(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養器具において、
表面を有する基体、
前記基体の表面上に配置された膨潤性（メタ）アクリレート層であって、カルボキシル基含有アクリレートまたはメタクリレートモノマー、架橋性アクリレートまたはメタクリレートモノマー、および前記カルボキシル基含有アクリレートまたはメタクリレートモノマーおよび前記架橋性アクリレートまたはメタクリレートモノマーと重合できる親水性モノマーを含む組成物から形成された膨潤性（メタ）アクリレート層、および
前記膨潤性（メタ）アクリレート層の前記カルボキシル基含有アクリレートまたはメタクリレートモノマーのカルボキシル基に結合されたペプチド、
を有してなり、前記カルボキシル基含有アクリレートまたはメタクリレートモノマーがアクリル酸２−カルボキシエチルであることを特徴とする細胞培養器具。
【請求項２】
前記膨潤性（メタ）アクリレート層が、約５％と約５０％の間の水中における平衡含水率を有することを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項３】
前記架橋性アクリレートまたはメタクリレートモノマーが、ジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）またはジアクリル酸テトラ（エチレングリコール）であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項４】
前記親水性モノマーが、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、１−ビニル−２−ピロリドン、メタクリル酸ジ（エチレングリコール）エチルエーテル、アクリルアミド、メタクリル酸エチレングリコールメチルエーテル、および３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００８年１月３０日に出願された、「Synthetic Surfaces for Culturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media」と題する米国仮特許出願第６１／０６２８９０号および２００８年１月３０日に出願された、「Stem Cell Article and Screening」と題する米国仮特許出願第６１／０６２９３７号の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、細胞培養器具に関し、より詳しくは、既知組成培地中の未分化幹細胞の培養を支援する器具に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）などの多能性幹細胞には、３種類の胚葉のいずれかに分化して、人体における任意の成人細胞種を産生する能力がある。この独特の性質により、糖尿病、脊髄損傷、心臓疾患などの、多数の重大な細胞退行性疾患の新たな治療法を開発する可能性が与えられた。しかしながら、そのようなｈＥＳＣに基づく治療の開発には、まだ障害がある。そのような障害としては、細胞と組織の培養において適切な数の未分化ｈＥＳＣを得て維持すること、および特定の細胞種を産生するためにそれらの分化を制御することが挙げられる。ｈＥＳＣ細胞培養などの幹細胞培養は、典型的に、細胞バンクまたはストックから少数の細胞が接種され、次いで、所定の治療用途にとって分化が望ましくなるまで、未分化状態で増幅される。これを成し遂げるために、ｈＥＳＣまたはそれらの分化された細胞集団は、現在、支持細胞層、ウシ胎仔血清、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの動物由来成分を含有する表面または培地の存在下で培養される。培養環境にこれらの動物由来物を添加すると、細胞が潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に曝露され、それは患者に移るかまたはｈＥＳＣの一般的な培養と維持を危うくし得る。その上、そのような生物学的生成物は、バッチ毎のばらつき、免疫応答および貯蔵寿命の制限を受けやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
未分化幹細胞は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」などの動物由来表面および血清タンパク質や細胞外基質タンパク質などのタンパク質上で既知組成培地中において増殖されてきたが、今日まで、未分化幹細胞の長期間培養のために、既知組成培地および合成非タンパク質表面を用いた動物性産物を完全に含まない系は発見されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この開示には、既知組成培地中における幹細胞および未分化幹細胞を含む真核細胞の培養に有用であろう合成表面が記載されている。未分化幹細胞は、その合成基体上で培養されたときに、５、７、１０またはそれより多くの継代について未分化のままであろう。
【０００６】
様々な実施の形態において、細胞培養器具は、表面を有する基体を含む。膨潤性（メタ）アクリレート層が、その基体の表面上に配置される。その膨潤性（メタ）アクリレート層は、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー、架橋性（二または高次官能性）（メタ）アクリレートモノマー、並びにこのカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーおよびこの架橋性（メタ）アクリレートモノマーと重合できる親水性モノマーを含む組成物から形成される。膨潤性（メタ）アクリレート層は、約５％および約７０％の間の水中における平衡含水率を有する。ペプチドが膨潤性（メタ）アクリレート層に結合(conjugated)される。このペプチドはＲＧＤアミノ酸配列を含有する。この細胞培養器具は、既知組成培地中におけるヒト胚性幹細胞などの未分化幹細胞の培養および維持を支援するであろう。
【０００７】
様々な実施の形態において、細胞培養器具を製造する方法は、その細胞培養器具の基体表面上にモノマーを配置する工程を含む。その表面に配置されるモノマーは、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー、架橋性（メタ）アクリレートモノマー、並びにこのカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーおよびこの架橋性（メタ）アクリレートモノマーと重合できる親水性モノマーを含む。この方法はさらに、基体表面上でモノマーを重合させて、約５％および約７０％の間の水中における平衡含水率を有する膨潤性（メタ）アクリレート層を形成する工程を含む。この方法は、この膨潤性（メタ）アクリレート層にペプチドを結合させる工程も含み、このペプチドはＲＧＤ含有ポリペプチドであってよい。
【０００８】
ここに提示された様々な実施の形態の１つ以上は、幹細胞、特に未分化の幹細胞を培養するための従来技術の表面より優れた１つ以上の利点を提供する。例えば、合成表面は、動物源から得られたまたはそれに由来する成分を有する表面に関連する潜在的な汚染問題を減らす。そのような表面は、生物学的成分を有する表面と比較して、貯蔵寿命が改善されるであろう。既知組成培地中で未分化幹細胞を培養する能力により、潜在的な汚染問題がさらに減少する。その上、合成表面すなわち既知組成培地の性能ケイパビリティ(performance capability)のバッチ毎のばらつきが少なくなり、培養結果および期待値の再現性が改善される。これらと他の利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】合成の膨潤性（メタ）アクリレート層が被覆された器具の側面図
【図１Ｂ】合成の膨潤性（メタ）アクリレート層が被覆された器具の側面図
【図２Ａ】未被覆のウェルを有する細胞培養器具の断面図
【図２Ｂ】表面が被覆されたウェルを有する細胞培養器具の断面図
【図２Ｃ】表面と側壁が被覆されたウェルを有する細胞培養器具の断面図
【図３】Ａは、マルチウェルプレートにおける膨潤性（メタ）アクリレート被覆の１マイクロメートル厚の層に結合されたポリペプチドの蛍光強度の画像であり、Ｂは、マルチウェルプレートにおける膨潤性（メタ）アクリレート被覆の０．１マイクロメートル厚の層に結合されたポリペプチドの蛍光強度の画像であり、Ｃは、１マイクロメートルまたは０．１マイクロメートル厚の表面上に被覆されたポリペプチドに関するポリペプチド濃度対蛍光強度のグラフである
【図４】ＱｕａｎｔｉＰｒｏ  ＢＣＡアッセイから得られたデータに関するポリペプチド濃度対５７０ｎｍでの吸光度のグラフ
【図５】様々な基体に対するＨＴ−１０８０細胞の接着性を測定するように設計されたアッセイからの結果を示す、ラミニンに正規化されたポリペプチド濃度対５７０ｎｍでの吸光度のグラフ
【図６】特定の結合ポリペプチドを有する膨潤性（メタ）アクリレート基体上の既知組成培地中で培養された未分化ｈＥＳＣの相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示すグラフ
【図７】「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」基体（Ａ）、ペプチド（配列番号４）（図６に特定された）が結合した膨潤性（メタ）アクリレート（Ｂ）、または膨潤性（メタ）アクリレート単独（Ｃ）上の既知組成培地中で培養した未分化のヒト胚性幹細胞の群体の画像
【図８】様々な濃度のペプチド（配列番号４）（図６に特定された）が結合された膨潤性（メタ）アクリレート上の既知組成培地中で培養された未分化ヒト胚性幹細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示すグラフ
【図９】膨潤性（メタ）アクリレート基体の実施の形態上の既知組成培地中で培養された未分化ヒト胚性幹細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示すグラフ
【図１０】ペプチドAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）が結合された後の膨潤性（メタ）アクリレート配合物の実施の形態上の既知組成培地条件下での未分化Ｈ７ｈＥＳ細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示す棒グラフ
【図１１】膨潤性（メタ）アクリレート被覆の実施の形態に結合された１０−、１００−および１０００−濃度の１−ＦＮ（配列番号１２）、ｓ−ＦＮ（配列番号１１）およびAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）上で培養された未分化Ｈ７ｈＥＳ細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示す棒グラフ
【図１２】膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されたジスルフィド結合した環化されたポリペプチドへの相対的なＨＴ−１０８０接着（ＯＤ５７０ｎｍによる）を示す棒グラフ
【図１３】膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されたアミド結合した環化されたポリペプチドへの相対的なＨＴ−１０８０接着（ＯＤ５７０ｎｍによる）を示す棒グラフ
【図１４】アミド結合した環化されたポリペプチドが結合された膨潤性（メタ）アクリレート層上で培養された未分化Ｈ７ｈＥＳ細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示す棒グラフ
【図１５】ジスルフィド結合した環化されたポリペプチドが結合された膨潤性（メタ）アクリレート層上で培養された未分化Ｈ７ｈＥＳ細胞の相対数（ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度による）を示す棒グラフ
【図１６】「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」（ＭＧ）表面、確定したＲＧＤ含有ペプチド（配列番号４）が結合した膨潤性（メタ）アクリレート層（ＢＳＰ）、およびリンカーを有する確定したＲＧＤ含有ペプチドが結合した膨潤性（メタ）アクリレート層（ＢＳＰ−ＰＥ０４）上の動物性産物を含まない既知組成培地条件下で培養した未分化Ｈ７ｈＥＳＣに関する倍加時間を示すグラフ
【図１７】１７Ａ〜１７Ｂは、接種から７日後の標準的なＴＣＴプラスチック培養器によるＳＡＰ−ＢＳＰペプチド−アクリレート上のヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の生存／増殖を比較した画像
【図１８】既知組成培地を含む異なる培地条件下での培養における７日後のＴＣＴおよびＳＡＰ−ＢＳＰ上のｈＭＳＣ細胞数の比較を示す棒グラフ
【図１９】１０継代に亘り「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆と比較した本発明の細胞培養表面の実施の形態上で培養したときのＨ７ｈＥＳＣ倍加時間の比較を示すグラフ
【図２０】１０継代に亘り「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照またはＳＡＰ−ＢＳＰ上で培養したＨ７ｈＥＳＣに関するｈＥＳＣ特異的マーカーのフローサイトメトリー分析の結果を示すチャート
【図２１】Ａは、ＳＡＰ−ＢＳＰペプチド結合アクリレート表面上で分化した心筋芽細胞に関するアクチニンおよびＮｋｘ２．５＋染色を示す蛍光画像であり、Ｂは、αアクチニンに関するフローサイトメトリーデータを示しており、Ｃは、本発明の細胞培養表面の実施の形態上のＨ７ｈＥＳＣから分化したＮｋｘ２．５心筋芽細胞に関するフローサイトメトリーデータを示している
【図２２】血清の存在下と不在下での、ＴＣＴ、ＳＡＰ−ＢＳＰ表面上でのＨＴ−１０８細胞のＨＴ１０８０細胞増殖（４９０ｎｍでの吸光度による）データを被覆した棒グラフ
【図２３】血清の存在下と不在下での、ＴＣＴおよび（メタ）アクリレート被覆およびＢＳＰ結合被覆上のＨＴ−１０８０細胞の形態を比較した画像
【図２４】ＳＡ−Ｐｓ、コラーゲンＩおよびＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標）処理Ｔｏｐａｓ（商標）上の生存細胞の概算数（ＬＤＨ活性の吸光度）を比較した棒グラフ
【発明を実施するための形態】
【００１０】
図１〜２に示された図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれていない。図１〜２に使用した同様の数字は、同様の部材を称する。しかしながら、所定の図面における部材を称するための数字の使用は、同じ数字が付けられた他の図面の部材を制限することは意図されないのが理解されよう。その上、部材を称するための異なる数字の使用は、異なる数字の部材が同じまたは類似であり得ないことを示すことを意図したものではない。
【００１１】
以下の詳細な説明において、その一部を形成し、例証によって、デバイス、システムおよび方法のいくつかの特別な実施の形態が示されている添付の図面を参照する。他の実施の形態が考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに、実施されることが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限の意味で解釈すべきではない。
【００１２】
ここに用いた全ての科学用語と技術用語は、別記しない限り、当該技術分野において一般に使用されている意味を持つ。ここに提供される定義は、ここに頻出する特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を制限することを意図したものではない。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いたように、単数形は、内容が明らかにそうではないと示していない限り、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いたように、「または」という用語は、内容が明らかにそうではないと示していない限り、「および／または」を含む意味で一般に用いられる。
【００１４】
ここに用いたように、方法の文脈においてある器具を「提供する」ことは、その器具がその方法において使用されるように、その器具を作製する、購入する、製造する、供給するまたは他の様式で得ることを意味する。
【００１５】
ペプチド配列はここでは、１文字コードまた３文字コードにより参照される。これらのコードは置換え可能に使用してもよい。
【００１６】
ここに用いたように、「モノマー」は、別のモノマーと重合できる化合物を意味し（その「モノマー」が他のモノマーと同じ化合物か異なる化合物であるか否かにかかわらず）、その化合物は、約１０００ダルトン未満の分子量を有する。多くの場合、モノマーは、約４００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１７】
ここに用いたように、「合成被覆」または「合成高分子層」は、細胞培養基体上に配置された高分子材料の層を意味する。高分子被覆は、動物由来の材料や成分を含まない。例えば、合成被覆は、動物源から単離されたタンパク質を有さない。ある実施の形態において、ここに記載された膨潤性（メタ）アクリレート層（ＳＡ層）は合成被覆を提供する。ある実施の形態において、適切な接着ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せは、合成被覆層に結合されられて、膨潤性（メタ）アクリレート−ペプチド結合層（ＳＡＰ層）を形成してもよい。
【００１８】
ここに用いたように、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、化学的に合成されてもよく、または組換えにより導いてもよいが、動物源からの完全なタンパク質として単離されていない、アミノ酸の配列を意味する。本開示の目的のために、ペプチドおよびポリペフチドは、完全なタンパク質ではない。ペプチドおよびポリペフチドは、タンパク質の断片であるアミノ酸配列を含んでいてよい。例えば、ペプチドおよびポリペフチドは、ＲＧＤなどの細胞接着配列として知られている配列を含んでもよい。ある実施の形態において、本発明のペプチドは、長さが３つのアミノ酸と３０のアミノ酸の間である。ある実施の形態において、本発明のペプチドは、１５ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１０ｍｅｒなどである。ある実施の形態において、ペプチドは、ペプチドの結合のための官能基を提供するであろうＬｙｓ残基を提供するＫＧＧ（ＬｙｓＧｌｙＧｌｙ）またはＫＹＧ（ＬｙｓＴｙｒＧｌｙ）などのリンカー配列を含んでもよい。ペプチドは、例えば、エクソペプチダーゼによって壊されるの保護するために、アセチル化（例えば、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙＧｌｙ）またはアミド化（例えば、ＳｅｒＬｙｓＳｅｒ−ＮＨ2）されていてもよい。これらの修飾は、配列が開示されている場合に考えられることが理解されよう。追加の実施の形態において、ペプチドは、ＰＥＯなどのスペーサ部分に結合されていてもよい。ＰＥＯは、例えば、ＰＥＯ4またはＰＥＯ12もしくは任意の長さのスペーサとして存在してもよい。
【００１９】
ここに用いたように、「（メタ）アクリレートモノマー」は、少なくとも１つのエチレン不飽和部分（アクリレート部分またはメタクリレート部分）を有する化合物を意味する。ここに用いたように、「ポリ（メタ）アクリレート」は、少なくとも１つの（メタ）アクリレートモノマーを含む１つ以上のモノマーから形成されたポリマーを意味する。
【００２０】
「ヒドロゲル」という用語は、細胞培養表面を記述するために用いられてきた。「ヒドロゲル」は、乾燥質量の３０％以上または１０，０００％までの量で水を吸収できるゲルまたはゼラチンを含むように様々に定義されてきた。水と接触したときに、ヒドロゲルは膨潤するが溶解しない。「ヒドロゲル」という用語は、幅広い材料を記述し、幅広い水膨潤および吸水性特徴を有する、非常に広い用語である。
【００２１】
ここに用いたように、「膨潤性（メタ）アクリレート」または「ＳＡ」は、少なくともある程度の架橋を有し、吸水性または水膨潤特徴を有する、少なくとも１つのエチレン不飽和モノマー（アクリレートまたはメタアクリレートモノマー）から製造された高分子マトリクスを意味する。膨潤性（メタ）アクリレートは合成されたものであってよい。すなわち、膨潤性（メタ）アクリレートは動物由来または動物抽出物由来の成分を含有しない。膨潤性（メタ）アクリレートは、ポリペプチドまたはタンパク質に結合される（「膨潤性（メタ）アクリレート−ポリペプチド」、「ＳＡ−ポリペプチド」または「ＳＡＰ」）。ポリペプチドまたはペプチドは、タンパク質の断片であり、合成されて、それらを合成の非動物由来材料としてもよい。タンパク質は、動物由来材料から単離されてもよい。このＳＡおよびＳＡＰは、層、被覆、表面、材料、または細胞培養に適した表面を称するために当該技術分野において公知の任意の他の用語として称されてもよい。特別なポリペプチド配列をさらに特定してもよい。例えば、ＳＡＰ表面は、ＲＧＤ含有ポリペプチドと結合されても、ＳＡＰ−ＲＧＤとして特定されてもよい。もしくは、ＳＡＰ表面は、特定のＲＧＤ含有ペプチド、例えば、KGGNGEPRGDTYRAY（配列番号４）に結合されてよく、マウスからの骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のＲＧＤ接着エピトープを含み、膨潤性（メタ）アクリレートポリマー（ＳＡＰ）に結合されて、ＳＡＰ−ＢＳＰ被覆を形成してもよい。本開示の実施の形態において、「膨潤性（メタ）アクリレート」という用語は、水を吸収し、水中で膨潤し、水中に溶解しない、様々な架橋したアクリレートまたはメタクリレート材料を表す。この吸水性特徴は、式１：
式１：  ＥＷＣ（％）＝［（Ｗゲル−Ｗ乾燥）／（Ｗゲル）］×１００
により示されるような平衡含水率（ＥＷＣ）により記載され、測定できる。
【００２２】
ここに用いたように、「持つ」、「有する」、「含む」、「構成する」、「成る」などは、制限なしの意味で用いられ、一般に、「含むが、それらに限られない」ことを意味する。「から実質的になる」、「からなる」などは、「含む」などに含まれることが理解されよう。したがって、親水性モノマー、架橋性モノマーおよびカルボキシル基含有モノマーを含むモノマーの混合物から形成されたＳＡ表面は、親水性モノマー、架橋性モノマーおよびカルボキシル基含有モノマーから実質的になる、またはからなる混合物から形成してもよい。
【００２３】
本開示は、特に、未分化幹細胞を培養するための合成表面を有する器具について記載する。この表面は、既知組成培地における未分化幹細胞の増殖および維持を支援するであろう。
【００２４】
１．  細胞培養器具
図１Ａを参照すると、細胞を培養するための器具１００の側面図が示されている。器具１００は、表面１５を有する基材または基体１０を含む。膨潤性（メタ）アクリレート被覆２０が、基体または基材１０の表面１５上に配置されている。図示されていないが、膨潤性（メタ）アクリレート被覆０は、基体または基材１０の一部分に配置されていてもよいことが理解されよう。基体または基材１０は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、その任意の組合せ、またはある材料を別のものの上に配置した被覆を含む、細胞を培養するのに適した任意の材料であってよい。そのような基体または基材１０としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル−共−無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；ポリ（酢酸ビニル−共−無水マレイン酸）、ポリ（スチレン−共−無水マレイン酸）、ポリ（エチレン−共−アクリル酸）またはこれらの誘導体などのコポリマーが挙げられる。
【００２５】
ここに用いたように、「環状オレフィンコポリマー」は、複数のモノマー種から形成されたポリマーを意味し、ここで、それらモノマー種の内の少なくとも１種類は環状オレフィンモノマーであり、少なくとも１種類の他のモノマー種は環状オレフィンモノマー種ではない。多くの実施の形態において、環状オレフィンコポリマーは、エチレンモノマーおよびノルボネンモノマーから形成される。環状オレフィンコポリマー樹脂は、ボーデッカー・プラスチックス社(Boedeker Plastics, Inc.)から「ＴＯＰＡＳ」の商標名で市販されている。
【００２６】
細胞培養に適した器具１００の例としては、６，１２，９６，３８４，および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、ジャー、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、チャンバー型およびマルチチャンバー型スライドなどのスライド、管、カバースリップ、バッグ、膜、中空ファイバ、ビーズ、およびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）および発酵槽が挙げられる。
【００２７】
膨潤性（メタ）アクリレート（ＳＡ）被覆２０は、１つ以上のポリペプチド７０が結合してよい表面２５を提供する。もちろん、１つ以上のポリペプチド７０は、表面２５の下の位置でＳＡ層２０に結合してもよい。ここに用いたように、「結合した(conjugated)」は、共有結合したことを意味する。ポリペプチド７０のＳＡ層２０への共有結合は、リンカーにより行われてもよい。ポリペプチド７０は、環状または直鎖状であってもよく、もしくは環状である部分および直鎖状である部分を含んでもよい。
【００２８】
本開示の目的にとって、「ペプチド」および「ポリペプチド」は交換可能に使用して差し支えない。基体１０の表面１５上に任意の適切なＳＡ被覆２０を施してもまたは形成してもよい。様々な実施の形態において、ＳＡ被覆は、１つ以上の親水性（メタ）アクリレートモノマー、１つ以上の二または高次官能性（メタ）アクリレートモノマー（「架橋性」（メタ）アクリレートモノマー）、および１つ以上のカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーの反応生成物を含む、から実質的になる、またはからなる。任意の適切な親水性（メタ）アクリレートモノマーを使用してよい。適切な親水性（メタ）アクリレートモノマーの例としては、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートなどが挙げられる。様々な実施の形態において、（メタ）アクリレート以外の親水性モノマーを用いて、ＳＡ被覆を形成してもよい。これらの他の親水性モノマーは、親水性（メタ）アクリレートモノマーに加えて、またはその代わりに含んでもよい。そのような他の親水性モノマーは、膨潤性（メタ）アクリレート層２０を形成するために使用される混合物中の（メタ）アクリレートモノマーと重合を経験できるべきである。ＳＡ被覆を形成するのに用いてもよい他の親水性モノマーの例としては、１−ビニル−２−ピロリドン、アクリルアミド、３−スルホプロピルジメチル−３−メチルアクリルアミドプロピルアンモニウムなどが挙げられる。（メタ）アクリレートモノマーまたは他のモノマーが用いられるか否かにかかわらず、親水性モノマーは、様々な実施の形態において、１００グラムの水中に１グラム以上のモノマーの水中の溶解度を有する。テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートまたはテトラ（エチレングリコール）ジアクリレートなどの任意の適切な二または高次官能性（メタ）アクリレートモノマーを架橋性モノマーとして用いてもよい。重合によりモノマーがＳＡ被覆２０中に含まれた後にポリペプチド７０と結合するのに利用できるカルボキシル官能基を有する任意の適切な（メタ）アクリレートモノマーを用いてもよい。カルボキシル官能基により、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学作用を用いて、ペプチドまたはポリペプチドの結合が可能になる。適切なカルボキシル基含有（メタ）アクリレートの例としては、アクリル酸２−カルボキシエチルおよびアクリル酸が挙げられる。
【００２９】
様々な実施の形態において、ＳＡ層２０は、それぞれ、親水性（メタ）アクリレートモノマー（約６０〜９０）、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー（約１０〜４０）、および架橋性（メタ）アクリレートモノマー（約１〜１０）を含む（体積パーセント）モノマーから形成される。このＳＡ層の平衡含水率（ＥＷＣ）は、ＳＡ層を形成するために選択されたモノマーによって調節されるであろうことが理解されよう。例えば、高度の親水性および高い百分率の親水性モノマーによって、高いＥＷＣを有するより膨潤性のＳＡ層が得られるはずである。しかしながら、このことは、架橋性モノマーの百分率を増加させることにより、またはその官能性を増加させることにより、低下するかもしれない。これにより、ＳＡ層が膨潤する能力が低下し、ＥＷＣが低下するはずである。
【００３０】
様々な実施の形態において、ＳＡ層を形成するために使用される特定のモノマーおよびそれらのそれぞれの質量または体積パーセントは、得られたＳＡ層が約５％と約７０％の間のＥＷＣを有するように選択される。ここに記載された様々な実施の形態のＳＡ中のカルボキシル基含有モノマーを使用したせいもあり、ＥＷＣはｐＨ依存性であるかもしれない。例えば、特定のＳＡのＥＷＣは、蒸留された脱イオン水（ｐＨ約５）中よりも、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるほうが高いであろう。様々な実施の形態において、蒸留された脱イオン水中のＳＡ層のＥＷＣは、本発明のＳＡのＥＷＣ（水中）は、水中で５％と７０％の間、５％と６０％の間、５％と５０％の間、５％と４０％の間、５％と３５％の間、１０％と７０％の間、１０％と５０％の間、１０％と４０％の間、５％と３５％の間、１０％と３５％の間または１５％と３５％の間に及んでよい。さらに別の実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレートがペプチドと結合された後（ＳＡＰ）、本発明のＳＡＰの実施の形態のＥＷＣは、例えば、水中で１０〜４０％の間であってよい（データは示さず）。
【００３１】
細胞培養において、調製された表面は、長期間に亘り水性環境に曝露される。著しく水を吸収する表面、高度にヒドロゲル状である表面は、水性環境に曝露されたときに、基体から剥離する傾向にあるであろう。このことは、これらの材料が、細胞培養の環境の５日以上などの長期間に亘り、水性環境に曝露されたときに、特に当てはまる。したがって、剥離の傾向を減少させるために、多くの水を吸収しないように、ＳＡおよびＳＡＰ層がより低いＥＷＣ値を有することが望ましいであろう。例えば、４０％未満のＥＷＣを有するＳＡ表面は、ヒト胚性幹細胞を含む、培養中の細胞を支援するのに特に適しているであろう。
【００３２】
ポリペプチド７０のＳＡ層２０への結合は、ＳＡ層の膨潤性および平衡含水率（ＥＷＣ）に影響を与え、一般に、ＥＷＣを増加させるであろうと理解される。ＳＡ層に結合されたポリペプチドの量は、様々である傾向にあり、ＳＡ層の厚さに応じて変わり得る。したがって、標準的なプロトコルにしたがって調製されたＳＡ−ポリペプチド層のＥＷＣは、様々であろう。再現性の目的のために、ポリペプチドとの結合の前に、ＳＡ層のＥＷＣを測定することが望ましいであろう。これに留意して、ある実施の形態において、ＳＡがポリペプチドと結合された後（ＳＡ−ポリペプチド）、ＳＡ−ポリペプチド層の実施の形態のＥＷＣは、水中で約１０％と約４０％の間であろう。
【００３３】
様々な実施の形態において、ＳＡ層２０は、メタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸２−カルボキシエチル、およびジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）を含む混合物から形成された、重合された（メタ）アクリレートモノマーを含む。数多くの実施の形態において、ＳＡ層２０を形成するために用いられるメタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸２−カルボキシエチル、およびジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）の比（体積）は、それぞれ、約８０／２０／３（ｖ／ｖ／ｖ）である。ある実施の形態において、ＳＡは、以下のモノマーの液体アリコート（体積）：それぞれ、メタクリル酸ヒドロキシエチル（約６０〜９０）、アクリル酸２−カルボキシエチル（約１０〜４０）、およびジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）（約１〜１０）：を用いて配合される。数多くの実施の形態において、ＳＡ層２０は、重合されたメタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸２−カルボキシエチル、およびジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）モノマーから実質的になる。様々な実施の形態において、ＳＡ層２０は、ポリペプチド架橋剤を実質的に含まない。
【００３４】
数多くの実施の形態において、ＳＡは、モノマー（液体のモノマーについては体積で、固体のモノマーについては質量で）：モノマーＸ（８０）、アクリル酸２−カルボキシエチル（２０）、およびジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）（３）を用いて配合される。モノマーＸは：メタクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、１−ビニル−２−ピロリドン、メタクリル酸ジ（エチレングリコール）エチルエーテル、アクリルアミド、メタクリル酸エチレングリコールメチルエーテル、または３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムである。
【００３５】
任意の適切なポリペプチド７０をＳＡ層２０に結合してもよい。ポリペプチド７０は、例えば、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーから形成された自由なカルボキシル基により、ＳＡ層２０に結合できるアミノ酸を含むことが好ましい。一例として、例えば、アミド結合の形成により、求核付加反応を可能にする官能性を有する任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸が、ＳＡ層２０への結合の目的のためにポリペプチド７０に含まれてもよい。リジン、ホモリジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノブタン酸が、ＳＡ層２０のカルボキシル基に結合するための適切な性質を有するアミノ酸の例である。その上、Ｎ末端アミンがキャッピングされていない場合、ポリペプチドのＮ末端アルファアミンを用いて、カルボキシル基に結合してもよい。様々な実施の形態において、ＳＡ層２０と結合するポリペプチド７０のアミノ酸は、ポリペプチド７０のカルボキシ末端位置またはアミノ末端位置にある。
【００３６】
数多くの実施の形態において、ポリペプチド７０、またはその一部は、細胞接着活性を有する。すなわち、ポリペプチド７０がＳＡ層に結合される場合、そのペプチドにより、細胞が、ＳＡ−Ｐ層を含む表面に接着することができる。一例として、ポリペプチド７０は、コラーゲン、ケラチン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどのアミノ酸配列、またはその細胞接着部分を含むであろう。様々な実施の形態において、ポリペプチド７０は、YaalXaanArgGlyAspXaamYaal （配列番号１）（ＲＧＤ）のアミノ酸配列を含み、ここで、XaaおよびYaaは、合成のまたは天然に生じる任意のアミノ酸を表し、ｎおよびｍは、０を含む任意の整数であり得る。ここに記載されたＳＡ層は、任意の適切な接着ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せが結合する合成表面を提供し、公知の成分を有する生物学的基体または血清に代わる代替物を提供する。現行の細胞培養の実施において、ある細胞種には、細胞が表面に接着し、維持可能に培養されるように、培養表面上に生物学的ポリペプチドまたはペプチドの組合せが存在する必要がある。例えば、HepG2/C3A肝細胞は、血清の存在下でプラスチック製培養器に付着できる。血清は、プラスチック製培養器に接着して、ある細胞が付着できる表面を提供できるポリペプチドを提供できることも知られている。しかしながら、生物学的誘導基質および血清は未知の成分を含有する。細胞を付着させる血清または生物学的誘導基質の特定の成分または成分の組合せ（ペプチド）が知られている細胞については、それらの公知のペプチドを合成し、ここに記載したＳＡ層に施して、細胞を、未知の期限または組成の成分が全くまたはわずかしかない合成表面上で培養することができる。
【００３７】
ある実施の形態において、ペプチド７０は、YaalXaanArgGlyAspXaamYaal （配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは０から４の整数であり、ｍは０から５の整数であり、ペプチド７０が少なくとも１つのYaaを含むことを条件として、ｌは０または１であり、各Xaaが独立して任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸であり、Yaaが任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸であり、XaaまたはYaaのいずれかが、例えば、ＳＡ表面の自由なカルボキシル基へのアミド結合の形成により、求核付加反応を可能にする官能性を有する。様々な実施の形態において、XaaまたはYaaは、リジン、システイン、ホモシステイン、ペニシラミン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、またはジアミノブタン酸であってよい。
【００３８】
ある実施の形態において、ペプチド７０は、ZaaXaanArgGlyAspXaamBaa （配列番号２）のアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは０から４の整数であり、ｍは０から５の整数であり、各Xaaが独立して任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸であり、ZaaおよびBaaの各々が、独立して、環状ポリペプチドまたはその一部を形成するためにそれぞれの側鎖の原子間に形成された共有結合を有する任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸である。様々な実施の形態において、ZaaおよびBaaは、ジスルフィド結合により連結されている。例えば、ZaaおよびBaaは、システイン、ホモシステインまたはペニシラミンであってよい。ある実施の形態において、ZaaおよびBaaは、アミド結合により連結されている。例えば、ZaaおよびBaaの内の１つは、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、またはジアミノブタン酸などの自由なアミノ基を有する側鎖を持ちアミノ酸であり、ZaaおよびBaaの他方は、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはホモグルタミン酸などの、自由なカルボキシル基を有する側鎖を持つアミノ酸である。ある実施の形態において、配列番号２によるポリペプチド７０は、YaalXaamZaaXaanArgGlyAspXaamBaa XaamYaal（配列番号３）のアミノ酸配列を含むものとさらに定義してもよく、ここで、ｎは０から４の整数であり、ｍは０から５の整数であり、このポリペプチドが少なくとも１つのYaaまたはXaaを含むという条件で、ｌは０または１であり、各YaaおよびXaaは、独立して、任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸であり、ZaaおよびBaaの各々は、独立して、ポリペプチドの環状部分を形成するためのそれぞれの側鎖の原子間に形成された共有結合を有する任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸であり、YaaまたはXaaは、例えば、ＳＡ層の自由なカルボキシル基へのアミド結合の形成により、求核付加反応を可能にする官能性を有する任意の天然のまたは生物模倣のアミノ酸である。理論により拘束することを意図するものではないが、ＲＧＤ配列を含有するポリペプチドの環化は、特にポリペプチドが比較的少ないアミノ酸、例えば、１０未満のアミノ酸からなる場合、直鎖状の対照物に対する生物学的機能を保つように水性環境において立体構造を維持するのに役立つであろうと考えられる。
【００３９】
ある実施の形態において、ポリペプチド７０は、LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTry（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。ある実施の形態において、ポリペプチド７０は、AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr（配列番号５）のアミノ酸配列から実質的になる。ある実施の形態において、ペプチド７０は、LysGlyGlyLys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17（配列番号６）のアミノ酸配列から実質的になり、ここで、Lys4およびAsp17は一緒にアミド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化する。ある実施の形態において、ペプチド７０は、LysGlyGlyLys4GluProArgGlyAspThrTryArgAsp13（配列番号７）のアミノ酸配列から実質的になり、ここで、Lys4およびAsp13は一緒にアミド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化する。ある実施の形態において、ペプチド７０は、LysGlyGlyCys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys17（配列番号８）のアミノ酸配列から実質的になり、ここで、Cys4およびCys17は一緒にジスルフィド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化する。ある実施の形態において、ペプチド７０は、LysGlyGlyCys4GluProArgGlyAspThrTryArgCys13（配列番号９）のアミノ酸配列から実質的になり、ここで、Cys4およびCys13は一緒にジスルフィド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化する。様々な実施の形態において、ペプチド７０は、XaaGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr（配列番号１０）のアミノ酸配列から実質的になり、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。数多くの実施の形態において、配列番号１０のXaaはリジンである。ある実施の形態において、ポリペプチド７０は、GlyArgGlyAspSerProLys（配列番号１１）のアミノ酸配列から実質的になる。
【００４０】
ある実施の形態において、ポリペプチド７０は、LysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSerSer（配列番号１２）のアミノ酸配列から実質的になる。
【００４１】
ここに述べた任意のポリペプチド配列について、特別に特定されたアミノ酸を同類アミノ酸で置換してもよいことが理解されよう。ここに用いたように、「同類アミノ酸」は、第２のアミノ酸と機能的に類似したアミノ酸を称する。そのようなアミノ酸は、よく知られた技法にしたがってポリペプチドの構造または機能への障害を最小にして、ポリペプチドにおいて互いに置換されてもよい。以下の５つの基の各々は、互いに同類置換基であるアミノ酸を含有する：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸：アスパラギン酸（Ｉ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【００４２】
繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカーまたは任意の他の適切なリンカーなどのリンカーまたはスペーサ８０を用いて、ポリペプチド７０から膨潤性（メタ）アクリレート層２０の表面２５までの距離を増加させてもよい。リンカー８０は、任意の適切な長さのものであってよい。例えば、リンカーが繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカーである場合、そのリンカーは、２と１０の間の繰り返しエチレングリコール単位を含有してよい。ある実施の形態において、リンカーは、約４の繰り返しエチレングリコール単位を有する繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカーである。ＳＡ層２０に、リンカー８０を介して、ポリペプチド７０の全て、いくつかが結合されていても、全くされていなくてもよい。結合基を提供するＳＡ層の鎖は、結合したペプチドのスペーサとして働いてもよい。他の可能性のあるリンカーは、ポリ（グリシン）またはポリ（β−アラニン）などのポリペプチドリンカーである。
【００４３】
ポリペプチド７０は、任意の密度で、好ましくは未分化幹細胞または他の細胞種の培養を支援するのに適した密度で、ＳＡ層２０に結合されていてよい。ポリペプチド７０は、ＳＡ被覆２０の表面２５の１ｍｍ2当たり約１ピコモルと約５０ピコモルの間の密度でＳＡ層２０に結合されていてよく、これは、表面１５がＳＡＰ層２０により均一に被覆されている実施の形態において被覆された基材基体１０の表面１５の面積により見積もることができる。例えば、ポリペプチドは、ＳＡ被覆２０の表面２５の５ピコモル／ｍｍ2より大きい、６ピコモル／ｍｍ2より大きい、７ピコモル／ｍｍ2より大きい、８ピコモル／ｍｍ2より大きい、９ピコモル／ｍｍ2より大きい、１０ピコモル／ｍｍ2より大きい、１２ピコモル／ｍｍ2より大きい、１５ピコモル／ｍｍ2より大きい、または２０ピコモル／ｍｍ2より大きい密度で存在してよい。存在するポリペプチド７０の量は、ＳＡ層２０の組成、ＳＡ層２０の厚さおよびポリペプチド７０自体の性質に依存して、様々であって差し支えない。実施例において以下に論じるように、より高濃度のポリペプチド７０が、既知組成培地における未分化幹細胞の付着および増殖をよりよく支援することができるであろう。
【００４４】
（メタ）アクリレートモノマーは、当該技術分野において公知のように合成しても、ポリサイエンシス社(Polysciences, Inc.)、シグマ・アルドリッチ社(Sigma Aldrich, Inc.)およびサートマー社(Sartomer, Inc.)などの供給メーカーから得てもよい。ポリペプチド７０は、当該技術分野において公知のように合成しても（または代わりに分子生物学的技法により産生しても）、またはアメリカン・ペプチド社(American Peptide Company)、ＣＥＭ社(CEM Corporation)、またはゼンスクリプト社(GenScript Corporation)などの供給メーカーから得てもよい。リンカー８０は、当該技術分野において公知のように合成しても、クオンタ・バイオデザイン社(Quanta BioDesign, Ltd.)から市販されている個別のポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）リンカーなどの、供給メーカーから得てもよい。
【００４５】
図１Ｂに示されるように、中間層３０を基材１０の表面１５とＳＡ被覆２０との間に配置してもよい。中間層３０は、被覆２０の基体１０への結合を改善するため、モノマーの広がりを促進するため、被覆区域での細胞増殖を促進するように未被覆の表面１０の部分を嫌細胞性にするため、モノマーまたは溶媒が基材１０に非適合性である場合にモノマーまたは溶媒に適合した基体を提供するため、所望であれば、例えば、パターンの形成されたプリントにより、立体的特徴構造を提供するために、構成してもよい。例えば、基体１０がガラス基体である場合、ガラス基体の表面をエポキシ被覆またはシラン被覆で処理することが望ましいであろう。様々なポリマー基材１０について、ポリアミド、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、またはポリ（メタ）アクリレートの中間層３０を提供することが望ましいであろう。図示されていないが、ＳＡ被覆２０は、中間層３０の一部に配置されていてもよいことが理解されよう。中間層３０は、基材１０の一部に配置されていてもよいことが理解されよう。
【００４６】
様々な実施の形態において、基材１０の表面１５は、表面１５に望ましい性質または特徴を与えるように、物理的または化学的のいずれかで処理される。例えば、以下に述べるように、表面１５は、コロナ処理またはプラズマ処理されてもよい。真空または大気圧プラズマの例としては、第１と第２両方の高周波ＲＦおよびマイクロ波プラズマ、誘電バリア放電、および空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、亜酸化窒素、または水蒸気を含む分子または混合ガス中で生成したコロナ放電が挙げられる。
【００４７】
ＳＡ被覆層２０は、中間層３０上または基材１０上に配置されているかにかかわらず、下にある基板を均一に被覆することが好ましい。「均一に被覆する」とは、所定の区域の層２０、例えば、培養皿のウェルの表面が、約５ｎｍ以上の厚さでその区域を完全に被覆することを意味する。均一に被覆された表面の厚さはその表面に亘り変動してもよいが、均一に被覆された表面には、下にある層（中間層３０または基材１０のいずれか）がそこを通して曝露される区域はない。不均一表面に亘り細胞応答は、均一表面に亘り細胞応答よりも変わりやすい傾向にある。
【００４８】
ＳＡ高分子被覆層２０は、任意の望ましい厚さを有していてもよい。様々な実施の形態において、被覆層２０の平均厚は約１０マイクロメートル未満である。例えば、その平均厚は、約５マイクロメートル未満、約２マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、約０．５マイクロメートル未満、約５０ｎｍと約３００ｎｍの間、または約０．１マイクロメートルであってよい。
【００４９】
ＳＡ層２０を形成する高分子材料は、任意の適切な程度に架橋されていてよい。架橋の程度が低いと、ＳＡ層が部分的または完全に分離し、重合反応効率が低くなるであろう。様々な実施の形態において、ＳＡ層２０の架橋密度は約０．９％と約９％の間である。
【００５０】
数多くの実施の形態において、器具１００は、６，１２，９６，３８４，および１５３６ウェルプレート、ジャー、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、チャンバー型およびマルチチャンバー型培養スライドなどのスライド、管、カバースリップ、バッグ、膜、中空ファイバ、ビーズ、およびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」および発酵槽などの、細胞培養に適した表面を有する細胞培養器である。数多くの実施の形態において、これらの細胞培養表面は、細胞培養ウェル内に含まれている。ここで図２を参照すると、基体または基材１０から形成された器具１００は、１つ以上のウェル５０を備えているであろう。ウェル５０は、側壁５５および表面１５を含む。図２Ｂ〜Ｃを参照すると、ＳＡ被覆２０は、表面１５または側壁５５（あるいは、図１に関して先に述べたように、１つ以上の中間層３０が表面１５または側壁５５とＳＡ被覆２０との間に配置されていてもよい）もしくはその一部に配置されていてよい。図２Ｃに示されたように、５５がＳＡ層２０で被覆されていてもよい。
【００５１】
様々な実施の形態において、器具１００は、約５ｍｍ2より大きい面積を持つ表面２５を有する均一に被覆された層２０を含む。もちろん、表面２５は任意の適切なサイズのものであってよい。表面１５の面積が小さすぎる場合、ヒト胚性幹細胞などのある種の細胞が、細胞の群体または集団（例えば、約０．５ｍｍの直径を有する）として接種され、定量的細胞応答を生じるのに十分な数の群体を確実に付着させるために適切な表面が望ましいので、信頼性のある細胞応答は有為に観察できないかもしれない。数多くの実施の形態において、器具１００は、均一に被覆された表面１５を有するウェル５０を備え、ここで、その表面１５は、約０．１ｃｍ2より大きい、約０．３ｃｍ2より大きい、約０．９ｃｍ2より大きい、または約１ｃｍ2より大きい面積を有する。
【００５２】
２．  合成膨潤性（メタ）アクリレート層の被覆
合成膨潤性（メタ）アクリレート（ＳＡ）層は、任意の公知のまたは将来開発されるプロセスにより、細胞培養器具の表面に配置されてもよい。合成ＳＡ層が、典型的な細胞培養条件の最中に剥離しない均一層を提供することが好ましい。すなわち、ＳＡ層は、基体または基材に付着させられる。合成ＳＡ表面は、共有または非共有相互作用により、基材の基体に結合されるまたは付着させられる。合成ＳＡ表面を基体に関連付けるであろう非共有相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面相互侵入、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、双極子と双極子の相互作用、機械的相互連結、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００５３】
様々な実施の形態において、基材の基体表面は、発明者としてZhou等を挙げ、CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENINGと題する同日に出願された同時係属出願の教示にしたがって被覆される。この出願は、本明細書に提示した開示に抵触しない程度まで全ての目的のためにその全てがここに引用により含まれる。
【００５４】
数多くの実施の形態において、モノマーが、細胞培養器具の表面上に配置され、その場で重合される。そのような実施の形態において、基材は、ここでは、合成膨潤性（メタ）アクリレート材料が上に配置される「基体」として称される。重合は液相またはバルク相で行われてもよいが、本発明の実施の形態において、その場の重合であるバルク相での重合により、網状構造の高分子表面である細胞培養表面を生成する。この網状構造の高分子表面は、相互侵入高分子表面ではない。ある実施の形態において、その場の重合により提供された網状構造の高分子表面は、基体に付着し、剥離せず、細胞培養に適切な期間に亘り剥離せずに細胞培養の水性環境中で存続する。ある実施の形態において、モノマーは１０００ダルトン未満である。
【００５５】
モノマーは粘性であるかもしれないので、表面に分配する前に、粘度を減少させるように、適切な溶媒中でモノマーを希釈することが望ましいであろう。粘度を減少させると、合成膨潤性（メタ）アクリレート材料のより薄くより均一な層を形成できるであろう。当業者は、適切な溶媒を適切に選択できるであろう。溶媒が細胞培養器具を形成する材料およびモノマーと相溶性であることが好ましい。培養すべき細胞に対して非毒性であり、重合反応に干渉しない溶媒を選択することが望ましいであろう。あるいは、またはそれに加え、非毒性であるか、またはもはや重合と干渉しない程度まで除去できるまたは実質的に完全に除去できる溶媒を選択することが望ましいであろう。そのような状況において、その溶媒は、真空または極度の高熱などの過酷な条件なく、容易に除去できることが望ましいであろう。揮発性溶媒は、そのような容易に除去できる溶媒の例である。
【００５６】
ここに記載した器具を被覆するために様々な状況において適した溶媒の例としては、エタノール、イソプロパノール、酢酸アセチル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENINGと題する同日に出願された同時係属出願に記載されたように、重合前に溶媒を除去することが望ましい場合、アセトン、メタノール、酢酸エチル、ブタノン、アセトニトリル、イソプロパノール、および２−ブタノール、並びにエタノールなどの揮発性溶媒が特に適した溶媒であろう。
【００５７】
モノマーは、所望の粘度およびモノマー濃度を達成するために任意の適切な量で溶媒により希釈されてもよい。一般に、ここに提示した教示により使用されるモノマー組成物は、約０．１％から約９９％の間のモノマーを含有する。一例として、モノマーは、約０．１体積％と約５０体積％の間のモノマー、または約０．１体積％と約１０体積％の間のモノマー、約０．１体積％と約５体積％の間のモノマー、または約０．１体積％と約１体積％の間のモノマーを有する組成物を提供するために、エタノールまたは他の溶媒により希釈されてもよい。モノマーは、膨潤性（メタ）アクリレート層が所望の厚さを達成するように溶媒により希釈されてもよい。上述したように、堆積されたモノマーの粘度が高すぎる場合、不均一な表面が生じ、被覆が、水性媒体と接触した後に剥離し易いかもしれない。
【００５８】
様々な実施の形態において、合成膨潤性（メタ）アクリレート層は、直接的にまたは１つ以上の追加の中間層（図示せず）を介して、共有または非共有相互作用により基材に結合された中間層の表面に堆積される。そのような実施の形態において、その中間層は、合成膨潤性（メタ）アクリレート層がその上に堆積される「基体」と称される。
【００５９】
様々な実施の形態において、基材の表面は処理されている。その表面は、合成膨潤性（メタ）アクリレート層の基材表面への結合を改善するため、基材表面上のモノマーの広がりを促進するため、などの理由で処理されてもよい。もちろん、基材は、中間層に対して同様の目的のために処理されてもよい。様々な実施の形態において、表面はプラズマ処理される。そのような処理により得られた高表面エネルギーにより、モノマーの伸展と均一な被覆が促進されるであろう。
【００６０】
膨潤性（メタ）アクリレート層を形成するモノマーに加え、その層を形成する組成物は、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、熱開始剤、触媒、活性剤、および架橋剤などの追加の化合物を１種類以上含んでもよい。
【００６１】
任意の適切な重合開始剤を使用してよい。当業者は、前記モノマーに使用するのに適した開始剤、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤を容易に選択することができる。様々な実施の形態において、ＵＶ光を用いて、連鎖重合を開始するためのフリーラジカルモノマーを生成する。
【００６２】
任意の適切な開始剤を用いてよい。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。適切な市販の紫外線活性化および可視光活性化光開始剤の例は、ニューヨーク州、タリータウン所在のチバ・スペシャルティー・ケミカルス社(Ciba Specialty Cemicals)から市販されているIRGACURE 651, IRGACURE 184, IRGACURE 369, IRGACURE 819, DARACUR 4265およびDARACUR 1173、並びにＢＡＳＦ社（ノースカロライナ州、シャーロット）から市販されているLUCIRIN TPOおよびLUCIRIN TPO-Lなどの商標名を有する。
【００６３】
光増感剤を適切な開始剤系に含ませてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三アミノ基またはそれらの混合物を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三アミンを有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、ビドル・ソーヤー社(Biddle Sawyer Corp.)からのQUANTICURE ITX, QUANTICURE QTX, QUANTICURE PTX, QUANTICURE EPDが挙げられる。
【００６４】
一般に、光増感剤または光開始剤系の量は、約０．０１質量％から約１０質量％まで様々であってよい。
【００６５】
カチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、並びにイオン性アレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００６６】
モノマーが、基体表面上に堆積される前に溶媒中で希釈される様々な実施の形態において、その溶媒は重合前に除去される。溶媒は任意の適切な機構またはプロセスによって除去してもよい。一般に、溶媒の約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上を、重合前に除去してもよい。Zhoe等を発明者として挙げた、CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENINGと題する同日に出願された同時係属出願に記載されたように、硬化前に溶媒の実質的に全てを除去することにより、硬化反応速度および転化されるモノマーの量をよりうまく制御できることが分かった。モノマーの転化速度が増加すると、廃物の生成と細胞毒性が減少する。
【００６７】
合成膨潤性（メタ）アクリレート表面を形成するために、モノマーは重合される。バルク相（実質的に溶媒を含まない）または溶媒相中で重合されるか否かにかかわらず、モノマーは、適切な開始機構により重合される。そのような機構の多くが当該技術分野においてよく知られている。例えば、温度を上昇させて熱開始剤を活性化してもよく、光開始剤は、適切な波長の光への曝露により活性化させてもよいなどである。数多くの実施の形態によれば、モノマーまたはモノマー混合物は、ＵＶ光を用いて硬化される。硬化は、酸素阻害を防ぐために、窒素保護などの不活性保護下で行われる。ガス保護と組み合わされた適切なＵＶ光は、ポリマー転化を増加させ、被覆健全性を保証し、細胞毒性を減少させる。
【００６８】
硬化した合成膨潤性（メタ）アクリレート層は、未反応モノマーまたは低分子量ポリマー種などの不純物を除去するために、溶媒で１回以上洗浄してもよい。様々な実施の形態において、その層は、エタノールまたはエタノール水溶液、例えば、７０％エタノール、９０％より多いエタノール、９５％より多いエタノール、または約９９％より多いエタノールで洗浄される。７０％のエタノール溶媒で洗浄することは、細胞毒性であろう不純物を除去するように働くだけでなく、細胞との培養前に表面を殺菌するようにも働く。
【００６９】
この教示にしたがって生成される膨潤性（メタ）アクリレート層は、１つの高分子マトリクス層を形成する。そのような層は構造と性質において局部的なばらつきを含むが、そのようなばらつきは、他者により記載された相互侵入網状構造とは反対に、無作為である傾向にある。上述したように、多くの実施の形態において、ここに記載された膨潤性（メタ）アクリレート層は、細胞培養器具の基体と接触している間に、その場でモノマーから重合される。
【００７０】
ポリペプチドは、任意の適切な技法により重合された膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されてもよい。ポリペプチドは、アミノ末端アミノ酸、カルボキシ末端アミノ酸、または内部アミノ酸により、重合された膨潤性（メタ）アクリレート層２０に結合されてもよい。適切な技法の１つは、当該技術分野において一般に知られているような、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応が挙げられる。ＥＤＣおよびＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）は、膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基と反応して、アミン反応性ＮＨＳエステルを保護することができる。ＥＤＣは膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基と反応して、加水分解を受けやすいアミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの添加により、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体をアミン反応性ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転化することによって、その中間体を安定化させ、二段階手法が可能になる。膨潤性（メタ）アクリレート層の活性化後、次いで、ポリペプチドを加えてもよく、そのポリペプチドの末端アミンが前記アミン反応性エステルと反応して、安定なアミド結合を形成し、それゆえ、ポリペプチドを膨潤性（メタ）アクリレート層に結合させる。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を用いてポリペプチドを膨潤性（メタ）アクリレート層に結合させる場合、Ｎ−末端アミノ酸が、リジン、オルニチン、ジアミノブタン酸、またはジアミノプロピオン酸などのアミン含有アミノ酸であることが好ましい。もちろん、ヒドロキシアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルなどの任意の許容される求核試薬を用いてもよい。
【００７１】
ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応により、ポリペプチド７０の膨潤性（メタ）アクリレート層２０へのゼロ長さの架橋が生じる。末端アミンを有するポリ（エチレングリコール）リンカー（例えば、クオンタ・バイオデザイン社から得られる）などのリンカーまたはスペーサをポリペプチド７０のＮ−末端アミノ酸に加えてもよい。リンカーをＮ−末端アミノ酸に加える場合、リンカーは、ＰＧが、Ｆｍｏｃ基、ＢＯＣ基、ＣＢＺ基またはペプチド合成を受けやすい任意の他の基などの保護基であり、Ｘが、２，４，６，８，１２，２４または利用してよい任意の他の別々のＰＥＧである、Ｎ−ＰＧ−アミド−ＰＥＧX−酸であることが好ましい。
【００７２】
様々な実施の形態において、１μＭ〜２５００μＭの溶液、懸濁液などのポリペプチド流体組成物を、活性化された膨潤性（メタ）アクリレート層と接触させて、ポリペプチドを結合させる。例えば、ポリペプチド濃度は、約１００μＭと約２０００μＭの間、約５００μＭと約１５００μＭの間、または約１０００μＭであってよい。ポリペプチド組成物の体積および濃度は、膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されるポリペプチドの所望の密度を達成するために変えられてよいことが理解されよう。
【００７３】
ポリペプチドは、環化されても、環状部分を含んでもよい。環状ポリペプチドを形成するための任意の適切な方法を用いてもよい。例えば、以下の実施例４を参照して、適切なアミノ酸側鎖上の自由なアミノ官能基および適切なアミノ酸側鎖上の自由なカルボキシル基を環化させることによって、アミド結合が形成される。また、以下の実施例４を参照すると、ペプチド配列中の適切なアミノ酸の側鎖の自由なスルフヒドリル基の間にジスルフィド結合を形成してもよい。任意の適切な技法を用いて、環状ポリペプチド（またはその部分）を形成してもよい。一例として、例えば、国際公開第１９８９／００５１５０号パンフレットに記載された方法を用いて、環状ポリペプチドを形成してもよい。ポリペプチドがカルボキシ末端とアミノ末端との間にアミド結合を有する頭−尾環状ポリペプチドを用いてもよい。ジスルフィド結合の代替案は、例えば、Koide et al, 1993, Chem. Pharm. Bull. 41(3):502-6; Koide et al.,1993, Chem. Pharm. Bull. 41(9):1596-1600; またはBesse and Moroder, 1997, Journal of Peptide Science, vol. 3, 442-453に記載されているように、２つのセレノシステインまたは混合セレナイド／スルフィド結合を用いたジセレナイド結合であろう。
【００７４】
３．  結合ポリペプチドを含有する合成膨潤性（メタ）アクリレート層上の細胞の培養
上述したポリペプチドと結合した膨潤性（メタ）アクリレート層を有する細胞培養器具に細胞を接種してよい。その細胞は任意の細胞種であってよい。例えば、細胞は、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、骨格または平滑筋細胞、心筋芽細胞、腸細胞、腎細胞、または他の臓器からの細胞、幹細胞、島細胞、血管細胞、リンパ球細胞、癌細胞、一次細胞、細胞株などであってよい。細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよいが、細菌、酵母、または植物細胞などの非哺乳類細胞であってもよい。
【００７５】
数多くの実施の形態において、細胞は、当該技術分野において一般に理解されるように、連続的に分割する能力（自己再生）を有し、かつ様々な範囲の特殊細胞に分化できる細胞を称する幹細胞である。ある実施の形態において、幹細胞は、検体の器官または組織から単離されるであろう多能性(multipotent)、全能(totipotent)、または多能性(pluripotent)幹細胞である。そのような細胞は、完全に分化したすなわち成熟した細胞種を産生できる。幹細胞は、自家または他の骨髄由来幹細胞、神経幹細胞、または胚性幹細胞であってよい。幹細胞はネスチン陽性であってよい。幹細胞は造血幹細胞であってよい。幹細胞は、上皮組織および脂肪組織、臍の緒の血液、肝臓、脳または他の器官由来の多系統(multi-lineage)細胞であってよい。様々な実施の形態において、幹細胞は、哺乳類から単離された多能性(pluripotent)胚性幹細胞などの多能性幹細胞である。適切な哺乳類としては、マウスやラットなどの齧歯動物、ヒトおよびヒト以外の霊長類を含む霊長類が挙げられる。様々な実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート−ポリペプチド層は、５以上の継代、７以上の継代、または１０以上の継代のための胚性幹細胞の未分化培養を支援する。典型的に、幹細胞は、約７５％のコンフルエンシー(confluency)に到達した後に新たな表面に継代される。細胞が７５％のコンフルエンシーに到達する時間は、培地、接種密度、および当業者に公知の他の要因に依存する。以下の実施例に記載したように培養した幹細胞が約７５％のコンフルエンシーに到達したのは、約３日と約７日の間、一般に、約５日であることが分かった。
【００７６】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）には、未分化状態で培養において連続的に増殖する能力があるので、本発明に使用するためのｈＥＳＣは、確立された細胞株から得てもよい。確立されたヒト胚性幹細胞株の例としては、以下に限られないが、H1, H7, H9, H13またはH14 (ウィスコンシン大学により設立されたWiCellから得られる) (Thompson (1998) Science 282:1145 ); hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03 (BresaGen, Inc., Athens, GA); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (シンガポール所在のESセル・インターナショナル社(ES Cell International, Inc.)から得られる); HSF-1, HSF-6 (カリフォルニア大学サンフランシスコ校から); I 3, I 3.2, I 3.3, I 4, I 6, I 6.2, J 3, J 3.2 (イスラエル国ハイファ市所在のテクニオン・イスラエル工科大学由来); UCSF-1およびUCSF-2 (Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005); lines HUES 1-17 (Cowan et al., NEJM 350(13):1353-56, 2004); および line ACT-14 (Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005)が挙げられる。本発明に用いられる胚性幹細胞は、一次胚組織から直接得てもよい。典型的に、これは、胚盤胞段階で凍結したイン・ビトロ受精卵を用いて行われるが、それはそうしなければ廃棄されるであろう。
【００７７】
多能性幹細胞の他の供給源としては、霊長類多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を獲得するように再プログラムされるように、例えば、１つ以上の適切なベクターによるトランスフェクションにより、遺伝子組み換えされた、ヒトなどの、十分に成長していないまたは成熟した哺乳類から得られた細胞を称する。これらの再プログラムされた細胞により獲得された表現型形質としては、胚盤胞から単離された幹細胞に類似の形態、並びに胚盤胞由来の胚性幹細胞に類似の表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、典型的に、一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉の各々から少なくとも１つの細胞種に分化する能力を有する。ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞は、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤマウスに注射されたときに、奇形腫を形成する（Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858）。
【００７８】
細胞を接種する前に、その細胞を収穫し、細胞を表面に一度接種したら培養すべき成長培地などの適切な培地中に懸濁させてよい。例えば、細胞は、血清含有培地、ならし培地、または既知組成培地中に懸濁し、培養してもよい。ここに用いたように、「既知組成培地」は、未知の組成の成分を含有しない細胞培養培地を意味する。既知組成細胞培養培地は、様々な実施の形態において、未知の組成のタンパク質、ヒドロシレート(hydrosylate)、またはペプチドを含有しない。ある実施の形態において、ならし培地は、組み換え成長ホルモンなどの、既知の組成のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。既知組成培地の全成分が既知の化学構造を有するので、培養条件の変動性、それゆえ細胞応答における変動性を減少させ、再現性を上昇させることができる。その上、汚染の可能性が低下する。さらに、少なくとも一部には、上述した要因のために、拡大の可能性が容易になる。既知組成細胞培養培地は、胚性幹細胞の増殖および拡張から完全に無血清・無フィーダー（ＳＦＭ）に特別に配合された、STEM PROとしてインビトロゲン（９２００８カリフォルニア州、カールズバッド、PO Box 6482、1600ファラデー通り所在のインビトロゲン社(Invirtogn Corporation)）から市販されたもの、Xvivo(Lonza)およびヒト胚性幹細胞のためのmTeSR（登録商標）1維持培地としてステム・セル・テクノロジー社(Stem Cell Technologies, Inc.)から販売されたものがある。
【００７９】
細胞が中でポリペプチドに結合された合成膨潤性（メタ）アクリレート層（ＳＡＰ）と培養される培地に、１つ以上の増殖または他の因子を加えてもよい。それらの因子は、細胞増殖、接着、自己再生、分化などを促進させるであろう。培地に加えるまたは含ませてもよい因子の例としては、筋形態因子（ＭＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポイエチン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アクティビンＡなどのアクティビンＡ（ＡＣＴ）、造血因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦβ１）などのトランスフォーミング増殖因子、およびコロニー刺激因子が挙げられる。
【００８０】
細胞は、任意の適切な濃度で接種してもよい。一般に、約１０，０００細胞／基板ｃｍ2から約５００，０００細胞／ｃｍ2で接種させる。例えば、細胞は、約５０，０００細胞／基板ｃｍ2から約１５０，０００細胞／ｃｍ2で接種してよい。しかしながら、それより高い濃度と低い濃度は容易に使用されるであろう。培養時間並びに温度、ＣＯ2およびＯ2レベル、増殖培地などの条件は、培養されている細胞の性質に依存し、容易に変更できる。細胞を表面で培養する時間の量は、所望の細胞応答に応じて様々であろう。
【００８１】
培養される細胞は、（ｉ）調査研究に使用するためまたは治療用途を開発するために既知組成培地内において合成表面上で培養した十分な量の未分化幹細胞を得ること、（ｉｉ）培養中の細胞の調査研究のため、（ｉｉｉ）治療用途を開発するため、（ｉｖ）治療目的、（ｖ）例えば、ｃＤＮＡライブラリを作成することにより、遺伝子発現を研究するため、および（ｖｉ）薬物と毒性のスクリーニングの研究のため、を含む任意の適切な目的に使用してよい。
【００８２】
以下の実施例により詳しく記載されるように、胚性幹細胞などの幹細胞の未分化状態は、ＳＡ−Ｐ基体を有する器具上の５，７，または１０以上の継代に亘り維持できることが分かった。様々な実施の形態において、細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上が、各継代後に未分化のままである。細胞が未分化であるか否かを判定するための適切な様式の１つは、例えば、以下に実施例において詳しく記載するように、ＯＣＴ４マーカーの存在を測定することにある。様々な実施の形態において、５，７，または１０以上の継代に亘りＳＡ−Ｐ基体上で培養された未分化幹細胞は、未分化である能力を維持する。
【００８３】
以下において、先に記載された器具と方法の様々な実施の形態を記載する非限定的実施例を提示する。
【実施例】
【００８４】
実施例１：  被覆の調製
膨潤性（メタ）アクリレート被覆表面をＵＶ重合性モノマーから調製した。この表面は、親水性モノマー、カルボキシル基含有モノマー、および架橋性モノマーを含有している。表１は、使用した膨潤性（メタ）アクリレートモノマーの組成を示している。表１に示されるように、配合ＳＡ１ＡおよびＳＡ１は同じモノマー組成を有する。それらは、ＳＡ１Ａが０．１％ｖ／ｖ濃度でエタノールにより希釈されるのに対し、ＳＡ１は０．２５％ｖ／ｖ以上の濃度でエタノールにより希釈されるという点で互いに異なる。エタノールで希釈されたモノマーの希釈が表３に示されている。表２は使用したモノマーの化学構造を示している。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【００８５】
手短に言えば、モノマーを（０．１体積％）または０．２５体積％の濃度にエタノールで希釈し、Durocure 1173（３％体積／モノマー体積）光開始剤を加えた。希釈されたモノマーの膨潤性（メタ）アクリレート配合物を、BioTek Precision Pipetting Systemを用いて、２μＬの体積でプラズマ処理済み環状オレフィンコポリマー製９６ウェルプレート（コーニング・ライフ・サイエンス社の開発グループ(Corning Life Science Development gourp)から提供）のウェルに加えた。
【００８６】
各ウェルは、所定の膨潤性（メタ）アクリレートモノマー配合物を受け取り、いくつかのウェルは、陽性対照として「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」で被覆した。それらの被覆は、０．５マイクロメートル以下の平均厚となるように施された。別記しない限り、得られた膨潤性（メタ）アクリレート被覆は約０．１マイクロメートルの平均厚を有した。膨潤性（メタ）アクリレートモノマー配合物が被覆されたウェルについて、エタノール溶媒は、ヒュームフード内において３時間に亘り室温での蒸発によって除去した。次いで、その被覆は、Ｎ2パージしたボックス（溶融シリカ窓を備えた）内において１分間に亘り１３ｍＷ／ｃｍ2パルスの（１００Ｈｚ）ＵＶ光（Xenon RC-801）で硬化させた。
【００８７】
多数の膨潤性（メタ）アクリレート配合物について、９６ウェルプレートのウェルを５マイクロリットルのアクリルモノマーの０．１ｖ／ｖ％エタノール溶液または２マイクロリットルのアクリルモノマーの０．２５ｖ／ｖ％エタノール溶液で被覆し、ウェル（０．３１６５ｃｍ2）当たり５ナノリットルのモノマーおよび０．１３〜０．２０マイクロメートルの被覆厚を得た。使用した様々な配合物および濃度と体積が以下の表３に列記されている。
【表３】
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【００８８】
実施例２：  膨潤性（メタ）アクリレート表面へのポリペプチドの結合
上述したように調製した膨潤性（メタ）アクリレート被覆へのポリペプチドの結合を評価するために設計された一連の実験において、ポリペプチドの混合物（Ac-ArgGlyGlySerAspProIleTyrLys-NH2（配列番号３）／Rhod-GlyArgGlyAspSerProIleIleLys-NH2（配列番号４））を、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）成分を含む配合ＳＡ１Ａ（表１，２および３を参照のこと）の膨潤性（メタ）アクリレート被覆に結合させた。手短に言えば、５０μＬの０．１ｍＭのＥＤＣおよび０．０５ｍＭのＮＨＳのＤＭＦ溶液を、膨潤性（メタ）アクリレート配合物で被覆された９６ウェルの環状オレフィンコポリマー製プレートのウェルに分配した。カルボキシル基の活性化を１〜１．５時間に亘り行い、次いで、活性化溶液を吸引した。その直後に、２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の５０μＬのポリペプチド溶液をそのウェル中に分配し、ウェル表面のＮＨＳエステルとペプチドの第１アミン基との間の反応を１．５時間に亘り周囲条件で行い、次いで、ペプチド溶液を吸引した。その直後に、５０μＬの１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．０〜８．５の水溶液をウェル中に分配し、１．５時間に亘り周囲条件で遮断反応を行った。次いで、遮断溶液を吸引し、ウェルをリン酸緩衝液で、１％のＳＤＳ溶液で、最後に脱イオン水で洗浄した。蛍光は、Ｔｅｃａｎマイクロアレイ・スキャナを用いて定量した。あるいは、ポリペプチドを、シグマ・アルドリッチ社から入手したQuantiPro BCAアッセイキットで定量した。そのペプチド溶液は、１０００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、または０μＭの総ペプチドを含んでいた。
【表４−１】
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【表４−２】
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【００８９】
これらの配列の多くは、Ｎ−末端にLys-Gly-Gly (KGG)アミノ酸配列を有する。このLysアミノ酸は、アミノ基を含む側鎖を有し、ペプチドを活性化された（メタ）アクリレート被覆に結合させるために用いられる。Gly-Glyアミノ酸は、ペプチドと細胞表面受容体との最適な生体特異的相互作用を可能にするように被覆表面から離れて推定ＲＧＤエピトープを突出させるように設計されたスペーサとして働くために用いた。リンカー配列は必要ではないか、またはより短い配列を使用して差し支えないと考えられる。あるいは、またはそれに加え、非アミノ酸系リンカー（ポリエチレンオキシドリンカーなどの）をスペーサとして用いてもよい（例えば、図６参照のこと）。この配列は、本発明のペプチド配列の実施の形態において存在してもしなくてもよいことが理解されよう。
【００９０】
図３は、ペプチドの混合物（Ac-ArgGlyGlySerAspProIleTyrLys-NH2（配列番号２７）／Rhod-GlyArgGlyAspSerProIleIleLys-NH2（配列番号２８））の上述したように調製した配合ＳＡ１Ａの膨潤性（メタ）アクリレート被覆に結合する能力に関する蛍光データを示している。図３Ａは、０から１０００μＭまでペプチドの濃度を上昇させた、平均約１マイクロメートルの厚さの層の膨潤性（メタ）アクリレート被覆に結合されたペプチドの蛍光強度の画像である。図３Ｂは、０から１０００μＭまでペプチドの濃度を上昇させた、平均約０．１マイクロメートルの厚さの層の膨潤性（メタ）アクリレート被覆に結合されたペプチドの蛍光強度の画像である。図３Ｃは、１マイクロメートルまたは０．１マイクロメートルの厚さの表面に被覆されたペプチドに関する蛍光強度に対するペプチド濃度（０から１ｍＭ）のグラフである。図３に示したように、被覆に結合されたペプチドの量は、結合緩衝液中のペプチド濃度と共に増加する。同じプロトコルを用いてペプチドが結合された、２つの厚さ、１μｍと０．１μｍの膨潤性（メタ）アクリレート被覆に関する蛍光強度は、ペプチドは、膨潤性（メタ）アクリレートの嵩に亘り均一にというよりむしろ、被覆の表面に固定化されることを示唆している。膨潤性（メタ）アクリレートの嵩に亘り均一だったとすれば、これらの２つの被覆について蛍光強度に大きな差が予測されるであろう。
【００９１】
図４は、実施例２に記載されたQuantiPro BCAアッセイの結果を示している。ペプチドに結合した膨潤性（メタ）アクリレートを分析すると、５７０ｎｍで０．０７６ＡＵの吸光度が得られた。１と１５μｇ／ｍｌの間に直線性が観察された（図の直線により示されるように）。得られたデータは、検出限界（１μｇ／ｍＬ）に近かったが、得られた密度は、蛍光実験から得られた密度に良好に対応した（ＢＣＡについては５．６ピコモル／ｍｍ2、蛍光については８．６ピコモル／ｍｍ2）。
【００９２】
実施例３：  ＨＴ−１０８０細胞接着および増殖アッセイ
細胞接着と増殖を可能にするためにこれらの結合法を用いて膨潤性（メタ）アクリレートの実施の形態に結合されたポリペプチドの能力を評価するために、ペプチドAc-LysTyrGlyArgLysArgLeuGlnValGlnLeuSerIleArgThr-NH2（配列番号２２）（ＡＧ−７３、接着ペプチド）およびAc-Ac-GlyArgGlyGluSerProIleTyrLys-NH2（配列番号３０）（ＲＧＥ、陰性対照）を、膨潤性（メタ）アクリレート（上述）に結合し、ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞の膨潤性（メタ）アクリレートへの接着を評価した。手短に言えば、ラミニン（５μｇ／ｍＬ、シグマ・アルドリッチ）対照ウェルを室温で１時間に亘り被覆した。全てのウェルを３７℃で１時間に亘りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で遮断した。細胞接種前に、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)（ＩＭＤＭ）中の０．１％のＢＳＡと共に培養する前に、ウェルをＰＢＳで手短に洗浄した。ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１２１）を、標準的な細胞培養条件で、１０％のＦＢＳ（Lonza）を含むＩＭＤＭ（Lonza）中で９０％のコンフルエンシーまで増殖させた。細胞をトリプシン化し、３７℃、５％のＣＯ2で３０分間に亘り１０％のＦＢＳを含むＩＭＤＭ中で回復させた。回復後、細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ中の０．１％のＢＳＡ中に再懸濁させ、３０，０００細胞／ウェルの密度でペプチド結合プレート上に接種した。細胞接着は、標準的な細胞培養条件で１時間に亘り行わせた。培地をウェルから吸引し、接着性細胞を固定し、室温で８分間に亘り５０μＬの２０％のメタノール中の０．２％のクリスタル・バイオレットで染色した。クリスタル・バイオレットの細胞吸収を、５７０ｎｍでの吸光度測定の前に、５分間に亘り、Ｈ2Ｏ中の１％のＳＤＳの添加により定量した。このアッセイについて、ポリペプチドの結合後、膨潤性（メタ）アクリレート上の残りのＮＨＳエステルをエタノールアミンまたはアミノプロピルモルホリンと反応させて、膨潤性（メタ）アクリレートによるクリスタル・バイオレット染料の取込みを減少させた。
【００９３】
図５は、実施例３に記載されたように、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態へのＨＴ−１０８０細胞の接着を示す、ＨＴ−１０８０接着アッセイからの結果を示している。膨潤性（メタ）アクリレート−ペプチド表面上の接着性細胞の相対数を、ラミニン上の細胞の相対数に正規化させた（ＯＤ５７０ｍｍによる）。ペプチドは、１００μｍのＡＧ−７３（配列番号２４）、１０、１および０μＭの濃度でテストした。ＯＤ５７０ｎｍ測定値を収集し、読取り値をラミニンの接着性に正規化した。「ＡＧ−７３」はＳＡＰ−ＡＧ−７３（配列番号２４）である。「ｂＡＧ−７３」は、ペプチド結合の得にエタノールアミンで遮断したＳＡＰ−ＡＧ−７３（配列番号２４）である。「ＲＧＥ」はＳＡＰ−ＲＧＥ（配列番号３０）である。ＲＧＥは非接着性ペプチドである。
【００９４】
ＨＴ−１０８０細胞は、接着性ペプチドAc-LysTyrGlyArgLysArgLeuGlnValGlnLeuSerIleArgThr-NH2（配列番号２２）（ＡＧ−７３）に特異的に接着し、（１）ペプチド結合前にエタノールアミンにより遮断した（ｂＡＧ−７３または遮断されたＡＧ−７３として示される）または（２）非接着性ペプチドAc-GlyArgGlyGluSerProIleTyrLy-NH2（配列番号３０）（ＲＧＥ）を結合させた場合：の表面には接着しなかった。１００μＭのペプチド溶液および１０μＭのＡＧ−７３ペプチド溶液により接着表面が得られるのに対し、１μＭのＡＧ−７３ペプチド溶液では細胞接着表面は得られなかった。非常にわずかな細胞しかＳＡＰ−ｂＡＧ−７３には接着せず、ＡＧ−７３は、合成高分子表面には非特異的には吸着しないことを示している。
【００９５】
実施例４：  未分化幹細胞の培養のためのアッセイ
細胞接着ペプチドを、表４に列記したようにｈＥＳＣに使用するために選択した。このポリペプチドのリストは、インテグリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の２種類の重要な細胞受容体の群を標的にすることが示されたペプチドを含んでいる。これらのペプチドは、ラミニンの様々な領域(domain)および鎖からの配列も包含する。また、他のタンパク質からの細胞接着ペプチドも含まれる。
【００９６】
未分化ｈＥＳＣに対する接着特性について満足な細胞培養表面を提供する能力について、表４に列記されたペプチドをスクリーニングするために、１０００μＭの溶液を用いて、配合ＳＡ１Ａの膨潤性（メタ）アクリレート（表１，２および３を参照のこと）にペプチドを結合させた。ペプチドはゼンスクリプト社から購入した。全てのペプチドをＣ−末端でアミド化した。選択されたペプチドのＮ−末端に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の繰り返し単位のスペーサを加えた。例えば、ＰＥＯ4は、エチレングリコールの４つの繰り返し単位を称し、ＰＥＯ12は、エチレングリコールの１２の繰り返し単位を称する。これらのスペーサは末端アミンを含んでいた。そのスペーサを、ゼンスクリプト社によるポリペプチドに加えた。
【００９７】
Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）（ＢＳＰ配列）を、上述した配合ＳＡ１、ＳＡ１ＡおよびＳＡ５の膨潤性（メタ）アクリレート被覆に、ペプチドの様々な濃度（１０００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、および０μＭ）で結合させた。
【００９８】
全ての実験プレートは、７０％のＥＴＯＨを吹きつけ、層流フード内で乾燥させ、２００μｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）により５回、洗浄することによって細胞接種前に殺菌した。Ｈ７ｈＥＳ細胞を、１００μｌの既知組成培地Ｘｖｉｖｏ１０（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−７４３Ｑ）中、ペプチド結合した膨潤性（メタ）アクリレート（ＳＡＰ）表面に３５，０００細胞／ウェル（９６ウェルプレート）の密度で接種し、８０ｍｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（R&D Systems、カタログ番号２３４−ＦＳＥ／ＣＦ）および５０ｍｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦβ１）（R&D Systems、カタログ番号２４０Ｂ）を補充した。「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」（ＭＧ）−被覆ウェルを、未分化ｈＥＳ細胞の接着についての陽性対照として用いた。細胞を、標準的な細胞培養条件（５％のＣＯ2、３７℃）下で４８時間に亘り培養し、次いで、固定し、AttoPhosアッセイのために処理して、未分化ｈＥＳ細胞の公知のマーカーである、アルカリホスファターゼ活性および／または以下に記載するようなＢＣＩＰ染色を測定した。
【００９９】
実施例５：  AttoPhosスクリーニング
AttoPhosスクリーニングを以下のように行った。手短に言うと、培養時間の終わりに、細胞を１５０μｌのＤＰＢＳで濯ぎ、１０分間に亘り室温で４％のパラホルムアルデヒドで固定した（７０μｌ／９６ウェルプレートのウェル）。細胞を一度１５０μｌのＤＰＢＳで洗浄し、光を防いだアルカリホスファターゼ（Promega）（ＤＰＢＳ中１：３に希釈）について１００μｌのAttoPhos蛍光基質で１０分間に亘り処理した。Victor 3 マイクロプレートリーダ（Perkin Elmer）を用いて、４８５／５３５ｎｍでAttoPhos蛍光強度を得た。実験表面についてのAttoPhos蛍光強度は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照に対する％として表した。
【０１００】
実施例６：  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色
コロニー形態評価のためのｈＥＳ細胞の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）染色を以下のように行った。手短に言えば、AttoPhos蛍光強度の読取り値を得た後、細胞を１５０μｌのＤＰＢＳで洗浄し、ＢＣＩＰ染色のために処理して、細胞コロニー形態を評価した。７０μｌのＢＣＩＰ／ＮＢＴを各ウェルに加え、穏やかに撹拌しながら、室温で２０〜３０分間に亘り（所望のコロニー強度を達成するために）培養した。染色の終わりに、細胞を１５０μｌのＤＰＢＳで一度洗浄し、光学顕微鏡法により分析したかまたは走査した。実験表面上のＨ７ｈＥＳコロニー形態を、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」（陽性対照）上のコロニー形態と比較した。
【０１０１】
図６は、配合ＳＡ１Ａを用いた未分化幹細胞のペプチド支援についてのスクリーニングアッセイからの結果を示している。ＢＳＰ配列のAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照と比較した未分化幹細胞を支援する顕著な能力（５６〜６０％のAttoPhos蛍光強度（ＦＩ））を示した。いくつかのペプチドを、以下のようなＰＥＯスペーサ／リンカー（配列番号２５および配列番号２６）に結合した：NH2PEO4-ArgAsnIleAlaGluIleIleLysAspIle-NH2（配列番号２５）またはNH2-PEO4-LysAlaPheAspIleThrTyrValArgLeuLysPhe- NH2（配列番号２６）、ここで、PEOはPEO4またはPEO12であって差し支えない。図７に示されるように、ＢＳＰ配列（図７Ｂ）であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）を含有する表面上で培養した幹細胞のコロニーは、細胞のＢＣＩＰ染色で評価して、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」（図７Ａ）と類似のコロニー形態を示した。膨潤性（メタ）アクリレート基体（配合１）のみ（図７Ｃ）には幹細胞の増殖は観察されなかった。図８は、ペプチドの濃度を１，１０，１００および１０００μＭに上昇させた、ＳＡ１配合物に関する「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」の性能の百分率として表されたAttoPhos測定値を示している。図８に示されるように、ＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）を含有する膨潤性（メタ）アクリレート配合ＳＡ１Ａ上の未分化幹細胞の接着と増殖は、ペプチドの濃度に依存した。また、これらのデータは、１０００μＭの濃度を用いて結合されたＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）が、既知組成培地条件下で未分化のＨ７ｈＥＳ細胞の接着および増殖を支援できることを示唆している。
【０１０２】
ここで図９を参照すると、膨潤性（メタ）アクリレート被覆が調製された様式と、その膨潤性（メタ）アクリレートの成分が、ＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）の未分化幹細胞の増殖を支援する能力に影響を与えている。ＣＢ／ＴＯＰは、被覆されていない環状オレフィンコポリマー製細胞培養器（プラズマ処理された「ＴＯＰＡＳ」）である。ＳＡ１Ａは、Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）が結合されたものとされていない膨潤性（メタ）アクリレート配合物である（図６に特定されるような）。ＳＡ５は、c-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）が結合されたものとされていない、表１に示された代わりの膨潤性（メタ）アクリレート配合物である。ＭＧは「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照である。図９に示されたように、配合物ＳＡ５は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」により示されるものに匹敵する既知組成培地の存在下で未分化ｈＥＳ細胞培養を支援する被覆を提供しなかった。理論により制限するものではないが、これは、端部で共重合されたアクリル酸カルボキシエチルがないポリ（エチレングリコール）６００が多量にあり、おそらくは、高分子の網状構造の代わりに、ＳＡ表面にブラシ層が形成されるからであろう。図９に示されるように、配合物ＳＡ１に結合したＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）により、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照と比べて、匹敵するAttoPhos FIが得られた。これは、ＢＳＰ配列（図６および８に示されるような）である結合されたAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）により、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」AttoPhos FIの約６０％を示した配合物ＳＡ１Ａとは対照的である。上述したように、配合物ＳＡ１およびＳＡ１Ａの成分は実質的に同じであるが、被覆層が調製された様式のみが異なった（ＳＡ１Ａ：５マイクロリットルで０．１％；ＳＡ１：２マイクロリットルで０．２５％）。被覆の厚さは重要であろう。例えば、ある実施の形態において、ＳＡ被覆の厚さを０．５μｍ未満に維持することが重要かもしれない。したがって、膨潤性（メタ）アクリレート基体が調製される様式、並びに膨潤性（メタ）アクリレートの化学組成と構造が、ペプチド−結合膨潤性（メタ）アクリレート表面の、既知組成培地における未分化幹細胞の培養を支援する能力に影響し得る。
【０１０３】
実施例７：  ＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）に結合された追加のＳＡ被覆のテスト
ＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）に結合された追加の膨潤性（メタ）アクリレート層（ＳＡ層または被覆）を、上述した実施例にしたがって調製し、テストした。図１０Ａおよび１０Ｂは、ペプチドAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）を結合した後の異なる膨潤性（メタ）アクリレート配合物上での既知組成培地条件下での未分化Ｈ７ｈＥＳ細胞の付着と増殖のAttoPhos測定値の棒グラフである。スクリーニングした全ての表面上での細胞に関するAttoPhos蛍光強度（ＦＩ）を、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」上の細胞のＦＩに正規化した（図１０）。図１０Ａおよび１０Ｂに報告された膨潤性（メタ）アクリレート配合物の全ては、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照に匹敵し、細胞のＢＣＩＰ染色で評価された「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」コロニー形態（データは示さず）に類似の、同様以上のAttoPhos FIを示した。
【０１０４】
図１０に報告された膨潤性（メタ）アクリレート配合物について、網状構造は、アクリルアミドなどの高親水性モノマーまたはメタクリル酸ヒドロキシプロピルなどの中程度の親水性のモノマーいずれかから重合した。親水性モノマーの比は６０から９０％に及んだ。カルボキシル基含有官能性モノマーの比は１０％から３０％に及んだ。ＢＳＰ−ＲＧＤペプチドAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）と結合した後、テストした配合物の全ては、既知組成の動物由来成分を含まない条件において、陽性対照の「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」と同様かそれより高いｈＥＳＣ付着を支援した。
【０１０５】
実施例８：  ＳＡ１に結合した追加のペプチドのテスト
ＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）は、マウスからの骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のＲＧＤ接着エピトープを含んだ。追加のＲＧＤ含有ペプチドを特定した。しかしながら、ＲＧＤ配列の全てにより、全ての細胞種に関して同じレベルの細胞培養性能が得られる訳ではないであろう。ある細胞種は、異なる特定のペプチド上でよりうまく培養されるかもれしない。ＲＧＤモチーフを側部に有する配列は、細胞接着の程度に著しく影響し、接着後の分化プロセスに影響するであろう。理論により制限するものではないが、インテグリンを介する細胞接着は、張線維による細胞の広がりおよび局所接着を含む、細胞付着の多数の細胞事象を含むであろう。理論により制限するものではないが、ペプチド結合（メタ）アクリレート骨格により、これらのインテグリンを介する細胞結合事象が可能になるであろう。この実施例において、異なるＲＧＤ含有ペプチドをＳＡ被覆の実施の形態に結合させる影響を探求する。特に、未分化幹細胞の、ＲＧＤエピトープが、（メタ）アクリレート被覆に結合したヒトフィブロネクチンタンパク質由来であるＲＧＤペプチドの実施の形態に対する応答を示すデータが提示されている。
【０１０６】
フィブロネクチンは細胞接着タンパク質である。フィブロネクチンの細胞付着活性を有し、ＲＧＤエピトープを含むポリペプチドが以前に特定された（例えば、米国特許第４６６１１１１号明細書参照のこと）。この実施例において、ヒトフィブロネクチン配列からの１５ｍｅｒ配列（配列番号１２）（ｌｏｎｇ−ＦＮまたはｌ−ＦＮと表される）をＳＡ１のＳＡ被覆に結合させた。ＳＡ１に結合されたより短い市販の（アメリカン・ペプチド社(American Peptide Co., Inc.)）７−ｍｅｒフィブロネクチン配列（配列番号１１）（ｓｈｏｒｔ−ＦＮまたはｓ−ＦＮと表される）も調査した。理論により制限するものではないが、短いペプチドは、限られた立体構造安定性を有することが予測され、細胞接着特性が減少するであろう。そのｓ−ＦＮポリペプチドは、追加のLysアミノ残基がＣ−末端にあるヒトフィブロネクチン由来の６−ｍｅｒ配列である。１５−ｍｅｒエピトープｌ−ＦＮのサイズの半分であることに加え、この６−ｍｅｒのｓ−ＦＮペプチドは、Ｃ−末端を介して付着し、それゆえ、細胞培養容器の表面上のＲＧＤエピトープの方向性を変える。
【０１０７】
その上、ペプチド内の結合アミノ酸残基の位置に差があるために、ｌ−ＦＮおよびｓ−ＦＮのＲＧＤ配列は、ＲＧＤエピトープを、２つの異なる反対の方向に細胞外インテグリンに提示する。
【０１０８】
この実施例において、ｌ−ＦＮ（配列番号１２）、ｓ−ＦＮ（配列番号１１）およびＢＳＰ配列であるAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）は、上述した実施例に記載されたように、配合物ＳＡ１から製造された（メタ）アクリレート層に結合された。AttoPhos研究は、実施例５に記載されたように行った。その結果が図１１に示されている。図１１は、フィブロネクチン結合膨潤性（メタ）アクリレートの勾配で増殖したｈＥＳＣのAttoPhos染色を示す棒グラフである。ｓ−ＦＮは７−ｍｅｒフィブロネクチンペプチド結合アクリレートである。ｌ−ＦＮは１５−ｍｅｒフィブロネクチンペプチド結合アクリレートである。１０−，１００−および１０００−は、これらの被覆を形成するための投入ペプチド濃度（μＭ）を反映している。
【０１０９】
図１１に示されるように、短いフィブロネクチン配列（ｓ−ＦＮ）は、長いフィブロネクチン配列のｌ−ＦＮに性能が匹敵する。ＢＳＰ配列は、未分化幹細胞の培養をよりよく支援するようである（フィブロネクチン配列と比べて）が、XaaおよびYaaが任意の天然に生じるまたは合成のアミノ酸であり、XaaまたはYaaの少なくとも一方が、表面のカルボキシル基と求核付加反応／アミド結合形成を可能にする官能性を有する、形態YaalXaanArgGlyAspXaamYaal （配列番号１）の任意のアミノ酸配列が、ペプチドに基づく細胞培養骨格の許容させる選択肢であるであろう。
【０１１０】
実施例９：  Ｓａ１に結合された追加のペプチドのテスト：環状ペプチド
実施例において、ＢＳＰ配列である上述した１５ｍｅｒのAc-KGGNGEPRGDTYRAY-NH2（配列番号４）は、膨潤性（メタ）アクリレート高分子層に結合されたときに、動物由来成分を含まない既知組成条件において、未分化ｈＥＳＣの培養を支援することが示された。理論により制限するものではないが、短く柔軟なペプチドは、水性培地中では元々の立体構造を非常にうまくは維持しないであろう。立体構造不安定性の問題は、非常に短いペプチドにおいて最も一般的であろう。天然タンパク質中の推定ＲＧＤエピトープの擬似ベータ回転状立体構造を模倣するために、５量体または８量体などの非常に短いペプチドを使用して、ペプチドの環化のための戦略を開発した。この実施例において、環状の１３および１７−ｍｅｒＲＧＤペプチドをＳＡ被覆の実施の形態に結合させた。
【０１１１】
その上、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）リンカー結合ＲＧＤ配列をＳＡ被覆の実施の形態に結合させた。理論により制限するものではないが、スペーサ／リンカーを加えることにより、ＳＡ被覆から離れてペプチドエピトープを突出させることにより、ペプチドエピトープのバイオアベイラビリティが改善されるであろう。その上、ＰＥＯリンカー中のエチレンオキシド単位の親水性により、表面への非特異的タンパク質の吸着が減少するであろう。そのリンカーは、カリフォルニア州、ビスタ所在のアメリカン・ペプチド社によりポリペプチドに加えられた。
【０１１２】
この実施例に使用した全てのペプチドは、ＣＡ９２０８１、ビスタ、１２７１アベニダ・チェルシー所在のアメリカン・ペプチド社、またはＮＣ２８１０６、マシュー、３１００スミス・ファーム・ロード、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ２００のＣＥＭ社で合成された。
【０１１３】
以下のペプチドを、先の実施例に記載したように、配合物ＳＡ１の膨潤性（メタ）アクリレート層に結合した。環状構造については、表５を参照のこと。  
(i)  Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2 （配列番号４）,「ＢＳＰ」;  
(ii)       NH2-PEO4-AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2 （配列番号５）, 「リンカーＢＳＰ」; 
(iii)    Ac-LysGlyGlyLys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17-NH2,Lys4-Asp17 amide cycle, （配列番号６）, 「環状ＢＳＰ  １７−ｍｅｒ」;
(iv)       Ac-LysGlyGlyLys4GluProArgGlyAspThrTyrArgAsp13-NH2, Lys4-Asp13 アミド環,（配列番号７）, 「環状ＢＳＰ  １３−ｍｅｒ」;
(v)  Ac-LysGlyGlyCys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys17-NH2, Cys4-Cys17 disulfide bonded cycle, （配列番号８）, 式４として示されている「ジスルフィド−ＢＳＰ  １７−ｍｅｒ」; および
(vi)  Ac-LysGlyGlyCys4GluProArgGlyAspThrTyrArgCys17-NH2, Cys4-Cys13 ジスルフィド結合環（配列番号９）, 「ジスルフィド−ＢＳＰ  １３−ｍｅｒ」。
【表５】
0005501981.tif 000010
【０１１４】
２つの化学的戦略を用いて、環状ポリペプチドを合成した。第１の戦略では、リジン側鎖の自由なアミノ官能基およびアスパラギン酸側鎖の自由なカルボキシル官能基を環化させることによって形成したアミド結合を用いた。第２の戦略では、ペプチド配列における２つのシステインアミノ酸の自由なスルフヒドリル側鎖の間に形成されたジスルフィド結合を用いた（国際公開第１９８９／００５１５０号パンフレット参照）。これらの環化は、ノースカロライナ州、マシュー所在のＣＥＭ社が行った。
【０１１５】
１３−ｍｅｒおよび１７−ｍｅｒのアミド結合環状ペプチドにより、それぞれ、１０および１４のアミノ酸であった環状ＲＧＤが得られた。同様に、１３−ｍｅｒおよび１７−ｍｅｒのジスルフィド結合環状ペプチドにより、それぞれ、１０および１４のアミノ酸であった環状ＲＧＤが得られた。
【０１１６】
図１２は、ＢＳＰペプチドがジスルフィド結合（配列番号８）および（配列番号９）により環化されたＳＡＰ−ＢＳＰ（環状）、Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）（１０００ｍＭ）、および細胞外基質タンパク質フィブロネクチン（ＦＮ、５ｍｇ／ｍＬ）被覆表面に正規化された非接着性ペプチドGRGESPIYK（配列番号３０）（ＲＧＥ、１０００ｍＭ）へのＨＴ−１０８０の接着を示している。（配列番号８）および（配列番号９）の環状ＢＳＰジスルフィドペプチド結合（メタ）アクリレート表面は、Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）結合（メタ）アクリレートと同様にＨＴ−１０８０の接着を支援した。図１３は、（配列番号６）（アミド環状ＢＳＰ  １７ｍｅｒ）および（配列番号７）（アミド環状ＢＳＰ  １３ｍｅｒ）のアミド環化ＢＳＰペプチド結合（メタ）アクリレートが、直鎖状ＢＳＰ結合（メタ）アクリレートであるAc-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）と同様にＨＴ−１０８０の接着を支援したことを示している。
【０１１７】
アミド結合した環化ポリペプチドが結合した膨潤性（メタ）アクリレート層上で培養されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のAttoPhos染色の結果が、図１４に示されている。手短に言えば、Ｈ７ｈＥＳＣを、ＳＡＰ−ＢＳＰまたはＳＡＰ−ＢＳＰ（環状）表面を形成するために直鎖状または環状のＢＳＰペプチドと結合したＳＡ上で培養した。ＢＳＰは、アミド結合を用いて環化した。ＳＡＰ−ＢＳＰ（配列番号４）表面および（配列番号６）（アミド環状ＢＳＰ  １７ｍｅｒ）と（配列番号７）（アミド環状ＢＳＰ  １３ｍｅｒ）に結合したＳＡ被覆上での４８時間の培養後、細胞にAttoPhosアッセイを行った。「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆基体ウェルを陽性対照として用いた。図１４に示されているように、Ｈ７細胞は、環状と直鎖状のＢＳＰ結合ＳＡ表面上で類似の接着／増殖応答を示した。アミド結合環化ＳＡＰ−ＢＳＰ（環状）表面の１３ｍｅｒと１７ｍｅｒの種類の間には、細胞応答において著しい差は観察されなかった。その結果は、両方のアミド結合した、環化と直鎖状のＢＳＰ結合ＳＡが、未分化Ｈ７ｈＥＳＣの接着／増殖を支援できることを示している。
【０１１８】
図１５は、ＳＡ−ＢＳＰ（配列番号４）および「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」と比べた、ジスルフィド結合した環化ポリペプチド（配列番号８）（ジスルフィド環状ＢＳＰ  １７ｍｅｒ）および（配列番号９）（ジスルフィド環状ＢＳＰ  １３ｍｅｒ）が結合した膨潤性（メタ）アクリレート層上で培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のAttoPhos染色の結果を示している。手短に言えば、Ｈ７ｈＥＳＣを、ＳＡＰ−ＢＳＰまたはＳＡＰ−ＢＳＰ（環状）表面を形成するために直鎖状または環状のＢＳＰペプチドと結合したＳＡ上で４８時間に亘り培養した。４８時間の培養後、細胞を固定し、AttoPhosアッセイを行った。図１５に示されるように、Ｈ７細胞は、環状と直鎖状のＢＳＰ結合ＳＡ表面上で同様の接着／増殖応答を示した。ＳＡＰ−ＢＳＰ（環状）表面の１３ｍｅｒと１７ｍｅｒの種類の間には、細胞応答において差は観察されなかった。興味深いことに、ジスルフィド結合したＳＡＰ−ＢＳＰ表面は、低い（１００μＭ）濃度で直鎖状ＳＡＰ−ＢＳＰに匹敵する高い細胞AttoPhos応答を示した（図１５と図８の１００μＭのペプチド濃度に関するAttoPhos FIを比較）。これらの結果は、ある実施の形態において、両方のジスルフィド結合した環状と直鎖状のＢＳＰ結合ＳＡは未分化Ｈ７接着／増殖を支援でき、低いペプチド濃度では環状ＢＳＰのほうが高い細胞応答を示すことを示唆している。
【０１１９】
ある実施の形態において、本発明は、表面を有する基体；基体の表面に配置された膨潤性（メタ）アクリレート層であって、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー、架橋性（メタ）アクリレートモノマー、およびこのカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーと架橋性（メタ）アクリレートモノマーと重合できる親水性モノマーを含む組成物から形成された膨潤性（メタ）アクリレート層；および膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーから得られるカルボキシル基に結合されたペプチド；を備えた細胞培養器具を提供する。ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層は、約５％と約５０％の間または約１０％と約４０％の間の水中における平衡含水率を有する。ある実施の形態において、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーはアクリル酸２−カルボキシエチルである。ある実施の形態において、架橋性（メタ）アクリレートモノマーは、ジメタクリル酸テトラ（エチレングリコール）またはジアクリル酸テトラ（エチレングリコール）である。ある実施の形態において、親水性モノマーは、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、１−ビニル−２−ピロリドン、メタクリル酸ジ（エチレングリコール）エチルエーテル、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレート、および３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムからなる群より選択される。ある実施の形態において、架橋性（メタ）アクリレートモノマー対カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー対親水性モノマーの体積比は、約１〜１０対約１０〜４０対約６０〜９０である。または、ある実施の形態において、架橋性（メタ）アクリレートモノマー対カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー対親水性モノマーの体積比は、約３対２０対８０である。ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層は、ポリペプチド架橋剤を含まない。
【０１２０】
ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基含有モノマーから生じるカルボキシル基に結合されたペプチドは、YaalXaanArgGlyAspXaamYaal（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは０から４の整数であり、ｍは０から５の整数であり、ｌは０または１であり、各Xaaは独立して任意の天然または生体模倣のアミノ酸であり、Yaaは独立して任意の天然または生体模倣のアミノ酸であり、ペプチドが、膨潤性（メタ）アクリレート層の自由なカルボキシル基への求核付加反応を可能にする官能基を有するアミノ酸を少なくとも１つ含むという条件で、その自由なカルボキシル基は、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーから得られる。ある実施の形態において、Yaaはリジンを含む。
【０１２１】
追加の実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基含有モノマーから生じたカルボキシル基に結合されたペプチドは、YaalXaamZaaXaanArgGlyAspXaamBaa XaamYaal （配列番号３）のアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは０から４の整数であり、ｍは０から５の整数であり、ｌは０または１であり、各Xaaは独立して任意の天然または生体模倣のアミノ酸であり、ZaaおよびBaaの各々は独立して、ポリペプチドの環状部分を形成するようにそれぞれの側鎖の原子間に形成される共有結合を有する任意の天然または生体模倣のアミノ酸であり、Yaaは独立して任意の天然または生体模倣のアミノ酸であり、ポリペプチドが、膨潤性（メタ）アクリレート層の自由なカルボキシル基への求核付加反応を可能にする官能基を有する天然または生体模倣のアミノ酸を少なくとも１つ含むという条件で、その自由なカルボキシル基は、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーから得られる。ある実施の形態において、Yaaはリジンを含む。
【０１２２】
ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層のカルボキシル基含有モノマーから生じたカルボキシル基に結合されたペプチドは、LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr（配列番号４）；AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr（配列番号５）LysGlyGlyLys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17（配列番号６）、ここで、Lys4およびAsp17が一緒になってアミド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化させる；LysGlyGlyLys4GluProArgGlyAspThrTryArgAsp13（配列番号７）、ここで、Lys4およびAsp13が一緒になってアミド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化させる；LysGlyGlyCys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys17（配列番号８）、ここで、Cys4およびCys17が一緒になってジスルフィド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化させる；LysGlyGlyCys4GluProArgGlyAspThrTryArgCys13（配列番号９）、ここで、Cys4およびCys13が一緒になってジスルフィド結合を形成して、ポリペプチドの一部を環化させる；GlyArgGlyAspSerProLys（配列番号１１）；およびLysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSerSer（配列番号１２）を含む。
【０１２３】
ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層の厚さは均一である。ある実施の形態において、膨潤性（メタ）アクリレート層の厚さは約２マイクロメートル未満である。
【０１２４】
実施例１０：  倍加時間
上述した実施例４に記載されたように培養されたＨ７ヒト幹細胞を、酵素的継代培養手法（コラゲナーゼＩＶ処理）を用いて、４〜５日毎に（約７５％のコンフルエンシー）継代し、その後ＤＰＢＳで洗浄し、スクレーピングし、既知組成培地中に再懸濁させた。各継代で、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」表面で並行して培養した細胞に対する、細胞コロニー形態、細胞数、生存度およびｈＥＳＣ特異的マーカ発現プロファイルを評価した。各表面被覆上での倍加時間（ＤＴ）を以下の式を用いて評価した；ここで、ＤＴ＝時で表された倍加時間；Ｔ＝時で表された総培養時間；Ｄ0＝接種細胞密度およびＤ＝収穫時細胞密度：
式２：      ＤＴ＝Ｔlog2／logＤ−logＤ0
【０１２５】
図１６は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」（ＭＧ）表面、所定のＲＧＤ含有ペプチド（ＢＳＰ）（配列番号４）が結合したＳＡ１、およびリンカー（ＢＳＰ−ＰＥＯ4）NH2-PE04-AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr（配列番号５）によりＲＧＤ含有ペプチドと結合したＳＡ１上での動物由来成分を含まない既知組成培地条件下で培養された未分化Ｈ７ｈＥＳＣに関する倍加時間実験の結果を示している。手短に言えば、Ｈ７ｈＥＳＣを、既知組成培地（Ｘｖｉｖｏ１０＋ｂＦＧＦおよびＴＧＦｂ１）中において１０連続継代に亘り６ウェルプレート内のＳＡＰ−ＢＳＰまたはＢＳＰ−ＰＥＯ４結合ＳＡ上で培養した。「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆基体表面上で培養した細胞を陽性対照として用いた。各継代の際に、細胞の倍加時間、細胞の生存度およびＯｃｔ４ｈＥＳＣマーカーの発現（データは示さず）を評価した。ある実施の形態において、１０継代に亘る未分化幹細胞の培養は、これらの細胞の「長期培養」と考えられる。ある実施の形態において、５継代、７継代、１０継代、１１継代、１２継代、１３継代、１４継代、１５継代、１６継代、１７継代、１８継代、１９継代、２０継代またはそれより多くの細胞の培養が長期培養と考えられる。当業者には、培養中の細胞の個体群は、混合細胞種であっても、混合細胞種となってもよいが、細胞培養において十分な割合の細胞が、成功であると考えられる継代に亘り未分化状態のままでなければならないことが理解されよう。本発明の実施の形態において、継代は、未分化の細胞個体群と考えられるように、十分な割合の細胞を未分化状態に維持する、うまくいく継代である。
【０１２６】
ある実施の形態において、未分化幹細胞の単離された個体群を培養する方法であって、基体、この基体上に配置された合成高分子層、およびこの合成高分子層に結合されたペプチドを有する細胞培養器具を提供する工程であって、このペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含むものである工程；既知組成培地中で細胞培養器具の合成高分子層に結合したポリペプチド上の未分化幹細胞を培養し、少なくとも５継代、少なくとも１０継代またはそれより多くの継代に亘り培養中の細胞を維持する工程を有してなる方法が提供される。ある実施の形態において、既知組成培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子−β１を含む。ある実施の形態において、幹細胞は、ヒト幹細胞またはヒト胚性幹細胞であり、これは、Ｈ１またはＨ７ヒト胚性幹細胞であってよい。
【０１２７】
追加の実施の形態において、細胞の単離された個体群を培養する方法であって、基体、この基体上に配置された膨潤性（メタ）アクリレート層、およびこの膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されたペプチドを有する細胞培養器具を提供する工程であって、この膨潤性（メタ）アクリレート層が、カルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマー、架橋性（メタ）アクリレートモノマー、およびこのカルボキシル基含有（メタ）アクリレートモノマーと架橋性（メタ）アクリレートモノマーと重合できる親水性モノマーを含む組成物から形成されたものであり、前記ペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含むモノである工程；細胞を、細胞培養器具の膨潤性（メタ）アクリレート層に結合されたポリペプチドと接触させる工程；および既知組成培地中で細胞を培養して、培養中の細胞を維持する工程を有してなる方法が提供される。ある実施の形態において、細胞は、未分化の幹細胞、ヒト胚性幹細胞、あるいはＨ１またはＨ７細胞である。ある実施の形態において、前記方法は、既知組成培地中の追加の細胞培養器具上で細胞を５回以上継代する工程であって、５継代以上または１０継代以上の各々の後に、細胞の５０％以上が未分化状態のままである工程をさらに含む。ある実施の形態において、既知組成培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子−β１を含み、これらは、約８０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子および約０．５ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子ベータであってよい。
【０１２８】
図１６に示されるように、ＳＡＰ−ＢＳＰまたはＳＡＰ−ＢＳＰ−ＰＥＯ4表面上のＨ７ｈＥＳＣの倍加時間は、継代毎に劇的に変動した「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆表面上で培養した細胞の倍加時間と比べると、より一貫していた。これらの変動は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆表面のロット間と調製間(prep-to-prep)の非一貫性によるものであり得る。ＳＡＰ−ＢＳＰまたはＳＡＰ−ＢＳＰ−ＰＥＯ4表面上の平均細胞倍加時間は４１（±６）時間であるのに対し、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」上では、平均細胞倍加時間は５０（±１２）時間であり、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」表面上での高レベルの非一貫性を反映した。
【０１２９】
平均の細胞生存度およびＯｃｔ４−陽性細胞分画は、ＳＡＰ−ＢＳＰ表面および「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」表面上で同様であった：生存度については８６（±２）％、Ｏｃｔ４−陽性細胞分画については９２（±４）％。この結果は、ある実施の形態において、ＳＡＰ−ＢＳＰまたはＳＡＰ−ＢＳＰ−ＰＥＯ4表面は、細胞生存度または未分化状態に影響を与えずに、細胞倍加時間の一貫性を改善して、多数の継代を含む、未分化Ｈ７ｈＥＳＣの長期培養を支援できることを示唆している。
【０１３０】
実施例１１：  追加の細胞種のテスト
ヒト胚性幹細胞は培養するのが難しい。したがって、それらの細胞は、培養するのが難しい細胞のための適切な細胞培養条件を提供するための細胞培養表面の実施の形態の適用性を示すのに使用できるうまいモデルである。しかしながら、多くの細胞種は「固定法(anchorage)依存性」である。すなわち、多くの細胞は、長期の細胞培養において健全さを維持するために追加の細胞基質または血清を必要とする。理論により制限するものではなく、血清含有培地を必要とする接着性細胞について、その血清は、細胞培養に必要とされるマイトジェン因子（様々な増殖因子などの）に加え、様々な接着タンパク質を提供する。血清中に存在する接着タンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなどを含んでよい）は、プラスチック製細胞培養器上に吸収されて、接着性細胞のための付着表面を形成するであろう。この実施例は、本発明のペプチド結合（メタ）アクリレート被覆の実施の形態の用途が、幹細胞には制限されないことを示す。この実施例に報告されたデータは、本発明の合成ペプチド結合（メタ）アクリレート被覆の実施の形態が、血清含有培地または生物学的被覆の必要性を置き換えられることを示している。
【０１３１】
以下の実施例において、成人のヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）、心筋芽細胞（Ｈ７ヒト胚性幹細胞から分化された）、ヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）およびＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａを、本発明のペプチド結合（メタ）アクリレート細胞培養基体の実施の形態に対してテストした。
【０１３２】
実施例１２〜１７に提示した結果について、細胞は、実施例２によるAc-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGly AspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）（ＢＳＰ）が結合した実施例２および実施例１の配合物ＳＡ１から形成した表面上で培養した。細胞培養表面は、別記しない限り、実施例１に記載したように調製した。
【０１３３】
実施例１２：  骨髄由来ｈＭＳＣ細胞
骨髄由来ｈＭＳＣ（Lonza、カタログ番号ＰＴ−２５０１）を、１継代、組織培養処理済みＴ−７５フラスコ上で１０％のＦＢＳを含有する標準培地（LonzaからのＭＳＣＧＭ、カタログ番号ＰＴ−３００１）内で増幅させた。ｈＭＳＣ細胞は一般に、培地内で２〜１０％の血清を必要とする。８日目に、細胞をトリプシンで約８０〜９０％のコンフルエンシーで収穫し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、コーニングからのＴＣＴ−ＰＳ６ウェルプレートまたはAc-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2（配列番号４）−結合した配合物ＳＡ１の膨潤性（メタ）アクリレートが被覆された６ウェルプレートいずれかの上で７，０００細胞／ｃｍ2の密度で接種した。両方の系を、以下に記載する３つの異なる培地条件について研究した。  
１）  １０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補給されたｈＭＳＣ培養のための標準的な培地であるＭＳＣＧＭは、ｈＭＳＣのイン・ビトロ培養に使用した標準条件である。細胞培養処理済み培養器と共に使用した。  
２）  ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ−ＳＦＭ（Invitrogen、カタログ番号Ａ１０３３２−０１）、ｈＭＳＣ培養のために設計された無血清培地。これらの既知組成培地は、ＣｅｌｌｓｔａｒｔヒューマナイズドＥＣＭマトリクス（Invitrogen、カタログ番号Ａ１０１４２）と共に使用する必要がある。  
３）  Ｘｖｉｖｏ１０（Lonza、カタログ番号０４−７４３Ｑ）＋ＧＦ（ＧＦ、増殖因子−２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋０．５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ１）。
【０１３４】
細胞に、対応する培地を２〜３日毎に再度供給した。細胞接着／拡大、形態および増殖を毎日モニタした。７日目に、細胞をトリプシンで収穫し、ＴＢおよび血球計を用いて細胞計数を行った。１０％のＦＢＳを補給したＭＳＣＧＭは、プラスチック製培養器上でのｈＭＳＣのイン・ビトロ培養にとって標準的な培地であり、この研究の対照であった。ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ−ＳＦＭおよびＸｖｉｖｏ１０＋ＧＦ（Lonza）培地は、この分野に用いられる２つのよく知られた無血清の既知組成培地であるので、これらの培地を選択した。このＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ−ＳＦＭは、ｈＭＳＣの培養のために特別に設計されたものであり、専用の増殖因子などを含有する。ＳＡＰ−ＢＳＰ表面を、血清含有培地と既知組成培地の両方を用いてこれらの標準と比較した。
【０１３５】
図１７Ａ〜Ｃは、３つの異なる培地条件における、ＴＣＴと比較した本発明の実施の形態上でのｈＭＳＣ増殖を示す顕微鏡写真である。図１７Ａにおいて、ＳＡＰ−ＢＳＰ表面（上の画像）およびＴＣＴ（下の画像）上でｈＭＳＣを培養するために、ＭＳＣＭ＋１０％ＦＢＳ培地を用いた。ＭＳＣＭ＋１０％ＦＢＳは、臨床用途のためのｈＭＳＣの商業的培養に用いられる標準的な培地条件を表す。真ん中の画像である図１７Ｂにおいて、ＭＳＣ＋ＳＦＭは、増殖因子の専用の混合物を含有するｈＭＳＣ培養のためのInvitrogen社により市販されている特別な培地であるＳｔｅｍＰｒｏである。図１７Ｃにおいて、Ｘｖｉｖｏ＋ＧＦを用いた。この培地の組合せは、実施例４に記載されたようにｂＦＧＦおよびＴＧＦｂ１が補給されたＸｖｉｖｏ基礎培地を含む。
【０１３６】
図１７Ａは、１０％ＦＢＳ補給ＭＳＣＭ培地において、ｈＭＳＣ細胞が、ＴＣＴ上および本発明のＳＡＰ−ＢＳＰ表面の実施の形態上で同様に見えることを示している。図１７ＢおよびＣは、ＦＢＳが含まれない状況において、本発明の合成膨潤性（メタ）アクリレート表面のＳＡＰ−ＢＳＰ実施の形態が、ＴＣＴ表面よりも良好な細胞増殖を提供することを示している。図１７ＢおよびＣは、７日目の全ての細胞条件での形態および細胞数を示している。ＢＳＰ−アクリレート表面上の細胞数は、両方の無血清条件についてＴＣＴ上よりも著しく多く、Ｘｖｉｖｏ＋ＧＦ条件の細胞数は、１０％ＦＢＳ条件の細胞数を超えている。その上、両方の表面について、無血清条件と比較して、１０％ＦＢＳ培地において初期の細胞付着と広がり（２〜２０時間）は、より効率的であった。後の時間で（３〜７日目）、無血清条件下でのＢＳＰ−アクリレート表面上の細胞生存／増殖は、ＴＣＴ上よりも高かった。本発明の実施の形態は、無血清培地におけるｈＭＳＣの培養を可能にできる。
【０１３７】
図１８は、先に定義したような、異なる既知組成培地条件における７日後のＴＣＴおよびＢＳＰ−アクリレート上のｈＭＳＣ細胞数の比較を示した棒グラフである。両方の表面ともＦＢＳの存在下では同等に機能しているが、ＳＡＰ−ＢＳＰ（ＢＳＰペプチドアクリレート）表面は、ＦＢＳのない状況下で、ＴＣＴと比べて著しく改善された細胞培養表面を提供する。
【０１３８】
実施例１３：  Ｈ７ｈＥＳＣ細胞
上述した実施例において、ｈＥＳＣのイン・ビトロ増幅についてペプチドに結合した膨潤性（メタ）アクリレート表面の実施の形態の使用を記載した。この実施例においては、追加のデータは、ｈＥＳＣ細胞の長期のイン・ビトロ増幅に関するＳＡＰ表面の実施の形態の使用を示している。Ｈ７ｈＥＳＣについてのデータが示されているが、同様の結果で、これらの表面上でＨ１ｈＥＳＣ細胞株も増幅された。実施例４に提示された培地条件におけるＢＳＰ結合表面および「ＭＡＲＩＧＥＬ」被覆表面上のＨ７細胞に関する倍加時間の比較が図１９に示されている。このデータは、合成ＳＡＰ表面が、細胞培養性能において、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」被覆と匹敵するかまたはそれより良好であることを示している。その上、ＢＳＰ結合アクリレート表面上で培養した細胞が、フローサイトメトリー分析（図２０）により決定されるように、ｈＥＳＣ特異的マーカーの「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」発現と同様であることを示した。
【０１３９】
実施例１４：  フローサイトメトリー
各継代の終わりに、合成表面または「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」上で培養したＨ７ｈＥＳ細胞を、フローサイトメトリーを用いて、ｈＥＳＣマーカー発現について分析した。染色手法の全ては４℃で行った。手短に言えば、各サンプルについて、５×１０5細胞（Ｏｃｔ４については固定化し、パーミビアライズし(permibialized)、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、およびＳＳＥＡ４マーカーについて生きている細胞）を５０マイクロリットルの遮断溶液（ＤＰＢＳ中の１０％のＨＩヤギ血清）中に再懸濁させ、１５分間培養し、その後、遮断緩衝液中のマーカー特異的一次抗体（０．５マイクログラム／サンプル）または対応するアイソタイプ対照（０．５マイクログラム／サンプル）５０マイクロリットルを加えた。２ｍｌの染色緩衝液（ＳＢ）（BD Biosciencesから）で洗浄した後、細胞を、光から保護して、３０分間に亘りＳＢ中の対応する二次抗体（０．２５マイクログラム／サンプル）と共に培養した。ＳＢで洗浄した後、細胞を、生存度評価のために５分間に亘りＰＩ（ＳＢ中２マイクログラム／ｍｌ）で染色した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）を用いて、各サンプルについて３０，０００回のゲートイベント（ゲートは、ＰＩ陰性の生存細胞個体群について定めた）を得た。全ての分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（BD）を用いて行った。結果が図２０に示されている。結果は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」表面とＳＡＰ−ＢＳＰ合成表面上で、ｈＥＳＣ特異的マーカーの発現が非常に似ていることを示した。
【０１４０】
実施例１５：  Ｈ７ｈＥＳＣの心筋芽細胞への分化
ＢＳＰ結合膨潤性（メタ）アクリレートの実施の形態上の未分化ｈＥＳＣの培養が、実施例１３に開示された。この実施例においては、これらの細胞の心筋芽細胞への分化のための同じ表面の使用が開示されている。幹細胞由来心筋芽細胞は、任意の適切な方法によって得てもよい。当業者には、この部類のペプチド結合（メタ）アクリレートは、ｈＥＳＣ細胞の、膵臓島細胞、神経細胞、骨形成原細胞などの他の系統への分化を可能にするために使用できるのが理解されよう。
【０１４１】
Laflamme et al., “Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rats, Nature Biotechnology, 25: 1015 - 1024 (2007)には、培養においてｈＥＳＣを分化させる方法が記載されている。手短に言えば、女性のＨ７ヒト胚性幹細胞株由来のものなどの未分化のヒト胚性幹細胞を、約１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で「ＭＡＴＲＩＴＥＬ」被覆プレート上に接種し、毎日、ｈＥＳ細胞増殖培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ＋２０％血清置換、１ｍＭの１−グルタミン、１％のＮＥＡＡ、０．１ｍＭの２−ＭＥ＋８０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦおよび０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦｂ１）を再度供給してよい。分化を誘発するために、ＫＯ−ＳＲを、約２４時間に亘り、約１００ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えアクティビンＡ（R&D Systemsから得られる）が補給されたＲＰＭＩ−Ｂ２７培地（Invitrogenから得られる）と置き換え、その後、７２時間に亘り１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えＢＭＰ４（R%D Systemsから得られる）と置き換えてもよい。もちろん、任意の他の適切な方法を利用してもよい。
【０１４２】
既知組成培地中の合成ＳＡＰ−ＢＳＰ表面上でのｈＥＳＣの長期培養後、細胞はまだ、治療の関心のある細胞種に分化する能力を維持している。Ｈ７細胞を１０継代に亘りＳＡＰ−ＢＳＰ表面上で培養し、次いで、同じＳＡＰ−ＢＳＰ表面を用いて、心筋芽細胞（ＣＭ）に分化させた。LaFlamme（前出）の直接分化プロトコルを用いた。手短に言えば、Ｈ７細胞を最初に、「ノックアウト血清リプレースメント」培地（ＫＯ−ＳＲ）［ＫＯ−ＤＭＥＭ（Invitrogen、＃１０８２９０１８）；２０％ＫＯ−ＳＲ（Invitrogen、＃１０８２８−０２８）；１％非必須アミノ酸（Invitrogen、＃１１１４０−０５０）；１ｍＭのＬ−グルタミン；０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノール；８０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦおよび０．５ｎｇ／ｍｌのｈＴＧＦ−β１（R&D Systems、＃２３４０ＦＳＥ／ＣＦおよび＃２４０−Ｂ）］中で１０〜１４日間に亘り調整した。後融合性(post-confluent)細胞単層の形成後、ＣＭ分化を、Ｂ２７（Invitrogen、＃１７５０４０４４）が補給されたＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen、＃１１８７５）内で以下の組み換え増殖因子の連続添加により誘発した：２４時間に亘りヒトアクティビンＡ−１００ｎｇ／ｍｌ（R&D Systems、＃３３８−ＡＣ−ＣＦ）、その後、７２時間に亘りヒトＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）−１０ｎｇ／ｍｌ（R&D Systems、＃３１４−ＢＰ−ＣＦ）。次いで、細胞をＲＰＭＩ  １６４０−Ｂ２７培地中で追加の２週間に亘り回復させた。培養液中に鼓動するＣＭが観察されるまで、培地を２〜３日毎に交換した。
【０１４３】
実施例１６：  心筋芽細胞（Ｈ７ヒト胚性幹細胞から分化した）
情報と信念に基づいて、生理学的に適切な（機能的な）心筋芽細胞へのｈＥＳＣ分化についての全ての発行された報告では、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」または他のＥＣＭタンパク質により被覆された基体が必要とされる。本実施例に報告されたデータは、ＳＡＰ−ＢＳＰ合成ＲＧＤ含有ポリペプチド結合膨潤性（メタ）アクリレート表面を含む、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態が、生物学的被覆により被覆された２Ｄ／３Ｄ足場の必要性を置き換えることができることを示している。
【０１４４】
ＣＭマーカー評価について、分化された細胞は、６ウェルプレート上に固定され、Ｎｋｘ２．５／α−アクティビン二重免疫染色（図２１Ａに示されている）のために処理されたか、または収穫され、固定され、α−アクティビン（図２１Ｂ）またはＮｋｘ２．５（図２１Ｃ）フローサイトメトリー分析のために処理された。これらの結果は、既知組成培地中のＳＡＰ−ＢＳＰ合成表面上での未分化Ｈ７ｈＥＳＣの長期の培養（１０＋継代）後に、細胞をまだ心筋芽細胞に分化できることを示している。分化効率は、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」表面について見られたもの（データは示さず）と非常に似ていた。また、このデータは、ｈＥＳＣの心筋芽細胞への直接分化について現在用いられている「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」を置換するのにＳＡＰ−ＢＳＰ表面が使用できることを示唆している。
【０１４５】
実施例１７：  ＨＴ１０８０細胞
この実施例において、ＨＴ１０８０細胞を用いて、この部類の合成ペプチド結合（メタ）アクリレート被覆が、生物学的被覆または血清含有培地を必要とする任意の細胞種のための適切な細胞培養表面を提供できることを示す。
【０１４６】
ペプチド結合アクリレート表面の万能性を示すために、ヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞の培養を選択した。ＨＴ１０８０細胞は、血清含有培地において日常的に増殖される。この細胞種の増殖のためのＡＴＣＣ推奨のプロトコルは、１０％ウシ胎仔血清が補給されたＡＴＣＣ配合のイーグル最小必須培地（カタログ番号２０−２００３）を必要とする。血清内の接着タンパク質がこれらの細胞のプラスチック表面への付着を促進させると考えられる。
【０１４７】
この実施例に関して、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−１２１）細胞を、組織培養処理済みＴ１５０フラスコ（ＴＣＴ、コーニング、４３０８２５）内で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Lonza、１４−５０２Ｆ）を含有するイスコヴ変更ダルベッコ培地（ＩＤＭ、Lonza、１２−７２２Ｑ）内で７０％のコンフルエンシーまで増殖させた。細胞培地を、細胞の収穫前に１日間に亘り血清含有（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ）培地または無血清（ＩＭＤＭ）培地のいずれかで７０％のコンフルエンシーまで補充した。細胞を０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibso/Invitrogen、２５３００）により１００％のコンフルエンシーで収穫し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Gibco/Invitrogen、１４１９０）で２回洗浄した。細胞を、以下の９６ウェルプレート上に、血清含有ＩＭＤＭまたは無血清ＩＭＤＭ（＋１６ｎｇ／ｍＬ  組み換えヒトＦＧＦ基礎（R&D Systems、２３４−ＦＳＥ／ＣＦ）および＋０．５ｎｇ／ｍＬ  組み換えヒトＴＧＦ−β１（R&D Systems、２４０−Ｂ−００２））いずれか内に２５，０００細胞／ｃｍ2の密度で接種した：ＴＣＴ−ＰｏｌｙＳｔｙｒｅｎｅ（ＴＣＴ−ＰＳ、コーニング、３６０３）、膨潤性（メタ）アクリレート（ＳＡ１）被覆Ｘｅｎｏｒ、およびＳＡＰ−ＢＳＰ被覆Ｘｅｎｏｒ。２〜３日毎に、細胞に対応する培地を再度供給した。細胞の接着／広がり、形態および増殖を毎日モニタした。細胞増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Promega、Ｇ３５８Ｂ）を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって、２日目（血清含有）および５日目（無血清）に、細胞コンフルエンシーでの各表面での相対的な細胞数を評価した。図２２は、血清の存在下（Ｓ、黒い棒線）および血清の不在下（ＳＦ、白い棒線）で、ＴＣＴ、ＳＡ１（メタ）アクリレート被覆およびＳＡＰ−ＢＳＰ結合被覆上のＨＴ−１０８０細胞の細胞定量データを比較した棒グラフである。図２３は、血清の存在下と不在下でのＴＣＴおよび（メタ）アクリレート被覆およびＢＳＰ結合被覆上のＨＴ−１０８０細胞の形態を比較した顕微鏡写真を示している。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒアッセイからのデータが図２２に示されており、セル形態の比較が図２３に示されている。ＴＣＴ−ＰＳはプラズマ処理ＴＣＴ表面である。ＳＡ１は表１からのＳＡ１配合物である。ＳＡＰ−ＢＳＰは、ＢＳＰ−ペプチド結合（配列番号４）ＳＡ１配合物である。最初の３つの画像は、無血清条件であり（ＳＦ、５日目）、最後のパネルは２日目の血清の存在下である。このデータは、ＨＴ−１０８０細胞の細胞培養のためのＲＧＤポリペプチド結合膨潤性（メタ）アクリレート被覆を使用する実行可能性を示している。ＨＴ−１０８０は、付着目的のために血清を使用する必要のある操作された細胞株の代表である。
【０１４８】
実施例１８：  ラミニンポリペプチドを結合したＳＡＰ層へのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の付着
ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１０７４１）を、９６ウェルフォーマットでＳＡＰ表面、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩおよびＣｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標）処理Ｔｏｐａｓ（商標）上で三重に１００μｌ培地中にウェル当たり２５，０００細胞で平板培養し、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen、＃１５１４０−１５５）を補給したイーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ、＃３０−２００３）中で培養した。培養培地には、ウシ胎仔血清（細胞株の供給業者が推奨するような）も補給せず、ウシ胎仔血清に露出されたＳＡＰ表面でもなかった。培養プレートを２４時間に亘り５％のＣＯ2および９５％の相対湿度において３７℃で培養した。ＳＡ表面を有する細胞培養プレートは、実施例１に記載されたように調製した。ペプチドは実施例２にしたがって結合した。ＳＡ層に結合したポリペプチドが表５に列記されている。Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ（図２４参照）と比べて７５％より良好な付着結果を示すポリペプチドは、には、表６においてアスタリスクが付けられている。図２４の線は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ上の細胞の７５％の性能を示している。
【表６−１】
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【表６−２】
0005501981.tif 000012
【０１４９】
ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の付着は、培養表面に付着した生存細胞の数を概算する細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ＃Ｇ１７８０）を用いて決定した。培養の２４時間後、細胞をリン酸緩衝液で激しく洗浄し、溶解緩衝液の導入により溶解させ、１時間に亘り３７℃で培養して、培養表面に付着したままの生存細胞から乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を放出した。放出された乳酸脱水素酵素の生物活性を、プレートリーダ（PerkinElmerからのＶｉｃｔｏｒ３）を用いて４９０ｎｍでの吸光度により測定した。
【０１５０】
ＳＡＰ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉおよび「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」処理「Ｔｏｐａｓ」上の生存細胞の概算数の比較が図２４に示されている。細胞培養表面の比較により、ラミニンペプチド配列KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS（配列番号１３）、KGGTWYKIAFQRNRK（配列番号１６）、KYGSETTVKYIFRLHE（配列番号１９）、およびKYGKAFDITYVRLKF（配列番号２１）を有するコーニングＳＡＰが、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの７５％以上であり、「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」処理「Ｔｏｐａｓ」より多く、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の無血清付着を支援することが示された。その上、コーニングＳＡＰ上で培養されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞は、Ｖｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ上で培養した細胞と同様の細胞形態を示した。
【０１５１】
それゆえ、既知組成培地中で細胞を培養するための合成表面の実施の形態が開示されている。当業者には、ここに記載されたアレイ、組成物、キットおよび方法は、開示された実施の形態以外の実施の形態により実施できることが理解されよう。開示された実施の形態は、説明の目的であって制限を目的とするものでなく提示されている。
【符号の説明】
【０１５２】
１０    基材または基体
２０    ＳＡ層または被覆
３０    中間層
５０    ウェル
５５    側壁
７０    ポリペプチド
８０    リンカー
１００    器具
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
0005501981.tif 000018
【図４】
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【図５】
0005501981.tif 000020
【図６】
0005501981.tif 000021
【図７Ａ】
0005501981.tif 000022
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
0005501981.tif 000027
【図１０Ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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