(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成するシースフローセルと、試料流に光を照射する光源と、光を受けた各有形成分から光学的情報を検出する光検出部と、検出された光学的情報に基づいて有形成分を分析する分析部を備え、分析部は、検出された光学的情報から前方散乱光強度、側方散乱光強度および蛍光強度を抽出するパラメータ抽出部と、蛍光強度と前方散乱光強度とをパラメータとする第１分布図を作成し第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現予想領域に出現する有形成分について前方散乱光強度と側方散乱光強度とをパラメータとする第２分布図を作成する分布図作成部と、第１分布図において赤血球出現領域を分画する分画領域決定部と、赤血球出現領域の有形成分の数を赤血球数として計数する計数部と、第２分布図中の予め設定された結晶出現予想領域に出現する有形成分の数に基づいて前記赤血球数の信頼性を評価する評価部を備えた尿中有形成分分析装置。
【請求項２】
染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成し、試料流に光を照射し、光をうけた各有形成分から前方散乱光強度、側方散乱光強度および蛍光強度を抽出し、蛍光強度と前方散乱光強度とをパラメータとする第１分布図を作成し、第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現予想領域に出現する有形成分について前方散乱光強度と側方散乱光強度とをパラメータとする第２分布図を作成し、第１分布図において赤血球出現領域を分画してその領域の有形成分の数を赤血球数として計数し、第２分布図中の予め設定された結晶出現予想領域に出現する有形成分数に基づいて前記赤血球数の信頼性を評価することを特徴とする尿中有形成分分析方法。
【請求項３】
染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成するシースフローセルと、試料流に光を照射する光源と、光を受けた各有形成分から前方散乱光信号、側方散乱光信号および蛍光信号を光学的情報として検出する光検出部と、検出された光学的情報に基づいて分布図を作成し、分布図中の予め設定された赤血球出現領域に出現する有形成分の数を赤血球数として計数する分析部を備え、
前記分析部は、蛍光信号と前方散乱光信号に基づいて第１分布図を作成し、第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現領域に出現する有形成分について前方散乱光信号と側方散乱光信号に基づいて第２分布図を作成し、第２分布図中の予め設定された結晶出現領域に出現する有形成分の数に基づいて赤血球計数の信頼性を評価することを特徴とする尿中有形成分分析装置。
【請求項４】
染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成し、試料流に光を照射し、光を受けた各有形成分から前方散乱光信号、側方散乱光信号および蛍光信号を光学的情報として検出し、検出された光学的情報に基づいて分布図を作成し、分布図中の予め設定された赤血球出現領域に出現する有形成分の数を赤血球数として計数する尿中有形成分分析方法であって、
蛍光信号と前方散乱光信号とをパラメーターとする第１分布図を作成し、第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現領域に出現する有形成分について前方散乱光信号と側方散乱光信号とをパラメーターとする第２分布図を作成し、第２分布図中の予め設定された結晶出現領域に出現する有形成分の数に基づいて赤血球計数の信頼性を評価することを特徴とする尿中有形成分分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は尿中有形成分分析装置および分析方法に関し、例えば、尿中に含有される血球、結晶、円柱、上皮細胞などを検出する装置および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の粒子分析装置においては、染色した粒子に光を照射して蛍光および散乱光を測光しスキャッタグラムを作成して粒子を計数するようにした光学式装置や、電気抵抗式の粒子計数器においてオリフィスに針状の部材を挿入して各種サイズの粒子を計数するようにした装置などが知られている（例えば、特開平４−３３７４５９号公報および欧州出願公開公報第２４２９７１Ａ２号参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の装置で尿中に含まれる粒子（有形成分）を分析すると、粒子の種類が多いため、分布図上の分布領域が互に重なり合い粒子の分類や分析が難しい。とくに、赤血球と結晶とは、分布図において、分布が重なり合うため、分析装置が結晶を赤血球として誤認識してしまうという問題点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この発明は、染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成するシースフローセルと、試料流に光を照射する光源と、光を受けた各有形成分から光学的情報を検出する光検出部と、検出された光学的情報に基づいて有形成分を分析する分析部を備え、分析部は、検出された光学的情報から前方散乱光強度、側方散乱光強度および蛍光強度を抽出するパラメータ抽出部と、蛍光強度と前方散乱光強度とをパラメータとする第１分布図を作成し第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現予想領域に出現する有形成分について前方散乱光強度と側方散乱光強度とをパラメータとする第２分布図を作成する分布図作成部と、第１分布図において赤血球出現領域を分画する分画領域決定部と、赤血球出現領域の有形成分の数を赤血球数として計数する計数部と、第２分布図中の予め設定された結晶出現予想領域に出現する有形成分の数に基づいて前記赤血球数の信頼性を評価する評価部を備えた尿中有形成分分析装置を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
この発明の分析装置における被検粒子（有形成分）は、主にヒトを含む動物の尿に含まれる赤血球や結晶のような有形成分であり、これらは予め蛍光染料や蛍光標識試薬によって処理される。
【０００６】
この発明のシースフローセルには、細孔によって連通された上下２つのセルからなり、粒子を含む試料液をシース液に包んで流すことにより流体力学的効果によって試料液の流れを形成して細孔に粒子を一列に通過させるようにしたものを用いることが好ましい。
【０００７】
この発明に用いるシースフローセルは、例えば、細孔に試料液を０．５〜１０m／sec程度の速度で流すものである。
光源は、細孔を通過中、通過直前、又は通過直後の粒子に、フローセルの外部から光ビームを照射するものであり、これには、連続的に発光する（パルス発光でないタイプのもの）レーザ光源に集光用レンズを付加したものを用いることが好ましい。レーザ光源としては、アルゴンレーザやヘリウム-ネオンレーザ（緑色）を用いることができる。
【０００８】
光検出部は、光ビームを受けた粒子から発せられる光学的情報つまり散乱光や蛍光を検出してパルス状の電気信号に変換するものであるが、これには、その光の強さに応じてホトダイオード、ホトトランジスタ又はホトマルチプライヤーチューブなどを用いることができる。
なお、分析部は、ＣＰＵ，ＲＯＭおよびＲＡＭからなるマイクロコンピュータやパーソナルコンピュータによって構成されることが好ましい。
【０００９】
パラメータ抽出部は、検出された蛍光および前方・側方散乱光についてのパルス信号の各波高値からパラメータとしてそれぞれ蛍光強度Ｆｌ，前方散乱光強度Ｆｓｃ及び側方散乱光Ｓｓｃを抽出するが、波高値の抽出にはピークホールド回路を用いることができる。
【００１０】
なお、ここでいう前方散乱光とは、光源からシースフローセルを透過する光の光軸に対して±５度の角度範囲において受光される有形成分の散乱光である。また、側方散乱光とは、通常は、光源からの光の光軸に直交する方向から受光される有形成分の散乱光であるが、この発明においては、光源の光軸に直交する方向に対して±５０度の範囲における任意の角度から受光される散乱光であってもよい。
【００１１】
この発明の装置の被験対象である赤血球は、健常人の尿にはほとんど出現せず、血尿の場合には数十個〜数千個／μｌ以上出現する。
結晶には尿酸（砥石片亜鈴状結晶）、尿酸塩（無結晶苔状集合）、ＤＨＡ結晶、シュウ酸カルシウム（正８面体および円盤状）、リン酸カルシウムなどが含まれているが、この発明では、とくに健常人の尿にも出現するシュウ酸カルシウムおよびリン酸カルシウムを対象としている。シュウ酸カルシウムやリン酸カルシウムのような結晶は、前方散乱光強度Ｆｓｃと蛍光強度Ｆ１をパラメータとする２次元分布図の赤血球出現領域とはほとんどオーバーラップして分布する。
【００１２】
従って、各種の結晶がスキャッタグラムの赤血球出現領域に混入して出現し、赤血球数の計測精度が低下するというような問題が生じる。
すなわち、結晶がリン酸カルシウムの場合には蛍光強度Ｆ１が赤血球とほとんど同じであり、前方散乱光強度Ｆｓｃは低い位置から高い位置にまで分布する。この分布位置は非溶血赤血球および溶血赤血球の出現領域とほとんど重なってしまうので結晶の出現による赤血球の擬陽性が発生する。
【００１３】
しかし、この発明では、赤血球は側方散乱光強度Ｓｓｃが非常に低く、結晶は側方散乱光強度Ｓｓｃが低い位置から高い位置にまで分布する点に着目し、高い側方散乱光強度Ｓｓｃの粒子を結晶として弁別しようとするものである。また、シュウ酸カルシウム結晶の場合でも同様である。
【００１４】
つまり、Ｆｓｃ-Ｓｓｃをパラメータとする２次元分布図における結晶出現領域に出現する有形成分の数に基づいて、ＦｓｃとＦ１をパラメータとする分布図に出現する赤血球数の計測精度を評価することができる。
【００１５】
また、この発明は、別の観点から、染色処理された尿中有形成分を含む試料液をシース液に包んで試料流を形成し、試料流に光を照射し、光をうけた各有形成分から前方散乱光強度、側方散乱光強度および蛍光強度を抽出し、蛍光強度と前方散乱光強度とをパラメータとする第１分布図を作成し、第１分布図中の予め設定された結晶および赤血球出現予想領域に出現する有形成分について前方散乱光強度と側方散乱光強度とをパラメータとする第２分布図を作成し、第１分布図において赤血球出現領域を分画してその領域の有形成分の数を赤血球数として計数し、第２分布図中の予め設定された結晶出現予想領域に出現する有形成分数に基づいて前記赤血球数の信頼性を評価する方法を提供するものである。
【００１６】
実施例
以下、図面に示す実施例を用いてこの発明を詳述する。
図１は分析装置の要部構成を示す説明図であり、２はシースフローセル１へ希釈および染色処理された試料液を試料ノズル２ａを介して供給する試料液供給部、３はシースフローセル１へシース液を供給するシース液供給部である。
【００１７】
また、４はレーザ光源、５はコンデンサーレンズ、６はビームストッパー、７はコレクターレンズ、８はピンホール板、９はダイクロイックミラー、１０はフィルター、１１，１２，１３はホトマルチプライヤーチューブ（以下、ホトマルという）、１４，１５はコレクターレンズ、１６はシースフローセル１から排出される試料液流である。
【００１８】
ここで、ホトマル１２とコレクターレンズ１４とは、レーザ光源４からのレーザビームの光軸に直交する光軸上に配置され、シースフローセル１を流れる有形成分からの側方散乱光を受光するようになっている。
【００１９】
このような構成において、シースフローセル１へ試料液とシース液とが試料液供給部２およびシース液供給部３からそれぞれ供給される。
【００２０】
これによって試料液はシース液に包まれ、さらにシースフローセル１内のオリフィスによって細く絞られてシースフローを形成する。
【００２１】
このようにシースフローを形成することによって試料液に予め含まれた粒子を一個ずつ一列に整列して流すことができる。
【００２２】
一方、フローセル１を流れる試料液流へレーザ光源４から発振したレーザ光がコンデンサーレンズ５で絞られて照射される。
【００２３】
試料液中の粒子に当たらずそのままシースフローセル１を透過したレーザ光はビームストッパー６で遮光される。レーザ光をうけた粒子から発せられる前方散乱光及び前方蛍光はコレクターレンズ７により集光され、ピンホール板８のピンホールを通過してダイクロイックミラー９に到達する。
【００２４】
散乱光より長波長の蛍光はそのままダイクロイックミラー９を透過し、フィルター１０で更に励起光が除かれた後にホトマルチプライヤーチューブ１１で検出され蛍光信号２７（パルス状のアナログ信号）として出力される。また、前方散乱光はダイクロイックミラー９で反射されレンズ１５を介してホトダイオード１３で受光されて前方散乱光信号２８（パルス状のアナログ信号）として出力される。
また、レーザ光をうけた粒子から発せられる側方散乱光は、レンズ１４を介してホトマル１２で受光されて側方散乱光信号２９として出力される。
【００２５】
図２は、前述のようにして得られた蛍光信号２７、前方散乱光信号２８および側方散乱光信号２９を処理する分析部１００のブロック図であり、パラメータ演算部２００は、増幅器３１〜３３、直流再生回路３４〜３６、ピークホールド回路３８〜４０およびＡ／Ｄ変換器４３〜４５を備える。４７はデータ格納部、４８はデータ処理部、４９は表示部である。
【００２６】
次に、このような構成における信号処理動作を説明する。
パルス状の前方散乱光信号２８は増幅器３２で増幅され、直流再生回路３５で直流レベルが固定される。直流再生回路３５から出力されるパルス信号Ｓ２は最大値がピークホールド回路３９にとらえられて、Ａ／Ｄ変換器４４によってＡ／Ｄ変換されて前方散乱光強度Ｆｓｃが得られる。
【００２７】
パルス状の蛍光信号２７は増幅器３１で増幅され、直流再生回路３４で直流レベルが固定され、信号Ｓ１として出力される。信号Ｓ１は最大値がピークホールド回路３８でとらえられてＡ／Ｄ変換器４３によってＡ／Ｄ変換され蛍光強度Ｆｌが得られる。
【００２８】
パルス状の側方散乱光信号２９は増幅器３３で増幅され、直流再生回路３６で直流レベルが固定され、信号Ｓ３として出力される。信号Ｓ３は最大値がピークホールド回路４０でとらえられＡ／Ｄ変換器４５でＡ／Ｄ変換され、側方散乱光強度Ｓｓｃが得られる。
【００２９】
Ａ／Ｄ変換器４３〜４５の出力信号は、データ格納部４７に格納されると共にデータ処理部４８に送られ粒子の弁別処理が行われる。
【００３０】
つまり、分布図（ヒストグラムやスキャッタグラム）に基づいて赤血球、結晶、酵母様真菌、白血球、上皮細胞などの分類が行われる。そして分類された粒子はカウント（計数）され、試料１マイクロリットル当たりの数に換算される。また、その結果は各種分布図と共に表示部４９に表示される。
【００３１】
図３は、データ処理部４８の構成を示すブロック図である。図３において、６１は各種の値や領域などを予め設定するためのデータの入力部であり、例えば、キーボードやマウスにより構成される。
【００３２】
また、６１ａは設定された各種条件を格納する設定条件格納部である。６２はデータ格納部４７に格納されたパラメータ情報に基づいて分布図、つまりＦｌ−ＦｓｃやＳｓｃ−Ｆｓｃについての各２次元スキャッタグラムを作成する分布図作成部である。
【００３３】
６４は分布図作成部６２で作成される分布図において各粒子の分画領域を決定する分画領域決定部、６５は領域内の粒子数の計数を行う計数部、６６は分画や計数の結果の信頼性を評価する評価部、６７は領域に存在する粒子の種類を判定する判定部である。そして、演算部６５の演算結果および評価部６６の評価結果は分布図作成部６２で作成された分布図と同様に表示部４９に表示される。
【００３４】
次に、データ処理部４８における主な動作について詳述する。
（１）分布図における分画領域の決定
この分析装置は、検出した粒子を分類するために、分布図において分画領域を決定するが、その処理の一例を図４のフローチャートを用いて説明する。
【００３５】
まず、分布図作成部６２によりＦｌ−Ｆｓｃ分布図（スキャッタグラム）が作成されて、図５のように表示されると（ステップＳ１）、設定条件格納部６１ａに記憶されている、赤血球の分布の度数極大点が存在すると予想される予想分画領域Ｓ０が呼出され、図６に示すように設定される（ステップＳ２）。
なお、入力部６１を用いて使用者が予想分画領域Ｓ０を変更することもできる。
【００３６】
次に、抽出部６３は、領域Ｓ０に閾値を設定し度数がその閾値を越え周囲より大きい度数を持つ点、つまり極大点Ｐ１，Ｐ２，……を図７のように抽出する（ステップＳ３）。
【００３７】
そして、この極大点Ｐ１には、求める分画領域を構成する１つの点であるとするマークが図８に示すように付加される（図８では黒点として表されている）（ステップＳ４）。
【００３８】
次に、マーク付きの点（黒点）とその周囲の点とが度数で比較され、度数の低い点は、図９に示すようにマークが付加される（ステップＳ５〜Ｓ７）。この処理がくり返されマーク付きの点の周囲に度数の低い点がなくなると（ステップＳ６）、図１０に示すようにマーク付きの点の集合が領域Ｓ１として決定される。
【００３９】
極大点が複数個ある場合についても、同様の処理が実行される。極大点Ｐ２については領域Ｓ２が決定され（ステップＳ９〜Ｓ１３）、図１１のように、領域Ｓ１と領域Ｓ２を合わせた領域が赤血球分画領域として決定される（ステップＳ１４）。
【００４０】
他の種類の粒子（有形成分）についても、同様に各分画領域が決定され、分画領域によって分類された粒子の度数が計数部６５で計数され、表示部４９に表示される。
【００４１】
（２）分析（分画）精度の評価
この分析装置は、種類の異なる粒子が同一分画領域に混在する可能性を判断して、分画結果を評価するようにしている。その処理手順を、赤血球と結晶を例にして説明する。
【００４２】
図１に示す装置において、レーザ光源４としてアルゴンレーザを用い、試料液供給部２は尿（例えば４００μｌ）を希釈液（例えば１１６０μｌ）で希釈し、染色液（例えば４０μｌ）を加えて作成した試料液をシースフローセル１に供給し、前方散乱光蛍光，蛍光および側方散乱光を測定する。
【００４３】
なお、希釈液および染色液は例えば次のようにして調製される。
0003642658.tif 000002
【００４４】
・染色液
第１染料              DiOC6(3)                  400ppm
第２蛍光染料          EB                        1600ppm
溶媒は、エチレングリコールを使用する。
【００４５】
前方散乱光、蛍光および側方散乱光が測定されると、分布図作成部６２により、図１２に示すように、Ｆ１−Ｆｓｃ分布図が作成され、分画領域決定部６４により、前述のようにして赤血球分布領域１０１、白血球分布領域１０２、および酵母用真菌分布領域１０３がそれぞれ分画される。
【００４６】
ところで、結晶（この場合、主にリン酸カルシウム）は若干の自家蛍光を発するため、リン酸カルシウム結晶が図１２の領域１０５に赤血球分布領域１０１と重なって出現する。従って、分布図作成部６２は、図１２において予め設定された結晶および赤血球出現予想領域３００に存在する粒子について、図１３に示すように、Ｓｓｃ−Ｆｓｃ分布図を作成する。
【００４７】
図１３においては、領域１０１ａに赤血球が、領域１０５ａに結晶がそれぞれ分布されると予想される。そこで、計数部６５は予め設定された結晶出現予想領域４００内に存在する粒子の数を計数し、計数した粒子数が所定数より大きいと、判定部６６は、図１２の領域１０１には結晶が混存する、つまり、赤血球として計数された数の信頼性が低いと判定して、表示部４９にその旨表示させる。
【００４８】
なお、図１に示す装置においてレーザ光源４としてＨｅ−Ｎｅ（緑色）レーザを用いてもよい。
この場合には、前述の染色液（第１染料および第２蛍光染料）に代えてアストラバイオレット（Astra Violet）を使用することが好ましい。
この場合、図１４に示すように赤血球分布領域１０１にシュウ酸カルシウム結晶１０４とリン酸カルシウム結晶１０５が重なって出現する。いずれの結晶も側方散乱光強度Ｓｓｃが大きくなるため、前述と同様にＳｓｃ−Ｆｓｃ分布図（図１５）を作成して赤血球の計数値の信頼性を判定することができる。
【００４９】
【発明の効果】
この発明によれば、尿中赤血球の計数に際して、その計数データの信頼性が評価されるので、分析精度を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施例の構成図である。
【図２】実施例の要部を示すブロック図である。
【図３】図３の要部を示すブロック図である。
【図４】実施例の要部の動作を示すフローチャートである。
【図５】実施例の動作を示す分布図である。
【図６】実施例の動作を示す分布図である。
【図７】実施例の動作を示す分布図である。
【図８】実施例の動作を示す説明図である。
【図９】実施例の動作を示す説明図である。
【図１０】実施例の動作を示す説明図である。
【図１１】実施例の動作を示す分布図である。
【図１２】実施例の動作を示す分布図である。
【図１３】実施例の動作を示す分布図である。
【図１４】実施例の動作を示す分布図である。
【図１５】実施例の動作を示す分布図である。
【符号の説明】
１    シースフローセル
２    試料液供給部
２ａ  試料ノズル
３    シース液供給部
４    レーザ光源
５    コンデンサーレンズ
６    ビームストッパー
７    コレクターレンズ
８    ピンホール板
９    ダイクロイックミラー
１０    フィルター
１１    ホトマルチプライヤーチューブ
１２    ホトダイオード
１３    ホトダイオード
１４    コレクターレンズ
１５    コレクターレンズ
１６    試料液流
２７    蛍光信号
２８    前方散乱光信号
２９    側方散乱光信号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003642658.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0003642658.tif 000014
【図１３】
0003642658.tif 000015
【図１４】
0003642658.tif 000016
【図１５】
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