(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの偏光ビームスプリット面と該偏光ビームスプリット面を挟んで該偏光ビームスプリット面に対して異なる距離に配置した二つの全反射面を備えた偏光ビームスプリッタを用いることにより、該偏光ビームスプリッタに入射したレーザビームを分割して該入射したレーザビームの２倍の数のレーザビームを出力することを特徴とするマルチスポット光形成方法。
【請求項２】
前記偏光ビームスプリッタに入射するレーザビームを、前記少なくとも一つの偏光ビームスプリット面に対して４５度の方向から入射させることを特徴とする請求項１記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項３】
前記偏光ビームスプリッタに入射するレーザビームは、円偏光又は前記偏光ビームスプリット面に対して４５度の直線偏光であることを特徴とする請求項１記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項４】
前記偏光ビームスプリッタから出射したレーザビームを１／４波長板を透過させて円偏光のレーザビームとすることを特徴とする請求項３記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項５】
前記偏光ビームスプリッタに入射させるレーザビームが、複数配列されたレンズにより形成された収束レーザビームであることを特徴とする請求項１記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項６】
少なくとも一つのスプリット面と該スプリット面を挟んで該スプリット面に対して異なる距離に配置した二つの全反射面を備えた偏光ビームスプリッタを複数組合わせることにより、該偏光ビームスプリッタに入射したレーザビームを順次分割して該入射したレーザビームの２倍以上の複数のレーザビームを出力することを特徴とするマルチスポット光形成方法。
【請求項７】
前記組合わせた複数の偏光ビームスプリッタの間に１／４波長板を挿入したことを特徴とする請求項６記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項８】
前記出力される複数のレーザビームは、間隔が等ピッチで互いに平行であることを特徴とする請求項６記載のマルチスポット光形成方法。
【請求項９】
マルチスポット光を被観測物体に投射し、被検査物体で反射もしくは透過した光を上記投射スポットが 結像する位置に配置したマルチ開口で透過せしめ、各開口の透過光を個別に検出することにより共焦点検出する共焦点検出方法であって、請求項１乃至８の何れかに記載のマルチスポット光形成方法により形成したマルチスポット光を用いることを特徴とする共焦点検出方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８の何れかに記載のマルチスポット光形成方法を用いて形成されたマルチスポット光を励起光とし、該励起光を蛍光体を含む被観測物体に投射し、被検査物体で発生した蛍光を励起光から分離し、上記投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に検出器を配置することにより各マルチスポット光の位置の蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１１】
請求項１乃至８の何れかに記載のマルチスポット光形成方法を用いて形成されたマルチスポット光を励起光とし、該励起光を蛍光体を含む被観測物体に投射し、被検査物体で発生した蛍光を励起光から分離し、上記投射した箇所で発生する蛍光が結像する位置に配置したマルチ開口で透過せしめ、各開口の蛍光透過光を個別に検出することにより各マルチスポット光位置の蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１２】
上記蛍光を励起光から分離する方法は、波長分離ビームスプリッタを用いると共に、各マルチスポット励起光で発生する蛍光が結像光学系から結像位置に至る各スポットからの蛍光の主光線が互いに平行となるテレセントリック結像光学系にし、該結像光学系と結像位置の間に干渉フィルタ又は及び波長分離ビームスプリッタを挿入する方法であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の蛍光検出方法。
【請求項１３】
請求項１乃至８の何れかに記載のマルチスポット光形成方法を用いて形成されたマルチスポット光を励起光として蛍光体を付加したＤＮＡを含む被観測物体に投射し、該投射により被検査物体で発生した蛍光を前記被検査物体で反射した前記励起光から分離し、前記投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に検出器を配置することにより各マルチスポット光を投射した位置で発生した蛍光を検出し、該蛍光を検出した位置と検出信号強度の情報からＤＮＡを検査することを特徴とするＤＮＡ検査方法。
【請求項１４】
請求項１乃至８の何れかに記載のマルチスポット光形成方法を用いて形成されたマルチスポット光を励起光として蛍光体を付加したＤＮＡを含む被検査物体に投射し、該投射により前記被検査物体で発生した蛍光を前記被検査物体で反射した前記励起光から分離し、該蛍光を該蛍光が結像する位置に配置した複数の開口部を通過せしめ、各開口部を通過した蛍光を個別に検出することにより前記マルチスポット光を投射した位置の蛍光強度を検出することを特徴とするＤＮＡ検査方法。
【請求項１５】
上記蛍光を励起光から分離する方法は、波長分離ビームスプリッタを用いると共に、各マルチスポット光による励起で発生する蛍光が結像光学系から結像位置に至る各スポットからの蛍光の主光線が互いに平行となるテレセントリック結像光学系にし、該結像光学系と結像位置の間に干渉フィルタ又は及び波長分離ビームスプリッタを挿入する方法であることを特徴とする請求項１３または１４に記載のＤＮＡ検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はレーザ光から複数のスポットを効率よく形成する方法に関し、更にこの方法を用いて共焦点検出する方法、蛍光検出する方法並びにＤＮＡを検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マルチスポット光を被検出物体に照射し、共焦点検出する方法は円盤上に多数の開口を開けたニッポウディスクを用いている。この方法では円盤全体に光を照射し、開口部を抜けた光が照明光となる。従って光源から出射した光の殆どが開口部以外で遮光され照明に寄与する光エネルギーは光源出射光の数％に止まる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
レーザ光源から出射したビームからマルチスポット光を形成する際、出射した光を無駄なくマルチスポット光にしようとすると、例えば１列状に０．４ｍｍのピッチで配列した０．０４ｍｍ径の５０個のマルチスポット光を形成しようとすると、出射したレーザビームを縦横比が１対５０の長円状の形状になるよう成形する。この長円状のビームを０．４ｍｍピッチで並ぶマイクロレンズアレイに照射すれば、このレンズ゛の焦点距離が例えば６０ｍｍであれば、ほぼ０．０４ｍｍ径のマルチスポット光が０．４ｍｍピッチで５０個得られる。レーザのビームの強度分布はガウス分布であるので、このような方法で形成されたマルチスポット光は５０個配列したマルチスポット光の配列の中心付近は明るく、周辺は暗くなってしまう。この中心と周辺のスポットの強度をできるだけ等しくしようとすると、マイクロレンズ５０個の幅に比べ入射する長円状のビームの広がりを十分大きくしなければならない。その結果レーザ光源より出射したレーザビームエネルギーの半分以上が無駄になってしまう。
【０００４】
本発明の目的は、このような従来のマルチスポット光形成方法における光の利用効率が悪く、マルチスポット光間の強度のばらつきが大きいという課題を解決し、ほぼ均一な強度のマルチスポット光を得る方法及びその装置を提供することにある。
【０００５】
更に本発明の目的は、ほぼ均一な強度のマルチスポット光を用いて、共焦点検出、蛍光検出及びＤＮＡ検査を行う方法及びその装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決し、近接したマルチスポット光を得るために、本発明は以下の様な構成にした。
【０００７】
即ち、ほぼ同一方向に向かい、隣同士が比較的近接している複数Ｎのレーザビームを、偏光素子に入射させることにより、この各ビームの２つの互いに直交する偏光成分のビームに分離することにより複数２Ｎのレーザビームとする。その後、ほぼ同一方向に向かい、隣同士が近接している複数２Ｎのレーザビームにする。
【０００８】
このような２倍の近接するビームを得る具体的方法として、複数Ｎの近接するレーザビームを、偏光ビームスプリット面と、この偏光ビームスプリット面に平行で、該偏光ビームスプリット面からＬ１及びＬ２の距離にある全反射面とを有するマルチスポット光２倍化プリズムで構成された上記偏光素子に入射する。このようにすれば、前記複数の近接するレーザビーム数を２倍の２Ｎにすることができる。
【０００９】
また複数Ｎの近接するレーザビームを、異方性光学媒体からなる上記偏光素子に入射し、該異方性光学媒体内を各ビームの２つの互いに直交する偏光成分のビームに分離することにより複数２Ｎのレーザビームとする。このようにすればほぼ同一方向に向かい、隣同士が近接している複数２Ｎのレーザビームにすることが可能になる。
【００１０】
更に上記のようなビームを２倍化する偏光素子を複数Ｍ用いることにより２ＭＮのレーザビームを得ることが可能になる。
【００１１】
上記1個以上の偏光素子の少なくとも１個に入射する複数Ｎの近接するレーザビームはそれぞれ収束レーザビームである様にすると、この収束ビームの収束位置で微小マルチスポット光が得られる。この際この収束ビームは複数配列されたレンズにより形成することでマルチスポット光が形成される。
【００１２】
また上記収束レーザビームの収束位置に１≦Ｍ′≦Ｍを満たす整数Ｍ′に対して２Ｍ′Ｎ個以上のマルチスポット光収束径程度の開口を並べたマスクを配置し、この開口にマルチスポット光が集光するようにすれば雑音迷光のない純粋な微小マルチスポット光を得ることが可能になる。
【００１３】
上記の複数Ｎのレーザビームはレーザ光源出射ビームもしくは平行ビーム化された半導体レーザのビーム径ｄに対し、４ｄ以下の隣接間隔ピッチを有する場合でも２倍化することが可能であり、また２倍化して隣接ビーム間隔を更に１／２Ｍ′にすることが可能である。即ち平行光束のレーザビームの径ｄより小さなピッチのマルチスポット光をレンズ系を用いずに形成することができる。
【００１４】
上記した複数Ｎのレーザビームの形成方法として、斜辺が出射面に対しほぼ４５度になる断面を有する三角形とこの斜面に接触しこの斜面と平行な全反射面を有する平行四辺形の断面を有する第２のビーム２倍化プリズムを１個以上設ける。このようにすれば例えばＮ／２個のレーザビームをこの第２のビーム２倍化プリズムにより複数Ｎのレーザビームを形成できる。
【００１５】
更に、上記第２のビーム２倍化プリズムを異なる寸法からなる２種以上のものを用い、これをビームの進行方向から順次大きいものから小さいものにｎ段のカスケード状に並べビーム数を２ｎ倍化する。即ち最終段のビーム２倍化プリズムの寸法をＤとし他とき、この数をＮ／２、その前の段のビーム２倍化プリズムの寸法を２Ｄとしその数をＮ／４、初段の寸法を２ｎ−１Ｄとし、その数をＮ／２ｎとする。このようにすると、Ｎ／２ｎ＋１個のわずかなビームからＮ個のレーザビームが得られる。
【００１６】
以上説明した方法により、１個又は複数のレーザ光源より出射したレーザビームからマルチスポット光が得られる。しかもビームの２倍化の方法は何れも１ビームを偏光素子やビーム分割プリズムで行っているため、２分化後のビームのエネルギー総和は元のビームエネルギーの９２％以上にすることが可能であり、収束ビームを作るレンズやこれら偏光素子の表面での反射ロス等を考慮しても各出射レーザエネルギーを総和した全エネルギーの７０％以上がマルチスポット光の合計エネルギーにすることが可能になる。
【００１７】
更に上記の光学部品の表面での反射損失を反射防止コート等で行うことにより１個以上のレーザ光源より出射したレーザビームの各出射レーザエネルギーを総和した全エネルギーの９０％以上がマルチスポット光の合計エネルギーになる様にできる。
【００１８】
ガウス分布のいろいろな場所の部分からマスチスポットを形成する従来の方法に比べ、ビームの分割を容易に均等にでき、マルチスポット光の各スポットエネルギーのばらつきが ±２０％以内にすることができる。
【００１９】
しかも上記の偏光素子に入射する光の偏光状態を適正化したり、多層膜タイプの偏光ビームスプリッタの膜厚を適正化することにより２倍化されたビームの強度をほぼ等しくすることが可能になり、マルチスポット光の各スポットのエネルギーばらつきが ±１０％以内にすることができる。
【００２０】
以上説明したレーザビームの２Ｍ′倍化により、近接したマルチ微小スポットを形成することが可能になるので、このようにして得られたマルチスポット光を共焦点検出、蛍光検出，あるいはＤＮＡ検出等に用いる。これにより、従来不可能であった光の利用効率の高い、またマルチスポット光間のばらつきが小さい検出ができるようになり、その結果高速で高精度の共焦点検出、蛍光検出，あるいはＤＮＡ検出等が可能になる。
【００２１】
上記した本発明のマルチスポット光形成手段を用いて作られたマルチスポット光を被観測物体に投射し、被検査物体で反射もしくは透過した光を上記投射スポットが 結像する位置に配置したマルチ開口で透過させる。この各開口の透過光をそれぞれ個別に検出する。このようにして共焦点検出することにより光の利用効率が高く、マルチスポット光間のばらつきが少ない共焦点検出が可能になり、高速高精度の共焦点検出が実現する。
【００２２】
上記した本発明のマルチスポット光形成手段を用いて作られたマルチスポット光を励起光とし、蛍光体を含む被観測物体に投射する。この励起光により被検査物体で発生した蛍光を励起光から分離し、上記励起光投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に検出器を配置することにより各マルチスポット光位置の蛍光を検出する。このようにすることにより、複数の位置に強度の高い励起光を同時に照射することができ、また各スポットのばらつきが小さいので、高速、高精度の蛍光検出が可能になる。
【００２３】
上記の蛍光検出において、上記励起光投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に配置したマルチ開口で透過させ、各開口の蛍光透過光を個別に検出する検出器を配置する。このようにすることにより励起光で発生する被観測物体以外の蛍光を排除し、信号対雑音比の高い蛍光検出が可能になう。
【００２４】
上記した本発明のマルチスポット光形成手段を用いて作られたマルチスポット光を励起光とし、蛍光体を付加したＤＮＡを含む被観測物体に投射する。被観測物体はガラス等の基板の予め決まられた位置に既知のプローブＤＮＡを付着させておき、被検査対象である生体試料から精製増幅したＤＮＡの一端に蛍光物質を付加したターゲットＤＮＡを上記ガラス基板上に流し、プローブＤＮＡの塩基配列に対応するターゲットＤＮＡをハイブリダイズされたものである。この被測定物体にマルチスポット光励起光を照射し、ＤＮＡに付加した蛍光体を励起し、蛍光を発生させる。この蛍光を励起光から分離し、上記投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に検出器を配置することにより各マルチスポット光位置の蛍光を検出し、検出した位置と検出信号強度からＤＮＡを検査する。
【００２５】
上記のＤＮＡ検査において、上記励起光投射スポットで発生する蛍光が結像する位置に配置したマルチ開口で透過させ、各開口の蛍光透過光を個別に検出することにより各マルチスポット光位置の蛍光強度を検出することによりＤＮＡを検査することにより更に信号対雑音比の大きなＤＮＡ検査ができる。
【００２６】
蛍光検出及びＤＮＡ検査においては励起光と蛍光の波長が比較的接近する場合が多い。このような場合マルチスポット光を用いると検出及び検査の視野が大きくなり、各マルチスポット励起光で発生する蛍光を検出系に導く途中に挿入する励起光から蛍光を分離する光学系の特性が不十分になる。即ち 結像光学系から検出器に至る途中に投入される波長分離ビームスプリッタや干渉フィルタ等の励起光から蛍光を分離する光学系に入射する蛍光の入射角が各スポットで異なってしまう。その結果マルチスポット光の場所により、遮蔽すべき励起光が洩れてしまい正確な蛍光検出ができなくなる。
上記課題を解決するため上記蛍光を励起光から分離する方法は、波長分離ビームスプリッタを用いると共に、各マルチスポット光励起で発生する蛍光が結像光学系から結像位置に至る各スポットからの蛍光の主光線が互いに平行となるテレセントリック結像光学系にし、該結像光学系と結像位置の間に干渉フィルタ又は及び波長分離ビームスプリッタを挿入する。このようにすれば、どのスポット励起光からの蛍光も干渉フィルタや、波長選択ビームスプリッタに同一の入射角で入射する。この結果どのスポットからの蛍光及び雑音成分となる励起光も同一条件で、従って最適な条件で、それぞれ蛍光を選択し、励起光を除去することができ、励起光漏れの極めて小さい、従ってノイズの極めて少ない蛍光検出ができる。以上の結果、更にこの蛍光検出法を用いて、励起光の反射光強度に対し極めて微弱な強度の蛍光を検出する必要のあるＤＮＡ検査を正確に高精度にできるようになる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施例を説明する。
【００２８】
図１は、本発明によるマルチスポット光を得る方法及びその手段の実施形態を示す図である。
【００２９】
１つ又は複数のレーザ光源より出射したほぼ平行光であるレーザビームは、後述の方法により数ｍｍピッチの互いに平行な同一方向に向かう複数（図では偶数）Ｎ／２本のレーザビーム８１となり、Ｎ／２個のビーム２倍化プリズム４１１，４１２等によりＮ個のレーザビームになる。ビーム２倍化プリズムは、図１（ｂ）に拡大斜視図が示されているように（但し、図１の（ａ）と（ｂ）とでは、ビーム２倍化プリズム４１１と４１２との配置は、必ずしも１対１に対応していない。）、出射面に対しほぼ４５度になる断面を有する三角形とこの斜面に接触しこの斜面と平行な全反射面を有する平行四辺形の断面を持っている。
【００３０】
平行四辺形の一辺に入射した光は三角形の斜面のビームスプリット面でほぼ５０％は反射し、残りのほぼ５０％は透過する。透過した光はそのまま三角形のプリズムを抜け、反射した光は平行四辺形の他の面で全反射し、平行四辺形のプリズムを抜ける。このように三角形及び平行四辺形のプリズムを抜けた光は互いに平行で強度はほぼ等しい。又両光の間隔はＰとなる。この結果、ビーム間隔が２Ｐであるレーザビーム８１の半分のビーム間隔Ｐになっている。
【００３１】
このようなビーム２倍化プリズムがＮ／２個、ピッチ２Ｐで配列したビーム２倍化プリズムアレイ４により、レーザビーム８１はピッチがＰで、ほぼ同一方向に向かい、隣同士が近接している複数Ｎのレーザビーム８となる。この複数Ｎのレーザビームを後述する偏光素子１１に入射させることにより、ほぼ同一方向に向かい、隣同士が近接している複数２Ｎのレーザビームにする。
【００３２】
図２に示すように、偏光素子１１は偏光ビームスプリット面１１０に平行で、この偏光ビームスプリット面１１０からそれぞれＬ１及びＬ２の距離にある全反射面１１０１と１１０２を有する透明なプリズム１１１と１１２からなる第１のマルチスポット光２倍化プリズムで構成されている。偏光素子１１のＮ本のビームの入射面には図１に拡大図が、図２に断面拡大図が示されているような球面平凸レンズを短冊状に切断した２１，２２の様な短冊状凸レンズがＮ個各Ｎ本の平行ビームの位置に対応して配置されている。この短冊状凸レンズのアレイ２０を透過したビームは図２に示すようにそれぞれ収束光となり、互いに平行に偏光ビームスプリット面に入射する。
【００３３】
各ビームは円偏光又はビームスプリット入射面に４５度の直線偏光であるので、図２に示すように入射光８２のＳ偏光成分はこの面で反射し、Ｐ偏光成分は透過する。図２に示すように反射した収束光８２２はプリズム１１１を透過し、ビームスプリット面１１０に平行な面である１１０１面に４５度の入射角で入射する。１１０１面で全反射した収束ビーム８２２′はＳ偏光であるため再びビームスプリット面１１０で反射する。反射した収束ビーム８２２″はプリズム１１１を透過し、抜ける。
他方Ｐ偏光成分はビームスプリット面１１０を透過した収束ビーム８２１は、プリズム１１２を透過し、ビームスプリット面１１０に平行な面である１１０２面に４５度の入射角で入射する。反射光は全反射収束ビーム８２１′となりし、再びビームスプリット面１１０に入射する。入射光はＰ偏光であるためほぼ１００％透過し、この透過光８２１″はプリズム１１１を透過し、抜ける。
【００３４】
プリズム１１１と１１２の全反射面１１０１と１１０２はビームスプリット面からそれぞれＬ１及びＬ２の距離にある。Ｌ１及びＬ２の値は√２（Ｌ２−Ｌ１）がＮ本の平行ビーム８のピッチＰの半分であるＰ／２である。従ってビームスプリット面で分離した光が辺呼応素子を抜けるときには、２つの光がＰ／２だけシフトする。この結果偏光素子１１に入射したピッチＰのＮ個の収束ビームはピッチがＰ／２で２Ｎ本の収束ビームとなって偏光素子１１を抜ける。
【００３５】
偏光素子１１のプリズム１１１の出射面には図３に示す直径がｄのピンホール開口２１１がピッチＰ／２で２Ｎ個配列したピンホールアレイマスク２があり、収束光はこのピンホールを通過する。２Ｎ個のピンホール開口以外の部分は光を遮光するので、収束光以外の雑音となる迷光はこのピンホールアレイマスク２により遮光される。この結果ピンホールアレイマスクを透過した光はピンホール部のみからスポットアレイ光が発する。
【００３６】
ピンホールアレイ２を透過した光は隣接スポット毎にＰとＳの直線偏光になっている。ピンホールアレイ２の直後には１／４波長板３が配置されている。この１／４波長板はその光学軸がＰ及びＳの偏光方向に対し４５度になるように設定されている。従って１／４波長板３を透過するＰとＳ偏光の光はそれぞれ右及び左回りの円偏光になる。
【００３７】
１／４波長板３を通過した２Ｎ個の平行な円偏光のビームは偏光素子１２に入射する。偏光素子１２は上述の偏光素子１１とほぼ同じ構造の偏光ビームスプリッタである。即ちビームスプリット面１２０でＰ偏光を透過、Ｓ偏光を反射する。またビームスプリット面で反射した後通過するプリズム１２１の全反射面１２０１、及び反射した後通過するプリズム１２２の全反射面１２０２とビームスプリット面までの距離Ｌ１′及びＬ２′はその値が√２（Ｌ２′−Ｌ１′）＝ ±Ｐ／４を満たす。このようにすることにより、プリズム１２に入射するピッチＰ／２の２Ｎ個の平行ビームはピッチＰ／４の４Ｎ個の互いに平行な発散ビームとなり、プリズム１２から出射される。
【００３８】
ピンホールアレイマスクにある２Ｎ個のスポットから出射する光は偏光素子１２により４Ｎ個のマルチスポット光がまるでマスク面から出射しているように見える。即ち反射面１２０、１２０１，及び１２０２による鏡像効果により、偏光素子１２を透過した側から見れば、４Ｎ個のマルチスポット光がマスク２の面にでき、ここから発散光となって出射してくる。
【００３９】
一例としてＮの数を１６、Ｐを１．６ｍｍとすると、上記実施形態のマルチスポット光の数は６４となり、ピッチは０．４ｍｍとなる。後に詳細を説明するが、この光を無限焦点顕微鏡の対物レンズに 結像レンズを介して入射させれば、光学系の倍率を２０倍とすれば被検査対象の試料上に２μｍのスポットを２０μｍピッチで６４スポット同時に照射することが可能になる。
【００４０】
上記図１の実施形態では第２のビーム２倍化プリズムアレイ４にはＮ／２個のマルチビームを入射させている。Ｎが８の場合、仮にレーザ光源がＨｅ−Ｎｅレーザのように大きな出力でなく、照射光として大きな強度が必要な場合、例えばＨｅ−Ｎｅレーザを８本用意し、１．６ｍｍピッチで第２のビーム２倍化プリズムアレイ４に入射するようにすればよい。また半導体レーザを８個用い、それぞれを平行ビームにして、上記のＨｅ−Ｎｅ同様にして８本のビームを構成し、第２のビーム２倍化プリズムに入射させればよい。この場合、Ｐを１．６ｍｍとしたので８個のレーザビームの間隔２Ｐは３ｍｍとなり、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光のビーム径１ｍｍに対し大きいため８本のレーザ光源から平行に入射させることが可能である。
【００４１】
このようにして第２のビーム２倍化プリズムによりレーザ光源から出射したビームの径ｄの４倍、即ち４ｄ以下の間隔Ｐにした状態でも、偏光素子を用いるマルチスポット光形成手段に入射すればその間隔の１／２にでき、また偏光素子を複数ｎ個用いれば１／２ｎにできる。このように従来困難であった、ビーム径ｄの４倍以下のピッチで入射する複数Ｎのレーザビームを２Ｍ′Ｎ個でピッチＰ／２Ｍ′のマルチビームにし、マルチスポット光に効率よく形成すること、ができるようになった。
【００４２】
図４は、本発明によるマルチスポットビーム光を形成するための他の実施形態を示す図であり、１つのレーザ光源を用いて、偏光素子に入射させるＮ本のマルチビームを形成するものである。例えば、ＹＡＧＳＨＧレーザの様に光源の出力が大きい場合には、光源が１個でも十分である。このような場合には、図４に示す様に、図１の４で示した第２のビーム２倍化プリズムの他に、このプリズムの寸法の２倍、４倍、及び８倍のものを計ｎ＝４段カスケード状に並べる。
【００４３】
即ち、１つの光源から出射した１本のビーム８０を８倍の寸法のビーム２倍化プリズム４４１に入射させ、間隔が８Ｐの２本のビーム８０１と８０２を得る。この２本のビームを４倍の寸法のビーム２倍化プリズム４３１、４３２に入射し、４本のピッチ４Ｐのビーム８０１１，８０１２，８０２１，及び８０２２を得る。この４本のビームを２倍の寸法のビーム２倍化プリズム４２１、４２２，４２３及び４２４に入射し、８本のピッチ２Ｐのビームを得る。これを前述の図１（ｂ）に図示した８個のビーム２倍化プリズム４１１、４１２，４１３、４１４，４１５，４１６，４１７及び４１８に入射し、１６本のピッチＰのビームを得る。このようにすれば１本のレーザ光源から出射した１本のビームから１．６ｍｍピッチの１６本のビームが得られる。
【００４４】
以上の実施形態で説明した方法により、従来では不可能であった、レーザ光源より出射したレーザビームのエネルギーの７０％以上の総エネルギーを有するマルチスポット光を形成することが可能になった。
【００４５】
また更に、光学部品の反射防止コートを施したり、ビーム分離の際の損失が小さくなる、多層コートを施したり、ピンホールアレイへの入射光の位置合わせ等を行うことにより、レーザ光源より出射したレーザビームのエネルギーの９０％以上の総エネルギーを有するマルチスポット光を形成することが可能になった。
【００４６】
更に、上記の実施形態で説明した方法により、従来不可能であったのマルチスポット光の各スポットエネルギーのばらつきを、±２０％以内にすることが可能になった。
また更に、ビーム分離の多層コートの条件出しと、製作のコントロールにより、或いは図１（ａ）の偏光器１１と、図１（ｃ）に詳細を示した短冊状凸レンズのアレイ２０、ピンホールアレイ２、及び波長板３、及び偏光器１２等の光学部品を互いに隣接するものにつて光学接着剤で接着する。このようにすることにより光学部品の表面で反射し干渉することにより発生するビーム強度のばらつきが大幅に少なくなり、マルチスポット光の各スポットエネルギーのばらつきを±１０％以内にするマルチスポット光形成が可能になった。
【００４７】
なお、上記実施の形態においては、６４又は１６のマルチスポット光を形成する場合について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、Ｎ＝２のとき、即ち８以上のマルチスポット光を得る場合に有効である。
【００４８】
次に、以上に説明したマルチスポット光の形成方法により得られるビームを、蛍光検出に、特に蛍光検出を用いたＤＮＡ検査に応用した例を、図５を用いて説明する。
【００４９】
図５において、８００１，８００２，８００３……はレーザ光源であり、図示していないが合計８本のレーザから構成されている。各レーザ光源から出射したビームは数ｍｍの大きさのミラー８０１１，８０１２，８０１３……により約１．６ｍｍのピッチで互いに平行に一方向に向ける。８本のビームは前記した方法により０．４ｍｍピッチで６４本のマルチスポット光がマスク面３から出射するように偏光プリズム１２から得られる。この６４個のマルチスポット光は 結像レンズ６１を通り、ミラー６３，波長選択ビームスプリッタ７０を通過して対物レンズ６０を介して、ＤＮＡチップ５の検査面５１に照射される。
【００５０】
ＤＮＡチップの表面には、予め所定の位置毎に決められたＤＮＡがプロービングされている。一方生体から精製、増幅して作ったＤＮＡに蛍光体が付加されたターゲットＤＮＡを上記のプローブＤＮＡの上に流すと、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡのそれぞれの塩基配列が対応していればハイブリダイズして、蛍光体の着いたターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡに結合する。
ターゲットＤＮＡに付加する蛍光体には種々のものがあるが、本実施形態では蛍光体はＨｅ―Ｎｅレーザの６３３ｎｍの光を吸収し、６７０ｎｍの蛍光を発する。この蛍光を対物レンズ６０で受け、透過光を波長選択ビームスプリッタ７０で反射させ検出光学系に導く。波長選択ビームスプリッタ７０は６３３ｎｍを透過し、６７０ｎｍを反射する多層コートビームスプリッタである。
【００５１】
７０で反射した蛍光はミラー７１で反射し 結像レンズ６２を通る。ＤＮＡチップ表面の蛍光体に照射した各マルチスポット光から発した蛍光の主光線は 結像レンズ６２を通過した後互いに平行に進むように、 結像レンズ６２はテレセントリックな光学系になっている。この結果、蛍光の波長の光を反射する波長分離ビームスプリッタにはどのマルチスポット光から来た蛍光も同一の入射角度で入射する。このためどの励起スポットから発した蛍光にもわずかに含まれている雑音成分である６３３ｎｍの励起光も殆ど反射させずに透過させることができる。即ち波長分離ビームスプリッタ７２には励起光の６３３ｎｍの光がわずかに来ているがその光は透過され蛍光のみが反射し、検出器９１，９２に向かう。
【００５２】
上記の励起光は、ＤＮＡチップで反射し、検出器側に向かうが、発生する蛍光の強度に比べ数桁以上強い光である。このため上記のように波長選択ビームスプリッタ７０だけでは分離できない特に７０には励起光のスポットの位置により７０に入射する角度が異なりどのスポットも励起光を同様に除去することが不可能である。これに比べ、 テレセントリックな結像レンズ６２と検出器９１，９２の間に置かれた波長選択ビームスプリッタ７２及び７３は上記したようにどのスポット位置からの光も同一入射条件で反射させることができる。このような励起光の除去と干渉フィルタ７４，７５によりほぼ完全に励起光を遮光し蛍光のみを検出器に取り込むことができる。
【００５３】
検出器９１，９２はマルチチャンネルフォトマルであり、それぞれ３２個の受光開口を有している。フォトマル９１，９２の前にある直角ミラーで６４この蛍光のスポット像を２つに分離し、ほぼフォトマルの受光開口位置に結像する。フォトマルの受光開口の前にはピンホールアレイがある。このピンホールアレイはＤＮＡチップに照射している２μｍ径２０μｍピッチの励起マルチスポット光が対物レンズと結像レンズの倍率Ｍで 結像する寸法にほぼ等しい開口とピッチを有する。即ち、２Ｍμｍ径の開口を持ち２０Ｍピッチを有する。このピッチ２０Ｍはマルチチャンネルフォトマルの受光開口ピッチに等しい。
【００５４】
このようにすればマルチスポット光アレイで同時照射し、生じる蛍光を共焦点検出していることになり、信号対雑音比の高い蛍光検出ができる。得られた６４個の信号は図示しない回路により増幅され、ＡＤ（アナログディジタル）変換器でディジタル情報に変換され図示しないＣＰＵ（処理回路）に送られ、照射位置での蛍光強度のデータが保存される。
【００５５】
ステージ５０１，５０２を駆動し、異なる位置における蛍光強度の検出を上記の方法で順次求めて行く。信号対雑音比の大きな蛍光検出を行うため照射スポットのピッチは照射スポット径の数倍〜数十倍にする。従って検査対象を全面検出するにはｘｙステージを駆動しマルチスポット光の配列と直角な方向だけでなく、配列の方向にも駆動して検出する。
【００５６】
図６は本発明の実施形態の図である。レーザ光源から来た平行ビーム８は円偏光又は紙面に４５度の直線偏光である。複数の平行ビーム８の内の１本のビームは、短冊状凸レンズのアレイ２０の内の一つのレンズ２１に入射し、収束ビームとなり、方解石等の複屈折材料に入射する。常光の偏光成分はそのまま直進し、異常光の偏光成分は屈折する。この偏光素子の厚さはこの常光と異常光の透過の間隔が複数Ｎからなる入射ビーム光８の配列ピッチＰの半分になるように設定されている。この結果偏光器１１′を透過後２Ｎ個の収束ビームがピッチＰ／２で平行に進む。
【００５７】
各ビームは交互に直線偏光の偏光方向が９０度異なっている。この偏光方向に４５度の光学軸を持つ１／４波長板もしくは、２２．５度の光学軸を持つ１／２波長板３を通すことにより円偏光もしくは紙面に対し ±４５度偏光方向を持つ直線偏光を得る。この２Ｎ個のビームを偏光器１２′に入射する。偏光器１２′は厚さが１１′の半分の方解石である。この偏光器１２′を透過すると４Ｎ本の集束ビームがピッチＰ／４で得られる。
【００５８】
この光を先に説明した波長板と同じ波長板３′を通すことにより円偏光又は紙面に４５度傾いている直線偏光となる。このマルチビームのピッチと同一でレンズ２１とレンズに入射するビーム径で決まる集光径にほぼ等しい開口径を有するマルチ開口アレイからなる板２に入射する。このようにすれば、この開口を透過した光のみからなる雑音の無いマルチスポット光が得られる。
【００５９】
図７は、本発明の共焦点検出に用いるマルチスポット光形成方法の実施形態図である。図７と図１の部品番号が同じものは同一物である。１又は複数のレーザ光源より出射したビームを８本の平行なビームにし、第２のビーム２倍化プリズム４により１６本の平行ビームにする。この１６本の平行ビームを凸レンズアレイ２０により収束ビームにする。
【００６０】
第１のマルチスポット光２倍化プリズム１１と１２によりマスク３の開口から実効的に６４個のマルチスポット光が出射するようにマルチスポット光２倍化プリズム１２より６４個のビームが得られる。このマルチスポット光２倍化プリズム１２の出射面に１／４波長板３′が貼り付けられており、６４のマルチスポット光は円偏光で方解石からなる偏光素子１１′に入射する。この偏光子１１′、１／４波長板３″、偏光子１２″、１／４波長板３′″、偏光子１３′、１／４波長板３″″は図６で説明したビーム２分割方法と同じであり、偏光子１１′、１２″及び１３′は方解石の厚さがｔ、１／２ｔ、１／４ｔと薄くなっている。またビームが分割されていく方向はｙ方向である。従って第１のビーム２倍化プリズム１１，１２によってｘ方向に６４個、方解石のビーム２分割法によってｙ方向に８個のスポット光が発生し、合計６４×８のスポット光が図８に示すように発生する。
【００６１】
図９は、上記の６４×８個のマルチスポット光を用いる共焦点検出方法を示している。図９の部品の番号と他の図面の番号が同じものは同一物を表している。レーザ光源から出射し、８本のビームを形成する８ビーム光学系８００から８本のビームが図７に示す６４×８マルチスポット光形成光学系１００に入り上記の方法により６４×８個の図８に示すマルチスポット光がマスク面３から実効的に出射している。
【００６２】
このマルチスポット光をハーフミラー７０′、 結像レンズ６１及び対物レンズ６０により、被測定物５′の表面に縮小投影する。投影されたマルチスポット光は被測定面で反射し、対物レンズ６０、 結像レンズ６１，ハーフミラー７０′を透過し、検出器９０′の撮像面の直前に配置された６４×８個のピンホールマスク９０１′面上に 結像し、このピンホールを透過した光は検出器の撮像面に至る。もし被測定物の表面が投影されたマルチスポット光の結像面と一致していれば、ピンホールマスクのピンホールに反射光が結像し、強い検出値が得られる。一致していなければピンホールマスク９０１′のピンホールには焦点が外れた、広がった光となるため、ピンホール透過光の強度は小さくなる。従って、図９に示すｚステージ５０３′により、被測定物を上下方向に動かしては、上記の検出をしていけば、各スポットの位置における高さを各位置での検出最大強度が得られるｚ値から求めることができる。
【００６３】
上に説明した図９の共焦点検出法では被測定物をｘｙ方向に固定していれば、例えば被測定面上のスポット径が１μｍでスポット間隔が８μｍであれば、８μｍ間隔の６４×８点の情報しか得られない。そこでｘｙステージ５０１′、５０２″を移動させ順次他の位置の共焦点像を検出していく必要がある。図１０は本発明の実施形態を表す図であり、この２次元的な共焦点像を得る方法を示している。図９のｘｙステージの駆動方向ｘ′、ｙ′と被測定物体に投影するマルチスポット光の配列方向を図１０に示すようにわずかにずらしておく。６４×８のマルチスポット光の場合にはこの２つの方向のなす角θをｔａｎθが１／８になるようにしておく。このようにすればｙ′方向にステージを走査するとスポット０１１と０２１の間の抜けた位置をスポット０１２，０１３…………０１８の７つのスポットが照射することになり、１μｍのスポットが１μｍおきに全面走査されることになる。
【００６４】
上記の方法を用いると、被測定物体に光強度の大きいマルチスポット光が照射されるため、短時間で６４×８のスポット位置を検出することが可能になる。そこで試料をｙステージによりｙ′方向に高速に１走査し、走査後ｚ方向にわずかに動かし、再び走査する動作を繰り返すことにより、順次高速に各高さの共焦点信号を検出していく。このようにして各高さｚで得られた各点の２次元強度データから各点で最も強度の大きい高さを求めることにより、高速の共焦点検出法による高さ計測が可能になる。なお、上記の走査の幅をマルチスポット光のピッチｐのｋ倍とすると、ｘ方向の画素数６４×８＝５１２、ｙ方向の画素数８ｋの２次元高さ情報が得られる。
【００６５】
【発明の効果】
本発明によりレーザ光源より発したレーザ光を非常に効率よく、無駄なく、マルチスポット光にし、かつ各マルチスポット光のばらつきが非常に少なくできるようになった。この結果このマルチスポット光を用いて高速、高精度の共焦点検出が可能になった。またこのマルチスポット光を用いて高速、高精度の蛍光検出、並びにＤＮＡ検査が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるマルチスポット光形成手段の１実施形態の構成を示す正面図。
【図２】本発明によるマルチスポット光形成手段の１実施形態の構成を示す正面図。
【図３】本発明によるマスクの１実施形態を示すマスクの正面図。
【図４】本発明によるマルチスポット光形成手段の１実施形態の構成を示す正面図。
【図５】本発明による蛍光検出およびＤＮＡ検査装置の１実施形態の構成を示す斜視図。
【図６】本発明によるマルチスポト形成手段の１実施形態を示す正面図。
【図７】本発明による２次元マルチスポト形成手段の１実施形態を示す正面図。
【図８】本発明による２次元マルチスポット光の配列の１例を示す正面図。
【図９】本発明による共焦点検出装置の１実施形態を示す正面図。
【図１０】本発明による共焦点検出のマルチスポット光とステージ走査の関係を示す図。
【符号の説明】
１１，１２、１１′、１２′、１３′・・・偏光素子    ２・・・ピンホールアレイマスク    ２０・・・レンズアレイ    ３、３′・・・波長板    ４・・・ビーム２倍化プリズム    ５・・・被測定物体    ６０・・・対物レンズ    ６１，６２・・・結像レンズ     ７０，７１，７２，７３・・・波長選択ビームスプリッタ    ９０、９１、９２・・・検出器    ９・・・制御回路
【図１】
0003675273.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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