(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0003653801.tif 000009
（上記一般式中、Ｒは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す）で表わされるトリス（ヒドロキシメチル）誘導体のメチロール基を酸化する能力を有するロドコッカス（Rhodococcus ）属もしくはアグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用せしめることを特徴とする、一般式（２）
【化２】
0003653801.tif 000010
（上記一般式中、Ｒは前記の意味）で表わされるジメチロールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcuserythropolis）である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ロドコッカス・エリスロポリスに属する微生物がロドコッカス・エリスロポリス ＳＤ８０６（Rhodococcus erythropolis SD806）株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２１）である請求項２記載の製造法。
【請求項４】
アグロバクテリウム属に属する微生物がアグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７（Agrobacteriumsp. SD807 ）株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２２）である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
微生物を培地中で培養し、得られた培養液、菌体または菌体処理物にトリス（ヒドロキシメチル）誘導体を作用させる請求項１〜４記載のジメチロールカルボン酸誘導体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、水溶性架橋剤として有用な２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸などのジメチロールカルボン酸誘導体を、微生物酸化を用いてトリス（ヒドロキシメチル）誘導体から製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体を酸化して２，２−ビス（ヒドロキシメチル）アルカン酸を製造する化学的な方法は、酸化剤として過酸化水素を用いる方法（特開昭６２−２６３１４１）、過イソ酪酸を用いる方法（有機合成化学協会誌,36,1095 (1978) ）が知られている。しかし、化学的酸化では危険な酸化剤を使用する上、ジメチロールカルボン酸誘導体の収率が低い。また、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を製造する別の化学的な方法としては、白金及び／またはパラジウムを主触媒とする接触空気酸化により、ペンタエリスリトールからトリメチロール酢酸ソーダを合成する方法（特開昭５４−１３８８８６）が開示されているが、高価な白金を用いる必要があり不経済である。従って、微生物的酸化によって、高収率で安価、安全に製造する方法の出現が期待されてきた。
【０００３】
しかしながら、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体は生物の主な代謝経路にないネオペンタン骨格を有するため、生物的酸化が非常に困難である。例えば、同様にネオペンタン骨格を有するペンタエリスリトールを酸化する微生物の存在は、フラボバクテリウム属（特公昭４８−１８８２７）、コリネバクテリウム属又はアースロバクター属（特開昭５２−７２８８２）において、知られているのみであった。しかし、これらの細菌においてさえ、ペンタエリスリトール以外のトリス（ヒドロキシメチル）誘導体の酸化は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物の酸化能力を利用して、常温・常圧にて安全かつ安価で、より高収率かつ高選択率でトリス（ヒドロキシメチル）誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段・作用】
本発明者らは上記課題を解決するべくトリス（ヒドロキシメチル）誘導体を酸化する微生物を広く自然界に求めた。目的の微生物の取得は極めて困難であったが、ついにロドコッカス（Rhodococcus ）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属に属する微生物を得、この細菌を用いることにより高収率で効果的にトリス（ヒドロキシメチル）誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、一般式（１）
【化３】
0003653801.tif 000002
（式中、Ｒは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す）で表わされるトリス（ヒドロキシメチル）誘導体のメチロール基を酸化する能力を有するロドコッカス（Rhodococcus ）属もしくはアグロバクテリウム（Agrobacterium ）属に属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用せしめることを特徴とする、一般式（２）
【０００７】
【化４】
0003653801.tif 000003
（上記一般式中、Ｒは前記の意味）で表わされるジメチロールカルボン酸誘導体の製造方法を提供したものである。
【０００８】
本発明の製造法で使用される微生物のうち代表的な菌株であるロドコッカス・エリスロポリス  ＳＤ８０６株の性状を表１に示した。本菌株は、赤色系のコロニーを形成すること、多極出芽により増殖し、子のう胞子を形成しないこと、糖の発酵性をまったく有さないことなどから、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）と同定された。本菌株はロドコッカス・エリスロポリス  ＳＤ８０６（Rhodococcus erythropolis  ＳＤ８０６）株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４９５６号として寄託されている。
【０００９】
【表１】
0003653801.tif 000004
【００１０】
さらに、アグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７の性状を表２に示した。本菌株は、周毛による運動性を有すること、グラム陰性の桿菌であること、３−ケトラクトースを生成すること、エタノールから酸を生成しないことなどから、Agrobacterium biovar 3  ではないかと考えられたが、マロン酸ナトリウムからアルカリを産生せず、リトマスミルクを酸化することから性状が完全には一致せず、種の確定には至らなかった。本菌株はアグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７（Agrobacterium sp.   ＳＤ８０７）株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４９５７号として寄託されている。
【００１１】
【表２】
0003653801.tif 000005
【００１２】
本発明記載の微生物を用いることで、例えば１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンを酸化して、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸を製造することができる。このとき、突然変異株の中から、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸生産性の増大したものを選択して用いることもできる。
このような突然変異体としては、例えば、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸に対する耐性の向上した変異株、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸を分解しなくなった２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸非資化変異株などが挙げられる。
【００１３】
このような突然変異体の取得方法としては、通常、栄養細胞、例えば、栄養培地で３０℃で２〜３日間程度振とう培養し得られた細胞を使用して変異誘起処理すればよい。突然変異源としては、一般に変異誘起化合物として知られている、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤、５−ブロモウラシル（５ＢＵ）等の塩基アナログ、ジメチルアミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム（ＤＡＰＡ）、アザセリンやアクリジンオレンジなどおよび紫外線が用いられる。ＤＡＰＡの場合は、栄養源存在下で増殖させながら処理し、また他の変異誘起化合物や紫外線の場合には細胞を生理食塩水やリン酸緩衝液等に懸濁して処理を行う。
【００１４】
これら人工突然変異による２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸生産性に関する特性は、各々単一の特性を付しても効果があるが、これらを組合せ複合した特性を有する変異株を得ることによって著しい生産性の向上を見ることが可能である。
【００１５】
本発明記載の菌株は、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体のヒドロキシメチル基酸化に係わる酵素をコードする遺伝子の取得源としても有用である。目的遺伝子を有するクローンの選択のためには、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンからの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸生成に伴うｐＨの下降を指標にして行う。すなわち、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン、適当な栄養源、ｐＨインジケーターを混入した寒天平板培地に処理後の細胞を塗布して培養し、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸生成によるｐＨの下降に伴うｐＨインジケーターの色調変化を認めるコロニーを釣菌する。こうして得られたクローンのなかに、高頻度で求めるトリス（ヒドロキシメチル）誘導体酸化能を有する株を見いだすことができる。
【００１６】
本発明において微生物の培養に用いる培地の炭素源・窒素源としては、菌株が資化し生育できる炭素化合物・窒素化合物であればいずれでも使用可能である。ヒドロキシメチル基酸化酵素の誘導は不用であり、通常の培養後、直ちに１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンなどを添加して酸化反応を進行させることができる。
【００１７】
培養は通常、好気的条件下、２０〜３５℃の温度範囲、好ましくは２７〜３２℃の温度範囲で行われる。培養時間は培地組成、培養条件により異なるが、通常１〜３日間で行われる。培養時のｐＨは６．０〜８．０の範囲、好ましくは６．４〜７．６の範囲で行われる。
【００１８】
本発明におけるジメチロールカルボン酸誘導体製造は、培養後の菌体を培養液から分離し、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体を含む緩衝液等に再懸濁して反応させる、いわゆるレスティング・セル・サスペンジョン法によっても可能である。この方法によれば、液中に培地成分や菌の代謝産物が少ないため、ジメチロールカルボン酸誘導体の分離、精製が容易である。
【００１９】
培養した菌体は遠心分離などの方法によって集めることができる。これに、例えば、リン酸、酢酸などとその塩を混合した緩衝液または水を加えて懸濁する。緩衝液の濃度は５０〜２００ｍＭ程度で行なう。反応時の溶液のｐＨは６．０〜８．０の範囲、好ましくは６．４〜７．２の範囲で行う。
【００２０】
菌体懸濁液に加える基質トリス（ヒドロキシメチル）誘導体の濃度は  ０．５〜１００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１０ｇ／ｌの濃度で行う。反応は好気的条件下、反応温度は２０〜３５℃の温度範囲、好ましくは２７〜３２℃で行う。反応中にｐＨが変動するが、ｐＨのコントロールを行うことが望ましい。
【００２１】
本発明におけるトリス（ヒドロキシメチル）誘導体としては、下記一般式（１）
【化５】
0003653801.tif 000006
（上記一般式中、Ｒは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す）で表わされるトリス（ヒドロキシメチル）誘導体であれば特に制限はないが、Ｒがアルキル基の場合、炭素数が１〜２０の炭素鎖を有するものが好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。又、Ｒが水酸基を有するアルキル基の場合、炭素数が１〜２０の炭素鎖を有するもので、その任意の炭素に１以上の水酸基を有するものが好ましく、ヒドロキシメチル基が特に好ましい。
【００２２】
なお、本発明の製造法において、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体、ジメチロールカルボン酸誘導体の検出および定量は、 Showdex KC-811 カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって行なった。
【００２３】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
表３に示す培地１の組成の培地（Ｌ培地）に１．８％寒天を加えた固形培地上で生育したロドコッカス・エリスロポリス  ＳＤ８０６株、アグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７株の菌体を用いて、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン、もしくは１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパン、もしくはペンタエリスリトール、もしくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを１％の濃度で含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液をそれぞれ調整した。反応液の濁度は、６６０ｎｍでの吸光度で１．０であった。これを、３０℃で４０時間振とうし反応を行った。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、それぞれの基質由来の、ヒドロキシメチル基が酸化された物質の生成・蓄積を認めた。
【００２４】
【表３】
0003653801.tif 000007
【００２５】
（実施例２）
表３に示す培地１の組成の培地２００ｍｌにロドコッカス・エリスロポリス  ＳＤ８０６株の菌体を１白金耳接種し、３０℃で２日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンを５ｇ含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーを１リッター加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整した。反応液の濁度は、６６０ｎｍでの吸光度で０．８であった。これを、３０℃で２４時間振とうした。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、３．３ｇの１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンが酸化分解され、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオンアルデヒドが１．１ｇ、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸が２．０ｇ生成していた。
【００２６】
（実施例３）
表３に示す培地２の組成の培地５ｍｌにアグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７株の菌体を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンを５ｇ／ｌの濃度で含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、３０℃で振とうした。反応液の濁度は、６６０ｎｍでの吸光度で０．２であった。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、反応開始後６６時間で４．９ｇ／ｌの１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンが酸化され、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオンアルデヒドが０．１ｇ／ｌ、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸が４．８ｇ／ｌ生成していた。１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンから２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸への変換率は約８８％である。
【００２７】
（実施例４）
表３に示す培地３の組成の培地１０ｍｌにアグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７株の菌体を１白金耳接種すると同時に、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンを０．５ｇ添加した。３０℃の好気的環境で培養と反応を行い、６６０ｎｍでの吸光度と反応液組成の経時変化を調べた。２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸生成に伴いｐＨが低下するため、１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨ６．８にコントロールした。培養・反応開始後２０時間での菌体の濁度は２．０に至りその後菌体量はほぼ一定となった。１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン量は培養・反応開始後３０時間まで直線的に減少し、同時に２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸が蓄積した。培養・反応開始後３０時間では、０．４ｇの１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンが酸化され、０．４１ｇの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸が生成蓄積していた。１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンから２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸への変換率は約９３％である。
【００２８】
（実施例５）
Ｌ寒天培地上に生育したアグロバクテリウム・ｓｐ．ＳＤ８０７株の菌体を５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで洗浄の後、これをトリス（ヒドロキシメチル）誘導体を５ｇ／ｌの濃度で含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーに加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、３０℃で６時間振とうした。反応液の濁度は、６６０ｎｍでの吸光度で１．０であった。反応後に液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、それぞれからの酸化物の生成蓄積速度を算出した結果を表４に示した。
【００２９】
【表４】
0003653801.tif 000008
【００３０】
【発明の効果】
本発明によりロドコッカス属、アグロバクテリウム属に属し、トリス（ヒドロキシメチル）誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を生成する能力を有する微生物を使用して、ジメチロ−ルカルボン酸誘導体を効率良く安全に製造することが可能である。