(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥＰＤＣ１に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチド、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５もしくは４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５もしくは４７のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチドを、ＺＮＦ２２４ポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程；および
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、５４、および５５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＥＰＤＣ１に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）試験化合物を、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞と接触させる工程；ならびに
（ｂ）試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現レベルを増加させる試験化合物を選択する工程。
【請求項４】
ＤＥＰＤＣ１に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ１を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞に、試験化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；ならびに
（ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを増加させる試験化合物を選択する工程。
【請求項５】
ＤＬＧ１の転写調節領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６のヌクレオチド配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写調節領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のヌクレオチド配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
がんが膀胱癌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む、１８〜３０個の残基からなるポリペプチドであって、がん細胞の増殖抑制効果を有するポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドを細胞膜透過性物質により修飾した、ポリペプチド。
【請求項１０】
以下の一般式を有する、請求項９に記載のポリペプチド：
［Ｒ］−［Ｄ］
式中、［Ｒ］および［Ｄ］は直接連結されていてもよいしまたはリンカーにより間接的に連結されていてもよく、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し；かつ［Ｄ］は請求項８に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を表す。
【請求項１１】
細胞膜透過性物質が以下のものからなる群より選択される、請求項１０に記載のポリペプチド：
ポリアルギニン／ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）；
ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）；
ブフォリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）；
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）；
ＭＡＰ（ｍｏｄｅｌ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）；
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）；
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）；
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）；
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）；
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）；
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）；
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）；および
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性成分として含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための剤。
【請求項１３】
がんが膀胱癌である、請求項１２に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２００８年８月２８日付で出願された米国特許仮出願第６１／１９０，５３１号の恩典を主張するものである。その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、膀胱癌を治療または予防するための方法、および膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法に関する。特に、本発明はＤＥＰＤＣ１に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
膀胱癌は、２番目に多い尿生殖器腫瘍であり、世界中で毎年およそ３５７，０００の新症例という発生率を有する（Parkin DM, et al., Cancer J Clin 2005 55:74-108（非特許文献１））。それらのおよそ３分の１は、診断の時点で浸潤性または転移性の疾患であると推測される（非特許文献１〜３）。世界の多くの地域で、浸潤性膀胱癌のための根治的膀胱切除が、治療の標準のままであるが、そのような患者のほぼ半分は、膀胱切除後２年以内に転移を発症し、その後、その疾患により死亡する。過去２０年間に、ＣＭＶ（シスプラチン、メトトレキサート、およびビンブラスチン）またはＭ−ＶＡＣ（メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、およびシスプラチン）などのシスプラチンに基づく組み合わせ化学療法レジメンが、進行膀胱癌を有する患者のために処方されるようになった（非特許文献３〜６）。しかしながら、全体の予後は依然として非常に不十分なままであり、これらの組み合わせ化学療法によって引き起こされる有害反応は著しく重篤である（非特許文献７）。したがって、膀胱癌に対する新たな分子標的薬の開発が、切実に望まれている。
【０００４】
その目標を念頭において、本発明者らは、以前に、２６例の膀胱癌ならびに２９例の正常ヒト組織の遺伝子発現プロファイルを分析し（非特許文献８、９）、ＤＥＰ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １（ＤＥＰＤＣ１）とされた遺伝子および対応するペプチドを同定した。ＤＥＰＤＣ１は、膀胱癌細胞の大多数において高度に上方制御されているが、精巣以外の正常ヒト器官には発現しておらず、このことから、この分子が新規ながん／精巣抗原であることが示された（特許文献１）。このデータは、ＤＥＰＤＣ１が、膀胱癌のための抗がん剤またはがんペプチドワクチンの開発のための有益な標的として役立つかもしれないことをさらに示唆した（特許文献２）。さらなる研究は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＤＥＰＤＣ１発現の抑制が、膀胱癌細胞の増殖を著しく阻害することを証明した。現在までのデータは、ＤＥＰＤＣ１が膀胱癌の増殖および／または生存において重大な役割を果たすことを示唆しているが、その分子的な機序は未知のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０８５６８４
【特許文献２】ＷＯ２００８／０４７４７３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Parkin DM, et al., Cancer J Clin 2005 55:74-108
【非特許文献２】Sternberg CN, et al., Ann Oncol 1995 6:113-26
【非特許文献３】Ardavanis A, et al., Br J Cancer 2005 92:645-50
【非特許文献４】Lehmann J, et al., World J Urol 2002 20:144-50
【非特許文献５】Rosenberg JE, et al., J Urology 2005 174:14-20
【非特許文献６】Theodore C, et al., Eur J Cancer 2005 41:1150-7
【非特許文献７】Vaughn DJ, et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2;117-22
【非特許文献８】Takata R, et al., Clin Cancer Res 2005 11:2625-36
【非特許文献９】Saito-Hisaminato A, et al., DNA Res 2002 9:35-45
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＤＥＰＤＣ１が、転写リプレッサーであるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２４（ＺＮＦ２２４）との相互作用を通して、ＤＩＧ１を含む複数の下流遺伝子を抑制することにより、膀胱癌発生において重要な役割を果たすことを開示する。本明細書において証明されるように、細胞透過性ドミナントネガティブペプチドによるＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との相互作用の阻害は、膀胱癌細胞の増殖抑制をもたらした。さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＺＮＦ２２４遺伝子の抑制は、膀胱癌細胞の増殖阻害および／または細胞死をもたらした。これらの知見は、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４複合体が膀胱癌発生において重大な役割を果たしており、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４複合体形成の阻害が、膀胱癌の治療のための可能性のある戦略をもたらすであろうという本発明の前提を支持する。
【０００８】
したがって、ＤＥＰＤＣ１タンパク質およびＺＮＦ２２４タンパク質を試験化合物と接触させる工程、ならびにこれらのペプチドの相対的な結合を決定する工程を含む、ＤＥＰＤＣ１タンパク質とＺＮＦ２２４タンパク質との間の結合を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明の目的である。試験化合物の非存在下で観察される対照レベルと比較した、これらのペプチドの結合の測定された阻害は、その試験化合物が膀胱癌の症状を軽減するために使用され得ることを示す。
【０００９】
ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞を試験化合物と接触させる工程、ならびにＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現レベルを決定する工程を含む、がんを治療または予防するための化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。試験化合物の非存在下で観察される対照レベルと比較した、発現レベルの測定された低下は、その試験化合物が膀胱癌の症状を軽減するために使用され得ることを示す。
【００１０】
ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写調節領域とレポーター遺伝子とを保持しているベクターが導入されている、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞を、試験化合物に接触させる工程、ならびにレポーター遺伝子の発現または活性を決定する工程を含む、がんを治療または予防するための化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。試験化合物の非存在下で観察される対照レベルと比較した、発現または活性の測定された低下は、その試験化合物が膀胱癌の症状を軽減するために使用され得ることを示す。
【００１１】
ｓｉＲＮＡ組成物を対象へ投与する工程を含む、対象における乳癌を治療または予防する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明との関連において、ｓｉＲＮＡ組成物は、ＺＮＦ２２４遺伝子の発現を低下させる。さらに別の方法において、対象における膀胱癌の治療または予防は、核酸組成物を対象へ投与することにより実施され得る。本発明との関連において、核酸またはアミノ酸に特異的な核酸組成物は、ＺＮＦ２２４遺伝子の発現または活性を低下させる。
【００１２】
本明細書に提示された結果は、ＺＮＦ２２４遺伝子に対するｓｉＲＮＡの阻害効果を立証する。例えば、ｓｉＲＮＡによるがん細胞の細胞増殖の阻害は、実施例セクションにおいて証明され、そのデータは、ＺＮＦ２２４遺伝子が膀胱癌の好ましい治療標的として役立つという事実を支持する。このように、ＺＮＦ２２４遺伝子に対するｓｉＲＮＡとして役立つ二本鎖分子、および該二本鎖分子を発現するベクターを提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１３】
本明細書に記載された方法の１つの利点は、膀胱癌の明白な臨床症状の検出前に、疾患が同定され得るという点である。疾患を早期に検出することによって、本発明は、患者の予後を改善し、回復および／または生存期間延長の確率を増加させることができる。本発明のその他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
[本発明1001]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：28のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれと機能的に等価なポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：45または47からなるペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチド。
[本発明1002]
生物学的機能が細胞増殖活性である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
8〜30個の残基からなる、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
細胞膜透過性物質により修飾されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
以下の一般式を有する、本発明1004のポリペプチド：
［Ｒ］−［Ｄ］
式中、［Ｒ］および［Ｄ］は直接連結されていてもよいしまたはリンカーにより間接的に連結されていてもよく、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し；かつ［Ｄ］は本発明1001のポリペプチドのアミノ酸配列を表す。
[本発明1006]
細胞膜透過性物質が以下のものからなる群より選択される、本発明1005のポリペプチド：
ポリアルギニン／ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：43）；
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：29）；
ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：30）；
ブフォリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：31）；
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：32）；
ＭＡＰ（ｍｏｄｅｌ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：33）；
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：34）；
Ｋｕ70／ＶＰＭＬＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）；
Ｋｕ70／ＰＭＬＫＥ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：36）；
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：37）；
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：38）；
Ｐｅｐ−1／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：39）；
ＳｙｎＢ1／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：40）；
Ｐｅｐ−7／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：41）；および
ＨＮ−1／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：42）。
[本発明1007]
本発明1001〜1006のいずれかのポリペプチドを活性成分として含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための剤。
[本発明1008]
がんが膀胱癌である、本発明1007の剤。
[本発明1009]
本発明1001〜1006のいずれかのポリペプチドを、その必要のある対象に投与する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法。
[本発明1010]
がんが膀胱癌である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
ＤＥＰＤＣ1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ1とＺＮＦ224との間の結合を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＤＥＰＤＣ1ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＺＮＦ224ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程；および
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
[本発明1012]
ＤＥＰＤＣ1ポリペプチドの機能的等価物がＺＮＦ224結合ドメインのアミノ酸配列を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
ＤＥＰＤＣ1ポリペプチドの機能的等価物がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：28、54、および55のアミノ酸配列を含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
ＺＮＦ224ポリペプチドの機能的等価物がＤＥＰＤＣ1結合ドメインのアミノ酸配列を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
ＤＥＰＤＣ1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ1およびＺＮＦ224を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）候補化合物を、ＤＥＰＤＣ1およびＺＮＦ224を発現している細胞と接触させる工程；ならびに
（ｂ）試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＤＬＧ1またはＡ20（ＴＮＦＡＩＰ3）の発現レベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
[本発明1016]
ＤＥＰＤＣ1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはＤＥＰＤＣ1を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
（ａ）ＤＬＧ1またはＡ20（ＴＮＦＡＩＰ3）の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている、ＤＥＰＤＣ1およびＺＮＦ224を発現している細胞に、候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；ならびに
（ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
[本発明1017]
ＤＬＧ1の転写調節領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：56のヌクレオチド配列である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
Ａ20（ＴＮＦＡＩＰ3）の転写調節領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：82のヌクレオチド配列である、本発明1016の方法。
[本発明1019]
がんが膀胱癌である、本発明1011、1015、および1016のいずれかの方法。
[本発明1020]
センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子であって、該センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：57または58からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス分子および前記二本鎖分子が、ＺＮＦ224遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
[本発明1021]
約19〜約25ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドである、本発明1020の二本鎖分子。
[本発明1022]
センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、本発明1021の二本鎖分子。
[本発明1023]
一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、本発明1020の二本鎖分子。
[本発明1024]
ポリヌクレオチドが、下記一般式を有する、本発明1023の二本鎖分子：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：57または58を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約3〜約23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
[本発明1025]
［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、本発明1024の二本鎖分子。
[本発明1026]
本発明1020〜1025のいずれかの二本鎖分子をコードするベクター。
[本発明1027]
薬学的に有効な量の、ＺＮＦ224遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容可能な担体とを対象へ投与する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子および該ベクターが、ＺＮＦ224遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、方法。
[本発明1028]
二本鎖分子が本発明1020の二本鎖分子である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
ベクターが本発明1026のベクターである、本発明1027の方法。
[本発明1030]
治療されるがんが膀胱癌である、本発明1027の方法。
[本発明1031]
薬学的に有効な量の、ＺＮＦ224遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子を含むベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該二本鎖分子および該ベクターが、ＺＮＦ224遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、組成物。
[本発明1032]
本発明1020の二本鎖分子を含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
本発明1026のベクターを含む、本発明1031の組成物。
[本発明1034]
治療されるがんが膀胱癌である、本発明1031の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
以下の図面の簡単な説明、ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明を考慮することにより、本発明の様々な局面および用途が、熟練した当業者には明白になるであろう。
【００１５】
【図１】膀胱癌細胞におけるＤＥＰＤＣ１のＺＮＦ２２４との相互作用を示す図である。パートＡは、臨床膀胱癌試料におけるＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４のアップレギュレーションを順に確認している半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＧＡＰＤＨ発現のレベルを定量対照としてとり、臨床膀胱癌試料のｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。上皮；正常上皮膀胱、Ｎ膀胱；正常膀胱。パートＢは、ＺＮＦ２２４−Ｆｌａｇプラスミドを一過性発現している膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３の抽出物からの内在性ＤＥＰＤＣ１および外来ＺＮＦ２２４の免疫沈降アッセイの結果を示す。パートＣは、ＵＭ−ＵＣ−３細胞における内在性ＤＥＰＤＣ１（緑）および外来ＺＮＦ２２４（赤）の共局在を示す。
【図２】ＺＮＦ２２４に対するｓｉＲＮＡによる膀胱癌細胞の増殖抑制を示す図である。左上部分は、ＵＭ−ＵＣ−３細胞における、ｓｉ−ＺＮＦ２２４−１、ｓｉ−ＺＮＦ２２４−２、または対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰまたはＳＣＲ）に応答して起こるノックダウン効果を証明している、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。左下および右の部分は、特異的ｓｉＲＮＡまたは対照プラスミドによりトランスフェクトされたＵＭ−ＵＣ−３細胞のコロニー形成アッセイおよびＭＴＴアッセイの結果を示す。バーは、３回のアッセイのＳＤを示す。
【図３】ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４の増殖促進効果および候補下流遺伝子の抑止を示す図である。パートＡは、ｓｉＲＮＡ−ＤＥＰＤＣ１、ｓｉＲＮＡ−ＺＮＦ２２４、またはｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ（対照）により処理された細胞におけるＤＬＧ１およびＡ２０の発現の増加を立証している、リアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す。パートＢは、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の過剰発現によるＤＬＧ１のトランス活性化の阻害を示す。パートＣは、レポーター活性アッセイの結果を示す。
【図４】ＤＥＰＤＣ１におけるＺＮＦ２２４結合領域の同定、およびＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブ断片による膀胱癌細胞の増殖の阻害を示す図である。パートＡは、末端領域の片方または両方を欠く、６種のＣＯＯＨ末端ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１部分クローンの概略図である。各部分クローンの分子量は括弧内に記載されている。上の部分は、構築物（アミノ酸）の相対的なポリペプチドサイズ（１〜２００）を示す。パートＢは、ＺＮＦ２２４に結合するＤＥＰＤＣ１における領域を同定している、免疫沈降実験の結果を示す。ＤＥＰＤＣ１における１４８〜１７６アミノ酸ポリペプチドまたは５９８〜６５３アミノ酸ポリペプチドを欠くＤＥＰ１−１４７構築物、ＤＥＰ１７７−５９７構築物、およびＤＥＰ６５４−８１１構築物は、Ｃｏｓ７細胞において外来ＺＮＦ２２４と相互作用するいかなる能力も保持していなかった。この結果は、２９アミノ酸セグメント（コドン１４８〜１７６）および５６アミノ酸セグメント（コドン５９８〜６５３）が、内在性ＺＮＦ２２４と相互作用するために重要であると考えられることを示唆している。
【図５】ＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブペプチドによる膀胱癌細胞の増殖阻害を示す図である。パートＡは、ＺＮＦ２２４を用いてＤＥＰＤＣ１の結合領域に由来する有効なペプチドがスクリーニングされた、ＵＭ−ＵＣ−３における増殖阻害アッセイの結果を提示する。本明細書中の６種の合成ペプチドから、ドミナントネガティブペプチドを選択した。パートＢは、複合体形成の低下が検出された、ＤＥＰＤＣ１６１１−６２８ペプチドにより処理された膀胱癌細胞における外来ＤＥＰＤＣ１タンパク質と外来ＺＮＦ２２４タンパク質との間の免疫沈降アッセイの結果（黒矢印）を示す。インプット画分が下に示される。パートＣは、アッセイされた４種の正常細胞株および膀胱癌細胞株における内在性ＤＥＰＤＣ１タンパク質および内在性ＺＮＦ２２４タンパク質の発現を検出するための、抗ＤＥＰＤＣ１抗体および抗ＺＮＦ２２４抗体を使用したウェスタンブロッティング分析の結果を示す。膀胱癌細胞株と比較した、正常ヒト皮膚線維芽細胞由来ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞におけるＤＥＰＤＣ１タンパク質およびＺＮＦ２２４のタンパク質の発現は無い。パートＤは、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４を過剰発現しているＵＭ−ＵＣ−３細胞およびＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４を発現していないＮＨＤＦ−Ａｄ細胞へ導入された、ＤＥＰＤＣ１６１１−６２８ペプチドの増殖抑制効果を確認している、ＭＴＴアッセイの結果を示す。バーは、３回のアッセイのＳＤを示す。ＭＴＴアッセイは、ＤＥＰＤＣ１タンパク質およびＺＮＦ２２４タンパク質をほとんど発現していないＮＨＤＦ−Ａｄ細胞に対するＤＥＰＤＣ１６１１−６２８ペプチドのオフターゲット効果が存在しないことを示している（下）。パートＥは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドにより処理されたＣＯＳ７細胞における、外来ＤＥＰＤＣ１タンパク質と外来ＺＮＦ２２４タンパク質との間の免疫沈降により検出された複合体形成の低下を実証している。ＣＯＳ７細胞を、ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１およびＦｌａｇタグ付きＺＮＦ２２４構築物によりコトランスフェクトし、次いでトランスフェクションの６時間後、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドまたはスクランブル６１１−６２８ペプチドにより処理した。１５時間後、ＭＴＴアッセイを実施した。パートＦは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる膀胱癌細胞株Ｊ８２の増殖の阻害を示す。ＭＴＴアッセイは、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４を過剰発現しているＪ８２細胞へ導入された、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドの増殖抑制効果を示した。パートＧは、免疫沈降実験によるＺＮＦ２２４に結合するＤＥＰＤＣ１における領域の同定を示す。１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチド処理は、外来Ｆｌａｇタグ付きＺＮＦ２２４と相互作用するための分析可能性を保持せず、この１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８は、ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１およびＦｌａｇタグ付きＺＮＦ２２４構築物の複合体形成、発現の阻害を示唆している。
【図６】１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理後のＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体によるＤＬＧ１およびＡ２０の抑止を示す図である。パートＡは、膀胱癌細胞におけるドミナントネガティブペプチドによるＤＬＧ１発現のアップレギュレーションおよびＧ１停止を示す。パートＢは、膀胱癌細胞におけるドミナントネガティブペプチドによるＡ２０発現のアップレギュレーションおよびＧ１停止を示す。
【図７】ＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブペプチドによる膀胱癌の細胞増殖の阻害を示す図である。パートＡは、４種のドミナントネガティブペプチド（１１Ｒ−ＤＥＰ５９８−６１５、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８、１１Ｒ−ＤＥＰ６２４−６４１、および１１Ｒ−ＤＥＰ６３６−６５３）の各々により処理されたＣＯＳ７細胞における、外因的に発現されたＤＥＰＤＣ１タンパク質（ＤＥＰＤＣ１−ＨＡ）と外因的に発現されたＺＮＦ２２４タンパク質（ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ）との間の免疫沈降により検出された複合体形成の効果を示す。パートＢは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドまたはスクランブルペプチドによる処理がアポトーシス細胞死を誘導した後のＵＭ−ＵＣ−３細胞のアポトーシス分析を示す。細胞を、ペプチド（１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドおよびスクランブルペプチド；３μＭ添加）またはＰＢＳと共に、それぞれ１２時間インキュベートした。上パネルは、ＴＵＮＥＬアッセイの代表的な画像を示す。ＴＵＮＥＬ染色の計数によりアポトーシス細胞を測定した（下パネル、材料および方法を参照されたい）。データは３回の実験からの平均値±ＳＥである。（１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８対ＰＢＳ；＊、Ｐ＜０．０００００１、独立ｔ検定、ＮＳ、非有意）。パートＣは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８による処理によるアポトーシスの増加を示す。ＦＡＣＳ分析におけるｓｕｂ−Ｇ１画分の比率としてアポトーシス細胞の割合を示した。
【図８】ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の共発現による細胞増殖の増強を示す図である。細胞生存能を評価するためにＭＴＴアッセイを実施し、モックを１．０として標準化した後、グラフ化した。ウェスタンブロット分析は、ＤＥＰＤＣ１−ＨＡタンパク質およびＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧタンパク質の発現をそれぞれ示した（下パネル）。βアクチンの発現を負荷対照として使用した。アスタリスクは、独立ｔ検定により決定された有意差（Ｐ＜０．０５）を意味する。
【図９】ＤＥＰＤＣ１内のＺＮＦ２２４結合領域の同定を示す図である。パートＡは、末端領域の片方または両方を欠く６種のＣＯＯＨ末端ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１部分クローンの模式図を示す。上は、構築物（アミノ酸）の相対ポリペプチドサイズ（１〜２００）を示す。パートＢは、免疫共沈降実験によるＺＮＦ２２４に結合するＤＥＰＤＣ１内の領域の同定を示す。ＤＥＰＤＣ１５９８−６５３に相当する５６アミノ酸ポリペプチドを失った１−１４７ＨＡ構築物、１−３００ＨＡ構築物、１７７−５９７ＨＡ構築物、および６５４−８１１ＨＡ構築物は、外来ＺＮＦ２２４タンパク質と相互作用することができなかった。
【図１０】ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の候補下流遺伝子としてのＡ２０の同定を示す図である。パートＡは、ＮＨＤＦ細胞におけるＡ２０遺伝子のプロモーター領域を含有しているレポータープラスミドのルシフェラーゼ活性に対するＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の効果を示す。ルシフェラーゼ活性は、Ａ２０プロモーター領域を含まないｐＲＬ−ＴＫプロモーターベクターの活性に対して相対的に示されている。パートＢは、ＣｈＩＰアッセイにより検出された、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の、Ａ２０プロモーター領域を含有しているＤＮＡ断片との会合を示す。上パネルにおいては、ＨＥＫ２９３細胞からのＤＮＡを、示された抗体により免疫沈降させ、ＰＣＲのために使用した。
【図１１】１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理による膀胱癌細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の阻害を示す図である。パートＡは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理によるＡ２０発現のアップレギュレーションおよびＩκＢの蓄積を示す。ＵＭ−ＵＣ−３細胞を１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチド（３μＭ）により処理した。次いで、処理の０時間後、１時間後、３時間後、６時間後、１２時間後、および２４時間後に、抗Ａ２０抗体および抗ＩκＢ抗体を用いたウェスタンブロット分析により、細胞溶解物を分析した。ＧＡＰＤＨをＲＴ−ＰＣＲのための定量対照として使用した。βアクチンをウェスタンブロット分析のための負荷対照として使用した。Ａ２０タンパク質およびＩκＢタンパク質の相対発現レベルを、濃度測定分析により定量化し、未処理の試料と比較した増加倍率を計算した。パートＢは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理によるＵＭ−ＵＣ−３細胞におけるＮＦ−κＢ（ｐ６５）核輸送の阻止を示す。ペプチド処理後、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質発現を、抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）モノクローナル抗体による免疫細胞化学的染色（緑）により分析した。画像分析のため、各実験について、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドにより処理された細胞（白矢印）およびスクランブルペプチドにより処理された細胞（黄矢印）の５０個の核を観察することにより、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）の核シグナル強度を測定した。データは３回の実験からの平均値±ＳＥである。＊、Ｐ＜０．０１、スクランブルペプチドと比較した１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチド処理。黄矢印は核輸送されたＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質を示す。
【図１２】１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによるＡ２０の再活性化を介したＮＦ−κＢ抗アポトーシス経路の阻止の模式図である。膀胱癌細胞において、トランス活性化されたＤＥＰＤＣ１タンパク質は、同時転写リプレッサーとしてのＺＮＦ２２４との相互作用を通して、Ａ２０トランス活性化を抑止し、ＮＦ−κＢの活性化を通して抗アポトーシス経路の活性化をもたらす（上パネル）。他方、ドミナントネガティブペプチドである１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８による処理においては、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体形成の阻害によりＡ２０の転写活性が上方制御されてＩκＢの細胞内蓄積がもたらされ、その後、ＮＦ−κＢの不活化を通して抗アポトーシス経路が阻害される（下パネル）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
態様の説明
本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本材料および本方法を記載する前に、本発明が、本明細書に記載された特定のサイズ、形、寸法、材料、方法論、プロトコル等に限定されず、これらがルーチンの実験法および最適化に従い変動し得ることを理解されたい。また、明細書中で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
【００１７】
本明細書中で言及された各々の公開、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなる記載も、先行発明のため、本発明がそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【００１８】
矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。
【００１９】
Ｉ．定義
「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」という用語は、完全な生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分のサブセット（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むが、これらに限定されない体液）をさす。「生物学的試料」とは、完全な生物、またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、またはそれらの画分もしくは部分をさらにさす。最後に、「生物学的試料」とは、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含有している、生物が増殖したニュートリエントブロスまたはゲルなどの培地をさす。
【００２１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーをさすために互換的に本明細書で使用され、特に指定されない限り、一般的に認められている一文字記号により言及される。これらの用語は、一つまたは複数の核酸がエステル結合により連結されている核酸（ヌクレオチド）ポリマーに当てはまる。核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成されていてよく、天然に存在する核酸ポリマーおよび天然には存在しない核酸ポリマーの両方を包含する。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために互換的に本明細書で使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸のみならず、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体もさし、１つまたは複数のアミノ酸残基が、修飾された残基であるか、または対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体などの、天然には存在しない残基であるアミノ酸ポリマーもさす。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をさす。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸と異なる構造を有するが、類似した機能を有する化学物質をさす。アミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された、それらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号により言及される場合もある。
【００２３】
他に定義されない限り、「がん」という用語は、ＤＥＰＤＣ１遺伝子を過剰発現しているがんをさす。ＤＥＰＤＣ１を過剰発現しているがんの例には膀胱癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
ＩＩ．遺伝子およびタンパク質
本発明の関心対象である遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は、以下の番号で示されるが、これらに限定されない；
ＤＥＰＤＣ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および４５、または４６および４７；
ＺＮＦ２２４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８および４９；
ＤＬＧ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および５１；ならびに
Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２および５３。
追加的な配列データは以下のアクセッション番号を介して入手可能である；
ＤＥＰＤＣ１：ＡＢ３８２２８７またはＮＭ＿０１７７７９．４；
ＺＮＦ２２４：ＮＭ＿０１３３９８；
ＤＬＧ１：ＮＭ＿００１０９８４２４；および
Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）：ＮＭ＿００６２９０。
【００２５】
本発明の一局面によると、機能的等価物も上記の「ポリペプチド」であると見なされる。本明細書において、タンパク質の「機能的等価物」とは、そのタンパク質と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、元のポリペプチドの生物学的能力を保持している任意のポリペプチドが、本発明において、そのような機能的等価物として使用され得る。そのような機能的等価物には、タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、付加されているか、または挿入されているものが含まれる。あるいは、ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、さらに好ましくは９６％〜９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されていてもよい。他の態様において、ポリペプチドは、遺伝子の天然に存在するヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、それを作製するために使用された細胞もしくは宿主、または利用された精製法に依って、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変動を有していてもよい。それにもかかわらず、本発明のヒトタンパク質のものと等価な機能を有する限り、それは本発明の範囲内である。
【００２７】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、その標的配列、典型的には核酸の複雑な混合物中にある標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で変動する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲の案内は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が、標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される）。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのため、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、５０℃での０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳによる洗浄。
【００２８】
本発明との関連において、上記のヒトタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件を、当業者はルーチンに選択することができる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを実施し、標識されたプローブを添加し、６８℃で１時間以上加熱することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。例えば、低ストリンジェントな条件においては、以下の洗浄工程を実施することができる。例示的な低ストリンジェントな条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。多くの場合、高ストリンジェンシー条件が好んで使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳで２０分間、室温での３回の洗浄、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、３７℃での３回の洗浄、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、５０℃での２回の洗浄が含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などの幾つかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があり、当業者は、必要なストリンジェンシーを達成するために適切に因子を選択することができる。
【００２９】
一般的に、タンパク質における１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、タンパク質の機能に影響を与えない。実際に、変異型タンパク質または改変型タンパク質（すなわち、１つ、２つ、または幾つかのアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、および／または付加により改変されているアミノ酸配列から構成されたペプチド）は、元の生物学的活性を保持することが公知である（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81： 5662-6 （1984）；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10：6487-500 （1982）；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79： 6409-13 （1982））。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、参照配列内の１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されているアミノ酸配列を有することができる。
【００３０】
単一のアミノ酸もしくは少ない比率のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、または「保存的修飾」であるとみなされるもの、すなわち、変更が元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすようなものは、元の参照タンパク質のものと類似した機能を有するタンパク質の生成をもたらす傾向があり、したがって、本発明に関して許容可能であることを、当業者は認識するであろう。
【００３１】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下を変えることが一般的に好ましい。したがって、好ましい一態様において、そのような変異体において変異させるべきアミノ酸の数は、一般的には、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは５または６アミノ酸以下、さらに好ましくは３または４アミノ酸以下である。
【００３２】
変異させられるアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有している側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有している側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有している側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有している側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含有している側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００３３】
そのような保存的に改変されたポリペプチドは、本タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、かつタンパク質の生物学的活性が少なくとも１つ保持される限り、非保存的改変を含む。さらに、改変されたタンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを除外しない。
【００３４】
さらに、本発明の遺伝子には、タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドが包含される。タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ハイブリダイゼーションに加えて、上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを使用した、遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒト遺伝子およびヒトタンパク質と機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それぞれ、通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは、典型的には４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％〜９５％以上、さらに好ましくは９６％〜９９％以上の相同性をさす。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従い、決定され得る。
【００３５】
ＩＩＩ．ＤＥＰＤＣ１変異ポリペプチド
本明細書に開示されるタンパク質のドミナントネガティブ変異体は、がんを治療または予防するために使用され得、該がんは膀胱癌である。例えば、本発明は、ドミナントネガティブ効果を有するＤＥＰＤＣ１変異体またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象におけるがんを治療または予防する方法を提供する。ＤＥＰＤＣ１変異体は、ＺＮＦ２２４結合領域を含むアミノ酸配列を含み得る（図４および図５を参照されたい）。ＤＥＰＤＣ１変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の６１１〜６２８位またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の３２７〜３４４位に相当するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有し得る。
【００３６】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７からなるペプチドの生物学的機能を欠く、配列ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を含むポリペプチド；または該ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列も提供する。好ましい態様において、欠失させられる生物学的機能は、がん細胞の細胞増殖を促進する活性である。本発明のポリペプチドの長さは、全長ＤＥＰＤＣ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７；８１１残基または５２７残基）未満であり得る。一般的に、本発明のポリペプチドは、２００個未満のアミノ酸残基、好ましくは１００個未満のアミノ酸残基、より好ましくは１０〜５０個、あるいは８〜３０個のアミノ酸残基を有し得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドには、修飾型ポリペプチドが包含される。本発明において、「修飾型」という用語は、例えば、他の物質との結合をさす。したがって、本発明との関連において、ポリペプチドは、細胞膜透過性物質などの他の物質をさらに含んでいてもよい。他の物質の例には、ペプチド、脂質、糖、および様々な天然に存在するポリマーまたは合成ポリマーなどの有機化合物が含まれるが、これらに限定されない。得られるポリペプチドが、ＤＥＰＤＣ１のＺＮＦ２２４との結合を阻害するという所望の活性を保持する限り、本発明のポリペプチドは、任意の数の修飾を有していてもよい。いくつかの態様において、阻害性ポリペプチドは、直接、ＤＥＰＤＣ１のＺＮＦ２２４との結合に競合することができる。修飾は、本発明のポリペプチドに付加的な機能を付与するものであってもよい。付加的な機能の例には、標的に向かう能力（ｔａｒｇｅｔａｂｉｌｉｔｙ）、送達能力（ｄｅｌｉｖｅｒａｂｉｌｉｔｙ）、および安定化が含まれる。
【００３８】
いくつかの好ましい態様において、ＤＥＰＤＣ１変異体は膜伝達剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に連結され得る。多数のペプチド配列が、生細胞へと移動する能力について特徴付けられており、本発明においてこの目的のため使用され得る。そのような膜伝達剤（典型的には、ペプチド）は、内部移行後に生細胞内の細胞質コンパートメントおよび／または核コンパートメントに到達する能力により定義される。伝達剤が由来し得るタンパク質の例には、ＨＩＶ  Ｔａｔトランス活性化因子１および２、ならびにキイロショウジョウバエ転写因子アンテナペディア３が含まれる。さらに、伝達活性を有する非天然ペプチドが使用されている。これらのペプチドは、典型的には、移動について試験される、膜相互作用特性について公知の低分子ペプチドである。Ｋ−線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の分泌シグナル配列内の疎水性領域、毒液毒素マストパラン（トランスポータン）１３、およびブフォリンＩ１４（両生類抗微生物ペプチド）が、伝達剤として有用であることが示されている。本発明に関して有用な伝達剤の概説に関しては、Joliot et al. Nature Cell Biology 6:189-96 (2004)を参照されたい。
【００３９】
ＤＥＰＤＣ１変異体は、一般式：
［Ｒ］−［Ｄ］
を有してもよく、式中、［Ｒ］は膜伝達剤であり、かつ［Ｄ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。該一般式において、［Ｒ］は、［Ｄ］に直接連結されていてもよいし、またはリンカーを通して［Ｄ］に間接的に連結されていてもよい。複数の官能基を有するペプチドまたは化合物が、リンカーとして使用され得る。特に、−ＧＧＧ−であるアミノ酸配列が、リンカーとして使用され得る。あるいは、膜伝達剤およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、微粒子の表面に結合していてもよい。
【００４０】
本発明との関連において、［Ｒ］は［Ｄ］の任意の領域に連結され得る。例えば、［Ｒ］は、［Ｄ］のＮ末端もしくはＣ末端、または［Ｄ］を構成するアミノ酸残基の側鎖に連結され得る。さらに、［Ｒ］の複数の分子が、［Ｄ］の１つの分子に連結されていてもよい。いくつかの態様において、［Ｒ］の複数の分子は、［Ｄ］の異なる部位に連結されていてもよい。別の態様において、共に連結された幾つかの［Ｒ］によって［Ｄ］が修飾されていてもよい。
【００４１】
膜伝達剤は、以下にリストされる群より選択され得る。
［ポリアルギニン］；  Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-7 (2003).
［Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９） Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988).
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988).
［ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994).
［ブフォリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000).
［トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２）
Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998).
［ＭＡＰ（ｍｏｄｅｌ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）  ／  ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998).
［Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995).
［Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ］（ＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：３５）
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003).
［Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003).
［プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002). 
［ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001).
［Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001).
［ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）
Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000).
［Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002).
［ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000).
【００４２】
本発明との関連において、ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は限定されないが、いくつかの好ましい態様において、５〜２０個の連続アルギニン残基が、例として挙げられうる。好ましい態様において、ポリアルギニンのアルギニン残基の数は、１１である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブ断片」という語句は、ＺＮＦ２２４と複合体化することができるＤＥＰＤＣ１の変異型をさす。このように、ドミナントネガティブ断片は、全長ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドと機能的に等価でないものである。好ましいドミナントネガティブ断片は、ＺＮＦ２２４結合領域を含むものである。
【００４４】
別の態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７からなるペプチドの生物学的機能を欠く、配列ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を有するポリペプチド；そのようなポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド；またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、がんを治療または予防するための医薬組成物の製造における使用を提供する。さらに、別の態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７のペプチドの生物学的機能を欠く、配列ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を含むポリペプチド；該ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド；またはそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを活性成分として含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための剤も提供する。あるいは、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５または４７のペプチドの生物学的機能を欠く、配列ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）から構成されるポリペプチド；または該ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド；および薬学的に許容可能な担体とを含む、がんの治療または予防のための医薬組成物も提供する。
【００４５】
がんを治療するかまたは細胞におけるアポトーシスを誘導するために、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなどのその他の哺乳動物に、例えば、調製された医薬として、本発明のポリペプチドを投与する場合には、単離された化合物を、直接投与してもよいし、または医薬を調製するための公知の方法を使用して適切な剤形へと製剤化してもよい。例えば、必要であれば、医薬は、水または任意のその他の薬学的に許容可能な液体を含む滅菌された溶液または懸濁物である注射可能な形態で投与され得る。例えば、化合物は、一般的に認められている医薬を製造するのに必要な単位剤形で、薬理学的に許容可能な担体または媒体、特に、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定剤、矯味剤、賦形剤、媒体、保存剤、および結合剤と混合され得る。これらの製剤の中の活性成分の量に依って、指定範囲内の好適な用量が決定され得る。
【００４６】
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、およびその他の条件；投与経路；ならびに投与が局所的であるかそれとも全身的であるかなどの因子を考慮することにより、所定の対象に投与されるポリペプチドの有効量を容易に決定することができる。
【００４７】
投薬量は症状によって変動し得るが、がんの治療または予防のためのポリペプチドまたはその活性断片の例示的な用量は、標準的な成人（体重６０ｋｇ）に経口投与される場合、１日当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約２０ｍｇである。
【００４８】
化合物が注射可能な形態で標準的な成人（体重６０ｋｇ）に非経口投与される場合、約０．０１ｍｇ〜約３０ｍｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／日、より好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／日の用量を静脈注射することが便利であるが、それは患者、標的器官、症状、および投与方法に依って、わずかに変動する。同様に、６０ｋｇの体重のための用量から変換された量で、他の動物に化合物を投与することができる。
【００４９】
より多量またはより少量のペプチドが投与され得ることが企図される。特定の状況に必要とされる正確な投薬量は、当業者によって容易にルーチンに決定され得る。
【００５０】
本発明は、膀胱癌などの、ＤＥＰＤＣ１を過剰発現しているがんを治療するための医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、そのような方法またはプロセスは、配列ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を含むポリペプチド；または該ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドである活性成分を、薬学的または生理学的に許容可能な担体と混和する工程を含む。
【００５１】
ＩＶ．抗がん化合物のスクリーニング
本発明との関連において、本スクリーニング法により同定される剤には、任意の化合物、または幾つかの化合物を含む組成物が含まれる。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であっても、または化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを前記方法において使用する場合には、化合物を逐次的に接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
【００５２】
任意の試験剤または試験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製されたタンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等などの核酸構築物を含む）、および天然化合物を、本発明のスクリーニング法において使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、（１）生物学的ライブラリ、（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相または液相のライブラリ、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法の多数のアプローチのいずれかを使用して入手され得る。アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12： 145-67）。分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野で見い出され得る（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90： 6909-13；Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91： 11422-6；Zuckermann et al., J Med Chem 37： 2678-85, 1994；Cho et al., Science 1993, 261： 1303-5；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33： 2059；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33： 2061；Gallop et al., J Med Chem 1994, 37： 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13： 412-21を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 1991, 354： 82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364： 555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89： 1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249： 386-90；Devlin, Science 1990, 249： 404-6；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87： 6378-82；Felici, J Mol Biol 1991, 222： 301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
【００５３】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって入手される剤に含まれる。
【００５４】
さらに、スクリーニングされた試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを入手するためには、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推定することもできるし、または入手されたタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、その配列に基づきオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手することもできる。入手されたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験剤または試験化合物の調製における有用性に関して確認される。
【００５５】
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物は、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよく、またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００５６】
試験剤／試験化合物ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、本スクリーニング法のための試験剤または試験化合物の同定およびそのような剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を以下に提供する。
【００５７】
（ｉ）分子モデリング
試験剤／試験化合物ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知の化合物の分子構造、および／またはＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４の分子構造の知識により容易になる。さらなる評価のために好適な試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための１つのアプローチは、試験剤／試験化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
【００５８】
コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全にするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方または両方に軽微な変化が加えられた場合に、分子−化合物相互作用がどのようになるかを予測するには、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要とされ、それらは、通常、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと連結される。
【００５９】
上記に概説された分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓが含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互作用的構築、改変、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【００６０】
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを主題として、多数の論文が発表されており、その例には、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97： 159-66；Ripka, New Scientist 1988, 54-8；McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29： 111-22；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291： 189-93；Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236： 125-40, 141-62；および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111： 1082-90が含まれる。
【００６１】
化学物質をスクリーニングし図示するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）などの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31： 722-9；Meng et al., J Computer Chem 1992, 13： 505-24；Meng et al., Proteins 1993, 17： 266-78；Shoichet et al., Science 1993, 259： 1445-50を参照されたい。
【００６２】
推定の阻害剤が同定されたならば、以下に詳述されるように、同定された推定の阻害剤の化学構造に基づき、多数のバリアントを構築するため、コンビナトリアルケミストリー技術を利用することができる。その結果得られた推定の阻害剤または「試験剤または試験化合物」のライブラリは、試験剤または試験化合物、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはそれらの術後再発の予防を同定するため、本発明の方法を使用してスクリーニングされ得、特に、該がんは膀胱癌である。
【００６３】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することにより、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。そのようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアルケミカルライブラリと称される。
【００６４】
コンビナトリアルケミカルライブラリの調製は、当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製され得る。コンビナトリアルケミカルライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37： 487-93；Houghten et al., Nature 1991, 354： 84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学を使用することもできる。そのような化学には、ペプチド（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90： 6909-13）、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114： 6568）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114： 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116： 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261： 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59： 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement；Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14（3）： 309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274： 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1； 6（6）： 624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を参照されたい）。さらに、コンビナトリアルライブラリ自体も多数市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．，Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｅｘｔｏｎ，  ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＭＤ等を参照されたい）。
【００６６】
（ｉｉｉ）その他の候補
もう１つのアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249： 386-90；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87： 6378-82；Devlin et al., Science 1990, 249： 404-6）を使用すれば、極めて大きいライブラリを構築することができる（例えば、１０６〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Ｇｅｙｓｅｎの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23： 709-15；Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102： 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251： 767-73）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR： 013； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37： 487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
【００６７】
アプタマーは、特定の分子標的に強固に結合する核酸から構成された巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249：505-510 （1990））は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【００６８】
Ｖ．ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を減少させる化合物のスクリーニング：
本発明との関連において、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の相互作用は、免疫沈降により確認される（図１Ｂ）。したがって、本発明は、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を阻害する化合物は、ＤＥＰＤＣ１を発現しているがん細胞の増殖を抑制し、ＤＥＰＤＣ１と関係のあるがんの治療または予防のために有用であると予想される。したがって、本発明は、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を阻害して、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供し、特に、該がんは膀胱癌である。
【００６９】
より具体的には、本発明の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＺＮＦ２２４ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程；および
（ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
【００７０】
本発明によると、細胞増殖の阻害に関する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＤＥＰＤＣ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果が評価され得る。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００７１】
より具体的には、前記方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＺＮＦ２２４ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合のレベルを検出する工程；および
（ｃ）ＤＥＰＤＣ１タンパク質とＺＮＦ２２４タンパク質との結合レベルを、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるものと比較する工程；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【００７２】
本発明との関連において、治療効果を、ＤＥＰＤＣ１タンパク質とＺＮＦ２２４タンパク質との結合レベルと相関させることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＤＥＰＤＣ１タンパク質とＺＮＦ２２４タンパク質との結合のレベルを低下させる場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＤＥＰＤＣ１タンパク質とＺＮＦ２２４タンパク質との結合レベルを低下させない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【００７３】
「ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドの機能的等価物」という語句は、本明細書で使用される場合、ＺＮＦ２２４結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドをさす。好ましくは、ＺＮＦ２２４結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の１４１〜３００、３００〜６６９、または５８７〜７４０を含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、５４、および５５の群より選択されるアミノ酸配列を含む。同様に、「ＺＮＦ２２４ポリペプチドの機能的等価物」という用語は、ＤＥＰＤＣ１結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドをさす。
【００７４】
本発明の方法を、さらに詳細に、以下に説明する。ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。インビトロアッセイシステムとして、そのようなスクリーニングを実施することができる。より具体的には、まず、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを支持体に結合させ、ＺＮＦ２２４ポリペプチドを試験化合物と共にそれに添加する。次に、混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合したＺＮＦ２２４ポリペプチドを検出し、および／または測定する。有望な候補化合物は、検出されるＺＮＦ２２４ポリペプチドの量を低下させることができる。
【００７５】
あるいは、ＺＮＦ２２４ポリペプチドを支持体に結合させ、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを添加してもよい。本明細書中、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４は、天然タンパク質としてだけでなく、遺伝子組換え技術により調製される組換えタンパク質としても調製され得る。天然タンパク質は、例えば、アフィニティクロマトグラフィにより調製され得る。他方、組換えタンパク質は、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４をコードするＤＮＡにより形質転換された細胞を培養してその中でタンパク質を発現させ、次いで、それを回収することにより調製され得る。
【００７６】
タンパク質を結合させるために使用され得る支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖；ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ等）が使用され得る。ビーズを使用する場合には、ビーズをカラムへ充填することができる。あるいは、同様に当技術分野において公知である磁気ビーズを使用すれば、ビーズ上に結合したタンパク質を磁気によって容易に単離することが可能である。
【００７７】
タンパク質の支持体との結合は、化学結合および物理的吸着などのルーチンの方法によって実施され得る。あるいは、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して、タンパク質を支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンおよびビオチンによっても、タンパク質の支持体との結合を実施することができる。緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限り、例えばリン酸緩衝液およびトリス緩衝液であるがこれらに限定されない緩衝液において、タンパク質間の結合を実施する。
【００７８】
本発明との関連において、結合したタンパク質を検出または定量化する手段として、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用してもよい。そのようなバイオセンサーを使用した場合、極微量のポリペプチドを使用して、標識することなく、タンパク質間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを使用して、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を評価することが可能である。
【００７９】
あるいは、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４を標識し、ポリペプチドの標識を、結合活性を検出または測定するために使用してもよい。具体的には、ポリペプチドの一方を前標識した後、試験化合物の存在下で、標識されたポリペプチドをもう一方のポリペプチドと接触させ、次いで、洗浄後に、結合したポリペプチドを標識によって検出または測定する。放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ｂ−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、およびビオチン／アビジンなどの標識物質を、本方法において、タンパク質の標識のために使用することができる。タンパク質を放射性同位元素により標識する場合には、液体シンチレーションにより検出または測定を実施することができる。あるいは、酵素により標識されたタンパク質は、酵素の基質を添加して、発色などの、酵素による基質の変化を、吸光光度計により検出することにより、検出または測定することができる。さらに、蛍光物質を標識として使用する場合には、蛍光光度計を使用して、結合したタンパク質を検出または測定することができる。
【００８０】
さらに、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４に対する抗体を使用して、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を検出または測定することもできる。例えば、支持体に固定化されたＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを、試験化合物およびＺＮＦ２２４ポリペプチドと接触させた後、混合物をインキュベートし、洗浄し、ＺＮＦ２２４ポリペプチドに対する抗体を使用して検出または測定を実施することができる。
【００８１】
あるいは、ＺＮＦ２２４ポリペプチドを支持体上に固定化し、ＤＥＰＤＣ１に対する抗体を抗体として使用してもよい。本スクリーニングとの関連において抗体を使用する場合には、抗体は、好ましくは、前記標識物質のうちの１つにより標識され、該標識物質に基づき検出または測定される。あるいは、標識物質により標識された二次抗体により検出される一次抗体として、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドまたはＺＮＦ２２４ポリペプチドに対する抗体を使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいて、タンパク質に結合した抗体を、プロテインＧカラムまたはプロテインＡカラムを使用して検出または測定することもできる。
【００８２】
あるいは、本発明のスクリーニング法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68： 597-612 （1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10： 286-92 （1994）」）。
【００８３】
ツーハイブリッドシステムにおいては、例えば、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させ、酵母細胞において発現させる。ＺＮＦ２２４ポリペプチドに結合するＤＥＰＤＣ１ポリペプチドに結合するＺＮＦ２２４ポリペプチドを、ＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合させ、試験化合物の存在下で、同様に酵母細胞において発現させる。あるいは、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させ、ＺＮＦ２２４ポリペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合させてもよい。２つの結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。
【００８４】
ＶＩ．ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現を変更する化合物のスクリーニング：
本発明との関連において、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現は、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４のｓｉＲＮＡにより増加した（図３Ａ）。さらに、ＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブタンパク質によるＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の増加は、細胞周期に関係していた（図６）。したがって、本発明は、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現しているがん細胞の増殖を抑制する化合物、またはＤＥＰＤＣ１と関係のあるがんを治療もしくは予防するために有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、特に、該がんは膀胱癌である。本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）候補化合物を、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞と接触させる工程、ならびに
（ｂ）試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現レベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
【００８５】
本発明によると、細胞増殖の阻害に関する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＤＥＰＤＣ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびＤＥＰＤＣ１関連疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【００８６】
本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＤＥＰＤＣ１遺伝子およびＺＮＦ２２４遺伝子を発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）ＤＬＧ１遺伝子またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子の発現レベルを検出する工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【００８７】
本発明との関連において、治療効果を、ＤＬＧ１遺伝子またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子の発現レベルと相関させることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＤＬＧ１遺伝子またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子の発現レベルを増加させる場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＤＬＧ１遺伝子またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子の発現レベルを増加させない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【００８８】
本発明の方法を、より詳細に、以下に説明する。ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞には、例えば、膀胱癌から樹立された細胞株、またはＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４発現ベクターによるトランスフェクションにより樹立された細胞株が含まれる。当業者に周知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、フローサイトメトリー分析により、発現レベルを推定することができる。本明細書で定義される「発現レベルを増加させる」とは、好ましくは、化合物の非存在下での発現レベルと比較した、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現レベルの少なくとも１１０％の低下、より好ましくは少なくとも１２５％、１５０％、または１７５％低下したレベル、最も好ましくは２００％低下したレベルである。本明細書中の化合物には、化学物質、ＤＥＰＤＣ１またはＺＮＦ２２４の二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。スクリーニングの方法において、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の発現レベルを増加させる化合物を、がんの治療または予防のために使用される候補化合物として選択することができる。
【００８９】
あるいは、本発明のスクリーニング法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している細胞に、候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）対照と比較して、レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
【００９０】
本発明によると、細胞増殖の阻害に関する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはＤＥＰＤＣ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびＤＥＰＤＣ１関連疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【００９１】
本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）ＤＬＧ１遺伝子またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に、試験剤または試験化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【００９２】
本発明との関連において、治療効果は、レポーター遺伝子の発現または活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現または活性を増加させる場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現または活性を増加させない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【００９３】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が含まれるがこれらに限定されず、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を、ＤＬＧ１またはＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写調節領域と接続することにより調製され得る。本明細書中のＤＬＧ１の転写調節領域には、転写開始部位から少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐまたは１００００ｂｐ上流までの領域が含まれる。ＤＬＧ１の好適な転写調節領域は、ＤＬＧ１の転写開始部位から−１２１１〜＋１９位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）である。あるいは、Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の好適な転写調節領域は、Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）の転写開始部位から−３００〜−３５位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）である。転写調節領域を含有しているヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離されてもよいし、またはＰＣＲによって増幅させられてもよい。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域と接続することにより調製され得る。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコルも周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【００９４】
前記レポーター構築物を含有しているベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を使用して）検出する。本明細書中で定義される「発現または活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現または活性の、化合物の非存在下と比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下である。
【００９５】
本発明において、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を抑制することにより、細胞増殖が低下することが明らかになった。したがって、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との結合を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物の治療的可能性は、がんの治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価され得る。
【００９６】
ＶＩＩ．二本鎖分子
本明細書で使用される場合、「単離二本鎖分子」という用語は標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および短鎖干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子をさす。ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型である技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＲＮＡは、ＺＮＦ２２４のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＺＮＦ２２４のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成している、２つのＲＮＡ分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書において、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドとＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ＺＮＦ２２４のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＺＮＦ２２４のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれであってもよい。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつ該相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、またはもう一つの選択肢として分子の一方がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「単離核酸」は、その元の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出した核酸であり、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明との関連において、単離核酸の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が挙げられる。
【０１０４】
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、ＺＮＦ２２４に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合し、それにより、翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することにより、ＺＮＦ２２４遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を減少させるかまたは阻害する。本明細書中で証明される通り、ＰＤＡＣ細胞株におけるＺＮＦ２２４の発現はｄｓＲＮＡによって阻害された（図２）。したがって、本発明は、ＺＮＦ２２４遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、ＺＮＦ２２４遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述されるものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
【０１０５】
ＺＮＦ２２４標的配列には、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）のヌクレオチドが含まれ、二本鎖分子のセンス鎖には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０のヌクレオチドが含まれる。特に、本発明は、以下の［１］〜［２０］の二本鎖分子を提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖と該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつ細胞に導入された場合にＺＮＦ２２４のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する、［１］に記載の二本鎖分子；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド長未満である、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド長未満である、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［７］に記載の二本鎖分子；
［１０］介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１１］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’ を有する二本鎖分子であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１０］に記載の二本鎖分子；
［１２］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１１］に記載の二本鎖分子；
［１３］ＲＮＡから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１４］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１４］に記載の二本鎖分子；
［１６］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１４］に記載の二本鎖分子；
［１８］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１７］に記載の二本鎖分子；
［１９］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから構成される、［１８］に記載の二本鎖分子；ならびに
［２０］３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の二本鎖分子。
【０１０６】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１０７】
細胞において標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから入手可能である（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【０１０８】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１０９】
標的部位の選択
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在とその３’側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これは、これらの領域に調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25（17）:3389-402）。
３．  合成のために適格である標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
【０１１０】
上記のプロトコルを使用して、本発明の単離二本鎖分子の標的配列を、以下のように設計した。
ＺＮＦ２２４遺伝子に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８。
【０１１１】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について調査した。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＺＮＦ２２４遺伝子に関して、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）。
【０１１２】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＺＮＦ２２４遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ＺＮＦ２２４遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１１３】
上述のＺＮＦ２２４遺伝子の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列および／または該標的配列に相補的な配列のいずれかを含有する単離ポリヌクレオチドを含む。ＺＮＦ２２４遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７または５８の配列、ならびに／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、上述の核酸配列における軽微な改変は、改変された分子がＺＮＦ２２４遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。本明細書において、核酸配列と関連して使用される「軽微な改変」という句は、配列に対する核酸の１つ、２つ、または幾つかの置換、欠失、付加、または挿入を示す。
【０１１４】
本発明との関連において、核酸の置換、欠失、付加、および／または挿入に対し適用される「幾つか」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、さらに好ましくは３〜４個、さらに好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【０１１５】
本発明の好ましい態様において、二本鎖分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の群から選択されるセンス鎖を有する。
【０１１６】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書の以下の実施例では、ＺＮＦ２２４遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖、またはそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を、がん細胞株におけるＺＮＦ２２４遺伝子産物の産生を低減させる能力に関して、標準的な方法に従って、インビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べた、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＺＮＦ２２４遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１における「半定量的逆転写−ＰＣＲ」の項で述べられたＺＮＦ２２４のｍＲＮＡに対するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいてＺＮＦ２２４遺伝子産物の産生を低減する配列は、続いて、細胞増殖に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、続いて、ＺＮＦ２２４遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認するために、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いて、これらのインビボ能力に関して試験することができる。
【０１１７】
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが改変ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合することができる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のミスマッチしか含有していない。特に好ましい態様では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【０１１８】
ポリヌクレオチドは好ましくは、ＺＮＦ２２４では２４６６ヌクレオチド長未満である。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子に関して、５００ヌクレオチド長未満、２００ヌクレオチド長未満、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＮＭ＿０１３３９８遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または該二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子の形成に使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、好ましくは２１ヌクレオチドより長くてもよく、およびより好ましくは、約１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１９】
したがって、本発明は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズすることで、ヌクレオチド対１９〜２５個の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【０１２０】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含有し得る。当技術分野において公知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（ＷＯ０３／０７０７４４、ＷＯ２００５／０４５０３７）。一態様では、分解耐性の改善または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基残基の組み込みが挙げられる（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）。
【０１２１】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的指向化効率を増大させるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様では、標的ｍＲＮＡにおける、および／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドオーバーハングヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【０１２２】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）から構成されるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方上でＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。
【０１２３】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害することが可能であれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドがＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、のいずれであってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するためには、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する事が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡである事が必要である。
【０１２４】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例では、二本鎖分子の上流部分領域（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域が、上流部分領域と称される。すなわち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから構成される。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型の二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’：アンチセンス鎖。
【０１２５】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９個〜１３個のヌクレオチドから構成されるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである、１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果が非常に高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。
【０１２６】
本発明との関連において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えば低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡおよびＲＮＡからなる低分子のヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる、タイトなヘアピンターン（ｔｉｇｈｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｕｒｎ）を作る、ＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に適合するｍＲＮＡと結合してこれを切断する。
【０１２７】
任意のヌクレオチド配列から構成されるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’ を有する二本鎖分子も提供し、式中、［Ａ］は標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である。標的配列は、例えば、ＺＮＦ２２４に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７または５８のヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１２８】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＺＮＦ２２４遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から改変された配列であってもよい。本発明において、領域［Ａ］は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９または１０の配列から選択される。［Ａ］領域は［Ａ’］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から構成されるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６．ｈｔｍｌ）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１２９】
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＧＡＵＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＡ−［Ｂ］−ＵＣＵＵＣＡＵＣＡＵＣＣＡＡＡＵＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７用）；
ＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＧＡ−［Ｂ］−ＵＣＵＵＧＡＵＧＵＧＵＵＣＣＵＧＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８用）；
ＣＣＧＡＵＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＡ−［Ｂ］−ＵＣＵＵＣＡＵＣＡＵＣＣＡＡＡＵＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９用）；
ＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＧＡ−［Ｂ］−ＵＣＵＵＧＡＵＧＵＧＵＵＣＣＵＧＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０用） 
【０１３０】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２、概して２〜１０、好ましくは２〜５である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
【０１３１】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で公知の化学合成方法を使用するのが好ましい。化学合成方法に従って、センスおよびアンチセンスの一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングの具体的な例では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６、最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、または残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって任意で取り除かれる方法が挙げられる。
【０１３２】
ＺＮＦ２２４配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよく、このためこれらの発現は独立に、または時間的もしくは空間的様式で調節することができる。二本鎖分子は、ＺＮＦ２２４遺伝子の鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
【０１３３】
ＶＩＩＩ．本発明の二本鎖分子を含有するベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、および該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。
【０１３４】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［１２］のベクターを提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＺＮＦ２２４のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクター；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する二本鎖分子をコードする、［１］に記載のベクター；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［１］に記載のベクター；
［４］約１００ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［３］に記載のベクター；
［５］約７５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［４］に記載のベクター；
［６］約５０ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［５］に記載のベクター；
［７］約２５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［６］に記載のベクター；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である二本鎖分子をコードする［７］に記載のベクター；
［９］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１］に記載のベクター；
［１０］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載のベクター；ならびに
［１１］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１０］に記載のベクター。
［１２］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１１］に記載のベクター。
【０１３５】
本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合に、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。好ましい態様では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。そのような本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに使用でき、またはがんを治療するための活性成分として直接使用することができる。
【０１３６】
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖が（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような方法で制御配列がＺＮＦ２２４配列と機能的に連結するように、ＺＮＦ２２４配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの３’末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。あるいは、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニングされた配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１３７】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１３８】
本発明のベクターは例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを含む。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、組換えワクシニアウイルスは前記分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１３９】
ＩＸ．本発明の二本鎖分子を使用して、がん細胞の増殖を阻害または低下させ、がんを治療する方法
特定のｓｉＲＮＡの、がんを阻害する能力は、参照として本明細書に組み入れられるＷＯ２００６／０８５６８４において以前に説明されている。本発明において、ＺＮＦ２２４についての２つの異なるｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力について試験した。がん細胞株における遺伝子の発現を効果的にノックダウンした、ＺＮＦ２２４についての２つのｄｓＲＮＡは、細胞増殖の抑制と一致した（図２）。
【０１４０】
したがって、本発明は、ＺＮＦ２２４の発現の阻害を介してＺＮＦ２２４遺伝子の機能障害を誘導することにより、細胞増殖、すなわち、膀胱癌の細胞増殖を阻害する方法を提供する。ＺＮＦ２２４遺伝子の発現は、ＺＮＦ２２４遺伝子を特異的に標的とする本発明の前記二本鎖分子のいずれか、または該二本鎖分子のいずれかを発現し得る本発明のベクターによって阻害され得る。
【０１４１】
本二本鎖分子および本ベクターの、がん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力は、それらが、がんを治療するための方法に使用され得ることを示す。したがって、ＺＮＦ２２４遺伝子が正常器官ではほとんど検出されなかったため（図１）、本発明は、有害作用なしに、ＺＮＦ２２４遺伝子に対する二本鎖分子、または該分子を発現するベクターを投与することによってがんを有する患者を治療する方法を提供する。
【０１４２】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［３８］の方法を提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつＺＮＦ２２４遺伝子を過剰発現している細胞におけるＺＮＦ２２４発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を、少なくとも１つ、投与する工程を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための方法であって、該がん細胞またはがんがＺＮＦ２２４遺伝子を発現している、方法；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の方法；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の方法；
［４］治療されるがんが膀胱癌である、［１］に記載の方法；
［５］複数種の二本鎖分子が投与される、［１］に記載の方法；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の方法；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の方法；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の方法；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の方法；
［１０］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［９］に記載の方法；
［１１］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１０］に記載の方法；
［１２］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１０］に記載の方法；
［１３］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する方法であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１２］に記載の方法；
［１４］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１３］に記載の方法；
［１５］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の方法；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含有している、［１］に記載の方法；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の方法；
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１７］に記載の方法；
［１９］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１６］に記載の方法；
［２０］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１９］に記載の方法；
［２１］隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドから構成される、［２０］に記載の方法；
［２２］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の方法；
［２３］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、［１］に記載の方法；
［２４］二本鎖分子がベクターによりコードされる、［１］に記載の方法；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４５５〜４８５位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２４］に記載の方法；
［２６］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２５］に記載の方法；
［２７］治療されるがんが膀胱癌である、［２４］に記載の方法；
［２８］複数種の二本鎖分子が投与される、［２４］に記載の方法；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２６］に記載の方法；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］に記載の方法；
［３１］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］に記載の方法；
［３２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］に記載の方法；
［３３］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］に記載の方法；
［３４］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［３３］に記載の方法；
［３５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２４］に記載の方法；
［３６］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する方法であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［３５］に記載の方法；
［３７］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［３６］に記載の方法；ならびに
［３８］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、［２４］に記載の方法。
【０１４３】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。ＺＮＦ２２４遺伝子を発現している細胞の増殖は、ＺＮＦ２２４遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれらを含有している組成物と、細胞を接触させることにより阻害され得る。さらに、細胞をトランスフェクション剤と接触させることもできる。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、その細胞が、分子に曝露されていない細胞と比較して、より低い速度で増殖するか、または減少した生存能を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、測定され得る。
【０１４４】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現している限り、任意の種類の細胞の増殖を、本方法によって抑制することができる。例示的な細胞にはがん細胞、特に膀胱細胞株が含まれる。
【０１４５】
したがって、ＺＮＦ２２４に関連した疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有する患者を、本二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現している少なくとも１つのベクター、または該分子の少なくとも１つを含有している少なくとも１つの組成物の投与によって治療することができる。例えば、膀胱癌に罹患している患者が、本方法によって治療され得る。がんの種類は、診断される腫瘍の特定の種類によって、標準的な方法によって同定され得る。好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって、患者由来の生検材料におけるＺＮＦ２２４の発現を検出することにより選択される。より好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検試料を、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫組織化学分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、ＺＮＦ２２４遺伝子の過剰発現について確認する。
【０１４６】
複数種の二本鎖分子（またはそれを発現するベクターまたはそれを含有している組成物）の投与を通して、細胞増殖を阻害し、それによりがんを治療する本方法によると、分子は各々、異なる構造を有するが、ＺＮＦ２２４の同一の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用しうる。あるいは、複数種の二本鎖分子は、同一の遺伝子の異なる標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用しうる。例えば、方法は、ＺＮＦ２２４から選択される１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に対する指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。
【０１４７】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、該分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｅｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業）を利用することができる。
【０１４８】
治療は、臨床的利点、例えばＺＮＦ２２４遺伝子の発現の低減、または対象におけるがんのサイズ、有病率、もしくは転移能の減少をもたらす場合に、「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療ががんの形成を遅らせるもしくは防ぐか、またはがんの臨床症状を防ぐかもしくは緩和するという意味である。有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して求められる。
【０１４９】
本発明の方法および組成物が予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の文脈で有用であるという点で、そのような用語は、疾患による死亡または罹患の負担を低減する任意の活性を意味するよう本明細書において互換的に用いられる。予防は、「一次的、二次的、および三次的な予防レベルで」行うことができる。一次的な予防は疾患の発症を回避するのに対して、二次的および三次的なレベルの予防は、機能を回復することおよび疾患に関連する合併症を低減することにより、疾患の進行および症状の出現の予防、ならびに既に確立された疾患の悪影響の低減を目的とする活動を包含する。あるいは、予防は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば、腫瘍の増殖および転移を低減することを目的とする広範な予防的療法を含み得る。
【０１５０】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または手術後のその再発の予防は、以下の工程のいずれかを含む：がん細胞の外科的除去、がん細胞の増殖阻害、腫瘍の退縮または退行、がんの発生の寛解および抑制の誘導、腫瘍退行、ならびに転移の低減または阻害等。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを減少させ、およびがんに付随する検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の低減または改善は、１０％、２０％、３０％、またはそれ以上の低減を含む効果的な治療および／または予防、または安定している疾患を構成する。
【０１５１】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＺＮＦ２２４のｍＲＮＡを分解することが理解される。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的様式で標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的ながん治療に比べて、本発明は治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くにおける二本鎖分子の有意に少ない送達を必要とする。
【０１５２】
当業者は、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的または全身的のいずれであるかなどの因子を考慮して、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近くにおいて約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである細胞内濃度である。より多くのまたはより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが意図される。特定の状況において必要とされる正確な用量は、当業者により容易にかつルーチン的に決定されうる。
【０１５３】
本発明の方法は、少なくとも１つのＺＮＦ２２４発現するがん、例えば膀胱癌の増殖または転移を阻害するために使用され得る。特に、ＺＮＦ２２４（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７または５８）の標的配列を含む二本鎖分子は、がんの治療にとって特に好ましい。
【０１５４】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子とは異なる薬剤と併用して対象に投与することもできる。あるいは、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するために設計された別の治療法と併用して対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するまたはがん転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンを用いた治療）と併用して投与することができる。
【０１５５】
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとしてのいずれかで対象に投与することができる。
【０１５６】
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１５７】
リポソームは、特定の組織、例えば膀胱組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明の文脈における使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成してもよく、概してこれには、中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【０１５８】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または血管内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１５９】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを避けるように改変される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１６０】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的にまたは物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号（その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変されたリポソームは、非改変リポソームよりも非常に長く循環中に留まる。この理由から、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１６１】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１６２】
リポソームを改変するのに好適なオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐、または樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖状または分岐状）；または、例えばカルボン酸基の結果として生じた連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０１６３】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を用いて改変したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１６４】
オプソニン化阻害部分は、多くの公知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比のテトラヒドロフランおよび水を用いて、還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１６５】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討されている。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するそのようなベクターもまた、直接、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームを含む好適な送達試薬と共に、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野の技術範囲内である。
【０１６６】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するのに好適な任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１６７】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸、鼻腔内、または膀胱内送達が挙げられる。
【０１６８】
好適な非経口投与経路としては、膀胱内または血管内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴注入）；周囲組織および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による、がん部位の領域またはその近くの領域への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がんの部位でまたはその近くで行われることが好ましい。
【０１６９】
本発明の二本鎖分子は、単回投与または複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、または複数回の注入によって送達することができる。剤の注射は、がん部位の組織、またはがん部位の近くの組織に直接行うことが好ましい。がん部位の組織にまたはがん部位の近くの組織に剤を複数回注射することが特に好ましい。
【０１７０】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するのに適当な投与計画を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えばがん部位でのまたはその近くでの単回注射または沈着として、対象に１回で投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与計画では、二本鎖分子は１日１回７日間、がん部位にまたはその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【０１７１】
Ｘ．本発明の二本鎖分子を含有している組成物
上記に加えて、本発明は、本二本鎖分子または該分子をコードするベクターのうちの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の［１］〜［３８］の組成物を提供する：
［１］ＺＮＦ２２４遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための組成物であって、該がんおよびがん細胞がＺＮＦ２２４遺伝子を発現し、さらに該分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、組成物；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の組成物；
［３］二本鎖分子、センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の組成物；
［４］治療されるがんが膀胱癌である、［１］に記載の組成物；
［５］複数種の二本鎖分子を含有している、［１］に記載の組成物；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の組成物；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の組成物；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の組成物；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の組成物；
［１０］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［９］に記載の組成物；
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の組成物；
［１２］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１１］に記載の方法；
［１３］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する組成物であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１２］に記載の組成物；
［１４］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［１３］に記載の方法；
［１５］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の組成物；
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１７］に記載の組成物；
［１９］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１６］に記載の組成物；
［２０］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１９］に記載の組成物；
［２１］隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドから構成される、［２０］に記載の組成物；
［２２］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の組成物；
［２３］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、［１］に記載の組成物；
［２４］二本鎖分子がベクターによりコードされ、かつ組成物に含有されている、［１］に記載の組成物；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の４９４〜５１０位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８の５７６〜５９２位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２４］に記載の組成物；
［２６］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２５］に記載の組成物；
［２７］治療されるがんが膀胱癌である、［２４］に記載の組成物；
［２８］複数種の二本鎖分子が投与される、［２４］に記載の組成物；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２６］に記載の組成物；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］に記載の組成物；
［３１］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］に記載の組成物；
［３２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］に記載の組成物；
［３３］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］に記載の組成物；
［３４］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［３３］に記載の方法；
［３５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２４］に記載の組成物；
［３６］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する組成物であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［２４］に記載の組成物；
［３７］［Ａ］が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０の中から選択される配列に対応する配列からなる、［３６］に記載の方法；ならびに
［３８］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、［２４］に記載の組成物。
【０１７２】
本発明の好適な組成物は以下でより詳細に説明される。
【０１７３】
本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として調合することができる。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌でありかつパイロジェンを含まないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、「医薬製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように当技術分野の技術範囲内である。
【０１７４】
本発明の医薬製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子もしくはこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含有する。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１７５】
本発明によれば、組成物は、複数種類の二本鎖分子を含有することができ、それらの分子のそれぞれが、ＺＮＦ２２４の同じ標的配列または異なる標的配列に対する指向性を有し得る。例えば、組成物は、ＺＮＦ２２４に対する指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。あるいは、例えば組成物は、ＺＮＦ２２４の１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に対する指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
【０１７６】
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、１つ、２つ、または幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。あるいは、本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、それらのベクターのそれぞれは異なる二本鎖分子をコードする。
【０１７７】
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「本発明の二本鎖分子を使用して、がん細胞の増殖を阻害または低下させ、がんを治療する方法」の項を参照されたい。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な医薬賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔ）の添加物（例えばＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または任意でカルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、もしくは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０１７９】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０１８０】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された担体および賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与用の医薬組成物は、上記のようにリポソームに封入された０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻腔内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０１８１】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０１８２】
別の態様において、本発明は、ＺＮＦ２２４の発現を特徴とするがんの治療用の医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用を提供する。例えば、本発明は、ＺＮＦ２２４を発現しているがんの治療用の医薬組成物の製造のための、細胞におけるＺＮＦ２２４遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される配列を標的とする。
【０１８３】
本発明は、ＺＮＦ２２４遺伝子を過剰発現している細胞におけるＺＮＦ２２４の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を調合する工程を含む、ＺＮＦ２２４の発現を特徴とするがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該分子は、活性成分として、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される配列を標的とする。
【０１８４】
別の態様において、本発明は、活性成分を薬学的または生理学的に許容可能な担体と混和する工程を含む、ＺＮＦ２２４の発現を特徴とするがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該活性成分は、ＺＮＦ２２４遺伝子を過剰発現している細胞におけるＺＮＦ２２４の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８の中から選択される配列を標的とする。
【０１８５】
本発明の局面を以下の実施例で説明するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１８６】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。
【０１８７】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１８８】
Ｉ．材料および方法
１．膀胱癌細胞株および組織試料
ヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３およびＪ８２は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。全ての膀胱癌細胞株およびＣＯＳ−７細胞は、以前に記載されたような適切な培地で単層で培養した（Takata R,et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22）。外科的に切除された侵潤性膀胱癌または表在性膀胱癌からの組織試料、ならびにそれらの対応する臨床的情報は、書面によるインフォームドコンセントをとった上で、高知大学医学部（Ｋｏｃｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）、京都府立医科大学（Ｋｙｏｔｏ  Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、名古屋市立大学大学院医学研究科（Ｎａｇｏｙａ  Ｃｉｔｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、金沢大学大学院医学系研究科（Ｋａｎａｚａｗａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および岩手医科大学（Ｉｗａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の５つの病院から入手した。
【０１８９】
２．ＤＥＰＤＣ１と相互作用するタンパク質の同定
膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３からの細胞抽出物を、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、１ｍＬの最終量の免疫沈降緩衝液（０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、１００μＬのプロテインＧ−アガロースビーズと共に４℃で１時間インキュベートすることにより予め浄化（ｐｒｅｃｌｅａｒ）した。８０ｇ、４℃での５分間の遠心分離の後、上清を、抗ＤＥＰＤＣ１ポリクローナル抗体またはノーマルウサギＩｇＧと共に４℃で２時間インキュベートした。次いで、ビーズを、２０００ｇで２分間の遠心分離により収集し、各１ｍＬの免疫沈降緩衝液で５回洗浄した。洗浄されたビーズを、５０μＬのレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸し、タンパク質を５〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分離した。電気泳動後、ゲルを銀染色した。抗ＤＥＰＤＣ１ポリクローナル抗体により免疫沈降した抽出物に特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出し、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＢＩＯＴＥＣＨ））に使用した。
【０１９０】
３．半定量的逆転写−ＰＣＲ
膀胱癌細胞のマイクロダイセクションを、以前に記載されたようにして実施した（Takata R,et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22）。本発明者らは、培養細胞ならびにマイクロダイセクションした膀胱臨床試料および正常ヒト膀胱上皮細胞の各々から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して抽出された全ＲＮＡ、ならびに心臓、肺、肝臓、腎臓、および膀胱から単離されたポリＡ（＋）ＲＮＡ（タカラクロンテック（Takara Clontech）、京都、日本）を調製した。その後、Ｔ７に基づく増幅および逆転写を、以前に記載されたようにして実施した（Takata R, et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22）。定量対照としてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の量をモニタリングすることにより、その後のＰＣＲのための各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。各プライマーセットの配列は以下の通りであった；
ＺＮＦ２２４：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および
５’−ＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ−３’  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および
５’−ＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
ＤＥＰＤＣ１：５’−ＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）および
５’−ＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）；
ＩｋＢ−ａｌｐｈａ；５’−ＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）および
５’−ＣＣＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）。
【０１９１】
４．発現ベクターの構築
ＺＮＦ２２４のオープンリーディングフレーム配列に対応するｃＤＮＡ、およびＤＥＰＤＣ１のコーディング配列の一部を、以下のようなプライマーと共にＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、大阪、日本）を使用したＰＣＲにより入手した。
ＺＮＦ２２４−フォワード：５’−ＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＺＮＦ２２４−リバース：５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＤＥＰＤＣ１１−１４７−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、
ＤＥＰＤＣ１１−１４７−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＤＥＰＤＣ１１−３００−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、
ＤＥＰＤＣ１１−３００−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、
ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＣＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）、
ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）、
ＤＥＰＤＣ１３００−６６９−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）、
ＤＥＰＤＣ１３００−６６９−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、
ＤＥＰＤＣ１５８７−７４０−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＡ  −３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）、
ＤＥＰＤＣ１５８７−７４０−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）、
ＤＥＰＤＣ１６５４−８１１−フォワード：５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）、
ＤＥＰＤＣ１６５４−８１１−リバース：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＧＡＣＴＡＣＧＧＡＡＣＴＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）。
フォワードプライマーの下線はＮｏｔＩ部位を示し、リバースプライマーの下線はＸｈｏＩ部位を示す。
【０１９２】
ＰＣＲ産物を、ＺＮＦ２２４についてはＣ末端ＦＬＡＧタグとインフレームでｐＣＡＧＧＳｃＦＬＡＧ発現ベクターのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し（ｐＣＡＧＧＳｃ−ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ）、または、ＤＥＰＤＣ１の部分ペプチドについてはＨＡタグとインフレームでｐＣＡＧＧＳｃＨＡ発現ベクターのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入した（ｐＣＡＧＧＳｃ−ＤＥＰＤＣ１−ＨＡ；ＤＥＰＤＣ１１−１４７、ＤＥＰＤＣ１１−３００、ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７、ＤＥＰＤＣ１３００−６６９、ＤＥＰＤＣ１５８７−７４０、およびＤＥＰＤＣ１６５４−８１１）。構築物は、全て、ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によるＤＮＡ配列決定により確認した。ＤＥＰＤＣ１構築物（ｐＣＡＧＧＳ−ＤＥＰＤＣ１−Ｖ１−ＨＡ）のコーディング領域全体は、以前に記載されたようにして作製した（Kanehira M, Harada Y, Takata R, et al. Oncogene 2007;26:6448-55）。
【０１９３】
５．免疫細胞化学的染色分析
ＵＭ−ＵＣ−３細胞を、１ウェル当たり１×１０５細胞で播いた（Ｌａｂ−ｔｅｋ  ＩＩ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ））。２４時間後、細胞を、Ｆｌａｇタグ付きＺＮＦ２２４により一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを含有しているＰＢＳ（−）で固定し、次いで、室温で２分間、０．１％トリトンＸ−１００を含有しているＰＢＳ（−）で透過性化した。その後、非特異的なハイブリダイゼーションをブロッキングするために、４℃で１２時間、ＰＢＳ（−）中３％ＢＳＡで細胞を覆った。次いで、ブロッキング溶液で１００倍希釈された、アフィニティ精製された抗ＤＥＰＤＣ１ポリクローナル抗体または抗ＺＮＦ２２４ポリクローナル抗体と共に、細胞をインキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８結合型抗ウサギ二次抗体およびＡｌｅｘａ５９７結合型抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）により、細胞を染色した。核を、４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で対比染色した。蛍光画像を、ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（ライカ、東京、日本）下で入手した。
【０１９４】
ドミナントネガティブペプチド（「ドミナントネガティブペプチドセクション」を参照されたい）による処理の後の核におけるＮＦ−κＢ発現の検出のため、ＵＭ−ＵＣ−３細胞（１×１０５個）を播き、次いで、各ペプチドにより１２時間処理した。その後、抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）モノクローナル抗体（２００倍希釈）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、免疫細胞化学的染色を実施した。ＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質の蛍光画像および核強度を、ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（ライカ、東京、日本）下で入手した。画像分析のため、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドまたはスクランブルペプチド（「ドミナントネガティブペプチドセクション」を参照されたい）により処理された５０個の細胞の核を観察することにより、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）の核シグナル強度を測定した。アッセイは、３回独立に実施した。
【０１９５】
６．ＲＮＡ干渉アッセイ
哺乳動物細胞において低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現するよう設計された、ベクターに基づくＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０は、以前に確立されている（Shimokawa T,et al., Cancer Res 2003 63:6116-20）。二本鎖オリゴヌクレオチドをｐｓｉＵ６ＢＸベクターのＢｂｓＩ部位へクローニングすることにより、ＺＮＦ２２４に対するｓｉＲＮＡを発現するよう設計されたプラスミドを調製した。ＲＮＡｉの合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：
対照としての、
ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質の変異体）：
５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ＳＣＲ（５Ｓ  ｒＲＮＡおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）葉緑体遺伝子）：
５’−ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ＺＮＦ２２４に特異的な配列に対する、
ｓｉ−ＺＮＦ２２４＃１：５’−ＣＣＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）； 
ｓｉ−ＺＮＦ２２４＃２：５’−ＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
全ての構築物のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。各８μｇのｓｉＲＮＡ発現ベクターを、供給元の推奨に従い、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＵＭ−ＵＣ−３細胞へそれぞれトランスフェクトした（１０ｃｍディッシュ１枚当たり１×１０６細胞）。特異的なプライマー（以下を参照されたい）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｓｉＲＮＡのノックダウン効果を評価するために、ネオマイシン（ジェネテシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４日間インキュベートした後、トランスフェクトされた細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲのための特異的なプライマーセットは以下の通りである；
ＺＮＦ２２４については、
５’−ＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）および
５’−ＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；ならびに
定量対照としてのＧＡＰＤＨについては、
５’−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）および
５’−ＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。
トランスフェクトされたＵＭ−ＵＣ−３細胞を、１．０ｍｇ／ｍｌのネオマイシンの存在下で２１日間または１４日間培養し、コロニーの数をギムザ染色により計数した。ネオマイシン処理の１４日後、製造業者の推奨に従い、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（和光純薬工業、大阪、日本）を用いて、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、ＵＭ−ＵＣ−３細胞の生存能を評価した。５７０ｎｍ波長での吸光度を、マイクロプレートリーダー５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で測定した。これらの実験は３回実施した。
【０１９６】
７．ｃＤＮＡマイクロアレイによるＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４の下流遺伝子の同定
ＵＭ−ＵＣ−３細胞を、ＤＥＰＤＣ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＥＰＤＣ１）、ＺＮＦ２２４に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＺＮＦ２２４−２）、またはＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）によりトランスフェクトした。ＤＥＰＤＣ１に対するｓｉＲＮＡの合成オリゴ二重鎖（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の標的配列は、以下の通りであった：
５’−ＣＣＡＡＡＧＵＵＣＣＧＵＡＧＵＣＵＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）、
ＺＮＦ２２４に対するもの（ｓｉ−ＺＮＦ２２４−２）、またはＥＧＦＰに対するものは、「ＲＮＡ干渉アッセイ」セクションに記載された通り。
【０１９７】
トランスフェクションの１２時間後および２４時間後に各試料から全ＲＮＡを抽出し、Ｃｙ５（ｓｉ−ＤＥＰＤＣ１およびｓｉ−ＺＮＦ２２４−２によりトランスフェクトされた細胞用）またはＣｙ３（ｓｉ−ＥＧＦＰによりトランスフェクトされた細胞用）により標識し、以前に記載されたような３６４６８種のｃＤＮＡまたはＥＳＴを含有しているｃＤＮＡマイクロアレイスライドへのコハイブリダイゼーションに供した（Takata R, et al., Clin Cancer Res 2005 11:2625-36）。データの標準化後、Ｃｙ５色素およびＣｙ３色素がカットオフ値より低いシグナル強度を与えた場合、その遺伝子はさらなる分析から排除した。その他の遺伝子について、各試料の生データを使用してＣｙ５／Ｃｙ３比を計算した。ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の両方の発現の低下に従い、強度が有意に増加した遺伝子を、最初に選択した。ＳＹＢＲグリーン色素（Ｒｈｏｃｈｅ）およびｃＤＮＡマイクロアレイ実験のために使用された、ＵＭ−ＵＣ−３細胞に由来する増幅された同一のＲＮＡを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の両方の候補下流遺伝子のバリデーションを、以下のような各遺伝子に特異的なプライマーを用いて実施した；
ＤＬＧ１、
５’−ＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＧＡＴＧＡＧＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）および
５’−  ＡＡＴＣＧＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；
Ａ２０、
５’−ＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）および
５’−ＡＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７  ）；
β２−ＭＧ（対照）、
５’−ＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）および
５’−ＡＡＴＧＴＣＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。
【０１９８】
全ての実験を２回実施した。次いで、各試料についての標的遺伝子の計算された量を、各試料に対応するβ２−ミクログロブリン（β２−ＭＧ）の計算された量の平均値で割り、各試料について標的遺伝子の相対発現を得た。
【０１９９】
８．ＤＬＧ１についてのルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＤＬＧ１プロモーターの断片（−１２１１〜＋１９位）を、以下のプライマー：
５’−ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）（下線はＭｌｕＩ部位を示す）および
５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧＴＴＴＣＣＡＡＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）
を使用したＰＣＲにより増幅し、ｐＧＬ３−エンハンサールシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）へクローニングした。ＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、１．６μｇのｐＲＬ−ＴＫプロモーターベクターと組み合わせた、１．６μｇのｐＧＬ３−エンハンサー−ＤＬＧ１ベクターまたはモックベクターのいずれかにより、Ｃｏｓ７細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳ（−）で濯ぎ、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により溶解した。特異的な基質に関するホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性の連続的な測定に依るＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、直接、溶解物を使用した。ルシフェラーゼ活性の定量化および相対比の計算は、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を用いて手動で実施した。
【０２００】
９．Ａ２０についてのルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ２０プロモーターの断片（−３３０〜−３５位）を、以下のプライマー：
５’−ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣＡＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）（下線はＭｌｕＩ部位を示す）および
５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）
を使用したＰＣＲにより増幅し、ｐＧＬ３−エンハンサールシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）へクローニングした。ヒト皮膚線維芽細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）を使用して、０．５μｇのｐＲＬ−ＴＫ−プロモーターベクターと組み合わせた、１μｇのｐＧＬ３−エンハンサー−Ａ２０プロモーターまたはモックベクターのいずれかにより、ＮＨＤＦ細胞をコトランスフェクトした。２４時間後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイキット（東洋インキ、東京、日本）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウミシイタケ発現プラスミドを、トランスフェクション効率を標準化するために使用した。ルシフェラーゼ活性の定量化および相対比の計算は、ルミノメーター（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて自動的に実施した。これらの実験は３回実施した。
【０２０１】
１０．ＤＥＰＤＣ１におけるＺＮＦ２２４結合領域の同定
膀胱癌細胞におけるＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の相互作用を確認し、ＤＥＰＤＣ１におけるＺＮＦ２２４結合領域を同定するために、免疫沈降実験を以下のように実施した。まず、免疫沈降のために抗ＤＥＰＤＣ１ポリクローナル抗体を使用し、イムノブロッティングのために抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した免疫沈降実験により、内在性ＤＥＰＤＣ１と外来ＺＮＦ２２４との間の相互作用を確認した。さらにＤＥＰＤＣ１におけるＺＮＦ２２４結合領域を決定するために、ＤＥＰＤＣ１の６種の部分構築物（ＤＥＰＤＣ１１−１４７、ＤＥＰＤＣ１１４１−３００、ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７、ＤＥＰＤＣ１３００−６６９、ＤＥＰＤＣ１５８７−７４０、およびＤＥＰＤＣ１６５４−８１１）を、ＣＯＯＨ末端ＨＡタグ付きｐＣＡＧＧＳベクターの適切な部位へクローニングした。各クローンのヌクレオチド配列は、各プライマーを使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）により決定した。これらの６種のＤＥＰＤＣ１の部分セグメントのうちの１つを発現する各プラスミドによりトランスフェクトされたＣｏｓ７細胞株からの細胞抽出物を、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、２ｍＬの最終量の免疫沈降緩衝液（０．５％ＮＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）中で１００μｌのプロテインＧ−アガロースビーズと共に４℃で１時間インキュベートすることにより予め浄化した。１，０００ｒｐｍ、４℃での５分間の遠心分離の後、上清を抗ＨＡラットと共に４℃で１時間インキュベートした。５，０００ｒｐｍでの２分間の遠心分離により各試料からビーズを収集し、免疫沈降緩衝液１ｍＬにより６回洗浄した後、洗浄したビーズを５０ｕＬのレムリ試料緩衝液に再懸濁し、３分間煮沸した後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。それぞれ、抗ＨＡラット抗体および抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を使用して、イムノブロットを行った。
【０２０２】
１１．合成ドミナントネガティブペプチド
ＤＥＰＤＣ１における２つの最小ＺＮＦ２２４結合ドメイン（コドン１４８〜１７６（第１領域）およびコドン５９８〜６５３（第２領域）；図４Ａを参照されたい）に由来する１８アミノ酸配列を、そのＮＨ２末端で、膜伝達１１ポリアルギニン配列（１１Ｒ）に共有結合的に連結した。コドン１４８〜１７６の領域（第１領域）：
ＤＥＰＤＣ１１４８−１６６、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＰＫＲＨＧＬＨＬＳＱＥＮＧＥＫＩＫＨＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）；  
ＤＥＰＤＣ１１５９−１７６、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＮＧＥＫＩＫＨＥＩＩＮＥＤＱＥＮＡＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
およびコドン５９８〜６５３の領域（第２領域）：
ＤＥＰＤＣ１５９８−６１５、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＡＩＤＡＬＱＬＣＣＬＬＬＰＰＰＮＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）；  
ＤＥＰＤＣ１６１１−６２８、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）；  
ＤＥＰＤＣ１６２４−６４１、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＩＳＲＭＳＱＮＶＤＭＰＫＬＨＤＡＭＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）；  
ＤＥＰＤＣ１６３６−６５３、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＬＨＤＡＭＧＴＲＳＬＭＩＨＴＦＳＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
をカバーする４種のドミナントネガティブペプチドを合成した。最も有効なＤＥＰＤＣ１６１１−６３９ペプチドに由来するスクランブルペプチドを対照として合成した：
スクランブル６１１−６２８、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＬＲＭＳＲＬＳＰＮＭＩＭＱＲＰＫＲＬ  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）。
ペプチドを調製用逆相高速液体クロマトグラフィにより精製し、＞９０％の純度とした。
【０２０３】
これらのポリアルギニン（１１Ｒ）連結ペプチドの、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体形成の阻害に対する効果を調査するために、これらをＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４構築物と共にＣＯＳ７細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、細胞を、２４時間、３μＭの濃度で４種のペプチドの各々を含有している培地でインキュベートした。「ＤＥＰＤＣ１タンパク質におけるＺＮＦ２２４結合領域の同定」セクションに記載されたような方法に従い、免疫沈降を実施した。
【０２０４】
ＵＭ−ＵＣ−３細胞株および正常ヒト皮膚線維芽細胞由来ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞株を、５日間、０、１、２、または３μｍｏｌ／Ｌの濃度の１１Ｒペプチドと共にインキュベートした。各ペプチドを適切な濃度で２４時間毎に添加し、処理後、毎日、細胞の生存能をＭＴＴアッセイにより評価した。
【０２０５】
１２．ウェスタンブロット分析
膀胱癌（ＵＭ−ＵＣ−３）および正常ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨＭＥＣ、ＳＡＥＣ、およびＮＨＤＦ−Ａｄ）における内在性ＤＥＰＤＣ１タンパク質および内在性ＺＮＦ２２４タンパク質の発現を検出するために、これらの細胞の各々を、０．１％のプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を含む溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ  ＮａＣＬ／０．５％ＮＰ−４０）中でインキュベートした。全タンパク質の量をタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）により推定し、次いで、タンパク質をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、３分間煮沸した後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへ負荷した。電気泳動後、タンパク質を、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）にブロットした。４％のＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬、大阪、日本）によるブロッキングの後、内在性ＤＥＰＤＣ１タンパク質または内在性ＺＥＦ２２４タンパク質の検出のため、それぞれ、抗ＤＥＰ１１ＤＣ１ポリクローナル抗体または抗ＺＮＦ２２４ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）と共に膜をインキュベートした。最後に、膜をＨＲＰ結合型二次抗体と共にインキュベートし、バンドをＥＣＬ検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により可視化した。βアクチン（ＡＣＴＢ）を負荷対照として使用した。細胞透過性ペプチド（下記参照）による処理後の内在性Ａ２０タンパク質および内在性ＩｋＢ−αタンパク質の発現を検出するためには、抗Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）モノクローナル抗体（５０倍希釈）（５９Ａ４２６；Ａｂｃａｍ）および抗ＩｋＢαモノクローナル抗体（１００倍希釈）（Ｃ−１５；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、実験を実施した。
【０２０６】
１３．細胞周期分析
ノコダゾールへの６時間の曝露およびドミナントネガティブペプチドＤＥＰＤＣ１６１１−６２８による１６時間の処理の後、細胞を分析した。細胞をトリプシン処理により採集し、ＰＢＳで洗浄し、固定し、４℃で保存した後、ＤＮＡ分析を行った。遠心分離によるエタノールの除去の後、細胞を３０分間３７℃でＲＮａｓｅと共にインキュベートした。次いで、遠心分離の後、細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液により１時間染色した。染色された核を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、ＤＮＡ−ＰＩ蛍光について分析した。得られたＤＮＡ分布を、細胞周期のｓｕｂ−Ｇ０期、Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２−Ｍ期の細胞の割合について、Ｍｏｄｆｉｔ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｔｏｐｓｈａｍ，  ＭＥ）により分析した。
【０２０７】
１４．細胞増殖アッセイ
細胞増殖に対するＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の効果を調査するために、ＵＭ−ＵＣ−３細胞（１×１０６細胞／１０ｃｍディッシュ）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、各８μｇのｐＣＡＧＧＳｎ−ＤＥＰＤＣ１−ＨＡまたはｐＣＡＧＧＳｎ−ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧまたはその両方によりトランスフェクトした。２４時間後、１×１０６細胞／ディッシュの密度で１０ｃｍディッシュプレートに細胞を再び播き、さらに５日間、１ｍｇ／ｍＬネオマイシン（ジェネテシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有しているＥＭＥＭで培養した。ネオマイシンによる処理の７日後、製造業者の推奨に従ってＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（和光純薬工業）を用いて、ＭＴＴアッセイにより、ＵＭ−ＵＣ−３細胞の生存能を評価した。５７０ｎｍの波長での吸光度をマイクロプレートリーダー５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。これらの実験は２回実施した。
【０２０８】
１５．膀胱癌細胞増殖の阻害
ＵＭ−ＵＣ−３細胞およびＮＨＤＦ細胞の細胞増殖に対するＤＥＰＤＣ１６１１−６２８ペプチドの効果を調査するために、それぞれ、０、１、２、または３μＭの濃度のＤＥＰＤＣ１６１１−６２８またはスクランブルペプチドと共に、細胞を５日間インキュベートした。各ペプチドを適切な濃度で２４時間毎に添加し、細胞の生存能を、毎日、ＭＴＴアッセイにより評価した。５７０ｎｍの波長での吸光度を、マイクロプレートリーダー５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。これらの実験は３回実施した。
【０２０９】
１６．アポトーシスの分析
ＵＭ−ＵＣ−３細胞を、ＤＥＰＤＣ１６１１−６２８またはスクランブルペプチドによる処理の後、１２時間インキュベートした。ＴＵＮＥＬアッセイのため、供給元の推奨に従いアポトーシスｉｎ  ｓｉｔｕ検出キット（和光純薬工業、大阪、日本）を使用して、細胞を評価した。アポトーシス細胞をＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡検査により観察した。各実験についてランダムに２００個の細胞を観察することにより、ＴＵＮＥＬ陽性を決定した。アッセイは３回独立に実施した。
【０２１０】
１７．クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を、１５ｃｍディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）１枚当たり４×１０６細胞で播いた。２４時間後、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１およびＦＬＡＧタグ付きＺＮＦ２２４構築物により、細胞を、一過性にコトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、３７℃で１０分間、１％ホルムアルデヒドで架橋させた。本明細書においては抗ＨＡタグ抗体を使用した以外は、製造業者により推奨された通りに、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ，  Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｅ，  ＶＡ）を使用して、固定されたクロマチン試料を免疫沈降に供した。回収されたＤＮＡを、Ａ２０プロモーター領域（−３３０〜−３５位）をカバーする以下のプライマーを使用して分析した：
５’−ＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣＡＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）および
５’−ＣＴＴＴＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）。
【０２１１】
１８．統計分析
統計的有意性は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ５．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を使用して、スチューデントｔ検定により決定した。Ｐ＜０．０５の差を、統計的に有意であると見なした。
【０２１２】
ＩＩ．結果
１．ＤＥＰＤＣ１と相互作用する分子の同定
ＤＥＰＤＣ１は膀胱癌細胞の生存または増殖に関与していることが、ｓｉＲＮＡ実験により、以前に証明された（Kanehira M, et al., Oncogene 2007 26:6448-55）。しかしながら、その正確な分子的機序は依然として未知であった。膀胱癌細胞におけるその生物学的機能を解明するために、ＤＥＰＤＣ１と相互作用するタンパク質を、免疫沈降および質量分析により検索した。ＵＭ−ＵＣ−３細胞からの細胞抽出物を、抗ＤＥＰＤＣ１抗体またはウサギＩｇＧ（陰性対照）を用いて免疫沈降させた。タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で銀染色した。抗ＤＥＰＤＣ１抗体による免疫沈降物には見られたが、ウサギＩｇＧによるものには見られなかった、およそ９３ｋＤａのタンパク質を抽出し、そのペプチド配列をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により決定した（データ非提示）。このアプローチにより、ＤＥＰＤＣ１と相互作用する候補としての、このタンパク質が、クルッペル関連ボックス含有ジンクフィンガータンパク質であるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２４（ＺＮＦ２２４）（Medugno L, et al., FEBS Lett. 2003 534: 93-100）であることが明確になった。臨床膀胱癌例でのＺＮＦ２２４の発現レベルを、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によりまず調査した；ＺＮＦ２２４およびＤＥＰＤＣ１のコアップレギュレーションが、膀胱癌例１０例あたり９例で観察された（図１Ａ）。この相互作用を実証するために、ＦＬＡＧタグ付きＺＮＦ２２４（ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ）を発現するよう設計されたプラスミドを構築し、免疫共沈降実験を実施した（材料および方法を参照されたい）。この構築物プラスミドをＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞へトランスフェクトし、タンパク質を抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降させた。ウサギ抗ＤＥＰＤＣ１抗体による沈降物のイムノブロッティングは、内在性ＤＥＰＤＣ１がＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧタンパク質と共沈降することを明らかにした（図１Ｂ）。さらに、ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ構築物をＵＭ−ＵＣ−３細胞へトランスフェクトした時の、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の細胞内局在を調査した。図１Ｃは、内在性ＤＥＰＤＣ１が細胞の核において外来ＺＮＦ２２４と共局在したことを明らかにしており、このことは、膀胱癌細胞の核におけるそれらの相互作用を意味している。
【０２１３】
２．膀胱癌細胞におけるＺＮＦ２２４特異的ｓｉＲＮＡの増殖阻害効果
さらに、ＤＥＰＤＣ１と相互作用するパートナーとしてのＺＮＦ２２４の、膀胱癌発生における生物学的意義を調査するために、ＺＮＦ２２４特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞における各構築物のノックダウン効果を調査した；ＺＮＦ２２４の過剰発現が観察された。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＺＮＦ２２４特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＺＮＦ２２４−１およびｓｉ−ＺＮＦ２２４−２）が、対照としてのｓｉ−ＥＧＦＰと比較して、ＺＮＦ２２４転写物の量を有意に抑制することを示した（図２左上）。次いで、ＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイ（図２左下）を実施した。ノックダウン効果の結果と一致して、ｓｉ−ＺＮＦ２２４−１およびｓｉ−ＺＮＦ２２４−２の導入が、ＵＭ−ＵＣ−３細胞の増殖の顕著な抑制をもたらすことが発見された（ｓｉ−ＺＮＦ２２４−１、Ｐ＝０．００００１９、または、ｓｉ−ＺＮＦ２２４−２、Ｐ＝０．０００１３、スチューデントｔ検定）（図２右パネル）。そのような結果は、ＺＮＦ２２４が、膀胱癌細胞の増殖において重大な役割を有する可能性が高いことを明白に示している。
【０２１４】
３．ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４に共通の下流遺伝子の同定
ＺＮＦ２２４は、調節性クルッペル様ジンクフィンガータンパク質ファミリーに属することが報告されており、そのファミリーのメンバーは転写リプレッサーとして機能することが公知である（Medugno L, et al., FEBS Lett 2003 534:93-100）。ＺＮＦ２２４は、ウィルムス腫瘍抑制因子（ＷＴ１）との相互作用を通して、ＷＴ１タンパク質により媒介される転写活性化を阻害することが、さらに報告されており（Lee TH, et al., J Biol Chem 2002 277:44826-37）、このことは、ＺＮＦ２２４が転写リプレッサーであると考えられることを示している。したがって、膀胱癌細胞におけるＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４複合体により調節される下流遺伝子を同定すべく努力した。ｓｉＲＮＡ−ＤＥＰＤＣ１、ｓｉＲＮＡ−ＺＮＦ２２４、またはｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ（対照ｓｉＲＮＡ）を、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４が高発現されているＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞へトランスフェクトし、３６４６８種の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイ分析を使用して、様々な時点で遺伝子発現の変化をモニタリングした。さらに、臨床膀胱癌試料において発現が有意に下方制御されていた遺伝子を、ｃＤＮＡマイクロアレイデータ（Takata R, et al., Clin Cancer Res 2005 11:2625-36）を通して選択した。ＤＬＧ１およびＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３としても公知）を、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４複合体における候補下流遺伝子として同定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｓｉ−ＤＥＰＤＣ１およびｓｉ−ＺＮＦ２２４によりそれぞれトランスフェクトされたＵＭ−ＵＣ−３細胞において、ｓｉＥＧＦＰによりトランスフェクトされた細胞と比較して、両転写物が時間依存的に増加することを確認した（図３Ａ）。特に、ＵＭ−ＵＣ−３におけるＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４のコトランスフェクションにより、ＤＬＧ１発現の抑止が検出された（図３Ｂ）。さらに、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４コトランスフェクションによってのみ、ＤＬＧ１プロモーターのトランス活性化が阻害されることが、ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して認識された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４複合体が、腫瘍抑制遺伝子の転写を抑止し得ることを示唆している。
【０２１５】
４．ＤＥＰＤＣ１におけるＺＮＦ２２４結合領域の同定
その後、これらの２つのタンパク質の結合の生物学的重要性、および膀胱癌の治療標的としてのそれらの可能性を調査した。まず、ＺＮＦ２２４との相互作用に必要とされるＤＥＰＤＣ１内のドメインを決定するために、ＣＯＯＨ末端にＨＡタグ配列を有するＤＥＰＤＣ１の６種の部分構築物（ＤＥＰＤＣ１１−１４７、ＤＥＰＤＣ１１４１−３００、ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７、ＤＥＰＤＣ１３００−６６９、ＤＥＰＤＣ１５８７−７４０、およびＤＥＰＤＣ１６５４−８１１；図４Ａ、図９Ａ）のうちの１つと、Ｆｌａｇタグ付きＺＮＦ２２４（ＺＮＦ２２４−Ｆｌａｇ）とを、Ｃｏｓ７細胞へコトランスフェクトした。モノクローナル抗ＨＡラット抗体による免疫沈降は、ＤＥＰＤＣ１１４１−３００、ＤＥＰＤＣ１３００−６６９、およびＤＥＰＤＣ１５８７−７４０は、ＺＮＦ２２４と相互作用することができるが、ＤＥＰＤＣ１１−１４７、ＤＥＰＤＣ１１７７−５９７、およびＤＥＰＤＣ１６５４−８１１はＺＮＦ２２４と相互作用できないことを示した（図４Ｂ、図９Ｂ）。これらの所見は、ＤＥＰＤＣ１内のＮＨ２末端の２９アミノ酸ポリペプチド（コドン１４８〜１７６）およびＣＯＯＨ末端の５６アミノ酸ポリペプチド（コドン５９８〜６５３）が、ＺＮＦ２２４との相互作用において重要な役割を果たすことを示唆している。
【０２１６】
５．ＤＥＰＤＣ１のドミナントネガティブペプチドによる膀胱癌細胞の増殖阻害
上に示されるように、ＮＨ２末端部分の２９アミノ酸ペプチドのＤＥＰＤＣ１１４８−１７６、およびＣＯＯＨ末端部分の５６アミノ酸ペプチドのＤＥＰＤＣ１５９８−６５３は、ＺＮＦ２２４と相互作用する領域を含有していると推定された。したがって、ＤＥＰＤＣ１のＺＮＦ２２４との機能的結合を阻害することができる細胞透過性の生理活性ペプチドを開発するために、膜透過性の１１アルギニン残基（１１Ｒ）がＮＨ２末端に付加された、ＤＥＰＤＣ１１４８−１７６およびＤＥＰＤＣ１５９８−６５３におけるＺＮＦ２２４結合ドメインをカバーする、６種の異なる１８アミノ酸ポリペプチドを合成した。膀胱癌細胞の増殖または生存に対するこれらポリアルギニンペプチドの阻害効果を試験するために、ＵＭ−ＵＣ−３細胞株を６種のペプチドの各々により処理した。様々な濃度の６種のペプチドを、培養培地へ処理したところ、ＭＴＴアッセイにより測定されるように、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが、細胞生存能の有意な減少を用量依存的にもたらし（図５Ａ；Ｐ＜０．００１、１．０μＭ、２．０μＭ、３．０μＭのペプチド処理について、独立ｔ検定による）、１１Ｒ−ＤＥＰ５９８−６１５ペプチドが、細胞生存能の中程度の抑制を用量依存的に引き起こすことが発見された。
【０２１７】
ＣＯＳ７細胞において外因的に発現されたＤＥＰＤＣ１−ＨＡとＺＮＦ２２４−Ｆｌａｇとの間の複合体形成を１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが阻害するか否かを調査するために、ＣＯＳ７細胞を、トランスフェクションの６時間後に６種のペプチドの各々により処理した。１５時間後、免疫沈降を抗ＨＡタグ抗体により実施し、次いで、ウェスタンブロット分析を抗Ｆｌａｇ抗体により実施した。図５Ｂは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドは、ＣＯＳ７細胞において外因的に発現されたＤＥＰＤＣ１−ＨＡとＺＮＦ２２４−Ｆｌａｇとの間の複合体形成を阻害し得るが（図５Ｂ）、スクランブル６１１−６２８ペプチドによる処理はそれを阻害し得ないことを示した（図５Ｅ）。Ｊ８２細胞の細胞生存能の抑制をさらに証明した（図５Ｆ）。２つの結合領域内の１１Ｒ−ＤＥＰ１４８−１６６、１１Ｒ−ＤＥＰ１５９−１７６、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８、１１Ｒ−ＤＥＰ６２４−６４１、および１１Ｒ−ＤＥＰ６３６−６５３などの他のペプチドによる処理は、阻害をもたらさないが（図５Ｇ）、１１Ｒ−ＤＥＰ５９８−６１５ペプチドによる処理は、図５Ａに示されるようなＭＴＴアッセイ結果と一致して、相互作用のわずかな阻害をもたらすことがさらに確認された。１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドは、ほぼ検出不可能なレベルのＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４を発現している正常ヒト皮膚線維芽細胞（成人）由来ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞の細胞生存能に対しては効果を示さなかった（図５ＣおよびＤ、下パネル）。さらに、細胞増殖または細胞形態の変化は、スクランブル６１１−６２８ペプチドにより処理された細胞において観察されなかった（図５Ｄ）。これらの発明は、伝達可能１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との機能的な複合体形成を阻害することができ、かつこれらのタンパク質を発現しない正常ヒト細胞に対しては毒性効果を有しないことを示唆している。
【０２１８】
６．１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理の後のＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の候補下流遺伝子の抑止
１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる腫瘍抑制の機序を明らかにするために、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の候補下流遺伝子の発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により調査した。ＤＬＧ１およびＡ２０の発現は、ペプチドによる処理により増強されるが、スクランブル６１１−６２８ペプチドによる処理では増強されないことが示された（図６Ａ、Ｂ）。さらに、これらのペプチドにより処理した腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析を実施したところ、細胞がＧ１−Ｓ停止を引き起こし、処理の２４時間後、Ｇ１画分が有意に増加することが発見された（図６Ｂ）。
【０２１９】
７．ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の発がん活性
ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体の増殖促進効果をさらに調査するため、ＨＡタグ付きＤＥＰＤＣ１、ＦＬＡＧタグ付きＺＮＦ２２４、またはその両方をＵＭ−ＵＣ−３細胞へトランスフェクトし、次いで、ＭＴＴアッセイにより、細胞生存能を調査した。抗ＨＡ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロット分析により、外来ＤＥＰＤＣ１−ＨＡタンパク質および外来ＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧタンパク質の発現を確認した（図８下パネル）。二重にトランスフェクトしたＵＭ−ＵＣ−３細胞は、モックプラスミドによりトランスフェクトされたものと比較して、ＤＥＰＤＣ１単独またはＺＮＦ２２４単独によりトランスフェクトされたものよりはるかに高い細胞増殖を示した（Ｐ＜０．０５、独立ｔ検定；図８上パネル）。総合すると、本発明者らの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体が、膀胱癌発生において重大な役割を果たす可能性が高いことを意味している。
【０２２０】
８．Ｒ１１−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドの増殖阻害効果
ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の相互作用の阻害に対する細胞透過性ペプチドのドミナントネガティブ効果の可能性を調査するために、本発明者らは、ＺＮＦ２２４結合ドメインであるＤＥＰＤＣ１５９８−６５３をカバーすることができ、ＮＨ２末端に膜透過性の１１アルギニン残基（１１Ｒ）を有する、４種の１８アミノ酸ポリペプチドを合成した。本発明者らは、タンパク質間相互作用および膀胱癌細胞増殖に対するこれらのペプチドの効果を調査した。まず、ＤＥＰＤＣ１−ＨＡおよびＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ構築物をＣＯＳ７細胞へコトランスフェクトし、次いで、トランスフェクションの６時間後に４種のペプチドの各々により細胞を処理した。２４時間後、本発明者らは、抗ＨＡタグ抗体による免疫沈降実験を実施し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロット分析を実施した。１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８による処理は、ＣＯＳ７細胞におけるＤＥＰＤＣ１−ＨＡとＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧとの複合体形成を明白に阻害し、１１Ｒ−ＤＥＰ５９８−６１５による処理は中程度の効果を示したが、その他のペプチドは複合体形成に対する効果を示さないことが証明された（図７Ａ）。さらに、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８のスクランブル配列ペプチド（スクランブル）による効果が存在しないことを確認することにより、複合体形成の阻害に関する１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８の特異性を確認した（図５Ｂ）。
【０２２１】
さらに、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドの添加は、ＭＴＴアッセイにより測定されるように、ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞の細胞生存能の有意な減少を用量依存的に引き起こしたが（図５Ｄ；上パネル；Ｐ＜０．０５、２．０および３．０μＭのペプチド、独立ｔ検定による）、スクランブルペプチドは効果を示さなかった。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４が共に上方制御（ｃｏ−ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）されている別の膀胱癌細胞株Ｊ８２においても類似した効果を観察した（図５Ｆ）。対照的に、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドは、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の発現がほぼ検出不可能であった（図５Ｃ）正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）細胞の細胞生存能に対しては有意な効果を示さなかった（図５Ｄ；下パネル）。
【０２２２】
１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる増殖抑制の機序をさらに明確にするために、本発明者らはこのペプチドにより処理されたがん細胞を使用して、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した（図７Ｂ）。結果は、このペプチドによる処理が、スクランブルペプチドおよび対照としてのＰＢＳによる処理と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の有意な増加をもたらすことを示した（下パネル；Ｐ＜０．０００００１、独立ｔ検定）。さらに、フローサイトメトリー分析により、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドがｓｕｂ−Ｇ１集団の有意な増加を示すことが確認され（図７Ｃ）、このことは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが、膀胱癌細胞のアポトーシス細胞死を引き起こすことを意味している。総合すると、これらのデータは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との機能的な複合体形成を特異的に阻害することができ、有意な増殖抑制をもたらしたが、これらのタンパク質を発現しない正常ヒト細胞に対しては毒性効果を示さなかったことを示唆している。
【０２２３】
９．ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体により調節される遺伝子の同定
ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体による、可能性のあるプロモーター特異的なＡ２０転写の抑止を調査するために、まず、Ａ２０遺伝子のプロモーター領域を、コンピュータ予測プログラムＷＷＷ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｓｃａｎ（ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ／）により検索した。次いで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合したＡ２０遺伝子のプロモーター領域に相当するおよそ３００ｂｐの断片を含有しているレポータープラスミドと、ＤＥＰＤＣ１もしくはＺＮＦ２２４を発現するよう設計された２つのプラスミドクローンのいずれかまたは両クローンとを、ＵＭ−ＵＣ−３細胞へコトランスフェクトした。Ａ２０レポータープラスミドを使用したルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ＤＥＰＤＣ１−ＨＡおよびＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ構築物の両方によりコトランスフェクトされたＮＨＤＦ細胞は、ＤＥＰＤＣ１単独、ＺＮＦ２２４単独、またはモックプラスミドによりトランスフェクトされたものと比較して、ルシフェラーゼレポーター活性の有意な低下を示した（図１０Ａ）。
【０２２４】
ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体がＡ２０プロモーター領域に結合し得るか否かをさらに調査するために、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＨＡおよびＺＮＦ２２４−ＦＬＡＧ構築物の両方によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から抽出された細胞溶解物を使用して、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施した。Ａ２０の２９６ｂｐのゲノム断片（−３３０〜−３５位）が、抗ＨＡ抗体による免疫沈降（ＩＰ）産物中のＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４−ＤＮＡ複合体に特異的に検出され、このことから、ＤＥＰＤＣ１ではなくＺＮＦ２２４が直接Ａ２０遺伝子プロモーター領域に結合することが示唆された（図１０Ｂ）。総合すると、本発明者らの所見は、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体が転写リプレッサーとして機能し、膀胱癌細胞におけるＡ２０遺伝子のトランス活性化を抑止し得ることを強く示唆している。
【０２２５】
１０．ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４により媒介される抗アポトーシスの１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる阻害
Ａ２０は、最初、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の刺激後に急速に誘導され、ＮＦ−κＢ古典的経路の負の調節因子として機能する細胞質ジンクフィンガータンパク質として同定された（Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. J Biol Chem. 1992;267:17971-6.、Beyaert R, Heyninck K, Van Huffel S, Biochem Pharmacol. 2000;60:1143-51）。したがって、本発明者らは、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路におけるＡ２０の効果に焦点を当てた。ウェスタンブロット分析は、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体形成を阻害する１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理の６時間後に、Ａ２０の発現が上昇することを示した（図１１Ａ；最初のパネル）。
【０２２６】
Ａ２０は、ＮＦ−κＢの阻害剤であるＩκＢαのリン酸化を阻害し、その後、そのユビキチン化およびプロテオソーム分解を阻止することが示された（Wertz IE, O'Rourke KM, Zhou H, et al. Nature. 2004 ;430:694-9、Boone DL, Turer EE, Lee EG, et al., Nat Immunol. 2004;5:1052-60.、Heyninck K, Beyaert R. Trends Biochem Sci. 2005;30:1-4.）。したがって、本発明者らは、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理によるＩκＢタンパク質レベルに対する効果を調査し、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる処理の１２時間後にＩκＢαタンパク質レベルが上昇するが（図１１Ａ；２番目のパネル）、ｍＲＮＡレベルは不変であることを見出した（図１１Ａ、３番目のパネル）。さらに、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドがＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質の核染色を明白に減ずるが（図１１Ｂ；左パネル、白矢印）、スクランブルペプチドによる処理は効果を示さないことが確認され（図１１Ｂ、左パネル、黄矢印；右パネル、Ｐ＜０．０１、独立ｔ検定）、このことは、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質の核輸送の１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによる阻害を意味している。総合すると、これらの結果は、１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドが、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体形成を阻害し、その下流遺伝子Ａ２０の転写を活性化し、ＮＦ−κＢ経路の不活化を通してアポトーシス誘導をもたらしたことを強く示唆している。
【０２２７】
ＩＩＩ．考察
がん治療のための分子標的薬の開発における著しい進歩が、過去２０年間に達成された。しかしながら、現在利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は依然として非常に限定されており、患者の一部は、利益なしに重篤な有害反応に苦しんでいる（Ardavanis A, et al., Br J Cancer 2005 92:645-50）。したがって、本発明は、現在の療法よりも特異的かつ効率的な抗がん効果を有し、かつ有害効果のリスクが最小限である低分子化合物を開発するという目標に向けて、治療標的およびその機能的に関連するパートナーを同定するための有効なスクリーニングシステムを確立する。ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １）は、膀胱癌細胞において高度かつ特異的にトランス活性化されることが以前に報告されている。さらに、ＤＥＰＤＣ１発現は、精巣以外の調査された２４種の正常ヒト組織のいずれにおいてもほぼ検出不可能であるので、ＤＥＰＤＣ１は、薬物標的としての可能性を有する（Kanehira M, et al., Oncogene 2007 26:6448-55）。ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体は、膀胱癌発生において重大な役割を果たす可能性が高い。ＤＥＰＤＣ１は、膀胱癌において過剰発現される遺伝子の遺伝子発現プロファイル検索を通して以前に同定されている。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、膀胱癌における増加したＤＥＰＤＣ１発現を検出した。また、その相互作用タンパク質ＺＮＦ２２４が、膀胱癌における増加した発現を有するものとして検出された。
【０２２８】
さらに、免疫細胞化学的分析は、主として膀胱癌細胞の核における、ＤＥＰＤＣ１およびＺＮＦ２２４の共局在を明らかにした（図１Ｃ）。さらに、ＤＥＰＤＣ１／ＺＮＦ２２４の過剰発現は、膀胱癌細胞株における増殖促進効果を示した（図３Ｂ上）。さらに、ｓｉＲＮＡによる内在性ＺＮＦ２２４のノックダウンは、膀胱癌細胞株の減少した増殖およびＤＥＰＤＣ１ノックダウン効果を引き起こすことが示された（図２）。これらの結果は、膀胱癌発生における、ＺＮＦ２２４との相互作用を通した、ＤＥＰＤＣ１の重要な役割を示唆する。
【０２２９】
クルッペル様ジンクフィンガータンパク質のメンバーである同定されたＺＮＦ２２４は、Ｎ末端にクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインを含有し、Ｃ末端に１９個のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメインを含有している（Medugno L, Costanzo P, Lupo A, et al. FEBS Lett 2003;534:93-100、Medugno L, Florio F, De Cegli R, et al. Gene. 2005;359:35-43）。
【０２３０】
蓄積されつつある証拠は、ＫＲＡＢジンクフィンガータンパク質ファミリーが標的遺伝子の転写抑止に関連していること、およびＫＲＡＢドメインが抑止システムのメディエーターとして機能することを示している（Margolin JF, Friedman JR, Meyer WK, Vissing H, Thiesen HJ, Rauscher FJ 3rd. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4509-13；Friedman JR, Fredericks WJ, Jensen DE, et al. Genes Dev 1996;10:2067-78）。ＺＮＦ２２４も、特異的な下流遺伝子のプロモーター領域に特異的に結合してそれらの転写を抑止するリプレッサータンパク質として機能することが報告されている（Lee, TH, Lwu S, Kim J, Pelletier J. J Biol Chem 2002;277:44826-37；Medugno L, Costanzo P, Lupo A, et al. FEBS Lett 2003;534:93-100；Medugno L, Florio F, De Cegli R, et al. Gene. 2005;359:35-43）。
【０２３１】
本発明者らは、本明細書において、ＺＮＦ２２４との相互作用を通したＤＥＰＤＣ１により媒介される転写抑止の可能性を示唆した。ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の負の調節因子として機能することが公知である（Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. J Biol Chem. 1992;267:17971-6；Beyaert R, Heyninck K, Van Huffel S. Biochem Pharmacol. 2000;60:1143-51）Ａ２０の転写を抑止する傾向があった。Ａ２０遺伝子の可能性のあるプロモーターセグメントを使用したレポーター遺伝子アッセイおよびＣｈＩＰ分析は、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体が、Ａ２０のプロモーター領域との相互作用を通して、転写抑制（ｔｒａｎｓｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）活性を有することを示唆した。興味深いことに、Ａ２０は、ＮＦ−κＢ抗アポトーシス経路において負の調節因子として働くことが報告されている（He KL, Ting AT. Mol Cell Biol 2002;22:6034-45；Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. J Biol Chem. 1992;267:17971-6）。
【０２３２】
ＮＦ−κＢは、抗アポトーシスタンパク質を誘導し、膀胱癌を含む様々なヒト腫瘍において構成的に活性化されている転写因子であることが公知である（Horiguchi Y, Kuroda K, Nakashima J, Murai M, Umezawa K. Expert Rev Anticancer ther. 2003;3:793-8；Umezawa K. Cancer Sci 2006; 97:990-5；Yamamoto Y, Gaynor RB. J Clin Invest 2001;107:135-42）。さらに、Ａ２０タンパク質の腫瘍抑制機能の喪失により引き起こされるＮＦ−κＢシグナル伝達の調節不全が、Ｂ細胞リンパ腫の一部の病原性に関与していることが最近報告され、そのことは、Ａ２０が腫瘍抑制機能を有することを意味している（Compagno M, Lim WK, Grunn A, et al. Nature. 2009;459:717-21；Kato M, Sanada M, Kato I, et al. Nature. 2009 ;459:712-6）。
【０２３３】
本明細書に提示されたこれらのデータは、ＤＥＰＤＣ１−ＺＮＦ２２４複合体がＡ２０遺伝子の転写を抑止し、ＮＦ−κＢタンパク質の核への輸送をもたらし、膀胱癌細胞のアポトーシスの抑制をもたらすことを示している（図１２；上パネル）。さらに、本発明者らは、ＺＮＦ２２４タンパク質に対する結合ドメインに相当し、ＤＥＰＤＣ１のＺＮＦ２２４との機能的相互作用を阻害することができた（図１２；下パネル）、ＤＥＰＤＣ１由来の１８アミノ酸ペプチドを保持している細胞透過性ペプチド（１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチド）を設計した。１１Ｒ−ＤＥＰ６１１−６２８ペプチドによるそれらの相互作用の阻止は、膀胱癌細胞のアポトーシス細胞死の誘導を明白にもたらした。
【０２３４】
臨床的な観点から見ると、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）の膀胱内注入療法が膀胱の上皮内癌（ＣＩＳ）のための標準的な治療になっているので、このペプチド阻害剤は膀胱を有する患者のために利用されることも期待される。結論として、本発明者らは、複合体形成を特異的に阻害し、増殖抑制効果をもたらすペプチド阻害剤を成功裡に作製した。
【０２３５】
産業上の利用可能性
本発明は、ＤＥＰＤＣ１とＺＮＦ２２４との間の結合を同定し、がんの発生におけるこの結合の重要性を証明する。
【０２３６】
特に、ペプチド間の結合を阻止する剤は、抗がん剤、特に、膀胱癌の治療のための抗がん剤としての治療的有用性を有すると考えられる。
【０２３７】
その目的のため、本発明は、これらのペプチドの結合を阻害するポリペプチドを提供し、膀胱癌などのがんの治療または予防において有用なポリペプチドを同定する。本発明のポリペプチドは、好ましくは、ＰＰＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８を含有しているアミノ酸配列から構成される。本発明のポリペプチドは、膀胱癌などのがん細胞の増殖を阻害するために投与され得る。
【０２３８】
さらに、ＺＮＦ２２４遺伝子を特異的に標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により、細胞増殖を抑制することができる。このように、本明細書に記述された新規なｓｉＲＮＡは、抗がん医薬の開発のための有用な標的である。
【０２３９】
膀胱癌は、有効な治療法が未だ提供されていない重要ながんである。したがって、本発明は、膀胱癌を治療／または予防するための有効な方法も提供するという点で重要である。
【０２４０】
詳細にかつ具体的な態様を参照しながら本発明を説明したが、上記の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を例示するためのものであることを理解されたい。ルーチンな実験を通して、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを、当業者は容易に認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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