(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱水ミセル粒子又は脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を再水和溶液で再水和するにあたり、再水和を１０℃〜０℃の温度範囲内で行うことを特徴とする閉鎖小胞の製造方法。
【請求項２】
閉鎖小胞が医薬品又は診断用薬剤が導入された閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
医薬品が抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
抗腫瘍剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラスチン並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体から選ばれることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
薬学的に許容し得る塩が多価陰イオン性物質と形成される塩であることを特徴とする請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
多価陰イオン性物質がクエン酸、酒石酸及びグルタミン酸から選ばれることを特徴とする請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
閉鎖小胞がリポソームであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
リポソームが凍結乾燥又は噴霧乾燥して得られることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
リポソームが乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
５％から４０％の濃度の乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
５％から２０％の濃度の乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１２】
乾燥助剤が糖類であることを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
リポソームに抗体及び／又はポリエチレングリコールが付与されていることを特徴とする請求項７から１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
再水和溶液がｐＨ６から８を有する溶液であることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
再水和溶液が生理食塩水であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤及び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなることを特徴とする医薬品キットであって、再水和溶液が１０℃〜０℃の温度範囲内であることを特徴とする医薬品キット。
【請求項１７】
脱水閉鎖小胞が、医薬品が導入された脱水閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１６記載の医薬品キット。
【請求項１８】
脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤及び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなることを特徴とする診断薬キットであって、再水和溶液が１０℃〜０℃の温度範囲内であることを特徴とする診断薬キット。
【請求項１９】
脱水閉鎖小胞が、診断用薬剤が導入された脱水閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１８記載の診断薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脱水ミセル粒子又は脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を特定の条件で再水和する工程を含む閉鎖小胞の製造方法および該方法を用いて得られる閉鎖小胞に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
リポソームは脂質ミセル二重層からなる閉鎖小胞である。この脂質相に脂溶性物質を、内部水相に水溶性物質を封入でき、低分子化合物のみならず蛋白質などの高分子物質まで担持できること、さらに生体適合性が高いことから、薬物、タンパク質、核酸などのドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）用キャリアーとして数多くの研究がなされている。近年、薬剤の封入による毒性低減、血中滞留性の改変に加え、リポソーム表面修飾によるターゲティング機能等が付与されたリポソームの実用化研究も進展している。
【０００３】
しかしながら、本来リポソームのミセル構造は熱力学的に安定性が高いとはいいがたく、実用化に際して長期保存法の確立が不可欠である。
長期安定性確保を目的としてエヴァンスらは特開昭５３−１４２５１４号公報でリポソーム溶液から水を除去し安定な乾燥脂質状態とした後、必要に応じて水溶液を加える（再水和する）ことでリポソームを再生する「脱水法」を開示した。これにより乾燥粉末形態で長期保管の可能性が示されたが、さらに脱水に伴うリポソームの凝集融合、内封物の漏れを低減化すべくその後の改良検討がなされてきた。
【０００４】
例えば、脱水時の保護剤の観点からは、特公昭６１−２１４４９号公報でデキストラン、アラビアゴム等、親水性化合物をリポソーム溶液に添加し凍結乾燥する方法、特表昭６２−５０１６３１号公報にはトレハロース、シュークロース等の２糖類を含有するリポソーム溶液の凍結乾燥法が開示されている。さらに特開平７−１４５０４１号公報で抗腫瘍剤を内部に封入したリポソームについて凍結乾燥法以外の方法で脱水されたリポソームが、特開平７−１４５０４３号公報では前凍結なしに脱水し、かつ残存水分量を２〜５％にする方法が開示されている。
【０００５】
また、再水和溶液については特開昭５３−１４２５１４号公報では凍結乾燥リポソームを５０℃〜７０℃で加温分散した例が記載されている。
しかしながら、これらの方法では脂質組成、内封物によって数十％から１０％程度の漏出（リーク）が認められ、リポソームの安定性は必ずしも十分でなかった。
【０００６】
このような内封物のリークは、特に内封物のリークによる影響が大きいアッセイ用リポソーム、生理活性の高い抗腫瘍剤のごとき薬剤を封入したリポソームでは影響が大きい。抗腫瘍剤封入リポソームを臨床応用する場合、リポソーム化によりなされた副作用の低減化が妨げられること、ターゲティング等の効果の低下が考えられ、たとえ１０〜３０％程度の量であっても重要な問題であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる従来の問題点を解決すべく検討した結果、従来検討されてきた方法に加え、むしろ再水和条件が重要であること、特に再水和時の分散液の温度が影響大であることを見いだした。驚くべきことに、従来示されていたリポソーム溶液をはじめとする閉鎖小胞の加温とは逆に再水和時に冷却することにより内封物のリークが極めて抑制されること、さらに一旦低温環境で再水和した閉鎖小胞は常温に戻したのちも安定性が大きく向上していることを見いだした。本発明はこの知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち本発明は、脱水ミセル粒子または脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を再水和溶液で再水和するにあたり、再水和を低温条件下で行うことを特徴とする閉鎖小胞の製造方法を提供するものである。
【０００９】
その他、発明の要旨として以下が挙げられる。
（１）脱水ミセル粒子又は脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を再水和溶液で再水和するにあたり、再水和を１０℃〜０℃の温度範囲内で行うことを特徴とする閉鎖小胞の製造方法。
（２）閉鎖小胞が医薬品又は診断用薬剤が導入された閉鎖小胞であることを特徴とする上記１記載の製造方法。
（３）医薬品が抗腫瘍剤であることを特徴とする上記２記載の製造方法。
（４）抗腫瘍剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラスチン並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体から選ばれることを特徴とする上記３に記載の製造方法。
（５）薬学的に許容し得る塩が多価陰イオン性物質と形成される塩であることを特徴とする上記４記載の製造方法。
（６）多価陰イオン性物質がクエン酸、酒石酸及びグルタミン酸から選ばれることを特徴とする上記５記載の製造方法。
（７）閉鎖小胞がリポソームであることを特徴とする上記１から６のいずれかに記載の製造方法。
（８）リポソームが凍結乾燥又は噴霧乾燥して得られることを特徴とする上記７に記載の製造方法。
（９）リポソームが乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする上記８に記載の製造方法。
（１０）５％から４０％の濃度の乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする上記８又は９に記載の製造方法。
（１１）５％から２０％の濃度の乾燥助剤を外水相に添加することを特徴とする上記８又は９に記載の製造方法。
（１２）乾燥助剤が糖類であることを特徴とする上記９から１１のいずれかに記載の製造方法。
（１３）リポソームに抗体及び／又はポリエチレングリコールが付与されていることを特徴とする上記７から１２のいずれかに記載の製造方法。
（１４）再水和溶液がｐＨ６から８を有する溶液であることを特徴とする上記１から１３のいずれかに記載の製造方法。
（１５）再水和溶液が生理食塩水であることを特徴とする上記１４に記載の製造方法。
【００１０】
また、本発明の要旨の別の態様として以下が挙げられる。
（１６）脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤及び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなることを特徴とする医薬品キットであって、再水和溶液が１０℃〜０℃の温度範囲内であることを特徴とする医薬品キット。
（１７）脱水閉鎖小胞が、医薬品が導入された脱水閉鎖小胞であることを特徴とする上記１６記載の医薬品キット。
（１８）脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤及び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなることを特徴とする診断薬キットであって、再水和溶液が１０℃〜０℃の温度範囲内であることを特徴とする診断薬キット。
（１９）脱水閉鎖小胞が、診断用薬剤が導入された脱水閉鎖小胞であることを特徴とする上記１８記載の診断薬キット。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本明細書において、ミセル粒子又はミセルとは、分子中に親水部分及び疎水部分を含む両親媒性分子の凝集によって得られる水溶性粒子を意味する。このようなミセル粒子又はミセルは、小球、楕円体又は長い円筒形の形態をとり得、また、後述する両親媒性分子の二つの平行な層から成る二重層、すなわち両親媒性ミセル二重層でもあり得る。
【００１２】
本明細書において、閉鎖小胞とは、上記ミセル粒子又はミセルより構成される閉鎖構造物を意味するものであり、例えば、細胞、ウィルス等の天然閉鎖小胞、リポソーム、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１，ｐ１４２（１９９３）に記載されているｎｏｖａｓｏｍｅ（商品名、Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、同書ｐ１５７に記載されている非イオン性界面活性ベシクル（ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、高分子マイクロスフェアー等の人工閉鎖小胞を包含するものである。これらの中で、本発明において好適に用いられる閉鎖小胞はリポソームである。
ミセル粒子又はミセルを構成する両親媒性分子としては、親水部分及び疎水部分を含み、それ自体既知の通常用いられる方法によりミセル粒子又はミセルを形成し得るものであれば如何なるものであってもよく、それらの中で、好適な両親媒性分子としては脂質を挙げることができる。
【００１３】
本発明に係る閉鎖小胞を構成し得る脂質としては、例えば、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）やジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルフォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親媒性ジアルキルジメチルアンモニウム（ｄｉａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）、ポリグリセロールアルキルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ）等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１  １４１（１９９３））、アルキルクリコシド（ａｌｋｙｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、アルキルメチルグルカミド（ａｌｋｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、アルキルスクローエステル（ａｌｋｙｌ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｅｓｔｅｒｓ）、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル（ｄｉａｌｋｙｌ  ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｅｔｈｅｒｓ）、ジアルキルポリグリセロールエーテル（ｄｉａｌｋｙｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒｓ）等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１  １５７（１９９３））、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等（特表平６−５０８８３１号公報）を挙げることができる。これらの脂質は単独又は二種以上、或いはこれらとコレステロール等の非極性物質と組合せて用いられる。
【００１４】
さらに、閉鎖小胞がリポソームである場合には、ステアリルアミン、ジセチルフォスフェートなどの荷電性物質、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子部分を有するリン脂質誘導体やマレイミド基を有するリン脂質誘導体を含んでも良い。また、例えば特開平４−３４６９１８号公報にあるようにこれら脂質誘導体を介し、抗体や水溶性高分子を結合したものであってもよい。また、融合リポソームとして知られるリポソームとセンダイウィルスを融合したリポソームのごとき、ウィルスの一部または全部を組み込んだものであってもよい。
【００１５】
閉鎖小胞は天然由来のものをそのまま用いても良く、いかなる方法で製造されたものでも良いが、例えば閉鎖小胞がリポソームである場合は上記した素材を用いてそれ自体既知の通常用いられる製造技術を用いて製造できる。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え機械的振盪を加え形成するマルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）や、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラメラリポソーム（ＳＵＶ）、界面活性剤除去法、逆相蒸発法（リポソーム  砂本順三ら  南江堂  １９８８）、ＭＬＶを均一ポア径を有するメンブランを加圧して押し出すイクストゥルージョン法等から得られるラージユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）を用いることができる（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００１６】
閉鎖小胞に導入し得る医薬品としては、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）等の抗腫瘍剤、チモロール等のアドレナリン遮断剤、クロニジン等の高血圧剤、プロカイアミド等の制吐剤、クロロキニーネ等の抗マラリア剤、並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体；リシンＡやジフテリアトキシン等の毒素蛋白およびそれをコードするＤＮＡ、ＴＮＦ等サイトカインの遺伝子をコードするＤＮＡがあげられる。
【００１７】
上記抗腫瘍剤等の薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との塩、例えばクエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、及びそれらの誘導体との塩が好ましい。これら閉鎖小胞に導入し得る医薬品の中で、抗腫瘍剤を用いるのが好ましい。
閉鎖小胞に導入し得る診断用薬剤としては、放射性元素、例えばインジウム、テクネシューム等のイメージング薬剤；ヨード、ガドリニウム等の造影剤；ホースラデイッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクロシダーゼ等の酵素；ユーロピウム誘導体等の蛍光体；Ｎ−メチルアクリジウム誘導体等の発光体等が挙げられる。
【００１８】
これら医薬品及び診断用薬剤の閉鎖小胞への導入は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。例えば、閉鎖小胞がリポソームである場合は、リポソーム形成時に水溶液として添加し封入しても良く、またリポソーム形成後ベシクル内外にｐＨ勾配等の濃度勾配を形成させ、このポテンシャルを駆動力としてイオン化可能な薬剤を取り込ませる方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９  ５９２２（１９８９），ＢＢＡ  ４５５，２６９（１９７６））を用いても良い。
【００１９】
閉鎖小胞の脱水は、凍結乾燥または噴霧乾燥等の公知の方法を用いることができるが、好ましくは凍結乾燥である。さらに凍結乾燥助剤として糖類、例えばシュークロース、トレハロース等を添加することができる。糖類は、リポソーム脱水時少なくとも外水相に添加して用いることができる。外水相に添加し得る糖類の濃度は、通常５〜４０％、好ましくは５〜２０％が適当である。
【００２０】
再水和溶液は、生理食塩水等の塩類を含んだ水溶液、リン酸緩衝液等の中性緩衝液、ブドウ糖等の糖溶液あるいはそれらの混合物を用いることができる。再水和溶液のｐＨは６から８程度の中性領域が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５からｐＨ７．５程度である。ｐＨ緩衝剤は、再水和溶液に加えて用いることもできるが、リポソーム凍結乾燥時点でリポソーム側に含有するか、あるいは再水和溶液と凍結乾燥リポソームの両方に含有していても良く、再水和時に閉鎖小胞を含有する水溶液が中性領域のｐＨを呈していれば如何なる方法で加えても良い。ｐＨ緩衝剤の濃度は、通常１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭが適当である。
【００２１】
上記閉鎖小胞及び再水和溶液は、好ましくは、適当な水性媒体に懸濁された閉鎖小胞及び再水和溶液を、それぞれ滅菌濾過し次に適当なバイアル又はアンプル等の薬剤容器に無菌的に充填し、再水和溶液はそのまま、閉鎖小胞は凍結乾燥等により脱水して密封される。
【００２２】
再水和は、低温条件下で、上記再水和溶液に脱水閉鎖小胞を分散させることにより行うことができる。ここで、低温条件とは室温よりも低い温度、通常約２０℃程度以下、すなわち、約２０℃程度から再水和溶液が凍結せずに溶液状態として存在し得る程度の温度範囲をいい、約１０℃〜０℃程度の温度範囲が好ましい。
【００２３】
再水和時の低温条件は、上記温度範囲であれば如何なる方法で惹起されたものであっても良い。例えば、脱水閉鎖小胞が入ったバイアル等の薬剤容器及び再水和溶液のいずれか一方又は両者を予め低温に冷却しておいても良いし、或いは再水和時に、適当な冷媒で低温条件に冷却しながら再水和溶液に脱水閉鎖小胞を分散させても良い。
【００２４】
再水和時間は、閉鎖小胞が再水和溶液に均一に分散可能な時間であれば特に制限はなく、用いる容器の大きさ及び攪拌速度等によっても異なるが、通常は１分間程度以内である。この間上記低温条件に保てば、導入物のリークが少く、安定に脱水閉鎖小胞の再水和ができる。
【００２５】
上記の如く再水和して得られた閉鎖小胞を含有する組成物、例えば医薬品が導入されたリポソームを含有する医薬組成物は、癌等の各種疾患に対して血管内投与法や膀胱内、腹腔内投与、局所投与法で用いることができる。投与量は封入薬剤により適宜調整できるが、アドリアマイシン封入体を例にとればアドリアマイシンとして、１０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
【００２６】
本発明においては、医薬品及び診断用薬剤が導入された脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤および該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなる、２本セットの医薬品及び診断薬キットの他、医薬品及び診断用薬剤を含有する凍結乾燥製剤と脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤が、別の薬剤容器に充填され、それらと、再水和溶液からなる、３本セットの医薬品及び診断薬キットも、その範囲に含まれる。３本セットのキットの場合は、脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤を、上記で記載したような方法で（低温条件下に）再水和し、この再水和小胞溶液に、あらかじめ適当な溶媒で溶かした医薬品又は、診断用薬剤を添加すると、上記で記載したベシクル内外のポテンシャルにより、閉鎖小胞内に医薬品又は診断用薬剤を取り込ませることが可能である。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細な説明をするが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（ｃｈｏｌ）、ε−マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比１８／１０／０．５でクロロホルムに溶解し、ロータリーエヴァポレーターで減圧乾燥した。さらに真空ポンプで減圧し残存溶媒を除去した。得られた脂質フィルム１００ｍｇに対し１ｍｌの割合で０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加え６０℃で加温しボルテックスミキサーで振盪乳化することでＭＬＶを作製した。このＭＬＶをイクストゥルーダー法により整粒した。すなわち０．２μｍヌクレオポアメンブランを装着したイクストゥルーダー（日油リポソーム社製）、さらに０．１μｍのヌクレオポアメンブランに順次通すことでＬＵＶリポソームを作製した。リポソーム外水相を１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で中和し、６０℃に加温しつつ２０ｍｇ／ｍｌのアドリアマイシン（ＡＤＭ）水溶液を脂質１００ｍｇに対し１０ｍｇの割合で添加した。９５％以上のＡＤＭはリポソーム内外のｐＨ勾配によりリポソームに装填された。さらに、未封入ＡＤＭをゲル濾過で除き、リポソーム外液を１０％シュクロースに調整したのち凍結乾燥により脱水リポソームとした。
【００２９】
凍結乾燥リポソームに対して、氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を凍結乾燥前の容量になるよう添加しバイアルを振盪し再水和した（再水和時の温度０℃）。
【００３０】
その一部をＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０（ファルマシア製）カラムでゲル濾過することでリポソーム封入ＡＤＭおよびリークしたＡＤＭを分離した。
【００３１】
リポソーム中のＡＤＭは０．３Ｍ塩酸／５０％エタノールを加え６０℃で抽出、５００ｎｍの吸光度により定量した。遊離ＡＤＭはそのまま５００ｎｍの吸光度から定量した。その結果、リーク量は３％以下であり単に凍結融解したリポソームと同程度であった。また、凝集等も認められなかった。
【００３２】
比較例１
再水和液を室温（２５℃）の蒸留水に代えること以外は実施例１と同様にリポソームを調製、再水和した。凝集等は認められなかったが、１５％から２５％程度のＡＤＭのリークが認められた。
【００３３】
実施例２
特開平５−３０４９８７号公報に記載のＧＡＨ抗体（胃癌反応性モノクロナール抗体）にイミノチオランを反応させることでチオール基を有する抗体をＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３２０６（１９７３）に記載の方法で調製した。また、２，４−ビス（ポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンにシスチンを反応後還元して、チオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を調製した。
【００３４】
さらに、実施例１と同様に調製したリポソームと、チオール化抗体およびチオール化ＰＥＧを順次反応させることで、抗体とＰＥＧを結合したリポソームを作製した。外水相を１０％シュクロースとし凍結乾燥した。凍結乾燥したリポソームに０℃〜３０℃の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加、分散後、同様にＡＤＭリーク量を測定した。その結果、図１に示す様に再水和溶液の温度に依存したリークの増加が認められた。
【００３５】
実施例３
実施例２と同様に作製した凍結乾燥リポソームに０℃の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加、分散後、ゲル濾過カラム（ＮＡＰ−１０、ファルマシア社製）に添加し再水和過程で生じたＡＤＭを除去した。さらに３７℃の水浴で１時間加温したのち、新たに生じたＡＤＭのリークを測定したところほぼ全量が保持されており、一旦低温で再水和された後は加温しても安定であった。
【００３６】
比較例２
再水和溶液を室温（２５℃）の生理食塩水にする以外は実施例３と同様にして再水和以降のリークを測定したところ、３７℃、１時間の加温で約６％のＡＤＭのリークが新たに生じていた。
【００３７】
実施例４
ヒト胃癌組織から樹立した胃癌細胞株Ｂ３７（実施例２で用いたＧＡＨ抗体と反応性を有する）を用い実施例２の抗腫瘍抗体およびＰＥＧを結合したＡＤＭ封入リポソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を確認した。
【００３８】
培養用９６穴プレートに細胞を播種、翌日細胞がプレートに付着したところで、脱水（凍結乾燥）後−２０℃で５ヶ月間保管し、低温（０℃）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で再水和したリポソームおよび１０％シュクロースで５ヶ月間凍結保管後に融解したリポソームを添加した。３７℃で１時間反応後、リポソームを除き１０％血清培地を添加し培養した。５日後、生細胞率をＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５（１９８３））により測定し効果を比較した。
【００３９】
その結果、図２に示すように、凍結乾燥／低温再水和リポソームは、凍結保存リポソームと同等の抗腫瘍活性を保持していた。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、脱水閉鎖小胞、例えば脱水リポソームから閉鎖小胞を再生する過程で生じる導入物のリーク量を極めて低減化することができ、また再水和後の安定性も高い閉鎖小胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アドリアマイシンのリークに及ぼす再水和溶液の温度の影響を示す図である。図中、横軸は再水和溶液の温度を示し、縦軸はアドリアマイシンのリーク量を示す。
【図２】アドリアマイシンが封入された、凍結乾燥低温再水和リポソームと凍結保存リポソームの抗腫瘍活性を示す図である。図中、横軸はリポソーム量をアドリアマイシン換算量として示し、縦軸は生細胞率を示す。
【図１】
0003693209.tif 000002
【図２】
0003693209.tif 000003