(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートもしくはプルプロガリンまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有するプロスタグランジン生合成阻害剤。
【請求項２】
エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートもしくはプルプロガリンまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症作用、特に、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａ
ｓｅ−２；以下、ＣＯＸ−２）阻害作用及び／又はプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧ
Ｅ２）生合成阻害作用を有するポリフェノール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）は、ヒト生体部位の器官、組織に
炎症を起こす生理活性物質である。中でも特に、ＰＧＥ２は、肺癌、乳癌、大腸癌、前立
腺癌などを誘発する物質であることが知られている。プロスタグランジン類は、アラキド
ン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を前駆物質として、シクロオキシゲナーゼ（
ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ＣＯＸ）の酵素によって生合成される。
【０００３】
ＣＯＸには３種類あることが知られている。これらの内、ひとつは各種臓器に存在し、
消化液の分泌や利尿、血小板を凝集させるなど、恒常的に働くシクロオキシゲナーゼ−１
（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１；ＣＯＸ−１）である。一つは、炎症性のサイトカ
インや活性酸素に刺激を受けて誘導される、ＣＯＸ−２である。
【０００４】
ＣＯＸ−２はプロスタグランジンＨ２合成酵素であり、アラキドン酸カスケード中最終
的にＰＧＥ２の生合成に関与する酵素として知られている。例えば、炎症性のサイトカイ
ンである腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α；ＴＮＦα
）の刺激を受け、転写因子であるＮＦ−κＢ（ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  κＢ；
ＮＦκＢ）が活性化され、この活性化によってＣＯＸ−２が発現する。ＣＯＸ−２の発現
によってＰＧＥ２の生合成が亢進し、癌細胞は増殖する上に、抗癌剤などに対しても抵抗
性を有するようになる。ヒト生体内のこの生合成カスケード中のどの部分を抑えることが
できるか、癌の治療や予防薬を開発する上で目標となることが示されている。
【０００５】
ＣＯＸ−２の発現を抑える効果のあるものは、ＣＯＸ−２阻害剤と呼ばれている。ＣＯ
Ｘ−２阻害剤の一例として、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）の記載がある。「血液
腫瘍や上皮性腫瘍の増殖抑制において、ＣＯＸ阻害剤の中で最も強力な活性を示す」とい
う記載がある（非特許文献１、Ｗａｓｋｅｗｉｃｈ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  
Ｒｅｓ．、６２：２０２９−２０３３）。
【０００６】
ポリフェノールは、タンパク質やアルカロイド等と結合し、難溶化の傾向を示す多価フ
ェノール類の総称である（非特許文献２、川崎敏男、他：天然薬物化学、廣川書店、１９
８６年４月：１２４）。中でも茶葉に含まれるポリフェノール（通称茶ポリフェノール）
には、多くの生物活性のあることが報告された。例えば、抗酸化作用（非特許文献３、Ｈ
ａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、６７：３９６−４０１、２００３）、抗ＨＩＶ作用（非特許文献４、Ｈａｓｈ
ｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、６：６
９５−７００、１９９６）、抗アレルギー作用（非特許文献５、Ｙａｍａｄａ、Ｋ．ｅｔ
ａｌ．：Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、５：１−８、１９９９）、抗
トポイソメラーゼＩ及びＩＩ作用（非特許文献６、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂ
ｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４：１０８８−１０９０、２００１）、抗癌作用（
非特許文献７、中村好志：茶の抗突然変異・抗癌作用、朝倉書店、１９９７年９月：１３
１−１４３）、リパーゼ活性阻害作用（非特許文献８、Ｎａｋａｉ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：
Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、５３：４５９３−４５９８、２００５）、の報告
がある。
【０００７】
茶ポリフェノールは、緑茶、紅茶、烏龍茶、黒（プーアル）茶から単離され、７０種以
上ものポリフェノール類が含有されていることが知られている（非特許文献９、橋本文雄
：各種茶のポリフェノールに関する化学的研究、１９８８年２月：６８−７２、１４７−
１５１、１６２−１６４；非特許文献１０、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃ
ｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３５：６１１−６１６、１９８７；非特許文献１１、
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６：１
６７６−１６８４、１９８８；非特許文献１２、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．
：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：７７−８５、１９８９；非特許文献１３、
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：３
２５５−３２６３、１９８９；非特許文献１４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．
：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４０：１３８３−１３８９、１９９２）。
【０００８】
茶ポリフェノールは、その生合成機構の違いにより、二つに分類されている。即ち、生
葉中に元来含まれる一次ポリフェノールと、紅茶、烏龍茶等の製造工程（萎凋、発酵）で
、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類から変換した二次ポリフェノールと
に大別される。一次ポリフェノールには、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ
）類、プロアントシアニジン（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）類、加水分解型タン
ニン（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ  ｔａｎｎｉｎ）類、チャルカン−フラバン二量体（ｃ
ｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ  ｄｉｍｅｒ）類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎ
ｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類が含まれる。一方、二次ポリフェノールとして、テア
シネンシン（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）類、テアフラガリン（ｔｈｅａｆｌａｇａｌｌ
ｉｎ）類、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類が含まれる（非特許文献９）。
【０００９】
いわゆる茶カテキン類と称する主ポリフェノールの、エピガロカテキン３−ガレート（
（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌｔｅ、ＥＧＣＧ）、エピ
ガロカテキン（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、エピカテキン３
−ガレート（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、エ
ピカテキン（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、ガロカテキン（（＋）−ｇａｌ
ｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ、ＣＡ）を除く、
種々のポリフェノール類は、茶葉からの単離が容易ではなかったこともあって、種々の生
物活性試験を行うことが困難であった問題点がある。
【００１０】
近年、発酵茶より分離される５種のテアシネンシン類（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）の
ＣＯＸ−２遺伝子の発現抑制について報告した。ＣＯＸ−２の発現により産生されるタン
パク質を分析したところ、テアシネンシンＡ及びＤはその産生を強く抑制し、結果として
ＣＯＸ−２の発現を抑制することを報告した（非特許文献１５、益崎智子、他４名：平成
１５年度日本農芸化学会西日本支部、中国・四国支部、日本栄養・食糧学会西日本支部、
日本食品科学工学会西日本支部鹿児島合同大会およびシンポジウム、２００３年９月：３
７）。
【００１１】
特開２００２−２２０３４０号（以下、特許文献１という）に、茶に由来する薬理組成
物（特許文献１の第００３３〜００５６段落）の記載がある。「茶から抽出される温水抽
出物、ポリフェノール、カテキン類、ＥＧＣｇなど、抽出後各生成段階で得られる成分に
ついて様々な薬理作用を検討し、その結果得られた知見に基づいて本発明を完成した物で
ある」、「この際、増強されるカテキンの薬理作用としては、少なくとも、シクロオキシ
ゲナーゼ−２活性阻害作用、インターフェロン−γ−産生抑制作用、腫瘍壊死因子−α−
産生抑制作用、フィブロネクチン介在細胞接着抑制作用、血管内皮細胞増殖因子（ＶＧＥ
Ｆ）による欠陥内皮細胞増殖抑制作用、及び乳癌細胞増殖抑制作用を挙げることができる
」、「本発明はまた、上記の「温水抽出非カテキン成分」とカテキン類とを含む「混合物
Ｘ」を有効成分として含有し、好ましくは当該「混合物Ｘ」中に、（−）−エピガロカテ
キンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（−）−エピガ
ロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−ガロカテキンガレート
（ＧＣｇ）、（−）−カテキンガレート（Ｃｇ）、（±）−ガロカテキン（ＧＣ）及び（
±）−カテキン（Ｃ）の総量（以下、この総量を「カテキン総量」と呼び、これら８種類
のカテキンを「総カテキン」と呼ぶ。）としてカテキン類を約３０％以上、例えば約３０
〜４０重量％含有してなる薬理組成物を提案する」という記載がある（特許文献の第００
３３、００３８、００３９段落）。
【００１２】
ＷＯ２００４０５２８７３号（以下、特許文献２という）に、緑茶のポリフェノール並
びに関連誘導体の化学療法剤または化学予防剤の記載がある。「化学療法剤または化学予
防剤として有用な新規化合物の調整法であり、緑茶に含まれる例えばエピガロカテキン３
−Ｏーガレート（ＥＧＣＧ）の関連化合物であって、化学式（Ｉ）［Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨
格］のＲ１からＲ１１までの官能基がここに示すものを含む。」、「Ｒ４の官能基は好ま
しくは、Ｏ，Ｓ，ＮＨ２，ＣＨ２の官能基であって、」、「化合物の提供と共に、化学療
法または化学予防法として、薬理学的方法論もまた提供する。」という記載がある（特許
文献の要旨）。
【００１３】
その他、特開２０００−２２６３２９号（以下、特許文献３という）に、ＭＭＰ阻害剤
（特許文献３の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「カテキン化合物の抗酸化活
性や抗ウィルス活性、など多様な生物活性に着目し、カテキン化合物がＭＭＰｓに対して
阻害作用を有するかもしれないと推測し、カテキンのＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、カ
テキンが、その多様な生物活性と併せて、ＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ
活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療及び予防に対する有用性が期待できることを
見出した」という記載がある（特許文献３の第００１３段落）。
【００１４】
特開２０００−３４４６７２号（以下、特許文献４という）には、マトリックスメタロ
プロテアーゼ阻害剤（特許文献４の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「ポリフ
ェノール類であるタンニン化合物についても、ＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、該化合物
が、優れたＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治
性疾患の治療および予防に対して有用性が期待できることを見出し、本発明を完成した」
という記載がある（特許文献４の第００１３段落）。
【００１５】
特開２００４−３５９５７６号（以下、特許文献５という）には、アポトーシス誘導剤
（特許文献５の第００１５、００１６段落）と記載がある。「紅茶から抽出されたプルプ
ロガリン誘導体並びにその合成したプルプロガリン誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患
細胞（ＨＬ−６０細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プルプロガリン（ｐｕ
ｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併
せて、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類も同様にＨＬ−６０細胞に対してアポト
ーシスを誘導することを見出し、結果として、正常細胞に対してアポトーシス誘導を起こ
させなくて、癌細胞に対してのみアポトーシスを誘導できることを見出した。」、「プル
プロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活
性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断
片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ８からはビッド
（Ｂｉｄ）は切断されず、ミトコンドリアからも細胞質へチトクロームｃは放出されず、
カスパーゼ９は結果として活性化されないことを見出した。この細胞死機構は、ＨＬ−６
０細胞内の活性酸素の増加を伴わないでアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を
完成した。」と記載がある。
【００１６】
特開２００５−０７５７９０号（以下、特許文献６という）には、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
誘導剤（特許文献６の第００１９、００２０段落）と記載がある。「紅茶から抽出された
ポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血
病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス
誘導を調べた結果、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  Ｂ−２
）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、ポリフェノール（
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類も同様にＨＬ−６０細胞、ＬｏＶｏ細胞に対してアポトーシス
を誘導すること、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。」、「プロ
デルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  Ｂ−２）がＨＬ−６０細胞に対
してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、
引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カス
パーゼ９も活性化されることを見出した。この細胞死機序は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸
素の増加を伴いアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。」と記載があ
る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００２−２２０３４０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４０５２８７３号パンフレット
【特許文献３】特開２０００−２２６３２９号公報
【特許文献４】特開２０００−３４４６７２号公報
【特許文献５】特開２００４−３５９５７６号公報
【特許文献６】特開２００５−０７５７９０号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｗａｓｋｅｗｉｃｈ、Ｃ．、他５名、「Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ  Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔｅｓｔ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｍｏｎｇｓｔ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  （ＣＯＸ）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯＸ−２−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００２年、第６２巻、Ｐ．２０２９−２０３３
【非特許文献２】川崎敏男、他１０名、「タンニン」、天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月、Ｐ．１２４
【非特許文献３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他９名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  （ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）  ｏｆ  Ｔｅａ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、Ｐ．３９６−４０１
【非特許文献４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他６名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅａ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ａｓ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９６年、第６巻、Ｐ．６９５−７００
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ、Ｋ．、他４名、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ」、Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、１９９９年、第５巻、Ｐ．１−８
【非特許文献６】Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．、他３名、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００１年、第２４巻、Ｐ．１０８８−１０９０
【非特許文献７】西岡五夫、「茶のポリフェノール」、茶の科学、朝倉書店、１９９７年９月、Ｐ．１１５−１２３
【非特許文献８】Ｎａｋａｉ、Ｍ．、他８名、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｅａ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｏｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００５年、第５３巻、Ｐ．４５９３−４５９８
【非特許文献９】橋本文雄、「各種茶のポリフェノールに関する化学的研究」、博士論文、１９８８年２月、Ｐ．６８−７２、１４７−１５１、１６２−１６４
【非特許文献１０】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＶＩ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  Ｎｅｗ  Ａｃｙｌａｔｅｄ  Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｏｌｏｎｇ  Ｔｅａ．（Ｉ）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８７年、第３５巻、Ｐ．６１１−６１６
【非特許文献１１】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＩＸ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ，Ｂ’−ｌｉｎｋｅｄ  Ｂｉｓｆｌａｖａｎｏｉｄｓ，  Ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎｓ  Ｄ−Ｇ  ａｎｄ  Ｏｏｌｏｎｇｔｈａｎｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｏｏｌｏｎｇ  Ｔｅａ  （２）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８８年、第３６巻、Ｐ．１６７６−１６８４
【非特許文献１２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＸＶＩＩ．Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ  Ｄｉｍｅｒｓ，  Ａｓｓａｍｉｃａｉｎｓ  Ａ，  Ｂ  ａｎｄＣ，  ａｎｄ  ａ  Ｎｅｗ  Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｓｈ  Ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．  ｖａｒ．  ａｓｓａｍｉｃａ  Ｋｉｔａｍｕｒａ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．７７−８５
【非特許文献１３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＸＣ．８−Ｃ−Ａｓｃｏｒｂｙｌ  （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ，  Ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，  ｆｒｏｍ  Ｏｏｌｏｎｇ  Ｔｅａ（３）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．３２５５−３２６３
【非特許文献１４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＣＸＩＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｔｈｅｏｇａｌｌｉｎｉｎ，  Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ  ａｎｄ  Ｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ  Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｔｅａ，  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｔｅａ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９９２年、第４０巻、Ｐ．１３８３−１３８９
【非特許文献１５】益▲崎▼智子、他４名、「ＴｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎによるＣＯＸ−２遺伝子発現の制御について」、平成１５年度日本農芸化学会西日本支部、中国・四国支部、日本栄養・食糧学会西日本支部、日本食品科学工学会西日本支部鹿児島合同大会およびシンポジウム、２００３年９月、Ｐ．３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記の特許文献の中で、８種類の茶カテキン類にＣＯＸ−２阻害活性があることが明ら
かにされたにも拘わらず、茶葉に含まれるテアシネンシン類を除く他の化合物がＣＯＸ−
２阻害活性を有することは知られていなかった。もしこれらの茶化合物にＣＯＸ−２阻害
活性の効果が確認できれば、８種類の茶カテキン類以外の茶化合物をＣＯＸ−２阻害剤及
び／又はＰＧＥ２生合成阻害剤の、いわゆる抗炎症剤として、種々の癌疾患の予防又は治
療に使用できるものと考えられる。
【００２０】
また上記の非特許文献の中で、テアシネンシン類にＣＯＸ−２阻害活性があることが明
らかにされたが、ＰＧＥ２生合成を阻害するかどうかは知られていなかった。もしテアシ
ネンシン類のＰＧＥ２生合成阻害活性の効果が確認できれば、テアシネンシン類をＰＧＥ
２生合成阻害剤の、いわゆる抗炎症剤として、種々の癌疾患の予防又は治療に使用できる
ものと考えられる。
【００２１】
本発明は茶由来の化合物のなかから抗炎症作用、より具体的にはＣＯＸ−２阻害作用及
び／又はＰＧＥ２生合成阻害作用、を有する化合物を見出すことを目的とする。そして本
発明はかかる化合物を有効成分として含有する抗炎症剤および抗炎症作用を有する飲食品
を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、緑茶、烏龍茶、紅茶から分離された茶化合
物を供試し、慢性炎症に引き起こす酵素ＣＯＸ−２およびその産物であるＰＧＥ２を標的
として鋭意研究を行った結果、１８種類の茶化合物がＣＯＸ−２の発現及び／又はＰＧＥ
２の産生を抑制することを見出し、本発明を完成した。
【００２３】
本発明は以下の発明を包含する。
【００２４】
（１）式（Ｉ）：
【化１】
0005424424.tif 000002
［式中、
Ｒ１１およびＲ１２は独立に−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ１３は−Ｈまたはガロイル基であり、
Ｒ１４は
【化２】
0005424424.tif 000003
で表される基（Ｒ１５は−Ｈまたは−ＯＨであり、Ｒ１６は−Ｈまたはガロイル基であり
、＊は結合位置を示す）であり、
式（Ｉ）の２位及び３位は独立にＲ配置またはＳ配置であり、
式（Ｉ）の３位がＲ配置の場合には基Ｒ１４は４位にβ結合により結合し、式（Ｉ）の
３位がＳ配置の場合には基Ｒ１４は４位にα結合により結合する。］
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含
有する抗炎症剤。
【００２５】
（２）前記化合物が表１及び表２に示すプロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−
ガレート（化合物１）、プロデルフィニジンＢ−２  ３’−Ｏ−ガレート（化合物２）、
エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート
（化合物３）、エピガロカテキン−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（化
合物４）、プロデルフィニジンＢ−４−３’−Ｏ−ガレート（化合物５）、プロデルフィ
ニジンＢ−４（化合物６）、ガロカテキン−（４α−８）−エピカテキン（化合物７）、
またはカテキン−（４α−８）−エピガロカテキン（化合物８）である（１）記載の抗炎
症剤。
【００２６】
【表１】
0005424424.tif 000004
【００２７】
【表２】
0005424424.tif 000005
【００２８】
（３）式（ＩＩ）：
【化３】
0005424424.tif 000006
［式中、
Ｒ２１およびＲ２２は独立に−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ２３は−Ｈまたはガロイル基であり、
Ｒ２４およびＲ２５は独立に−Ｈまたは
【化４】
0005424424.tif 000007
で表される基（Ｒ２６は−Ｈまたは−ＯＨ、好ましくは−ＯＨ、であり、Ｒ２７は−Ｈま
たはガロイル基であり、＊は結合位置を示す）であり、
式（ＩＩ）の２位及び３位は独立にＲ配置またはＳ配置である。］
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含
有する抗炎症剤。
【００２９】
（４）前記化合物が表３に示すウーロンホモビスフラバンＡ（化合物９）、またはモノデ
スガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（化合物１０）である（３）記載の抗炎症剤。
【００３０】
【表３】
0005424424.tif 000008
【００３１】
（５）式（ＩＩＩ）： 
【化５】
0005424424.tif 000009
［式中、
Ｒ３１は−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ３２およびＲ３３は独立に−Ｈまたは
【化６】
0005424424.tif 000010
で表される基（Ｒ３４は−Ｈまたはガロイル基であり、＊は結合位置を示す）である。］
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含
有する抗炎症剤。
【００３２】
（６）前記化合物が表４に示すテアフラビン３’−Ｏ−ガレート（化合物１１）、テアフ
ラビン３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（化合物１２）、エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレー
ト（化合物１３）、またはプルプロガリン（化合物１４）である（５）記載の抗炎症剤。
【００３３】
【表４】
0005424424.tif 000011
【００３４】
（７）式（ＩＶ）：
【化７】
0005424424.tif 000012
［式中、
Ｒ４１およびＲ４２は独立に−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ４３は−Ｈまたはガロイル基であり、
Ｒ４４は
【化８】
0005424424.tif 000013
で表される基（Ｒ４５は−Ｈまたは−ＯＨ、好ましくは−ＯＨ、であり、Ｒ４６は−Ｈま
たはガロイル基であり、＊は結合位置を示す）であり、
式（ＩＶ）の２位及び３位は独立にＲ配置またはＳ配置であり、
式（ＩＶ）のフラバン骨格と基Ｒ４４との間で生じる立体配置はＲ配置であってもＳ配
置であってもよい。］
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を有効成分として含
有する抗炎症剤。
【００３５】
（８）前記化合物が表５に示すテアシネンシンＡ（化合物１５）、テアシネンシンＢ（化
合物１６）、テアシネンシンＤ（化合物１７）、またはテアシネンシンＥ（化合物１８）
である（７）記載の抗炎症剤。
【００３６】
【表５】
0005424424.tif 000014
【００３７】
（９）プロスタグランジン生合成阻害剤である（１）〜（８）のいずれか記載の抗炎症剤
。
（１０）シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤である（１）〜（６）のいずれ
か記載の抗炎症剤。
（１１）前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物、前記式（Ｉ
ＩＩ）で表される化合物、および前記式（ＩＶ）で表される化合物からなる群から選択さ
れる少なくとも１種の化合物または飲食品として許容されるその塩もしくは溶媒和物が人
為的に添加された、抗炎症作用を有する飲食品。
（１２）前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物、前記式（Ｉ
ＩＩ）で表される化合物、および前記式（ＩＶ）で表される化合物からなる群から選択さ
れる少なくとも１種の化合物または飲食品として許容されるその塩もしくは溶媒和物を含
有し、抗炎症作用を有する旨の表示が付された、抗炎症作用を有する飲食品。
（１３）不発酵茶、半発酵茶、強発酵茶または後発酵茶である（１１）または（１２）記
載の飲食品。
【００３８】
表１〜４に挙げる化合物はいずれも、緑茶（不発酵茶）、烏龍茶（半発酵茶）、紅茶（
強発酵茶）、黒（プーアル）茶（後発酵茶）などのいわゆる茶葉から抽出された化合物で
ある。本発明者らの鋭意研究の結果、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）阻害作用、及
びプロスタグランジン生合成阻害作用を有することが見出された。一方、表５に挙げる化
合物は、烏龍茶（半発酵茶）、紅茶（強発酵茶）、黒（プーアル）茶（後発酵茶）などの
いわゆる発酵茶葉から抽出された化合物である。本発明者らの鋭意研究の結果、プロスタ
グランジン生合成阻害作用を有することが見出された。
【００３９】
本発明に用いられる化合物は薬理学的に許容される塩として存在することができる。そ
のような塩としては、薬理学的に許容される非毒性塩が挙げられ、例えばナトリウム塩、
カリウム塩又はカルシウム塩等のアルカリ金属塩、又はアルカリ土類金属塩、塩酸塩等の
ハロゲン化水素塩、硝酸塩、硫酸塩又はリン酸塩等の無機酸塩、メタンスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸等のスルホン酸塩、フマル酸、コハク酸、クエン酸、シュウ酸又はマレイ
ン酸等の有機酸塩及びグルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸塩等を挙げることがで
きる。
【００４０】
本発明に用いられる化合物はまた、溶媒和物として存在することができる。好ましい溶
媒和物としては、水和物、エタノール和物等を挙げることができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、茶由来の化合物を有効成分として含有する抗炎症剤および抗炎症作用を
有する飲食品が提供される。本発明の抗炎症剤は、ＣＯＸ−２阻害作用及び／又はＰＧＥ
２生合成阻害作用を有することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実験４の電気泳動の図である。
【図２】実験４の電気泳動の図である。
【図３】実験４の電気泳動の図である。
【図４】実験４の電気泳動の図である。
【図５】実験４の電気泳動の図である。
【図６】実験５の電気泳動の図である。
【図７】実験５のプロスタグランジンＥ２産生量を比較した図である。
【図８】実験５のプロスタグランジンＥ２産生量のポリフェノール濃度的変化を示した図である。
【図９】実験６の電気泳動の図である。ＣＯＸ−２の発現について、ポリフェノールの濃度的変化を示した図である。
【図１０】実験６のプロスタグランジンＥ２産生量のポリフェノール濃度的変化を示した図である。
【図１１】実験７の電気泳動の図である。
【図１２】実験８の電気泳動の図である。
【図１３】実験８の電気泳動の図である。ＣＯＸ−２の発現について、ポリフェノールの濃度的変化を示した図である。
【図１４】実験８のプロスタグランジンＥ２産生量を比較した図である。
【図１５】実験８のプロスタグランジンＥ２産生量のポリフェノール濃度的変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４４】
本発明において有効成分として用いられる化合物はいずれも新鮮チャ葉、或いは不発酵
茶（例えば緑茶）、半発酵茶（例えば烏龍茶）、強発酵茶（例えば紅茶）、後発酵茶（例
えば黒（プーアル）茶）などのいわゆる茶葉から常法を用いて抽出により単離することが
できる。抽出方法は特に限定されないが、新鮮チャ葉または上記の茶葉から水や、低級ア
ルコール、アセトンなどの水溶性有機溶媒、水性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて常法
に従い抽出することができる。本発明において有効成分として用いられる化合物はまた、
化学的な合成法により合成されたものであってもよい。
【００４５】
本発明において有効成分として用いられる化合物は、例えば本出願人による特開２００
４−３５９５７６号（特許文献４）および特開２００５−０７５７９０号（特許文献５）
に記載される方法によって調製することができる。
【００４６】
下記の実施例では、文献記載の方法を用いて単離した化合物を使用した（非特許文献９
）。また、プルプロガリン、テアシネンシン類、ウーロンホモビスフラバン類は特許文献
記載の方法で合成した化合物を使用した（特許文献５）。また、文献記載の方法を用いて
エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレートを合成し使用した（Ｎｏｎａｋａ，Ｇ．、ｅｔ．ａ
ｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３４、６１−６５：１９８６）。
【００４７】
本発明の抗炎症剤は、例えば経口投与または非経口投与（静脈内、動脈内、腹腔内、経
直腸内、皮下、筋肉内、舌下、経鼻腔内、経膣内など）用に製剤化され得る。かかる製剤
は例えば抗炎症剤としてヒトや哺乳動物などの動物に投与することができる。本発明の抗
炎症剤は、ＣＯＸ−２阻害作用及び／又はＰＧＥ２生合成阻害作用を有することを特徴と
する。本発明の抗炎症剤は癌の予防または治療に有用であると期待される。製剤の形態は
、特に制限されないが、溶液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、座剤、噴霧剤、制
御放出剤、懸濁剤、ドリンク剤などが挙げられる。
【００４８】
本発明の抗炎症剤の製剤化に際しては、製薬上許容可能な担体（賦形剤もしくは希釈剤
）、ならびに、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁化剤、
保存剤、着色剤、風味剤、甘味剤などから適宜選択される添加剤を含有させることができ
る。担体および添加剤は、製剤化のために一般的に使用されるものを、本発明の抗炎症剤
の製造に使用することができる。結合剤の例としては、デンプン、ポリビニルピロリドン
、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。増量剤の例としては、ラクト
ース、微結晶セルロースなどが挙げられる。滑沢剤の例としては、タルク、シリカ、ステ
アリン酸マグネシウムなどが挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、デンプングリ
コール酸ナトリウムなどが挙げられる。湿潤剤の例はとしては、ラウリウ硫酸ナトリウム
などが挙げられる。乳化剤の例としては、セルロース誘導体、ソルビトールなどが挙げら
れる。保存剤の例としては、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸などが挙
げられる。しかしながら、上記の特定例に制限されない。
【００４９】
本発明の茶化合物の用量は、患者の年齢、体重、性別、状態、重篤度などによって変化
しうる。患者に投与される一日用量は、例えば患者の体重１ｋｇあたり０．１〜２００ｍ
ｇ、好ましくは１〜１００ｍｇの範囲であるが、この範囲に制限されない。必要に応じて
、用量を数回、例えば２〜３回に分けて分割投与してもよい。また、本発明の抗炎症剤は
治療用途の同じまたは異なる他のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、プロ
スタグランジン生合成阻害剤と併用して患者に投与することもできる。
【００５０】
本発明の化合物はまた、常法に従って、固形食品、半固形食品、飲料等の飲食品に添加
することができる。具体的には菓子類、レトルト食品、ジュース類、茶類、乳製品、清涼
飲料、アルコール飲料などを挙げることができるがこれらには限定されない。これらの飲
食品は、いわゆる特定保健用食品や健康補助食品とするのが好ましい。かかる食品は抗炎
症作用（具体的にはＣＯＸ−２阻害作用及び／又はＰＧＥ２生合成阻害作用）を有する。
【００５１】
本発明の飲食品は、茶化合物の有効量を、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボ
トルなどの任意の形態に添加または封入するか、あるいは任意の食品に添加して得られる
。
【００５２】
本発明の飲食品には必要に応じて甘味剤、調味料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤などを添
加してもよいし、あるいはビタミン類、栄養剤、免疫増強剤（例えば、プロポリス、きの
こ抽出物など）などを添加してもよい。
【００５３】
飲食品中への茶化合物の添加量は、成人体重１ｋｇあたり０．１〜２００ｍｇに相当す
る範囲内の量、１製品あたり例えば５０ｍｇ〜１ｇであるが、この範囲に制限されないも
のとする。
【００５４】
本発明の飲食品は、所定の茶化合物を人為的に添加した上記飲食品だけでなく、従来か
ら存在する不発酵茶、半発酵茶、強発酵茶または後発酵茶であって抗炎症作用を奏するの
に有効な量の茶化合物が含有されているものをも包含する。
【００５５】
本発明の飲食品はその本体、包装、説明書、宣伝物または宣伝用電子的情報にその効能
の表示、例えば抗炎症作用を有する旨の表示、より具体的には、シクロオキシゲナーゼ−
２（ＣＯＸ−２）阻害作用を有する旨の表示やプロスタグランジン生合成阻害作用を有す
る旨の表示が付されたものであることが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されないものとする。
【００５７】
本実施例に使用する茶化合物（化合物１〜１８）は、非特許文献９記載の方法で調整し
た（非特許文献９のＰ．１６６−２１８）。材料の茶葉として、市販の烏龍茶「白折」、
紅茶の製造原料である新鮮アッサム茶葉（大葉種、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ
ｖａｒ．  ａｓｓａｍｉｃａ）、市販の紅茶「日東：インド・セイロン茶のブレンド茶
」を用いた。これらの茶葉を８０％水性のアセトン溶液に冷浸し、抽出した（操作は３回
繰り返した）。抽出液は、減圧下アセトンを留去し、析出するクロロフィルなどを濾去、
または、エーテルなどの溶媒で分配し、除去した。濾液または分配液（いずれも水溶液の
状態）を直接、エムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ  ｇｅｌ  ＣＨＰ−２０Ｐ、三
菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
、セファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、ファルマシアファインケ
ミカル株式会社）のオープンカラムクロマトグラフィーに付した。移動層にＡ液として水
（Ｈ２Ｏ）、Ｂ液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用い、Ａ液からＢ液の含量を増やすこ
とによってクロマトグラフィーを行った。この方法には、移動層にＡ液（Ｈ２Ｏ）を用い
、Ｃ液としてアセトン（Ｍｅ２ＣＯ）を用い、Ｃ液からＡ液の含量を増やすことによって
クロマトグラフィーを行うこともできる。また、固定相にボンダパックＣ１８（Ｂｏｎｄ
ａｐａｋＣ１８  ＯＤＳ、Ｗａｔｅｒｓ株式会社）を用い、移動層にＡ液（Ｈ２Ｏ）及び
Ｂ液（ＭｅＯＨ）を用い、Ａ液からＢ液の含量を増やすことによってクロマトグラフィー
を行った。これらのクロマトグラフィーを繰り返すことによって、本実施例に使用する茶
化合物（化合物１〜１８）を抽出、単離することができる。
【００５８】
また、ウーロンホモビスフラバン類は、非特許文献１３に記載の方法で合成できる。（
−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートを塩酸などの酸性溶媒下、室温でホルマリンと
処理すると主成物として、ウーロンホモビスフラバン類が合成される。
【００５９】
テアシネンシン類は、非特許文献１１に記載の方法で合成できる。（−）−エピガロカ
テキン３−Ｏ−ガレートを炭酸水素ナトリウムＮａＨＣＯ３などの弱アルカリ性の条件下
、室温でフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６で酸化すると、テアシネンシン類を
合成することができる。
【００６０】
［実験１］細胞の培養法
（１）細胞の種類
ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫから入手したマウスのマクロファージ様細胞（Ｃｅｌ
ｌ  Ｎｏ．ＲＣＢ０５３５、以下、ＲＡＷ２６４と称す）を用いた。
【００６１】
（２）培地の準備
Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  
“Ｎｉｓｓｕｉ”）９．５ｇを水（Ｈ２Ｏ）１Ｌに溶解し、オートクレーブにて高温加圧
滅菌した。冷却後、１０％ＮａＨＣＯ３溶液を１５ｍｌ加え、抗生物質混合試薬（ＰＳＧ
［ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｇｌｕｔａｍｉｎ］：Ｇｉｂｃｏ
１００ｍＬ  Ｌｏｔ  Ｎｏ．１１８５８９１）を１０ｍＬ加えた。ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ
Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ  ５００ｍＬ  Ｌｏｔ  Ｎｏ．
ＳＦＢ３０−１４６３）溶液を前記調整した溶液に１０％の割合で添加し、培地を準備し
た。
【００６２】
（３）細胞の継代
予め冷凍庫（−８０℃）にて保管しておいたＲＡＷ２６４細胞を解凍し、前記調整した
培地（以下、培地と称す）を１０ｍＬ添加し、細胞と混合した。軽く混ぜ、遠心分離（１
０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上澄みを捨て、この操作を２回繰り返した。上澄みを除去
し、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ：Ｇｉｂｃｏ  １００ｍＬ）を１ｍＬ加え、
培地９ｍＬを加え攪拌した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上澄み培地を
除去、培地１０ｍＬを加えた。細胞の入った培地を１０ｃｍのシャーレに置床した。各シ
ャーレのＲＡＷ２６４細胞の濃度が１〜３ｘ１０５セル数程度になるよう調整した。細胞
は、３７℃、５％の二酸化炭素（ＣＯ２）を気流に混入させたインキュベーター（以下、
ＣＯ２インキュベーターと称す）中で培養した。
【００６３】
［実験２］細胞中のＣＯＸ−２の誘導法
（１）コントロール細胞の培養
シャーレ（６ｍＬサイズ）中、ＲＡＷ２６４細胞の濃度が１ｘ１０６セル数になるよう
調整した。これを予め３７℃、２１時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、
細胞をシャーレ（３ｍＬサイズ）へ置床した。このときは、培地にＦＢＳ溶液を加えなか
った。引き続き、３７℃、３時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、リポ多
糖を５ｎｇ／μＬに調整したもの（以下、ＬＰＳと称す）を、２４μＬ培地へ添加し、３
７℃、１２時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。この方法により、ＣＯＸ−２に加
えて、ＣＯＸ−１、ｉＮＯＳの誘導も調査した。
【００６４】
（２）試験化合物の調整
所定の茶化合物を各４０〜１００μＭの濃度で溶解した。溶媒に水（Ｈ２Ｏ）とジメチ
ルスルフォキシド（以下、ＤＭＳＯと称す）を用いた。以下、この濃度に調整したサンプ
ルを試験化合物と称す。
【００６５】
（３）試験細胞の培養
シャーレ（６ｍＬサイズ）中、ＲＡＷ２６４細胞の濃度が１ｘ１０６セル数になるよう
調整した。これを予め３７℃、２１時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、
細胞をシャーレ（３ｍＬサイズ）へ置床した。このときは、培地にＦＢＳ溶液を加えなか
った。引き続き、３７℃、２時間半、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、調整
した試験化合物を添加し、３７℃、３０分間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。これ
に、リポ多糖を５ｎｇ／μＬに調整したもの（以下、ＬＰＳと称す）を、２４μＬ培地へ
添加し、３７℃、１２時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。この方法により、ＣＯ
Ｘ−２に加えて、ＣＯＸ−１、ｉＮＯＳの誘導も調査した。
【００６６】
［実験３］細胞中のＣＯＸ−２発現蛋白の回収と検出法
（１）ＣＯＸ−２発現蛋白の回収
前記実験２（１）及び（３）で培養した細胞を回収した。回収した細胞を３７℃、ＰＢ
Ｓ（ＫＣｌ：０．０２％、KH2PO4：０．０２％、ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：０．２９％
、ＮａＣｌ：０．８％の水溶液）で洗浄後、ＳＤＳ試薬（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
６．８を１．２５ｍＬ；ＳＤＳ（２％ｗ／ｖ）０．４ｇ；Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（１０％）２
ｍＬ；１Ｍ  ＤＴＴ（５０ｍＭ）１ｍＬ；ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ（０．１％
）０．０２ｇを混合したもの）を２０ｍＬ添加し、１００℃、５分間煮沸加熱し、細胞中
のタンパク質を回収した。
【００６７】
（２）ＣＯＸ−２発現蛋白の検出
前記（１）にて回収したタンパク質溶液を、ＣＯＸ−２の発現タンパク質を調べるため
には１０μＬ、ＣＯＸ−１の発現タンパク質を調べるためには３０μＬ、ｉＮＯＳの発現
タンパク質を調べるためには３７μＬを電気泳動用ウェルにそれぞれ吸着させた。定電流
で電気泳動を行った。メンブランを活性化し、よく洗浄した後、トランスファー緩衝液に
浸積し、ゲル版と濾紙とを共に装着し、定電流でトランスファーした。回収したメンブラ
ンについてウェスタンブロットを行い、抗体反応を繰り返し行い、化学発光検出器によっ
てタンパク質を検出した。検出されたタンパク質について、Ｌｕｍｉ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ  １４０を用いて、泳動画像を保存した。
【００６８】
［実験４］茶化合物の抗炎症機能のスクリーニング
（１）４β−８結合を有するプロアントシアニジン類のＣＯＸ−２抑制効果
プロデルフィニジンＢ−２、プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート
（１）、プロデルフィニジンＢ−２  ３’−Ｏ−ガレート（２）、エピガロカテキン−３
−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（３）、エピガロカテ
キン−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（４）（表１）について、ＣＯＸ
−２発現の抑制効果のスクリーニングを行った。その結果を図１に示す。図中、番号は化
合物番号を示す。また、ＬＰＳが「−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していな
いものであり、ＣＯＸ−２の発現が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているもの
は、ＬＰＳを添加したもので、ＣＯＸ−２が発現していることが分かる。「ＰＤＢ２」は
、茶葉より単離したプロデルフィニジンＢ−２である。プロデルフィニジンＢ−２はＬＰ
Ｓ誘導によるＣＯＸ−２発現を抑制しないことが分かる。プロデルフィニジンＢ−２  ３
，３’−ジ−Ｏ−ガレート（１）が最も強く、次にエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート
−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（３）の順で、ＣＯＸ−２の発現を抑
制していることが分かる。なお、５つのプロアントシアニジン類は、いずれもＣＯＸ−１
の発現を抑制しないことが分かる（図１）。
【００６９】
（２）４α−８結合を有するプロアントシアニジン類のＣＯＸ−２抑制効果
プロシアニジンＢ−４、プロデルフィニジンＢ−４−３’−Ｏ−ガレート（５）、プロ
デルフィニジンＢ−４（６）、ガロカテキン−（４α−８）−エピカテキン（７）、カテ
キン−（４α−８）−エピガロカテキン（８）（表２）について、ＣＯＸ−２発現の抑制
効果のスクリーニングを行った。その結果を図２に示す。図中、番号は化合物番号を示す
。また、ＬＰＳが「−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、
ＣＯＸ−２の発現が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添
加したもので、ＣＯＸ−２が発現していることが分かる。「ＰＣＢ４」は、茶葉より単離
したプロシアニジンＢ−４である。プロシアニジンＢ−４はＬＰＳ誘導によるＣＯＸ−２
発現を抑制しないことが分かる。プロデルフィニジンＢ−４−３’−Ｏ−ガレート（５）
並びにプロデルフィニジンＢ−４（６）が最も強く、ガロカテキン−（４α−８）−エピ
カテキン（７）、カテキン−（４α−８）−エピガロカテキン（８）も同様に、ＣＯＸ−
２の発現を抑制していることが分かる（図２）。
【００７０】
（３）ウーロンホモビスフラバン類のＣＯＸ−２抑制効果
ウーロンホモビスフラバンＡ（９）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（
１０）（表３）について、ＣＯＸ−２発現の抑制効果のスクリーニングを行った。その結
果を図３及び図４に示す。図中、番号は化合物番号を示す。また、ＬＰＳが「−」と標記
されているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２の発現が認められな
い。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、ＣＯＸ−２が発
現していることが分かる。図４中、「ＳＴ」は、茶葉より単離したストリクティニンであ
る。「ＴｒｉＧ」は、茶葉より単離した１，４，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グル
コースである。「ｐＣＱＡ」は、茶葉より単離したｐ−クマロイル−キナ酸である。「Ｔ
Ｇ」は、茶葉より単離したテオガリンである。［ＳＴ］、［ＴｒｉＧ］、「ｐＣＱＡ」、
「ＴＧ」はＬＰＳ誘導によるＣＯＸ−２発現を抑制しないことが分かる。ウーロンホモビ
スフラバンＡ（９）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（１０）、共にＣＯ
Ｘ−２の発現を抑制していることが分かる（図３及び図４）。
【００７１】
（４）プルプロガリンのＣＯＸ−２抑制効果
プルプロガリン（１４）（表４）について、ＣＯＸ−２発現の抑制効果のスクリーニン
グを行った。その結果を図５に示す。図中、番号は化合物番号を示す。また、ＬＰＳが「
−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２の発現が
認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、ＣＯ
Ｘ−２が発現していることが分かる。図４中、「ＡｓＥＣ」は、茶葉より単離したアスコ
ルビン酸（−）−エピガロカテキンである。「Ｃａｆ」は、茶葉より単離したカフェイン
である。「ＧＡ」は、茶葉より単離した没食子酸である。［ＡｓＥＣ］、［Ｃａｆ］、「
ＧＡ」はＬＰＳ誘導によるＣＯＸ−２発現を抑制しないことが分かる。プルプロガリン（
１４）はＣＯＸ−２の発現を抑制することが分かる（図５）。
【００７２】
（５）その他茶ポリフェノール単量体のＣＯＸ−２抑制効果
（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート、（−）−エピガロカテキン、（−）−エ
ピカテキン３−Ｏ−ガレート、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキン、（±）−ガロ
カテキン、（−）−エピカテキン３−Ｏ−（３‘−Ｏ−メチル）−ガレート、（−）−エ
ピガロカテキン３，５−ジ−Ｏ−ガレートについて、ＣＯＸ−２発現の抑制効果のスクリ
ーニングを行った。その結果、いずれのポリフェノールもＣＯＸ−２の発現を抑制しない
か、または、その効果はかなり弱いことが分かった。
【００７３】
［実験５］４β−８結合を有するプロアントシアニジン類の抗炎症機能
（１）ＬＰＳ誘発による細胞内ｉＮＯＳ産生の抑制効果
プロデルフィニジンＢ−２、プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート
（１）、プロデルフィニジンＢ−２  ３’−Ｏ−ガレート（２）、エピガロカテキン−３
−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（３）、エピガロカテ
キン−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（４）（表１）の化合物について
、ｉＮＯＳ産生の抑制効果試験を行った。その結果を図６に示す。図中、番号は化合物番
号を示す。また、ＬＰＳが「−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していないもの
であり、ｉＮＯＳの産生が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰ
Ｓを添加したもので、ｉＮＯＳが産生されていることが分かる。「ＰＤＢ２」は、茶葉よ
り単離したプロデルフィニジンＢ−２である。プロデルフィニジンＢ−２はＬＰＳ誘導に
よるｉＮＯＳ産生を抑制しないことが分かる。プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ
−Ｏ−ガレート（１）及びエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカ
テキン−３−Ｏ−ガレート（３）が、ｉＮＯＳ産生を抑制していることが分かる（図６）
。
【００７４】
（２）ＬＰＳ誘発による細胞内プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生の抑制効果
プロデルフィニジンＢ−２、プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート
（１）、プロデルフィニジンＢ−２  ３’−Ｏ−ガレート（２）、エピガロカテキン−３
−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（３）、エピガロカテ
キン−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（４）（表１）の化合物について
、ＰＧＥ２産生の抑制効果試験を行った。その結果を図７に示す。図中、番号は化合物番
号を示す。また、ＬＰＳが「−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していないもの
であり、ＰＧＥ２の産生が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰ
Ｓを添加したもので、ＰＧＥ２が産生されていることが分かる。「ＰＤＢ２」は、茶葉よ
り単離したプロデルフィニジンＢ−２である。プロデルフィニジンＢ−２はＬＰＳ誘導に
よるＰＧＥ２産生を抑制しないことが分かる。プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ
−Ｏ−ガレート（１）、プロデルフィニジンＢ−２  ３’−Ｏ−ガレート（２）、エピガ
ロカテキン−３−Ｏ−ガレート−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（３）
、エピガロカテキン−（４β−８）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（４）は全て、Ｐ
ＧＥ２産生を抑制することが分かる（図７）。
【００７５】
（３）プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（１）のＰＧＥ２産生
抑制効果の濃度的変化
プロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（１）のＰＧＥ２産生抑制効
果について、濃度的変化を調査した。その結果を図８に示す。図中、ＬＰＳが「−」と標
記されているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＰＧＥ２の産生が認められな
い。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、ＰＧＥ２が産生
されていることが分かる。これにプロデルフィニジンＢ−２  ３，３’−ジ−Ｏ−ガレー
ト（１）の１２．５，２５，５０μＭの各濃度で処理すると、ＰＧＥ２の産生を強く抑制
することが分かる（図８）。
【００７６】
［実験６］４α−８結合を有するプロアントシアニジン類の抗炎症機能
（１）プロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）のＬＰＳ誘発によるＣＯ
Ｘ−２の発現抑制並びに細胞内ｉＮＯＳ産生抑制効果の濃度的変化
プロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）のＣＯＸ−２の発現抑制及びｉ
ＮＯＳ産生抑制効果について、濃度的変化を調査した。その結果を図９に示す。図中、Ｌ
ＰＳが「−」と標記されているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２
の発現及びｉＮＯＳの産生が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、Ｌ
ＰＳを添加したもので、ＣＯＸ−２が発現し、また、ｉＮＯＳが産生されていることが分
かる。これにプロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）の２５，５０，７５
，１００μＭの各濃度で処理すると、濃度依存的にＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産生
を抑制することが分かる。なお、プロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）
はＣＯＸ−１の発現を抑制しないことも分かる（図９）。
【００７７】
（２）プロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）のＬＰＳ誘発によるＰＧ
Ｅ２産生抑制効果の濃度的変化
プロデルフィニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）のＰＧＥ２産生抑制効果につい
て、濃度的変化を調査した。その結果を図１０に示す。図中、ＬＰＳは、ＬＰＳ添加した
もので、ＰＧＥ２が産生されていることが分かる。このＬＰＳ添加培地に、プロデルフィ
ニジンＢ−４  ３’−Ｏ−ガレート（５）を２５，５０，７５，１００μＭの各濃度で処
理すると、濃度依存的にＰＧＥ２の産生を抑制することが分かる（図１０）。
【００７８】
［実験７］プルプロガリン誘導体の抗炎症機能
テアフラビン３’−Ｏ−ガレート（１１）、テアフラビン３，３’−ジ−Ｏ−ガレート
（１２）、エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレート（１３）、プルプロガリン（１４）（表
４）の化合物について、ＣＯＸ−２発現及びｉＮＯＳ産生の抑制効果試験を行った。その
結果を図１１に示す。図中、番号は化合物番号を示す。また、ＬＰＳが「−」と標記され
ているものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産
生が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、
ＣＯＸ−２が発現及びｉＮＯＳが産生していることが分かる。「ＰＧＣ」は、プルプロガ
リンガルボン酸である。プロデルフィニジンＢ−２はＬＰＳ誘導によるＣＯＸ−２発現を
抑制しないことが分かる。テアフラビン３’−Ｏ−ガレート（１１）、テアフラビン３，
３’−ジ−Ｏ−ガレート（１２）、エピテアフラガリン３−Ｏ−ガレート（１３）、プル
プロガリン（１４）はＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産生を抑制することが分かる（図
１１）。
【００７９】
［実験８］テアシネンシン類の抗炎症機能
（１）テアシネンシン類のＣＯＸ−２、ＣＯＸ−１発現抑制及びｉＮＯＳ産生抑制
テアシネンシンＡ（１５）、テアシネンシンＢ（１６）、テアシネンシンＤ（１７）、
テアシネンシンＥ（１８）（表５）のＣＯＸ−２の発現抑制及びｉＮＯＳ産生抑制効果に
ついて調査した。その結果を図１２に示す。図中、ＬＰＳが「−」と標記されているもの
は、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産生が認めら
れない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、ＣＯＸ−２
が発現し、また、ｉＮＯＳが産生されていることが分かる。また図中、「ＴＳＳ」とはテ
アシネンシン類であり、Ａ〜Ｅの記号は、それぞれテアシネンシンＡ（１５）、テアシネ
ンシンＢ（１６）、テシネンシンＣ、テアシネンシンＤ（１７）、テアシネンシンＥ（１
８）である。この結果、テアシネンシンＡ（１５）及びテアシネンシンＤ（１７）は強く
ＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産生を抑制することが分かる。全ての化合物はＣＯＸ−
１を抑制しない（図１２）。
【００８０】
（２）テアシネンシンＡ（１５）のＬＰＳ誘発によるＣＯＸ−２の発現抑制並びに細胞
内ｉＮＯＳ産生抑制効果の濃度的変化
テアシネンシンＡ（１５）のＣＯＸ−２の発現抑制及びｉＮＯＳ産生抑制効果について
、濃度的変化を調査した。その結果を図１３に示す。図中、ＬＰＳが「−」と標記されて
いるものは、ＬＰＳを添加していないものであり、ＣＯＸ−２の発現及びｉＮＯＳの産生
が認められない。ＬＰＳが「＋」と標記されているものは、ＬＰＳを添加したもので、Ｃ
ＯＸ−２が発現し、また、ｉＮＯＳが産生されていることが分かる。これにテアシネンシ
ンＡ（１５）の２５，５０，７５，１００μＭの各濃度で処理すると、濃度依存的にＣＯ
Ｘ−２の発現及びｉＮＯＳの産生を抑制することが分かる。なお、テアシネンシンＡ（１
５）はＣＯＸ−１の発現を抑制しないことも分かる（図１３）。
【００８１】
（３）ＬＰＳ誘発によるＰＧＥ２産生抑制
テアシネンシンＡ（１５）、テアシネンシンＢ（１６）、テアシネンシンＤ（１７）、
テアシネンシンＥ（１８）（表５）について、ＰＧＥ２産生の抑制効果試験を行った。そ
の結果を図１４に示す。図中、番号は化合物番号を示す。また図中、ＬＰＳは、ＬＰＳ添
加したもので、ＰＧＥ２が産生されていることが分かる。このＬＰＳ添加培地に、各テア
シネンシン類を添加した結果、テアシネンシンＡ（１５）、テアシネンシンＢ（１６）、
テアシネンシンＤ（１７）、テアシネンシンＥ（１８）は、ＰＧＥ２の産生を抑制するこ
とが分かる。「ＴＳＣ」は、茶葉より単離したテアシネンシンＣである。テアシネンシン
ＣはＬＰＳ誘導によるＰＧＥ２産生を抑制しないことが分かる（図１４）。
【００８２】
（４）テアシネンシンＡ（１５）のＬＰＳ誘発によるＰＧＥ２産生抑制効果の濃度的変
化
テアシネンシンＡ（１５）のＰＧＥ２産生抑制効果について、濃度的変化を調査した。
その結果を図１５に示す。図中、ＬＰＳは、ＬＰＳを添加したもので、ＰＧＥ２が産生さ
れていることが分かる。このＬＰＳ添加培地に、テアシネンシンＡ（１５）の２５，５０
，７５，１００μＭの各濃度で処理すると、濃度依存的にＰＧＥ２の産生を抑制すること
が分かる（図１３）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、緑茶、烏龍茶、紅茶から分離された１８種類の茶化合物がＣＯＸ−２の
発現及び／又はＰＧＥ２の産生抑制の作用を有することから、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＧＥ
２阻害剤として利用可能である。
【図１】
0005424424.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005424424.tif 000020
【図７】
0005424424.tif 000021
【図８】
0005424424.tif 000022
【図９】
0005424424.tif 000023
【図１０】
0005424424.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
0005424424.tif 000026
【図１３】
0005424424.tif 000027
【図１４】
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【図１５】
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