(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブリ腹水症ウイルス（Yellowtail ascites virus）構造遺伝子セグメントＡのｃＤＮＡ断片をバキュロウイルスへ組み込んだ組換えバキュロウイルスを昆虫細胞もしくは昆虫である宿主に感染させ、該感染宿主に発現されるブリ腹水症ウイルス抗原物質を含む、ブリのブリ腹水症ウイルス感染防御のための、ブリ腹水症ウイルスサブユニットワクチン。
【請求項２】
宿主が、昆虫細胞である請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
宿主が、カイコである請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
ブリ腹水症ウイルス構造遺伝子のセグメントＡのｃＤＮＡ断片を、バキュロウイルスへ挿入して組換えバキュロウイルスを得る工程、
昆虫細胞または昆虫である宿主に該組換えウイルスを感染させる工程および、
該宿主においてブリ腹水症ウイルス抗原物質を発現させる工程を含む、ブリ腹水症ウイルスサブユニットワクチンの製造方法。
【請求項５】
宿主が昆虫細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
宿主が、カイコである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれかに記載のブリ腹水症ウイルスサブユニットワクチンを、感染防御の対象とするブリへ投与することを含む、ブリのブリ腹水症ウイルス感染防御方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、様々な動物において疾患を誘導するビルナウイルスの抗原物質、該抗原物質の製法、該抗原物質を有するビルナウイルスサブユニットワクチン、および該ワクチンを用いるビルナウイルスの防御方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
魚類養殖の分野においては天然海域における漁獲が減少し、養殖漁業に対する期待が高まっている。わが国の養殖漁業の生産量は約１４０万トンであり、魚病による損失率は低く見積もっても１０％、金額ベースで約７００億円と推定される。
今日養殖漁業が直面する最も重要な課題は魚の感染症対策である。従来からの予防法、即ち抗生物質の投与や化学薬剤の使用、飼育法の改良、病害耐性種の開発等はある程度は機能している。しかしながら、抗生物質や化学薬剤の使用については限度がありまた、残存する薬品自体の毒性の問題がある。また、病害耐性種の育成には莫大な時間と投資が必要となる。従って、養殖漁業の分野においては有効な魚病ワクチン、特にウイルス感染症に対するワクチンが待望されている。
ここで、ワクチンには一般に３種の基本形がある。
【０００３】
１）不活性化ワクチン
細菌やウイルスを感染防御抗原の免疫原性を残したままホルマリンなどで不活化したワクチンである。細菌性の魚病に対してはいくつかの不活化ワクチンが開発され、優れた効果をあげ、実用化されている。しかしながら、ウイルス病の不活化ワクチンについては、現時点では製造原価が高すぎ、水産業で使用するには採算性の問題がある。
【０００４】
２）弱毒化ワクチン
試験管内または異なる宿主で繰り返し育成して毒性を弱めたワクチンである。弱毒化ワクチンは、ヒトの小児麻痺ワクチン等、医薬品の分野では厳重な管理の下、安全なワクチンが製造、使用されている。しかしながら、毒性の戻りの問題があり、特に養殖等のコストをそれほど掛けられない場合には実用上大きな問題となる。また目的とする魚類には無害であっても他の海洋生物には何らかの影響を及ぼすことも考えられ、安心して使用できない。
【０００５】
３）サブユニットワクチン
ウイルス表面の主要感染抗原を含むワクチンである。目的とする抗原性部位の遺伝子をクローニングし、これを培養細胞等で発現させて得られる。ウイルスの抗原性部位のみをコードし、毒性部分をコードしないように発現させることができれば、上記２種のワクチンとは異なり、安全なものを得ることができる。
【０００６】
ビルナウイルスファミリーに属するウイルスは、様々な動物において疾患を誘導することが知られている。魚類においては、腹水症の原因となるYellowtail Ascites Virus (YAV)や、ウイルス性変形症ウイルスViral Deformity Virus (DVD)、伝染性膵臓壊死ウイルスInfectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV)などが知られている。また、家禽類に感染する伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)および昆虫に感染するDrosophila Xウイルスもまた、ビルナウイルスのファミリーである。
【０００７】
ビルナウイルスに対する防除手段としては、従来より不活化ワクチンを用いる方法が主流である。しかしながら不活化あるいは弱毒化ワクチンには、上述のごとき様々な問題があり、特に魚類の養殖など、高いコストパフォーマンスが必要となる場では実用に耐え得るとは言い得ない。
【０００８】
ビルナウイルスファミリーのウイルスはそれぞれが、非常に類似したゲノム構成および複製サイクルを有することが知られている。このウイルスのゲノムは２つのセグメント、セグメントＡおよびセグメントＢの二本鎖ＲＮＡから構成される。セグメントＡは、ＶＰ２、ＮＳ、ＶＰ３タンパク質コード部位がこの順で含まれるポリタンパク質をコードし、このポリタンパク質はプロテアーゼＮＳによるタンパク質分解により開裂して、成熟タンパク質ＶＰ２およびＶＰ３を提供する。このＶＰ２およびＶＰ３は、ビルナウイルスのキャプシドタンパク質を構成する。キャプシドの主成分は、Ｖ２であり、このタンパク質が中和抗体の誘導に寄与する抗原領域を含むと考えられている（E. Tarrab et al., J. Gen. Virology (1995) 76, 551-558)。しかしながら、ＶＰ２あるいはＶＰ３タンパク質を遺伝子組換え法により発現させて得た抗原物質を用いて免疫処理を施しても、ビルナウイルスのワクチンとしての効果が得られず、実用に供するには至らなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価で大量生産の可能な、ビルナウイルス抗原物質、該抗原物質を有するビルナウイルスサブユニットワクチンおよびこれらの製造方法を提供する。本発明は、さらに該ワクチンを用いるビルナウイルスの防除方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ビルナウイルスセグメントＡのｃＤＮＡをバキュロウイルスベクターに組み込んでリコンビナントバキュロウイルスを作製し、これを宿主へ感染させて発現させて得られるタンパク質が、ビルナウイルスのサブユニットワクチンとして非常に高い効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ビルナウイルス構造遺伝子セグメントＡのｃＤＮＡ断片を組み込んだ組換えバキュロウイルスを宿主に感染させ、該感染宿主に発現されるビルナウイルス抗原物質を提供する。本発明はさらに、該ビルナウイルス抗原物質を含む、ビルナウイルスサブユニットワクチンを提供する。
【００１２】
本発明はまた、ビルナウイルス構造遺伝子セグメントＡのｃＤＮＡ断片を組み込んだ組換えバキュロウイルスおよび該バキュロウイルスに感染した宿主を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ビルナウイルス構造遺伝子のセグメントＡのｃＤＮＡ断片を、バキュロウイルスへ挿入して組換えバキュロウイルスを得る工程、
宿主に該組換えウイルスを感染させる工程および、
該宿主においてビルナウイルス抗原物質を発現させる工程を含む、ビルナウイルス抗原物質の製造方法を提供する。
【００１４】
さらにまた本発明は、該ビルナウイルスサブユニットワクチンを、対象とするヒト以外の動物に投与することを含む、ヒト以外の動物におけるビルナウイルス感染防御の方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において調製される、ビルナウイルス抗原物質は、ビルナウイルス構造遺伝子のセグメントＡのｃＤＮＡを遺伝子組換えによりバキュロウイルスベクター系で発現させたものである。
【００１６】
本発明に用いられるビルナウイルス構造遺伝子のセグメントＡは、従来公知の、あるいは将来入手できるようになるいずれのビルナウイルスから単離したものであってもよい。現在まで知られているビルナウイルスファミリーに属する各ウイルスの構造遺伝子配列は85％以上のホモロジーを有することが知られている（H Sato et al., Arch. Virology (1999) 144, 1405-1413; L.S. Havarstein et al., J. Gen. Virology (1990) 71, 299-308; R. Duncan and P Dobos, Nucleic Acids Res.(1986) 14, 5934; P.J. Hudson et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14, 5001-5012)。
【００１７】
まずウイルスの二本鎖ＲＮＡを得、これより構造遺伝子のセグメントＡのｃＤＮＡをクローニングする。クローニングは、当業者に公知のいずれの方法でおこなってもよい。セグメントＡの塩基配列は、ビルナウイルスファミリーのいくつかの種について公知となっている（H Sato et al., Arch. Virology (1999) 144, 1405-1413; L.S. Havarstein et al., J. Gen. Virology (1990) 71, 299-308; R. Duncan and P Dobos, Nucleic Acids Res.(1986) 14, 5934; P.J. Hudson et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14, 5001-5012)。この公知の塩基配列からプライマーを合成し、標的とするビルナウイルスゲノムの二本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを得ればよい。かかるクローニング方法は、当業者によく知られている。
【００１８】
以下に示す実施例において、本発明者らは魚類ビルナウイルスであるＹＡＶのゲノム二本鎖ＲＮＡからセグメントＡのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により得、その塩基配列を決定した。これを添付の配列表、配列番号１として示す。得られるｃＤＮＡはＶＰ３、ＮＳ、ＶＰ２をこの順でコードする。
【００１９】
こうして得られたｃＤＮＡを、バキュロウイルスベクターのポリヘドリンプロモーター下流に、該プロモーターが機能し得る状態で挿入する。
【００２０】
本発明に用いられるバキュロウイルスは、現在知られており、また将来的に開発されるいずれのバキュロウイルスであっても用いることができる。具体例としてはSpodoptera frugiperda由来培養細胞であるIPBL-SF21-AE(ファーミンジェン社、PM-21301C）や、Trichoplusia ni由来の培養細胞であるHigh Five (フナコシ社，IV-0855-02)）を宿主として増殖するＡｃＮＰＶ（ファーミンジェン社、PM-21103E)および蚕由来の培養細胞であるＢｍ-Ｎ（フナコシ、NQ-0150-00:ATCC CRL-8910)）や、蚕幼虫もしくは蛹を宿主として増殖するＢｍＮＰＶ（フナコシ社、NQ-0110-00、ATCC：40188）が挙げられる。さらに公知のウイルスを、当業者にはよく知られている遺伝子工学的手法に基づいて操作して得られるハイブリッドウイルスもまた、好適に用いることができる。かかるハイブリッドウイルスの例としては、ＡｃＮＰＶとＢｍＮＰＶのハイブリッドであるＨｙＮＰＶ(H. Mori et al., J. Gen. Virology (1992) 73, 1877-1880)が挙げられる。ＨｙＮＰＶは上記いずれの宿主を用いても増幅させことができる。
【００２１】
バキュロウイルスベクター系を用いる遺伝子操作については、当業者には公知であり例えば松浦善治「バキュロウイルス発現ベクター」実験医学(1990)8, 93-96およびY. Matsuura et al., Virology (1989) 173, 674-682に詳しく記載されている。
【００２２】
簡単に述べると、まず、バキュロウイルス転移ベクターへ、上記で得たｃＤＮＡを挿入する。バキュロウイルス転移ベクターは、適当な制限酵素を用いて、バキュロウイルスゲノムＤＮＡのポリヘドリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を得、これをプラスミドにサブクローン化して得られるものであり、pAcYM1、pAcG2T、pAcGP67、およびVL1392（いずれもファーミンジェン社）などが市販されている。上記で得たｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクター、例えばpAcYM1などとライゲーションする。これを用いて大腸菌等を形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離し、さらに制限酵素処理あるいはシークエンスによってポリヘドリンのプロモーターに対して正しい向きに遺伝子が挿入されているクローンを選び出し、組換えバキュロウイルストランスファーベクターを得ればよい。
【００２３】
次いで、得られた組換えトランスファーベクターを用いて、相同的組換え法により、組換えバキュロウイルスを得る。上記により得られたトランスファーベクターと、ＡｃＮＰＶまたはＨｙＮＰＶなどのバキュロウイルスＤＮＡとを宿主すなわち、昆虫または昆虫の樹立細胞にリポフェクチン法にてトランスフェクションする。ここで使用する宿主としては、用いるバキュロウイルスが感染するものであればよい。これらのベクターＤＮＡとＡｃＮＰＶまたはＨｙＮＰＶなどのバキュロウイルスＤＮＡとをＳｆ細胞にトランスフェクションさせた場合、ポリヘドリン遺伝子の上流部分と下流部分とで相同組換えが生じ、ウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびポリヘドリン遺伝子が、抗原タンパク質をコードする抗原遺伝子がポリヘドリンプロモーターにつながったままの状態で交換され、これがウイルスゲノムＤＮＡ中へ挿入される。すなわち、このウイルスはポリヘドリン遺伝子に代えて抗原タンパク質をコードする抗原遺伝子を有することとなり、ポリヘドリンを合成する代わりに抗原タンパク質を合成する。従って、かかるウイルスが細胞に感染しても多角体を生成することはない。この多角体を形成しないウイルスを宿主より単離し、プラーク純化法によって組換えバキュロウイルスを得れば良い。
【００２４】
得られた組換えバキュロウイルスを、次いで宿主に感染させて培養する。宿主としては、用いたバキュロウイルス系が感染する宿主であれば特に限定されず、例えば上記の昆虫由来の樹立細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈ５細胞など市販の細胞等、カイコ、ヨトウガなどの昆虫が挙げられる。昆虫を用いる場合には、卵であっても、幼虫であっても蛹であってもよい。
宿主が昆虫の場合には、バキュロウイルスに感染させるには、皮下注射法または経口投与法等により行えばよい。
【００２５】
宿主の培養は、それぞれの宿主について、従来知られている常套の方法および条件にて行えばよい。
組換えバキュロウイルスに感染した宿主を増殖させることにより、宿主はビルナウイルス抗原物質を産生する。以下の実施例で該抗原物質は、ＶＰ２およびＶＰ３を含むことを確認した。宿主としてカイコを用いた場合には、カイコの血球細胞や脂肪体組織においてＶＰ２およびＶＰ３の両方が確認された。
【００２６】
こうして得られたビルナウイルス抗原物質は、ビルナウイルスのサブユニットワクチンとして用いることができる。ワクチンとしては、該抗原物質を含む宿主培養物をそのまま、あるいは細胞もしくは虫体ホモジネイトとして特に精製することなく用いてもよい。さらに本発明のサブユニットワクチンには通常の不活化ワクチンに用いられる担体および添加物を添加してもよい。
【００２７】
または、ビルナウイルス抗原物質を含む宿主培養物から、タンパク質精製のための公知のいずれかの方法を用いて抗原物質を精製してもよい。精製された抗原は、適当な担体や添加物と組み合わせてサブユニットワクチンとして用いてもよいし、またはビルナウイルス感染症の診断のための、抗体検出用の試薬を調製してもよい。
【００２８】
本発明のビルナウイルス抗原物質を含有するワクチンは、該抗原物質と共に適当な担体、および通常ワクチンに含まれるいずれの物質を含有していてもよい。投与対象、投与経路その他当業者には公知の要因に基づき、添加剤などを選択するのは当業者には容易である。
【００２９】
本発明のビルナウイルス抗原物質を含むビルナウイルスサブユニットワクチンは、特に魚類ビルナウイルスに対するワクチンとして好適に用いられる。対象となる魚類は特に限定されないが、養殖魚類、例えばサケ、マス、ブリなどのビルナウイルス感染症のコントロールに有用である。養殖魚に対してワクチンの投与は、従来養殖漁業の分野で用いられているワクチンの投与と同様の方法で行えばよく、ワクチンを幼魚へ注射しても、ワクチンを餌に混入しても、あるいはワクチンを液体中に適当な濃度に溶解し、ここへ対象となる魚を一定時間浸ける浸漬によってもよい。宿主として昆虫を用いる場合、宿主の昆虫自体が栄養原としても有用である。
【００３０】
ビルナウイルスファミリーは、種間においてそのセグメントＡのゲノム構造に非常に高い相同性を有しており、本発明に従い魚類に限らず様々な動物のビルナウイルス抗原を得ることができる。なお、本願明細書において「動物」という語には、鳥類、魚類、昆虫類等を含むものとする。
【００３１】
したがって、本発明のビルナウイルスサブユニットワクチンは、魚類のみならず、鳥類、例えば家禽類、特にニワトリ、その他昆虫等のビルナウイルス感染の防御においても好適に用いられる。
【００３２】
本発明のビルナウイルス抗原物質は、ビルナウイルスの抗体を検出するための診断用の材料としても用いることができる。および該組成物を使用するヒトを除く動物のビルナウイルス感染の検出方法を提供する。動物としては、魚類、特に養殖魚類、鳥類、特にニワトリ等の家禽類および昆虫類等が挙げられる。
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の理解の助けとするものであり本発明を限定するものではない。
【実施例】
（１）セグメントＡのクローニング
Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV)のセグメントＡの配列（J. Hudson et al., Nucleic Acid Res.(1986)14 5001-5012）をもとに２種類のプライマーを作成した（プライマー１：ATGAACACAAACAAGGCAACCGCAA、プライマー２：CCAGGGGATCAGTCAGGAAAGAG)。この２つのプライマーを用い、魚類ビルナウイルスであるYellowtail Ascites Virus (YAV)のゲノムＲＮＡからセグメントＡのｃＤＮＡを合成した。
YAVをサケ胚由来ＣＨＳＥ−２１４細胞(Chinook salmon embryo cell)に感染させ、20℃にて５-７日間培養し、培養上清液を10,000×gにて45分間遠心して細胞破片を除去した。続いて、100,000×gにて２時間超遠心し、ウイルスを沈殿として集めた。集めたウイルスから常法によりＲＮＡを抽出し、これをもとに上記プライマーを用い、ｃＤＮＡを合成した。
【００３４】
ウイルスのｃＤＮＡの合成は、TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech)を用いて、説明書に記載の通り行った。この得られたｃＤＮＡを鋳型にして、セグメントＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。ＰＣＲは、得られたｃＤＮＡ 100ng と、2.5ユニットのTaKaRa LA Taq  ポリメラーゼ（宝酒造株式会社）、各400μMのｄＮＴＰｓ、上記プライマー１および２それぞれ200μMを用い、ポリメラーゼに付属して提供される１０×ＬＡ ＰＣＲバッファーを用いて、全量500μlとして行った。反応は94℃3分間加熱した後、94℃30秒間-55℃30秒間-72℃１分間の温度サイクルを30回繰り返して行った。最後に72℃にて２分間インキュベートした後４℃に温度を下げて反応を終了させた。
【００３５】
こうして増幅されたｃＤＮＡの塩基配列を、Applied Biosystem 373A DNA Sequencing Systemを用いて、ジデオキシターミネーターサイクル配列決定法にて決定した。配列決定により、開始コドンから終了コドンまでのタンパク質をコードする領域（オープンリーディングフレーム）を決定した。得られた配列を配列表、配列番号１に示す。
【００３６】
得られたオープンリーディングフレームを解析したところ、5'側よりＶＰ３、ＮＳ、ＶＰ２がこの順でコードされていることを確認した。
得られたｃＤＮＡをプラスミドPCR2.1(Invitrogen 社）にクローニングし、プラスミドｐＴＡ-ＳｅｇＡを得た。
【００３７】
（２）抗原タンパク質を発現するリコンビナントウイルスの作製
i)組換えトランスファーベクタ-の調製
得られたプラスミドｐＴＡ−ＳｅｇＡを制限酵素ＳｐｅｌおよびＸｂａｌにて消化し、バキュロウイルス用トランスファーベクターｐＶＬ１３９３(ファーミンジェン）のＸＢａｌ部位にクローニングして、組換えトランスファーベクターｐＶＬ−ＳｅｇＡを調製した。
【００３８】
ii)リコンビナントウイルスの調製
得られた組換えトランスファーベクターｐＶＬ−ＳｅｇＡ１５μgとＡｃＮＰＶまたはＨｙＮＰＶのＤＮＡ１μgと、リポフェクチン試薬(GIBCO BRL)を用い、常套の方法によってＳｆ２１細胞にコトランスフェクトした。
TC-100（無血清）培地に分散させたＳf21細胞にリポフェクチン（Gibco）、トランスファーベクター(pVL-SegA ）15μgおよびＨｙＮＰＶ１μｇを混合し、水を加えて体積を40μｌに調整したものを、滴下した。一晩27℃にてインキュベートした後に、培地を血清を含有する培地に交換した。さらに４日間、この細胞を0.26% tryptose brothおよび10%ウシ胎児血清を含む培地中、27℃にて培養した後、培養液をピペットで集め、1,000回転で２-３分遠心して細胞破片を沈殿として除去した。プラーク純化法によっ培養液中に含まれる組換えバキュロウイルスを選択した。
【００３９】
それぞれバキュロウイルスＡｃＮＰＶおよびＨｙＮＰＶを用いて上記のごとく作製し、単離されたリコンビナントウイルスを感染させたＳｆ細胞を工業技術院生命工学研究所に寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８７４およびＦＥＲＭＢＰ−６８７５を得た。
【００４０】
（３）抗原タンパク質の宿主内での発現
得られたリコンビナントウイルスを、TC-100培地で培養したＳｆ２１細胞およびESF-921培地（イワキ社）で培養したＨ５細胞に感染させ、これらの細胞を27℃にて４日間培養した、培養細胞を集め、ＳＤＳ電気泳動を行った。さらに、抗ＶＰ２マウスモノクローナル抗体および抗ＶＰ３ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、ＶＰ２およびＶＰ３のバンドが確認された。
また、上記でコトランスフェクションの際にＨｙＮＰＶを用いて、ＨｙＮＰＶのリコンビナントバキュロウイルスを調製し、これをカイコ５齢幼虫に注射して感染させた。感染させたカイコを25℃にて４日間、桑葉を給餌して生育させた。カイコ虫体から血球細胞および脂肪体組織を摘出し、ＳＤＳ電気泳動を行い、さらにウエスタンブロッティングを行った。上記と同様にして、ＶＰ２およびＶＰ３のバンドが血球細胞および脂肪体組織のいずれにおいても発現されていることが確認された。
【００４１】
（４）ビルナウイルスサブユニットワクチンの調製
リコンビナントビルナウイルスに感染させたＨ５細胞を４日間上記と同条件にて培養させたものを凍結融解法にて磨砕し、2.5ｍＭ  EDTA、0.3Ｍ  NaCl、0.1％SDSを含む50mM  Tris-HCl（pH7.5）に懸濁して魚類ビルナウイルスサブユニットワクチンを調製した。
【００４２】
得られた細胞磨砕物中、ＳＤＳ電気泳動にてＶＰ２およびＶＰ３タンパク質量を調べ、ＶＰ２およびＶＰ３の濃度の合計がおよそ50μｇ／0.1mlとなるよう調節したものをビルナウイルスサブユニットワクチンとして以下の試験に供した。
【００４３】
（５）ワクチン効果の検定試験
試験例１
得られたサブユニットワクチン溶液のワクチン能を調べた。
ブリ稚魚（１２週齢）腹腔内に（４）で得たサブユニットワクチン溶液0.1mlを注射し、１０日間飼育後、YAV懸濁液（100.9TCID50/ml)0.1mlを注射して感染させた。その後さらに飼育して、１０日目の生存率を観測した。ポジティブコントロールとして、不活化ＹＡＶワクチンを同じ抗原濃度として調製したものを0.1ml投与したもの、ネガティブコントロールとしては、無処置の稚魚を用いた。1群を３０尾として、同じ試験を３回行った。
結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
0003681933.tif 000002
【００４５】
試験例２
本願ビルナウイルスサブユニットワクチンのワクチン能を、ビルナウイルスタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３のワクチン能と比較した。
試験例１と同じ、上記で調製したビルナウイルスセグメントＡのサブユニットワクチンを用いた。ＶＰ２およびＶＰ３のサブユニットワクチンとしては、プラスミドｐＴＡ−ｓｅｇＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりポリプロテインＶＰ２−ＮＳおよびＮＳ−ＶＰ３をコードする領域のｃＤＮＡを得、それぞれをトランスファーベクターpVL1393（ファーミンジェン社）に組み込み、セグメントＡの場合と同様にリポフェクチンを用いてＳｆ２１細胞中でＡｃＮＰＶのＤＮＡとコトランスフェクトした。得られたリコンビナントウイルスをHigh Five細胞に感染させ、ＶＰ２−ＮＳおよびＮＳ−ＶＰ３を発現させた。リコンビナントウイルスを感染させた細胞についてのＳＤＳ電気泳動およびウエスタンブロッティングにおいて、抗ＶＰ２マウスモノクローナル抗体および抗ＶＰ３ウサギポリクローナル抗体を対照として用い、それぞれのタンパク質の発現を確認した。感染High Five細胞を４日間培養したものを上記と同様にして磨砕し、ＶＰ２−ＮＳおよびＮＳ−ＶＰ３それぞれの濃度をＳＤＳ電気泳動の結果から推定してそれぞれ５０μｇ／ｍｌとなるよう調製したものを用いた。
上記の通り調製したビルナウイルスセグメントＡ、ＶＰ２、およびＶＰ３それぞれのサブユニットワクチンを試験例１と同様にしてブリ稚魚に接種した。また試験例１と同様にポジティブコントロールとしてＹＡＶ不活化ワクチン投与を行い、ネガティブコントロールとして無処理のものと比較した。実験は１群３０匹で行った。
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
0003681933.tif 000003
上記より、本願発明のビルナウイルス抗原物質を含有するワクチンは、ビルナウイルス感染に対して、不活化ＹＡＶワクチンと同等の効果を有することがわかる。
【配列表】
Sequence Listing
<110> Hara, Saburo; National Research Institute of Aquaculture
<120> Birnavirus subunit vaccine
<130> 167376
<160> 1
<170>
<210> 1
<211> 3666
<212> cDNA
<213> Yellowtail Ascites Virus
<400>
atga
121 acacaacaaa ggcaaccgca acttacttga gatccattat gcttcccgag aatggtccag
181 caagcattcc ggacgacata acagagagac acatactaaa acaagagacc tcgtcataca
241 acttagaggt ctcagactcc ggaagtgggc ttcttgtctg cttccctgga gctcctggat
301 ccagagtcgg tgcccactac aagtggaatg cgaaccagac caggcaggaa ttcgaccagt
361 ggctgaaaac atcacaggac ctgaagaagg cattcaacta cgggaggctg atctcacgga
421 aatacgacgt ccagagctca accctacctg ctggtctgta tgccctgaat gggaccctga
481 acgccgcgac cttcgaagga agtctgtctg aagtggagag cttctcctac aacagtctga
541 tgtccctcac cacgaacccc caggacaaag tgaacaacca gccagtcacc aaaggagtga
601 cagtcctaaa cctaccaaca gggttcgaca agccatacgt ccgcctggag gacgagaccc
661 cacaagggcc ccagtcaatg aacggcgccc ggatgaggtg cacagctgca attgcaccac
721 gaaggtacga aatcgacctc ccatccgcac gcctccccac agtaccagcg actgggaccc
781 tcacaacaat gtatgaaggg aacgccgaca ttgtgaactc aaccacagtg accggcgaca
841 tcagcttcag actggatcaa gaccccccga acgacacgaa gtacgacttc cagctcgact
901 tcctcggctt agacaacaac gtccccgtcg tgtcaataac cagctatacg ctggccacaa
961 ccgacaacta caggggggtc tcagtcaaat tcacacagtc aatcccaaca gagacaatca
1021 caaaacccat caccagggtc aagctgtcct acaaaatcaa ccagcagaca gccatcggca
1081 atgcagcaac gcttggaccc ctggggccct catccgtctc attctcatca ggaaacggca
1141 acgtacctgg agtgctcagg ccaatcaccc tggtggcgta cgagaagatg accccccagt
1201 cgatcctgac ggtagctgga gtgtcaaact acgagctgat cccaaacccc gaactcctga
1261 agaacatggt cacgaaatat ggcaagtatg accctgaagg tctcaactac gccaagatga
1321 tcctgtccca ccgagaggag ctagacatca gaacagtctg gagaaccgag gagtacaagg
1381 agagaacaag agccttcaat gagatcacag acttctcaag tgacctccca acctcaaaag
1441 cctgggggtg gagagacatt gtgagaggca tccggaaggt ggcagcacca gtgttgtcaa
1501 cactcttccc catggcggca ccactcatcg gagccgccga ccaattcatc ggaggcctga
1561 ccaagaccaa cgcagccgga ggccgctacc taacacatgc agcaggagga cgctacactg
1621 acgtaatgga ctcctgggcc agcggcacag acactgggag gttctcacgc aacctcaaag
1681 accggctgga gtcaaacaac tatgaggaga tggaacttcc tccaccaacg aaaggagtca
1741 tcatacctgt agtgcacaca gtggagagtg cacctggtga ggcctttggg tcccttctgg
1801 taatcatccc aggagcatac ccagaacttc ttgacccaaa ccagcaggtc ctgtcccact
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