(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当り、栄養源及び海水を含む基本培地にレシチンを添加することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項２】
基本培地に対し、レシチン５〜４０ｇ／リットルの割合で添加する請求項１記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項３】
レシチンが大豆レシチンである請求項２記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項４】
ｐＨ７〜９、温度２０〜３０℃、海水濃度２５〜１２５％の培養条件で行う請求項１、２又は３記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用して、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの高度不飽和脂肪酸を高収率で製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）類には、スラウストキトリウム科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）及びラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）の２つの科が存在し、そのうちラビリンチュラ科はラビリンチュラ属の１属からなる微生物である。これらはアラキドン酸、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を蓄積する微生物として知られている。
【０００３】
しかしながら、ラビリンチュラ科の微生物は、自然界からの単離が困難な上に、有効な培養方法が無いため、これまでこの微生物を利用して長鎖高度不飽和脂肪酸を製造することは行われていなかったが、最近、それを容易に単離しうる方法が知られ（特許第２９７６０２７号）、これを油脂含有寒天培地を用いて培養することにより、高度不飽和脂肪酸を製造する方法が提案されるに至った（特願２０００−９４４４１号）。
【０００４】
この方法は、グルコース、酵母エキス、ペプトンなどの栄養源と寒天５〜２０ｇ／リットルを含む天然海水又は人工海水からなる基本培地に炭素源として油脂又は脂肪酸を加え、これにラビリンチュラ属微生物を接種し、２０〜３０℃で７〜１４日間培養することにより、高度不飽和脂肪酸を生産する方法であるが、高度不飽和脂肪酸の生産量はせいぜい寒天培地１ｇ当り０．１〜０．７６ｍｇであり、最高含有量０．７６ｍｇにおける高度不飽和脂肪酸の含有率は７％以下という低い値であった。また、含有率を１０％以上に高めようとすると、高度不飽和脂肪酸の生産量が寒天培地１ｇ当り０．２３ｍｇに低下するため、工業的に高度不飽和脂肪酸を回収、精製するのに望ましい条件、すなわち寒天培地１ｇ当り高度不飽和脂肪酸１ｍｇ以上で含有率１０％以上を考えると、この方法は工業的には必ずしも満足できるものとはいえない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、ラビリンチュラ科に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を生産するに当り、その生産効率を高め、高収率で高度不飽和脂肪酸を得るための改良方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラビリンチュラ科に属する微生物を培養して、高度不飽和脂肪酸を生産させる際に、基本培地にレシチンを添加することにより、従来の油脂や脂肪酸を炭素源とした場合に比べ、著しく高い収率で高度不飽和脂肪酸が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当り、栄養源及び海水を含む基本培地にレシチンを添加することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法を提供するものである。
【０００８】
ここで用いるレシチンは、ホスファチジルコリンとも呼ばれ、動物、酵母、カビ類に広く存在するリン脂質で、哺乳動物の膜リン脂質では全リン脂質の５０％近くを占めている。このものは、一般式
【化１】
0003723822.tif 000002
（式中のＲ及びＲ′は脂肪酸残基である）
で表わされる化学構造を有し、その多くはＲが飽和脂肪酸残基、Ｒ′が不飽和脂肪酸残基である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法で用いる高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科に属する微生物としては、例えば石垣島で採取されたオヒルギの落葉から分離されたラビリンチュラ・エスピーＳ３−２（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ  ｓｐ．Ｓ３−２株、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０９０）、ラビリンチュラ・ゾーステラエ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ  ｚｏｓｔｅｒａｅ、ＡＴＣＣ７６１２０）、ラビリンチュラ・Ｌ４、Ｌ２２、Ｌ２５、Ｌ２９などがある。
【００１０】
次に、本発明においては、基本培地として、例えばグルコースのような糖類、ペプトン、無機塩及び酵母エキスのような栄養源０．１〜１０ｇ／リットルと寒天５〜２０ｇ／リットルを含む海水を滅菌したものが用いられる。この際の海水濃度としては、通常の海水濃度の２５〜１２５％、特に５０〜９０％の範囲に調整されたものを用いるのが好ましい。
また、無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ3、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などが用いられるが、海水中に含まれる成分については、特に添加する必要はない。
【００１１】
本発明方法において用いるレシチンについては、特に制限はなく、植物由来、動物由来のいずれのものも用いることができるが、安価に入手できるという点で大豆レシチンや卵黄レシチン、特に大豆レシチンが好ましい。このレシチンは、基本培地１リットル当り、通常５〜４０ｇ、好ましくは５〜２５ｇの範囲で添加された場合、培地中の目的物含量が高くなるが、所望ならばさらに高い濃度で用いることができ、このようにすれば全脂質中の高度不飽和脂肪酸の含有率をより高くすることができる。
【００１２】
本発明方法を好適に実施するには、例えば塩分濃度を通常の海水における濃度の５０％に調整した海水に、グルコース１．０ｇ／リットル、ペプトン０．５ｇ／リットル、酵母エキス０．２５ｇ／リットル及び少量の無機塩を溶解し、これに寒天５〜２０ｇ／リットルを加えて調製した培地を蒸気滅菌する。
【００１３】
蒸気滅菌後、所要量のレシチンを加え、通常の培養用シャーレに混入し、冷却固化させる。レシチンを加える際、その分散を促進するためにＴｗｅｅｎ８０のような界面活性剤を培地中に添加しておくのが好ましい。次いで、これにラビリンチュラ属微生物を接種し、２〜１４日間、好ましくは７〜１０日間静置培養する。この際の至適温度は２０〜３０℃、至適ｐＨは７〜９の範囲である。
したがって、培養条件としては、ｐＨ７〜９、温度２０〜３０℃、海水濃度２５〜１２５％の範囲で選ぶのが好ましい。
【００１４】
このようにして得られた培養物から、常法に従い、非水溶性有機溶剤で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、所望の高度不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロール混合物として回収することができる。そして、そのトリアシルグリセロール混合物を加水分解し、クロマトグラフィー処理により各高度不飽和脂肪酸を分離、回収することができる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００１６】
なお、各例における基本培地としては、ポリぺプトン１ｇ／リットル、酵母エキス０．５ｇ／リットル、ＫＨ2ＰＯ4・７Ｈ2Ｏ０．２ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4０．２ｇ／リットル、Ｔｗｅｅｎ８０  １．２５ｇ／リットル及び寒天１５ｇ／リットルを含む５０％濃度人工海水を、また実施例７以外は菌株としてはラビリンチュラＳ３−２（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０９０）を用いた。
そして、脂肪酸組成分析は、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、その中に含まれる全脂肪酸量及び高度不飽和脂肪酸生産量を測定することにより行った。
【００１７】
実施例１
あらかじめ液体培地でサイクロバクタ属微生物（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１２）を増殖させた培養液を、表１に示す量すなわち０〜２５ｇ／リットルの大豆レシチンを加えた基本培地上に塗布し、その中央にラビリンチュラ属微生物を、レシチンを５ｇ／リットルの濃度で加えた基本培地で培養した培養物（約２５ｍｍ2の寒天片）を植菌し、２５℃において７日間又は１４日間培養した。
培養後、寒天培地の高度不飽和脂肪酸の生産量を分析し、その結果を全脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の含有率とともに表１に示す。
【００１８】
【表１】
0003723822.tif 000003
【００１９】
この表から分るように、７日間の培養では、大豆レシチン濃度の高い方が、高度不飽和脂肪酸の生産量が高くなるが、１４日間の培養では１５ｇ／リットルの濃度で最高値を示した。また、高度不飽和脂肪酸含有率は１４日間の培養において、レシチン濃度５〜１５ｇ／リットルで最高値（約３０質量％）を示した。
【００２０】
実施例２
大豆レシチン濃度を５ｇ／リットルとし、２５℃から３５℃までの異なった温度において、他の条件は実施例１と同様にして７日間培養した。
このときの高度不飽和脂肪酸の生産量及び全脂質中の高度不飽和脂肪酸の含有率を表２に示す。
【００２１】
【表２】
0003723822.tif 000004
【００２２】
この表から明らかなように、低温域の２０℃及び高温域の３２．５℃、３５℃において、高度不飽和脂肪酸はほとんど生産されず、２５℃及び３０℃において生産量、含有率ともに高い値を示した。また、生産量は３０℃で含有率は２５℃で最高値を示した。
【００２３】
実施例３
大豆レシチン濃度を５ｇ／リットルとし、異なったｐＨ条件下、他の条件は実施例１と同様にして７日間培養を行った。この結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
0003723822.tif 000005
【００２５】
この表から分るように、生産量はｐＨ８で最高値を示し、含有率はｐＨ６〜９の間で高い値を示しているので至適ｐＨは８付近であると考えられる。
なお、培養終了後における培地のｐＨはいずれもほぼ中性となるため、このｐＨ条件は培養初期において、ラビリンチュラ属微生物の増殖に好適な条件となっていると考えられる。
【００２６】
実施例４
大豆レシチン濃度を５ｇ／リットルとし、通常海水における塩分濃度の０〜１２５％の異なる塩分濃度に調整した人工海水を用い、他は実施例１と同様の条件下で７日間培養した。この結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
0003723822.tif 000006
【００２８】
この表から明らかなように、海水濃度と同じ１００％が生産量で最高値を示したが、含有率では７５％で最高値を示した。
【００２９】
実施例５
大豆レシチン濃度を５ｇ／リットルとし、基本培地の異なる寒天濃度において、実施例１と同様にして７日間培養を行った。この結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】
0003723822.tif 000007
【００３１】
この表から明らかなように、生産量、含有率ともに濃度５ｇ／リットルにおいて最高値を示した。このことより、寒天濃度はあまり高くしない方がよいことが分る。
【００３２】
実施例６
大豆レシチン濃度１５ｇ／リットル、塩分濃度１００％の人工海水、寒天濃度５ｇ／リットルに調整した培地を用い、温度２８℃、初期ｐＨ８の条件下で、７日間又は１４日間培養したところ、高度不飽和脂肪酸生産量は、７日間で０．９９ｍｇ／ｇ−寒天、１４日間で１．３８ｍｇ／ｇ−寒天を示し、また含有率は７日間で３５．０質量％、１４日間で３３．４質量％という高い値を示した。
【００３３】
実施例７
実施例６で用いた培地の大豆レシチン濃度を４０ｇ／リットルに変え、特許第２９７６０２７号の方法によって小笠原その他で得られた分離株４株（Ｌ４、Ｌ２２、Ｌ２５、Ｌ２９）を用い、７日間、１４日間又は２１日間培養を行った。その結果を表６に示す。
【００３４】
【表６】
0003723822.tif 000008
【００３５】
この表から分るように、実施例１に示したように、ラビリンチュラＳ３−２株を用いた場合においては、大豆レシチン濃度を１５ｇ／リットルよりも高くして生産量は増加せず、含有率はむしろ低下する傾向がみられたが、別の菌株を用いると、大豆レシチン濃度をさらに上げると生産量が増加することが分った。
すなわち、Ｌ２５株は２１日後において培地１ｇ当り３．０ｍｇ以上の生産量を示すが、この値は大豆油のようなトリアシルグリセロールを添加した場合の約１０倍に相当する。
【００３６】
比較例
基本培地に、大豆油、トリオレイン、オレイン酸、オレイン酸エチル、γ‐リノレン酸含有微生物油（モールド油）、ゴマ油、ココナッツ油、オリーブ油、パーム油、アマニ油、牛脂の１１種類の油脂をそれぞれ５ｇ／リットル加えたもの、及び大豆レシチンを５ｇ／リットル加えたものを用いて２５℃において７日間培養した。なお、各油脂は、界面活性剤（ｔｗｅｅｎ−８０）を加えることによって分散性を高め、基本培地とは別にオートクレーブを用い、クリーンベンチ内で無菌的に混合した。
培養終了後、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成分析を行った結果を棒グラフとして図１及び図２に示す。図１は、高度不飽和脂肪酸の生産量のグラフであり、図２は含有率のグラフである。
これらの図から明らかなように、生産量、含有率ともに大豆レシチンを用いた場合、油脂を用いた場合に比べ著しく高い値を示した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、植物油の抽出の際に副生し、これまでほとんど利用されていなかった大豆レシチンのようなレシチンを添加した基本培地を用いて、ラビリンチュラ属に属する微生物を培養することにより、効率よく高度不飽和脂肪酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  各種油脂又は大豆レシチンを添加した基本培地を用いたときの高度不飽和脂肪酸の生産量を示す棒グラフ。
【図２】  同じく含有率を示す棒グラフ。
【図１】
0003723822.tif 000009
【図２】
0003723822.tif 000010