(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦと、レーザー光散乱法による分子量が25000-35000であり、ゲル濾過法による分子量が18000-23000であるヘパリンを含有することを特徴とする医薬製剤。
【請求項２】
ＨＧＦが、ヒト又は動物の組織又は血液成分由来である請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
ＨＧＦが、遺伝子組換により製造したものである請求項１記載の医薬製剤。
【請求項４】
使用時に、ＨＧＦと、レーザー光散乱法による分子量が25000-35000であり、ゲル濾過法による分子量が18000-23000であるヘパリンとを混合して調製される請求項１から３のいずれかに記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＨＧＦ(Hepatocyto Growth Factor、肝細胞増殖因子)を含有する医薬製剤に関し、より詳細にはＨＧＦの作用時間の持続性を図ることのできる医薬製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦは、中村らにより発見された、成熟肝細胞に対して最も強力な増殖促進活性を持つ生理活性ペプチドであり（例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450, 1984、FEBS Letter, 22, 311, 1987など参照）、近年生物工学的手法により量産が可能になった（例えば、Nature, 342, 440, 1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990、Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321, 1990など参照)。本因子は、肝炎や肝硬変のみならず、腎炎や癌などに対する治療・予防薬として、また制癌剤の副作用抑制剤や創傷治癒剤などへの適用が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ＨＧＦは医薬品としての利用が期待されている物質であるが、本因子を単独で投与しても半減期数分で血中から消失することが、本因子を医薬品として開発していく上での大きな障害となっていた。因に、本因子の血中よりのクリアランスに関わる主要臓器は肝臓であることも既に知られている。
本因子は高分子ペプチドであり、例えば、注射剤として患者に投与されることになるが、半減期の短い薬剤はそのままでは頻回投与か持続投与を余儀なくされる。従って、患者は治療に当たって、持続性の長い薬剤に比べてより大きな苦痛を強いられることになる。また、血中からのクリアランスが速ければ大量の薬剤投与が必要となり、医療費の高騰を招来するとともに大量に本因子を生産することが必要になる。
一般的な製剤技術でこの点を克服しようとする試みもあるが、本因子の特性に対応して設計されたものではなく、十分な効果は得られていない。
本発明は上記の課題を解決すべくなされたもので、本発明の目的は、ＨＧＦの生物活性を維持させたままで、血中からのクリアランスを低下させ、本因子の作用持続時間を延長させることのできる製剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らはＨＧＦの作用時間を持続させることを鋭意検討したところ、ＨＧＦの持つヘパリン親和性の特性を考慮してＨＧＦとヘパリンとを併用すること、即ちＨＧＦとヘパリンの複合体を形成させることにより、血中よりのＨＧＦのクリアランスを低下させ得ることを見出した。また、当該複合体の形成がＨＧＦの持つ生物活性の発現に支障を与えないことも確認した。本発明はかかる知見に基づいてなされたものである。即ち、本発明の医薬製剤は、ＨＧＦとヘパリンを含有することからなる。
【０００５】
上記の構成からなる本発明の有効成分であるＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られており、例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞など）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養物から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００６】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００７】
かくして得られたＨＧＦは、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。かかるＨＧＦ同効物としては、例えば、特開平３−１３００９１号公報、国際公開ＷＯ９０／１０６５１号公報などに記載の物質が挙げられ、これらも本発明に適用でき、本発明の範囲に含まれる。
【０００８】
本発明の他の成分であるヘパリンとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであればいずれのものも用いることができ、その由来（例えば、ウシ、ブタなど）も特に限定されない。また、使用されるヘパリンの分子量も特に限定されず、高分子量ヘパリン、低分子量ヘパリン及びそれらの混合物のいずれも使用することができる。ＨＧＦに対するヘパリンの使用割合としては、ＨＧＦ１ｐｍｏｌに対して、ヘパリンを0.01〜50ｍｇ程度とされる。ヘパリンの使用量が0.01ｍｇ未満では十分なＨＧＦクリアランス低下効果を発現できないことがあり、また50ｍｇを超えても問題はないがそれまでの量で効果を発揮できるので、その量を超えて加える必要性は少ない。
【０００９】
本発明の目的は、予め調製されたＨＧＦ及びヘパリンを含有する製剤を投与するか、又はＨＧＦとヘパリンを含む製剤を用時に調製して投与することにより達成される。適用症状としては、肝炎、肝硬変、腎炎、癌などの治療・予防、制癌剤の副作用抑制、創傷治癒の促進などが挙げられる。
【００１０】
本発明の製剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦ及びヘパリンのみ又はそれらと慣用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体と共に外用薬とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦ及びヘパリンを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整され、ヘパリン含量はＨＧＦ含量に応じて適宜調整される。また、外用薬としては、例えば、軟膏状、ゲル状、液状などの剤形に製剤化され、製剤中のＨＧＦ含量は、外用薬の適用疾患、適用部位などに応じて適宜調整することができる。
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１１】
本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例及び試験例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、以下に述べる実施例では中村らの総説（例えば、Critical Reviews in Oncogenesis, 3, 27-54, 1992、代謝 28, 599-608, 1991など参照）に述べられているタイプ１のＨＧＦを使用したが、既にタイプ２及びタイプ３のＨＧＦもタイプ１のＨＧＦと同等の活性を有することが知られており、タイプ２及びタイプ３並びに各タイプの誘導体を用いても同様の効果が得られることは明らかである。
【００１３】
実施例１
生理食塩水100ml中にＨＧＦ１mg、ヘパリン４ｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート80 10mgを含む溶液を無菌的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注し、常法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
【００１４】
実施例２
0.15M ＮａＣｌと0.01%ポリソルベート80を含むpH7.4の0.02Mリン酸緩衝液100mlに、ＨＧＦ１mg、ヘパリン４ｇ及びヒト血清アルブミン100mgを添加した水溶液を無菌的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注し、常法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
【００１５】
以下、試験例に基づいて、本発明を説明する。なお、試験に用いたヘパリンは以下のとおりである。
高分子量ヘパリン：シグマ製、製品番号 H 7005［ナトリウム塩、グレード II、ブタ腸粘膜由来、分子量:２５０００−３５０００（レーザー光散法）、１８０００−２３０００（ゲル濾過法）］
低分子量ヘパリン：シグマ社製、製品番号 H 5640（ナトリウム塩、ブタ腸粘膜由来、分子量:４０００−６０００）
【００１６】
試験例１
ラット肝臓にＨＧＦ−ヘパリン複合体を灌流したときの流出液中に出現した放射活性の割合及び肝抽出率
125Ｉで標識したトレーサー濃度（０．８ｐＭ）のＨＧＦのみ、及びこの標品とそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリンをそれぞれ混合した後、室温で５０分インキュベートして作成した各複合体をラットに一回通過で灌流させた（灌流速度、１２ｍｌ／分）。灌流液は２０％（Ｖ／Ｖ）の牛赤血球、２％（Ｗ／Ｖ）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、５ｍＭグルコースを含む中性緩衝液［１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭＫＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２．２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．４）］を用いた。
流入液中のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）−沈殿性の放射活性に対する肝静脈中のＴＣＡ−沈殿性の放射活性の割合の時間推移（図１左側）及びその肝抽出率（図１右側）を測定した。なお、肝抽出率は、定常状態下での（流入液中放射能−肝静脈中放射能）／（流入液中放射能）より計算した。
図１に示されるように、１ｍｇ／ｍｌ以上のヘパリンと混合したとき、肝抽出率が顕著に低下した。また、ＨＧＦの血中からのクリアランスに関わる主要臓器が肝臓であることを併せ考えると、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件でも、ヘパリンによりＨＧＦの血中からのクリアランスも顕著に低下することが示唆された。
【００１７】
試験例２
125Ｉ−ＨＧＦ−ヘパリン複合体を静注したときの血漿中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移
125Ｉで標識したトレーサー濃度（５００ｐＭ）のＨＧＦのみ、及びこの標品とそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリン、あるいは８０ｍｇ／ｍｌの低分子量ヘパリンをそれぞれ混合した後、室温で５０分インキュベートして作成した各複合体を、ラットに大腿静脈より約０．２５ｍｌ静注した。次いで、大腿動脈より採血を行い、血漿中ＴＣＡ−沈殿性放射濃度の推移を測定した。なお、この条件下では、ＨＧＦの投与量は、０．１３ｐｍｏｌ／ラット、ヘパリンの投与量は、高分子量ヘパリンでそれぞれ、５ｍｇ／ラット、１０ｍｇ／ラット、２０ｍｇ／ラット、及び低分子量ヘパリンで、２０ｍｇ／ラットに相当する。得られた結果を図２に示す。なお、結果として得られた血漿中濃度を投与量で規格化して示した。
図２に示されるように、高分子量ヘパリンでは５ｍｇ／ラット以上、低分子ヘパリンでは２０ｍｇ／ラットで著明な血中からのＨＧＦクリアランスの低下がみられた。
【００１８】
試験例３
ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成促進（ＨＧＦとの接触時間の影響）
コラゲナーゼ灌流法により調製したラット遊離肝細胞（２．５×１０5細胞／ｍｌ）を、培養用ディッシュに１ｃｍ2当りの細胞数が７×１０4個になるように入れ、Williams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデキサメサゾン、５％（Ｖ／Ｖ）子ウシ血清、３０ｍｇ／ｌカナマイシン  モノサルフェートを含む）中で２４時間培養した。途中、培養開始２時間後に同じ培地の新鮮なものに交換した。培養開始２４時間後に、培地をWilliams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデキサメサゾン、５Ｕ／ｍｌアプロチニン、３０ｍｇ／ｌカナマイシン  モノサルフェートを含む）に交換するとともに、ＨＧＦ（０−２５０ｐＭ）を種々の時間（０．３−２８時間）インキュベートした後に細胞を洗浄し、同培養用メディウムを加え、合計２８時間になるまでインキュベートを続けた。インキュベーションの途中２２時間後に、125Ｉでラベルしたデオキシウリジン（採取濃度、０．３μＣｉ／ｍｌ、０．１４ｎＭ）を非標識体（最終濃度、４８０ｎＭ）と共に加えた。２８時間後（125Ｉ−デオキシウリジン添加６時間後）に、125Ｉ−デオキシウリジンの取り込み量を測定することによりＤＮＡ合成を評価した。その結果を図３に示した。なお、結果は、９０ｐＭのＨＧＦを２８時間接触させたときに得られた最大活性を１００として表した。
図３から明らかなように、ＨＧＦと標的細胞である肝細胞との接触時間が長いほどＤＮＡ合成が増大していた。このことは、ＨＧＦを血中により長時間にわたって存在させた方が、その有効性の増強につながることを示している。
【００１９】
試験例４
ＨＧＦ−ヘパリン複合体による初代培養肝細胞のＤＮＡ合成
ＨＧＦ１ｎＭ又は１２．５ｎＭと、ヘパリン（濃度、０−１００ｍｇ／ｍｌ）を室温で５０分間プレインキュベートして、複合体を形成させた。この混合溶液２０μｌを、試験例３に示した培地５００μｌ中の培養肝細胞に加え、２８時間インキュベートした。従って、培地中での最終濃度としては、ＨＧＦで約４０ｐＭ及び５００ｐＭ、ヘパリンで０−４ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。途中、ＨＧＦ−ヘパリン混合液添加２２時間後に、試験例３と同様に125Ｉ−デオキシウリジンを添加し、ＤＮＡ合成能を測定した。その結果を図４に示す。なお、図４においては、ヘパリン非存在下のＤＮＡ合成能を１００とし、それに対する割合（％）で表示した。
図４から明らかなように、高濃度のヘパリンとの複合体でも十分に高い生物活性がされていた。因に、試験例２で示されたＨＧＦの血中クリアランス低下に十分な１０ｍｇ／ラットというハペリンの量は、循環血漿の容積（約１０ｍｌ／ラット）を考慮すると、ほぼ１ｍｇ／ｍｌに相当する。
【００２０】
試験例５
125Ｉ−ＨＧＦ静注後にヘパリンを静注したときの血漿中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移
正常ラット及び四塩化炭素処理ラット（オリーブ油で１０倍に希釈した四塩化炭素を、ラット腹腔に１ｍｌ／１００ｇ体重投与し、２４時間後のラットを用いた）に、125Ｉ−標識したトレーサー量（０．１３ｐｍｏｌ／ラット）のＨＧＦを大腿静脈より静注した後１１〜１６分後に高分子量ヘパリンを種々の投与量（０、１０、２５、５０ｍｇ／ラット）で静注したときの血漿中のＴＣＡ−沈殿性放射活性の時間推移を測定した。なお、採血は大腿動脈より行った。
図５に、正常ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１６分してヘパリンを静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。また、図６に、正常ラット（コントロール）及び四塩化炭素処理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘパリン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。
図５及び６に示されるように、ヘパリン投与により125Ｉ−ＨＧＦの血漿中濃度が一過的に上昇することが明らかである。この理由としては、ヘパリンによりＨＧＦの血中クリアランスが低下すること、及び各組織表面に結合している125Ｉ−ＨＧＦがヘパリンにより除去され循環血中に移行することの両原因が考えられる。ここで、重要なことは、四塩化炭素処理をして肝炎惹起ラットでも正常ラットと同様なヘパリンの効果がみられている点である。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように、ＨＧＦをヘパリンと混合して複合体を形成させることにより、さらに通常用いられる各種の賦形剤や安定化剤を添加することで、低用量で有効な持続性のあるＨＧＦ含有医薬品を得ることができる。従って、本発明によれば、投与回数及び投与量を低減できるので、患者の苦痛の緩和、医療費の低減などを図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット肝臓にＨＧＦ−ヘパリン複合体を灌流したときの流出液中に出現した放射活性の割合（左側）及び肝抽出率（右側）を示す図である。
【図２】125Ｉ−ＨＧＦ−ヘパリン複合体を静注したときの血漿中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す図である。
【図３】ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成促進におけるＨＧＦとの接触時間の影響を示す図である。
【図４】ＨＧＦ−ヘパリン複合体による初代培養肝細胞のＤＮＡ合成を示す図である。左側の図はＨＧＦ濃度４０ｐＭの場合を、右側の図はＨＧＦ濃度５００ｐＭの場合を示す。
【図５】正常ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１６分してヘパリンを静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す図である。
【図６】正常ラット（コントロール）及び四塩化炭素処理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘパリン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す図である。
【図１】
0003697460.tif 000002
【図２】
0003697460.tif 000003
【図３】
0003697460.tif 000004
【図４】
0003697460.tif 000005
【図５】
0003697460.tif 000006
【図６】
0003697460.tif 000007