(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）まず、遺伝子導入生物ないし遺伝子導入細胞内において、輸送蛋白質を符号化するＤＮＡ配列の異種発現により、輸送蛋白質を製造し、次いで
（ｂ）この組換えが行なわれた生物全体もしくは遺伝子導入細胞を、化合物の上記輸送蛋白質に対する抑制効果を検査するために使用し、かつ
（ｃ）前記化合物がこの生物もしくは細胞の他のメカニズムに対しても抑制作用する可能性を排除するために、対応する輸送蛋白質を生産しない生物もしくは細胞に対する、前記化合物の抑制作用を追加的に検査し、次いで
（ｄ）輸送蛋白質に対して活性の化合物を、植物における除草、生長制御作用に関して検査することを特徴とする、植物における輸送プロセスの抑制ないし不活性化によりもたらされる潜在的除草、生長制御作用を示す物質を同定する方法。
【請求項２】
輸送蛋白質が、蔗糖輸送蛋白質であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
輸送蛋白質が、アミノ酸輸送蛋白質であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
輸送蛋白質が、アンモニウム輸送蛋白質であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項５】
遺伝子導入生物が単細胞動物であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項６】
単細胞生物が、バクテリア、菌類または酵母であることを特徴とする請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項７】
細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項８】
細胞が動物細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項９】
細胞が卵母細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項１０】
細胞がＸｅｎｏｐｓ（無舌類）卵母細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物における輸送蛋白質（輸送体）により潜在的除草作用ないし生長制御作用を有する物質を発見、同定する方法、輸送蛋白質の利用方法、およびこれにより同定された除草、生長制御作用を有する物質に関する。
新規の栽培植物保護剤は、低い毒性、高い環境適合性および従来の剤に比べて改善された効果を示すことが要求される。このような物質の発見に成功する可能性は、入手し得る物質の数のほかに、有効物質を同定する方法に本質的に依存している。このための従来方法は、一般的に除草、生長制御効果に関し、各物質を逐一直接的に試験することを基本としているので、原則的に極めて長い期間と高いコストが必要であり、また広大な試験用地を必要とする。
そこで、充分な数ないし種類の物質を試験することができるように、簡単かつ迅速に行われ得る同定方法が求められる。
しかるに、植物における輸送蛋白質と特定的に相互作用する化学的化合物を発見、同定するために使用可能な方法が、本発明者らにより見出されるに至った。本発明方法は、まず、植物の輸送蛋白質を機能的に発現する遺伝子導入生物、ことに単細胞生物に対し、あるいは植物の輸送蛋白質を機能的に発現する遺伝子導入細胞に対して、これらの物質の輸送プロセス抑制作用を試験することから成る。
これにより、抑制的であるとして同定された物質は、次いであらゆる植物に対するその効果について調査される。
ここで輸送蛋白質と称するのは、本発明において、植物細胞膜を通って種々の物質を輸送する役割を果たす蛋白質を意味する。本発明方法において、植物における輸送蛋白質は、生化学的、微生物学的および生理学的測定方法により、細胞膜輸送機能を定性的かつ定量的に測定することを可能ならしめる試験システムに組込まれる。この試験システムにより、植物の輸送蛋白質と相互作用し得る有効物質の発見が可能となる。この物質と輸送蛋白質の相互作用は、輸送プロセスの抑制ないし不活性化をもたらし、さらに物質自体の輸送にまで到達し得る。
輸送プロセスは、植物における新陳代謝作用全体の中心的役割を果たし、しばしば植物生長に対して本質的に作用するから、本発明方法は、植物の生長に影響を及ぼす物質を特定的に、かつ高い確率で同定することを可能ならしめる。
自然の輸送プロセスを抑制する物質が見出されると、この相互作用は生長制御作用ないし除草作用を誘引し得る。輸送抑制作用を有する物質自体が輸送されるならば、これは殺菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、ことに除草剤、生長制御剤などの栽培植物保護剤の組成分として、この物質の植物体内における移動性を増大させ、さらに有効な新規の栽培植物保護剤を提供することになる。
本発明による試験システムは、さらに植物における輸送蛋白質を分子レベルで検査するために使用され得る。
植物の輸送蛋白質により、除草もしくは植物生長制御効果を有する物質を同定するための方法を開示する刊行物は、これまでに存在していない。同様に、除草作用のメカニズムとして、植物における輸送プロセス抑制を記載した刊行物も見当たらない。さらに、植物の輸送蛋白質が、その新陳代謝における、例えば再生器官の供与におけるその役割の故に、除草剤ないし生長制御剤のための重要な潜在的ターゲットとなり得るかについても、これまでに知られていない。
本発明方法において、単細胞生物または培養されている細胞に対して行われるべき生化学的試験システムが、第１工程に含まれていることが重要である。この試験システムは、これまでの除草、生長制御作用を有する物質を同定する方法に比べて、迅速かつ簡単に行われ得る利点を有する。さらに本発明による試験システムは、比較的短時間で、多数の物質の除草、生長制御効果に関する検査を行うことを可能ならしめる。
さらに本発明方法は、極めて特定的な植物蛋白質と相互作用する物質を、特定的に同定し得る利点を有する。ヒト、動物および環境に対する好ましくない作用を回避するために、本発明におけるターゲット蛋白質は、植物に対してのみ特定的に作用するように選択され得る。
本発明方法において、ターゲット蛋白質として有利に使用される蛋白質は、植物体内において細胞膜を通して種々の物質を輸送する蛋白質（輸送蛋白質）、ことに植物に特定的な輸送蛋白質である。
従って本発明の対象は、（ａ）まず、遺伝子導入生物ないし遺伝子導入細胞内において、輸送蛋白質を符号化するＤＮＡ配列の異種発現により、輸送蛋白質を製造し、次いで
（ｂ）この組換えが行なわれた生物全体もしくは遺伝子導入細胞を、化合物の上記輸送蛋白質に対する抑制効果を検査するために使用し、かつ
（ｃ）前記化合物がこの生物もしくは細胞の他のメカニズムに対しても抑制作用する可能性を排除するために、対応する輸送蛋白質を生産しない生物もしくは細胞に対する、前記化合物の抑制作用を追加的に検査し、次いで
（ｄ）輸送蛋白質に対して活性の化合物を、植物における除草、生長制御作用に関して検査することを特徴とする、植物における輸送プロセスの抑制ないし不活性化によりもたらされる潜在的除草、生長制御作用を示す物質を同定する方法。である。
本発明方法において、一般的に植物中にもたらされるすべての輸送蛋白質およびこのような輸送蛋白質を符号化するＤＮＡ配列を使用することができる。
植物において、細胞膜を通って種々の物質を輸送する役割を果たす種々の輸送蛋白質がすでに発見、同定されており、また若干の場合、このような輸送蛋白質を符号化、すなわちコーディングするＤＮＡ配列が入手可能である。
例えば蔗糖輸送蛋白質を、生体植物について、または分離された葉の組織について、直接的に検知することは、すでに可能になっている。この場合、蔗糖受領はｐＨ値に依存する（”Ｎａｔｕｒｅ”、”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ”２６７、３６７−３７０、１９７７におけるジアキンタの論稿、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４、３４７−３４８、１９８３、同６７、５６０−５６４、１９８１におけるデルローおよびボネマンの論稿、同６７、５６０−５６４、１９８１におけるデルローの論稿）。これに関連して、α−クロロ水銀ベンジルスルホン酸およびジエチルピロカーボネートは、極めて高い輸送抑制効果を示す（１９８９、”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．”８９、１３１８−１３２３におけるブッシュの論稿）。植物における蔗糖輸送蛋白質を符号化するｃＤＮＡ配列は、すでに刊行物に記載されている。例えば、ジャガイモについてはＰ６２およびＳｔＳＵＴ１に、ホウレンソウについてはＳ２１およびＳｏＳＵＴ１、ＷＯ９４／００５７４、１９９３、”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ”５、１５９１−１５９８におけるリースマイラーらの論稿、１９９２、”ＥＭＢＯ  Ｊ．”１１、４７０５−４７１３におけるリースマイアーらの論稿、アブラナ科に属するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ｓｕｃ１およびｓｕｃ２遺伝子）についてはＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７５３６５号、オオバコ科に属するＰｌａｎｔａｇｏ  ｍａｊｏｒについてはＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７５７６４、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍについてはＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ８２２７５、タバコの類のＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍについてはＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ８２２７６およびＸ８２２７７号をそれぞれ参照され度い。蔗糖輸送蛋白質（蔗糖輸送体）の場合には、コウボ菌のｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける人工相補系を発生させて、ホウレンソウ、ジャガイモからのこれら輸送体のｃＤＮＡ配列符号をクローンすることがすでに可能になっている（ＥＭＢＯ  Ｊ．１１、４７０５−４７１３、１９９２におけるリースマイアーらの論稿、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５、１５９１−１５９８における同上リースマイアーらの論稿参照）。
植物におけるアミノ酸輸送体も同様にして同定可能である。高等植物に関係する緑色藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａは、少なくとも３種類に調節制御されるアミノ酸輸送体組織を有する（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７９、７６０−７６４、１９８５におけるザウアーおよびタナーの論稿参照）。これはＨ▲+▼−ＡＴＰａｓｅによりもたらされるプロトン勾配からのエネルギーを有する能動的輸送体を含む。高等植物においては、受動的輸送体（促進拡散）の存在することが、木部（Ｘｙｌｅｍ）および師部（Ｐｈｌｏｅｍ）の構造研究から間接的に結論ずけられている。これと対照的にトウゴマ類の子葉および根の木部および師部は、アミノ酸で負荷されており、濃度勾配に対向する（Ｐｌａｎｔａ  １７７、３４２−３４９、１９８９および同１８１、８５−９０、１９９０におけるショーベルトおよびコーマーの論稿参照）。種を異にする植物の分離された小胞内に少なくとも４個の独立するＨ▲+▼共輸送体が存在することは実証可能になっている（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９４、２６８−２７７、１９９１におけるリーおよびブッシュの論稿参照）。酵母のアミノ酸輸送体突然変異体の相補により、アブラナ科に属するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからのウレイドおよびアミノ酸透過酵素遺伝子を分離し、例えばアミノ酸輸送体ＡＡＰ１およびＡＡＰ２を符号化するｃＤＮＡ塩基配列を形質化することがすでに可能になっている（１９９３年Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡの９０：５９４４−５９４８におけるフロマーらの論稿、１９９３年、Ｐｌａｎｔａ  Ｊ．４：９９３−１００２におけるクワートらの論稿、ＷＯ９４／１５５９号公報参照）。細胞膜へのアミノ酸輸送体の内長分枝が不可能になっている酵母突然変異体ｓｈｒ３を使用する相補法により、植物のアミノ酸輸送体を符号化する他の多数のＤＮＡ配列、例えばアミノ酸輸送体ＡＡＰ３（ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７７０５１）、ＡＡＰ４（ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７７５００）、ＡＡＰ５（ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７７５０１）、ＡＡＴ１（ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７１７８７）およびＮＴＲ１（ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７７５０３）をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから分離し得た。また、植物のアンモニウム輸送体を符号化するｃＤＮＡ配列、例えばアンモニウム輸送体ＡＭＴ１を符号化するｃＤＮＡ配列Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから分離することも知られている（１９９４年ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、３４６４−３４７１におけるニンネマンらの論稿、独国特願Ｐ４３３７５９７．９号明細書、ＥＭＢＬ遺伝子バンク、アクセス番号Ｘ７５８７９号）。
細胞膜出入輸送蛋白質の遺伝子をクローニングすることは、上述した例のほかにも何例かが公知になっている。細胞膜蛋白質遺伝子のクローニングは、原則として異なる若干のルートで行われ得る。例えば蔗糖輸送体遺伝子を赤血球から分離するに際し、蛋白質の精製によりｃＤＮＡクローンを同定し得た。（Ｓｉｅｎｃｅ  ２２９、９４１−９４５、１９８５におけるミュックラーらの論稿参照）。しかしながら、多くの場合において細胞膜輸送蛋白質の精製は困難であって、他の方法、例えば卵細胞における異種干渉発現を利用しなければならない場合がある（Ｎａｔｕｒｅ  ３３０、３７９−３８１、１９８７におけるヘディガーらの論稿参照）。植物原形質膜Ｈ▲+▼ −ＡＴＰａｓｅ遺伝子は、動物および菌の遺伝子との相同を介してクローンされた。植物の蔗糖輸送体遺伝子のＣｈｌｏｒｅｌｌａからの分離は、異なるｃＤＮＡスクリーニングにより可能になされた（ＥＭＢＯ  Ｊ．８、３０４５−３０５０、１９９０におけるザウアーらの論稿参照）。ＣｈｌｏｒｅｌｌａからのｃＤＮＡクローンが、高等植物からの若干の蔗糖輸送体遺伝子のクローニングのための異種干渉試料として使用された（同士ザウアーらの論稿）。葉緑体トリオースホスフェートトランスロケータ（ＴＰＴ）をインヒビタＤＩＤＳを経て放射線標識し、標識された蛋白質を精製し、部分配列した。部分的ペプチド配列からの合成オリゴヌクレオチドが、ＴＰＴエンコーディングｃＤＮＡを分離するための試料として使用された（ＥＭＢＯ  Ｊ．８、３９−４６、１９８９におけるフリューゲらの論稿参照）。植物の輸送蛋白質を符号化するための既知のＤＮＡ配列は、分子生物学で慣用されている技術により、他の植物の異なるＤＮＡ配列を同定し、分離するために使用され得る。
本発明方法に使用される遺伝子は、植物生長に必須の輸送体、すなわち輸送蛋白質を符号化する。対応する輸送蛋白質の抑制は、従って生長を阻害するに至る。対応する輸送蛋白質を符号化するＤＮＡ配列を入手できるとすれば、例えば遺伝子導入植物の対応する遺伝子の発現およびアンチセンス抑制により、その検知が可能である（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ４、１３−１８、１９８８におけるウィルミッツァーの論稿参照）。このような遺伝子導入植物をもたらす技術は、この分野の技術者には公知である。従って、例えばトリオールホスフェートトランスロケータを符号化するアンチセンスＲＮＡの発現により、蛋白質の発現のわずかな減少でも植物生長の劇的な抑制をもたらすに至ることが見出された。（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、６１６０−６１６４、１９９３におけるリースマイアーらの論稿参照）。同様にして、蔗糖輸送蛋白質の活性低減は、ジャガイモの著しい生長抑制をもたらし得ることも認められている。さらに、影響を受けたこの植物の葉が傷害され、ジャガイモ塊茎を全く、もしくはほとんど形成しなくなる（１９９４年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、１−７におけるリースマイアーらの論稿参照）。再生器官の形成が著しく阻害されるので、適当な除草剤は、植物の生長を抑制するのみでなく、その再生を阻止することが期待される。同様のことは、アンモニウムおよびアミノ酸の輸送蛋白質についても予想され得る。これらは窒素輸送蛋白質の新陳代謝に本質的な機能を果たしているからである。
上述した本質的機能を基礎として、本発明方法の有利な実施態様は、アミノ酸、蔗糖およびアンモニウムの輸送蛋白質を植物に特有な潜在的作用を示す物質を発見するためのターゲット蛋白質として使用する用途を提供する。
分子遺伝学の慣用方法により、輸送蛋白質を符号化する適当な遺伝子を、生物ないし細胞中に導入し、機能し得る輸送蛋白質の発現を保証することができる。
本発明方法の工程（ａ）における生物は、単細胞生物であるのが好ましい。単細胞生物としては、培養が容易に行われ、かつ輸送蛋白質の発現に適当なものが選定される。この目的に特に適するのは、バクテリア、菌類、酵母のような微生物である。しかしながら、各種生物の単一の細胞を使用することもできる。本発明方法において、さらに細胞培養基もしくはカルス培養基中の植物細胞または細胞培養基中の動物細胞、好ましくは卵細胞、ことにＸｅｎｏｐｓ（コウモリガエルなどの無舌類）の卵細胞も有利に使用され得る。植物の輸送蛋白質遺伝子を導入して得られる導入遺伝子細胞またはこれによりもたらされる組換え生物は、全体として本発明の試験システム中に組込まれ、あるいは細胞膜もしくは精製された輸送蛋白質の分離のために使用され得る。本発明は、またこのような組換え生物（バクテリア、菌類、酵母）および遺伝子導入細胞に関する。輸送蛋白質符号化遺伝子が、対応する輸送蛋白質機能を欠除して生長し得ない生物の特定の突然変異体中に追加的に導入され得る（ＥＭＢＯ  Ｊ．１１、４７０５−４７１３、１９９２におけるリースマイアーらの論稿参照）。このような突然変異体の利用は、適当な媒体中における組換え生物の生長を可能ならしめ、輸送蛋白質の機能を計測する尺度として役立ち、また細胞膜輸送蛋白質に対する被験物質の効果を記述するのに役立つ利点を有する。この生長試験は、ことに簡単に行われることができ、被験物質の迅速なスループットをもたらし得る点において特徴的である。従って、前述したような適当な突然変異体、例えば蔗糖輸送体（ＳＵＳＹ７、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１、４７０５−４７１３、１９９２におけるリースマイアーらの論稿）、アミノ酸輸送体（酵母突然変異体２２５７４ｄおよびＪＴ１６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｔ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５９４４−５９４８、１９９３におけるフロマーらの論稿）、酵母突然変異体（ｓｈｒ．３，１９９２、Ｃｅｌｌ、７１、４６３−４７８におけるリュングダールらの論稿）、アンモニウム輸送体（１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、３４６４−３４７１におけるニンネマンらの論稿）を使用するのが好ましい。
適当な輸送蛋白質の遺伝子が本発明において使用され、上述した生物ないし細胞を形質転換する。次いで、組換え生物ないし遺伝子導入細胞は、慣用の微生物学的方法により増殖され、従って無制限に本発明試験システムに使用され得る。段階的方法は、被験物質の除草特性および／または生長制御特性を試験するのに有利である。すなわち、まず組換え生物もしくは遺伝子導入細胞は、適当な媒体中で培養されるが、この場合生長培養基は、媒体中において被験輸送蛋白質を介してのみ細胞内に入ることができ、かつ媒体中において他の培養基により機能的に置換されることがないように適当なものが選定される。例えば蔗糖輸送体の場合には、媒体は唯一の炭素源として蔗糖を含有し、アミノ酸輸送体の場合には、細胞用の唯一の炭素もしくは窒素源としてアミノ酸を含有し、アンモニア輸送体の場合には、唯一の窒素源としてアンモニウムを含有する。被験物質は細胞成長相の間に媒体中に添加されるが、細胞成長は慣用の方法で決定される。
経細胞膜輸送体と物質との特定の相互作用を検知し、生長抑制の原因としての他の作用モードを排除するために、この物質は以下の用途に適合しなければならない。
（１）組換え細胞は、物質を添加しない場合に比べて、物質添加後に顕著な成長低減を示さなければならない。
（２）細胞内輸送体の固有培養基と機能的に置換可能であり、かつ対応する輸送体を介してそれ自体が細胞内に入り込まない他の成長培養基が媒体中に存在する場合には、物質添加後、同じ生物が成長抑制されてはならない。
例えば、酵母細胞は炭素源としての蔗糖でも、またアミノ酸でも成長することができる。また酵母はアミノ酸でもアンモニウムイオンでも窒素源として利用できる。
培養基が上述した用件を充足する場合、これはさらに生化学的に検査され得る。この検査では、天然培養基の、または抑制物質の細胞膜通過が試験される。この目的のために、すべての酵母または分離された細胞膜小胞を使用し得る。輸送体培養基または抑制物質の細胞膜通過は、この培養基または物質を分離された細胞または細胞膜小胞から培養基または物質を分離することにより、あるいはまた慣用の分析方法により検知され得る。原則として、上記培養基または上記物質は、放射線標識された状態で添加され、次いでこの放射線放射による分析される。抑制の形態は、培養基および抑制物質の濃度を変更することにより、慣用の生化学的方法を使用して決定される。また、これにより、さらにこの物質自体が輸送体により輸送されるか否かも検知され得る。
上記物質が上記用件を充足するならば、さらに他の生化学的検査を行い、あるいは行うことなく直ちに、植物もしくは植物の部分に対するその除草作用およびその物質の植物体内の移動性に関する検査が行われる。このために、慣用の植物生物学的および生理学的方法が使用され得る。
本発明は、また本発明方法により同定され、かつ除草作用および／または植物生長制御作用を示す物質、ならびに他の除草剤、生長制御剤、殺線虫剤、殺昆虫剤、殺ダニ剤、殺菌剤および農業上慣用の助剤との混合物ないし組成物に関する。
本発明方法は、また輸送蛋白質により植物細胞膜を通って輸送され得る物質を発見、同定するために使用され得る。本発明またこのようにして同定された物質に関する。この方法は、植物体内をことによく輸送される化学的構造を同定するために使用され得る。この良好な移動性は、除草剤、殺虫剤のような栽培植物保護剤にとってことに望ましい。
本発明方法は、また輸送可能化学的構造を同定するために使用され得る。蔗糖およびアミノ酸の輸送蛋白質は、細胞膜における有機分子のための主要輸送系を代表するものであるから、例えば酵母を利用して有機物質の植物体内における移動性を簡単に試験するために使用され得る。これに関して好ましい方法は、多段階法であって、まず第１に成長試験において、異物質受領を検査する。次いで、さらに詳細な検査のために、これを基礎として、未使用酵母または分離された細胞膜における直接的計測が行われる。輸送蛋白質を持たない酵母は、常に対照として使用され得る。このためには、酵母のほかに、さらに他の生物、好ましくは単細胞生物、ことに動物または植物の培養細胞も使用され得る。
輸送の特定の障害の場合、遺伝子導入酵母の成長低減が認められる。輸送蛋白質を検査することにより、輸送可能であるために物質にどのような特性が必要であるかに関する理解が得られる。これまでに、輸送性欠除の故に殺菌剤として非効果的とされて来た数多くの物質について、化学的に分子構造を変更して、物質のこのような特性を獲得し、上記作用を改善することが可能になり得る。同様にして、分子生物学的方法により、あるいは突然変異により輸送蛋白質を改造して、殺虫剤、除草剤のような農薬を細胞膜を通って輸送し得るようにすることも可能である。この改造された輸送蛋白質は、植物体内に導入され得る。従って、本発明はまた農薬を植物細胞膜を通って輸送するこのような輸送蛋白質の用途に関する。
同様にして、本発明は、例えば蔗糖、アンモニウム、アミノ酸などの輸送蛋白質による植物の輸送機能を抑制し得る農薬、ことに除草剤および生長制御剤に関する。
本発明における試験システムは、有効物質の発見、同定のほかに、他の重要な疑問、例えば、このような蛋白質の構造がどのようになっているのか、どのようにして培養基を認識するのか、この構造がその機能とどのように関連するのか、物質がどのようにして生物体内に分配されるのかなどを研究するためにも使用され得る。上述した輸送蛋白質を分離し、特徴を解明し得た本発明方法は、また他の蛋白質、例えばイオン輸送体、動物器官からの蛋白質の輸送体を分離するためにも使用され得る。
以下の実施例は、本発明の使用態様を限定的にではなく、例示的にさらに具体的に説明する。ここでは、植物の蔗糖、アミノ酸、アンモニウムの輸送蛋白質を使用して、これらに対して抑制効果を有する物質を発見、同定する方法が説明される。
［使用実施例］
実施例１
植物におけるアミノ酸輸送体の機能を抑制する物質の同定
植物におけるアミノ酸輸送体の機能を抑制する物質を発見、同定するために、アミノ酸透過酵素のための遺伝子における突然変異を生成する酵母突然変異体２２５７４ｄ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０、３９−４４、１９９０におけるジョーニオーおよびグレンソンの論稿参照）、およびヒスチジンを受容し得ない酵母突然変異体ＪＴ１６（Ｇｅｎｅ  ３８、２０５−２１４、１９８５におけるタナカおよびフィンクの論稿参照）について、輸送体の探査が行なわれた。これらの突然変異体は、植物のアミノ酸輸送体を符号化し、酵母細胞内に機能的輸送体の発現をもたらすｃＤＮＡ配列で転換される。このｃＤＮＡ配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからのアミノ酸輸送体ＡＡＰ１およびＡＡＰ２を符号化するｃＤＮＡ配列である（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５６４４−５９４８におけるフロマーらおよび１９９３、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．４、９９３−１００２におけるクオートらの各論稿参照）。これら突然変異体の細胞を媒体（ＮＡＡＧ＋プロリン５ミリモル／リットル）中において、２８℃で培養し、対数増殖期（ＯＤ600＝０．６）に採取した。細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、ＡＵＢ緩衝液で２回洗浄した。ＡＵＢ緩衝液中の細胞濃度を２５ＯＤ600に調整した。
使用媒体および緩衝液
ＮＡＡＧ媒体−１．７８／リットルの酵母窒素ベース、ｗ／ｏアミノ酸、アンモニウムサルフェート
ＳＤＧｌｕ媒体−１０ｇ／リットルのグルコース
−２０ｇ／リットルのアガロース
−６．７ｇ／リットルの酵母窒素ベース、ｗ／ｏアミノ酸
ＳＤｓｕｃ媒体−２０ｇ／リットルのグルコース
−２０ｇ／リットルのアガロース
−６．７ｇ／リットルの酵母窒素ベース、ｗ／ｏアミノ酸
−２０ｇ／リットルの蔗糖
−２０ｇ／リットルのアガロース
ＡＵＢ緩衝液−１０ミリモル／リットルのＭＥＳ
−２ミリモル／リットルの塩化マグネシウム
−０．６ミリモル／リットルのソルビトール
１００μリットルの細胞懸濁液を、１００μリットルの１ミリモル／リットルＬ−プロリン溶液（１８．５ｋＢｑのＬ−［１４Ｃ］−プロリン）および種々の濃度の探査されるべき適宜の物質と混合する。それぞれ２０、６０、１２０および１８０秒後に、５０μリットルの試料分を除去し、４ミリリットルの氷冷ＡＵＢ緩衝液中に希釈し、グラスファイバフィルタで濾過する。非特異的Ｌ−［１４Ｃ］−プロリンを除去するため、細胞をそれぞれ４ミリリットルの氷冷水で洗浄する。グラスファイバーに残留する放射能を液体シンチレーションカウンタで測定する。この放射能は細胞により攝取された放射線標識プロリンの量を反映している。潜在的抑制作用を示す物質を添加しない放射線標識プロリン試料は、対照として放射能測定される。植物アミノ酸輸送体を符号化するｃＤＮＡ配列で変換されなかった各突然変異体２２５７４ｄおよびＪＹ１６の細胞は、これもまた対照として使用される。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからアミノ酸輸送体ＡＡＰ２を発現する突然変異体２２４５７ｄ−ＡＡＰ２に関する上記測定の結果を下表に示す。
0003693672.tif 000002
探査のため、株２２４５７ｄの酵母細胞は、アミノ酸輸送蛋白質ＡＡＰ２を符号化するｃＤＮＡ配列で変換され、放射線標識したプロリンの試料を各種被験物質の存在下に放射能測定された。各種被験物質、その濃度、および輸送蛋白質の活性（潜在的抑制効果を示す物質を添加しなかった対照の活性に対するパーセンテイジとして表わされる）が示されている。
アミノ酸輸送蛋白質ＡＡＰ２に対して特に抑制効果を示す物質は、次いで各植物に対する除草効果、生長制御効果につき試験される。
実施例２
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａからの蔗糖輸送体の機能抑制物質の同定ホウレン草から取出された蔗糖輸送体の機能抑制効果を有する物質を発見、同定するために、株ＳＵＳＹ７の酵母細胞（１９９２、ＥＭＢＯ、Ｊ、４７０５−４７１３におけるリースマイアーらの論稿参照）が使用される。この細胞は、ホウレン草の蔗糖輸送体Ｓ２１（ＳｏＵＳＴ１）を符号化し、細胞内に機能的輸送体の発現をもたらすことを保証するｃＤＮＡ配列で転換される。この酵母細胞を媒体（ＳＤ＋２％（ｗ／ｖ）蔗糖、ｐＨ３．８）中において、２８℃で培養し、対数増殖期（ＯＤ600＝０．６）で採取する。この細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＳＤ媒体で２回洗浄する。ＳＤ媒体中の細胞濃度Ｃ＝５０ｇ／リットルを細胞湿潤重量により調整し、２００μリットルの試料分を採取する。実際の反応前に、細胞を１００ｍＢグルコースで５分間培養し、ＭＥＳ緩衝液でｐＨ値を３．８に調整する。ＳＤ媒体（ｐＨ３．８）中に、０．２ミリモル／リットルの［１４Ｃ］−蔗糖溶液（３ｍＣｉ／ミリモル）２００μリットルを添加して、反応を開始させる。それぞれ２０、６０、１２０、１８０および２４０秒後に、細胞懸濁液からそれぞれ７０μリットルを採取し、反応を停止させるために、４ミリリットルの氷水中に注下する。グラスファイバーフィルターで細胞を濾過し、氷水で２回洗浄する。次いでフィルターの放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。被験物質は、蔗糖添加の３０秒前に添加される。潜在的抑制効果物質を添加しない放射線標識蔗糖の試料は対照として使用される。またホウレンソウの蔗糖輸送体を符号化するｃＤＮＡ配列で転換されない株ＳＵＳＹ７の細胞の対照として使用される。このようにして行なわれた測定の結果を下表に示す。
0003693672.tif 000003
各被験物質、その濃度および輸送蛋白質活性（潜在的抑制効果を示す物質を添加しなかった対照の活性に対するパーセンテージで表わされる）が示されている。蔗糖輸送蛋白質Ｓ２１（ＳｏＳＵＴ１）に対して特に抑制効果を示す物質は、次いで各植物に対する除草、生長制御効果につき試験される。蔗糖輸送体機能を抑制する効果を示す、同定された物質中の若干のもの、ことにＰＣＭＢＳは植物に対し除草効果を示した。
実施例３
Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからの蔗糖輸送体の機能抑制物質の同定
ジャガイモから取出された蔗糖輸送体の機能抑制効果を有する物質を発見、同定するために、株ＳＵＳＹ７の酵母細胞（１９９２、ＥＭＢＯ  Ｊ、１１、４７０５−４７１３におけるリースマイアーらの論稿参照）が使用される。この細胞は、ジャガイモの蔗糖輸送体Ｐ６２（ＳｔＳＵＴ１）を符号化し、細胞内に機能的輸送体の発現をもたらすことを保証するｃＤＮＡ配列で転換される。これにより得られる酵母株はＳＵＳＹ−７−Ｐ６２（ＳｔＳＵＴ１）と称される。この酵母細胞を媒体（ＳＤ＋２％（ｗ／ｖ）蔗糖、ｐＨ３．８）中で２８℃において培養され、対数増殖期（ＯＤ600＝０．６）に採取される。この細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＳＤ媒体で２回洗浄する。ＳＤ媒体中の細胞濃度Ｃ＝５０ｇ／リットルを湿潤細胞重量で調整し、２００μリットルの試料分を採取する。実際の反応前に、細胞を１０ｍＭグルコースで５分間培養し、ＭＥＳ緩衝液でｐＨ値を３．７に調整する。ＳＤ媒体中における０．２ミリモル／リットルの［１４Ｃ］−蔗糖溶液（３ｍＣｉ／ミリモル）（ｐＨ３．８）２００μリットルを添加して反応を開始させる。それぞれ２０、６０、１２０、１８０および２４０秒後に、細胞懸濁液からそれぞれ７０μリットルの試料を採取し、反応を停止させるために、４ミリリットルの氷水中に注下する。グラスファイバーフィルターで細胞を濾過し、氷水で２回洗浄する。次いで各試料のフィルターにおける放射能を液体シンチレイションで測定する。蔗糖添加３０秒前に各被験物質を添加する。潜在的抑制作用を示す物質を添加しない放射線標識蔗糖試料は、対照として放射能測定される。また、ジャガイモの蔗糖輸送体を符号化するｃＤＮＡ配列で転換されていないＳＵＳＹ７株の酵母細胞も、対照として使用される。この輸送体測定結果を下表に示す。
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各被験物質、その濃度および輸送蛋白質活性（潜在的抑制効果を示す物質を添加しなかった対照の活性に対するパーセンテージで表わされる）が示されている。
蔗糖輸送体Ｐ６２（ＳｔＳＵＴ１）の機能を抑制する効果を示す、同定された物質中の若干のもの、例えばＰＣＢＭＳは植物に対し除草効果を有する。
実施例４
蔗糖輸送体の培養基特異性の測定
Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）の蔗糖輸送体の発現をもたらす、ＳＵＳＹ７−ｐＰ６２（ＳｔＳＵＴ１）株酵母（１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、５、１５９１−１５９８におけるリースマイアーらの論稿参照）における培養基特異性の検査およびＫｍ値の測定が行なわれる。これは、培養基濃度が変更され、潜在的抑制効果を示す物質を添加しない点を除いて実施例３と同様に行なわれる。背景的活性の対照のため、輸送体の発現をもたらさないＳＵＳＹ７株酵母による［１４Ｃ］−蔗糖の試料を測定する。この酵母は測定時間にわたって測定可能の［１４Ｃ］−蔗糖試料をもたらさない。
試験結果
蔗糖Ｋｍ値              １ｍＭ
マルトースＫｍ値      １０ｍＭ
実施例５
蔗糖輸送体の活性化
Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）の蔗糖輸送体Ｐ６２（ＳｔＳＵＴ１）による蔗糖輸送量は、酵母細胞のグルコース、スタキオースおよびアデニン中での培養による予備的賦活により増大される。輸送体活性の同様な増大が、ｐＨ値を３．８に低減することにより達成される。活性化を決定するための輸送体の測定は、実施例３と同様にして行なわれるが、本実施例において、細胞は、実際の測定前に、１０ｍＭグルコース中における５分の培養ではなく、グルコース、スタキオースおよびアデニンの種々の濃度の溶液中において５分間培養される。測定前にこのような溶液中で培養されない酵母細胞は、対照として使用される。下表は、グルコース、スタキオースおよびアデニンの各種濃度の溶液中における培養により、蔗糖輸送体が活性化される程度を、対照と対比して示す。
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スタキオースは、低濃度で蔗糖輸送を賦活するが、この効果は高濃度出（ｃ＞０．４ミリモル／リットル）では逆転し、低減し始める。アデニンに関しては、アデニン濃度と蔗糖輸送量割合との間に比例関係が認められる。蔗糖輸送体親近性にとって、いずれが優性的なものが重要であるかは、競合試験により示され得る。
実施例６
植物におけるアンモニウム輸送体の機能抑制作用を示す物質の同定
植物のアンモニウム輸送体の機能抑制物質を同定するための輸送量測定は、放射線標識アンモニウムが市販されていないので、構造的に類似するメチルアミンで行なわれる。
この探査のためＮＨ4+透過酵素遺伝子ＭＥＰ１およびＭＥＰ２において突然変異をもたらす、■２６９７２ｃ株の酵母（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、１７５、６７−７６、１９７９におけるデュボアおよびグレンソンの論稿参照）が使用される。
この酵母細胞は、この細胞内に機能的輸送体の発現をもたらすアンモニウム輸送体を符号化するｃＤＮＡ配列により、標準的方法で転換される。これは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの輸送体ＡＭＴ１（１９７４、ＥＭＢＯＪ．１３、３４６４−３４７１におけるニンネマンらの論稿参照）である。この酵母細胞は、ＮＡＡＧ媒体（２％グルコース、１．７ｇ／リットルの酵母窒素ベース、ｗ／ｏアミノ酸およびアンモニウムサルフェート（Ｄｉｆｃｏ）、５０μｇ／ミリリットルのＬ−プロリンを追加）中において２８℃で培養され、対数増殖期（ＯＤ660＝０．６）に採取される。次いで、細胞は４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離され、２０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７で２回洗浄される。同じ緩衝液中でＯＤ660＝８の増殖期における試料が採取される。細胞懸濁液から２００μリットルの試料が採取される。実際の測定が行なわれる５分前に、酵母は１００ｍＭのグルコース添加により活性化され、３０℃で培養される。反応を開始させるため、１００μリットルの細胞懸濁液が１００μリットルの反応混合物（２０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、１８．５ｋＢｑの［１４Ｃ］−メチルアミン（ＮＥＮ）、１００μＭのメチルアミン、被験物質（図４参照）に添加される。反応開始からそれぞれ、１０、６０、１２０および１８０秒後に、それぞれ５０μリットルの試料を採取し、氷冷５ｍＭメチルアミン溶液４ミリリットル中に注下し、グラスファイバーフィルターで濾過した。８ミリリットルのメチルアミン溶液で洗浄してから、このフィルターの放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。同定されるべき輸送機能抑制物質は、グルコース添加の６０秒前に添加される。
潜在的抑制物質を添加しない放射線標識メチルアミンの試料は、対照として放射能測定される。同様の輸送量測定試験が、対照として、転換されない■２６９７２Ｃ株の酵母細胞について行なわれる。
この試験の結果が下表に示される。
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各被験物質、それぞれの濃度および潜在的抑制作用物質を添加しない対照に対するパーセンテージで表わされるそれぞれの活性が示されている。
アンモニウム輸送体ＡＭＴ１に対する機能抑制効果を示す物質が、各種植物に対する除草および生長制御効果に関して検査される。
同定された、アンモニウム輸送体に対する機能抑制物質、例えばメチルアミンは、現実に除草作用を示す。
実施例７
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからのアンモニウム輸送体ＡＭＴ１の培養基特異性の測定
培養基特異性の検査および数値Ｋｍの測定が、植物のアンモニウム輸送体ＡＭＴ１の発現をもたらす酵母株■２６９７２ｃの酵母細胞（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７５、６７−７６、１９７９におけるデュボアおよびグレンソンの論文参照）に関して行なわれる。メチルアミン／培養基温度を変更するほかは、実施例６と同様である。背景的活性の対照のため、上記輸送体の発現をもたらさない酵母株による［１４Ｃ］−メチルアミンの取込み量が測定される。輸送体のアンモニウム親近性を測定するため、種々の濃度のアンモニウムによる、メチルアミンの抑制度を測定する（抑制物質定数Ｋｉ）。
メチルアミンのＫｍ              ６５μＭ
アンモニウムのＫｉ            ＜１０μＭ