(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤。
【化１】
0003670685.tif 000022
【請求項２】
下記の化学式（２）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤。
【化２】
0003670685.tif 000023
【請求項３】
下記の化学式（３）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤。
【化３】
0003670685.tif 000024
【請求項４】
下記の化学式（４）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤。
【化４】
0003670685.tif 000025
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はアルドースレダクターゼ阻害剤に関するものであり、さらには、糖尿病性白内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性角膜症、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経症等の糖尿病性合併症の予防及び治療に有用なアルドースレダクターゼ阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病のような高血糖状態では、アルドースレダクターゼ活性の亢進によりポリオール系での代謝が促進され、ソルビトール、ガラクチトール、フラクトースの異常蓄積を助長する。また、これらのソルビトール、ガラクチトール、フラクトースは細胞内で比較的安定で、一度生成されると細胞外への移行はほとんど認められないので、細胞内に蓄積される。その結果、細胞内の浸透圧が上昇して細胞内に水分貯留が起こり、細胞機能を正常に維持できなくなり、組織障害を起こすと考えられている。従って、アルドースレダクターゼ活性を阻害すれば、細胞内ソルビトール、ガラクチトール、フラクトースの異常蓄積は回避され、細胞機能を正常に維持できると考えられている。また、アルドースレダクターゼ阻害剤が白内障、神経症、腎症、網膜症等の糖尿病合併症の治療に有用であることが知られている〔バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochem. Biophys. Acta) ,158,472 (1968）、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem. Pharmacol.),32, 1495 (1983)  参照〕。
【０００３】
従来、アルドースレダクターゼ阻害剤としては、ヒダントイン誘導体（特開昭５３−５３６５３号公報参照）、チアゾリン誘導体（特開昭５７−２８０７３号公報参照）等、多くの化合物が開発されているが、さらに優れたアルドースレダクターゼ阻害作用を有するアルドースレダクターゼ阻害剤の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、数多くのアルドースレダクターゼ阻害剤が存在するが、これらの多くは毒性をもつことや、あまり活性が強くないという点で解決すべき課題を持っていた。
【０００５】
本発明は、安全で、かつ強い活性を持つアルドースレダクターゼ阻害剤を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定のサーモルビン誘導体が安全で、かつアルドースレダクターゼ活性を阻害するという事実を見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、第１の発明は、下記の一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤を要旨とするものである。
【０００８】
【化５】
0003670685.tif 000002
【０００９】
また、第２の発明は、下記の化学式（２）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤を要旨とするものである。
【００１０】
【化６】
0003670685.tif 000003
【００１１】
さらに、第３の発明は、下記の化学式（３）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤を要旨とするものである。
【００１２】
【化７】
0003670685.tif 000004
【００１３】
また、第４の発明は、下記の化学式（４）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアルドースレダクターゼ阻害剤を要旨とするものである。
【００１４】
【化８】
0003670685.tif 000005
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のアルドースレダクターゼ阻害剤は、上記の一般式（１）又は化学式（２）〜（４）で示されるサーモルビン誘導体を有効成分として含有してなるものである。
【００１７】
上記の一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体としては、Ｒ1 がＣＯＯＨ、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＯＨ、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＯＣＨ3 、Ｒ2 がＯＣＨ3 、Ｒ3 がＣＯＯＣＨ3 、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＯＨ、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＮＨ2 、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＯＨ、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＮＨＣＨ3 、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＯＨ、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＯＨ、ＸがＮＣＨ3 のもの、Ｒ1 がＣＯＯＨ、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＨ2 ＯＨ、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＯＣＨ3 、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＯＣＨ3 、ＸがＯのもの、Ｒ1 がＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）2 ＣＨ3 、Ｒ2 がＯＨ、Ｒ3 がＣＯＯＣＨ3 、ＸがＯのもの等が挙げられる。
【００１８】
また、本発明に用いられるサーモルビン誘導体としては、塩基性化合物の医薬として許容される塩付加物塩、あるいは酸性化合物の医薬として許容される塩基から誘導される塩の形であってもよい。塩基性化合物の医薬として許容される塩としては、好ましくは医薬として許容される無機酸又は有機酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸等の強鉱酸、ハロゲン化水素酸、臭化水素酸、燐酸、脂肪酸、芳香族カルボン酸、スルホン酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、安息香酸、サリチル酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸等の酸付加塩が挙げられる。
【００１９】
また、酸性化合物の医薬として許容される塩としては、医薬として許容される塩基と共に形成される塩、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム、カルシウム塩）、アミン塩（例えば、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、トロメタミンの塩）等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いられる一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体又は化学式（２）〜（４）で示されるサーモルビン誘導体を得るには、例えば以下のようにすればよい。
【００２１】
まず、サーモアクチノマイセス・サルホフィラス(Thermoactinomyces thalpophilus, ATCC 14570)やサーモクチノミセス  エス・ピー(Thermoactinomyces sp.) ＵＡＴ−８（FERM P-13372) の微生物を培養してサーモルビンを産生させる。これらの微生物を培養するための培地としては、放線菌の培養に用いられる一般的培地であればよく、液体培地、固体培地どちらを用いてもよい。この培地の栄養源において炭素源としては、D-マンニトール以外の糖（例えば、グルコース、シュクロース、フルクトース、アラビノース等）が使用でき、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、ファーマメディア等が使用できる。また無機塩類としては、例えば、各種りん酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄等が使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも添加を必要としない。さらに、栄養要求を必要とする変異株を用いる場合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなければならない。
【００２２】
この培地のｐＨとしては、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ４〜８、最適にはｐＨ５〜７．５に調節すればよい。
【００２３】
これらの微生物を培養する条件としては、３５〜６５℃、好ましくは４０〜５５℃、最適には４５〜５０℃で、３〜７日間振とう培養又は通気撹はん培養すればよい。このときの培養中の通気量としては、０．２〜２ｖ／ｖ／ｍ、好ましくは０．５〜１．５ｖ／ｖ／ｍ、より好ましくは０．７５〜１ｖ／ｖ／ｍである。このようにして得られた培養物から、本発明に用いられるサーモルビンを単離する方法としては、一般の有機化合物の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。例えば、培養物を遠心分離、ろ過又は分相等に付して、培養濾液を分取し、疎水性吸着剤ＨＰ−２０（三菱化成社製）カラムクロマトグラフィー等により活性物質を吸着させ、水洗後エタノール等により溶出することにより濃縮する。次いで、この濃縮液から酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出し、この抽出物から逆層分配クロマトグラフィー等の方法により、不純物を取り除いた後、さらに、高速液体クロマトグラフィー等の方法により分別精製することができる。
【００２４】
次に、上記のようにして製造したサーモルビンを用いて、ジアゾメタンによるメチル化反応や開裂反応、アルカリによる加水分解、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤による還元反応等通常の化学反応を組み合わせることによって各種のサーモルビン誘導体を合成することができ、また、公知の方法〔ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス (Bruno Cavalleri et al, The journal of antibiotics), 38, 1752, 1985又はテトラヘドロン(Maruco Turconi et al, Tetrahedron), 42, 727,1986 参照〕に従って合成することもできる。
【００２５】
本発明のアルドースレダクターゼ阻害剤を糖尿病性合併症の予防あるいは治療に使用する場合、投与経路としては、経口、皮下注射、静脈注射、局所投与等のいずれでもよい。また、投与形態としては、通常、製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加材を用いて、散剤、錠剤、細粒剤、丸剤、カプセル材、顆粒剤等の経口剤、点眼剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加材としては、グルコース、ラクトース、ゼラチン、マンニトール、でんぷんペースト、トリケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ等であり、さらには、安定剤、増量剤、着色剤、及び芳香剤の様な補助剤も含有してもよい。
【００２６】
この場合のアルドースレダクターゼ阻害剤中に配合するサーモルビン誘導体の量としては、１〜１００重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜７０重量％であり、３０〜５０重量％が好適である。
【００２７】
また、その投与量としては、投与対照、投与ルート、症状等によっても異なるが、通常０．１〜１０００mg／kg／日であることが好ましく、これを一日１〜５回に分けて投与すればよい。
【００２８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００２９】
参考例１
サーモアクチノマイセス・サルホフィラス(Thermoactinomyces thalpophilus,ATCC 14570）のスラント培養から１００ミリリットルの培地（大豆粉  ５ｇ、マルトース  ２０ｇ、イーストエキス  ２ｇ、ペプトン  ５ｇ、グルコース  ５ｇ、蒸留水  １リットル）を入れた５００ミリリットル坂口フラスコに植菌し、培養温度５０℃で、２４時間振とう培養した。この培養液１リットルを２０リットルの培地〔大豆粉  ５ｇ、マルトース  ２０ｇ、イーストエキス  ２ｇ、ペプトン  ５ｇ、グルコース  ５ｇ、ＫＭ−７３Ｆ（信越シリコーン社製）  ０．１ｇ，蒸留水  １リットル〕を仕込んだ３０リットルジャーファーメンターに植菌し、通気量０．７５ｖ／ｖ／ｍ、培養温度５０℃、回転数５００ｒｐｍで２６時間培養し、１６リットルの培養液を得た。この培養液を遠心分離し、得られた培養上清を４ＮのＨＣｌでｐＨを３．５に調整した後、等量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧乾固し、粗抽出物を６．９ｇ得た。
【００３０】
得られた粗抽出物の５ｇを１０ミリリットルのテトラヒドロフランに溶解し、４ｗ／ｗ％（以下、％と略記する。）のＫＨ2 ＰＯ4 を混合したシリカゲル（シリカゲル  ６０、メルク社製）  ５００ｇを充填したカラム（φ５×５０ｃｍ）にアプライした。このカラムを１リットルのクロロホルムで洗浄した後、クロロホルム：メタノールが容量比で９９：１の混合溶媒で展開した。得られた溶出液からサーモルビンを含む画分を回収し、回収液を減圧濃縮して、サーモルビンのオレンジ色の粉末０．９６ｇを得た。
【００３１】
参考例２（サーモルビン誘導体Ａの合成）
参考例１で得たサーモルビン１ｇを５０ミリリットルの０．１ＮのＮａＯＨに溶解し、室温で２時間放置した。この反応溶液に氷を５０ｇ加えた後、１ＮのＨＣｌでｐＨを３．５に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を半量の蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮し、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ａ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＨ、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＯＨ、Ｘ＝Ｏのもの〕のオレンジ色結晶０．４ｇを得た。
【００３２】
得られたサーモルビン誘導体Ａの構造式は以下に示すとおりであり、融点は２１０℃であった。
【００３３】
【化９】
0003670685.tif 000006
【００３４】
参考例３（サーモルビン誘導体Ｂの合成）
参考例２で得たサーモルビン誘導体Ａ５００ｍｇを２５ミリリットルのテトラヒドロフランに溶解し、これに、ジアゾメタンの１．５％のエチルエーテル溶液１０ミリリットルを滴下し、５分間、室温で放置した。この溶液に、０．５ミリリットルの酢酸を徐々に滴下し、続いて、蒸留水を１５０ミリリットル加えた。４ＮのＨＣｌでこの溶液のｐＨを４．０に調整した後、１００ミリリットルの酢酸エチルで抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮した後、濃縮物を５％のＫＨ2 ＰＯ4 を混合したシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）５０ｇを充填したカラム（φ２×５０ｃｍ）にアプライした。このカラムをクロロホルム：メタノールが容量比で９９：１の混合溶媒で展開し、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｂ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＣＨ3 、Ｒ2 ＝ＯＣＨ3 、Ｒ3 ＝ＣＯＯＣＨ3 、Ｘ＝Ｏ〕を含む画分を回収して減圧濃縮することにより、融点１１９〜１２１℃を示すサーモルビン誘導体Ｂの黄色粉末４８ｍｇを得た。
【００３５】
得られたサーモルビン誘導体Ｂの構造式は以下のとおりであった。
【００３６】
【化１０】
0003670685.tif 000007
【００３７】
参考例４（サーモルビン誘導体Ｃの合成）
参考例１で得たサーモルビン１．５ｇを１６％アンモニア水溶液４０ミリリットルに溶解し、−５℃で２５分間放置した。この反応溶液に氷を５０ｇ加えた後、４ＮのＨＣｌでｐＨを４．０に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を半量の蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮し、酢酸エチルから再結晶操作を行って、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｃ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＨ、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＮＨ2 、Ｘ＝Ｏ〕の赤色結晶０．８ｇを得た。
【００３８】
得られたサーモルビン誘導体Ｃの構造式は以下のとおりであり、融点は２７０℃以上であった。
【００３９】
【化１１】
0003670685.tif 000008
【００４０】
参考例５（サーモルビン誘導体Ｄの合成）
参考例１で得たサーモルビン１ｇを−５℃に冷却したメチルアミンの３５％水溶液１５ミリリットルに、撹はんしながら徐々に添加した後、この溶液を−５℃で２分間撹はんした。この反応溶液に氷を５０ｇ加えた後、４ＮのＨＣｌでｐＨを４．０に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を半量の蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮し、酢酸エチルから再結晶操作を行って、融点２７０℃以上を示すサーモルビン誘導体Ｄ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＨ、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＮＨＣＨ3 、Ｘ＝Ｏ〕のオレンジ色の粉末０．８ｇを得た。
【００４１】
得られたサーモルビン誘導体Ｄの構造式は以下のとおりであった。
【００４２】
【化１２】
0003670685.tif 000009
【００４３】
参考例６（サーモルビン誘導体Ｅの合成）
参考例１で得たサーモルビンの５ｇを−５℃に冷却したメチルアミンの３５％水溶液７０ミリリットルに、撹はんしながら徐々に添加した後、この溶液を−５℃で５分間撹はんした。この反応溶液に氷を１５０ｇ加えた後、４ＮのＨＣｌでｐＨを４．０に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を半量の蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水して減圧濃縮した後、５％のＫＨ2 ＰＯ4 を混合したシリカゲル（シリカゲル６０  メルク社製）１５０ｇを充填したカラム（φ３×５０ｃｍ）にアプライした。カラムをクロロホルム：メタノールが容量比で９９：１及び６：４の混合溶媒でスッテプワイズ法で展開し、化学式（２）で示されるサーモルビン誘導体Ｅを含む画分を回収した。得られた溶出液を減圧濃縮して、融点２７０℃以上を示すサーモルビン誘導体Ｅの黄色の粉末１．２ｇを得た。
【００４４】
得られたサーモルビン誘導体Ｅの構造式は以下のとおりであった。
【００４５】
【化１３】
0003670685.tif 000010
【００４６】
参考例７（サーモルビン誘導体Ｆの合成）
参考例１で得たサーモルビン１．２ｇを５０ミリリットルの０．１ＮのＮａＯＨに溶解し、室温で２時間放置した。この反応溶液に氷を５０ｇ加えた後、４ＮのＨＣｌでｐＨを３．５に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を半量の蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物を３３％のメチルアミン無水エタノール溶液５０ミリリットルに添加し、室温で１０分間撹はんした。これに１００ｇの氷を加えた後、８ＮのＨＣｌでｐＨを４．０に調整した。この溶液を室温で３分間放置し、生じた沈澱をろ過で集めた。この沈澱を蒸留水で洗浄した後、減圧乾固した。濃縮物をメタノールに溶解し、再結晶操作を行って、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｆ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＨ、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＯＨ、Ｘ＝ＮＣＨ3 〕の赤色の粉末０．４８ｇを得た。
【００４７】
得られたサーモルビン誘導体Ｆの構造式は以下のとおりであり、融点は２７０℃以上であった。
【００４８】
【化１４】
0003670685.tif 000011
【００４９】
参考例８（サーモルビン誘導体Ｇ及びＨの合成）
参考例１で得たサーモルビン５ｇを２５０ミリリットルのテトラヒドロフランに溶解し、さらに５ｇのＫＨ2 ＰＯ4 を混合した。この懸濁液に、５ｇの水素化ほう素ナトリウムを９５％エタノール２５０ミリリットルに溶解させた溶液を、１５分間かけて撹はんしながら滴下した。この反応液を室温で１５時間撹はんした後、反応液を分液ろうとに移し、さらに、蒸留水１０００ミリリットルと酢酸エチル５００ミリリットルを加えた。４ＮのＨＣｌを滴下して、過剰の水素化ほう素ナトリウムを失活させた後、分液ろうと中の反応液を撹はんして、酢酸エチル層に目的物を抽出した。酢酸エチル層を蒸留水で洗浄後、酢酸エチル層を減圧濃縮し、濃縮物を得た。この濃縮物をシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）２５０ｇを充填したカラム（φ３×５０ｃｍ）にアプライした。このカラムをジクロロメタン：メタノールが容量比で９７：３及び９：１の混合溶媒でスッテプワイズ法で展開し、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｇ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＨ、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＨ2 ＯＨ、Ｘ＝Ｏ〕を含むｇ画分と化学式（３）で示されるサーモルビン誘導体Ｈを含むｈ画分をそれぞれ回収した後、各画分を減圧濃縮した。ｇ画分の濃縮物をメタノールに溶解し、再結晶操作を行い、融点１６５〜１６７℃を示すサーモルビン誘導体Ｇの赤色結晶０．９ｇを得た。
【００５０】
得られたサーモルビン誘導体Ｇの構造式は以下のとおりである。
【００５１】
【化１５】
0003670685.tif 000012
【００５２】
一方、ｈ画分の濃縮物を酢酸エチルに溶解し、この溶液に石油エーテルを添加して、オレンジ色の沈澱を析出させた。沈澱をろ過で回収し、減圧乾燥し、融点１６９〜１７１℃を示すサーモルビン誘導体Ｈのオレンジ色の粉末１．２ｇを得た。
【００５３】
得られたサーモルビン誘導体Ｈの構造式は以下のとおりであった。
【００５４】
【化１６】
0003670685.tif 000013
【００５５】
参考例９（サーモルビン誘導体Ｉの合成）
参考例１で得たサーモルビン２ｇを７０ミリリットルのテトラヒドロフランに溶解した。この溶液に２，２−ジメトキシプロパン１００ミリリットルと濃硫酸０．１ミリリットルを滴下した。この反応液を１６時間還流した後、室温まで冷却し、反応液に炭酸ナトリウム１ｇを加え、中性になるまで撹はんした後、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、濃縮物を酢酸エチルに溶解した。この酢酸エチル溶液より、結晶化操作を行い、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｉ〔Ｒ1 ＝ＣＯＯＣＨ3 、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＯＣＨ3 、Ｘ＝Ｏ〕のオレンジ色の結晶０．６ｇを得た。
【００５６】
得られたサーモルビン誘導体Ｉの構造式は以下のとおりであり、融点は２０４〜２０６℃であった。
【００５７】
【化１７】
0003670685.tif 000014
【００５８】
参考例１０（サーモルビン誘導体Ｊの合成）
２０ミリリットルのテトラヒドロフランと１．７ミリリットルのｎ−プロピルアミンを混合した溶液を０℃に冷却し、これに０．２９ミリリットルの３塩化リンを撹はんしながら滴下した。この溶液を室温まで加温して、これに参考例１で得たサーモルビン３ｇを溶解した６０ミリリットルのテトラヒドロフラン溶液を加えた。この反応液を５０℃で２時間、撹はんした。反応液をろ過し、１０００ミリリットルの水を加えて、ろ液を濃塩酸でｐＨを４．０に調整した後、これを４００ミリリットルの酢酸エチルで２回、抽出した。酢酸エチル液を減圧濃縮し、濃縮物を１００ｇのシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）を充填したカラム（φ２×５０）にアプライした。カラムをジクロロメタン：メタノールが容量比で９８：２の混合溶媒で展開し、サーモルビン誘導体Ｊを含む画分を得た。この画分を減圧濃縮し、濃縮物を得た。この濃縮物を分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ  ２５４、メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メタノールが９８：２の展開溶媒で展開した。Ｒｆ０．４付近の主バンドをかきとり、クロロホルム：メタノールが９：１の混合溶媒で溶出させた。溶出液を減圧濃縮し、一般式（１）で示されるサーモルビン誘導体Ｊ〔Ｒ1 ＝ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）2 ＣＨ3 、Ｒ2 ＝ＯＨ、Ｒ3 ＝ＣＯＯＣＨ3 、Ｘ＝Ｏ〕のオレンジ色結晶０．１６ｇを得た。
【００５９】
得られたサーモルビン誘導体Ｊの構造式は以下のとおりであり、融点は２７０℃以上であった。
【００６０】
【化１８】
0003670685.tif 000015
【００６１】
参考例１１（サーモルビン誘導体Ｋの合成）
２００ミリリットルのテトラヒドロフランに０．３３ミリリットルの４０％ホルムアルデヒド水溶液と０．１３ｇのジメチルアミンを加えた。この溶液に参考例１で得たサーモルビン１．８ｇを溶解し、室温で、３０分間撹はんした。この反応液を１０ミリリットルまで減圧濃縮し、１００ミリリットルの蒸留水を加えた。この溶液を濃塩酸でｐＨ４．０に調整した後、２００ミリリットルの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を蒸留水で洗浄後、減圧濃縮した。濃縮物を１００ｇのシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）を充填したカラム（φ２×５０ｃｍ）にアプライした。このカラムをジクロロメタン：メタノールが容量比で９９：１の混合溶媒で展開し、化学式（４）で示されるサーモルビン誘導体Ｋを含む画分を得た。この画分を減圧濃縮し、濃縮物を得た。この濃縮物をジクロロメタンに溶解し、再結晶操作を行い、融点２７０℃以上を示すサーモルビン誘導体Ｋのオレンジ色結晶０．５８ｇを得た。
【００６２】
得られたサーモルビン誘導体Ｋの構造式は以下のとおりであった。
【００６３】
【化１９】
0003670685.tif 000016
【００６４】
実施例１〜１１（アルドースレダクターゼ阻害活性の測定）
牛眼球より水晶体を摘出し、３倍量の冷純水でホモゲナイズし、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。その上澄みを０．０５Ｍの塩化ナトリウム水溶液で一夜透析したものを、アルドースレダクターゼ液とした。以上の操作は４℃で行い、酵素液は−８０℃で保存した。
【００６５】
アルドースレダクターゼの活性測定はハイマンとキノシタ（Hayman and Kinoshita）の方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（The journal of Biological Chemistry),240, 877, 1965 〕に基づいて、一部改変して行った。すなわち、硫酸リチウム水溶液（最終濃度４００ｍＭ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（最終濃度０．１５ｍＭ）、上記アルドースレダクターゼ液及び参考例２〜１１で得られたサーモルビン誘導体Ａ〜Ｋ（最終濃度１０-5Ｍ，１０-6Ｍ，１０-7Ｍ及び１０-8Ｍ）を含むように調製した１００ｍＭのナトリウムカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）０．９ミリリットルにＤＬ−グリセルアルデヒド（最終濃度１０ｍＭ）０．１ミリリットルを加えて、２８℃で５分間反応を行った。その間の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に測定し、そのときのｔａｎθを求めた。阻害剤を添加したときのｔａｎθ値をＡとし、阻害剤を添加していないときのｔａｎθ値をＢとして、次式によって阻害率（％）を求めた。
【００６６】
【数１】
0003670685.tif 000017
【００６７】
その結果を表１に示す。なお、表中の値はアルドースレダクターゼ活性を５０％抑制するときの化合物の濃度〔ＩＣ50（Ｍ）〕で示した。
【００６８】
【表１】
0003670685.tif 000018
【００６９】
参考例１２（急性毒性試験）
両方の性の平均体重１２０ｇのウィスターラット（Wister rats ）を使用し、１８時間絶食させた後、参考例２〜１１ので得たサーモルビン誘導体Ａ〜Ｋをカルボキシメチルセルロースに懸濁させて、胃プローブで経口投与した。また、サーモルビン誘導体を懸濁していないカルボキシメチルセルロースを経口投与して対照群とした。その結果、サーモルビン誘導体Ａ〜Ｋを５０００ｍｇ／ｋｇ経口投与した場合においても死亡例は観察されなかった。また、挙動及び一般状態は対照群と比べて変化はなかった。以上の結果から、サーモルビン誘導体Ａ〜Ｋのラットにおける経口投与での急性毒性は５０００ｍｇ／ｋｇ以上であることがわかる。
【００７０】
0003670685.tif 000019
この錠剤は通常行われるフィルムコーテイングを行っても差し支えなく、更に糖衣を行うこともできる。
【００７１】
0003670685.tif 000020
製剤例２（注射剤）
蒸留水にサーモルビン誘導体Ａを１〜３０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した（ｐＨ６．５〜７．０）。
【００７２】
製剤例３（点眼液）
５ｍｌ中に次の成分含量を含有させた。
【００７３】
0003670685.tif 000021
【００７４】
【発明の効果】
本発明のアルドースレダクターゼ阻害剤は安全で、かつ強いアルドースレダクターゼ阻害活性を有しており、糖尿病性合併症の予防、治療薬として有用である。