(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を含有するビニル系モノマーと、光反応性官能基を含有するビニル系モノマーとを共重合させて得られる共重合体からなることを特徴とする機能性糖鎖高分子。
【請求項２】
前記光反応性官能基がアジド基であることを特徴とする請求項１記載の機能性糖鎖高分子。
【請求項３】
前記糖鎖を含有するビニル系モノマーが、Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノシル-（１→４）-Ｄ-マンナアミド］；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→６）-Ｄ-グルコンアミド］；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチル-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カルボキシメチル-グルコンアミド］；３-Ｏ-４’-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］、及びＮ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］、またはそれらの混合物；Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→３）-Ｄ-グルコンアミド］；及び、Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-Ｄ-グルコンアミドからなる群から選択される少なくとも１つのモノマーであることを特徴とする請求項１記載の機能性糖鎖高分子。
【請求項４】
前記光反応性官能基を含有するモノマーが、３−アジドスチレンであることを特徴とする請求項２記載の機能性糖鎖高分子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの機能性糖鎖高分子の溶液を基材に塗布し、光照射または加熱することからなる機能性糖鎖高分子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、機能化した糖鎖高分子に関する。特に、光反応性官能基を有し、光照射によって簡便に架橋させることにより基材等に確実に固定化させることのできる糖鎖高分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特異な立体構造を有し、その立体構造の中で豊富な極性部位と疎水性部位とが均衡している糖分子は、生体の認識機構に深く関わっているほか、植物の細胞壁やカニの甲羅などの生体骨格を構成する材料などに用いられている。
本発明者等は、このような糖分子の機能に着目し、ポリビニル系高分子に糖分子を導入した糖鎖高分子を合成し、精力的に研究を行ってきた（例えば、由良洋文、赤池敏宏、「細胞培養」、第１９巻、３１７−３２２頁、１９９３年）。
【０００３】
本発明者等は、これらの糖鎖高分子で表面修飾することにより、糖の持つ臓器、組織または細胞特異的な性質を利用することを提唱している。しかし、これまでの糖鎖高分子の固定化方法では、主にビニル系高分子からなる主鎖の物理吸着を利用して基材に固定化していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
物理吸着による固定化では、主鎖をなすビニル系高分子と基材表面との親和性により固定化できる材料が限定される場合があり、固定化された糖鎖高分子が温度や湿度などの環境の変化によって脱離しやすくなる場合もあった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するため、本発明は、ビニル系高分子主鎖に糖分子と光反応性官能基とをグラフトさせた機能性糖鎖高分子を提供する。この光反応性官能基は、アジドベンゼンなどのアジド基であるのが好ましい。
【０００６】
この機能性糖鎖高分子は、糖分子を含有するビニル系モノマーと、光反応性官能基を含有するビニル系モノマーとを共重合させることによって好適に合成することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の機能化糖鎖高分子の一例として、下記式（１）で表されるポリ（３−アジドスチレン−ｃｏ−｛Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］｝）（以後、Ａｚｏ−ＰＶＬＡと略記）を挙げることができる。
【０００８】
【化１】
0003630348.tif 000002
【０００９】
このＡｚｏ−ＰＶＬＡは、β−ガラクトース残基を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］）（ＰＶＬＡと略記）と、３−アジドスチレンとが共重合した構造を有している。
【００１０】
また、本発明の機能性糖鎖高分子の他の例として、下記式（２）で表されるポリ（３−アジドスチレン−ｃｏ−｛Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］｝）（以後、Ａｚｏ−ＰＶＭＡと略記）を挙げることもできる。このＰＶＭＡはグルコース残基を有する。
【００１１】
【化２】
0003630348.tif 000003
【００１２】
さらに、本発明の機能性糖鎖高分子は、例えば、
マンノース残基を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンナアミド］）（ＰＶＭａｎと略記）；
ガラクトース残基を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｄ−グルコンアミド］）（ＰＶＭｅＡと略記）；
カルボキシメチル化ガラクトース残基を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−６−カルボキシメチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−６−カルボキシメチル−グルコンアミド］）（ＰＶＬＡＣＯＯＨと略記）；
グルコース残基を有するポリ（３−Ｏ−４’−ビニルベンジル−Ｄ−グルコース）（ＰＶＧと略記）；
Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコンアミド］）、及びポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコンアミド］）、またはそれらの混合物（いずれもＰＶＧｌｃＮＡｃと略記）；
Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｄ−グルコンアミド］（ＰＶＬａｍと略記）；または、
Ｄ−グルコースを開環させた構造を有するポリ（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−グルコンアミド）（ＰＶＧＡと略記）等の糖鎖を含有するビニル系高分子と、前記ポリアジドスチレンとが共重合した構造をなしていてもよい。
【００１３】
ここで、上記式（１）で表されるＡｚｏ−ＰＶＬＡの合成法について述べる。まず、下記式（３）に示すように、３−ニトロスチレンをアジド化して３−アジドスチレンとする。
【００１４】
【化３】
0003630348.tif 000004
【００１５】
これとは別に、ｐ−アミノメチルスチレンとラクトースとから、下記式（４）で表されるＮ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］）（ＶＬＡと略記）を合成し、このＶＬＡと前記３−アジドスチレンとを共重合させることによってＡｚｏ−ＰＶＬＡを得ることができる。
【００１６】
【化４】
0003630348.tif 000005
【００１７】
このＡｚｏ−ＰＶＬＡ以外の、ＰＶＭＡ、ＰＶＭａｎ、ＰＶＭｅＡ、ＰＶＬＡＣＯＯＨ、ＰＶＧ、ＰＮＧｌｃＮＡｃ、またはＰＶＧＡ構造を有する機能性糖鎖高分子も、各々のモノマーと３−アジドスチレンとを共重合させることによって得ることができる。
【００１８】
本発明の機能性高分子は、光反応性の官能基を有して光架橋が可能とされているのが好ましい。この光反応性官能基としては、架橋反応後に、細胞などと非特異的相互作用をする可能性のあるアミノ基を残さないもの、触媒を用いなくても容易に架橋反応が起こる程度の反応性を持つもの、常温から高くとも１２０℃程度の温度で架橋反応が完了するもの、糖鎖高分子への導入が容易であるもの、及び反応が限定的でなく汎用性が高いものが好ましい。このような条件に合致する官能基としては、アジド基等の光アゾ・カップリングを起こす官能基等が好ましい。また、光反応性官能基に代えて、６０から１２０℃程度の加熱によって架橋する官能基を用いてもよい。
【００１９】
このアジド基などの光反応性官能基は、ビニル基系モノマーに共有結合を介して結合させるのが好ましい。このビニル系モノマーは特に限られないが、上述したようなアミノメチルスチレンに糖分子を結合させた糖鎖を含むモノマーと共重合させる場合には、スチレンモノマーを用いるのが好ましい。また、当該光反応性官能基は、天然の多糖類、オリゴ糖類、好ましくはアミノ基を有するものあるいはアミノ基を誘導したものにも簡単に誘導できる。
【００２０】
このようにして合成された機能性糖鎖高分子は、ポリビニル系高分子を主鎖とし、その主鎖に糖分子及び光反応系官能基がグラフトされている。従って、この機能性糖鎖高分子を適当な溶媒に溶解または分散させて、その溶液または分散液を基材に塗布し、必要に応じて乾燥させ、次いで光照射することによって架橋させることができる。
【００２１】
このように架橋させた機能性糖鎖高分子は、従来の物理吸着による固定化に比較して、より強固に確実に基材に固定化される。よって、本発明の機能性糖鎖高分子は、基材表面に糖分子を強固かつ確実に固定化し、基材の表面改質をするために好適に使用することができる。
【００２２】
ここで、本発明の機能性糖鎖高分子によって表面改質される基材としては、種々の医用材料、臨床診断用基材、アフィニティ・クロマトグラフィーの担体等の固体材料等が挙げられる。また、水に難溶性の物質の表面に本発明の機能性糖鎖高分子を固定化することにより、物質表面に糖分子が導入されて可溶化することができる。さらに、非特異的に作用する薬剤を本発明の機能性糖鎖高分子で包接することにより、糖分子が持つ特異性に基づいた薬剤の局所的投与、いわゆるドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）を構築することも可能である。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の機能性糖鎖高分子は、生体器官、組織、または細胞などとの間に特異的親和性を有する糖分子を含んでいるので、その特異性を利用することによってこの機能性糖鎖高分子で被覆した種々の基材の表面機能化が図れる。
【００２４】
本発明の糖鎖高分子は、分子内に光反応性官能基が導入されているので、その官能基を介して光架橋させることにより、より強固にそして確実に基材に固定化することができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２６】
実施例１：Ａｚｏ−ＰＶＬＡの合成
（１）３−アジドスチレンの合成
３−ニトロスチレン（５ｇ）を、１０ｍＬのエタノールに分散させ、２０ｍＬの濃塩酸を加えた後、塩化スズ（６水和物）の２２．５ｇ／２５ｍＬエタノールを添加して１２時間撹拌した。これに水酸化ナトリウム溶液を添加して中和した後、エーテルを加えて抽出した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、塩素ガスを加えて粗化合物を得た。
【００２７】
次いで、この粗化合物２．４ｇを２０ｍＬの水溶液とし、２ｍＬの濃硫酸を加えて、氷冷下２６ｍＬの１Ｎ亜硝酸ナトリウムの溶液を加えた。３時間後、１．６ｇのアジ化ナトリウムの水溶液２００ｍＬをゆっくりと添加して５時間反応させた。反応終了後、エーテル抽出を行い、０．１Ｎ炭酸水素ナトリウム溶液で４回洗浄した後に、エーテル層を乾燥、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラム（クロロホルム：ヘキサン＝２０：８０）で精製し（Ｒｆ＝０．８５）、０．８ｇの３−アジドスチレンを得た。
【００２８】
（２）Ａｚｏ−ＰＶＬＡの合成
上記の３−アジドスチレン（１０、５ｍｏｌ％）と、ＶＬＡ（９０、９５ｍｏｌ％）とを共重合させ、本発明の機能性糖鎖高分子の一例であるＡｚｏ−ＰＶＬＡを合成した。
このＡｚｏ−ＰＶＬＡのＩＲスペクトルを図１に示す。２０１０ｃｍ−１付近にアジド基に特有の吸収ピークが見られる。
【００２９】
実施例２：Ａｚｏ−ＰＶＭＡの合成
ＶＬＡの代わりにＮ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］（ＶＭＡと略記）を用いた以外は実施例１と同様にして、本発明の機能性糖鎖高分子の他の例であるＡｚｏ−ＰＶＭＡを合成した。
このＡｚｏ−ＰＶＭＡのＩＲスペクトルを図１に示す。２０１０ｃｍ−１付近にアジド基に特有の吸収ピークが見られる。
【００３０】
実施例３
Ａｚｏ−ＰＶＬＡを少量の水に溶解した後、各々０．０５、０．０２５、及び０．００５重量％の濃度となるようにイソプロパノール：水（７：３）の混合溶媒で希釈した。
塩化ビニル（塩ビ）シートを直径２０ｍｍの円形に成型し、エタノールで洗浄した後に１２ｗｅｌｌ細胞培養用シャーレの底面にシリコーン樹脂を用いて固定した。このシャーレに各濃度のＡｚｏ−ＰＶＬＡ溶液を各々２５０μＬずつ添加して、６０℃で１時間キャストした。
その後、これらのキャスト膜に、殺菌用ＵＶランプ下１５ｃｍにおいて、３時間ＵＶ照射を照射した。キャスト膜を蒸留水で数回洗浄した後、各シャーレ毎にビーカー中で蒸留水に浸漬し、器具洗浄用のソニケーターで２０分間超音波処理した。
【００３１】
これらのシャーレに、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を加えて１５分間放置した後、ＰＢＳで十分に洗浄した。
その後、Ａｚｏ−ＰＶＬＡに含まれるβ−ガラクトースと特異的に結合するレクチンであるＡｌｌｏ−Ａのペルオキシダーゼ修飾したものを１μｇ含むＰＢＳを各シャーレに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液中を加えて２０分間インキュベートした。この上澄液の波長４５０ｎｍでの吸収を測定することにより、Ａｌｌｏ−Ａの固定量、即ち塩ビシート表面への糖導入量を算出した。
結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0003630348.tif 000006
【００３３】
実施例４
エポキシ樹脂シート表面へのＡｚｏ−ＰＶＬＡの固定化について、実施例３の方法に準じて評価した。
その結果、超音波処理前の固定化量は１６１±５９ｎｇであり、超音波処理後の固定化量は１７６±５０ｎｇであった。測定誤差を含めても、超音波処理という過酷な処理を行っても本発明の機能性糖鎖高分子の被覆は脱離しないことがわかった。
【００３４】
実施例５
架橋ポリスチレン（ジビニルベンゼン）ビーズ（ＤＶＢビーズと略記）表面へのＡｚｏ−ＰＶＬＡの固定化についても同様に評価した。このビーズの粒径は０．３ｍｍであり、ビーズ０．１ｇ当たりの表面積は１０００ｍｍ２であった。
その結果、何も被覆していないＤＶＢビーズ表面には、２．１ｎｇ／ｃｍ２しか固定化されないのに対し、Ａｚｏ−ＰＶＬＡで被覆したＤＶＢビーズでは５．２ｎｇ／ｃｍ２が固定化されていた。一般に非特異的吸着の影響が大きなマイクロビーズにおいて、Ａｚｏ−ＰＶＬＡの被覆効果に基づく３倍以上のＡｌｌｏＡの吸着が見られた。
【００３５】
実施例３から５の結果から、本発明の機能性糖鎖高分子を用いることにより、塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリスチレン等といった基材材料によらず、さらには、平面状、球面状等の基材の形状にもよらずに糖分子を強固に固定化できることがわかった。
【００３６】
実施例６
機能性糖鎖高分子としてＡｚｏ−ＰＶＬＡ及びＡｚｏ−ＰＶＭＡを選択した。実施例１と同様にして各々の糖鎖高分子溶液を調製した。それらの溶液に１０００ＩＵ／ｍＬのヘパリンを添加した。各溶液をポリスチレン製シャーレに添加して乾燥させ、ＵＶ照射後に超純水で２０分間超音波処理を行い、さらに３回洗浄してから乾燥させた。
【００３７】
正常ヒト血液を室温で遠心（１００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清をＰＲＰ（Ｐｌａｔｅ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ）として用いた。ＰＲＰを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し、１ｃｍ３当たり１〜５×１０６細胞数になるように調製して、これを上記各シャーレに添加した。添加後、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心し、３７℃で１時間静置して血小板を接着させた。接着後の上清をピペッティングにより回収し血球計測装置（ｓｙｓｍｅｘ社製）で上清に残った血小板を計数することによって接着量を算出した。結果を図３に示す。但し、記載したデータは、３回の測定結果の平均値である。
【００３８】
図３には、対照用として、何も被覆していないシャーレについての結果も記載した。図から明らかなように、ヘパリン濃度固定化していない場合でも、Ａｚｏ−ＰＶＬＡまたはＡｚｏ−ＰＶＭＡで被覆することによって、血小板の接着を低下させることが可能であり、高濃度のヘパリン（１０００ＩＵ／ｍＬ）とともに固定化することによって、この効果はさらに顕著になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成したＡｚｏ−ＰＶＬＡのＩＲスペクトルを示す図である。
【図２】実施例２で合成したＡｚｏ−ＰＶＭＡのＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】実施例のヘパリン吸着実験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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