染色された赤血球の比率も正常人より有意的に高く、（１．８７±０．７２％、Ｐ＝０．００１）、染色された赤血球の比率が１％より少ない唯一な場合はスライド上にただ一つの輪状のマラリア原虫であることが判明した。
【００１７】
さらに、球状赤血球症患者の染色された赤血球の比率は正常人より有意的に高く、（３．０２±１．１２％、Ｐ＝０．０００）、８名のサンプル全てが染色された赤血球の比率が１％以上のものと示された。遺伝的球状赤血球症患者と自家免疫性溶血性貧血症患者間には有意的な差がなかった。
本発明で浸透圧詭弱性検査結果２名の遺伝的球状赤血球症患者の場合０．５２％の食塩水で溶血が開始され、０．６％の食塩水では溶血が現れなかったものの、夫々赤血球の５．０６％と２．２４％が抗血色素により染色された。残りの１名が遺伝的球状赤血球症患者のサンプルは０．６２％で溶血が開始され、赤血球の３．４０％が０．６％の食塩水で抗血色素で染色されて、患者の父親のサンプルは０．５％で溶血が開始されたものの、赤血球の４．０４％が０．６％の食塩水で抗血色素で染色された。
際立つ卵型赤血球症患者２名は染色された赤血球が夫々２．２０％と２．２１％であった。
【００１８】
以前に脾臓除去手術を受けた患者の染色された赤血球の比率は正常人と近似していた（０．７８±０．２４％、Ｐ＝０．０６９）。多数の壊れた赤血球（平均４．４２％）と有核赤血球が末梢血液で発見されたものの、壊れた赤血球の数は抗血色素により染色された赤血球の比率と相関関係が無かった（Ｐ＝０．８５３）。
鉄分欠乏症患者は全て染色された赤血球の比率が１％以下のものとして示された（０．５９±０．１１％）。
【００１９】
前記のように実施される本発明の検査方法により現れた結果、壊れた赤血球細胞が血色素の損失無しに、いかにして血液内を循環することができたかは明らかにされていない。壊れた赤血球は細胞質の損失が生ずるので我々は壊れた赤血球を抗血色素の抗体で染色しようと試みた。しかしながら、等張液では染色されなかった。従って、赤血球を貯蔵液と０．６％の食塩水に放置することにより、損傷した細胞質の一時的な保護膜を通じて血色素を露出させようとした。濃度がさらに低い貯蔵液では一部正常赤血球も抗血色素で染色されたものの、これは０．６％の食塩水以下の貯蔵液で放置する場合、正常赤血球も損傷し得ることを意味するものである。さらに２％までの食塩水と同じ固定液での放置は正常サンプルとＭＡＨＡサンプル全て赤血球が抗血色素に染色されなかった。歪んだ赤血球は損傷した細胞質を通じて血色素を露出させることができなかった。
【００２０】
正常人の染色された赤血球の比率は０．５５±０．２３％であって、ＭＡＨＡ患者は正常人よりも有意に高かった（２．９５±２．９５％、Ｐ＝０．０００）。壊れた赤血球の数は抗血色素によって染色された赤血球の比率と高い相関関係があった（ｒ＝０．６３７，Ｐ＝０．０００）。本発明の実験で流細胞分析法は洗浄またはｌｙｓｉｎｇ  ｓｔｅｐ  が不要であり、結果は２０分以内に容易に得られる。血液塗抹での壊れた赤血球の数を数えることはかなりの手間が掛かり、たまには歪んだ赤血球との区別がつかなくなる。しかしながら、本発明の実験が簡便で迅速な方法を用いることにより、壊れた赤血球の正確な測定が可能となる。
【００２１】
しかも、脾臓除去手術を受けた患者の場合のように多数の壊れた赤血球が細胞内溶血症の臨床的症状無しに発見される場合がたまにある。このような場合顕微鏡検査だけでは壊れた赤血球の重要性を決定することが不可能である。本実験の流細胞分析法を用いる場合、脾臓除去手術を受けた患者に存在する古い壊れた赤血球は検出されなかった。脾臓は損傷した細胞等を循環から除去させる役割をするため、脾臓除去手術を受けた患者は壊れた赤血球が生き残ることができ、損傷された細胞質が持続的に治療でき得るほどの十分な時間の間血液内を循環することができる。前記本発明の実験の際、壊れた赤血球の流細胞分析検出法は脾臓除去手術を受けた患者に発生するＭＡＨＡを診断し、モニターし得る唯一な方法となり得るであろう。
【００２２】
さらに、マラリア患者の染色された赤血球の比率は正常人より有意的に高かった（１．８７±０．７２％，Ｐ＝０．００１）。マラリアはマラリア原虫により誘発される寄生性の疾病である。従って損傷した赤血球の一部が血液内を循環していることを発見した。風土性地域でこの方法を用いることにより、発熱患者の繰返し検査を通じてマラリアの診断にも貢献するであろう。
球状赤血球症患者の染色された赤血球の比率は正常人より有意的に高く（３．０２±１．１２％，Ｐ＝０．０００）。８名全てが染色された赤血球の比率が１％以上として現れた。
【００２３】
本発明の検査方法において、遺伝的球状赤血球症患者と自家免疫性溶血性貧血症患者の間では染色された赤血球の比率の差が無かった。このような球状赤血球の変化は従来にも研究されてきており、細胞質膜の幾つかの構造的欠陥が報告されている。その欠点等は抗血色素抗体を通過させ得る程の十分な大きさのものと見える。
遺伝的球状赤血球症を診断するための実験室テストとして、浸透圧脆弱性検査と顕微鏡検査がある。遺伝的球状赤血球症患者の家族において、患者の父母と２名の兄弟は正常的な浸透圧脆弱性を示しているものの、父母の内父は抗血色素により染色された赤血球が増加したことが見出された。このような結果は本実験に伴う損傷された細胞の流細胞分析検出法が浸透圧脆弱性検査よりさらに正確な方法であることを示すものである。
【００２４】
自家免疫性疾病等は米国で若い女性と中年の女性等の主要死亡の原因である。自家免疫性溶血性貧血は略１０％の全身性紅班性ループス患者に発生するものの、溶血が軽症の場合が一層一般的であり得る。これがこの疾病の唯一な発病徴候でもあり、他の疾病の徴候が現れるのを数年繰り上げることもできる。しかしながら直接抗グロブリンテストが自家免疫性溶血性貧血の唯一な診断方法であるため、損傷された細胞に対しこの流細胞分析機を用いることにより、他の疾病の徴候が現れる前に軽症の溶血症を初期に検査することができる。
卵型赤血球症も亦かなりの遺伝的な疾病であり、機能障害または膜蛋白質欠乏症が報告された。卵型赤血球症患者２名全てより球状赤血球症患者のように抗血色素によって、染色された赤血球が増加したものと現れた。従って、球状赤血球症と卵型赤血球症が主に血管外溶血症で発見されるものの、本実験結果はこれら異形赤血球症の膜の欠陥が貯蔵液で抗血色素抗体が通過するに十分な程大きいことを説明している。
【００２５】
本発明の実験で全ての鉄分欠乏性貧血患者と涙の滴細胞または標的細胞のある患者は抗血色素により染色された赤血球の増加が見られなかった。これはこれら異形赤血球症患者等が損傷された細胞質を通じて血色素を露出するに十分な膜の欠損を有していないことを意味する。結論的に貯蔵液で抗血色素を用いて損傷された赤血球を検出する流細胞検査法は簡便で正確な溶血性貧血診断法である。さらに、溶血性貧血の初期診断を可能にし、重要な壊れた赤血球と重要で無い古い壊れた赤血球との区別に役立つ。
【００２６】
【発明の効果】
以上のように、本発明は溶血性貧血検査方法において、生理食塩水貯蔵液で抗血色素を利用して損傷された RBCｓを検出する流細胞測定法を行い、溶血性貧血の迅速な診断のみならず重要な壊れた赤血球と重要で無い古い壊れた赤血球とを簡単でかつ容易に区別ができるようにすることにより、遺伝、妊娠、中毒、癌、骨髄移植の際、敗血症患者、火傷をした場合、現在患者の赤血球が破損進行中の可否を判断し得ることは勿論、従来の顕微鏡検査方法より精度が高く、時間が経った赤血球と最近に破損された赤血球を正確に診断し得るようにした効果を有するようになった。