(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）精子を含む試料を、前記試料中の夾雑物を除去するのに有効な量のカチオン性界面活性剤を含む水溶液と混合して界面活性剤処理試料を調製し、
（２）核酸染色色素を含む染色液を添加して前記界面活性剤処理試料中の精子を染色して測定用試料を調製し、
（３）前記測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入して、前記測定試料中の染色された精子に励起光を照射し、
（４）前記励起光を照射された精子より発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、
（５）前記散乱光信号ならびに前記蛍光信号に基づいて、散乱光強度と蛍光強度を２軸とする２次元分布を作成し、
（６）前記２次元分布上の精子集団領域を特定し、前記精子集団領域内の精子数を計数する、ことを特徴とする精子計数方法。
【請求項２】
前記カチオン界面活性剤が、以下の四級アンモニウム塩及びピリジニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１記載の精子計数方法。
【式２】
0003673137.tif 000003
式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；Ｒ5はＣ8-18のアルキル基；Ｘはアニオン）
【請求項３】
前記核酸染色色素が、以下の核酸染色色素からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１または２記載の精子計数方法。
エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド，N-メチル-4-(1-ピレン)ビニル-プロピジウムアイオダイド，TOTO-1，TOTO-3，YOYO-1，YOYO-3，BOBO-1，BOBO-3，エチジウムホモダイマー-1（EthD-1），エチジウムホモダイマー-2（EthD-2），POPO-1，POPO-3，BO-PRO-1，YO-PRO-1，TO-PRO-1
【請求項４】
精子を含む試料中の夾雑物を除去するのに有効な量のカチオン性界面活性剤を含む水溶液からなる精子計数用試薬。
【請求項５】
前記カチオン性界面活性剤が、以下の四級アンモニウム塩及びピリジニウム塩からなる群より選択される請求項４記載の精子計数用試薬。
【式２】
0003673137.tif 000004
式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；Ｒ5はＣ8-18のアルキル基；Ｘはアニオン）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フローサイトメトリによる精子の計数方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
泌尿器科における男性不妊治療においては、その原因を特定するための一つの手段として、精液中の精子濃度、運動能、奇形率などの妊孕性に関係する性状が検査されている。また近年、内分泌撹乱化学物質の影響により成人男子の精子濃度、精液量は減少傾向にあるという報告がなされた。その後、疫学的調査による精子関連報告が多くなされてきたが、精液性状の低下には肯定・否定の様々な報告が混在する結果となった。精子濃度測定方法の標準化がなされていないため、データの信頼性ないしは統計的に有意であるかについての疑問が投げかけられている。
【０００３】
従来の精液検査における精子計数法は、ＷＨＯから出されているガイドラインに示されている血球計算盤を用いる方法や、Maklerチェンバー等の精子計測用計算盤を用いた顕微鏡観察によるものである。しかし、これらの方法は精子を目視下で数える主観的な方法であり、同一検体でも検査機関・検査実施者の間で測定値が異なる問題があった。また計測に時間がかかるため、大量の検体の処理には適していない。さらに、精液の高い粘度のために精子細胞に分布むらが生じることや計数する細胞数が非常に少ないことなどにより正確度や再現性に問題があった。
【０００４】
上記問題点を克服するための方法として、自動血球計算器（人工授精研誌  ７巻  ２号、1985，５月）、電気抵抗式粒子計数装置（福岡医誌  88(8):294-297）やフローサイトメータ（米国特許第4,559,309号）を用いて精子を計数する方法が既に試みられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
精液中には、しばしば白血球、赤血球、顆粒成分、細菌、油滴等の夾雑物が含まれる。上述の自動化の試みにおいても、これら夾雑物の影響を受け、計数値に誤差が生じることが指摘されている。特に乏精子症などによる精子濃度の低い精液を測定する場合には夾雑物の影響が大きく、精子の数を正確に定量することは困難である。トリプシン及びリパーゼ溶液で夾雑物の影響を除去することも行われてはいるが、効果は十分とは言えず、精子の数を正確に定量することは困難であった。
【０００６】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたもので、夾雑物を含む精液サンプルにおいても、正確に精子数を計数することのできる方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の精子計数方法は、（１）精子を含む試料を、前記試料中の夾雑物を除去するのに有効な量のカチオン性界面活性剤を含む水溶液と混合して界面活性剤処理試料を調製し、
（２）核酸染色色素を含む染色液を添加して前記界面活性剤処理試料中の精子を染色して測定用試料を調製し、
（３）前記測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入して、前記測定試料中の染色された精子に励起光を照射し、
（４）前記励起光を照射された精子より発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、
（５）前記散乱光信号ならびに前記蛍光信号に基づいて、散乱光強度と蛍光強度を２軸とする２次元分布を作成し、
（６）前記２次元分布上の精子集団領域を特定し、前記精子集団領域内の精子数を計数する、ことを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明における測定対象とする精子を含む試料とは、精液、尿及び精巣をホモジナイズした試料を含む。
【０００９】
また、本発明におけるカチオン性界面活性剤は、精液を含む試料中に含まれる白血球、赤血球、顆粒成分、細菌、組織片、油滴等の精子以外の夾雑物を除去するために使用される。カチオン性界面活性剤は夾雑物が除去できれば特に制限されないが、下記に示したような四級アンモニウム塩及びピリジニウム塩が好適である。
【式２】
0003673137.tif 000002
【００１０】
式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；Ｒ5はＣ8-18のアルキル基；Ｘはアニオン）
【００１１】
このうち、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3におけるＣ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基としては、オクチル、ヘプチル、ヘキシル、ベンジルなどを挙げることができるが、メチル、エチルなどのＣ1-3のアルキル基が好ましい。また、Ｒ4におけるＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基としては、オクチル、ベンジルなどを挙げることができるが、例えば、デシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ5におけるＣ8-18のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基が好ましい。これらカチオン性界面活性剤の具体例としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルピリジニウムクロライド、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウムブロマイド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
【００１２】
夾雑物を除去するのに有効な量は、使用するカチオン性界面活性剤によって異なるが、最終濃度が0.01〜25%、好適には0.5〜15%の範囲で使用できる。例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドの場合、最終濃度が０．１〜２０％の範囲で用いられ、１．０〜１０％が好適である。カチオン性界面活性剤の疎水基部分の炭素数が増加するごとに、必要量は少量ですむようになる。
【００１３】
夾雑物を除去するための界面活性剤処理は、精子を含む試料とカチオン性界面活性剤を含む水溶液を混合するだけでよい。
【００１４】
本発明で使用される核酸染色色素は、蛍光を発するものであれば特に限定されないが、アルゴンレーザーを光源とする場合は、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド，N-メチル-4-(1-ピレン)ビニル-プロピジウムアイオダイド，TOTO-1，TOTO-3，YOYO-1，YOYO-3，BOBO-1，BOBO-3，エチジウムホモダイマー-1（EthD-1），エチジウムホモダイマー-2（EthD-2），POPO-1，POPO-3，BO-PRO-1，YO-PRO-1，TO-PRO-1からなる群より選択される少なくとも１種類の色素が好適に使用される。なお、これらの色素は市販されており、例えばモレキュラープローブ社から入手することができる。これらの色素濃度は、色素によって好適な濃度が選択されるが、好適には最終濃度が０．１〜１００ｐｐｍとなる範囲で用いられ、３０〜６０ｐｐｍが好適である。光源として他の波長のレーザーを使用する場合には、その波長に適した色素を使用できる。
【００１５】
また、別の異なる色素、例えば細胞膜を染色する色素を組み合わせて使用することもできる。細胞膜を染色する色素としては、蛍光を発するものであれば特に限定されないが、アルゴンレーザーを光源とする場合は、例えば、縮合ベンゼン誘導体、特にオキサカルボシアニン系色素であるＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）を用いることができ、ＤｉＯＣ６（３）（3,3'-(ジ-n-ヘキシル)-2,2'-オキサカルボシアニンアイオダイド）が好適である。これらの色素は例えばＮＫ−シリーズとして日本感光色素研究所（株）より入手できる。その他の好ましい縮合ベンゼン誘導体には、ＮＫ−９１、ＮＫ−５２８、ＮＫ−９７、Ｂａｓｉｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １１、Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｄ  １４を含む。細胞膜を染色する色素の濃度は、最終濃度（測定試料中の濃度）が０．１〜５０ｐｐｍとなる範囲で用いられ、１〜３０ｐｐｍが好適である。光源として他の波長のレーザーを使用する場合には、その波長に適した色素を使用できる。
【００１６】
なお、精子を染色するに際しては、試料を染色に都合のよいｐＨに維持しておくのが好適である。このためには、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲を維持できる緩衝剤が使用される。これら緩衝剤は、カチオン性界面活性剤を含む水溶液に含有させてもよいし、核酸染色色素を含む染色液に含有させてもよい。
【００１７】
ここで、染色液は、水溶液中に核酸染色色素と緩衝剤を含んでいてもよいし、核酸染色色素をエタノールやエチレングリコールなどのような水溶性有機溶媒に溶解した原液と、緩衝剤を含む水溶液からなる希釈液の２液からなるものであってもよい。カチオン性界面活性剤は、この希釈液に含有させることもできる。
【００１８】
精子の染色に際しては、染色温度は、室温から４０℃まで、好ましくは３３〜３７℃の範囲で、染色時間は、５秒〜１２０秒間、好ましくは１０〜３０秒間の範囲で行うことができる。
【００１９】
本発明で使用できるフローサイトメータは、使用する核酸染色色素を励起できる光源を有するものであれば特に制限されない。例えば、４８８ｎｍ付近で励起可能な色素を用いる場合であれば、アルゴンレーザーを光源とするフローサイトメータを使用することができ、FACScan（Becton Dickinson and Company）、Ｒシリーズ（シスメックス（株））、ＵＦシリーズ（シスメックス（株））など市販の装置を利用することができる。使用する色素に応じて、使える光源を有するフローサイトメータを適宜選択すればよい。
【００２０】
精子を含む試料にカチオン性界面活性剤を添加すると、白血球、赤血球、顆粒成分、細菌、組織片、油滴等の夾雑物は溶解し、一方精子は精子細胞膜にダメージを受け、核酸染色色素が細胞内部に入り込みやすくなる。次いで、核酸染色色素を添加すると、細胞中のDNAが染色される。
【００２１】
こうして染色された精子を含む試料を、フローサイトメータのフローセルに導入し、染色された精子に励起光を照射すると、染色された精子から、散乱光と、ＤＮＡと結合した色素に基づく蛍光が発せられる。発せられる散乱光のうち例えば前方散乱光と蛍光を検出し、前方散乱光強度と蛍光強度を２軸とする２次元分布図を描くと、分布図上に細胞集団が形成される。
【００２２】
この細胞集団に対してゲーティングを行うことによって、精子細胞集団の領域を決定し、この領域内の細胞数を計数する。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００２４】
実施例１
カチオン性界面活性剤水溶液の調製
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド          ２５３．８ｇ
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド        １６．２ｇ
オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド          ４．５ｇ
イソプロピルアルコール                                ３０ｍｌ
精製水                                                    １ｌ
オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライドをイソプロピルアルコールに溶解し、この溶解液をドデシルトリメチルアンモニウムクロライド及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライドとともに精製水に添加、混合しカチオン性界面活性剤水溶液を調製した。
【００２５】
染色液の調製
3,3'-(ジ-n-ヘキシル)-2,2'-オキサカルボシアニンアイオダイド  400ppm
エチジウムブロマイド                                        1600ppm
溶媒には、エチレングリコールを使用した。
【００２６】
希釈液の調製
HEPES                              50mM
水酸化ナトリウム                  pH7.0になる量
プロピオン酸ナトリウム            60mM
EDTA-3K                            4.0ｇ／ｌ
精製水                            １ｌ
精製水中に上記成分を溶解した。
【００２７】
精液の測定
精液４０μｌにカチオン性界面活性剤水溶液３６０μｌを添加し、１０秒間混合し、次いで希釈液１１６０μｌ及び染色液４０μｌを加え、３７℃、１０秒間インキュベーションした後、アルゴンレーザーを光源とするフローサイトメータ（UF-100、シスメックス（株））で前方散乱光強度（ＦＳＣ）及び前方蛍光強度（ＦＬ）を測定し、前方散乱光強度及び前方蛍光強度を２軸とする２次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。結果を図１に示す。
【００２８】
また、精液をカチオン性界面活性剤で処理するかわりに生理食塩水で希釈したものを対照とした。結果を図２に示す。
【００２９】
図１に示したように、カチオン性界面活性剤で精液を処理することで、図２の前方散乱光強度の低い部分に広がった夾雑物が除去され、また、精子細胞集団のまとまりもよくなり、精子細胞集団領域の特定が容易になった。
【００３０】
実施例２
赤血球、白血球などの夾雑物を含む精液を、実施例１と同様に界面活性剤による処理ならびに染色を行い測定を行って、前方散乱光強度及び前方蛍光強度を２軸とする２次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。結果を図３に示す。
【００３１】
また、精液をカチオン性界面活性剤で処理するかわりに生理食塩水で希釈したものを対照とした。結果を図４に示す。
【００３２】
図３に示したように、カチオン性界面活性剤で精液を処理することで、図４の前方蛍光強度の高い部分に広がった白血球、前方散乱光強度が高く前方蛍光の低い部分にある赤血球、および前方散乱光強度の低い部分に広がった夾雑物が除去された。また、精子細胞集団のまとまりもよくなり、精子細胞集団領域の特定が容易になった。
【００３３】
実施例３
直線性試験
精液を生理食塩水で２，４，８，１６，３２倍希釈した試料を調製し、実施例１と同様に界面活性剤による処理ならびに染色を行い測定を行って、計算値と実測値とを比較した。結果を図５に示す。
【００３４】
計算値とほぼ同じ実測値が得られ、直線性は良好であった。
【００３５】
実施例４
目視法との相関
精液サンプル６４検体について、実施例１と同じ試薬及び同じ操作を行い、顕微鏡法（Maklerチェンバー法）と比較した。図６に示したように良好な相関が得られた。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、夾雑物を多数含む精液サンプルでも、高精度で精子数を計数することが可能となった。また、精子濃度の低いサンプルでも、高精度で精子数を計数することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において、精液をカチオン性界面活性剤で処理したときのスキャッタグラムである。
【図２】本発明の実施例１において、精液をカチオン性界面活性剤の代わりに生理食塩水で希釈したときのスキャッタグラムである。
【図３】本発明の実施例２において、赤血球、白血球などの夾雑物を含む精液をカチオン性界面活性剤で処理したときのスキャッタグラムである。
【図４】本発明の実施例２において、精液をカチオン性界面活性剤の代わりに生理食塩水で希釈したときのスキャッタグラムである。
【図５】実施例３の直線性試験の結果を示した図である。
【図６】実施例４の結果を示した相関図である。
【図１】
0003673137.tif 000005
【図２】
0003673137.tif 000006
【図３】
0003673137.tif 000007
【図４】
0003673137.tif 000008
【図５】
0003673137.tif 000009
【図６】
0003673137.tif 000010