(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に固定され生体分子が吸着すると色が変化する貴金属誘電体コンポジット微粒子をプローブで修飾した後、この微粒子に被検体である生体分子を含む試料を接触させて前記プローブに生体分子を吸着させる吸着工程と、この吸着を光学的に確認する確認工程と、生体分子が吸着した前記プローブを有する微粒子を基板から剥離する剥離工程と、剥離した微粒子から生体分子を回収する回収工程とを有し、前記確認工程では、微粒子に照射した光の反射光における吸収極大波長の変化を求めて吸着量を確認することを特徴とする生体分子回収方法。
【請求項２】
前記剥離工程では、超音波を前記基板に照射する、パルス状のレーザ光を前記基板に照射する、スクレーパまたは粘着テープを用いて外すの少なくともいずれかを実行することを特徴とする請求項１に記載の生体分子回収方法。
【請求項３】
前記回収工程では、剥離した前記微粒子を遠心分離するかフィルターを用いて回収するかすることを特徴とする請求項１に記載の生体分子回収方法。
【請求項４】
前記微粒子に予め超常磁性体が含まれているときは、前記回収工程では剥離した前記微粒子を磁石で集めることを特徴とする請求項１に記載の生体分子回収方法。
【請求項５】
前記微粒子が予め電荷を有するときは、前記回収工程では、剥離した前記微粒子を静電的に回収することを特徴とする請求項１に記載の生体分子回収方法。
【請求項６】
前記生体分子の回収率を測定する測定工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の生体分子回収方法。
【請求項７】
前記測定工程では、前記微粒子の光吸収と光散乱のいずれかを測定することを特徴とする請求項６に記載の生体分子回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質、核酸、抗体、ホルモン、細胞等の生体分子および生体組織の相互作用を高感度で検出し、この生体分子や生体組織を高効率で回収する方法、装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術として、特開平１１−３２６１９３号に、基板表面に形成された金微粒子の光学特性を利用した生体分子吸着測定装置について記載されている。これは液体中の生体分子を固相面に選択的に捕捉し、非標識で検出するものである。固相面であるセンサ表面は、図１１（Ａ）に示す様に、厚さ20nmの金薄膜１５１がコートされた基板上１５２に、厚さ20nmの金１５３で被覆された粒径100nmの高分子微粒子１５４が形成されている微細構造から構成されている。この様な構造は図１１（Ｂ）に示す様に、顕著な吸収特性を有し、吸収極大波長は微粒子近傍の屈折率に依存して変化する。したがって、微粒子表面を抗体等１５７で修飾しておき、それに対する抗原１５８が選択的に吸着すると、吸着開始時１５９から吸収極大波長が変化する。即ち、吸光度のピーク波長が１５５から１５６にシフトするため、吸収極大波長を測定することによって吸着過程をモニタすることができる。
【０００３】
別な従来の精製方法としてカラムクロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる（「タンパク質精製法―理論と実際」ロバートK.スコープス著シュプリンガー・フェアラーク東京）。
イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ジエチルアミノエチルセルロースやカルボキシメチルセルロースから作られたイオン交換体表面に生体分子を静電的に吸着させ、対象物以外を洗い流す。その後、ｐＨもしくは塩濃度を変えた緩衝液をカラムに流すことにより生体分子が溶出および回収できる。より選択性高く生体分子をカラム表面に吸着させる場合には、抗体が固相化された免疫吸着体カラムを用い、ｐＨもしくは塩濃度を変えた緩衝液をカラムに流すことにより生体分子を溶出および回収できる。
【０００４】
別の従来の方法として、USP6,093,370に記載されている通り、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションしたＤＮＡフラグメントを、レーザ照射による局所的加熱により基板から剥離し回収する技術が挙げられる。
【０００５】
また、別の従来の方法としては、表面プラズモン共鳴センサの応用が挙げられる（「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法―BIACOREを中心に」永田和宏・半田宏共著シュプリンガー・フェアラーク東京）。この原理を図２に示す。表面プラズモン共鳴センサは金コート２１されたプリズム２２から構成されている。プリズム２２の表面が静電的もしくは抗体２３等により修飾されてある場合、プリズム表面に形成された微細流路２４を介して導入された生体分子２５は捕捉される。プリズム２２の下部から照射された単色光２６の反射率は照射角度およびプリズム表面における屈折率に依存する。反射率の照射角度依存性はセンサグラム２７として知られている。分子の吸着により表面の屈折率が変化するとセンサグラム２８も変化するため、分子吸着をモニタできる。吸着の確認後、ｐＨもしくは塩濃度を変えた緩衝液を流すことにより生体分子を溶出できる。コンピュータ２９で制御されたポンプ３０、バルブ３１等から微細流路を構成することにより、生体分子を任意の生体分子回収容器３２に回収できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような、小容量カラムを用いたり、プリズム上の微細流路構成を工夫する方法では、試料の量が少ない際、生体分子を回収することが、ある程度可能である。
【０００７】
しかし、溶出後生体分子が流路表面で物理吸着することによる損失は避けられない。具体例として、試料導入が微小流路によりなされる生体分子相互作用センサにおいては、100fm程度の試料を質量分析計に持ち込む場合、一時間後には半分の試料が失われてしまう。また、回収試料をインジェクション・ニードルに吸引するとさらに失われてしまう（「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法―BIACOREを中心に」永田和宏・半田宏共著シュプリンガー・フェアラーク東京）。
【０００８】
従って、本発明の目的は、生体分子等の回収を高効率で行うことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するための方法を図１に示す。静電的もしくは抗体１１で免疫的に表面修飾された微粒子１２を基板１３上に形成し、生体分子１４を捕捉する（図１（A））。微粒子表面で生体分子が吸着された後に微粒子１５そのものを基板から剥離し（図１（Ｂ））、微粒子の物性を用いることにより生体分子を溶出することなく微粒子と共に回収する（図１（Ｃ））ものである。微粒子の物性としては、磁気特性、静電特性、比重等が挙げられる。この微粒子の物性を用いて回収する具体的手法については後述する。生体分子自体の物性に基づき回収するのとは異なり、より幅広い回収方法を用いることができる。
【００１０】
また、微粒子表面に吸着した生体分子をモニタする方法として、発明者らが最近発明した方法により調製された貴金属・誘電体コンポジット微粒子の光学特性を利用するものである（図３）。表面に生体分子が吸着すると色が変わる貴金属・誘電体コンポジット微粒子を基板の上に形成する。ここで、本願明細書では、貴金属誘電体コンポジット微粒子とは、基板上に形成された粒径10nmから100μmの誘電体微粒子に、厚さ2nmから40nmの貴金属が形成されたものをいう。まず、厚さ10nmから40nmの金薄膜４１が蒸着された基板４２の上に粒径30nmから300nmの誘電体微粒子４３を一層吸着する。さらに例えば金のような貴金属を、厚さ10nmから40nm真空蒸着し、誘電体微粒子４３の上に帽子状の貴金属微粒子４４、即ち上面に貴金属が形成された微粒子４３を形成する。貴金属微粒子４４の表面をＤＮＡ、抗体、受容体、酵素等のプローブ生体分子４５で修飾する。そして、被検体生体分子４６を含む試料を導入した結果、特異的結合が生じると、基板全体の反射スペクトル４７が４８に変化するため、被検体生体分子４６の存在を光学的にモニタすることができる。吸着開始時４９から反射スペクトルの吸収極大波長変化することがわかる（図３（B））。この吸収極大波長変化の検出は、特開平１１−３２６１９３号に記された方法と同様にして行う。即ち、光源２２０からの光を基板４２に照射し、その反射光をディテクター２２１によって検出する。なお、この公知例は、吸着、即ち生体分子の相互作用を検出するものであり、生体分子を回収するものではない。誘電体微粒子と基板との結合は比較的弱く設定されていることから、測定後に生体分子を貴金属・誘電体コンポジット微粒子ごと基板から剥がすことができる（図３（C））。なお、剥がす方法については、後述する。そして、貴金属・誘電体コンポジット微粒子の磁気特性、静電特性、比重等の物性を利用することにより、貴金属・誘電体コンポジット微粒子をほぼ１００％回収することができる。なお、回収の方法についても、後述する。この方法においては生体分子が貴金属・誘電体コンポジット微粒子表面に吸着している限り、生体分子と貴金属・誘電体コンポジット微粒子の回収率と同じであることから、量の測定が容易な貴金属・誘電体コンポジット微粒子をモニタすることによって生体分子の回収率を常に確認することができる。なお、微粒子量の測定方法については、後述する。これに対して、従来の方法の様に液相に溶出された生体分子においては、固相面での再吸着過程を抑制または制御することが困難であり、さらに最終的に回収された試料の定量も容易ではない。したがって、従来の方法においては回収率が５０％以下であり、かつ実際の回収率を数値で表すことが困難であるのに対して、本発明の方式においては、貴金属・誘電体コンポジット微粒子表面に吸着した生体分子を９０％以上の効率で回収でき、実際の回収率も容易に測定できる。回収率の測定方法については、後述する。
【００１１】
上記の説明の通り、本願発明では、以下の構成を有する。貴金属に被覆された高分子もしくは無機誘電体の微粒子を基板上に形成する。貴金属表面における生体分子の特異的結合を光学的に検出し、次に貴金属誘電体コンポジット微粒子を基板から外し、生体分子を回収し、必要に応じて濃縮する。ここで、高分子としてはポリスチレン、デキストラン、スチレン・ブタジエン、ポリビニルトルエン、スチレン・ヂビニルベンゼン、ビニルトルエン・ｔ−ブチルスチレンを用いることができ、また、無機材料としてはシリコン、酸化シリコン、酸化チタンを用いることができる。
【００１２】
続いて、貴金属誘電体コンポジット微粒子の基板からの剥離の方法について説明する。この剥離は、超音波５１により剥がす（図４（A））、またはレーザ照射５２により剥がす（図４（B））、またはスクレーパ５３により機械的に剥がす（図４（C））、または粘着テープ５４で剥がすことによって行われる。超音波により剥離する場合は、例えば、発振周波数を10kHzから100kHz、出力１０Ｗ以上１０００Ｗ以下の超音波照射７６を1ミリ秒から100秒間緩衝液中で基板に対して行う。また、レーザ照射により剥離する場合は、例えば、強度が平方ｃｍあたり1mJから50mJのYAGの基本波もしくはYAGの二倍波もしくはYAGの三倍波を１から１００パルス、または、強度が平方ｃｍあたり1mJから50mJの窒素レーザ光１３１を１から１００パルス、緩衝液中または大気中で貴金属誘電体コンポジット微粒子に照射する、または、1mJから50mJのエキシマ光１４４を１から１００パルス緩衝液中または大気中で照射する。ここで、パルス照射としたのは、生体分子が損傷を受けるおそれがないためである。さらに、スクレーパとして、表面の材質がゴム、ビニール、紙、木製のものを用いると良い。スクレーパで、貴金属誘電体コンポジット微粒子を基板から剥離する際は、緩衝液中または大気中のいずれで行っても良い。また、粘着テープとして、一般的な文房具用のテープを用いる。平坦な金表面に粘着した際、１平方ｃｍあたり100ニュートン以上の力を加えられる物が良い。粘着テープを用いた場合は、大気中で、貴金属誘電体コンポジット微粒子を基板から剥離する。なお、レーザ照射及び機械的に、貴金属誘電体コンポジット微粒子を基板から剥離する場合には、上記の通り、緩衝液中または大気中で行うが、プローブやプローブに吸着する生体分子が乾燥に強い物質である場合には大気中で、乾燥に弱い場合には緩衝液中で行う。
【００１３】
上記のいずれの方法においても、貴金属誘電体コンポジット微粒子を基板から９５％以上の効率で剥離することができた。図１２（Ａ）は、超音波照射により剥離する過程を示す。貴金属誘電体コンポジット微粒子がウエルの底に形成されたものサンプルを三個示し、右端は照射前、中央は照射の中間状態、左端は照射終了後の状態である。貴金属誘電体コンポジット微粒子が剥離するに伴い、貴金属誘電体コンポジット微粒子の吸収による色が失われ、基板の金薄膜による反射が顕著になることがわかる。図１２（Ｂ）では超音波で貴金属誘電体コンポジット微粒子が剥離された試料（左上）と共に、レーザ照射により剥離し基板の金薄膜が露出している様子（左下）、スクレーパにより剥離し基板の金薄膜が露出している様子（右上）、粘着テープにより剥離し基板の金薄膜が露出している様子（右下）を示す。ここでも、超音波をかけた領域、レーザを照射した領域、スクレーパにより剥離した領域、粘着テープにより剥離した領域は、貴金属誘電体コンポジット微粒子が剥離するに伴い、貴金属誘電体コンポジット微粒子の吸収による色が失われ、基板の金薄膜による反射が顕著になることがわかる。
【００１４】
また、それぞれの剥離方法の効果を述べる。超音波による剥離方法の効果として、基板全体から均一に剥離でき、蛋白質等の高分子量生体分子に損傷を与えない照射条件が緩やかであることが挙げられる。レーザ照射による剥離方法の効果として、基板上の任意領域から選択的に剥離することができることが挙げられる。従って、複数種類の生体分子を異なる領域で吸着させた場合、任意の生体分子を容易に回収できる。スクレーパによる剥離方法の効果として、最も簡便であることが挙げられる。粘着テープによる剥離方法の効果として、複数種類の生体分子を異なる領域で吸着させた場合、それぞれの位置関係を保ったまま回収および保存することができることを挙げられる。
【００１５】
このように剥離した段階では、貴金属誘電体コンポジット微粒子は、緩衝液等に分散されている状態か、または大気中にある状態である。
【００１６】
続いて、剥離された貴金属誘電体コンポジット微粒子を回収する方法について説明する。前述の剥離した段階では、貴金属誘電体コンポジット微粒子は緩衝液に分散されているか、または大気中に存在する。回収の段階では、まず、大気中にある場合には、緩衝液に分散される状態にする。即ち、大気中でレーザ照射や機械的剥離を行った場合は、剥離後の貴金属誘電体コンポジット微粒子を緩衝液に移し、また、粘着テープを用いて剥離した場合は、粘着テープごと液体に浸けて粘着テープから貴金属誘電体コンポジット微粒子を剥がす。なお、粘着テープを溶液中で溶かすことによって、結果的に粘着テープから貴金属誘電体コンポジット微粒子を剥がすようにしても良い。このようにして、緩衝液中に分散された貴金属誘電体コンポジット微粒子を準備する。緩衝液中に分散された貴金属誘電体コンポジット微粒子から、貴金属誘電体コンポジット微粒子を回収する。回収する方法として、貴金属誘電体コンポジット微粒子をフィルター６１により回収（図５（A））する、または遠心分離機６２により回収（図５（B））する、または貴金属誘電体コンポジット微粒子に予め超常磁性体を含ませておくことにより磁石６３で回収（図５（C））する、または静電的に電極６４にて回収（図５（D））することが挙げられる。フィルターを用いて回収する場合は、フィルターの穴径を、用いる粒径の直径の８割程度とする。また、遠心分離機６２により回収する場合は、150,000g以上の遠心力で1時間以上遠心する。また、磁石で回収する場合は、1000ガウス以上の表面磁束密度を発生するものを用いる。更に、静電的に電極にて回収する場合は、電極として白金、金を用い、電圧を０．１から２ボルトとする。
【００１７】
それぞれの回収効率は、上記のフィルターの場合９５％以上、遠心分離器を用いる場合９０％以上、磁石の場合９０％以上、電極を用いての分離の場合９０％以上である。
【００１８】
また、それぞれの回収方法の効果を述べる。フィルターによる回収方法の効果として、回収時間が数秒以内と迅速であることが挙げられる。遠心分離器による回収方法の効果として、簡便であることが挙げられる。磁石による回収方法の効果として、迅速であり制御性に優れていることを挙げられる。電極を用いた回収方法の効果として小型化に適していることが挙げられる。
【００１９】
続いて、回収方法の別の方法を説明する。生体分子を最終的に液相に再溶出する場合、その濃度は貴金属・誘電体コンポジット微粒子が分散された溶液の容量に依存する。貴金属・誘電体コンポジット微粒子を液体から回収し、別の液体に再分散させることは容易である。小容量の液体中に再分散してから生体分子を溶出することにより生体分子を実質的に濃縮することができる。図１４に貴金属・誘電体コンポジット微粒子の回収方法を示す。貴金属・誘電体コンポジット微粒子を一時的かつ局所的に保持し、液体を移動させる方法を図１４（Ａ）に示す。貴金属誘電体コンポジット微粒子を予め超磁性にさせておく。そして、超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子の懸濁液１７１を微細流路１７２の中を流し、電磁石１７３により捕捉する。液体のみを電磁石１７３の領域から移動させ、より容量が少ない液体１７４中に超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子を再懸濁する。または図１４（Ｂ）に示す様に、貴金属・誘電体コンポジット微粒子を集め移動させてもよい。容器１７５中の超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子１７６を電磁石１７７で集め、電磁石１７７を容器１７８に移動後、超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子を再懸濁する。容器１７８中の液量は容器１７５中よりも少ないとする。回収の目的に応じて、試料が必要とされる領域に貴金属・誘電体コンポジット微粒子を移動後、必要最低限容量の液体に生体分子を再溶出させることにより、濃縮された状態で試料を再利用できる。溶出の方法は対象となる生体分子の種類に依存するが、pH３以下の10mMグリシンー塩酸緩衝液を用いる、1M以上の高塩濃度塩化ナトリウム溶液を用いる、8Mの塩酸グアニジンの蛋白質変性剤を用いる、50%エチレンゴリコール等の溶剤を用いたりする。なお、従来の方法において試料を高濃度で溶出しようとすると、溶出後における小容量液体のハンドリングの問題および固相面における再吸着による試料の損失問題は避けられない。
【００２０】
以上のようにして、貴金属・誘電体コンポジット微粒子を、緩衝液から回収する。
【００２１】
続いて、微粒子の回収率を測定する方法を説明する。なお、勿論、回収率の測定は、回収率をデータとして得たい場合に行われ、貴金属・誘電体コンポジット微粒子を回収する際、必ず行われる工程ではない。まず測定する方法として、貴金属・誘電体コンポジット微粒子自体の光吸収による測定（図１３（Ａ））、貴金属・誘電体コンポジット微粒子自体の光散乱による測定（図１３（Ｂ））、もしくは蛍光色素を含む貴金属・誘電体コンポジット微粒子を用いて蛍光信号強度から測定（図１３（Ｃ））する方法が挙げられる。貴金属・誘電体コンポジット微粒子自体は近赤外波長領域において顕著な吸収および散乱特性を見せることから、近赤外波長光を照射することが好ましい。図中、１６１は貴金属誘電体コンポジット微粒子の懸濁液、１６２は光源、１６３は照射光、１６４は透過光、１６５は光検出器、１６６は散乱光、１６７は蛍光、１６８はカットオフフィルターである。
【００２２】
また、それぞれの回収率測定方法の効果を述べる。吸収と散乱による回収率測定方法の効果として、簡便であることが挙げられる。蛍光色素を用いることによる回収率測定方法の効果として、高感度であることが挙げられる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
本発明の利用形態の一実施例を図６に示す。ポリリジン７１でコーティングされたシリコン基板７２上に、粒径30nmから100μmのポリスチレン微粒子７３を静電的に吸着させ、次に抗体７４をポリスチレン表面に物理吸着させる。ターゲット分子である抗原７５を含む試料を基板上に流すことにより、抗原７５を微粒子表面で捕捉することができる。次に、発振周波数50kHz、出力１０Ｗの超音波照射７６を水中で５秒間基板に対して行うことにより、ポリスチレン微粒子７３をシリコン基板７２から剥離する。フィルター７７で回収されたポリスチレン微粒子７３は10mMグリシンー塩酸緩衝液（pH3）で処理され、溶出された抗原７５はレーザ照射７８により質量分析計７９等で分析される。
（実施例２）
本発明の利用形態の一実施例を図７に示す。2nm厚のクロム薄膜８１と、50nm厚の金薄膜８２が形成されたガラス基板８３を用意する。３から２０の炭素原子と、アミノ基を有するアルカンチオールを濃度1μMから10mMでエタノールに懸濁する。ガラス基板をアルカンチオール溶液に一昼夜浸透させることにより、金薄膜８２の表面にアルカンチオールの単分子層８４が形成される。次に、カルボジイミド溶液に懸濁されたアビジン蛋白質８５を添加することにより、アビジン蛋白質８５表面のカルボキシル基とアルカンチオール８４のアミノ基間の縮合反応により、アビジン蛋白質８５を基板上に固定化する。次に、ビオチン分子８６でコートされた粒径30nmから100μmのポリスチレン微粒子８７を添加すると、ビオチン８６とアビジン蛋白質８５間の特異的結合により、ポリスチレン微粒子８７が基板上に固定化される。次に、濃度1μg/mlから10mg/mlのアビジン蛋白質溶液を加えることにより、ポリスチレン微粒子８７上のビオチン８６にアビジン蛋白質が結合し、さらにビオチン化ＤＮＡ８８を加えることにより、ビオチン化ＤＮＡ８８をポリスチレン微粒子上に固定化する。蛍光色素８９で修飾された相補的配列を有するＤＮＡ９０を含む試料を流すと、ハイブリダイゼーションにより捕捉される。従って、ＤＮＡチップのように診断に用いることができる。結合をＤＮＡの蛍光色素により確認後、微粒子はスクレーパ９１により機械的に基板からいったん剥がされ、遠心分離９２により回収される。遠心分離器により回収した後、溶出されたＤＮＡ試料を電気泳動にかけ、電気泳動後のバンド幅によってハイブリダイゼーションの選択性の精度を確認することができる。
（実施例３）
本発明の利用形態の一実施例を図８に示す。ＰＭＭＡ製の微細流路内１０１には厚さ20nmの金薄膜１０２がコーティングされており、粒径30nmから300nmのデキストラン製の磁気ビーズ１０３が一層吸着されている。ビーズの上半分は真空蒸着により厚さ10nmから25nmの金が形成されている。この構造体は可視光領域に顕著な吸収スペクトルを有し、吸収極大波長は微粒子表面の屈折率に応じて変化する。したがって、金微粒子表面に成長因子レセプター１０４を固定化しておき、成長因子１０５を含むサンプルを微細流路内１０１に導入すると、成長因子とレセプターの結合を光学的にモニタすることができる。具体的にはファイバーバンドル１０６で金微粒子を照射し、反射光を同軸のファイバーにより分光光度計に導く。成長因子の吸着前と後では、反射スペクトルの吸収極大波長１０７がシフトする（図８（A））。吸着の確認後、強度が平方ｃｍあたり5mJのYAGの二倍波１０８を５バルス金微粒子に照射する。照射により金微粒子が基板から剥離すると同時に、基板の吸収極大波長における吸光度が２以上から（１０９）、0.5以下（１１０）に減少することから、剥離の過程を光学的にモニタできる。剥離した微粒子を微細流路１０１から外に導き、磁石１１１により容易に回収できる（図８（B））。成長因子の生体活性を確認するために成長因子を溶出し、神経細胞等の培養細胞に添加する。
（実施例４）
本発明の利用形態の一実施例を図９に示す。ポリスチレンで作製されたチップ１２１は生体分子吸着部１２２と生体分子回収部１２３から構成される。生体分子吸着部１２２の底部には金薄膜１２４が形成されてあり、上には粒径30nmから300nmのデキストラン製の磁気ビーズ１２５が一層吸着されている。ビーズの上半分には真空蒸着により厚さ10nmから25nmの金が形成されている。この構造体は可視光領域に顕著な吸収スペクトル１２６を有し、吸収極大波長は微粒子表面の屈折率に応じて変化する。したがって、金微粒子表面にレセプター１２７を固定化しておき、ターゲットリガンド１２８を含む試料を添加すると、リガンド１２８とレセプター１２７の結合を光学的にモニタすることができる。生体分子吸着部１２２は複数の領域に分割されており、それぞれの領域内の磁気ビーズは異なるレセプターにより修飾されていることから、複数のターゲットリガンドを同時に検出することができる。例えば、領域Ａ１２９と領域Ｂ１３０にてターゲット分子が吸着するとする。
【００２４】
まず領域Ａを強度が平方ｃｍあたり10mJの窒素レーザ光１３１を１パルス照射して、磁気ビーズを剥離する。ポンプ１３７を用いて磁気ビーズを吸引すると同時に、電磁石Ａ１３２に通電することにより1000ガウスの表面磁束密度を発生させ磁気ビーズを電磁石A１３２の上に集める。
【００２５】
次に、電磁石Ｂ１３３に1000ガウスの表面磁束密度を発生させると同時に電磁石Ａ１３２をoffにすると、磁気ビーズは電磁石Ｂ１３３の上に集まる。緩衝液で磁気ビーズを処理することによりリガンドを溶出し、質量分析計で解析することができる。
【００２６】
次に、領域Ｂ１３０を強度が平方ｃｍあたり10mJの窒素レーザ光１３１を１パルス照射して、領域Ｂ１３０から磁気ビーズを剥離する。ポンプ１３７を用いて磁気ビーズを吸引すると同時に、電磁石Ａ１３２に1000ガウスの表面磁束密度を発生させることにより磁気ビーズを電磁石Ａ１３２の上に集める。次に、電磁石Ｃ１３４に1000ガウスの表面磁束密度を発生させると同時に電磁石Ａ１３２をoffにすると、磁気ビーズは電磁石Ｃ１３４の上に集められる。電磁石Ｃ１３４の近傍に電磁石Ｄ１３５を配置して、電磁石Ｄ１３５に1000ガウスの表面磁束密度を発生させると同時に電磁石Ｃ１３４をoffにすることにより、磁気ビーズを電磁石Ｄ１３５に吸着する。吸着後、電磁石Ｄ１３５をチューブ１３６内移動させ、電磁石Ｄ１３５をoffにすると、磁気ビーズをチューブ１３６内に移すことができる。これら一連の作業により、磁気ビーズ表面で捕捉されたリガンドを損失することなく容易に回収し、次の分析にかけることができる。
（実施例５）
本発明の利用形態の一実施例を図１０に示す。回転軸１４１で保持された直径１センチから３０センチの円盤１４２の上に、上半分が厚さ２０nmの金にコートされた粒径100nmのデキストラン製の磁気ビーズが一層吸着されている。円盤上の微粒子層は複数のリング状領域１４３に分割されており、それぞれの領域内の磁気ビーズは異なるレセプターにより修飾されていることから、複数のターゲットリガンドを同時に検出することができる。円盤１４２を毎分１から５０回転の速さで回転させながら、試料チャンバ１４４内の試料を回転軸領域から流し込む。試料中には表面にペプチドを表示した複数種類のバクテリオファージが含まれており、表面のペプチドとレセプターが結合するとバクテリオファージは捕捉される。次に、円盤１４２の回転数を毎分１００００回転に増速して、強度が平方ｃｍあたり1mJのエキシマ光１４４を１パルス照射してポリスチレン微粒子を剥離する。照射領域は鏡１４５を移動することにより制御する。剥離されたビーズは遠心力により弾き飛ばされ、回収流路１４６に導かれる。流路の奥には電極１４７が一対配置されており、電極１４７に2Vの電圧をかけると、ビーズの電荷によりバクテリオファージをビーズと共に分離することができる。回収されたバクテリオファージを利用することにより、特異的結合能に優れたペプチドを大量生産できる。
（実施例６）
本発明の利用形態の一実施例を図１５に示す。容器１９１は複数のウエル１９２に分割されており、それぞれのウエルには未精製生体試料１９３が含まれている。未精製生体試料１９３を次の工程により自動的に精製する。ロボットにより制御されるピペット１９４を用いて試料をウエルから吸引する。ピペットは精製ブロック１９５に移動され、試料注入口１９６から微細流路１９７に注入される。微細流路１９７の底には厚さ20nmの金でコーティングされた粒径100nmのポリスチレン微粒子１９８が形成されており、精製対象生体分子１９９を選択的に結合する抗体２００により修飾されている。ポンプブロック２０１が精製ブロック１９５とドッキングされ、ポンプ２０２の作用により未精製試料１９３はポリスチレン微粒子１９８近傍に導入される。ポンプ２０２の動作方向を定期的に反転することにより、未精製試料１９３を行き来させることも可能である。抗体２００により未精製試料１９３中の精製対象生体分子１９９が捕捉されると、ポリスチレン微粒子１９８の光学特性が変化する。光ファイバーバンドル２０３によるモニターされる吸収スペクトルの吸収極大波長が長波長側にシフトする。精製対象生体分子１９９の捕捉量が増えるにしたがって、吸収極大波長のシフト量も増大する。吸収極大波長が予め設定された波長２０４に達すると、洗浄液が微細流路１９７に注入され、ポリスチレン微粒子１９７が洗浄される、精製対象生体分子１９３以外の不純物が取り除かれる。洗浄後、ポンプ２０２の動作が停止し、ポンプブロック２０１が精製ブロック１９５から分離される。次に微細流路１９７の下部から、強度が平方ｃｍあたり1mJのYAGの二倍波２０５を照射する。レーザ照射によりポリスチレン微粒子１９８が剥離され、それに伴い吸収スペクトルの吸光度が減衰する。吸光度が予め設定された値２０６を下回ると、ポリスチレン微粒子１９８が全部剥離されたと判断し、レーザ照射を停止する。次に精製ブロックの吸出し口２０７から電磁石２０８を挿入し、表面磁束密度3000ガウスの磁場を発生することにより、超磁性微粒子を含むポリスチレン微粒子１９８を集める。磁場を発生した状態の電磁石２０８を容器２０９のウエル２１０に移動させ、電磁石２０８をoffにすることにより、ポリスチレン微粒子１９８を放出させる。精製された生体分子が変性しないのに必要最低限量の緩衝液２１０により精製、濃縮された状態で保存する。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の構成により、生体分子等の試料の回収を損失することなく、高効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の基本概念を示す図。
【図２】従来技術の装置構成および原理を示す図。
【図３】生体分子の吸着を金微粒子の光学特性によりモニタする方法を示す図。
【図４】微粒子を基板から剥離する方法を示す図。
【図５】剥離された微粒子を回収する方法を示す図。
【図６】超音波照射により剥離された微粒子をフィルターにより回収する実施例を示す図。
【図７】機械的に剥離された微粒子を遠心分離により回収する実施例を示す図。
【図８】レーザ照射により剥離された微粒子を磁石により回収する実施例を示す図。
【図９】複数種のターゲット分子を回収する実施例を示す図。
【図１０】円盤状の基板上に固相化された微粒子をレーザ照射により剥離し、遠心力により回収する方法を示す図。
【図１１】従来技術の装置構成および原理を示す図。
【図１２】基板から剥離された微粒子の様子を示す図。
【図１３】剥離された微粒子の濃度測定方法を示す図。
【図１４】緩衝液を置換する方法を示す図。
【図１５】自動的に試料を精製、濃縮する装置を示す図。
【符号の説明】
１１：抗体、１２：微粒子、１３：基板、１４：生体分子、１５：剥離された微粒子および生体分子、１６：回収された微粒子および生体分子、２１：金コート、２２：プリズム、２３：抗体、２４：微細流路、２５：生体分子、２６：単色光、２７：分子吸着前のセンサグラム、２８：分子吸着後のセンサグラム、２９：コンピュータ、３０：ポンプ、３１：バルブ、３２：生体分子回収容器、４１：金薄膜、４２：基板、４３：ポリスチレン微粒子、４４：貴金属微粒子、４５：プローブ生体分子、４６：被検体生体分子、４７：反射スペクトル、４８：結合後の反射スペクトル、４９：吸着開始時、５１：超音波、５２：パルスレーザの照射、５３：スクレーパ、５４：粘着テープ、６１：フィルター、６２：遠心分離器、６３：磁石、６４：電極、７１：ポリリジン、７２：シリコン基板、７３：ポリスチレン微粒子、７４：抗体、７５：抗原、７６：超音波照射、７７：フィルター、７８：レーザ照射、７９：質量分析計、８１：クロム薄膜、８２：金薄膜、８３：ガラス基板、８４：アルカンチオール、８５：アビジン蛋白質、８６：ビオチン分子、８７：ポリスチレン微粒子、８８：ビオチン化ＤＮＡ、８９：蛍光色素、９０：相補的配列を有するＤＮＡ、９１：スクレーパ、９２：遠心分離、１０１：ＰＭＭＡ製の微細流路、１０２：金薄膜、１０３：デキストラン製の磁気ビーズ、１０４：成長因子レセプター、１０５：成長因子、１０６：ファイバーバンドル、１０７：吸収極大波長、１０８：YAGの基本波もしくはYAGの二倍波、１０９：微粒子剥離前の反射スペクトル、１１０：微粒子剥離跡の反射スペクトル、１１１：磁石、１２１：チップ、１２２：生体分子吸着部、１２３：生体分子回収部、１２４：金薄膜、１２５：磁気ビーズ、１２６：吸収スペクトル、１２７：レセプター、１２８：リガンド、１２９：領域A、１３０：領域B、１３１：窒素レーザ、１３２：電磁石A、１３３：電磁石B、１３４：電磁石C、１３５：電磁石D、１３６：チューブ、ポンプ１３７、１４１：回転軸、１４２：円盤、１４３：リング状領域、１４４：試料チャンバ、１４５：鏡、１４６：回収流路、１４７：電極、１５１：金薄膜、１５２：基板、１５３：高分子微粒子、１５４：変化前の吸収スペクトル、１５５：変化後の吸収スペクトル、１５６：抗体、１５７：抗原、１５８：吸収極大波長の測定、１６１：貴金属誘電体コンポジット微粒子の懸濁液、１６２：光源、１６３：照射光、１６４：透過光、１６５：光検出器、１６６：散乱光、１６７：蛍光、１６８：カットオフフィルター、１７１：超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子の懸濁液、１７２：微細流路、１７３：電磁石、１７４：液体、１７５：容器、１７６：超磁性貴金属・誘電体コンポジット微粒子、１７７：電磁石、１７８：容器、１９１：容器、１９２：ウエル、１９３：未精製生体試料、１９４：ピペット、１９５：精製ブロック、１９６：試料注入口、１９７：微細流路、１９８：ポリスチレン微粒子、１９９：精製対象生体分子、２００：抗体、２０１：ポンプブロック、２０２：ポンプ、２０３：光ファイバーバンドル、２０４：設定波長、２０５：YAGの二倍波、２０６：設定吸光度、２０７：吸出し口、２０８：電磁石、２０９：容器、２１０：緩衝液、２２０：光源、２２１：ディテクター。
【図１】
0003685119.tif 000002
【図２】
0003685119.tif 000003
【図３】
0003685119.tif 000004
【図４】
0003685119.tif 000005
【図５】
0003685119.tif 000006
【図６】
0003685119.tif 000007
【図７】
0003685119.tif 000008
【図８】
0003685119.tif 000009
【図９】
0003685119.tif 000010
【図１０】
0003685119.tif 000011
【図１１】
0003685119.tif 000012
【図１２】
0003685119.tif 000013
【図１３】
0003685119.tif 000014
【図１４】
0003685119.tif 000015
【図１５】
0003685119.tif 000016