(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトールを比色定量することを特徴とするＤ−アラビニトールの定量方法。
【請求項２】
マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトールを比色定量して生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の有無を判定する方法。
【請求項３】
マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第１定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有し、マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトールを比色定量して生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量するための、カンジダ感染症診断用キット。
【請求項４】
マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を並行して行うことを特徴とするＤ−アラビニトールの定量方法。
【請求項５】
マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の有無を判定する方法。
【請求項６】
マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第１定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有し、マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量するための、カンジダ感染症診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｄ−アラビニトールの定量方法、カンジダ感染症の診断方法およびカンジダ感染症診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術およびその問題点】
カンジダ症は、真菌感染症の一種であり、特に深在性カンジダ症は白血病や悪性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍や臓器移植のため免疫機能の低下した患者などに見られる疾患である。このカンジダ症の患者は、既に免疫機能が低下しており回復が難しいため、早期に発見し、治療する必要がある。
【０００３】
深在性のカンジダ感染を判定する手段としては、カンジダ属の主要代謝産物であるＤ−アラビニトールの血中濃度を測定する方法、カンジダ抗原を検出する方法、カンジダに対する抗体を検出する方法または血液中の微生物を培養し、検鏡観察する方法などがある。
【０００４】
これらのうち、Ｄ−アラビニトールによる方法は操作が比較的簡単であるため、有用である。この方法は、血中のＤ−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇することを利用したものであり、Ｄ−アラビニトール脱水素酵素（以下、ＡＲＤと略記する）を用いたＤ−アラビニトール測定用試薬（LABOFIT 、半井化学株式会社製）が既に市販されている。この試薬に使用されているＡＲＤは、Ｄ−アラビニトールの他に、反応性は低いがＤ−マンニトールとも交差反応するため、上記測定用試薬は、Ｄ−アラビニトールとＤ−マンニトールの反応速度の差の大きい反応初期の段階でＤ−アラビニトール濃度を測定してカンジダ感染の有無を判定している。
【０００５】
この方法は、試料のＤ−アラビニトール濃度を短時間に測定できる利点はあるが、ＡＲＤの酵素反応初期の段階で反応を測定するため、高感度の検出法である蛍光装置を用いる必要があり、また蛍光分析を行う場合には、測定値のバラツキを抑えるため血清などの生体試料を除蛋白した後測定を行う必要がある。しかしながら、この測定法では病院の臨床検査の現場に余り普及していない高価な蛍光測定装置を用いるため、装置の汎用性に欠け、さらに、測定に先立ち血清等の生体試料の除蛋白を要する点で煩雑である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＡＲＤによるＤ−アラビニトール測定の際のＤ−マンニトールの影響を回避し、かつ前処理が不要で、通常汎用される比色計で簡便に測定できるＤ−アラビニトールの定量方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の測定試薬の問題点を解消するため鋭意検討を重ねた結果、生体試料をまずマンニトール脱水素酵素（以下、ＭＮＤと略記する）で処理し、次いでＡＲＤで処理することにより、除蛋白などの前処理なしに、汎用されている比色装置を用いて生体試料のＤ−アラビニトール濃度を測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、マンニトール脱水素酵素により生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトールを比色定量することを特徴とするＤ−アラビニトールの定量方法を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、マンニトール脱水素酵素により生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトールを比色定量して生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法を提供するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第１定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有するカンジダ感染症診断用キットを提供するものである。
【００１１】
なお、上記方法等は、Ｄ−マンニトールを先ず定量し、次いでＤ−アラビニトールを定量するものであり、この方法は、１つの測定用セルのみを用いて測定できるものである。しかし、Ｄ−マンニトールとＤ−アラビニトールは、２つの測定用セルを用いて並行して測定してもよく、この場合の定量方法等を以下に示す。
【００１２】
１．  マンニトール脱水素酵素による生体試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を並行して行うことを特徴とするＤ−アラビニトールの定量方法。
【００１３】
２．  マンニトール脱水素酵素による生体試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。３．  マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第１定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有するカンジダ感染症診断用キット。
【００１４】
本発明において、生体試料とは、血液、尿などの体液が挙げられ、通常は血清、血漿などの血液由来の試料が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用するＡＲＤおよびＭＮＤは、いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、ＡＲＤはAerobacter aerogenes由来のものが用いられ、ＭＮＤはLeuconostoc mesenteroides やLactobacillus brevis由来のものが用いられる。ＡＲＤの精製は、例えばFossitt, D.D. & Wood, W.A., Methods in Enzymology 9, 184-186 (1966) の文献の記載に従って行うことができる。また、ＭＮＤの精製は、例えばYamanaka, K., Methods in Enzymology, 41, 138-142 (1975) の文献記載に従って行うことができる。
【００１６】
本発明で使用する発色系は、脱水素酵素の基質の比色定量に従来用いられている発色系をすべて用いることができ、このような発色系としては、ＮＡＤ+ （ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型）／ジアホラーゼ／ＮＴＢ（ｐ−ニトロテトラゾリウムブルークロライド）が挙げられ、ジアホラーゼの代わりにフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、あるいは１−メトキシＰＭＳも使用できる。また、テトラゾリウム塩としては、ＮＴＢ以外にＩＮＴ（２−（４−ヨードフェニール）−３−（４−ニトロフェニール）−５−フェニール−２Ｈ  テトラゾリウム・クロライド、あるいはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ  テトラゾリウム・ブロマイド）が挙げられる。
【００１７】
本発明のＤ−アラビニトールの測定機構を、ＮＡＤ+ ／ジアホラーゼ／ＮＴＢを発色系として用いた場合について例示すると、以下のようになる。
【００１８】
【化１】
0003653575.tif 000002
【００１９】
反応（１）では、ＮＡＤ+ の存在下に、Ｄ−アラビニトールはＡＲＤによりＤ−キシルロースに酸化され、同時にＮＡＤＨが生成する。生じたＮＡＤＨは、ＮＴＢの存在下に、ジアホラーゼでＮＡＤ+ に酸化され、ＮＴＢからはジホルマザンが生じる。このジホルマザンを波長５４０ｎｍ付近にて比色定量することにより、Ｄ−アラビニトールを定量できる。同様にして、反応（２）ではＤ−マンニトールを定量できる。
【００２０】
本発明による生体試料中のＤ−アラビニトールの定量は、生体試料中にＭＮＤを加えて反応（２）を行い、次いでＡＲＤを加えて反応（１）を行うことにより１つの測定用セル中で行ってもよく、２つの測定用セルを用い、一方はＭＮＤのみを加えてＤ−マンニトールのみを定量し、他方はＭＮＤ及びＡＲＤを加えＤ−マンニトールおよびＤ−アラビニトールの総量を定量し、その差からＤ−アラビニトールの定量を行ってもよい。
【００２１】
本発明の方法は、例えば生体試料として血清を用い、発色系としてＮＡＤＨ／ジアホラーゼ／ＮＴＢを用いた場合には、血清１００μｌに対し、ＡＲＤを０．１〜１０単位、ＭＮＤを０．１〜２０単位、ＮＡＤ+ を０．５〜１０ｍｇ、ジアホラーゼを０．１〜１０単位およびＮＴＢを１０〜５００μｇ使用する。各酵素反応は、２５〜４５℃の温度下に３０秒〜６０分間程度反応させる。
【００２２】
本発明では、血清などの生体試料を直接測定するため、該試料中に含まれる夾雑成分の影響を無効にする目的で、種々の添加剤を生体試料に加えることができる。このような添加剤としては、例えば、乳酸脱水素酵素の阻害剤であるオキサミド酸、アスコルビン酸の影響を無くすためのアスコルビン酸オキシダーゼなどを加えることができる。またこの時、反応液にＴｗｅｅｎ系やＴｒｉｔｏｎ系などの界面活性剤を０．１〜５％程度添加することが望ましい。
【００２３】
本発明のカンジダ感染症の診断方法は、血中のＤ−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇することを利用したものであり、Ｄ−アラビニトール濃度が設定値以上になれば、カンジダに感染したものと判定される。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、生体試料中のＤ−アラビニトールの濃度を、高価な蛍光測定装置を用いることなく汎用品である比色計を用いて測定できるようになった。
【００２５】
また、蛍光測定装置を用いていないため、除蛋白をしなくても測定値が大きく変動することはない。
【００２６】
さらに、上記両効果から、本測定方法は通常血清の自動分析装置により測定されている生化学検査項目中に組み込むことが可能となり、測定の操作性が大幅に改善されることになる。
【００２７】
本発明のカンジダ感染症の診断方法によれば、簡単な装置で容易に且つ高い正確度でカンジダ感染症の診断を行うことができる。
【００２８】
また、本発明のカンジダ感染症診断用キットを用いれば、カンジダ感染症の診断を簡単かつ正確に行うことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例を用いて、より詳細に説明する。
【００３０】
参考例１
本発明で用いるＭＮＤ（１．１．１．６７）は、以下の方法で得られる。
【００３１】
１．酵素の調製
本酵素は、Leuconostoc mesenteroides に由来し、菌株の培養はペプトン、酢酸ナトリウム、グルコースを各１％、酵母エキスを０．２％含み、その他に無機塩類を含む培地で行った。培養液３０リットルを１８０００ｇで遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程にて精製し、６５００単位の精製酵素標品を調製した。本酵素の比活性は２０３単位／ｍｇであった。
【００３２】
２．酵素の諸性質
本酵素は、ｐＨ５〜９で安定であり、反応に適したｐＨは８．６付近である。また、基質特異性はＤ−マンニトールに極めて高いことが知られている。
【００３３】
参考例２
本発明で用いるＡＲＤ（１．１．１．１１）は、以下の方法で得られる。
【００３４】
１．酵素の調製
本酵素は、Aerobacter aerogenesに由来し、菌株の培養はＤ−アラビニトール２％、酵母エキス１％、硫酸アンモニウム０．５％を含み、その他に無機成分を含む培地で行った。培養液１０リットルを１８０００ｇで遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程にて精製し、１６８００単位の精製酵素標品を調製した。本酵素の比活性は８１単位／ｍｇであった。
【００３５】
２．酵素の諸性質
本酵素は、ｐＨ５〜９で安定であり、反応に適したｐＨは９付近である。また、基質特異性はＤ−アラビニトールに対して１００％作用するとしたとき、Ｄ−マンニトールに５０％程度作用し、その他の糖に対してはほとんど作用しない。
【００３６】
【実施例１】
Ｄ−アラビニトールの標準液を、次の方法で定量し、検量線を作成した。
【００３７】
0003653575.tif 000003
これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶かして、全容を４２ｍｌとした。
【００３８】
0003653575.tif 000004
これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶かして、全容を４２ｍｌとした。
【００３９】
試薬３    ０．５Ｍクエン酸溶液
操作方法
Ｄ−アラビニトールを含む標準液１００μｌに試薬１を７００μｌ加え、混和後３７℃で２０分間加熱した後、試薬３を４００μｌ加えて反応を停止する。盲検は、試薬１に代えて試薬２を等量加えて同様にして反応を行った。反応液の吸光度は、５４０ｎｍにて測定し、盲検の吸光度を差し引いた。以上の方法で測定した値より、図１に示す検量線を作成した。
【００４０】
次に、本発明の効果を確認するため、Ｄ−マンニトールを一定量含んだＤ−アラビニトール標準液について同様の測定を行い、図１の検量線より定量値を得た。結果を下記表１に示す。
【００４１】
【表１】
0003653575.tif 000005
【００４２】
【実施例２】
自動分析装置により、Ｄ−アラビニトールの定量を試みた。
【００４３】
0003653575.tif 000006
これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶かして、全容を３２ｍｌとした。
【００４４】
試薬Ｂ    ＡＲＤ                  ２５０単位／ｍｌ
操作方法
自動分析装置「ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ」（日本ロシュ株式会社製）を用いて、Ｄ−アラビニトールの検量線の作成を行った。以下の表２に、測定サイクル（１サイクルは２５秒）及び測定モードを説明する。反応温度は３７℃、測定波長は５５０ｎｍで実施した。
【００４５】
【表２】
0003653575.tif 000007
【００４６】
Ｄ−アラビニトール標準液を用いて測定して得られた検量線を図２に示す。
【００４７】
次に、血中に共存する他の糖成分の影響を調べるため、各成分およびＤ−アラビニトール５０μＭを含む試験液を自動分析装置「ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ  Ｓ」（日本ロシュ株式会社製）にて測定した。図２の検量線から求めた定量結果を下記表３に示す。
【００４８】
【表３】
0003653575.tif 000008
【００４９】
次に、血清試料を用いて、Ｄ−アラビニトールの添加回収試験を実施した結果を、以下の表４に示す。表４中、回収率は、定量したＤ−アラビニトールの値から無添加試料の定量値を差し引き、添加したＤ−アラビニトールに対する比率で示した。
【００５０】
【表４】
0003653575.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄ−アラビニトールの検量線を示す。
【図２】自動分析装置を用いたＤ−アラビニトールの検量線を示す。
【図１】
0003653575.tif 000010
【図２】
0003653575.tif 000011