(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ウイルスのキャプシドタンパク質遺伝子を不活性化することが可能なポリリボザイムであって、
前記ポリリボザイムは、複数のハンマーヘッド型リボザイムを含み、前記リボザイムの各々が、前記キャプシドタンパク質遺伝子またはそれに対応する転写産物、またはその複製中間体を開裂し、前記リボザイムの各々が、触媒部位と、前記キャプシドタンパク質遺伝子の一部分に相補的なハイブリダイジング・アームとを含み、
前記リボザイムの各々が、前記キャプシドタンパク質遺伝子またはそれに対応する転写産物におけるXUX部位をターゲットとする、ポリリボザイム。
【請求項２】
下記式を有する請求項１に記載のポリリボザイム：
［(Ｙ1−Ｑ−Ｙ2)−(Ｓ)n］P
ここでＹ1およびＹ2は、それぞれ、少なくとも４塩基を有し、前記キャプシドタンパク質遺伝子の一部分、それに対応する転写産物の一部分、または前記キャプシドタンパク質遺伝子に対応する複製中間体の一部分に相補的であるハイブリダイジング・アームであり；
Ｑはリボザイムの触媒領域であり；
Ｓは少なくとも２塩基を有し、前記キャプシドタンパク質遺伝子、それに対応する転写産物、またはその複製中間体に相補的でないヌクレオチド配列であり；
ｎ＝０または１であり；
ｐは１より大きい整数である。
【請求項３】
請求項１に記載のポリリボザイムであって、前記リボザイムの数が、前記キャプシドタンパク質遺伝子、または前記キャプシドタンパク質遺伝子に対応する転写産物、またはその複製中間体に存在するＸＵＸ部位の総数と同じか、または少ないポリリボザイム。
【請求項４】
請求項３に記載のポリリボザイムであって、前記リボザイムの各々が、前記キャプシドタンパク質遺伝子またはそれに対応する転写産物に存在するＸＵＸ部位であって、同じウイルスの異なる株の間または異なる関連ウイルスの間で保存されている相同域内に生じるＸＵＸ部位をターゲットとするポリリボザイム。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリリボザイムであって、前記ハイブリダイジング・アームが、下記ウイルス群から選択される植物ウイルスのキャプシドタンパク質に相補的であるポリリボザイム：
カリモウイルス群（Caulimoviruses）、ジェミニウイルス群（Geminiviruses）、レオウイルス科（Reoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、タバモウイルス群（Tobamoviruses）、ポテックスウイルス群（Potexviruses）、ポチウイルス群（Potyviruses）、カーラウイルス群（Carlaviruses）、クロステロウイルス群（Closteroviruses）、トブラウイルス群（Tobraviruses）、ホルデイウイルス群（Hordeiviruses）、チモウイルス群（Tymoviruses）、ルテオウイルス群（Luteoviruses）、トンブスウイルス群（Tombusviruses）、ソベモウイルス群（Sobemoviruses）、ネポウイルス群（Nepoviruses）、コモウイルス群（Comoviruses）、ククモウイルス群（Cucumoviruses）、ブロモウイルス群（Bromoviruses）、アイラーウイルス群（Ilarviruses）。
【請求項６】
請求項５に記載のポリリボザイムであって、前記植物ウイルスが、下記ウイルス群から選択されるポリリボザイム：
カリフラワーモザイクウイルス（Califlower Mosaic Virus；ＣａＭＶ）、トウモロコシストリークウイルス（Maize Streak Virus；ＭＳＶ）、ウーンドテューモアウイルス（Wound Tumour Virus；ＷＴＶ）、ジャガイモ黄萎ウイルス（Potato Yellow Dwarf Virus；ＰＹＤＶ）、トマトスポッテッドウイルトウイルス（Tomato Spotted Wilt Virus；ＴＳＷＶ）、タバコモザイクウイルス（Tobacco Mosaic Virus；ＴＭＶ）、ジャガイモＸウイルス（Potato Virus X；ＰＸＶ）、ジャガイモＹウイルス（Potato Virus Y；ＰＹＶ）、カーネーション潜在ウイルス（Carnation Latent Virus；ＣＬＶ）、ビート萎黄ウイルス（Beet Yellow Virus；ＢＹＶ）、タバコラットルウイルス（Tobacco Rattle Virus；ＴＲＶ）、ムギ斑葉モザイクウイルス（Barley Stripe Mosaic Virus；ＢＳＭＶ）、カブ黄斑モザイクウイルス（Turnip Yellow Mosaic Virus；ＴＹＭＶ）、オオムギ黄萎ウイルス（Barley Yellow Dwarf Virus；ＢＹＤＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（Potato Leaf Roll Virus；ＰＬＲＶ）、トマトブッシスタントウイルス（Tomato Bushy Stunt Virus；ＴＢＳＶ）、南部インゲンモザイクウイルス（Southern Bean Mosaic Virus；ＳＢＭＶ）、タバコネクロシスウイルス（Tobacco Necrosis Virus；ＴＮＶ）、タバコリングスポットウイルス（Tobacco Ring Spot Virus；ＴＲＳＶ）、カウピーモザイクウイルス（Cow Pea Mosaic Virus；ＣＰＭＶ）、エンドウエネーションモザイクウイルス（Pea Enation Mosaic Virus；ＰＥＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（Cucumber Mosaic Virus；ＣＭＶ）、ブロモモザイクウイルス（Brome Mosaic Virus；ＢＭＶ）、タバコストリークウイルス（Tobacco Streak Virus；ＴＳＶ）。
【請求項７】
請求項６に記載のポリリボザイムであって、前記ハイブリダイジング・アームが、キュウリモザイクウイルスのキャプシドタンパク質遺伝子の転写産物に相補的であるポリリボザイム。
【請求項８】
ＲＮＡからなる請求項１〜７の何れか１項に記載のポリリボザイム。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のポリリボザイムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
植物をウイルスに対して耐性にする方法であって、請求項１〜８の何れか１項に記載のポリリボザイムまたは請求項１〜８の何れか１項に記載のポリリボザイムをコードする核酸分子を植物に導入することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ポリリボザイムの植物への導入が、前記ポリリボザイムをコードするＤＮＡ分子で植物の一部を遺伝的に形質転換し、次いでトランスジェニック植物を再生することにより行われる方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記形質転換が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスを介在させて行われる方法。
【請求項１３】
ウイルスに対して耐性のトランスジェニック植物であって、そのゲノム内に、請求項１〜８の何れか１項に記載のポリリボザイムを転写により生じる配列を有するトランスジェニック植物。
【請求項１４】
ＣＭＶに対して耐性である請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
メロン、キュウリ、ズッキーニ、トマト、スウィートペッパーまたはマメである請求項１４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
請求項１３〜１５の何れか１項に記載のトランスジェニック植物の果実であって、前記ポリリボザイムを転写により生じる前記配列を含む果実。
【請求項１７】
請求項１３〜１５の何れか１項に記載のトランスジェニック植物の種子であって、前記ポリリボザイムを転写により生じる前記配列を含む種子。
【請求項１８】
請求項９に記載のＤＮＡにより形質転換された植物細胞。
【発明の詳細な説明】
この発明は、“ポリリボザイム”と呼ばれ、植物体にウイルスに対する耐性を付与し得るヌクレオチド配列、および植物対を耐性にする方法に関する。この発明はまた、このポリリボザイムを発現する植物体に関する。
植物体のゲノムにウイルスの核酸配列（カプシドタンパクの遺伝子、非構成タンパク質の遺伝子、アンチセンスウイルスＲＮＡ配列およびサテライドウイルスのＲＮＡ類）を組み込むことにより栽培植物に耐ウイルス性を付与する幾つかのアプローチが開発されている（例えば、Cuozzo et al., 1988, Bio/Technology 6, 549-557；Rezaian et al., 1988, Plant.Mol.Biol., 11, 463-471；Harrison et al., 1987, Nature 328, 797-802を参照）。
これらの刊行物は、部分的な抵抗性または寛容性の生成を報告している。それにもかかわらず、ほとんどの場合、徴候が遅れて出現したり、弱い徴候があり、完全に耐性ではない。
さらに、これらの手順の幾つか、例えばサテライトウイルスを用いるものは、新たな問題を生起することがある。例えば、ある種において徴候を軽減するサテライトウイルスが他の種に対しては致命的になることがある。さらに、植物体に導入されたサテライトウイルスのヌクレオチド配列における突然変異が、感染の重篤性を、軽減する代わりに増大させることがある。
同様に、カプシドタンパクを耐性の付与に用いることには不利な点がある。例えば、ウイルスの特定の株のカプシドタンパクは、必ずしも、ウイルスの他の株による感染に対して植物体を保護するものではない。タンパク質の発現によって許容される寛容性の程度の予測に、異なるウイルスまたは異なる株の間のカプシドタンパクのアミノ酸配列の相同性を用いることは困難である。さらに、ウイルス感染に対して保護するためのカプシドタンパクの発現は、植物対において発現したカプシドタンパクとこの遺伝子導入（トランスジェニック）植物に感染する他のウイルスとの間の異質カプシド形成［heteroencapsidation］を誘発する危険性をもたらす。この異質カプシド形成は、遺伝子導入植物ではいまだ示されていないが、ＢＹＤＶとＰＲＳＶ、およびＺＹＭＶとＰＲＳＶの株の間では既に観察されている。
植物体に耐ウイルス性を付与するために、リボザイムの使用もまた考慮されている。リボザイムは、標的ＲＮＡの開裂を特異的に触媒することにより酵素として作用するＲＮＡ分子である。植物細胞におけるリボザイムを用いた最初の実験は、特許出願EP-A-321021に記述された。それ以来、ウイルスＲＮＡの効率的な開裂を得るために、何人かの著書がリボザイムの構造および操作条件を最適化しようと試みている。
例えば、LambおよびHay（J.Gen.Virol., 1990, 71: 2257-2264）は、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）のＲＮＡのモノリボザイムを用いて、ＲＮＡポリメラーゼおよびカプシドタンパクをコードする領域におけるイン・ビトロ開裂を示している。しかしながら、このイン・ビトロ開裂反応は40℃でのみ生じる；0℃ではいかなる反応も全く観察することができない。植物は、種に依存はするが、通常10ないし30℃で栽培する。LambおよびHayは、イン・ビボでの使用に対しては、相補的アームの長さが増大したことを示している。しかしながら、アームが非常に長いとしても、標的ＲＮＡとリボザイムとの間で安定な二重鎖の形成が起こり得る。これは、リボザイムの解離を妨げ、リボザイムが他の開裂反応を触媒することを不可能にする。さらに、相補的アームの長さおよび配列によっては、リボザイム自身が２次構造を形成することがある。これは、その開裂活性を減少させる。
EdingtonおよびNelson（“遺伝子調節：アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生物学：ERICKSONおよびIZANT編、Raven Press Ltd, New-York, 1992）は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のポリメラーゼ遺伝子の不活性化に、モノリボザイムをイン・ビトロおよびイン・ビボで使用することを記述している。彼らは、リボザイムが、イン・ビトロで用いられるか、イン・ビボで用いられるかによって非常に異なる挙動を示すことを観察した。このため、イン・ビトロでのリボザイムの活性は、イン・ビボでの同じリボザイムの活性の予測に用いることはできない。例えば、イン・ビトロでの開裂は低効率であるように思われ、ＴＭＶゲノムＲＮＡの濃度よりも20倍も高いリボザイム濃度を要する。一方、ＴＭＶに感染したタバコプロトプラストを用いるイン・ビボ実験では、リボザイムはウイルスＲＮＡ増殖の90％を抑制する。対照として用いられたアンチセンスＲＮＡがウイルス増殖のわずかに20％しか阻害しないことは注目に値する。これらの研究者はまた、ＴＭＶのポリメラーゼ遺伝子を標的とするポリリボザイムを使い始めたGerlachらの研究を参照している。このポリリボザイムは、リボザイムと標的ＲＮＡとの間に形成された二重鎖の長さのために、イン・ビトロでは機能しない。一方では、イン・ビボにおいては、このポリリボザイムは基質を開裂した。モノリボザイムまたはポリリボザイムを発現する遺伝子導入タバコ植物体は、ＴＭＶ感染後の徴候の遅れを示している。完全耐性、すなわち徴候の決定的な欠如は記述されていない。この著者らは、起こり得るリボザイムの“コンパートメント・アライゼーション［compartment-alisation］”の問題を克服可能にする、相補的アームの最適長さ、標的配列の選択およびプロモータの選択のようなパラメータは、実験によって決定しなければならないと結論付けている。
EP-A-0421376には、ＣＭＶの非コーディングＲＮＡ配列に対するリボザイムが記述されている。WO-A-9213090には、“グループＩイントロン”型のモノリボザイムを用いて配列中に異質配列を導入することによる、ＣＭＶカプシドタンパクのＲＮＡの不活性化が記述されている。これらの文献のいずれも、ＣＭＶに対する完全な耐性の生成は記述されていない。
この発明が解決しようとする技術的な問題は、植物体に耐ウイルス性を付与する上で不利な点が全くない信頼に足る薬剤を供給することである。
本発明者らは、ウイルスのカプシドタンパクに対するポリリボザイムを着想し、それを使用することによりこの問題を軽決した。このポリリボザイムは、このタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することが可能であり、したがって完全な耐ウイルス性を付与することが可能である。
この発明のポリリボザイムの効率は、従来の技術においてカプシドタンパク遺伝子のアンチセンス配列を用いて得られた平凡な結果の観点からは驚くべきものである。これは、これらの方法の各々が対応ＲＮＡの不活性化に関与しているためである。加えて、何人かの著者はトランス作用ポリリボザイム類［trans acting polyribozymes］の使用に対しては忠告を与えている。これは、リボザイム類が、互いに独立には機能し得ず、また同一の配列を有する触媒領域がしばしば互いにハイブリダイズする傾向があるためであり、後者は不活性構造につながる（例えば、Taira、ＨＦＳＰワークショップ“ＲＮＡ−エディッティング−植物ミトコンドリア”、アブストラクト・ブック、ベルリン、1992年9月15-20日を参照）。この発明に従って得られた結果は、一方で選択された標的、すなわちカプシドタンパクの観点においても、他方で標的の不活性化に用いられる方法、すなわちポリリボザイムの観点においても、予期されるものではない。
不活性化の効率に加えて、この発明のポリリボザイムは、周知の方法と比較して多くの利点を有している：
- このリボザイムは、幾つかのウイルスＲＮＡの開裂を構造を変形させることなく特異的に触媒する酵素として機能する。この酵素的開裂は、カプシドタンパクの発現がウイルス感染を阻害し、ウイルス増殖のインヒビターとして機能するのに対して、全てのウイルスＲＮＡの破壊につながる。
- このリボザイムは異質カプシド形成を誘発し得ず、あるいは新たなウイルス株を産生し得ない。
- カプシドタンパクによって誘発される寛容の特異性を予測する困難であるのに対して、リボザイムは１以上のウイルス株を、あるいは、相同領域に対応する相補鎖が異なる株もしくは異なる関連株の間で保存されているのであれば幾つかの関連ウイルスを、特異的に開裂するために構築することが可能である。
この発明を完全に理解するために、リボザイムに関する事実を一般的に特定することは有益であろう。リボザイムは、その配列および二次構造によって、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。このエンドリボヌクレアーゼ活性は、リボザイムが相補的ＲＮＡの二次分子とハイブリダイズした際に、その二次ＲＮＡを開裂することを可能にする。したがって、後者はリボザイムの“基質”である。
リボザイムは２つの必須部分を有している：
（ｉ）以下では“相補的配列”と呼ばれ、開裂することが望まれる基質と相補的になるように選択される配列。これは、２つの分子がハイブリダイズすることを可能にする；
（ii）および、選択された基質にかかわらず保存された配列を有し、かつ“ループ”の形態にあるその二次構造のために基質とのハイブリダイゼーションに関与しない触媒領域。
通常、触媒領域は相補的配列中に位置し、したがって相補的配列の一部が触媒領域の５′に位置し、他の部分が３′に位置する。触媒領域の各々の側に当たるこれらの相補的配列の断片はしばしば“ハイブリダイジング・アーム”と呼ばれる。
この発明の目的はポリリボザイムである。それは、特には、エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ウイルスのカプシドタンパク遺伝子を不活性化することが可能な“ポリリボザイム”と呼ばれる核酸配列であって、
ｉ）この遺伝子もしくはその転写物もしくはその複製中間体の少なくとも一部に相補的な配列、およびこの相補的配列の異なる部位に含まれる：
ii）複数のリボザイム触媒領域；
iii）および、任意の、前記遺伝子の転写物に相補的ではなく、前記相補的配列の２つの保存塩基の間に挿入されている１以上の配列、
を包含することを特徴とする核酸配列である。
この明細書において、“ポリリボザイム”という用語は、頭−尾結合で連なるリボザイムで構成され、そのためこのリボザイムがポリリボザイムの単位モチーフであるＲＮＡ分子を意味する。換言すると、それはハイブリダイジング・アームによって互いに結合する一連の触媒領域であり、これらのアームの全長が相補的配列を構成する。ポリリボザイムは、通常、単一の転写物に対して“単一分子［uni-molecule］として作用する。すなわち、各々の触媒領域の開裂部位は同じ転写物：カプシドタンパク上に位置する。また、この発明のポリリボザイムは、上述の２つの必須部分である［（ｉ）、相補的配列］および［（ii）、触媒領域］に加えて、１以上の（iii）基質に非相補的な配列を含んでいてもよい。これらの非相補的配列の性質および機能は、後に詳述する。
ポリリボザイムの２つの必須部分のうち、相補的配列は基質を決定するものである。この発明では、それはウイルスのカプシドタンパク遺伝子またはこの遺伝子の断片に相補的な配列である。ウイルスが、その遺伝子が直接ｍＲＮＡとして働くＲＮＡ（＋）ウイルスである場合には、相補的配列は実際にその遺伝子に相補的である。他の場合には、遺伝子の転写物に相補的である。また、複製中間体に相補的であってもよい。
相補的配列は、カプシド遺伝子の全長とハイブリダイズしてもよい。この場合には、相補的配列の全長は、問題となるカプシド遺伝子の長さの関数として変化する。他方、相補的配列は遺伝子の断片とのみハイブリダイズしてもよい。問題となる断片は、ポリリボザイムの対応配列中に少なくとも２つの触媒領域が組み込まれることを可能にするに十分な長さでなければならない。一般に、相補的配列の長さは、触媒領域（すなわち、ハイブリダイジング・アームの合計）を計算せずに、約40ないし2000塩基の間を変化し得る。非常に多くのウイルスが約1000塩基のカプシドタンパク遺伝子を有しており（例えば、ＣＭＶ、ＰＬＲＶ）、400ないし1000の長さが好ましい。
この明細書において、“相補的”という用語は、ポリリボザイムとこの基質との安定なハイブリダイゼーションおよび基質の効率的な開裂を可能とするに十分な、高度の相補性を意味する。ポリリボザイムがタイプ（iii）、すなわち“非相補的”配列を含まない場合には、相補性の程度は通常100％である。配列中における特定の数、例えば10％までの不適合対の存在は、ハイブリダイゼーションおよび基質の開裂を妨げない限りにおいて許容することができる。
ポリリボザイムの（ii）部分、すなわち触媒領域は、あらゆるタイプの適切なリボザイム、例えば“ハンマー・ヘッド”、“ヘアピン”または“グループＩイントロン”から誘導される。１種および同種のポリリボザイムは、異なるタイプのリボザイム、例えば“ハンマー・ヘッド”および“ヘアピン”、から誘導される触媒領域を有していてもよい。触媒領域は、“ハンマー・ヘッド”タイプのリボザイムから誘導されることが好ましい。このリボザイムのコンセンサス構造を図１Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示す。これらのリボザイムは、特許出願EP-A-321021およびWO-A-9119789に詳細に記述されている。
図１に示される触媒領域は保存構造および配列を有するが、幾つかのヌクレオチドが、リボザイムの活性を損なうことなく、欠落し、挿入され、置換され、または変性され得ることが観察されている。この発明は、ポリリボザイム中のこれらの触媒領域の使用を、それらの触媒活性が保存されているという条件の下で、包含する。この活性は、下記試験を用いることにより確かめることができる。
例えば、図１Ａに示される触媒領域IIの１以上のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、メチルシトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシンもしくは他のメチル化塩基のような塩基を含むヌクレオチドで置き換えることができる。触媒ループの最初の塩基対を一緒に形成する“保存された”塩基Ｃ−Ｇは、Ｕ−Ａで置き換えることができる（Koizumi et al., FEBS Letts. 228, 2, 228-230, 1988）。
図１に示される触媒領域のヌクレオチドはまた、化学的に変性させることができる。ヌクレオチドは塩基、糖および一リン酸塩基からなる。したがって、これらの基の各々を変性させることができる。そのような変性は、“核酸構造の原理［Principles of Nucleic Acid Structure］”（Wolfram Sanger編，Springer Verlag, New York, 1984）に記述されている。例えば、塩基は、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アジド、ニトロ、フェニル基等の置換基を有していてもよい。また、ヌクレオチドの糖部分が、ハロゲノ、アミノもしくはアジド基による第２ヒドロキシル基の置換のような変性、あるいは２’メチル化さえも受けていてもよい。
ヌクレオチドのリン酸基は、Ｎ、ＳもしくはＣによる酸素の置換（それぞれ、ホスホラミデート、ホスホロチオエートおよびホスホネートを生じる）による変性を受けていてもよい。これら後者は、有用な薬学動力学特性を示す可能性がある。
また、触媒領域の塩基および／またはヌクレオチドは、アミノ酸、例えばチロシンもしくはヒスチジン、のような置換基を有していてもよい。
リボザイムの活性を損なうことなく、触媒領域の特定の部位にさらなるヌクレオチドが挿入され得ることも観察されている。例えば、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＵから選択されるさらなる塩基が、図１Ａまたは１ＢにおけるＡ1の後に挿入されてもよい。
この発明の変形によると、リボザイムは、図１Ｄに示されるような構造の１以上を触媒領域として含むことができる。“ミニザイム”と呼ばれるこの構造は、国際特許出願WO-A-9119789に記述されている。これは、その“ループ”が“Ｐ”群で置き換えられている“ハンマーヘッド”タイプの触媒領域を表わしている。Ｐは、Ｇおよび1Ａの間の共有結合的連結、１以上のヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または混合物、または上述の誘導体）あるいは触媒活性に影響を与えないヌクレオチド以外の原子もしくは原子団であり得る。Ｐが複数のヌクレオチドを表わす場合には、それは内部塩基ペアリングを含むことがある。“Ｐ”群を構成するヌクレオチドの配列および数は重要ではなく、例えば1ないし20ヌクレオチド、好ましくは1ないし6ヌクレオチドの範囲を変化し得る。ワトソン−クリック・タイプの内部塩基ペアリングを欠く配列を選択することが好ましい。
この発明のポリリボザイムの触媒活性は、ポリリボザイム、または転写後にポリリボザイムを生じる配列を、続いて開裂を示すことになる基質と接触した状態に置くことにより、イン・ビトロで確かめることができる。イン・ビトロ開裂反応の実験条件は以下の通りである：4ないし60℃、好ましくは20ないし55℃の温度、約7.0ないし9.0のｐＨ、Ｍｇ2+のようなニ価金属の存在下、1ないし100ｍＭ（好ましくは1ないし20ｍＭ）の濃度。ポリリボザイムは、通常、基質と等モル比、または過剰に存在する。このイン・ビトロ開裂反応は、Lamb and Hayによって記述された方法（J. Gen. Virol., 1990, 71, 2257-2264）に従って有利に行なわれる。また、この論文は、リボザイムを産生させるための、プラスミドに挿入されているオリゴデオキシリボヌクレオチドからのイン・ビトロ転写の適切な条件も記述している。
このイン・ビトロ開裂条件は、細胞中に本来存在するものである。
“ハンマーヘッド”リボザイムは、“標的”部位ＸＸＸ、好ましくはＸＵＸ（ここで、Ｘは４種の塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの１つを表わし、Ｕはウラシルを表わす）のすぐ下流で基質を開裂する。特に好ましい標的配列の１つはＸＵＹ（ここで、ＹはＡ、ＣもしくはＵを表わし、ＸはしばしばＧである）、例えばＧＵＣである。他の標的部位、例えばＣＡＣ、ＵＡＣおよびＡＡＣ、も可能ではあるが、有効性は低い。“ヘアピン”タイプのリボザイムの場合には、好ましい標的配列はＡＧＵＣである。
これらの標的配列は、それらが基質の開裂位置を示すためだけではなく、相補的配列において触媒領域が挿入されるべき位置を定義するので、ポリリボザイムの構成および機能の上で重要である。実際、ポリリボザイムの各触媒領域は、転写物のＸＵＸ部位に対応する相補的配列中の部位に位置していなければならない。例えば、１つのＸＵＸ部位がキャプシドタンパク遺伝子の108位に位置し、他方が205位に位置する場合には、相補的配列中の対応位置である108、他方は205に触媒領域が挿入されている。
ＸＵＸというモチーフはＲＮＡ配列中に非常に頻繁に発生するモチーフである。例えば、塩基が無作為かつ均質に分布している配列中では、平均して64塩基毎にＧＵＣモチーフが存在する。これは、基質が、通常複数のＸＵＸ開裂部位を有していることを意味している。前に示されるように、ポリリボザイムの触媒領域は、相補的配列のＸＵＸ部位に対応する位置に位置する。しかしながら、この発明による有効な開裂を得るためには、基質の各ＸＵＸ標的配列毎に触媒領域を含む必要はない。この発明によると、ポリリボザイムが少なくとも２つの触媒領域を含んでいれば有効な開裂が得られる。相補的配列中に含まれる触媒領域の総数は、遺伝子中に存在するＸＵＸ部位の総数に等しいか、もしくは少ない。このように、この発明のポリリボザイムに含まれる触媒領域の数は一定していない。例えば、ＣＭＶでは、標的配列がＧＵＣである場合、ポリリボザイムは約2ないし約11もしくは12の触媒領域を有することができる。相補的配列中に、基質中のＸＵＸ部位の数よりも少ない数の触媒領域を含めることが決定された場合には、選択された部位は以下の基準を考慮することにより選定することができる：
ａ）標的とする２つのＸＵＸ部位の間、結果的にはポリリボザイムにおける２つの触媒領域の間の距離は、対応する触媒領域の間に位置するポリリボザイムのハイブリダイジング・アームが安定な様式で基質とハイブリダイズし、触媒領域がそれら自身とハイブリダイズすることを妨げることを可能とするのに十分な長さでなければならない。少なくとも8塩基、好ましくは少なくとも14塩基、例えば約20塩基の距離が特に有益である。もちろん、この基準は、基質が互いに非常に近接したＸＵＸ部位を有する場合にのみ考慮されるべきである。そうではなく、基質のＸＵＸ部位が互いに8ないし20塩基よりも離れている場合には、この選択基準は重要ではない。
ｂ）標的とされるＸＵＸ部位は、好ましくは、意味のある二次構造を有していないキャプシドタンパク遺伝子の一部に位置する。これは、基質へのポリリボザイムの接近を容易にし、その効率を増大させる。
ｃ）標的とされるＸＵＸ部位は、１つの同じウイルスの異なる株の間で、もしくは異なる関連ウイルスの間で保存された相同領域を形成することができる。この基準を考慮して構成されたポリリボザイムは、幾つかのウイルス株もしくは幾つかの関連ウイルスを特異的に開裂することが可能である。例えば、ＰＬＲＶのキャプシドタンパク遺伝子の中央領域は、関連ウイルスＢＷＹＶおよびＢＹＤＶのキャプシドタンパクの配列と比較して、高度に保存されている。このため、この中央領域内のＸＵＸ部位、特にＧＵＸは、この発明のこの変形によるポリリボザイムの好ましい部位を構成する。
また、例として、ＣＭＶのキャプシドタンパクの配列の５’末端は（約100塩基の長さにわたって）、Ｉ17Ｆ、ＦＮＹ、Ｍ、Ｉ、Ｏ、Ｙ、ＤおよびＣ株の間で高度に保存されている。この保存配列の84位には、これらの株の全てにおいて、保存されたＧＵＣ部位が存在する。
この発明の変形によると、ＣＭＶの幾つかの株を不活性化し得るポリリボザイムは、その触媒領域の中に、この84位に対応する相補的配列の部位に位置する１つの触媒領域を含む（後述の例を参照）。
ｄ）標的とされるＸＵＸ部位の他の選択基準は、形質転換しようとする植物の内在遺伝子との相同性がないことである。実際、稀ではあるが、幾つかのウイルスは、植物のゲノム中に相同性が見出せる配列を有している。このため、そのような配列中に位置するＸＵＸ部位は避けることが重要である。
この発明の特に好ましい態様によると、ポリリボザイムは、上述の２つの必須部分（ｉ）および（ii）に加えて、第３の構成要素（iii）を包含し得る。この第３の構成要素（iii）は、ウイルスのキャプシドタンパク遺伝子に非相補的な１以上の配列である。触媒領域と同様に、これらの非相補的配列は、相補的配列の異なる部位に挿入されている。相補性は、この挿入によって断絶されている。驚くべきことに、ポリリボザイムのハイブリダイジング・アーム内でのそのような非相補的配列の存在によって、ポリリボザイムと基質とのハイブリダイゼーションが妨げられることはなく、幾つかの場合には開裂反応の効率が改善され得ることさえあることを発明者らは観察した。
これらの非相補的配列は相補的配列の２つの連続した塩基の間に挿入され、その結果、非相補的配列は相補的配列と共線形挿入［colinear insertion］を形成する。この場合、ポリリボザイムは以下の構造を有する：
（（ハイブリダイジング・アーム−触媒領域−
ハイブリダイジング・アーム）−（非相補的配列）n）p
（ここで、ｎ＝０または１、およびｐ＞１）
この発明のこの態様の例として、ハイブリダイジング・アームが、連続しかつ隣接する、基質の異なる断片に相補的であり、非相補的配列によって共に連結されているリボザイムの配列からなるポリリボザイムに言及することができる。換言すると、このような構造のハイブリダイジング・アームの集合は、キャプシドタンパク遺伝子に相補的な配列を再構築する。
ポリリボザイムにおける非相補的配列の存在は、ポリリボザイムの２つの触媒領域の間の距離が基質における２つの対応ＧＵＣ部位の間の距離よりも大きいことを意味する。この発明のこの変形によると、触媒領域の各側部に位置するハイブリダイジング・アームの長さは、各側部について少なくとも4塩基、好ましくは少なくとも8塩基でなければならず、800ないし1000塩基もの長さであってもよい。
非相補的配列（複数）の性質は、その（それらの）機能によって大きく変化し得る。基質の対応する２つＸＵＸ部位が互いに比較的近接している場合には、“パッディング”機能を有する配列、すなわち、ポリリボザイムの２つの触媒領域の間の距離を増大させる働きをする配列があり得る。この方式においては、２つの隣接する触媒領域の間の不活性二重鎖［inactive duplexes］の形成を回避することができる。予め定めされた二次構造を有し、相当の長さ、例えば800を超える塩基を有するポリリボザイムが、それ自身再度折り畳まれて活性のない二次構造となることを防ぐ効果を有する配列を、非相補的配列として用いることも可能である。このタイプの構造の例として、１以上の必須塩基が欠失することによって不活性化されたリボザイムに言及することができる。この発明の態様のこの様式は、下記例に記述されるポリリボザイム136によって例示されている。
ポリリボザイムの非相補的配列はまた、厳格な機能を有していてもよい。例えば、形質転換体の選別に用いることができるコーディング配列、またはキャプシドタンパク以外の基質に作用し、もしくはポリリボザイムの一部に対して作用するｃｉｓであるリボザイムを含む配列によって構成されていてもよい。一般的に言えば、非相補的配列はタンパク質をコードしない。クローニングの多重部位を有していてもよい。非相補的配列は、通常、2ないし500塩基、例えば20ないし100塩基の長さを有する。複数の相補的配列がある場合には、それらが一緒になってポリリボザイムの長さの約90％まで、例えば50％を構成することができる。
この発明のポリリボザイムは、通常ＲＮＡからなる。とは言うものの、ポリリボザイムの幾らかの部分、例えば、ハイブリダイジング・アームもしくはそれらのアームの一部、または触媒領域の一部、特に“ループ”、でさえも、触媒活性が維持されるという条件の下で、ＤＮＡで置き換えることが可能である（例えば、国際特許出願WO-9119789に記述されるＤＮＡによるＲＮＡの置換を参照）。
この発明のポリリボザイムは、あらゆるウイルスキャプシドタンパクを不活性化するために構築することができる。キャプシドタンパクは、ウイルスゲノムによってコードされ、重合体キャプシド［polymeric capsid］を造り上げるタンパクサブユニットである。キャプシドは、核酸に沿って整列するこれらの同一のタンパクサブユニットの連続からなる。キャプシドサブユニットの空間配置が、ウイルスによって、螺旋もしくは二十面体構造のいずれかを生じる。この発明は、エンベロープを有するウイルスの他に、螺旋状粒子、もしくは二十面体粒子のいずれかを有するウイルスのキャプシドタンパクを指向するポリリボザイムに関する。エンベロープはヌクレオキャプシドを取り巻くリポタンパク質の膜である。
適切なウイルスの例として、以下の群から選択されるウイルスに言及することができる：カリモウイルス群［Caulimoviruses］、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；ジェミニウイルス群［Geminiviruses］、例えばメイズストリークウイルス［Maize Streak Virus］（ＭＳＶ）；レオウイルス科［Reoviridae］、例えばウーンドツモーウイルス［Wound Tumor Virus］（ＷＴＶ）；ラブドウイルス科［Rhabdoviridae］、例えばジャガイモ黄萎ウイルス［Potato Yellow Dwarf Virus］（ＰＹＤＶ）、トマトスポッテッドウイルス群［Tomato Spotted Wilt Virus］（ＴＳＷＶ）；タバモウイルス群［Tobamoviruses］、例えばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；ポテックスウイルス群［Potexviruses］、例えばジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）；ポチウイルス群［Potyviruses］、例えばジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）；カーラウイルス群［Carlaviruses］、例えばカーネーション潜在ウイルス［Carnation Latent Virus］（ＣＬＶ）；クロステロウイルス群［Closteroviruses］、例えばビート萎黄ウイルス［Beet Yellow Virus］（ＢＹＶ）；トブラウイルス群［Tobraviruses］、例えばタバコラットルウイルス［Tob acco Rattle Virus］（ＴＲＶ）；ホルデイウイルス群［Hordeiviruses］、例えばムギ斑葉モザイクウイルス［Barley Stripe Mosaic Virus］；チモウイルス群［Tymoviruses］、例えばターニップイエローモザイクウイルス［Turnip Yellow Mosaic Virus］（ＴＹＭＶ）；ルテオウイルス群［Luteoviruses］、例えばオオムギ黄萎ウイルス［Barley Yellow Dwarf Viruses］（ＢＹＤＶ）もしくはジャガイモ葉巻ウイルス［Potato Leaf Roll Virus］（ＰＬＲＶ）；トンブスウイルス群［Tombusviruses］、例えばトマトブッシスタントウイルス［Tomato Bushy Stunt Virus］（ＴＢＳＶ）；ソベモウイルス群［Sobemoviruses］、例えば南部インゲンモザイクウイルス［Southern Bean Mosaic Virus］（ＳＢＭＶ）；タバコネクロシスウイルス群（ＴＮＶ）；ネポウイルス群［Nepoviruses］、例えばタバコリングスポットウイルス［Tabacco Ring Spot Virus］（ＴＲＳＶ）；コモウイルス群［Comoviruses］、例えばカウペアモザイクウイルス［Cow Pea Mosaic Virus］（ＣＰＭＶ）；エンドウエネーションモザイクウイルス群［Pea Enation Mosaic Virus］（ＰＥＭＶ）；ククモウイルス群［Cucumoviruses］、例えばキュウリモザイクウイルス［Cucumber Mosaic Virus］（ＣＭＶ）；ブロモウイルス群［Bromoviruses］、例えばブロモモザイクウイルス［Brome Mosaic Virus］（ＢＭＶ）；アイラーウイルス群［Ilarviruses］、例えばタバコストリークウイルス［Tobacco Streak Virus］（ＴＳＶ）。これらのタンパクの配列は公知である（例えば、モノグラフ：“Elements de Virologie Vegetale”、Pierre Cornuet、I.N.R.A. Paris、1987、ISBN：2-85340-808-6に引用されている多くの参考文献を参照）。
特に好ましい変形によると、キャプシドタンパクはキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のものである。キュウリモザイクウイルスはククモウイルス群に属するウイルスであり、750種を超える植物がＣＭＶに感染し得るため、耕種学的に非常に重要なものである。ＣＭＶは、３つのゲノムＲＮＡ（ＲＮＡ1ないし3）およびサブゲノムＲＮＡ（ＲＮＡ4）を有する二十面体粒子からなる多成分ウイルスである。ＲＮＡ3は、キャプシドタンパク遺伝子のコピーを有している；しかしながら、ＲＮＡ3から誘導されるサブゲノムＲＮＡ4はキャプシドタンパク合成のためのマトリックスとして働く。ＣＭＶの異なる株は２つの群に分けられる：
＊株Ｃ、Ｄ、ＦＮＹ、Ｙ、Ｉ17ＦおよびＣｈｉを含む、サブグループＩ；
＊株ＱおよびＷＬが属するサブグループII。
同じサブグループに属するＣＭＶ株のキャプシドタンパクのアミノ酸配列の比較では、95％の相同性が示された。サブグループＩおよびIIの間の配列相同性は低く、80％のオーダーである。
ＣＭＶ（Ｉ17Ｆ株）のキャプシドタンパクを指向するこの発明のポリリボザイムは、ＣＭＶの異なる株の不活性化に極めて有効であることが見出されており、結果として形質転換植物を完全に耐性としている。
このポリリボザイムに加えて、この発明はまた、前述の類のポリリボザイムもしくはポリリボザイムをコードする配列を植物体に導入することを特徴とする、植物体をウイルスに対して耐性にする方法にも関する。
通常、植物体へのポリリボザイムの導入は遺伝子形質転換によって行なわれ、それによりポリリボザイムをコードするＤＮＡ配列が植物のゲノムに安定に組み込まれる。
外来ＤＮＡを植物に導入する公知手段の全て、例えば、アグロバクテリウム［Agrobacterium］、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、粒子銃を用いる衝撃、または花粉、小胞子、種子および未成熟の胚のような細胞へのＤＮＡの浸透、ジェミニウイルスもしくはサテライトウイルスのようなウイルスベクター、を用いることができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス［Agrobacterium tumefaciens］およびリゾジェネス［rhizogenes］が好ましい手段である。この場合には、ポリリボザイムをコードする配列が、形質転換体を選別するために必要な配列の他に、プロモータ、ターミネータ等の必要な全ての調節配列と共に、適切なベクターに導入される。
また、この発明は、この方法によって得られる遺伝子導入植物体にも関する。特には、この発明は、ウイルスに対して耐性の遺伝子導入植物体であって、転写後にこの発明によるポリリボザイムを生じる配列をそれらのゲノム中に有する植物体に関する。
この明細書において、“完全な耐性［complete resistance］”という用語は、徴候の完全な欠如を意味する；“寛容性［tolerance］”は、植物体が感染はするが、すなわち徴候は示すが、直に回復することを意味する。“感受性［sensitive］”という用語は、植物体が徴候を示し、かつウイルスを複製することを意味する。“耐性型［resistant type］”という表現は、完全に耐性の植物体と寛容性の植物体の総体を意味する。
この発明の遺伝子導入植物体の“耐性”は、以下の方法で試験することができる：第１世代の子孫に対して自家受精、または非形質転換ゲノタイプとの異種交配を行ない、Ｔ1を得る。続いて、Ｔ1植物体に問題のウイルスを接種する。この発明によると、自家受精の後には、Ｔ1の75％が完全な耐性である。非形質転換ゲノタイプとの異種交配の場合には、植物体の50％が完全な耐性である（これらの数字は、この発明に従って、形質転換および再生手続を受けた植物体の全てのポピュレーションを試験することにより得た。形質転換されたのが、これらの植物体のわずかに75％のみであることは注目されるべきことである）。
植物体の形質転換された性質は、“サザーンブロット”分析を行なうことにより確かめることができ、形質転換によって導入された配列の発現は、“ノーザンブロット”分析を行なうことにより確かめることができる。これらの分析は、後記の例に記述されている。
従来の技術において周知の、植物体の形質転換および再生の方法は、この発明のポリリボザイムによって保護された遺伝子導入植物体の作製に完全に適合している。例として、特許出願EP-A-0412912に記述されるメロンの形質転換および再生方法に言及することができる。
ＣＭＶに対して耐性の遺伝子導入植物体、例えば、メロン、キュウリ、ズッキーニ、トマト、ペッパー、マメが特に好ましい。
図面には、発明の様々な面が示されている：
−図１は、この発明のポリリボザイムの触媒領域の好ましい構造を示しており、これらの領域は、各々の側部で、ウイルスのキャプシドタンパクの一部に相補的な配列に取り囲まれている：
（ｉ）図１Ａにおいて：Ｘは、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＵを表わす；各々のＸは同じであるか、もしくは異なっている；ｎ＋ｎ’≧6、ｎおよびｎ’は同じであるか、異なっている；（＊）は相補的リボヌクレオチド間の水素結合を表わす；Ｘ’およびＸ”は、それらの長さの少なくとも一部に亘って互いに相補的であり、かつ少なくとも１つのヌクレオチドによって互いに連結してループを形成する可能性があるオリゴリボヌクレオチドを表わす。Ａ’の後に、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＵから選択されるさらなるヌクレオチドが挿入されていてもよい。このリボザイムの触媒領域は、図１Ａの部分（II）で表わされ、ハイブリダイジング・アームは部分（Ｉ）で表わされる。
（ii）図１Ｂにおいて：Ｘ、（＊）、ｎ、ｎ’およびＡ’は図１Ａと同じ意味である。ＭおよびＭ’≧1で、これらは同じであるか、異なっている。Ｂは、結合、塩基対、リボヌクレオチドもしくは少なくとも２つのリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを表わす。
（iii）図１Ｃはリボザイムの好ましいモデルを表わす（Haseloff and Gerlach, 1988）。ＲＮＡ基質は、ＧＵＣ開裂部位の周りに、リボザイムに相補的ないかなる配列（Ｘ）を有していてもよい。矢印は開裂部位を示す。保存された塩基は黒で示されている。
（iv）図１Ｄは、その触媒領域のループが要素“Ｐ”で置き換えられた（“ミニザイム”と呼ばれる）リボザイムの構造を表わす。Ｐは、配列（Ｘ’）nおよび（Ｘ）n′およびＰがリボヌクレオチドのみからなる場合に、“Ｐ”群のリボヌクレオチドが“ワトソン−クリック”塩基対形成［base pairing］で対を形成する塩基ではないという条件の下で、少なくとも１つのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、誘導体もしくは混合物）であればよい。“Ｐ”はまた、リボザイムの触媒活性に影響を及ぼさない結合、もしくは原子、もしくは原子団であってもよい。Ｘは図１Ａと同じ意味を有する。
−図２はＣＭＶ（Ｉ17Ｆ株）のキャプシドタンパクの配列を示し、ＧＵＣ部位には下線が付されている。
−図３は、ＴｏｂＲＳＶの触媒部位をＣＭＶキャプシドタンパクの配列の異なる部位に導入するための指向変異生成実験［directed mutagenesis experiments］に用いられるオリゴデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅの構造を示す（ＤＮＡマトリックス配列とハイブリダイズして示される）。
−図４は、ＣＭＶに耐性を誘導するために構築された遺伝子の構造を示す：
（ｉ）キャプシドタンパク
（ii）ポリリボザイム136：２つのリボザイムを有する、キャプシドタンパクに相補的な配列；
（iii）ポリリボザイム161：３つのリボザイムを有する、キャプシドタンパクに相補的な配列；
（iv）ポリリボザイム163：３つのリボザイムを有する、キャプシドタンパクに相補的な断片；
（ｖ）ポリリボザイム165：４つのリボザイムを有する、キャプシドタンパクに相補的な配列；
−図５は、ポリリボザイム136を発現する遺伝子導入メロン植物体（第１代形質転換体、幾つかの場合にＴ1およびＴ2子孫）のノーザンブロット分析を示す：
Ｔ0 ：第１代形質転換体；
Ｔ1 ：Ｔ1 子孫；
Ｔ2 ：Ｔ2 子孫；
Ａ  ：141.1 株；
ＮＴ：非形質転換対照
−図６は、ポリリボザイム136を発現する遺伝子導入メロン植物体（第１代形質転換体、幾つかの場合にＴ1およびＴ2子孫）のサザーンブロット分析を示す：
Ｔ0 ：第１代形質転換体；
Ｔ1 ：Ｔ1 子孫；
Ｔ2 ：Ｔ2 子孫；
ＮＴ：非形質転換対照
−図７は、キャプシドタンパク遺伝子を発現する遺伝子導入メロン植物体（第１代形質転換体、幾つかの場合にＴ1およびＴ2子孫）のサザーンブロット分析を示す：
Ｔ0 ：第１代形質転換体；
Ｔ1 ：Ｔ1 子孫；
Ｔ2 ：Ｔ2 子孫；
Ａ  ：88.105株；
Ｂ  ：159.8 株；
ＮＴ：非形質転換対照。
−図８は、ｐＢＩＯＳ135で形質転換された遺伝子導入メロン植物体（第１代形質転換体）のウェスタンブロット分析を示す：
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ：5つの株の第１代形質転換体
ＮＴ：非形質転換対照
Ｒ  ：20ｎｇのＣＭＶでの再構築。
−図９は、ｐＢＩＯＳ135で形質転換された株における、時間の経過に伴うＣＭＶの徴候の発症を示す：
0003681751.tif 000002
−図10は、ｐＢＩＯＳ135で形質転換された株における、時間の経過に伴うＣＭＶの徴候の発症を示す：
0003681751.tif 000003
実施例
以下の例は、24塩基のハンマーヘッド・コンセンサス構造（図１）および異なるサイズの、ＣＭＶ（Ｉ17Ｆ株）のキャプシドタンパクの配列に相補的なアームからなる３もしくは４つのリボザイムを含む４つのポリリボザイムの構築を記述する。これらの例に示されるキャプシドタンパクのヌクレオチド配列の番号付けは、特許出願EP-A-0412912において用いられるものに相当する。
これらのリボザイムの各々は、ＣＭＶのキャプシドタンパクの遺伝子配列に沿って異なるＧＵＣ配列を開裂する。これらの構築物の構造は図４に示される：
- 1074塩基長のポリリボザイム136は、リボザイムＡ（84位）およびＢ（108位）、並びにＧおよびＡ（20および21位）が欠失しているリボザイムＣ*（204位）を含み、これらのリボザイムは以下の長さの相補的アームに取り囲まれている：
・５′末端からリボザイムＡまでの82ヌクレオチド；
・リボザイムＡおよびＢの間の22ヌクレオチド；
・リボザイムＢおよびＣ*の間の94ヌクレオチド；
・およびリボザイムＣ*から３′末端までの803ヌクレオチド。
- 1076塩基長のポリリボザイム161はポリリボザイム136と同一であり、唯一の相違は204位のリボザイムＣがリボザイムＣ*で欠損しているＧおよびＡを有していることである。
- 426塩基長のポリリボザイム163は、以下の長さの相補的アームに取り囲まれる、３つのリボザイムＡ（84位）、Ｂ（108位）およびＣ（204位）を有している：
・５′末端からリボザイムＡまでの82ヌクレオチド；
・リボザイムＡおよびＢの間の22ヌクレオチド；
・リボザイムＢおよびＣの間の94ヌクレオチド；
・およびリボザイムＣから３′末端までの153ヌクレオチド。
- 1099塩基長のポリリボザイム165は、以下の長さの相補的アームに取り囲まれる、４つのリボザイムＡ（84位）、Ｂ（108位）、Ｃ（204位）およびＥ（608位）を有している：
・５′末端からリボザイムＡまでの82ヌクレオチド；
・リボザイムＡおよびＢの間の22ヌクレオチド；
・リボザイムＣおよびＥの間の94ヌクレオチド；
・リボザイムＥから３′末端までの399ヌクレオチド。
これらのポリリボザイムは、それらの発現および植物ゲノムへの組み込みに必要なシグナルを含んでいない。構成もしくは非構成プロモータ（例えば、ＮＯＳのようなウイルスもしくはバクテリアプロモータ、またはルビスコ［Rubisco］もしくはユビキノンのプロモータのような植物プロモータ）をポリリボザイムの５′末端に配置し、ポリ（Ａ）配列を３′末端に配置しなければならない。植物において機能する幾つかのプロモータを用いることができる；発明者らは、最も強力な構成プロモータであると思われるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の35Ｓプロモータを選択した。ポリアデニル化シグナル・ポリ（Ａ）は、ＣａＭＶの35Ｓ遺伝子のものであっても、植物から単離された遺伝子のものであっても、あるいはオクトピンシンターゼのものであってもよい；発明者らは、ノパリンシンターゼの遺伝子（ｔｎｏｓ）由来のポリ（Ａ）シグナルを選択した。構築されたこの発現カセットを、カナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシン・ホスホ-トランスフェラーゼをコードする遺伝子ｎｅｏ）およびグルクロニダーゼをコードするｉｕｄ  Ａ遺伝子を含むｐＢＩ121ベクターに由来するｐＢＩＯＳ4形質転換ベクターに導入した。メロン子葉の遺伝的形質転換およびトランスジェニックメロン植物体の再生のプロトコルは、バイオセム［BIOSEM］名義の特許“トランスジェニックメロン”、EP-A-0412912に記述されているものと同じである。
例  １：キュウリ・モザイクウイルスのキャプシドタンパク遺伝子に対するリボザイムの構築、Ｉ17Ｆ株：
ｐＢＩＯＳ133と呼ばれるＣＭＶ  Ｉ17Ｆ株のＲＮＡ4に相補的なＤＮＡを有する、ファージミド・ブルースクライブ［phagemid bluescribe］ｐＢＳＩＩＳＫ（STRATAGENE）を用いて、ＣＭＶの異なる株に耐性のトランスジェニックメロンを得た。前記ファージミドの作製手順は欧州特許出願EP-A-0412912に記述されており、異なるリボザイムを構築するための出発点として役立つ。
サテライトＴｏｂＲＶ（タバコ輪紋病ウイルス）の触媒部位をキャプシドタンパク遺伝子の配列中の異なる位置に導入した。1007塩基長の、ＣＭＶ  Ｉ17Ｆ株のＲＮＡ4に相補的なＤＮＡ配列はEP-A-0412912の図３に示されている；キャプシドタンパクをコードする部分はアミノ酸配列を伴って示されている。
ハーゼルホフおよびゲルラッハ［Haselhoff and Gerlach］によって記述された“ハンマーヘッド”型のリボザイムがＧＵＣモチーフのＣの後を優先的に開裂させるので、キャプシドタンパクをコードする配列上の４つ位置が選択された（図２）：
＊位置Ａ、ヌクレオチド84、
＊位置Ｂ、ヌクレオチド108、
＊位置Ｃ、ヌクレオチド204、
＊位置Ｄ、ヌクレオチド608。
これらの位置に、通常“ハンマーヘッド”と呼ばれる24塩基のリボザイムを導入するために、クンケル［KUNKEL］によって開発された一本鎖ＤＮＡ上での変異誘発法（Proc.Nat.Acad.Sci. 82:488-492）を用いることを決定した。この方法は、変異誘発されるＤＮＡと部分的にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成するためのプライマーとして３′末端で役立つ合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを必要とする。以下の４種のオリゴヌクレオチドをユーロジェンテック社［EUROGENTEC company］に注文した：
0003681751.tif 000004
これら４種のオリゴヌクレオチドおよびバイオラド社［BIORAD company］から購入した誘発変異キット［directed mutagenesis kit］（カタログ番号170-3576）の助けを借りて、ファージミドｐＢＩＯＳ113から生成した一本鎖ＤＮＡに変異を誘発した。図３は４種のオリゴヌクレオチドの標的一本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを示し、矢印は、相補鎖を合成するＤＮＡポリメラーゼの作用を示す。最初に、断片の幾つかのサイズ増加を検出するために、大腸菌の形質転換後に得られた幾つかの組換えクローンの分析を、制限酵素で消化することにより行なった。ユナイテッド・ステート・バイオケミカルズ社［United States Biochemicals company］から得た“シークエンスＲ［sequence R］”キット・バージョンIIの助けを借り、22塩基のオリゴヌクレオチドであるオリゴNo.13（53ないし74位）により、クローンの１つであるｐＢＩＯＳ116（これは明らかに３つの触媒部位を含んでいる）の配列決定を行なった。この結果は、触媒部位ＡおよびＢの完全な挿入と、触媒部位Ｃの不完全な挿入を示した。触媒部位の20および21位での２つの塩基（ＧおよびＡ）の欠損も生じた。ラムおよびヘイ［Lamb and Hay］（Journal of General Virology, 1990, 71: 2257-2264）によって示されたように、この部位は開裂については機能し得なかったが、リボザイム活性を欠く非相補的配列がポリリボザイム中に存在することによる効果を研究するために、発現ベクターｐＢＩＯＳ3（Perez et al., Plant Mol.Biology 1989, 13: 365-373）に約1100ｂｐのＤＮＡ断片（1007ｂｐ＋21ｂｐ×2＋19ｂｐ＋５′および３′でのポリリンカーの隣接配列）を反対向きにクローン化することが決定された。このために、プロメガバイオテック社［PROMEGA BIOTECH company］から得たプラスミドｐＧＥＨ 7 2ｆ（＋）のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位にｐＢＩＯＳ113のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片をクローン化した：これは、触媒部位を含むキャプシドタンパクの配列のいずれかの側にＢａｍＨＩ部位を備える目的で行なわれた。次いで、得られたプラスミドｐＢＩＯＳ151をＢａｍＨＩで消化し、考察対象の断片（ポリリボザイム136、図４）をｐＢＩＯＳ3のＢａｍＨＩ部位に導入した。カリフラワーモザイクウイルスの強力な構成プロモータとノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータとの制御の下、この断片をアンチセンスの向きに含む組換えクローンを選択し、ｐＢＩＯＳ125と名付けた。
上述の転写調節のための配列の制御の下、リボザイム（２つの機能的触媒部位と１つの削除された部位とを有する相補的断片）を含むこのプラスミドのＥｃｏＲＩ断片を、二元ベクター［binary vector］ｐＢＩＯＳ4のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。後者は、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子の３′末端に位置するＥｃｏＲＩ部位を抑制し、かつ同じ遺伝子の５′末端にＥｃｏＲＩ部位を創出することによって変性されたベクターｐＢＩ121（Jefferson et al., 1987: EMBO Journal 6: 3901-3907）の誘導体である。得られた二元ベクターｐＢＩＯＳ136を、Ｃ58′3株由来の、アグロバクテリウム・ツメファシエンス［Agrobacterium tumefaciens］の無毒化株ＲＣ58′3（Mullineaux et al., Plant Science 63: 237-245, 1989）におけるトリペアレンタル［triparental］接合の後、異なる形質転換実験に用いた。この二元ベクターは、実際、リファムピシンに耐性の偶発突然変異体である。
例  ２：キュウリモザイクウイルスＩ１７Ｆ株のキャプシド蛋白の遺伝子に対して作用する異種リボザイムの構築
例１に記載のポリリボザイム１３６（図４）が６０８位に対して作用する触媒部位を含んでいなかったと仮定して、また２０４位に対して作用する触媒部位が不完全であったと仮定して、更なる突然変異誘発指示実験が開始された。この目的のために、ファルマシア（PHARMACIA）社から入手されたＥｃｏＲＩにより消化したファージＭ１３・ｍｐ１８中に、プラスミドのＥｃｏＲＩ断片がクローン化された。二つの目的触媒部位を含むキャプシドタンパク遺伝子のコード鎖のキャプシド化を可能にする組換ファージの特徴づけを行い、それをオリゴデオキシリボヌクレオチドＣおよびＥを（一緒にまたは別々に）使用する新しい突然変異誘発実験用のマトリックスとして使用した。後者は、出発物質がファージであるので、単一鎖のマトリックスの産生に非常に好ましい事を除いては、前記の例において提示された様に行なわれた。異なる組換クローンを、オリゴヌクレオチドＮｏ．１３および１９量体オリゴヌクレオチド（ポジション６９４から６７６）を使用して配列決定した。後者は、６０８位に導入された触媒部位の配列決定を可能にした。本発明に適合した触媒部位を含むクローンを使用して、二元ベクター（binary bector）ｐＢＩＯＳ１６１、ｐＢＩＯＳ１６３、ｐＢＩＯＳ１６５（図４参照）が構築された。二元ベクターｐＢＩＯＳ１６１は、無欠損触媒部位Ｃを含んでいることを除いて、ｐＢＩＯＳ１３６と同一である。
キャプシドタンパクの遺伝子の全配列とハブリダイズするリボザイムをコードしており、且つ３つの機能的触媒部位Ａ、Ｂ、Ｃ（ｐＢＩＯＳ１６１の場合）または４つの機能的触媒部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ（ｐＢＩＯＳ１６５の場合）を含む遺伝子の場合には、二元体ベクターｐＢＩＯＳ４のＥｃｏＲＩ部位におけるクローニングは、３５Ｓプロモータ、リボザイム、ターミネータＮＯＳから構成されるＥｃｏＲＩ断片を精製した直後に行われる。３つの触媒部位Ａ、Ｂ、Ｃを含み、ＣＭＶ（ｐＢＩＯＳ１６３の場合）のＲＮＡ４の５′末端における最初の３６０塩基のみとハブリダイズするリボザイムの場合には、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（キャプシドタンパクの遺伝子の配列の３６１位、並びにこの配列とポリリンカーに由来する配列との３′境界に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位）で消化した後、残りの３′部分の欠損を生じさせた。このように欠損させたプラスミドのＥｃｏＲＩ断片を、次いで二元ベクターｐＢＩＯＳ４のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。
ポリリボザイムを発現するメロンの形質転換及び再生：
最後の３つの二元ベクターをアグロバクテリアに導入し、特許出願ＥＰ−Ａ−０４１２９１２に述べたようにして、形質転換に使用した。
例  ３：遺伝子導入植物体の分子レベルでの分析
＊ノーザン・ブロット分析：
ｐＢＩＯＳ１３６による形質転換後に得られたメロン植物体をノーザン・ブロットにより分析した（図５）。温室で栽培された遺伝子導入および非遺伝子導入植物体の若葉から、チャンドラーら（Chandler et al.）（Plant Physiology (1983), 74:47-54）のプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡを、１％変性アガロースゲル中において電気泳動にかけ、ハイボンドＣ(Hybond C)に移し、ＢａｍＨＩ断片の三重消化物から得られた断片により構成されたプローブでハブリダイズした。該ＢａｍＨＩ断片は、３つのリボザイム［（そのうち二つは機能的（ポリリボザイム１３６）である］を持つキャプシドタンパクの遺伝子の完全な相補的断片に相当する。三重消化物は相同配列同志のハイブリダイゼーションを有利に行ない、より強い信号を得る事が可能である。
ゲルに投入される全ＲＮＡの量及び該ＲＮＡの質の同一性がメチレンブルーによる膜染色によって解明された。第一次形質転換細胞および対応するＴ１およびＴ２世代の転写レベルで得られた結果を図２に図示すると共に、下記のことが示された。
−  形質転換された植物体に由来する全てのサンプルで、１．４５ｋｂの主要転写物が観察されたが、ネガテイブコントロールでは観察されなかった；
−  転写物の数は、第一次形質転換細胞によりかなりばらつきがある。これは、植物ゲノムの異なる遺伝子座にＴ−ＤＮＡが組み込まれたか、またはＴ−ＤＮＡの断片が組み込まれたかによって、つまり環境の影響によって説明され得るかもしない。
−  第一次転写物の転写レベルおよびそのＴ１およびＴ２世代には相関関係が存在しない。
＊サザン・ブロット分析
ｐＢＩＯＳ１３６またはｐＢＩＯＳ１３５による形質転換後に得られたメロン植物体は、サザン・ブロットで分析された（図６及び７）。室温で栽培された植物体植物（第一次形質転換細胞、場合によっては、Ｔ１及びＴ２世代）および非形質導入若葉より、デラポータ（Dellaporta et al.）（Plant Molecular Biology Reporter(1983) 1: 19-21）のプロトコールに従って、全ＤＮＡが抽出された。全ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ（ｐＢＩＯＳ４における目的遺伝子の発現カセットのクローニング部位）で加水分解され、０．８％アガロースゲル中での電気泳動に供され、ハイボンドＮ＋に移され、三つのプローブ：遺伝子ｎｐｔＩＩ、３重消化されたポリリボザイム１３６（ノーザレンブロット分析参照）及び遺伝子ｇｕｓでハブリダイズされた。
ｐＢＩＯＳ１３６（図６）による５つの形質転換ケースで得られた結果：
−  １４６．４２系：
第一次形質転換細胞１４６．４２、Ｔ１世代およびふたつのＴ２世代の場合、３つのプローブによるハブリダイゼーションプロフィルが同一であり、これはＴ−ＤＮＡの断片に隔絶がなく、おそらく単一の遺伝子座がある事を示す。ポリリボザイム１３６は、植物体ゲノム中に数コピー存在している。実際、１．７５ｋｂ；４、４ｋｂ；８．３ｋｂ；８．８ｋｂの大きさを持つ４つのハブリダイゼーション・バンドは目視可能である。１．７５ｋｂバンドは、ＥｃｏＲＩ、ポリリボザイムのカップルで得られる理論値サイズのバンドに相当する。４．４ｋｂバンドは、ポリリボザイム１３６及び遺伝子ｎｐｔＩＩの両者とハブリダイズする。さらに、ＥｃｏＲＩ／ｎｐｔＩＩのカップルによる分析では、このバンドの検出には至らない。これは、ｎｐｔＩＩ遺伝子の単一コピーが植物体ゲノムに存在することを示す。８．３ｋｂおよび８．８ｋｂのバンドは、ポリリボザイム１３６およびｇｕｓ遺伝子とハブリダイズする。これらの二つのバンドだけが、ＥｃｏＲＩ／ｇｕｓのカップルで検出され、これは、ｇｕｓ遺伝子のすべてまたは一部分のコピーがふたつある事を示している。ＸｂａＩによって消化された、Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２植物のＤＮＡをもつ３つのプローブのハブリダイゼーションは、単一遺伝子座の存在を示唆している。
−  １４６．３４系
第一次形質転換細胞１４６．３４およびそのＴ１世代の場合には、第一次形質転換細胞の数個のハブリダイゼーション・バンドのみが、個々のＴ１に存在している。これは、Ｔ−ＤＮＡの一定の断片が排除されたという事実を強調している。ＥｃｏＲＩ／ポリリボザイム１３６の分析について、１．７５ｋｂ、３ｋｂ、５．３ｋｂのサイズの３バンドの存在が、Ｔ０及びＴ１植物に共通しており、植物体Ｔ０には、さらに７．３ｋｂ、６．８ｋｂおよび４．２５ｋｂサイズの３バンドが存在していることが特徴的である。これは、少なくとも３および６のポリリボゾーム１３６のコピーが、Ｔ１およびＴ０植物に夫々存在することを示している。ｎｐｔＩＩハブリデイゼーションにおいて、３ｋｂおよび５．３ｋｂの２つのＥｃｏＲＩバンドがＴ０植物で検出される。これは、ｎｐｔＩＩ遺伝子のすべてまたは部分の二つのコピーがある事を示している。Ｔ１植物では、３ｋｂのＥｃｏＲＩバンドのみが目視可能である。これは、ｎｐｔＩＩ遺伝子の単一コピーが存在することを示している。ｇｕｓハブリダイゼーションにおいては、４．２５ｋｂ、５．３ｋｂ、６．８ｋｂサイズの３つのＥｃｏＲＩバンドが、Ｔ０植物で発見されるのに対して、Ｔ１世代では、５．３ｋｂバンドのみが存在している。これは、ｇｕｓ遺伝子の全てまたは一部分の３コピー及び１コピーが、Ｔ０およびＴ１植物に夫々存在していることを示す。さらに、ＸｂａＩによって消化されたＴ０及びＴ１植物のＤＮＡを持つ３プローブのハブリデイゼーションは、２つの遺伝子座の存在を示唆している。
−  １４６．３０及び１４６．２８系：
第一次形質転換細胞１４６．３０及び１４６．２８、およびそれら各々のＴ１世代の場合、類似の観察が得られた。
−  １４１．１系：
第一次形質転換細胞１４１．１およびその後続世代の場合には、そのハブリデイゼーション・プロフィルは同様であった。１．７５ｋｂ、１０ｋｂ、および１０ｋｂのＥｃｏＲＩバンドが、夫々ポリリボザイム１３６、ｎｐｔＩＩ及びｇｕｓのプローブで解明される。これは、植物ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡの単一コピーが存在することを示す。
結論として、形質転換細胞１４６．４２及びその後続世代（Ｔ１およびＴ２）および形質転換細胞１４１．１およびＴ１世代の場合に、遺伝的安定性がみられる。Ｔ−ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ断片のコピーが非常に多いことが、調査された４つの系に特徴的であるが、１４１．１系は、Ｔ−ＤＮＡの組み込まれたコピーのみを保有している。
さらに、Ｔ−ＤＮＡおよび／またはＴ−ＤＮＡの部分のコピーは、ｐＢＩＯＳ１３５で形質転換を行なった系にも存在することには注意を要する（図７）。
＊ウエスタンブロット分析（比較分析）
キャプシドタンパク遺伝子の発現カセットを含むｐＢＩＯＳ４で形質転換された遺伝子導入メロン植物体を、ウエスタンブロットで分析した。ＢＩＯＳＥＭの名義で１９８９年１１月８日に出願された特許出願ＥＰ−Ａ−０４１２９１２には、使用された方法論及び得られた結果が詳述されている。しかしながら、キャプシドタンパク遺伝子の発現の程度は、全タンパクの０．００１％から０．４％と様々である事は強調を要する。数例を用いて、図８には発現レベルのばらつきが図示されており、これは葉齢およびおそらくは植物体ゲノムに対する環境の影響に依存する。
例  ４：ポリリボザイム１３６およびキャプシドタンパク質により形質転換したメロンのＣＭＶに対する抵抗力の試験
（比較試験）
キャプシドタンパク質またはポリリボザイム１３６の遺伝子を発現する遺伝子導入メロン植物体（遺伝子型TEZIER  10）を自家受精させ、または遺伝子型がTEZIER  10の非形質転換植物と交配させた。これらの自家受精世代（Ｔ１世代）及び引き続く自家受精世代（Ｔ２世代、・・・）に由来する種子が、フィトトロン（phytotron;光照射時間を１６時間に設定した環境調節実験施設）に播種された。
二葉から四葉の成育段階で、上記の子孫植物の２３株を、ＴＬ２８株ＣＭＶに感染した新葉の粉末標品により機械的に接種した。感染の１６日（最適期間）後、病状（モザイク、葉身のひだ発生）が観察評価された。被感染植物は、以下の３つのカテゴリーに分類される。
−  発症のない抵抗性（resistant）植物（Ｒ）；
−  発症した感受性（sensitive）植物（Ｓ）；
−  「回復（recover）」があった耐病性(tolerant)植物（Ｔ）、すなわち、古い葉が病状を示すのに対し、新生の葉に発症のないものである。
「回復」にも幾つかの周期があるらしい。環境条件次第では、健常を示した新生の葉も感染症状が現れたり現れなかったりする。
「抵抗型(resistant-type)」植物と言った場合、発症のない植物も耐病性植物もともに含まれる。
ＣＭＶに対する抵抗性試験に用いた対照は、次の通りである。
−  感受性対照：TEZIER  10株及びベドランテス（Vedrantais）；
−  抵抗性対照は、少なくとも３つのＣＭＶの劣性遺伝子を有するビルゴ(Virgos)及びフリーのキュウリ(Free Cucumber)である。
＊キャプシドタンパク質遺伝子を発現する系統のＴ１世代のメロンの、ＴＬ２８株ＣＭＶに対する抵抗力：
２０系統から得られた結果を表１に示す。それによれば以下のことが示される：
−  ＴＬ２８を感染させた結果、病状を示さないＴＩ植物が３％から３０％得られる。非形質転換の対照TEZIER  10にＴＬ２８を接種したところ、得られた病状を示さない植物は、０％であった。抵抗性対照のビルゴ及びフリーのキュウリにおいては、病状を示さない植物はそれぞれ９２％及び１００％であり、いかなる耐病性現象(tolerance phenomenon)も示さない。
−  回復現象(The phenomenon of recovery)は、高い頻度で現れる。調べられた１４系統では、耐病性Ｔ１植物はそれ程顕著なパーセンテージ（22から59%）では見られない。
−  抵抗性（resistant）及び耐病性(tolerant)のＴ１植物のパーセンテージとキャプシドタンパク質の発現レベルの間には相関性はない。実際に、例えば１５９．８および１６４．２の系統は、同一レベルのキャプシドタンパク質（0.01%）を発現するが、抵抗性のレベルは異なる。１５９．８の系統のＴ１世代の個体はすべて感受性であるのに対し、１６４．２の系統では２６％は病状を示さず、４８％は耐病性である。
キャプシドタンパク質の遺伝子を発現する系統のほとんどは、自家受精により得られた。ＣＭＶ接種したＴ１植物における、キャプシドタンパク質遺伝子の理論的に予測される発現頻度は、７５％である。抵抗型植物（病状を示さないものおよび耐病性のものである）のパーセンテージは、各遺伝子導入系統に応じて、２５％から７５％の範囲で変動する。
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＊ポリリボザイム１３６を発現する系統のＴ１世代のメロンの、ＴＬ２８株ＣＭＶに対する抵抗力：
１３系統について得られた結果を表２に示す。それによれば：  −  １０系統では、Ｔ１個体の３０％から８７％は、ＴＬ２８の感染後に病状を示さない；
−  「回復」現象はほとんど見られない。４系統で、９％から２６％程度の耐病性Ｔ１植物が見られるだけである。
ポリリボザイム１３６を発現する系統のほとんどは、非形質転換系統のTZ10との交配により得られたものである。ＣＭＶ接種したＴ１植物において、ポリリボザイムの理論的に予測される発現頻度は５０％である。抵抗型植物のパーセンテージは、各遺伝子導入系統に応じて、３０％から６５％の範囲で変動する。
結果として、「リボザイム」構想(strategy)の場合では、Ｔ１世代の系統の多くは病状を示さず、耐病性植物となるものはほとんど無い。
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＊ＴＬ２８株ＣＭＶに対する抵抗力の試験および特定系統についてのＧＵＳ試験による分離の評価の概要：
表３に示された結果によれば：
−  キャプシドタンパク質の遺伝子を発現する（８８．１０５系統および１５３．８系統）抵抗型の２系統（病状を示さない植物および耐病性植物）並びにポリリボザイム１３６を発現する（１４６．４２系統）完全な抵抗性の１系統（病状を示さない植物）が得られた。
−  ポリリボザイム１３６を発現する（１４１．１系統および１４６．２８系統）耐病性の２系統（耐病性植物）が得られた。
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１）各系統の遺伝学的検討：
ｇｕｓ遺伝子の発現のレベルから、分離の様式及びホモ接合の状態の確認が可能である。
８８．１０５および１５３．８の２系統の場合、ｇｕｓ遺伝子の発現のレベルは、自家受精により得られたＴ１世代においてそれぞれ、８０％及び７３％である。これは、単独部位でのＴ−ＤＮＡの挿入に基づく優性遺伝子の分離がメンデル型（３：１）であることを示唆する。分子的な解析により、植物ゲノムに挿入された１複製物（a single copy）分のＴ−ＤＮＡの存在が示されている。
さらに、ｇｕｓ遺伝子の発現のレベルは、両系統のＴ２世代においては１００％であり、挿入遺伝子がホモ接合の状態であることが確認される。
１４６．４２系統の場合、ｇｕｓ遺伝子の発現のレベルは、自家受精により得られたＴ１世代において７７％である。このことは、単独部位でのＴ−ＤＮＡの挿入に基づく優性遺伝子の分離がメンデル型であることを示す。分子的な解析により、植物ゲノムの単独部位に複数のＴ−ＤＮＡおよび／またはＴ−ＤＮＡ断片が存在することが示されている。
さらに、Ｔ２世代におけるｇｕｓ遺伝子の発現のレベルが９０％であるという事実によって、試験対象の系統がこの挿入遺伝子についてホモ接合的（homo-zygous）ではないことが強調される（表３）。１４６．４２系統の場合、Ｔ３世代においてホモ接合が現れた。未形質転換のTEZIER  10遺伝子型株との交配により得られたＴ１世代において、１４１．１系統のｇｕｓ遺伝子の発現のレベルは５７％である。このこともまた、単独部位でのＴ−ＤＮＡの挿入に基づく優性遺伝子の分離がメンデル型（１：１）であることと一致する。分子的な解析により、植物ゲノムに挿入された１つのＴ−ＤＮＡの存在が示されている。
１４６．２８系統の場合、未形質転換のTEZIER  10遺伝子型株との交配により得られたＴ１世代において、ｇｕｓ遺伝子の発現のレベルは７３％である。このことは、複数の遺伝子座でのＴ−ＤＮＡの挿入についての、優性遺伝子の分離を示唆する。分子的な解析により、植物ゲノムの２つの部位に複数のＴ−ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ断片が存在することが示されている。
２）ウイルスに対する挙動：
抵抗型植物はすべて、ｇｕｓ遺伝子を発現する。幾つかの感受性植物は、ｇｕｓ遺伝子を発現する（表３）。
８８．１０５系統の場合、自家受精により得られたＴ１世代において、抵抗型の植物は２５％であり、感受性植物は７５％であった。このことは、抵抗性遺伝子が劣性遺伝子であり、分離がメンデル型（１：３）であることを示す。
１５３．８系統の場合、自家受精により得られたＴ１世代において、抵抗型の植物は５５％であり、感受性植物は４５％であった。抵抗性遺伝子［resistance gene］に関する結論を出すことは困難である。
１４１．１系統の場合、未形質転換のTEZIER  10遺伝子型株との交配により得られたＴ１世代において、耐病性植物は４０％であり、感受性植物は６０％であった。このことは、抵抗性遺伝子が優性遺伝子であり、分離がメンデル型（１：１）であることを示唆する。この様に、ポリリボザイム１３６の挙動は、ｇｕｓ遺伝子と同様である。
１４６．４２系統の場合、自家受精により得られたＴ１世代において、病状のない植物は７９％であり、感受性植物は２１％であった。このことは、抵抗性遺伝子が優性遺伝子であり、分離がメンデル型（３：１）であることを示唆する。ここでも、ポリリボザイム１３６の挙動は、ｇｕｓ遺伝子と同様である。
３）ウイルス量の評価：
ＥＬＩＳＡ定量法により検出されたウイルス量は、病状のない植物では極めて小さいが、それでも抵抗性対照であるフリーのキュウリよりも大きい（表１０）。
耐病性植物は、検出可能な量のウイルスを有する。感受性植物は、極めて大きな量のウイルスを有する。
ポリリボザイムを発現する植物（１４６．４２系統、Ｔ２及びＴ３）のウイルス量は、キャプシドタンパク質を発現する抵抗型の植物（１５３．８系統、Ｔ２）のウイルス量よりも少ない。
以上から、検出されたウイルス量と病状の進行の度合いとの間には、良好な相関があるように思われる。
４）ＣＭＶによる病状の経時変化：
図１及び図２で言及した系統のＴ１植物を、ＴＬ２８株のＣＭＶに感染させた。病状は、接種の６日、８日、１２日、１４日、１６日及び１９日後に記録した。結果をヒストグラムで示す（図９及び図１０）。
Ｄ１６の後に得られた値には、それ以上の変動は見られない。「キャプシドタンパク質」系統の場合には、病状の見られない植物の数が多少なりとも減少することは、病状を有する植物の出現として留意すべきである。Ｔ１世代の８８−１０５系統および１５３−８系統の場合、それぞれＤ１６およびＤ１４の日に、「回復」の特徴を有する耐病性植物が現れる。さらに、Ｔ２世代の８８−１０５系統では、Ｄ８の日に病状の見られない植物の１００％が、Ｄ１９まで生存する１００％耐病性の植物に転換する（図９）。
病状の見られない植物から耐病性植物へのこの急速な変化は、環境条件の顕著な影響より説明し得る。
１５３．８系統のＴ２世代では、耐病性植物の漸増的な出現に注意すべきである。Ｄ１６の日以降は、Ｔ２世代の５０％は病状の見られない植物であり、５０％は耐病性植物である。
「ポリリボザイム」系統の場合、１４１．１系統および１４６．２８系統において、病状の見られないＴ１植物の数が減少して、病状の見られる植物が優勢になることが強調されるべきである（図１０）。
さらに、１４１．１系統の場合、Ｄ１６の日以降は耐病性のＴ１植物が４０％であることに注意すべきである。１４６．２８系統では、耐病性のＴ２植物がＤ１４から増大し、Ｄ１６には２６％に達する。
加えて、１４６．４２系統では、病状の見られないＴ１植物はＤ６において８０％であり、これが経時的にほぼ安定に維持される（Ｄ８、Ｄ１２及びＤ１４では７８％、Ｄ１６からは７９％）。
１４６．４２系統のＴ２植物は、同様の挙動を示す。この結果は、当該系統の抵抗性が極めて高いこと、並びに子孫世代における抵抗性遺伝子［resistance gene］が安定性であることを示している。
結果として、キャプシドタンパク質を発現する「抵抗」型の２系統と、ポリリボザイム１３６を発現する完全に抵抗性である１系統が得られた。キャプシドタンパク質の遺伝子を発現する２系統の場合には、観察される抵抗性は、完全な抵抗性というよりも、むしろ耐病性に近いものである。実際に、ウイルスに感染し、且つ深刻な病状を示す植物には、特定の環境条件下では健康な新葉が発育できるものもある。
ポリリボザイム１３６を発現する完全な抵抗性系統の場合には、耐病性現象は見られない。キャプシドタンパク質を発現する２系統の場合には、抵抗性植物において相対的に大きな量のウイルスが観察される。一方、ポリリボザイム１３６を発現する抵抗性植物においては、ウイルス量は抵抗性対照であるフリーのキュウリ［Free Cucumber］におけるウイルス量とほとんど同じくらいである。
例  ５：ポリリボザイム１６５を発現するメロン系統のＴ１世代における、ＴＬ２８株ＣＭＶの感染に対する抵抗力：
ポリリボザイム１６５を発現する１３のＴ１系統で得られた結果を表４に示す。それによれば：
−  ＴＬ２８を感染させた後、１２系統については、Ｔ１個体の１５％から１００％は病状を示さない；
−  「回復」現象は、ほんのわずかしか見られない。５系統だけが６％から６０％のＴ１耐病性植物を有する。
ポリリボザイム１６５を発現する系統の大半は自家受精により得られた。ＣＭＶ接種したＴ１植物において、ポリリボザイム１６５の理論的に予測される発現頻度は７５％である。抵抗型植物のパーセンテージは、各遺伝子導入系統に応じて、１５％から１００％の範囲で変動する。
結論として、ポリリボザイム１３６を発現する系統についてと同様に、ポリリボザイム１６５を発現する系統の多くは病状を示さず、耐病性植物の出現は少ない。ポリリボザイム１６５は、２つのリボザイム機能がさらに加わっている点で、ポリリボザイム１３６とは異なる。ＣＭＶの感染に対する抵抗力について、上記の２つの構築物は同様の結果を与える。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２ｃ】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図４（ｄ）】
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【図４（ｅ）】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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