(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
静止期分生子をコルヒチン又はトリコスタチンなしで４時間以上発芽前までの培養を行った糸状菌類の膨潤分生子に、コルヒチン又はトリコスタチン、もしくはその両者を加えて培養することを特徴とする糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法。
【請求項２】
培養を静置培養で行うことを特徴とする請求項１に記載の糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法。
【請求項３】
培養を静置培養で２４時間以上行うことを特徴とする請求項１に記載の糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法。
【請求項４】
加えるコルヒチンの濃度が１％以下であるか、又は加えるトリコスタチンの濃度が１μｇ／ｍｌ（０．０００１％）以下であることを特徴とする請求項１に記載の糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、産業上有用な糸状菌の超高次同質倍数体、特にトリコデルマ属(Trichoderma) 糸状菌の超高次同質倍数体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、先に、糸状菌類の菌糸体又は分生子を低濃度（０．０１〜０．５％）のコルヒチン又はコルヒチン誘導体で処理することにより、同質多倍数体を獲得する方法を発明した（特開平２−２３１０８０号公報）。また、当該方法で得られる同質多倍数体の有用菌としての各種諸性質を更に高める目的で、同質多倍数体を更に、熱処理もしくは高濃度のコルヒチン処理を施すことにより、同質多倍数体中の巨大核の微小核化を実現できることを発明した（特開平６−２５３８２２号公報、及び特開平６−２５３８２１号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、特開平２−２３１０８０の方法で得られる同質多倍数体は、４倍体程度であり、また、更に巨大核の微小核化を起させた株についても、有用菌としての各種諸性質、例えばセルラーゼ生産性についても、元株の２〜４倍程度であり、必ずしも満足すべき結果は得られていない。即ち、この場合、核径増大が分生子内径によって制限され、更に微小核形成が起こり、必要なレベルまでの倍数化が困難であった。
【０００４】
このような現状の下、本発明者らは、核径増大の制限を回避する方法を検討するため微小核形成を抑制するための条件を調査し、更に鋭意研究検討を行った結果、有用菌としての各種諸性質を更に高めるためには、さらに高次の多倍数体を得る必要があることを突き止め、本発明に至った。
【０００５】
即ち、本発明では、８倍以上という超高次の多倍数体を製造することを目的とするものである。更に、多倍数体を製造するにあたって倍数核を形成させる場合に、核の微小核化を防いで多倍数体を良好に製造することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本請求項１に記載された発明に係る糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法では、静止期分生子をコルヒチン又はトリコスタチンなしで４時間以上発芽前までの培養を行った糸状菌類の膨潤分生子にコルヒチン又はトリコスタチン、もしくはその両者を加えて培養するものである。
【０００７】
本請求項２に記載された発明に係る糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法では、請求項１に記載された培養を静置培養で行うものである。
【０００８】
本請求項３に記載された発明に係る糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法では、請求項１に記載された培養を静置培養で２４時間以上行うものである。
【０００９】
本請求項４に記載された発明に係る糸状菌類の超高次同質倍数体の製造方法では、請求項１に記載された加えるコルヒチンの濃度が１％以下であるか、又は加えるトリコスタチンの濃度が１μｇ／ｍｌ（０．０００１％）以下である。
【００１０】
【作用】
本発明においては、糸状菌類の膨潤分生子にコルヒチン又はトリコスタチン、もしくはその両者を加えて培養することにより、８倍以上、例えば８〜３２という超高次の倍数核が得られる。この超高次倍数核をへた超高次同質多倍数体は、高くしかも安定なセルラーゼ生産性等の優れた諸性質を有している。
【００１１】
即ち、より高次の倍数核を形成するためには、処理される糸状菌類の分生子の状態は、乾燥されたものではなく、膨潤された分生子、即ち膨潤分生子を使用する方がより大型で安定な倍数核の形成が確認された。
【００１２】
また、多倍数体の製造は、倍数核の形成を経て行われるが、倍数核の形成時に核の微小核化が確認されている。この微小核化をできるだけ避けて、好ましくは倍数核のみを形成させるためには、培養条件を工夫する。即ち、この培養を静置培養で行うことにより、倍数核の形成時に微小核化を防ぎ、多倍数体のみとすることが可能である。
【００１３】
尚、この静置培養での多倍数体の製造には、少なくとも２４時間程度の培養が不可欠である。また、好ましくは９６時間培養することにより最終的に９割近くの核を倍数化できることも確認されている。
【００１４】
また、多倍数体の製造には、少なくともコルヒチンの濃度が１％以下であることが必要であり、少なくともトリコスタチンの濃度が１μｇ／ｍｌ（０．０００１％）以下であることが必要である。しかしながら、各処理薬の濃度が高い場合には、培養の後半に微小核化が生じることがあるので培養時間を短くする必要がある。微小核化を生じさせない好ましいコルヒチンの濃度及びトリコスタチンの濃度は、コルヒチン濃度では０．１％以下であり、また、トリコスタチンの濃度は０．１μｇ／ｍｌ以下である。これらの場合では９６時間培養後のものでも微小核の形成が見られなかった。また、０．００１％のコルヒチン、又は０．０１μｇ／ｍｌのトリコスタチンを加えて培養したものでも、充分に有効であったが、これ以下の低い濃度では倍数体の形成が効率の悪いものになった。
【００１５】
尚、本発明は、後述する実施例において開示されているトリコデルマ属(Trichoderma) に限らず、アスペルギルス属(Aspergillus) の子嚢菌亜門、リゾプス属(Rhizopus)の接合菌亜門、ムコール属(Mucor) 、ペニシリウム属(Penicillium) 、レンチヌス属(Lentinus edodes) 、プロイロタス属(Pleurotus ostreatus) 、フラムリナ属（Flammulina velutipes）のような一般に真菌類と呼ばれる糸状菌類に広く用いることができる。
【００１６】
【実施例】
実施例(1) 対象分生子の時期の検討
本実施例で使用した株は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei) QM 6a株である。この糸状菌の分生子は緑色で卵型をしており、一個の核を保持している。尚、この状態の分生子を静止期分生子と称す。図１は糸状菌の分裂の仕組みを示す説明図である。図に示す通り、例えば、静止期分生子を薬剤なしで培養すると、培養４時間経過後に膨潤が始まり、徐々にサイズを増大させる。核径が増大してメタフエイズに至り、その後二つに分裂し、発芽する。
【００１７】
このような分生子の薬剤処理時期の検討を行った。分生子は乾燥分生子と膨潤分生子とを用いた。静止期分生子としては乾燥分生子を、また、膨潤分生子としては薬剤非添加で４時間回転振盪培養した分生子を使用した。各々の分生子を０．１％コルヒチン溶液で最大４８０時間処理し、一定時間毎に１００個の分生子中の倍数核の分布を調べた。
【００１８】
図２は薬剤処理の対象として静止期分生子を用いた場合と膨潤分生子を用いた場合との倍数核形成状況を比較した結果を示す線図である。図において、黒い部分が倍数核（直径が０．８６μｍ以上の核）で、白い部分が微小核（直径が０．５４μｍ以下の核）である。網かけ部分は薬剤が存在しない場合に見られる正常な核である。
【００１９】
図２に示す通り、静止期分生子を用いた場合には、０．８６μｍから１．３５μｍの範囲の核が大半を占め、１．３６μｍ以上の核は殆ど形成されなかった。このとき、分生子は２核〜３核性となった。一方、膨潤分生子を用いた場合には、最後まで分生子は単核性であり、核の直径も増大を続け４８０時間処理した場合、１．８６μｍ以上の核がおよそ２割形成された。
【００２０】
以上の結果から、より高次の倍数核を形成するためには、膨潤分生子を使用する方がよいことが判明した。ここで膨潤分生子を用いて得られた倍数核を静止期分生子を用いて得られた倍数核と区別するために超高次倍数核と称す。
【００２１】
実施例(2) 培養方法の検討
次に、薬剤処理方法と倍数核形成との関連を検討した。培養方法としては、回転振盪方式、往復振盪方式、それに静置培養方式を検討した。具体的には、緑色成熟分生子を０．０１％コルヒチン溶液中で各々の方式で２８℃で９６時間処理し、２４時間毎に分生子を集め、ギームザ液ないしはＤＡＰＩ液で核染色を行い、分生子１００個中の核径の分布を調べた。
【００２２】
図３は薬剤処理方法と倍数核形成との関連を示した図である。図において、黒い部分が倍数核（直径が０．８６μｍ以上の核）で、白い部分が微小核（直径が０．５４μｍ以下の核）である。網かけ部分は薬剤が存在しない場合に見られる正常な核である。
【００２３】
図３に示す通り、回転振盪方式は増殖には最適の条件で、倍数核の形成も最大であったが、同時に微小核の形成が起こった。同様な現象は往復振盪の場合にも見られた。結果、倍数核の形成という観点から静置培養するのが最も良いと考えられた。
【００２４】
実施例(3) 処理薬剤の種類・濃度の検討
次に、薬剤の種類、組み合わせ、それに濃度と倍数核形成との関連を調べた。薬剤として、分裂機構を阻害するコルヒチンと、Ｇ１期とＧ２期の両方を阻害するトリコスタチンＡとを検討した。
【００２５】
コルヒチンは０．００１％、０．１％、それに１．０％の濃度で、トリコスタチンは０．０１μｇ／ｍｌ，０．１μｇ／ｍｌ，それに１．０μｇ／ｍｌの濃度で、０．００１％コルヒチンと０．０１μｇ／ｍｌトリコスタチンとを同時に用いたものを用意した。用意した薬剤溶液で、分生子を２８℃、９６時間静置培養し、２４時間毎に１００個の分生子に倍数核、正常核、それに微小核が何％存在するかを調べた。
【００２６】
図４は薬剤の種類、組み合わせ、それに濃度と倍数核形成との関連を調べた結果である。図において、黒い部分が倍数核（直径が０．８６μｍ以上の核）で、白い部分が微小核（直径が０．５４μｍ以下の核）である。網かけ部分は薬剤が存在しない場合に見られる正常な核である。
【００２７】
図４に示す通り、コルヒチンの場合には、０．００１％、０．１％、それに１．０％の濃度の何れの場合でも倍数核の形成が見られた。また、倍数核の割合が最大となったのは、濃度が０．１％の場合であり、９６時間後のものでも微小核の形成が見られなかった。しかしながら、濃度が１．０％の場合には、７２時間後には微小核の形成が見られた。
【００２８】
また、トリコスタチンの場合にも、０．０１μｇ／ｍｌ，０．１μｇ／ｍｌ，それに１．０μｇ／ｍｌの濃度の何れでも倍数核の形成が見られた。また、コルヒチンよりも初期の倍数核形成率が高くなる結果が得られた。倍数核の割合が最大となったのは、濃度が０．１μｇ／ｍｌの場合であり、９６時間後のものでも微小核の形成が見られなかった。しかしながら、濃度が１．０μｇ／ｍｌの場合には、４８時間後には微小核が出現した。
【００２９】
更に、０．００１％コルヒチンと０．０１μｇ／ｍｌトリコスタチンとを合わせて用いた場合には、９６時間後の倍数核形成率がそれほど高くなかったが、個々の同じ濃度の薬剤処理に比較して初期の倍数核形成率が向上し、微小核の形成も見られなかった。以上の結果から、条件次第で９６時間培養することにより最終的に９割近くの核を倍数化できることが判明した。
【００３０】
実施例(4) 培養時間の検討
また、前述の図４に示されるように、コルヒチン及びトリコスタチンの場合にも、２４時間で倍数核の形成が見られたことから、少なくとも２４時間静置培養を行うことにより倍数核の形成が見られることが判明した。
【００３１】
実施例(5) 高次同質多倍数体の製造
０．１％コルヒチンで２４０時間乃至４８０時間処理した分生子を０．１％ＣＭＣ−Ｎａを含む寒天培地におき、２８℃で５日間培養した。培養後０．１％コンゴーレッド溶液を添加し、食塩水で洗浄後、より大きな透明域を形成した株をＨ−１，Ｈ−２，Ｈ−３として分離した。これらの分生子より過塩素酸でＤＮＡを抽出し、インドール法で定量し、元株と得られたＨ−１，Ｈ−２，Ｈ−３株の超高次倍数体の分生子の核酸含量を測定して何倍体であるかを調べた。結果を次の表１に示す。
【００３２】
【表１】
0003685518.tif 000002
【００３３】
表１に示した結果、Ｈ−１株はおよそ８倍体、Ｈ−２株は１２倍体、そして、Ｈ−３は１６倍体であると考えられた。尚、核径増大率を求めて正倍数体の形成時期を求めることを試みたが、効果があったのは、４８時間までで２４０時間から４８０時間の長時間では不正確となり、あまり効果がなかった。
【００３４】
実施例(6) 高次同質多倍数体のセルラーゼ生産活性
高次同質多倍数体のセルラーゼ生産活性を検証した。実施例(5) で得られたＨ−１，Ｈ−２，Ｈ−３株の分生子を１００ｍｌ三角フラスコに加えたフスマ培地に植え、２８℃で５日間培養し、２４時間毎にフスマ培地より酢酸緩衝液で酵素を抽出し、セルラーゼ活性を測定した。セルラーゼ活性としてはアビセル分解活性、ＣＭＣ−Ｎａ分解活性、それにサリシン分解活性を測定した。
【００３５】
図５はＨ−１〜３株のセルラーゼ生産性と元株のセルラーゼ生産性を調べた結果を示す線図である。図において、●はアビセル分解活性、○はＣＭＣ−Ｎａ分解活性、それに◆はサリシン分解活性を示す。
【００３６】
図５に示す通り、Ｈ−１株ではＣＭＣ−Ｎａ分解活性が元株のおよそ２倍に、Ｈ−２株ではおよそ４倍程度に向上し、Ｈ−３株では４倍以上に達した。コルヒチン処理株はセルラーゼ生産性の増大が後半も継続することが特徴であった。
【００３７】
従って、以上の結果より、コルヒチン処理による超高次倍数核をへた多核体形成によりセルラーゼ生産性が向上すると考えた。
【００３８】
実施例(7) 得られた高次多倍数体の遺伝的安定性
得られた高次多倍数体の遺伝的安定性を検証した。即ち、実施例(5) で得られたＨ−１〜３株の菌糸中の大形の核が遺伝的に安定なのかどうか調べた。具体的には、処理した菌体が着生した分生子を１世代目、１世代目由来のコロニーが着生した分生子を２世代目、２世代目由来のコロニーが着生した分生子を３世代目として、継代培養した。各々の世代で大形核の割合を検証した。結果を次の表２に示す。
【００３９】
【表２】
0003685518.tif 000003
【００４０】
表２に示す通り、Ｈ−１〜３株の処理菌体中には直径が１．８６μｍ以上の大形の核が大量に存在したが、分生子中にはそのような大形核は見られず、複数（３−４個）の小型の核が存在するようになっていた。また、一度分生子中に配分された核の直径と核数とは３世代目で減少が見られず、これらの核の性状は遺伝的に安定であると考えた。
【００４１】
以上の結果を総合すると、膨潤分生子を用いて静置培養で薬剤処理をすればこの糸状菌の核を微小核の形成なしにかなりの高次にまで倍数化できるということになる。その結果、セルラーゼ生産性の向上を図ることが可能となり、セルラーゼ製剤のコストダウンに貢献できる。
【００４２】
また、分生子を膨潤させてコルヒチンやトリコスタチンあるいは両薬剤で処理すると、分生子内径は核径増大と共に増大するため、８倍体形成後も更に核径増大のための広い余地が得られた。微小核形成は分裂用培地に薬剤が残存した場合と非正倍数体が形成された場合に起こった。そこでこれらの要因を除去した結果、微小核の形成なしに均一な大形核のみを菌糸中に配分することができた。核径増大率の算出は正倍数体形成時期を把握するのに効果的であった。この増大率は増殖条件と関連し、最適化するほど向上した。更に重要なことには、この超高次倍数体ではセルラーゼ生産性も大幅に向上していた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、より高次の倍数核を形成するためには、処理される糸状菌類の分生子の状態は、乾燥されたものではなく、膨潤された分生子、即ち膨潤分生子を使用する方がより大型で安定な倍数核の形成が確認された。従って、糸状菌類の膨潤分生子にコルヒチン又はトリコスタチン、もしくはその両者を加えて培養することにより、８倍以上という超高次の倍数核が得られる。この超高次倍数核をへた超高次同質多倍数体は、高くしかも安定なセルラーゼ生産性等の優れた諸性質を有しており、遺伝子組換えの手段としても有効である。
【００４４】
また、この培養を静置培養で行うことにより、倍数核の形成時に微小核化を防ぎ、多倍数体のみとすることが可能である。尚、この静置培養での多倍数体の製造には、少なくとも２４時間程度の培養が不可欠である。また、好ましくは９６時間処理することにより最終的に９割近くの核を倍数化できることも確認されている。
【００４５】
また、多倍数体の製造には、少なくともコルヒチンの濃度が１％以下であることが必要であり、少なくともトリコスタチンの濃度が１μｇ／ｍｌ（０．０００１％）以下であることが必要である。しかしながら、各処理薬の濃度が高い場合には、培養の後半に微小核化が生じることがある。微小核化を生じさせない好ましいコルヒチンの濃度及びトリコスタチンの濃度は、コルヒチン濃度では０．１％であり、また、トリコスタチンの濃度は０．１μｇ／ｍｌである等の効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】糸状菌の分裂の仕組みを示す説明図である。
【図２】薬剤処理の対象として静止期分生子を用いた場合と膨潤分生子を用いた場合との倍数核形成状況を比較した結果を示す線図である。
【図３】薬剤処理方法と倍数核形成との関連を示した図である。
【図４】薬剤の種類、組み合わせ、それに濃度と倍数核形成との関連を調べた結果を示した図である。
【図５】Ｈ−１〜３株のセルラーゼ生産性と元株のセルラーゼ生産性を調べた結果を示す線図である。
【図１】
0003685518.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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