(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部において優先的に骨形成を生じさせるべく使用される第１の基体と、内部および外表面付近のそれぞれにおいて骨形成を生じさせるべく使用される第２の基体と、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列および発現プラスミド由来の塩基配列を含む核酸と、該核酸を保持する非ウィルス由来のベクターとして、正荷電リポソームおよび負荷電リポソームのうちの少なくとも一方のリポソームとを含む骨形成治療デバイスであって、
前記第１の基体および前記第２の基体は、いずれも、隣接する空孔同士が連通する連続空孔を有し、正負両荷電を有するハイドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムを主としてなる多孔質ブロック体で構成され、
該多孔質ブロック体は、その空孔率が５５〜９０％、かつ、隣接する前記空孔同士の境界部の面積の平均値をＡ［μｍ２］とし、前記空孔の最大断面積の平均値をＢ［μｍ２］としたとき、Ｂが１．８×１０４〜７．９×１０５μｍ２であり、前記第１の基体のＢ／Ａの値が２〜６であり、前記第２の基体のＢ／Ａの値が５０〜１５０であり、
当該骨形成治療デバイスの内部に優先的に骨形成を生じさせる必要がある場合には、前記第１の基体を選択し、当該骨形成治療デバイスの内部および外表面付近のそれぞれに骨形成を生じさせる必要がある場合には、前記第２の基体を選択し、選択された方の基体に、前記リポソームを担持させ、さらに、該リポソームに前記核酸を保持させて使用することを特徴とする骨形成治療デバイス。
【請求項２】
前記骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７のうちの少なくとも１種である請求項１に記載の骨形成治療デバイス。
【請求項３】
前記核酸の配合量は、前記基体の体積１ｍＬあたり１〜１００μｇである請求項１または２に記載の骨形成治療デバイス。
【請求項４】
前記リポソームと前記核酸との配合比は、重量比で１：１〜２０：１である請求項１ないし３のいずれかに記載の骨形成治療デバイス。
【請求項５】
血管形成誘導因子を含む請求項１ないし４のいずれかに記載の骨形成治療デバイス。
【請求項６】
前記血管形成誘導因子は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のうちの少なくとも１種である請求項５に記載の骨形成治療デバイス。
【請求項７】
前記血管形成誘導因子と前記核酸との配合比は、重量比で１０：１〜１：１００である請求項５または６に記載の骨形成治療デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、骨形成治療デバイス（骨形成制御デバイス）に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医療の分野では、いわゆる人工骨、人工皮膚、人工臓器に対する研究が注目を集めており、これらについて、既に臨床の現場でも種々の立場から新たな挑戦が行われており、ここ数年技術的にも多大な伸展を示している。
【０００３】
特に、同種移植に関しては、需要が供給を大きく上回る状態が慢性的に持続していることに加え、未知の感染症などの問題もある。
【０００４】
これらを回避するため、このような同種組織の移植に代わるものとして、人工的に製造した人工組織・人工臓器の開発が待望されている。この点に関しては、骨移植においても同様である。
【０００５】
骨の形成過程、修復過程について、多くの研究者によって解明され、その制御の要となる骨誘導因子の発見・同定・分離に加え、遺伝子工学的手法での骨誘導因子の生成が可能となり、その作用機序についての知見も集積されている。
【０００６】
この骨誘導因子としては、Transforming Growth Factor b（ＴＧＦｂ）のｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙに属する骨形態形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein：ＢＭＰ）が多くの研究者の注目を集めている。このＢＭＰは、皮下組織または筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これを骨芽細胞や軟骨芽細胞に分化させ、骨または軟骨を形成させる活性タンパク質であり、その基礎的検討が開始されている。
【０００７】
例えば、特許文献１には、ＢＭＰ自体またはＢＭＰをコードするＤＮＡを、マトリックス材料（基体）に担持（適用）した移植体材料が開示されている。
【０００８】
このマットリックス材料は、通常、移植体材料を移植する骨欠損部等の移植部位の形状に対応して形成される。そして、移植部位では、マトリックス材料が骨形成の場となる。
【０００９】
ここで、症例によっては、骨形成治療を早期に達成するためには、マトリックス材料の内部での骨形成が優先的に進行することが好ましい場合や、マトリックス材料の外表面付近での骨形成が優先的に進行することが好ましい場合等、様々である。
【００１０】
ところが、従来の移植体材料では、このような骨形成のパターンを制御することが困難である。
【００１１】
【特許文献１】
特表２００１−５０５０９７号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、骨形成のパターンを制御し得る骨形成治療デバイスを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（７）の本発明により達成される。
【００１４】
（１）  内部において優先的に骨形成を生じさせるべく使用される第１の基体と、内部および外表面付近のそれぞれにおいて骨形成を生じさせるべく使用される第２の基体と、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列および発現プラスミド由来の塩基配列を含む核酸と、該核酸を保持する非ウィルス由来のベクターとして、正荷電リポソームおよび負荷電リポソームのうちの少なくとも一方のリポソームとを含む骨形成治療デバイスであって、
前記第１の基体および前記第２の基体は、いずれも、隣接する空孔同士が連通する連続空孔を有し、正負両荷電を有するハイドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムを主としてなる多孔質ブロック体で構成され、
該多孔質ブロック体は、その空孔率が５５〜９０％、かつ、隣接する前記空孔同士の境界部の面積の平均値をＡ［μｍ２］とし、前記空孔の最大断面積の平均値をＢ［μｍ２］としたとき、Ｂが１．８×１０４〜７．９×１０５μｍ２であり、前記第１の基体のＢ／Ａの値が２〜６であり、前記第２の基体のＢ／Ａの値が５０〜１５０であり、
当該骨形成治療デバイスの内部に優先的に骨形成を生じさせる必要がある場合には、前記第１の基体を選択し、当該骨形成治療デバイスの内部および外表面付近のそれぞれに骨形成を生じさせる必要がある場合には、前記第２の基体を選択し、選択された方の基体に、前記リポソームを担持させ、さらに、該リポソームに前記核酸を保持させて使用することを特徴とする骨形成治療デバイス。
これにより、骨形成のパターンを制御することができる。
また、骨誘導因子として、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列および発現プラスミド由来の塩基配列を含む核酸を用いることにより、未分化間葉系細胞、炎症細胞、線維芽細胞のような骨形成に関与する細胞内におけるＢＭＰの発現効率を、極めて高くすることができ、より迅速な骨形成を促すことができる。
また、前記核酸を保持するベクターを含むことにより、骨形成に関与する細胞への組換えプラスミドの取り込みの効率がより向上し、結果として、より迅速な骨形成が促される。
また、前記ベクターが非ウィルス由来のベクターであることにより、限局した部位に比較的大量の核酸を、容易かつ確実に供給することができ、また、患者のより高い安全性を確保することができる。
また、前記非ウィルス由来のベクターがリポソームであることにより、リポソームは、細胞膜の構成成分に近い成分で構成されるため、細胞膜への結合（融合）が比較的容易かつ円滑になされ、核酸の未分化間葉系細胞、炎症細胞、線維芽細胞のような骨形成に関与する細胞への取り込みの効率をより向上させることができる。
また、前記リポソームが正荷電リポソームであることにより、正荷電リポソームは、その内部に核酸を封入する操作を必要としないことから、骨形成治療デバイスの作製時間の短縮に有利である。
また、前記空孔の最大断面積の平均値Ｂが、７．９×１０３〜１．１×１０６μｍ２であることにより、基体の機械的強度を好適に維持しつつ、基体をより好適な骨形成の場とすることができる。
また、前記基体の空孔率が、３０〜９５％であることにより、基体の機械的強度を好適に維持しつつ、基体をより好適な骨形成の場とすることができる。
また、前記基体は、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムを主としてなるものであることにより、ハイドロキシアパタイトやリン酸三カルシウムが、骨の無機質主成分と同様（近似）の組成、構造、物性を有するため、特に優れた生体適合性を有している。
【００２１】
（２）  前記骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７のうちの少なくとも１種である上記（１）に記載の骨形成治療デバイス。
【００２２】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７は、特に、未分化間葉系細胞の骨芽細胞への分化を誘導する作用に優れる。
【００２５】
（３）  前記核酸の配合量は、前記基体の体積１ｍＬあたり１〜１００μｇである上記（１）または（２）に記載の骨形成治療デバイス。
これにより、より迅速な骨形成を促すことができる。
【００３４】
（４）  前記リポソームと前記核酸との配合比は、重量比で１：１〜２０：１である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の骨形成治療デバイス。
【００３５】
これにより、コストの増大や細胞毒性の発生を防止しつつ、核酸の未分化間葉系細胞、炎症細胞、線維芽細胞のような骨形成に関与する細胞への取り込みの効率を十分に大きくすることができる。
【００３６】
（５）  血管形成誘導因子を含む上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の骨形成治療デバイス。
これにより、より迅速な骨形成が促される。
【００３７】
（６）  前記血管形成誘導因子は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のうちの少なくとも１種である上記（５）に記載の骨形成治療デバイス。
【００３８】
これらのものは、血管形成能に優れるため、得られる骨形成治療デバイスは、特に、高い骨形成能を有するものとなる。
【００３９】
（７）  前記血管形成誘導因子と前記核酸との配合比は、重量比で１０：１〜１：１００である上記（５）または（６）に記載の骨形成治療デバイス。
【００４０】
これにより、新生血管が効率よく形成されるとともに、骨芽細胞が効率よく増殖することができる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の骨形成治療デバイス（骨形成制御デバイス）について詳細に説明する。
【００４８】
本発明の骨形成治療デバイスは、骨誘導因子と、基体とを含むものであり、生体内に移植して骨形成治療を行うものである。
【００４９】
ここで、本明細書中における「骨形成」とは、骨形成および軟骨形成の双方を含み、未分化間葉系細胞に対して骨芽細胞や軟骨芽細胞（以下、骨芽細胞で代表する）の分化を誘導することによる骨形成や軟骨形成のことを言う。
【００５０】
また、「骨形成治療」とは、医科領域および歯科領域において、骨組織や軟骨組織の形成や補填を要する疾患の予防や治療を行うこと、あるいは、症状を改善させることを言う。
【００５１】
なお、以下の説明では、骨誘導因子として、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列を含む核酸を代表に説明する。骨誘導因子として、ＢＭＰをコードする塩基配列を含む核酸を用いることにより、より迅速な骨形成を促すことができる。
【００５２】
また、ＢＭＰをコードする塩基配列としては、通常、ｃＤＮＡが用いられるため、以下では、ＢＭＰをコードする塩基配列を、「ＢＭＰ  ｃＤＮＡ」と言う。
【００５３】
本発明におけるＢＭＰとしては、未分化間葉系細胞に対して骨芽細胞への分化を誘導することにより骨形成を促す活性を有するものであればよく、特に限定されないが、例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２（以上、ホモダイマー）、もしくは、これらのＢＭＰのヘテロダイマーまたは改変体（すなわち、天然に存在するＢＭＰのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、天然に存在するＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質）等が挙げられる。これらの中でも、ＢＭＰとしては、特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７のうちの少なくとも１種が好ましい。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７は、特に、未分化間葉系細胞の骨芽細胞への分化を誘導する作用に優れるため、得られる骨形成治療デバイスは、特に高い骨形成能を示す。
【００５４】
このようなことから、本発明で用いるＢＭＰ  ｃＤＮＡとしては、前述のような各種ＢＭＰを産生（発現）し得る塩基配列を含むものであればよい。すなわち、ＢＭＰ  ｃＤＮＡとしては、天然に存在するＢＭＰをコードする塩基配列と同一、または、天然に存在するＢＭＰをコードする塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換および／または付加されたものを用いることができる。また、これらのものは、１種または２種以上を組み合わせて用いるようにしてもよい。
【００５５】
このようなＢＭＰ  ｃＤＮＡは、例えば、特表平２−５００２４１号公報、特表平３−５０３６４９号公報、特表平３−５０５０９８号公報等に記載の方法に従って、入手することができる。
【００５６】
また、このような核酸は、発現プラスミド由来の塩基配列を含むもの、すなわち、ＢＭＰ  ｃＤＮＡを発現プラスミドに組み込んだ（導入した）ものであるのが好ましい。
【００５７】
以下では、ＢＭＰ  ｃＤＮＡを発現プラスミドに組み込んだものを、「組換えプラスミド」と言い、この組換えプラスミドを、ＢＭＰ  ｃＤＮＡをコードする塩基配列を含む核酸の代表として説明する。
【００５８】
このような組換えプラスミドを用いることにより、これを取り込んだ未分化間葉系細胞、炎症細胞、線維芽細胞等（以下、これらを総称して、「骨形成に関与する細胞」と言う。）内におけるＢＭＰの発現効率を、極めて高くすることができる。
【００５９】
発現プラスミドには、遺伝子組換え工学技術の分野で広く用いられるものの中から選択することができ、例えば、ｐＣＡＨ、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等の１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６０】
また、この組換えプラスミドには、適宜、ＢＭＰの発現を適切に制御する塩基配列（ＤＮＡ断片）を導入することができる。
【００６１】
発現プラスミドに、ＢＭＰ  ｃＤＮＡを含む各種の塩基配列を組み込む方法には、公知の方法を用いることができる。
【００６２】
ここで、図１に、組換えプラスミド（キメラＤＮＡ）の一例を示す。
図１に示す組換えプラスミドは、ＢＭＰ−２  ｃＤＮＡを、発現プラスミドであるｐＣＡＨに導入したものである。
【００６３】
この組換えプラスミドは、Ａｍｐ（アンピシリン）に耐性を示すＤＮＡ断片を含むとともに、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサー・プロモーターを含むＤＮＡ断片と、ＢＭＰ−２  ｃＤＮＡの下流域には、ＳＶ４０由来の転写終結信号を含むＤＮＡ断片とが組み込まれている。
【００６４】
用いる組換えプラスミド（核酸）の量は、特に限定されないが、後述する基体の体積１ｍＬあたり１〜１００μｇ程度であるのが好ましく、１０〜７０μｇ程度であるのがより好ましい。用いる組換えプラスミドの量が少な過ぎると、迅速な骨形成を促すことができない場合がある。一方、用いる組換えプラスミドの量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００６５】
また、本発明の骨形成治療デバイスは、多孔質ブロック体（例えば、焼結体）で構成された基体を有している。この基体は、未分化間葉系細胞から分化した骨芽細胞による骨形成の場（フィールド）となる。
【００６６】
この多孔質ブロック体は、隣接する空孔同士が閉鎖された閉鎖空孔ではなく、互いに連通する連続空孔を有するものである。
【００６７】
図２は、本発明における基体の縦断面を示す模式図、図３および図４は、それぞれ、骨形成パターンの一例を示す模式図である。図３および図４中の符号「２」は、新生骨を示す。
【００６８】
本発明者は、上記問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、基体の内部形状（空孔形態）を適宜設定することにより、骨形成のパターンが異なってくることを見出した。
【００６９】
さらに、本発明者は、研究を進めた結果、図２に示すように、基体１の隣接する空孔１ａ同士の境界部の面積（平均）をＡ［μｍ２］とし、前記空孔１ａの最大断面積（平均）をＢ［μｍ２］としたとき、このＢ／Ａの値の大小に、前述したような骨形成のパターンが大きく依存することが判ってきた。
【００７０】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明は、前記Ｂ／Ａの値の大小に応じて、骨形成のパターンを制御し得ることを特徴とする。
【００７１】
例えば、Ｂ／Ａの値が５０未満の第１の場合と、Ｂ／Ａの値が５０以上の第２の場合とで、骨形成のパターンは、次のような傾向を示す。
【００７２】
具体的には、Ｂ／Ａの値が５０未満の場合、換言すれば、隣接する空孔１ａ同士の境界部の面積（平均）Ａが、空孔１ａの最大断面積（平均）Ｂに対して比較的大きい場合、新生骨２は、図３に示すように、基体１の内部で優先して形成される傾向を示す。これは、前記Ａが大きいことにより、骨形成に関与する細胞の隣接する空孔１ａ同士の間での移動が円滑になされるためであると推察される。
【００７３】
また、この場合、骨形成に関与する細胞は、空孔１ａを十分に満した後、逸脱（逸流）するように移動（拡散）して、図３に示すように、新生骨２は、基体１の形状に対応して形成されることとなる。
【００７４】
一方、Ｂ／Ａの値が５０以上の場合、換言すれば、隣接する空孔１ａ同士の境界部の面積（平均）Ａが、空孔１ａの最大断面積（平均）Ｂに対して比較的小さい場合、新生骨２は、図４に示すように、基体１の内部だけでなく、その外表面１ｂ（特に、基体１の鉛直下方の外表面１ｂ）付近においても形成される傾向を示す。これは、前記Ａが小さいことに起因して、骨形成に関与する細胞の基体１の内部への侵入が緩除になるためであると推察される。
【００７５】
このようなＢ／Ａの値は、第１の場合と第２の場合とで差がある程よく、その差は、３０以上であるのが好ましく、４０以上であるのがより好ましい。これにより、第１の場合と第２の場合とにおける（Ｂ／Ａの値の大小関係に応じた）骨形成のパターンの傾向の差異を、より明確にすることができる。
【００７６】
具体的には、第１の場合のＢ／Ａの値は、２〜６程度、第２の場合のＢ／Ａの値は、５０〜１５０程度であるのが好ましい。これにより、骨形成のパターンの傾向がより一層顕著となるとともに、第１の場合と第２の場合とにおける（Ｂ／Ａの値の大小関係に応じた）骨形成のパターンの傾向の差異を、特に明確にすることができる。
【００７７】
このようなことから、本発明によれば、目的（例えば、症例、治療部位、治療目的等）に応じて、Ｂ／Ａの値の異なる２種以上の基体１を用意し、これらを選択的に使用することにより、それぞれに適した骨形成治療、すなわち、早期の骨形成治療が可能となる。これにより、患者のＱＯＬの向上を図ることができる。
【００７８】
前記空孔の最大断面積（平均）Ｂは、７．９×１０３〜１．１×１０６μｍ２程度であるのが好ましく、１．８×１０４〜７．９×１０５μｍ２程度であるのがより好ましい。なお、この空孔の最大断面積（平均）Ｂを平均空孔径に換算した場合、その値は、１００〜１２００μｍ（好ましくは１５０〜１０００μｍ）となる。空孔の最大断面積（平均）Ｂを前記範囲とすることにより、基体の機械的強度を好適に維持しつつ、基体をより好適な骨形成の場とすることができる。
【００７９】
また、基体の空孔率は、特に限定されないが、３０〜９５％程度であるのが好ましく、５５〜９０％程度であるのがより好ましい。空孔率を前記範囲とすることにより、基体の機械的強度を好適に維持しつつ、基体をより好適な骨形成の場とすることができる。
【００８０】
また、基体の構成材料としては、生体適合性を有するものであればよく、特に限定されないが、例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイト、炭酸アパタイト、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウムのようなリン酸カルシウム系化合物、アルミナ、チタニア、ジルコニア、イットリア等のセラミックス材料、チタンまたはチタン合金、ステンレス鋼、Ｃｏ−Ｃｒ系合金、Ｎｉ−Ｔｉ系合金等の各種金属材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
これらの中でも、基体の構成材料としては、リン酸カルシウム系化合物、アルミナ、ジルコニア等のセラミックス材料（いわゆる、バイオセラミックス）が好ましく、特に、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムを主材料とするものが好ましい。
【００８２】
ハイドロキシアパタイトやリン酸三カルシウムは、骨の無機質主成分と同様（近似）の組成、構造、特性を有するため、特に優れた生体適合性を有している。また、正負両荷電を有しているため、特に、ベクターとしてリポソームを用いる場合（この点については、後に詳述する）には、このリポソームを基体に長時間、安定的に担持させることができる。その結果、リポソームに吸着または封入された組換えプラスミド（核酸）も基体に長時間、安定的に保持されることになり、より迅速な骨形成に寄与する。また、骨芽細胞との親和性も高いことから新生骨を維持する上でも好ましい。
【００８３】
このような基体は、種々の方法により作製（製造）することができる。基体として、セラミックス材料で構成される多孔質ブロック体を作製する場合を一例に説明すると、このような多孔質ブロック体は、例えば、水溶性高分子を含むセラミックススラリーを攪拌起泡後に乾燥させ多孔質ブロックにし、骨欠損部等の移植部位に対応した形状に、例えばマシニングセンター等の汎用加工機械により成形体を得、かかる成形体を焼結（焼成）することによって作製することができる。
【００８４】
このような基体の製造方法において、例えば、原料粉体合成の条件（１次粒子径、１次粒子分散状態等）、原料粉体の条件（平均粒径、仮焼成の有無、粉砕処理の有無等）、攪拌起泡の条件（界面活性剤の種類、スラリーを攪拌する攪拌力等）、焼成条件（焼成雰囲気、焼成温度等）等を適宜設定することにより、前記Ｂ／Ａの値を所望のものに設定することができる。例えば、焼成温度を高くすると、原料粉体同士の間で拡散が促進され、Ａの値が小さくなり、Ｂ／Ａの値が大きくなる傾向を示す。
【００８５】
特に、原料粉体の条件、攪拌起泡の条件等は、Ｂ／Ａの値に大きく影響を与えるため、これらの条件の管理は、より厳密に行うのが好ましい。
【００８６】
なお、目的とするＢ／Ａの値を得るための各種条件は、実験的に求めることができる。
【００８７】
以上のような骨形成治療デバイスは、組換えプラスミド（核酸）を基体に接触させることにより作製（製造）することができる。具体的には、骨形成治療デバイスは、例えば、組換えプラスミドを含む液体（溶液または懸濁液）を基体に供給すること、あるいは、この液体に基体を浸漬すること等により、容易に作製することができる。
【００８８】
また、例えば、粉末状、顆粒状、ペレット状等の基体の前駆体とバインダーと前述したような液体とを混練した混練物を、成形することにより骨形成治療デバイスを作製することもできる。
【００８９】
このような骨形成治療デバイスを、例えば骨欠損部等の移植部位に埋設（適用）すると、この骨形成治療デバイスの近傍に存在する骨形成に関与する細胞が、その細胞内に組換えプラスミド（核酸）を取り込む。これらの細胞内では、組換えプラスミドを鋳型として順次ＢＭＰが産生され、このＢＭＰにより、未分化間葉系細胞の骨芽細胞への分化が誘導され、その結果、骨形成が進行する。なお、この骨形成は、前記Ｂ／Ａの値の大小により、異なる骨形成のパターンで迅速に進行する。
【００９０】
また、このような骨形成治療デバイスは、ベクターや血管形成誘導因子を含むのが好ましい。骨形成治療デバイスが、これらのものを含むことにより、より迅速な骨形成が促される。なお、骨形成治療デバイスは、いずれか一方を含むのが好ましく、双方を含むのがより好ましい。
【００９１】
以下、ベクターおよび血管形成誘導因子について、それぞれ、詳細に説明する。
【００９２】
ベクターは、組換えプラスミド（核酸）を保持し、骨形成に関与する細胞への組換えプラスミドの取り込みを促進する機能を有するものである。ベクターを用いることにより、骨形成に関与する細胞への組換えプラスミドの取り込みの効率がより向上し、結果として、より迅速な骨形成が促される。
【００９３】
ベクターとしては、ウィルス由来でないベクター（すなわち、非ウィルス由来のベクター）、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクターのようなウィルス由来のベクターのいずれを用いてもよいが、非ウィルス由来のベクターを用いるのが好ましい。非ウィルス由来のベクターを用いることにより、限局した部位に比較的大量の組換えプラスミドを、容易かつ確実に供給することができ、また、感染を起こさないことから患者のより高い安全性を確保することができるという利点もある。さらに、非ウィルス由来のベクターを用いる方法は、ウィルスベクターや細胞を用いるｅｘ  ｖｉｖｏ等の方法では、ウィルスベクターや細胞への核酸の導入操作、核酸を導入したウィルスベクターや細胞を増殖させる操作等が必要であるのに対し、これらの操作を必要としないことから、時間と手間とを低減できるという点においても優れている。
【００９４】
非ウィルス由来のベクターとしては、種々のものを用いることができるが、リポソーム（脂質膜）を用いるのが好適である。リポソームは、細胞膜の構成成分に近い成分で構成されるため、細胞膜への結合（融合）が比較的容易かつ円滑になされる。このため、組換えプラスミドの骨形成に関与する細胞への取り込みの効率をより向上させることができる。
【００９５】
リポソームとしては、例えば、表面に組換えプラスミドを吸着する形態の正荷電リポソーム、内部に組換えプラスミドを封入する形態の負荷電リポソーム等を用いることができる。これらのリポソームは、単独または組み合わせて用いることもできる。
【００９６】
正荷電リポソームは、例えば、ＤＯＳＰＡ（2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate）のようなポリカチオン性脂質を主としてなるものである。なお、正荷電リポソームとしては、例えば、ＱＩＡＧＥＮ社製の「ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ」等の市販品を用いることができる。
【００９７】
一方、負荷電リポソームは、例えば、３−ｓｎ−ホスファチジルコリン、３−ｓｎ−ホスファチジルセリン、３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン、３−ｓｎ−ホスファチダルエタノールアミン、または、これらの誘導体のようなリン脂質を主としてなるものである。
【００９８】
また、これらのリポソームには、例えばコレステロール等の脂質膜を安定化する添加剤を添加するようにしてもよい。
【００９９】
なお、リポソームとしては、特に、正荷電リポソームを用いるのが好ましい。正荷電リポソームは、その内部に組換えプラスミドを封入する操作を必要としないことから、骨形成治療デバイスの作製時間の短縮に有利である。
【０１００】
用いるベクターの量は、その種類等により適宜設定され、特に限定されないが、ベクターと組換えプラスミド（核酸）との配合比が、重量比で１：１〜２０：１程度であるのが好ましく、２：１〜１０：１程度であるのがより好ましい。用いるベクターの量が少な過ぎると、ベクターの種類等によっては、組換えプラスミドの骨形成に関与する細胞への取り込みの効率を十分に大きくすることができない場合がある。一方、用いるベクターの量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりでなく、細胞毒性が生じる場合がある。また、コストの増大を招き好ましくない。
【０１０１】
血管形成誘導因子は、血管形成に関与する細胞（例えば、血管皮内細胞等）に作用して、新生血管の形成を促進するものである。この血管形成誘導因子を用いることにより、骨芽細胞の周囲に新生血管が形成される。これにより、細胞の構築（形成）に必要な各種基質が骨芽細胞に供給されるので、骨芽細胞は、効率よく増殖することができる。その結果、骨形成をより促進することができる。
【０１０２】
本発明における血管形成誘導因子としては、血管形成を促進し得るものであれはよく、特に限定されないが、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic Fibroblast Growth Factor：ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor：ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor：ＨＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor：ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor：Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Macrophage-Colony Stimulating Factor：Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（Stem Cell Factor：ＳＣＦ）、アンジオポエチン−１（Angiopoietin-1）、アンジオポエチン−２（Angiopoietin-2）、リポヌクレアーゼ類似タンパク質、ニコチンアミド、プロスタグランジンＥ（プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＥ３）、プロリン誘導体、ディブチルサイクリックＡＭＰ（ｄＢｃＡＭＰ）のようなサイクリックＡＭＰ誘導体等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの中でも、血管形成誘導因子としては、特に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のうちの少なくとも１種であるのが好ましい。これらのものは、血管形成能に優れるため、得られる骨形成治療デバイスは、特に、高い骨形成能を有するものとなる。
【０１０３】
用いる血管形成誘導因子の量は、その種類等により適宜設定され、特に限定されないが、血管形成誘導因子と組換えプラスミド（核酸）との配合比が、重量比で１０：１〜１：１００程度であるのが好ましく、１：１〜１：１００程度であるのがより好ましい。用いる血管形成誘導因子の量が少な過ぎると、血管形成誘導因子の種類等によっては、新生血管が効率よく形成されず、骨芽細胞が十分に増殖できない場合がある。一方、用いる血管形成誘導因子の量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１０４】
以上、本発明の骨形成治療デバイスの好適な実施形態について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１０５】
前記実施形態では、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列を含む核酸として、ＢＭＰ  ｃＤＮＡを発現プラスミドに組み込んだ組換えプラスミドを代表に説明したが、本発明におけるＢＭＰをコードする塩基配列を含む核酸としては、例えば、ＢＭＰ  ｃＤＮＡ（発現プラスミドに組み込まないもの）、ＢＭＰのｍＲＮＡ、あるいは、これらに任意の塩基を付加したもの等であってもよい。
【０１０６】
また、骨誘導因子として、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする塩基配列を含む核酸を代表に説明したが、本発明における骨誘導因子としては、前述したようなＢＭＰ自体等が挙げられる。
【０１０７】
【実施例】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【０１０８】
（実施例１）
１．組換えプラスミドの調製
公知の方法により、ヒトＢＭＰ−２  ｃＤＮＡ（ヒトＢＭＰ−２をコードする塩基配列）と、所望の塩基配列とを、発現プラスミドに組み込んで、図１に示すような組換えプラスミドを得た。
そして、この組換えプラスミドを、次のようにして増殖させた。
【０１０９】
まず、室温で、組換えプラスミドを、ＤＨ５α（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）の懸濁液２００μＬに添加した。
次に、この混合液をＬＢ寒天培地に添加して、３７℃×１２時間、培養した。
【０１１０】
次に、この培養終了後、ＬＢ寒天培地に増殖したコロニーの中から比較的大きいコロニーを選択し、これをＡｍｐ（アンピシリン）を含むＬＢ寒天培地に移植し、さらに３７℃×１２時間、培養した。
【０１１１】
その後、Ａｍｐを含むＬＢ寒天培地で増殖したＤＨ５αの細胞膜を破壊し、その溶液から、組換えプラスミドを精製分離した。
【０１１２】
２．ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体（基体）の製造
公知の湿式合成法によりハイドロキシアパタイトを合成し、ハイドロキシアパタイトスラリーを得た。
【０１１３】
このハイドロキシアパタイトスラリーを噴霧乾燥して平均粒径１５μｍ程度の粉体を得た。その後、この粉体を７００℃×２時間、仮焼成した後、汎用粉砕装置を使用し、平均粒径１２μｍ程度に粉砕した。粉砕したハイドロキシアパタイト粉体を、１％メチルセルロース（水溶性高分子）水溶液に混合した後、攪拌して、気泡を含有するペースト状混合物を得た。なお、ハイドロキシアパタイト粉体とメチルセルロース水溶液とは、重量比５：６で混合した。
【０１１４】
このペースト状混練物を型に入れて、水溶性高分子をゲル化させるため８０℃で乾燥し、成形体を製造した。成形体を汎用旋盤等の加工機械を使用し直径１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ（体積：約０．２４ｍＬ）の円盤状に加工した。
【０１１５】
この円盤状成形体を１２００℃、大気中で２時間焼成し、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体を得た。
【０１１６】
なお、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体は、空孔率７０％であった。この測定は、アルキメデス法により行った。また、前記Ｂ／Ａは、約１００であった。
【０１１７】
３．骨形成治療デバイスの作製
組換えプラスミドを含有するリン酸緩衝液と、血管形成誘導因子である塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有するリン酸緩衝液と、ベクターである正荷電リポソーム（ＱＩＡＧＥＮ社製、「ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ」)を含有するリン酸緩衝液とを用意し、組換えプラスミドが１０μｇ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）１μｇ、正荷電リポソームが４０μｇとなるように、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体に含浸させた。
これにより、骨形成治療デバイスを得た。
【０１１８】
（実施例２）
前記実施例１と同様のハイドロキシアパタイト粉体と、非イオン性界面活性剤であるＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンオキサイド（ライオン（株）製、「ＡＲＯＭＯＸ」）とを、１％メチルセルロース（水溶性高分子）水溶液に混合した後、前記実施例１より激しく攪拌して、気泡を含有するペースト状混合物を得た。なお、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンオキサイドは、ペースト状混合物中に、２ｗｔ％となるよう添加した。
【０１１９】
かかるペースト状混合物を用いて、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体（基体）を製造した以外は、前記実施例１と同様にして、骨形成治療デバイスを作製した。
【０１２０】
なお、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体（基体）は、Ｂ／Ａが約３、かつ、空孔率が８５％であった。
【０１２１】
＜評価＞
１．評価実験
１２羽の家兎（平均体重３．０ｋｇ）を用意した。各家兎には、それぞれ、次のような手術を施した。
【０１２２】
まず、家兎に対して、２５ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（アボットラボラトリー社製、「ネンブタ−ル」）を静脈内投与することにより麻酔した。
【０１２３】
次に、家兎の頭皮に切開を入れ、尾側を茎とする幅２．５ｃｍ×長さ３．０ｃｍの皮弁として挙上した。
【０１２４】
次に、露出した骨膜に２〜３ｍｍの切開を入れ、かかる部分に骨膜剥離子を当てて、直径約３ｍｍの部分を剥離して頭蓋骨を露出させた。
【０１２５】
次に、露出した頭蓋骨の正中付近を、頭蓋骨穿頭器を用いて開頭し、硬膜は温存するように、その直上まで頭蓋骨を除去した後、完全に止血した。なお、頭蓋骨の厚さは約３ｍｍであり、開頭部分の直径は約１．２ｃｍとした。
【０１２６】
次に、開頭を行った家兎を６羽ずつの計２群に分け、第１群の各家兎には、それぞれ、実施例１の骨形成治療デバイスを、第２群の各家兎には、それぞれ、実施例２の骨形成治療デバイスを移植した後、皮弁を元の位置へ戻して縫合した。
【０１２７】
そして、手術が行われた各家兎を、それぞれ、個別のケージに入れて飼育した。
【０１２８】
２．評価結果
手術後９週目に全ての家兎を、前記同様の麻酔薬を過量投与することにより屠殺した。
【０１２９】
その後、頭蓋骨を直上の皮膚とともに一塊として切除し、採取した組織を直ちに１０％中性緩衝ホルマリン液に浸して固定した後、ポリエステル樹脂に埋入した。次に、このポリエステル樹脂に埋入した組織を、厚さ５０μｍとなるように薄切研磨した後、ｃｏｌｅ−ＨＥ染色を行った。これにより、組織標本を得た。
【０１３０】
得られた各組織標本について、それぞれ、次のようにして骨形成率を測定した。すなわち、各組織標本を、それぞれ、デジタルカメラ（ＤＰ−１２）付き実体顕微鏡システムＳＺＸ−１２（オリンパス社製）で撮影した。
【０１３１】
その結果、第１群の６羽において、それぞれ、同様の骨形成のパターンが認められ、また、第２群の６羽において、それぞれ、同様の骨形成のパターンが認められた。
【０１３２】
図５に、第１群の組織標本の観察像（画像）の一例を、また、図６に、第２群の組織標本の観察像（画像）の一例を示す。
【０１３３】
これらの図に示すように、第１群、すなわち、実施例１の骨形成治療デバイスを移植した家兎では、骨形成が、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体の内部だけでなく、その鉛直下方の外表面付近においても進行する傾向を示し、一方、第２群、すなわち、実施例２の骨形成治療デバイスを移植した家兎では、骨形成が、骨形成治療デバイスの内部で優先的に進行する傾向を示した。
【０１３４】
このように、Ｂ／Ａを適宜設定することにより、骨形成のパターンを制御し得ることが明らかとなった。
【０１３５】
また、基体として、ハイドロキシアパタイト多孔質焼結体に代わり、リン酸三カルシウム多孔質焼結体を用いて骨形成治療デバイスを作製して、前記と同様の評価実験を行った結果、前記とほぼ同様の評価結果が得られた。
【０１３６】
また、骨誘導因子として、各種ヒトＢＭＰ、各種ヒトＢＭＰをコードする塩基配列を含む核酸、プロスタグランジン等の薬剤、あるいは、これらを任意に組み合わせて骨形成治療デバイスを作製して、前記と同様の評価実験を行った結果、前記実施例とほぼ同様の評価結果が得られた。
【０１３７】
また、血管形成誘導因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に代わり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、あるいは、これらを任意に組み合わせて骨形成治療デバイスを作製して、前記と同様の評価実験を行った結果、前記実施例とほぼ同様の評価結果が得られた。
【０１３８】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、骨形成のパターンを制御（コントロール）することができる。
【０１３９】
このため、目的に応じて、骨形成のパターンを制御することにより、それぞれに適した骨形成治療、すなわち、早期の骨形成治療が可能となる。
【０１４０】
また、本発明によれば、各種骨形成治療に際し、遊離骨移植を行う必要がなくなり、採骨部が不要となることから、より安全かつ確実で、合理的な手術が可能となる。
【０１４１】
このようなことから、手術時間や入院期間の短縮を図ることができ、トータルの医療コストの削減、治療クオリティーの向上、患者のＱＯＬの向上を図ることができる。
【０１４２】
また、血管形成誘導因子を併用することにより、骨芽細胞の周囲に新生血管が活発に形成され、骨芽細胞が効率よく増殖して、その結果、より迅速な骨形成がなされる。
【０１４３】
また、核酸を保持するベクターを併用することにより、未分化間葉系細胞、炎症細胞、線維芽細胞のような骨形成に関与する細胞内への核酸の取り込みの効率が向上して、結果として、より迅速な骨形成がなされる。
【０１４４】
また、基体のＢ／Ａの値をコントロールすることにより、例えば、各種骨誘導因子、各種ベクター、各種血管形成誘導因子等を、目的に応じて、基体の最適な箇所に、かつ、最適な量を担持（保持）させることができる。このような点からも、本発明の骨形成治療デバイスは、目的に適した骨形成治療、すなわち、早期の骨形成治療が可能となる。
【０１４５】
また、本発明の骨形成治療デバイスは、保存、取扱いや手術時の加工等が容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えプラスミドの一例を示す遺伝子地図である。
【図２】本発明における基体の縦断面を示す模式図である。
【図３】骨形成パターンの一例を示す模式図である。
【図４】骨形成パターンの一例を示す模式図である。
【図５】第１群の組織標本の観察像の一例を示す画像である。
【図６】第２群の組織標本の観察像の一例を示す画像である。
【符号の説明】
１            基体
１ａ          空孔
１ｂ          外表面
２            新生骨
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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