(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、カリコシンおよびカリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの両方と、従来の薬物担体と、を含み、前記カリコシンの前記カリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対する重量比が１：２または２：１であり、前記活性成分は０．１〜９９．５重量％のパーセンテージである、糖尿病性腎症を阻止および治療するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記従来の薬物担体は、希釈剤、賦形剤、フィラー、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収増強剤、界面活性剤、吸着担体、潤滑剤、香味料および甘味料のうちの少なくとも１つを含み、前記賦形剤は水であり、前記フィラーはデンプン、スクロースまたはラクトースであり、前記接着剤はセルロース誘導体、アルギナート、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも１つであり、前記湿潤剤はグリセリンであり、前記崩壊剤は寒天、炭酸カルシウムまたは重炭酸ナトリウムであり、前記吸収増強剤は第４級アンモニウム化合物であり、前記界面活性剤はパルミチルアルコールであり、前記吸着担体はカオリンクレイまたはソープクレイであり、前記潤滑剤はタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、またはポリエチレングリコールである、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記薬学的組成物の剤形は、錠剤、顆粒、ピル、粉末、顆粒、カプセル、または液体製剤である、請求項２記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、漢方薬の分野に関し、特定的には、糖尿病性腎症（ＤＮ）を阻止および治療するための薬物の製造における、カリコシン（ＣＡＬ）および／またはカリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ＣＡＧ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎糸球体中の毛細血管の血管障害により引き起こされる進行性腎疾患であるＤＮは、糖尿病の最も重篤な合併症の１つである。ＤＮは初期のメサンギウム細胞増殖、その後の、腎糸球体の高濾過およびアルブミン尿に至る細胞外マトリクスタンパク質の蓄積により特徴づけられる。その主な臨床症状はアルブミン尿、進行性腎病変、高血圧および浮腫であり、これらは主な死因の１つである末期腎不全に至る可能性がある。統計学的データによれば、糖尿病患者の約３０〜４０％が腎病変を有する。これは合衆国および欧州において、それぞれ、末期腎疾患の主因および二次的原因となっている。現在では、中国人の末期腎疾患患者の１５％が糖尿病である。しかしながら、糖尿病発生率が増加し続け、集団が高齢化すると、この数字は上昇し続けるであろう。
【０００３】
今なお、ＤＮに対し有効な治療効果を有する薬物はほとんどなく、血糖降下薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＣＥＩ）および降圧薬、例えばインスリンおよびカプトプリルが臨床診療で広く使用されている。しかしながら、これらの薬物の長期の適用により、多くの重篤な副作用、すなわち、高カリウム血症、または機能性または器質性腎動脈狭窄による急性腎不全さえも起こる結果となるであろう。そのため、安全で有効に、ＤＮを阻止および治療する新規薬物の開発が非常に重要である。
【０００４】
ＤＮはまた、糖尿病性糸球体硬化症としても公知である。腎糸球体では、メサンギウム細胞が中心位置を占め、総腎糸球体細胞集団の約３０〜４０％を構成する。糸球体メサンギウム細胞は、多くの様々な生理機能、すなわちメサンギウム細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構造支持および分泌、サイトカイン類への応答および分泌、高分子および免疫複合体の食作用が可能である。メサンギウム細胞増殖、ＥＣＭ拡大および沈着はＤＮにおける重要な病理学的特徴である。
【０００５】
オウギ（Ｒａｄｉｘ  Ａｓｔｒａｇａｌｉ）は漢方薬として広く使用されている。主な効能は、鬱血を分散し、疼痛を軽減すること、血液循環を促進し、チャネルを開口させること、熱を除去しイライラの元を緩和すること、などである。現在、ますます実験および臨床診療により、オウギ抽出物がＤＮの進行に有利な効果を有することが証明されている。この所見はまた、オウギが漢方薬において糖尿病の治療に広く使用されているという事実と一致する。現在のところ、ほとんどの研究者がハーブ粗エキスに焦点を当て続けているが、効果に対応するその生物活性成分は依然として不明瞭である。そのため、ＤＮを阻止し、治療するために、明確な構造および品質制御の利便性という特徴を有する現代の漢方調製物を開発するためには、それについてさらなる研究を実施することが重要である。
【０００６】
オウギの前の化学的調査では、イソフラボノイドが主化学成分の１つであり、フリーラジカルスカベンジャ、免疫調節、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含む様々な生物学的効果を有することが示された。カリコシン（ＣＡＬ）およびカリコシン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ＣＡＧ）はオウギ中の２つの主なイソフラボノイドである。特許ＣＮ０１１２６６０８．２は、ＣＡＬおよびＣＡＧが抗心筋虚血活性を示すことを報告した。特許ＣＮ２００５１０１１０６４１．３は、ＣＡＧがコクサッキーウィルスを阻害し、ウイルス性心筋炎を治療することができることを報告した。さらに、それらはまた、いくつかの他の生物学的効果、例えば、酸化防止剤（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｓｃｉ，２００５，１８（５），ｐｐ．２９７−３０１）、血管内皮細胞への保護効果（Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２００８，４３（８），ｐｐ．５９４−５９７；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｎ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ，２０００，１６（４），ｐｐ．１６−１８）、およびカルシウムチャネル遮断活性（Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ，２００６，２７（８），ｐｐ．１００７−１０１２）、赤血球細胞変形態の修正（Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ，１９９９，６（２），ｐｐ．１−５）、ならびに変形性関節症の軽減（変形性関節症軟骨（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００７，１５（９），ｐｐ．１０８６−１０９２）を有した。
【０００７】
上記のように、それらは様々な生物学的効果を示したが、ＤＮを阻止し、治療するためのＣＡＬおよびＣＡＧの効果に対して何の情報も得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｓｃｉ，２００５，１８（５），ｐｐ．２９７−３０１
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２００８，４３（８），ｐｐ．５９４−５９７
【非特許文献３】Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｎ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ，２０００，１６（４），ｐｐ．１６−１８
【非特許文献４】Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ，２００６，２７（８），ｐｐ．１００７−１０１２
【非特許文献５】Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ，１９９９，６（２），ｐｐ．１−５
【非特許文献６】Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００７，１５（９），ｐｐ．１０８６−１０９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＤＮの阻止および治療を有する薬学的組成物、ならびにその調製方法を提供することであり、薬学的組成物の活性成分はＣＡＬおよび／またはＣＡＧである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、技術的解決策は以下の通りである。
【００１１】
ＤＮを阻止し、治療するための薬学的組成物は、組成物の総重量に基づき、０．１〜９９．５重量％としてＣＡＬおよびＣＡＧのうちの１つまたは両方と、従来の薬物担体（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒ）と、を含んでもよい。
【００１２】
好ましくは、本発明の化合物の量は組成物の総重量に基づき５から９０重量％の間で存在すべきである。
【００１３】
好ましくは、ＤＮの阻止および治療を有する薬学的組成物はＣＡＬおよびＣＡＧの両方と従来の薬物担体とを含み、ＣＡＬとＣＡＧの含有比率は１：５〜５：１である。
【００１４】
薬物担体は薬学分野における従来型のものであり、例として、希釈剤または賦形剤、例えば水、フィラー、例えばデンプン、スクロース、接着剤、例えばセルロース誘導体、藻類酸、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン、湿潤剤、例えばグリセロール、崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウム、吸収増強剤、例えば第４級アンモニウム化合物類、界面活性剤、例えばパルミチルアルコール、吸着担体、例えばカオリンおよびソープクレイ、潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびにポリエチレングリコール、などである。さらに、香味料および甘味料などの他の補助剤も添加することができる。
【００１５】
薬学的組成物は、従来の方法により従来の剤形に調製することができ、従来の剤形は基礎的な経口調製物、例として、固体剤形、例えば錠剤、顆粒、ピル、粉末、顆粒またはカプセル、および液体剤形、例えば水もしくは油懸濁液またはエリキシル、などである。
【００１６】
本発明の化合物または組成物の望ましい用量は、被験体の状態および体重、重篤度、薬物形態、投与経路および期間によって変動し、当業者であれば選択することができる。しかしながら、ラットに対する本発明の化合物の有効量は２〜１０ｍｇ／ｋｇ重量／時間であるので、身体表面積の比により、本発明の発明化合物の２０〜１００ｍｇ／６０ｋｇ重量／時間の範囲の量で投与されることが一般に推奨される。
【００１７】
本発明の別の目的は、薬学的組成物の調製法を提供することであり、目的のための技術プロジェクトは下記の通りである。
【００１８】
薬学的組成物の調製法は、ＣＡＬおよびＣＡＧの１つまたは両方と従来の薬物担体との混合である。
【００１９】
ＣＡＬおよびＣＡＧは下記工程を含む手順により調製することができる。
Ａ．微粉化されたオウギを８０％エタノールで還流および濾過下、抽出し、アルコール抽出物を合わせ、その後真空で濃縮する。濃縮物をその後、一晩中４℃で冷蔵した。
Ｂ．工程Ａにより得られた上清をマクロポーラス樹脂カラム上で流し、水で溶離し、その後、ＴＬＣを用いてＣＡＧが検出されなくなるまで、５０％エタノールで溶離する。
Ｃ．５０％エタノール画分溶媒を濃縮し、その後、等量の酢酸エチルを用いて抽出し、酢酸エチル抽出物を合わせ、その後、真空で濃縮する。
Ｄ．抽出物をシリカゲルクロマトグラフィにかけ、クロロホルム−メタノール溶媒系で徐々に溶離し、ＴＣＬ分析により同じ画分を合わせ、結晶化させ、その後、吸引濾過により結晶を得る。最後に、ＣＡＬおよびＣＡＧをメタノール中での再結晶化により得る。
【００２０】
ＣＡＬおよびＣＡＧはまた、上記方法にしたがい他の漢方薬から得ることができる。
【００２１】
本発明はまた、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型ＤＮを含むＤＮの阻止および治療における薬物製造でのＣＡＬおよび／またはＣＡＧの使用を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の薬学的組成物は下記有用な重要性を有した。
１．本発明は、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧが、薬理実験によりＤＮの阻止および治療を有する新規医学的用途を有することを発見し、ならびに、ＤＮ患者に対する新規薬物候補を提供した。
２．薬学的組成物の効果は、明確な構造および品質制御の利便性のキャラクタリゼーションと共に、オウギの水性抽出物よりも良好であった。
３．薬学的組成物は糖尿病により誘発される糸球体損傷、および糖尿病自体の治療および阻止の著しい効果を示し、というのは、血清クレアチニンの増加、尿産生および尿タンパクの誘発を著しく阻止することができたからである。
４．薬学的組成物を様々な便利な経口剤形、例えば、ピル、顆粒、錠剤などに加工することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】高グルコースにより誘発されたＥＣＭ芽生生殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果を示す（ＰＡＳ、２００×）。  ここで、Ａ：正常グルコース群、Ｂ：高グルコース群（２５ｍＭ）、Ｃ：オウギ群（ＲＡ、５０ｍｇ／ｍｌ水性抽出物）、Ｄ：ＣＡＬ群（１００ｎＭ）、Ｅ：ＣＡＬ群（１０ｎＭ）、Ｆ：ＣＡＬ群（１ｎＭ）、Ｇ：ＣＡＧ群（１００ｎＭ）、Ｈ：ＣＡＧ群（１０ｎＭ）、Ｉ：ＣＡＧ群（１ｎＭ）、Ｊ：ＣＡＬ：ＣＡＧ群（１０μｇ／ｍｌ：５μｇ／ｍｌ）、Ｋ：ＣＡＬ：ＣＡＧ群（５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）。
【図２】高グルコースにより誘発されたＴＧＦβ−１発現に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果を示す（２００×）。  ここで、Ａ：正常グルコース群、Ｂ：高グルコース群（２５ｍＭ）、Ｃ：陰性対照群、Ｄ：ＣＡＬ群（１００ｎＭ）、Ｅ：ＣＡＬ群（１０ｎＭ）、Ｆ：ＣＡＬ群（１ｎＭ）、Ｇ：ＣＡＧ群（１００ｎＭ）、Ｈ：ＣＡＧ群（１０ｎＭ）、Ｉ：ＣＡＧ群（１ｎＭ）、Ｊ：オウギ群（ＲＡ、５０ｍｇ／ｍｌ水性抽出物）、Ｋ：ＣＡＬ：ＣＡＧ群（１０μｇ／ｍｌ：５μｇ／ｍｌ）、Ｌ：ＣＡＬ：ＣＡＧ群（５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明はより詳細には、下記実施例により説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例にいかなる形においても限定されないことを理解すべきである。
【００２５】
＜実施例１  オウギからのＣＡＬおよびＣＡＧの調製＞
モウコモメンヅル（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ  ｖａｒ．ｍｏｎｇｈｕｌｉｃｕｓ）（１０ｋｇ）の乾燥させた根を８０％エタノールで還流下（８０Ｌ×３）、３度（２時間、１時間、１時間）抽出した。アルコール抽出物を合わせ、その後、真空で濃縮した。濃縮物を水に溶解し、その後、一晩中４℃で冷蔵した。上清をＤ１０１マクロポーラス樹脂カラム上で流し、水で溶離し、その後、ＴＬＣを用いてＣＡＧが検出されなくなるまで、５０％エタノールで溶離した。５０％エタノール画分溶媒を濃縮し、その後、酢酸エチルを用いて７度抽出し、その後、抽出物を濃縮し、シリカゲル（２００〜３００メッシュ）クロマトグラフィにかけ、クロロホルム−メタノール（５０：１、２５：１、１２：１、６：１、３：１、１．５：１、１：１）溶媒系で徐々に溶離した。同じ画分を合わせ、結晶化させた。最後に白色針状結晶（ＣＡＬ）および粉末（ＣＡＧ）が、メタノールを使用する再結晶化により得られた。それらの構造をＮＭＲならびにＭＳにより確認し、純度はＨＰＬＣ分析により９８％を超えた。それらの構造を下記に示す。
【００２６】
【化１】
0005383709.tif 000002
ＣＡＬ：分子量：２８４、分子式Ｃ１６Ｈ１２Ｏ５、化学名：３’−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン
【化２】
0005383709.tif 000003
ＣＡＧ：分子量：４４６、分子式Ｃ２２Ｈ２２Ｏ１０、化学名：３’−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド。
【００２７】
以下、調合法および賦形剤の種類について記載するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例は以下のように記載される。
【００２８】
＜実施例２  顆粒の調製＞
CAG                         1mg
デンプン                    500mg
微結晶セルロース            500mg
粉末調製物は上記成分を混合し、密閉パッケージに充填することにより調製した。
【００２９】
＜実施例３  錠剤の調製＞
CAG                     20mg
ラクトース              127mg
トウモロコシデンプン    50mg
ステアリン酸マグネシウム3mg
錠剤調製物は上記成分を混合し、錠剤化することにより調製した。
【００３０】
＜実施例４  カプセルの調製＞
CAL            30mg
CAG            70mg
ラクトース     40mg
デキストリン   15mg
デンプン       45mg
3%HPMC         適当
カプセル調製物は上記成分を混合し、従来のゼラチン調製法によりゼラチンカプセルに充填することにより調製した。
【００３１】
＜実施例５  顆粒の調製＞
CAG                         50mg
デンプン                    400mg
微結晶セルロース            550mg
粉末調製物は上記成分を混合し、密閉パッケージに充填することにより調製した。
【００３２】
＜実施例６  カプセルの調製＞
CAL            120mg
CAG            60mg
デキストリン   10mg
デンプン       10mg
カプセル調製物は上記成分を混合し、従来のゼラチン調製法によりゼラチンカプセルに充填することにより調製した。
【００３３】
＜実施例７  錠剤の調製＞
CAL          200mg
HPMC         2mg
錠剤調製物は上記成分を混合し、錠剤化することにより調製した。
【００３４】
＜実施例８  錠剤の調製＞
CAG          200mg
HPMC         2mg
錠剤調製物は上記成分を混合し、錠剤化することにより調製した。
【００３５】
＜実施例９  カプセルの調製＞
CAL            80mg
CAG            20mg
ラクトース     40mg
デキストリン   15mg
デンプン       45mg
3%HPMC         適当
カプセル調製物は上記成分を混合し、従来のゼラチン調製法によりゼラチンカプセルに充填することにより調製した。
【００３６】
本発明では、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧを実験で使用し、ＤＮを阻止し、治療する効果を確認し、これをオウギ水性抽出物と比較した。
【００３７】
＜実験１  高グルコースまたはＡＧＥ誘発ラットメサンギウム細胞増殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果＞
メサンギウム細胞は腎糸球体において最も活性な細胞であり、メサンギウム細胞の病理学的変化はＤＮ発生において中央位置を占め、ＤＮの標的細胞でもある。このように、高グルコースまたはＡＧＥ誘発ラットメサンギウム細胞増殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果はインビトロで研究された。
【００３８】
１．材料および試薬
ラットメサンギウム細胞系ＨＢＺＹ２１（武漢細胞生物学学会（Ｗｕｈａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、新生仔ウシ血清（杭州シジキン血清工場（Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｓｉｊｉｑｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆａｃｔｏｒｙ）、ＭＴＴ（アムレスコ（Ａｍｒｅｓｃｏ））、ジメチルスルホキシド（上海ジウチー化学試薬社（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｕｑｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）、ＣＯ２インキュベータ（ナプコ（ＮＡＰＣＯ）０５４１０、プレシジョンサイエンティフィック（ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ））、ＸＳＺ−Ｄ２倒立顕微鏡（重慶光学機器工場（Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒｙ）、超クリーンベンチ（蘇州バイシェンネットワークシステム社（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｂａｉｓｈｅｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、マイクロプレート分光光度計（スペクトラマックス（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ）１９０、ＡＤ  ＣＯ．  Ｌｔｄ．ＵＳＡ）、臨床遠心分離機（ＬＤＺ５−２、北京臨床遠心分離機工場（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ）。
【００３９】
２．方法
２．１  実験モデル
指数増殖期のメサンギウム細胞を９６ウェルプレートにおいて、５００００ｃｍ−２の密度で、ＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース）中、３７℃で、５％ＣＯ２−９５％空気中２４時間培養した。仔ウシ血清が添加されていないＤＭＥＭ中で２４時間プレインキュベートした後、細胞をその後、様々な濃度のグルコースまたはＡＧＥでそれぞれ、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間処理した。メサンギウム細胞増殖をＭＴＴにより測定し、結果から、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＡＧＥまたは２５ｍＭグルコースにより２４時間処理されたメサンギウム細胞は最良の実験モデル条件であることが示された。
【００４０】
２．２  高グルコースにより誘発されたラットメサンギウム細胞増殖に対する効果
上記方法にしたがい、仔ウシ血清が添加されていないＤＭＥＭ中で２４時間プレインキュベートした後、細胞を２５ｍＭグルコースで予め処理し、その後、示したように様々な濃度の試薬で処理した：正常グルコース群（ＮＧ、５．５ｍＭグルコース）、高グルコース群（ＨＧ、２５ｍＭグルコース）、ＣＡＬ群（ＣＡＬ、１０、１００ｎＭ）、ＣＡＧ群（ＣＡＧ、１０、１００ｎＭ）、ＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、１０μｇ／ｍｌ：５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）、オウギ群（ＲＡ、５０ｍｇ／ｍｌ水性抽出物）。その後、プレートを２４時間インキュベートした。ＭＴＴ還元アッセイ法により増殖を調べた。実験条件を６通り試験した（１実験条件あたり９６ウェルプレートの６ウェル）。
【００４１】
２．３  ＡＧＥにより誘発されたラットメサンギウム細胞増殖に対する効果
細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＡＧＥで予め処理し、その後、示したように様々な濃度の試薬で処理した：正常グルコース群（ＮＧ、５．５ｍＭグルコース）、ＡＧＥ群（ＡＧＥ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＡＧＥ）、ＣＡＬ群（ＣＡＬ、１０、１００ｎＭ）、ＣＡＧ群（ＣＡＧ、１０、１００ｎＭ）、ＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、１０μｇ／ｍｌ：５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）、オウギ群（ＲＡ、５０ｍｇ／ｍｌ水性抽出物）。その後、プレートを２４時間インキュベートした。ＭＴＴ還元アッセイ法により増殖を調べた。実験条件を６通り試験した（１実験条件あたり９６ウェルプレートの６ウェル）。
【００４２】
３．結果
３．１  高グルコース誘発ラットメサンギウム細胞増殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表１に示されるように、ＮＧ群と比較して、２５ｍＭグルコース（ＨＧ）単独では、２４時間の処理後、ラットメサンギウム細胞増殖が増加した（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧ、オウギを添加すると、１０から１００ｎＭの範囲の濃度では、用量依存様式で、高グルコース誘発ラットメサンギウム細胞増殖が阻害された。さらに、１００ｎＭ  ＣＡＬ、１００ｎＭ  ＣＡＧ、およびＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）の効果は全てオウギ群よりも良好であった。ＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）の効果はＣＡＬおよびＣＡＧ群よりも良好であった。これらの結果から、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧは初期ＤＮに対し有益な効果を有することができることが示された。
【００４３】
【表１】
0005383709.tif 000004
【００４４】
３．２  ＡＧＥ誘発ラットメサンギウム細胞増殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表２に示されるように、ＮＧ群と比較して、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＡＧＥ単独では、２４時間の処理後、ラットメサンギウム細胞増殖が増加した（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧ、オウギを添加すると、それぞれ、ＡＧＥ誘発ラットメサンギウム細胞増殖が阻害された。さらに、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果は全てオウギ群よりも良好であった。ＣＡＬ＋ＣＡＧ群の効果はＣＡＬ群よりも良好であった。これらの結果から、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧは初期ＤＮに対し有益な効果を有することができることが示された。
【００４５】
【表２】
0005383709.tif 000005
【００４６】
＜実験２  高グルコース誘発ラットＥＣＭ拡大に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果＞
メサンギウム細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の拡大および沈着はＤＮにおける主な病理学的特徴であり、これはＤＮを含む慢性腎疾患の治療のための重要な標的である。
【００４７】
１．材料および試薬
ＴＧＦβ−１抗体（キャンタクルズ（Ｃａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、Ｄｉ−抗体（深川ジングメイバイオエンジニアリング社（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ  Ｊｉｎｇｍｅｉ  Ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、ＳＡＢＣ免疫組織化学染色キット（武漢ボスター社（Ｗｕｈａｎ  Ｂｏｓｔｅｒ  Ｃｏ．））、ＤＡＢ呈色システム（遺伝子工学生命工学社（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．））、免疫組織化学ボックス（福州マイキシン生物工学開発社（Ｆｕｚｈｏｕ  Ｍａｉｘｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．）。
【００４８】
２．方法
処理は実験１のセクション２．１と同じとした。マトリクス増殖の測定は、ヒドロキシプロリンの量およびＴＧＦβ−１の発現を決定することにより測定した。
カバーガラスを２４ウェルプレート内に予め配置し、細胞を付着させた。細胞を、実施例１で示したように、様々な濃度の試薬で処理した。細胞をカバーガラスで覆った後、ヒドロキシプロリンの定量のために上清を使用し、細胞のスライドを免疫組織化学およびＰＡＳ染色により染色して処理した。ＴＧＦβ−１抗体なしで培養させた細胞を陰性対照と見なした。
【００４９】
３．結果
３．１  高グルコースにより誘発されたラットメサンギウム細胞の細胞培養液中のヒドロキシプロリンの量に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表３に示されるように、ＮＧ群と比較して、２５ｍＭグルコース（ＨＧ）は、ラットメサンギウム細胞の細胞培養液中のヒドロキシプロリンの量を増加させる可能性があった（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧ、オウギを添加すると、それぞれ、ヒドロキシプロリンの量の増加が阻害された。さらに、１００ｎＭ  ＣＡＬおよび１００ｎＭ  ＣＡＧの効果は全てオウギ群よりも良好であった。ＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、５μｇ／ｍｌ：１０μｇ／ｍｌ）の効果は別のＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、１０μｇ／ｍｌ：５μｇ／ｍｌ）群よりも良好であった。
【００５０】
【表３】
0005383709.tif 000006
【００５１】
３．２  高グルコースによるＥＣＭ芽生生殖に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
図１および２に示されるように、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧ、オウギを添加すると、高グルコースにより誘発された、ＥＣＭ芽生生殖およびＴＧＦβ−１の発現が阻害された。ＣＡＬまたはＣＡＧ（１０、１００ｎＭ）の効果はオウギ群よりも良好であり、ＣＡＬとＣＡＧを組み合わせて使用すると、単独使用よりも良好であった。
実験１および２の結果から、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧはラットメサンギウム細胞増殖、ＥＣＭ芽生生殖およびＴＧＦβ−１発現を阻害することができた。これらの結果からＣＡＬおよび／またはＣＡＧのＤＮに対する治癒効果が支持された。
【００５２】
＜実験３  ストレプトゾトシンにより誘発された糖尿病性腎症モデルラットに対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果＞
１．材料および試薬
ストレプトゾトシンにより誘発されたＤＮモデルウィスターラットは、南方医科大学（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物実験センターから供給された。バイオベース−パール（ＢＩＯＢＡＳＥ−ＰＥＡＲＬ）個別自動生化学アナライザ（山東バイオベース社（Ｓｈａｎｄｏｎ  ＢＩＯＢＡＳＥ  Ｃｏ．））。
【００５３】
２．方法
ＤＮモデルウィスターラットは無作為に、示したように、各群１０匹の１１の群に分割した：正常グルコース群、モデル群、ＣＡＬ群（６、２、０．７ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＧ群（９、３、１ｍｇ／ｋｇ）、ＣＡＬ＋ＣＡＧ群（ＣＡＬ：ＣＡＧ、２ｍｇ／ｋｇ：１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ：２ｍｇ／ｋｇ）、オウギ群（５ｇ／ｋｇ）、アミノグアニジン群（１００ｍｇ／ｋｇ）。
薬物または塩化ナトリウムを、毎日１回、１４週間胃内投与した。投与後、代謝ケージにより総体積尿を収集した。尿産生、総タンパク、ミクロアルブミン、およびクレアチニンの量を決定し、血液中の生化学的指標を、自動生化学アナライザを用いて決定した。その後、ホルマリン固定した腎臓を病理組織検査のために確保した。
【００５４】
３．結果
３．１  ＳＴＺ  ＤＮモデルラットにおける尿産生、総タンパク、ミクロアルブミン、およびクレアチニンに対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表４に示されるように、中等量または高用量でのＣＡＬおよび／またはＣＡＧの胃内投与により、尿産生、総タンパク、ミクロアルブミン、およびクレアチニンの量を減少させることができ、ＣＡＬまたはＣＡＧの効果はオウギ群よりも良好であり、ＣＡＬとＣＡＧを組み合わせて使用すると、単独使用よりも良好であるか、同じであった。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
３．２  ＳＴＺ  ＤＮモデルラットにおける血清生化学的指標に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表５に示されるように、オウギ、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧの胃内投与により、血清中のトリグリセリド、ＭＤＡ、Ｓｃｒ、ＢＵＮ、ＡＧＥおよびＬＤＬの量を減少させることができ、ＳＯＤ活性が著しく上昇した。ＣＡＬまたはＣＡＧの効果はオウギ群よりも良好であり、ＣＡＬとＣＡＧを組み合わせて使用すると、単独使用よりも良好であった。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
３．３  ＳＴＺ  ＤＮモデルラットにおける病理組織学的指標に対するＣＡＬおよび／またはＣＡＧの効果
表６に示されるように、オウギ、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧの胃内投与により、ＥＣＭ芽生生殖およびＴＧＦβ−１発現が著しく阻害され、病理学的損傷スコアが減少する可能性があった。ＣＡＬまたはＣＡＧの効果はオウギ群よりも良好であり、ＣＡＬとＣＡＧを組み合わせて使用すると、単独使用よりもわずかに良好であった。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
全体に、上記実験結果により、ＣＡＬおよび／またはＣＡＧはＤＮの発症および発生の阻止および治療、ならびにＳＴＺ  ＤＮモデルラットに対する保護効果を示すことができることが示された。さらに、ＡＧＥにより引き起こされる腎臓酸化ストレスおよび線維症のレベルを低減させることができ、効果はオウギ水性抽出物よりも優れていた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
0005383709.tif 000016
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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