(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８.０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを生産する、シュードモナス  エルギノーザＡＮ−１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９）。
【請求項２】
８．０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを生産する、シュードモナス  エルギノーザＡＮ−１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９）を培養し、培養物より８.０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを採取することを特徴とするセラミダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はセラミダーゼを生産するシュードモナス属に属する細菌及び該細菌を用いるセラミダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セラミダーゼはスフィンゴ脂質の一種であるセラミドを長鎖塩基スフィンゴシンと脂肪酸に加水分解する酵素である。これまでセラミダーゼ活性の存在はラット脳、モルモット上皮細胞、ブタ上皮、ヒト脳、腎臓、脾臓、繊維芽細胞、上皮等の哺乳動物組織のみにおいて報告されている。しかし哺乳動物組織由来のセラミダーゼは膜結合型酵素であり存在量も少なく精製が困難であり大量の酵素を得ることはできなかった。
セラミドをセラミダーゼにより加水分解することにより得られる長鎖塩基スフィンゴシンはプロテインキナーゼＣの阻害、ホスフォリパーゼＤの活性化、カルモジュリン依存性の酵素の阻害等の活性を有しており、細胞の増殖や細胞内情報伝達に関与することにより、細胞機能の調節に働いていると考えられている重要な物質である。
またセラミドは角層に存在する角質細胞間脂質の５０％を占め、皮膚の乾燥からの保護とバリア機能において重要な働きを担っていると考えられている。アトピー性皮膚炎患者の皮膚においてはセラミドの減少が見られ皮膚の易乾燥性とバリア機能の低下の原因である可能性がこれまでに示されている。一方、アトピー性皮膚炎の病変部に黄色ブドウ球菌〔スタフィロコッカス  アウレウス（Staphyrococcus aureus)〕が存在することは広く知られており、このほかカンジダ属、マラセチア属の真菌類が病変部より単離されこれらの菌が病変部の増悪に関与している可能性が示されている。しかしながら、緑膿菌〔シュードモナス  エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa) 〕が病変部より単離された報告もなく、しかもこれらの菌がアトピー性皮膚炎患者のセラミド減少に関与するという報告も無い。アトピー性皮膚炎病変部にセラミドを分解する酵素を生産する微生物が存在すればセラミドの減少に関与すると考えられ、皮膚炎の増悪にも関与すると考えられる。しかし、セラミドを加水分解しスフィンゴシンと脂肪酸を生成する酵素セラミダーゼはこれまでに微生物が生産することは知られておらず、アトピー性皮膚炎病変部にセラミドを分解する酵素を生産する微生物が存在することも知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アトピー性皮膚炎の増悪に関与するセラミダーゼ生産性微生物及びその検出方法を提供すること、また、該微生物が生産するセラミダーゼを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、８.０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを生産する、シュードモナス  エルギノーザＡＮ−１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９）に関する。
本発明の第２の発明は、セラミダーゼの製造方法に関する発明であって、８．０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを生産する、シュードモナス  エルギノーザＡＮ−１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９）を培養し、培養物より８.０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを採取することを特徴とする。
【０００５】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎の増悪に関与するセラミダーゼを生産する微生物を見出すべく、アトピー性皮膚炎患者の病変部表皮を採取し、スクリーニングに用いた。このスクリーニングの過程でこれまで微生物においては知られていないセラミドをスフィンゴシンと脂肪酸に分解する活性を有する微生物を見出した。更に、本発明者らが、鋭意検討を行った結果、本発明の酵素を生産する微生物を特定することができた。更に該酵素の理化学的性質を明らかにし、また更に、該酵素を用いてセラミドを処理することにより、スフィンゴシンを効率よく製造することに成功し、本発明を完成させた。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明のセラミダーゼの製造方法は特に限定されるものではなく、本発明のセラミダーゼを有するシュードモナス属に属する微生物でよい。例えば、シュードモナス  エルギノーザ  ＡＮ−１７（Pseudomonas aeruginosa AN-17）が挙げられる。本菌株は、本発明者らがアトピー性皮膚炎患者の落屑中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は以下のとおりである。
【０００７】
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【０００８】
以上の特徴から本菌株はシュードモナス  エルギノーザに属する菌株と同定され、本菌株は Pseudomonas aeruginosa ＡＮ−１７と命名し、ＡＮ−１７と表示され工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９として寄託されている。該菌株は、セラミダーゼ及びスフィンゴミエリナーゼを生産するという新菌株である。
【０００９】
本発明の酵素は、例えば上述した菌株を栄養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離することによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭素源として例えば、グリセロール、グルコース、スクロース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当である。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えてもよい。また培地中にスフィンゴミエリンなどの脂質を０．０１〜０．５％添加して本発明の酵素の生産性を高めることができる。本発明の酵素の生産菌を培養するに当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく変動するが、一般的に培養温度は２０〜３７℃、培地のｐＨ５〜８が良く、１日から７日の通気かくはん培養で本発明の酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然である。
上述した菌株によって生産された本発明の酵素は主に菌体外に存在するので、培養物を固液分離し、得られた上清から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、ハイドロキシアパタイトカラムクロマト、ゲルろ過カラムクロマト、疎水クロマト等により精製することができる。酵素の純度は例えば、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法等によって検定することができる。
【００１０】
本発明により得られるセラミダーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおりである。
（１）作用
セラミドに作用して、スフィンゴシンと脂肪酸とに加水分解する。
（２）基質特異性
本酵素はセラミドに作用し、炭素数１２の脂肪酸を持つセラミド（Ｃ１２セラミド）及びＣ１８セラミドに比べＣ１６セラミドを良く分解する（図１）
（３）至適ｐＨ
本酵素の至適ｐＨはｐＨ８．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ７．５〜ｐＨ１０．５で比較的高い活性を示す。（図２）
（４）温度安定性
本酵素をｐＨ６．０、２５ｍＭ酢酸緩衝液中、０℃、２４℃、３７℃の各温度で１２時間保存した場合、本酵素は３７℃で約２０％の活性の低下が見られるが２４℃ではほとんど活性の低下は見られない。（図３）
（５）界面活性剤の影響
本酵素をｐＨ８．５、２５ｍＭトリス緩衝液中、各種濃度トリトン（Triton) Ｘ−１００でセラミドに作用させたところトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が最大となった。（図４）
【００１１】
本発明の細菌をアトピー性皮膚炎患者から検出するには患部から得た各種試料、例えば患部を拭った滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の一部、表皮の落屑等を用い各種選択分離培地で培養することにより検出することが可能である。また、本発明により単離された菌株を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出することも可能である。更には本菌株の遺伝子の配列の一部をプローブあるいはプライマーとして遺伝子工学的に、例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法等を用いて検出することができる。このようにして本発明の細菌を患部から検出することによりアトピー性皮膚炎の起炎菌を同定することができる。更にアトピー性皮膚炎の検出を行うことができる。
【００１２】
以上、詳細に説明したように、本発明により８.０〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼを生産するシュードモナス  エルギノーザＡＮ−１７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６９９）が提供され、更にはその細菌による該セラミダーゼの製造方法が提供される。
【００１３】
【実施例】
次に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらになんら限定されるものではない。
【００１４】
実施例１
アトピー性皮膚炎患者の皮膚からのセラミダーゼ生産菌の単離
少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑（表皮のはがれ落ちた物）を１００μｌのＳＭ合成培地（０．０５％リン酸水素二カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、０．０５％スフィンゴミエリン、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に取り、２５℃で３日間培養を行う。その培養液から５μｌを取り出し、１００μｌのＳＭ合成培地に植え継いだ。同じ培養操作をもう一度行った後、培養液をＳＭ含有トリプトソーヤ寒天培地（０．０５％スフィンゴミエリン、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含むトリプトソーヤ寒天培地）にまき、培養後得られたコロニーを１００μｌのＳＭ合成培地で培養した。この培養液中のスフィンゴミエリンの分解物を薄層クロマトグラフにより分析し、分解活性の強いコロニーの選択を行った。薄層クロマトグラフは培養液２０μｌを蒸発乾固した試料を２０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた上清１０μｌをＴＬＣプレート（メルク社シリカゲル６０）にのせ、クロロホルム／メタノール／アンモニア水溶液（９０：２０：０．５）で展開した。展開されたＴＬＣプレートはオルシノール−硫酸で焼き付けた後、クマシーブリリアントブルー染色液によって染色を行った。選択されたコロニーは以上の操作を繰り返し行いスフィンゴミエリンをスフィンゴシンまで分解する菌株の単離を行った。以上の操作により、スフィンゴミエリンを分解する活性を持つＡＮ−１７株が単離された。本菌株のＳＭ合成培地培養上清中にはスフィンゴミエリンの分解産物であるセラミドとセラミドの分解産物であるスフィンゴシンが薄層クロマトグラフィーにより検出された。またＴＬＣプレートをニンヒドリンにより染色した結果からもスフィンゴシンが生成していることが確認された。この結果は本菌株がスフィンゴミエリナーゼ及びセラミダーゼを生産することを示している。
【００１５】
実施例２
酵素活性測定
セラミダーゼ活性の測定は次のようにして行う。基質溶液（炭素数１６の脂肪酸を持つ14Ｃ放射性同位元素ラベルされたセラミド（Ｃ１６−14Ｃ−Ｃｅｒ）２５ｐｍｏｌ、０．２５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．５）１５μｌに酵素液１５μｌを加え３７℃で１．５時間反応させる。１５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を加え反応を止め、濃縮遠心機で反応液を濃縮し、これをＴＬＣプレート（シリカゲル６０、メルク社製）にのせ、クロロホルム／メタノール／アンモニア（９０：２０：０．５）で展開した後、イメージングアナライザーＢａｓ１０００（富士写真フィルム社製）を用いセラミドの量を定量する。
活性は１ｎｍｏｌのセラミドを１分間に分解する量を１Ｕとすると本菌株は培養上精１ｍｌ中に１．６ｍＵのセラミダーゼを生産する。
【００１６】
実施例３
基質特異性
０．１％ルブロール（Lubrol) を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中で脂肪酸鎖長の異なる３種の14Ｃ−セラミド（Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）に対して酵素を３７℃、２時間あるいは１９時間反応させたところ図１に示したようにＣ１６の14Ｃ−セラミドを最も良く分解した。図１の縦軸は分解率（％）、横軸は時間（ｈ）を示す。
【００１７】
実施例４
至適ｐＨ
本発明の酵素の至適ｐＨは図２に示すようにｐＨ８．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ７．５〜１０．５付近で比較的高い活性を示す。活性測定に用いる緩衝液はｐＨ４．０〜６．０においては２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５においては２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０においてはトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１０．５においては２５ｍＭグリシン緩衝液を使用する。
図２は本発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は分解率（％）、横軸は反応ｐＨを示す。図中白丸印は酢酸緩衝液を、黒丸印はリン酸緩衝液を、白四角印はトリス塩酸緩衝液を、黒四角印はグリシン緩衝液を示す。
【００１８】
実施例５
温度安定性
酵素液を氷上、２４℃、３７℃で１２時間放置した後、０．０５％ブロール、０．２５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中で14Ｃ−セラミド（Ｃ１６）に対して各酵素を３７℃、１．５時間あるいは１３．５時間反応させた時の相対活性を図３に示した。図３の縦軸は相対活性（％）、横軸は時間（ｈ）を示す。図３に示されたように本酵素は３７℃で約２０％の活性の低下が見られるが２４℃ではほとんど活性の低下は見られない。
【００１９】
実施例６
本発明の酵素をｐＨ８．５、２５ｍＭトリス緩衝液中、各種濃度トリトンＸ−１００でＣ１６−14Ｃ−セラミドに３７℃、１．５時間作用させた結果を図４に示す。本発明の酵素はトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が最大となった。図４の縦軸は分解率（％）を、横軸はトリトンＸ−１００の濃度（％）を示す。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によって、アトピー性皮膚炎増悪に関与すると考えられる、セラミドを分解する酵素を生産する微生物が単離され提供された。この微生物が純粋培養できるようになったことにより、この微生物を駆除することによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減作用を持つ薬剤の新たな開発が容易になった。またこの微生物の検出法の開発が可能となりアトピー性皮膚炎の患者における起炎菌の同定が容易になった。更にこの微生物の生産するセラミダーゼが得られたことにより、この酵素を不活化することによりアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の軽減作用を持つ薬剤の開発が可能となった。またこの微生物によりセラミダーゼが安価に大量に生産できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による酵素の基質特異性を示すグラフである。
【図２】本発明による酵素の至適ｐＨを示すグラフである。
【図３】本発明による酵素の温度安定性を示すグラフである。
【図４】本発明による酵素に対する界面活性剤の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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