(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
{２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル}［（４−クロロフェニル）メチル］アミン、{２−［（２−アミノプロピル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル}［（４−クロロフェニル）メチル］アミン、２−［（２−アミノエチル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］エタン−１−オル、２−［（２−ヒドロキシエチル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］エタン−１−オルからなる群から選択される、１つの化合物。
【請求項２】
該化合物が、{２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル}［（４−クロロフェニル）メチル］アミンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該化合物が、{２−［（２−アミノプロピル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル}［（４−クロロフェニル）メチル］アミンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
該化合物が、２−［（２−アミノエチル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］エタン−１−オルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
該化合物が、２−［（２−ヒドロキシエチル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］エタン−１−オルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物の陽イオン塩。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物の酸付加塩。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を包含する、哺乳動物における細胞増殖を阻害するための薬剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の該化合物を、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲内の適用量となるように包含する、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を、リューマチ様関節炎、狼瘡、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、癌、バルーン血管形成または粥腫切除術に続く再狭窄、血管改質手術手段に続く再狭窄、宿主移植片疾患および通風からなる群から選択される細胞増殖疾患を有する哺乳動物に投与するための、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１１】
細胞増殖疾患は再狭窄である請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
細胞増殖疾患は癌である請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１３】
細胞増殖疾患はリンパ球様新生物、結腸の癌、胸部癌、卵巣癌、膵臓癌、および上皮細胞から誘導される癌から構成される群から選択される、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１４】
細胞増殖疾患は多嚢胞性腎疾患である、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１５】
哺乳動物がヒトである請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物および１種類以上の製薬上の賦形剤を含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、順次１９９６年８月２日に提出された米国特許出願第０８／６９２，０１２号の部分継続である１９９７年８月１日に提出されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３３８６号に対する優先権を主張する１９９９年１月２９日に提出された米国特許出願第０９／２３０，８２９号の部分継続である。
【０００２】
（１）発明の分野
本発明は、細胞サイクルキナーゼの選択的阻害剤であることが発見されている２，６，９−トリ置換プリンに関係し、それらの化合物は、それ自体が、細胞増殖の阻害剤である。２，６，９−トリ置換プリンは、自己免疫病、たとえばリューマチ様関節炎、狼瘡、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症などの治療、および癌、再狭窄などの心臓病、宿主対移植片疾患、通風、多嚢胞性腎臓病および病因に異常な細胞増殖が関わっているその他の病気の治療に有用である。
【０００３】
本発明は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいて、シグナルによって誘発されＮＦ−κＢの活性化とサイトカイン合成を阻止するＩκＢ−αキナーゼの効果的で特異的な阻害剤であることが見つかっている２，６，９−トリ置換プリンにも関する。この種の阻害剤は、サイトカインの合成およびＮＦ−κＢによってその合成が転写的に調節される接着タンパク質の合成を阻害することが期待される。ＩＬ−１、ＩＬ−６，ＴＮＦのような前炎症サイトカインおよび接着タンパク質（たとえばＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよびセレクチン）はこのクラスの分子に属し、炎症性疾患の病因に関わっている。そのようなわけで、ＩκＢ−αキナーゼの効果的な阻害剤は、誘発にＮＦ−κＢ活性化を必要とする病気を臨床的に管理する上で有用である。
【０００４】
（２）従来の技術
ここ数年、分子生物学および細胞生物学の進歩により、細胞増殖の機構および有糸分裂を介して細胞が進展する過程で起こる特異的現象の機構に関する理解が深まってきた。たとえば、Ｌ．  マイヤー（Ｍｅｉｊｅｒ）、Ｓ．  ギデ（Ｇｕｉｄｅｔ）およびＨ．Ｙ．Ｌ．トウン（Ｔｕｎｇ）編、「細胞サイクルに関する研究の進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」第１巻  、プレナム社刊、ニューヨーク、１９９５年を参照。これらの研究から、細胞サイクルの進展は、サイクリン依存性キナーゼと呼ばれる一群のセリン／スレオニンキナーゼによって制御されていることが明らかになっている。これらの酵素は（ａ）ＡＴＰを基質とするサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれる触媒タンパク質と（ｂ）サイクリンと呼ばれる調節タンパク質とを含んでいる。サイクリンとＣＤＫの組み合わせの違いによって、成長、ＤＮＡの複製、細胞分裂などの現象を制御している。酵素の中のＣＤＫ群のカギになるメンバーはＣＤＫ２である。そしてそのＣＤＫ２はＧ１／Ｓの境界における哺乳類の細胞サイクルの進展に不可欠であることが明らかにされている。ＣＤＫ２に対抗する抗体を微量注入するとヒト二倍体繊維芽細胞の細胞サイクルＳ相への進行が阻止される。ヒト骨肉腫における優勢な負のＣＤＫ２変異体の発現は似たような効果を持っている。これらの研究は、共に、細胞のＣＤＫ２活性が有糸分裂サイクルを通して行われる細胞の進展を阻止し、Ｓ相の前で成長の停止を誘発することになることを指摘している。この見方に一致して、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、（２−（ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリン）を使ったイン・ビトロでの研究は、この物質がＩＣ５０が約２．１μｇ／ｍｌのＣＤＫ２の特異的阻害物質であることを明らかにしている：Ｊ．ヴェスリ（Ｊ，Ｖｅｓｌｙ）ほか；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４，７７１−７８６（１９９４）およびＬ．  マイヤー（Ｌ．Ｍｅｉｊｅｒ）、Ｓ．ギデ（Ｓ．Ｇｕｉｄｅｔ）およびＨ．Ｙ．Ｌ．トウン（Ｈ．Ｙ．Ｌ．Ｔｕｎｇ）編、「細胞サイクルに関する研究の進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」第１巻  、プレナム社刊、ニューヨーク、１９９５年の中のＬ．マイヤー「サイクリン依存キナーゼの化学阻害剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅｓ）、３５１−３５６ページを参照。哺乳動物細胞を使用した培養でのイン・ビボの研究で、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）が約５０μｇ／ｍｌの濃度で細胞の増殖を阻害することが明らかにされている。
【０００５】
本発明において、発明者は、生物活性がオロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）よりかなり高い数種類の化合物を開発した。哺乳動物の細胞を使用したイン・ビボの実験は、開示した化合物のいくつかがオロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）より有意に低い濃度で細胞の増殖を阻害することを示している。
【０００６】
最近、刺激を受けたヒト臍静脈内皮細胞の細胞質におけるＩκＢ−αキナーゼの活性が報告されている（ベネットら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１９６８０−１９６８８）。本発明の化合物のいくつかは、イン・ビトロとイン・ビボでシグナルによって誘発されるＮＦ−κＢの活性化とサイトカインの合成を阻止するＩκＢ−αキナーゼの効果的で特異的な阻害物質であることが確認されている。ヘテロ二量体である転写因子ＮＦ−κＢの活性化は複雑な過程である。刺激を受けていない細胞ではＮＦ−κＢ（ｐ５０／ｐ６５）ヘテロ二量体はサイトゾルに存在し、そこで阻害サブユニットＩκＢ−αと複合体を形成している。このように、ＩκＢ−αはＮＦ−κＢとの結合によって、核局在化シグナルを発して核への転位を阻止する。様々なシグナル（たとえばリポ多糖）で細胞を刺激するとＩκＢ−αは速やかにリン酸化され、ユニクイットネイト（ｕｎｉｗｕｉｔｉｎａｔｅ）され、プロテアソームによって分解される。ＩκＢ−αの分解によってＮＦ−κＢの核への転位が可能となり、転位したＮＦ−κＢはいくつかの炎症応答遺伝子の転写を活性化する。
【０００７】
これらの観察は、ＩκＢ−αキナーゼが、病気の誘導にＮＦ−κＢの活性化が必要な炎症性疾患の治療に有用となるかもしれない阻害物質を同定するための魅力的なターゲットであることを示唆している。
【０００８】
（発明の要約）
本発明の目的は、サイクリン依存性キナーゼ２を阻害する２，６，９−トリ置換プリン化合物を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、細胞の増殖を阻害するために有用な２，６，９−トリ置換プリン化合物を提供することにある。
【００１０】
さらに、本発明は、２，６，９−トリ置換プリン化合物と製薬的に許容される担体とからなることを特徴とする製薬組成物を構成する。
【００１１】
さらにまた、本発明は、投薬を必要とする哺乳動物に効果的な量の２，６，９−トリ置換プリン化合物を投与することを特徴とする細胞増殖を阻害する方法を構成する。
【００１２】
１つの実施例において、本発明は次式で表される２，６，９−トリ置換プリン組成物である：
【化４】
0003681984.tif 000002
式中、Ｒ１は、ハロゲンまたはＲ’１−Ｘ（式中、Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ２））である。組成物中、Ｒ’１は、アルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルであり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ＣＦ３、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている。さらに、組成物では、Ｒ２は、水素、または基アルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニルおよびアルケニルから選択される炭化水素であり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている。さらに、組成物では、Ｒ３は、水素、水酸、チオ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキル、−ＮＲ４Ｒ５または式：
【化５】
0003681984.tif 000003
式中、ｍ＝１−３、ｎ＝１−３、ｏ＝１−３；Ｙ＝カルボニル、−ＮＲ４Ｒ５、ヒドロキシル、チオ、アルコキシ、アルキルチオールであり、
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、水素、ＯＲ２０、ＮＲ２０Ｒ２３、またはアルキル、アシル、複素環、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルを含む群から選択される炭化水素であり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、アシル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；
Ｒ２０は、Ｈ、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、およびヘテロアリールは、ハロ、アルキル、モノ−またはジアルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＣＮ、Ｏ−Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、アリール、およびヘテロアリールから独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；
Ｒ２１は、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、およびヘテロアリールは、ハロ、複素環、アリール、ヘテロアリール、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２０、ＳＲ２０、Ｎ（Ｒ２０）２、Ｓ（Ｏ）Ｒ２２、ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮ（Ｒ２０）２、Ｎ（Ｒ２０）２ＮＲ２０ＣＯＲ２２、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＮＲ２０ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＮＲ２０Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＣＯＲ２０、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、およびＯＸＯＮ（Ｒ２０）２から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されており、そして各任意のヘテロアリール、アリールおよび複素環置換基は、任意に、ハロ、アルキル、ＣＦ３、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＮＣＯＲ２２、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＣＯＲ２０、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＮＲ２０ＣＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２０）２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２２、ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＣＮ、またはＯＲ２０で置換されている；
Ｒ２２は、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、およびヘテロアリールは、ハロ、アルキル、モノ−またはジアルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＣＮ、Ｏ−Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、アリールおよびヘテロアリールから独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；および
Ｒ２３は、Ｒ２１またはＨである。
【００１３】
本発明の組成物の範囲に対するある程度の限定がある。Ｙがカルボニルである場合、ＹおよびＲ’４は、一緒になって、単独の酸素原子であってよく、Ｒ４”およびＲ５”は、一緒になって、単独の酸素原子であってよく、Ｒ４”’およびＲ５”’は、一緒になって、単独の酸素原子であってよい。Ｒ３が、２−ヒドロキシエチルアミノであり、そしてＲ２が、メチルである場合、Ｒ１’−Ｘは、アミノ、３−メチル−２−ブテニルアミノ、ベンジルアミノでないか、またはＲ３が、２−ヒドロキシエチルアミノでない場合、ｍ−ヒドロキシベンジルアミノでない。Ｒ２が、イソプロピルである場合、Ｒ１’−Ｘは、ベンジルアミノ、ｍ−ヒドロキシベンジルアミノ、または３−メチルブチルアミノでない。Ｒ３が、２−ヒドロキシエチルメチルであり、そしてＲ２が、２−ヒドロキシエチルである場合、Ｒ１’−Ｘは、ベンジルアミノでなく；そしてＲ３が、２−メチル−２−ヒドロキシプロピルアミノ、および２−ジメチルアミノエチルアミノから構成される群から選択される、そしてＲ２がメチルである場合、それによりＲ１’−Ｘは、ベンジルアミノでない。
【００１４】
別の実施例において、本発明は、特許請求項１の組成物の製薬的に効果的な量を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の細胞増殖を阻害する方法である。この方法は、リューマチ様関節炎、狼瘡、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、癌、再狭窄、宿主対移植片疾患および通風などの細胞増殖疾患を治療するのに有用である。
【００１５】
さらに別の実施例において、本発明は、１種類以上の賦形剤と混合した上述の組成物からなる製薬組成物である。
【００１６】
さらに別の実施例において、本発明は、ヒト、動物および植物の真菌類による感染症（真菌類）の治療に有用な組成物である。
【００１７】
（本願実施例の説明）
本発明は、次式で表される２，６，９−トリ置換プリン化合物である：
【化６】
0003681984.tif 000004
式中：
Ｒ１は、ハロゲンまたはＲ’１−Ｘ（式中、Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ２））である。
【００１８】
Ｒ’１は、アルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルであり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ＣＦ３、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；
Ｒ２は、水素、または基アルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニルおよびアルケニルから選択される炭化水素であり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；
Ｒ３は、水素、水酸、チオ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキル、−ＮＲ４Ｒ５または式：
【化７】
0003681984.tif 000005
（式中、ｍ＝１−３、ｎ＝１−３、ｏ＝１−３；ｙ＝カルボニル、−ＮＲ４Ｒ５、水酸基、チオール、アルコキシ、アルキルチオール）
を有する構成要素である；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、水素、ＯＲ２０、ＮＲ２０Ｒ２３、またはアルキル、アシル、複素環、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルを含む群から選択される炭化水素であり、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、アシル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、ハロ、アリール、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、Ｎ（Ｒ２０）Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；ただし、Ｙがカルボニルである場合、ＹおよびＲ’４は、一緒になって、単独の酸素原子であってよく、Ｒ４”およびＲ５”は、一緒になって、単独の酸素原子であってよく、Ｒ４”’およびＲ５”’は、一緒になって、単独の酸素原子であってよく、そしてＲ３が、２−ヒドロキシエチルアミノであり、そしてＲ２が、メチルである場合、Ｒ１’−Ｘは、アミノ、３−メチル−２−ブテニルアミノ、ベンジルアミノ、またはｍ−ヒドロキシベンジルアミノでなく；Ｒ３が、２−ヒドロキシエチルアミノでなく、Ｒ２が、イソプロピルである場合、Ｒ１’−Ｘは、ベンジルアミノ、ｍ−ヒドロキシベンジルアミノ、または３−メチルブチルアミノでなく；Ｒ３が、２−ヒドロキシエチルメチルであり、そしてＲ２が、２−ヒドロキシエチルである場合、Ｒ１’−Ｘは、ベンジルアミノでなく；そしてＲ３が、２−メチル−２−ヒドロキシプロピルアミノ、および２−ジメチルアミノエチルアミノから構成される群から選択される、そしてＲ２がメチルである場合、それによりＲ１’−Ｘは、ベンジルアミノでない。
【００１９】
組成物中では、Ｒ２０は、Ｈ、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、およびヘテロアリールは、ハロ、アルキル、モノ−またはジアルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＣＮ、Ｏ−Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、アリール、およびヘテロアリールから独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている。
【００２０】
さらに、組成物中では、Ｒ２１は、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、およびヘテロアリールは、ハロ、複素環、アリール、ヘテロアリール、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２０、ＳＲ２０、Ｎ（Ｒ２０）２、Ｓ（Ｏ）Ｒ２２、ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＲ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯＮ（Ｒ２０）２、Ｎ（Ｒ２０）２ＮＲ２０ＣＯＲ２２、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＮＲ２０ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＮＲ２０Ｃ（ＮＲ２０）ＮＨＲ２３、ＣＯＲ２０、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２２、ＯＲ２０、ＯＣＯＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、およびＯＣＯＮ（Ｒ２０）２から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されており、そして各任意のヘテロアリール、アリールおよび複素環置換基は、任意に、ハロ、アルキル、ＣＦ３、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＮＣＯＲ２２、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２２、ＣＯＲ２０、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮ（Ｒ２０）２、ＮＲ２０ＣＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２０）２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２２、ＳＯ２Ｒ２２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ２０）２、ＣＮ、またはＯＲ２０で置換されている。
【００２１】
組成物中では、Ｒ２２は、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ２−１５アルケニル、Ｃ２−１５アルキニル、複素環、アリールおよびヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、アリール、およびヘテロアリールは、ハロ、アルキル、モノ−またはジアルキルアミノ、アルキルまたはアリールまたはヘテロアリールアミド、ＣＮ、Ｏ−Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、アリールおよびヘテロアリールから独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されている；およびＲ２３は、Ｒ２１またはＨである。
【００２２】
Ｒ’１は、好ましくは、各々が、置換としては、ハロ、ＣＦ３、アリール、Ｒ２２、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＯＲ２０、ＣＮから構成される群から独立に選択される１から２個の置換基での任意の置換が挙げられる場合に６個の炭素原子を有するアリール、置換アリールであり；各々が、置換としては、ハロ、ＣＦ３、アリール、Ｒ２２、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＯＲ２０、ＣＮから構成される群から独立に選択される１から２個の置換基での任意の置換が挙げられる場合に６−８個の炭素原子を有するアラルキル、置換アラルキルであり；フェニル環が、ハロ、ＣＦ３、Ｒ２２、ＯＲ２０、ＣＮから構成される群から独立に選択される１から２個の置換基での任意に置換される場合に−ＣＨ２−フェニルであり；置換ピリジルアルキル；未置換ピリジルアルキル；ピリジル；置換ピリジル；およびハロゲン、アルコキシ、フェニル、ピリジルまたはニトロ基で置換されたベンジルである。ある種の組成物では、Ｒ１’は、好ましくはＣＨ２−アリールまたはＣＨ２−置換アリールである。最も好ましくは、Ｒ１’は、３−メチルチオフェニル、４−メチルチオフェニル、４−フェニルベンジル、４−メトキシベンジル、４−ビフェニル、３−メトキシベンジル、４−（２−チエニル）ベンジル、４−（４−メチル）フェニルベンジル、４−（４−トリフルオロメチル）フェニルベンジル、４−（４−ニトリロ）フェニルベンジル、４−（２−ピリジニル）ベンジル、ピペロニル、３−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、および４−ニトロベンジルから選択される。
【００２３】
Ｒ２は、好ましくは、水素、または各々が、置換としては、ハロ、Ｒ２２、ＮＲ２０Ｒ２３、ＯＲ２０から構成される群から独立に選択された１から２個の置換基での任意の置換が挙げられる１から６個の炭素原子を有する基、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキルから選択される炭化水素であり；各々が、置換としては、ハロ、Ｒ２２、ＮＲ２０Ｒ２３、ＯＲ２０から構成される群から独立に選択された１から２個の置換基での任意の置換が挙げられる１から６個の炭素原子を有する置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキルである。さらに好ましくは、Ｒ２は、イソプロピルである。
【００２４】
Ｒ３は、Ｒ４およびＲ５が、各々、水素、アルキル、複素環、アシル、アリール、ヘテロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニルから構成される群から選択され、各々は、１から２０個までの炭素原子を有し、そのアルキル、アシル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアリールアルキルは、ハロ、アリール、ヘテロアリール、複素環、Ｒ２２、ＳＲ２０、Ｓ（Ｏ）Ｒ２１、ＳＯ２Ｒ２１、ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＣＯＲ２１、ＮＲ２０ＣＯ２Ｒ２１、ＮＲ２０ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、ＮＲ２０ＳＯ２Ｒ２１、ＯＲ２０、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ２０、ＣＯＮＲ２０Ｒ２３、およびＣＯＲ２０から構成される群から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されているとき−ＮＲ４Ｒ５であるのが好ましい。ある種の組成物では、Ｒ４およびＲ５は、Ｒ’が、水素または１から６個の炭素原子を有するアルキルであるとき、各々Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨＲ’ＣＨ２ＯＨ、または−ＣＨ２ＣＨＲ’ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨＲ’ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨＣＨＲ’ＮＨ２であるのが好ましい。
【００２５】
Ｒ２０は、Ｈ、Ｃ１−８アルキルから構成される群から選択される構成員である。
【００２６】
Ｒ２１は、Ｃ１−３アルキルから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキルは、ハロ、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２０、ＳＲ２０、Ｎ（Ｒ２０）２の群から独立に選択される１から２個の置換基で任意に置換されるのが好ましい。
【００２７】
Ｒ２２は、Ｃ１−３アルキル、アリール、ヘテロアリールから構成される群から選択される構成員であり、そのアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロ、アルキル、モノ−またはジアルキルアミノ、アルキルまたはアリール、ＣＮ、Ｏ−Ｃ１−６アルキル、およびＣＦ３から独立に選択される１から３個の置換基に任意に置換されているのが好ましい。
【００２８】
本発明の好ましい２，６，９−トリ置換プリン組成物としては、２−｛（２−ヒドロキシエチル）［９−（メチルエチル）−６−（｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝アミノ）プリン−２−イル］アミノ｝エタン−１−オル、｛（（２Ｓ）オキソラン−２−イル）メチル｝（６−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、［（（２Ｒ）オキソラン−２−イル）メチル］（６−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、（２−アミノエチル）（６−｛［３，５−ジクロロフェニル］メチル｝アミノ）−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、（２−アミノエチル）（６−｛［３，５−ジクロロフェニル］メチル｝アミノ）−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、（２−アミノエチル）（６−（｛［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝アミノ）−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、［−［（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］−３−メチルブタンアミド、（２−アミノ−２−メチルプロピル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミン、３−（２−［ビス（２−ヒトロキシエチル）アミノ］−６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝プリン−９−イル）ブタン−２−ワン、２−［（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］−３−メチルブタン−１−オル、４−［（｛２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝アミノ）メチル］ベンゼンスルホンアミド、２−［（２−ヒドロキシメチル）（６−｛［（４−メトキシフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−６−イル）アミノ］エタン−１−オル、２−（（２−ヒドロキシエチル）｛９−（メチルエチル）−６−［（４−フェニルフェニル）アミノ］ピリン−２−イル｝アミノ）エタン−１−オル、｛２−［（２−アミノ−２−プロピル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−ホロフェニル）メチル］アミン、｛２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミン、｛２−［（２−アミノプロピル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミンおよび２−［（２−アミノエチル）（６−｛［（４−クロロフェニル）メチル］アミノ｝−９−（メチルエチル）プリン−２−イル）アミノ］エタン−１−オルが挙げられる。
Ｒ１、Ｒ１′、Ｒ２、Ｒ３の範囲には若干の制限がある。上記のように、Ｒ３が２−ヒドロキシルエチルアミノ、Ｒ２がメチルの時は、Ｒ１′−Ｘはアミノ、３−メチル−２−ブテニルアミノ、ベンジルアミノまたは３−ヒドロキシベンジルアミノであることはできない。Ｒ３が２−ヒドロキシエチルアミノ、Ｒ２がイソプロピルの時は、Ｒ１′−Ｘはベンジルアミノ、ｍ−ヒドロキシベンジルアミノまたは３−メチルブチルアミノであることはできない。Ｒ３が２−ヒドロキシルエチルアミノ、Ｒ２が２−ヒドロキシエチルの時は、Ｒ１′−Ｘはベンジルアミノであることはできない。Ｒ３が２−プロパノール−２−メチルアミノまたは２−ジメチルアミノエチルアミノからなるグループから選択され、Ｒ２がメチルの時は、Ｒ１′−Ｘはベンジルアミノであることはできない。
【００２９】
以下では、本特許で使用されるいくつかの用語の定義について説明する。
【００３０】
「ハロ」または「ハロゲン」単独、または組合せは、全てのハロゲンを意味し、すなわち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）、ヨード（Ｉ）である。
【００３１】
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を表す。
【００３２】
「チオール」または「メルカプト」という用語は、−ＳＨ基を表す。
【００３３】
「アルキル」単独、または組合せは、１から２０個、好ましくは１から１５個の炭素原子（特に定義されない限り）を含むアルケン由来の基を意味する。それは、直鎖アルキル、分岐アルキルまたはシクロアルキルである。好ましくは、直鎖または分岐アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル等のような、１から１５個まで、好ましくは１から８個まで、いっそう好ましくは１−６個、さらにいっそう好ましくは１−４個、そして最も好ましくは１−２個の炭素原子を有する。用語「低級アルキル」は、すぐ上記の直鎖アルキル基を記載するためにここで使用される。好ましくは、シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等のような環当たり３−８個、より好ましくは３−６個の環員の１環、２環または３環系である。アルキルとしては、シクロアルキル部分を含むか、またはそれに中断される直鎖または分岐アルキル基が挙げられる。直鎖または分岐アルキル基は、安定な化合物を生成するための任意の利用可能な点で付着される。この例としては、それに限定されないが、４−（イソプロピル）−シクロヘキスルエチルまたは２−メチル−シクロプロピルペンチルが挙げられる。置換アルキルは、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換したアミノ；アミジノ；アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環基で任意に置換された尿素；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されたアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１から３個の基または置換基で独立に置換した、先に定義された直鎖アルキル、分岐アルキル、またはシクロアルキル基である。
【００３４】
「アルケニル」単独、または組合せは、２−２０個、好ましくは２−１７個、さらに好ましくは２−１０個、さらにいっそう好ましくは２−８個、最も好ましくは２−４個の炭素原子、および少なくとも１個、好ましくは１−３個、さらに好ましくは１−２個、最も好ましくは１個の炭素対炭素二重結合を含む直鎖、分岐または環状炭化水素を意味する。シクロアルキル基の場合には、１個以上の炭素対炭素二重結合の接合は、環に芳香族性を供与するようにではない。炭素対炭素二重結合は、シクロアルキル部分何に、シクロプロピル以外で含有されるか、または直鎖または分岐部分内に含まれるかのいずれかである。アルケニル基の例としては、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキセニルアルキル等が挙げられる。置換アルケニルは、安定な化合物を生成する任意の利用可能な点で付着したハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換したアミノ；アミジノ；アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環基で任意に置換された尿素；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されたアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル等が挙げられる。
【００３５】
「アルキニル」単独または組合せでは、少なくとも１個、好ましくは１個の炭素対炭素三重結合を含む２−２０個、好ましくは２−１７個、さらに好ましくは２−１０個、いっそうさらに好ましくは２−８個、最も好ましくは２−４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐炭化水素を意味する。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル等が挙げられる。置換アルキニルは、安定な化合物を生成する任意の利用可能な点で付着したハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換されたアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環基で任意に置換された尿素；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されたアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１から３個の基または置換基で独立に置換された、先に定義される直鎖アルキニル、または分岐アルケニルに該当する。
【００３６】
「アルキルアルケニル」という用語は、−Ｒ−ＣＲ′＝ＣＲ″′Ｒ″″で表され、Ｒは低級アルキルまたは置換された低級アルキル基であって、Ｒ′、Ｒ″′、Ｒ″″は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、低級アルキル、置換された低級アルキル、または以下に定義されている、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリールであってもよい。
【００３７】
「アルキルアルキニル」という用語は、−ＲＣ≡ＣＲ’基を表し、そしてＲは低級アルキルまたは置換された低級アルキル、Ｒ’は水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、または以下に定義されている、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリールを表す。
【００３８】
「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ基を表し、そしてＲは、定義されているように、低級アルキル、置換された低級アルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロヘテロアルキルまたは置換されたシクロヘテロアルキルを表す。
【００３９】
「アルキルチオ」という用語は、−ＳＲ、−Ｓ（Ｏ）ｎ＝１−２−Ｒ基を表し、そしてＲは、ここに定義されているように、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルまたは置換されたアリールアルキルを表す。
【００４０】
「アシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を表し、そしてＲは、ここに定義されているように、水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリールその他を表す。
【００４１】
「アリールオキシ」という用語は、−ＯＡｒ基を表し、そしてＡｒは、ここに定義されているように、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリール基を表す。
【００４２】
「アミノ」という用語は、ＮＲＲ’基を表し、そしてＲおよびＲ’はそれぞれ独立に、ここに定義されているように、水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリールまたはアシルを表す。
【００４３】
「アミド」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基を表し、そしてＲおよびＲ’はそれぞれ独立に、ここに定義されているように、水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリールを表す。
【００４４】
「カルボキシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を表し、そしてＲはここに定義されているように、水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールおよび置換されたヘテロアリールを表す。
【００４５】
「アリール」単独または組合せでは、好ましくは５−７個、さらに好ましくは５−６個の環員と任意に炭素環融合し、および／またはハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換されたアミノ；アミジノ；アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環基で任意に置換された尿素；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されたアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１から３個の基または置換基で任意に置換したフェニルまたはナフチルを意味する。
【００４６】
「置換されたアリール」という用語は、１個以上の官能基、たとえば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の基で任意に置換されたアリール基を表す。
【００４７】
「複素環」という用語は、単環（たとえばモルホリノ、ピリジルまたはフリル）または多重縮合環（たとえばナフトピリジル、キノキサリル、キノリル、インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を持ち、その環内にＮ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子を少なくとも１個持つ飽和、不飽和または芳香族炭素環の基を表し、その環は置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどで置換されていてもよい。
【００４８】
「ヘテロアリール」単独、または組合せで、Ｏ、ＳおよびＮ基から独立に選択される１またはそれ以上、好ましくは１−４個、さらに好ましくは１−３個、さらにより好ましくは１−２個の異種原子を含有し、そしてハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にモノ−またはジ−置換されたアミノ；アミジノ；アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環基で任意に置換された尿素；アルキル、アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されたアミノスルホニル；アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１から３個の基または置換基で任意に置換される、５または６環原子を含む単環芳香族環構造、または８から１０個の原子を有する２環芳香族基を意味する。ヘテロアリールは、スルフィニル、スルホニルおよび３級の環窒素のＮ−オキシドのような酸化したＳまたはＮを含むことも意図される。炭素または窒素原子は、安定な芳香族環が保持されるようにヘテロアリール環構造の付着の点である。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、ヨードリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフリル、ヨードリル等である。置換ヘテロアリールは、安定な化合物を生成するために利用可能な炭素または窒素で付着した置換基を含有する。
【００４９】
「ヘテロサイクリル」は単独、または組合せで、環中の１から３個の炭素原子が、Ｏ、ＳまたはＮの異種原子に置換される５から１０個までの原子を有する非芳香族シクロアルキル基を意味し、そして任意に、融合ベンジルまたは５−６員環および／またはの融合ヘテロアリールであり、および／または任意に、シクロアルキルの場合のように置換される。複素環は、スルフィニル、スルホニル、および３級の環窒素のＮ−オキシドのような酸化ＳまたはＮを含むことも意図される。付着の点は、炭素または窒素原子にある。複素環の例は、テトラヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジヒドロベンゾフリル、ジヒドロインドリル等である。置換複素環は、安定な化合物を生成する利用可能な炭素または窒素に付着した置換基窒素を含有する。
【００５０】
「置換されたヘテロアリール」という用語は、１個以上の官能基、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどで任意に置換された複素環を表す。
【００５１】
「アリールアルキル」という用語は、−Ｒ−Ａｒ基を表し、そしてＲは、低級アルキル基または置換された低級アルキル基である。アリール基は、置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の基で置換されていてもよい。
【００５２】
「ヘテロアルキル」という用語は、−Ｒ−Ｈｅｔを表し、そしてＨｅｔは、ヘテロ環の基であり、Ｒは低級アルキル基である。ヘテロアルキル基は、置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の基で置換されていてもよい。
【００５３】
「ヘテロアリールアルキル」という用語は、−Ｒ−ＨｅｔＡｒ基を表し、そしてＨｅｔＡｒはヘテロアリール基であり、Ｒは低級アルキルまたは置換された低級アルキルである。ヘテロアリールアルキル基は、置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、置換された低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の基で置換されていてもよい。
【００５４】
「シクロアルキル」という用語は、３ないし１５個の炭素原子を含む２価の環式または多環式アルキル基を表す。
【００５５】
「置換されたシクロアルキル」という用語は、たとえばハロゲン、低級アルキル、置換された低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の置換基を１個以上含むシクロアルキル基を表す。
【００５６】
「シクロヘテロアルキル」という用語は、１個以上の環炭素原子がヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＰ）で置換されたシクロアルキル基を表す。
【００５７】
「置換されたシクロヘテロアルキル」という用語は、ここで定義されているように、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の置換基を１個以上含むシクロヘテロアルキル基を表す。
【００５８】
「アルキルシクロアルキル」という用語は、−Ｒ−シクロアルキル基を表す。ここでシクロアルキルはシクロアルキル基であり、Ｒは低級アルキルまたは置換された低級アルキルである。シクロアルキル基は、置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドその他の基で置換されていてもよい。
【００５９】
「アルキルシクロヘテロアルキル」という用語は、−Ｒ−シクロヘテロアルキル基を表す。ここで、Ｒは低級アルキルまたは置換された低級アルキルであり、シクロヘテロアルキル基は、置換されていなくてもよいし、たとえばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アミド、カルボキシル、アセチレン、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換された複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド小野他の基で置換されていてもよい。
【００６０】
「医薬上許容しうる塩」は、従来の手段によって製造される塩であり、そして当業者によく知られている。「医薬上許容しうる塩」としては、無機および有機酸の塩基性塩が挙げられ、そしてそれに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデリン酸等が挙げられる。式Ｉ−ＩＩＩで表される化合物としては、カルボキシ基のような酸性官能基が挙げられ場合、それによりカルボキシ基についての適切な医薬上許容しうる陽イオン対は、当業者によく知られ、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、４級アンモニウム陽イオン等が挙げられる。「医薬上許容しうる塩」である化合物のタイプの追加の例としては、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６、１（１９７７）参照。
【００６１】
もし本発明の最終的な２，６，９−トリ置換プリン化合物が塩基性基を含んでいるなら、組成物の酸付加塩を調製してもよい。本発明の化合物の酸付加塩は、標準的な方法により適当な溶媒中で、その母体化合物と過剰の酸から調製される。酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、コハク酸またはメタンスルホン酸をあげることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。塩酸塩は特に有用である。
【００６２】
もし本発明の最終的な２，６，９−トリ置換プリン化合物が酸性基を含んでいるなら、組成物のカチオン塩を調製してもよい。代表的な調製法としては、母体酸性化合物を過剰のアルカリ試薬と処理する。使用されるアルカリ試薬としては、適当なカチオン、たとえばＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋２、ＮＨ４＋を含む水酸化物、炭酸塩またはアルコキシドをあげることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。化合物のうちある種のものは、許容可能な分子内塩または双性イオンを形成する。
【００６３】
本発明の化合物は、人間を含め哺乳動物の細胞増殖を阻害するのに有用である。２，６，９−トリ置換プリンは、自己免疫疾病、例えば、リューマチ様関節炎、狼瘡、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、癌、バルーン血管形成および粥腫切除術に続く再狭窄のような心臓血管疾病、血管改質手術手段に続く再狭窄、宿主対移殖片疾病、通風、多発性嚢胞腎およびその病原論が異常な細胞増殖に関与している他の増殖性疾病を治療する上で有用である。特に、本発明の組成物は、リンパ球様新生物を含む癌、結腸の癌、胸部癌、卵巣癌、膵臓癌、および上皮細胞由来の癌を含む癌の治療に有用である。
【００６４】
治療方法は、本発明の選び出した化合物の効果量を、好ましくは製薬担体に分散させ、非経口的に、また経口的に投与することからなる。本発明の組成物の治療上有用な量は、概括的には、約０．０１から１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲にあるが、当業者であれは、投与経路および患者の年齢と状態に応じて、その量を容易に決定することができよう。本発明の組成物の治療上有用な量は、急性または慢性の疾患に対して１日当たり１ないし１０回またはそれ以上投与することができる。本発明の化合物を本発明に従って投与する時、許容できないような毒性の作用は予想されない。
【００６５】
本発明の化合物は、抗炎症剤および抗真菌剤としても有用である。本発明の組成物は、それ自体でヒトおよび動物の抗炎症および真菌感染症の治療ならびに植物の真菌感染症の治療に有用である。
【００６６】
本発明の化合物またはその誘導体、または両者を含む製薬組成物は、非経口投与用に溶液または凍結乾燥粉末として処方することができる。粉末は、使用前に適当な希釈剤またはその他の製薬的に許容できる担体を加えて溶かしてもよい。液状で使用する場合には、本発明の組成物を緩衝させた等張溶液に配合することが好ましい。好適な希釈剤の例として、普通の等張生理食塩水、標準５％デキストロース水溶液、酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウム緩衝液をあげることができる。このような液体配合剤は非経口投与に適しているが、経口投与に使用することもできる。
【００６７】
ポリビニルピロリジノン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカイア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、あるいは当業者に知られているその他の賦形剤を本発明の化合物を含有する薬物組成物に添加するとよい場合があるかもしれない。別のやり方として、経口投与向けに本発明の薬物化合物をカプセル、錠剤または乳剤もしくはシロップ剤とすることも考えられる。組成物の安定性を高めてたり組成物を調製しやすくするため、薬物的に受け入れられる固体の担体または液状の担体を加えることも可能である。液状の担体として、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコールおよび水があるが、これらに限定されるものではない。固体の担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、テファアルバ（ｔｅｆｆａ  ａｌｂａ）、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが考えられるが、これらに限定されるものではない。さらに、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート単独、またはワックスと一緒に組み合わせた持続放出剤も担体として可能であるが、これらに限定されるものではない。固体の担体の量は変化するが、薬用量単位当たり２０ｍｇから１ｇ程度が好ましいだろう。
【００６８】
剤形を錠剤とする場合は、必要に応じて、粉砕、混合、造粒、圧縮成形；そして、剤形を硬いゼラチンカプセルとする場合は、粉砕、混合、充填といった従来の方法で薬用量に調製されるが、もちろんこれらに限定されるものではない。また、液状の担体を使用する場合は、シロップ、エリキシル剤、乳剤または水もしくは非水懸濁剤の形に調製されよう。このような液剤は直接投与してもよいし、軟らかいゼラチンカプセルに入れて投与することもできる。
【００６９】
次にあげる例によって本発明を具体的に説明する。ここにあげる例は、本発明の化合物の作り方と使用法を明らかにするためのものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない。ここにあげた例の温度表示はすべて摂氏であり、ＲＴは室温を表す。
【００７０】
［実施例１］
本発明の化合物は有機化学の普通の方法によって合成される。下に示す一連の反応は本発明の化合物を合成するのに有用な一般的方法である。２，６−ジクロロプリンをブタノールに溶解し、該当するアミンＲ１を加える。数時間加熱した後、反応混合物を冷却して化合物１を得る。化合物１に水素化ナトリウムを加え、それからＲ２を加え、化合物２を単離する。化合物２にＲ３をＮ−メチルピロリジノンの溶液として加える。混合物をそれぞれのケースに応じた時間加熱し、それから精製を行い目的とする化合物を得る。
【００７１】
【化８】
0003681984.tif 000006
以下の化合物は上で述べた方法により合成した。
【００７２】
２−クロロ−６−（４−メトキシベンジルアミノ）プリン（１）の合成
２，６−ジクロロプリン（４．０６ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノール（１５０ｍｌ）に溶解し、４−メトキシベンジルアミン（３．４ｍｌ，２６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は透明になり、それから数分後には濁ってきた。溶液を１２０℃に２時間加熱し、それから冷却した。ｎ−ブタノールを留去し、残渣を水とジエチルエーテルの混合物に懸濁させた。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（１．３ｍｌ，２６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１０分間攪拌した後、濾過した。濾取した沈殿を水および少量のエーテルで洗い、真空乾燥した。残った濾液を１晩放置し、さらに析出した結晶を翌日集め、ジエチルエーテルで洗った。
【００７３】
２−クロロ−６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン（２）の合成
２−クロロ−６−（４−メトキシベンジルアミノ）プリンを乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁させ、６０％懸濁液の水素化ナトリウム（８２ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を３０分間攪拌した。その間に懸濁液は透明な黄色／緑色溶液に変化した。２−ヨードプロパン（０．２８０ｍＬ，１．７当量）を５分間かけて加え、生成した溶液を２日間攪拌した。水を加え、溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を蒸発させ生成物のイソプロピルプリンを得た。
【００７４】
３−ジエタノールアミノ−６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン（３）の合成
プリン（１．６５ｇ，４．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１２ｍＬ）およびジエタノールアミン（４ｍＬ）に溶解し、１４０℃で２−３日間、それから１６０℃で１日加熱した。溶液を冷却し、水で飽和したブタノール（１００ｍＬ）を加えた。溶液を水で洗浄し（３×５０ｍＬ）、続いて溶媒を蒸発させ褐色油状物を得た。この残留物をシリカゲルカラムにかけ、酢酸エチルそれから酢酸エチルの３％メタノール溶液で溶離して淡黄色油状生成物（７３０ｍｇ、３７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（δ，ＣＤＣ１３）：７．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．２５（ｄ，２Ｈ），６．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．８３（ｄ，２Ｈ），５．４３（ｂｒ  ｓ，＜２Ｈ），４．６３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．５３（ｍ，  １Ｈ），３．８６（ｔ，４Ｈ），３．７６（ｍ，７Ｈ），１．４７（ｄ，６Ｈ）。
【００７５】
この例に述べた合成法に従って合成した本発明の化合物を表１に示す。
【００７６】
【表１】
0003681984.tif 000007
0003681984.tif 000008
0003681984.tif 000009
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0003681984.tif 000011
0003681984.tif 000012
【００７７】
［実施例２］
本実施例は、以下の一般的な合成概略による本発明の化合物を調製するための方法を記載する。
【００７８】
【化９】
0003681984.tif 000013
｛２−クロロプリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミンの調製：
２５０ｍＬの無水エタノール中の２，６−ジクロロプリン、１５ｇ（０．０７９４ｍｏｌ）の懸濁液に、１２．７ｍＬ（０．０８７３ｍｏｌ）のトリエチルアミンと１０．６２ｍＬ（０．０８７３ｍｏｌ）の４−クロロベンジルアミンを加えた。この混合液を８０℃にて１６時間還流した（クリーム状の白色沈殿物の形成が観察された）。反応混合液を冷却し、沈殿産物を濾過により取り除いた。沈殿物をエタノール（３５０ｍＬ）で洗浄し、２４時間高吸引で乾燥させた。産物を１Ｈ−ＮＭＲにて特性化した。
【００７９】
｛２−クロロ−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［４−（クロロフェニル）メチル］アミンの調製
４１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中の２−クロロ−６−（４−クロロフェニル）メチルアミノプリン、６ｇ（０．０２０ｍｏｌ）の溶液に、５．６４ｇ（０．０４１ｍｏｌ）の無水炭酸カリウムと３．４１ｍＬ（０．０３５ｍｏｌ）の２−ヨードプロパンを加え、室温にて１６時間攪拌した。混合液に、５００ｍＬの水を加え、１時間攪拌した。沈殿物を濾過し、水（３５０ｍＬ）で洗浄し、１６時間５０℃にて吸引オーブン内で乾燥させた。産物はオフホワイト固体として得られ、１Ｈ−ＮＭＲにて特性化した。
【００８０】
｛２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミンの調製
１３ｍＬの無水１−メチル−２−ピロリジノン中の｛２−クロロ−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミン、３．３６ｇ（０．０１ｍｏｌ）の溶液に、４．６８ｍＬ（０．７０ｍｏｌ）の２−アミノエチルアミンを加え、この混合液を１４０℃にて２４時間熱した。化合物を、ジクロロメタン／メタノール混合液でのシリカゲル上の可変勾配クロマトグラフィにかけ、１−メチル−２−ピロリジノンが産出された。この混合物をジクロロメタン中に溶解し、水（５２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、オフホワイト固体になるまで蒸発させた。産物を１Ｈ−ＮＭＲにて特性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＹＭＣ  Ｃ−１８カラム、５０×４．４ｍｍ、Ｓ−５  １２０Ａ°  ０．１％  ＴＦＡ−水／０．１％  ＴＦＡ−アセトニトリル）にて純度を確認した。
【００８１】
以下の表２は、本実施例における一般的な合成方法によって調製された本発明の化合物を同定している。表２において、ＭＳは重量スペクトルであり、ＭＨ＋は親分子イオン＋１水素原子の重量である。
【００８２】
【表２】
0003681984.tif 000014
0003681984.tif 000015
0003681984.tif 000016
0003681984.tif 000017
0003681984.tif 000018
【００８３】
［実施例３］
この実施例は本発明の化合物を調製するための方法を述べている。この実施例で開示されている合成法は、実施例１に開示されているものをほんのわずか変更したものである。
【００８４】
【化１０】
0003681984.tif 000019
次の化合物は上に示す方法によって合成した。
【００８５】
２，６−ジクロロ−９−イソプロピルプリン（４）の合成
室温下で、５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の２，６−ジクロロプリン、０．６７ｇの溶液に、０．１６ｇｍ（１．１当量）の５０％ナトリウムヒドリド／油粉末を加えた。水素発生が停止したら、大過剰（２ｍＬ）のヨウ化イソプロピルを陰イオン性溶液に加えた。この反応溶液を室温にて３日間攪拌した。反応を３０ｍＬの水で停止させ、酢酸エチル（３５０ｍＬ）で抽出した。有機性抽出物を合わせ、３５０ｍＬの水、続いて２０ｍＬの塩水で洗い直した。この酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。この化合物をヘキサン／酢酸エチル混合液での、シリカゲル上の可変勾配フラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、Ｎ−９産物とＮ−７異性体を得た。
【００８６】
２−クロロ−６−アニリノ−９−イソプロピルプリン（５）の調製
２，６−ジクロロ−９−イソプロピルプリン（０．０１９ｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）をブタノール（０．５ｍｌ）に溶解し、アニリン（０．０４４ｍｌ、０．２４４ｍｍｏｌ）を添加した。この反抗混合液を１２０℃まで１０時間熱し、冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水で３回洗浄した。この混合液をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、オフホワイト固体まで濃縮した。
【００８７】
２−ジエタノールアミノ−６−（４−フェニルアニリノ）−９−イソプロピルプリン（６）の調製
１ｍＬのｎ−オクタノール中の２，６−ジクロロ−Ｎ−９−イソプロピルプリン、６７ｍｇおよび４−フェニルアニリン、１００ｍｇの溶液を８０℃まで２４時間熱した。ｎ−オクタノールを吸引して除去し、ついでＤＭＳＯ中の１ｍＬの４０％ジエタノールアミンに置換した。この溶液を１３０℃にて４８時間熱した。反応液を室温まで冷却し、ついで１０ｍＬの水で希釈し、続いて酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を集め、３×２０ｍＬの水、続いて１０ｍＬの塩水で洗浄し直した。この酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。６５ｍｇの未精製産物をＴＨＦ−エーテル溶液より再結晶した。
【００８８】
この例に述べた一般合成法に従って合成した本発明の化合物を下の表３に示す。
【００８９】
【表３】
0003681984.tif 000020
0003681984.tif 000021
0003681984.tif 000022
0003681984.tif 000023
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0003681984.tif 000025
0003681984.tif 000026
【００９０】
［実施例４］
この実施例は本発明の化合物を調製するための方法を述べている。この実施例で開示されている合成法は、実施例１に開示されているものをほんのわずか変更したものである。
【００９１】
【化１１】
0003681984.tif 000027
次の化合物は上に示す方法によって合成した。
【００９２】
２−アミノ−６−クロロ−９−メチルプリン（４）の合成
２，６−ジクロロプリン（５．００ｇ、２６．４６ｍｍｏｌ）を室温にて５５ｍｌの乾燥ＤＭＦに懸濁させ、部分的に加えたナトリウムヒドリド、６０％分散（１．２７ｇ。３１．７５ｍｍｏｌ）で処理した。１時間の攪拌後、２−ヨードプロパン（４．５ｍｌ，４４．９８ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２日間攪拌した。この反応液をジエチルエーテル中に注ぎ込み、飽和重炭酸ナトリウム溶液で１回、水で１回洗浄した。混合液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、吸引して濃縮した。濃縮物をシリカゲル上で色層分析し、ジクロロメタン溶液中の１０％アセトンで溶出し、望ましいＮ−９アルキル化産物を白色固体として得た。
【００９３】
２−クロロ−６−（４−メチルメルカプト）アニリノ−９−イソプロピルプリン（５Ａ）の調製
２，６−ジクロロ−９−イソプロピルプリン（０．１５ｇ、０．６４９ｍｍｏｌ）を、ｎ−ブタノール（４ｍｌ）および４−（メチルメルカプト）アニリン（０．０８９ｍｌ、０．７１４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２０ｍｌ、１．４３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を８０℃にて一晩熱した。反応液を冷却し、酢酸エチルで希釈し、１×１Ｍ  ＨＣｌ、１×飽和重炭酸ナトリウムおよび１×塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引して濃縮した。残余物をシリカゲル上で色層分析し、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶出し、望ましい産物を白色固体として得た。
【００９４】
２−ジエタノールアミン−６−（４−メチルメルカプト）アニリノ−９−イソプロピルプリン（６Ａ）の調製
プリン（０．１８ｇ、５３９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリジノン（３ｍｌ）およびジエタノールアミン（１ｍｌ）中の溶解し、１２０℃にて一晩熱した。反応液を冷却し、ジエチルエーテル中に注ぎ込み、水にて３回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、吸引して濃縮した。残余物をシリカゲル上で色層分析し、ジクロロメタン中の５％メタノールで溶出し、望ましい産物をオフホワイト固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（δ、ＣＤＣｌ３）：８．０８（ｓ、１Ｈ）、７．５８（ｄ、２Ｈ）、７．４７（ｓ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、２Ｈ）、４．９５（ｂｒ  ｓ、＜２Ｈ）、４．５２（ｍ、１Ｈ）、３．９４（ｍ、４Ｈ）、３．８３（ｍ、４Ｈ）、２．４３（ｓ、３Ｈ）、１．４７（ｄ、６Ｈ）。
【００９５】
４−（２−チエニル）ベンゾニトリルの調製
いくつかのＲ１’基は、まず２，６−ジクロロ−９−イソプロピルプリンと反応する前に合成されなければならない。これらの基は、様々な結合方法および有機合成の分野の当業者に公知の他の合成手順によって合成してよい。
【００９６】
圧力チューブに４−ブロモベンゾニトリル（０．２０ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１２７ｇ、０．１当量）および２−チオフェンホウ素酸（０．２１１ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を吸引下フラッシュさせ、乾燥窒素で３回フラッシュした。フラッシュの後、エチレングリコールジメチルエーテル（５．５ｍｌ）と炭酸ナトリウムの無水溶液（２．５３ｍｌ、１Ｍ）をこのチューブに加えた。次いでチューブを密封し、８０℃にて一晩熱した。反応液を冷却し、ジエチルエーテルで希釈し、水で２回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、吸引して濃縮した。残余物をシリカゲル上で色層分析し、ヘキサン中の１０％酢酸エチルで溶出し、望ましい産物を白色固体として得た。
【００９７】
４−（２−チエニル）ベンジルアミンの調製
４−（２−チエニル）ベンゾニトリル（０．０８６ｇ、０．４６４ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（１．６ｍｌ）中に溶解し、リチウムアルミニウムヒドリド（０．４６ｍｌ、０．４６４ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を滴下して加えた。反応液を室温で一晩攪拌したままにした。ＴＬＣ（ジクロロメタン中５％メタノール）ではまだ開始物質が残っていることが示された。さらに１当量のＬＡＨを添加した。さらに１時間の後、反応をウェージャ（ｗａｇｅｒ）（１７．４６μｌ）、水和水酸化ナトリウム溶液（１７．４６μｌ、１５％溶液）水（５２．３７μｌ）を連続的に反応液に加えて使用したＦｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ方法にて停止させた。次いで反応液をジメチルエーテルおよび水で希釈し、ジメチルエーテルで２回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、吸引して濃縮した。残余物は、さらに精製はせず、未精製のまま使用した。
【００９８】
以下の表３は、本実施例における一般的な合成方法によって調製された本発明の化合物を同定している。
【００９９】
【表４】
0003681984.tif 000028
0003681984.tif 000029
【０１００】
［実施例５］
この実施例は本発明の化合物を調製するための方法を述べている。この実施例で開示されている合成法は、実施例１に開示されているものをほんのわずか変更したものである。
【０１０１】
【化１２】
0003681984.tif 000030
次の化合物は上に示す方法によって合成した。
【０１０２】
２−アミノ−６−クロロ−９−メチルプリン（７）の調製
２−アミノ−６−クロロプリン（１．０８ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（７５ｍｌ）中に懸濁し、ナトリウムヒドリド、６０％分散（０．２８ｇ、７ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を１５分間攪拌し、ヨードメタン（０．４４ｍｌ、７．０６ｍｍｏｌ）を加え、得られた黄色溶液を１時間４５分の間攪拌した。固体を濾過し、濾液を１０分間蒸発させ、水を添加した。得られた固体を濾過し、一晩乾燥させて、Ｎ−７とＮ−９アルキル化産物の混合物として産物を得た。残った溶液を一晩そのまま放置し、さらなる結晶を次の日に回収し、乾燥させた。
【０１０３】
６−クロロ−２−（２−メトキシアセチルアミノ）−９−メチルプリン（８）の調製
上記のものからの異性体の混合物をジクロロメタンとピリジン（２当量）中に溶解し、メトキシアセチルクロライド（４当量）で処理した。反応液を室温にて完了するまで攪拌した。反応液を蒸発させ、シリカゲルのプラグを通して濾過し、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶出し、シリカゲルを用いたクロマトロン上での精製を行い、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶出して望ましい産物を単離した。
【０１０４】
表５は、本実施例における一般的な合成方法によって調製された本発明の化合物を同定している。
【０１０５】
【表５】
0003681984.tif 000031
【０１０６】
［実施例６］
本実施例は本発明の化合物を調整するための方法を記載する。本実施例で記載した合成方法は、単に実施例１で記載したものをわずかに改変したものである。
【０１０７】
【化１３】
0003681984.tif 000032
以下の化合物を上記の方法にしたがって調製した。
【０１０８】
２−クロロ−６−（４−フェニルベンジルアミノ）プリン（９）の調製
２，６−ジクロロプリン（５．０ｇ、２６．４５ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノール（５０ｍｌ）と４−フェニルベンジルアミン（６．６１ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）中に懸濁させ、トリエチルアミン（４．１ｍｌ、２９．１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を１２０℃にて一晩加熱し、次いで冷却した。過剰のｎ−ブタノールを使用して産物を濾過して除き、沈殿物を１００ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌと２００ｍｌの水で洗浄した。固体を一晩７０℃にて吸引して乾燥させ、淡黄色固体として望ましい産物を得た。
【０１０９】
２−ジエタノールアミノ−６−（４−フェニルベンジルアミノ）プリン（１０）の調製
２−クロロ−６−（４−フェニルベンジルアミノ）プリン（２．０ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）をジエタノールアミン（１１．４ｍｌ、１１９．２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルピロリジノン（１０ｍｌ）と共に加え、１２０℃にて一晩加熱した。反応液を冷却し、ジクロロメタン中に注ぎ込み、水で２回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引して濃縮し、望ましい産物を淡緑色固体として得、２日間、６０℃にて吸引オーブン内でさらに乾燥させた。
【０１１０】
２−ジエタノールアミン−６−（４−フェニルベンジルアミノ）−９−メチルプリン（１１）の調製
２−ジエタノールアミン−６−（４−フェニルベンジルアミノ）−９−メチルプリン（０．０５０ｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ中に溶解し、ナトリウムヒドリド、６０％分散（５．５ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）で１時間処理し、ヨードメタン（０．００９ｍｌ、０．１４８ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を室温で一晩攪拌した。ジエチルエーテル中に反応液を注ぎ込み、飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、吸引して濃縮した。残余物をシリカゲル上で色層分析し、ジクロロメタン中の５％メタノールで溶出し、白色固体として産物を得た。
【０１１１】
１Ｈ−ＮＭＲ（δ、ＣＤＣｌ３）：７．５５（ｍ、４Ｈ）、７．４１（ｍ、４Ｈ）、７．３５（ｍ、４Ｈ）、６．４１（ｂｒ  ｓ、＜１Ｈ）、５．１０（ｂｒ  ｓ、＜２Ｈ）、４．７２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、３．８６（ｍ、４Ｈ）、３．７４（ｍ、４Ｈ）、３．５９（ｓ、３Ｈ）。
【０１１２】
表５は、本実施例における一般的な合成方法にしたがって調製された本発明の化合物を同定している。
【０１１３】
【表６】
0003681984.tif 000033
【０１１４】
［実施例７］
本発明の組成物を以下のアッセイにかけて評価した。
【０１１５】
ＣＤＫ２検定
本発明の組成物をアッセイにかけ、ＣＤＫ２阻止活性を決定した。アッセイ系には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、ヒストンＨ１  １μｇ、３０μＭ  ＡＴＰ（ガンマ３２Ｐで標識したＡＴＰ  １μＣｉ）、ＢＳＡ  １０μｇ、精製したＣＤＫ２  １ｎｇを含む系（全量５０μｌ）を使用した。３０℃で３０分間インキュベートした後、１０％ＴＣＡ  １０μｌを添加して反応を停止させ、試料をニトロセルロースフィルター上にブロットした。これらのフィルターを１０％ＴＣＡでよく洗い、放射能を測定した。酵素を含まないものをブランクとした。本発明で合成したさまざまな化合物の有効性を確かめるため、１００μｇ／ｍｌから０．０２μｇ／ｍｌまでの各濃度で化合物を上述のアッセイに加えた。３０分間インキュベートした後、アッセイチューブを上で述べたように処理した。全てのアッセイにおいて、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）の濃度を様々に変えて添加し、標準陽性対照として使用した。表６にかかげたＩＣ５０（酵素）は、ＣＤＫ２の活性を５０％だけ阻害するのに必要な濃度として定められている。
【０１１６】
［実施例８］
細胞増殖検定：
早期継代ラット大動脈平滑筋細胞（ＣＶ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を、熱不活性化した牛血清を含むＤＭＥ中、２０，０００個細胞／ｍｌの密度となるように４８ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ、ｍｌ／ｗｅｌｌ）接種した。接種した細胞を標準組織培養インキュベーターで４８時間インキュベートした。培地を吸引し、新しい培地０．２ｍｌと入れ替えた。本発明の化合物を０．３７μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌまでの各種濃度で添加した。４８時間インキュベートした後、培地を吸引し、ＭＴＳ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６Ｒ水溶液の非放射性細胞増殖試験キット、カタログ番号Ｇ  ５４３０、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２８００ウッヅ・ホロウ・ロード（Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｏａｄ）、マデイソン市（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州５３７１−５３９９）を含むフェノジンメトサルフェート溶液の０．２５μｌを含む食塩溶液０．２ｍｌで、培養物を処理した。表６に記載したＩＣ５０細胞は、細胞の増殖を５０％阻害するのに必要な濃度として規定した。オロモウシン（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）の添加濃度を様々に変えて添加し、標準陽性対照として使用した。
【０１１７】
【表７】
0003681984.tif 000034
0003681984.tif 000035
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上の表から、本発明の化合物が、約０．０５μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌの濃度範囲、好ましくは０．５μｇ／ｍｌより低い濃度で細胞増殖を阻害する能力を持っていることは明らかであり、これにより、これらの化合物の細胞増殖性阻害が立証される。
【０１１８】
同様のアッセイを、下記の細胞系を用いて行った。Ｐ３８８−マウスリンパ腫瘍。Ｌ１２１０−マウスのリンパ細胞性白血病。Ｃａｃｏ２ヒト結腸腺癌。ＭＣＦ７ヒト胸腺癌。Ｐａｎｃ１ヒト膵臓腺癌。およびＨＵＶＥＣヒト臍帯内皮細胞。本発明のいくつかの構成物の、１つ以上の細胞系に対する阻害活性を以下の表８および表９に示す。
【０１１９】
【表８】
0003681984.tif 000038
【表９】
0003681984.tif 000039
ＭＲＣ−５＝ヒト繊維芽細胞
ＰｕｐＶＳＭＣ＝ラット新生児大動脈平滑筋細胞
【０１２０】
［実施例８］
ネズミ白血病モデル（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｍｏｄｅｌ）を使って本発明の化合物の有効性を評価した。ネズミ白血病モデルは抗腫瘍剤の評価に使用される標準的なモデルである。ＣＤＦ１マウスの腹腔内にＬ１２１０細胞（細胞数１×１０３／マウス）を注射した。２４時間経過後、これらのマウスを用量を変ながら、実施例１の化合物３の生理食塩水溶液で処理した（腹腔内投与）。この研究で使用した用量は下の表７に示してある通りである。化合物３は毎日または１日おきにマウスに投与した。対照群のマウスには生理食塩水を注射した。７日経過したところで投与を中止し、生存数をモニターした。
【０１２１】
【表１０】
0003681984.tif 000040
この表から、化合物３を投与したラットは、対照のラットより長期間生存したことが分かる。
【０１２２】
［実施例９］
この実施例は、ラットの頸動脈モデルのバルーン血管形成術実施後に形成される新生内膜が減少するかによって、実施例１の化合物３の急性局所輸送（デリバリー）の効果を測定したものである。この実施例においては、フォガーティ（Ｆｏｇａｒｔｙ）動脈塞栓摘出カテーテルを使用して、オスの成熟ラット（実験群につきｎ＝１０）の左総頸動脈に損傷を与えた。施術後、直ちに総頸動脈を血管クランプで２分割し、処置しない部分と処置する部分とに分けた。次に、薬物輸送カテーテルを総頸動脈の遠位の半分に挿入した。薬物を輸送したら、カテーテルを抜去し、動脈を縫合する前に血管クランプを外して血流を再開し、過剰の薬物を洗い去った。１４日間の回復を待って被験ラットの総頸動脈を取り出した。採取した組織を切片にし、新生内膜面積をデジタル化しコンピューター面積計算システムを使用して測定した。各動物の処置した部位と処置しなかった部位についてそれぞれ１５測定を平均した。｛２−［（２−アミノエチル）アミノ］−９−（メチルエチル）プリン−６−イル｝［（４−クロロフェニル）メチル］アミンを、５ｍｇ／ｍＬの用量で投与し、このことで、生理食塩水のみの６％の縮小と比較して、新内膜領域が約９０％縮小した。
【０１２３】
この実施例の結果は図１に示してある。図１から分かるように、損傷を与えた頸動脈に実施例１の化合物３を投与すると、生理食塩水ビヒクル単独の場合の６％の減少に比して、新しい内膜の面積は約８８％縮小した。
【０１２４】
［実施例１０］
ＩκＢ−αキナーゼ検定：
本発明の組成物をアッセイし、ＩκＢ−αキナーゼ阻害活性を決定した。この研究に使用したヒト臍帯血管内皮細胞株（ＨＵＶＥＣ）はクロネティクス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入し、２％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え表皮成長因子、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢおよび１２μｇ／ｍｌのウシの脳抽出物を添加した内皮細胞成育培地により組織培養インキュベーター中、３７℃で維持した。すべての培地および添加試薬はクロネティクス社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入した。血清型０１１１：Ｂ４の大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ、ミシシッピ州、セントルイス）から購入した。他の薬品についてはすべて試薬級のものを使用した。
【０１２５】
細胞溶解物（ライセート）の調製：ＨＵＶＥＣ細胞の単層（７５ｃｍ２）をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理し、そのあと速やかに細胞培地を除いて単層を氷冷ＰＢＳで３回洗った。細胞層をかき取って１０ｍｌのＰＢＳに入れ、遠心分離にかけて細胞をペレット化した（３０００ｒｐｍ、５分間、４℃）。得られた細胞ペレットを０．２ｍｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフロライド、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５％  ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０）中、頻繁に撹拌しながら、３７℃で１５分間インキュベートすることによって、細胞溶解物（ライセート）を調製した。試料を微量遠心機にかけて（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）細胞破片物を除き、セファロース４Ｂを溶解用緩衝液に懸濁させた液１００ｍｌを上清に加えて「前清澄化」した。微量遠心機でセファロース４Ｂのビーズを除き、上清を小分けし、８０°Ｃで保存した。
【０１２６】
固相ＩκＢ−αキナーゼアッセイ：
ヒト由来の全長ＩκＢ−αに相当するＧＳＴ−ＩκＢ−α（サンタクルスバイオテクノロジ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１μｇを、反応用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  β−グリセロホスフェート、０．５ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）にグルタチオンＳセファロースＢ（ファルマシア社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を懸濁させた５０％スラリー２０μｌとともに室温で３０分間インキュベートした。ＧＴＳ−ＩκＢ−αビーズ複合体を反応用緩衝液０．５ｍｌにより、再縣濁しそして微量遠心する操作をくり返して３回洗浄した。次に、反応用緩衝液１００μｌにＨＵＶＥＣ細胞溶解物（リセート）タンパク質１０μｇを加えた液をＧＴＳ−ＩκＢ−αビーズ複合体に加え、その混合物を穏やかに攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。ビーズ複合体を０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む反応用緩衝液で３回、反応用緩衝液だけで１回洗浄した。最後に、ビーズ複合体を５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（＞５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイングランドニュークリア社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｏｒｐ．）、ボストン、マスチューセッツ州）を含む反応用緩衝液２０μｌに再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液１０μｌを加えて反応を停止させ、３分間沸騰させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０−２０％グラジエントレーディゲル（Ｒｅａｄｙｇｅｌ）、バイオラド社（ＢｉｏＲａｄ））で分離した。電気泳動に続いて、ゲルを１５分間固定し（５０％メタノール１０％酢酸）、それから各々を蒸留水で５分間づつ３回洗浄し、５％グリセロールで１５％間処理し、水を切り、オートラジオグラフィにかけフィルムに露光した（Ｘ−ＯＭＡＴ  ＸＡＲ−５コダック）。
【０１２７】
ゲル内キナーゼアッセイ：以前に報告した方法（１１，１９，２０）を改変して、ＩκＢ−αアイソザイムの活性をアッセイした。すなわち、ＩκＢ−グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ複合体の複製試料を上述のように調製し、１５μｇ／ｍｌＧＳＴ−ＩκＢ−αの存在下に重合させた１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用する電気泳動によって分離した。電気泳動が終了したら、ゲルを３０分間、それぞれ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；２０％イソプロピルアルコールで穏やかに２回洗い、ＳＤＳを除去した。タンパク質を１００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；０．０４％  ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０中で４５分間インキュベートし、ゲル内で変性させた。ゲルを半分に切り、２つの試料に分離した。一方の半分は反応用緩衝液単独の１０ｍｌ中で、他方の半分は２−ジエタノールアミノ−６（４−フェニルアニリノ）−９−イソプロピルプリン（実施例２の化合物６）を含む反応緩衝液１０ｍｌ中で室温で１時間インキュベートし、１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを加え、さらに室温で１時間インキュベートした。洗液１ｍｌの放射能がバックグラウンドに近づくまで、１回当たり１％ピロリン酸ナトリウムを含む５％トリクロロ酢酸１００ｍｌでゲルを１５分間洗浄する操作をくり返す。ゲルの水を切り、オートグラフィにかけてフィルムに露光した。
【０１２８】
２−ジエタノールアミノ−６−（４−フェニルベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリンエポキシ活性化セファロース６Ｂアフィニティマトリックスの調製
ヒドロキシル基を含むリガンドとセファロース上のエポキシ基との間でエーテル結合を形成することができることから、カップリング反応にエポキシで活性化された凍結乾燥セファロース６Ｂ（ファルマシア  ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を選んだ。ゲルをメーカーの説明書に従って膨潤させ、実施例２の化合物６（１００ｍｇ）をカップリング溶液（１．２：１  ｖ／ｖジメチルホルムアミド：０．１Ｎ  ＮａＯＨ）に溶解し、膨潤したゲル０．５ｍｌと混合し、穏やかに攪拌しながら、ｐＨ１０−１１で７２時間、室温で反応させた。余分な反応性基を１Ｍエタノールアミンと５０℃で４時間処理してブロックし、それからゲルのスラリーを１ｍｌのシリンジカラムに注いだ。それぞれカラム体積の２０倍量のｐＨ４．０（０．１Ｍ  酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の緩衝液とｐＨ８．０（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の緩衝液で交互に３回活性化し、それから、同じくカラム体積の２０倍量の反応用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  β−グリセロホスフェート、０．５ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）で活性化した。カラムは０．５％アジ化ナトリウムを含む反応用緩衝液中、４°Ｃで保存し、使用前には、上で述べたように低いｐＨの緩衝液と高いｐＨの緩衝液とを交互に流して再生した。
【０１２９】
活性化したＨＵＶＥＣ細胞溶解物（反応緩衝液１ｍｌ中にタンパク質５００μｇ）をＣＶＴ−１５４５セファロースマトリックスに順次５回流し、通過した液は取っておいた（結合しなかった物質）。次に、マトリックスを反応緩衝液１ｍｌで３回、それから０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む反応緩衝液でそれぞれ３回洗浄した（溶出液１−３）。各試料のアリコート（１ｍｌから２０μｌ）について、ＧＳＴ−ＩκＢ−セファロースビーズ複合体におけるリン酸化能をアッセイし、上述のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１３０】
アフィニテイ富化ＩκＢ−αキナーゼのアッセイ
ＩκＢ−αキナーゼのフィルターアッセイを開発する酵素源としてアフィニティマトリックスからの０．５Ｍ  ＮａＣｌバルク溶出液を使用した。各反応液は、反応緩衝液２０μｌ中に、アフィニテイによって富化されたＩκＢ−αキナーゼ（１μｇのタンパク質）、１０ｎｇＧＳＴ−ＩκＢ−αキナーゼ、０．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（＞５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイングランドニュークリア社、ボストン、マスチューセッツ州）を含んでいた。反応は室温で１５分間インキュベートし、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ添加して停止させた。反応混合物をホスホセルロースディスク（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ゲテイスバーグ、メリーランド）上にブロットし、フィルターをゆるやかに振りながら１５分間、０．１５Ｍ  リン酸で３回洗浄した（０．１５Ｍ  リン酸３００ｍｌでフィルターを１０個まで洗浄した）。３回洗浄したら、濾紙を空気乾燥し、それからシンチレーション液に加え、液体シンチレーション分光光度法によってアッセイした。
【０１３１】
電気泳動移動度のシフトアッセイ：高濃度塩緩衝液抽出法を用いて核抽出物を調製した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとともに３７℃で１時間インキュベートすることにより、１０ｐｍｏｌの二本鎖ＮＦ−κＢコンセンサス・オリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）（プロメガ社）の５’末端を５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（＞５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイングランドニュークリア社、ボストン、マスチューセッツ州）で標識した。取り込まれなかったヌクレオチドを、反応混合物を１ｍｌセファデクスＧ−５スピンカラムに通して除去した。結合のアッセイは、５０倍量の非標識オリゴヌクレオチドの存在および不在において、核抽出タンパク質１０μｇ、サケ精子ＤＮＡ１μｇおよび５×１０４ｃｐｍの３２Ｐでラベルしたコンセンサス・オリゴヌクレオチドで構成され、室温で１時間行った。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、８％無変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ゲルは濾紙上で乾燥させ、オートグラフィで可視化した。
【０１３２】
【表１１】
0003681984.tif 000041
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、生理食塩水ビヒクル、および実施例２に従って調製した化合物３で処置したラットの頸動脈の新生内膜の平均面積をプロットしたものであり、塗りつぶされていない棒は処置されていない頸動脈部分を、また、塗りつぶされた棒は処置された頸動脈部分を表す。
【図１】
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