(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトリンパ球系細胞株の培養上清中に出現し、配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、還元条件下の分子量が1万4千付近で、等電点が5.2付近のポリペプチドもしくはタンパク質であり、腫瘍細胞の細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を促進する作用を有するポリペプチドもしくはタンパク質。
【請求項２】
ヒトリンパ球系細胞株がヒト皮膚Ｔ細胞系リンパ腫細胞株HUT-78である請求項１記載のポリペプチドもしくはタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規サイトカイン様生理活性物質であり、腫瘍細胞に作用して細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を促進するポリペプチドもしくはタンパク質に関する。従って、本新規サイトカイン様生理活性物質を腫瘍の発生あるいは進展を予測するための診断用試薬の開発などに利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
プラスミノーゲンアクチベーターにはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターと組織型プラスミノーゲンアクチベーターの２種類が知られている。どちらも元来は腫瘍細胞が周辺組織を破壊して進展する際に役割を果たす物質として単離精製された。いずれも血中に大量に存在するプロテアーゼ前駆体であるプラスミノーゲンに作用して活性型であるプラスミンに変換する。そしてこのプラスミンが血栓の本体であるフィブリン等の分解を促すことで生体内組織の再構築が進む。ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターの場合には、様々な細胞の表面に特異的な受容体が存在することが知られている。ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターは受容体に結合した状態で溶液中よりも高い活性を示すことから、とりわけ細胞表面上でのプラスミノーゲン活性化が、腫瘍細胞が組織内に浸潤する際に重要な役割を演じていると考えられる。
【０００３】
この細胞表面上でのプラスミノーゲン活性化がどのように制御されているかという問題は、現在のところ不明である。細胞表面上でのプラスミノーゲン活性化を制御する鍵を握る因子を明らかにすることによって腫瘍の発生あるいは進展を的確に診断することが可能になると考えられる。また、この因子は腫瘍の発生あるいは進展を防ぐ医薬品の開発にも結び付くと考えられる。本発明者は細胞表面上でのプラスミノーゲン活性化を直接計測する方法（特開平５−１９２１９２号）を開発し、この問題の解明に着手した。マクロファージや血管内皮細胞のプラスミノーゲンアクチベーターの産生を促進する因子としてはさまざまなものが知られているが、それらのなかでは腫瘍細胞が本来持つ細胞表面上でのプラスミノーゲン活性を促進する物質は見いだされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
既存の腫瘍マーカーはいずれも正常組織に対して偽陽性を呈することがあり、必ずしも腫瘍に対して特異性が高いとは言えない。また腫瘍の個性に必ずしも適応できないという欠点においても共通している。従って、本当の意味で腫瘍の発生あるいは進展を確実に予測できる物質は依然として得られていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、とくに組織浸潤性の高いヒトリンパ球系細胞株の培養上清から、培養器に付着した腫瘍細胞の細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を顕著に促進する物質を単離精製した。
【０００６】
すなわち本発明は、ヒトリンパ球系細胞株の培養上清中に出現し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４で表されるアミノ酸配列の何れかを含み、等電点が5.2付近のポリペプチドもしくはタンパク質であり、腫瘍細胞の細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を促進する作用を有するポリペプチドもしくはタンパク質を提供する。。
また、本発明は、上記のポリペプチドもしくはタンパク質を生産する為のcDNAを提供する。
さらに、本発明は、上記のポリペプチドもしくはタンパク質に対するモノクローナル抗体を提供する。
【０００７】
本発明におけるヒトリンパ球系細胞株としては、組織浸潤性が高いものが好ましく、ヒト皮膚Ｔ細胞系リンパ腫細胞株HUT-78細胞、ヒトＴ細胞系白血病細胞株Jurkat細胞、ヒト・バーキットリンパ腫細胞株Raji細胞等を挙げることができる。とくに組織浸潤性の点で、ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株HUT-78細胞が好ましい。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のポリペプチドもしくはタンパク質の精製方法
ヒトリンパ球系細胞株を無血清培地で十分な密度になるまで培養し、ホルボルミリステートアセテート（Phorbol myristate acetate）で刺激した後の上清を集める。上清を８０％飽和硫酸アンモニウム塩析で濃縮した後、亜鉛キレートカラムとハイドロキシルアパタイトカラムとを順に連結した系に添加して、亜鉛キレートカラムを素通りしてハイドロキシルアパタイトに吸着した画分を回収する。次に、陰イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過濃縮、ゲル濾過、クロマトフォーカシングの順に精製を進め、最終的に水ーアセトニトリル系で平衡化した逆相HPLCで単離する。
【０００９】
（２）本発明のポリペプチドもしくはタンパク質の検出方法
ポリペプチドもしくはタンパク質は各精製段階において、培養器に付着したヒト繊維芽細胞形質転換株WI-38 VA13 2 RAを用いた細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性測定法（長田ら著、Thrombosis Research、第６２巻、５１９〜５３０頁、１９９１年）で容易に検出することができる。この測定方法の原理は特開平５−１９２１９２号に記載のプロテアーゼ活性の測定方法に基づく。また、本物質の等電点が5.2であることも、補助的な検出手段と成り得る。
【００１０】
得られた本発明のポリペプチドもしくはタンパク質をエンドペプチダーゼで限定分解し、アミノ酸分析を行うことにより、部分ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。以下の実施例で示すように、ヒト皮膚Ｔ細胞系リンパ腫細胞株HUT-78の培養上清から得られる本発明のポリペプチドもしくはタンパク質は、配列番号１、２、３、および４で表されるアミノ酸配列を含んでいる。
【００１１】
配列番号１、２、３または４で表される個々のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは市販のDNA自動合成装置を用いて容易に合成することができる。これらの合成オリゴヌクレオチドを放射性同位体や蛍光物質で標識してコロニーハイブリッド形成法やプラークハイブリッド形成法に用いることにより、本物質を産生する細胞（例えば、PMAで刺激したHUT-78細胞）から調製したcDNAライブラリーに含まれる本物質に相当するcDNAを容易に選択することができる。したがって、配列番号１、２、３または４で表される個々のアミノ酸配列から本発明のポリペプチドまたはタンパク質を生産する為のcDNAを容易に取得することが可能である。
【００１２】
また、配列番号１、２、３または４で表される個々のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを市販のペプチド自動合成装置を用いて容易に合成することができる。これらの合成オリゴペプチドを抗原として用い、マウス等の動物に免疫感作し、モノクローナル抗体作製のための通常の操作を行うことにより、本発明のポリペプチドまたはタンパク質に対するモノクローナル抗体を容易に取得することも可能である。
【００１３】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドもしくはタンパク質は、検出に用いたヒト繊維芽細胞形質転換株WI-38 VA13 2 RA以外にも、ヒト肺カルシノーマＡ５４９、ヒト皮膚カルシノーマＡ４３１、ヒト繊維肉腫細胞株HT-1080等の様々な腫瘍細胞の細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を促進する。一方で、正常繊維芽細胞株WI-38に対しては促進作用を示さなかった。従って、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質は、腫瘍の発生または進展を予測するための診断用試薬の開発に利用することができる。また、腫瘍の進展を防ぐ医薬の開発に研究用試薬として利用することもできる。一方で血栓傾向を伴う疾患の患者の体内に投与することにより、体内のプラスミノーゲンアクチベーター活性の促進作用を介して血栓傾向を改善する可能性もある。従って、血栓傾向の治療薬あるいは予防薬としての利用も可能である。
【００１４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
ヒト皮膚Ｔ細胞系リンパ腫細胞株HUT-78を市販の無血清培地ASF-104（味の素タカラコーポレイション）を用いて、CO2非存在下、３７度で培養した。細胞数が凡そ5 x 105個になったところで終濃度1 x 10-7 M のホルボルミリステートアセテート（Phorbol myristate acetate）を添加して、２４時間後に上清を集め、細胞断片等の不溶性凝集物を除いた後の上清に終濃度８０％飽和の硫酸アンモニウムを添加して沈殿を得た。この沈殿を10 mM りん酸ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム、0.01 % Tween 80、pH 7.2からなるりん酸緩衝液（以下"PBSTw"と略記する）に溶解し、分子量一万カットの透析膜に入れ、同緩衝液に対して透析した。透析後得られた濃縮画分をPBSTwで平衡化した亜鉛キレートセファロースカラム（ファルマシア製品をファルマシア使用説明書に基づき調製した）とハイドロキシルアパタイト（バイオラド）カラムとを順に連結した系に添加して、亜鉛キレーティングセファロースを素通りしてハイドロキシルアパタイトに吸着した画分を集めた。PBSTwのりん酸濃度を10 mMから150 mMに段階的に上昇させて活性画分を溶出させた後、20 mM ビストリス塩酸、0.01 % Tween 80、pH 6.5で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーQ-Sepharoseに吸着させ、200 mMまでの塩化ナトリウム濃度の上昇によって溶出した。活性画分を集めて限外濾過濃縮した後、25 mM ビストリス塩酸、0.01 % Tween 80、pH 6.5で平衡化したゲル濾過Superose 12 prepで分画し、活性画分を更に同緩衝液で平衡化したクロマトフォーカシングMono Pに吸着させ、pH 4.0のPolybuffer 74（ファルマシア）の添加によりpH勾配を形成して溶出させた。活性は等電点5.2付近に再現性良く検出された。図１にMono Pの活性の溶出位置とpH勾配との対応を示した。
【００１６】
次いで、活性画分を５％アセトニトリル−９５％水、0.05 %トリフルオロ酢酸、pH ２で平衡化した逆相HPLCカラムCosmosil 5C4-300 Packed Column（ナカライテスク）に吸着させ、5-100%アセトニトリルの濃度勾配で溶出させた。図２に逆相HPLCの分離パターンと活性の溶出位置との対応を示した。図３には逆相HPLCにより得られた精製標品の還元条件下でのSDS-PAGEの泳動像を示した。通常のLaemmliの方法（ネイチャー、２２７巻、６８０〜６８５頁）に従い、１０〜２０％アクリルアミドのミニゲルを用いた。泳動後は銀染色によりタンパク質のバンドを検出した。この図より、本発明の物質の還元条件下の分子量が１万４千付近であると算定される。このようにして培養上清凡そ１００リットルから、凡そ７μgの精製標品を得た。
【００１７】
活性測定は、毎回次のようにして行った。WI-38 VA13 2 RA細胞を96穴マイクロタイタープレートに蒔いて底面に付着させた後、本物質を含む溶液を添加して４時間、5% CO2、37度で培養した。アスピレーターで上清を除き、プラスミノーゲンとプラスミンの基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド（KabiVitrum製）を含むハンクス調製緩衝液（フェノールレッド不含）を細胞上に添加して、5% CO2、37度で培養し、３０分と９０分の波長405 nmの吸光度変化を測定した。図４には、Mono P溶出画分のWI-38 VA13 2 RA細胞に対する活性の濃度依存性の様子を示した。
【００１８】
尚、図２に示した逆相HPLCにより得られた精製標品をLys-Cエンドペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム山ノ内）で限定分解した後、逆相HPLC（ウォータース、Puresil C18）で分画し、220 nmの吸収を示すピークを順に気相アミノ酸シーケンサーで分析した。その結果、得られた部分ポリペプチドが以下の配列表に示すアミノ酸配列を有することを確認した。
【００１９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
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【００２０】
配列番号：２
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
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【００２１】
配列番号：３
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
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【００２２】
配列番号：４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
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【図面の簡単な説明】
【図１】  クロマトフォーカシングMono Pの活性の溶出位置とpH勾配。横軸の数字はフラクションの番号を、白抜四角は対応する細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を、黒菱形は対応するpHを示す。
【図２】  逆相HPLCの分離パターンと活性の溶出位置。横軸の数字はフラクションの番号を、上部の縦軸はA280の吸光度変化の様子を、上部の点線は対応するアセトニトリル濃度を、下部の縦軸は対応する細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を示す。
【図３】  逆相HPLCにより得られた精製標品の還元条件下でのSDS-PAGEの泳動像。上部の数字は図２のフラクションの番号に対応し、左側には分子量マーカーを示す。
【図４】  Mono P溶出画分のWI-38 VA13 2 RA細胞に対する活性の濃度依存性。横軸にタンパク濃度を、縦軸に細胞表面上のプラスミノーゲンアクチベーター活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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