(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シバ（Ｚｏｙｓｉａ属）を遺伝子形質転換するための方法であって、以下の工程：
ｉ）３％スクロース（ｗ／ｖ）、１００ｍｇ／ｌ  αケトグルタル酸、４ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌ  ＢＡ、および０．２％ゲルライト（ｗ／ｖ）を含有するＭＳ培地上で、該シバの種子から得たカルスを誘導および生長させる工程；
ｉｉ）該シバのカルスにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を感染させ、ビアラフォス抵抗性ｂａｒのＤＮＡコード配列を該シバのカルスに導入する工程；
ｉｉｉ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびカルシウムの両方を含まずにアセトシリンゴンを含有する共存培養培地中で、シバのカルスおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を共存培養する工程；
ｉｖ）該共存培養培地から該Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を除去する工程；ならびに
ｖ）該カルスをトランスジェニックシバへと再生する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ビアラフォス抵抗性ｂａｒ遺伝子のＤＮＡコード配列で安定に形質転換されている、請求項１に記載の方法によって生産されるトランスジェニックシバ。
【請求項３】
トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターで形質転換された請求項２に記載のトランスジェニックシバであって、該プロモーターは、前記ビアラフォス抵抗性ｂａｒ遺伝子のＤＮＡコード配列に作動可能に連結されている、トランスジェニックシバ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の背景）
本発明は、シバ（ｚｏｙｓｉａｇｒａｓｓ）（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｓｔｅｕｄ．）（朝鮮芝（Ｋｏｒｅａｎ  ｇｒａｓｓ）とも呼ばれる）の効率的な遺伝子形質転換方法に関する。本発明は、他の密接に関連する芝草種に適用可能であり得る。本発明はまた、除草剤に抵抗性であるトランスジェニックシバ植物、ならびにこのような除草剤抵抗性シバの産生のための実験方法およびプロセスを提供する。
【０００２】
本発明は、シバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｓｔｅｕｄ．）（朝鮮芝としてもまた公知である）に対する効率的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介遺伝子形質転換方法、この形質転換効率に大いに影響する最適化された培地組成および培養条件、ならびに除草剤抵抗性を有するトランスジェニックシバ植物およびビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）抵抗性遺伝子（ｂａｒ）を有するこのようなトランスジェニックシバを開発するための関連する実験手段を提供する。
【０００３】
【従来の技術】
シバは、芝草の最も重要な種の１つであり、韓国、日本および中国東部を含む極東アジアならびに世界中の温帯で広範に栽培されている。シバの栽培地域は、近年、米国および他の国々において急速に拡大しており、これは主に、乾燥抵抗性および交通上の損傷から急速に回復する能力のような、その並外れた特性に起因する。さらに、シバは、実質的に全ての気候において、やせた土壌で良好に成長する。これらの有用な形質に起因して、シバは、ゴルフ場、競技場、道端、住宅庭園、および川堤に広範に使用されている。その市場規模が急速に成長するにつれ、消費者は、病原体、除草剤および種々の環境ストレスに対して改良された抵抗性を有する、新品種を要求する。近年までに、主に古典的な育種法を使用して、芝草におけるこのような新たな形質が開発されてきた。しかし、ますます多くの研究所および研究機関が、芝草を遺伝子操作するために、分子生物学的方法を適用することに努めている（Ｉｎｏｋｕｍａら、１９９８；ＰａｒｋおよびＡｈｎ  １９９８）。なぜなら、これらの方法を使用して、予測可能な様式で有用な形質を開発または改変することが現在可能であるからである。
【０００４】
多くの単子葉植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによって容易に感染されないが、効率的なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換系が、イネ科の数種（例えば、イネ（Ｈｉｅｉら、１９９４；Ｒａｓｈｉｄら、１９９６）、トウモロコシ（Ｉｓｈｉｄａら、１９９６）およびコムギ（Ｃｈｅｎｇら、１９９７）について、近年、首尾よく開発されてきた。しかし、不幸なことに、このようなＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換法は、コヌカグサ（ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（Ｙｕら、２０００）を除く芝草については依然として確立されていない（ＣｈａｉおよびＳｔｉｃｋｌｅｎ、１９９８）。特に、シバの遺伝子形質転換は、いくつかのさらなる技術的問題によってさらに妨げられている。例えば、芝草の種子発芽速度は非常に遅く、そして再生可能なカルスの産生は困難である（Ａｓａｎｏ  １９８９）。
【０００５】
カルスの形態は、種々の植物種において証明されているように（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＧｒｅｅｎ  １９８５；ＫｅおよびＬｅｅ  １９９６；ＬｕｏおよびＪｉａ  １９９８）、植物の再生可能性に密接に関連する。近年、本発明者らは、シバについての効率的なカルス誘導および植物再生系を確立し（Ｂａｅら、２００１）、これを、２００１年７月２４日に日本国特許出願番号２００１−２２３２７８として出願した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に従って、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介感染によって、シバを目的の遺伝子で遺伝的に形質転換することが現在可能である。
【０００７】
シバの遺伝子形質転換についてのいくつかの潜在的な標的形質としては、改良された地表植被能力、交通上の損傷に対する耐性、損傷後の急速な回復、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する抵抗性、生長率の操作（加速または遅延）、ならびに陰回避性（ｓｈａｄｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ）が挙げられる。特に興味深いことは、生長率および／または陰回避性を操作して、その結果、灌水および刈り取りのための維持費を劇的に減少し得ることである。
【０００８】
近年の分子生物学的技術の急速な蓄積ならびに植物の効率的な組織培養および遺伝子形質転換系の確立によって、現在、作物学上重要な任意の遺伝子が、作物の収量および品質ならびに環境適応性を増強するための目的で、任意の所望の植物に容易に導入され得る。本発明において、本発明者らは、効率的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介シバ形質転換法、および除草剤抵抗性を有するトランスジェニックシバ植物を提供する。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子形質転換」とは、予測可能な様式で、目的の高等植物に遺伝子または遺伝物質を導入するための手段をいう。この遺伝子または遺伝物質は、植物ゲノム内に安定に組み込まれ、そして世代を通して遺伝される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（発明の要旨）
本発明は、シバに対する確実なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換法に関し、この形質転換法は、シバまたは密接に関連する芝草種の遺伝子形質転換に慣用的に使用され得る。
【００１１】
本発明はまた、シバ（Ｚｏｙｓｉａ属）を遺伝子形質転換する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ｉ）種々のホルモンを含有する改変ＭＳ培地上で、シバのカルスを誘導および生長させる工程；ｉｉ）このシバのカルスにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を感染させ、ビアラフォス抵抗性ｂａｒ遺伝子を導入する工程；ｉｉｉ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびカルシウムを含まずにアセトシリンゴンを含有する共存培養培地中で、シバのカルスおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を共存培養する工程；ｉｖ）共存培養培地からＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を排除する工程；およびｖ）トランスジェニックシバを再生する工程を包含する。
【００１２】
さらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞は、ｐＧＰＴ−ＨＢ形質転換ベクターを有し、そして３型カルス（本発明者らの以前の出願番号２００１−２２３２７８に定義される）は、共存培養培地中で５〜７日間共存培養される。
【００１３】
また、本発明は、上記の方法によってトランスジェニックシバを提供し、このトランスジェニックシバは、植物特異的プロモーターの制御下においてｂａｒ遺伝子を安定に形質転換されている。特定のプロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
【００１４】
本発明において評価された重要な培地成分または培養条件としては、カルス型、共存培養期間、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ＣａＣｌ2、およびアセトシリンゴンが挙げられる。最も高い形質転換効率は、３型カルスを、２，４−Ｄを含まない培地上で５〜７日間共存培養した場合に得られた。さらに、共存培養の間のカルシウムの除去および３０〜７０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンの含有は、この形質転換効率を大幅に増強した。
【００１５】
この最適化された形質転換プロトコルを、ｂａｒ遺伝子でのシバ形質転換に使用した場合、選択培地上にプレートした苗条の２０．５％までが、除草剤抵抗性を示した。
【００１６】
また、本発明において、除草剤抵抗性を有するトランスジェニックシバ植物が提供される。このトランスジェニックシバは、５ｇ／ｌの除草剤溶液を、２週間の間、毎日噴霧した後でさえ生存し得、そして最終的に成熟期まで生長した。一方、コントロール植物は、同じ実験条件下で処理した場合に、生長を停止し、そして枯死した。
【００１７】
従って、本発明は、除草剤抵抗性のトランスジェニックシバカルス（登録番号ＫＣＴＣ−１００７６ＢＰの下に寄託される）をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、シバ（Ｚｏｙｓｉａ属）を遺伝子形質転換するための方法であって、以下の工程：ｉ）種々のホルモンを含有する改変ＭＳ培地上で、該シバのカルスを誘導および生長させる工程；ｉｉ）該シバのカルスにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を感染させ、ビアラフォス抵抗性ｂａｒ遺伝子を導入する工程；ｉｉｉ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびカルシウムを含まずにアセトシリンゴンを含有する共存培養培地中で、シバのカルスおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を共存培養する工程；ｉｖ）共存培養培地からＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を除去する工程；ならびにｖ）トランスジェニックシバを再生する工程を包含する、方法を提供する。
【００１９】
１つの実施形態において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞は、ｐＧＰＴ−ＨＢ形質転換ベクターを有する。
【００２０】
１つの実施形態において、３型カルスを、共存培養培地中で５〜７日間共存培養する。
【００２１】
本発明はまた、植物特異的プロモーターの制御下においてｂａｒ遺伝子を安定に形質転換されている、上記の方法によるトランスジェニックシバを提供する。
【００２２】
１つの実施形態において、該ｂａｒ遺伝子は、ユビキチンプロモーターの制御下で発現される。
【００２３】
本発明はさらに、ビアラフォス抵抗性ｂａｒ遺伝子（ＫＣＴＣ−１００７６ＢＰ）を導入された、トランスジェニックシバカルスを提供する。
【００２４】
上記のカルスは、ブダペスト条約に基づき、２００１年９月２１日付けで、コリアコレクションフォータイプカルチャー（Ｋｏｒｅａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（＃５２  Ｏｕｎ−Ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ、Ｔａｅｊｏｎ、Ｓｅｏｕｌ、３０５−３３３、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ
ｏｆ  Ｋｏｒｅａ）に登録番号ＫＣＴＣ−１００７６ＢＰで寄託された。
【００２５】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
作物学的に重要な植物の遺伝子形質転換は、新規または改良された有用形質を有する植物種の新品種を開発するための潜在的な方法である。作物植物に関連した標的形質としては、生長率の改善または遅延、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する抵抗性の増強、収量の増加、および環境の変動に対する柔軟な適応性が挙げられる。植物の首尾良い遺伝子形質転換のために予め必要なのは、組織培養および植物再生のための確実な系、および遺伝物質の堅実な送達デバイスである。植物分子生物学および方法論における近年の進歩によって、任意の目的の遺伝子が、任意の目的の植物種に容易に送達され得る。しかし、いくつかの作物植物（特に、単子葉植物）は、遺伝子操作に対して扱いにくく、そして普通の研究所において、植物再生を実施することが容易ではない。芝草は、多様な目的（ゴルフ場、芝地、住宅庭園、およびレクリエーション公園を含む）のために広範に使用され、そして近年の植物生物工学的適用のための潜在的な商業的標的植物として浮かび上がっている。しかし、効率的な組織培養および遺伝子形質転換系は、開発されていない。結果として、芝草の生物工学的な遺伝子操作は、いまだ、さほど進歩していなかった。
【００２６】
本発明は、シバ（ｚｏｙｓｉａｇｒａｓｓ）の種子由来カルスからの効率的な遺伝子形質転換および植物再生のために最適化された、培地組成および培養条件を提供する。暖地型芝草の亜型であるシバは、極東アジアを含む温帯において、広範に分布し、そして栽培されている。さらに、栽培地域は、いくつかの利点（例えば、乾燥損害および交通損害に対する抵抗性）に起因して、近年急速に拡大しつつある。本発明において、２，４−Ｄを含まないが、５０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンを有する共存培養培地において、３型カルスを６日間共存培養した場合に、最も効率的な形質転換が達成された。他の植物において形質転換効率を改善するとして公知のカルシウムは、負の効果を有する。植物の組織培養および再生実験は、十分に確立された植物分子研究所において、慣用的に実施されており、そして当該分野において周知である。
【００２７】
本発明はまた、除草剤抵抗性のシバ植物に関し、この除草剤抵抗性のシバ植物は、２週間にわたり毎日、ビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）溶液を噴霧した後でさえ生存し得る。ゴルフ場および競技場においてこのトランスジェニックシバを生育させることにより、単に除草剤を噴霧することによって選択的に雑草を除去することがより容易となり、そして維持費が劇的に低減される。さらに、少量の肥料が、このトランスジェニックシバを生育させるために必要とされると予期される。なぜなら、栄養を消費する雑草が、効率的に除去されるからである。このトランスジェニックシバは、いかなる形態学的な歪みも示さず、そして良好に生育し、親植物から識別不可能であった。
【００２８】
本発明はまた、他の密接に関連した芝草種ならびにおそらくＧｒａｍｉｎｅａｅ科に属する他の単子葉植物種に適用され得る。このような遺伝子操作された植物の開発のための実験的手順は、当該分野において周知である。本発明は、高度に再生可能なカルス系統を使用することによる、シバの効率的なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換についての最初の発明である。
【００２９】
【実施例】
（実施例）
（再生可能なカルスの調製）
約１００粒のシバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｓｔｅｕｄ．）の成熟種子を、２ｍｌの遠心管において１５分間、チューブミキサーを使用して攪拌しながら、１ｍｌの２％次亜塩素酸ナトリウムで表面滅菌した。次いで、この種子を、滅菌二重蒸留水で３回洗浄した。カルス誘導のために、約１００粒の種子を、３％スクロース（ｗ／ｖ）、１００ｍｇ／ｌ  αケトグルタル酸、４ｍｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌ  ＢＡ、および０．２％ゲルライト（ｗ／ｖ）を含有する、濾紙を載せたＭＳ（ＭｕｒａｓｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ  １９６２）培地ペトリ皿に配置した。この培地を、１．２〜１．３ｋｇ／ｃｍ2圧および１２１℃で２０分間オートクレーブする前に、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調整した。カルス誘導を、完全な暗所で、３ヶ月間２６±１℃にて、培養室において実施した。各ペトリ皿（直径９０ｍｍ）は、約３０ｍｌの培地を含み、そしてパラフィルム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎ，ＵＳＡ）で密封された。蛍光管によって提供された３０μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1の強度を有する連続的な白色光の下でのさらなる３日間のインキュベーション後、緑色組織のみを、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄおよび０．２ｍｇ／ｌ  ＢＡを含有するＭＳ培地に移し、そして引き続き、さらなる生長のために暗所で培養した。暗所での５週間の培養後、緑色を有する独立した種子由来のカルスを移し、そして暗所で、２，４−ＤおよびＢＡの異なるホルモンの組合せを含有する、濾紙を載せたＭＳ培地においてさらに培養した。４つの型のカルスを、最終的に得た。４週間の間隔での継代培養後に、１型、２型、および４型のカルスを、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ含有培地において発生させ、そして３型のカルスを、４ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ含有培地において発生させた（図１）。各ペトリ皿（直径９０ｍｍ）は、２５ｍｌの培地を含み、そしてＭｉｃｒｏｐｏｒｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｔａｐｅ（３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、ＵＳＡ）で密封された。
【００３０】
（４つのカルス型の特徴付け）
１型カルスの継代培養において生じる形態学的変化を調査するために、１型カルスを、暗所で、２，４−Ｄ（１、２、４、および８ｍｇ／ｌ）およびＢＡ（０、０．０１、および０．１ｍｇ／ｌ）の種々のホルモンの組合せを含有するＭＳ培地に移した。暗所での５週間の継代培養後、４つのカルス型が観察された。各カルス型の重量を計り、そして重量率を算出した。２型、３型、および４型のカルスもまた、１型カルスでの場合と同じ様式で試験した。
【００３１】
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染のための最適化条件）
ｐＩＧ１２１Ｈｍを含む、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの無害化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）株ＥＨＡ１０１を、本実験に使用した。ｐＩＧ１２１ＨｍのＴ−ＤＮＡは、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔ）、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔ）、およびイントロン−ｇｕｓ遺伝子（ｕｉｄＡ）を含んでいた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌカナマイシン、および１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシン（ｐＧＰＴＶ−ＨＢ）を補充した２０ｍｌのＬＢ培地（表１）を含む、１００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて、１６０ｒｐｍで振盪しながら、２８℃にて一晩増殖した。
【００３２】
表１は、シバの形質転換系において使用された、異なる培地およびそれらの組成を示す。
【００３３】
【表１】
0003659346.tif 000002
１０ｍｌの懸濁培養物中の細胞を、５０ｍｌのポリプロピレンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、ＵＳＡ）中において、２０分間２５００ｒｐｍで遠心分離することによって収集し、そして１０ｍｌの液体感染培地（表１のＬｑＭＳＡＳ）中で、穏やかにボルテックスすることによって再懸濁した。
【００３４】
アセトシリンゴンを、１００ｍｇ／ｍｌ濃度で、ジメチルスルホキシド中に適切な量の粉末を溶解することによって調製し、そして暗所で４℃にて保存した。これを、必要とされる場合に、適切な最終濃度まで滅菌培地に添加した。ＭＳＣＧ４培地において生長したカルスを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞懸濁液中に１分間浸漬した。滅菌濾紙上での脱水後、このカルスを、４ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを有する共存培養培地（ＭＳＡＳ）において、暗所で１５日間２６±１℃にて培養した。共存培養後、このカルスを、界面活性剤（０．０２％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８）を補充した滅菌二重蒸留水中で、この洗浄溶液が透明になるまでボルテックスすることによって徹底的に洗浄し、そして最終的に、１０００ｍｇ／ｌカルベニシリン（ｃａｌｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および０．０２％界面活性剤を含有する滅菌二重蒸留水中で洗浄した。洗浄後、このカルスの半分を、Ｓｃｈｅｎｋら（１９９８）によって記載された方法によるＧＵＳ活性アッセイのために使用した。
【００３５】
いくつかの因子を、形質転換効率を最適化するために試験した。（１）浸潤についての異なるカルス型の比較のために、１型、２型、および３型のカルスを、６日間、２，４−Ｄを含まないＭＳＡＳ培地において共存培養した；（２）共存培養期間の比較のために、カルスを、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７日間、共存培養した；（３）培地成分の試験のために、異なる量の２，４−Ｄ（０、１、２、４、および８ｍｇ／ｌ）、ＣａＣｌ2（０、１１、１１０、２２０、および４４０ｍｇ／ｌ）、およびアセトシリンゴン（０、１０、５０、１００、および２００ｍｇ／ｌ）を、ＭＳＡＳ培地に添加した。
【００３６】
（ｐＧＰＴＶ−ＨＢ共存培養）
シバカルスのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染についての最適化条件は、ドナーとしての３型カルスの使用、９日間の共存培養期間、培地からの２，４−ＤおよびＣａＣｌ2の排除、ならびに１００ｍｇ／ｌアセトシリンゴンの使用を含んでいた。実験に使用された、すべての培地およびそれらの組成を、表１に要約する。ｐＧＰＴＶ−ＨＢ共存培養後、カルスを、濾紙を載せたＭＳＣＧ培地に移し、そして暗所で２〜４週間培養した。次いで、このカルスを、苗条誘導のために、濾紙を載せたＭＳＳＩ培地に移した。種々の濃度（１２５、２５０、および５００ｍｇ／ｌ）のカルベニシリンを、苗条誘導培地に添加した。誘導された苗条を、引き続いて、４週間の発根および選択のために、ＭＳＲＳ培地に移した。５ｍｇ／ｌビアラフォスおよび１０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを、ビアラフォス抵抗性小植物およびハイグロマイシン抵抗性小植物の選択のために使用した。選択培地上で発根した植物を、抗生物質およびビアラフォスを有さないＭＳＰＧ培地に移し、そしてさらに生長させた。次いで、完全に生長した植物を土壌を含むポットに移し、そして３０℃、８０％相対湿度、および冷白色蛍光管によって提供される３０μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1の強度を有するイラディアンスでの１８時間光周期に設定された環境制御グロースチャンバにおいて生長させた。根が十分に発生した時点で、ポットを温室に移した。
【００３７】
（トランスジェニックシバ植物の分析）
推定トランスジェニックシバ植物が、除草剤に対して抵抗性であるか否かを試験するために、この推定トランスジェニックシバ植物に、５ｇ／ｌの除草剤溶液（１ｇ／ｌビアラフォス、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ、Ｊａｐａｎ）を噴霧した。さらに、除草剤抵抗性遺伝子が、植物ゲノム中に組み込まれているか否かを研究するために、ＲｏｇｅｒおよびＢｅｎｄｉｃｈ（１９８５）の方法に従って、ゲノムＤＮＡを、トランスジェニック植物の葉から単離した。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで消化した２０μｇのゲノムＤＮＡを、０．８％アガロースゲルにおいて分離し、標準的な方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  １９７５）によってナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+）にブロットし、そして32Ｐ標識化したｈｐｔ遺伝子配列またはｂａｒ遺伝子配列で探索した。これらのプローブを、ランダムプライミング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって調製した。
【００３８】
（結果）
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染に適切なカルス形態）
種々の組合せの２，４−ＤおよびＢＡを含むＭＳ培地における成熟種子由来１型カルスの培養は、１〜４型のカルスの混合物を生じた（表２）。
【００３９】
表２は、異なる組合せの生長調節物質を含む培地における、シバ１型カルスの異なる生長を示す。１０ｍｇの１型カルスを、２，４−ＤおよびＢＡの種々の組合せ、ならびに２ｇ／ｌゲルライトを有するＭＳ培地において、暗所で、５週間２８℃にて生長させた。各値は、１０個のカルスから算出された平均を示す。カルスの形態を、以下によって評価した；１＝やや白色〜黄色、緻密および非破砕性、２＝白色、緻密および破砕性、３＝黄色、緻密および非常に破砕性、４＝半透明、軟性および水っぽい。
【００４０】
【表２】
0003659346.tif 000003
結果として生じた４つの型のカルスを、形態学的に特徴付けた。１型カルスは、やや白色〜黄色または薄緑色であり、緻密かつ非破砕性の構造を有する。複数の苗条原基が、いくつかの１型カルスの表面に観察された（図１Ａ）。２型カルスは白色であり、緻密かつ破砕性の構造を有する（図１Ｂ）。３型カルスは黄色であり、そして緻密かつ非常に破砕性の構造を有した（図１Ｃ）。４型カルスは、軟性の水っぽい外観を有して半透明であるという点で、独特である（図１Ｄ）。１〜３型のカルスは再生可能であったが、４型カルスは再生不可能であった。１型および２型カルスの最良の生長および発生率（それぞれ、６７．４±９．１ｍｇ、５８％、および３２．３±５．２ｍｇ、２８％）および３型カルスの最良の生長および発生率（３３．７±１１．３ｍｇ、５９％）は、それぞれ、１および４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄと組合せて０．０１ｍｇ／ｌ  ＢＡを含むＭＳ培地において得られた（表２）。再生不可能な４型カルスの発生率は、２，４−Ｄと組合せて０．０１ｍｇ／ｌ  ＢＡを添加することによって、１／１．８倍〜１／３．４倍に減少した。従って、１または４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄと組合せて０．０１ｍｇ／ｌのＢＡを、それぞれ、１〜２型または３型のカルスのさらなる生長のために使用した。２型および３型のカルスの継代培養は、１型カルス継代培養での出現率と類似した出現率で、１型、２型、３型、および４型カルスの混合物を生じた。しかし、４型カルスの継代培養は、４型カルスのみを生じた。興味深いことに、１〜３型のカルスは、ホルモンの異なる組合せを使用した場合に、形態学的なバリエーションを示した。さらに、継代培養する前に３日間、カルスを明所で継代培養した場合、緑色カルスが出現した。この緑色カルスからは、苗条誘導培地において、小さな白子植物が再生した（図２Ｃ）。４型カルスの発生を抑制することによって、そして継代培養工程毎に緑色カルスを選択することによって、カルス系統からの緑色植物の再生可能性は、２年間にわたって、いかなる有害な影響も伴なわずに維持され得る（図２Ｃ）。
【００４１】
カルスの形態と苗条の再生可能性との間の密接な関係は、種々の植物種において実証されてきた（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＧｒｅｅｎ  １９８５；ＫｅおよびＬｅｅ  １９９６；ＬｕｏおよびＪｉａ  １９９８）。ナガハグサ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌ．）では、子葉鞘および胚から誘導されるカルスは、形態および破砕性に基づいて４つの型に分類され得る（ＫｅおよびＬｅｅ  １９９６）。ナガハグサの４型カルスは、柔らかく、構造を有さず、そして半透明であり、そこから苗条が全く再生されなかった。この結果は、シバで得た結果と類似している。ナガハグサにおける４型カルスの誘導は、オーキシンによってのみ制御され得、一方、シバの誘導は、サイトカイニンレベルを減少させることによって制御することができた。Ａｓｔｒａｎｇａｌｕｓ  ａｄｓｕｒｇｅｎｓでは、胚軸由来のカルスがまた４つの型に分類されたが（ＬｕｏおよびＪｉａ  １９９８）、４つのカルスの型のいずれもが、８ヶ月間継代培養した後でさえ、形態の変化を示さなかった。他方、４型を除き、１〜３型のシバカルス型の各々の継代培養は、４つのカルス型を生じた。シバ、ナガハグサ、およびＡｓｔｒａｎｇａｌｕｓ  ａｄｓｕｒｇｅｎｓ間におけるこれらの差異は、異なる種間の差示的再生可能性を反映する。
【００４２】
（形質転換効率に影響を及ぼす因子）
（カルス型の効果）
ＭＳＣＧ１培地上で生長した１型および２型のカルス、ならびにＭＳＣＧ４培地上で生長した３型カルスを、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０１（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）と、６日間、２，４−Ｄを含まない共存培養培地で共存培養し、そしてＧＵＳ発現の測定を使用して、異なるカルス型と形質転換効率との間の関係を検査した（表３、図２Ａ）。
【００４３】
表３は、異なるカルス型の形質転換効率を示す。３つのカルス型を、２，４−Ｄを含まないＭＳＡＳ培地（表１を参照のこと）上で、６日間暗所で、２６℃で共存培養した。３つの複製を測定し平均した。
【００４４】
【表３】
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ＧＵＳ発現は、１型および３型カルス上で検出されたが、２型カルス上では青斑は検出されなかった。３型カルスは、１ｇのカルス新鮮重量あたり７２１±２０１個の青斑という最も高いＧＵＳ発現頻度を生じた。これは、１型カルスにおいて観察されたものよりも３４倍高かった。この結果は、他のいずれのカルスの型よりも、３型カルスがより容易に形質転換されることを示す。
【００４５】
（２，４−Ｄ濃度の効果）
カルスの単位新鮮重量あたりの青斑の数によって決定された各カルス型の形質転換頻度はまた、表２に示される共存培養培地における２，４−Ｄ濃度によって影響を受けた。共存培養培地における２，４−Ｄの効果を、ＭＳＣＧ４培地上で生長したカルス上の青斑を計数することによって検査した（図３）。共存培養の９日後、青斑は、２，４−Ｄを含まない共存培養培地上でのカルスの新鮮重量１ｇあたり７９３±１４５個であった。しかし、青斑の数は、２，４−Ｄ濃度が増加するにつれ減少した（図３）。この観察は、２，４−Ｄが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換効率に対して負の効果を有することを示唆する。これは、他の植物において観察されたものとは対照的である。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換における活性な細胞分裂についての正の役割は、種々の植物種において議論されてきた。アマ（ＭｃＨｕｇｈｅｎら、１９８９）およびナス（Ｃｌａｕｄｉａら、２０００）において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の前の２，４−Ｄを含む再生培地での外植片の予備培養は、効率的な遺伝子移入にとって必須であった。傷を受けた外植片における活性な細胞分裂は、Ｔ−ＤＮＡフラグメントの植物ゲノムＤＮＡへの組み込みを大きく改善した（ＭｃＨｕｇｈｅｎら、１９８９；Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒら、１９９６；Ｃｌａｕｄｉａら、２０００）。２，４−Ｄを含まない共存培養培地が、シバカルスの細胞分裂を活性化させ得ること、またはそれ自体の遺伝子移入を促進し得ることは、正確な分子機構は解明されていないが、可能である。
【００４６】
（共存培養期間）
２〜３日の共存培養の期間が、イネ科の形質転換において一般的に使用されてており（Ｈｉｅｉら、１９９４；Ｒａｓｈｉｄら、１９９６；Ｄｏｎｇら、１９９６；Ｉｓｈｉｄａら、１９９６、Ｃｈｅｎｇら、１９９７）、一方、５〜７日までの延長した共存培養の期間が、ｌｉｌｉｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、シトレンジ（ｃｉｔｒａｎｇｅ）、およびアガパンサス（ａｇａｐａｎｔｈｕｓ）においてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換効率を増大させることが示されている（Ｃｅｒｖｅｒａら、１９９８；Ｓｕｚｕｋｉら、２００１）。共存培養期間の延長により、細菌細胞の膨大な増殖が生じ、そして通常再生頻度は減少する（Ｃｅｒｖｅｒａら、１９９８）。細菌細胞の過剰増殖が６日間の共存培養期間に観察されたが、ボルテックスによる完全な洗浄により、カルスを細菌の汚染から保護することが可能であり、そして形質転換効率は減少しなかった（データ示さず）。
【００４７】
（共存培養培地におけるＣａＣｌ2濃度）
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換頻度に対するＣａＣｌ2の効果を調査した。カルシウムを含まない共存培養培地は、ＧＵＳ発現青斑の数を有意に増大させた（図４）。青斑は、ＣａＣｌ2を含まない共存培養培地上で、１ｇの新鮮カルス重量あたり１３６８個であったが、ＣａＣｌ2濃度が増大するにつれ減少した。しかし、カルスの生長は、カルシウムを含まない共存培養培地において、カルシウムを含む培地より遅かった。したがって、カルスは、共存培養後にカルシウムを含有するカルス生長培地に迅速に移されなければならない。同様のカルシウム効果が、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｕｌｉｅｎｓｉｓで観察された（Ｍｏｎｔｏｒｏら、２０００）。
【００４８】
カルシウムは、病原感染に対する植物応答において重要な役割を演じ、そして最近の生理学研究において議論されている（Ｄｉｅｒｋ  １９９８）。このカルシウム媒介植物防御機構はまた、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ細胞により感染させたときに、シバカルスにおいて誘発され得る。これは、シバカルスがカルシウムを含まない共存培養培地でより容易に感染される理由を説明し得る。
【００４９】
（アセトシリンゴン濃度の効果）
フェノール化合物であるアセトシリンゴンは、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉプラスミドにおけるｖｉｒ遺伝子発現を活性化する誘導物質として周知である（Ｓｔａｃｈｅｌら、１９８５）。アセトシリンゴンは、ジャポニカイネおよびインディカイネ（Ｈｉｅｉら、１９９４；Ｒａｓｈｉｄら、１９９６）、ファラエノフォシス（ｐｈａｒａｅｎｏｐｓｉｓ）、ランおよびアガパンサス（Ｓｕｚｕｋｉら、２００１）のような単子葉植物において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に重要であることが示されている。アセトシリンゴンは、キュウリ、ブロッコリ、ダイズ、およびシトレンジのような双子葉植物における形質転換効率もまた大いに増大する（Ｎｉｓｈｉｂａｙａｓｈｉら、１９９６；Ｃｅｒｖｅｒａら、１９９８；Ｓａｎｔａｒｅｍら、１９９８；Ｈｅｎｚｉら、２０００）。
【００５０】
アセトシリンゴンを含まない共存培養培地を使用した場合、形質転換効率が非常に低く、１ｇのカルス新鮮重量あたり８６．３±２４．０個の青斑であった。５０ｍｇ／リットルのアセトシリンゴンをその共存培養培地に添加すると、青斑の数が有意に９倍増大した（図５）。しかし、１００ｍｇ／リットル濃度よりも高い濃度は、形質転換に対して負の効果を有していた。特に、２００ｍｇ／ｌのアセトシリンゴン含有培地上での共存培養したカルスは、共存培養後にカルス培養培地上で生長しなかった。
【００５１】
（ｂａｒ遺伝子でのシバの形質転換）
シバ植物のための最適な形質転換系を評価するために、除草剤抵抗性遺伝子（ｂａｒ）を含有するｐＧＰＴＶ−ＨＢ形質転換ベクターでシバ植物を遺伝的に形質転換するために、確立されたプロトコルを適用した。このプロトコルの主要な構成要素は、３型カルスおよび９日間の共存培養期間の使用であった。この共存培養培地は、２，４−ＤおよびＣａＣｌ2を含まなかったが、５０ｍｇ／リットルのアセトシリンゴンを含んだ。その共存培養カルスを、カルス生長培地で生長させ、そしてハイグロマイシンおよびビアラフォス選択なしで苗条誘導に供した。時折、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ細胞混入を、１２５ｍｇ／リットルのカルベニシリン含有培地上で観察したので、２５０ｍｇ／リットルのカルベニシリンを苗条誘導培地において使用した。
【００５２】
選択を、１０ｍｇ／リットルのハイグロマイシンまたは５ｍｇ／リットルのビアラフォスを含有する発根培地上でのみ行った。発根した苗条は、４週間後に現れた。この発根した苗条を、再度、新鮮選択培地上で２〜４週間継代培養した場合、最初の選択培地上で発根したエスケープ（ｅｓｃａｐｅ）が最終的に枯死し、一方、推定の真のトランスジェニック植物が発根しそして活発に伸長した。抵抗性植物の頻度は、約２０．５％であった（表４）。
【００５３】
表４は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染カルスから再生した苗条の生存率を示す。ＥＨＡ１０１（ｐＧＰＴＶ−ＨＢ）感染カルスから再生した苗条を、５ｍｇ／リットルのビアラフォス（Ｂ）および１０ｍｇ／リットルのハイグロマイシン（Ｈ）を含有するＭＳＲＳ培地（表１を参照のこと）上で４週間培養した。生存率は、産生した抵抗性植物／播種した苗条の数に、１００をかけたものを表す。
【００５４】
【表４】
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（トランスジェニックシバ植物に対する除草剤抵抗性アッセイ）
トランスジェニック植物および非トランスジェニック植物を、土壌中に確立した後、それらに、５ｇ／リットル除草剤溶液（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ、Ｊａｐａｎ）を２週間毎日適用した。除草剤溶液を２週間散布した後、トランスジェニック植物は、ビアラフォス塗布を生存し、そして成熟まで成長した。しかし、コントロール植物は、成長を止め、そして最終的に枯死した（図３）。この結果は、ｂａｒ遺伝子が、トランスジェニック植物において正常に発現されることを示す。
【００５５】
（ＤＮＡゲルブロット分析）
トランスジェニックシバ植物の除草剤抵抗性がその植物ゲノムに組み込まれたｂａｒ遺伝子に由来することを確認するために、ビアラフォス抵抗性植物を、ＤＮＡゲルブロット分析によって分析した。ゲノムＤＮＡをトランスジェニック植物から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｂａｒまたはｈｐｔ特異的プローブとハイブリダイズさせた（図６Ａ）。同時に、コントロール植物からのゲノムＤＮＡをまた、同一のやり方で分析した。コントロールサンプルは、いかなるバンドを示さなかった（図７Ｂ、レーンｃ；図７Ｃ、レーンｃ）。一方、トランスジェニック植物からのサンプルは、ｂａｒおよびｈｐｔ特異的プローブと特異的にハイブリダイズするバンドを示した（図７Ｂ、レーン１；図７Ｃ、レーン１）。ｐＧＰＴＶ−ＨＢのＴ−ＤＮＡフラグメントは、単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するので（図７Ａ）、ハイブリダイズしたバンドの数は、トランスジェニックシバ植物に組み込まれた遺伝子コピーのコピー数を反映していた。検出されたバンドは、ｐＧＰＴＶ−ＨＢのマップ（図７Ａ）から予想されたような、ｂａｒまたはｈｐｔ特異的プローブについてのそれぞれ１．６ｋｂまたは１．８ｋｂよりも大きいフラグメントを表した。これは、組み込まれた遺伝子のコピー数が２であったことを示す（図７Ｂ、レーン１；図７Ｃ、レーン１）。ＢａｍＨＩおよびｂａｒプローブでのゲノムＤＮＡサザンブロットはまた、同じ結果を与えた。これは、コピー数が、２であることを示す（図７Ｂ、レーン２）。これらの結果は、２つの安定な組み込み事象が存在したことを示し、明らかに、このトランスジェニック植物において観察された除草剤抵抗性が、組み込まれたｂａｒ遺伝子によって決定されたことを実証する。
【００５６】
本発明におけるシバのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換系は、シバならびに密接に関連する芝草種の遺伝子操作を迅速化させる。本発明は、シバの遺伝子形質転換のための最適化された培地組成および培養条件を提供し、これは、目的の遺伝子が、生物的および非生物的ストレスに対しての抵抗性を改良するため、および生長率を調節するために、シバに導入されるべき場合に特に有益である。
【００５７】
（参考文献）
【表５】
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（要約）
本発明は、シバ植物（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｓｔｅｕｄ．）に対する効率的な遺伝子形質転換系を提供する。シバ形質転換のための最適化された培地組成および培養条件もまた提供される。このシバについての確実な形質転換系を、カルス生長および植物再生に有意に影響するいくつかの因子を最適化することによって開発した。カルス型および共存培養期間は、形質転換効率に絶対的に影響した。２，４−Ｄ、ＣａＣｌ2およびアセトシリンゴンの濃度もまた、重要な因子であった。最良の結果は、３型カルスを、２，４−Ｄを含まない共存培養培地上で６日間共存培養した場合に達成された。共存培養の間のカルシウムの除去および５０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンの添加は、その効率を劇的に増強させた。本発明はまた、ビアラフォス抵抗性シバ植物を提供し、これは、ゴルフ場および競技場に使用され、維持費を節約し得る。
【００５８】
【発明の効果】
本発明に従って、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介感染によって、シバを目的の遺伝子で遺伝的に形質転換することが現在可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、カルス生長培地上で生長した、４つの異なる型のカルスを示す写真である。（Ａ）１型カルスは、やや白色〜黄色または薄緑色を有し、そして緻密かつ非破砕性の構造を示す。（Ｂ）２型カルスは、白色であり、そして緻密かつ破砕性の構造を示す。（Ｃ）３型カルスは、黄色であり、そして緻密かつ非常に破砕性の構造を示す。（Ｄ）４型カルスは、半透明の軟性の水っぽい外見を有する。この４つのカルス型は、表２に要約されるような生長調節物質の異なる組み合わせを補充した、カルス生長培地上で得られた。
【図２】図２は、ｐＧＰＴＶ−ＨＢベクター（図７を参照のこと）を保有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを感染させたシバカルスにおける、トランスジェニックＧＵＳ発現を示す写真である。（Ａ）シバカルスにおけるトランスジェニックＧＵＳ発現。（Ｂ）Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染後の、濾紙を載せ、そして抗生物質を含まないＭＳＣＧＣＢ培地上での、カルスの急速な生長。（Ｃ）濾紙上を載せ、そして抗生物質を含まない苗条誘導培地上での、苗条誘導。（Ｄ）ビアラフォス含有培地上での、苗条伸長および発根。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染カルスから誘導された苗条を、５ｍｇ／ｌのビアラフォスを含有する選抜発根培地ＭＳＲＳ上で培養した。
【図３】図３は、形質転換効率に対する２，４−Ｄの効果を示す。異なる濃度の２，４−Ｄを含有するカルス増殖培地上で培養したカルスの、１グラムの新鮮重量あたりの青斑を計数した。
【図４】図４は、形質転換効率に対するＣａＣｌ2の効果を示す。培地に異なる濃度のＣａＣｌ2を含有させることを除いて、図３の簡単な説明に記載のように、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染カルスを培養した。
【図５】図５は、形質転換効率に対するアセトシリンゴンの効果を示す。異なる濃度のアセトシリンゴンを含有させることを除いて、図３の簡単な説明に記載のように、この実験を行った。
【図６】図６は、トランスジェニックシバ植物（右）および親シバ植物（左）を示す写真である。これらのシバ植物に、２週間の間、毎日、除草剤溶液を噴霧した（５ｇ／ｌのビアラフォス）。（Ａ）除草剤溶液を噴霧しなかった植物。（Ｂ）２週間の間、除草剤溶液を毎日噴霧した植物。
【図７】図７は、形質転換ベクターの略図、および植物ゲノム中の除草剤抵抗性（ｂａｒ）遺伝子の存在を確認するためのサザンブロット分析を示す。（Ａ）形質転換ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＢのベクター地図。Ｐｎｏｓ、ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター；ＨｙｇR、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔ）；ＮＯＳ、ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター；Ｕｂｉ−Ｐ、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター；Ｂａｒ、ビアラフォス抵抗性遺伝子；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｓ、ＳａｃＩ。（Ｂ）および（Ｃ）トランスジェニックシバ植物のサザンブロット分析を示す写真である。ゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン１）またはＢａｍＨＩ（レーン２）のいずれかで消化した。メンブレンに、ｂａｒ（Ｂ）プローブまたはｈｐｔ（Ｃ）プローブのいずれかをハイブリダイズさせた。形質転換されていない植物のゲノムＤＮＡを、ネガティブコントロールとして含んだ（レーンｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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