(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）水性懸濁液相および実質的に該水性懸濁液相から分離しているガス相を含む容器；
ｂ）小胞が形成されるように、該容器に往復運動を伝えることにより該容器を震盪するためのデバイスであって、（ｉ）アーム、（ii）該容器を該アームと連結するための手段および（iii）相互に垂直な第一および第二方向で前後にアームを震盪するための手段を備えた該デバイス、を含んで成り、
かつ、該アームが少なくとも約6cmの長さを有し、該アームを震盪するための手段が、少なくとも約6cmの曲率半径を有し、少なくとも約３゜の角度を囲む弓形の経路に沿って第一方向で該アームを回転するための手段を備え、そして該往復運動の総体的な経路が数字の８のパターンで起こる、ことを特徴とする最適なサイズの小胞を作成するための装置。
【請求項２】
上記震盪するための手段が、少なくとも約0.3cmの振幅で震盪する手段を含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
上記震盪するための手段が、さらに約2.5cm以下の振幅で震盪する手段を含んで成る、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
該アームを回転するための手段が、上記第二方向で少なくとも約0.02cmの振幅で該アームを回転するための手段を備える請求項２に記載の装置。
【請求項５】
上記震盪するための手段が、少なくとも約0.7cmの全長を有する数字の８のパターンの経路に沿って上記容器を震盪するための手段を備える請求項１に記載の装置。
【請求項６】
上記弓形の経路に囲まれた角度が、約９゜以下である請求項１に記載の装置。
【請求項７】
上記弓形の経路の曲率半径が、約15cmより短い請求項１に記載の装置。
【請求項８】
上記震盪するための手段が、少なくとも約2800RPMの頻度で震盪する手段を備える請求項１に記載の装置。
【請求項９】
上記水性懸濁液相が、脂質を含んで成る請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
上記水性懸濁液相が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを含んで成る請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
上記脂質が、単層の形態にある請求項９または10に記載の装置。
【請求項１２】
上記小胞が、リポソームを含んで成る請求項１〜11のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
上記リポソームが、リン脂質を含んで成る請求項12記載の装置。
【請求項１４】
上記ガス相が、最初に上記容器の容量の少なくとも10％を占める請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
上記ガス相が、ペルフルオロカーボンガスを含んで成る請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
上記ガス相が、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサンおよびサルファーヘキサフルオリドからなる群より選ばれるガスを含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
上記ガス相が、ペルフルオロペンタンである請求項16に記載の装置。
【請求項１８】
上記ガス相が、サルファーヘキサフルオリドである請求項16に記載の装置。
【請求項１９】
上記ガス相が、ペルフルオロプロパンである請求項16に記載の装置。
【請求項２０】
上記ガス相が、ペルフルオロヘキサンである請求項16に記載の装置。
【請求項２１】
上記水性懸濁液相が、ポリマーを含んで成る請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
上記ポリマーが、ポリメタクリレートを含んで成る請求項21に記載の装置。
【請求項２３】
上記ガス相が、空気を含んで成る請求項21又は22に記載の装置。
【請求項２４】
上記水性懸濁液相が、多糖を含んで成る請求項１に記載の装置。
【請求項２５】
上記水性懸濁液相が、ガラクトースを含んで成る請求項１に記載の装置。
【請求項２６】
上記ガス相が、窒素を含んで成る請求項25に記載の装置。
【請求項２７】
上記リポソームが、架橋リポソーム又は重合リポソームを含んで成る請求項12に記載の装置。
【請求項２８】
上記水性懸濁液相が、ポリエチレングリコールをさらに含んで成る請求項９に記載の装置。
【請求項２９】
最適サイズの小胞の作成方法であって、請求項１〜28のいずれかに記載の装置を提供する段階、および上記容器中で小胞を形成するのに十分な時間、約2,800RPMより多く、約10,000RPM以下の頻度で該容器を震盪する段階を含んで成る方法。
【請求項３０】
上記震盪する段階が、95％が10μｍより小さい小胞を形成する請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
上記震盪する段階が、2.5μｍ未満の平均サイズを有する小胞を形成する請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
上記ガス相が最初に、上記容器の容量の少なくとも10％を占める請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
上記震盪時間が、約２分以下である請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
上記容器が、シリンジである請求項33に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、1989年12月22日に出願された米国特許出願第455,707号の一部継続出願である、1990年８月20日に出願された米国特許出願第569,828号の一部継続出願である、双方とも1991年６月18日に出願された米国特許出願第717,084号および同第716,899号の一部継続出願である、1993年６月11日に出願された米国特許出願第076,239号の一部継続出願である、1993年11月30日に出願された米国特許出願である第159,687号の一部継続出願である1994年９月19日に出願された同時係属出願の米国特許出願第307,305号の一部継続出願である。
本出願はまた、1989年12月22日に出願された米国特許出願第455,707号の一部継続出願である、1990年８月20日に出願された米国特許出願第569,828号の一部継続出願である、双方とも1991年６月18日に出願された米国特許出願第717,084号および同第716,899号の一部継続出願である、1993年６月11日に出願された米国特許出願第076,250号の一部継続出願である、1993年11月30日に出願された同時係属出願の米国特許出願第160,232号の一部継続出願である。
これら各出願の開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。
発明の分野
本発明はガス−充填小胞、特に超音波画像化に有用な種類のガス−充填小胞を作成するための方法および装置を対象とする。より詳細には、本発明は、震盪パラメーターが最短の時間で最適サイズの小胞を提供するように制御される震盪により、ガス−充填小胞を作成する方法および装置を対象とする。
発明の背景
超音波は、他の診断技法よりも多数の利点を提供する診断用の画像化法である。核医学およびＸ−線のような技法とは異なり、超音波はDNA、RNAおよびタンパク質のような生物物質に害を及ぼす可能性がある、潜在的に有害な電離電子放射線に患者を暴露しない。さらに超音波法は、コンピューター連動断層撮影法（CT）または磁気共鳴画像法のような技法と比較したときに比較的廉価な療法様式である。
超音波の原理は、音波が観察する組織または脈管構造の構成および密度に依存して、組織を差別的に反射するという事実に基づく。組織組成に依存して、超音波は吸収により放散するか、組織透過するか、または後方に反射する。後方散乱または反射能と呼ばれる反射は、超音波画像を顕出させるための基礎である。臨床的な設定で、典型的に1MHz−10MHzの範囲の音波を検出できる振動子を、戻ってくる音波を感度よく検出するために使用する。これらの波を次に定量できる画像に統合する。次に定量した波を、観察する組織の画像に転換する。
超音波の療法様式に対する技術的向上にもかかわらず、得られた画像は、特に血管の血液供給で潅流している脈管構造および組織の撮影に関してさらなる精密化に供される。したがって、脈管構造および脈管関連器官の視覚化を目的とする薬剤組成物に関する必要性が存在する。
小胞は、小胞の表面のような液体−ガス界面での音波の反響が極めて有力であるので、造影剤として望ましい。
超音波造影剤として有効的であるためには、小胞の大きさおよび弾性特性（バブルサイズおよび弾性）が小胞からの音の反射を最大にするのに重要であるので、小胞は可能な限り大きく、かつ弾性があるべきである。さらに、小胞は圧力に対して安定であるべきであり、すなわち、圧力に暴露された後に50％より多くのガス含量を保持するべきである。また小胞は、圧力の解除後に再度、膨張すべきであることも高度に望まれる。さらに反射能、すなわちコントラストを最大にするために、高い小胞濃度を有することも高度に望まれる。したがって小胞濃度は、小胞の効力の決定に重要な因子である。特に、mLあたり100×106個の小胞、そしてより好ましくはmLあたり500×106個の小胞を有することが望ましい。
しかし、サイズも撮影用の小胞の適性を決定するため重大な因子である。毛細脈管構造を安全に通過することができる小胞の形態では、反射された信号（レイリー散乱）は、６乗まで高められた小胞の直径の関数となることができるので、直径４μｍの小胞は直径２μｍの小胞の64倍の散乱能を有することができる。
またサイズは、10μｍより大きな小胞が危険であることからも重要である。大きな小胞は、静脈または脈管注射後に微小−管（micro−vessels）を閉塞する傾向を有する。したがって、音を効率的に反射するためにできる限り大きく、しかし毛細管を通過するために十分小さい小胞であることが重要である。
これに関して、99％の小胞が10μｍ未満であることが高度に望ましい。さらに最も効果的なコントラストのためには、平均小胞サイズは、少なくとも0.5μｍ、好ましくは１μｍより大きく、そしてより好ましくは２μｍに近い。さらに、容積重量平均は、７μｍのオーダーであるべきである。
小胞の弾性が大きくなるほど、小胞が毛細管を通過して“押し入る（squeeze）”能力が大きいので、小胞の弾性はその最大許容サイズに影響を及ぼし得る。残念ながら、多数の因子が高度に弾性のある小胞の形成を妨げ、これにより小胞サイズ至適化の重要性がさらに増す。
未被覆小胞は最大の弾性を有するが、それらは一般的に不安定である。その結果、小胞の弾性を減じる効果を持つ被覆によるような、小胞の安定性の向上に関する努力がしばしばなされている。さらに、生分解性架橋剤で架橋されているタンパク質を用いたタンパク質様の殻中にカプセル化されたガスまたはガス−前駆体を、使用すること、ならびに生物適合性化合物を用いて共有的に架橋結合した非−タンパク質様小胞の使用がすでに提案された。そのような架橋は小胞に剛性の成分を加え、これにより小胞の弾性を減少させると仮定できる。
リポソームは、液体媒質中で界面活性剤の溶液を震盪することにより作成できるが（米国特許第4,684,479号明細書（D'Arrigo）を参照にされたい）、最短の時間で最適サイズを持つ小胞の作成法は、これまで開発されなかった。その結果、前述のすべての理由から、震盪パラメーターが最短の時間で最適サイズの小胞を提供するように制御される、小胞作成の方法および装置の必要性がある。
発明の要約
本発明の目的は、震盪変数が最短時間で最適サイズの小胞を生成するように制御される、小胞の作成方法および装置を提供することである。このおよび他の目的は、水性懸濁液相およびガス相を含む容器を、往復運動を使用して震盪する方法で達成される。この往復運動は震盪機のアームが、容器を実質的に垂直な２方向に動かすことにより生じる。この運動の第一方向は、少なくとも6cmの曲率半径を有する弓形の経路に沿って起こり、そして少なくとも３゜の角度を囲む。この運動の全経路は、数字の８の８パターンのように起こる。震盪回数は、少なくとも2800RPMであり、震盪振幅は少なくとも0.3cmであり、そして各回数中に容器が移動する全長は、少なくとも0.7cmである。
また本発明は、上記方法を使用して、水性懸濁液相およびガス相を含む容器を震盪するための装置も包含する。好ましくは、この装置は少なくとも３゜の角度を通って回転する少なくとも6cm長さを有する震盪機アームを有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の震盪装置の容器部分の正面図であり、中で小胞が本発明の震盪法により作成される。
図２は、容器を含まない本発明の震盪装置の等尺図である。
図３は、図２に示す震盪機の縦軸方向の断面図であり、カバーは無いが、図１に示す容器を設置して含んでいる。
図４および５はそれぞれ、図２に示した震盪機が設置された時に、図１に示す容器が取る経路の正面図および平面図であり、図５は図４に示すＶ−Ｖ線に沿っている。
図６は、図２に示す震盪装置の主な内部構成部品の等尺図である。
図７および８は、震盪機のアームがモーターシャフトに取り付けられた近傍の、図２に示す震盪装置の縦軸方向の断面図であり、遍心軸受筒が図８に示す方向である時に、震盪機アームの方向は図７の破線で示される。
図９（ａ）および（ｂ）は、図７に示す震盪機アームのIX−IX線に沿った図であるが、図９（ａ）および（ｂ）では図７に示す方向からそれぞれ90゜および270゜回転した遍心軸受筒を除く。
図10は、図９（ｂ）に示すＸ−Ｘ線を通る断面図であり、破線で示す遍心軸受筒が180゜回転したスリーブの方向である。
図11は、モーターシャフトに取り付けられた遍心軸受筒の等尺図である。
図12は、図９と同様な図であり、低いスプリング張力を使用した時の震盪機アームの方向を示す。
図13は、図14−16に示す試験結果を得るために使用した、一方は震盪回数（RPMで）、震盪機アーム長さＬ（cmで）、および他方はベアリングのオフセット角（θ）との間の関係を示すチャートである。
図14（ａ）−（ｃ）は、震盪機アーム長およびRPMを６゜のオフセット角θで図13に従い変動させた時の、震盪機アーム長Ｌ（mmで）に対する10μｍ未満のサイズを有する小胞の割合、数重量平均サイズ、およびmLあたりの粒子を示すチャートである。
図15（ａ）−（ｃ）は、図14（ａ）−（ｃ）と同様なチャートであり、９゜のオフセット角を使用して得た結果を図14（ａ）−（ｃ）の結果と比較する。
図16（ａ）−（ｃ）は、震盪経路の全長（cmで）に対する10μｍ未満のサイズを有する小胞の割合、数重量平均サイズ、およびmLあたりの粒子を示すチャートである。
図17は、図16に示す試験結果を得るために使用した、震盪回数（RPMで）と震盪経路の全長（cmで）との間の関係を示すチャートである。
図18（ａ）−（ｃ）は、３つの異なる種類の震盪デバイスに関して、10μｍ未満のサイズを有する小胞の割合、数重量平均サイズ、およびmLあたりの粒子を示すチャートである。
好適な態様の説明
本発明の方法に従えば、最適サイズの小胞は図１に示すように、好ましくは脂質を含んで成る水性懸濁液34を、最初に容器９に入れることにより作成される。
本明細書で使用する場合、用語“小胞”は、内部気孔の存在を特徴とする球状の物体を言う。好適な小胞は、本明細書に記載する種々の脂質を含む脂質から処方される。任意に与えられた小胞で、脂質は単層または二重層であり、そして単−または二重層の脂質は、１つ以上の単層または二重層を形成するために使用できる。１つより多くの単層または二重層の場合は、この単層または二重層は、一般的に同心である。本明細書に記載の小胞は時々、バブルまたはミクロバブルと呼ばれることもあり、そして通常、リポソームおよびミセル等と呼ばれるような物体も含む。このように脂質をユニラメラ小胞（１つの単層または二重層から成る）、オリゴラメラ小胞（約２つまたは約３つの単層または二重層から成る）、またはマルチラメラ小胞（約３つより多くの単層または二重層から成る）を形成するために使用できる。小胞の内部気孔は所望により、例えば水性液体、ガス、ガス前駆体を含む液体、および／または所望により例えば標的リガンドおよび／または生物活性剤を含む固体または溶質材料で満たすことができる。
“リポソーム”とは、脂質化合物を含む両親媒性化合物の、典型的には１つ以上の同心層状態の、一般的に球状クラスターまたは凝集物を言う。最も好ましくは、ガス充填リポソームは、脂質の単一の層（すなわちユニラメラ）または単一の単層から構成される。広範な種類の脂質をリポソームを作成するために使用でき、リン脂質および非−イオン性界面活性剤（例えばニオソーム）を含む。最も好ましくは、ガス充填リポソームを含んで成る脂質は、生理的温度でゲル状態である。このリポソームは、架橋するか、または重合することができ、そしてそれらの表面にポリエチレングリコールのようなポリマーを有してもよい。内皮細胞に向けられた標的リガンドは、ガス充填リポソームの表面に結合している。標的リガンドは、小胞に結合し、そして小胞を特定の細胞型（限定するわけではないが、内皮組織および／または細胞のような）に向ける物質である。標的リガンドは、共有結合または非−共有結合により小胞に結合することができる。リポソームも、本明細書では脂質小胞と呼ぶ。最も好ましくは、リポソームは実質的にその内部に水が全く無い。
“ミセル”は、脂質性化合物（ラウリル硫酸のような）の濃度が、臨界濃度より高い時に、脂質性化合物から形成されるコロイド状の物体を言う。ミセルを形成する多くの化合物は、界面活性剤の特性（すなわち、表面張力を下げる能力、ならびに水および脂質の両方を好む−親水性および親油性ドメイン）も有し、これら同じ物質がバブルを安定化するためにも使用できる。一般的に、これらのミセル状物質は、単層またはヘキサゴナルH2相配置をとることを好み、さらに二重層配置をとることもできる。ミセル状物質が、ガス充填小胞を形成するために使用される時、この化合物は、一般的に脂肪性（脂質を好む）部分を小胞に向け、そして親水性部分ドメインを小胞表面から遠ざけるように配置する放射状の配置をとるだろう。内皮細胞を標的とするために、標的リガンドはミセル化合物に付けるか、またはミセル化合物と混合する両親媒性物質に付けることができる。あるいは標的リガンドは、小胞を安定化するミセル物質の表面に吸着させることができる。
ガス相は、水性懸濁液相34の残る部分の上、または容器９の頭隙32で使用される。ガス相の導入は、もし空気以外のガスがガス相に使用されるならば、ガスが水性懸濁液34の上の頭隙32を占めるように、容器９をガスを用いてパージすることにより行うことができる。このように震盪前に、容器９は水性懸濁液相およびガス相を含む。次に容器９を、本発明の震盪デバイス１の震盪アーム７上に設置し、その好適な態様を図２、３および６−11に表し、そして所望の小胞が形成するのに十分な時間、振盪する。
フィルターは、震盪後の小胞サイズの分布をさらに精密にするために使用できるが、本発明の焦点は任意の後−震盪濾過の前に、最適サイズの小胞を生成するための震盪パラメーターを制御することである。このために、本出願人は震盪により生成される小胞のサイズが主に４つの変数の関数であることを見いだした：
（ｉ）水性懸濁液相の組成、
（ii）頭隙中のガス相の組成、
（iii）容器の容積、および最初にガス相に占有される頭隙の相対容積、および
（iv）第一の震盪パラメーターの明確な限定…すなわち震盪中に容器が移動する経路の形、震盪運動の振幅、および震盪期間および回数。
本発明の方法に従い、これらの各変数は、所望の小胞サイズ分布および濃度が得られるように、小胞作成の工程中で調整すべきであり、好ましい小胞サイズ分布は、小胞が少なくとも約0.5μｍの平均サイズを有し、そして中の少なくとも95％の小胞、そしてより好ましくは少なくとも99％の小胞が10μｍ未満の直径を有し、そして生成された小胞の濃度が少なくともmLあたり100×106、より好ましくはmLあたり500×106である。その結果、以下の第Ｉ−IV章では、これら４つの各変数を個別に検討する。第Ｖ章では、本発明の方法を実施するための好適な装置を開示する。第VI章は、本発明に従い作成された小胞の幾つかの応用を検討する。
I.水性懸濁液相の組成
広範な種々のバブル被覆剤を、水性懸濁液相中に使用できる。好ましくは被覆剤は脂質である。脂質は所望により、飽和または不飽和であることができ、そして直鎖状または分枝状であることができる。そのような脂質は、例えば好ましくは約12個の炭素原子から約22個の炭素原子の間の広範な炭素原子含む脂肪酸分子を含んで成ることができる。イソプレノイド単位、プレニル基および／またはステロール部分（例えばコレステロール、硫酸コレステロールおよびそれらの類似体）から成る炭化水素基も同様に使用できる。脂質は、両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール（PEG）またはポリビニルピロリドン（PVP）またはそれらの誘導体（インビボターゲッティング用に）、あるいはポリリシンまたはポリアルギニンのような荷電アミノ酸（負に荷電した化合物の結合用に）、あるいは米国特許第4,310,505号明細書に記載されているような炭水化物（インビボターゲッティング用に）、あるいは糖脂質（インビボターゲッティング用に）、あるいは抗体および他のペプチドおよびタンパク質（インビボターゲッティング用に）等のようなポリマー鎖も、所望により担持することができる。そのようなターゲッティングまたは結合化合物は、単に水性脂質懸濁液相に加えてもよく、または脂質に特別に化学的に結合させることもできる。脂質は所望によりアニオン性またはカチオン性脂質であってよく、そのためそれら自体が医薬品、遺伝物質または他の治療物質のような他の化合物を結合することができる。
適当な脂質および特に適当な脂質の種類の例には：ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）およびジステアロイルホスファチジルコリンのようなホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびＮ−スクシニル−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；スフィンゴリピッド；ガングリオシドGM1のようなグリコリピッド；グリコリピッド；スルファチド；グリコスフィンゴリピッド；ジパルマトイルホスファチジン酸（DPPA）のようなホスファチジン酸；パルミチン脂肪酸；ステアリン脂肪酸；アラキドン脂肪酸；ラウリン脂肪酸；ミリスチン脂肪酸；ラウロレイン脂肪酸；フィゼテリン脂肪酸；ミリストレイン脂肪酸；パルミトレイン脂肪酸；ペトロセリン脂肪酸；オレイン脂肪酸；イソラウリン脂肪酸；イソミリスチン脂肪酸；イソパルミチン脂肪酸；イソステアリン脂肪酸；コレステロールヘミスクシネート、コレステロールスルフェートおよびコレステリル−（4'−トリメチルアンモニオ）−ブタノエートのようなコレステロールおよびコレステロール誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル；ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル；グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート；グリセロールポリエチレングリコールリシノレート；エトキシル化大豆ステロール；エトキシル化キャスター油；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン脂肪酸ポリマー；ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート;12−（（（7'−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）−メチル−アミノ）オクタデカン酸;N−［12−（（（7'−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノ−パルミチン酸;1,2−ジオレオイル−sn−グリセロール;1,2−ジパルミトイル−sn−３−スクシニルグリセロール;1,3−ジパルミトイル−２−スクシニル−グリセロール；および１−ヘキサデシル−２−パルミトイル−グリセロホスホエタノールアミンおよびパルミトイルホモシステイン；ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ラウリル＝ドデシル−）；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（セチル＝ヘキサデシル−）；ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド（ミリスチル＝テトラデシル−）；アルキルがC12、C14またはC16アルキルのようなアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロライド；ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド；ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド；セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド；セチルジメチルエチルアンモニウムクロライド；セチルピリジニウムブロミド；セチルピリジニウムクロライド;N−［１−2,3−ジオレ��イルオキシ）−プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）;1,2−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（DOTAP）；および1,2−ジオレオイル−ｅ−（4'−トリメチルアンモニオ）−ブタノイル−sn−グリセロール（DOTB）を含む。
当業者には、いったん本開示事項を身につけたならば、前述の脂質リストは例示のみであり、他の有用な脂質、脂肪酸およびそれらの誘導体および組み合わせを使用でき、そしてそのようなさらなる化合物も本明細書で使用する脂質という用語の範囲内であることを意図することは明らかである。また当業者は、そのような脂質および／またはそれらの組み合わせは、容器を震盪すると、リポソーム（これは内部気孔を有する脂質の球である）の内部気孔中に、ガス相からのガスが封入されたリポソームを形成すると認識するだろう。このリポソームは、単一の脂質層（脂質単層）、２つの脂質層（脂質二重層）または２つより多くの脂質層（脂質多重層）から成ることができる。
一般的に、脂質は特に震盪中に、ゲル状で留まることが好ましく、すなわち脂質材料のゲル状態から液体結晶状への相転移温度（Tm）未満であることが好ましい。種々の脂質のゲル状から液体結晶状への相転移温度は周知である。そのような温度は、周知の技法を使用して容易に計算することもできる。Derek Marsh、“脂質二重層のCRCハンドブック（CRC Handbook of Lipid Bilayers）”第139頁、CRC出版、ボカラトン、フロリダ州、1990からの、以下の表１は、例えば種々の代表的な飽和ホスホコリン脂質の主鎖の相転移温度を表している。
0003645909.tif 000002
本発明の好適な態様では、水性脂質相はさらにポリマー、好ましくは両親媒性ポリマー、そして好ましくは脂質に直接結合した（すなわち、化学的に付いている）ポリマーを含んで成る。好ましくは両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールまたはその誘導体である。最も好適な組み合わせは、ポリエチレングリコール（PEG）、特に約5000の平均分子量のポリエチレングリコール（PEG）に結合した脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）である（DPPE−PEG5000）。このPEGまたは他のポリマーをDPPEまたは他の脂質に、アミド、カルバメートまたはアミン結合のような共有結合を介して結合させることができる。あるいはエステル、エーテル、チチオエステル、オアミドまたはジスルフィド（チオエステル）結合を、PEGまたは他のポリマーと一緒に使用して、ポリマーを、例えばコレステロールまたは他のリン脂質に結合させるために使用できる。特に好適な脂質の組み合わせは、DPPC、DPPE−PEG5000およびDPPAであり、特に約82％:8％:10％（モル％）の比率のDPPC:DPPE−PEG5000:DPPAである。
別に、またはさらに水性懸濁液相中に使用できる他の被覆剤は、タンパク質、天然および半天然の炭水化物および合成ポリマーのようなポリマーを含む。ガス充填小胞を作成するために、異なる種々のタンパク質を本発明に使用できる。そのようなタンパク質は、天然（ヒトおよび動物）および組換え体起源に由来するアルブミン、フィブリン、コラーゲン、抗体およびエラスチンを含む。天然の多糖には、澱粉、セルロース、アルギン酸、ペクチン、デキストラン、ヘパリンおよびヒアルロン酸を含む。半−天然の多糖には、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチル澱粉を含む。合成ポリマーには、ポリビニルピロリドン、エチレンおよびプロピレングリコール（例えばPluronic F−68および他のPluronic）のコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリメタクリレートならびに二重エステルポリマーを含む。ヒドロキシアパタイトおよびピロリン酸カルシウムのような無機媒質も本発明に使用できる。これらすべての場合でバブル被覆剤は、予め選択されたガスの頭隙を持つ容器中の水性相に懸濁され、そして次に震盪される。この結果、安定化された被覆小胞が形成される。当業者はいったん本発明の開示事項を身に付けたならば、広範な種々の安定化剤を、小胞を作成するために本発明の原理に従い使用できると認識するだろう。
メリーランド州、ゲチスバーグのBRL−ライフテクノロジーズ（BRL−Life Technologies）のヒト血清アルブミンを用いた１つの実験では、アルブミン溶液およびペルフルオロプロパンガスの頭隙を含む10mlのガラスバイアル（液体容量＝6ml、5mg/mlのアルブミン溶液）を、2800RPMで２分間、Wig−Ｌ−Bug（商標）を用いて震盪し、５ミクロンの平均直径を有するアルブミン被覆ペルフルオロプロパン小胞を、mlあたり5000万個の濃度で生成した。
さらに本発明の使用は、種々の沈殿防止化剤および／または粘性剤とも適合する。本明細書で使用する沈殿防止剤という句は、コントラスト媒質に相対的な均一性または均質性を提供することを補助する化合物を表す。多数のそのような試薬を入手することができ、キサンタンガム、アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、バソリン、カラヤ、アラビアガム、未精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマ、カーボマー934P、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、カラゲーナン、セルロース（微結晶化）、デキストラン、ゼラチン、グアガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、珪酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、カゼイン、ゼラチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、プロピレングリコール、アルギン酸塩、二酸化珪素、コロイド状二酸化珪素、アルギン酸ナトリウムおよび他のアルギン酸塩およびトラガカントを含む。当業者は、広範な沈殿防止剤を必要に応じて、または所望により本発明のコントラスト媒質に使用できると認識するだろう。
これら試薬の濃度は、選択したバブル安定化媒質に依存して変動させ、そして震盪パラメーターも使用する材料に依存して変動させることができるだろう。脂質はその生物適合性、低毒性、純度および医薬品等級の材料としての入手し易さにより、本発明のガス充填小胞を作成するための好適なバブル被覆剤である。
水性相を調製するために、脂質または他の被覆剤を水（好ましくは蒸留水）、標準の（生理）塩溶液、リン酸緩衝化塩溶液、または当業者には明らかな他の水性基剤溶液と組み合わせることができる。
当業者はいったん本開示の物質について知得したならば、水性懸濁相を安定化するために、または震盪時のガス−充填小胞を安定化するために、種々の添加物を本発明の水性懸濁相中に使用できると認識するだろう。所望により、これらの添加物は、震盪前に水性懸濁相中に加えることができ、あるいは震盪後の組成物および生成したガス−充填小胞の調製物に加えることができる。当業者には明白であるように、そのような添加剤の使用は、もちろん生成したガス−充填小胞が目的とする特定の応用に依存する。
本発明に使用できる多数の安定化剤は入手可能であり、キサンタンガム、アカシア、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウム、カラゲーナン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、グアガム、トラガカント、ローカストビーン、バソリン、カラヤ、アラビアガム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、未精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマ、コロイド状セルロース、セルロース（微結晶化）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、ならびに他の天然の、または修飾した天然セルロース、ポリソルベート、カーボマー934P、珪酸アルミニウムマグネシウム、モノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、二酸化珪素、コロイド状二酸化珪素を含む。
ペルフルオロオクチルブロミド（PFOB）、ペルフルオロオクチルヨージド、ペルフルオロトリプロピルアミンおよびペルフルオロトリブチルアミンのような化合物も、安定化剤として脂質相中に使用できる。５個より多くの炭素原子を持つペルフルオロカーボンは、一般的に体温で液体であり、そしてそのようなペルフルオロカーボンも、安定化剤として高度に好ましい。適当なペルフルオロカーボンには、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロデカリンおよびペルフルオロドデカリンを含む。さらに過弗化脂質または部分弗化脂質は、安定化を補助するために使用することもできる。当業者には明白であるように、本発明に開示する脂質の広範な種々の過弗化および部分弗化類似体を使用することができる。炭化水素脂質に関して、それらの比較的疎水的な性質により、そのような過弗化または部分弗化脂質は、安定性という意味でも利点を提供することができる。過弗化または部分弗化脂質の例は、F6C11ホスファチジルコリン（PC）およびF8C5PCである。そのような類似体は、例えばSantaellaら、フェデレーションオブヨーロピアンバイオケミカルソサイエティー（Federation of European Biochemical Societies:FEBS）、第336巻、第３号、第418−484頁（1993）に記載されており、その開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。
ピーナッツ油、キャノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、トウモロコシ油、アーモンド油、綿実油、杏油、ゴマ油、大豆油、鉱物油、軽鉱物油、オレイン酸エチル、ミリスチルアルコール、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、オクチルドデカノール、プロピレングリコール、グリセロール、スクワレン、または消化できると通常知られている任意の他の油のような広範な生物適合性油も、安定化の補助を目的として使用できる。これらはレシチン、スフィンゴミエリン、コレステロール、硫酸コレステロールおよびトリグリセリドも含んでもよい。
また安定化は、本発明に従い安定化剤として役立ち得る広範な粘性モディファイヤー（すなわち、粘性改質剤）を添加することによっても行える。この種類の化合物には、限定するわけではないが：
１）炭水化物ならびにそのリン酸化およびスルホン化誘導体;2）400から8,000の間の分子量範囲を有するポリエーテル;3）ジ−およびトリヒドロキシアルカンおよび800から8,000の間の分子量範囲のそのポリマーを含む。リポソームも、限定するわけではないが、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレート、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−およびジ−グリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポリオキサマー、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシル35ヒマシ油、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシ20セトステアリルエーテル、ポリオキシ40ステアレート、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノ−ラウレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミンおよび乳化ワックス、Pluronic F61、Pluronic F64およびPluronic F68から成ることができる乳化剤および／または可溶化剤と組み合わせて使用することができる。
添加できる他の薬剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのようなポリアルコール、グルコース、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等のような強壮剤を含む。
所望により、抗菌剤および／または保存剤を組成物中に含むことができる。そのような薬剤は、安息香酸ナトリウム、すべての四級アンモニウム塩、アジ化ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ二亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、二亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄および有機水銀塩を含む。
所望により、浸透剤（osmolarity agent）を、浸透性を制御するために使用できる。適当な浸透圧的に活性な物質は、単糖類の糖、二糖類の糖、糖アルコール、アミノ酸および種々の合成化合物のような生理的に適合性のある化合物を含む。適当な単糖類の糖または糖アルコールは、例えばエリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、タロース、トレハロース、リブロース、フルクトース、ソルビトール、マンニトールおよびセドヘプツロースを含み、好適な単糖類はフルクトース、マンノート、キシロース、アラビノース、マンニトールおよびソルビトールである。適当な二糖類の糖は、例えばラクトース、シュクロース、マルトースおよびセルビオースを含む。適当なアミノ酸は、例えばグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。合成化合物は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリビニル−ピロリドンを含む。種々の他の適当な浸透圧的に活性な物質は、当業者に周知であり、そして本明細書に使用する浸透圧的に活性な薬剤の範囲内にあることを意図する。
上記のような種々のポリマーは、種々の異なる目的および使用のために加えてもよい。
当業者は、特定の最終的な使用に依存して必要に応じて、または所望により、広い範囲の添加剤量（上記の沈殿防止剤のような）を、本発明の水性懸濁液相中に使用できることを認識するだろう。そのような添加剤は、一般的に生成した造影剤組成物の0.01容量％から約95容量％の間で含んで成ることができるが、より高い、または低い量を使用してもよい。一般的な指導では、沈殿防止剤は典型的には少なくとも約0.5容量％、より好ましくは少なくとも約１容量％、より一層好ましくは少なくとも約10容量％の量で存在する。一般的に沈殿防止剤は典型的には約50容量％未満、より好ましくは約40容量％未満、より一層好ましくは約30容量％未満の量で存在する。例えば典型的な沈殿防止剤の量は、約20容量％である。また典型的には、一般的に好適な浸透性の範囲に達するために、約25g/リットル未満、より好ましくは約20g/リットル未満、より一層好ましくは約15g/リットル未満、そしてさらに一層好ましくは約10g/リットル未満の浸透圧的に活性な物質が使用され、そして浸透圧的に活性な物質を使用しない場合もある。浸透圧的に活性な物質の最も好適な範囲は、一般的に約0.002g/リットルから約10g/リットルの間である。これらの、および他の適当な添加物の範囲は、当業者がいったん本発明を入手すれば容易に明らかとなるだろう。
広範な種々の治療薬および／または診断薬も、水性懸濁液相に所望の治療薬または診断薬を単に加えることにより、包含することができる。適当な治療薬および診断薬は、ならびにそれらの適当な量は、当業者がいったん本開事項を身に付けたならば容易に明白となるだろう。これらの薬剤は脂質膜中または上に取り込まれるか、あるいは生成したリポソーム中にカプセル化されることができる。
MRI用に生成したガス−充填小胞の磁気効果をさらに向上させるために、常磁性または超常磁性造影増感剤のような、例えば１つ以上のMRI造影増感剤を加えてもよい。有用なMRI造影増感剤には、鉄（Fe3+）、銅（Cu+2）およびマンガン（Mn+2）のような遷移金属、およびガドリニウム（Gd+3）およびジスプロシウム（Dy+3）のようなランタニド系のような常磁性イオン、ニトロキシド、酸化鉄（Fe3O4）、亜硫酸鉄およびマンガン（Mn+2）置換ヒドロキシアパタイトのような常磁性粒子を含む。ならびに、クロミウム（Cr+3）、ニッケル（Ni+2）、コバルト（Co+2）およびユーロピウム（Eu+2）は、使用できる常磁性イオンの他の例である。ニトロキシドラジカルのような他の造影増感剤、または常磁性をもつ不対電子スピンを維持する他の原子を使用できる。理想的には、造影増感剤を水性懸濁液相に震盪する前に加え、そして震盪後にこの造影増感剤が生成したガス−充填小胞中または表面上に取り込まれるように設計するが、小胞調製後の添加も可能である。生成したガス−充填小胞は、大いに増強された緩和性を有し、磁気共鳴撮像に特に効果的な造影剤を提供できる。例として、マンガン（Mn+2）は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリンが水性脂質相中に使用されるときに、それ自体が脂質の頭基中に取りまれる。所望により金属は、例えばUngerらの米国特許第5,312,617号明細書（この開示内容は全部、引用により本明細書に編入する）に示されているように脂溶性化合物を使用してキレート化することができる。そのような脂溶性化合物は極めて有用であり、リポソーム膜中に容易に取り込まれるだろう。酸化鉄および他の粒子は、最適なリポソーム中または表面上への取り込みを達成するために、一般的に小さく、好ましくは約１μ未満、より好ましくは約200nm未満、そして最も好ましくは100nm未満であるべきである。取り込みを向上させるために、脂肪族または親油性化合物を用いて被覆した酸化鉄は、それ自体がバブル表面の脂質コーティング中へ包含される傾向があるので使用できる。
水性懸濁液相が、ゲル化を引き起こす材料（自然にゲルになるのではなく、脂質ポリマーおよび金属とのゲル化を引き起こすか、またはゲル化を強化する材料のような）を含むことができる、ということも本発明の範囲内である。多価金属カチオン、糖およびポリアルコールのようなゲル化剤を使用できる。ゲル化剤として有用な多価金属カチオンの例には、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄およびマグネシウムを含む。有用な糖は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、アロースおよびアルトロースのような単糖類、マルトース、シュクロース、セロビオースおよびラクトースのような二糖類、ならびに澱粉のような多糖を含む。好ましくは糖は単純な糖、すなわち単糖類または二糖類である。本発明に有用なポリアルコールゲル化剤は、例えばグリシドール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、ペンタエリトリトール、ガラシトールおよびポリビニルアルコールを含む。最も好ましくは、本発明に使用するゲル化剤は、シュクロースおよび／またはカルシウムである。本発明の種々の組成物中に使用できる特別なゲル化剤は、当業者ばいったん本開示から準備し始めれば容易に明らかになるだろう。
脂質の組み合わせ、例えばホスファチジン酸とカルシウムまたはマグネシウム塩およびアルギン酸、ヒアルロン酸またはカルボキシメチルセルロースのようなポリマーを、脂質を安定化するために使用できる。二価のカチオンは、脂質とポリマーとの間に金属ブリッジを形成し、脂質／ポリマー系内にガス−充填リポソームを安定化させる、と仮定される。同様に、キトサン（またはキチン−基本材料）、ポリリシン、ポリエチレンイミンおよびアルギン酸（またはその誘導体）またはヒアルロン酸の混合物を含む懸濁液を調製できる。
水性相中の異なる材料は、生成したガス−充填小胞のサイズの制御に重要であることが見いだされた。表２は、水性相および頭隙を窒素で満たした滅菌容器を、震盪することにより生成されたリポソームのサイズを表す。すべての場合で、リポソームのサイズは、パーティクルサイジングシステム（Particle Sizing System）モデル770ライトオブスキュレーション（light obscuration）整粒機（パーティクルサイジングシステムズ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）により測定した。データから明らかなように、水性相中の脂質の比率は、生成するガス−充填リポソームのサイズ分布に影響を及ぼす。特に、以下の表２は、平均リポソームサイズに対する脂質組成の効果を表している。
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表３は、定めた脂質組成混合物の濃度の、平均リポソームサイズへの依存性を示す。表３に示すように、脂質の総濃度の変動も、震盪後のリポソームサイズに影響を及ぼす点で重要である。これらの実験で、３つの異なる脂質の成分比率を一定に保ち、そして水相中の脂質濃度を0.5から5.0mg ml-1に変動させた。使用したガスは窒素であった。ペルフルオロブタンの頭隙を持つ超音波診断用に最適サイズの小胞は、水相中の脂質濃度が1.0mg ml-1の時に生成された。
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小胞のサイズは、安定化媒質（例えば脂質）の濃度にも依存する。例えば1.0mg ml-1の脂質濃度は、窒素を使用たときに、ペルフルオロブタンを含む5.0mg ml-1の脂質濃度とほぼ同じ直径のガス−充填リポソームを生成する。しかしより高濃度では、分布がより大きなガス−充填リポソームへとわずかにずれ得ることが分かった。この現象は、より高い脂質濃度でガス−充填リポソームの安定性が増大したことを反映しているようである。したがってより高濃度の脂質が、水性相中の安定化剤として作用することにより、あるいはより高濃度の脂質が、ガスの回りにより多くの薄膜を提供することのいずれかにより安定性に貢献し、リポソームをより安定化し、そしてこれによりより大きなリポソームの比率が持続できるようになると考えられる。
また他の変数を一緒に考慮するとき、ガス−充填小胞界面および水性環境での表面張力が、ガス−充填小胞の最終的なサイズのさらなる決定因子とも考えられる。
II.ガス相の組成
広範な種々のガスを、本発明のガス相に使用できる。好ましくは、ガスは実質的に水性懸濁液相中で不溶性である。実質的に不溶性とは、20℃および１気圧で、水中でのガスの溶解度をkgの水あたり約18mlのガス以下に維持することを意味する。それ自体では、実質的に不溶性のガスは窒素ガスの溶解度よりも低い溶解度を有する。好ましくは溶解度は、20℃および１気圧で、kgの水あたり約15mlのガス以下、より好ましくはkgの水あたり約10mlのガス以下である。１つの好ましい種類のガスでは、上記の温度および圧力で、溶解度はkgの水あたり約0.001から約18mlガスの間、またはkgの水あたり約0.01から約15mlガスの間、またはkgの水あたり約0.1から約10mlガスの間、またはkgの水あたり約１から約8mlガスの間、またはkgの水あたり約２から約6mlの間である。ペルフルオロカーボンガスおよび弗化ガス六弗化硫黄は、例えば20℃および１気圧で、kgの水あたり10ml未満のガスの溶解度であるので、好適である。本明細書で定義するような実質的に不溶性ではないガスは、可溶性ガスと呼ぶ。
他の適当な実施的に不溶性または可溶化のガスには、限定するわけではないがヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三弗化ホウ素、1,2−ブタジエン、1,3−ブタジエン、1,2,3−トリクロロブタジエン、２−フルオロ−1,3−ブタジエン、２−メチル−1,3−ブタジエン、ヘキサフルオロ−1,3−ブタジエン、ブタジイン、１−フルオロブタン、２−メチルブタン、デカフルオロブタン（ペルフルオロブタン）、デカフルオロイソブタン（ペルフルオロイソブタン）、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３−イン、硝酸ブチル、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−1,1,1,4,4,4−ヘキサフルオロブチン、３−メチル−１−ブチン、ペルフルオロ−２−ブチン、２−ブロモ−ブチルアルデヒド、カルボニルスルフィド、クロトノニトリル、シクロブタン、メチルシクロブタン、オクタフルオロシクロブタン（ペルフルオロシクロブタン）、ペルフルオロイソブタン、３−クロロシクロペンテン、シクロプロパン、1,2−ジメチルシクロプロパン、1,1−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリジン、1,1,1−トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス−（ジメチルホスフィン）アミン、2,3−ジメチル−２−ノルボルナン、ペルフルオロ−ジメチルアミン、ジメチルオキソニウムクロライド、1,3−ジオキソラン−２−オン、1,1,1,1,2−テトラフルオロエタン、1,1,1,−トリフルオロエタン、1,1,2,2−テトラフルオロエタン、1,1,2−トリクロロ−1,2,2−トリフルオロエタン、1,1−ジクロロエタン、1,1−ジクロロ−1,2,2,2−テトラフルオロエタン、1,2−ジフルオロエタン、１−クロロ−1,1,2,2,2−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−1,1−ジフルオロエタン、１−クロロ−1,1,2,2−テトラフルオロ−エタン、２−クロロ−1,1−ジフルオロエタン、、クロロエタン、クロロ−ペンタフルオロエタン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ニトロペンタフルオロエタン、ニトロソペンタフルオロ−エタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、エチルビニルエーテル、1,1−ジクロロエチレン、1,1−ジクロロ−1,2−ジフルオロエチレン、1,2−ジフルオロエチレン、メタン、メタン−スルホニル−クロライド−トリフルオロ、メタン−スルホニル−フルオリド−トリフルオロ、メタン−（ペンタフルオロチオ）トリフルオロ、メタン−ブロモ−ジフルオロ−ニトロソ、メタン−ブロモ−フルオロ、メタン−ブロモ−クロロ−フルオロ、メタン−ブロモ−トリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオロ−ニトロ、メタン−クロロ−ジニトロ、メタン−クロロ−フルオロ、メタン−クロロ−トリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオロ、メタン−ジブロモ−ジフルオロ、メタン−ジクロロ−ジフルオロ、メタン−ジクロロ−フルオロ、メタン−ジフルオロ、メタン−ジフルオロ−ヨード、メタン−ジシラノ、メタン−フルオロ、メタン−ヨードメタン−ヨード−トリフ��オロ、メタン−ニトロ−トリフルオロ、メタン−ニトロソ−トリフルオロ、メタン−テトラフルオロ、メタン−トリクロロ−フルオロ、メタン−トリフルオロ、メタンスルフェニルクロライド−トリロオロ、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチルラクテート、メチルニトリット、メチルスルフィド、メチルビニルエーテル、ネオペンタン、窒素（N2）、亜酸化窒素、1,2,3−ノナデカン−トリカルボン酸−２−ヒドロキシトリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、酸素（O2）、酸素17（17O2）、1,4−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ドデカフルオロペンタン（ペルフルオロペンタン）、テトラデカフルオロヘキサン（ペルフルオロヘキサン）、ペルフルオロイソペンタン、ペルフルオロネオペンタン、２−ペンタノン−４−アミノ−４−メチル、１−ペンテン、２−ペンテン｛シス｝、２−ペンテン｛トランス｝、１−ペンテン−３−ブロモ、１−ペンテン−ペルフルオロ、フタル酸−テトラクロロ、ピペリジン−2,3,6−トリメチル、プロパン、プロパン−1,1,1,2,2,3−ヘキサフルオロ、プロパン−1,2−エポキシ、プロパン−2,2ジフルオロ、プロパン−２−アミノ、プロパン−２−クロロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロソ、ペルフルオロプロパン、プロペン、プロピル−1,1,1,2,3,3−ヘキサフルオロ−2,3−ジクロロ、プロピレン−１−クロロ、プロピレン−クロロ−｛トランス｝、プロピレン−２−クロロ、プロピレン−３−フルオロ、プロピレン−ペルフルオロ、プロピン、プロピン−3,3,3−トリフルオロ、スチレン−３−フルオロ、サルファーヘキサフルオリド、サルファー（ジ）−デカフルオロ（S2F10）、トルエン−2,4−ジアミノ、トリフルオロアセトニトリル、トリフルオロメチルペルオキシド、トリフルオロメチルスルフィッド、六弗化タングステン、ビニルアセチレン、ビニルエーテル、ネオン、ヘリウム、クリプトン、キセノン（特にルビジウム強化過分極化キセノンガス）、二酸化炭素、ヘリウムおよび空気を含む。弗化ガス（これは、六弗化硫黄のような１つ以上のフッ素分子を含むガスである）、フルオロカーボンガス（これは弗化炭素またはガスである弗化ガスである）、およびペルフルオロカーボンガス（これは、ペルフルオロプロパンおよびペルフルオロブタンのような完全に弗化された弗化炭素ガスである）が好ましい。
ほとんどすべての任意のガスが、理論的には本発明のガス相に使用することができ、生成するコントラスト媒質に望ましい特性を至適化し、そして特定の診断的応用に適するように、特別なガスを選択することができる。
例えば特定のガスは他のガスよりも、震盪時にガス−充填リポソームをより安定にすることが分かり、そしてそのようなガスが好ましい。また特定のガスが、超音波またはMRIのような診断用撮影で、より良い画像を提供することが見いだされた。
ガス−充填小胞の安定性の増大例として、二酸化炭素＜酸素＜空気＜窒素＜ネオン＝ヘリウム＜ペルフルオロカーボンガスであることが分かった。このような、および他の理由から、弗化ガス、特にペルフルオロカーボンガスが好ましい。
場合によっては、可溶性ガスが本発明のガス相として十分に機能する場合もあるが、特に震盪でコントラスト剤を作成するときには、実質的に不溶性のガスはより高い可溶性のガスよりも大きな安定性をもたらす傾向がある。またそのような不溶性ガスを含むガス相は、本発明に従い震盪する前に、水性懸濁液相と実質的に離しておくことがより容易である。このように、これまでに定義したような実質的に不溶性のガスが好ましい。
超音波画像の晶質およびそのような画像の持続時間は、水性環境中でのガスの溶解度と相関する。ガスの溶解度が低下すると、一般的に超音波に対し、より良く解像された長期持続時間の画像が提供される。
さらに震盪により生成したガス−充填小胞のサイズは、水性環境中のガスの溶解度と相関し、一般的により大きな溶解度のガスは、より大きなガス−充填小胞を生じることが観察される。
小胞のサイズは、ガスと小胞の内壁との相互作用により影響され得るとも考えられる。特に、界面での相互作用は張力に影響し、その結果、内部ガスの外側への力が小胞の小胞内壁に影響すると考えられる。内部ガスにより発揮される力を低下させることにより、張力の低下でより小さな小胞になり、これは水性環境により小胞の外部に対して発揮される力により、ガス−充填小胞を縮ませる。
水性溶媒中のガスの溶解性は、Henryの法則が一般的に最高約１気圧まで、そしてわずかに溶解性のガスに応用できるので、この法則を使用することにより予想できる（Daniels、F.およびAlberty,R.A.,物理化学（Physical Chemistry、第３版、ウィリー  アンド  サンズ:Wiley ＆ Sons、ニューヨーク、1966）。例として、酸素は25℃で1kgの水あたり31.6mlの溶解度を有し、大気は25℃で1kgの水あたり21.36mlの溶解度を有し、窒素は25℃で約18.8ml kg-1の溶解度を維持している。一方、六弗化硫黄は25℃で約5.4ml kg-1の溶解度を有する。
まとめると、弗化ガス、フルオロカーボンガスおよびペルフルオロカーボンガスが、安定性、不溶性および生成した小胞サイズという理由から好適である。特に好適であるのは、弗化ガスの六弗化硫黄およびペルフルオロカーボンガス類のペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタンおよびペルフルオロペンタンであり、特にペルフルオロプロパンおよびペルフルオロブタンである。
５個未満の炭素原子を有するペルフルオロカーボンが、室温でガスであることは注目すべきである。例えば、ペルフルオロペンタンは、約27℃まで液体である。この温度より高いと、ペルフルオロペンタンは容器の頭隙を占有するだろう。しかしまたペルフルオロペンタンは、室温でも頭隙（これはバイアル中の脂質懸濁液相の上の空間）を満たすためにも使用できる。頭隙を満たすように計算された定めた値の液体ペルフルオロペンタンを選択し、そして液体を容器に低温（例えば−20℃）で加え、そして次に容器を吸引（効果的に頭隙の空気を除去すること）し、そして次に容器を密閉することにより、ペルフルオロペンタンは、１気圧でその沸点未満の温度で、液相から気相へと転移するだろう。このように室温では、ペルフルオロペンタンは頭隙の幾らか、またはすべてをガスで占有するだろう。当業者は、通例の“一般原則”の予測を使用して、液相から気相への相転移温度の低下を予測することができると認識するだろう。特に、圧力を半分減少させる毎に、沸点は約10℃減少する。あるいはBoyleの法則に基づく理想ガスの法則に基づく関係を使用することにより、圧力減少の関数として、温度減少を算出できる。頭隙をペルフルオロペンタンで満たすための別の方法は、最初に頭隙を吸引し、そして次に頭隙を27℃より高いペルフルオロペンタンガスで満たすことである。もちろん、この方法はペルフルオロペンタンのみに限定されわけではなく、すべてのペルフルオロカーボンガス、ならびに一般的にガスの沸点が知られているガスに適用できる。
所望により、２つ以上の異なるガスを一緒に頭隙を満たすために使用できる。ガスの混合物は、生成したガス−充填小胞の広範な種々の応用に多数の利点を有することができる（超音波撮像、MR撮像等のような応用）。少量の実質的に不溶性のガスを可溶性ガスと混合して、組み合わせにより予想されるよりも大きな安定性を提供できることが分かった。例えば、少量のペルフルオロカーボンガス（例えば、一般的に少なくとも約１モル％）を、空気、窒素、酸素、二酸化炭素または他のより可溶性ガスと混合できる）。震盪後に作成された生成したガス−充填小胞コントラスト剤は、空気、窒素、酸素、二酸化炭素または他のより可溶性ガス単独よりも、より安定であり得る。
さらにガスの混合物の使用は、ガス−充填小胞サイズの増大を補うために使用でき、そうしなければインビボで存在するのは、インビボに注射される純粋なペルフルオロカーボンガス含有小胞となるだろう。ペルフルオロカーボンガスの中には酸素のような他のガスを取り込む、または吸収できる傾向があるものがあることが見いだされた。したがって、もしペルフルオロカーボンガスを静脈に注射すれば、循環している血液中に溶解している酸素または他の可溶性ガスを取り込むことができる。次に生成した小胞はこの取り込みの結果、インビボで成長し得る。この現象の知識を用いて準備すると、ペルフルオロカーボンガスを、空気、窒素、酸素、二酸化炭素のような可溶性ガスと前混合し、これによりペルフルオロカーボンの取り込みまたは吸収性を飽和することができる。その結果、ガス−充填小胞が血流中で膨張する可能性を妨げるか、または排除さえするだろう。これはもし小胞が10μＭより大きなサイズに成長するならば、血流中に投与したときに危険な閉塞を起こす可能性があるという観点から、極めて重要である。頭隙をペルフルオロカーボンガスよりも可溶性のガスを用いてペルフルオロカーボンガスと一緒に充填することにより、ガス−充填小胞は、一般的にインビボ注射後にサイズの増加を受けることはない。したがって本発明の結果として、小胞膨張の結果としての閉塞は、そのような膨張が排除された、または十分に阻止された小胞を生成することにより克服できる。
このように本発明に従い、所望により実質的に不溶性ガスを可溶性ガスと混合して、高度に効率的かつ安定なガス−充填小胞を効率よく作成することができる。
ウィートンインダストリーズ（Wheaton Industries）（ミルビレ、ニュージャージー州）の2mlのバイアル（実際のサイズは3.7ml）中の8:1:1の重量比の生理食塩液：グリセロール：プロピレングリコール中の、脂質溶液の多数の試料（1mg/mL;82:10:8モル％比のDPPC:DPPA:DPPE−PEG−5000）を、４立法フィート容量を持つ改良型EdwardモデルSO4凍結乾燥機に置き、減圧に供した。全容量の60％を形成するバイアルの頭隙に、20％の空気を含む80％PFP、40％の空気を含む60％PFP、50％の空気を含む50％PFP、80％の空気を含む20％PFPまたは100％空気を封入した。種々の試料の頭隙中のガスの割合は、ヒューレットパッカード（Hewlett Packard）Chem（商標）ソフトウェアと連結した、ヒューレットパッカードガスクロマトグラフモデル1050Lのガスクロマトグラフィーにより確認した。検出のモードは、水素炎イオン化検出器であった。次に試料を、標準的なWig−Ｌ−Bug（商標）モデル3110Bを使用して3,300RPMで60秒間震盪し、そしてサイズおよび小胞計数を光学整粒により測定した。光学整粒器（Optical particle Sizer、パーティクルサイジングシステムズ:Particle Sizing Systems、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を使用して、ガス−充填小胞サイズおよび総計数を分析した。５マイクロリットルの試料容量を各分析に使用し、４つの試料を各測定に使用した。結果を表４上に表す。
表４に表すように、わずか20％のガスがPFP（実質的に不溶性のガス）であり、そして80％のガスが空気（可溶性ガスとの混合物）である時、空気単独（０％PFP）で使用した時よりも100倍多い小胞が生成した。さらに、空気を単独（０％PFP）で使用した時、小胞は大変安定性が低く、そして大きな画分は10ミクロンよりも大きかった。しかし80％空気を含む20％PFPの小胞は、20％空気を含む80％PFPの小胞ならびに他の中間PFP濃度の試料と丁度同じ程度に安定であり、そして80％空気を含む20％PFPは、20％空気を含む80％PFPほぼ同じくらい多くのガス−充填小胞を生成した。
0003645909.tif 000005
表４において、STDev＝標準偏差、およびCV＝変動係数。また表４において、Ｅ＋は特定の累乗の指数を表し、例えば5.45E＋05＝5.45×105。
まとめると、少量の比較的不溶性のガス（PEPのような）が小胞の安定化に必要であり、ガスのほとんどは可溶性ガスである。以下の式：
0003645909.tif 000006
により算出される２つ以上のガスの組み合わせの効果的な溶解度は、可溶性ガスの溶解度とはわずかに異なるだけであるが、少量の不溶性ガスを加えただけでも高いガス−充填小胞数およびガス−充填小胞の安定性が存在する。
いかなる操作理論とも関連付けられることを望まないが、実質的に不溶性のガスは、膜安定化効果に重要であると考えられる。実際、実質的に不溶性のガス（PFPのような）は、脂質膜に対してバリアとして作用し、膜の内面に層を効果的に形成する可能性があり、これは可溶性ガス（空気、窒素のような）が出て行くことを妨げると考えられる。これによりわずか少量の実質的に不溶性ガス（例えばペルフルオロカーボンまたは他の弗化ガス）、およびほとんどの小胞容量を構成するための空気または窒素のような、主により生物適合性（毒性の可能性が低い）ガスを使用することができるようになるので、この知見は驚くべきことであり、しかも有用である。
当業者は認識するように、任意の混合物中の実質的に不溶性ガスおよび可溶性ガスの量は、広い範囲で変動できる。しかし典型的には、ガスの総量の少なくとも約0.01％、より好ましくは少なくとも約0.1％、より一層好ましくは少なくとも約１％、そして最も好ましくは少なくとも約10％が実質的に不溶性ガスである。実質的に不溶性のガスの適当な範囲は、さらに使用される可溶性ガス、脂質の種類、特定の応用等のような様々な因子に依存して変動する。例示範囲は、約0.01％から約99％の間の実質的に不溶性ガス、好ましくは約１％から約95％の間、より好ましくは約10％から約90％の間、そして最も好ましくは約30％から約85％の間を含む。
診断用の磁気共鳴撮像（MRI）で使用するような診断用超音波撮像を超えた他の使用のために、例えば強力な常磁性酸素17ガス（17O2）、ネオン、キセノン、ヘリウム、アルゴン（特にルビジウム強化過分極化キセノンガス）、または酸素（この作用は弱いが、それでも常磁性である）のような常磁性ガスを、好ましくは頭隙を充填するために使用することができるが、他のガスも使用できる。最も好ましくは17O2ガス、ネオン、ルビジウム強化過分極化キセノンガスまたは酸素ガスが、例えばペルフルオロカーボンガスのような実質的に不溶性ガスと組み合わされる。常磁性ガスは当該技術分野では周知であり、そして適当な常磁性ガスは当業者に明らかである。MRIの応用に最も好適なガスは、単独で、または別のガスと組み合わせても、17O2である。
ガスの組み合わせを使用することにより、17O2または他の常磁性ガスは、最適なコントラストを提供し、そしてペルフルオロカーボンガスは震盪後に封入されたガス内の17O2ガスを安定化する。ペルフルオロカーボンガスを加えないと、静脈注射後に17O2のようなガスはその溶解度から脂質の囲いから拡散するので、一般的に効果が大変低い。さらに17O2ガスは、大変高価である。ペルフルオロカーボンガスと17O2ガスとを組み合わせることにより、生成物の効力が大いに増大し、そして経費がかかる17O2ガスのより効率的使用を通して経費が下がる。同様に、ネオンのような望ましい常磁性特性を有する他のガスも、ペルフルオロカーボンガスと混合することができる。
以下の表５では、広範な種々の異なるガスをMR撮像の応用に使用できることを明らかにしている。表５では、ガス−充填小胞中の異なるガスについて、R2（1/T2/mmol/L.sec-1）を示す。表５に示すように、異なるガス−充填小胞の緩和性に劇的な差異があり、R2緩和値が高いほどMR撮像剤として小胞がより効果的であることを示している。示したガスの中で、空気は最高のR2値を有する。空気中の酸素の常磁性効果により、空気が最高であると考えられる。しかし純粋な酸素は、幾分効果が低く、これは小胞を取り巻く水性環境中への酸素のより高い溶解性および酸素の平衡化によるものであろう。空気を用いると、窒素（空気は約80％の窒素である）は酸素が小胞内に安定化されることを助ける。窒素は空気よりも水溶性がはるかに低い。上記のように、PFPまたは他のペルフルオロカーボンガスを、より磁性的に活性なガス（空気、酸素、17O2またはルビジウム強化過分極化キセノンのような）と混合することができる。そのように混合すれば、安定で高度に磁性的に活性なガス−充填小胞を調製できる。
0003645909.tif 000007
容器の頭隙は、所望により大気圧、減圧または加圧でガスを充填することができる。
本発明の容器中で、ガス相は水性懸濁液相から実質的に離れている。実質的に離れているとは、約50％未満のガスが水性懸濁液相と震盪前に組み合わされることを意味する。好ましくは約40％未満、より好ましくは約30％未満、より一層好ましくは約20％未満、そして最も好ましくは約10％未満のガスが、水性懸濁液相と組み合わされる。このガス相は、およそ使用時まで実質的に水性懸濁液相から離れたままであり、その後、使用時に容器を震盪し、そしてガス相および水性懸濁液相が混合されて、ガス−充填小胞の水性懸濁液が形成される。この様式では、超音波または磁気共鳴撮像用の優れたコントラスト剤が生成される。さらに、このコントラスト剤は使用直前に調製されるので、使用期限の安定性に関する問題は最小である。
III.容器容量および頭隙
ガスの頭隙のサイズも、ガス−充填小胞のサイズに効果を及ぼすために使用できることが見いだされた。より大きな頭隙は、水相のサイズに対して比例してより多くのガスを含むので、大きな頭隙が小さいサイズの頭隙よりも、一般的に大きな小胞を作成するだろう。したがって、容器の総容量の割合として表される頭隙は、最大値を超えるべきではない。さらに小さすぎる頭隙は、流体が震盪中に移動して小胞を効果的に形成するための十分な空間を与えない。
例えば本発明では、表示サイズ2ml、直径×高さ＝15mm×32mmと言われている実際容量が3.7mlのバイアル（ウィートン300硼珪酸ガラス、ウィートンインダストリーズ、ミルビレ、ニュージャージー州）を使用した時、ガス−含有頭隙の容量は、バイアル総容量の好ましくは約10％から約60％の間であることが見いだされた。一般的にバイアル中のガス−含有頭隙は、バイアル総容量の約10％から約80％の間であるが、特別な状況および所望の応用に依存して、より多い、または少ないガスでもよい。より好ましくは、頭隙は総容量の約30％から約70％の間を含んで成る。一般的に最も好適なガス−含有頭隙の容量は、容器の総容量の約60％であることが分かった。
IV.震盪パラメーターの最適値
A.移動経路および震盪振幅の形
すでに検討したように、水性懸濁液およびガス相の組成に加えて、これらの相を含む容器を震盪する特別な様式も、小胞サイズの分布に影響を及ぼすだろう。最適な震盪条件は、４つのパラメーター（震盪中に容器が移動する経路の形、震盪運動の振幅、震盪回数および震盪時間）を参考にすることにより定めることができる。
震盪中に容器が移動する経路は、適切な大きさの小胞を形成するために特に重要であることが分かった。特に小さい小胞は、震盪が往復運動の状態で起こる時に最短時間で生成することが見いだされた。ボルテックス混合のような他の種類の震盪も、小さい小胞を生成できる。しかし往復震盪は、高濃度の小さい小胞を作成するために必要とする震盪時間を大きく減少させる。
本出願人は、震盪振幅が、特に震盪中に容器が移動する往復経路の長さＣが少なくとも0.3cmである時に、小さいサイズの小胞が比較的短時間、すなわち２分以下で得られることを見い出した。一般的に、より大きな震盪振幅で、小胞は小さくなる。しかし以下に検討するように、震盪回数も重要なパラメーターである。震盪機に付随する実際的な要件は典型的に、震盪振幅を特定の最大量を越えて増加させると、望ましくない程度にまで震盪回数を落としてしまうので、振幅は震盪回数が十分維持されることを確実とするために十分低く維持されるべきである。Wig−Ｌ−Bug（商標）モデル3110B震盪デバイスは、この最大振幅が約2.5cmである。
また本出願人は、図４に表すように、高い回数の震盪運動は往復運動が弓形の経路20に沿って起こることにより容易に達成されるので、この様式が好ましいことを見い出し、ここで震盪運動の振幅はＣで表されている。本発明の好適な態様では、弓形の経路20は、曲率半径Ｌにより定められ、これは長さＬの震盪機アームにより形成される。好ましくは震盪機アーム７は少なくとも6cmの長さＬを有し、そして少なくとも３゜の角度θを通って回転する。さらに以下で検討するように、本発明の好適な態様に従い、震盪機アームの回転角度θは、θに等しいオフセット角を持つベアリングを使用することにより達成される。さらに震盪機アームの長さＬは以下に記載するように、上に振盪機アーム７のベアリング50が取り付けられている偏心軸受筒40の中心線から、図３に示される容器９の中心線への距離として定められる。
より長い震盪機アームの長さＬおよびより大きな回転角度θを使用すると、震盪の振幅を増大させ、したがって小胞サイズは一般的に小さくなるだろう。しかし上記で検討したように、震盪機アーム長Ｌの最大値、および使用する回転角度θは、振盪の振幅Ｃが不十分な振盪回数を生じるほど大きくならないように、確実に制限すべきである。さらに機械的要件も、震盪機アーム７の回転角度のサイズを制限するだろう。Wig−Ｌ−Bug（商標）モデル3110Bに関しては、使用すべき最大の震盪機アーム長および回転角度は、それぞれ約15cmおよび約９゜である。
さらに震盪デバイスは、瞬時に、およそ垂直である第一方向の往復運動方向である、往復運動に重なることが好ましい。好ましくは第二方向の震盪の振幅C'は、第一方向Ｃの震盪振幅の少なくとも約10分の１である。説明の目的で、往復運動の第一方向が縦方向であり、そして往復運動の第二方向を横方向と呼ぶ。
最良には、縦方向および横方向の運動のタイミングは、２方向の運動の合計が数字の８のパターンで容器９に震盪を生じるように調整されている。
前述の記載に基づき、本発明の震盪デバイス１の震盪アーム７の末端に付いている時に、容器９により記載される好適な震盪経路20は、図４および５により表される。図５に示すように、本発明に従い震盪アーム７は、アームが前後方向に動く時に容器９の点が数字の８のパターン20のように移動するように、容器９に横方向の運動を伝える。数字の８の長さは、縦方向での振幅Ｃであり、および数字８の横幅は横方向での震盪の振幅C'である。図４に示すように側面から見た時、この経路は縦方向では弓形であり、そして特に震盪アーム７の長さＬに等しい曲率半径を有する弓形である。弓形の長さＣは、震盪アーム長Ｌにより作成されるものであり、縦平面中の震盪アームの回転により囲まれる角度θは、半径で表され、これはＣ＝Ｌθである。
好ましくは数字８のパターンは、角度φで交差するおよそ２つの直線部分21および２つのおよそ半円部分22から成る。さらに以下で検討するように、本発明の好適な態様では、数字８のパターンにより形成される角度φは、縦方向中の震盪アーム７の回転角度θにおよそ等しい。以下で検討するように、これは図９および10に示すように、震盪中に横平面で本質的に垂直方向の震盪アームを維持するように、バネ46から震盪アーム７に十分な力を適用することにより達成される。図12に示すように、もしバネの張力が震盪アーム７を横平面での角度ωを通って回転することができるように調整されれば、容器９が経験する数字８の震盪パターンの角度φはθよりも大きくなるだろう。
もしφがθに等しいならば、経路20を回る１回路中を移動する全距離Ｄは、２つの変数（震盪アームＬの長さ、および縦平面を移動する時の震盪アームにより描かれる角度θ）の関数となるだろう。この距離Ｄは式：
Ｄ＝2L［2sinθ/2＋II tan2θ/2）／（１＋tanθ/2）］
に近似する。
好ましくは長さＬは少なくとも6cmであり、そして角度θは少なくとも３゜であるので、距離Ｄは好ましくは少なくとも約0.6cmになるべきである。
さらにφ＝θならば、横方向の震盪振幅C'は縦方向の振幅Ｃおよび角度θの関数となり、そして式：
C'＝（2C tanθ/2）／（１＋tanθ/2）
に近似する。
好ましくは縦方向の震盪振幅Ｃは少なくとも約0.3cmであり、そして角度θは少なくとも約３゜であるので、横方向の振幅C'は好ましくは少なくとも約0.02cmになるべきである。
上記で検討したような震盪運動の振幅および形の最適値は、以下の章の小区分で検討する一連の試験に基づき到達した。
B.震盪回数および期間
震盪運動の形および振幅に加えて、震盪の回数も適切なサイズの小胞を形成するための重要なパラメーターである。震盪回数は、震盪アーム７が経験する１分あたりの回転（“RPM"）として定量され、そして震盪アームの回転数と定義され、したがってそれに付いている容器９は１分間に全震盪経路を移動する。すなわち本発明の好適な態様では、3600RPM回数での震盪は、容器９が１分間に3600回、すなわち１秒間に60回、数字８の経路20に沿って震盪運動することを意味する。
小胞は100RPMから10,000RPMの範囲の震盪回数を使用することにより作成できることが分かった。しかし比較的短時間内に、最適なサイズの小胞の生成を生じる最小の震盪回数があることが見いだされた。以下のＣ章で検討するように、この最小回数は、約2800RPMであることが判明した。一般的に震盪回数を増加させると小胞サイズが下がるが、震盪デバイスの限界により、典型的には得られる最大の回数を設定することになるだろう。Wig−Ｌ−Bug（商標）については、得られる最大の回数は約3300RPMである。
2800−3300RPMの範囲の回数で、最適な震盪時間は少なくとも約60秒である。しかし震盪の最適時間は回数と関連し、そして高い回数ではその時間を下げることができる。したがって例えば、4500RPMでは最適な震盪期間はわずか50秒である。
C.試験結果
震盪回数の最適値、ならびに震盪運動の形および振幅は、以下に記載する一連の試験を通して見いだした。
試験の第一群では、小胞サイズに及ぼす震盪回数の効果を決定するために行った。それぞれ82モル％:10モル％:8モル％のモル比のジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）（アバンチポーラーリピッズ:Avanti Polar Lipids、アラバスター、アラバマ州）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）（アバンチポーラーリピッズ、アラバスター、アラバマ州）、および分子量＝5000のポリンチレングリコールモノメチルエーテルに共有結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE PEG−5000）（アバンチポーラーリピッズ、アラバスター、アラバマ州）から成る1mgmL-1の脂質試料を、生理食塩水、グリセロール（スペクトラムケミカル社:Spectrum Chemical Co.、ガルデン、カリフォルニア州）、およびプロピレングリコール（スペクトラムケミカル社、ガルデナ、カリフォルニア州）（8:1:1、容量：容量：容量）から成る希釈物に加えた。試料を次に45℃に10分間加熱し、そして次に室温（25℃）に平衡化した。
次に試料を、図１に示す型の公称2.0mLの硼珪酸バイアル（VWRサイエンティフィック:VWR Scientific、ボストン、マサチューセッツ州）（実際容量3.7mL）に加えた。次にバイアルをブチルラバーストッパーで密閉し、そしてアルミニウムクリンプを用いてガスをキッチリと封じ込めた。バイアルの頭隙は、バイアルの全容量のおよそ60％であった。次に試料を、ペルフルオロプロパン（フルラ  コーポレーション:Flura Corporation、ナッシュビル、テネシー州）でパージし、そして図３に示す震盪デバイスに置き、これをさらに第Ｖ章で記載する。
容器は２分間、図４および５に表すように数字の８型の運動を使用して震盪させた。震盪アームの長さＬは、7.7cmであり、そしてベアリングのオフセット角θ、したがって縦平面の震盪アームの回転角度は６゜であった。上記の関係を使用して、縦および横方向の震盪振幅ＣおよびC'は、それぞれ約0.8cmおよび0.1cmであると決めた。コード−パルマー（Code−Palmer）モデル08210ピストルグリップタコメーター（コード−パルマー、ニーレ、イリノイ州）を介して測定した、震盪回数1500、2800および3300RPMを使用した。整粒は、パーティクルサイジングシステムのライトオブスキュレーション整粒器（サンタバーバラ、カリフォルニア州）で、小粒子の光学整粒により決定した。
表６はこれらの試験結果を表し、そして震盪回数が生成した平均小胞サイズに及ぼす効果を示している。
0003645909.tif 000008
見れば分かるように、2800RPMを越えた回数での震盪は、２分間の震盪後に得られる平均小胞サイズを大いに減少させる。
第２組の試験では、震盪アーム長Ｌの増加、したがって縦および横方向の振幅ＣおよびC'、ならびにサイクルＤあたりの震盪距離Ｄの増加が小胞サイズに及ぼす効果を定めるために行った。この試験は、容器を60秒間、6.7−14.8cmの範囲にわたる震盪アーム長Ｌを使用して震盪した点は除いて、上記に検討したものと同じく行った。
震盪アーム長の変動は、震盪回数2250−3260RPMにわたり震盪回数に変化をもたらし、震盪アーム長を増加させると震盪回数が減少した。震盪アーム長Ｌおよび震盪アーム回転角θを用いたこの震盪回数の変動は、図13に示されている。このように、例えば6.7cmの震盪アーム長Ｌおよび６゜の回転角θを使用した時、振盪回数は約3200RPMであり、一方、振盪アーム長を13.8cmに増加して、同じ回転角を維持すると、回数は約2700RPMに落ちた。
この一連の試験結果を、図14（ａ）−（ｃ）に表す。図14（ａ）に示すように、６゜の縦平面の回転角度θで、震盪アーム長Ｌが7.7cm以上の時はいつでも（これは縦方向の震盪の振幅Ｃが0.8cmよりも大きいことを意味している）、少なくとも98％の小胞が10ミクロン未満である。さらに10μｍ未満の小胞の割合は、9.8cm以上の震盪アーム長Ｌで、約99−99.5％のプラトーに到達し、これは縦方向の震盪振幅が1.0cm以上である時である。小胞の数重量平均サイズは、図14（ｂ）に示すように、これらの同じ条件で約２μｍのプラトーに達する。
震盪回数増大の一般的効果は、既に検討し、そして表６に示したように、他のすべての変数を一定に維持した時に小胞サイズを下げることであるが、これらのデータは、図13に示すように震盪アーム長を増加させることにより震盪振幅を増加させると、そのような増加と震盪回数の減少とが組み合わわさっても、小胞サイズを下げることを示している。
図14（ｃ）に示すように、mLあたり400×106個より多くの小胞はすべての震盪アーム長で得られ、そして事実、約10−12cmの範囲の震盪アーム長の使用で、mLあたり1000×106個より多くの小胞が生成した。しかし約12cmより長く震盪アーム長を増加させると、mLあたりの粒子は低下し始め、そして14.8cmでmLあたり800×106個の小胞に達した。図13には示していないが、14.8cmの震盪アーム長および６゜の震盪アームの回転角で、回数はわずか2550RPMと測定された。このように、14.8cmのアーム長を用いて生成された小胞濃度の低下は、すでに検討したように震盪振幅の増加に伴う震盪回数の低下によると考えられる。したがってこれらのデータは、Wig−Ｌ−Bug（商標）震盪デバイスを使用した時に、小胞濃度を最大にするためには震盪アーム長を好ましくは約15cm未満にすべきことを示している。第３の試験群は、ベアリングのオフセット角を除いて、上記と同じ材料および手順を使用して行い、したがって縦方向の震盪アームの回転角度θを６゜から９゜に増加し、そしてこれにより縦方向の振盪振幅を増加させた。さらに、11.8cmを越える震盪アーム長は使用しなかった。これらの試験結果は、比較のためにすでに説明した試験結果と一緒に、図15（ａ）−（ｃ）に示す。
図15（ａ）から分かるように、震盪アームθの回転角度を６゜から９゜に増加すると、例えば震盪回数の減少効果があるとしても、図13に示すように小胞サイズは減少する。このように、９゜の震盪アームの回転角度を用いると、たとえ震盪アーム長がわずか6.7cmでも、99.5％を越える小胞が10μｍ未満であり、しかも約２μｍの平均サイズとなる。さらに図15（ｃ）に示すように、すべての震盪アーム長で、mLあたり1000×106個より多くの小胞が得られた。
別の試験群は、ベアリングのオフセット角を除いて、上記と同じ材料および手順を使用して行い、したがって6.7から13.8cmの間の震盪アーム長Ｌ（約1cm間隔で増加する）と一緒に、縦方向の震盪アームの回転角度θは、３゜、5.2゜、６゜、7.8゜および９゜を使用した。振盪経路20の全長Ｄは、各点で予想した。全経路長の関数として回数を、図17に示す。結果は、全経路長Ｄの関数として図16（ａ）−（ｃ）に示す。見れば分かるように、試験したすべての条件下（すなわち、0.7cm以上の全経路長Ｄ）で、95％より多くの小胞が10μｍ未満であり、そして生成した小胞の濃度はmLあたり100×106より多かった。さらに、全経路長Ｄが2.19cm以上のすべての条件下で、98％より多くの小胞が10μｍ未満であった。
これは震盪運動の全経路が、少なくとも0.7cmであり、そしてより好ましくは少なくとも2.2cmであることを示唆している。
このように、前述の記載は、震盪回数が少なくとも2800RPMで行われるような往復震盪が行われる時に、小さいサイズの小胞をおよそ２分以内で得ることができることを示している。さらに震盪運動は、２つの実質的に垂直な方向で行われ、そしてより好ましくは数字の８のパターンで行われる。さらに、主要な方向での震盪振幅は、少なくとも0.3cm、そしてより好ましくは少なくとも.8cmであるか、または震盪経路の全長が少なくとも0.7cm、そしてより好ましくは少なくとも2.2cmであるべきである。
V.本発明の装置
A.好適な震盪デバイス
本発明の好適な震盪デバイス１を、図２および３に示す。この装置は、台２および蝶番式の安全カバー３から成る。開始−停止ボタン６および速度制御ダイアル５が、台２を含むハウジング４に取り付けられている。アーム７は、開口12を通って上方向にハウジング４の上部に突き出る。ダイアル５を時計回りに回すと、震盪速度が増す一方、ダイアルを反時計回りに回すと震盪速度が下がる。
本発明に従い、張り出し棚受け８を、さらに以下に検討する容器９をアームに固定するアーム７の遠位末端に取り付ける。張り出し棚受け８は、この場所に容器９を確実に保持するいくつかのバネクリップ11および12を備えている。あるいは親指締め型の張り出し棚受けも、容器９の固定をより一層確実にするために使用できる。図３に示すように、張り出し棚受けは水平に対して角度δの方向に向けることができ、これでデバイス１が設定された時に、容器９の軸も水平から角度δに位置する。好ましくは角度δは、−５゜から＋５゜の範囲であり、最も好ましくは約０゜である。使用では、容器９を張り出し棚受け８に固定し、そして震盪デバイス１は、図４および５に表す移動経路に沿って容器を激しく震盪するように操作する。
図６−12は、本発明の震盪デバイス１の主要な内部構成部品を表す。見ればわかるように、震盪アーム７は電気モーター44のシャフト42に回転できるように取り付けられている。図６および９で最もよく表されているように、円筒状のスリーブ41が震盪アーム７の近位末端に形成されている。スリーブ41は、円筒状の偏心軸受け筒40を支えるベアリング50を囲む。図11に最も良く表されている軸受け筒40は、シャフト42に固定されて付けられており（例えばシャフトにプレスされているか、または一体として形成されている）、そしてベアリング50内で回転する。
図11に示すように、軸受け筒40の１つの末端43は、シャフト42に関しては偏心であるが、軸受け筒のもう一方の末端45はシャフトと同心である。その結果、図７で最も良く表されているように、軸受け筒40の中心線は、シャフト42の中心線と鋭角θ/2を形成する。角度θは、ベアリングオフセット角と呼ばれる。これまでに述べたように、ベアリングオフセット角θは、好ましくは少なくとも約３゜である。図７および８に示すように、シャフト42および軸受け筒40が360゜回転すると、震盪アーム７はθに等しい角度で、縦平面中を前後に回転する（軸受け筒40が図８に示す方位である時、震盪アーム７の位置は図７の破線で示される）。このように図４に示すように、シャフト42の回転運動はスリーブ41を縦平面中で回転させ、そして弓形の経路に沿って容器９が固定されている震盪アーム７の遠位末端までの直進運動を伝える。
軸受け筒40の偏心性から、シャフト42の回転もまた図10に示すように、横方向にベアリングオフセット角θを通って、震盪アーム７のスリーブ41を回転させるように向く（軸受け筒が180゜で回転した時、震盪アームの位置は、図10の破線により表される）。このように、図７で左から右へ見たときに、もしシャフト42の回転が時計回りならば、偏心軸受け筒40が０゜である時には、震盪アーム７の方位は図７の実線により表され、軸受け筒が90゜である時には、この方位は図10の破線により表され、軸受け筒が180゜である時には、この方位は図８により表され、そして軸受け筒が270゜である時には、この方位は図10の実線により表される。このように、偏心軸受け筒40はベアリング50内で360゜回転し、震盪アーム７は縦および横方向の両方向の震盪運動を容器９に伝えて、すでに検討したような数字の８のパターンを達成する。
バネ46は図６に示すように、スリーブ41の底の不動中心（dead center）から震盪ハウジングの台板５へ伸びる。バネ46の張力は、軸受け筒40が回転する時に震盪アーム７が直立位置に保たれるように作用する。好ましくはバネ46は、図９（ａ）および（ｂ）に示すように、震盪アーム７が横面に本質的に垂直方位に維持されるように十分な張力を有するが、図７に示すように、縦面で垂直にθ/2まで離れる。図12に示すように、より低いバネ定数を有するバネ46を使用すると、震盪アーム７が横面で角度ωを通って回転できるようになるだろう。これは横方向に振幅C'の増大効果を有する。
好ましくは震盪デバイス１は、60534イリノイ州、リオン、ウエスト第47通り、7750のクレセントデンタルマニファクチュァリング社（Crescent Dental Manufacturing Inc.）から、Wig−Ｌ−Bug（商標）3110Bという名前で製造されている市販の震盪デバイスを改良することにより構成されている。そのようなWig−Ｌ−Bug（商標）デバイスは、数字の８の文型の震盪パターンを採用し、そして4cmの長さＬ、ベアリングオフセット角度および、したがって６゜の縦方向での震盪アームの回転角度θを持つ震盪アームを有して販売され、そして3200RPMの固定速度で作動する。さらにWig−Ｌ−Bugの震盪アームは、試料を保持する一対のスプーンが特徴である。
このように本発明の震盪装置は、Wig−Ｌ−Bug（商標）3110B震盪機を容器９を包含するように改良することにより作成でき、アーム７の遠位末端上のその容器中に、すでに述べたように水性懸濁液およびガス相が加えられた。好ましくはWig−Ｌ−Bug（商標）震盪機は、図３および６に示すように、震盪アーム７上に容器９を固定するための張り出し棚受け８を取り付けて包含するようにも改良される。さらに水性相およびガス相の組成、容器のサイズ等に依存して、最適な結果は、さらにWig−Ｌ−Bug（商標）震盪機が（ｉ）3200RPM以外の回数の震盪を提供するか、または震盪回数の範囲を越えて操作できる、（ii）4cm以外の震盪アーム長を使用する、あるいは（iii）オフセット軸受け筒40を改良することにより６゜以外のベアリングオフセット角θを使用するように、改良することにより得ることができる。
本発明の実施には、他の種類の往復震盪デバイスも使用でき、最も好ましくは、数字の８の震盪運動を伝えるデバイスである。Wig−Ｌ−Bug（商標）に加えて、そのようなデバイスには（ｉ）独国、フランクフルトのデカッサ社（Degussa AG）により販売されているMixomat、（ii）オベレイ独国、シーフェルドのエスペ  ファブリーク  ファルマツァイチッシャー  プラエパラーテ  有限責任会社（Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH ＆ Co）により販売されているCapmix、（iii）リヒテンシュタインのビバデント（Vivadent）により販売されているSilamat Plus、および（iv）英国、サセックスのクァイールデンタル（Quayle Dental）により販売されているVibrosを含む。
図18（ａ）−（ｃ）は、図13−17に示した試験結果に関してすでに検討した同じ材料および手順、ならびに60秒間の震盪時間を使用して、3200RPMの回数で操作したWig−Ｌ−Bug（商標）、4100RPMの回数で操作したMixomat、および4500の回数で操作したCapmixを用いて、Wig−Ｌ−Bug（商標）3110Bから得た試験結果と比較したMixomatおよびCapmixに関する試験結果を表す。見れば分かるように各々の場合で、98％より多くの小胞が10μｍ未満であり、そしてmLあたり800×106より多くの小胞が生成された。
B.好適な容器
本発明に従い、震盪デバイス１に固定される容器は、異なる種々の形態をとることができる。好適な容器９は図１に示され、そして本体30およびガスをきっちり閉めるフタ10を含んで成る。充填した時に、容器９は実質的に互いに離れているガスの頭隙32および水性懸濁液相34を形成する。あるいは、容器は前−充填したシリンジの形態をとってもよく、これは所望により１つ以上のフィルターを備えることができる。したがって、本明細書で使用する用語、容器はシリンジを含む。水相および前−選択したガスの頭隙で満たされたシリンジは、好ましくは震盪デバイス１上にシリンジの長軸を横方向に向けて取り付けられ、これは弓形の長さＣに対して垂直である。震盪後、ガス−充填小胞がシリンジ中で生成され、即使用できる状態である。使用する容器の種類にかかわらず、好ましくは内容物と一緒に滅菌されている。
一般的に本発明は、容器中に水相がすでに存在する滅菌容器を用いて実施されるが、選択された応用のために、安定化媒質を乾燥または凍結乾燥状態で、容器中に保存することができる。水溶液の場合では、例えば滅菌リン酸緩衝塩溶液を、震盪直前に滅菌容器に加える。そのように行うと、水相内で再水和した安定化媒質が、再び震盪中にガス頭隙と相互反応して、上記のようなガス−充填小胞を生成する。乾燥または凍結乾燥懸濁媒質の再水和は、さらに生成物を必ず複雑にし、そして一般的には望ましくないが、特別な調製物では生成物の使用期限をさらに延ばすために有用であり得る。例えば、シクロホスファミド、ペプチドおよび遺伝物質（DNAのような）のような特定の治療薬は、長期の水性保存で加水分解するかもしれない。事前に凍結乾燥した試料を再水和して、震盪前に水相および頭隙を形成すると、そうしなければ十分な使用期限を持たない化合物を含むガス−充填小胞の生成を現実的なものとすることができる。
容器を製造するためにはガラス、硼珪酸ガラス、珪酸ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリレート、ポリスチレンまたは他のプラスチックのような、異なる種々の材料を使用できる。好適な容器は、ガス非透過性またはガスを充填する前に外部ガス非透過性バリアーに覆われたいずれかの容器である。もちろんこれは、事前に選択されたガスの容器中の完全性を維持するために望ましい。ガスをきっちりとじ込める能力を有するシリンジ材料の例は、限定するわけではないが、シリカ−融合シリンジまたはルアーロック型シリンジ、およびテフロン−先端に付けた、またはテフロン被覆プランジャーを備えた珪酸ガラスまたは硼珪酸ガラスを含む。
容器のサイズは、最も特別にはその重量がガス−充填小胞のサイズに影響を及ぼすだろう。震盪デバイスは一般的に、容器の重量が特定のレベルを越えて増加すると、より遅く震盪し、例えばWig−Ｌ−Bug（商標）3110Bは2mlのバイアル（実際容量3.7ml）では10mlのバイアルより速く震盪する。したがって容器の容量は、使用する特定の震盪デバイスに応じて、特定量を越えるべきではない。
10mlの透明バイアル（ウィートンインダストリーズ、ミルビレ、ニュージャージー州）および2ml（実際容量3.7ml）の褐色バイアル（ウィートンインダストリーズ、ミルビレ、ニュージャージー州）の両方を使用して、Wig−Ｌ−Bugで試験を行った。ここでもコード−パルマーPistol Gripタコメーター（コード−パルマー、ニレ、イリノイ州）を使用して震盪の速度を測定した。表７は結果の一覧であり、これはバイアルの許容量が増大すると、震盪回数が下がることを示している。
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見れば分かるように、公称2mLではWig−Ｌ−Bugでの高震盪回数の使用が可能となる。図１に表す寸法に関して、公称2mL、実際容量3.7mLの容器９は、好ましくは約0.7インチの直径Ｄ、および約1.4インチの全高HO、および約１インチの本体の高さHBを有する。
VI.本発明に従い生成された小胞の応用
前記では、ガス−充填小胞のサイズの決定における種々のパラメーターを説明する。小胞サイズは、生成物の効力を最大とし、そして毒性を最小にするという意味で重要である。さらに小胞は、効力を最大とし、そして肺に閊えるような悪い組織相互作用を最小にする両方のために、できるかぎり柔軟であるべきてある。本発明は、大変薄く、扱い易い膜を持つ所望のサイズの小胞を作成する。小胞膜は大変薄く、しかも扱い易いので（例えばわずか1mgml-1の脂質が膜を安定化するために必要である）、より大きな直径のガス−充填小胞が肺高血圧症を生じることなく使用できることが見いだされた。例えばブタは、いかなる肺高血圧症をも現すことなく、診断的撮像用の投与に必要な投与量の５倍まで投与された。比較のために、より小さい直径のアルブミン被覆空気バブルをより低投与量でこれらの動物へ投与すると、重度の肺高血圧症を引き起こす。本発明の小胞は大変柔軟性があり、かつ変形できるので、これらは容易に肺の毛細管に入り込む。さらに、本脂質（例えばポリエチレングリコールを担持する脂質）を用いた被覆法は、肺との悪い相互作用を減らす一方、同時に生成物のインビトロおよびインビボ安定性および効力を増大させる。
汎用的な超音波コントラスト媒質として使用するためのガス−充填小胞のサイズは、ガス−充填小胞がレイリー散乱型となるような回数であるときは、後方散乱または超音波効果が６の累乗まで半径に比例するので、できる限り大きいべきである（閉塞効果を引き起こさずに）。MRIに関しても、本発明のより大きな小胞が好ましい。毒性の可能性が少ない、より大きな小胞を調製し、そして使用するための本発明の能力は、他の生成物と比べて本発明の小胞の効力を増大させる。
超音波コントラストに影響するさらなるパラメーターは、小胞膜の弾性である。弾性が大きいほど、コントラスト効果が大きい。本小胞は脂質の超−薄膜により被覆されているので、弾性は裸のガスとほぼ同様であり、そして反射およびコントラスト効果は最大である。
本発明の震盪手順で、滅菌容器内の水相およびガスの頭隙から容易に小胞が生成される。本発明は、超音波および磁気共撮像法の応用に高度に望ましい特性を持つ小胞を生成するために十分である。しかし選択した応用によっては、より一層均一なサイズ分布および望ましい直径を持つ小胞を作成するためにフィルターを使用できる。例えばガス−充填小胞の倍音現象を利用する超音波では、インビボ圧力を測定するために、狭いサイズ範囲内の大変厳しく定めた小胞直径を有することが有用となり得る。これは小胞（水相およびガスの頭隙を含む容器を震盪することにより作成される）を、定めたサイズのフィルターを通して注射することにより容易に成される。生成した小胞は、フィルター膜中のフィルター孔のサイズに大変近似した値よりも大きくはないだろう。上記のように、多くの超音波またはMRI応用のために、できる限り大きなガス−充填小胞を有することが望ましい。しかし特定の応用には、小さいガス−充填小胞が望ましいかもしれない。例えば腫瘍または他の疾患組織のターゲッティングには、ガス−充填小胞は脈管空間に残り、そして組織の隙間に入ることが必要かもしれない。さらに一層小さいガス−充填小胞が、これらの応用に有用である。これらの小さいガス−充填小胞は（例えば直径が１ミクロン未満と考えられる）、水相中の化合物（組成および濃度）、ならびに頭隙中の化合物（ガスの組成および頭隙容量）を変化させることにより、かなりの程度生成できるが、フィルターを通す注射によっても生成できる。実質的に均一サイズの大変小さいガス−充填小胞は、例えば0.22ミクロンフィルターを通して注射することにより生成できる。生成したナノメーターサイズのガス−充填小胞は、これでターゲッティングに望ましい特性を有することができる。
上記の脂質懸濁液の例は、懸濁液のサイズをそれほど変化させることなくオートクレーブを介して滅菌することもできる。コントラスト媒質の滅菌はオートクレーブにより、および／または震盪工程の前または後のいずれかに行われる滅菌濾過により、あるいは当業者に周知な他の手段により成されることができる。
水相および予め選択したガスの頭隙で容器を充填した後、密閉したビンを無期限で保存できる。粒子が沈殿し、ガス−充填小胞が破裂し、あるいはガス−充填小胞、粒子、コロイドまたは乳液との間の他の不都合な問題はない。水相およびガスの頭隙で満たされた容器の使用期限は、水相内の化合物の安定性に依存するだけである。長期の使用期限および滅菌可能性というこれらの特性は、本発明に従来技術に優る実質的利点を与える。超音波コントラスト媒質の分野に共通していた、粒子の凝集および沈殿というような安定性の問題が、本発明で取り組まれた。
本発明の多−相容器を震盪することにより生成されるガス−充填小胞は、超音波または磁気共鳴撮像法のような診断用撮像のための造影剤としてすぐれた利用性を持つことが判明した。この小胞は患者全体を撮影するために、および／または特に患者中の疾患組織の存在を診断するために有用である。画像化工程は、本発明のガス−充填小胞を患者に投与し、そして次に患者を超音波または磁気共鳴画像を使用してスキャンニングして患者内部領域の、および／または領域内の任意の疾患組織の可視画像を得ることにより行うことができる。患者の領域とは、患者の全身、または患者の特定の領域または部分を意味する。リポソームコントラスト剤は、脈管構造、心臓、肝臓および脾臓の画像を提供するために、ならびに胃腸管領域または他の体腔、あるいは組織特性、血液プール造影等の当業者に容易に明らかである他の様式での造影に使用できる。任意の種々の型の超音波または磁気共鳴造影デバイスを、本発明の実施に使用でき、特定の型またはモデルのデバイスが本発明の方法に決定的であるということはない。
本発明のガス−充填小胞は、当業者が認識するような種々の疾患、疾病および苦痛を処置するために、広範な種々の治療物質を患者に送達するために使用できる。
また磁性的に活性な小胞は、MRIにより圧力を予測するためにも使用できる。小胞はバルク感受性を増大させ、したがってT2緩和を増大させるが、T2★緩和についてはより一層増大させる。静電場勾配の効果は、主にスピンエコー実験で相補されるので（180゜のラジオ波正相化パルスにより）、小胞の効果は静電場効果が相補されない場所では、T2★強調パルス系列よりもT2では低く記録される。圧力を増大させると、小胞の損失または小胞破壊（より可溶性のガスについて）、ならびに小胞直径の減少をもたらす。したがって、圧力が上がると1/T2は下がる。圧力を解除すると、残る幾つかの小胞は再度膨張し、そして1/T2は再度わずかに増加する。約20％の空気を含む約80％PFPから成る小胞は、増強された安定性および圧力解除後にベースラインに戻る圧力での1/T2のわずかな低下を示す（すなわち、小胞は安定であるが、わずかな1/T2圧効果を表す）。グラジエントエコー画像が得られ、そして信号強度が測定された時、これらの効果はより一層注目される。圧力が上がると信号強度が上がる（圧力が上がると1/T2★は下がる）。この実験は比較的迅速に行われたので（グラジエントエコー画像を作成するための時間は、T2測定よりも10倍短い）。圧力に暴露する期間は、はるかに短く、そして窒素充填小胞は圧力解除後にほぼベースラインに戻る（すなわち、小胞の損失は大変少ない）。したがって、グラジエントエコーの信号強度は、大気圧に戻るとほぼベースラインに落ちる。MRIによる圧力測定のために、小胞は圧力増加でばらばらに壊れるか、あるいは圧力増加で安定であるが、小胞直径が下がる、いずれかに設計することができる。MRIでは、小胞半径が1/T2★に影響するので、この関係をMRIによる圧力を予測するために使用できる。
当業者は、ガス−充填小胞を患者に投与することは、例えば注射により静脈内または動脈内に、経口に、または直腸に種々の様式で行えると認識するだろう。投与される有用な投与量および特定の投与様式は、年齢、体重および特別な哺乳類、およびそれらの走査または処置される領域、ならびに使用する特定のコントラスト媒質または治療物質に依存して変動する。典型的には、投与量はより低いレベルから始めて、そして望ましいコントラスト増強または治療効果が達成されるまで増加させる。患者は任意の種類の哺乳動物でよいが、最も好ましくはヒトである。
本明細書中で引用または参照した各特許の開示および公報は、全部、引用により本明細書に編入する。
本明細書に示し、そして記載したような態様に加えて、本発明の種々の変更が当業者には前述の記載から明らかになるだろう。そのような変更も、添付の請求の範囲内にあることを意図する。
【図１】
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【図１１】
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【図２】
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【図９（ｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９（ａ）】
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【図８】
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【図１４（ａ）】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４（ｂ）】
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【図１４（ｃ）】
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【図１５（ａ）】
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【図１５（ｂ）】
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【図１５（ｃ）】
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【図１６（ａ）】
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【図１６（ｂ）】
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【図１６（ｃ）】
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【図１７】
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【図１８（ａ）】
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【図１８（ｂ）】
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【図１８（ｃ）】
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