(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安水処理活性汚泥から抽出、精製したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸分子をプライマーとして用いたＰＣＲにより、前記安水処理活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子の数量を調べ、当該遺伝子の数量が、少なくとも１０６コピー／ｍＬである場合に、安水処理活性汚泥の状態を良好であると診断することを特徴とする安水処理活性汚泥の診断方法。
【請求項２】
請求項１に記載の安水処理活性汚泥の診断方法を用いる安水処理活性汚泥の操業管理方法であって、前記カテコール分解酵素の遺伝子の数量が１０６コピー／ｍＬ未満である場合に、当該案水処理活性汚泥に、カテコール分解酵素の遺伝子の数量が１０６コピー／ｍＬ以上の安水処理活性汚泥を加えることを特徴とする安水処理活性汚泥の操業管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安水処理活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子の検出に基づく安水処理活性汚泥の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製鉄所においてコークス炉から発生する安水には、フェノール類、チオシアン、チオ硫酸等の環境上好ましくない成分や、高濃度のアンモニアが含まれている。現在の安水処理システムでは、ＣＯＤ成分となるフェノール類等の有機物や、チオシアン、チオ硫酸等の硫黄化合物は、活性汚泥法で生物処理されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
コークス炉から排出される安水の中に最も高濃度に含まれるＣＯＤ成分は、フェノール類である。生物処理によるフェノールの分解では、フェノールは、まず、水酸化酵素によって初発酸素添加を受けて、中間反応生成物質であるカテコールに変換されることが知られている（非特許文献２参照）。このカテコールの分解は、芳香環を開裂する反応であるため、進みにくい反応であると考えられており、フェノールの分解反応においても、カテコールの芳香環の開裂反応が、反応律速になっていると考えられている。
【０００４】
特に、安水の生物処理は、高濃度のアンモニアや硫黄化合物等を含む特殊な環境条件で進むので、安水処理で機能するカテコール分解酵素は、従来から知られているカテコール分解酵素とは異なる特異な酵素群であることが、明らかにされた（特許文献１、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−３０１７１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shaw,K.C.(1993)Biological treatment of full-strength coke plant wastewater at Genova Steel.,Iron and Steel Engineering ,29-32.
【非特許文献２】Smith,M.R.(1990)The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria., Biodegradation 1,191-206.
【非特許文献３】伊藤ほか（２００９）メタゲノム解析を利用した安水含有フェノール分解関連酵素の解析、用水と廃水、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．９、７６１−７６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
安水の活性汚泥処理は、活性汚泥中で安水に含まれるＣＯＤ成分の分解に機能する酵素が良く分かっていなかったため、ブラックボックスとして操業管理されてきた。安水の活性汚泥処理において、最大のＣＯＤ成分であるフェノールの分解を安定に行うこと、特に、フェノールの分解で律速になると考えられる、芳香環の開裂反応、すなわち、カテコールの分解反応を安定に行うことは、安水の活性汚泥処理の操業において極めて重要と考えられる。しかしながら、活性汚泥のカテコールの分解のポテンシャルを定量的に判定して、安水活性汚泥処理の状態を診断する方法がこれまで確立されてこなかった。
【０００８】
安水は、製鉄所から発生する排水の中で、有機物起因のＣＯＤ成分を最も多く含む排水であるとともに、石炭由来の硫黄化合物も多く含む。したがって、活性汚泥の微生物に悪影響を及ぼすことも懸念される。
【０００９】
活性汚泥の微生物がダメージを受け、浄化機能が悪化すると、安水の浄化処理が滞るので、製鉄所の操業にも大きな影響を及ぼす可能性がある。したがって、安水処理活性汚泥の状態を簡便に診断できることは、製鉄所の操業にとって極めて重要と考えられる。
【００１０】
このような事情を踏まえ、本発明は、安水処理活性汚泥の状態を簡便に診断できる診断方法及びこれを用いた安水処理活性汚泥の操業管理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の課題を解決するため、本発明者らは、安水活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子を検出、定量することにより、安水処理活性汚泥を診断する方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明の要旨とするところは、次の（１）〜（３）である。
【００１３】
（１）安水処理活性汚泥から抽出、精製したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸分子をプライマーとして用いたＰＣＲにより、前記安水処理活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子の数量を調べ、当該遺伝子の数量が、少なくとも１０６コピー／ｍＬである場合に、安水処理活性汚泥の状態を良好であると診断することを特徴とする安水処理活性汚泥の診断方法。
【００１５】
（２）前記（１）の安水処理活性汚泥の診断方法を用いる安水処理活性汚泥の操業管理方法であって、前記カテコール分解酵素の遺伝子の数量が１０６コピー／ｍＬ未満である場合に、当該案水処理活性汚泥に、カテコール分解酵素の遺伝子の数量が１０６コピー／ｍＬ以上の安水処理活性汚泥を加えることを特徴とする安水処理活性汚泥の操業管理方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、簡便な手法で、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子を検出、定量できるので、安水処理活性汚泥の状態診断が可能となり、安水活性汚泥処理の安定操業に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で用いたバッチ試験反応槽
【図２】実施例２で用いた安水活性汚泥処理装置
【図３】実施例２における処理水の残存ＣＯＤの推移
【発明を実施するための形態】
【００１８】
まず、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸分子について説明する。配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列は、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の塩基配列及び相補鎖の塩基配列に相補的な塩基配列である。
【００１９】
配列番号１の塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２の塩基配列からなる核酸分子は、例えば、合成ＤＮＡとして用意することができる。本発明では、配列番号１に示される塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸分子をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして使用する。
【００２０】
以下、安水処理活性汚泥から、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子を検出、又は、定量するための具体的な方法について説明する。以下に示す方法は、あくまで一例であり、本発明で用いられる方法は、以下の例に限られるものではない。
【００２１】
まず、安水処理活性汚泥から全ＤＮＡを抽出、精製する。活性汚泥からの全ＤＮＡ抽出方法には、フェノール、クロロホルムによる抽出、精製等、さまざまな方法が適用可能である。なるべく高い効率で、簡便かつ安定して活性汚泥から全ＤＮＡを抽出するために、例えば、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて全ＤＮＡを抽出、精製する方法等がある。
【００２２】
次に、抽出、精製した全ＤＮＡの量を分光光度計の２６０ｎｍの吸光度により定量する。より正確に二本鎖構造を維持しているＤＮＡ量を定量するためには、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、蛍光光度計（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）を用いてＤＮＡを定量することも可能である。
【００２３】
次に、上記の安水処理活性汚泥から抽出、精製したＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示される塩基配列からなる核酸分子、及び、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸分子をプライマーとして用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ後の反応生成物を、例えば、アガロースゲル電気泳動することにより、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子のＤＮＡ断片を検出することができる。
【００２４】
さらに、定量ＰＣＲによって、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を測定することも可能である。定量ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲにより、下記の解析条件で実施することが可能である。
【００２５】
定量ＰＣＲの反応系としては、例えば、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＴａＫａＲａ）、配列番号１の塩基配列からなるＰＣＲプライマー、配列番号２の塩基配列からなるＰＣＲプライマー、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）、安水処理活性汚泥から抽出したＤＮＡを混合したＰＣＲ反応液を用いて、例えば、以下の条件でＰＣＲ反応を行う。
【００２６】
９５℃、３０秒でホットスタート後、ＰＣＲ反応として９５℃、１０秒、６３℃、１５秒、７２℃、１０秒を５０回繰り返し。次いで、９５℃、１５秒後、４０℃、１５秒とした後、０．２℃毎秒で温度を９５℃まで上昇させ、次いで４０℃で１２０秒間冷却する。
【００２７】
リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲのサイクル数に依存して、増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ断片に取り込まれたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（励起波長５２１ｎｍ、蛍光波長４９４ｎｍ）の蛍光により、蛍光強度が増加する。したがって、蛍光強度をモニタリングすることにより、増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ断片の量を知ることが可能となる。このリアルタイムＰＣＲの結果から、安水処理活性汚泥に特徴的な、カテコール分解酵素の遺伝子の量を算出することができる。
【００２８】
以上のように、定量ＰＣＲにより、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を定量することが可能である。安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量は、例えば、安水処理活性汚泥１ｍＬあたり何コピー存在するか、で表すことができる。
【００２９】
本発明者らは、複数の製鉄所の安水処理活性汚泥において、この活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を調べた。その結果、遺伝子の数量が、活性汚泥１ｍＬあたり１０６コピー未満の場合、活性汚泥のフェノール分解活性が不調となることを見出した。したがって、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量は、少なくとも１０６／ｍＬであることで、安水処理活性汚泥のフェノール処理活性が十分に機能することを診断することが可能である。
【００３０】
安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量が、１０６／ｍＬ未満である場合には、例えば、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量が１０６／ｍＬを十分に超えている他の安水処理活性汚泥を加えることにより、遺伝子の数量を１０６／ｍＬ以上に高めることが可能である。
【００３１】
上記のような方法で、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を１０6／ｍＬ以上に維持することが可能であり、安水活性汚泥処理を安定に操業管理することが可能となる。
【００３２】
また、安水処理活性汚泥槽に何らかの悪影響を及ぼす水、物質等が混入して安水処理活性汚泥にダメージを与えた際においても、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を１０６／ｍＬ以上に復活させることを指標に、例えば、上記のような方法により活性汚泥を復旧させることが可能となり、安水活性汚泥処理を安定に操業管理することが可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例により、限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（安水処理活性汚泥の診断）
フェノール分解活性が良好な、７種類の異なる安水処理活性汚泥（Ａ〜Ｇ）、及びフェノール分解活性が不調な３種類の異なる安水処理活性汚泥（Ｈ〜Ｊ）を、それぞれ製鉄所の安水処理活性汚泥槽から採取した。採取した各安水処理活性汚泥を遠心分離により沈降した活性汚泥を回収した。
【００３５】
図１に示すバッチ試験装置の水槽に、表１の組成のフェノールをＣＯＤ成分とする、海水：蒸留水＝１．５：１の希釈海水を用いて調製した、模擬安水１Ｌを入れ、さらに上記の遠心分離により回収した活性汚泥９０ｇを添加し、２５℃において、空気で２４時間曝気処理した。
【００３６】
活性汚泥の添加により、バッチ試験反応液のＭＬＳＳは、通常安水処理活性汚泥が操業される条件と同程度のＭＬＳＳであり約５０００ｍｇ／Ｌであった。２４時間後、処理水をバッチ試験槽から回収して、孔径１μｍのろ紙を用いてろ過した液について、処理水に残存するＣＯＤを過マンガン酸法（ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２  １７）により分析した。
【００３７】
【表１】
0005640462.tif 000002
【００３８】
また、各安水処理活性汚泥に含まれる、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の定量を以下のように実施した。
【００３９】
採取した各安水処理活性汚泥０．５ｍＬから、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、全ＤＮＡを抽出、精製し、５０μＬの精製ＤＮＡを得た。これら精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した後、ＴＥバッファーを用いて各精製したＤＮＡの濃度を１０（ｎｇ／μＬ）に揃えた。
【００４０】
これら各活性汚泥から抽出、精製したＤＮＡを、定量ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲプライマーには、配列番号１に記載の塩基配列からなる合成ＤＮＡ及び配列番号２に記載の塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。表２にＰＣＲ反応液の組成、表３にＰＣＲ反応条件を示す。なお、遺伝子の数量を定量するための標準試料として、クローニングされた安水処理活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子を用いた。
【００４１】
【表２】
0005640462.tif 000003
【００４２】
【表３】
0005640462.tif 000004
【００４３】
表４に、上記のバッチ試験による残存ＣＯＤの測定結果と、定量ＰＣＲによる、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の定量結果を示す。
【００４４】
【表４】
0005640462.tif 000005
【００４５】
上記のように、計１０か所の異なる安水処理活性汚泥を試験した結果、７種類の安水処理活性汚泥（Ａ〜Ｇ）では、フェノール由来のＣＯＤ成分の分解活性が良好であり、カテコール分解酵素の遺伝子の数量は、いずれも活性汚泥１ｍＬあたり１０６コピーを超える量存在することが確認された。したがって、安水処理活性汚泥の状態が、カテコールの分解に関して良い状態にあると診断された。
【００４６】
一方、３種類の安水処理活性汚泥（Ｈ〜Ｊ）では、フェノール由来のＣＯＤ成分の分解活性がよくなく、フェノール由来のＣＯＤ成分が２４時間処理後でも１ｍｇ／Ｌ以上、処理水中に残存することが判明した。カテコール分解酵素の遺伝子の数量は、いずれも活性汚泥１ｍＬあたり１０６コピー未満しか存在しないことが確認された。したがって、安水処理活性汚泥の状態が、カテコールの分解に関して良くない状態にあると診断された。
【実施例２】
【００４７】
（安水処理活性汚泥の管理）
図２に示した容積２．７ｍ３の活性汚泥槽で流量１．３Ｌ／ｍｉｎでＨＲＴ３６時間の条件で、表１の組成の模擬安水の処理を行った。経時的に処理水中の残存ＣＯＤを測定した。図３に示すように、運転開始後１２６日目から１５４日目にかけて処理水の残存ＣＯＤが徐々に増加し、活性汚泥の性能の悪化が起こった。そこで、運転開始後１５４日目の、活性汚泥に含まれる、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子の数量を以下のようにして調べた。
【００４８】
安水処理活性汚泥０．５ｍＬからＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、全ＤＮＡを抽出、精製し、５０μＬの精製ＤＮＡを得た。これら精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した後、ＴＥバッファーを用いて各精製したＤＮＡの濃度を１０（ｎｇ／μＬ）に揃えた。これら各活性汚泥から抽出、精製したＤＮＡを、定量ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。
【００４９】
ＰＣＲプライマーには、配列番号１に記載の塩基配列からなる合成ＤＮＡ及び配列番号２に記載の塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。ＰＣＲ反応液の組成及びＰＣＲ反応条件は、表２、表３に示したものと同様とした。なお、遺伝子の数量を定量するための標準試料として、クローニングされた安水処理活性汚泥に含まれるカテコール分解酵素の遺伝子を用いた。
【００５０】
その結果、活性汚泥中に、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子が２．２×１０５コピー存在しており、１×１０６コピー未満に低下していることが明らかになった。そこで、運転開始後１５７日目に、本酵素の遺伝子を１．７×１０７コピー含む別の安水処理活性汚泥を、上記の活性汚泥に加えて、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子が１．３×１０６コピー存在する活性汚泥とした。
【００５１】
その結果、図３に示すとおり、運転開始後１６１日目の以降の処理水の残存ＣＯＤは再び低下して、以降、活性汚泥は安定して機能した。したがって、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素遺伝子の活性汚泥中の数量を１．０×１０６コピー／ｍＬ以上に維持することにより、安水処理活性汚泥を安定に操業管理できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、簡便な手法で、安水処理活性汚泥に特徴的なカテコール分解酵素の遺伝子を検出、定量できる。その結果、安水処理活性汚泥の状態診断が可能となり、安水活性汚泥処理の安定操業に貢献することができる。したがって、例えば、安水を活性汚泥法で処理する製鉄所の安定操業に貢献することができるので、産業上の利用可能性は大きい。
【符号の説明】
【００５３】
１    空気ブロワー（０．５Ｌ／分）
２    散気管
３    撹拌プロペラ
４    試験槽（容積２Ｌ）
５    原水槽
６    ポンプ（流量１．３Ｌ／ｍｉｎ）
７    活性汚泥槽（容積２．７ｍ3）
８    散気管
９    空気ブロワー
１０    処理水槽
【図１】
0005640462.tif 000006
【図２】
0005640462.tif 000007
【図３】
0005640462.tif 000008
【配列表】
0005640462000001.app