(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボン酸の生産方法であって、
ａ）炭素源を有する培地にバイオマスを有するカルボン酸生産微生物を接種すること；
ｂ）該微生物を好気的雰囲気下インキュベートし、該微生物の急速増殖を促進し該微生物のバイオマスを増加させること；
ｃ）酸素を制御しながら供給し、好気的雰囲気を維持すること；
ｄ）該微生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、該培地の炭素源の濃度を０．５ｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌに維持すること；
ｅ）好気的雰囲気から酸素を奪い、嫌気的雰囲気にして該微生物に嫌気的代謝をさせること；
ｆ）該微生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、培地の炭素源の濃度を１ｇ／Ｌ以上に維持すること；及び
ｇ）該微生物の嫌気的代謝を用い、炭素源をカルボン酸に転換すること；
の各工程を含み、
前記カルボン酸生産微生物は、受託番号がＡＴＣＣ−２０２０２１である大腸菌と、ピルビン酸をジカルボン酸に転換するのを可能とするリンゴ酸酵素を発現するように遺伝子操作されている微生物とからなる群より選択される方法。
【請求項２】
前記ピルビン酸をジカルボン酸に転換するのを可能とするリンゴ酸酵素を発現するように遺伝子操作されている微生物が大腸菌及び乳酸桿菌からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は耐浸透圧性であり、それによって該微生物は、該微生物の代謝の阻害無くして有機酸を生産可能である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
嫌気的代謝を用いる微生物は、コハク酸、酢酸、及びエタノールを生産し、コハク酸が主産物である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
嫌気的代謝を用いる微生物は、リンゴ酸、酢酸、及びエタノールを生産し、リンゴ酸が主産物である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
嫌気的代謝を用いる微生物は、フマル酸、酢酸、及びエタノールを生産し、フマル酸が主産物である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
カルボン酸の生産方法であって、
ａ）炭素源を有する培地にバイオマスを有するカルボン酸生産微生物を接種すること；
ｂ）該微生物を維持されたｐＨ値と好気的雰囲気を有する環境中でインキュベートし、該微生物の急速増殖を促進し該微生物のバイオマスを増加させること；
ｃ）酸素を制御しながら供給し、好気的雰囲気を維持すること；
ｄ）該微生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、該培地の炭素源の濃度を０．５ｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌに維持すること；
ｅ）増加したバイオマスを有する該微生物を、嫌気的雰囲気を有する生産発酵槽へ移し、該微生物に嫌気的代謝をさせること；
ｆ）該微生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、生産発酵槽の炭素源の濃度を１ｇ／Ｌ以上に維持すること；及び
ｇ）該微生物の嫌気的代謝を用い、炭素源をカルボン酸に転換すること；
の各工程を含み、
前記カルボン酸生産微生物は、受託番号がＡＴＣＣ−２０２０２１である大腸菌と、ピルビン酸をジカルボン酸に転換するのを可能とするリンゴ酸酵素を発現するように遺伝子操作されている微生物とからなる群より選択される方法。
【請求項８】
前記ピルビン酸をジカルボン酸に転換するのを可能とするリンゴ酸酵素を発現するように遺伝子操作されている微生物が大腸菌及び乳酸桿菌からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は耐浸透圧性であり、それによって該微生物は、該微生物の代謝の阻害無くして有機酸を生産可能である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
嫌気的代謝を用いる微生物は、コハク酸、酢酸、及びエタノールを生産し、コハク酸が主産物である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
嫌気的代謝を用いる微生物は、リンゴ酸、酢酸、及びエタノールを生産し、リンゴ酸が主産物である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
嫌気的雰囲気を用いる微生物は、フマル酸、酢酸、及びエタノールを生産し、フマル酸が主産物である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ジカルボン酸の生産方法に関し、詳細には、リンゴ酸、フマル酸及びコハク酸などのジカルボン酸を大量に生産するために、大腸菌株を用いる発酵方法に関する。
発明の背景
カルボン酸及びその誘導体は、ポリマー、食品、医薬、及び化粧品での適用のための専門化学薬品として広範に使用される。例えば、コハク酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、テトラヒドロフラン、及びガンマブチロラクトンのようなプラスティック前駆体の製造に有用である。コハク酸由来の新製品は、ポリエステルの開発を含む絶えざる開発下にある。ポリエステルは、コハク酸とＢＤＯを結合させて製造する。一般的に、コハク酸のエステルは、より有害な溶媒に取って代わることができる新しく“グリーン”な溶媒としての可能性を有し、百万ドル以上の総市場価値をもつ毎年何百万ポンドの化学品の前駆体として役立つ。
再生できる供給原料から、リンゴ酸、コハク酸、及びフマル酸などのカルボン酸の生産は（この場合、発酵法による）、再生できない資源からこのような酸を得る、よりエネルギー集中的な方法に取って代われる方法である。コハク酸はプロピオン酸生産細菌による嫌気的発酵の中間体であるが、嫌気的発酵法では低収量及び低濃度しか達成されない。
多数のコハク酸生産生物が分離された。例えば、嫌気的ルーメン細菌、Bacteroides ruminicolaやBacteroides amylophilusである。しかし、ルーメン生物は特徴として発酵プロセスで不安定である。別のコハク酸生産生物は、Anaerobiospirillum succiniciproducens（A.succiniciproducens）である。嫌気的発酵法でコハク酸を生産するために、この生物の使用に関する幾つかの特許が発行された。Glassnerらによるこのような１つの特許、米国特許第５，１４３，８３４号は、中程度の収率で自然でコハク酸を生産させるために発酵法でのこの生物の使用を記載する。しかし、A.succiniciproducensを用いる発酵法では幾つかの問題がある。１つの問題は、該生物は絶対嫌気性菌であり、その培養は、酸素を全く含まない環境で行わなければならない。市販の発酵プラントでの該生物の増殖は困難で、非常に技術力のある作業者が必要である。A.succiniciproducensはまた、実験室規模の実施においてさえ取り扱いが困難で、好ましくない条件下で衰退しがちである。その衰退は逆転できない。該生物は市場の発酵法では決して使用されなかった。換言すれば、この特定の生物による製造規模の発酵の経験は存在しない。更に、コハク酸の高い収量を達成するために、該生物では二酸化炭素の外部供給が必要である。発酵法では、純粋の二酸化炭素の流れを発酵ブロスに供給しなければならない。A.succiniciproducensは、コハク酸と酢酸の混合物を生産する（コハク酸と酢酸のモル比は約２）。発酵ブロス中で高濃度の酢酸の存在は、コハク酸精製のコストを増加させる。共産物としての酢酸の生産は、高価なグルコースの１／３はコハク酸に転換されないことを示す。更に、A.succiniciproducens宿主株は、高濃度の塩に耐えられなく、更に中程度の濃度の産物によって阻害されるという点で、あまり耐浸透圧性ではないことが示された。A.succiniciproducensの使用の別の問題は、接種のための培地調製には、トリプトファンの添加が必要であり、また４つの異なる溶液の混合が必要であり、そのうちの１つは腐食性で毒性のＨ2Ｓを含む。
J.L.Stokes，1949，“Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli”J.Bacteriol．，57:147-158によって記載されたように、酸の混合物が大腸菌発酵から生産されることが長く知られてきた。しかし、発酵されたグルコース１モル当たり、ギ酸１．２モル、乳酸０．１−０．２モル、コハク酸０．３−０．４モルしか生産されない。カルボン酸を発酵で生産するための努力は、比較的多量の増殖基質、例えばグルコース、が必要で、増殖基質は所望の産物に転換されない。
Fairoz Mat-JanらはJ.Bacteriol．，v.171(1989)，pp.342-348で、分離された発酵的ＮＡＤ連関乳酸脱水素酵素欠損（ｌｄｈ）の大腸菌の変異株で行われた研究は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ欠損（ｐｆｌ）と共に存在していなければ嫌気的条件下で増殖欠損を示さないことを記載する。二重変異株（ｐｆｌ  ｌｄｈ）は、酢酸が補充されたときでさえ、グルコース又は他の糖で嫌気的に増殖できなく、一方ｐｆｌ変異体はそうすることができる。該研究では、コハク酸又はジカルボン酸の生産を考察も調査もしなかった。
コハク酸イオンは幾つかの嫌気的微生物の代謝経路での普通の中間体であるけれども、コハク酸、及びリンゴ酸やフマル酸などの他のカルボン酸を経済的に、大量又は高収率で生産する発酵法の必要性が当業界に存在する。方法は低コストの栄養素と基質を利用すべきであり、発酵速度は高生産性のために大きくあるべきで、発酵ブロス中の産物濃度は大きくあるべきである。
本発明の目的
それ故、従来技術によって示された不利な点と問題を克服するジカルボン酸生産の改良され、実際的で、経済的な方法を提供することが本発明の目的である。
高収率でのコハク酸、リンゴ酸及びフマル酸生産の改良され、実際的で、経済的な方法を提供することが本発明のもう一つの目的である。
高収率でのコハク酸、リンゴ酸及びフマル酸生産の、大腸菌変異株を用いる発酵法を提供することが本発明の更にもう一つの目的である。
高収率でのコハク酸、リンゴ酸及びフマル酸の生産のための、大腸菌変異株を用いる改良された、実際的な、経済的発酵方法であって、酸素化、グルコースレベル、ｐＨ、及び栄養素の添加速度の正確な制御と行いながら、単一容器で行う該発酵方法を提供することは、本発明の更に別の目的である。
本発明の更に別の目的は、本明細書の記載から明白となろう。
本発明の概要
本発明の一面によれば、前述の目的及び他の目的は、カルボン酸の生産方法であって、ａ）炭素源を有する培地にカルボン酸生産生物を接種すること；ｂ）該カルボン酸生産生物を好気的雰囲気下インキュベートし、該生物の急速増殖を促進し該生物のバイオマスを増加させること；ｃ）好気的雰囲気を維持するために酸素を制御しながら供給すること；ｄ）増加したバイオマスを有する生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、該培地の炭素源の濃度を約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌに維持すること；ｅ）好気的雰囲気から酸素を奪い、嫌気的雰囲気にし該生物に嫌気的代謝をさせること；ｆ）増加したバイオマスを有する該生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、培地の炭素源の濃度を１ｇ／Ｌ以上に維持すること；及びｇ）該生物の嫌気的代謝を用い、炭素源をカルボン酸に転換すること；の各工程を含む該方法によって達成される。
本発明のもう一つの目的によれば、他の目的は、カルボン酸の生産方法であって、ａ）炭素源を有する培地にカルボン酸生産生物を接種すること；ｂ）該生物を維持されたｐＨ値と好気的雰囲気を有する環境中でインキュベートし、該生物の急速増殖を促進し該生物のバイオマスを増加させること；ｃ）酸素を制御しながら供給し、好気的雰囲気を維持すること；ｄ）該生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、該培地の炭素源の濃度を約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌに維持すること；ｅ）増加したバイオマスを有する該生物を嫌気的雰囲気を有する生産発酵槽へ移し、該生物に嫌気的代謝をさせること；ｆ）該生物に炭素源を有する溶液を制御しながら与え、生産発酵槽の炭素源の濃度を１ｇ／Ｌ以上に維持すること；及びｇ）該生物の嫌気的代謝を用い、炭素源をカルボン酸に転換すること；の各工程を含む該方法によって達成される。
【図面の簡単な説明】
本発明の他の、及び更なる目的、利点、及び能力と共に、本発明のより良き理解のために、図面と共に、以下の開示及び請求の範囲を見られたい。
図１は実施例１に記載の実験の結果を示す。
図２は実施例２に記載の実験の結果を示す。
図３は実施例３に記載の実験の結果を示す。
図４は実施例４に記載の実験の結果を示す。
図５は実施例５に記載の実験の結果を示す。
図６は実施例６に記載の実験の結果を示す。
図７は実施例７に記載の実験の結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、制御された発酵法における大量のコハク酸、フマル酸及びリンゴ酸の新規で、実際的で、経済的な生産方法である。従来技術の問題点を克服するために、ＡＦＰ−１１１と命名した大腸菌（E.coli）の１株を本発明の発酵法で用いた。ＮＺＮ−１１１  大腸菌の変異株であるＡＦＰ−１１１は能力のある生物である。大腸菌は非常に取り扱い易い。大腸菌の分子生物学と生理学は詳細に知られている。それ故、方法の改良は、分子生物学又は方法のパラメーターの改変、又は両方により、容易に達成できる。更に、大腸菌は、バイオ医薬品や化学品の製造のために発酵法で広範に使用されてきた。この生物に関し豊かな製造スケールの経験がある。
大腸菌はまたコハク酸と酢酸の混合物を生産するが、非最適条件下ではコハク酸：酢酸のモル比は既に約３以上である。この比はかなり増加されうる。発酵ブロス中の酢酸の低濃度により、コハク酸の精製費用はかなり減少するであろう。更に、大腸菌は、高収量のコハク酸を得るために、二酸化炭素の外部供給は必要ではないかもしれない。二酸化炭素供給無しに、ピーク生産時間のコハク酸の収量は、二酸化炭素供給下でのA．succiniciproducensによって得られるものに匹敵する。
通常、嫌気的条件下、野生型大腸菌は発酵産物の混合物を生産するが、その内コハク酸は少量成分である。しかし、ＡＦＰ−１１１を嫌気性条件下増殖させると、主要代謝産物はコハク酸である。ＡＦＰ−１１１は、コハク酸、酢酸及びエタノールの混合物（コハク酸が主要産物である）を生産する独特の自然発生的なクロモソーム変異を有する。グルコース重量当たりコハク酸重量で最大収率９９％がＡＦＰ−１１１により生産される。ＡＦＰ−１１１の使用は、発酵法によるコハク酸の生産費用を大きく減少できる。
大腸菌発酵法は２段階からなる。最初に、発酵槽で高い細胞密度まで、好気性条件下、低グルコース環境下、ＡＦＰ−１１１株を増殖させた。本発明では、生物のバイオマスの成長とジカルボン酸の生産の両方のために炭素源として、グルコースを用いる。所望の細胞密度が達成されたとき、空気供給を止め、該生物が嫌気性代謝に転換するようにさせ、最終産物としてリンゴ酸、フマル酸、及びコハク酸を含むジカルボン酸の生産をさせる。本発明の一実施形態では、この２段階発酵法を単一容器で行う。
大腸菌におけるコハク酸生産の生化学的経路は、一連の転換段階を含む。ピルビン酸は最初にオキサロ酢酸、次いでリンゴ酸、フマル酸、最終的にコハク酸に転換する。これらの酸のうち、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸は産業的に重要である。ＡＦＰ−１１１は最終産物としてコハク酸を蓄積する。フマル酸が所望産物であるならば、フマル酸からコハク酸への転換を担う酵素をコードする遺伝子を欠失させると、得られる生物はコハク酸の代わりにフマル酸を蓄積するであろう。同様に、リンゴ酸が所望産物ならば、リンゴ酸からフマル酸への転換を担う酵素をコードする遺伝子を欠失させ、リンゴ酸生産生物を作出する。分子生物学の現在の技術状態と大腸菌の連関地図の全部の知識により、特定の遺伝子の欠失は単純な仕事である。コハク酸生産の発酵法は、リンゴ酸生産生物とフマル酸生産生物をそれぞれ用いて、リンゴ酸とフマル酸の生産に容易に適用される。
本方法全体は養分を供給するバッチである。この方法では、有機窒素源及び成長因子、並びに無機栄養分として、ライトスティープ（light steep）水をも含む濃縮グルコース溶液を十分な速度で発酵槽に供給し、残りのグルコース濃度を１ｇ／Ｌ以下に保つ。低グルコース濃度は、過剰の酢酸形成を防ぐために必要である。好気性増殖相での高濃度の酢酸の形成は、結局生物の増殖を止め、高細胞密度は達成できない。嫌気性生産相では、高酢酸濃度はコハク酸の生産速度を減少させ、結局それを完全の止めうる。ＡＦＰ−１１１の使用は、発酵法によるコハク酸の生産費用を大きく減少できる。
市販の発酵槽での低グルコース濃度の維持は、オフガス（off-gas）分析又はオンライングルコース分析に基づくグルコース供給速度のコンピューター制御により容易に達成される。これは非常にありふれた産業上の実務になった。
嫌気性発酵は、グルコースのような燃料からエネルギーを得るための最古の経路である。嫌気性細胞で、それは唯一のエネルギー生産プロセスである。ほとんどの能力のある細胞で、それはグルコース異化の義務的第１段階であり、続いてトリカルボン酸サイクルにより発酵産物の好気的酸化が起る。
発酵の最も広範に使用される型は、終わりから二番目の産物がピルビン酸である解糖系である。ピルビン酸の処分は、どの遺伝子が生物に存在するかによる。乳酸脱水素酵素の存在下、ＮＡＤＨとＨ+を介し、ピルビン酸が乳酸に還元されるときに、解糖系は終わる。ピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコール脱水素酵素の存在下、エタノールが生成する。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）の存在下、酢酸、エタノール及びギ酸、又は水素プラス二酸化炭素の生産で発酵は終わる。
細菌ゲノムの単一又は複数の変異によって、ピルビン酸異化を担うその生物での遺伝子が欠失するならば、ピルビン酸が蓄積するであろう。嫌気的に増殖している大腸菌では、その遺伝子はピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）と乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）である。大腸菌株ＮＺＮ１１１は、Dr.David Clark，Southern Illinois University，Carbondale，III．62901から研究者には広範に入手可能であるが、両方の遺伝子に変異を有し、大腸菌クロモソームＤＮＡ配列の変化によりｐｆｌとｌｄｈの両方が不活化されている。ＮＺＮ１１１それ自体は発酵で増殖できない。更なる遺伝子変化を適用することによって、ＮＺＮ−１１１から得られたＡＦＰ−１１１は、嫌気的条件下、コハク酸、酢酸及びエタノールの混合物を生産する（コハク酸が主要産物である）。
自然発生か、選択的培養か、又はプラスミド形質転換によって起るＮＺＮ１１１の更なる変化により、結局、主要産物としてコハク酸を生産するＡＦＰ−１１１が出現することが見出された。
ＡＦＰ−１１１型の特徴に至るＮＺＮ１１１への自然発生的クロモソーム変異は、選択的環境が連続的培養技術で用いられるときに起る。第１段階で、ＮＺＮ１１１バイオマスは、Luria Bertaini(LB)ブロス（０．５％酵母エキス、１％トリプトン、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）などの栄養の豊富な培地で好気的に増加させる。ｍＬ当たり約１０9〜１０10個の細胞の収量が好ましい。インキュベーション時間は変化できるが、３７℃、標準圧力下で５〜７時間の増殖相持続によって上記濃度になる。
第２段階として、ピルビン酸を異化できる細胞（変異株）の増殖のみを容易にするために、蓄積されたバイオマスを、グルコースに富む嫌気性条件に置く。例えば、グルコース約１〜３０ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ、及びカナマイシン３０μｇ／ｍＬを有する１．５％寒天プレートに細胞を広げる。カナマイシン耐性の遺伝子は、ＮＺＮ１１１中の乳酸脱水素酵素の遺伝子中に挿入する。培養物を、制御された嫌気性雰囲気下、３７℃で２４時間増殖させる。良い結果を生み出す一つの嫌気性雰囲気は二酸化炭素と水素の混合物であり、その混合物は、ＧＡＳＰＡＫTMとしてBecton-Dickinson，Cockeysville，Marylandから市販の雰囲気制御装置の使用により供給された。
インキュベーション時間後、ＡＦＰ１１１の多数のコロニー（約２×１０7個）を得、それらの約半分は、液体培地で増殖でき、産物の所望の混合物を生産できた。
プラスミド形質転換の場合、ＮＺＮ１１１をリンゴ酸脱水素酵素の変異体の遺伝子ｍｄｈを有するプラスミドｐＭＤＨ１３で形質転換すると、ピルビン酸異化により、乳酸を再び生産し始める。この形質転換体（ＮＺＮ１１１（ｐＭＤＨ１３）の連続培養により、自然発生のクロモソーム変異を有するＡＦＰ１１１が得られる。ＡＦＰ１１１は、発酵産物としてコハク酸、酢酸及びエタノールの混合物を生産し、増殖培地で使用されたグルコースの重量と比較して９９重量％までコハク酸が生産される。ｐＭＤＨ１３の開発と形質転換プロトコルは、W.E.Boernkeら，（1995年９月10日）Archives of Biochemistry and Biophysics 322，No.1 pp.43-52（引用により本明細書に含まれるものとする）に開示のものと同様である。
本明細書記載の株の実験的評価のために、細胞密度０．５〜１０  ＯＤ600になるまで、グルコースを含まない増殖培地（ルリアブロス）で好気的に細胞を培養する。
ＡＦＰ１１１の適当なバイオマスが得られると、次いで密封した発酵反応槽に注入又は移転させ、その中に含ませた。約１０〜３０ｇ／Ｌの濃度のグルコース、又はキシロース、ガラクトースもしくはアラビノースのような幾つかのその他の適当な炭水化物とブロスを混合する。そのときに含まれた混合物を、嫌気性条件が達成される雰囲気変化に曝す。その雰囲気変化を達成する一つの方法は、外界空気を二酸化炭素と交換するガシングステーション（gassing station）によってである。
発酵反応槽への混合物の導入前に、中性ｐＨ近くに維持するように、ＭｇＣＯ3、ＣａＣＯ3、又はＣａＭｇ（ＣＯ3）2などの緩衝物質の適当量を該槽に供給する。典型的には、緩衝化物質の約４〜８重量％を適当な緩衝化能力のために用いる。特に、発酵液体に時間と共に放出される緩衝化能力を与えるように、緩衝化物質が固体として存在するときに、良い結果が得られる。
上記方法により、高収量のコハク酸が得られる。例えば、コハク酸：酢酸の比６：１（重量比）が収率９９％で得られた。更にＨ2濃度が約２５〜１００％の水素ガスの存在下に発酵を行うときでさえ、コハク酸：酢酸の比は増加する。これらの結果は、従来技術の生物の状態とは異なり、変異株ＡＦＰ１１１は還元剤として外来の水素を用いることを示す。例えば、ルリアブロス、グルコース、緩衝化剤、及び水素ガスと二酸化炭素（ＣＯ2は緩衝化剤から放出される）の混合物が存在するとき、９に近いコハク酸：酢酸の比が得られる。これらの結果は、望ましくない酢酸生産副反応無くして、所望の産物へのグルコースの異化に目標を定めることのもう一つの利点を反映する。
下記の表１は、元の親株Ｗ１４８５（これもSouthern Illinois Universityから入手できる）、ＮＺＮ１１１及びＡＦＰ１１１の場合のジカルボン酸の産物分布を示す。
0003681404.tif 000002
１００％二酸化炭素雰囲気を用いるとき、コハク酸生産は高められ、コハク酸濃度は約４５ｇ／Ｌに達し、生産性は約１．６ｇ／Ｌ／時間に達し、グルコースのグラム数に対するコハク酸のグラム数の％収率は９９％に達し、酢酸に対するコハク酸の重量比は約６に達する。
大腸菌ＮＡＤ依存性リンゴ酸酵素がＮＺＮ１１１中で生産されるとき（遺伝子ｍａｅＡの付加と誘導によって）、コハク酸も生産される。この場合、誘導性プラスミドｐＭＥＥ２−１を用い、形質転換体ＮＺＮ１１１（ｐＭＥＥ２−１）中のリンゴ酸酵素遺伝子の発現が可能となる。
大腸菌ＭＣ１０６１から分離されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによるリンゴ酸酵素のクローニングのための鋳型として用いた。大腸菌ＭＣ１０６１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、得られた消化産物を１％アガロースゲルでサイズ分離した。リンゴ酸酵素遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントのサイズを、上記のように、PhotoGene Nucleic Acid Detection System(Cat.8192SA)によるサザンブロット解析を用い決定した。
プライマーは該遺伝子の発表された部分ＤＮＡ配列に基づいた。
0003681404.tif 000003
これらのプライマーを、標準１００μＬのＰＣＲ反応液中で、ゲノムＤＮＡ約２０ｎｇと１μＭの濃度で混合した。ＰＣＲ反応により、リンゴ酸酵素遺伝子の予期される０．８ｋｂの内部フラグメントが産生した。ＰＣＲ産物をQiaex Gel Extraction Kit(Qiagen,Inc.,Chatsworth，California)を用い精製し、BioNick Labeling System(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)を用いビオチニル化した。ビオチニル化ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩと幾つかの他の第２のエンドヌクレアーゼの一つで切断されたゲノム大腸菌ＤＮＡのサザンブロット解析でプローブとして用いた。リンゴ酸酵素遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ消化ＤＮＡの２．０−２．５ｋｂフラグメントを含む領域に位置していると決定された。
大腸菌ＤＮＡ  １μｇをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、分取用１％ＴＡＥアガロースゲルでサイズ分離した。２．０−２．５ｋｂ領域の大腸菌ＤＮＡフラグメントを分離し、Qiaex Gel Extraction Kitを用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、小エビアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１９のポリリンカー領域に連結した。次いで連結体をＰＣＲ反応の鋳型として用い、リンゴ酸酵素遺伝子全体を増幅した。連結混合物１μＬを鋳型として用い、センスプライマーGATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT（これはリンゴ酸酵素遺伝子を標的とした）１μＭと、アンチセンスプライマーTTTTCCCAGTCACGACGTTG（これは連結したｐＵＣ１９  ＤＮＡを標的とした）０．２５μＭを用いた。増幅パラメーターは、９４℃変性、５５℃１分のハイブリダイゼーション、７２℃３分の伸長、合計３５サイクルであった。ＰＣＲ産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルで分析し、１．８ｋｂフラグメントを分離し、Qiaex Gel Extraction Kitを用い精製した。ＰＣＲ産物の一部をＢｃｌとＢｇｌで消化し、該産物はリンゴ酸酵素遺伝子を含むことを示した。ＰＣＲ産物の残りをＰｓｔＩとＮｃｏＩで消化し、ゲル分離し、再精製し、次いで、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した発現ベクターｐＴＲＣ９９ａ（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）のポリリンカー領域に連結した。大腸菌ＮＺＮ１１１株を、標準的方法により連結混合物で形質転換し、得られたコロニー（実験から４コロニーと対照から２コロニー）を、Ｘｍｎを用いる制限フラグメント解析によってリンゴ酸酵素遺伝子についてアッセイした（０．７ｋｂ、１．４ｋｂ、３．９ｋｂが予期された）。クローニングされたリンゴ酸酵素遺伝子を含むプラスミドをｐＭＥＥ３と命名した。
ＮＺＮ（ｐＭＥＥ３）の１００ｍＬ培養液を一晩培養で増殖させ、プラスミドを、Qiagen Plasmid Kitを用い分離した。分離したプラスミドを、ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。新規プライマーは、リンゴ酸酵素の第１のクローニングで用いたプライマーから８１塩基対下流である代わりのＮ−末端を与えるように設計した。プラスミド２０ｎｇを鋳型として用い、センスプライマーAGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC  １μＭと、アンチセンスプライマーCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC  １μＭを用いた。増殖パラメーターは上記と同じであった。ＰＣＲ産物の一部を再度、ＢｃｌＩとＢｇｌＩＩを用いる制限マッピングで確かめたが、該産物はリンゴ酸酵素遺伝子を含むことが証明された。ＰＣＲ産物の残りをＰｓｔＩとＮｃｏＩで消化し、ゲル分離し、再精製し、次いでＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断された発現ベクターｐＴＲＣ９９ａ（Pharmacia，Inc．Piscataway，N.J.）のポリリンカー領域に連結した。大腸菌ＪＭ１０９株を、標準的方法によって連結混合物で形質転換させ、得られたコロニー（３つの実験クローンと１つの対照クローン）を、制限フラグメント解析によって所望の挿入体についてスクリーニングした。リンゴ酸酵素遺伝子のこのバージョンを含むプラスミドをｐＭＥＥ２と命名した。
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢブロス３０ｍＬに、ｐＭＥＥ２の一晩培養液１．５ｍＬを植菌した。増殖２時間後、３０ｍＬ培養液を３−１０ｍＬアリコートに分離した。酵素活性を、０、１００μＭ、１０μＭ  イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。サンプル２ｍＬを、０、１、２、３、４時間で各培養液から取り出した。タンパク質は標準的方法で分離し、活性は上記のように測定した。
時間に対する酵素生産を下記の表２に示す。
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ＮＺＮ１１１（ｐＭＥＥ２）の培養液２つと対照としてのＮＺＮ１１１（ｐＴＲＣ９９ａ）を、アンピシリンを含む２ｍＬ  ＬＢ培地で好気的に増殖させた。各培養液を１０μＭ  ＩＰＴＧで誘導した。３時間後、ＯＤ600は０．６から４．８に増加した。培養液１ｍＬを、グルコース２０ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、固体ＭｇＣＯ3  ０．５ｇを含むＬＢ培地１０ｍＬを含む密封５８ｍＬバイアルに注入した。雰囲気は、空気：水素：二酸化炭素（１：１：２比）からなり、圧力は外界圧力より１気圧上であった。培養液から直ちに、そして３７℃でのインキュベーションの間、間隔をあけてサンプリングした。このとき、１００ｒｐｍで振盪を行った。下記の表３は、ＮＺＮ１１１を未加工ベクター（ｐＴＲＣ９９ａ）対ｐＭＥＥ２で形質転換したときの産物収量の比較を示す。
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表３で示した結果は、約１９〜４２時間のインキュベーション時間の結果である。
コハク酸の前駆体であるリンゴ酸は、その生産で一つのより還元性ではない段階が必要なので、コハク酸よりも原則的により良い最終産物である。リンゴ酸生産の理論上の化学量論では、グルコース１モルと二酸化炭素２モルが２モルのリンゴ酸に変換される。リンゴ酸生産それ自体は、グルコースの浪費無くしてできる。フマル酸はリンゴ酸の脱水産物であり、還元経路でコハク酸の前駆体であるが、フマル酸も生成できる。リンゴ酸とフマル酸の両方とも、副産物の生産無くして生成できるが、リンゴ酸の高溶解性のために、リンゴ酸生産は大規模生産法のために好ましい。
リンゴ酸酵素（ｍａｅＡなど）の生産を担う遺伝子による適当な細菌の形質転換により、余剰のリンゴ酸が得られる。一般的に、理想的細菌は乳酸脱水素酵素活性とピルビン酸を代謝する他の酵素を欠き、そのためにピルビン酸が蓄積するであろう。代わりに、リンゴ酸を直接生産するように、細菌はｍａｅＡで形質転換される。生産されたリンゴ酸の高レベルを維持するために、リンゴ酸を乳酸に戻し転換、又はフマル酸もしくはコハク酸に転換できてはいけない。ある種の乳酸桿菌（Lactobacillus）株はこのような転換を担うマロラクテート酵素、フマラーゼ、フマレートレダクターゼを欠くので、これらの株は発酵法でリンゴ酸生産の特に好適な候補である。乳酸桿菌の適切性は、非常に大きい浸透圧耐性という特徴を備えれば更に高められる。Lactobacillus gasseriはこのような操作の近々の宿主である。というのは、それは、グルコースの発酵中、リンゴ酸を代謝しないことが示され、遺伝的にかなりキャラクタライズされているからである。Lactobacillus caseiは、Lactobacillus gasseriよりも比較的大きい浸透圧耐性を示すので、Lactobacillus caseiもかなりの可能性を有する。
一般的に、機能ある乳酸脱水素酵素遺伝子を欠く乳酸桿菌宿主で誘導されたｐＴＲＫ３２７のような適切な乳酸桿菌発現ベクター中のリンゴ酸酵素遺伝子（ｍａｅＡなど）により、リンゴ酸生成が可能となろう。このことは、宿主の乳酸脱水素酵素遺伝子中へのリンゴ酸酵素の挿入により達成できよう。
カルボン酸生産のための以下の実施例で使用される化学薬品には、酵母エキスとトリプトン（Difco）、グルコース（A.E.Staley）、ライトスティープ水（Loudon，TnにあるA.E.Staley corn processing plant）、無機化学品（E.Merck Science又はJ.T.Baker，試薬グレード）などがある。使用される装置には、発酵槽−１Ｌ（Virtis）、発酵槽−５Ｌ（New Brunswick，Bioflow 3000）、ポンプ（Cole-Parmer，Master Flex）、ｐＨプローブ（Cole-Parmer）、ｐＨコントローラー（Cole-Parmer，Chem Cadet）、溶解酸素測定器（Cole-Parmer，01971-00）、溶解酸素プローブ（Ingold）、オートクレーブ（Amsco，Eagle 3000）、シェーカー（New Brunswick）、極低温用バイアル（Cole Parmer）などがある。
グルコースアナライザーはYellow Springs Instrument Company(YSI2700 Select)から得た。更に、ＣＤ測定のための分光光度計はMilton Roy（SPEC 21D）製である。
大腸菌ＡＦＰ−１１１株はArgonne National Laboratoryから得た。ＡＦＰ−１１１株はＮＺＮ−１１１由来であった。ストックカルチャーは、２５０ｍＬフラスコ中に１ｇ炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ3）を入れ、フォームプラグで覆い、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。次に、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１０ｇ／Ｌ、リン酸カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）７ｇ／Ｌ、リン酸カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）３ｇ／Ｌを含む５００ｍＬ培地を調製した。次いで、培地を、１２１℃で２０分オートクレーブし、室温に冷却した。培地５０ｍＬを、炭酸マグネシウムを含む第１のフラスコに無菌的に移した。次いで、Argonne National Laboratoryから送られた寒天スラントから完全な１植菌ループのＡＦＰ−１１１をフラスコに植菌した。次いで、植菌したフラスコをシェーカー（２５０ｒｐｍ，３７℃）中でインキュベートした。
次いで、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ７ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）０．２ｇ／Ｌを含む１Ｌの培地を調製した。培地は１２１℃で２０分間オートクレーブし、冷却した。次いで、８５０ｍＬを１Ｌ発酵槽に無菌的に移した。
２５０ｍＬフラスコを１６時間インキュベートしたとき、その内容物を全部、１Ｌ発酵槽に無菌的に移した。発酵槽は３７℃、ｐＨ７．０に維持した。空気を発酵槽の底に流入させ、回転翼速度を５００ｒｐｍ以上にセットし、酸素制限を避けるために、発酵ブロスへの十分な酸素移転を可能とした。ｐＨはｐＨコントローラーで７に維持されたが、ｐＨコントローラーは必要なときにポンプを作動し、発酵槽へ塩基溶液を加えた。
塩基溶液は、２５０ｍＬ脱イオン水を、攪拌バーを有する目盛り付き５００ｍＬシリンダーに入れることによって調製した。目盛り付きシリンダーは、２枚のオートクレーブ用ペーパーカバーで覆い、１２１℃で２０分間オートクレーブし、次いで室温に冷却した。次いで、３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）２５０ｍＬを加えた。次いで、油オーバーレイを置き、アンモニアが逃げるのを防止した。油は１２１℃で２０分オートクレーブした後、シリンダーに加えた。溶液は、磁石プレート上で攪拌して混合した。得られた塩基溶液は１５％ＮＨ4ＯＨ溶液であった。
グリセロール溶液を作製するために、グリセロール１５ｇを小フラスコに入れ、それに脱イオン水１５ｍＬを加えた。小攪拌バーをそのフラスコに加え、次いでフラスコをフォームプラグで覆い、磁石プレート上で混合し、５０％グリセロール溶液を作製した。グリセロール溶液を１２１℃で２０分オートクレーブし、次いで室温に冷却した。
発酵槽のグルコース濃度が約１ｇ／Ｌであるとき、発酵槽から３０ｍＬを無菌的に取り出し、５０％グリセロールフラスコに加えた。次いで、混合液を磁石プレート上で攪拌した。次いで、混合液を無菌的に極低温用バイアル（製造業者によって包装前に滅菌されている）に移した（１バイアル当たり約１．２ｍＬ）。バイアルを密封し、−７０℃フリーザーで保存した。これらのバイアルは、以下の実施例全てでＡＦＰ−１１１ストックカルチャーとして役立った。
実施例１
振盪フラスコで植菌材料を作出した。培地は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  １４ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ６ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4  ０．２ｇ／Ｌを含んだ。培地５０ｍＬを２５０ｍＬフラスコに入れた。フラスコに栓をし、１２１℃で２０分間オートクレーブし、室温に冷却し、一つのストックカルチャーバイアルからの１ｍＬを植菌した。次いで、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。発酵培地は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ０．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4  ０．２ｇ／Ｌを含んだ。培地１Ｌを調製し、１２１℃で２０分オートクレーブし、室温に冷却し、次いで８５０ｍＬを１Ｌ発酵槽に移した。フラスコの内容物全部を発酵槽に植菌した。（発酵槽培地は１０ｇ／Ｌ未満の低濃度のグルコースを含む。）発酵は、空気流入を行いながら、３７℃、ｐＨ７．０で行った。ｐＨコントローラーの作用により、必要に応じて１５％ＮＨ4ＯＨ溶液を加えることにより、ｐＨを７．０に保った。発酵ブロス中の最初のグルコースが消費されたとき、供給ポンプが作動し、発酵槽にフィード溶液を加えた。
フィード溶液（溶液１）は、脱イオン水４００ｍＬ中にグルコース２５０ｇとライトスティープ水５０ｇを溶解して作製した。この溶液１を１２１℃で２０分間オートクレーブし、室温に冷却した。次いで、溶液２のために、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ７ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ３ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２２．５ｇ、ＭｇＳＯ4  １ｇ／Ｌを脱イオン水１００ｍＬに溶解した。次いで、その溶液を１２１℃で２０分間オートクレーブし、室温に冷却し、溶液１に加えた。得られた溶液を、発酵槽への供給液として用いた。
供給ポンプの速度は手動で調節し、発酵槽内の残りのグルコース濃度を１ｇ／Ｌ以下に保った。グルコース濃度が１ｇ／Ｌを超えたとき、ポンプの速度を減少させた。グルコース濃度があまりに高いとき、即ち約５ｇ／Ｌ以上のとき、グルコース濃度が１ｇ／Ｌ未満に落ちるまでポンプのスイッチを切った。最初の２４時間、発酵槽には空気を供給し、好気性環境にし、生物が高細胞密度まで増殖させた。６６０ｎｍで測った光学密度（ＯＤ600）は２４時間で２４であった。次いで、空気供給を止め、嫌気性環境にし、生物がコハク酸生産のために嫌気性代謝に入るようにさせた。嫌気性条件は、実験の最後まで維持した。嫌気性段階では、グルコース濃度は１ｇ／Ｌ以上に維持した。実施例１の結果は図１ニプロットしてあり、以下の表４に要約する。
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実施例２
この実施例の実験は、空気供給は２４時間後の代わりに６時間後に断ったことを除いて実施例１と全く同じように行った。空気を断ったときにＯＤ600は６であった。
結果は図２にプロットし、表５に要約してある。
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結果は、発酵槽で好気性から嫌気性へより早く移行することによる顕著な改良を示した。
実施例３
この実施例で使用した培地は以下のものを含んでいた。即ち、酵母エキス２ｇ／Ｌ、トリプトン１５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １．３ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2  ０．０１ｇ／Ｌ。４回の発酵を５Ｌ発酵槽で行った。これらの実験のｐＨは、必要に応じて５Ｎ  ＮａＯＨを加えることによって６．２、６．６、７．０、７．４に制御した。植菌材料は、ｐＨ７．０に調整した同じ培地を用い、振盪フラスコ中に作出した。発酵槽では、ＯＤ600が６に達するまで（約５〜６時間）、空気供給及び５００ｒｐｍの回転翼速度により細胞を好気的に増殖させた。次いで攪拌を２５０ｒｐｍまで下げ、空気供給を純粋な二酸化炭素に変えた。
実施例３の結果は図３にプロットし、表６に要約する。表６は、異なるｐＨ値での１００時間の発酵結果の比較を示す。
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結果は、コハク酸は、広範囲のｐＨ、好ましくは６．６〜７．０で生産できることを示した。
実施例４
この実施例では、酵母エキスとトリプトンの両方を、コーン加工産業の非常に安価な副産物であるライトスティープ水によって置き換えた。ライトスティープ水は、５０％ＮａＯＨによってスティープ水のｐＨを７．０に調整して製造した。懸濁固体を、WhatmanフィルターペーパーＮｏ．２による濾過で除去した。清澄な濾液を発酵実験で用いた。
植菌材料を振盪フラスコで作出した。溶液は以下のもので調製した。即ち、ＮａＣｌ  ２０ｇ／Ｌ、Ｋ2ＰＯ4  ２８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １２ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4  ０．４ｇ／Ｌ。次いで、溶液を１２１℃で２０分間オートクレーブした。次いで、ライトスティープ水濾液３０ｍＬを２５０ｍＬフラスコに加えた。フラスコに栓をし、１２１℃で２０分間オートクレーブし、次いで室温に冷却した。次いで、そのフラスコに溶液１（実施例１より）３０ｍＬを加えた。それ故、この培地は５０％ライトスティープ水濾液を含んでいた。そのフラスコに、グリセロールストックカルチャーバイアル（実施例１）０．１ｍＬを植菌し、３５℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
溶液２は以下のものにより調製した。即ち、ＮａＣｌ  ２０ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ２．８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １．２ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4  ０．４ｇ／Ｌ。次いで、この溶液を１２１℃で２０分間オートクレーブし、室温に冷却した。１Ｌ発酵槽に、４２５ｍＬライトスティープ水濾液を加えた。発酵槽を１２１℃で２０分間オートクレーブし、室温に冷却した。次いで、溶液２を４２５ｍＬ  １Ｌ発酵槽に加え、発酵培地は５０％ライトスティープ水濾液を含むことになった。発酵槽に振盪フラスコの内容全部を植菌した。発酵は３７℃、ｐＨ７．０で行った。ｐＨは、必要により１．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加えて維持した。この溶液を１２１℃でオートクレーブして滅菌した。６時間発酵槽に空気供給を行って、最初に細胞を好気的に増殖させた。この時間の間、溶解酸素をモニターした。たまに、溶解酸素は飽和の５％未満に落ちたが、空気の連続的供給により、発酵槽内の状態はまだ好気性であった。その時間の最後に、空気を断ち、該生物の嫌気性代謝によるコハク酸生産をスタートさせた。同時に、ポンプを作動させ、発酵槽に約５００ｇ／Ｌグルコースを含む溶液を供給した。供給ポンプの速度は、発酵槽ブロスのグルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に保つように手動で調整した。
実施例４の結果は図４にプロットし、表７に要約する。表７は、５０％ライトスティープ水発酵培地中でのコハク酸の蓄積を示す。
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これらの結果は、高価な酵母エキスとトリプトンの両方を安価なライトスティープ水で置き換えた安価な培地でコハク酸は生産できることを示した。
実施例５
この実施例では、振盪フラスコと発酵培地の両方でのライトスティープ水濃度は２５％に減少させた。他の条件は実施例４に記載のものと全く同じであった。使用したより少量のライトスティープ水による体積不足を補うために、水を加えた。
結果を図５にプロットし、表８に要約する。表８は、２５％ライトスティープ水発酵培地でのコハク酸の蓄積を示す。
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結果は、ライトスティープ水が２５％まで減少したより経済的な培地でさえ、コハク酸は生産できることを示す。
実施例６
この実施例では、振盪フラスコと発酵培地の両方のライトスティープ水濃度は２５％であり、塩基は１．５Ｍ炭酸アンモニウムであった。他の条件は実施例４に記載のものと同じであった。
結果を図６にプロットし、表９に要約する。表９は、ｐＨ制御を炭酸アンモニウムで行う２５％ライトスティープ水発酵培地中でのコハク酸蓄積を示す。
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結果は、炭酸アンモニウムや炭酸マグネシウムなどのような炭酸ナトリウム以外の炭酸塩が、コハク酸発酵法におけるｐＨ制御のために使用できることを示した。
実施例７
４つの実験をこの実施例で記載する。２つの実験では、振盪フラスコと発酵培地でのライトスティープ水濃度は２５％であり、塩基は２Ｍ  ＮａＯＨであった。その他の２つの実験ではライトスティープ水濃度は５０％であり、塩基は１５％ＮＨ4ＯＨであった。ｐＨ制御に同じ塩基を用いる２つの実験の各セットでは、嫌気性代謝によるコハク酸の生産のための嫌気性相の間、１回の実験で約１００ｍＬ／分で純粋二酸化炭素を発酵槽に供給した。
結果を図７にプロットし、表１０に要約する。表１０は、ｐＨ制御を水酸化アンモニウム及び水酸化ナトリウムで行う、ライトスティープ水発酵培地でのコハク酸蓄積を示す。
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結果は、炭酸塩以外の塩基がｐＨ制御に使用されるならば、嫌気性相の間、発酵槽への二酸化炭素ガスの供給が、かなりのコハク酸生産に必要であろうことを示す。
本発明は、発酵によるリンゴ酸の生産方法も提供する。コハク酸の前駆体であるリンゴ酸は、その生産で一つのより還元的ではない段階を必要なので、コハク酸よりも原則的により良い最終産物である。リンゴ酸生産の理論的化学量論では、グルコース１モルと２モルの二酸化炭素が２モルのリンゴ酸に変換される。リンゴ酸の生産自体はグルコースの浪費無くしてできる。フマル酸はリンゴ酸の脱水産物であり、還元経路でコハク酸の前駆体であるが、フマル酸も生成できる。リンゴ酸とフマル酸の両方とも、副産物の生産無くして生成できるが、リンゴ酸の高溶解性のために、リンゴ酸生産は大規模生産法のために好ましい。
本発明はまた、発酵槽と固定タンクからなる連続的発酵法でもありうる。固定タンクの底の細胞は発酵槽に戻され、細胞濃度を増加させ、次に生産性を増加させる。混合を止めると、細胞は凝集し、非常に良く沈殿することが観察された。
コハク酸はまた、発酵槽と限外濾過ユニットからなる連続的発酵法により生産される。このユニットに集められた細胞は発酵槽に戻され、細胞濃度を増加させ、次に生産性を増加させる。限外濾過ユニットによるブロスからの発酵産物の除去は、産物阻害を無くし、収量を増加させる。
コハク酸はまた、吸着剤を連続的に発酵槽に加え、発酵槽から除去する連続的発酵法により生産される。ブロスから発酵産物の除去は産物阻害を無くし、収量を増加させる。
コハク酸はまた、直列の２個の発酵槽からなるバッチ法により生産される。該生物は、第１発酵槽中で好気的条件下高細胞密度まで増殖する（増殖発酵槽）。次いで、バイオマスを第２発酵槽（生産発酵槽）に移転させる。第２発酵槽では、コハク酸の生産を促進するために嫌気的条件を適用する。次いで、増殖発酵槽は空にされ、もう一つの生産発酵槽への転移のためにより大きいバイオマスを増殖させるために使用できる。生産時間は増殖時間よりずっと長いので、１個の増殖発酵槽を用いて、幾つかの生産発酵槽のためにバイオマスを提供できる。
本発明の好適実施形態と現在考えられるものを記載したが、種々の改変や修飾が、請求の範囲で規定された発明の範囲から離れること無しになしうることは当業者に明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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