(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療すべき腫瘍形成を治療するための化合物を選択する方法であって、
（ａ）治療すべき該腫瘍形成に対する該化合物の抗新生物活性を評価する工程；
（ｂ）該化合物が治療すべき該腫瘍形成においてＰＫＧ活性を高めるかを評価する工程；
（ｃ）該化合物が治療すべき該腫瘍形成においてＪＮＫ活性を活性化するかを評価する工程；及び
（ｄ）治療すべき該腫瘍形成において、抗新生物活性を示し、ＰＫＧ活性を高め、かつＪＮＫを活性化する該化合物を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
該化合物がＰＤＥ5を阻害するかを評価する工程、及びＰＤＥ5を阻害する該化合物を選択する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該化合物が治療すべき該腫瘍形成においてβ-カテニンを減少させるかを評価する工程、及びβ-カテニンをそのように減少させる該化合物を選択する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該化合物がcＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ（『ＰＤＥ』）を阻害するかを評価する工程及び前記ＰＤＥを阻害する該化合物を選択する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該化合物がＰＫＧ発現を高めるかを評価する工程、及びＰＫＧ発現を高める場合に該化合物を選択する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該化合物がＰＫＧ活性化を高めるかを評価する工程、及びＰＫＧ活性化を高める場合に該化合物を選択する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
治療すべき腫瘍形成を治療するための化合物を選択する方法であって、
（ａ）該化合物が治療すべき該腫瘍形成においてＰＫＧ活性を高めるかを評価する工程；
（ｂ）該化合物が新生細胞中のβ-カテニンを減少させるかを評価する工程；
（ｃ）該化合物が治療すべき該腫瘍形成においてＪＮＫ活性を活性化するかを評価する工程；及び
（ｄ）治療すべき該腫瘍形成において、ＰＫＧ活性を高め、β-カテニンを減少させ、かつＪＮＫ1を活性化する該化合物を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項８】
腫瘍形成を治療する可能性をもつ化合物を同定する方法であって、
該腫瘍形成においてＰＫＧ活性を高めかつＪＮＫを活性化する化合物を選択する工程；及び
該化合物の該腫瘍形成増殖阻止活性を評価し、ＰＫＧ活性を高め、ＪＮＫを活性化し、かつ腫瘍形成増殖阻止活性をもつ化合物が正常細胞の増殖をほとんど阻止せずに腫瘍形成を阻害する該可能性をもっている工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
腫瘍形成を治療する可能性をもつ化合物を同定する方法であって、
該化合物のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害活性を求める工程；及び
該化合物が新生細胞においてＪＮＫを活性化するかを求める工程
を含み、低ＣＯＸ阻害活性及びＪＮＫの活性化が、該化合物が腫瘍形成を治療する可能性をもつことを示している、前記方法。
【請求項１０】
該化合物が試料において腫瘍細胞増殖を阻止するかを求める工程；
を更に含み、腫瘍細胞増殖の阻止が、該化合物が腫瘍形成を治療するのに有効であることを更に示している、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍形成を治療する化合物を選択する方法であって、
該化合物の該新生細胞増殖阻止活性を求める工程；
該化合物が新生細胞においてＰＫＧ活性を高めかつＪＮＫを活性化するかを求める工程；及び
新生細胞において新生細胞増殖阻害活性を示し、ＰＫＧ活性を高め、かつＪＮＫを活性化する該化合物を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
腫瘍形成を治療する化合物を選択する方法であって、
（ａ）化合物が前記腫瘍形成においてＰＫＧ活性を高めるかを評価する工程；
（ｂ）化合物が新生細胞中のβ-カテニンを減少させるかを評価する工程；
（ｃ）化合物が前記腫瘍形成においてＪＮＫを活性化するかを評価する工程；
（ｄ）前記腫瘍形成において、ＰＫＧ活性を高め、ＪＮＫを活性化し、かつβ-カテニンを減少させる化合物を選択する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物において前がん病巣又はがん病巣を選択的に治療又は予防するのに潜在的に有効な化合物を同定する方法、及びその化合物を含む医薬組成物である。
【０００２】
【従来の技術】
長年、研究者らは、正常細胞に対して不利な増殖阻止作用をほとんどせずに新生細胞を選択的に治療する化合物を探究してきた。特定されたがんの種類に関係なく、がんの従来の化学療法剤は、共通の特徴：新生細胞に対してかなり効果がある程度の従来の組成物（例えば、ヘルセプチン、タキソール、シスプラチン、タモキシフェン等）は、ほとんど常に正常細胞に対してかなり不利な作用を有することを共有している。副作用の多くは衰弱と寿命を脅かすことである。このように、従来の化学療法剤は、典型的には、薬剤の副作用が化学療法をしない危険を明らかに償って余りある段階まで腫瘍形成が非常に進行した後にのみ投与される。
従来の化学療法剤は、典型的には、かなり特定的な種類の腫瘍形成を治療するために用いられる。例えば、ロイプロリドは、一般に、進行性前立腺がんを治療するために処方されるが、結腸がん又は肺がんには処方されない。広範囲の腫瘍形成に対して活性をもつ組成物が求められている。
Pamukcuらの米国特許第5,401,774号には、エクシスリンド（exisulind）として現在既知のような化合物が抗新生物剤のために開示されている。従来の化学療法剤と対照的に、そのような化合物は、正常細胞と反対に新生細胞に対して非常に選択的である。従って、そのような化合物は、従来の化学療法剤にふつうは伴う副作用を含まずに慢性的に投与し得る。更に、安全性の側面があることから、そのような化合物は、病気の最も初期の段階で投与し得る。従って、新規な化合物は、選択的アポトーシス抗新生物剤（『ＳＡＡＮＤ』）として既知の抗新生物剤の新しい種類として認められた。
【０００３】
従来の化学療法剤より目だった安全性の利点のほかに、ＳＡＡＮＤは従来の化学療法剤と比べて治療上の適用が広範囲である。例えば、最初のＳＡＡＮＤ、エクシスリンドは、結腸、乳房、肺、前立腺、腎、及びメラノーマの腫瘍形成に対して抗新生物作用をもつことが報告されている。
ＮＳＡＩＤと異なり、ＳＡＡＮＤがＣＯＸI/II酵素を阻害しないことから、ＳＡＡＮＤは抗新生物ＮＳＡＩＤ（例えば、スリンダク）より有利である。ＣＯＸI及び/又はＣＯＸII酵素（例えば、インドメタシン、セレコキシブ又は他のＮＳＡＩＤ）を阻害することにより、慢性的に用いた場合にかなり副作用が生じる。更に、ＣＯＸ阻害は、抗新生物効能に不要である。そのような多くのＣＯＸIやＣＯＸIIの阻害剤が、顕著な抗新生物活性をもつことが証明されていないことは驚くべきことではない。ＣＯＸIやＣＯＸIIの阻害剤の副作用としては、重篤な潰瘍、及び腎毒性を生じ得る胃の過敏症が含まれる。ＳＡＡＮＤ抗新生物治療は慢性的又は長期投与により強められるので、抗新生物特性を示す程度のＣＯＸ阻害剤は、安全性に問題があることから単に不適切である。患者が現実的にはまれに慢性的に又は長期にＣＯＸ阻害剤を用い得るからである。炎症については、ＣＯＸ阻害剤は、一般的には、結果として短期に又は急性投与でのみ用いられている。
【０００４】
ＳＡＡＮＤがＣＯＸ阻害剤の副作用（又は従来の化学療法剤の重い副作用）なしにどのように作用し得るかは、最近までなぞのままであった。米国特許第5,858,694号に示されているように、ＳＡＡＮＤは、一部にはＰＤＥ5の阻害によって作用し、これはＳＡＡＮＤがどのようにして新生細胞中でアポトーシス（細胞死の形）を誘発し、正常細胞中では誘発しないかという必要な部分であると思われる。‘694特許に示されているように、ＳＡＡＮＤが新生細胞においてcＧＭＰを高めかつcＡＭＰを減少させることにより作用することが発見された。
しかしながら、一部のＰＤＥ5阻害剤はアポトーシスを誘発しないことが後に発見された（例えば、1998年10月15日出願の米国特許出願第09/173,375号を参照されたい）。‘375出願において、新生細胞中に見出される新規なcＧＭＰ特異的ＰＤＥの発見が最初に示された。抗新生物ＰＤＥ5阻害剤を不活性なＰＥＤ5阻害剤から分けた所見は、抗新生物ＰＤＥ5阻害剤は新規なcＧＭＰ特異的ＰＤＥを阻害するが、不活性ＰＤＥ5阻害剤（例えば、シルデナフィル）は相対作用をほとんどもたないというものであった。‘375出願に開示されたようにこの所見により、活性な抗新生物ＰＤＥ5阻害剤（即ち、追加のＳＡＡＮＤ）を同定する正確な薬剤発見スクリーニング法がもたらされた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＳＡＡＮＤとしての有用性について化合物を評価及び同定する正確で代替的な方法が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＳＡＡＮＤとしての有用性について化合物をスクリーニング及び同定する新規な方法に関する。特に、本発明は、ＣＯＸ阻害に伴う副作用や従来の化学療法剤に伴う他の非特異的相互作用ができるだけ少ない前がん病巣を含む腫瘍形成を治療又は予防するために使用し得る化合物を同定する方法を提供する。一部のＰＤＥ5阻害剤がなぜアポトーシスを誘発するかを研究する過程で、我々は、アポトーシスを誘発するものがＪＮＫ1キナーゼ活性を最後には活性化することによりそのように誘発することを発見した。ＪＮＫは、ＭＡＰキナーゼ拡張ファミリーのプロリン特定キナーゼである。この作用は、Piazzaらの米国特許第5,858,694号に教示されるように、プロアポトーシスＰＤＥ5阻害剤によるcＧＭＰ及びcＡＭＰの調節によってＪＮＫアポトーシス経路の上流をもたらすと考えられる。cＧＭＰ/cＡＭＰ調節とＪＮＫ1活性間のこの関係は驚くべきことであり、cＧＭＰ阻害剤がＳＡＡＮＤであるかを確認する有効な方法をなすものである。ＪＮＫキナーゼ活性に対するこの作用と対照的に、試験したＳＡＡＮＤは、細胞増殖を刺激する点で役割を果たすことが一般に報告されているシグナル導入の関連するが別個の経路のＥＲＫ2キナーゼ活性をほんのわずかな活性化しかもたらさなかった。
【０００７】
本発明は、化合物が新生細胞においてcＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼＧ（『ＰＫＧ』）活性を高めかつＪＮＫ1キナーゼを活性化させるかを評価することを必要とする。ＰＫＧ活性の評価は、上記のように、少なくとも一部は適切なＰＤＥのＳＡＡＮＤ阻害によるcＧＭＰの増加のためであると我々は考える。
ＳＡＡＮＤの他の特徴は、(1)上記‘694特許に示されたＰＤＥ5の阻害、(2)新規なcＧＭＰ特異的ＰＤＥコンホメーションの阻害、(3)ＰＤＥ2の阻害、(4)ＳＡＡＮＤが新生細胞中で細胞内cＧＭＰを高めるという事実、及び(5)あるタイプの新生細胞中でcＡＭＰレベルを減少させるという事実である。
従って、本発明の新規な方法の実施態様は、化合物が、新生細胞中のＪＮＫを活性化するか、ＰＫＧ活性を高めるか、及びその化合物がＰＤＥ5を阻害するかを評価している。本発明の新規なスクリーニング法の他の実施態様は、ＪＮＫを活性化する化合物が新生細胞においてＰＫＧ活性を高めるか及びその化合物が上記の新規なcＧＭＰ特異的ＰＤＥ及び/又はＰＤＥ2を阻害するかを評価している。第3の実施態様は、化合物が新生細胞中でＪＮＫを活性化するか、ＰＫＧ活性を高めるか及びその化合物が新生細胞中でcＧＭＰを高めるか及び/又はcＡＭＰレベルを下げるかを評価している。そのような方式で巧く評価された化合物は、ＳＡＡＮＤとして適用される。
【０００８】
特に、本発明は、腫瘍形成、特に前がん病巣を安全に治療又は予防する能力について化合物を選択する新規な試験管内又は生体内方法に関する。特に、本発明は、前がん病巣を含む腫瘍形成を治療又は予防するために使用し得る化合物を選択する方法である。そのように同定された化合物は、ＣＯＸ阻害及び従来の化学療法剤に伴う他の非特異的相互作用に起因する副作用が最少であり得る。問題の化合物は、新生細胞をcＧＭＰ ＰＤＥ阻害化合物に曝すことにより試験され得、化合物がその細胞中でＪＮＫを活性化する場合には、その化合物は他の抗新生物特性（例えば、試験管内及び/又は生体内でアポトーシスを誘発させる能力）について評価される（例えば、試験管内又は生体内動物又はヒト試験モデル又は試験）。
従って、本発明の態様は、化合物のＰＤＥ5及び/又はＰＤＥ2の阻害及びそのＣＯＸの阻害を確認することを含む腫瘍形成を治療するのに効果的な化合物を同定するスクリーニング/選択法を必要とする。好ましくは、本発明のスクリーニング又は選択法は、化合物が試験管内又は生体内で腫瘍細胞の増殖を阻止するかを求める工程を更に含んでいる。
この方式で化合物を選択することにより、腫瘍形成を治療する潜在的に有益かつ改善された化合物が医薬組成物を開発するために及び腫瘍形成を治療的に治療するために過去に可能であったものより迅速かつ正確に同定され得る。他の利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。
本発明は、また、そのような化合物を含む医薬組成物、及びそのような化合物を含む治療方法を包含する。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１Ａは硫化スリンダク又は数種のＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のＪＮＫ1の活性化を示す図である。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯ（-）又は指定した濃度（μM）の硫化スリンダク、エクシスリンド、化合物Ａ又は化合物Ｂで1時間処理した。細胞が溶解し、ＪＮＫ1が抗ＪＮＫ1抗体で免疫沈降し、免疫沈降物（『ＩＰ』）について試験管内キナーゼ活性を基質としてＧＳＴ-c-Ｊun（1-79）を用いて分析した。実験を3回繰り返し、結果は同じであった。ホスファイメージャを用いて活性化比を測定した。
図１ＢはＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のＪＮＫ1の活性化を示す図である。ＳＷ480細胞を化合物Ａ（1μM）で指定した時間処理し、試験管内ＪＮＫ1キナーゼ活性を上記のように求めた。
図１Ｃは硫化スリンダク又は数種のＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のカスパーゼ-3の活性化を示す図である。ＳＷ480細胞を硫化スリンダク（200μM）、エクシスリンド（600μM）、化合物Ａ（1μM）又は化合物Ｂ（10μM）で24時間処理した。細胞が溶解し、抽出液について基質としてＡc-ＤＥＶＤ-ＡＦＣを用いてカスパーゼ-3阻害剤Ａc-ＤＥＶＤ-ＣＨＯの存在下又は不在下にカスパース-3活性を分析した。Ａc-ＤＥＶＤ-ＣＨＯの存在下のＡＦＣ蛍光（励起；400nm、放射；505nm）をＡc-ＤＥＶＤ-ＣＨＯの不在下のＡＦＣ蛍光から引くことによりカスパース-3活性を算出した。
【００１０】
図２ＡはcＧＭＰモジュレータによるＪＮＫ1の活性化及びＰＫＧの役割を示す図である。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯ（-）か又は化合物Ａ、0.1μM；dbcＧＭＰ、500μM；ＹＣ-1、50μM；ＭＹ-5445、50μM；ジピリダモール、10μM又はdbcＡＭＰ、500μMで1時間処理した。細胞が溶解し、ＪＮＫ1が免疫沈降し、ＩＰについて試験管内キナーゼ活性を図１Ａに記載されたように分析した。
図２ＢはcＧＭＰモジュレータによるＪＮＫ1の活性化及びＰＫＧの役割を示す図である。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯ、ＫＴ5720（2μM）か又はＲp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳ（2μM）で2時間前処理してから、化合物Ｂ（0、1又は10μM）で1時間処理した。細胞が溶解し、ＩＰ中のＪＮＫ1活性化を上記のように分析した。
図３ＡはＭＥＫＫ1-ＳＥＫ1経路のＳＡＡＮＤによる活性化を示す図である。ＳＷ480細胞を化合物Ａ（1μM）で処理し、指定した時点で収集し、細胞溶解物についてＳＥＫ1活性化を抗ホスホＳＥＫ1（Thr223）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。リン酸化の比増加をデンシトメトリーにより測定した。実験を3回繰り返し、結果は同じであった。
図３ＢはＭＥＫＫ1-ＳＥＫ1経路のＳＡＡＮＤによる活性化を示す図である。ＳＷ480細胞を化合物Ａ（1μM）で処理し、1日又は2日後に収集し、細胞溶解物についてＭＥＫＫ1切断を抗ＭＥＫＫ1抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。マイナス（-）はＤＭＳＯ処理対照細胞を示す。
【００１１】
図４は化合物Ａ誘導のＲp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳによるＰＡＲＰ切断の阻止を示す図である。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯ（-）か又はＲp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳ（2μM）で前処理し、ＤＭＳＯ（-）か又は化合物Ａ（1μM）で処理した。2日後に浮遊細胞も付着細胞も収集し、細胞溶解物についてＰＡＲＰ切断を抗ＰＡＲＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。ＰＡＲＰ切断の比増加を85kＤ断片のデンシメトリーにより測定した。
図５はＳＡＡＮＤにより活性化したアポトーシスシグナル導入経路を示す図である。ＳＡＡＮＤは、ＰＤＥ2/5の阻害によってcＧＭＰの細胞内レベルの増加を誘導する。これにより、ＭＥＫＫ-1/ＳＥＫ1/ＪＮＫ1経路の活性化を生じるＰＫＧが活性化される。次に、ＪＮＫ1の活性化がカスパーゼ、ＰＡＲＰ切断及びアポトーシスを仲介する他の因子の活性化においておそらく他のシグナルと共に役割を果たす。
図６は50μM化合物Iで処理した後のＬＮＣaＰ細胞培養内のヒストン結合断片化ＤＮＡの量の時間依存性増加を示す図である。
【００１２】
図７は環状ヌクレオチド類縁体及び選択されたＰＤＥ5阻害剤に対するＰＤＥ5の非触媒cＧＭＰ結合部位の特異結合を示す棒グラフである。
図８Ａは添加cＧＭＰ不在下の薬剤処理細胞溶解物からのＳＷ480細胞溶解物のＳＤＳ（Ｘ線フィルム露光）タンパク質ゲルＰＫＧ分析である。細胞をＤＭＳＯ（0.03％、レーン1及び2）、エクシスリンド（200、400及び600μM；レーン3、3、3）及びＥ4021（0.1、1及び10μM、レーン6、7、8）で48時間培養内で処理した。
図８Ｂは添加cＧＭＰ存在下の薬剤処理細胞溶解物からのＳＷ480細胞溶解物のＳＤＳ（Ｘ線フィルム露光）タンパク質ゲルＰＫＧ分析である。細胞をＤＭＳＯ（0.03％、レーン1及び2）、エクシスリンド（200、400及び600μM；レーン3、4、5）及びＥ4021（0.1、1及び10μM、レーン6、7、8）で48時間培養内で処理した。
図９は対照に相対する新生細胞中のβ-カテニンとＰＫＧレベルに対するエクシスリンドの作用のウェスタンブロット実験の結果を示す棒グラフである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
Ｉ．ＳＡＡＮＤの特徴
Ａ．c-Ｊun及びＪＮＫ--概説
c-Ｊunは、種々の細胞外刺激剤によって活性化される転写因子ＡＰ-1の成分である。c-Ｊunの調節は複雑であり、Ｊun Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）によるc-Ｊunタンパク質及び個々のセリン（６３及び７３）のリン酸化のレベルの増加の双方に関与すると思われる。
【００１４】
ＪＮＫ活性化は、かつてはアポトーシスと関連があった。例えば、Gajate CらMol Pharmacol, 1998 Apr, 53:4, 602-12によって、ヒト腫瘍細胞においてアポトーシスの有効な誘導物質であるエーテルリン脂質1-O-オクタデシル-2-O-メチル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン（『ＥＴ-18-ＯＣＨ3』）がＪＮＫシグナリングの活性化と関連のある方法でアポトーシスを誘導することがわかった。特に、ＥＴ-18-ＯＣＨ3で処理したときに急速にアポトーシスを受ける、異なるヒト白血病細胞（ＨＬ-60、Ｕ937、及びジャーカット）にＥＴ-18-ＯＣＨ3を添加すると、アクチベータータンパク質-1転写因子の活性化と関連があるc-jun mＲＮＡレベルの劇的で持続した増加が誘導されることがわかった。ＥＴ-18-ＯＣＨ3は、アポトーシスが起こる前に検出されるＨＬ-60細胞においてＪＮＫの永続型活性化を誘導することがわかった。これは、ＤＮＡ断片化や原形質膜の外部リーフレット上のホスファチジルセリンの出現によって評価された。ＨＬ-60単球/マクロファージ分化やＥＴ-18-ＯＣＨ3仲介アポトーシス後のＪＮＫの誘導は、それぞれ異なった活性化パターン、一時的と永続的によって区別された。ＥＴ-18-ＯＣＨ3依存性ＪＮＫ活性化は、Ｋ562細胞には検出されず、ＥＴ-18-ＯＣＨ3による処理時にアポトーシスを受けなかった。ホルボールミリステートアセテートは、ＥＴ-18-ＯＣＨ3誘導アポトーシスと持続したＪＮＫ活性化の双方を阻害した。従って、ＥＴ-18-ＯＣＨ3による永続型ＪＮＫ活性化は、そのエーテルリン脂質のアポトーシス誘導能と関連があった。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、c-jun阻止ＥＴ-18-ＯＣＨ3誘導アポトーシスに対向し、ＥＴ-18-ＯＣＨ3に対するアポトーシス応答においてc-junが役割を示した。
同様に、Li Yら, Mol Cell Biol, 1998 Aug, 18:8, 4719-31には、ＵＶ刺激ＪＮＫ1活性化がＵＶ誘導ＳＣＬＣアポトーシスを促進したことが示された。
これらの報告等によって、ＪＮＫ活性化やc-Ｊunがアポトーシス誘導の経路に存在し得ることが示される。
【００１５】
Ｂ．ＳＡＡＮＤの役割ＪＮＫ経路についての確認実験の概要
上で説明したように、非ステロイド系抗炎症剤スリンダクのように、エクシスリンド（Aptosyn）のようなＳＡＡＮＤは、家族性アデノーマポリポーシス（ＦＡＰ）をもつ患者においてポリープを退縮させ再発を阻止する。エクシスリンドは、げっ歯類動物において発がんを阻止し、種々のヒトがん細胞系において増殖を阻止しアポトーシスをもたらす。しかしながら、エクシスリンドは、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ-1又は2を阻害しない。米国特許出願第09/046,739号、同第09/173,375号及び同第09/414,626号（これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする）には、エクシスリンドや他のＳＡＡＮＤが新生細胞中のcＧＭＰ加水分解ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ2/5）を阻害することにより作用し、新生細胞中のタンパク質キナーゼＧ（『ＰＫＧ』）の増加をもたらすことが開示された。
本発明においては、新生細胞中で得られた、ＳＡＡＮＤにより誘導されたcＧＭＰの増加の予想外の作用の1つがＪＮＫ経路におけるシグナル導入に対する作用であることを発見した。この所見を確認すると、硫化スリンダク、エクシスリンド及び2種の他のＳＡＡＮＤ、化合物Ａ（[(Ｚ)-5-フルオロ-2-メチル-(3,4,5-トリメチルオキシベンジリデン)-3-(Ｎ-ベンジル）インデニルアセトアミド]）及び化合物Ｂ（[(Ｚ)-5-フルオロ-2-メチル-(4-ピリジリデン)-3-(Ｎ-ベンジル）インデニルアセトアミド塩酸塩]）がそのような薬剤に曝露したＳＷ480結腸がん細胞、及び下記の薬剤に曝露した他の種類のがん細胞中のc-Ｊunアミノ末端キナーゼ1（『ＪＮＫ1』）を迅速かつ持続的に活性化することがわかった。
【００１６】
ＳＡＡＮＤのこの新規な特性を証明するために、新生細胞に対するＳＡＡＮＤの作用の1つがそのような細胞中のcＧＭＰレベルを高めることであるので、cＧＭＰの細胞レベルを高めることが既知の他の化合物も新生細胞中のＪＮＫ1を活性化することがわかった。更に、ＳＡＡＮＤ治療の作用の１つがＰＫＧ活性を高めることであるために、ＰＫＧ阻害剤、Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳは、ＰＫＧ阻害剤及び硫化スリンダクやＳＡＡＮＤのような抗新生物cＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害剤双方に曝された新生細胞においてＪＮＫ1活性化を阻害することを発見した。
ＪＮＫ1の上流であるＳＥＫ1及びＭＥＫＫ1の活性化は、新生細胞がＳＡＡＮＤに曝された場合に見られた。ＰＫＧアンタゴニスト、Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳは、ＰＡＲＰ、アポトーシスのマーカーのスリンダク誘導切断を阻害した。従って、エクシスリンドやＳＡＡＮＤによるcＧＭＰレベルの上昇は、少なくとも一部には、ＰＫＧの活性化、次にＭＥＫＫ1-ＳＥＫ1-ＪＮＫ1カスケードの活性化によってアポトーシスを誘導する。これらの研究によって、初めてＪＮＫ経路におけるcＧＭＰの役割が示された。
【００１７】
最近の研究は、上記特許出願に示されるように、ＳＡＡＮＤがcＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ2又は5（ＰＤＥ2/5）の特異的阻害剤であることを示している。これらの知見に基づき、2つの有効なＳＡＡＮＤ、化合物Ａと化合物Ｂは、ＰＤＥ5/2の特異的阻害剤であることがわかった。米国特許出願第09/046,739号及び同第09/414,626号に示されるように、ＰＤＥ5/2をＳＡＡＮＤで阻害するとcＧＭＰの細胞内レベルの上昇が誘導される。これらの知見は、cＧＭＰの細胞内レベルの上昇がアポトーシスの引き金になる重要なメカニズムであることを示しているが、下流シグナリング経路のすべてが確認されていなかった。
本明細書に示される実験において、ＳＡＡＮＤがＪＮＫ1を迅速かつ持続的に活性化させることがわかり、ＰＫＧのcＧＭＰ刺激活性化によって仲介されると我々は考える。これらの研究によって、初めてＪＮＫ1の活性化におけるＰＫＧの役割が示された。
【００１８】
Ｃ．実験の手順と結果--ＪＮＫ活性
ＳＷ480ヒト結腸がん細胞を溶媒ＤＭＳＯか又はcＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害剤（即ち、硫化スリンダク、50-500μM；エクシスリンド、100-600μM；化合物Ａ、0.1-5μM；化合物Ｂ、1-50μM）で1時間処理し、ＪＮＫ1活性化を分析した。アポトーシスの最適誘導が得られたので、これらの濃度が選ばれた。抗ＪＮＫ1抗体を用いて内在ＪＮＫ1を免疫沈降させ、基質としてＧＳＴ-c-Ｊun（1-79）を用いて試験管内キナーゼ分析を行った。図１Ａに示されるように、硫化スリンダク、エクシスリンド及び化合物Ａ及びＢはＪＮＫ1を活性化した。ホスファイメージャ分析によって比誘導を定量した。これを図１Ａに示す。非常に少量の投与量でさえ強力なＳＡＡＮＤ、化合物Ａ及びＢは硫化スリンダク又はエクシスリンドより強くＪＮＫ1を活性化した。ＨＣＴ116やＨＴ29を含む他の結腸がん細胞系で同様の効果が見られた（データは示されていない）。
経時実験から、ＳＷ480細胞を化合物Ａ（1μM）で処理した場合にＪＮＫ1活性化が少なくとも２４時間維持されることが示された（図１Ｂ）。次に、ＳＷ480細胞を同じ濃度の硫化スリンダク、エクシスリンド、化合物Ａ又は化合物Ｂで24時間処理した後にカスパーゼ-3活性を測定することによりこれらの化合物のアポトーシス活性を確認した。次に、タンパク質抽出液を調製し、カスパーゼ-3阻害剤Ａc-ＤＥＶＤ-ＣＨＯの存在下又は不在下に基質としてＡc-ＤＥＶＤ-ＡＦＣを用いてカスパーゼ-3活性を測定した。図１Ｃは、ＳＷ480細胞をこれらの化合物の全部で処理することによりカスパーゼ-3の活性化がもたらされたことを示している（データは示されていない）。
【００１９】
次に、ＳＷ480細胞中のＪＮＫ1活性に対するcＧＭＰレベルの上昇の影響を調べた。cＧＭＰの細胞内レベルは、前述の米国特許出願（8、9）に教示されているように、グアニレートシクラーゼによって正に調節され、ホスホジエステラーゼ2又は5（ＰＤＥ2/5）によって負に調節される。ＳＷ480細胞を種々のcＧＭＰモジュレータで1時間処理してから、ＪＮＫ1分析のためにタンパク質抽出液を収集した（図２Ａ）。ジブチリルグアノシン3'：5'-サイクリック一リン酸（『dbcＧＭＰ』;500μM）、細胞透過性cＧＭＰ類縁体は、ＳＷ480細胞中のＪＮＫ1を活性化したが、細胞透過性cＡＭＰ類縁体ジブチリルアデノシン3':5'-サイクリック一リン酸（dbcＡＭＰ；500μM）は不活性であった。ＹＣ-1（50μM）、グアニレートシクラーゼアクチベーターもＪＮＫ1を活性化した。ＭＹ-5445（50μM）とジピリダモール（10μM）、ＰＤＥ5特異的阻害剤もＳＷ480細胞中のＪＮＫ1を活性化した。これらのcＧＭＰモジュレーターによるＪＮＫ1の同様の活性化は、ＨＣＴ116細胞やＨＴ29細胞にも見られた（データは示されていない）。これらの結果から、種々の手段によるcＧＭＰレベルの上昇により結腸がん細胞中のＪＮＫ1の活性化がもたらされることがわかる。dbcＧＭＰはこれらの細胞中のＪＮＫ1を活性化したがdbcＡＭＰは活性化しなかったので、シグナルはcＧＭＰに特異的でありcＡＭＰに特異的でないと思われる。
【００２０】
ＰＫＧは、cＧＭＰの主要な細胞標的の１つであり、cＧＭＰ、又は上記類縁体の結合は、生体内及び試験管内双方でＰＫＧ活性を活性化する。しかしながら、シグナル導入経路におけるＰＫＧの正確な役割は不明である。本発明に至る実験の結果からcＧＭＰを高める因子がＪＮＫ1の活性化をもたらすことが示されたので、ＰＫＧ特異的阻害剤、Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰがＳＡＡＮＤのＪＮＫ1活性化誘導能を阻害し得るかを試験した。対照として、ＫＴ5720をタンパク質キナーゼＡ（『ＰＫＡ』）特異的阻害剤として用いた。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯ、ＫＴ5720（2μM）又はＲp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰ（2μM）で2時間処理してから、ＤＭＳＯ又は化合物Ｂ（1又は10μM）で1時間処理した。細胞抽出液を集め、ＪＮＫ1活性化を分析した。図２Ｂに示されるように、Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰは化合物Ｂ誘導ＪＮＫ1活性化を強く阻害するが、ＫＴ5720は阻害活性を有しなかった。纏めると、これらの結果からＳＡＡＮＤはcＧＭＰ/ＰＫＧ経路によってＪＮＫ1を活性化することがわかる。
【００２１】
上記ＪＮＫ1活性化に関与したシグナル導入経路を更に確認するために、ＳＥＫ1、ＪＮＫ1のすぐ上流のタンパク質キナーゼがＳＡＡＮＤにより活性化されるかを試験した。ＳＥＫ1の活性化は、このタンパク質、Ser219とThr223の2つの残基のリン酸化によって、タンパク質キナーゼＭＥＫＫ1により生じる。ＳＷ480細胞を化合物Ａ（1μM）で6時間までの種々の時間処理し、抽出液をホスホ-Thr223特異的ＳＥＫ1抗体を用いたウェスタンブロット分析により分析した。化合物Ａで処理すると、15〜30分以内に内在ＳＥＫ１タンパク質の全細胞レベルを変化させずにＳＥＫ1のリン酸化の増加が誘導された（図３Ａ参照）。1時間で9の比誘導があり、この作用は少なくとも6時間持続した（図３Ｂ）。細胞をＤＭＳＯ溶媒だけで処理するとＳＥＫ1のリン酸化を誘導しなかった（データは示されていない）。
【００２２】
次に、ＭＥＫＫ1、ＳＥＫ1のすぐ上流のタンパク質キナーゼに対するＳＡＡＮＤの影響を調べた。ＭＥＫＫ1タンパク質のウェスタンブロット分析から、ＳＷ480細胞を化合物Ａで1日又は2日処理した後にこのタンパク質の切断が示されたが、細胞をＤＭＳＯで処理したときには切断は見られなかった（図３Ｂ）。前の研究から、ＭＥＫＫ1がカスパーゼ（19）による活性化中に切断されることが示されている。ＭＥＫＫ1自己リン酸化及びＧＳＴ-ＳＥＫ1のリン酸化によって求められるように化合物ＡによるＭＥＫＫ1活性の強くかつ一時的な活性化も見られた。これらのデータは、ＳＡＡＮＤがＭＥＫＫ１-ＳＥＫ１経路によってＪＮＫ1を活性化することを示している。しかしながら、cＧＭＰ活性化ＰＫＧが直接ＭＥＫＫ1を活性化するか又はＭＥＫＫ1の切断や活性化がアポトーシス過程の間接的作用であるかは明らかではない。
【００２３】
最後に、ＳＡＡＮＤによるアポトーシスの誘導にはＰＫＧ経路の活性化が必要であるかを調べた。ＳＷ480細胞をＤＭＳＯか又はＰＫＧ阻害剤Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳ（2μM）で2時間処理してから、細胞をＤＭＳＯか又は化合物Ａ（1μM）で2日間処理した。浮遊細胞も付着細胞も収集し、細胞溶解物についてポリ（ＡＤＰ-リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断を抗ＰＡＲＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。ＰＡＲＰはＮＡＤをニコチンアミドとタンパク質結合ＡＤＰ-リボースポリマーに変換する116kＤ核酵素であり、ＤＮＡ修復やゲノム維持に重要である。アポトーシスを受ける細胞においては、１１６kＤ ＰＡＲＰタンパク質はカスパーゼ-3を85kＤと25kＤの断片に切断するので、正常なＰＡＲＰ機能が喪失する結果となる。このＰＡＲＰの不活性化は、アポトーシスにおける後の事象に必要であると思われる細胞レベルのＮＡＤとＡＴＰの消耗を妨げることは明らかである。図４に示されるように、化合物ＡはＰＡＲＰ切断を誘導するが、この切断は、細胞とＰＫＧ阻害剤Ｒp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳとを前インキュベートすることにより著しく阻害された。ＳＷ480細胞中の負の優性ＪＮＫ1タンパク質の発現がＰＡＲＰの化合物Ａ誘導切断を強く阻害したことも見られた。これらのデータから、cＧＭＰ/ＰＫＧ/ＪＮＫ1経路がＳＷ480細胞中でこのＳＡＡＮＤによって誘導されるアポトーシスに重要な役割を果たすことは明らかである。
従って、これらの実験において、我々は、初めて、ＳＡＡＮＤ及び他の誘導物質がシグナル導入のＪＮＫ1経路を活性化しかつこの経路がこれらの化合物によって誘導されたアポトーシスにおいて重要な役割を果たすことが明らかであることを示した。本結果に基づくスキームを図５に示す。
【００２４】
米国特許出願第09/414,626号及び同第09/216,070号には、エクシスリンド（Aptosyn）、及び2種の強力な誘導体化合物Ａ及びＢがＳＷ480細胞や他のがん由来細胞系においてcＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ2又は5を阻害し、よって細胞レベルのcＧＭＰを高めることが示された。これにより、米国特許出願第09/414,628号に教示されるようにＰＫＧの活性化がもたらされる。ＰＫＧの活性化は、図５に示されるように、30〜60分以内にＳＥＫ1の持続したリン酸化や活性化をもたらし、ＪＮＫ1の迅速かつ持続した活性化がもたらされる。ＪＮＫ1の活性化により、ＪＮＫ1を活性化する他の非ＳＡＡＮＤアポトーシス物質について前述したように、カスパーゼの活性化、ＰＡＲＰの切断及びアポトーシスプログラムに寄与する遺伝子の転写がもたらされると思われる。一部の研究者らによって、ＪＮＫ1がＵＶ又はγ放射線、ベンジルイソチオシアネート、又はＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤β-ラパコーンを含む種々の物質が引き金になるアポトーシスシグナリング経路に関係することが報告された。しかし、これらの方法はいずれもcＧＭＰ又はＰＫＧを含むことは示されていない。
ＪＮＫ1はＡＰ-1転写因子を活性化し、よってアポトーシスに関与する数種の遺伝子を誘導する。bcl-2をリン酸化するので、その抗アポトーシス活性を不活性化する。ＰＫＧの活性化は、ＳＡＡＮＤの増殖阻止やアポトーシス作用に寄与することができる他の経路に影響すると思われる。これらの研究は、シグナル導入のＪＮＫ1経路にＰＫＧが関与することを示し、よってシグナル導入のこの酵素系の役割及び遺伝子発現の制御を拡張する最初の証明である。
【００２５】
Ｄ．ＳＡＡＮＤが新生細胞においてＰＫＧ活性を高めることを更に確認する
下記のＰＫＧ分析を用いて、ＳＡＡＮＤで処理した新生細胞中のＰＫＧ発現の増強か又はcＧＭＰレベル（又はその双方）のためにＳＡＡＮＤがＰＫＧ活性を高めることを確かめるために次の実験を行った。
2種類の異なるＰＤＥ阻害剤について新生細胞中のＰＫＧに対する影響を評価した。ＳＡＡＮＤ、エクシスリンドを抗新生物性であるので評価した。また、非ＳＡＡＮＤの古典的ＰＤＥ5阻害剤、Ｅ4021を、ＰＫＧ上昇が単に古典的ＰＤＥ5阻害のためであるか、又はＰＫＧ上昇がＰＤＥ5又は1998年10月15日出願のLiuらの米国特許出願第09/173,375号に開示された新規なＰＤＥのＳＡＡＮＤ阻害のプロアポトーシス作用に関与するかを確かめるために評価した。
ＡＰＣ突然変異を含む腫瘍形成に対するcＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害作用を試験するために、ＳＷ480結腸がん細胞を用いた。ＳＷ480はＡＰＣ突然変異を含むことが既知である。ＲＰＭＩ5％血清中約5百万個のＳＷ480細胞を8個の皿のそれぞれに加える。
2個の10cm皿---30μlのDMSO賦形剤対照（薬剤を含まない）、
3個の10cm皿---DMSO中の200μM、400μM、600μMエクシスリンド、及び
3個の10cm皿---E4021; DMSO中0.1μM、1μM又は10μM。
皿を5％ＣＯ2インキュベーター中37℃で48時間インキュベートする。
【００２６】
液体培養液を皿から吸引する（細胞は皿に付着する）。付着した細胞をそれぞれの皿中で冷ＰＢＳで洗浄し、200μlの細胞溶解緩衝液（即ち、50mMトリス-ＨＣl、１％ＮＰ-40、150mM ＮaＣl、1mM ＥＤＴＡ、1mM Ｎa3ＶＯ4、1mM ＮaＦ、500μMＩＢＭＸとプロテイナーゼインヒビター）を各皿に添加する。細胞溶解緩衝液を添加した直後、各皿から細胞を削り取ることにより溶解した細胞を収集する。各皿からの細胞溶解物をミクロチューブに移し、ミクロチューブを穏やかに撹拌しつつ4℃で15分間インキュベートして細胞を完全に溶解させる。溶解が完了した後、ミクロチューブを全速（14,000r.p.m.）で15分間遠心する。各ミクロチューブからの上清を新しいミクロチューブに移す。
次に、薬剤が細胞増殖を阻害する場合には、全タンパク質量が薬剤処理試料より対照の方が多いことから各ミクロチューブの内容物についてタンパク質分析を行う。薬剤が作用する場合には、薬剤処理試料中の全タンパク質は、対照とほとんど同じでなければならない。上の状態では、対照とＥ-4021ミクロチューブは多量用量のエクシスリンド処理試料に標準化するために希釈する必要があった（少量用量グループのエクシスリンドは最大用量のエクシスリンド試料に標準化しなければならない）。従って、タンパク質分析を行った後、種々の試料の全タンパク質濃度は標準化しなければならない（例えば、希釈により）。
【００２７】
各薬剤濃度及び対照については、下で詳述されるように、2種のＰＫＧ分析が行われ、一方はcＧＭＰを添加し、一方はcＧＭＰを添加しない。これらの2種類の異なるＰＫＧ分析を行う理由は、cＧＭＰがＰＫＧを特異的に活性化するためである。ＰＫＧ活性が本発明の新規なＰＫＧ分析を用いて分析される場合には、ＰＫＧ活性の増大が細胞中のcＧＭＰの増加によるものであるか（cＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害に起因してもよい）又はＰＫＧ活性レベルがＰＫＧタンパク質の発現増強によるものであるかを確かめることができない。cＧＭＰを添加する又は添加しない同じ試料中のＰＫＧ活性を求めることにより、いずれにせよＰＫＧ活性がＰＫＧ発現の増強によるものであるかを確かめ得る。従って、抗新生物剤が対照に相対してＰＫＧ活性を高める場合には、薬剤誘導増加が薬剤処理試料中のＰＫＧタンパク質発現増強（活性化とは反対に）によるものであるかを(1)過剰のcＧＭＰが過剰のcＧＭＰを含む対照試料と比べてＰＫＧ活性が大きいか、及び(2)過剰のcＧＭＰを含まない薬剤処理試料が対照に相対してＰＫＧ活性が大きいか確かめ得る。
【００２８】
cＧＭＰを添加した又は添加しない対応試料を調製した後、50μlの各細胞溶解物を20μlの上記ＰＤＥ5/ＧＳＴ固相基質に添加する。評価されるそれぞれの対照又は薬剤細胞溶解物試料については、10μＣｉ32Ｐ-γ-ＡＴＰ溶液（200μM ＡＴＰ、4.5mM ＭｇＣl；５mM ＫＨ2ＰＯ4；５mM Ｋ2ＨＰＯ4）を含有するリン酸化緩衝液を各混合液に添加することにより反応が開始される。得られた混合液を30℃で30分間インキュベートする。次に、得られた混合液を遠心して固相を分離し、上清を捨てる。各チューブの固相を700μlの冷ＰＢＳで洗浄する。固相にレムリ試料緩衝液（Bio-Rad)(30μl)を添加する。混合液を5分間煮沸し、7.5％ＳＤＳ-ＰＡＧＥに装填する。ゲルを150Ｖで１時間行う。得られたバンドをクーマシーブルーで染色して存在する場合には85ＫdＧＳＴ-ＰＤＥ5融合タンパク質バンドを可視化する。ゲルを乾燥し、ゲルは、ＰＤＥ5がリン酸化される場合には、フィルムが対応する暗くなったバンドを示すｘ線フィルム上にある。各バンドの暗さは、リン酸化度に関連する。
図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ＳＡＡＮＤエクシスリンドは、過剰のcＧＭＰを含んだ又は含まない対照試料に相対してcＧＭＰを添加した又は添加しない試料のいずれも用量依存方式でＰＫＧ活性を高める。これは、薬剤処理試料のそれぞれにおける85Ｋdバンドの暗い出現によって証明する。更に、エクシスリンドで処理したＳＷ480試料は、エクシスリンドのみで処理した（即ち、cＧＭＰを添加していない）試料に相対した分析においてcＧＭＰを添加したＰＫＧリン酸化活性の方が大きい。従って、薬剤処理試料におけるＰＫＧ活性の増加は、ＳＡＡＮＤがcＧＭＰ特異的ＰＤＥを阻害したときの細胞cＧＭＰの増加によるＰＫＧの活性化によるものだけでなく、ＡＰＣ突然変異を含んでいる腫瘍形成におけるＰＫＧ活性の増加もＰＫＧ発現の増強によるものである。
【００２９】
また、Ｅ4021処理ＳＷ480試料が対照に相対してＰＫＧ活性化を示さないという事実は（図８Ａ及び図８Ｂを参照されたい）、ＡＰＣ突然変異を含む腫瘍形成においてＳＡＡＮＤによるＰＫＧ活性化の増大が単に古典的なＰＤＥ5の阻害によるものでないことを示している。
ＰＫＧ活性化を評価する分析手法として、上記のｘ線フィルム露光の代わりにＳＤＳ-pageからの85Ｋdバンドについてゲルからのバンドを切断することによりリン酸化度を評価し得る。取出したバンドに組込まれた32Ｐは、32Ｐ窓でのシンチレーション（β）カウンターによって計数し得る。
β-カテニンを含む腫瘍形成に対するcＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害の影響を試験するために、ＨＣＴ116結腸がん細胞を用いた。ＨＣＴ116は、β-カテニン突然変異を含み、ＡＰＣ突然変異を含まないことが既知である。
上記ＳＷ480手順と同じ手順を用いてＨＣＴ116細胞を増殖する。この実験において、エクシスリンドのみと対照を用いた。エクシスリンド処理細胞によって、対応する対照より大きい程度のリン酸化したＰＫＧが得られ、ＰＫＧ活性化がＡＰＣ突然変異に依存しない薬剤処理細胞で起こることが示された。
従って、本発明のために、特許請求の範囲の『β-カテニンを減少させる』はそのタンパク質の野生型及び/又は突然変異体を指すことを意味する。
【００３０】
Ｅ．ＳＷ480 BvウェスタンブロットにおけるＰＫＧ発現増強及びβ-カテニン減少の確認
上で示したように、ＳＡＡＮＤは、ＰＫＧ発現の増強及びcＧＭＰレベルの上昇をもたらし、いずれもＳＡＡＮＤ処理新生細胞中のＰＫＧ活性の増大をもたらす。このＰＫＧタンパク質発現の増強を、下記の相対的に定量的なウェスタンブロットによって更に証明した。
上記のエクシスリンドで処理したＳＷ480細胞を、氷冷ＰＢＳで1回すすぐことによりミクロチューブから採取する。細胞を改変ＲＩＰＡ緩衝液で15分間撹拌しつつ溶解する。細胞溶解物は低温室内で遠心沈殿する。上清を遠心直後に新しいミクロチューブに移す。試料中のタンパク質濃度を求めるためにバイオラドＤＣタンパク質分析（カリフォルニア州テメキュラ）を行う。上記のように、試料についてタンパク質濃度を標準化する。
50μgの各試料を10％ＳＤＳゲルに装填する。ＳＤＳ-ＰＡＧＡを行ってから、タンパク質をニトロセルロース膜に移す。ブロットしたニトロセルロース膜を新たに調製した5％脱脂ドライミルクを含むＴＢＳＴ中室温で1時間連続的に撹拌しつつ阻止する。
【００３１】
ヤギ抗ＰＫＧ一次抗体を新しいＴＢＳＴ/5％脱脂ドライミルクで推奨した濃度/希釈度まで希釈する。ニトロセルロース膜を一次抗体溶液に入れ、室温で1時間撹拌しつつインキュベートする。ニトロセルロース膜を10分間3回それぞれＴＢＳＴで洗浄する。ニトロセルロース膜を二次ＰＯＤ結合ウサギ抗ヤギ抗体を含む溶液中室温で1時間撹拌しつつインキュベートする。ニトロセルロース膜を10分間3回それぞれＴＢＳＴで洗浄する。ベーリンガーマンハイムＢＭブルーＰＯＤ基質を用いて検出する。
図９にグラフで示されるように、エクシスリンドはβ-カテニンの減少及びＰＫＧの増加を引き起こし、これらのデータはウェスタンブロットによって得た。ＳＷ480細胞をエクシスリンド又は賦形剤（0.1％ＤＭＳＯ）で48時間処理した。各細胞溶解物の50μg上清を10％ＳＤＳ-ゲルに装填し、ニトロセルロース膜にブロットし、膜をウサギ抗β-カテニン及びウサギ抗ＰＫＧ抗体でプローブした。
【００３２】
Ｆ．ＳＡＡＮＤは新生細胞中のβ-カテニンレベルを低下させる
これは、ＳＷ480細胞を200、400又は600μMエクシスリンド又は賦形剤（0.1％ＤＭＳＯ）と培養することにより見出された。細胞を処理の48時間後に採取し、免疫ブロッティングするために処理する。免疫反応性タンパク質は、ウェスタンブロットで検出し得る。ウェスタンブロット分析により、β-カテニンの発現が対照に比べてエクシスリンド処理細胞の50％だけ減少することが証明された。これらの結果から、β-カテニンがＳＡＡＮＤ処理により減少することが示される。そのような処理によるＰＫＧ活性増大を確かめた上記結果とβ-カテニンがＰＫＧによりリン酸化されることを確かめる下記結果と共に、これらの結果から、新生細胞中のβ-カテニンの減少がＰＫＧの活性化によって開始されることが示される。従って、抗新生物として化合物を選択するためにスクリーニングツールとして腫瘍形成においてＰＫＧ活性を用いることは有効である。
【００３３】
Ｇ．ＰＫＧによるβ-カテニンのリン酸化
試験管内で、ＰＫＧはβ-カテニンをリン酸化する。これを確かめる実験には、『β-カテニン免疫沈降』による下記の方法でＳＷ480細胞（いかなる薬剤でも処理していない）からβ-カテニン含有複合体を免疫沈降することを含んでいる。固相（即ち、ビーズ）にトラップされたままの免疫沈降複合体を32Ｐ-γ-ＡＴＰ及び純粋ＰＫＧ（100単位）と混合する。ＰＫＧを添加していない対応する対照を調製する。
タンパク質をＳＤＳ緩衝液によって固相から遊離させ、タンパク質含有混合液を7.5％ＳＤＳ-pageゲルにより実験する。混合液のゲルによる実験により、混合液から過剰量の32Ｐ-γ-ＡＴＰが除去される。従って、93Ｋdβ-カテニンバンドに検出された32Ｐ-γ-ＡＴＰは、β-カテニンのリン酸化によるものである。過剰のＰＫＧを含まない対照に相対する過剰のＰＫＧで処理した93Ｋdβ-カテニンバンドに検出された32Ｐ-γ-ＡＴＰの増加は、過剰のＰＫＧによる処理バンドのβ-カテニンのリン酸化によるものである。
得られた結果は、最少の、ほとんど検出できないリン酸化を示す対照と比べてＰＫＧで処理したバンドにリン酸化の注目すべき増加があることであった。この結果から、β-カテニンはＰＫＧによりリン酸化され得ることが示される。
【００３４】
Ｈ．突然変異β-カテニンのＰＫＧによるリン酸化
ＡＰＣ突然変異を含まず、β-カテニン突然変異を含むＨＣＴ116細胞を用いてすぐ前の項に記載された同じ手順を行った。実験の結果から、突然変異β-カテニンがＰＫＧでリン酸化されることが示される。
従って、本発明のために、特許請求の範囲中のβ-カテニンのリン酸化はそのタンパク質の野生型及び/又は突然変異体のリン酸化を指すことを意味する。
【００３５】
Ｉ．β-カテニンはＰＫＧで沈殿する
ＳＷ480とＨＣＴ116の細胞溶解物の上清を、上記ウェスタンブロット実験と同様の方法で調製する。500μgの細胞溶解物に対して150μlのプロテインＡセファロースビーズスラリー（50％）を添加し、チューブシェーカーにより4℃で10分間インキュベートすることにより細胞溶解物を前清澄する。プロテインＡビーズを14,000×g、4℃で10分間遠心分離することにより除去する。上清を新しい遠心管に移す。10μgのウサギポリクローナル抗β-カテニン抗体（Upstate Biotechnology, ニューヨーク州レイクプラシッド）を500μgの細胞溶解物に添加する。細胞溶解物/抗体混合液をチューブシェーカーにより4℃で2時間弱く混合する。150μlのプロテインＡセファロースビーズスラリー（75μl充填ビーズ）を添加し、その混合液をチューブシェーカーにより4℃で一晩弱く揺り動かすことにより、免疫複合体を捕捉する。セファロースビーズを瞬間遠心分離により収集する（ミクロ遠心機で14,000rpmにおいて5秒間）。上清部分を捨て、ビーズを800μl氷冷ＰＢＳ緩衝液で3回洗浄する。セファロースビースを150μlの2×試料緩衝液に再懸濁し、弱く混合する。セファロースビースを5分間煮沸して免疫複合体をビーズから解離する。ビーズを遠心分離により集め、上清についてＳＤＳ-ＰＡＧＥを行う。
【００３６】
ウェスタンブロットは、上清について行われ、次に、膜をウサギ抗β-カテニン抗体でプローブする。次に、膜を10分間3回それぞれＴＢＳＴで洗浄して過剰量の抗β-カテニン抗体を除去する。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ、抗ウサギ抗体を添加し、続いて室温で1時間インキュベートする。それが行われる場合、ＨＲＰＯ基質によりβ-カテニンの存在が可視化され得る。本実験においては、β-カテニンの存在がはっきりと可視化され得た。
同じ膜上にＰＫＧを検出するために、2％ＳＤＳ及び100μM 2β-メルカプトエタノールを含む62mMトリスＨＣl緩衝液（pＨ7.6）を用いて55℃の水浴中で0.5時間膜から抗β-カテニン抗体結合体をまず除去する。次に、除去した膜を5％脱脂乾燥ミルクを含むＴＢＳＴ中室温で1時間膜を撹拌しつつ阻止する。次に、阻止した除去膜を、ＨＲＰＯに結合したヤギ抗ウサギ二次抗体で検出されるウサギポリクローナル抗ＰＫＧ抗体（Calbiochem、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）でプローブする。ブロット膜上のＰＫＧの存在をＨＲＰＯ基質で可視化する。この実験において、ＰＫＧが実際に可視化された。膜上のタンパク質のみが細胞上清中のβ-カテニンで免疫沈降したものであると考えれば、この結果から、ＰＫＧが細胞上清中にβ-カテニンを含有するタンパク質複合体に物理的に結合したことが確かめられる。
【００３７】
β-カテニンで共沈降したかを確かめるために抗ＧＳＫ3-β抗体で除去した後に同じウェスタンブロット膜をプローブした。その実験では、膜上にＧＳＫ3-βも検出され、ＧＳＫ3-βがＧＳＫ3-βとＰＫＧで沈殿したことが示され、3種のタンパク質が同じ複合体の一部であってもよいことが示された。ＡＰＣ複合体ＧＳＫ3-βとβ-カテニンが正常細胞中でＡＰＣ複合体の一部をなすので、そのＰＫＧは同じ複合体の一部であってもよく、その複合体の一部としてβ-カテニンのリン酸化に関与することができる。
【００３８】
II．本発明を用いた医薬組成物をスクリーニングする
Ａ．概説
化合物を同定するためにＰＫＧ又はＰＤＥ5を含む又は含まないＰＤＥ2と組合わせたＪＮＫにより、腫瘍形成を治療又は予防するために使用し得る化合物、及び深刻な副作用を特徴としない化合物が同定される。
がん又は全がんは、無秩序な細胞増殖を含む疾患として考えられ得る。細胞増殖は、多くの異なる要因を含んでいる。1つの要因は、細胞がどのように速やかに増殖するかであり、もう1つは細胞がどのように速やかに死滅するかを含んでいる。細胞は、環境上の刺激の種類によって壊死か又はアポトーシスによって死滅し得る。細胞分化は、腫瘍増殖速度論に影響するもう1つの要因である。細胞増殖の多くの態様が化合物によって影響されることを解決することは、医薬療法の適切な標的の発見に重要である。この技術に基づくスクリーニング分析は、増殖阻止活性やプロアポトーシス活性を有する化合物を選択するために他の試験と組合わせ得る。
【００３９】
本発明は、腫瘍細胞増殖の望ましい阻害剤がアポトーシスによってがん細胞の成熟前の死滅を誘導する発見から発展した（Piazza, G.A.ら, Cancer Research, 55(14), 3110-16, 1995）。更に、予想外にも、ＣＯＸをほとんど阻害せずにアポトーシスを選択的に誘導する化合物がＰＤＥ5/2を阻害することが発見された。特に、そして主導的な化学実験と対照的に、新生物病巣を治療するのに望ましい化合物はＰＤＥ5を阻害する（ＥＣ3.1.4.17）。ＰＤＥ5は、ホスホジエステラーゼの少なくとも10の遺伝子ファミリーの１つである。ＰＤＥ5と本発明の新規なＰＤＥは、サイクリックＧＭＰを選択的に分解し、cＡＭＰを分解しない点でユニークであるが、他のファミリーのＰＤＥはcＡＭＰを選択的に分解/加水分解し、cＧＭＰを選択的に分解/加水分解せず、cＧＭＰ及びcＡＭＰ双方を非選択的に分解もする。
【００４０】
Ｂ．ＪＮＫスクリーニング
上で説明したように、上記方法を用いて新生細胞中のＪＮＫを活性化する能力について化合物を評価し得る。
【００４１】
Ｃ．ＰＫＧスクリーニング
新規な分析を用いて本発明のスクリーニング法に用いられるＰＫＧ活性を分析する。説明のために、まずＰＫＧ分析を記載した後に、腫瘍形成の治療に化合物が潜在的に有効であるかを確かめるのにＰＫＧ活性がどのように薬剤評価に用い得るかを記載することが有効である。
新規なＰＫＧ分析は、各々が少なくともcＧＭＰ結合ドメイン及びホスホジエステラーゼ型5（『ＰＤＥ5』）のリン酸化部位を含む、複数の固相アミノ酸配列に結合することを含んでいる。その配列は、既知であり、下記の文献に記載されている。好ましくは、結合したＰＤＥ5は、下記のＰＤＥ5の触媒ドメインを含んでいない。ＰＤＥ5配列を固相に結合する方法は、ＰＤＥ5配列の融合タンパク質及びアミノ酸結合対の一方としての配列を発現すること、及びそのアミノ酸結合対の一方を固相（例えば、ビーズ）に化学的に結合することである。使用し得る結合対は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（『ＧＳＴ』）とグルタチオン（『ＧＳＨ』）であり、ＧＳＴは上記ＰＤＥ5配列との融合タンパク質として発現し、ＧＳＨは固相に共有結合する。この方式で、下記のように、単に融合タンパク質を含む溶液を固相上に通すことによってＰＤＥ5配列/ＧＳＴ融合タンパク質を固相に結合し得る。
【００４２】
ＲＴ-ＰＣＲ法は、ウシＰＤＥ5Ａ cＤＮＡ配列から設計された正又は逆プライマーを含むＰＤＥ5のcＧＢドメインを得るために用いられ（McAllister-Lucas L. M.ら, J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993）、5'-3'、Inc. キットＰＤＥ1〜10ファミリーの中から全ＲＮＡの選択に続いてmＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）カラム精製をＨＴ-29細胞と共に用いる。正プライマー（GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G、203-227）や逆プライマー（CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG、1664-1686）を用いてリン酸化部位やヒトＰＤＥ5Ａ（203-1686bp、cＧＢ-ＰＤＥ5）の低親和性及び高親和性双方のcＧＭＰ結合部位をコードしている1484bp断片を合成する。合成したcＧＢ-ＰＤＥ5ヌクレオチド断片は、ウシＰＤＥ5Ａと97％類似した494アミノ酸をコードしている。次に、tacプロモーター、及びＥcoＲＩとＸhoＩ切断部位を含むpＧＥＸ-5Ｘ-3グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクター（Pharmacia Biotech）にクローン化する。次に、融合ベクターをＥ．Ｃoli ＢＬ21（ＤＥ3）細菌（Invitrogen）にトランスフェクトする。トランスフェクトしたＢＬ21細菌を対数期まで増殖してから、誘導物質としてＩＰＴＧを添加する。誘導は、20℃で24時間行われる。細菌を収集し、溶解する。可溶性細胞溶解物をＧＳＨ結合セファロース4Ｂ（GSH-セファロース4Ｂ）とインキュベートする。ＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5融合タンパク質はＧＳＨ-セファロースビーズに結合し得るし、その他のタンパク質は過剰量の冷ＰＢＳでビースから洗い流される。
【００４３】
発現したＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5融合タンパク質は、85Ｋdタンパク質として7.5％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにより示される。プロテインキナーゼＧ及びＡによるcＧＭＰ結合及びリン酸化を特徴とする。2つのcＧＭＰ結合部位を示し、ＫdはＫd＝1.3μMの未変性ウシＰＤＥ5に近い1.6±0.2μMである。ＧＳＨ結合セファロースビーズによるＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5は、cＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ及びcＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡによって試験管内でリン酸化し得る。ＰＫＧによるＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5のＫmは2.7μMであり、Ｖmaxは2.8μMであり、ＢＰＤＥtideリン酸化のＥmは68μMである。ＰＫＧによるリン酸化は、1のＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5タンパク質に取込まれた1分子のリン酸の比率を示すものである。上記ＰＤＥ5結合固相を用いてＰＫＧを含むと思われる液体試料を分析するために、試料及び固相を32Ｐ-γ-ＡＴＰを含有するリン酸化緩衝液と混合する。その溶液を30℃で30分間インキュベートし、ＰＫＧが存在するならばＰＫＧによるＰＤＥ5配列のリン酸化が起こる。次に、固相を溶液から分離（例えば、遠心分離又はろ過）し、リン酸塩緩衝食塩水（『ＰＢＳ』）で洗浄して残存する溶液を除去するとともに未処理32Ｐ-γ-ＡＴＰを除去する。
【００４４】
次に、固相を直接（液体シンチレーションカウンターで）試験して32Ｐが取込まれたかを確かめる。取込まれた場合には、ＰＫＧがＰＤＥ5をリン酸化するので試料はＰＫＧを含有したことを意味する。上記のようにＰＤＥ5が融合タンパク質を介して結合する場合には、ＰＤＥ5含有融合タンパク質をＳＤＳ緩衝液で固相から溶離し得るし、溶出液について32Ｐの取込みを分析し得る。融合タンパク質部分について32Ｐの取込みを分析し得るように溶出液は種々のタンパク質を相互に分離するために処理（例えば、ゲル分離により）し得るので、他のタンパク質が存在する可能性がある場合には特に有利である。リン酸化融合タンパク質は、ＳＤＳ緩衝液で固相から溶離し得るし、電気泳動で分割し得る。ゲル分離が行われる場合には、タンパク質はタンパク質の位置を見るために染色し得るし、ＰＫＧによる融合タンパク質のＰＤＥ5部分の32Ｐリン酸化はゲルへのＸ線フィルム露光によって測定し得る。32ＰがＸ線フィルム上に目で見える場合には、ＰＫＧがＰＫＧを含有した最初の試料中に存在し、固相から溶離した融合タンパク質のＰＤＥ5部分をリン酸化したことを意味する。
分析上好ましくは、ＰＫＧを阻害せずにプロテインキナーゼＡ（『ＰＫＡ』）を特異的かつ強力に阻害する過剰（例えば、100倍）のプロテインキナーゼインヒビター（『ＰＫＩ』）を分析緩衝液に添加しなければならない。ＰＫＡを阻害することは、ＰＫＧ基質（例えば、ＰＤＥ5）のリン酸化に寄与することができるので望ましい。ＰＫＩを添加することにより、ＰＫＡによるリン酸化への寄与が排除され、検出されるリン酸化はＰＫＧのみによると思われる。
【００４５】
ＰＫＧ分析用キットを調製し得る。そのキットは、次の前パッケージ試薬を別個の容器に含む。
１．細胞溶解緩衝液：50mMトリス-HCl、1％NP-40、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM Na3VO4、1mM NaF、500μM IBMX、プロテイナーゼインヒビター。
２．プロテインキナーゼG固相基質：組換えGST-cGB-ＰＤＥ5結合セファロース4B(50％スラリー)。
３．2×リン酸化緩衝液：32P-γ-ATP(3000mCi/ミリモル、5〜10μCi/分析)、10mM KH2PO4、10mM K2HPO4、200μM ATP、5mM MgCl2。
４．ＰＫＡプロテンキナーゼインヒビター。
上記反応を行う使い捨て容器等は、キット内に備え得る。
上記から、分析技術における当業者は、記載された分析方式を他の方式に適応させる様々な方法を容易に講じる。要するに、ＰＤＥ5（又はＰＫＧにより選択的にリン酸化し得る他のタンパク質）の少なくとも一部を用いて、ＰＫＧの存在や相対量（対照と比較した）は、標識リン酸化剤を用いてリン酸化可能タンパク質のリン酸化を評価することにより確かめ得る。
【００４６】
Ｄ．ＣＯＸスクリーニング
本発明の好適実施態様は、或る化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害活性を求める工程、及び化合物のcＧＭＰ ＰＤＥ阻害活性を求める工程を必要とする。試験化合物について、新生物病巣を治療するのに有効な既知の化合物に対して活性を比較することにより直接か又は間接に新生物病巣を治療する能力を分析する。胃の刺激を生ずることなく新生物病巣を治療するのに有効であることが既知である標準化合物は、5-フルオロ-2-メチル-1-(p-メチルスルホニルベンジリデン)-3-インデニル酢酸（『エクシスリンド』）である。比較のために他の有効な化合物としては、ＣＯＸを阻害することが既知であるもの、例えば、インドメタシンやスリンダク：5-フルオロ-2-メチル-1-(p-メチルスルフィニルベンジリデン)-3-インデニル酢酸の硫化代謝物質（『硫化スリンダク』が挙げられる。比較のために他の有効な化合物としては、cＧＭＰ特異的ＰＤＥを阻害することが既知であるもの、例えば、1-(3-クロロアニリン)-4-フェニフタラジン（『ＭＹ5445』）が挙げられる。
【００４７】
本明細書に用いられる『前がん病巣』という用語には、組織の形成異常を含む新生物の異常な変化によって示される症候群が含まれる。例としては、形成異常神経症候群の他に、病巣が臨床上確認可能であってもなくても、ポリポーシス症候群、結腸ポリープ、頚の前がん病巣（即ち、頚の形成異常）、食道、肺、前立腺形成異常、前立腺内腫瘍形成、乳房及び/又は皮膚及び関連症状（例えば、光線性角化症が挙げられる。
本明細書に用いられる『がん腫』又は『がん』という用語は、がん性である病巣を意味する。例としては、悪性メラノーマ、乳房がん、前立腺がん又は結腸がんが挙げられる。本明細書に用いられる『腫瘍形成』及び『線生物』という用語は、がん病巣及び前がん病巣双方を意味する。
本明細書に用いられる、略語ＰＧはプロスタグランジンであり；ＰＳはプロスタグランジンシンテターゼであり；ＰＧＥ2はプロスタグランジンＥ2であり；ＰＤＥはホスホジエステラーゼであり；ＣＯＸはシクロオキシゲナーゼであり；環状ヌクレオチド、ＲＩＡはラジオイムノアッセイである。
【００４８】
化合物によるＣＯＸ阻害は、2つの方法のいずれかによって求め得る。一方の方法は、スクリーンされる化合物に曝露した後の無傷ＨＬ-60細胞によるＰＧＥ2分泌を測定することを必要とする。もう一方の方法は、化合物の存在下に精製シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の活性を測定することを必要とする。いずれの方法も以前に文献に示されたプロトコールを必要とするが、好ましいプロトコールを下記に示す。プロスタグランジンＥ2（『ＰＧＥ2』）の生産を阻害するかをアマーシャム、米国イリノイ州アーリントンハイツから市販されているようなＰＧＥ2の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）キットを用いてＰＧＥ2を測定することにより求めるために化合物を評価し得る。適切な細胞としては、ＨＬ-60細胞のようなＰＧを産生させるものが含まれる。ＨＬ-60細胞は、成熟顆粒球にＤＭＳＯに分化されるヒト前骨髄球である（Collins, S.J., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.E. & Gallo, R.C.,『ジメチルスルホキシドによる分化導入後の培養ヒト前骨髄球白血病細胞（ＨＬ-６０）の正常機能特性』, J. Exp. Med., 149:969-974, 1979を参照されたい）。これらの分化細胞は、カルシウムイオノホア、A23187で刺激した後にＰＧＥ2を生産する（Kargman, S., Prasit, P. & Evans, J.F.,『ＨＬ-60細胞5-リポキシゲナーゼのトランスロケーション』, J. Biol. Chem., 266: 23745-23752, 1991を参照されたい）。ＨＬ-60は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ:ＣＣＬ240）から入手し得る。5％ＣＯ2の雰囲気中37℃で20％加熱不活性化ウシ胎児血清、50U/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンで補足したＲＰＭＩ1640培養液中で増殖し得る。骨髄分化を誘導するために、細胞を1.3％ＤＭＳＯに9日間曝露してから、洗浄し、3×106細胞/mlの濃度のダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水に再懸濁する。
【００４９】
分化ＨＬ-60細胞（3×106細胞/ml）を所望の濃度で試験される化合物の存在下に37℃で15分間インキュベートする。次に、細胞をA23187（5×10-6Ｍ）で15分間刺激する。外部培養液に分泌したＰＧＥ2を上記のように測定する。
上に示したように、化合物のＣＯＸ阻害を評価する第2の方法は、試験化合物の存在下にＣＯＸ活性を測定するものである。プロスタグランジン合成を調節するために文献には2種類の異なる形のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ-I又はＣＯＸ-2）が示されている。ＣＯＸ-2はＣＯＸの誘導形であり、ＣＯＸ-Ｉは構成形である。ＣＯＸ-I活性は、Boopathy & Balasubramanian,『ヒツジ血小板シクロオキシゲナーゼの精製と確認』（Biochem, J., 239:371-377, 1988、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）に記載された雄ヒツジ精嚢から精製したＣＯＸ-Iを用いたMitchellら（『構成性又は誘導性シクロオキシゲナーゼの阻害剤としての非ステロイド系抗炎症剤の選択』, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11693-11697, 1993、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）に記載された方法を用いて測定し得る。ＣＯＸ-2活性は、上記Mitchellら, 1993によって記載されたヒツジ胎盤から精製されたＣＯＸ-2を用いて測定し得る。
【００５０】
薬剤のシクロオキシゲナーゼ阻害活性は、当該技術において既知の方法によって求め得る。例えば、上記Boopathy & Balasubramanian, 1988には、プロスタグランジンＨシンターゼ1（Cayman Chemical、ミシガン州アンアーバ）を100μMアラキドン酸（Sigma Chemical Co.）、補助因子（例えば、100mMトリス-ＨＣl、pＨ7.4中1.0mMグルタチオン、1.0mMヒドロキノン、0.625μMヘモグロビン及び1.25mM CaCl2）及び試験すべき薬剤と37℃で20分間インキュベートする手順が記載されている。インキュベートした後、反応をトリクロロ酢酸で終結し得る。チオバルビツール酸とマロンアルデヒドを添加することにより反応を停止させた後に、酵素活性を530nmにおいて分光光度法で測定し得る。
高いＰＤＥ5/新規ＰＤＥ/ＰＤＥ2併用阻害活性に関して低いＣＯＸ-I又はＣＯＸ-2阻害活性を示す化合物が望ましい化合物であることは明らかである。
ＣＯＸ阻害量は、試験化合物の存在下又は不在下にシクロオキシゲナーゼの活性を比較することにより求められる。約100μMの濃度での残存している（即ち、約25％未満）又は全くないＣＯＸ阻害活性は、化合物が腫瘍形成を治療する有用性を評価しなければならないことを示している。
【００５１】
Ｅ．ホスホジエステラーゼ阻害活性の定量
化合物について、上記のように分離した酵素、組換え形、又は新規なＰＤＥ及び/又はＰＤＥ2をＰＤＥ5と共に本発明の新規なホスホジエステラーゼの活性に対する阻害作用をスクリーニングし得る。また、全細胞中の環状ヌクレオチドレベルをＲＩＡによって測定し、未処理又はザプリナスト処理細胞と比較した。
ホスホジエステラーゼ活性を、ＰＤＥ酵素の基質として放射性3ＨサイクリックＧＭＰ（cＧＭＰ）(サイクリック3',5'-グアノシン一リン酸)を用いた方法のような当該技術において既知の方法を用いて求め得る。(Thompson, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M., Strada, S.J., Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10:69-92, 1979、この文献の記載は本願明細書に含まれているものとする。) 概要としては、特定基質3Ｈ-cＧＭＰ特異活性（0.2μM；100,000cpm；40mMトリス-ＨＣl（pＨ8.0）、5mM ＭｇＣl2及び1mg/mlＢＳＡを含む）を400μlの全容量で試験すべき薬剤と混合する。混合液を30℃で10分間インキュベートし、本発明のＰＤＥを単離する。反応を、例えば、反応混合液を75秒間沸騰させることにより終結させる。氷で冷却した後、100μlの0.5mg/mlのヘビ毒（シグマから入手し得るO. ハナー（Hannah）毒）を添加し、30℃で10分間インキュベートする。次に、この反応をアルコール、例えば、1mlの100％メタノールを添加することにより終結させる。分析試料を1mlのダウエックス1-Ｘ8カラムに適用し、1mlの100％メタノールで洗浄する。カラムからの漏出と洗浄液中の放射能量を合わせ、シンチレーションカウンタで測定する。ホスホジエステラーゼ阻害度を、薬剤処理反応中の放射能量を算出し、対照試料（試験化合物を欠くが薬剤溶媒を含む反応混合液）と比較することにより求める。
【００５２】
また、本発明のホスホジエステラーゼを阻害する望ましい化合物の能力は、スクリーニングされる化合物に曝露した新生細胞中のcＧＭＰの増加によって反映する。ＰＤＥ活性量は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて処理細胞の抽出液中のサイクリックＧＭＰ量を分析することにより求め得る。この手順においては、ＨＴ-29又はＳＷ-480細胞を塗布し、集密まで増殖する。上に示されたように、ＳＷ-480はＰＤＥ5もＰＤＥ2も含有するので、この方式でＰＤＥ活性が評価される場合、合わせたcＧＭＰ加水分解活性が同時に分析される。次に、試験化合物を細胞培養物と約200μM〜約200pMの化合物濃度でインキュベートする。約24〜48時間後に、細胞から培養液を除去し、細胞を可溶化する。0.2Ｎ ＨＣl/50％ＭeＯＨを用いることにより反応を停止させる。試料についてタンパク質分析を除去する。サイクリックＧＭＰをダウエックスカラムのようなアニオン交換クロマトグラフィーを用いて細胞の酸/アルコール抽出液から精製する。cＧＭＰを乾燥し、発表された手順に従って、例えば、トリエチルアミン中酢酸無水物を用いてアセチル化する（Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M., J. Biol. Chem., 247(4):1106-13, 1971、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。ラジオイムノアッセイ手順を用いてアセチル化cＧＭＰを定量する（Harper, J., Brooker, G., Advances in Nucleotide Research, 10:1-33, 1979、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。誘導体化サイクリックＧＭＰのヨウ素化リガンド（チロシンメチルエステル）を抗血清と適切な緩衝液の存在下に標準物質又は未知物質とインキュベートする。環状ヌクレオチドハプテン特定手法を用いて抗血清を産生させることができる。抗血清は、スクシニル-cＧＭＰ-アルブミン結合体を注射し1/20,000に希釈したヒツジ由来である。以前に記載されているように標準曲線から用量内挿誤差解析をあてはめる（Seibert, A.F., Thompson, W.J., Taylor, A., Wilbourn, W.H., Barnard, J. & Haynes, J., J. Applied Physiol., 72:389-395, 1992、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。
【００５３】
更に、培養液を酸性にし、凍結（-70℃）し、cＧＭＰとcＡＭＰを分析することができる。
望ましい化合物による新生細胞中のcＧＭＰ含量の増加が見られるほかに、cＡＭＰ含量の低下も見られた。特に望ましい化合物（即ち、新生細胞中でアポトーシスを選択的に誘導するが正常細胞中ではほとんどしないもの）は、数分以内にcＧＭＰ含量の増加をもたらす初期作用としてcＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害と一致する時間的経過に従うことが見られた。二次的には、新生細胞を望ましい抗新生化合物で処理することによって、24時間以内にcＡＭＰ含量が低下する結果となる。薬剤作用の細胞内標的は、更に研究されているが、望ましい化合物に曝露した新生細胞においてアポトーシスの前にcＧＭＰ含量が初期上昇し続いてcＡＭＰ含量が低下することを現在のデータは支持している。
【００５４】
2つの環状ヌクレオチドの割合の変化は、cＧＭＰの絶対値だけ、cＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害だけ、又はcＧＭＰ加水分解レベルだけを測定するよりはむしろ試験化合物の望ましいcＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害活性を評価する正確な手段であることができる。抗新生物性化合物で処理していない新生細胞において、cＧＭＰ含量/cＡＭＰ含量比は0.03〜0.05の範囲内である（即ち、300〜500fmol/mgタンパク質cＧＭＰ含量に対して6000〜8000fmol/mgタンパク質cＡＭＰ含量）。望ましい抗新生物性化合物に曝露した後、その比率はサイクリックＧＭＰの初期増加とサイクリックＡＭＰのその後の減少の結果として数倍（好ましくは少なくとも約3倍の増加）高められる。
特に、特に望ましい化合物は、約500fmol/mgタンパク質より大きいレベルのcＧＭＰまで処理新生細胞中のcＧＭＰ含量の初期増加を達成することが見られた。更に、特に望ましい化合物は、約4000fmol/mgタンパク質未満のレベルのcＡＭＰまで処理新生細胞中のcＡＭＰ含量が後に低下する。
【００５５】
サイクリックＡＭＰの含量を求めるために、cＧＭＰについて上で述べたのと同じラジオイムノアッセイ法を用いる。基本的には、環状ヌクレオチドを、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて細胞の酸/アルコール抽出液から精製し、乾燥し、発表された手順に従ってアセチル化し、ラジオイムノアッセイ手順を用いて定量する。誘導体化サイクリックＡＭＰとサイクリックＧＭＰのヨウ素化リガンドを特異的抗血清と適切な緩衝液の存在下に標準物質又は未知物質とインキュベートする。
環状ヌクレオチド含量の検定は、無傷細胞中の環状ヌクレオチドの代謝回転又は蓄積を求めることにより得ることができる。無傷細胞cＡＭＰを測定するために、3Ｈアデニン前標識が発表された手順に従って使用される（Whalin, M.E., Garrett Jr., R.L., Thompson, W.J., & Strada, S.J.『無傷脳切片におけるサイクリックＡＭＰ崩壊との無細胞脳環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の相関』, Sec. Mess, & Phos. Protein Research, 12:311-325, 1989、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。その手順がサイクリックＡＭＰへの標識ＡＴＰのフラックスを測定し、特定のプロトコールによって無傷細胞アデニル酸シクラーゼ又は環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を測るために使用し得る。サイクリックＧＭＰの蓄積は、少なすぎて発表された手順に従って無傷細胞前標識によって実験できなかった（Reynolds, P.E., S.J. Strada & W.J. Thompson,『無傷細胞前標識によって測定した肺微小血管内皮細胞におけるサイクリックＧＭＰ蓄積』Life Sci., 60:909-918, 1997、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。
【００５６】
化合物のＰＤＥ阻害活性作用は、組織試料からも求め得る。ヒトからの組織生検又は麻酔した動物からの組織を、試験化合物に曝露した被検者から集める。概要としては、組織試料を500μlの6％ＴＣＡ中でホモジェナイズする。タンパク質分析用に既知量のホモジェネートを取出す。残りのホモジェネートを氷上に20分間載せてタンパク質を沈殿させる。次に、ホモジェネートを4℃、15,000ｇで30分間遠心する。上清を回収し、沈降物を回収する。上清を5容量の水飽和ジエチルエーテルで4回洗浄する。各洗浄の間にエーテル上層を捨てる。水性エーテル抽出液を高速真空中で乾燥する。一旦乾燥すると、試料は将来の使用のために凍結し得るし、直ちにも使用し得る。乾燥した抽出液を500μlの分析緩衝液に溶解する。上記のようにＲＩＡ手順を用いて環状ヌクレオチドの量を分析することによりcＧＭＰ特異的阻害量を求める。
化合物の存在下又は不在下にＰＤＥの活性を比較することにより阻害量を求める。上記cＧＭＰ ＰＤＥの阻害は、化合物が腫瘍を治療するのに有効であることを示している。基準、エクシスリンドより大きい、好ましくは10μM以下の濃度で50％より大きい顕著な阻害活性は、化合物が抗新生物特性を更に評価されるべきであることを示している。新規なＰＤＥ阻害のＩＣ50値は、化合物が潜在的使用を更に考慮するために、好ましくは50μM未満でなければならない。
【００５７】
Ｆ．化合物が腫瘍細胞増殖を減少させるかを求める
代替的実施態様においては、本発明の方法は、化合物が腫瘍細胞の増殖を減少させるかを求める工程を更に含んでいる。試験すべき組織によっては様々な細胞系が試料に使用し得る。例えば、細胞系としては、ＳＷ-480-結腸腺がん；ＨＴ-29-結腸腺がん；Ａ-427-肺腺がん；ＭＣＦ-7-乳腺がん；ＵＡＣＣ-375-メラノーマ系；及びＤＵ145-前立腺がんが挙げられる。これらの細胞系を用いて得られた細胞毒性データは、新生物病巣に対して阻害作用を示している。これらの細胞系は、十分に確認され、新規な抗がん剤のスクリーニングプログラムに米国の国立がん研究所で用いられている。
腫瘍細胞増殖を阻害する化合物の能力は、ＡＴＣＣから得られたＨＴ-29ヒト結腸がん細胞系を用いて測定し得る。ＨＴ-29細胞は、適切な結腸腫瘍細胞培養モデルとして以前に確認されている（Fogh, J. & Trempe, G. 試験管内ヒト腫瘍細胞, J. Fogh(eds.), Plenum Press, New York, pp. 115-159, 1975）。ＨＴ-29細胞は、37℃における95％空気と5％ＣＯ2の加湿雰囲気中5％ウシ胎児血清（Gemini Bioproducts、カリフォルニア州カールズバッド）及び2mmグルタミン、及び1％抗生物質-抗真菌剤で補足したＲＰＭＩ培養液中に維持される。概要としては、ＨＴ-29細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに500細胞/ウェルの密度で塗布し、化合物を添加する前に37℃で24時間インキュベートする。細胞数のそれぞれの定量は、6回の繰り返しを必要とした。培養内で6日後、10％の最終濃度まで冷トリクロロ酢酸を添加することにより細胞を固定し、タンパク質レベルをスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）比色タンパク質染色分析を用いてSkehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., & Boyd, M.R.,『抗がん剤スクリーニング用の新規な比色分析』, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990に記載されているように測定する。
【００５８】
ＳＲＢ分析のほかに、多くの方法が増殖阻止を測定するために利用でき、ＳＲＢ分析を置き換え得る。これらの方法としては、トリパン青染色後の生細胞の計数、ＢrdＵ又は放射能標識チミジンによるＤＮＡ合成可能な細胞の標識、生細胞のニュートラルレッド染色、又は生細胞のＭＴＴ染色が挙げられる。
100μM以下の用量で約50％より大きい顕著な腫瘍細胞増殖阻止は、化合物が新生物病巣に有効であることを更に示している。好ましくは、ＩＣ50値が求められ、比較のために用いられる。この値は、対照と相対して50％だけ腫瘍細胞増殖を阻害するのに必要とされる薬剤濃度である。好ましくは、ＩＣ50値は、化合物が新生物病巣を治療する潜在的使用を更に考慮するために100μM未満でなければならない。
【００５９】
Ｇ．化合物がアポトーシスを誘導するかを求める
第２の代替的実施態様においては、本発明のスクリーニング法は、化合物が腫瘍細胞の培養内でアポトーシスを誘導するかを求める工程を更に必要とする。
形態学的基準と生化学的基準によって2種類の異なる形の細胞死：壊死とアポトーシスを記載することができる。壊死は、血漿膜の透過性増加によって達成され、細胞が膨潤し、血漿膜が数分内に破壊する。アポトーシスは、膜の小疱形成、細胞質の濃縮又は内在エンドヌクレアーゼの活性化を特徴とする。
アポトーシスは、正常組織の代謝回転中や臓器と肢の胚発達中に自然に生じる。アポトーシスは、また、細胞毒性Ｔリンパ球やナチュラルキラー細胞によって、電離放射線によって又はある種の化学療法剤によって誘起される。アポトーシスの不適切な調節は、がん、エイズ、又はアルツハイマー病等を含む多くの病状に重要な役割を果たすと考えられる。上記の条件下に維持された腫瘍細胞の培養物を用いて化合物のアポトーシス誘導をスクリーニングし得る。試験化合物による細胞の処理には、集密前か又は集密後の培養物や種々の濃度での2〜7日間の処理が必要である。アポトーシス細胞は、培養物の付着した又は『浮遊した』分画双方で測定される。双方の分画は、上清を除去し、付着細胞をトリプシン処理し、双方の標品を遠心洗浄工程（10分間、2000rpm）後に合わせることにより集める。有意量のアポトーシスを得るために腫瘍細胞をスリンダク又は関連化合物で処理するプロトコールは、文献に記載されている。（Piazza, G.A.ら, Cancer Research, 55:3110-16, 1995を参照されたい。この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。新規な特徴としては、浮遊した細胞と付着した細胞双方を集めること、アポトーシスを観察するための最適処理時間と用量範囲の確認、又は最適細胞培養条件の確認が含まれる。
【００６０】
化合物で処理した後、培養物をアクリジンオレンジと臭化エチジウムで標識した後に蛍光顕微鏡でアポトーシスと壊死を分析し得る。アポトーシス細胞数を測定する方法は、Duke & Cohen,『アポトーシスの形態学的及び生化学的分析』, Current Protocols In Immunology, Coliganら, eds., 3.17.1-3.17.16(1992、この文献の記載は本願明細書に含まれている)に記載されている。
例えば、浮遊した細胞と付着した細胞を、トリプシン処理することにより集めかつＰＢＳ中で３回洗浄し得る。細胞のアリコートを遠心分離し得る．次に、沈降物を培養液に再懸濁し、アクリジンオレンジと臭化エチジウムを含む染料混合物をＰＢＳ中で調製し、弱く混合し得る。次に、混合液を顕微鏡のスライドに載せ、アポトーシスの形態学的特徴を調べ得る。
アポトーシスは、試験化合物で処理した細胞中のＤＮＡ断片化の増加を測定することにより定量化し得る。細胞質ヒストン結合ＤＮＡ断片（モノ-又はオリゴヌクレオソーム）の定量的試験管内分析用の市販の光度ＥＩＡが利用し得る（細胞死検定ＥＬＩＳＡ（okys）、Cat. No.1,774,425、ベーリンガーマンハイム）。ベーリンガーマンハイム分析は、ＤＮＡとヒストンのそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素イムノアッセイ原理に基づくものである。これにより、細胞溶解物の細胞質画分中のモノ-又はオリゴヌクレオソームの個々の定量が可能である。
【００６１】
ベンダーによれば、アポトーシスは、次の方法で測定される。試料（細胞溶解物）をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（『ＭＴＰ』）に入れる。次に、抗ヒストンビオチンと抗ＤＮＡペルオキシダーゼの結合体の混合物を添加し、2時間インキュベートする。インキュベーション時間中に、抗ヒストン抗体がヌクレオソームのヒストン成分に結合し、同時にストレプトアビジン被覆ＭＴＰにビオチニル化によって免疫複合体を固定する。更に、抗ＤＮＡペルオキシダーゼ抗体がヌクレオソームのＤＮＡ成分と反応する。洗浄工程による非結合抗体の除去後、免疫複合体に保持されたペルオキシダーゼによってヌクレオソーム量が定量される。ペルオキシダーゼを、基質としてＡＢＴＳ7（2,2'-アジド-[3-エチルベンズチアゾリンスルホネート]）を用いて光度測定で求める。
例えば、ＳＷ-480結腸腺がん細胞を、10,000/ウェルの密度で96ウェルＭＴＰに塗布する。次に、細胞を試験化合物で処理、37℃で48時間インキュベートする。インキュベートした後、ＭＴＰを遠心分離し、上清を除去する。各ウェル中の細胞沈降物を溶解緩衝液に30分間再懸濁する。次に、溶解物を遠心分離し、上清のアリコート（即ち、細胞質画分）をストレプトアビジン被覆ＭＴＰに移す。ＭＴＰ中に溶解した沈降物（即ち、断片化されていない高分子量のＤＮＡを含む細胞核）を振盪しないように注意する。次に、試料を分析する。
【００６２】
一定の濃度で試験した各化合物の比刺激（ＦＳ＝ＯＤmax/ＯＤveh）、アポトーシス応答の指標を求める。ＥＣ50値も、試験化合物の一連の濃度を評価することにより求めることができる。
統計的に有意なアポトーシスの増加（即ち、100μMの濃度の比刺激が2より大きい）は、化合物が新生物病巣を治療するのに有効であることを示している。好ましくは、アポトーシス活性のＥＣ50値は、化合物が新生物病巣を治療する潜在的使用に考慮されるのに100μM未満でなければならない。ＥＣ50は、賦形剤治療に相対してアポトーシスの50％誘導を引き起こす濃度として本明細書中で定義される。
【００６３】
Ｈ．乳腺器官培養モデル試験
上記方法によって同定される試験化合物について、乳腺器官培養系における前新生物病巣の発生を阻害する能力によって抗新生物活性を試験し得る。このマウス乳腺器官培養技術は、ある種のＮＳＡＩＤ、レイノイド、タモキシフェン、セレン、又はある種の天然産物のような既知の抗新生物剤の作用を実験するために他の研究者によって巧く使用されており、本明細書のスクリーニング法の確証に有効である。
例えば、雌ＢＡＬＢ/cマウスをエストラジオールとプロゲステロンの組合わせで毎日処理して試験管内ホルモンに応答性であるように乳腺を初回感作し得る。マウスを犠牲にし、胸管乳腺を無菌的に切除し、インスリン、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びアルドステロンで補足した増殖培地中で10日間インキュベートする。ＤＭＢＡ（7,12-ジメチルベンザアントラセン）を培地に添加して前がん病巣の形成を誘導する。次に、十分に発達した乳腺は、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びアルドステロンが欠乏し、結果として乳腺は退行するが前がん病巣は退縮しない。
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、培養期間中に培養液に添加する。培養期間の終わりに、乳腺を10％ホルマリンに固定し、ミョウバンカーミンで染色し、ガラススライド上に載せる。乳房病巣を生じる頻度は、乳房病巣を含む乳腺と病巣を含まない乳腺との比率である。試験化合物処理乳腺における乳房病巣の頻度を未処理乳腺と比較する。
乳房病巣によって占められた領域の程度を、ディジテーションパッド上に乳腺の画像を投影することにより定量し得る。乳腺によってカバーされた領域を追跡し、100％の面積とみなす。退縮していない組織のそれぞれによってカバーされた場所も、ディジテーションパッド上に示され、コンピュータで定量される。
【００６４】
III．cＧＭＰ ＰＤＥ阻害剤/ＪＮＫ1活性化剤を含む抗新生物性医薬組成物
上で説明したように、エクシスリンドは、望ましい抗新生物特性を示す化合物である。抗新生物剤としての効能と使用は、化合物が新生細胞中のcＧＭＰ特異的ＰＤＥ活性を阻害しＪＮＫ1を活性化することにより作用することが理解される前に発見された。
特に、本発明の選択プロセスがヒト治療用化合物を選択するために用い得るという検定は、新生物をもつ患者のヒト臨床試験で得られた。エクシスリンドが抗新生物性（試験管内）であったという事実後に本発明の選択基準に適合する望ましい化合物のプロファイルを有したことを理解することにより、2回のヒト臨床試験での化合物の成功によって、他の化合物を本発明の選択基準に適合して選択し得ることが決定される。
上で示したように、多くの腫瘍形成はＡＰＣ突然変異を含んでいる。特に、本発明の選択プロセスの検定は、ＡＰＣ突然変異を含む腫瘍形成をもつ患者のヒト臨床試験において決定された。
ＡＰＣ突然変異は、遺伝性腫瘍形成、腺腫性多発結腸ポリープ症（『ＡＰＣ』）をもつ患者に最初に発見された。ＡＰＣ疾患は、結腸に数百〜数千のポリープが10代に出現することを特徴とし、一般的な治療は、20代の前に結腸を外科的に切除するものである。
【００６５】
最初の臨床試験は、エクシスリンドを用いたＡＰＣをもつ患者を含んだ。その試験において、各患者は、直腸機能を保存するために直腸（小腸が結合したところ）に隣接する結腸のわずかな部分を除いて結腸がすでに除去されている。しかしながら、そのような患者は、一般的には、結腸部分が残っている小さな部分にポリープを形成し、そのポリープは周期的な除去（例えば、電気メスによる）を必要とする。
エクシスリンドが選択されたその試験は、薬剤グループとプラセボグループによる12ヶ月にわたって生じた新しいポリープの累積した数を比較することにより薬剤の抗新生物特性を評価するように設計された予防試験とした。望ましい患者は、毎年9〜44のポリープを生じるものとした。患者は、試験の始め、6ヶ月の終わり及び12ヶ月の終わりに完全に切除した（すべてのポリープを切除した）。試験によって34人の患者を登録した。病歴に毎年9〜44のポリープを生じるＡＰＣ患者において1年間に生じるポリープの推定平均数に基づき、エクシスリンドがポリープ形成速度を低下させる点でプラセボより臨床的かつ統計的に著しく良好であった。試験の最初の6ヶ月に生じたポリープのメジアン数に基づき、エクシスリンドで治療した患者は、プラセボで治療した患者のポリープ数の約1/3であった（メジアン値はそれぞれ9ポリープ/年と26ポリープ/年；p＝0.013）。試験の全12ヶ月間で生じたポリープのメジアン数に基づき、エクシスリンドで治療した患者は、プラセボで治療した患者のポリープ数の約1/2であった（メジアン値はそれぞれ18ポリープ/年と38ポリープ/年；p＝0.020）。
【００６６】
別の臨床試験は、前立腺がんに罹った男性患者で行い、結果として前立腺を切除した。試験は、前立腺がんの再発を意味する、根治前立腺切除術後に上昇する検出可能なＰＳＡ（前立腺特異抗原）レベルをもつ患者で行った。
前立腺がん評価：二重盲検、プラセボ制御、500mg/日で薬剤投与患者に投与したエクシスリンドを含む多施設試験に96人の患者を登録した。下記に示されるように、データは、エクシスリンド治療グループとプラセボ治療グループ間にＰＳＡレベルの統計的に有意な差を示している。エクシスリンド治療グループのＰＳＡレベルは、プラセボ治療グループのＰＳＡレベルと比べて顕著に低下した。ＰＳＡの上昇レベルがそれ自体病態ではないが、そのような人に前立腺がんの再発の存在を示す代用薬マーカーとして医学界では広くみなされている。
全体としてエクシスリンドグループとプラセボグループ間の平均ＰＳＡレベルの差に基づく評価のほかに、中間分析としてはサブグループ分析が含まれる。試験の患者を、転移性疾患を生じるリスクによって高リスクグループ、中間リスクグループ又は低リスクグループに分類した。この分類は、Jornal of the American Medical Association（JAMA May 5, 1999, pp. 1591-97）に発表された方法を用いて行った。試験患者がリスクグループに入ったことを確かめるために、患者が薬剤か又はプラセボを投与中であるかについて知らされていない研究者に病歴が与えられた。彼は、上で引用した方法に従って適切なリスクグループに試験患者を割り当てた。統計的分析から、高リスクグループと中間リスクグループ双方におけるエクシスリンド患者とプラセボ患者間の平均ＰＳＡレベルの統計的に有意な差がわかった。
前立腺試験からのデータは次の通りである。
【００６７】
表１
ＰＳＡが上昇する前立腺切除術後の男性における
平均ＰＳＡレベルに対するエクシスリンドの影響
0003725800.tif 000002
【００６８】
エクシスリンド試験は他の徴候での薬剤を含む他のいくつかの試験においては、不利な因子（ＡＥ）、臨床検査試験（血液学、血清化学、又は尿検査）、生徴候（血圧、脈拍、呼吸数、体温、又は体重）、身体検査、又は上方内視鏡をモニターすることにより安全性を評価した。
目だった安全性の課題は、400人を超える患者に現在までエクシスリンドで行われた臨床試験では示されなかった。エクシスリンドには、血液疾患、用量制限嘔吐、又は従来の化学療法剤に伴う神経学的又は腎毒性が示されなかった。また、生徴候に臨床的に有意な変化を生じなかった。実際に、ＡＰＣ患者のポリープと正常結腸組織の対の生検において、エクシスリンドはポリープのアポトーシス率を高めたが、正常結腸組織では高めず、正常組織に対しては最少作用を示すことがわかった。
最大許容量より多い用量（部分的結腸切除の患者にはＭＴＤ＝600mg；無傷結腸の患者には400mg；小児科の患者には350mg）に見られる用量を制限する不利な因子は、治療中の初期にみられる肝機能検査（ＬＦＴ）の上昇であった。経験した場合、ＬＦＴ上昇は速やかに戻り、用量を少なくした場合、再発しない。
【００６９】
他の因子（例えば、ときどきの腹痛）は、典型的には短時間であり、弱いものから中程度の強さであり、エクシスリンド用量を中断したり少なくしたりすることを必要としなかった。
要するに、試験は、エクシスリンドが腫瘍形成の臨床管理に有効な十分に許容された長期にわたる治療法であることが示された。従って、これらの結果は、cＧＭＰ特異的ＰＤＥ活性を特に阻害する化合物を更に選択すること（及び本発明の他の選択基準に適合すること）が生体内で治療的に有効な薬剤になり得ることを示している。
作用メカニズムがcＧＭＰ阻害を含むことがわかる前に及び本発明の選択基準に適合することが知られる前に発明された第2の薬剤は、化合物Ｂである。広範囲の腫瘍形成に対して活性を有する抗新生物剤として試験管内又は生体内評価において証明された。動物実験及び単一の段階的用量ヒト実験においても安全である。
当業者が下記に示されるデータから認識するように、化合物Ｂは従来の化学療法剤又は抗新生物剤ＮＳＡＩＤの許容量（及び多くの場合に毒性量）をはるかに超える用量で動物に安全に投与し得る。例えば、ラットにおける急性毒性試験において、2000mg/kgまで又は2000mg/kgを含む用量で投与した（0.5％カルボキシメチルセルロース賦形剤）化合物Ｂの1回の経口投与量により、毒性の観察しうる徴候は生じなかった。4000mg/kgにおいて、体重増加分がわずかに減少した。腹腔内に投与した1000mg/kgの1回の用量により、体重増加分の減少が生じ、剖検においてこのグループの一部の動物に腸間膜癒着が見られた。
【００７０】
イヌにおいて、1000mg/kgのカプセルで化合物Ｂを投与すると、2匹の雄と2匹の雌のイヌの1つのグループに毒性の徴候が見られなかった。化合物Ｂカプセルの種類によっては、各イヌに少なくとも13カプセルの使用を必要とし、これはイヌにストレスを受けない最大数であると判断した。従って、続いてイヌに1000mg/kg/日の逐次用量を７回投与した。いずれの投与期のときも観察される薬剤関連作用の明らかな徴候はなかった。
従って、1回の用量に基づき、化合物Ｂは急性毒性ではない。これらの試験の知見に基づき、化合物Ｂの経口ＬＤ50を、イヌにおいて1000mg/kgより大きく、ラットにおいて4000mg/kgより大きいとみなし、腹腔内ＬＤ50は、ラットにおいて1000mg/kgより大きいとみなした。
ラットにおける7日間の用量範囲の所見試験の場合、化合物Ｂを0、50、500又は2000mg/kg/日の用量で投与することにより評価し、50mg/kg/日において毒性の観察し得る徴候は生じなかった。500mg/kg/日における治療関連作用は、雌ラットの絶対肝重量又は相対肝重量の増加に限られた。2000mg/kg/日の作用は、雄ラットにおいて呼吸困難及び/又は異常呼吸音、体重増加分の減少又は摂食量の減少、又は雌ラットにおいて肝重量の増加が含まれた。いずれの用量レベルにおいても血液学的又は血液の化学変化も顕微鏡的病理変化も見られなかった。
【００７１】
ラットにおける28日間の実験は、0、50、500及び2000mg/kg/日で行った。化合物Ｂによる異常な臨床所見はなく、体重の変化、検眼鏡試験、血液学又は血液化学値及び尿検査は目立たなかった。肉眼的組織変化は、剖検で見られなかった。臓器重量データから、2000mg/kg/日に肝重量が統計的に顕著に増加し、2000mg/kg/日グループの甲状腺重量が統計的に顕著に増加した。少量の用量でのわずかな増加は、統計的に有意ではなかった。組織の組織病理的評価によって、小胞細胞肥大の痕跡の存在、甲状腺における有糸分裂像の数の増加（可能な細胞増殖を暗示する）及び肝臓における小葉中心付近の肥大が示された。これらの変化は、一般的には、2000mg/kg/日用量の少数の動物に限定されたが、500mg/kg/日の雌が甲状腺の有糸分裂像を増加した。肝臓の知見は、ミクロソーム酵素の非常に弱い刺激を示すものであり、結果として甲状腺ホルモンの代謝が高められ、甲状腺刺激を生じた。従って、当業者は、これらの作用が従来の化学療法剤又はＮＳＡＩＤの同様の用量で予想されるものに比べて非常に小さいことを認識する。
【００７２】
化合物Ｂの安全性プロファイルを更に確かめるために、前立腺腫瘍細胞系の化合物Ｂ誘導アポトーシスが正常組織由来の前立腺内皮細胞に対する作用に匹敵するものであるかを評価するために実験を行った。アンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞系、ＬＮＣaＰ（ＡＴＣＣ（メリーランド州ロックビル））を5％ウシ胎児血清及び2mMグルタミンを含むＲＰＭＩ160培養液を用いて標準条件下に増殖した。正常前立腺由来の前立腺内皮細胞初代培養物（ＰrＥＣ）（クロネチクス社（Clonetics Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)）を、その培養物の増殖に最適化した無血清培養液（クロネチクス社）を用いた以外は腫瘍細胞系と同じ条件下で増殖した。実験のために、ＬＮＣaＰ又はＰrＥＣ細胞を10,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を賦形剤（0.1％ＤＭＳＯ）か又はＤＭＳＯに可溶化した50μM化合物Ｂ（遊離塩基）で処理した。各薬剤処理（4、24、48、72、又は99時間）後に、アポトーシス細胞死の指標としてヒストン結合ＤＮＡの測定のために細胞を処理した（Piazzaら, Cancer Research 57:2452-2459, 1997を参照されたい）。
【００７３】
図６は、50μM化合物Ｂ（遊離塩基）で処理後のＬＮＣaＰ細胞培養物内のヒストン結合断片化ＤＮＡ量の時間依存性増加を示すグラフである。処理の24時間後に断片化ＤＮＡの顕著な増加が検出され、連続処理の4日間まで誘導が維持された。対照的に、化合物Ｂ（50μM）によるＰrＥＣ（『正常』前立腺）の処理は、処理の4日間までＤＮＡ断片化に影響しなかった。これらの結果から、正常細胞とは反対に新生細胞中の選択的アポトーシス誘導が示される。これは、正常細胞も新生細胞も同様に急速に増殖する点でアポトーシス又は壊死を誘導する従来の化学療法剤と著しく対照的である。
最後に安全性について、薬剤を経口的に摂取した1回の増加する用量のヒト臨床試験、患者、ヒト安全性実験において、化合物Ｂは抗がん作用を生じるのに必要であると予想されるレベルより多い用量を含むいずれの用量においてもほとんど副作用を示さなかった。
上で示したように、化合物Ｂは、強力な抗新生物特性を示す。化合物Ｂについて得られた増殖阻止ＩＣ50値は、ＳＷ-480細胞系で0.7μMであった。この結果は、発がんの指標として異常小嚢腺病巣（『ＡＣＦ』）を用いたげっ歯類動物において化合物Ｂを評価することにより確認された（Bird, Cancer Lett. 37:147-151, 1987）。このアゾキシメタン（『ＡＯＭ』）誘導発がんの確立したげっ歯類動物モデルを用いて生体内で結腸がん発生に対する化合物Ｂ（遊離塩基と塩）の影響を評価した。ＡＣＦは結腸腫瘍の前駆物質であり、ＡＣＦ阻害は化学予防効力が予想される。
【００７４】
本実験のラットにおいては、発がんの2回の週1回の注射によってＡＣＦ開始を行った。ＡＣＦ開始の1週間前と実験の期間中に化合物Ｂを投与した。治療の5週間後にＡＣＦを記録した。化合物Ｂを雄フィッシャ344ラットにラットの食事で経口投与した。毎日の食事の消費（mg/kg体重）が実験の過程で変化したので、化合物Ｂの用量を食事のｋｇあたりのグラムを表して用量間の比較基準とした。化合物Ｂが増殖及び/又は摂食挙動に対して不利な作用を有するかを求めるために、実験の過程を通して体重を測った。実験グループは対照より体重が減り、生体利用性を示した。しかしながら、体重差は、10％未満であり、ＡＣＦ形成に影響すると考えられなかった。
化合物Ｂの遊離塩基は、結腸に対する小嚢腺の減少によって測定されるようにＡＣＦ形成を阻害した。データを表2に纏める。少量の用量グループ（わずか0.5g/kg食事）を除いて、治療グループと対照グループ間の差は、かなりあり、1.0と2.0g/kg食事グループの場合には統計的に有意であった。
【００７５】
表2
化合物Bによる異常小嚢腺病巣の阻害
0003725800.tif 000003
【００７６】
また、化合物Ｂは、本発明の選択基準に遡及的に適合し、この選択基準の妥当性を確立するために用いた化合物の１種であった。例えば、以前に記載されたプロトコールを用いた化合物ＢのcＧＭＰ特異的ＰＤＥ ＩＣ50値は、ＨＴ29細胞抽出液由来のcＧＭＰ特異的ＰＤＥを用いて0.68であった。そのＣＯＸ Ｉ阻害（100μMにおける）は25％未満であった。
プロアポトーシスのように、化合物ＢのＤＮＡ断片化ＥＣ50は15μMであった。更に、種々の薬剤濃度でのＳＷ-480における化合物Ｂのアポトーシス％を表3に示す。
【００７７】
表3
形態学によって求めた化合物ＢによるＳＷ-480
結腸腺がん細胞のＨＴ-29のアポトーシス誘導
0003725800.tif 000004
【００７８】
化合物の活性は、結腸がん細胞系又は結腸がんの動物モデルに対する活性に限定されない。種々の新生細胞系において広範囲の抗新生物作用を有する。さまざまな種類のヒトがん細胞系を10％ウシ胎児血清、2mM Ｌ-グルタミン及び重炭酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ 1640培養液中で無菌条件下に増殖した。化合物Ｂの増殖阻止作用を求めるために、細胞を96ウェルプレートに1000細胞/ウェルの密度で播種した。塗布した24時間後に、細胞にＤＭＳＯに可溶化した化合物Ｂの遊離塩基の種々の濃度を投与した（最終濃度0.1％）。腫瘍細胞増殖に対する薬剤の影響を、連続処理した5日後にニュートラルレッド細胞毒性を用いて求めた。ニュートラルレッドは、ＡＴＰ依存性輸送メカニズムによる生細胞によって選択的に吸収される色素である。
表4に纏められるように、化合物Ｂ（遊離塩基）によって、種々の組織起原由来の培養細胞系のパネルに対して評価した場合の強力な増殖阻止活性が示された。化合物Ｂによって、細胞系が由来する腫瘍の組織発生に関係なく匹敵する増殖阻止作用が示された。すべての細胞系について算出されたＧＩ50値（賦形剤対照に相対して50％だけ増殖を阻害する薬剤濃度）は、1〜2μMであった。
下記表のデータのほかに、化合物Ｂ（ＨＣl塩）に対するヒト白血病細胞系（ＣＣＲＦ-ＣＥＭ、Ｋ562、及びＭolt-4）、ミエローマ細胞系（ＲＰＭＩ8226）、膵臓腫瘍細胞（ＰＡＮ-1）、及び卵巣腫瘍細胞系（ＯＶＣＡＲ-3）の匹敵する感受性も見出された。
【００７９】
表4
化合物Ｂによる種々のヒト腫瘍細胞系の増殖阻止
0003725800.tif 000005
* 試験がHCl塩で行われた星印の付いたものでない限り試験は化合物の遊離塩基で行った。
【００８０】
動物やヒトの安全特性、及び化合物Ｂの動物や非常に広範囲の細胞培養効能を考えると、本発明の選択基準（cＧＭＰ特異的ＰＤＥ阻害を含む）に適合する化合物が有効な抗新生物治療剤であり得ることは明らかである。
抗新生物剤として治療的に有効であり得る構造的にcＧＭＰ特異的なＰＤＥ阻害化合物を更に同定することについて、当業者は、同じコンホメーションを有するが化学的に異なる追加の化合物のコンピュータモデリングのベースとして使用し得る本明細書に開示された多くの有効なモデル化合物（及び本願明細書に含まれるそれらの類縁体）を有する。例えば、モレキュラーシミュレーション社（Molecular Simulation Inc.）リリースのWebLab(登録商標)ViewerPro(登録商標)によって販売されたようなソフトウェアとしては、分子の視覚化性能やケミカルコミュニケーション性能が挙げられる。そのようなソフトウェアには、正確さを保つためにスケッチした又は移入した化学構造を確かめるために既知の活性化合物の3Ｄ視覚化を含む機能性が含まれる。更に、ソフトウェアは、使用者が決めた特徴に基づいて構造を上書きされることを可能にし、使用者は、距離、角度、又は二面体を測定し得る。
【００８１】
この状態において、他の活性化合物の構造が上で開示されたので、新規な潜在的化合物を更に同定し、次に本発明の選択基準に従ってスクリーニング及び選択し得るようにクラスタ分析及びそのようなソフトウェアによる2Ｄや3Ｄの類似性探索法が適用され得る。これらのソフトウェア法は、同じように見え、同様の性質ももつ化合物が同様の活性をもつと思われる原理によるものであり、本発明の選択基準を用いて確認され得る。
同様に、そのような化合物が更にコンピュータモデルとなる場合、多くのそのような化合物及びその変形は、医薬工業における当業者によって一般に用いられる既知のコンビナトリアルケミストリー法を用いて合成され得る。いくつかの賃貸のコンビナトリアルケミストリーサービスの例としては、ワシントン州ボーゼルのニューケミカルエンティティーズ社（New Chemical Entities, Inc.）、カリフォルニア州パロアルトのプロトジーンラボラトリーズ社（Protogene Laboratories, Inc.）、カリフォルニア州の南サンフランシスコのアクシス社（Axys, Inc.）、アリゾナ州トゥーソンのナノシン社（Nanosyn, Inc.）、カリフォルニア州サンディエゴのトレガ社（Trega, Inc.）、及びマサチューセッツ州ナティックのＲＢＩ社によって提供されたものが挙げられる。多くの他の賃貸会社がある。多くの大きな製薬会社は、優れているとまではいかないが同様の企業内能力をもっている。要するに、当業者は、本明細書に開示された化合物の本来の性質をもつ腫瘍形成の治療に有望な化合物を選択するためにスクリーニングする多くの化合物を容易に製造し得る。
【００８２】
本発明の基準を用いてスクリーニングされてから選択され得る化合物を同定するのに更に援助するために、選択された抗新生物性化合物のＰＤＥ5タンパク質への結合を知ることは興味深いことである。下で述べる手順によって、本発明の選択基準に適合する好ましい望ましい化合物がＰＤＥ5のcＧＭＰ触媒領域に結合することがわかった。
このことを確立するために、触媒ドメインを含まないＰＤＥ5配列を用いた。そのような配列を作製する方法は、明らかになる理由で、好ましくはグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（『ＧＳＴ』）との融合タンパク質としての配列を発現させることである。
【００８３】
ＲＴ-ＰＣＲ法は、ウシＰＤＥ5Ａ cＤＮＡ配列（McAllister-Lucas L. M.ら, J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993）及びＰＤＥ1-10ファミリーからの選択から設計された前向き又は逆向きプライマーを含むＰＤＥ5のcＧＢドメインを得るために用いられる。mＲＮＡのオリゴ（dＴ）カラム精製が続く全ＲＮＡの5'-3', Inc. キットは、ＨＴ-29細胞と用いられる。前向きプライマー（GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G. 203-227）及び逆向きプライマー（CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664-1686）は、リン酸化部位をコードする1464bp断片及びヒトＰＤＥ5Ａの低又は高親和性cＧＭＰ結合部位（203-1686bp、cＧＢ-ＰＤＥ5）を合成するために用いられる。合成したcＧＢ-ＰＤＥ5ヌクレオチド断片は、ウシＰＤＥ5Ａに97％類似性をもつ494アミノ酸をコードしている。次に、tacプロモーター、及びＥcoＲＩ及びＸhoＩ切断部位を含むpＧＥＸ-5Ｘ-3グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクター（Pharmacia Biotech）の中へクローン化する。次に、融合ベクターをＥ．Ｃoli ＢＬ21（ＤＥ3）細菌（Invitrogen）へトランスフェクトする。トランスフェクトしたＢＬ21細菌を対数期まで増殖し、次に、ＩＰＴＧをインデューサーとして添加する。誘導は、20℃で24時間行われる。細菌を取り出し、溶解する。可溶性細胞溶解物をＧＳＨ結合セファロース4Ｂ（ＧＳＨ-セファロース4Ｂ）とインキュベートする。ＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5融合タンパク質は、ＧＳＨ-セファロースビーズに結合し得るし、他のタンパク質は、過剰の冷ＰＢＳでビーズから洗い流す。
【００８４】
発現したＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5融合タンパク質は、85Ｋdタンパク質として7.5％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにより示される。cＧＭＰ結合及びタンパク質キナーゼＧ及びＡによるリン酸化によって確認される。２つのcＧＭＰ結合部位を示し、Ｋｄは1.6±0.2μMであり、未変性ウシＰＤＥ5のＫｄ＝1.3μMに近い。ＧＳＨ結合セファロースビーズ上のＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5は、cＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ及びcＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡによって試験管内でリン酸化し得る。ＰＫＧによるＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5リン酸化のＫｍは2.7μMであり、Ｖmaxは2.8μMであり、ＢＰＤＥtideリン酸化のＫｍは68μMである。ＰＫＧによるリン酸化は、1/1比でＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5に取込まれた分子のリン酸を示している。
問題の化合物のcＧＭＰ結合分析（Francis S. H.ら, J. Biol. Chem. 255, 620-626, 1980）は、5mMリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ＝6.8）、1mM ＥＤＴＡ、0.25mg/ml ＢＳＡ、Ｈ3-cＧＭＰ（2μM、ＮＥＮ）及びＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5（30μg/分析）を含む全量100μl中で行われる。試験すべき各化合物を3Ｈ-cＧＭＰ基質と同時に添加し、混合液を22℃で1時間インキュベートする。次に、混合液をフィルター膜としてＧＦ/Ｂを有するブランデルＭＢ-24細胞ハーベスターに移し、続いて10mlの冷5mMカリウム緩衝液（pＨ6.8）で洗浄する。次に、膜を除去し、シンチレーションバイアルに移した後に各バイアルに1mlのＨ2Ｏ及び6mlのReady Safe(登録商標)液体シンチレーション反応混液を添加する。ベックマンＬＳ 6500シンチレーションカウンターによりバイアルを計数する。
【００８５】
計算のために、結合タンパク質を5分間煮沸することによりブランク試料を調製し、煮沸しないタンパク質と比べた場合に結合計数は＜1％である。フィルター膜又は他の破片による急冷も調整される。
ＰＤＥ5阻害剤、スルフィド、エクシスリンド、化合物Ｂ、化合物Ａ、Ｅ4021及びザプリナスト、及び環状ヌクレオチド類縁体、cＡＭＰ、サクリックＩＭＰ、8-ブロモcＧＭＰ、サイクリックＵＭＰ、サイクリックＣＭＰ、8-ブロモcＡＭＰ、2'-Ｏ-ブチルcＧＭＰ及び2'-Ｏ-ブチルcＡＭＰを、ＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5タンパク質のcＧＭＰ結合部位に競合的に結合し得るかを試験するために選択する。結果を図３Ｂに示した。cＧＭＰは、ＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5タンパク質を特異的に結合する。サイクリックＡＭＰ、cＵＭＰ、cＣＭＰ、8-ブロモcＡＭＰ、2'-Ｏ-ブチルcＡＭＰ及び2'-Ｏ-ブチルcＧＭＰは、結合にはcＧＭＰと競合しなかった。高濃度（100μM）のサイクリックＩＭＰ及び8-ブロモcＧＭＰは、cＧＭＰ（2μM）結合と部分的に競合し得る。ＰＤＥ5阻害剤はいずれもＧＳＴ-cＧＢ-ＰＤＥ5の結合にcＧＭＰと競合しなかった。従って、ＰＤＥ5のcＧＭＰ結合部位に結合しない。
【００８６】
しかしながら、化合物Ａは、ＰＤＥ5に競合的に（cＧＭＰと）結合する（即ち、ピークＡ）。（化合物ＡもＰＤＥピークＢに競合的に（cＧＭＰと）結合する。）化合物ＡがＰＤＥ5のcＧＭＰ結合部位に結合しないと考えられること、及び化合物ＡとcＧＭＰ間にすべて競合結合があるという事実は、化合物Ａのような望ましい化合物がＰＤＥ5上のcＧＭＰ触媒部位に結合することを意味し、その情報は当業者に容易に入手できるが他の化合物をモデルにするために容易に当業者を援助し得る。従って、本明細書に示される望ましい化合物の化学構造及びcＧＭＰ結合部位情報とともに、当業者は、治療剤として用いられる他の化学化合物をモデルにし、同定し、選択（本発明の選択基準を用いて）し得る。
本発明の方法に従って選択される化合物は、『医薬組成物』という用語の通常の意味から十分に理解される場合の医薬組成物、即ち、固体又は液体として経口投与することにより、液体としてＩＶ又はＩＰ投与することにより、軟膏として局所投与することにより、又は坐薬製剤として直腸又は局所投与することにより患者に送達するための化合物（例えば、上記固形分のような）及び薬学的に許容しうる担体に処方することができる。経口投与用の担体が最も好ましい。
【００８７】
当該技術において周知であるように、経口投与用の医薬組成物中の薬学的に許容しうる担体としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤又は顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形においては、担体は、スクロース、ラクトース又はデンプンのような少なくとも１種の不活性希釈剤を含み得る。そのような担体は、通常の実施である場合、希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も含み得る。錠剤、丸剤又は顆粒剤のような担体は、錠剤、丸剤又は顆粒剤の表面に腸溶剤皮で施され得る。また、腸溶剤皮が施された化合物は、錠剤、丸剤、又は顆粒剤、及び患者に投与するための錠剤、丸剤又は顆粒剤に圧縮され得る。好ましい腸溶剤皮としては、シェラック又はユードラゲットＳのような結腸pＨで溶解又は崩壊するものが含まれる。
医薬組成物中の薬学的に許容しうる担体としては、経口投与用の液体剤形、例えば、水のような当該技術において一般に用いられる不活性希釈剤を含む薬学的に許容しうる乳剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤又はエリキシル剤が含まれる。そのような不活性希釈剤のほかに、組成物としては、湿潤剤、乳化剤又は沈殿防止剤、又は甘味剤、香味剤又は香料のような補助剤が含まれ得る。
ＩＶ又はＩＰ投与用の医薬組成物中の薬学的に許容しうる担体としては、一般用医薬品の生理食塩水が含まれる。
局所投与用の医薬組成物中の薬学的に許容しうる担体としては、貼布剤又は薬剤が乾燥しないように皮膚の定位置に薬剤を保つ他の液体保持材料と用い得るＤＭＳＯ、アルコール又はプロピレングリコール等が含まれる。
【００８８】
好ましくは坐薬である直腸投与用の医薬組成物中の薬学的に許容しうる担体は、本発明の化合物のほかにカカオ脂又は坐薬ワックスような賦形剤、又はゲルを含有することができる。単位用量中の活性成分の用量レベル（即ち、本発明に従って選択された化合物）は、所望の投与方法（即ち、経口又は直腸）に従って先生物除去活性を達成するのに効果的な有効成分量を得るように変動することができる。従って、選択された用量レベルは、投与される活性化合物の種類（例えば、容易に確認され得るＩＣ50）、投与経路、所望の治療期間、及び他の要因に依存する。所望される場合には、単位用量は、活性化合物が１日１回の投与に、又は数回に分けて、例えば、１日2〜4回に要求されるような量であってもよい。ＩＶ投与については、投与の初回用量は、平均成人男性の血漿内容物（即ち、約4リットル）中のＩＣ50を得る用量に基づくことにより確認され得る。本発明に従って選択された活性化合物の初回用量は、0.5〜600mgの範囲にあり得る。
本発明の医薬組成物は、効能書、使い方らを含む適切な印刷物（例えば、添付文書）を含む容器にパッケージされることが好ましい。
上記教示からして本発明の多くの修正及び変更が可能であることは明らかである。従って、前述の特許請求の範囲内で本発明が本明細書に特に記載されたもの以外の方法で実施することができることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】硫化スリンダク又は数種のＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のＪＮＫ1の活性化を示す図である。
【図１Ｂ】ＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のＪＮＫ1の活性化を示す図である。
【図１Ｃ】硫化スリンダク又は数種のＳＡＡＮＤに曝露したＳＷ480結腸がん細胞中のカスパーゼ-3の活性化を示す図である。
【図２Ａ】  cＧＭＰモジュレータによるＪＮＫ1の活性化及びＰＫＧの役割を示す図である。
【図２Ｂ】    cＧＭＰモジュレータによるＪＮＫ1の活性化及びＰＫＧの役割を示す図である。
【図３Ａ】ＭＥＫＫ1-ＳＥＫ1経路のＳＡＡＮＤによる活性化を示す図である。
【図３Ｂ】ＭＥＫＫ1-ＳＥＫ1経路のＳＡＡＮＤによる活性化を示す図である。
【図４】化合物Ａ誘導のＲp-8-pＣＰＴ-cＧＭＰＳによるＰＡＲＰ切断の阻止を示す図である。
【図５】ＳＡＡＮＤにより活性化したアポトーシスシグナル導入経路を示す図である。
【図６】  50μM化合物Iで処理した後のＬＮＣaＰ細胞培養内のヒストン結合断片化ＤＮＡの量の時間依存性増加を示す図である。
【図７】環状ヌクレオチド類縁体及び選択されたＰＤＥ5阻害剤に対するＰＤＥ5の非触媒cＧＭＰ結合部位の特異結合を示す棒グラフである。
【図８Ａ】添加cＧＭＰ不在下の薬剤処理細胞溶解物からのＳＷ480細胞溶解物のＳＤＳ（Ｘ線フィルム露光）タンパク質ゲルＰＫＧ分析である。
【図８Ｂ】添加cＧＭＰ存在下の薬剤処理細胞溶解物からのＳＷ480細胞溶解物のＳＤＳ（Ｘ線フィルム露光）タンパク質ゲルＰＫＧ分析である。
【図９】対照に相対する新生細胞中のβ-カテニンとＰＫＧレベルに対するエクシスリンドの作用のウェスタンブロット実験の結果を示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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