(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＦＡ／１、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６からなる群から選択されるコロニー化因子抗原の少なくとも１つのタイプをコードし、かつ該コロニー化因子抗原の生産に対して温度調節的手法で発現される、プラスミド内の遺伝子を有するEscherichia coli（ＥＴＥＣ）バクテリアの培養方法であって、
このバクテリアがそのプラスミドを保持し、かつなんらの発現も起こさない室温で該バクテリアを先ず培養基中で接種物へと培養し、次いで、
発現が起こる３４〜３９℃で上記接種物を培養基中でさらに培養し、該バクテリアを、そのプラスミドを失う前に収集することを特徴とする、培養方法。
【請求項２】
上記コロニー化因子抗原を、収集したバクテリアから単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記室温が約２０℃である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
接種物への最初の培養を、先ず培養平板上で、次いで液体培養基中での２段階工程で行なう、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
さらなる培養を液体培養基中で行う、請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該ＥＴＥＣバクテリアが、ＣＳ２およびＣＳ３を発現する能力を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該ＥＴＥＣバクテリアが、ＣＳ４を発現する能力を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該ＥＴＥＣバクテリアが、ＣＳ１を発現する能力を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該ＥＴＥＣバクテリアが、ＣＳ５を発現する能力を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらなる培養を３７℃で行う、請求項６ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技  術  分  野
本発明はバクテリアの培養方法に関するものである。一層詳細には、その方法は表面もしくは膜結合抗原類または他のタンパク質ををコードし、かつ所望のバクテリア産物の生産に温度調節的手法（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で発現される、プラスミド内遺伝子を有するバクテリアの培養に関する。
背  景  技  術
バクテリアおよびウイルスはしばしばそれらの膜上または膜中にタンパク質を発現し、このタンパク質はある種の環境では生物に対する支持体として機能して特異の方式で、ある表面に結合または粘着する。かかる表面とは、ヒトまたは動物体内の胃腸管、食道または他の生物学的表面もしくは膜のいずれかの内壁であり、ここで生物は成長に対する最適環境を見いだすことができる。この種の膜タンパク質はしばしばコロニー化因子抗原（ＣＦＡ）（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）またはフィムブリエ（毛縁）と命名される。文献中では、ピリ（ｐｉｌｉ）、血球凝集素、糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）もしくは小繊維状（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）タンパク質等の他の用語が上記と同一種の物質に対して用いられる。便宜上、ここでは“ＣＦＡ”なる用語は、抗原的性質をも有し得る、これらすべての種類の膜タンパク質を網羅するものとして用いる。
医学上重要性がある多くのバクテリアは、それらの膜と結合するＣＦＡを生産することで知られている。これらの中で人類にとって最も重要なものは、ヒト胃腸管および呼吸気道にコロニーをつくる生物である。胃腸管にコロニーをつくる生物の例としては、エンテロトキシン生成のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａが挙げられる。
医学的に特に重要性があるのはエンテロトキシン生成のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）であり、その理由は発展途上国における子供達の間の下痢の主原因の１つであり、かつ年間１０億（１  ｂｉｌｌｉｏｎ）以上の下痢の再発と、主として子供達の間で年間少なくとも百万人の死亡者が数えられるからである。同様に、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは発展途上国の人々の間に下痢を起こす。またＥＴＥＣおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、これらの地域への旅行者間での下痢の主原因でもある。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ Ｐｙｌｏｒｉは、その胃潰瘍との関連で近年重要になっている。
これらの生物のほとんどの場合、それらのＣＦＡｓの生産は環境中の各種要因により制御され、一方でこれらはプラスミドＤＮＡ中の調節遺伝子を活性化し得る。
このように、ヒト腸内に自然成長環境をもつバクテリアの場合、この腸における条件に対してその成長および生存可能性を最適化することは有利である。換言すれば、生存の最適戦略が存在し、このことは生存に適する条件を備えた環境中での粘着性タンパク質の生産を暗に意味している。
文献から知られるように、調節プラスミド遺伝子を活性化するような一つのパラメーターは温度であり、このことは多数のバクテリアにおけるＣＦＡｓの生産は温度調節的であることを暗示している。数種のヒト病原性生物は室温より上の温度のみでＣＦＡｓを生産し、かつ室温では生産しないことが判っている。これら生物のある種のものは、これらの生物またはバクテリアに対する経口ワクチンの生産が可能であることが判明しているので、特別に商業的重要性がある。
ＷＯ９２／１４４８７号公報中には、経口ＥＴＥＣワクチンの生産方法および使用方法が開示されている。ＣＦＡｓおよびそれらのサブ構成部分（ＣＳ−抗原）を伴うＥＴＥＣバクテリアを商業的量で得るために、ＥＴＥＣバクテリアを寒天平板から液体培地にまでの範囲で３７℃で成長させる。引き続いてホルマリン死滅したこれらのバクテリアはＥＴＥＣバクテリアに対する経口ワクチンとして使用することができる。かくして、このＣＦＡおよびＣＳ抗原類は腸で生起する免疫プロセスにおける抗原として機能する。ＣＦＡｓを有するＥＴＥＣバクテリアの生産を大規模化において、このバクテリアは各新世代毎にますますＣＦＡ生産能力を喪失するという意外な事実を見い出した。この原因の研究において、室温より上の温度でＣＦＡを生産するバクテリアの能力の喪失は、バクテリア中のプラスミドに局在する調節遺伝子の喪失に伴って起きることが認められた。
発明の説明
本発明は表面もしくは膜結合抗原または他のタンパク質をコードし、かつ所望のバクテリア産物の生産に対して温度調節的手法で発現される、プラスミド内遺伝子を有するバクテリアの培養方法に関するものであり、この培養方法では、このバクテリアがそのプラスミドを保持し、その上なんらの発現も起こさない温度条件下で上記バクテリアを培養基中で先ず接種物へと培養し、次いで、発現が起きる温度条件下で上記接種物を培養基中でさらに培養し、バクテリアを、それらのプラスミドを失う前に収集し、さらにその後、所望の産物を単離する。
他のタンパク質をコードし、かつ所望のバクテリア産物の生産について温度調節的手法で発現する、プラスミド内の遺伝子の例は、それらの温度調節的発現を保持し、かつ所望のタンパク質産物を生産する、プラスミド内の組み換え遺伝子である。
好ましい一つの実施態様では、接種物への最初の培養は室温で行い、さらなる培養は哺乳動物の体温で行う。
他の好ましい実施態様では室温は約２０℃であり、かつ哺乳動物の体温は３４〜３９℃である。
さらに他の好ましい実施態様では、接種物への最初の培養は、まず培養平板上で、次いで液体培養基中での２段階で行う。
本発明のさらに好ましい他の実施態様では、さらなる培養を液体培養基中で行う。
本発明のこれら好ましい実施態様は、表面もしくは膜結合抗原または他のタンパク質をコードし、かつ所望のバクテリア産物の大量生産について大規模な工業的醗酵槽中で温度調節的手法で発現される、プラスミド内遺伝子を有するバクテリアの培養を可能にする。
本発明の一つの実施態様では、この培養されるバクテリアは、ＣＦＡ／１、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６からなる群から選択された少なくとも一つのタイプのコロニー化因子抗原（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。
かかる培養における所望のバクテリア産物は、コロニー化因子抗原ＣＦＡ／１、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６の少なくとも１つを有するＥ．ｃｏｌｉであるか、またはこのバクテリアから単離した、このようなコロニー化因子抗原のいずれかである。
表１の簡単な説明
表１は２０℃、２０＋３７℃、および３７℃においてＣＳ２＋ＣＳ３を発現するＥＴＥＣ−菌株の培養について説明するものである。
実  施  例
次の実施例において、ＣＦＡ培地を培養基として用いた。液体ＣＦＡ培地の組成は次のようである：カザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）１％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物０．０７８％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ4０．４ｍＭ、ＭｎＣｌ2０．０４ｍＭ、脱イオン化Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．４。培養平板としてＣＦＡ寒天平板を用いた。これらにはＣＦＡ培地が添加寒天２０ｇ／Ｌと共に含まれている。
実施例１
ＣＳ２＋ＣＳ３抗原を発現するＥＴＥＣ株を−７０℃から採取し、膜構成部分の発現については次のように評価した。
ＣＦＡ寒天平板にＣＳ２＋ＣＳ３株を接種し、２０℃または３０℃で２４時間培養した。このバクテリアを平板から収集し、それぞれ４０×１０6バクテリアを含む複数試料を、８００ｍＬ（ＣＦＡ培地）に接種して、２０℃または３７℃において振盪培養中でさらに２４時間培養した。７０時間で４．５ｍＬの試料を２０℃培地から採取し、これを８００ｍＬ震盪培養（ＣＦＡ培地）中、３７℃でさらに培養した。異なった間隔でＣＳ２の発現を、ＣＳ２抗原に対して特異性を示すことが判っているモノクロナール抗体を用いたＥＬＩＳＡ手法を用いて分析した。すべてのＥＬＩＳＡ結果は、それらの光学濃度により測定されるような標準化されたバクテリア量に調整した。ＥＬＩＳＡ−任意ユニット（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ）において測定された結果を表１に示す。
0003675824.tif 000002
実施例２
実施例１と同じ条件下で、ＣＳ４抗原を有するＥＴＥＣバクテリアを液体ＣＦＡ培地中で成長させた。３１時間でのサンプリング後、温度を３７℃に高めた。
ＥＬＩＳＡ−任意ユニットで測定した結果を表２に示す。
0003675824.tif 000003
実施例３
実施例１と同じ条件下で、ＣＳ５抗原を有するＥＴＥＣバクテリアを液体ＣＦＡ培地中で成長させた。３１時間でのサンプリング後、温度を３７℃に高めた。
ＥＬＩＳＡ−任意ユニットで測定した結果を表３に示す。
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実施例４
抗原ＣＳ１を発現するＥＴＥＣバクテリアの培養を震盪器上、３７℃で一夜、液体ＣＦＡ培地中で成長させた。コロニーをＣＦＡ寒天上にプレーティングし、３７℃で一夜インキュベーションした。翌日、ＣＳ１フィムブリエを発現するコロニーが第２抗体としてのＣＳ１特異的マウスモノクローナル抗体を用いたコロニーブロット法により検出された。イムノブロットはニトロブルーテトラソディウム塩染色により展開された。個々のＣＳ１フィムブリエ陽性および陰性のコロニーを取り上げ、上記のようなＣＦＡ寒天平板上に拡げて培養した。
この時点で各平板は、上記のようなＣＳ１特異的モノクロナール抗体の場合の１つのフイルターでプローブされ、また２つの放射性標識された（３２Ｐ）プローブの１つを用いたコロニーハイブリッド形成法に使用した１つのフイルターでもプローブされた。１つのプローブはＣＳ１（ｃｏｏＡ）の構造遺伝子に対して特異的で、１プローブは調節ＲＮＳタンパク質（ｒｎｓ）に対して特異的である。
陽性のコロニー：抗体評価で陽性と記録されたすべてのコロニーはｒｎｓプローブおよびＣＳ１プローブを用いても陽性として記録された。
陰性のコロニー：抗体で陰性と記録されたコロニーのいずれもｒｎｓプローブとの反応性を示さず、若干の陰性のコロニーはＣＳ１プローブとの反応性も失っていたが、しかし大多数はそれらのＣＳ１構造遺伝子を保持していた。
結論的に、ＣＳ１抗体反応性（ＣＳ１フィムブリエの発現）の喪失およびｒｎｓプローブとの反応性の喪失（ｒｎｓ遺伝子をコードするプラスミドの喪失）の付随的喪失がある。