(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を固定液中で５０〜１００μｍの厚さに薄切りして薄切り切片を作成するステップと、
前記薄切り切片を固定、脱水、置換するステップと、
前記置換された薄切り切片を包埋樹脂液中に浸漬して、薄切り切片組織中に包埋樹脂を浸透させるステップと、
前記包埋樹脂が浸透した薄切り切片を透明な合成樹脂シートにてサンドウイッチ状に挟んで包埋樹脂を重合硬化するステップと、
前記サンドウイッチ状に挟まれて重合硬化された包埋薄切り切片にパウチフィルムを接着シールするステップと、
前記パウチフィルムに被覆された包埋薄切り切片の、電子顕微鏡観察部位をパンチングにより抜取るステップとから成ることを特徴とする電子顕微鏡観察用生体標本作成方法。
【請求項２】
生体試料から５０〜１００μｍの厚さに切出された薄切り切片を、固定、脱水、置換し、包埋樹脂剤を浸透した後、透明合成樹脂シートにてサンドウイッチに挟んで重合硬化させた構造体をパウチフィルムにて接着シールして成ることを特徴とする電子顕微鏡観察用生体標本カード。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電子顕微鏡的検索を行うために生体から採取された生体試料から電子顕微鏡観察用の、生体標本を作製する方法および生体標本保持カードに関する。
【０００２】
【従来技術】
手術、生検等で摘出された腫瘍の本態が悪性腫瘍（ガン、肉腫）なのか、良性腫瘍であるかを判断するために、病理学的検索に委ねられる。
【０００３】
病理学的検索方法として
（１）  肉眼的検索
（２）  光学顕微鏡的検索（＝組織学的検索）            ５０倍−１０００倍
（３）  電子顕微鏡的検索（＝細胞学的検索）        １０００倍−１０万倍
がある。
【０００４】
光学顕微鏡的検索（パラフィンに包埋された組織片を２．５μ−５．０μの厚さの切片に薄切りし染色をして検査する方法）は、病理学的検索の主流を占めている。すなわち腫瘍の性格（悪性であるか良性か？）悪性なら癌なのか肉腫なのか？そして血管又はリンパ管の中に腫瘍細胞が浸襲しているか、どうか等の検索を行い手術時の臓器の摘出範囲を決定したり、後の治療方針の決定（放射線療法、化学療法、免疫学的療法）を下だす判断が行われる。ところが光学顕微鏡的検索において腫瘍の性格が判定困難な場合、つぎの検索として（３）電子顕微鏡的検索にその判定を委ねることとなる。すなわち細胞レベルでの検索が行われる。この際観察により、特殊な線維の存在や、神経分泌顆粒等の光学顕微鏡では確認し得なかったものを探りあてることにより腫瘍の本態を明確なものとする。
【０００５】
次に従来の電子顕微鏡観察用の標本作成方法について説明する。
【０００６】
電子顕微鏡観察のための生検材料からの標本作成は
（１）組織切出し→（２）固定→（３）→脱水→（４）置換→（５）→包埋→（６）超薄切り→（７）染色→（８）検鏡の手順で行われる。（藤田企画出版社発行「病理技術詳解」２頁〜４７頁参照）
（１）組織片の切出し：切り出す組織は固定液の浸透を良くするため、薄く、小さく、電顕的に通常厚さ１ｍｍに切出し、１ｍｍ3角に細切りする。
【０００７】
（２）固定          ：組織、細胞を生体に近い状態で保存する目的で、タンパク成分分子を安定化、不溶化し、細胞内外の物質の移動拡散を防ぎ染色性を良くするために四酸化オスミウム等の固定液により組織を固定する。
【０００８】
（３）脱水          ：エポキシ樹脂やポリエステル樹脂等は非水溶性包埋剤であるため、組織中の水分を除くために通常エタノールまたはアセトンを用いて脱水する。
【０００９】
（４）置換          ：エタノールは包埋樹脂としてのエポキシ樹脂、ポリエステル樹脂、メタクリル樹脂になじみにくいため、脱水剤と包埋樹脂の双方に親和性をもつプロピレンオキサイド等の置換剤で置換する。
【００１０】
（５）包埋          ：組織中にエポキシ樹脂等の包埋樹脂を浸透させて、ゼラチンカプセルとかポリエチレンカプセル（８ｍｍ径）に注入された包埋樹脂溶液（例えばＥＰＯＮ８１２；Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ.  ＵＳＡ）の中に入れて硬化させる。
【００１１】
（６）超薄切り      ：電子顕微鏡用のミクロトームを用いて０．０８〜０．１μｍに薄切りする。
【００１２】
（７）染色          ：電子顕微鏡において透過電子を利用するため酢酸ウラン、クエン酸鉛の重金属にて、その親和性を利用して細胞膜、タンパク質、糖質を染めることにより観察する。
【００１３】
上述の手順で示したように通常１ｍｍ3角に細切りした生検試料を包埋樹脂液が入った直径８ｍｍのゼラチンカプセルやポリエチレンカプセルに包埋している。
【００１４】
上述のように組織片をゼラチンカプセルまたはポリエチレンカプセル中に包埋する方法はＬｕｆｔ（１９６１）らによってエポキシ樹脂による包埋法が確立されて以来、電子顕微鏡包埋法において、今なお広く用いられている方法である。しかしながら皮膚、心筋、腎臓皮質、消化管粘膜などの多くの組織では方向性を留意せねばならず、さらに１ｍｍ3角ということで、情報量の範囲も限定される。
【００１５】
すなわち、組織片が１ｍｍ3角に細切りされているため組織の周辺の部位の状態がどうであったかわからなく、しかも本質的に電子顕微鏡で観察したい部位に適さないことがある。さらにゼラチンカプセルの中で硬化されている１ｍｍ3角の生検試料を種々の方位でスライスする必要があるが、その位置決めが困難な上、時間もかかり熟練を要する。しかもゼラチンカプセルの中の生検試料の埋込み位置が試料毎に異なるので標本として超薄切りして切出すのにも多くの時間と労力を要する。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は上述の問題点を克服し、包埋操作を簡単化し、熟練を要することなく適切に電子顕微鏡で観察したい生検試料の部位を切出すことができるようにする生体標本作成方法および生体標本保持カードを提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記課題は本発明によれば生体試料を固定液中で５０〜１００μｍの厚さに薄切りして薄切り切片を作成し、これを、従来公知のように固定、脱水、置換、包埋樹脂溶液に浸透させた後、包埋樹脂が浸透した薄切り切片を透明な合成樹脂シートにてサンドウイッチに挟んで、包埋樹脂を重合硬化し、重合硬化されたサンドウイッチ構成体をパウチフィルムにて接着シールすることにより解決される。さらに本発明によれば生体試料から５０〜１００μｍの厚さ切出された薄切り切片を、固定、脱水、置換し、包埋樹脂剤を浸透した後、透明合成樹脂シートにてサンドウイッチに挟んで重合硬化させた構造体をパウチフィルムにて接着シールして成る電子顕微鏡観察用生体標本カードを提案する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
組織片の切出し、固定
ヒト及び各種動物から得られた臓器例えば腎臓を最大割面にて固定液中でマイクロスライサにて５０〜１００μｍの厚さの薄切り切片に切出す。
【００１９】
切出された薄切り切片を公知のように電子顕微鏡用固定液、例えば２．５％グルタールアルデヒド／緩衝液中にて固定する。
【００２０】
脱水
公知のように固定された薄切り切片をアルコールやアセトンにて脱水する。
【００２１】
置換
公知のように脱水された薄切り切片を例えばプロピレンオキサイドで置換する。
【００２２】
包埋
公知のように置換された薄切り切片を包埋樹脂液例えばエポキシ樹脂溶液としてＥＰＯＮ８１２（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ.  米国）又はＴＡＡＢ８１２（ＴＡＢＢ  Ｃｈｅｍ.ＣＯ.  米国）又はＰｏｌｙｂｅｄ８１２（Ｐｏｌｙｓｉｅｎｃｅ  ＣＯ.  米国）又はＱｕｅｔｏｌ  ８１２（日新  ＥＭ日本）又はＥＰＯＫ８１２（応研商事  日本）に、硬化剤としてＤＤＳＡ（ｄｏｄｅｃｅｎｙｌ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）とかＭＮＡ（ｍｅｔｈｙｌ  ｎａｄｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、加速剤としてＤＭＰ−３０を混合した混合液中に浸漬する。
【００２３】
図１はこの過程を模式的に示すものである。図において１は包埋樹脂液、２は置換された薄切り切片、３はビーカである。この段階で包埋樹脂液は粘稠性があり、流動性を有する。この浸漬状態で薄切り切片２中に包埋樹脂を良く浸透させる。
【００２４】
これまでの固定、脱水、置換、包埋樹脂浸透の各工程では振盪機を用いて振盪する。
【００２５】
次にビーカから取出した包埋樹脂液で濡れた状態の薄切り切片を図２に示すように２枚の透明な合成樹脂フィルム４例えば厚さ１．５ｍｍのビニールシート２枚で挟む。
【００２６】
合成樹脂シートとしてはＡＣＬＡＲ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｆｉｌｍ（Ａｌｌｉｄｅｓｉｇｎａｌ  Ｉｎｃ.  ＵＳＡ）を使用すると好適であった。この合成樹脂フィルムは吸水性がなく透明で、難燃性で四酸化オスミウム、エタノール、アセトンプロピレンオキサイド等に対して耐性があるのが良い。図２に示すサンドウイッチ構造体を恒温槽の中にて包埋樹脂を重合硬化させる。
【００２７】
包埋して重合硬化されたサンドウイッチ片を図３に示すようにパウチフィルム（明光商会）５で接着シールする。パウチフィルムはパスポートの偽造防止のため写真の上などに貼着されるフィルムで、２軸延伸ポリエチレンテレフタレート、２軸延伸ポリプロピレン、２軸延伸ナイロンシートの片面にシーラント層を有するものである。
【００２８】
このパウチフィルムにて接着シールするのは、硬化状態のサンドウイッチ構造体の側面は空気に触れている状態にあり、硬化した包埋樹脂から透明合成樹脂フィルム４が剥離し易い状態にあるのでサンドウイッチ構造体の側面が空気に触れないようにすると共に透明合成樹脂フィルム４が包埋樹脂から剥離しないようにし、保護すると共に、後から透明合成樹脂フィルムを包埋樹脂から剥離するときに、パウチフィルムと一体に剥離させるためである。
【００２９】
上述のようにパウチフィルム５により接着シールされた構造の平面図を図４に示す。図４ａに示すパウチフィルム接着シール構造体をプロジェクタ又は光学顕微鏡にて観察したい目的部位を選定し、例えばパンチ鋏みにより実線円６で示す目的部位を打抜いて取出す。このパンチされた部位の直径は例えば３〜５ｍｍである。この打抜かれた部分を断面図にて拡大して示す。
【００３０】
この打抜かれた部分のパウチフィルム５とそれと接着されている透明合成樹脂フィルムを、包埋樹脂薄切り切片から剥離する。
【００３１】
このように包埋された薄切り切片を例えば直径８ｍｍの、合成樹脂の台座（好ましくは包埋樹脂と同一樹脂から成る台座例えばエポキシ樹脂系のＥＰＯＮ８１２から成る台座に例えば瞬間接着により図５に示すように接着し電子顕微鏡の観察に適する厚さ０．０８〜０．１μｍに超薄切りする。
【００３２】
この超薄切りされた切片を電子染色（酢酸ウランとクエン酸の二重染色）を行った後透過形電子顕微鏡で検鏡する。
【００３３】
なお上述のパウチフィルムを接着して出来上った構成体は図６ａに示すように３５ｍｍのプロジェクタにて投影できるカードサイズに選定すると電子顕微鏡での観察部位を選定するのが非常に容易となる。
【００３４】
また図６ｂに示すようにテレホンカードのような大きさのカードサイズとして分類とか整理保存のために例えばバーコード等のマーキングを印刷するとか、日時、患者名、病名、臓器名、科名等を記録する領域を設けると、電子顕微鏡の検索作業上、極めて取扱い処理が簡単化される。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば組織包埋片はパウチフィルムに被覆されたカードに形成されているため光学顕微鏡下及びプロジェクター投影が可能で目的部位の選定が従来のゼラチンカプセル、ポリエチレンカプセル包埋による１ｍｍ3角から得られる情報量と比較して格段の差をもって容易に行うことができる。
【００３６】
さらに派生効果として
（１）梗塞、出血部位等の病変部の位置の把握とその部位の観察ができる。
【００３７】
（２）アミロイドなど標的物を組織片上で多数選定、観察ができる。
【００３８】
（３）腫瘍において、腫瘍本態と正常組織部位および境界部位を同一平面上において比較検討ができる。
【００３９】
など電子顕微鏡レベルでの応用観察が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】薄切り切片の包埋樹脂浸透過程を示す側面略図。
【図２】包埋樹脂を浸透した薄切り切片を透明合成樹脂シートでサンドイッチに挟んで重合硬化する過程を示す断面略図。
【図３】図２で重合硬化されたサンドウイッチ構成体にパウチフィルムを接着シールした過程の断面略図。
【図４】図３で作成されたパウチフィルムで被覆された薄切り切片の一部のパンチングにより抜取る個所を示す平面略図。
【図５】台座上にパンチングにより抜取った薄切り切片を付着した状態を示す斜視略図。
【図６】カード形状の本発明による生体標本カードを示す平面略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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