(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査下の材料中の所定の細菌宿主特異性を示す標的バクテリオファージを検出、同定及び／又は定量するための方法であって、細菌が標的ファージに感染するとその細胞成分が放出させられるように選択された条件下で、材料から得た試料を宿主型細菌と共にインキュベートし、インキュベーション中に試料内に存在する任意のバクテリオファージによって細菌から放出された１種以上の特定成分の量を測定し、これを、標的バクテリオファージの存在、同定及び／又は量と関連づけることを含む前記方法。
【請求項２】
測定される特定の細胞成分が１種以上のヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定される成分が、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ又はＡＤＰ、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの１種以上である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種の酵素反応を用いてヌクレオチドを測定する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
アッセイシステムが酵素カスケードアッセイである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
成分がＡＴＰであり、アッセイが、発光を生ずる酵素反応を使用するアッセイである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アッセイシステムがルシフェリン／ルシフェラーゼシステムである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料を宿主細菌培養物と混合して、試料を宿主細菌とインキュベートする段階を実施する請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
特定の成分アッセイ試薬の存在下で又は、該試薬を後で添加して、試料を宿主細菌とインキュベートする段階を実施する請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応試薬を使用し、インキュベーション中及び／又はインキュベーション終了後に発生した光の量を測定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
成分放出及び測定段階での添加前に、増殖し得る標的バクテリオファージが寄生し得るタイプの宿主細菌培養物と共にインキュベートすることにより試料中のバクテリオファージを増殖する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
増殖インキュベーションを１〜４時間実施する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試料を宿主細菌の対数培養期に添加して増殖段階を実施する請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
成分放出が数種のバクテリオファージタイプを指示する数種の特異性の異なる宿主細菌型を使用して、増殖及び成分放出インキュベーションを実施する請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
分析すべき試料を濾過して細菌を除去した後に、該試料を増殖又は成分放出段階で添加する請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（１）標的バクテリオファージに特異的に感染して、細胞成分を放出させる能力について選択された細菌と、ならびに
（２）（ａ）前記細菌を、前記細菌が前記標的ファージに感染すると前記細胞成分が放出させられるように選択された条件下で、前記バクテリオファージを検出し同定し及び／又は定量すべき材料または試料と共にインキュベートするために必要な少なくとも１種の試薬、
（ｂ）上記インキュベーション中に前記細菌の細胞より放出された前記細胞成分の量を測定するために必要な少なくとも１種の試薬
（ｃ）前記細胞成分の前記量の測定値を前記標的バクテリオファージの存在、同定及び／又は量と関連づけるために必要な少なくとも１種の試薬、および
（ｄ）前記標的バクテリオファージの増殖を支える細菌
からなる群より選択される少なくとも１種の試薬
を含んでなる、標的バクテリオファージの検出、同定及び／又は定量用試験キット。
【請求項１７】
（ａ）標的バクテリオファージに特異的に感染して、細胞成分を放出させる能力について選択された細菌と、
（ｂ）バクテリオファージの細菌への作用によって放出された細胞成分についてアッセイを実施するのに必要な試薬と、
（ｃ）標的バクテリオファージの増殖を支える細菌
とを含んでなる請求項１６に記載の試験キット。
【請求項１８】
アッセイを実施するために必要な試薬が、細菌によって放出されるヌクレオチドの量を分析するためのものである請求項１６又は１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
試薬がルシフェリン及びルシフェラーゼを含んでいる請求項１８に記載の試験キット。
【請求項２０】
更に標的バクテリオファージ試料を含んでいる請求項１６から１９のいずれか一項に記載の試験キット。
【請求項２１】
細菌スターター培養物に特異的なバクテリオファージを検出するための、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の試験キット。
【請求項２２】
細菌スターター培養物に特異的なバクテリオファージを検出するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、バクテリオファージ（１種以上のファージ）の検出、同定及び／又は定量方法、並びに該方法を実施する際に使用する試験キットに関する。特にこの方法では、特定の細菌属、種又は血清型に特異的なバクテリオファージを単離形態であれ、環境試料、法廷用試料又は食物中の汚染物質としてであれ検出することができる。
望ましくない場合が多いが、細菌は多数の工業用途でも使用されている。遺伝子工学の分野、及び特に遺伝子工学細菌のようなタンパク質産物の大規模生産での細菌の役割は益々重要になっている。細菌は従来、自然食品の発酵による製造、とりわけチーズや牛乳の発酵製品の製造で使用されていた。ラクトースから乳酸への急速発酵はこのような乳製品の製造の主要反応であり、牛乳基質に乳酸菌種のスターター培養物を加えることにより生起する。様々な理由によって、これらのスターター培養物が不良で、正常な酸生成が開始しないか又は維持されないことがある。
スターター培養物不良の最も重大な理由の一つは、酪農環境を母体とすることが多いバクテリオファージが牛乳中に存在することである。これらは、細菌（この場合はスターター培養物の細菌）を攻撃して死滅させる特異的なウイルス剤である。バクテリオファージはその細菌宿主に寄生して繁殖し、新しい子孫ファージ粒子が細菌細胞の溶解によって環境中に放出される。乳製品製造工場がバクテリオファージに感染すると、スターター培養物による乳酸生成が大幅に減少し、場合によっては全滅する。長年にわたり、ファージの問題は、被る経済損失のために、チーズ製造業者が直面する最も深刻な問題であった。これらには、製造での時間損失、原料や規格外製品の損失が含まれる（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ（１９８４）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６，３１３−２５及びＨｅａｐ  ＆  Ｌａｗｒｅｎｃｅ（１９８８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい）。バクテリオファージ検出のために酪農工業で使用されている従来技術は慣用的な微生物学的技術に基づくが、労働が苛酷で、時間もかかる。これらには、ペトリ皿のスターター培養菌のローン（lawns）上で生成された細菌プラーク（即ち細菌のバックグラウンドの透明エリア）を観察し、共に環境試料を接種した培養物中での乳酸生成率を測定することを含む。迅速で簡単なバクテリオファージ検出技術が開発されれば、酪農工業に莫大な利益がもたらされることは明白である。
本発明者らは、検査試料中の特異バクテリオファージの存在や量又はバクテリオファージのタイプを指示する光シグナルによって、２４時間以上かかる既存方法に対して約４〜５時間以内で陽性結果をだす生物発光技術を好ましい形態で使用する技術を提供する。
本発明の方法は、特にバクテリオファージが溶菌サイクル複製下にあるときに、バクテリオファージに感染した細菌から細胞成分を放出させることに基づく。このサイクルでは、バクテリオファージは細胞の代謝を借用して自己複製し、サイクル終了後に細菌細胞壁が破壊されて、子孫及び実質的に全ての細菌細胞含有物が放出される。ファージによってインキュベーション媒質中の試薬に接近可能となる、細菌細胞に関連することが判明している１種以上の特定成分を測定することにより、例えば溶菌を介し、検定曲線又は他の統計技術を用いて感染を測定することが可能であり、従って、元の試料中のファージ量を推定することが可能である。試料を、試験の対象であるファージの特異的な標的である細菌に暴露し、細菌の特異ファージ感染を可能とするインキュベーション条件を提供することにより、感染を起こさないファージの存在下であっても、前述のように接近可能になった特定の細胞成分を分析することにより特異ファージの存在及び量を調べることが可能である。
従って、本発明は、検査中の材料で所定の細菌宿主特異性を示す標的バクテリオファージを検出、同定及び／又は定量するための方法を提供する。該方法は、細菌が標的ファージに感染すると細胞成分が放出させられるような条件下で、好ましくは液体培養で、材料から得た試料を宿主型細菌と共にインキュベートし、インキュベーション中に試料内に存在する任意のバクテリオファージによって細菌から放出された１種以上の特定成分の量を測定し、これを、標的バクテリオファージの存在、同定及び／又は利用と関連づけることからなる。特定の１種以上の成分がヌクレオチドを含んでいることが好ましい。
新たなファージ粒子の放出によって引き起こされる細胞溶菌によって放出されるヌクレオチド（例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ又はＡＤＰ、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）のいずれかを、当業界で入手可能な多くの酵素ベースのアッセイシステムの一つ以上、例えば「カスケード」システムを使用して得られる感度でもって測定することが理論的に可能である。例えば、英国特許第２２１３２６１号明細書は、サリチレートモノオキシゲナーゼシステムに基づく還元ピリジンヌクレオチド（例えばＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）の分析で使用され得る方法を開示しており、アルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１）／ＮＡＤ／ＮＡＤＰシステムのような他の酵素システムは英国特許第２２４０８４５号明細書に開示されている。ＡＤＰ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等に適したアッセイシステムは当業者には自明である。
しかしながら、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の測定が特に好ましい。ＡＴＰは多数の基質変換の補助因子となり、他の細菌ヌクレオチドに比べて比較的多量に放出されるので、酵素／酵素基質を様々に組み合わせたアッセイにより容易に測定することができる。本出願で放出されたＡＴＰのレベルを迅速かつ効果的に測定するには、発光を生ずる酵素、最も好都合には酵素のルシフェラーゼを使用することが特に好ましい。ＡＴＰ放出は、生物発光法を用い、市販の試薬で定量可能である。前記生物発光法は、ルシフェラーゼが触媒となってルシフェリンを酸化して、発光を生ずる反応を駆動するために使用される。この反応の量子効率は極めて高く、発生する光の量は、アッセイ反応によってＡＴＰが消失する前の試料中に最初に存在しているＡＴＰの量の尺度となる。
材料、例えば単離ファージの培養物中に生ずる比較的高濃度の特異ファージを同定又は定量するには、単に成分アッセイ試薬の存在下で又はこの試薬を後で添加して特異宿主細菌を材料試料と共にインキュベートし、アッセイを実施して成分の放出量を測定することが可能である。
溶菌ファージが標的となる場合、複製サイクル終了後に、標的バクテリオファージに感染した特異宿主細菌が（種によって例えば２０分から６０分の範囲の時間で）破裂して、細胞成分（例えばヌクレオチド）が放出され、アッセイによって検出される。ファージを含まない対照試料も、細菌を含まずファージを含む対照試料も、バックグラウンドレベルを超えるレベルまでの増加は示さなかった。
例えば水又は食物材料の内部又は表面上の汚染物質のような低濃度の特異ファージを同定、検出及び／又は定量するには、まず試験中の試料を例えば数時間増殖して、放出される成分（例えばヌクレオチド）がバックグラウンドレベルを超えて検出できるレベルまで標的ファージを増殖させる必要がある。この増殖は、標的バクテリオファージが寄生し得るタイプの別の宿主細菌の培養物（好ましくは対数期培養物）を用いて、好ましくは特異的に接種して実施することが好ましい。
宿主細菌と共にインキュベートしてファージ数を増した後に、無細胞ファージ数の多い培地の試料を、好ましくは対数期でスターター微生物の培養物と混合し、細胞成分の放出を生ずるように選択された設定温度及び設定時間でインキュベートする。これらは、使用されるファージ／細菌の組み合わせ及び成分（例えばヌクレオチド）の特性に依存し、成分放出は適切なアッセイ（例えば酵素／基質系）を用いて測定すべきである。
分析すべき試料は好ましくは、濾過して任意の細菌を除去した後に、増殖又は成分放出段階に添加すべきであり、かくして非標的バクテリオファージが汚染細菌に作用して干渉すると考えられる放出は回避される。検査中の環境から試料を採取するために、例えば表面の拭き取り、又は液体アリコートのサンプリングのような従来技術を使用することができる。
選択するファージ／宿主対の生物学的特性に依存して、本方法は、高い特異性、及び更なる感受性や迅速性に対する可能性を有する。前述のＡＴＰアッセイ法を使用することにより、本発明者らは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓに特異的なファージの検出を可能とするシステムを簡単に開発した。当業者は、本発明方法の適用が、必要な特異ファージ／細菌ペアリングが利用できる場合以外に限定されないことを認識するであろう。ＡＴＰ放出が測定される好ましい発光アッセイ法では、ファージが増殖されていようといまいと、試験試料を、ルミノメーターチューブ内で好ましくは対数期の細菌培養物と混合し、適当な時間インキュベートすることが好都合である。これは通常、ファージ／細菌系に応じて３０分から６０分である。この期間の後又はこの期間中であるが、好ましくはこの期間の後に、光発生アッセイ（例えばルシフェリン／ルシフェラーゼ反応系）を用いて放出されたＡＴＰを測定して、ルミノメーターで検出されかつＡＴＰ量と関連する光量を調べる。
いずれの場合も、バックグラウンド成分レベル（例えばヌクレオチドレベル）を比較するために、例えば細菌を含まない及び／又は細菌及び既知量のファージと共にインキュベートした対数期培地試料で対照を実施して、検定曲線を作成し得ることが有利であり得る。このような対照は、試料中に存在するファージの特性又は種々のタイプをより完全に決定するために特異性の異なる他の宿主でチャレンジすることを含み得る。同様に、１回のインキュベーションで数種の細菌種を使用してもよい。この方法は、慣用的な細菌が特異性を十分に示さない数種のファージをスクリーニングするために使用される。
利用可能な細菌の範囲、及び細菌が特異性を示すバクテリオファージは当業者によって広範囲であると理解されよう。例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なファージ型のリストは、ＡＴＣＣの「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ＆  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」に掲載されている。他のこのような寄託機関も自所のカタログに同様のデータを掲載しており、これを使用して本発明方法で考えられるファージ「試薬」を同定することができる。細菌をとりわけ水性懸濁液又は凍結乾燥形態にて、例えばマイクロタイタープレートウェル上で使用することができる。この方法では、プレートルミノメトリーを使用することができる。本発明の方法は、溶菌ファージ、即ち試験細菌を溶解させるファージの検出及び定量に特に使用されるが、その作用によって細胞成分を放出させるファージを検出してもよい。
本発明は更に、本発明方法を実施するための試験キットを提供する。該キットは、標的バクテリオファージへの特異的感染能力について選択された細菌、即ち検出、同定及び／又は定量を望む１種以上のタイプの細菌を、上述の本発明方法と特に関連する試薬の幾つか又は全てと組み合わせて含んでいることを特徴とする。
従って、本発明の試験キットは好ましくは、
（ａ）標的バクテリオファージに特異的に感染して、細胞成分を放出させる能力について選択された細菌と、
（ｂ）バクテリオファージの細菌への作用によって放出された細胞成分についてアッセイを実施するのに必要な試薬と、
（ｃ）標的バクテリオファージの増殖を支える細菌
とを含んでなる。
従って、本発明の好ましい試験キットは、アッセイを実施するために必要な試薬が、細菌によって放出されるヌクレオチドの量を分析するためのものであり、好ましくは試薬はルシフェリン及びルシフェラーゼを含んでいる。バクテリオファージの高感度アッセイの性能のために最適化された試験キットは、上記成分（ｃ）の細菌を含んでいる。これは成分（ａ）の細菌と同一であってもよいが、これほど特異的には寄生化しなくともファージのより迅速な複製を支持し得るか又はより多量のファージを生成し得る細菌であってもよい。
以下の非制限的な実施例を参照して、本発明の方法及びキットを例示する。上述し以下にも記載する一般的な方法、及び利用可能な種類の細菌／ファージペアリング、及び例えばヌクレオチドアッセイを考慮すれば、多岐にわたる利用可能なオプションが当業者によって容易に決定されよう。
実施例１：酪農環境及び乳製品における細菌スターター培養物に特異的なバクテリオファージの検出で使用するためのキット
本発明の方法で使用するためのキットは好都合には、以下の星印の付いた物質を、場合によっては実施例の方法のために必要であるとして以下に記載する他の部品（装置）や試薬と共に含んでいる。
必要な部品（装置）：滅菌綿棒；孔径０．８μｍのシリンジフィルター；孔径０．２２μｍのシリンジフィルター；滅菌５ｍｌシリンジ；滅菌万能ビン又は装飾（bijou）用ビン；遠心分離管；ルミノメーター（モデルＬＢ９５３  Ａｕｔｏｌｕｍａｔ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）；ポリスチレンルミノメーターチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ  Ｌｅｙｓ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ）。
必要な試薬：滅菌ペプトン／食塩水（それぞれ蒸留水１ｌ当たり１ｇ／８．５ｇ）；Ｍ１７ブロス（Ｕｎｉｐａｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ）、＊ルシフェリン／ルシフェラーゼ及び希釈緩衝液を含むアデノシン−５’−トリホスフェートアッセイミックス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ）；滅菌１０％乳酸；＊スターター培養細菌のストック培養物（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＤＦ  ２６３／１９９１  第２章で参照されたい）。
実施例２：（Ａ）酪農環境及び（Ｂ）乳製品で細菌スターター培養物に特異的なバクテリオファージを検出するための方法
Ａ：酪農設備での方法：
サンプリング；滅菌蒸留水を湿らせた滅菌綿棒を使用して設備エリア（０．５ｍ2）を拭き、次いで綿棒を５ｍｌの滅菌ペプトン／食塩水中で撹拌した。次いで、ペプトン／食塩水を孔径０．８μｍのシリンジフィルターで滅菌容器内に濾過し、次いで孔径０．２２μｍのシリンジフィルターで再度濾過して、同様の第２の容器に入れた。バクテリオファージ力価が低いと予想されると、ファージ増殖段階を実施した。
増殖：新鮮なＭ１７ブロス８ｍｌにスターター微生物の対数期培養物１ｍｌを接種し、１ｍｌのバクテリオファージ濾液を加え、混合物を適温（中温性スターター培養物の場合２０〜２２℃、好熱性スターター培養物の場合４２℃）で４時間インキュベートした。この増殖培養物を遠心分離管に移して、回転させて細菌を除去した（２０分間で５０００ｇ）後、孔径０．２２μｍのシリンジフィルターで上清を滅菌容器内に濾過した。
アッセイ：上述したように使用する宿主スターター培養物に応じて２２℃又は４２℃に保持したＭ１７ブロス５０μｌを、同一温度に予熱したルミノメーター中の８０個全てのポリスチレンルミノメーターチューブに添加した。陰性対照として作用させるために５０μｌの対数期スターター培養物を一つおきの各管内に入れ、増殖又はサンプリング段階からの「ファージ」濾液０．５ｍｌを４．５ｍｌの残りの培養物に加え、このうち５０μｌを残りのルミノメーターチューブの各々に入れた。１００μｌのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を各チューブに注入して光測定を開始し、光出力を６０秒間測定した。次いで、試料チューブ及び陰性対照チューブの両方について、時間に対するピーク光測定値（カウント／秒）をプロットした。
結果：試験試料の遊離ＡＴＰレベルが陰性対照に比べて約５倍に増加したことは試験試料中にスターターに特異的なファージが存在することを示していた。
Ｂ：乳製品での方法：
サンプリング：液体は特定の前処理を必要としなかった；有利には粉末を適当な容量（例えば１：１０に希釈）の滅菌水に懸濁させた；チーズのような固体を９倍重量のペプトン／食塩水と混合して、均質化した。全ての試料のｐＨを４．５〜４．７に無菌調整して、カゼインを沈殿させた。０．３ｍｌの滅菌１０％乳酸を１０ｍｌの牛乳又は乳漿に加えた；汚染の危険性があるため、オートクレーブ処理しない場合には、ｐＨ電極の使用は避けた。試料を５０００ｇで２０分間遠心分離し、孔径０．２２μｍのシリンジフィルターで上清を滅菌容器内に濾過して、大きな粒子や細菌を除去した。上記（Ａ）のように、この滅菌濾液中のバクテリオファージの力価が低いと思われたならば、増殖段階で力価を増した。増殖及び光測定段階は方法Ａで上述したように実施した。