(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中において、配列番号１を含むヒトパーキン遺伝子におけるヘテロ接合性遺伝子変異を同定する方法であって、前記遺伝子変異が、
ａ）次の単一エキソン又はエキソンの組合せのいずれか１個の欠失：
エキソン２−３；
エキソン２；
エキソン２−４；
エキソン３−６；
エキソン６；
エキソン６−７；
エキソン８；
エキソン７−９；もしくは
エキソン３−９；
ｂ）エキソン３、６、７又は１１のいずれか１個の重複、
ｃ）次のアミノ酸変化のいずれか１個を生じる点突然変異：
Ｇｌｎ３４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ１６１Ａｓｎ；
Ｌｙｓ２１１Ａｓｎ；
Ａｒｇ２５６Ｃｙｓ；及び
Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ、
（ここにおいて、前記アミノ酸は、配列番号１によりコードされる）、
ｄ）エキソン２の三重重複、あるいは
ｅ）前記ａ）乃至ｄ）の組合せ
を含んでなる同定方法。
【請求項２】
前記パーキン遺伝子中の遺伝子変異の検出が、前記試料中の核酸を単離することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パーキン遺伝子中の遺伝子変異の検出が、前記試料中の核酸を増幅することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程が、
遺伝子変異の５’に位置するパーキン遺伝子の領域に相補的な第１のプライマー；及び
遺伝子変異の３’に位置するパーキン遺伝子の領域に相補的な第２のプライマー
を含んでなるプライマー対の手段にて行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、血液、組織、血漿及び細胞培養物からなる群から選択される生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、前記増幅工程においてパーキン遺伝子又はその一部が利用し易くなるように前処理され、該前処理は細胞の溶解、酵素処理又は変性から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
検出工程が、配列決定、ＰＣＲ／制限、ＡＳＯ、ＰＡＧＥ又は多重ＰＣＲにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、エキソンの欠失、エキソンの重複、エキソンの三重重複、又はそれらの組合せを明示する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１個以上の遺伝子変異が、常染色体劣性パーキンソン症候群に伴われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
試験試料又は生物学的試料が、ヒト対象から得られるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト対象が、常染色体劣性パーキンソン症候群を有するヒトである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は遺伝分野、特にパーキン遺伝子の突然変異の同定に関する。本発明はパーキンの突然変異形態、切断形態又はエキソン重複を含む形態のこれらの突然変異を試料中で同定するための組成物と方法、及び例えば診断、スクリーニング又は治療目的のその使用に関する。
【０００２】  パーキンソン病は頻度の高い神経変性病であり、６５歳以上では２％近い罹病率である［ｄｅ  Ｒｉｊｋら，１９９７］。疾病の主徴候は硬直、運動緩慢、静止振戦及び少なくとも初期の良好なレボドーパ反応性である。障害は黒質のドーパーミン作動性ニューロンの実質損失に起因する。疾病の原因は分かっていないが、遺伝的感受性因子の関与が強く疑われている［Ｗｏｏｄ，１９９７］。優性伝達を示す多数の家族型が報告されている。早期発病と急速悪化を示す少数の家族では、４ｑ２１−ｑ２３に位置するα−シヌクレインをコードする遺伝子の突然変異が報告されている［Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら，１９９７；Ｋｒｕｇｅｒら，１９９８］。第２の遺伝子座は２ｐ１３に位置する［Ｇａｓｓｅｒら，１９９８］。日本では常染色体劣性伝達パーキンソン病（ＡＲ−ＪＰ）が報告されている［Ｙａｍａｍｕｒａら，１９７３；ＩｓｈｉｋａｗａとＴｓｕｊｉ，１９９６］。この疾病はパーキンソン病の主徴候を発現し、ｉ）一般に４０歳前の早期発病、ｉｉ）下肢に多いジストニーの存在、ｉｉｉ）日中変動、及びｉｖ）進行の程度は緩慢であるが、常にレボドーパ下の運動障害を伴う病気の進行等の特徴がある。神経病理試験によると、特発性パーキンソン病の組織病理特徴としてレーヴィ体をもたない黒質緻密部のニューロンの実質損失が明らかである［Ｙａｍａｍｕｒａら，１９７３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９４］。日本人家族における疾病と６ｑ２５．２−２７マーカーの遺伝関係が立証され、ＰＡＲＫ２遺伝子座が明示されている［Ｍａｔｓｕｍｉｎｅら，１９９７］。その後、２チームが日本人以外、特に米国、ヨーロッパ及び中東のＰＡＲＫ２家族について記載している［Ｊｏｎｅｓら，１９９８；Ｔａｓｓｉｎら，１９９８］。非常に最近では、Ｋｉｔａｄａら［Ｋａｔａｄａら，１９９８］が日本人４家族でパーキンと呼ばれる新規遺伝子のエキソン（３−７）又はエキソン４の欠失を発見している。
【０００３】  本願は早発パーキンソン病をもつ主にヨーロッパ人の７７家族と１０２個別症例におけるパーキン遺伝子の新規遺伝子変異の存在の立証と特性決定に関する。更に、本願はこれらの遺伝子変異が早期発病パーキンソン病だけでなく、後期又は異型パーキンソン病にも存在することを示す。従って、これらの新規変異は同時にパーキンソン病の診断と治療の新規ツールを提供する。
【０００４】  本発明は特に、
ａ）組み合わせるか又は組み合わせない１個以上のエキソンの欠失、
ｂ）エキソンの重複（例えば二重、三重）、
ｃ）点突然変異、
ｄ）読み枠シフトを誘導する１隣接塩基対以上の欠失、及び
ｅ）１隣接塩基対以上の挿入から選択される１個以上の遺伝子変異を含むことを特徴とするヒトパーキンをコードする核酸に関する。
【０００５】  本願で定義する核酸なる用語はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。更に、ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が挙げられる。本発明の核酸は天然又は合成のいずれの起源でもよい。一般には、バンクスクリーニング、人工合成、連結、制限等の慣用分子生物学技術により作製される。本明細書に記載する位置は図１に示すヒトパーキン配列（配列番号１）に基づいて計算している。この配列はヒトパーキンをコードするｃＤＮＡの配列を表す。この配列はＫｉｔａｄａらにより記載されている配列に対してヌクレオチド７６８のレベルに変異（Ｃ→Ｔ）を含む。
【０００６】  上記遺伝子変異ａ）〜ｅ）は主にエキソン変異であり、即ちヒトパーキン遺伝子のコーディング領域の変異である。しかし、イントロン変異、即ち遺伝子の非コーディング部分の変異も検出された。
【０００７】  ヒトパーキン遺伝子は下記ヌクレオチド位置をもつ１２個のエキソンを含む。
【０００８】
【表１】
0005424519.tif 000002
【０００９】  第１の実施態様では、本発明は１個以上のエキソンの欠失、特にエキソン欠失の組み合わせを含むパーキンをコードする核酸に関する。より特定的には、これらの欠失は別々又は組み合わせたエキソン２〜９の欠失である。パーキン遺伝子のエキソンのこれらの欠失及び欠失組み合わせの具体例を表２及び４に示す。更に、これらの欠失はホモ接合即ち２個の染色体に同時に存在してもよいし、ヘテロ接合（一方の染色体のみに存在）でもよい。
【００１０】  本発明者らは特にエキソン２のヘテロ接合欠失と、このエキソンと他のエキソン（特にエキソン３及びエキソン４）の欠失組み合わせを発見した。即ち、まずエキソン２、２＋３、２＋３＋４、３−６、３−９、６、６＋７、７＋８＋９及び８からなる９個の欠失又は欠失組み合わせを発見した。更に、複合ヘテロ接合の場合にはこれらの欠失又は欠失組み合わせを組み合わせてもよい。
【００１１】  本発明者らは単独又は組み合わせた所定数のホモ接合欠失（例えばエキソン５及び６の欠失）も発見した。
【００１２】  上記欠失の具体的な位置は図１のヌクレオチド番号により表すことができる。
【００１３】  別の特定態様では、本発明はエキソン３の欠失を含むパーキンをコードする核酸に関する。より特定的には、この欠失は図１のヌクレオチド２７３〜５１３に関する。
【００１４】  別の特定態様では、本発明はエキソン８及び９の欠失を含むパーキンをコードする核酸に関する。より特定的には、この欠失は図１のヌクレオチド９７３〜１１８４に関する。
【００１５】  これらの欠失又は欠失組み合わせの結果、読み枠がシフトすることが多い。検出された欠失又は欠失組み合わせに関して判明した結果を表４に要約する。
【００１６】  別の特定実施態様では、本発明はエキソン重複即ち遺伝子の１個以上のエキソンの反復を含むパーキンをコードする核酸に関する。エキソン３の二重により実施例に例示するようなホモ接合及びヘテロ接合二重や、エキソン６、７又は１１の二重により例示されるようなヘテロ接合型二重を示すのは本願が最初である。ホモ接合三重や、エキソン２の三重により実施例に例示するようなヘテロ接合三重といったエキソン三重を示すのも本願が最初である。
【００１７】  エキソン重複なる用語は２〜５コピー、好ましくは２〜３コピーの該当エキソンの存在を表すことが好ましい。一般に、各エキソンコピーは元のエキソンに隣接する配列に配置される。
【００１８】  別の特定態様では、本発明は点突然変異即ちある塩基対を別の塩基対で置換したパーキンをコードする核酸に関する。本願は実際にパーキンソン病の発病及び進行におけるパーキンの点突然変異体の存在とそのいくつかの病因性を立証する。より特定的には、本発明の点突然変異はナンセンス突然変異、ミスセンス点突然変異又は読み枠シフトを誘導する突然変異である。
【００１９】  ナンセンス突然変異は配列に停止コドンを導入する突然変異である。このような突然変異は翻訳の早期停止を誘導し、従って、切断タンパク質の合成を誘導する。従って、以下の文中ではこのような突然変異を「切断」なる用語で表す場合もある。本発明によると、核酸はヒトパーキンのＮ又はＣ末端ドメインに対応する領域に位置するナンセンス突然変異を含むことがより好ましい。本発明は実際にこの種の突然変異が患者の遺伝子（従ってタンパク質）の末端領域に高頻度で存在することを立証する。更に好ましくは、本発明はエキソン２、３、１１又は１２に対応する領域に切断点突然変異を含むヒトパーキンをコードする核酸に関する。より好ましくは、このような突然変異はミリストイル化部位（タンパク質の残基４５０−４５５）の不活化を優先的に誘導するパーキン遺伝子のエキソン１２の突然変異である。例えば、Ｔｒｐ４５３残基の代わりに停止コドンを導入するヌクレオチド１４５９のＧ→Ａ点突然変異を挙げることができる。従って、この突然変異体は野生型タンパク質の最初の４５２個のアミノ酸を含む切断タンパク質をコードする。驚くべきことに、本発明者らは野生型タンパク質の最後の１２残基のみを欠失するこの突然変異体パーキン１−４５２がパーキンソン病の原因であることを立証した。
【００２０】  別の実施態様によると、本発明はエキソン７に切断点突然変異を含むヒトパーキンをコードする核酸に関する。例えば、システイン２６８残基の代わりに停止コドンを導入するヌクレオチド９０５のＴ→Ａ点突然変異を挙げることができる。
【００２１】  本発明による別の型の点突然変異はミスセンス突然変異である。ミスセンス突然変異はコドンに１塩基対の置換を含み、配列を遮断せずに天然アミノ酸と異なるアミノ酸をコードするコドンを誘導する。従って、このような孤立突然変異は残基数は変わらないが、野生型タンパク質と残基の１個が異なるタンパク質を誘導する。本願はパーキンのミスセンス点突然変異体がパーキンソン病患者に存在し、これらの突然変異体が病因性をもち得ることを立証した。より好ましくは、本発明は特にエキソン４〜１２、好ましくはエキソン４、６、７、９、１１及び１２に対応する領域に位置する少なくとも１個のミスセンス点突然変異を含むヒトパーキンをコードする核酸に関する。
【００２２】  本発明の意味での第１の型のより特定的なミスセンス点突然変異はコード化タンパク質に核酸の非保存置換を誘導する突然変異を含む。このような突然変異は実際にパーキンソン病の表現型により特異的に関連している。非保存置換とは第１のアミノ酸と異なる構造、物理化学及び／又は生物学的性質をもつ第２のアミノ酸で第１のアミノ酸を置換することを意味する。例えば、非塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換は非保存置換である。この種の置換はより特定的には酸性、塩基性、極性中性、非極性中性の範疇のアミノ酸の相互置換を含む。本発明のこの種の突然変異体の特定例は特に単独又は組み合わせた下記遺伝子変異を含む核酸である。
−エキソン４におけるヌクレオチド５８４のＡ→Ｔ突然変異（Ｌｙｓ１６１Ａｓｐ）、
−エキソン６におけるヌクレオチド７３４のＡ→Ｔ突然変異（Ｌｙｓ２１１Ａｓｎ）、
−エキソン７におけるヌクレオチド８６７のＣ→Ｔ突然変異（Ａｒｇ２５６Ｃｙｓ）、
−エキソン７におけるヌクレオチド９２４のＣ→Ｔ突然変異（Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ）、
−エキソン７におけるヌクレオチド９３９のＧ→Ａ突然変異（Ａｓｐ２８０Ａｓｎ）、
−エキソン９におけるヌクレオチド１０８４のＧ→Ａ突然変異（Ｇｌｙ３２８Ｇｌｕ）、
−エキソン９におけるヌクレオチド１１０１のＣ→Ｔ突然変異（Ａｒｇ３３４Ｃｙｓ）、及び／又は
−エキソン１２におけるヌクレオチド１３９０のＧ→Ａ突然変異（Ｇｌｙ４３０Ａｓｐ）。
【００２３】  本発明の意味での第２の型のより特定的なミスセンス点突然変異は保存突然変異を含む。このような突然変異はあるアミノ酸をコードするコドンを同一群のアミノ酸をコードするコドンにより置換する任意置換を意味する。アミノ酸群とは、構造、物理化学及び／又は生物学的性質が非常に似ており、酸性、塩基性、極性中性、非極性中性の範疇に従って定義される性質をもつアミノ酸を意味する。保存突然変異の例としては、一般にコドンＡＧＡ（Ａｒｇ）によるコドンＡＡＡ（Ｌｙｓ）の置換を挙げることができ、ＬｙｓとＡｒｇは同一塩基性アミノ酸群に属する。本発明のこの種の突然変異の特定例は特に単独又は組み合わせた下記遺伝子変異を含む核酸である。
−エキソン７におけるヌクレオチド９６６のＴ→Ｇ突然変異（Ｃｙｓ２８９Ｇｌｙ）。
【００２４】  本発明の意味でのより特定的な第３の型のミスセンス点突然変異はコード化タンパク質の潜在リン酸化部位の突然変異を含む。本願は実際に、この種の突然変異体が一部のパーキンソン病患者に出現しており、従って、リン酸化イベントの公知生物学的機能により発病に関与するイベントであることを立証する。従って、特定突然変異はリン酸化可能なアミノ酸をリン酸化不能な残基に変異させる突然変異である。この点で、リン酸化可能な残基は例えばセリン、スレオニン及びチロシン残基である。
【００２５】本発明のこの種の突然変異体の特定例は特に単独又は組み合わせた下記遺伝子変異を含む核酸である。
−エキソン１１におけるヌクレオチド１３４５のＣ→Ａ突然変異（Ｔｈｒ４１５Ａｓｎ）。
【００２６】更に、上述のように、本発明は読み枠シフトを誘導する１隣接塩基対以上の欠失を含む任意核酸（ｄ参照）にも関する。本願はパーキンの制限欠失突然変異体の存在と、パーキンソン病の発病及び進行におけるその関与を初めて立証する。より好ましくは、本発明の制限欠失は読み枠シフトの結果、（ｉ）切断され、（ｉｉ）野生型タンパク質とＣ末端配列が異なるタンパク質の合成を誘導する。イントロン欠失の場合には、読み枠シフトの結果、突然変異がエキソン−イントロン境界に存在するならばイントロンの非認識を生じ、異常タンパク質がされ、突然変異がイントロンの内部に存在するならばイントロンの不正折り曲げによりイントロンの切り出し−スプライシングが行われなくなる。上述のように、このタンパク質（又は元のドメイン）は本願の別の目的を構成する。
【００２７】より好ましくは、本発明は１〜１０、好ましくは１〜５隣接塩基対の欠失を含む核酸に関する。より特定的には、本発明の欠失はイントロン８もしくはエキソン９に対応する核酸の領域又はタンパク質の末端領域、特にエキソン２もしくは３、例えばエキソン２に位置する。具体例としては、単独又は組み合わせた下記変異を含む核酸を挙げることができる。
−２０２及び２０３位のヌクレオチドＡＧの欠失。この欠失はアミノ酸残基３４（Ｇｌｎ→Ａｒｇ）のレベルから開始し、停止コドン（３７）で終結する読み枠の変異を導入する。従って、このタンパク質は切断されており、元の４アミノ酸のＣ末端領域を含む。
−２５５位のヌクレオチドＡの欠失。この欠失はアミノ酸残基５２（Ａｓｎ→Ｍｅｔ）のレベルから開始し、停止コドン（８１）で終結する読み枠の変異を導入する。従って、このタンパク質は切断されており、元の３０アミノ酸のＣ末端領域を含む。
−エキソン９に対して−２１〜−１７位のイントロン８の５塩基対ＴＣＴＧＣの欠失。この欠失はスプライシング部位の非認識を生じ得る。
−Ａｒｇ３４８をＧｌｕに変異させる１１４２−１１４３ｄｅｌＧＡ位のエキソン９における２塩基対の欠失。この欠失は読み枠の変異を導入し、エキソン１０の３６８位に停止コドンを生成する。
【００２８】上述のように、本発明は特に１隣接塩基対以上の挿入等の１個以上の遺伝子変異を含む核酸にも関する（ｅ参照）。本願は実際にパーキンの挿入突然変異体の存在とパーキンソン病の発病及び進行におけるその関与を初めて立証する。より好ましくは、本発明の挿入は読み枠シフトを生じるような挿入である。従って、挿入は突然変異の下流（Ｃ末端側）に位置する残基を変異させる。更に、この挿入はより一般には早期停止コドンの生成をもたらし、従って、（ｉ）切断され、（ｉｉ）Ｃ末端配列が野生型タンパク質と異なるタンパク質の合成をもたらす。後述するように、このタンパク質（又は元のドメイン）は本願の別の目的を構成し、診断又は治療用ツールとして使用することができる。
【００２９】  より好ましくは、本発明は１〜５、好ましくは１又は２隣接塩基対の挿入を含む核酸に関する。具体例としては、ヌクレオチド３２１〜３２２間にＧＴ挿入を含む核酸を挙げることができる。この挿入はアミノ酸残基７４（Ｔｒｐ→Ｃｙｓ）のレベルから開始して停止コドン（８１）で終結する読み枠の変異を導入する。従って、このタンパク質は切断されており、元の８アミノ酸のＣ末端領域を含む。
【００３０】  当然のことながら、上記遺伝子変異ａ）〜ｅ）は単独でもよいし、組み合わせてもよく、例えば、特にミスセンス突然変異と欠失の組み合わせや、２つのミスセンス突然変異の組み合わせが挙げられる。この種の組み合わせの具体例として、下記変異の組み合わせを特に挙げることができる。
−エキソン９の１１０１位のＣ→Ｔミスセンス突然変異（Ａｒｇ３３４Ｃｙｓ）とエキソン９に対して−２１〜−１７位のイントロン８の５塩基対の欠失。
−エキソン７の９２４位のＣ→Ｔミスセンス突然変異（Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ）とエキソン１２の１３９０位のＧ→Ａミスセンス突然変異（Ｇｌｙ４３０Ａｓｐ）。
【００３１】  本発明は図１に示す配列（配列番号１）を含むことを特徴とするヒトパーキンをコードする核酸にも関する。この配列はＫｉｔａｄａらにより単離された配列に対して７６８位にＣの代わりにＴを含み、その結果、コード化タンパク質の２２３位がプロリンの代わりにアミノ酸セリンとなる。この核酸はヨーロッパ人に検出される野生型パーキンをコードする。
【００３２】  本発明は更に、図１に示す核酸の多型変異体にも関する。本願は実際に、ヒトパーキン遺伝子がある種の多型性をもつことを立証し、より詳細には具体的に下記配列の変異をもつ所定変異体について記載する。
−エキソン４のヌクレオチド６０１のＧ→Ａ突然変異（Ｓｅｒ１６７Ａｓｎ）、−エキソン１０のヌクレオチド１２３９のＧ→Ｃ突然変異（Ｖａｌ３８０Ｌｅｕ）、
−エキソン１１のヌクレオチド１２８１のＧ→Ａ突然変異（Ａｓｐ３９４Ａｓｎ）。
【００３３】  本発明は更に、上記核酸を含む任意ベクターにも関する。ベクターはプラスミドベクター、コスミド、ウイルスベクター、エピソーム、人工染色体等とすることができる。特定態様では、このようなベクターは更に前記核酸の発現を可能にするプロモーター領域も含む。
【００３４】  このようなベクターは本発明の核酸を大量に生産するため、又は適当な細胞宿主（例えば原核、真核、動物又は植物細胞）で対応するポリペプチドを生産するために使用することができる。好ましい細胞宿主は特に細菌細胞（例えば大腸菌）又は酵母細胞又は動物もしくはヒトの哺乳動物細胞である。
【００３５】  この点で、本発明は上記核酸又はベクターを含む任意組換え細胞に関する。
【００３６】  本発明は更に野生型パーキン遺伝子の代わりに上記核酸又はベクターを含む任意哺乳動物細胞、特にヒト細胞にも関する。
【００３７】  本発明の細胞は特にパーキンの性質を試験するためや、パーキン遺伝子の遺伝子変異を補償することが可能な化合物の調査用モデルとして使用することができる。
【００３８】  本発明は更に上記核酸をその細胞に含む任意非ヒト哺乳動物にも関する。これらの哺乳動物は上記変異の「ノックイン」、相同組換え、又は本発明の変異体により置換された野生型遺伝子の「ノックアウト」により得ると有利である。
【００３９】  このような哺乳動物（齧歯類、イヌ、ウサギ等）は特に、例えばパーキンの性質の試験や治療用化合物の同定に使用可能である。
【００４０】  本発明は更に上記核酸によりコードされる任意ポリペプチドにも関する。従って、これらのポリペプチドはパーキンソン病の発病及び／又は進行に関与するヒトパーキン、その多型変異体、並びに突然変異及び／又は切断変異体及び／又はエキソン重複を含む変異体である。本発明は特に上記パーキンの切断もしくは異常変異体、又は読み枠シフトにより生成される配列に対応する前記変異体の一部に関する。このようなポリペプチド又はフラグメント又は対応する核酸はこれらを発現する細胞に正常表現型を回復することが可能な化合物を同定及び／又は試験するために使用可能である。特に、上記核酸は適当な宿主細胞、好ましくは真核細胞（例えば哺乳動物、酵母）に導入し、化学的、生化学的又は遺伝子化合物のいずれであるかを問わずにその活性を抑制することが可能な化合物のスクリーニング試験に使用することができる。このようなポリペプチド又はフラグメントは変異体の検出に使用可能な特異抗体を作製するために抗原として使用することもできる。特に、切断形の特定ポリペプチド領域（特に末端）は慣用免疫技術により抗体を作製するために使用することができ、これらの抗体は患者由来生物試料におけるこれらの変異体の存在の検出用ツールを構成する。このような抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい（例えば抗原で免疫した動物の脾細胞をミエローマ細胞と融合した後、モノクローナル抗体を生産すクローンを選択することにより作製する）。
【００４１】  この点で、本発明は上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドの特定領域の任意特異抗体にも関する。「特異抗体」なる用語は他の全抗原に比較して所与抗原に特に高い親和性をもつ抗体を意味する。
【００４２】  本発明は更に上記のような本発明の核酸により形質転換されたポリペプチド又は抗体又はベクター又は宿主細胞を含む任意組成物にも関する。これらの組成物は例えば安定剤又は保存剤の存在下に種々の型の媒体（等張塩類溶液等）で調製することができる。これらの組成物は適当な任意装置（チューブ、ボックス、フラスコ、びん、バッグ等）で低温保存又は冷凍することができる。
【００４３】  更に、上記エキソン遺伝子変異に加え、本発明はパーキン遺伝子のイントロン遺伝子変異にも関する。これらの変異はコード化タンパク質の配列に変異を誘導せず、主に多型変異体を構成する。これらの変異体を特に表２に示す。
【００４４】  本発明の用途の１つはパーキン遺伝子における突然変異の存在と、例えばパーキンソン病罹病性とのその相関の検出である。この点で、本発明はこのような検出法を実施するのに有用な各種ツール（プローブ、プライマー、抗体等）にも関する。
【００４５】  特に、本発明は上記核酸と特異的にハイブリダイズする任意プローブ又はオリゴヌクレオチドに関する。
【００４６】  本発明の特定プローブ又はオリゴヌクレオチドは一般に５００ｂｐ未満、より好ましくは３００ｂｐ未満を含む。一般に、本発明の特定オリゴヌクレオチドは５〜１００ｂｐ、有利には５〜５０ｂｐを含む。オリゴヌクレオチド長は当然のことながら当業者により調節することができる。本発明のプローブ又はオリゴヌクレオチドは更に一般にその検出を可能にするように標識されている。当業者に公知の各種標識を使用することができる（末端又は内部の放射性、蛍光、酵素、化学的標識等）。更に、本発明のプローブ又はオリゴヌクレオチドは上記核酸即ちパーキン遺伝子の各種変異形と特異的にハイブリダイズする能力をもつ。プローブ又はオリゴヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下で着目変異をもつ核酸とハイブリダイズし、前記変異をもたない同一核酸とは全く又は殆どハイブリダイズしない場合にハイブリダイゼーションは特異的であると言う。従って、特異的／バックグラウンド示差シグナルが十分に大きく、検出可能である場合にハイブリダイゼーションは特異的であると言う。
【００４７】  従って、本発明のプローブ又はオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも上記遺伝子変異ａ）〜ｄ）をもつパーキン遺伝子の領域に相補的である。相補性は一般最良のハイブリダイゼーション選択性を確保するように完全である。これらのプローブ又はオリゴヌクレオチドは例えば上記核酸から切断したり、人工的に合成したり、これらの技術を組み合わせることにより当業者に公知の任意技術により合成することができる。これらのプローブ又はオリゴヌクレオチドはパーキン遺伝子の遺伝子変異の存在を生物試料で同定するために使用することができる。
【００４８】  本発明は、
−遺伝子変異の５’に配置されたパーキン遺伝子領域に相補的な第１のプライマーと、
−前記遺伝子変異の３’に配置されたパーキン遺伝子領域に相補的な第２のプライマーを含むことを特徴とする上記核酸の全部又は一部の増幅用プライマー対にも関する。
【００４９】  本発明のプライマーは一般にパーキン遺伝子の領域に相補的であり、３０ｂｐ未満を含むと有利である。
【００５０】  本発明は更にパーキン遺伝子における遺伝子変異の同定方法、特にホモ接合及びヘテロ接合状態のエキソンの欠失及び／又は重複（例えば二重、三重）の検出方法にも関する。
【００５１】  本発明のこの方法は、
ｉ）パーキン遺伝子を含む試料を準備する段階と、
ｉｉ）上記遺伝子変異を含む前記遺伝子の少なくとも一部を（半定量的に）増幅する段階と、
ｉｉｉ）遺伝子変異の存在を検出する段階を含む。
【００５２】  本発明の方法では、試料は患者、特に哺乳動物、特にヒト由来の血液、組織、血漿試料又は細胞培養物が有利である。好適実施態様では、パーキン遺伝子又はその一部を増幅に利用できるように試料を予備処理する。この予備処理は細胞の溶解、酵素処理、変性等により実施することができる
【００５３】  上記プライマー対又は参考資料として本明細書の一部とするＫｉｔａｄａらの文献に記載されているプライマー対により増幅を行うと有利である。
【００５４】  本発明のプライマー対の特定例としては、エキソン３の変異又は点突然変異の検出に使用するプライマーを挙げることができる。例えば、本発明の範囲では下記プライマー対を使用した。
For：5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3'（配列番号２）、及び
Rev：5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'（配列番号３）
【００５５】  下記点突然変異を検出するために下記プライマーも使用した。
Asp280Asn:5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3'（配列番号４）
野生型                    G
Arg334Cys:5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'（配列番号５）
野生型                    G
【００５６】  上記遺伝子変異の検出は種々の技術により実施することができ、実験の項で詳述するように特にシーケンシング、ＰＣＲ／制限、ＡＳＯ、ＰＡＧＥ又は半定量的多重ＰＣＲにより実施することができる。要約すると、この方法は鋳型ＤＮＡの指数期における半定量的ＰＣＲ増幅である。この方法によると、ＤＮＡ量の減少（エキソン欠失）又は逆にＤＮＡ量の増加（エキソン重複）を検出するために鋳型ＤＮＡの相対濃度を比較すれば十分である。
【００５７】  本発明は更に上記プローブ又はオリゴヌクレオチド又はプライマー対を含む本発明の方法を実施するためのキットにも関する。本発明のキットは増幅及び／又はハイブリダイゼーション反応に適した試薬と、場合によりこのような反応の支持体（フィルター、膜、チップ等）を含むと有利である。
【００５８】  本発明はパーキン遺伝子で上記遺伝子変異を調査することによりパーキンソン病罹病性を診断するのに特に適している。
【００５９】  本発明は更に、特に治療目的でパーキン遺伝子の遺伝子変異の作用を少なくとも部分的に抑制することが可能な化合物を同定するための上記ツール（核酸、プローブ、ポリペプチド、抗体、細胞、動物）の使用にも関する。例えば、このような化合物は上記細胞又は動物の存在下に試験組成物（又は製剤）を接触させ、表現型又は遺伝子型作用を検出することにより検出することができる。
【００６０】  本発明の方法は特に、パーキンソン病の治療（即ち緩和）のために単独又は他の製剤もしくは治療と組み合わせて使用可能な化合物を同定することができる。このような化合物は本発明の別の目的を構成する。
【００６１】  本発明の他の利点及び用途は下記実施例に明示されるが、下記実施例は例示であり、発明を限定するものではない。
【００６２】  実施例
Ａ−図面の説明
図１：ヒトパーキンをコードするｃＤＮＡの配列。エキソン間の境界を表示する。開始コドン（ａｔｇ）と停止コドン（ｔａｇ）を太字で示す。７６８位のＣ→Ｔ変異を太字と下線で示す。
【００６３】  図２：パーキン遺伝子に点突然変異をもつ家族。突然変異と疾病の完全同時分離を示す。黒い四角（男子）と丸（女子）は罹患個体を示し、患者の記号の下に発病年齢（歳）を示す。記号に斜線を引いたものは死亡患者を示す。分析しなかった非罹患兄弟姉妹の数を菱形の中に示す。突然変異（アミノ酸変異）毎に家族のメンバーの遺伝子型（＋／＋野生型ホモ接合、＋／−突然変異ヘテロ接合、−／−突然変異ホモ接合）を示す。各遺伝子型の下に検出結果を示す。ＰＡＧＥ：電気泳動図（対立遺伝子寸法をｂｐで表す）、ＡＳＯ：突然変異及び野生型対立遺伝子のオートラジオグラム、ＰＣＲ／制限：適当な制限酵素による消化後のＰＣＲ産物。フラグメント長（ｂｐ）を示す。Ｍｕｔ：突然変異、ｎｄ：患者に自覚症状がないために発病年齢を決定できなかった。
【００６４】  図３：パーキン遺伝子の点突然変異の模式図と位置。１２個のエキソンを含む遺伝子のコーディング配列を示す（棒線）。エキソンを１〜１２の番号で示す。タンパク質へのその作用（切断とミスセンス）に従って８個の病原点突然変異を配置する。ユビキチン様ドメインとリングモチーフ（「リングフィンガー」）を線影で示す。Ｔｈｒ４１５Ａｓｎ及びＴｒｐ４５３Ｓｔｏｐ突然変異については、リン酸化部位（Ｐ）とミリストイル化部位（Ｍ）を示す。ＵＴＲ：非翻訳領域。
【００６５】  図４：早発パーキンソン病をもつ家族（ＦＰＤ−ＧＲＥ−ＷＡＧ−１５５）におけるヘテロ接合エキソンの欠失を本発明の半定量的多重ＰＣＲ法により検出した結果を示す。黒い四角（男子）と丸（女子）は罹患個体を示す。ピークは半定量的多重ＰＣＲにより生産されたエキソンを表す。四角内の数字はピーク高を示す。電気泳動図の上部の目盛りはＰＣＲ産物の塩基対寸法を示す。
【００６６】  表１：ＡＳＯ法に使用したオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオチド変異を太字と下線で示す。ＷＴ＝野生型、Ｖ＝変異体。
【００６７】  表２：検出された突然変異の一覧。ヌクレオチド位置は日本のＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ；アクセス番号ＡＢ００９９７３）で公開されているｃＤＮＡ配列に準拠し、図１に示す。ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＡＳＯ＝対立遺伝子の特異的オリゴヌクレオチドを使用する突然変異検出法。
【００６８】  表３：遺伝子変異型による患者の臨床特徴。ミスセンス突然変異と切断突然変異の複合ヘテロ接合体であるＩＴ−０２０家族の患者はこの表には示していない。ａ：ホモ接合欠失をもつ患者と切断突然変異をもつ患者の比較ｐ＜０．０５。
【００６９】  表４：エキソン欠失／重複の頻度と結果。ｄｅｌ＝欠失、ｈｅｔ＝ヘテロ接合、ｈｏｍ＝ホモ接合。
【００７０】  表５：図４で得られた結果の比。表の左側部分に各エキソンのピーク高を示し、二重ピークの値は加算した。表の右側部分にはピーク値の比の計算値を示す。斜字＝正常値、下線値＝対照に対する病理値。表の２行目には症例毎に対照の比を症例の比で割った値を示す。病理値は≦０．６２５又は≧１．６（＝１／０．６２５）である。エキソン欠失は患者ＦＲ１５５５（エキソン３）、ＦＲ１５５６（エキソン２）、ＦＲ１５５８及びＦＲ１５５９（エキソン２＋３）で検出された。後者２人の患者では、２個のエキソンがヘテロ接合で欠失していたのでエキソン比の値３／２は正常である。
【００７１】  Ｂ−材料と方法
１．家族及び患者
第１系列の実験では、下記基準に従って３８家族を選択した。ｉ）レボドパ反応性パーキンソン病、ｉｉ）罹患メンバーの少なくとも１人の発病年齢が４５歳まで、ｉｉｉ）常染色体劣性遺伝に適合可能な伝達。
【００７２】  別の系列の実験では、（Ｌｕｃｋｉｎｇら，１９９８；Ａｂｂａｓら，１９９９に示されているような）下記基準に従って７７家族を選択した。ｉ）兄弟姉妹の少なくとも２人（又は血族結婚の記録がある場合には１人）に良好なレボドパ反応（≧３０％改善）を示すパーキンソン病が存在、ｉｉ）２年間進行前に突発するバビンスキー徴候、眼筋麻痺、痴呆又は自律神経不全等の除外基準が不在、ｉｉｉ）患者の少なくとも１人が≦４５歳で発病、ｉｖ）常染色体劣性伝達に適合可能な遺伝（血族結婚の記録の有無を問わずに１世代で数人の患者）。家族の出自はフランス（ｎ＝２０）、イタリー（ｎ＝１９）、英国（ｎ＝１４）、オランダ（ｎ＝９）、ドイツ（ｎ＝９）、レバノン（ｎ＝２）、アルジェリア（ｎ＝１）、モロッコ（ｎ＝１）、ポルトガル（ｎ＝１）、ベトナム（ｎ＝１）であった。
【００７３】  更に、既知血族結婚のない個人１０２人を同一臨床基準で選択した。その出自はフランス（ｎ＝３１）、イタリー（ｎ＝２３）、英国（ｎ＝２６）、ドイツ（ｎ＝２１）、オランダ（ｎ＝１）であった。
【００７４】  全患者を標準化プロトコールにより評価した。全参加者から書面でインフォームドコンセントを得た。
【００７５】  ２．パーキン遺伝子の分析
パーキン遺伝子をコードする１２個のエキソンのＤＮＡをＫｉｔａｄａらに記載されている条件に従って各指針症例の末梢血白血球からＰＣＲ増幅した。要約すると、各ｄＮＴＰ３５０μＭ、各プライマー３５０μＭ及びＴａｑポリメラーゼの存在下にＤＮＡ１００ｎｇで増幅を行った。増幅条件は９４℃３０秒間、５５〜６１℃３０秒間、次いで６８℃３０秒間を３５サイクルとした。エキソン４及び７についてはイントロンプライマー対のみを使用した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーとシーケンシングキット“Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）を使用して１２個のエキソンの配列を２本鎖で作製し、電気泳動後に“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３．０”（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）ソフトウェアを使用してＡＢＩ３７７シーケンサーで分析した。
【００７６】  ＰＣＲ／適当な制限酵素による制限消化、ＡＳＯ（“Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”）法、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（“ＰＡＧＥ”）の３種の技術を表２に示すように単独又は組み合わせて使用することにより、試料における突然変異の検出と４５人の対照個体からなる集団の分析を行った。より詳細に説明すると、これらの技術は次のように実施した。
【００７７】  ＡＳＯ法：このアプローチは（例えばＰＣＲにより）増幅した試料に２種のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズするものであり、第１のプローブは遺伝子変異に特異的でこれをカバーし、第２のプローブは対応野生型領域に特異的でこれをカバーする。即ち、突然変異遺伝子の存在下では、第１のプローブのみがＤＮＡフラグメントとハイブリダイズすることができ、非突然変異遺伝子の存在下では、第２のプローブのみがＤＮＡフラグメントとハイブリダイズすることができる。ヘテロ接合遺伝子の場合には、プローブの各々とハイブリダイゼーションが得られる。この方法は、第１のプライマー対が対応野生型領域に特異的でこれをカバーするような２個のプライマー対を使用することにより、増幅と同時に実施することもできる。この実施態様では、突然変異遺伝子の存在下では、第１対のみがＤＮＡフラグメントを増幅することができ、非突然変異遺伝子の存在下では第２対のみがＤＮＡフラグメントを増幅することができる。ヘテロ接合遺伝子の場合には、プライマー対の各々で増幅産物が得られる。
【００７８】  この方法を実施するために、ＰＣＲ産物１０μｌを９５℃で５分間変性させ、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に堆積した後、６００Ｗのマイクロ波で２分間固定した。検出（又は場合によっては増幅）に使用した特異的プライマー（又はオリゴヌクレオチド）については実施例に記載する（表１参照）。エキソン３には、エキソンプライマーＥｘ３ｉＦｏｒ（前）友びＥｘ３ｉＲｅｖ（後）を使用した。これらのプライマーの配列を以下に示す。
Ex3iFor:
5'-AATTGTGACCTGGATCAGC-3'（配列番号６）
Ex3iRev:
5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'（配列番号７）
【００７９】  これらのオリゴヌクレオチド（同時増幅の場合にプライマーを含む）はＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によりｄＣＴＰ３２で標識し、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ及び０．１％ＳＤＳから構成される緩衝液中で４４℃で一晩膜にハイブリダイズさせた。次に、膜を５９℃、２×ＳＳＣ培地で３０分間２回洗浄し、ＭＰフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に３〜６時間露光した。
【００８０】  ＰＣＲ／制限法：この方法は遺伝子変異により消化プロフィルが変化する制限酵素の使用に基づく。従って、この方法は遺伝子変異により部位が変化（破壊又は生成）する制限酵素を使用することが好ましい。こうして、核酸（一般に増幅産物）の消化プロフィルに従って着目遺伝子変異の有無を識別することが可能である。当然のことながら、この方法は酵素切断部位に変異を誘導する特徴的遺伝子変異の調査に特に適している。これを実施するためには、増幅産物１５μｌを製造業者の指示に従って適当な制限酵素の存在下に消化する。実施例で使用する特定酵素と予想制限フラグメント寸法を表２に示す。
【００８１】  ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（“ＰＡＧＥ”）：この方法は増幅産物の寸法を測定することにより突然変異の存在を検出することができる。従って、挿入又は欠失型の遺伝子変異の検出に特に適している。これを実施するために、標識前のプライマー（５’−蛍光、Ｈｅｘ）を使用してパーキン遺伝子のエキソン２を増幅した。“Ｇｅｎｅｓｃａｎ  ２．０．２”及び“Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  １．１．１”（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）ソフトウェアを搭載した自動シーケンサーＡＢＩ３７７を使用して増幅フラグメントの寸法を測定することにより、短いＰＣＲ産物（３０８ｂｐに対して３０６ｂｐ）をもたらす２０２−２０３ｄｅｌＡＧ変異の存在を確認した。
【００８２】  本願で使用するヌクレオチド番号は日本のＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ；アクセス番号ＡＢ００９９７３）に表示されているｃＤＮＡ配列に準拠する。図１に配列を示す。この配列はヌクレオチド７６８のレベルがＫｉｔａｄａらにより記載されている配列と異なる。図１に示す配列はヨーロッパ人に認められる野生型タンパク質に対応する。
【００８３】  ３．ホモ接合及びヘテロ接合状態のエキソン欠失／重複の検出のための半定量的多重ＰＣＲ
ａ）原理
パーキン遺伝子におけるエキソンのヘテロ接合欠失又は重複の検出は非定量的ＰＣＲにより実施することができない。そこで、１個以上のエキソンに鋳型ＤＮＡの５０％が不足しているか、又は逆にヘテロ接合もしくはホモ接合重複の場合には例えば１個以上のエキソンに過剰の例えば５０％（ヘテロ接合二重）、１００％（ホモ接合二重又はヘテロ接合三重）又は２００％（ホモ接合三重）のＤＮＡが存在しているかを知るためには、鋳型ＤＮＡの相対率を比較する半定量的ＰＣＲを実施すればよい。この比較を実施するためには、同一個体の数個のエキソンをＰＣＲ反応で同時に増幅し（多重ＰＣＲ）、同時増幅したエキソンを量の内部標準として使用する。蛍光プライマーを使用してＰＣＲを実施すると、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＬＯＨ  Ａｓｓａｙ（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）で適用されるように、自動シーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７）でピーク高によりＰＣＲ産物の量を測定することができる。利用可能な支持体による制限のない指数期にＰＣＲを実施するならば、ＰＣＲ産物の量（ピーク高）は鋳型ＤＮＡの量に直接関連する。多重ＰＣＲ毎にエキソンの所与組み合わせについて対照個体のピーク高の代表分布と各ピーク間で決定される比が得られる。
【００８４】  エキソンのホモ接合欠失は対応ピークの不在により示される。ヘテロ接合状態でエキソンが欠失しているならば、対応ピークはその正常高の２分の１となり、欠失エキソンと非欠失エキソンの比は対照に対して因数２で変化する（高値と低値を比較、図４と図４に関する表４参照）。エキソン二重については、比は（同様に高値を低値と比較すると）ヘテロ接合では因数１．５、ホモ接合では因数２で変化する。従って、ヘテロ接合又はホモ接合三重の因数は（同様に高値を低値と比較すると）夫々２又は３である。パーキン遺伝子全体の欠失又は重複も検出できるように、離して配置した遺伝子（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ遺伝子）の３２８塩基対のＰＣＲ産物（Ｃ３２８）を増幅し、多重ＰＣＲで外部標準として使用する。ピーク間の高さの比のみを比較するので、最初の計算ではＤＮＡの量と質から独立した方法となる。
【００８５】  ｂ）多重ＰＣＲの適切な条件の設定
予備実験の間に、最良に増幅するエキソンは効率が良くない他のエキソンの増幅に負の効果があることが認められた。そこで、増幅効率が同等のエキソンを再編成した。更に、ＰＣＲ産物の寸法も増幅効率に影響を与え得る（短い配列は一般に長い配列よりも良好に増幅される）ので、多重反応で同等寸法のＰＣＲ産物を再編成した。こうして、３種のエキソン組み合わせを選択した。
【００８６】  組み合わせ１：Ｅｘ４ｏ（２６１ｂｐ）＋７ｏ（２３９ｂｐ）＋８（２０６ｂｐ）＋１１（３０３ｂｐ）、
組み合わせ２：Ｅｘ５（２２７ｂｐ）＋６（２６８ｂｐ）＋８（２０６ｂｐ）＋１０（１６５ｂｐ）及び
組み合わせ３：Ｅｘ２（３０８ｂｐ）＋３ｉ（２４３ｂｐ）＋９（２７８ｂｐ）＋１２（２５５ｂｐ）＋Ｃ３２８（３２８塩基対の外部対照）。
【００８７】  使用したプライマーはＫｉｔａｄａら（１９９８）により記載されているプライマーである。エキソン３にはエキソンプライマー対を使用した。
For:5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3'（配列番号８）及び
Rev:5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'（配列番号９）
【００８８】  Ｃ３２８のプライマーは下記のものを使用した。
TTRForHex:5'-(Hex)ACGTTCCTGATAATGGGATC-3'（配列番号１０）及び
TTR328Rev:5'-CCTCTCTCTACCAAGTGAGG-3'（配列番号１１）。
【００８９】  各多重ＰＣＲで同等の高さのピークが得られ、各エキソンについて指数期に実施されるように、（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら，１９９７）の推奨に一部従って）ＰＣＲ条件を連続調節した。特に、ハイブリダイゼーション及び伸長温度を下げ、ＭｇＣｌ２濃度と伸長時間を増した。更に、増幅効率に応じてプライマー濃度を０．８μＭの標準濃度から調節した（プライマー濃度は良好に増幅するエキソンでは下げ、他のエキソンでは上げた）。
【００９０】  各エキソン組み合わせを試験し、指数期にあることを確認し、３種のプライマー組み合わせで多重ＰＣＲを２回平行して行う場合には対照個体で２２、２３及び２４サイクルで得られることを確認した。内部分子量マーカー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴＡＭＲＡ  ５００ＸＬ）によりピーク高をローディング変動について補正した。補正ピーク高をサイクル数に比較すると対数スケールで上昇直線を示し、５分間９５℃を１サイクル、３０秒間９５℃、４５秒間５３℃及び２．５分間６８℃を２３サイクル、５分間６８℃を１サイクルの条件で指数期に配置されることが明らかである。
【００９１】  ３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ及び１Ｕ  Ｔａｑ／２５μｌを加えた容量２５μｌのＰＣＲ溶液中、ＤＮＡ４０ｎｇを用いて反応を実施した。各プライマーの濃度は、Ｅｘ２（０．８μＭ）、Ｅｘ３（０．４μＭ）、Ｅｘ４（１．０Ｍμ）、Ｅｘ５（０．６μＭ）、Ｅｘ６（１．４μＭ）、Ｅｘ７（０．４４μＭ）、Ｅｘ８（組み合わせ１：１．０μＭ及び組み合わせ２：０．８μＭ）、Ｅｘ９（０．４μＭ）、Ｅｘ１０（１．０４μＭ）、Ｅｘ１１（０．８μＭ）、Ｅｘ１２（１．２μＭ）及びＣ３２８（１．９２μＭ）とした。
【００９２】  ｃ）多重ＰＣＲの適用、内部対照及び電気泳動
一般に、個体毎に少なくとも２回の平行反応で多重ＰＣＲを実施した。患者系列毎に（既知エキソンヘテロ接合欠失をもつ）少なくとも１個の陽性対照と少なくとも１個の陰性対照（対照個体）を平行処理し、プレミックスに存在し得る差（ピペッティング変動）に起因する過誤結果を避けるように反応プレミックス毎に正常値と病理値を得た。鋳型ＤＮＡを含まない２個の付加対照も加えた。ＰＣＲ産物１．５〜２．５μｌを（サイズマーカーとしてＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴＡＭＲＡ  ５００ＸＬ  ０．３μｌを含む）ローディング緩衝液４μｌと混合した。自動シーケンサーＡＢＩ３７７で９６ウェルを含む４％変性ポリアクリルアミドゲルにこの混合物１．５μｌをロードした。ゲルをＧｅｎｅＳｃａｎ  ３．１及びＧｅｎｏｔｙｐｅｒ  １．１．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒに指示されるようにピーク高を測定した。（Ｔａｑポリメラーゼが各末端にＡを不定期に加える結果として生じる）１塩基対差の二重ピークについては、２個のピーク高を加算した。Ｅｘｃｅｌ  ５．０ソフトウェアを使用して各反応の各ピーク組み合わせの比を計算し（表５）、２回の反応の平均値を計算する。
【００９３】  ｄ）解釈
欠失については、比の差が対照と症例の夫々の全比（患者の比／対照の比、図４に関する表５参照）で少なくとも１．６の逆数即ち≦０．６２５（＝１／１．６）であるならば、結果は疾病であると解釈する。（例えばＰＣＲのある回の増幅率が低いために）平行反応間の比の差が不一致の場合には、十分な増幅で得られた比が正常であるならばこれらの比を採用する。
【００９４】  二重については、（高値を低値と比較することにより）因数１．３０〜１．６５又は＞１．７５の比の変化を夫々ヘテロ接合又はホモ接合二重と解釈する。
【００９５】  三重については、（高値を低値と比較することにより）因数１．６〜２．４又は＞２．６の比の変化を夫々ヘテロ接合又はホモ接合三重と解釈する。
【００９６】  しかし、方法の進行中に条件を連続調節したので、多少異なる条件で得られた結果もあった。これらの結果は正常又は疾病であることが明白で且つ再現可能な場合に採用する。曖昧な状況では、適応条件で実験を繰り返した。
【００９７】  ４．同時分離と対照集団の分析
ａ）点突然変異
パーキン配列変異体を（他の試料の利用可能性による）家族内の同時分離と、パーキンソン病をもたない対照集団（６１〜７３個体）におけるその存在について試験した。１１４２−１１４３ｄｅｌＧＡ突然変異は明らかに病原性であるため、この突然変異については対照を試験しなかった。使用した方法はＰＣＲと、適当な制限酵素による消化又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ＝ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）であった（表２参照）。変異体がそのままでは制限部位変化を生じなかった場合には、ミスマッチをもつプライマーを使用して部位を人工的に生成した。配列変異体の位置の近傍に１塩基の変異を導入し、この変異体を含む制限部位を生成するようにプライマーを設計した。プライマーを下表に示す。
【００９８】
【表２】
0005424519.tif 000003
【００９９】  ｂ）ホモ接合及びヘテロ接合エキソンの欠失又は重複
家族内のエキソン欠失又は重複の同時分離を従来記載されている方法により分析した。これらの突然変異は読み枠シフトを伴うか又は伴わずにタンパク質の内部欠失を誘導する病原性である可能性が非常に高いので、対照集団を試験しなかった。
【０１００】  ５．遺伝子関係の分析
ＰＡＲＫ２遺伝子座との関係を分析するために、Ｔａｓｓｉｎら（１９９８）に記載されているようにこの遺伝子座の近傍に位置する４種のマイクロサテライト型マーカー（Ｄ６Ｓ１５７９、Ｄ６Ｓ４１１、Ｄ６Ｓ１５５０及びＤ６Ｓ３０５）を試験した。
【０１０１】  Ｃ−結果
ａ）第１系列の実験では８７人の患者を含むＡＲ−ＪＰをもつ３８家族の指針症例でパーキン遺伝子の分析を行った。
【０１０２】  １．エキソン欠失の検出
エキソン増幅の結果、３家族でホモ接合状態の欠失の存在が判明し、その内訳はフランス人１家族（ＳＡＬ−０２４）とポルトガル人１家族（ＳＡＬ−７１１）でエキソン３が欠失しており、アルジェリア人１家族（ＤＥＬ−００１）でエキソン８及び９が欠失していた。これらの欠失はホモ接合状態の各家族では全患者で検出されるが、関連健常サンプルでは検出されないので、疾病と共に伝達される（図２）。
【０１０３】  ２．点突然変異の検出
欠失のない家族で配列を分析した結果、エキソン１２個とイントロン４個（表２及び３、図３）の１６個の核酸配列変異体の存在が判明した。３個の変異体は読み枠シフトと切断タンパク質合成を誘導する。これらの変異体はエキソン２の２０２−２０３ｄｅｌＡＧ（Ｇｌｎ３４Ａｒｇ（Ｓｔｏｐ３７））及び２５５ｄｅｌＡ（Ａｓｎ５２Ｍｅｔ（Ｓｔｏｐ８１））とエキソン３の３２１−３２２ｉｎｓＧＴ（Ｔｒｐ７４Ｃｙｓ（Ｓｔｏｐ８１））の突然変異であり、夫々ＩＴ−０２０及びＵＫ−０８６、ＴＯＵ−０９６、ＬＹＯ−１１９家族に検出された。これらの突然変異は２０２−２０３ｄｅｌＡＧ以外はホモ接合状態である。ＩＴ−００６家族にはエキソン１２にナンセンス突然変異１４５９Ｇ→Ａ（Ｔｒｐ４５３Ｓｔｏｐ）がホモ接合状態で存在している。変異体の８個はミスセンス型である。エキソン４には５８４Ａ→Ｔ（Ｌｙｓ１６１Ａｓｐ）及び６０１Ｇ→Ａ（Ｓｅｒ１６７Ａｓｎ）が夫々ＩＴ−０２０及びＳＡＬ−７３０家族の患者にヘテロ接合状態で存在している。エキソン７には、８６７Ｃ→Ｔ（Ａｒｇ２５６Ｃｙｓ）及び９２４Ｃ→Ｔ（Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ）変異体が夫々ＤＥ−０１２及びＩＴ−０１５家族にヘテロ接合状態で検出される。エキソン１０には、１２３９Ｇ→Ｃ（Ｖａｌ３８０Ｌｅｕ）変異体が１１家族（ＩＴ−０１４、ＩＴ−０２０、ＩＴ−０５８、ＳＡＬ−０１７、ＧＲＥ−０２９、ＳＡＬ−０３８、ＴＯＵ−０９６、ＳＡＬ−４３１、ＵＫ−００６、ＵＫ−０８６、ＤＥ−０２２）にヘテロ接合及びホモ接合状態で検出される。エキソン１１には１２８１Ｇ→Ａ（Ａｓｐ３９４Ａｓｎ）変異体がＵＫ−０４６家族にヘテロ接合状態で検出され、１３４５Ｃ→Ａ（Ｔｈｒ４１５Ａｓｎ）変異体がＩＴ−０１４家族にホモ接合状態で検出される。最後に、７６８Ｃ→Ｔ（Ｐｒｏ２２３Ｓｅｒ）変異体は配列決定した全個体にホモ接合状態で検出されるので非病原性であり、パーキン配列のミスプリントであると思われる［Ｋｉｔａｄａら，１９９８］。対照集団でこれらの変異体を調査した処、Ｓｅｒ１６７Ａｓｎ、Ｖａｌ３８０Ｌｅｕ及びＡｓｐ３９４Ａｓｎの３種が多型性を示すことが判明した（表２）。他の変異体は切断パーキン合成又は非保存置換又はリン酸化可能なアミノ酸の１個の置換を誘導したので、病原突然変異である可能性が非常に大きい。更に、これらの変異体は家族内で疾病と共に分離し、９０個の対照染色体では検出されない。
【０１０４】イントロン２、３、６及び７で同定された変異体（ＩＶＳ２＋２５Ｔ→Ｃ（２７２＋２５Ｔ→Ｃ）、ＩＶＳ３−２０Ｃ→Ｔ（５１４−２０Ｃ→Ｔ）、ＩＶＳ６＋１９Ｔ→Ｃ（８３５＋１９Ｔ→Ｃ）及びＩＶＳ７−３５Ａ→Ｇ（９７３−３５Ａ→Ｇ））は多型性である（表２）。これらの変異体はスプライシング部位の近傍には位置せず、対照染色体で検出される。
【０１０５】３．パーキンの機能的ドメイン
配列の分析と比較によりパーキンの機能的ドメインを試験した。この試験の結果、アミノ酸保存置換Ｔｈｒ４１５ＡｓｎはｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼのコンセンサス配列（ＫＫＴＴ）とタンパク質キナーゼＣのリン酸化部位（ＴＴＫ）に位置することが判明した。この試験の結果、ナンセンス突然変異Ｔｒｐ４３５Ｓｔｏｐはミリストイル化Ｎ末端部位（ＧＣＥＷＮＲ）に位置することも判明した。
【０１０６】４．表現型遺伝子型相関
ホモ接合欠失と点突然変異は患者２６人を含む１２家族で検出された。平均発病年齢は３６．７歳であり、その範囲は７〜５６歳であった（表３）。突然変異の機能的結果（ホモ接合欠失、切断突然変異及びミスセンス突然変異）により家族間を比較した処、振戦はホモ接合欠失をもつ家族のほうが切断突然変異をもつ家族に比較して有意に低頻度であるが、発病年齢、重篤度又は関連徴候頻度に有意差は認められない（表３）。
【０１０７】  ｂ）新規点突然変異の検出
エキソンに８個の新規点突然変異が同定され、そのうち６個はミスセンス突然変異であり、１個が切断、１個がナンセンスであり、即ちエキソン６の７３４Ａ→Ｔ（Ｌｙｓ２１１Ａｓｎ）、エキソン７の９０５Ｔ→Ａ（Ｃｙｓ２６８Ｓｔｏｐ）、９３９Ｇ→Ａ（Ａｓｐ２８０Ａｓｎ）及び９６６Ｔ→Ｇ（Ｃｙｓ２８９Ｇｌｙ）、エキソン９の１０８４Ｇ→Ａ（Ｇｌｙ３２８Ｇｌｕ）、１１４２−１１４３ｄｅｌＧＡ及び１１０１Ｃ→Ｔ（Ａｒｇ３３４Ｃｙｓ）、エキソン１２の１３９０Ｇ→Ａ（Ｇｌｙ４３０Ａｓｐ）であった。ミスセンス突然変異のうちの５個は非保存アミノ酸置換を誘導し、１個は保存置換（Ｃｙｓ２８９Ｇｌｙ）を誘導する。更に、エキソン９に対して−２１〜−１７位に位置するイントロン８に５塩基対の欠失も検出された。これらの全配列変異体は６１〜７３人の対照個体では検出されなかったので（１１４２−１１４３ｄｅｌＧＡ突然変異は試験しない）、多型性ではない。結果を表２に詳細に示す。
【０１０８】  ｃ）エキソンの新規ホモ接合欠失の検出
Ｈａｔｔｏｒｉら（１９９８ａ）とＬｕｃｋｉｎｇら（１９９８）によりエキソン３、Ｈａｔｔｏｒｉら（１９９８ａ）によりエキソン３＋４について既に報告されている欠失以外に、エキソンのホモ接合欠失が３家族で検出された。これらの欠失はエキソン３（ＦＤＰ−ＡＮＧ−ＧＥＯ−１４１）、３＋４（ＩＴ−０６４）及び５＋６（ＳＰＤ−ＬＩＢ−ＨＡＧ−０７６）である。読み枠に及ぼすエキソン欠失の結果と試料におけるその相対頻度を表４に示す。
【０１０９】  ｄ）ホモ接合及びヘテロ接合二重／三重の検出
５種の新規エキソン二重、即ちホモ接合状態のエキソン３の二重（ＳＰＤ−ＮＩＣ−ＡＩＴ−０９１）と、ヘテロ接合状態のエキソン３の二重（ＳＡＬ  ３９９  ２１３）が検出された。更に、エキソン６（ＦＰＤ−ＬＩＬ−ＣＨＡ−１７１）、エキソン７（ＤＥ４００１）及びエキソン１１（ＳＡＬ  ３９９  ２１３）の二重も検出された。２種の三重即ちホモ接合状態（ＲＭ３４７）とヘテロ接合状態（ＲＭ３３０）のエキソン２の三重も検出された。
【０１１０】  ｅ）新規ヘテロ接合欠失の検出
１３種の異なるエキソンヘテロ接合欠失組み合わせが２１家族で検出された。検出された欠失はエキソン２、２＋３、２＋３＋４、３、３＋４、３−６、３−９、４、５、６、６＋７、７＋８＋９及び８であった。エキソン２、２＋３、２＋３＋４、３−６、３−９、６、６＋７、７＋８＋９及び８の欠失は新規である。
【０１１１】  ２家族（Ｓａｌ−Ｈａｂ−４３６及びＵＫ１２４１６）については、夫々エキソン２＋３又は６−７のヘテロ接合突然変異が同一染色体に位置しているのか、あるいはこれらの家族の他のメンバーにＤＮＡが不在のために複合ヘテロ接合症例であるのかはっきり断定することができなかった。読み枠に及ぼす上記エキソンの失及び重複の検出と、本願の試料におけるその相対頻度を表４に示す。
【０１１２】  ｆ）反復点突然変異
２家族以上で５個の点突然変異が検出された。これらの突然変異は２０２−２０３ｄｅｌＡＧ（５家族でヘテロ接合又はホモ接合状態）、２５５ｄｅｌＡ（６家族でホモ接合又はヘテロ接合状態）、Ｌｙｓ２１１Ａｓｎ（２家族でヘテロ接合状態）及びＡｒｇ２７５Ｔｒｐ（５家族でヘテロ接合状態）である。
【０１１３】  ｇ）各種突然変異及び複合ヘテロ接合の頻度
パーキン突然変異をもつ家族のうち、８家族でエキソンのホモ接合欠失、１０家族でホモ接合状態の点突然変異、１家族でホモ接合エキソン二重、１家族でエキソン三重が検出された。２１家族の患者は２種の異なる突然変異の複合ヘテロ接合であった（異なる点突然変異３回、点突然変異とエキソン欠失６回、点突然変異と二重２回、三重とエキソン欠失１回、異なる２種のエキソン二重１回及び異なる２種のエキソン欠失６回、表４参照）。２症例では、数個の隣接エキソンの複合欠失がヘテロ接合であるか否かを判定することができず、１３症例（点突然変異６例とエキソン突然変異７例）ではヘテロ接合状態の突然変異しか検出されなかった。
【０１１４】  Ｄ）考察
本発明はパーキン遺伝子の変異体、その診断及び／又は治療的使用、及びパーキン遺伝子の変異（特にヘテロ接合エキソン欠失とエキソン重複）を検出するための技術に関する。
【０１１５】  種々の病原性遺伝子変異（特にエキソンのヘテロ接合欠失、点突然変異、挿入及び重複）が判明し、パーキン遺伝子異常がＡＲ−ＪＰの高頻度原因であることが判った。
【０１１６】  １．ヨーロッパ人３８家族に関する第１試験
第１試験ではパーキン遺伝子における欠失、突然変異及び挿入の存在を検出することができた。
【０１１７】    ホモ接合欠失の病原役割を立証するのは容易であると思われた。記載した２種の突然変異であるエキソン３及びエキソン８−９の欠失では、エキソンの欠失は読み枠シフトを伴い、終結コドンの早期出現をもたらす。選択的スプライシングの不在下では切断タンパク質を生じる。
【０１１８】  エキソン変異体の８個が病原性突然変異である。第１に、これらの突然変異は家族内で疾病と共に分離する。第２に、これらの変異体は９０個の対照染色体でＡＳＯ、ＰＡＧＥ又はＰＣＲ／制限により検出されない。第３に、突然変異の機能的結果は欠失であると思われる。５家族のうちの３家族の患者にホモ接合状態で検出される４種の切断点突然変異（Ｇｌｎ３４Ａｒｇ（Ｓｔｏｐ３７）、Ａｓｎ５２Ｍｅｔ（Ｓｔｏｐ８１）、Ｔｒｐ７４Ｃｙｓ（Ｓｔｏｐ８１）、Ｔｒｐ４５３Ｓｔｏｐ）が疾病の常染色体劣性伝達に従ってパーキンの機能喪失をもたらすことは容易に予想される。４種のミスセンス突然変異のうちの３種はアミノ酸の非保存置換を誘導する。その１種（Ｌｙｓ１６１Ａｓｐ）は他方の対立遺伝子の切断突然変異に関連しているので、病原役割の仮説が裏付けられる。１種のミスセンス突然変異（Ｔｈｒ４１５Ａｓｎ）は保存性であるが、潜在リン酸化部位に関係がある。ミスセンス突然変異の３種は他の突然変異が確認されなかった患者にヘテロ接合状態で存在する。これはヘテロ接合状態の１個以上のエキソンの欠失であると思われ、本試験に使用した技術で可視化することができる。
【０１１９】  検出されたパーキン遺伝子異常は多様であり、突然変異のホットスポットは存在しない。切断点突然変異は（特にユビキチン様モチーフとリングモチーフ“リングフィンガー”を夫々含む）パーキンのＮ及びＣ末端領域に優先的に対応し、ミスセンス型突然変異は中心領域に位置することに留意すべきである。この第１試験に記載した１１種の突然変異のうち、数家族で認められたのは２種だけであった。エキソン３のホモ接合欠失はフランス人家族ＳＡＬ−０２４とポルトガル人家族ＳＡＬ−７１１で検出される。読み枠シフトを伴う突然変異２０２−２０３ｄｅｌＡＧ（Ｇｌｎ３４Ａｒｇ（Ｓｔｏｐ３７））はイタリア人家族ＩＴ−０２０と英国人家族ＵＫ−０８６でヘテロ接合状態で検出される。家族の出自が異なる点は、これらの突然変異が非依存的に突発するという仮説に有利である。
【０１２０】  上記突然変異はアルジェリア、ドイツ、英国、フランス、イタリー及びポルトガルの６カ国の家族で検出された。突然変異をもつ家族の表現型を試験した処、パーキン異常に関連する臨床スペクトルは日本人家族よりも広いことが判明した［Ｋｉｔａｄａら，１９９８］。これらの結果は、遺伝子関係により試験したヨーロッパ人及び北アフリカ人家族での知見［Ｔａｓｓｉｎら，１９９８］を裏付けている。数人の患者では発病年齢が５０歳を越え、最高５６歳である。失調又は下肢錐体路徴候等の所定臨床徴候は数十年間の進行後でも突然変異患者に必ずしも存在しない。全体的に表現型は突然変異の機能的結果に従って分類した患者群で非常に似通っている。他方、失調エピソードの存在はホモ接合欠失患者にしか認められないように思われる。発病年齢、重篤度及び関連徴候の頻度に関して切断点突然変異とミスセンス突然変異の間に有意差がないことは、これらの突然変異における変異アミノ酸がパーキン生理学に重要な役割を果たすことを示唆している。
【０１２１】  結論として、この第１試験はヨーロッパでは早期発病家族性パーキンソン病におけるパーキン遺伝子の突然変異の頻度が高いことを強調している。この遺伝子の異常は後期又は異型パーキンソン病の原因でもある。個別症例におけるパーキンの突然変異又はその多型性の役割は分かっていない。検出された突然変異はその性質も位置も非常に多様である。パーキンにおける突然変異の位置決定試験によると、このタンパク質の多数の領域が未知のその機能に関与していると考えられる。
【０１２２】  ２．エキソン欠失及びエキソン重複の検出方法
まず、パーキン遺伝子におけるヘテロ接合状態のエキソン欠失とホモ接合及びヘテロ接合状態のエキソン重複（例えば、二重、三重）の検出について説明する。エキソン欠失は比較的頻度が高い（後記参照）ので、この側面は有用である。検出方法として、半定量的多重ＰＣＲプロトコールを選択し、開発した。この方法は指数期にＰＣＲ増幅を行うならば遺伝子定量、例えばＰＭＰ２２遺伝子の欠失の検出（ＰｏｒｏｐａｔとＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９９８）に有効であると既に認められている。これらの全実験において、定量の標準として使用する同時増幅対照の選択は重要である（Ｐｒｉｏｒ，１９９８）。実験では、同一個体で多重ＰＣＲ増幅の内部対照として非欠失エキソンを使用する。隣接する２個に欠失がある場合には対照として使用できないので、隣接する２個以上のエキソンを含まないように４又は５個のエキソンの組み合わせを選択した。別の遺伝子（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）のエキソンを３種の組み合わせのうちの１種で同時増幅し、パーキン遺伝子全体のヘテロ接合欠失を同定した。この外部対照はＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎと共に試験したエキソン９の両側のエキソンを含む他の２種の組み合わせで間接的に表した。
【０１２３】  この方法により得られる結果は非常に再現性が高く、異常結果は理論的に予想される因数に対応する因数で比の差を示す。これらの結果は、この方法が迅速なスクリーニングに有効な簡単な方法であることを示している。更に、比較的高頻度（下記参照）のＰＣＲ産物における小欠失又は挿入をこの方法により同時に検出することができる。
【０１２４】  ３．エキソン欠失及びエキソン重複
比較的頻度は低いが、過去にパーキン遺伝子で記載されていない４種のエキソン二重と１種のエキソン三重を同定することができた。更に、１０種の新規エキソン欠失組み合わせが同定され、エキソン２の欠失を立証したのは今回が最初であった。点突然変異とエキソン欠失の相対頻度は約５０％であると推定された。即ち、（ヘテロ接合又はホモ接合）エキソン欠失はパーキンの突然変異の５０％までを占め、本願に記載する技術の有用性が強調される。実際に、この技術は５３家族のうちの２６家族で突然変異を検出することができた。即ち、試料でパーキン遺伝子における点突然変異及び欠失は同一頻度であったが、日本人ではエキソン欠失が大半を占めている（Ｈａｔｔｏｒｉら，１９９８）。記載したエキソン欠失又は重複の機能的結果（読み枠シフト又はインフレーム欠失／重複）はパーキンの公開ｃＤＮＡ配列（Ｋｉｔａｄａら，１９９８）から推定したが、ＰＣＲ産物の不在はエキソン欠失が必ずしも完全に存在することを意味しないので（上記参照）、上記結果は推測に過ぎない。しかし、検出された変異は試験することができた家族で疾病と共に伝達され、複合ヘテロ接合体で点突然変異に関連しており、欠失は点突然変異と似た頻度で同定されるので、このような変異が疾病に関与している可能性は非常に高い。更に、個別症例では、ヘテロ接合欠失と点突然変異の頻度は似通っている。エキソン３の場合には、ＰＣＲ産物が存在しない場合にこのエキソンの変異を示すエキソンプライマーを使用した。更に、症例の一部では、隣接する数個のエキソンを同時に欠失させ、ゲノム欠失を大きくした。
【０１２５】  パーキン遺伝子全体のヘテロ接合欠失又は重複は認められなかった。これはこの遺伝子（Ｋｉｔａｄａら，１９９８）の寸法が非常に大きい（約５００ｋｂ）ために起こりにくいのだと思われる。
【０１２６】  検出されたエキソン欠失はエキソン３〜５の頻度が高い。この知見はヨーロッパ人家族で確認される。更に、単独又は他のエキソンと結合したエキソン２もヨーロッパ人確認で頻度が高いことが判明した（表２）。
【０１２７】  ４．新規点突然変異  ８種の新規点突然変異（ミスセンス６種、切断１種及びナンセンス１種）が同定され、パーキン遺伝子の点突然変異の多様性が増した。記載した突然変異は疾病と共に分離することから明らかなように病原性であり、１２２〜１４７個の対照染色体には検出されない（１１４２−１１４３ｄｅｌＧＡ突然変異は含まない）。２８９位システインがタンパク質の機能に重要なジスルフィド結合に関与しているならば、Ｃｙｓ２８９Ｇｌｙ置換は保存性であるとしても、このアミノ酸置換は重要な欠失結果をもつと思われる。
【０１２８】  興味深いことに、ＵＫ−０４０家族の２人の患者はホモ接合状態のエキソン９におけるＡｒｇ３３４Ｃｙｓミスセンス突然変異、イントロン８の−１７〜−２１位の５塩基対のホモ接合欠失、及びヘテロ接合状態の非保存ミスセンス突然変異Ａｓｐ２８０Ａｓｎの３種の異なる突然変異をもつ（表５参照）。ホモ接合状態のＡｒｇ３３４Ｃｙｓ突然変異は病原性であるが、エキソン９のスプライシング受容部位の近傍のホモ接合状態の５塩基対の欠失も機能的結果を生じると思われる。
【０１２９】  分析した数家族に５種の点突然変異が存在する。より高頻度の３種は２５５ｄｅｌＡ（６家族で検出）、２０２−２０３ｄｅｌＡＧ（５家族で検出）、Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ（５家族で検出）である。フランス人５家族の２５５ｄｅｌＡ突然変異にはファウンダー効果が予想される。しかし、この仮説はハプロタイプの分析によってしか確認できないであろう。
【０１３０】  ５．疫学遺伝
得られた結果は、早期発病パーキンソン病をもつ７７家族のうちの３４家族がパーキン遺伝子の突然変異をもつことを示しており、この遺伝子がヨーロッパ人家族で重要であることを裏付けている。分析した１０２個別症例のうちの１８症例で突然変異が検出されたが、度数が低く、症例によっては分析が不完全であるので、これを解釈するのは難しい。他方、驚くべきことに、分かっている７症例の発病年齢は特に早く（１３〜２２歳）、パーキン遺伝子の突然変異なしに非常に早期に発病する症例（例えば、ＩＴ−ＮＡ−ＪＭＰ−３）は非常に少ないことが分かった。この結果は、年齢が低い場合、特に２５歳以下の場合に個別症例でパーキン遺伝子の突然変異の頻度が増すことを示唆している。小家族では常染色体劣性病が個別症例として出現する全可能性があることを考慮するならば、個別症例でパーキン遺伝子の突然変異が観察されるのは意外ではない。発病年齢によるパーキンの突然変異の頻度を個別症例で正確に決定するためには、もっと大きい試料を分析すると有用であろう。
【０１３１】  フランス、イタリー、英国、ドイツ、オランダ、アルジェリア、ポルトガルの非常に多様な出自の家族で突然変異が同定された。これらの結果は、パーキン遺伝子の突然変異が現在までに試験されている全人種で検出されることを示している。
【０１３２】  ６．ヘテロ接合状態のパーキン遺伝子異常をもつ患者
エキソンのヘテロ接合欠失又にエキソン重複の検出技術により複合ヘテロ接合症例を同定することができたが、家族の約１／４（５３家族のうちの１３家族）では単一突然変異しか検出されなかった。その内訳は、ヘテロ接合状態の点突然変異６症例と、ヘテロ接合状態のエキソン欠失７症例であった。これらの突然変異はアミノ酸の非保存置換又は切断タンパク質を誘導するので、病原役割をもつ可能性が非常に高い。更に、これらのミスセンス型突然変異の１種（Ａｒｇ２７５Ｔｒｐ）は別のヘテロ接合点突然変異（Ｇｌｙ４３０Ａｓｐ）とヘテロ接合エキソン欠失（エキソン３−６又はエキソン５＋６）に関連しており、異なる３家族で他の対立遺伝子に検出される。１３家族では他の対立遺伝子に突然変異が検出されなかったので、検出されない第２の突然変異が遺伝子の別の領域に存在すると考えられる。この仮説は、ＰＡＲＫ２遺伝子座に関係すると予想される６家族で患者が領域の４種のマーカーに対してハロタイプであるために突然変異が全く検出されなかったという事実により裏付けられる。従って、プロモーター領域、非翻訳５‘及び３’領域又はイントロン配列等の遺伝子の他の領域に存在すると考えられる。
【０１３３】  ７．早期発病常染色体劣性パーキンソン病の遺伝子異質性
７７家族のうちの５家族では、パーキン遺伝子座との遺伝子関係を除外することができた。更に、この遺伝子座を明確に排除できなかった２１家族では突然変異が同定されなかった。これらの結果は、ヨーロッパでは早期発病常染色体劣性パーキンソン病をもつ家族に少なくとも１個の別の遺伝子座が存在するらしいということを示唆している。この仮説はＬｅｒｏｙら（１９９８）により提案され、２つに分岐する家族が報告され、一方はパーキン遺伝子の欠失を示すが、他方はこれらの欠失も同一ハプロタイプも示さないため、この遺伝子座との関係が除外される。
【０１３４】  ８．結論
エキソンのヘテロ接合欠失又はエキソン重複の新規検出方法を報告する。特に、エキソン二重／三重とエキソン２及び他のエキソン組み合わせの欠失は新規である。エキソン配列決定と組み合わせることにより、８種の新規点突然変異と、スプライシング部位に関係すると思われるイントロン欠失を同定することができた。即ち、分析した７７家族のうちの３４家族（約５０％）がパーキン遺伝子の突然変異を示す。更に、１９個別症例でこの遺伝子の突然変異が検出された。ヨーロッパ人では、点突然変異とエキソン欠失の割合は等しいと思われる。更に、欠失に関するエキソン３〜５と３種の点突然変異（２０２−２０３ｄｅｌＡＧ、２５５ｄｅｌＡ及びＡｒｇ２７５Ｔｒｐ）に対応する２つの突然変異ホットスポットも判明した。
【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
【表４】
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【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトパーキンをコードするｃＤＮＡの配列。エキソン間の境界を表示する。開始コドン（ａｔｇ）と停止コドン（ｔａｇ）を太字で示す。７６８位のＣ→Ｔ変異を太字と下線で示す。
【図２】  パーキン遺伝子に点突然変異をもつ家族。突然変異と疾病の完全同時分離を示す。黒い四角（男子）と丸（女子）は罹患個体を示し、患者の記号の下に発病年齢（歳）を示す。記号に斜線を引いたものは死亡患者を示す。分析しなかった非罹患兄弟姉妹の数を菱形の中に示す。突然変異（アミノ酸変異）毎に家族のメンバーの遺伝子型（＋／＋野生型ホモ接合、＋／−突然変異ヘテロ接合、−／−突然変異ホモ接合）を示す。各遺伝子型の下に検出結果を示す。ＰＡＧＥ：電気泳動図（対立遺伝子寸法をｂｐで表す）、ＡＳＯ：突然変異及び野生型対立遺伝子のオートラジオグラム、ＰＣＲ／制限：適当な制限酵素による消化後のＰＣＲ産物。フラグメント長（ｂｐ）を示す。Ｍｕｔ：突然変異、ｎｄ：患者に自覚症状がないために発病年齢を決定できなかった。
【図３】  パーキン遺伝子の点突然変異の模式図と位置。１２個のエキソンを含む遺伝子のコーディング配列を示す（棒線）。エキソンを１〜１２の番号で示す。タンパク質へのその作用（切断とミスセンス）に従って８種の病原点突然変異を配置する。ユビキチン様ドメインとリングモチーフ（「リングフィンガー」）を線影で示す。Ｔｈｒ４１５Ａｓｎ及びＴｒｐ４５３Ｓｔｏｐ突然変異については、リン酸化部位（Ｐ）とミリストイル化部位（Ｍ）を示す。ＵＴＲ：非翻訳領域。
【図４】  早発パーキンソン病をもつ家族（ＦＰＤ−ＧＲＥ−ＷＡＧ−１５５）におけるヘテロ接合エキソンの欠失を本発明の半定量的多重ＰＣＲ法により検出した結果を示す。黒い四角（男子）と丸（女子）は罹患個体を示す。ピークは半定量的多重ＰＣＲにより生産されたエキソンを表す。四角内の数字はピーク高を示す。電気泳動図の上部の目盛りはＰＣＲ産物の塩基対寸法を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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