(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な、完全長の感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードし、さらに少なくとも１つのウイルスの増殖を制限し、かつ、神経毒性を低減させる突然変異を含む単離された組換えＤＮＡ構築物であって、前記突然変異は、プレメンブレンタンパク質、エンベロープタンパク質、またはＮＳ１（１）タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ又は数個の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質への開裂を減少させる１つ又は数個の突然変異、ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコードする部位における１つ又は数個の置換、３’非コード末端の最も３’寄りのヌクレオチドを第１番としたとき、ヌクレオチド１１３番から３８４番までの間（１１３番および３８４番を含む）の少なくともヌクレオチド３０個からなる１つ又は数箇所の欠失、ＮＳ１のＣ末端開裂部位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコードする配列における１つ又は数個の突然変異からなる群から選択されることを特徴とする単離された組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ構築物を転写する工程を含む、RNAセグメントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換え活性キメラフラビウイルスに関し、さらに、デング熱ウイルスと、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）を含むその他のフラビウイルスに対するワクチンに関する。本発明は、さらに、組換え４型デング熱ウイルスの生成を導くようにＲＮＡ転写物をコードするｃＤＮＡ配列と、組換え突然変異４型デング熱ウイルスキメラデング熱ウイルスと、組換えＤＮＡ断片を作製して突然変異を組み込んだキメラデング熱ウイルスと、それらを用いて形質転換した細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラビウイルス科（Flaviviridae）には、約６０個の包被正鎖ＲＮＡウイルスが含まれ、その大半は昆虫により媒介される。この科に属する多数のウイルスは、世界各地で重大な公衆衛生上の問題を起こしている（Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ（１９８６）「トガウイルス科（Togaviridae）およびフラビウイルス科」Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ他編、３７５〜４４０頁、プレナム・プレス社、ニューヨーク）。これまでに配列決定されたすべてのフラビウイルスのゲノムは、同一の遺伝子順序を有している。すなわち、５’−Ｃ−ｐｒｅＭ−Ｅ−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５−３’であり、最初の３つの遺伝子は、構造タンパク質であるカプシド（Ｃ）と、プレメンブレンタンパク質（ｐｒｅＭ）と、エンベロープタンパク質（Ｅ）をコードしている。
【０００３】
デング熱は、蚊媒介ウイルス性疾病であり、世界各地の熱帯および亜熱帯地域で発生する。デング熱ウイルス亜群［ｓｕｂｇｒｏｕｐ］は、フラビウイルス科の他のウイルスのどれよりもヒト疾病を起こす。デング熱は、発熱、発疹、激しい頭痛、関節痛を特徴としている。その死亡率は低い。しかしながら、過去数十年間にわたり、出血およびショックを特徴とする、より重症のデング熱（デング出血熱／デング熱ショック症候群；ＤＨＦ／ＤＳＳ）が、子供および若者に増加している。ＤＨＦ／ＤＳＳは、ある血清型［ｓｅｒｏｔｙｐｅ］のデング熱ウイルスにすでに感染した者が別のデング熱ウイルスに感染した際に、もっとも頻繁に発生する。このことは、ウイルス複製の免疫強化が、より重症の疾病の病因においてある役割を果たしていることを示唆している（Ｓ．Ｂ．Ｈａｌｓｔｅａｄ（１９８８）サイエンス第２３９巻４７６〜４８１頁）。
【０００４】
デング熱伝染は、媒介となる蚊種が豊富な熱帯および亜熱帯の多くの地域において、大きな公衆衛生問題となっている。４０年間もの熱心な研究にもかかわらず、デング熱ウイルス疾病のための安全で有効なワクチンはできていない。デング熱ウイルスは、ＷＨＯにより、研究促進およびワクチン開発の高優先度目標として指定された。
【０００５】
デング熱ウイルスは、１９４４年における単離の後まもなく、マウスの脳において繰り返し継代培養［ｐａｓｓａｇｅ］され、その結果、マウス神経毒性［ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｔ］突然変異体が選抜された（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。興味深いことに、被験希望者において実施された研究により、１型または２型デング熱ウイルスの３つの株のマウス脳適合神経毒性突然変異体は弱毒化されてはいるが、なお、ヒトについて免疫原性をもつことが示された（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁、Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第４巻１９８〜２０７頁、Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第４巻１９８〜２０７頁、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ他（１９５６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第７７巻３５２〜３６４頁、Ｃ．Ｌ．Ｗｉｓｓｅｍａｎ他（１９６３）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．第１２巻６２０〜６２３頁）。しかしながら、これらの突然変異体は、ワクチン株候補としてはそれ以上開発されなかった。これは、ワクチン製剤中のマウス脳抗原に対する懸念の故である。このとき以来、（ｉ）小型プラーク（溶菌斑）表現型を示した、および／または（ii）温度感受性であった、および／または（iii ）人工的な宿主から由来する細胞培養に適合した（すなわち宿主域突然変異）ウイルス突然変異が、弱毒化生菌ウイルスワクチンに包含させるための候補として選抜され評価されてきた（Ｖ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ他（１９７７）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．第１８巻１５１〜１５６頁；Ｃ．Ｈ．Ｈｏｋｅ他（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第４３巻２１９〜２２６頁；Ｎ．Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ他（１９８７）Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ第６５巻１８９〜１９５頁）。しかしながら、２５年間のこのような努力にもかかわらず、安全で効果的なデング熱ワクチンは、一般用としてはまだ得られていない。不活化全デング熱ウイルスワクチンは、免疫原性が不十分であることが証明されている。細胞培養において連続継代培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、弱毒化による遺伝子的不安定性や免疫原性の欠乏という難点がある。本発明は、キメラデング熱ウイルスおよびキメラフラビウイルスワクチンを提供することにより、技術的発展をもたらすものである。
【０００６】
４つの血清型のデング熱ウイルス（１型〜４型）は、血清型特異的モノクローナル抗体を用いたプラーク減縮中和法により、および、ポリクローナル血清を用いたやや特異性の低い試験により区別することができる（Ｗ．Ｍ．Ｂａｎｋｃｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ  Ａｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁；Ｅ．Ａ．Ｈｅｎｃｈａｌ他（１９８２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３１巻５４８〜５５５頁）。血清型の存在は、ヒト被験希望者における初期の研究において最初に発見され、１つの血清型のデング熱に感染すると耐久性のある同型免疫が誘導されるものの異型免疫は３〜５ケ月しか持続しないことが証明された（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。デング熱ウイルス一般に対して広範囲の免疫を誘導するために４つの血清型すべてを含む効果的なデング熱ワクチンがあれば、ＤＨＦ／ＤＳＳの発生を妨害することができるだろう。
【０００７】
３型および４型デング熱ウイルスおよびマウス神経毒性ニューギニアＣ型を含む２型ウイルスの数株については、完全なヌクレオチド配列が決定されている。しかしながら、１型ウイルスゲノムについては、５’部分だけが配列決定されているにすぎない（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁；Ｋ．ＯｓａｔｏｍｉおよびＨ．Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７６巻６４３〜６４７頁；Ａ．Ｉｒｉｅ他（１９８９）Ｇｅｎｅ第７５巻１９７〜２１１頁；Ｐ．Ｗ．Ｍａｓｏｎ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１６１巻２６２〜２６７頁；Ｙ．Ｓ．Ｈａｈｎ他（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１６２巻１６７〜１８０頁）。これらの研究の成果は、デング熱ウイルスの４つの血清型が共通のゲノム構成をもつことを示している。４型デング熱のカリブ株８１４６６９のゲノムは１０６４６個のヌクレオチドを含むことがわかっている（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。５’末端における最初の１０１個のヌクレオチドおよび３’末端における最後の３８４個はコードしていない。残りの配列は、３３８６個のアミノ酸ポリタンパク質をコードしており、これには、３つの構造タンパク質、すなわち、カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒｅ−Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）がそのＮ末端に含まれ、７個の非構造タンパク質が上述した順序で続いている。これは、これまでに識別されたすべてのフラビウイルスゲノムに共通している。ポリタンパク質は、細胞信号ペプチダーゼにより、および、ウイルスプロテアーゼにより、１１個以上のウイルスタンパク質を生じるようにプロセス（Ｌ．Ｍａｒｋｏｆｆ（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６３巻３３４５〜３３５２頁；Ｂ．Ｆａｌｇｏｕｔ他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６３巻１８５２〜１８６０頁；Ｂ．Ｆａｌｇｏｕｔ他（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５巻２４６７〜２４７６頁；Ｈ．ＨｏｒｉおよびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻４５７３〜４５７７頁）。
【０００８】
我々はすでに、感染性ＲＮＡの転写のための鋳型として用いることのできる完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡを構築した。我々は、安定的にクローンされた完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡを得、ＤＮＡ鋳型から派生した（インビトロ）試験管内ＲＮＡ転写物が培養中の細胞に対して感染性をもつことがわかった。しかしながら、この感染性構築物と、そこから生成された感染性ＲＮＡ転写物は病原性である。さらに、これまでに生成された弱毒化デング熱ウイルスは遺伝学的に不安定で、時間がたつと病原性形態に逆戻りする可能性を有している。それでも、弱毒化ウイルスは望ましい。その理由は、弱毒化ウイルスにより長期間持続する免疫が得られることが一般に知られているからである。したがって、この構築物またはキメラ構築物を病原性の低いウイルスの産生を導くように改変すれば、弱毒化フラビウイルスワクチン技術において相当の進歩となるだろう。したがって、我々は、ここに開示するとおり、ｃＤＮＡの３’非コード領域において一連の欠失を構築し、活性デング熱ウイルス突然変異体を回収して増殖特性を分析した。
【０００９】
フラビウイルス科のその他のウイルスもやはり病原性である。その例としては、ダニ媒介脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスがあげられる。弱毒化デング熱ウイルスワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）ウイルスは、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい傾向があった。したがって、他の弱毒化フラビウイルスワクチンも、技術におけるかなりの前進となるであろう。すなわち、本発明は、さらに、他のフラビウイルスに対するワクチン製造のための遺伝子操作およびキメラウイルス開発のフレームワークとして、デング熱ウイルスや別のフラビウイルスの改変完全長組換えｃＤＮＡ構築物を採用する。
【００１０】
ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）は、ダニによってのみ媒介され、血清学的に区別できる２つのサブタイプに分類される。ロシアのシベリア地方と極東地方に優勢な東部サブタイプ（プロトタイプ株Ｓｏｆｊｉｎ）と、ヨーロッパ東部および中央部に見られる西部サブタイプ（プロトタイプ株Ｎｅｕｄｏｒｆｌ）である。ＴＢＥＶは、死亡率が１〜３０％の重い脳炎を引き起こす。ＴＢＥＶの詳細についてはＣａｌｉｓｈｅｒ他（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻３７〜４３頁）を参照されたい。現在、ＴＢＥＶのホルマリン不活化により製造された試験的ＴＢＥワクチンが入手できるが、このワクチンはいくつかの制約を有している。たとえば、このワクチンの免疫原性は十分ではないため、防御免疫反応を生じさせるためには繰返し接種が必要である。ワクチンに対する抗体反応があった場合でも、このワクチンは、個体群の２０％において、ウイルスに対する防御反応を提供することができない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、より改良されたデング熱ワクチン及びＴＢＥＶワクチンが必要とされている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
一態様において、本発明は、少なくとも２つのフラビウイルスから由来した核酸を含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。この構築物は、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）からの２つ以下の構造タンパク質を作動可能（operably）にコードする核酸領域を含む。この領域は、ＴＢＥＶ以外のフラビウイルスからの構造タンパク質を作動可能にコードする核酸領域に結合する。好ましくは、この構築物は、ダニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構造タンパク質を作動可能にコードする核酸領域に結合する、フラビウイルスカプシドタンパク質を作動可能にコードする核酸領域を含む。カプシドタンパク質および非構造タンパク質をコードする核酸領域は、好ましくは、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウイルス由来のものである。好ましい形態において、この構築物は、少なくとも２つのフラビウイルスに由来する核酸内に、少なくとも１つの突然変異を含む。この好ましい形態の一実施例において、突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排除する。この形態の別の実施例において、突然変異は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する。突然変異がウイルス増殖速度に影響することが好ましい。さらに、本発明は、これらの組換えＤＮＡ構築物に対応するＲＮＡ転写物を含む。
【００１３】
本発明の別の態様において、フラビウイルス由来のゲノムを有するキメラウイルスが得られる。このキメラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構造タンパク質をコードする核酸領域と、他のフラビウイルスからの非構造タンパク質をコードする核酸領域とを含む。好ましくは、このウイルスは、フラビウイルスファミリーの他のメンバーからのカプシドタンパク質をコードする核酸領域を含む。ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、プレメンブレンおよび／またはエンベロープタンパク質など、多数のタンパク質のどれでもコードすることができる。他のフラビウイルスからの非構造タンパク質をコードする核酸は、好ましくは、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウイルスである。一実施例において、本発明の本態様のキメラウイルスは、核酸内に少なくとも１つの突然変異を含む。この突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排除する突然変異や、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害する突然変異など、多数の形態のいずれをとってもよい。突然変異がウイルス増殖速度に影響することが好ましい。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコードする核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコードする核酸領域と、同じフラビウイルスからの非構造タンパク質をコードする核酸領域とを含むキメラウイルスが得られる。フラビウイルスは、たとえば、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウイルスである。本発明の本態様において、好ましい形態のキメラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコードする核酸領域内に少なくとも１つの突然変異を含む。突然変異は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害するものを用いることができる。別の好ましい形態において、キメラウイルスは、他のフラビウイルスからの核酸領域内に少なくとも１つの突然変異を含む。この突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排除するものを用いることができる。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明によれば、脊椎動物において防御免疫反応を生起することのできる、本発明のキメラウイルスからなるダニ媒介脳炎に対するヒト用ワクチンが得られる。すなわち、本発明は、さらに、フラビウイルスに対するヒト用ワクチンを製造する方法を含み、フラビウイルスからのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質と、デング熱ウイルスからのカプシドおよび非構造タンパク質とをコードすることのできるＤＮＡ構築物を作製し、上記ＤＮＡ構築物から感染性ＲＮＡ転写物を生成し、上記ＲＮＡ転写物を細胞に導入し、上記細胞内でＲＮＡ転写物を発現させ、上記細胞からウイルスを収穫し、上記ウイルスを脊椎動物において試験し、上記ウイルスをヒトに接種することを含む。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、日本脳炎ウイルスのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコードする核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコードする核酸領域と、デング熱ウイルスなどの、同じフラビウイルスからの非構造タンパク質をコードする核酸領域とを含むキメラウイルスが得られる。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスが得られる。このゲノムは、４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質を作動可能（operatively）にコードする核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質を作動可能にコードする核酸領域とを含む。本発明の一実施例において、キメラウイルスのゲノムは、４型デング熱ウイルス構造タンパク質を作動可能にコードする核酸を実質的にもっていない。このキメラウイルスの好ましい実施例は、ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡを含む。好ましくは、キメラウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコードすることのできる核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質をコードすることのできる核酸領域とを含む。非構造タンパク質を作動可能にコードすることのできる核酸は、好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコードすることのできる核酸の領域とは異なるウイルス由来のものである。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスが得られる。このゲノムは、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質を作動可能にコードする核酸領域とを含む。構造タンパク質を作動可能にコードする核酸の領域は、好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸の領域とは異なるウイルス由来のものである。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物においてウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできるワクチンが得られる。このワクチンは、安全でかつ免疫学的に有効な量の本発明のウイルスのいずれかと、薬学的および免疫学的に受容可能な担体とを含んでいる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物においてウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできる別のワクチンが得られる。本発明の本態様において、このワクチンは、以下のウイルスの安全でかつ免疫学的に有効な量を含む。ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコードする核酸領域と、１型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、ｂ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコードする核酸領域と、２型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、ｃ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコードする核酸領域と、３型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、ｄ）弱毒化４型デング熱ウイルス。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうちの１つからの構造領域とを含むＤＮＡセグメントが得られる。本発明の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントは、構造および非構造領域に作動可能に結合するプロモーターを含む。別の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントは、プロモーターとしてＳＰ６またはＴ７プロモーターを含む。さらに別の実施例において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）である。
【００２２】
本発明の他のいくつかの態様によれば、他のキメラＤＮＡセグメントが得られる。本発明のこれらの態様によるＤＮＡセグメントは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非構造領域を含んでいる。これらのＤＮＡセグメントは、さらに、以下のウイルスのうちの１つからの構造領域を含んでいる。１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、フラビウイルス。ただし、構造領域と非構造領域は同一ウイルス由来ではないことを条件とする。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡセグメントは、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうちの１つからの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうちの１つからの構造領域とを含み、構造領域は非構造領域とは異なるウイルス由来である。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、フラビウイルスの非構造領域またはその一部、および異なるフラビウイルスの構造領域またはその一部からなるＤＮＡセグメントが得られる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物においてウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできるワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免疫学的に有効な量のキメラウイルスを含む。このウイルスのゲノムは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク質を作動可能にコードする核酸と、デング熱ウイルスからの非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸とを含む。
【００２６】
本発明のさらに別の態様によれば、別のキメラウイルスが得られる。この態様において、キメラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および４型デング熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコードするウイルスのゲノムをもつ。好ましい実施例において、ウイルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウイルス由来のものである。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および４型デング熱ウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡセグメントが得られる。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードする、単離されたＤＮＡ断片が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片とベクターからなる組換えＤＮＡ構築物が得られる。好ましい実施例において、ベクターはプラスミドである。本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡ断片の発現を可能とするようにして本発明の組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細胞である。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、４型デング熱ウイルスの突然変異を作製する方法が得られる。この方法は、（ｉ）部位特異的突然変異誘発により４型デング熱ウイルスのゲノムに突然変異を導入し、（ii）突然変異を有する感染性４型デング熱ウイルスを回収し、（iii ）回収したウイルスを評価するステップを含む。本方法の一実施例において、回収されたウイルスは、弱毒化または無毒性の表現型について評価される。
【００３０】
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンが得られる。このワクチンは、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無毒性４型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。好ましい実施例において、無毒性４型デング熱ウイルスは、ウイルスゲノム内の重要な領域において突然変異を加工することにより得られる。
【００３１】
本発明のさらに別の態様によれば、キメラフラビウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片が得られる。キメラＲＮＡは、たとえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウイルスを含んでいる。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、キメラデング熱ウイルスの構築のための方法が得られる。この方法は、本発明の方法により得られた４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルスからの、対応する遺伝子全体またはその画分［ｆｒａｃｔｉｏｎ］で置換することを含んでいる。好ましい実施例において、異なるフラビウイルスは以下のウイルスの１つである。１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス。別の好ましい実施例において、４型デング熱ウイルスは少なくとも１つの突然変異を含む。
【００３３】
本発明は、デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンを提供する別の態様を含む。本態様において、本発明は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量の感染性キメラウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。キメラウイルスは、たとえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、あるいは４型デング熱ウイルスに由来する。
【００３４】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片と、ベクターからなる組換えＤＮＡ構築物が得られる。１つの好ましい実施例において、ベクターはプラスミドである。本発明のさらに別の態様によれば、ＤＮＡの発現を可能とするようにして、本発明の方法により得られた組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細胞である。
【００３５】
本発明のさらに別の態様によれば、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコードする配列内に置換突然変異を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片が得られる。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコードする部位に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片が得られる。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、３’側非コード領域内に欠失を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片が得られる。好ましい実施例において、欠失は、ヌクレオチド３０〜２０２個分の長さをもつ。
【００３８】
本発明の別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片のいずれかとベクターとを含む組換えＤＮＡ構築物が得られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物が得られる。本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡ断片の発現を可能とするようにして、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた宿主細胞が得られる。このような宿主細胞には哺乳類または昆虫の細胞を用いることができる。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンが得られる。本発明の本態様において、このワクチンは、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量の、毒性低減化突然変異４型デング熱ウイルスを含む。好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、ウイルスゲノムにおける３’側非コード領域内に欠失突然変異を加工することにより得られる。別の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコードするウイルスＤＮＡ配列内に置換突然変異を加工することにより得られる。さらに別の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルスは、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコードするウイルスＤＮＡ部位に置換を加工することにより得られる。
【００４０】
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換することを含む、キメラデング熱ウイルスの構築方法が得られる。好ましい実施例において、異なるフラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスの１つである。別の好ましい実施例において、キメラデング熱ウイルスの構築方法は、本発明による４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換することを含む。好ましくは、フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルスからなる群から選択される。さらに好ましくは、キメラデング熱ウイルスの構築方法は、本発明による４型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、フラビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置換することを含む。好ましい方法において、フラビウイルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のさらに１つの態様によれば、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量を投与される、デング熱ウイルスに対するワクチンが得られる。このワクチンは、毒性が低減したキメラウイルスを含み、上記キメラウイルスは、３’側非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む。好ましい実施例において、キメラウイルスは２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルスからなる群から選択される。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、以下の発明の詳細な説明を参照することにより、当業者にとって明らかになるであろう。
【００４３】
【発明の実施の形態】
キメラフラビウイルスの生成
デング熱ウイルスは、ほぼ１１キロベースの正鎖ＲＮＡゲノムを含み、このゲノムは、３つの構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒｅＭ）、エンベロープ（Ｅ））を１つの読取りフレームでコードしており、７個の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）がそれに続いている。
【００４４】
本発明は、１つの「型（type）」のデング熱ウイルスまたはフラビウイルスからの非構造タンパク質と、異なる「型」のデング熱ウイルスまたは別のフラビウイルスからの構造タンパク質とを含むキメラデング熱ウイルスに関する。
【００４５】
一実施例において、本発明は、
１）１型、２型、３型、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、またはフラビウイルスの非構造領域と、
２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、またはフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構造領域とは異なる「型」のデング熱ウイルスまたはフラビウイルス由来のものであることを特徴とするキメラウイルスに関する。
【００４６】
別の実施例において、本発明は、
１）４型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）の非構造領域と、
２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。１つの好ましい実施例において、このウイルスは、４型デング熱ウイルス構造領域を実質的にもっていない。好ましい実施例において、このウイルスはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡからなる。
【００４７】
さらなる実施例において、本発明は、
１）１型デング熱ウイルスの非構造領域と、
２）２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
【００４８】
さらなる実施例において、本発明は、
１）２型デング熱ウイルスの非構造領域と、
２）１型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
【００４９】
別の実施例において、本発明は、
１）３型デング熱ウイルスの非構造領域と、
２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
【００５０】
別の実施例において、本発明は、
１）黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された非構造領域と、
２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構造領域とは異なるウイルス由来のものであることを特徴とする、キメラウイルスに関する。
【００５１】
さらなる実施例において、本発明は、上記キメラウイルスの少なくとも１つと、薬学的ならびに免疫学的に受容可能な担体からなるワクチンに関する。
【００５２】
ワクチンに含まれるウイルスの量は、投与の経路に応じて選択される。皮下経路が好ましいが、上述のワクチンは、皮内経路によっても投与できる。当業者であれば、いかなる治療法についても、投与すべき量を容易に決定できることが理解されよう。
【００５３】
さらに別の実施例において、本発明は、
１）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デング熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、
２）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、２型デング熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、
３）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、３型デング熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、
４）弱毒型４型デング熱ウイルスからなるワクチンに関する。
【００５４】
１つの好ましい実施例において、弱毒化ウイルスは、非構造タンパク質領域（たとえば、改変されたＮＳ１−ＮＳ２開裂部位配列）内に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。別の好ましい実施例において、弱毒化ウイルスは、３’非コード領域内に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。さらに好ましい実施例において、弱毒化ウイルスは、５’非コード領域に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。別の好ましい実施例において、弱毒化ウイルスは、天然由来のものまたは研究室で加工したものである。
【００５５】
別の実施例において、本発明は、上述のウイルスの少なくとも１つをコードするＤＮＡセグメントに関する。１つの好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントは、構造および非構造領域に作動可能に連結するプロモーター（好ましくは、真核、原核、ウイルス性プロモーター、より好ましくはＳＰ６またはＴ７プロモーター）を含む。別の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を含む。
【００５６】
すなわち、当業者であれば、後述の実施例において提供される方法を用いて、フラビウイルス科の１つのウイルスの構造領域を、フラビウイルス科の別のウイルスからの非構造領域に組合せて得られる型間組換え体を含むキメラデング熱ウイルスワクチンを生成できることはいうまでもない。好ましい実施例において、４型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）の非構造タンパク質を１型デング熱ウイルスの構造タンパク質に組み込んだキメラデング熱ウイルスが作製される。これらの方法の詳細は、Ｂｒａｙ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻１０４２〜１０４６頁、１９９１年）を参照されたい。
【００５７】
後述の実施例１７は、実施例１に説明するキメラデング熱ウイルス製造のための方法につづいて４型デング熱ウイルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスの構造領域に組み合わせたキメラウイルス（ＴＢＥＶ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４）の作製を開示している。これらの方法により作製されたウイルスは培養中で複製され、組織培養細胞または実験動物の感染に用いられた。
【００５８】
神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然変異
我々は、細胞培養における増殖特性およびプラーク形態の変化を示す、３’非コード領域における欠失を含む一連の活性デング熱ウイルス突然変異体を加工した。同様に、我々は、ウイルスポリタンパク質の非構造タンパク質領域の新規な開裂部位配列内に核酸酸置換を含む、別の一連の、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異体を加工した。複製能力が低下したデング熱ウイルス突然変異体は、生菌ウイルスワクチンに用いるための適格性を判定するために、実験動物における毒性の低下について評価を受ける。
【００５９】
本発明において、３’非コード領域内に欠失を含む増殖制限された４型デング熱ウイルス突然変異体の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンを用いて重要な領域内に欠失を加工することにより実行される。欠失突然変異は、アミノ酸置換突然変異に比べて、表現型の逆転が少ないという利点をもっている。
【００６０】
他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング熱ウイルスは、指定された保存配列１（ＣＳ−１）および保存配列２（ＣＳ−２）の保存領域と、潜在的末端ステム・アンド・ループ構造とを含む３’非コード配列を有している。ヌクレオチド３〜２０２個の範囲の欠失は、４型デングｃＤＮＡのヌクレオチド３８４個の３’非コード配列内のさまざまな位置に導入することができる。ＣＳ−１領域のｃＤＮＡクローン欠損配列から作製され、しかしステム・アンド・ループ構造をとどめているＲＮＡ転写物は、子孫ウイルスを生じることがなく、欠失が致死的であることを示している。一方、たいていの他の３’非コード領域欠失構築物からは、感染性ウイルスを回収することができる。
【００６１】
これらの突然変異体および野生型ウイルスのプラーク検定は、蚊細胞（Ｃ６／３６）に対して実施することができる。分析の結果、ほとんどの欠失突然変異体が、欠失の位置と程度に応じて、１．０から０．３ｃｍにわたる、縮減サイズのプラークを形成することが示されている。プラーク形態のこのような変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限表現型をあらわすことを示すものである。３’非コード領域内に欠失を含むデング熱ウイルス突然変異体のこのパネルは、実験動物においてそれらの感染性および免疫原性について評価することができる。実験霊長類に対して低下した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウイルス候補として選択され、ヒトにおける評価を受ける。
【００６２】
さらに、本発明は、３’非コード領域に欠失を含むＤＮＡ断片およびベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクションした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ウイルスゲノムの３’非コード領域に欠失突然変異を導入し、欠失突然変異を宿す感染ウイルスを回収する工程を含む、４型デング熱ウイルスの突然変異を生成する方法に関する。
【００６３】
別の実施例において、本発明は、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコードする配列内に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片に関する。置換の概略は図１６に示されている。さらに、本発明は、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコードする位置に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片に関する。本発明は、さらに、ここに述べたＤＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物に関する。
【００６４】
非構造タンパク質内に突然変異を含む増殖制限された４型デング熱ウイルス突然変異の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンを用いてこのような戦略的突然変異を加工することにより実行できる。デング熱ウイルス非構造タンパク質の機能的活性に影響する突然変異により、増殖制限を誘起することができる。たとえば、開裂配列またはウイルスプロテアーゼ部分を改変することにより、ウイルスポリタンパク質の開裂を最適以下に抑え、ウイルス増殖を制限する。
【００６５】
我々は、非効率的な開裂により増殖制限されるデング熱ウイルス突然変異を構築するためのターゲットとして、ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂部位を選択した。我々は、４型デング熱ウイルスＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂には、ＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸ドメインが必要であることを証明した。我々は、さらに、これらの位置の各々における置換および開裂部位のつぎの＋１位置のＧｌｙの置換の効果を証明した。
【００６６】
このドメインにおけるアミノ酸置換の突然変異のパネルは、開裂に対する効果について評価された（図１６参照）。開裂に対して広範囲の効果を生じた突然変異を識別し、多数のこのような突然変異を選抜して、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンに組み込んだ。突然変異体ｃＤＮＡ由来のＲＮＡ転写物を用いて細胞のトランスフェクションを行ない、これにより、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂領域内に指定された突然変異をもつ活性デング熱ウイルス突然変異体が生成された。これらの突然変異体は、まず、蚊Ｃ６／３６細胞でのプラーク検定により特徴づけられた。突然変異体のいくつかは、サイズの縮小したプラークを生じ、これらの突然変異体ウイルスが細胞培養において増殖制限を呈したことを示す。
【００６７】
さらに、本発明は、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコードする配列内に置換突然変異を含むＤＮＡ断片と、ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞に関する。
【００６８】
さらに、本発明は、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置である、グリシンをコードする位置に置換を含むＤＮＡ断片と、ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした宿主細胞に関する。
【００６９】
別の実施例において、本発明は、上述したように、毒性の低下した突然変異体４型デング熱ウイルスを、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量含んでなる４型デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンに関する。
【００７０】
本発明の突然変異体は、（１）ウイルス血症の期間として測定される毒性と、（２）ウイルス感染後の抗体反応の種類と規模により示される免疫原性について、霊長類において評価される。サルにおいて毒性が低下しなお十分な免疫原性を維持するデング熱ウイルス突然変異体は、ヒトに対する臨床試験において評価される。
【００７１】
さらなる実施例において、本発明は、４型デング３’非コード領域および／または非構造タンパク質遺伝子内に、十分な弱毒化をもたらす突然変異を含む４型デング熱ウイルスを構築すること、ならびに、４型デング熱ウイルス突然変異体の各々を用いて他のデング熱ウイルス血清型の抗原特異性をもつ型間キメラウイルスを構築しこれにより１型、２型、または３型デング熱ウイルスにより発生する疾病の防御のために用いることのできる弱毒化ウイルスを創作することに関する。さらに、キメラウイルスは、日本脳炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルスなどのその他のフラビウイルスに対する抗原特異性をもつものとしても構築することができる。
【００７２】
デング熱に対する免疫のための現在の戦略としては、４つのデング熱血清型すべてを含むワクチン製剤の使用が好ましい。このことは、異なるデング熱血清型に連続して感染することから生じる重いデング出血性ショック症候群の危険から、風土病地域の人々を守ることになろう。現在、弱毒化デング熱ワクチン候補は、人工的な宿主の細胞内の連続継代培養を含む標準的技術により作製されている。これらの宿主域突然変異体を用いて達成された成功は、ごく限られたものに過ぎない。たとえば、２型デング熱ワクチンは満足できる程度に弱毒化されたけれども、この方法により作製された３型デング熱ワクチンはヒト被験希望者にデング熱を引き起こした。
【００７３】
本発明は、活性キメラデング熱ウイルスを構築する方法を提供する。本発明は、さらに、４型ウイルス５’および３’非コード配列と、その７個の非構造タンパク質のすべてをコードする配列とを含む、共通の４型デング熱ウイルス遺伝子的背景を共有するキメラウイルスを用いて、４つのデング熱血清型すべてに対して有効なワクチンを製造する方法を提供する。
【００７４】
この目的のため、我々は、３’非コード系に、あるいは、非構造タンパク質遺伝子の１つに欠失を含む４型デング熱ウイルスを構築し、これらのデング熱ウイルス突然変異体が複製能力の大幅な抑制を示すことを証明した。したがって、満足できる程度の弱毒化をもたらす突然変異をこれらの共通領域内において加工することができ、その結果、４つのデング熱血清型特異性を別々に発現することになる４個のクローン化された弱毒化デング熱ウイルスのひと組が得られる。これらのウイルスには、親４型ウイルス、１型（構造タンパク質遺伝子領域）−４型キメラ、同様な２型−４型キメラ、および同様な３型−４型キメラ、ならびに、日本脳炎およびダニ媒介脳炎のキメラが含まれる。
【００７５】
不活化全デング熱ウイルスワクチンは、十分な免疫原性を欠くことが示されていた。細胞培養における連続継代培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、不十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化などの欠点をもっていた。２型デング熱ワクチンは、まだ、開発の初期段階にある。残りの３つの血清型の生菌ワクチンは得られていない。本発明は、ウイルスゲノム内に指定された突然変異をもつデング熱ウイルスを構築する能力における技術的進歩を提供する。
【００７６】
キメラダニ媒介脳炎ウイルスワクチン
カプシド、メンブレン、エンベロープの３つの構造タンパク質配列を、デング熱ウイルス非構造タンパク質をコードする配列を含むデング熱ウイルス構築物に組み込むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウイルスが作製された。
【００７７】
デング熱／ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）の組合せは、デング熱ウイルスとＴＢＥＶウイルスタンパク質および核酸配列の協力を必要とするようである。構築物のウイルスは、それぞれ対応する天然のウイルスより感染性が低かった。ＤＥＮ４およびＴＢＥＶは、同じゲノム構成をもち、遺伝子発現の同じ戦略を共有する。しかし、２つのウイルス間の配列を比較すると、配列相同性が比較的低いことが示される（Ｐｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７４巻２５０〜２６３頁（１９９０）をここに参考として取り入れる）。たとえば、２つのウイルスの間のアミノ酸同一性は、カプシドタンパク質（Ｃ）については１５．４％、メンブレンタンパク質（Ｍ）については１５．９％、エンベロープグリコタンパク質（Ｅ）については３６．５％、非構造タンパク質（ＮＳ１）については３９．１％である。以下の実施例に、改良されたキメラＴＢＥＶワクチンを開示する。
【００７８】
我々は、すでに、感染性ＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いることのできるクローン化された完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡについて説明した。これは、ｐＢＲ３２２ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全長デング熱ｃＤＮＡコピーをクローン化することにより達成された。デング熱ウイルスは、ｃＤＮＡのインビトロＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした受容細胞から回収された。デング熱ｃＤＮＡの感染性ＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした細胞により生成されたウイルスの特性は、ｃＤＮＡクローンが由来したもとのウイルスの特性と同一であった。
【００７９】
さらに、我々は、本発明において、１つの血清型のデング熱ウイルスの非構造タンパク質遺伝子と、別の血清型のデング熱ウイルスからの構造タンパク質遺伝子とを含むゲノムを有するキメラデング熱ウイルスの作製を開示した。キメラデング熱ウイルスの１例として、１つのデング熱ウイルスからのカプシド、ｐｒｅＭ（メンブレン）、エンベロープ遺伝子配列を用いて、組換えｃＤＮＡ構築物における４型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を置換した。この構築物でトランスフェクションした細胞内で生成されたウイルスは、同型デング熱ウイルスに対するワクチンの作製において有用である。上述したように、本出願は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域と別のフラビウイルスの構造領域に対応する遺伝子配列を含むキメラウイルスの構築を開示している。特に、キメラダニ媒介脳炎ウイルスが開示されている。「キメラフラビウイルスの生成」と題した項において概説した本発明の方法は、ＴＢＥＶからの３つの構造タンパク質を組み込んだ組換えデング熱ウイルス構築物の製造を開示している。この構築物でトランスフェクションした細胞から生成されるウイルスは、生菌ウイルスワクチンのためのウイルス候補である。
【００８０】
本出願に係る発明は、キメラフラビウイルス作製の技術に対する重要かつ予想外の改良と、この新規なワクチン戦略の有用性についてのあらがえない証拠を提供する。当業者であれば、１つのウイルスの構造タンパク質のすべてを第２のウイルスの非構造要素に組み込んだキメラフラビウイルス組合せが容易に回収可能であり、培養細胞において効率的に複製することを期待できる。これは、関連性の離れたフラビウイルス由来の構造タンパク質の機能的協力という要件の可能性があるためである。しかしながら、予期せぬことに、本発明は、ＴＢＥＶゲノムからの２つの構造タンパク質（すなわちＭおよびＥ）を、デング熱ウイルスからの第３の構造タンパク質（すなわちＣ）と組み合わせたキメラＴＢＥＶウイルス（ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４）を識別する。
【００８１】
キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物の作製
ＤＥＮ４とＴＢＥＶとの間のアミノ酸配列相同性は低いため、ＴＢＥＶ配列を用いて対応するＤＥＮ４配列を置換することにより、多様なＴＢＥＶおよびＤＥＮ４キメラｃＤＮＡ構築物が作られた。これらの構築物は、分子生物学分野において公知の技術を用いて作製された。ｃＤＮＡ構築物のインビトロ転写およびＲＮＡ産物の受容細胞内へのトランスフェクションの後、さまざまな遺伝子組合せのいずれかにより活性キメラウイルスが産生されるかどうかを決定するために、構築物を試験した。すでに、ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）のサブゲノムｃＤＮＡ断片がクローンされ、公知の技術を用いてヌクレオチド配列が決定された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、および、Ｐｌｅｔｎｅｖ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．第２００巻３１７〜３２１頁１９８６を参照）。これらのプラスミドは、全ＴＢＥＶゲノム配列を一緒に含む重複遺伝子配列を提供する。
プラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥまたはｐＧＥＭ２−ＥＮＳ１を鋳型として用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（例１７参照）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により一連のＴＢＥＶ ｃＤＮＡ断片を作製し、各断片は、制限酵素開裂部位が脇にある１つ又はそれ以上の特異遺伝子を定めている。断片は図１７に示されており、右端のヌクレオチド位置により示される断片の配列は、Ｐｌｅｔｎｅｖ他による刊行物（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７４巻２５０〜２６３頁、１９９０）において提供されている。図１７に、７個のこのようなＴＢＥＶ ｃＤＮＡ断片と、部位特異的突然変異誘発により完全長ＤＥＮ４ ｃＤＮＡのＲＮＡ転写物内に同様に導入された適当な部位に連結するのに適した修飾末端を示す。ＴＢＥＶ配列の、ヌクレオチド（ｎｔ）７６〜１９７７を含むプラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥおよびヌクレオチド９６６〜３６７２を含むｐＧＥＭ２−ＥＮＳ１は、共有された制限酵素部位におけるＴＢＥＶ断片のライゲーション（連結）により、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ１８、ｐ２、ｐ１１から構築された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０参照）。プラスミドＤＥＮ４ｐ５’−２およびｐ５’−２（ΔＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ）（前出のＢｒａｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９１）、および誘導体ｐ５’−２（ΔＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ΔＨｉｎｄIII ）が、対応するＤＥＮ４遺伝子のかわりに１つ又はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子を置換するために用いられた。分子生物学の当業者であれば、実施例１７に示したプライマー配列すなわち配列番号２１〜３１を用いてキメラＴＢＥＶ構築物を生成することができる。キメラ構築物の接合部における配列は、核酸配列決定により証明された。得られたキメラプラスミドのすべては、ＤＥＮ４の第１のヌクレオチドをあらわすＡ残基が後に続く転写開始のＧの上流に位置するＳＰ６プロモーターを含んでいた。プラスミドは、インビトロ転写物の前に、ＤＥＮ４配列の３’末端の直後の唯一のＡｓｐ７１８開裂部位で線状化された。この構築物は、Ｌａｉ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻５１３９〜５１４３頁、１９９１）により開示された技術を用いて、インビトロ転写により転写された。図１７のキメラ構築物からの転写物は、サルＬＬＣ−ＭＫ2細胞にＲＮＡをトランスフェクションすることにより、感染性について試験された。
【００８２】
トランスフェクション処理には、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）またはＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム硫酸ジメチル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）のいずれかを用い、キメラＲＮＡ転写物を受容細胞に導入した。サルＬＬＣ−ＭＫ2細胞の培養をこれらの処理に用いたが、ＴＢＥＶ複製のための受容細胞型のどれでもかわりに用いることができることは言うまでもない。トランスフェクションされた培養は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清または高度免疫マウス腹水を用いた免疫蛍光検査により、時間に対するウイルスの存在について、評価された。
ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４（ＴＢＥＶのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質からの配列をＤＥＮ４のカプシドタンパク質および非構造配列に連結したものを含む）のＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションされた細胞は、
ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清、ＴＢＥＶ特異的高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）、およびＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦで、陽性に染まった。ＤＥＮ４のみに感染した対照培養は、免疫蛍光標識されたＴＢＥＶ特異的血清に対しては、陰性であった。このことは、キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４がＴＢＥＶおよびＤＥＮ４双方の特異抗原を発現したことを示す。
【００８３】
キメラウイルスをトランスフェクションｖＴＢＥＶから単離し、ＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４（ＴＢＥＶのカプシド、メンブレン、エンベロープ遺伝子と、ＤＥＮ４の非構造配列とを含むゲノム構築物）と、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４と呼ぶ。実施例１７に開示したように、ＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のＲＮＡによるトランスフェクションの１６日後、約１％の細胞が、ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４特異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合は時間とともに増加し、トランスフェクション後２６日目に６×１０5ｐｆｕ／ｍＬのピーク力価を示し、８０％の細胞がトランスフェクションされた。一方、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＲＮＡを用いてトランスフェクションした細胞はより迅速にウイルスを生成し１６日目に培養の１００％が感染した。トランスフェクション細胞内に存在するＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルス（ｖ ＴＢＥ（ＭＥ）／（ＤＥＮ４）で示す）の力価は、感染後２６日目に４×１０6ｐｆｕ／ｍＬであった。さらに、キメラ構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウイルスの配列決定により、図１７に示すように、キメラビリオン（ウイルス粒子）からのゲノム断片のＤＥＮ４およびＴＢＥＶ接合部が、キメラ構築物の接合部に符合することが確認された。
【００８４】
ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウイルスの性質
実施例１７において提供された方法を用いて、キメラウイルスの性質を調べた。キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウイルスを用いたすべての作業は、ＢＬ−３封じ込め設備において実施された。
【００８５】
キメラウイルスから製造されたタンパク質を、４型デング熱ウイルスから作製されたタンパク質と比較した。完全長ＤＥＮ４ｃＤＮＡクローンから回収した４型デング熱ウイルスのタンパク質は、「キメラフラビウイルス」と題する項において同定され、図４に示され、Ｂｒａｙ他（前出のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１））に開示されている。デング熱ウイルスタンパク質のタンパク質分離のパターンを、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４感染細胞から生成されたキメラウイルスタンパク質と比較した。この検定（図１８および実施例１８参照）において、融合性ＬＬＣ−ＭＫ2細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感染させた。前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）により開示された技術を用いて、被感染培養を35Ｓメチオニンとともにインキュベートした。以下のレーンを用いて感染細胞溶解物の免疫沈降検査を実施した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡＦ、２）ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦ、３）ＤＥＮ４ＮＳ３に対して作製されたウサギ抗血清、４）ＤＥＮ４ＮＳ５に特異なウサギ抗血清、５）ＤＥＮ４のｐｒｅＭに特異なウサギ抗血清、６）ＤＥＮ４のＥタンパク質に特異なウサギ抗血清。免疫沈降物は、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ第２２７巻６８０〜６８５頁、１９７０）により開示された技術を用い、図１８に示すように、変性条件のもとで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。キメラおよび親ＤＥＮ４ウイルスのいずれも、
ＤＥＮ４ ＮＳ３およびＮＳ５として識別されたタンパク質バンドを生じた（レーン３および４）。ＤＥＮ４のｐｒｅＭまたはＥタンパク質は、キメラウイルスに感染した細胞においては識別されなかったが、ＤＥＮ４感染細胞においては識別された（レーン５および６参照）。ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦは、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４感染細胞溶解物からのタンパク質バンドのみを沈降させ、これはＤＥＮ４  ＮＳ１およびＮＳ３非構造タンパク質と共に泳動した（レーン２）。ＴＢＥＶのＨＭＡＦは、キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染した細胞の溶解物からのＴＢＥＶのＥタンパク質（５５ｋＤａ）について正確なサイズを有するタンパク質を免疫沈降した。キメラウイルス感染細胞タンパク質は、ＤＥＮ４のＥよりも迅速に泳動した（レーン１および６）。以前の実験において、ＴＢＥＶのＨＭＡＦは、ＴＢＥＶ感染細胞からの天然ＴＢＥＶ ｐｒｅＭおよびＣタンパク質を沈降しなかった。したがって、ＴＢＥＶのｐｒｅＭおよびＣタンパク質の同定は期待されなかった。ＬＬＣ−ＭＫ2細胞においてｖＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されたタンパク質バンドのプロフィールは、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されたものと同一であった。このように、キメラウイルスはＬＬＣ−ＭＫ2細胞において期待されたタンパク質を生成した。
【００８６】
ＤＥＮ４により生じたウイルスプラークをキメラ構築物から生じたプラークと比較することにより、ウイルスのプラーク形態観察を評価した。蚊Ｃ６／３６細胞上で、ＤＥＮ４ウイルスプラークの平均サイズは１２．１ｍｍであった。一方、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は平均６．５ｍｍのプラークを生じた。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、サルＬＬＣ−ＭＫ2細胞上にＤＥＮ４により生じるものと比べて５倍大きいプラークを生じた。このことは、キメラウイルスが、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞において、ＤＥＮ４よりも効果的に複製したことを示唆する。これらの思わぬ結果は、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞におけるｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の増殖速度およびウイルス収量の分析により確認された（図１９参照）。
【００８７】
キメラウイルスの力価は１０8ｐｆｕ／ｍＬに達し、これは、同一条件下で親ＤＥＮ４により達成されるものにくらべて、ほぼ１０００倍高い。キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスは、蚊Ｃ６／３６細胞上でゆっくりと増殖し、親ＤＥＮ４により生成されるよりも１００倍低い力価に達した。キメラｖＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のプラークサイズは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上のＤＥＮ４のものと比べて、検知できるほどには異なっていなかった。これらの研究において、ウイルスは、Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（Ｐａｎ  Ａｍ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁、１９７９）に開示された技術を用いたプラーク検定により、測定された。プラークサイズの相違は、ＴＢＥＶのＣタンパク質とＤＥＮ４ウイルスＲＮＡとの非互換性を反映するものであり、これは、ウイルスＲＮＡパッケージングおよびウイルス成熟の際のタンパク質の効率的な相互作用を妨げる。また、プラークサイズの相違は、ＤＥＮ４の５’非コード領域におけるＡＵＧコドンの上流の６個のヌクレオチドの置換の結果である可能性もある。この配列変更は、ウイルスタンパク質翻訳の効率に影響し得る。
【００８８】
キメラ構築物からのウイルスＲＮＡ生成の分析（図２０）は、図２１のタンパク質データとあわせて、被感染Ｃ６／３６細胞におけるｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の小型プラーク表現型と増殖速度低下の説明を与える。ＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞の培養（約１０6個の細胞）は、ウイルス吸着の後のさまざまな時間に収集され、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液中に溶解された。Ｍａｎｉａｔｉｓ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク）により提供された技術を用いて、フェノール抽出により、全ＲＮＡが細胞溶解物と培地から単離された。ＲＮＡ試料をホルムアルデヒド中で変性し、ニトロセルロースフィルター（ＢＡ８５，ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に塗布した。フィルターは、ニックトランスレーションされた32Ｐ標識ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイズされた。ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４からインビトロで作製されたＲＮＡ転写物を陽性対照（コントロール）として用いた。
【００８９】
ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞からのウイルスタンパク質は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞からのウイルスタンパク質と比較された。ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞において、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ３を含むＤＥＮ４ウイルスタンパク質は感染後４８時間で高レベルに蓄積した（図２１）。しかしながら、ウイルスタンパク質合成の動態は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４感染ＬＬＣ−ＭＫ2とＣ６／３６細胞では異なっていた。ウイルスタンパク質は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞においては感染後８時間と早く検出された。一方、Ｃ６／３６細胞においては感染後４８時間まではウイルスタンパク質は検出されなかった。Ｃ６／３６細胞への接種の後、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ビリオンの約７０％が培地中に残っていた。一方、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞培養の培地においては接種されたウイルスの小さなフラクションのみが見られた。この発見は、キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＬＬＣ−ＭＫ2細胞への導入は、Ｃ６／３６細胞への導入よりも、効率的であることを示唆している。そしてその結果としてあり得ることは、このウイルスがＤＥＮ４ウイルスと比較してこれらの細胞においてよりゆっくりと、かつ、より低い力価に増殖するということである。ＬＬＣ−ＭＫ2細胞への導入の後、キメラウイルスＲＮＡの複製は、ＤＥＮ４ウイルスＲＮＡのそれとくらべて迅速であった。一方、キメラウイルスのＲＮＡ合成は、被感染Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮ４のそれよりもゆっくりであった。このように、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、蚊細胞内への導入の効率が低く、これは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の生成低減に関連していた。これらの観察結果は、ＴＢＥＶウイルスＲＮＡのＣ６／３６細胞内へのトランスフェクションの効率が低いことと符合している（Ｍａｎｄｌ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５巻、４０７０〜４０７７頁、１９９１年）。
【００９０】
当業者には、１つのウイルスからの核酸配列を別のウイルスの核酸配列に組合せるために用いることのできるさまざまな方法があることが理解されよう。このようなライゲーション技法とクローニング戦略は公知である。したがって、他の技術を用い得ること、および、これらの技術の採用はクレームされた発明から逸脱しないことは言うまでもない。
【００９１】
キメラワクチンの効力と神経毒性の判定
ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、さまざまな投与経路を介して試験動物にウイルス試料を導入することにより、ワクチンとしての防御効力について評価された。親デング熱ウイルスと比較したｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経毒性は、マウスへの脳内接種（ＩＣ）により分析された。他の投与経路としては、皮内（ＩＤ）または腹腔内（ＩＰ）注射が含まれる。１つの実験において、生後３日のＢＡＬＢ／ｃマウス乳児に、ウイルス１０2ｐｆｕをＭＥＭ０．０２ｍＬ／０．２５％ヒト血清アルブミンに加えた服用量を、ＩＣ注射した。別の組の実験において、生後６週のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＩＣ、ＩＤ、ＩＰ接種を行なった。２１日間にわたり、脳炎の症候や死亡について、マウスを観察した。生存した成体マウスは感染後２０日後に採血し、ＴＢＥＶに対する抗体反応を評価した。ワクチンの防御効力を判定するため、感染後２１日目に、ＢＬ−４封じ込め設備において、生存したマウスに、１０3ＬＤ50 ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）をＩＰ投与した。
【００９２】
ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、乳児または成体マウスの脳（ＩＣ）内に直接接種した場合、親ＴＢＥＶの神経毒性を維持していた（図２２および実施例２１）。陽性対照として、ＴＢＥＶの典型的な株（Ｓｏｆｊｉｎ株）との比較を行なった。ＴＢＥＶは神経毒性が高く、０．１ｐｆｕで、ＩＣ接種した乳児マウスの５０％に新生児脳炎を起こした。同様に、ＴＢＥＶは、ＩＰ接種した成体マウスに対しても神経毒性が高かった。この場合には、ＩＤ50は１４．２ｐｆｕであった。一方、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、ＩＤまたはＩＰのいずれかの周辺（末梢）経路により接種した場合には脳炎を起こさず（図２２参照）、これらが潜在的に安全なワクチン接種経路であることが示された。
【００９３】
ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の免疫原性は、生存したマウスの血清抗体を用いた35Ｓ標識抗原を使用して、ウイルスに対する抗体の免疫沈降検査を行うことにより分析された。免疫沈殿物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、ＤＥＮ４ ＮＳ１（キメラウイルスによりコードされるタンパク質）に特異な抗体は容易に検出されること、しかし、ＴＢＥＶ Ｅに対する抗体は力価が低いか、検出不可能であることが明らかになった。マウスはＴＢＥＶに対する天然の宿主ではないため、マウスの周辺接種では、低レベルのウイルス複製しか行なわれないということが推定される。
【００９４】
ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＩＰまたはＩＤ接種を生き延びたマウスは、つぎに、致死量の投与に対する抵抗の徴候について研究された。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウイルス接種の２１日後、神経毒性の高いＴＢＥＶのＳｏｆｊｉｎ株１０3ＬＤ50を投与した。キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＩＰまたはＩＤ接種で生き延びたマウスは、この投与に対して防御ができていた。一方、先にＤＥＮ４で免疫化されたマウスの３つのグループのすべては、１１日〜２０日の間に死亡した（図２２参照）。これらの結果は、ワクチンとしてのこのウイルスは、ＴＢＥＶ感染に対して防御的であり特異的であることを示した。非免疫化対照マウスは、ＴＢＥＶ感染の後、１０日〜１６日の間に脳炎で死亡した。ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスは、脳内接種の後、乳児および成体マウスの両方に、均等に脳炎を起こした。一方、ＤＥＮ４を接種したマウスでは、デング熱ウイルス関連の疾病の発生頻度は低かった。このように、キメラウイルスは、ｐｒｅＭおよびＥ遺伝子が由来した、もとのＴＢＥＶのマウス神経毒性を維持している。このことは、すべてでないとしても、ＴＢＥＶマウス神経毒性マップの遺伝的決定基のほとんどが、これら２つの構造タンパク質遺伝子内にあることを示している。しかしながら、親ＴＢＥＶとは異なり、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、成体マウスに周辺接種した場合には病原性ではなく、周辺接種により神経侵入性の損失が起きたことが示される。これらの発見は、ＴＢＥＶがＣＮＳに侵入し脳炎を生じるためには、ｐｒｅＭおよびＥ遺伝子以外のＴＢＥＶゲノムの領域が必要であることを示唆するものである。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４で周辺接種したマウスは、次回の致死量ＴＢＥＶの腹腔内投与に対して防御された。一方、ＤＥＮ４で同様に接種したマウスではそうではなかった。これらの発見は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４のｐｒｅＭ（Ｍの前駆体）、Ｍ、および／またはＥタンパク質が、マウスにおけるＴＢＥＶ脳炎に対する防御免疫の主要な抗原決定基を含んでいることを示すものである。
【００９５】
キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経毒性の改変
上記の「神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然変異」と題する項において説明したように、組換えデング熱ウイルス構築物を、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲなどによる突然変異誘発により改変し、神経毒性特性が低減したことによりワクチン接種に適した改変ウイルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術を用いて、ｖＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ゲノムを改変して神経毒性を低減させることができ、これにより、ＴＢＥＶに対する弱毒化ウイルスワクチンの安全性が改善される。
【００９６】
ＴＢＥＶの防御抗原を維持し、かつ、ＴＢＥＶの周辺侵入性を欠く、活性ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラを構築することができれば、この重要な病原体の免疫予防のための新規な戦略、すなわち、弱毒化ＴＢＥＶワクチンの開発の基盤が得られる。しかしながら、このゴールに到達するには、まず、キメラのさらなる改変を達成しなければならない。すなわち、ウイルスの脳内への直接接種により測定される、ＣＮＳに対する神経毒性の除去である。ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラは、親ＴＢＥＶの神経毒性を維持しているため、キメラゲノムのＤＥＮ４またはＴＢＥＶ部分において戦略的突然変異を加工し、マウス神経毒性に対するそれらの効果を評価することにより、この特性を無効にする必要があった。これらの突然変異体は、ウイルスゲノム内の位置のいくつにでも導入される突然変異を潜在的に含んでいる。初期の研究は、以下の突然変異をもつキメラウイルスを評価した。すなわち、（１）５’非コード領域における欠失、（２）ｐｒｅＭ−Ｍ開裂部位またはｐｒｅＭあるいはＥあるいはＮＳ１タンパク質のグリコシル化部位を除去する突然変異、（３）Ｅ遺伝子における点突然変異である。これまでに試験された突然変異は図２４に含まれている。
【００９７】
ＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４構築物を系統的に改変し、神経毒性に対する遺伝子的変更の効果について試験を行なうという研究の一部として、タンパク質配列に１つ又はそれ以上の変化を含む、６個の異なる構築物を作製した。実施例２２参照。当業者であれば、本発明において提供される技術を用いて、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に対して任意の数の置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性における変化を試験することができる。同様に、当業者であれば、遺伝子組成における好ましくは少なくとも１つの変更を有するキメラ構築物を、天然の配列を組合せたキメラ構築物と比べて試験するために、図２３に示す突然変異をこれらのまたはその他の突然変異と組合せることが容易に行なえる。
【００９８】
突然変異体キメラウイルスの作製を導く突然変異構築物の能力を評価する研究において、トランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から６個の突然変異体キメラを回収し、プラーク形態観察における変化についてウイルスを分析した。突然変異体ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスの子孫をＬＬＣ−ＭＫ2細胞内の継代培養により増幅し、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上または蚊Ｃ６／３６細胞上でのプラーク検定により分析した。キメラウイルスＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４は、ＴＢＥＶの３つの構造タンパク質遺伝子すべてを含んでいたが、同様に分析された。また、野生型ＤＥＮ４も、対照として用いられた。図２４に示すように、各細胞株上のたいていの突然変異体のプラークサイズは、親ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のウイルスプラークに比して縮減しており、これらの突然変異体はウイルス複製について制限されていることが示唆される。ＥまたはＮＳ１に欠陥グルコシル化部位を含んでいた突然変異体は、試験された数組の突然変異体の中で最小サイズのプラークを生じた。
【００９９】
突然変異体キメラ構築物は、マウスにおける神経毒性についてさらに試験された。実施例２１に記載されるように、および、実施例２３に記載されるように、マウスにウイルスを接種した。脳炎の徴候および死亡について、被感染マウスを３１日間観察した。*ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-および*ＰｒｅＭ／Ｍ-突然変異を含む構築物のＬＤ50は、１００ｐｆｕより大きく、これらの突然変異体がマウス神経毒性において１００倍以上減少したことが示された。この発見は、ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-、ＰｒｅＭ／Ｍ-、あるいは両方の突然変異を、マウス神経毒性の弱毒化を提供するために用いることができることを示す。この発見は、同様の突然変異を、日本脳炎ウイルスを含む他の脳炎フラビウイルスの弱毒化を提供するためにも採用できることを示唆するものである。
【０１００】
さらに、ＬＤ50の値の増加により証明されるとおりマウスにおける神経毒性低下を示すこれらのキメラ構築物は、つぎに、霊長類において試験されることはいうまでもない。実施例２４は、霊長類におけるワクチン効力に対する試験法を提供する。霊長類研究における成功に続き、本発明のワクチンは、ヒトに対する臨床試験において試験される。当業者であれば、霊長類での研究をヒトにおける研究に適したものに改変することができる。
【０１０１】
したがって、本出願の発明は、多数のワクチンを提供するとともに、デング熱ウイルスやその他のフラビウイルスの血清型に対する防御免疫反応を発生させるためにキメラデング熱ウイルスワクチンを作製することを当業者に教示する。このようなワクチン試料は、好ましくは、キメラウイルスの集団を含み、各ウイルスは少なくとも１つのデング熱ウイルスに対して構造タンパク質を発現する。ウイルス学および分子生物学の当業者であれば、ここに開示された技術を用いて、１つのフラビウイルスの構造領域と第２のウイルスの非構造領域とを組合せたキメラウイルスを作製することができる。好ましくは、この第２のウイルスはデング熱ウイルスである、さらに好ましくは、この第２のウイルスは４型デング熱ウイルスである。さらに、本発明は、部位特異的突然変異誘発などを用いてデング熱ウイルス構築物を改変することにより改良されたデング熱ウイルスワクチンを作製することを当業者に教示する。
【０１０２】
これらの改変は、キメラウイルス構築物に同様に組み込まれることは言うまでもない。本発明は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域および少なくとも１つの構造領域を、別のフラビウイルスからの構造遺伝子領域と組合せて含むキメラウイルスの作製ならびに試験を教示する。特に、４型デング熱ウイルスからの１つの構造領域ならびに非構造領域と、ＴＢＥＶからの２つの構造タンパク質をコードする配列とを含むキメラウイルスを含む、ＴＢＥＶのためのワクチンが開示されている。
【０１０３】
ＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４についてこれまでに観察された、励みになる成果は、これらの技術が、ＴＢＥＶよりもデング熱ウイルスにより密接に関連したウイルスに対するワクチンを作製する際にも有用であることを示唆している。このような例の１つは、極東において依然として大きな公衆衛生問題である日本脳炎ウイルスである。すなわち、さらなる実施例において、本発明の技術は、ＤＥＮ４ｃＤＮＡ非構造領域を、日本脳炎ウイルスからの少なくとも１つの構造遺伝子とＤＥＮ４の残りの構造遺伝子領域に組合せるために用いられる。
【０１０４】
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイルス間の非構造領域および構造領域の他の組合せを同様にして作製し試験することができることは言うまでもない。たとえば、日本脳炎ウイルスの組換え構築物を、ウイルス非構造領域はそのままにして、１つ又はそれ以上の構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスからの対応する遺伝子配列で置換するように改変することができる。同様に、ダニ媒介脳炎ウイルスをコードする組換えｃＤＮＡを生成し、構造領域を、デング熱ウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子で置換することができる。
【０１０５】
ここにおよび下記の実施例において引用されるすべての刊行物は参照として取り入れられる。以下、本発明の特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内での可能な変型について言及する。本発明を成功裡に実施することのできる、さまざまな代替技術や手順が当業者には知られている。
【０１０６】
【実施例】
ウイルス ： ４型デング熱ウイルス株８１４６６９を用いて、完全長感染性ＲＮＡ転写物の転写源として用いられる完全長ｃＤＮＡを構築した（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁、Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。アカゲザル胎児肺細胞継代培養レベル９の１型デング熱ウイルス西太平洋株（Ｄ１ＷＰ）の標本は、Ｋ．Ｅｃｋｅｌｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ、ワシントンＤＣ）（Ｋ．Ｔ．ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３６巻４３５〜４４２頁）。マウス脳継代培養レベル３８の、マウス神経毒性２型デング熱ウイルスニューギニアＣ株（Ｄ２ＮＧＣ）のマウス脳標本は、Ｄ．Ｄｕｂｏｉｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ、ワシントンＤＣ）（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。１型および２型デング熱ウイルスは、Ｃ６／３６蚊細胞内で１回、継代培養することにより増幅された。つぎに、これらの３つのウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2サル腎臓細胞内で１回、継代培養された。得られたウイルス懸濁液はプラーク形態観察およびマウス神経毒性の研究に用いられた。
【０１０７】
クローニングベクター ： ４型デングゲノムの５’側半分を含むプラスミドｐ５’−２を、３つの構造タンパク質遺伝子の置換を容易にするために改変した（Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。まず、唯一のＸｈｏＩ部位が、部位特異的突然変異誘発により、Ｅの３’末端の近くの、４型デング配列のヌクレオチド２３４２（Ａ−Ｇ）に導入され、ｐ５’−２（ＸｈｏＩ）を作製した。このヌクレオチド変更はアミノ酸配列を変更するものではなかった。このベクターはつぎに、デング配列内の唯一のＢｓｔＢＩ部位において、および、ｐ５’−２内のデング配列の直後の唯一のＡｓｐ７１８部位において、消化された。断片はデング４ゲノムの３’側半分に連結され、完全長ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）を作製した。第２に、フラビウイルスに保存されている、ヌクレオチド８８のＢｇｌII部位は、ｐ５’−２内の他の３つのＢｇｌII部位を除くことにより、唯一の部位とされた。ｐＢＲ３２２およびＳＰ６プロモーター間の接合部におけるＢａｌII部位は、ＮｏｔＩリンカーを挿入することにより除去された。４１２８および４２７７の他の２つの部位は、最近導入された３４７３のＰｓｔＩ部位までベクターを短くすることにより、除去された（Ｋ．Ｔ．ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３６巻４３５〜４４２頁）。つぎに、プラスミドｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）をフラグメント交換に用い、キメラｃＤＮＡを作製した。
【０１０８】
図１は、構築された完全長デングｃＤＮＡを含む、以下のプラスミドを示す。ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）は、４型デングゲノムの完全なｃＤＮＡコピーであり、唯一のＸｈｏＩ部位がＥ遺伝子の３’末端の近くに創製された。ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）は、ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）から、５’非コード領域内のＢｇｌII部位と唯一のＸｈｏＩ部位との間の配列を、１型デング西太平洋株の対応するｃＤＮＡで置換することにより、得られた。ｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）は、同様にして、ＢｇｌII−ＸｈｏＩ断片を、２型デングニューギニアＣ株からの対応するｃＤＮＡで置換することにより、作製された。Ｂ：ＢｇｌII、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ａ：Ａｓｐ７１８ 制限酵素部位。
【０１０９】
キメラｃＤＮＡ ： Ｃ６／３６蚊細胞内で増殖した１型または２型デング熱ウイルスを精製し、Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）により説明された手順にしたがってビリオンＲＮＡを抽出した。１型デング配列のヌクレオチド２３０６〜２３３８にハイブリダイズするネガティブセンスオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写により、１型デング第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマー配列は、上記のｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）内の４型デングＥ遺伝子内の部位に対応する位置にＸｈｏＩ部位を創製するために、ヌクレオチド２３１６におけるサイレントな第３塩基変更（Ａ−Ｇ）を含んでいた。つぎに、１型デングｃＤＮＡを鋳型として、ネガティブセンスオリゴヌクレオチドおよび１型デングヌクレオチド５１〜７０にハイブリダイズする保存されたＢｇｌII部位を含むポジティブセンスプライマーを用いて、ＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物をＢｇｌIIおよびＸｈｏＩで消化し、つぎに、ｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）にクローン化し、対応する４型デング配列を置換した。つぎに、１型デング配列を含むＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）からの残りの４型デングｃＤＮＡに連結し、完全長キメラｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）を創製した。同様に、２型デングヌクレオチド２３１０〜２３６４にハイブリダイズするネガティブセンスプライマーを用いて、２型デング第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマーは、２３３３におけるＴ−Ｃ、２３３６におけるＡ−Ｇ、２３３７におけるＣ−Ａの、３つの塩基変更を含む。これらの変更は、上述した４型デング遺伝子におけるＸｈｏＩ部位に対応する位置にＸｈｏＩ部位を創製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものではなかった。ＰＣＲによる２本鎖ＤＮＡ合成のために、ネガティブセンスプライマーが用いられ、１型デングに対してはポジティブセンスプライマーが同じく用いられた。ＰＣＲ産物をＢｇｌIIおよびＸｈｏＩで消化し、ｐ５’−２（ＸｈｏＩ）にクローン化し、ＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片を用いてｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）の対応する断片を置換してｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を作製した。
【０１１０】
ＲＮＡ転写、トランスフェクション、およびウイルスの回収 ： 完全長ＲＮＡ転写物を用いた細胞のトランスフェクションは、Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁に記載されているようにして実施された。トランスフェクションの１０日後、細胞はトリプシン処理され、６穴プレートおよびチェンバースライドに移された。２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デング熱ウイルス抗原の存在について、スライド上の細胞を試験した。ほとんどの細胞が感染したことがＩＦＡにより示された場合には、６穴プレート内の細胞をトリプシン処理し、６倍量の非感染細胞と混合し、通常６〜７日後に細胞病理効果（培地内の多数の死亡細胞の出現）があらわれるまで、インキュベートした。つぎに、培地を取り出し、細胞をかきとり、標準容積の５０％Ｅａｇｌｅ最小必須培地／５０％血清に再懸濁し、凍結することにより、感染細胞を収穫した。他方、陽性細胞の割合が小さい場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮培地に１：３で希釈し、非感染細胞を添加せずに増殖させる。感染細胞の割合を週ベースで評価し、間隔をおいて細胞溶解物を収穫しウイルスの力価を測定した。
【０１１１】
デング熱ウイルス抗原の検出 ： 感染細胞は、血清型特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）１Ｆ１（１型デング）、３Ｍ５（２型デング）、５Ｄ４（３型デング）、１Ｈ１０（４型デング）およびＮＳ１特異的ｍａｂ１Ｇ６（４型デング）を用いて、ＩＦＡにより分析された。これらは、もともとＭ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ博士およびＥ．Ｈｅｎｃｈａｌ博士により作製されたものである（ＷＲＡＩＲ、ワシントンＤＣ）（Ｅ．Ａ．Ｈｅｎｃｈａｌ他（１９８２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３１巻５４８〜５５５頁）。モノクローナル抗体は、１：５０〜１：３００の希釈で用いた。一方、フルオレセイン接合抗マウス抗血清（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）は１：１００で用いた。結果は写真で記録した。各ｍａｂについて、陰性結果を生じた感染細胞を、陽性細胞と同じ露光時間で写真撮影した。親（野生型）デング熱ウイルスと子孫ウイルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のタンパク質を分析するため、６穴プレート内のコンフルエントＬＬＣ−ＭＫ2細胞をＭＯＩ ０．２でウイルスに感染させた。感染の６日後、６時間にわたり５０μＣｉ／ウェルのＳ−メチオニンを含まない培地で細胞を標識した。つぎに、ＲＩＰＡ緩衝液に細胞を溶解した。キメラウイルスｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）については、細胞のほぼ１００％が感染したときに、標識化を実施した。一方、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）については、約３０％が感染したときに標識化を実施した。適当な同型または異型高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）を用いて溶解物を沈殿させ、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。
【０１１２】
プラーク形態 ： ウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上でのプラーク形態について調べられた（Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ．Ａｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁）。プラーク形態の分析の前に、各親ウイルスをＬＬＣ−ＭＫ2細胞内で１回、継代培養した。インキュベーションの６〜９日後に、ニュートラルレッドを培養物に重層した。
【０１１３】
乳児マウスにおけるキメラウイルスの評価 ： 生後３日のスイスマウスに、２０００ｐｆｕの親またはキメラデング熱ウイルスを、ウイルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ2細胞を希釈した溶解物の形で、脳内接種した。陰性対照マウスには非感染細胞の溶解物を注射した。親４型デング熱ウイルス（８１４６６９）、１型デング熱ウイルスＷＰ、または２型デング熱ウイルスＮＧＣについて、１リットルが接種された。ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｖ２Ａ（Ｄ１ ＷＰ）、またはｖ２Ａ（Ｄ２ ＮＧＣ）について、２リットルが接種された。２１日間にわたり、脳炎の徴候および死亡について接種されたマウスを監視した。
【０１１４】
【実施例１】
キメラｃＤＮＡおよびウイルス
完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ（ｐ２Ａ）を用い、構造遺伝子配列を１型または２型デング熱ウイルスの対応する配列により置換したキメラウイルスを構築した。この目的のために選択された１型ウイルス（ＷＰ）は、マウスの脳内での増殖に適さなかった低レベルの継代組織培養株であった。２型株（ＮＧＣ）は、マウスにおける脳内連続継代培養の間に選抜された神経毒性の高い突然変異体であった。２型突然変異体がこの研究のために選択されたのは、マウス神経毒性の遺伝的決定基のマッピングの可能性を提供するからである。
【０１１５】
プラスミド構築体ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）、またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を用いた大腸菌ＨＤ１５２８株の形質転換により、安定なプラスミド集団が創製された。これらのプラスミドの推定された構造は図１に示されている。これらの構造は制限酵素マッピングにより証明された。
【０１１６】
第１２日目のデング熱ウイルス抗原に対する免疫蛍光染色により、ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）からのＲＮＡ転写物でトランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ2細胞のほぼ半数が陽性であった（図２Ａ）。
【０１１７】
図２は、（Ａ）ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｐ２Ａ（Ｄ１Ｗ）、またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）からのＲＮＡ転写物を同一濃度で用いてトランスフェクションしたＬＬＣ−ＭＫ2細胞を示す。トランスフェクション後のウイルス感染細胞のパーセンテージは、新鮮培地中に移した後でＩＦＡにより測定された。（Ｂ）細胞の大多数がＩＦＡで陽性となったときに感染細胞を収穫した。ウイルスの力価測定はプラーク検定により実施された（Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（１９７９）ＰａｎＡｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁）。
【０１１８】
以前の研究において、ｐ２Ａおよびｐ２Ａ（ＰｓｔＩ）からの転写物を用いたトランスフェクションの１２日後に、２０〜５０％の範囲の同様な割合の抗原陽性細胞が観察された。いずれの場合にも野生型表現型をもつウイルスが産生された（Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。一方、ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）からの転写物を用いてトランスフェクションされた細胞は、１２日目に、その１％未満が陽性であった。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）に感染した細胞の割合は、１９日目にほぼ５％、２６日目に３０％、３３日目に８０％に増加した。このとき、トランスフェクションされた細胞内に存在するウイルスの力価は５×１０6ｐｆｕ／ｍＬであった（図２Ａおよび２Ｂ）。また、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）はよりゆっくりと増殖した。我々は、１９日目に細胞の１％が陽性であると算定したが、５４日目までに感染したのは細胞の３分の１に満たなかった。ウイルス力価は３０日目には１．５×１０2ｐｆｕ／ｍＬ、４４日目には２．５×１０2に過ぎなかった。１０4ｐｆｕ／ｍＬに到達したのは５８日目であった。トランスフェクションの７２日後に、細胞の大多数が感染し、細胞懸濁液の力価が１０2ｐｆｕ／ｍＬであることが認められた。
【０１１９】
ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）ＲＮＡ転写物（１０6ｐｆｕ／ｍＬ）でトランスフェクションした細胞により生成されるウイルスの力価は、細胞培養に４型ウイルスをＭＯＩ ０．１で感染させたときに観察されたものと同じであった。さらに、１型／４型キメラ（５×１０6ｐｆｕ／ｍＬ）でトランスフェクションされた培養により生成されるウイルスの最高力価は、１型ウイルス（１．５×１０7ｐｆｕ／ｍＬ）をＭＯＩ０．１で用いて細胞培養を感染させた後に観察されたものと同じであった。トランスフェクション（１０2ｐｆｕ／ｍＬ）の後に生成される２型／４型キメラの最高力価は、ＭＯＩ０．５で親２型ウイルスに感染させた細胞培養により生成されたものと同じであった。
【０１２０】
【実施例２】
キメラ構造タンパク質の性質
図３に示すように、子孫ウイルスを調べるために、間接的免疫蛍光検査を実施した。
【０１２１】
図３は、ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）、または、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）に感染させたＬＬＣ−ＭＫ2細胞、もしくは非感染細胞上で実施された免疫蛍光検定を示す。モノクローナル抗体は、１：５０〜１：３００の希釈で用いた。一方、フルオレセイン接合抗マウス抗体は１：１００で用いた。モノクローナル抗体の血清型特異性は左側に示されている。
【０１２２】
ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）に感染させた細胞は、ＩＦＡにより、４型デング特異的ｍａｂＩＨ１０で染まったが、１型デング特異的ｍａｂ １Ｆ１または２型デング特異的ｍａｂ ３Ｍ５には結合しなかった。予測されたように、ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）に感染した細胞は１Ｆ１とのみ反応した。ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）に感染したものは、３Ｈ５のみに染まった。３型デングに特異的なｍａｂ ５Ｄ４は、どの感染細胞とも反応しなかった。これらの結果は、キメラウイルスの両方とも、その構造タンパク質遺伝子により特定される免疫原性をあらわすことを示した。期待されるように、４型デング非構造タンパク質ＮＳ１に特異的なｍａｂ １Ｇ５は、４型デングｃＤＮＡすなわち２Ａ（ＸｈｏＩ）の子孫に感染した細胞を染めた。なお、４型ウイルスに由来するキメラウイルス２Ａ（Ｄ１ＷＰ）または２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）の各々についても同様であった。
【０１２３】
親４型デング熱ウイルスの、および、そのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のタンパク質は、同型ＨＭＡＦを用いた免疫沈殿検査とその後のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析すると、同一のようであった（図４）。図４は、ウイルス感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞または非感染対照細胞の35Ｓ−メチオニン標識された溶解物を示し、１型、２型、４型デングに対して作製された高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）で免疫沈降され、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス＝６０：１．６）上の電気泳動により分析された。各レーンの先頭に、ウイルスが縦に示され、溶解物を免疫沈降させたＨＭＡＦが横に示されている。マーカー：タンパク質分子サイズマーカーはキロダルトンである。１型、２型、４型デングのＥおよびｐｒｅ−Ｍグリコタンパク質の位置が示されている（図４）。
【０１２４】
さらに、親１型デング熱ウイルス（ＷＰ）および２型デング熱ウイルス（ＮＧＣ）のタンパク質を分析した。１型デングおよび２型デングのＥグリコタンパク質は共に移動したが、それらは４型デングよりもゆっくりと移動した。同様に、１型および２型デングのｐｒｅ−Ｍグリコタンパク質は共に移動したが、やはり４型デングのｐｒｅ−Ｍよりもゆっくりと移動した。Ｅタンパク質の相対的な分子サイズの相違はほぼ４ｋｄであった。一方、ｐｒｅ−Ｍタンパク質については約１ｋｄであった。これらＥおよびｐｒｅ−Ｍの分子サイズの相違は、おそらく、グリコシル化の程度における変化または配座的相違によるものであろう。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）およびｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ウイルスの免疫沈降されたタンパク質はハイブリッドパターンを示した。１型デングＨＭＡＦを用いて免疫沈降したｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）のｐｒｅ−ＭおよびＥは、親１型デングのｐｒｅ−ＭおよびＥと共に移動した。しかし４型デングＨＭＡＦは、４型デング非構造タンパク質と共に移動したバンドだけを沈降した。親２型デングのｐｒｅ−ＭおよびＥも同様であったが、４型デングＨＭＡＦは４型ウイルスのものに似ている非構造タンパク質を沈降させた。
【０１２５】
親４型デング熱ウイルスおよびそのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞（図示せず）上に同様のプラークを生成した。親ウイルスのプラークは、感染の６日後にニュートラルレッドで染色すると明確に目視できた。しかし、キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）は、その時点では、検出可能なプラークを生成しなかった。しかしながら、染色を第９日まで遅らせると、非常に小さいｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）プラークが検出され、これはｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）または野生型２型デングＮＧＣのものよりも非常に小さかった（図５）。４型デング８１４６６９のプラークは、子孫ウイルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のそれとは異ならなかった。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）のプラークは基本的にｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のものと同様であった。
【０１２６】
図５は、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞の単層を示し、子孫ウイルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のものとは異なっている。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）のプラークは基本的にはｖ２２Ａ（ＸｈｏＩ）のものと同様であった。
【０１２７】
図５は、デングウイルスに感染し、ついでアガロースオーバーレイが加えられたＬＬＣ−ＭＫ2の単層（モノレイヤー）を示す（Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ  Ａｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁）。細胞単層の感染の９日後、ニュートラルレッドを重層し、翌日プラークの写真を撮影した。Ａ：２Ａ（ＸｈｏＩ）、Ｂ：２Ａ（Ｄ１ＮＧＣ）、Ｃ：野生型ＮＧＣ３型デング。
【０１２８】
【実施例３】
乳児マウスに対するウイルスの神経毒性
キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を、その親ウイルスであるマウス脳適合２型デングＮＧＣおよびｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）と、マウス神経毒性について比較した。２型デングＮＧＣはもっとも迅速な致死性をもつことが証明された。接種後第５日または第６日に１０匹のマウスの各々が脳炎で死亡し、平均生存時間は５．１日であった。一方、キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を接種した１５匹のマウスの各々は死亡するまで８〜１１日間生存し、平均生存期間９．１日であった（図６）。
【０１２９】
図６は、親またはキメラデングウイルス２０００ｐｆｕを、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞を希釈した溶解物の形で脳内接種した生後３日のスイスマウスについて示す。注射されたマウスの数は：２型デング（ＮＧＣ）１０匹、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）１５匹、４型デング８１４６６９  １２匹、ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）１８匹。陰性対照（マウス１１匹）には非感染細胞の希釈溶解物を注射した。マウスは、脳炎の徴候および死亡について毎日観察された。
【０１３０】
生存分布における差異は大きい（ｐ＝００００１、スミルノフ２点統計）。さらに、親ウイルス４型デング８１４６６９は、その子孫ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）と比較された。親ウイルスを接種した１２匹のマウスのうち５匹が脳炎で死亡し、最初の死亡は第１１日に起きた。一方、ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）を接種した１８匹のマウスのうちただ１匹だけが接種の１６日後に死亡し残りは健康を保った。生存分布は、スミルノフ統計によれば大きく異なってはいない（ｐ＞．１４）が、２つのグループの生存率はフィッシャー精密試験では異なっている（ｐ＝．０２５６）。このことは、４型デング８１４６６９、または、ウイルス調製におけるビリオンのサブセットが、ある程度の神経毒性を所有していること、および、子孫ウイルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）が非神経毒性の下位集団［ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ］をつくるかクローニングまたはウイルス繁殖の際に生じるヌクレオチド変化を含むことを示唆している。親１型デング熱ウイルス（ＷＰ）を接種したマウスと、またはそのキメラ子孫ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）を注射した１２匹のマウスと、非感染細胞の溶解物を受け入れた１１匹のいずれも、脳炎を起こさなかったし死亡しなかった。
【０１３１】
突然変異分析
我々は、４型デング熱ウイルスゲノムの完全長にわたる一連のデングｃＤＮＡインサートをクローン化した。これらは、実施例４にあるように、完全長デングＤＮＡをクローン化するという最初の試行において用いられた。
【０１３２】
【実施例４】
ＳＰ６プロモーターを含むプラスミドｐＢＲ３２２における完全長デングＤＮＡをクローン化する最初の試行
さまざまな４型デングｃＤＮＡインサートを、共有された制限酵素部位において連結し、ｐＢＲ３２２の同じＰｓｔＩクローニング部位を用いて、完全長デングＤＮＡコピーを形成した。インビトロ転写のために、ＳＰ６ポリメラーゼプロモーター配列を、デング配列の前の５’末端に配置した。ＲＮＡ転写物の予測された５’配列は図７に示されている。第１のデングヌクレオチドのＡ残基は、Ｇで始まる正常ＳＰ６ポリメラーゼ転写物の直後に位置している。ゲノムＲＮＡの５’末端に存在するｍ７Ｇキャップ構造は、転写反応にｍ７ＧｐｐｐＧ類似物を添加することにより得られる。このようなＤＮＡ構造は、５’末端に付加ヌクレオチドを含むデングＲＮＡを生成することになるだろう。ランオフ［ｒｕｎ−ｏｆｆ］転写物を作製するために、唯一のＡｓｐ７１８開裂配列が、デング配列の３’末端に導入された。図７に示すように、鋳型鎖中には、Ａｓｐ７１８開裂部位の前に５個の付加ヌクレオチドが存在する。転写が最後のヌクレオチドに進むと、ＲＮＡ転写物には、３’末端におけるこれらの５個の付加残基が含まれることになる。
【０１３３】
形質転換のための宿主として大腸菌株ＨＢ１０１を用いたこの研究中に気づいたことは、完全長デングＤＮＡを含むプラスミドは、再配列を経た多くの形質転換体におけるプラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制限酵素パターンをもつクローンＤＮＡを単離するためには多数のコロニーをスクリーニングしなければならないということである。我々は、異なる大腸菌株により作製されるプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用いられていた、形質転換に高度に適した市販の大腸菌株ＤＨ５αおよび大腸菌株ＤＢ１５２８を、大腸菌株ＨＢ１０１と比較した。ＤＢ１５２８株は、ＨＢ１０１よりもコロニーサイズが３〜４倍大きい形質転換体を産生した。特に、ＤＢ１５２８の形質転換体は、一般に、予測された制限酵素パターンをもつプラスミドを産生し、このことは、大腸菌株ＤＢ１５２８が、安定的にクローン化されたデング完全長ＤＮＡを生成するための優秀な株であることを示唆している。しかしながら、トランスフェクション細胞上で試験した場合、この第１の完全長デングＤＮＡクローンから作製されたインビトロＲＮＡ転写物は、デング熱ウイルスを産生しなかった。ここで、免疫蛍光検定により検出されるように、１００倍低い濃度の、陽性対照としてのビリオンＲＮＡはデング熱ウイルスを産生した。
【０１３４】
【実施例５】
独立に由来するＤＮＡクローンを用いた、完全長構築物におけるデングＤＮＡセグメントの置換
感染性ＲＮＡ転写物を産生できないのは、完全長クローンにおける欠陥突然変異の存在によるものであると説明された。このような突然変異は、ウイルス株における欠陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニングまたは繁殖の際の結合エラーから生じると推定される。我々は、１つ又はそれ以上の欠陥突然変異を含むデングＤＮＡセグメントを、独立にクローン化したデングＤＮＡ構築物からの対応するセグメントで置換することに決定した。系統的な置換実験のためのフレームワークとして、デング配列の５’および３’断片を別々にクローン化した。ヌクレオチド５０６９における唯一のＢｓｔＢ１部位を用いて、完全長デング配列を、各々ゲノムの約５０％を示す２つの断片に分離した。ＳＰ６プロモーターを含む第１の完全長クローンの５’断片は、５’−１と呼ばれ、ＢｓｔＢ１とＡｓｐ７１８の間の残りの３’配列は３’−Ａと呼ばれた。第２の５’断片５’−２を含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデングｃＤＮＡインサートから構築された。唯一のＡｓｐ７１８部位は、デング配列のＢｓｔＢ１部位の下流のｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に導入された。このように、このプラスミドは、完全長ＤＮＡ構築物に３’断片を挿入するためのクローニングベクターとしても適している。２つの付加３’断片３’−Ｂおよび３’−Ｃも、デングｃＤＮＡインサートの独立したひと組から構築された（図８）。第１の完全長クローン１Ａ内の３’断片を３’−Ｂおよび３’−Ｃ断片で置換すると、２つの別の完全長クローン１Ｂおよび１Ｃが作製された。同様に、３つの完全長ＤＮＡ構築物すべてにおいて５’断片を５’−２断片で置換すると、３つの別の完全長クローン、すなわち、２Ａ、２Ｂ、２Ｃが生成された。これらのプラスミドをＢｇｌII、ＮｓｉＩ、Ａｓｐ７１８で消化すると、図９に示されるように、６個の完全長クローンすべてについて区別不可能な、予測されたＤＮＡ断片のパターンを示した。このように、大腸菌株ＤＢ１５２８中の完全長デングＤＮＡ配列を明らかに含むプラスミドの増殖に成功することによって、培養細胞における感染性の評価のためのインビトロＲＮＡ転写物の生成が可能となった。
【０１３５】
【実施例６】
インビトロで作製されたＲＮＡ転写物の感染性についての最初の証拠
構築された完全長デングＤＮＡ鋳型から生成されたＲＮＡ転写物は、ＬＬＣ−ＭＫ2のトランスフェクションにより、感染性についてそれぞれ試験された。デング感染細胞は、間接的免疫蛍光検定により検出されるとおり、２Ａ ＲＮＡでのトランスフェクションの１０日後に容易に観察された。他の４つの完全長ＤＮＡクローンからのＲＮＡ転写物は、この検定では陰性であり、これらのＤＮＡクローンは、クローン１Ａのように、制限酵素分析では検出できない致死突然変異を含んでいることが示された。
【０１３６】
上述したデング熱ウイルス感染細胞の陽性判定に加えて、感染性デング熱ウイルスを、培地または２Ａ ＲＮＡトランスフェクション細胞の細胞溶解物から回収した。トランスフェクション細胞溶解物中に存在するデング熱ウイルスの力価は１０5ｐｆｕ／ｍＬであった。２Ａ ＲＮＡ転写物をＤＮａｓｅＩを用いて処理した場合、その感染性には影響がなかったが、ＲＮａｓｅ処理ではその感染性は完全に損なわれた。ＲＮＡを用いた細胞モノレイヤーのトランスフェクションの後、デング熱ウイルスのプラーク形成は行なわれなかったため、ウイルスの生成は、ウイルス増幅のための延長されたインキュベーションの後で判定された。この間接的免疫蛍光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムＲＮＡ１ｎｇまたは２ＡＲＮＡ転写物１０ｎｇの最小濃度において検出された。この試験のこれらの結果は、クローン２Ａから作製されたＲＮＡ転写物が、受容培養細胞のトランスフェクションの後で、感染性を持つことを示している。
【０１３７】
【実施例７】
ＲＮＡ転写物の感染性についてのその他の証拠
クローン２Ａ ＲＮＡ転写物でトランスフェクションした細胞により、感染性デング熱ウイルスが生成されたことを正式に証明するため、デングゲノムのヌクレオチド３４７３に新たなＰｓｔＩ部位を創製するがアミノ酸配列には影響しない２つの突然変異（Ｇ３４７３−→ＴおよびＣ３４７６−→Ｔ）を、完全長デングクローン２Ａ ＤＮＡに導入した。この突然変異ＤＮＡから作製されたＲＮＡ転写物を、ＤＮａｓｅＩを用いた消耗性消化によりＤＮＡ鋳型を完全に除去したのち、細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクションされた細胞は感染性デング熱ウイルスを生成した。子孫ウイルスから抽出されたゲノムＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ産物をＰＣＲのための鋳型として用いて、ヌクレオチド３１９３〜４５３６の間にＤＮＡ断片を生成した。図１０に示すように、ＰＣＲＤＮＡ産物のＰｓｔＩ消化は、ＰｓｔＩ開裂配列の存在により予測されるように、それぞれ２８０個および１０６３個の塩基対の長さの２つの断片を産生した。
２Ａ ＲＮＡ由来のウイルスの対照ＰＣＲ ＤＮＡ産物は、ＰｓｔＩ消化に対しては非感受性であった。この観察は、突然変異体２Ａ ＤＮＡのＲＮＡ転写物に由来する子孫ウイルスがＰｓｔＩ部位を含むことの証拠を提供した。
【０１３８】
【実施例８】
インビトロで転写された感染性ＲＮＡから回収されたデング熱ウイルス
クローン２Ａまたはクローン２Ａ（Ｐｓｔ）鋳型から作製されたＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした細胞の溶解物から子孫デング熱ウイルスを単離し、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞単層上でのプラーク形成能力について、親・野生型ウイルスと比較した。感染の６日後、子孫ウイルスおよび親ウイルスは、ともに、さまざまな大きさの特徴的なデングプラークを生成した。蚊細胞内の継代培養により増殖した親ウイルスでは圧倒的に小型プラークがみられたが、子孫ウイルスでは混合的でありしかし主に大きいプラークが生成され、回収されたウイルスがクローン化集団を提供することを示唆している。子孫ウイルス感染細胞および親ウイルス感染細胞において生成されたデング特異タンパク質についても比較を行なった。図１１に示すように、デング高度免疫腹水により沈殿させたＰｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２、およびその他未決定のデングタンパク質バンドのプロフィールは、子孫ウイルスおよび親ウイルス双方について識別不可能であるように見えた。この結果は、回収されたデング熱ウイルスが、ｃＤＮＡクローンが由来するもとのウイルスと同じ遺伝子型および表現型を呈することを示すものである。ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部におけるアミノ酸置換による活性デング熱ウイルスの加工
【０１３９】
【実施例９】
開裂部位配列におけるアミノ酸置換を特定するＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮＡの構築
真正［ａｕｔｈｅｎｔｉｃ］ＮＳ１の発現のために構築された中間組換えｐＳＣ１１−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮＡをこの研究に用いた。デング熱ウイルスＤＮＡは、２４アミノ酸Ｎ末端信号のためのコード配列と、ＮＳ１およびＮＳ２Ａの完全ポリペプチド配列を含んでいた。まず、このプラスミドＤＮＡを、突然変異を含むＤＮＡセグメントの置換を容易にするために改変した。２つのサイレントな突然変異が、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、ＮＳ１−ＮＳ２ＡＤＮＡ（Ｇ3473→ＴおよびＣ3476→Ａ）に導入された。これらの変更は、ヌクレオチド（ｎｔ）３４７６に新たなＰｓｔＩ部位を作製した。組換えプラスミドは、デングＮＳ１コード配列中のｎｔ３３２０に唯一のＮｃｏＩ部位を含んでいた。ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部はｎｔ３４７７に位置している。開裂部位配列にアミノ酸置換を導入するために、オリゴヌクレオチド誘発突然変異により、ヌクレオチド変更を行った。一連のオリゴヌクレオチドを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における負鎖プライマーとして用いた。正鎖プライマーは、
５’ＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＡＡ３’（配列番号１）であり、
ＮｃｏＩ部位の上流に位置していた。たとえば、開裂位置−２（Ｔｈｒ1124）において、オリゴＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧＴＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ（配列番号２）が、ＴｈｒをＬｙｓで置換するために用いられた。同様にして、オリゴＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＧＣＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ（配列番号３）が、ＴｈｒをＧｌｎで置換するために用いられ、オリゴＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ（配列番号４）が、ＴｈｒをＬｅｕで置換するために用いられた。同様に、オリゴＴＴＣＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧＴＧＡ（配列番号５）が、開裂位置＋１においてＧｌｙ1120をＧｌｕで置換するために用いられ、あるいは、オリゴＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧＣＣＡＧＧＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ（配列番号６）が、開裂位置＋１において同じＧｌｙをＴｒｐで置換するために用いられた。
【０１４０】
特定された突然変異を含む中間組換えＤＮＡの構築のため、あらたに作製されたＰｓｔＩ部位と唯一のＮｃｏＩ部位の間のＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで開裂されたＰＣＲ ＤＮＡ産物のシリーズで置換した。これらの突然変異体ＮＳ１−ＮＳ２Ａ配列を発現する組換えワクシニアウイルスは、すでに説明された手順（Ｂ．Ｚｈａｏ、Ｇ．Ｐｒｉｎｃｅ、Ｒ．Ｈｏｒｓｗｏｏｄ、Ｋ．Ｅｃｋｅｌｓ、Ｐ．Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｒ．Ｃｈａｎｏｃｋ、およびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９８７）、組換え体ワクシニアウイルスによるデング熱ウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質ＮＳ１の発現、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６１巻４０１９〜４０２２頁）にしたがって作製された。
【０１４１】
【実施例１０】
ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における開裂の分析
６穴プレート内のコンフルエントＣＶ−１細胞を、細胞あたり５ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスに感染させ、最小必須培地に２％ウシ胎児血清（ＭＥＭ２）を加えた中に保持した。感染の１６〜２０時間後、培地を取り出してメチオニン非含有ＭＥＭ２とともに置いた。１時間のインキュベーションの後、この培地は、ふたたび、１００μの35Ｓメチオニン（比放射能＞８００μ／ｍｏｌ）を含む０．７ｍＬのメチオニン遊離ＭＥＭ２とともに置かれた。２時間の標識期間の後、ＲＩＰＡ緩衝液（デオキシコール酸ナトリウム１％、ＮｏｎｉｄｏｔＰ−４０を１％、硫酸ドデシルナトリウム［ＳＤＳ］０．１％、０．１Ｍ トリス塩酸、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に細胞を溶解し、溶解物を遠心分離して細胞砕片を除く。溶解物の澄んだ上澄み液に対して、デング高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）を用いた免疫沈降検査を行ない、デング熱ウイルスを分析した。免疫沈殿物は、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビス比６０：１．６）上の電気泳動分離により分析された。標識されたタンパク質バンドは、蛍光撮影により視覚化された。非開裂ＮＳ１−ＮＳ２Ａ前駆体および開裂ＮＳ１産物に対応するゲルバンドが切り出され、液体シンチレーションカウンターで放射能が計測された。
【０１４２】
ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における開裂の程度を判定するために、発現したＮＳ１−ＮＳ２Ａの総標識は、同じｐｆｕ使用で各突然変異体に感染した細胞において同じであるという仮定にもとづいて、ＮＳ１−ＮＳ２ＡおよびＮＳ１の間の免疫沈降能力差を補正した。野生型ＮＳ１−ＮＳ２Ａは、開裂されたＮＳ１を優勢的に発現し、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ前駆体は検出されなかった。野生型ウイルスについての開裂度を１００％と定めた。
【０１４３】
【実施例１１】
ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂配列におけるアミノ酸置換を特定する完全長４型デングｃＤＮＡの構築
前項において構築され分析された、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における開裂度が低下したＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮＡの突然変異体は、このようなアミノ酸置換を含むデング熱ウイルス突然変異体の構築のために選抜された。すでに構築された以下の４つの突然変異が採用された。（１）開裂位置＋１におけるＧｌｙをＧｌｕに置換、（２）−２位置のＴｈｒをＬｙｓに置換、（３）−２位置のＴｈｒをＧｌｎに置換、（４）−２位置のＴｈｒをＬｅｕに置換。突然変異体ｐｓｃ１１−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮＡを、ｎｔ３３３８のＳｐｅＩおよびｎｔ３６１６のＳｔｕＩで消化し、２７８個を断片として単離した。突然変異を含むこのＤＮＡ断片は、デングｃＤＮＡ配列の５’側半分を含むプラスミドｐ５’−２内の対応する野生型ＤＮＡ断片の置換に用いられた。ＢｓｔＥ１（ｎｔ５０６９）と３’末端のＡｓｐ７１８の間の残りの３’デングｃＤＮＡ断片は、共有制限酵素開裂部位においてｐ５’−２ＤＮＡに連結された。このようにして、完全長ｃＤＮＡが作製され、ｐＢＲ３２２ベクターを用いてクローン化された。このシリーズのｃＤＮＡは、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部にアミノ酸置換をコードする突然変異された配列を含んでいた。
【０１４４】
【実施例１２】
ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における最適でない開裂を呈する４型デング熱ウイルス突然変異体
ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効果的な弱毒化生菌ウイルスワクチンの開発に、デング熱ウイルスの分子理解を応用することである。デング熱ウイルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配列またはウイルスプロテアーゼ構成要素の改変の結果、ウイルスポリタンパク質の開裂は最適以下となり、ウイルス増殖が制限される。
【０１４５】
ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂部位は、その非効率的開裂の故に、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異体を構築するための第１のターゲットとして選択された。我々は、４型デング熱ウイルスのＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂には、開裂接合部の前のＮＳ１のＣ末端に８アミノ酸配列が必要であることを証明した（Ｈ．ＨｏｒｉおよびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９９０）。デング熱ウイルスＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂には、ＮＳ１のＣ末端にオクタペプチド配列が必要である。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻４５７３〜４５７７頁）。
【０１４６】
フラビウイルス間で８アミノ酸配列を比較すると、Ａｌａ（−１）、Ｖａｌ（−３）、Ｓｅｒ（−５）、Ｖａｌ（−７）、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ−８）は正確に保存されるのに対し、Ｔｈｒ（−２）、Ｇｌｎ（−４）、Ｌｙｓ（−６）は変化するという興味深い特色が明らかになった。位置−１のＡｌａ、位置−２のＴｈｒ、位置−３のＶａｌ、位置＋１のＧｌｙのアミノ酸置換の効果を分析した。この分析の結果は図１６に示されている。保存された位置−１または−３におけるアミノ酸置換は、低レベルの開裂を生じた。非保存位置−２または＋１におけるアミノ酸置換は、効果がないかもしくはごくおだやかな開裂低減を呈した。
【０１４７】
ある範囲の開裂効率を生じたアミノ酸置換のパネルを、完全長ｃＤＮＡへの組み込みのために選抜し、インビトロ由来ＲＮＡ転写物をデング熱ウイルス突然変異体の構築のために用いた。１つのデング熱ウイルス突然変異体は、Ｇｌｙ（＋１）のかわりにＧｌｕを含むＤＥＮ４（Ｇｌｙ1120→Ｇｌｕ）であり、他の３つの突然変異体は、ＤＥＮ４（Ｔｈｒ1124→Ｌｙｓ）、ＤＥＮ４（Ｔｈｒ1124→Ｇｌｎ）、ＤＥＮ４（Ｔｈｒ1124→Ｌｅｕ）であり、Ｔｈｒ（２）の置換を含んでいる。これらはトランスフェクションしたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から回収された。
【０１４８】
以下に述べるように、これらの突然変異体の増殖特性は、蚊Ｃ６／３６細胞上のプラーク検定により調べられた。図１２はＤＥＮ４（Ｇｌｙ1124→Ｇｌｕ）および対照親ウイルスに対するこの検定の結果を示す。突然変異体ウイルスのプラークサイズは直径約０．１ｃｍが計測され、親ウイルスの１．１ｃｍのプラークサイズと比較して大きく縮減していた。その他のデング熱ウイルス突然変異体もプラークサイズの縮減を示し、これらのウイルスが培養細胞において増殖制限を示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因する増殖制限は、感染宿主におけるウイルス毒性に対して、大きな効果をもつようである。
活性デング熱ウイルス３’非コード領域欠失突然変異体の加工
【０１４９】
【実施例１３】
３’非コード領域に欠失を含むデングｃＤＮＡの構築
ヌクレオチド３８４個の３’非コード領域への欠失突然変異の導入を容易にするために、まず、ｎｔ１０１０４の唯一のＢａｍＨＩ部位と３’末端のＡｓｐ７１８部位の間の４型デングｃＤＮＡの５４０ｎｔのサブフラグメントを、ｐＧＥＭ３クローニングベクターに挿入した。この組換えプラスミドにおいて、４型デング配列のｎｔ１０４７０の唯一のＡｐａＩ部位は、３’非コード配列のほぼ中心点に位置している。この便利な位置にあるＡｐａＩ部位を用いて、２つの欠失突然変異配列を構築した。すなわち、構築物の１つの配列は、ＡｐａＩ部位の下流に欠失を含んでいた。他の配列の欠失はＡｐａＩ部位の上流に位置していた。ヌクレオチド３０〜９０個の長さをもつ欠失突然変異の第１の配列を加工するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が実施された。
【０１５０】
ＡｐａＩ開裂部位に指定された適当な欠失を含み、下流配列が続く以下のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける正鎖プライマーとして用いた。
【０１５１】
オリゴＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＣ−（Δ３’１７２−１４３）（配列番号７）
オリゴＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ−（Δ３’１７２−１１３）（配列番号８）
オリゴＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ--（Δ３’１７２−８３）（配列番号９）
負鎖プライマーは、オリゴＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＣＣＴＧＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  Ａ（配列番号１０）であり、これは、３’デング配列にＡｓｐ７１８開裂配列がつづいたものを含んでいる。完全長４型デングｃＤＮＡ（クローン２Ａ）を鋳型として用いた。これらの欠失突然変異を４型デング配列に導入するために、ｐＧＥＭ３組換えプラスミド中のＡｐａＩおよびＡｓｐ７１８部位の間の野生型ウイルスＤＮＡ断片を、ＡｐａＩおよびＡｓｐ７１８で開裂したＰＣＲ ＤＮＡ産物で置換した。
【０１５２】
同様に、ヌクレオチド６１〜２０２個の長さをもつ欠失突然変異の第２の配列を加工しＡｐａＩ部位の上流に配置するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を施した。下記のオリゴヌクレオチドが合成され、ＰＣＲにおける負鎖プライマーとして用いられた。
【０１５３】
オリゴＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＣＧＣ--（Δ３’，２４３−１８３）（配列番号１１）
オリゴＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＴ--（Δ３’，３０３−１８３）（配列番号１２）
オリゴＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ--（Δ３’，３３３−１８３）（配列番号１３）
オリゴＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＡ--（Δ３’，３８４−１８３）（配列番号１４）
正鎖プライマーはオリゴＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣ（配列番号１５）であり、これは、ＢａｍＨＩ部位の上流のヌクレオチド９８８５〜９９０７の間に位置している。完全長４型デングｃＤＮＡを鋳型として用いた。先に説明したように、これらの欠失突然変異を４型デング配列に導入するために、中間体ｐＧＥＭ３プラスミド中のＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ部位の間の野生型ウイルスＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで開裂したＰＣＲ ＤＮＡ産物で置換した。ｃＤＮＡ鋳型を加工する最終段階において、構築物の両方の配列からのＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片が単離され、残りの４型デング配列でクローン化された。
【０１５４】
【実施例１４】
ＲＮＡ転写、トランスフェクションおよびウイルスの回収
デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンは、３’末端におけるＡｓｐ７１８での消化により線状化され、線状ｃＤＮＡは、ＳＰ６ポリメラーゼによるインビトロ転写のための鋳型として用いられた。ＲＮＡ転写物による細胞のトランスフェクションは、先に説明されているように実施された（Ｌａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁（１９９１））。トランスフェクションの１０日後、細胞をトリプシン処理し、６穴プレートおよびチェンバースライドに移した。２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デング熱ウイルス抗原の形跡について、スライド上の細胞を試験した。ＩＦＡにより大半の細胞が感染したことが示された場合には、６穴プレート上の感染細胞は、培地を取り出し、細胞を掻き取り、標準容積の５０％イーグル最小必須培地／５０％血清に再懸濁し、凍結させることにより、収穫された。一方、陽性の細胞の割合が小さい場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮な媒地中に１：３で希釈し、増殖させた。感染細胞の割合は週ベースで算定され、細胞溶解物を収穫した。
【０１５５】
【実施例１５】
プラーク形態観察
ウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞または蚊Ｃ６／Ｃ３６細胞上のプラーク形態について調べられた（Ｂａｎｋｃｒｏｆｔ他、Ｐａｎ  Ａｍ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁（１９７９）；Ｈｏｋｅ他、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第４３巻２１９〜２２６頁（１９９０））。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞中で１回、継代培養された。すなわち、２％ウシ胎児血清を含む培地１９９中に試験すべきデング熱ウイルス０．２ｍＬを連続１０倍希釈し、これを２５ｃｍ2ビンに入れたＬＬＣ−ＭＫ2細胞に注入した。３５℃で１時間の吸着の後、各単層に、１×培地１９９、０．３％重炭酸ナトリウム、１／２×イーグル基本培地ビタミン、１／２ｘイーグル基本培地アミノ酸、１０％ウシ胎児血清、０．５％アガロースを含む７ｍＬのアガロースを重層した。３５℃で６日間のインキュベーションの後、このビンに、０．５％ＭＥアガロースおよび１：７，５００ニュートラルレッドを含む通常生理食塩水４ｍＬを２回目のオーバーレイとしてかけた。染色から２４時間以内にウイルスプラークがあらわれた。Ｃ６／３６細胞上のプラーク形態観察を行ない、単離されたすべてのウイルス突然変異体が調べられた。この目的のため、７５ｃｍ2ビンに入れたのコンフルエントなＣ６／３６細胞に、２％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭに連続的に希釈された０．５ｍＬのウイルスを接種し、１〜２時間３５℃で吸着させた。つぎに被感染細胞に、２０ｍＬ／フラスコのアガロース（１×ハンク平衡食塩溶液、０．５％ラクトアルブミン加水分解物、１０％ウシ胎児血清、０．１２％重炭酸ナトリウム、０．７５％   ＳｅａｋｅｍTM  ＧＴＧアガロース）を重層した。培養を３５℃で７日間、インキュベートした。つぎに、ＮａＣｌ ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．４ｇ／Ｌ、グルコース１．０ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＣＯ2 ２２．５ｍｇ／Ｌ、ニュートラルレッド３．３ｍｇ／Ｌからなるニュートラルレッド染色液５ｍＬを用いて培養物を染色した。３５℃で３〜５時間のインキュベーションののち、余分の染色液を取り除き培養物はインキュベータに戻した。一般に、インキュベータ内で２４〜３６時間経過した後プラークがあらわれた。
【０１５６】
【実施例１６】
３’非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウイルス突然変異体
ここで、デング組換えＤＮＡ系により、ウイルスＤＮＡの５’および３’非コード領域ならびにコード領域における欠失を含むデングウイルス突然変異体を構築することも可能となる。欠失突然変異体は、アミノ酸置換突然変異体よりも、表現型の復帰が起きることが少ないという利点を提供する。４型デング熱ウイルスゲノムの３’非コード領域における欠失突然変異の加工において進展がみられた。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング熱ウイルスは、保存配列１（ＣＳ−１）および保存配列２（ＣＳ−２）と呼ばれる伸張した保存配列と、
３’非コード領域内の末端ステムアンドループを取り得る構造を含む。
【０１５７】
ヌクレオチド３０〜１２０個の範囲の欠失は、４型デング熱ウイルスＲＮＡのヌクレオチド３８５個の３’非コード配列のさまざまな位置において作製された。ＣＳ−１領域に配列を欠いていても、ステムアンドループ構造は維持しているｃＤＮＡクローンから転写された突然変異体ＲＮＡは、子孫ウイルスを生成せず、これは、欠失ウイルスがほとんどの他の欠失構築物から回収されたことを示唆している（図１３）。これらの突然変異体および野生型ウイルス対照のプラーク検定はＣ６／３６細胞上で実施された。
【０１５８】
この分析の結果、これらの突然変異体のほとんどが、欠失の位置と程度に応じて１．０〜０．３ｃｍの範囲の縮減サイズのプラークを形成したことが示された（図１４および１５）。プラーク形態の変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限表現型をあらわしたことを示すものである。この欠失突然変異体のパネルは、実験動物およびヒトに対する毒性低減など、その他の興味深い潜在的に重要な特性をみせる。
【０１５９】
【実施例１７】
完全長キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ ｃＤＮＡおよびキメラウイルスの生成
すでに、ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）のサブゲノムｃＤＮＡ断片がクローン化され、ヌクレオチド配列が決定された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）参照）。ＴＢＥＶ配列のヌクレオチド（ｎｔ）７６〜１９７７を含むプラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥおよびヌクレオチド９６６〜３６７２を含むｐＧＥＭ２−ＥＮＳ１は、Ｅ．Ｙｕ．Ｄｏｂｒｉｃｏｖａ博士（Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ロシア）により、共有される制限酵素部位においてＴＢＥＶセグメントを連結することにより、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ１８、ｐ２、ｐ１１から（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他）提供された。プラスミドＤＥＮ４ ｐ５’−２およびｐ５’−２（ΔＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ）および誘導体ｐ５’−２（ΔＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ，ΔＨｉｎｄIII ）（前出のＢｒａｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９１））が、対応するＤＥＮ４遺伝子に代えて１つ又はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子を置換するための組換えｃＤＮＡ構築物として、用いられた。合成オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により２本鎖ＤＮＡを生成するための負または正鎖プライマーとして用いられた。ＰＣＲ特異的部位特異的突然変異誘発により、制限酵素開裂配列を、ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子間接合部またはその近くに導入した（図１７）。まず、示されたＴＢＥＶ遺伝子を含む７個の中間キメラプラスミドが構築され、安定な完全長ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ ｃＤＮＡが、大腸菌株ＢＤ１５２８（前出のＬａｉ他（１９９１）により説明されている）の形質転換後に同定された。各プラスミド内のＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子の間の接合部を囲む配列は、分子生物学の分野で公知の技術を用いた核酸配列決定により確認された。すべてのキメラプラスミドは、第１のＤＥＮ４ヌクレオチドであるＡ残基が続く転写開始点Ｇの上流に位置するＳＰ６プロモーターを含んでいた。インビトロ転写の前に、ＤＥＮ４配列の３’末端の直後の唯一のＡｓｐ開裂部位において、プラスミドを線状化した（前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に説明された技術を用いて）。キメラウイルスの回収とその特性の研究は、ＢＬ−３封じ込め設備において実施された。転写反応は、実質的に、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に記載されているように実施された。トランスフェクションの前に、３７℃で１５分間、４０ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを用いて転写混合物を処理した。つぎに、ＲＮＡ転写物は、（ｉ）前出のＬａｉ他によりすでに述べられているＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、または（ii）Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ）の存在のもとで、セミコンフルエントなサルＬＬＣ−ＭＫ2細胞のトランスフェクションに用いられた。ＤＯＴＡＰトランスフェクション条件のもとで、トランスフェクション混合物は、０．０２ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液４０μＬ、ｐＨ７．０５中にＲＮＡ転写物（２μｇ）、および、Ｈｅｐｅｓ緩衝液３０μＬ中にＤＯＴＡＰ １２μＬを含んでいた。室温において１０分間のインキュベーションの後、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む２ｍＬの培地１９９を添加した。混合物０．５ｍＬを、２４穴プレートの４つのウェル中の半融合性細胞に分注した。１０日後、細胞をトリプシン処理し、６穴プレートとチェンバースライドに移し、さらに２日間、増殖培地においてインキュベーションした。スライド上の細胞を免疫蛍光検定（ＩＦＡ）により試験し、１：１００希釈のＤＥＮ４特異高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）、ＴＢＥＦ特異的ＨＭＡＦ、またはＴＢＥＶ特異的ウサギ血清（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ  Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ロシア、モスクワのＡ．Ｓ．Ｋａｒａｖａｎｏｖ博士の好意により提供された）を用いてＤＥＮ４またはＴＢＥＶ抗原の存在を検出した。フルオレセイン接合抗マウスまたは抗ウサギ血清（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）を同一希釈で用いた。ＩＦＡにより５０〜８０％の細胞が感染したことが示された場合には、６穴プレート内の細胞をトリプシン処理し、２倍量の非感染細胞と混合し、Ｔ75フラスコ中で６日間増殖させた。つぎに、被感染細胞を培地とともに収穫し、同一容積のウシ胎児血清と混合し、細胞懸濁液として凍結した。解凍された細胞溶解物を、子孫キメラウイルスの源として用いた。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMまたはＤＯＴＡＰを用いたトランスフェクション実験により、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４のみが同定された。子孫ウイルスは免疫蛍光検定により同定された。
【０１６０】
ｖＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４と呼ばれる子孫キメラＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスのゲノム構造を証明するために、Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２１８頁（１９８７）に提供される技術を用いたフェノール抽出により、総細胞ＲＮＡを感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞から単離した。ＤＥＮ４配列のヌクレオチド（ｎｔ）位置５０９０〜５１１０（Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁１９８７参照）に対して相補的なオリゴ５’ＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＴ３’（配列番号１６）を、逆転写のためのプライマーとして用いた。一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＥＮ４配列のｎｔ位置１８〜４４のオリゴ５’ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ３’（配列番号１７）をＰＣＲの正鎖プライマーとして、ＴＢＥＶ配列のｎｔ位置２１３０〜２１５２のオリゴ５’ＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴ３’（配列番号１８）を負鎖プライマーとして用いた。デング熱ウイルスに関連するヌクレオチド位置については、Ｚｈａｏ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁１９８６参照。ダニ媒介脳炎ウイルスに関連するヌクレオチド位置については、前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）を参照。制限酵素部位の存在を証明するため、２１１８塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ ＤＮＡ産物は、ＰｓｔＩ、ＢｇｌII 、またはＥｃｏＲＩで消化された。同様に、オリゴ５’ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴ３’（配列番号１９）およびオリゴ５’ＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣ３’（配列番号２０）（これらはそれぞれ、３４５９〜３４８０ｎｔのＤＥＮ４ゲノムに相補的、および、９６７〜９８５ｎｔのＴＢＥＶゲノムの負鎖に相補的である）を、ＰＣＲに用いた。ＤＮＡ配列を証明するため、ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＳｐｈＩで消化された。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ゲノムからのＰＣＲＤＮＡ産物（２１１８ｂｐ）は、ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて消化された。ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ−サブフラグメント（１９２２ｂｐ）をＰＡＧＥにより精製し、相補的な制限部位においてｐＧＥＭ３ベクター内にクローン化した。ＤＥＮ４（３００〜３９８ｎｔ）のＣ遺伝子とＴＢＥＶ（４１８〜４６０ｎｔ）のｐｒｅＭ遺伝子の間の接合部の配列は、核酸配列決定により確認された。ＴＢＥ／ＤＥＮ４キメラＤＮＡの構築に用いられたオリゴヌクレオチドは以下のものを含む。
【０１６１】
ＴＢＥＶ特異的オリゴ
５’ＣＣＧＧＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣ＋（配列番号２１）
５’ＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣ−（配列番号２２）
５’ＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧ＋（配列番号２３）
５’ＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＧ＋（配列番号２４）
５’ＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣ−（配列番号２５）
５’ＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣ＋（配列番号２６）
５’ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＴＴＴＧ−（配列番号２７）
ＤＥＮ４特異オリゴ
５’ＴＡＣＧＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧＡＴＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴ−（配列番号２８）
５’ＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴ＋（配列番号２９）
５’ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣ−（配列番号３０）
５’ＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＣＣＣ＋（配列番号３１）
配列番号２３は、ＤＥＮ４の５’非コード領域／ＴＢＥＶカプシド接合を作製するために用いられ、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ部位を形成した。配列番号３０および２４は、ＤＥＮ４ Ｃ／ＴＢＥＶ ｐｒｅＭ接合を作製するために用いられ、ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ部位を形成した。配列番号２８および２１は、ＤＥＮ４ ｐｒｅＭ／ＴＢＥＶ Ｅ接合を作製するために用いられ、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII部位を形成した。ＤＥＮ４ ＮＳ１／ＴＢＥＶ ＮＳ１接合は、配列番号２６を用いて作製され、ＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ Ｅ／ＤＥＮ４ ＮＳ１接合は配列番号２５を用いて作製され、ＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ Ｃ／ＤＥＮ４ ｐｒｅＭ接合は配列番号２７および３１を用いて作製され、ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ ＮＳ１／ＤＥＮ４ ＮＳ２Ａ接合は配列番号２２および２９を用いて作製され、ＳｐｈＩ／ＳｐｈＩ部位を生成した。配列に付した＋および−の符号は、それぞれ上流および下流のプライマーを示す。
【０１６２】
【実施例１８】
キメラビリオンのタンパク質分析
ＤＥＮ４ｖ ２Ａ（ＸｈｏＩ）、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ構築物、または、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されるタンパク質を分析するために、６穴プレート内のコンフルエントなＬＬＣ−ＭＫ2細胞を、ＭＯＩ １．０で各ウイルスに感染させた。感染の６日後、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に述べられているように、メチオニン非含有ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）中の35Ｓメチオニン（ウェルあたり６０μＣｉ、比放射能６００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で４時間にわたり、細胞を標識した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡＦ、２）ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦ、３）ＴＢＥＶ Ｅに対して作製されたウサギ血清、または、４）ＤＥＮ４ ｐｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ３、または、ＮＳ５タンパク質に特異なウサギ抗血清を用いて、溶解物を免疫降させた。前出のＬａｅｍｍｌｉにより説明される技術を用いて、変性条件下でＰＡＧＥにより免疫沈降物を分析した。
時間に対するタンパク質合成の分析
Ｔ25フラスコに入れたＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞単層に、ＭＯＩ １で、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４（ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ））を感染させた。３７℃で１時間の吸着の後、ウイルス接種物を取り出し、新鮮培地を細胞に添加した。タンパク質合成の分析のため、ウイルス吸着後さまざまな時間（０、４、８、２４、４８時間）経過した被感染細胞を、メチオニン非含有ＭＥＭとともに、２０分間インキュベートし、同じ培地中で２時間にわたり、35Ｓメチオニンで標識した。標識された細胞の溶解物をＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦを用いて沈降させ、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。
【０１６３】
【実施例１９】
キメラ構築物の増殖分析
親ＤＥＮ４およびそのキメラウイルスは、サルＬＬＣ−ＭＫ2および蚊Ｃ６／３６細胞上のプラーク検定により、調べられた。プラーク検定の技術は前出のＢａｎｃｒｏｆｔ他に説明されている。図１９に示されている増殖分析は、感染後のさまざまな日付に、ＤＥＮ４またはＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2およびＣ６／３６培養中に存在するウイルスの量を計量することにより、実施された。感染およびウイルス吸着の後、培養を収穫し、各培養をプラーク検定によりサンプリングした。Ｌｏｇ（ｐｆｕ／ｍＬ）で表したウイルス力価の変化は、時間に対する増殖曲線として与えられている。
【０１６４】
【実施例２０】
ウイルスＲＮＡ合成の分析
ウイルスＲＮＡ合成の分析のために、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞（約１０6個の細胞）をウイルス吸着後のさまざまな時間（０、４、８、２４、４８時間）に収集し、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５で洗浄し、ついで、０．３Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳを含む緩衝液中に溶解した。前出のＭａｎｉａｔｉｓ他により提供される技術を用いて、フェノール抽出により、総ＲＮＡを細胞溶解物および培地から単離した。６０℃で１５分間、７．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ホルムアルデヒドを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）中でのインキュベーションにより、ＲＮＡ試料は変性され、ニトロセルロースフィルターＢＡ８５（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に接合された。フィルターは８０℃で１時間焼かれ、６×ＳＳＣ、３×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、２５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．５）、０．１％ＳＤＳ、２５μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中において、６５℃で１時間、プレハイブリダイゼーションされた。ニックトランスレーションされた32Ｐ標識ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ ＤＮＡプローブ（５０ｎｇ／ｍＬ、比放射能３．４×１０8ｃｐｍ／μｇ）を含む同じ溶液中で、６５℃で一晩、ハイブリダイゼーションが続けられた。ハイブリダイゼーションの後、６５℃で、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中でフィルターを５回洗浄し、乾燥し、７０℃でＸ線フィルムに曝した。また、ＲＮＡにハイブリダイズされた32Ｐ標識ＤＮＡの放射能が、液体シンチレーションカウンターで計測された。ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４からインビトロで作製されたＲＮＡ転写物が、陽性対照として用いられた。
【０１６５】
【実施例２１】
ワクチン試料の防御効力とキメラウイルスの神経毒性の試験
ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４および親デング熱ウイルスは、マウスに脳内（ＩＣ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）経路により接種することにより、神経毒性について分析された。生後３日の乳児ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０２ｍＬＭＥＭ／０．２５％ヒト血清アルブミン中にウイルス１０2ｐｆｕを加えて、ＩＣ注射で投与した。生後６週のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、（ｉ）１０3ｐｆｕのウイルスを上記のとおり希釈し、容積０．０３ｍＬにしてＩＣ接種により投与、または、（ii）０．１０ｍＬに希釈した１０3ｐｆｕのウイルスをＩＤまたはＩＰ接種した。マウスは、２１日間、脳炎の徴候や死亡について観察され、生き延びた成体マウスは、感染の２０日後に採血して接種されたウイルスに対する抗体反応を評価した。生存マウスに対しては、第２１日に、ＢＬ−４封じ込め設備において、
１０3ＬＤ50ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）をＩＰ投与した。
【０１６６】
【実施例２２】
キメラウイルス突然変異体の構築および配列決定
分子生物学の当業者に公知の標準的オリゴＰＣＲ操作手順にしたがい、部位特異的突然変異誘発を用いて、ＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に突然変異を導入した（下記のオリゴ配列参照）。得られた構築物は、実施例１７に開示された技術を用いて、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞内にトランスフェクションされた。突然変異誘発された構築物から回収した子孫ウイルスは、実施例１９において提供されている技術を用いてプラーク形態の変化について評価された。キメラウイルスゲノムの予め定められた領域内に改変を系統的に達成するために、完全長ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ｃＤＮＡ構築物に戦略的突然変異を導入した。６個の突然変異キメラが、トランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から回収され、子孫ウイルスが、マウス神経毒性を誘導する能力について分析された。さらに、他のウイルス増殖特性が、培養細胞において評価された。図２３に示すように、ＰｒｅＭ、Ｅ、または、ＮＳ１グリコタンパク質における切断されたグリコシル化部位を含む４つのウイルス突然変異が、示された部位におけるグルコシル化欠損を示すものと予測された。変異*ＰｒｅＭ／Ｍ-は、ＰｒｅＭ／Ｍ遺伝子間接合部において欠陥開裂配列を含んでいた。変異*Ｅは、２つのアミノ酸置換を含み、これらの置換が選択された理由は、これらのアミノ酸が蚊媒介フラビウイルス内にのみ見られるからである。
【０１６７】
突然変異は、標準的オリゴＰＣＲ起動手順にしたがい、部位特異的突然変異誘発により、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に導入された。要するに、正鎖オリゴおよびその相補的負鎖オリゴは、それぞれ突然変異配列と唯一の制限酵素部位を含んでいるが、ＰＣＲにおいて、それぞれ下流または上流プライマー対のオリゴとともに用いられる。両方のＰＣＲ産物は、共有される唯一の制限酵素部位において連結された。このようにして、突然変異された配列を含む、ＤＮＡ断片産物が作製され、完全長ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ ｃＤＮＡにおける対応する野生型ＤＮＡ断片を置換した。以下は特異的突然変異体キメラＤＮＡおよび構築に用いられたオリゴヌクレオチドのリストである。
（１）変異ＰｒｅＭ／Ｍ−Ｇｌｃ：
５’ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧ＋（配列番号３２）
５’ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣ−（配列番号３３）
（２）変異Ｅ−Ｇｌｃ：
５’ＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡ＋（配列番号３４）
５’ＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＣＣＣ−（配列番号３５）
（３）変異ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ：
５’ＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣ＋（配列番号３６）
５’ＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡ−（配列番号３７）
（４）変異ＮＳ１（２）−Ｇｌｃ：
５’ＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＡ＋（配列番号３８）
５’ＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡ−（配列番号３９）
（５）変異ＰｒｅＭ／Ｍ：
５’ＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣ＋（配列番号４０）
５’ＧＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧ（配列番号４１）
（６）変異Ｅ：
５’ＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡ＋（配列番号４２）
５’ＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣＧＧ−（配列番号４３）
さらに、上流プライマーは（配列番号４４）
５’ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ＋
および下流プライマーは（配列番号４５）
５’ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＡ−
【０１６８】
【実施例２３】
マウスにおける神経毒性の分析
さらに、突然変異されたキメラウイルス調製物は、マウスにＩＣ接種され、実施例２１に提供されている技術を用いて、ＤＥＮ４、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４と比較された。試験動物の半数を死亡させるのに必要な致死量が、突然変異キメラウイルスの各々について比較された。生後６週間のＢＡＬＢ／ｃマウスの８匹ずつのグループに、さまざまな変異キメラ、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４、ＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４、またはＤＥＮ４を、１０００、１００、１０、１、０．１ｐｆｕの投与量で、脳内接種した。被感染マウスは、３１日間、脳炎の徴候および死亡について観察された。５０％致死量（ＬＤ５０）が各ウイルスについて算出され、その値がマウス神経毒性の基盤として用いられた。図２４に示すように、親ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスのＬＤ５０は約１０ｐｆｕであった。このレベルのＬＤ５０は、いくつかの変異ウイルスについても観察された。少なくとも２つの突然変異体、すなわち*ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-および*ＰｒｅＭ／Ｍ-のＬＤ５０は、１００ｐｆｕよりも大きく、これらの突然変異体のマウス神経毒性は１００倍以上減少したことを示している。この発見は、キメラウイルスゲノムにおけるＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-またはＰｒｅＭ／Ｍ-突然変異は、それぞれ、マウス神経毒性の弱毒化を提供することを示すものである。これらの突然変異ウイルスは、個別にまたは組合わせて、ワクチン候補としての有用性のさらなる評価に有益であろう。
【０１６９】
【実施例２４】
霊長類における最適化キメラ構築物の試験
その他の動物ではなく、ヒトよりも下位の霊長類は、周辺経路により容易にデング熱ウイルスに感染することが証明されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ他、Ｐｈｉｌｉｐｐ．Ｊ．Ｓｃｉ．第４４巻１〜２４７頁、１９３１およびＲｏｓｅｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第７巻：４０６〜４１０頁、１９５８）。サルの感染は、ヒトのデング熱ウイルス感染に最も近い実験系である。デング感染に対するアカゲザルの反応は、４〜６日のウイルス血症があるという点において、ヒトのそれと類似している。これよりも低級な霊長類は臨床的デング徴候を起こさない。サルにおけるデングその他のフラビウイルス研究の目的は、（１）さまざまなワクチン候補の免疫原性を評価すること、（２）ウイルス血症の期間を日数で、ピークウイルス力価をｐｆｕ／ｍＬで計測して、デングまたはキメラデング熱生菌ウイルスワクチン候補の感染性および毒性（弱毒化表現型）を評価すること、（３）同型デング熱ウイルスまたは同一のキメラウイルス特異性をもつその他のフラビウイルスによる投与に対する上記ワクチンの防御効力を評価すること、である。
【０１７０】
（１）接種：各アカゲザルに、イーグル最小必須培地／０．２５％ヒト血清アルブミンに希釈した合計３×１０6ｐｆｕのウイルスを接種する。通常、麻酔された動物に２回の皮下投与を施す。
【０１７１】
（２）血液採取：デング熱ウイルスまたはキメラデング熱ウイルスの接種の後、３．０ｍＬの血液試料を２週間のあいだ毎日と、３週目、４週目、６週目、８週目に採取する。
【０１７２】
（３）デング熱ウイルスまたは他のフラビウイルスの投与：ウイルス投与が、防御効力を評価するために適切であると考えられる場合、１０5ｐｆｕ／１投与の非弱毒化ウイルスを容積０．５ｍＬにしてサルの上腕部に皮下接種する。
【０１７３】
（４）研究室内検定：血清試料を用いて以下を決定した。（ａ）直接的ウイルスプラーク検定によるウイルス血症期間、（ｂ）放射性免疫沈降およびＥＬＩＳＡによるデングまたは他のフラビウイルス特異抗体の力価、（ｃ）プラーク縮減中和試験による中和抗体の力価。これらすべての試験はワクチン開発技術の当業者には公知である。
【０１７４】
以上、本発明を特別の実施例について説明したが、当業者であれば、これらの実施例は例示のためのものに過ぎず本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の真の範囲は下記の請求の範囲に鑑みて解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キメラデング熱ウイルスの作製に用いられる完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡの構造を示す。
【図２】図２は、ＲＮＡ転写物を用いたトランスフェクション後の、ウイルス感染細胞のパーセンテージとウイルスの力価［ｔｉｔｅｒ］を示す。
【図３】図３は、キメラデング熱ウイルスの血清型分析を示す（写真）。
【図４】図４は、親またはキメラのデング熱ウイルスにより生成された１型、２型、または４型ウイルスタンパク質のポリアクリルアミドゲル分析を示す（写真）。
【図５】図５は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上のウイルスプラークの形態観察を示す（写真）。
【図６】図６は、親２型ＮＧＣまたは４型デング熱ウイルスまたは２型／４型キメラウイルスのマウス神経毒性を示す。
【図７】図７は、感染性ＲＮＡの転写に用いられるクローン化された完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡの末端配列を示す。合計１０６４６個のヌクレオチドの長さをもつ完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡは、図示のように、ＳＰ６ポリメラーゼのためのプロモーター配列および唯一のＡｓｐ７１８開裂部位に隣接してクローン化される。ここで、１０４４８および１０４４９の間の位置に付加Ｃ残基が、１０４７０および１０４７１の間に付加Ｇ残基が存在する。これらはもとの４型デング熱ウイルス配列にはなかったものである。ＲＮＡ転写物の予測５’末端および３’末端の近くの配列も示されている。転写開始のＧは、太字体で示される３’デング配列の前に配置されていた。Ａｓｐ７１８開裂配列ＧＧＴＡＣＣは、太字体で示される３’デング配列の直後に位置していた。
【図８】図８は、完全長デングｃＤＮＡクローンおよび制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを示す。図には、５’端にＳＰ６プロモーター、３’端にＡｓｐ７１８開裂部位を含む完全長デングｃＤＮＡクローンが示されている。ヌクレオチド５０６９のＢｓｔＢ１開裂部位により、デングゲノムは５’および３’断片に分離される。完全長クローン１Ａの断片を、対応する５’−２、３’−Ｂ、または３’−Ｃ断片で置換することにより、図示されている他の完全長の組合せが得られる。
【図９】図９は、ＢｇｌII，ＮｓｉＩ、およびＡｓｐ７１８で消化された完全長デングｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼパターンを示し、消化物はアガロースゲル上での分離により分析された。Ｍは、キロ塩基対の分子サイズマーカーとしてのλＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を示す（写真）。
【図１０】図１０は、感染ＲＮＡから回収されたデング熱ウイルスが鋳型ＤＮＡのゲノム配列を含むことの実例を示す。子孫デング熱ウイルスは、クローン２ＡＤＮＡ（野生型対照（コントロール））から、または、デング配列のヌクレオチド３４７３のＰｓｔＩ部位を含むクローン２Ａ（Ｐ）ＤＮＡから転写されたＲＮＡでトランスフェクションしたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から回収された。回収されたウイルスから抽出されたゲノムＲＮＡは、逆転写に用いられ、ｃＤＮＡ産物は、適当なプライマーを用いたＰＣＲにより１３４３ｂｐのＤＮＡ断片（ヌクレオチド３１９３〜４５３６）を製造するための鋳型として用いられた。ＰＣＲ産物のＰｓｔＩ消化が図示されている。レーンＭは、サイズマーカーとしての１２３のＤＮＡラダーを示す（写真）。
【図１１】図１１は、回収されたウイルスおよび親ウイルスに感染した細胞からのデング熱ウイルスタンパク質の比較を示す。回収されたデング熱ウイルスまたは親野生型ウイルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ2細胞からの溶解物［ライゼート（lysates）］を35Ｓメチオニンで標識したものを用意し、デング高度免疫マウス腹水を用いた免疫沈降を行なった。沈殿物は、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分離された。図示のゲルレーンは、下記のものに感染した細胞からの溶解物を含んでいる。（１）親デング熱ウイルス、（２）クローン２ＡＤＮＡから回収されたデング熱ウイルス、（３）クローン２Ａ（Ｐ）ＤＮＡから回収されたデング熱ウイルス。レーン４はダミー［ｍｏｃｋ］感染細胞溶解物からのものである。レーンＭは、左側に示したキロダルトンのタンパク質サイズマーカーを含む。ＰｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ、ＮＳ３を含むデング熱ウイルスタンパク質に対応する標識バンドが図示されている。その他の標識バンドの特定はしなかった（写真）。
【図１２】図１２は、野生型４型デング熱ウイルスと、それに由来するアミノ酸置換突然変異体Ｄ４（Ｄ1126−Ｅ）のプラーク形態観察を示す（写真）。７６ｃｍ2ビンに入れた集密な（コンフルエント(confluent)な）蚊Ｃ６／３６細胞をデング熱ウイルスに感染させ、次に、アガロースのオーバーレイを加えた。感染の６日後、ニュートラルレッドを用いて細胞を染色した。翌日、プラークサイズを測定した。１０個の別々のプラークから、野生型４型デング熱ウイルスおよび置換突然変異体の平均プラークサイズを算出した。図示の突然変異ウイルスは、４型デングポリペプチド配列の１１２６位置に、Ｇｌｙ（Ｇ）を置換したＧｌｕ（Ｅ）を含んでいた。この位置は、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂配列の＋１位置に対応する。
【図１３】図１３は、３’非コード配列中に欠失を含む４型デング熱ウイルス突然変異のゲノム構造と特性を示す。図示の線形マップは、４型デング熱ウイルスのヌクレオチド３８４個の３’非コード配列を示す。この領域には、少なくとも３つの配列要素が示されている。塗り潰した四角形で示したのは、ｎｔ２３４からｎｔ２１１、および、ｎｔ１４３からｎｔ１２０の保存配列２（ＣＳ−２）である。白抜きの四角形で示したのは、ｎｔ１０５からｎｔ８２の保存配列１（ＣＳ−１）であり、最後の８４個のヌクレオチド内にはステム・アンド・ループ構造がある。各々特定の位置に長さ３０〜２０２個のヌクレオチドの欠失突然変異を含む、７個のｃＤＮＡクローンが構築され、これから誘導されたＲＮＡ転写物を用いて、受容（permissive）ＬＬＣ−ＭＫ2細胞のトランスフェクションを行なった。ＣＳ−１配列を全く欠いた突然変異Ｄ４（Δ３’、１７２〜８３）ｃＤＮＡは致死突然変異のようである。というのは、活性ウイルスが試行を繰返しても検出されなかったからである。活性欠失突然変異体は、残り６個のＲＮＡ転写物から回収された。感染の６日後、野生型ウイルスとこれから誘導された欠失突然変異体の増殖特性を、染色したＬＬＣ−ＭＫ2細胞単層上のプラーク検定により比較した。同一条件のもとで、野生型ウイルスは約０．３ｃｍの大きさのプラークを示した。逆番号付与システム（reverse numbering system）を用いて、４型デング熱ウイルスのヌクレオチド位置を割り当てた。１０６４６の最後のヌクレオチドには、この番号付与システムを用いてｎｔ１が割り当てられた。
【図１４】図１４は、野生型デング熱ウイルス、および、これから誘導された、３’非コード領域に欠失を含む突然変異体のプラーク形態観察を示す。プラーク検定は、蚊Ｃ６／３６細胞に対して実施された。７５ｃｍ2ビンに入れたコンフルエントな蚊Ｃ６／３６細胞を、野生型４型デング熱ウイルスまたは活性欠失突然変異体ウイルスに、適当な多重度で感染させた。実施例に述べるように、感染の６日後に、被感染細胞をニュートラルレッドで染色した。翌日、プラークサイズを測定した。各突然変異体について、１０個の別々のプラークの平均プラークサイズを算出した。パネルＡは、非感染細胞単層（ダミー）、４型デング熱ウイルス欠失突然変異体（Δ３’、１７２〜１１３）、（Δ３’、１７２〜１４３）、親・野生型ウイルスを示す（写真）。
【図１５】図１５は、野生型ウイルスと、欠失突然変異体（Δ３’、２４３〜１８３）、（Δ３’、３０３〜１８３）、（Δ３’、３８４〜１８３）を示す。逆番号付与システムを用いて４型デング配列の欠失位置を割り当てた（写真）。
【図１６】図１６は、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部の表を示す。
【図１７】図１７は、キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物における遺伝子間接合部を示す。制限酵素で開裂したＴＢＥＶｃＤＮＡ断片を、下線を付した配列により示される適当な部位において、ＤＥＮ４ ｃＤＮＡに挿入した。ＴＢＥＶのアミノ酸およびコードヌクレオチド配列は太字で示されている。ヌクレオチド番号付与システムは、Ｐｌｅｔｎｅｖ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ第１７４巻２５０〜２６３頁（１９９０）に開示されたものである。
【図１８】図１８は、親ＤＥＮ４およびキメラＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスにより産生されたウイルスタンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真である。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウイルスに感染したサル細胞、または、非感染のサル細胞の溶解物を35Ｓメチオニンで標識し、ＴＢＥＶのＨＭＡＦ（１）、またはＤＥＮ４のＨＭＡＦ（２）、またはＤＥＮ４のＮＳ３（３）、ＮＳ５（４）、ｐｒｅＭ（５）、Ｅ（６）に特異的なウサギ血清を用いた免疫沈殿を行ない、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質マーカーの分子量はキロダルトンで示す。ＤＥＮ４タンパク質の位置は右端に沿って示されている（写真）。
【図１９】図１９は、ＬＬＣ−ＭＫ2およびＣ６／３６細胞上のｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＤＥＮ４についての増殖曲線を示す。細胞は、細胞当り０．０１ｐｆｕのＭＯＩで、図示の時点（感染後日数）において細胞を収穫し、プラーク検定によりウイルス力価を判定した。
【図２０】図２０は、被感染組織培養細胞から単離したＲＮＡの試料をブロットしたニトロセルロースフィルターの写真のコピーである。フィルターは、32Ｐで標識したｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ニックトランスレーションＤＮＡをプローブとして検査された。
【図２１】図２１は、感染後のさまざまな時点における、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞からの細胞溶解物タンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真である。
【図２２】図２２は、マウスにおけるｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の防御効力および神経毒性を判定するための研究の結果を示す。
【図２３】図２３は、神経毒性に対する突然変異の効果を評価するために、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に組み込んだいくつかの突然変異例のリストである。
【図２４】図２４は、図２３に示した突然変異を含む構築物から回収したＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４キメラを用いた神経毒性研究の結果をまとめたものである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> The United States of America
<120> Chimeric and/or Growth-Restricted Flaviviruses
<130> P-B0404F
<150> US 07/761,222
<151> 1991-09-19
<150> US 07/761,224
<151> 1991-09-19
<160> 45
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
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caaaaggggg cccaacagag atcctgctgc tgtctctgc  39
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cctggcttgg gcccccgcgt acagcttccg tggcgc  36
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cctggcttgg gccccggagc tacaggcagc acggtt  36
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cctggcttgg gcccccgtgg cacaagtggc ctgact  36
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cctggcttgg gccccttaca gaactccttc actctctga  39
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gcctccatgg ccatatgctc agc  23
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gaccgacaag gacagttcca aatcgga  27
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ctttttggaa ccattggtga ct  22
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gtccggccgt cacctgtgat t  21
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tcacggtgca cacatttgga aaac  24
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ccggtttata gatctcggtg cacacatttg gaaaac  36
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ctccattgtc tgcatgcacc attgagcgga caagccc  37
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cttaggagaa cggatcctgg ggatggccgg gaaggccatt ctg  43
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ggcaaaagaa ggtctgcagt agactggaca ggttgg  36
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gaaggaagct catggacatg gtcggattcc tcgagttcag gcccaaccag gc  52
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cctggcctgg ttgggccgaa ctcgaggaat ccgaccatgt c  41
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gtccagtcta ctgcagacct tcttttgcca cgtctttg  38
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tacgcatcgg gatccgtagg atggggcgac cagcat  36
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tcacaggtgc atgccggaca gggcacatca gaaact  36
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cagcaatgtt actgcagacc tttttctccc gttc  34
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gggagaaaaa ggtctgcagt aacattgctg tgcttgattc cc  42
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gcggcaaccc aggtgcgtgt cgatcgtggc acctgtgtga tcctgg  46
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ccaggatcac acaggtgcca cgatcgacac gcacctgggt tgccgc  46
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gggggattac gtcgctgctc tagagactca cagtggaaga aaa  43
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ttttcttcca ctgtgagtct ctagagcagc gacgtaatcc ccc  43
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<220>
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ttcaccccag aagcaaggat ccgcacattt ttaatagacg gac  43
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gtccgtctat taaaaatgtg cggatccttg cttctggggt gaa  43
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tggatagaga gctcaaggat ccagacttgg cagatagaga  40
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cccatatata tttttcccct ttacactctg tcatc  35
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ggatcaagaa caagacgcgt agtgctgatc ccatcccac  39
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gatgggatca gcactacgcg tcttgttctt gatccttctt g  41
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agagaccaga gcgatcgagg ctggggcaac gggtgtggat tttttggaaa a  51
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gccccagcct cgatcgctct ggtctctctt acacacttac gacgg  45
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gaccgacaag gacagttcca aatcgga  27
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie
<400> 45
cttgaactgt gaagcccaga aacagagtga ttcctccaac agctatgca  49
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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