(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’−デオキシ−Ｌ−チミジン ５’−トリりん酸を有効成分として含む逆転写酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、逆転写酵素阻害剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、エイズウイルス（ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス）等のレトロウイルスが産生する逆転写酵素を阻害し、後天性免疫不全症候群（AIDS, エイズ）の治療や感染後の発病抑制に有用な逆転写酵素阻害剤に関する。
【従来の技術】
従来、天然型ヌクレオシドの光学対掌体（エナンチオマー）である非天然型エナンチオヌクレオシドが種々合成されてきた。これらのうち、Ｌ型ヌクレオシドに属する３′−チア−２′−デオキシ−Ｌ−シチジン(3TC, Antimicrob. Agents Chemother., 36, 1688-1694, 1992) および３′−チア−２′−デオキシ−５−フルオロ−Ｌ−シチジン(FTC, Antimicrob. Agents Chemother., 36, 2423-2431, 1992) には強い抗ＨＩＶ活性が報告されている。また、Ｌ−チミジンが、単純ヘルペスウイルスＩ型にコードされるチミジンキナーゼによってりん酸化され、感染細胞中におけるウイルスの複製を阻害することが報告されている(J. Med. Chem., 35, 4214-4220, 1992)。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明者は、２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシド  ５′−トリりん酸を製造してその生物活性を検討したところ、この化合物がレトロウイルスの産生する逆転写酵素を強く阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の逆転写酵素阻害剤は、特にＨＩＶの産生する逆転写酵素を強く阻害するので、エイズの治療や予防、ならびにエイズ・ウイルス感染後の発病抑制・遅延に有用である。また、生化学、遺伝子工学等の研究のために用いられる試薬としても有用である。
本発明の逆転写酵素阻害剤に有効成分として含まれる２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシド  ５′−トリりん酸としては、例えば、２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−トリりん酸；２′−デオキシ−Ｌ−ウリジン  ５′−トリりん酸；２′−デオキシ−Ｌ−アデノシン  ５′−トリりん酸；２′−デオキシ−Ｌ−グアノシン  ５′−トリりん酸；２′−デオキシ−Ｌ−シチジン  ５′−トリりん酸等の天然型２′−デオキシリボヌクレオシド  ５′−トリりん酸の光学対掌体、および２′−デオキシ−Ｌ−５−フルオロウリジン  ５′−トリりん酸等の非天然型２′−デオキシリボヌクレオシド  ５′−トリりん酸の光学対掌体を挙げることができる。
【０００３】
本発明の逆転写酵素阻害剤に有効成分として含まれる２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシド  ５′−トリりん酸は、Ｌ−チミジン等のＬ−ヌクレオシド（天然型ヌクレオシドの光学対掌体）を、例えばオキシ塩化りん等により５′−モノりん酸化体とした後、例えばホスホロイミダゾリデート法によって対応する５′−トリりん酸化体とすることにより製造することができる。
本発明の逆転写酵素阻害剤を、例えばＨＩＶウイルス等のレトロウイルスの関与する疾患などの治療や予防、またはレトロウイルス感染後の発病抑制あるいは遅延のための医薬として用いることができる。この場合には、上記の２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシド  ５′−トリりん酸を有効成分として含む医薬組成物として患者に投与すればよい。医薬組成物としては、例えば、カプセル剤、錠剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口投与用組成物、あるいは注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、点耳剤、または外皮用剤等の非経口投与用組成物を挙げることができる。これらの医薬用組成物は常法により製造できるが、必要により薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物を加えて製造してもよい。
【０００４】
経口剤及び坐剤の製造には、乳糖、D-マンニトール、トウモロコシデンプン、結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、酸化チタン等のコーティング剤；又はポリエチレングリコール、ハードファット等の基剤を製剤用成分として使用すればよい。注射剤あるいは点眼，点耳剤の製造には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型剤型を構成しうる溶解剤ないし溶解補助剤；無機又は有機の酸あるいは塩基のpH調節剤；食塩、ブドウ糖、グリセリン等の等張化剤；又は安定化剤等の製剤成分を使用すればよい。眼軟膏剤、外皮用剤の製造には、白色ワセリン、マクロゴール、グリセリン、綿布等の軟膏剤、クリーム剤、貼付剤に汎用される適切な製剤成分を使用すればよい。
本発明の逆転写酵素阻害剤を医薬組成物として用いる場合には、例えば、成人の患者に対して、有効成分である２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシド  ５′−トリりん酸の一日あたり投与量が0.１〜1,000 mg/kg 程度となるように投与すればよいが、治療や予防の目的や患者の年齢や症状により適宜増減してもよい。
【０００５】
【実施例】
以下、本発明の好ましい態様である２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−トリりん酸についてさらに具体的に説明するが、本発明はこの化合物およびこれらの実施例に限定されることはない。
例１：２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−トリりん酸の製造
Ｌ−チミジン２０mg（0.０８３ミリモル）をりん酸トリエチル１mlに溶解し、−１０℃に冷却した後、オキシ塩化りん５０μl を添加した。４℃にて１６時間反応させた後、反応液を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液２mlに攪拌しながら注いだ。中和後、水を添加して全量を５０mlに希釈した後、クロロホルム１０mlで３回洗浄した。水層をＤＥＡＥ−セルロース（３cm I.D. × 7 cm, Whatman DE-52) に吸着させて水洗した後、トリエチルアンモニウムビカーボネートの直線濃度勾配（０−0.３M,  ５００ml×２）で溶出した。５′−モノりん酸を含むフラクションを集めて濃縮し、２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−モノりん酸（Ｌ−ｄＴＭＰ）を得た。505 OD267 （0.１Ｎ HCl）  収率  ６３％
【０００６】
２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−モノりん酸 475 OD267をジメチルホルムアミドに溶解し、カルボニルジイミダゾール４0.５mgを添加後、室温にて3.５時間攪拌した。メタノール１5.４μl を添加して３０分攪拌した後、ピロりん酸トリブチルアミン塩ジメチルホルムアミド溶液（0.６ミリモル／ml）１mlを添加し室温で２４時間攪拌した。反応液を減圧乾固した後、残渣を水５０mlに溶解して、活性炭１グラムを添加した。穏やかに１０分間攪拌した後に濾過し、残渣に水５０mlを添加して溶解した。この溶液をＤＥＡＥ−セルロース（３cm I.D. × 7 cm, Whatman DE-52) に吸着させて水洗した後、トリエチルアンモニウムビカーボネートの直線濃度勾配（０−0.５M,  ５００ml×２）で溶出した。５′−トリりん酸を含むフラクションを集めて濃縮し、２′−デオキシ−Ｌ−チミジン５′−トリりん酸（Ｌ−ｄＴＴＰ）を得た。370 OD267 （0.１Ｎ HCl）  収率７８％
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カラム  ＹＭＣＯＤＳ  Ａ−３０２逆相樹脂、水−アセトニトリルおよび１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（pH 7.0)(78:2:20, v/v/v) 、流速１ml／分、５０℃。
【０００７】
例２：試験例
上記の２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−トリりん酸（Ｌ−ｄＴＴＰ）を用いて真核生物およびウイルスのＤＮＡポリメラーゼに対する作用を検討した。ポリメラーゼとしては、コウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼα(Polα）、ラットＤＮＡポリメラーゼβ(Polβ：Date, T., et al., Biochemistry, 27, 2983-2990, 1988)、ウシ肝臓ＤＮＡポリメラーゼγ(Polγ：Izuta, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179, 776-783 , 1991) 、およびＨＩＶ−１由来のレトロウイルス逆転写酵素(HIV-1 RT)を用いた。ＤＮＡポリメラーゼβとレトロウイルス逆転写酵素は、遺伝子組換えにより大腸菌で生産、精製された酵素である。酵素活性測定は、以下の表１に示す条件を用い、各ポリメラーゼを３７℃で２０分間インキュベートした後、反応液を冷却して DE 81イオン交換紙に吸着させ、5% Na2HPO4で６回、つづいて水で２回洗浄した後、イオン交換紙を乾燥して放射活性を測定することにより行った。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
上記の各ＤＮＡポリメラーゼに対する２′−デオキシ−Ｌ−チミジン  ５′−トリりん酸（Ｌ−ｄＴＴＰ）の作用を５０μＭｄＴＴＰ存在下で検討した。対照として、抗ＨＩＶ剤として周知の３′−アジド−３′−デオキシチミジン(AZT) の５′−トリりん酸化体(AZT-TP: Ono, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 140, 498-507, 1986) およびα−ｄＴＴＰ(Yamaguchi, T., et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 1441-1450, 1984)を用いた。 Polαの鋳型プライマーとして活性化ＤＮＡを用いた場合、Ｌ−ｄＴＴＰによる阻害効果はほとんど認められず、 Polβに対しても、ポリ[rA]−オリゴ[dT]を鋳型プライマーとして用いた場合には、わずかな阻害が認められるにすぎなかった。一方、 Polγに対しては、Ｌ−ｄＴＴＰによる阻害効果が認められたが、ＡＺＴ−ＴＰと比較すると、その阻害活性はやや低かった。また、α−ｄＴＴＰは Polγに対して弱い阻害作用を示した。レトロウイルス逆転写酵素の活性測定に頻用されるポリ[rA]−オリゴ[dT]を鋳型プライマーとして用いると、Ｌ−ｄＴＴＰはHIV-1 RTに対して強い阻害作用を示した。結果を図１ないし図４に示す。
図４に示されたＬ−ｄＴＴＰのHIV-1 RTに対する阻害効果について、ラインウィーバー−バーク・プロットで酵素阻害様式を検討したところ、Ｌ−ｄＴＴＰは基質であるｄＴＴＰと拮抗阻害することが示された。HIV-1 RTに対するＬ−ｄＴＴＰのＫｉ／Ｋｍ値は0.０７であり、Ｌ−ｄＴＴＰはHIV-1 RTに対して、基質のｄＴＴＰよりも約１４倍高い親和性を示した。
【００１０】
【発明の効果】
本発明の逆転写酵素阻害剤は、特にＨＩＶの産生する逆転写酵素を強く阻害するので、エイズの治療や感染後の発病抑制・遅延に有用である。また、生化学、遺伝子工学等の研究のために用いられる試薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  コウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼα(Polα）に対する本発明の逆転写酵素阻害剤の効果を示した図である。
【図２】  ラットＤＮＡポリメラーゼβに対する本発明の逆転写酵素阻害剤の効果を示した図である。
【図３】  ウシ肝臓ＤＮＡポリメラーゼγに対する本発明の逆転写酵素阻害剤の効果を示した図である。
【図４】  ＨＩＶ−１由来のレトロウイルス逆転写酵素(HIV-1 RT)に対する本発明の逆転写酵素阻害剤の効果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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