(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。
（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する。
（２）至適ｐＨ：至適ｐＨは、７．０である。
（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である。
（４）至適温度：至適作用温度は、３０〜３７℃である。
（５）阻害、活性化：活性の発現に、２価金属イオンを要求せず、また、５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されない。
（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。
【請求項２】
ブタの脳から精製された請求項１記載のブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はブタ由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼに関し、詳細にはアスパラギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）の根幹部のＡｓｎに結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に、α１→６結合でもって、ＧＤＰ（グアノシンジホスフェート）−フコースからフコースを転移する酵素であって、糖鎖の修飾や合成などの糖鎖工学および／または癌などの疾病の診断に有用なブタ由来の新規なα１→６フコシルトランスフェラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で種々の重要な生理作用を有する糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンの糖鎖部分の構造と機能に関する関心が高まっており、近年、その研究が盛んに行われている。糖鎖は糖加水分解酵素および糖転移酵素の作用により形成されるが、その中でも糖転移酵素が寄与するところが大きい。一般に、糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であると定義されるが、その受容体糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通常、一つのグリコシド結合は、対応する一つの糖転移酵素によって形成される。それ故、糖転移酵素は複合糖質の糖鎖部分の構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合成、天然の糖鎖構造の修飾など様々な用途への利用、また、糖鎖の人工的な改変による複合糖質あるいは細胞性質の改変への利用が期待されている。しかしながら、現在、利用できる糖転移酵素の種類とその供給には限りがあり、このことが、実用上の大きな障壁となっていた。これらのことから、基質特異性の明らかな種々の糖転移酵素の開発と量的供給が望まれているのが実情である。
【０００３】
α１→６フコシルトランスフェラーゼは、細胞内小器官のゴルジ体に存在する酵素であり、アスパラギン結合型糖鎖のプロセッシングを制御する酵素のうちの一つであると考えられる重要な酵素である。該酵素をアスパラギン結合型糖鎖に作用させることで、その制御機構の解明、糖鎖構造形成の制御等に役立つと考えられる。また、肝臓癌や嚢胞性線維症などのいくつかの疾病におけるα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の上昇、本酵素反応生成物の割合の増加が知られており、該酵素の診断用途としての早急なる開発も望まれている。
【０００４】
従来、α１→６フコシルトランスフェラーゼは、各種動物の体液あるいは臓器中、各種動物の培養細胞に活性は検出されているものの、精製された酵素標品としては、ヒト嚢胞性線維症細胞破砕物由来の酵素〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  (Journal of Biological Chemistry）、第２６６巻、第２１５７２〜２１５７７頁（１９９１）〕以外には知られてない。しかしながら、この報告では、１）至適ｐＨが５．６であって、生理学的ｐＨとは異なる、２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が３４，０００および３９，０００と比較的低分子量である、３）ヒト細胞由来のため大量および安定供給が事実上、困難であるなどの欠点を有していた。
【０００５】
一方、糖鎖の合成法としては、化学合成法も時として採用されているが、その複雑な合成経路および反応の特異性から、実用上は少糖類の合成に適用されるに限定されている。特に、受容体基質であるアスパラギン結合型糖鎖の合成は、事実上、困難であった。さらに、フコースをα１→６結合で、アスパラギン型糖鎖のＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃに結合させる反応は、非常な困難性を伴う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖鎖構造解析、糖鎖工学用試薬、診断薬として、大量にしかも安定に供給可能なα１→６フコシルトランスフェラーゼを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明者らは、該酵素の受容体であるアスパラギン型糖鎖に類似した蛍光標識された基質を用いることにより、フコースをα１→６結合でもって、アスパラギン型糖鎖のＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃに結合させる酵素の検討に着手し、その結果、精製出発材料として入手が容易なブタ脳の抽出画分に、該酵素活性を検出し、該画分から該酵素を精製し、その酵素学的および理化学的性質を解明し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有するブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼである。
（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する。
（２）至適ｐＨ：至適ｐＨは、７．０である。
（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である。
（４）至適温度：至適作用温度は、３０〜３７℃である。
（５）阻害、活性化：活性の発現に、２価金属イオンを要求せず、また、５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されない。
（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。
【０００９】
【発明の実施態様】
本発明の酵素の精製出発材料としては、フコシルトランスフェラーゼ活性を有するブタの臓器または体液がある。臓器の具体例としては、例えば、脳、精巣、膵臓、肺、腎臓等が挙げられる。また、血液や血清などのブタ体液を用いることもできる。
【００１０】
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、例えばブタ脳の破砕物から粗酵素抽出物を調製し、次に、この粗酵素抽出物から、目的の酵素を分離する。この場合、ブタ脳中のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、膜結合型酵素であるので、脳破砕物より適当な界面活性剤を用いて粗酵素抽出液を得ることが通常、採用される。さらに、この粗酵素抽出液から公知の精製手段を組み合わせて、精製酵素標品を得ることができる。例えば、限外ろ過膜による濃縮や脱塩、基質類似体を固定化したアフィニティーカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水結合カラムクロマトグラフィーなどの組み合わせにより精製を行い、他のトランスフェラーゼの夾雑活性のない実質的に単一の酵素標品を得ることができる。例えば、ブタ脳をリン酸緩衝液中でワーリングブレンダーを用いて破砕、超遠心分離により膜画分を集めた後、この膜画分より界面活性剤、トリトン（Triton）Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液で目的酵素を抽出し、さらに超遠心分離によって上清を集めて、粗酵素抽出液を得ることができる。ＧＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロース、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン−セファロース等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、フコシルトランスフェラーゼ活性を示す各画分を集めて、精製することができる。
【００１１】
本発明の一実施態様であるブタ脳由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼの理化学的性質を下記に示す。
（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの生成物を与える。
【００１２】
（２）活性測定法
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の測定は、次のようにして行った。すなわち、糖鎖末端のアスパラギンを４−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミン〔ＰＡＢＡ：−ＮＨ2 （ＣＨ2 ）4 −ＮＨ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ〕で蛍光標識してある下記化１で示される化合物を酵素活性の測定基質として用いた。該基質を用いることにより、フコースがα１→６結合で転移した酵素反応の生成物の高速液体クロマトグラフィーによる蛍光検出が可能となる。
【００１３】
【化１】
0003642361.tif 000002
〔ＰＡ：ピリジルアミノ基を示す〕
【００１４】
具体的な測定方法を以下に述べる。上記化１で示される受容体蛍光標識基質６２．５μＭ、供与体基質（ＧＤＰ−フコース）６２５μＭを含む２５０ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ７．０、４０μｌに、試料液１０μｌおよび１．２５％トリトンＸ−１００を添加混合する。３７℃で１時間反応させた後、５分間の煮沸により反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーに供し、生成物のピークを蛍光検出器で定量する。酵素量１単位は、この条件下で、１分間に１ｐｍｏｌｅのＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ〔ＲはＡｓｎ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）4 −ＰＡ〕を生じるものとした。
【００１５】
（３）至適ｐＨ
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、ｐＨ７．０〜７．５付近に高い活性を示す。
（４）ｐＨ安定性
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、ｐＨ４〜１０で比較的安定であり、特にｐＨ５〜９の間においてより良好な安定性を示す。
（５）至適温度
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、至適温度が３７℃付近に認められ、また、２０〜４０℃の範囲で十分な作用を保持する。
（６）２価金属イオン要求性
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、マグネシウム、マンガンなどの２価金属イオンの非存在下でも十分な活性を示す。さらに、キレート剤であるＥＤＴＡ５ｍＭの存在下でも十分な活性を示す。
（７）分子量
本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼの精製標品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０，０００のところに単一バンドを示す。
【００１６】
以上の性質より判断して、本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、至適ｐＨ、金属イオン要求性、分子量の点で、従来のヒト嚢胞性線維症細胞由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼ（至適ｐＨ５．６、分子量３４，０００および３９，０００）とは明らかに相違する新規な酵素である。
【００１７】
本発明のα１，６−フコシルトランスフェラーゼの期待される用途としては、１）糖鎖構造の改変と機能解析：アスパラギン型糖鎖に新たにフコースを導入し、糖鎖構造を人工的に改変することができ、細胞機能変化や複合糖質のプロセッシング制御機構の解明および糖鎖の役割を解明することができる、２）酵素活性による病変の診断：本酵素活性は腫瘍化に伴う種々の病変を反映しており、酵素活性を測定することにより癌などの疾病の診断を行うことができる、３）特異抗体による病変の診断：本酵素により誘導される特異抗体を用いることにより種々の疾病の診断を行うことができる、などの極めて有用な用途がある。
【００１８】
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
（１）ブタ脳の破砕物と粗抽出液の調製
ブタ脳、１００ｇを２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でワーリングブレンダーを用いて破砕した後、超遠心分離により膜画分を集めた。この膜画分を、濃度０．５％のトリトン  Ｘ−１００を含む同緩衝液を用いて、酵素の抽出を行った。抽出操作後、遠心分離によって上清を集め、粗酵素抽出液とした。
【００１９】
（２）粗抽出液からの酵素の精製
０．０５％  トリトンＸ−１００、５０ｍＭ  ＫＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン−セファロースのカラム（トランスフェリン由来のアシアロアガラクト糖ペプチドカラム）を平衡化し、実施例１で調製した粗酵素抽出液を供した。非吸着画分に蛋白質が検出されなくなるまでカラムを同緩衝液で洗浄した後、活性画分を、１Ｍ  ＫＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。次に、酵素の活性画分を限外濾過膜により濃縮、脱塩を行った後、同緩衝液で平衡化したＧＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースのカラムに供した。溶出は１００ｍＭ  ＧＤＰを含む同緩衝液により行った。活性画分を集めて限外ろ過膜で濃縮、脱塩を行うことにより、α１→６フコシルトランスフェラーゼを得ることができた。このようにして得られたα１→６フコシルトランスフェラーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で、分子量約６０，０００の位置に単一バンドを示し、不純物に起因する他のバンドはみられず、また、他のトランスフェラーゼ活性もなく、高純度の酵素標品であった。
【００２０】
本発明の酵素の至適ｐＨを緩衝液のｐＨを変化させ求めた結果を図１に示す。該酵素は、ｐＨ７．０〜７．５付近に高い活性を示した。なお、緩衝液は、２００ｍＭ  メス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を使用した。グラフの横軸は本発明により得られるα１→６フコシルトランスフェラーゼのｐＨ、縦軸は相対活性（％）を表す。
【００２１】
本発明の酵素のｐＨ安定性についても、同様に検討した。図２は、該酵素を各緩衝液中でそれぞれのｐＨにおいて、４℃、５時間処理した後の残存活性を示しているが、該酵素はｐＨ４〜１０で比較的安定であり、特にｐＨ５〜９の間においてより良好な安定性を示した。緩衝液は、ｐＨ３．５〜５．５は５０ｍＭ酢酸緩衝液（黒三角）を、ｐＨ５．５〜７．５は５０ｍＭ  メス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を、ｐＨ７．５〜９．０は５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（白丸）を、ｐＨ９．０〜１１．５は炭酸水素ナトリウム緩衝液（白三角）を、それぞれ用いた。グラフの横軸は本発明により得られるα１→６フコシルトランスフェラーゼのｐＨ、縦軸は残存活性（％）を表す。
【００２２】
本発明の酵素の至適温度は、図３に示すように３７℃付近に認められ、また、２０〜４０℃の範囲で十分な作用を保持すると考えられた。また、凍結品は−２０℃で少なくとも数カ月間は安定にその活性を保持した。緩衝液は、２００ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ７．０（黒丸）を使用した。グラフの横軸は、処理温度（℃）、縦軸は、本発明により得られるα１→６フコシルトランスフェラーゼの相対活性（％）を表す。
【００２３】
多くの糖転移酵素はその活性の発現にマグネシウム、マンガンなどの２価金属イオンを必要とするが、本発明の酵素はこれらの２価金属イオン非存在下でも十分な活性を示した。さらに、キレート剤であるＥＤＴＡ５ｍＭの存在下でも十分な活性を示したことから、２価金属イオンの要求性は示さないと結論した。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼは、公知のヒトα１→６フコシルトランスフェラーゼとは、理化学的性質が種々の点で大きく異なり、より生理学的条件に近い反応至適条件で作用を示す。したがって、本発明により、糖鎖の修飾や合成などの糖鎖工学および／または癌などの疾病の診断に、有用な新規α１→６フコシルトランスフェラーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の至適ｐＨを示す。
【図２】本発明の酵素の４℃におけるｐＨ安定性を示す。
【図３】本発明の酵素の至適温度を示す。
【図１】
0003642361.tif 000003
【図２】
0003642361.tif 000004
【図３】
0003642361.tif 000005