(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ｎｍ〜１００μｍの間の直径を有する球面粒子上に共有結合した、金属、金属合金、ポリマー、共重合体及びセラミックスから選択される支持材料を含む生体適合材料であって、前記粒子は、環を構成する炭素原子の総数が６〜２０個である多環式アルケンの重合から得られ、下記の式（Ｚ２）：
＝［ＣＨ−Ｒ2−ＣＨ］＝      （Ｚ２）
｛式中、
Ｒ2は、式：
【化１】
0005383039.tif 000047
（式中、
Ｙは、−ＣＨ2−、又はヘテロ原子、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、
Ｙ1及びＹ2は、互いに独立して、Ｈ、若しくはＲ鎖若しくはＸ基を表し、又はＹ1及びＹ2を有する炭素原子（複数）とともに、４〜８個の炭素原子を有する環を形成し、この環は、場合により、上記のＲ鎖若しくはＸ基によって置換され、
ａは、単結合又は二重結合を表す）
で表される環、又は、
式：
【化２】
0005383039.tif 000048
（式中、
Ｙ'は、−ＣＨ2−、又はヘテロ原子、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、
Ｙ'1及びＹ'2は、互いに独立して、−ＣＨ2−、又は−Ｃ（Ｏ）基、又は−ＣＯＲ基、又は−Ｃ−ＯＸ基を表す）
で表される環を表す｝
で表される同一の又は異なった３０〜１００００モノマーユニットを含有するポリマー鎖によって形成され、前記モノマーユニットが：
−モノマーユニットの少なくとも０．５％が、場合によりε−カプロラクトン、又は−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−官能基の１〜１０個のユニットを有する鎖形成体のうちから選択される加水分解型ブリッジを介して、前記モノマーユニットに共有結合した式（Ａ）：
−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−Ｘ      （Ａ）
｛式中、
ｎは、５０〜３４０の整数を表し、及びＸは、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｘ1（ここで、Ｘ1は、水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ'又はＮＨＲ'基を表し；Ｒ'は、水素原子、又は置換され若しくは置換されていない１〜１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表す）の反応性官能基を含む１〜１０個の炭素原子を有するアルキル又はアルコキシ鎖を表し、ここで、前記反応性官能基は、前記支持材料上に配置した反応性置換基に結合することができ、ここで、前記支持材料に配置した反応性官能基は、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ2、又はＣ（Ｏ）Ｘ'1（ここで、Ｘ'1は、水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ"又はＮＨＲ"基を表し、Ｒ"は、前記粒子の反応性官能基を用いて−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−の結合を形成するための、水素原子、又は１〜１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表す）である｝
で表されるエチレンポリオキシドを含むＲ鎖によって置換され；そして、
−モノマーユニットの少なくとも０．５％が、上記の式（Ａ）のエチレンポリオキシドを含むＲ鎖によって置換され、ここで、前記反応性置換基が、治療において使用される薬剤、又は生体分子に結合し、及びＲ鎖が前記モノマーに共有結合する、前記生体適合材料。
【請求項２】
多環式アルケンが：
−下記の式（Ｚ２ａ）：
【化３】
0005383039.tif 000049
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロブテン環を含有するモノマー；
−下記の式（Ｚ２ｂ）：
【化４】
0005383039.tif 000050
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロペンテン環を含有するモノマー；
−下記の式（Ｚ２ｃ）：
【化５】
0005383039.tif 000051
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン）ノルボルネン；
−下記の式（Ｚ２ｄ）：
【化６】
0005383039.tif 000052
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルナジエン；
−下記の式（Ｚ２ｅ）：
【化７】
0005383039.tif 000053
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く７−オキサノルボルネン；又は
−下記の式（Ｚ２ｆ）：
【化８】
0005383039.tif 000054
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く７−オキサノルボルナジエン
である、請求項１に記載の生体適合材料。
【請求項３】
多環式アルケンが：
−式（Ｚ２ｃ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルネン（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン）
である、請求項１又は２に記載の生体適合材料。
【請求項４】
球状粒子が、下記：
請求項１で定義されるＲ鎖によって置換された０．５％〜９９．５％の間のモノマーユニット（ここで、Ｒ鎖は、これらのモノマーに関して同一であり、及び前記支持材料と前記粒子との間の共有結合を確実にするための、前記材料上に配置した反応性官能基に結合することができる反応性官能基を含む）；
及び、請求項１で定義されるＲ鎖によって置換された０．５％〜９９．５％の間のモノマーユニット（ここで、Ｒ鎖は、これらのモノマーに関して同一であり、前記反応性官能基が、治療において使用される薬剤、又は生体分子に結合する；
及び／又は、請求項１で定義されるＸ基によって直接的に置換された０．５％〜９９．５％の間のモノマーユニット（ここで、これらのモノマーのこのＸ基は、前述するモノマーのＲ鎖のＸ基と同一であるか若しくは異なっている）；
及び／又は、１％〜９９．５％の間の未置換のモノマーユニット
を含み、上記の異なるモノマーのパーセントの合計が１００％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項５】
モノマーを置換するＲ鎖が、式：
−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｘ
（式中、
ｎは、請求項１で定義される通りであり、及びＸは、Ｈ、−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2−ＣＯＣｌ、−ＣＨ2−ＣＯＹを表し、Ｙは、治療において使用される薬剤、又は生体分子である）
によって表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項６】
前記Ｒ鎖が、式：
−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）5）t−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−（ＣＨ2）2−Ｏ−Ｘ
（式中、
ｎは、請求項１で定義される通りであり、ｔは、１〜１０の間の自然数を表し、及びＸは、Ｈ、−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2−ＣＯＣｌ又は−ＣＨ2−ＣＯＹを表し、Ｙは、治療において使用される薬剤、又は生体分子を表す）
を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項７】
前記支持材料が、
−チタニウム；
−Ｎｉ−Ｔｉ合金；
−ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフロリド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）；
−共重合体エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、共重合体ビニリデンフルオリドヘキサフルオロプロピレンＰ（ＶＤＦ−ＨＦＰ）、ポリ（乳酸）−ｃｏ−ポリ（グリコール酸）（ＰＬＡ−ＰＧＡ）；
−ヒドロキシアパタイト、又はヒドロキシアパタイト及びリン酸トリカルシウムの化合物
から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項８】
前記支持材料の反応性官能基が、前記材料にグラフトした１〜１０個の炭素原子を有するアルキル鎖であって、場合によって、前記鎖内に１から数個のヘテロ原子を含むアルキル鎖に配置される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項９】
前記材料の反応性官能基が、下記の式：
【化９】
0005383039.tif 000055
に記載した材料にグラフトしたアミノプロピルトリエトキシシラン分子上に配置したＮＨ2官能基であり、
−Ｍは、金属酸化物、又はセラミックス、又はその表面にＯＨ部位を有する任意の他のポリマー（天然若しくは前官能基化による）を表し、又は
−前記材料の反応性官能基が、二官能性スペーサーアームに結合するアクリル酸によって前官能基化された表面上に配置したＮＨ2官能基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項１０】
前記薬剤が、下記の治療カテゴリー：抗生物質、抗炎症薬、抗有糸分裂剤、ホルモン、増殖因子における薬剤から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体適合材料。
【請求項１１】
移植可能な医療用具を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体適合材料の使用。
【請求項１２】
前記移植可能な医療用具が、インプラント、プロテーゼ、ステント又はセメントから選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体適合材料を含むインプラント、プロテーゼ、脈管ステント又はセメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分の輸送制御のための生物活性な生体融合材料、及びその合成法、並びのその使用に関する。
本発明の一般的な目的は、移植可能な装置に、それらの導入に続くかもしれない種々の感染及び／又は炎症過程の発症を抑える能力を提供することである。
【背景技術】
【０００２】
現在、これらの影響を緩和するために、一般的な経路による薬剤を投与すること（Ａ）、並びに局所的に骨の手術における抗生物質を投与すること（Ｂ）が提案されている。
【０００３】
Ａ−薬剤が一般的な経路によって投与される場合、それは、生物全体に分布され、意図された部位（即ち、感染及び／又は炎症及び／又は腫瘍過程の部位であり得る場所）でのその濃度は、投与される濃度が患者を毒性効果に晒す危険が十分に高い場合、有効性の閾値を越えることができるに過ぎない。
経口又は非経口経路によって薬理学的に投与された物質は、短すぎる半減期を有し、所望の局所的な効果を達成するための一般的な毒性の危険性を有する。
【０００４】
Ｂ−１９７０年以降、抗生物質を含むセメントが、人口装具の手術において使用されている。フランスでは、市場において、ゲンタマイシン又はエリスロマイシンとコリマイシンの組み合わせのいずれかを用いた２つの製造品がある。標準的でない条件の手術室において、「抗生物質を含むセメント」、特にバンコマイシンを含むセメントを製造することも可能である。この方法の制限因子は、使用される有効成分の制御されない放出（濃度及び期間の点において）である。実際に、装置がその輸送を調整することができず、したがって、その作用を所定の期間に持続することができないので、有効成分の放出の反応速度論は制御されない。さらに、有効成分の一部は、セメント内であまりにも深部に捕捉されるため放出されない。
【０００５】
これらの欠点を改善するために、有効成分の輸送システム、いわゆる「薬物輸送システム（ＤＤＳ）」が開発されてきた。これらの薬物輸送システムの原理は、長期に渡って常に、十分な量でかつ非毒性な量で、ｉｎ  ｓｉｔｕで薬理学的に活性な物質を輸送するものである。
【０００６】
さらに、刺激性ポリマーは、即ち、ｐＨ又は温度の変化のような外部刺激に感受性なポリマーであり、それ自身、材料に吸収され又はグラフトされる材料又はビーズにおいて直接的に有効成分のカプセル化又は吸収によって得られる反応性官能基を提示するものは、すでに開示されている。
【０００７】
しかしながら、吸収は、有効成分の放出制御を可能にしない。一方、カプセル化に関して、有効成分の放出制御を可能にする場合、長期の使用を伴って、及び／又は材料が非常なストレス（流動、摩擦など）に晒される場合に、相容れないことが示される。
【０００８】
官能化したナノ粒子上に有効成分の共有的なグラフトによって得た反応性ポリマーのナノ粒子はまたすでに開示されている。しかしながら、このようなナノ粒子の合成は、２工程（ラテックスの合成、次に有効成分との反応）で、したがってグラフティングの直接的な制御なしに（無作為な数の官能基が導入される）行われる。さらに、これらのナノ粒子は、さらに、有効成分の特定の場所での放出を可能にする有効成分との固着部位を有しない。これらの材料は、ほとんどしばしば、ベクトル化又は免疫学的試験のために意図される。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、放出制御を可能にする生体融合材料の移植部位（調節し得る期間）で、有効成分によって官能化した球面粒子（特にナノ粒子）の化学的固着によって後者の表面上で共有結合的に固定した有効成分の放出を制御した生体融合材料を提供することを目的とする。粒子／有効成分の結合の切断反応は、生理学的な媒体と材料との接触によって、又はｐＨの変化によって作動し、制御した方法で、自然な形態で生物活性分子を放出する。この概念は、インプラントとそれを取り囲む組織との間の関係を制御することができる因子の局所的輸送にまで広げることができる。応用の主要な領域は、生物医薬分野であり、より正確には脈管、血管（ステント）及び骨の手術に使用される生体適合材料である。
【００１０】
つまり、本発明は、生体融合材料の表面に、生物活性であり及び刺激性である、即ち、外部刺激、例えばｐＨ又は温度変化に感受性であって、酸、アミン、アルコール若しくは酸塩化物のタイプの周辺の反応性官能基を提示し、ただ一工程で得ることができる球状ポリマー粒子を固定することが可能であるという事実を示すことに起因する。この材料上の有効成分の結合は、好都合には、ｐＨ及び／又は温度の影響下で加水分解され得る結合である。
【００１１】
本発明は、１０ｎｍ〜１００μｍの間の直径を有する球面粒子を支持体に共有結合した支持材料を含む生体融合材料に関し、前記粒子は、約３０〜１００００モノマーユニットを含有するポリマー鎖によって形成され、このモノマーユニットは、同一か又は異なっていて、環を構成する炭素原子数が約４〜１２個である単環式アルケン類、又は環を構成する炭素原子数の全体が約６〜２０個である多環式アルケンの重合から誘導され、そして、該モノマーユニットが、
【００１２】
それらの少なくとも約０．５％が、場合によっては加水分解型ブリッジを介して該モノマーユニットに共有結合しており、式（Ａ）：
−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−Ｘ      （Ａ）
（式中、
ｎは、約５０〜３４０、特に７０〜２００の整数を表し、及びＸは、約１〜１０個の炭素原子を有し、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｘ1タイプの反応性官能基を含むアルキル又はアルコキシ鎖を表し、ここで、Ｘ1は、水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ'又はＮＨＲ'基を表し、Ｒ'は、水素原子、又は置換若しくは未置換の約１〜１０個の炭素原子を有する炭化水素基を表し、前記反応性官能基は、前記材料と粒子との間の共有結合を確実にするために、前記支持材料上に配置した反応性官能基に結合することができる）
で表されるエチレンポリオキシドを含むＲ鎖によって置換される；
【００１３】
そして、それらの少なくとも約０．５％が、前述の式（Ａ）のエチレンポリオキシドを含むＲ鎖によって置換され、ここで、前記反応性官能基が有効成分、又はタンパク質のような生体分子との結合に関与し、前記Ｒ鎖が、前記モノマーに共有結合する
ようなものである。
【００１４】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、前記モノマーユニットが、単環式アルケン類の重合から誘導され、そして、下記の式（Ｚ１）：
＝［ＣＨ−Ｒ1−ＣＨ］＝      （Ｚ１）
（式中、
Ｒ1は、飽和又は不飽和の２〜１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表し、前記モノマーが、上記で定義したＲ鎖によって場合により置換され、又は直接的にＸ基によって置換される）
で表されるものである。
【００１５】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、モノマーユニットが誘導される単環式アルケン類が、
−下記の式（Ｚ１ａ）：
【化１】
0005383039.tif 000002
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロブテン；
【００１６】
−下記の式（Ｚ１ｂ）：
【化２】
0005383039.tif 000003
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロペンテン；
【００１７】
−下記の式（Ｚ１ｃ）：
【化３】
0005383039.tif 000004
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロペンタジエン；
【００１８】
−下記の式（Ｚ１ｄ）：
【化４】
0005383039.tif 000005
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロヘキセン；
【００１９】
−下記の式（Ｚ１ｅ）：
【化５】
0005383039.tif 000006
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロヘキサジエン；
【００２０】
−下記の式（Ｚ１ｆ）：
【化６】
0005383039.tif 000007
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロヘプテン；
【００２１】
−下記の式（Ｚ１ｈ）：
【化７】
0005383039.tif 000008
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロオクテン；
【００２２】
−下記の式（Ｚ１ｉ）：
【化８】
0005383039.tif 000009
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロオクタポリエン、特にシクロオクタ−１，５−ジエン；
【００２３】
−下記の式（Ｚ１ｊ）：
【化９】
0005383039.tif 000010
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロノネン；
【００２４】
−下記の式（Ｚ１ｋ）：
【化１０】
0005383039.tif 000011
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロノナジエン；
【００２５】
−下記の式（Ｚ１ｌ）：
【化１１】
0005383039.tif 000012
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロデセン；
【００２６】
−下記の式（Ｚ１ｍ）：
【化１２】
0005383039.tif 000013
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロデカ−１，５−ジエン；
【００２７】
−下記の式（Ｚ１ｎ）：
【化１３】
0005383039.tif 000014
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロドデセン；
【００２８】
−又は、２，３，４，５−テトラヒドロオキセピン−２−イル酢酸、シクロペンタデセン、パラシクロファン、フェロセノファン
である。
【００２９】
本発明はまた、上記で定義される生体融合材料に関し、ここで、前記モノマーユニットが、多環式アルケン類から誘導され、そして、
−下記の式（Ｚ２）：
＝［ＣＨ−Ｒ2−ＣＨ］＝      （Ｚ２）
｛式中、
Ｒ2は、式：
【化１４】
0005383039.tif 000015
（式中、
Ｙは、−ＣＨ2−、又はヘテロ原子、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、Ｒ及びＸは、上記で定義される通りであり、
Ｙ1及びＹ2は、互いに独立して、Ｈ、若しくは上記で言及されるＲ鎖若しくはＸ基を表し、又はそれらを有する炭素原子（複数）と関連して、４〜８個の炭素原子を有する環を形成し、この環は、場合により、上記で言及されるＲ鎖又はＸ基によって置換され、
ａは、単結合又は二重結合を表す）
で表される環、又は、
【００３０】
式：
【化１５】
0005383039.tif 000016
（式中、
Ｙ'は、−ＣＨ2−、又はヘテロ原子、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、Ｒ及びＸは上記で定義される通りであり、
Ｙ'1及びＹ'2は、互いに独立して、−ＣＨ2−、又は−Ｃ（Ｏ）基、又は−ＣＯＲ基、又は−Ｃ−ＯＸ基を表し、Ｒ及びＸは上記で定義される通りである）
で表される環を表す｝、あるいは、
【００３１】
下記の式（Ｚ３）：
【化１６】
0005383039.tif 000017
｛式中、
Ｒ3は、式：
【化１７】
0005383039.tif 000018
（式中、
ｎ1及びｎ2は、互いに独立して、０又は１を表し、
Ｙ"は、−ＣＨ2−、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、Ｒ及びＸは上記で定義される通りであり、
Ｙ"1及びＹ"2は、互いに独立して、０〜１０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を表す）
で表される環、又は、
【００３２】
式：
【化１８】
0005383039.tif 000019
（式中、
Ｙ"及びＹ"ａは、互いに独立して、−ＣＨ2−、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、Ｒ及びＸは上記で定義される通りである）
で表される環、又は、
【００３３】
式：
【化１９】
0005383039.tif 000020
（式中、
Ｙ"及びＹ"ａは、互いに独立して、−ＣＨ2−、又は−ＣＨＲ−基、又は−ＣＨＸ−基を表し、Ｒ及びＸは上記で定義される通りである）
で表される環を表す｝
で表されるものである。
【００３４】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、モノマーユニットが誘導される多環式アルケン類が、
−下記の式（Ｚ２ａ）：
【化２０】
0005383039.tif 000021
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロブテン環を含有するモノマー；
【００３５】
−下記の式（Ｚ２ｂ）：
【化２１】
0005383039.tif 000022
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロペンテン環を含有するモノマー；
【００３６】
−下記の式（Ｚ２ｃ）：
【化２２】
0005383039.tif 000023
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン）ノルボルネン；
【００３７】
−下記の式（Ｚ２ｄ）：
【化２３】
0005383039.tif 000024
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルナジエン；
【００３８】
−下記の式（Ｚ２ｅ）：
【化２４】
0005383039.tif 000025
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く７−オキサノルボルネン；
【００３９】
−下記の式（Ｚ２ｆ）：
【化２５】
0005383039.tif 000026
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導く７−オキサノルボルナジエン；
【００４０】
−下記の式（Ｚ３ａ）：
【化２６】
0005383039.tif 000027
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルナジエンの二量体；
【００４１】
−下記の式（Ｚ３ｂ）：
【化２７】
0005383039.tif 000028
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くジシクロペンタジエン；
【００４２】
−下記の式（Ｚ３ｃ）：
【化２８】
0005383039.tif 000029
で表されるモノマーユニットを含むポリマーに導くテトラシクロドデカジエン；
−又は、ビシクロ［５．１．０］オクト−２−エン、ビシクロ［６．１．０］ノン−４−エンである。
【００４３】
本発明は、より具体的には、上記で定義される好ましい生体融合材料に関し、モノマーユニットが誘導される単環式又は多環式アルケン類が、
−式（Ｚ２ｃ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルネン（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エン）；
−式（Ｚ３ｃ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くテトラシクロドデカジエン；
−式（Ｚ３ｂ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くジシクロペンタジエン；
−式（Ｚ３ａ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くノルボルナジエンの二量体；
−式（Ｚ１ｉ）のモノマーユニットを含むポリマーに導くシクロオクタ−１，５−ジエンである。
【００４４】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、それらが、下記：
−上記で定義されるＲ鎖によって置換された約０．５％〜１００％の間のモノマーユニット（ここで、Ｒ鎖は、これらのモノマーに関して同一であり、及び前記支持材料と前記粒子との間の共有結合を確実にするために、前記材料に配置した反応性官能基に結合することができる反応性官能基を含む）
−及び、上記で定義されるＲ鎖によって置換された約０．５％〜９９．５％の間のモノマーユニット（ここで、これらモノマーのＲ鎖は、これらのモノマーに関して同一であり、前記反応性官能基が、有効成分、又はタンパク質のような生体分子との結合に関与する）
−及び／又は、上記で定義されるＸ基によって直接的に置換された約０．５％〜９９．５％の間のモノマーユニット（ここで、これらのモノマーのこのＸ基は、前述するモノマーのＲ鎖のＸ基と同一であるか若しくは異なっている）
−及び／又は、約１％〜９９．５％の間の未置換のモノマーユニット
を含み、上記の異なるモノマーのパーセントの合計が１００％である。
【００４５】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、モノマーを置換するＲ鎖（又は複数）が、式：
−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｘ
（式中、
ｎは、上記で定義される通りであり、及びＸは、Ｈ、−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2−ＣＯＣｌ、−ＣＨ2−ＣＯＹを表し、Ｙは、有効成分、又はタンパク質のような生体分子である）
によって表される。
【００４６】
本発明はまた、上記で定義される生体融合材料に関し、前記鎖（又は複数）は、加水分解型ブリッジによって前記モノマーユニットに共有結合した式（Ａ）のエチレンポリオキシドを含む。
【００４７】
このような材料は、インビボで安定であるか又は不安定である有効成分の放出制御を可能にする程度において特に好都合である。この戦略に従って、粒子内部に捕捉された、従って外部媒体から単離した、そして、粒子へ共有結合した有効成分の放出は、モノマーユニット及びＲ鎖の間の結合を外部刺激（例えば、ｐＨ、高温等）を介して崩壊することによって前記粒子の不安定化の第一工程によって影響され、それは、安定化Ｒ鎖の塩析に関与する。第二の反応時間では、得られたＲ鎖又はＺ１は、有効成分によって官能化され又は官能化されず、加水分解反応を受け、そして、有効成分を放出する。
【００４８】
本発明に係る材料は、それらの表面上に、刺激性である、即ち、ｐＨ又は温度変化のような外部刺激に感受性であり、次に、これらの粒子内部に捕捉された有効成分を放出することができる球面粒子を結合した材料である。
【００４９】
上記で言及した加水分解型ブリッジは、好ましくは、ε−カプロラクトン、又は−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−官能基の約１〜１０個のユニットを有する鎖形成体のうちから選択される。
【００５０】
これに関連して、本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、前記Ｒ鎖（又は複数）が、式：
−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）5）t−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）5−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−（ＣＨ2）2−Ｏ−Ｘ
（式中、
ｔは、１〜１０の間の自然数を表し、及びＸは、Ｈ、−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2−ＣＯＣｌ又は−ＣＨ2−ＣＯＹを表し、Ｙは、有効成分、若しくはタンパク質のような生体分子を表す）
によって表される約１〜１０個のユニットのε−カプロラクトンを有する鎖形成体のうちから選択される加水分解型ブリッジに共有結合した式（Ａ）のエチレンポリオキシドを含む。
【００５１】
上記で定義される本発明に係る生体融合材料は、好都合には、前記支持材料は、
−金属、例えばチタニウム；
−金属合金、特に、Ｎｉ−Ｔｉ合金のような形状記憶を有する又は有しない合金；
−ポリマー、例えばポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフロリド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）；
−共重合体、例えば共重合体エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、共重合体ビニリデンフルオリドヘキサフルオロプロピレンＰ（ＶＤＦ−ＨＦＰ）、ポリ（乳酸）−ｃｏ−ポリ（グリコール酸）（ＰＬＡ−ＰＧＡ）；
−セラミックス、例えばヒドロキシアパタイト、種々の比率、特に５０／５０の比率のヒドロキシアパタイト及びリン酸トリカルシウムの化合物
から選択される。
【００５２】
本発明はまた、上記で定義した生体融合材料に関し、前記支持材料に配置した反応性官能基は、前記材料と前記粒子との間の共有結合を後者の反応性官能基との反応によって確実にするために、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｘ'１のタイプであり、ここで、Ｘ'1は、水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ"又はＮＨＲ"基を表し、Ｒ"は、前記粒子の反応性官能基を用いて−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−Ｃ（ＯＣ）2タイプの結合を形成するために、水素原子、又は約１〜１０個の置換若しくは未置換の炭素原子を有する炭化水素を表す。
【００５３】
本発明は、より具体的には、上記で定義した生体融合材料に関し、前記支持材料の反応性官能基は、前記材料にグラフトした置換又は未置換の約１〜１０個の炭素原子を有するアルキル鎖であって、場合によって、前記鎖内に１から数個のヘテロ原子、特にＯ、及びＳｉを含むアルキル鎖に配置される。
【００５４】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、前記材料の反応性官能基が、下記の式：
【００５５】
【化２９】
0005383039.tif 000030
【００５６】
に記載した材料にグラフトしたアミノプロピルトリエトキシシラン分子上に配置したＮＨ2官能基であり、
Ｍは、金属酸化物、又はヒドロキシアパタイトのようなセラミックス、又はその表面上にＯＨ部位を有する任意のポリマー（天然若しくは前官能基化による）を表し、
前記材料の反応性官能基は、二官能性スペーサーアーム、例えばｂＮＨ2ＰＥＧ（Ｏ，Ｏ'−ビス−（２−アミノプロピル）−ポリエチレングリコール５００（この前官能基化は、論文Ｎｕｃｌ．Ｉｎｓｔｒ．Ａｎｄ  Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｂ１５１  １９９９  ２５５−２６２に記載される）に結合するアクリル酸によって前官能基化された表面上に配置したＮＨ2官能基である。
【００５７】
本発明はまた、蒸気で定義される生体融合材料に関し、前記有効成分が、治療、化粧品、香料、又は、種々のタイプの微生物（藻類、真菌、細菌等）によってそれらにコロニー形成させないようにするために、表面コーティング、例えばペイント及び防汚コーティングに使用される分子から選択される。
【００５８】
本発明は、より具体的には、上記で定義される生体融合材料に関し、前記有効成分が、治療において使用される薬剤であって、特に下記の治療カテゴリー：抗生物質、抗炎症薬、抗有糸分裂剤、ホルモン、増殖因子における薬剤から選択される。
【００５９】
本発明はまた、特にインプラント、プロテーゼ、ステント又はセメントの形態で、特に脈管、血管又は骨の手術において、移植可能な医療用具を製造するための上記で定義される生体融合材料の使用に関する。
【００６０】
本発明はまた、上記で定義した生体融合材料を含むインプラント、プロテーゼ、脈管ステント又はセメント、並びに任意の医薬組成物に関する。
本発明は、より具体的には、上記で定義した生体融合材料に関し、前記生体分子が、細胞内若しくは細胞外の生物学的標的、又は抗体若しく任意の他の特異的リガンドに結合することができるタンパク質から選択される。
【００６１】
本発明は、より具体的には、上記で定義した生体融合材料に関し、前記生体分子が、下記のタンパク質：アビジン、アルブミン、ＶＥＧＦのような増殖因子のうちから選択される。
【００６２】
本発明はまた、上記で定義される生体適合材料を含む医薬組成物に関し、種々のＸ基（又は複数）は、薬剤としての活性な成分、場合によっては、医薬として許容される担体と共同して含有する。
【００６３】
本発明はまた、上記で定義される生体融合材料を含む化粧品組成物に関し、種々のＸ基（又は複数）は、化粧品に使用される有効成分、場合によっては、特に乳化剤、クリームの形態での適用に関して、適切な担体と共同して含有する。
【００６４】
本発明はまた、上記で定義される球状粒子を含む表面コーティング用組成物に関し、種々のＸ基（又は複数）は、表面コーティングに使用される有効成分、場合によっては、適切な担体と共同して含有する。
【００６５】
本発明はまた、上記で定義される生体融合材料の調製方法に関し、該方法は、下記：
−場合によっては、
＊前述のものと同一であるか又は異なっており、そして、上記で定義されるＲ鎖によって置換される、上記で定義される１個若しくは複数個の単環式又は多環式アルケン類（ここで、Ｒ鎖は、前述の単環式又は多環式アルケンを置換するものとは異なる）
＊及び／又は、前述のものと同一であるか又は異なっており、そして、上記で定義されるＸ基によって置換される、上記で定義される１個若しくは複数個の単環式又は多環式アルケン類（ここで、基Ｘは、前述のアルケンの鎖Ｒの基Ｘと同一であるか又は異なっている）
【００６６】
＊及び／又は、前述のものと同一であるか又は異なっている上記で定義した１個若しくは複数個の単環式又は多環式アルケン類（前記アルケン類は未置換である）
の存在下において、上記で定義されるＲ鎖によって置換された上記で定義される単環式又は多環式アルケンの重合の工程、
（前記重合は、特に、基ＩＶ又はＶＩ又はＶＩＩ又はＶＩＩＩにあるものから選択される反応の開始剤としての遷移金属複合体、例えば、ルテニウム、オスミウム、モリブデン、タングステン、イリジウム、チタニウムの存在下で、極性又は非極性溶媒中で、特に下記のルテニウムを基礎とした複合体：ＲｕＣｌ3、ＲｕＣｌ2（ＰＣｙ3）2ＣＨＰｈ等を用いて、撹拌しながら実行される）
−そして、前記の工程で得られた球状粒子を上記で定義される支持材料上に、前記材料の存在下で前記粒子を置換することによって固定する工程（後者は、場合によって、前記粒子の反応性官能基と反応させることによって、前記材料と前記粒子との間の共有結合を確実にすることができる上記で定義した反応性官能基を用いて官能化されている）
を含む。
【００６７】
さて、本発明は、本発明に係る生体融合材料を得ること、及び粒子の物理化学的な特徴付けという下記の詳細な説明を支持して説明されるであろう。
球状粒子の合成は、一工程で行われ、そして、想定される応用に応じて、容易に修飾されるように活性分子の放出の反応速度論を可能にする。さらに、本目的が材料への共有的にグラフトすることできるという事実は、機械的安定性の優れた特徴を与え、期間中安定であるということを確証する。
【００６８】
球面粒子の使用は、生体活性分子の十分な濃度を保証するために材料の特異的な表面領域を増加するだけでなく、また、生体融合材料の表面への容易に複数の化学的官能基又は有効成分を導入することが可能である。
【実施例】
【００６９】
図式的に、提案された装置の製造は、３つの直接的な工程：
１−生体融合材料の官能化
２−生物活性なナノ粒子の合成
３−生体融合材料上のナノ粒子の固定
に分類され得る。
【００７０】
１−生体融合材料の官能化
材料に関して、生物活性のプロテーゼの開発は、材料と分子との間、又は材料と生体分子との間の接触面の制御を必要とする。グラフティングは、特定の特性について選択された１個又は複数個の分子を任意の材料の表面に共有結合することによって固定を可能にする手法である。処置の全ては、制御された大気、温度及び圧力下で実行され、グラフティング条件の完全な制御を可能にする。採用した手法は、より反応的にさせるために、生体融合材料の表面で機能性の修飾から成る。
【００７１】
例証として、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）上にアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の分子のグラフティングの場合に使用される実験条件（図式１）は、下記に詳述する。
【００７２】
【化３０】
0005383039.tif 000031
【００７３】
ａ）表面調製
ＨＡは、ソックスレー（Ｓｏｘｌｈｅｔ）抽出（エタノールを用いる）を使用して２４時間洗浄する。
【００７４】
ｂ）表面の修飾
表面の修飾は、周囲の雰囲気由来の水および炭素化合物による表面の汚染を避けるために、並びに単層の再現性及び安定性を確実にするために空気を欠いた乾燥チャンバー内で行われる。リガンドの固定化のための戦略（図解１）は、ヒドロキシアパタイト表面（ＨＡ）上にアミノ機能的オルガノシラン（ＡＰＴＥＳ）のグラフティングに関係する。
【００７５】
実験的には、ＨＡ表面の修飾は、図１にも示されるように、下記の手順を用いて実行した。
１．ＨＡは、１００℃、真空下（１０-5）で２０時間脱気した（表面Ａ）。
２．ＨＡ表面のシラン化は、撹拌しながら、アルゴン雰囲気下で２時間無水ヘキサンＡＰＴＥＳ（１×１０-2Ｍ）の溶液に基質を浸すことによって行った。
３．試料を撹拌しながら３回リンスすることによってアルゴン雰囲気下で洗浄し、３０分間超音波処理した（２工程は無水ヘキサンを用いて実行した）。
４．試料を真空下（１０-5トール）で４時間７０℃で脱基した（表面Ｂ）。
【００７６】
ｃ）表面の特徴付け
Ｘ線光電子分光計（ＸＰＳ）は、手順の各工程で反応の制御に適用した。ＸＰＳスペクトルは、ＲＧＤペプチドのグラフティングの各工程でＨＡ基質に関してＣＧ２２０ｉ−ＸＬ  Ｅｓｃａｌａｂ分光計を用いて記録した。非単色のＭｇＫα源のパワーは、約２５０ミクロンの考慮したゾーンを含む２００Ｗであった。電子銃はチャージ用に補填するために使用した。高分解能スペクトルの獲得は、２０ｅＶの定常エネルギー流で達成した。次に、調整は、ＶＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって提供されたソフトウェアを使用して実行し、各スペクトルは、参照として２８４．４ｅＶで炭素汚染を有する。結合エネルギー値（ＢＥ）は、±０．２ｅＶとして与えられる。
【００７７】
２−ナノ粒子の合成
ナノ粒子の合成は、重合可能な実体、並びに反応性官能基及び／又は有効成分（薬物、有機分子等）によって官能化されたマクロモノマーα、ωを用いてビニルモノマー（シクロ−オレフィン類）の分散媒における共重合によって実行される。この合成例は、下記に詳述される。
【００７８】
Ａ）下記の式Ａ及びＢのマクロモノマーの合成
マクロモノマー（Ａ及びＢ）は、７０００ｇ／ｍｏｌのモル質量
【化３１】
0005383039.tif 000032
を有するポリ（エチレンオキシド）オリゴマーである。それらは、鎖の長さ及び機能性の制御を可能にする「リビング（ｌｉｖｅ）」アニオン重合から誘導される。それらは、メタセシスによる重合におけるその高い反応性に関して選択された実体であるノルボルネニルユニットによってそれらの末端の１つで官能化され、そして、アルコール、酸、アミン等の反応性官能基によって（Ａ）、又は有効成分（インドメタシン）によって（Ｂ）、開裂可能なブリッジ（無水酸、エステル、アミド等）を介して他の末端で官能化される。
【００７９】
１．α−ノルボルネニル−ω−カルボン酸−ポリ（エチレンオキシド）；式Ａ
化学式：
【化３２】
0005383039.tif 000033
想定される応用の要求に応じてｎは５０〜３４０の間である。
【００８０】
参照：ＮＢ−ＰＯＥ−ＣＯＯＨ
【化３３】
0005383039.tif 000034
【００８１】
合成手順：
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２００ｍＬ）の溶液中の５−ノルボルネン−２−メタノール（０．５ｍＬ）は、ジフェニルメチルカリウムのモル当量の添加によって第一に脱プロトン化する。得られるラジカルは、その後、メタノール（１ｍＬ）の添加によって活性中心の破壊まで、「リビング」法（４８時間）でエチレンオキシドの重合を開始するであろう。得られるポリ（エチレンオキシド）（Ａ０）のアルコール基は、その後、ＴＨＦ（１５ｍＬ）の溶液中のＮａＨ（０．１７ｇ）を用いてＡ０（１０ｇ）の脱プロトン化によって、さらに、ブロモ酢酸（０．４２ｇ）の添加によって酸性官能基に変換されるであろう。生産物を塩酸（１８ｍＬ、１Ｍ）で洗浄後、次に、エーテル中で沈殿させ、マクロモノマーＡを純粋な形態で得られる。
【００８２】
２．α−ノルボルネニル−ω−インドメタシン−ポリ（エチレンオキシド）；式Ｂ
【化３４】
0005383039.tif 000035
想定される応用の要求に応じてｎは７０〜２００の間である。
【００８３】
参照：ＮＢ−ＰＯＥ−ＣＯ（Ｏ）−ＩＮＤ
【化３５】
0005383039.tif 000036
【００８４】
合成手順：
ＮＢ−ＰＯＥ−ＣＯＯＨ（Ａ）の酸性官能基は、ジメチルホルムアミドの触媒量の存在下で、２４時間、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の塩化オキサリル（０．０８ｍＬ）上でＡ（５．２ｇ）の反応によって、酸塩化物（Ａ２）に変換する。インドメタシン（０．６ｇ）及びトリエチルアミン（０．２４ｍＬ）は、その後、Ａ２の溶液に添加し、１５時間撹拌し続ける。エーテル中での沈殿後、マクロモノマーＢが得られる。
【００８５】
ａ−３．ノルボルネンのインドメタシン誘導体
先行する反応に使用されるモノマーは、ノルボルネン（ＮＢＨ）又は有効成分によって官能化したノルボルネン（ＮＢＤ）である。次に、後者は、エステル、無水物、アミド等の加水分解型ブリッジを介して導入される。インドメタシンによって官能化されたノルボルネンの合成は下記に詳述される。
【００８６】
化学式：
【化３６】
0005383039.tif 000037
【００８７】
参照：ＮＢＤ
【化３７】
0005383039.tif 000038
【００８８】
合成手順：
モノマーＮＢＤの合成
典型的な反応の間、塩化オキサリル（０．８７ｍＬ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液中のインドメタシン（１．１ｇ）に添加する。反応を２時間行い、未反応の塩化オキサリルの除去後、得られる化合物１は、その後、トリエチルアミン（０．８４ｍＬ）の存在下で、１５時間４５℃で撹拌をし続けながら、ジクロロメタン（２０ｍＬ）の５−ノルボルネン−２−メタノール（０．３６ｍＬ）の溶液に添加する。抽出による精製後、モノマーＮＢＤを得る（ρ＞９５％）。
【００８９】
ｂ．粒子の合成
本発明に係る粒子は、重合可能な実体によって官能化したマクロモノマーα、ωと有効成分（薬物、有機分子等）の反応性官能基を用いてビニルモノマー（シクロ−オレフィン類）の分散媒（乳化剤、ミニ−乳化剤及びマクロ−乳化剤、分散剤、懸濁剤）で共重合によって得られる。重合は、遷移金属によって開始し、水性又は有機媒体（ジクロロメタン／エタノール）中で実行することができる。安定化剤の能力では、反応媒体でのポリマー形成中に、球状のナノ粒子の形態で分散することを可能にする。純粋な立体構造の点から、安定化は、媒体のｐＨの任意の変化に非感受性である。さらに、マクロモノマーの手段によってラテックスの官能化は、ラテックス表面上の反応性官能基の利用性を改善し、その反応性を保存する。
【００９０】
重合開始剤は、極性媒体に安定であるルテニウムを基礎とした複合体：ＲｕＣｌ3、ＲｕＣｌ2（ＰＣｙ3）2ＣＨＰｈ及びそれらの同族体である。これらの条件で合成されるラテックスは、粒子の安定化に役立つであろうポリ（エチレンオキシド）グラフトを有するポリアルケナマー（ｐｏｌｙａｋｌｅｎａｍｅｒ）鎖から成るであろう。
【００９１】
得られる粒子は、水性及び／又は有機媒体中で安定である。それらのサイズは、使用される重合（分散、懸濁、ミニ−乳濁等）の方法に応じて、数ナノメートル〜数ミクロメートルの間である。ナノ粒子は、非常に良好な同じ大きさの球形である。
【００９２】
合成スキーム：
【化３８】
0005383039.tif 000039
【００９３】
合成手順：
マクロモノマーＡ及びＢは、モノマー（ＮＢＨ及び／又はＮＢＤ）の存在下で共重合される。典型的な反応において、０．８ｇのモノマー及び１ｇのマクロモノマー（０．２ｇのＡ及び０．８ｇのＢ）を予め１４ｍｌのジクロロメタン／エタノール混合物（３５％／６５％）に溶解し、窒素雰囲気下で激しく撹拌しながら、２０ｍｇの開始剤を含有する１０ｍｌのジクロロメタン／エタノール（５０％／５０％）に添加する。重合時間は１時間である。全体的に同族の出発媒体は、重合が起こるにつれて、徐々に濁ってくる。ガスクロマトグラフィーによる重合の監視は、１分未満でモノマーの全変換を示している。マクロモノマーＡ及びＢのラテックスへの導入は完全である。
【００９４】
ｃ．感受性有効成分の輸送の変化
ラテックスは、有効成分（インドメタシン）を担持する又は担持しないシクロ−オレフィン（ノルボルネン）と安定化ポリマー（ＮＢ−ＰＣＬ−ＰＯＥ−ＯＭｅ）との間の共重合によって前述のように製造される。このラテックスは、酸、酸塩化物、アルコール、アミン型（前述と同じ官能基）の反応性官能基によって官能化され又は官能化されておらず、加水分解型ブリッジ、特に重合可能な官能基及び下記のスキーム：
【００９５】
【化３９】
0005383039.tif 000040
によるエチレンポリオキシド鎖との間のε−カプロラクロン（ＰＣＬ）のユニットを有する。
【００９６】
この手順に従って、粒子内に捕捉され、それに共有結合した（図１３）有効成分の放出は、ラテックスの不安定化の第一工程を必要とする。これは、安定化鎖の塩析によって外部刺激物（ｐＨ、高熱等）により達成することができる。
第二の反応時間では、有効成分によって官能化されるポリアルケナマーの得られる直鎖は、加水分解反応を受け、有効成分を放出する（図１４）。
【００９７】
ｃ−１）共重合体ポリ（カプロラクトン−β−エチレングリコール）−α−ノルボルネン−ω−メチルエーテルＮＢ−ＰＣＫ−ＰＯＥ−ＯＭｅの合成手順
ポリ（カプロラクトン）α−ノルボルネニル（ＮＢ−Ｐｃａｐｒｏ）の製造
トリエチルアルミニウム（１．３×１０-2モル）を−８０℃まで冷却したトルエン（１００ｍＬ）中の２−ヒドロキシメチル−５−ノルボルネン（１．３×１０-2モル）の溶液に滴下して添加する。周囲温度まで進行的に戻した後、反応を２．５時間続ける。カプロラクトン（３．９モル）は、その後、激しく撹拌しながら、反応媒体に添加する。反応１８時間後、５０ｍＬの塩酸（０．１Ｎ）を添加する。中和になるまで洗浄後、ポリ（ε−カプロラクトン）α−ノルボルネニルをヘプタン中に冷却して沈殿させ、その後、フリットＮｏ．４上でろ過する。微量のヘプタンは、真空で１０時間加熱（４０℃）することによって除去されるであろう。得られるポリマーは、その後、溶媒としてのジオキサンを用いて３回凍結乾燥させる。
【００９８】
ポリ（エチレングリコール）−α−カルボン酸−ω−メチルエーテルの製造
３．８９×１０-3モルの無水コハク酸及び４．１０×１０-3モルのトリエチルアミンを４５ｍＬの無水アセトンに溶解させる。撹拌しながら、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（６×１０-4モル）の溶液を１５ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2に滴下して添加する。反応１６時間後、１ｍＬのメタノールを添加する。回転エバポレーターで濃縮後、エチルエーテル中でポリマーを沈殿させる。溶解／沈殿の工程をさらに２回再開する。動的真空中に１０時間ポリマーを置き、微量の溶媒を全て除去する。
【００９９】
共重合体ポリ（カプロラクトン−ｂ−エチレングリコール）−α−ノルボルネン−ω−メチルエーテル（ＮＢ−Ｐｃａｐｒｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）の製造
４×１０-4モルのポリ（エチレングリコール）−α−カルボン酸−ω−メチルエーテルを４０ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2に溶解させる。塩化オキサリル（８×１０-4モル）を５℃まで冷却したこの溶液に添加する。反応の１５分後、過剰の未反応の塩化オキサリル及びＣＨ2Ｃｌ2を減圧下で除去する。その後、得られた黄色の残渣を４０ｍＬのジクロロメタンに再溶解させる。トリエチルアミン（４．３×１０-4モル）を添加後、α−ノルボルネニルポリ（カプロラクトン）を添加する。回転エバポレーターで濃縮後、エチルエーテル中でポリマーを沈殿させる。溶解／沈殿の工程をさらに２回再開する。減圧下で１０時間ポリマーを置き、微量の溶媒を全て除去する。
【０１００】
α−ノルボルネニルポリ（カプロラクトン）の合成は、下記のスキームに従って達成される：
【０１０１】
【化４０】
0005383039.tif 000041
【０１０２】
ポリ（ε−カプロラクトン−ｂ−エチレングリコール）−α−ノルボルネン−ω−メチルエーテルの合成は、下記のスキームに従って達成させる：
【０１０３】
【化４１】
0005383039.tif 000042
【０１０４】
２）有効成分の放出
粒子を合成し、本出願人は、ｐＨの単なる低下によって薬剤の放出の可能性をＵＶ可視分光光度計によって実証した。得られた結果は、進行的で放出制御したインドメタシンの立証を可能にした。さらに、３に等しいｐＨの適用は、その８５％より多くを４８時間で塩析することができた。
【０１０５】
３−生体融合材料上へのナノ粒子の固定化
材料上への粒子の共有的な固定化は、２つの拮抗反応性官能基の縮合によって実行され、１つは、材料上に配置し、他方は、粒子上に配置する。対の酸／アミン、酸／アルコール、酸／塩化物、アルコール／酸塩化物等の例によって言及がなされてもよい。
【０１０６】
本明細書において本出願人が関心ある場合では、この反応は、反応性官能基（この場合、アミン類）、及び生物活性分子（本実施例ではインドメタシン）とアンカー部位（この場合、酸）によってのみではない官能化されたナノ粒子との間で達成される。その後、材料は、生物活性であると言われ、つまり、生物学的活性を有するとされる（図解２）。本実施例では、この活性は、材料が、生理学的媒体と接触している場合自然な形態で有効成分放出によって、又はｐＨの変更によって刺激される。このために、分裂可能な結合は、ナノ粒子及び有効成分との間に導入される。
【０１０７】
【化４２】
0005383039.tif 000043
図解２：材料上の生物活性なナノ粒子の固定化
【０１０８】
典型的な反応中、３×１０-4モルのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を２ｍＬのジメチルホルムアミド中のナノ粒子（３．６６×１０-5モルの酸性官能基）の溶液に添加する。ＨＯＢＴの完全な溶解後、次に、材料を導入し、１５分間、周囲温度で撹拌し続ける。その後、２．５×１０-4モルの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを反応媒体に添加し、１２時間撹拌しながら維持する。次に、生物活性な粒子によって官能化した材料を連続的に洗浄、その後の乾燥によって精製する。
【０１０９】
ヒドロキシアパタイト材料のトポグラフィーは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって研究される（図１５−１７；拡大：２００００；図１８−１９；拡大：５０００）。ナノ粒子の存在は、グラフティング反応の前（図１５、１６のイメージ）と後（図１７のイメージ）で材料のトポグラフィーの比較によって明確に示されている。
【０１１０】
さらに、ナノ粒子の化学的固着の安定性を変化させた：１２時間８０℃でエタノールを用いた抽出に続いて放出されなかった（図１８のイメージ）。単なる物理吸着を有する材料に適用された同処理は、ナノ粒子の全抽出へと導く（図１９のイメージ）。
【０１１１】
生物的官能化手順
ＸＰＳは、化学結合及び原子濃度に関する情報を提供することができるので、反応の各工程に続いて使用した。表１は、上面の原子比の修飾を与える。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
表１：処理の各工程でのＨＡパーセントにおけるＸＰＳによる原子構成
【０１１４】
図２０及び２１は、処理の各工程後に得られるスペクトルＣ１及びＮ１を首尾よく示す。言及される結合エネルギー（ＢＥ）を文献で見出されるＢＥと比較する（表２）。下記の検討では、ペプチドシクロ−ＤｆＫＲＧのＸＰＳにおける特徴付けだけが示され、ＧＲＧＤＳＰＣのグラフティングについての手順は同様の結果に導く。
【０１１５】
【表２】
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表２：文献におけるデータに係る窒素原子、炭素及びケイ素を含有する特定の官能基に帰属した結合エネルギー（ｅＶ）
【０１１６】
ヒドロキシアパタイト表面の主要な元素は、Ｃａ、Ｐ、Ｃ及びＯである。期待される理論的なＣａ：Ｐ比は、約１．７である。得られる実験的な比は、首尾よくは、それぞれ、ＨＡ及びＨＡ＋ＡＰＴＥＳに関して１．８、１．３である。表面のグラフティング後、Ｃａ及びＰの検出はより困難であり、これは、電子がグラフトした相を上手く通過しなければならないからである。
【０１１７】
ＡＰＴＥＳによって処理されるＨＡのＸＰＳ分析は、ケイ素及び窒素が、通常、ＨＡ表面に見られるＣａ、Ｐ、Ｏ及びＣに加えて検出される。本出願人による実験的測定（表２）は、理論的に期待される比（４．０：４．０）に近いＮ：Ａｉ比に導く。２８４．８ｅＶに見られるＣＨｘ結合（図２０ｂ）に加えて、（２８５．４ｅＶで）より小さいサイズの酸化物化合物を含む炭素の貢献は、シラン分子に属する残存エトキシ基に対応するかもしれない。Ｃ１の「Ａ」スペクトル（図２０ａ）と比較して、新規な貢献は２８３．９Ｖで見られる。後者のピークは、Ｓｉ２Ｐスペクトルにおける１０２．５ｅＶで現れるピークに従って、ＳｉＯ３Ｃ基（表２）に起因する。同時に、Ｎ１スペクトル（図３ａ）は、２つの成分を表し；１つは、Ｃ−ＮＨ2基（３９８．９ｅＶ）の低エネルギーを有するものであり、酸化的環境に関与する窒素に起因するかもしれない。後者の貢献は、末端のアミン基及び表面に近い酸素基との間のある種の相互作用によるかもしれない。これら全ての観察に基づいて、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2鎖は、表面上で十分にグラフトされることが明白である。
【０１１８】
４−有効成分の放出の研究
材料上へのナノ粒子のグラフティング後、有効成分（この場合、インドメタシン）の放出は、生理学的媒体を用いた材料の接触によって達成された。得られた結果は、材料表面の変更なしに有効成分の制御した塩析を確実にすることを可能にした。
【０１１９】
５−抽出物の細胞適合性
細胞に関して材料の可能な毒性は、この材料の抽出物によって引き起こされる効果を研究することによって調査することができる。これらの効果は、塩析の蒸留可能な基質又は可溶な産物の毒性効果を示すことが可能となった。
【０１２０】
ａ）抽出物を得ること
標準に従って、抽出物は、試料の埋没した部分の見せ掛けの表面領域と抽出媒体の体積の比を３〜６ｃｍ2／ｍｌとの間に固守することによって生産された。本出願人は、この比を５ｃｍ2／ｍｌに固定することを選択する。
【０１２１】
抽出媒体は、実験者の判断に委ねられる：血清の有無の細胞培地、ＮａＣｌ  ９％溶液又は他の適切な溶液。本出願人は、細胞培地を選択する。
抽出は、任意の相互作用を避けるために、ホウケイ酸塩ガラス管内で実行する。この抽出の時間は、３７℃のインキュベーターで１２０時間である。この抽出の終わりに、材料の断片を取り出し、得られた液体は、試験の過程で使用されるであろう抽出物に対応する。
【０１２２】
本出願人は、５０％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）及び１％（ｖ／ｖ）の希釈物を得るために、純粋な形態（希釈していない）又は希釈剤として細胞培地を用いて希釈した形態で抽出物を使用した。フェノール溶液（細胞培地中６４ｇ／ｌ）を「正の対照」として入れ、つまり、再現可能なやり方で細胞毒性の応答を誘導することができる。
【０１２３】
ｂ）細胞の播種並びに抽出物及び溶液の産生
生体適合性試験について、分光光度計（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｓａｉｎｔ−Ｃｌｏｕｄ，Ｆｒａｎｃｅ）上で読むことを可能にする９６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）に細胞を置く。播種密度は、ヒト骨幹細胞では６０００細胞／ｃｍ2である。７２時間で、細胞マットは、サブコンフルエントに達し、試験を実行することができる。
【０１２４】
ｃ）試験を行うこと
これらは、細胞の代謝活性又は単なる細胞生存率を示すことが可能となる比色分析試験である。分光光度計を用いて染色した反応の強度の測定が定量的評価を可能にする。
【０１２５】
ｃ−１）ニュートラルレッド試験
ｃ−１−１）原理
この試験は、細胞の生存率を示すために、１９８３年にＰａｒｉｓｈ及びＭｕｌｌｂａｃｈｅｒによって開発された。ニュートラルレッドは、生存細胞中のリソソーム膜の陰イオン部位に静電結合によって固定される生体染色である。この膜の変化は、染色の固定において減少を引き起こす。染色した反応の強度は、毒性試薬の存在下でのインキュベーション後に生存細胞の数を評価することができる。
【０１２６】
２−１−２）プロトコール
抽出液体又は溶液と細胞との間の２４時間の接触後、培養プレートをインキュベーターから引き出し、各ウェルを０．２ｍｌのリン酸緩衝液を用いて少なくとも２回リンスする。培養液中のニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ）（１００μｌ／ウェル）の０．４％溶液（ｖ／ｖ）を各ウェルに分配する。３７℃で３時間インキュベーション後、ニュートラルレッド溶液を除去し、染色物の抽出は、５０％（ｖ／ｖ）のエタノール中の酢酸水の１％溶液（ｖ／ｖ）の１００μｌ／ウェルの添加によって実行される。
【０１２７】
プレートを５分間振とうする。各ウェルに、視覚化能な強度の着色が得られ、波長５４０ｎｍでの分光光度計で吸光度を測定する。着色は、１００％毒性に関与する着色についての無色から、対照及びあまり毒性でない抽出物についての多少の赤色まで広がる。
【０１２８】
ｃ−２）ＭＴＴ試験
ｃ−２−１）原理
この試験は、細胞の代謝活性を測定するために１９８３年にＭｏｓｍａｎｎによって紹介された。ＭＴＴ又は３−（４，５−ジメタジオール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）ブロマイドは、ｐＨ中和で水溶液中では黄色に呈色したテトラゾリウム塩である。生存細胞のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによって青色のホルマザン結晶体に代謝される。細胞によって生じたホルマザンの定量は、毒性試薬の存在下でのインキュベーション後、生存細胞の数及び代謝活性の指標を与える。
【０１２９】
ｃ−２−２）プロトコール
溶液の抽出液体及び細胞との間の２４時間の接触後、インキュベーターから培養プレートを引き出し、各ウェルは、０．２ｍｌのリン酸緩衝液を用いて少なくとも２回リンスする。ＭＴＴ溶液（１ｇ／ｌのグルコースを含有するＨａｎｋｓ緩衝液に調製した１ｇ／ｍｌの０．１２５ｍｌ）を各ウェルに分配する。期待される控訴反応が発生するために３時間インキュベート内にプレートを置く。上清の除去後、形成したホルマザン結晶物を０．１ｍｌ／ウェルのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ）の添加によって可溶化する。結晶物の可溶化は瞬時であるが、その着色は、１時間しか安定でない。したがって、プレートを５４０ｎｍの波長で分光光度計で素早く読み、ウェル当りの吸光度を得ることが可能である。着色は、１００％毒性に関係する濃度についての無色から対照及びあまり毒性でない抽出物についての非常に深い紫色まで広がる。
【０１３０】
参考文献
【化４３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】式Ａのマクロモノマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図２】式Ａのマクロモノマーの13Ｃ  ＮＭＲスペクトル。
【図３】ＴＨＦ中の式Ａのマクロモノマーの立体排除クロマトグラフィー。
【図４】式Ｂのマクロモノマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図５】ＴＨＦ中の式Ｂのマクロモノマーの立体排除クロマトグラフィー。
【図６】化合物ＮＢＤの1Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図７】化合物ＮＢＤの13Ｃ  ＮＭＲスペクトル。
【図８】重合反応中のＮＢ及びＮＢ−ＰＯＥ−ＣＯ（Ｏ）−ＩＮＤ変換の研究。時間に応じたノルボルネン（◆、ＮＢ）及びマクロモノマー（●、ＮＢ−ＰＯＥ−ＣＯ（Ｏ）−ＩＮＤ）への変換の発生。
【図９】モノマーＮＢＨ及び／又はＮＢＤの存在下でのマクロモノマーＡ及びＢの共重合によって得られた球状粒子の走査型電子顕微鏡画像。
【図１０】モノマーＮＢＨ及び／又はＮＢＤの存在下でのマクロモノマーＡ及びＢの共重合によって得られた球状粒子の透過型電子顕微鏡画像。
【図１１】動的光拡散によるモノマーＮＢＨ及び／又はＮＢＤの存在下でのマクロモノマーＡ及びＢの共重合によって得られた球状粒子のサイズ及びサイズ分布。
【図１２】ＴＨＦ中のモノマーＮＢＨ及び／又はＮＢＤの存在下でのマクロモノマーＡ及びＢの共重合によって得られた球状粒子の立体排除クロマトグラフィー。
【図１３】有効成分が粒子内に捕捉され、それに共有結合される本発明に係る球状粒子の描写。
【図１４】本発明に係る球状粒子（又はラテックス）の不安的化及び薬物の塩析の説明図。
【図１５】ヒドロキシアパタイトの走査型電子顕微鏡による観察。
【図１６】ヒドロキシアパタイト＋ＡＰＴＥＳの走査型電子顕微鏡による観察。
【図１７】ヒドロキシアパタイト＋ＡＰＴＥＳ＋ナノ粒子の走査型電子顕微鏡による観察。
【図１８】ヒドロキシアパタイト＋ＡＰＴＥＳ＋抽出後に官能化したナノ粒子の走査型電子顕微鏡による観察。
【図１９】ヒドロキシアパタイト＋ＡＰＴＥＳ＋抽出後に官能化していないナノ粒子の走査型電子顕微鏡による観察。
【図２０】（ａ，ｂ）：それぞれ材料「Ａ」及び「Ｂ」に対するＣ１のＸＰＳスペクトル。
【図２１】材料Ｂの表面についてのＮ１のＸＰＳスペクトル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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