(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列
0003670666.tif 000037
を有し、システインプロテアーゼ活性を有する組換えカテプシンタンパク質。
【請求項２】
ヘテロローガスなポリペプチドに融合した、請求項１記載の 組換えカテプシンタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された組換えカテプシンタンパク質を含む組成物であって、コラーゲンの分解、細胞外マトリックスの溶解、カテプシンＯ２プロテアーゼ阻害剤またはシステインプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングのための組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はカテプシンO2タンパク質、核酸および抗体に関する。
発明の背景
カテプシンはシステインプロテアーゼのパパイン・スーパーファミリーに属する。システインまたはチロールプロテアーゼはタンパク質加水分解に寄与する活性部位にシステイン残基とヒスチジンおよびアスパラギンを含有する。このスーパーファミリーはオキシアニオン孔にグルタミンをも持つ。
最近の研究によって、システインプロテアーゼはDNAに結合して転写因子活性を持つと推定されており（Xuら, J. Biol. Chem. 269（33）: 21177-21183（1994））、長期免疫抑制因子である（Hamajimaら, Parasite Immunology 16: 261（1994））と目されている。
現在までのところ、数種類の動物からいくつかのカテプシンが同定され、配列決定されている。例えばカテプシンSはラット（Petanceskaら, J. Biol. Chem. 267: 26038-20643（1992））、ウシ（Wiederandersら, FEBS Lett. 286: 189-192（1991））およびヒト（Widerandersら, J. Biol. Chem. 267: 13708-13713（1992）； Shiら, J. Biol. Chem. 267: 7258-7262（1992））からクローン化されている。カテプシンLはヒト、ラット、マウスおよびニワトリからクローン化されている（Galら, Biochem. J., 253: 303-306（1988）; Ishidohら, FEBS Lett. 223: 69-73（1987）; Josephら， J. Clin. Invest. 81: 1621-1629（1988）; Ritonjaら, FEBS Lett. 283: 329-331（1991））。カテプシンHはヒトとラットからクローン化されている（Fuchsら, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369-375（1988）; Fuchsら, Nucleic Acid Res. 17: 9471（1989）; Whittierら, Nucleic Acid Res. 15: 2515-2535（1987））。カテプシンBはヒトとマウスからクローン化されている（Ferraraら, FEBS Lett. 273: 195-199（1990）; Chanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7721-7725（1986））。
ウサギ破骨細胞由来のシステインプロテアーゼが最近クローン化されたが、これはカテプシンLおよびSと構造的に関係する（Tezukaら, J. Biol. Chem. 269（2）: 1106（1994））。
カテプシンは広範囲にわたる様々な組織中に天然に認められる。例えばカテプシンLは心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、肝臓、精巣および膵臓を含む組織中に認められる。カテプシンSは肺、肝臓、脾臓および骨格筋に認められる。
カテプシンはいくつかの疾患状態に関連付けられている。例えばカテプシンBおよびLに類似する酵素が腫瘍から放出され、これらは腫瘍転移に関係すると思われる。カテプシンLは病気にかかったヒト滑液と形質転換した組織中に存在する。さらに、カテプシンBと他のリソソームプロテアーゼの多形核顆粒球およびマクロファージからの放出は外傷と炎症に認められる。カテプシンは関節炎に関連付けられている。さらにいくつかの腫瘍細胞系にはカテプシンが異常に多量に認められる。
システインプロテアーゼは骨の再構築にも関連付けられている。骨再構築は骨形成と骨再吸収をつなぐ過程であり、骨成長の一部である。骨再吸収には細胞外マトリックスタンパク質の分解と脱塩が含まれる（Delaisseら, Biochem. J. 279: 167-174（1991））。Ｉ型コラーゲンは有機マトリックスの95％を構成する（Kraneら, Scientific American Medicine, Rubensttein, E.およびFederman, D.D. 編,第3巻,「15リウマチ， XI骨の形成と再吸収」，1-26頁,Scientific American, Inc.,ニューヨーク）。間質性コラーゲナーゼに加えて、リソソームシステインプロテアーゼであるカテプシンBおよびLが破骨細胞骨再吸収に関与すると考えられている（Delaisseら, 1991,上記）。両酵素はリソソーム内に存在すると共に、破骨細胞の酸性化した細胞外再吸収窩中にも存在し（Gotoら, Histochemistry 99, 411-414 （1993））、両プロテアーゼは酸性pHでコラーゲンＩ型を分解する能力を試験管内で発揮する（Maciewiczら, Collagen Rel. Res. 7, 295-304（1987）; Delaisseら, 1991,上記）。E-64やロイペプチンのようなシステインプロテアーゼ阻害剤は破骨細胞骨再吸収を防止することが示されている（Delaisseら, Bone 8, 305-313（1987）; Evertsら, Calcif. Tissue Int. 43, 172-178（1988））。カテプシンLは骨中のコラーゲン分解に関与する主要なプロテアーゼの1つであると見なされている（Maciewieczら, Biochem. J. 256, 433-440（1988）; Kakegawaら, FEBS Lett. 321, 247-250（1993））。
骨物質の固体状態はヒドロキシアパタイトと他のカルシウム−リン酸骨塩の生理学的pHにおける低い溶解性によっているが、骨は酸性pHでは分解しうる。
破骨細胞は骨再吸収に重要な役割を果たす多核細胞である。骨表面に結合した破骨細胞は、特殊化した破骨細胞境界膜と骨マトリックスの間の強固に限定された接合部に酸性微細環境を作り、骨マトリックスの局在化した可溶化を可能にする。続いてこれは脱塩された骨コラーゲンのタンパク質加水分解を促進する。
Zn含有コラーゲナーゼが脱塩されたマトリックスと塩化されたマトリックスの間の界面に位置する中性環境でより活性であるのに対して、システインプロテアーゼのコラーゲン分解作用は、波立った境界に近い骨再吸収窩の最も酸性（3.5または4.5付近のpH）な部分に選択的に発揮されると考えられている（Delaisseら, 1991,上記）。カテプシンLおよびBの他にも様々なカテプシンL-およびB-様活性がコラーゲン分解的骨分解に関与しうる。Pageら（Biochim. Biophys. Acta 1116, 57-66（1992））は複数の形態のカテプシンBを破骨細胞腫から単離した。これらは酸性pH至適条件と可溶性および不溶性Ｉ型コラーゲン分解能を持つ。Delaisseら（1992,上記）は骨組織中に70kDaチオール依存性プロテアーゼを同定したが、これもＩ型コラーゲンを分解することができる。
システインプロテアーゼ阻害剤はコラーゲン繊維の分解を阻害することによって破骨細胞骨再吸収を阻害することが示されている。カテプシンB、L、NおよびSは酸性pHでＩ型コラーゲンを分解することができる。3つのカテプシン型プロテアーゼがマウスの頭蓋冠から単離されており、これらはカテプシンL-様プロテアーゼならびにカテプシンBおよびLと推定されている（Delaisseら, Biochem. J. 279: 167（1991））。しかしどのシステインプロテアーゼが破骨細胞によって実際に生産されるのかは未だに不明である。
最近、新しいヒトシステインプロテアーゼをコード化するcDNAがいくつかのグループにより独立してクローン化され（Shiら, FEBS Lett. 357, 129-134（1995）; Inaokaら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 89-96（1995）; BrommeおよびOkamoto, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376, 379-384（1995））、それぞれカテプシンO、カテプシンKおよびカテプシンO2と命名された。
発明の要約
本発明の目的は新しいクラスの組換えカテプシンすなわちカテプシンO2とその変種を提供し、組換えDNA技術を用いてこれらカテプシンO2タンパク質の有用量を生産することである。
また、カテプシンO2タンパク質をコード化する組換え核酸と、カテプシンO2タンパク質をコード化する核酸を含有する発現ベクターと宿主細胞を提供することも本発明の目的である。
本発明のもう1つの目的は、カテプシンO2の存在を検出し、カテプシンO2に関連する状態を診断するためのポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、カテプシンO2タンパク質の生産法を提供することである。
上述の目的に即し、本発明は組換えカテプシンO2タンパク質と、本発明のカテプシンO2タンパク質をコード化する単離された核酸または組換え核酸を提供する。また、転写および翻訳制御DNAに機能的に連結したカテプシンO2タンパク質コード化DNAを含む発現ベクターと、その発現ベクターを含有する宿主細胞をも提供する。
さらに本発明はもう1つの側面として、発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、カテプシンO2タンパク質をコード化する核酸の発現を引き起こすことによって組換えカテプシンO2タンパク質を生産することからなるカテプシンO2タンパク質の生産法を提供する。
本発明はさらなる側面として、カテプシンO2タンパク質に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
図1Aと1BはヒトカテプシンO2 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号1）と推定アミノ酸配列（配列番号2）を表す。アミノ酸配列（配列番号2）はヌクレオチド配列（配列番号1）の下に1文字コードで示してある。活性部位残基（C25、H159およびN175；パパイン番号法）を太字で示し、潜在的N-グリコシル化部位に一重下線を付す。矢印はプレシグナルとプロ領域の間ならびにプロ領域と成熟酵素の間の推定翻訳後切断部位を示す。プロ領域と成熟タンパク質の間の切断はタンパク質配列決定によって確認した（二重下線部）。
図2Aと2BはヒトカテプシンO2（配列番号2）とヒトカテプシンS（配列番号4）、ヒトカテプシンL（配列番号5）およびウサギ0C2.（配列番号3）＊活性部位残基の複数アミノ酸配列照合である。太字はパパインファミリーの既知の全システインプロテアーゼ中に保存されている残基を表す。6種のプロテアーゼすべてに共通なアミノ酸を共通配列中の大文字で表し、6種類中5種類で共通なアミノ酸を小文字で表す。ギャップをハイフンで表す。数字は各行の最後のアミノ酸位置を示し、矢印は推定翻訳後切断部位を示す。
図3はプロカテプシンO2のペプシンによる成熟を表す。プロカテプシンO2を含有する培養上清の一部を100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）中でペプシン（0.4mg/mL）と共に40℃でインキュベートした。試料緩衝液の添加によってそのインキュベーションを停止した。消化の時間は示した通りである。分子質量標品（kDa）を左余白に示す。
図4は精製した組換えヒトカテプシンO2のSDS-PAGEを表す（クーマシーブルー染色）。レーン1は粗Sf9画分；レーン2はn-Butyl Fast Flowに通した後；レーン３はMono Sに通した後。分子質量標品を右側のレーンに示す。
図5は組換えヒトカテプシンO2のpH−活性特性図である。Z-FR-MCA加水分解の初速を測定し、酵素および基質濃度で割ることによってkcat/Km値を得た。
図6はカテプシンO2、S、LおよびBによるZ-X-R-MCAの加水分解に関するkcat/Km値を表す（最適基質=1に規格化）。カテプシンO2（Z-LR-MCA）257,900M-1s-1；カテプシンS（Z-LR-MCA）243,000M-1s-1；カテプシンL（Z-FR-MCA）5,111,000M-1s-1；カテプシンB（Z-FR-MCA）460,000M-1s-1（カテプシンS、LおよびBに関するデータはBrommeら, 1994による）。
図7は、pH4.5、5.5および7.0における組換えヒトカテプシンO2のエラスチン分解活性をカテプシンSおよびLならびに膵臓エラスターゼと比較したものである。基質は3H-標識不溶性エラスチンである。
図8は破骨細胞腫調製物中のヒトカテプシンO2、LおよびSのノーザンブロット分析を表す。レーン1は患者（繊維および細胞組織）；レーン2は患者2（細胞組織）；レーン3は患者2（繊維組織）。ニトロセルロースブロットをカテプシンO2、LおよびSの32P-標識プローブとハイブリッド形成させた。
図9Aと9Bは、組換えヒトカテプシンO2およびLならびにウシトリプシンで消化した後のＩ型コラーゲン（可溶性ウシ皮膚コラーゲン）のSDS-PAGEを表す。図9A：コラーゲナーゼ活性：28℃、pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0におけるヒトカテプシンO2、SおよびL（各50nM）による可溶性ウシ皮膚コラーゲンの12時間消化。10μM E-64の添加によって反応を停止した。未処理の可溶性コラーゲンを標品として使用した（S）。図9B：ゼラチナーゼ活性：28℃、pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0におけるヒトカテプシンO2（0.1nM）、カテプシンL（0.2nM）およびヒトカテプシンS（1nM）による変性した可溶性ウシ皮膚コラーゲン（70℃で10分間加熱）の消化。分子質量標品を左側のレーンに示す。
図10はヒトカテプシンO2のプロ部分精製のSDS-PAGEを表す。
図11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11Kおよび11Lはヒト組織中のヒトカテプシンO2の免疫組織化学的染色を表す。（A）破骨細胞腫、（B）肺マクロファージ、（C）細気管支、（D）子宮内膜、（E）胃、（F）結腸、（G）腎臓、（H）胎盤、（I）肝臓、（J）卵巣、（K）副腎、（L）精巣。
発明の詳細な説明
本発明は新規カテプシンO2タンパク質と核酸を提供する。
本発明のカテプシンO2タンパク質はいくつかの方法で同定できる。カテプシンO2核酸またはカテプシンO2タンパク質はまず図1に示す配列への本質的な核酸および/またはアミノ酸配列相同性によって同定される。そのような相同性は全核酸またはアミノ酸配列に基づきうる。
本発明のカテプシンO2タンパク質は他のカテプシンに対して限定された相同性を持つ。例えば成熟ヒトカテプシンO2は成熟ヒトカテプシンLに対しておおよそ59％相同であり、成熟ヒトカテプシンSに対して58％相同、成熟ヒトカテプシンBに対して26％相同、成熟ヒトカテプシンHに対して47％相同である。さらに、ヒトカテプシンO2のプロ部分はヒトカテプシンLのプロ部分に対して38％相同であり、ヒトカテプシンSのプロ部分に対して51％相同、ヒトカテプシンBのプロ部分に対して13％相同、ヒトカテプシンHのプロ部分に対して23％相同である。さらにヒトカテプシンO2タンパク質はウサギ破骨細胞タンパク質に対しておよそ90％相同である。
本明細書においては、図１に示すアミノ酸配列に対するタンパク質配列の全相同性が好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、最も好ましくは98％以上であるならば、そのタンパク質を「カテプシンO2タンパク質」であるとする。この相同性は、Devereuxら, Nucl. Acid Res. 12: 387-395（1984）に記載のBest Fit配列プログラムのような当該技術分野で知られる標準的な技術を用いて決定される。照合の際には照合する配列にギャップを導入してもよい。さらに図1に記載のタンパク質よりアミノ酸が多い配列や少ない配列については、アミノ酸の総数に対する相同なアミノ酸の数に基づいて相同性率が決定されると理解される。したがって、例えば図1に記載の配列より短い配列の相同性は、後述のように、短い配列中のアミノ酸数を用いて決定されるだろう。
好ましい態様では、本発明のカテプシンO2タンパク質がヒトカテプシンO2タンパク質である。
本発明のカテプシンO2タンパク質は図1に示すアミノ酸配列より短くてもよい。実施例２に示すように、ヒトカテプシンO2タンパク質はカテプシンBやSあるいはパパインに認められるような翻訳後プロセシングを受けうる（Brommeら, J. Biol. Chem. 268: 4832-4838（1993）; Vernatら, J. Biol. Chem. 266: 21451-21457（1991）; Rowanら, J. Biol. Chem. 267: 15993-15999（1992））。カテプシンO2タンパク質は、従来のプレ配列、プロ配列または「プロ部分」および成熟タンパク質を伴うプレプロタンパク質として生産される。これらは、プレ、プロおよび成熟コード配列を含めて、図１のヒトカテプシンO2配列に示されている。プレ配列は図1に示す配列の最初の15アミノ酸からなり、プロ部分はアミノ酸16からアミノ酸114に及び（98アミノ酸）、成熟タンパク質は位置115から329に及ぶ（215アミノ酸）。プロ配列またはプロ部分は、この酵素がおそらくはpH変化の結果として活性化されるまで、この酵素の阻害因子として機能すると考えられる。プロ部分のタンパク質加水分解プロセシングは、パパイン（Vernetら,上記）、カテプシンSおよびカテプシンLについては、自己タンパク質加水分解的である。カテプシンO2の定義にはプレプロカテプシンO2、プロカテプシンO2、成熟カテプシンO2および成熟カテプシンO2から分離したプロ部分が包含される。
好ましい態様では、図1に示す配列の一部または断片もカテプシンO2タンパク質の定義に包含される。ある態様では、その断片が約40から200アミノ酸の範囲にある。好ましくはそれらの断片がTezukaら（上記）のウサギ破骨細胞タンパク質と同一ではなく、ヒトカテプシンO2タンパク質に対して少なくとも約95〜98％相同である。好ましい態様として、カテプシンO2タンパク質を例えば診断用の抗体の作成に使用する場合、そのカテプシンO2タンパク質は図1に記載のプロ部分または成熟タンパク質と少なくとも1つのエピトープまたは決定基を共有しなければならない。「エピトープ」または「決定基」という用語は、本明細書において、抗体を生成させ、抗体を結合するタンパク質の一部を意味する。したがってほとんどの場合、より小さいカテプシンO2タンパク質に対して作成した抗体が全長タンパク質に結合することができるだろう。好ましい態様として、抗体をユニークなエピトープに対して生成させる。つまり、その抗体は他のタンパク質（他のカテプシンタンパク質など）や他の生物由来のカテプシンに対する交差反応性をほとんど示さないか、もしくは全く示さない。
核酸の場合、核酸配列の全相同性はアミノ酸相同性に相応するが、遺伝コードの縮重と異なる生物のコドン偏向を考慮する。したがって、核酸配列相同性はタンパク質配列の相同性より低い場合もあるし、高い場合もある。つまり、図1の核酸配列と比較した核酸配列の相同性は好ましくは65％以上、より好ましくは約75％以上、最も好ましくは85％以上である。いくつかの態様では、相同性が約95〜98または99％の高さになるだろう。
ある態様では、核酸相同性をハイブリッド形成研究によって決定する。つまり、例えば高い厳密性で図1に記載の核酸配列とハイブリッド形成する核酸をカテプシンO2遺伝子であると見なす。高厳密条件は一般に37〜65℃で0.1×SSCである。
もう1つの態様では、より低い厳密条件を用いる。例えば低厳密条件は一般に2×SSCと0.1％SDSである。
本発明のカテプシンO2タンパク質および核酸は好ましくは組換え体である。本明細書において「核酸」とはDNAまたはRNA、あるいはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する分子を意味しうる。核酸にはゲノムDNA、cDNAならびにセンス核酸とアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドが包含される。アンチセンス核酸は特に核酸の定義に包含される。アンチセンス核酸は図1に記載の核酸配列の対応する非コード鎖にハイブリッド形成するが、デオキシリボヌクレオチドばかりでなくリボヌクレオチドを含有してもよい。一般にアンチセンス核酸はmRNAの発現を防止して、カテプシンO2タンパク質が生産されないように機能する。核酸は二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよく、また二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。
本明細書において「組換え核酸」という用語は、元々はエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって試験管内で形成された、通常は天然には見られない形態の核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離されたカテプシンO2タンパク質遺伝子や、通常は結合していないDNA分子を連結することによって試験管内で形成された発現ベクターは共に、本発明については、組換え体であると見なされる。組換え核酸を一旦作成し、それを宿主細胞や宿主生物中に再導入したら、非組換え的に、すなわち試験管内での操作ではなく宿主細胞の生体内細胞機構を用いて、そのような核酸が複製しうることは理解される。しかし、一旦は組換え的に生産されたものの、その後、非組換え的に複製されたそのような核酸も、本発明については、組換え体であると見なされる。
さらに、「組換えタンパク質」とは組換え技術を用いて、すなわち上述の組換え核酸の発現によって、生産されるタンパク質である。組換えタンパク質は少なくとも1以上の特徴によって天然に存在するタンパク質と識別される。例えばそのタンパク質は、その野生型宿主内で通常それに付随するタンパク質および化合物のいくつかまたはすべてから単離され得る。つまり、例えば本質的に精製されたカテプシンO2や部分的に精製されたカテプシンO2もしくは細胞を伴わずに存在するカテプシンO2が組換え体であると見なされる。この定義にはある生物由来のカテプシンO2タンパク質の異なる生物または宿主細胞内での生産が含まれる。あるいはそのタンパク質は、タンパク質が増大した濃度レベルで生産されるように誘導性プロモーターや高発現プロモーターを使用することによって、通常に認められるよりも有意に高い濃度で生産され得る。あるいはそのタンパク質は、エピトープ標識の付加やアミノ酸の置換、挿入および欠失など、天然には通常認められない形態であり得る。
カテプシンO2タンパク質の定義には、後に概論するようにクローン化され、発現される他の生物由来のカテプシンO2タンパク質も含まれる。
アンチセンス核酸の場合、アンチセンス核酸は図1に記載の対応する非コード配列の全部または一部にハイブリッド形成するものと定義される。一般にアンチセンスハイブリッド形成の決定に使用されるハイブリッド形成条件は、65℃で0.1×SSCなどの高厳密条件であろう。
カテプシンO2タンパク質核酸を一旦同定したら、それをクローン化し、必要であれば、その構成部分を組換えて全カテプシンO2タンパク質核酸を作成することができる。一旦その天然の供給源から単離し、例えばプラスミドや他のベクター内に組込み、そこから直鎖状核酸断片として切り出したら、その組換えカテプシンO2タンパク質核酸をさらに、他のカテプシンO2タンパク質核酸を同定単離するためのプローブとして使用することができる。またそれを修飾または変種カテプシンO2タンパク質核酸およびタンパク質を形成するための「前駆体」核酸として使用することもできる。
カテプシンO2タンパク質をコード化する本発明の核酸を用いて、様々な発現ベクターを作成する。発現ベクターは自己複製染色体外ベクターであってもよいし、宿主ゲノムに統合するベクターであってもよい。一般にこれらの発現ベクターは、カテプシンO2タンパク質をコード化する核酸に機能的に連結した転写および翻訳制御核酸を含む。ここに「機能的に連結した」とは、転写および翻訳制御DNAがカテプシンO2タンパク質のコード配列に関して、転写が開始されるように位置することを意味する。これは一般に、プロモーターと転写起動または開始配列がカテプシンO2タンパク質コード領域の5'側に位置することを意味するだろう。転写および翻訳制御核酸は一般に、カテプシンO2タンパク質を発現させるために使用する宿主細胞に適したものである。例えばBacillus由来の転写および翻訳制御核酸を、Bacillus内でカテプシンO2タンパク質を発現させるために使用する。様々な宿主細胞について数多くのタイプの適当な発現ベクターと好適な制御配列が当該技術分野で知られている。
転写および翻訳制御配列には一般にプロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が含まれ得るが、これらに限定されない。好ましい態様では、制御配列がプロモーターと転写開始および終止配列を含有する。
プロモーター配列は構成的または誘導性プロモーターをコード化する。プロモーターは天然に存在するプロモーターでもよいし、ハイブリッドプロモーターでもよい。当該技術分野では2以上のプロモーター要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターも知られており、これらは本発明でも有用である。
さらに、発現ベクターが他の要素を含有してもよい。例えば、発現ベクターが2種類の生物内（例えば発現用の哺乳類細胞または昆虫細胞とクローニング用の原核宿主）で維持されうるように、2つの複製系を持ってもよい。また、組込み発現ベクターの場合、発現ベクターは宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも1つの配列（好ましくは2つの相同配列）を発現構築物に隣接して含有する。適当な相同配列を選択してベクターに含めることによって、組込みベクターを宿主細胞内の特定の座に向けることができる。組込みベクターの構築は当該技術分野で良く知られている。
加えて、好ましい態様では、発現ベクターが形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は当該技術分野で良く知られており、使用する宿主細胞によって様々である。
本発明のカテプシンO2タンパク質は、カテプシンO2タンパク質をコード化した核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、カテプシンO2タンパク質を誘導し、あるいはその発現を引き起こすのに適した条件下で培養することによって生産される。カテプシンO2タンパク質発現に適した条件は選択した発現ベクターと宿主細胞によって変動するが、当業者は日常的な実験によってそれを容易に確かめることができるだろう。例えば、発現ベクター中に構成的プロモーターを使用するならば宿主細胞の生育と増殖を最適化する必要があり、誘導性プロモーターを使用するならば誘導に適した生育条件が必要である。加えて、いくつかの態様では、収集の時期が重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用するバクロウイルスは溶解性ウイルスであるので、収集時期の選択は生産物の収量に極めて重要でありうる。
適当な宿主細胞には酵母、細菌、古細菌、カビ、昆虫細胞、哺乳類細胞を含む動物細胞が含まれる。とりわけ興味深いものはキイロショウジョウバエ細胞、サッカロミセス・セレビセシェと他の酵母、大腸菌、枯草菌、SF9細胞、C129細胞、293細胞、ニューロスポラ、BHK、CHO、COS、HeLa細胞、不死化哺乳類骨髄およびリンパ細胞系である。
好ましい態様として、カテプシンO2タンパク質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当該技術分野で良く知られている。
好適な細菌性プロモーターは、細菌性RNAポリメラーゼを結合し、カテプシンO2タンパク質コード配列のmRNAへの下流（3'）転写を開始し得る核酸配列である。細菌性プロモーターは転写開始領域を持ち、通常それはコード配列の5'末端の近くに位置する。この転写開始領域は典型的にはRNAポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコード化する配列はとりわけ有用なプロモーター配列を提供する。その例には、ガラクトース、乳糖およびマルトースなどの糖代謝酵素由来のプロモーター配列やトリプトファンなどの生合成酵素由来の配列が含まれる。バクテリオファージのプロモーターは当該技術分野で良く知られており、これも使用することができる。加えて、合成プロモーターとハイブリッドプロモーターも有用である。例えばtacプロモーターはtrpプロモーター配列とlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌性プロモーターは、天然に存在する非細菌起源のプロモーターであって、細菌性RNAポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を持つものをも含み得る。
機能性プロモーター配列に加えて、効率の良いリボソーム結合部位も望ましい。大腸菌では、リボソーム結合部位はシャイン・ダルガノ（SD）配列と呼ばれ、開始コドンと、開始コドンの3〜11ヌクレオチド上流に位置する3〜9ヌクレオチド長の配列とを含む。
発現ベクターは、細菌におけるカテプシンO2タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列を含有してもよい。シグナル配列は典型的には疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコード化し、当該技術分野で良く知られているように、これが細胞からのタンパク質の分泌を指示する。タンパク質は生育培地（グラム陽性細菌）か、もしくは細胞の内膜と外膜の間に位置する周辺腔（グラム陰性細菌）に分泌される。
細菌性発現ベクターは、形質転換されている細菌株の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有してもよい。好適な選択遺伝子には、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれる。選択可能マーカーには、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路のような生合成遺伝子も含まれる。
これらの成分を発現ベクターへ組み立てる。細菌用の発現ベクターは当該技術分野で良く知られており、なかんずく枯草菌、大腸菌、ストレプトコッカス・クレモリスおよびストレプトコッカス・リビダンス用のベクターが含まれる。
細菌性発現ベクターは、塩化カルシウム処理や電気穿孔法など、当該技術分野で良く知られた技術を用いて細菌宿主細胞中に導入される。
一態様として、カテプシンO2タンパク質を昆虫細胞内で生産する。昆虫細胞形質転換用の発現ベクター、とりわけバクロウイルスに基づく発現ベクターは当該技術分野で良く知られている。簡単に述べると、バクロウイルスは極めて大きなDNAウイルスであり、その外殻タンパク質を極めて高レベルに生産する。バクロウイルスゲノムのサイズゆえに、外因性の遺伝子は組換えによってウイルスゲノム内に入れなければならない。したがって、この発現系の成分には、転移ベクター（通常はバクロウイルスゲノムの断片と、カテプシンO2タンパク質の挿入に便利な制限部位の両方を含む細菌性プラスミド）、転移ベクター内のバクロウイルス特異的断片に相同な配列を持つ野生型バクロウイルス（これは異種遺伝子のバクロウイルスゲノムへの相同的組換えを可能にする）、適当な昆虫宿主細胞および生育培地が含まれる。
当該技術分野では哺乳類発現系も知られており、これも一態様として使用される。哺乳類プロモーターは、哺乳類RNAポリメラーゼを結合し、カテプシンO2タンパク質コード配列のmRNAへの下流（3'）転写を開始することのできるDNA配列である。プロモーターは、通常はコード配列の5'末端近くに位置する転写開始領域と、転写開始部位の25〜30塩基対上流に位置するTATAボックスを持つだろう。TATAボックスはRNAポリメラーゼIIに正しい部位でRNA合成を開始するようにと指図すると考えられる。哺乳類プロモーターは、典型的にはTATAボックスの100〜200塩基対上流以内に位置する上流プロモーター要素をも含有するだろう。上流プロモーター要素は転写が開始される速度を決定し、どちらの方向にも作用できる。ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、広い宿主範囲を持つので、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターは哺乳類プロモーターとしてとりわけ有用である。その例にはSV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。
典型的な場合、哺乳類細胞によって認識される転写終止配列とポリアデニル化配列は翻訳終止コドンの3'側に位置する制御領域であり、それゆえにプロモーター要素と共にコード配列に隣接する。成熟mRNAの3'末端は部位特異的翻訳後切断とポリアデニル化によって形成される。転写終結因子とポリアデニル化シグナルの例にはSV40由来のものが含まれる。
外因性核酸を哺乳類宿主や他の宿主に導入する方法は当該技術分野で良く知られており、使用する宿主細胞によって様々である。これらの技術にはデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、DNAの核への直接微量注射が含まれる。
好ましい態様として、カテプシンO2タンパク質を酵母細胞内で生産する。酵母発現系は当該技術分野で良く知られており、サッカロミセス・セレビシェ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・マルトーサ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア・グイレリモンジ（Pichia guillerimondii）、ピチア・パストリス、スキゾサッカロミッセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）用の発現ベクターが含まれる。酵母での発現に好ましいプロモーター配列には、誘導性GAL1,10プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、3-ホスフォグリセル酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼおよび酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが含まれる。酵母選択可能マーカーにはADE2、HIS4、LEU2、TRP1、ALG7（これはツニカマイシンに対する耐性を付与する）、G418耐性遺伝子（これはG418に対する耐性を付与する）、CPU1（これは酵母が銅イオンの存在下で生育することを可能にする）が含まれる。
組換えカテプシンO2タンパク質は細胞内的にも発現されうるし、分泌もされうる。当該技術分野で良く知られている技術を用いて、カテプシンO2タンパク質を融合タンパク質として製造することもできる。したがって例えば、所望のエピトープが小さい場合、カテプシンO2タンパク質を担体タンパク質に融合して免疫原を作成することができる。また、発現を増大させるためや、あるいは他の理由で、カテプシンO2タンパク質を融合タンパク質として製造してもよい。
本発明のカテプシンO2タンパク質の定義にはアミノ酸配列変種も含まれる。これらの変種は3つのクラス、すなわち置換変種、挿入変種または欠失変種の1以上に分類される。通常これらの変種はカテプシンO2タンパク質をコード化するDNA中のヌクレオチドの部位特異的突然変異導入によって製造される。つまり、カセット突然変異導入や当該技術分野で良く知られている他の技術を用いて変種をコード化するDNAを作成した後、そのDNAを上に概論したような組換え細胞培養で発現させる。ただし、約100〜150残基までの変種カテプシンO2タンパク質断片は、確立された技術を用いる試験管内合成によって製造することができる。アミノ酸配列変種はその変種の予定された性質、すなわち天然に存在するカテプシンO2タンパク質アミノ酸配列の対立遺伝子変種や種間変種とその変種とを区別する特性によって特徴づけられる。変種は典型的には天然に存在する類縁体と定性的に等しい生物学的活性を示すが、後により詳しく概論するように、改変された特徴を持つ変種を選択することもできる。
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は前もって決定されるが、突然変異そのものを予め決定しておく必要はない。例えば、ある部位における突然変異を最適化するために、標的コドンまたは領域においてランダム突然変異導入を行い、発現したカテプシンO2タンパク質変種を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を持つDNA中の予定の部位に置換突然変異を作成する技術は良く知られており、例えばM13プライマー突然変異導入がある。突然変異体のスクリーニングはカテプシンO2タンパク質活性の検定を用いて行われる。例えば精製カテプシンO2や部分精製カテプシンO2を実施例に記載のような速度検定に用いて、アミノ酸置換、挿入または欠失の効果を決定することができる。あるいは、突然変異カテプシンO2遺伝子をカテプシンO2欠失株に入れ、本明細書に開示の如く、カテプシンO2活性について試験する。遺伝子配列がわかっている場合の欠失株の作成は当該技術分野で良く知られている。
アミノ酸置換は典型的には1残基置換であり、挿入は通常ほぼ約1〜20アミノ酸程度であろうが、それよりかなり長い挿入も可能である。欠失は約1〜30残基の範囲であるが、場合によっては、例えばカテプシンO2タンパク質のプロ配列や成熟部分を削除する場合のように、欠失がもっと長くてもよい。さらに、上に概論したように、カテプシンO2タンパク質のもっと短い断片を使用して抗体を作成してもよい。
置換、欠失、挿入あるいはその組み合わせを用いて最終誘導体を得ることができる。一般にこれらの変化は、その分子の改変を最小限にとどめるべく、数アミノ酸に対して行われる。しかしある種の状況下では、さらに大きい変化も可能である。
カテプシンO2タンパク質の特徴に小さな改変を望む場合には、一般に次の図に従って置換を行う。
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機能や免疫学的同一性の本質的な変化は上の図に示すものより保存性の少ない置換を選択することによって作られる。例えば、改変する領域のポリペプチド骨格の構造（例えばアルファ螺旋構造やベータシート構造）、標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは側鎖のかさだかさに、より有意な影響を与える置換を作成することができる。ポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすと一般に予想される置換は次の置換である：（a）親水性残基（例：セリルまたはスレオニル）を（で）疎水性残基（例：ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）で（を）置換する；（b）システインまたはプロリンを（で）他の残基で（を）置換する：（c）正荷電側鎖を持つ残基（例：リジル、アルギニルまたはヒスチジル）を（で）負荷電残基（例：グルタミルまたはアスパルチル）で（を）置換する；（d）かさだかい側鎖を持つ残基（例：フェニルアラニン）を（で）側鎖を持たないもの（例：グリシン）で(を)置換する。
変種は典型的には天然に存在する類縁体と定性的に等しい生物学的活性を示し、天然に存在する類縁体と同じ免疫応答を引き出すだろうが、必要に応じてポリペプチドの特徴を改変するために変種を選択してもよい。あるいは、カテプシンO2タンパク質の生物学的活性を変えるように変種を設計してもよい。例えば、触媒三基のアミノ酸を置換することによって、カテプシンO2タンパク質のタンパク質加水分解活性を変えることができる。位置25のシステイン、位置162のヒスチジンおよび位置182のアスパラギンからなる触媒三基を個別にあるいは同時に改変することによって、タンパク質加水分解活性を減少させ、あるいは除去することができる。これは投与されたカテプシンO2の毒性を減少させるために行うことができる。さらに、プロ配列と成熟配列の間の切断部位を改変して、例えばタンパク質加水分解プロセシングを排除することができる。
好ましい態様として、カテプシンO2タンパク質を発現後に精製または単離する。カテプシンO2タンパク質は、その試料中に他にどんな成分が存在するかに応じて、当業者の知る様々な方法で単離または精製することができる。標準的な精製法には、電気泳動法、分子法、免疫学的方法や、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相HPLCクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法、およびクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、標準的な抗カテプシンO2抗体カラムを用いてカテプシンO2タンパク質を精製することができる。限外ろ過やダイアフィルトレーションもタンパク質濃縮との関連で有用である。好適な精製技術に関する一般的な参考書として、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag,ニューヨーク（1982）を参照のこと。必用な精製程度はカテプシンO2タンパク質の用途に応じて様々であろう。場合によっては、精製が不必要なこともあろう。
いくつかの態様では、カテプシンO2酵素をプロ酵素として発現させる。実施例に記載するように、プロ酵素を外因性のプロテアーゼで処理して、酵素を成熟活性型に変換できることは、当該技術分野で知られている通りである。好適な外因性プロテアーゼにはペプシンとカテプシンDが含まれるが、これらに限定されない。
発現し、必要に応じて精製したら、カテプシンO2タンパク質はいくつかの応用で有用である。
例えば実施例5に示すように、本発明のカテプシンO2タンパク質はコラーゲナーゼ活性を持つ。したがって、カテプシンO2タンパク質を生体内でも試験管内でもコラーゲナーゼとして使用することができる。例えばカテプシンO2を用いて、干渉するレベルまたは不確定なレベルのコラーゲンを含有する分析試料を処理することができる。
さらに、カテプシンO2タンパク質を用いて、体内の過剰なコラーゲンを分解することができる。過剰のコラーゲンを伴う様々な症状がある。例えば重篤なディスク炎症や脱漏といった脊髄ディスクの問題を処置する1つの方法には、コラーゲナーゼやキモパパインを注射してディスクコラーゲンを分解することが含まれる（Leonardoら, Ann. Chirm. Gyneacol. 82: 141-148（1993）; Goganら, Spine 17: 388-94（1992）; Stula, Nerochirurgia 33: 169-172（1990）; Boccaneraら, Chir. Organi. Mov. 75: 25-32（1990））。あるいは、骨盤癒着、外科後癒着、肺癒着、腹部癒着などの癒着の処置はカテプシンO2によって治療または溶解される。さらに、傷痕やケロイドをカテプシンO2で処理して過剰に存在するコラーゲンを除去または減少させることができる。また、子宮内膜症は過剰量のコラーゲンと他の物質の子宮とその周辺組織内への沈着を伴うもう1つの重要な臨床的問題である。ある種の形態の子宮内膜症も本発明のカテプシンO2で処置することができる。
もう1つの態様として、カテプシンO2を用いて腫瘍周辺のマトリックスを溶解することができる。一般に、腫瘍pHは生理学的pHより低く、実施例に概論するように、カテプシンO2は酸性pHで活性である。したがって、カテプシンO2は、一般に腫瘍を取り巻くコラーゲンに基づくマトリックスを溶解するのに適している。
一つの態様として、骨化石症様の骨疾患である多発異骨症を治療するために本発明のカテプシンO2タンパク質を投与することもできる。この疾患は不十分な破骨細胞システインプロテアーゼ活性によって引き起こされるようである。ある態様では、遺伝子治療を用いてカテプシンO2を投与してもよい。
さらに、カテプシンO2は酸性pHで機能的であるから、酸などの骨脱塩化合物と共にカテプシンO2を投与することによって骨組織を分解することができる。したがって、異常な骨成長や過剰な骨成長を処置することができる。
本発明のカテプシンO2タンパク質はカテプシンO2プロテアーゼ阻害剤とシステインプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするにも有用である。システインプロテアーゼ阻害剤は、既知のシステインプロテアーゼ阻害剤と同様に、当該技術分野では理解されるであろうが、アフィニティークロマトグラフィーカラムへの結合によるシステインプロテアーゼの精製やシステインプロテアーゼの阻害を含む様々な用途を持つ。さらに、広範囲にわたる様々な生理学的障害（リウマチ、炎症、骨粗鬆症、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、多発性骨髄腫および糸球体腎炎を含む）は当該術分野で知られているようにシステインプロテアーゼレベルの増大を伴うので、システインプロテアーゼ阻害剤は治療的用途をも持ち得る。
好ましい態様として、カテプシンO2のプロ部分をカテプシンO2の特異的阻害剤として用いることができる。したがって、例えば実施例3に示すように、プロ部分を別個に、すなわち成熟配列を伴わずに発現させ、カテプシンO2の高度に特異的で強固に結合する阻害剤として使用することができる。したがって、後に概論するように、例えば骨の疾患または腫瘍の治療において、過剰のカテプシンO2を含有する試料または組織にプロ部分を治療的に添加することができる。
一態様として、カテプシンO2のプロ部分を標識し、試料または組織内のカテプシンO2の存在を診断、定量または同定する。
さらに、カテプシンO2タンパク質を用いて、カテプシンO2タンパク質に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成することができ、このような抗体は後述のように有用である。また、標準的な技術を用いて、カテプシンO2タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができる。次いでこれらのカラムを用いてカテプシンO2抗体を精製することができる。
好ましい態様として、当該技術分野で良く知られている技術を用いてカテプシンO2タンパク質に対するモノクローナル抗体を作成する。上に概論したように、抗体は完全長カテプシンO2タンパク質に対して生成させてもよいし、カテプシンO2タンパク質の一部に対して生成させてもよい。
好ましい態様として、ヒトカテプシンO2タンパク質に特有なエピトープに対して抗体を生成させる。つまり、その抗体は他の生物由来のカテプシンO2タンパク質（ウサギやラット由来のカテプシン類）に対して生成した抗体との交差反応性をほとんど示さないか、もしくは全く示さない。
これらの抗体はいくつかの応用で用途を持つ。好ましい態様として、試料または患者中のカテプシンO2の存在を診断するためにこれらの抗体を使用する。例えば、過剰のカテプシンO2タンパク質は破骨細胞関連疾患や骨疾患および腫瘍に存在しうるが、これを上記の抗体を用いて診断することができる。
さらに、高レベルのカテプシンO2は、HeLa細胞中の高レベルなカテプシンO2によって立証されるように、ある種の卵巣または子宮頚管ガン腫に伴う。したがって、本発明の抗体を用いてこれらのタイプの腫瘍を検出または診断することができる。
カテプシンO2の検出は当該技術分野で良く知られている技術を用いて行われるだろう。例えば、血液や組織試料のような試料を患者から入手し、例えばRIAやELISAのような標準的な技術を用いて、標識したカテプシンO2抗体との反応性について試験することができる。その試料の反応性について試験することができる。
一態様として、抗体を直接的に標識してもよいし、間接的に標識してもよい。本明細書において「標識（した）」とは、その化合物の検出を可能にするように結合された少なくとも1つの要素、同位体または化学物質を持つ化合物を意味する。一般に、標識は3つのクラス、すなわちa）同位体標識（これは放射活性同位体であってもよいし、重同位体であってもよい）、b）免疫標識（抗体であってもよいし、抗原であってもよい）、c）着色または蛍光色素に分類される。これらの標識を化合物のどの位置に組込んでもよい。したがって、例えばカテプシンO2タンパク質抗体を検出のために標識することができるし、カテプシンO2タンパク質抗体に対する二次抗体を作成して、それを標識することもできる。
一態様として、本発明のカテプシンO2タンパク質に対して生成した抗体を用いて、カテプシンO2タンパク質を試料から単離または精製する。つまり、例えばカテプシンO2タンパク質に対して生成した抗体を、標準的な技術を用いて、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができる。これらのカラムを使用して、カテプシンO2タンパク質を組織試料中から引き出すことができる。
最近の研究によって、システインプロテアーゼをDNA結合性転写因子として使用しうることが示唆されている（Xuら,上記）。ある態様では、本発明のカテプシンO2タンパク質を転写因子として使用することができる。
寄生虫ウェステルマン肺吸虫は最近になって、システインプロテアーゼに対して相同性を持つ免疫抑制因子を発現することが示された（Hamajimaら,上記）。実際、本発明のカテプシンO2タンパク質に対する相同性はほぼ40％である。したがって、一態様として、カテプシンO2タンパク質は免疫抑制因子として有用であろう。
好ましい態様として、カテプシンO2タンパク質をヒトに投与する場合、そのカテプシンO2タンパク質はヒトカテプシンO2タンパク質である。これは、投与されたカテプシンO2に対する望ましくない免疫反応を最小限にとどめることを保証するため、治療的に望ましいことである。
本発明のカテプシンO2タンパク質の投与は様々な方法で行うことができ、それには経口、皮下、静脈内、鼻孔内、経皮、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼中内が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適した形態のカテプシンO2タンパク質を含む。医薬組成物は次の物質の1以上を含有してもよい：血清アルブミンのような担体タンパク質、緩衝剤、微小結晶性セルロース、乳糖、トウモロコシでん紛、他のでん紛のような充填剤、結合剤、甘味料および他の着香料、着色料、ポリエチレングリコール。添加物は当該技術分野で良く知られており、様々な製剤に使用することができる。
本発明の医薬組成物は一般に、当業者が容易に決定することのできる治療的有効投与量で投与される。
本発明のヒトカテプシンO2タンパク質は、治療的用途に関して、このヒトタンパク質を他の種由来のカテプシンO2タンパク質よりも許容され得るようにする特徴を持つと考えられる。具体的には、他の種由来のカテプシンO2タンパク質の抗原性は、ヒトにおいて、これらのタンパク質を治療的組成物としてはあまり許容し得ないものにしている。すなわち、他の種由来のカテプシン類はヒトにおいて望ましくない免疫学的応答を引き出すだろう。
次の実施例は上述の発明を用いる方法をさらに詳しく記述し、本発明の様々な側面の実行に関して予測される最善の方法を説明するものである。これらの実施例は決して本発明の真の範囲を限定するものではなく、例示のために記載するものである。本明細書に挙げる参考文献は本明細書の一部を構成する。
実施例
実施例1：ヒトカテプシンO2のクローニング
特に指定しない限り、すべての一般的組換えDNA技術はSambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載の方法に従った。
次に示す2つの縮重PCRプライマーを、刊行されたウサギオステオクラスチン遺伝子の配列（Tezukoら, 1994）に基づいて設計した。
5'−GGA-TAC-GTT-CAN-CCN-GT−3'（配列番号8）
5'−GC-CAT-GAG-G/ATA-NCC−3'（配列番号9）
これらのプライマーをヒト脾臓Quick Clone cDNA調製物（Clontech）のスクリーニングに用いた。増幅した450塩基対断片を単離精製し、ヒト脾臓cDNAライブラリー（Clonetech製のgt10）をスクリーニングするためのcDNAプローブとして用いた。プラークがフィルター上に直接再形成する技術（Woo, Methods Enzymol. 68: 389-395（1979））を用いて、20枚のフィルター上で600,000クローンをスクリーニングした。これは陽性プラークからのシグナルの増幅を可能にし、暴露時間を短くできるので、バックグラウンドと儀陽性体の可視化を減少させることができる。フィルターを中度の厳密条件（2×SSC, 0.1％SDS、室温、10分間を1回、2×SSC, 0.1％SDS、68℃、20分間を1回）で洗浄した。
2つの陽性プラークからファージを単離し、pBluescript SK＋ベクター（Stratagene）のEcoRI部位にクローニングした。
1つの陽性クローンをABI配列決定装置モデル373Aで完全に配列決定した。その配列（配列番号1）を図1に示す。ヒトカテプシンO2（配列番号2）、ヒトカテプシンS（配列番号4）およびヒトカテプシンL（配列番号5）タンパク質の配列照合を図2に示す。
実施例2：ヒトカテプシンO2の実現
ヒトカテプシンO2 cDNAをバクロウイルス転移ベクターのポリヘドリン遺伝子中に標準的な方法を用いてクローニングした。プレプロ酵素の完全な読み取り枠をコード化するcDNAをpVL1392転移ベクター（PharMingen）のBg1IIおよびBamHI部位に挿入した。バクロウイルス転移ベクターと直鎖化したAcNPVゲノムDNA（PharMingen）をSf9細胞に同時トランスフェクトした後、相同的組換えによって組換えバクロウイルスを生成させた。終点希釈の後、ヒトカテプシンO2発現を後に概論する蛍光基質検定法で測定した。
純粋なウイルス（AcNPVCO2）をプラーク精製によって得た。Sf9細胞をSf900II培地（Gibco BRL,ニューヨーク州グランドアイランド）中で2×106細胞/mlまで生育し、moi=1で感染させた。全細胞数とカテプシンO2の細胞活性および分泌活性を24時間毎に監視した。3.5日後に細胞を収集した。
約43kDaの免疫反応性物質の大半が感染細胞内に認められた。培養培地内の43kDaの単一産物とは対照的に、細胞抽出物内にはさらに44kDaのわずかなバンドが検出された。高分子量バンドはおそらくプロセシングを受けなかったプレプロカテプシンO2を表し、43kDaタンパク質はおそらくプロ酵素であろう。pH7.5で合成基質Z-FR-MCAを用いたところ、細胞の溶解直後には活性が観測されず、ジチオスレイトールの存在下4℃でpH4.0〜4.5の自己活性化条件中にも活性は観測されなかった。自己活性化条件下とpH5.5で測定されたE-64阻害活性の増大は内因性Sf9システインプロテアーゼのせいだと決定された（未刊行の結果）。pH4.0と5.5でヒトカテプシンBと共に37℃で2時間インキュベートしたが、カテプシンO2前駆体のプロセシングは観測されなかった（データは示していない）。
組換えヒトカテプシンO2の活性化、精製およびN-末端配列決定
細胞内カテプシンO2はSF9細胞内で不活性前駆体として生産された。この酵素を細胞溶解液内で次の還元および酸性条件下で活性化した。2000×gの遠心分離によってSf9細胞を生産培地から収集し、Dounceホモジナイザーで溶解した。不活性なカテプシンO2前駆体を含む細胞溶解液を、0.5％トリトンX-100, 5mMジチオスレイトールおよび2.5mM Na2EDTAを含む100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.75）で100mlにし、pHを4.0に調節した。プロ型の活性酵素への変換をペプシンでの処理によって達成した。最終濃度0.4mg/mLのブタペプシン（Sigma, ミズーリ州セントルイス）を添加した後、活性化混合物を200rpmの振とう器中40℃で90分間インキュベートした。Z-FR-MCA（10μM）を蛍光原性基質として用い、100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）中で測定することによって活性化を監視した。
カテプシンO2の前駆体は、pH4.0におけるペプシンでの処理によって、成熟した活性酵素に効率よく変換された。粗細胞抽出物または濃縮培養培地上清の消化は、前駆体の時間依存的な消失と36kDの中間体を経由する成熟酵素（29kD）の生成をもたらした（図3）。この過程と並行して、pH7.5で測定されるE-64阻害活性の増大が観測された。
精製した活性カテプシンのpH4.5における添加によっては、前駆体の活性化が観測されず（データは示していない）、リソソーム内におけるカテプシンO2のシスまたはトランス自己活性化はいずれも考え難いことが示された。これは、潜在的な自己触媒活性化経路を示すパパインやカテプシンSのような関連システインプロテアーゼとは対照的である（Vernetら, J. Biol. Chem., 265: 1661-1666（1991）; Brommeら, J. Biol. Chem. 268: 4832-4838（1993））。破骨細胞内のカテプシンO2の天然の活性化酵素は、破骨細胞リソソーム内に存在するが低レベルで再吸収窩中に分泌されるアスパルチルプロテアーゼすなわちカテプシンDであるかもしれない（Gotoら, 1993）。
活性化した溶解液を2M Tris塩基でpH7.0に調節し、10,000×gの遠心分離で清浄化し、その上清をpH5.5の2.5M硫酸アンモニウムに調節した。16,000×gでの遠心分離後、透明になった上清を限外ろ過（YM10 Amicon）で50mLに濃縮した。さらに10,000×gで遠心分離した後、透明になった上清をブチルSepharose 4 Fast Flow（Pharmacia,スウェーデン）にのせ、そのカラムを硫酸アンモニウム勾配（pH5.5の25mM酢酸緩衝液中2.5Mから0Mへ）で洗浄した。活性は0M硫酸アンモニウムで溶出した。集めて濃縮した画分をFPLC Mono Sカラム（Pharmacia,スウェーデン）に適用し、20mM酢酸ナトリウム（pH5.5）中の直線的NaCl勾配（0〜2M）で溶出させた。電気泳動的に均一なカテプシンO2が1.4M NaClで溶出した。
1L Sf9細胞培養（約2×10９細胞）の平均収量は約1mg精製酵素であった(表１)。
0003670666.tif 000003
精製した酵素は一本鎖酵素であり、還元条件下の4〜20％Tris/グリシンSDSゲルで29kDaの見かけ上の分子量を示した。エンドグリコシダーゼHおよびFならびにN-グリコシダーゼFによる処理は分子量のシフトをもたらさなかった（データは示していない）。これはこのプロテアーゼがグリコシル化されないことを意味する。ヒトカテプシンO2はその成熟配列内に2つの潜在的グリコシル化部位を持つ。しかし、両部位ともアスパラギンまたはスレオニンに連続するプロリン残基を持つので、それらが使用されることは考えがたい。カテプシンO2はさらに、成熟酵素とプロ部分の間のプロセシング部位近くのプロ部分中に、1つの推定グリコシル化部位を含有する。エンドグリコシダーゼHおよびFならびにN-グリコシダーゼFで終夜処理した後に、やはり、プロ酵素の分子量のシフトは観測されなかった。
NH2-末端配列決定を自動エドマン分解によって行った。成熟プロテアーゼのN-末端配列決定により、N-末端アラニンに隣接するプロリンを伴う、パパインファミリーのシステインプロテアーゼの天然のプロセシング部位が明らかになった（NH2-APDSVDYRKKGYVTPVKN（配列番号10））。対照的に、自己触媒的に活性化されるシステインプロテアーゼはしばしばそのプロセシング部位にプロ部分から3〜6アミノ酸のN-末端伸長を持つ（Brommeら, 1993）。成熟カテプシンO2の計算分子質量は23,495であり、これがこの酵素の実際の重さであると思われる。トリプシン（24kDa）は類似の条件下で試験すると同じ見かけ上の分子量29kDaを示した。
他の文献に記載のごとく、バクロウイルス発現系を用いて組換えヒトカテプシンＳを発現させ、精製した（BrommeおよびMcGrath,未刊行の結果）。組換えヒトカテプシンLはMort博士（Shriner's Hospital for Crippled Children,ケベック州モントリオール）のご厚意で提供してもらった。使用したカテプシン類はすべて電気泳動的に均一であり、その重量モル濃度は、BarettおよびKirschke（1981）が記述したE-64による活性部位滴定によって決定した。
蛍光酵素検定法
2.5nMジチオスレイトールと2.5mM EDTAを含む100mM酢酸ナトリウム緩衝液中の蛍光原性基質Z-FR-MCA（MCA＝メチルクマリルアミド）で、ヒトカテプシンO2を検定した。MCA基質の加水分解の初速を、励起波長380nm、放射波長450nm、25℃で1cmキュベット内で監視した。Z-FR-MCAの濃度は標準条件下で5μMである。
プログラムEnzfitter（Leatherbarrow, Enzfitter, Elsevier Biosoft,英国ケンブリッジ（1987））を用い、非線型回帰分析によって速度定数VmaxとKmを得た。
基質検定緩衝液中、異なる阻害剤濃度の存在下、一定の基質濃度（5μM Z-FR-MCA）と酵素濃度（1nM）でカテプシンO2の阻害を検定した。カテプシンO2を阻害剤と共に10分間予備インキュベートし、基質で反応を開始した。残存活性を監視し、阻害百分率を非阻害速度から計算した。
実施例3：カテプシンO2のプロ部分のクローニングと発現
次のプライマーを用い、標準的な技術を用いるPCRによって、ヒトカテプシンO2のプロ部分を増幅した：
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翻訳されたタンパク質中で金属結合ドメインとして機能する一連の6ヒスチジン残基を含有するpTrcHisベクター（Invitrogen Corp.,カリフォルニア州サンディエゴ）内でプロ領域を発現させた。この金属結合ドメインを用いて、Xpress system Protein Expressionキットに含まれるInvitorgen製ProBond ResinでカテプシンO2のプロ部分を精製した。精製したプロ部分のゲルを図10に示す。
精製したプロ部分は親酵素を0.1nMのKi値で阻害した。
実施例4：ヒトカテプシンO2に対する抗体と免疫組織化学
ヒトカテプシンO2のプロ酵素に対するポリクローナル抗体をニュージーランド白ウサギ内で作成した。Pfu DNAポリメラーゼ（Promega）を用いて、プロ酵素をコード化するcDNAを、そのプレプロ酵素配列の調製物からPCRによって増幅した。使用したプライマーはNheI部位を伴うプロ酵素の5'末端とBamHI部位を伴う3'末端に対して作成した。ヒトカテプシンO2をNovagen製のpET11cベクターにクローニングし、大腸菌（BL21(DE3)）内で発現させた。0.4mM IPTGを用いてOD600=0.6で発現を誘導し、誘導の2時間後に細胞を収集した。収集後、発現したタンパク質をNovex 12％Tris−グリシンSDSゲルで泳動し、クーマシー染色し、脱色した。N-末端配列決定によって確認したカテプシンO2のプロ酵素バンドを切り出した。タンパク質をゲル切片から電気溶出し、1×溶出緩衝液で予め処理しておいたCentricon 10で濃縮した。その抗原を1×PBSで1mlにし、免疫感作に用いた（EL Labs,カリフォルニア州ソーケル）。
BL21(DE3)の誘導培養に対して作成したアセトン粉末と、ニトロセルロール上の抗原に対するアフィニティー結合ならびにそのニトロセルロースからの溶離によって、全血清から抗体を精製した。精製した抗体はヒトプロカテプシンO2（プロ部分）と成熟酵素に特異的であり、1:2000希釈液のウェスタンブロット分析でヒトカテプシンS、LおよびBとの交差反応性を示さない。
ホルマリン固定およびパラフィン包埋ヒト組織切片（Biogenex,カリフォルニア州サンラモン）を既に記述されているように調製し（Cattorettiら, 1992）、StrAviGen検出キット（Biogenex）を用いて、対照ウサギIgGまたはアフィニティー精製抗カテプシンO2抗体で染色した。切片をMayer製ヘマトキシリンで対比染色した。
破骨細胞腫の免疫染色によって、多核破骨細胞の強い特異的染色が明らかになったが、ストロマ細胞は反応を示さなかった（図11）。胎児期ヒト骨内の破骨細胞の強い免疫組織化学的染色も観測された（データは示していない）。肺では、カテプシンO2が2つの部位、すなわち肺胞マクロファージ（図11）と気管支上皮細胞に検出された。カテプシンO2は胃内の胃腺、結腸内の腸腺、腎臓の近位および遠位細管の各上皮細胞と、子宮内膜中の子宮腺の上皮内にも検出された。さらに、肝臓内のクッパー細胞と精巣内で発達しつつある精子細胞もカテプシンO2に対する強い染色を示す。副腎皮質、卵巣および胎盤ではより均質な染色が認められた（図11）。
同様にして、電気泳動的に均一なヒトカテプシンO2のプロ部分に対するポリクローナル抗体をニュージーランド白ウサギ内で作成し、標準的な技術で、プロ部分、プロカテプシンO2および成熟カテプシンO2に対するモノクローナル抗体を作成した。
実施例5：ヒトカテプシンO2の特徴づけ
部分的に精製した実施例2のヒトカテプシンO2を用いて、次の実験を行った。
組換えヒトカテプシンO2のpH−活性特性およびpH−安定性特性
5mMジチオスレイトールと5mM EDTAの存在下25℃で、様々なpH値で活性プロテアーゼをインキュベートすることによって、カテプシンO2のpH安定性を決定した。上述の蛍光基質検定法を用いて、間隔において残存活性を測定した。
基質加水分解の初速を上述のように監視した。ヒトカテプシンO2のpH−活性特性を1μM基質（Z-FR-MCA）濃度で得た（［S］＜＜Km, ここに初速voはkcat/Km値に直接比例する）。pH−活性特性には次の緩衝液を使用した：100mMクエン酸ナトリウム（pH2.8〜5.6）および100mMリン酸ナトリウム（pH5.8〜8.0）。イオン強度の変動を最小限にとどめるため、すべての緩衝液に1mM EDTAと0.4M NaClを含ませた。三プロトン化モデル（Khouriら, Biochem. 30: 8929-8936(1991)）をpH−活性データの最小二乗回帰分析に用いた。データを次の等式に合わせた。
（kcat/Km)obs＝（kcat/Km)／([H+]/K1＋1＋K2/[H+])
カテプシンO2、SおよびLのpH安定性を3つの異なるpHで研究した。組換えヒトカテプシンO2、SおよびLを、5mMジチオスレイトールと2.5mM EDTAの入った100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）中、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）中および100mM Tris/HCl（pH7.5）中、37℃でインキュベートした。0.5、1、2および4時間インキュベートし、カテプシンO2（100mMリン酸カリウム緩衝液,pH6.5）とカテプシンL（100mM酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.5）には5μM Z-FR-MCAを、カテプシンS（100mMリン酸カリウム緩衝液,pH6.5）には5μM Z-VVR-MCAを用いて、残存活性を決定した。
pH−活性特性は酵素機能と構造的完全性の敏感な尺度である。異なるが関連するプロテアーゼのpH特性を比較することにより、これらプロテーゼの固有の活性と安定性の相違が明らかになる。ヒトカテプシンO2は4.0と8.13の側面pKを持つベル型pH特性図を示す（表2；図5）。
0003670666.tif 000005
ヒトカテプシンO2のpH至適条件は6.0と6.5の間にあり、カテプシンSについて観測された値（Brommeら,上記, 1993）と同等であった。イオン対の安定性を反映するpH特性図の幅（Menardら, Biochem. 30: 5531-5538(1991)）は、カテプシンO2については4.15であったが、カテプシンSについては3.35しかなかった（Brommeら, 1993,上記）。ヒトカテプシンO2に関するこのパラメーターは、3.91の特性図幅を示す極めて安定なパパイン（Khouriら,上記, 1991）により近いものである。
ヒトカテプシンO2はわずかに酸性から中性のpHでカテプシンLより安定であるが、カテプシンSより不安定である（表3）。
0003670666.tif 000006
pH6.5および37℃で1時間後にカテプシンO2活性の約50％が残存していたが、カテプシンL活性は実質上これらの条件下で観測できなかった。
ただし、基質保護（通常これはpH安定性を増大させる）なしでこのpH安定性を決定したことを考慮しなければならない。カテプシンO2による3Hエラスチン分解検定では、pH7.0で２時間後でもまだ可溶化3H断片の増大が観測された。
組換えヒトカテプシンO2の阻害剤特性
蛍光酵素検定(上述)において、精製した酵素に阻害剤を添加することによって、プロテアーゼクラス特異的阻害剤がカテプシンO2を阻害する効率を決定した。
ヒトカテプシンO2はシステインプロテアーゼの典型的な阻害剤特性を示す。それはシステインプロテアーゼ阻害剤によって阻害され、システインプロテーゼとセリンプロテアーゼ両方の阻害剤によって阻害される（表4）。ペプチドアルデヒド類、ジアゾメンタン類、E-64およびニワトリシスタチンは、0.1μM以上の濃度で酵素活性を完全に阻害する。一方、特異的セリンおよびアスパラギン酸プロテーゼ阻害剤は酵素活性に影響を与えなかった。4mM濃度のEDTAカテプシンO2活性に対する効果は観測されなかった。より高い濃度（＞5mM）では、部分的な非特異的阻害が観測された。
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カテプシンO2活性はシステインプロテアーゼ特異的阻害剤によってのみ阻害される。
組換えヒトカテプシンO2の基質特異性
上述の基質検定法を用いて、合成基質に対する基質特異性を決定した。
ヒトカテプシンO2のS2P2特異性を、Z-X-R-MCA型（ここにX＝F、L、VまたはR）の合成基質を用いて特徴づけた。システインプロテアーゼのS2サブサイトポケットは構造的によく規定されており、このプロテアーゼクラスの一次的特異性を決定する。例えば、カテプシンBはグルタミン酸（E245）残基をS2サブサイトポケットの底部に含有し、それがアルギニンなどの塩基性残基の結合を促進する。他の既知のヒトカテプシンではいずれも、このグルタミン酸残基が中性残基に置換されていて、それがZ-R-R-MCA基質の加水分解速度を著しく遅くしている。カテプシンO2は位置205にロイシン残基を含有し、それがZ-R-R-MCAを極めて悪い基質にしている（図6）。カテプシンO2のP2残基に対する特異性はカテプシンSの場合に類似している。両酵素ともこの位置にフェニルアラニンよりもロイシンを好むが、カテプシンLは逆の特異性によって特徴づけられる（表5；図6）。カテプシンO2は位置P2のバリンを比較的よく許容するが、P2にこのベータ分枝残基が存在するとカテプシンL、SおよびBにとっては悪い基質になる。
0003670666.tif 000008
速度パラメーターkcatとKmを計算するため、典型的には9〜11の異なる基質濃度で初速を得て、その結果を等式（1）に当てはめた。酵素濃度はE-64による活性部位滴定によって決定する（Kinderら, Biohcem. J. 201: 367-372(1982)）。
v＝（kcat×E0×[S]）／（Km＋[S]）    等式（1）
ジペプチド基質に対するカテプシンO2の触媒効率（kcat/Km）はカテプシンSおよびBと同等であったが、カテプシンLよりもおよそ1桁低かった。興味深いことに、カテプシンO2に関するKm値はカテプシンLに関して決定された値と同等であった。Km値はプロテアーゼに対する基質の親和性をある程度反映する。この傾向はトリペプチド基質Z-LLR-MCAに関してさらに明瞭で、4×10-7M程度のKm値を示す。しかし、カテプシンSおよびLとは対照的に、カテプシンO2に関するkcat値はほとんど2桁小さい。これは非生産的結合を反映しているのだろう。
細胞外マトリックスタンパク質に対する組換えヒトカテプシンO2タンパク質の活性
比活性113,000cpm/mgタンパク質の[3H]エラスチンを記述されているように調製した（Bandaら, Methods Enzymol. 144: 288-305(1987)）。カテプシンO2、SおよびL検定のため、2.5mMジオチスレイトール, 2.5M EDTAおよび0.05％Triton X-100を含む緩衝液1ml中でエラスチン（2mg）をインキュベートした。10、20、30、50、90、120および180分後に一部を取り出し、14000×gで1分間遠心分離し、Liquid Scintillation計数器（1450 Microbeta Plus, Wallac/Pharmacia製）を用いて、シンチレーション液を含有する24穴プレート中で計数した。エラスチン分解検定におけるヒトカテプシンO2、SおよびLとウシエラスターゼの濃度はそれぞれ65nM、28nM、80nMおよび80nMであった。プロテアーゼ活性に対するpH効果を決定するため、pH4.5と5.5（100mM酢酸ナトリウム, 2.5ｍＭジオチスレイトール,2.5mM EDTA, 0.05％Triton X-100)およびpH7.0(100mM Tris/HCl, 2.5mMジチオスレイトール, 2.5mM EDTA, 0.05％Triton X-100）で消化を行った。ウシ膵臓エラスターゼ（Boehringer-Mannheim,インディアナ州）を、ジチオスレイトールとEDTAをインキュベーション混合物に加えなかった点以外は同じ条件下で検定した。
最大活性はpH5.5で観測された。カテプシンO2はpH4.5と7.0の間でエラスチン分解活性を持ち、それはカテプシンSより1.7〜3.5倍高い。カテプシンLのpH至適条件（pH5.5）と中性pHにおけるそのエラスチン分解活性は、カテプシンLおよび膵臓エラスターゼに比べて、それぞれほとんど9倍および2.4倍高かった（図7）。カテプシンLおよびSについて決定した値は刊行されたデータと良く一致している（Kirschkeら, Proteolysis and Protein Turnover, Bond, J.S.およびBarrett, A.J.編, 33-37頁, Portland Press,ロンドン−チャペルヒル(1993)；KirschkeおよびWiederanders, Methods Enzymol. 244: 500-511(1994)）。
2mMジチオスレイトール/2mM EDTAを含む100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5、5.0、5.5）、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0、6.5）および100mM Tris/HCl（pH7.0）で、可溶性ウシ皮膚I型コラーゲンを0.4mg/mlの濃度に希釈した。100nM酵素濃度のヒトカテプシンO2、SおよびLとウシトリプシン（Sigma）を28℃で10時間インキュベートした。カテプシンO2とSのゼラチナーゼ活性を測定するため、I型コラーゲンを70℃で10分間インキュベートした後、プロテアーゼと共にインキュベートした。1nMプロテアーゼの存在下で反応混合物を28℃で30分間インキュベートした。その試料を4〜20％Tris−グリシンゲル（Novex,カリフォルニア州サンディエゴ）によるSDSポリアクリルアミド電気泳動にかけた。
カテプシンO2はpH5.0と6.0の間では28℃で著しくI型コラーゲンを分解したが、pH4.5と7.0での分解はそれほど顕著でない（図9a）。ベータおよびガンマ成分から放出されるアルファ単量体はわずかに小さかったので、主要な切断はテロペプチド領域で起こるようであった。さらに、アルファ単量体内でも切断がおこるようである。切断が無傷の螺旋領域で起こるのか、ほどけたアルファ単量体で起こるのかは未だ不明である。カテプシンO2作用後に観測されるI型コラーゲンの主要断片は70〜80kDaのサイズであった。カテプシンLもテロペプチド領域で切断したが、小分子量断片は実質上検出されなかった。カテプシンLのコラーゲン分解活性に関する有効pH範囲は、カテプシンO2について観測された値（pH4.0と5.5の間）に比してより酸性であった。カテプシンSは極めて弱いコラーゲン分解活性を示すに過ぎないようだった。対照的に、組織コラーゲナーゼはアルファ単量体を3/4断片と1/4断片に切断する（GrossおよびNagai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54: 1197-1204(1965)）。カテプシンO2と等しい酵素濃度のトリプシンではI型コラーゲンの分解が観測されなかった。これは使用したコラーゲンの三重螺旋の完全性が損なわれなかったことを示している（データは示していない）。
そのコラーゲナーゼ活性に加えて、カテプシンO2は強力なゼラチナーゼ活性を発揮する。0.1nMの酵素濃度では、変性したコラーゲンが5.0〜7.0のpH範囲で30分以内に完全に分解された。対照的に、カテプシンLは4.5〜5.5のpH範囲でしかそのゼラチナーゼ活性を発揮しなかった（図6b）。カテプシンSはpH4.0と7.0の間で活性であったが、カテプシンO2およびLよりかなり弱い活性を示した。
カテプシン類の相対的エラスチン分解活性をウシ膵臓エラスターゼと比較した。
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メッセージレベルでのヒトカテプシンO2の組織分布
ヒトカテプシンO2、LおよびSのメッセージレベルの組織分布を、適当なヒト酵素のcDNAプローブを用いるノーザンブロットで決定した。そのプローブは約450塩基対長であり、活性部位残基システイン-25（パパイン番号系に従う）とアスパラギン-175の間の残基をコードする領域に広がっている。図8はヒトカテプシンO2のノーザンブロットを表す。図8に示すように、ヒト破骨細胞腫調製物におけるメッセージレベルは、カテプシンO2の発現レベルがカテプシンLの何倍も高いことを示している。
ヒトカテプシンO2 mRNAの組織分布はカテプシンLとの類似性をいくらか示したが、その組織濃度はほとんどの器官（心臓、胎盤、肺、膵臓および腎臓）でかなり低いようであった。一方、ヒトカテプシンO2をヒトカテプシンLおよびSと比べると、そのヒト組織および細胞系における分布が著しく異なった。カテプシンO2は卵巣、小腸および結腸で高い転写レベルを示したが、カテプシンLに富む肝臓にはメッセージがなかった。これはHeLa細胞にも認められた。
0003670666.tif 000010
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ケプリ・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：カテプシンO2プロテアーゼ
（iii）配列の数：１２
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：フレール，ホーバック，テスト，アルブリットン・アンド・ハーバート
（Ｂ）通り：フォー・エンバーカデロ・センター，スウィート３４００
（Ｃ）市：サンフランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９４１１１−４１８７
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：パテントイン・リリース・ナンバー１．０、バージョン・ナンバー１．３０
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９５
（Ｂ）出願日：１９９５年１０月２６日
（Ｃ）分類
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ未詳
（Ｂ）出願日：１９９５年１０月２日
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ／３３０，１２１
（Ｂ）出願日：１９９４年１０月２７日
（viii）弁理士／代理人 情報：
（Ａ）氏名：シルバ，ロビン・エム
（Ｂ）登録番号：３８，３０４
（Ｃ）参照／整理番号：FP-60261-1-PC/DJB/RMS
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：（４１５）７８１−１９８９
（Ｂ）ファックス番号：（４１５）３９８−３２４９
（Ｃ）テレックス番号：９１０  ２７７２９９
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１４２．．１１２８
（xi）配列：配列番号１：
0003670666.tif 000011
0003670666.tif 000012
0003670666.tif 000013
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（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
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（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号３：
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0003670666.tif 000019
0003670666.tif 000020
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：
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（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号５：
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（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６：
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（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号７：
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（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号８：
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（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号９：
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（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号１０：
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（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（xi）配列：配列番号１１：
0003670666.tif 000035
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：未詳
（Ｄ）トポロジー：未詳
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（xi）配列：配列番号１２：
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【図１Ａ】
0003670666.tif 000038
【図１Ｂ】
0003670666.tif 000039
【図１Ｃ】
0003670666.tif 000040
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
0003670666.tif 000043
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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