(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物の製造の方法であって；
【化１】
0003671003.tif 000015
（Ｉ）
[式中、
Ｒ１−Ｒ９は、互いに独立的に水素または置換基を表す；
ｍは、０、１または２である；
ｎは、０、１、２または３である；そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦでマークを付した結合は、互いに独立的に、２つの隣接する炭素原子が二重結合、一重結合、一重結合および次式のエポキシド架橋
式
【化２】
0003671003.tif 000016
または一重結合および次式のメチレン架橋
式
【化３】
0003671003.tif 000017
によって接続されていることを示し、適用可能な場合、Ｅ／Ｚイソマー、Ｅ／Ｚイソマーの混合物、および／またはその互変体を含み、それぞれの場合に遊離形態または塩形態である]
下記工程を含む方法；
１）下記式の化合物を、
式
【化４】
0003671003.tif 000018
（ＩＩ）
[式中、
Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは前記の式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である]
４’’位のアルコールを特異的に酸化することのできる（ｉ）Streptomyces属の微生物であるか（ｉｉ）Streptomyces属の微生物に由来する生体触媒と接触させて下記式の化合物を形成させる工程；
式
【化５】
0003671003.tif 000019
（ＩＩＩ）
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である]；そして
２）式（ＩＩＩ）の化合物を、還元剤の存在下、式ＨＮ（Ｒ８）Ｒ９のアミンと反応させ、ここで、Ｒ８およびＲ９は、式（Ｉ）について与えたのと同じ意味であり、
そして、要すれば、それぞれの場合に遊離形態または塩形態である、当該方法に従ってまたはその他の方法によって得られうる、式（Ｉ）の化合物、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体であって、それぞれの場合に遊離形態または塩形態であるものを、式（Ｉ）の異なる化合物またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体であって、それぞれの場合に遊離形態または塩形態であるものに変換し、当該方法に従って得られうるＥ／Ｚイソマーの混合物を分離し、そして望まれるイソマーを単離し、そして／または当該方法に従ってまたはその他の方法によって得られうる、遊離の式（Ｉ）の化合物、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体を塩に変換し、または当該方法に従ってまたはその他の方法によって得られうる、式（Ｉ）の化合物の、またはそのＥ／Ｚイソマーのまたは互変体の塩を遊離の式（Ｉ）の化合物に、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体に、または異なる塩に変換する工程。
【請求項２】
下記式の化合物の製造方法であって；
【化６】
0003671003.tif 000020
（ＩＩＩ）
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは請求項１の式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である]
下記工程を含む方法；
１）下記式の化合物を、
【化７】
0003671003.tif 000021
（ＩＩ）
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは前記式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である]
４’’のアルコールを特異的に酸化することのできる（ｉ）Streptomyces属の微生物であるか（ｉｉ）Streptomyces属の微生物に由来する生体触媒と接触させ、当該接触を酸化反応が起こるのに十分である時間維持し、そして式（ＩＩＩ）の化合物を単離し、そして精製する工程。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物を製造する請求項１に記載の方法；
ここで、
ｎは、１である；
ｍは、１である；
Ａは、二重結合である；
Ｂは、一重結合または二重結合である、
Ｃは、二重結合である；
Ｄは、一重結合である；
Ｅは、二重結合である；
Ｆは、二重結合；または一重結合およびエポキシ架橋；または一重結合およびメチレン架橋である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨである；
Ｒ４はメチルである；
Ｒ５はＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキルまたはＣ２−Ｃ１０−アルケニルである；
Ｒ６はＨである；
Ｒ７はＯＨである；
Ｒ８およびＲ９は相互に独立的にＨ；Ｃ１−Ｃ１０−アルキルまたはＣ１−Ｃ１０−アシルであり；または一体となって−（ＣＨ２）ｑ−を形成する；そして
ｑは４、５または６である。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物を製造する請求項１に記載の方法；
ここで、
ｎは、１である；
ｍは、１である；
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、二重結合である；
Ｄは、一重結合である；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、Ｈである；
Ｒ４は、メチルである；
Ｒ５は、ｓ−ブチルまたはイソプロピルである；
Ｒ６は、Ｈである；
Ｒ７は、ＯＨである；
Ｒ８は、メチルである；
Ｒ９は、Ｈである。
【請求項５】
４’’−デオキシ−４’’−Ｎ−メチルアミノアバーメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂ安息香酸塩を製造する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体触媒が下記からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法；
ａ）栄養細胞、休眠細胞または凍結乾燥細胞の形態である生存している微生物、
b）当該微生物の胞子（spore）
c)好ましくは部分的に崩壊された（disintegarated）形態である、死んだ微生物であって、いわゆる機械的に、または化学的に、またはスプレードライによって透過可能にされた（permeabilized）細胞壁／細胞膜を有するもの、
d)当該微生物の細胞内容物の粗エキストラクト、および
e) 式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に変換する酵素。
【請求項７】
微生物が下記の群より選択されるStreptomyces菌株である、請求項３または請求項４に記載の方法；
Streptomyces  tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis、Streptomyces lydicus、Streptomyces saraceticusおよびStreptomyces kasugaensis。
【請求項８】
当該微生物がアクセッションナンバーＤＳＭ−１３１３６で寄託された菌株Streptomyces R-922である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
当該微生物がアクセッションナンバーＤＳＭ−１３１３５で寄託された菌株Streptomyces I-1529である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
以下のステップを含む式（ＩＩＩ）の化合物の生産方法；
（１）式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に変換することのできるStreptomyces属の微生物の前培養物で、細胞成長を促進する栄養培地に接種することによって細胞を生産するステップ；
（２）成長後に細胞を収集するステップ；
（３）式（ＩＩ）の化合物を適当な溶媒に溶解するステップ；
（４）ステップ（３）からの溶液を、細胞増殖を促進しない反応培地に添加するステップ；
（５）ステップ（２）からの細胞を、ステップ（４）からの反応培地に添加するステップ；
（６）空気の存在下でステップ（５）の反応混合物を振とうまたは撹拌するステップ；
（７）培地から細胞を分離するステップ；
（８）上清および細胞を適当な溶媒で抽出するステップ；
（９）ステップ（８）から有機溶媒相を濃縮するステップ；
（１０）クロマトグラフィーまたは結晶化によって、エキストラクト（９）に含まれる式（ＩＩＩ）の化合物を精製するステップ。
【請求項１１】
以下のステップを含む式（ＩＩＩ）の化合物の生産方法；
（１）式（ＩＩ）の化合物を適当な溶媒に溶解するステップ；
（２）ステップ（１）からの溶液を細胞成長を促進する栄養培地に添加するステップ；
（３）ステップ（２）の栄養培地に、式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に変換することのできるStreptomyces属の微生物の前培養物で接種するステップ；
（４）前記Streptomyces属の微生物を培養するステップ；
（５）培地から細胞を分離するステップ；
（６）上清および細胞を適当な溶媒で抽出するステップ；
（７）ステップ（６）からの有機溶媒相を減圧濃縮するステップ；
（８）エキストラクト（７）に含まれている式（ＩＩＩ）の化合物をクロマトグラフィーまたは結晶化によって精製するステップ。
【請求項１２】
式（ＩＩ）の化合物がアバーメクチンであり、そして式（ＩＩＩ）の化合物が４’’−オキソ−アバーメクチンであるものである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、大環状ラクトンの製造方法、当該方法に使用される中間体化合物の製造方法および中間体化合物に関する。特に、本発明は、下記式の化合物の製造の方法に関し、
【化８】
0003671003.tif 000002
0003671003.tif 000003
【０００２】
式中、
Ｒ１−Ｒ９は、互いに独立的に水素または置換基を表す；
ｍは、０、１または２である；
ｎは、０、１、２または３である；そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦでマークを付した結合は、互いに独立的に、２つの隣接する炭素原子が二重結合、一重結合、一重結合および式のエポキシド架橋
式
【化９】
0003671003.tif 000004
または一重結合および式のメチレン架橋
式
【化１０】
0003671003.tif 000005
によって接続されていることを示し、適用可能な場合、Ｅ／Ｚイソマー、Ｅ／Ｚイソマーの混合物、および／またはその互変体を含み、それぞれの場合に遊離形態または塩形態であり、
【０００３】
当該方法は下記工程を含む；
１）式の化合物を、
式
【化１１】
0003671003.tif 000006
0003671003.tif 000007
【０００４】
（式中、
Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは前記の式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である）
４’’位でアルコールを特異的に酸化することのできる生体触媒と接触させて下記式；
【化１２】
0003671003.tif 000008
0003671003.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である）の化合物を形成させる工程；および
【０００５】
２）式（ＩＩＩ）の化合物を、還元剤の存在下、既知である式ＨＮ（Ｒ８）Ｒ９のアミンと反応させ、ここで、Ｒ８およびＲ９は、式（Ｉ）について与えたのと同じ意味であり、
そしてそれぞれの場合に、要すれば、それぞれの場合に遊離形態または塩形態である、当該方法に従ってまたはさらなる方法によって得られ得る、式（Ｉ）の化合物、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体を、それぞれの場合に遊離形態または塩形態である、式（Ｉ）の異なる化合物またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体に変換し、当該方法に従って得られ得るＥ／Ｚイソマーの混合物を分離し、そして望まれるイソマーを単離し、
そして／または当該方法に従ってまたはさらなる方法によって得られ得る、遊離の式（Ｉ）の化合物、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体を、塩に変換し、または当該方法に従ってまたはさらなる方法によって得られ得る、式（Ｉ）の化合物の、またはそのＥ／Ｚイソマーのまたは互変体の塩を、遊離の式（Ｉ）の化合物に、またはそのＥ／Ｚイソマーまたは互変体に、または異なる塩に変換する工程。
【０００６】
式（Ｉ）の化合物の合成の方法は、文献に記載されている。しかし、文献中で知られている方法は、低収率、そして使用されければならない冗長な手法の点に基づく生産中の相当な問題を生じることが見出される。例えば、ＥＰ−Ａ０４６５１２１は、４’’−ケト−および４’’−アミノ−４’’−デオキシアバーメクチン化合物およびその置換アミノ誘導体を記載している。アバーメクチン化合物にある４’’ヒドロキシ基はケトン基に酸化され、または（置換）アミノ基で置換される。５および２３位のヒドロキシ基は、望ましくない酸化を避けるために保護する必要がある。４’’−ケト化合物をアミノ化し、前記式（Ｉ）のそれに対応する化合物をもたらす。したがって、既知の方法は、この点で満足されるものではなく、これらの化合物の改良された製造方法を利用可能にする必要が生じる。
【０００７】
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は互変体の形態であってよい。これにより、前記および後記で、適当な場合に化合物（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、それぞれの場合に後者が特別に言及されないとしても、対応する互変体を含むと理解されるべきである。
【０００８】
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、酸付加塩を形成することができる。例えば、これらの塩は、強無機酸、例えば、鉱酸、例えば、過塩素酸、硫酸、亜硝酸、リン酸またはハロゲン化水素酸によって、強有機カルボン酸、例えば、非置換または置換、例えば、ハロ置換、Ｃ１−Ｃ４アルカンカルボン酸、例えば、酢酸、置換または非置換ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸またはフタル酸、ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸、または安息香酸によって、または有機スルフォン酸、例えば、非置換または置換、例えば、ハロ置換、Ｃ１−Ｃ４アルカンまたはアリールスルフォン酸、例えば、メタンまたはｐ−トルエン−スルフォン酸によって形成される。
【０００９】
さらに、少なくとも１つの酸性基を有する式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物を塩基によって形成することができる。塩基との好適な塩は、例えば、金属塩、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム、カリウムまたはマグネシウム塩、またはアンモニアまたは有機アミンによる塩、例えば、モルフォリン、ピペリジンまたはピロリドン、モノ、ジまたはトリ低級アルキルアミン、例えば、エチル、ジエチル、トリエチルまたはジメチルプロピルアミン、またはモノ、ジまたはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノ、ジまたはトリエタノールアミンである。加えて、対応する内部塩を、また、形成し得る。
【００１０】
本発明の範囲では、農芸化学的に有利な塩が好ましい。遊離形態およびそれらの塩の形態の式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物の間の深い関連性の観点から、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の遊離化合物についての、またはそれらのそれぞれの塩についての前記または後記の任意の言及は、適当であり便宜である場合に、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の対応する塩または遊離化合物をまた、含むものとして理解されるべきである。式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物の互変体の場合も同様である。遊離形態がそれぞれの場合に一般に好ましい。
【００１１】
本発明の範囲で好ましいのは、下記式（Ｉ）の化合物の製造方法である。
式中、
ｎは、１である；
ｍは、１である；
Ａは、二重結合である；
Ｂは、一重結合または二重結合である、
Ｃは、二重結合である；
Ｄは、一重結合である；
Ｅは、二重結合である；
Ｆは、二重結合；または一重結合およびエポキシ(epoxiy)架橋；または一重結合およびメチレン架橋である；
【００１２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨである；
Ｒ４は、メチルである；
Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキルまたはＣ２−Ｃ１０−アルケニルである；
Ｒ６は、Ｈである；
Ｒ７は、ＯＨである；
Ｒ８およびＲ９は互いに独立的にＨ；Ｃ１−Ｃ１０−アルキルまたはＣ１−Ｃ１０−アシルであり；または一体となって−（ＣＨ２）ｑ−を形成する；そして
ｑは、４、５または６である。
【００１３】
下記式（Ｉ）の化合物の製造方法が、本発明の範囲内の特に好ましい形態である。
式中、
ｎは、１である；
ｍは、１である；
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、二重結合である；
Ｄは、一重結合である；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、Ｈである；
Ｒ４は、メチルである；
Ｒ５は、ｓ−ブチルまたはイソプロピルである；
Ｒ６は、Ｈである；
Ｒ７は、ＯＨである；
Ｒ８は、メチルである；
Ｒ９は、Ｈである。
【００１４】
エマメクチンの製造方法が特に好ましく、エマメクチンの安息香酸塩がより特に好ましい。エマメクチンは、４’’−デオキシ−４’’−Ｎ−メチルアミノアバーメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂの混合物であり、そしてUS-P-4、4874,749に、そしてMK-244としてJournal of Organic Chemistry, Vol. 59 (1994), 7704-7708に記載されている。農芸化学的に特に有益であるエマメクチンの塩がUS-P-5,288,710に記載されている。式(I)の化合物は、特に害虫を駆除するために有益な殺虫剤であり、Acarina目が代表的である。例えば、説明される害虫は、欧州特許出願EP-A 736,252の5頁、55ないし58行、6頁および7頁、1ないし21行に記載されている。そこに説明される害虫は、本発明の対象物に含まれる。
【００１５】
前記および後記で使用する全般的な用語は、以下の意味を有し、ただし、他の定義があるときはこの限りでない:
炭素含有基および化合物は、それぞれ、１ないし８、好ましくは１ないし６、特に１ないし４、およびより特に１または２の炭素原子を含む。
【００１６】
アルキルは、直鎖、すなわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシル、または分枝鎖、例えばイソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチルまたはイソヘキシルのいずれかである。
アルケニルは、基自体として、および他の基および化合物、例えば、ハロアルケニルおよびアリールアルケニルの構造要素として、直鎖、例えば、ビニル、１−メチルビニル、アリル、１−ブテニルまたは２−ヘキセニル、または分枝鎖、例えば、イソプロペニルのいずれかであり、ここでそれぞれの場合に所望の基または化合物に含まれる炭素原子の数を十分に考慮する。
【００１７】
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル、特にシクロヘキシルである。
本発明のさらなる側面は、
−先に定義した式（ＩＩＩ）の化合物；または
−前記ステップ１）に従って式（ＩＩ）の化合物から出発する、式（ＩＩＩ）の化合物の製造方法；または
−前記ステップ２）に従って式（ＩＩＩ）の化合物から出発する、式（Ｉ）の化合物の製造方法である。
【００１８】
本発明の範囲では、「生体触媒」は、以下の意味を含む：
ａ）生存している微生物であって、例えば、栄養細胞、休眠細胞または凍結乾燥細胞の形態であるもの、
ｂ）当該微生物の胞子（spore）
ｃ）好ましくは部分的に崩壊された（disintegrated）形態である、死んだ（dead）微生物であって、いわゆる機械的に、または化学的に、またはスプレードライによって透過化（permeabilized）された細胞壁／細胞膜を有するもの、
d)当該微生物の細胞内容物（content）の粗エキストラクト、および
e)式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に変換する酵素。
【００１９】
細菌および真菌は、本発明に従う方法に特に好適な微生物である。好適な細菌は特にActinomycetesを、特にStreptomyces属を表す。好ましいのは、Streptomyces  tubercidicus; Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus、 Streptomyces saraceticusおよびStreptomyces kasugaensisからなる群より選択される、Streptomyces属の菌株である。菌株StreptomycesＲ−９２２  (Streptomyces tubercidicus)、および特にStreptomyces Ｉ−１５２９(Streptomyces tubercidicus)は、式（ＩＩ）の化合物の４’’−位でのヒドロキシル基の位置特異的な（regiospecific）酸化に特に好適であるとわかった。
【００２０】
Streptomyces菌株Streptomyces  Ｉ−１５２９およびStreptomycesＲ−９２２を、ブダペスト条約の規定に従って、DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D - 38124 Braunschweig - Germanyに、それぞれアクセッションナンバーＤＳＭ−１３１３５およびＤＳＭ−１３１３６で、１９９９年１１月５日に寄託した。
【００２１】
本発明に従う位置特異的酸化を実行するために使用するのに好適であることのできるさらなる菌株を同定した。これらは、例えば、Streptomyces菌株MAAG-7027 (Streptomyces tubercidicus)、 Streptomyces菌株DSM-40241 (Streptomyces saraceticus、また、Streptomyces chattanoogensisとして同定した)、 Streptomyces菌株NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp. lydicus)およびStreptomyces菌株A/96-1208710 (Streptomyces kasugaensis)。前記菌株のすべては、それぞれStreptomyces菌株Streptomyces I-1529およびStreptomycesＲ−９２２に深く関連する。これらは１６ｓrＤＮＡ分析によって９９．４％ないし１００％の同一性を示すことが実証される。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物は植物害虫を制御するための高度に活性のある物質として知られている。式（Ｉ）の化合物の既知の製造方法で、例えば、ＥＰ３０１８０６に記載され、そしてまた本発明に従う微生物的方法で、式（ＩＩ）の化合物は出発材料として使用される。
【００２３】
既知の方法では、第１のステップで式（ＩＩ）の化合物を、５位の酸素を保護し、次いで４’’−ケトンに酸化し、次いでアミンに酸化し、そして５位のマスクしたヒドロキシル基を脱保護し、それによってGreene and Wuts, 1999(Protective Groups in Organic Synthesis)によって記載されるような通常の保護基技術を使用する。
【００２４】
本発明に従う方法は、既知の方法の４つのステップと比較すると、２つのステップのみを含む点が有利である。それはさらに、保護基の使用を回避し、そしてより少ない化学物質の使用ですむことから、生態学的により安全である。本発明に従う生体触媒的ステップから得られる式（ＩＩＩ）の化合物は、例えば、ＥＰ４０１０２９から既知である。
【００２５】
特定の実施態様において、本発明に従う方法を、詳細には以下の通り実施し得る。
【００２６】
第１のステップで、式（ＩＩＩ）の化合物を調製する。これは、式（ＩＩ）の化合物を、４’’位でアルコールを式（ＩＩＩ）のケトンに特異的に酸化することのできる生体触媒と直接的に接触させ、そして酸化反応が起こるのに十分である時間この接触を維持させることによって達成することができる。
【００２７】
最も好都合には、この方法を生体触媒（バイオ触媒）として微生物を使用することによって実施し、この微生物は、本発明に従う酸化反応を実施することができる。好ましくは当該微生物を、式（ＩＩ）の化合物の存在下で制御条件下で微生物増殖（proliferation）を促進する好適な培養培地で培養し、そして当該微生物およびその基質を酸化反応が起こるのに十分な時間、好ましくは２５％ないし９９．９％、より好ましくは５０％ないし９９．９％、そして最も好ましくは８０ないし９９,９％の添加した式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＩＩ）の化合物に変換されるまでジョイントインキュベーション（joint incubation）を維持する。
【００２８】
あるいはおよびより好ましくは、当該方法を最初に、本発明に従う酸化反応を実施することのできる微生物を、微生物増殖を促進する好適な培養培地で、そして制御条件下で培養し、それから好適な方法、例えば、濾過または遠心分離を適用することによって微生物のバイオマスを収集することによって実施する。微生物のバイオマスを、次いで、生体触媒として式（ＩＩ）の化合物の式（ＩＩＩ）の化合物への変換のためにすぐに使用し、または反応に使用する前に、そのまま低温で、または凍結乾燥またはスプレードライの後に貯蔵し得る。
【００２９】
当該微生物を新鮮に収集し、または記載のように貯蔵し、それから式（ＩＩ）の化合物を微生物増殖に適当ではない反応培地で、酸化反応が起こるのに十分な時間、好ましくは、２５％ないし９９．９％、より好ましくは５０％ないし９９．９％そして最も好ましくは８０ないし９９，９％の添加した式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＩＩ）の化合物に変換されるまで、ジョイントインキュベーションする。
【００３０】
この方法で得られる式（ＩＩＩ）の反応産物を、慣行の分離方法、例えば、分別結晶化またはクロマトグラフィーによって、大きな技術的不利益なく式（ＩＩ）の出発材料から分離し得る。クロマトグラフィーは、例えば、カラムクロマトグラフィー、厚層クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーであって鉱物担体材料、例えばシリカゲルまたは有機質イオン交換樹脂上のものを含む。
【００３１】
栄養細胞構造の代わりに、４’’位でアルコールを式（ＩＩＩ）のケトンに特異的に酸化することのできる微生物から収集される微生物胞子を使用し得、それから式（ＩＩ）の化合物と、対応する酸化反応が起こるのに十分である時間インキュベーションする。胞子および基質のインキュベーションは、胞子の発芽を防止するために、好ましくは培養培地の不存在下で実施する。
【００３２】
式（ＩＩ）の化合物を本発明に従う酸化反応のための基質として使用する。これらの化合物は既知であり（ＤＥ２７１７０４０参照）、または既知の方法と類似するように既知の化合物から製造することができる。それらは、動物および植物における害虫を制御するために好適であり、そしてさらに式（Ｉ）の化合物の製造での有益な出発材料または中間体である。式（ＩＩＩ）の化合物の製造は、また、式（ＩＩ）の化合物の酸化のために、微生物それ自体でなく、この微生物（前記の定義ｂ）ないしｅ）に従う）に起源する活性成分であって４’’位でアルコールを式（ＩＩＩ）のケトンに特異的に酸化することのできるものを使用することによって実施することができる。
【００３３】
従って、本発明のさらなる側面は、栄養微生物細胞、細胞フリーエキストラクト、胞子、酵素および４’’位でアルコールを式（ＩＩＩ）のケトンに特異的に酸化することのできる当該微生物の酵素の混合物の固定化形態における使用である。
【００３４】
当該生体触媒の固定化を、それ自体既知の方法と類似のように実施することができる。本発明の範囲内で、固体、概して非水溶性担体材料への当該生体触媒の吸着結合またはイオンまたは共有結合に、二官能性または多官能性試薬によって生体触媒を架橋させることに、マトリックスカプセル化（matrix encapsulation）に、膜分離に、または２または３以上の前記方法の組み合わせに基づく方法を特別に説明し得る。
【００３５】
非水溶性担体（吸着剤）への吸着結合を、特にファンデルワールス力によって実施し得る。多くの無機および有機化合物およびまた合成ポリマーが吸着剤として好適である。
【００３６】
微生物の固定化のための方法は、Bickerstaff (Ed.), 1997 (酵素および細胞の固定化), van Haecht et al., 1985 (酵母細胞/ガラス), Black et al., 1984 (酵母細胞/精錬鋼,ポリエステル), Wiegel and Dykstra, 1984 (clostridia/セルロース, ヘミセルロース), Foerberg and Haeggstroem, 1984 (clostridia/経木)によって、およびまたEhrhardt and Rehm, 1985 (Pseudomonads/活性炭)によって記載されている。
【００３７】
吸着性結合によって固定化された酵素の使用のための対応する詳細は、Krakowiak et al., 1984 (グルコアミラーゼ/酸化アルミニウム), Cabral et al.,1984 (グルコアミラーゼ/チタニウム-活性化ガラス（activated glass）), Miyawaki andWingard 1984 (グルコースオキシダーゼ/活性炭), Kato and Horikoshi,1984 (グルコーストランスフェラーゼ/合成樹脂)にとりわけ見出され得る。イオン結合は、担体材料（例えば、商業的に入手可能なイオン交換体、例えば、多糖類または合成樹脂に基づくもの）の、および結合されるべき生体触媒の反対に荷電した基の間の電気的引力に基づく。
【００３８】
イオン結合に基づく微生物を固定化する方法は、DiLuccioおよびKirwan, 1984 (Azotobacter spec./Cellex E (セルロース))によっておよびGiard et al., 1977 (動物細胞/DEAE-Sephadex)によって記載されている。酵素の対応する固定化を、Angelino et al., 1985 (アルデヒドオキシダーゼ/オクチルアミノ-Sepharose 4B), Hofstee, 1973 (ラクトースデヒドロゲナーゼ/オクチルアミノ-Sephadex), Kuehn et al., 1980 (グルコースオキシダーゼ/DEAE-Sephadex, DEAE-セルラーゼ)およびその他によって与えられる詳細に従って実施することができる。
【００３９】
固定化のさらなる方法は共有結合力の使用に基づく。それは相互の、または生体触媒および担体材料の間の生体触媒の固定化連結を一般に生じる。好適な担体材料は、多孔性材料、例えば、ガラス、シリカまたは他の不溶性無機材料である。
【００４０】
本発明に従う方法の範囲内では、例えば、Messing and Oppermann, 1979 (Enterobacteria/ボロシリケートガラス;酵母細胞/酸化ジルコン), Romanovskaya et al., 1981 (メタン細菌/Silochrome), Navarro and Durand, 1977 (酵母細胞/多孔性シリカ)と同様に微生物を固定化し得る。
【００４１】
酵素の固定化を、Weetall and Mason, 1973 (パパイン/多孔性ガラス) and Monsan et al., 1984 (インベルターゼ/多孔性シリカ)によって記載される方法に従って実施することができる。
【００４２】
固定化のために好適であるとすでに述べた担体材料だけでなく、一連の天然または合成ポリマー、例えば、セルロース、デキストラン、デンプン、アガロース等またはポリマー、例えば、アクリルまたはメタクリル酸誘導体であって、反応性コポリマーの製造に通常使用されるものもまた、本発明の範囲内である。生体触媒に結合する方法によって適当な反応性基は、ジニトロフルオロフェニルまたはイソチオシアネート基、または特にオキシランおよび酸無水物基である。カルボキシル基を有する樹脂の塩化物活性化におけるさらなる可能性のある残基は、例えば、商品名Amberlite（登録商標）XE-64およびAmberlite（登録商標）IRC-50で商業的に入手可能である。
【００４３】
天然または合成担体材料の助けによる微生物の固定化を、Chipley, 1974 (Bacillus subtilis/アガロース), Gainer et al., 1980 (Azotobacter species/セルロース), Jack and Zajic, 1977 (Micrococcus/-カルボキシメチル−セルロース), Jirku et al., 1980 (酵母細胞/ヒドロキシアルキル-メタクリレート)およびまたShimizu et al., 1975 (細菌細胞/エチレン-マレイン酸無水物コポリマー)によって記載されるように実施することができる。酵素の固定化をCannon et al., 1984 (ラクトースオキシダーゼ/セルロース), Dennis et al., 1984 (キモトリプシン/Sepharose), Ibrahim et al., 1985 (エポキシヒドロラーゼ/デキストラン); Beddows et al., 1981 (α-ガラクトシダーゼ/ナイロン-アクリレートコポリマー), Raghunath et al., 1984 (ウレアーゼ/メタクリレート−アクリレート)によってとりわけ記載されるのと類似のように実施することができる。
【００４４】
架橋プロセスでは、生体触媒を相互にビ−またはポリ−官能性試薬、例えば、グルタルジアルデヒド、ジイソシアネートによってとりわけ結合し、そして特徴的に不溶性の、通常は、高分子量のゼラチン状集合体を形成する。
【００４５】
微生物のそのような固定化を、De Rosa et al., 1981 (細菌細胞/グルタルジアルデヒドによる卵アルブミンとの共-架橋)と類似するように実施することができる。本発明の範囲ないで使用することのできる酵素の固定化のための方法は、Barbaric et al.,1984 (インベルターゼ/アジピン酸ジヒドラジドとの架橋), Talsky and Gianitsopoulos, 1984 (キモトリプシン/架橋剤を欠く酵素間のペプチド結合), Workman and Day, 1984 (イヌリナーゼ／グルタルジアルデヒドによる酵素含有細胞の−架橋), Khan and Siddiqi, 1985 (ペプシン／グルタルジアルデヒドによる架橋), Bachmann et al., 1981 (グルコースイソメラーゼ/グルタルジアルデヒドによるゼラチンとの共架橋), Kaul et -al.,1984 (α-ガラクトシダーゼ/グルタルジアルデヒドによる卵アルブミンとの共架橋)によって記載されている。
【００４６】
マトリックスカプセル化は、天然または合成ポリマーにおける生体触媒の封入を含み、それは通常ゼラチン状構造のものである。細胞、生物および胞子（spore）の封入に特に好適であるマトリックス材料は、天然ポリマー、例えば、アルギネート、カラギーナン、ペクチン、アガー、アガロースまたはゼラチンであり、なぜなら、これらの化合物は非毒性で、そして取り扱い中に細胞を保護するからである。また、合成ポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、光架橋樹脂がとりわけ好適である。マトリックスカプセル化の形態は広い範囲で変化可能で、そして例えば、球状、円筒状、繊維状およびシート状形態を含み得る。
【００４７】
天然または合成マトリックス材料の助けによる微生物の固定化は、Mazumder et al., 1985 (細菌細胞/光-架橋樹脂), Bettmann and Rehm, 1984 (細菌細胞/ポリアクリルアミドヒドラジド), Umemura et al., 1984 (細菌細胞/カラギーナン), Karube et al.,1985 (細菌プロトプラスト/アガー-アセチルセルロース), Cantarella et al.,1984 (酵母細胞/ヒドロキシエチルメタクリレート), Qureshi and Tamhane, 1985 (酵母細胞/アルギネート), Deo and Gaucher, 1984 (Hyphomycetes／カラギーナン), Eikmeier and Rehm, 1984 (Hyphomycetes/-アルギネート), Bihari et al., 1984 (Hyphomycetes conidial/ポリアクリルアミド),Vogel and Brodelius, 1984 (植物細胞/アルギネート,アガロース), Nakajima et al., 1985 (植物細胞/アガー, アルギネート, カラギーナン)によって記載されたように実施することができる。
【００４８】
酵素の固定化を、Mori et al., 1972(aminoacylase/polyacrylamide)と類似するように実施することができる。
膜分離は、反応の進行において特異的に定義される領域の創出に関係する。膜分離の基本的な変形は、以下のように区別することができる：
a)マイクロカプセル化
b)リポソーム技術
c)膜リアクターでの生体触媒の使用。
【００４９】
前記の固定化方法を、相互に組み合せることができ、例えば吸着および架橋である。実際、その場合に、酵素は、なかでも最初に担体上に吸着され、それから相互に双官能性試薬によって架橋させる。
【００５０】
４’’位でアルコールを式（ＩＩＩ）のケトンに特異的に酸化するための式（ＩＩ）の化合物による、本発明の範囲内で使用される生体触媒のインキュベーションを、応用微生物学の慣行法のような方法の助けによって実施することができる。振とう培養の使用に加えて、微生物学的調査および産業上の生産でながく確立された、特に種々のファーメンターシステムを述べ得る。
【００５１】
生体触媒の主な課題は、みかけのミカエリス定数を減少させ、そして反応速度を増加させるための最適な流体力学的条件の創出である。
【００５２】
これを、生体触媒および周辺の培地の間の十分な相対的な移動（これはその障害となるものが実際上もはや適用しない程度まで、外部へのマス（mass）の移動を増加させる）を維持することによって本質的に達成する。
【００５３】
関係する方法に好適であるリアクターの型は、例えば、撹拌式容器リアクター、環状型リアクター、流動式ベッドリアクター、膜型リアクター、およびまた多数の特別な形態のリアクター、たとえば篩撹拌式リアクター、ひし形リアクター、管形リアクターをとりわけ含む（W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger and A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Praeve et al., Handbuch der Biotechnologie, 1984）。撹拌式容器リアクターの使用は、本発明の範囲内で好ましい。
【００５４】
撹拌式容器リアクターは、発酵の生物工学において最も使用されるリアクターの方の中のものである。リアクターのこの型は、高い撹拌能力および高い酸素送達能力の結果として、基質および生体触媒の急速および徹底的な混合を確保する。
【００５５】
撹拌式リアクターの有利な点は、単純でそのため経済的な構成およびよく調査された特性にある。
本質的に、撹拌式容器リアクターを使用するとき、２種類の操作が可能である：
まず第１に「バッチ式」操作工程、いわゆる「バッチ」工程、および、第２に連続式工程である。
【００５６】
「バッチ」工程では、ひとたび工程が完了すると生体触媒を分離または濾過によって除去し、そして廃棄（栄養細胞）するか、または再び第２のバッチで使用する（固定化生体触媒）。
【００５７】
連続式工程を使用するとき、反応の最終産物のための新しい基質の永続的、連続的な交換がある。生体触媒が、好適な方法（篩、フィルター、返送装置）の手段によってリアクターから離れることをさまたげなければならない。
【００５８】
本発明の範囲内の栄養微生物細胞の培養を、知られた一般的な慣行方法に従って実施し、液体栄養培地が好ましくは実際上の理由により使用される。
【００５９】
栄養培地の組成は、使用される微生物に依存して変化する。一般に、あまり定義されていない複合培地（complex media）であって、例えば、また、抗生物質の生産のために慣行的に使用されるように、容易に同化できる炭素（Ｃ）および窒素（Ｎ）源が好ましい。
【００６０】
加えて、しかし、使用される複合栄養培地の成分または不純物として、概して十分な濃度で含まれているビタミンおよび必須金属イオンが必要である。要すれば、当該成分、例えば、必須ビタミンおよびＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２+、Ｍｇ２＋、ＮＨ４＋、（ＳＯ４）２−、Ｃｌ−、（ＣＯ３）２−イオンおよび微量要素コバルトおよびマンガンおよび亜鉛を、とりわけこれらの塩類の形態に添加し得る。酵母エキス、酵母加水分解物、酵母自己消化物および酵母細胞を除く他、特に好適な窒素源は、特にダイズミール、トウモロコシミール、オートミール、エダミン（edamine）（酵素的に消化したラクトアルブミン）、ペプトン、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー（corn steep liquors）および肉エキスである。
【００６１】
当該窒素源の好ましい濃度は、０．１ないし６ｇ／ｌである。好適な炭素源は、特に、グルコース、ラクトース、スクロース、デキストロース、マルトース、スターチ、セレロース、セルロース、マンニトール、モルトエキス、および糖蜜である。当該炭素源の好ましい濃度範囲は、１．０ないし２５ｇ／ｌである。特に使用される微生物がStreptomyces属に属するものであるならば、Ｄ−グルコース、可溶性スターチまたはモルトエキスおよびまたセルロースの炭素源としての使用が、以下に記載する酸化工程のために有利である。こうして、例えば、以下の培養培地が、Streptomyces属に属するものに極めて好適である。
【００６２】
培地１
１．０  ｇの可溶性スターチ
０．２  ｇのペプトン
０．２  ｇの酵母エキス
蒸留水で１リットルに調節し、ＮａＯＨでｐＨ７に調節し、オートクレーブする。
培地２
４．０  ｇのＤ−グルコース
１０．０  ｇのモルトエキス
４．０  ｇの酵母エキス
蒸留水で１リットルに調節し、ＮａＯＨでｐＨ７に調節し、オートクレーブする。
【００６３】
培地３
１０．０  ｇのグリセロール
２０．０  ｇのデキストリン
１０．０  ｇのソイトン(soytone)(Difco Manual, 9th ed., Detroit, Difco Laboratories, 1969)
２．０  ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４
２．０  ｇのＣａＣＯ３
蒸留水で１リットルに調節し、ＮａＯＨでｐＨ７に調節し、オートクレーブする。
培地４
１０．０  ｇのＤ−グルコース
１０．０  ｇのモルトエキス
３．０  ｇの酵母エキス
１０．０  ｇのPharmamedia(Traders Protein, Southern Cotton Oil Co., Memphis TN, USA)
１．０  ｇの肉エキス
蒸留水で１リットルに調節し、ＮａＯＨでｐＨ７に調節し、オートクレーブする。
【００６４】
培地５    （ＩＳＰ−２アガー）
酵母エキス  ４ｇ（Oxoid Ltd, Basingstoke, Hampshire, England)
D(+)-グルコース  4g
バクト（bacto）モルトエキス  １０ｇ(Difco No. 0186-17-7)
アガー  ２０ｇ(Difco No. 0140-01)
を1lの脱塩水に溶解し、そしてｐＨを７．０に調節する。溶液を１２１℃で２０分間滅菌し、冷却しそしてアガープレートを直ちに調製するために必要な短い時間、５５℃を保つ。
【００６５】
培地６（ＰＨＧ培地）
ペプトン  １０ｇ（Ｓｉｇｍａ  ０５２１）
酵母エキス  １０ｇ（Ｄｉｆｃｏ）
Ｄ−（＋）−グルコース  １０ｇ
ＮａＣｌ  ２ｇ
ＭｇＳＯ４ｘ  ７Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４  ｘ  Ｈ２Ｏ  １．３ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４  ４．４ｇ
を１ｌの脱塩水に溶解し、そしてｐＨを７．０に調節する。
【００６６】
前記の培地は、また、Streptmyces属に属するものを培養するために、および酸化反応を実施するために非常に好適である。培地の組成についての前記の一般的データ、およびまた、ここに詳細に列挙した培地は、本発明を例示するだけで、そして限定的な性質のものではない。
【００６７】
培地の組成を除く他、培地を作成するために使用する手法、例えば、溶解または懸濁順序、全体としてまたは個々の成分の栄養溶液の滅菌、とりわけ汚染の防止が、また、重要な役割を演じ、そして関係する製造工程のために従って最適化すべきである。
【００６８】
滅菌は栄養培地のｐＨ値の変化およびまた沈殿を生じ得ることが、また注目されるべきである。
残りの培養方法は、また、微生物を培養するために慣行的に使用される方法に対応する。
【００６９】
小規模において、任意の前培養を含む、本発明の範囲内で実施する発酵は、通常は振とう培養の形態であり、この場合、０．１ないし５リットル、好ましくは０．５ないし５リットルの容量のガラスフラスコを使用するのが有利であり、それは０．０５ないし２リットル、好ましくは０．１ないし２リットルの栄養培地を含む。フラスコは、好ましくはバッフルを備えている。オートクレーブおよびｐＨ４ないしｐＨ８の値へのｐＨの調節、特にｐＨ７．０ないしｐＨ７．５（細菌）またはｐＨ６ないしｐＨ７．５（真菌）の値への調節後、フラスコを対応する微生物培養物を滅菌条件下で接種する。使用する接種材料は、一般に以下に与えるデータに従って保存した接種材料から生産した前培養物である。
【００７０】
任意の前培養物を含む培養物を、約２５℃ないし約３７℃、好ましくは約２６℃ないし約３０℃、しかし特に約２８℃の温度で、約８０ｒｐｍないし約３００ｒｐｍ、好ましくは約１００ｒｐｍないし約２５０ｒｐｍ、しかし特に約１２０ｒｐｍ（回転／分）でロータリー式振とう機で好気的条件下で有利に成長させる（または増殖させる、grow）。前記条件下で、Streptomyces最適酸化活性に、一般に約１．５ないし７日の培養後に到達する。
【００７１】
細胞の触媒の能力が望まれる酸化反応を実施するために十分高くなれば、好ましくは40時間後に、基質（式（ＩＩ）の化合物）を添加し、これによって微生物および酸化されるべき基質を任意の態様で相互に接触させることができる。実際上の理由のために、基質、すなわち式（ＩＩ）の化合物を、栄養溶液中の微生物に添加するのが有利であるとわかった。
【００７２】
酸化すべき基質を、例えば、粉末形態または溶液形態で、好適な溶媒、例えば、ジメチルフォルムアミド、アセトン、ジメチルスルフォキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンまたはアルコール性溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール、またはエーテル溶媒、例えば、テトラヒドロフランま他は１，４−ジオキサン（０．５ないし１５容量％、好ましくは２容量％）またはエステル溶媒、例えば、酢酸エチルまたは炭化水素溶媒、例えば、オクタンまたはシクロヘキサンまたはトルエンまたはキシレン、または好適な溶媒および好適な界面活性剤の混合物中で使用することができる。用語「界面活性剤」は、イオン性、非イオン性および両性イオン性界面活性剤を含み、およびまた、界面活性剤の混合物を含むと理解されるべきである。
【００７３】
水溶性石鹸および水溶性合成表面活性化合物の両方が、好適なアニオン性界面活性剤である。好適な石鹸は、高級脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ２２）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸の、または例えば、ココナツオイルまたは牛脂油から得られ得る天然脂肪酸混合物の例えばナトリウムまたはカリウム塩である。さらに好適な界面活性剤はまた脂肪酸メチルタウリン塩である。しかし、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪族スルフォネート、脂肪族スルフェート、スルフォン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルアリールスルフォネートを使用する。脂肪族スルフォネートまたはスルフェートは、通常アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換アンモニウム塩であり、そしてアシル基のアルキル部分をまた含むＣ１０−Ｃ２２アルキル基を含み、例えば、リグノスルフォン酸の、ドデシルスルフェートの、または天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールスルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。
【００７４】
これらの化合物は、また硫酸化およびスルフォン化脂肪族アルコール／エチレンオキシド添加物を含む。スルフォン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは、２つのスルフォン酸基および８ないし２２炭素原子を含む１つの脂肪酸基を含む。アルキルアリールスルフォネートの例は、ドデシルベンゼンスルフォン酸、ジブチルナフタレンスルフォン酸の、またはナフタレンスルフォン酸およびホルム−アルデヒドの縮合物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。また、好適なアニオン性界面活性剤は、胆汁酸塩、例えば、コール酸またはデオキシコール酸のナトリウム塩である。また、対応するフォスフェート、例えば、４ないし１４モルのエチレンオキシドの付加しているｐ−ノニルフェノールのリン酸エステルの塩；またはリン脂質が好適である。
【００７５】
好適なカチオン性界面活性剤は、テトラアルキルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドである。
【００７６】
好適な中性界面活性剤は、アルキルグリコシド、例えば、アルキル−β−グルコピラノシド、アルキル−β−Ｄチオグルコピラノシド、アルキル−β−ＤマルトシドであってＣ６−Ｃ１２−アルキル基を含むものである。さらなる好適な中性界面活性剤は、グルカミド、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−コールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミド、脂肪酸Ｎ−メチルグルカミドであってＣ７−Ｃ１２−アシル基を含むものである。さらなる好適な中性界面活性剤はモノ−およびポリ分散ポリオキシエチレン、例えばＢＲＩＪ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）、ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）である。
【００７７】
好適な両性イオン性界面活性剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルグリシン、例えば、Ｎ−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ，−ジメチルグリシンである。さらなる好適な両性イオン性界面活性剤は、ω−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアンモニウムアルキルスルフォネート、例えば、３−（Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ，−ジメチル）−１−プロパン−スルフォネートであってＣ８−Ｃ１６−アルキル基を含むものである。さらなる好適な両性イオン性界面活性剤は、３−[（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−１−プロパン−スルフォネートおよび３−[（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルフォネートである。
【００７８】
可溶化および製剤の技術で慣行的に使用される界面活性剤は、とりわけ、以下の刊行物に記載されている："A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego CA; "1999 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, U.S.A.。
反応の過程を、微生物学的調査に一般に使用されるクロマトグラフィー的方法によって連続的に監視する。
【００７９】
本発明は、また、アルコールを４’’位で特異的に式（ＩＩＩ）のケトンに酸化することのできる微生物の培養、およびバイオリアクター中、特に撹拌式容器リアクター型のバイオリアクターにおける当該化合物とのそのインキュベーションに関する。実際の生産ファーメンターでの産物形成の最適速度を確保するために、微生物を先ず第１に前培養において増殖（multiply）することを推奨する。ファーメンター前培養の数は、各特定の場合に最適である接種材料濃度に依存する。使用する微生物に依存して、接種材料の以下の濃度をファーメンターステージについて生産するのが有利である：細菌０．１−３％、真菌５−１０％、Actinomycetales５−１０％。
【００８０】
小さいファーメンター（２０Ｌまで）の接種を通常は振とうフラスコ前培養を使用して実施する。この場合に、全フラスコ内容物（content）をファーメンターに接種するために使用する。前培養物の生産のために使用する出発材料は、通常は例えば、liophilisatesの、または冷凍または低温保存材料の形態であってよい保存接種材料である。本発明の範囲内で使用される保存した接種材料を、好ましくは−８０℃で貯蔵する。
【００８１】
接種材料の増殖（multiplying）は、ロータリー振とう器のガラスフラスコの液体培地中で好ましくは実施しまたは、胞子（spore）を使用するとき、固体栄養基質上で実施する。栄養基質および培養パラメーター、例えば温度、ｐH、酸素の導入にとりわけ関連する条件は、使用する微生物または方法に従って最適化しなければならない。保存した接種材料のための成長時間は、使用する出発材料に依存して数時間から数日に変化する。
【００８２】
lysophilisates  ３−１０日
冷凍保存
細菌  ４−１８時間
Actinomycetales  １−５日
真菌  １−７日
低温保存培養
細菌  ４−２４時間
Actinomycetales  １−３日
真菌  １５日
【００８３】
胞子を接種材料として使用するならば、胞子を先ず第１に、標準化した条件下（滅菌好気的、気候室）で、固体栄養基質上で保存した接種材料から増殖させる。ピート、ブラン、ライスまたはオオムギに基づく多孔性栄養基質を使用するならば、培養物を徹底的に毎日振とうし、高い胞子密度を達成する。さらなる可能性がアガーまたは他の慣行ゲル化剤によって固めた栄養培地上の保存した接種材料を培養することにあり、胞子形成の誘導をトリガーする栄養培地の使用が好ましい。
胞子形成時間は、使用する微生物および使用する栄養培地に依存して７ないし３０日である。
【００８４】
前培養または生産ファーメンターに接種するために、胞子を表面活性物質、例えばＴｗｅｅｎ８０（界面活性剤、Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA）溶液で懸濁し、そしてその栄養培地とともにファーメンターに移しまたは、固体栄養培地を使用するならば、固体栄養基質を、当該表面活性剤を使用して洗浄する。この態様で取得した胞子含有溶液を、次いで使用し、ファーメンターを接種する。好ましくは、胞子の回復およびファーメンターの接種の両方を滅菌条件下で実施する。
【００８５】
本発明の範囲内で式（ＩＩＩ）の化合物を生産するために、要する産物の量に依存して、０．００１ｍ３ないし４５０ｍ３のオーダーの容量を含む、種々の次元のバイオリアクターを使用し得る。
撹拌式容器バイオリアクターを使用するならば、そのときは、以下の発酵パラメーターが最適であるべき反応の過程のために重要であるとして考えることができる：
【００８６】
１．温度：本発明に従う方法の範囲内の生体触媒酸化反応を好ましくは中温性温度範囲（２０ないし４５℃の温度範囲）で実施する。成長および産物形成のための最適温度範囲は、２０℃ないし３２℃、特に２４℃ないし３０℃である。
２．通気：通気速度は、０．１ないし２．５ｖｖｍ（空気の体積／液体の体積／分）、好ましくは０．３ないし１．７５ｖｖｍである。要すれば通気速度は、発酵の過程の要求される酸素要求に適合させるべきである。
【００８７】
３．圧力：撹拌式容器リアクターは、汚染のリスクを減少させるために、０．２ないし１．０バール、好ましくは０．５ないし０．７バールのわずかに過剰の圧力下で一般に操作する。
４．ｐＨ値：ｐＨ値は、使用する微生物に依存するある種の限度内で変化し得る。Actinomycetesの群からの微生物を使用するならば、当初のｐＨ値は、ｐＨ６ないしｐＨ８、好ましくはｐＨ６．５ないしｐＨ７．５である。
真菌を使用するならば、培養溶液の当初ｐＨは好ましくはｐＨ４ないしｐＨ８、好ましくはｐＨ６ないしｐＨ７．５である。
【００８８】
５．撹拌：撹拌速度は、使用する撹拌器の型およびファーメンターのサイズに依存する。本発明の範囲内で、ディスク型の回転翼を有する撹拌器が好ましく、これは０．００２ｍ３の撹拌式容器リアクターサイズを有し、１５０ｒｐｍないし５５０ｒｐｍ、特に２００ｒｐｍないし５００ｒｐｍのスピードで作動する。
【００８９】
本発明の範囲内で、発酵の期間は、使用する微生物に依存して２０時間ないし１０日で変化する。生体触媒反応は、約２５％ないし約９９．９％、より好ましくは約５０％ないし９９．９％、そして最も好ましくは約８０％ないし約９９．９％の、最初に添加した基質（式（ＩＩ）の化合物）が、式（ＩＩＩ）の化合物に変換されたときに、停止させる。
【００９０】
酸化反応の終結のための最適時間を保証するために、反応の過程を慣行の分析方法、特にクロマトグラフィー的な方法、例えば、ＨＰＬＣまたは薄層クロマトグラフィーの方法によって発酵の全体を監視する。
【００９１】
前に概説した方法の修飾において、バイオリアクターをバイオマスを生成するためのみに使用し得、次いでこれを濾過または遠心分離によって収集する。次いで微生物のバイオマスを直ちに式（ＩＩ）の化合物の式（ＩＩＩ）の化合物への変換のための生態触媒として使用し、またはそのまま、または凍結乾燥またはスプレードライ後に低温で貯蔵する。新鮮に収集し、または記載のように貯蔵した当該微生物を、次いでさらに他の容器、例えば、好ましくはバッフルを備えたフラスコに、または撹拌式容器バイオリアクターに分配し、ここで、生物変換（bioconvertion）工程を実施する。
【００９２】
基質（式（II）の化合物）を添加し、これによって微生物および酸化されるべき基質を任意の態様で相互に接触させることができる。実際上の理由のために、基質、すなわち式（ＩＩ）の化合物を、増殖には好適ではないバッファー溶液中の微生物に加えることが有利であるとわかった。酸化されるべき基質（式（ＩＩ）の化合物）を、粉末形態または好適な溶媒、例えば、ここに以前記載したもののいずれか中の溶液の形態で使用することができる。
【００９３】
本発明の好ましい実施態様では、基質（式（ＩＩ）の化合物）を好適な溶媒、例えば、ジメチルスルフォキシドまたはＴｗｅｅｎ４０（界面活性剤、Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USAから入手可能）または両方の組み合わせ中に最初に溶解し、そしてバファー溶液、好ましくは燐酸バッファー、より好ましくは０．０７Ｍ  ｐＨ７．０のリン酸バッファーを含むバッフルのあるフラスコ（baffled flask）に添加する。得られる溶液を次いで、生体触媒（微生物のバイオマス）を添加する前に滅菌する。この反応混合物を、次いで室温でインキュベーションし、１００ｒｐｍと１５０ｒｐｍの間、好ましくは約１２０ｒｐｍで２−７日間、微生物菌株に依存して振とうする。
【００９４】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、基質（式（ＩＩ）の化合物）を、好適な溶媒、例えば、ジメチルスルフォキシドまたはＴｗｅｅｎ４０（界面活性剤、Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USAから入手可能）または両方の組み合わせ中に最初に溶解し、そして望まれる酸化反応を実施するために使用されるべき微生物の成長を促進する培養培地を含むバッフルのあるフラスコに添加する。得られる溶液を次いで、生体触媒（微生物のバイオマス）を添加する前に滅菌する。この反応混合物を次いで、室温でインキュベーションし、そして１００ｒｐｍと１５０ｒｐｍの間、好ましくは約１２０ｒｐｍで約２−９日、微生物株に依存して振とうする。
【００９５】
本発明のさらなる特定の実施態様では、細胞フリーエキストラクトを湿った細胞を使用して調製し、これを好適なバッファー溶液中で洗浄し、破壊バッファー中に再懸濁し、そして例えば、２℃と１５℃の間の温度、好ましくは３℃と６℃の間の温度、そして最も好ましくは４℃で機械的手段によって、破壊する（disrupt）。得られる懸濁液を遠心分離し、そして上清細胞をフリーエキストラクトを収集する。
【００９６】
このように取得した細胞フリーエキストラクト溶液に、好適な等量の外来性電子供給系、例えば、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼおよび基質を含むものを添加する。基質の添加後、混合物を好ましくは直ちに、そして徹底的に混合し、そして通気する。次いで等量のＮＡＤＨを添加し、混合物を１５℃と４０℃の間の温度、好ましくは２０℃と３５℃の間の温度、そして最も好ましくは３０℃でインキュベーションする。
【００９７】
酸化産物（式（ＩＩＩ）の化合物）を回収するために発酵ブロス（fermentation broth）の加工を、発酵の当業界で慣行的に使用される方法によって実施することができる（W. Crueger and A. Crueger, 1984; P/ Praeve, 1984）。
先ず第１に、微粒子成分を反応ブロスからフィルター、遠心機または分離機を使用して除去し、濾液から分離的に抽出する。
【００９８】
栄養細胞または死んだ細胞を生体触媒として使用するならば、そして反応産物の一部（式（ＩＩＩ）の化合物）が細胞内に存在するならば、細胞を抽出前に崩壊させ（disintegrate）なければならない。この目的のために、種々の細胞崩壊方法が機械的、温度的、化学的または酵素的工程に基づいて利用可能である。
【００９９】
本発明に従う方法での使用に好適である機械的方法は、例えば撹拌式ボールミルまたはコロイドミルでの粉砕、ホモジナイザーでの圧力および緩和の使用および超音波の作用による細胞崩壊である。非機械的方法は、乾燥、浸透圧ショックによる溶解、化学的自己分解および細胞の酵素的分解を含む。
【０１００】
微粒子成分を除去したら、反応産物を培養溶液を抽出することによって濃縮し、そして細胞性成分を好適な溶媒によって分離する。抽出のために、発酵の当業界で慣行的に使用される種々の助けであって利用可能なもの、例えば、ミキサーセトラー、カウンターカレントコラム、抽出遠心機がまたとりわけある。
【０１０１】
また、反応産物を、例えば、とりわけ膜濾過、限外濾過、凍結濃縮、イオン交換方法によって濃縮することができる。
抽出後に得られる粗産物のさらなる加工を、微生物学的および化学的調査および産業上の使用でよく確立されている方法によって実施することができる。
【０１０２】
これらの方法は、例えば、クロマトグラフィー的方法、例えば、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、コバレントクロマトグラフィーおよびその他、しかしこれらに加えてまた、種々の結晶化方法を含む。
【０１０３】
抽出のために好適な溶媒は、例えば：芳香族炭化水素、例えば、トルエン、キシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えば、ジブチルフタレートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはパラフィンまたはシクロヘキサンのイソマー、アルコールおよびグリコールおよびそれらのエーテルおよびエステル、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔブタノール、エチレングリコール、メチルｔｅｒｔブチルエーテル、酢酸エチル、エチレングリコールモノメチルまたはモノエチルエーテル、ケトン、例えば、アセトンまたは２−ブタノンまたはシクロヘキサノン、塩素化炭化水素、例えば、ジクロロメタンまたはクロロホルムまたは四塩化炭素のそれ自体または混合物のいずれかである。
【０１０４】
用語「界面活性剤」は、また、界面活性剤の混合物を含むと理解される。水溶性性石鹸および水溶性合成表面活性化合物は、好適なアニオン性界面活性剤である。好適な石鹸は、高級脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ２２）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸の、またはココナツオイルまたは牛脂油から得られる天然脂肪酸混合物のナトリウムまたはカリウム塩である。さらなる好適な界面活性剤は、また、脂肪酸メチルタウリン塩である。しかし、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪族スルフォネート、脂肪族スルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルアリールスルフォネートを使用する。
【０１０５】
脂肪族スルフォネートまたはスルフェートは、通常はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換アンモニウム塩の形態であり、そしてアシル基のアルキル部分をまた含む、Ｃ１０−Ｃ２２−アルキル基を含み、例えば、リグノスルフォン酸の、ドデシル硫酸の、または天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールスルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。これらの化合物は、また、硫酸化およびスルフォン化脂肪族アルコール／エチレンオキシド付加の塩を含む。スルフォン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは１脂肪酸基が８ないし２２炭素原子を含む２つのスルフォン酸基を含む。アルキルアリールスルフォエートの例は、ドデシルベンゼンスルフォン酸の、ジブチルナフタレンスルフォン酸の、またはナフタレンスルフォン酸およびホルム−アルデヒドの縮合物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。また、対応するフォスフェート、例えば、４ないし１４モルのエチレンオキシドのｐ−ノニルフェノールの付加のリン酸エステルの塩；またはリン脂質が好適である。
【０１０６】
当業界で慣行的に使用される界面活性剤が、とりわけ以下の刊行物に記載されている："1986 International McCutcheon's Emulsifiers and Detergents" The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, New Jersey, U.S.A.。
【０１０７】
本発明の好ましい実施態様は、生体触媒、例えば、アバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することができる微生物を用意し、アバーメクチンと接触させ、そして生産した４’’−オキソ−アバーメクチンを反応混合物から炭離することによって４’’−オキソ−アバーメクチンを生産するための方法である。
【０１０８】
本発明のある実施態様は、式（ＩＩＩ）、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンを生産するための方法であり、それは以下のステップを含む。
（１）式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に、好ましくはアバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することのできる微生物の前培養物によって、細胞成長を促進する栄養培地に接種することによって細胞を生産するステップ；
（２）成長後に細胞を収集するステップ；
（３）式（ＩＩ）の化合物、好ましくはアバーメクチンを適当な溶媒に溶解するステップ；
（４）ステップ（３）からの溶液を、細胞増殖を促進しない反応培地に添加するステップ；
（５）ステップ（２）からの細胞を、ステップ（４）からの反応培地に添加するステップ；
（６）空気の存在下でステップ（５）の反応混合物を振とうまたは撹拌するステップ；
（７）培地から細胞を分離するステップ；
（８）上清および細胞を適当な溶媒で抽出するステップ；
（９）ステップ（８）から有機溶媒相を濃縮するステップ；
（１０）クロマトグラフィーまたは結晶化によって、エキストラクト（９）に含まれる、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物を精製するステップ。
【０１０９】
本発明のさらなる好ましい実施態様は、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物を生産するための方法であり、以下のステップを含む：
（１）式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物、好ましくはアバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することのできる微生物の前培養物によって、細胞成長を促進する栄養培地に接種することによって細胞を生産するステップ；
（２）成長後に細胞を収集するステップ；
（３）式（ＩＩ）の化合物、好ましくはアバーメクチンを適当な溶媒に溶解するステップ；
（４）ステップ（３）からの溶液を、細胞増殖を促進しない反応培地に添加するステップ；
（５）ステップ（２）からの細胞を、ステップ（４）からの反応培地に添加するステップ；
（６）空気の存在下でステップ（５）の反応混合物を振とうまたは撹拌するステップ；
（７）適当な溶媒で全ブロスを抽出するステップ；
（８）相を分離するステップ；
（９）ステップ（８）から溶媒相を減圧濃縮するステップ；
（１０）クロマトグラフィーまたは結晶化によって、エキストラクト（９）に含まれる、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物を精製するステップ。
【０１１０】
本発明のさらなる好ましい実施態様は、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物を生産するための方法であり、以下のステップを含む：
（１）好ましくはアバーメクチンである、式（ＩＩ）の化合物を適当な溶媒に溶解するステップ；
（２）ステップ（１）からの溶液を細胞成長を促進する栄養培地に添加するステップ；
（３）ステップ（２）の栄養培地に、式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物、好ましくはアバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンへ変換することのできる微生物の前培養物で接種するステップ；
（４）式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に、好ましくはアバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することのできる微生物を培養するステップ；
（５）培地から細胞を分離するステップ；
（６）上清および細胞を適当な溶媒で抽出するステップ；
（７）ステップ（６）からの有機溶媒相を減圧濃縮するステップ；
（８）エキストラクト（７）に含まれている、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物をクロマトグラフィーまたは結晶化によって精製するステップ。
【０１１１】
本発明のさらなる好ましい実施態様は、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物を生産するための方法であり、以下のステップを含む：
（１）好ましくはアバーメクチンである、式（ＩＩ）の化合物を適当な溶媒に溶解するステップ；
（２）ステップ（１）からの溶液を細胞成長を促進する栄養培地に添加するステップ；
（３）ステップ（２）の栄養培地に、アバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することのできる微生物の前培養物で接種するステップ；
（４）式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物に、好ましくはアバーメクチンを４’’−オキソ−アバーメクチンに変換することのできる微生物を培養するステップ；
（５）全ブロスを適当な溶媒で抽出するステップ；
（６）相分離ステップ；
（７）ステップ（６）からの溶媒相を減圧濃縮するステップ；
（８）エキストラクト（７）に含まれている、好ましくは４’’−オキソ−アバーメクチンである、式（ＩＩＩ）の化合物をクロマトグラフィーまたは結晶化によって精製するステップ。
【０１１２】
第２の純粋に化学的なステップにおいて、既知のように還元剤の存在下、そのように取得した式（ＩＩＩ）の化合物を式ＨＮ（Ｒ８）Ｒ９（ここで、Ｒ８およびＲ９は式（Ｉ）について与えたのと同じ意味である）のアミンと反応させることができる。
【０１１３】
この反応コンポーネントを溶媒の不存在で、しかし好ましくは、溶媒の存在下で反応させることができる。さらなる可能性は、過剰のある反応パートナー、特に液体アミンにおいて反応を実施することからなる。しかし通常は、不活性の液体溶媒または希釈剤の添加が有利である。そのような溶媒または希釈剤の例は、芳香族、脂肪族および脂環式炭化水素およびハロゲン化炭化水素、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、テトラリン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、石油エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロルメタン、トリクロルメタン、テトラクロルメタン、ジクロルメタン、トリクロルエテンまたはテトラクロルエテン；エステル、例えば、酢酸エチルエステル；エーテル、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングルコールジメチルエーテル、ジメトキシジエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、ジメトキシジエチルエーテル、テトラヒドロフランまたはジオキサン；ケトン、例えば、アセトン、メチルエチルケトンまたはメチルイソプロピルケトン；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコールまたはグリセリン；アミド、たとえばＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルフォルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはヘキサメチルリン酸トリアミド；ニトリル、例えば、アセトニトリルまたはプロピオニトリル；およびスルフォキシド、例えば、ジメチルスルフォキシド；有機酸、例えば、酢酸；および水である。
【０１１４】
好ましい溶媒は、エーテル、例えば、テトラヒドロフランおよびエチレングリコールジメチルエーテル；特にテトラヒドロフラン；アルコール、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノール；ハロゲン化溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロルエタン；芳香族溶媒、例えば、ベンゼンまたはトルエン；ニトリル、例えば、アセトニトリル、アミド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、カルボン酸、例えば、酢酸；水；およびそれらの混合物である。
【０１１５】
特に好ましい溶媒は、メタノールまたはエタノールまたはそれらの混合物である。反応は好ましくは、０ないし１４、特に２ないし１０、多くの場合６ないし９のｐＨの範囲で、特にｐＨ９で実施する。反応は好ましくは−８０ないし＋１４０℃、好ましくは−３０℃ないし＋１００℃、多くの場合―１０℃ないし＋８０℃の温度範囲で、特に０℃ないし＋５０℃で実施する。
【０１１６】
好ましい還元剤は、ヒドリド、例えば、ボロヒドリド；ボラン；ギ酸；フォルメート（formiates）；または水素である。ヒドリド、例えば、ナトリウムボロヒドリド、亜鉛ボロヒドリド、リチウムボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドまたはテトラメチル−アンモニウムトリアセトキシボロヒドリドが特に好ましい。ナトリウムボロヒドリドが特に好ましい。
【０１１７】
適用可能な場合、ある種のさらなる化学物質、例えば、同種のまたは異種の触媒または酸の存在下で反応を実施することができる。酸、例えば塩酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸またはフタル酸；ルイス酸、例えば、チタニウムテトラクロリド、チタニウムテトライソプロピレートまたは塩化亜鉛；塩、例えば、過塩素酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、塩化イッテルビウムまたはピリジニウム−ｐ−トルエン−スルフォネート；吸水剤、例えば、硫酸ナトリウム、分子篩またはシリカゲル；またはそれらの混合物が特に好適である。
【０１１８】
好ましいさらなる物質は、酸、例えば、酢酸、プロピオン酸または酒石酸であり；好ましくは酢酸である。還元を水素で実施されるとき、１またはいくつかの好適な同種または異種の触媒が有利である。好ましいそのような触媒は、当業界で既知の異種金属触媒であり、好ましくはＮｉ−、Ｐｔ−またはＰｄ触媒、特に、ＲａｎｅｙニッケルおよびＬｉｎｄｌａｒ触媒（Ｐｄ−ＣａＣＯ３−ＰｂＯ）である。好適な同種触媒は、特にロジウム錯体、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ触媒（クロロ−トリス−トリフェニル−ロジウム）である。
【０１１９】
遊離形態または塩形態のそれぞれの場合に、式（Ｉ）の化合物は可能性のあるイソマーの１の形態でまたはその混合物の形態であり得、これらは例えば、分子内の不斉炭素原子の数およびその絶対的および相対的コンフィギュレーションに依存し、および／または純粋なイソマー、例えばアンチポードおよび／またはジアステレオイソマーの形態で、またはイソマーの混合物、例えばエナンチオマーの混合物、例えばラセメート、ジアステレオイソマーの混合物またはラセメートの混合物の形態であってよい分子内の非芳香族二重結合のコンフィギュレーションに依存し；本発明は、純粋なイソマーおよびすべての可能なイソマーの混合物の両方に関し、そして、前記および後記で、立体化学的詳細が特定してそれぞれの場合に述べられていないとしてもこのことが理解されるべきである。
【０１２０】
出発材料および選択される手法に依存する、または他の手段による方法に従って得られ得る、式（Ｉ）の化合物のジアステレオイソマーの混合物およびラセメートの混合物またはそれらの塩は、構成成分の間の物理化学的な相違に基づき既知の態様で、例えば、分画結晶化、蒸留および／またはクロマトグラフィーによって純粋なジアステレオイソマーまたはラセメートに分離することができる。
【０１２１】
こうして得られ得るエナンチオマー、例えばラセメートの混合物を、既知の方法によって、例えば、光学的に活性な溶媒からの再結晶によって、キラル吸着剤のクロマトグラフィー、例えば、酢酸セルロースの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、好適な微生物の助けによって、特異的固定化酵素による切断によって、それぞれの場合にただ１つのエナンチオマーを錯体化する、例えばキラルクラウンエーテルを使用する、包摂化合物の形成によって、またはジアステレオイソマー塩への変換によって、例えば、塩基性最終産物ラセメートと光学的に活性の酸、例えばカルボン酸、例えば樟脳酸、酒石酸またはリンゴ酸、またはスルフォン酸、例えば、樟脳スルフォン酸（camphorsulfonic acid）と反応させ、そして得られるジアステレオイソマーの混合物を、例えば、それらの異なる溶解性に基づいて分別結晶化によって、望まれるエナンチオマーを好適な、例えば塩基性物質の作用によって遊離させることのできるジアステレオイソマーに分離することによって、光学的アンチポードに分離することができる。
【０１２２】
イソマーの対応する混合物の分離はさておき、ジアステレオ選択性またはエナンチオ選択性合成の一般的に既知の方法によって、例えば、対応して好適な立体化学を有する出発材料を使用する本発明に従う方法を実施することによって、純粋なジアステレオイソマーまたはエナンチオマーを得ることが、本発明に従ってまた可能である。
【０１２３】
式（Ｉ）と式（ＩＩＩ）の化合物、酸付加産物およびそれらの塩は、また、それらの水和物の形態で得ることができ、および／または他の溶媒、例えば、固体形態で存在する化合物の結晶化に使用され得る溶媒を含むことができる。
【０１２４】
本発明は、当該方法の任意のステージで出発材料または中間体として得られ得る化合物が出発材料として使用され、そして残りのステップのすべてまたは幾つかが実施され、または出発材料が誘導体または塩の形態および／またはそのラセメートまたはアンチポードの形態で使用されまたは、特に反応条件下で形成される、当該方法のすべてのこれらの形態に関する。
【０１２５】
当該方法に従って、または他の手段によって得られ得る式（Ｉ）および（ＩＩＩ）の化合物を、それ自体既知の態様で式（Ｉ）および（ＩＩＩ）の種々の化合物に変換し得る。
【０１２６】
本発明の方法では、遊離形態または塩形態であるそれぞれの場合に、これらの出発材料および中間体を好ましくは使用し、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）の化合物、またはそれらの塩であって、特に有益であると最初に記載したものを生じる。
【０１２７】
Ｒ９が水素である場合に、反応ステップ（２）を２つの別個のステップに分割し得、ここで第一のステップでは式の化合物
【化１３】
0003671003.tif 000010
0003671003.tif 000011
【０１２８】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは前記式（Ｉ）で与えた意味と同じ意味である]
を、式（ＩＩＩ）の化合物の式Ｈ２Ｎ（Ｒ８）
[式中、Ｒ８は前記式（Ｉ）とで与えた意味と同じ意味である]
の化合物との反応によって形成し、そして第２のステップで、式（ＩＶ）の化合物を前記ステップ２）の手法に従って還元する。当該２つの個々のステップを、式（ＩＶ）の化合物を単離することなく１ポット合成で実施し得る；しかし、化合物（ＩＶ）を例えば、精製目的のために単離することが有利で（anevatageous）有り得る。式（ＩＶ）の化合物は新規であり、そしてまた本発明の１側面である。
【０１２９】
実施例
本発明を以下の詳細な実施例を記載することがでさらに説明する。これらの実施例は、例示のためのみ提供し、そして特に特定しない限り限定するつもりはない。本発明は、特に実施例に記載した製造方法に関連する。
【０１３０】
実施例1:細胞生産
1.1  Streptomyces tubercidicus菌株I-1529
菌株I-1529(Streptomyces tubercidicus.; DSM-13135)の前培養物を、それぞれが１００ｍｌの培地２を含む２０５００ｍｌのバッフルのあるエルレンマイヤーフラスコ中で、１２０ｒｐｍで２８℃で３日間オービタル振とうしながら成長させる。
これらの培養物を４０ｌの培地４を含む５０リットルのファーメンターに接種するために使用する。細胞を０．７ｖｖｍ（＝３０リットル／分）で通気しながら２８℃で成長させた。ｐＯ２が２５％以下に低下するのを防止するために、ｐＯ２センサーによって案内されるながら、撹拌機のスピードは２００ｒｐｍないし３００ｒｐｍの間に維持した。２日間の成長後、貫流遠心機を使用して細胞を遠心分離によって収集した。４．２ｋｇの細胞（湿めった）を取得した。
【０１３１】
1.2  Streptomyces tubercidicus菌株R-922
Streptomyces tubercidicus菌株R-922 (DSM-13136)を、ISP-2 アガー(培地5)上でペトリ皿で成長させる。この培養物を、それぞれが１００ｍｌのＰＨＧ培地（培地６）を含む、バッフルのある４５００ｍｌの振とうフラスコに接種するために使用する。これらの前培養物を、２８℃で１２０ｒｐｍのオービタル振とう機で９６時間成長させ、それから機械的撹拌機を備え、８リットルのＰＨＧ培地を含む１０リットルのファーメンターに接種するために使用する。この主要な培養物を５００ｒｐｍの撹拌および１．７５ｖｖｍ（１４ｌ／分）の通気および０．７バールの圧力で成長させる。約２０時間後、対数成長の終わりに、細胞を遠心分離によって収集する。湿潤細胞の収量は７０−８０ｇ／ｌ培養である。さらなる加工のために、湿潤細胞を４℃で好ましくは１週間以内貯蔵することができる。
【０１３２】
実施例  ２：反応手法
２．１休眠培養
２．１．１  反応条件
３５．５  ｇのアバーメクチン(techn.)を、１．０５ｌのジメチルスルフォキシド／Ｔｗｅｅｎ４０の１：１に溶解する。この溶液を、２５ｍｌの等量物を、それぞれが１ｌの反応培地を含む、バッフルを有する４２３ｌエルレンマイヤーフラスコに添加することによって分配する。これらの溶液を１２１℃で２０分間滅菌する。室温に冷却後、実施例１．１および１．２で調製した１００ｇの湿潤細胞（新鮮、または４℃で４日以内貯蔵）をそれぞれ添加する。次にこれらの反応混合物を室温で１２０℃で４−５日間振とうする。
【０１３３】
反応培地:
０．５  ｇ  糖蜜
０．５  ｇ  ＭｇＣｌ２
１２．５  ｍｇ  ＺｎＣｌ２
１２．５  ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
２５  ｍｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
１２．５  ｍｇ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
２．５  ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
６．３  ｍｇ  ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ
０．１５  ｍｌ  １Ｍ  ＨＣｌ
１リットルにリン酸バッファー７０ｍＭ、ｐＨ６．０で調節し、オートクレーブする。
【０１３４】
２．１．２  ワークアップ
反応混合物を、５００ｍｌのポリプロピレン遠心フラスコで４℃で１５分間１３０００Ｘｇで遠心分離する。
４０ｌの反応混合物から上清をプールし、そしてメチルｔｅｒｔ．ブチルエーテル（０．５ｖｏｌ当量、０．４ｖｏｌ当量）で２回抽出する。プールしたメチルｔｅｒｔ．ブチルエーテル相を次いで、０．１８５ｖｏｌ当量の蒸留水で３回バックエキストラクトする。メチルｔｅｒｔブチルエーテル相をロータリーエバポレーターで減圧濃縮する。残さの乾燥により１０−１２ｇのエキストラクトＳを得る。水性相を廃棄する。
１２０ないし１３２個の遠心フラスコからの遠心分離した細胞を以下のように抽出した。
【０１３５】
２４の遠心フラスコからの細胞を２ｌのエルレンマイヤーフラスコに移す。それぞれのエルレンマイヤーフラスコに、８０ｇのdiatomeous earth（Hyflo Supercell（登録商標）、精製）および１．２ｌのアセトンを添加する。手で混合した後、混合物を大マグネチックスターラーバーによってホモゲナイズする。得られたパルプを２０ｃｍ直径のブフナーろうと上のペーパーを通して減圧濾過し、そしてアセトンで溶出液が無色になるまで洗浄した。こうして濾液Ｃ１および濾過固形物Ｃ１を得る。
【０１３６】
濾液C1をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、アセトンを除去する。得られる水性相を次いで０．７ｌのトルエンで３回抽出する。合わせたトルエン相を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。濾過し、ロータリーエバポレーターで減圧で蒸発させ、エキストラクトＣ１を得る。
濾過固形物Ｃ１を２ｌのエルレンマイヤーフラスコに移し、そして手で１．５Ｌのトルエンと混合する。混合物を大マグネチックスターラーバーによってホモゲナイズする。得られるパルプを２０ｃｍ直径のブフナーろうと上のペーパーを通して濾過し、そしてトルエンで溶出液が無色となるまで洗浄する。こうして濾液Ｃ２および濾過固形物Ｃ２を得る。濾過固形物Ｃ２を廃棄する。
【０１３７】
濾液C2をローターリーエバポレーターで減圧で濃縮し、エキストラクトＣ２を得、高い真空で乾燥する。
４０ｌ反応混合物からのあわせたエキストラクトＣ１およびＣ２を高い真空で乾燥し、３０−３５ｇのエキストラクトＣを得る。
４５ｇの合わせたエキストラクトＳ＆Ｃを、Clark-Still et al.の記載と類似するように１．５ｋｇのシリカゲル（Merck 60, 0.040-0.063mm）を詰めたカラムによるフラッシュクロマトグラフィーに付し、ここで０．５バールのＮ２−圧力、酢酸エチル：ヘキサン  ３：２の溶出および薄層クロマトグラフィによるモニタリングによる。純粋な４’’−オキソ−アバーメクチンの収量は５．６ｇである。
【０１３８】
2.2増殖培養
2.2.1反応条件
1ｇのアバーメクチン(techn.)を５０ｍｌのジメチルスルフォキシド／Ｔｗｅｅｎ４０  １：１に溶解する。この溶液を、それぞれが１００ｍｌの培地４を含むバッフルがある２０５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに２．５ｍｌの当量物を添加することによって分配する。これらの溶液を１２１℃で２０分間滅菌する。室温に冷却した後、それぞれ実施例１．１および１．２で調製したような５ｍｌの前培養物を添加する。次に、これらの接種培養物を、２８℃で７日間１２０ＲＰＭのオービタル振とうでインキュベーションした。
【０１３９】
2.2.2ワークアップ
反応混合物を、４℃で１５分間１３０００Ｘｇで５００ｍｌポリプロピレン遠心フラスコにおいて遠心分離し、そして実施例３の記載と類似するように加工する。２５２ｍｇの純粋な４’’−オキソ−アバーメクチンを得る。
【０１４０】
2.3細胞フリー生体触媒
2.3.1細胞フリーエキストラクトの調製
ストック溶液:
ＰＰ−バッファー：
５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  （ｐＨ  ７．０）
破壊バッファー：
５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４  （ｐＨ  ７．０），
５ｍＭ  ベンズミジン
２ｍＭ  ジチオスレイトール
０．５ｍＭ  Pefabloc (Roche Diagnosticsから）
基質：
１０ｍｇのアバーメクチンを１ｍｌイソプロパノールに溶解する。
【０１４１】
ＰＰ−バッファーで洗浄した、6gの湿潤細胞を３５ｍｌの破壊バッファーに再懸濁し、そして４℃でフレンチプレスで破壊する。得られた懸濁液を１時間３５０００Ｘｇで遠心分離する。上清細胞フリーエキストラクトを収集する。
【０１４２】
2.3.2酵素活性の検定の開発
ストック溶液:
フェレドキシン:
トリス／ＨＣｌ−バッファー(Flukaから)中の５ｍｇのフェレドキシン(ホレンソウから)溶液１−３ｍｇ／ｍｌ
または
トリス／ＨＣｌ−バッファー(Flukaから)中の５ｍｇのフェレドキシン(Clostridium pasteurianumから)溶液１−３ｍｇ／ｍｌ
または
トリス／ＨＣｌ−バッファー(Flukaから)中の５ｍｇのフェレドキシン(Porphyra umbilicalisから)溶液１−３ｍｇ／ｍｌ
フェレドキシンレダクターゼ：
１ｍｌのＨ２Ｏ中の１ｍｇの凍結乾燥したフェレドキシンレダクターゼ(ホウレンソウから)３，９Ｕ／ｍｇの溶液(Sigmaから)
ＮＡＤＰＨ：
Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭのＮＡＤＰＨ(Roche Diagnosticsから)
(すべてのストック溶液は−２０℃で貯蔵し、使用時に氷上で維持する)
【０１４３】
ＨＰＬＣ条件：
ＨＰＬＣ装置：Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ
ＨＰＬＣ−カラム：７０ｘ４ｍｍ、Kromasil 100 C18、３．５μ(Macherey-Nagel, Switzerlandから)。
【０１４４】
溶媒Ａ：  ０．００７５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
溶媒Ｂ：  ０．０１％のトリフルオロ酢酸を含む水
流速：１．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ２４３ｎｍ
サンプル：３０μｌ
リテンションタイム：アバーメクチンＢ１ａ  ３．１８分
４"−オキソ−アバーメクチンＢ１ａ  ４．７４分
【０１４５】
0003671003.tif 000012
【０１４６】
４７５μｌの細胞・フリーのエキストラクトに以下の溶液を添加する：  １０μｌのフェレドキシン、１０μｌのフェレドキシンレダクターゼおよび１μｌの基質。基質の添加後、混合物をすぐにそして徹底的に混合および通気する。次いで５μｌのＮＡＤＰＨを添加し、そして該混合物を３０℃で３０分間インキュベートする。次いで、１ｍｌのメチル−ｔ−ブチルエーテルを反応混合物に添加し、そして徹底的に混合する。混合物を１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、そしてメチル−ｔ−ブチルエーテル相を１０ｍｌのフラスコに移し、そしてロータリーエバポレーターによって減圧で濃縮する。残さを２００μｌのアセトニトリルに溶解し、そしてＨＰＬＣサンプルバイアルに移す。３０μｌのサンプルをインジェクションすると、４．７４分にピークが現れ、このことは４’’−オキソ−アバーメクチンＢ１ａの存在を指摘している。８７０Ｄａの質量が、ＨＰＬＣ質量分析によってこのピークに割り当てられ、これは４’’−オキソ−アバーメクチンＢ１ａの分子量に対応している。
【０１４７】
ＨＰＬＣおよびＨＬＰＣ−質量分析法によって生成物形成を分析すると、第２のピークが２，０１分に現れ、これはケトヒドレート４’’−ヒドロキシ−アバーメクチンに対応している。このことは、該細胞・フリーエキストラクトが、ヒドロキシル化によってアバーメクチンを４’’−ヒドロキシ−アバーメクチンに変換し、それから脱水素によって４’’−オキソ−アバーメクチンが形成されることを指摘している。
【０１４８】
ホレンソウフェレドキシンを、例えば、細菌Clostridium pasteurianumまたは紅藻Porphyra umbilicalis由来のフェレドキシンと置換することができる。これらはまた、アバーメクチンの４’’−オキソ−アバーメクチンへの生体触媒による変換をもたらす。
【０１４９】
実施例 3: Steptomyces菌株
本発明の方法に使用することのできる、Streptomyces属の菌株および、１６ｓ  ｒＤＮＡ分析に基づくそれらのS.tubercidicus菌株Ｉ−１５２９およびＲ−９２２に対する類縁関係を以下の表に示す：
【表１】
0003671003.tif 000013
【０１５０】
実施例４：式の４’’−デオキシ−４’’−エピ−（メチルアミノ）−アバーメクチンＢ１の製造
【化１４】
0003671003.tif 000014
【０１５１】
式中、Ｒは、メチルおよびエチルである；
３０ｍｌのメタノール中の３ｍｌの酢酸を０ないし５℃に冷却する。ガス状メチルアミンを溶液のｐＨが９となるまで添加する。
８．２５ｍｌのメチルアミンのこの溶液に、６ｍｌのメタノール中の１．０ｇの４’’−オキソ−アバーメクチンＢ１の溶液を０℃で添加する。この混合物を環境温度に暖め、それからさらに５０分間室温で撹拌する。次いで、２．５ｍｌのエタノール中の９０ｍｇのナトリウムボロヒドリドを添加し、そして得られる混合物をもう４５分撹拌する。１０ｍｌの酢酸エチルを反応混合物に添加し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回抽出し、該有機相を分離し、そして硫酸ナトリウムで乾燥する。この溶媒を蒸留し４’’−デオキシ−４’’−エピ−（メチルアミノ）−アバーメクチンＢ１を得る。純度は９０％を超える。
【０１５２】
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【０１５９】
引用した特許文献
US-P-5,288,710
EP-A-736,252
EP-301,806
EP-401,029
DE-2,717,040