(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５、又は２６のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つ癌関連抗原をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１５のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号２６のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた真核細胞系または原核細胞株。
【請求項６】
配列番号１５、又は２６によってコードされるアミノ酸配列の全部を含む単離された癌関連抗原。
【請求項７】
請求項１記載の単離された核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた真核細胞系または原核細胞株。
【請求項８】
前記細胞系がサイトカインをコードする核酸分子でもトランスフェクトされる請求項７記載の真核細胞系または原核細胞株。
【請求項９】
前記細胞系がＭＨＣ分子をコードする核酸分子によってさらにトランスフェクトされる請求項８記載の真核細胞系または原核細胞株。
【請求項１０】
前記サイトカインがインターロイキンである請求項８記載の真核細胞系または原核細胞株。
【請求項１１】
前記インターロイキンがＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−１２である請求項１０記載の真核細胞系または原核細胞株。
【請求項１２】
前記細胞系が非増殖性にされている請求項７記載の真核細胞系または原核細胞株。
【請求項１３】
前記細胞系が線維芽細胞系である請求項７記載の真核細胞系。
【請求項１４】
突然変異ウイルスまたは弱毒化ウイルスと請求項１記載の単離された核酸分子とを含む発現ベクター。
【請求項１５】
前記ウイルスがアデノウイルスまたはワクシニアウイルスである請求項１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記ウイルスがワクシニアウイルスである請求項１５記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記ウイルスがアデノウイルスである請求項１５記載の発現ベクター。
【請求項１８】
（ｉ）請求項６記載の単離された癌関連抗原をコードする核酸分子を含む第１ベクターと、（ｉｉ）（ａ）前記癌関連抗原に由来する抗原を提示するＭＨＣまたはＨＬＡ分子をコードする核酸分子を含むベクターおよび（ｂ）インターロイキンをコードする核酸分子を含むベクターからなる群より選択される第２ベクターとを含む、細胞のトランスフェクションに有用な発現系。
【請求項１９】
配列番号１５、又は２６のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件で十分にハイブリダイズする配列を相補配列とし、癌関連抗原をコードする単離された核酸分子であって、前記癌関連抗原がタンパク質であり、前記タンパク質がヒトで発現したとき、前記タンパク質に対するヒト応答が引き起こされる、単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（関連出願）
本願は、特許出願第０９／４５１，７３９号（１９９９年１１月３０日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／６０２，３６２号（２０００年６月２２日出願）の一部継続出願であり、上記特許出願はどちらも参考文献として本明細書の一部を構成する。
【０００２】（発明の分野）
本発明は、癌関連抗原、それらをコードする核酸分子およびそれらの使用に関する。
【０００３】（背景と先行技術）
多くの病理学的状態、例えば感染症、癌、自己免疫障害などが、ある特定分子の不適当な発現を特徴とすることは、かなり確立された事実である。したがって、これらの分子は特定の病理学的状態または異常状態の「マーカー」として役立つ。これらの分子は、診断上の「ターゲット」、すなわち上記異常状態を診断するために同定すべき物質として使用される他、診断薬および／または治療薬を創出するために使用できる試薬としても役立つ。癌マーカーを使って特定のマーカーに特異的な抗体を産生させることはその一例であるが、決してこれに限るわけではない。また、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドを使って、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を生成させることも、その一例である。
【０００４】  このような物質の製造は、もちろん、これらの物質の製造に使用される試薬の供給源を前提としている。細胞からの精製は面倒であり、確実というには程遠い方法である。もう一つの好ましい方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離した後、単離されたコード分子を使って所望の分子を発現させることである。
【０００５】  上記のような、例えばヒト腫瘍中の抗原の検出には、２つの基本的戦略が使用されてきた。以下、これらの戦略を遺伝子的アプローチおよび生化学的アプローチと呼ぶことにする。遺伝子的アプローチは、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するｄｅＰｌａｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２２７５（１９８８）などに、その例を見ることができる。このアプローチでは、腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーのプラスミド数百プールをＣＯＳ細胞などの受容細胞または腫瘍細胞系の抗原陰性変異株にトランスフェクトし、それらの細胞を特異的抗原の発現について調べる。生化学的アプローチは、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＯ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６９（１９９４）などにその例を見ることができ、このアプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ分子に結合しているペプチドを酸によって溶出した後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことに基づいている。抗原ペプチドは、抗原処理能力が欠損した突然変異細胞系の空のＭＨＣクラスＩ分子に抗原ペプチドが結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球との特異的反応を誘発することによって同定される。これらの反応には、例えばＣＴＬ増殖の誘導、ＴＮＦ放出およびターゲット細胞の溶解（ＭＴＴアッセイや51Ｃｒ放出アッセイで測定することができる）などがある。
【０００６】  抗原の分子的定義を目的とする上記２つのアプローチには次の欠点がある。すなわち、第１に、これらの方法は著しく煩雑であり、時間と費用を要する。第２に、これらの方法は、所定の特異性を持つ細胞傷害性Ｔ細胞系（ＣＴＬ）の樹立に依存している。
【０００７】  抗原の同定および分子的定義を目的とする上記２つの既知のアプローチが本質的に抱えている上記の課題は、どちらの方法でもヒト腫瘍中の新規抗原を今までにごく少数しか定義づけることに成功していないという事実が最もよく物語っている。例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）、Ｂｒｉｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）、Ｃｏｕｌｉｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４）、Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５−３５１９（１９９４）などを参照されたい。
【０００８】  さらにまた上記の方法論は、問題にしている癌タイプの樹立永久細胞系が入手できることを前提としている。ある特定の癌タイプから細胞系を樹立することが極めて困難であることは、例えばＯｅｔｔｇｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１０：６０７−６３７（１９９０）などに示されているとおりである。また、一部の上皮細胞タイプの癌はインビトロでＣＴＬに対する感受性に乏しいため、常法による分析は不可能であることも知られている。これらの課題に刺激されて、当技術分野では、癌関連抗原のさらなる同定方法の開発が行われてきた。
【０００９】  重要な方法論の一つは、参考文献として本明細書の一部を構成するＳａｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１９１３（１９９５）に記載されている。米国特許第５，６９８，３９６号および米国特許出願第０８／４７９，３２８号（それぞれ１９９５年６月７日および１９９６年１月３日出願）も参照されたい。これら３つの参考文献はいずれも本明細書の一部を構成する。要約すると、この方法ではｃＤＮＡライブラリーを原核宿主中で発現させる。（ライブラリーは腫瘍試料から取得される）。次に、高力価の体液性応答を誘発する抗原を検出するために、発現させたライブラリーを希釈吸収血清によるイムノスクリーニングにかける。この方法論はＳＥＲＥＸ法（「組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定」）と呼ばれている。この方法論は、新しい腫瘍関連抗原の検出に使用されていると共に、先に同定された腫瘍関連抗原の発現を確認するためにも使用されている。前掲の特許出願およびＳａｈｉｎら（前掲）ならびにＣｒｅｗら，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４４：２３３３−２３４０（１９９５）を参照されたい。
【００１０】  この方法論は、例えばＳａｈｉｎら（前掲）およびＰｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ（前掲）に記載されている腫瘍タイプ、ならびに食道癌（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７））、肺癌（Ｇｕｅｒｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１０３４−１０４１（１９９８））、大腸癌（特許出願第０８／９４８，７０５号（１９９７年１０月１０日出願））など、これらは参考文献として本明細書の一部を構成しており、様々な腫瘍タイプに応用されている。ＳＥＲＥＸ法によって同定された抗原には、ＳＳＸ２分子（Ｓａｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）、Ｔｕｒｅｃｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４７６６−４７７２（１９９６））、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７））およびＳＣＰ１（特許出願第０８／８９２，７０５号（１９９７年７月１５日出願））があり、これらは参考文献として本明細書の一部を構成している。ＳＥＲＥＸによって同定された抗原の解析により、ＳＥＲＥＸによって規定される抗原とＣＴＬによって規定される抗原との重複が明らかになっている。ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼおよびＮＹ−ＥＳＯ−１はいずれも、ＣＴＬだけでなく患者の抗体によっても認識されることが明らかになっているので、体液性応答と細胞性応答は協調して作用することがわかる。
【００１１】  ＳＥＲＥＸによる関連抗原の同定が望ましい目標であることは、この要約から明らかである。本発明者らは、この方法論を応用して、以下に詳述するように、いくつかの新しい癌関連抗原を同定した。
【００１２】  （好ましい態様の詳細な説明）
実施例１
いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する、Ｓａｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）、Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）および米国特許第５，６９８，３９６号などに記載されているＳＥＲＥＸ法。簡単に述べると、標準的なＣｓＣｌチオシアン酸グアニジン勾配法を使って、ある乳癌患者（以下「ＢＲ１１」という）の皮膚転移の試料から全ＲＮＡを抽出した。次に市販のｃＤＮＡライブラリー作製用キットを使って、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。上記のＳＥＲＥＸ法に従って、このｃＤＮＡ発現ライブラリーを増幅し、自家ＢＲ１１血清の１：２００希釈液または７人の異なる乳癌患者から得た同種異系プール血清の１：１０００希釈液を使ってスクリーニングした。このスクリーニングを行うために、血清試料をまず１：１０に希釈し、次に裸のベクターをトランスフェクトしておいた大腸菌の溶解液で前吸収し、その血清試料を上述のレベルに希釈した。最終希釈液を、１３０ｍｍプレートあたり４〜５０００プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）の密度でファージプラークを含むニトロセルロース膜と共に、室温で一晩インキュベートした。
【００１３】  ニトロセルロースフィルターを洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦｃγ二次抗体と共にインキュベートし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムと共にインキュベートすることにより、反応性ファージプラークを可視化した。
【００１４】  この操作を、１：２００血清希釈液を使って正常精巣ｃＤＮＡライブラリーにも行った。
【００１５】  乳癌ｃＤＮＡライブラリーでは合計１．１２×１０6 ｐｆｕをスクリーニングして、３８個の陽性クローンを同定した。精巣ライブラリーについては４×１０5 ｐｆｕをスクリーニングして、２８個の陽性クローンを同定した。
【００１６】  さらに、ＢＲ１１  ｃＤＮＡライブラリーから得た８×１０5 ｐｆｕを、上記のプール血清でスクリーニングした。これらのうち２３個が陽性だった。
【００１７】  陽性クローンをサブクローニングし、精製し、プラスミドへの挿入に適した形に切り出した。プラスミドを増幅した後、ＤＮＡインサートを制限酵素マッピング  （ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ）によって調べ、異なるｃＤＮＡインサートに相当するクローンを標準的方法論で配列決定した。
【００１８】  配列がＧｅｎＢａｎｋに見いだされる配列と一致した場合はそれらを既知遺伝子に分類し、ＥＳＴとだけ一致する配列またはこれらのデータベースに一致する配列がない配列は未知遺伝子とした。自家血清で陽性だった乳癌ライブラリー由来のクローンのうち、３つは未知遺伝子だった。残り３５個のうち１５個は、上記ＣＴ抗原ファミリーの２つの既知のメンバーであるＮＹ−ＥＳＯ−１またはＳＳＸ２と一致し、残りのクローンは１４個の既知遺伝子に相当した。精巣ライブラリーでは、上記クローンのうち１２個がＳＳＸ２だった。
【００１９】  ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は見つからなかった。これはおそらく、使用した市販のライブラリーは、約７５０塩基対長である完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｃＤＮＡよりも長い１．５キロベースの平均長を持つようにサイズ分画されていたからであろう。
【００２０】  同種異系プール血清で行ったスクリーニングの場合は、上記クローンのうち４個がＮＹ−ＥＳＯ−１だった。他のＣＴ抗原は同定されなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−１を除けば、同定された遺伝子は全て正常組織に普遍的に発現されていた。
【００２１】  単離された遺伝子およびその発生頻度の詳細な一覧を下記の表１、２および３に示す。ＢＲ１１ライブラリーと精巣ライブラリーの両方に２つの遺伝子、すなわちポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ遺伝子と腫瘍抑制遺伝子ＩＮＧ１が見つかった。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ遺伝子は、Ｓｃａｎｌｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６：６５２−５８（１９９８）に開示されているように、ＳＥＲＥＸ法でスクリーニングされた大腸癌ライブラリーにも見いだされている。自家血清と同種異系血清によるＢＲ１１  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングで同定された遺伝子を比較した場合は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびヒトケラチン。
【００２２】［表１］
ＢＲ１１  ｃＤＮＡライブラリーの自家スクリーニングによって同定されたＳＥＲＥＸ規定遺伝子
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
遺伝子群    クローン数            注釈                    発現
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
CT遺伝子    １０        ＮＹ−ＥＳＯ−１                    腫瘍、精巣
５        ＳＳＸ２                            腫瘍、精巣
非CT遺伝子    ５        核受容体コリプレッサー                  遍在性
４        ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ        遍在性
２        アデニロコハク酸リアーゼ                遍在性
２        コスミド313 （ヒト）        EST:筋肉、脳、乳腺
１        CD151 （膜貫通タンパク質）              遍在性
１        ヒトHRY 遺伝子           RT-PCR:複数の正常組織
１        アラニル-t-RNAシンテターゼ              遍在性
１        NAD(+)ADP-リボシルトランスフェラーゼ    遍在性
１        ヒトケラチン10              EST:複数の正常組織
１        ヒトEGFRキナーゼ基質                    遍在性
１        ING1腫瘍抑制遺伝子       RT-PCR:複数の正常組織
１        未知遺伝子                      EST:膵臓、肝臓
NCI ＿CGAP＿Pr12  cDNAクローン      脾臓、子宮
１        未知遺伝子                  EST:複数の正常組織
１        未知遺伝子              RT-PCR: 複数の正常組織
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
［表２］
ＢＲ１１  ｃＤＮＡライブラリーの同種異系スクリーニングによって同定されたＳＥＲＥＸ規定遺伝子
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
遺伝子群    クローン数          注釈                    発現
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
CT遺伝子      ４        ＮＹ−ＥＳＯ−１                    腫瘍、精巣
非CT遺伝子    ６        ジンクフィンガーヘリカーゼ    EST:脳、胎児心臓
全胎児
４        アセトアセチル-CoA- チオラーゼ          遍在性
３        KIAA0330遺伝子              EST:複数の正常組織
２        U1nRNP                                 遍在性
１        ヒトアルドラーゼＡ                      遍在性
１        網膜芽細胞腫結合タンパク質6   EST:扁桃腺、胎児脳
内皮細胞、脳
１        ａ2-マクログロブリン受容体              遍在性
関連タンパク質
１        ヒトケラチン１０            EST:複数の正常組織
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
［表３］
ＢＲ１１血清を用いた精巣ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングで同定されたＳＥＲＥＸ規定遺伝子
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
遺伝子群    クローン数          注釈                      発現
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
CT遺伝子    １２        ＳＳＸ２                            腫瘍、精巣
非CT遺伝子    ３       Rho関連コイルドコイル形成タンパク質      遍在性
３        ポリ (ADP-リボース）ポリメラーゼ        遍在性
３        TITIN に似たHeLa細胞由来の遺伝子        遍在性
２        副甲状腺腫瘍由来の遺伝子   RT-PCR:複数の正常組織
１        転写終結因子Ｉ相互作用ペプチド21        遍在性
１        胎児心臓由来の遺伝子        EST:複数の正常組織
１        ING1腫瘍抑制遺伝子       RT-PCR:複数の正常組織
１        KIAA0647 cDNA               EST:複数の正常組織
１        KIAA0647 cDNA               EST:複数の正常組織
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
実施例２
実施例１で同定されたｃＤＮＡのｍＲＮＡ発現パターンを正常組織と悪性腫瘍組織の両方で調べた。これを行うために、６５〜７０℃のプライマー融解温度を使って、３００〜６００塩基対長のｃＤＮＡセグメントが増幅されるような遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＭＡＧＥ−１、２、３および４、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ１およびＳＳＸ１、２、３、４および５の増幅に使用したプライマーは既知のプライマーであるか、または公表された配列に基づいた。Ｃｈｅｎら（前掲）、Ｔｕｒｅｃｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５２１１−１６（１９９８）、Ｇｕｒｅら，Iｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９６５−７１（１９９７）、Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１００４−１００８  （１９９４）、Ｇａｕｇｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：９２１−９３０（１９９４）、ｄｅＰｌａｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０：３６０−３６９（１９９４）を参照されたい。これらは全て参考文献として本明細書の一部を構成する。ＲＴ−ＰＣＲは６０℃のアニーリング温度で３５増幅サイクル行った。このＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた場合、乳癌腫瘍標本は、ＭＡＧＥ−１、３および４、ＢＡＧＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＴ７を含む広範囲のＣＴ抗原について陽性だった。既知のＣＴ抗原ＳＣＰ−１、ＳＳＸ１、４および５の発現は見いだされなかった。
【００２３】  腫瘍抗原に対する患者血清の血清反応性を調べるもう一組の実験を行った。具体的には、患者血清中に抗体が存在するかどうかを決定するために、参考文献として本明細書の一部を構成するＳｔｏｃｋｅｒｔら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３４９−１３５４（１９９８）に従って、ＥＬＩＳＡを行った。アッセイはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＳＸ２について行った。ＥＬＩＳＡはＮＹ−ＥＳＯ−１とＳＳＸ２については陽性だったが、上記２つのＭＡＧＥ抗原については陰性だった。
【００２４】  実施例３
２つのクローン（乳癌ｃＤＮＡライブラリー由来の１クローンと精巣ライブラリー由来の１クローン）は、ＩＮＧ１と呼ばれる遺伝子であると同定された。ＩＮＧ１は腫瘍抑制遺伝子候補である。参考文献として本明細書の一部を構成するＧａｒｋａｖｔｓｅｖら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２９５−８（１９９８）を参照されたい。乳癌ライブラリー中に見いだされた配列はＩＮＧ１の既知配列と６残基、すなわち８１８位、８３６位、８５５位、８６１位、８６６位および８７４位で異なっていた。これら６つの変異を持つ配列を配列番号１に記載する。野生型ＩＮＧ１の配列を配列番号２に記載する。
【００２５】  これらの相違のいずれかが腫瘍中の突然変異に相当するかどうかを決定するために、上述した６つの位置を含む短いＰＣＲ断片を、標準的方法に従って同種異系正常組織パネルから増幅し、サブクローニングし、増幅し、配列決定した。
【００２６】  その結果、同種異系組織中の配列は腫瘍中に見いだされたものと同一であることがわかったため、上述した配列の相違が腫瘍関連突然変異であるという仮説は棄却された。この結論は、精巣ライブラリークローンを使用し、正常組織から採取したＩＮＧ１  ｃＤＮＡの制限酵素解析を使って裏付けられた。したがって、Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら（前掲）による配列情報は正しいと結論しなければならない。
【００２７】  実施例４
遺伝子変異が上述したクローン（配列番号１）の５’部分とは異なるＩＮＧ１遺伝子の５  部分に存在する可能性を検討するために、追加実験を行った。第１の実験群では、乳癌腫瘍ライブラリーと精巣ライブラリーの両方から完全長ＩＮＧ１  ｃＤＮＡを得ることを試みた。標準的方法により、配列番号１をライブラリーのプローブとして使用した。
【００２８】  精巣ライブラリーからは４つのクローンが単離され、乳癌ライブラリーからはクローンは単離されなかった。上記４つのクローンは配列決定により、３つの転写物変異体に由来することがわかった。これら３つの転写物変異体は５８６位から３’末端までは同じであるが、５’領域に相違があり、同じエキソン−イントロン接合部が関与する選択的スプライス変異体が示唆された。これら３つはいずれもＧａｒｋａｖｔｓｅｖらがＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４１５−４２０（１９９６）に記載したＩＮＧ１の配列とは異なっていた。これら３つの変異体を配列番号１、３および４に示す。
【００２９】  次に全ての配列を解析した。配列番号２、１および４（配列番号２は最初に開示されたＩＮＧ１配列である）のＯＲＦは、２９４、２７９および２３５アミノ酸のポリペプチドをコードし、そのうちの２３３アミノ酸は３つの配列に共通する３’領域によってコードされている。これらの推定配列を配列番号１９、５および７に記載する。しかし配列番号３については、翻訳開始部位をその５’領域中に見いだすことができなかった。
【００３０】  実施例５
上記配列番号３に関するデータを見て、この分子の変異体転写物の５末端にさらなるＯＲＦを見つけるためにさらに実験を行うことにした。これを決定するために、遺伝子特異的プライマーおよびアダプター特異的プライマーを市販の製品および標準的方法論と共に使用して、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。
【００３１】  これらの実験で使用したプライマーは、
配列番号１用は、
ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＧ
ＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＧ
（配列番号９および１０）、
配列番号３用は、
ＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣ
ＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＧ
（配列番号１１および１２）、ならびに
配列番号４用は、
ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＣＣＴＡＧＧＧＡＡＧ
ＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＧ
（配列番号１３および１４）
である。
【００３２】  ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物のクローニングと配列決定により、配列番号４の変異体配列は配列番号３の５’側にあり、変異体配列番号３の完全長ｃＤＮＡは、配列番号３と上述した共通の３’配列との間に位置する６０９ヌクレオチド長の追加エキソンを含むことが明らかになろた。このエキソンはＯＲＦを含まない。最初の利用可能な開始部位は、配列番号１のアミノ酸７０にある開始メチオニンだろう。したがって配列番号３は、発現されると、６８１塩基対の非翻訳５’末端と２１０アミノ酸（配列番号６）をコードする領域を持つ分子に相当するだろう。
【００３３】  実施例６
少なくとも３種類の転写開始部位とおそらくは異なるプロモーターを持つ転写物変異体が存在することから、ｍＲＮＡ発現は異なる組織特異的調節下にあるのかもしれないことが示唆された。
【００３４】  これを決定するために、標準的方法を用いて、変異体特異的プライマーを合成し、組織パネルに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３５】  配列番号１は、調べた正常乳腺、脳および精巣組織、６つの乳癌株および８つのメラノーマ細胞系および培養メラニン細胞の全てで例外なく発現されることがわかった。配列番号３は６つの乳癌株のうちの４つ、正常精巣、肝臓、腎臓、結腸および脳で発現されることがわかった。配列番号４は正常精巣細胞によって発現され、脳細胞で弱く発現させることがわかった。
【００３６】  実施例７
ＩＮＧ１に対する抗体が健常者および癌患者の血清中に存在するかどうかを決定するために、さらにもう一組の実験を行った。配列番号１のクローンをターゲットとして、上述したタイプのフェーズプラーク免疫アッセイを行った。乳癌患者から採取した１４の同種異系血清のうち、２つが１：２００の希釈率で陽性だった。正常血清は全て陰性だった。
【００３７】  実施例８
次に、上述したＢＲ１１  ｃＤＮＡライブラリーを、配列番号１と標準的方法論を用いてスクリーニングした。調査したデータバンクのどの配列とも異なる５９３塩基対のｃＤＮＡが同定された。このｃＤＮＡ分子の配列を配列番号８に記載する。
【００３８】  次に、配列番号１に記載のｃＤＮＡ分子を使ってサザンブロット実験を行った。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを正常ヒト組織から単離し、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII で消化した後、０．７％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにブロットし、32Ｐ標識配列番号１を使って高ストリンジェンシー条件（水性緩衝液、６５℃）でハイブリダイズした。プローブを一晩ハイブリダイズさせた後、オートラジオグラフィーのために露出した。２つのハイブリッド形成性ＤＮＡ種、すなわち配列番号１および８が同定された。
【００３９】  実施例９
次に、配列番号８に記載のｃＤＮＡ分子を解析した。正常胎児ｃＤＮＡを使って５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。この分子の完全長ｃＤＮＡはポリＡテールを含まないで７７１塩基対の長さである。これは配列番号１に強い相同性を示し、最も強い相同性は５’側の２／３（ヌクレオチド１〜４８０にわたって７６％一致）にあった。しかし、最も長いＯＲＦは、配列番号１の予想発現産物に相同ではあるがはるかに短い４２アミノ酸長のポリペプチドをコードする１２９塩基対しかない。
【００４０】  コード領域の他に、配列番号８は２０３塩基対の５’非翻訳領域と４３９塩基対の３’非翻訳領域を含む。
【００４１】  ＲＴ−ＰＣＲアッセイを上述のように行った。試験した正常組織は、脳、結腸、精巣および乳腺組織を含めて全て、この遺伝子の発現に関して陽性だった。８つのメラノーマ細胞系を試験したところ、そのうちの７つは様々な発現レベルを示し、１つは発現を示さなかった。６つの乳癌細胞系を試験したところ、そのうちの４つは様々な発現レベルを示し、２つは発現を示さなかった。
【００４２】  実施例１０
「ＢＲ１７−１２８」と呼ぶもう１つの乳癌ｃＤＮＡライブラリーを、自家血清を使ってスクリーニングした。１つのｃＤＮＡ分子が同定された。
【００４３】  この配列を解析したところ、その５’末端は不完全であることが示唆された。この配列を延長するために、精巣ｃＤＮＡライブラリーを、乳癌ライブラリー中に見いだされた部分配列に基づくヌクレオチドプローブでスクリーニングした。これらのスクリーニングにより、さらに１２００塩基対が同定された。その２０１１塩基対の情報を配列番号１５に記載する。
【００４４】  最も長いオープンリーディングフレームは約５９．１５キロダルトンのタンパク質に相当する１５３９塩基対である。その推定配列を配列番号１６に記載する。
【００４５】  次に、下記のプライマーを使ってＲＴ−ＰＣＲを行った：
ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＧＡＧ
ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧ
（配列番号１７および１８）。
【００４６】  正常な精巣および乳腺組織に強いシグナルが観察され、胎盤に弱い発現が観察された。
【００４７】  正常な脳、腎臓、肝臓、結腸、副腎、胎児脳、肺、膵臓、前立腺、胸腺、子宮および卵巣組織には発現は認められなかった。試験した腫瘍細胞系のなかでは、乳癌細胞系のうち２株は強い陽性であり、２株は弱い陽性だった。メラノーマの場合、８株中２株は強い陽性であり、３株は弱い陽性だった。肺癌細胞系の場合、１５株中４株は強い陽性であり、３株は弱い陽性だった。
【００４８】  癌組織標本を試験したところ、２５個の乳癌試料中１６個が強い陽性であり、さらに３個の試料が弱い陽性だった。３６個のメラノーマ試料のうち２個が陽性（１つは強い陽性、１つは弱い陽性）だった。他の癌組織試料を全て陰性だった。
【００４９】  ノーザンブロット法を行ったところ、高分子量スミアが精巣に観察されたが、試験した他の組織には観察されなかった。
【００５０】  実施例１１
上記実施例１０に述べた腫瘍試料を使ってさらなる実験を行った。この試料は６０歳の女性乳癌患者の皮下転移から得られた。全ＲＮＡを上述のように抽出した。抽出に続いて、やはり上述したように、ｃＤＮＡライブラリーをλ−ＺＡＰ発現ベクターに構築した。実施例１に説明したプロトコールを使ってスクリーニングを行った。合計７×１０5 ｐｆｕをスクリーニングした。１４個の反応性クローンを同定し、精製し、配列決定した。次に、前記配列を、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＳＴデータベース中の公開配列と比較した。これらの解析により、上記のクローンは７つの異なる遺伝子に由来し、そのうちの２つは既知遺伝子であり、５つは未知遺伝子であることがわかった。２つの既知遺伝子は「ＰＢＫ−１」（３クローン）およびＴＩ−２２７（１クローン）だった。これらは普遍的に発現する遺伝子であり、上記ライブラリーは多くの異なる組織に由来するこれら遺伝子のＥＳＴを示す。
【００５１】  残りの１０クローンについては、６クローンが同じ遺伝子に由来した。この遺伝子を以下「ＮＹ−ＢＲ−１」という。この遺伝子と一致するｃＤＮＡ配列はＥＳＴデータベース中に３つ見つかった。そのうちの２つ（ＡＩ９５１１１８とＡＷ３７３５７４）は乳癌ライブラリーに由来することが確認され、残りの１つ（ＡＷ１７００３５）はプール組織源に由来した。
【００５２】  実施例１２
上述した新しい遺伝子ＮＹ−ＢＲ−１の分布をＲＴ−ＰＣＲによって決定した。簡単に述べると、３００〜６００塩基対長のｃＤＮＡセグメントを増幅するために、推定値６５〜７０℃のプライマー融解温度を持つ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＮＹ−ＢＲ−１プライマーを設計した。
【００５３】  次に、サーマルサイクラーと６０℃のアニーリング温度を使って増幅サイクル３０以上でＲＴ−ＰＣＲを行った。産物は、１．５％ゲル電気泳動と臭化エチジウム染色によって解析した。１５個の正常組織（副腎、胎児脳、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、胸腺、子宮、卵巣、脳、腎臓、肝臓、結腸および精巣）をアッセイした。ＮＹ−ＢＲ−１クローンは乳腺および精巣組織で強いシグナルを与え、胎盤では極めてかすかなシグナルを与えた。他の組織はいずれも陰性だった。ＥＳＴデータベースライブラリーの情報との比較によれば、他のクローンは普遍的に発現していたため、これ以上追求しなかった。
【００５４】  次に、腫瘍試料に対して上述のようにＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、癌試料におけるＮＹ−ＢＲ−１の発現パターンを調べた。
【００５５】  発現パターンを決定するために以下のプライマーを使用した：
ｃａａａｇｃａｇａｇ  ｃｃｔｃｃｃｇａｇａ  ａｇ（配列番号２０）および
ｃｃｔａｔｇｃｔｇｃ  ｔｃｔｔｃｇａｔｔｃ  ｔｔｃｃ（配列番号２１）。
【００５６】試験した２５個の乳癌試料のうち、２２個がＮＹ−ＢＲ−１に関して陽性だった。これらのうち１７個は強いシグナルを与え、５個は中ぐらいのシグナルを与えた。
【００５７】  さらに８２個の非乳癌試料も解析した。内訳はメラノーマ３６、非小細胞肺癌２６、大腸癌６、扁平上皮細胞癌６、移行上皮癌６および平滑筋肉腫２である。２つのメラノーマ試料だけがＮＹ−ＢＲ−１発現に関して陽性だった。
【００５８】  次に、研究対象を組織培養でのＮＹ−ＢＲ−１の発現に拡張した。乳癌、メラノーマおよび小細胞肺癌由来の細胞系を調べた。６株の乳癌細胞のうち４株が陽性（２株は極めて弱い）であり、８株のメラノーマのうち４株（２株は極めて弱い）、そして１４株の小細胞肺癌株のうち７株（２株は極めて弱い）が陽性だった。
【００５９】  実施例１３
ＮＹ−ＢＲ−１の完全なｃＤＮＡ分子を決定するために、上述した６つのクローンの配列を編集して、１４６４塩基対長のヌクレオチド配列を作製した。オープンリーディングフレームを解析したところ、全体にわたって連続したＯＲＦが見いだされたことから、編集した配列は完全ではないことがわかった。
【００６０】  編集した配列を上記３つのＥＳＴライブラリー配列と比較することにより、配列を伸長することができた。ＥＳＴエントリーＡＷ１７００３５（４４６塩基対長）は、その５’末端が編集した配列と８９塩基対重なっていたので、配列をさらに３５７塩基対伸長することができた。このようにして翻訳停止コドンを同定することにより、３３３塩基対長の３’非翻訳領域を持つ分子が得られた。しかし、この分子の５’末端は欠けているので、以下の実験を行うことにした。
【００６１】  実施例１４
上記クローンの欠けている５’末端を決定するために、上述したタイプのＰＣＲ発現産物をプローブとして、市販の精巣ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。簡単に述べると、１５０ｍｍプレート１枚につき５×１０4 ｐｆｕをニトロセルロース膜に転写した後、そのニトロセルロース膜を変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍ  ＮａＯＨ）に浸漬し、中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍトリス−ＨＣｌ）に移した後、０．２Ｍトリス−ＨＣｌおよび２×ＳＳＣですすいだ。プローブを32Ｐで標識し、高ストリンジェンシー条件（すなわち６８℃、水性緩衝液）でハイブリダイゼーションを行った。陽性クローンは全て上述のようにサブクローニングし、精製し、インビボでプラスミドＰＢＫ−ＣＭＶに切り出した。
【００６２】  この方法で同定されたクローンの１つは、その５’末端に新たな１３４６塩基対を含んでいたが、完全長分子ではなかった。市販の製品を使って５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＧＥＭＴにクローニングし、配列決定した。その結果、ｃＤＮＡ配列はさらに１２９２塩基対長くなることがわかったが、停止コドンを検出することができなかったので、翻訳開始部位を決定することはできなかった。しかし、ＮＹ−ＢＲ１７クローンのｃＤＮＡは配列番号２２に示す少なくとも４０２６ヌクレオチドを含む。この分子は、少なくとも約１５２．８ｋＤＡの分子量を持つタンパク質をコードする。構造的には推定翻訳開始部位の５’側に９９塩基対があり、３’末端には３３３塩基対長の非翻訳セグメントがある。配列番号２２のコード領域の予想アミノ酸配列を配列番号２３に記載する。
【００６３】  既知の検索プログラムＰＲＯＳＩＴＥおよびＰｆａｍを使って、配列番号２３をモチーフに関して解析した。二極性核移行シグナルモチーフがアミノ酸１７〜３４に確認されたことから、このタンパク質は核タンパク質であることが示唆される。５つの縦列アンキリン反復配列がアミノ酸４９〜８１、８２〜１１４、１１５〜１４７、１４８〜１８０および１８１〜２１３に確認された。ｂＺＩＰ部位（すなわちロイシンジッパーモチーフが後続しているＤＮＡ結合部位）がアミノ酸位置１０７７〜１１０４に確認されたことから、転写因子機能が示唆される。またアンキリン反復配列とｂＺＩＰ  ＤＮＡ結合部位の間にも３つの反復配列が認められた。詳しく述べると、アミノ酸４５９〜８１５の間に、１１７ヌクレオチド長の反復配列が直列に３回反復している。１１アミノ酸からなる第２の反復配列は、アミノ酸２２４とアミノ酸３００の間で７回反復している。第３の反復配列は３４アミノ酸長で、アミノ酸３０１〜３６８の間で２回反復している。
【００６４】  実施例１５
上述した６つのクローンを比較し、解析したところ、これらは２つの異なるスプライス変異体に由来することが明らかになった。具体的に述べると、「ＢＲ１７−８」および「ＢＲ１７−４４ａ」と呼ぶ２つのクローンは、クローンＢＲ１７−１ａ、ＢＲ１７−３５ｂおよびＢＲ１７−４４ｂと比較するとエキソンが１つ多く、配列番号２３のアミノ酸９７３〜１００９をコードする１１１塩基対（配列番号２２のヌクレオチド３０１５〜３１２５）のエキソンを含んでいる。上記６つのクローンのなかで最も短いＢＲ１７−１２８は、他のエキソンの３’側から始まっている。上述した重要な構造要素はどちらのスプライス変異体にも存在することから、生物学的機能に相違はないことが示唆された。
【００６５】  上述した１１１塩基対エキソンをまたぐプライマーを使って、これら２つのスプライス変異体の発現パターンをＰＴ−ＰＣＲによって評価した。
【００６６】  使用したプライマーは、
ａａｔｇｇｇａａｃａ  ａｇａｇｃｔｃｔｇｃ  ａｇ（配列番号２４）および
ｇｇｇｔｃａｔc ｔｇ  ａａｇｔｔｃａｇｃａ  ｔｔｃ（配列番号２５）
である。どちらの変異体も正常な精巣および乳腺で強く発現した。精巣では長い方の変異体が優勢であり、乳腺細胞では短い方の変異体が優勢だった。乳癌細胞を調べたところ、変異体のコタイピング（ｃｏ−ｔｙｐｉｎｇ）が観察され（強陽性７、弱陽性２、陰性１）、一貫して短い方の変異体が優勢だった。
【００６７】  実施例１６
乳癌患者におけるＮＹ−ＢＲ−１に対する抗体応答の頻度を調べた。これを行うために、配列番号２３のアミノ酸９９３〜１１８８からなる組換えタンパク質を調製した。（これは上述したクローンＢＲ１７−１２８がコードするタンパク質である）。合計１４０個の血清試料を乳癌患者から採取すると共に、６０個の正常血清試料も採取した。これらを標準的方法によりウェスタンブロット法で解析した。
【００６８】  癌血清試料のうち、患者ＢＲ１７から得た試料を含む４つが陽性だった。正常血清は全て陰性だった。
【００６９】  次に、ＮＹ−ＢＲ−１タンパク質の反復配列含有部分を血清が認識するかどうかを決定するために、もう一組の実験を行った。これを行うために、アミノ酸４０５〜１０００からなる異なる組換えタンパク質を作製し、ウェスタンブロットアッセイで試験した。４つの抗体陽性血清はいずれもこのタンパク質とは反応しなかったことから、抗体エピトープは分子の非反復カルボキシ末端にあることがわかった。
【００７０】  実施例１７
上述した精巣ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、なかんずく、ＮＹ−ＢＲ−１に相同なｃＤＮＡ分子が同定されることになった。この分子はポリＡテールを除いて３６７３塩基対長である。これは配列番号２２のヌクレオチド１〜３４８１に対応し、これに６２％のホモロジーを示した。ライブラリー中の配列に対する配列一致は認められなかった。ＯＲＦ解析により、配列番号２３のタンパク質配列に対して５４％のホモロジーを持つヌクレオチド６４１から配列の末端に至るＯＲＦが同定された。この配列のＡＴＧ開始コドンは、ＮＹ−ＢＲ−１の推定開始コドンからさらに２９２塩基対３’側にあり、その５’末端には６４０個の非翻訳塩基対が先行している。この６４０塩基対配列には停止コドンが散在している。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２７に記載する。
【００７１】  プライマー、
ｔｃｔ  ｃａｔａｇａｔ  ｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇ  ａｔｃ（配列番号２８）および
ｃｃｃａｇａｃａｔｔ  ｇａａｔｔｔｔｇｇｃ  ａｇａｃ（配列番号２９）
を使用し、上記と同じ方法で、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。組織限定的ｍＲＮＡ発現が認められた。発現パターンは配列番号２２とは異なっていた。簡単に述べると、検討した６つの正常組織のうち、強いシグナルは脳と精巣だけに見いだされた。正常乳腺組織では発現はないか弱く、腎臓、肝臓および結腸組織は陰性だった。上で試験した１０個の乳癌標本のうち８個は、配列番号２６について陽性だった。６個の試料は配列番号２２と２６の両方について陽性、１個は配列番号２２のみについて陽性、２個は配列番号２６のみについて陽性、１個はどちらについても陰性だった。
【００７２】  実施例１８
最近、ヒトゲノム配列のドラフト配列が公表された。このデータベースを標準的方法で検索したところ、ＮＹ−ＢＲ−１は少なくとも３つの１０番染色体クローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ１５７３８７、ＡＬ３７１４８およびＡＣ０６７７４４）と配列同一性を持つことがわかった。これらのクローンにより、ＮＹ−ＢＲ−１の位置は、１０番染色体のｐ１１．２１−１２．１に特定される。
【００７３】  ＮＹ−ＢＲ−１とヒトゲノム配列の比較から、ＮＹ−ＢＲ−１エキソン−イントロン構成が明確になった。簡単に述べると、この遺伝子のコード領域は基本的に１９個の構造的に異なるエキソンを含み、少なくとも２つのエキソンが３’非翻訳領域をコードする。詳細なエキソン−イントロン接合部情報は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２６９０８１に記載されている。
【００７４】  上述した６つのアンキリン反復配列は、全てエキソン７に見いだされる。３５７ヌクレオチドの反復単位は、エキソン１０〜１５からなる。しかし、利用できるゲノム配列は完全ではなく、３つのコピーのうち１つだけが同定されたことから、遺伝子進化中にエキソン５と１０の間のＤＮＡ配列は複写され、直列に挿入されたのかもしれないことが示唆される。簡単に述べると、単離されたＮＹ−ＢＲ−１  ｃＤＮＡクローンを解析したところ、反復単位の完全なコピーが３つと不完全なコピーが１つ存在する。エキソン配列は、エキソン１−２−３−４−５−６−７−８−９−（１０−１１−１２−１３−１４−１５）−（１０Ａ−１１Ａ−１２Ａ−１３Ａ−１４Ａ−１５Ａ）−（１０Ｂ−１１Ｂ−１２Ｂ−１３Ｂ−１４Ｂ−１５Ｂ）−（１０Ｃ−１１Ｃ−１２Ｃ−１３Ｃ−１４Ｃ）−１６−１７−１８−１９−２０−２１と表すことができる（ここにＡ、ＢおよびＣはエキソン１０〜１５配列の不正確なコピーである）。クローン化されたＮＹ−ＢＲ−１  ｃＤＮＡは全部で３８個のエキソンを持っている。
【００７５】  上記のように、ＮＹ−ＢＲ−１  ｃＤＮＡの配列は５’末端が完全でなかったことが注目された。ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０６７７４４）により、５’末端を伸長することができた。５’ゲノム配列の翻訳により、先に予想したＡＴＧ開始コドンの１６８塩基対上流に、新しい翻訳開始部位が同定された。これにより、１３９７アミノ酸長を含み、先の配列情報と比較すると、そのうちの５６残基、すなわちＭＥＥＩＳＡＡＡＶＫＶＶＰＧＰＥＲＰＳＰＦＳＱＬＶＹＴＳＮＤＳＹＩＶＨＳＧＤＬＲＫＩＨＫＡＡＳＲＧＱＶＲＫＬＥＫ（配列番号３０）がＮ末端に付加されているＮＹ−ＢＲ−１ポリペプチドが得られた。
【００７６】  実施例２０
上ではＮＹ−ＢＲ−１の２種類のスプライス変異体について述べた。これらのスプライス変異体とゲノム配列との比較により、長い方の変異体がイントロン３３の一部をエキソン３４（すなわち上述した基本的エキソン／イントロンフレームワークのエキソン１７）に組み込んでいるという選択的スプライシングが確認された。
【００７７】  ＮＹ−ＢＲ−１で予測された上記の重要な構造要素はどちらの変異体にも存在することから、生物学的機能または細胞内位置には相違はないことが示唆される。
【００７８】  実施例２１
ＮＹ−ＢＲ−１の場合と同様に、上記の変異体ＮＹ−ＢＲ−１．１をヒトゲノムのドラフト配列に対してスクリーニングした。配列同一性を持つ１つのクローン、すなわち９番染色体由来のＧｅｎＢａｎｋ  ＡＬ３５９３１２がみつかった。したがって、ＮＹ−ＢＲ−１およびＮＹ−ＢＲ−１．１は共に、２つの異なる染色体上にある機能性遺伝子であるらしい。ここに挙げるＧｅｎＢａｎｋ配列はＮＹ−ＢＲ−１．１の全てを含まないので、エキソン−イントロン構造を明確にすることはできない。それでも、ＮＹ−ＢＲ−１基本フレームワークのエキソン１６〜１８に相当する少なくとも３つのエキソンを明確にすることができる。エキソン−イントロン接合部は保存されている。
【００７９】  実施例２２
配列番号２３に記載するＮＹ−ＢＲ−１のアミノ酸配列に基づいて、一連のペプチドを合成した。次に、これらをＨＬＡ−Ａ２分子に結合する能力およびＣＴＬの増殖を刺激する能力について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法で試験した。このアッセイでは、９６穴平底ニトロセルロースプレートを１ウェルにつきＰＢＳ１００μｌ中の５μｇ／ｍｌの抗インターフェロンγ抗体でコーティングした後、終夜インキュベートした。次に、抗ＣＤ８抗体で被覆された磁気ビーズを使ってＰＢＬ試料から分離した精製ＣＤ８+ 細胞を、１０％ヒト血清、Ｌ−アスパラギン（５０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−アルギニン（２４２ｍｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（３００ｍｇ／ｌ）およびＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０に、最終液量を１００μｌとして、１×１０5 細胞／ウェルの濃度で加えた。ペプチドによる前感作でＣＤ８+ エフェクター細胞を調製した後、５×１０3 〜２×１０4 細胞／ウェルの密度で加えた。放射線照射Ｔ２細胞に１０μｇ／ｍｌの濃度でペプチドを１時間パルスし、洗浄し、５×１０4 細胞／ウェルの濃度でエフェクター細胞に加えた。プレートを３７℃で１６時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで６回洗浄した後、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗インターフェロンγ特異抗体を添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、市販の試薬を使って１時間、続いて色素基質と共に１０分間インキュベートすることにより発色させた。次にプレートを調製して計数した。陽性は青いスポットによって示される。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異ＣＴＬの頻度／ウェルとして青スポット数／ウェルを決定した。
【００８０】  実験は三連で行い、ＣＴＬの総数を計算した。対照としては、試薬類のうち一つだけ、エフェクター細胞だけ、または抗原提示細胞だけを使用した。刺激細胞と非刺激細胞の陽性数の差を、バックグラウンドを上回るペプチド特異ＣＴＬの有効数として計算した。３つのペプチド、すなわち
ＬＬＳＨＧＡＶＩＥＶ（配列番号２３のアミノ酸１０２〜１１１）
ＳＬＳＫＩＬＤＴＶ（配列番号２３のアミノ酸９０４〜９１２）
ＳＬＤＱＫＬＦＱＬ（配列番号２３のアミノ酸１２６２〜１２７０）
が反応性であることことがわかった。
【００８１】  試験したペプチドの完全な一覧を、配列番号２３中の位置を併記して、以下に示す。
【００８２】
【表４】
0005640237.tif 000002
上記の実施例では癌関連抗原をコードする核酸分子の単離を説明した。問題の分子がいくつかのタイプの癌によって発現されることは明らかであるが、ここではスクリーニングしなかった他の癌もその抗原を発現させるかもしれないので、ここでは「関連」という用語を使用する。
【００８３】  本発明は、例えば配列番号１、３、８、１５、２２および２６などによってコードされる抗原をコードする核酸分子、ならびにその核酸分子によってコードされる抗原、例えば配列番号５、６、７、１６、２３、２７および３０のアミノ酸配列を持つタンパク質に関する。本明細書に記載の抗原をコードする配列は全て本発明の一部であると理解すべきである。
【００８４】  また、例えば配列番号２３中に見いだされる少なくとも９個の連続するアミノ酸または配列番号３０のアミノ酸の少なくとも９個の連続するアミノ酸を含むタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドも、本発明の一部である。配列番号５、６、７、１６または２７のアミノ酸の９個以上を含むタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドも本発明の一部である。配列番号２３のアミノ酸１０２〜１１１、９０４〜９１２または１２６２〜１２７０を含むペプチドまたは前記アミノ酸から構成されるペプチドは、特に好ましい。これらのペプチドはＨＬＡ−Ａ２分子などのＨＬＡ分子と複合体化するとＣＴＬ応答を誘発するかもしれない（ただし必ず誘発するとは限らない）。またこれらのペプチドは、例えばＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ８、Ｃｗ３、Ｃｗ６など（ただしこれらに限らない）といった他のＭＨＣまたはＨＬＡ分子に結合するか、または例えば免疫原として、または他のタンパク質またはポリペプチドと組み合わされた免疫原カクテル組成物の一部などとして役立ちうる。また、これらの分子をコードする「ミニ遺伝子」などの核酸分子、コード領域を含む発現ベクター、それらを含有する組換え細胞なども、本発明の一部である。全て本発明の一部である。
【００８５】  また、プロモーターに対して作動可能な結合状態にある（すなわち作動可能に連結された）本発明の核酸分子を組み込んだ発現ベクターも、本発明の一部である。このようなベクター（例えばウイルス（アデノウイルスまたはワクシニアウイルスなど）または弱毒化ウイルスベクター）の構築は当技術分野では十分に可能であり、興味ある分子をコードする真核細胞系または原核細胞株の作製のための細胞の形質転換またはトランスフェクションも同様である。このようにして使用することができる宿主細胞の典型例はＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などである。大腸菌および他の細菌などの原核細胞も使用することができる。これらの細胞はいずれも、さらなる核酸分子、例えばインターロイキン（ＩＬ−２、４、６または１２など）などのサイトカイン、ＨＬＡ分子またはＭＨＣ分子などをコードする核酸分子などで形質転換またはトランスフェクトすることもできる。
【００８６】  本明細書に記載する抗原は原型でも翻訳後修飾型でも本発明の一部である。翻訳後修飾を受けていない状態で本分子は抗原性を示すのに十分な大きさを持つ。したがって本分子は、アジュバントと組み合わせると（またはアジュバントなしで）、前駆体型でも翻訳後修飾型でも、免疫原として有用である。これらの抗原を使って産生させた抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも本発明の一部であり、これらの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマも同様である。本タンパク質の全部または一部は後述するように治療的に使用することができる。この抗原に対する抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、反応性断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2 ’および他の断片ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体など）も本発明の一部である。
【００８７】  本明細書の開示から明らかなように、本発明のタンパク質および核酸分子は診断的に使用することができる。上述したＳＥＲＥＸ法は、病理関連抗原に対する免疫応答を前提としている。したがって、例えば被験者の体液試料、例えば血清を抗原そのものとの反応性について調べることなどにより、関連する病理について検査することができる。反応性はその病理が存在する可能性を示す。同様に、当技術分野でよく知られていてここに詳述する必要のない標準的核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって、抗原の発現に関する検査を行うこともできる。同様に、標準的免疫アッセイ法で対象分子に対する抗体に関する検査を行うこともできるだろう。
【００８８】  配列番号１、３、４、８、１５、２２および２６を解析すれば、５’および３’非コード領域がそこに存在することがわかるだろう。本発明は、少なくともコードセグメントを含み、非コード５’および３’部分の任意の部分または全てを含んでよい単離された核酸分子に関する。
【００８９】  また、例えばオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブなどとして使用することができる関連核酸分子の一部、例えば配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、２０、２１、２４、２５、２８および２９、ならびに配列番号１の少なくともヌクレオチド３０５〜７４８を含む核酸分子のような増幅産物または実施例に記載した増幅産物、例えば実施例１２、１４などに記載したものも、本発明の一部である。
【００９０】  上述したように、「ＣＴ」ファミリーの他のメンバーの研究により、これらは細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発するペプチドにもプロセシングされることがわかる。様々なＭＨＣまたはＨＬＡ分子のモチーフについては多数の研究が行われており、それらは本発明に応用することができる。したがって、本発明のさらなる一側面は、患者の腫瘍細胞の表面にあるＨＬＡ分子に結合する、本発明の抗原に由来する１または複数のペプチドを、当該ペプチドが当該ＭＨＣ／ＨＬＡ分子に結合してＴ細胞による溶解を誘発するのに十分な量で、当該患者に投与する治療法である。ペプチドの任意の組合わせを使用することができる。単独でまたは組み合わせて使用することができるこれらのペプチドは、タンパク質全体またはその免疫反応性部分と共に、それを必要とする対象に、標準的な投与法、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、直腸および経皮投与などを用いて投与することができる。標準的な医薬担体、アジュバント、例えばサポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキンなどを使用することもできる。さらにこれらのペプチドおよびタンパク質は、本明細書に記載の物質（それは関連ＭＨＣ／ペプチド複合体を提示する樹状細胞もしくは他の細胞であってもよい）と共にワクチンに製剤化することもできる。
【００９１】  同様に、本発明では、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、それらのタンパク質に由来する１または複数のペプチドを、ワクシニアまたはアデノウイルス系ベクターなどのベクターに組み込んで、ヒト細胞などの真核細胞にトランスフェクトすることができるようにする治療法も考えられる。同様に、１または複数のペプチドをコードする核酸分子をこれらのベクターに組み込んで、核酸に基づく治療法の主要構成要素とすることができる。
【００９２】  これらのアッセイはいずれも、進行／後退試験にも使用することができる。上述した方法のいずれかまたは全てを使って本タンパク質、その発現、それに対する抗体などのレベルをモニターするだけで、これらの抗原の発現が関与する異常の経過をモニターすることができる。
【００９３】  これらの方法論は治療計画の効力を追跡するために使用することもできることは明らかだろう。基本的には、上述したアッセイのいずれかを用いて興味あるタンパク質のベースライン値を測定し、所定の治療薬を投与した後、本タンパク質のレベルをモニターして、治療計画の効力の指標として、抗原レベルの変化を観察することができる。
【００９４】  上記のように、本発明はとりわけ本発明の分子に対する「総合的」免疫応答の認識に関する。そこから派生する効果の一つとして、癌治療の経過をモニターすることができる。本発明の一部であるこの方法では、治療を必要とする対象に本明細書に記載するタイプのワクチン接種を施す。そのようなワクチン接種は、例えばＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞に対するＴ細胞応答を引き起す。応答には抗体応答も含まれ、これはおそらくＴ細胞による細胞の溶解によって抗体誘発タンパク質が放出される結果だろう。したがって、抗体応答をモニターすることにより、ワクチンの効果をモニターすることができる。上記のように抗体価の増加はワクチンによる進行の指標と解釈することができ、逆も同様である。したがって、本発明のさらなる一側面は、ワクチン投与後のワクチンの効力をモニターする方法であって、ワクチンそのものまたはワクチンをその一部とする大分子に特異的な抗体の、対象内でのレベルを決定することによる方法である。
【００９５】  本タンパク質は癌などの病的状態に関係することが確認されたことから、上述の治療的アプローチの他にも、多くの治療的アプローチが示唆される。上記の実験は、本タンパク質の発現に応答して抗体が産生されることを立証している。したがって、本発明のさらなる態様は、ヒト化抗体、抗体断片などの抗体の投与による、１または複数のタンパク質の異状または異常レベルを特徴とする状態の処置である。これらの抗体は、適当な細胞分裂抑制剤または細胞傷害剤を付加するか、それらで標識することができる。
【００９６】  Ｔ細胞を投与してもよい。例えば樹状細胞、リンパ球などの免疫応答細胞を使ってインビトロでＴ細胞を誘導した後、それを処置対象に再灌流することができることに注目すべきである。
【００９７】  Ｔ細胞および／または抗体の生成は、上述したエピトープなどの適切なＴ細胞またはＢ細胞エピトープを提示して応答を引き起こす細胞、好ましくは非増殖性になるように処理された細胞を投与することによって達成することもできることに注意されたい。
【００９８】  治療的アプローチには、アンチセンス分子（好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長の分子）を「ニート」で、または細胞への取り込みを容易にするためにリポソームなどの担体に入れて対象に投与し、よってタンパク質の発現を阻害するアンチセンス療法を含めることもできる。そのようなアンチセンス配列は適当なワクチンに、例えばウイルスベクター（ワクシニアなど）、既知のＢＣＧワクチンの変形物などの細菌コンストラクトなどに組み込むこともできる。
【００９９】  本発明の他の特徴および応用例は当業者には明白であり、ここに説明する必要はないだろう。本明細書で使用した用語および表現は、説明を目的として使用されたものであって、限定を目的とするものではなく、これらの用語および表現の使用に、上に示し説明した特徴またはその一部と等価なものを排除する意図はなく、様々な変更態様が本発明の範囲内で可能であると考えられる。
【配列表】
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