(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２（配列番号：２）の４６４から１１１１までのヌクレオチド位置の配列からなる単離された核酸分子。
【請求項２】
以下の分子：
（ａ）図２（配列番号：２）の４６４から１１１１までのヌクレオチド位置の配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体
からなる単離された核酸分子。
【請求項３】
図２（配列番号：２）の配列からなる単離された核酸分子。
【請求項４】
ＦＧＦＲ−４に結合するがＦＧＦＲ１−３には結合しないポリペプチドをコードし、図２（配列番号：２）の４６４から１１１１までのヌクレオチド位置の配列からなる核酸の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる単離された核酸分子（ただし、EST「Zr01g05.rl Stratagene NT2 neuronal precursor 937230 Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 650264 5’」を除く）。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
該ベクターによって形質転換した宿主細胞によって認識される制御配列に操作可能に結合された請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
上記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
上記細胞が大腸菌である請求項７記載の宿主細胞。
【請求項１０】
上記細胞が酵母細胞である請求項７記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養すること、及び該細胞培養物からポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし４のいずれか一項記載のＤＮＡによってコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
（ｉ）（ａ）図２（配列番号：２）の４６４から１１１１までのヌクレオチド位置の配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体とストリンジェント条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてハイブリダイズした試験ＤＮＡ分子について、上記ポリペプチドの発現のために好適な条件下で上記試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から上記ポリペプチドを回収すること、によって製造されるＦＧＦＲ−４に結合するがＦＧＦＲ１−３には結合しない単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
異種アミノ酸配列に融合した請求項１２または１３記載のポリペプチドからなるキメラ分子。
【請求項１５】
上記異種アミノ酸配列がエピトープ標識配列である請求項１４記載のキメラ分子。
【請求項１６】
上記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１４記載のキメラ分子。
【請求項１７】
請求項１２または１３記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
上記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
これは、全体の開示が参考によりここに組み込まれ及び米国特許法第１１９条の下に出願優先権が請求される、1997年11月24日に出願した仮出願第６０／０６６８４０号に優先権を請求する非-仮出願である。
【０００２】
本発明は、全体的に新規ＤＮＡの同定と単離、及び線維芽細胞増殖因子に相同性を有することによって特徴付けられる新規ポリペプチドの組換え製造に関する。特に、本発明はＦＧＦ-１９（ＰＲＯ５３３）とここで称した線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーの新規のメンバーの同定、単離、特徴付け及び使用に関する。特に、本発明は、腫瘍及び／又はＦＧＦ-１９変調によって特徴付けられる他の病状の診断及び治療のための組成物と方法に関する。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
細胞外タンパク質は、多細胞生体の形成、分化及び維持において重要な役割を演じる。大部分の個別の細胞の発生運命、例えば増殖、移動、分化、又は他の細胞との相互作用は、他の細胞及び／又は当面の環境から与えられる情報によって典型的に支配される。この情報は、異なった細胞レセプター又は膜結合タンパク質によって順に受容され、そして解釈される分泌ポリペプチド（例えばマイトジェン因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、ニューロペプチド、及びホルモン）によってしばしば伝達される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナリング分子は、細胞外環境での作用のその部位に到達するための細胞分泌通路を通常は通過する。
【０００４】
分泌タンパク質は、薬学上、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む各種の工業的な適用を有する。目下利用可能な多くのタンパク質医薬、例えば血栓崩壊剤、インターフェロン、インターロイキン、エリトロポイエチン、コロニー刺激因子、及び他の各種サイトカインは、分泌タンパク質である。膜結合タンパク質であるそのレセプターはまた、治療用又は診断用薬剤としての可能性をも有する。新規の天然分泌タンパク質を同定するための努力が、工業的及び学術的の両方で始められている。主な努力は、新規分泌タンパク質のコード化配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに集中される。スクリーニング法と技術の実例は、文献中に記載される［例えば、Kleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996)；及び米国特許第５５３６６３７号を参照］。
【０００５】
増殖因子は、特異的細胞表面レセプターに結合することによって、単独で或いは共同で、細胞成長又は増殖を高める分子シグナル又はメディエイタである。しかしながら、増殖因子に対し徐々に高まる発現のみならず、それ以外に細胞の反応がある。結果として、増殖因子は、多機能及び有効な細胞調節因子としてより良好に特徴付けられる。その生物学的作用は、増殖、化学走性及び細胞外マトリックス生産の刺激を含む。増殖因子は、刺激的及び阻害的作用の両方を持つことができる。例えば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ-β）は、高い多面発現であり及びリンパ球及び上皮細胞のような他のものにおいて有効な増殖のインヒビターである一方、幾つかの細胞、特に結合組織において増殖を刺激できる。
【０００６】
増殖因子による増殖の刺激又は阻害の生理学的作用は、標的組織の発育と分化の段階による。従来の内分泌分子による局部細胞調節のメカニズムは、オートクライン（同じ細胞）、ジャクスタクリン（隣接細胞）、及びパラクリン（近接細胞）経路と解される。ペプチド増殖因子は、細胞間連絡のための基礎を提供する、複合生物学的言語の要素である。それは、互いの間の情報を伝達する、細胞間の相互作用を仲介する細胞を与える。これらの多機能及び多能性因子の作用は、他のペプチドの存在又は不在に基づくものである。
【０００７】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）は、正常な二倍体線維芽細胞及び確立した細胞系、Godpodarowicz,D.ら(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6983 の両方のためのヘパリン結合、マイトジェンのファミリーである。ＦＧＦファミリーは、酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ-１）、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＩＮＴ-２（ＦＧＦ-３）、Ｋ-ＦＧＦ／ＨＳＴ（ＦＧＦ-４）、ＦＧＦ-５、ＦＧＦ-６、ＫＧＦ（ＦＧＦ-７）、ＡＩＧＦ（ＦＧＦ-８）、及び他に混じってＦＧＦ-９からＦＧＦ-１８を含む。全てのＦＧＦｓは、２の保存的システイン残基を有し、そしてアミノ酸レベルで３０−５０％配列相同性を共有する。これらの因子は、広範な正常二倍体中胚葉由来及び神経堤由来細胞、顆粒膜細胞を誘導する、副腎皮質細胞、クロンドサイト(chrondocytes)、筋芽細胞、角膜及び血管内皮細胞（ウシ又はヒト）、血管平滑筋細胞、水晶体、網膜及び前立腺上皮細胞、稀突起神経膠細胞、星状細胞、クロンドサイト、筋芽細胞及び骨芽細胞のためのマイトジェンである。
【０００８】
線維芽細胞増殖因子は、非-マイトジェン手法で多数の細胞型をも刺激することができる。これらの活性は、創傷部への細胞移動の促進（化学走性）、新たな血管形成の開始（新脈管形成）、神経再生と生存性の変調（神経栄養）、エンドクリン機能の変調、及び特異的細胞タンパク質発現、細胞外マトリックス生産及び細胞生存性の刺激と抑制を含む。Baird,A.とBohlen,P.,Handbook of Exp.Phrmacol.95(1):369-418(1990)。これらの特性は、創傷治癒、神経修復、補足の血管形成などを促進するための治療的アプローチにおいて線維芽細胞増殖因子を用いるための基礎を提供する。例えば、線維芽細胞は、心臓疾患及び手術において心筋層損傷を最小限にすることが示唆されている（米国特許第４３７８４３７号）。
【０００９】
線維芽細胞増殖因子は、マイトジェンのサイトカインの大きなファミリーを構成する。このファミリーの最初のメンバーは、３Ｔ３線維芽細胞で有効な増殖活性を示した化合物として同定された。ＦＧＦメンバーは、発育の間に分化した表現型を促進又は阻害する、新脈管形成及び神経栄養作用を仲介する、及び細胞移動を変調する能力を含む役割を持つ中胚葉又は神経外胚葉起源の細胞で、異なった活性を有することが現在示されている。Goldfarb,M.,Cytokine Growth Factor Rev.7:311-25(1996);Naski,M.C.とOrnitz,D.M.,Front Biosci.3:D781-94(1998);及びSlavin J.,Cell Biol.Int.19:431-44(1995)。生物学的特異性は、異なったＦＧＦｓとＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）の両方の制御された発現の一部の形を生起すると思われる。４の高度の関連したレセプターチロシンキナーゼは、ＦＧＦファミリーのメンバーに結合するものが同定されている。変異体スプライス型は、３のＦＧＦＲｓについて同定されている。今日までに研究された個々のＦＧＦは、１の例外を伴い、たとえ相対的親和性における相違が選択性に寄与すると思われるとしても、複数のＦＧＦＲイソ型と相互作用することが示されている。Mathieu,M.ら、J.Biol.Chem.270:24197-203(1995);Ornitz,D.M.とP.Leder,J.Biol.Chem.267:16305-11(1992);Ornitz,D.M.ら、J.Biol.Chem.271:15292-7(1996)及びSantos-Ocampo,S.ら、J.Biol.Chem.271:1726-31(1996)。ＦＧＦｓはＦＧＦＲｓに直接相互作用する。しかしながら、生物学的活性は、ＦＧＦダイマー化を容易にする及び機能の制御のための付加の好機を提供すると確信されるシンジカン(syndican)又はパーレカン(perlecan)のようなヘパリン又はヘパリンスルファートプロテオグリカンを必要とすることが見出される。Aviezerら、Cell 79:1005-13(1994);Bashkinら、Biochemistry 28:1737-43(1989);Folkman,J.ら、Am.J.Pathol.130:393-400(1988);Herrら、J.Biol.Chem.272:16382-89;Kiefer,M.C.ら、A528-530.N.Y.Acad.Sci.638:167-76(1991);Mach,H.ら、Biochemistry 32:5480-90(1993);Moscatelli.D.,J.Cell Physiol.131:123-30;Ornitz,D.M.ら、Mol.Cell Biol.12:240-47(1992);Saksela,O.ら、J.Cell Biol.107:743-51(1988)。
【００１０】
遺伝子発現の変更は、全ての癌の共通の特徴である非制御細胞増殖と脱分化に密接に関係付けられる。ある種の良く研究された腫瘍のゲノムは、悪性細胞増殖を防止するように通例は機能するであろう腫瘍抑制遺伝子と普通呼ばれる劣性遺伝子の発現を減じ、及び／又は悪性の増殖を促進するように作用する、オンコジーンのようなある種の優性遺伝子の過剰発現を示すことが見出されている。これら遺伝子変化のそれぞれは、全体として、完全な新生表現型を表すいくつかの特徴を移入するために応答可能とされると思われる（Hunter,Cell 64:1129[1991];Bishop,Cell,64,235-248[1991])。
【００１１】
癌細胞における遺伝子(例えばオンコジーン)過剰発現の良く知られたメカニズムは、遺伝子増幅である。これは、特有な遺伝子の祖先細胞多重コピーの染色体が生産される場合のプロセスである。該プロセスは、該遺伝子を含む染色体の領域の無計画な複製、その後の染色体に戻る複製したセグメントの組換えを含む。（Alitaloら、Adv.Cancer Res.,47:235-281[1986])。それは、該遺伝子の過剰発現が遺伝子増幅と並行して起こる、即ち作られたコピーの数に比例すると思われる。
【００１２】
増殖因子及び増殖因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、胸癌を含む各種のヒトの悪性疾患の病因において重要な役割を演じることが同定されている。例えば、上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した185-kdトランスメンブレン糖タンパク質レセプター(ｐ１８５HER2；ＨＥＲ２)をコードするヒトＥｒｂＢ２遺伝子(erbB2、her2又はc-erbB-2としても知られる)が、ヒトの胸癌の約２５％から３０％で過剰発現されることが見出されている（Slamonら、Science,235:177-182[1987];Slamonら、Science,244:707-712[1989])。プロトオンコジーンの遺伝子増幅が、癌のより悪性形に典型的に含まれる事象であるとともに臨床的な結果の前兆として作用できることが報告されている（Schwabら、Genes Chromosomes Cancer 1,181-193[1990];Alitaloら、上記）。かくしてｅｒｂＢ２過剰発現は、特に腋窩のリンパ節を含む初期疾患に罹った患者において、乏しい予後徴候予測として普通関わり(Slamonら、[1987]と[1989],上記；RavdinとChamness,Gene,159:19-27[1995];及びHynesとStern,Biochem Biophys Acta 1198:165-184[1994])、及びホルモン治療と、ＣＭＦ(シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリンを含む化学療法的な養生の感受性及び／又は抵抗性に結び付けられている（Baselgaら、Oncology,11(3 Suppl 1):43-48[1997])。しかしながら、乏しい予後徴候を持つｅｒＢ２過剰発現の関連にかかわらず、タキサン(taxanes)による治療に臨床的に応答するＨＥＲ２陽性患者の率は、ＨＥＲ２陰性患者のそれらの３倍以上である(Ibid)。組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２(抗ＨＥＲ２)モノクローナル抗体(ネズミ抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化したバーション、rhuMAb HER2又はHerceptinRと呼ばれる)は、広範囲の従来の抗癌治療で受け入れられているＥｒｂＢ２過剰発現転移性胸癌に罹った患者において臨床的に活用されている。（Baselgaら、J.Clin.Oncol.14:737-744[1996])。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４９４３５）は、「ＰＲＯ５３３」として本出願において生じた線維芽細胞増殖因子に相同性を有するものが同定されている。この新規ＦＧＦはまた、ＦＧＦ-１９とも称している。ＰＲＯ５３３（ＤＮＡ４９４３５）をコードしているＤＮＡは、ある種の腫瘍細胞のゲノム中で増幅される遺伝子として同定されている。そのような増幅は、遺伝子生成物の過剰発現に関連すること及び腫瘍原性及び／又はオートクラインシグナリングに寄与することが予測される。従って、ＰＲＯ５３３は、ある種の癌の診断及び／又は治療（予防を含む）のための有用な標的となり、及び腫瘍治療の予後の予測対象として作用し得ると確信される。ＤＮＡ４９４３５の他の企図される効果は、軟骨又は骨の発育と骨粗しょう症-偽性神経膠腫における役割の可能性を含む。
【００１４】
一つの実施態様において、本発明は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む単離した核酸分子を提供する。
【００１５】
一つの態様において、該単離した核酸は、（ａ）図１に含まれる、約２３から約２１６までのアミノ酸残基の配列（配列番号：１）を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するＤＮＡを含む。
【００１６】
別な態様において、本発明は、図１（配列番号：１）のアミノ酸残基１から２１６を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしている単離した核酸分子、そのようなコード化核酸配列の相補体であり、且つ少なくとも中等度の、及び任意に高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合を残すものに関する。あるいは、ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしている単離した核酸は、図２（配列番号：２）に含まれる、残基約４６４−４６６から約１１０９−１１１１までの間のヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするＤＮＡを含む。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。
【００１７】
更なる態様において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）中のヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に、少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸分子に関する。好ましい実施態様において、該核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）中のヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む。
【００１８】
更なる態様において、本発明は、（ａ）図１（配列番号：１）に含まれる、約２３から約２１６までのアミノ酸残基の配列に少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ、又は（ａ）のＤＮＡの相補体を含む単離した核酸分子に関する。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、少なくとも約２０−８０ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図２（配列番号：２）に含まれる１から約８２６までと約１１９９から約２１３７のヌクレオチド残基の配列を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドフラグメントをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェント条件下で試験ＤＮＡ分子にハイブリダイズすること、及び、もし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を分離すること、によって製造される単離した核酸分子に関する。そのような核酸分子は、増幅した遺伝子のアンチセンス分子として、又は増幅反応においてアンチセンスプライマーとして作動することができる。さらに、そのような配列は、代わってＰＲＯ５３３発現の調節において使用し得る、リボザイム及び／又は三重らせん配列の一部として使用することができる。
【００２０】
特有な態様において、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持つ又は持たない、ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む、及びその可溶性、即ちトランスメンブランドメインが欠失した又は不活性化した変異体、またはそのようなコード化核酸分子に相補である、単離した核酸分子を提供する。該シグナルペプチドは、図１の配列（配列番号：１）中のアミノ酸位置１から約アミノ酸位置２２までの範囲として仮に同定されている。Ｎ-ミリストリル化部位は、アミノ酸残基Ｇ１５，Ｇ５４，Ｇ６６及びＧ２０１で存在するとして仮に同定されている一方、原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位は、アミノ酸残基Ｙ４８ないしＣ５８に存在すると確信される。
【００２１】
別な態様において、本発明は、（ａ）図１（配列番号：１）の約２３から約２１６までのアミノ酸残基の配列と比較した場合に少なくとも８０％正の、好ましくは少なくとも約８５％正の、より好ましくは少なくとも約９０％正の、最も好ましくは少なくとも約９５％正のスコアとなるポリペプチドをコードしているＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補体を含む単離した核酸分子に関する。
【００２２】
別な実施態様において、本発明は、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡ又はその変異体を含むベクターを提供する。該ベクターは、上記に定義した何れかの単離した核酸分子を含み得る。そのようなベクターを含む宿主細胞も、また提供される。例示として、該宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母とし得る。ＰＲＯ５３３ポリペプチドを製造するための方法がさらに提供され、且つＰＲＯ５３３ポリペプチドの発現のために好適な条件下で宿主細胞を培養すること、及び該細胞培養物からＰＲＯ５３３ポリペプチドを回収することを含む。
【００２３】
別な実施態様において、本発明は、上記定義した何れかの単離した核酸分子によってコードされた単離したＰＲＯ５３３ポリペプチドを提供する。特有な実施態様において、本発明は、一つの実施態様において図１（配列番号：１）の残基２３から２１６を含むアミノ酸配列を含む、単離した天然配列ＰＲＯ５３３ポリペプチドを提供する。天然シグナル配列（図１のアミノ酸１から２２）を持つ又は持たない、及び開始メチオニンを持つ又は持たない天然ＰＲＯ５３３ポリペプチドが特に包含される。あるいは、本発明は受託番号ＡＴＣＣ２０９４８０の下に寄託した核酸によってコードされたＰＲＯ５３３ポリペプチドを提供する。
【００２４】
別な態様において、本発明は、図１（配列番号：１）に含まれる、アミノ酸残基２３から約２１６の配列に少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するポリペプチドを含む単離したＰＲＯ５３３ポリペプチドに関する。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、図１（配列番号：１）の約２３から約２１６までのアミノ酸残基の配列と比較した場合に少なくとも８０％正の、好ましくは少なくとも約８５％正の、より好ましくは少なくとも約９０％正の、最も好ましくは少なくとも約９５％正のスコアとなる単離したＰＲＯ５３３ポリペプチドに関する。
【００２６】
さらに別な態様において、本発明は、図１（配列番号：１）に含まれる、アミノ酸残基２３から約２１６の配列、又は抗ＰＲＯ５３３抗体用の結合部位を提供するために十分なそれのフラグメントを含む単離したＰＲＯ５３３ポリペプチドに関する。
【００２７】
更なる態様において、本発明は、（ｉ）（ａ）図１（配列番号：１）の約２３から約２１６までのアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体とストリンジェント条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために好適な条件下で該試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から上記ポリペプチドを回収すること、によって製造される単離したポリペプチドを提供する。
【００２８】
別な実施態様において、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ５３３ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例示は、エピトープ標識配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＰＲＯ５３３ポリペプチドを含む。
【００２９】
別な実施態様において、本発明は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。任意に、該抗体はモノクローナル抗体である。一つの態様において、該抗体は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドを過剰発現する細胞の死を誘導する。別な態様において、該抗体は、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基とヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基とを有するモノクローナル抗体である。該抗体は、標識化され得ると共に固体支持体上に固定化し得る。更なる態様において、該抗体は、抗体フラグメント、一本鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
【００３０】
さらに別な実施態様において、本発明は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドの機能又は活性の１以上を阻害する天然ＰＲＯ５３３ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特有な実施態様において、該アゴニストとアンタゴニストは、抗-ＰＲＯ５３３（抗-ＦＧＦ-１９）抗体である。
【００３１】
更なる実施態様において、本発明は、相互作用をこれら２つの成分に与えるために十分な条件と時間の下で候補化合物とＰＲＯ５３３とを接触させることを含む、天然ＰＲＯ５３３ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法に関する。特有な態様において、候補化合物又はＰＲＯ５３３のいずれか一方は、固体支持体上に固定化される。別な態様において、非-固定化化合物は検出可能な標識を持つ。
【００３２】
更なる実施態様において、本発明は、製薬上許容される担体と組み合わせて、ＰＲＯ５３３ポリペプチド、又は上記定義した通りのアゴニスト又はアンタゴニストを含む組成物に関する。一つの態様において、該組成物は、抗体アンタゴニストの治療有効量を含む。さらに別な態様において、該組成物は、例えば、更なる抗体又は細胞毒性又は化学療法剤とし得る、更なる有効成分を含む。好ましくは、該組成物は無菌である。
【００３３】
更なる実施態様において、本発明は、抗-ＰＲＯ５３３抗体をコードしている核酸、及びそのような核酸を含むベクターと組換え宿主細胞に関する。
【００３４】
更なる実施態様において、本発明は、抗体が発現するような条件下で抗体をコードしている核酸によって形質転換した宿主細胞を培養すること、及び該細胞培養物から抗体を回収することによって抗-ＰＲＯ５３３抗体を製造する方法に関する。
【００３５】
別な実施態様において、本発明は、抗-ＰＲＯ５３３抗体にＰＲＯ５３３の含有が疑われる細胞を曝露すること、及び該細胞への抗体の結合を測定することを含むＰＲＯ５３３ポリペプチドの存在を測定するための方法に関する。
【００３６】
さらに別な実施態様において、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試料において、及び（ｂ）同じ細胞型の知られた正常組織細胞のコントロール試料において、ＰＲＯ５３３をコードしている遺伝子の発現のレベルを検出すること、ここで該試験試料においてより高い発現レベルは、試験組織細胞が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す、を含む哺乳動物中の腫瘍の診断方法に関する。
【００３７】
別な実施態様において、本発明は、（ａ）抗-ＰＲＯ５３３抗体と哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料とを接触させること、及び（ｂ）該試験試料中の抗-ＰＲＯ５３３抗体とＰＲＯ５３３ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出すること、を含む哺乳動物における腫瘍を診断する方法に関する。検出は、定性的又は定量的として良く、同じ細胞型の知られた正常組織細胞のコントロール試料中での複合体形成のモニタリングとの比較において実行し得る。該抗体は、好ましくは標識されている。複合体形成は、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光比色法、又は当該分野で周知の他の技術によってモニターすることができる。
【００３８】
別な実施態様において、本発明は、適当な包装中に抗-ＰＲＯ５３３抗体と担体（例えば緩衝液）を含む癌診断方法キットに関する。該キットは、ＰＲＯ５３３を検出するための抗体を用いるための指示書を好ましくは含む。
【００３９】
さらに別な実施態様において、本発明は、ＰＲＯ５３３の発現及び／又は活性化を阻害する剤の有効量に、ＰＲＯ５３３ポリペプチドが過剰発現している細胞を曝露することを含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。該剤は、好ましくは抗-ＰＲＯ５３３、小さい有機及び無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、又は三重らせん分子である。特有な態様において、該剤（例えば抗-ＰＲＯ５３３抗体）は、細胞死滅を誘導する。更なる態様において、該腫瘍細胞は、放射線処理及び／又は細胞毒性又は化学療法剤にさらに曝露される。
【００４０】
更なる実施態様において、本発明は：
容器；
該容器上のラベル；及び
該容器内に収容された活性剤を含む組成物；
（ここで該組成物は、ＰＲＯ５３３の過剰発現によって特徴付けられる病状を治療するために用いることができ、且つ該組成物中の活性剤はＰＲＯ５３３ポリペプチドの発現及び／又は活性化を阻害する剤である）
を含む製品に関する。好適な態様において、活性剤は、抗-ＰＲＯ５３３抗体である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
１．  定義
語句「遺伝子増幅」及び「遺伝子重複」は、相互交換可能に用いられ、且つ遺伝子又は遺伝子フラグメントの多重コピーが特有の細胞又は細胞系において形成されることによるプロセスに関する。重複した領域（増幅したＤＮＡの伸長）は、しばしば「アンプリコン」と称される。通例、生産されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現のレベルもまた、発現した特有な遺伝子の作製された多数のコピーに比例して増加する。
【００４２】
ここで用いたような「腫瘍」は、悪性か又は良性の全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性の及び癌の細胞と組織に関する。
【００４３】
用語「癌」、「癌性の」は、無調節細胞増殖によって典型的に特徴付けされる哺乳動物における生理学的状態に関し又は表される。癌の実例は制限されることなしに、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む癌を含む。そのような癌のより特有な実例は、胸癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸の癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸の癌、子宮内膜の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝癌腫及び頭部と首部の各種のタイプの癌を含む。
【００４４】
「治療」は、疾患の進行を防止する又は病理学的に変更する意図によって実施される介在である。従って、「治療」は、治療的処置と予防的な及び予防的意味の両方に関する。治療の必要なそれらは、既に疾患に罹った又は状態の、同じくその疾患又は状態が予期されるそれらを含む。腫瘍（例えば癌）治療において、治療的作因は、腫瘍細胞の病理学を直接減じる、又は他の治療的作因、例えば放射線及び／又は化学療法によって治療するためにより影響を受けやすい腫瘍細胞として良い。
【００４５】
癌の「病理学」は、患者の福利を危うくする全ての徴候を含む。これは制限なしに、異常な又は無制御な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルでのサイトカイン又は他の分泌生成物の放出、炎症又は免疫学的応答の抑制又は悪化、などを含む。
【００４６】
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、及び動物園の、スポーツの又は愛玩用動物を含み、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの、哺乳動物として分類される何れかの動物に関する。好ましくは、該哺乳動物はヒトである。
【００４７】
「慢性」投与は、延長された期間の間最初の治療効果（活性）を維持するために、急性のモードに対して連続モードでその剤を投与することに関する。「間欠性」投与は、休止無しの連続的に行わないが、しかしある程度まで本質において周期的である治療である。
【００４８】
ここで用いたような「担体」は、用いる用量と濃度でそれにさらされる細胞又は哺乳動物に無毒である、薬学上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含むしばしば生理学上許容される担体は、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学上許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０分子以下）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含むモノサッカリド、ジサッカリド、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；及び／又はTWEENTM、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびPLURONICSTMのような非イオン性界面活性剤を含む。
【００４９】
１以上の更なる治療作因「との組合せにおける」投与は、何れかのオーダーにおいて同時（共同）及び連続した投与を含む。
【００５０】
ここで用いたような用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を抑制又は防止する及び／又は細胞の破壊を生じる物質に関する。その用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ131，Ｉ125，Ｙ90，及びＲｅ186）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメントのような毒素を含むことを意図する。
【００５１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の実例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（"Ara-C"）、シクロフォスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ）、及びドキセタキセル（例えばTaxotereR,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France）、トクソテル、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４６７５１８７号参照）、メルファラン、及び他の関連するニトロジェンマスタードを含む。またこの定義には、タモキシフェンとオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調整する又は抑制するように作用するホルモン剤も含まれる。
【００５２】
ここで用いる場合、「増殖抑制剤」は、細胞、特にインビトロ又はインビボでのいずれか一方で、ここで同定した何れかの遺伝子を過剰発現する癌細胞の増殖を抑制する化合物又は組成物に関する。かくして、増殖抑制剤は、Ｓ相においてそのような遺伝子を過剰発現する細胞のパーセンテージを有意に減じるそれである。増殖抑制剤の実例は、Ｇ１阻止とＭ-相阻止を誘導する剤のような、細胞循環進行を（Ｓ相以外の所で）阻止する剤を含む。従来のＭ-相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチンとビンブラスチン）、タキソール、及びドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンのようなtopoIIインヒビターを含む。ＧＩがＳ-相阻止にも流出するのを阻止するそれらの剤は、例えば、タモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。更なる情報が、ムラカミらによって"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"と題されたThe Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel,eds.,Chapter 1,(WB Saunders:Philadelphia,1995)、特に13頁中に見出すことができる。
【００５３】
「ドキソルビシン」は、アトラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(8S-cis)-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキシ-5,12-ナフタセンジオンである。
【００５４】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエイタとして別な細胞上で作用する、１の細胞集団により放出されるタンパク質のための一般的用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。含まれるサイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤のラクトゲン；腫瘍壊死因子-αと-β；ミューラー阻害因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-αとＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦｓ）；インスリン様増殖因子-Ｉと-ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン-α，-β，及び-γのようなインターフェロン；マクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；ＩＬ-１，ＩＬ-２，ＩＬ-３，ＩＬ-４，ＩＬ-５，ＩＬ-６，ＩＬ-７，ＩＬ-８，ＩＬ-９，ＩＬ-１１，ＩＬ-１２のようなインターロイキン（ＩＬｓ）；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βのような腫瘍壊死因子；及びＬＩＦとｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いたような用語サイトカインは、天然供給源から又は組換え細胞培養からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的活性均等物を含む。
【００５５】
ここで用いる場合に用語「ＰＲＯ５３３ポリペプチド」、「ＰＲＯ５３３タンパク質」及び「ＰＲＯ５３３」は、天然配列ＰＲＯ５３３とＰＲＯ５３３変異体（ここでさらに定義される）を包含する。該ＰＲＯ５３３は、広い組織タイプから又は別な供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え及び／又は合成方法によって製造し得る。
【００５６】
「天然配列ＰＲＯ５３３」は、天然から得られたＰＲＯ５３３と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＰＲＯ５３３は、天然物から単離することができ、又は組換え及び／又は合成手段によって生産できる。該用語「天然配列ＰＲＯ５３３」は、ＰＲＯ５３３の天然発生端切り又は分泌形態（例えば細胞外ドメイン配列）、天然発生変異形態（例えば代替スプライス形態）及び天然発生アレル変異体を特に包含する。本発明の一つの実施態様において、天然配列ＰＲＯ５３３は、図１（配列番号：１）のアミノ酸２３から２１６（あるいは１から２１６）を含む成熟又は全長天然配列ＰＲＯ５３３である。
【００５７】
「ＰＲＯ５３３変異体」は、図１（配列番号：１）中に示した推定アミノ酸配列を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドの残基２３から２１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する、以下に定義した、活性ＰＲＯ５３３である天然配列ＰＲＯ５３３以外のどれかを意味する。そのようなＰＲＯ５３３変異体は、例えば、Ｎ又はＣ末端で１以上の、同じく図１（配列番号：１）の配列の１以上の内部ドメインの中のアミノ酸残基が付加又は欠失されたＰＲＯ５３３ポリペプチドを含む。通常、ＰＲＯ５３３変異体は、図１（配列番号：１）の残基２３から２１６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有するであろう。
【００５８】
ここに同定したＰＲＯ５３３配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、その配列のアライニング及びギャップ導入後、ＰＲＯ５３３配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基とのそのパーセンテージとして定義され、及び配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない。該％同一性の値は、［Altschulら、Methods in Enzymology,266:460-480(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html］から得られたＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって生成される。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２は、殆どが不履行値にセットされる幾つかのサーチパラメーターを用いる。調整パラメーターは次の値にセットされる：オーバーラップスパン＝１，オーバーラップフラクション＝０．１２５，ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳとＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、且つ特有な配列の組成とサーチされている興味ある配列に対する特有なデータベースの組成に基づいてそれ自身プログラムによって確立される；しかしながら、その値は感度を増すために調整して良い。％アミノ酸配列同一性値は、整列した領域中の「より長い」配列の残基の総数によって除した適合同一残基の数によって決定される。その「より長い」配列は、整列した領域中の大部分の実在の残基を有するそれである（アライメントスコアを最大化するためＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって導入されるギャップは無視される）。
【００５９】
上述した通り実行した配列比較の状況において、用語「正の」は、同一でないが、しかし類似の特性（例えば保存的置換の結果として）を有するそれと同等と見なした配列中の残基を含む。正の％値は、上述した通りの、より長い配列中の残基の総数で除したＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス中の正の値でスコアされる残基のフラクションによって決定される。
【００６０】
類似の手法において、ここで同定したＰＲＯ５３３ポリペプチドのコード化配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、ＰＲＯ５３３コード化配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ここで用いた同一性値は、それぞれ１と０．１２５にセットしたオーバーラップスパンとオーバーラップフラクションとともに、不履行パラメーターにセットしたＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２によって生成される。
【００６１】
ここに開示した各種のポリペプチドを記述するために用いる場合、「単離した」とは、その天然環境の成分から同定し及び分離及び／又は回収されているポリペプチドを意味する。その天然環境の不純成分は、そのペプチドの診断的又は治療的な使用を典型的に妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様において、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１５残基又は中間アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又は（２）クマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均質となるまで精製されるであろう。単離したポリペプチドは、ＰＲＯ５３３天然環境の成分の少なくとも一つが存在しないであろうことから、組換え細胞内の原位置にポリペプチドを含む。通常、しかしながら、単離したポリペプチドは、少なくとも一の精製工程によって製造されるだろう。
【００６２】
ＰＲＯ５３３ポリペプチド（例えばＤＮＡ４９４３５）をコードしている「単離した」核酸は、ＰＲＯ５３３コード化核酸の天然供給源にそれが普通に結合される少なくとも一の不純核酸分子から同定され且つ分離される核酸分子である。単離したＰＲＯ５３３コード化核酸分子は、天然で見出される形態又はセッティング以外のものである。単離したＰＲＯ５３３コード化核酸分子（例えばＤＮＡ４９４３５）は、従って、それが天然細胞に存在するようなＰＲＯ５３３コード化核酸分子とそれぞれ区別される。しかしながら、単離したＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしている核酸分子は、例えばその核酸分子が天然細胞のそれと異なる染色体配置中にある場合、ＰＲＯ５３３を普通に発現する細胞中に含まれたＰＲＯ５３３コード化核酸分子を含む。
【００６３】
用語「制御配列」は、特有な宿主成体中の操作可能に結合したコード化配列の発現のために必要なＤＮＡ配列に関する。原核生物のために好適である制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることが知られる。
【００６４】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれる場合に「操作可能」に結合される。例えば、予備配列決定又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしそれが該ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチド用のＤＮＡに操作可能に結合される；プロモーターとエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に操作可能に結合される；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように配置されるならば、コード化配列に操作可能に結合される。一般に「操作可能に結合」は、結合されるそのＤＮＡ配列が隣接し、且つ分泌リーダーのケースにおいては隣接し且つリーディング相中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していない。結合は、利便的な制限部位での結紮によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが通常の実施に従って使用される。
【００６５】
用語「抗体」は、最も広い認識で用いられ、且つ単純抗-ＰＲＯ５３３モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及びポリエピトピック特異性を持つ抗-ＰＲＯ５３３抗体組成物を明確にカバーする。ここで用いた用語「モノクローナル抗体」は、実質上均一な抗体の集団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の抗体が少量で存在し得る天然発生変異の可能性を除いて同一であることに関する。
【００６６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、且つ一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験による見積りである。一般に、より長いプローブでは適切なアニーリングのためにより高温を必要とし、一方、より短いプローブは低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点より低い環境で存在する場合に、再アニールのための変性したＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の望まれる相同性の度合がより高いと、使用することができる相対温度はより高い。結果として、それは、より高い相対温度がよりストリンジェントな反応条件を作る一方、低温はそれに劣る傾向にあるだろう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細と説明のために、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers.(1995)を参照。
【００６７】
「ストリンジェント条件」又は「高度ストリンジェント条件」は、（１）洗浄のための低いイオン強度と高温を使う、例えば５０℃で0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使う、例えば４２℃で、0.1%ウシ血清アルブミンとともに50%(vol/vol)ホルムアミド／0.1%のFicoll／0.1%ポリビニルピロリドン／750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを伴う50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5；又は（３）0.2xSSCと0.1%のSDS中、４２℃での及び５５℃で50%ホルムアミド洗浄とともに、４２℃で50%ホルムアミド、5xSSC（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)、0.1%ＳＤＳ、及び10%デキストラン硫酸を、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む0.1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄を用いる、それらによって同定し得る。
【００６８】
「中等度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York: Cold Spring Harbor Press,1989中に記載され、且つ上述したよりも、より劣る洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度にストリンジェントな条件の実例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデンハード溶液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性し切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩のインキュベーション、続いて約37-50℃で1xSSC中で該フィルターの洗浄、のような条件である。熟達した研究者であれば、プローブ長などのようなファクターを調整するために必要な、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識するであろう。
【００６９】
ここで用いる場合に用語「エピトープ標識化」は、「標識ポリペプチド」に融合したＰＲＯ５３３ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに関する。該標識ポリペプチドは、作製できる、さらにそれが融合されるポリペプチドの活性に干渉しないよう十分に短い抗体に対しエピトープを提供するために十分な残基を有する。該標識ポリペプチドは、好ましくはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないよう適正に独創的である。好適な標識ポリペプチドは、一般に少なくとも６アミノ酸残基を、普通は約８と５０アミノ酸残基の間（好ましくは約１０と２０アミノ酸残基の間）を有する。
【００７０】
ここで用いたような、用語「免疫付着因子」は、異種タンパク質（「付着因子」）の結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを合体した抗体様分子を意味する。構造的に、該免疫付着因子は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である望まれる結合特異性を持ったアミノ酸配列（即ち「異種」）の融合、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。免疫付着因子の付着因子部分は、典型的に、少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。免疫付着因子中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１，ＩｇＧ-２，ＩｇＧ-３，又はｉｇＧ-４サブタイプ，ＩｇＡ（ＩｇＡ-１とＩｇＡ-２を含む），ＩｇＥ，ＩｇＤ又はＩｇＭのような何れかの免疫グロブリンから得ることができる。
【００７１】
ここで目的とする「活性な」又は「活性」は、天然又は天然-発生ＰＲＯ５３３の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ５３３の形に関する。好ましくは、活性は、線維芽細胞増殖因子レセプター４（ＦＧＦＲ４）に高い親和性で結合するための能力に関する。
【００７２】
ここに開示したスクリーニングアッセイによって同定することができる抗体又は別な分子（例えば有機又は無機の小分子、ペプチドなど）の背景において「生物学的活性」は、ここで同定した、又は標的腫瘍細胞の相互作用を妨害するその他の増幅した遺伝子によってコードされたポリペプチドと結合する又は複合体化するそのような分子の能力に関して用いられる。別の好適な生物学的活性は、標的腫瘍細胞の死滅をもたらす細胞毒性活性である。
【００７３】
語句「免疫学的特性」は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドの少なくとも１のエピトープとの免疫学的交差反応を意味する。ここで用いたような「免疫学的交差反応」は、候補ポリペプチドが、知られた活性ＰＲＯ５３３ポリペプチドに対して生起したポリクローナル抗血清とともにこの活性を有するＰＲＯ５３３ポリペプチドの性質上の生物学的活性を競合的に阻害することができることを意味する。そのような抗血清は、ヤギ又はウサギに注射することによって、例えば完全フロイントアジュバントにおいて周知の活性類似物によって皮下的に、次いで不完全フロイントのブースター腹腔内又は皮下注射による、通常の方式で作製される。該免疫学的交差反応性は、好ましくは、相当するＰＲＯ１８７，ＰＲＯ５３３，ＰＲＯ２１４，ＰＲＯ２４０，ＰＲＯ２１１，ＰＲＯ２３０，ＰＲＯ２６１，ＰＲＯ２４６，又はＥＢＡＦ-２ポリペプチドに対し、同定した免疫学的交差反応分子（例えば抗体）の結合親和性が、何れかの他の天然ポリペプチドに対するその分子の結合親和性よりも顕著により高い（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約４倍、さらにより好ましくは少なくとも約８倍、最も好ましくは少なくとも約８倍より高い）ことを意味する「特異的」である。
【００７４】
用語「アンタゴニスト」は、最広義で用いられ、且つここに開示した天然ＰＲＯ５３３ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止する、阻害する、又は中和化する何れかの分子を含む。類似の手法において、用語「アゴニスト」は、最広義で用いられ、且つここに開示された天然ＰＲＯ５３３ポリペプチドの生物学的活性を模倣する何れかの分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、特に、天然ＰＲＯ５３３ポリペプチド、ペプチド、小有機分子のアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメント、フラグメント又はアミノ酸配列変異体を含む。
【００７５】
「小分子」は、約５００ダルトンより低い分子量を有すると、ここでは定義される。
【００７６】
「抗体」（Ａｂｓ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、同じ構造的特徴を有するグリコプロテインである。抗体は特異的抗原に対する特異的結合を示す一方、免疫グロブリンは、抗体と、抗原特異性を欠いた他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルで、及び骨髄腫によって増加したレベルで生産される。用語「抗体」は、最広義で用いられ、且つ制限なしに、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び望まれる生物学的活性をそれが示す限りにおいて抗体フラグメントを特に包含する。
【００７７】
「天然抗体」と「天然免疫グロブリン」は普通、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）から構成された約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーのグリコプロテインである。それぞれの軽鎖は、１の共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、一方多数のジスルフィド結合が異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の中で変わる。それぞれの重鎖と軽鎖は、定期的に間隔を置いた鎖間ジスルフィド架橋をも有する。それぞれの重鎖は、一端で可変ドメイン（ＶH）、続く多数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一端で可変ドメイン（ＶL）、及びその他端で定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと連合され、且つ軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと連合される。個々のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると確信される。
【００７８】
用語「可変」は、該可変ドメインの一定の部分が抗体の中の配列において広範囲に異なり、且つその特有な抗原のためのそれぞれの抗体の結合及び特異性において使用されるという事実に関する。しかしながら、その可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均等に分布していない。それは、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）又は軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方の高度可変領域と呼ばれる３つのセグメント中に集中される。可変ドメインのより高く保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４のＦＲ領域、大部分はβ-シート相対的配置を採用する、ループ接点を形成する３つのＣＤＲｓにより接続された、及び一部を形成する幾つかのケースにおいて、β-シート構造、を含む。それぞれの鎖内のＣＤＲｓは、ＦＲ領域によって、及び抗体の抗原結合部位の形成に寄与する、他の鎖からのＣＤＲｓとともに近接状態で一緒に保持される（Kabatら、NIH Publ.No.91-3242,Vil.1,647-669頁(1991)を参照）。該定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合において直接含まれないが、しかし抗体-依存細胞毒性における抗体の参加のような各種のエフェクター機能を示す。
【００７９】
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の、好ましくは完全な抗体の抗原結合又は可変領域の部分を含む。抗体フラグメントの例示は、Ｆａｂ，Ｆａｂ'，Ｆ(ab')2，及びＦｖフラグメント；ディアボディ(diabodies)；線状抗体(Zapataら、Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；一本鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成した多特異性抗体を含む。
【００８０】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単独の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」フラグメントと称する２つの同じ抗原結合フラグメント、及び容易な結晶化のその能力に反映して命名した残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、２の抗原結合部位を有し且つ交差結合抗原がさらに可能となるＦ(ab')2フラグメントをもたらす。
【００８１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗原フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合で１の重鎖と１の軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。それは、それぞれの可変ドメインの３のＣＤＲｓがＶH-ＶLダイマーの表面上の抗原結合部位を表すために相互作用するこの配置においてである。集合的に、その６のＣＤＲｓは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、たとえ全部の結合部位よりも低い親和性でも、等しい単独の可変ドメイン（又は抗原用の３つのＣＤＲｓ特異性のみを含むＦｖの半分）は、抗原を認識し且つ結合する能力を有する。
【００８２】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をも含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端で幾つかの残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、該定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を生じるＦａｂ'として個々に定義する。Ｆ(ab')2フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'フラグメントの対として最初に生成された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた周知である。
【００８３】
何れかの脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２つの明確に異なるタイプの一方に特定することができる。
【００８４】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５の主要なクラス：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭがあり、且つこれらの幾つかは、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ，及びＩｇＡ２のようにサブクラス（イソタイプ）に更に分割し得る。免疫グロブリンの異なるクラスに一致する重鎖定常ドメインは、それぞれα，δ，ε，γ，及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置は周知である。
【００８５】
ここで用いたような用語「モノクローナル抗体」は、実質的に相同な抗体の集団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の抗体が少量で存在し得る天然発生変異の可能性を除いて同一であることに関する。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられ、高度に特異的である。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体製造に対して、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定因子に対して向けられる。それらの特徴に加え、該モノクローナル抗体は、それが他の免疫グロブリンによって不純化されない、ハイブリドーマ培養によって合成される有効性がある。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質上相同な集団から得られているような抗体の特徴を示し、且つ何れかの特有な方法によって抗体の製造が必要であるとして解釈すべきでない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495[1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製して良く、又は組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）によって作製して良い。該「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら、Nature,352:624-628[1991]とMarksら、J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００８６】
ここでのモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の部分が特有の種又は特有な抗体クラス又はサブクラスに属するものから得られた抗体中の配列と同一又は相同である「キメラ」抗体を含み、一方、該鎖の残りは、別な種又は別な抗体クラス又はサブクラスに属するものから得られた抗体中の配列、同じく望まれる生物学的活性をそれが示す限りは、そのような抗体のフラグメントと同一であるか又は相同である（米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855[1984]）。
【００８７】
非-ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非-ヒト免疫グロブリンから得られる最小の配列を含む、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ'，Ｆ(ab')2又は他の抗体の抗原結合配列）である。多くの場合、ヒト化抗体は、受容体のＣＤＲからの残基が、望まれる特異性、親和性、及び容量を有するマウス、ラット又はウサギのような非-ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。例えば、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ残基は、相当する非-ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体においても移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列においていずれも見出されない残基を含み得る。これらの変更は、更なる精製のために行われ且つ抗体の性能を最大にする。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当するＣＤＲ配列の全て又は実質上全て及びＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のそれらである、少なくとも１の、典型的には２の可変ドメインの全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれをも含むであろう。更なる詳細のために、Jonesら、Naure,321:522-525(1986);Reichmannら、Nature,332:323-329[1988];及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)を参照。ヒト化抗体は、PRIMATIZEDR抗体を含み、該抗体の抗原結合領域は、興味ある抗原でマカクサルを免疫化することによって製造した抗体から得られる。
【００８８】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHとＶLドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合用の望まれる構造を形成するためにｓＦｖを与えるＶHとＶLドメイン間にポリペプチド結合をさらに含む。ｓＦｖの再考のために、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.1 13,RosenburgとMoore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)を参照。
【００８９】
用語「ディアボディ」は、２の抗原結合部位を持つ小さい抗原フラグメントに関し、フラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶH-ＶL）において軽鎖可変ドメイン（ＶL）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上の２のドメイン間に対合を与えるために余りに短いリンカーを用いることによって、該ドメインは、別な鎖の相補ドメインと対合するように作動し、且つ２の抗原結合部位を創作する。ディアボディは、例えばＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中により完全に記載される。
【００９０】
「単離した」抗体は、その天然環境の成分から同定され及び分離され及び／又は回収されているそれである。その天然環境の不純成分は、その抗体の診断的又は治療的な使用を典型的に妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様において、該抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定したとして抗体が９５重量％より大きく、最も好ましくは９９重量％より大きくなるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１５残基又は中間アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又は（３）クマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均質となるまで精製されるであろう。単離した抗体は、該抗体の天然環境の成分の少なくとも一つが存在しないであろうことから、組換え細胞内の原位置に該抗体を含む。通常、しかしながら、単離した抗体は、少なくとも一の精製工程によって製造されるだろう。
【００９１】
ここで用いる場合に語「標識」は、「標識した」抗体をもたらすよう該抗体に直接又は間接的に接合される検出可能な化合物又は組成物に関する。該標識は、それ自身を検出可能として良く（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は、酵素的標識のケースにおいては、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒し得る。
【００９２】
「固相」については、本発明の抗体が付着できる非水性マトリックスを意味する。ここに包含される固相の例は、ガラス（例えば孔度制御ガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールとシリコーンで一部が又は全体が構成されたそれらを含む。ある種の実施態様において、状況に応じて、該固相は、アッセイプレートのウェルを含むことができる；他においてそれは精製カラムである（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）。この用語はまた、米国特許第４２７５１４９号中に記載されたそれらのような、分離した粒子の不連続固相をも含む。
【００９３】
「リポソーム」は、哺乳動物に薬剤（例えばＰＲＯ５３３ポリペプチド又はそれの抗体及び任意の化学療法剤）の送達のために有用である、各種タイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤で構成される小さいベシクルである。該リポソームの成分は、生物学的な膜の脂質配列に類似の、二層構造で通例は並べられる。
【００９４】
ここで用いたような、用語「免疫付着因子」は、異種タンパク質（「付着因子」）の結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを合体した抗体様分子を意味する。構造的に、該免疫付着因子は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である望まれる結合特異性を持ったアミノ酸配列（即ち「異種」）の融合、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。免疫付着因子の付着因子部分は、典型的に、少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。免疫付着因子中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１，ＩｇＧ-２，ＩｇＧ-３，又はＩｇＧ-４サブタイプ，ＩｇＡ（ＩｇＡ-１とＩｇＡ-２を含む），ＩｇＥ，ＩｇＤ又はＩｇＭのような何れかの免疫グロブリンから得て良い。
【００９５】
２．  本発明の組成物と方法
ａ．全長ＰＲＯ５３３
本発明は、ＰＲＯ５３３（ＵＮＱ３３４）として本出願中で言うポリペプチドをコードしている新たに同定し且つ単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、以下の実施例中でさらに詳細に開示した通り、同定され且つ単離されている。分離発現ラウンドで製造されたタンパク質は、異なるＰＲＯ番号を与えるが、ＵＮＱ番号は何れの得られたＤＮＡとコードしたタンパク質について独自であり、且つ変更されないであろう。しかしながら、簡略化のために、本明細書においてＤＮＡ４９４３５によってコードされたタンパク質、同じくＰＲＯ５３３の上記定義に包含される相同体と変異体は、その起源又は作製の方式に関わらず、「ＰＲＯ５３３」と称されるであろう。
【００９６】
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アライメントコンピュータープログラムを用いて、全長配列ＰＲＯ５３３（図１中及び配列番号：１で示す）は、ネズミ線維芽細胞増殖因子-１５と約５３％アミノ酸配列同一性を有することが見出されている。従って、本出願中に開示したＰＲＯ５３３は、線維芽細胞成長因子の新たに同定されたメンバーであり、さらにそのようなポリペプチドの典型的な活性を所有し得るものと現在確信される。好ましくは、そのような活性は、ＦＧＦＲ４に対する選択的な高い親和性で結合するための能力を含む。
【００９７】
ＤＮＡ４９４３５は、ヒト胎児網膜ライブラリーから単離された。図２中に示したＰＲＯ５３３をコードしているｃＤＮＡは、長さにおいて２１３７塩基対であり、２１６アミノ酸の予測したオープンリーディングフレームを含む。ＧｅｎＢａｎｋによるＢｌａｓｔ比較では、これが新規のタンパク質を表すこと、及びＦＧＦファミリーの他の周知のメンバーと有意の相同性を有することを示した。ＦＧＦファミリーの他のメンバーとのアライメントは、たとえそれが予期したタンパク質の長さに沿って他のＦＧＦにいくらかの相同性を所有するとしても、この新規のメンバーが、該ファミリーの他のメンバーにいくらか明確に関係があること（＝２０％同一性、図１１を参照）を示す。ＦＧＦの幾つかのメンバーが古典的シグナル配列を欠く一方で、ＤＮＡ４９４３５は、しかしながら、アミノ酸残基約１−２２からそのような配列を所有する。
【００９８】
染色体配座は、染色体１１ｑ１３．１となることが放射ハイブリッドマッピングによって決定された。In situ分析は、胎児皮膚、軟骨、胎児網膜の内面、及び成人胆嚢上皮（図８）、同じく胎児小腸、胎盤の絨毛及び臍帯（図示せず）での発現を示した。ＤＮＡ４９４３５は、多重組織ノーザンブロット分析によって明確に分析可能でないが、しかし幾つかの組織においてＲＴ-ＰＣＲによって検出可能であった（図示せず）。おもしろいことには、幾つかの癌細胞系の調査は、結腸腺癌系ＳＷ４８０がＤＮＡ４９４３５メッセージの顕著に上昇したレベルを示すことを明らかにした。
【００９９】
ＤＮＡ４９４３５が周知のＦＧＦレセプターのための実際上のリガンドであるかを測定するために、結合実験を実施した。ＤＮＡ４９４３５は、Ｎ末端又はＣ末端エピトープ標識のいずれか一方で組換えタンパク質として製造した。そのＣ末端Ｈｉｓ標識タンパク質は、該タンパク質が機能化シグナル配列を実際に含むことを示している天然Ｎ末端を用いたバキュロウイルス感染昆虫細胞から作製した。精製したＤＮＡ４９４３５のＮ末端配列は、残基２５、予期した切断位置の２のＣ末端残基で始まる。４の周知のＦＧＦレセプター(IIIcスプライス形）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＩｇＧ Ｆｃ融合として発現した。ＤＮＡ４９４３５は、ＦＧＦＲ４に結合したが、しかし試験した他のＦＧＦレセプターには結合しない（図９Ａ−Ｃ）。Ｎ末端及びＣ末端エピトープ標識形は、ＦＧＦＲ４によってにも観測された結合によって類似の結果を与えた。ＥＣＤのドメイン３のＣ末端で異なる代替スプライス形は、ＦＧＦレセプター１−３(IIIbスプライス形)について記載されている、Dell,K.R.とWilliams,L.T.,J.Biol.Chem.267:21225-29(1992);Johnson,D.E.ら、Mol.Cell Biol.11:4627-34(1991);Murgue,B.S.ら、Cancer Res.54:5206-11(1994);Perez-Castro.A.V.ら、Genomics 30:157-62(1995)。ＤＮＡ４９４３５は、ＦＧＦＲ３(IIIb)又はＦＧＦＲ２(IIIb)のいずれか一方に結合するとは思われない。ＦＧＦＲ４への結合は、100ng/mlヘパリンの存在で生じる最大結合を持つヘパリン依存性である（図１０）。ＤＮＡ４９４３５結合は、ＦＧＦ４に高い親和性(200pM)で結合することが知られる１００倍過剰のＦＧＦ-１と競合できるが、しかしより低い(2nM)親和性でＦＧＦＲ４を結合する、ＦＧＦ−２とは乏しい競合のみであった（図示せず）。Ornitz,D.M.ら、J.Biol.Chem.271:15292-97(1996)。細胞増殖についてのＤＮＡ４９４３５の効果は、Ｋ５６３，ＦＧＦＲ４を発現することが以前に報告された赤白血病細胞系[Armstrong,E.ら、Cancer Res.,52:2004-07(1992);Partanen,J.ら、Embo.J.10:1347-54(1991)、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、及び一次ヒト包皮線維芽細胞を含む幾つかの細胞系によって試験された。ＦＧＦ-１と試験した幾つかの他のＦＧＦｓと対照的に、ＤＮＡ４９４３５は、僅かなマイトジェン活性を示した（図示せず）。
【０１００】
ＤＮＡ４９４３５（ＦＧＦ-１９）は、増殖因子のＦＧＦファミリーの新たなメンバーである。分析が報告されている他のメンバーと同様、ＤＮＡ４９４３５（ＦＧＦ-１９）は、ＦＧＦＲファミリーのメンバーのためのリガンドである。ＦＧＦファミリーの最近記載された幾つかの結合特異性は、既に測定されている。しかしながら、結合が調べられている大部分のメンバーについて、結合は１種類のＦＧＦＲに特異的であることは見出されていない。報告された唯一の例外は、ＦＧＦＲ２のIIIbスプライス変異体、ＫＧＦＲを単独で結合すると思われるＦＧＦ-７（ケラチノサイト増殖因子、ＫＧＦ）である。多数の周知のＦＧＦメンバーは、ＦＧＦＲ４を結合することができる[Ornitz,D.M.ら、J.Biol.Chem.271:15292-97;Ron,D.ら、J.Biol Chem.268:5388-94(1993);Vainikka,S.ら、Embo.J.11:4273-80(1992)]；しかしながら、これらのＦＧＦのそれぞれはまた、他のＦＧＦＲとの結合も示す。結合は、高い親和性とともにヘパリンの存在が必要である。おもしろいことに、他のＦＧＦメンバーに反応を示さないことが広く調べられている３Ｔ３線維芽細胞細胞系と一次ヒト包皮線維芽細胞を含む幾つかの細胞系は、ＦＧＦ-１９に対するマイトジェン応答を示さず、ＦＧＦ４についてのＤＮＡ４９４３５の独創的な特異性を強調している。この結果は、個々のＦＧＦＲによって引き出されたシグナル導入事象が異なることを示し、且つＦＧＦＲ４シグナリングがより劣るマイトジェンであることを示唆する幾つかの報告と一致する。Shaoul,E.ら、Oncogene 10:1553-61(1995);Vainikka,S.ら、J.Biol.Chem.271:1270-73(1996);Vainikka,S.ら、J.Biol.Chem.269:18320-26(1994);Wang,J.ら、Mol.Cell Biol.14:181-88(1994)。このマイトジェン性の相対的な欠如は、ＦＧＦＲ４ではないのに対して、ＢａＦ３細胞において生存性と増殖を誘導するＦＧＦ４の細胞外ドメインとＦＧＦＲ１の細胞内ドメインで構成されたキメラレセプターのような細胞内ドメインに基づくと思われる。Ornitz,D.M.ら、J.Biol.Chem.271:15292-97(1996);Wang,J.K.ら、Mol.Cell Biol.14:181-88(1994)。これらのレセプターは、ＦＧＦＲ４に特異的なリガンドが今日までにない他のＦＧＦＲを欠くと思われた細胞系における個々のレセプターの過剰発現による。比較により、ＤＮＡ４９４３５は、最初の細胞系と動物モデルの複合体においてＦＧＦＲ４機能の分析を可能にする新規の試薬として利用し得る。マイトジェン活性の明らかな欠如にもかかわらず、ＦＧＦＲ４のアップレギュレーション又は増幅及び各種のヒトの癌、特に胸癌と相関関係が多数報告されている。Abass,S.A.ら、J.Clin.Endocrinol.Metab.82:1160-66(1997),Johnston,C.L.ら、Biochem.J.306:609-16(1995),McLeskey,S.W.ら、Cancer Res.54:523-30(1994),Penault-Llorca,F.ら、Int.J.Cancer 61:170-76(1995),Ron,D.ら、J.Biol.Chem.268:5388-94(1993)。ＦＧＦＲ４，しかしＦＧＦＲ１−３ではない、は癌細胞部分に関連し得る膜ラフ化(ruffling)応答を仲介することができる。Johnston,C.L.ら、Biochem.J.306:609-16(1995)。ＳＷ４８０結腸腺癌におけるＤＮＡ４９４３５メッセージの非常に高いレベルは、オートクラインシグナリングにおけるＦＧＦＲ４の包含を反映する。
【０１０１】
相対的に特異的な役割が何れかの個々のＦＧＦリガンドに存在すると同時に、より広い役割がＦＧＦＲｓにより演じられる。ＦＧＦＲ１，又はＦＧＦＲ２についてのマウスの欠乏は、胎児死亡率を悪化させる。Arman,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5082-87(1998);Ciruna,B.ら、Development 124:2829-41(1997);Deng,C.ら、Genes Dev.8:3045-57(1994)。ＦＧＦＲ３でのマウス欠乏症は、骨格成長における重篤な欠陥、同じく内耳欠陥と聴覚消失を現れす。Colvin,J.S.ら、Nat.Genet.12:390-97(1996);Deng,C.ら、Cell 84;911-21(1996)。ＦＧＦＲ４欠乏マウスの表現型は、既に報告されている。これに対し、幾つかのＦＧＦｓについて、無価値の表現型は軽度である。ＦＧＦ-５欠乏マウスは長い体毛を有し、且つラットのアンゴラ(go)変異体は、ＦＧＦ-５アレル欠乏のためであることが示されている。Hebert,J.ら、Cell 78:1017-25(1994)。ＦＧＦ-６欠乏マウスは健全であるが、しかし筋肉再生における欠陥を呈する。Fiore,F.ら、Int.J.Dev.Biol.41:639-42(1997);Floss,T.ら、Genes Dev.11:2040-51(1997)。ＦＧＦ-７／ＫＧＦの一様な破壊、表皮細胞増殖と創傷治癒における主要な役割を演じることを通して増殖因子は、体毛小胞欠陥を生じるマイナーな「密生した」体毛表現型のみが現れた欠乏マウスをもたらした。Guo,L.ら、Genes Dev.10:165-75(1996)。個々のＦＧＦｓの機能の理解は、インビトロ系において生理学的応答を引き出さないその能力によって及び遺伝子分裂実験における他のＦＧＦメンバーの補償効果の可能性によって明らかに困難になる。該ＦＧＦＲは、骨格の発育において特に重要な役割を有すると思われる。骨格又は頭のヒトの遺伝疾患は、ＦＧＦＲ１−３の本質的な活性化に起因する変異体に結び付けられている。Webster,M.K.とDonoghue,D.J.,Trends Genet.13:178-182(1997),Wilkie,A.O.,Human Mol.Genet.6:1647-56(1997)。胎児軟骨におけるＦＧＦＲ４に特異的なリガンド、ＤＮＡ４９４３５の発現は、さらに軟骨又は骨の発育におけるＦＧＦＲ４の可能性のある役割を示唆する。１１ｑ１３に対するＦＧＦ-１９の染色体マッピング、同じく軟骨及び胎児網膜におけるＤＮＡ４９４３５の発現は、それが骨粗しょう症-偽性神経膠腫症候群、骨粗しょう症によって表される希な疾患、硝子体網膜の形成異常症、筋肉緊張低下、及び靭帯弛緩のための候補遺伝子であることを示唆する。Frontali,M.ら、Am.J.Med.Genet.22:35-47(1985);Gong,Y.M.ら、Am.J.Hum.Genet.59:146-51(1996),Johnson,M.L.ら、Am.J.Hum.Genet.60:1326-32(1997),Somer,H.,J.Med.Genet.25:543-49(1988)。ＦＧＦの２つの他の周知のメンバー、ＦＧＦ-３とＦＧＦ-４もまた１１ｑ１３にマップされるが、しかしこの疾患について応答可能であることは明らかでない。しかしながら、１１ｑ１３がＦＧＦメンバーのクラスターを含む配座であることは明らかである。
【０１０２】
ＤＮＡ４９４３５は、最近記載されたネズミＦＧＦ-１５に最も類似（５３％同一性）する。McWhirter,J.R.ら、Development 124:3221-32(1997)。近接のこの度合は、マウス／ヒトＦＧＦオルトログの一般に観測された近接（ＦＧＦ１−８について８１−９９％）よりも実質上劣るが、しかし発展段階のＦＧＦ８／１７／１８サブファミリー（５４−６３％）又はＦＧＦ１１／１２／１３／１４／１５サブファミリー（６６−７２％）のようなＦＧＦファミリーの中のサブグループのメンバー間の近接と概略一致する。ネズミＦＧＦ-１５は、恒常性セレクター(Hox)転写因子Ｐｂｘ１の下流標的として同定されており、且つ神経発達において役割を有すると思われる。幾つかの胎児組織における発現と異常なレセプター特異性を持つＦＧＦファミリーの新規のメンバーとして、ＤＮＡ４９４３５は、発育パターン化を導くことにおける役割を有し、それによって独自の治療的潜在能力を所有すると思われる。
【０１０３】
ｂ．  ＰＲＯ５３３変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ５３３ポリペプチドに加え、ＰＲＯ５３３変異体が作製できることが意図される。ＰＲＯ５３３変異体は、適当なヌクレオチドをＰＲＯ５３３ＤＮＡへの変更を誘導することによって、及び／又は望まれるＰＲＯ５３３ポリペプチドの合成によって作製することができる。当業者であれば、アミノ酸変更が、グリコシル化部位の数又は位置を変えること、又は膜固定特性を変えることのような、ＰＲＯ５３３ポリペプチドの後翻訳プロセスを変更し得ることを予測するであろう。
【０１０４】
ここに記載した天然の全長ＰＲＯ５３３配列における、又はＰＲＯ５３３の各種ドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号中に記載されるような保存的及び非保存的変異のための技術とガイドラインのいずれかを用いて作製することができる。変異は、天然配列ＰＲＯ５３３との比較として、ＰＲＯ５３３のアミノ酸配列における変化に帰結するＰＲＯ５３３をコードする１以上のコドンの置換、欠失、又は挿入として良い。任意に、その変異は、該ＰＲＯ５３３の何れかの位置で何れかの他のアミノ酸による少なくとも１のアミノ酸の置換による。アミノ酸残基が望まれる活性に不利な影響を及ぼすことなしに挿入され、置換され又は欠失されることの測定におけるガイダンスは、相同性が知られたタンパク質分子のそれとＰＲＯ５３３の配列を比べること、及び高い相同性の領域でなされるアミノ酸配列変更の数を最少化することによって見出し得る。アミノ酸置換は、セリンによるロイシンの置換のような、即ち保存性アミノ酸置換体のような、構造及び／又は化学的特徴の類似性を有する別なアミノ酸によって一つのアミノ酸を置換することの結果とすることができる。挿入又は欠失は、任意に１から約５アミノ酸の範囲内とし得る。その変異は、その配列中のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統的に作ること及び後述の実施例中に記載したインビトロアッセイにおいて活性について得られる変異体を試験することによって測定できる。
【０１０５】
該変異は、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異誘発のような当該分野で周知の方法を用いて作製できる。部位特異的変異誘発[Carterら、Nucl. Acids Res.,13:4331(1986)；Zollerら、Nucl. Acids Res.,10:6487(1987)]、カセット変異誘導[Wellsら、Gene,34:315(1985)]、制限選択変異誘導[Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986)]、又は他の周知の技術は、ＰＲＯ５３３変異体ＤＮＡを製造するためのクローン化ＤＮＡで実行できる。
【０１０６】
スキャニングアミノ酸分析はまた、隣接配列に従って１以上のアミノ酸を同定するために利用することができる。スキャニングアミノ酸の中で好適なものは、相対的に小さい、中性アミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、それがベータ炭素以外の側鎖がなく、しかもその変異体の主鎖構造を変更する可能性が少ないため、このグループの中で典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である[CunninghamとWells、Science,244:1081-1085(1989)]。アラニンはまた、それが最も普通のアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方で頻繁に見出される[Creighton,The Proteins(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。もしアラニン置換が変異体の要求量を生じないならば、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【０１０７】
ｃ．  ＰＲＯ５３３の修飾
ＰＲＯ５３３の共有結合修飾物は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、選択した側鎖又はＮかＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤によって、ＰＲＯ５３３ポリペプチドの標的としたアミノ酸残基を反応させることを含む。二官能剤による誘導体化は、例えば抗-ＰＲＯ５３３抗体を精製するための方法において使用するために水不溶性支持体マトリックスに又は表面にＰＲＯ５３３を、及びその反対を架橋するために有用である。普通に使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートを含む。
【０１０８】
他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニル残基をそれぞれ相当するグルタミルとアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンとリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E.Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１０９】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ５３３ポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変えることを含む。「天然グリコシル化パターンを変える」とは、該天然配列中で見出される１以上の炭水化物部分を欠失すること（内在するグリコシル化部位を欠失することによって又は化学的及び／又は酵素的手段によりグリコシル化部分を取り去ることによって）及び／又は天然配列ＰＲＯ５３３中に存在しない１以上のグリコシル化部位を加えることを意味すると、ここでの目的のために意図される。加えて、その表現は、存在する各種糖残基の本質と比率における変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における質的な変化を含む。
【０１１０】
ＰＲＯ５３３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変えることによって達成し得る。その変更は、例えば、天然配列ＰＲＯ５３３への１以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれによる置換によって作製し得る（Ｏ-結合したグリコシル化部位）。該ＰＲＯ５３３アミノ酸配列は、特にコドンが望まれるアミノ酸に翻訳されるであろうようにそれが生成されるよう、予備選択した塩基で該ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているＤＮＡを変異することによって、ＤＮＡレベルでの変更を通して任意に変更し得る。
【０１１１】
ＰＲＯ５３３ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加するための別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。そのような方法は、当該分野において、例えば、1987年9月11日公開のＷＯ８７／０５３３０中に、及びAplinとWriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,259-306頁(1981)中に記載されている。
【０１１２】
ＰＲＯ５３３ポリペプチド上にある炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化のための標識として利用されるアミノ酸残基をコードしているコドンの突然変異的置換によって達成し得る。化学的な脱グリコシル化は、当該分野で周知であるとともに、例えば、Hakimuddin,ら、Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)によって、及びEdgeら、Anal. Biochem.,118:131(1981)によって記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的な切断は、Thotakuraら、Meth. Enzymol.,138:350(1987)により記載されたようなエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０１１３】
ＰＲＯ５３３の共有結合修飾の別なタイプは、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９：４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２又は４１７９３３７号中に記載される手法において、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような各種の非タンパク様ポリマーの一つにＰＲＯ５３３ポリペプチドを結合することを含む。
【０１１４】
本発明のＰＲＯ５３３はまた、別な、非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ５３３を含むキメラ分子を形成する手法においても修飾され得る。
【０１１５】
一つの実施態様において、そのようなキメラ分子は、ＰＲＯ５３３と、抗-標識抗体が選択的に結合できるエピトープを提供する標識ポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープ標識は一般に、ＰＲＯ５３３のアミノ又はカルボキシ末端に配される。そのようなエピトープ-標識化した形の存在は、該標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープ標識の提供は、エピトープ標識に結合する抗-標識抗体又は別なタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるＰＲＯ５３３を可能にする。各種の標識ポリペプチドとそのそれぞれの抗体は、当該分野で良く知られる。実例は、ポリヒスチジン（ポリ-his）又はポリヒスチジングリシン(ポリ-his-gly)標識；ｆｌｕ ＨＡ標識ポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５[Fieldら、Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988)]；ｃ-ｍｙｃ標識とそれの８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１０，Ｇ４，Ｂ７，及び９Ｅ１０抗体[Evanら、Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識及びその抗体[Paborskyら、Protein Engineering,3(6):547-553(1990)]を含む。他の標識ポリペプチドは、Ｆｌａｇ-ペプチド[Hoppら、BioTechnology, 6:1204-1210(1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martinら、Science,255:192-194(1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら、J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識[Lutz-Freyermuthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]を含む。
【０１１６】
代わりの実施態様において、該キメラ分子は、ＰＲＯ５３３と、免疫グロブリンとの又は免疫グロブリンの特有な領域との融合を含み得る。キメラ分子の二価の形態のため（「免疫付着因子」とも称す）、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域までとすることができる。該Ｉｇ融合は、Ｉｇ分子の中の少なくとも１の可変領域に変えてＰＲＯ５３３ポリペプチドの可溶性（トランスメンブレンドメインを欠失又は不活性化した）形態の置換を含む。特に好適な実施態様において、該免疫グロブリン融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２とＣＨ３、又はヒンジＣＨ１，ＣＨ２とＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の製造のためには、1995年6月27日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照。
【０１１７】
Ｄ．ＰＲＯ５３３の製造
以下の記載は、ＰＲＯ５３３核酸を含むベクターによって形質転換した又はトランスフェクトした細胞を培養することによるＰＲＯ５３３の製造に本質的に関する。勿論、それはＰＲＯ５３３を製造するために利用し得る、当該分野で周知の方法で代替することが意図される。例えば、ＰＲＯ５３３配列、又はその一部は、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって製造し得る[例えば、Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA,(1969); Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)を参照]。インビトロタンパク質合成は、手動技術を用いて又は自動によって実施して良い。自動化合成は、例えば、製造者の指示に従ってApplied Biosystemsペプチドシンセサイザー(Foster City,CA)を用いて達成し得る。ＰＲＯ５３３の各部は、別々に化学合成し、全長ＰＲＯ５３３を製造するための化学的又は酵素的方法を用いて結合して良い。
【０１１８】
ｉ．ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡの単離
ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡは、ＰＲＯ５３３ｍＲＮＡを持つとともにそれを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から作製したｃＤＮＡライブラリーから得られる。従って、ヒトＰＲＯ５３３ＤＮＡは、実施例中に記載したようなヒト組織から作製したｃＤＮＡライブラリーから利便的に得ることができる。ＰＲＯ５３３-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから、或いはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１１９】
ライブラリーは、興味ある遺伝子又はそれによってコードしたタンパク質を同定するために設計したプローブ（ＰＲＯ５３３に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）によってスクリーンすることができる。その選択したプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(new York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中に記載されるような標準手法を用いて処理し得る。ＰＲＯ５３３をコードしている遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである[Sambrookら、上記；Dieffenbachら、PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)]。
【０１２０】
後述の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記載する。プローブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最少化されるように十分な長さにすると共に十分に明白なものにすべきである。そのオリゴヌクレオチドは、それがスクリーンするべきライブラリー中のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出できるように好ましくは標識される。標識化の方法は、当該分野で周知であり、32Ｐ-標識したＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化、又は酵素標識を含む。中等度ストリンジェンシー及び高度なストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、上記、中に提供される。
【０１２１】
そのようなライブラリースクリーニング法で同定される配列は、寄託された及びＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース又は他のプライベートな配列データベースで利用可能な他の周知の配列と比較し且つアライメントすることができる。その分子の定められた領域内の又は全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルでの何れか一方）は、相同性を測定するため各種アルゴリズムを利用する、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ２，ＡＬＩＧＮ，ＤＮＡｓｔａｒ，及びＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを経て決定することができる。
【０１２２】
ポリペプチドコード化配列を有する核酸は、最初にここに記載した推定アミノ酸配列を用いて、もし必要なら、プレカーサーを検出する及びｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの中間体を加工するために、Sambrookら、上記、中に記載したような通常のプライマー伸長法を用いて、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１２３】
ｉｉ．宿主細胞の選択と形質転換
宿主細胞は、ＰＲＯ５３３作製用にここに記載した発現又はクローニングベクターによって形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は望まれる配列をコードしている遺伝子の増幅のために適切なように修正した通常の栄養培地中で培養される。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度の実験なしに熟達した研究者であれば選択することができる。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実践技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)及びSambrookら、上記、中に見出すことができる。
【０１２４】
トランスフェクションの方法は、例えば、ＣａＰＯ4とエレクトロポレーションのように、当業者に周知である。使用される宿主細胞に基づいて、形質転換は、そのような細胞に対して適切な標準技術を用いて実行される。Sambrookら、上記、に記載される塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレーションは、一般に原核生物又は本質的に細胞壁バリアを含む他の細胞用に使用される。アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染は、Shawら、Gene,23:315(1983)と1989年6月29日に公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されるようなある種の植物細胞の形質転換のために使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、Grahamとvan der Eb,Virology,52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が利用できる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般態様は、米国特許第４３９９２１６号中に記載されている。酵母における形質転換は典型的に、Van Solingenら、J.Bact.,130:946(1977)とHsiaoら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法に従って行われる。しかしながら、核ミクロ注入、エレクトロポレーション、完全な細胞と細菌のプロトプラスト融合、ポリカチオン、例えばポリブレン又はポリオルニチン、のような細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するための各種の技術については、Keownら、Methods in Enzymology,185:527-537(1990)とMansourら、Nature,336:348-352(1988)を参照。
【０１２５】
ここでのベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現するために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等な真核生物を含む。適当な原核生物は、真性細菌属に制限されることなく、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌のようなエシェリキア属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能である。
【０１２６】
原核生物に加えて、糸状真菌又は酵母のような真核微生物は、ＰＲＯ５３３-コード化ベクターのための適当なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエは、普通に用いられる下等な真核宿主微生物である。
【０１２７】
グリコシル化ＰＲＯ５３３の発現用に好適な宿主細胞は、多細胞生体から得られる。無脊椎動物細胞の実例は、ショウジョウバエＳ２とスポドプテラＳｆ９のような昆虫細胞、同じく植物細胞を含む。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、Grahamら、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内と思われる。
【０１２８】
ｉｉｉ．複製可能ベクターの選択と使用
ＰＲＯ５３３をコードしている核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニングのため（そのＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクターに挿入し得る。各種のベクターが、公共的に利用可能である。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とし得る。その適切な核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１以上のシグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止配列を含む。これらの１以上の構成要素を含む適当なベクターの構築は、熟達した研究者に周知である標準的な結紮技術を利用する。
【０１２９】
該ＰＲＯ５３３は、直接的にのみならず、シグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチドとし得る非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えによって製造し得る。一般に、該シグナル配列は、ベクターの構成要素として良く、又はそれはベクターに挿入されるＰＲＯ５３３-コード化ＤＮＡの一部とし得る。該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は心臓-安定エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物のシグナル配列とし得る。酵母分泌用のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセスとクリベロミセスα因子リーダーを含む、後者は米国特許第５０１０１８２号中に記載される)、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362179)、又は1990年11月15日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載されたシグナルとして良い。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、同じ又は関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列のようなタンパク質の直接分泌、同じくウイルス分泌リーダーに使用し得る。
【０１３０】
発現及びクローニングベクターの両方は、選択した宿主細胞の１以上の中でそのベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、各種の細菌、酵母、及びウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点は、大部分のグラム陰性細菌用に好適であり、２μプラスミド起点は、酵母用に好適であり、且つ各種のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ)は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。
【０１３１】
発現及びクローニングベクターは、典型的に選択遺伝子、選択可能マーカーとも言われる、を含むであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）補充栄養要求性欠如、又は（ｃ）例えばバチルス属のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子のような、複合培地から利用可能でない臨界栄養源の供給、のタンパク質をコードする。
【０１３２】
哺乳動物細胞用の適当な選択マーカーの実例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような、ＰＲＯ５３３-コード化核酸を取り込むための感応細胞の同定を可能にするそれらである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適当な宿主細胞は、Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)によって記載されるように製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨＯ細胞系である。酵母において使用するために適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である[Stinchcombら、Nature,282:39(1979)；Kingsmanら、Gene, 7:141(1979)；Tschemperら、Gene,10:157(1980)]。該ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ATCC No.44076又はPEP4-1用の選択マーカーを提供する[Jones,Genetics,85:12(1977)]。
【０１３３】
発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を導くためのＰＲＯ５３３コード化核酸配列に操作可能に結合したプロモーターを通例は含む。各種の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主で使用するために好適なプロモーターは、β-ラクタマーゼとラクトースプロモーター系[Changら、Nature,275:615(1978)；Goeddelら、Nature,281:544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res.,8:4057(1980); EP36776]、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター[deBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]を含む。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡに操作可能に結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列をも含むであろう。
【０１３４】
酵母宿主で使用するために適当なプロモーター配列は、３-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzemanら、J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖酵素[Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]を含む。
【０１３５】
増殖状態によって制御される転写の更なる効果を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵素プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクトース利用のための応答可能な酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適当なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３６５７中に更に記載される。
【０１３６】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＰＲＯ５３３転写は、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(アデノウイルス２のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから；非相同哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター；及び宿主細胞系と和合されるそのようなプロモーターを提供する、熱ショックプロモーター、から得られたプロモーターによって制御される。
【０１３７】
より高等な真核生物によるＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加し得る。エンハンサーは、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス-作用要素であり、その転写を増加するプロモーターに作用する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物から現在知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、及びインスリン）。典型的に、しかしながら、それは真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるだろう。実例は、複製起点の後の側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。該エンハンサーは、ＰＲＯ５３３コード化配列の位置５’又は３’でベクター内にスプライスされるが、しかし好ましくは該プロモーターから部位５’に配される。
【０１３８】
真核生物細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現は、転写の終止のため及びｍＲＮＡを安定化するために必要な配列をも含むであろう。そのような配列は普通、真核生物又はウイルスＤＮＡｓ又はｃＤＮＡｓの５’及び時折３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ＰＲＯ５３３をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写したヌクレオチドセグメントを含む。
【０１３９】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＷＩＳＰポリペプチドの合成への適合のために好適な更に他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gethingら、Nature,293:620-625(1981); Manteiら、Nature,281:40-46(1979); EP117060;とEP117058中に記載される。
【０１４０】
ＩＶ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用いて、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法[Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイゼーションで測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識できるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良く、且つ該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本鎖の形成において、該二本鎖に結合した抗体の存在が検出できるように表面に結合される場合、実行し得る。
【０１４１】
あるいは遺伝子発現は、細胞の免疫組織学的染色又は組織切片のような免疫学的方法及び遺伝子生成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のアッセイによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染色のために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物においても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＰＲＯ５３３ポリペプチドに対して、又はここに提供したＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して又はＰＲＯ５３３ＤＮＡと特異的抗体エピトープをコードしているものと融合した外因性配列に対して製造し得る。
【０１４２】
Ｖ．ポリペプチドの精製
ＰＲＯ５３３の形成物は、培地又は宿主細胞溶解物から回収し得る。もし膜に結合しているならば、それは適当な洗剤溶液(例えばTriton-X100)を用いて又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。ＰＲＯ５３３の発現において用いた細胞は、凍結-融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。
【０１４３】
それは組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＰＲＯ５３３を精製するために望まれるであろう。以下の手法は、好適な精製手法の例示である：イオン交換カラムでの分画によって；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでの又はＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSEPHADEXTMG-75を用いたゲル濾過；ＩｇＧのような不純物を除去するためのプロテインＡSEPHAROSETMカラム；及びＰＲＯ５３３のエピトープ-標識化形を結合する金属キレート化カラム。タンパク質精製の各種の方法を用いて良く、さらにそのような方法は当該分野で周知であり、且つ、例えば、Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990);及びScopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York,1982)中に記載される。選択した精製工程は、例えば使用した生産物の及び生産した特有のＰＲＯ５３３の本質に基づくであろう。
【０１４４】
Ｅ．ＰＲＯ５３３及び／又は抗-ＰＲＯ５３３抗体の使用
１．ＰＲＯ５３３の遺伝的使用
ＰＲＯ５３３をコードしているヌクレオチド配列（又はその相補体）は、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡとＤＮＡの生成においてハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む、当該分野及び分子生物学の分野における各種の適用を有する。ＰＲＯ５３３核酸は、ここに記載した組換え技術によってＰＲＯ５３３ポリペプチドの製造用にも有用であろう。
【０１４５】
全長天然ＰＲＯ５３３遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、全長遺伝子を単離するための又は図１（配列番号：１）に開示したＰＲＯ５３３と同一の望まれる配列を有する、更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯ５３３の天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯ５３３）を単離するためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。任意に、該プローブの長さは、約２０から約８０塩基とされるであろう。好ましくは、その長さは約２０から約５０塩基までである。例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択したプローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いてＰＲＯ５３３遺伝子のコード化領域を単離することを含むであろう。加えて、図５中に記載したプローブもまた、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。ハイブリダイゼーションプローブは、32Ｐ又は35Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系に結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識を含む、各種の標識によって標識化し得る。本発明のＰＲＯ５３３遺伝子のそれに相補な配列を有する標識化プローブは、プローブをハイブリダイズするそのようなライブラリーのメンバーを決定するためヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンするために使用することができる。ハイブリダイゼーション技術は、後述の実施例中に更に詳細に記載される。
【０１４６】
該プローブは、密接に関係したＰＲＯ５３３配列の同定のための配列のプールを生成するためのＰＣＲ技術においても利用し得る。
【０１４７】
ＰＲＯ５３３をコードしているヌクレオチド配列はまた、ＰＲＯ５３３をコードするその遺伝子のマッピングのため及び遺伝的疾患を持つ個人の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用できる。ここに提供されたヌクレオチド配列は、in situハイブリダイゼーション、周知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのような周知技術を用いた染色体及び染色体の特有の領域にマッピングし得る。
【０１４８】
ＰＲＯ５３３がＦＧＦ４レセプター（ＦＧＦＲ４）に結合することを示しているように、それは結合相互作用に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイにおいて使用することができる。そのような方法により、レセプターリガンド結合相互作用のインヒビターを同定することができる。そのような結合相互作用に含まれたタンパク質はまた、ペプチド又は小分子インヒビター又は結合相互作用のアゴニストをスクリーンするために使用することもできる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ５３３又はＰＲＯ５３３用レセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に好適なそれらを作る、化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに服しやすいアッセイを含むであろう。意図される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。該アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ及び当該分野において十分に特徴付けされる細胞ベースのアッセイを含む、各種の方式において実行することができる。
【０１４９】
ＰＲＯ５３３又は何れかのその修正された形態をコードしている核酸は、治療的に有効な試薬の開発又はスクリーニングにおいて、その結果有用であるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れか一方を生産するためにも使用できる。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）は、出生前の、例えば胎児段階で、トランスジーンがその動物に、又はその動物の親に導入された、トランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、開発するトランスジェニック動物からの細胞のゲノム内に導入されるＤＮＡである。一つの実施態様において、ＰＲＯ５３３をコードしているｃＤＮＡは、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために用いた確立した技術及びゲノムの配列に従いＰＲＯ５３３をコードしているゲノムＤＮＡをクローンするため使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラットのような動物を作製するための方法は、当該分野において通常的になされており、例えば米国特許第４７３６８６６と４８７０００９号中に記載される。典型的に、個々の細胞は、組織特異的エンハンサーによるＰＲＯ５３３トランスジーン組み込みのための標的とされるであろう。胎児段階でその動物の生殖細胞系に導入したＰＲＯ５３３をコードしているトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物は、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡの増加した発現の作用を実験するために用いることができる。そのような動物は、例えば、それの過剰発現と関連した病的状態からの保護を与えることを通して試薬のためのテスター動物として使用することができる。本発明のこの態様に従い、動物はその試薬で治療され、その病的状態の可能性のある治療的な介入を示すであろう、該トランスジーンを持つ治療しない動物と比べて、病的状態の徴候が減じられる。
【０１５０】
ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしている核酸はまた、遺伝子治療においても使用し得る。遺伝子治療適用において、遺伝子は、治療的に有効な遺伝子生産物、例えば欠陥遺伝子の置換のため、インビボ合成を達成するために細胞内に導入される。「遺伝子治療」は、永続的な効果が単独治療で達成される通常の遺伝子治療、及び治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一度の又は繰り返される投与を含む遺伝子治療剤の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡとＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止するための治療薬として使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それがインヒビターとして作用する場合に、細胞膜によってそれの取込みが制限されることに起因したそれの低い細胞内濃度にもかかわらず、細胞内に移入できることが既に示されている。(Zamecnikら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,4143-4146[1986])。該オリゴヌクレオチドは、その取込みを増すために、例えば非荷電基によって陰性荷電したホスホジエステル基を置換することによって修飾できる。
【０１５１】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な各種の技術がある。該技術は、該核酸が、意図した宿主の細胞中にインビトロで、又はインビボで培養細胞中に転移されるかどうかに基づいて変化する。インビトロで哺乳動物細胞への核酸の転移のための好適な技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、ミクロ注入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストリン、リン酸カルシウム沈澱法などを含む。現在好適なインビボ遺伝子転移技術は、ウイルス（典型的にレトロウイルス）ベクターとウイルス被覆タンパク質-リポソーム仲介トランスフェクション(Dzauら、Trends in Biotechnology 11,205-210[1993])を含む。いくつかの状態において、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞、該標的細胞上のレセプター用のリガンドなどに特異的な抗体のような、標的細胞を標的にする作用因子によって核酸供給源を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連した細胞膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化のため及び／又は取込みを容易にするために、例えば、特有な細胞型に向性のカプシドタンパク質又はそれのフラグメント、循環において内在化を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的にし且つ細胞内半減期を増加するタンパク質を使用し得る。レセプター-仲介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら、J.Biol.Chem.262,4429-4432(1987);及びWagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3410-3414(1990)に記載される。遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの再考のためには、Andersonら、Science 256,808-813(1992)を参照。
【０１５２】
本発明の抗-ＰＲＯ５３３抗体は、各種の有用性を有する。例えば、抗-ＰＲＯ５３３抗体は、ＰＲＯ５３３の診断アッセイにおいて、例えば特異的な細胞、組織、又は血清中のその発現を検出することにおいて使用し得る。競合結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び異種又は同種相で実施される免疫沈降アッセイ[Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)147-158頁]のような当該分野で周知の各種診断アッセイ技術が使用し得る。診断アッセイにおいて使用した抗体は、検出可能な部分で標識することができる。該検出可能な部分は、直接又は間接的のいずれか一方で、検出可能なシグナルをもたらすことができるべきである。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ，14Ｃ，32Ｐ，35Ｓ，又は125Ｉのような放射性同位体、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素とし得る。該検出可能部分への抗体の接合のための当該分野で周知のいずれ以下の方法は、Hunterら、Nature,144:945(1962);Davidら、Biochemistry,13:1014(1974);Painら、J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)によって記載されたそれらの方法を含み、利用し得る。
【０１５３】
抗-ＰＲＯ５３３抗体はまた、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯ５３３のアフィニティー精製に有用である。この方法において、ＰＲＯ５３３に対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、Sephadex樹脂又は濾紙のような適当な支持体上に固定化される。固定化した抗体は、次いで精製するべきＰＲＯ５３３を含む試料に接触させ、その後該支持体を、ＰＲＯ５３３以外の試料中の実質上全ての材料を除去するであろう適当な溶媒で洗浄される。最後に、該支持体は、該抗体からＰＲＯ５３３を放出するであろう別の適当な溶媒で洗浄される。
【０１５４】
ＦＧＦｓは、マイトジェン的な及び非マイトジェン的な手法の両方において細胞と作用することができる。これらの因子は、顆粒膜細胞、副腎皮質細胞、クロンドルサイト(chrondorcytes)、筋芽細胞、角膜及び血管内皮細胞（ウシ又はヒト）、血管平滑筋細胞、水晶体、網膜及び前立腺上皮細胞、稀突起神経膠細胞、星状細胞及び骨芽細胞を含む、広範な正常な二倍体中胚葉-由来及び神経堤-由来細胞についてマイトジェンである。
【０１５５】
ＦＧＦの非-マイトジェン作用は、創傷部への細胞移動の促進（化学走性）、新たな血管形成の開始（新脈管形成）、エンドクリン機能の変調、及び特異的細胞タンパク質発現、細胞外マトリックス生成物と細胞生存性の刺激又は抑制を含む。Barird,A. Bohlen,P.,Handbook of Exp.Pharmacol.95(1):369-418(1990)。これらの特性は、創傷治癒、神経再生、副次の血管形成などを促進する治療的アプローチにおけるＦＧＦｓを用いるための基礎を提供する。例えば、ＦＧＦｓは、心臓疾患と手術における心筋層の損傷を最少にすることが示唆されている（米国特許第４３７８４３７号）。
【０１５６】
ＦＧＦメンバーは、発育の間に分化した表現形を促進及び阻止する、新脈管形成及び好中球作用を仲介する、及び細胞移動を変調する能力を含む役割を持つ中胚葉又は神経外胚葉の細胞で異なった活性を有することが示されている。Goldfarb,M.,Cytokine Growth Factor Rev.7:311-25(1996);Naski,M.C.とOrnitz,D.M.,Front Biosci.3:D781-94(1998);Slavin,J.Cell.Biol.Int/19:431-44(1995)。ＤＮＡ４９４３５のin situ分析は、胎児皮膚、軟骨、胎児網膜の内面、及び成人胆嚢上皮（図８）、同じく胎児小腸、胎盤の絨毛と臍帯（図示せず）において発現を示す。ＤＮＡ４９４３５は、生存組織におけるＲＴ-ＰＣＲによって明確に検出可能でなかった（図示せず）。ＤＮＡ４９４３５が結腸腺癌細胞形ＳＷ４８０における増加したレベルを示し、それによってＰＲＯ５３３のアンタゴニストが結腸癌の治療において治療効果を有すことができることを示す、更なる証拠がある。
【０１５７】
ＤＮＡ４９４３５をコードしたＰＲＯ５３３は、周知のＦＧＦファミリーにおいて独自な特性、線維芽細胞増殖因子レセプター-４（ＦＧＦＲ-４）に独創的に結合する特異性を示す。ＦＧＦＲ-４シグナリングは、実際上非-マイトジェンであることが提案される。その独自の結合特性のために、ＰＲＯ５３３は、最初の細胞と動物モデルの複合体中でのＦＧＦＲ４機能を検査する及び分析するための試薬として使用することができる。ＦＧＦＲ４のアップレギュレーション又は増幅は、各種のヒトの癌、特に胸癌に関係付けられている。Abass,S.A.ら、J.Clin.Endocrinol.Metal.82:1160-66(1997);Johnston,C.L.ら、Biochem.J.306:609-16(1995);McLeskey,S.W.ら、Cancer Res.54:523-30(1994);Penault-Llorca,F.ら、Int.J.Cancer 61:170-76(1995);Ron,D.R.,J.Biol.Chem.268:5388-94(1993)。ＦＧＦＲ４が、しかしＦＧＦＲ１−３ではない、癌細胞部分に関連し得る膜ラフ化応答を仲介できることが示されている。Johnston,C.L.,Biochem.J.306:609-16(1995)。ＳＷ４８０結腸腺癌におけるＤＮＡ４９４３５の高いレベルでの発現は、オートクラインシグナリングにおけるＦＧＦＲ４の変調効果を反映する。
【０１５８】
胎児軟骨における特異的なＦＧＦＲ４-リガンド、ＰＲＯ５３３の発現は、その上に軟骨又は骨の発育におけるＦＧＦ１９の可能性のある役割を示唆する。軟骨と胎児網膜におけるその発現との関連において１１ｑ１３に対するＤＮＡ４９４３５の染色体マッピングは、ＰＲＯ５３３-コード化ＤＮＡが骨粗しょう症-偽性神経膠腫症候群、骨粗しょう症によって定義される稀な疾患、硝子体網膜の異常形成症、筋肉低張、及び靱帯の弛緩についての候補遺伝子であることを示唆する。Frontail,M.ら、Am.J.Med.Genet.22:35-47(1985);Gong,Yら、Am.J.Hum.Genet.59:146-51(1996);Johnson,M.L.ら、Am.J.Hum.Genet.60:1326-32(1997);Somer,J.ら、J.Med.Genet.25:543-49(1988)。
【０１５９】
２．腫瘍組織と細胞系中のＰＲＯ５３３をコードしている遺伝子の増幅
本発明は、ＰＲＯ５３３をコードしている遺伝子が一次肺癌中で増幅されることの知見に基づいている。
【０１６０】
原核生物と真核生物のゲノムは、２つの一見したところ相反する要求に支配される。一つは、多重生産を通して安定な遺伝的性質を保証するための、その最初の形における遺伝情報としてのＤＮＡの保存と増殖である。他方、細胞又は生体は、永続的な環境変化に適合できる必要がある。その適合メカニズムは遺伝的材料の定性的又は定量的改変を含むことができる。定性的改変は、コード化配列が構造的及び／又は機能的に異なるタンパク質を生じるように変えられるＤＮＡ変異を含む。遺伝子増幅は定量的な改変であり、それによって完全なコード化配列、即ち遺伝子の実際の数は、転写のために利用可能内型の増加した数、翻訳可能な転写物の増加した数に至るように、及び結局は増幅した遺伝子によってコードされたタンパク質の増加した豊富さに至るように増加する。
【０１６１】
遺伝子増幅の現象とその基礎をなすメカニズムは、幾つかの原核生物と真核生物系においてインビトロで調査されている。遺伝子増幅の最も良く特徴付けされた実例は、細胞毒性薬メトトレキサート（ＭＴＸ）の各種の濃度を含む培地における真核生物細胞の培養を含む。ＭＴＸは、葉酸類似体であり、酵素デヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）によるＤＮＡ合成に干渉する低濃度のＭＴＸに最初に曝露される間に、多くの細胞（＞９９．９％）が死ぬであろう。少数の細胞が生き残り、大量のＤＨＦＲ-ＲＮＡとタンパク質を生産することによりＭＴＸの増加した濃度で増殖することができる。この過剰生産の基礎は、単一のＤＨＦＲ遺伝子の増幅である。該遺伝子の付加のコピーは、少量の、余分な染色体（double minutes）の形態において染色体外コピーとして又は組み込まれた染色体コピーとして見出される。
【０１６２】
遺伝子増幅は、細胞毒性薬（細菌用の抗生物質と真核生物用の化学療法剤）に対する抵抗性の進展及び腫瘍性の形質転換において最も普通に直面する。自然発生的な事象又はウイルス又は化学的／環境的攻撃のためのような真核生物細胞の形質転換は、その細胞の遺伝的材料の変化に典型的には関連付けられる。ヒト悪性疾患で観測される最も普通の遺伝的変化の一つは、ｐ５３タンパク質の変異である。ｐ５３は、定常期（Ｇ１）から複製の（Ｓ）相までの細胞の遷移を制御し、且つＤＮＡ損傷の存在においてこの遷移を防止する。換言すれば、ｐ５３変異を無効にすることの主要な重要性の一つは、ＤＮＡ損傷、即ち遺伝的な変化の蓄積と増殖である。新生物性細胞における遺伝的変化の共通の形は、点変異に加え、増幅と粗大、転座のような構造的変更である。
【０１６３】
ＤＮＡ配列の増幅は、ＤＨＦＲ実験系において説明した通り特異的な機能的要求を示し得る。従って、悪性疾患におけるある種のオンコジーンの増幅は、悪性の形質転換及び形質転換した表現型の維持のプロセスにおいてこれらの遺伝子の使役的役割に向けられる。この仮説は、細菌の研究で裏付けが得られている。例えば、ｂｃｌ-２タンパク質は、非-ホジキンリンパ腫のある種の型において増幅されることが見出されている。このタンパク質は、アポトーシスを阻害し、新形成細胞の進展的蓄積に至る。増殖因子レセプターのメンバーは、これらレセプターの過剰発現が利用可能な増殖因子の制限された量へのより劣る感受性の腫瘍性細胞を作り得ることを示唆する、各種タイプの癌において増幅されることが見出されている。実例は、アンドロゲン剥脱治療の間の再発性前立腺癌におけるアンドロゲンレセプターの増幅と、胸癌における増殖因子レセプター相同体ＥＲＢ２の増幅を含む。最後に、細胞内シグナリングと細胞サイクル順行の制御に含まれた遺伝子は、悪性の形質転換を間に増幅を受けることができる。これは、各種の上皮とリンパ様新形成におけるｂｃｌ-１とｒａｓ遺伝子の増幅によって説明される。
【０１６４】
これらの以前の研究は、このアプローチが悪性の形質転換のために重要な遺伝子を同定することができるために、新形成において増幅したＤＮＡ配列の同定の実現可能性を表す。ＥＲＢ２のケースはまた、形質転換タンパク質が腫瘍治療のための新規且つ特異的な標的を表し得ることから、治療的な立場から実現可能性を示す。
【０１６５】
幾つかの異なる技術が、増幅した遺伝子配列を示すために使用することができる。癌細胞から調製した染色体伸長の旧来の細胞遺伝学的分析は、転座、欠失及び逆転のような相対的な構造的変更を同定するために適する。増幅された遺伝的領域は、もしそれが高いコピー数を持つ大きな領域を含むか又は染色体外材料として提供されるなら、初めて視覚化することができる。細胞遺伝学が特有の新生物形成による特異的な染色体の一貫した関連を実証するための最初の技術であった一方で、それは管理できるＤＮＡ配列の同定と単離のために不十分である。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）のより最近開発された技術は、新生物におけるゲノム増幅の広範囲に及ぶ現象を示している。腫瘍と正常なＤＮＡは、正常細胞の中期で同時にハイブリダイズされると共に、全体のゲノムは増加した頻度で主要において存在するＤＮＡ配列のためのイメージ分析によってスクリーンすることができる。（ＷＯ９３／１８１８６；Grayら、Radiation Res.137,275-289[1994]）。スクリーニング法として、このタイプの分析は、各種のヒト新生物において繰り返される非常に多数のアンプリコン（増幅したＤＮＡのストレッチ）を明らかにしている。たとえＣＧＨがＤＮＡの増幅したストレッチの同定において古典的な細胞遺伝学的分析よりもより感受性であったとしても、それは標準の分子遺伝学的技術によってアプリコンの中のコード化配列の迅速な同定と単離を与えない。
【０１６６】
遺伝子増幅を検出するための最も敏感な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイである。出発材料として非常に少量の腫瘍ＤＮＡを用いるこれらのアッセイは、非常に鋭敏であり、配列決定のような更なる分析で扱いやすいＤＮＡを提供し且つ高-容量スループット分析用に好適である。
【０１６７】
上述したアッセイは互いに排他的ではないが、新生物における増幅を同定するために組み合わせて度々使用される。細胞遺伝学的分析とＣＧＨが増幅した領域のための全体のゲノムを調査するためのスクリーニング法を表す一方、ＰＣＲ-ベースのアッセイは、コード化配列、即ち増幅した領域中の遺伝子の最終的な同定のために最も好適である。
【０１６８】
本発明に従って、そのような遺伝子は、胸、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの癌を含む、各種の一次腫瘍、又は健康者ドナーからのプールされたＤＮＡと腫瘍細胞系からのＤＮＡとを比較することによって、定量ＰＣＲ(S.Gelminiら、Clin.Chem.43:752[1997]によって同定されている。定量的ＰＣＲは、TaqMan手段（ＡＢＩ）を用いて実行した。遺伝子-特異的プライマーと蛍光原生プローブは、該ＤＮＡｓのコード化配列に基づいて設計した。
【０１６９】
一次ヒト肺癌細胞は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、非-小細胞癌、小細胞癌、及び気管支肺胞癌から通常得られ、且つ例えば、ＳＲＣＣ７２４(「ＳｑＣＣａ」と略記した扁平上皮癌)、ＳＲＣＣ７２５（「ＮＳＣＣａ」と略記した小細胞癌）、ＳＲＣＣ７２６（「ＡｄｅｎｏＣａ」と略記される腺癌）、ＳＲＣＣ７２７（腺癌）、ＳＲＣＣ７２８（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７２９（腺癌）、ＳＲＣＣ７３０（腺／扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３１（腺癌）、ＳＲＣＣ７３２（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３３（腺癌）、ＳＲＣＣ７３４（腺癌）、ＳＲＣＣ７３５（「ＢＡＣ」と略記される、気管支肺胞癌）、ＳＲＣＣ７３６（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３８（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３９（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７４０（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７４０（「ＬＣＣａ」と略記した肺細胞癌）を含む。
【０１７０】
３．組織分布
ここでの遺伝子増幅アッセイの結果は、各種のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することによるような更なる研究によって証明することができる。
【０１７１】
前に記載したように、各種の組織における遺伝子増幅及び／又は遺伝子発現は、通常のサザーンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205[1980])、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はここに提供した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識できるそれを利用し得る。
【０１７２】
各種組織における遺伝子発現は、あるいは、遺伝子生成物の発現を直接定量するため、組織切片の免疫組織学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイのような免疫学的方法によって測定し得る。免疫組織学的染色及び／又は試料流体のアッセイのために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物においても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＰＲＯ５３３ポリペプチドに対して、又はここに提供したＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して又はＰＲＯ５３３ＤＮＡと特異的抗体エピトープをコードしているＤＮＡとを融合した外因性配列に対して製造し得る。抗体を生成するための一般的な技術、及びノーザンブロット法及びin situハイブリダイゼーションのための特別なプロトコールは、以下に提供される。
【０１７３】
４．染色体マッピング
もし得られた遺伝子の増幅が機能的に関係するならば、次にその遺伝子は、腫瘍生存のために重要でない隣接ゲノム領域より以上を増幅すべきである。この試験のために、該遺伝子は、例えば放射線-ハイブリッド分析によって特有の染色体にマップすることができる。次いで増幅レベルが同定した位置で測定され、且つ隣接ゲノム領域でのレベルが比較される。マップ化されている遺伝子についてゲノム領域での選択と優先する増幅は、観測された遺伝子増幅が腫瘍増殖又は生存を促進するその可能性と一致する。染色体マッピングは、フレームワークと中心点マッピングの両方を含む。更なる詳細のために、例えばStewartら、Genome Research 7,422-433(1997)を参照。
【０１７４】
５．抗体結合実験
遺伝子増幅実験の結果は、腫瘍（癌）細胞上のＰＲＯ５３３ポリペプチドの効果を阻止する抗-ＰＲＯ５３３抗体の能力が試験される抗体結合実験によってさらに証明することができる。例示抗体は、その製造が後述されるだろう、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及び異種接合抗体を含む。
【０１７５】
抗体結合実験は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイのようないずれか周知のアッセイで利用し得る。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,147-158頁(CRC Press, Inc.,1987)。
【０１７６】
競合結合アッセイは、制限された量の抗体と結合することについて試験試料分析物と競合する標識した標準の能力による。試験試料中の標的タンパク質（腫瘍細胞中の増幅した遺伝子によってコードされた）の量は、該抗体に結合が起こる標準の量に反比例する。結合が起こる標準の量を容易に測定するため、その抗体は、該抗体に結合される標準と分析物が、結合せずに残る標準と分析物と利便的に分離し得るように、該競合化の前又は後に好ましくは不溶化される。
【０１７７】
サンドウィッチアッセイは、検出するべきタンパク質の、異なる免疫原性部分、又はエピトープにそれぞれが結合できる、二つの抗体の使用を含む。サンドウィッチアッセイにおいて、該試験試料分析物は、固体支持体上に固定化される第１の抗体に結合させ、その後、第２の抗体を該分析物に結合させ、かくして不溶性の３成分複合体が形成される。例えば、米国特許第４３７６１１０号参照。該第２の抗体は検出可能な部分によりそれ自身標識して良く(直接サンドウィッチアッセイ)又は検出可能な部分で標識される抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定して良い(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一つのタイプは、その検出可能な部分が酵素であるケースにおけるＥＬＩＳＡである。
【０１７８】
免疫組織化学のために、腫瘍試料は、新鮮物又は凍結物として良く又はパラフィン包埋及び例えばホルマリンのような保存剤で固定して良い。
【０１７９】
６．細胞-ベースの腫瘍アッセイ
腫瘍（例えば癌）のための細胞-ベースのアッセイと動物モデルは、遺伝子増幅アッセイの知見を証明するために、且つここで同定した遺伝子と腫瘍性の細胞増殖の進行と病因との間の相関関係をさらに理解するために使用することができる。腫瘍又は癌の進行と病因におけるここに同定した遺伝子生成物の役割は、ここでの遺伝子を増幅することが同定されている一次腫瘍細胞を用いることによって試験することができる。そのような細胞は、先に記した肺癌細胞を含む。
【０１８０】
異なるアプローチにおいて、特有な腫瘍に含まれることが知られる細胞型の細胞は、ここでのｃＤＮＡによってトランスフェクトされ、且つ過度の増殖を誘導するためにこれらのｃＤＮＡｓの能力が分析される。適当な細胞は、望まれる遺伝子でトランスフェクトすること及び腫瘍形成性増殖をモニターすることができる、Ｂ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーンでトランスフェクトした安定なＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）及びｒａｓ-トランスフェクト化ＮＩＨ-３Ｔ３細胞のような安定な腫瘍細胞系を含む。そのようなトランスフェクト化細胞系は、トランスフェクトした細胞についての細胞増殖抑制性又は細胞毒性活性を行使することによって、又は抗体-依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介することによって、腫瘍形成性細胞増殖を阻害するためのポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するために用いることができる。ここで同定した遺伝子のコード化配列でトランスフェクトした細胞は、癌の治療用の薬剤候補を同定するためにさらに使用することができる。
【０１８１】
加えて、トランスジェニック動物（後述するような）中の腫瘍から得た一次培養物は、たとえ安定細胞系が好ましいとしても、ここでの細胞-ベースのアッセイにおいて使用することができる。トランスジェニック動物から連続的な細胞系を得るための技術は、当該分野で周知である（例えば、Smallら、Mol.Cell.Biol.5,642-648[1985]）。
【０１８２】
７．動物モデル
種々の周知の動物モデルは、腫瘍の進行と病因においてここで同定した遺伝子の役割をさらに理解するために、及び抗体と、小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアンタゴニストを含む候補治療剤の有効性を試験するために使用することができる。そのようなモデルのインビボでの本質は、ヒトの患者における応答の特有な予測をそれで実行する。腫瘍と癌（例えば胸癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非-組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非-組換え動物モデルは、例えば、ネズミモデルのような齧歯動物を含む。そのようなモデルは、例えば、皮下注射、尾の静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎被膜下の移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例えば結腸組織に移植した結腸癌細胞、のような標準技術を用いた同系マウスに腫瘍細胞を導入することによって生起することができる。（例えば、1997年9月18日公開のＷＯ９７／３３５５１参照）。
【０１８３】
オンコロジー実験において最も頻繁に用いられる動物種の一つは、免疫不全マウスであり、特にヌードマウスである。発育不全に罹ったヌードマウスがヒト腫瘍異種移植のための宿主として成功裏に振る舞うことができるという観測は、この目的のために広範に拡がったその使用に至っている。常染色体の劣性ｎｕ遺伝子は、例えば、ＡＳＷ，Ａ／Ｈｅ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ，Ｂ１０．ＬＰ，Ｃ１７，Ｃ３Ｈ，Ｃ５７ＢＬ，Ｃ５７，ＣＢＡ，ＤＢＡ，ＤＤＤ，ｌ／ｓｔ，ＮＣ，ＮＦＲ，ＮＦＳ，ＮＦＳ／Ｎ，ＮＺＢ，ＮＺＣ，ＮＺＷ，Ｐ，ＲＩＩＩとＳＪＬを含む、ヌードマウスの非常に多数の別個の類似遺伝子系統内に導入されている。加えて、該ヌードマウス以外の遺伝した免疫学的欠損を持つ広範な他の動物が、繁殖され且つ腫瘍異種移植の受容体として用いられている。更なる詳細のために、例えば、The Nude Mouse in Oncology Research,E.BovenとB.Winograd,eds.,CRC Press,Inc.,1991を参照。
【０１８４】
そのような動物に導入される細胞は、上述した腫瘍細胞系のいずれか、及び、例えばＢ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーンでトランスフェクトした安定なＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ-トランスフェクト化ＮＩＨ-３Ｔ３細胞；Ｃａｃｏ-２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ-３７）；適度に十分に-分化したグレードＩＩヒト結腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ-３８）のような周知の腫瘍／癌細胞系から、又は腫瘍と癌から得ることができる。腫瘍又は癌の試料は、手術を受けている患者から標準条件を用いて得ることができる（例えば、液体窒素中での凍結と保存。Karmaliら、Br.J.Cancer 48,689-696[1983]）。
【０１８５】
腫瘍細胞は、各種の手法によってヌードマウスのような動物中に導入することができる。マウスにおける皮下(s.c.)腔は、腫瘍移植のために非常に好適である。腫瘍は、固体ブロックとして、トロカールの使用によってニードルバイオプシーとして、又は参謀懸濁液として、s.c.移植することができる。固体ブロック又はトロカール移植のため、適当なサイズの腫瘍組織片がs.c.腔に導入される。細胞懸濁液は、一次腫瘍又は安定腫瘍細胞系から新鮮なものを作製し、皮下的に注射される。腫瘍細胞は、皮下移植として注入することもできる。この状況において、該接種材料は、真皮結合組織の底部とs.c.組織との間に堆積される。BovenとWingrad,上記。
【０１８６】
胸癌の動物モデルは、例えば、Drebinら、PNAS USA 83,9129-9133(1986)によって本質的に記載されたように、ヌードマウスへのラット神経芽細胞腫細胞（ｎｅｗオンコジーンが最初に単離された）、又はｎｅｗ-形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３を移植することによってもたらすことができる。
【０１８７】
同じく、結腸癌の動物モデルは、これらの動物における腫瘍の出現に至る、動物、例えばヌードマウスにおいて結腸癌細胞を継代接種することによってもたらすことができる。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植は、例えば、Wangら、Cancer Res.54,4726-4728(1994)とTooら、Cancer Res.55,681-684(1995)によって記載されている。このモデルは、AntiCancer社(San Diego,California)によって販売される「METAMOUSER」と呼ばれるものをベースにしている。
【０１８８】
動物中で生じる腫瘍は、取り出し且つインビトロで培養することができる。インビトロ培養からの細胞は、次いで動物で継代接種することができる。そのような腫瘍は、更なる試験又は薬剤スクリーニングのための標的として利用することができる。あるいは、該継代接種で生じた腫瘍が単離され、そして予備継代接種細胞及び継代接種の１以上のラウンドの後の細胞からのＲＮＡが、興味ある遺伝子の示差発現によって分析される。そのような継代接種技術は、何れかの周知の腫瘍又は癌細胞系で実行することができる。
【０１８９】
例えば、Ｍｅｔｈ Ａ，ＣＭＳ４，ＣＭＳ５，ＣＭＳ２１，及びＷＥＨＩ-１６４は、各種作用因子の抗-腫瘍活性を実験するための高度に制御可能なモデル系を提供するＢＡＬＢ／ｃ雌マウス(DeLeoら、J.Exp.Med.146,720[1977])の線維肉腫が化学的に誘導される(Palladinoら、J.Immunol.138,4023-4032[1987])。概略は、腫瘍細胞は、細胞培養においてインビトロで伝播される。該動物への注射の前に、該細胞系は洗浄され、且つ約１０ｘ１０6から１０ｘ１０7細胞／ｍｌまでの細胞濃度で、緩衝液中に懸濁される。該動物は、該細胞懸濁液の１００から１００μｌを皮下的に注射し、腫瘍の出現まで１から３週間を見越しておく。
【０１９０】
加えて最も完全に研究された一つである、マウスのルイス肺（３ＬＬ）癌が、実験腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルでの有効性は、肺の小細胞癌（ＳＣＣＬ）で診断したヒト患者の治療において有益な効果と相関している。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断片の又は培養において維持した細胞の注射で正常マウス中に導入することができ(Zupiら、Br.J.Cancer 41,suuppl.4,309[1980])、且つ証拠は、腫瘍が一様な単細胞の注射によって開始でき、且つ感染した腫瘍細胞生存性の非常に高い比率を示す。この腫瘍モデルに関しての更なる情報のために、Zacharski,Haemostasis 16,300-320[1986])を参照。
【０１９１】
腫瘍が移植される動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療の前と後に該腫瘍のサイズを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍のサイズは、二又は三次元でのスライドカリパスで測定されている。二次元に制限した測定は、腫瘍のサイズを正確に反映しておらず、それ故に、それは数学上の式を用いることによって一致する容積に通例は変換される。しかしながら、腫瘍サイズの測定は、非常に不正確である。薬剤候補の治療効果は、治療-誘導増殖遅延と特異的増殖遅延としてより良好に記述することができる。腫瘍増殖の記述における別の重要な変数は、腫瘍容積倍化時間である。腫瘍増殖の計算と記述のためのコンピュータープログラムもまた、RygaardとSpang-Thomsen,Proc.6th int.Workshop on lmmune-Deficient Animals,WuとSheng eds.,Basel,1989,301によって報告されたプログラムのように利用可能である。しかしながら、治療に続く壊死と炎症性応答が、少なくとも初めに、腫瘍サイズにおける増加に実際にもたらされ得ることが記載される。従って、これらの変化は、体型測定とフローサイトメトリー分析との組合せによって、注意深くモニターすることが必要である。
【０１９２】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を生産するための標準技術を用いて、興味ある動物のゲノム中に、ここで同定した遺伝子のコード化部分を導入することによって製造することができる。トランスジェニック操作のための標的として利用できる動物は、制限なしに、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。そのような動物にトランスジーンを導入するための当該分野で周知の技術は、前核ミクロ注入(HoppeとWanger,米国特許第４８７３１９１号)；生殖細胞系へのレトロウイルス-介在遺伝子転移(例えば、Van der Puttenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148-615[1985])；胚の幹細胞における遺伝子標的化(Thompsonら、Cell 56,313-321[1989])；胚のエレクトロポレーション(Lo,Mol.Cell Biol.3,1803-1814[1983])；精子-仲介遺伝子転移(Lavitranoら、Cell 57,717-73[1989])を含む。再考のため、例えば米国特許第４７３６８６６を参照。
【０１９３】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その細胞の一部のみにトランスジーンを持つそれを含む（「モザイク動物」）。該トランスジーンは、単一のトランスジーンとして、又はコンカテマーで、例えばhead-to-head又はhead-to-tailタンデムでのいずれかで組み込むことができる。特有な細胞型エノトランスジーンの選択組込みは、例えばLaskoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,6232-636(1992)の技術に続けることも可能性である。
【０１９４】
トランスジェニック動物におけるトランスジーンの発現は、標準技術によってモニターすることができる。例えば、サザーンブロット分析又はＰＣＲ増幅は、該トランスジーンの組込みに用いることができる。ｍＲＮＡ発現のレベルは、in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫細胞学のような技術を用いて分析することができる。該動物は、腫瘍又は癌進行の徴候についてさらに検査される。
【０１９５】
あるいは、「ノックアウト」動物は、該ポリペプチドをコードしている内因性遺伝子と、該動物の胚細胞に導入した同じポリペプチドをコードしている変更したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ここで同定したＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしている欠陥のある又は変更された遺伝子を有するものを構築することができる。例えば、特有のＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、確立された技術に従い、そのポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするために用いることができる。特有のＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、或いはモニター組込みに用いることができる選択可能なマーカーをコードしている遺伝子のような、別な遺伝子と置換することができる。典型的に、変更していない隣接ＤＮＡの数キロ塩基（５’と３’での両方）は、ベクター中に含まれる[例えば、相同組換えベクターの記載についてのThomasとCapecchi,Cell,51:503(1987)を参照]。該ベクターは、胚の幹細胞系内に導入され（例えばエレクトロポレーションで）、内因性ＤＮＡで相同的に組み換えられている導入されたＤＮＡで細胞が選択される[例えば、Liら、Cell,69:915(1992)を参照]。選択した細胞は、次いで凝集キメラを形成するために動物（例えばマウス又はラット）の芽細胞に注入される[例えば、Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987),113-152頁中を参照]。キメラの胚は、適当な偽妊娠メス里親動物に移植することができ、その胚は「ノックアウト」動物が生成するまで成長させる。それの生殖細胞における相同的に組換えたＤＮＡを持った子孫は、標準的な技術によって同定することができ、相同的に組み換えたＤＮＡを含むその動物の全ての全ての細胞が動物繁殖に使用できる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病的状態に対して防御するその能力によって及びＰＲＯ５３３の不在のための病的状態のその進行によって特徴付けできる。
【０１９６】
ここで同定したポリペプチド及び他の薬剤候補を特異的に結合する抗体の有効性は、自然発生的な動物の腫瘍の治療においてもまた、試験することができる。そのような研究のための適当な標的は、ネコの口の扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコの口のＳＣＣは、高度に侵襲性の、この種において報告された口の腫瘍の６０％を越える原因となる、ネコの最も普通の口の悪性疾患である悪性腫瘍である。たとえこれの転移の低い発生がこの腫瘍に罹ったネコの短い生存時間の単なる反映とし得るとしても、それはたまに遠い部位に転移する。これらの腫瘍は、本質的にネコの口腔の解剖学的構造のために、普通は手術に服し難い。現在、この腫瘍の有効な治療はない。該研究に入る前に、それぞれのネコは、完全な臨床検査、バイオプシーを受け、且つコンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）によってスキャンされる。舌下の口の扁平上皮腫瘍と診断されたネコは、該試験から除外される。その舌は、その腫瘍の結果として麻痺しており、一様な治療はその腫瘍を殺し、その動物はそれ自身で給餌することができない。それぞれのネコは、より長い期間にわたり、繰り返し治療される。その腫瘍の写真は、その治療期間の間に毎日撮影され、それぞれが続いて再チェックされるだろう。治療の後、それぞれのネコは、別なＣＴスキャンを受けさせる。ＣＴスキャンと胸部ラジオグラムは、その後８週毎に評価される。該データは、コントロール群と比較しての生存性、応答及び毒性の相違について評価される。陽性の応答は、好ましくは基本条件の改善及び／又は増加した寿命スパンを伴う、腫瘍後退の証拠が必要とされる。
加えて、イヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫のような他の自然発生的動物腫瘍もまた、試験することができる。イヌとネコにおけるこれらの乳房腺癌は、その発生と挙動がヒトにおけるそれと非常に類似する好適なモデルである。しかしながら、このモデルの使用は、動物におけるこのタイプの腫瘍の稀な発生により制限される。
【０１９７】
８．薬剤候補用のスクリーニングアッセイ
薬剤候補のスクリーニングアッセイは、ここで同定した遺伝子によってコードされたポリペプチドに結合する又は複合化する、或いは他の細胞のタンパク質と該コード化タンパク質との相互作用を妨害するその他の化合物を同定することと定義される。そのようなスクリーニングアッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に適したそれを行う化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに適し易いアッセイを含むであろう。意図される小分子は、ペプチド、好ましくは可溶ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合体を含む合成有機又は無機化合物、特に、制限されることなしにポリ-及びモノクローナル抗体と抗体フラグメント、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又はフラグメントのキメラ又はヒト化版、同じくヒト抗体と抗体フラグメントを含む抗体を含む。該アッセイは、当該分野で充分特徴付けられた、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む、各種の形式で実行することができる。
【０１９８】
全てのアッセイは、それが、ここで同定した核酸によってコードされたポリペプチドと該薬剤候補とを、これら２の化合物に相互作用を与えるに十分な条件下及び時間接触させることを要することにおいて共通である。
【０１９９】
結合アッセイにおいて、その相互作用は結合であり、生じた複合体は該反応混合物中で単離又は検出できる。特有の実施態様において、ここで同定した遺伝子によってコードされたポリペプチド又は該薬剤候補は、共有結合又は非共有結合付着によって固相、例えばミクロタイタープレート上に固定化される。非共有結合付着は一般に、該ポリペプチドの溶液によって固相表面をコーティングし乾燥することによって達せされる。あるいは、固定化した抗体、例えば固定化するべき該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、固相表面にそれを固定(anchor)するために用いることができる。該アッセイは、固定化成分、例えば固定した成分を含むコート化表面に、検出可能な標識によって標識し得る、非固定化成分を加えることによって実行される。該反応が完遂される場合、未反応成分は、例えば洗浄によって除去され、固相表面上に固定された複合体が検出される。初め非固定化成分が検出可能な標識を持つ場合、該表面上に固定された標識の検出は、複合体が生じたことを示す。初めの非固定化成分が標識を有さない場合、複合体は、例えば該固定化された複合体に特異的に結合する標識した抗体を用いることによって検出することができる。
【０２００】
該候補化合物は、ここに同定した遺伝子によってコードされた特有のＰＲＯ５３３タンパク質と相互作用するが、結合しないなら、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によって測定することができるポリペプチドと相互作用させる。そのようなアッセイは、例えば、架橋、共免疫沈降、及び濃度勾配又はクロマトグラフィーカラムを通しての共精製のような従来のアプローチを含む。加えて、タンパク質-タンパク質相互作用は、ChevrayとNathans[Proc. Natl.Acad.Sci.USA,89:5789-5793(1991)]によって開示されるようなFieldsと共同研究者[FieldsとSong,Nature(London)340:245-246(1989); Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:9578-9582(1991)]によって記載された酵母ベースの遺伝的システムを用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４のような多くの転写アクチベーターは、一方でＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方で転写活性化ドメインとして機能する２の生理的に別個のモジュラードメインからなる。上述の公表文献(全体として「２-ハイブリッドシステム」に関する)中に記載された交互発現系は、この特性の有効性を保持し、２のハイブリッドタンパク質、その１つは標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、もう１つは候補活性化タンパク質が活性化ドメインに融合される、を利用する。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１-ｌａｃＺレセプター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を経てＧＡＬ４活性化の再構築に基づく。相互作用ポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼによって色素形成基質によって検出される。２-ハイブリッド技術を用いて２の特異性タンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完成キット(MATCHMAKERTM)がClontechから商業的に利用できる。この系はまた、特異的なタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメイン地図に、同じくこれらの相互作用に極めて重要なピンポイントアミノ酸残基に拡張することもできる。
【０２０１】
ここで同定したＰＲＯ５３３-コード化遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を妨害する化合物は、以下のように試験できる：通例、反応混合物は、２つの生成物の相互作用と結合を与える条件下及び時間で、遺伝子の生成物と細胞内又は細胞外成分とを含み作製される。結合を抑制するための候補化合物の能力を試験するために、その反応は、該試験化合物の不在及び存在中で実行される。加えて、プラシーボが陽性コントロールとして利用する第３の反応混合物に加えられる。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との間の結合(複合体形成)は、上述した通りモニターされる。コントロール反応における複合体の形成、しかし試験化合物を含む反応混合物において無いことは、該試験化合物が試験化合物とその反応パートナーの相互作用を妨げることを示す。
【０２０２】
９．腫瘍の治療のための組成物と方法
ここで同定した遺伝子の増幅と関連した腫瘍の治療において有用な組成物は、制限されることなしに、標的遺伝子生成物の発現及び／又は活性を阻害する、抗体、小有機又は無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重らせん分子などを含む。
【０２０３】
例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡ分子は、標的化ｍＲＮＡにハイブリダイズすること及びタンパク質翻訳を防止することによってｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、転写開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０と＋１０位置の間から得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０２０４】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補標的ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイゼーションし、その後エンドヌクレアーゼ分解的切断によって作用する。潜在ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、周知の技術によって同定することができる。更なる詳細のために、例えば、Rossi,Curr. Biol.4:469-471(1994)，及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１(1997年9月18日公開)を参照。
【０２０５】
転写を抑制するために用いた三重らせん構造における核酸分子は、一本鎖とされ、且つデオキシヌクレオチドで構成されるべきである。これらオリゴヌクレオチドのベース組成は、一つの一本鎖又は二本鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きなストレッチが一般に要求される、フーグスティーン型塩基対則を経てそれが三重らせん構造を助長するように設計される。更なる詳細のため、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１，上記、を参照。
【０２０６】
これらの分子は、上述したスクリーニングアッセイのいずれか又は何れかの組合せによって及び／又は当業者に周知の何れかの他のスクリーニング技術によって同定することができる。
【０２０７】
１０．抗-ＰＲＯ５３３抗体
本発明は、抗-ＰＲＯ５３３抗体をさらに提供する。抗体の例示は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及び非相同接合抗体を含む。本発明に従う見込みのある薬剤候補は、ここで同定した遺伝子の精製又は増幅した遺伝子生成物を阻害し得る及び／又は該遺伝子生成物の活性を減じ得る抗体と抗体フラグメントである。
【０２０８】
１０．１．ポリクローナル抗体
本発明の抗-ＰＲＯ５３３抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の製造方法は、熟達した研究者に周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤の、及び望まれるなら、アジュバントとともに１回以上の注射によって哺乳動物中に生じさせることができる。典型的に、該免疫化剤及び／又はアジュバントは、多重皮下又は腹腔内注射によって該哺乳動物に注射されるであろう。該免疫化剤は、ＰＲＯ５３３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含み得る。それは、免疫化される哺乳動物において免疫原であることが知られたタンパク質に対する免疫化剤を接合するために有用となり得る。そのような免疫原性タンパク質の実例は、制限されることなしに、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターを含む。利用し得るアジュバントの実例は、フロイント完全アジュバントとＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコラート）を含む。該免疫化プロトコールは、過度の実験なしに当業者によって選択され得る。
【０２０９】
１０．２．モノクローナル抗体
抗-ＰＲＯ５３３抗体は、あるいは、モノクローナル抗体とし得る。モノクローナル抗体は、KohlerとMilstein,Nature,256:495(1975)によって記載されたそれらのようなハイブリドーマ法を用いて作製し得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を生成する又は精製することができるリンパ球を引き出すための免疫化剤によって典型的に免疫化される。あるいは、該リンパ球はインビトロで免疫化し得る。
【０２１０】
該免疫化剤は、ＰＲＯ５３３ポリペプチド又はその融合タンパク質を典型的に含むであろう。一般に、もしヒト起源の細胞が望まれるなら末梢血液リンパ球("ＰＢＬｓ")が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれるなら脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。該リンパ球は、次いでハイブリドーマ細胞を形成するために、ＰＥＧのような適当な融合化剤を用いて、不朽化細胞系に融合される[Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press,(1986)59-103頁]。不朽化細胞系は、哺乳類細胞、特に齧歯類の骨髄腫細胞、ウシ、及びヒト起源が通例形質転換される。通例、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が利用される。該ハイブリドーマ細胞は、融合していない不朽化細胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養し得る。例えば、もしその親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、そのハイブリドーマ用の培養培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを典型的に含むであろう(「ＨＡＴ培地」)。
【０２１１】
好ましい不朽化細胞系は、十分に融合する、選択した抗体生産細胞によって抗体の安定な抗レベル発現を支持する、且つそのようなＨＡＴ培地のような培地に感受性であるそれらである。より好ましい不朽化細胞系は、例えば、Salk Insitute Cell Distribution Center,San Diego,California,及びAmerican Type Culture Collection,Manassas,Virginiaから得ることができるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている[Kozbor, J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)51-63頁]。
【０２１２】
ハイブリドーマが培養される培養培地は、次いでＰＲＯ５３３に対するモノクローナル抗体の存在について測定することができる。好ましくは、該ハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。そのような技術と測定法は、当該分野で周知である。該モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonとPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
【０２１３】
望まれるハイブリドーマが同定された後、そのクローンは、制限希釈法と標準法による増殖によってサブクローンし得る[Goding,上記]。この目的のための適当な培養培地は、例えば、Dulbecco's修正イーグル培地とＲＰＭＩ-１６４０培地を含む。あるいは、該ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボで増殖し得る。
【０２１４】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法によって培地又は腹水液から単離又は精製し得る。
【０２１５】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号中に記載されるそれらのような組換えＤＮＡ法によっても作製し得る。本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手法（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として利用される。一度単離した該ＤＮＡは、発現ベクターの中に組み込むことができ、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るため、他の免疫グロブリンタンパク質を生産しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトされる。そのＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列[米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら、上記]の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置換することにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード化配列に共有結合接続することによって修正され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換することができ、又はキメラ二価抗体を創造するように本発明の抗体の１の抗原結合部位の可変領域と置換することができる。
【０２１６】
該抗体は、一価抗体とし得る。一価抗体を製造するための方法は、当該分野で周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修正した重鎖との組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖架橋化を防ぐため、Ｆｃ領域中の何れかのポイントで一般に端切りされる。あるいは、関係のあるシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換され又は架橋を防ぐために欠失される。
【０２１７】
インビトロでの方法はまた、一価抗体を調製するためにも適当である。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該分野において知られたルーチンの技術を用いて達成することができる。
【０２１８】
１０．３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯ５３３抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体をさらに含む。非ヒト(例えばネズミ)抗体のヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又は非-ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含むそのフラグメント(Fv,Fab,Fab',F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合配列のような)である。ヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望まれる特異性、親和性、及び用量を有する、マウス、ラット、又はウサギのような非-ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）を含む。いずれかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基と置換される。ヒト化抗体はまた、該受容体抗体中にも、或いは移入したＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質上全て、及びＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のそれである可変領域の少なくとも１，及び典型的には２の実質上全てを含むであろう。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも部分をも含むであろう[Jonesら、Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら、Nature,332:323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
【０２１９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からそれに導入した１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」可変領域から典型的に取られる「移入」残基として関係する。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列で齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによって、Winterと共同研究者の方法[Jonesら、Nature 321,522-525(1986);Riechmannら、Nature,332,323-327(1988);Verhoeyenら、Science 239,1534-1536(1988)]に従い本質的に実行される。従って、そのような「ヒト化した」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質上劣るものが非ヒト種からの相当する配列により置換されている。実際、ヒト化した抗体は幾つかのＣＤＲ残基と可能性のある幾つかのＦＲ残基が齧歯類中の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２２０】
ヒト化抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む、当該分野で周知の各種の技術を用いて製造することもできる[HoogenboomとWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marksら、J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Coleら及びBoernerらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及びBoernerら、J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているマウス中にヒト免疫グロブリン座の導入によって作製できる。チャレンジにおいて、ヒト抗体生成物は、遺伝子再配列、整列、及び抗体レパートリーを含む全ての関係においてヒトにおいて見られるそれと密接に類似することが観測される。このアプローチは、例えば米国特許第５５４５８０７；５５４５８０６；５５６９８２５；５６２５１２６；５６３３４２５；５６６１０１６号、及び次の科学公知文献：Marksら、Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonbergら、Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwildら、Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；LonbergとHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中に記載される。
【０２２１】
１０．４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２の異なる抗原に特異的結合性を有する、好ましくはヒト又はヒト化したモノクローナル抗体である。本ケースにおいて、特異的結合性の一つは、ＰＲＯ５３３のためのものであり、他方は、何れかの他の抗原のためのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットのためのものである。
【０２２２】
二重特異性抗体の製造方法は、当該分野で周知である。従来、二重特異性抗体の組み換え体生産は、二つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づいている[MilsteinとCuello, Nature 305,537-539(1983)]。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の取り合わせがランダムであるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つのみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物が生産される。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通例は達成される。類似の手法は、1993年5月13日公開のＷＯ９３／０８８２９中に、及びTrauneckerら、EMBO J.,10:3655-3659(1991)中に開示される。
【０２２３】
望まれる結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴う。その融合体の少なくとも一つにおいて存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及びもし望むなら、免疫グロブリン軽鎖、をコードしているＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、且つ適当な宿主生物に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細のために、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照。
【０２２４】
１０．５．ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合抗体は、共有結合した二つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、希望しない細胞に免疫系細胞を標的化する[米国特許第４６７６９８０号]、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている[ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９]。該抗体は、架橋剤が含まれるそれらを含む、合成タンパク質化学において周知の方法を用いてインビトロで製造し得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための好適な試薬の実例は、イミノチオラートとメチル-4-メルカプトブチルイミダート及び米国特許第４６７６９８０号中に記載されるそれらを含む。
【０２２５】
１０．６．エフェクター機能作製
例えば、癌の治療において抗体の有効性を増加するように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を変更することが望まれるであろう。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して良く、それによってこの領域で鎖間ジスルフィド結合形成を与える。かくして生成したホモダイマー抗体は、改善された内在化能力及び／又は増加した-相補-介在した細胞殺傷及び抗体-依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caronら、J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)及びShopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)を参照。増大した抗-腫瘍活性を持つホモダイマー抗体は、Wolffら、Cancer Researh 53:2560-2565(1993)中に記載されたような異種二価架橋剤を用いて作製することもできる。あるいは、抗体は、２のＦｃ領域を有するとともに、それによって増加した相補溶解性とＡＤＣＣ能力とを有し得るものを作製することができる。Stevensonら、Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)を参照。
【０２２６】
１０．７．免疫接合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば細菌、心筋、植物又は動物起源の酵素的活性毒素又はそのフラグメント）のような細胞毒性剤、又は放射性同位体（即ち放射性接合体）に接合した抗体を含む免疫接合体にも関する。
【０２２７】
そのような免疫接合体の生成において有用な化学療法剤は、上記されている。使用することができる酵素的に活性な毒素とそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ-サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（PAPI,PAPIIとPAP-S）、momordica charantiaインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、saponaria officinalisインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを含む。各種の放射性核種が、放射性接合した抗体の製造に利用可能である。実例は、212Ｂｉ，131，131Ｉｎ，90Ｙと186Ｒｅを含む。
【０２２８】
抗体と細胞毒性剤との接合体は、プロピオン酸Ｎ-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二価誘導体(ジメチルアジピミダートＨＣＬのような)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベラートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビス-アジド化合物(ビス-(p-アジドベンゾイル)-ヘキサンジアミンのような)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリル-2,6-ジイソシアネートのような)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンのような)のような各種の二価タンパク質カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitettaら、Science 238:1098(1987)中に記載されるように作製することができる。炭素-14-標識化-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジメチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、抗体への放射性ヌクレオチドの接合用の典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
【０２２９】
別な実施態様において、該抗体は、腫瘍予備標的価において利用するための「レセプター」（ストレプタビジンのような）に接合して良く、該抗体-レセプター接合体は患者に投与され、次いで浄化剤を用いて循環系から未結合接合体の除去、次いで細胞毒性剤(例えば放射性ヌクレオチド)に接合される「リガンド」を投与する。
【０２３０】
１０．８．免疫リポソーム
ここに開示した抗体はまた、免疫リポソームとしても調製し得る。抗体を含むリポソームは、Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985);Hwangら、Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980);及び米国特許第４４８５０４５と４５４４５４５号中に記載されるような当該分野で周知の方法によって製造される。増加した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５０１３５５６号中に開示される。
【０２３１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールとＰＥＧ-誘導化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物によって逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、望まれる直径を持つリポソームをもたらすために定義された孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド相互交換反応を経て、Martinら、J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中に記載されたようなリポソームに接合することができる。化学療法剤(ドキソルビシンのような)は、該リポソーム内に任意に含有される。Gabizonら、J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)を参照。
【０２３２】
Ｆ．薬学組成物
ＰＲＯ５３３（ＦＧＦ-１９）に特異的に結合する抗体、同じく先に開示したスクリーニングアッセイによって同定した他の分子は、薬学組成物の形態で、癌を含む腫瘍の治療のために投与することができる。
【０２３３】
もし増幅した遺伝子によってコードされたタンパク質が細胞内にあり且つ全部の抗体がインヒビターとして使用されるなら、内在化抗体が好適である。しかしながら、リポフェクション又はリポソームはまた、その抗体又は抗体フラグメントを誘導するために使用することもできる。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい抑制フラグメントが好適である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は標的タンパク質配列を結合する能力を保持するように設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成及び／又は組換えＤＮＡ技術によって製造できる(例えば、Marascoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893[1993]参照)。
【０２３４】
ポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で、望ましい度合の純度を持つポリペプチドと、任意に「製薬上許容される」又は「生理学的に許容される」当該分野で典型的に用いられる担体、賦形剤、又は安定化剤（全てが「賦形剤」と呼ばれる）とを混合することにより貯蔵用に製造される。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存料、等張剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤及び他の多岐にわたる添加剤。(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)参照)。そのような添加剤は、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性である必要がある。
【０２３５】
緩衝剤は、生理学的状態に近い範囲内のｐＨを維持することを助ける。それは、約２ｍＭから５０ｍＭの範囲内で存在させるのが好適である。本発明で使用するために好適な緩衝剤は、有機と無機酸の両方とそれの塩を含む。例えば、クエン酸塩緩衝液(例えば、クエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸塩緩衝液(例えば、コハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸塩緩衝液(例えば、酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム緩衝液、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸塩緩衝液(例えば、フマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物など)、フマル酸塩緩衝液(例えば、フマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸塩緩衝液(例えば、グルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物など)、シュウ酸塩緩衝液(例えば、シュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸塩緩衝液(例えば、乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-シュウ酸カリウム混合物など)及び酢酸塩緩衝液(例えば、酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など)。加えて、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びトリスのようなトリメチルアミン塩が利用し得る。
【０２３６】
保存料は、微生物の増殖を遅延するために添加され、０．２％−１％(w/v)の範囲の量で添加される。本発明で使用するために好適な保存料は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンザルコニウム(例えば、塩化、臭化、ヨウ化)、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３-ペンタノールを含む。
【０２３７】
「安定化剤」として時折知られる等張剤は、本発明の液状組成物の等張性を保証するために提供され、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールのようなトリヒドロ又はより高度の糖アルコールを含む。多価アルコールは、他の成分の相対的な量を考慮して０．１重量％から１５重量％の間、好ましくは１重量％から５重量％間での量で存在させることができる。
【０２３８】
安定化剤は、バルキング剤から治療剤を安定にする又は変質又は容器壁への付着を防ぐことに役立つ添加剤までの機能における範囲とすることができる賦形剤の広範なカテゴリーに関する。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（先に列挙した）；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ-ロイシン、２-フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのようなアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、イノシトールのようなサイクリトールを含む、のような有機の糖又は糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、a-モノチオグリセロールとチオ硫酸ナトリウムのような硫黄含有還元剤：低分子量ポリペプチド(即ち＜１０残基)、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンモノサッカリド、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースのような親水性ポリマー；ラクトース、マルトース、ショ糖のような二糖類とラフィノースのような三糖類；デキストランのような多糖、とすることができる。安定化剤は、活性タンパク質重量の０．１から１００００重量部までの範囲で存在させることができる。
【０２３９】
非イオン性界面活性剤又は洗剤(「湿潤剤」としても知られる)は、該治療剤を安定化するのを助けるため、同じくタンパク質の変性を生じることなしに表面張力を変えることを曝露される製剤にも許容する撹拌-誘導集合に対して治療用タンパク質を保護するために提供される。適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(20,80など)、ポリオキサマー(184,188など)、PluronicRポリオール、ポリエチレンソルビタンモノオレアート(TweenR20，TweenR80など)を含む。非イオン性界面活性剤は、約0.05mg/mlから約1.0mg/l、好ましくは約0.07mg/mlから約0.2mg/mlの範囲で存在させる。
【０２４０】
付加の種々の賦形剤は、バルキング剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）と共溶媒を含む。
【０２４１】
ここでの製剤は、治療される特有な徴候に必要な１以上の活性化合物、好ましくは互いに反する影響を及ぼさない相補の活性を持つそれらもまた含み得る。例えば、それは免疫抑制剤をさらに提供することが望まれる。そのような分子は、意図した目的のために有効である量での組み合わせにおいて好ましく提供される。
【０２４２】
該有効成分はまた、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合化によって、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセルとポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルで製造したマイクロカプセル中に、コロイダル薬剤到達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロ球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に捕捉し得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition（又はより後の),A.Osol,Ed.(1980)中に開示される。
【０２４３】
インビボ投与のために用いる製剤は、無菌とする必要がある。これは、例えば無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０２４４】
徐放性製剤を調製し得る。徐放性製剤の好適な実例は、例えばマトリックスはフィルム又はマイクロカプセルに成型した製品の形態で、該抗体変異体を含む固体疎水性ポリマーの半透性材料を含む。徐放性材料の実例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とエチル-L-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロ球体)のような非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニルと乳酸-グリコール酸のようなポリマーが１００日を越えて分子の放出が可能である一方、ある種のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包した抗体が長期間体内に保持される場合、それは、生物学的活性の欠如をもたらし且つ免疫原性に変化する可能性のある、３７℃で水分にさらされる結果として、変性又は凝集し得る。論理的な計画は、包含されたメカニズムに基づいて安定化するために工夫することができる。例えば、もしその凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド間交換を経て分子内Ｓ-Ｓ結合形であることが発見されるなら、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含量を制御すること、適当な添加物を用いること、及び特別なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成し得る。
【０２４５】
本発明のスクリーニングアッセイで同定した非-抗体化合物は、当該分野で周知の標準技術を用いて、類似の手法において製剤化することができる。
【０２４６】
Ｇ．治療の方法
本発明の抗体と他の抗腫瘍化合物が、ＰＲＯ５３３をコードしている遺伝子の過剰発現及び／又は活性化によって特徴付けられるそれらを含む各種の病状を治療するために使用し得ることが意図される。そのような抗体及び、例えば制限なしに、小有機及び無機分子、ペプチド、アンチセンス分子などを含む他の分子で治療するべき典型的な病状と疾患は、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓、肝臓、腎臓、膀胱、胸部、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、甲状腺、肝性癌；肉腫；グリア芽細胞腫；及び各種の頭部と頸部の腫瘍）；白血病及び悪性リンパ腫；ニューロンの、グリア細胞の、星状細胞の、視床下部の、及び他の腺の、マクロファージの、上皮の、間質の、及び胞胚腔の疾患のような他の疾患；及び炎症性、新脈管形成及び免疫学的疾患を含む。
【０２４７】
本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体は、ボーラス又は一定期間にわたり継続する注入によるような静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液包内、鞘内、経口、局所又は吸入ルートによるような周知の方法に従って、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。抗体の静脈内投与が好適である。
【０２４８】
他の治療用養生法は、抗癌剤、例えば本発明の抗体の投与と組み合わせて良い。例えば、そのような抗癌剤により治療すべき患者は、放射線治療を受けて良い。あるいは、又は加えて、化学療法剤を患者に投与して良い。そのような化学療法剤のための製剤と用量は、製造者の指示に従って又は熟達した開業医によって経験的に決められるように使用されるであろう。そのような化学療法剤のための製剤と投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992)中にも記載される。化学療法剤は、抗癌剤、例えば抗体の投与の前或いは後に投与して良く又はそれと同時に与えて良い。該抗体は、そのような分子の周知の用量で、タモキシフェンのような抗エストロゲン化合物又はオナプリストン(EP616812を参照)のような抗プロゲステロンと組み合わせて良い。
【０２４９】
ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体のような、他の腫瘍結合抗原に対する抗体もまた投与することが望まれるであろう。あるいは、又は加えて、ここに開示した同じか又は２以上の異なる抗原に結合する２以上の抗体を患者に共-投与して良い。時折、それは患者に１以上のサイトカインを投与することも有益となるだろう。好適な実施態様において、ここでの抗体は、増殖抑制剤と共投与される。例えば、増殖抑制剤は、最初に、本発明の抗体を続けて投与して良い。しかしながら、同時投与又は最初に本発明の抗体の投与もまた意図される。増殖抑制剤の適切な用量は、目下使用されるそれらであり、且つ増殖抑制剤とここでの抗体との組み合わせ作用（相乗作用）のため低くすることができる。
【０２５０】
病気又は疾患の予防又は治療のために、抗癌剤、例えばここでの抗体の好適な用量は、上述した通り、治療するべき疾患のタイプ、その重篤度と疾患の原因、該剤が予防的又は治療的目的、治療に先立って投与されるかどうか、その患者の病歴と該剤に対する応答、及び主治医の判断に基づくであろう。該剤は、一度で又は一連の治療にわたって、患者に適当に投与される。
【０２５１】
特有な疾患又は病状の治療において有効とされるであろう治療用ペプチド、抗体又はそのフラグメントの量は、疾患又は病状の本質に基づくであろうし、標準の臨床技術により決定することができる。可能な場合、それは、インビトロで最初に、次いでヒトにおける試験の前に有用な動物モデル系において、用量応答曲線及び本発明の薬学組成物を決定することが望ましい。しかしながら、当該分野の普通の知識に基づいて、感覚ニューロンの生存を促進することにおいて有効な薬学組成物は、約５と２０ｎｇ／ｍｌの間の、好ましくは約１０と２０ｎｇ／ｍｌの間の局所治療剤濃度を提供し得る。
【０２５２】
皮下投与のための用量スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重篤度、及び治療剤に対する被験者の感度を含む多くの臨床ファクターも基づいて月に一度から毎日まで変更し得る。
【０２５３】
例えば、疾患のタイプと重篤度に従って、抗体の約５００ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ(即ち0.0005-100mg/kg)が、例えば１以上の分離投与による、又は連続注入によるいずれかで、患者に対する投与のための最初の候補用量とされる。典型的な１日当たりの用量は、上述したファクターに基づいて、約１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上までの範囲とし得る。数日又はより長きにわたる投与のために、その病状に基づいて、治療は、疾患の徴候発生の望まれる抑制まで維持される。しかしながら、他の用量養生法が有用となり得る。この治療の進展は、通常の技術とアッセイによって容易にモニターされる。
【０２５４】
当業者が予測できるように、本発明の薬剤組成物の最適な用量と望まれる薬剤濃度は、創造した特有の使用に基づいて変更して良い。投与の適切な用量とルートの決定は、熟達した当業者の十分な技量の範囲内である。動物実験は、ヒトの治療のために有効な用量の決定のための信頼できるガイドラインを提供する。有効な用量の間隔のスケーリングは、Mordenti,J.とChappell,W.,"The use of interspecies scaling in toxicokinetics",Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobiら、Eds,Pergamon Press,New York 1989,42-96頁によって規定される原理に従い実行することができる。
【０２５５】
Ｈ．製品
本発明の別な実施態様において、上述した疾患の診断と治療用に有用な材料を含む製品が提供される。該製品は、容器とラベルを含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。該容器は、ガラス又はプラスチックのような各種の材料から形成して良い。該容器は、病状を診断する又は治療するために有効である組成物を保持し、且つ無菌入出口(例えば、該容器は静脈輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルとし得る)を有して良い。該組成物中の活性剤は、普通、ここで同定した遺伝子生成物の活性を干渉することができる抗腫瘍剤、例えば抗体である。容器上の、又はそれに取り付けられたラベルは、該組成物が選択した病状を診断する又は治療するために使用されることを示す。該製品は、リン酸塩緩衝化食塩水、リンゲル液、及びブドウ糖溶液のような製薬上許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含めて良い。他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示書を伴う包装挿入物を含む、商業上及び使用者の立場から望まれる他の材料をさらに含めて良い。
【０２５６】
Ｉ．腫瘍の診断と予後
ある種の腫瘍における増殖レセプター過剰発現のような細胞表面タンパク質が、薬剤候補の又は腫瘍（例えば癌）治療のための優れた標的である一方、腫瘍細胞中で増幅した遺伝子によってコードされた分泌タンパク質と一緒にその同じタンパク質が、腫瘍の診断と予後において付加的な使用が見出される。例えば、腫瘍細胞中で増幅した遺伝子のタンパク質生成物に対し向けられる抗体は、腫瘍の診断剤又は予後診断剤として使用することができる。
【０２５７】
例えば、抗体フラグメントを含む抗体は、増幅した遺伝子によってコードされたタンパク質（マーカー遺伝子生成物）の発現を検出するため定性的に又は定量的に使用することができる。該抗体は、検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光強度法、又は当該分野で周知の他の技術によってモニターすることができる。これらの技術は、もしその増幅した遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば増殖因子をコードするならば、特に好適である。そのような結合アッセイは、本質的に上記セクション５で記載した通りに実行される。
【０２５８】
マーカー遺伝子生成物に結合している抗体のin situ検出は、例えば、免疫蛍光法又は免疫電子検鏡によって実行することができる。この目的のために、組織学的標本が患者から取り出され、標識した抗体が、好ましくは生物学的試料上に抗体を積層することによって適用される。この方法はまた、検査した組織におけるマーカー遺伝子生成物の分布を測定することも与える。広範な組織学的方法がin situ検出用に容易に利用可能であることは当業者に予期されるであろう。
【０２５９】
以下の実施例は、説明の目的のためにのみ提供され、且ついずれの手法も本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０２６０】
本明細書中に引用した全ての特許と参考文献は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０２６１】
【実施例】
本実施例中で参照される商業的に入手可能な試薬は、特に言及しない限り、製造者の指示通り使用した。以下の実施例において、及び本明細書を通じて、ＡＴＣＣ番号で同定される細胞の供給源は、American Type Culture Collection, Manassas,VAのものである。
【０２６２】
実施例１
ヒトＰＲＯ５３３をコードしているｃＤＮＡクローンの単離
ＥＳＴ配列受託番号ＡＦ００７２６８、ネズミ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ-１５）は、各種の公的ＥＳＴデータバンク（例えば、GenBank,Dayhoffなど）をサーチするため使用した。該サーチは、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳へのＥＣＤタンパク質配列の比較として、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２[Altschulら、Methods in Enzymology,266:460-480(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html]を用いて実行した。該サーチは、stratagene NT2 neuronal precursor 937230として同定されているGenBank KST AA220994とのヒットをもたらした。AA220994(DNA47412)は図６中に同定される。
【０２６３】
この配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを：１）興味ある配列を含有したｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲによって同定するために、及び２）全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために合成した。前進及び逆進ＰＣＲプライマー（それぞれ*.fと*.rと記した）は、２０から３０ヌクレオチドまでの（典型的には約２４）範囲とし、且つ長さにおいて100-1000bpのＰＣＲ生成物を与えるように設計し得る。全長クローンの供給源用の幾つかのライブラリーをスクリーンするために、該ライブラリーからのＤＮＡを、ＰＣＲプライマー対によって、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biologyに示された通り、ＰＣＲによってスクリーンした。陽性ライブラリーは、プローブオリゴヌクレオチドと該ＰＣＲプライマーの一つを争わす(suing)インビボクローニング法によって興味ある遺伝子をコードしているクローンを単離するために用いた。
【０２６４】
全長クローンの供給源のための幾つかのライブラリーをスクリーンするために、該ライブラリーからのＤＮＡは、上記同定したＰＣＲプライマー対によるＰＣＲ増幅によってスクリーンした。陽性ライブラリーは、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一つを用いてＰＲＯ５３３遺伝子をコードしているクローンを単離するために用いた。
【０２６５】
ｃＤＮＡライブラリー構築用のＲＮＡを、ヒト胎児網膜から単離した。該ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、商業上利用可能な試薬（例えば、Invitrogen,San Diego,CA;Clontech,など）を用いた標準法によって構築した。該ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴｄＴで開始され、SaIIヘミキナーゼアダプターに平滑端で結合し、NotIで切断し、ゲル電気泳動によって適当なサイズ分けをし、且つ独自のXhoIとNotI部位において適当なクローニングベクター(ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤのような；ｐＲＫＢはSfiI部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmesら、Science,253:1278-1280(1991)を参照)中の定義された位置でクローン化した。
【０２６６】
ｃＤＮＡクローンは、その全体を配列決定した。ＰＲＯ５３３の全長ヌクレオチド配列は、図１（配列番号：１）中に示される。クローンＤＮＡ４９４３５は、ヌクレオチド位置459-461で外見上翻訳開始部位を持つ単一オープンリーディングフレームを含む（図２；配列番号：２）。予測したポリペプチドプレカーサーは、２１６アミノ酸長である。クローンＤＮＡ４９４３５−１２１９は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０で受託されている。
【０２６７】
線維芽細胞増殖因子１−４の細胞外ドメイン（即ち、それぞれアミノ酸1-404,1-408,1-403と1-412）は、胎児胚ｃＤＮＡからＰｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いたＰＣＲによって単離され(製造者の指示に従い)、真核生物発現ベクターpRK5tkNEO、誘導体又はpRK5においてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域でフレーム内で鎖うクローンした。
【０２６８】
全長配列のＢＬＡＳＴ−２とＦａｓｔＡ配列アライメント分析に基づいて、ＰＲＯ５３３は、ネズミ線維芽細胞増殖因子-１５にアミノ酸配列同一性を示した（５３％）。
【０２６９】
上記手法において使用したオリゴヌクレオチド配列は、以下のものであった：
FGF15.f:ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA（配列番号：１６）
FGF15.p2:AGACCGGGAGGCGGTGCTTCTCGGATCGGTACACATTGTA（配列番号：１７）
FGF15.r:CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA（配列番号：１８）
【０２７０】
実施例２
ノーザンブロット分析
ヒト組織におけるＰＲＯ５３３ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析によって調べた。多重組織ヒトＲＮＡブロットは、製造者（Clontech）の指示に従ってランダムプライム化ＤＮＡ４９４３５ｃＤＮＡの32Ｐ-標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(Clontech)と成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-ＩＩ(Clontech)を該ＤＮＡプローブとインキュベーションした。ブロットは、４２℃で６０時間、ハイブリダイゼーション緩衝液（5X SSPE；2X Denhardt's溶液；100mg/mLの変性し切断したサケ精子ＤＮＡ；50%ホルムアミド；2% SDS）中で該プローブとインキュベーションした。該ブロットは、室温で１時間2X SSC；0.05% SDS中で数回洗浄し、次いで５０℃で0.1X SSC；0.1% SDS中で３０分間洗浄した。該ブロットは、７２時間X-omat(Kodak)の露光した後に現像した。
【０２７１】
図７中に示したように、ＰＲＯ５３３ｍＲＮＡ転写物を検出した。強い発現が結腸直腸の腺癌ＳＷ４８０で見られた。
【０２７２】
実施例３
in situハイブリダイゼーション
in situハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内における核酸配列の検出および位置決定のための強力かつ用途の広い技術である。例えば、遺伝子発現部位を同定するため、転写の組織分布を分析するため、ウイルス感染を同定および位置決定するため、特異的なｍＲＮＡ合成の変化を追求するため、並びに染色体地図作製を支援するために使用できる。
【０２７３】
in situハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ産生33Ｐ-ラベル化リボプローブを用いて、LuとGillett,Cell Vision 1:169-176 (1994)によるプロトコールの最適化されたバージョンに従って行った。簡単に言うと、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたヒト組織を切断し、パラフィン除去し、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃でタンパク除去し、上記LuとGillettに記載されているようにin situハイブリダイゼーションのために更に処理される。［33-Ｐ］ＵＴＰ-標識したアンチセンスリボプローブがＰＣＲ生成物から産生され、５５℃で一晩ハイブリダイズした。このスライドを、Kodak NTB2核トラックエマルジョンに浸して、４週間感光させた。
【０２７４】
33Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ-ＵＴＰ(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol）を急速真空乾燥した。乾燥した33Ｐ-ＵＴＰを含む各チューブに、以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ 転写緩衝液
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ；それぞれ１０ｍＭのＧＴＰ、ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌのＨ2Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのRnasin
１．０μｌのＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌのＨ2Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ生成物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
【０２７５】
このチューブを、３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮアーゼを添加し、その後に３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Tris pH7.6/1mM EDTA pH8.0）を添加し、この混合物をＤＥ８１ペーパーにピペットで移した。残りの溶液を、Microcon-50限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いて遠心分離した（６分）。濾過ユニットを第二チューブに入れ、プログラム２を用いて遠心分離した（３分）。最終的な回収遠心分離の後に、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１ペーパーにピペットで移し、６ｍｌのBiofluor II中でカウントした。
【０２７６】
このプローブをＴＢＥ／尿素ゲルにかけた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ IIIを３μｌの充填緩衝液に添加した。９５℃のヒートブロックで３分間熱した後、このゲルを直ちに氷に移した。ゲルのウェルを洗い、サンプルを充填し、４５分間１８０−２５０ボルトで泳動させた。このゲルをサランラップで覆い、−７０℃のフリーザーの中で１時間から一晩、増感紙を用いてＸＡＲフィルムに感光させた。
【０２７７】
33Ｐ-ハイブリダイゼーション
冷凍切片の前処理    このスライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムのトレイに移し、室温で５分間解凍した。このトレイを、凝縮を下げるために、５分間５５℃のインキュベーター中に置いた。このスライドをフュームフードにおいて氷上で４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間、室温で洗浄した（２５ｍｌ  ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱＨ2Ｏ）。１０分間３７℃で０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で脱タンパクした後（２５０ｍｌの予め温められたＲＮアーゼを含まないＲＮＡ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌストックの１２．５μｌ）、この切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。この切片を７０％、９５％、１００％のエタノール、２分間でそれぞれ脱水した。
【０２７８】
パラフィン-包埋された切片の前処理    このスライドを脱パラフィン化し、ＳＱ Ｈ2Ｏに移し、２ｘＳＳＣ、室温、５分間でそれぞれ二回濯いだ。この切片を、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮアーゼを含まないＲＮアーゼ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ；３７℃、１５分）−ヒト胎芽、又は８ｘのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮアーゼ緩衝液中の１００μｌ；３７℃、３０分）−ホルマリン組織、において脱タンパク化した。次いで、上述したように０．５ｘＳＳＣで濯ぎ、脱水を行った。
【０２７９】
予備ハイブリダイゼーション：  このスライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和フィルターペーパーを備えたプラスチックボックスに配置した。この組織を５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇ デキストランスルファート＋６ｍｌＳＱ Ｈ2Ｏ）で被覆し、渦動撹拌し、キャップを緩めて２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ Ｈ2Ｏを添加し、組織をよく渦動撹拌し、４２℃で１−４時間インキュベートした。
【０２８０】
ハイブリダイゼーション：  スライド当たり、１．０ｘ１０6ｃｐｍプローブと１．０μｌｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を３分間９５℃で加熱した。このスライドを氷冷し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。渦動撹拌した後、５０μｌの33Ｐ混合物を、スライドの５０μｌの予備ハイブリダイゼーションに添加した。このスライドを５５℃で一晩インキュベートした。
【０２８１】
洗浄：  洗浄を２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で行い（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）、その後に３７℃で３０分間ＲＮアーゼＡ処理した（２５０ｍｌのＲＮアーゼ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。このスライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は、５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）とした。
【０２８２】
ＤＮＡ４９４３５（ＦＧＦ相同体、ＦＧＦレセプター３リガンド）
オリゴA-251G  46マー：GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA TCC TGG CCG GCC TCG G  （配列番号：１９）
オリゴA-251H  48マー：CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCC CGG GCA TGG TCT CAG TTA  （配列番号２０）
【０２８３】
中程度の発現が、胎児の脳中の皮質ニューロンの全面にわたって観測された。発現は、胎児網膜の内側の全面にわたって観測され、且つ発育途上の水晶体において可能性があった。発現は、胎児の皮膚、軟骨、小腸、胎盤絨毛及び臍帯にわたって見られた。成人組織では、胆嚢上皮の全面にわたって非常に高いレベルであった（図３４参照）。中等度の発現は、成人腎臓、胃及び結腸上皮に渡って見られた。これらのデータは、軟骨と骨の成長におけるこの分子の潜在的な役割と一致する。
【０２８４】
実施例４
ＰＲＯ５３３と線維芽細胞増殖因子レセプターのウェスタン分析
興味あるタンパク質を、室温で１時間、結合緩衝液（ＤＭＥＭ媒体，１０ｍＭのHepes,pH7.4，0.1%のアルブミン，200ng/mlのヘパリン）中で相互作用させた。プロテインＡセファロース(Pharmacia)を加え(0.01ml)、結合を３０分間継続した。プロテインＡセファロースビーズを採取し、結合緩衝液中で二度洗浄した。次いで還元条件下でSDS PAGEによって分解した。ウェスタンブロット分析は、製造者の指示に従って、抗-Ｈｉｓ抗体(Quiagen)、抗-ｇＤ抗体５Ｂ６、又は抗-酸性ＦＧＦ(R&D systems)で実行し、ＥＣＬ(Amersham)で明示した。
【０２８５】
図９は、ＦＧＦレセプターへのＰＲＯ５３３の結合を示すウェスタンブロットである。ＦＧＦ１(A)又はＰＲＯ５３３(FGF-19)は、Ｎ末端ｇＤエピトープ標識(B)又はＣ末端Ｈｉｓ８エピトープ標識(C)のいずれか一方で発現し、レセプター-Ｆｃ融合タンパク質への結合について試験した。特異的な結合成分は、上のレーン１−８に示した通りである。レーン９は、比較のためにゲル上に直接ロードしたＦＧＦを含む。分子量マーカーは、比較のためにゲルの左側上に示される。
【０２８６】
図１０は、ヘパリンについてＰＲＯ５３３(ＦＧＦ-１９)結合の依存性示すウェスタンブロットである。Ｎ末端ｇＤ-標識化ＰＲＯ５３３（ＦＧＦ-１９）は、ヘパリンの表示した濃度の存在中でＦＧＦＲ４-Ｆｃと相互作用させた。
【０２８７】
実施例５
遺伝子増幅
この実施例は、ＰＲＯ５３３-コード化遺伝子が、ある種のヒトの肺、癌のゲノム中で増幅されることを示す。増幅は、ＰＲＯ５３３タンパク質が、肺及び他の癌のようなある種の癌の過剰発現と関連付けられる。治療剤は、ＰＲＯ５３３-コード化遺伝子のアンタゴニスト、例えばＰＲＯ５３３ポリペプチドに対するネズミ-ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形をとり得る。
【０２８８】
該スクリーンのための出発材料は、各種の癌から単離したゲノムＤＮＡとした。該ＤＮＡは、例えば蛍光分析的に、正確に定量される。陰性コントロールとして、ＤＮＡは、健全な個人における遺伝子コピー用のアッセイコントロールとしてプールし且つ使用した、１０名の正常で健康な個人の細胞から単離した。５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎTM）とリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection SystemTM(Perkin Elmer,Biosystems Division,Foster City,CA製)）を、ある種の癌において潜在的に増幅された遺伝子を見出すために使用した。その結果は、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡが、一次肺癌又は結腸癌又は癌細胞系又はスクリーンした胸癌細胞系のいずれかで過剰に現れたかどうか測定するために用いた。その一次肺癌は、表１中に示した通りの型(type)と期(stage)の腫瘍を持つ個人から得た。表１中に記した一次腫瘍及びこの実施例を通して関係した一次腫瘍と細胞系の表記に用いた略語の説明が後述に与えられている。
【０２８９】
ＴａｑｍａｎTMの結果は、デルタ(Δ)ＣＴ単位で報告される。１単位は、１ＰＣＲサイクル又は正常に対してほぼ２倍の増幅に相当し、２単位は４倍に、３単位は８倍の増幅と続く、に相当する。定量は、プライマーと、独自の核酸配列を含むと最も思われ且つプライマーとプローブ誘導体、例えば３-未翻訳領域のために好適であるスプライスしたイントロンを有すると少なくとも思われるＰＲＯ５３３-から得られたＴａｑｍａｎTM蛍光プローブを用いて得られた。ＰＲＯ５３３遺伝子増幅のために用いたプライマーとプローブ（前進、後進とプローブ）の配列は次の通りであった：
ＤＮＡ４９４３５.tm.f
5'GGGACGTGCTTCTACAAGAACAG-3'          （配列番号：２１）
ＤＮＡ４９４３５.tm.r
5'-CAGGCTTACAATGTTATGATCAGACA-3'      （配列番号：２２）
ＤＮＡ４９４３５.tm.p
5'-TATTCAGAGTTTTCCATTGGCAGTGCCAGTT-3' （配列番号：２３）
【０２９０】
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、リアルタイムで増幅をモニターするためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する蛍光ＰＣＲ-ベースの技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ反応の典型的なアンプリコンを産生するために使用した。第３のオリゴヌクレオチド又はプローブは、２のＰＣＲプライマーの間に配されたヌクレオチド配列を検出するために設計した。該プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長されず、且つリポーター蛍光染料と消光剤蛍光染料によって標識される。該リポーター染料からの何れかのレーザー誘発放射は、該２つの染料が、それらがプローブ上にあるように接近して一緒に配される場合に該消光染料によって消光される。増幅反応の間、ＴＡＱＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型-依存手法において該プローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントが溶液から分離され、放出したリポーター染料からのシグナルは、第２の蛍光団の消光作用から解放される。リポーター染料の１分子は、合成した新たな分子をそれぞれ解放し、消光されないリポーター染料の検出は、該データの定量的な解釈のための基礎を提供する。
【０２９１】
該５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ装置により行われる。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子(CCD)カメラ及びコンピューターからなる。該システムは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマット中のサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘発蛍光シグナルが、９６ウェル全てについて光ファイバケーブルを通してリアルタイムで捕集され、ＣＣＤで検出される。該システムは、装置を動作するための及び該データを解析するためのソフトウェアを含む。
【０２９２】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、Ｃｔ、又は始めサイクルとして冒頭に表される。これは、リポーターシグナルが蛍光のバックグランドレベル以上に蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌ＤＮＡでの結果と正常なヒトＤＮＡでの結果とを比較する場合に核酸試料中の特有な相対的に多数の標的配列のコピーの定量測定値として用いられる。
【０２９３】
表１は、本発明のＰＲＯ５３３化合物をスクリーンするために用いた各種の一次腫瘍の期、Ｔ期及びＮ期を記載する。
【表１】
0003653469.tif 000002
【０２９４】
ＤＮＡ作製：
ＤＮＡは、培養した細胞系、一次腫瘍、正常ヒト血液から製造した。単離は、全てQuiagenからの精製キット、緩衝液セット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と後述の通り実行した。
【０２９５】
細胞培養溶解物：
細胞を洗浄し、チップ当たり７．５ｘ１０8の濃度でトリプシン処理し、４℃で５分間1000rpmで遠心分離することによってペレットとし、続いてＰＢＳの1/2容量で再度洗浄し再遠心分離した。該ペレットは三度洗浄し、懸濁した細胞を採取し、ＰＢＳで２ｘ洗浄した。その細胞を１０ｍＬのＰＢＳに懸濁させた。緩衝液Ｃ１を４℃で平衡化した。Quiagenプロテアーゼ＝１９１５５は、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に６．２５ｍｌ冷ｄｄＨ2Ｏ中で希釈し、４℃で平衡化した。Ｇ２緩衝液の１０ｍＬは、２００μｇ／ｍｌの最終濃度にQuiagen RNAse A stock(100mg/ml)を希釈することによって作製した。
【０２９６】
緩衝液Ｃ１(10mL,４℃)とddH2O(40mL,４℃)細胞懸濁液の１０ｍＬに加え、転倒することによって混合し、１０分間氷上でインキュベーションした。細胞の核は、１５分間、４℃、2500rpmでBeckman swinging bucketローター中で遠心分離することによってペレット化した。上清を廃棄し、その核は２ｍＬの緩衝液Ｃ１(４℃で)と６ｍＬのｄｄＨ2Ｏ中で渦動によって懸濁し、続いて１５分間2500rpmで二次の４℃遠心分離した。次いでその核を、チップ当たり２００μｌを用いて残る緩衝液に再懸濁させた。Ｇ２緩衝液(10ml)を懸濁した核に加えると同時に、温和な渦動撹拌を施した。緩衝液添加の完遂時点で、活発な渦動撹拌を３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ(２００μｌ，上記の通り作製した)を加え、６０分間５０℃でインキュベーションした。そのインキュベーションと遠心分離は、該溶解物が透明となるまで繰り返した(例えば、付加の３０−６０分間インキュベーションし、４℃１０分間3000xgでペレット化)。
【０２９７】
固形ヒト腫瘍試料調製と溶解：
腫瘍試料を秤量し、５０ｍｌコニカルチューブに入れ、氷上で保持した。加工は、調製物当たり２５０ｍｇ組織以下に制限した(１チップ／調製物)。プロテアーゼ溶液は、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に６．２５ｍｌ冷ｄｄＨ2Ｏで希釈することによって新たに作製し、４℃で保管した。Ｇ２緩衝液(20ml)は、２００ｍｇ／ｍｌの最終濃度に(10mg/mlストック)ＤＮアーゼＡを希釈することによって調製した。該腫瘍組織は、エアゾルの吸入を避けるためにlaminar-フローＴＣフード内でポリトロン(polytron)の大きなチップを用いて６０秒間１９ｍｌのＧ２緩衝液中でホモジナイズし、そして室温で保持した。試料間のポリトロンは、２ＬｄｄＨ2Ｏ、続いてＧ２緩衝液(50ml)中でそれぞれ２ｘ３０秒スピニングすることによって透明にした。組織が発生器チップ上にまだ存在している場合には、装置を分解し清浄化した。
【０２９８】
Quiagenプロテアーゼ(上述した通り作製した、1.0ml)を加え、続いて渦動撹拌し、３時間５０℃でインキュベーションした。そのインキュベーションと遠心分離は、該溶解物が透明となるまで繰り返した(例えば、付加の３０−６０分間インキュベーションし、４℃１０分間3000xgでペレット化)。
【０２９９】
ヒト血液調製及び溶解：
血液は、標準感染作因プロトコールを用いて健康なボランティアから採取し、チップ当たり１０ｍｌ試料の中へクエン酸塩処理(citrated)した。Quiagenプロテアーゼは、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に６．２５ｍｌ冷ｄｄＨ2Ｏで希釈することによって新たに作製し、４℃で保管した。Ｇ２緩衝液は、１００ｍｇ／ｍｌストックから２００μｇ／ｍｌの最終濃度にＲＮアーゼＡを希釈することによって調製した。該血液(10ml)は、５０ｍｌコニカルチューブの中に入れ、１０ｍｌのＣ１緩衝液と３０ｍｌのｄｄＨ2Ｏ（両方とも予め４℃で平衡化した）を加え、そして該成分を転倒することによって混合し、１０分間氷上で保持した。その核は、１５分間、４℃、2500rpmでBeckman swinging bucketローター中で遠心分離することによってペレット化し、さらに上清を廃棄した。渦動撹拌とともに、その核は２ｍＬの緩衝液Ｃ１(４℃)と６ｍＬのｄｄＨ2Ｏ（４℃）中に懸濁した。渦動撹拌は、該ペレットが白色化するまで繰り返した。次いでその核を、２００μｌチップを用いて残る緩衝液に懸濁させた。Ｇ２緩衝液(10ml)を懸濁した核に加えると同時に、温和な渦動撹拌を３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ(２００μｌ)を加え、６０分間５０℃でインキュベーションした。そのインキュベーションと遠心分離は、該溶解物が透明となるまで繰り返した(例えば、付加の３０−６０分間インキュベーションし、４℃１０分間3000xgでペレット化)。
【０３００】
透明な溶解物の精製
(1)ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡは、１０ｍｌのＱＢＴ緩衝液で平衡化(マキシチューブ調製物当たり１試料)した。ＱＦ溶出緩衝液は５０℃で平衡化した。試料は３０秒間渦動撹拌し、次いで平衡化チップ上にロードし、重力によって排出した。そのチップは２ｘ１５ｍｌのＱＣ緩衝液で洗浄した。そのＤＮＡは、３０ｍＬのシラン化処理しオートクレーブ処理した３０ｍｌCorexチューブの中に１５ｍｌのＱＦ緩衝液によって溶出した（５０℃）。イソプロパノール(10.5ml)をそれぞれの試料に加え、該チューブをパラフィンで被覆し且つＤＮＡが沈澱するまで繰り返し転倒することによって混合した。試料は、４℃で１０分間、15000rpmでＳＳ-３４ローターで遠心分離することによってペレット化した。該ペレット位置をマークし、上清を捨て、そして１０ｍｌの７０％エタノール(４℃)を加えた。試料は、４℃で１０分間、10000rpmでＳＳ-３４ローターで遠心分離することによって再度ペレット化した。そのペレット位置をマークし、上清を捨てた。次いで該チューブを乾燥ラックの中にその側部を置き、試料を過剰に乾燥させないように注意しつつ、３７℃で１０分間乾燥させた。
【０３０１】
乾燥後、該ペレットを１．０mlのＴＥ(pH8.5)の中に溶かし、そして１−２時間、５０℃で保持した。試料は、溶解が継続する用４℃で一晩保持した。次いでそのＤＮＡ溶液は、ツベルクリン注射器の２６ゲージ注射針によって１．５ｍｌのチューブに移した。その移し換えは、ＤＮＡを分割するため５ｘ繰り返した。次いで試料は、１−２時間５０℃で保持した。
【０３０２】
ゲノムＤＮＡの定量及び遺伝し増幅アッセイのための調製：
それぞれのチューブのＤＮＡレベルは、Beckman DU640分光光度計において０．１ｍｌ水晶キュベットを用いて１：２０希釈（５μｌのＤＮＡ＋９５μｌのｄｄＨ2Ｏについて標準Ａ２６０，Ａ２８０分光光度法によって定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は、１．８−１．９の範囲内であった。次いでそれぞれのＤＮＡ試料は、ＴＥ(pH8.5)中でほぼ２００ｎｇ／ｍｌまで更に希釈した。最初の材料がより高く濃縮された場合(約７００ｎｇ／μｇ)、該材料は、再懸濁するまで数時間５０℃で保持した。
【０３０３】
蛍光測定法によるＤＮＡ定量は、以下を改変した製造者のガイドラインを用いて希釈した材料(20-600ng/ml)で実行した。これは、約１５分間ウォーミングアップをHoeffer DyNA Quant 200蛍光光度計に与えることによって達成された。そのHoechst染料作動溶液(#H33258,10μl,使用の12時間以内に調製した)は、100mlの１ｘＴＮＥ緩衝液の中で希釈した。２ｍｌキュベットに蛍光測定溶液を満たし、機械の内部に配し、機械をゼロ調製した。ｐＧＥＭ ３Ｚｆ(+)(2μl,ロット#360851026)を蛍光測定溶液の２ｍｌに加え、２００単位で測定した。付加のｐＧＥＭ ３Ｚｆ(+)ＤＮＡの２μｌを次いで試験し、その読みを400+/-10単位で確認した。次いでそれぞれの試料を少なくとも三度読んだ。三つの試料が互いに１０％以内であると認められた場合、その平均を取り、この値を定量値として用いた。
【０３０４】
蛍光測定法で測定した濃度は、ｄｄＨ２Ｏ中１０ｎｇ／μｌにそれぞれの試料を希釈するために用いた。これは、単一のＴａｑＭａｎプレートアッセイ用の、及び500-1000アッセイを実行するために十分な材料とともに、全ての鋳型試料で同時に行った。その試料は、正常なヒトＤＮＡと非-鋳型コントロールとともに単一プレート上にＴａｑｍａｎTMプライマー及びＢ-アクチンとＧＡＰＤＨの両方のプローブにより三度試験した。希釈した試料は、試験ＤＮＡから減じた正常なヒトＤＮＡのＣＴ値が+/-１ＣＴとなる条件で使用した。希釈した、ロット-限定したゲノムＤＮＡは、−８０℃で１．０ｍｌアリコートにおいて保管した。遺伝子増幅アッセイにおいて続けて使用したアリコートは、４℃で保管した。それぞれ１ｍｌのアリコートは、８−９プレート又は６４試験用に十分である。
【０３０５】
遺伝子増幅アッセイ
本発明のＰＲＯ５３３化合物は、以下の一次腫瘍でスクリーンし、得られたΔＣｔ値が表２中に報告される。
【表２】
0003653469.tif 000003
【０３０６】
考察と結論
各種の肺腫瘍におけるＤＮＡ４９４３５（ＰＲＯ５３３）のΔＣｔ値は、表２中に報告される。＞１のΔＣｔ値は、これが遺伝子コピーの二重化を表す増幅スコアリングのための境界値として典型的に用いられた。表２は、ＤＮＡ４９４３５の増幅が一次肺腫瘍ＬＴ１ａ，ＬＴ７，ＬＴ１１，ＬＴ１６，ＬＴ１７とＬＴ１９でもたらされたことを示す。これらの腫瘍におけるΔＣｔ値は、１．０２，１．０４，１．０９，１．６６，１．３２と１．６７であった。これは、正常な組織に対して遺伝しコピーの増加倍率がそれぞれほぼ２．０，２．１，２．１，３．２，２．５と３．２を表す。ＤＮＡ４９４３５（ＰＲＯ５３３）の増幅が各種の腫瘍で生じたために、それが腫瘍形成又は増殖と恐らくは関係付けられる。結果として、ＤＮＡ４９４３５（ＰＲＯ５３３）によってコードされたタンパク質に対して向けられたアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌の治療において有効とされることが予期されるであろう。
【０３０７】
実施例６
ハイブリダイゼーションプローブとしてのＰＲＯ５３３の使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてＰＲＯ５３３をコードしているヌクレオチドプローブ配列の使用を記載する。
【０３０８】
全長又は成熟ＰＲＯ５３３(図１において示した通りの配列番号：１)のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー中の相同ＤＮＡｓ(ＰＲＯ５３３の自然発生変異体をコードしているそれらのような)をスクリーンするためのプローブとして利用される。
【０３０９】
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄は、次の高いストリンジェンシー条件下で行われる。該フィルターへの放射能標識したＰＲＯ５３３-誘導プローブのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、pH6.8、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中、２０時間４２℃で行われる。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行われる。
【０３１０】
全長天然配列ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡとの望まれる配列同一性を有するＤＮＡｓは、当該分野で周知の標準技術を用いて同定することができる。
【０３１１】
実施例７
大腸菌におけるＰＲＯ５３３の発現
この実施例は、大腸菌における組換え発現によってＰＲＯ５３３の非グリコシル化形の作製を説明する。
【０３１２】
ＰＲＯ５３３（配列番号：１）をコードするＤＮＡ配列をまず、選択したＰＣＲプライマーで増幅した。該プライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を有するべきである。種々の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を有するｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら、Gene,2:95 (1977)を参照）がある。ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。ＰＣＲで増幅した配列を次いでこのベクターへ結紮する。ベクターは好ましくは、抗生物質抵抗性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含む）、ＰＲＯ５３３コード領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含むであろう。
【０３１３】
次に、結紮混合物は、Sambrookら、上記、に記載される方法により、選択した大腸菌を形質転換するために使用される。形質転換体は、ＬＢ平板培地上での増殖能により同定し、抗生物質抵抗性コロニーが選択される。プラスミドＤＮＡは、単離し、制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０３１４】
選択したクローンは、抗生物質を添加したＬＢ培地等の液体培地で一晩増殖させことができる。一晩培養したものは、次により大規模な培養に接種するのに使用し得る。次いで細胞を所望の光学密度まで増殖させるが、その間に発現プロモーターを作動させる。
【０３１５】
細胞を更に数時間培養した後、その細胞は遠心分離で回収することができる。遠心分離して得られた細胞の沈殿を当該技術分野で既知の種々の薬剤を使用して可溶化し、次いで金属キレートカラムをタンパク質との強固な結合を許容する条件下で使用してＰＲＯ５３３タンパク質を精製する。
【０３１６】
実施例８
哺乳類細胞中でのＰＲＯ５３３の発現
本実施例は、哺乳類細胞における組換え発現による、ＰＲＯ５３３の潜在的にグリコシル化された形態の調製を例示する。
【０３１７】
ベクターｐＲＫ５Ｅ(1989年3月15日公開のＥＰ３０７２４７号を参照)が発現ベクターとして使用される。任意に、該ＰＲＯ５３３ＤＮＡは、Sambrookら(上記)に記載される結紮方法を使用してＰＲＯ５３３ＤＮＡの挿入を許容するために選択した制限酵素でｐＲＫ５の中に結紮される。
【０３１８】
一つの態様において、該選択した宿主細胞は、２９３細胞として良い。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び任意に栄養成分及び／又は抗生物質を補充したＤＭＥＭのような培地中、組織培養プレートで集密的になるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ-ＰＲＯ５３３ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子[Thimmapparaら、Cell,31:543(1982)]をコードしている約１μｇのＤＮＡと混合し、５００μｌの、１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ2に溶かす。この混合物に対して、５００μｌの、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ7.35）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ4を滴下し、沈殿物を２５℃で１０分間かけて生成させる。この沈殿物を懸濁して２９３細胞へ添加し、３７℃で４時間静置した。培地を吸引除去して、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２０％グリセリン２ｍｌを３０秒間添加した。次いで２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間培養した。
【０３１９】
トランスフェクションの後約２４時間で、培地を除去して培地（のみ）、又は２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含む培地と交換した。インキュベーションの１２時間後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルにロードした。工程にかけたゲルを乾燥して、ＷＩＳＰポリペプチドの存在がわかるのに必要な時間だけ露出した。トランスフェクションした細胞を含んだ培養物は、更に（無血清培地中での）インキュベーションを受けさせ、且つ培地は選択したバイオアッセイで試験し得る。
【０３２０】
代替技術において、ＰＲＯ５３３は、Somparyracら、Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)）によって記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞の中に一過的に導入して良い。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯ５３３ＤＮＡを添加する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物は、細胞ペレット上で４時間インキュベーションする。細胞を２０％グリセリンで９０秒間処理し、組織培養液で洗浄し、組織培養液、５μｇ／ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコへ再導入する。約４日後、馴化培地を遠心し、フィルターにかけて細胞とその破片を除去する。発現したＰＲＯ５３３を含有する試料は次いで、濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した何れかの方法によって精製してもよい。
【０３２１】
ここで望まれる各種のＦＧＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は、無血清培地において２９３細胞で一過的に発現し、プロテインＧカラムを通して精製した。ＤＮＡ４９４３５は、ｇＤシグナル配列とエピトープ標識とＮ-末端に融合したゲネナーゼ(genenase)切断部位(MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLPG)を伴う融合タンパク質として発現ベクターｐＲＫ-ｇＤ-ＦＧＦ-１９によって無血清培地において２９３細胞中で一過的に発現した。
【０３２２】
別の態様において、ＰＲＯ５３３はＣＨＯ細胞内で発現することができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯ５３３は、ＣａＰＯ4やＤＥＡＥデキストラン等の既知の試薬を使用して、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることができる。上記したように、培養細胞をインキュベーションし、培地を培養液（のみ）又は35Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培養液と交換することができる。ＰＲＯ５３３ポリペプチドの存在を確認した後、培地を無血清培地と交換してもよい。好ましくは、培養物は、約６日間インキュベーションし、そして馴化培地を回収する。発現したＰＲＯ５３３を含む培地は、次いで濃縮し、何れかの選択した方法で精製することができる。
【０３２３】
エピトープ標識化ＰＲＯ５３３は、宿主ＣＨＯ細胞内でも発現し得る。ＰＲＯ５３３は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングして良い。該サブクローン挿入物は、バキュロウイルス発現ベクターの中にポリ-ｈｉｓ標識のような選択したエピトープ標識とフレーム内で融合するためにＰＣＲにかけることができる。そのポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯ５３３挿入物は次いで、安定クローンの選択用のＤＨＦＲのような選択マーカーを含んだＳＶ４０駆動性ベクター中にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞は、（上記したように）ＳＶ４０駆動性ベクターでトランスフェクションすることができる。上記したように標識して、発現を確認してもよい。発現したポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯ５３３を含む培養培地は次いで、濃縮し、Ｎｉ2+-キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択した何れかの方法で精製することができる。
【０３２４】
実施例９
酵母におけるＰＲＯ５３３の発現
以下の方法は、酵母におけるＰＲＯ５３３の組換え発現を記載する。最初に、酵母発現ベクターが、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからＰＲＯ５３３の細胞内産生又は分泌のために構築される。ＰＲＯ５３３及びプロモーターをコードするＤＮＡが、ＰＲＯ５３３の細胞内発現を導くため、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に挿入する。分泌の場合には、ＰＲＯ５３３をコードしているＤＮＡは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯ５３３シグナルペプチド又は他の哺乳類のシグナルペプチド、又は、例えば酵母アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、そして（必要ならば）ＰＲＯ５３３発現用リンカー配列をコードするＤＮＡとともに選択したプラスミドの中にクローニングすることができる。
【０３２５】
酵母細胞、例えばＡＢ１１０株などを次に、上記した発現プラスミドで形質転換し、選択した培養液中で培養する。形質転換した酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈殿及びＳＤＳ-ＰＡＧＥでの分離、そしてその後のクマシーブルー染料でのゲルの染色により分析することができる。
【０３２６】
組換え体ＰＲＯ５３３は、酵母細胞を遠心分離により培養液から除去すること、次いで選択したカートリッジフィルターを使用して培地を濃縮することによって連続的に単離し且つ精製することができる。ＰＲＯ５３３を含む濃縮物は更に、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を使用して精製して良い。
【０３２７】
実施例１０
バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＰＲＯ５３３の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＰＲＯ５３３の組換え発現を記載する。
【０３２８】
ＰＲＯ５３３用コード配列は、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープ標識の上流に融合される。そのようなエピトープ標識は、ポリ-ｈｉｓ標識、及び免疫グロブリン標識（ＩｇＧのＦｃ領域と同じ）が含まれる。ｐＶＬ１３９３(Novagen)のような商業的に入手可能なプラスミドを含む、種々のプラスミドを使用し得る。簡潔に言うと、ＰＲＯ５３３をコードしている配列、又はＰＲＯ５３３のコード配列の所望の部分[例えば該タンパク質が細胞外タンパク質である場合には、トランスメンブレンタンパク質の細胞外ドメインをコードしている配列又は成熟タンパク質をコードしている配列]は、その５’と３’の領域に相補的なプライマーによって増幅される。５’プライマーは、両端に（選択した）制限酵素部位が組み込まれ得る。次に生成物が前記の選択した制限酵素で消化され、発現ベクター中へサブクローニングされる。
【０３２９】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミドと、BaculoGoldTMウイルスＤＮＡ(pharmingen)とを、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)("Sf19")細胞(ATCC CRL 1711)に、リポフェクチン(GIBCO-BRLより商業的に入手可能)を使用して共-トランスフェクションすることによって産生される。２８℃でのインキュベーションの４−５日後、放出されたウイルスが回収され更なる増幅に使用される。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら、Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual (Oxford:Oxford University Press; 1994)に記載されるように行われる。
【０３３０】
発現したポリ-Ｈｉｓ標識化ＷＩＳＰポリペプチドは次いで、Ｎｉ2+-キレートアフィニティークロマトグラフィーを使用して以下のように精製した。抽出物は、組換ウイルス感染Ｓｆ９細胞より、Rupertら、Nature,362:175-179(1993)に記載されるようにして調製した。簡潔に言うと、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理用緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセリン；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２０秒間、二回音波処理した。音波処理物を遠心分離して透明化し、上清をロード用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセリン、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターに通した。Ｎｉ2+-ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎより商業的に入手可能）を、床容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのロード用緩衝液で平衡化する。フィルターを通した細胞抽出物を、０．５ｍＬ／分でカラムにのせる。Ａ280のベースラインになるまでカラムをロード用緩衝液で洗浄し、そこで分画を開始する。次にカラムを二次洗浄用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ６．０）で洗浄するが、これにより非特異的に結合したタンパク質が溶出される。Ａ280のベースラインに到達した後、カラムを二次洗浄用緩衝液中の０−５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配で展開する。１ｍｌの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び銀染色又はアルカリホスファターゼに接合したＮｉ2+-ＮＴＡ(Qiagen)でのウェスタンブロットにより分析する。溶出されたＨｉｓ10-標識化ＰＲＯ５３３を含む画分をプールし、ロード用緩衝液に対して透析する。
【０３３１】
あるいは、ＩｇＧ標識化（又はＦｃ-標識化）ＰＲＯ５３３の精製は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、既知のクロマトグラフィー技術を使用して行うことができる。
【０３３２】
ＰＲＯ５３３（ＵＮＱ３３４）は、バキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞で発現した。その発現は０．５−２Ｌスケールで実際に実行したが、それはより大きな（例えば８Ｌ）調製用に容易にスケールアップすることができる。ＰＲＯ５３３は、ヒンジ、ＣＨ２とＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したタンパク質細胞外領域のＩｇＧ構造（免疫付着因子）として及び／又はポリ-ｈｉｓ標識化形態において発現し得る。ＤＮＡ４９４３５は、Ｃ末端延長GHHHHHHHHの包含によってＨｉｓ-標識化形態で発現した。
【０３３３】
ＰＣＲ増幅に続いて、該コード化配列は、バキュウロウイルス発現ベクター(pb.PH.His.c)の中にサブクローンし、そして該ベクターとBaculogoldRバキュウロウイルスＤＮＡ(Pharmingen)は、リポフェクチン(Gibco BRL)を用いてスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)("Sf19")細胞(ATCC CRL 1711)に共-トランスフェクションした。pb.PH.Hisは、Ｈｉｓ標識配列を含むように修飾したポリリンカー領域を持つ、商業上利用可能な発現ベクターｐＶＬ１３９３(Pharmingen)の修正物である。該細胞は、１０％ＦＢＳ(Hyclone)を補充したヒンクスＴＮＭ-ＦＨ培地中で増殖させた。細胞は、２８℃で５日間インキュベーションした。上清を収穫し、ほぼ１０の感染の多重度（ＭＯＩ）で１０％ＦＢＳを補充したヒンクスＴＮＭ-ＦＨ培地中でＳｆ９細胞を感染させることによって第１のウイルス増幅のために続いて使用した。細胞は２８℃で３日間インキュベーションした。その上清を収穫し、バキュウロウイルス発現ベクターにおける構築物の発現を、ヒスチジン標識化タンパク質用のＮｉ-ＮＴＡビーズ(QIAGEN)又はＩｇＧ標識化タンパク質用のプロテイン-ＡセファロースＣＬ-４Ｂビーズ(Pharmacia)の２５ｍＬに対して上清の１ｍｌのバッチ結合、続いてクマシーブルー染色によってタンパク質標準の周知の濃度と比較するＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０３３４】
第１のウイルス増幅上清は、ほぼ０．１のＭＯＩでＥＳＦ-９２１培地(Expression Systems LLC)中で培養したＳｆ９細胞のスピナー培養物(500ml)を感染するために用いた。細胞は２８℃で３日間インキュベーションした。その上清を収穫し、濾過した。バッチ結合とＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、必要なら、該スピナー培養の発現が確証されるまで繰り返した。
【０３３５】
形質移入した細胞の馴化培地（０．５乃至３Ｌ）を遠心分離により回収し、細胞を除去して０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。ポリ-Ｈｉｓ標識化構築物の場合、タンパク質はＮｉ-ＮＴＡカラム(Qiagen)を使用して精製した。精製前に、イミダゾールを馴化培地に５ｍＭとなるようにして添加した。馴化培地を０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾールを含んだ２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４緩衝液で平衡化した６ｍｌのＮｉ-ＮＴＡカラムに、４℃で４−５ｍｌ／分ポンプ負荷した。ロード後、カラムを更なる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。高度に精製されたタンパク質を次に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１４ＭのＮａＣｌ、及び４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存緩衝液に対して、２５ｍｌのG25 Superfine(Pharmacia)カラムを使用して脱塩し、−８０℃で保存した。
【０３３６】
実施例１１
ＦＧＦレセプター４に対するＰＲＯ５３３（ＵＮＯ３３４）の結合の実証
ＰＲＯ５３３は、制御Ｃ末端Ｈｉｓ８エピトープタンパク質としたように、実施例８中に記載したと同じくＣ末端Ｈｉｓ８エピトープ標識形態でバキュウロウイルスの中で発現した。ＦＧＦレセプター１−４とＴＩＥ１レセプターの細胞外ドメインは、Ｆｃ融合タンパク質として発現した。タンパク質は、室温で１時間、結合緩衝液（ＤＭＥＭ媒体＋１０ｍＭのHepes,pH7.4＋0.1%のアルブミン＋200ng/mlのヘパリン）中で相互作用させた。プロテインＡセファロース(Pharmacia)を加え(0.01ml)、結合を３０分間継続した。プロテインＡセファロースビーズを採取し、結合緩衝液中で二度洗浄した。次いで還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって分解した。ウェスタンブロット分析は、製造者に推奨された通り、抗-Ｈｉｓ抗体(Quiagen)で実行した。その結果が図９中に示される。その特異的結合成分は、図９中のレーン１−８上に示す通りである。レーン９は、比較のためにゲル上に直接ロードしたＰＲＯ５３３-Ｈｉｓ(ＵＮＱ３３４-Ｈｉｓ)を含む。分子量マーカーの位置は、比較のためにゲルの左側上に示される。
【０３３７】
その結果は、ＦＧＦレセプター４（ＦＧＦＲ-Ｆｃ）に対する高い特異的結合を示す。これは、大部分のＦＧＦリガンドが１より多くのＦＧＦレセプターに結合することから、非常に重要である。
【０３３８】
実施例１２
ＰＲＯ５３３に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ５３３に特異的に結合するモノクローナル抗体の調製を説明する。
【０３３９】
モノクローナル抗体を産生する技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Goding、上記、に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲＯ５３３、ＰＲＯ５３３を含む融合タンパク質、並びに細胞表面に組換えＰＲＯ５３３を発現している細胞を含む。免疫原の選択は、過度の実験を要することなく当業者によって実施される。
【０３４０】
Balb/cのようなマウスが、フロイント完全アジュバント中に乳化したＰＲＯ５３３免疫原で免疫され、１−１００マイクログラムの量で皮下または腹膜内に注射される。あるいは、この免疫原はＭＰＩ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）に乳化され、動物の後足に注入される。免疫されたマウスは、選択されたアジュバントに乳化されたさらなる免疫原を用いて１０ないし１２日後にブーストされる。その後、数週間、マウスは、さらなる免疫注射でブーストし得る。血清サンプルは、抗ＰＲＯポリペプチド抗体を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイで試験するための後眼窩採血(retro-orbital bleeding)によりマウスから定期的に得ることができる。
【０３４１】
適切な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」の動物は、ＰＲＯ５３３の最終的な静脈注射を注射することができる。３−４日後、このマウスを屠殺し、脾臓細胞が採取される。脾臓細胞は、ATCC、No.CRL1597から入手できるP3X63AgU.1のような選別されたマウスミエローマ細胞系に融合（３５％ポリエチレングリコールを用いて）される。融合体はハイブリドーマ細胞を生じ、非融合細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに平板培養され得る。
【０３４２】
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ５３３に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯ５３３に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技術範囲である。
【０３４３】
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗-ＰＲＯ５３３モノクローナル抗体を含む腹水を産生するために同系のBalb/cマウスに腹膜内注入されてもよい。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコまたはローラーボトルで生育することもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて実施することができる。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【０３４４】
材料の寄託
以下の材料は、American Type Culture Collection, 2301 Parklawn Drive, Rockville, MD,USA (ATCC)に寄託されている：
材料                 ATCC寄託番号    寄託日
DNA49435-1219        209480           1997年11月21日
【０３４５】
これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびそれに基づく規則の下で行われた（ブダペスト条約）。これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の下でＡＴＣＣにより入手可能であり、Genentech, Inc.とＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関係する米国特許の発行、もしくは米国またはその他の国の早い方の特許出願の公開に基づいて、公衆に寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして、その子孫の入手を、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に関して米国特許法施行規則§１．１４を含む）に従って付与される米国特許商標庁長官によって定められた者に保証する。
【０３４６】
本願の譲受人は、寄託物の培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅または損なわれた場合には、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意した。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従って政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されない。
【０３４７】
上記明細書は、当業者が本発明を十分に実施できるものと解する。寄託された実施態様は、本発明の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機能的に均等なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、寄託された構築物により、範囲が制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、上記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態様の実施を可能にするのに不適切であることの承認、あるいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を限定すると解釈されるとの承認を構成するものではない。実際に、ここに記載または示されたものに加えて、本発明の種々の変更が、上記記載から当業者にとって明白になり、添付された請求の範囲内に含まれる。
「配列表」
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、天然配列ＰＲＯ５３３の誘導アミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは、図１（配列番号：１）の配列中のアミノ酸位置１から約アミノ酸位置２２までの範囲として仮に同定されている。Ｎ-ミリストリル化部位は、アミノ酸残基Ｇ１５，Ｇ５４，Ｇ６６とＧ２０１で存在するとして仮に同定されている一方、原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位は、アミノ酸残基Ｙ４８ないしＣ５８で存在すると確信される。
【図２】  図２は、天然配列ＰＲＯ５３３（ＤＮＡ４９４３５）をコードしているｃＤＮＡの核酸配列を示す。その開始コドンは、残基１１１２−１１１４での停止コドンとともに、ヌクレオチド残基４６４−４６６で存在すると確信される。
【図３】  図３は、ＤＮＡ４９４３５によってコードされた天然配列ＰＲＯ５３３タンパク質のアミノ酸残基３ないし２１６と、ＡＦ００７２８ １，線維芽細胞増殖因子配列（ＦＧＦ-１５）の残基６ないし２１８との間のＢｌａｓｔ-２スコア、マッチ及びパーセント同一性を表すアライメントである。
【図４】  図４は、ＤＮＡ４９４３５と、染色体１１から製造したゲノムクローン、Ｂ０３７６７とのＢｌａｓｔスコア、マッチ及びパーセント同一性を表す。
【図５】  図５は、ヌクレオチド配列と一緒にＤＮＡ４７４１２(GenBank AA220994)から二本鎖にした、及びＤＮＡ４９４３５を単離するために使用することができるＰＣＲオリゴ（FGF15.f,FGF15.p2,FGF15.r）のハイブリダイゼーション領域を示す。
【図６】  図６は、ＰＲＯ５３３を単離するプロセスにおいて各種の公共配列データベース（例えばGenbank、Dayhoff,など）をサーチするために使用した、ＡＦ００７２６８，ＦＧＦ-１５ＥＳＴ配列の全体配列を示す。
【図７】  図７は、各種の癌細胞系におけるＤＮＡ４９４３５のノーザンブロットである。示したレーン１−８は、次の癌細胞系からのポリＡ ｍＲＮＡである：(1)前骨髄球白血病ＨＬ-６０；(2)Ｈｅｌａ Ｓ３；(3)慢性骨髄性白血病Ｋ-５６２；(4)リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ-４；(5)バーキットリンパ腫Raji；(6)結腸直腸腺癌ＳＷ４８０；(7)肺癌Ａ５４９；(8)黒色腫Ｇ３６１。
【図８】  図８は、ヒト胎児（E12-E16週）及び成人組織におけるＤＮＡ４９４３５のin situ分析の結果を示す。表示は：Ａ，Ｂ-胎児低肢軟骨；Ｃ，Ｄ-胎児網膜；Ｅ，Ｆ-胎児皮膚；Ｇ，Ｈ-成人胆嚢、の相当する明及び暗領域イメージである。発現のエリアは矢印により示される。
【図９】  図９は、ＦＧＦレセプターに対するＰＲＯ５３３の結合を示すウェスタンブロットである。Ｎ末端ｇＤエピトープ標識（Ｂ）又はＣ末端Ｈｉｓ８エピトープ標識（Ｃ）のいずれかで発現したＦＧＦ１（Ａ）又はＰＲＯ５３３（ＦＧＦ-１９）は、レセプター-Ｆｃ融合タンパク質への結合について試験した。特異的に結合する成分は、上記レーン１−８で示した通りである。レーン９は、比較用に該ゲル上に直接ロードしたＦＧＦを含む。分子量マーカーは比較用に該ゲルの左側に示される。
【図１０】  図１０は、ヘパリン上に結合しているＰＲＯ５３３（ＦＧＦ-１９）の依存関係を示すウェスタンブロットである。Ｎ末端ｇＤ-標識化ＰＲＯ５３３（ＦＧＦ-１９）は、ヘパリンの示された濃度の存在中でＦＧＦＲ４-Ｆｃとの相互作用を許容した。
【図１１】  図１１は、ＦＧＦファミリーの他のメンバーとＤＮＡ４９４３５（ＦＧＦ-１９）によってコードされたＰＲＯ５３３配列のアライメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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