(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロバクルム・イスランジカム（Pyrobaculum islandicum）から得られるDNAポリメラーゼであって、
3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を示し、
標準アッセイ条件下で100℃で30〜40分の半減期を示し、
dNTPを基質として作用し、
pH 7.3で最大の活性を示し、
分子量がおよそ90kDaである、
ことを特徴とする、前記DNAポリメラーゼ。
【請求項２】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる組換えDNAポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリメラーゼをコードするDNA。
【請求項４】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列によって特定される請求項３記載のDNA。
【請求項５】
請求項１または２記載のポリメラーゼの遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターにより形質転換された宿主。
【請求項７】
請求項１または２記載のDNAポリメラーゼをコードする遺伝子を含むベクターにより形質転換された大腸菌BL21から、組換えDNAポリメラーゼを生産する方法。
【請求項８】
DNA断片のin vitro増幅のための請求項１または２記載のDNAポリメラーゼの使用。
【請求項９】
DNA配列を決定するための請求項１または２記載のDNAポリメラーゼの使用。
【請求項１０】
配列番号１および２のヌクレオチド配列を各々有するプライマーを用いたファミリーB DNAポリメラーゼのクローニング方法。
【請求項１１】
配列番号１および２のヌクレオチド配列を各々有するプライマーを用いたファミリーB DNAポリメラーゼの断片の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はピロバクルム・イスランジカム（Pyrobaculum islandicum）から得られるDNAポリメラーゼに関し、ここで該ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼの配列にはファミリーB DNAポリメラーゼの指標となる6個の保存されたモチーフが含まれており、このポリメラーゼは3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を示す。
【０００２】
古細菌（Archaea）は、真核生物(Eukarya)および真正細菌(Bacteria)ドメインと区別できる第３の生命ドメインを構成する(WoeseおよびFox 1977)。ここ２０年間で多数の古細菌が単離され、その特性が決定されている。超好熱性古細菌（系統樹の最深かつ最短の分岐にある）は、110℃に至る温度でも増殖することができる(Stetter 1996)。従って、これらの生物は熱安定性酵素を研究するのに最適の候補である。真核生物および真正細菌におけるDNA複製に関する知識は非常に進歩しているが(Kornberg および Baker 1992)、超好熱性古細菌のDNA複製に関しては限られた情報しか得られない。100℃近いまたはそれ以上の温度で、いかにゲノムが保持され複製されるかは依然として未解決の問題である。
【０００３】
真核生物、真正細菌、および古細菌由来の50個以上のDNAポリメラーゼ遺伝子がクローン化され、配列決定されている。それらのアミノ酸配列から推論すると、これらの酵素は次の４つのグループに分類される。すなわち、大腸菌DNAポリメラーゼI（ファミリーA）、DNAポリメラーゼII（ファミリーB）、DNAポリメラーゼIII（ファミリーC）、および真核生物DNAポリメラーゼβ（ファミリーX）である(BraithwaiteおよびIto 1993)。これまでに記載された古細菌DNAポリメラーゼの大多数は、ファミリーBに属する。多数のeuryarchaeal DNA ポリメラーゼ遺伝子がクローン化され、配列決定されている。数種のテルモコッカス(Thermococcus)およびピロコッカス（Pyrococcus）株由来の熱安定性酵素の発現に成功し、その特性が決定されて商業的に得fられるようになった(Perlerら1996)。それに比べて、超好熱性crenarchaeota由来のDNAポリメラーゼに関する情報はほとんど得られない。Uemoriら(1995)は、超好熱性crenarchaeonピロディクティウム・オカルタム（Pyrodictium occultum）由来の2種のファミリーB DNAポリメラーゼのクローン化および特性決定を記載した。３個のファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子がスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）において検出された(Prangishviliら1993；Datukishviliら1996；Edgellら1997)という事実にもかかわらず、これらの遺伝子のうち1個のみが発現に成功した(Pisan;ら 1992)。
【０００４】
超好熱菌由来のDNAポリメラーゼは、さまざまな分子生物学的用途（DNAの増幅、配列決定、標識化または逆転写など）において重要な役割を果たす。ポリメラーゼ連鎖反応の開発(PCR; Mullisら 1986; Erlichら. 1988)は、ここ10年間でバイオテクノロジーに対する功績の中でも最も重要なものの一つであった。Taqポリメラーゼと呼ばれる真正細菌サーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus)由来のDNAポリメラーゼIは、PCRに応用された最初の熱安定性DNAポリメラーゼであった。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が存在しないため、該酵素はミスマッチを切り出すことができず、その結果塩基挿入の忠実度が低い(Longleyら1990; KeohavongおよびThilly 1989)。更に、Taqポリメラーゼは100℃ではせいぜい数分の熱安定性しか示さないことが研究によりわかっている。より高い熱安定性および付随した3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するeuryarchaeal DNAポリメラーゼ、例えばピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来のPfu pol(Lundberg ら 1991)またはテルモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来のVent pol (Cariello ら 1991)などはすでに記載されており、商業的にも入手可能である。しかしながら、それらは主に伸長速度が遅いためにTaqポリメラーゼと置き換わることはなかった。従って、熱安定性が高く、塩基挿入の忠実度が高く、しかも伸長速度が充分である新しいDNAポリメラーゼが依然必要とされている。超好熱性crenarchaeotaは、新たな特性を有する熱安定性DNAポリメラーゼの有力な供与源となり得るであろう。更に、組換え酵素の大量生産は非常に有用であろう。
【０００５】
嫌気性超好熱性古細菌ピロバクルム・イスランジカム（crenarchaeotaに属する）は、アイスランドの温泉から単離された(Huberら1987)。過度の実験を伴わずにポリメラーゼを天然株から単離することは、該株の培養が困難であるためできなかった。更に、従来のプライマーを用いてピロバクルム・イスランジカム由来のB DNAポリメラーゼ遺伝子の断片を増幅することは不可能であった。
【０００６】
PCRプライマースクリーニング
ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼの断片を増幅するために、種々のプライマーを用いてプライマースクリーニングを行った。古細菌ファミリーB DNAポリメラーゼは、アミノ酸保存が低いか又は全くない長いストレッチにより、保存性の高い短鎖ドメインが分離されているためアライメントするのが困難である。ポリメラーゼの配列が同定されている古細菌に系統樹上遠く離れた古細菌から新規ファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子をクローン化することは特に困難なようである。
【０００７】
ピロバクルム・イスランジカムは、crenarchaeal目のテルモプロテアレス（Thermoproteales）に属する。研究を開始した時点では、ピロディクティウム（Pyrodictium）およびスルホロブス(Sulfolobus)種由来のcrenarchaealポリメラーゼ遺伝子がほんの少数同定されていたにすぎず、またeuryarchaealピロコッカスおよびテルモコッカス（Thermococcus）種由来のポリメラーゼ遺伝子配列がいくつか同定されていた。
【０００８】
PCRプライマースクリーニング（ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAを鋳型として用いる）は、保存されたテルモコッカスおよびピロコッカス由来のポリメラーゼ配列から導き出されたいくつかのプライマーの組合せを用いて行なった。
【０００９】
0003702182.tif 000002
テルモコッカスポリメラーゼ遺伝子の断片を増幅するために、プライマー対 tcg1/c1190を使用し、成功していた(Niehausら1997)。
【００１０】
しかしながら、テルモコッカスポリメラーゼ遺伝子と対照的に、ファミリーB DNAポリメラーゼと同一性を示すピロバクルム・イスランジカム由来のPCR産物を増幅することはできなかった。
【００１１】
Uemoriら(1995)はまた、ファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子の高保存領域から導き出された縮重プライマーを用いた。
【００１２】
0003702182.tif 000003
これらのプライマーおよび鋳型としてピロバクルム・イスランジカムDNAを用いたPCRも成功しなかった。
【００１３】
従って、新たな縮重プライマーの設計が必要であった。さらに、デオキシイノシットを含むプライマーはいくつかの縮重トリプレットを受け入れることができるため、デオキシイノシット (I)を含む縮重プライマーを用いることは新しい古細菌遺伝子を増幅するのに大変有利であると予測されうる。
【００１４】
ピロディクティウム・オカルタム(Pyrodictium occultum)由来の2個の入手可能なファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子(Uemoriら1995；受託番号 D38574およびD38573)およびスルホロブス・ソルファタリカス(受託番号Y08257)由来の1個のポリメラーゼ遺伝子が、プライマースクリーニングに適したプライマーを合成することを目的として、アライメントのために選択された。縮重トリプレットコードのため、デオキシイノシン(I)を用いて、縮重プライマーを設計する必要があった。該プライマーはファミリーB DNAポリメラーゼの高保存領域から導き出された。
【００１５】
0003702182.tif 000004
各順方向プライマーと各逆方向プライマーの組合せを用いて、多数のプライマースクリーニングを行った。48℃の低いアニーリング温度が用いられた。
【００１６】
順方向プライマーf3および逆方向プライマー r2bを用いたPCRのみがPCR産物の増幅をもたらし、古細菌ファミリーB DNAポリメラーゼと同一性を示した。実施例２に記載の通り、この断片をプローブとして用いて完全なポリメラーゼ遺伝子を同定した。この結果は、新規crenarchaeal DNAポリメラーゼ遺伝子断片の増幅に適切なプライマーの設計が大変困難であることを示した。
【００１７】
本発明の主題は、ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼ遺伝子のクローニング方法および配列決定を含む。本発明は配列番号３を有する遺伝子を含む。また、本発明の主題はピロバクルム・イスランジカム由来のB DNAポリメラーゼを含む。本発明は、配列番号４に示した配列を有するポリメラーゼを含む。更に、ピロバクルム・イスランジカム由来の組換えポリメラーゼの発現、精製および特徴付けを開示する。
【００１８】
ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列決定
古細菌α様DNAポリメラーゼに見られる最も保存されたアミノ酸配列に基づいて、配列番号１および２に示した２つの縮重プライマーを設計した。PCRをピロバクルム・イスランジカム由来の染色体DNAを用いて行なったところ、445bpの増幅産物が得られた。PCR産物の配列を決定すると、該配列は予想通りBLAST アライメントにおいて既知の古細菌ポリメラーゼ領域と相同性を示した。本発明の重要な結果として、既知の古細菌DNAポリメラーゼの配列を用いて新規縮重プライマーを効果的に設計し、超好熱性古細菌由来の新規DNAポリメラーゼ遺伝子を探すことができる。従って、配列番号１および２に示した縮重プライマーを用いたクローニング方法も本発明の主題である。次にPCR産物をプローブとして用いて、全DNAポリメラーゼ遺伝子を得た。サザンブロットハイブリダイゼーションにおいて、SacIで消化した6〜7.5 kbpの大きさのピロバクルム・イスランジカム由来のDNA断片を選択し、コスミドベクター系にクローン化した。784個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする2356bpからなるオープンリーディングフレーム（図１）を、コロニーフィルターハイブリダイゼーションにより同定されたコスミドクローンの挿入部分で検出した。オープンリーディングフレームはバリンをコードするGTGで始まっていた。約25％の古細菌タンパク質は、GTGコドンで開始するらしいことが示されている(Dennis 1997)。例えば、Schleperら(1997; 1998)は、crenarchaeoteセナルケウム・シンビオサム（Cenarchaeum symbiosum）において、ファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子のものを含めて、オープンリーディングフレームがATGではなくGTGで始まるものがあることを記載した。ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼ遺伝子の推定上の転写および翻訳開始領域を調べるために、5’RACE PCRをおこない、増幅されたcDNAを配列決定した。mRNAの配列は、決定された開始コドンの１または2ヌクレオチド上流で開始した（データは示さない）。
【００１９】
DNAポリメラーゼ配列を、公開データベースで利用できるすべての古細菌DNAポリメラーゼの配列とアライメントした。ファミリーB DNAポリメラーゼの指標となる6個の保存されたモチーフ(BraithwaiteおよびIto 1993)は、すべてのDNAポリメラーゼにおいて不変であり機能的に重要であることが示されている残基を含めて、ピロバクルム・イスランジカムの配列中に同定された。3個の3'-5'エキソヌクレアーゼモチーフ(Blanco ら1991)も、該配列中に局在していた。ClustalW ソフトウェアプログラム(Higgins, EMBL, ドイツ国バイデルベルク)を用いて行われたマルチプルアライメントにおいて、このDNAポリメラーゼ配列は, ピロディクティウム・オカルタム（Pyrodictium occultum）由来の2つのファミリーB DNAポリメラーゼの片方(polB；受託番号D38574)、またはアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来のファミリーB DNAポリメラーゼ(受託番号 AE001070)、およびPfuポリメラーゼ(受託番号 D12983)に対して、それぞれ51%、37%、および32%の同一残基を共有し、最も高い同一性を示した。
【００２０】
ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼの発現および精製
配列を決定した後、遺伝子をベクターpASK-IBA 3にクローン化し、ポリメラーゼをC-末端ストレプトアクチン結合オリゴペプチドとの融合タンパク質として発現させた。組換えDNAポリメラーゼを、熱変性ステップとストレプトアクチン上でのアフィニティークロマトグラフィーを組合せてほぼ均質になるまで精製した。大腸菌BL21培養物1000 mlから始めて、組換えDNAポリメラーゼの調製物約1 mgにつき2000 Uの比活性のある組換えDNAポリメラーゼ1 mgを精製した。バッファーWにプロテアーゼ阻害剤を添加せずにポリメラーゼの精製を試みると、SDS-PAGEにより測定される多数の細かい汚染物質を出現させることになった（データは示さない）。各分画におけるDNAポリメラーゼの純度をSDS-PAGEにより調べた（図２）。融合タンパク質は、汚染物質として少量の約70 kDaタンパク質を伴って共精製された。活性ゲルは、ストレプトアクチン調製物中の精製された約90kDaタンパク質がDNAポリメラーゼ活性を有することを示した（図３）。わずかな活性が約70kDaでも検出され、このことは共精製されたタンパク質が組換えポリメラーゼのタンパク質分解産物であることを示した。更に、ピロバクルム・イスランジカム由来の粗抽出物中において、約90kDaのタンパク質バンドに同様のDNAポリメラーゼ活性を検出できた。
【００２１】
本発明のB DNAポリメラーゼの突然変異体およびこれらの突然変異体をコードするDNA配列も本発明の主題である。これらの突然変異体は、このエキソヌクレアーゼ活性の高保存アミノ酸領域(ExoI, ExoIIおよびExoIII)における突然変異によって、例えばプルーフリーディング活性の減少を示す可能性がある。例えばExoI領域はX1DX2EX3モチーフを含み、アミノ酸D（アスパラギン酸）およびE（グルタミン酸）はB型ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に必須であることが知られている。
【００２２】
生化学的特性
精製された組換えDNAポリメラーゼの生化学的特性を調べるために、「材料および方法」に記載の非放射性アッセイをさまざまな反応条件下で行った。
【００２３】
DNAポリメラーゼ活性の最適条件を、鋳型として、活性化された仔ウシ胸腺DNAの存在下75℃で調べた。図４に示すように、このポリメラーゼはpH7.3で最も活性であった。活性の最適温度は、活性化されたDNAが80℃以上では安定でないため検出できなかった。酵素が活性化するためには、きわめて低い濃度の二価カチオンを必要とした。0.5 mM MgCl2の最適濃度を超えると、ポリメラーゼが阻害された（図５）。二価カチオンの非存在下では活性は検出されなかった。図６に示されるように、一価のカリウムイオンはDNAポリメラーゼを強く阻害した。100 mM KClの存在下では、7％の残留活性しか検出されなかった。
【００２４】
DNAポリメラーゼの熱安定性を測定するために、標準アッセイ条件下、50 mMトリス-HCl (pH 7.2)中において90℃および100℃で酵素をプレインキュベートし、続いて75℃でインキュベートした。100℃では30〜40分の半減期、90℃では10時間を超える半減期が検出された（図７）。
【００２５】
代表的な阻害剤がDNAポリメラーゼ活性に及ぼす影響を検討した（表１）。スルフヒドリルのブロッキング剤であるN-エチルマレイミド(NEM)は、DNAポリメラーゼ活性を強く阻害した。1 mM NEMの存在下では、40％の残留活性が検出された。活性の完全な消失は、5 mM NEMとのプレインキュベーションの後で検出された。酵素の四環ジテルペノイドアフィジコリン（DNAポリメラーゼとの結合について各dNTPと競合する）への感受性についても検討した。DNAポリメラーゼは、ピロディクティウム・オカルタム(Pyrodictium occultum) 由来のpolBおよびPfuポリメラーゼを阻害するのに相当する量のアフィジコリンにより阻害された(Uemoriら 1995)。500および2000μMアフィジコリンの存在下で、ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼに関して55％および21％の残留活性を検出した。検出されたddGTPに対するポリメラーゼの感受性は大変低かった。ddGTP/dGTP比が２の場合、およびddGTP/dGTP比が10の場合、阻害は測定されず、約80％の残留活性が検出された。
【００２６】
ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼにおいて、付随したエキソヌクレアーゼ活性を測定するため、まずdNTPの非存在下でBamHI消化pUC 19 DNAを精製酵素と共にインキュベートした。75℃で2時間後著しい分解をアガロースゲル上で検出した（データは示さない）。37℃では分解は測定されず、大腸菌BL21細胞由来のエキソヌクレアーゼの汚染物質が、熱処理およびストレプトアクチンセファロース上で精製した後の酵素調製物中に存在しないことを示した。
【００２７】
エキソヌクレアーゼ活性は、超音波処理した仔ウシ胸腺DNAの鋳型からの3H標識ヌクレオチドの放出に基づいて、標準的アッセイで定量化した。1.5Uの精製ポリメラーゼと共に鋳型を65℃でインキュベートした後のヌクレオチドの放出は、他の古細菌プルーフリーディングDNAポリメラーゼによりもたらされる放出に匹敵した。4時間インキュベートした後、104 cpm/10分が測定された。それに対して、15U（10倍高い濃度）のTaqポリメラーゼは150〜250 cpm/10分をもたらし、またPfuポリメラーゼ等のプルーフリーディングポリメラーゼの同量の場合は1000〜3000 cpm/分をもたらした。37℃でのインキュベーションの後、ヌクレオチドの放出は検出されず、大腸菌エキソヌクレアーゼ活性がこの実験を妨害しないことを示した。ピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼの検出されたエキソヌクレアーゼ活性は、推定上のDNAポリメラーゼの配列内で同定された3個の3’-5’エキソヌクレアーゼドメインに対応しており(Blancoら1991)、測定されたのが5’-3’エキソヌクレアーゼ活性ではなく、この種のエキソヌクレアーゼ活性であったことを示している。
【００２８】
上記エキソヌクレアーゼ活性のアッセイに加えて、下記の通り3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を一本鎖において試験した。一本鎖および二本鎖DNA上で3’-5’エキソヌクレアーゼ活性が検出され得るか否かを調べるために、5’-DIG標識プライマーおよびプライマー／鋳型複合体を用いた。3’-5’エキソヌクレアーゼ活性は、DNAポリメラーゼと共に70℃で1時間インキュベートした後、プライマーの分解により示された。図８に示すように、ピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼに付随した3’-5’エキソヌクレアーゼ活性の速度は、反応バッファーのpHに大きく依存している。最適なポリメラーゼバッファー(pH 7.3)を用いると、ピロバクルム・イスランジカム由来の酵素によるプライマーの分解は、Pwoポリメラーゼを用いた場合より著しく低いが、バッファー２（pH 8.6）でのエキソヌクレアーゼ活性の値はPwoポリメラーゼの活性に相当した。一本鎖プライマーおよび二本鎖プライマー／鋳型のどちらにおいても、ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼはdNTPの非存在下で3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を示した。0.01および0.1μMのdNTPの存在下でさえ、Taqポリメラーゼは一本鎖、二本鎖DNA基質のどちらにおいてもプライマーの分解を示さなかった（図８）。3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼについて予想されるように、ピロバクルム・イスランジカムおよびピロコッカス・ウーゼイ由来のDNAポリメラーゼによるプライマー／鋳型基質の分解は、dNTPの量が増えると（1μM）減少した。37℃でアッセイした場合、ピロバクルム・イスランジカムから得たDNAポリメラーゼによるプライマーの分解および伸長は検出されなかった（データは示さない）。この結果は、酵素調製物に実験を妨害しうる大腸菌由来の汚染性エキソヌクレアーゼ活性が含まれなかったことを明らかに示している。
【００２９】
応用
本発明において、DNAポリメラーゼ遺伝子のクローニング法、およびピロバクルム・イスランジカム由来の新規熱安定性DNAポリメラーゼの生化学的特性をいくつか提供する。熱安定性DNAポリメラーゼの主用途は、in vitroにおけるDNA断片の増幅およびDNAの配列決定である。TaqDNAポリメラーゼは、依然多くの場合において用いられているが、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性がないためその忠実度は大変低い(KeohavongおよびThilly 1989;Longleyら1990)。更に、Taqポリメラーゼは100℃では熱安定性がせいぜい数分である。
【００３０】
本発明において提示されるDNAポリメラーゼは、90℃および100℃での高い熱安定性を有する。非イオン性界面活性剤またはウシ血清アルブミン(BSA)のような安定剤が存在することでも熱安定性の増加がもたらされるか否か調べる必要がある。非イオン系界面活性剤オクトキシノール（一般にTRITON X-100として知られる）およびBSAがピロコッカス・フリオサスおよびテルモコッカス リトラリス由来のDNAポリメラーゼの熱安定性に及ぼすプラスの影響については記載されている(EP出願番号92118965および91303787.5)。ピロバクルム・イスランジカム由来の熱安定性DNAポリメラーゼは、二本鎖DNAの変性（PCR法において重要なステップである）をもたらすのに必要な時間間隔で高温度にさらされても不可逆的に不活性化されない。その結果として該酵素は以前に特徴付けられた熱安定性酵素以上の更なる利点を提供し得る。100℃に至る高温度が、例えばDNA鋳型のGC含量が増加する時などに要求されるかもしれない。標的配列には、95℃を超える変性温度が必要である。このため、グリセロールまたはDMSOのような溶媒をPCRに含め、部分的に二本鎖DNAを脱安定化する(Wongら1991; Korgeら1992)。これらの薬剤は、二本鎖DNAを脱安定化するのに加えて、プライマーの安定性に影響を及ぼし、ポリメラーゼの活性を阻害してその熱安定性を減少させうる。これに対し、ピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼの場合は変性温度を95℃または100℃に上げるだけで（その他の点では標準的なPCRで）PCR産物の完全な鎖分離が容易にでき、DNA二本鎖の脱安定化剤が不要になる。
【００３１】
また、更に高い熱安定性を有し、かつ3’-5’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を持った精製DNAポリメラーゼを取得および生産することが依然必要とされている。3’-5’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼは、非プルーフリーディングDNAポリメラーゼと比べた場合、塩基取込みの誤差率が実質的に低い。
【００３２】
ピロバクルム・イスランジカムDNA ポリメラーゼを用いてPCRをおこなった。熱安定性DNAポリメラーゼを、特にPCRによるDNA断片のin vitro増幅およびDNA配列決定に用いた。付随する3’-5’エキソヌクレアーゼ活性により、古細菌DNAポリメラーゼはDNA断片を高い忠実度（低い突然変異頻度）で増幅する可能性を与える。今日まで、PCRに用いられたすべての古細菌DNAポリメラーゼは、Euryarchaeotaに由来するものである。PCRにおいてcrenarchaeal DNAポリメラーゼの適用に成功したという報告は得られていない。
【００３３】
ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼがDNA増幅に適していることを証明するため、1 Uの酵素およびいくつかのプライマーの組合せを用いてPCRをおこなった。図９に示すように、1500bpまでのλDNA鋳型を増幅できた。これは、PCRにcrenarchaeal DNAポリメラーゼを用いうることについての最初の報告である。
【００３４】
上記の通り、配列番号１および２に示した縮重プライマーを用いたB DNAポリメラーゼのクローニング方法も本発明の主題である。更に、配列番号１および２によるプライマーを用いたB DNAポリメラーゼの断片の増幅法も本発明の主題である。本発明はまた、配列番号１および２を有するプライマーの以下の変異形を用いた場合の上記方法を含むものである。
【００３５】
−トリプレットが追加または除外されたプライマー（特に1〜3個のトリプレットが除外され、1〜5個のトリプレットが追加された場合）
−配列番号１または２に示される、１個以上のイノシンが天然に存在する塩基で再置換されたプライマー
−1個以上の天然の塩基が、配列番号１または２に従った置換に加えて、イノシンにより置換されたプライマー（好ましくは天然の塩基がトリプレットの３番目の位置にあるイノシンにより置換されたプライマー）。
【００３６】
【表１】
阻害剤がピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼに及ぼす影響
さまざまな阻害剤の影響を、標準的アッセイ条件(pH7.5；0.5 mM MgCl2；0 mM KCl；75℃)で0.5 Uの精製DNAポリメラーゼを用いて検出した。酵素とN-エチルマレイミドとのプレインキュベーションを90℃で20分間おこなった。
0003702182.tif 000005
【００３７】
実施例１
菌株、酵素、ベクターおよび化学物質
ピロバクルム・イスランジカムDSMZ4184 (Huberら1987)をDeutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen社(DSMZ;ドイツ国ブラウンシュヴァイク)から入手した。大腸菌 DH5α細胞のマグネシウム培養物はエクスパンドクローニングキット(Expand Cloning Kit) (Boehringer Mannheim社)に含まれていた。大腸菌BL21細胞は、Novagen社(アメリカ合衆国マディソン)から入手した。
【００３８】
DNA操作用の酵素およびキットはBoehringer Mannheim社から入手するか、または記載されていれば他社から入手した。DNAの精製およびゲル抽出用のキットはQIAGEN社（ドイツ国ヒルデン）の製品であった。プラスミドおよびコスミドDNA調製用のキットはBioRad社（ドイツ国ミュンヘン）から入手した。
【００３９】
発現ベクターpASK-IBA3、誘導物質アンヒドロテトラサイクリン、およびストレプトアクチンセファロースカラムはIBA社（ドイツ国ゲッティンゲン）から取得した。
【００４０】
DNAポリメラーゼを特徴付けるための材料は、Boehringer Mannheim社から購入した。N-エチルマレイミドはServa社から入手した。培地およびバッファーを調製するためのその他の化学物質は、Difco社(デトロイド、ウィスコンシン州)、Serva社（ドイツ国ハイデルベルク）、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）、およびMerck社（ドイツ国ダームスタット）から入手した。
【００４１】
DNAの単離
ピロバクルム・イスランジカムを、1.5 Lの培地390中でDMSZが推奨するとおりに98℃で嫌気的に増殖させた。細胞を回収し、TEバッファー(10 mM トリス-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)で洗浄し、10 mM トリス-HCl pH 8.0を含む20%スクロース3 mL中に懸濁した。トリトンX-100を添加して0.3%の最終濃度とした。20℃で１時間インキュベートした後、SETバッファー (150 mM NaCl 20 mM トリス-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 3 ml、10%ドデシル硫酸ナトリウム0.32 mlおよびプロテイナーゼK(10 mg/ml)0.16 mlを添加した。混合物を37℃で1時間インキュベートした。続いてフェノール-クロロホルム抽出の後、DNAをエタノール沈殿により回収した (Maniatis ら1982)。
【００４２】
実施例２
PCRおよびプローブの調製
一回目のPCRをおこなうため、２個の縮重プライマーをα様DNAポリメラーゼの保存領域IおよびIIに基づいて設計した(Wangら1989)。
【００４３】
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4種のヌクレオチドすべてに対して相補的な、デオキシ-イノシン(I)を用いた。プライマーをARK Scientific, GmbH Biosystems社（ドイツ国ダームスタット）に注文して合成した。ピロバクルム・イスランジカムDNA約１ナノグラムおよび各プライマー100 pmolを、デオキシリボヌクレオシド三リン酸200μM、ExpandTMHigh Fidelityバッファー系、ExpandTMHigh Fidelity酵素（Boehringer Mannheim社）2Uを含むPCR反応混合物に添加した。最初の変性ステップ（94℃で2分間）の後、DNAサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 2400; Perkin-Elmer,Weiterstadt)を用いて、94℃で10秒、46℃で30秒および68℃で90秒の温度プロフィールで30サイクルおこなった。最終サイクルに続いて、サンプルを更に68℃で7分間インキュベートして、伸長ステップを確実に完結させた。PCR産物を精製して配列決定した。同じ条件下、その他のPCR反応を様々なアニーリング温度および伸長時間でおこなった。上記鋳型およびプライマー、ならびに200μM dATP、dGTPおよびdCTPを含むがdTTPを190μM、DIG-11-dUTP(ジゴキシゲニン標識dUTP、耐アルカリ性；Boehringer Mannheim社)を10μM含む同じPCR反応混合物を用いて、非放射性プローブを調製した。
【００４４】
ゲノムのサザンブロットハイブリダイゼーション
ピロバクルム・イスランジカムDNAをいくつかの制限酵素を用いて一晩消化し、0.7%アガロースゲル上で分離させた。制限されたDNAは正電荷を帯びたナイロンメンブランに移行させた。上記のDIG標識プローブを用いて68℃でハイブリダイゼーションを行ない、３ステップ法（メンブランブロッキング、抗DIG抗体のFabフラグメントとのインキュベーション、ならびに抗体結合アルカリ性ホスファターゼと化学発光基質CDP-StarTM(Boehringer Mannheim社)の反応）をおこない、ハイブリダイズしたプローブの部位を検出した。
【００４５】
コスミドクローニング
サザンブロットに続いて、制限酵素SacIを選択してピロバクルム・イスランジカムDNAの調製的消化をおこなった。大きさが6〜7.5kbpの制限DNA断片をアガロースゲルから抽出し、エクスパンドTMクローニングキット（Boehringer Mannheim社）を用いてクローン化した。断片を平滑末端にしてコスミドベクターにライゲートし、この構築物をバクテリオファージに挿入した。続いて大腸菌DH5αマグネシウム培養物に感染させ、陽性クローンをベクター媒介アンピシリン耐性により選択した。DNAポリメラーゼ遺伝子を含むコスミドクローンは、コロニーフィルターハイブリダイゼーション(フィルターハイブリダイゼーションのためのDIG System User’s Guide)により上記のプローブを用いて同定した。陽性クローン由来のコスミドDNAを調製し配列決定した。
【００４６】
DNA配列決定
精製PCR産物およびコスミドDNA調製物をSeqLab社(ドイツ国ゲッティンゲン)に注文して配列決定した。ヌクレオチド配列はジデオキシ・チェーン・ターミネーション法(Sangerら1977)により決定された。すべてのDNAサンプルをABI PRISMTM BigDyeターミネーターを用いて配列決定し、配列解析ソフトウェアを用いた自動シーケンサー（Applied Biosystems社）により解析した。
【００４７】
実施例３
RNAの単離および転写開始の決定
検出されたDNAポリメラーゼ遺伝子の推定上の転写開始領域を調べるため、新たに培養したピロバクルム・イスランジカム細胞から得られるRNAを、DiRuggieroおよびRobb(1995)により記載されたプロトコルに従って調製し、5’RACE PCRを5’/3’ RACEキット（Boehringer Mannheim社）を用いておこなった。第一鎖cDNA合成、cDNAの増幅および対照PCRに、遺伝子配列から導かれた逆方向のプライマーを用いた。増幅されたcDNAをゲル抽出し、直接配列決定をおこなった。
【００４８】
実施例４
ピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼの発現および精製
DNAポリメラーゼ遺伝子を、ベクターpASK-IBA 3 (IBA社、ゲッティンゲン)を用いて大腸菌において発現させた。このベクターの発現カセットは、化学的に誘導可能なテトラサイクリンプロモーターによって転写的に制御されている(Skerra 1994)。組換えタンパク質を都合良く精製するため、このベクターはStrepタグという９個のアミノ酸からなるC末端のコード配列を含む。該Strepタグにより、セファロース結合ストレプトアビジンまたはストレプトアクチンによるアフィニティークロマトグラフィーの工程で、生じた融合タンパク質を精製することができる(SchmidtおよびSkerra 1994; VossおよびSkerra 1997)。２つのプライマー
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を用いて、染色体ピロバクルム・イスランジカムDNAからポリメラーゼ遺伝子を増幅した。順方向のプライマーは、BsaIの制限部位が生成されかつバリンをコードする開始コドンが除去されるように設計した。組換え融合タンパク質は、ベクターによりコードされたメチオニンから開始された。逆方向のプライマーは、BsaIの制限部位が生成されかつポリメラーゼ遺伝子の終止コドンが除去されるように設計した。PCR産物をゲル抽出により精製し、BsaIで切断し、再びゲル抽出し、BsaI制限pASK-IBA 3ベクターにライゲートした。ポリメラーゼ遺伝子を、大腸菌BL21において発現させた。形質転換細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地1000 mlにおいて37℃で培養した。600 nmでの光学濃度0.5で、100μlのアンヒドロテトラサイクリン(ジメチルホルムアミド中2 mg/ml；最終濃度200μg/l)を添加して細胞を誘導し、培養物を更に15時間インキュベートした。冷却した後、細胞を4℃で遠心分離して回収し、バッファーW（50 mMトリス-HCI pH 8.0, 1 mM EDTA およびthe Complete mini, EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Boehringer Mannheim社））で洗浄し、再び5 mlのバッファーW中に懸濁した。細胞を超音波処理で破砕し、遠心分離した後で粗抽出物を80℃で20分間熱処理し、再び遠心分離した。サンプルを5 mlのバッファーWで平衡化したストレプトアクチンの既製セファロースカラム(1 ml)にアプライした。カラムを5 mlのバッファーWで２回洗浄した後、結合タンパク質を、2.5 mMのデスチオビオチン (Sigma社)を含む10 mlのバッファーWを段階的に適用することによって溶出した。活性画分をプールし、500倍容の50 mMトリス-HC1（pH 7.2）および10%グリセロールに対して透析した。
【００４９】
実施例５
ポリメラーゼ活性アッセイ
非放射性比色定量エンザイムイムノアッセイ（DNAポリメラーゼアッセイ、非放射性；Boehringer Mannheim社）は、標準DNAポリメラーゼアッセイに用いられる放射標識されたヌクレオチドの代わりに、ジコキシゲニンおよびビオチンで標識されたdUTPを同じDNAに取り込ませておこなった。Suzukiら(1993) が証明したように、化学発光エンザイムイムノアッセイ（本明細書に記載した試験と同じ原理に従う）は、標準的な放射性同位体アッセイと類似した結果を示した。合成されたDNAの検出および定量は、製造業者が推奨するとおりにサンドイッチELISAプロトコルに従った。特に明記しない限りは、標準的反応混合物には100μl中に、50 mMのトリス-HCl (pH 7.2)、0.5 mMのMgCl2、60μgのBSA、0.36 μMのDIG-11-dUTP、18 nMのビオチン-11-dUTP、18 μMの各dNTP、0.27 μgのDNアーゼIに活性化仔ウシ胸腺DNA（鋳型として）、およびDNAポリメラーゼサンプルが含まれていた。反応混合物を75℃で1時間インキュベートした。Taq DNAポリメラーゼを標準として使用した（反応混合物中には50 mMのトリス-HCl (pH 7.9)、5 mMのMgCl2および50 mMのKClを含む）。１ユニットは10 nmolのdNTPを30分間75℃で酸不溶性の形態に取り込むのに必要とされる酵素の量として定義した。ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAの熱安定性を調べるために、プレインキュベーションをBSA、標識／非標識dNTP、および鋳型DNAを含まない反応混合物中でおこない、続いて不足している成分を添加して75℃で1時間の標準的インキュベーションをおこなった。DNAポリメラーゼの生化学的特性を決定するため、すべての反応混合物に0.5 Uの酵素を加えた。
【００５０】
実施例６
DNAポリメラーゼ活性ゲル
DNAポリメラーゼ活性の検出を、SDSポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)上でSpanosおよびHubscher(1983)に記載された方法の変法(Niehausら 1997)に従っておこなった。各DNAポリメラーゼの1〜5ユニットのサンプル濃度をSDS-PAGE(10%)上で電気泳動にかけた。サンプルの調製およびゲル電気泳動をLaemmli (1970)に記載された通りにおこなった。泳動ゲルは、ポリメラーゼの鋳型として150μg/mlのDNアーゼI活性化仔ウシ胸腺DNAを更に含んでいた。サーマス・アクアティクス (Taqポリメラーゼ)およびピロコッカス・ウーゼイ(Pyrococcus woesei)(Pwoポリメラーゼ)由来のDNAポリメラーゼをBoehringer Mannheim社から購入した。ゲルを50 mMのトリス-HCl pH 7.2、3 mMの β-メルカプトエタノール、1mMのEDTA, 5% グリセロール中に４回浸してSDSで除去した。タンパク質の再生は、サンプルバッファーに添加された1 mM MgCl2および1μM dATPを用いて４℃で一晩おこなった。その後、ゲルを50 mMのトリス-HCI pH 7.2、3 mMのβ-メルカプトエタノール、1 mMのDTT、1 mMのMgCl2、5% グリセロール、8μMのdGTP、dATPおよびdCTP、4μMのdTTPおよび5μM DIG-11-dUTPを含む活性バッファー中でインキュベートし、４時間70℃でインキュベートした。DNAをナイロンメンブランに移行させ、取り込まれたDIG-11-dUTPを前述の通り免疫学的に検出した。
【００５１】
実施例７
エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ
エキソヌクレアーゼ活性を分析するために、1.5 Uの精製ポリメラーゼを1μgの３H標識されたDNA鋳型（超音波処理で消化したもの）と共にインキュベートした。放出された３H標識ヌクレオチドは、4時間のインキュベーションの後、シンチライザー上でcpm/10分として検出した。インキュベーションを65℃および37℃で、この実験に通常用いられるバッファー(10mMのトリス-HCl、1mMのDTT、50 mMのNaCl、10 mMのMgCl2)中で実施した。
【００５２】
実施例８
一本鎖に対する3'-5’-エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ
一本鎖に対する3'-5'エキソヌクレアーゼ活性の場合は、合成プライマー(22 mer)（免疫学的に検出するためにジゴキシゲニンを用いて5’標識されたもの）の分解を分析した。二本鎖に対する3’-5’エキソヌクレアーゼ活性は鋳型(34 mer)にハイブリダイズさせた同じプライマーを用いて測定した。 プライマーおよび鋳型の配列は図８に示す。アッセイの原理は以前に記載された(Niehaus, 1997 #77)。標識された基質0.5 pmolおよび精製DNAポリメラーゼ0.1 Uを、dNTPを含まない又は１μMまで次第に増加する量のdNTPを含むさまざまなバッファー10μl中70℃で１時間インキュベートした。大腸菌由来の汚染性エキソヌクレアーゼ活性が測定されていないことを確認するため、アッセイを更に37℃でおこなった。50 mMのトリス-HCl pH 7.3および0.5 mMのMgCl2を含む最適DNAポリメラーゼバッファーのみならず、50 mMのトリス-HCl pH 8.6および0.5 mMのMgCl2を含むバッファーも用いた。ホルムアミドバッファーを用いて反応を氷上で停止させ、サンプルをTBEバッファー中の8 M尿素を含む12％ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で電気泳動した。分解産物または重合産物を免疫学的検出により可視化した。10 mMのトリス-HCl pH 8.9、25 mMのKCl、2 mMのMgSO4および5 mMの(NH4)2SO4を含むバッファー中のPwoポリメラーゼならびに前記活性バッファー中のTaqポリメラーゼを対照として用いた。
【００５３】
実施例９
ピロバクルム・イスランジカムを用いたPCR反応
ピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼによるPCR反応を、以下のバッファー中で、1 Uの酵素を用いておこなった。すなわち、15 mMのトリス-HCl pH 8.6、12.5 mMのKCl、2.5 mMの(NH4)2SO4、1.25 mMのMgCl2、20μg/mlのBSAを含むバッファーである。λDNA 10 ngを鋳型として用いた。順方向プライマー 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3' を以下の逆方向プライマーと組み合わせた。
【００５４】
5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCG-3 （500 bp増幅用）
5'-GTTAACTTTGATTCTGGCCTGCG-3 （1000 bp増幅用）および
5'-GTGAGATAAACGGCAACTGCCGG-3 （1500 bp増幅用）
PCRサイクルを前記の通り94℃で10秒、56℃で30秒、75℃で1.5分の温度プロフィールでおこなった。PCR条件下でExpand High Fidelity酵素を対照として製造会社に推奨される通りに用いた。
【００５５】
参考文献
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0003702182.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】  ピロバクルム・イスランジカム由来のファミリーB DNAポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列。ヌクレオチドは5’部位から番号付けした。翻訳開始部位はヌクレオチド番号131で、終止部位はヌクレオチド番号2486である。
【図２】  ピロバクルム・イスランジカム由来の組換えDNAポリメラーゼの精製中における酵素画分のSDS PAGE (10%)。
レーン１  粗抽出物
レーン２  熱処理(80℃で20分)後の粗抽出物
レーン３  分子量マーカー（広範囲；BioRad社）
レーン４  ストレプトアクチン上でのクロマトグラフィー後の酵素調製物。分子量を示す。
【図３】  DNAポリメラーゼ活性ゲル
レーン１  Taqポリメラーゼ(5U)
レーン２  ストレプトアクチン上でのクロマトグラフィー後のピロバクルム・イスランジカムDNAポリメラーゼ酵素調製物(2 U)
レーン３  ピロバクルム・イスランジカム由来の粗抽出物
レーン４  Pwoポリメラーゼ(2.5 U).
【図４】  DNAポリメラーゼ活性の最適pH
0.5 mM MgCl2を用いて75℃で標準的なアッセイにより最適pHを検出した。
【図５】  DNAポリメラーゼ活性に関するKCl、(NH4)2SO4およびMgCl2の最適濃度
MgCl2の最適濃度を75℃、pH 7.3で標準的アッセイにより測定した。標準的アッセイはさまざまな濃度のKCl, (NH4)2SO4およびMgCl2の存在下で0.2 Uの精製DNAポリメラーゼを用いておこなった。
【図６】  KClがDNAポリメラーゼ活性に及ぼす影響
一価カリウムイオンの影響を75℃、pH 7.3で0.5 mM MgCI2を用いて標準的アッセイにより検出した。
【図７】  組換えDNAポリメラーゼの熱安定性
DNAポリメラーゼの熱安定性を調べるために、酵素をBSA、ヌクレオチドおよび鋳型DNAを添加せずに90℃および100℃でプレインキュベートし、続いて不足しているすべての化合物を添加し、75℃、pH7.3で0.5 mM MgCI2を用いて標準的インキュベーションをおこなった。
【図８】  ピロバクルム・イスランジカム (P. isl. pol)、サーマス・アクアティクス (Taq pol)およびピロコッカス・ウーゼイ (Pwo pol)由来の DNAポリメラーゼの、一本鎖および二本鎖依存性3’-5' エキソヌクレアーゼ活性。アッセイを「材料および方法」に記載の通り各ポリメラーゼ0.1 Uを用いて70℃で1時間おこなった。ジゴキシゲニン標識プライマーを一本鎖の基質(ss)として、およびプライマー／鋳型複合体を二本鎖の基質(ds)として用いた。各反応におけるdNTPの濃度（μM）を示す。反応産物を8M尿素を含む12％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、免疫学的検出により視覚化した。非分解プライマーおよび反応産物の大きさ（ヌクレオチド、nt）を示す。レーンP：dNTPを含まないバッファー中のジゴキシゲニン標識プライマー；バッファー１：40 mMのトリス-HCl pH 7.3、0.5 mMのMgCl2；バッファー２：50 mMのトリス-HCI pH 8.6、0.5 mMのMgCl2。TaqおよびPwoポリメラーゼを「材料および方法」に記載のバッファーを用いて試験した。プライマーおよび鋳型の配列を右に図示した。
【図９】  ピロバクルム・イスランジカム由来のDNAポリメラーゼのPCRでの使用。15 mM トリス-HCl pH 8.6、12.5 mM KC1、2.5 mM (NH4)2SO4、1.25 mM MgCl2および20μg/ml BSAを含むバッファー中で反応させた。ピロバクルム・イスランジカム由来の1 U のDNAポリメラーゼを用いてλDNA鋳型の500 bp (レーン1)、1000 bp (レーン 2)および1500 bp (レーン 3)を増幅した。対照のPCRを2.5 UのHigh Fidelity酵素を用いておこなった（レーン４）。各PCR産物20μlを1%アガロースゲルにアプライした。対応するマーカー分子量（レーン５）をキロ塩基対(kb)で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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