(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を好気的に培地に培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、リン酸分濃度が５０〜３００ｍｇ／ｌ、Ｌ−リジンの含有量が2〜20g/l、硫酸アンモニウムの含有量が１０〜２０ｇ／ｌである培地を用いることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項２】
ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を好気的に請求項１記載の培地にて培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、培養液中のＬ−リジンの含有量が1〜10g/lとなるようにＬ−リジンを培養液中に逐次添加もしくは連続添加することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus ）である請求項１または請求項２のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項４】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus ）No346-D 株のＳ−アミノエチル−Ｌシステインにグリシンを添加したものに耐性を持つ変異株11011A-1株（微工研条寄第1109号）である請求項１または請求項２のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、対炭素源収率を向上させたε−ポリ−Ｌ−リジン（以下εＰＬと略記する）の製造法に関する。
εＰＬは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマ−であるため安全性が高くかつカチオン含量が高いので、特異な物性を有する。したがって食品添加物として広く用いられているだけでなく、トイレタリ−用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、電子材料等への利用も期待できる。
【０００２】
【従来の技術】
ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を用いたεＰＬの製造法が、特公昭59−20359 号公報に、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス菌株をＬ−リシンのアナログ物質に耐性を有する変異株に変異処理して得られた該変異株を培地に培養し、培養液中にεＰＬを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするεＰＬの製造方法が特公平3-78998 号公報に、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス菌株をクロラムフェニコールを用いて、εＰＬの生産に関与する遺伝子を含むプラスミドを増幅させたεＰＬを生産する菌株をＬ−リシンを添加した培地にて培養し、培養液中にεＰＬを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするεＰＬの製造方法が特公平3-42075 号公報に記載されている。しかし上記のεＰＬの製造方法に用いる培地には、Ｌ−リシン、硫酸アンモニウムおよびリン酸分が含まれてはいるが、リン酸分濃度が高く、また、培養液中のＬ−リシン濃度を制御した製造方法はなかった。そこで、εＰＬ以外の副生成物の生産に培地中の炭素源が多量に消費されるため、εＰＬ生産における対炭素源収率が悪く、工業的生産を考えた場合、生産コストが高くなるという問題点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明者らは、対炭素源収率のよいεＰＬの製造法について鋭意検討を重ねた結果、ストレプトマイセス・アルブラス種微生物を培養してεＰＬを発酵生産する際に、培地中のリン酸分濃度を制限し、かつ培地中にＬ−リジン及び硫酸アンモニウムを一定量含有させた培地を用いるか、または培養液中のＬ−リジン濃度を制御して培養することによって、副生成物の生産を抑え、εＰＬの対炭素源収率が向上することを見いだし、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
本発明は、εＰＬ以外の副生成物に消費される炭素源量を抑制し、εＰＬの対炭素源収率を向上させることにより、安価で有利なεＰＬの製造法を提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記の構成を有する。
（１）ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を好気的に培地に培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、培地中のリン酸分濃度が５０〜３００ｍｇ／ｌ、Ｌ−リジンの含有量が2 〜 20g/l、硫酸アンモニウムの含有量が１０〜２０ｇ／ｌであることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（２）ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces albulus）種微生物を好気的に前記第（１）項記載の培地にて培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法において、培養液中のＬ−リジンの含有量が１〜１０ｇ／ｌとなるようＬ−リジンを培養液中に逐次添加あるいは連続添加することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【０００５】
（３）ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus ）である前記第（１）項もしくは第（２）項のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（４）ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus ）No346-D 株のＳ−アミノエチル−Ｌシステインにグリシンを添加したものに耐性を持つ変異株11011A-1株（微工研条寄第1109号）である前記第（１）項もしくは第２項のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【０００６】
本発明に使用できる微生物は、εＰＬを発酵液中に蓄積するストレプトマイセス・アルブラス種の菌株であればいずれも使用可能であり、特に、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)11011A-1株（微工研条寄第1109号）およびストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No346-D株が好ましい。
【０００７】
本発明に使用する培地のＬ−リジンの含有量は、２〜２０ｇ／ｌ、好ましくは５〜１０ｇ／ｌである。Ｌ−リジンの含有量が少ないとεＰＬの生産量が少なくなる。また、Ｌ−リジンの含有量が多過ぎると、菌の増殖が抑制される。また、培地に用いられるＬ−リジンは、塩酸塩あるいは他の塩の形でも差し支えない。本発明に使用する培地の硫酸アンモニウムの含有量は１０〜２０ｇ／ｌである。硫酸アンモニウムを含まない培地では、εＰＬの生産量が著しく低下する。培養中に培養液中の硫酸アンモニウム含有量が低下した場合は、硫酸アンモニウム含有量が２〜２０ｇ／ｌになるように追加するのが好ましい。
【０００８】
培地に添加されるリン酸分は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酵母中に含まれるリン酸塩等どの形でも構わない。
培地に含まれるリン酸分の含有量は、50〜300mg/l、好ましくは、50〜150 mg/l と通常の培地に比べ1/5 〜1/30程度に制限する。リン酸分の含有量が多いと副生成物の生産が多くなり、含有量が少ないと微生物の増殖に影響を及ぼす。
【０００９】
本発明に使用する培地には上記のＬ−リジン、硫酸アンモニウム、リン酸塩の他に、炭素源及びミネラルが用いられる。炭素源としては、好ましくはグルコ−スであるが、その他フラクト−ス、グリセリン、スタ−チ等の、εＰＬ生産菌が資化可能なものなら制限されず、また該炭素源の培地中の含有量としては10〜50g/lが好ましい。培養中に培養液の炭素源含有量が低下した場合は、炭素源含有量が10〜50g/lになるように追加する。ミネラルとしては、カリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等が挙げられ、これらは0.01 〜1 g/lの範囲で培地中に含有することが好ましい。また、培地中に酵母エキスを1 〜5g/l含有させると、菌の生育を良くし、εＰＬの生産においても好ましい結果を与える。
【００１０】
Ｌ−リジンを逐次添加する場合は、培養液中のＬ−リジンの含有量が、例えば1g/l以下になった時に１〜１０ｇ／ｌになるように添加する。また、連続添加する場合は、培養液中のＬ−リジンが常に１〜１０ｇ／ｌになるように添加する。
【００１１】
培養は、好気的条件下で振とう培養、撹拌培養等を行う。培養温度は２５〜３０℃が好ましい。培地のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましいが、培養開始後菌の生育とともにｐＨは低下する。εＰＬの生産には培地のｐＨが４付近が好ましいので、培養液のｐＨが４以下に低下した時点で、アルカリを添加してｐＨを４に維持させる。添加するアルカリはアンモニア水が好ましいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの水溶液等でも差し支えない。通常１〜５日間でεＰＬが培養液中に蓄積される。
【００１２】
遠心分離あるいはフィルタ−で上記培養液から菌体を除いた後、菌体除去液を精製、脱色し、これを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノ−ル等の有機溶媒で晶析することにより、εＰＬが得られる。
【００１３】
実施例
本発明を実施例より更に詳細に説明する。
εＰＬ濃度、残存グルコ−ス濃度、残存Ｌ−リジン濃度を以下の方法により測定した。
（１）εＰＬ濃度をイツアキ（Itzhaki)（アナリティカルバイオケミストリー  (Analytical  Biochemistry),50,569) の方法により測定した。すなわち、０〜２００μｇのεＰＬを含む溶液２ｍｌと１ｍＭメチルオレンジ水溶液２ｍｌとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたεＰＬ−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の４６５ｎｍにおける吸光度を測定し、εＰＬ量を求めた。
【００１４】
（２）残存グルコ−ス濃度を、ムタロタ−ゼ・グルコ−スオキシダ−ゼ法、すなわち、試料（グルコースを０〜１００μｇ含む）２０μｌに発色試薬（ムタローゼ0.13ユニット／ｍｌ、グルコースオキシダーゼ9.0ユニット／ｍｌ、ペルオキシダーゼ0.65ユニット／ｍｌ、４−アミノアンチピリン0.50ｍＭ、アスコルビン酸オキシダーゼ2.7ユニット／ｍｌを添加したフェノール５．３ｍＭを含む６０ｍｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．１)）３ｍｌを混合し、３７℃で５分間加温後、５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、求めた。
（３）残存Ｌ−リジン濃度を、Ｌ−リジン−α−オキシダ−ゼ法で測定した。すなわち、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌに７０ｍＭフェノール１００μｌ、３０ｍＭ４ーアミノアンチピリン１００μｌを加え、さらに０〜３００μｇのＬ−リジンを含む溶液４５０μｌを加え混合した後、１２０ユニット／ｍｌのパーオキシダーゼ５０μｌを加え、３０℃で２０分間加温した後に、５００ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。
【００１５】
実施例１
グルコ−ス50g/l、酵母エキス 5g/l（リン酸濃度として約100mg/l 含有) 、硫酸アンモニウム10g/l、Ｌ−リジン10g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、ZnSO4・7H2O 0.04g/l、FeSO4・7H2O 0.03g/l  pH6.8 の培地２Ｌを調整し、３Ｌ容ジャ−に入れ、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)11011A-1株（微工研条寄第1109号）を接種し、３０℃、７００rpm で９６時間好気培養を行った。
発酵液を遠心分離によって除菌した後、上澄水のεＰＬ濃度、残存グルコ−ス濃度、残存Ｌ−リジン濃度を測定した。
その結果、εＰＬの対炭素源収率は２２％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.51g/g・dry cell/dayであった。
【００１６】
実施例２
Ｌ−リジン含有量を 5g/lとした以外は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は２２％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.50g/g・dry cell/dayであった。
【００１７】
実施例３
Ｌ−リジン含有量を 2g/lとした以外は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は１８％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.44g/g・dry cell/dayであった。
【００１８】
実施例４
KH2PO4 0.2g/lを添加する（全リン酸濃度として240mg/l 含有）こと以外は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は１４％であった。また菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.40g/g・dry cell/dayであった。
【００１９】
実施例５
ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)11011A-1株の代わりに、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No346-D株を用いた以外は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は１５％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.35g/g・dry cell/dayであった。
【００２０】
実施例６
培養時間を２８８時間とし、培養液中のグルコース含有量が10g/l以下に、硫酸アンモニウム含有量が5g/l以下に、またＬ−リジンの含有量が1g/l以下にならないように、それぞれを逐次添加した。それ以外の条件については実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は２６％となった。
【００２１】
比較例１
グルコ−ス50g/l、酵母エキス 5g/l（リン酸濃度として約100mg/l 含有) 、硫酸アンモニウム10g/l、K2HPO4 0.8 g/l、KH2PO4 1.36g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、ZnSO4・7H2O 0.04g/l、FeSO4・7H2O 0.03g/l pH 6.8 の培地２Ｌを調整し、実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は８％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.28g/g・dry cell/dayであった。
【００２２】
比較例２
Ｌ−リジン10g/lを添加すること以外は比較例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は９％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.31g/g・dry cell/dayであった。
【００２３】
比較例３
K2HPO4 及び KH2PO4 を添加しないこと以外は比較例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は１０％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.32g/g・dry cell/dayであった。
【００２４】
比較例４
Ｌ−リジン10g/lを添加し、硫酸アンモニウムを添加しないこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は３％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.04g/g・dry cell/dayであった。
【００２５】
比較例５
ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) 11011A-1 株の代わりに、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No346-D株を用いた以外は、比較例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は５％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.22g/g・dry cell/dayであった。
【００２６】
比較例６
Ｌ−リジンを追加しないこと以外は、実施例６に準拠して培養を行った結果、εＰＬの対炭素源収率は１９％であった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の製造法により、副生成物の生産を抑制し、εＰＬの対炭素源収率を従来の２〜３倍に高めることが可能となり、収率よくεＰＬを製造することができる。