(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する１５アミノ酸未満の単離されたペプチドであって、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３、４、１１、１４および２２；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３、４、１１、１４および２２のアミノ酸配列中、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列であって、前記置換が以下の特徴の一方または両方である；；
（１）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそうであるように改変されている、ならびに
（２）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそうであるように改変されている。
【請求項２】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３、４、１１、１４および２２；ならびに
（ｂ）ＣＴＬ誘導能を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３、４、１１、１４および２２のアミノ酸配列中、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列であって、前記置換が以下の特徴の一方または両方である；
（１）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそうであるように改変されている、ならびに
（２）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそうであるように改変されている。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３、４、１１、１４および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、および／または請求項４記載のポリヌクレオチドを用いることによって、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞をインビトロで誘導するための方法。
【請求項６】
以下の段階の一方または両方を含む、請求項５記載の方法：
（ａ）抗原提示細胞を、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）請求項４記載のポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入する段階。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する、単離された抗原提示細胞。
【請求項８】
請求項５または６記載の方法によって誘導される、請求項７記載の抗原提示細胞。
【請求項９】
以下を用いることによって、ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド；
（ｂ）請求項４記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／もしくはエキソソーム；
（ｄ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）それらの組み合わせ。
【請求項１０】
以下からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含む、請求項９記載の方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
（ｂ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
【請求項１１】
ＣＴＬを誘導するための作用物質であって、以下からなる群より選択される有効成分を含む作用物質：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド；
（ｂ）請求項４記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；ならびに
（ｄ）それらの組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１〜３記載のペプチドのいずれか一つを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１３】
請求項９または１０記載の方法を用いることによって誘導される、単離されたＣＴＬ。
【請求項１４】
（ｉ）がんの治療；
（ｉｉ）がんの予防；
（ｉｉｉ）がんの術後再発の予防；および
（ｉｖ）それらの組み合わせ、
からなる群より選択される目的のために製剤化され、薬理学的に許容される担体と組み合わされた、以下からなる群より選択される有効成分：
（ａ）少なくとも１つの、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド；
（ｂ）少なくとも１つの、請求項４記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）少なくとも１つの、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
（ｄ）請求項１２または１３記載のＣＴＬ；ならびに
（ｅ）それらの組み合わせ、
を含む、薬学的作用物質。
【請求項１５】
以下を含む、がんに対する免疫誘導剤：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド；
（ｂ）請求項４記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／もしくはエキソソーム；
（ｄ）請求項１２もしくは１３記載のＣＴＬ；または
（ｅ）それらの組み合わせ。
【請求項１６】
対象において抗腫瘍免疫を誘導するためのワクチンであって、以下からなる群より選択される有効成分を含むワクチン：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド；
（ｂ）請求項４記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
（ｄ）請求項１２もしくは１３記載のＣＴＬ；ならびに
（ｅ）それらの組み合わせ。
【請求項１７】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象に対する投与のために製剤化される、請求項１４記載の薬学的作用物質、請求項１５記載の免疫誘導剤または請求項１６記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０７４,０６２号、および２００８年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／１９７,５９９号、の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関連する。特に本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80（非特許文献１）;Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9（非特許文献２）)。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床的適用が保証される（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55（非特許文献３）;Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42（非特許文献４）;Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9（非特許文献５）;van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14（非特許文献６）;Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8（非特許文献７）;Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72（非特許文献８）;Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66（非特許文献９）;Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94（非特許文献１０））。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察されていない（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80（非特許文献１１）;Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42（非特許文献１２）;Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15（非特許文献１３））。
【０００５】
がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡは、免疫療法の標的として優れている。というのも、そのようなＴＡＡを用いることで、治療によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳説されているリスクを、最小限に抑えられ得るためである。
【０００６】
ＣＤＣＡ１、すなわち細胞分裂周期関連物1（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ 1）は、ＣＤＣ２、サイクリン、トポイソメラーゼＩＩおよび他のものといった細胞周期遺伝子と共発現される遺伝子クラスのメンバーとして同定された（Walker et al., Curr Cancer Drug Targets 2001 May;1(1):73-83（非特許文献１４））。ＣＤＣＡ１は特に、有糸分裂中のＨｅＬａ細胞の動原体に付随することが見いだされており、このため、酵母Ｎｕｆ２の機能的相同体と考えられている（J Cell Biol 2001 Jan 22; 152(2):349-60（非特許文献１５））。
【０００７】
加えて、２３，０４０種の遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイル分析を通じて（Cancer Res 2006 Nov 1; 66(21):10339-48（非特許文献１６））、ＣＤＣＡ１は、乳癌（ＷＯ２００５／０２８６７６号（特許文献１））、膀胱癌（ＷＯ２００６／０８５６８４号（特許文献２））、食道癌（ＷＯ２００７／０１３６７１号（特許文献３））、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＷＯ２００７／０１３６６５号（特許文献４））および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ＷＯ２００５／０８９７３５号（特許文献５））において上方制御される新規分子としても同定されており、そのような開示の内容は参照により本明細書に組み入れられる。ＣＤＣＡ１の発現は特にＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣおよび腫瘍細胞株において上方制御されていたが、23種の正常組織では精巣を除いて発現が検出されなかった。さらに、ｓｉＲＮＡによるＣＤＣＡ１発現の下方制御は、ＣＤＣＡ１を発現する肺がん細胞株における細胞増殖抑制を引き起こした（ＷＯ２００５／０８９７３５号（特許文献５））。
【０００８】
以上を総合すると、このデータは、ＣＤＣＡ１が新規で普遍的ながん抗原の可能性があることを示唆する。このため、ＣＤＣＡ１に由来するエピトープペプチドを、多様ながんの治療のためのがん免疫治療薬として適用しうる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０２８６７６号
【特許文献２】ＷＯ２００６／０８５６８４号
【特許文献３】ＷＯ２００７／０１３６７１号
【特許文献４】ＷＯ２００７／０１３６６５号
【特許文献５】ＷＯ２００５／０８９７３５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Walker et al., Curr Cancer Drug Targets 2001 May;1(1):73-83
【非特許文献１５】J Cell Biol 2001 Jan 22; 152(2):349-60
【非特許文献１６】Cancer Res 2006 Nov 1; 66(21):10339-48
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、免疫療法の標的として役立ち得る適切なエピトープペプチドの発見に一部基づく。ＣＤＣＡ１が、乳癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、および食道癌を含む多くのがん型において上方制御されるという認識のもとに、本発明は、この細胞分裂周期関連物1（ＣＤＣＡ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_１４５６９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）をさらなる解析のための標的とする。特に、対応する分子に特異的なＣＴＬを誘導するエピトープペプチドを含むＣＤＣＡ１遺伝子産物を選択した。健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤＣＡ１由来のＨＬＡ−Ａ＊２４０２結合候補ペプチドを用いて刺激した。各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４陽性標的細胞を特異的に認識するＣＴＬを樹立し、ＣＤＣＡ１に対する強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドを同定した。これらの結果から、ＣＤＣＡ１は免疫原性が強く、かつそのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが実証される。
【００１２】
従って、本発明の一つの目的は、ＣＴＬ誘導能ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することである。本発明は、改変されたペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、挿入、欠失、または付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２または２３のアミノ酸配列を有する改変ペプチドを意図する。
【００１３】
対象に投与された場合、本ペプチドは抗原提示細胞の表面上またはエキソソームの表面上に提示され、その後各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。従って、本発明の一つの目的は、本ペプチドのいずれかを提示する抗原提示細胞およびエキソソーム、ならびに抗原提示細胞を誘導するための方法を提供することである。
【００１４】
本ＣＤＣＡ１ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣＤＣＡ１ポリペプチドを提示するエキソソームおよび抗原提示細胞の投与によって、抗腫瘍免疫応答が誘導される。従って、本発明の一つの目的は、本発明のポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを含むエキソソームおよび抗原提示細胞をその有効成分として含む薬学的作用物質を提供することである。本発明の薬学的作用物質は、ワクチンとして特に有用である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、本発明のＣＤＣＡ１ポリペプチド、ＣＤＣＡ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＣＤＣＡ１ポリペプチドを提示するエキソソームもしくは抗原提示細胞、または薬学的作用物質を投与する段階を含む、がん（腫瘍）の治療および／もしくは予防（prophylaxis）（すなわち、予防（preventing））、ならびに／または術後のその再発の予防のための方法、ならびにＣＴＬを誘導するための方法、抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供することである。加えて、本発明のＣＴＬも同様に、がんに対するワクチンとして使用される。本発明によって意図されるがんの例には、乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本明細書において本発明はいくつかの特定の態様を参照しながら説明されるが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に思い至ることができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになると考えられ、当業者には容易に明白であろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
[本発明1001]
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：35のアミノ酸配列またはその断片を含むペプチド。
[本発明1002]
ノナペプチドまたはデカペプチドである、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1003]
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1002の単離されたペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3、4、11、14、22および23；ならびに
（ｂ）1個、2個または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、または付加されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3、4、11、14、22および23。
[本発明1004]
以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1001〜1003の単離されたペプチド：
（ａ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそうであるように改変されている、ならびに
（ｂ）前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択されるか、またはそうであるように改変されている。
[本発明1005]
本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1006]
本発明1001〜1004のいずれかのペプチド、および／または本発明1005のポリヌクレオチドを用いることによって、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法。
[本発明1007]
以下の段階の一方または両方を含む、本発明1006の方法：
（ａ）抗原提示細胞を、本発明1001〜1004のいずれかのペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）本発明1005のポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入する段階。
[本発明1008]
本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する、単離された抗原提示細胞。
[本発明1009]
本発明1006または1007の方法によって誘導される、本発明1008の抗原提示細胞。
[本発明1010]
以下を用いることによって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチド；
（ｂ）本発明1005のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／もしくはエキソソーム；
（ｄ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）それらの組み合わせ。
[本発明1011]
以下からなる群より選択される少なくとも1つの段階を含む、本発明1010の方法：
（ａ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
（ｂ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ8陽性Ｔ細胞に導入する段階。
[本発明1012]
ＣＴＬを誘導するための作用物質であって、以下からなる群より選択される有効成分を含む作用物質：
（ａ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチド；
（ｂ）本発明1005のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；ならびに
（ｄ）それらの組み合わせ。
[本発明1013]
本発明1001〜1004のペプチドのいずれか一つを標的とする、単離されたＣＴＬ。
[本発明1014]
本発明1010または1011の方法を用いることによって誘導される、単離されたＣＴＬ。
[本発明1015]
（ｉ）がんの治療；
（ｉｉ）がんの予防；
（ｉｉｉ）がんの術後再発の予防；および
（ｉｖ）それらの組み合わせ、
からなる群より選択される目的のために製剤化され、薬理学的に許容される担体と組み合わされた、以下からなる群より選択される有効成分：
（ａ）少なくとも1つの、本発明1001〜1004のいずれかのペプチド；
（ｂ）少なくとも1つの、本発明1005のポリヌクレオチド；
（ｃ）少なくとも1つの、本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
（ｄ）本発明1013または1014のＣＴＬ；ならびに
（ｅ）それらの組み合わせ、
を含む、薬学的作用物質。
[本発明1016]
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、以下を該対象に投与する段階を含む方法：
（ａ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチド；
（ｂ）本発明1005のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／もしくはエキソソーム；
（ｄ）本発明1013もしくは1014のＣＴＬ；または
（ｅ）それらの組み合わせ。
[本発明1017]
対象において抗腫瘍免疫を誘導するためのワクチンであって、以下からなる群より選択される有効成分を含むワクチン：
（ａ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチド；
（ｂ）本発明1005のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明1001〜1004のいずれかのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
（ｄ）本発明1013または1014のＣＴＬ；ならびに
（ｅ）それらの組み合わせ。
[本発明1018]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24である対象に対する投与のために製剤化される、本発明1015の薬学的作用物質または本発明1017のワクチン。
[本発明1019]
対象のＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24である、本発明1016の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【００１８】
【図１】図１は、ＣＤＣＡ１由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真、（ａ）〜（ｇ）から構成される。ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃８（ａ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）で刺激したウェル番号＃１（ｂ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）で刺激したウェル番号＃１（ｃ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で刺激したウェル番号＃４（ｄ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で刺激したウェル番号＃２（ｅ）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）で刺激したウェル番号＃２（ｆ）中のＣＴＬはそれぞれ、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。対照的に、ペプチドパルスした標的細胞に対して、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で刺激したＣＴＬでは、特異的なＩＦＮ−γ産生は検出されなかった（ｇ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２】図２は、上記のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ａ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（ｂ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）（ｃ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）（ｄ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）（ｅ）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）（ｆ）を用いて樹立されたＣＴＬ株におけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ、（ａ）〜（ｇ）から構成される。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。対照的に、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）により樹立されたＣＴＬ株では、ペプチドパルスした標的細胞に対する特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｇ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で刺激したＣＴＬ株から限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフである。この結果は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことを実証している。図中、「＋」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３でパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示しており、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】図４は、ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）により樹立されたＣＴＬクローンは、ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する高い特異的ＣＴＬ活性を示した(◆）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（△）またはＣＤＣＡ１（○）のいずれかを発現する標的細胞に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は、慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。
【００２０】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先の発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
【００２１】
Ｉ．定義
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている用語と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
【００２２】
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に具体的に指示がない限り「少なくとも１つ」を意味する。
【００２３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。
【００２４】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００２５】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００２６】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特記しない限り一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
【００２７】
特記しない限り、「がん」という用語は、例えば乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、ＣＤＣＡ１遺伝子を過剰発現しているがんを指す。
【００２８】
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、具体的に指示されている場合を除き、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識してそのような細胞の死滅を誘導することのできる、Ｔリンパ球のサブグループのことを指す。
【００２９】
ＩＩ．ペプチド
ＣＤＣＡ１由来のペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原として機能することを実証するために、ＣＤＣＡ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）由来のペプチドを解析して、それらが、通常ＨＬＡ対立遺伝子に見られるＨＬＡ−Ａ２４によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＣＤＣＡ１由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬをうまく樹立した：
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、および
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）。
【００３０】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、ＣＤＣＡ１がＣＴＬによって認識される抗原であること、および前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４によって拘束されるＣＤＣＡ１のエピトープペプチドであることが実証される。
【００３１】
ＣＤＣＡ１遺伝子は、例えば乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含むほとんどのがん組織で過剰発現しているため、これは免疫療法のための優れた標的となる。従って本発明は、ＣＴＬに認識されるＣＤＣＡ１のエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。
【００３２】
一般的に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているソフトウェアプログラムなどを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75;およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190、およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。従って本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定された、ＨＬＡ抗原と結合することが明らかなＣＤＣＡ１のペプチドを包含する。
【００３３】
本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、ペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、任意で付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドは、典型的には約４０アミノ酸未満であり、約２０アミノ酸未満である場合が多く、通常は約１５アミノ酸未満である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに隣接する特定のアミノ酸配列は、それが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。従って本発明は、ＣＴＬ誘導能、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドもまた提供する。
【００３４】
一般的に、あるタンパク質中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、欠失、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。従って、１つの態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能、ならびに１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中より選択されるアミノ酸配列の双方を有してよい。
【００３５】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。従って、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質と類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００３６】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＣＤＣＡ１の多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００３７】
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満または１〜５％である。
【００３８】
本発明の好ましいペプチドであるＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）の相同性解析から、これらのペプチドが任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが確認された。従って、免疫療法に用いた場合に、これらのペプチドが未知または望ましくない免疫応答を起こす可能性は有意に低くなっている。従って、これらのペプチドは、ＣＤＣＡ１に対する免疫を腫瘍患者において誘発するのに非常に有用であると予測される。
【００３９】
免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。従って、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913;Immunogenetics 1995, 41: 178;J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい場合がある。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３のアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴＣＲ認識の部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、ペプチド中のアミノ酸置換が元のものと同等であるかまたはより優れたものであり得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００４０】
本発明はまた、記載したペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１個〜２個のアミノ酸の付加を意図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。
【００４１】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内在性または外来のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。従って、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、第一に、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００４２】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、指標としての高い結合親和性の存在に従って選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００４３】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドを用いた刺激後にＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A＊0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、ＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００４４】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するものが、必ずしも高いＣＴＬ誘導能を有するわけではないことが見出された。しかしながら、同定および評価されたペプチドのうち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２、および２３の中から選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドまたはデカペプチドは、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。従って、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例証される。
【００４５】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。前記ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、例えば、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。
【００４６】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドに適合させることもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００４７】
本発明のペプチドは、ＨＬＡ抗原と組み合わされた複合体として、細胞（例えば、抗原提示細胞）またはエキソソームの表面上に提示され、その後ＣＴＬを誘導する。従って、細胞またはエキソソームの表面上でＨＬＡ抗原と複合体を形成するペプチドもまた、本発明に含まれる。そのようなエキソソームは、例えば日本特許出願公表公報平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、ならびに治療および／または予防を受ける患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のペプチドを提示するエキソソームまたは細胞を、ワクチンとして接種することができる。
【００４８】
上記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４、特にＨＬＡ−Ａ２４０２が広く一般的であり、従って日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現しているＡ２４型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ２４０２などの亜型もまた使用される。典型的に、臨床においては、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型をあらかじめ調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。
【００４９】
エキソソームまたは細胞に対してＡ２４型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２および２３の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを用いることが好ましい。
【００５０】
本明細書において、本発明のペプチドは「ＣＤＣＡ１ペプチド」または「ＣＤＣＡ１ポリペプチド」と記載することもできる。
【００５１】
ＩＩＩ．ＣＤＣＡ１ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離すること、すなわち他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他の任意の化学物質を実質的に含まないように、精製することができる。
【００５２】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1975；
（ｉｖ）Basics and Experiment of Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1985；
（ｖ）Development of Pharmaceuticals (second volume) （日本語）, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００５３】
あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を適合させて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００５４】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然のＣＤＣＡ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_１４５６９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能性のあるあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。従って、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００５７】
組換え技法および化学合成技法の両方を用いて、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311;Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００５８】
Ｖ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。本発明のペプチドを接触させることによって、または本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを発現可能な形態で導入することによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防を受ける患者に由来してよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００５９】
前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００６０】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによってＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」という語句は、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を細胞表面上に提示させることを含む。あるいは、ＡＰＣが本発明のペプチドを提示できるように該ペプチドをＡＰＣに導入した後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣとペプチドを接触させる段階；および
ｃ：前記ペプチドを負荷したＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００６１】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明に従って、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化するための段階を含む方法である、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階（ｂ）によって得られたＡＰＣを、ワクチンとして対象に投与することができる。
【００６２】
本発明の１つの局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、当分野において従来より実施される様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などを用いることができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7;J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによって処理されて、提示経路を経てペプチドが提示される。
【００６３】
ＶＩ．細胞傷害性Ｔ細胞
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させるため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。従って本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかよって特異的に誘導または活性化された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。
【００６４】
そのような細胞傷害性Ｔ細胞は、（１）本発明のペプチドを対象に投与して、細胞傷害性Ｔ細胞を対象から収集すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、続いて細胞傷害性Ｔ細胞を単離することによって、得ることができる。
【００６５】
本発明のペプチドを提示するＡＰＣの刺激によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、治療および／または予防を受ける患者に由来してよく、かつ、単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＣＤＣＡ１を内因的に発現する細胞、またはＣＤＣＡ１遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ、本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００６６】
ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＣＤＣＡ１を提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。ＴＣＲ誘導体は、ＣＤＣＡ１ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＣＤＣＡ１ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
【００６７】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする、既製の組成物を提供する。
【００６８】
また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４との関連で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２、および２３のＣＤＣＡ１ペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＴ細胞は、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００６９】
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管新生を減少させること、を目的とした広範囲の予防的治療を含む。
【００７０】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療を構成し、および／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患を含む。
【００７１】
ＶＩＩＩ．薬学的な作用物質または組成物
ＣＤＣＡ１の発現は、正常組織と比較して、乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含むいくつかの種類のがんで特異的に増大しているため（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６  Ｎｏｖ  １；６６（２１）：１０３３９−４８、ＷＯ２００５／０２８６７６号、ＷＯ２００５／０８９７３５号、ＷＯ２００６／０８５６８４号、ＷＯ２００７／０１３６６５号、ＷＯ２００７／０１３６７１号）、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんもしくは腫瘍の、治療および／もしくは予防のために、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。従って本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、がんもしくは腫瘍の、治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な作用物質または組成物を提供する。あるいは、薬学的な作用物質または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述の細胞傷害性Ｔ細胞もまた、本発明の薬学的な作用物質または組成物の有効成分として用いることができる。
【００７２】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または作用物質の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドをその表面に提示するAPCまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００７３】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドをその表面に提示するAPCまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００７４】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または作用物質を製造するための方法または工程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドをその表面に提示するAPCまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００７５】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または作用物質を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドをその表面に提示するAPCまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００７６】
あるいは、本発明の薬学的な組成物または作用物質は、がんまたは腫瘍の予防、および術後のその再発の予防のいずれかまたは双方に用いることができる。
【００７７】
本発明の薬学的な作用物質または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００７８】
本発明の薬学的な作用物質または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんまたは腫瘍を、治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【００７９】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２、および２３の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが判明した。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、１１、１４、２２、および２３のアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な作用物質は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的な作用物質または組成物にも当てはまる。
【００８０】
本発明の薬学的な作用物質または組成物によって治療されるがんまたは腫瘍は限定されず、例えば乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、ＣＤＣＡ１が関与するすべての種類のがんまたは腫瘍を含む。
【００８１】
本薬学的な作用物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例証されるが、これに限定されない。
【００８２】
必要に応じて、本発明の薬学的な作用物質または組成物は、例えば本発明のペプチドのいずれかといった有効成分の抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な作用物質と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な作用物質の量は、例えば、使用される薬理学的な作用物質の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
【００８３】
本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な作用物質または組成物は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野における従来の他の作用物質も含み得ることが理解されるべきである。
【００８４】
本発明の１つの態様において、本薬学的な作用物質または組成物を、例えばがんのような治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本薬学的な作用物質または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、作用物質が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【００８５】
上記の容器に加えて、本発明の薬学的な作用物質または組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および使用者の立場から見て望ましい他の材料をさらに含み得る。
【００８６】
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的作用物質または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付され得る。
【００８７】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な作用物質または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な作用物質もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な作用物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な作用物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００８８】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種またはそれ以上から構成される組み合わせで調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いにコンジュゲートしてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。
【００８９】
本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象に由来するＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を本発明のペプチドにより刺激することによって得ることのできる、本発明のペプチドのいずれかをその細胞表面に提示するＡＰＣを対象に投与し、結果として、対象においてＣＴＬを誘導させ、がん細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【００９０】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な作用物質または組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な作用物質または組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒内への製剤化によって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００９２】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な作用物質または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る作用物質として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【００９３】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日から数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。
【００９４】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な作用物質または組成物
本発明の薬学的な作用物質または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５,５８０,８５９号；第５,５８９,４６６号；第５,８０４,５６６号；第５,７３９,１１８号；第５,７３６,５２４号；第５,６７９,６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５,９２２,６８７号を参照されたい）。
【００９５】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４,７２２,８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかであろう。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71;Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００９６】
ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよいし（この場合、ポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露する）、または間接的であってもよい（この場合、まずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する）。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【００９７】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95;Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96;Mulligan, Science 1993, 260: 926-32;Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993;およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【００９８】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。
【００９９】
ＩＸ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、任意の他の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。従って、前述の本発明の薬学的作用物質または組成物のいずれかをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを、以下に議論されるように、ＡＰＣを誘導するために用いることもできる。
【０１００】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、ＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上記したように行うことができる。本発明はまた、高レベルのＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、その誘導もまた上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の項目で言及されている。
【０１０１】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを用いた、ＣＴＬを誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導するための方法も提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
ｂ：本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
【０１０２】
本発明のペプチドを対象に投与した場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。あるいは、対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核白血球を、インビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、ＣＴＬを誘導した後、活性化したＣＴＬ細胞を該対象に戻すエクスビボ治療法に、前記ペプチドおよび前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣと前記ペプチドを接触させる段階；
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８＋ Ｔ細胞と混合し、ＣＴＬを誘導するために共培養する段階；および
ｄ：段階ｃの共培養物からＣＤ８＋ Ｔ細胞を回収する段階。
【０１０３】
あるいは、本発明に従って、ＣＴＬを誘導する薬学的作用物質または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化するための段階を含む方法である、ＣＴＬを誘導する薬学的作用物質または組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための本発明のペプチドを提供する。
【０１０４】
段階ｄによって得られた細胞傷害活性を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ワクチンとして前記対象に投与することができる。上記の段階ｃにおいてＣＤ８＋ Ｔ細胞と混合するＡＰＣは、上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で詳述されているように、本ペプチドをコードする遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、これに限定されない。従って、本発明のペプチドをＴ細胞に対して効果的に提示する任意のＡＰＣまたはエキソソームを、本発明の方法に用いることができる。
【０１０５】
以下の実施例は、本発明を例証し、当業者がそれを作製および使用するのを補助するために提供される。実施例は、いかなる形であれ他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０６】
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＢリンパ球をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによって、Ａ２４リンパ芽球様細胞株（Ａ２４ＬＣＬ）細胞を樹立した。
【０１０７】
ＣＤＣＡ１由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に結合するＣＤＣＡ１由来の９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒのペプチドを、Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)およびKuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)によってアルゴリズムが記載されている結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１０８】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１０００ Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮した集団を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、３７℃にて、３ ｍｃｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０ ｍｃｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で不活化し（３０ ｍｃｇ／ｍｌで３０分間）、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し；各ウェルは、０．５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋ Ｔ細胞、および１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１０９】
ＣＴＬ増殖手順
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＭＭＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１１０】
ＣＴＬクローンの樹立
９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において０．３、１、および３  ＣＴＬ／ウェルとなるように希釈系列を作製した。５％ＡＳを含む総量１５０  ｍｃｌ／ウェルのＡＩＭ−Ｖ培地において、１  ×１０４  細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５  Ｕ／ｍｌのＩＬ−２  と共にＣＴＬを培養した。１０日後に、ＩＬ−２の最終濃度が１２５  Ｕ／ｍｌに到達するように、培地に５０  ｍｃｌ／ウェルのＩＬ−２を加えた。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記に説明されるものと同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１１１】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造元の手順に従って行った。
【０１１２】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４のいずれかまたは両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ２４のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲにより増幅した産物をｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。製造者の推奨手順に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４のヌル細胞株であるＣＯＳ７に、前記プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４細胞／ウェル）として用いた。
【０１１３】
結果
ＣＤＣＡ１由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表１は、ＣＤＣＡ１のＨＬＡ−Ａ＊２４０２結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計４０種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために試験した。
【０１１４】
（表１）ＣＤＣＡ１由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド
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開始位置は、ＣＤＣＡ１のＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０１１５】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性のＣＤＣＡ１由来の予測されたペプチドを用いたＣＴＬの誘導、およびＣＤＣＡ１由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
ＣＤＣＡ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ペプチド特異的なＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した（図１ａ〜ｆ）。それにより、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが明らかとなった。さらに、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）で刺激した陽性ウェル番号＃８中の細胞、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）による＃１、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）による＃１、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）による＃４、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）による＃２、およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）による＃２中の細胞を増殖して、ＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｆ）。これにより、すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが明らかとなった。一方、他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドを用いた刺激によってＣＴＬ株は樹立され得なかった。例えば、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激したＣＴＬ応答の典型的なネガティブデータを、図１ｇおよび図２ｇに示した。本明細書における結果から、ＣＤＣＡ１由来の６つのペプチドが、強力なＣＴＬ株を誘導する能力を有することが示される。
【０１１６】
ＣＤＣＡ１特異的ペプチドに対するＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載されたようにＣＴＬ株から限界希釈によってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。図３において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が明らかになった。
【０１１７】
ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して誘導された樹立ＣＴＬ株を、ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を外因的に発現する標的細胞を認識する能力について検討した。完全長のＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子の遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を外因的に発現する標的細胞の具体的なモデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって誘導されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。完全長のＣＤＣＡ１遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、対照として調製した。図４において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で刺激したＣＴＬは、ＣＤＣＡ１およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対する強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。従って、これらのデータは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するペプチドが、標的細胞上にＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子とともに自然に提示されて、ＣＴＬによって認識されることを明らかに実証している。この結果は、ＣＤＣＡ１に由来するこのペプチドを、がん免疫療法に、特にＣＤＣＡ１を発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンとして、適用しうることを示すものである。
【０１１８】
抗原ペプチドの相同性解析
ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）で刺激したＣＴＬは、顕著かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−１１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−３３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−１０−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４−９−５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）の配列は固有のものであり、従って、これらの分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどないことが示された。
【０１１９】
結論として、ＣＤＣＡ１由来の新規なＨＬＡ−Ａ２４エピトープペプチドが同定され、がん免疫療法に適用可能であることが実証された。
【０１２０】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、幅広いがんのタイプに対する適用性を有する、ＣＤＣＡ１由来の新規ＴＡＡについて記載する。このようなＴＡＡは、ＣＤＣＡ１に関連した疾患、例えばがん、より詳細には精巣腫瘍、膵癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、および食道癌に対するペプチドワクチンとしてのさらなる発展を保証する。
【０１２１】
本発明はその特定の態様に関して本明細書において詳細に記載されるが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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