(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌由来野生型ラクトースリプレッサーの94番目のアミノ酸がメチオニンに、241番目のアミノ酸がスレオニンに、265番目のアミノ酸がアスパラギン酸に、又は300番目のアミノ酸がアスパラギン、フェニルアラニンもしくはプロリンに置換され、35℃〜40℃において温度感受性を示す温度感受性変異ラクトースリプレッサー。
【請求項２】
大腸菌由来野生型ラクトースリプレッサーの94番目のアミノ酸がメチオニンに、241番目のアミノ酸がスレオニンに、265番目のアミノ酸がアスパラギン酸に、又は300番目のアミノ酸がアスパラギン、フェニルアラニンもしくはプロリンに置換され、35℃〜40℃において温度感受性を示す温度感受性変異ラクトースリプレッサーをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の温度感受性変異ラクトースリプレッサーをコードする遺伝子及び目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有する宿主細胞における当該目的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現の制御方法において、当該細胞の培養温度を３５℃〜４０℃に変化させて当該温度感受性変異ラクトースリプレッサーの機能を調整することにより当該目的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御することを特徴とする当該制御方法。
【請求項４】
前記温度感受性変異ラクトースリプレッサー遺伝子を、目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミド又は宿主染色体上に組み込むことを含んでなる請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記温度感受性変異ラクトースリプレッサー遺伝子を、目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するクローニングベクター又は発現ベクターに組み込むことを含んでなる請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞、原核細胞、真菌、酵母、または昆虫細胞である請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載の温度感受性変異ラクトースリプレッサーをコードする遺伝子及び目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有する発現ベクターを用いる目的ポリペプチドの製造方法において、当該発現ベクターにより形質転換された形質転換細胞の培養温度を３５℃〜４０℃に変化させて当該温度感受性変異ラクトースリプレッサーの機能を調整することにより当該目的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御することを特徴とする当該製造方法。
【請求項８】
前記温度感受性変異ラクトースリプレッサー遺伝子を、目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミド又は宿主染色体上に組み込むことを含んでなる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記温度感受性変異ラクトースリプレッサー遺伝子を、目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するクローニングベクター又は発現ベクターに組み込むことを含んでなる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞、原核生物、真菌、酵母または昆虫細胞である請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、温度感受性変異を有するラクトースリプレッサー遺伝子を用いた遺伝子発現の新規な制御方法に関するものである。また、本発明は当該制御方法を用いた遺伝子の発現方法に関するものであり、詳しくは宿主細胞の培養温度を調節することにより遺伝子発現の制御を行う発現方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌ラクトースオペロンの発現制御遺伝子領域、即ちリプレッサー蛋白をコードするlac I 遺伝子からプロモーター／オペレーターまでの遺伝子領域は、その下流の遺伝子の発現に最もよく使用されている制御遺伝子領域の一つである。その理由として菌体中にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下 IPTG ）の様な誘導物質が存在するとき、ラクトースオペレーター領域にラクトースリプレッサーが結合できなくなり、ラクトースプロモーターからの転写が起り、遺伝子発現の転写制御が行えるという点にある。
【０００３】
IPTGのような誘導物質を培地に添加することにより遺伝子発現の制御がうまく行えることを利用して、様々なクローニングベクターや有用物質の生産のための遺伝子発現プラスミドに使用されている。例えば、遺伝子クローニングベクターとしてpUC18 等のpUC シリーズ等、DNA 塩基配列決定用のＭ１３ファージシリーズ等、またcDNAクローニング用のλgt11等に使用されている。近年では動物細胞を用いた研究にもこの発現制御システムが使用されている（Ulrich Deuschle 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 5400-5404, 1989,  Mickey C.-T. Hu 等, Mol. Cell. Biol. Vol. 10, pp. 6141-6151, 1990 ）。
【０００４】
さらに、有用物質生産のためにもこの発現制御システムが使用されている（Mercedes Zazo 等、Gene, Vol. 113, pp. 231-238, 1992 ）。但し、この方法の欠点として、高価であるIPTGを誘導物質として培地に添加し、遺伝子発現を開始しなければならない。特に工業的スケールで有用物質をこの遺伝子発現システムを用いて生産する場合においてはIPTGの使用はコストアップにつながるため問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように産業上望ましい遺伝子発現の新たな制御方法に関する期待は非常に大きいものである。従って、目的遺伝子発現の制御に関し、当該遺伝子発現の制御システムにおいてＩＰＴＧのような高価な誘導物質を使わない遺伝子発現の制御方法及び／又は当該方法を用いた目的遺伝子の発現方法の開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は大腸菌ラクトースオペロンの発現制御遺伝子の中でリプレッサー蛋白に着目した結果、新たなラクトースリプレッサー蛋白を見いだした。当該リプレッサー蛋白は低温では転写抑制活性のある蛋白としてオペレーターに結合し、遺伝子発現を抑制するが、高温では失活し、オペレーターに結合できず遺伝子発現を行える性質、即ち温度感受性変異を有するリプレッサー蛋白である。そこで、当該蛋白をコードする遺伝子を単離し、遺伝子発現の制御に利用すれば上記の目的は達成できると考え、鋭意研究した結果、本発明を完成した。
【０００７】
従って本発明は、野生型ラクトースリプレッサーの９４番目のアミノ酸がメチオニン、２４１番目のアミノ酸がスレオニン、２６５番目のアミノ酸がアスパラギン酸、又は３００番目のアミノ酸がアスパラギン、プロリン、フェニルアラニンの中から選ばれるアミノ酸残基に置き換えられることによって温度感受性にされたラクトースリプレッサー蛋白を提供する。
【０００８】
上記のアミノ酸置換は、例えば９４番目のアミノ酸バリンからメチオニンへの変異、２４１番目のアミノ酸アラニンからスレオニンへの変異、２６５番目のアミノ酸グリシンからアスパラギン酸への変異、及び／又は３００番目のアミノ酸セリンからアスパラギン、フェニルアラニンもしくはプロリンへの変異である。変異したラクトースリプレッサー蛋白のアミノ酸配列の例を配列番号：２０に示す。
本発明はまた、上記の温度感受性ラクトースリプレッサー蛋白をコードする遺伝子（ラクトースリプレッサー蛋白遺伝子）に関する。これらの遺伝子の塩基配列の例を配列番号２０に示す。
【０００９】
本発明はさらに、前記のラクトースリプレッサー蛋白遺伝子及び目的とする蛋白をコードする遺伝子（目的遺伝子）を有する宿主細胞における該目的遺伝子の発現の制御方法において、当該細胞の培養温度を変化させて当該ラクトースリプレッサー蛋白の機能を調整することにより目的遺伝子の発現を制御することを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
この方法においては、前記ラクトースリプレッサー蛋白質遺伝子は、宿主染色体又は染色体外因子、例えばプラスミド、例えばクローニングベクターもしくは発現ベクターに組み込まれる。宿主細胞の例として、哺乳動物細胞、原核生物、真菌、酵母または昆虫細胞等が挙げられる。この方法においては、常温、例えば３０℃において目的遺伝子の発現を抑制し、高温、例えば３５℃以上、例えば３７℃以上で制御を解除して目的遺伝子の発現を得ることができる。
【００１１】
本発明はさらに、前記ラクトースリプレッサー蛋白遺伝子と目的とする蛋白をコードする遺伝子（目的遺伝子）とを含んで成る発現ベクターにより形質転換された形質転換細胞の培養温度を変化させて当該ラクトースリプレッサー蛋白質の機能を調整することにより目的遺伝子の発現を制御することを特徴とする発現方法を提供する。宿主細胞、及び制御温度は前記の通りである。
【００１２】
【具体的な説明】
以下に本発明を詳述する。ラクトースリプレッサー蛋白をコードするlacI遺伝子をもつプラスミドpMC9を突然変異誘起剤、例えばヒドロキシルアミン処理を行いlacI遺伝子配列上に変異を起こさせる。この処理を行ったプラスミドを大腸菌Ｋ１２株由来のlacI遺伝子変異株ＭＹＷ３１１０に形質転換を行う。形質転換した菌株をアンピシリン及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、X-gal ）を含む寒天培地に拡げ、３８℃で一夜培養を行う。
【００１３】
培養後、形質転換株の中で青い色に呈色したコロニーを選び、同じ選択培地上２枚に塗布し、３０℃及び３８℃で一夜培養を行う。このスクリーニングで３０℃で白色、３８℃で青色を示す温度感受性変異株が７株得られた。このようにして得られた株がリプレッサー遺伝子上の変異であることを確認するため温度感受性変異を示す菌株よりプラスミドを単離し、lacI遺伝子のDNA 塩基配列を決定した。
【００１４】
その結果、変異はリプレッサー蛋白の３００番目のセリン残基がアスパラギン残基に、２４１番目のアラニン残基がスレオニン残基に、２６５番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に、９４番目のバリン残基がメチオニン残基に変換されていた。これらの変異部位は今までに温度感受性変異として報告されたものではなく、今回、本発明者等により初めて単離同定されたものである。
【００１５】
次に、これら単離された温度感受性変異をもつラクトースリプレッサー遺伝子が遺伝子発現の制御に使用できるかどうかの検討を行った。まず、コリシンＥ１系のプラスミドと和合性（compatibility)のあるプラスミド、例えばpMW119に上記の変異をもつ変異型lacI遺伝子を挿入し、新たにpYO1, pYO2及びpYO16 プラスミドを作製した。
次に、発現させる目的蛋白質の一例としてヒトカルシトニン前駆体蛋白の融合蛋白を挙げることができる。当該蛋白を生産する菌株から単離したプラスミドpG97S4DhCT[GRRR]をそれぞれ大腸菌MYW3110 / pYO1, MYW3110 / pYO2及びMYW3110 / pYO16 に形質転換法で導入し形質転換株を得る。
【００１６】
なお、プラスミドpG97S4DhCT[GRRR]と実質的に同じであるプラスミドpG97S4DhCT[G] を含有する大腸菌Ｗ３１１０株はブダペスト条約に基づいて工業技術院生命工学技術研究所にEscherichai coli SBM323 として１９９１年８月８日に寄託されており、受託番号微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０３）が付与されている。プラスミドpG97S4DhCT[GRRR]とpG97S4DhCT[G] との相違は、pG97S4DhCT[G] によりコードされる融合蛋白質中の目的ペプチドのＣ−末端がグリシンであるのに対して、pG97S4DhCT[GRRR]においては該グリシンの後にさらにアルギニンが３個付加されている点のみである。従って、pG97S4DhCT[G] から常法に従って容易にpG97S4DhCT[GRRR]を作製することができる。
【００１７】
得られた形質転換株を３０℃で培養後、さらに培養温度を３７℃に上げて培養し、蛋白（特に融合蛋白）の生産を検討したところ、３０℃では蛋白を生産していないが３７℃では発現の誘導が起こり、蛋白を発現していることが明らかとなり、温度感受性変異を有するリプレッサー蛋白及び当該遺伝子が目的の遺伝子発現の制御に十分に使用できることが実証できる。
【００１８】
上記の変異部位はラクトースリプレッサー蛋白の高次構造上温度変化に対して非常に影響を受けやすい部位であると考えられる。言い換えれば蛋白の高次構造を保つうえで重要な位置であると考えられる。従って、これらの変異が起きた部位に他のアミノ酸残基を導入することにより、温度感受性変異を有する新たなリプレッサー蛋白が得られると考えられる。
【００１９】
そこで、まずラクトースリプレッサー蛋白の３００番目のアミノ酸をコードする遺伝子の位置に１８種類のアミノ酸残基をコードする遺伝子を導入した変異型lacI遺伝子をIn vitro mutagenesis法で作製し、温度感受性変異の有無について検討した。その結果、この部位では他のアミノ酸残基、特にフェニルアラニンまたはプロリン残基に変換されたものが温度感受性変異の性質を示した。
【００２０】
本願発明に係る単離されたリプレッサー蛋白の温度感受性変異部位、即ちラクトースリプレッサー蛋白の９４、２４１、２６５及び３００番目のアミノ酸残基は蛋白の高次構造を保つうえで重要な部位であることが明らかになった。従って、これらの部位に上記に記載したように他のアミノ酸を導入することで温度感受性変異を導入できる。以下の実施例では実際に蛋白の生産を検討することで、本発明に係る温度感受性変異を有するリプレッサー遺伝子を用いて目的の遺伝子発現の制御ができることを示した。
【００２１】
本発明に関連するラクトースリプレッサー蛋白のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を配列番号：２０示す。このアミノ酸配列において、９４位のXaa がVal であり、２４１位のXaa がAla であり、２６５位のXaa がGly であり、そして３００位のXaa がSer である場合が、野生型のラクトースリプレッサー蛋白のアミノ酸配列を示す。本発明の１つの態様によれば、９４位のXaa がMet であり、他の態様によれば２４１位のXaa がThr であり、他の態様によれば２６５位のXaa がAsp であり、そして他の態様によれば３００位のXaa がAsn, Phe又はPro である。
【００２２】
前記のごとく９４位、２４１位、２６５位及び３００位のいずれか１つのアミノ酸が変異したものの他に、これらのアミノ酸部位の内の２ケ所が変異したもの、すなわち９４位と２４１位、９４位と２６５位、および９４位と３００位が変異したもの、前記アミノ酸部位の内３ケ所が変異したもの、すなわち９４位と２４１位と２６５位が変異したもの、９４位と２４１位と３００位が変異したもの、および２４１位と２６５位と３００位が変異したもの、並びに前記のアミノ酸のすべての部位、すなわち、９４位と２４１位と２６５位と３００位が変異したラクトースリプレッサー蛋白質も温度感受性を有することが考えられる。
【００２３】
３００位のアミノ酸としては、野生型のアミノ酸セリンがアスパラギン、フェニルアラニン又はプロリンに変化したものが挙げられることから明らかなごとく、変異部位において野生型のアミノ酸に代るアミノ酸は必ずしも１種類ではない。すなわち、２６５位の野生型のアミノ酸グリシンに代るアミノ酸としてアスパラギン酸が挙げられ、２４１位の野生型のアミノ酸アラニンに代るアミノ酸としてスレオニンが挙げられる。また９４位の野生型のアミノ酸バリンに代るアミノ酸としてメチオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
すなわち、３００位のアミノ酸の置換について詳細に記載するのと同様にして、２６５位、２４１位及び９４位についても、置換すべきアミノ酸を決定することができる。すなわち、これらの部位の野生型のアミノ酸を他のアミノ酸に変換するため部位特異的変異処理を行い、上記の部位のいずれかに変異を有するリプレッサー蛋白をコードするDNA を合成することができる。次にこれを、３００位のアミノ酸の変異について実施例６に記載した方法と同様にして、各部位について、ラクトースリプレッサーを温度感受性にするアミノ酸に置換することができる。
【００２５】
本発明はまた、前記種々の温度感受性ラクトースリプレッサー蛋白をコードする遺伝子に関する。この遺伝子には、前記の種々のラクトースリプレッサー蛋白質のアミノ酸配列をコードしており、遺伝子コドンの縮重により種々の塩基配列を有するものが含まれる。これらの遺伝子は、アミノ酸配列に基いて設計された塩基配列を有するように全合成することもでき、また、変異させようとする所定のアミノ酸部位において野生型のアミノ酸、又は目的とするアミノ酸以外の他のアミノ酸をコードしているDNA を部位特異的変異を行うことによっても得られる。複数の場所に変異を有するラクトースリプレッサー蛋白をコードする遺伝子は、目的とするアミノ酸配列に基き全合成することができ、あるいは前記の部位特異的変異を行うことによっても得られる。
【００２６】
本発明はまた、温度感受性ラクトースリプレッサー蛋白を用いて、目的とする蛋白をコードする遺伝子（目的遺伝子）の発現を制御する方法を提供する。この方法は、温度感受性ラクトースリプレッサー遺伝子を、ラクトースオペレーター遺伝子領域に連結された目的遺伝子とを同一の細胞内に存在せしめ、培養温度を調整することにより行う。前記のリプレッサー遺伝子と目的遺伝子とは同一の遺伝物質上にあってもよく、又は異る遺伝子上にあってもよい。
【００２７】
例えばリプレッサー遺伝子と目的遺伝子とが共に染色体上に存在してもよく、目的遺伝子が染色体上に存在し、リプレッサー遺伝子が染色体外遺伝子上に存在してもよく、また、リプレッサー遺伝子及び目的遺伝子が共に染色体外遺伝子に存在してもよい。また、目的遺伝子とリプレッサー遺伝子が異る染色体外遺伝子上に存在していてもよい。ここで染色体外遺伝子とは、自己複製可能なプラスミド、ファージ、ウイルス等を意味する。
【００２８】
本発明の温度感受性ラクトースリプレッサー蛋白は、３０℃以下の培養温度、例えば２０℃〜３０℃においてはラクトースオペレーターに連結された目的遺伝子の発現を抑制するが、温度、例えば３５℃以上、例えば３７℃以上の培養温度においては、ラクトースオペレーターに連結された目的遺伝子の発現を抑制しない。従って、３０℃又はそれ以下の温度において宿主細胞を培養し、宿主細胞を増殖させ、培養温度を３５℃以上、例えば３７℃に上昇せしめることにより目的遺伝子を発現させることができる。
【００２９】
本発明の方法に用いる宿主としては、遺伝子組換法によって目的遺伝子を発現させるために常用されている任意の細胞を用いることができる。例えば、原核細胞、例えば細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli) 、バチルス (Bacillus) 属細菌、例えばバチルス・ブレビス(Bacillus brevis) 、等を用いることができ、さらに真核細胞、例えば単細胞性真核細胞、例えば酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces) 属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー (Saccharomyces cerevisiae) 等、アルコール資化酵母、例えばピキア−パストリス(Pichia pastoris) やハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、さらには糸状菌、例えばアスペルギルス(Aspergillus) 属真菌、等が使用される。
【００３０】
さらに、高等真核細胞、例えば動物細胞、例えばCOS 細胞、CHO 細胞 (チャイニーズハムスター卵巣細胞) 、BHK 細胞 (ベイビーハムスターキドニー細胞) 等が使用され、さらに昆虫細胞、例えばSF9 細胞等が使用される。
後述の実施例ではラクトースプロモーターを用いた例を挙げているが、それ以外の適当なプロモーター領域遺伝子の下流にラクトースオペレーター領域遺伝子を組み込んだ発現ベクターやクローニングベクター（例えば、プラスミド、ファージ等）を用いて目的の遺伝子発現をコンロトールする系にも本発明に係るリプレッサー遺伝子は適用できる。ラクトースプロモーター以外の適当なプロモーター領域としては、特に限定されるものではないが、tac, trc, lacUV5等が挙げられる。
【００３１】
本発明によれば、遺伝子組換えにより製造し得るあらゆる蛋白又はペプチドを製造することができ、これらの例として、例えば、生理活性ペプチド、例えばインシュリン、成長ホルモン、利尿ペプチド (特にＣタイプナトリウム性利尿ペプチド；CNP)、カルシトニン、副甲状腺ホルモン(PTH1-34, PTH1-84)等、生理活性蛋白、例えば細胞分化増殖因子、細胞増殖抑制因子、さらに生理的に重要である酵素類等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係る温度感受性変異を有するラクトースリプレッサー蛋白遺伝子はプラスミド又は宿主染色体に組み込んで目的遺伝子の発現制御を行うことが可能であり、後述の実施例ではプラスミドについて詳述する。
よって、本発明に係る温度感受性変異を有するラクトースリプレッサー遺伝子を用いて遺伝子発現の制御を行うことにより高価な誘導物質であるIPTG等を形質転換細胞の培養培地中に添加することなく、目的遺伝子のクローニングや発現研究、更には目的蛋白の大量生産系に適用できるため、本発明は非常に産業上有用である。
【００３３】
【実施例】
以下に、詳細な実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１．大腸菌Ｗ３１１０由来のラクトースリプレッサー変異株の作製
温度感受性変異を有する新規なリプレッサー遺伝子を単離するためには、宿主細胞がリプレッサー変異株である必要がある。本発明においては特に温度感受性変異を有する新規なリプレッサーとしてラクトースリプレッサーに着目した。温度感受性変異を有するラクトースリプレッサー遺伝子（lac I 遺伝子）を単離するためには、宿主細胞がラクトースリプレッサー変異株である必要がある。
【００３４】
そこで、まずラクトースリプレッサー変異株の作製を行った。ラクトースリプレッサーが変異すれば細胞の表現型はいわゆるβ- ガラクトシダーゼが構成的な発現（constitutive phenotype）になることが知られ、そのような変異株を単離する方法としてフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いたスクリーニング法が知られている（ J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Laboratory Manual  pp.131-134, Cold Spring Harbor Laboratory 1992）。
【００３５】
この方法に従いフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを炭素原とした寒天培地に親株Ｗ３１１０（本菌株はATCC14948 より入手できる）を拡げ、３７℃で２日間培養した。培養後生じたコロニーを単離し、β- ガラクトシダーゼが構成的な発現を示すラクトースリプレッサー変異株であるMYW3110 を作製した。
【００３６】
実施例２．温度感受性変異のラクトースリプレッサー遺伝子の単離
プラスミドｐＭＣ９は、大腸菌Ｙ１０８９株 (Huynh, T. V. et al. (1985) DNA Cloning, vol 1, IRL Press Limited, Oxford, England. pp.56-110；入手先InVitrogen (カタログ番号789-00) に存在するpBR322由来のプラスミドである。
【００３７】
10μｇのpMC9を50mMリン酸バッファー(pH7.0) 、100mM NaCl、2mM EDTA及び1Mヒドロキシルアミンを含む１ ml の溶液に加え、65℃、30分反応を行った。その後、反応液を5 リッターのTE（10mM Tris HCl pH8.0, 1 mM EDTA）に対して透析を行った。透析後、常法に従いエタノール沈殿をおこない、エタノール沈殿を20μｌのTEに溶かした。この溶液4 μｌを用い、常法に従い塩化カルシウム法でMYW3110 に形質転換を行った。
【００３８】
形質転換株を、40μｇ/ mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下X-gal ) 及び50μｇ / ml のアンピシリンを含むＬ−寒天培地（ポリペプトン10ｇ、NaCl  5 ｇ、酵母エキス5g及び寒天15g をイオン交換水１リッター中に含む）のシャーレに拡げ、３８℃で一夜培養を行った。形質転換株の中でこの培地上で青色に呈色しているコロニーを選択し、上記寒天培地２枚にコロニーを塗布し、３０℃及び３８℃で一夜培養を行った。
【００３９】
その結果、３０℃では白色、３８℃では青色に呈色した形質転換株が７株得られた。これらの温度感受性変異が lac I  遺伝子上に起きていることを確認するため、常法に従いアルカリ変性法により形質転換株からプラスミドを単離し、再度MYW3110 株に形質転換を行い、同様の表現系を示すことを確認し、プラスミドの名前をpMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 及びpMC9-24 と命名した。
【００４０】
実施例３．変異部位の決定
上記のpMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 及びpMC9-24 のプラスミドのlac I 遺伝子上の変異部位を決定するために以下の実験を行った。lac I 遺伝子上の変異部位を決定するため, 上記のプラスミドを超遠心法で分離精製し、化学合成したプライマーを用い、Ｔ７Sequencing TM キット（Pharmacia 社）を使用して塩基配列を決定した。プライマーとして下記の20mer を用いた。
【００４１】
【化１】
0003723240.tif 000002
【００４２】
プライマー１はlac I 遺伝子の翻訳開始コドンのGTG (initiation コドン）のG を塩基番号１として183ー200 塩基番号に相当し、プライマー２は同じく448ー465 塩基番号に相当し、プライマー３は同じく720ー741 塩基番号に相当し、プライマー４は同じく224ー241 塩基番号に相当し、プライマー５は同じく483ー501 塩基番号に相当し、プライマー６は同じく757ー774 塩基番号に相当し、及びプライマー７は翻訳開始コドン上流の-72  -  -56 塩基番号に相当する。アッパープライマー(upper primer)としてプライマー１−３および７、ローワープライマー(lower primer)としてプライマー４−６を使用した。単離した各遺伝子のＤＮＡ配列及び当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列表１〜１２に示す。
【００４３】
J. H. Miller著（ A Short Course in Bacterial Genetics, Handbook  Section 16, Cold Spring Harbor Laboratory 1992 ）に示された野生型lac I 遺伝子の塩基配列と我々が得た変異型lac I 遺伝子を比較したところ、表１に示すようにpMC9-1,pMC9-17及びpMC9-24 では３００番目のアミノ酸セリンをコードするAGC がアスパラギンをコードするAAC に変異し、pMC9-16 及びpMC9-22 では241 番目のアミノ酸アラニンをコードするGCG がスレオニンをコードするACG に変異し、pMC9-2では265 番目のアミノ酸グリシンをコードするGGT がアスパラギン酸をコードするGAT に変異し、またpMC9-6では94番目のアミノ酸バリンをコードするGTG がメチオニンをコードするATG に変異していた。
【００４４】
【表１】
0003723240.tif 000003
【００４５】
ラクトースリプレッサーの様々な変異株についてはJ. H. MillerらによりJ. M. Biol. (1990) Vol 212, pp. 295-318 に報告されているが、本発明において単離された変異部位は温度感受性変異として新規な変異部位である。ラクトースリプレッサーは２つの機能をもったドメイン構造、すなわちＮ末端側はオペレーターDNA 領域と結合し、Ｃ末端側は４量体の形成に関与すると同時に、誘導物質の結合に必要な構造を持つことが知られている。
【００４６】
本発明に係るリプレッサー遺伝子ではラクトースリプレッサー蛋白の94、241、265及び300 番目のアミノ酸残基をコードする遺伝子に変異が起きているが、この領域はＣ末端側のドメインに相当している。従って、これらの変異は高温において４量体形成が出来なくなったか、あるいは誘導物質が結合した時のような構造変化が生じている可能性が強い。
以下に、今回単離したlac I 遺伝子変異の中で、温度感受性変異として優れた性質をもつpMC9-1、pMC9-2及びpMC9-16 を用いて検討を行った。
【００４７】
実施例４．温度感受性変異ラクトースリプレッサーと培養温度の関係
上記実施例３では、培養温度として３０℃を低温、３８℃を高温としてラクトースリプレッサー温度感受性変異の性質を調べたが、何度以上で遺伝子発現が起こるのかは形質転換細胞の培養条件を決定する上で重要と考えられる。そこで３０℃で培養した形質転換細胞を種培養として、次に培養温度を３５、３７、４０、４２または４５℃に上げて宿主染色体上のβーガラクトシダーゼ活性を指標に何度以上で遺伝子発現が起こるのかを検討した。
【００４８】
大腸菌ＭＹＷ３１１０／pMC9-1、ＭＹＷ３１１０／pMC9-2及びＭＹＷ３１１０／pMC9-16 をアンピシリン50μｇ / ml を含むＬ−培地３mlに接種し、３０℃一夜培養した。この培養液のOD660 値を測定し、OD660 x 液量(ml)が0.5 になる分量の培養液を、アンピシリン50μｇ/ mlを含む２mlのＬ培地に接種して３０、３５、３７、４０、４２または４５℃で３時間培養を行った。
【００４９】
発現したβーガラクトシダーゼ活性をONPG (Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド) を基質としたMiller等の方法（Experiment in Molecular Genetics, pp. 352-355, Cold Spring Harbor Laboratory 1972 ）に従い測定した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＭＹＷ３１１０／pMC9-1、ＭＹＷ３１１０／pMC9-2、及びＭＹＷ３１１０／pMC9-16 は３０℃ではβーガラクトシダーゼ活性はほとんどなく、遺伝子発現は抑えられ、３５℃乃至３７℃以上の温度において遺伝子発現が起きていることがわかる。
【００５０】
遺伝子発現が起こる温度、即ちラクトースリプレッサーが温度感受性変異により機能しなくなる温度はＭＹＷ３１１０／pMC9-1、およびＭＹＷ３１１０／pMC9-2では３５℃以上、ＭＹＷ３１１０／pMC9-16 では３７℃以上であれば十分であることが明らかになった。さらに、いずれの形質転換細胞も培養温度が４０℃の時、最大の遺伝子発現の誘導を起こしていた。従って、通常生育が一番良いとされ、実験または大量培養に用いられている３７℃で、これらの温度感受性変異は十分に遺伝子発現の制御に使用できることが明らかになった。
【００５１】
実施例５．有用融合蛋白の生産への温度感受性変異のラクトースリプレッサ遺伝子を利用した発現の制御
上記実施例４は温度感受性変異のラクトースリプレッサー遺伝子を利用した宿主染色体上のβーガラクトシダーゼ遺伝子の発現制御に関するものであるが、次に本発明のもう１つの目的である当該遺伝子を用いた遺伝子発現方法であって形質転換細胞の培養温度を調整することにより目的の遺伝子発現方法について検討した。
【００５２】
即ち、本発明者等はラクトースオペロンのプロモーター／オペレーター領域を発現制御遺伝子領域としてもち、その下流にβーガラクトシダーゼ誘導体と目的蛋白の例としてヒトカルシトニン前駆体からなる融合蛋白コードする遺伝子をもつ発現プラスミドの融合蛋白の発現制御にこの温度感受性変異をもつラクトースリプレッサー遺伝子が利用できるかどうかの検討を行った。
【００５３】
まずpMC9-1をEcoRI で切断し、1.7kb の温度感受性変異のラクトースリプレッサー遺伝子領域を単離し、pMW119 (pSC101由来の複製開始点をもつ低コピープラスミド、ニッポンジーン社製）のEcoRI 部位に常法に従い挿入し、pYO1を作製した（図２）。これと同操作をpMC9, pMC9-2及びpMC9-16 についても行い、pYOW, pYO2及びpYO16 を作製した。
【００５４】
これらのプラスミドを有するＭＹＷ３１１０に、大腸菌由来のβーガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシトニン前駆体の融合蛋白をラクトースプロモーター／オペレーター(lacPO) 下流にコードするプラスミドpG97S4DhCT[GRRR]を形質転換し、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYOW、ＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO1、ＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO2、及びＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO16 と称する形質転換株を得た。
【００５５】
これらの菌株を、アンピシリン50μｇ / ml 及びテトラサイクリン10μｇ / ml を含むＬ−培地で３０℃一夜培養後、同じ培地３mlに５％量接種した試験管を２本用意し、一方は３７℃でもう一方は３０℃で１５時間培養を行った。野生型ラクトースリプレッサー遺伝子をもつMYW3110 ／pG97S4DhCT[GRRR], pYOWは、最終濃度が5mM になるようにIPTGを培地に添加し、発現の誘導を行った。培養後、培養液を遠心し、得られた菌体について常法に従い、SDS-１６％PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動) をおこない培養温度と上記融合蛋白の発現の関係について検討した。その結果を図３に示す。
【００５６】
図３から明らかなように野生型ラクトースリプレッサー遺伝子を有するＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYOWは、IPTG添加したときのみに融合蛋白を発現している。変異型ラクトースリプレッサー遺伝子を有するＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO1、ＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO2、及びＭＹＷ３１１０／pG97S4DhCT[GRRR], pYO16 では、３０℃では融合蛋白を発現せず、３７℃で培養した場合には、野生型ラクトースリプレッサー遺伝子を有する菌株をIPTGで誘導して発現させた融合蛋白の量に匹敵する融合蛋白を発現していることが明らかになった。
【００５７】
従って、ラクトースオペロンのプロモーター／オペレーター領域を発現制御遺伝子領域としてもち、その下流にβーガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシトニン前駆体からなる融合蛋白コードする遺伝子をもつ発現プラスミドの融合蛋白の発現制御にこの温度感受性変異をもつラクトースリプレッサー遺伝子が利用でき、温度感受性変異のラクトースリプレッサー遺伝子を用いた発現制御が有用ポリペプチドの発現（生産）の制御に十分利用できることが明らかになった。
【００５８】
よって、本実施例に限らず、本発明に係る温度感受性変異を有するラクトースリプレッサー遺伝子はラクトースオペレーター領域遺伝子とラクトースリプレッサー遺伝子の組み合わせで遺伝子発現を制御する系において用いることができる。
【００５９】
実施例６．変異部位のアミノ酸置換が温度感受性変異に及ぼす影響
本発明者がラクトースリプレッサーの温度感受性変異部位として同定した９４、２４１、２６５及び３００番目のアミノ酸の位置はリプレッサー蛋白の構造を保つ上で重要な位置と考えられる。この位置に実施例３で単離した変異型のアミノ酸以外のアミノ酸と置換した場合、そのアミノ酸の種類によっては温度感受性変異の性質が現われることが十分に考えられる。
【００６０】
そこで、３００番目のアミノ酸をコードする遺伝子を変換し、様々なアミノ酸に置換した変異型のラクトースリプレッサー蛋白質を発現する遺伝子を１８種類作製して、その性質の解析を行なった。すなわち、PCR （ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた部位特異的変異を導入した。まず、lac I 遺伝子の903 番目の塩基配列のＧをＣに変えることでアミノ酸配列を変えることなく新しくlac I 遺伝子にSalI制限酵素部位を導入したpMC9ーSalIを以下のように作製した。
【００６１】
５’側にSalI切断部位ができるようにデザインしたプライマー8 及び9 を化学合成し、プライマー9 とプライマー10を組み合わせ、鋳型DNA としてpMC9-1を用いてPCR を行った（DNA 断片A)。一方、プライマー8 はプライマー11と組み合わせ鋳型DNA としてpMC9-1を用いてPCR を行った（DNA 断片B)。
【００６２】
【化２】
0003723240.tif 000004
【００６３】
PCR は１μmol のプライマー、１μg 鋳型DNA 、50mM KCl、10mM Tris-HCl, pH8.3、1.5mM MgCl2 、0.01% ゼラチン、200 μＭのdNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP の混合物）を含む50μl の反応液に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼを添加し、94℃,1分、72℃,2分、55℃,2分のPCR を30サイクルの条件で行った。得られたDNA 断片A を制限酵素Mlu I 及びSalIで切断し、得られたDNA 断片B は制限酵素SalI及びHind IIIで切断した。
【００６４】
得られたDNA 断片を、pMC9をMlu I 及びHind IIIで切断して得られる4.7Kb の断片と混合後、T4 DNAリガーゼにより連結し、常法に従いMYW3110 に形質転換を行い、５０μｇ / ml のアンピシリンを含むＬ−寒天培地に拡げ３０℃一夜培養しMYW3110 / pMC9ーSalIを作製した（図４）。
次に、３００番目のアミノ酸の位置に変異を導入するためプライマー12からプライマー19までを合成し、プライマー10と組み合わせ、pMC9を鋳型DNA として同様にPCR を行った。
【００６５】
【化３】
0003723240.tif 000005
【００６６】
PCR で得られた各DNA 断片をBssH II とSalIで切断し、0.15kbの断片を回収後、先に作製したpMC9ーSalIの1.0kb SalI-BamHI断片及び4.9kb BamHI-BssHII断片と混合し、T4 DNAリガーゼを用いて連結し、常法に従いMYW3110 に形質転換し、５０μｇ / ml のアンピシリンを含むＬ−寒天培地に拡げ３０℃一夜培養した。得られた形質転換株からプラスミド(pMC9-300AからpMC9-300Y,  図５参照) を単離し、実施例３で示した方法によりDNA 塩基配列を決定し置換部位に正しく目的とするアミノ酸に対応するコドンが導入されていることを確認した。
【００６７】
これら作製した株を前述のＸ−gal とアンピシリンを含む寒天培地に塗布し、３０℃及び３７℃で一夜培養を行ないコロニーの発色を調べた。その結果、３００番目のアミノ酸にフェニルアラニン及びプロリン残基が導入された変異型lac I 遺伝子をもつそれぞれMYW3110 / pMC9-300F 、及びMYW3110 / pMC9-300P の菌株ではコロニーが３０℃では白色、３７℃では青色を呈し温度感受性であることが明らかになった。
【００６８】
従って、実施例３で示したアスパラギン以外のアミノ酸であるフェニルアラニン及びプロリンも温度感受性変異であることが明らかになり、この部位のアミノ酸置換により新しい温度感受性変異が得られることが証明できた。
よって、上記の結果から本実施例以外、即ちラクトースリプレッサーの３００番目以外の位置である９４、２４１及び２６５番目のアミノ酸残基の部位又はこれら変異部位を２以上有する場合においても、今回判明した変異に係るアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を導入することで望ましい温度感受性を示ラクトースリプレッサー蛋白が得られるのでそのようなリプレッサー蛋白も本発明に含まれる。また、そのようなラクトースリプレッサー蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を用いた遺伝子発現の制御方法及び当該制御方法を用いた遺伝子の発現方法も本発明に含まれる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明に係る温度感受性変異を有するリプレッサー遺伝子を用いて遺伝子発現の制御を行うことにより高価な誘導物質であるIPTG等を形質転換細胞の培養培地中に添加することなく、目的遺伝子のクローニングや発現研究、更には目的蛋白の大量生産系に適用できるため非常に産業上有用である。
【００７０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
GCAACGCCAA TCAGCAAC                                                 17
【００７１】
配列番号：２
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
GGGTGTCTGG TCAGAGAC                                                 18
【００７２】
配列番号：３
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CA                                            22
【００７３】
配列番号：４
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CGCCGTCGCA AATTGTCG                                                 18
【００７４】
配列番号：５
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CTCCCATGAA GACGGTACG                                                19
【００７５】
配列番号：６
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
GCAATGCGCG CCATTACC                                                 18
【００７６】
配列番号：７
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CATCGAATGG CGCAAAA                                                  17
【００７７】
配列番号：８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
GGGGCAAACC AACGTCGACC GCTTGCTGCA                                    30
【００７８】
配列番号：９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
TGCAGCAAGC GGTCGACGTT GGTTTGCCCC                                    30
【００７９】
配列番号：１０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
GGGAATAAGG GCGACACGGA                                               20
【００８０】
配列番号：１１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
CACGGTGCCT GACTGCGTT                                                20
【００８１】
配列番号：１２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CACVGGTTTG CCCC                                          24
【００８２】
配列番号：１３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CCTBGGTTTG CCCC                                          24
【００８３】
配列番号：１４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CCAHGGTTTG CCCC                                          24
【００８４】
配列番号：１５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CAGBGGTTTG CCCC                                          24
【００８５】
配列番号：１６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CGTVGGTTTG CCCC                                          24
【００８６】
配列番号：１７
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CGAAGGTTTG CCCC                                          24
【００８７】
配列番号：１８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CCCAGGTTTG CCCC                                          24
【００８８】
配列番号：１９
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：合成 DNA
配列
AAGCGGTCGA CTATGGTTTG CCCC                                          24
【００８９】
配列番号：２０
配列の長さ：１０８３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：
配列の特徴：ラクトースリプレッサー蛋白のアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列。
９４位のXaa はVal 又はMet であり、２４１位のXaa はAla 又はThr であり、２６５位のXaa はGly 又はAsp であり、３００位のXaa はSer, Asn, Phe 又はPro である。
0003723240.tif 000006
0003723240.tif 000007
0003723240.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、培養温度がβ−ガラクトシダーゼ生産に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、プラスミドpMC9-1とpMW119とからのプラスミドpYO1の作製を示す図である。
【図３】図３は、蛋白質の生産に及ぼす培養温度及び誘導剤の効果を示す電気泳動図であって、図面に代る写真である。
【図４】図４は、プラスミドpMC9-SalI の作製を示す図である。
【図５】図５は、３００番目のアミノ酸の部位特異的変異を含む種々のプラスミドの作製を示す図である。
【図１】
0003723240.tif 000009
【図２】
0003723240.tif 000010
【図３】
0003723240.tif 000011
【図４】
0003723240.tif 000012
【図５】
0003723240.tif 000013