(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示される蛋白質の全部を含むものからなるＭＤＣ蛋白質。
【請求項２】
配列番号３に示される蛋白質の全部を含むものからなるＭＤＣ蛋白質。
【請求項３】
配列番号６に示されるＤＮＡの全部を含むものからなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号７に示されるＤＮＡの全部を含むものからなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号９に示される、エクソン／イントロンを含むＤＮＡの全部を含むものからなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３、４または５のいずれかに記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項７】
請求項６記載のプラスミドを保持する形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含む請求項１または２のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項１または２のいずれかに記載の蛋白質と結合する抗体。
【請求項１０】
請求項３、４または５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むプライマーまたはプローブ。
【請求項１１】
請求項１０記載のプライマ−またはプロ−ブを被検ＤＮＡとハイブリダイズさせることを含む遺伝子解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＭＤＣ蛋白質、それをコードする遺伝子ＤＮＡおよび該ＤＮＡを用いる遺伝子解析法に関し、医療、診断等の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
癌の発症には細胞の蛋白質の変異が重要な役割を演ずるという考え方は古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。
これまでに細胞の癌化、癌細胞の異常増殖に関与すると考えられている蛋白質をコードする遺伝子（癌遺伝子）の解析、同定が進み、その数は数十に及んでいる。一方これと反対に作用するもの（癌抑制遺伝子）がここ数年脚光を浴びており、これまでに癌抑制遺伝子として、網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子（Friend,S.H.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9095, 1987)、大腸癌のｐ５３遺伝子（Lane,D.P. et al., Nature, 278, 261, 1979) およびＡＰＣ遺伝子( Kenneth,W.K., et al, Science  253, 661, 1991)、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子(Call,K.M. et al., Cell, 60, 509, 1990) などが発見されており、 ｐ５３遺伝子の場合には、変異遺伝子を家系を通じて伝えている例がある（”Li-Fraumeni 症候群”(Makin, D. et al, Science 250, 1233, 1990; Srivastava,S. et al, Nature 348, 747, 1990 ) ）ことが知られている。また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子、癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。それらの発見、解明は研究、臨床の専門家はもとより全世界の人々から期待されているところである。
【０００３】
乳癌は遺伝性（家族性）乳癌と非遺伝性（散発性）乳癌に分けられ、遺伝性乳癌は発症年齢の区分から早発型と晩発型に分けられる。このうち少なくとも遺伝性で早発型の乳癌においては、家系解析によって第１７番染色体のごく一部が欠けている頻度が極めて高いことが明らかとなっている（ Hall,J.M. et al., Science, 250, 1684-1689, 1990) 。また、これと同じ部位は遺伝性卵巣癌でも高頻度に欠失していることが示されている( Narod,S.A. et al., Lancet, 338,82-83,1991)。
従って、この欠失部位に癌抑制遺伝子が存在し、その欠損や変異によってひき起こされる蛋白質の欠損や異常が乳癌や卵巣癌の原因の一つであると考えられている。
また一般の（散発性）乳癌の発生においても、この部位の遺伝子の後天的な変異や欠損による蛋白質の異常や欠損が起こり、その細胞が癌となるケースとして関与しているものと考えられている（Sato et al.,Cancer Res.,51, 5794-5799,1991) 。このためこの部位に存在する原因遺伝子を単離し、蛋白質を同定することは、今や世界中の医師や研究者のみならず一般の人々、特に乳癌患者の多い欧米では女性にとって切実な問題として期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、乳癌および卵巣癌に関わる新規な蛋白質と、それをコードする遺伝子、さらにそれらを用いた癌の検査方法、診断方法等を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト第１７番染色体のＤＮＡ断片を導入したコスミド・クローンを多数作成した。さらにその多数のコスミド・クローンについて、そのＤＮＡ断片をプローブとした蛍光 in situ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法；Inazawa et al., Genomics, 10, 1075-1078, 1991 ）によって染色体上での存在位置を決定した。これら染色体上の位置を決定したコスミド・クローン（コスミド・マーカー）によって第１７番染色体についての非常に詳細な物理的染色体地図を作成した。プローブとした各コスミドのクローン名と、決定された染色体上の位置についての一覧を表１〜３および図１に示した。図１ではクローン名はクローン番号でのみ示してある。
【０００６】
【表１】
0003670030.tif 000002
【０００７】
【表２】
0003670030.tif 000003
【０００８】
【表３】
0003670030.tif 000004
【０００９】
これらのマーカーの中から、個体によって制限酵素断片の長さが異なる性質（ＲＦＬＰ：Restriction Fragment Length Polymorphism：制限酵素断片長多型）を持つもの、すなわちＲＦＬＰマーカーを選び出した。表４〜６に、選ばれたマーカークローンと、使用する制限酵素名、およびそれによって検出される複数種の断片の具体的断片長を記載した。
【００１０】
【表４】
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【００１１】
【表５】
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【００１２】
【表６】
0003670030.tif 000007
【００１３】
ＲＦＬＰマーカーは、これを用いることによって両親から受け継いだ２本の相同染色体を多型性の差により識別できる（ informative，ただし、両方が同じ多型パターンを示す場合には識別できない： not informative  ）という特徴を有している。この２本の相同染色体の多型性パターンの差（ヘテロ接合性）が、正常組織で存在し、癌組織で消失している現象（ＬＯＨ：loss of heterozygosity) が検出されることは、片方の染色体でそのＲＦＬＰマーカー部位が欠失していることを意味する。また一般的に、一対の染色体のうち一方の欠失と他方の変異などによる両方の染色体上の癌抑制遺伝子の不活化が癌化につながるものと考えられており、多くの癌に共通して欠失している領域に癌抑制遺伝子が存在しているものと考えられている。
本発明者らは、このようにして得た詳細な染色体地図とＲＦＬＰマーカーを使用して、約３００例の乳癌と約１００例の卵巣癌について第１７番染色体のＬＯＨを調べた結果、ヘテロ接合性が識別可能なケースにおいて、１７ｑ２１付近のｃＣＩ１７−７０１とｃＣＩ１７−７３０の二つのコスミド・マーカーの間の領域（２．４ｃＭ）が高頻度に欠失していることが明らかとなった。
卵巣癌における第１７番染色体染色体長腕の部分的欠失を図２に示した。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
乳癌における第１７番染色体染色体長腕の部分的欠失を図３に示した。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【００１４】
この領域は遺伝性乳癌の家系解析から原因遺伝子の存在が示唆されている領域と一部が重なりあっていた。両者の重なりあう領域の中のコスミド・クローンをプローブとして、６５０例の乳癌症例における変異を、サザンブロット解析によって調べたところ、２例において、上記で選別されたコスミド・クローンｃＣＩ１７−９０４に含まれるＤＮＡの一部の領域が数倍に増幅していることが明らかとなった。この異常について詳細に調べたところ、約６〜９Ｋｂの断片が４〜６コピー程度の異常な繰り返しとしてつながっていることが分かった。さらに、このコスミド・クローンの制限酵素断片のうち種を越えて保存されている配列を有する断片をプローブとして、ｃＤＮＡ（メッセンジャーＲＮＡから逆翻訳された相補配列ＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングした結果、新規な蛋白質をコードする遺伝子を単離した。この遺伝子の配列構造を決定し、乳癌についての遺伝子異常の有無を調べたところ、明らかな遺伝子変異が同定された。これらのことから、本蛋白質の欠損や異常およびこれをコードする遺伝子ＤＮＡの欠失や変異が乳癌・卵巣癌の発生に深く関与していることが明らかとなった。
上記の、マーカー群から該遺伝子の単離までの過程、さらに乳癌組織で遺伝子の異常が起きていた箇所を図４に示した。クローン名はクローン番号でのみ示してある。
【００１５】
本発明は、例えば本蛋白質の欠損や異常の有無あるいはそれをコードする遺伝子の欠失や変異の有無を調べることによって、少なくとも、乳癌・卵巣癌の一部についてのリスク診断、早期発見、経過観察、治療方針の決定、予後の推定などの困難な問題に対する解決方法と材料を提供し、この分野の技術を飛躍的に進歩させ得るという点できわめて重要である。
すなわち本発明は、（１）配列番号１、２、３または４に示されたアミノ酸配列を有する蛋白質の、全部または一部を含むものからなる蛋白質、（２）配列番号５、６、７、８または９に示された塩基配列を有するＤＮＡの全部または一部を含むものからなるＤＮＡ、（３）配列番号５、６、７、８または９に示された塩基配列を有するＤＮＡの、全部または一部を組み込んだプラスミド、該プラスミドで形質転換された宿主細胞および該宿主細胞培養物より発現産物を回収することを含む蛋白質の製造方法、（４）配列番号１、２、３または４で表される蛋白質の全部または一部を含むものを抗原とする抗体、（５）配列番号５、６、７、８または９で表されるＤＮＡ配列の一部を含むプライマー、プローブまたはマーカー、またはこれらを使用することを特徴とする遺伝子解析方法、からなる。これら蛋白質とＤＮＡに関しては、それと実質的に同等であるものも本発明に含まれる。
【００１６】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）ｃＤＮＡクローンの単離
ヒト第１７番染色体のコスミド・クローンは、例えばヒト第１７染色体だけを含むヒト−マウスの雑種細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、時野らの報告した方法(Tokino et al., Am.J.Hum.Genet., 48, 258-268, 1991) により、その染色体ＤＮＡ断片をｐＷＥＸ１５などのベクターに組み込むことにより作成することができる。この中から、全ヒトＤＮＡをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行って、ヒト染色体由来の挿入配列（インサート）を持つクローンを選び出すことができる。
こうして得られるヒト第１７染色体由来ＤＮＡを含む多数のコスミド・クローンについて、ＦＩＳＨ法により、染色体上の位置を決定してマーカーとし、詳細な物理的染色体地図を作成することができる。また、制限酵素を用いて切断した断片長のパターンからＲＦＬＰマーカーを選別することができる（Nakamura et al., Am.J.Hum.Genet.43, 854-859,1988) 。この地図とＲＦＬＰマーカーを利用して癌患者癌組織のＤＮＡについてＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）を調べ、癌組織における染色体上の共通欠失領域を第１７番染色体のｑ２１付近のきわめて小さい領域に限局化することができる。
この限局化された領域内に存在するコスミド・クローンをプローブとして癌組織ＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより、癌組織における遺伝子異常に関わっている配列を有するクローンを選択することができる。さらにコスミド・クローンの制限酵素断片をプローブとして、種々の哺乳動物の染色体ＤＮＡに対するサザンブロット法を行うことにより、種を越えて保存されている基本的な細胞機能に関わるＤＮＡ配列を含む断片を選択することができる。重要な蛋白質をコードしているＤＮＡ配列領域は種を越えて保存されていることが多く、実際、現在までに単離された遺伝性疾患の遺伝子はその多くが種を越えて保存されている（Call,K.M. et al. Cell, 60, 509-520, 1990）。
このようにして得られたＤＮＡ断片をプローブとして用いることにより、ヒト第１７番染色体のｑ２１付近の限局化された領域に存在する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングすることができる。ｃＤＮＡの塩基配列は常法に従って決定することができる（Maniatis,J. et al. Molecular Cloning 2nd.ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.1989)。
このようにして得られた遺伝子ＤＮＡのクローンは、その配列についてのＳＳＣＰ法( Orita,M. et al, Genomics, 5, 874-879, 1984 )( Orita,M. et al. Cell, 60, 509-520, 1990 ) 、RNase Protection法( Winter, E., Perucho,M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575-7579, 1985 )( Myers,R.M., et al. Science, 230, 1242-1246, 1985 ) などを用いた癌患者での異常の有無、異常の出現頻度の検索により、目的の原因遺伝子のクローンであることを確かめることができる。
【００１７】
（２）遺伝子の全構造の確認
上記の方法により得られたｃＤＮＡは、配列番号６および７の新規なＤＮＡ配列であることが確認され、対応する配列番号２および３のアミノ酸配列が判明した。さらに５′ＲＡＣＥ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって、配列番号８に示されるＤＮＡ配列と対応する配列番号４に示されるアミノ酸配列が明らかにされた。さらに染色体ＤＮＡについては、もとのコスミドクローンｃＣＩ１７−９０４の塩基配列を解析し、ｃＤＮＡの塩基配列と比較することによって、イントロン−エクソン結合部が確認され、イントロン／エクソンを含む配列番号９の構造が明らかにされた。
本発明者らは、これらすべてに共通のアミノ酸配列であるところの配列番号１で示される配列の全部または一部を含む蛋白質をＭＤＣ蛋白質と命名し、以下ＭＤＣ蛋白質と記載する。同様に配列番号５には、ＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡに共通のＤＮＡ配列が示されている。
本発明のＤＮＡは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、遺伝子解析、診断に利用することができる。「一部」とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列と相補的な少なくとも約６個の塩基配列からなり、好ましくは少なくとも約８個の塩基配列、さらに好ましくは約１０〜１２個の、さらに好ましくは約１５〜２５個の塩基配列からなる対応するポリヌクレオチドを意味する。
このＤＮＡがコードするＭＤＣ蛋白質は全部または一部をエピトープとして用いて、抗体の作成およびその抗体を用いる研究用、診断用試薬として利用することができる。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも５個のアミノ酸で構成される。（例えば、６個のアミノ酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは公知である。公表特許公報60-500684 号）ＭＤＣ蛋白質の一部とは、本発明のＭＤＣ蛋白質の連続するアミノ酸配列を有する少なくとも約３〜５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。また約２０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであっても使用できることは言うまでもない。
「実質的に同等である」とは、ＭＤＣ蛋白質およびその一部からなるものにおいて、それらのアミノ酸配列が１つまたは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入を伴うものであって、ＭＤＣ蛋白質を用いる研究、診断に同等の効果を奏するものを意味し、これら均等物も本発明に含まれる。また本発明のＤＮＡの場合も、「実質的に同等である」とは上記蛋白質の場合と同様の意味（ただし、１つまたは複数個の塩基配列の置換、欠失、挿入を伴うもの）を示すものである。
【００１８】
（３）組換え発現ベクターとその形質転換体
上記記載の方法により得られたヒトＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡあるいはその断片を適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することにより形質転換体を得ることができる。これを常法により培養し培養物よりヒトＭＤＣ蛋白質を大量に生産することができる。さらに具体的には、ヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡまたはその断片を、その発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組換え発現ベクターを作成することができる。使用できるベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドｐＲＢ３２２，ｐＵＣ１８，枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０，酵母菌由来のプラスミドｐＲＢ１５，ファージベクタ−λｇｔ１０，λｇｔ１１あるいは動物ウイルス由来のベクタ−ＳＶ４０などが挙げられるが宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。プロモーターおよびターミネーターに関してもヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。用いるＤＮＡはヒトＭＤＣ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでも良く、配列番号１、２、３または４記載の塩基配列に限定されるものではなく、意図的であるか否かにかかわらず塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また化学合成によって合成されたものでも良い。
【００１９】
このようにして得られた組換え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 154, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からのＭＤＣ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２０】
（４）抗体の作成
抗体は、ＭＤＣ蛋白質の全部あるいは一部分を抗原として、通常の方法で作成することができる。例えば、ポリクローナル抗体はマウス、モルモット、ウサギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離して作製する。なお、市販のアジュバントも使用できる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＭＤＣ蛋白質で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から調製することができる。
抗原とするＭＤＣ蛋白質は必ずしも全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチド、その変異体、誘導体、あるいは他のペプチドとの融合ペプチドであってもよく、調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
これら抗体はヒト生体試料中のＭＤＣ蛋白質の同定や定量を可能とし癌診断試薬などに使用できる。
ＭＤＣ蛋白質の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。
【００２１】
（５）ヒト癌組織の遺伝子解析
遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織、各種ヒト癌組織をはじめヒト血液、体液、分泌液などを用いることができる。ＤＮＡの抽出・調製は、たとえば（Sato T., et al. Cancer Res., 50, 7184, 1990 ）の方法で行う。
本発明により提供されるヒトＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片をプローブとして、または該遺伝子ＤＮＡの中から適切な位置の塩基配列を適宜選択し、その合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより該遺伝子の変異の有無を解析することができる。
また、試料中の該遺伝子における挿入、欠失などの異常もこれらの解析により検知することができる。
選択する塩基配列の部位は該遺伝子のエクソン部分、イントロン部分あるいは両部分の結合部分など、いずれも選択し得る。また用いる塩基配列を人為的に改変したものを用いることができるのは言うまでもなく、これにより対応する遺伝子変異を検出することができる。
解析の方法としては、例えば選ばれた２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で部分配列を増幅させ、増幅産物の塩基配列を直接解析するか、あるいはこの増幅産物を前記と同様にプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することができる。あるいはまた、Ligase Chain Reaction 法(Wu et al., Genomics, 4, 560-569, 1989) 、さらに、変異配列特異的ＰＣＲ法(Ruano and Kidd, Nucleic Acid Research, 17, 8392, 1989) 、(C.R.Newton et al., Nucleic Acid Research, 17, 2503-2517, 1989) を利用することにより試料中の該遺伝子の特定の変異の有無を直接検出することができる。
また同様に、選ばれたＤＮＡ配列あるいはこれに由来するＲＮＡ配列を含むプローブを用いて、ＳＳＣＰ法、RNase-Protection法により点突然変異の検出を行うことができる。またこれらのプローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の変異の検出、ノーザンハイブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の発現量の異常を検出することができる。
【００２２】
なお、このＭＤＣ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドを保有するEscherichia coli DH5/pBR1 、Escherichia coli XL1-Blue MRF'Kan/pCR-5P2 、および該遺伝子の染色体ＤＮＡを含むコスミドを保有するEscherichia coli 490A/cCI 17-904は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託番号FERM BP-4286、FERM BP-4555、FERM BP-4287、として平成５年４月２８日、平成６年２月８日、平成５年４月２８日寄託された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の、ヒトＭＤＣ蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの、全部またはその一部を含むものは、癌の研究試薬、検査・診断試薬および治療薬として期待される。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）ヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンの単離と染色体地図の作成
時野らの方法(Tokino et al., Am.J.Hum.Genet., 48, 258-268, 1991) によりヒトの正常細胞とマウスの株化細胞とを融合させた雑種細胞の中から、ヒト染色体のうち第１７番染色体のみを保有するヒト・マウス雑種細胞株（ＧＭ１０３３１）を選択した。この雑種細胞株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで適度に切断し、断片の末端をｄＡＴＰとｄＧＴＰを用いた部分的フィルインによって処理した。このうち３５〜４２ｋｂのサイズの断片を分画し、予め制限酵素ＸｈｏＩで切断し同様に末端をｄＣＴＰとｄＴＴＰを用いた部分的フィルインによって処理したコスミドベクターｐＷＥＸ１５に挿入した。こうして得られたコスミド・クローンの中から、32Ｐラベルしたヒト染色体ＤＮＡをプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法で、ヒトのＤＮＡ断片を含むクローンを選び出すことによって３４２個のヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンを単離した。
これらそれぞれのヒト第１７番染色体特異的コスミド・クローンについて、そのＤＮＡ断片がハイブリダイズする染色体上の位置をＦＩＳＨ法(Inazawa et al., Genomics, 10, 1075-1078, 1991) によって決定し、第１７番染色体の物理的染色体地図を作成した（表１〜３）（図１）。
染色体上の位置を決定したコスミド・クローン（コスミド・マーカー）について、ＲＦＬＰを検出しうるか否かを、６人の非血縁者のＤＮＡを用い、既知の方法(Nakamura et al., Am.J.Hum.Genet., 43, 854-859, 1988) によって検索した。制限酵素は、Ｍｓｐ I，Ｔａｑ I，ＢｇｌII，Ｐｓｔ I，ＰｖｕII，Ｒｓａ I，ＥｃｏＲ Iのいずれかを用いた。この結果４３個のクローンがＲＦＬＰを検出した（表４〜６）、すなわちＲＦＬＰマーカーとして使用可能であった。
【００２６】
（実施例２）卵巣癌および乳癌におけるヒト第１７番染色体長腕の共通欠失領域の検索
卵巣癌９４症例と乳癌２４６症例の手術材料より腫瘍組織を得た。対応する正常組織あるいは末梢血サンプルを各々の患者より得た。これらの組織、サンプルよりＤＮＡを既知の方法(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) で抽出した。ＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに０．１Ｎ−ＮａＯＨ／０．１Ｍ−ＮａＣｌでサザントランスファーした(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) 。
これらのメンブレンに対して、実施例１の方法で得られたヒト第１７番染色体長腕（１７ｑ）上に位置付けられたＲＦＬＰマーカーをプローブとしてサザンハイブリダイゼーション(Sato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) を行うことによりＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）を検索した。結果を表７に示す。
【００２７】
【表７】
0003670030.tif 000008
【００２８】
卵巣癌においては９４例中８４例で少なくとも１つのマーカーによりヘテロ接合性を識別可能(informative) であり、そのうち３３例（３９．３％）で少なくとも１つのマーカーによりＬＯＨが検出された。乳癌では２４６例中２１４例が少なくとも１つのマーカーについてヘテロ接合性が識別可能であり、そのうち８８例（４１．４％）で少なくとも１つのマーカーがＬＯＨを検出した。
【００２９】
上記の結果からヒト第１７番染色体長腕（１７ｑ）に部分的欠失があると判定できる例、すなわち２つ以上のマーカーでヘテロ接合性を識別可能(informative) であり、なおかつ欠失部分（ＬＯＨ検出）と保持部分（ＬＯＨ不検出）とを示す例を集めて解析した。
その結果、卵巣癌では８例で２つの共通欠失領域が見出された（図２）。１つはＣＩ１７−３１６（１７ｑ１２−２１．１）とＣＩ１７−５０７（１７ｑ２１．３）の２つのマーカー間の領域であり、もう一つはＣＩ１７−５１６（１７ｑ２５．１）マーカーより末端側の領域である。
同様に、乳癌では３５例で２つの共通欠失領域が見いだされた（図３）。１つは卵巣癌においても見いだされたＣＩ１７−７０１（１７ｑ２１．３）とＣＩ１７−７３０（１７ｑ２１．３）の２つのマーカー間の領域でありさらに狭い領域に限局化されている、もう１つはＣＩ１７−５１６（１７ｑ２５．１）マーカーより末端側の領域であり、これも卵巣癌で欠失の認められた領域である。
上記の欠失領域の解析(deletion mapping)  で得られた２つの共通欠失領域のうち、ＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０の二つのマーカーの間の領域は、遺伝性乳癌および卵巣癌の家系解析(linkage mapping) の結果から発症と強く連関を示す領域１７ｑ２１（Hall et al., Am.J.Hum.Genet., 50, 1235-1242, 1992)に近いものであった。この領域の長さ（二つのマーカーの間の遺伝学的距離）はリンケージ解析法(Lathrop at al., Am.J.Hum.Genet., 37, 482-498, 1985 ;Donis-Keller et al., Cell, 51, 319-337, 1987)により２．４ｃＭと推定された。
【００３０】
（実施例３）最小限局領域に含まれるコスミド・クローンの単離
家系解析の結果から限局化された領域は１７ｑ２１上のＴＨＲＡ１とＭｆｄ１８８の２つのマーカー間の領域であることが示されている（Hall et al., Am.J.Hum.Genet., 50, 1235-1242, 1992) (Bowcock A.M. et al., Am.J.Hum.Genet., 52,718-22, 1933)ので、これらのマーカーとＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０マーカーの相対的順序を決定することにより２つの別々の戦略によって得られたマッピング情報を統合することを試みた。各マーカーの相対的順序の決定は、本発明者らが新たに開発した２色ＦＩＳＨ法（ 2-color Fish method )によって行った。この方法は、細胞の同調操作によって高度に伸展した染色体標本を作製して用いることにより精密度を増し、さらに異なる色の蛍光体で標識したプローブによっておこなうＦＩＳＨ法であり、これにより極めて近接したマーカーの相対的順序の決定が可能である。
【００３１】
その結果、Ｍｆｄ１８８マーカーはＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０のマーカーの中間に位置し、ＴＨＲＡ１マーカーはＣＩ１７−７０１よりもセントロメア側に位置することが見出された（図４ａ）。すなわち、家系解析によって限局化された遺伝性乳癌と連関する領域と、欠失領域の解析で限局化された散発性乳癌における共通欠失領域とは互いに重なり合っており、重なり合っている最小領域はＣＩ１７−７０１とＭｆｄ１８８の２つのマーカーにはさまれる領域であることを見出した（図４ａ）。パルスフィールドゲル電気泳動によりこの領域の物理的地図を作製したところ、重複領域の長さは約５００ｋｂと非常に限局化された。
さらに、実施例１の方法で得られたコスミド・クローンのうち１７ｑ２１．３に位置づけられた３７個のクローンと既知のマーカーＴＨＲＡ１、Ｍｆｄ１８８およびＰＰＹについて２色ＦＩＳＨ法による精密なマッピングを行った。その結果、ＣＩ１７−７０１とＣＩ１７−７３０の２つのマーカーに囲まれる領域に１５個のコスミド・クローンが位置づけられ、そのうち、上記重複領域上にはＣＩ１７−５２７とＣＩ１７−９０４の２つのコスミド・クローンが位置していることが判明した（図４ａ、ｂ）。
【００３２】
（実施例４）乳癌における遺伝子異常の検出
重複領域約５００ｋｂのうち約１５０ｋｂはすでに４つのコスミド・クローンＣＩ１７−７０１、ＣＩ１７−５２７、ＣＩ１７−９０４およびＭｆｄ１８８でカバ−されているので、まず６５０例の散発性乳癌組織のＤＮＡの制限酵素（ＳａｃＩ、ＰｖｕIIまたはＰｓｔＩ）断片に対してこれらのコスミド・クローンのＤＮＡあるいはその断片をプローブとしたサザンブロット解析によって、癌細胞に生じている欠失、重複、増幅、転座などの大きな構造的遺伝子異常、いわゆる遺伝子再構成を検出することを試みた。
その結果、ＣＩ１７−９０４のＤＮＡまたはその９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片（図４ｃ）をプローブとしたとき、２例の乳癌組織において遺伝子再構成が検出された（図５ａ，ｂ）。これらの遺伝子再構成は癌組織においてのみ起きており、正常組織では認められない、サイズの異なる余分のバンドが認められ、さらにいくつかのバンドの濃度が増大していた。すなわち、このプローブに対応する一定のＤＮＡ領域に遺伝子増幅が生じていた。２例のうち、１例においては、９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片（図４ｃ）と隣接するＥ−Ｈ５．２もしくはＨｉｎｄ６．１断片をプローブとして乳癌組織のＤＮＡＳａｃＩ断片に対してサザンブロット解析を行った時には遺伝子増幅は検出されなかった（図６、Case 1）。すなわち、この Case の遺伝子増幅は９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片に対応する領域内に起きており、４〜５倍に増幅していることが示された。
これを、より詳細に検討するため９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片内の６個のＳａｃＩ断片、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（図４ｃ）の各々をプローブとして乳癌組織のＤＮＡＳａｃI 断片に対してサザンブロット解析を行った。その結果、プローブＡ、Ｂで２．５ｋｂ、プローブＢ、Ｃ、Ｄで３．０ｋｂ、プローブＥ、Ｆで２．５ｋｂ、プローブＦで０．９ｋｂの異常サイズの増幅バンドが認められた（図７）。
【００３３】
他の１例においては、乳癌組織のＤＮＡＳａｃＩ断片に対してＥ−Ｈ５．２をプローブとした時に遺伝子増幅が検出された（図６、Case 2）が、Ｈｉｎｄ６．１断片をプローブとした時には検出されなかった（図６、Case 2）。この時、Ｅ−Ｈ５．２をプローブとした時にはサイズ異常を示すバンドは認められず、増幅のみが認められた。すなわち、この Case の遺伝子増幅は９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片に対応する領域内から E-H5.2 に対応する領域のさらに外側（テロミア側）にわたる範囲に起きていることが示された。
【００３４】
（実施例５）ｃＤＮＡの単離と構造決定
２例の乳癌組織において遺伝子再構成の認められた領域内あるいはその近傍から、発現されている遺伝子を単離するために、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４のＤＮＡ断片について、種を越えて保存されている基本的な細胞機能に関わるＤＮＡ配列を含むものの選択を行った。すなわち、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４のＤＮＡ断片の各々をプローブとして、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリのＤＮＡ断片のサザンブロットに対してハイブリダイゼーションを行った。その結果、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４の３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片（図４ｃ）がウシ、ブタ、マウス、ラットのＤＮＡとハイブリダイズし、種を越えてよく保存されていた。
この３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片をプローブとして乳腺、乳癌細胞株、胎児脳、大脳、小脳の５つの異なる臓器由来のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このうち、小脳ｃＤＮＡライブラリーから最長のｃＤＮＡがクローニングされた。このｃＤＮＡはコスミド・クローンＣＩ１７−９０４の３．５ｋｂＨｉｎｄIII −ＫｓｐＩ断片および隣接する複数の制限酵素断片とハイブリダイズし、その範囲は染色体上で２０ｋｂを超える領域に広がっていた。
このｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、２９２３ｂｐよりなり、２７ｂｐの５′非翻訳領域、１５７５ｂｐのコーディング領域、１３０６ｂｐの３′非翻訳領域および１５ｂｐのｐｏｌｙ（Ａ）テールを含む新規なＤＮＡ塩基配列であることを確認した（配列番号６）。このｃＤＮＡ配列に含まれるオープンリーディングフレームは、５２４アミノ酸よりなる新規な蛋白質（ＭＤＣ蛋白質：配列番号２）をコードしていた。オープンリーディングフレームの最初のＡＴＧのすぐ上流にはイン・フレームの停止コドンが存在した。ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡはポリアデニル化部位から約２０ｂｐ上流に認められた。
【００３５】
（実施例６）染色体ＤＮＡの構造決定
実施例５で得られたｃＤＮＡに対応する染色体ＤＮＡの構造を明らかにするために、コスミド・クローンＣＩ１７−９０４について、このｃＤＮＡの塩基配列を含む部分とその周辺の塩基配列を決定し、両者の配列を比較することにより、エクソン−イントロン結合部を決定した。その結果、実施例５で得られたｃＤＮＡに対応する２５個のエクソンを含む新規な遺伝子ＤＮＡの配列構造が明らかとなった（配列番号９）。２５個のエクソンは比較的小さなサイズで、染色体上約２０ｋｂの領域にまたがって存在していることが示された。
【００３６】
（実施例７）乳癌における該遺伝子エクソン構造の異常の検出
実施例６で明らかとなったエクソン／イントロンを含む該遺伝子ＤＮＡの構造から、実施例４で２例の乳癌組織に共通して異常を検出したプローブ（コスミド・クローンＣＩ１７−９０４の９．５ｋｂＨｉｎｄIII 断片）の配列領域中に、第２、第３、第４エクソンが存在していることが明らかとなった。さらに、第２エクソンはプローブＥの配列領域中に存在し、第３、第４エクソンはプローブＦの配列領域中に存在する（図４ｃ）。従って、実施例４の９．５ｋｂのＨｉｎｄIII 断片領域を含む遺伝子再構成は該遺伝子の３つのエクソンを含む領域において正常なエクソン構造を破壊していると考えられる。このことを確認するために、第２、第３、第４エクソンに対応するＤＮＡ配列のプローブによって、上記２例の乳癌組織の染色体ＤＮＡに対するサザンブロット解析を行った結果、先に示したプローブＥあるいはプローブＦを用いて行った結果（図７）と同様の異常サイズの増幅バンドが認められた。
【００３７】
（実施例８）遺伝子発現の組織特異性
実施例５で得られたｃＤＮＡをプローブとして、種々のヒト組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、大腸、末梢血リンパ球、卵巣、小腸、脾臓、睾丸、胸腺）由来のｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析を行った結果、脳に最も強い発現が、心臓、卵巣、睾丸に弱い発現が認められた。
さらに、より微弱な発現を検出するためにＲＴ- ＰＣＲ(reverse-transcriptase PCR) による増幅での検出をおこなった。すなわち、種々のヒト組織由来のｍＲＮＡから逆転写酵素反応により、ランダムヘキサマーをプライマーとして１本鎖ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として実施例６で明らかとなったエクソン２１および２３の配列にそれぞれ由来するプライマーＢＣＯ９およびＢＣＯ１２を用いてＰＣＲをおこなった。その結果、期待される大きさのＰＣＲ産物は主に中枢神経系（大脳、小脳および胎児脳）と内分泌系または生殖系臓器（睾丸、卵巣、乳腺、副腎、胸腺および膵臓）に認められた。
用いたプライマーの配列は下記のとおりである。
ＢＣＯ９     5'-GCACCTGCCCCGGCAGT-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1764-1780に相当)
ＢＣＯ１２  5'-CCAGGACAGCCCCAGCGATG-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1976-1957に相当) 。
【００３８】
（実施例９）ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの直接塩基配列決定
ヒト胎児脳およびヒト睾丸ｍＲＮＡをもとに、エクソン１９上の配列に由来するプライマ−ＧＭＡ７０１とエクソン２１上の配列に由来するプライマ−ＧＭＢ７０４を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列をプライマーＧＭＡ７０２またはプライマーＧＭＢ７０３を用いて直接決定した。その結果、実施例５で得られた配列番号６の小脳由来の cＤＮＡ配列から１０塩基（塩基番号1512-1521 の欠失した配列が発見され、配列番号７のＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡが発現していることが明らかとなった。胎児脳、睾丸のいずれのｍＲＮＡでも同一の結果が得られた。配列番号７のｃＤＮＡ配列に含まれるオープンリーディングフレームは、６７０アミノ酸よりなるＭＤＣ蛋白質（配列番号３）をコードしていた。
これは配列番号９の染色体ＤＮＡ上のエクソン２０の開始が塩基番号６０７３番ではなく塩基番号６０８３番から始まる別のＲＮＡスプライシングによっているものと考えられた。このようなスプライシングのバリエーションは例えばＯｄａらの報告によっても知られている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 897-904 (1993)) 。これにより配列番号６のｃＤＮＡと配列番号７のｃＤＮＡのコードするアミノ酸配列（配列番号２と配列番号３）は、この部分以降で異なっている。すなわち配列番号６のｃＤＮＡではエクソン２０内の部分で停止コドンを生じるが、配列番号７のｃＤＮＡではリーディングフレームがシフトしてさらに下流までオープンリーディングフレームが続いている。
PCR および塩基配列決定に用いたプライマーの配列は下記のとおりである。
GMA701  5'-GGCTGCTGATCGCTTCTGCTAC-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1413-1434に相当)
GMA702  5'-GAGAAGCTGAATGTGGAGGG-3'
( コーディング鎖、配列番号６の塩基番号 1435-1456に相当)
GMB703  5'-GTCAGAGCCGTCCGCCAGC-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1675-1657に相当)
GMB704  5'-GCCATCCTCCACATAGCTCAGG-3'
( アンチセンス鎖、配列番号６の塩基番号 1696-1675に相当) 。
【００３９】
（実施例１０）ＲＡＣＥ法による５’末端配列の増幅
配列番号７のｃＤＮＡの全長ｃＤＮＡを得るため、５’−ｃＤＮＡ末端のＰＣＲ増幅（５’−ＲＡＣＥ；Frohman, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988   ；Belyavski, et al, Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1988 ）を行った。ヒト脳由来 poly A(+) RNA 2μg （Clontech社）をもとに特異的オリゴマーＳＧＮ０１２をプライマーとし市販の合成キットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡ末端にアンカーオリゴマーを結合する Edwards  らの方法（Nucleic Acid Res. 19, 5227-5232, 1991 ）を応用した市販キットを用いて５’ＲＡＣＥを行った。キットのアンカーオリゴマーと特異的オリゴマーＳＧＮ０１２をプライマーとしてＰＣＲを行った結果、約５８０ｂｐの増幅産物を電気泳動法で検出した。
この増幅産物を電気泳動ゲルより抽出、精製し、プラスミドベクター pCR-Script （Stratagene  社）のSrf I 切断部位に挿入しクローニングした。各クローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。そのうちの一つである pCR-5P2  はアンカーオリゴマーの配列に続いてＡＴＧから始まる５０１ｂｐのｃＤＮＡインサートを有し、その３１５番目以降の塩基配列は配列番号７の塩基番号４５（エクソン２の開始位置）以降の配列と、後述する１塩基を除いて、まったく一致した。さらに、 pCR-5P2  の最初のＡＴＧから始まるリーディングフレームは、配列番号７のｃＤＮＡのコードするポリペプチドとフレームが一致した。また、これによって得られたポリペプチド配列のＮ末端領域には疎水性に富むアミノ酸が連続するシグナルペプチドがコードされていた。
【００４０】
以上の、５’ＲＡＣＥによって得られた、５’末端配列がｍＲＮＡ上で真に配列番号７の塩基番号４５以降の配列とつながっていることを確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。ヒトの脳、胎児脳、卵巣、および睾丸由来の poly A(+) RNA（Clontech社）をもとにランダムヘキサマーをプライマーとして一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで pCR-5P2  の最初の２０塩基の配列を有するオリゴマー（ＳＧＮ０１３）をセンスプライマー、ＳＧＮ０１１またはＳＧＮ０１２をアンチセンスプライマーとした。その結果、いずれの組織のＲＮＡを用いた場合においても、期待される増幅産物（ＳＧＮ０１３／ＳＧＮ０１１で約５００ｂｐ、ＳＧＮ０１３／ＳＧＮ０１２で約７５０ｂｐ）を電気泳動法で検出した。従って、  ５’ＲＡＣＥによって得られたpCR-5P2 の５’末端配列がｍＲＮＡ上で配列番号７の塩基番号４５以降の配列とつながっていることが確認され、配列番号８のｃＤＮＡが構成された。配列番号８のｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、７６９アミノ酸よりなるＭＤＣ蛋白質（配列番号４）をコードしている。
用いた特異的オリゴマーの配列は以下の通りである。
ＳＧＮ０１１  ５’-GATGTAAGTCAAGTTCCCATCAGAGA-３’
( アンチセンス鎖、配列番号７の塩基番号 231-206に相当)
ＳＧＮ０１２  ５’-AACAGCTGGTGGTCGTTGATCACAA- ３’
( アンチセンス鎖、配列番号７の塩基番号 485-461に相当)
ＳＧＮ０１３  ５’-ATGAGGCTGCTGCGGCGCTG-３’
( コーディング鎖、配列番号８の塩基番号 1-20 に相当)
なお、エクソン２の開始位置以降で配列番号８が配列番号６または７と相違している１塩基は、エクソン２の開始位置から４番目の塩基（配列番号８の 318番目のＣ、配列番号６および７の48番目のＡ）に当たり、コ−ドするアミノ酸は配列番号４の 106番目Ｈｉｓ、配列番号２および３の７番目Ｇｌｎである。これは多型を反映しているものと考えられる。
これら３つのＭＤＣ蛋白質（配列番号２、３および４）のバリエ−ションに共通なアミノ酸配列は、488 アミノ酸からなる配列（配列番号１）であり、この部分をコ−ドするＤＮＡ配列も共通の配列（配列番号５）である。
【００４１】
（実施例１１）既知蛋白質とのホモロジー
ＭＤＣ蛋白質のアミノ酸配列は、蛇毒の出血性毒素であるＨＲ１Ｂ(Takeya et al., J.Biol.Chem.,265,16068-16073,1990)、 Prorhodostomin (Au et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.,181,585-593,1991) 、Protrigramin(Neeper et al.,Nucleic Acid Res.,18,4255,1990)  とホモロジーを有していた。また、モルモット精子表層蛋白であるＰＨ３０（Blobel et al., Nature, 356, 248-252,1992）、ラットまたはサル副睾丸の蛋白であるＥＡＰI （Perry et al., Biochem.J.,286,671-675,1992 ）ともホモロジーを有していた。ＭＤＣ蛋白質、配列番号２（524 アミノ酸）、配列番号４（769 アミノ酸）とのホモロジーの「一致％／対象領域アミノ酸数」は次のとおりであった。左が配列番号２について、右が配列番号４についての値である。
ＨＲ１Ｂ          ３２．５／３３５        ３２．２／３７９
Prorhodostomin    ２９．０／４２０        ２９．０／４２０
Protrigramin      ２７．７／４３０        ２８．１／４３８
ＰＨ３０ｂ        ３８．１／１４７        ３０．８／３０２
ＥＡＰ１  ｒａｔ  ３６．０／３６４        ３３．１／４７５
ＥＡＰ１ monkey   ３０．４／５０３        ２９．９／５９９。
【００４２】
（実施例１２）形質転換体の作製
ＭＤＣ蛋白質（配列番号２）をコードするＤＮＡ（配列番号６）を基質として、プライマーＳＧＮ００６とＳＧＮ００８を用いて、ＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＳＧＮ００６  ５’-CACAGATCTGGGGGCATATGCTCCCTG- ３’
( コーディング鎖、配列番号6 の塩基番号 766-783に相当)
ＳＧＮ００８  ５’-AACAAGCTTCTACTGATGTCTCCCACC- ３’
( アンチセンス鎖、配列番号6 の塩基番号 1602-1585に相当、下線は終止コドンを示す)
ベクター構築用に、プライマーの５’端にはそれぞれ Bgl II 、Hind III  の切断部位配列を付加してある。
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分取し、 Bgl II と Hind III で切断した。こうして得られたＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片を、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pMAL-c2 (New England Biolabs 社製) ベクターに結合してプラスミド pMAL-MDC(C1) を構築した。
同様に、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pQE-13 (Diagen 社製) ベクターに結合してプラスミド pH6-MDC(C1)  を構築した。
さらに、 pMAL-MDC(C1) のＭＤＣ蛋白質コーディング領域から BamH I 切断部位（配列番号6 の塩基番号 1483 ）以降を除き、ＭＤＣ蛋白質の２つのバリエーション（配列番号２および３）に共通する部分のコーディング領域となるようにした。すなわち pMAL-MDC(C1) を BamH I と Hind III で切断し、末端を平滑化したのち再結合して、プラスミド pMAL-MDC(dC1)  を構築した。
【００４３】
pMAL-c2  ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側にマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質はアミロースカラムによってアフィニティー精製した。また、 pQE-13 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側に６個のヒスチジン残基よりなるペプチド（His ６）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質は金属キレートカラムによってアフィニティー精製した。
各プラスミド pMAL-MDC(C1)  pMAL-MDC(dC1)  および pH6-MDC(C1)  を用いて E.coli JM109 をトランスフォームし、アンピシリン耐性で選択してそれぞれの形質転換体を得た。
【００４４】
（実施例１３）組換えＭＤＣ蛋白質の発現と精製
実施例１２で得られたそれぞれの形質転換体を培養し、培養物より組換えＭＤＣ融合蛋白質を抽出、精製した。
すなわち、各形質転換体を 100ml  のＬＢ培地 (1%ポリペプトン、 0.5% 酵母抽出物, 1%NaCl) で 37 ℃  一夜振とう培養した。培養液を予め 37 ℃  に加温したＬＢ培地で１０倍に希釈したうえ、さらに３０分〜９０分培養して、対数増殖期の培養物を得た。培養物１リッタ−にＩＰＴＧ（ Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside ）を終濃度１ｍＭとなるように添加して３〜４時間培養した。培養物から遠心分離により菌体を集めた。
プラスミド pMAL-MDC(C1) 、pMAL-MDC(dC1) による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのカラムバッファー（20mM Tris-HCl  pH7.4, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕した。組換えＭＤＣ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在したので、これを遠心分離して変性バッファー（8M  尿素、 20mM Tris-HCl  pH8.5, 10mM ジチオスライト−ル）に溶解した。次いで、これをカラムバッファーに透析後、遠心分離して上清可溶画分を集めた。透析不溶性画分は、さらに変性、透析、遠心分離を繰返して上清可溶画分を回収した。集めた可溶性画分をアミロースカラム (New England Biolabs 社製) にかけ、カラムバッファーで洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラムバッファーで溶出した。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画した。この結果、プラスミド pMAL-MDC(C1) および pMAL-MDC(dC1)  による形質転換体のそれぞれで、期待される約６８ＫｄのＭＢＰ融合蛋白質が主要バンドとして検出される画分が得られた。収量はそれぞれ４６．４ｍｇ、１０．０ｍｇであった（ＯＤ280 ＝１のとき、１mg/ml としたとき）。これらの融合蛋白質を以下、それぞれ MBP-MDC(C1)、 MBP-MDC(dC1) と称する。
【００４５】
同様に、プラスミド pH6-MDC(C1)  による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのソニケーションバッファー（10mM リン 酸ナトリウム  pH8.0, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕した。組換えＭＤＣ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在したので、これを遠心分離してバッファーＡ（6M塩酸グアニジン, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 ) に溶解し、遠心分離して上清可溶画分を集め、Ｎｉ−ＮＴＡカラム (Diagen社製) にかけ、バッファーＡ、次いでバッファーＢ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 )で洗浄後、バッファーＣ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH6.3 )、バッファーＤ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH5.9 )、バッファーＥ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH4.5 )およびバッファーＦ（6M塩酸グアニジン, 200ｍＭ酢酸) で段階的に溶出した。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画した。この結果、バッファーＦによる溶出液に、期待される約３４Ｋｄの His６融合蛋白質が単一バンドとして検出される画分が得られた。収量は５１．９ｍｇであった（ＯＤ280 ＝１のとき、１mg/ml としたとき）。この融合蛋白質を以下、His ６-MDC(C1)と称する。
【００４６】
（実施例１４）モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の作製
実施例１３で得られた３種の組換え融合蛋白質、His ６-MDC(C1)、 MBP-MDC(dC1) 、および MBP-MDC(C1)  を、それぞれ、免疫抗原、抗体精製・スクリーニング用抗原、測定用標準抗原として用いた。
抗ＭＤＣ蛋白特異的モノクローナル抗体は、His ６-MDC(C1)  をマウスに免疫して作製した。すなわち、His ６-MDC(C1)  の３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００μｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹腔内に１００μｇ／匹にて２週間隔で４〜６回免疫を行った。免疫終了後、Ｐ３Ｕ１細胞とＢ細胞とのハイブリドーマをＰＥＧ１５００を用いて作製し、培養上清中の抗体価をモニターし、抗ＭＤＣ蛋白特異的抗体を産生するハイブリドーマの選択を行った。
抗体価の測定は、実施例１３で得た MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化（５μｇ／ｍｌ）したポリスチレン製カップに培養上清１００μｌを加え第一反応を行い、洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Horse-raddish peroxidase）を加え第二反応を行った。洗浄後、酵素基質溶液（過酸化水素水およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）混合液）を添加し、発色反応（第三反応）を行いモニターした。
ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレートにて培養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上清中の抗体価を測定し抗原と特異的に反応するクローンを選択した。更に、クローニング操作を行い、３クローン（Ｇ１−５Ａ２−２Ｃ８，Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１，Ｇ２−２Ｄ１０−３Ｆ５）を抗体産生ハイブリドーマとして樹立した。樹立したクローンの産生抗体のクラスおよびサブクラスは、Ｇ１−５Ａ２−２Ｃ８はＩｇＧ1 ，Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１は、ＩｇＧ2b、Ｇ２−２Ｄ１０−３Ｆ５はＩｇＭであった。各ハイブリドーマ細胞３００万個を、予め約１週間前に０.5ml  のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウスの腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取した。各腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製した。
【００４７】
同様に、実施例１３で得られた His６-MDC(C1)  を免疫抗原として、ウサギに免疫し、抗ＭＤＣ蛋白ポリクローナル抗体を作製した。
すなわち、マウスと同様、 His６-MDC(C1)  の３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００μｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合し免疫を行った。免疫終了後、抗血清を得、実施例１３で得た MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したポリスチレン製カップを用いて、抗体価を測定した。抗血清を５００倍から６４０００倍まで希釈し、その１００μｌをウエルに添加し、抗体価をヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検討したところ、６４０００倍まで検出が可能であった。また、免疫前の血清中には、 MBP-MDC(dC1) と反応する抗体が存在しなかったことから、ＭＤＣ蛋白質に特異的に反応する抗体が産生されていることが確認することができた。さらに、この抗血清を、プロテインＧカラムおよび MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したセファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００４８】
このようにして得られた精製モノクローナル抗体および精製ウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＭＤＣ蛋白質の定量法を確立した。
すなわち、ハイブリドーマ（Ｇ２−２Ｆ２−３Ｄ１１）由来の精製モノクローナル抗体を９６ウエルプレートに固相化し、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）でブロッキング後、精製 MBP-MDC(C1)  溶液を被検液として、0.156 〜5.00 ug/mlの範囲で 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。ウエルを洗浄後、精製ウサギポリクローナル抗体溶液（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。ウエルを洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させた。反応終了後２ｍＭアジ化ナトリウムを 100 ul ／ウエルずつ添加し、405nm と 490nm  の吸光値を測定した。得られた差分吸光値は、被検液濃度とよく相関した値を示し、０〜２．５μｇ／ｍｌの間でほぼ直線的な関係であることが確かめられた（図８）。このことは、これらのモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ法がＭＤＣ蛋白質の定量法として充分に使用できることを示している。
【００４９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：４８８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
0003670030.tif 000009
0003670030.tif 000010
0003670030.tif 000011
【００５０】
配列番号：2
配列の長さ：５２４
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
0003670030.tif 000012
0003670030.tif 000013
0003670030.tif 000014
【００５１】
配列番号：３
配列の長さ：６７０
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
0003670030.tif 000015
0003670030.tif 000016
0003670030.tif 000017
【００５２】
配列番号：４
配列の長さ：７６９
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
0003670030.tif 000018
0003670030.tif 000019
0003670030.tif 000020
0003670030.tif 000021
【００５３】
配列番号：５
配列の長さ：１４６４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．１４６４
特徴を決定した方法：Ｅ
0003670030.tif 000022
0003670030.tif 000023
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【００５４】
配列番号：６
配列の長さ：２９２３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１．．２７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：１６００．．２９２３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２８．．１５９９
特徴を決定した方法：Ｅ
0003670030.tif 000026
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【００５５】
配列番号：７
配列の長さ：２９１３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１．．２７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：２０３８．．２９１３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２８．．２０３７
特徴を決定した方法：Ｅ
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【００５６】
配列番号：８
配列の長さ：３１８３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：２３０８．．３１８３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．２３０７
特徴を決定した方法：Ｅ
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【００５７】
配列番号：９
配列の長さ：９２７８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー
配列の特徴
特徴を表す記号：exon 1
存在位置：２８．．４４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 2
存在位置：３０８．．３７４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 3
存在位置：９０９．．９９４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 4
存在位置：１０８１．．１１５６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 5
存在位置：１５９１．．１６５７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 6
存在位置：１７２５．．１７９２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 7
存在位置：２１８２．．２２５６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 8
存在位置：２３３９．．２４１０
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 9
存在位置：２５８８．．２７５４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 10
存在位置：３２４８．．３３３２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 11
存在位置：３４４５．．３５３５
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 12
存在位置：３６４５．．３６９６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 13
存在位置：４０１４．．４１１３
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 14
存在位置：４１９６．．４２６７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 15
存在位置：４３８６．．４４７８
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 16
存在位置：４９２０．．５０００
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 17
存在位置：５３４７．．５３９７
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 18
存在位置：５５０１．．５５６４
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 19
存在位置：５７６７．．５８６６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 20
存在位置：６０７３．．６２０２
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 21
存在位置：６３００．．６４６８
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 22
存在位置：６５５７．．６６７１
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 23
存在位置：６７５６．．６８４６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 24
存在位置：７８２９．．７８４６
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：exon 25
存在位置：８１６５．．９０３８
特徴を決定した方法：Ｅ
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【図面の簡単な説明】
【図１】３４２個のコスミド・クローンの第１７番染色体上の位置を示した図である。クローン名はクローン番号のみで示してある。
【図２】卵巣癌における第１７番染色体長腕の部分的欠失を示した図である。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【図３】乳癌における第１７番染色体長腕の部分的欠失を示した図である。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。２カ所の共通欠失領域は傍線で示した。
【図４】第１７番染色体長腕２１．３領域に位置づけられたマーカーから該遺伝子の単離に至る過程、および乳癌組織で遺伝子再構成の起きている箇所（斜線の矩形）を示した図である。クローン名はクローン番号のみで示してある。
【図５】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図６】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図７】乳癌における遺伝子再構成のサザンブロットによる検出を示した図であり、Ｎは正常組織のＤＮＡ、Ｔは癌組織ＤＮＡを示す。
【図８】モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体でのＥＬＩＳＡ法によるＭＤＣ蛋白質の濃度測定検量線の図である。
【図１】
0003670030.tif 000053
【図２】
0003670030.tif 000054
【図３】
0003670030.tif 000055
【図４】
0003670030.tif 000056
【図５】
0003670030.tif 000057
【図６】
0003670030.tif 000058
【図７】
0003670030.tif 000059
【図８】
0003670030.tif 000060