(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0003716296.tif 000003
（式中のＲは、炭素数１〜６の分岐していてもよいアルキル基を示す）で表されるチオリボース類化合物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、活性酸素が膜脂質の過酸化、炎症、老化、虚血性障害、発癌、糖尿病、動脈硬化、白内障、肺気腫、パーキンソン病等の生体の様々な病体の起因物質と考えられている。活性酸素とは、一般に、酸素が還元されて水を生ずるまでの中間に生成するスーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシラジカルなどである。
活性酸素は、ミトコンドリアやミクロソームにおいて電子伝達、ヘモグロビンによる酸素運搬などに際して常に生成しているが、通常、スーパーオキシドディスムターゼなどの酵素により分解されるため、生体への影響は抑えられている。通常はスーパーオキシムターゼなどの酵素により活性酸素は分解され、細胞障害の発生が抑えられているが、酵素機能が低下し、細胞膜脂質の過酸化により種々の疾病が発生する。
【０００３】
悪性腫瘍に対する放射線照射療法を受けている人や放射線取扱者、原子炉従事者などは多量の放射線に被曝しているほか、最近では、フロンガス等による上空の成層圏にあるオゾン層破壊のため、一般の人もより強力な紫外線の被曝している。放射線の被曝は、生体内にラジカルを発生させる。ラジカルは通常の酸素分子を活性化し、スーパーオキサイドやヒドロキシラジカルとなることから、放射線の被曝による遺伝的影響、発癌作用等の増加が懸念されている。
【０００４】
放射線被曝から生体を防護する薬剤として、従来、含硫アミン化合物等が検討されてきたが、臨床上適用されるまでに至っていない。最近、放射線障害防護剤として、アミフォスチン（Ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）の臨床治験がなされているが、副作用の点で問題が存在する。
【０００５】
米国特許第４４２０４８９号は、５−チオ−Ｄ−リボース、６−チオ−Ｄ−フルクトース等の環内に硫黄原子を有する糖化合物の放射線障害防止効果を開示しているが、臨床に供与出来るだけの強い効果に至っていない。一方、５−メチルチオ−Ｄ−リボースなどは、米国特許第４８２０６９２号に原虫に対する殺生物剤として用途が記載されクレームされている。しかしこれらの化合物に活性酸素除去作用に基づく放射線障害防護活性を有することは全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、新たな活性酸素除去作用を有する化合物を見いだすべく鋭意検討を重ねた結果、ある種のチオリボース類化合物が、毒性が低くかつ強力な放射線障害防護活性を有することを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
【問題を解決するための手段】
かくして本発明は、一般式（１）
【化２】
0003716296.tif 000002
で表されるチオリボース類化合物、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）が提供される。
【０００８】
上記一般式（１）において、Ｒは、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３,３−ジメチルブチル基、２,２−ジメチルブチル基、１,１−ジメチルブチル基、１,２−ジメチルブチル基、１,３−ジメチルブチル基、２,３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基のような炭素数１〜６個の分枝していてもよいアルキル基をであり、好適には炭素数１〜４個の分岐していてもよいアルキル基である。このような化合物は公知の化合物である。
【０００９】
このような化合物の具体例としては、５−デオキシ−５−メチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−エチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−プロピルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−イソプロピルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ブチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−イソブチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ｓ−ブチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ｔ−ブチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ペンチルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−イソペンチル−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２−メチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ネオペンチル−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ヘキシルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（４−メチルペンチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（３−メチルペンチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２−メチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ネオペンチル−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−ヘキシルチオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（４−メチルペンチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（３−メチルペンチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２−メチルペンチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（３，３−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２，２−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（１，１−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（１，２−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（１，３−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２，３−ジメチルブチル）チオ−Ｄ−リボース、５−デオキシ−５−（２−エチルブチル）チオ−Ｄ−リボースなどが挙げられる。
【００１０】
本発明に係わる放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）は、その剤型に応じて通常慣用の製剤手段を用いて調製される。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、腸溶剤およびカプセル剤などの経口剤、注射剤、坐剤などの非経口剤が挙げられる。経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明の有効成分量として１日１０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で服用する。
【００１１】
本発明において、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口剤は常法に従って製造される。錠剤はチオリボース類化合物をゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、滑石、アラビヤゴム等の製剤学的賦形剤と混合し賦形することにより製造され、カプセル剤は、本発明でいう有効成分であるチオリボース類化合物を製剤充填剤、もしくは希釈剤と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセル等に充填することにより製造される。シロップ剤、エリキシル剤は、本発明の化合物をショ糖等の甘味剤、メチルパラベンおよびプロピルパラベン類等の防腐剤、着色剤、調味剤、芳香剤、補助剤と混合して製造される。
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で１日１〜２００ｍｇの静注、皮下注、筋肉注射することができる。
非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、注射用植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、適宜、殺菌剤、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、アンプル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することができる。
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造することができる。
【００１２】
【発明の効果】
かくして、本発明によれば、放射線の障害を予防することができる放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）を得ることができる。
【００１３】
【実施例】
本発明の放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）について以下実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００１４】
合成例１  ５−デオキシ−５−メチルチオ−Ｄ−リボースの製造
特開昭５８−１４６２７４記載の従い製造したＳ−アデノシルメチオニンのパラトルエンスルホン酸塩１７００ｇを１ｌの蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを５.６とした後、８０℃で１.５時間加熱して加水分解を行った。反応終了後、低下したｐＨを再び水酸化ナトリウムで５.６に戻して結晶化を行い、５−デオキシ−５−メチルチオアデノシンの粗結晶９２３ｇを得た。この粗結晶を、０.５Ｎ硫酸２ｌに懸濁し、１００℃で３０分間加熱し加水分解を行った。放冷後、水酸化バリウムを加え中和すると、硫酸バリウムとアデニンが結晶化し析出沈澱した。この沈澱物を濾別後、強酸性イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗでカラム精製、さらに活性炭カラム精製を行い、非吸着画分を濃縮、凍結乾燥することにより、無色シロップ状の５−デオキシ−５−メチルチオ−Ｄ−リボース（以下、化合物１という）４０１ｇを得た。
【００１５】
合成例２  ５−デオキシ−５−エチルチオ−Ｄ−リボースの製造
ナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液１１．０ｇ、エタノール１５０ｍｌを混合した。エチルメルカプタン３．５ｇを加え、室温で５分間攪拌した。これにメチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−（ｐ−トルンスルホニル）−Ｄ−リボフラノシド２０ｇを加え、８０〜８５℃で２時間攪拌した。冷却後、反応液中の不溶物（主にｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム）を濾別した。濾液を酸性イオン交換樹脂（アンバーリスト１５）で中和した。樹脂を取り除き、溶媒を減圧留去した。残分をクロロホルムに溶解し、水で２回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下にクロロホルムを留去した。この反応混合物をベンゼンを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、メチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−エチルチオ−Ｄ−リボフラノシド１１ｇを得た。
得られたメチル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５−エチルチオ−Ｄ−リボフラノシド１０ｇ、ジオキサン５０ｍｌ、０．１Ｎ硫酸１３０ｍｌを混合し、１００℃で２時間攪拌した。冷却後、反応液に炭酸バリウムを加え中和した。不溶物を濾別し、濾液を減圧下に濃縮して、粗生成物６．９ｇを得た。これをクロロホルム：メタノール＝２０：１（Ｖ／Ｖ）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色シロップ状の５−デオキシ−５−エチルチオ−Ｄ−リボース（以下、化合物２という）４．２ｇを得た。
【００１６】
合成例３  ５−デオキシ−５−イソブチルチオ−Ｄ−リボースの製造
エチルメルカプタンに代えイソブチルメルカプタンを用いる以外は合成例２と同様の方法によって無色の５−デオキシ−５−イソブチルチオ−Ｄ−リボース（以下、化合物３という）を得た。得られた無色粘性液体は常温下で固化した。融点は４２〜４６℃であった。
【００１７】
試験例１  ＯＨラジカルスカベンジャー試験
本発明における有効成分のヒドロキシラジカル（以下ＯＨラジカルという）に対するスカベンジャー活性を、パルスラジオリシス法に従って検討した。
【００１８】
大型ライナックパルスラジオリシスシステム（４５ＭｅＶ、１ｎｓｅｃパルス幅、分析光；Ｘｅランプ（１ｋｗ））を用いて、化合物１とＯＨラジカルの反応速度定数を求めた。イソチオシアン化カリウム（以下ＫＳＣＮという）と化合物１とで、下記の試験溶液を調製した。
▲１▼１ｍＭ  ＫＳＣＮ
▲２▼１ｍＭ  ＫＳＣＮ  ／  ０.５ｍＭ  化合物１
▲３▼１ｍＭ  ＫＳＣＮ  ／  １ｍＭ  化合物１
▲４▼１ｍＭ  ＫＳＣＮ  ／  ２ｍＭ  化合物１
▲５▼１ｍＭ  ＫＳＣＮ  ／  ４ｍＭ  化合物１
【００１９】
上記の試験溶液をＮ2Ｏガスにて飽和（２７ｍｍｏｌ／Ｌ）後、上記装置にセットし、ＳＣＮ-とＯＨラジカルとの反応で生成する（ＳＣＮ）2-の４７５ｎｍでの吸光度を測定し、化合物を添加した時の吸光度の減衰を調べた。結果は、１＋（ｋ２／ｋ１）×［化合物１］／［ＳＣＮ-］の計算式から求められるＯＤO／ＯＤ値を［化合物１］／［ＳＣＮ-］対してプロットし、図１に示した。
ここで、ＯＤ0は化合物の試験溶液▲１▼の吸光度、ＯＤは試験溶液▲２▼〜▲５▼の吸光度、ｋ１はＳＣＮ-イオンのＯＨラジカルとの反応速度定数（＝２.８×１０10Ｍ-1ｓ-1）であり、ｋ２が化合物１の反応速度定数である。
【００２０】
【図１】
【００２１】
直線の傾きより、ＯＨラジカルに対する化合物１の反応速度定数を算出した。
求めた本発明化合物のＯＨラジカルとの反応速度定数は、ｋ２＝９．１×１０9Ｍ-1Ｓ-1と非常に強いＯＨラジカルスカベンジャー活性を持っていることが確認された。
【００２２】
試験例２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放射線障害防護試験
（細胞の調製）
ヒト唾液腺腫瘍細胞（以下、ＨＳＧ細胞という）１×１０5個を５ｍｌ培養ボトル（ファルコン社製）で１０％牛胎児血清含むＭＥＭ（以下、単に培地ということがある）で１週間培養した。そのＨＳＧ細胞２.５×１０5個を５ｍｌ照射用ボトル（ヌンク社製）に播種し２日間前培養した。
（薬剤の調製）
試験化合物として上記合成例で得られた化合物１、２、および３と比較化合物として５−チオ−Ｄ−リボースを培地で溶解し、０.２２μｍフィルターで濾過滅菌後、１．１８８、２．３７５、４．７５、９．５、１９、３８ｍｇ／ｍｌの６段階の濃度の薬剤含有培地を調製した。
（試験方法）
前培養したＨＳＧ細胞の培地を上記調製の薬剤含有培地と交換し、３７℃×３０分間培養した。３０分間処理後薬剤混在のまま、Ｘ線発生装置（島津製作所製；信愛２５０号）を用い、２００ｋｖ×１５Ａで７００ｒａｄのＸ線を照射した。
照射後、無血清ＭＥＭ培地で洗浄し、０.１％トリプシンで細胞を剥離させた。細胞数をコールターカウンターで計測し、１０日間培養後に１００前後のコロニーが生育しうる細胞数の細胞を６ｃｍφのプラスティックデッシュに播種した。コロニーは１％メチレンブルー溶液で染色し、１００倍の顕微鏡下でコロニー数を計測した。
計測されたコロニー数から、試験化合物の各薬剤濃度に対してのプレーティングエフィシャンシー（以下ＰＥという）および生存率（以下ＳＦという）を求めた。それぞれの計算式は、ＰＥ＝無照射群のコロニー数／無照射群の播種細胞数、ＳＦ＝（（照射群のコロニー数）／（照射群の播種細胞数×ＰＥ））×１００である。結果を図２に示す。
【００２３】
【図２】
【００２４】
試験例３ ｉｎ ｖｉｖｏ放射線骨髄障害延命試験（動物）マウスは、雌性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの２〜３ケ月齢を使用した。（１群１０匹）
（薬剤の調製）化合物１及び比較剤として５−チオ−Ｄ−リボースをそれぞれ秤量後生理食塩水に溶解し、０.２２μｍフィルターで濾過滅菌した。濃度は、マウス体重３０ｇ当り、０.３ｍｌで所定濃度の投与量になるように調製した。対照群には生理食塩水を投与した。
（試験方法）試験化合物水溶液を腹腔内に投与し、３０分後に137Ｃｓ γ線照射装置（東京芝浦電機製）を用いて、１０００ｒａｄのγ線を全身照射した。照射後、マウスの生死を毎日観察した。その結果、対照群および比較剤投与群では、９日目に全てのマウスが死亡したが、化合物１を投与した群では、９日目では全てのマウスが生存し、１５日目まで生存しているマウスが２匹であった。この結果から、本発明の放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）には、放射線障害に対して優れた延命効果、即ち放射線防護作用があることが判った。
【００２５】
試験例４  ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線腸管障害延命試験
（動物）
マウスは、雌性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの２〜３ケ月齢を使用した（１群１０匹）。
（薬剤の調製）
試験化合物の調製および投与は試験例３と同じ。
（照射条件）
試験化合物水溶液を腹腔内投与３０分後、東芝製137Ｃｓ γ線照射装置を用いて、１１００、１２００、１３００、１４００ｒａｄのγ線を全身照射した。
（放射線障害防護活性評価）
照射後７日目の死亡率を図３に図示した。
【００２６】
【図３】
【００２７】
この結果から、本発明の放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）は対照群に対して、放射線による骨髄障害を有意に低減することが判った。
【００２８】
試験例５  空腸クリプト細胞生存試験
（動物）
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雌性マウスの５ケ月齢を使用した（１群４匹）。
（薬剤の調製）
試験化合物は化合物１を用い、調製および投与法は試験例２と同様。
（照射条件）
薬剤投与から３０分後に、Ｘ線照射装置（島津製作所製；信愛７号）を用い、１１００〜１７００ｒａｄのＸ線を全身照射した。
（評価方法）
照射後３．５日目に開腹し、空腸をカルノア固定後パラフィン包埋した。パラフィン溶解後ミクロトームで組織切片を作成し、顕微鏡２００倍下でヘマトキシリンで染まる生存クリプト細胞数を計測した。結果は、図４に示す。
【００２９】
【図４】
【００３０】
この結果からも本発明の放射線障害防護剤（抗癌剤を除く）は、強い放射線防護効果が認められた。
【００３１】
試験例６  培養細胞生存試験
（細胞の調製）
ＨＳＧ細胞を５ｍｌ照射用ボトルに２.５×１０5個播種し２日間前培養した。
（薬剤の調製）
化合物１の３０ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製した。
（試験方法）
前培養したＨＳＧ細胞の培地を上記調製の薬剤含有培地と交換し、３７℃×３０分間培養した。無処理群は、新しい培地と入れ換えた。その後、Ｘ線発生装置（島津製作所製；信愛２５０号）を用い、２００ｋｖ×１５Ａで１００、３００、５００、７００および９００ｒａｄのＸ線を照射した。照射後、トリプシンで細胞を剥離させ、所定数の細胞を６ｃｍφのプラスティックデッシュに播種し、３７℃×１０日間培養しコロニーを形成させた。コロニーは１％メチレンブルー溶液で染色し、１００倍の顕微鏡下でコロニー数を計測した。
（生存曲線の作成）
試験例１と同様にして、各放射線量におけるＰＥおよびＳＦを求め、放射線に対する生存曲線を作成した。結果は、図５に示した。
【００３２】
【図５】
【００３３】
また、（ｌｎ（生存率））／放射線量と放射線量との関係を図６に図示した。
【００３４】
【図６】
【００３５】
これらの結果から、無処理群と薬剤処理群とでは、直線の接点は変わらず、傾きを変えているいることから、この化合物の効果はＤＮＡの一本鎖切断を防護していることわかる。
【００３６】
試験例７  毒性試験
ＢＤＦ１の６週齢雄性マウスに、化合物１の３０００ｍｇ／ｋｇを腹腔に１回、あるいは同化合物の２００ｍｇ／ｋｇを３０日間（総量６ｇ／ｋｇ）腹腔に連日投与した。
この結果、両投与群とも３０日目まで異常な症状は認められず、何れにも死亡例は認められなかった。また、３０日目に開腹し病理的に観察したが異常は認められなかった。このように本発明の薬剤は、きわめて毒性の少ない安全な薬剤であり、長期間投与することが可能である。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ラジカルスカベンジャー活性を示した図面である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放射線障害防護効果を示した図面である。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線腸管障害延命効果を示した図面である。
【図４】空腸クリプト細胞生存試験データを示した図面である。
【図５】培養細胞生存曲線を示した図面である。
【図６】（ｌｎ（生存率））／放射線量と放射線量との関係を示した図面である。
【図１】
0003716296.tif 000004
【図２】
0003716296.tif 000005
【図３】
0003716296.tif 000006
【図４】
0003716296.tif 000007
【図５】
0003716296.tif 000008
【図６】
0003716296.tif 000009