(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の膵細胞の分化状態をin vitroで試験する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｃ）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物の膵細胞の分化状態をin vivoで試験する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｃ）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３】
（ｄ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｅ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｆ）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物が、
（ｉ）胚体期、
（ii）新生児期、または
（iii）成体期、
にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１、３または４に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）と場合によりステップ（ｄ）での前記確認を、
（ｉ）Pax6遺伝子の少なくとも一部に一致する核酸配列、および場合によりPax4遺伝子の少なくとも一部に一致する第２核酸配列、
（ii）（ｉ）の核酸配列に相補的な核酸配列、または
（iii）（ｉ）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーまたはプライマー対、
を用いて行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）と場合によりステップ（ｅ）での前記確認を、Pax6タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用し、場合により、Pax4タンパク質と特異的に結合する第２の抗体またはそのフラグメントを使用して行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記膵細胞がα細胞またはβ細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化状態が膵細胞の悪性腫瘍の指標となる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（a'）前記試験に先立って、ヒトを除く前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること、および
（b'）前記試験後、Pax6遺伝子および場合によりPax4遺伝子が過剰発現している場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除すること、またはPax6遺伝子および場合によりPax4遺伝子が過少発現しているか発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしくは発現可能な機能性Pax6遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を前記細胞に導入すること、および
（b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を、前記ヒトを除く哺乳動物に再導入すること、
をさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
α細胞またはβ細胞における前記分化状態が低血糖症の指標となる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
α細胞またはβ細胞における前記分化状態を胚体または新生児の状態で試験する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトを除く前記新生児を、低血糖症を好転または軽減する薬剤で治療することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化状態が薬剤の活性の結果である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤がmRNAまたはタンパク質のレベルでPax6遺伝子の発現レベルと場合によりPax4遺伝子の発現レベルに影響を与える、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
同時にPax4ノックアウトマウスであり得るPax6ノックアウトマウスで前記分化状態を試験する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
in vitroで膵管上皮細胞に発現可能な機能性Pax6遺伝子を導入し、場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの不活性化Pax6対立遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子をさらに含む、請求項19に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
マウスまたはラットである、請求項19または20に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
発明の利用分野
本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この方法は、例えば膵細胞（または前膵細胞）におけるPax6 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルもしくは状態を確かめて、そのレベルもしくは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対応するレベルもしくは状態と比較することによる。この方法はある種の膵細胞もしくは脳細胞に起因する疾病の診断または検出手段を提供し、特に例えば低血糖症または精神疾患の診断または検出手段を提供する。前記方法は、膵細胞（または前膵細胞）におけるPax4 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルもしくは状態を確かめて、そのレベルもしくは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対応するレベルもしくは状態と比較することと組み合わせて行うことができる。
以下に提示したデータは、Pax6発現の不足がα細胞発生の欠損または不全、それ故にグルカゴン産生の欠乏または低下（故に、低血糖症および精神疾患）の指標となることを示す。したがって、本発明は、グルカゴン遺伝子の不適切な発現から生じる低血糖症や精神疾患などの膵臓または脳の疾患を治療し、予防しまたは遅延させるためにPax6発現を回復させることに関し、それ故に発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする配列を有する第１の核酸分子少なくとも１つ、および場合により発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする第２の核酸配列、を含むように改変することでPax6発現を回復させたトランスジェニック哺乳動物に関する。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、グルカゴン遺伝子の不適切な発現から生じる低血糖症や精神疾患などの膵臓または脳の疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax6を単独でまたはPax4と一緒に、および／またはPax6の発現またはPax4とPax6の両発現を刺激する物質を投与することに関する。
以下に提示したデータは、Pax6発現の不足がα細胞発生の欠損または不全、それ故にグルカゴン産生の欠乏または低下（故に、低血糖症）の指標となることを示すから、本発明はまた、少なくとも１つの不活性化されたPax6対立遺伝子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物に関する。この哺乳動物には低血糖症および／または精神疾患のような膵臓および／または脳の疾患の研究用モデル動物をはじめとして多くの有用性があり、それ故、膵細胞の欠損または不全に起因する疾患の治療法などを開発するうえで有用な新規動物を提供する。したがって、この場合の哺乳動物はヒト以外の動物、例えばマウスやラットといった実験動物であることが好ましい。
さらに、Pax6の不適切な発現は腫瘍などの疾病を引き起こすこともあるので、本発明はまた、腫瘍などのPax6の不適切な発現に起因する膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、少なくとも１つの不活性化されたPax6対立遺伝子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物に関する。この場合の哺乳動物はヒトであってもよい。というのは、少なくとも１つの不活性化されたPax6対立遺伝子の哺乳動物への導入が治療のためだからである。この治療は（少なくとも１つの不活性化されたPax6対立遺伝子の導入に加えて）少なくとも１つの不活性化されたPax4対立遺伝子の哺乳動物への導入を含んでいてもよい。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、腫瘍などのPax6の不適切な発現に起因する膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax6を阻害する物質またはPax4とPax6を阻害する物質を投与することに関する。
さらに、本明細書中に示したデータからは、Pax4とPax6は発生中の内分泌前駆細胞の細胞運命を決定する。詳細には、第１段階で、Pdx1遺伝子が膵臓の外分泌および内分泌の前駆細胞のもととなる内胚葉の領域を規定する。その理由は、Pdx1遺伝子の発現がPax遺伝子の発現前に起こり、また、Pdx1を欠失しているマウスが膵臓を形成しないからである。膵臓でのPax発現の開始により内分泌前駆細胞は２つの集団に分割される。すなわち、Pax4とPax6の両方を発現する細胞は成熟β細胞へと分化し、一方Pax6のみを発現する細胞はα細胞へと分化する。Pax4が存在しないと、Pax6がこれらの前駆細胞に依然存在するので全部の前駆細胞がα細胞系統へと向かう。Pax6を欠失させると、α細胞系統が完全に無くなるか、または前駆細胞がβ細胞系統へと向かう。Pax4とPax6の両方が存在しないと、前駆細胞は成熟した内分泌細胞へと発生することができない。かくして、膵臓発生中の内分泌細胞の分化には両方のPax遺伝子が必要となる。
したがって、本発明はさらに、膵細胞（または前膵細胞）におけるPax4およびPax6 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルもしくは状態を確かめて、そのレベルもしくは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対応するレベルもしくは状態と比較することによる、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関する。この方法は、ある種の膵細胞に起因する疾患を診断または検出する手段、特に、例えば若年型糖尿病などの糖尿病および／または低血糖症を診断または検出する手段を提供する。
さらに、本発明は、若年型糖尿病などの糖尿病および／または低血糖症のような膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるためにPax4およびPax6発現を回復させることに関し、それゆえ、発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする配列を有する少なくとも１つの第１核酸分子および発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする第２核酸配列を含むように修飾することで、Pax4およびPax6発現を回復させたトランスジェニック哺乳動物に関する。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、若年型糖尿病などの糖尿病および／または低血糖症のような膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるためにPax4をPax6と共に投与し、かつ／またはPax4とPax6の発現を促進させる薬剤を投与することに関する。
いくつかの文献が本明細書全体にわたって引用されている。ここに引用された文献（製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、それぞれを参照することにより本明細書中に含めるものとする。
発明の背景
膵臓は、消化管への酵素の供給に係わる外分泌機能と、各種ホルモンを血流中に分泌する内分泌機能の両方を併せもつ重要な臓器である。外分泌機能は、種々の消化酵素（アミラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼなど）を産生する腺房細胞および房心細胞と、アルカリ性溶液中のこれら酵素を十二指腸に輸送する介在導管細胞が担当している。
内分泌膵臓の機能性単位は、膵臓の外分泌部全体に分散していて、４種類の細胞型（すなわち、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞）から構成されるランゲルハンス島であり、これについてはSlack,Development 121（1995）,1569−1580に概説されている。β細胞はインスリンを産生するもので、内分泌細胞の大部分に該当し、ランゲルハンス島のコアを形成している。一方、α細胞はグルカゴンを分泌し、周辺に局在している。δ細胞とPP細胞はあまり多くはないが、それぞれソマトスタチンおよび膵性ポリペプチドを分泌する。インスリンとグルカゴンは血中グルコース濃度を調節するための重要な物質である。インスリンは細胞によるグルコースの取込みおよびグルコースのグリコーゲンへの変換を高めることで血中グルコース濃度を低下させる。グルカゴンは肝臓グリコーゲンの分解により介在して血中グルコース濃度を上昇させる。内分泌機能が損なわれる通常の膵臓疾患としては真性糖尿病、ホルモン分泌性腫瘍などがある。
４種類全ての内分泌細胞は内胚葉由来の共通の多能性前駆細胞から生ずると考えられる。膵臓発生の初期に、これらの前駆細胞はインスリンやグルカゴンなどの数種のホルモンを同時発現する。マウスでは、α細胞が受胎後（p.c.）9.5日目に分化する最初の内分泌細胞であり、続いて受胎後14.5日目にβ細胞とδ細胞への分化、そして生後１日目にPP細胞への分化が起こる。異なる内分泌細胞の系列を規定することに係わっている分子および遺伝子要素については殆ど知られていない。これまでに記載された数個の遺伝子の一つはホメオボックス遺伝子Pdx1であり、この遺伝子は膵臓発生の初期段階で発現されて、成体ランゲルハンス島のβ細胞に制限されるようになる（Guzら,Development 121（1995）,11−18）。ホモ接合性マウスPdx1の突然変異体は膵臓を発生させることができず、生後数日で死亡する（Jonssonら,Nature 371（1994）,606−609）。Pax遺伝子ファミリーの２つのメンバーであるPax6およびPax4もまた膵臓の発生中に内分泌細胞において発現される。しかし、特にPax6およびPax4遺伝子が膵臓の発生にどのような影響を及ぼすのか、今日まで知られていなかった。
膵臓における種々の分化パラメーターを試験する方法は、これまで利用できなかったとは言え、非常に望ましいものである。かかる方法により得られる結果は、例えば膵臓関連疾患の診断および治療に、大きな影響を及ぼすことが期待されよう。
発明の概要
本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法に関する。本発明ははさらに、本発明の方法から直接もたらされる医療分野での応用（用途）に関する。加えて、本発明は、少なくとも１つの不活性化Pax6遺伝子を含み、場合により少なくとも１つの不活性化Pax4遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。
発明の詳細な説明
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、膵細胞の分化状態をモニターする方法を提供することである。この技術的課題の解決は請求の範囲において特徴づけられた実施形態により達成される。
かくして、本発明は哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この方法は、
（ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｃ）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる。
本発明に関連して、「レベル」とは産生されたmRNAまたはタンパク質の量のことである。「状態」という用語には、この遺伝子、mRNA、タンパク質または転写制御エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）が、野生型の正常遺伝子産物と比較したとき、この遺伝子の全体的な活性に影響を与えるような突然変異、欠失または他の改変をもつ可能性があるという選択肢が含まれる。この用語にはタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。
本発明によれば、驚いたことにPax6が膵臓で発現されることが見出された。
本発明の方法により、膵臓組織における異なる細胞型（すなわち、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞）の発生についての詳細な研究が初めて可能となる。以後の実施例に示したように、Pax6遺伝子は、場合によりPax4遺伝子と共同して、膵臓の発生の初期段階に係わっている。この驚くべき結果により、細胞の運命を追跡することが可能となり、また膵臓に含まれる特定の細胞型に起因する疾患の発症についての研究が可能となる。さらに、本発明が提示した結果により、Pax6および／またはPax4は特定の膵細胞のマスター調節剤であると結論づけることができる。こうして、Pax6はα細胞のマスター調節剤であるようだ。Pax6は非膵細胞においても発現される。Pax6の発現は発生中の脊髄に存在する細胞のサブセットにおいて検出される。特に、Pax6遺伝子の発現は予定された前脳および後脳に観察され、発生の間中、脳、眼および神経管において維持される（Grindleyら,Development 121（1995）,1433−1442;Stoykovaら,Development 122（1996）、3453−3465）。それゆえ、Pax6は同様にこうした細胞の分化状態においても、ある役割を担っている可能性がある。Pax6遺伝子発現の欠乏はマーカー「スモール・アイ」（Small eye）を用いてモニターすることができる。
したがって、本発明の方法は、膵細胞、脳細胞などの特定の細胞に起因する疾患の診断または検出手段を提供し、特に、例えば低血糖症や精神疾患を診断または検出するための、早期診断または検出手段を提供する。
好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、
（ｄ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｅ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｆ）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる。
本発明のこの実施形態により、Pax6およびPax4遺伝子産物の相乗作用の研究が可能となる。この相乗作用の分析は膵臓における細胞特異的発生の調節に対するより深い洞察を提供すると期待される。膵臓特異的疾患に関係した診断用または医薬用組成物の開発は、こうした深い洞察から大いに恩恵を受けるだろう。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態では、前記哺乳動物は、
（ｉ）胚体期、
（ii）新生児期、または
（iii）成体期、
にあるものである。
本発明により示されたように、Pax6遺伝子は、好ましくはPax4遺伝子と共に、異なるレベルで、かつ哺乳動物の膵臓および脳の異なる発生段階において発現される。胚体期、新生児期または成体期の膵細胞の発生段階の詳細な分析により、例えば各時期と関連した特定の疾病状態に関して、さらなる洞察が得られるだろう。例えば、本発明の方法を応用し、かつ本発明のトランスジェニック哺乳動物（ヒト以外）を用いることにより、例えば低血糖症の原因を解明することが期待される（以下で述べる；実施例も参照のこと）。さらに、膵臓におけるPax6の発現を研究し、本発明のトランスジェニック哺乳動物（ヒト以外）を用いて得られる知識（以下で述べる；実施例も参照のこと）からは、精神疾患の病因および治療が洞察されるだろう。というのは、Pax6遺伝子産物とグルカゴン遺伝子は脳で発現されることが知られているからである（Drucker and Asa,J.Biol.Chem.263（1988）、13475−13478;Leeら,Endocrinology 127（1990）,2217−2222;Luiら,Endocrinology 126（1990）110−117;Hanら,J.Neurosci.Res.16（1986）,97−107）。この知識に基づいて、新しい医薬（例えば、低血糖症および精神疾患の新薬）が開発されて、試験されるだろう。
本発明の方法は、研究の目的に応じて、さまざまな哺乳動物に適用することができる。好ましい実施形態においては、哺乳動物はマウスである。この実施形態は、膵臓の発生を調節している各種タンパク質の機能的相互関係をより明確に理解するための基礎研究に特に有用である。別の実施形態においては、哺乳動物はヒトである。この実施形態では、好ましくは診断および治療上の適用例が考えられる。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合により（ｄ）、および／またはステップ（ｂ）と場合により（ｅ）はin vivoでおこなわれる。
本発明のこの実施形態は特に基礎研究または治療上の適用例において有用であると予想される。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合により（ｄ）、および／またはステップ（ｂ）と場合により（ｅ）はin vitroでおこなわれる。
この実施形態の利点は主に診断上の適用例にあり、また基礎研究にも有利であると予想される。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合によりステップ（ｄ）での前記確認を、
（ｉ）Pax6遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax6タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列、および場合によりPax4遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax4タンパク質の少なくとも一部をコードする第２核酸配列、
（ii）（ｉ）の核酸配列に相補的な核酸配列、または
（iii）（ｉ）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーまたはプライマー対、
を用いて行う。
本発明のこの実施形態によると、分化状態を試験する方法は、例えばサザンもしくはノーザンブロットまたはin situ分析の形で、Pax6遺伝子および／またはPax4遺伝子またはその一部をコードする核酸分子を用いておこなうことができる。前記核酸配列は遺伝子のコード領域または非コード領域にハイブリダイズしうる。本発明の方法において（ii）の相補配列を用いる場合には、前記核酸分子はノーザンブロットにおいて再使用することができる。さらに、前記試験は実際上のブロック、例えば遺伝子転写のブロックと共におこなってもよく、かくして治療との関連性を有する。さらに、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、上記のPax遺伝子または対応mRNAの１つにハイブリダイズさせるためにも使用できる。ハイブリダイゼーション用の核酸は、当然、放射性マーカーや他のマーカーを組み込んだり結合させることで便利に標識される。このようなマーカーは当技術分野で周知である。核酸分子の標識付けも慣用方法でおこなうことができる。
さらに、Pax6および場合によりPax4の存在または発現は、対応する核酸配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて、標準方法に従ってPCR反応をおこなうことでモニターすることができる。
上記プローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはストリンジェントのハイブリダイゼーション条件でおこなうことが好ましい。「ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件」は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら，“Molecular Cloning,A Laboratory Manual"第２版,CSH Press,Cold Spring Harbor,1989;“Nucleic Acid Hybridisation,A Practical Approach",Hames and Higgins編,IRL Press,Oxford,1985を参照のこと。
本発明の上記実施形態のさらなる変更は、当業者には容易に考えつくことである。
本発明の追加の実施形態は、ステップ（ｂ）と場合によりステップ（ｅ）での前記確認を、Pax6タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを用いて、場合により、Pax4タンパク質と特異的に結合する第２の抗体またはそのフラグメントを用いて行う方法に関する。
前記タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントは、例えばHarlow and Lane“Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988に記載される慣用方法を用いて取得することができる。これらの抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗血清中に含まれていても、またはそのフラグメントであってもよい。本発明の方法で用いる抗体を、ヒスチジンフラッグやビオチン分子などの検出可能なタグにより標識することができる。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、前記膵細胞がα細胞またはβ細胞である。
本発明によると、Pax6はα細胞とβ細胞において発現されることがわかった。さらに、本出願人は、Pax6がソマトスタチン産生δ細胞およびPP細胞において発現されることを示す。したがって、Pax6遺伝子機能の破壊は、膵臓における前記細胞の発生の精密な追跡を可能にする。β細胞ではPax4も発現されるので、Pax6発現は、Pax4が作用しうる環境を整えるために必要とされるのかもしれない。
Pax6とPax4は両方とも内分泌細胞の適正な分化にとって必要な調節タンパク質であるので、この実施形態は膵臓腫瘍のような疾病の発生に関してさまざまな結論を可能しうる。
したがって、さらに好ましい実施形態は、前記分化状態が膵細胞の悪性度または悪性力の指標となる方法に関する。機能性Pax6産物および場合によりPax4産物の過剰発現または欠損は、正常な内分泌細胞を癌化するように誘導する可能性がある。この記載に一致して、Pax4遺伝子の近くの染色体7qにおける対立遺伝子欠損が多くの膵臓癌に観察されている（Albertoら,Cancer Res.56（1996）,3808−3818）。Pax6は、場合によりPax4も、他の発癌因子と相互作用しているかもしれない。
悪性度または悪性力は、本発明によれば、好ましくは、しかし排他的ではなく、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ソマトスタチノーマ、管細胞腺癌などの膵臓腫瘍との関連において用いられる。
本発明は、さらに好ましい実施形態において、
（a'）前記試験に先立って、前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること、および
（b'）前記試験後、Pax6遺伝子および場合によりPax4遺伝子が過剰発現している場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除すること、またはPax6遺伝子および場合によりPax4遺伝子が過少発現しているか発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしくは発現可能な機能性Pax6遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を前記細胞に導入すること、および
（b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物に再導入すること、
をさらに含む方法に関する。
これに関連して、本発明書全体を通して用いられる「機能性」Pax6（Pax4）とは、α細胞およびランゲルハンス細胞（β細胞）への内分泌細胞の発生に寄与するという生物学的性質をもつPax6（Pax4）タンパク質の一次構造コホメーションの一部または全部を有するタンパク質を意味し、前記タンパク質はPax6（Pax4）をコードするDNA配列の原核または真核生物発現の産物であって、配列番号２（配列番号４）のアミノ酸配列、または配列番号２（配列番号４）に示したアミノ酸配列のアミノ酸欠失、置換、挿入および／または付加を有するその断片もしくは誘導体を含んでなるアミノ酸配列を有する。また、「機能性」Pax6（Pax4）タンパク質という用語には、抗体応答のような特異的免疫応答を生じさせる前記タンパク質またはその一部の能力も含まれる。
本発明のこの実施形態は、腫瘍（特にヒトの腫瘍）を治療するのに適している。したがって、膵臓腫瘍細胞のPax6タンパク質および場合によりPax4タンパク質の発現レベルをモニターすることが考えられる。前記タンパク質の過剰発現の検出は、かかる過剰発現が腫瘍の発生または維持に相互関係していると結論づけることができよう。したがって、その発現レベルを正常レベルにまで下げるステップが追加されよう。例えば、これは、生物学的手段により、例えばリボザイム、アンチセンス核酸分子、またはPax6タンパク質かPax4タンパク質に対する細胞内抗体を用いることで、Pax6遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除することにより行うことができる。さらに、Pax6の発現レベルを下げるための薬剤が開発される可能性がある。目下のところPax6および場合によりPax4が膵臓組織においてどのように調節されるのかは不明であるが、さまざまな発生因子とホルモン因子がこれらの遺伝子の活性レベルを決定していると考えられる。例えば、特定の遺伝子の発現を抑制する小分子が知られている。TGFβスーパーファミリーの一員であるアクチビンＡは、発生しつつある脊髄におけるPax6の発現をダウンレギュレートすることが実証されている（Pituelloら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,6952−6956）。同様の分子が膵臓でのPax6の発現と、場合によりPax4の発現、をダウンレギュレートする可能性がある。一方、発現の不足つまり過少発現は腫瘍細胞で発現可能な機能性Pax6遺伝子および場合によりPax4遺伝子により回復される。また、発現の刺激または誘導が小分子やその他の手段（この場合はPax6遺伝子発現を活性化するもの）を用いることで得られる。これに関して、本発明は、前記Pax遺伝子の一方が過剰発現されるが他方のPax遺伝子は前記悪性状態で過少発現されるという可能性を意図している点に留意することが重要である。最後に、ヒトの膵臓腫瘍の外科的切除または化学療法による治療により、しばしば、患者はグルカゴン産生細胞の相当数が存在しない状態になってしまう。Pax6および場合によりPax4は、欠損しているかまたは損傷を受けたαおよびβ細胞の機能性代替物を開発するための組織遺伝子工学的操作（Langer and Vacanti,Science 260（1993）,920−924）において使用することができる。in vitroで正常レベルのPax6発現および場合によりPax4発現に復帰した膵臓腫瘍細胞を患者に再導入すると、患者自身の遺伝的背景にある正常なグルカゴン産生細胞および場合によりインスリン産生細胞が患者に供給される結果、細胞の免疫学的拒絶反応の危険性が低減する。
本発明のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験することは、実施例に示すように、低血糖症の指標となるα細胞の発生状態を試験することである。低血糖症はα細胞発生の欠損または不全の結果として発症することが多い。実施例により、Pax6発現の不足がα細胞発生の欠損または不全の指標となり、したがってグルカゴン産生の欠乏または低下（それ故に低血糖症）の指標となることが示される。
低血糖症の早期診断は特に有利であり、かなり医学的に重要なことである。したがって、低血糖症の診断または検出のために本発明の方法を用いることが好ましい実施形態となる。この好ましい実施形態は、コロナ絨毛（coronar villi）において、すなわち胚の着床前に、低血糖症を診断するのに用いることができる。さらに、本発明の方法を用いて、羊水穿刺により低血糖症を診断することも可能である。本発明の方法のあらゆる適用例に従う低血糖症の早期診断は、誕生後で臨床的徴候の発現前に直接治療することを可能にする。
本発明方法の特に好ましい実施形態では、前記α細胞の分化状態を試験することが胚体または新生児哺乳動物において行われる。
先に示したように、個々の薬剤治療および遺伝子治療のアプローチに特有の、少なくとも１つの追加のステップを本発明の方法に含めることが特に好適である。上述したように、Pax6を活性化し、それゆえ、グルカゴン産生α細胞の分化および生産とランゲルハンス島の発生を誘導するために、医薬として有効な種々の小分子を用いることができよう。同様に、活性Pax6の細胞内ターゲティングは同様の成果を前進させるだろう。この記載に合致して、膵管上皮細胞は内分泌細胞型の潜在的な幹細胞を含むことが提唱された。前記細胞に限らないが、前記細胞におけるPax6活性の誘導は、グルカゴン産生細胞への分化を促進することが期待される。
本発明方法のさらに好ましい実施形態においては、膵細胞の前記分化状態が薬剤活性のまたは遺伝子治療法の結果である。例えば、前記分化状態は、機能性Pax6および場合によりPax4遺伝子を、レトロウイルスベクター（Naldiniら,Science 272（1996）,263−267;Mulligan,Science 260（1993）,926−932）または他の適切なベクターを用いて、in vivoで細胞に導入する遺伝子治療アプローチにより影響を受ける。同様に、本発明によると、患者由来の細胞を分離し、それらの細胞を標準的な組織培養技術を用いてα細胞とβ細胞のランゲルハンス島へと分化するようにin vitroで改変し、そして患者に再導入することができる。
特に好ましい実施形態では、前記薬剤または遺伝子治療法が、Pax6遺伝子と場合によりPax4遺伝子の発現レベルにmRNAまたはタンパク質レベルで影響を与える。
本発明の上記実施形態は、とりわけ、上記Pax遺伝子の発現に及ぼす薬剤の影響について薬剤を試験することを可能にする。さらに上で述べたように、Pax6と場合によりPax4の異常な発現レベルは、例えば膵臓の固形腫瘍の、発症の原因となると予想される。したがって、本発明の方法は、薬剤の適用により細胞が正常な発言レベルに戻れるような、そういった薬剤の試験を可能にする。前記正常な発現レベルは、例えば細胞の悪性度に直接影響を与えることが期待されよう。例えば、疾病または腫瘍がPax6の過少発現の直接的または間接的結果であるとすると、個々の患者を治療している医師は、Pax6の発現を刺激する薬剤を投与するだろう。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験することはPax6（場合により、同時にPax4）のノックアウトマウスにおける発生状態を試験することである。
本発明方法のさらに好ましい実施形態において、前記方法は、αおよびβ細胞と比べたとき、類似しているが異なる分化経路を有する管上皮細胞に、発現可能な機能性Pax6遺伝子を導入し、場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入することをさらに含む。本発明のこの実施形態を用いると、当業者は管上皮細胞の運命をαおよびβ細胞へと再度方向づけすることができる。こうして、前記細胞は、Pax6遺伝子によるトランスフェクション後に、α細胞およびβ細胞へと分化してランゲルハンス島を形成することが期待される。患者がα細胞の不足、それ故グルカゴンの欠損に苦しんでいる場合は、相応の薬剤投与が考えられる。この方法はin vitroでもin vivoでも行うことができる。
本発明はさらに、少なくとも１つの不活性化Pax6対立遺伝子を含むトランジェニック哺乳動物に関する。特にトランスジェニック哺乳動物の研究上の使用に関しては、哺乳動物はヒト以外のものであることが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば膵臓における、種々の細胞の発生をモニターするのに有利に使用することができる。しかし、トランスジェニック哺乳動物の使用は膵臓の発生研究に制限されない。本発明によると、Pax6は今やα細胞のマスター調節剤であると考えられるので、その影響は生体の他の細胞型でも研究することが可能である。
本発明のトランスジェニック動物（好ましくは、ホモ接合状態のトランスジェニックマウス）は重症の膵臓疾患および神経障害（トランスジェニックマウスの場合には、生後数分以内に死に至る）を有するので、前記トランスジェニック動物は、特に膵臓と脳の、発生障害と関連した疾患の研究にさらに使用することができる。トランスジェニックマウスはグルカゴン産生細胞に欠陥があり、低血糖症の患者によく似た臨床的徴候を呈するので、前記マウスは低血糖症に対する治療および薬剤研究用のモデル動物として有用である。上記と同じ理由で、前記トランスジェニック哺乳動物、好ましくはトランスジェニックマウスは精神疾患を研究するためのモデル系としても使用することができる。
好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物は少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子をさらに含有する。
この実施形態は、哺乳動物またはその特定の組織（特に膵臓の組織）の発生に関するPax6とPax4の相互作用の研究を可能にする。Pax6トランスジェニック哺乳動物に関して本明細書中で先に述べた応用例はすべて、２個のトランスジーンを保有する哺乳動物にも当てはまる。また、トランスジェニック動物の発生および／または生涯の特定の時期にPax6遺伝子発現と場合によりPax4遺伝子発現を不活性化することが望ましいかもしれない。これは例えば、Pax6タンパク質をコードするRNA転写産物および場合によりPax4コード化RNAに対するアンチセンスまたはリボザイムの発現を駆動する、例えば組織特異的な、発生および／または細胞調節型のおよび／または誘導可能なプロモーターを使うことで達成できる。適当誘導系は、例えばGossen ＆ Bujard（Proc.Natl.Acad.Sci.89 USA（1992）,5547−5551）およびGossenら（Trends Biotech.12（1994）、58−62）に記載されるテトラサイクリン調節遺伝子発現である。
したがって、この実施形態において、トランスジェニック哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であることが好ましく、例えばマウスやラットなどの実験動物である。
本発明の別の好ましい実施形態においては、前記トランスジェニック哺乳動物はヒト、マウスまたはラットである。上述したように、治療のために少なくとも１つの不活性化Pax6対立遺伝子を哺乳動物に導入し得るから、トランスジェニック動物はヒトであってよい。
本発明によれば、トランスジェニック動物は不活性化Pax4または不活性化Pax6のいずれかまたは両方の不活性化遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
さらに、本発明は、哺乳動物の低血糖症および／または神経障害を治療し、予防しおよび／または遅延させるための医薬組成物を調製するための、発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする少なくとも１つの第１核酸配列および場合により発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする第２核酸配列の使用ならびに前記核酸配列の使用方法に関する。本発明によると、前記核酸配列を含むベクターは、前記核酸配列の発現および／または前記核酸配列の膵細胞へのターゲティングを可能にする調節エレメントに機能しうる形で連結させることができる。
さらに、本発明は、哺乳動物の低血糖症および／または神経障害を治療し、予防しおよび／または遅延させるための機能性Pax6タンパク質および場合により機能性Pax4タンパク質の使用に関する。「機能性」という用語は本明細書中で先に説明した意味を有する。
好ましくは、上記実施形態で言及された哺乳動物はヒト、マウスまたはラットである。かくして、本発明はさらに、発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする配列からなる少なくとも１つの第１核酸分子および場合により発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする配列からなる第２核酸分子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物（ただし、前記核酸分子は前記哺乳動物において発現される）を包含する。この哺乳動物は、出生前または出生後に、例えば本発明の方法により低い、欠損したまたは皆無のPax6タンパク質もしくはmRNAが示された後に、低血糖症または精神疾患を治療し、予防しおよび／または遅延させるために改変され得る。この改変は、本明細書中で述べた技法によりまたは当業者の技量の範囲内で、本明細書の開示から過度の実験をおこなうことなしに可能である。
本発明では、核酸およびタンパク質を単独でまたは任意の組合せで、場合により製薬上許容される担体または賦形剤と共に、投与することが意図される。前記核酸配列は哺乳動物のゲノムに安定に組み込むことができる。一方、ある種の細胞や組織、好ましくは膵臓および／または脳に特異的で、前記細胞内にとどまって前記細胞内でのPax遺伝子の発現を賦与するウイルスベクターを使用することもできる。適当な製薬上の担体および賦形剤は当技術分野で周知である。核酸分子および／またはタンパク質を特定の細胞にターゲティングすることができるエレメントは先行技術、例えばSomiaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,7570−7574に記載されている。医薬組成物は哺乳動物に適切な用量で投与されるが、その用量は、本明細書の開示および当技術分野の知識から過度の実験をおこなうことなしに、とりわけ哺乳動物の種、年齢、性別、体重、健康状態、投与経路、Pax6タンパク質を投与するのかPax4タンパク質とPax6タンパク質を投与するのか、Pax6もしくはPax4とPax6を抑制する薬剤または刺激する薬剤を投与するのか、核酸を投与するのか、その核酸がPax6もしくはPax4とPax6を発現させるためのものなのか、またはPax6もしくはPax4とPax6の発現を抑制するためのものなのか、といった典型的な要因を考慮に入れて、当業者により決定され得る。典型的な用量は例えば0.001〜1000μｇの範囲内（またはこの範囲内の発現用または発現抑制用の核酸の用量）であってよい。しかし、この代表的範囲より少ないまたは多い用量も、特に上記要因を考慮して、考えられる。
適切な組成物の投与はいろいろな方法でおこなうことができ、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によるものである。本発明に従って調製された医薬組成物は、さまざまな種類の疾患、例えば膵臓関連疾患、すなわち低血糖症、またはさまざまな種類の後天性もしくは先天性神経障害、神経変性および関連疾患（例えば精神疾患）を治療し、予防しまたは遅延させるために使用することができる。前記疾患および障害は好ましくは内分泌または神経組織、例えば膵臓や脳に起因するものである。
さらに、Pax6タンパク質をコードする核酸配列および場合によりPax4タンパク質をコードする核酸配列を含む医薬組成物を遺伝子治療のために使用することが可能である。当然、両配列が同じベクター中に含まれていてもよい。上述したように、細胞がPax遺伝子の両方の機能性コピーを失うときに病気が発生することが多い。こうした場合に、対応する遺伝子の機能性コピーを導入してやると、その状況を改善させることができる。例えば、生殖細胞系の細胞への遺伝子導入に関する研究は生殖生物学において最も急速に進展している分野の一つである。遺伝子治療は、ex−vivoまたはin−vivo技術による治療用遺伝子の細胞への導入に基づくもので、遺伝子導入の最も重要な応用例の一つである。適当なベクターおよびin−vitroまたはin−vivo遺伝子治療法は文献に記載されており、当業者には公知である。例えば、Giordano,Nature Medicine 2（1996）,534−539;Schaper,Circ.Res.79（1996）,911−919;Anderson,Science 256（1992）,808−812;Isner,Lancet 348（1996）,370−374;Muhlhauser,Circ.Res.77（1995）,1077−1086;Wang,Nature Medicine 2（1996）,714−716;WO94/29469またはWO97−00957およびそこに引用された文献を参照のこと。Pax6および場合によりPax4をコードする遺伝子は細胞への直接導入のために、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介しての導入のために設計され得る。例えば、ヒトPax6をコードする配列および場合によりPax4遺伝子を、標的細胞および組織内での前記遺伝子の発現を可能にする調節配列に機能しうる形で連結させることができる。遺伝病において、突然変異を起こしている核遺伝子の正常なまたは機能的に十分な対立遺伝子を導入することが遺伝子置換療法に相当し（例えば、Mouellic,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87（1990）,4712−4716;Joyner,Gene Targeting,A Practical Approach,Oxford University Pressを参照のこと）、これは主に糖尿病や低血糖症などの単一遺伝子劣性疾患に応用される。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は低血糖症の治療方法に関し、この方法は、
（ａ）哺乳動物から細胞を取り出し、
（ｂ）発現可能な機能性Pax6遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を前記細胞に導入し、そして
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の哺乳動物に再導入する、
ことを含んでなる。
また、さらなる実施形態において、本発明は神経障害の治療方法に関し、この方法は、
（ａ）哺乳動物から細胞を取り出し、
（ｂ）発現可能な機能性Pax6遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax4遺伝子を前記細胞に導入し、そして
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の哺乳動物に再導入する、
ことを含んでなる。
導入された遺伝子は、前記細胞への導入後に機能性で、かつ発現可能であり、好ましくは前記細胞の寿命の間その状態のままであり続けることを理解すべきである。
好ましくは、前記哺乳動物はヒト、ラットまたはマウスである。
本発明方法の好ましい実施形態において、前記細胞は生殖細胞系の細胞もしくは胚性細胞またはそれ由来の細胞である。胚性細胞は、例えばNagy,Proc.Natl.Acad.Sci.90（1993）8424−8428に記載されるような、胚性幹細胞であってよい。最も好ましい実施形態では、前記細胞が卵細胞またはそれ由来の細胞である。
適当なベクターおよびin−vitroまたはin−vivo遺伝子治療法は文献に記載されており、当業者には公知である。本発明による医薬組成物は、Pax6遺伝子および／またはPax4遺伝子の発現および／または無発現に関係することがこれまで知られていない種類の疾患の治療に使用することができる。
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例により開示されて、それらを包含するものである。例えば、本発明に従って用いられる化合物、使用および方法のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子機器を使って、図書館から検索することができる。例えば、パブリックデータベースの「Medline」を利用することができ、これは例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlのアドレスのもとにインターネットで入手可能である。更なるデータベースおよびアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html,http://www.tigr.org/が当業者に公知であり、また、例えばhttp://www.lycos.comを使って得ることもできる。バイオテクノロジーの特許情報の総覧および従来技術のサーチや現在の事情に有用な特許情報の関連ソースの概論は、Berks,TIBTECH 12（1994）,352−364に載っている。
【図面の簡単な説明】
本明細書の開示内容は、参照することにより本明細書中に組み入れられる添付図面と関連させることで最もよく理解されよう。
図１（図1a,1b,1c）：β−ガラクトシダーゼ遺伝子によるPax6のターゲット置換およびヘテロ接合性マウスの作製。
野生型およびターゲットされたPax6遺伝子座の構造。Pax6開始コドンおよび対応する全ドメインの欠失は、Philippe Brulet（Le Mouellic,H.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87（1990）,4712−4716）により開発されたβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシンカセットpGNAを挿入することにより作られた。略号:A,ATG;B,Bam H I;K,Kpn I;RV,Eco RV;S,Spe I。
図２（図2a,2b,2c,2d,2e,2f,2g,2h）：異なる発生段階のヘテロ接合性Pax6−LacZ胚におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。
Pax6/β−ガラクトシダーゼ染色は、8.0日目の胚の開放神経板と閉鎖神経ひだ（矢印）において最初に検出された。8.5日目に、強いβ−ガラクトシダーゼ染色が予定された前脳（ｆ）と後脳（ｈ）で観察され、閉鎖神経管（ｎ）を有する尾側に進行していた。予定中脳（ｍ）領域には発現が全く検出されなかった。9.5日目に、前脳は終脳（ｔ）、間脳（ｄ）および眼胞体に分かれた。強いβ−ガラクトシダーゼ活性が後脳、神経管および発生しつつある膵臓（矢印）にも検出された。発現は発生の間中、脳、眼、神経管および膵臓において維持され、また、成体動物のいくつかの細胞にも残存していた。
図３（図3a,3b）：受胎後13.5日目のホモ接合性Pax6−LacZにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性。
−／−動物には眼と嗅球（矢印）がなかった。
図４（図4a,4b,4c）：ヘテロ接合性Pax6−LacZ胚体および新生児マウスの膵臓におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。
a,  受胎後9.0日目の＋／−胚体におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。前脳、間脳、眼胞、神経管および膵臓（矢印）に強い染色が検出される。
b,  受胎後10.0日目の＋／−胚体の矢状切断。陽性のβ−ガラクトシダーゼ発現に一致して膵臓芽のサブセットの細胞のみが青色に染まった。倍率、X400。略号:f,前腸;p,膵臓芽。
c,  β−ガラクトシダーゼ活性について染色し、ヘマトキシリン−エオシンで対比染色した新生児の膵臓。青色のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞はランゲルハンス島のみに見られ、このことはPax6が内分泌細胞においてのみ発現されることを示す。
図５（図5a,5b,5c,5d,5e,5f）：＋／−および−／− Pax6欠損新生児マウスの膵臓におけるβ−ガラクトシダーゼ、インスリンおよびグルカゴンの分析。
β−ガラクトシダーゼ染色は＋／−マウス（a,b,c）のランゲルハンス島に制限される。青色に染まった細胞はインスリン（ａ）またはグルカゴン（b,c）のいずれかを発現する。インスリン産生細胞は島の中心部を形成し、一方、グルカゴン産生細胞は周辺部に局在する（矢印で示した）。−／−マウス（d,e,f）では、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞はインスリンのみを発現し、島様構造へと組織化することができなかった。パネルa,bおよびd,eは隣接切片である。倍率、X200。
図６（図6a,6b）：ホモ接合性スモール・アイ（Small eye）変異体新生児マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン発現の分析。
ホモ接合性スモール・アイ動物の膵臓はインスリンのみを発現する（矢印）。インスリン産生細胞はランゲルハンス島で組織化されず、外分泌組織全体にわたって分散したままだった。グルカゴン合成は全く検出されず、このことはα細胞集団が存在しないことを示す。倍率、X200。
図７（図7a,7b）：＋／−および−／− Pax6欠損新生児マウスの膵臓の外分泌組織におけるアミラーゼ発現の分析。
−／−マウスでは外分泌組織におけるアミラーゼ発現は変わらなかった。
図８（図8a,8b,8c,8d）:Pax6とPax4の両方についてホモ接合性のマウス新生児の膵臓におけるβ−ガラクトシダーゼ、インスリン、グルカゴンおよびPdx1発現の分析。
Pax6とPax4の両方を欠失しているマウスではβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞がほとんど観察されなかった（a,b）。これらの細胞はインスリン（ａ）もグルカゴン（ｂ）も発現しなかった。しかし、Pdx1陽性細胞を膵臓で検出することができた。倍率、パネルa,bはX200;パネルc,dはX400。
図9:膵臓発生中のα細胞およびβ細胞の分化におけるPax4およびPax6の役割のモデル提案。
受胎後8.5日目でPdx1発現が外分泌および内分泌前駆細胞を生じさせる内胚葉の領域を規定する。受胎後9.0日目の内分泌始原細胞でのPax遺伝子発現の開始が、これらの細胞を２タイプの前駆細胞へと規定する。Pax4とPax6の両方を発現する前駆細胞は成熟インスリン産生β細胞へと発生するが、Pax6のみを発現する前駆細胞はグルカゴン産生α細胞へと分化する。Pax4を欠失させると、β細胞系列がα細胞系列へと転じる。Pax6の不在はα細胞の系列を排除する。
図10:ヘテロ接合性（＋／−）およびホモ接合性（−／−）Pax6変異体新生児マウスの膵臓におけるβ−ガラクトシダーゼ、ソマトスタチンおよびPP発現の分析。青色に染まった細胞はソマトスタチンまたはPPのいずれかを発現した。＋／−マウスでは、両方の細胞型がランゲルハンス島の周辺部に局在した（矢印で示す）。−／−マウスでは、ソマトスタチンおよびPP細胞がまだ存在するが、島様構造へと組織化されなかった。倍率、X200。
図11:野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax6変異体新生児マウスの膵臓におけるホルモン濃度。
野生型動物とヘテロ接合性動物の間にはインスリンまたはグルカゴン濃度の差がほとんど認められないか全く認められなかった。ホモ接合性動物はインスリン濃度の70％低下およびグルカゴン濃度の100％低下を示した。
図12:膵臓腫瘍細胞系のノーザンブロット分析。
Pax6の高発現はインスリンの高発現と相関し、また時にグルカゴンの高発現とも相関した。
本発明およびその多くの利点は、例示としての以下の実施例からさらに理解されるだろう。
実施例
インスリン、グルカゴンおよびアミラーゼに対する抗体は数社から販売されている。本出願人の実験で用いた抗体はBoehringer Mannheim社から購入した。Pdx1抗体はUmea大学（Ｓ−901 87 Umea,Sweden）微生物学部のThomas Edlund教授から親切にも贈られたものである。同じ特異性を有する抗体、すなわちPdx1タンパク質を特異的に認識する抗体は、通常の手順に従って、抗原としてPdx1タンパク質を用いることで調製することができる。
実施例1:相同的組換え用の構築物の作製およびPax6欠損マウスの作出
Pax6欠損マウスは、十分に確立された技術を用いて胚性幹（embryonic stem:ES）細胞での相同的組換えにより作製した。例えばA.L.Joyner編，“Gene targeting:a practical approach",Oxford University Press,Oxford,1993を参照のこと。簡単に述べると、Walter ＆ Gruss,Development 113（1993）,1435−1449に記載されるPax6 cDNAの断片をプローブとして用いて、相同性スクリーニングにより129Svマウスのゲノムライブラリーから11.5kbのゲノムDNA断片を単離した。ゲノムライブラリーの作製、相同性スクリーニングおよび全てのクローニングステップは当技術分野で周知の技術を用いておこなった。例えば、Sambrookら，“Molecular Cloning,A Laboratory Manual"第２版,CSH Press,Cold Spring Harbor,1989;“Nucleic Acid Hybridisation,A Practical Approach",Hames ＆ Higgins編,IRL Press,Oxford,1985を参照のこと。前記ゲノムDNAのBamH I−Kpn I制限部位にβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシンカセットを挿入することで機能性Pax6タンパク質を排除する突然変異を作ることにより、Pax6開始コドンおよび対応する全ドメインを置き換えた（図１）。次に、ターゲティング構築物を胚性幹細胞系R1（Nagy,A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90（1993）,8424−8428）に導入した。直鎖状にしたターゲティング構築物30μｇを含有するトリス−リン酸緩衝液中に約107個のES細胞を加え、500μF/250ボルトの単一パルスを室温で与えてエレクトロポレーションをおこなった。次に、細胞をプレートし、抗生物質G418に対して２週間選択した。耐性クローンを個々に単離し、それらのDNAを制限酵素Spe I−EcoR Vで消化し、Pax6遺伝子座に特異的なプローブを使ってサザンブロットにより分析した。変異型Pax6対立遺伝子は、野生型対立遺伝子が11kbの断片であるのに対して8.2kbの断片をもたらした。分析した200個のコロニーのうち、３個が変異型Pax6対立遺伝子を含むことがわかった。変異体クローンのES細胞をNMR Iマウス系統由来の８細胞桑実胚に集合させてキメラ動物を作出した。その後キメラ動物は生殖系伝達のためにかけあわせた。
実施例2:発生中の動物および新生児動物におけるPax6の発現
発生中のヘテロ接合性胚においてβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。さまざまな発生段階で胚を単離し、リン酸緩衝溶液（PBS）の２％ホルムアルデヒド/0.02％グルタルアルデヒドの中に30分入れて固定し、0.1％ X−gal,2mM MgCl2,5mM K3Fe（CN）6,5mM K4Fe（CN）6,0.2％Nonidet P−40および2.5mMデオキシコール酸を含有するPBS溶液中30℃で一夜染色した。Pax6/β−ガラクトシダーゼ染色は、8.0日目の胚の開放神経板と閉鎖神経ひだにおいてまず検出された（図２）。数時間後の8.5日目に、強いβ−ガラクトシダーゼ染色が予定前脳と後脳に観察され、閉鎖神経管を有する尾側に進行していた。予定中脳領域には発現が全く検出されなかった。9.5日目に、前脳は終脳と間脳と眼胞体に分割された。強いβ−ガラクトシダーゼ活性が後脳、神経管および発生しつつある膵臓にも検出された。発現は発生の間中、脳、眼、神経管および膵臓において維持され、また、成体動物の一部の細胞にも残存していた。β−ガラクトシダーゼの発現はin situ分析（Walter ＆ Gruss,Development 113（1991）,1435−1449）により先に記載したPax6発現パターンと一致した。本出願人は変異体動物においてどのような異所性β−ガラクトシダーゼ発現も検出しなかった。
ホモ接合性の動物は眼と鼻球を欠き、脳顔面頭蓋の奇形が生じた（図３）。それらは間脳と終脳にも欠陥があり、生後数分で死亡した。ホモ接合性Pax6−LacZマウスで観察された表現型は、ホモ接合性のスモール・アイ変異体について記載されたものと似通っていた（Stoykova,A.ら,Development 122（1996）,3453−3465;Grindley,J.C.ら,Development 121（1995）,1433−1442）。
実施例3:膵臓の内分泌細胞内でのPax6の発現
ヘテロ接合性Pax6−LacZ胚におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を調べることで発生中の膵臓のPax6発現を分析した。受胎後9.0日目の膵臓の湾曲部の個々の細胞においてβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞が最初に検出された。Pax6発現は、膵臓の発生中はあるサブセットの細胞において維持され、新生児および成体動物ではランゲルハンス島に限定されてしまった（図４）。外分泌組織にはPax6発現が全く検出されなかった。
胚性および新生児膵臓におけるホルモン産生は、インスリンまたはグルカゴンに特異的なモノクロナール抗体を用いた間接的免疫化学により証明された（図5a,b,c）。Pax6を発現している細胞はグルカゴンまたはインスリンのいずれかを合成したが、このことはPax6がα細胞とβ細胞の両方で発現されることを示す。膵臓を摘出し、上記のようにβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した。染色後、組織をパラフィンに包埋し、10μｍの切片とした。免疫組織化学的分析はすべて、標準方法に従ってβ−ガラクトシダーゼ染色の後に実施した。簡単に述べると、切片をエタノール希釈系列で再水和し、1mg/mlのブロッキング試薬（Boehringer Mannheimカタログ番号1096176）、20％ウシ胎児血清、100mMマレイン酸、150mM NaClを含むブロッキング溶液中室温で30分、加湿ボックス内でプレハイブリダイズさせた。ブロッキング溶液を除去した後、切片を加湿ボックス内で室温にてグルカゴンまたはインスリンに対する一次抗体と一夜ハイブリダイズさせた。一次抗体は両方ともSigma社（カタログ番号Ｇ−2654;I−2018）から購入し、ブロッキング緩衝液で1:500に希釈した。次に、切片を10mM Tris−Cl pH8.0,150mM NaCl,0.05％Tween−20を含むTBST緩衝液で10分ずつ３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗マウスIgG抗体（Cappel Teknika Corp.抗体カタログ番号55559）と一夜ハイブリダイズさせた。再度、切片をTBST緩衝液で３回洗浄し、0.5mg/mlのジアミノベンジジン、0.066％H2O2を含むTBST溶液中で染色した。
実施例4:Pax6遺伝子を欠失しているマウスでのインスリンおよびグルカゴンの分析
β−ガラクトシダーゼ陽性細胞はホモ接合性Pax6変異体新生児動物の膵臓でまだ検出された。しかし、それらは島を形成することができず、外分泌組織全体に散らばったままだった（図5d,e,f）。さらに、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞はインスリンのみを産生した。グルカゴン産生細胞は全然検出されず、このことはホモ接合性変異体膵臓にはα細胞集団が存在しないことを示す。変異型Pax6対立遺伝子をやはり保有する天然のマウス変異体スモール・アイの場合（図６）にも同様の結果が得られた（Van de Meer−Jong,R.ら,Genomics 7（1990）,270−275）。
さらに、ホモ接合性変異体Pax6マウスの膵臓のβ細胞集団は依然としてインスリンを産生したが、それらはランゲルハンス島を形成しなかった。正常な膵臓において、島の形成はその起源がクローンではない（Deltour,L.ら,Development 112（1991）,1115−1121）ものの、発生の後期に起こる細胞の移動および集合の結果であると考えられている（Herrera,P.L.ら,Development 113（1991）,1257−1265）。Pax6は内分泌細胞を組織化して島を形成することに関わっている可能性がある。最近の研究から、島の形成には細胞接着分子が重要な役割を担っていることが示唆され（Dahl,U.ら,Development 122（1996）,2895−2902;Moller,C.J.ら,Mol.Endocrinol.6（1922）,1332−1342;Rouiller,D.G.ら,Dev.Biol.148（1991）,233−242）、Pax6は少なくとも１種の細胞接着分子のプロモーターに結合できることが明らかにされた（Chalepakis,G.ら,DNA Cell Biol.13（1994）,891−900）。最後に、ホモ接合膵臓の外分泌組織をアミラーゼの生産に関してヘテロ接合性膵臓と比較した（Sigma抗体カタログ番号Ａ−8273）。ホモ接合性とヘテロ接合性の間に差異は認められず、外分泌組織はPax6の非存在により影響を受けないことが示された（図７）。
実施例5:内分泌の分化にはPax4とPax6の両方が必要である
β細胞の分化にはPax4遺伝子が必要であるので、変異体マウスはインスリン分泌細胞を発生しない。Pax6とPax4の両方を欠失している新生児動物の膵臓の内分泌細胞の運命を分析した。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の小集団が外分泌組織内にまだ観察された。これらの細胞はインスリンもグルカゴンも産生しなかったが、ホメオボックス遺伝子Pdx1の発現が検出された（図８）。Pdx1は前駆細胞と成熟β細胞においてのみ発現され（Guz,Y.ら,Development 121（1995）,11−18）かつβ細胞を欠くホモ接合性Pax4マウスはPdx1を発現しないので、本出願人らの結果からは、Pax4/Pax6ホモ接合性新生児マウスの膵臓には内分泌前駆細胞が存在しているが、成熟内分泌細胞へと分化できないことが示唆される。
本出願人らの観察に基づいて、本出願人らは、Pax4とPax6は発生中の内分泌前駆細胞の細胞運命を決定している、と提唱する（図９）。第１段階で、Pdx1遺伝子が膵臓の外分泌および内分泌前駆細胞を生起させる内胚葉の領域を規定する。なぜならば、Pdx1遺伝子の発現がPax遺伝子の発現前に起こり（Serup,P.ら,Biochem.J.310（1995）,997−1003;Guz,Y.ら,Development 121（1995）,11−18）、また、Pdx1を欠くマウスが膵臓を形成しないからである（Jonsson,J.ら,Nature 371（1994）,606−609）。膵臓でPax発現が開始されることにより内分泌前駆細胞は２つの集団に分割される。すなわち、Pax4とPax6の両方を発現する細胞は成熟β細胞に分化し、一方Pax6のみを発現する細胞はα細胞に分化する。Pax4の非存在は、これらの細胞にPax6が依然存在することとなるので、全ての前駆細胞をα細胞系統へと向かわせる。これは、ホモ接合性Pax4変異体マウスがβ細胞を欠失しているのに、正常なα細胞集団より大きいα細胞集団を有するという観察により支持される。Pax6の欠失はα細胞系列を完全に排除するか、または前駆細胞をβ細胞系列へと向かわせる。Pax4とPax6の両方が存在しないと、前駆細胞は成熟内分泌細胞へと発生することができない。したがって、両Pax遺伝子は膵臓の発生過程での内分泌細胞分化にとって必要なものである。
実施例6:膵臓δ細胞およびPP細胞におけるPax6の発現
ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax6−LacZ新生児マウスでのβ−ガラクトシダーゼ活性を調べることで、ソマトスタチン産生δ細胞とPP細胞におけるPax6発現を分析した（図10）。新生児膵臓のホルモン産生は、ソマトスタチンまたは膵臓ポリペプチド（PP）に特異的なモノクロナール抗体を用いる間接的免疫化学により証明した。ソマトスタチンまたはPPのいずれかを産生する細胞はPax6を発現し、Pax6はδ細胞とPP細胞でも発現されることが示された。両細胞型はランゲルハンス島の周辺に見いだされた。これらの細胞はホモ接合性動物に依然存在していたが、島へと組織化されなかった。新生児膵臓を摘出し、実施例２に記載のようにβ−ガラクトシダーゼ活性について染色し、一方間接的免疫化学は実施例３に記載のように実施した。ソマトスタチンとPPに対するモノクロナール抗体はDacko社（カタログ番号A0566,A0619）から入手した。
実施例7:ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax6変異体新生児マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン濃度
ヘテロ接合性またはホモ接合性新生児Pax6−LacZマウスから得られた完全な膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン産生はラジオイムノアッセイ（RIA）で定量した。野生型とヘテロ接合性の動物の間にはインスリンまたはグルカゴン濃度に有意差がなかった（図11）。ところが、ホモ接合性動物ではインスリン濃度が３分の１に低下し、グルカゴン産生は完全に失われていることが認められた。こうした結果は免疫化学により得られた結果（実施例４）と合致しており、Pax6は膵臓の発生過程でのα細胞の形成に必要とされ、またβ細胞内のインスリン遺伝子の調節に関与していることが示唆される。最近、Pax6タンパク質はインスリンプロモーターに結合してそれを活性化しうることも実証されている（Sanderら,Genes Dev.11（1997）,1662−1673）。
インスリンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット（カタログ番号RI−13K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。野生型および変異型マウスから妊娠e19で帝王切開により生まれる直前に膵臓を摘出した。個々の膵臓を酸抽出緩衝液（80mlエタノール,17.9ml蒸留水,2.1ml濃HCl）40μｌ中に入れ、氷上で音波処理してそれらのタンパク質内容物を抽出した。４℃で一夜インキュベーション後、サンプルを13000rpmで15分遠心した。次に上清を新しいチューブに移し、1:1000から1:10,000に希釈した各タンパク質抽出物についてRIAを実施した。簡単に述べると、各希釈抽出物100μｌをラット・インスリン抗体100μｌおよび125I−インスリン標識100μｌと共に４℃で18時間インキュベートした。次に、サンプルを1mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15分遠心した。上清をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数した。
グルカゴンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット（カタログ番号GL−32K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。新生児野生型および変異型膵臓から上記のようにタンパク質を分離し、各希釈サンプル100μｌをラット・グルカゴン抗体100μｌと共に４℃で18時間、続いて125I−グルカゴン標識100μｌと共に４℃で24時間インキュベートした。次に、サンプルを1mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15分遠心した。上清をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数した。
実施例8:膵臓腫瘍細胞系におけるPax6の発現
各種のインスリノーマ（RIN 5F,βTC1）、グルカゴノーマ（αTC 1−９）、ソマトスタチノーマ（RIN 14β）、島腫瘍（HC 13,HC 13T,RINm）および腺管癌（mPAC）細胞系におけるPax6発現レベルを分析した（図12）。βTC1およびHC 13細胞系では非常に高いPax6発現が検出され、一方RINm、RIN 5FおよびRIN 14β細胞系では中程度の発現レベルが認められた。mPAC、αTC 1−９およびHC 13T細胞系では発現がほとんど検出されないか、全然検出されなかった。
膵臓の内分泌腫瘍はしばしばホルモンの高分泌と関連がある。インスリンおよびグルカゴンの高レベル発現はPax6を高レベルで発現している腫瘍細胞系において観察され、このことは内分泌腫瘍での異常なPax6発現と異常なホルモン産生との間に関係が存在しうることを示唆する。さらに、Pax6、インスリンおよびグルカゴンの発現は、島腫瘍細胞系HC 13が繊維芽細胞系HC 13Tへと脱分化した後では消失した。様々な細胞系の発現レベルは、例えば、Sambrookら，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1989に記載されるような通常のノーザンブロット分析により評価した。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、1mlのホモジナイゼーション緩衝液（3M LiCl,6M尿素,0.1％SDS）を含むチューブに移し、氷上で20秒ずつ３〜４回音波処理した。４℃で一夜インキュベートした後、溶解物を18600rpmで30分遠心した。RNAペレットを1mlの3M LiCl中で２回洗浄し、可溶化緩衝液（10mM Tris−Cl pH7.5,0.5％SDS）500μｌに溶解し、フェノール−クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により精製した。20μｇのRNAをアガロースゲル上で電気泳動にかけ、標準的なノーザンブロット法に従ってナイロン膜に移行させた。その後、膜をマウスPax6 cDNAプローブ（EMBL受託番号X63963）、マウス・グルカゴンcDNAプローブ（EMBL受託番号Z46845）またはラット・インスリンcDNAプローブ（EMBL受託番号J04807）のいずれかとハイブリダイズさせた。細胞系RINm（カタログ番号CRL−2057）、RIM−5F（カタログ番号CRL−2058）およびRIN 14β（カタログ番号CRL−2059）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞系βTC1、αTC 1−９、HC 13TおよびmPacは、Rip1Tag2トランスジェニックマウス（Hanahan,D.,Nature 315（1985）,115−122）から通常の組織培養技術を用いて単離することができる。
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲により規定される本発明は、上記説明において示した特定の細部により限定されるものでなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多くの明らかな変更が可能であることを理解すべきである。
配列表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:2481塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:163..1470
（xi）配列：
0003631764.tif 000002
0003631764.tif 000003
0003631764.tif 000004
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0003631764.tif 000006
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:436アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：
0003631764.tif 000007
0003631764.tif 000008
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（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:1275塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:166..1161
（xi）配列：
0003631764.tif 000010
0003631764.tif 000011
0003631764.tif 000012
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:332アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：
0003631764.tif 000013
0003631764.tif 000014
【図１】
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0003631764.tif 000016
【図１１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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