(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とを含む難溶性生理活性物質を細胞内に導入するための混合溶媒。
【請求項２】
難溶性生理活性物質が天然セラミドである請求項１に記載の混合溶媒。
【請求項３】
脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールである請求項１または２に記載の混合溶媒。
【請求項４】
ドデカンとエタノールの比率が容量比で容量比で 2：98である請求項３に記載の混合溶媒。
【請求項５】
炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とを含む混合溶媒および難溶性制癌剤を含み難溶性制癌剤を癌細胞内に導入するための癌治療用の製剤。
【請求項６】
難溶性制癌剤が天然セラミドである請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールである請求項５または６に記載の製剤。
【請求項８】
ドデカンとエタノールの比率が容量比で容量比で 2：98である請求項７に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、難溶性生理活性物質を細胞内あるいは生体膜へ効率的に導入するための溶媒系に関するものである。さらに本発明は、難溶性制癌剤を癌細胞に効率的に導入するための製剤に関する。
【従来の技術】
水に難溶又は不溶な医薬品はそれ自体では水にほとんどあるいは全く溶解しないので、生体膜を通過することができず、細胞内への移行がほとんど期待できないという問題を有している。このため、このような難溶性医薬品等の難溶性生理活性物質を細胞内に効率的に導入するための方法が開発されている。
【０００２】
例えば、難溶性生理活性物質をリン脂質リポソーム膜の内部に取り込んで可溶化し、細胞内部に導入する方法が知られている。また、難溶性生理活性物質のアルコール溶液やジメチルスルホキシド溶液をさらに水性媒体に注入して、得られた水性分散物を細胞内部に導入する方法なども開発されている。しかしながら、このような方法は、細胞への導入効率が著しく悪いものであった。
また、難溶性生理活性物質を化学的に修飾することにより、同様の生理活性を保持しつつ水溶性が改善された誘導体を製造する試みもなされている。しかしながら、このような化学的修飾法には多大な研究投資が必要であり、また、化学的修飾の対象となる難溶性生理活性物質が本来有している生理活性を損なう場合があった。
【０００３】
一方、ここ数年の間に腫瘍壊死因子 (tumor necrosis factor, TNF)-αが主に炎症性作用及び免疫調節作用に関する広い範囲の生物活性を発揮していることが示されている。 TNFαは、抗腫瘍効果及び抗悪性細胞効果の他に、種々のタイプの細胞の有糸分裂誘発、分化及び免疫調節に影響を持つことが報告されており、種々の生理学的及び病理学的条件下におけるこのサイトカインの重要な役割が示唆されている (Beutler, B., and Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7, pp.625-655, 1989 ；及び Grunfeld, C. and Feingold, K.R., Biotherapy, 3, pp.143-158, 1991 ）。
【０００４】
例えば、TNF αを細胞に添加した後 15-30分以内に原形質膜のスフィンゴミエリン(SM)の加水分解を開始させることが観察されている（Kim M-Y et al., J. Biol. Chem., 266, pp.484-489, 1991 ；Dressler, K.A. et al., Science, 255, pp.1715-1718, 1992 ）。この効果は TNFαに対する 55 KDa レセプターにより仲介されており、、それがホスホリパーゼ A2 及びホスホリパーゼ Cを活性化させている（Wiegmann K. et al., J. Biol. Chem., 267, pp.17997-18001, 1992 ；Yanaga F. and Watson S.P., FEBS Lett., 314, pp.297-300, 1992；Schuetze, S. et al., J. Exp. Med., 174, pp.975-988, 1991）。
【０００５】
最近、 TNFαが仲介する細胞調節活性メカニズムが解明されつつあり、スフィンゴリピド分解産物であるセラミド(Cer) が TNFαの作用を仲介する新しいシグナル経路を構成しているという証拠が蓄積されつつある (Obeid, L.M. et al., Science, 259, pp.1769-1771, 1993；Jarvis, W.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp.73-77, 1994 ）。また、セラミドがキナーゼ及びホスファターゼを活性化し核転写因子κB の核への局在化を誘導することが観察されている（Schuetze,S. et al., Cell, 71, pp.765-776, 1992；Obaibo G.S. et al., J. Biol. Chem., 268, pp.17762-17766, 1993 ；Yang Z. et al., J. Biol. Chem., 268, pp.20520-20523, 1993 ）。
【０００６】
哺乳動物組織由来の天然セラミドは、16-24 炭素原子を有するアルキル鎖を持つ長鎖脂肪酸がアミド結合によって結合している長鎖アミノアルコールからなる物質である。通常の両親媒性脂質はエタノール水溶液等を用いることにより水溶化できるが、天然セラミドは非常に疎水性の高い長鎖炭化水素尾部を有しているためにエタノールまたはジメチルスルホキシドのような通常の脂質導入溶媒 (lipid-delivering solvent) を用いても水中に溶解することができない。このため、実験的に細胞内のセラミド濃度を操作するには、2-8 炭素原子の脂肪酸を持つ化学合成セラミド (C2-Cer及び C8-Cer)を導入する方法あるいはバクテリア由来のスフィンゴミエリン(SM)加水分解酵素 (SMase)を外部から導入する方法によって行われている。
【０００７】
しかしながら、スフィンゴミエリンの加水分解はスフィンゴミエリン濃度低下をもたらすばかりでなく、TNF αシグナルの変換におけるメッセンジャー系として作用すると考えられるセラミド及びホスホコリンのような分解産物を与えるので、外部から細胞内にSMase を導入する方法によってはTNF αとセラミドの直接的な関係を解析することはできなかった。また、短鎖脂肪酸を有する合成セラミドを用いる方法にしても、これらの合成セラミドが受容体に対して天然セラミドと同等の親和性を有している保証はなく、さらに、短鎖脂肪酸合成セラミドが天然セラミドと異なる非生理学的あるいは人工的効果を惹起する可能性を排除することはできなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、例えばセラミドのような難溶性生理活性物質を細胞内に効率的に導入するための方法を提供することを目的としている。さらに本発明の目的は、このような方法に好適に使用される溶媒系を提供することにある。
別の観点からいえば、本発明の目的は、難溶性生理活性物質に化学的な修飾を加えることなく、難溶性生理活性物質それ自体を効率的に細胞内に導入するための方法、並びに該方法に有用な溶媒系を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、有効成分である難溶性制癌剤が効率的に細胞内に導入される特定の形態の製剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、エタノール及びドデカンの混合溶媒が天然セラミドを水性媒体中に効率的かつ安定に分散させることができることを見出した。また、上記の溶媒系が疎水性の天然セラミドを細胞内に効率的に導入する作用を有していることを見出した。本発明は上記の知見を基に完成されたものである。
【００１０】
すなわち本発明は、炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とを含む溶媒系の存在下で難溶性生理活性物質を細胞内に導入する方法を提供するものである。上記発明の好ましい態様として、難溶性生理活性物質が天然セラミドである上記方法；脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールである上記方法；脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールであり、ドデカンとエタノールの比率が容量比で容量比で 2：98である上記方法が提供される。
【００１１】
また、本発明によれば、難溶性生理活性物質を細胞内に導入するために有用な炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とを含む溶媒系、並びにその好ましい態様として、難溶性生理活性物質が天然セラミドである上記溶媒系；脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールである上記溶媒系；脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールであり、ドデカンとエタノールの比率が容量比で容量比で 2：98である上記溶媒系が提供される。
【００１２】
さらに本発明は、難溶性制癌剤と上記の溶媒系とを含み難溶性制癌剤を癌細胞内に導入するための癌治療用の製剤を提供するものである。その好ましい態様として、難溶性制癌剤が天然セラミドである上記製剤；脂肪族炭化水素がドデカンと水性有機溶媒がエタノールである溶媒系を用いる上記製剤；脂肪族炭化水素がドデカンであり水性有機溶媒がエタノールであり、ドデカンとエタノールの比率が容量比で容量比で 2：98である溶媒系を用いる上記製剤が提供される。
【００１３】
本発明の方法によれば、炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とを含む溶媒系の作用により難溶性生理活性物質を細胞内に効率的に導入できる。本発明の溶媒系に含まれる炭素数10〜12の脂肪族炭化水素としては、直鎖または分枝のデカン、ウンデカン、ドデカンであるアルカン類、あるいはこれらのアルカン類に任意の数の二重結合あるいは三重結合が導入されたアルケン類またはアルキン類を用いることができる。これらのうちドデカンを用いることが好ましい。
【００１４】
本明細書において、水性有機溶媒とは水と混じり合う性質を有する有機溶媒をいう。水性有機溶媒として、例えば、アセトン等のケトン類、グリコール類、グリセリン等のトリオール類、低級アルコール類等を用いることができる。これらのうち、低級アルコール類を用いることが好ましい。低級アルコールとしては、例えば炭素数４個以下のアルコールを使用することができるが、これらのうちエタノールを特に好適に用いることができる。本発明の溶媒系において、炭素数10〜12の脂肪族炭化水素と水性有機溶媒とは、脂肪族炭化水素と水性有機溶媒の容量比が、例えば 0.05 : 99.95 〜 20 : 80、好ましくは 1 : 99 〜 10 : 90となるように用いられる。水性有機溶媒としてエタノールを用いる場合には、脂肪族炭化水素とエタノールの比率を容量比で 2：98とすることが特に好ましい。
【００１５】
本発明の方法に用いられる難溶性生理活性物質は、水あるいは水性媒体に対して難溶あるいは不溶の性質を示すものである。例えば、水に対する溶解度が  μg/ml以下のものを用いることができる。本発明において特に好適な難溶性生理活性物質としては、脂溶性あるいは疎水性の高い分子団を有する難溶性生理活性物質を挙げることができる。例えば、本発明では、非常に疎水性の高い長鎖炭化水素尾部を有する天然セラミドを特に好適に用いることができる。天然セラミドとしては哺乳動物組織由来の天然セラミドを挙げることができ、例えば、16-24 炭素原子を有するアルキル鎖を含む長鎖脂肪酸により構成される天然セラミドを好適に用いることができる。もっとも、本発明の範囲は上記の天然セラミドを用いたものに限定されることはない。
【００１６】
上記の溶媒系は難溶性生理活性物質に対して極めて高い溶解性を有しており、難溶性生理活性物質を完全にあるいはほぼ完全に溶解した溶液を製造することができる。さらに必要に応じて、上記の溶液を水、水性培地、血液やリンパ液等の体液等の水性媒体中に分散させた水性分散物を製造することができる。本発明の方法に従えば、このような溶液あるいは水性分散物は難溶性生理活性物質を細胞内に導入するために有用である。細胞としては動物細胞が好適に用いられるが、例えば、ヒト等の哺乳類の正常組織由来の細胞、あるいは白血病等の細胞や固形悪性腫瘍細胞を用いることができる。上記の溶媒系は生体膜を実質的に破壊することがなく、また、細胞の生理的状態を実質的に損なうことなしに難溶性生理活性物質を細胞内部に導入することができる。
【００１７】
例えば、難溶性生理活性物質として天然セラミドを用い、溶媒系としてドデカン：エタノール＝ 2:98 (v/v) を用いた場合には、セラミドを 0.01 〜 0.3重量％、好ましくは 20 〜 500μM 程度で含む溶液を製造することができる。さらにその溶液を水に分散させることにより、最終濃度としてセラミド：0.1 〜50μM;ドデカン：0.001 〜 0.02 重量％；エタノール 0.01 〜1 重量％、好ましくはセラミド：0.5 μM;ドデカン：0.01重量％；エタノール：0.49重量％の水性分散物を製造することができる。
【００１８】
本発明のさらに別な態様によれば、難溶性制癌剤と上記の溶媒系とを含み難溶性制癌剤を癌細胞内に導入するための癌治療用の製剤が提供される。有効成分である難溶性制癌剤としては、上記の難溶性生理活性物質と同様の性質を有する制癌剤を用いることができ、例えば、天然セラミドや合成セラミド等を用いることができる。これらのうち、天然セラミドを用いることが好ましい。例えば天然セラミドを上記の溶媒系に溶解することにより、本発明の癌治療用製剤を製造することができる。本発明の癌治療用の製剤は、一般には溶液の形態として提供されるが、例えば凍結乾燥品として提供される難溶性制癌剤に対して投与直前に上記の溶媒系を添加して用時調製してもよい。
【００１９】
本発明の癌治療用の製剤は静脈内投与等により全身投与してもよいが、局所投与として患部の腫瘍組織に直接注射する等の方法を採用することもできる。上記の製剤をさらに注射用蒸留水、生理食塩水等の水性媒体に分散した後に点滴等の手段により静脈内投与してもよい。もっとも、投与方法は上記のものに限定されることはなく、患者の状態や癌の進行度等に応じて適宜の投与方法を選択することができる。本発明の製剤を用いることにより、難溶性制癌剤が効率的に癌細胞内部に導入され、特に本発明の製剤を局所投与に用いた場合には、癌細胞の内部に選択的に高濃度の制癌剤を導入することができるので有用である。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
なお、実施例中で以下の略号を用いる場合がある。 FCS: ウシ胎児血清； BSA: ウシ血清アルブミン；DMEM: ダルベッコの改良イーグル培地； F12: ハムの F12培地； HPTLC: 高性能薄層クロマトグラフィー；SM: スフィンゴミエリン；Cer:セラミド；Sph:スフィンゴシン；SMase:スフィンゴミエリナーゼ；HEPES: 4-(ヒドロキシエチル-1- ピペラジンエタンスルホン酸；PBS:リン酸緩衝生理食塩水； TNFα: 腫瘍壊死因子；C2-Cer: N-アセチルスフィンゴシン；DAG:  ジアシルグリセロール；C6-NBD-Cer: N-[7-(4-ニトロベンゾ-2- オキサ-1,3- ジアゾール)]-6- アミノカプロイル-D- エリスロ- スフィンゴシン；PKC:プロテインキナーゼ C；PMA: 4b-フォルボ 12-ミリステート 13-アセテート；EDC:塩酸 1- エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド。
【００２１】
(a) セラミドノ細胞内導入
0.1 mM Cerをエタノール：ドデカン（98:2, v/v) 5μl 中に溶解し、さらにこの溶液を1 mlの水に分散させた。最終濃度はそれぞれ 0.5μM Cer 、0.49% エタノール及び 0.01%ドデカンであった。この溶液は、リポソーム懸濁液のようにわずかな乳白色を呈していた。粒子の物性を動的光散乱法により調べたところ、その粒子の平均直径は 400〜450 nmであり、ゼータ膜電位は約 -10 mV であった。ドデカンをデカンまたはウンデカンに換えて試験したところ、これらのアルカンもドデカンと同様の効果を有していた。
上記の溶媒系を用いて Cerを細胞に導入することができるかどうかを、脂肪酸部分を[14C]-パルミチン酸によりラベルした[14C]-Cer を用いて検討した。本発明の溶媒系としてエタノール：ドデカン（98:2,v/v) 、及び対照としてエタノールを用い、 500nM [14C]-Cerを U937 細胞 (2 x 106 細胞/ml)と 37 ℃でインキュベートした。脂質は実施例の最後に述べる方法により分析した。定量データを図１に示す。各値は３回の実験からの平均値±標準偏差として示した(n=6) 。
【００２２】
[14C]-Cer の取り込みは二つの相として現れ、初期の相（40分以内）では細胞の放射能活性は急速に増加し、その後ゆっくりした取り込み相が続いていた。オートラジオグラフィー分析により、取り込まれたCer が SM に迅速に転化していることが観察された。取り込まれたCer の濃度は１時間後に最大に達しており、その後徐々に低下していた。この濃度低下は、おそらく Cerの遅い取り込み、SMへの転化及び Cerの分解によるものと考えられる。この Cer取り込みの動態は、蛍光性 Cerアナログ (C6-NBD-Cer) を用いた研究報告結果とよく一致していた (Pagano, R.E. and Sleight, R.G., Science, 229, pp.1051-1057, 1985）。
【００２３】
(b) 細胞内に導入された天然Cer の生理作用
DNAフラグメンテーションは細胞死に対する最も特徴的な生化学的マーカーであることが知られている（Russel, J.H. and Dobos, C.B., J.Immunol, 125, pp.1256-1261, 1980；Wyllie, A.H., Nature, 284, pp.555-556, 1980 ；Cohen, J.J. and Duke, R.C., J. Immunol, 132, pp.38-42, 1984)。一方、 TNFαは U937 細胞において DNAフラグメンテーションを引き起こすことが証明されている (Elias, E. and Berry, C.O.A., Leukemia, 5, pp.879-885, 1991；Greenblatt, M.S. and Elias, L., Blood, 80, pp.1339-1346, 1991 ；Wright, S.C. et al., J. Cell. Biochem., 48, pp.344-355, 1992；Obeid, L.M.et al., Science, 259, pp.1769-1771, 1993 ；Jarvis, W.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp.73-77, 1994 ）。
【００２４】
そこで、U937細胞におけるTNF α誘導による DNAフラグメンテーションの時間経過をアガロースDNA 電気泳動により追跡した。U937細胞 (2 x 105 細胞/ml)を(A) 500IU/ml TNFα、(B) 1 mU/ml SMase 、(C) エタノール／ドデカンのみ、及び (D)エタノール／ドデカン溶媒系を用いた 200 nM Cer で処理した。DNA は実施例の末尾に記載した方法で調製及び分析した。500 U/ml TNFαの存在下で U937 細胞を２時間インキュベートした後、アガロースゲル上に DNAフラグメントのラダーが明らかに観察された。
【００２５】
TNF αは U937 細胞において SM の早期加水分解を引き起こすことが報告されている（Obeid, L.M.et al., Science, 259, pp.1769-1771, 1993)。 SM あるいはそのCer 又はSph のような誘導体が TNFαの作用を仲介するのであれば、最も重要な判断基準は、それらの物質濃度を人工的に操作することによってTNF αにより誘導されるものと同等の反応を誘発できるかどうか、及びそれらの反応が TNFα作用に対する反応に必要な時間に匹敵する時間内に起こるかどうかということである。
【００２６】
そこで、バチルス・セレウス(Bacillus Cereus) からの組み換え SMaseを U937 細胞の表面における SM の加水分解に使用したところ、２時間以内に DNAフラグメンテーションが惹起された。これは TNFαに対して必要な最少時間にほぼ等しく、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) から精製したSMase の作用に対するものに類似していた（Jarvis W.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp.73-77, 1994）。この効果は低い SMase濃度 (0.04 mU/ml) で検出することができ、SMase を 100℃で 10 分間加熱することにより消失した。
【００２７】
SMase 又は TNFαにより活性化された SMaseによる SM の加水分解は、SM含有量を減少させるだけでなく、 TNFαシグナルの変換におけるメッセンジャー系として作用すると考えられるCer 及びホスホコリンのような分解産物を産生するので、本発明の溶媒系としてエタノール／ドデカンを用いて、U937細胞に天然Cer を導入した。U937細胞(2×105 細胞/ml)を、実施例の末尾に述べた方法により(1) エタノール／ドデカン、(2) エタノール／ドデカンで可溶化されたCer で処理した。エタノール／ドデカンのみの添加では、細胞形態、生存力及び DNAフラグメンテーションに何ら影響は見られなかった。一方、エタノール／ドデカンを用いてU937細胞を天然Cer で処理した場合には、細胞サイズの縮小、及び核内領域の凝縮がもたらされた。なお、培養物の形態は、３時間の処理の後に位相差顕微鏡 (×400)を用いて観察した。
【００２８】
アガロースゲル電気泳動を行ったところ、DNA が複数のヌクレオソームサイズのフラグメントに開裂することが示されたが、そのプロフィールは TNFα又は外生 SMase処理によりもたらされるものと区別ができなかった。 DNAフラグメンテーションプロフィールは１時間後には検出可能であり、1.5 時間の処理後には明らかであった。 DNAフラグメンテーションにおける天然Cer の効果は 25 nMという低い濃度でも検出することができ、100 nMでは効果が明らかであった。同様にエタノール／ドデカン溶媒系によって U937 細胞に導入された C2-Cer は１μM よりも高い濃度で DNAフラグメンテーションを誘導した。 C2-Cer についてのこの濃度は、エタノールを用いて U937 細胞に C2-Cer を導入した場合のものと一致していた（Obeid, L.M. et al., Science, 259, pp.1769-1771, 1993) 。天然Cer 及び C2-Cer の生理活性の差は、天然Cer では C2-Cer に比べて長鎖の脂肪酸を有していることに起因すると考えられる。
【００２９】
TNF α及び C2-Cer により誘導される DNAフラグメンテーションは、 Zn2+ 及び PMAの存在により阻害できることが示されている。この知見と同様に、天然Cer により誘導される DNAフラグメンテーションも Zn2+ 及び PMAにより阻害された。このことは TNFα及び Cerが DNAフラグメンテーションを起こさせる共通の最終経路を活性化することを示唆するものである。
さらに、  本発明の溶媒系としてエタノール／ドデカンを用いて、天然Cer の特異性を幾つかのCer アナログと比較検討した。この結果、DAG 及び Sphは DNAフラグメンテーションの誘導において効果を示さず、脂肪酸のα−ヒドロキシル化は（ウシ脳セレブロシド由来のCer はα−ヒドロキシル脂肪酸を含有する） DNAフラグメンテーションの誘導におけるCer の能力を著しく低下させることが明らかとなった。
【００３０】
FS-4フィブロブラスト中の TNFαによるシグナル変換におけるプロテインキナーゼ C (PKC)の役割が示唆されている（Sehgal, P.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp.1657-1661, 1987)。しかしながら、それは普遍的な事象ではないことも示唆されている (Bird, T.A. and Saklatvala J., J. Biol. Chem., 265, pp.235-240, 1990)。 U937 細胞に対しては、ともに PKCのアクティベーターである PMA及びDAG を導入しても DNAフラグメンテーションを起こさなかったため、 DNAフラグメンテーションにおけるPKC の関与は無視できるものと考えられた。
【００３１】
一方、 PKCのアクティベーターである PMAは U937 細胞において TNFαにより誘導される DNAフラグメンテーションを阻害することが示されている (Obeid, L.M.et al., Science, 259, pp.1769-1771, 1993)。また、U937細胞を PMAで前処理するとTNF αレセプターの再分配によってレセプターへの TNFαの結合が減少することも示されている (Aggarwal, B.B. and Eessalu, T.E., J. Biol. Chem., 262, 16450-16455, 1987) 。 PMAが SMase及びCer により誘導されるDNA フラグメンテーションを阻害することは、 PMAの効果が TNFαレセプターの調節に限定されるものではなく、後のシグナル変換を遮断することにも依っていることを意味するものである。
【００３２】
PKC は多様な成長因子のシグナル変換に関与していることが証明されており、培養細胞から成長因子が奪われるとアポプトシスが起きることが知られている。Cer は PKCの阻害剤ではないが、Cer の脱アシル化誘導体であるスフィンゴシンは PKCの強い阻害剤であることが知られている（Ballou, L.R. et al., J. Biol. Chem., 267, pp.20044-20050, 1992) 。しかしながら、スフィンゴシンの添加は DNAフラグメンテーションを誘導しなかったので、Cer の効果は PKCの低下調節によるものではないことが示唆された。
【００３３】
それぞれ RNA合成及び蛋白合成の阻害剤であるアクチノマイシン D及びシクロヘキシミドは、プログラム化された細胞死から細胞を保護する場合があることが観察されている。一方、 TNFαによって誘導されるプログラム化された DNAフラグメンテーションは蛋白合成には依存しないことが報告されている (Ostrove, J.M. and Gifford, G.E., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160, pp.354-358, 1979 ；Ruff, M.R., and Gifford, G.E., Infect. Immun., 31, pp.380-385, 1981 ；Rubin, B.Y. et al., Cancer Res., 48, pp.6006-6010, 1988)。そこで、Cer が仲介する DNAフラグメンテーションにおけるこれらの試薬の効果を試験したところ、シクロヘキシミド又はアクチノマイシン Dは、Cer により誘導される DNAフラグメンテーションを阻害しないことが確認された。
【００３４】
以上の実施例により、本発明の溶媒系を用いてU937細胞に天然セラミドを導入することにより、TNF αにより誘導されるものに類似した、プログラム化された DNAフラグメンテーションがU937細胞に誘導されることが明らかである。天然Cer は 25 nMという低い濃度で有効であり、この濃度は C2-Cer の最少有効濃度よりも 40 倍も低いものである。この事実はセラミドが TNFαの作用を仲介していることを強く示唆している。従って、上記の溶媒系を用いて天然セラミドを細胞内に導入することによって癌を治療することが可能であり、さらに、セラミドを上記の溶媒系中に含む本発明の制癌剤が癌治療に有用であることが当業者に容易に理解されよう。
【００３５】
(c) 以下に上記の実施例に用いた試薬等の材料と実験の詳細を示す。
材料：
[14C]-パルミチン酸（比放射活性：45 mCi/mmol)は NENから購入し；組み換え SMase(10 ユニット/mg 蛋白）はフナコシから購入し；牛脳 SM からのCer 、牛脳セレブロシドからのCer 、DAG 及びスフィンゴシンはシグマ（アメリカ）から購入したものを用いた。HPTLC プレート（シリカゲル 60)はメルク（ドイツ）から購入し；ドデカンはナカライ・テスクから購入し；EDC はピアースから購入し；組み換え TNFαはベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（ドイツ）から購入したものを用いた。
【００３６】
細胞及び培養条件：
U937 ヒト前単球細胞を、ダルベッコの改良イーグル培地及びハムの F12培地の等容量混合液 (DME/F12)に 10%加熱不活性化ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン及び 0.1 mg/mlストレプトマイシンを追加した培地中で生育させた。
TNFα及び SMaseによる細胞処理は、10μg/mlインシュリン及び10μg/mlトランスフェリンを追加した血清フリーの DME/F12培地中で行った。牛脳 SM 又はセレブロシドからのCer, C2-Cer, DAG, 又は Sphをエタノール：ドデカン (98:2, v/v)に溶解し、この溶液を試験管中の血清フリー培地に加えて振動により培地とよく混合させた。全試験を通じて、エタノール及びドデカンの最終濃度はそれぞれ 0.49%及び 0.01%であった。培地を培養皿に移した後、穏やかに振動させながら細胞を培地中に分散させた。
【００３７】
DNA 単離及びゲル電気泳動：
DNA は標準的方法（Strauss, W.M.:分子生物学における最新プロトコール；Ausubel, F.M. et al.編, ウィレイ社, ニューヨーク, ２章，pp.1-3, 1992）を用いて調製した。細胞を冷却したリン酸緩衝化食塩水で洗浄し、細胞ペレットを 0.1 NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム, 及び0.1 mg/ml プロテイナーゼ Kを含む溶液 200μl 中に再懸濁した。蛋白分解は 50 ℃で 12-16時間行なった。試料をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、DNA を１容量の 7.5 M NH4Ac及び２容量の無水エタノールで沈殿させ、10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA/0.1 % SDSバッファー (pH 8.0) 中に再懸濁し、１μg/ml DNaseフリー RNaseで 37 ℃で一晩処理した。続いて上記のように有機抽出及びエタノール沈殿した後に、0.1 mg/ml エチヂウムブロマイドを含む 2% アガロースゲル上に載せた。DNA を UV 光下で可視化し、写真撮影を行った。
【００３８】
[14C]-パルミトイル Sphの合成及び脂質分析：
[14C]-パルミトイル Sphをハマーストレン, S.ら(Hammarstroem, S. et al., J. Lipid Res., 12, pp.760-765, 1971 ）の方法により以下のように合成した。1,128 mg[14C]-パルミチン酸、3 mg Sph及び 3.4 mg EDC を 1 ml のジクロロエタン：アセトニトリル：メタノール (5:5:1,v/v)に溶解した。該溶液を 43 ℃で16時間インキュベートし、10倍容量のジエチルエーテルを加え、混合液を 5% NaHCO3、15% NaCl、1 N HCl 、15% NaCl及び再蒸留水で連続的に洗浄した。エーテル層を減圧留去して乾固した。
【００３９】
Cer はハラ及びタケトミ(Hara A. and Taketomi T., J. Biochem., 78, pp.527-536, 1975)の方法により珪酸カラムで精製した。エーテル層の残査をクロロホルムに溶解し、珪酸カラムに載せた。該カラムをクロロホルムで洗浄した後、Cer をクロロホルム：アセトンの段階的勾配（それぞれ、19:1, 9:1, 8:1, 4:1 及び 3:1, v/v)を用いて溶出した。Cer の純度は HPTLCで確認した。97% より高い純度で Cerを含む数個の分画をその後の実験に使用した。
【００４０】
細胞中への Cerの取り込みを測定するために、[14C]-パルミトイルCer を溶媒系としてエタノール−ドデカンとともに37℃でインキュベートした後、細胞を遠心分離で回収し、10% FCS を含む DME/F12培地を用いて室温下で２回洗浄した。脂質をクロロホルム：メタノール (2:1, v/v) で抽出し、一定量をシンチレーションカウンターでカウントして細胞に取り込まれた Cerを測定した。 Cerをクロロホルム：メタノール：酢酸 (94:1:5, v/v)を展開溶媒に用いて HPTLCプレート上で分離し、他の脂質はクロロホルム：メタノール：水 (60:35:8, v/v) を用いた二次展開により分離した。 HPTLCプレート上で分離された各々の放射性脂質を、イメージアナライザーにより分析及び定量した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、難溶性生理活性物質を効率的に細胞内に導入するのに有用な溶媒系が提供される。本発明の製剤を用いることにより、癌細胞の内部に効率的に制癌剤を導入することができるので有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の溶媒系を用いたセラミドの細胞内導入を示した図である。図中、○：エタノール：ドデカンを用いて取り込まれた Cerの総量；●：エタノールを用いて取り込まれた Cerの総量；□： Cerとしてカウントした細胞中に取り込まれた脂質量；及び△：SMとしてカウントした細胞中に取り込まれた脂質量を示す。
【図１】
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