(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラコッカス属またはスフィンゴバクテリウム属に属し、かつ、以下の特性を有するクレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にクレアチンアミジノハイドロラーゼを生成蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取することを特徴とするクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
１．つぎの反応を触媒する
クレアチン  ＋  Ｈ2Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
２．クレアチンに対するＫｍ値：約２２．８ｍＭ
３．至適ｐＨ：約８．０〜９．５
４．安定ｐＨ：ｐＨ約４〜１０
５．至適温度：約３５〜４０℃
６．熱安定性：約４０℃まで安定
７．分子量：約６８，０００（ゲル濾過法）、約５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
８．等電点：約４．１（等電点電気泳動）
【請求項２】
パラコッカス属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物が、パラコッカス・デナイトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）  またはパラコッカス・アルカロフィラス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）  であることを特徴とする請求項１記載のクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
【請求項３】
パラコッカス属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物が、パラコッカス・デナイトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）  ＩＦＯ１４９０７またはパラコッカス・アルカロフィラス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＪＣＭ７３６４であることを特徴とする請求項１記載のクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
【請求項４】
スフィンゴバクテリウム属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物が、スフィンンゴバクテリウム・マルチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）であることを特徴とする請求項１記載のクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
【請求項５】
スフィンゴバクテリウム属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物が、スフィンンゴバクテリウム・マルチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）ＴＥ３５８０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２０９）であることを特徴とする請求項１記載のクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法に関する。
【０００２】
クレアチニンおよびクレアチンは血液または尿中に見いだされ、その量を迅速かつ正確に検出測定することは疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養症等を診断するのに非常に重要である。このような診断を行うために、血液または尿中のクレアチニンおよびクレアチンを定量することが一般的に行われている。
【０００３】
【従来の技術】
従来からクレアチンの定量法としては、試料中のクレアチンにクレアチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素検出手段により測定して、試料中のクレアチンを定量する方法があり、またクレアチニンの定量法としては、試料中のクレアチニンにクレアチニンアミドハイドロラーゼを作用させ、生成するクレアチンにクレアチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼを作用させて、試料中のクレアチニンを定量する方法がある。
【０００４】
一方、これらの定量法に使用するクレアチニンアミドハイドロラーゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼは微生物界に広く見いだされており、特にクレアチンアミジノハイドロラーゼは、シュードモナス属、アースロバクター属、フラボバクテリウム属、マイクロコッカス属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、アクチノバチルス属、バチルス属細菌から得られることが報告されており、その中の幾つかは既に工業的に製造され、臨床検査薬として使用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは上記細菌の他の菌株から、新しくクレアチンアミジノハイドロラーゼを製造することを試みた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは種々検討した結果、新たにパラコッカス属またはスフィンゴバクテリウム属に属する菌株がクレアチンアミジノハイドロラーゼを生産することを見い出し本発明に到達した。
【０００７】
すなわち本発明はパラコッカス属またはスフィンゴバクテリウム属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にクレアチンアミジノハイドロラーゼを生成蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取することを特徴とするクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法である。
【０００８】
本発明に使用する微生物としては、パラコッカス属またはスフィンゴバクテリウム属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼを産生する能力を有するものであれば、いずれの菌株を用いても良い。パラコッカス属に属する菌株としては、好ましくはパラコッカス・デナイトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）、パラコッカス・アルカロフィラス（Paracoccus alkalophilus)などが挙げられる。スフィンゴバクテリウム属に属する菌株としては、スフィンンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum)などが挙げられる。
【０００９】
更により好ましくはパラコッカス・デナイトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ＩＦＯ１４９０７、パラコッカス・アルカロフィラス（Paracoccus alkalophilus)ＪＣＭ７３６４、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum)ＴＥ３５８０などが挙げられる。なお、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivoraum）ＴＥ３５８０は、京都市左京区深泥池の土壌から分離した菌株であり、その菌学的性質は以下の通りである。
【００１０】
（ａ）形態
（１）菌形：かん菌
（２）細胞の大きさ：０．５×１．５〜２．５μｍ
（３）細胞の多形性：無し
（４）運動性：無し
（５）胞子の有無：無し
（ｂ）各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培地：３０℃、４８時間培養でロウ色のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁（Entire）であり、クッション状（Pulvinat        e）である。表面は円滑（smooth）で光沢を有し、不透明である。
（２）肉汁液体培養：生育は普通で一様に混濁する。
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育する。ゼラチンは液化しない。
（４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化しない。
（５）マッコンキー寒天培地：生育しない。
（６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育しない。
【００１１】
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【００１２】
上記菌学的性質同定のための実験法は、主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学会出版センター（１９８５年）によって行った。また分類同定の基準として、「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー」（１９８４）およびインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテリオロジーＶｏｌ．３３，５８０（１９８３）を参考にした。
以上の文献および菌学的性質を参考にするとグルコース非発酵性グラム陰性かん菌で黄土色の色素を生成すること、オキシダーゼ、カタラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼが陽性、各種糖類より酸を生成することより、本菌はスフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属するとみなされる。またスフィンゴバクテリウム中ではデンプンを分解しないこと、マンニトールより酸を生成しないことを考えるとスフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum)に属すると考えられ、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum)ＴＥ３５８０と命名した。本菌は受託番号、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２０９として寄託されている。
【００１３】
本発明の酵素を製造するにあたっては、上記クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取することにより製造できる。クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。またクレアチンアミジノハイドロラーゼの生産誘導物質として、クレアチンを培地に添加しておくことが望ましい。
【００１４】
本発明では通常、振盪培養あるいは通気撹拌培養を行う。培養温度は約２０〜４５℃、好ましくは約２５〜３７℃、培養ｐＨは約５〜９の範囲で、好ましくは約６〜８に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常、約１〜７日で生育し、菌体内にクレアチンアミジノハイドロラーゼが生産蓄積される。
【００１５】
本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いれば良い。例えば抽出法としては超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化剤などいずれを用いても良い。さらに抽出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１６】
本発明の製造法により得られたクレアチンアミジノハイドロラーゼは、クレアチンに作用して、ザルコシンおよび尿素を生産する。このクレアチンアミジノハイドロラーゼは、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出組成物と組み合わせてクレアチンの測定に使用することができる。またクレアチニアミドハイドロラーゼを共存させて、クレアチニンを定量することができる。
【００１７】
次に本発明のクレアチンアミジノハイドロラーゼの活性測定法を示す。
まず試験管に基質溶液（クレアチンを０．１Ｍとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したもの）０．９ｍｌをとり、３７℃で約５分予備加温する。次に酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始し、３７℃で正確に１０分間反応させた後、ＤＡＢ溶液（２．０ｇのジメチルアミノベンズアルデヒドを１００ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解させた後、濃塩酸１５ｍｌを加える。）２．０ｍｌを加えて反応を停止させる。２５℃で２０分間放置後、生成した尿素がジメチルアミノベンズアルデヒドと縮合して生成した黄色色素（Ehrich反応生成物）を４２５ｎｍにおける吸光度で測定する。盲検は基質溶液０．９ｍｌを３７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液２．０ｍｌを加えて混和し、ついで酵素溶液０．１ｍｌを加えて調製し、以下同様に２５℃で２０分間放置後、吸光度を測定する。上記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例１
クレアチン１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、パラコッカス・デナイトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ＩＦＯ１４９０７を一白金耳植菌し、３０℃で時間培養し、種培養液とした。次に同培地６リットルを１０リットル容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【００１９】
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比活性、約１８Ｕ／ｍｇにまで精製した。
得られたクレアチンアミジノハイドロラーゼは下記特性を有していた。
１．下記の反応を触媒した。
【００２０】
【化１】
0003642344.tif 000005
【００２１】
２．Ｋｍ値：クレアチンに対するＫｍ値は約２２．８ｍＭであった。
３．至適ｐＨ：５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に示す通りであって、至適ｐＨは約８．０〜９．５であった。
４．安定ｐＨ：グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で２５℃、約１８時間保存してその残存活性を測定した。その結果は図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ約４〜１０であった。
５．至適温度：各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に示す通りであって、至適温度は約３５〜４０℃であった。
６．熱安定性：本発明の酵素を５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は図４に示す通りであって、約４０℃まで安定であった。
７．分子量：約６８，０００（ゲル濾過法）
約５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
８．等電点：約４．１（等電点電気泳動）
【００２２】
実施例２
クレアチン１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、パラコッカス・アルカロフィラス（Paracoccus alkalophilus)ＪＣＭ７３６４を一白金耳植菌し、３０℃で時間培養し、種培養液とした。次に同培地６リットルを１０リットル容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液は約０．３Ｕ／ｍｌのクレアチンアミジノハイドロラーゼを含有していた。
【００２３】
実施例３
クレアチン１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、スフィンゴモナス・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum)ＴＥ３５８０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２０９）を一白金耳植菌し、３０℃で時間培養し、種培養液とした。次に同培地６リットルを１０リットル容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【００２４】
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比活性約２１Ｕ／ｍｇにまで精製した。
得られたクレアチンアミジノハイドロラーゼは下記特性を有していた。
１．下記の反応を触媒した。
【００２５】
【化２】
0003642344.tif 000006
２．Ｋｍ値：クレアチンに対するＫｍ値は約１８．５ｍＭであった。
３．至適ｐＨ：５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）中での酵素活性を測定した。その結果は第５図に示す通りであって、至適ｐＨは約７．５〜９．０であった。
４．安定ｐＨ：グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で、２５℃、１８時間保存してその残存活性を測定した。その結果、安定ｐＨは約４〜１０であった（図６）。５．至適温度：各温度における酵素活性を測定した。その結果は図７に示す通りであって、至適温度は約４０℃であった。
６．熱安定性：本発明の酵素を５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は図８に示す通りであって、４５℃まで安定であった。
７．分子量：約７３，０００（ゲル濾過法）
約４４，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２６】
【発明の効果】
本発明の製造法により、今まで未報告の菌株であるパラコッカス属またはスフィンゴバクテリウム属に属する菌株からクレアチンアミジノハイドロラーゼを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】パラコッカス属の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
【図２】パラコッカス属の酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図３】パラコッカス属の酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図４】パラコッカス属の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図５】スフィンゴバクテリウム属の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
【図６】スフィンゴバクテリウム属の酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図７】スフィンゴバクテリウム属の酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図８】スフィンゴバクテリウム属の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図１】
0003642344.tif 000007
【図２】
0003642344.tif 000008
【図３】
0003642344.tif 000009
【図４】
0003642344.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
0003642344.tif 000013
【図８】
0003642344.tif 000014