(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる、完全長の抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に結合する１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメント
ここで、ｂ）での前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介してａ）での前記の完全長抗体に融合している、
を含む、多重特異的抗体。
【請求項２】
第２抗原に結合する１つまたは２つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の重鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、請求項１記載の多重特異的抗体。
【請求項３】
第２抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、請求項１記載の多重特異的抗体。
【請求項４】
第２抗原に結合する、２つの同一な単鎖ＦａｂフラグメントＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬが、そのＮ末端で、前記の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＣ末端または２つの軽鎖の２つのＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、請求項１記載の多重特異的抗体。
【請求項５】
請求項１〜４記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１〜４記載の抗体を含む薬学的組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載の多重特異的抗体をコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全長抗体と単鎖Ｆａｂフラグメントとを含む、多重特異的、特に二重特異的抗体、その産生のための方法、前記抗体を含む薬学的組成物、並びにその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
最近、例えばＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの融合による４価の二重特異的抗体などの、多種多様な多重特異的組換え抗体フォーマットが開発されている（例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342;およびMorrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照されたい）。
【０００３】
また、２つ以上の抗原に結合することのできる、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの単鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）などの、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの他の新たなフォーマットも開発されている（Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297）。
【０００４】
全てのこのようなフォーマットは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）をさらなる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合させるため、または例えば２つのＦａｂフラグメントもしくはｓｃＦｖｓを融合するためのいずれかのために、リンカーを使用する（Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）。天然に存在する抗体に対する高度の類似性を維持することによって、Ｆｃレセプター結合を通して媒介される、例えば補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を保持したいと思うかもしれないことを心に留めておかなければならない。
【０００５】
ＷＯ２００７/０２４７１５において、操作された多価および多重特異的結合タンパク質などの二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製のための過程は、ＵＳ６，８９７，０４４に報告されている。ペプチドリンカーを介して互いに連結された少なくとも４つの可変ドメインを有する多価Ｆｖ抗体構築物が、ＵＳ７，１２９，３３０に報告されている。二量体および多量体抗原結合構造がＵＳ２００５/００７９１７０に報告されている。接続構造によって互いに共有結合した３つまたは４つのＦａｂフラグメントを含む３価または４価の単一特異的な抗原結合タンパク質（このタンパク質は天然の免疫グロブリンではない）が、ＵＳ６，５１１，６６３に報告されている。ＷＯ２００６/０２０２５８において、原核細胞および真核細胞において効率的に発現され得、そして、治療法および診断法において有用である、４価の二重特異的な抗体が報告されている。２種類のポリペプチド二量体を含む混合物からの、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されていない二量体から、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている二量体を分離または優先的に合成する方法が、ＵＳ２００５/０１６３７８２に報告されている。二重特異的な４価のレセプターが、ＵＳ５，９５９，０８３に報告されている。３つ以上の機能的抗原結合部位を有する工学操作された抗体が、ＷＯ２００１/０７７３４２に報告されている。
【０００６】
多重特異的および多価の抗原結合ポリペプチドが、ＷＯ１９９７/００１５８０に報告されている。ＷＯ１９９２/００４０５３は、同じ抗原性決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から典型的には調製されたホモコンジュゲートが、合成的な架橋によって共有結合的に連結されていることを報告する。抗原に対する高い結合力を有するオリゴマー性モノクローナル抗体がＷＯ１９９１/０６３０５に報告されており、それによると、一緒に会合して４価または６価のＩｇＧ分子を形成している２つ以上の免疫グロブリンモノマーを有する典型的にはＩｇＧクラスのオリゴマーが分泌される。ヒツジ由来抗体および工学操作された抗体構築物がＵＳ６，３５０，８６０に報告され、これはインターフェロンγ活性が病原性である疾病を処置するために使用することができる。ＵＳ２００５/０１００５４３においては二重特異的抗体の多価保有体である標的可能な構築物が報告されており、すなわち、標的可能な構築物の各分子は、２つ以上の二重特異的抗体の保有体として作用することができる。遺伝子工学操作された二重特異的４価抗体がＷＯ１９９５/００９９１７に報告されている。ＷＯ２００７/１０９２４５において、安定化されたｓｃＦｖからなるまたは含む安定化された結合分子が報告されている。
【０００７】
Mueller, D., et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Part III, Chapter 2, (2008) 345-378は、二重特異的抗体、例えば、２つのｓｃＦｖフラグメントが重鎖のＣ末端においてペプチドリンカーを介して融合している完全長の抗体を言及している（また、ＷＯ１９９５/００９９１７も参照）。Hust, M., et al., BMC Biotechnology (2007) 7は、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントを言及している。
【０００８】
しかしながら、多重特異的抗体の種々の問題および局面の観点から（例えば薬物動態特性および生物学的特性、安定性、凝集、発現収量）、さらに他の代替的な多重特異的抗体フォーマットが必要である。WO 1995/009917およびMueller D., et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Part III, Chapter 2, (2008) 345-378に報告された特に遺伝子工学操作された二重特異的４価抗体は、非常に低い発現収量しか示さなかった。
【０００９】
発明の要約
本発明の第１の局面は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる、完全長の抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（好ましくは１つのさらなる抗原に特異的に結合する）１つ以上の単鎖Ｆａｂフラグメント
（ここで、ｂ）の下の前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合している）
を含む、多重特異的抗体である。
【００１０】
本発明の好ましい局面は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる、完全長の抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（好ましくは１つのさらなる抗原に特異的に結合する）１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメント
（ここで、ｂ）の下の前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合している）
を含む、多重特異的抗体である。
【００１１】
好ましくは、前記の多重特異的抗体は、第２抗原に結合する１つまたは２つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む（二重特異的抗体）。
【００１２】
好ましくは、前記の多重特異的抗体は、第２抗原に結合する２つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む（二重特異的抗体）。
【００１３】
好ましくは、前記の多重特異的抗体は、第２抗原および第３抗原に結合する２つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む（三重特異的抗体）。
【００１４】
本発明のさらなる局面は前記の多重特異的抗体の鎖をコードする核酸分子であり、単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端に融合している。
【００１５】
本発明のまたさらなる局面は、前記の多重特異的抗体を含む薬学的組成物である。
【００１６】
本発明による多重特異的抗体は、例えば２つのｓｃＦｖフラグメントが重鎖のＣ末端においてペプチドリンカーを介して融合している完全長抗体と比較した場合、高い安定性、低い凝集傾向（例えば実施例２参照）などの価値ある特性を示した（WO 1995/009917またはMueller, D., et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Part III, Chapter 2, (2008) 345-378を参照されたい）。本発明による多重特異的抗体は一方で、種々の抗原へのその結合に因る新たな特性を示し、そして他方で、その良好な安定性、低い凝集特性および価値ある薬物動態特性および生物学的特性に因り生産および医薬品製剤化にとって適している。そのＩｇコアおよび哺乳動物発現系において産生できることに因り、それらは依然としてＡＤＣＣおよびＣＤＣのような天然抗体の特性を保持する。
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明の第１の局面は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる、完全長抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（好ましくは１つのさらなる抗原に特異的に結合する）１つ以上の単鎖Ｆａｂフラグメント
（ここで、ｂ）の下の前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合している）
を含む、多重特異的抗体である。
【００１８】
本発明の好ましい局面は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる、完全長抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（好ましくは１つのさらなる抗原に特異的に結合する）１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメント
（ここで、ｂ）の下の前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合している）
を含む、多重特異的抗体である。
【００１９】
１つの態様において、第２抗原に結合する１つまたは２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２０】
１つの態様において、第２抗原に結合する１つまたは２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の重鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２１】
１つの態様において、第２抗原に結合する１つまたは２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２２】
１つの態様において、第２抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の各重鎖または軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２３】
１つの態様において、第２抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の各重鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２４】
１つの態様において、第２抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを、前記の完全長抗体の各軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合する。
【００２５】
「完全長抗体」という用語は、２つの「完全長抗体重鎖」および２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を示す（図１参照）。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略称される）；並びに場合により、サブクラスＩｇＥの抗体の場合には抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなるポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチド（ＶＬ−ＣＬと略称される）である。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間、および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間がポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結されている。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような天然抗体である。本発明による完全長抗体は、単一の種、例えばヒトに由来し得るか、あるいはそれらはキメラ化またはヒト化抗体であってもよい。本発明による完全長抗体は、各々がＶＨとＶＬの対によって形成され、両方共に同じ抗原に特異的に結合する、２つの抗原結合部位を含む。前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、前記の重鎖または軽鎖のＣ末端における最後のアミノ酸を示す。前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は、前記の重鎖または軽鎖のＮ末端における最後のアミノ酸を示す。
【００２６】
「単鎖Ｆａｂフラグメント」（図２参照）は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の順序の１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；そして、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記の単鎖Ｆａｂフラグメントａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１およびｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。「Ｎ末端」という用語は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を示し、「Ｃ末端」という用語はＣ末端の最後のアミノ酸を示す。
【００２７】
好ましい態様において、前記の単鎖Ｆａｂフラグメント中の前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の順序の１つを有する：
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、またはｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、より好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１。
【００２８】
別の好ましい態様において、前記の単鎖Ｆａｂフラグメント中の前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の順序の１つを有する：
ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１またはｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。
【００２９】
場合により前記の単鎖Ｆａｂフラグメントにおいて、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合に加えて、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）も、以下の位置の間でのジスルフィド結合の導入によってジスルフィド安定化されている：
ｉ）重鎖可変ドメイン４４位から軽鎖可変ドメイン１００位、
ｉｉ）重鎖可変ドメイン１０５位から軽鎖可変ドメイン４３位、または
ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン１０１位から軽鎖可変ドメイン１００位（ナンバリングは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【００３０】
単鎖Ｆａｂフラグメントのこのようなさらなるジスルフィド安定化は、単鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合の導入によって達成される。単鎖Ｆｖの安定化のための非天然ジスルフィド橋を導入するための技術は、例えば、WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25 (1998) 387-393;またはSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。１つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン４４位と軽鎖可変ドメイン１００位との間にある。１つの態様において、本発明による抗体に含まれる単鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン１０５位と軽鎖可変ドメイン４３位との間にある（ナンバリングは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【００３１】
１つの態様において、単鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間に前記の任意のジスルフィド安定化を含まない単鎖Ｆａｂフラグメントが好ましい。
【００３２】
本発明内において使用する「ペプチドコネクター」という用語は、好ましくは合成起源であるアミノ酸配列を有するペプチドを示す。本発明によるこれらのペプチドコネクターは、単鎖Ｆａｂフラグメントを、完全長抗体のＣ末端またはＮ末端に融合させて、本発明による多重特異的抗体を形成するために使用される。好ましくは、ｂ）の下での前記ペプチドコネクターは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは５〜１００の長さ、より好ましくは１０〜５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。１つの態様において、前記ペプチドコネクターは（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ただし、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、および（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５または６、およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４または５、およびｍ＝０、１、２または３）、好ましくはｘ＝４、ｎ＝２または３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝２である。１つの態様において、前記ペプチドコネクターは（Ｇ４Ｓ）２である。
【００３３】
本発明内において使用する「リンカー」という用語は、好ましくは合成起源であるアミノ酸配列を有するペプチドを示す。本発明によるこれらのペプチドは、ａ）ＶＨ−ＣＨ１をＶＬ−ＣＬに、ｂ）ＶＬ−ＣＬをＶＨ−ＣＨ１に、ｃ）ＶＨ−ＣＬをＶＬ−ＣＨ１に、またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１をＶＨ−ＣＬに連結させて、本発明による以下の単鎖Ｆａｂフラグメントａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬを形成するために使用される。単鎖Ｆａｂフラグメント内の前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸の長さ、好ましくは３２〜５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。１つの態様において、前記リンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、ただし、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９または１０、およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４、およびｎ＝６、７または８、およびｍ＝０、１、２または３）、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６または７、およびｍ＝０、１、２または３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７、およびｍ＝２である。１つの態様において、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
【００３４】
前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖の各Ｃ末端またはＮ末端に、ｂ）の下の単鎖Ｆａｂフラグメントの唯１つだけを、同時に融合させることができる。このように８つまでの単鎖Ｆａｂフラグメントを前記の完全長抗体に融合させることができる。好ましくは、本発明による多重特異的抗体は、１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む。より好ましくは、本発明による多重特異的抗体は、２つの同一な単鎖Ｆａｂフラグメント（好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、この両方共が、ａ）の下の前記の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＣ末端または２つの軽鎖の２つのＣ末端に融合している。このような融合により、２つの同一な融合ペプチド（ｉ）重鎖および単鎖Ｆａｂフラグメント、またはｉｉ）軽鎖および単鎖Ｆａｂフラグメントのいずれか）が得られ、これはｉ）完全長抗体の軽鎖または重鎖のいずれかと同時発現され、これにより本発明による多重特異的抗体が得られる（図３、４および５参照）。
【００３５】
別の好ましい態様において、本発明による多重特異的抗体は、２つの同一な単鎖Ｆａｂフラグメント（好ましくはＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）を含み、この両方共が、ａ）の下の前記の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＮ末端または２つの軽鎖の２つのＮ末端に融合している。このような融合により、２つの同一な融合ペプチド（ｉ）重鎖および単鎖Ｆａｂフラグメント、またはｉｉ）軽鎖および単鎖Ｆａｂフラグメントのいずれか）が得られ、これはｉ）完全長抗体の軽鎖または重鎖のいずれかと同時発現され、これにより本発明による多重特異的抗体が得られる。
【００３６】
本発明による多重特異的抗体の両方の部分が、抗原結合部位を含む(本発明による完全長抗体は、２つの抗原結合部位を含み、そして各単鎖Ｆａｂフラグメントは１つの抗原結合部位を含む）。本明細書において使用する「結合部位」または「抗原結合部位」という用語は、それぞれの抗原が実際に特異的に結合する本発明による前記の多重特異的抗体の領域（群）を示す。完全長抗体または単鎖Ｆａｂフラグメントのいずれかにおける抗原結合部位は各々、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる対によって形成される。
【００３７】
所望の抗原（例えばＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗原結合部位は、抗原に対する公知の抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体）に由来し得るか、あるいはとりわけ抗原タンパク質もしくは核酸もしくはそのフラグメントのいずれかを使用した新規免疫化法によって、またはファージディスプレイによって得られた新たな抗体または抗体フラグメントに由来し得る。
【００３８】
本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に種々の程度で寄与する、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、そのような領域が配列間の違いによって定義された、編纂されたアミノ酸配列データベースとの比較によって決定される。
【００３９】
抗体の特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異的である。本明細書において使用する「多重特異的」抗体という用語は、２つ以上の抗原結合部位を有し、その抗原結合部位の少なくとも２つが異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープに結合する、抗体を示す。本発明による「二重特異的抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対して、すなわち第１抗原としてのＥＧＦＲおよび第２抗原としてのＩＧＦ−１Ｒに対して多重特異的である。本発明の１つの態様において、本発明による多重特異的抗体は二重特異的である。本発明の別の態様において、本発明による多重特異的抗体は三重特異的である。
【００４０】
本明細書において使用する「単一特異的」抗体という用語は、１つ以上の結合部位を有し、その結合部位の各々が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、抗体を示す。
【００４１】
本出願内において使用する「価」という用語は、抗体分子中における明記した数の結合部位の存在を示す。例えば天然抗体または本発明による完全長抗体は２つの結合部位を有し、そして２価である。従って、「３価」、「４価」、「５価」および「６価」という用語は、抗体分子における、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位および６つの結合部位の存在を示す。本発明による多重特異的抗体は少なくとも「３価」である。好ましくはそれらは「３価」、「４価」、「５価」または「６価」であり、より好ましくはそれらは「３価」または「４価」である。
【００４２】
本発明の抗体は３つ以上の結合部位を有し、そして多重特異的、好ましくは二重特異的または三重特異的である。本発明による多重特異的抗体は、３つを超える結合部位が存在する場合でさえも二重特異的である場合もある（すなわち、抗体は４価、５価または６価または多価である）。２つを超える抗原結合部位を有する抗体については、タンパク質が２つの異なる抗原に対する結合部位を有している限り、いくつかの結合部位は同一であり得る。
【００４３】
本発明の別の態様は、
ａ）第１抗原に特異的に結合し、そして
ａａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなる、２つの同一の抗体重鎖；および
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（ＣＬ−ＣＬ）からなる、２つの同一な抗体軽鎖
からなる、完全長抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に特異的に結合する（好ましくは１つのさらなる抗原に特異的に結合する）１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメント
（ここで、単鎖Ｆａｂフラグメントは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなり、そして前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の順序の１つを有する：
ｂａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｂｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、またはｂｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ（ここで、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のペプチドである））
（ここで、ｂ）の下の前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介してａ）の下の前記の完全長抗体に融合し、
前記ペプチドコネクターは少なくとも５アミノ酸、好ましくは１０〜５０アミノ酸のペプチドである）
を含む多重特異的抗体である。
【００４４】
この態様内において、第２抗原に特異的に結合する、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは２つの単鎖Ｆａｂフラグメントｂａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬまたはｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、好ましくはｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１が、前記の完全長抗体の重鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合し、そして単鎖Ｆａｂフラグメントはジスルフィド安定化されていない。
【００４５】
本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する１つまたは２つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の重鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している（二重特異的抗体）、本発明による多重特異的抗体である。
【００４６】
好ましくは、本発明による多重特異的抗体は、第２抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂフラグメントを含み、これは両方共が重鎖に融合しているか、または両方共が軽鎖Ｃ末端もしくはＮ末端に融合しているかのいずれかである（二重特異的抗体）。
【００４７】
本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する、２つの同一な単鎖ＦａｂフラグメントＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１が、そのＮ末端で、前記の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＣ末端または２つの軽鎖の２つのＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している（４価の二重特異的抗体）、本発明による多重特異的抗体である。好ましい態様において、本発明による前記の多重特異的抗体（好ましくは前記の４価の二重特異的抗体）は、完全長ＩｇＧおよび前記したような本発明による２つの同一な単鎖Ｆａｂフラグメントを含み、そしてヒトＩＧＦ−１Ｒ並びにヒトＥＧＦＲに特異的に結合する。これらの分子は、好ましくは、ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（DSM ACC 2587; WO 2005/005635、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８または＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＡＫ１８と略称される）およびヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（WO 2006/082515、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と略称される）の抗原結合部位に基づく。これらの分子は、腫瘍細胞上の２つのレセプターチロシンキナーゼの作用を同時にターゲティングしそして干渉する。この二重活性は、これらの一方のレセプターのみを干渉する抗体と比較して、顕著に改善された抗腫瘍活性を引き起こす。このような分子の設計、組成、生成および特徴付けを実施例１〜６に示す。
【００４８】
従って１つの態様において、本発明によるこのような多重特異的抗体は、
ｉ）前記の完全長抗体が、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメイン中に配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ１領域、そして軽鎖可変ドメイン中に配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ１領域を含み；そして
ｉｉ）前記の単鎖ＦａｂフラグメントがＥＧＦＲに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメイン中に配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、および配列番号１１のＣＤＲ１領域、そして軽鎖可変ドメイン中に配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、および配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む
ことを特徴とする。
【００４９】
１つの態様において、本発明によるこのような多重特異的抗体は、
ｉ）前記の完全長抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメインとして配列番号７、および軽鎖可変ドメインとして配列番号８を含み、そして
ｉｉ）前記の単鎖ＦａｂフラグメントがＥＧＦＲに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメインとして配列番号１５、および軽鎖可変ドメインとして配列番号１６を含む
ことを特徴とする。
【００５０】
１つの態様において、本発明によるこのような多重特異的抗体は、
ｉ）前記の完全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメイン中に配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、および配列番号１１のＣＤＲ１領域、そして軽鎖可変ドメイン中に配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、および配列番号１４のＣＤＲ１領域を含み；そして
ｉｉ）前記の単鎖ＦａｂフラグメントがＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメイン中に配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ１領域、そして軽鎖可変ドメイン中に配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ１領域を含む
ことを特徴とする。
【００５１】
１つの態様において、本発明によるこのような多重特異的抗体は、
ｉ）前記の完全長抗体が、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメインとして配列番号１５、および軽鎖可変ドメインとして配列番号１６を含み、そして
ｉｉ）前記の単鎖ＦａｂフラグメントがＩＧＦ１Ｒに特異的に結合し、そして重鎖可変ドメインとして配列番号７、および軽鎖可変ドメインとして配列番号８を含む
ことを特徴とする。
【００５２】
本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する、２つの同一な単鎖ＦａｂフラグメントＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＬ１が、そのＣ末端で、前記の完全長抗体の２つの重鎖の２つのＮ末端または２つの軽鎖の２つのＮ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、本発明による多重特異的抗体である。
【００５３】
本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、本発明による多重特異的抗体である。本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＮ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、本発明による多重特異的抗体である。本発明の１つの態様は、第２抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合している、本発明による多重特異的抗体である（例えば図６参照）。
【００５４】
好ましくは、本発明による多重特異的抗体は、第２抗原および第３抗原に結合する２つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む（三重特異的抗体）（例えば図７参照）。
【００５５】
本発明の別の局面において、本発明による多重特異的抗体は、
ａ）２つの同一な抗体重鎖ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３および２つの同一な抗体軽鎖ＶＬ−ＣＬからなる、第１抗原に結合する、完全長抗体；並びに
ｂ）１〜４つのさらなる抗原に結合する、１〜４つの単鎖Ｆａｂフラグメントｂａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬまたはｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１
を含み、前記の単鎖Ｆａｂフラグメントは、前記の完全長抗体の重鎖および軽鎖のＣ末端またはＮ末端においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に連結されている。
【００５６】
本発明の完全長抗体は、１つ以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥアイソタイプを含み、並びにＩｇＧおよびＩｇＡの場合にはそのサブタイプを含む。好ましい態様において、本発明の完全長抗体は、ＩｇＧタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する。
【００５７】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００５８】
「キメラ抗体」という用語は、通常組換えＤＮＡ技術によって調製された、１つの起源または種に由来する可変領域、すなわち結合領域と、異なる起源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む、抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、定常領域を、元の抗体の定常領域から改変または変化させて、本発明による特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関しての特性を生じさせたものである。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチされた抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 and US 5,204,244を参照されたい。
【００５９】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのそれと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むようになった、抗体を指す。好ましい態様において、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について前記した抗原を認識する配列を示すものに相当する。本発明によって包含される他の形態の「ヒト化抗体」は、定常領域を元の抗体の定常領域からさらに改変または変化させて、本発明による特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する特性を生じさせたものである。
【００６０】
本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は当技術分野の最新技術において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J., G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体をトランスジェニック動物（例えばマウス）において産生することもでき、前記動物は免疫化されると、内因性免疫グロブリンの産生を伴うことなくヒト抗体の全レパートリーまたは選択されたものを産生することができる。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異マウスに導入することにより、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生される（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40参照）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生することができる（Hoogenboom, H.R.およびWinter, G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。Cole, et al.およびBoerner, et al.の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用することができる（Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, (1985) 77; and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体についてすでに記載したように、本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語はまた、例えば「クラススイッチ」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４へおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において改変して、本発明による特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関する特性を生じさせたような抗体を含む。
【００６１】
本発明による多重特異的抗体が、ヘテロ二量体融合ペプチドを生じる１つまたは３つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む場合には（あるいは、重鎖または軽鎖のいずれかのＣ末端またはＮ末端に両方が付着した２つの同一ではない単鎖フラグメントの場合）、本発明による前記の完全長抗体のＣＨ３ドメインを、「ノブから穴への」技術によって改変させることができ、この技術は、例えばWO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621;およびMerchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681においていくつかの例と共に詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これらの２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させている。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々が「ノブ」となることができ、一方で他方は「穴」である。ジルスフィド橋の導入は、ヘテロ二量体を安定化させ（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、そして収量を増加させる。
【００６２】
従って、本発明の１つの局面において、本発明による前記の多重特異的抗体は、唯一つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含み、そしてさらに、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが各々、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の界面を含む界面で接触し；
前記界面は、２価の二重特異的抗体の形成を促進するように改変されており、前記改変は、
ａ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインが、
２価の二重特異的抗体内の一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞に位置することのできる他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を生成するように、改変され、
ｂ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、
３価の二重特異的抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面に接触する第２のＣＨ３ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞が生成され、その中に第１のＣＨ３ドメインの界面内の隆起が位置することができるように、改変されることを特徴とする。
【００６３】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【００６４】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【００６５】
本発明の１つの局面において、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）を導入することによってさらに改変される。
【００６６】
好ましい態様において、唯１つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む前記の多重特異的抗体は、３価の二重特異的抗体である。前記の３価の二重特異的抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異を含み、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。例えば「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ突然変異またはＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって、ＣＨ３ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィド橋を使用することもできる(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。従って、別の好ましい態様において、前記の３価の二重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、または前記の３価の二重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける追加のＹ３４９Ｃ突然変異および他方のＣＨ３ドメインにおける追加のＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド橋を形成する）（ナンバリングは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。しかしまた、EP 1870459A1によって記載された他の穴中のノブ（knobs-in-holes）の技術を代替的にまたは追加的に使用することができる。前記の３価の二重特異的抗体の好ましい例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、および「穴鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（ナンバリングは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【００６７】
別の好ましい態様において、前記の３価の二重特異的抗体（多重特異的抗体は、唯１つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む）は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｋ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を、そしてさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
【００６８】
別の好ましい態様において、前記の３価の二重特異的抗体（多重特異的抗体は、唯１つの単鎖Ｆａｂフラグメントを含む）は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、または前記の３価の二重特異的抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を、そしてさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を、そして「穴鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
【００６９】
従って、本発明の１つの態様は、第２の抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端またはＮ末端（好ましくは１つの重鎖のＣ末端）においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合し、前記の完全長抗体が、２つのＣＨ３ドメインの一方にＴ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む、本発明による多重特的抗体である。本発明の別の態様は、第２の抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端またはＮ末端（好ましくは１つの重鎖のＣ末端）においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合し、前記の完全長抗体が、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む、本発明による多重特異的抗体である（例えば図６参照）。本発明の別の態様は、第２の抗原に結合する１つの単鎖Ｆａｂフラグメントが、前記の完全長抗体の１つの重鎖または１つの軽鎖のＣ末端またはＮ末端（好ましくは１つの重鎖のＣ末端）においてペプチドコネクターを介して前記の完全長抗体に融合し、前記の完全長抗体が、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を、そして２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む、本発明による多重特異的抗体である。
【００７０】
本明細書において使用する「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された全てのヒト抗体、例えば、ＮＳ０もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、あるいは、宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体は、in vivoにおける体細胞高頻度突然変異にかけられる。従って、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来しそしてこれに関連しているが、in vivoのヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在しない可能性がある、配列である。
【００７１】
本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは同じ一般構造を有し、そして各々のドメインは、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲは、β−シート構造を接続するループを形成し得る。各々の鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってその３次元構造が保持され、そして他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、そしてそれ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００７２】
本明細書において使用した場合の「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のドメインを含む。各々の鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸によって分離されている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００７３】
本明細書において使用する「結合」または「特異的に結合」という用語は、精製された野生型抗原を用いる、in vitroアッセイにおいて、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)においての、抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、およびＫＤ（ｋＤ／ｋａ）という項によって定義される。結合または特異的に結合とは、１０−８mol/lまたはそれ以下、好ましくは１０−９Ｍ〜１０−１３mol/lの結合親和性（ＫＤ）を意味する。従って、本発明による多重特異的抗体は、それが特異的である各々の抗原に、１０−８mol/lまたはそれ以下、好ましくは１０−９Ｍ〜１０−１３mol/lの結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。
【００７４】
ＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合は、BIAcoreアッセイ（GE-Healthcare Uppsala, Sweden）によって調査することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）およびＫＤ（ｋＤ／ｋａ）という項によって定義される。
【００７５】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することのできる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの化学的に活性な分子の表面基を含み、そして特定の態様において、特異的な３次元構造特徴、およびまたは特異的な荷電特徴を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
【００７６】
特定の態様において、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中におけるその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７７】
本出願内において使用する「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を示す。定常領域は、抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのクラスに分類され、そしてこれらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのサブクラスにさらに分類され得る。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、α、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。５つ全ての抗体クラスに見出され得る軽鎖定常領域（ＣＬ）はκ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００７８】
本出願において使用する「ヒト起源に由来する定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域および／または定常軽鎖κもしくはλ領域を示す。このような定常領域は当技術分野の最新技術において周知であり、そして例えばKabat, E.A., (例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788参照)によって記載されている。
【００７９】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体は、低下したＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ）への結合を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強力な結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃの炭水化物の欠失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５は、もし改変させた場合に、低下したＦｃレセプターへの結合も提供する残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434）。
【００８０】
１つの態様において、本発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して低下したＦｃＲへの結合を示し、そして完全長の親抗体は、ＦｃＲ結合に関して、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５において突然変異を有するＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスであり、そして／またはＰＶＡ２３６突然変異を含む。１つの態様において、完全長の親抗体における突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である。別の態様において、完全長親抗体における突然変異は、ＩｇＧ４においてはＳ２２８Ｐであり、そしてＩｇＧ１においてはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。定常重鎖領域は配列番号１７および１８に示される。１つの態様において、完全長親抗体の定常重鎖領域は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号１７である。別の態様において、完全長親抗体の定常重鎖領域は、突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号１８である。別の態様において、完全長親抗体の定常軽鎖領域は、配列番号１９のκ軽鎖領域またはλ軽鎖領域である。好ましくは、完全長親抗体の定常重鎖領域は、突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号１７または配列番号１８である。
【００８１】
抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞障害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害作用）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における規定のタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。このような定常領域結合部位は当技術分野の最新技術において公知であり、そして例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324;および EP 0 307 434によって記載されている。このような定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９によって特徴付けられる（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【００８２】
「抗体依存性細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）」という用語は、エフェクター細胞の存在下における本発明による抗体によるヒトターゲット細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、新しく単離したＰＢＭＣなどのエフェクター細胞、あるいは単球もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または永久増殖するＮＫ細胞株のようなバフィーコートから精製されたエフェクター細胞の存在下において、本発明による抗体を用いて、抗原発現細胞の調製物を処理することによって測定される。
【００８３】
「補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）」という用語は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補因子Ｃ１ｑの結合によって開始される過程を示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における規定のタンパク質−タンパク質相互作用によって引き起こされる。このようなＦｃ部分結合部位は当技術分野の最新技術において公知である（前記参照）。このようなＦｃ部分結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９によって特徴付けられる（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は通常、Ｃ１ｑおよびＣ３の結合を含む補体活性化を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑおよび／またはＣ３に結合しない。
【００８４】
さらなる態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラスであるか、または突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする。
【００８５】
さらなる態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体がヒトＩｇＧ２サブクラスであることを特徴とする。
【００８６】
さらなる態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体がヒトＩｇＧ３サブクラスであることを特徴とする。
【００８７】
さらなる態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体がヒトＩｇＧ４サブクラスであるか、または追加の突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。
【００８８】
好ましくは、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体が、追加の突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ１サブクラス、ヒトＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。
【００８９】
さらなる態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体が、ヒトＦｃγレセプターＩＩＩａへの親和性を増加させて、ＡＤＣＣを媒介するその適格性を増加させるように改変されている（Ｆｃ領域における突然変異によって、または糖鎖工学によってのいずれかで）ことを特徴とする。フコースの量を減少させることによって抗体のＡＤＣＣを増強させる方法が、例えば、WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739 Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993またはUS 2005/0249722に記載されている。それ故、本発明の１つの態様において、本発明による多重特異的抗体は、前記の完全長抗体が、フコシル化されたＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプであり、フコースの量は、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖（糖）の全量の６０％以下である（これは、Ａｓｎ２９７におけるＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも４０％以上がフコシル化されていることを意味する）ことを特徴とする。
【００９０】
本発明による抗体は組換え手段によって産生される。従って、本発明の１つの局面は、本発明による抗体をコードする核酸であり、そしてさらなる局面は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換え産生のための方法は当技術分野の最新技術において広く知られており、そして原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現、その後の抗体の単離、および通常は薬学的に許容される純度までの精製を含む。宿主細胞における前記したような抗体の発現のために、それぞれの改変された軽鎖および重鎖をコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母またはE.coli細胞などの適切な原核または真核宿主細胞において行なわれ、そして、抗体を細胞（上清または溶解後の細胞）から回収する。抗体の組換え産生のための一般的な方法は当技術分野の最新技術において周知であり、そして例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文に記載されている。
【００９１】
本発明による多重特異的抗体は、培養培地から、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離およびシークエンスされる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡおよびＲＮＡの入手源として役立ち得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、その後、これを免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄細胞などの宿主細胞にトランスフェクションすることにより、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【００９２】
多重特異的抗体のアミノ酸配列変異体（または突然変異体）は、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば前記したように、非常に制限された範囲でしか実施することができない。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプおよび抗原結合などの前記の抗体特徴を改変させないが、組換え産生の収量、タンパク質の安定性を改善し得るか、または精製を容易にし得る。
【００９３】
本出願において使用する「宿主細胞」という用語は、本発明による抗体を生成するために工学操作することのできる任意の種類の細胞系を示す。１つの態様において、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。
【００９４】
本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」および「細胞培養液」という表現は同義語として使用され、そして全てのこのような名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代の対象の細胞、および継代の回数に関係なくそれから誘導された培養液を含む。全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異に因り、ＤＮＡ内容物において正確に同一ではない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能または生物活性を有する子孫の変異体も含まれる。明確に異なる名称が考えられるが、それは内容から明らかである。
【００９５】
ＮＳ０細胞における発現が、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001)261-270によって記載されている。一過性発現が、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングが、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997)77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）が、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83によって、並びにSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996)191-199によって記載されている。
【００９６】
原核生物に対して適切である制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００９７】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置された場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現された場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置されている場合にコード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合には、連続的でありそしてリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。従来の制限酵素部位におけるライゲーションによって連結が行なわれる。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。
【００９８】
細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を排除するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって、抗体の精製を行なう。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。種々の方法が良好に確立され、そしてタンパク質精製のために広く使用されており、これには例えば、微生物タンパク質を用いてのアフィニティクロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合形の交換）、チオフィリック吸着（例えばβ−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドを用いて）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂またはｍ−アミノフェニルボロン酸を用いて）、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）親和性材料）、サイズ排除クロマトグラフィーおよび電気泳動法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）がある。
【００９９】
本明細書において使用する「形質転換」という用語は、宿主細胞へのベクター／核酸の導入の過程を指す。厄介な細胞壁障壁を含まない細胞を宿主細胞として使用する場合には、トランスフェクションは、例えばGraham, F.L.およびvan der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467によって記載されたリン酸カルシウム沈降法によって行なわれる。しかしながら、核内注入によるまたはプロトプラスト融合によるなどの、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法も使用し得る。原核細胞または実質的な細胞壁構築物を含まない細胞を使用する場合には、例えば、トランスフェクションの１つの方法は、Cohen, S.N., et al., PNAS. 69 (1972) 2110-2114によって記載されたような塩化カルシウムを使用したカルシウム処理である。
【０１００】
本明細書において使用する「発現」は、核酸をｍＲＮＡに転写する過程および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物とも呼ばれる）を続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳する過程を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、まとめて遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合には、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１０１】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞に導入および／または宿主細胞間で導入する、特に自己複製する、核酸分子である。この用語は、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入（例えば染色体への組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能する複製ベクター、並びにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。記載したような１つより多くの機能を提供するベクターも含まれる。
【０１０２】
「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチドへと転写および翻訳されることのできるポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能することのできる発現ベクターからなる適切な宿主細胞を指す。
【０１０３】
本発明による多重特異的抗体は、生物学的または薬理学的活性、薬物動態学的特性または毒性などの、改善された特徴を有することが今回判明した。それらを、癌などの疾病の処置のために使用することができる。
【０１０４】
本発明の１つの局面は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。本発明の別の局面は、薬学的組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる局面は、本発明による抗体を含む薬学的組成物の製造のための方法である。別の局面において、本発明は、薬学的担体と一緒に製剤化された、本発明による抗体を含む、組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【０１０５】
本発明の１つの態様は、癌の処置のための本発明による多重特異的、好ましくは二重特異的な抗体である。
【０１０６】
本発明の別の局面は、癌の処置のための前記薬学的組成物である。
【０１０７】
本発明の別の局面は、癌の処置のための医薬品の製造のための本発明による抗体の使用である。
【０１０８】
本発明の別の局面は、このような処置の必要な患者に本発明による抗体を投与することによる、癌を患う患者の処置法である。
【０１０９】
本明細書において使用する「薬学的担体」は、生理学的に適合性である、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄内または表皮投与（例えば注入または点滴による）に適している。
【０１１０】
本発明の組成物を、当技術分野において公知の多種多様な方法によって投与することができる。当業者によって理解されているように、投与経路および／または投与形態は、所望の結果に依存して変更される。特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐ材料で前記化合物をコーティングするか、または前記材料と共に前記化合物を共投与することが必要であり得る。例えば、前記化合物は、適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤中で被験体に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤としては、食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。薬学的担体としては、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
【０１１１】
本明細書において使用する「非経口投与」および「非経口的に投与」というフレーズは、通常、注射による、経腸投与および外用投与以外の投与形態を意味し、それは、以下に制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮下組織内、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜下および胸骨内への注入および点滴を含む。
【０１１２】
本明細書において使用する癌という用語は、増殖性疾病、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃（stomach）癌、胃（gastric）癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸（spinal axis）腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（前記の癌のいずれかの難治形態、または前記の癌の１つ以上の組合せを含む）を指す。
【０１１３】
これらの組成物はまた保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含み得る。微生物の存在の防御は、上記の滅菌手順によって、並びに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含によって確実にされ得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を前記組成物中に含めることが望ましくあり得る。さらに、注射可能な剤形の延長吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤の包含によってもたらされ得る。
【０１１４】
選択する投与経路に関係なく、本発明の化合物（これは、適切な水和形態で使用され得る）および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルを変更して、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物および投与形態に対して所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量を得ることができる。選択した投与量レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時刻、使用する特定の化合物の排泄速度、処置持続期間、使用する特定の組成物と併用して使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態および病歴、並びに医学分野において周知である同様な因子を含む、多種多様な薬物動態因子に依存する。
【０１１６】
前記組成物は、無菌でなければならず、そして前記組成物がシリンジによって送達できる程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は好ましくは等張緩衝食塩水溶液である。
【０１１７】
適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムなどの等張化剤を前記組成物中に含めることが好ましい。
【０１１８】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を行なうことができることが理解される。
【０１１９】
アミノ酸配列の記載
配列番号１  重鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号２  重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号３  重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号４  軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号５  軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号６  軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号７  重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号８  軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号９  重鎖ＣＤＲ３、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１０  重鎖ＣＤＲ２、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１１  重鎖ＣＤＲ１、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１２  軽鎖ＣＤＲ３、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１３  軽鎖ＣＤＲ２、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１４  軽鎖ＣＤＲ１、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号１５  重鎖可変ドメイン、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＨＨＤ
配列番号１６  軽鎖可変ドメイン、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＫＣ
配列番号１７  ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１８  ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１９  κ軽鎖定常領域
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】可変ドメインおよび定常ドメインを典型的な順序で含む２対の重鎖および軽鎖を有する、第１の抗原１に特異的に結合する、ＣＨ４ドメインを含まない、完全長抗体の図解構造。
【図２】例えば第２の抗原２に特異的に結合する４つの可能な単鎖Ｆａｂフラグメントの図解構造。
【図３】第１の抗原１に特異的に結合する完全長抗体と、第２の抗原２に特異的に結合する２つの単鎖Ｆａｂとを含む、本発明による多重特異的抗体の図解構造−二重特異的４価の例。
【図４】ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する完全長抗体と、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つの同一な単鎖Ｆａｂとを含む、本発明による二重特異的抗体−ＳｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ並びに精製後の発現レベル。Ａ：重鎖のＣ末端に融合したｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）。Ｂ：重鎖のＣ末端に（融合した追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド橋を含むＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）ｓｃＦａｂ。Ｃ：軽鎖のＣ末端に融合したｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）。Ｄ：軽鎖のＣ末端に（融合した追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド橋を含むＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）ｓｃＦａｂ。
【図５】ＥＧＦＲに特異的に結合する完全長抗体と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する２つの同一な軽鎖Ｆａｂとを含む、本発明による二重特異的抗体−ＳｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２分子Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ。Ａ：重鎖のＣ末端に融合したｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）。Ｂ：重鎖のＣ末端に（融合した追加のＶＨ４４−ＶＬ１００−ジスルフィド橋を含むＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）ｓｃＦａｂ。Ｃ：軽鎖のＣ末端に融合したｓｃＦａｂ（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）。Ｄ：軽鎖のＣ末端に（融合した追加のＶＨ４４−ＶＬ１００ジスルフィド橋を含むＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）ｓｃＦａｂ。
【図６】第１の抗原１に特異的に結合する完全長抗体と、第２の抗原２に特異的に結合する１つの単鎖Ｆａｂとを含む、本発明による多重特異的抗体の図解構造−ノブおよび穴を含む二重特異的３価の例。
【図７】第１の抗原１に特異的に結合する完全長抗体と、第２の抗原２に特異的に結合する１つの単鎖Ｆａｂとを含む、本発明による多重特異的抗体の図解構造−ノブおよび穴を含む三重特異的４価の例。
【図８】単鎖Ｆａｂを含む二重特異的抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２０（還元されておらず）。２：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２１（還元されておらず）。３：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２０（還元されている）。４：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿４７２１（還元されている）。
【図９ａ】ｓｃＦａｂを含む二重特異的抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＨＰ−ＳＥＣ分析。図９ａ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２０；７．７％、凝集体（ボックス内に印す）。図９ｂ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２１；３．５％、凝集体（ボックス内に印す）。
【図９ｂ】ｓｃＦａｂを含む二重特異的抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１のＨＰ−ＳＥＣ分析。図９ａ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２０；７．７％、凝集体（ボックス内に印す）。図９ｂ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１−４７２１；３．５％、凝集体（ボックス内に印す）。
【図１０ａ】ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合。図１０ａ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｂ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＲ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｃ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝０．５nM。図１０ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＦ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝１１nM。
【図１０ｂ】ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合。図１０ａ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｂ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＲ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｃ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝０．５nM。図１０ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＦ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝１１nM。
【図１０ｃ】ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合。図１０ａ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｂ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＲ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｃ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝０．５nM。図１０ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＦ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝１１nM。
【図１０ｄ】ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２の結合。図１０ａ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｂ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＲ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２０の結合、ＫＤ＝２nM。図１０ｃ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＥＧＦＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝０．５nM。図１０ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅダイアグラム−ＩＧＦ−１ＲへのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２＿２７２０の結合、ＫＤ＝１１nM。
【図１１】スキーム−以下の一般的な手順を用いてＦＡＣＳ競合アッセイによって分析した細胞へのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲの結合：・Ａｌｅｘａ６４７（１μg/mL）で標識された＜ＩＧＦ１Ｒ＞Ｍａｂと、標識されていないｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ（１００μg/mL〜０．００１μg/mL）を平行して加える。・氷上で４５分間インキュベーションし、洗浄し、そして非結合抗体を除去する。・１％ＨＣＨＯで固定し、その後ＦＡＣＳ。
【図１２ａ】ＦＡＣＳ競合アッセイによって分析した細胞へのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１および親＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合。図１２ａ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８（０．１８μg/ml）およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１（０．１５μg/ml）のＩＣ５０値の比較。図１２ｂ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８の結合曲線（ターニングポイント０．１１μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。図１２ｃ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１の結合曲線（ターニングポイント０．１０μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。
【図１２ｂ】ＦＡＣＳ競合アッセイによって分析した細胞へのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１および親＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合。図１２ａ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８（０．１８μg/ml）およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１（０．１５μg/ml）のＩＣ５０値の比較。図１２ｂ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８の結合曲線（ターニングポイント０．１１μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。図１２ｃ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１の結合曲線（ターニングポイント０．１０μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。
【図１２ｃ】ＦＡＣＳ競合アッセイによって分析した細胞へのｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１および親＜ＩＧＦ１Ｒ＞クローン１８の結合。図１２ａ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８（０．１８μg/ml）およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１（０．１５μg/ml）のＩＣ５０値の比較。図１２ｂ：＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８の結合曲線（ターニングポイント０．１１μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。図１２ｃ：ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１の結合曲線（ターニングポイント０．１０μg/ml）−ｙ軸＝ＲＬＵ；ｘ軸、抗体濃度（μg/ml）。
【図１３】種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ変異体（１００nM）と共に２４時間インキュベーションした後のＨ３２２Ｍ細胞上でのＩＧＦ１−Ｒのダウンレギュレーション。
【図１４】種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ変異体（１００nM）と共に２４時間インキュベーションした後のＨ３２２Ｍ細胞上でのＥＧＦＲのダウンレギュレーション。
【図１５】種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ変異体（１００nM）による、Ｈ３２２Ｍ細胞の増殖の阻害。
【０１２１】
実験手順
実施例
材料および一般的な方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示される。抗体鎖のアミノ酸には番号が付けられ、ＥＵナンバリングに従って言及される（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【０１２２】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のようにＤＮＡを操作した。分子生物試薬を、製造業者の指示に従って使用した。
【０１２３】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって製造されたオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位によってフランキングされる６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション（ＰＣＲ増幅を含む）によって会合させ、その後、例えばＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ、ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ、ＢｓｔＥＩＩ／ＮｏｔＩまたはＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩなどの指定された制限酵素部位を介して、ｐＵＣクローニングベクターに基づいたｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Invitrogen）にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンスによって確認した。遺伝子合成フラグメントを、Geneart (Regensburg, Germany)の所与の明細に従って順番に並べた。
【０１２４】
ＤＮＡ配列の決定
ＤＮＡ配列を、Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)において実施された二本鎖シークエンスによって決定した。
【０１２５】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データの管理
ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）のソフトウェアパッケージバージョン１０．２およびInvitrogensベクターＮＴ１アドバンススイートバージョン９．１を、配列の作製、マッピング、分析、アノテーションおよび説明のために使用した。
【０１２６】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J., and Yamada, K.M., (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載のような標準的な細胞培養技術を使用した。
【０１２７】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
多重特異的抗体を、FreeStyle（登録商標）２９３発現系を使用して製造業者の指示(Invitrogen, USA)に従ってヒト胚腎臓２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡潔に言うと、FreeStyle（登録商標）２９３Ｆ細胞懸濁液を、３７℃／８％ＣＯ２でFreeStyle（登録商標）２９３発現培地中で培養し、そして細胞をトランスフェクションの日に１〜２×１０６個の生細胞/mlの密度で新鮮な培地に播種した。ＤＮＡ−２９３fectin（登録商標）複合体を、２５０mlの最終トランスフェクション容量に対して３３３μlの２９３fectin（登録商標）(Invitrogen, Germany)および１：１のモル比の２５０μgの重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを使用して、Opti-MEM（登録商標）培地(Invitrogen, USA)中で調製した。二重特異的抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクションから７日後に、１４０００ｇで３０分間の遠心分離および滅菌フィルター（０．２２μm）を通してのろ過によって清澄化した。上清を精製まで−２０℃で保存した。
【０１２８】
タンパク質の決定
精製した抗体および誘導体のタンパク質濃度を、Pace, C.N., et. al., Protein Science, 4 (1995) 2411-2423によるアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、バックグラウンド修正として３２０nmにおけるＯＤを用いて、２８０nmにおける吸光度（ＯＤ）を決定することによって決定した。
【０１２９】
上清中の抗体濃度の決定
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、アフィニティＨＰＬＣクロマトグラフィーによって測定した。簡潔に言うと、プロテインＡに結合する抗体および誘導体を含む細胞培養上清を、２００mM ＫＨ２ＰＯ４、１００mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中のApplied Biosystems Poros A/20カラムにアプライし、そしてUltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)で２００mM ＮａＣｌ、１００mMクエン酸（ｐＨ２．５）を用いてマトリックスから溶出させた。溶出されたタンパク質を、ＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体は標準としての役目を果たした。
【０１３０】
タンパク質の精製
分泌された抗体を、上清から、２工程で、プロテインＡセファロース（登録商標）(GE Healthcare, Sweden)を使用したアフィニティクロマトグラフィー、およびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。簡潔に言うと、二重特異的および三重特異的抗体を含む清澄化された培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰ（５ml）カラムにアプライした。非結合タンパク質を平衡緩衝液を用いて洗浄除去した。二重特異的抗体を、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、そしてタンパク質を含む画分を、０．１mlの１Ｍトリス（ｐＨ８．５）を用いて中和した。その後、溶出したタンパク質画分をプールし、３mlの容量となるまでAmicon Ultra遠心式フィルター装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Millipore）を用いて濃縮し、そして２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて平衡化されたSuperdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にローディングした。単量体の抗体画分をプールし、瞬時に凍結させ、そして−８０℃で保存した。試料の一部を、その後のタンパク質分析および特徴付けのために提供した。
【０１３１】
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０nmにおける吸光度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異的抗体の純度を、還元剤（５mMの１，４−ジチオトレイトール）の存在下および非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにクーマシーブリリアントブルーを用いての染色によって分析した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を製造業者の指示に従って使用した（４〜２０％トリス−グリシンゲル）。二重特異的抗体試料の凝集内容物を、UltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)での高速ＳＥＣによって、２５℃の２００mM ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ（ｐＨ７．０）のランニング緩衝液中のSuperdex 200分析サイズ排除カラム(GE Healthcare, Sweden)を使用して分析した。２５μgのタンパク質を０．５ml/分の流速でカラムに注入し、そして５０分間かけて均一濃度で溶出させた。安定性の分析のために、０．１mg/ml、１mg/mlおよび3mg/mlの濃度の精製タンパク質を調製し、そして４℃、３７℃で７日間インキュベーションし、その後、高速ＳＥＣによって評価した。還元された二重特異的抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ(Roche Molecular Biochemicals)を用いての酵素的処理によってＮ−グリカンを除去した後に、ナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０１３２】
実施例１
ヒトＩＧＦ−１レセプター並びにヒトＥＧＦ−レセプターを認識する分子である本発明による多重特異的抗体の設計
以下に、本発明の１つの態様として、第１の抗原（ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＦＲ）に結合する完全長抗体を、完全長抗体にペプチドコネクターを介して接続された第２の異なる抗原（ＩＧＦ−１ＲまたはＥＧＦＲのもう一方）に結合する２つの単鎖Ｆａｂフラグメント（重鎖の２つのＣ末端または軽鎖の２つのＣ末端における両方の単鎖Ｆａｂフラグメント）と共に含む、４価の二重特異的な抗体を例示する。前記の単鎖Ｆａｂフラグメント中の抗体ドメインおよびリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の順序を有する：ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１。
【０１３３】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位のための重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号１５を使用した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位のための軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号１６を使用した。
【０１３４】
＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位のための重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号７を使用した。＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位のための軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号８を使用した。
【０１３５】
遺伝子合成および組換え分子生物学技術によって、それぞれの抗原結合部位のＶＨおよびＶＬを含む、ＶＬ−ＣＬおよびＶＨ−ＣＨ１を、グリシンセリン（Ｇ４Ｓ）ｎ単鎖リンカーによって連結して、短鎖ＦａｂフラグメントＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１を得、これを、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを使用して抗体重鎖または軽鎖のＣ末端に付着した。
【０１３６】
場合により、シスチン残基を、以前に記載されたような技術（例えばWO 94/029350; Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Young, N.M., et al., FEBS Letters 377 (1995) 135-139;またはRajagopal, V., et al., Protein Engineering 10 (1997) 1453-59）に従って単鎖ＦａｂフラグメントのＶＨ（Ｋａｂａｔ４４位を含む）およびＶＬ（Ｋａｂａｔ１００位を含む）ドメインに導入した。
【０１３７】
全てのこれらの分子を組換え産生し、精製し、そして特徴付け、そしてタンパク質の発現、安定性および生物学的活性を評価した。
【０１３８】
４価の二重特異的な＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞、＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体を生成するために適用した多重特異的抗体の設計の要約を表１に示す。この研究のために、本発明者らは、種々の４価のタンパク質実体を記載するために「ｓｃＦａｂ−Ａｂ」という用語を使用する。設計したフォーマットの代表を図４および５に示し、そして表１に列挙する。
【０１３９】
【表１】
0005501439.tif 000002
【０１４０】
実施例２
二重特異的＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂＸＧＦＲ１分子の発現および精製
対応する二重特異的抗体の軽鎖および重鎖を、原核細胞および真核細胞選択マーカーを有する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドをE.coliにおいて増幅させ、精製し、そしてその後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における組換えタンパク質の一過性発現のためにトランスフェクションした（Invitrogenのfreesyleシステムを使用）。７日後、ＨＥＫ２９３細胞上清を収集し、そしてプロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。全ての二重特異的抗体構築物の均一性を、非還元条件下および還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。還元条件下において（図８）、Ｃ末端およびＮ末端ｓｃＦａｂ融合体を有するポリペプチド鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ時に、計算された分子量に類似した見かけの分子サイズを示した。全ての構築物の発現レベルをプロテインＡ ＨＰＬＣによって分析し、そして「標準的な」ＩｇＧの発現収量に類似していたか、またはいくつかの場合においては幾分低かった。平均タンパク質収量は、このような最適化されていない一過性発現実験において細胞培養上清１リットルあたり１．５〜１０mgのタンパク質であった（図４および５）。
【０１４１】
精製タンパク質のＨＰサイズ排除クロマトグラフィー分析は、組換え分子が凝集するという幾分の傾向を示した。このような二重特異的抗体の凝集による問題に対処するために、追加した結合部分のＶＨとＶＬとの間のジスルフィドによる安定化を行なった。そのために、本発明者らは、ｓｃＦａｂのＶＨおよびＶＬ内の規定の位置に１つのシステイン置換を導入した（ＫａｂａｔのナンバリングスキームによるとＶＨ４４／ＶＬ１００位）。これらの突然変異は、ＶＨとＶＬとの間の安定な鎖間ジスルフィドの形成を可能とし、これは次いで、生じるジスルフィドにより安定化されたｓｃＦａｂモジュールを安定化させる。ｓｃＦａｂへのＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドの導入はタンパク質発現レベルに有意に干渉せず、そしていくつかの場合においては発現収量を改善さえした（図４および５参照）。
【０１４２】
二重特異的抗体を、FreeStyle（登録商標）２９３発現系を使用して、製造業者の指示(Invitrogen, USA)に従って、ヒト胚腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡潔に言うと、FreeStyle（登録商標）２９３−Ｆ細胞懸濁液を、３７℃／８％ＣＯ２でFreeStyle（登録商標）２９３発現培地中で培養し、そして細胞をトランスフェクションの日に１〜２×１０６個の生細胞/mlの密度で新鮮な培地に播種した。ＤＮＡ−２９３fectin（登録商標）複合体を、２５０mlの最終トランスフェクション容量に対して３３３μlの２９３fectin（登録商標）(Invitrogen, Germany)および１：１のモル比の２５０μgの重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを使用して、Opti-MEM（登録商標）培地(Invitrogen, USA)中で調製した。組換え抗体誘導体を含む細胞培養上清を、トランスフェクションから７日後に、１４０００ｇで３０分間の遠心分離および滅菌フィルター（０．２２μm）を通してのろ過によって清澄化した。上清を精製まで−２０℃で保存した。
【０１４３】
分泌された抗体誘導体を、上清から、２工程で、プロテインＡセファロース（登録商標）(GE Healthcare, Sweden)を使用したアフィニティクロマトグラフィー、およびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。簡潔に言うと、二重特異的および三重特異的抗体を含む清澄化された培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰ（５ml）カラムにアプライした。非結合タンパク質を平衡緩衝液を用いて洗浄除去した。抗体誘導体を、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、そしてタンパク質を含む画分を、０．１mlの１Ｍトリス（ｐＨ８．５）を用いて中和した。その後、溶出したタンパク質画分をプールし、３mlの容量となるまでAmicon Ultra遠心式フィルター装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Millipore）を用いて濃縮し、そして２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて平衡化されたSuperdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にローディングした。単量体の抗体画分をプールし、瞬時に凍結させ、そして−８０℃で保存した。試料の一部を、その後のタンパク質分析および特徴付けのために提供した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の例および二重特異的抗体誘導体のＨＰサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のプロファイルを図８および９に示す。
【０１４４】
図５は、一過性発現系において観察された発現収量を列挙する。設計された全ての抗体誘導体を、さらなる分析のために十分量で発現および精製することができた。
【０１４５】
比較理由のために、２つのｓｃＦｖフラグメントが、ペプチドリンカーを介して、WO 1995/009917およびMueller D., et al, Handbook of Therapeutic antibodies, Part III, Chapter 2, (2008) 345-378に記載のように重鎖のＣ末端において融合している、完全長抗体に基づいた４価の二重特異的抗体を調製し、そして命名した。それが代わりに有するｓｃＦａｂの代わりに。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位のための重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号１５を使用した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位のための軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号１６を使用した。＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位のための重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号７を使用した。＜ＥＧＦＲ＞抗原結合部位のための軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号８を使用した。この比較分子はＸＧＦＲ１＿２３２０と命名される（そしてまたPCT PCT/EP2009/006782にも記載されている）。
【０１４６】
【表２】
0005501439.tif 000003
【０１４７】
二重特異的単鎖Ｆｖ分子ＸＧＦＲ１−２３２０は、精製後に０．２７mgの最終収量を有し、一方で対応する単鎖Ｆａｂ分子ＸＧＦＲ１−２７２０は、６．８mgの最終収量を有し（図４の化合物Ａ参照）、これは２００倍を超える収量の増加を示す。
【０１４８】
実施例３
二重特異的＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ分子の安定性および凝集傾向
ＨＰサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ない、組換え抗体誘導体の調製物中に存在する凝集体の量を決定した。そのために、二重特異的抗体試料を、Superdex 200分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare, Sweden)を使用して、UltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)での高速ＳＥＣによって分析した。図９は、これらの分析の一例を示す。凝集体は、単量体の抗体誘導体を含む画分の前に別々のピークまたはショルダーとして出現する。この研究のために、本発明者らは、所望の「単量体」分子を、両方のいずれかに接続されたｓｃＦａｂを有する、重鎖および軽鎖の２つのヘテロ二量体からなると定義する。還元された二重特異的抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸骨格の完全性並びに融合タンパク質を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ(Roche Molecular Biochemicals)を用いての酵素的処理によってＮ−グリカンを除去した後に、ナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０１４９】
種々の条件下（種々の濃度および時間）における精製タンパク質のＨＰサイズ排除クロマトグラフィー分析は、正常なＩｇＧと比較して、ｓｃＦａｂを含む分子については凝集する軽い傾向を示した。いくつかの分子について本発明者らが観察したこの軽い凝集傾向は、ｓｃＦａｂモジュールへのＶＨ４４／ＶＬ１００鎖間ジスルフィド結合の導入によって軽減することができた。
【０１５０】
実施例４
ＲＴＫであるＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒへの二重特異的＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ分子の結合
種々の二重特異的抗体フォーマットｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲのｓｃＦａｂモジュールの結合と、保持された完全長のＩｇＧモジュールの抗原結合部位の結合とを、結合モジュールおよび二重特異的抗体の由来する「野生型」ＩｇＧの結合と比較した。これらの分析を、表面プラズモン共鳴（Biacore）並びに細胞ＥＬＩＳＡを適用することによって行なった。
【０１５１】
二重特異的＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体の結合特性を、Biacore T100機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsla)を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって分析した。このシステムは、分子の相互作用の研究のために十分に確立されている。それはリガンド／アナライトの結合の連続的でリアルタイムなモニタリングを可能とし、従って、種々のアッセイ環境において会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡定数（ＫＤ）の決定を可能とする。ＳＰＲ技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定したリガンドと、溶液中に注入したアナライトとの相互作用によって引き起こされる表面上における質量変化を示す。分子が表面上に固定されたリガンドに結合すれば、質量は増加し、解離の場合には質量は減少する。
【０１５２】
キャプチャー抗ヒトＩｇＧ抗体を、アミンカップリング化学反応を使用してＣｌバイオセンサーチップの表面上に固定した。フローセルを、５μl/分の流速の０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび０．１Ｍの３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの１：１混合物を用いて活性化した。酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中５μg/mlの抗ヒトＩｇＧ抗体を注入し、これにより、約２００ＲＵの表面密度が得られた。リファレンス対照フローセルを同じように処理したが、キャプチャー抗体の代わりにビヒクル緩衝液のみで処理した。表面を、１Ｍエタノールアミン/ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の注入により遮断した。二重特異的抗体をＨＢＳ−Ｐ中で希釈し、そして５μl/分の流速で注入した。１〜５nMの濃度の抗体についての接触時間（結合相）は１分間であった。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００および３００nMの漸増濃度で注入し、ＩＧＦ−１Ｒを０．３７、１．１１、３．３３、１０、３０および９０nMの濃度で注入した。３０μl/分の流速での両方の分子についての接触時間（結合相）は３分間であり、解離時間（ランニング緩衝液を用いての洗浄）は５分間であった。全ての相互作用は２５℃（標準温度）で行なわれた。０．８５％リン酸および５mMの水酸化ナトリウムの再生溶液を、各々５μl/分で６０秒間注入して、各結合サイクルの後のあらゆる非共有結合的に結合したタンパク質を除去した。シグナルは、１秒間あたり１つのシグナルの割合で検出された。試料を、漸増濃度で注入した。
【０１５３】
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒへの二重特異的抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ＞抗体の同時結合の例を、図１０ａ〜ｄに示す。
【０１５４】
【表３】
0005501439.tif 000004
【０１５５】
培養細胞上におけるＦＡＣＳに基づいた結合分析および競合分析を適用して、細胞表面上に曝されたＲＴＫに対する二重特異的抗体誘導体の結合能も評価することができる。図１１は、Ａ５４９癌細胞上におけるｓｃＦａｂを含む二重特異的ＸＧＦＲ誘導体の結合能を試験するために本発明者らが使用した実験設定を示す。これらの細胞競合アッセイのために、抗原のＥＧＦＲ並びにＩＧＦ１Ｒを発現するＡ５４９細胞を脱着させ、そして計測した。コニカル底９６ウェルプレートの１ウェルあたり１．５×１０５個の細胞を播種した。細胞を遠心分離で沈降させ（１５００rpm、４℃、５分間）、そして１μg/mLのAlexa647標識ＩＧＦ１Ｒ特異的抗体を含む２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＰＢＳ中の５０μLのそれぞれの二重特異的抗体の連続希釈液中で氷上で４５分間インキュベーションした。細胞を再度遠心分離して沈降させ、そして２％ＦＣＳを含む２００μLのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細胞を、BD CellFix溶液(BD Biosciences)中に再懸濁し、そして少なくとも１０分間氷上でインキュベーションした。細胞の平均蛍光強度（ｍｆｉ）をフローサイトメトリー(FACS Canto)によって決定した。Ｍｆｉを、少なくとも２回の２つの独立した染色において決定した。フローサイトメトリースペクトルを、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用してさらに処理した。最大半量の結合を、XLFit 4.0 (IDBS)および用量応答１部位モデル（dose response one site model）205を使用して決定した。
【０１５６】
図１２ａ〜ｃに示されるこれらのアッセイの結果は、腫瘍細胞の表面上における二重特異的ｓｃＦａｂを含む抗体誘導体の結合機能性を実証する。例えば、二重特異的抗体誘導体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１＿２７２１の競合実験におけるＩＣ５０は０．１１μg/mlであり、一方、単一特異的抗体のＩＣ５０は５０％より高かった（０．１８μg/ml）。競合アッセイにおける親抗体と比較した二重特異的ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２１誘導体のこの増加した活性は、二重特異的分子が、単一特異的抗体よりも細胞表面に、より良好に結合することを示唆する。
【０１５７】
実施例５
二重特異的＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ分子による、ＥＧＦＲ並びにＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーション
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８(DSM ACC 2587)は、ＩＧＦＲ１シグナル伝達を阻害し、そしてヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２はＥＧＦＲによるシグナル伝達を阻害する。種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体の可能性ある阻害活性を評価するために、両方のレセプターのダウンレギュレーション度を分析した。
【０１５８】
腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）の量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、ＩＧＦ−１ＲおよびＥＧＦＲに特異的な抗体を用いての時間経過実験およびその後のＥＬＩＳＡ分析を実施した。
【０１５９】
６ウェルプレートに、１ウェルあたり、１０％ＦＣＳ(PAA、製造番号E15-039）および１％PenStrepの補充されたＲＰＭＩ １６４０中のヒト腫瘍細胞（H322M、５×１０５個の細胞/ml）を接種した。３mlの培地を各ウェルに加え、そして細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した。
【０１６０】
培地を注意深く除去し、そしてＲＰＭＩ−ＶＭ培地中に希釈した２mlの１００nM ＸＧＦＲ抗体によって置き換えた。対照ウェルにおいては、培地を、抗体を含まない培地および緩衝液、並びに対照抗体（＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８および＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の最終濃度１００nM）を含む培地のいずれかによって置き換えた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、そして個々のプレートを２４時間後にさらに処理するために取り出した。
【０１６１】
培地を吸引によって注意深く除去し、そして細胞を１mlのＰＢＳで洗浄した。３００μl/ウェルの冷ＭＥＳ溶解緩衝液を加えた（ＭＥＳ、１０mM Ｎａ３ＶＯ４、およびComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）。１時間後、細胞をセルスクレーパー(Corning、製造番号3010)を使用して氷上で脱着させ、そしてウェル内容物をエッペンドルフ反応チューブに移した。細胞フラグメントを、１３０００rpmおよび４℃で１０分間の遠心分離によって除去した。
【０１６２】
ＥＧＦＲの検出のために
９６ウェルマイクロタイタープレート(ＭＴＰ)をプロトコール(ヒトＥＧＦＲのためのDuoSet ELISA、RnD systems、製造番号DY231)に従って調製した。ＰＢＳ中１４４μg/mlのヒトＥＧＦＲヤギ抗体をＰＢＳ中で１：１８０に希釈し、そして１００μl/ウェルをＭＴＰに加えた。ＭＴＰを室温で撹拌しながら一晩インキュベーションした。プレートを、３回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の補充されたＰＢＳで洗浄し、そして３００μl/ウェルのＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を用いて１時間かけて室温（ＲＴ）で撹拌しながら遮断した。プレートを、３回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の補充されたＰＢＳで洗浄した。
【０１６３】
細胞溶解液中のタンパク質の量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット(Pierce)を使用して決定し、その後、細胞溶解液を、１００mMのＮａ３ＶＯ４１：１００およびComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤１：２０の補充されたＭＥＳ溶解緩衝液を用いて０．０４mg/mlのタンパク質濃度に調整し、そして１ウェルあたり１００μlの溶解液を、予め調製されたＭＴＰに加えた。バックグラウンド測定のために、１００μlの溶解緩衝液をＭＴＰのウェルに加えた。
【０１６４】
第２の細胞溶解液の濃度を０．０２５mg/mlで使用し、溶解液を１：２に希釈し、そして１ウェルあたり１００μlを、予め調製されたＭＴＰに加えた。ＭＴＰをさらに２時間室温で撹拌しながらインキュベーションし、その後、３回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含むＰＢＳで洗浄した。
【０１６５】
ＥＧＦＲのための検出抗体は、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で１：１８０に希釈された３６μg/mlの濃度のヒトＥＧＦＲヤギビオチニル化抗体であった。１ウェルあたり１００μlを加え、そして室温で２時間撹拌しながらインキュベーションした。その後、ＭＴＰを、３回、１ウェルあたり、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含む２００μlのＰＢＳで洗浄した。その後、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１：２００のストレプトアビジン−ＨＲＰを、１ウェルあたり１００μl加え、そして撹拌しながら２０分間室温でインキュベーションした。その後、プレートを、６回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含むＰＢＳで洗浄した。１ウェルあたり１００μlの３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン(Roche, BM-Blue ID番号: 11484581)を加え、そして２０分間室温で撹拌しながらインキュベーションした。１ウェルあたり２５μlの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、そしてさらに５分間室温でインキュベーションすることによって色反応を停止した。４５０nmにおける吸光度を測定した。
【０１６６】
ＩＧＦ−１Ｒの検出のために
ストレプトアビジン−ＭＴＰ(Roche ID番号: 11965891001)を、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で１：２００に希釈したＡＫ１ａビオチニル化抗体(Genmab, Denmark)を１ウェルあたり１００μl加えることによって調製した。ストレプトアビジン−ＭＴＰを１時間室温で撹拌しながらインキュベーションし、その後、３回、１ウェルあたり、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含む２００μlのＰＢＳで洗浄した。
【０１６７】
細胞溶解液中のタンパク質の量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット(Pierce)を使用して決定し、その後、細胞溶解液を、５０mMトリスｐＨ７．４、１００mM Ｎａ３ＶＯ４ １：１００およびComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤１：２０を用いて０．３mg/mlのタンパク質濃度に調整し、そして１ウェルあたり１００μlの溶解液を、予め調製されたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。
【０１６８】
第２の細胞溶解液の濃度を０．１５mg/mlで使用し、溶解液を希釈し、そして１ウェルあたり１００μlを、予め調製されたストレプトアビジン−ＭＴＰに加えた。バックグラウンド測定のために、１００μlの溶解緩衝液をストレプトアビジン−ＭＴＰのウェルに加えた。
【０１６９】
ＭＴＰを、さらに１時間室温で撹拌しながらインキュベーションし、その後、３回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含むＰＢＳで洗浄した。
【０１７０】
ＩＧＦ−１Ｒのための検出抗体は、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で１：７５０に希釈したヒトＩＧＦ−１Ｒβウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnology、製造番号sc-713)であった。１ウェルあたり１００μlを加え、そして室温で１時間撹拌しながらインキュベーションした。その後、ＭＴＰを、３回、１ウェルあたり、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含む２００μlのＰＢＳで洗浄した。その後、二次抗体である、ＰＢＳ、３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録証用）２０中のウサギＩｇＧ−ＰＯＤ(Cell signaling、製造番号7074)１：４０００を、１ウェルあたり１００μl加え、そして撹拌しながら１時間室温でインキュベーションした。その後、プレートを、６回、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液を含むＰＢＳで洗浄した。１ウェルあたり１００μlの３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン(Roche, BM-Blue ID番号: 11484581)を加え、そして２０分間室温で撹拌しながらインキュベーションした。１ウェルあたり２５μlの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、そしてさらに５分間室温でインキュベーションすることによって色反応を停止した。４５０nmにおける吸光度を測定した。
【０１７１】
Ａ５４９細胞における親の単一特異的な抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２および＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８と比較した、二重特異的ｓｃＦａｂを含むＸＧＦＲ分子によるレセプターダウンレギュレーションの検出の結果を図１３および１４に示す。二重特異的抗体のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲは、ＥＧＦＲ並びにＩＧＦ１Ｒの両方をダウンレギュレーションする。これは、結合モジュールの完全な機能性（生物学的機能性）および表現型の媒介が保持されていることを示す。図１４はまた、驚くべきことに、二重特異的抗体ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ＿２７２０が、親の＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２抗体のみと比較して、ＥＧＦＲの改善されたダウンレギュレーションを示したことを示す。
【０１７２】
ｓｃＦａｂを含むＸＧＦＲ１変異体は、同じモル数で同じアッセイに適用された場合に、野生型抗体と同じまたはそれよりも良好な活性を示したという事実は、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子が、両方のシグナル伝達経路に干渉することができることを示す。
【０１７３】
実施例６
in vitroにおけるｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１およびｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ２により媒介される腫瘍細胞株の増殖阻害
ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８(DSM ACC 2587)は、ＩＧＦ１Ｒを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する(WO 2005/005635)。同じように、ヒト化ラット抗ＥＧＦＲ抗体＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示された(WO 2006/082515)。腫瘍細胞株の増殖アッセイにおいて種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体の可能性ある阻害活性を評価するために、ＥＧＦＲ並びにＩＧＦ１Ｒを発現するＨ３２２Ｍ細胞における阻害度を分析した。
【０１７４】
Ｈ３２２Ｍ細胞（５０００個の細胞/ウェル）を、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））でコーティングされたディッシュ上の、１０％ＦＣＳの補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養して、プラスチック表面への接着を防いだ。これらの条件下で、Ｈ３２２Ｍ細胞は、３次元的に増殖する濃密な球状体を形成する（足場非依存性と呼ばれる特性）。これらの球状体は、in-situにおける固形腫瘍の３次元組織構築および構造に非常に類似している。球状体培養液を、７日間、１００nMの抗体の存在下においてインキュベーションした。Celltiter Glow発光アッセイを使用して、増殖阻害を測定した。Ｈ３２２Ｍ球状体培養液を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８で処理した場合、増殖の阻害を観察することができた。
【０１７５】
図１５は、１００nMの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８の適用が、細胞増殖を７２％減少させ、そして１００nMの＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２の適用が同じアッセイにおいて細胞増殖を７７％減少させたことを示す。両方の抗体の同時適用により（両方共に１００nMの同じ濃度で）、細胞生存度は完全に減少した（１００％の阻害）。このことは、両方のＲＴＫ経路の同時干渉は、ただ１つの経路のみの干渉よりも、腫瘍細胞株に対してより顕著な作用を及ぼすことを示す。１００nMのモル濃度の種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体の適用により、単一の分子のみを用いて観察されたよりも顕著なより高度な増殖阻害が得られた。事実、１００nMの抗体濃度において、種々のｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１変異体は、細胞増殖の完全な（１００％）阻害を示し、一方、単一モジュールの適用は部分的な阻害しか引き起こさなかった。
【０１７６】
本発明者らは、ｓｃＦａｂ−ＸＧＦＲ１分子が、ＥＧＦＲシグナル伝達またはＩＧＦ１Ｒシグナル伝達のいずれかを単独に干渉するＩｇＧと比較して、顕著に増加した増殖阻害活性を有すると結論づける。
【図１】
0005501439.tif 000005
【図２】
0005501439.tif 000006
【図３】
0005501439.tif 000007
【図４】
0005501439.tif 000008
【図５】
0005501439.tif 000009
【図６】
0005501439.tif 000010
【図７】
0005501439.tif 000011
【図８】
0005501439.tif 000012
【図９ａ】
0005501439.tif 000013
【図９ｂ】
0005501439.tif 000014
【図１０ａ】
0005501439.tif 000015
【図１０ｂ】
0005501439.tif 000016
【図１０ｃ】
0005501439.tif 000017
【図１０ｄ】
0005501439.tif 000018
【図１１】
0005501439.tif 000019
【図１２ａ】
0005501439.tif 000020
【図１２ｂ】
0005501439.tif 000021
【図１２ｃ】
0005501439.tif 000022
【図１３】
0005501439.tif 000023
【図１４】
0005501439.tif 000024
【図１５】
0005501439.tif 000025
【配列表】
0005501439000001.app