(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析物の存在に関する、あるいは生物学的又は医学的パラメーターを測定するためのアッセイにおいて、
磁性粒子を充填されたｐＨ感受性材料にアッセイ成分を添加して、アッセイ成分に被分析物又は測定されるパラメーターのファンクションであるｐＨ変化を生じさせ；
磁性粒子を振動磁界におき；かつ
磁性粒子に対する磁界の効果を測定することを特徴とする、被分析物の存在に関する、あるいは生物学的又は医学的パラメーターを測定するためのアッセイ。
【請求項２】
アッセイされる標本と反応種との相互作用からアッセイ成分が生じる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
被分析物の存在に関するアッセイにおいて、
被分析物の存在に関してアッセイされる標本を反応種に接触させて、被分析物を反応種と相互に作用させてｐＨ変化を生じさせ；
磁性粒子で充填されたｐＨ感受性材料と直接又は間接に反応させ；
磁界を磁性粒子に適用し；
磁界に対する前記の磁性粒子の応答をモニターし；かつ
磁性粒子の応答を分析することにより前記の標本中の被分析物の量を測定する
ことを特徴とする、被分析物の存在に関するアッセイ。
【請求項４】
生物学的又は医学的パラメーターを測定するためのアッセイにおいて、
生物学的又は医学的パラメーターに関してアッセイされる標本を反応種に接触させて、標本を反応種と相互に作用させてｐＨ変化を生じさせ；
磁性粒子で充填されたｐＨ感受性材料と直接又は間接に反応させ；
磁界を磁性粒子に適用し；
磁界に対する前記の磁性粒子の応答をモニターし；かつ
磁性粒子の応答を分析することによりパラメーターを測定することを特徴とする、生物学的又は医学的パラメーターを測定するためのアッセイ。
【請求項５】
反応種がウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼである、請求項２から５までのいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
アッセイ成分がヒドロキシル基である、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項７】
ｐＨ感受性材料が腸溶ポリマー、有利には酢酸水素フタル酸セルロース、メチルビニルエーテルマレイン酸無水物エステル、メタクリル酸のアニオン性ポリマー又はメタクリル酸のエステルである、請求項１から６までのいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
アッセイがイムノアッセイ、有利に酵素イムノアッセイである、請求項１から７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
結合対反応により生じるｐＨが標本中の被分析物の存在又は標本の生物学的又は医学的パラメーターのファンクションであり、
このｐＨの変化が磁性粒子で充填されたｐＨ感受性材料との反応を直接的又は間接的に生じさせ、
かつ、その際ｐＨ感受性材料からの磁性粒子の遊離を検出することを特徴とする、結合対アッセイ。
【請求項１０】
ｐＨ感受性材料中に捕捉された磁性粒子を含む反応チャンバ、磁界を発生させるための装置及び検出装置を有する、請求項１から９までのいずれか１項に記載のアッセイを実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、被分析物の存在あるいは生物学的又は医学的パラメーターの測定に関するアッセイ並びにそのようなアッセイのためのキットに関する。
医師が患者を治療する場合、体液標本を採取して分析検査所に送付することは一般的なことである。このような不可避的な検査法は標本の処理に多少の遅れをもたらす。このことは特に標本を検査のために別の検査所に送らなければならない場合にまさに当てはまる。病院でさえしばしば、医師に結果が伝えられるまで数時間かかることがある。従って、必要ないくつかの検査結果を知らずに医師が患者の治療を始めることは珍しいことではない。
患者が重病である状況では、標本検査の遅れが患者の容態を危険な状態におくことも考えられる。
特定の患者を担当する医師が検査所に標本を送らないで、自分自身で検査を行うことが、この問題を克服するための好適な方法であろうと考えられる。しかしながら、標本の検査は往々にして複雑なプロセスであり、結果を信用し、医師により実際に使用される場合には高度に習熟した人物により行われるべきである。
従って、特に患者から得られた標本のために使用者（オペレーターとも記載）により迅速に、かつ確実に実施することができるアッセイが必要である。
ＧＢ−Ａ２２８４８９０は被分析物センサに関しており、その際、被分析物はポリマー被覆された電極の所で、又はその非常に近くでそれと酵素又は触媒種との反応により検出される。酵素又は触媒種は直接又は間接に前記のポリマー相と反応して、ポリマー相は電極表面に電気的特性に測定可能な変化をもたらす多孔性となる。１実施態ではポリマーはｐＨ感受性であり、かつ反応はｐＨの変化をもたらす。
ＷＯ８９／１０７８８はアッセイされる標本中の磁性粒子の運動をモニターすることによる血餅形成時間、血餅溶解時間又は凝固パラメータの測定法に関しており、その際、その運動は磁界により生じる。
ＷＯ９４／１９６９０は親和性アッセイの実施法に関しており、これは磁性粒子に対する振動磁界の反応をモニターして、被分析物の濃度を測定する。
ＷＯ９５／０６８６８も振動粒子タイプの凝固アッセイを記載している。
本発明は標本、特に患者の標本の検査法を提供する。この方法の利点には、血液成分の分離を含むプレアッセイ工程の回避の故に、該アッセイを全血に使用することができるという事実が含まれる。本発明の方法は自動化することができ、かつ信頼できる検査結果を迅速にもたらし、従って患者の容態の早期かつ迅速な診断をもたらす。この方法は簡単で、従って最小限のオペレーター技術が必要とされるだけである。加えて、この方法を自動化するために必要な装置は直ちに入手可能であり、従ってこの方法は経済的である。
広い観点では本発明は、その終点としてｐＨ変化を有するアッセイを実施するための方法を提供している。
第一の観点では本発明は、次の工程からなる被分析物の存在のための、又は生物学的又は医学的パラメーターを測定するためのアッセイを提供する：
アッセイ成分を磁性粒子を充填されたｐＨ感受性材料に添加すると、アッセイ成分が測定パラメータの関数であるｐＨ変化をもたらし；
磁性粒子を振動磁界におき；
磁性粒子に対する磁界の効果を測定する。
磁界に対する磁性粒子の応答の分析により、被分析物の存在を検出するか、又はパラメーターの測定を行う。
ｐＨ材料が被分析物のファンクション又はパラメーターとして変化して、このことが、振動磁界中の磁性粒子の動きを変化させるということは、認められるであろう。
標本は、水性、全血、血清、血漿、尿又は唾液であってよい。
第２の観点では、次からなる、被分析物の存在に関するアッセイの実施法を提供する：
被分析物の存在に関してアッセイすべき標本を反応種と接触させ、被分析物を反応性種と反応させて、ｐＨ変化を生じさせ；
ｐＨ感受性材料磁性粒子で充填されたｐＨ感受性材料と直接、又は間接的に反応させ、
磁性粒子に磁界を適用し；
磁界に対する前記の磁性粒子の応答をモニターし；かつ
磁性粒子の応答の分析により前記標本中の被分析物の量を測定する。
ｐＨ変化は被分析物の存在のファンクションの１つである。
反応種との被分析物の相互作用はアッセイ成分をもたらし、かつアッセイ成分がｐＨ変化を生じさせる。
被分析物と反応種とは相互に作用して、ｐＨ変化が被分析物の存在のファンクションであるようなアッセイ成分を形成する。このファンクションは標本中に存在する被分析物の量の定性又は定量測定を可能にする。
有利には、このアッセイは結合対を使用する。通常使用される結合対の非排他的リストには、アビジン／ビオチン、抗体／抗原、ハプテン／核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が含まれる。通常、結合対が抗体／抗原である場合にはアッセイは、イムノアッセイとして記載される。分子的認識の可能な他のバイオ物質には、糖類ではレクチン、ホルモンではホルモンレセプター及び薬剤及び活性薬剤代謝物では薬剤レセプターが含まれる。
有利な観点では、方法をイムノアッセイを行うために使用する。
第３の観点では本発明は、酵素反応により生じたｐＨが被分析物の量のファンクションであり、かつその際、ｐＨ感受性材料からの磁性粒子の遊離を検出する酵素イムノアッセイに関する。
ｐＨ変化は多くの酵素反応に伴うので、本発明は、広く応用できる柔軟なアッセイを提供する。一般に、酵素イムノアッセイでは測定される標本中のものと同じ酵素−抗体対の一方と結合する標識として、酵素を使用する。酵素と結びついた抗原−抗体は次いで、補体抗体／抗原の限られた供給で結合部位に関して標本抗原／抗体と競合する。
イムノアッセイのための従来法には次が含まれる：
i)  固相、例えばプラスチック製タイタープレート上に抗体を捕捉し、生物学的標本に晒して、関連抗原を付着し、洗浄し、次いで第２の標識抗体に晒す。抗体上の標識は例えば、酵素であってよい。更に、洗浄にラベルの検出（従って当初標本中の抗体量の検出）を続ける。これはサンドイッチ型アッセイ又はツー・サイト型アッセイとして知られている。又は
ii)  固相上に抗体を捕捉して、続いて抗原及び標識抗原の添加量を含有する生物学的標本に晒す。標識抗原及び非標識抗原は、固相上で抗体サイトに関して競合する。洗浄後に表れた標識の量は、生物学的標本中の本来の抗原量に反比例する。これは競合アッセイとして知られている。
当業者に公知の、又は公知になりつつある他のイムノアッセイ法も使用することができる。例えば、このアッセイは直接分子識別を使用することができる。このアプローチでは固定されている結合対の一方、例えば抗体は標本中に存在するその結合対と結合し、ｐＨ変化をもたらす。直接認識アッセイの利点は簡単さである。
酵素イムノアッセイでは酵素物質を添加し、かつ好適な方法により生成物をモニターすることにより、標識を測定する。本発明の場合には、酵素反応によりｐＨ変化を生じさせ、かつこれを、ｐＨ感受性材料中に捕捉された磁性粒子への磁界の効果を使用してモニターする。次いでこの信号を処理し、かつ結果を算出する。
別の有利な観点では、本発明の方法を生物学的又は医学的パラメーターのアッセイを実施するために使用する。
従って、本発明の第４の観点では、生物学的及び医学的パラメーターのためのアッセイを実施するための方法を提供し、その際、これは生物学的又は医学的パラメーターに関してアッセイするための標本を反応性種に接触させて、測定するパラメーターのファンクションであるアッセイ成分を生じさせ、かつｐＨ変化を生じさせ；
直接又は間接に、磁性粒子を充填されたｐＨ感受性材料と反応させ、；
磁界を磁性粒子に適用し；
磁界に対する前記の磁性粒子の応答をモニターし；かつ
磁性粒子の応答の分析によりパラメーターを測定することによりなる。
ｐＨの変化は、生物学的又は医学的パラメーターのファンクションである。
標本と反応種との相互作用によりアッセイ成分が生じ、かつアッセイ成分がｐＨ変化をもたらす。
標本と反応種とは相互に作用し、測定するパラメーターのファンクションであるｐＨ変化を生じさせるアッセイ成分を形成する。このファンクションは、該当パラメーターの定性又は定量測定を可能にする。
生物学的又は医学的パラメーターには臨床化学パラメーター、典型的には血液電解質及び代謝物質、又は血液ガス測定が含まれる。
有利な実施態では、特に臨床化学又は血液ガスアッセイでは標本を、該当する被分析物の存在に比例してアッセイ成分を生じさせる試薬コンビネーション、通常は酵素及び基質にさらす。従って、本発明の別の観点では、生物学的又は医学的パラメーター、例えば臨床化学又は血液ガス測定のためのアッセイを提供し、その際、被分析物を含有する標本を、被分析物濃度に比例してｐＨ変化を生じさせるのに好適な試薬と混合する。この場合、被分析物は該当パラメーターに相応すると認められる。
本発明の方法を以下では主にイムノアッセイと関連させて述べる；しかしながら、一般的な記述は、他のアッセイ、例えば生物学的又は医学的パラメーターの測定に同じく適用できることは認められるであろう。
被分析物の量又は存在を、振動磁界においた場合の磁性粒子の時間変動シグナルの分析により測定することができる。
該磁界は、静的又は動的磁界の使用により発生させることができる。有利には、振動磁界をそれ自体は定常な振動磁界発生素子により発生させる。
有利な実施態では、アッセイは、ｐＨ感受性材料中に捕捉された磁性粒子を含有する小さいチャンバを使用する。アッセイ成分をチャンバに添加する。磁性粒子を振動磁界におく。その動きをチャンバの上方の、下方を向いている光源から反射される光をモニターすることにより検出する。粒子が立っていると、該カードからの反射光はチャンバ上に置かれた光検出器上で反射する。粒子が倒れていると、光はブロックされ、かつ最低値が光検出器に達する。ｐＨ感受性材料が溶解するか、又は崩壊すると、粒子は開放され、有利には特異的に時間に依存して動き、かつ反射光のレベルが変化する。
有利には、チャンバはプラスチック製カード系の一部である。
ポリマーは有利には薄膜の形であり、かつ通常は透明である。溶液中に特定のｐＨで溶解する特性を有する腸溶ポリマーを選択することができる。
アッセイを好適な緩衝液中で、又は患者標本自体の中でｐＨ変化を生じさせる吸上形式（wicking format）で設計することもできる。ｐＨ変化は存在する被分析物の量に依存し、かつポリマーを溶解させ、かつ粒子を動かす。粒子の動きは反射光レベルの変化として検出される。反射光の時間依存特性をイムノアッセイの算出のために使用する。
ｐＨ感受性材料の分子の架橋により、従って磁性粒子の捕獲又は捕捉により磁性粒子をｐＨ感受性材料中に固定するのが便利である。
本発明は、磁性粒子の回りからのｐＨ感受性材料の部分的な又は完全な除去を伴う。前記のように、有利には本発明は酵素イムノアッセイに関する。通常、この実施態では、酵素又は触媒がポリマーと反応可能であるか、又は直接ポリマー膜を加水分解しうる生成物をもたらす。
酵素又は触媒は内部で、又は直接にポリマーに結合してよく、例えば酵素−標識複合体を伴う抗体−抗原相互作用を介してポリマーに結合してよいか、ｐＨ感受性材料に極めて接近した多孔性膜に結合してよいか、又はバルク溶液中に存在してよい。有利には、酵素又は触媒を第２反応チャンバに含ませて、酵素反応の生成物（本発明ではアッセイ成分とも記載）をｐＨ感受性材料及び磁性粒子を含むそのチャンバに入れる。
酵素とポリマー被覆との多くの適当なコンビネーションの１つは、ウレアーゼと錠剤の腸溶被覆で使用されるような材料とのコンビネーションである。これらの被覆は胃の低いｐＨでは不溶性に作用するが、腸内でのｐＨ（ｐＨ６以上）では可溶性である。このような被覆材料の例は酢酸水素フタル酸セルロース、メチルビニルエーテルマレイン酸無水物コポリマーエステル、メタクリル酸のアニオン性ポリマー及びメタクリル酸のエステル（Rohm-Pharma社（Darmstadt, Germany）のEurragit▲Ｒ▼）である。
１つの特定の反応ではウレアーゼは、次の式によりアンモニアと二酸化炭素への尿素の分解を触媒する：
Ｈ２Ｏ＋尿素→２ＮＨ３＋ＣＯ２
ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ→ＮＨ４＋＋ＯＨ−
生じたｐＨ値の上昇がポリマーの溶解をもたらす。
抗体が前記のｐＨ感受性ポリマー上に固定されている場合には、ウレアーゼ−標識複合体をイムノアッセイ中に捕捉することができる。次いで、結合したウレアーゼ複合体は複合体捕捉の時点でポリマーの溶解をもたらす局所的ｐＨ変化を生じさせる。バルク溶液の緩衝能の故に、溶液中で著しいｐＨ変化が起こらない場合には、局所的溶解が溶液中で生じうる。本発明のアッセイは洗浄工程を必要としないので、これは均一アッセイの要求を全て満たす。
別の実施態では、フェントン反応（Fenton's reaction）によりＨ２Ｏ２−産生酵素、例えばグリコースオキシダーゼを使用することができる。この反応は通常、芳香族化合物をヒドロキシル化するために合成有機化学で使用され、かつ極めて反応性の高い基ＯＨ●；例えば
Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２＋→Ｆｅ３＋＋ＯＨ−＋ＨＯ●
を生じさせる。
ヒドロキシル基は反応性で、有機種と遭遇するまでに限り存在する。この場合、ＨＯ基と反応する構造要素を含むポリマー被覆が選択される。ヒドロキシル基の導入により、被覆の溶解が高まる。
本発明によるアッセイは、当業者に公知の多くの様々な形式で実施することができる。
当業者に公知の方法で抗体をポリマー表面に、又は有利には、測定する被分析物と被分析物酵素複合体又は被分析物類似体酵素複合体とがそのために競合する第２反応チャンバ中に固定することができる。
サンドイッチ型イムノアッセイでは、測定される被分析物に対する第１の抗体はｐＨ感受性材料に固定し、かつ酵素標識された第２抗体は溶液中に存在させる。第１の抗体は標本中の該当抗原（被分析物）に結合する。酵素標識された第２抗体はその捕捉された抗原に結合する。基質が存在し、これは酵素によりアッセイ成分に変化してｐＨ変化をもたらす。
競合型では捕捉抗体を固相に固定し、次いで標本を添加するが、これは固相上で抗体サイトに関して競合する標識抗原及び非標識抗原を含有する。表れたラベルの量は標本中の抗原の量に反比例する。
競合形式の実施態の１つでは、溶液はビオチン標識された被分析物又はビオチン標識された被分析物類似体を含有する。アビジンとの酵素複合体も溶液中に存在するか、又はビオチン標識された被分析物又は分析物類似体及び測定される被分析物と固定された抗体との捕捉反応の後に添加されてよい。アビジン／ビオチンの代わりに他の結合対、例えばＩｇＧ：抗−ＩｇＧを同様に使用することができる。
前記のように、被分析物又は被分析物の類似体が抗酵素抗体と複合する競合アッセイを使用することも可能である。測定される被分析物及び遊離の酵素も溶液中に存在し、その際、生じる信号は測定される被分析物濃度に反比例する。
有利な形式では、被分析物と酵素を有する被分析物又は被分析物類似体の酵素複合体との相互作用をウィック（wick；吸収層）又は被分析物に対する抗体がその中でその表面に固定されている毛管路中で行うことができる。ウィック又は毛細管を通過した後に、結合されていない被分析物の酵素複合体は、抗酵素抗体が固定されている材料に接触する。生じる信号は存在する被分析物の濃度に比例する。
もう１つの有利な実施態では、血液ガス測定を含む臨床化学パラメーターを同じ装置上で実施できるように、反応試薬系を設計することができる。
さて、本発明の様々な有利な形式及び実施態様を図面を参照しつつ、非限定的な例で記載するが、その際：
図１は被分析物を検出するために好適な本発明の１実施態によるアッセイの配置図を示している；
図２は生物学的又は医学的に重要なパラメーターを分析するために好適な本発明の別の実施態でのアッセイの配置図を示している；かつ
図３は本発明の１実施態での検出法の配置図を示している。
例１
図１を参照しつつこのアッセイを記載する。
工程：
ａ）  全血を血液分離膜１上に添加する。血漿は流路を通ってエリア２に流れる。
ｂ）  抗原はエリア２でトレーサー抗体を拾う。このトレーサー抗体は相応する基質（ウレアーゼ）の存在下にｐＨ変化を生じさせうる酵素で標識されている。
ｃ）  エリア３の所の捕捉抗体が抗原−標識抗体複合体と結合する。過剰の標本及びトレーサー抗体は吸上作用により吸収エリア４に除去される。
ｄ）酵素基質（例えば尿素）をエリア５から出し、かつエリア３上に流すと、それが酵素ラベルに接触するとｐＨ変化が生じる。
ｅ）時間に応じて変化するｐＨを有する溶液がｐＨ感受性材料に到達し、かつ磁性粒子がチャンバ６で混合する。
ｆ）ｐＨ感受性材料が時間に依存して溶解し始め、これは抗原濃度のファンクションである。磁性粒子は適用振動磁界で動くことができ、反射光の変化を引き起こし、これを検出する。
流路エリアを制御し、かつ基質タンクを開放するための圧力接触変化のような、何らかの慣用の方法で、エリア４、５及び６の間の反応試薬標本流を制御することができる。
例２
例２を参照しつつこのアッセイを記載する。
ａ）  全血を標本チャンバ１上に添加する。１実施態では標本チャンバ１は血液分離膜を含む。別の実施態では、これは単に、診断テストカードに標本を導入するための室である。
ｂ）全血又は血漿を吸上により、又はカードに沿ったフローにより反応エリア２に導く。エリア２で、測定されるパラメーターに関してｐＨ変化が生じるように選択された反応試薬を標本に混合する。
ｃ）反応液を流すか、又はウィッキングにより、ｐＨ感受性材料及び磁性粒子混合物を含むチャンバ３に吸い出す。
ｄ）測定されるパラメーターの濃度のファンクションであるｐＨ感受性材料が、時間に依存して溶解し始める。磁性粒子は適用された振動磁界で動くことが可能であり、かつ反射光に変化を生じさせるので、これを検出する。
前記の検査は検査カード上で実施可能であることが認められ、これは有利には、ｐＨ感受性材料中に捕捉された常磁性酸化鉄を含む反応室を有するほぼクレジットカード大のサイズである。
検査を実施するために、分離反応チャンバの磁性粒子及びｐＨ感受性材料を含むチャンバ自体であってよいカードの適当なウェルに標本滴を添加する。この例では、標本滴を図１及び２に示されるようなエリア１に添加する。
光検出器により、添加標本からの光の変化を検出する。検査を実施している間、電磁石を毎秒、オン及びオフする。検査カード中の磁性粒子が遊離していると、磁石がオンの場合には立ち、光検出器によりおおくの光を通すようになる。磁石がオフの場合には粒子は倒れ、検出光を少なくする。これらの粒子の動きはシグナルを生み出す。ｐＨ感受性材料の分解により、粒子は動き始める。分析器により粒子運動をモニターする。
図３に示すように、光源１は検査カード３上の標本２に達する光を生じさせる。この標本はカバーを有しないか、又は透明カバーを有する。光源からの光はカバーの下の反射面で反射する。反射光は光検出器４に入射する。振動磁界を生じさせる電磁石は５で示している。
【図１】
0003693680.tif 000002
【図２】
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【図３】
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