(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも抗体フラグメントに結合した第１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
（ｂ）少なくとも抗体フラグメントに結合した第２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
を含む多機能性タンパク質であって、前記第１のアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記第２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相補的な形態で相互作用して、単一の親ポリペプチドに由来する親の未変性構造に類似する三次構造を形成する、前記多機能性タンパク質。
【請求項２】
前記単一の親ポリペプチドがユビキチン、アシルホスファターゼ、IL−２、カルビンジンまたはアポミオグロビンである、請求項１に記載の多機能性タンパク質。
【請求項３】
前記親の未変性構造に類似する三次構造が生物学的に活性である、請求項１または２に記載の多機能性タンパク質。
【請求項４】
前記親の未変性構造に類似する三次構造が共有結合によって安定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質。
【請求項５】
前記第１のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび前記第２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうちの少なくとも１つが、柔軟なペプチドリンカーを介して前記抗体フラグメントに結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質。
【請求項６】
前記柔軟なペプチドリンカーが抗体ヒンジ領域である、請求項５に記載の多機能性タンパク質。
【請求項７】
前記抗体フラグメントに結合した第１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと前記抗体フラグメントに結合した第２のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち少なくとも一方が、少なくとも１つの別のポリペプチドまたはペプチドに結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質。
【請求項８】
前記別のポリペプチドまたはペプチドが、酵素、毒素、サイトカイン、金属結合部位、金属結合タンパク質、可溶性レセプター、DNA結合ドメイン、転写因子、免疫グロブリン、５〜15アミノ酸残基の生物活性ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、レクチン、リポタンパク質、および独立した結合体に結合可能なペプチドよりなる群から選択される、請求項７に記載の多機能性タンパク質。
【請求項９】
少なくとも１つの抗体フラグメント、結合ドメインまたは別のポリペプチドもしくはペプチドが、ヒト由来のものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質をコードするDNA。
【請求項１１】
請求項10に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１２】
バイシストロン性ベクターである、請求項11に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項10に記載のDNAまたは請求項11もしくは12に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または細菌細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ヒト細胞または大腸菌細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項13〜15のいずれか１項に記載の宿主細胞を適当な培地中で培養し、その宿主細胞によって産生された多機能性タンパク質を回収することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
請求項13〜15のいずれか１項に記載の宿主細胞の少なくとも２種を適当な培地中で培養し、その際、該宿主細胞のそれぞれが多機能性タンパク質であるポリペプチドを１種のみ産生し、それらポリペプチドを回収し、それらを穏やかな変性条件下で混合し、そしてそれらのタンパク質から請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質がin vitroで折り畳まれるようにすることを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性タンパク質を製造する方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性ポリペプチドを含む医療組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性ポリペプチドを製薬上許容し得る担体とともに含む医療組成物。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の多機能性ポリペプチドを含む、診断用組成物。
【請求項２１】
多機能性タンパク質を発現させるためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）：
（ａ）少なくとも抗体フラグメントに結合した第１のアミノ酸配列をコードするDNA、および
（ｂ）少なくとも抗体フラグメントに結合した第２のアミノ酸配列をコードするDNA、
を含み、かつ、前記第１のアミノ酸配列からなるポリペプチドは前記第２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相補的な形態で相互作用して、単一の親ポリペプチドに由来する親の未変性構造に類似する三次構造を形成するものである、前記キット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
単一の構造に２以上の機能、例えば結合能、触媒能等を兼ね備えたタンパク質に対する必要性が増加している。典型的には、２以上の機能を兼ね備えたタンパク質は融合タンパク質として製造されるか、機能的ドメイン成分の化学的結合により製造される。これらのアプローチはいずれの欠点を有している。遺伝的に「単一鎖」の融合は、（ｉ）数個（２〜３）のタンパク質しか融合できないこと（Rockら、1992,Prot.Eng.5,583−591）、（ii）成分ドメイン間の相互の干渉により折り畳みが阻害され得ること、及び（iii）融合タンパク質のサイズにより製造が困難となること等の欠点を有する。別の方法としての、独立に発現されたタンパク質を精製してin vitroで化学的架橋を形うことは制御するのが困難であり、常に所望のものではない生成物を生じ、機能的物質の収率を大幅に低下させる。
最近、２以上の同じ機能性ドメインを非共有結合する方法が開発された。これは自己結合してホモ多量体を形成するペプチドに結合したドメインを使用して達成される（Pack ＆ Pluckthun,1992,Biochemistry 31,1579−1584）。例えば、in vivoでＣ−末端に融合された両親媒性ヘリックスにより、別々に発現された２つのscFv抗体フラグメントを結合して、大腸菌中で抗体フラグメントのホモ二量体（PCT/EP93/00082;Packら、1993,Bio/Technology 11,1271−1277）またはホモ四量体（Packら、1995,J.Mol.Biol.,246,28−34）が得られる。
そのような結合ドメインに融合した異なる特異性を有する２つの抗体フラグメントのような別々のタンパク質機能を組み立てるためには、ヘリックスはヘテロ多量体を形成する傾向を有していなければならない。原理的には、これは相補的なヘリックス、例えばAP−１転写因子のヘテロ二量化JUN及びFOSジッパーにより得られる（O'Sheaら、1992,Cell 68,699−708）。しかし、ヘテロ結合ヘリックスに基づく結合ドメインの明白な欠点は、その偽対称性、並びに疎水性残基及び親水性残基の類似した周期性である。この構造上の類似性によりホモ二量体を形成する強い傾向を示し、従って、ヘテロ二量体の収率を有意に低下させる（O'Sheaら、1992,Cell 68,699−708;Pack,1994,博士論文、
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さらに、JUN/FOSヘテロ二量体の形成は速度論的に不利であり、速度論的に有利なホモ二量体、特にJUN/JUNホモ二量体の温度依存性の変性（unfolding）を必要とする（PCT/EP93/00082;O'Sheaら、1992,Cell 68,699−708;Pack,1994,博士論文、Ludwig−Maximilians−Universitat Munchen）。望ましくないホモ二量体をヘテロ二量体から分離するための付加的精製段階の必要性及びその結果として生じる収率の低下のために、両親媒性ヘリックスに基づくヘテロ結合ドメインは、従来の化学結合と比較して実用上の利点をもたらさない。
従来の技術のこれらの欠点は、多機能性ポリペプチド及びこれらの多機能性タンパク質の製造方法を提供する本発明により克服される。これは主として相補的な形態で結合し、自己結合しないように設計された結合ドメインの使用により達成される。
発明の詳細な説明
タンパク質の折り畳みの最初の段階においては、疎水性残基を中間体「溶融小球体（molten globule）」内部中に折り畳むことによりペプチド鎖が無秩序な疎水性コアを形成する。この疎水性効果は折り畳みの最も重要な駆動力となると考えられている（Matthews,1993,Annu.Rev.Biochem.62,653−683;Fersht,1993,FEBS Letters 325,5−16）。疎水性残基の埋没とその結果起こる溶媒の排除は、例えばアシルホスファターゼ（Pastoreら、J.Mol.Biol.224,427−440,1992）、インターロイキン−２（Brandhuberら、1987、Science 238,1707−1709）、カルビンジン（Parmentier,1990,Adv.Exp.Med.Biol.269,27−34）またはユビキチン（Briggs ＆ Roder,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,2017−2021）のようなコンパクトな三次構造の安定性を決定する要因である。
この概念は本発明の基礎を構成するものであり、単一の連続鎖中に高度に疎水性のコアを有するコンパクトな三次構造を含む、個々にコードされたペプチドまたは「セグメント」を提供する。成分のペプチドは、その推定構造において非対称であり、自己結合してホモ多量体を形成しないが、相補的な形態で結合し、親の三次構造に似た安定な複合体となるように選択される。遺伝子レベルにおいては、これらのセグメントは適当な制限部位を有する互換性のあるカセットによりコードされる。これらの標準化されたカセットは、適する発現ベクター系中のリンカーまたはヒンジを介して種々の組換体タンパク質のＣ−またはＮ−末端に融合する。
従って本発明は、
（ａ）少なくとも一つの機能性ドメインに結合した第１のアミノ酸配列、
（ｂ）少なくとも一つの別の機能性ドメインに結合した第２のアミノ酸配列、及び
（ｃ）必要により、それぞれ少なくとも一つの別の機能性ドメインに結合した別のアミノ酸配列を含む多機能性ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列の任意の１つ以上のものが前記アミノ酸配列の少なくとも１つと相補的な形態で相互作用して親の未変性構造に類似する三次構造、または必要に応じて四次構造を形成し、該親の未変性構造に類似する三次構造、または必要に応じて四次構造が単一の親ポリペプチドに由来する、前記多機能性ポリペプチドに関する。上記において、親ポリペプチドの用語は、疎水性コアを有するコンパクトな三次構造または四次構造をもつポリペプチドをいうものである。本発明は、結合ドメインの基礎として使用し得る種々の親ポリペプチドを多数提供するものである。適するポリペプチドは、公知のタンパク質構造のデータベース（Protein Data Bank,PDB）においてコンパクトな単一ドメインタンパク質またはタンパク質断片を検索し、組換体形態で高い収率で発現され得る安定な構造を選択することにより同定することができる。これらの構造はその後Karpeisky及びIlynの方法（1992,J.Mol.Biol.224,629−638）により疎水性サブクラスターについて、または構造単位（例えば、β−成分またはらせん状ヘアピン構造）について標準的な分子モデリング法により分析することができる。別の態様においては、本発明は、単一の親ペプチドがユビキチン、アシルホスファターゼ、IL−２、カルビンジン及びミオグロビンから得られることを特徴とする多機能性ポリペプチドを提供する。
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも１つの機能性ドメインにそれぞれ結合した２つ以上のアミノ酸配列を含む多機能性ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列の任意の２つ以上のものが相補的な形態で結合して親の未変性構造に類似する三次構造または必要に応じて四次構造を与える、前記多機能性ポリペプチドを提供する。
構造サブドメインが同定されれば、これらのサブドメインを無傷の状態に保ったままタンパク質が切断される。選択工程は、利用できる構造がないが、安定性及び良好な発現の基準を満足するタンパク質にまで拡張できる。このようなタンパク質については、折り畳まれるサブドメインは、折り畳み反応の間のアミド主鎖の水素交換パルス標識とその後の天然の状態のNMR検出により決定できる（Roderら、1988,Nature 355,700−704;Udgaonkar ＆ Baldwin,1988,Science 255,594−597）。また、折り畳みサブドメインは、穏やかなタンパク質分解、変性、断片の精製及びin vitroにおける再構成により同定することができる（Tasayco ＆ Carey,1992,Science 255,594−597;Wuら、1993,Biochmistry 32,10271−10276）。さらに、真核生物タンパク質の場合には、エキソン構造から開裂部位の選択の別の手掛かりが得られる。これはエキソンが（常にではないにしても）タンパク質の構造サブドメインに対応していることが多いことによるものである。これは例えばミオグロビンの場合について論じられている（Go 1981,Nature 291,90）。
適切に組み立てられた分子が生成されることにより、タンパク質ドメインが３つ以上の部分に分割される構造物を有意に減少すると考えられる。これは残存可能な構造を形成するためにはいくつかのサブドメインが同時に一緒にならなければならないという事実によるものである。この効果は、ポリペプチド鎖が折り畳み単位（上記の方法により同定できる）を示すサブドメインに分割されることにより阻害される。従って、最終的に組み立てられた複合体のみならず、組み立ての中間体もが、発現の間に宿主に蓄積するために必要な安定性を有することになり、非常に改善された系の速度論的挙動が得られる。
溶解状態においては、単離されたセグメントは殆ど二次構造を有しておらず、モノマー状態のままであるか、非特異的で一時的な、容易に破壊される凝集物を形成する。別々の発現と精製、または同時の発現により混合したときにのみ、相補的なセグメントの協調した折り畳みが残基の必要な中間相互作用を与え（Matthews,1993,Annu.Rev.Biochem.62,653−683）、これによりコンパクトで未変性構造に類似する構造を生じる。全セグメントの疎水性残基の単一の疎水性コアへの埋没により主として駆動されるこの結合により、in vivoまたはin vitroにおいてＮ−またはＣ−末端に融合したタンパク質の多機能性複合体への標的化された組み立てが得られる。
必要により、再構成された未変性構造に類似する構造は酵素活性または結合活性にも寄与して、組み立てられた複合体のエフェクター機能の数を増加させ得る。従って本発明は、未変性構造に類似する三次構造または四次構造が生物学的活性を与える、上記のような多機能性ポリペプチドも提供するものである。例えば、アシルホスファターゼを結合ドメインの基礎として使用する場合、多機能性ポリペプチドはいくらかのホスファターゼ活性を保持するものと考えられる。
本発明は、多機能性ポリペプチド中に結合される様々なタイプの機能性ドメインを提供する。特に好ましいのは、前記機能性ドメインの１つ以上、好ましくは２つが免疫グロブリンスーパーファミリーの分子に由来するフラグメントである場合である。特に好ましい態様においては、前記フラグメントは抗体フラグメントである。同様に好ましいのは、機能性ドメインの少なくとも１つが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーに由来するフラグメントに関連する生物学的活性以外の生物学的活性を有している場合である。例としては、本発明は、酵素、毒素、サイトカイン、ペプチドホルモン、免疫グロブリン、金属結合ドメイン、可溶性レセプター、レクチン、リポタンパク質、精製テイル及び生物活性ペプチドの、多機能性複合体への標的化された組み立てを提供するものであり（図１）、これは発現ベクター、制限部位、並びに組み立てセグメント、ペプチドリンカー及び機能性ドメインをコードする「プラグイン」（plgu−in）遺伝子カセットのモジュール系に基づくものである（図２）。
低濃度において解離を防ぐためにセグメント間の共有結合が必要である場合は、システインを導入して結合ドメインを含むアミノ酸配列の間にセグメント間ジスルフィド架橋を形成することができる（Eckerら、1989,J.Biol.Chem.264,1887−1893;Pack ＆ Pluckthun,1992,Biochemistry 31,1579−1584）。従って本発明は、成分であるアミノ酸配列の折り畳みが共有結合により安定化された多機能性ポリペプチドを提供する。
結合ドメインと付加された機能性ドメインとの間にいくらかの柔軟性を付与するためには、リンカーペプチドを導入することが望ましい。従って本発明は、少なくとも１つの機能性ドメインが柔軟なペプチドリンカーを介して前記アミノ酸配列に結合する、上記タイプの多機能性ポリペプチドを提供する。例としては、柔軟なリンカーは抗体のヒンジ領域由来のものとすることができる。
本発明は、少なくとも１つの別の（ポリ）ペプチドを前記アミノ酸配列の１つ以上のものに結合することにより、さらに複雑な多機能性ポリペプチドを構築することをも可能とする。例としては、別の（ポリ）ペプチドを、酵素、毒素、サイトカイン、ペプチドホルモン、免疫グロブリン、金属結合ドメイン、可溶性レセプター、レクチン、リポタンパク質、精製テイルから得ることができ、特に、独立した結合体に結合できるペプチド、生物活性ペプチド（好ましくは５〜15アミノ酸残基）、金属結合タンパク質、DNA結合ドメイン、転写因子、及び増殖因子から得ることができる。
治療の目的のためには、タンパク質性物質が示し得る免疫原性は可能な限り最小限のものであることが望ましい場合が多い。従って本発明は、前記アミノ酸配列、機能性ドメイン、または別の（ポリ）ペプチドの少なくとも１つがヒトに由来するものである、上記の多機能性ポリペプチドを提供する。
上記で提供されるペプチド及びタンパク質に加え、本発明は、上記の本発明の多機能性ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列及び必要により少なくとも１つの別の（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列、並びに少なくとも１つの別の機能性ドメインをコードするDNAを挿入するための少なくとも１つ、好ましくは単一のクローニング部位を含むか、または上記の本発明の多機能性ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列及び必要により別の（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列、並びに機能性ドメインをコードするDNA配列のクローニングのための適当な制限部位を含み、機能性ドメインをコードするDNA配列を制限部位に挿入した後の該DNA配列の発現に際し、適当な宿主中で本発明の多機能性ポリペプチドが形成されることを特徴とするDNA配列、ベクター、好ましくはビシストロン性のベクター、ベクターカセットも提供する。好ましい態様においては、前記ベクターカセットは、前記機能性ドメインをコードする挿入されたDNA配列、及び本発明の少なくとも１つのベクターまたはベクターカセットで軽質転換された宿主細胞を含むことを特徴とし、前記多機能性ポリペプチドの製造に使用できる。
別の好ましい態様においては、前記宿主細胞は哺乳動物、好ましくはヒト、酵母、昆虫、植物、または細菌、好ましくは大腸菌細胞である。
本発明はさらに本発明の多機能性ポリペプチドの製造方法を提供するものであり、該方法は本発明の宿主細胞を適当な培地中で培養し、該宿主細胞により産生された前記多機能性ポリペプチドを回収することを含んでなる。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明の多機能性ポリペプチドの製造方法であって、少なくとも２種の本発明の宿主細胞を適当な培地中で培養し、該宿主細胞のそれぞれは少なくとも１つの別の機能性ドメインに結合する第１及び第２のアミノ酸配列の１つのみを産生し、さらにそのアミノ酸配列を回収し、それらを穏やかな変性条件下で混合し、前記アミノ酸配列から本発明の多機能性ポリペプチドのin vitro折り畳みを得ることを含む前記方法に関する。
特定の好ましい態様においては、前記方法は、少なくとも１つの別の機能性ドメインに結合した別のアミノ酸配列が、前記第１または第２のアミノ酸配列を産生しない少なくとも１種の別の宿主細胞により産生されることを特徴とする。
また本発明の別の特に好ましい態様においては、前記方法は、少なくとも１つの別の機能性ドメインに結合した少なくとも１つの別のアミノ酸配列が、前記第１または第２のアミノ酸配列を産生する本発明の宿主細胞により産生されるものであることを特徴とする。
別の好ましい態様においては、本発明は、上記の多機能性ポリペプチドを含む医薬または診断組成物を提供するものであり、前記医薬組成物は必要により製薬上許容し得る担体を含む。さらに本発明は、前記多機能性ポリペプチドの製造に有用な１つ以上のベクターカセットを含むキットを提供する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は説明のために示されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1:組み立てデバイスとしてのセグメント化されたヒトユビキチン
ユビキチンはわずかに76残基（図３）、分子量5kDaのコンパクトな細胞内タンパク質である。これは全ての公知のタンパク質の中で最も高い保存性を示し、そのＣ−末端及びLys48に中間イソペプチド結合を形成することにより細胞内真核生物タンパク質の分解経路に関与している（Hershko ＆ Ciechanover,1992,Ann.Rev.Biochem.61,761−807）。
ユビキチンを組み立てデバイスとして使用するために、３つのＣ−末端残基（−−Arg−Gly−Gly）を切断することにより望ましくない機能を除去することができ、Lys48をArgに変更することによりこの残基に結合したイソペプチド結合の形成を阻止することができる。この改変された配列を次に位置Gly36でループ中で分割し、疎水性コアが２つのセグメントに分かれるようにする（これをα及びβと呼ぶ）。これらのセグメントの合成ヌクレオチド配列（図４、５）は、適当な制限部位（Mro I−Hind III）を末端に有しており、セグメントをコードするカセットは、柔軟性リンカー（hulgG3のヒンジ、図６）をコードするEcoR I−Mro Iカセットに容易に結合することができる。このカセットを、lacプロモーター／オペレーターのもとで抗体McPC603のscFvフラグメントをコードする発現ベクターplG3（EcoR I−Hind III、図７）中に挿入する（Geら、1995,Antibody engineering:A practical approach.IRL Press,New York,Borrebaeck編,229−261）。結合セグメントβに結合した第２の機能性フラグメント（phoAシグナル配列を有する抗−β−ラクタム抗体2H10のsvFcフラグメント）をXba I−Hind III DNA断片として挿入することにより（図８）、ジシストロン性の発現ベクターを得る（Pack,1994、博士論文、Ludwig−Maximilians−Universitat Munchen）。IPTGによる誘導及び翻訳の後、シグナル配列により組み立てセグメントに融合した抗体フラグメントがペリプラズムに誘導され、そこで再構成された未変性構造に類似するユビキチン折り畳みと２種の異なる抗体特異性とを有する複合体に組み立てられる。この二種特異性（bispecific）免疫グロブリンである複合体は細胞抽出物のアフィニティクロマトグラフィーにより回収し精製することができる（Pack,1994,博士論文、Ludwig−Maximilians−Universitat Munchen）。
実施例2:形成されたジスルフィド架橋及びＣ−末端ペプチドリンカーとフレーム内制限部位との組み合わせによる、組み立てデバイスの未変性構成に類似する三次構造の共有結合
分割されていない、天然のユビキチンの配座安定性は、位置４及び66にジスルフィドを導入することにより主鎖に影響を及ぼすことなく増強することができる（Eckerら、1989,J.Biol.Chem.264,1887−1893、図９）。本発明においては、ジスルフィド架橋の形成により、同時の折り畳み及び組み立ての後、セグメントの共有結合が得られる（図10、11）。
組み立てられた複合体中の可能な機能性ドメインの数を増加させるために、Ｃ−末端ペプチドを組み立てデバイスの１つ以上のセグメントに融合することができる。酵素、サイトカイン、抗体フラグメント、精製ペプチドあるいは毒素のような機能性ドメインをこのリンカーに融合するためには、好ましくは独特の制限部位をフレーム内に導入しなければならない（図11）。遺伝子合成、クローニング、発現並びに組み立てられた共有結合した複合体の回収は実施例１のように行うことができる。
実施例3:組み立てデバイスとしてのセグメント化ヒトインターロイキン−２（IL−２）
ヒトインターロイキン−２（Brandhuberら、1987,Science 238,1707−1709;Kuziel ＆ Greene,1991,The Cytokine Handbook.Academic Press,84−100）を、His79及びLys80の間でのセグメント化により組み立てデバイスとして使用する（図12）。Mro I−Asc I−Hind II遺伝子カセットによりコードされたデバイス（図13、14）は、未変性構造に類似するサイトカイン構造の好ましいエフェクター機能及びセグメント間システイン架橋（Cys58−Cys105）を有する低免疫原性の血漿タンパク質の組み立て後に結合する。腫瘍抗原に対する１つ以上の抗体フラグメントをIL6またはIL12のような別のサイトカインと組み合わせたマルチサイトカイン複合体（Rockら、1992,Prot.Eng.5,583−591）は直接腫瘍に向かう。
実施例4:3つのセグメントを有する組み立てデバイスとしてのセグメント化されたヒトアポミオグロビン
２つより多い天然の構造のセグメントを組み立てデバイスとして使用するためには、セグメント間の疎水性界面は非共有結合のための十分な疎水性相互反応を与えるのに十分大きくなくてはならない。ミオグロビン（図15）は、大腸菌中で多量に発現可能である（Guillemetteら、1991,Protein Eng.4,585−592）。６個までの機能性ドメインを３重にセグメント化した構造により組み立てることができ、３つをセグメントのＮ−末端に、３つをＣ−末端に組み立てることができる（図16、17、18）。ヘムの存在により未変性構造に類似するアポミオグロビンの折り畳みがさらに安定化され、多機能性複合体の結合定数を変化させるスイッチとして使用することができる。
実施例5:機能性ドメインとしての生物学的活性ペプチド
LSP−結合タンパク質の両親媒性ループ構造に由来するある種のペプチド（Hoessら、1993,EMBO J.12,3351−3356）は、エンドトキシンを中和することができる。この効果は、これらの短いペプチドが多価を示すことにより増強される（10−15残基、Hoess,未出版の結果）。本発明は、組み立てセグメントに融合したいくつかの短いペプチド（図19）の、多価複合体におけるまたはその他の機能性ドメインとの組み合わせにおける、発現及び組み立ての方法を提供する。ペプチドは、ペプチドリンカーを介して組み立てドメインのＮ−またはＣ−末端のいずれに融合してもよい（図20、21）。
実施例6:機能性ドメインとしてのIMACのための精製テイル
ヒスチジンからなるペプチドテイルは金属イオンを配位できる。それらは固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）において天然のタンパク質を精製するのに使用することができる。精製テイルが多価を示すことによりIMACにより得られる最大の純度がかなり改善される（Lindnerら,1992,Methods:a companion to methods in enzymology 4,41−56）。ポリヒスチジンテイルをコードする１つ以上の遺伝子カセット（図22）を組み立てセグメントに融合することにより、多機能性複合体の簡単で効率的な精製方法が得られる。
実施例7:機能性ドメインとしての血小板凝集阻害剤デコルシン
ヒルのMacrobdella decoraの39残基タンパク質であるデコルシン（図23）は、血小板糖タンパク質II b−III aの強力な拮抗薬として作用する（Seymourら、1990,J.Biol.Chem.265,10143−10147）。デコルシンをコードする遺伝子カセットは結合セグメントのＣ−またはＮ−末端に融合することができる（図24、25）。動脈血栓症において、抗フィブリン抗体フラグメントに結合した多価デコルシン複合体は強力な抗血栓剤として作用し得る。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１９】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１４】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１７】
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【図２４】
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【図１８】
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【図２５】
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