(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ９エロンガーゼ活性を有し、配列番号１３または配列番号１４と、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする非天然ポリヌクレオチドを含む、形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の微生物宿主細胞。
【請求項３】
非天然ポリヌクレオチドが、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６を含む、請求項２に記載の微生物宿主細胞。
【請求項４】
酵母、藻類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物宿主細胞。
【請求項５】
細胞が酵母である、請求項４に記載の微生物宿主細胞。
【請求項６】
酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される油性酵母である、請求項５に記載の微生物宿主細胞。
【請求項７】
油性酵母がヤロウィア・リポリティカである、請求項６に記載の微生物宿主細胞。
【請求項８】
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物宿主細胞であって、且つ、さらにリノール酸源を含む微生物宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現して、リノール酸をエイコサジエン酸に変換する条件下でステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
を含む、エイコサジエン酸を生産する方法。
【請求項９】
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物宿主細胞であって、且つ、さらにα−リノレン酸源を含む微生物宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現して、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換する条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、を含む、エイコサトリエン酸を生産する方法。
【請求項１０】
（ｉ）微生物宿主細胞が、ヤロウィア種であり、（ii）ポリペプチドが配列番号２７を含み、そして、（iii）ポリヌクレオチドが、ヤロウィア中での発現のために最適化された少なくとも９８個のコドンを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するΔ９エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列のうちの少なくとも９８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２００７年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／９１１，９２５号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、Δ９脂肪酸エロンガーゼをコードするポリヌクレオチド配列の同定、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造におけるこれらのエロンガーゼの使用に関する。
【０００３】
今日、商業的ＰＵＦＡ生産の手段として、植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が調査されている。遺伝子操作では、いくつかの宿主の天然の能力（天然ではリノール酸（ＬＡ；１８：２  ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ；１８：３  ω−３）脂肪酸生成に限定されるものでさえ）を実質的に改変して、様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡの高レベル生成をもたらすことができると実証されている。これが天然の能力であるかまたは組み換え技術の結果であるかに関わらず、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４  ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５  ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６  ω−３）の生成はΔ９エロンガーゼの発現を必要とするかもしれない。
【０００４】
これまでに同定されたほとんどのΔ９エロンガーゼ酵素は、ＬＡをエイコサジエン酸（ＥＤＡ；２０：２  ω−６）に、ＡＬＡをエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ；２０：３  ω−３）に変換する双方の能力を有する（Δ８デサチュラーゼとの反応に続いて、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ；２０：３  ω−６）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４  ω−３）がＥＤＡおよびＥＴｒＡからそれぞれ引き続いて合成され、Δ５デサチュラーゼとの反応に続いて、ＡＲＡおよびＥＰＡがＤＧＬＡおよびＥＴＡからそれぞれ引き続いて合成され、ＤＨＡ合成は追加的Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの引き続く発現を必要とする）。
【０００５】
ＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡを生成する新しい方法に対する必要性にもかかわらず、わずかなΔ９エロンガーゼ酵素のみが同定されている。イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）からのΔ９エロンガーゼは公的に入手可能である（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＬ３７６２６、ならびに特許文献１、２、３、および４で述べられている）。特許文献５および６（出願人らの譲受人の同時係属出願）は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのΔ９エロンガーゼ、ならびにΔ９エロンガーゼモチーフを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／０７７２１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０８３０９３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０１２３１６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがってω−３／ω−６脂肪酸の生成で使用するための多様な宿主生物中での異種性発現に適したΔ９エロンガーゼをコードする追加的遺伝子を同定および単離する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
出願人らは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）からΔ９脂肪酸エロンガーゼをコードする遺伝子を単離することで既述の問題を解決した。
【０００９】
本発明は、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子コンストラクト、およびＰＵＦＡを生成するための、藻類、細菌、酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイル、および真菌におけるそれらの使用に関する。したがって本発明は、
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有して、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなり、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞を提供する。
【００１０】
他の実施態様では本発明は、
ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）リノール酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、リノール酸がエイコサジエン酸に変換される条件下でステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサジエン酸を生成する方法を提供する。
【００１１】
追加的な実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）α−リノレン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、α−リノレン酸がエイコサトリエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサトリエン酸を生成する方法を提供する。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼをコードして、少なくとも９８個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中での発現についてコドン最適化されている、単離された核酸分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】様々な中間体を通じてミリスチン酸のＤＨＡへの変換をもたらす、代表的なω−３およびω−６脂肪酸生合成経路である。
【図２】実施例で述べられるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）細胞抽出物の脂質プロフィールのクロマトグラムを示す。
【図３】（Ａ）ｐＹ１１５（配列番号１９）、（Ｂ）ｐＹ１５９（配列番号２３）、（Ｃ）ｐＹ１７３（配列番号２４）および（Ｄ）ｐＹ１７４（配列番号２５）のプラスミドマップを提供する。
【図４Ａ】ＥａＤ９Ｅｌｏ（配列番号１１）とＥａＤ９ＥＳ（配列番号２６）のヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４Ｂ】ＥａＤ９Ｅｌｏ（配列番号１１）とＥａＤ９ＥＳ（配列番号２６）のヌクレオチド配列の比較を示す。
【図５】（Ａ）ｐＥａＤ９ＥＳ（配列番号２８）および（Ｂ）ｐＺＵＦｍＥａＤ９ｅＳ（配列番号２９）のプラスミドマップを提供する。
【００１４】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００１５】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１６】
配列番号１〜４、９〜１９、および２２〜２９は、表１のように同定されるＯＲＦをコードする遺伝子またはタンパク質（またはその部分）、またはプラスミドである。
【００１７】
【表１】
0005501954.tif 000002
【００１８】
配列番号５および６は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼの増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドｏＥｕｇＥＬ１−１およびｏＥｕｇＥＬ１−２にそれぞれ対応する。
【００１９】
配列番号７および８は、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＤＮＡ挿入断片の末端配列決定のために使用されるＭ１３ＦユニバーサルプライマーおよびプライマーＭ１３−２８Ｒｅｖにそれぞれ対応する。
【００２０】
配列番号２０および２１は、プラスミドｐＹ１１５からのＦＢＡＩＮｍプロモーターを増幅するのに使用されるプライマーｏＹＦＢＡ１およびｏＹＦＢＡ１−６にそれぞれ対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
健康に良いＰＵＦＡの生成のため生化学的経路を操作するために使用してもよい、新しいユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ酵素および同酵素をコードする遺伝子が、ここで開示される。
【００２２】
ＰＵＦＡまたはその誘導体は、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防または治療するために、食餌代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として使用される。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、純化されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品中に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、製薬用途（ヒトまたは獣医）のために使用してもよい。
【００２３】
定義
本開示の文脈で、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００２４】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００２６】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
【００２７】
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
【００２８】
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
【００２９】
「発明」または「本発明」という用語は、ここでの用法では本発明の特定の実施態様のどれか１つへの限定を意図せず、特許請求の範囲および明細書で述べられるように、一般に本発明のあらゆる全ての実施態様に当てはまる。
【００３０】
ここでのおよび添付の特許請求の範囲の用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り複数の言及を含む。したがって例えば「植物（ａ  ｐｌａｎｔ）」への言及は複数のこのような植物を含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は１つ以上の細胞および当業者に知られているその同等物等を含む。
【００３１】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）」対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の違いについて、さらに詳しくは米国特許第７，２３８，４８２号明細書で規定される。
【００３２】
脂肪酸は単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」によってここで記述され、Ｘは特定の脂肪酸の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。脂肪酸名に続く番号は、脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示し、接辞「ｃ」は二重結合のｃｉｓ配置を示す（例えばパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１、９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１、６ｃ）、ＬＡ（１８：２、９ｃ，１２ｃ）、ＧＬＡ（１８：３、６ｃ，９ｃ，１２ｃ）、およびＡＬＡ（１８：３、９ｃ，１２ｃ，１５ｃ））。特に断りのない限り、１８：１、１８：２、および１８：３は、オレイン酸、ＬＡ、およびＡＬＡ脂肪酸をそれぞれ指す。特に断りのない限り、二重結合はｃｉｓ配置にあると見なされる。例えば１８：２（９，１２）中の二重結合はｃｉｓ配置にあると見なされる。
【００３３】
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体で使用される残りの略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００３４】
【表２】
0005501954.tif 000003
【００３５】
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞中でのＴＡＧ合成を指す。
【００３６】
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本明細書全体で同義的に使用される。
【００３７】
代謝経路または生合成経路は、生化学的意味において、細胞内で起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または別の代謝経路の開始（流束発生ステップと称される）のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
【００３８】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸と、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸とに変換する代謝過程を指す。この過程は、文献で詳しく述べられる（例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べると、この過程は、小胞体膜中に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）による、炭素原子の添加を通じた炭素鎖延長、および二重結合付加を通じた分子不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼをはじめとする、ＰＵＦＡ生合成と関連付けられている酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。
【００３９】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸を発生させる。
【００４０】
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸産物はこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、全てのＰＵＦＡ生合成経路酵素遺伝子が要求されることを暗示しないものと理解される。
【００４１】
「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」という用語は、少なくとも１つのΔ６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ１８／２０エロンガーゼ（Δ６エロンガーゼとも称される）を最低限含み、それによってＧＬＡおよび／またはＳＴＡを中間体脂肪酸として、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡを生合成できるようにするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現があれば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
【００４２】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、少なくとも１つのΔ９エロンガーゼおよび少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを最低限含み、それによってＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを中間体脂肪酸として、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡを生合成できるようにするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現があれば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
【００４３】
「中間体脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路においてその他の代謝経路酵素の作用によって、意図される生成物脂肪酸にさらに変換できる、この経路内で生成されるあらゆる脂肪酸を指す。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用してＥＰＡが生成される場合、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、およびＡＲＡが生成され、これらの脂肪酸は、その他の代謝経路酵素の作用を通じてＥＰＡにさらに変換できるので、「中間体脂肪酸」と見なすことができる。
【００４４】
「副産物脂肪酸」という用語は、経路の意図される脂肪酸生成物でなく、また経路の「中間体脂肪酸」でもない、脂肪酸代謝経路内で生成されるあらゆる脂肪酸を指す。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用してＥＰＡが生成される場合、それぞれＥＤＡまたはＥＴｒＡのどちらかに対するΔ５デサチュラーゼの作用によって、シアドン酸（ＳＣＩ）およびジュニペロン酸（ＪＵＰ）もまた生成され得る。それらはどちらもその他の代謝経路酵素の作用によってＥＰＡにさらに変換されないので、「副産物脂肪酸」と見なされる。
【００４５】
「デサチュラーゼ」という用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。対象のデサチュラーゼは、例えば（１）ＥＤＡからＤＧＬＡへの、および／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒できる、分子のカルボキシル末端から数えて８番目と９番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化するΔ８デサチュラーゼ、（２）ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、（３）ＬＡからＧＬＡおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、（４）ＤＰＡからＤＨＡおよび／またはＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、（５）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、（６）ＬＡからＡＬＡおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、（７）ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、および（８）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換するそれらの能力（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡへ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）に基づいて、時に「オメガ３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」および／または「ω−３デサチュラーゼ」とも称される。いくつかの実施態様では、脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子によって適切な宿主を形質転換し、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することで、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましいかもしれない。
【００４６】
ここでの目的のために、第１の縮合反応（すなわちマロニル−ＣｏＡおよび長鎖アシル−ＣｏＡからβ−ケトアシル−ＣｏＡへの変換）を触媒する酵素を「エロンガーゼ」と総称する。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくらか広いが、鎖長および不飽和度の双方によって差別される。したがってエロンガーゼは異なる特異性を有することができる。例えばＣ１４／１６エロンガーゼはＣ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼ（同義的に使用できる用語としてΔ６エロンガーゼとしてもまた知られている）はＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。同様にして、ここで特に興味深いことには、「Δ９エロンガーゼ」はＬＡからＥＤＡおよび／またはＡＬＡからＥＴｒＡへの変換を触媒する。いくつかのエロンガーゼが広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれないことに留意することは重要である。したがって例えばΔ９エロンガーゼはまた、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼとして機能するかもしれず、好ましくはないが、ＥＰＡおよび／またはＧＬＡなどのΔ５およびΔ６脂肪酸に対する代案の各特異性を有するかもしれない。好ましい実施態様では、適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼ遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することで、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。エロンガーゼ系は一般に、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い脂肪酸を生成する脂肪酸炭素鎖の延長の役割を担う４つの酵素を含んでなる。より具体的には延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸シンターゼとの関連で起きる（Ｌａｓｓｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：２８１〜２９２（１９９６年））。基質特異的であり律速でもあることが分かっている第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、二酸化炭素（ＣＯ２）および（アシル部分が炭素原子２個分延長された）β−ケトアシル−ＣｏＡを生じる。引き続く反応は、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および延長されたアシル−ＣｏＡが生じる第２の還元を含む。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、ＬＡからＥＤＡへ、ＡＬＡからＥＴｒＡへ、ＡＲＡからＤＴＡへ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
【００４７】
ここでの目的では、「ＥａＤ９Ｅｌｏ１」という用語は、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）から単離され、ここで配列番号１１によってコードされるΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号１３）を指す。「ＥａＤ９Ｅｌｏ２」という用語は、Ｅ．アナベナ（ａｎａｂａｅｎａ）から単離され、ここで配列番号１２によってコードされるΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号１４）を指す。同様に、「ＥａＤ９ｅＳ」という用語は、Ｅ．アナベナ（ａｎａｂａｅｎａ）に由来して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼを指す（すなわち配列番号２６および２７）。
【００４８】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、特定の酵素（例えばエロンガーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は、次の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００、式中「生成物」は、即時生成物およびそれに由来する経路中の全ての生成物を含む。
【００４９】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。油性微生物内では、細胞性油またはＴＡＧ含量は一般にＳ字形曲線に従って、脂質濃度は対数後期または静止増殖期初期でそれが最大に達するまで増大し、次に静止後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９〜２５（１９９１年））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％超を油として蓄積することは珍しくない。
【００５０】
「油性酵母」という用語は、油を作る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これにどのようにも限定されるものではない。
【００５１】
「ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）」という用語は、淡水、海洋、土壌、および寄生性環境に生息する一群の単細胞無色のまたは光合成鞭毛虫（「ユーグレナ属」）を指す。本綱は単生の単細胞によって特徴づけられ、ほとんどは自由遊泳性であり、レザバーとして知られる前部陥入から生える２本の鞭毛を有する（その１つは非出現性であってもよい）。光合成ユーグレナ属は１個から多数の葉緑体を含有し、それは微小円盤から幅広いプレートまたはリボン状と多様である。無色のユーグレナ属は、栄養素同化作用のために浸透栄養または摂食栄養に依存する。約１０００種について記載されており、約４０の属と６つの目に分類される。ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）の例としては、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）、およびテトルエトレプチア（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
ここでの用法では、「核酸」はポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および修飾ヌクレオチドを含んでもよい。したがって「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」という用語は同義的に使用され、一本鎖または二本鎖であり、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸塩形態で見られる）は、次のようなそれらの一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡについて）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」はあらゆるヌクレオチド。
【００５３】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿って、特定位置で保存されたアミノ酸のセットを意味する。その他の位置のアミノ酸は相同的なタンパク質の間で変動できるが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存の程度によって識別されるので、それらを識別子または「シグネチャー」として使用して、新たに判定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定できる。国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレットおよび国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレットは、Δ９エロンガーゼと関連付けられている特徴的なモチーフについて述べている。
【００５４】
「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」、および「実質的に一致」という用語はここで同義的に使用される。それらは１つ以上のヌクレオチド塩基における変化が、核酸断片が遺伝子発現を仲介し、または特定の表現型を生じる能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の変更も指す。したがって当業者によって理解されるように、本発明は具体的な例示的配列を超えるものを包含する。
【００５５】
さらに当業者は、本発明に包含される実質的に類似した核酸配列が、ここで例示する配列と、またはここで開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等であるここで開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分と、（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの中程度にストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするそれらの能力によってもまた定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件を調節して、遠縁の生物からの相同配列などの中程度に類似した断片や、近縁関係にある生物からの機能的酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片をスクリーンできる。ハイブリダイゼーション後洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
【００５６】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、その非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出できる程度により大きい（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における核酸配列の規定の核酸標的配列へのハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的な排除への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、互いに典型的に少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、および１００％までの配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
【００５７】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を調製することで、プローブと１００％相補的な標的配列を同定できる（相同的プロービング）。代案としては、ストリンジェンシー条件を調節して、より低い程度の類似性が検出されるように配列中のいくらかのミスマッチを可能にできる（異種性プロービング）。一般にプローブは、長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により長さは５００ヌクレオチド未満である。
【００５８】
典型的にストリンジェントな条件は、その中でｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）のものであり、温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃における３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液溶液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、３７℃における４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣによる洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣによる洗浄が挙げられる。
【００５９】
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７〜２８４（１９８４年）の式、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッド長である）から近似することができる。Ｔｍは（規定のイオン強度およびｐＨ下で）５０％の相補的標的配列が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍはそれぞれ１％のミスマッチ毎に約１℃低下する。したがってＴｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節して、所望の同一性の配列にハイブリダイズすることができる。例えば≧９０％同一性の配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列とその相補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし厳しくストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、低いストリンジェンシー条件は熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションについて、本質的に述べられていることを理解するであろう。所望のミスマッチ度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらすようであれば、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションの詳しいガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１���０または２４０分間適用できる。
【００６０】
核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」とは、規定の比較ウィンドウ上の最大一致について整列させると同一である、２つの配列内の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【００６１】
したがって「配列同一性」百分率とは、比較ウィンドウ上で２つの最適に整合した配列を比較して判定された値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を判定して整合位置数を求め、比較ウィンドウ内の整合位置数を位置総数で除して、配列同一性百分率を得るために結果に１００を乗じて計算される。配列同一性百分率の有用な例は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、または５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの同一性は、ここで述べられるプログラムのいずれかを使用して判定できる。
【００６２】
配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定されてもよい。本明細書の文脈では、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」を基準にするものと理解される。ここでの用法では「デフォルト値」とは、最初に初期化した際に、ソフトウェアと共に当初ロードされるあらゆる値またはパラメーターのセットを意味する。
【００６３】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されるアラインメント法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年））で述べられている）に対応し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラム（前出）にある。多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性の計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターはＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列アラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることができる。
【００６４】
「アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法」は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供される、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較するためのアルゴリズムである。
【００６５】
当業者は、同一または類似機能または活性を有するその他の種からのポリペプチドを同定するのに、多くのレベルの配列同一性が有用であることを良く理解するであろう。有用な％同一性の例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。実際、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など、５０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が、本発明について述べるのに有用かもしれない。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的相補体も興味深い。
【００６６】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。したがって本発明は、配列番号１３および配列番号１４に記載の本ユーグレナ属ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全て、またはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６７】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００６８】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、宿主生物中に常態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００６９】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほぼすべての発育段階で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界、特に５’末端は完全に画定されていないので、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００７１】
プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流要素からなってもよく、後者の要素はエンハンサーおよび／またはサイレンサーと称されることが多い。したがって「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有要素であっても、またはプロモーターのレベルまたは段階特異的活性を増強するために挿入された異種要素であってもよい。「サイレンサー」はプロモーター活性を抑制できるＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得要素であっても、またはプロモーターのレベルまたは段階特異的活性を抑制するために挿入された異種の要素であってもよい。
【００７２】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子の転写開始部位とコード配列との間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全に加工されたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写物のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を与えるかもしれない。翻訳リーダー配列の例については述べられている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：２２５〜２３６（１９９５年））。
【００７３】
「３’非翻訳配列」、「終結配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列、およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００７４】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。「ＲＮＡ転写物」がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物が一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列である場合、それは成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく細胞がタンパク質に翻訳できるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であり、逆転写酵素を使用してそれから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができ、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して二本鎖形態に変換できる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み細胞内または生体外でタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列との相補性であってもよい。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないかもしれないがなおも細胞プロセスに影響を与える、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。「相補体」および「逆相補体」という用語は、ここでｍＲＮＡ転写物に関して同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図される。
【００７５】
「作動的に結合した」という用語は、１つの機能が他方の機能による影響を受けるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動的に結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
【００７６】
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、２つのさもなければ別々の配列セグメントの人為的組み合わせを指す。
【００７７】
「発現」という用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのタンパク質（前駆または成熟のいずれか）への翻訳も指す。
【００７８】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレまたはプロペプチドが依然として存在するものを指す。プレまたはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよい（が、これに限定されるものではない）。
【００７９】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合または組み換えされて、細胞に発現カセットを導入できるユニークな構造になる。
【００８０】
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列とを含んでなるＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に（１）プロモーター配列、（２）コード配列（すなわちＯＲＦ）、および（３）真核生物では通常はポリアデニル化部位を含有する３’非翻訳領域（すなわちターミネーター）から構成される。発現カセットは通常はベクターに含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用さえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。
【００８１】
「組み換えＤＮＡコンストラクト」（ここで同義的に「発現コンストラクト」および「コンストラクト」とも称される）は、例えば自然界に一緒には見られない制御およびコード配列などの核酸断片の人為的組み合わせを含んでなる。例えば組み換えＤＮＡコンストラクトは、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来するが自然界見られるのとは異なる様式で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。このようなコンストラクトは単独で使用してもよく、またはベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者に良く知られているように、ベクターの選択は宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えばプラスミドベクターが使用できる。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換、選択、および増殖するために、ベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を十分承知している。当業者は、異なる独立した形質転換事象が、異なる発現レベルおよびパターンをもたらすであろうこと（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯＪ．，４：２４１１〜２４１８（１９８５年）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８〜８６（１９８９年））、したがって所望の発現レベルとパターンを示す系統を得るためには、複数の事象をスクリーンしなくてはならないこともまた認識するであろう。このようなスクリーニングは、特にＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロット分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
【００８２】
「導入される」という用語は、細胞に核酸（例えば発現カセット）またはタンパク質を提供することを意味する。導入されるとは、真核または原核細胞への核酸の組み込みへの言及を含み、核酸は細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、細胞への核酸またはタンパク質の一時的提供への言及を含む。導入されるとは、安定したまたは一時的形質転換法、ならびに有性交雑への言及を含む。したがって細胞中への核酸断片（例えば組み換えＤＮＡコンストラクトまたは発現カセット）挿入の文脈において「導入される」とは、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核または原核細胞中への核酸断片の組み込みへの言及を含み、核酸断片は、細胞（例えば染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）のゲノム中に組み込まれても、自律性レプリコンに変換されても、または一時的に発現されてもよい（例えば形質移入ｍＲＮＡ）。
【００８３】
ここでの用法では、「遺伝子導入」とは、そのゲノム中に異種のポリヌクレオチドを含んでなる細胞を指す。好ましくは異種のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが次に続く世代に受け継がれるようにゲノム中に安定して組み込まれる。異種のポリヌクレオチドを単独でまたは発現カセットの一部として、ゲノム中に組み込んでもよい。遺伝子導入は、最初からそのように改変された遺伝子導入、ならびに異種の交配型と交配して最初の遺伝子導入から作り出されたものをはじめとする、その遺伝子型が異種の核酸の存在によって改変されているあらゆる細胞または細胞系を含めてここで使用される。「遺伝子導入」という用語は、ここでの用法では、ランダム他家受精、非組み換えウィルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え遺伝子転位、または自然突然変異などの天然事象によるゲノム（染色体または染色体外）の改変を包含しない。
【００８４】
ここで使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術については、当該技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）でより詳しく述べられている。形質転換法については当業者に良く知られており、下のＡｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ：  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎｄ  Ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓで述べられている。
【００８５】
一般に油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応じて始動する。油性微生物中での遊離パルミチン酸（１６：０）の新規合成につながるこの過程は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で詳細に述べられている。パルミチン酸は、エロンガーゼとデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より鎖長の長い飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
【００８６】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
【００８７】
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下で述べられるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
【００８８】
具体的には全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによる、オレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡへの最初の変換を必要とする。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。（１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってＥＤＡに変換され、（２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってＤＧＬＡに変換され、（３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってＡＲＡに変換され、（４）ＡＲＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってＤＴＡに変換され、（５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってＤＰＡｎ−６に変換される。代案としては「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、基質としてＡＬＡを使用して、次のように長鎖ω−３脂肪酸を生成できる。（１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換され、（２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってＥＴｒＡに変換され、（３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってＥＴＡに変換され、（４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってＥＰＡに変換され、（５）ＥＰＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってＤＰＡに変換され、（６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってＤＨＡに変換される。場合によりω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよく、例えばＡＬＡがΔ１５デサチュラーゼ活性によってＬＡから生成され、ＥＴＡおよびＥＰＡがΔ１７デサチュラーゼ活性によってＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生成される。
【００８９】
ω−３／ω−６脂肪酸を生合成するための代案の経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼ（すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」）を利用する。より具体的にはＬＡおよびＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡに変換されてもよく、次にＣ１８／２０エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。下流ＰＵＦＡは、引き続いて上述のように形成される。
【００９０】
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物中に導入することが必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。前者の経路によって生成されるＰＵＦＡはＧＬＡおよび／またはＳＴＡを欠くので、例えば実施態様によっては、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現とは対照的に、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現が好ましいかもしれない。
【００９１】
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、４．）ポリペプチドが必要とする補助因子、および／または、５．）ポリペプチドが、その生成後に修飾されたかどうか（例えば、キナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼによって）。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する（さらなる詳細は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。
【００９２】
さらなる実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。さらに具体的には、各酵素は、基質を生成物に変換するのに１００％効率では滅多に機能しないので、宿主細胞中で生成される非精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に、所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物になるであろう。したがって所望の脂肪酸の生合成を最適化するにあたって、各酵素の変換効率もまた考慮すべき変数である。
【００９３】
上の各考察を念頭に置いて、公的に入手可能な文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は生物のＰＵＦＡ合成を可能にし、または増強するために、特定の宿主生物に導入するのに適するであろう。
【００９４】
新しいΔ９エロンガーゼの配列同定
本発明では、下の表３で要約するようにΔ９エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列が、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）から単離されている。
【００９５】
【表３】
0005501954.tif 000004
【００９６】
したがって本発明は、
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有して、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなり、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００９７】
なおも別の態様では、本発明は、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法に基づいて少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００９８】
少なくとも約８０％〜９０％同一のより好ましいアミノ酸断片が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいΔ９エロンガーゼは、活性タンパク質をコードして少なくとも約８０％〜９０％同一のものであり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。
【００９９】
代案の実施態様では、本ＥａＤ９Ｅｌｏ１および／またはＥａＤ９Ｅｌｏ２の配列を特定の宿主生物中での発現のためにコドン最適化できる。当該技術分野でよく知られているように、宿主が好むコドンの使用はポリペプチドをコードする外来遺伝子発現を実質的に増強できるので、これは代案の宿主中での酵素発現をさらに最適化するのに有用な手段である。一般に宿主が好むコドンは、対象とする特定の宿主種中で、タンパク質（好ましくは最大量で発現するもの）中のコドン使用頻度を調べ、どのコドンが最高頻度で使用されるかを判定することで判定できる。次に宿主種中で好まれるコドンを使用して、例えばエロンガーゼ活性を有する対象とするポリペプチドのコード配列が、全体的にまたは部分的に合成できる。全ての（または一部の）ＤＮＡを合成して、転写されたｍＲＮＡ中に存在する二次構造のあらゆる不安定化配列または領域を除去することもできる。全ての（または一部の）ＤＮＡを合成して、所望の宿主細胞中で塩基組成物をより好ましいものに改変することもできる。
【０１００】
本発明の一実施態様では、ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１１）がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された。これは、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロフィールの以前の判定、好ましいコドンの同定、および「ＡＴＧ」開始コドン周辺の共通配列の判定に基づいて可能であった（米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，１２５，６７２号明細書を参照されたい）。得られた合成遺伝子はＥａＤ９ＥＳ（配列番号２６）と称される。コドン最適化されたΔ９エロンガーゼ遺伝子（すなわち配列番号２７）によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号１３）と同一である。類似の技術を利用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１２）に由来する合成Δ９エロンガーゼを生成できる。
【０１０１】
当業者はここでの教示を使用して、野生型ＥａＤ９Ｅｌｏ１および／またはＥａＤ９Ｅｌｏ２配列に基づいて、代案の（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外の）宿主中での最適発現に適した、様々なその他のコドン最適化されたΔ９エロンガーゼタンパク質を作り出すことができるであろう。したがって本発明は、野生型ヌクレオチド配列ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１１）またはＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１２）に由来する、あらゆるコドン最適化されたΔ９エロンガーゼタンパク質に関する。これとしては、合成Δ９エロンガーゼタンパク質（すなわちＥａＤ９ｅＳ）をコードして、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された配列番号２６に記載のヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。代案の実施態様では、ＥａＤ９Ｅｌｏ１および／またはＥａＤ９Ｅｌｏ２をコードするコドンの部分を修飾して、植物または植物部分、藻類、細菌、代案の酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイルまたは真菌をはじめとするが、これに限定されるものではない、宿主生物中の遺伝子発現を増強することが望ましいかもしれない。
【０１０２】
相同体の同定および単離
本エロンガーゼ配列（すなわちＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２、またはＥａＤ９ｅＳ）またはその部分のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、ユーグレナ属のまたは植物種中で、配列分析ソフトウェアを使用してΔ９エロンガーゼ相同体を検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修正に相同性の程度を割り当てることで、類似配列をマッチさせる。
【０１０３】
代案としてはΔ９エロンガーゼ相同体の同定のために、本エロンガーゼ配列またはその部分のいずれかをハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい（塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウム）。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
【０１０５】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％重量／体積のグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えば硫酸デキストランなどの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
【０１０６】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【０１０７】
さらに別の実施態様では、ここで述べられるΔ９エロンガーゼ核酸断片（または同定されたそのあらゆる相同体）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、ユーグレナ属または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコールを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばＭｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書のポリメラーゼ連鎖反）（ＰＣＲ）；Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４（１９８５年）のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；または（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２年）の連鎖置換増幅（ＳＤＡ）］、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０８】
例えば当業者に良く知られている方法を使用して、ライブラリーをスクリーンするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全てまたは一部を使用して、例えばあらゆる所望の酵母または真菌（ＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを生成する生物が好ましい）から、ここで述べられるΔ９エロンガーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離できる。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１０９】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当該技術分野で一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」よりＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（１９８６年）３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＷｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９、Ｈｕｍａｎａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１１０】
一般に本配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコールで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。またクローンされた核酸断片ライブラリーに対して、１つのプライマーの配列が本核酸断片に由来し、別のプライマーの配列が真核生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する、ＰＣＲを実施してもよい。
【０１１１】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本配列からデザインできる。Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１１２】
別の実施態様では、新しい改善された脂肪酸エロンガーゼを作り出すために、ここで述べられるいずれのΔ９エロンガーゼ核酸断片（または同定されるそのいずれの相同体）を使用してもよい。当該技術分野でよく知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を用いて、天然エロンガーゼ遺伝子の変異を得ることができる（このような変異としては、欠失、挿入、および点突然変異、またはそれらの組み合わせが挙げられる）。これによって、生体内で、宿主細胞中における機能について、所望のＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成速度などのより望ましい物理学的および動態学的パラメーターがそれぞれあるエロンガーゼ活性を有するポリペプチドの生成が可能になる。または所望ならば、通例の変異誘発、得られた変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の定量を通じて、酵素活性に重要である関心のあるポリペプチド（すなわちΔ９エロンガーゼ）の領域を判定できる。これらの技術の概要については米国特許第７，２３８，４８２号明細書で述べられている。ＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２およびＥａＤ９ｅＳに由来するこのような全ての変異タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１１３】
代案としては、ドメイン交換によって改善された脂肪酸を合成してもよく、ここで述べられるΔ９エロンガーゼ核酸断片のいずれかからの機能ドメインが代案のエロンガーゼ遺伝子中の機能ドメインと交換され、それによって新しいタンパク質がもたらされる。ここでの用法では「ドメイン」または「機能ドメイン」とは、微生物中において生物学的反応を引き起こすことができる核酸配列を指す。
【０１１４】
様々なオメガ３および／またはオメガ６脂肪酸を生成する方法
適切なプロモーター制御下における、ここで述べられるΔ９エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子（すなわちＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２、ＥａＤ９ｅＳまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはそれらの相同体）の導入は、形質転換宿主生物中でのＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡ生成増大をそれぞれもたらすであろうことが予期される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちそれぞれＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡ）に変換されるように、脂肪酸基質（すなわちＬＡおよび／またはＡＬＡ）をここで述べられるエロンガーゼ酵素（例えばＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２またはＥａＤ９ｅＳ）に曝露するステップを含んでなる、ＰＵＦＡを直接生成する方法を包含する。
【０１１５】
より具体的には、微生物宿主細胞（例えば酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、および真菌）中でＥＤＡを生成する方法を提供することが本発明の目的であり、微生物宿主細胞は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ｂ）ＬＡ源
を含んでなり、微生物宿主細胞は、Δ９エロンガーゼをコードする核酸断片が発現されて、ＬＡがＥＤＡに変換されるような条件下で成長させ、ＥＤＡは場合により回収される。
【０１１６】
本発明の代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼをＡＬＡからＥＴｒＡへの変換のために使用してもよい。したがって本発明はＥＴｒＡを生成する方法を提供し、微生物宿主細胞は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ｂ）ＡＬＡ源
を含んでなり、微生物宿主細胞は、Δ９エロンガーゼをコードする核酸断片が発現されて、ＡＬＡがＥＴｒＡに変換されるような条件下で成長させ、ＥＴｒＡは場合により回収される。
【０１１７】
代案としては、様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡを製造するために、ここで述べられる各Δ９エロンガーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を間接的に使用できる（図１および米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、脂肪酸基質が所望の脂肪酸生成物に間接的に変換される中間ステップまたは経路中間体の手段を通じて起きる。したがってＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて、ここで述べられるΔ９エロンガーゼ（すなわちＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２、ＥａＤ９ｅＳまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはそれらの相同体）を発現させて、より鎖長の長いω−３／ω−６脂肪酸（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡ）のより高レベルの生成をもたらしてもよいことが考察される。
【０１１８】
好ましい実施態様では、本発明のΔ９エロンガーゼは、（例えばミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの［Ｗａｌｌｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３６５（２）：３０７〜３１６（１９９９年５月）；国際公開第２０００／３４４３９号パンフレット；米国特許第６，８２５，０１７号明細書；国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット、国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット、米国特許第７，２５６，０３３号明細書、米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書］；アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）からの［Ｓａｙａｎｏｖａら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，５８０：１９４６〜１９５２（２００６年）］；パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）からの［国際公開第２００５／１０３２５３号パンフレット］；パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）からの［国際公開第２００７／１２７３８１号パンフレット］；テトルエトレプチア・ポムクテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ  ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１からの［米国特許出願第１１／８７６１１５号明細書］；ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からの［米国特許出願第１１／８７６１１５号明細書］；ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からの［米国特許出願第１１／８７６１１５号明細書］；およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）からの［同時係属米国特許出願第１２／０９９７９９号明細書および米国特許出願第１２／０９９８１１号明細書で述べられる］）Δ８デサチュラーゼと併せて、最小限で発現されるであろう。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右されるであろう。
【０１１９】
代案の実施態様では、ここで述べられる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それらに由来するコドン最適化されたエロンガーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物の天然Δ９エロンガーゼを破壊することが有用かもしれない。
【０１２０】
微生物の発現系、カセット、およびベクター
ここで述べられるΔ９エロンガーゼ遺伝子および遺伝子産物（すなわちＥａＤ９Ｅｌｏ１、ＥａＤ９Ｅｌｏ２、ＥａＤ９ｅＳまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはそれらの相同体）は、異種の微生物宿主細胞中、特に油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））細胞中で発現されてもよい。
【０１２１】
外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する、微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１２２】
適切な微生物宿主細胞の形質転換のために有用なベクター（例えばコンストラクト、プラスミド）およびＤＮＡ発現カセットについては、当該技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物（前出）、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離するのに提案される手段に左右される。しかし典型的にベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、転写を制御する遺伝子（例えばプロモーター）の５’領域、遺伝子コード配列、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換された微生物宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に必ずしも由来しないと理解される。
【０１２３】
所望の微生物宿主細胞中において、本Δ９エロンガーゼＯＲＦの発現を推進する有用な転写制御領域（開始制御領域またはプロモーターとも）は多数あり、当業者によく知られている。選択された宿主細胞中において、これらの遺伝子の発現を誘導できる実質的にあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が本発明に適するが、宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用である。微生物宿主細胞中での発現は、誘導性または構成的な様式で達成できる。誘導性発現は関心のある遺伝子と作動的に連結する制御可能プロモーターの活性を誘導することで達成できるのに対し、構成的な発現は関心のある遺伝子と作動的に連結する構成的プロモーターを使用することで達成できる。例として宿主細胞が酵母である場合、特に宿主種からの酵母細胞中で機能する転写および翻訳領域が提供される（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましい転写開始調節領域については、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書を参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１２４】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周辺のヌクレオチド配列は、酵母細胞中での発現に影響を与えることが分かった。所望のポリペプチドが酵母中で不十分に発現される場合、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修飾して効率的な酵母翻訳開始配列を含めて、最適遺伝子発現を得ることができる。酵母中での発現では、これは好ましくは高度に発現される遺伝子である内在性酵母遺伝子に非効率的発現遺伝子をインフレームで融合させることにより、それを部位特異的に変異誘発して実施できる。代案としては、宿主中でコンセンサス翻訳開始配列を判定し、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のためにこの配列を異種の遺伝子に導入できる。
【０１２５】
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域に、または異なる遺伝子に由来することができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。代案の実施態様では、当業者は入手できる情報を利用して転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成できるので、３’領域はまた合成することもできる。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１２６】
当業者は認識しているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および微生物宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するために操作される分子の特徴のいくつかとしては、関連する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローンされる遺伝子のコピー数（追加的コピーを単一発現コンストラクト中にクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはクローン遺伝子のゲノム中への複数組み込みによって、追加的コピーを宿主細胞中に導入してもよい）；遺伝子がプラスミド媒介性であるかまたは宿主細胞ゲノム中に組み込まれるかどうか；合成された外来性タンパク質の最終細胞内所在；宿主生物中の翻訳効率およびタンパク質の正確な折りたたみ；宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；およびその頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度近づくようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度が挙げられる。これらの各タイプの改変は、ここで述べられるΔ９エロンガーゼの発現をさらに最適化する手段として本発明に包含される。
【０１２７】
微生物宿主細胞の形質転換
ひとたび適切な微生物宿主細胞中での発現に適したＤＮＡカセット（例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子）が得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１２８】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１２９】
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準技術によって微生物宿主細胞中に導入されてもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６〜１８７（１９９１年）］）、プロトプラスト形質転換、弾道衝撃、電気穿孔、微量注入、または関心のある遺伝子を宿主細胞に導入するあらゆるその他の方法が挙げられる。
【０１３０】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込ませるあらゆる方法で操作された宿主細胞は、ここで「形質転換された」、「形質転換体」または「組み換え」と称される。したがって、「形質転換された」および「組み換え」という用語はここで同義的に使用される。形質転換宿主は少なくとも１つの発現コンストラクトのコピーを有し、発現カセットがゲノムに組み込まれるのか、または複数コピー数を有する染色体外要素上に存在するのかどうかによって、２つ以上を有してもよい。
【０１３１】
形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで述べられるような様々な選択技術によって同定できる。
【０１３２】
形質転換に続いて、本Δ９エロンガーゼ（そして場合により、宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１３３】
組み換え発現のための好ましい微生物宿主
本遺伝子および核酸断片発現のための微生物宿主細胞としては、広範な温度とｐＨ値にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロール、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で成長する宿主が挙げられる。出願人らの譲受人の要件に基づいて、本発明で述べられている遺伝子は油性酵母（特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中で発現されているが、転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイルおよび／または真菌が、本核酸断片の発現に適した微生物宿主であることが考察される。
【０１３４】
しかしながら、好ましい微生物宿主は油性酵母などの油性生物である。これらの生物は天然に油を合成および蓄積でき、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超えて構成できる。油性酵母として典型的に同定された属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例示的な油合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。代案の実施態様では、微生物宿主細胞（例えば酵母）が細胞乾燥重量の２５％を超える油を生成でき、その結果油性と見なされるように油生合成を遺伝子改変してもよい。
【０１３５】
最も好ましいのは油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらに別の実施態様では最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である。（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３〜９（２００２年））。
【０１３６】
歴史的に、イソクエン酸リアーゼ、リパーゼ、ポリヒドロキシアルカノアート、クエン酸、エリトリトール、２−オキソグルタル酸、γ−デカラクトン、γ−ドデカラトン、およびピルビン酸の製造および生成のために、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が使用されている。油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の形質転換に適用できる特定の教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書、米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ生成の操作に適用できる特定の教示は、それぞれ米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書、および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書で提供される。この酵母中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主のゲノム中への線状ＤＮＡの組み込みによる。ゲノム中の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であることができる［例えばＵｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）中への］。
【０１３７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。代案の実施態様では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物、「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用され得る。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒であり、したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７、１９９７年；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における５−ＦＯＡの使用について国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットもまた参照されたい）。
【０１３８】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で使用される代案の好ましい選択法は、スルホニル尿素（「Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）」からのクロリムロンエチル）抵抗性に基づく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の顕性非抗生物質マーカーに依存する。より具体的にはマーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤抵抗性を与える単一アミノ酸変化（Ｗ４９７Ｌ）を有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳまたはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。ＡＨＡＳは分枝鎖アミノ酸（すなわちバリン、ロイシン、イソロイシン）生合成経路内の最初の共通酵素であり、スルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。
【０１３９】
その他の好ましい微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、およびその他の真菌が挙げられ、この広範な微生物宿主群の中で特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物（またはこの目的のために遺伝子改変できるもの［例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのその他の酵母］）である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーターの制御下で、本Δ９エロンガーゼ遺伝子のいずれかによって、（ＡＲＡ生成のために商業的に使用される）モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を形質転換することで、大量のＥＤＡを合成できる形質転換生物を得ることができ、Δ８デサチュラーゼ遺伝子が同時発現されれば、これは大量のＤＧＬＡに変換することもできる。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換の方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００年））によって述べられている。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換の方法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
【０１４０】
ここで述べられるΔ９エロンガーゼ発現のために選択される宿主に関わりなく、複数の形質転換体をスクリーンして、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得ることが必要かもしれない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥｌｉｓａ分析、ＰＵＦＡ産物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１４１】
上述の教示に基づいて、一実施態様では、本発明は、
（ａ）ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する第１の組み換えヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）それぞれＬＡおよび／またはＡＬＡからなるエロンガーゼ基質源
を含んでなる油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））を提供するステップと、
（ｂ）適切な発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）の酵母を成長させて、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現されて、ＬＡがＥＤＡに変換され、および／またはＡＬＡがＥＴｒＡに変換されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを場合によりそれぞれ回収するステップと
を含んでなる、ＥＤＡまたはＥＴｒＡのどちらかをそれぞれ生成する方法に関するものである。
【０１４２】
基質の供給が必要かもしれない。
【０１４３】
Δ９エロンガーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されてもよい。代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２６で記載される（配列番号１１と比較して、少なくとも９８個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のために最適化されている）。
【０１４４】
油性酵母中で天然に生成されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）と、一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）とに限定されているので、油性酵母を遺伝子改変して、ここで述べられるΔ９エロンガーゼに加えて、長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な複数の酵素を発現させる（それによって例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの生成を可能にする）。
【０１４５】
具体的には一実施態様では、本発明は、
（ａ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
（ｂ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードして少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる油性酵母に関する。
【０１４６】
特に好ましい実施態様では、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクトが、Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１４７】
微生物中におけるオメガ３および／またはオメガ６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ９エロンガーゼの配列知識は、様々な宿主細胞中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するのに有用であろう。生化学的経路を操作する方法は当業者によく知られており、油性酵母中で、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するのに多数の操作が可能なことが予期される。この操作は、直接にＰＵＦＡ生合成経路内の代謝エンジニアリング、または炭素からＰＵＦＡへの生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路をアップレギュレートして、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートする有用な方法は当業者によく知られている。
【０１４８】
例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子破壊によって排除し、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によってダウンレギュレートしてもよい。
【０１４９】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内の操作の詳細な考察（およびその関連技術）は、それぞれ米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書にあり、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路内の望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
【０１５０】
本発明の文脈で、上述の戦略のいずれか１つによって脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸生成のために、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路内の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母中に導入する方法を提供する。宿主生物の代謝エンジニアリングのための様々な手段を使用して、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を天然に有さない油性酵母中で本Δ９エロンガーゼ遺伝子を発現させて、これらの遺伝子の発現を調整し、好ましいＰＵＦＡ産物の生成を最大化させることは特に有用であろう。
【０１５１】
ＰＵＦＡ生成のための微生物の発酵過程
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラデサチュラーゼおよびエロンガーゼ
遺伝子の発現を最適化する条件下で成長させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母のような、対象の微生物（例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で成長させる。
【０１５２】
本発明における発酵培地は適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で教示されている。本発明で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖（例えばグルコース)、グリセロール、および／または脂肪酸である。
【０１５３】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主の生育と、ＰＵＦＡ生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＦｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、「Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌ」より、Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、６１〜９７（１９９２年）。
【０１５４】
本発明における好ましい増殖培地は、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１５５】
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるＰＵＦＡ生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては米国特許第７，２３８，４８２号明細書で述べられ、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成長中の考察事項についても同様に述べられる。
【０１５６】
ＰＵＦＡ油の精製および処理
ＰＵＦＡは、宿主微生物中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態で含まれるかもしれず、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および許容基準に関する総説は、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２年））によるものである。Ａ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１〜３１２（１９９７年））による後処理プロセスの短いレビューもまた入手できる。
【０１５７】
一般にＰＵＦＡを精製する手段は、有機溶剤による抽出（例えば米国特許第６，７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出、鹸化、およびプレスなどの物理的手段、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに詳しくは米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示を参照されたい。
【０１５８】
食材、健康食品、医薬品、および動物飼料で使用するためのＰＵＦＡ含有油
市場は、目下ω−３および／またはω−６脂肪酸（例えば特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）を組み込んだ多岐にわたる食物および飼料製品をサポートする。長鎖ＰＵＦＡを含んでなる微生物由来資源、ＰＵＦＡを含んでなる部分的に精製された微生物由来資源、ＰＵＦＡを含んでなる精製された微生物油、および／または精製されたＰＵＦＡは、食物および飼料製品中で機能して本調合物の健康上の利点を与えるであろうことが考察される。より具体的にはω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する本発明の油は、類似食品、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な食物および飼料製品中で使用するのに適する（詳細については米国特許出願公開第２００６／００９４０９２号明細書を参照されたい）。
【０１５９】
さらに本組成物を調合物中で使用して、医療栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳ならびに医薬品をはじめとするメディカルフードに健康上の利点を与えてもよい。食物加工および食物調合の当業者は、どのように食物または飼料製品に本油の量および組成物を添加してもよいかを理解するであろう。このような量はここで「効果的」量と称され、食物または飼料製品、製品が栄養補給することが意図される食餌またはメディカルフード、または医療栄養物が矯正または治療することが意図される疾患に左右される。
【実施例】
【０１６０】
特に断りのない限り、部および百分率は重量を基準とし、温度は摂氏である、次の実施例中で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。したがってここで提示され述べられるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明白であろう。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０１６１】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられる。
【０１６２】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で成長させた。
【０１６３】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。配列編集を「Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）」からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ中で実施した。全ての配列は、両方向で少なくとも２回のカバレッジを表す。遺伝子配列の比較はＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
【０１６４】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１６５】
発現カセット命名法：
発現カセット構造は、「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の簡便表記体系によって表され、Ｘはプロモーター断片を示し、Ｙは遺伝子断片を示し、Ｚはターミネーター断片を示して、全て互いに作動的に連結する。
【０１６６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養：
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的に下に示す処方に従っていくつかの培地内で２８〜３０℃で成長させた。標準法に従って各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加して、寒天プレートを必要に応じて調製した。
【０１６７】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、および２０ｇのグルコース。
【０１６８】
基礎最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸非含有酵母窒素ベース、１．０ｇのプロリン、ｐＨ６．１（調節なし）。
【０１６９】
最少培地＋５−フルオロオロト酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１Ｌあたり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素ベース、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジン、および（供給元から受領された各バッチ内にバリエーションがあるため）１００ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌまでの一連の濃度に対して試験されたＦＯＡ活性に基づく適量のＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）からのＦＯＡ。
【０１７０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間成長させた。いくつかの山盛り白金耳量の細胞をプレートから掻き取って、以下を含んでなる１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、平均ＭＷ３３５０；０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸リチウム、ｐＨ６．０；０．１２５ｍＬの２ＭＤＴＴ；および（場合により）５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ。次におよそ５００ｎｇの（好ましくは少なくとも１つのキメラ遺伝子を含んでなる）線状ＤＮＡ（または１００ｎｇの環状プラスミド）を１００μＬの再懸濁された細胞中でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに播種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０１７１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、引き続きＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄからの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１７２】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０１７３】
実施例１
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３からのｃＤＮＡライブラリーの合成
本例はユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３からのｃＤＮＡライブラリーの合成について述べる。この作業は、ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの合成、およびｃＤＮＡライブラリーの作成を含んだ。
【０１７４】
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３の生育およびＲＮＡの調製
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３は、ミシガン州立大学（Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）のＲｉｃｈａｒｄ  Ｔｒｉｅｍｅｒ博士の研究室から入手した。およそ２ｍＬの培養物を脂質分析のために除去し、１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１回洗浄し、再度遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥させ、１００μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）に再懸濁して、振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後０．５ｍＬのヘキサンを添加して、バイアルを振盪しながら室温で１５分間さらにインキュベートした。脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から５μＬを注入）を分離させ、Ｏｍｅｇａｗａｘ  ３２０溶融石英キャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．、カタログ番号２４１５２）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量化した。オーブン温度をプログラムして１７０℃に１．０分間保ち、５℃／分で２４０℃に上昇させ、次にさらに１．０分間保った。キャリアガスはＷｈａｔｍａｎ水素発生装置によって供給された。滞留時間を市販される標準メチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｕ−９９−Ａ））と比較して、得られたクロマトグラムを図２に示す。脂肪酸プロフィール中のＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの存在は、ＧＬＡおよびＳＴＡの不在と共に、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）が長鎖（ＬＣ）ＰＵＦＡ生合成のためにΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用すること、およびΔ９エロンガーゼなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成遺伝子の良好な起源になり得ることを示唆した。
【０１７５】
残る５ｍＬの活発に成長する培養物を１２５ｍＬガラスフラスコ内の２５ｍＬのＡＦ−６培地（Ｗａｔａｎａｂｅ  ＆  Ｈｉｒｏｋｉ，ＮＩＥＳ−Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ，第５版，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｔｓｕｋｕｂａ，１２７ｐｐ（２００４年））中に移した。ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）培養物を非常に穏やかに撹拌しながら、１６時間の明期と８時間の暗期のサイクルで２２℃で２週間成長させた。
【０１７６】
２週間後、培養物（２５ｍＬ）を５００ｍＬガラス瓶内の１００ｍＬのＡＦ−６培地に移し、上述のように培養物を１ヶ月間成長させた。この期間後、２つの５０ｍＬのアリコートを２５０ｍＬのＡＦ−６培地を含有する２つの別個の５００ｍＬガラス瓶内に移し、上述のように培養物を２ヶ月間成長させた（合計約６００ｍＬの培養物を得た）。次に培養物を１，８００×ｇで１０分間遠心分離してペレット化し、水で１回洗浄して再度遠心分離した。ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）からのＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０ＴＭ試薬を使用し、提供された製造業者のプロトコール（５ｍＬの試薬を使用してＲＮＡを０．５ｍＬの水に溶解する）に従って、得られたペレットの１つから全ＲＮＡを抽出した。このようにして３４０μｇの全ＲＮＡ（６８０μｇ／ｍＬ）がペレットから得られた。残りのペレットを液体窒素内で凍結し−８０℃に保存した。（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのｍＲＮＡ精製キットを使用して提供された製造業者のプロトコールに従って、３４０μｇの全ＲＮＡの全てからｍＲＮＡを単離した。このようにして９．０μｇのｍＲＮＡを得た。
【０１７７】
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ｃＤＮＡの調製およびｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃの作成
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＣｌｏｎｅｍｉｎｅｒＴＭ  ｃＤＮＡライブラリー構築キット（カタログ番号１８２４９−０２９）を使用し、提供された製造業者のプロトコール（バージョンＢ、２５−０６０８）に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成した。非放射標識法を使用して、５．１２μｇの（上述の）ｍＲＮＡから、ビオチン−ａｔｔＢ２−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。第１および第２のストランドの合成後、ａｔｔＢ１アダプターを添加してライゲートし、カラムクロマトグラフィーを使用してｃＤＮＡをサイズ分画した。画分からのＤＮＡを濃縮し、ｐＤＯＮＲＴＭ２２２に遺伝子組み換えして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＴＭ  ＤＨ１０ＢＴＭ  Ｔ１ファージ−抵抗性細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に形質転換した。ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ライブラリーをｅｕｇ１ｃと命名した。
【０１７８】
ｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃをＬＢ＋カナマイシンプレート上に播種して（およそ１００，０００個のコロニー）、コロニーを掻き取りＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用し製造業者のプロトコールに従ってＤＮＡを単離した。このようにしてｅｕｇ１ｃからのプラスミドＤＮＡ下位ライブラリーを得た。
【０１７９】
実施例２
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３からの全長Δ９エロンガーゼの単離
本実施例は、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３からのΔ９エロンガーゼをコードするｃＤＮＡ（配列番号１および２）の同定について述べている。この研究はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ；配列番号３）に由来するプローブの作成、およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３からのΔ９エロンガーゼ相同体を同定するためのプローブとｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃとのハイブリダイゼーションを含んだ。
【０１８０】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からのＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ）使用し製造業者のプロトコールに従って、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ；配列番号３；米国特許出願第１１／６０１，５６３号明細書で述べられている）を含有してｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５ｆと称されるユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）ｃＤＮＡライブラリーからのクローン（ｅｅｇ１ｃ）をテンプレートとして使用して、ＥｇＤ９ｅをオリゴヌクレオチドプライマーｏＥｕｇＥＬ１−１（配列番号５）およびｏＥｕｇＥＬ１−２（配列番号６）によって増幅した。得られたＤＮＡ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し製造業者のプロトコールに従って、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローンしてｐＫＲ９０６（配列番号１５）を生成した。
【０１８１】
コロニーのリフト
ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン寒天培地をそれぞれ含有するＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）からの３個の大型正方形（２４ｃｍ×２４ｃｍ）ペトリ皿に、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃのおよそ１７，０００個のクローンを播種した。細胞を３７℃で一晩成長させ、次にプレートを室温に冷却した。
【０１８２】
Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｅｎｓａｃｏｌａ，ＦＬ）からのＢｉｏｄｙｎｅ  Ｂ  ０．４５μｍ膜（カタログ番号６０２０７）をおよそ２２ｃｍ×２２ｃｍに裁断し、膜を寒天上に気泡を避けて注意深く載せた。室温で２分間のインキュベーション後、膜の方向性を標識してピンセットで持ち上げ、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙にコロニー面を上にして載せた。４分間の変性後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）と１．５Ｍ塩化ナトリウムに４分間浸した濾紙に膜を載せて、水酸化ナトリウムを中和した。ステップを繰り返し、２×ＳＳＣ緩衝液（２０×ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で膜を手早くすすぎ、濾紙上で風乾した。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション
膜を２００ｍＬハイブリダイゼーション溶液中で、６５℃で２時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、５×デンハルト試薬（１００×デンハルト試薬は２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、２％（ｗ／ｖ）アセチル化ウシ血清アルブミン）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍＬ剪断サケ精子ＤＮＡ、および５％硫酸デキストランを含有した。
【０１８４】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＲａｄＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（カタログ番号１８４２８−０１１）を使用し製造業者の使用説明書に従って、Δ９エロンガーゼ遺伝子を含有するアガロースゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＤＮＡ断片を使用して、Ｐ３２ｄＣＴＰで標識したｐＫＲ９０６（配列番号１５）からミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＮＡプローブを作成した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのＮＩＣＫカラム（カタログ番号１７−０８５５−０２）を使用し製造業者の使用説明書に従って、取り込まれなかったＰ３２ｄＣＴＰを分離した。プローブを１００℃で５分間変性させ氷の上に３分間載せて、半分をハイブリダイゼーション溶液に添加した。
【０１８５】
穏やかに振盪しながら、膜をプローブと６５℃で一晩ハイブリダイズし、次に翌日０．５％のＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで２回（各５分間）、０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣで２回（各１５分間）洗浄した。洗浄後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（カタログ番号ＲＰＮ３０Ｋ）を−８０℃で一晩、膜に曝露した。
【０１８６】
曝露されたｈｙｐｅｒｆｉｌｍとプレートのアラインメントに基づいて、パスツールピペットの平滑末端を使用して陽性コロニーを１ｍＬの水中に拾い上げ、ボルテックスした。希釈を何回か行って５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＬＢ培地を含有する小型円形ペトリ皿（８２ｍｍ）上に播種し、単一プレート上に約１００個の良好に単離されたコロニーを得た。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）からのＮｙｔｒａｎＮメンブランサークル（カタログ番号１０４１６１１６）を使用したこと以外は上述のようにして持ち上げて、残りの放射標識プローブを使用して１００ｍＬ中でハイブリダイゼーションを実施した。このようにして陽性のクローンを確認した。
【０１８７】
個々の陽性クローンをＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン液体培地中で３７℃で成長させ、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用し製造業者のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。
【０１８８】
ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅバージョン３  Ｐｒｉｓｍ配列決定キットを用いて、ベクターで予め刺激されたＭ１３Ｆユニバーサルプライマー（配列番号７）、Ｍ１３ｒｅｖ−２８プライマー（配列番号８）、およびｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌで予め刺激されたＷｏｂｂｌｅＴオリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ挿入断片を３８４ウェルプレート内で末端配列決定した。配列決定反応のために、１００〜２００ｎｇのテンプレートおよび６．４ｐｍｏｌのプライマーを使用して、以下の反応条件を２５回繰り返した。９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および６０℃で４分間。エタノールベースの精製後、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡＢＩ  ３７００自動化配列決定装置上でサイクル配列決定反応生成物を解析して検出した。ＷｏｂｂｌｅＴプライマーは、ｃＤＮＡクローンの３’末端の配列決定のために使用される２１ｍｅｒ  ｐｏｌｙ（Ｔ）Ａ、ｐｏｌｙ（Ｔ）Ｃ、およびｐｏｌｙ（Ｔ）Ｇの等モルの混合物である。
【０１８９】
Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＴＭ（バージョン４．２）を使用して配列を整列させて比較することで、クローンを挿入断片配列に基づいて２つの異なる群（ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２と称する）の１つに分類できた。各配列クラスについてｃＤＮＡを含有する代表的なクローンをさらなる研究のために選択し、代表的な各プラスミドの配列（すなわちｐＬＦ１２１−１およびｐＬＦ１２１−２）をそれぞれ配列番号９および配列番号１０によって示す。ＮＮＮＮの文字列によって示される配列は、配列決定されなかったｐｏｌｙＡ  ｔａｉｌの領域に相当する。ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２のコード配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２で示す。ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２に対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および配列番号１４で示す。
【０１９０】
実施例３
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３（ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２）のΔ９エロンガーゼ配列の一次配列分析およびその他の公開されたΔ９エロンガーゼ配列との比較
ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭｖ６．１プログラムをペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で使用して、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年））を使用して、ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１３）およびＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１４）のアミノ酸配列を比較した。
【０１９１】
ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１３）と比較して、ＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１４）は１個のアミノ酸置換（すなわちＲ２５４Ｑ；ＥａＤ９Ｅｌｏ１の番号付けを基準にして）を有する。ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１１）およびＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１２）のヌクレオチド配列は、７７４ｂｐの全長に対して６個の塩基対が異なる。
【０１９２】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳と、三次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新メジャーリリース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースに由来する配列とを含んでなる）に含有される配列との類似性を検索するＢＬＡＳＴＰ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９３年））によってデフォルトパラメーターを使用してフィルターをオフにして、ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１３）およびＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１４）のアミノ酸配列を評価した。便宜上、ＢＬＡＳＴによる計算で、ｃＤＮＡ配列と検索されるデータベース中に含有される配列とのマッチが単なる偶然で観察されるＰ値（確率）をここで報告されるＰ値の対数の負数に相当する「ｐＬｏｇ」値として報告する。したがってｐＬｏｇ値が大きいほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴ「ｈｉｔ」が相同的なタンパク質を表す可能性が大きい。
【０１９３】
「ｎｒ」データベースと比較すると、どちらの配列もイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）長鎖多価不飽和脂肪酸延長酵素（ＩｇＤ９ｅ；配列番号１６）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ１７２２６１２３）、遺伝子座ＡＡＬ３７６２６、ＣＤＳＡＦ３９０１７４；Ｑｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５１０：１５９〜１６５（２００２年））に対して３８．７０のｐＬｏｇ値（２ｅ−３９のＰ値）をもたらした。ＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本核酸断片がユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ９脂肪酸エロンガーゼ全体をコードすることを示唆する。
【０１９４】
配列比較のＢｌａｓｔＰ、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＶおよびＪｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法を使用して、ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１３）およびＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１４）のアミノ酸配列をＩｇＤ９ｅ（配列番号１６）およびミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼアミノ酸配列（ＥｇＤ９ｅ；配列番号４；国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレット）と比較した。各方法を使用したＩｇＤ９ｅおよびＥｇＤ９ｅに対する％同一性を表４および表５にそれぞれ示す。
【０１９５】
上述のようにＢｌａｓｔＰおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法によって、配列％同一性の計算を実施した。Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ，１８３：６２６〜６４５（１９９０年））によって実施された配列％同一性計算は、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭｖ６．１プログラムをペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝２）で使用して行った。
【０１９６】
【表４】
0005501954.tif 000005
【０１９７】
【表５】
0005501954.tif 000006
【０１９８】
実施例４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ  ３７３Δ９エロンガーゼの機能解析
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１３）およびＥａＤ９Ｅｌｏ２（配列番号１４）の機能解析について述べる。この研究は、（１）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）適合性ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１５９を構築するステップと（２）ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２をｐＹ１５９に転移してｐＹ１７３およびｐＹ１７４を生成するステップと、（３）ｐＹ１７３およびｐＹ１７４を含んでなる形質転換生物内の脂質プロフィールを比較するステップとを含む。
【０１９９】
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）適合性ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１５９の構築
プラスミドｐＹ５−３０（米国特許第７，２５９，２５５号明細書ですでに述べられている）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の双方の中で複製できるシャトルプラスミドである。プラスミドｐＹ５−３０は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中における選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、およびキメラＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲ遺伝子を含有する。当業者によく知られている技術を使用して、ＴＥＦプロモーターをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）で置換して、プラスミドｐＤＭＷ２６３（配列番号１７）をｐＹ５−３０から作り出した。簡単に述べるとこのプロモーターは、ｆｂａ１遺伝子によってコードされる果糖−ビスホスフェートアルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドン前の５’上流非翻訳領域に位置して発現に必要な修飾プロモーターと、イントロンを有する５’コード領域の部分とを指し、ＦＢＡＩＮｍは、ＦＢＡＩＮプロモーターのＡＴＧ翻訳開始コドンおよびイントロン間の５２ｂｐの欠失（その結果Ｎ−末端の２２個のアミノ酸のみを含む）と、イントロン後の新しい翻訳コンセンサスモチーフとを有する。表６はｐＤＭＷ２６３（配列番号１７）の構成要素を要約する。
【０２００】
【表６】
0005501954.tif 000007
【０２０１】
イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＩｇＤ９ｅＳ）を含有し、（その内容を参照によって本明細書に援用する）国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットで以前述べられているｐＤＭＷ２３７（配列番号１８）のＮｃｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡ断片に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含有するｐＤＭＷ２６３（配列番号１７）からのＮｃｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡ断片をクローンして、ｐＹ１１５（配列番号１９；図３Ａ）を生成した。図３Ａでは修飾ＦＢＡＩＮｍプロモーターはＦＢＡ１＋イントロンと標識されるのに対し、図３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄでは、ＹＡＲ  ＦＢＡ１  ＰＲＯ＋イントロンと標識される。
【０２０２】
オリゴヌクレオチドプライマーｏＹＦＢＡ１（配列番号２０）およびｏＹＦＢＡ１−６（配列番号２１）を用いたＰＣＲを使用して、プラスミドｐＹ１１５（配列番号１９）からＦＢＡＩＮｍプロモーターを増幅した。プライマーｏＹＦＢＡ１（配列番号２０）はプロモーター５’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入するようにデザインされ、プライマーｏＹＦＢＡ１−６（配列番号２１）はＮｃｏＩ部位、ひいてはＡＴＧ開始コドンを除去しながらプロモーターの３’末端にＮｏｔＩ部位を導入するようにデザインされた。得られたＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化して、ベクター主鎖を含有するｐＹ１１５のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片にクローンして、ｐＹ１５８（配列番号２２）を形成した。
【０２０３】
プラスミドｐＹ１５８（配列番号２２）をＮｏｔＩで消化して、得られたＤＮＡ末端を充填した。充填して平滑末端を形成した後、ＤＮＡ断片を仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理して、アガロースゲル電気泳動法を使用して分離した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含有する６９９２ｂｐの断片をアガロースゲルから切除し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キットを使用し製造業者のプロトコールに従って精製した。精製された６９９２ｂｐの断片をＧａｔｅｗａｙベクター変換システム（カタログ番号１１８２３−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し製造業者のプロトコールに従って、カセットｒｆＡとライゲートし、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＹ１５９（配列番号２３；図３Ｂ）を形成した。
【０２０４】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターｐＹ１７３およびｐＹ１７４の構築
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＴＭＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し製造業者のプロトコールに従って、ｐＬＦ１２１−１（配列番号９；実施例２）およびｐＬＦ１２１−２（配列番号１０；実施例２）からのｃＤＮＡ挿入断片をｐＹ１５９（配列番号２３）に転移して、ｐＹ１７３（配列番号２４；図３Ｃ）およびｐＹ１７４（配列番号２５；図３Ｄ）をそれぞれ形成した。
【０２０５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中におけるＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２の機能解析
Ｙ２２２４株を次の様にして単離した。２５０ｍｇ／Ｌの５−ＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＭＭプレート（各７５ｍｇ／Ｌのウラシルおよびウリジン、硫酸アンモニア添加６．７ｇ／Ｌ  ＹＮＢ、アミノ酸非含有、２０ｇ／Ｌグルコース）上に、ＹＰＤ寒天プレート（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞を画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートし、得られたコロニーの内４つを２００ｍｇ／ｍＬの５−ＦＯＡを含有するＭＭプレートと、ウラシルおよびウリジンを欠くＭＭプレート上とに別々にパッチ培養して、ウラシルＵｒａ３栄養要求性を確認した。
【０２０６】
一般方法で述べられるようにして、Ｙ２２２４株をｐＹ１７３（配列番号２４；図３Ｃ）およびｐＹ１７４（配列番号２５；図３Ｄ）で形質転換した。
【０２０７】
ｐＹ１７３およびｐＹ１７４を含有する形質転換ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーをウラシルを欠く３ｍＬのＭＭ中で３０℃で１６時間成長させ、その後細胞を２５０ｒｐｍで遠心分離してペレット化した。細胞を水で１回洗浄し、遠心分離によってペレット化し風乾した。５００μＬの１％ナトリウムメトキシドを用いて５０℃で３０分間ペレットをエステル交換し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、その後５００μＬの１Ｍ塩化ナトリウムおよび１００μＬのヘプタンを添加した。完全な混合および遠心分離後、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をＧＣによって分析した。ＦＡＭＥ（ヘキサン層から５μＬを注入）を分離させ、Ｏｍｅｇａｗａｘ  ３２０溶融石英キャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量化した。オーブン温度をプログラムして、２２０℃に２．６分間保ち、２０℃／分で２４０℃に上昇させ、次にさらに２．４分間保った。キャリアガスはＷｈａｔｍａｎ水素発生装置によって供給された。滞留時間を市販される標準メチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）と比較した。
【０２０８】
ｐＹ１７３およびｐＹ１７４を発現するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸プロフィールを表７に示す。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、２０：０、２０：１（１１）、ＥＤＡ、２２：０、２４：０、および２４：１と同定された。％Δ９延長（Δ９％Ｅｌｏｎｇ）は、ＥＤＡの重量部（重量％）をＥＤＡとＬＡの重量％の和で除して、％として表すために１００を乗じて計算した。平均はＡｖｅ．で表される。
【０２０９】
【表７】
0005501954.tif 000008
【０２１０】
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ９エロンガーゼ遺伝子（ＥａＤ９ＥＳ）の合成
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書で述べられているのと類似した方法で、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）のΔ９エロンガーゼ遺伝子（ＥａＤ９Ｅｌｏ１）のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、コドン最適化されたΔ９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ＥＳ」と称される；配列番号２６）をＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１１）のコード配列に基づいて、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の原則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従ってデザインした。翻訳開始部位の修飾に加えて、７７４ｂｐコード領域の１０６ｂｐ（１３．７％）を修飾し、９８個のコドン（３８．０％）を最適化した。ＧＣ含量（５２．１％）は、野性型遺伝子（すなわちＥａＤ９Ｅｌｏ１）と合成遺伝子（すなわちＥａＤ９ＥＳ）の間でほぼ同一であった。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位を翻訳開始コドン周辺、およびＥａＤ９ＥＳ（配列番号２６）の停止コドン後にそれぞれ組み込んだ。図４Ａおよび４Ｂは、ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号１１）とＥａＤ９ＥＳ（配列番号２６）のヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化された遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号２７）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号１３）と同一である。デザインされたＥａＤ９ＥＳ遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成されｐＵＣ５７（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローンされて、ｐＥａＤ９ＥＳ（配列番号２８；図５Ａ）が作り出された。
【０２１１】
実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された（ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＥａＤ９ＥＳ）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳの構築および機能解析
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳの機能発現について述べており、ＥａＤ９ＥＳはユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼである。プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳ（図５Ｂ）は以下の構成要素を含有した。
【０２１２】
【表８】
0005501954.tif 000009
【０２１３】
ｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べられるようにして、プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳをＹ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律性突然変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）に形質転換した。形質転換体を上ＭＭプレートで選択した。３０℃で２日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に３ｍＬの液体ＭＭに３０℃で接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、５つの形質転換体全てにおいて総脂質の約２．２％のＣ２０：２（ＥＤＡ）および１５．３％のＣ１８：２（ＬＡ）が生成したことを示し、これらの５株中でのＣ１８：２からＣ２０：２への変換効率は約１３％と判定された。したがってこの実験データは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（すなわち配列番号２６および２７に記載されるＥａＤ９ＥＳ）が、能動的にＬＡをＥＤＡに延長することを実証した。
【０２１４】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有して、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのブラストＮ法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体
を含み、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含む、微生物宿主細胞。
２．単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする、上記１に記載の微生物宿主細胞。
３．酵母、藻類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、上記１に記載の微生物宿主細胞。
４．細胞がクサレケカビ属の真菌である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
５．細胞がヤブレツボカビ種およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、上記３に記載の微生物宿主細胞。
６．酵母が油性酵母である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
７．油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、上記６に記載の微生物宿主細胞。
８．ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）リノール酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、リノール酸をエイコサジエン酸に変換する条件下でステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサジエン酸を生産する方法。
９．ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）α−リノレン酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換する条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサトリエン酸を生産する方法。
１０．微生物宿主細胞が、配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含むヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現のために最適化された少なくとも９８個のコドンを含む、上記８または９に記載の方法。
１１．ａ．）組み換え核酸分子が、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
上記８または９に記載の方法。
１２．配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼをコードして、少なくとも９８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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