(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの重鎖と二つの軽鎖を含むＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能な、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体であって、該重鎖が以下のアミノ酸配列：
【化１】
0003670276.tif 000007
を有し、該軽鎖が以下のアミノ酸配列：
【化２】
0003670276.tif 000008
を有する、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
【請求項２】
前記重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９３号）と命名された発現ベクターによってコードされる、請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
【請求項３】
前記軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９４号）と命名された発現ベクターによってコードされる、請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
【請求項４】
ＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止するのに有効な量の、請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する、ＨＩＶ−１ウィルス阻止用医薬組成物。
【請求項５】
本質的に、ＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止するのに有効な量の、請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体と、薬剤的に許容され得る担体とからなる、ＨＩＶ−１ウィルス阻止用医薬組成物。
【請求項６】
毒素に結合された請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体と、薬剤的に許容され得る担体とを含有するＨＩＶ−１ウィルス阻止用医薬組成物。
【請求項７】
前記毒素が、脱グリコシル化されたリシンのＡ鎖、シュードモナスエキソトキシンＡのドメインII、シュードモナスエキソトキシンＡのドメインIII、及びジフテリア毒素からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
検出マーカーに結合された、請求項１に記載の精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を含有する診断試薬。
【請求項９】
前記検出マーカーが放射性アイソトープ、発色団または蛍光基である、請求項８に記載の診断試薬
【請求項１０】
ＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能な精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法であって、
ａ）以下に示すアミノ酸配列：
【化３】
0003670276.tif 000009
をコードする発現ベクターと、以下に示すアミノ酸配列：
【化４】
0003670276.tif 000010
をコードする発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入することと；
ｂ）前記工程で得られる同時形質移入された哺乳動物細胞を、キメラヘテロ四量体が培地中に分泌される条件下に培地において培養することと；
ｃ）前記工程で分泌されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収し、これを精製することにより、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を製造することとを含み、前記四量体がＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能である製造方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能な精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法であって、
ａ）ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９３号）と命名された発現ベクターと、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９４号）と命名された発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入することと；
ｂ）前記工程で得られる同時形質移入された哺乳動物細胞を、キメラヘテロ四量体が培地中に分泌される条件下に培地において培養することと；
ｃ）前記工程で分泌されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収し、これを精製することにより、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を製造することとを含み、前記四量体がＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能である製造方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも二つのベクターと、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する少なくとも一つのベクターと、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する少なくとも一つのベクターとを含有する形質転換された宿主細胞であって、該ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が、以下に示すアミノ酸配列：
【化５】
0003670276.tif 000011
を有する二つの重鎖と、以下に示すアミノ酸配列：
【化６】
0003670276.tif 000012
を有する二つの軽鎖とを含有し、該細胞中で産生された該ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体がＨＩＶ−１感染した個体においてＨＩＶ−１ウィルスを阻止することが可能である、形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞がＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を分泌する、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
前記重鎖をコードするベクターがＡＴＣＣ第７５１９３号を有するＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名される、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
前記軽鎖をコードするベクターがＡＴＣＣ第７５１９４号を有するＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名される、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
前記重鎖をコードするベクターがＡＴＣＣ第７５１９３号を有するＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名され、前記軽鎖をコードするベクターがＡＴＣＣ第７５１９４号を有するＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名される、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
前記重鎖をコードするＤＮＡ配列が以下に示すＤＮＡ配列を有する、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞：
【化７−１】
0003670276.tif 000013
【化７−２】
0003670276.tif 000014
【化７−３】
0003670276.tif 000015
【請求項２１】
前記軽鎖をコードするＤＮＡ配列が以下に示すＤＮＡ配列を有する、請求項１３に記載の形質転換された宿主細胞：
【化８】
0003670276.tif 000016
【発明の詳細な説明】
〔発明の背景〕
本出願を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字で参照される。これら全ての刊行物は、請求の範囲の直前の明細書末尾に列挙してある。これらの刊行物の開示は、その全体が、ここに記載され権利請求される本発明の日に、当業者に知られた技術の状態をより完全に記述するために参考として本出願に取り込まれる。
動物ウイルスのライフサイクルは、宿主細胞の多量の感染に必要とされる一連の現象によって特徴付けられる。複製サイクルの最初のステップは細胞表面へのウイルスの付着であり、この付着は、標的細胞表面の受容体に対するウイルスの付着タンパク（ＶＡＰ）の特異的な相互作用によって媒介される。ウイルスの宿主レンジ及び属性は、主にこれら受容体の発現パターンによるものである。ＶＡＰとその細胞受容体との相互作用は、ウイルス性疾患の感染および病理に重要な役割を演じ、また抗ウイルス治療剤の開発を目的とした重要な領域を提供する。
細胞受容体は、タンパク、糖鎖および脂質を含む膜の全ての成分を具備し得る。標的細胞表面へのウイルスの付着を媒介する分子の同定は、数例しか行われていない。最も広範に特性が明らかにされたウイルス受容体タンパクは、ＣＤ４（Ｔ４）である。（１）。ＣＤ４は、主にヘルパーＴリンパ球および単球／マクロファージ系列の細胞表面に発現する非多形性の細胞表面糖タンパクである。ＣＤ４は、抗原提示細胞表面の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子と共働して、効率的な細胞性の免疫応答相互作用を媒介する。ＣＤ４はまた、人間においてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）との相互作用の標的になる。
ＨＩＶは表面にＣＤ４を発現している細胞、主にヘルパーＴリンパ球および単球／マクロファージに感染し、免疫機能を徐々に喪失させ、ヒト後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の発病をもたらす。ＨＩＶ複製サイクルの初期相には、ＨＩＶの外部エンベロープ糖タンパクｇｐ120と、表面ＣＤ４（Kdは略４×１０-9）との間の親和性の高い相互作用が含まれる（２）。幾つかの系統についての証拠は、ウイルスの感染性に関するこの必要性を示している。イン・ビトロにおいては、ＨＩＶに対して耐性である細胞をＨＩＶ感受性にするためには、ＣＤ４を発現しないヒト細胞内に、ＣＤ４を発現する機能的ｃＤＮＡを導入すれば充分である（３）。イン・ビボにおいて、ウイルス感染はＣＤ４を発現している細胞に限定されるように思える。細胞表面のＣＤ４に対するＨＩＶｇｐ120の結合に続いて、ウイルス膜および標的細胞膜が融合し、ウイルスキャプシドは標的細胞の細胞質内に導入される。
ＨＩＶのｇｐ120及びＣＤ４の間の相互作用に関する特性の解明は、両分子をコードするｃＤＮＡクローンの単離によって容易になっている。ＣＤ４は非多形性で且つ系列限定の細胞表面糖タンパクであり、これは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一員である。完全な長さのＣＤ４、並びに切断された不完全な可溶性ＣＤ４変種（ｓＣＤ４）の両者についての高レベルの発現が、安定した発現系に記述されている。多量の精製ｓＣＤ４が入手可能になったことにより、この複雑な糖タンパクの構造に関する詳細な理解が可能になっている。成熟ＣＤ４は55キロドルトンの相対分子量（Ｍｒ）を有しており、Ｖ１−Ｖ４と称される四つのタンデム免疫グロブリン様領域を含んだアミノ末端の372アミノ酸細胞外ドメインと、これに続く23アミノ酸のトランスメンブランドメイン及び38アミノ酸の細胞質セグメントとからなっている。アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶ１は、カッパ軽鎖可変領域との間で32％の相同性を有している。四つの免疫グロブリン様ドメインのうちの三つ（Ｖ１，Ｖ２およびＶ４）はジスルフィド結合を含んでおり、該分子のカルボキシ末端部分におけるＮ−結合されたグリコシル化部位が利用される（４，６）。
切断された不完全なｓＣＤ４を用いた実験により、ＨＩＶ・ｇｐ120に対する高い親和性を決定する領域は、アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶ１内にあることが示された（７−９）。Ｖ１の変異分析によって、免疫グロブリンの第二相補性決定領域（ＣＤＲ２）との構造的相同性を有する領域を具備した、分離されたｇｐ120結合部位（成熟ＣＤ４タンパクの残基38-52）が定義された（９）。Ｖ１，Ｖ２が大量に製造されることによって、この二つのアミノ末端免疫グロブリン様領域の構造的分析が可能になっている。2.3オングストロームの解像度で決定された構造によって、該分子は、連続的なベータ鎖で結合された免疫グロブリン折り畳み構造を含んだ、二つの密接に関連したドメインを有することが明らかになった。モノクローナル抗体、クラスIIＭＨＣ分子およびＨＩＶ・ｇｐ120（変異分析によって決定されたもの）のための推定される結合部位は、分子表面に存在する（１０，１１）。
ＣＤ４細胞外セグメントの全体の可溶性変種（Ｖ１−Ｖ４、ｓＣＤ４）が記述されており、これはＨＩＶ感染の治療に対する可能な治療上のアプローチであると思われる（１２）。イン・ビボの実験によって次のことが示される：1)ｓＣＤ４は、ＨＩＶ・ｇｐ120への結合によって「分子的誘因物」として作用し、ウイルス付着およびこれに続くヒト細胞の感染を阻害する；2)ｓＣＤ４は、ウイルス表面からウイルスエンベロープ糖タンパクｇｐ120を「剥ぎ取る」；3)ｓＣＤ４はウイルスに媒介された細胞融合を阻害することによって、細胞間でのウイルスの広がり、即ちＨＩＶ感染細胞から非感染細胞へのウイルスの広がりを阻止する（１，１３）。
イン・ビトロでの結果に加え、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染したアカゲザルにおいてｓＣＤ４を用いた実験が記載されている。これらの研究によって、ＳＩＶに感染したアカゲザルに２ミリグラムのｓＣＤ４を28日間投与（筋肉内）すると、抹消血液リンパ球および骨髄からウイルスを単離する能力が減少することが示された。加えて、骨髄中の顆粒球-マクロファージおよび赤血球前駆細胞コロニーの増殖は正常レベルに戻った。これらのデータは、ＳＩＶ感染アカゲザルに対するｓＣＤ４の投与が、ウイルス貯蔵庫の縮小を導びくことを示唆している。
ヒト臨床試験のフェーズＩによって、30mg／日の高い投与量で投与した場合にも、ｓＣＤ４は顕著な毒性または免疫原性を伴わないことが示された。薬物動態学的研究によって、ｓＣＤ４の血清半減期は静脈投与によれば45分、筋肉内投与後では9.4時間、薬物が皮下に投与された後では10.3時間であることが明らかになった（１４，１５）。ＣＤ４細胞のカウント及びＨＩＶ抗原のレベルに関して、予備的な抗ウイルス的研究では結論が出ていない。最大耐容量に達しないためｓＣＤ４の抗ウイルス効果は過少評価されており、特に、主要なウイルス単離に比較して、ＨＩＶ−１の実験室株を阻害するのに必要なｓＣＤ４濃度の相違に関する最近のデータにおいてはそうである（１６）。
ｓＣＤ４を用いたこれらイン・ビトロ及び霊長類での研究、並びにヒト臨床研究では勇気づけられる積極的な結果が得られたが、これらは又、幾つかの制約をも規定している。第一に、測定されたｓＣＤ４の血清半減期が相対的に短い。第二に、細胞表面ＣＤ４およびウイルス表面ｇｐ120が多価であるのとは対称的に、ｓＣＤ４はｇｐ120結合に関して一価である。第三に、ｓＣＤ４はＨＩＶ感染細胞に対して細胞障害性ではない。第四に、ｓＣＤ４は胎盤を有意に通過し得ない。従って、ＣＤ４の免疫グロブリン様特性の利点および免疫グロブリン自体の有利な性質を併有したキメラＣＤ４分子（即ち、ＣＤ４−免疫グロブリン・融合）が記載されている。
免疫グロブリン又は抗体はＢリンパ球によって製造される抗原結合性分子であり、これは液性免疫応答を包含する。免疫グロブリン分子の基本的なユニットは、二つの同じ重鎖および二つの同じ軽鎖からなる。夫々の鎖のアミノ末端は、アミノ酸配列が可変の領域（可変領域）を含んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は相互作用して、二つの抗原結合部位を形成する。夫々の鎖のカルボキシ末端は、アミノ酸配列が一定である領域（定常領域）を含んでいる。軽鎖は単一の定常領域を含んでいるのに対して、重鎖の定常ドメインは四つの分離したドメインに分けられる（ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，及びＣＨ３）。免疫グロブリン分子の重鎖には、ミュー（Ｍ）、デルタ（Ｄ）、ガンマ（Ｇ）、アルファ（Ａ）及びエプシロン（Ｅ）を含む幾つかのタイプが存在する。免疫グロブリン分子の軽鎖には、カッパ又はラムダの二つのタイプが存在する。重鎖および軽鎖の個々のタイプには、エフェクター機能において異なり得るサブタイプが存在する。組み立てられた免疫グロブリン分子は、それが具備する重鎖のタイプに由来した名前が付される。
モノクローナル抗体の発展によって、動物またはヒトの血清から得られる抗体の固有の不均一性の問題が解消されてきている。しかしながら、殆どのモノクローナル抗体はマウス起源の細胞に由来しており、従って、ヒトニ投与されるときには免疫原性を有する。より最近では、分子遺伝学とモノクローナル抗体技術との組み合わせによって、「ヒト化された」キメラ抗体のイン・ビボでの製造が開発されている。これらのキメラ抗体においては、ヒト免疫グロブリンにおける重鎖および軽鎖の可変ドメインが、ネズミモノクローナル抗体に由来する重鎖および軽鎖の特異的な可変ドメインで置き換えられる（１７−１９）。この遺伝子操作の結果、特定の抗原に対する特異性およびヒト免疫グロブリンの特性をもった分子が得られる。
ＣＤ４の配列解析および構造解析によって、前記四つの細胞外ドメインは免疫グロブリン様であることが示された。免疫グロブリンのＦｃ部分は該分子の異化速度を制御し（14〜21日の血清半減期）、また種々のエフェクター機能を提供するから、幾つかの報告は、免疫グロブリンの可変領域および定常領域をＣＤ４の免疫グロブリン様ドメインで置き換えることを記載している（２１−２４）。
キメラガンマ１・重鎖二量体をもたらすＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖融合タンパクが記載されている（２１）。これらの分子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに加えて、ガンマ１重鎖ＣＨ１ドメインを含んでいる。しかしながら、軽鎖の不存在下でＣＨ１ドメインが発現すされると、Ｋ重鎖の組み立て及び哺乳動物細胞からの分泌は効率が低い（２５）。その後、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域の最初の５アミノ酸を欠いたＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖融合タンパクは、高レベルで分泌されることが記載された（２２）。これら融合タンパクは、Ｆｃ受容体結合、ＨＩＢ−１感染細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＦｃ受容体依存性の機構を介した胎盤通過のような、免疫グロブリン分子の種々のエフェクター機能を保持している。ＣＤ４−ＩｇＭ・重鎖融合タンパクもまた記載されている（２６）。加えて、ＣＤ４のＶ１，Ｖ２ドメインがガンマ１重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣＤ４−ＩｇＧ１・融合タンパク、及びＣＤ４のＶ１，Ｖ２ドメインがカッパ軽鎖の定常領域に融合されたＣＤ４−ＩｇＧ１・融合タンパクが記載されている（２９）。
また、ＣＤ４を毒素に結合した融合タンパクが構築され、そのＨＩＶ感染細胞を殺す能力が試験されている。一つの研究においては、ｓＣＤ４が、リボソームを不活性化してタンパク合成を阻害し、細胞を殺すリシンの脱グリコシル化されたＡ鎖に結合された（２７）。この融合タンパクは、ＨＩＶの五つの異なった単離体で感染された細胞を特異的に溶解するが、非感染細胞に対しては無毒である。別の研究においては、ＣＤ４のＶ１，Ｖ２ドメインがシュードモナスエキソトキシンＡのドメインIIおよびIIIに結合された（２８）。この融合タンパクは、ＨＩＶエンベロープ糖タンパクｇｐ120を発現する細胞に特異的に結合し、該細胞内でのタンパク合成を阻害する（２５）。
ヒト単球およびマクロファージ（Ｍ／Ｍ）はＣＤ４を発現し、ＨＩＶに感染し得、感染の貯蔵庫およびウイルス播種担体として働くことが確立されている（２９）。更に、ヒトＭ／ＭはＦｃ受容体をも含んでおり、このＦｃ受容体は、Ｍ／Ｍが特定のＩｇＧ分子のＦｃ部分を介して該ＩｇＧ分子に結合する原因である（表１参照）。親和性の高いＦｃ受容体（ＦｃＲＩ）は、単量体ＩｇＧおよび複合体ＩｇＧ（抗原プラス抗体）に結合する。ＦｃＲＩのＩｇＧアイソタイプに対する親和性の序列は、ＩｇＧ１＝ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４＞であり、またＩｇＧ２とは相互作用しない。親和性の低いＦｃ受容体（ＦｃＲII）は、複合体の形のＩｇＧ寄りも低い親和性で単量体ＩｇＧに結合する。親和性の序列についていえば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の結合はＩｇＧ２及びＩｇＧ４のそれよりも大きい（３０）。
0003670276.tif 000002
ＨＩＶ+患者の血清がＨＩＶエンベロープ糖タンパクを認識する低力価の抗体を含むという最近のデモンストレーションのために、Ｍ／Ｍの感染が低力価の抗ＨＩＶ抗体によって、恐らくはＨＩＶおよびＦｃ受容体の交差結合により増大されることが観察されている（３１）。イン・ビトロ並びにアカゲザルにおいて、デングル熱ウイルス、黄熱ウイルス及びシンドビスウイルスによりマクロファージの感染が増大することが良く記録されている（３２）。このような増大は、これらウイルスに対する準無力化抗体の存在下で生じることが示されており、該抗体は該ウイルスのオプソニン化作用を有し、又これを細胞表面のＦｃＲｓ（または相補的受容体）に結合する。ＨＩＶの場合、この交差結合はＭ／Ｍの表面にＨＩＶを濃縮するように作用する。ｓＣＤ４は低力価抗体で見られる増大を阻害することができるから、Ｍ／Ｍ表面に濃縮されたウイルスは、次に細胞内への侵入のためにＣＤ４を利用することができる（３１）。
最近、バイルン等（２２）はｓＣＤ４の血漿半減期を増大させるため、並びにキメラ分子にエフェクター機能を与えるために、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＤ４−ＩｇＧ・キメラ抗体を製造した。従って、該分子はＭ／Ｍ表面に存在するＦｃ受容体に結合する能力を有し、これら細胞タイプの感染を潜在的に増大させる。これら細胞タイプの感染の増大は、新規治療剤の開発においては考慮すべき重大な問題であるから、ＣＤ４−ＩｇＧ分子を設計する我々の目的は、Ｍ／Ｍ・Ｆｃ受容体に結合する能力が大幅に減少したＩｇＧ２タイプを用いることである。更に、ヒトＩｇＧ１抗体はアロタイプ変種を含むのに対して、ヒトＩｇＧ２抗体は顕著なアロタイプ変種を含まないように思える（３３）。従って、免疫グロブリンドメインを含む組換分子に対する可能な免疫応答を回避するために、我々は多形性が最も少なく、且つマクロファージ表面にＨＩＶを濃縮する能力が低下した分子を選択した。
第二に、妊婦に対するＣＤ４−ＩｇＧ１の投与についても、胎児感染の増大が同様に観察されることが示され得る。例えば、胎盤の合胞体栄養細胞層の形質膜にＦｃ受容体が含まれることが記述されている（３０）。母体−胎児の間の免疫グロブリンの輸送は主にＩｇＧクラスに限定されるので、受動免疫は、特異的なＦｃ受容体の細胞透過機構を介した胎盤を横切る特異的輸送によって達成され得ると考えられる。更に、胎盤合胞体層の膜上に存在するＦｃ受容体は、前記ＩｇＧ１タイプの免疫グロブリンが該受容体に対する略10〜20倍高い結合親和性を有する点において選択的であるように思える。事実、全てのＩｇＧサブタイプの中で、ＩｇＧ１及び３は該受容体に対して最も高い親和性を有し、ＩｇＧ４がこれに続き、最後がＩｇＧ２である（３０）。これらの結果は、ヒト胎盤からのＦｃＲのクローニングで得られた結果、即ち該受容体がＭ／Ｍ上に見られるＦｃＲIIタイプに非常に似ていることを示す結果と一致する。胎盤を通過する免疫グロブリンの輸送は子宮内の胎児にとって有益であり得るとの議論は可能であるが、特定の病原（ＨＩＶのような）に提示された母体の特定の免疫グロブリンは、ポリＩｇ受容体を介した上皮（Epithelia）を横切るＩｇＡの輸送に発展する機構と同様、Ｆｃ依存機構を介した胎盤を横切る輸送を容易にして胎児の感染を増大し得るとの議論もまた可能である（３４）。従って、胎盤を通過して胎児血清中に濃縮することが示されている特定のＣＤ４−ＩｇＧ１・融合タンパク（２２）は、ＨＩＶに胎盤障壁を横切る新しい機構をを提供することにより、胎児にとって有害となり得る。
今回、我々は特定のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が、１年以上前に記述されたＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖ホモ二量体に比して利点を提供することを発見した。特に、我々はＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインを含むＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を構築した。このキメラ重鎖ホモ二量体は、哺乳動物細胞内で効率的に組み立てられ、哺乳動物細胞から効率的に分泌されて、このキメラ重鎖ホモ二量体を発現する細胞の培地から効率での回収および精製を可能とする。このホモ二量体を構築するために、我々はヒトガンマ２・重鎖からの全体のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域を用いた。これは二量体化および効率的な分泌の原因であるヒト・ＩｇＧ２分子の定常ドメインを含むキメラ分子をもたらす。これは、カプロンおよびグレゴリー（２０）によって記述された、ＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖二量体中にＣＨ１を含み、組換分子の分泌および細胞培養からの回収性が乏しい重鎖二量体とは対照的である。我々はまた、効率的な二量体化を提供するために、本発明のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体中にガンマ２・重鎖の全体のヒンジドメインを含ませた。何故なら、このドメイン中に含まれるシステイン残基は、ホモ二量体の第二鎖に対してジスルヒド結合を形成し、二つの鎖を正しい空間的配置に位置づけて抗原結合部位の形成を容易にする原因だからである。
更に、全体のヒンジドメインを含ませることによって、我々は重鎖二量体の切片のフレキシビリティーを維持し、補体活性化およびＦｃ受容体結合のような生物学的機能の調節を（２９）可能とした。
ＩｇＧ２免疫グロブリンは単球、マクロファージ及び胎盤膜上のＦｃ受容体に結合する極めて減少された能力を有するから、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体およびＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の構築によって、ＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖ホモ二量体およびＣＤ４−ＩｇＧ１・キメラヘテロ四量体にはない多くの利点を有するキメラタンパクがもたらされる（２０，２３，２４，２６）。更に、他のＩｇＧタイプに比較すると、ヒトＩｇＧ２は顕著に多形性が少なく、従ってヒトに投与されたときの免疫原性は小さくなる。これは、多くのアロタイプを含んでおり、従ってヒトに投与されたときに免疫原性となる可能性が高いヒトＩｇＧ１とは対照的である。
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に加えて、我々はヒトガンマ２・重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインを含んだ、ＣＤ４−ＩｇＧ２・重鎖を構築した。これらの分子はＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体をコードし、またヒト・カッパ軽鎖（又はラムダ軽鎖）の全体の定常ドメインに融合されたＣＤ４のＶ１及びＶ２ドメインを含むＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の存在下で同時発現されると、前記ヘテロ四量体の製造を可能にする。このヘテロ四量体は、二つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖及び二つのＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を具備する。ＣＨ１ドメインを含む重鎖の製造は、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖との効率的な会合または共働を可能とし、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の効率的な分泌をもたらす。これらＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体は、重鎖二量体に比較して、増大した血清半減期およびＨＩＶに対する増大したアビディティーを有する。
〔発明の概要〕
本発明は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする発現ベクターを提供する。本発明はまた、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖をコードする発現ベクターを提供する。最後に、本発明はＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
図１：Ａ）ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子のドメイン構造；Ｂ）ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のタンパク構造。下に示した配列は、ＣＤ４（Phe176）とヒトガンマ２・重鎖のヒンジ領域との間の連結部の１文字アミノ酸コードである。なお、ガンマ２・重鎖のヒンジ領域は四つのシステイン（テキストの考察を参照）を含んでいる。略語：ＬはヒトＣＤ４のリーダー（シグナル）配列；Ｖ１Ｖ２はヒトＣＤ４のアミノ末端可変様ドメイン；Ｈはヒトガンマ２・重鎖のヒンジ領域；ＣＨ２およびＣＨ３はヒトガンマ２・重鎖の第二および第三定常領域。
図２：Ａ）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の発現に用いられるキメラ遺伝子のドメイン構造。上部はＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子；下部はＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子。Ｂ）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のタンパク構造。略語：ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３はヒト・カッパ軽鎖の第一、第二及び第三定常領域；Ｃ−カッパはヒト・カッパ軽鎖の定常領域。
図３：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体（一本鎖）のＤＮＡ配列および予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号はヌクレオチド位置を示す。夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。
図４：ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖のＤＮＡ配列および予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号は、ヌクレオチド位置を示す。夫々の行の上の数字夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。
図５：ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖のＤＮＡ配列および予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号は、ヌクレオチド位置を示す。夫々の行の上の数字夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。
図６：形質移入された細胞からのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の分泌。Ｃｏｓ−Ｍ５細胞が偽って形質移入され、またはＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入され、或いはＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１を形質移入された。形質移入後48-72時間の時点で、該細胞が35Ｓ−メチオニンで放射能ラベルされた。放射能ラベルされた培地が、プロテインＡ・セファロースビーズで沈殿された。沈殿されたタンパクは、還元性条件または非還元性条件の下にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、フルオログラフィーによって可視化された。レーンＭは偽りの形質導入された細胞からの培地；レーン１はＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入された細胞からの培地；レーン２はＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１を形質移入された細胞からの培地。
図７：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を用いたＨＩＶ−１・ｇｐ120の沈殿。Ｃｏｓ−Ｍ５細胞が偽って形質移入され、またはＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入され、或いはＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１を形質移入された。形質移入後48-72時間の時点で、培地のラベルされていないアリコートが35Ｓ−メチオニンでラベルされたｇｐ120のアリコートと共にインキュベートされた。この複合体は、プロテインＡ・セファロースビーズで沈殿された。次いで、沈殿物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いてフルオログラフィーにかけられた。レーンＭは偽りの形質導入された細胞からの培地；レーン１はＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入された細胞からの培地；レーン２はＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１を形質移入された細胞からの培地。
図８：ＣＨＯ細胞馴らし培地から得たＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製。ＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖ホモ二量体またはＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を本質的に分泌する安定なＣＨＯ細胞が、ローラボトル内で増殖された。馴らし培地がプロテインＡ−セファロースカラムに通され、結合物質がカラムから溶出された。ピーク画分がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、続いて銀染色およびプールされた。次いで、精製されたタンパクが還元性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いて銀染色された。レーン１は、ＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖ホモ二量体；レーン２は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体。
図９：ＣＤ４系分子による、ＨＩＶのＣＥＭ細胞への結合の阻害。ＣＤ４陽性細胞へのウイルスへの結合の阻害について、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）、部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ１、または部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ２が試験された。間接的免疫蛍光分析およびサイトフルオログラフィーによって、結合したウイルスが検出された。結果は、阻害剤の濃度に対するパーセント阻害として表わされた。
図１０：ＣＤ４系分子による、ＣＤ４陽性細胞のＨＩＶ感染の阻害。ｓＣＤ４、部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ１または部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ２が、ＨＩＶ−１播種（100ＴＣＩＤ50）と共にインキュベートされ、該混合物に対してＰＨＡ刺激されたリンパ球が添加され、37℃で一晩インキュベートされた。該細胞を洗浄し、微小培養器内にプレーティングし（１×１０5細胞／培養；稀釈当たり１０カルチャー）、８日後および１２日後に培養上清中のＨＩＶ抗原を検出することによって、ウイルスの複製をモニターした。結果は、阻害剤の所定濃度におけるパーセント陽性培養として表現した。
図１１：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を本質的に分泌する安定なＣＨＯ細胞が、ローラボトル内で増殖された。馴らし培地がプロテインＡ−セファロースカラムに通され、結合物質がカラムから溶出された（図８参照）。ピーク画分がプールされ、Ｓ−セファロースカラムに通された。広範に洗浄した後、50mM BES pH7.0，500mM NaClを用いてＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が溶出された。ピーク画分がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、続いて銀染色され、プールされて濃縮された。プールされて濃縮されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、ＰＢＳで予め平衡化されたセファクリルＳ-300ＨＲカラムに掛けられ、ＰＢＳで溶出された。精製されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に対応するピーク画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びこれに続く銀染色によって同定された。次いで、ピーク画分がプールされ、濃縮された。精製されたタンパクは、次いで非還元性条件および還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いて銀染色された。レーン１は、非還元性条件下で行った略1.5μｇタンパク；レーン２は、還元性条件下で行った略1.5μｇタンパク。
図１２：安定に形質移入された細胞からの、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の分泌。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を安定に発現するＣＨＯ細胞が、35Ｓ−メチオニン及びシステインで放射能ラベルされた。放射能ラベルされた培地は、プロテインＡ−セファロース・ビーズで沈殿された。（Ａ）沈殿されたタンパクは、非還元性条件下でのＳＣＤ−ＰＡＧＥによって分析され、フルオログラフィーによって可視化された。レーン１は、非形質移入ＣＨＯ細胞からの培地；レーン２は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を安定に発現する細胞からの培地。（Ｂ）Ａのレーン２で分析されたのと同じサンプルが、非還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのレーンが切り取られ、該ゲル切片は、平衡化緩衝液（62.5mM Tris HCl pH6.8、2.3% SDS 5%β−メルカプトエタノール、10%グリセロール）中において４℃で45分間インキュベートすることにより還元された。このゲル切片を還元性条件下でインキュベートした後、該ゲル内に含まれるタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、フルオログラフィーによって可視化した。
〔発明の詳細な記述〕
ＣＤ４−ＩｇＧ２−Ｒｆ，ＣＤ４−ＩｇＧ１−Ｒｆ，ＣＤ４−ＩｇＧ１ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ，ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ，ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ，ＣＤ４−ＩｇＧ１−ｐｃＤＮＡ１，及びＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡと命名された五つの発現ベクター及び二つのプラスミドの夫々、ＡＴＣＣ受付番号第40949号、第40950、第75192号、第75193号、第75194号、第40951号、第40952号の下に、ＵＳＡ．20852メリーランド、ロックウイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。
特に、本発明はＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１（ＡＴＣＣ第40951号）と命名された発現ベクターを提供する。加えて、本発明はこの発現ベクター、或いは同ＤＮＡコード領域を挿入された他の何れかの発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を提供する。特に、本発明はまた、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖をコードする、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第75193号）及びＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第75194号）と命名された発現ベクターを提供する。加えて、本発明はこれらの発現ベクター、或いは同ＤＮＡコード領域を挿入された他の何れかの発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を提供する。
本発明に従えば、発現のための多くのベクター系が用いられ得る。例えば、或るクラスのベクターでは、ウシ・パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチンウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、又はＳＶ40ウイルスのような動物ウイルスから誘導されたＤＮＡ要素が利用される。加えて、形質移入されたホスト細胞の選別を可能にする一以上のマカーを導入することによって、該ＤＮＡをクロモソーム中に安定に組み込んだ細胞が選択され得る。このマーカーは、原栄養株を栄養要求性宿主にしたり、生物致死耐性（抗生物質耐性）や銅等の重金属に対する耐性を与え得る。選別可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接に結合され得、或いは同時形質転換によって同じ細胞内に導入され得る。ｍＲＮＡの最適合成のために、追加の要素もまた必要とされ得る。これらの要素にはスプライス信号、並びに転写プロモータ、エンハンサー及び停止信号が含まれる。このような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、オカヤマによって記載されたものが含まれる（３７）。
こうして、本発明は更に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の製造方法を提供する。この方法は、下記のa)〜c)を具備する。
a）哺乳動物細胞に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を産生するための発現ベクターで形質移入すること；
b）上記で得られた形質転換哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が産生される条件の下で培養すること；及び
c）こうして産生されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を回収すること。
発現のための構造を含むＤＮＡベクター又はＤＮＡ配列が製造されると、この発現ベクターは適切な哺乳動物宿主細胞に形質転換され、または該細胞内に導入される。プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又は他の従来技術のような種々の技術が用いられ得る。プロトプラスト融合においては、細胞が培地中で増殖され、適切な活性についてスクリーニングされる。当該遺伝子の発現によって、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の一つの鎖に対応する融合タンパクの産生がもたらされる。この融合タンパクは、次いでキメラ重鎖ホモ二量体を形成するように処理される。
更に、得られた形質転換細胞を培養する方法、並びにこうして産生されたキメラ重鎖ホモ二量体を回収するための方法は当業者に周知であり、使用される個々の発現ベクター及び哺乳動物宿主細胞に基づいて変形または最適化され得る。
権利請求される発明に従えば、本発明のキメラ重鎖ホモ二量体を発現させるための好ましい宿主細胞は哺乳動物セルラインであり、例えば、ＳＶ40（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎ＣＶ１ライン；ヒト胚体腎ライン293；新生ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アルリカ緑サル腎細胞（ＶＥＲＯ-76）；ヒト頸部腫瘍細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；ヒト肺細胞（Ｗ 138）；ヒト肝細胞（ＨepＧ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ060562）；マウス・セルライン（Ｃ 127）およびミエローマ・セルラインが含まれる。
本発明は更に、ＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法を提供する。この方法は、ＣＤ４+細胞を、該細胞の感染を阻止するのに有効な量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体で処理することを具備する。
加えて、本発明は対象をＨＩＶによる感染から防ぐ方法を提供する。この方法は、対象に対して、該対象をＨＩＶによる感染から防止するために有効な量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与することを具備する。
本発明は種々の対象に対するキメラ重鎖ホモ二量体の投与を包含するが、興味の対象は特にＡＩＤＳ患者である。更に、該ホモ二量体を投与する方法は当該技術分野において周知であり、例示のみを目的として列記すれば、これを単独またはＡＺＴもしくはＤＤＩと組み合わせた形での、皮下注射、筋肉内注射および静脈内注射が挙げられる。
更に、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するように、ＨＩＶに感染した対象を治療する方法が提供される。この方法は、対象に対して、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するために有効な量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与することを具備する。
例えば、該ホモ二量体は、血漿１ml当たり約100ngのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の濃度を維持できる投与量で、ＨＩＶ感染を有する患者に対して投与され得る。異なった分子量を有するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の変種については、血漿１ml当たり約２ピコモルの可溶性受容体、例えば、天然の可溶性受容体（膜に結合したもの）との化学量論的等量を達成するのに充分な量が投与される。典型的には、可溶性ＣＤ４の投与量は、１日当たり、約100μｇ／ｋｇ患者体重である。
上記の方法は、ＨＩＶ感染患者の体内におけるＨＩＶウイルスの広がり防止を補助する。加えて、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、ＨＩＶの広がりに対する患者血液の感受性を低下させる予防的手段として投与され得る。このような予防的投与には、ＨＩＶ接触の前、該接触後の短期間またはその両方での投与が含まれる。
更に、ＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻止するのに有効な量の本発明によるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、薬剤的に許容可能な担体とを含有する薬剤組成物が提供される。
薬剤的に許容され得る担体は、本発明が関係する技術の分野において周知であり、何等限定されるものではないが、その中には0.01-0.1Ｍ、好ましくは0.05Ｍのリン酸緩衝液、または0.8％生理食塩水溶液が含まれる。加えて、このような薬剤的に許容され得る担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、並びにオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、整理食塩水および緩衝媒質を含む水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。非経腸的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定化オイル（fixed oil）が含まれる。静脈内担体には、液体の栄養補液、リンゲルのブドウ糖液をベースとするような電解質補液、その他が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も存在せしめ得る（３８）。
本発明は更に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、これに結合した毒素とを含有する組成物を提供する。
毒素の幾つかの例としては、リシンの脱グリコシル化されたＡ鎖、ジフテリア毒素、又は非ペプチジル細胞毒がある。これらの毒素は、従来のイン・ビトロでのタンパク架橋剤を用いて結合され得る。加えて、該毒素は組換合成によって、融合タンパクとして結合され得る（例えば、米国特許第4,765,382号を参照のこと）。
本発明はまた、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、これに結合された検出マーカーとを含有した診断試薬を提供する。ＨＩＶウイルスに結合することに加え、検出マーカーが結合されている分子を用いることによって、ＨＩＶ感染細胞を同定することができる。従来の検出マーカーの例には、125Ｉのような放射性アイソトープ、発色団、および蛍光基が含まれる。
こうして、本発明のキメラ重鎖ホモ二量体は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染が疑われる動物から採取したサンプルを本発明のホモ二量体と接触させ、単独またはＨＩＶ感染細胞表面のｐｇ120と複合体を形成するか否かを検出することによって、生物学的サンプルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶウイルス感染を試験するために用いられ得る。この目的のために、本発明のホモ二量体は、検出マーカーでラベルされ又はラベルされずに、該ホモ二量体またはこれとｇｐ120との複合体に特異的に向けられる検出可能にラベルされた別の試薬で検出される。
例えば、生物学的サンプルは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパクを固相化できるニトロセルロース又は他の固相支持体で処理され得る。該支持体は、次いで適切な緩衝液で洗浄され、続いて検出可能にラベルされ得るキメラ重鎖ホモ二量体で処理され得る。次に、固相支持体は緩衝液で二回目の洗浄が行なわれて未結合の融合タンパクが除去され、ラベルされたホモ二量体が検出される。
この試験を行うに際しては、次のステップが採用される。
a）ｇｐ120を含有することが疑われるサンプルを固相支持体に接触させ、ｇｐ120または表面にｇｐ120を発現する細胞の固相化を行なうこと；
b）前記固相支持体を、検出可能にラベルされた本発明のキメラ重鎖ホモ二量体と接触させること；
c）前記検出可能にラベルされたホモ二量体を、該ホモ二量体が前記固相化されたｇｐ120又はｇｐ120を表面に発現した細胞に結合するのに充分な時間だけ、前記支持体と共にインキュベートすること；
d）ステップc)で得られたインキュベーション混合物から、該固相支持体を分離すること；および
e）結合されたラベル化ホモ二量体を検出し、これによってｇｐ120を検出すること；
このような方法は、当該技術分野で周知の方法を用いて、定性試験または定量試験としてフォーマット化される。
或いは、ラベルされたホモ二量体ｇｐ120複合体は、該複合体を、例えば免疫グロブリン、プロテインＡ、プロテインＧまたは抗ＩｇＧ抗体に特異的な固相化された抗体またはタンパクと接触させることにより、反応混合物から分離され得る。このような抗免疫グロブリン抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。次いで、固相化されたｇｐ120-ラベル化ホモ二量体／抗体の複合体を得るために、固相支持体は適切な緩衝液で洗浄され得る。ホモ二量体上のラベルが検出されて内因性ｇｐ120が測定され、これによってＨＩＶの存在が検出される。
本発明の一つの態様において、サンプル中におけるＨＩＶまたはＳＩＶウイルス感染の検出方法は、次のa)およびb)を具備する。
a）ｇｐ120の含有が疑われるサンプルを、本発明に従うＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体および免疫グロブリンのＦｃ部分と接触させることと；
b）複合体が形成されたか否かを検出すること。
本発明はまた、下記のa)〜c)を具備したサンプル中におけるｇｐ120の検出方法を提供する。
a）ｇｐ120の含有が疑われるサンプルを本発明のホモ二量体および免疫グロブリン鎖のＦｃ部分と接触させることにより得られた混合物を、前記ホモ二量体に特異的で且つ固相支持体に固相化された抗体、プロテインＡまたはプロテインＧのようなＦｃ結合性分子と接触させて、ｇｐ120-ホモ二量体固相化抗体の複合体を得ること；
b）ステップa)で得られた該固相支持体を洗浄し、未結合のホモ二量体を除去すること；および
c）このホモ二量体を検出すること。
勿論、未ラベル又は検出可能にラベルされたホモ二量体およびｇｐ120の特定の濃度、温度、インキュベーション時間、並びに他の試験条件は、サンプル中のｇｐ120の濃度およびサンプルの性質等を含む種々の因子に応じて変化し得る。当業者は、夫々の測定のための操作条件および最適試験条件を容易に決定することができる。
また、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）またはＣＤ４キメラタンパクを検出し、定量するための酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）が提供される。この試験を行う際、そのプロセスは次のa)〜e)を具備する。
a）可溶性ｓＣＤ４を固相化するために、ｓＣＤ４を含むサンプルを固相支持体と接触させること；
b）前記固相支持体を、検出可能にラベルされたモノクローナル抗体ＯＫＴ４ａ単独と接触させるか、またはｓＣＤ４若しくはＣＤ４キメラタンパクを含むサンプルおよびＯＫＧ４ａと接触させること；
c）前記検出可能にラベルされたＯＫＧ４ａを含む培地を、固相化されたｓＣＤ４に結合させるために充分な時間だけインキュベートすること；
d）ステップc)におけるインキュベーション混合物から、前記固相支持体を分離することと、
e）結合されたＯＫＴ４ａを検出し、これによってサンプル中に含まれるＣＤ４の量を定量すること。
本発明は更に、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第75193号）と命名された、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖をコードする発現ベクターを提供する。本発明は又、その重鎖が上記発現ベクター若しくはこれと同じコーディング配列を含む他のベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を提供する。
加えて、ＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第75194号）と命名された、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクターを提供する。本発明は最後に、その軽鎖が上記ＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ発現ベクター若しくはこれと同じコーディング配列を含む他のベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を提供する。
更に本発明は、その重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を提供する。
本発明は更に、このようなＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法を提供する。この方法は、次のa)〜c)を具備する。
a）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生するための発現ベクターと、軽鎖をコードする発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入すること；
b）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が産生されるような条件下で培養すること；および
c）こうして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収すること。
哺乳動物細胞に同時形質移入する方法は当該技術において周知であり、これまでに議論されたものが含まれる。同様に、軽鎖をコードする発現ベクターは当該技術分野において周知である。
加えて、本発明は次のa)〜c)を具備した、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法を提供する。
a）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生するための発現ベクターと、重鎖をコードする発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入すること；
b）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が産生されるような条件下で培養すること；および
c）こうして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収すること。
更に、本発明は下記a)〜c)を具備した、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法を提供する。
a）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖を産生するための発現ベクターと、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生するための発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入すること；
b）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が産生されるような条件下で培養すること；および
c）こうして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収すること。
本発明は又、ＣＤ+細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法を提供する。この方法は、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかを用い、ＣＤ４+細胞の感染を防止するのに有効な量の上記ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体で、該ＣＤ４+細胞を処理することを具備する。
本発明は更に、対象がＨＩＶで感染されるのを防止する方法を提供する。この方法は、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかを、対象がＨＩＶで感染されるのを防止するのに有効な量で、対象に対して投与することを具備する。
本発明はまた、ＨＩＶで感染された対象を、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するように治療する方法を提供する。この方法は、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかを、対象またはＡＩＤＳ患者の体内におけるＨＩＶ感染の広がりを阻止するのに有効な量で、対象に対して投与することを具備する。
また、本発明は薬剤組成物を提供する。該組成物は、ＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻止するのに有効な量のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体であって、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する。
本発明によれば、更に、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかと、これに結合された毒素とを含有する組成物が提供される。
本発明の一つの態様において、該毒素は脱グリコシル化されたリシンのＡ鎖、シュードモナスエキソトキシンＡのドメンIIもしくはIII、または非ペプチジル化細胞毒である。
本発明は更に診断試薬を提供する。この診断試薬は、その重鎖がＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎖および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかと、これに結合された検出マーカーとを含有する。
以下に示す例の理解を容易にするために、頻繁に出てくる一定の方法および／または用語はマニアティス等（４２）に最も良く説明されている。
以下の実験の詳細のセクションにおいて、本発明が例示される。これらのセクションは本発明の理解を助けるために提示されるものであって、後述の請求の範囲に記載される発明を限定することを意図したものではなく、また如何なる意味でもそのように解釈されてはならない。
〔実験の詳細〕
Ａ．材料及び方法
１．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子の作成
プラスミドｐＳＰ６Ｔ４（４）からＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１制限酵素断片としてヒトＣＤ４ｃＤＮＡを切り出した。０．７０キロベース断片を単離し、ＥｃｏＲ１／Ｓｍａ１で消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化した。その後この中間ベクター（Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））を単離し、Ｐｓｔ１でリニア化し、精製し、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で処理した。ヒトガンマ２・重鎖遺伝子を含むプラスミドｐＢｒガンマ２から２．０Ｋｂ  Ｐｓｔ１／Ｐｓｔ１断片（３６）（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エキソンを含む）を単離し、ＢＡＰ処理したＭ１３ｍｐ１８／ＣＤ４ベクターにクローン化した。得られた組み換え体をその後Ｐｓｔ１断片の正方向に対して（ＣＤ４配列に関して）スクリーニングし、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１）−ガンマ２（Ｐｓｔ１／Ｐｓｔ１）を含むベクターを得た。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子を得るために、オリゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発（oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis）を遂行して、ＣＤ４及びガンマ２・重鎖ＤＮＡ配列を並べて、フレームのＣＤ４配列をヒンジエキソンにつなげた。得られたキメラＤＮＡ分子はＣＤ４のＶ１Ｖ２領域及びそれに続くガンマ２・重鎖のヒンジＣＨ２及びＣＨ３領域を含む蛋白質をコードする（図１Ａ）。突然変異誘発は、形質転換したＴＧ１細胞からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡ（アマシャム）で遂行された。簡単には、鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶ１Ｖ２のＰｈｅ（１７９）をコードする最終コドンをＩｇＧ２に対するヒンジの最初のコドン（Ｇｌｕをコードする）に接続する配列を含む３４ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５′−ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３′）でアニーリングした（図１Ａ及び図３）。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換した。単離したプラークをその後新鮮なＴＧ１細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製した。すべての変異をシークエナーゼシステム（ＵＳＢ）を用いてジデオキシ法により立証及び確認した。正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをその後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡ（ＣＤ４−ＩｇＧ２−Ｒｆと称する）を単離した。
２．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする哺乳類発現ベクター作成
ＥｃｏＲ１を用いたリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子を単離した。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてうめた。平坦な末端を有するＤＮＡをその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過剰のＨｉｎｄＩＩＩリンカーにつなげた。７０℃、１５分間でＴ４ＤＮＡリガーゼを熱不活性化した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで広範囲に消化し、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子を含む断片を遊離した。その後このＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン）につなげた。得られたプラスミドをその後ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換した。プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部の存在及びプラスミド中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入部の方向を制限酵素分析により確かめた。得られたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする哺乳動物発現プラスミドはＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１と称する。
３．哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１の発現
ａ．一時的な発現
10％牛胎児血清を含有するDMEM中で増殖したＣｏｓＭ５細胞を７５％コンフレントになるように分割した。次の日、標準的なＣａＰＯ（４）沈降法により、この細胞にＣｓＣｌで精製されたプラスミドＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮＡ１０μｇを１６〜２０時間でトランスフェクションした。トランスフェクションの後、この細胞に新鮮な培地を添加した。トランスフェクション後４８〜７２時間後に合成された生成物の分析を、トランスフェクタントの35Ｓ−メチオニンによる１２〜１８時間の放射能ラベル及びそれに続く抗ＣＤ４抗体を用いた培地及び細胞溶解産物の沈降、或いはプロテインＡ−セファロースビーズのみを用いたインキュベーション及びそれに続く還元或いは非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより遂行した（図６）。更に、培地及び細胞溶解産物の分析をトランスフェクション後４８〜７２時間後に、標準的なウエスタンブロッティング手順により遂行した。
ｂ．安定な発現
Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、ＣｓＣｌで精製されたＤＮＡ２０μｇを、ＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１：ｐ４１０（ｐ４１０はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミドである）１０００：１のモル比でトランスフェクションした。しかし他の比率も用いることができる。トランスフェクション後約３〜５日後に、細胞を選択培地（１０％透析牛胎児血清を含む無ヌクレオシドアルファＭＥＭ）にまいた。セレクション後約１０〜１５日後に、個々の細胞クローンを採取し、ＥＬＩＺＡ、プロテインＡ−セファロースビーズを用いた沈降及びそれに続く還元或いは非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ等のいくつかのスクリーニング技術を用いてＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の安定な発現を分析した。高レベルで発現したクローンを、メソトレキセートの濃度を増加させた中で増やし、新しく導入されたＤＮＡ配列を連続的に繰り返し増幅させた。このように、１０〜１００μｇ／ｍｌのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を分泌する安定なＣＨＯ細胞株が樹立された。
４．ＣＨＯ馴らし培地からのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を、プロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーを用いて１工程で精製した。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を分泌するＣＨＯ細胞を、１０％無ＩｇＧ牛胎児血清アルファＭＥＭが入っているローラーボトル中で高密度になるまで増殖させた。馴らし培地を回収し、遠心により分離し、この及び次の緩衝液中に界面活性剤（すなわちＴｗｅｅｎ）を含む、或いは含まないＰＢＳで１：１希釈した。その後、希釈した培地を、６０ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたプロテインＡ−セファロースファーストフロウの５ｍｌカラムにかけた。広範囲な洗浄の後、特異的に結合した材料を、直ぐに溶出フラクションを中和するために、１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）のアリコートに直接溶出した。その後フラクションを還元及び非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により分析し、プールした（図８）。
その後プールしたフラクションを、１２０ｍｌ／時間の流速で、予め５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）で平衡にしたＳ−セファロースファーストフロウの１０ｍｌカラムにかけた。サンプルをのせた後、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を特異的に溶出させるために、１工程溶出勾配（a step elution gradient）（以下の４工程からなる：５カラム体積の５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、４カラム体積の５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６カラム体積の５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、及びそれに続く８カラム体積の５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用した。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を、５０ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムから溶出させた。その後ピークフラクションをプールし、濃縮して、最終的に蛋白質の濃度を少なくとも１ｍｇ／ｍｌにした。プールし、濃縮されたフラクションをその後、８ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたセファクリル  Ｓ−３００ＨＲの１２０ｍｌカラムにかけた。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のフラクションをＰＢＳ中に特異的に溶出させ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
５．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＨＩＶエンベロープ糖タンパクｇｐ１２０に対する結合の例証
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を発現しているＣｏｓＭ５トランスフェクタントを、１０％無ＩｇＧ牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートした。その後ラベルされていない培地を回収し、35Ｓ−メチオニン−放射能ラベルＨＩＶ  ｇｐ１２０を沈降させるために用いた。35Ｓ−メチオニン−ラベルＨＩＶ  ｇｐ１２０を含むＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体含有培地をインキュベーションした後、複合体をプロテインＡ−セファロースに吸着させた。プロテインＡ−セファロース複合体を遠心により回収し、沈降物を還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くフルオログラフィーにより分析した（図７）。また、ＣＨＯ細胞から精製されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のアリコートも、同様の手順で35Ｓ−放射能ラベル  ｇｐ１２０を沈降させるために用いた。
６．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の血漿半減期及び胎盤移入の例証
血漿半減期及び胎盤移入の例証を、すでに確立されている技術により遂行する。簡単には、ウサギ又はサルに、精製されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を静脈内或いは筋肉内注射する。注射後種々の時点において、血漿サンプルを採取し、血清中に存在するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の量をＥＬＩＺＡにより測定する。更に妊娠したサルにもＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をＩＶ又はＩＭ注射し、新生サルのさい帯血及び血清中の濃度を測定する。新生サルのさい帯血及び血清中に加えて、母親の血清中のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の量の測定及び比較は、これら分子の胎盤を通した移入比率を示す。
７．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染性の測定
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染性の測定はすでに確立されている技術を用いて行う。これらの研究に対して、ヒト末梢血からの単球／マクロファージ群から精製されたＵ９３７細胞（ＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩを発現しているヒト単球細胞株）及びヒト組み換えＦｃＲｓを本質的に発現するヘラ細胞が用いられる。更にＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩに特異的なモノクローナル抗体は商業的に入手可能である。簡単には、放射能標識された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を上記細胞及び適当なコントロール細胞と共に４℃で種々の時間でインキュベートする。各インキュベーションの終りに、細胞を溶解し、細胞に結合している放射能活性を測定し、各細胞型に特異的に結合するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の量を立証する。コントロールとして、特異的な抗体の結合のレベルを測定するために、放射能標識された正常の単量体の或いは凝集した正常ヒトＩｇＧ２を用いる。更に、放射能標識された成分と、標識されていない単量体のまたは凝集した正常ヒトＩｇＧ２、或いはＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩに対するモノクローナル抗体との競合は、各細胞型に対するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の結合効率及び特異性を立証する。
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が単球／マクロファージのＨＩＶ感染の増強を媒介するか否かを確認するために、ＨＩＶ−１を培地のみと共に、或いはいくつかの希釈された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のいずれかと共にインキュベートする。コントロールとして、正常な個人及びＨＩＶ感染した個人からの血清を用いる（３１）。１時間、４℃のインキュベーションの後、前パラグラフに記載された細胞型にオプソニン化ウイルスを添加する。感染後種々の時点において、培地を回収し、ウイルス逆転写活性をアッセイしてウイルス感染の程度を測定する。コントロールとして、細胞の感染の間に、ｓＣＤ４、ＯＫＴ４ａ、又はＬｅｕ３ａを含ませる。更にＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体及び適当なコントロールの種々の希釈液を、結合が可能になるように４℃で細胞と共にまずインキュベートする。その後ＨＩＶを添加し、ウイルス逆転写活性により感染アッセイを行う。
８．ＨＩＶ結合アッセイ
ＨＩＶの結合は、前記の通り遂行された（４３，４４）。簡単には、濃縮されたＨＩＶ−１調製液をｓＣＤ４、ＣＤ４−ガンマ２、又はＣＤ４−ガンマ２の種々の希釈液と共に３０分間インキュベートし、その後５×１０5のＣＥＭ細胞に添加する。結合したウイルスを、前述の間接蛍光抗体法及びサイトフルオログラフィーによって検出した（４４）。
９．中和アッセイ
増殖性ウイルス複製のマイクロカルチャーアッセイは前述の通りであった（４３，４５）。簡単には、ｓＣＤ４、ＣＤ４−ガンマ２、又はＣＤ４−ガンマ２の希釈液を、１００ＴＣＩＤ50ＨＩＶ−１と共に室温で３０分間インキュベートした。この混合液をＰＨＡ−刺激性リンパ球に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。その後に細胞を洗浄し、１×１０5／カルチャーでマイクロカルチャープレートにまいた。そして希釈当たり１０カルチャーについて、８日及び１２日後の培養上清中のＨＩＶ抗原を検出することによって増殖性ウイルス複製をモニタリングした。
Ｂ．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の発現のためのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖及びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の作成
１．イントロダクション
本発明は、形質転換した哺乳動物の細胞から効率よく分泌されるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子に関する。このキメラ分子は、効果的なホモ二量体の組立て及び分泌を可能とする、ヒトＩｇＧ２・重鎖からの配列を含むように設計されている。ＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域は、細胞内に重鎖分子を保持させ、軽鎖とヘテロ四量体を形成させる（２５）。効率よくＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を生産するために、前記ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子は特異的にＣＨ１領域を欠いている。得られたホモ二量体は２つのＣＤ４Ｖ１Ｖ２成分を含み、従って、ｇｐ１２０結合に関して二価となる可能性を有し、またｓＣＤ４と比較してＨＩＶに対して増強されたアビディティーを有する。
更に、本発明は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の作成に関する。得られたヘテロ四量体は、２つ或いは４つのＣＤ４Ｖ１Ｖ２成分を含み、ｇｐ１２０結合に関して四価となる可能性を有している。また、ｓＣＤ４と比較してＨＩＶに対して増強されたアビディティーを有する。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産するために用いられるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子は完全な重鎖定常部を含み、またＣＨ１領域も含む。ＣＨ１領域を含むと、軽鎖との効率のよい細胞内相互作用を促進し、ジスルフィド結合したヘテロ四量体の分泌を可能にする。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子及びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子は共にＣＤ４のＶ１Ｖ２領域を含む。ＣＤ４のＶ１領域のみを含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子またはＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を（何れか一方または両者を組み合わせて）発現させる試みは失敗であった。
２．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産するためのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖発現ベクター又はＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖発現ベクターの作成
ａ．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターの作成
ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ配列をプラスミドｐａＳＰ６Ｔ４（４）からＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１制限酵素断片として切り出す。０．７０キロベース断片を単離し、ＥｃｏＲ１／Ｓｍａ１で消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化する。その後得られたベクター（Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））を単離し、ＢａｍＨ１で消化する。Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））のＢａｍＨ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平坦な末端とする。ポリメラーゼを６５℃１５分間で熱不活性化した後、リニア化したＭ１３ｍｐ１８（ＣＤ４）ベクターをＰｓｔ１で消化し、精製する。
ヒトガンマ２・重鎖遺伝子のＣＨ１エキソンを含む断片を切り出すために、プラスミドｐＢｒガンマ２（３６）をＳａｃＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ部位をその後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦にする。ポリメラーゼを熱不活性化した後、この断片をＰｓｔ１で消化する。得られたＣＨ１エキソンを含むＳａｃＩＩ（平坦）−Ｐｓｔ１断片をその後精製し、前パラグラフで記載したＭ１３ｍｐ１８（ＣＤ４）ベクターにつなげる。コンピテントＴＧ１細胞の形質転換の後、得られた組み換え体を、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１）−ＣＨ１（ＳａｃＩＩ（平坦）／Ｐｓｔ１）を含むＣＤ４及びＣＨ１の両配列の存在について制限酵素分析を用いてスクリーニングする。その後オリゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発を遂行して、フレーム中にＣＤ４及びＣＨ１配列を並べる。得られたキメラＤＮＡ分子はガンマ２・重鎖のＣＨ１領域に融合されたＣＤ４のＶ１Ｖ２領域を含む。突然変異誘発は、形質転換したＴＧ１細胞からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡ（アマシャム）で遂行される。鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶ１Ｖ２のＰｈｅ（１７９）をコードする最終コドンをガンマ２・重鎖に対するＣＨ１領域の最初のコドン（Ａｌａをコードする）に接続する配列を含む３３ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５′−ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３′）でアニーリングする。第二の鎖合金の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換する。単離したプラークを新鮮なＴＧ１細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製する。すべての変異をシークエナーゼシステム（ＵＳＢ）を用いたジデオキシ法により確認する。制限酵素分析によって決定された正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをその後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡを単離する。
ＣＤ４−ＣＨ１・キメラ遺伝子からのＲｆＤＮＡをその後Ｐｓｔ１による消化によってリニア化する。Ｐｓｔ１でリニア化されたベクターをその後ＢＰＡ処理し、ヒトガンマ２・重鎖遺伝子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エキソンを含むプラスミドｐＢｒガンマ２のＰｓｔ１−Ｐｓｔ１ＤＮＡ断片につなげる。その後キメラＣＤ４−ＣＨ１断片に関するＰｓｔ１−Ｐｓｔ１断片の正しい方向を制限酵素分析によって立証する。得られたキメラ遺伝子はＣＤ４のＶ１Ｖ２領域及びそれに続くガンマ２・重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む蛋白質をコードする（図２Ａ、２Ｂ及び４）。
ＥｃｏＲ１を用いたＲｆのリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ＤＮＡ分子を単離する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋める。平坦な末端を有するＤＮＡをその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過剰のＨｉｎｄＩＩＩリンカーにつなげる。７０℃、１５分間でＴ４ＤＮＡリガーゼを熱不活性化した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより広範囲に消化し、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子を含む断片を遊離する。このＨｉｎｄＩＩＩ断片をその後精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン）につなげる。得られたプラスミドをその後ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部の存在及びプラスミド中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入部の方向を制限酵素分析により確かめる。得られたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖をコードする哺乳動物発現プラスミドはＣＤ４−ＩｇＧ２ＣＨ−ｐＲｃＣＭＶと称する。
ｂ．ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖哺乳動物発現ベクターの作成
ヒトカッパー軽鎖の定常部を、プラスミドｐＣＮカッパ軽鎖からＭｓｅ１断片として切り出す。精製されたＭｓｅ１断片をその後ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメントを用いて平坦な末端とする。その後Ｍ１３ｍｐ１８ＲｆをＨｉｎｃＩＩを用いてリニア化し、平坦な末端を有するＭｓｅ１カッパー軽鎖断片をベクターの平坦な末端のＨｉｎｃＩＩ部位につなげる。ＴＧ１細胞の形質転換の後、この組み換え体を、制限酵素分析によって、ベクター中の挿入部の存在及び正しい方向について確認する。感染したＴＧ１細胞からＲｆを精製し、ＥｃｏＲ１及びＳｍａ１を用いて消化する。カッパー軽鎖定常部を含む精製されたベクターをその後前後ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１断片につなげる。得られた組み換え体を、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１）−Ｃカッパ（Ｍｓｅ１（平坦）／Ｍｓｅ１（平坦））を含む挿入部の存在及び方向について確認し、オリゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発を行うために１本鎖ＤＮＡを精製する。
鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶ１Ｖ２のＰｈｅ（１７９）をコードする最終コドンをカッパー軽鎖定常部の最初のコドン（ｔｈｒをコードする）に接続する配列を含む３３ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５′−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３′）でアニーリングする。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換し、単離したプラークをＤＮＡの塩基配列を決定するために新鮮なＴＧ１細胞で増殖させる。変異の存在をジデオキシ法で確認する。正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをその後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡを単離する。得られたＤＮＡ分子はＣＤ４のＶ１Ｖ２領域及びそれに続くカッパー軽鎖の定常部を含む蛋白質をコードする（図２Ａ、２Ｂ及び５）。
ＥｃｏＲ１によりリニア化の後、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖ＤＮＡ分子を組み換えＲｆＤＮＡから精製する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋める。平坦な末端を有するＤＮＡをその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過剰のＨｉｎｄＩＩＩリンカーにつなげる。７０℃、１５分間でＴ４ＤＮＡリガーゼを熱不活性化した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより広範囲に消化し、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を含む断片を遊離する。このＨｉｎｄＩＩＩ断片をその後精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン）につなげる。得られたプラスミドをその後ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部の存在及びプラスミド中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入部の方向を制限酵素分析により確かめる。得られたＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖をコードする哺乳動物発現プラスミドをＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと称する。
３．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産するための哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ及びＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶの同時発現（coexpression）
ａ．一時的な発現
10％牛胎児血清を含有するDMEM中で増殖したＣｏｓＭ５細胞を７５％コンフレントになるように分割する。次の日、標準的なＣａＰＯ（４）沈降法により、この細胞にＣｓＣｌで精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ  ＤＮＡ５μｇ及びＣｓＣｌで精製されたＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶプラスミドＤＮＡ５μｇを１６〜２０時間でトランスフェクションする。トランスフェクションの後、この細胞に新鮮な培地を添加する。トランスフェクション後４８〜７２時間後に合成された生成物の分析を、トランスフェクタントの35Ｓ−メチオニンによる１２〜１８時間の放射能ラベル及びそれに続く抗ＣＤ４抗体を用いた培地及び細胞溶解産物の沈降、或いはプロテインＡ−セファロースビーズのみを用いたインキュベーション及びそれに続く還元或いは非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより遂行する。更に、培地及び細胞溶解産物の分析をトランスフェクション後４８〜７２時間後に、標準的なウエスタンブロッティング手順により遂行する。
ｂ．安定な発現
Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、ＣｓＣｌで精製されたＤＮＡ２０μｇを、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｃＲｃＣＭＶ：ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ：ｐ４１０（ｐ４１０はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミドである）＝１０００：１０００：１の比でトランスフェクションする。しかし他の比率も用いることができる。トランスフェクション後約３〜５日後に、細胞を選択培地（１０％透析牛胎児血清を含む無ヌクレオシドアルファＭＥＭ）にまく。セレクション後約１０〜１５日後に、個々の細胞クローンを採取する。このクローンを、その後、ＥＬＩＺＡ、プロテインＡ−セファロースビーズを用いた沈降及びそれに続く還元或いは非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ等のいくつかのスクリーニング技術を用いてＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の安定な発現について分析する。高レベルで発現したクローンを、メソトレキセートの濃度を増加させた中で増やし、新しく導入されたＤＮＡ配列を連続的に繰り返し増幅させる。このように、高レベルのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を分泌する安定なＣＨＯ細胞株が樹立される。
４．ＣＨＯ馴らし培地培地からのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の精製
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を、プロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーを用いてで精製する。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を分泌するＣＨＯ細胞を、１０％無ＩｇＧ牛胎児血清アルファＭＥＭが入っているローラーボトル中で高密度になるまで増殖させる。馴らし培地を回収し、遠心により分離し、この及び次の緩衝液中に界面活性剤（すなわちＴｗｅｅｎ）を含む、或いは含まないＰＢＳで１：１希釈する。その後、希釈した培地を、６０ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたプロテインＡ−セファロースファーストフロウの５ｍｌカラムにかける。広範囲な洗浄の後、結合した材料を、直ぐに溶出フラクションを中和するために、１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）のアリコートに直接溶出する。その後フラクションを還元及び非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により分析し、プールする（図８）。
５．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のエンベロープ糖タンパクｇｐ１２０に対する結合の例証
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を発現しているＣｏｓＭ５トランスフェクタントを、１０％無ＩｇＧ牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートする。その後ラベルされていない培地を回収し、35Ｓ−メチオニンで放射能ラベルされたＨＩＶ・ｇｐ１２０を沈降させるために用いる。35Ｓ−メチオニンでラベルされたＨＩＶ・ｇｐ１２０を含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体含有培地をインキュベーションした後、複合体をプロテインＡ−セファロースに吸着させる。プロテインＡ−セファロース複合体を遠心により回収し、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くフルオログラフィーにより分析する。また、ＣＨＯ細胞から精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のアリコートも、同様の手順で35Ｓ−放射能ラベルされたｇｐ１２０を沈降させるために用いる。
６．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の血漿半減期及び胎盤移入の例証
血漿半減期及び胎盤移入の例証を、すでに確立されている技術により遂行する。簡単には、ウサギ又はサルに、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を静脈内或いは筋肉内注射する。注射後種々の時点において、血漿サンプルを採取し、血清中に存在するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の量をＥＬＩＺＡにより測定する。更に妊娠したサルにもＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体をＩＶ又はＩＭ注射し、新生サルのさい帯血及び血清中の濃度を測定する。新生サルのさい帯血及び血清中に加えて、母親の血清中のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の量の測定及び比較は、これらの分子の胎盤を通した移入比率を示す。
７．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染性の測定
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染性の測定はすでに確立されている技術を用いて行う。これらの研究に対して、ヒト末梢血からの単球／マクロファージ群から精製されたＵ９３７細胞（ＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩを発現しているヒト単球細胞株）及びヒト組み換えＦｃＲｓを本質的に発現するヘラ細胞が用いられる。更にＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩに特異的なモノクローナル抗体は商業的に入手可能である。簡単には、放射能標識された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を上記細胞及び適当なコントロール細胞と共に４℃で種々の時間でインキュベートする。各インキュベーションの終りに、細胞を溶解し、細胞に結合している放射能活性を測定し、各細胞型に特異的に結合するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の量を立証する。コントロールとして、特異的な抗体の結合のレベルを測定するために、放射能標識された正常の単量体の或いは凝集した正常ヒトＩｇＧ２を用いる。更に、放射能標識された成分と、標識されていない単量体のまたは凝集した正常ヒトＩｇＧ２、或いはＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩに対するモノクローナル抗体との競合は、各細胞型に対するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の結合効率及び特異性を立証する。
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が単球／マクロファージのＨＩＶ感染の増強を媒介するか否かを確認するために、ＨＩＶ−１を培地のみと共に、或いはいくつかの希釈された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかと共にインキュベートする。コントロールとして、正常な個人及びＨＩＶ感染した個人からの血清を用いる（３１）。１時間、４℃のインキュベーションの後、前パラグラフに記載された細胞型にオプソニン化ウイルスを添加する。感染後種々の時点において、培地を回収し、ウイルス逆転写活性をアッセイしてウイルス感染の程度を測定する。コントロールとして、細胞の感染の間に、ｓＣＤ４、ＯＫＴ４ａ、又はＬｅｕ３ａを含ませる。更にＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体及び適当なコントロールの種々の希釈液を、結合が可能になるように４℃で細胞と共にまずインキュベートする。その後ＨＩＶを添加し、ウイルス逆転写活性により感染アッセイを行う。
Ｂ．結  果
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ（４）のリーダー・Ｖ１Ｖ２セグメントをヒトガンマ２・重鎖遺伝子（30）のヒンジエキソンに結合させることにより生成した（図１Ａ）。得られた組換えＤＮＡ分子（ＣＤ４−ＩｇＧ２−Ｒｆと称する）は、シグナル配列およびＣＤ４タンパクの２つのアミノ末端免疫グロブリン様ドメイン（成熟ＣＤ４の最初の１７９アミノ酸）、次いでガンマ２・重鎖タンパクのヒンジ（１５アミノ酸）、ＣＨ２（１１０アミノ酸）、およびＣＨ３（１０７アミノ酸）領域（図３）をコードする。この組換えＤＮＡ分子は、ガンマ２・重鎖遺伝子内（ＨおよびＣＨ２ドメインの間、およびＣＨ２およびＣＨ３の間）に存在する２つのイントロンをも有している。このＣＤ４−ガンマ２・キメラ遺伝子は、ガンマ２・重鎖のＣＨ１ドメインを特異的に欠いているＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするように設計されている。軽鎖を伴わないＣＨ１ドメインの発現は、哺乳動物細胞からの効率的な重鎖分泌を提供する（25）。
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体において、１本の鎖ヒンジ領域は、４か所の鎖間ジスルフィド結合の可能性を提供する４つのシステイン残基を有している（図１Ｂ）。同様に、天然のヒトＩｇＧ２は、ガンマ２・重鎖の間に４つの鎖間ジスルフィド結合を有している。
ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ１内にサブクローンされた。このベクターは以下のＤＮＡ要素を有している：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子の転写を推進するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）直接初期プロモーターおよびエンヘンサー；ＳＶ４０ポリアデニレーション配列；およびＣｏｓＭ５細胞においてこのプラスミドを高いコピー数で複製することを可能にする複製のＳＶ４０オリジン。得られたＣＤ４−ガンマ２・重鎖哺乳動物発現ベクター（ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１と称する）はＣｏｓＭ５細胞に形質導入され、この細胞を形質導入の４８−７２時間後に35Ｓメチオニンで放射性標識した。放射性標識した培地を、プロテインＡ−セファロースビーズを用いる沈降、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで蛍光光度法により分析した（図６）。還元条件下において約４７キロダルトンの相対分子質量（Ｍｒ）で移動するタンパク質が沈殿する。沈殿した物質を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、Ｍｒ約９４キロダルトンで移動するタンパク質が観察された。これは、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖が組み立てられ、ホモ二量体として分泌されていることを示している。加えて、これらの結果は、分泌されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体がプロテインＡと結合することから、それらが損なわれていない免疫グロブリンＦｃドメインを有していることを示している。さらに、精製可溶ヒトＣＤ４に対するウサギ・ポリクローナル抗血清を用いて、形質導入後４８−７２時間に培地内に分泌されたタンパク質のウェスタンブロット分析による特徴付けを行なった。沈殿により得られた結果と同様に、還元条件下で培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでニトロセルロースにウェスタン移動させた場合には、主要な免疫反応性タンパク質はＭｒ約４７キロダルトンで移動する。非還元条件下においては、主な免疫反応性タンパク質はＭｒ約９４キロダルトンで移動する。まとめると、これらは、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖が予期された分子量のホモ二量体として産生され、分泌されていることを示している。
上記結果は、ガンマ２・重鎖の定常領域によってコードされるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃタンパク質がプロテインＡと結合し、したがって機能的に活性であることを示している。ＣＤ４部分が果たして機能的に完全であるかを決定するために、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を、それらのＨＩＶ外部エンベロープ糖タンパク、ｇｐ１２０への結合能力について検定した（図７）。ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮＡを形質導入したＣｏｓＭ５細胞からの非標識培地を35Ｓメチオニン標識ｇｐ１２０と共にインキュベートした。プロテインＡ−セファロースビーズと共にインキュベートすることによりＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体／ｇｐ１２０複合体を沈殿させ、この沈殿物を還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで蛍光光度法により分析した。これらの結果は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が、ＨＩＶｇｐ１２０を効率よく認識し、高い親和力で結合することを示している。上段に記述した結果とまとめると、これらの観察は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体がＣＤ４およびガンマ２・重鎖の機能的に活性な領域を有していることを示している。
大量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を安定に製造するために、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１ベクターを（酵素ジヒドロフォレート・レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする）プラスミドｐ４１０と共にｄｈｆｒ−キナーゼ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質導入した。形質導入の約２週間後、ヌクレオシド非含有αＭＥＭおよび１０％透析仔ウシ血清（したがって、ｄｈｆｒ＋）中に増殖した個々のクローンを単離し、沈殿およびＥＬＩＳＡによりＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の共発現について分析した。最大産生細胞系を同定し、濃度が段階的に増加するメトトレキセートを作用させた。これは、新規に導入されたＤＮＡ配列の増加を選択する。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体１０μｇ／ｍｌを発現するＣＨＯ細胞系を、ローラーボトル内での安定な組織だった産生に用いた。この細胞を、１０％ＩｇＧ非含有仔ウシ血清を含むαＭＥＭ中において増殖させ、合流させた。次いで、これらの細胞に毎日栄養を補給し、２日経た馴らし培地をＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製に用いた。馴らし培地をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、プロテインＡ−セファロース・ファースト・フロー（ファルマシア）の５ｍｌカラムに流速６０ミリリットル／時で流した。その後、このカラムを１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、結合物質を１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５で溶出させた。溶出した物質は５０μｌの１Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０に直接集め、溶離液（eluant）を中和した。ＯＤ（２８０）が０．１より大きい分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色またはウェスタン・ブロット分析により分析し、ピーク分画をプールした。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に相当するＭｒを有する単独のバンドがプロテインＡ−セファロースカラムから特異的に溶出された（図８）。溶出したタンパク質は、可溶ヒトＣＤ４に対するポリクローナル抗血清に免疫反応性を有することがウェスタン・ブロット分析により確認された。加えて、精製タンパク質は、35Ｓメチオニン標識ｇｐ１２０と高い親和力で結合する能力を保持している。これらの結果は、哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の安定で高レベルの産生、および生物学的な機能を保持するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製を示している。
図８に示される方法で部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモ二量体は、ＣＤ４細胞に結合するＨＩＶの妨害（図９）および固定ＨＩＶ接種物の感染力の中和（図10）に有効である。この後の検定においては、５０％の培養物へのＨＩＶの感染を妨げるために、ｓＣＤ４の他に約１０−２５μｇ／ｍｌのＣＤ４−ガンマ２が必要であった。
イオン交換クロマトグラフィを用いることにより、ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモ二量体のさらなる精製を達成した。プロテインＡ−セファロースカラムからのピーク分画を、５０ｍＭ  ＢＥＳ、ｐＨ７．０で予め平衡にした１０ｍｌ Ｓ−セファロース・ファースト・フローカラムに流速１２０ｍｌ／時で流した。試料を流した後、カラムを塩濃度が増加する５０ｍＭ  ＢＥＳ、ｐＨ７．０で広範に洗浄した（材料および方法を参照）。ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモ二量体は、カラムから、５００Ｍｍ、ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＢＥＳ、ｐＨ７．０中に特異的に溶出した。イオン交換クロマトグラフィの後、我々は、予期せぬことに、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を含有するピーク分画がいまだ不純であることを見出した。したがって、Ｓ−セファロースカラムからのピーク分画をプールし、濃縮して、予めＰＢＳで平衡にした１２０ｍｌセファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００ＨＲカラムに流速毎時８ｍｌで流した。精製ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモ二量体のピーク分画を、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析し、かつ精製した分画をプールして非還元条件下（図11、レーン１）、もしくは還元条件下（図11、レーン２）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続く銀染色により分析した。精製ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のグリコシル化の違いによるものと思われる二重バンドが観察された（データは示さず）。
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖をコードするＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣキメラ重鎖遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・Ｖ１Ｖ２セグメントをヒトＩｇＧ２重鎖遺伝子のＣＨ１エキソンに結合させることにより生成した（図２Ａ）。加えて、ＣＤ４−カッパ軽鎖をコードするＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子が、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・Ｖ１・Ｖ２セグメントをカッパ軽鎖遺伝子の定常ドメインに結合させることにより生成した（図２Ａ）。これらのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子およびＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ軽鎖遺伝子は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・重鎖がカッパ軽鎖に効率よく結合するＣＨ１を含有するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体をコードするように設計されている。
ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子の両者は、哺乳動物発現ベクターｐＲｃＣＭＶもしくはｐＰＰＩ−２にサブクローンされる。いずれのベクターも、サイトメガロウイルス直接初期プロモーターおよびキメラ遺伝子の転写を推進するエンヘンサーを有する。ベクターｐＲｃＣＭＶにおいては、ＲＳＶプロモーターおよびエンヘンサーを有する第２の転写カセットが耐ネオマイシン遺伝子の転写の指令に用いられる。ｐＰＰＩ−２においては、β−グロビンプロモーターを含有する第２の転写カセットがｄｈｆｒ遺伝子の転写を指令する（前記参照）。大量のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロテトロマーを安定に製造するために、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖発現ベクターおよびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖発現ベクターを同時に形質導入した（典型的には、ｐＲｃＣＭＶ内でクローンしたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子およびｐＰＰＩ−２内でクローンしたＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を１：１の割合で用いた）。形質導入の約２週間後、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８および１０％透析仔ウシ血清を含有するヌクレオシド非含有αＭＥＭ中で増殖した個々のクローンを単離し、免疫沈降およびＥＬＩＳＡによりＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖両者の共発現を解析した。図12は、選択され、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖両者の発現について解析された１つのクローンを示す。ＣＨＯ細胞系もしくは形質導入されていないＣＨＯ親細胞系を35Ｓメチオニンおよび35Ｓシステインで１６時間放射性標識した。放射性標識した培地を、プロテインＡ−セファロースビーズを用いる沈殿および非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで蛍光光度法により分析した（図12Ａ）。非還元条件下において相対分子質量約１４０キロダルトンおよび２１０キロダルトンで移動する２種のタンパク質が沈殿する。沈殿した物質を非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、相対分子質量６９キロダルトンおよび３５キロダルトンで移動する２種のタンパク質が観察された。これは、それぞれＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の予期された相対分子質量に一致する（データは示された）。非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１４０キロダルトンで移動するタンパク質がＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖のみを有するのに対して、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２１０キロダルトンで移動するタンパク質は共有結合で結合するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の両者を含有するというさらなる特徴付けが示されている（図12Ｂ）。これらのデータは、共有結合で結合してＨ2Ｌ2（Ｈ＝重鎖、Ｌ＝軽鎖）構造を有する分子を形成する、２つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖および２つのＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を有する２１０キロダルトン・タンパク質の予期された分子量に一致する。さらに、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に見出される１４０キロダルトン・タンパク質は、構造Ｈ2を有するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラホモ二量体の予期された分子量に一致する。まとめると、これらの結果は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の両者を発現するＣＨＯ細胞系が、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を効率よく組み立てかつ分泌することが可能であることを示している。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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