(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定極である複数のピン電極を有する、遺伝子の検出用チップであって、
前記ピン電極と、前記ピン電極の対極である共通電極との間に電圧を印加し、電流を検出することが可能であることを特徴とする、遺伝子の検出用チップ。
【請求項２】
さらに、前記ピン電極の対極であって前記ピン電極と接触しないように配置された共通電極を有することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項３】
さらに、前記ピン電極を受容し得るとともに、サンプルＤＮＡを充填し得る窪みを有することを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項４】
前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する遺伝子がそれぞれ固定されてなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項５】
前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する複数のＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ（peptidic  nucleic  acid）、またはＬＮＡ（locked  nucleic  acid；Proligo  LLC社商標）が固定されてなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項６】
前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有する遺伝子がそれぞれ固定されてなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項７】
前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有するＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ（peptidic  nucleic  acid）、またはＬＮＡ（locked  nucleic  acid；Proligo  LLC社商標）が固定されてなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項８】
さらに、前記ピン電極をそれぞれ受容し得るとともに、サンプルＤＮＡを充填し得る複数の窪みを有してなり、
当該複数の窪みに異なるサンプルＤＮＡをぞれぞれ充填し得るようにしたことを特徴とする、請求項６または７に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項９】
遺伝子の塩基配列、一塩基置換ＳＮＰ、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレットリピートを検出するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１０】
前記ピン電極は、表面に金がメッキされてなることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１１】
前記ピン電極は、表面の一部が樹脂でコーティングされてなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１２】
前記樹脂が、ＰＥＥＫまたはＰＴＦＥであることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１３】
さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、
前記ピン電極は、当該支持部材上に突設されてなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１４】
前記ピン電極は、前記支持部材上にスポット電極を介して突設されてなることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１５】
さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、
前記ピン電極の一の端部が、当該支持部材上に植設されてなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１６】
前記支持部材が回路基板である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１７】
前記ピン電極は、前記支持部材上に接触または植設されている端部がエポキシ樹脂またはＰＴＦＥにより包囲され支持部材上に固定されていることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項１８】
前記ピン電極においては、前記支持部材上に接触または植設されている端部ではない側の端部にのみ遺伝子が固定されてなることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項１９】
前記ピン電極においては、ピン電極の全体にわたり遺伝子が固定されてなることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項２０】
内部に空隙を有してなる請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップであって、
前記ピン電極は、当該空隙内へ突出するように前記支持部材上に設けられ、
前記共通電極の一部または全部が当該空隙内に露出していることを特徴とする、
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項２１】
本体部と当該本体部と結合し得るフレーム部とを有してなる請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップであって、
前記本体部は、その内側面に前記ピン電極を有し、
前記フレーム部は、その内側面に、当該本体部と結合した際に前記ピン電極を受容し得るとともにサンプルＤＮＡを充填し得る窪みを有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項２２】
前記本体部と前記フレーム部とが着脱自在である、請求項２１に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項２３】
互いに着脱自在な本体部とフレーム部とを有する遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出用チップであって、
前記本体部は、その内側面にマトリックス状に配列されて突出した測定極である多数のピン電極を有し、
前記フレーム部は、その内側面に、前記本体部を装着した際に前記多数のピン電極を受け入れることができるとともに、サンプルＤＮＡを充填することのできる窪みを有し、
前記窪みには、前記ピン電極と接触しないように配置された対極である共通電極が配設されており、
前記ピン電極は、異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されており、
前記共通電極と前記ピン電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であることを特徴とする遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出用チップ。
【請求項２４】
前記ピン電極は、夫々マトリックス状に多数配列され、異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドを収容する収容部の各々に、挿入されることにより、前記異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されているものであることを特徴とする請求項２３に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項２５】
遺伝子診断用である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ、ならびに当該検出用チップを装入および取り出し可能な測定装置を有する遺伝子の検出装置。
【請求項２７】
前記遺伝子の検出用チップの温度をペルチエ素子を用いコントロール可能としたことを特徴とする、請求項２６記載の遺伝子の検出装置。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、
前記窪み内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成し、
その後、前記サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを前記窪みから除去し洗浄してから、前記窪み内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、
そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、
前記窪み内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡと、電気化学活性分子を含む電解質とを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成しながら、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法。
【請求項３０】
温度をコントロールしながら前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の検出方法。
【請求項３１】
前記電気化学活性分子を含む電解質が、フェロセン、カテコールアミン、金属ピピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ピオローゲン、もしくはこれら化合物を導入した縫い込み型インターカレータを有効成分とすることを特徴とする、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の塩基配列のほか、遺伝子ＤＮＡの一塩基置換ＳＮＰ（シングル・ヌクレオチド・ポリモフィズム：人の遺伝コード中の変種）、数塩基置換、点突然変異、遺伝子の欠損等の遺伝子の異常を検出し解析可能とする遺伝子の検出用チップ、検出装置、並びに検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一塩基置換ＳＮＰとは、ヒトＤＮＡの１０００ｂｐから２０００ｂｐに１つあると言われている塩基配列の一塩基変化であり、正常人、病気の人問わず人には十万から数百万のＳＮＰがあると考えられており、病因の解明、予防に有効なマーカーと期待されている。
【０００３】
数塩基置換とは、遺伝子の塩基配列の数塩基変化である。
【０００４】
点突然変異とは、すでに既知である遺伝子における塩基配列の一塩基の変化であり、これにより翻訳されるタンパク質の機能異常がみられ、疾患の原因になる場合がある。
【０００５】
遺伝子の転座とは、塩基配列の順序が一部逆さまになるものであり、疾患の原因となる場合がある。
【０００６】
遺伝子の欠損とは、塩基配列の一部が欠乏したものであり、疾患の原因となる場合がある。
【０００７】
遺伝子の増幅とは、塩基配列の一部が重複したものであり、疾患の原因となる場合がある。
【０００８】
トリプレットリピートとは、３塩基対がリピートして伸長するものであり、疾患の原因となる場合がある。
【０００９】
遺伝子ＤＮＡの塩基配列の違いを検出、解析する手段としては、ＤＮＡシーケンス法（塩基配列決定法）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Polymerase  chain  reaction−single  stranded  polymorphism）法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ法等が用いられている。
【００１０】
ＤＮＡシーケンス法は、マキサム・ギルバート法とサンガー（ダイデオキシ）法があるが、現在は主にダイデオキシ法が用いられている。ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ法（ポリミラーゼ連鎖反応法）で増幅したのち、ＰＣＲ法で用いたプライマー若しくは増幅ＤＮＡ内に設定したプライマーを用いてシーケンスを行い、当領域内の遺伝子配列を決定する。
【００１１】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Polymerase  chain  reaction−single  stranded  polymorphism）法はヒトの遣伝子の解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、熱変性で一本鎖にし、これを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行うことで、ＰＣＲ法で増幅した２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に２次構造（分子内水素結合）を形成させる。一塩基配列の違いによってとる２次構造（分子内水素結合）がことなるため、電気泳動距離の違いによって遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異等を検出する。
【００１２】
アレル特異的ハイブリダイゼーション法では、解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、メンブレン（ナイロンフィルター）の領域内に２０塩基程度のＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを作成し、そこに放射性同位元素３２Ｐなどで標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。その際の温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、遺伝子の−塩基性ＳＮＰと点突然変異を放射性同位元素の強度の差で検出する。
【００１３】
ＤＮＡチップ法は、原理的にはアレル特異的ハイブリダイゼーション法とほぼ同じであるが、２０塩基程度のＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを固定相（基盤上）に並べ、そこに蛍光標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、ヒトの遺伝子の一塩基置換ＳＮＰ等を蛍光強度の差によって検出するものである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
アレル特異的ハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションの場合は、ＤＮＡを放射性同位元素で標識するために、放射性同位元素の取り扱いと管理に多大な費用が有することが問題である。又、ＤＮＡチップ法の場合は、蛍光色素で標識すると、蛍光色素の大きな分子構造のために十分な頻度で蛍光がＤＮＡにとりこまれないために、蛍光標識プローブの蛍光強度が高くないこと、さらに蛍光の退色及びガラス等の基盤の有する蛍光（背景部分の蛍光）が問題になる。
【００１５】
このような問題点を解決するために、ＤＮＡハイブリッド形成の検出、二本鎖ＤＮＡを検出する簡単で感度の優れた方法として、プローブＤＮＡを電極に固定し、このプローブＤＮＡを、インターカレータ存在下においてサンプルＤＮＡと反応させて、二本鎖ＤＮＡの検出、ハイブリッド形成体の検出を電気化学的に行う方法が開示されている（特開平９−２８８０８０号公報及び第５７回分析化学討論会予稿集、Ｐ１３７−１３８、１９９６年、参照）。
【００１６】
しかしながら、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰや遺伝子の突然変異等の数は莫大であり、例えばヒトの場合１５ＫＢの密度（解像度）の一塩基置換ＳＮＰ地図を作成するためには、すくなくとも２００万の一塩基置換ＳＮＰを同定しなければならない。又、既知の疾患に関係する遺伝子の点突然変異の数もきわめて多い。一塩基置換や点突然変異を網羅的に解析することは従来の方法では現実的に不可能に近い。
【００１７】
本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、複数のサンプルＤＮＡを対象に、大量の遺伝子を検出、解析することが可能な、すなわちハイスループット（高速大量）の処理ができ、しかも高感度に検出と解析が可能な遺伝子の同定装置を提供する。要するに、本発明は、特開平９−２８８０８０号公報に記載された二本鎖ＤＮＡの検出、ハイブリッド形成体の検出を電気化学的に行う原理に基づいて、大量かつ高感度な遺伝子の検出・解析装置として実現しようとするものである。
【００１８】
さらに、本発明は、実際の検出等の作業において、取り扱いが簡単で、作業しやすい、遺伝子の検出方法、検出装置及び検出用チップを実現しようとするものである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために、測定極である複数のピン電極を有し、前記ピン電極と前記ピン電極の対極である共通電極との間に電圧を印加し、電流を検出することが可能であることを特徴とする、遺伝子の検出用チップを提供する。
本発明ではアレイ状に複数配列されたピン電極を用いているので、大量の遺伝子を同時に解析することができる。
【００２０】
また、ピン先端部および側面部に遺伝子を固定することができ、固定する面積を多く取ることができるという利点がある。
【００２１】
また、平面電極上に遺伝子を分注する場合では平面電極の表面に凹凸があると均一に固定することができないのに比べて、ピン電極を遺伝子を含む液体の中に挿入することにより固定するので、ピン電極の表面に凹凸があっても均一に一定量の遺伝子を固定することができるという利点もある。一定量の遺伝子を固定できることにより、定量分析する上で精度・感度が高まる。
【００２２】
さらに、本発明では、遺伝子を含む液体を分注する操作が不要であり、操作が簡便であるという利点もある。
【００２３】
本発明では、ピン電極に固定されたプローブ遺伝子とサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより検出を行った後に、サンプルＤＮＡを除去して、再度別のサンプルＤＮＡをハイブリダーゼーションさせることができるので、繰り返してチップを使用することができる。あるいは、プローブ遺伝子を除去する処理を行い、再度別のプローブ遺伝子をピン電極に固定することができるので、異なる検出用途にて繰り返してチップを使用することができる。
【００２４】
本発明における検出用チップは、さらに、前記ピン電極の対極であって前記ピン電極と接触しないように配置された共通電極を有していてもよい。
【００２５】
本発明における検出用チップは、さらに前記ピンを受容し得るとともに、サンプルＤＮＡを充填し得る窪みを有していてもよい。
【００２６】
前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する遺伝子がそれぞれ固定されていてもよい。
【００２７】
前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する複数のＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ（peptidic  nucleic  acid）、またはＬＮＡ（locked  nucleic  acid；Proligo  LLC社商標）が固定されていてもよい。
【００２８】
本発明に係る他の検出用チップは、前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有する遺伝子がそれぞれ固定されていてもよい。
【００２９】
前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有するＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ（peptidic  nucleic  acid）、またはＬＮＡ（locked  nucleic  acid；Proligo  LLC社商標）が固定されていてもよい。
【００３０】
当該検出用チップは、さらに前記ピン電極をそれぞれ受容し得るとともに、サンプルＤＮＡを充填し得る複数の窪みを有してなり、当該複数の窪みに異なるサンプルＤＮＡをぞれぞれ充填し得るようにしてもよい。
【００３１】
前記遺伝子の検出用チップは、例えば、遺伝子の塩基配列、一塩基置換ＳＮＰ、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレットリピートを検出するのに有用である。
【００３２】
前記ピン電極は、表面に金がメッキされていてもよい。
【００３３】
前記ピン電極は、表面の一部が樹脂でコーティングされていてもよい。
【００３４】
前記樹脂は、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）またはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）であってもよい。
【００３５】
前記遺伝子の検出用チップは、さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、前記ピン電極は、当該支持部材上に突設されていてもよい。
【００３６】
ここで突設とは、ピン電極が支持部材を土台として支持部材から突出するように配置されていることを意味する。
【００３７】
前記ピン電極は、前記支持部材上にスポット電極を介して突設されていてもよい。
【００３８】
スポット電極とは、支持部材上にスポット上に配置された電極を意味する。
【００３９】
前記遺伝子の検出用チップは、さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、前記ピン電極の一の端部が、当該支持部材上に植設されていてもよい。
【００４０】
ここで植設とは、ピン電極の一の端部が支持部材に設けられた凹部に嵌合され、ピン電極が支持部材から突出するように配置されていることを意味する。
【００４１】
前記支持部材は回路基板であってもよい。
【００４２】
前記ピン電極は、前記支持部材上に接触または植設されている端部がエポキシ樹脂またはＰＴＦＥにより包囲され支持部材上に固定されていてもよい。
【００４３】
前記ピン電極においては、前記支持部材上に接触または植設されている端部ではない側の端部にのみ遺伝子が固定されていても、あるいは、ピン電極の全体にわたり遺伝子が固定されていてもよい。
【００４４】
ピン電極の表面の所定の場所に樹脂コーティングをすることにより、コーティングされず露出している部分にのみ遺伝子が固定されるようにしてもよい。
【００４５】
前記遺伝子の検出用チップが内部に空隙を有してなり、前記ピン電極は、当該空隙内へ突出するように前記支持部材上に設けられ、前記共通電極の一部または全部が当該空隙内に露出していてもよい。
【００４６】
チップに当該空隙内へ通じる注入口を設けて、当該空隙内へサンプル遺伝子や電解質等を注入・排出できるようにしてもよい。
【００４７】
前記遺伝子の検出用チップは、本体部と当該本体部と結合し得るフレーム部とを有しており、前記本体部は、その内側面に前記ピン電極を有し、前記フレーム部は、その内側面に、当該本体部と結合した際に前記ピン電極を受容し得るとともにサンプルＤＮＡを充填し得る窪みを有していてもよい。
【００４８】
前記本体部と前記フレーム部とは着脱自在であってもよい。
【００４９】
本体部とフレーム部とを着脱自在に結合する構成としては、本体部またはフレームのいずれか一方に凸部を設け他方に凹部を設け当該凸部と凹部とを係合できるようにした構成や、両者をクリップやクランプで止める構成や、一方を他方に対してスライドさせながら嵌着させる構成や、磁石により互いに吸着させる構成など、公知の方法が適宜採用され得る。
【００５０】
本発明は、上記課題を解決するために、互いに着脱自在な本体部とフレーム部とを有する遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出用チップであって、前記本体部は、その内側面にマトリックス状に配列されて突出した測定極である多数のピン電極を有し、前記フレーム部は、その内側面に、前記本体部を装着した際に前記多数のピン電極を受け入れることができるとともに、サンプルＤＮＡを充填することのできる窪みを有し、前記窪みには前記ピン電極と接触しないように配置された対極である共通電極が配設されており、前記ピン電極は、異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されており、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であることを待徴とする追伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異の検出用チップを提供する。
【００５１】
なお、本発明においてマトリックス状とは、多数のピン電極が互いに平行になるように所定の面から突出するように配列されている状態を意味する。
【００５２】
上記ピン電極は、夫々マトリックス状に多数配列され、異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドを収容する収容部の各々に、挿入されることにより、上記異なる遺伝子配列から成るＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されているものとしてもよい。
【００５３】
上記検出用チップは、遺伝子診断用であってもよい。本発明の検出用チップを用いて遺伝子診断することにより、筋ジストロフィー、血友病、フェニルケトン尿症等の単一遺伝子病、糖尿病、がん、高血圧、心筋梗塞、肥満症等の多因子遺伝子病に関する遺伝子を持っているか否かを診断したり、発症前の遺伝子を診断したり、適切な治療法や薬を選択するための判断材料にすることができる。
【００５４】
又、本発明は、上記課題を解決するために、前記遺伝子の検出用チップ、ならびに該検出チップを装入及び取り出し可能な測定装置を有する遺伝子の検出装置を提供する。
【００５５】
上記検出用チップにおいては、温度制御手段として、ペルチエ素子を用いて温度をコントロール可能としてもよい。
【００５６】
さらに、本発明は、上記課題を解決するために、前記遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、前記窪み内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成し、その後、前記サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡを前記窪みから除去し洗浄してから、前記窪み内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする検出方法を提供する。
【００５７】
あるいは、前記遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、前記窪み内に、サンプルＤＮＡ又はサンプルＤＮＡから遺伝子増幅されたＤＮＡと、電気化学活性分子を含む電解質とを充填し、ハイブリダイゼーションを行わせて二本鎖を形成しながら、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法を提供する。
【００５８】
このように、前記チップを用いて、ハイブリダイゼーションをした後に電気化学活性分子を結合させたり、あるいは、電気化学活性分子の存在下にハイブリダイゼーションを行わせることにより、大量の遺伝子を同時にかつ極めて高精度・高感度に、極めて簡便な操作で解析することができる。
【００５９】
前記検出方法においては、温度をコントロールしながら前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させるようにしてもよい。
【００６０】
前記電気化学活性分子を含む電解質は、フェロセン、カテコールアミン、金属ピピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ピオローゲン、またはこれら化合物を導入した縫い込み型インターカレータを有効成分とするものであってもよい。特に好ましくは、フェロセン縫い込み型インターカレータである。
【００６１】
前記電気化学活性分子を含む電解質としては、上記の他に、エチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体を有効成分としてもよい。
【００６２】
【発明の実施の形態】
本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップの実施の形態を図面を参照しながら以下に説明する。なお、図面は本発明の一実施の形態にすぎず、これに限定されるものではない。
【００６３】
図１において、本発明に係る遺伝子の検出装置１は、検出用チップ２と、この検出用チップ２を差し込み可能な装入口２９を有し、ハイブリダイゼーションにより生じる二本鎖ＤＮＡを検出し解析可能とする測定装置３と、パソコン３５とから構成される。
【００６４】
図２は、検出用チップ２の構造を示す図であり、図２（ａ）は、検出用チップ２の全体斜視図を示しており、これは、カードあるいはカセット状のチップとして形成されている。図２（ｂ）に分解斜視図として示すように、検出用チップ２は、セラミックスや合成樹脂材等により形成されたフレーム４と、該フレーム４に着脱可能に装着される本体部５とから構成される。
【００６５】
フレーム４に対して本体部５を着脱自在に結合する構成は、例えば、互いに弾性的に嵌合する凹凸をフレーム４と本体部５の当接面に夫々形成することにより可能である。本実施例では、図２（ｂ）、（ｃ）、図３（ａ）、図５（ａ）に示すように、本体部５およびフレーム４に、ピン電極の配列を避けた箇所にそれぞれ凸部６および凹部７を設け着脱可能とした。
【００６６】
フレーム４と本体部５とを互いに着脱自在に結合する構成としては、両者をクリップやクランプで止めたり、磁石により互いに吸着させたり、公知の方法が適宜採用され得る。
【００６７】
フレーム４のほぼ中央には、矩形の窪み８が形成されている。この窪み８の周囲には、シール９が付設されている。この窪み８内には後述するように、溶液（サンプルＤＮＡ、縫い込み式インターカレータ、洗浄液等）を充填することができ、本体部５をフレーム４に装着することにより封止される。又、本体部５をフレーム４からはずすことにより、窪み８内の溶液の交換や混合、洗浄等を迅速に行うことができる。
【００６８】
一方、本体部５には、図２（ｃ）に示すように、フレーム４の窪み８に対応する領域に、多数のピン電極１０が均等に突設されている。ピン電極１０の突出長さは、本体部５をフレーム４に装着した際、窪み８内に収まる長さである。
【００６９】
図３（ａ）は、図２（ｃ）のＡ−Ａ断面を示す図であり、本体部５の構成と、ピン電極１０の突設されている状態を示している。本体部５は、内側壁１１と外側壁１２との間に回路基板１３が設けられて構成される。回路基板１３の端部が露出し、当該露出部分にピン電極用のターミナル端子２０および共通電極用のターミナル端子（図４において示す２７）が設けられている。また、回路基板１３には配線（図４において示す２１、２２、２３）等を含む回路が形成されている。
【００７０】
図３（ａ）、（ｂ）に示すように、ピン電極１０は、回路基板１３から内側壁１１を貫通して突出するように構成される。
【００７１】
ピン電極１０は、図３（ｃ）に示すように、外側壁１２から回路基板１３及び内側壁１１を貫通して突出するように構成されてもよい。
【００７２】
ピン電極１０は、図３（ｄ）に示すように、本体部５を、基台１４上に回路基板１３を設け、その上にピン電極１０を突設するような構成としてもよい。
【００７３】
あるいは、図３（ｅ）に示すように、予め回路基板１３上に多数のスポット電極１５を蒸着して、多数のスポット電極１５を形成しておき、ピン電極１０をこのスポット電極１５上に電気的に接触した状態で突設してもよい。
【００７４】
ピン電極１０の表面には、図６（ｂ）でその拡大図を示すように、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール化してＳＨ基を導入したＳＨ化オリゴヌクレオチド１６が固定されている。ＰＣＲ産物は二本鎖ＤＮＡであるが、一方の鎖の５’末端をチオール化し、ＳＨ基を導入してあるこのオリゴヌクレオチドは、２０〜５０塩基含む長さを有し、その基端に導入したチオール基を介してピン電極１０上に固定されている。
【００７５】
このオリゴヌクレオチドの固定は、図６（ａ）に示すように、ピン電極１０を、ピン電極１０と同じピッチ配列されたＤＮＡ収容部１８を有するマイクロプレート１７の各収容部１８内に、挿入することにより、同時に種類の異なるＤＮＡを同時に修飾して行うことが可能である。ピン電極１０の表面は金がメッキされており、金にＳＨ基を介してＳＨ化オリゴヌクレオチド１６を固定する手法は公知である。
【００７６】
ピン電極の表面に金メッキをする前の前処理方法やSH−金結合に関しては、例えばJ.Am.Chem.Soc  111号P321〜  1989年  C．D．Bain著や、Anal．Chem．70号P2396〜1998年  JJ.Gooding著に記載がある。なお、プローブ遺伝子の除去は、J.Am.Chem.Soc  111号P321〜  1989年  C．D．Bain著に記載の方法等で行う。
【００７７】
多数のピン電極１０は、回路基板１３の上に設けられ、電気的にも回路基板の一部となるように構成されている。そして、図２（ｃ）に示すように、本体部５の先端部には、ターミナル端子２０、２７が並設されている。
【００７８】
図４（ａ）、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、ピン電極１０は、夫々回路基板上の配線２１に接続され、該配線２１の他端はターミナル端子２０とそれぞれ独立して接続されている。
【００７９】
図４は、遺伝子の電気検出回路を示すものであり、図４（ａ）に示すように、ピン電極１０に対する配線２１は、ピン電極１０それぞれに対応して一本づつ接続してそれぞれターミナル端子２０に接続してもよいが、図４（ｂ）に示すように、ＴＦＴからなるスイッチング素子を設けたアクティブマトリックス型のＴＦＴ液晶表示装置等のマトリックス電極のように、多数の縦及び横の導線２２、２３から成るマトリックス配線の交差部で、夫々マトリックス配線の導線２２、２３とピン電極１０がＦＥＴ（電界効果型トランジスタ）２４を介して接続するような構成としてもよい。このような構成とすると、縦及び横の導線２２、２３が走査され、選択されたＴＦＴがＯＮし特定のピン電極がターミナル端子に電気的に接続されるようになる。
【００８０】
本実施例では、さらに、図４で示す共通電極２５を有する。図４で示す共通電極は、あくまでも回路構成を説明するために模式的に記載しているものであり、実際は、窪み８に配設されることが好ましい。例えば、共通電極２５は、図５（ａ）に示すように、窪み８の底面の一部（例えば周縁等）又は全面、或いは窪み８の底面近くの内周側面等に、ピン電極１０の対極として配設されている。そして、共通電極２５は、ピン電極１０と接しない位置に設けられている。共通電極２０は、本体部５をフレーム４に装着すると、図５（ｂ）に拡大図で示すように、本体部５の共通電極用の端子２６と接触するように構成されている。そして、この共通電極用の端子２６は、共通電極用ターミナル端子２７に配線２８を介して接続されている。
【００８１】
なお、それぞれのピン電極１０と対極である共通電極２５の間の電流値は、窪み８内の空間に後述する電解質溶液を充填した場合にこの電解質溶液に接するように配線された参照電極（図示せず）の値を基準に測定され、測定ごとに正確な電流値が得られる構造としてもよい。
【００８２】
測定装置における検出用チップの装入口（図1の２９）の内部には、図４（ｃ）で示すように、共通電極用ターミナル端子２７及び各ピン電極用ターミナル端子２０に接続して、共通電極用ターミナル端子２７及び各ピン電極用ターミナル端子２０間に電圧を印加する回路３０が配設されている。
【００８３】
そして、共通電極用ターミナル端子２７と各ピン電極用ターミナル端子２０間に電圧Ｅが印加された際に、共通電極２５と各ピン電極１０の間に流れる電流を、回路３０に設けられた検出器３１で検出して測定できるような構成とされている。
【００８４】
なお、ピン電極１０のターミナル端子２０を選択的に接続するためには、測定装置３には、検出用チップ２を装入口２９から差し込んだ場合に、各ピン電極用ターミナル端子２０と接続するための受け端子３２と、受け端子３２を回路３０に選択的に接続するための走査端子３３とが設けられている。
【００８５】
この検出した電流に基づく測定データは、検出器３１に接続するＡ−Ｄ変換器３４等でデジタル化され、パソコン３５によりサンプルＤＮＡの解析、同定等の処理データとして利用される。
【００８６】
さらに、測定装置３には、ペルチエ素子から成る温度コントロール装置（図示せず）が装備されている。この温度コントロール装置により、後述するハイブリダイゼーションの温度条件をコントロールすることができる。
【００８７】
以上のような構成から成る本発明に係る検出装置１の作用について説明する。図６（ａ）は、ピン電極１０と同じピッチで収容部１８がアレイ状に配列されたマイクロプレート１７である。このマイクロプレート１７の各収容部１８内に、種類の同じ又は異なるＤＮＡを収容しておく。
【００８８】
そして、図６（ａ）に示すように、検出用チップ２の本体部５の多数の電極ピン１０を、夫々収容部１８に挿入する。これにより、図６（ｂ）にその一部拡大図を示すように、夫々の電極ピン１０に種類の同じ又は異なるＤＮＡを修飾することができる。
【００８９】
一方、フレーム４の窪み８内にサンプルＤＮＡ溶液を注入し充填する。そして、この窪み８内に、上記ＤＮＡの修飾された多数のピン電極１０を挿入するように、本体部５をフレーム４に、凸部と凹部を係合して装着する。すると、窪み８内はシール９で封止され、共通電極２５は、本体部５の共通電極用の端子２６と接触する。
【００９０】
なお、サンプルＤＮＡは、生物材料から抽出したＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素もしくは超音波処理で分解したもの、又は特定の遺伝子からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって増帽したＤＮＡを用いる。これらのサンプルＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの直前に熱処理によって変性しておく。
【００９１】
ピン電極に固定されたＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドのＤＮＡ（一本鎖の体態）にサンプルＤＮＡ（一本鎖の状態）が添加されると、互いに相補的な塩基配列を持つＰＣＲ産物もしくはオリゴヌクレオチドのＤＮＡとサンプルＤＮＡは、ハイブリダイゼーションが行われる。
【００９２】
このハイブリダイゼーションの際、検出用チップ２を測定装置３内の装入口２９に装入して装着し、測定装置３内に装備されたペルチエ素子から成る温度コントロール装置により、ハイブリダイゼーションの温度条件をコントロールする。
【００９３】
このハイブリダイゼーションが行われた後、検出用チップ２を測定装置３から抜いて、本体部５をフレーム４から外す。そして、窪み８内のサンプルＤＮＡ溶液を除去して、窪み８内に洗浄液を注入し、ハイブリダイゼーションしなかったサンプルＤＮＡを洗い流して洗浄する。
【００９４】
このような洗浄を行った後に、電気化学活性分子を含む電解質溶液を窪み８内に充填し、本体部５をフレーム４に装着する。電気化学活性分子は、ハイブリダイゼーションにより二本鎖ＤＮＡの抵抗値等の電気的特性を変化させる機能を奏する。この点については、特開平９−２８８０８０号公報に詳細に説明されている。
【００９５】
このような処理を行った検出用チップ２を測定装置３に再度装着し、検出用チップ２の共通電極用ターミナル端子２７及び各ピン電極用ターミナル端子２０を、測定装置の受け端子３２に接続し、選択スイッチを介して電圧回路３０に接続し、共通電極２５と各ピン電極１０の間に弱い電圧をかけると、ハイブリダイゼーションにより生じた二本鎖ＤＮＡと接続されたピン電極１０には、電圧回路３０及び共通電極２５を通して微弱電流が流れる。測定装置３内に装備されたペルチエ素子により温度をコントロールし、異なる温度での電流値を測定する。
【００９６】
測定装置３では、図４（ｃ）に示すように、各ピン電極用ターミナル端子２０及び受け端子３２に対して走査端子３３を切り替える（切り替えは、自動又は手動で行うことが可能であるが、その構成はこの発明の要旨ではないので説明は省略する。）ことにより、順次ハイブリダイゼーションの後の二本鎖ＤＮＡに電流が流れて、検出器３１で検出される。
【００９７】
この検出結果が、Ａ−Ｄ変換器３４によりデジタルデータに変換されて、パソコン３５で測定データとしてメモリ等に蓄積される。この測定データにより、サンプルＤＮＡの同定や解析が行われる。例えば、予め蓄績されている各種類のＤＮＡデータ等と比較することにより、サンプルＤＮＡの解析や同定が可能となる。
【００９８】
次に本発明に係わる遺伝子の電気化学的検出装置の実験例を説明する。
【００９９】
（実験例１）
遺伝子p53の72番目のコドンにおける一塩基置換ＳＮＰの検出の実験例を示す。以下の２種類のポリモルフィズム（遺伝的多型）に相当する塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをピン電極１０それぞれにスポットすることにより固定化した。
【０１００】
p53Pro（コドン72番目がPro）
p53Arg（コドン72番目がArg）
【０１０１】
これにp53のコドン72番目がProであるの正常人の未梢血から採取したＤＮＡ、及びこのＤＮＡからp53のエキソン４に存在するコドン72を含む領域を増幅したＰＣＲ産物を熱変性後ハイブリダイゼーション反応を行った。測定用電解質溶液（0.1M  AcOH−AcOK（pH5.6），0.1M  KCl，0.05mM  NFc）中で20度で470ｍＶ（Ag／AgCl参照電極基準）のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
【０１０２】
末梢血から採取したＤＮＡ
p53Proの電流変化（％）  ５２％
p53Argの電流変化（％）  １５％
ＰＣＲ産物
p53Proの電流変化（％）  ６５％
p53Argの電流変化（％）  １３％
【０１０３】
さらにp53のコドン72番目がArgである正常人の末梢血から採取したＤＮＡ、及びこのＤＮＡからp53のエキソン４に存在するコドン72を含む領域を増幅したＰＣＲ産物を同様にハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１０４】
末梢血から採取したＤＮＡ
p53Proの電流変化（％）  ４６％
p53Argの電流変化（％）  １７％
ＰＣＲ産物
p53Proの電流変化（％）  ５３％
p53Argの電流変化（％）  １１％
【０１０５】
これらの電流変化は、完全にマッチした塩基配列の場合とミスマッチの場合では明らかな差が認められた。
【０１０６】
（実験例２）
塩基置換の数によって測定する電流値が異なり、これによりミスマッチの量が測定できることを示した実験例を説明する。dT20，dT10dAdT9，dT8dA4dT8，dAdT19，dA3dT17，dT19dA，dT17dA3の７種のオリゴヌクレオチドをピン電極１０それぞれにスポットすることにより固定化した。これにdA20をハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１０７】
これを、測定電解質用溶液（0.1M  AcOH−AcOK（pH5.6）、0.1M  KCl，0.05mM  NFc）中で20度で470ｍＶ（Ag／AgCl参照電極基準）のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
【０１０８】
この測定結果を表１に示す。
【０１０９】
【表１】
0003685989.tif 000002
【０１１０】
表１における電流変化は、ほぼミスマッチ塩基の量に依存した変化であった。特に末端部にミスマッチが存在する場合は、Ｔｍ値より大きな変化が見られた。従来のＳＳＣＰでは、このような系は検出できなかったが本手法で初めて明らかとなった。
【０１１１】
（実験例３)
ｍＲＮＡ発現量の定量について実験例を示す。大腸菌ラクトースオペロン上のｌａｃｚ遺伝子上に存在するユニーク配列４０量体（高次構造を形成しないように設計している）のオリゴヌクレオチドの５’末端にチオール基（ＨＳ）を導入したものを、ピン電極１０のそれぞれに固定化した（ＨＳ−ｍ１：６０ｆｍｏｌ）。
【０１１２】
また、異なった発現量のｍＲＮＡを含む大腸菌からのｍＲＮＡ抽出液をタイタープレート上の異なったウェルに入れた。このタイタープレートのウェルに先に調製したピン電極１０を浸し、２×ＳＳＣ、室温、１時間の条件下でハイブリダイゼーション反応を行った。これを、測定用電解質溶液（0.1M  AcOH−AcOK（pH5.6），0.1M  KCl，0.05mM  NFc）中で20度で470ｍＶ（Ag／AgCl参照電極基準）のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
【０１１３】
得られた測定結果を図７に示す。図７から分かるように、ｍＲＮＡ量が６０ｆｍｏｌまではｍＲＮＡ量の増加に伴って電流変化Δｉ（％）が直線的に増加した。
【０１１４】
このように、本実施例では、ｍＲＮＡの発現量をｆｍｏｌレベルで定量化することができることが分かった。
【０１１５】
（実験例４）
遺伝子の検出について実験例を示す。アフリカツメガエルの卵細胞由来シトクロムＣの遺伝子検出用ＤＮＡプローブ（５’−ＨＳ−ＡＡＧＧＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＴＴＡ−３’）を、ピン電極１０のそれぞれに固定化した。また、異なったＤＮＡ量の目的遺伝子（ＤＮＡプローブと相補するＤＮＡ）を含む溶液をタイタープレート上の異なったウェルに入れた。このタイタープレートのウェルに先に調製したピン電極１０を浸し、２×ＳＳＣ、室温、１時間の条件下でハイブリダイゼーション反応を行った。これを測定用電解質溶液（0.1M  AcOH−AcOK（pH5.6），0.1M  KCl，0.05mM  NFc）中で20度で470ｍＶ（Ag／AgCl参照電極基準）のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
【０１１６】
得られた結果を図８に示す。図８から分かるように、数１０〜数１００ｆｍｏｌの目的遺伝子が検出できた。一方、シトクロムＣを含まないＤＮＡサンプルの電流変化はほとんど観察されなかった。
【０１１７】
以上、本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップについて、その実施例で説明したが、本発明は、特にこのような実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内で、いろいろな実施の態様があることは言うまでもない。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップは、以上のような構成であるから、高感度でもって、高速大量に、簡便に遺伝子を検出・解析することができる。
【０１１９】
このように、高感度、ハイスループット（高速大量）の処理ができる本発明に係る検出装置は、生物学、医学分野での遺伝子、表現形質との相関の解析に有効な手段である。薬剤代謝酵素、がん抑制遺伝子などの特定の遺伝子を、本発明に係る遺伝子の塩基配列、一塩基置換ＳＮＰ、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレットリピートの検出・解析装置よって、解析することにより、遺伝子診断にも利用できる。
【０１２０】
例えば、本発明に係る検出装置では、高感度、ハイスループット（高速大量）の処理が可能であるから、日本人の遺伝子に関するデータを収集し、病気の発症と関連する遺伝子を同定し、将来発症するのを予測・予防することに役立てることができる。
【０１２１】
また、遺伝子を診断することにより、適切な治療法を選択したり、副作用の少ない薬を選択したりする上で役立てることができる。
【０１２２】
さらに、病気の遺伝子解析の結果を利用して、臨床実験等を繰り返すことなく、新薬を開発することもできる。
【０１２３】
本発明では、検出用チップを互いに着脱自在な本体部とフレーム部とで構成し、フレーム部にサンプルＤＮＡ溶液等を充填できる窪みを形成したので、サンプルＤＮＡ、縫い込み式インターカレータ等の溶液を、極めて簡単な作業で充填したり取り出したりできるとともに、窪み内を洗浄液で簡単に洗浄をすることができる。
【０１２４】
本発明では、検出用チップの測定極として、本体部の内側にマトリックス状に配列したピン電極を突出して設けたので、ピン電極を、異なるＤＮＡを収容したマイクロプレートの収容部内に挿入することにより、同時に種類の異なるＤＮＡを一度に修飾（固定）させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】    本発明に係る遺伝子の検出装置の全体構成を説明する斜視図である。
【図２】    本発明に係る遺伝子の検出用チップの全体構成を説明する斜視図である。
【図３】    図３（ａ）は図２（ｃ）のＡ一Ａ断面図、図３（ｂ）は図３（ａ）の要部拡大図、図３（ｃ）〜（ｅ）は、ピン電極を回路基板に設けるいろいろな構造を示している。
【図４】    本発明に係る遺伝子の検出装置及び検出用チップの電極、配線等の構成を説明するための図である。
【図５】    図２の検出用チップの断面図及びその要部拡大図である。
【図６】    本発明に係る遺伝子の検出用チップの使用状態を説明する斜視図である。
【図７】    実験例３の測定結果である。
【図８】    実験例４の測定結果である。
【符号の説明】
１    検出装置
２    検出用チップ
３    測定装置
４    検出用チップのフレーム
５    検出用チップの本体部
８    窪み
１０    ピン電極
１３    回路基板
１４    本体部の基台
１６    オリゴヌクレオチド
１７    マイクロプレート
１８    マイクロプレートの収容部
２０    ピン電極用のターミナル端子
２５    共通電極
２７    共通電極用のターミナル端子
２８    配線
２９    測定装置の装入ロ
３１    検出器
３５    パソコン
【図１】
0003685989.tif 000003
【図２】
0003685989.tif 000004
【図３】
0003685989.tif 000005
【図４】
0003685989.tif 000006
【図５】
0003685989.tif 000007
【図６】
0003685989.tif 000008
【図７】
0003685989.tif 000009
【図８】
0003685989.tif 000010