(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、分子量が約７６ｋＤａ及びエンドグリコシダーゼ処理後の分子量が約６７ｋＤａであり、分化した軟骨細胞から得られるが脱分化した軟骨細胞からは得られない、コンカナバリンＡ結合性軟骨細胞膜蛋白質（ＣＭＰ）。
【請求項２】
（ａ）単離した軟骨細胞から膜蛋白質を選別する工程、
（ｂ）この膜蛋白質を、コンカナバリンＡ以外のレクチンのアフィニテイカラムを通す工程、
（ｃ）コンカナバリンＡアフィニテイカラムを通して、コンカナバリンＡ結合性糖蛋白質を分離する工程、
（ｄ）工程（ｃ）のコンカナバリンＡ結合性糖蛋白質からＣＭＰを単離する工程、
（ｅ）グラジュエントゲルから約７６ｋＤａの分子量のバンドを切り出す工程、
からなる、請求項１のＣＭＰの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、軟骨細胞の分化に係わる新規な糖蛋白質に関する。本発明による新規な糖蛋白質は軟骨細胞の分化のマーカーとしても使用できる。
【０００２】
【従来の技術】
動物の軟骨組織は軟骨細胞（chondrocytes）と細胞間基質（matrix）により構成されている。軟骨組織は胎生期の骨格の大部分を占めており、出生後は軟骨性骨化により、骨組織に置き換わってゆく。軟骨性骨化を開始するにあたって、軟骨細胞は静止軟骨細胞から増殖軟骨細胞となり、ついで肥大性軟骨細胞に分化していく（文献；津田ら編集「骨の科学」１９８２年、東京医歯薬出版、p.11〜29）。このように軟骨細胞は特に成長期の骨組織形成にとって必須な細胞であることがよく知られてきた。しかし軟骨細胞の分化や軟骨性骨化についてはまだ未解明の領域が多い。
【０００３】
他方、ヤン（Yan）ら（Yan et al.；J. Biol. Chem., vol.265, p.10125〜10131, 1990）及び加藤ら（加藤ら、日本骨代謝学会雑誌、vol.10, No.2, p.187〜192, 1992）は種々のレクチンの軟骨細胞の分化、増殖に対する効果を調べ、中でもタチナタマメレクチンでありα−Ｄ−マンノース残基およびα−Ｄ−グルコース残基に親和性を有するコンカナバリンＡ（concanavalin A）が軟骨細胞の分化を強く促進することを、プロテオグリカン（proteoglycan）の合成を増大させることなどを指標として明らかにしている。しかし、コンカナバリンＡが軟骨細胞の細胞膜上のどのような受容体分子と結合し、その刺激をどのように細胞内の核などの標的部位に伝えるのかなど、そのメカニズムについてはいまだ不明な点は多い。
【０００４】
さらに軟骨細胞は、過剰のレチノイン酸（retinoic acid、ビタミンＡに同じ）を添加することにより、形態が分化した軟骨細胞特有の球形細胞から線維芽細胞様の伸展能が増加し偏平な広がった細胞形に変化し、また生化学的にも軟骨細胞の分化マーカーであるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の合成能が失なわれるなど、いわゆる脱分化型の細胞に変化することが知られている（文献；津田ら前出、及びBenya et al.；Develop. Biol., vol．118, p.296〜305, 1986）。しかし、コンカナバリンＡに対する軟骨細胞の反応性と軟骨細胞の分化との関係についてもまだ報告はない。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
したがって、軟骨細胞の分化に関連する物質を明らかにすることは、軟骨細胞の機能の制御、及びゆくゆくは骨形成の促進をつかさどる物質の発明につながるものであり、このような物質は新しいタイプの軟骨代謝性疾患および骨代謝性疾患の治療、予防、診断につながるものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、軟骨細胞の強力な分化促進活性を有するコンカナバリンＡに結合する軟骨細胞膜上の新規な膜糖蛋白質を取得することを試みた。また得られた蛋白質について、軟骨細胞の分化との関連をレチノイン酸の添加により、もはや軟骨細胞特有の性質も失った脱分化細胞との比較実験から明らかにし本発明を完成させた。
【０００７】
軟骨細胞の材料としては、種々の動物の軟骨組織を使うことができるが、例えばウサギの肋軟骨成長板を材料として、加藤らの方法（Kato et al.；J. Cell Biol., vol．100, p.477〜485, 1985）に従い、プロテアーゼ及びコラゲナーゼ処理により軟骨細胞を得ることができる。この分離された軟骨細胞は培養皿でウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地で５％ＣＯ2、９５％空気の環境下で３７℃で培養できる。この軟骨培養細胞を回収しホモジナイザーで破砕し、１７％／４０％のショ糖平衡密度勾配による沈降平衡遠心により、膜蛋白を分取することができる。得られた膜蛋白画分を直接にコンカナバリンＡ・アフィニティカラムに展開するか、または、あらかじめコンカナバリンＡ以外のレクチンに結合する膜蛋白を除くために、例えば、代表的なレクチンである小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）のアフィニティカラムに一旦展開した後、コンカナバリンＡ・アフィニティカラムに展開する等の方法を使うことにより、コンカナバリンＡ結合蛋白分画をさらに分取することができる。種々の濃度のレチノイン酸で誘導した脱分化型軟骨細胞を作成し、これら脱分化型細胞からもコンカナバリンＡ結合蛋白分画を分取する。この得られたコンカナバリンＡ結合蛋白の軟骨細胞に対する特異性は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、これらの分画を比較することで検討できる。目的とする軟骨細胞に特異的な糖蛋白質が特定できたらゲルから目的のバンドを切り出し、エレクトロエリューション等により抽出精製し、エンドグリコシダーゼを用いて糖蛋白質の糖質を分析できる。さらにＮ末端からのアミノ酸配列及びペプチドマッピングにより内部アミノ酸配列を決定して、従来知られていた蛋白質及びＤＮＡの配列と比較することにより、その新規性を判断することができる。
【０００８】
本発明により、得られる軟骨細胞に存在するが軟骨細胞が脱分化した細胞には存在しない、コンカナバリンＡ結合性蛋白質は、次の特性を有するＣＭＰと名付けられた新規な蛋白質である。
（１）  分子量：約７６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより）及びエンドグリコシダーゼ処理により約６７ｋＤａとなる
（２）  アミノ末端アミノ酸配列：配列表配列番号１及び内部アミノ酸配列：配列表配列番号２〜５
【０００９】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に示す実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  ＣＭＰの精製
（１）  軟骨細胞の分離培養
軟骨細胞としてはウサギの軟骨細胞を用いた。生後４週令のニュージーランドウサギの肋軟骨成長板を外科的に摘出し、加藤らの方法（前出）に基づいて、肋軟骨成長板をトリプシンおよびコラゲナーゼ処理することにより軟骨細胞を分離した。この方法によりウサギ一羽当たり約４×１０6個の軟骨細胞が得られた。これらの細胞を、培養面積５００ｃｍ2の培養皿当たり約８×１０5個播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を１００ｍｌ加え、３７℃で５％ＣＯ2、９５％空気の気相下にて培養した。
【００１０】
（２）  軟骨細胞の膜蛋白質画分の分取
（１）で得た軟骨細胞をコンフルエントになるまで培養し、培養した軟骨細胞を培養皿に接着した状態にて生理的食塩水で２回洗浄したのち、スクレーパー（Scraper）にて細胞を回収した。回収した細胞を４倍量の細胞破砕用緩衝液（０.２５Ｍショ糖、５ｍＭ ＭＯＰＳ／ＫＯＨ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μＭ ペプスタチン）で懸濁し、氷上でホモジナイザー（ポリトロン社製）にて細胞を破砕した。
【００１１】
その細胞破砕液を、テフロン棒を用いてガラスホモジナイザーにてさらに細かく細胞を破砕したのち、４℃、１０５,０００×ｇで１時間遠心し、遠心上清を除いた。その沈澱に同細胞破砕用緩衝液を２４ｍｌを加え懸濁し、さらにもう一度ガラスホモジナイザーとテフロンペッスルにて細胞破砕を行った。この細胞破砕液を、遠沈管に予め用意してあった１７％／４０％のショ糖平衡密度勾配の溶液に重層し、４℃にて２００,０００×ｇで１.５時間沈降平衡遠心を行った。その後、１７％ショ糖と４０％ショ糖の境界面に分離された膜蛋白質を分取した。
【００１２】
（３）  コンカナバリンＡ結合糖蛋白質画分の分取
上記の膜画分を、画分に存在するショ糖を除くために以下の操作に付した。
上記の膜画分を緩衝液（５ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７.４）で希釈した後、４℃にて１００,５００×ｇで１時間遠心分離し、遠心上清を除いた。その沈澱を１％デオキシコール酸を含有する溶解用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１０μＭ ＡＰＭＳＦ、１０μＭ ペプスタチン）にて溶解した。
【００１３】
次に、コンカナバリンＡに特異的に結合する糖蛋白質を得るため、この溶液からコンカナバリンＡ以外のレクチンである小麦胚芽レクチンに結合する画分を除いた。すなわち、この溶液を溶解用緩衝液にて予め平衡化しておいた小麦胚芽レクチン―ＷＧＡ―セファロース６ＭＢカラム（４ｃｍ×２.５ｃｍ ファルマシア社製）に展開し、結合しなかった画分を回収した。
【００１４】
その後、小麦胚芽レクチンセファロースカラムに結合しなかった画分を、溶解用緩衝液にて予め平衡化しておいたコンカナバリンＡ―セファロースカラム（５ｃｍ×１.５ｃｍ ファルマシア社製）に展開し、同カラムを同緩衝液にて洗浄した後、結合した糖蛋白質を０.５Ｍ メチル−α−マンノピラノシドを含む同緩衝液にて溶出した。
【００１５】
その溶出画分を透析チューブに封入したのち透析用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１０μＭ ＡＰＭＳＦ、１０μＭ ペプスタチン）に対して透析後、限外ろ過膜（セントリコン アミコン社製）で濃縮した。
【００１６】
濃縮した試料をラムリ（Lammli）の方法に基づいて４％／２０％のグラジュエントゲルにて還元条件下で電気泳動を行った。蛋白質の同定は、クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）あるいは銀染色（２Ｄ−銀染色試薬・II、第一化学薬品(株)）により行った。その結果、分子量の異なる２０種類以上の糖蛋白質の存在が確認された。
【００１７】
（４）  グラジュエントゲルにより分離したＣＭＰのゲルからの抽出
上記の電気泳動により分離された蛋白質のうち、約７６ｋＤａの分子量を有するバンドをＣＢＢ染色または銀染色しない状態でゲルごと切り出し、エレクトロエリューター（バイオラッド社製、アメリカ）を用いて目的の蛋白質をゲルより抽出した。
【００１８】
以上の操作により、約７６ｋＤａの分子量を有する均一な糖蛋白質が得られ、chondrocyte membrane protein、略してＣＭＰと名付けられた。
【００１９】
（５）  ＣＭＰの糖鎖の分析
エンドグリコシダーゼＨ（EndoＨ)、エンドグリコシダーゼＦ（EndoＦ)及びＮ−グリコシダーゼＦ（ＮＧＦ）(Boehringer Mannheim Biochemica社, Germany）を用いて糖蛋白ＣＭＰと反応させることによって、糖鎖の分析を行った（C. Maillard et al.; Bone vol.13, pages 257−264, 1992）。２０μｌのEndo Ｈ反応液（８ｍＵ EndoＨ，５０ｍＭ sodium phosphate ｐＨ５.６, ５０ｍＭ ＥＤＴＡ, ０.５ｍＭ ＰＭＳＦ）、EndoＦ反応液（４０ｍＵ EndoＦ，５０ｍＭ sodium phosphate ｐＨ５.６, ５０ｍＭ ＥＤＴＡ, ０.５％ nonident P40，２％ ＳＤＳ，１％ ２−mercaptoethanol）及びＮＧＦ反応液（５ｍＵ ＮＧＦ，４５ｍＭ potassium phosphate，ｐＨ７.４，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.５％ nonident P40，２％ ＳＤＳ，１％ ２−mercaptoethanol）にそれぞれに精製したＣＭＰ ０.５μｇを加え、３７℃で５時間あるいは一晩中インキュベートした。対照として酵素を含まない緩衝液で行った。試料を３分間ボイリングした後ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質の分析を銀染色で行った。その結果を図２に示す。
【００２０】
図２はＣＭＰのエンドグリコシダーゼ処置した後のパターンを示す。レーン１と１２はそれぞれ高分子と低分子のマーカーで、レーン２は精製したＣＭＰを示す。レーン３、６と９は各種のエンドグリコシダーゼのパターンで、レーン４、７、１０及びレーン５、８、１１はＣＭＰがEndoＨ、ＮＧＦ、EndoＦと３７℃で５時間あるいは一晩中反応させた後のパターンを示す。EndoＨ及びＮＧＦの処置によってＣＭＰの分子量は７６ｋＤａから６７ｋＤａに減少した。しかし、EndoＦはＣＭＰ分子量の変化には影響がなかった。
【００２１】
〔実施例２〕  ＣＭＰのアミノ末端のアミノ酸配列および内部アミノ酸配列の決定
（１）  ＣＭＰのアミノ末端のアミノ酸配列決定
ＣＭＰのアミノ末端のアミノ酸配列は以下の方法により決定した。すなわち、実施例１（３）の操作により得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、１％酢酸、０.２％ポンソーＳにて染色し各蛋白質のバンドを確認し、膜上に印を付けた。その後、染色された膜を０.５ｍＭの水酸化ナトリウム溶液にて脱色し、ＣＭＰが転写された部分のＰＶＤＦ膜を切り出し、アミノ酸分析装置（アプライドバイオシステム社製、アメリカ）によりアミノ末端アミノ酸配列を決定した。
【００２２】
配列表配列番号１に、決定したアミノ末端のアミノ酸配列を示す。配列表中のｘｘｘはアミノ酸残基が決定されなかったことを示す。
【００２３】
（２）  ＣＭＰの内部アミノ酸配列決定
ＣＭＰのペプチドマッピングは「マイクロシークエンスのための微量蛋白質精製法」（Academic Press Inc., 1989）に基づいて行った。２０μｇのＣＭＰに４５ｍＭジチオスレイトールを含む８Ｍ尿素−０.４Ｍ重炭酸アンモニウムｐＨ８.０溶液５０μｌを加え５０℃で１５分間インキュベートした。更に１００ｍＭ iodoacetamide ５μｌを添加し室温で１５分間放置し、カルボキシメチル化した。上記の試料に１４０μｌの水を加え３ｍＵ／ｍｇのトリプシンを添加し３７℃で２４時間インキュベートした。ペプチドマッピングはμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８逆相カラムを用いたＳＭＡＲＴTMシステム（Pharmacia Inc., Sweden）上で行われた。ペプチドの溶出は勾配０％〜１００％アセトニトリル（０.１２％ＴＦＡ）、０.１ｍｌ／minの流速で波長２１５ｎｍの条件下で検出された。４−ペプチド断片を分離し各々Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４と名付け、アミノ酸分析装置（４７６Ａプロテインシークエンサー、アプライドバイオシステムズ社）によりアミノ酸配列を決定した。
【００２４】
配列表配列番号２にペプチド断片Ｔ１のアミノ酸配列を示す。配列表配列番号３にペプチド断片Ｔ２のアミノ酸配列を示す。配列表配列番号４にペプチド断片Ｔ３のアミノ酸配列を示す。配列表配列番号５にペプチド断片Ｔ４のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
〔実施例３〕  軟骨細胞およびレチノイン酸により脱分化され生じた線維芽細胞様細胞に存在するＣＭＰの比較
実施例１（１）により分離した軟骨細胞をレチノイン酸で処理し、線維芽細胞様細胞に脱分化させた。すなわち、実施例１（１）で得た軟骨細胞の培養液に最終濃度が０、０.０１μＭ、０.１μＭ、１μＭになるようにエタノールに溶解したレチノイン酸を加え９６時間培養した。
【００２６】
軟骨細胞は細胞伸展能が弱く球形の形態をとるが、レチノイン酸の添加により、脱分化され線維芽細胞様細胞になることに伴い、伸展能が増加し偏平な広がった細胞形態となった。この形態の変化により、脱分化が起こったか否かが確認し得、本実験においても脱分化が確認された。また脱分化の程度は、レチノイン酸の濃度および処理時間に依存して起こることも確認された。
【００２７】
上記のように各濃度のレチノイン酸を添加して培養した軟骨細胞のそれぞれについて、実施例１（２）の方法に従い細胞を回収し、膜蛋白質画分を得た。さらに、実施例１（３）の方法によりコンカナバリンＡ結合性糖蛋白質画分を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその泳動パターンを比較した。結果を図１に示す。
【００２８】
図１は、軟骨細胞および脱分化して生じた線維芽細胞様細胞に存在するＣＭＰの比較を示す。レーン１はレチノイン酸無添加の場合の電気泳動パターンを、レーン２、３、４はそれぞれレチノイン酸を最終濃度が０.０１μＭ、０.１μＭ、１μＭになるよう培地に添加した場合の電気泳動パターンを示す。レーンの左端に分子量を示す。レーンの右端にＣＭＰを存在位置を分子量と共に示す。
【００２９】
これにより添加したレチノイン酸の濃度に依存してＣＭＰが消失することが確認された。脱分化にともない、すなわち線維芽細胞様細胞に脱分化されることに伴いＣＭＰが消失した。
【００３０】
〔実施例４〕  抗ＣＭＰ抗血清の作製
実施例１（４）においてＣＭＰを含むゲルのバンドをゲルごと切り出し、ホモジナイズした後、マウスに皮下投与した。投与後３週間目に一部採血し、ＣＭＰに対する抗体価が充分高くなっていることを確認した後、血清を採取し、抗体ＣＭＰ抗血清を得た。
【００３１】
〔実施例５〕  種々の臓器でのＣＭＰの存在の確認試験
ＣＭＰが軟骨細胞に特異的に発現していることを、実施例４で得た抗ＣＭＰ抗血清によるウエスタンブロッティング法で、種々の臓器又は細胞を用いてさらに検討した。即ち、ウサギより腎臓、肝臓、脳、精巣、腸管、脾臓の６種の臓器及びウサギ培養線維芽細胞から各々実施例１（２）の方法により膜蛋白質画分を得た。それぞれの膜蛋白質画分についてウエスタンブロッティングにより、ＣＭＰの存在の有無を調べたところ、いずれも存在せず、ＣＭＰが軟骨細胞に対し特異性の高い蛋白質であることが確認された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により提供されるＣＭＰは、軟骨細胞の分化に関連する物質で、軟骨細胞の機能の調整および軟骨性骨化の調整に関連する物質であり、このような物質は新しいタイプの軟骨代謝性疾患および骨代謝性疾患の治療、予防、診断などに利用できる新規な糖蛋白質である。
【００３３】
【配列表】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】コンカナバリンＡ結合性糖蛋白画分の電気泳動パターンを示す図。
【図２】糖を除去したＣＭＰの電気泳動パターンを示す図。
【図１】
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【図２】
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