(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロ−ルと一般式 (βGal)n-Glc (Galはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、ｎ=１〜３である)で示されるガラクトース化合物の混合物に、サッカロミセス属酵母存在下でβ−ガラクトシダ−ゼを生産する微生物菌体又はその微生物より調製されたβ−ガラクトシダ−ゼを作用させることにより、下記式１で示されるガラクトシルグリセロール類を製造する方法。
(βGal)n-Gly （式１）(式中Galはガラクトース残基、Glyはグリセロール、ｎ=１〜２を示す。)
【請求項２】
ガラクトース化合物が、ラクトースである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は食品、化成品、飼料、医薬品等に利用可能なガラクトシルグリセロ−ル類の製造方法に関する。ガラクトシルグリセロ−ル類は、特に、食品、化成品、飼料分野において甘味料、甘味改善剤、保湿剤としての用途が期待される。さらにガラクトシルグリセロ−ル類は、医薬の分野で利用可能なグリセロ糖脂質合成のための基質となりうる。このグリセロ糖脂質は、動植物から微生物に至るまで広く分布しており、グリセロ糖脂質の生理的役割を解明することは、医薬への応用につながるものである。
【０００２】
【従来の技術】
グリセロ−ルに糖を付加させる反応としては、Ｋａｐｌｕｍ等がオルソエステルと糖のハロゲン誘導体を使って有機的に合成している例がある（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１（１１），１６７５−６（１９７５））。
しかしながら、有機的な合成は収量が低く、工業的に安価にかつ大量に製造することは困難である。また食品製造においては安全性に問題がある。
また、酵素的にガラクト−スをグリセロ−ルに転移させるものとしては、糖供与体として多糖体であるアラビノガラクタンを用いてガラクタナ−ゼを作用させた例がある。（特開平２−３０８７９８）。
しかしながらこの方法では、多糖体の溶解度が低く大量に使用できない、未反応の多糖体が残存し目的物の精製を困難にする等の問題がある。
またクレビジ−ラ・プランティコラＧ−１７のβ−ガラクトシダ−ゼを作用させた例もある（特開平６−３３９３７６）。
しかしながらこの方法では、酵素の温度安定性が低く、収量も数％と低い等の問題があり、ガラクトシルグリセロ−ル類の工業的生産を実用化させる要請に応じていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決しようとする課題は、ラクトースなどのガラクト−ス化合物とグリセロ−ルから、ガラクト−スの転移活性を持つβ−ガラクトシダ−ゼを生産する微生物又はその微生物から調製されたβ−ガラクトシダ−ゼとサッカロミセス属酵母とを併用して、食品、化成品、飼料、医薬品等に利用可能なガラクトシルグリセロ−ル類を含量効率よく生産することにある。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、グリセロ−ルとガラクト−ス化合物の混合物に、サッカロミセス属酵母存在下でガラクト−スの転移活性を持つβ−ガラクトシダ−ゼを生産する微生物菌体又はその微生物より調製されたβ−ガラクトシダ−ゼを作用させることにより、グリセロ−ルに効率よくガラクト−ス残基を転移させることに成功し、ガラクトシルグリセロ−ル類の製造方法を完成するに至った。
【０００５】本発明に使用できるβ−ガラクトシダーゼを生産する微生物としては、β−ガラクトシダーゼを生産する微生物であれば特に制限はないが、例えばクリプトコッカス  ローレンティ  バラエティ  ローレンティ  ＯＫＮ−４  （Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ  ｖａｒ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ  ＯＫＮ−４；ＦＥＲＭ  Ｐ−７６２９）株等が挙げられる。本菌は、炭素源としてラクトースを用いた培地で培養し、得られた菌体又はポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等の通常の固定化法により菌体を固定化したものがガラクトシルグリセロール類の製造方法に使用できる。
【０００６】
本発明に使用できるβ−ガラクトシダ−ゼは、糖転移作用のあるものであればどのようなβ−ガラクトシダ−ゼでもよく、β−ガラクトシダ−ゼを生産する微生物菌体およびそれから一般的に行われる菌体破砕の方法によって調製された粗酵素や精製酵素が使用できる。β−ガラクトシダ−ゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，３．２．１．２３）は、ガラクト−スがβ結合したβ−ガラクトサイドを認識切断する酵素であるが、反応条件によっては糖転移反応を示すものである。例えば、クリプトコッカス  ロ−レンティ  バラエティ  ロ−レンティ  ＯＫＮ−４  （Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ  ｖａｒ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ  ＯＫＮ−４；  ＦＥＲＭ  Ｐ−７６２９）  より調製されたβ−ガラクトシダ−ゼＡ（特公平６−２０５７、特許第１８８２１１１号）、リポマイセスに属する酵母より調製されたβ−ガラクトシダ−ゼ  （特開平１−１１２９７８）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）  ＩＦＯ８７９より調製されたβ−ガラクトシダ−ゼ（特開平２−７２８９０）、バチルス  サ−キュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）  より調製されたβ−１，４  ガラクトシダ−ゼＩＩ（大和化成株式会社製）等が特に好適に使用できる。
【０００７】
本発明に使用できるサッカロミセス属酵母としては、反応基質であるガラクトース化合物及びグリセロール並びに目的生成物であるガラクトシルグリセロール類を消費せず、ラクト−スの分解あるいはガラクトシルグリセロ−ル類生成時に生ずる単糖類（グルコ−ス、ガラクト−ス）のみをよく消費するものであればどのようなものでも良い。入手の容易性及び価格の点から、市販のパン酵母が好ましい。
サッカロミセス属酵母は、反応の基質の一つであるラクトースを用いた場合、目的物質であるガラクトシルグリセロール類を消費せず、ラクトースの分解あるいはガラクトシルグリセロ−ル類生成時に生ずる単糖類（グルコース、ガラクトース）のみをよく消費する。このためラクトースのガラクトース残基を転移させる受容体としてはグリセロールと原料のラクトースのみとなる。またこの反応において、この一方の受容体であるラクトースにガラクトース残基が転移することによって生じた４’−ガラクトシルラクトースなどのガラクトース化合物は、この反応においてはグリセロールへのガラクトース転移反応の供与体となりうる。
このためこのサッカロミセス属酵母の併用の結果、従来の方法では達成できなかったガラクトシルグリセロール類の高収率の生産方法が完成できた。
【０００８】
本発明で使用される原料の一であるガラクトース化合物としては、グリセロールにガラクトース残基を供与できるガラクトース化合物であればどのようなものでも良いが、一般式  （βＧａｌ）ｎ−Ｇｌｃ  （Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎ＝１〜３である）で表されたものが好ましい。例えば、ラクトースや４’−ガラクトシルラクト−ス等が好適に使用できる。
【０００９】
本発明で用いられる反応系は、本発明で用いるβ−ガラクトシダーゼを失活させず、且つサッカロミセス属酵母が生存できる温度、ｐＨであれば特に制限はない。好ましくは、反応液のｐＨを３〜６に調節し、３０〜６０℃で反応することが好適である。
【００１０】
また、原料の組成としては、グリセロールとラクトースが１：１０〜１０：１（ｗ／ｖ）とすることが好ましい。また、ラクトースの濃度を１％〜４０％（ｗ／ｖ）とすることが好適である。
【００１１】
反応は酵素液をそのままバッチ法で使用することもできるが、酵素をリサイクルするために菌体又は酵素を固定化することが望ましい。固定化方法に特別な制限はなく、アルギン酸カルシウムやカラギ−ナン等に包括固定化したものや、セルロ−スやアガロ−ス、ポリアクリルアミドゲルなどの担体に、酵素をグルタルアルデヒド等の架橋材で処理したものや、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換担体にイオン結合させたり、キトサンビ−ズなどに物理的に吸着させる方法が用いられる。
固定化担体をバッチ法に用いて生産するより、カラムに充填して連続生産する方が生産効率上望ましい。
【００１２】
本発明によれば、糖転移反応によりガラクト−ス残基がグリセロールに転移したガラクトシルグリセロ−ル（Ｇａｌ−Ｇｌｙ、以下Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｙはグリセロールを示す）と、反応時間が長くなればガラクトース残基がさらに転移したジガラクトシルグリセロ−ル（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｙ）も生成される。本発明においてガラクトシルグリセロ−ル類とはこのガラクトシルグリセロ−ルとジガラクトシルグリセロ−ルを示す。よって、反応終了時点（ガラクトシルグリセロ−ル類の生成率が原料ガラストース化合物に対して３０〜９９％）には、ガラクトシルグリセロ−ル類、サッカロミセス属酵母で完全に消費されずに残った少量のガラクト−ス、原料であるグリセロ−ル、ラクト−ス、４’−ガラクトシルラクト−スといった糖を含んだ糖液となる。
【００１３】
この糖液を脱色、脱塩、ろ過し、濃縮してシロップとしたり凍結乾燥やスプレ−ドライで粉末として製品とすることができる。また、この糖液を活性炭カラムクロマトグラフィ−、イオン交換カラムクロマトグラフィ−、ゲルろ過等で前もって処理することにより、ガラクトシルグリセロ−ル類の含量の多い製品つくることができる。
【００１４】
以下、実施例により、本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
実施例１
グリセロ−ル１０％（Ｗ／Ｖ）、ラクト−ス１％（Ｗ／Ｖ）を水に溶解し１００ｍｌとし、その２ｍｌの混合液に、パン酵母０．１ｇとβ−ガラクトシダ−ゼ（β−ガラクトシダ−ゼＡ、『新規β−  ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造方法（特公平６−２０５７、特許第１８８２１１１号）』に従って調製した）を２ｕｎｉｔｓ  添加し、４０℃で６時間作用させた。分析は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとする）により行った。ＨＰＬＣのカラムには日立化成工業株式会社製  ＧＬ−Ｃ６１０を用い、分析は、溶媒に水を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度６０℃の条件で行った。検出にはＲＩ検出器を使用し、Ｄ−２５００  Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ（日立製作所）で解析した。
【００１６】
この結果、図１から理解されるように、０時間に見られる、１２．２ｍｉｎの原料であるラクトースのピ−クが消失し、１３．５ｍｉｎに新しいピ−ク（以後ピ−クＡと称する）が出現した。このピ−クＡはコントロ−ルとして同様に分析したグルコ−スやガラクト−スなどの単糖の溶出時間とも異なる位置に出現しており、グリセロ−ルに糖が転移することにより生成された物質であることが推定された。
【００１７】比較例１
パン酵母を添加せず、β−ガラクトシダーゼのみで実施例１と同様に反応させて分析した。この結果を表１に示す。反応効率はパン酵母を併用することにより飛躍的に向上することが判明した。
【００１８】表１
0003630378.tif 000002
【００１９】
生成率は、原料ラクト−スに対するピ−クＡの生成量の比率（モル比）を示す。
【００２０】
実施例２
ラクト−スとグリセロ−ルをそれぞれ１０％（Ｗ／Ｖ）  になるように水に溶解し１００ｍｌとし、そこにパン酵母５ｇとβ−ガラクトシダ−ゼＡを２０ｕ添加し、５０℃、２２時間反応させた。反応終了後、アニリン：酢酸＝５：２（ｖ／ｖ）に混合した溶液を１０ｍｌ添加し、８０℃、４  時間反応させ生成した還元糖のアニリン誘導体をエ−テル抽出により除去した。この水相区分を活性炭カラムとＢＩＯ−ＧＥＬ  Ｐ−２ゲル濾過カラムに順次アプライし、ピ−クＡ  ３０７ｍｇ（  純度９８．５％）を得た。
【００２１】
上述で得られたピ−クＡの１％水溶液１ｍｌと２Ｎ塩酸溶液１ｍｌを混合し、１時間煮沸した。この溶液にＡｇＣＯ３粉末を炭酸ガスの発生がなくなるまで添加し、反応液を中和し、０．４５μｍのフィルタ−で濾過した。この水溶液を実施例１のＨＰＬＣで分析したところピ−クＡのピ−クが消失し、グリセロ−ルとガラクト−スが検出された（図２）。このモル比は１：１  であった。従って、ピ−クＡの構造はグリセロ−ルにガラクト−スが１残基結合している物質であることが判明した。
【００２２】
上述で得られたピ−クＡの１０ｍＭ水溶液２００μｌに各種グリコシダ−ゼ１０ｕを添加し、４０℃で５時間反応させた。この反応液を同様にＨＰＬＣで分析した。このようにして得られたクロマトグラムを酵素を添加しないサンプルと標準のグリセロ−ルやガラクト−ス、グルコ−ス等と比較し、ピ−クＡの減少とグリセロ−ル、ガラクト−スのピ−クの出現を調べ、分解の有無を確認した。
【００２３】
その結果を表２に示す。この結果、α−ガラクトシダ−ゼ、α−およびβ−グルコシダ−ゼは分解せず、３種のβ−ガラクトシダ−ゼは分解したことから、このピ−クＡの物質の構造は、ガラクト−スがβ結合している下記式１に示されるガラクトシルグリセロ−ルであることが判明した。
（βＧａｌ）ｎ  −Ｇｌｙ                        （式１）
（式中Ｇａｌはガラクト−  ス残基、Ｇｌｙはグリセロール、ｎ＝１〜２を示す。）
【００２４】
0003630378.tif 000003
【００２５】
実施例３
グリセロ−ル１０％（Ｗ／Ｖ）、ラクト−ス１０％（Ｗ／Ｖ）になるように水に溶解し１００ｍｌとし、その混合液１００ｍｌに、パン酵母  ２．５ｇ  とアルギン酸カルシウムによる固定化菌体（『ガラクトオリゴ糖の製造法（  特許第１６２８５２１号）』に従って調製した）を２０ｇ（１１ｕｎｉｔｓ  ）添加し、４０℃で２２時間反応させた。分析は実施例１と同様にＨＰＬＣにより行った。
【００２６】
この結果、２．３４ｇのガラクトシルグリセロ−ルが得られた。このとき、原料ラクト−スに含まれるガラクト−スの３１．５％がグリセロ−ルに転移していた。
【００２７】
実施例４
グリセロ−ル１０％（Ｗ／Ｖ）、ラクト−ス１〜１０％（Ｗ／Ｖ）  になるように水に溶解し１００ｍｌとし、その２ｍｌの混合液に実施例１と同様にパン酵母０．１ｇとβ−ガラクトシダ−ゼを２ｕｎｉｔｓ添加し４０℃で６時間まで作用させた。分析はＨＰＬＣにより行った。
【００２８】
この結果、原料ラクト−スが１％および２％の時には２時間後、原料ラクト−スが４％で４時間後、原料ラクト−ス６％では６時間後にラクト−スが消失し、ガラクトシルグリセロ−ルが生成した。この時、原料ラクト−ス由来のガラクト−スの７０％がグリセロ−ルに転移していた。原料ラクト−スが８％及び１０％では１％の時の７倍の糖転移生成物が得られた（図３）。この時、原料ラクト−スの構成糖であるガラクト−スはその約５０％がグリセロ−ルに転移していた。
【００２９】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、ガラクトシルグリセロ−ル類を効率よく大量に提供することができる。本発明によって生産されたガラクトシルグリセロ−ル類は食品、化成品、飼料、医薬品等に利用可能となる。特に食品、化成品、飼料分野では甘味料、甘味改善剤、保湿剤としての用途が期待される。さらに医薬の分野で利用可能なグリセロ糖脂質合成のための基質となりうる。グリセロ糖脂質は、動植物から微生物に至るまで広く分布しており、グリセロ糖脂質の生理的役割を解明することは、医薬への応用につながるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準物質及びβ−  ガラクトシダ−ゼを作用させた溶液をＨＰＬＣで分析した図。図１（ａ）〜（ｄ）は標準物質であるガラクト−ス、グルコ−ス、ラクト−ス、グリセロ−ルのクロマトグラムである。（ｅ）〜（ｇ）はβ−ガラクトシダ−ゼを併用させた溶液の０時間、２時間、６時間後のクロマトグラムである。
【図２】ピ−クＡを酸加水分解し、その構成糖の種類と構成比をＨＰＬＣで分析した図。図２（ａ）はピ−クＡの反応前のサンプルであり、（ｂ）はピ−クＡの反応後のサンプルである。（ｃ）はコントロ−ルとして、グリセロ−ル：ガラクト−ス＝１：１（  各１０ｍＭ）  を同様に分析した。
【図３】グリセロ−ル１０％（Ｗ／Ｖ）  、ラクト−ス１〜１０％（Ｗ／Ｖ）  の水溶液に、パン酵母とβ−ガラクトシダ−ゼを併用して作用させた反応液をＨＰＬＣで分析し、生成されたピ−クＡ（ガラクトシルグリセロ−ル）を時間毎にプロットした図。
【図１】
0003630378.tif 000004
【図２】
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【図３】
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