(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形成されたマイクロ流体デバイスのクリーニング方法であって、
分析対象の核酸及び／又はタンパク質と、前記分析対象以外の不純物成分とを含む試料が接触した流路を、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが８〜１０である緩衝液中に含むクリーニング液に接触させることによってクリーニングする、マイクロ流体デバイスのクリーニング方法。
【請求項２】
前記ポリマー皮膜は、前記シラノール基とシランカップリング剤とを介して、流路表面
に形成されているものである、請求項１に記載のクリーニング方法。
【請求項３】
前記緩衝液中に３〜８Ｍのタンパク質変性剤をさらに含む、請求項１〜２のうちのいずれかに記載のクリーニング方法。
【請求項４】
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形成されたマイクロ流体デバイスのクリーニング方法であって、
分析対象の核酸及び／又はタンパク質と、前記分析対象以外の不純物成分とを含む試料が接触した流路を、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが２〜４である緩衝液中に含むクリーニング液に接触させることによってクリーニングする、マイクロ流体デバイスのクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細加工したマイクロ流体デバイス（マイクロチップ）中で行う、マイクロチップＬＣやマイクロチップ電気泳動に関する。
本発明は、使用後のマイクロチップのクリーニング方法及びクリーニング液に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の特徴的な配列を利用したアッセイは、年々増加する傾向にあり、特に、シングル又はマルチプレックスＰＣＲ産物、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる制限酵素消化物、ＳＮＰ解析などのジェノタイピング、ＰＣＲ反応条件検討、リアルタイムＰＣＲ測定後の反応液の分析などを、簡便で迅速且つ低コストで行いたいという要求が強い。
【０００３】
その要求に対して、アガロースゲル電気泳動に代わり、マイクロチップ電気泳動法が非常に適した手法となりつつある。特に分離検出時間が1〜2分と極めて短い上に、アガロースゲル電気泳動では識別が不可能だった高精度な分離を行うことが可能であり、また、数値データとして表示・保存ができる点が特長である。さらに、ＰＣＲプレートの反応液を精製したり希釈したりすることなく、そのまま装置にセットすることができれば、操作性は格段に向上する。
ただし、微細加工されたマイクロチップ（例えば特許文献１）は高価であるため、ランニングコストの点で、使い捨てよりも再利用することが好ましい。
【０００４】
マイクロチップ再利用のための洗浄方法としては、試料の電気泳動終了毎に、マイクロチップのリザーバ及び流路内を洗浄し、泳動バッファー、分離媒体及び試料などの除去を行う方法が行われている（例えば非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２１４７１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】株式会社島津製作所  MultiNA  取扱説明書  装置システム編
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
PCRプレートの増幅産物をそのまま電気泳動装置にセットし、マイクロチップ電気泳動にかける場合、サンプル中には、DNAポリメラーゼ、プライマーDNA、動物・植物由来のターゲットDNA、dNTPの他、DNAポリメラ−ゼの活性を維持するためにKClやMgCl2が共存する。さらにPCR反応バッファー中には効率的なDNA増幅が行われるように、非イオン性界面活性剤や、アガロースゲル電気泳動の使用を前提としたローディング色素及び比重増加剤が予め混合されている場合がある。制限酵素が入るアッセイでは、BSAやベタイン等が含まれることも珍しくない。これらのうち、サンプル中に含まれるタンパク質、塩基性又は疎水性化合物は、マイクロチップ表面がガラス・石英・樹脂その他、材料によって程度の差はあっても基本的には表面に吸着する傾向があり、マイクロチップを繰り返し利用する場合は、分離特性が経時的に変化するリスクが残る。一方、クルードなサンプルを精製または希釈することにより、流路表面への影響を軽減することは可能であるが、反応生成物に対する操作が追加されるため簡便さを損なうことになる。
【０００８】
これまでは、使用後のマイクロチップは、水を用いて洗浄され、再利用されてきた。しかしながら、上述の通り様々な成分の吸着により、マイクロチップの性能の回復が不十分となる場合がある。
そこで、本発明の目的は、マイクロチップの性能を回復することが可能なクリーニング法及びクリーニング液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、極性有機溶媒ベースのクリーニング液を用いることによって上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
【００１０】
（１）
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形
成されたマイクロ流体デバイスのクリーニング方法であって、
分析対象の核酸及び／又はタンパク質と、前記分析対象以外の不純物成分とを含む試料
が接触した流路を、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが８〜１０である緩衝液中に含むクリーニング液に接触させることによってクリーニングする、マイクロ流体デバイスのクリーニング方法。
（２）
前記ポリマー皮膜は、前記シラノール基とシランカップリング剤とを介して、流路表面
に形成されているものである、請求項１に記載のクリーニング方法。
【００１１】
（３）
前記緩衝液中に３〜８Ｍのタンパク質変性剤をさらに含む、（１）〜（２）のいずれか
に記載のクリーニング方法。
【００１２】
（４）
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形成されたマイクロ流体デバイスのクリーニング方法であって、
分析対象の核酸及び／又はタンパク質と、前記分析対象以外の不純物成分とを含む試料が接触した流路を、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが２〜４である緩衝液中に含むクリーニング液に接触させることによってクリーニングする、マイクロ流体デバイスのクリーニング方法。
【００１３】
（５）
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形成されたマイクロ流体デバイス用のクリーニング液であって、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが８〜１０である緩衝液中に含む、マイクロ流体デバイスクリーニング液。
（６）
前記緩衝液中に３〜８Ｍのタンパク質変性剤をさらに含む、（５）に記載のクリーニング液。
（７）
流路表面にシラノール基と、流路表面に共有結合したポリマー皮膜とを有する流路が形成されたマイクロ流体デバイス用のクリーニング液であって、
５０体積％以上の、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有する有機溶媒を、ｐＨが２〜４である緩衝液中に含む、マイクロ流体デバイスクリーニング液。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、マイクロチップの性能を回復することが可能なクリーニング法及びクリーニング液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マイクロチップ流路表面と流路近傍の成分との相互作用を模式的に示す。
【図２】クリーニングされるマイクロチップの一例を示す。
【図３】クリーニング前及びクリーニング後のマイクロチップを用いたエレクトロフェログラムを比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［１．マイクロ流体デバイス（マイクロチップ）］
本発明においてクリーニングの対象となるマイクロ流体デバイスの流路構成又はデザインは特に限定されるものではなく、核酸及び／又はタンパク質を含む液体の保持及び輸送を行うことができるものであればよい。
マイクロ流体デバイスの素材は石英、ガラス、樹脂など、特に限定されない。それらは光学特性の観点から透明性の高いものが望ましい。特に、本発明のクリーニング方法及びクリーニング液は、表面にシラノール基を有する材質の場合に有効である。
マイクロ流体デバイスには流路が形成されており、流路はポリマー皮膜の表面処理がなされている。
【００１７】
［１−１．ポリマー皮膜］
ポリマー皮膜は、核酸やタンパク質を含む試料の分離環境を提供する親水性基を有しうるものであり、流路表面を試料や分離バッファーとの相互作用から保護するものでありうる。流路内で核酸やタンパク質を含む試料の電気泳動分離を行う場合、電気浸透流を抑制を目的とするものでもあり、流路内で核酸やタンパク質を含む試料のクロマトグラフィによる分離を行う場合においては、分離用担体、分離用固定相でもありうる。
【００１８】
ポリマー皮膜は、流路表面への吸着によるもの及び共有結合によるものを問わない。
ポリマー皮膜が流路表面への共有結合によるものである場合、そのような皮膜の一態様においては、流路表面に、二官能性基の一方の官能基が共有結合し、前記二官能性基の他方の官能基が有機系皮膜（単分子膜）を形成するポリマーと共有結合している。このようなポリマー皮膜は、二官能性化合物を流路表面に接触させて一方の官能基を前記表面へ共有結合させた後、モノマーを加えて他方の官能基と重合させることによって行われうる。この場合、二官能性化合物としては、流路表面にシラノール基を有する材質の場合、γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラン、ビニルトリ（β−メトキシエトキシ）シラン、ビニルトリクロロシラン、メチルビニルジクロロシランなどのシランカップリング剤が挙げられる。また、上記モノマーとしては、アクリル、アクリロイル、メタクリル、アリル、ビニル及びアクリルアミドモノマーなどが挙げられる。上記モノマーは、さらに、アミノ基、水酸基、ピロール基などの親水性基を置換基として有しうる。特に、本発明のクリーニング方法及びクリーニング液においては、流路表面がｐＫａ８〜１０である共重合ポリマーの皮膜を有する場合に、ポリマー皮膜の帯電が抑制され、静電相互作用による流路内成分の吸着を防ぐことが可能となり有効である。
【００１９】
ポリマー皮膜が流路表面への吸着によるものである場合、そのような皮膜は、ポリマーの塗布によって、又は、単に分離バッファーにポリマーを混合させ、流路表面に分離バッファーを接触させることで前記ポリマーを吸着させることによって、上記ポリマーの皮膜を流路表面上に形成することによって作成されうる。
【００２０】
液体クロマトグラフィが行われるマイクロ流体デバイスにおいても、流路表面のシラノール基に疎水性官能基を有するシリル化剤を化学結合させた分離担体の他、アルカリ耐性を向上させたりタンパク質の吸着を軽減させることを目的とした水溶性ポリマーの皮膜を有するものが適用可能である。水溶性ポリマーの例としては、メチルセルロース、ポリオキシエチレンなどが挙げられる。
【００２１】
［１−２．流路］
マイクロ流体デバイスは、流路が形成されたものであればよく、必ずしもサイズの小さいものに限定されるものではない。流路は、一般的に、溶液の移動とともに分析が行なわれる主流路が含まれうる。例えば電気泳動工程が行われる分離用流路を含む電気泳動流路、液体クロマトグラフィ工程が行われる分離用担体を含む送液流路、及び、分離用固定相としての表面修飾を有する送液流路などが挙げられる。さらに、主流路に通じる試料及び／又は移動相導入路が形成されていてもよい。それぞれの流路は、複数形成されていてよい。
【００２２】
［１−３．具体例］
図２は、マイクロ流体デバイスの一例として、電気泳動用マイクロチップを示したものである。
図２に示されるように、このマイクロチップ１は一対の透明基板（石英ガラスその他のガラス基板や樹脂基板）１１，１２からなり、一方の基板１２の表面に、（Ｂ）に示されるように、互いに交差する泳動用キャピラリ溝１４，１５を形成し、他方の基板１１には、（Ｃ）に示されるように、その溝１４，１５の端に対応する位置にリザーバ１３を貫通穴として設け、両基板１１，１２を（Ｃ）に示すように重ねて接合し、キャピラリ溝１４，１５を試料の電気泳動分離用の分離流路１５と、その分離流路に試料を導入するための試料導入流路１４とする。
マイクロチップ１は基本的には図２（Ａ）〜（Ｃ）に示したものであるが、取扱いを容易にするために、図２（Ｄ）に示されるように、電圧を印加するための電極端子を予めチップ上に形成したものでありうる（実施例において後述）。
【００２３】
［２．試料等由来成分の吸着］
本発明は、使用済みのマイクロ流体デバイスに用いられる。マイクロ流体デバイスの使用履歴としては、分離媒体やインターカレータ蛍光色素を含む電気泳動バッファーが封入されたか、核酸及び／又はタンパク質を含む試料が流路表面に接触した経緯があれば特に限定されない。核酸やタンパク質は分析対象となりうるものである。上記試料は、分析時において、移動相又は分離用バッファーなどとともに流路表面に接触しうる。
【００２４】
［２−１．吸着成分］
核酸を含む試料及び移動相には、分析対象としての核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の他に、例えば、分析対象以外の核酸成分、酵素、安定化剤、比重増加剤、蛍光色素などの成分が、塩とともに、緩衝液中に含まれうる。これら成分が、マイクロ流体デバイスの流路表面に不純物として吸着しうる。
【００２５】
より具体的には、酵素としては、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素などが挙げられる。
分析対象以外の核酸成分としては、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）などが挙げられる。
安定化剤としては、グリセロール、タンパク質、界面活性剤、ベタインなどが挙げられる。界面活性剤としては、Tween 20、Nonidet P-40、Brij-35、Triton X-100などが挙げられる。安定化剤としてのタンパク質としては、ＢＳＡが挙げられる。
蛍光色素としては、ローディング色素としてブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、オレンジGなどが挙げられ、インターカレータとしてエチジウムブロマイド、SYBR Gold、SYBR Green、SYBR Safe、GelStarなどが挙げられる。
【００２６】
核酸を含む試料は、例えば核酸増幅反応の結果得られるものでありうる。核酸増幅反応はＰＣＲに代表されるが、この他にも様々な反応が当業者に知られている。ＰＣＲを例に挙げた場合、そのバリエーションとしては、通常のＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、コロニーＰＣＲその他あらゆる態様が含まれる。また、反応液のスケール（反応液量）、増幅産物量も特に限定されない。また、核酸を含む試料は、核酸増幅反応の後、精製工程及び／又は希釈工程を経たものであってもよいし、そのような工程を経ていないものであってもよい。
【００２７】
［２−２．吸着の想定メカニズム］
マイクロ流体デバイスに形成された流路にて、DNA分子の電気泳動分離を行う場合を例に挙げて説明を行う。ＤＮＡ分子を含む試料及び分離バッファーが流路表面に接触する際、基本的にＤＮＡ分子は、流路表面と相互作用せずに、インターカレータとして作用しうる蛍光色素と結合しながらＤＮＡの負電荷で泳動され、分離バッファー中の水溶性ポリマーの篩い分け効果により分離される。この場合、流路内に存在する様々な成分は、例えば図１に模式的に示すように、流路表面との間及び／又は上記成分同士の間で生じうる様々な相互作用によって吸着しうる。図１は、表面にシラノール基を有する流路であって、シランカップリング剤としてγ-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランを使用し、この有機官能基とアクリルアミドのラジカル共重合反応により、リニアポリアクリルアミド（ＬＰＡ）の皮膜処理を行った流路表面を有するマイクロ流体デバイスを用い、ＤＮＡを含む試料をｐＨ８．３の分離バッファーで電気泳動を実施した場合に、流路表面と試料及び分離バッファー含有成分の相互作用を模式的に示している。
【００２８】
泳動条件が例えばｐＨ８．３である場合、流路表面には遊離のシラノール基が残存しているため、バッファー中のSYBR Goldがイオン結合により吸着したり、塩基性成分が吸着したりしうる。酵素や、ＰＣＲ反応などの安定化剤として含まれうる非イオン性界面活性剤やBSAは流路表面に共有結合したシランカップリング剤との疎水性相互作用により吸着しうる。
さらに、リニアポリアクリルアミド（ＬＰＡ）はｐＫａが８．０〜１０．０であると考えられ、ｐＨ８付近であるバッファーや水洗浄により正電荷を持ちうる状態が想定され、ＤＮＡ分子やＢＳＡなどが静電気的に吸着しうる。
なお、図１に示す吸着の想定メカニズムは、主要な相互作用を図示したのみであり、実際には、図１に上げた成分以外の成分（グリセロール、制限酵素など）が流路内に共存し、各種相互作用が働いていると考えられる。
【００２９】
［３．クリーニング液］
［３−１．極性有機溶媒ベースクリーニング液］
これらの吸着成分を取り除くため、本発明においては、１００％極性有機溶媒からなるクリーニング液、又は、５０体積％以上、好ましくは７０体積％以上の極性有機溶媒が水又は緩衝液に溶解したクリーニング液を流路表面に接触させる。極性有機溶媒の量が上記範囲を下回ると、本発明のクリーニング効果が得られにくくなる傾向にある。
本発明における極性有機溶媒は、２５℃において少なくとも同体積の水への溶解性を有するものである。具体例として、アルコール及び／又はアセトニトリルが挙げられる。アルコールとしては、特に、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが用いられる。
このようなクリーニング液は、疎水性相互作用を緩和しうるため、例えば、流路表面のシランカップリング剤の疎水性部分と相互作用しうるタンパク質や安定化剤などを除去することが可能である。
【００３０】
［３−２．アルカリ性クリーニング液］
上記のクリーニング液が緩衝液を含む場合、緩衝液は、例えば、ｐＨが８〜１０、好ましくは８．３〜８．９でありうる。
緩衝液としては、トリス塩酸バッファー、トリス酢酸バッファー、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-エタンスルホン酸）バッファー、ＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸）バッファー、ＴＡＰＳ（N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸）バッファー、リン酸バッファー等を用いることができる。
【００３１】
ｐＨ８〜１０といったアルカリ域では、流路表面のポリマー皮膜の帯電を抑えうるため、流路表面と静電気的相互作用を有しうる核酸成分（例えばＤＮＡ）やタンパク質（例えばＢＳＡ）などを除去することが可能である。
緩衝液のｐＨが上記範囲を下回ると、上述の効果が得られにくくなる傾向にある。緩衝液のｐＨが上記範囲を上回ると、シランカップリング剤が加水分解を起こし、ポリマー皮膜に不可逆的なダメージを与えるうる傾向にある。
このクリーニング液は、基本的に、本明細書に例示するどのような使用履歴を経たマイクロ流体デバイスに対しても使用することが可能である。
【００３２】
［３−３．変性剤含有クリーニング液］
上記のクリーニング液には、さらに、変性剤を含ませることができる。変性剤としては、例えば、水素結合の安定性を壊す尿素やグアニジン塩が挙げられる。グアニジン塩としては、塩酸グアニジンやグアニジンイソチオシアナートなどが挙げられる。変性剤の濃度としては、緩衝液中に３〜８Ｍ、好ましくは６〜８Ｍでありうる。また、有機溶媒と緩衝液との混合液中に３〜８Ｍ、又は６〜８Ｍであってもよい。グアニジン塩を用いる場合、グアニジン塩に加えて、還元剤としてのジチオスレイトールを共存させてもよい。
このような変性剤によってタンパク質が高次構造を失い、ポリペプチド鎖に解離することにより吸着を緩和しうる。このため、そのような変性剤を含むクリーニング液によって、流路表面に吸着しうるタンパク質（例えばＢＳＡ、酵素）を除去することが可能である。
ただし塩濃度が高過ぎると調製しにくくなる上、結晶が残る場合は微細流路内に詰まる恐れがあるので注意が必要である。
【００３３】
［３−４．酸性クリーニング液］
一方、上記のクリーニング液が緩衝液を含む場合、緩衝液は、例えば、ｐＨが２〜４、好ましくは２．５〜３．５でありうる。
酸性域では流路表面に残存するシラノール基の解離が抑制されるため、酸性のクリーニング液によって、流路表面の解離シラノール基にイオン結合しうる正電荷を有する蛍光色素や塩基性化合物を除去することが可能である。
ポリアクリルアミドは、緩衝液のｐＨが上記範囲を下回ると、アミドの加水分解が起こってポリカルボン酸構造となり、分離特性（選択性）に影響を与える可能性がある。
【００３４】
［４．クリーニング方法］
クリーニングの方法としては、流路表面にクリーニング液を接触させることができる方法であれば特に限定されるものではない。マイクロ流体デバイスに試料や移動相または分離バッファーを導入する方法と同じ方法を用いて、流路にクリーニング液を満たせばよい。例えば、ポンプなどの圧送手段でデバイス流路内に連続的にクリーニング液を一定容量通液する方法、又は、前記手段でクリーニング液を圧送して流路をクリーニング液で満たした後、デバイスを前記のクリーニング液中に一定時間浸漬する方法などが挙げられる。
【００３５】
クリーニングの時間は特に限定されないが、流路表面に吸着した成分を効果的に除去するために、上述の通液する方法であれば例えば流量２０〜５００μＬ／分で０．１〜４時間、好ましくは５０μＬ／分で１〜２時間、上述の浸漬する方法であれば例えば２〜４８時間、好ましくは６〜１８時間程度の時間をかけることが好ましい。
クリーニングを行う際の温度としては特に限定されず、室温（例えば２０℃±１５℃）で行うことができる。
【００３６】
上記試料及び移動相または分離バッファーの組成などによって、流路表面に残存する成分及びその量が変わりうるため、クリーニングの回数および頻度（すなわち、マイクロ流体デバイスで何分析使用された後に何回クリーニングするのが適切であるか）については限定されるものではない。例えば、数十〜数百回（例えば２０回〜５００回）使用する毎に定期的にクリーニングを行うことができる。
【００３７】
より具体的には、例えば、通常の核酸増幅反応（PCR反応スケール50uL、増幅産物量５ｎｇ／μＬ程度）の場合で水洗浄による再生を行うことにより１００回〜５００回程度使用した後に、本発明によってクリーニングを行うことができる。また、増幅産物量が多い(５０ｎｇ／μＬ以上）場合、特に吸着傾向の強いポリメラ―ゼ量が多い場合や安定化剤、比重増加剤濃度が高い場合には、分析毎にまたは数十分析（例えば２０〜５０分析）毎に本発明によるクリーニングを行うことができる。
【００３８】
所定のクリーニング回数および頻度で定期的にクリーニングを行う自動クリーニング機能を装置内に組み込み、タイムスケジュールに従って処理してもよい。定期的にクリーニングを行うことにより、マイクロ流体デバイスの性能を最大限維持させることが可能になる。
クリーニング液は、吸着していると考えられる成分に応じて選択することができる。この際、上述の３−１〜３−４の記載に基づいて選択することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下において、クリーニング液の組成を表すための％で示される量は、容量百分率を示す。
【００４０】
１．マイクロ流体デバイス（マイクロチップ）
核酸を含む試料の電気泳動分析の繰り返し使用により、性能が劣化したマイクロチップ135個（のべ数）を供試サンプルとした。このマイクロチップは、具体的には図２（Ｄ）に模式的に示されるものである。図２（Ｄ）には使用したマイクロチップ１の平面図を示したものである。マイクロチップ１は石英製基板により構成され、リザーバ１３は流路１４，１５に電圧を印加するためのポートでもある。ポート＃１及び＃２は試料導入流路１４の両端に位置するポートであり、ポート＃３及び＃４は分離流路１５の両端に位置するポートである。各ポートに電圧を印加するために、このチップ１の表面に形成された電極パターン２１〜２４がそれぞれのポートからマイクロチップ１の側端部に延びて形成されており、電気泳動用高圧電源部に接続されるようになっている。流路１４、１５内壁は、表面に、シランカップリング剤としてのγ-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランを介して、ＬＰＡの皮膜を有している。
【００４１】
用意した１３５個のマイクロチップの使用履歴について、マイクロチップが供された分析の種類は、１３５個中１２３個は核酸を含む試料の分析であり、次の５種のカテゴリーに分けられた。
i）通常ＰＣＲ産物量（ＢＳＡを含まない反応系によるもの）の分析、
ii）通常ＰＣＲ産物量（ＢＳＡを含む反応系によるもの）の分析、
iii）ＰＣＲ−ＲＦＬＰにより得られた生成物（未精製且つ未希釈のもの）の分析、
iv）大量ＰＣＲ産物量（過剰のポリメラーゼを含む反応系によるもの）の分析
v）インターカレータであるSYBR Goldを過剰量使用した分析
【００４２】
なお、通常ＰＣＲ産物量は５ｎｇ／μＬ程度、大量ＰＣＲ産物量（例えばマルチプレックスＰＣＲによるもの）５０ｎｇ／μＬ以上である。過剰のポリメラーゼとは、前記の大量ＰＣＲ産物量を生じさせるために必要なＰＣＲ系を構築する量のポリメラーゼである。過剰量のインターカレータとは、例えば10,000倍希釈より高濃度のインターカレータである。
【００４３】
123個のマイクロチップからランダムに選択した、29個をクリーニング液A（クリーニング液の組成については後述する。）で、25個をクリーニング液B で、47個をクリーニング液Cで、22個をクリーニング液Dでクリーニングした。但し、クリーニング液Dでクリーニングした22個のうち5個は、クリーニング液Cでのクリーニングによっても性能が回復しなかったものである。
【００４４】
135個中残り12個のマイクロチップが供された分析は、核酸の電気泳動分析用の精製されたDNAラダーの電気泳動分析、もしくは、核酸の電気泳動分析用の標準物質の電気泳動分析である。この12個をクリーニング液Eでクリーニングした。
【００４５】
２．クリーニング液
以下の組成を有するクリーニング液Ａ〜Ｅを調製した。
Ａ：メタノール100%
Ｂ：エタノール100%
Ｃ：エタノール70%、及び、1mM EDTAを含む10mM TAPS-NaOHバッファー (pH8.9) 30%
Ｄ：エタノール70%、及び、1mM EDTAと8M グアニジン-HClとを含む10mM TAPS-NaOHバッファー (pH8.9) 30%
Ｅ：アセトニトリル70%、及び、0.1M NaClO4を含む20mM リン酸(Na)バッファー(pH2.5) 30%
【００４６】
３．流路のクリーニング手順
クリーニング液Ａによるクリーニングは、通液法によって行った。通液法によるクリーニングは、送液用ポンプ（液体クロマトグラフィー用ポンプやシリンジポンプ等）を使用して、ポート♯4からポート♯1〜3へ、50μL/分の一定流量で80分間送液を行う手順により行った。
【００４７】
クリーニング液Ｂ〜Ｅによるクリーニングは、浸漬法によって行った。浸漬法によるクリーニングは以下の手順で行った。
(1)   1mL ディスポシリンジでクリーニング液をチップのポート#4から0.2mL圧入した。
(2)  ポート#1〜#3に溢れたクリーニング液はそのまま吸引せずに、ファルコンチューブ(10mLまたは50mL)に入れたクリーニング液中にチップを浸漬した。
(3)  そのまま、18〜24時間静置した。
(4)  チップをクリーニング液から取り出し、1mLディスポシリンジでミリQ水をポート#4から0.2mL以上圧入した。溢れた水は吸引除去し、ベンコットでチップ表面を拭き取った。（チップ表面に塩が残留し、ベンコットが石英表面で滑らない場合は、再度、表面を水で軽く拭き取った）
(5)  チップをチップフレームにセットし、MultiNA上でチップ洗浄を行う。
【００４８】
４．性能評価
島津製作所製マイクロチップ電気泳動装置MultiNAを用い、DNA-1000オンチップモード、TEバッファーブランク分析(6分析/チップ)の分析条件下で、（a）〜（b）のグループのチップの性能評価を行った。
【００４９】
本分析条件についての詳細は以下のとおりである。
使用した試薬キット：島津製作所製  DNA-1000（適用DNAサイズレンジが100bpから1000bp）
分析モード：オンチップ混合モード（サンプルと内部標準マーカをチップ上で自動混合する分析モード）
性能評価に使用したサンプル：TEバッファー（ブランク分析であり、検出されるピークは、内部標準マーカ2種類（低分子側内部標準マーカ、高分子側内部標準マーカ）の2ピークのみである）
分析数：24分析（6分析/チップ）（装置は、チップが4個までセットでき、4チップを交互にチップ当り6分析繰り返し分析するスケジュールを作成した）
【００５０】
５．クリーニング効果
表１に、各クリーニング液におけるクリーニング効果を回復率(%)（すなわち、クリーニングに供したチップ数に対する性能回復したチップ数の割合）と高分子側内部標準ピークの理論段数平均値（av.）及び泳動時間（平均値）によって示す。
マイクロチップの性能回復の定義としては、高分子側内部標準（以下、UMともいう）ピークの理論段数が80,000以上、且つ、UMの泳動時間（すなわち分離開始からUMピークが検出されるまでの時間）が123秒以下であることとした。チップの劣化が認められない初期性能を維持した状態では、上述の性能評価の条件におけるUMピークの理論段数は80,000以上、泳動時間は113±10秒である。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
図３に、クリーニング前後のエレクトロフェログラムの比較を示したものを示す。図３は、上記表１に記載のうちクリーニング液Ｃを用いた場合を挙げて示したものである。4つのフェログラムは4つのマイクロチップに対応し、第1のピークは低分子側の内部標準マーカ、第2のピークは高分子側の内部標準マーカを示す。クリーニング前は、第2ピークが拡がり、泳動時間が遅くチップ間のばらつきが大きいのに対して、クリーニング後は、ピーク拡がりが改善され、泳動時間が速く揃っている。
【００５３】
(a) （クリーニング液Ａによるクリーニングの評価結果）
29チップ中15チップで性能が回復した。また、UMの泳動時間がクリーニング前の平均123.0秒の遅延傾向から平均118.1秒に改善した。
(b)（クリーニング液Ｂによるクリーニングの評価結果）
25チップ中11チップで性能が回復した。また、UMの泳動時間がクリーニング前の平均122.1秒から平均118.0秒に改善した。
(a)及び(b)の結果より、100%極性有機溶媒によるクリーニングによって50%程度の回復率が得られた。このことから主として疎水性相互作用により流路表面に吸着した成分が除去できたと推察される。
【００５４】
(c) （クリーニング液Ｃによるクリーニングの評価結果）
47チップ中42チップで性能が回復した。また、UMの泳動時間も平均121.2秒から117.0秒に改善し、91%の回復率が得られた。このことから、極性有機溶媒による疎水性相互作用による吸着成分の除去に加えて、pHをアルカリに変化させることにより、静電気的相互作用による吸着成分の除去も効果的に行えたと推察される。
(d) （クリーニング液Ｄによるクリーニングの評価結果）
22チップ中16チップで性能が回復した。UMの泳動時間は平均119.4秒に対して118.1秒であり特に有意な差は認められなかった。22チップには、クリーニング液Cにより回復しなかった5チップが含まれており、これらがいずれもクリーニング液Dで回復したことから、サンプル成分に含まれるタンパク質成分（例えばBSAや制限酵素）が変性剤によりポリペプチド鎖に解離した結果、洗浄効果が上がったものと推察される。
【００５５】
(e) （クリーニング液Ｅによるクリーニングの評価結果）
12チップ中6チップで性能が回復した。また、UMの泳動時間も平均114.0秒から108.2秒に短縮された。クリニーング液Eによるクリーニングを施した12チップは、上述の通りPCR産物、PCR-RFLP生成物等の核酸を含む試料の分析履歴を持たない。これより、分離バッファーに含まれていたSYBR Goldの吸着が性能劣化の主な原因と思われるマイクロチップに対しては、シラノール基へのイオン結合を抑制する処置(pH2.5)に一定の効果が見られたと推察される。
【００５６】
以上より、有機溶媒ベースのクリーニング液が試料由来の吸着成分を除去し、一時的に性能が劣化したチップの回復に一定の効果を奏することが示された。
【００５７】
さらに供試個数を427個に増やして同様に本発明のクリーニング法を行い、表２に、本発明によるマイクロチップのクリーニング法の概略を示す。クリーニング液としてはB〜Eを使用し、クリーニングを施したマイクロチップの使用履歴としては上述のカテゴリーｉ）〜ｖ）の分析に供したマイクロチップである。クリーニング液B 〜Eのクリーニング効果を、マイクロチップの使用履歴毎に効果の程度をまとめた。なお、「顕著な効果あり」は、回復率が50%以上であった場合をいい、「効果あり」は、回復率が25〜50%であった場合をいい、「有意な効果なし」は、回復率が25%以下であった場合をいう。当業者であれば、表２をもとに、マイクロチップの使用履歴に応じて適当なクリーニング液の組成を選択することが可能である。
【００５８】
【表２】
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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