(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドと、メチレンビスアクリルアミドにより合成される、血液と接触する環境下で使用される医療用具用ゲル材料であって、
前記ゲル材料を合成する際の、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドに対するメチレンビスアクリルアミドの比が、３〜５モル％である、医療用具用ゲル材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテーテルや人工血管といった、血液と接触する環境下に配される医療用具で使用可能な、低摩擦性・抗血栓性ゲル材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、血液と接触する環境下に配される医療用具は多種に亘る。例えば、カテーテル（ｃａｔｈｅｔｅｒ）は、血管から挿入して心臓や脳に到達させて血管造影剤の注入や血栓の除去等を目的として使用される医療用具である。
【０００３】
このような血液と接触する環境に配される医療用具に関しては、二点の重要な問題が存する。一点目が、例えば前述のカテーテルのように血管中に導入する使用態様に係る医療用具に関しての、当該医療用具と血管壁の摩擦による血管の破損である。このように、当該医療用具と血管内皮細胞との摩擦挙動は、当該分野において重要な問題となる。
【０００４】
二点目が、当該医療用具と血液の適合性である。血液適合性が低い医療用具に血液が接触した場合、血小板が活性化され、血液凝固が誘発され、更には血栓を形成するおそれがあることは周知である。このように、医療用具の血液適合性も、上記の摩擦挙動に加え重要な問題となる。
【０００５】
ここで、このような医療用具材料としては、古くは、例えばカテーテルに関しては、基材の高分子材料表面に所定ポリマーをグラフト結合させる手法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、このようなグラフト結合させる場合、グラフト鎖が非常に短いため、実際に使用したときには、グラフト鎖が本来奏する作用（低摩擦性・抗血栓性）を十分に発揮できないことに加え、当該グラフト鎖が内皮細胞と前記基材との間に介在しているものの、当該グラフト鎖はその厚さゆえ緩衝材としての機能を殆ど奏さない結果、柔らかい内皮細胞を堅い基材が傷つけてしまうという問題も危惧されている。
【０００６】
そこで、最近は、このようなグラフト結合させる手法とは異なる手法として、ハイドロゲルを医療用具材料として使用することが提案されている（特許文献２〜７）。例えば、低摩擦性に関しては、当該ハイドロゲル層が潤滑層となり摩擦を低減させることが記載されている。更に、血液適合性の問題に関しては、古くは、抗血栓性薬剤をハイドロゲル層中に保持させる等の手法が提案されていたが、最近は、ノニオン系の非生体由来材料それ自体が抗血栓性を有していることが報告されている。
【０００７】
また、発明者等は、高分子ハイドロゲルが、他の固体物質と比較して表面摩擦係数が極めて低いことを明らかにしている（非特許文献１〜１２）。
【特許文献１】特開昭６０−２２７７６３号公報
【特許文献２】特開２００５−３３４２１６
【特許文献３】特開２００４−３０５７６８
【特許文献４】特開平７−３２８１２４号公報
【特許文献５】特開平８−１９５９９号公報
【特許文献６】特開平８−２４３２７号公報
【特許文献７】特開平８−２４３２８号公報
【非特許文献１】J. P. Gong, M. Higa, Y. Iwasaki, Y. Katsuyama and Y. Osada, J. Phys. Chem. B, 1997, 101, 5487.
【非特許文献２】J. P. Gong and Y.Osada, J.Chem. Phys., 1998, 109,8062.
【非特許文献３】J. P. Gong, Y.Iwasaki, Y. Osada, K. Kurihara and Y. Hamai, J. Phys. Chem. B, 1999, 103, 6001.
【非特許文献４】J. P. Gong, G. Kagataand Y. Osada, J. Phys. Chem. B, 1999, 103, 6007.
【非特許文献５】J. P. Gong, Y.Iwasaki and Y. Osada, J. Phys. Chem. B, 2000, 104, 3423.
【非特許文献６】J. P. Gong, T.Kurokawa, T. Narita, K. Kagata, Y. Osada, G. Nishimura and M. Kinjo, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 5582.
【非特許文献７】G. Kagata, J. P. Gongand Y. Osada, J. Phys. Chem. B, 2002, 106, 4596.
【非特許文献８】G. Kagata, J. P. Gongand Y. Osada, J. Phys. Chem. B, 2003, 107, 10221.
【非特許文献９】T. Kurokawa, J. P.Gong and Y. Osada, Macromolecules, 2002, 35, 8161.
【非特許文献１０】Y. Ohsedo, R.Takashina, J. P. Gong and Y. Osada, Langmiur, 2004, 20, 6549.
【非特許文献１１】D. Kaneko, T. Tada,T. Kurokawa, J. P. Gong and Y. Osada, Adv, Mater., 2004, 17, 535.
【非特許文献１２】T. Kurokawa, T. Tominaga, Y. Kat s u yama , R. Kuwabara, H. Furukawa,Y. Osada and J. P. Gong, Langmiur, 2005, 21, 8643.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、血液と接触する環境下に配される医療用具において、ハイドロゲルを使用すること、そして、当該ハイドロゲルの材料としてノニオン系非生体材料を使用すること、が既に提案されている。
【０００９】
ここで、例えば、特許文献２〜７では、いずれもジメチルアクリルアミドとグリシジルメタクリレートとの共重合体からなるハイドロゲルが提案されている。しかしながら、当該ハイドロゲルは、血管内皮細胞との、いわゆるズリ応力が高いという問題を抱えている。一般に、血液が血管を流れる際、血液と血管との間にはズリ応力が生じるが、当該ズリ応力は数Ｐａ程度といわれている。ここで、血液と接触する環境下に配される医療用具が血管と接触する部位に適用される材料として、当該ズリ応力が前記血液と血管間のズリ応力と同等であることが、血管へのダメージを低減できるという観点から好ましいことである。
【００１０】
そこで、本発明は、血管へのダメージを顕著に低減可能な低摩擦性を有する、抗血栓性の医療用具用材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意研究の結果、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを基材としつつ、所定の架橋剤を使用することにより、血管へのダメージを顕著に低減可能な低摩擦性ゲルとなることを見出し、以下の発明（１）を完成させたものである。
【００１２】
本発明（１）は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドと、メチレンビスアクリルアミドにより合成される、血液と接触する環境下で使用される医療用具用ゲル材料であって、前記ゲル材料を合成する際の、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドに対するメチレンビスアクリルアミドの比が、３〜５モル％である、医療用具用ゲル材料である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
＜＜ゲル材料の構成＞＞
本発明に係る医療用具用材料は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドと、少なくとも二つ以上のエチレン性不飽和結合を有する架橋剤により構成されるゲルである。ここで、当該ゲルは、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（以下、「ＤＭＡＡｍ」という）が、主成分として含まれるゲルであれば特に限定されず、例えば、ＤＭＡＡｍと、架橋剤となる二以上のエチレン性不飽和結合を有する化合物の混合物を重合することにより合成される。ここで、主成分とは、ゲルを構成するモノマーの中で、好適には９０ｍｏｌ％以上、より好適には９１ｍｏｌ％以上、更に好適には９５％含有されている成分モノマーを指す。また、ＤＭＡＡｍが主成分である限り、どのようなモノマー成分を用いてもよく、例えば、他のノニオン系モノマー、例えば、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートを挙げることができる。ここで、「アルコキシ」や「アルキル」の炭素数は、例えば１〜４である。
【００１６】
少なくとも二以上のエチレン性不飽和結合を有する架橋剤とは、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドと重合した場合に、得られる高分子が網目構造を構築するものであれば特に限定されないが、例えば、ビスアクリルアミド、多官能性アクリレート、少なくとも二つの末端ＣＨ２基を含む多官能性ビニリデンモノマーである。具体的には、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）、トリメチロールプロパントリアクリレート、ブタジエン、イソプレン、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アリルアクリレート等が挙げられる。中でも、ビスアクリルアミドのような、親水性架橋剤（特に好適には二個のビニル基を有する親水性架橋剤）が好適である。また、酸性環境下で使用する場合には、酸性下でも結合状態が安定である、ジビニルベンゼンのような疎水性架橋剤が好適である。ここで、本明細書にいう「親水性」とは、２５℃の水１００ｍｌへの溶解量が０．１ｇ以上であるものを指し、「疎水性」とは、２５℃の水１００ｍｌへの溶解量が０．１ｇ未満であるものを指す。
【００１７】
本発明に係るＰＤＭＡＡｍゲルの架橋密度は、１〜１０ｍｏｌ％が好適であり、２〜９ｍｏｌ％がより好適であり、３〜５ｍｏｌ％が更に好適である。ここで、本明細書にいう「架橋密度」とは、モノマーの仕込みモル濃度に対する架橋剤のモル濃度の比をパーセントで表した値をいう。尚、実際には、重合に関与しなかったモノマーや架橋に関与しなかった架橋剤も僅かにある場合もあるが、この際も、本明細書におけるゲルの架橋密度は、前記の通りとする。
【００１８】
尚、血液と接触する環境下に配される医療用具として、血液貯存パック等の用途で用いる際は、高強度等の観点から、ＰＤＭＡＡｍ単独ゲルの形態ではなく、ＰＡＭＰＳページ : 5／ＰＤＭＡＡｍ  ＤＮゲル等の多重ネットワークゲル（例えばダブルネットゲル）の形態としてもよい。
【００１９】
《ゲル材料の物性》
摩擦力
血管内皮細胞とゲルの摩擦力（ずり応力）は、滑り速度１０−４ｍ／ｓの条件において、１５Ｐａ以下が好適であり、１０Ｐａ以下がより好適であり、４Ｐａ以下が更に好適であり、血管内を通過する血液と血管内壁の摩擦力に相当する２〜３Ｐａが最も好適である。ここで、摩擦力（ずり応力）とは、本明細書の「摩擦力測定」（段落番号００００）に示した方法で測定した摩擦力を指す。
【００２０】
血液適応性
血清及び血漿に含まれる血小板の吸着が、５０ｃｅｌｌ／１０４μｍ２以下であることが望ましい。
【００２１】
《ゲル材料が適用される医療用具の基材》
カテーテルの基材は特に限定されない。有機材料、複合材料であっても、超弾性合金のパイプや金属よりなるコイル状物、メッシュ状物等を含んだものであってもよい。ただし、基材表面には、有機高分子化合物が存在していることが好ましい。該高分子単体で成形加工された基材であってもかまわないし、ポリマーアロイを成形加工した基材表面であってもよい。有機高分子材料としては、ポリオレフィン、変性ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステルやそれらの共重合体等を例示できる。
【００２２】
＜＜ゲル材料の製造方法＞＞
重合方法
ゲルの重合方法は、特に限定されず、例えば、ラジカル重合操作によって行うことができる。このようなフリーラジカル重合として、光開始、放射線開始、熱開始、又は酸化還元開始による重合開始が挙げられうる。典型的開始剤として、ベンゾインエーテルやベンゾイルペルオキシド、２−オキソグルタル酸が挙げられる。
【００２３】
膨潤方法
前記重合方法により得られたゲルを一週間、大量の水で膨潤させた後に、更に緩衝生理食塩水にて、一週間、溶媒交換を行うことにより、試料を調製する。
【００２４】
＜＜医療用具上へのゲル材料の適用方法＞＞
医療用具上へのゲル材料の適用方法は、特に限定されず、周知手法により適用可能である。例えば、バルーンやカテーテルチューブの該表面にゲル化層を設ける方法は、グラフト法、架橋不溶化法、コーティング法、表面重合法等、材料の種類によって適宜選択することができる。例えば、グラフト法では、材料表面に重合開始点を形成させた後モノマーをグラフト重合してゲル化層を形成する方法や予め高分子を合成した後材料表面に結合させる方法等がある。また、高分子間の架橋反応を伴って材料表面に結合させる方法も、材料表面で重合と架橋を同時に行う方法や合成した高分子を架橋する方法等がある。ゲルの架橋度や強度は、投与する医薬品の分子量や電荷により、目的に応じて設定される。
【００２５】
《ゲル材料の用途》
本発明に係るゲル材料は、血液と接触する環境下に配される医療用具であれば特に限定されず、例えば、各種カテーテルやガイドワイヤー類、人工血管をはじめとする人工臓器を挙げることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例を参照しながら具体的に説明することとする。尚、以下の実施例において、例えば「Ｘｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍ」なる表示が存在するが、これはＤＭＡＡｍ１Ｍに対するＭＢＡＡのモル濃度の比がＸ％であることを意味する。
【００２７】
製造例
モノマー溶液を調製する。Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）１Ｍ、ＵＶ開始剤（２−オキソグルタル酸  ０．１ｍｏｌ％）、架橋剤｛Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡ）｝０．０４Ｍを蒸留水に溶解させ、窒素バブリングによって、ラジカル重合の妨げとなる溶存酸素の窒素置換を行った。続いて、得られたモノマー溶液を２枚のガラス基板の間に１．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟んだ鋳型に流し込み、室温でＵＶを６時間照射し、重合を行なった。これにより４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲルを得た。
【００２８】
製造例の製造方法に従い、以下に示すゲルを合成した。尚、これらゲルの化学構造を図１に示す。
・ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム)（ＰＮａＳＳ）：
架橋密度４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％
・ポリ（ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ)共重合ゲル：
ＦＮａＳＳ＝０．０５、０．１、０．５（すべて、架橋密度４ｍｏｌ％）
ここで、ＦＮａＳＳとは、仕込みモノマーのうちＮａＳＳが含まれるモル比率を表す値であり、すなわち、ＦＮａＳＳ＝ＮａＳＳ／（ＮａＳＳ＋ＤＭＡＡｍ)である。
【００２９】
ゲルの平衡膨潤
前記製造例において重合して得られたゲルを大量の蒸留水で一週間膨潤した後、ｐＨ７．４の４−(２−ヒドロキシエチル)−ピペラジンー１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＨＣＯ３  １．５５ｘ１０−２Ｍ，ＨＥＰＥＳ  ５ｘ１０−３Ｍ，ＮａＣｌ  ０．１４Ｍ）中でさらに一週間溶媒交換した。
【００３０】
＜＜ゲルと細胞の摩擦力測定試験＞＞
本実施例においては、擬似血管として、血管と同等の性質を有する、表面にグリコカリックス層を有する細胞シートを作成した。そして、当該細胞シートに対する円盤状のゲル試料の摩擦力を測定した。ここで、当該試験において、この細胞シートが実際の血管と同一視できる理由は以下の通りである。
【００３１】
毛細血管は数μｍという非常に細いサイズにもかかわらず、血球は詰まることなくスムーズに流れる。これは、血管壁が、一層の内皮細胞で覆われており、内皮細胞表面にはグリコカリックスという、マイナス電荷を有し、血管壁から血管内側に向かってブラシのように伸びている糖鎖の層が存在しているからである。そして、当該グリコカリックスは、血管内皮細胞と血管内部を通過する物質との摩擦低減に寄与するものである。
【００３２】
ゲルの試料調製
前記平行膨潤により得られたゲルを直径１５ｍｍの円盤形に調製した。
【００３３】
細胞シート
平衡膨潤した１０ｍｏｌ％ＰＮａＳＳ（直径１５ｍｍ、厚さ約３ｍ）をシャーレに移し、１２１℃、２０分でオートクレーブ後、直径１５ｍｍの円盤に切り出した。各基板上に４ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌのＨｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）の懸濁液を１ｍｌずつ加えた。細胞を乗せた基板を３７℃、５％ＣＯ2のインキュべータ内に入れて、細胞を培養した。細胞を位相差観微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  Ｊａｐａｎ）で観察した。
【００３４】
＜ゲル上で培養した細胞のｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（ＰＧｓ）の発現の調製法＞
ＰＧｓの合成を促進させる方法
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β  (ＴＧＦ−β)シグナルは、細胞増殖や分化、アポトーシス、遊走、細胞外マトリックスの産生と分解等を調節することが知られているサイトカイン（細胞の働きを調節する分泌性蛋白の一種）である。ＴＧＦ−β1が内皮細胞表皮ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（ＰＧｓ）の合成を促進させることが報告されている（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：２０００，２７５，１４６３  １４７０）。細胞培養液中にＴＧＦ−β1を加えて細胞表面ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（ＰＧｓ）の合成を促進させた（Ｋａｓｉｎａｔｈ  ＢＳ．  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ＥＣ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＧＦ−β１．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９９３；３０５：３７０−７．）。
【００３５】
ＰＧｓを分解させる方法
Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉ（へパリナーゼＩ）を用いてｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎを分解する。
【００３６】
摩擦力測定
１０ｍｏｌ％ＰＮａＳＳ上にコンフルエントまで培養した細胞シートと前記方法により調製した細胞シートと摩擦基板（ガラス、ゲル）は回転型レオメーターの平行平板にセットし、摩擦基板へ６０ｇの加重により、圧縮した。
培養した細胞シート表面に対し、一方向で回転する摩擦基板とのトルクを測定し、単位面積あたりの摩擦応力（ずり応力）に換算して、これを、「摩擦力」とした（摩擦速度：７．５x１０−６m／ｓ〜７．５ｘ１０−３ｍ／ｓ）。摩擦力測定は３７℃の無血清培地中で行なわれた。測定時間に伴って、大量の細胞（８０％以上）が残っており、且つ、摩擦力が一定値を示した時間における測定値を用いた。
【００３７】
例１〜９  細胞シートとガラス間の摩擦（グリコカリックスが摩擦に与える影響の評価）
図２は、未処理の細胞シート、ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで処理した細胞シート(グリコカリックスを分解させたもの）及びＴＧＦ−β１で処理した細胞シート（グリコカリックス含量を促進させたもの）とガラスに滑らせたときの細胞表面の摩擦カの速度依存性を示している。細胞表面のグリコカリックスを分解させたときでは、処理していない細胞表面のそれに比べて摩擦力の増大が見られる。細胞表面のグリコカリックスの含量を促進させたときでは、処理していない細胞表面に比べて摩擦力の減少が見られる。そして、処理していない細胞表面の摩擦力は滑り速度に依存しないのに対して、処理した細胞表面の摩擦力は滑り速度依存性が見られる。遅い滑り速度(７ｘ１０−６ｍ／ｓと１．２５ｘ１０−５ｍ／ｓ）ときの摩擦力の変化は速い滑り速度（７．５ｘ１０−５ｍ／ｓ)ときのそれに比べて顕著である。これらの結果から、内皮細胞表面のグリコカリックスが摩擦に関して重要な役割を果たしていることを明らかとなった。
【００３８】
例１０〜１８  細胞シートとゲル間の摩擦
図３は、未処理の細胞シート、ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで処理した細胞シート（グリコカリックスを分解させたもの）及びＴＧＦ−β１で処理した細胞シート（グリコカリックス含量を促進させたもの）と４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲルに滑らせたときの細胞表面の摩擦力の速度依存性を示している。Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで細胞表面のグリコカリックスを分解させたときでは、処理してない細胞表面のそれに比べて摩擦力の増大が見られた。ＴＧＦ−β１で細胞表面のグリコカリックスの含量を促進させたときでは、処理していない細胞表面のそれに比べて摩擦力の減少が見られた。細胞シートとガラス、４ｍｏｌ％  ＰＮａＳＳゲルと滑らせたとき、ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで細胞表面のＨＳＰＧｓを分解したとき、滑り速度の増加に伴ってその摩擦力の減少が見られた。つまり、摩擦力が滑り速度に対して負の依存性を示している。この場合、細胞が基板（ガラス、ＰＮａＳＳゲル）表面に吸着することが考えられる（吸着系）。ＴＧＦ−β１で細胞表面のＨＳＰＧｓの合成を促進したときは、滑り速度の増加に伴ってその摩擦力の増大が見られた。この場合、細胞と基板間に反発力が働くことが考えられる（反発系）。これらの摩擦力の滑り速度依存性の変化は、基板に対して細胞が吸着的相互作用から反発的相互作用に変化していることを示している。これらのことからグリコカリックスの量の調整によって、細胞表面に電荷変化が起こったと示唆された。ところで、細胞−ゲル間の摩擦は細胞−ガラス間の摩擦より大きい。これについてニつの理由が考えられる。ひとつはＰＮａＳＳゲルの電荷密度はガラスの電荷密度より小さい。もうひとつはゲルが粘弾性であり、その表面に存在する高分子鎖と細胞表面のグリコカリックスがつりあって、摩擦力は大きくなったのではないかと考えられる。
【００３９】
＜ゲルの電荷密度による摩擦力への影響＞
例１９〜３０  負の電荷密度による影響
図４に細胞シートと電荷密度が違うゲルとの摩擦力の滑り速度依存性を示している。ゲルの電荷密度はＰｏｌｙ（ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）共重合ゲル中ＮａＳＳのモル量（Ｆ）で調整し、それぞれ０．０５、０．１、０．５である。これらのゲルの弾性率はほぼおなじ値を示している。Ｆ＝０．５の場合、滑り速度は７．５ｘ１０−5m／ｓ、１．２５ｘ１０−５ｍ／ｓ、７．５ｘ１０−６ｍ／ｓのとき、摩擦力はそれぞれ２９２Ｐａ、２３８Ｐａ、６１７Ｐａである。これら値と細胞−ＰＮａＳＳゲル間の摩擦力に近い。ところで、摩擦基板はＦ＝０．１の場合、滑り連度は７．５ｘ１０−5m／ｓ、１．２５ｘ１０−５ｍ／ｓ、７．５ｘ１０−６ｍ／ｓのとき、摩擦力はそれぞれ２１Ｐａ、２８Ｐａ、４２Ｐａである。そして、F=０．０５ときの摩擦力とＦ＝０．１ときと近い値を示している。つまり、摩擦基板の電荷密度の減少に伴って、細胞摩擦力は約一桁下がることを示している。
【００４０】
例３１〜４８  電気的に中性のゲルを用いた場合
例１９〜３０の結果から、中性ゲルと滑らせたとき、細胞シート−ゲル間の摩擦はもっと減少すると予想される。これを証明するため、細胞シートＰＤＭＡＡｍ（４mol％、弾性率１５２．５ｋＰａ）ゲル間の摩擦測定を行った。図５に細胞シート−ＰＤＭＡＡｍゲル間の摩擦力の滑り速度依存性を示している。滑り速度は、７．５ｘ１０−5m／ｓ、１．２５ｘ１０−５ｍ／ｓ、７．５ｘ１０−４ｍ／ｓ、２．７３ｘ１０−４ｍ／ｓのとき、摩擦力はいずれの細胞に対しても約２〜４Ｐａである。このように摩擦力が低く、これらの滑り速度の範囲中に細胞シートの摩擦は２００ｓ〜１８００ｓ間に８０％以上の細胞は残ったため、長い時間にわたって細胞シートの摩擦測定ができた。そして、高い滑り速度での摩擦力の測定が実現した。滑り速度は７．５ｘ１０−３m／ｓ、７．５ｘ１０−２ｍ／ｓのとき、摩擦力は約９〜１４Ｐａである。これらの滑り速度範囲中に細胞シートの摩擦は５０ｓ〜１００ｓ間８０％以上の細胞は残った。以上の結果から細胞シートＰＤＭＡＡｍ間の摩擦力は血管中のせん断応力に近いことが分かった。
【００４１】
以上の結果から、ゲルの負の電荷密度の減少につれて細胞シートとゲルとの相互作用は吸着から斥力に推移することが分かった。つまり、負の電荷密度が低いほうが細胞と基板間の吸着が弱い。これは細胞表面に負と正の電荷を持つタンパク質を持つため、おそらくゲルと細胞表面のタンパク質との相互作用にかかわると考えられる。
【００４２】
図６に未処理の細胞シートと４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル、ｐｏｌｙ（ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）Ｆ＝０．５（ＰＮａＳＳの含有量は５０％）ゲル、４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル、ガラス間での摩擦挙動を示している。４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳや、ｐｏｌｙ（ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）（Ｆ＝０．５）ゲルは、ガラスよりも摩擦力が大きい。しかし、ＰＤＭＡＡｍゲルの摩擦力は、他のゲルよりも顕著に低い摩擦力を示す。
【００４３】
図７にＴＧＦ−β１で処理した細胞シート（細胞表面のグリコカリックスの含量を促進させた）と４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル、４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル、ガラス間での摩擦挙動を示す。この場合にも、ＰＤＭＡＡｍゲルは顕著に低い摩擦力を示す。
【００４４】
図８にＨｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで処理した細胞シート（細胞表面のグリコカリックスの含量を減少させた）と４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル、４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル、ガラス間での摩擦挙動を示している。この場合にも、ＰＤＭＡＡｍゲルは顕著に低い摩擦力を示す。
【００４５】
以上の結果から、細胞表面でのグリコカリックスの含量に関係なく、細胞シートと４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル間での摩擦は、４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル、Ｐｌｏｙ  (ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）Ｆ＝０．５（ＰＮａＳＳの含有量は５０％）ゲル、ガラスに比べ、１００倍小さいことが分かった。
【００４６】
例４９  正の電荷を持つゲルとの摩擦
細胞シート−中性ゲル間の摩擦は細胞シート−負の電荷を持つゲルより低いという結果を受けて、細胞シート−正の電荷を持つゲル間の摩擦確認試験を行った。正の電荷を持つゲルはＰＤＭＰＡＡ−Ｑ（１０ｍｏｌ％）用いた。その結果、細胞シート−ＰＤＭＰＡＡ−Ｑゲル問の摩擦は１０００Ｐａという高い値を示した。そして、摩擦測定後、ＰＤＭＰＡＡ−Ｑゲル表面に細胞シートと同じサイズの跡がみられた。これは細胞シートがＰＤＭＰＡＡ−Ｑゲルに吸着して残った跡と考えられる。このことから細胞シートは主に負の電荷を帯びていることが分かった。
【００４７】
＜＜血液適合性試験＞＞
先に記載した製造例の方法に従い、以下に示すゲルを合成し、更に平衡膨潤させた。各種ゲルの構造を図９に示した。
・ポリ（アクリル酸）：
（ＰＡＡ）架橋密度１mol%、２mol%
・ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）：
（ＰＮａＳＳ）架橋密度４mol%、１０mol%
・ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルー１ープロパンスルホン酸ナトリウム）：
（ＰＮａＡＭＰＳ）架橋密度 ２mol%、４mol%、１０mol%
【００４８】
ゲルの試料調製
前記の平衡膨潤したゲルをシャーレに移し、１２１℃、２０分でオートクレーブ後、直径１５ｍｍの円盤に切り出した。ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）とポリスチレン（ＰＳ）をコントロールとして用いた。直径１５ｍｍのＰＥＴとＰＳ基板を７５％のアルコールで滅菌した。減菌した基板を２４穴ＰＳディッシュに入れた。種々ゲルを無血清培地、血清培地中で平衡膨潤した。一種類基板につき、３〜４個を用いた。
【００４９】
血小板血漿の調製
ヒト肘静脈より３．８％クエン酸ナトリウム１／９容を加えて採血した血液を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、この上澄みを分離した（上澄みに血小板が含まれている）。血小板を活性化させないように静かに別の容器に移した。これをＰＲＰ（多血小板血漿）とした。残りの血液を３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを分離した。これをＰＰＰ（乏血小板血漿）とした。そして、ＰＲＰとＰＰＰを合わせて血小板血漿とした。
【００５０】
血液適合性試験の方法
ゲル基板に上記の血小板血漿を１５０ｍｌずつキャストし、３７℃で２時間インキュベートした。２時間後基板上の血小板血漿を軽く除去し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した。これを２．５％グルタルアルデヒド溶液に浸漬し、３７℃で２時間静置した。架橋後基板についているグルタルアルデヒド溶液を軽く拭き取った後、ＰＢＳ溶液１回、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５０％に希釈したＰＢＳ溶彼１回、続いてＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１回洗浄した。
【００５１】
ＳＥＭでの細胞観察
血小板がサイズ的に小さいため、光学顕微鏡で形を観察するのが難しい。そのため、ＳＥＭでの観察が必要になる。サンプルは凍結乾燥する前に２．５％グルタルアルデヒド溶液で細胞を固定した。サンプルを凍結乾燥機に入れて、凍結乾燥機の温度を−４０℃まで冷やして、−４０℃保ったまま５ｈ凍結乾燥し、次に−２５℃に保ったまま４ｈ凍結乾燥し、更に２５℃保ったまま４ｈ凍結乾燥した。当該方法で準備したＨＵＶＥＣがコンフルエントまで増殖したサンプルをＳＥＭで観察したところ、伸展した細胞が形を保ったまま観測された。
【００５２】
評価方法
各ゲルについて、倍率１０００倍で５視野撮影し、粘着している血小板を以下のように分類し，それぞれの個数をカウントする。
Ｉ型      球状を保っている正常血小板。
ＩＩ型      球状を保っているが、偽足を出している活性化された血小板。
ＩＩＩ型      完全に伸展している一番活性化された血小板。
【００５３】
コントロールサンプル
コントロールとしてＰＥＴとＰＳを用いた。ＰＥＴは血小板粘着実験のnegativeコントロールとしてよく用いられる基板である。ＰＳは細胞培養に広く使われている。
【００５４】
比較例１〜２  コントロールサンプルの血液適合性試験
図１０にコントロール基板上で吸着した血小板のＳＥＭ写真を示している。基板上吸着した血小板の数は図１７に示している。ＰＥＴ、ＰＳ上にそれぞれ２７ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２、３２０ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２血小板の吸着がみられた。ＰＳ上で吸着した血小板が直径２〜４μｍの正常の球状を示しているのに対して、ＰＥＴ上で吸着した血小板の活性化が認められた。ＰＥＴ上で吸着した血小板のうち約５３．９％が伸展、４３．１％が偽足の形に示し、僅か３％が正常の球状を示している。これらの値から、ＰＥＴ、ＰＳ基板上に大量の血小板の吸着し、ＰＥＴ基板上では血小板が活性化しやすいことが分かった。
【００５５】
例５０〜５１  ＰＤＭＡＡｍゲル
無血清培地と血清培地中で平衡膨潤した中性のＰＤＭＡＡｍゲル表面でははっきりとした網目が観察され、血清と血漿中含むタンパク質や血小板の吸着は認められなかった（図１１）。
【００５６】
例５２〜５５  ＰＡＡゲル
無血清培地と血清培地中で平衡膨潤した２ｍｏｌ％ＰＡＡゲル表面にファイバと塊まり状のタンパク質の集合体と見られるものが吸着された（図１２）。１ｍｏｌ％ＰＡＡゲルを用いた場合であっても、同じ結果を示した。無血清培中にはタンパク質が含まれていないため、無血清培中で平衡膨潤したＰＡＡゲル表面の吸着したタンパク質は、血小板血漿中に含まれていたものと考えられる。無血清培地と血清培地中で平衡膨潤した１ｍｏｌ％のＰＡＡゲル上に、それぞれ密度７０、７４ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２球状を保っている血小板（２〜４μｍ）の吸着が観察された。無血清培地と血清培地中で平衡膨潤した２ｍｏｌ％のＰＡＡゲル上に、それぞれ密度３２９、２４７ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２血小板の吸着を観察された。その中でそれぞれ約１５％、１２％が偽足を出していた。２ｍｏｌ％  ＰＡＡゲル上に吸着した血小板の数が１ｍｏｌ％のＰＡＡゲル上に比べてやく４倍多い。これらの結果より、血清の存在に関係なく、血小板がＰＡＡゲルに吸着しやすく、さらには、血小板の吸着がＰＡＡゲルの架橋密度に敏感に依存していることが分かった。
【００５７】
５６〜６１  ＰＮａＡＭＰＳゲル
無血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＡＭＰＳゲル表面には、たくさんのタンパク質の集合体と見られるものが吸着している（図１３）。無血清培地中にタンパク質は、含まれていないため、ゲル表面に吸着したタンパク質は、血小板血漿中に含まれていたものと考えられる。２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳゲルに、球状を保っている血小板（２〜４  μｍ）が、それぞれ３６、２、８ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２の密度で吸着している様子が観察された。血清培地中で平衡膨潤した２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％のＰＮａＡＭＰＳゲルに、球状を保っている血小板（２〜４  μｍ）が、それぞれ１２３、４４、６  ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２の密度で吸着している様子が観察された。
血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＡＭＰＳゲル表面にたくさんのタンパク質の集合体と見られるものが吸着している（図１４）。さらにタンパク質の集合体に中心として球状の血小板（２〜４  μｍ）の吸着がみられた。これらの結果から、血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＡＭＰＳゲル上に血小板が吸着しやすいことが分かった。
【００５８】
実施例６２〜６５  ＰＮａＳＳゲル
無血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＳＳゲル上にタンパク質の集合体と見られるものの吸着が観察されなかった（図１５）。血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＳＳゲル上に密度高いファイバ状のタンパク質と見られるものの吸着が観察された。無血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＳＳゲル上に僅かな血小板の吸着が観察されたのに対して、血清培地中で平衡膨潤した４ｍｏｌ％と１０ｍｏ１％のＰＮａＳＳゲル上に、血小板が、それぞれ６８、１７２ｃｅｌｌｓ／１０４μｍ２の密度で吸着している様子が観察された。さらにその上に、ゲル表面は、タンパク質の線維が均一に覆われている（図１６）。このため、吸着した血小板の形態がよく分からない。これらの結果から、血清培地中で平衡膨潤したＰＮａＳＳゲル上に血小板が吸着しやすいことが分かった。
【００５９】
実施例の総括
図１７に種々のゲル上で吸着した血小板の数を示している。これらの結果より、無血清培地中で平衡膨潤したゲルの場合では、血小板の粘着がＰＡＡ＞ＰＮａＡＭＰＳ＞ＰＮａＳＳ＞ＰＤＭＡＡｍの順で減少し、血清培地中で平衡膨潤したゲルの場合では、血小板の粘着がＰＡＡ＞ＰＮａＡＭＰＳ〜ＰＮａＳＳ＞ＰＤＭＡＡｍの順で減少することが分かった。何れの場合にも、ＰＡＡゲル上での血小板の粘着が強い。そしで、血小板の吸着がＰＡＡゲルの架橋密度に敏感に依存していることが分かった。血清培地中で平衡膨潤したＰＡＡ、ＰＮａＡＭＰＳ、ＰＮａＳＳゲル表面に血清タンパク質のファイバとみられるものが観察された。とくに、タンパク質の集合体の上とその周りに、血小板の粘着が顕著であった。これらの結果から、血清タンパク質が血小板の粘着を誘導するのではないかと示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、種々のゲルの化学構造を示した図である。
【図２】図２は、各種細胞シートとガラス間の摩擦を示した図である。
【図３】図３は、各種細胞シートと４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳ間の摩擦を示した図である。
【図４】図４は、細胞シートとＰｏｌｙ（ＮａＳＳ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）の摩擦を示した図である。
【図５】図５は、細胞シートと４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル間の摩擦を示した図である。
【図６】図６は、細胞シートと各種ゲルとの摩擦を示した図である。
【図７】図７は、ＴＧＦ−β１で処理した細胞シートと各種ゲルもしくはガラス間の摩擦を示した図である。
【図８】図８は、Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  Ｉで処理した細胞シートとゲルガラス間での摩擦を示した図である。
【図９】図９は、種々ゲルの化学構造を示した図である。
【図１０】図１０は、コントロール基板上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１１】図１１は、４ｍｏｌ％ＰＤＭＡＡｍゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１２】図１２は、２ｍｏｌ％ＰＡＡゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１３】図１３は、２ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１４】図１４は、１０ｍｏｌ％ＰＮａＡＭＰＳゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１５】図１５は、４ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１６】図１６は、１０ｍｏｌ％ＰＮａＳＳゲル上で吸着した血小板のＳＥＭ写真である。
【図１７】図１７は、コントロール基板と種々のゲル上で吸着した血小板の数を示した図である。
【図１】
0005424535.tif 000002
【図２】
0005424535.tif 000003
【図３】
0005424535.tif 000004
【図４】
0005424535.tif 000005
【図５】
0005424535.tif 000006
【図６】
0005424535.tif 000007
【図７】
0005424535.tif 000008
【図８】
0005424535.tif 000009
【図９】
0005424535.tif 000010
【図１０】
0005424535.tif 000011
【図１１】
0005424535.tif 000012
【図１２】
0005424535.tif 000013
【図１３】
0005424535.tif 000014
【図１４】
0005424535.tif 000015
【図１５】
0005424535.tif 000016
【図１６】
0005424535.tif 000017
【図１７】
0005424535.tif 000018