(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、該基体の表面に存在する重合体と、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、前記重合体が、下記一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなり、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合しており、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの前記第一の標的物質捕捉体が結合していないカルボキシル基の少なくとも一部に一般式（２）に示される化合物が結合していることを特徴とする構造体。
【化１】
0005383115.tif 000054
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【化２】
0005383115.tif 000055
（式中、ｎは１以上４以下の整数であり、且つｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。Ｙは、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈのうちのいずれかの基である。また、メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。）
【請求項２】
前記一般式（２）に記載の化合物が、アミノメタンスルホン酸、硫酸モノアミノエチルのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記一般式（１）に記載の化合物が、下記一般式（３）に記載の化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の構造体。
【化３】
0005383115.tif 000056
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【請求項４】
前記一般式（１）に記載の化合物が、下記の化学式（Ａ）に記載の化合物であり、前記一般式（２）に記載の化合物が、アミノメタンスルホン酸、硫酸モノアミノエチルのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の構造体。
【化４】
0005383115.tif 000057
【請求項５】
検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在する重合体と、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、前記重合体が、下記一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなり、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合しており、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの前記第一の標的物質捕捉体が結合していないカルボキシル基の少なくとも一部に一般式（２）に示される化合物が結合していることを特徴とする標的物質検出素子。
【化５】
0005383115.tif 000058
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【化６】
0005383115.tif 000059
（式中、ｎは１以上４以下の整数であり、且つｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。Ｙは、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈのうちのいずれかの基である。また、メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。）
【請求項６】
請求項５に記載の標的物質検出素子と、標識物質と第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする標的物質検出キット。
【請求項７】
前記検出領域が、磁性物質を検出することができる検出領域であり、前記標識物質が磁性物質であることを特徴とする請求項６に記載の標的物質検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質や夾雑物の非特異吸着を良好に防止することが可能であり、標的物質を高感度に検出する標的物質検出素子、標的物質検出キットおよび標的物質検出素子を構成するための構造体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、検体中の標的物質を検出する手段として分子間の相互作用が用いられてきた。相互作用を用いた手段としては、一方の分子を捕捉体として基体表面上に固定し、標的物質を含む検体を接触させることによって反応を行わせる方法が一般的である。
【０００３】
固定した捕捉体と相互作用する標的物質を定量的に測定するとき、基体表面の性質もしくは固定方法によっては、前記生体分子と相互作用した標的物質以外に、基体表面に非特異的に吸着した物質も同時に検出してしまう恐れがある。このことが、微量検出を必要とするセンサでは、最小検出感度を低下させる原因となる。そのため、非特異吸着を抑制しつつ、標的物質のみが検出される手法が必要とされている。
【０００４】
基体表面への非特異吸着を防止する技術として、非特許文献１には、シリコン表面において、ＭＰＣ（２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）をモノマーとして原子移動ラジカル重合により基体表面にＭＰＣポリマーを高密度に形成し、タンパク質の非特異吸着および細胞の接着を防止する技術が開示されている。
【０００５】
一方、非特許文献２には、ＣＢＭＡ（ｃａｒｂｏｘｙｂｅｔａｉｎｅ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をモノマーとして原子移動ラジカル重合によりＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）センサ表面にＣＢＭＡポリマーを高密度で形成した後、更にＣＢＭＡポリマーの側鎖官能基であるカルボキシル基に標的物質捕捉体を固定し、夾雑物の非特異吸着を防止して標的物質を検出する技術が開示されている。
【非特許文献１】“Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，２００４，５，２３０８から２３１４頁
【非特許文献２】“Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，２００６，７，３３１１から３３１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１で使用されているＭＰＣポリマーは標的物質捕捉体を固定できる構造ではなく、固定する工夫はなされていない。
また、非特許文献２においては、ＣＢＭＡポリマーに標的物質捕捉体を固定した後、活性エステル基（スクシンイミド基）をエタノールアミンで失活させていることから、側鎖ベタイン構造のカルボキシル基のマイナス電荷が消失し、側鎖の電荷は中性からプラス電荷に偏ることになる。その結果、マイナス電荷を持つ夾雑物の非特異吸着が発生する可能性があり、更に固定化した標的物質捕捉体の機能が低下する恐れがある。
【０００７】
そこで、本発明は、標的物質や夾雑物の非特異吸着を良好に防止することが可能であり、標的物質を高感度に検出する標的物質検出素子、標的物質検出キットおよび標的物質検出素子を構成する構造体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一は、基体と、該基体の表面に存在する重合体と、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、前記重合体が、下記一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなり、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合しており、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの前記第一の標的物質捕捉体が結合していないカルボキシル基の少なくとも一部に一般式（２）に示される化合物が結合していることを特徴とする構造体である。
【０００９】
【化１】
0005383115.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【００１１】
【化２】
0005383115.tif 000003
【００１２】
（式中、ｎは１以上４以下の整数であり、且つｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。Ｙは、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈのうちのいずれかの基である。また、メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。）
前記一般式（２）に記載の化合物が、アミノメタンスルホン酸、硫酸モノアミノエチルのいずれかであることが好ましい。
【００１３】
前記一般式（１）に記載の化合物が、下記一般式（３）に記載の化合物であることが好ましい。
【００１４】
【化３】
0005383115.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【００１６】
前記一般式（１）に記載の化合物が、下記の化学式（Ａ）に記載の化合物であり、前記一般式（２）に記載の化合物が、アミノメタンスルホン酸、硫酸モノアミノエチルのいずれかであることが好ましい。
【００１７】
【化４】
0005383115.tif 000005
【００１８】
また、別の本発明は、検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在する重合体と、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、前記重合体が、下記一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなり、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合しており、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの前記第一の標的物質捕捉体が結合していないカルボキシル基の少なくとも一部に一般式（２）に示される化合物が結合していることを特徴とする標的物質検出素子である。
【００１９】
【化５】
0005383115.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【００２１】
【化６】
0005383115.tif 000007
【００２２】
（式中、ｎは１以上４以下の整数であり、且つｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。Ｙは、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈのうちのいずれかの基である。また、メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。）
【００２３】
また、別の本発明は、前記の標的物質検出素子と、標識物質と第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする標的物質検出キットである。
【００２４】
また、前記検出領域が、磁性物質を検出することができる検出領域であり、前記標識物質が磁性物質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、標的物質や夾雑物の非特異吸着を良好に防止することが可能であり、標的物質を高感度に検出する標的物質検出素子、標的物質検出キットおよび標的物質検出素子を構成するための構造体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
まず、本発明の第一の構造体について図１を用いて説明する。
本発明の第一の構造体は、図１（Ａ）に示すように、基体１と、基体表面に存在する重合体２と、重合体２に結合する第一の標的物質捕捉体（第一の捕捉分子）５と、保護分子４からなる。
以下、各部分について説明する。
【００２７】
（基体）
基体１は、構造体の支持体として機能するものであり、かつ表面に重合体２を形成可能なものである。
【００２８】
基体１の材質は、本発明の構造体の支持体として機能するものであれば、いかなる材質でもよいが、好ましくは、アミノ基もしくはチオール基が結合可能である金、銀、銅、白金、アルミニウム等の金属、ＣｄＳ、ＺｎＳ等の半導体、酸化チタン、酸化アルミニウム等の金属酸化物、もしくは、シラノール基が結合可能なガラス、シリコン、酸化チタン、セラミック、もしくは、カルボキシル基が結合可能なセラミック、カーボンが好適である。酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化することによりカルボキシル基を提示することが可能なプラスチックでもよい。
【００２９】
基体１の形状は、平板もしくは粒子、微小構造体などいかなる形状でもよい。また、基体１の形状は、平板、曲板、粒子、微小構造体、あるいはマイクロタイタープレートなどいかなる形状でもよい。
【００３０】
（重合体）
重合体２は、一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなる。
【００３１】
一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体は、一方の末端が基体１に固定されており、重合体の側鎖には生体分子の非特異吸着を防止する分子内塩構造（両性イオン）が存在する。即ち、一般式（１）のモノマーの重合体の側鎖はカルボキシベタイン構造、言い換えれば、一分子中に四級アンモニウムのカチオンとカルボキシル基のアニオンを有する分子内塩構造であり、このような分子内塩構造は、検体中の夾雑物等の非特異吸着を防止するのに優れた機能を有している。なお、以下の記載では、基体１の表面に高密度に形成された重合体２の膜を非特異吸着防止膜１４と称する。
【００３２】
【化７】
0005383115.tif 000008
【００３３】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
言い換えると、一般式（１）に示される化合物は、下記一般式（３）もしくは下記一般式（４）に示される化合物である。
【００３４】
【化８】
0005383115.tif 000009
【００３５】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２、Ｒ３はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかである。ａは１以上５以下の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
もしくは
【００３６】
【化９】
0005383115.tif 000010
【００３７】
（式中、Ｒ４は水素原子又はメチル基である。Ｒ５、Ｒ６はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかである。ｘは１以上５以下の整数である。ｙは１以上４以下の整数である。）
【００３８】
前記基体１上における重合体２の数平均分子量は５０００以上１００００００以下であり、好ましくは１００００以上１００００００以下である。分子量分布は１以上２未満が好ましい。また、前記重合体の密度は０．１分子／ｎｍ２以上が好ましい。
【００３９】
重合体２の一方の末端を基体１へ固定化する方法として、既に合成された重合体２を基体１の表面に接触させて固定させても良いが、好ましくは重合によって合成されるものであり、より好ましくは、重合がリビングラジカル重合であるものである。リビングラジカル重合については後に説明する。
【００４０】
また、非特異吸着防止膜１４に含まれるカルボキシル基３のうちの一部に第一の標的物質捕捉体５が固定されており、他のカルボキシル基３の少なくとも一部に一般式（２）で示される化合物が結合している。なお、図（Ｂ）には、重合体２が側鎖に有するカルボキシル基３に保護分子４が結合した状態を示している。なお、第一の標的物質捕捉体の固定方法、及び一般式（２）の化合物の固定方法については後に説明する。
【００４１】
（リビングラジカル重合）
一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの合成に関しては、一般式（１）のｂが１の場合、Ｇａｏｆｅｎｚｉ  Ｃａｉｌｉａｏ  Ｋｅｘｕｅ  Ｙｕ  Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ（２０００），１６（６），４４から４６．を参考にして合成することができる。即ち、（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリルアミドをクロロ酢酸ナトリウムと反応させることによって、目的とするカルボキシベタインモノマーを得ることができる。
【００４２】
一方、一般式（１）のｂが２以上の場合、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．  １９９７，３５，３５２７から３５３６を参考にして合成することができる。即ち、（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリルアミドをラクトンと反応させることによって、目的とするカルボキシベタインモノマーを得ることができる。
【００４３】
一般的に、リビングラジカル重合は、合成されるポリマーの分子量分布が狭く、かつ基体上に高密度にポリマー層をグラフト化できる。よって、本発明においては、一般式（１）又は（２）で示されるカルボキシベタインモノマーを重合すれば、基体上に高密度に重合体が形成されたからなる非特異吸着防止膜を設けることが可能であり、その非特異吸着防止膜が有するカルボキシル基の少なくとも一部に第一の標的物質捕捉体を固定することが可能である。リビングラジカル重合法としては、有機ハロゲン化物などを開始剤とし、遷移金属錯体を触媒とする原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＴＲＰ）、ニトロキシド化合物などのラジカル捕捉剤を用いるニトロキシド媒介重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＮＭＰ）や、ジチオカルバメイトなどのラジカル捕捉剤を用いる光イニシエーター重合などが挙げられる。本発明においてはいずれの方法により前記構造体を製造してもよいが、制御の容易さなどから原子移動ラジカル重合を利用するのが好ましい。
【００４４】
基体表面への重合体の形成方法を説明する。
（原子移動ラジカル重合）
リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合の場合、化学式１から３に示すような有機ハロゲン化物、又は化学式４に示すようなハロゲン化スルホニル化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００４５】
【化１０】
0005383115.tif 000011
【００４６】
原子移動ラジカル重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、重合することによって非特異吸着防止膜となる一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマー、遷移金属錯体を添加し、反応系を不活性ガスで置換して原子移動ラジカル重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての重合体を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００４７】
反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、水、メタノール、エタノール、プロパノ−ル、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
【００４８】
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
使用する遷移金属錯体はハロゲン化金属とリガンドからなる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、特にＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
【００４９】
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されないが、例えば、２，２’−ビピリジル、４，４’−ジ−（ｎ−ヘプチル）−２，２’−ビピリジル、２−（Ｎ−ペンチルイミノメチル）ピリジン、（−）−スパルテイン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。
【００５０】
遷移金属錯体の添加量は、非特異吸着防止膜となるカルボキシベタインモノマーに対して、０．００１重量％から１０重量％、好ましくは０．０５重量％から５重量％である。
重合温度は、１０℃から１００℃の範囲であり、好ましくは２０℃から８０℃の範囲である。
【００５１】
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された重合体の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００５２】
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している原子移動ラジカル重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。したがって、化学式１（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対しては、フリーな重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを用いることが好ましい。また、化学式２（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対しては、フリーな重合開始剤として２−ブロモプロピオン酸エチルを用いることが好ましい。
【００５３】
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、重合体がグラフト化し、非特異吸着防止膜が形成された基体を得ることができる。
【００５４】
（ニトロキシド媒介重合）
リビングラジカル重合がニトロキシド媒介重合である場合、化学式５から７に示すようなニトロキシド化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００５５】
【化１１】
0005383115.tif 000012
【００５６】
ニトロキシド媒介重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、非特異吸着防止膜となる一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換してニトロキシド媒介重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての重合体を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００５７】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００５８】
重合温度は、１０℃から１２０℃の範囲であり、好ましくは、２０℃から１００℃の範囲である。重合温度が１０℃未満では、形成される非特異吸着防止膜が低分子量であったり、あるいは重合が進行し難いので好ましくない。
【００５９】
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。
フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された重合体の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００６０】
フリーな重合開始剤としては、基体に固定しているニトロキシド媒介重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。したがって、化学式５の重合開始剤に対しては、フリーな重合開始剤として化学式８に示されるニトロキシド化合物を用いることが好ましい。
【００６１】
【化１２】
0005383115.tif 000013
【００６２】
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、重合体がグラフト化された基体を得ることができる。
【００６３】
（光イニシエーター重合）
リビングラジカル重合が光イニシエーター重合である場合、化学式９に示すようなＮ，Ｎ−ジチオカルバミン系化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００６４】
【化１３】
0005383115.tif 000014
【００６５】
光イニシエーター重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、非特異吸着防止膜となる一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換して光照射することによって光イニシエーター重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての重合体を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００６６】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００６７】
照射する光の波長は、使用する光イニシエーター重合開始剤の種類によって異なる。化学式９に例示する光イニシエーター重合開始剤を有する基体表面に重合体をグラフト化する場合、反応系に３００ｎｍから６００ｎｍの波長を示す光を照射することによって光イニシエーター重合が良好に進行する。
【００６８】
重合温度は、副反応を抑制するため、室温あるいはそれ以下の温度であることが好ましい。但し、同様の効果が得られる範囲においてこの温度領域に限定されるわけではない。
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された重合体の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００６９】
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している光イニシエーター重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。したがって、化学式９の重合開始剤に対しては、フリーな重合開始剤として化学式１０に示されるジチオカルバメイト系化合物を用いることが好ましい。
【００７０】
【化１４】
0005383115.tif 000015
【００７１】
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、重合体がグラフト化された基体を得ることができる。
基体表面に重合開始剤を固定する方法は特に限定されるものではないが、基体が金属であれば、チオール化合物を含む重合開始剤を基体表面に結合するか、又は、前記基体をチオール化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００７２】
基体が酸化膜を有する金属であれば、シランカップリング剤を含む重合開始剤を結合するか、又は、前記基体をシランカップリング剤で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００７３】
基体がプラスチックであれば、酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化してカルボキシル基を発現させた後、アミノ化合物を含む重合開始剤を結合するか、又はアミノ化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００７４】
（第一の標的物質捕捉体）
標的物質捕捉体５は、標的物質と相互作用することにより捕捉、あるいは変換を行う分子である。このような標的物質捕捉体５としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体などが挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、抗体フラグメント、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴ脂質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのうちでも、生体物質を捕捉、あるいは変換することができる抗体、抗体フラグメント、あるいは酵素であることが好ましい。
【００７５】
第一の標的物質捕捉体を基体１に固定する方法としては、重合体２が有する側鎖のカルボキシル基３の少なくとも一部に第一の標的物質捕捉体５を共有結合させる方法を使用することができる。
【００７６】
具体的には、反応式１に示すように、一般式（１）のカルボキシベタインモノマーの重合体を形成した後に、側鎖のカルボキシル基に、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等を使用して、重合体が有する側鎖のカルボキシル基をスクシンイミド基に置換して活性エステル化する。このスクシンイミド基（活性エステル基）に第一の標的物質捕捉体のアミノ基を反応させて、重合体の側鎖に第一の標的物質捕捉体を固定することができる。
【００７７】
【化１５】
0005383115.tif 000016
【００７８】
（スクシンイミド基の失活）
次に、第一の標的物質捕捉体を重合体に固定した後で、重合体の未反応のスクシンイミド基（活性エステル基）を、一般式（２）の化合物４と反応させてスクシンイミド基（活性エステル基）を失活させる。
【００７９】
なお、一般式（２）で示される化合物４は、言い換えると、以下の一般式（５）〜（９）のいずれかに示される化合物である。これらのうち、一般式（５）、（８）、（９）で示される化合物は参考例である。
【００８０】
【化１６】
0005383115.tif 000017
【００８１】
一般式（５）のｎは１以上４以下の整数であり、かつ一般式（１）のｂによって限定され、ｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。
【００８２】
【化１７】
0005383115.tif 000018
【００８３】
一般式（６）のｍは１以上４以下の整数であり、かつ一般式（１）のｂによって限定され、ｍ＋ｂは２以上５以下の整数である。メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い
【００８４】
【化１８】
0005383115.tif 000019
【００８５】
一般式（７）のｐは１以上４以下の整数であり、かつ一般式（１）のｂによって限定され、ｐ＋ｂは２以上５以下の整数である。メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。
【００８６】
【化１９】
0005383115.tif 000020
【００８７】
一般式（８）のＲ７はメチル基又はエチル基である。一般式（８）のｑは１以上４以下の整数であり、かつ一般式（１）のｂによって限定され、ｑ＋ｂは２以上５以下の整数である。メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。
【００８８】
【化２０】
0005383115.tif 000021
【００８９】
一般式（９）のＲ８はメチル基又はエチル基である。一般式（９）のｒは１以上４以下の整数であり、かつ一般式（１）のｂによって限定され、ｒ＋ｂはいずれも２以上５以下の整数である。メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。
【００９０】
したがって、重合体の未反応のスクシンイミド基（活性エステル基）は、反応式２〜６の反応で、一般式（５）〜（９）の化合物と反応させてスクシンイミド基（活性エステル基）を失活させることができる。
【００９１】
【化２１】
0005383115.tif 000022
【００９２】
【化２２】
0005383115.tif 000023
【００９３】
【化２３】
0005383115.tif 000024
【００９４】
【化２４】
0005383115.tif 000025
【００９５】
【化２５】
0005383115.tif 000026
【００９６】
（標的物質検出素子）
次に、本発明の第二について説明する。
本発明の第二は、検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在する重合体と、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、前記重合体が、下記一般式（１）で示されるカルボキシベタインモノマーの重合体からなり、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合しており、前記重合体が有するカルボキシル基のうちの前記第一の標的物質捕捉体が結合していないカルボキシル基のうちの少なくとも一部に一般式（２）に示される化合物が結合していることを特徴とする標的物質検出素子である。
【００９７】
【化２６】
0005383115.tif 000027
【００９８】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｒ２およびＲ３は各々独立にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基のいずれかから選ばれる基である。Ｘは酸素原子もしくはＮＨである。ａは１から５の整数である。ｂは１以上４以下の整数である。）
【００９９】
【化２７】
0005383115.tif 000028
【０１００】
（式中、ｎは１以上４以下の整数であり、且つｎ＋ｂは２以上５以下の整数である。Ｙは、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈのうちのいずれかの基である。また、メチレン基の水素原子は、水酸基、メチル基、ヒドロキシメチル基で置換されていても良い。）
【０１０１】
図２は、本発明の第二の標的物質検出素子１２を示す模式図である。
基体１は検出領域６を有する。
【０１０２】
検出領域６は、捕捉した標的物質を検出する領域である。検出領域６には、捕捉した標的物質に由来する信号を伝達する材質で構成される。例えば、検出方法が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）あるいは局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）であれば、表面プラズモンを発生する材質を表面に含む。検出方法が水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）であれば、吸着した物質の重さに比例して振動数が変化する材質を含む。検出方法が電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であれば、電流を通し、微細加工が可能な材質で構成する。検出方法が磁気検出方法であれば、軟磁性体のように比較的簡単に磁極が消えたり反転したりする材質を含む。検出方法が電気化学であれば、電気化学反応を阻害しない広い電位領域を有する材質で表面を形成することが好ましい。検出方法が吸光検出であれば、検出する波長光を透過する材質でできていることが好ましい。検出方法が蛍光検出あるいは発光検出であれば、検出する波長光を吸収しない材質でできていることが好ましい。
【０１０３】
検出領域６の材質としては、金、銀、銅、白金、水晶、シリコン、ゲルマニウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化シリコン、酸化インジウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、ガリウム砒素、パーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）、Ｃｏ−Ｆｅ−Ｂ合金、水銀、カーボン、ダイヤモンド、ガラス、あるいはプラスチックなどが挙げられるが、以上に限定されない。
【０１０４】
これら検出領域６の材質は、標的物質の検出方法によって使い分けられることが多い。検出方法としてＳＰＲを用いる場合は、検出領域６の材質が金、銀、銅、あるいは白金などの金属であることが好ましい。好ましくは金である。検出方法としてＱＣＭを用いる場合は、検出領域６の材質が水晶であることが好ましい。検出方法としてＦＥＴを用いる場合は、検出領域６の材質として、シリコン、ゲルマニウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化シリコン、酸化インジウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、ガリウム砒素などが挙げられる。以上のように、検出方法として、ＳＰＲ、ＱＣＭあるいはＦＥＴを使用すれば、標的物質を非標識で検出することができる。
【０１０５】
また、検出方法として磁気検出方法を用いる場合は、検出領域６の材質がパーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）あるいはＣｏ−Ｆｅ−Ｂ合金に代表される軟磁性体であることが好ましい。検出方法として電気化学を用いる場合は、検出領域６の材質が金、白金、水銀、カーボン、あるいはダイヤモンドであることが好ましい。検出方法として吸光検出、蛍光検出あるいは発光検出を用いる場合は、検出領域６の材質がガラスあるいはプラスチックであることが好ましい。
【０１０６】
検出領域６は、基体１の表面に存在していても良いし、基体１の内部に存在していても良い。例えば、検出領域６が基体１の表面に存在するケースとして、ＳＰＲ、電気化学が挙げられる。ＳＰＲであれば、表面プラズモンを発生する金属薄膜を基体の表面に形成する。電気化学であれば、金属を作用電極の少なくとも表面に形成する。
【０１０７】
一方、検出領域６が基体１の内部に存在してもよいケースとして、ＱＣＭ、ＦＥＴ、あるいは磁気センサが挙げられる。ＱＣＭでは、水晶の表面に形成された金薄膜上に非特異吸着防止膜を形成することで、標的物質検出素子を作製することができる。ＦＥＴでは、電流を通す材質からなる構造体の表面に非特異吸着防止膜を形成することで、本発明の標的物質検出素子を作製することができる。磁気センサでは、パーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）あるいはＣｏ−Ｆｅ−Ｂ合金を含む複数層の表面に形成された層上に非特異吸着防止膜を形成することで、標的物質検出素子を作製することができる。
【０１０８】
なお、図２では、基体１の表面が検出領域６である例として、基体１が複数の層からなり、該層のうちの基体１の表面を含む層が検出領域６である場合を例に挙げて記載している。しかしながら、基体１は、前記例に限られず、複数の層のうちの表面を含まない層であっても良いし、基体１が一つの層で形成されており、基体１全体が検出領域６となる構成であっても良い。
なお、非特異吸着防止膜１４および第一の標的物質捕捉体５は、本発明の第一における非特異吸着防止膜および第一の標的物質捕捉体と同様である。
【０１０９】
（標的物質検出キット）
次に、本発明の第三について説明する。
本発明の第三は、標的物質検出キットであって、本発明の第二の標的物質検出素子と、標識物質と該標識物質の表面に存在する第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする標的物質検出キットである。
【０１１０】
図３に本発明の第三の標的物質検出キットの一例を示す。
標的物質検出キットは、標的物質検出素子１２と、標識材料９とからなる。
標的物質検出素子１２は、本発明の第二の標的物質検出素子と同様であるが、標的物質検出素子１２が有する検出領域６は標識材料９が有する標識物質７を感知することができる検出領域である。なお、１１は夾雑物である。
【０１１１】
標識材料９は、標識物質７と、第二の標的物質捕捉体８と、からなる。
第二の標的物質捕捉体８は、標識物質７と結合していても良いし、標識物質７の表面に存在していても良い。第二の標的物質捕捉体８が標識物質７と結合している場合、第二の標的物質捕捉体８と標識物質７との間の結合は、共有結合、配位結合、ファンデルワールス結合であることが好ましく、より好ましくは共有結合あるいは配位結合である。
【０１１２】
標識物質７としては、金コロイド、ラテックスビーズ、ルミノール、ルテニウム、酵素、放射性物質、蛍光物質、および磁性物質などが挙げられる。蛍光物質の具体例としては、量子ドット、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰおよびその誘導体）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フルオレセイン、およびＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ５６８）が挙げられる。酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。磁性物質の例としては、フェライトが挙げられる。フェライトは、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。また、標識物質は、以上に挙げた材料の複合体であっても構わない。
【０１１３】
標識物質７の形状としては、粒子形状、柱状、星状などが挙げられるが、粒子形状であることが好ましい。粒子形状である場合、平均粒径は、１ｎｍから１００μｍが好ましく、更に３ｎｍから１０μｍが好ましい。尚、標識物質が粒子形状である場合は、平均粒径は動的光散乱法で測定できる。
【０１１４】
磁性物質としては、例えば、Ｄｙｎａｌ社から市販されているダイナビーズ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社から市販されているｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ、ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ、メルク社から市販されているエスタポール等を使用することができる。
【０１１５】
第二の標的物質捕捉体８は、第一の標的物質捕捉体５と同様、標的物質１０を捕捉する機能を有する。したがって、第二の標的物質捕捉体８の例としては、第一の標的物質捕捉体５の例として挙げたものと同様である。なお、第二の標的物質捕捉体８と第一の標的物質捕捉体５とは、標的物質１０の異なる部分を捕捉する必要がある。その場合、第二の標的物質捕捉体８と第一の標的物質捕捉体５とで標的物質１０をサンドイッチした形態の複合体が形成される。また、例えば、第二の標的物質捕捉体８と第一の標的物質捕捉体５がモノクローナル抗体であれば、異なる種類のものでなければならない。しかし、ポリクローナル抗体であれば、同一の種類であっても良いし、異なる種類であっても良い。２つの標的物質捕捉体のうち、一方をモノクローナル抗体とし、他方をポリクローナル抗体とする場合もある。
【０１１６】
具体的には、標的物質検出素子１２の表面に配置された第一の標的物質捕捉体５に標的物質１０が捕捉され、第一の標的物質捕捉体５に捕捉された標的物質１０を、更に、標識材料９が有する第二の標的物質捕捉体８が捕捉する。すなわち、第一の標的物質捕捉体５−標的物質１０−第二の標的物質捕捉体８の複合体が形成され、標識材料９が標的物質検出素子１２の検出領域６の近傍に配置される。検出領域６の近傍に配置された標識材料９が有する標識物質７は検出領域６で検知され、検出領域６における標識物質７の検知は標的物質検出素子１２の電気的もしくは物理的なシグナルの変化として現れる。この標的物質検出素子１２のシグナルの変化を利用して、標的物質の有無もしくは数が検知される。
【０１１７】
なお、ここでは、第一の標的物質捕捉体５により、標的物質１０が捕捉された後に、標的物質１０が第二の標的物質捕捉体８により捕捉される場合を想定して記載している。しかしながら、第二の標的物質捕捉体８によって標的物質１０が捕捉された後に、第二の標的物質捕捉体８によって捕捉された標的物質１０が第一の標的物質捕捉体５によって捕捉されても良い。
【０１１８】
このような標的物質検出素子１２と標識物質７との組み合わせとしては、次のようなものが挙げられる。例えば、標的物質検出素子１２が磁気センサ素子であれば、標識物質７は磁性物質であることが好ましい。標的物質検出素子１２が電極であれば、標識物質７は酵素であることが好ましい。標的物質検出素子１２がマイクロタイタープレートであれば、標識物質７は金コロイド、ラテックスビーズ、ルミノール、ルテニウム、酵素、放射性物質、あるいは蛍光物質であることが好ましい。
【０１１９】
なお、前述したように、標的物質検出素子１２が磁気センサ素子である場合、磁気センサ素子は、検出領域６の近傍に位置する磁性物質の有無、数を検知することができる。このような場合、標的物質検出素子１２としては、磁性の変化を検出する検出領域を有するものであり、例えば、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子などを好適に用いることができる。
【０１２０】
磁性物質の例としては、フェライトを使用することができる。フェライトは、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する磁気バイオセンサが得られる範囲で自由に変えることができる。
【０１２２】
実施例１
（１）ＳＰＲ基板の調整
ＳＩＡ  Ｋｉｔ  Ａｕ（ＢＩＡＣＯＲＥ製）の金膜チップに、化学式３３で示される原子移動ラジカル重合開始剤を含むエタノール溶液にＡｕ膜を侵漬し、前記開始剤とＡｕ膜を反応させて、Ａｕ膜表面に原子移動ラジカル重合開始剤を導入した。
【０１２３】
【化２８】
0005383115.tif 000029
【０１２４】
次に、原子移動ラジカル重合開始剤を導入した金膜チップをメタノールに浸漬させた後、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加えた。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、化学式３４で示されるカルボキシベタインモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させた。反応後、表面にグラフト化されたポリマーの膜厚を分光エリプソメーター（Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｌｌａｍ製、Ｍ−２０００）で測定したところ、１７．６±０．６ｎｍ（ｎ＝４）であった。
【０１２５】
【化２９】
0005383115.tif 000030
【０１２６】
（２）ＳＰＲによる非特異吸着防止能の評価
前記（１）で調整した金膜チップを付属のセンサーチップ支持体に貼り付け、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ（ＢＩＡＣＯＲＥ製）のセンサーチップポートにセットし、センサーチップをドッキングした。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．１ｍＭ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、０．４ｍＭ）との混合液をＳＰＲ装置のコネクターブロックのサンプル添加ポジションからオートピペットを用いて注入し、流速５μＬ／ｍｉｎで７分間インジェクトした。このようにして、非特異吸着防止膜に含まれるカルボキシル基にスクシンイミド基を導入した。その後、スクシンイミド基を失活させるための試薬を流速５μＬ／ｍｉｎで７分間インジェクトし、非特異吸着防止膜に含まれるスクシンイミド基を失活させた。スクシンイミド基を失活させるための試薬としては、図４に示すように、１）グリシン、２）β−アラニン、３）アミノメタンスルホン酸、４）硫酸モノアミノエチル、および従来技術による比較例１として、５）エタノールアミンの水溶液を個別の流路に用いた。
【０１２７】
センサーグラムのベースが落ち着いたことを確認した後、１％Ｂｏｖｉｎｅ−ＩｇＧ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を流速２０μＬ／ｍｉｎで２分間インジェクトし、インジェクト終了から５分後の共鳴シグナル変化量（ＲＵ）を測定した。
【０１２８】
本ＳＰＲ装置において、タンパク吸着による変化量１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２とすることができるため、この測定結果をＩｇＧの非特異吸着量として図５のように示した。図５の結果から、本発明である化学式３４から化学式３７（ただし、化学式３４、３５は参考例）の非特異吸着防止膜におけるＩｇＧの非特異吸着量は、従来技術である化学式３８の非特異吸着防止膜のそれと比較すると少ないことから、非特異吸着防止能が向上していることが確認された。
なお、以下の方法によって、構造体および磁気バイオセンサを得ることもできる。
【０１２９】
実施例２（参考例）
本実施例は、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡ（前立腺特異抗原）を捕捉する一次抗体を含む非特異吸着防止膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサと、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を備えたマグネタイトからなる標識材料（磁性標識）を作製し、磁気バイオセンサとしてＰＳＡを検出する例である。尚、磁気バイオセンサの検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用する。
【０１３０】
（１）磁気マーカーの作製
まず、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を有する標識材料を作製する。
【０１３１】
マグネタイト粒子（平均粒径１００ｎｍ）を乾燥窒素雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このマグネタイト粒子／トルエン分散液に、シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシシランを添加し、マグネタイト粒子表面にアミノ基を導入する。次に、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を固定化する為にグルタルアルデヒド架橋剤を用いて、前記アミノ基と二次抗体のアミノ基を共有結合させ、第二の標的物質捕捉体をマグネタイト粒子表面に固定化することができる。
以上の操作を経ることで、第二の標的物質捕捉体を備えた標識材料を得ることができる。
【０１３２】
（２）磁気バイオセンサの作製
次に、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を含み、重合体の側鎖の電荷が中性に保持された非特異吸着防止膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサを作製する。
【０１３３】
まず、図６のように、磁気検出領域６上面にＡｕ膜１３を形成する。本実施例では、検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用するため、前記検出領域は磁気抵効果膜を意味する。
【０１３４】
次に、検出領域であるＡｕ表面に非特異吸着防止膜を形成する。まず、化学式３３で示される原子移動ラジカル重合開始剤を含むエタノール溶液にＡｕ膜を侵漬し、前記開始剤とＡｕ膜を反応させて、Ａｕ膜表面に原子移動ラジカル重合開始剤を導入することができる。
【０１３５】
【化３０】
0005383115.tif 000031
【０１３６】
次に、原子移動ラジカル重合開始剤を導入した検出領域をメタノールに浸漬させた後、フリーな重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加える。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、化学式１１で示されるカルボキシベタインモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。また、フリーな重合開始種として加えておいた２−ブロモイソ酪酸エチルから生成したポリマーの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が９７０００で、分子量分布が１．１５である。このことから、検出領域にグラフト化されたグラフトポリマーは鎖長の揃ったポリマーであることを確認できる。
【０１３７】
【化３１】
0005383115.tif 000032
【０１３８】
検出領域に形成された非特異吸着防止膜の膜厚と重量を測定することによって、重合体のグラフト密度は、０．６５分子／ｎｍ２であることを確認できる。
【０１３９】
次に、検出領域に形成された非特異吸着防止膜に含まれるカルボキシル基の少なくとも一部に第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する。まず、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液を同様に塗布する。これらの操作により、非特異吸着防止膜に含まれるカルボキシル基がスクシンイミド基（活性エステル基）に変換することになる。前記スクシンイミド基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基は、化学式１２で示される化合物によって失活させて、化学式１３に示すような分子内塩構造に変換することができる。
【０１４０】
【化３２】
0005383115.tif 000033
【０１４１】
【化３３】
0005383115.tif 000034
【０１４２】
以上の操作により、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を含み、重合体の側鎖の電荷が中性に保持された非特異吸着防止膜を備えた検出領域を有する磁気バイオセンサを作製することができる。
【０１４３】
（３）ＰＳＡの検出
上述の（１）、（２）において作製される磁気マーカーと磁気バイオセンサを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出を試みることができる。
【０１４４】
１）標的物質（抗原）であるＰＳＡ、及び夾雑物であるＢＳＡとＩｇＧを含むリン酸緩衝液に上記磁気バイオセンサの検出領域を浸す。
２）未反応のＰＳＡと夾雑物をリン酸緩衝液で洗浄する。
３）磁気マーカーを含むリン酸緩衝液に工程１）及び２）が終了した上記磁気バイオセンサの検出領域を浸し、５分間インキュベートする。
４）未反応の磁気マーカーをリン酸緩衝液で洗浄する。
【０１４５】
上記操作によって、抗原が一次抗体、二次抗体により捕捉され、磁気マーカーが図２に示すように磁気バイオセンサの検出領域に固定化される。つまり、検体中に抗原が存在しない場合には、磁気マーカーは磁気バイオセンサの検出領域上に固定化されない。よって、磁気マーカーの有無を検出することにより、抗原の検出が可能である。また、固定化された磁気マーカーの数を検出することによって、検体中に含まれる抗原の量を間接的に知ることも可能である。本実施例の磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１４６】
実施例３
実施例２の化学式１２の化合物を化学式１４の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式１５に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１４７】
【化３４】
0005383115.tif 000035
【０１４８】
【化３５】
0005383115.tif 000036
【０１４９】
実施例４
実施例２の化学式１２の化合物を化学式１６の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式１７に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１５０】
【化３６】
0005383115.tif 000037
【０１５１】
【化３７】
0005383115.tif 000038
【０１５２】
実施例５（参考例）
実施例２の化学式１２の化合物を化学式１８の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式１９に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１５３】
【化３８】
0005383115.tif 000039
【０１５４】
【化３９】
0005383115.tif 000040
【０１５５】
実施例６（参考例）
実施例２の化学式１２の化合物を化学式２０の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式２１に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１５６】
【化４０】
0005383115.tif 000041
【０１５７】
【化４１】
0005383115.tif 000042
【０１５８】
実施例７（参考例）
実施例２のカルボキシベタインモノマー（化学式１１）を化学式２２で示されるカルボキシベタインモノマーに替え、更に、化学式１２の化合物を化学式２３の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて化学式２４に示すような分子内塩構造に変換する。尚、本実施例の重合体の数平均分子量が８９０００で、分子量分布が１．１３であり、重合体のグラフト密度は、０．６８分子／ｎｍ２である。実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１５９】
【化４２】
0005383115.tif 000043
【０１６０】
【化４３】
0005383115.tif 000044
【０１６１】
【化４４】
0005383115.tif 000045
【０１６２】
実施例８
実施例７の化学式２３の化合物を化学式２５の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式２６に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例７と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１６３】
【化４５】
0005383115.tif 000046
【０１６４】
【化４６】
0005383115.tif 000047
【０１６５】
実施例９
実施例７の化学式２３の化合物を化学式２７の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式２８に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例７と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１６６】
【化４７】
0005383115.tif 000048
【０１６７】
【化４８】
0005383115.tif 000049
【０１６８】
実施例１０（参考例）
実施例７の化学式２３の化合物を化学式２９の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式３０に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例７と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１６９】
【化４９】
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【０１７０】
【化５０】
0005383115.tif 000051
【０１７１】
実施例１１（参考例）
実施例７の化学式２３の化合物を化学式３１の化合物に替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させて、化学式３２に示すような分子内塩構造に変換する。その後、実施例７と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷が中性に保持されている。このことから、検体に含まれる夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することができ、標的物質を高感度に検出することができる。
【０１７２】
【化５１】
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【０１７３】
【化５２】
0005383115.tif 000053
【０１７４】
比較例２
実施例２の化学式１２の化合物をエタノールアミンに替え、非特異吸着防止膜に含まれる未反応のスクシンイミド基を失活させる。その後、実施例２と同様にＰＳＡの検出を行うと、非特異吸着防止膜では、重合体の側鎖の電荷がプラス電荷に偏っていることによって夾雑物が付着し、実施例２から１１のいずれの感度よりも劣ることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明の構造体の一例を示す概略図である。
【図２】本発明の標的物質検出素子の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の標的物質検出キットの一例を示す概略図である。
【図４】本発明の非特吸着異防止膜に含まれるスクシンイミド基の失活方法を示す反応式である。
【図５】実施例１の非特吸着異防止膜に対するＩｇＧの非特異吸着量を示すグラフである。
【図６】磁気センサの一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【０１７６】
１  基体
２  重合体
３  カルボキシル基
４  保護分子
５  第一の標的物質捕捉体
６  検出領域
７  標識物質
８  第二の標的物質捕捉体
９  標識材料
１０  標的物質
１１  夾雑物
１２  標的物質検出素子
１３  金薄膜
１４  非特異吸着防止膜
【図１】
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【図２】
0005383115.tif 000061
【図３】
0005383115.tif 000062
【図４】
0005383115.tif 000063
【図５】
0005383115.tif 000064
【図６】
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