(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスティチュート・パスツールのCNCMコレクションに寄託されてＩ−1390、Ｉ−1391、Ｉ−1392およびＩ−1447の番号を有することを特徴とするラクトバチルス属菌株であって、下記の炭水化物発酵特性を有する菌株。
0003653277.tif 000019
0003653277.tif 000020
0003653277.tif 000021
0003653277.tif 000022
【請求項２】
共存可能なビヒクルとの混合物中に請求項１のラクトバチルス菌株CNCMI−1390、CNCMI−1391、CNCMI−1392およびCNCMI−1447の少なくとも１種類を含んでいることを特徴とする医薬用組成物。
【請求項３】
共存可能なビヒクルとの混合物中に請求項１のラクトバチルス菌株CNCMI−1390、CNCMI−1391、CNCMI−1392およびCNCMI−1447の少なくとも１種類を含んでいることを特徴とする獣医学用組成物。
【請求項４】
共存可能なビヒクルとの混合物中に請求項１のラクトバチルス菌株CNCMI−1390、CNCMI−1391、CNCMI−1392およびCNCMI−1447の少なくとも１種類を含んでいることを特徴とする栄養学的組成物。
【請求項５】
補足的な特性を有した他の菌株との混合物中に請求項１の１種類以上のラクトバチルス菌株を含んでいることを特徴とする医薬用組成物。
【請求項６】
補足的な特性を有した他の菌株との混合物中に請求項１の１種類以上のラクトバチルス菌株を含んでいることを特徴とする獣医学用組成物。
【請求項７】
補足的な特性を有した他の菌株との混合物中に請求項１の１種類以上のラクトバチルス菌株を含んでいることを特徴とする栄養学的組成物。
【請求項８】
少なくとも１種類の菌株がラクトバチルス好酸性種に属し、少なくとも１種類が非好酸性種に属することを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
全ての菌株CNCMI−1390、CNCMI−1391、CNCMI−1392およびCNCMI−1447の混合物を含んでいることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
菌株CNCMI−1390および／またはCNCMI−1391および／またはCNCMI−1392および／またはCNCMI−1447が凍結乾燥形態で存在することを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
カプセル、溶液または可飲性サスペンジョンまたは包袋粉末状であることを特徴とする請求項２〜10のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
単一の投与量当り各菌株の106〜1010個の細胞を含んでいることを特徴とする請求項２〜11のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ラクトバチルスの投与が望ましい胃腸病理の治療または予防に有用な薬剤調製のための請求項１のラクトバチルス菌株の使用法。
【請求項１４】
腸内の細菌感染症、種々の原因による下痢または潰瘍性大腸炎の治療または予防のための薬剤調製のための請求項13に記載の使用法。
【請求項１５】
胃腸管の好ましくない増殖の全状態における新生児の治療に有用な薬剤の調製のための請求項１のラクトバチルス菌株の使用法。
【請求項１６】
乳製食品調製のための請求項１のラクトバチルス菌株の使用法。
【発明の詳細な説明】
この発明はラクトバチルス（乳酸菌）該菌株の組成物および該菌株の使用法に関するものである。
更に詳しくは本発明は、ブタペスト条約に従って1994年１月13日にインスチチュート  パスツールのCNCMコレクションに寄託されたコード番号CNCM  Ｉ−1390、CNCM  Ｉ−1391およびCNCM  Ｉ−1392を特徴とする新規な三種類の人間の非好酸性ラクトバチルス株、および1994年７月13日に同インスチチュートに寄託された番号CNCM  Ｉ−1447の新規な人間の好菌性ラクトバチルス株に関する。
乳酸バクテリア製剤の治療的使用は、今世紀の始めにさかのぼりそして使用者の健康条件におよぼす発酵ミルクの使用の効果的な影響を指摘した研究にさかのぼる、長期間のそして確立した伝統を有するものである。（文献１〜５）。
その後乳酸バクテリアは、医薬業界にて広く使用されており、そして病原体による腸疾患の治療用にそして抗生物質治療における補助薬剤として種々の配合物の活性的主要剤を構成している（文献６〜９）。
過去数十年間にわたり科学者は、一般的に乳酸バクテリアそして特にラクトバチルスに関する知識を深め、著しい量の情報を得た。
しかし現在市場にある製品は、最近の科学的研究結果を考慮していないようである（文献10〜11）。
…ラクトバチルスは乳酸および特定の抗バクテリア物質を生成して、ラクトバチルスは腸管のミクロ菌相（microflora）を制限する特異な役割をしている（文献12〜16）。
…これらのバクテリアは腸内環境から発生するものである。「ホスト特定性」要件を保証するために該バクテリアは次いで腸内にて再植されるであろう（例えば人間に利用するために人間の腸内系から分離される）（文献17）。
…ラクトバチルスは、良状態の健康の維持および種々の病理的条件の防止に特に関連する、種々の代謝活性に関与する。特にニトロサミンの劣化、バクテリア毒素の中和および抗発癌性活性が注目される（文献18）。
…腸内上皮に対する付着能力は腸内バクテリアに極めて有利な特長である（種々の病原性バクテリアは該粘膜に付着する能力を失うとその毒性を失うことが知られている）。従って上皮に集落する可能性は、病原性バクテリアの増殖に対するバリアーを提供するために、ラクトバチルスに関しても特に重要であり得る（文献10、19）。
…腸から分離された菌株の系統学的分類は非常に改訂されてきている。この生態系における新しいバクテリア種の存在、ならびに各種族内の特定の純型（biotypes）の区別が認識されてきた（文献20）。
…菌株の技術的特性（第一に凍結保存処理に対する耐性）が、乳酸バクテリア株の可能性のある開発の決定に特に重要である。事実、生体用の目的に現在まで使用されているラクトバチルス株は、凍結乾燥条件に対して一般的に僅かに耐性である（文献21）。付着特性は凍結乾燥後にも維持される必要がある（かならずしも適合しない要件である）。
腸内粘膜細胞に付着する高能力を有するラクトバチルス株を分離する試みにおいて特に、健康な個人の糞便等の相同の源からの分離法が報告されてきた。
例えば米国特許4839281号、欧州特許EP−Ａ−199535号および米国特許5032399号に、成人から分離されそしてヒトの腸内粘膜細胞に付着する多くのバクテリア細胞でありそして参考菌株と比較して強い付着特性を特徴とする、好酸性ラクトバチルス株が記述されている。しかしこのような菌株の系統学的な正確な分類は、米国特許局による出願の実体審査過程にて反論者自身が実験データにもとづき該ラクトバチルスは非好酸性種に属すると主張したように（米国特許4839281号、1987年10月30日付の特許局通知に対する回答第７頁末尾の記録）、疑わしいものである。
Reniero他（文献27）は二人の幼児の糞便からの二種類のラクトバチルス  カセイ株の分離を報告している。糞便中の同一の菌株の数日間の存在によって、著者はこれらの菌株が付着特性を有すると結論した。前記のような他の生物学的または技術的特性については言及されなかった。なおこれらの事項は、本発明にて請求しているラクトバチルス株の顕著な特長である。
事実CNCM  Ｉ−1390、CNCM  Ｉ−1391、CNCM  Ｉ−1392およびCNCM  Ｉ−1447菌株は、参考菌株よりも優れている場合の多い腸内および口内の細胞に対する付着性のほかに、下記の特長も有するものであった。
…人間の腸内病原体の生長を抑制する能力；
…好気生活および嫌気生活の両者においておよび種々のpH値における、多くの条件下にて生長する能力；これらの特性は胃腸管中の移行間に遭遇する生理学的および病理学的状態に適合する良好な能力を意味する；
…多量の乳酸の生成；
…胆汁に対する高抵抗性；
…付着能力を損わない凍結乾燥抵抗性。
これらの菌株はラクトバチルス属に所属し、そして多くの病理の予防および処理に特に興味のある一連の特質を特徴とする。
本発明によって、適当な賦形剤（ベヒクル）と混合した好ましくは凍結乾燥した剤形にて、該CNCM  Ｉ−1390、CNCM  Ｉ−1391、CNCM  Ｉ−1392およびCNCM  Ｉ−1447菌株の少なくとも一つを含有する医薬用、獣医薬用または栄養用組成物が提供される。例えば腸内の異常細菌感染症、種々の原因による下痢、潰瘍性大腸炎および関連する病理の場合のように、ラクトバチルスの投与が望ましい胃腸の病理の治療または予防用に、これらの組成物を経口的に投与するかまたはミルク、ヨーグルトまたはミルク製品等の食品と混合することができる。また本発明の組成物は、非病理的腸内バクテリアの菌相を保持するために、抗生物質治療に関連して投与することもできる。
本発明の菌株の他の重要な特長は、該菌株が健康な新生児および離乳児の糞便から分離されたことである。哺乳動物の胃腸管は出産時には無菌であることが事実知られている。一般に該菌株は母親の膣および肛門周囲の菌相によって迅速に増殖される。有用な微生物の移行に関するこの自然な経路は、帝王切開出産の子供には存在しない。事実としてこのような子供は、好ましくない微生物の増殖を受ける傾向がある。また好ましくない微生物による腸内増殖は未熟児にも観察されてきた。両者の場合にこの危険性は本発明の菌株の経口投与によって大幅に低減され得る。更に母乳児と比較して人工乳児は、腸内にてクロストリジア、コリホルムスおよびエンテロコッカスの数を増加させる。またこの状態において、本発明のラクトバチルスによる治療によって腸内の菌相の再均衡化が助長される。
また菌株は本発明の菌株の混合物単独としておよび／または補助的な特性すなわち異なる固有の性質を有する他の菌株と共に配合することができる。このような配合物の例として、多量のＬ−乳酸を生成する少なくも一種の菌株と組合わせて強い付着特性を有する少なくも一種の菌株からなる混合物が例示できる。限定する意図ではないが好ましい組成物は、例えば各菌株あたり106〜1010個の細胞の適当量の本発明のCNCM  Ｉ−1394株およびエントロコッカス  フアエシウムSF68株を、通常に使用される添加物または賦形剤と共に混合して調製できる。
代表的にカプセル、溶液または可飲性サスペンジョン、包袋中の粉末；および類似の形態の剤形にて、単一の各投与剤は、各菌株あたり106〜1010個の細胞を一般に含有する。
本発明のラクトバチルスは食品の栄養価を改善するのに非常に有用であることも実証された。特に好ましいものは、ミルクおよびその誘導物から得られる乳製品である。
本発明の菌株の分離を該株の特性と共に下記する。
例１  菌株の分離および特性表示
誕生第１日から第６日の新生児から該菌株を分離した。また離乳期の他の乳児からも試料を採取した。
採取は診療所にて一日二回対象者の糞便から行い、そして嫌気性菌条件下に無菌の綿材（swabs）に保存した。該ラクトバチルスの選択的な最初の分離はLBSTM選択媒体（Lactobacillus  Selection  Agar,Oxoid）中で実施した。試料板を嫌気性菌条件（ガスパックシステム、BBL）下にて37℃で48時間培養した。このようにして得た集落（colonies）を、MRS液体媒体（de  Man−Rogosa−Sharpe  broth,Oxoid）中で分離し、そして純粋な培養物を得るために一連の再分離処理をした（選択用寒天媒体上に塗布しそして単一の集落を分離）。これらの工程はSharpeによって提案された方法にもとづく（文献22）。分離および精製の後に、該ラクトバチルス属に所属する株だけを選別するために該菌株を更に特徴づけた。次いで下記の特性を試験した：形態（位相差顕微鏡による光学的検査）；グラム染色の反応（すべてのラクトバチルスについて陽性）；カタラ−ゼの存在（すべてのラクトバチルスについて陰性）；および、24時間培養後の各菌株の培養体中に存在する二種類の乳酸立体異性体の決定（Boehringerのキットによる酵素的測定）。これらのテストの結果、該分離物は該ラクトバチルス属に決定することが可能であった。次いで該菌株を凍結乾燥しそして４℃にて保存した。
アルカリ性抽出後のプラスミドのプロフィルの分析（文献23）を、次いでラクトバチルスとして同定されたすべての菌株について実施した。この分析によって、分離した菌株の同定が可能であった（文献24）。また可溶性細胞質の蛋白質のプロフィル（文献25）および抗生物の抵抗性のパターン（文献26）も検査した。
次いですべての分離物の代表的な菌株を、糖発酵パターン等の標準的な表現型によって系統学的決定に関して分析した（API  CH  50  galleries  system,Biomerieux）。
本発明の菌株の系統および特性を下記のチャートに示す。
0003653277.tif 000002
0003653277.tif 000003
0003653277.tif 000004
0003653277.tif 000005
例２
本発明の菌株を、種々の種類の細胞に付着する能力、種々のpH値にて生長する能力、種々の濃度の胆汁にて生長する能力、および種々の培養条件下にて生長する能力、腸内病原体の生長に影響をおよぼす能力の持続性を評価するために、参考用菌株と比較した。各評価前に、菌株の凍結乾燥試料を再水和し、そしてMRS培地中で培養した。
該参考試料を下記に示す：
ラクトバチルス  アシドフイルス  ATCC  53103
ラクトバチルス  アシドフイルス  ATCC  4357
ラクトバチルス  デルブルエキイ  ATCC  7994
サルモネラ      エンテリチジス  IMM2
エスケリチア    コリ            ATCC  35401
人間の上皮細胞への付着
二種類の上皮細胞について付着テストを「イン  ビトロ」で実施した：
…分離したての人間の口内細胞；および
…腸内細胞（Instituto  Zooprofilattico  Sperimentale  in  Bresciaから得た、collection  cell  line、Intestine  407）。
健康な非喫煙者から口内細胞を分離した。木製の舌用押圧具を用いて頬の内表面をこすって細胞を集めた。次いで該口腔粘膜の細胞を、PBS（リン酸塩緩衝サリン）液を用いて洗った。
腸内細胞を、10％の牛胎児の血清を含むHanks  BSSのEagle's  Basal培地中にて生長するように調製し、そして５％CO2の雰囲気下で37℃で48時間培養した。得られた単層体（monostrata）を標準の方法によってトリプシン処理した（生長媒体を除き、PBS液で基体を洗い、0.25％濃度のトリプシン−ベルセン2mlを加える）。次に得られたサスペンジョンを1700gにて10分間遠心処理した。該細胞をPBS液で二度洗い、そして次に100細胞/mLの濃度となるまでPBS液で希釈した。
PBS液中の105個の上皮細胞（口内または腸内細胞）に、適当な条件下で生長させた107個のバクテリアを加えて付着テストを行った。該混合物を連続撹拌下に37℃で30分間培養した。その後に５μｍ径の細孔ポリカーボネート膜（Sartorius）を通して該サスペンジョンを濾過して、付着しないバクテリアを除いた。繰返して洗った後に付着した該バクテリアを検出するために、該膜をガラスのスライド上に置き、空気中で乾燥し、メタノールにて固定し、そしてクリスタル−バイオレットにて染色した。１個の細胞あたりの付着したバクテリアの平均数（Ｘ）を、100個の細胞に付着したバクテリアの個数を数えて測定した。
検査した菌株の付着を、参考用のATCC53103株の付着数と下記の式を用いて比較した。
0003653277.tif 000006
これらの実験の結果を表１に示す。
0003653277.tif 000007
上記の結果は、腸内および口内の粘膜の細胞に付着する本発明の菌株の優れた能力を示す。参考用菌株よりもはるかに大きい結果を示した場合も存在する。
種々のpH値における生長
pH3（HClを添加して得た）、pH5（培地の通常のpH値）およびpH8（NaOHを添加して得た）にて、本発明のラクトバチルスはMRS（Oxoid）液培地中で生長した。
該試料を５％CO2雰囲気下で37℃にて培養し、そして種々の間隔（12時間、24時間、48時間）にてバクテリア細胞を数えた。これらの結果を表２に示す。
0003653277.tif 000008
数値はlog  CFU/mLにて表す。CFU＝コロニイ形成単位。この結果は、本発明の菌株が広範囲のpH値で生長できることを示す。特に本発明の菌株は、参考用菌株と同等またはより強い酸性のpH値に対して耐性であることを示す。
胆汁に対する耐性
本発明の菌株および参考用のATCC  53103株を、MRS液状培地中で48時間培養した。スープ状の該培養物を、希釈（107CFU/mL）し、そして1.5g/Lまたは3g/Lの胆汁（Oxgall  powder,Sigma）を補充したMRS寒天培地で生長させた。嫌気性条件下37℃で48時間培養した後に、該バクテリアの数を数えて胆汁に対する耐性を実証した。結果を表３に示す。
0003653277.tif 000009
上記の結果は本発明の新規な菌種が、高濃度の場合でも胆汁に対する良好な耐性を有することを示す。胆汁のより高い濃度に対しても特に該CNCM  Ｉ−1447株が耐性であることは予想外であった。
嫌気性および好気性条件下の生長
MRS液培地中で嫌気性および好気性条件下37℃で、ラクトバチルスを一夜培養しそして計数した。結果を表４に示す。
0003653277.tif 000010
上記の結果は、本発明の菌株が嫌気性および好気性の両条件下で生長することを示す。
腸内病原体の生長に対する抑制
腸内病原体の生長を抑制する本発明の菌株の能力を、エスケリチア  コア（腸内毒素発生性ATCC  35401）そしてサルモネラ  エンテリチジス（IMM2）を用いる共存培養実験で評価した。
第一の系列の実験においては、本発明の菌株および参考用菌株を一夜生長させた。次いで二倍濃度のMRS液状培地および二倍濃度のMueller−Hilton液状培地の１対１混合物からなる培養媒体中で、５％CO2雰囲気下37℃でこれらの菌株を病原体と共に培養した。24時間および48時間後に、検査する病原体およびラクトバチルス株のバクテリア数を計数した。純粋な培養物として生長させた病原体およびラクトバチルス株を、対照として用いた。これらの実験の結果を表５および表６に示す。
他の系列の実験においては、本発明の菌株および参考用菌株を病原体と共に同時に培養し、そして上記の条件下に共存して生長させた。24時間および48時間の培養の後に、該病原体および該ラクトバチルス株のバクテリア数を計数した。対照物は上記の通りであった。これらの実験の結果を表７および表８に示す。
ラクトバチルスとの共存培養における病原体の生長の実験結果によって、本発明の菌株は有害な微生物の生長抑制に効果的であることが示される。
表５および表６に示すように実際に、エスケリチア  コリおよびサルモネラ  エンテリチジスの生長は、充分量のラクトバチルスを二種類の該病原体と共に培養した際に強く抑制された（log  CFU/mLとして表された値＜３はすべての実験に認められた）。本発明の菌株は、同時に培養される場合においても該病原体の生長を抑制し得る（表７および８）。特にサルモネラ  エンテリチジスの場合、ラクトバチルスを一夜生長させそして次に培養した際に同等の抑制が認められた（表８および表６を参照）。更に該ラクトバチルス株の生長は、病原体を同時に存在させても影響されないことが興味深く注目される。すべての実験において共存培養における該ラクトバチルスの生長に関するデータは、該ラクトバチルスの純粋培養の生長のデータに相等するものであった。
0003653277.tif 000011
0003653277.tif 000012
0003653277.tif 000013
0003653277.tif 000014
他の系列の実験において、本発明のラクトバチルスの混合物をエスケリチア  コリおよびサルモネラ  エンテリチジスと共に培養して、このような混合物が病原体菌株の生長抑制に相乗的効果を達成可能かどうかを評価した。同時に培養したラクトバチルスを用いた共存培養における、腸内毒素発生性エスケリチア  コリATCC  35401株にて得られた若干の結果を表９に示す。
0003653277.tif 000015
これらのデータによって、該病原体の生長を24時間および48時間後の両時点において該ラクトバチルス混合物は充分に抑制できたことが、明示される。更に該ラクトバチルス混合物は、単一種類のラクトバチルス株よりも該病原体の生長抑制に一そう効果的であった（表９を表７と比較のこと）。これらのデータは、ラクトバチルスと同時に培養された病原体の場合にも得られた。またこれらの実験において該ラクトバチルスの生長は、該病原体および他のラクトバチルス株の同時の存在によっても影響を受けなかった。同様の結果がサルモネラ  エンテリチジスの場合にも得られた。
本発明の菌株は、薬剤の調製に特に適合する一連の特長を有することが明らかである。本発明の菌株は人間の上皮細胞に付着する能力（増殖に重要な特性）を有し、そして該菌株は胆汁に対する耐性がよくない場合に有用である。該菌株は、酸性のpH値にて耐性でありそして生長でき、そして嫌気性および好気性の両条件下にて生長できる。更に本発明の菌株は、単独または該株の混合物として、胃腸管内中の病原体の生長を抑制する優れた能力を示す。これらの特性は凍結乾燥後にも維持される。
凍結乾燥に対する本発明の菌株の耐性は、４℃にて３ケ月後に35％から60％の範囲にて変化する。また該菌株は、高速度の生長性を有しそして溶菌素（lysogeny）が不在である。
これらの特性によって該菌株は、汚染した食物および水による疾病の予防および治療に、ならびに抗生物質を用いる治療中または一般的なストレス状態下における補助剤として特に適合する。また該菌株の安定性によって、旅行の多い人が感染しやすい病理の予防および治療に使用するのが、特に有用である。本発明の菌株は、好ましくない微生物による腸内増殖が生起し得るすべての状態の新生児（例えば帝王切開誕生児、未熟児、人工乳児）の治療にも、特に適合する。最後に該菌株はミルクおよび関連する食品の製造にて使用できる。
参考文献
［文献番号］
0003653277.tif 000016
0003653277.tif 000017
0003653277.tif 000018