(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（１）で示されるサーモルビンからなるアルドースレダクターゼ阻害剤。
【化１】
0003681188.tif 000004
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アルドースレダクターゼ阻害剤に関するものであり、さらには、糖尿病性白内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性角膜症、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経症、糖尿病性循環器障害等の糖尿病性合併症の予防及び治療に有用なアルドースレダクターゼ阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病のような高血糖状態では、アルドースレダクターゼ活性の亢進によりポリオール系での代謝が促進され、ソルビトール、ガラクチトール、フラクトース等のポリオールが異常蓄積することにより、細胞内浸透圧が上昇して組織障害を起こすと考えられている。従って、アルドースレダクターゼ活性を阻害し、ポリオールの生産や蓄積を低下させることが糖尿病性合併症の治療に有効であると考えられている。
従来、アルドースレダクターゼ阻害剤としては、チアゾリン誘導体（特開昭５７−２８０７３号公報）やヒダントイン誘導体（特開昭５３−５３６５３号公報）等、多くの化合物が知られている。また、アクチノシネマ属Ｃ−３０４株が生産するアルドースレダクターゼ阻害剤（特開昭６３−３０４９３号公報）や、コニオケータエリプソイデアＭ４５２９株が生産するアルドースレダクターゼ阻害剤（特開昭６４−８３０９０号公報）が知られているが、いずれも特に強い活性を持つアルドースレダクターゼ阻害剤ではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記したように、各種のアルドースレダクターゼ阻害剤が見いだされているが、これらの多くは毒性を持つことや、あまり活性が強くないという点で解決すべき課題を持っていた。
本発明は安全で、かつ強い活性を持つアルドースレダクターゼ阻害剤を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、サーモルビンが安全で、かつアルドースレダクターゼ活性を阻害するという事実を見いだし、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、下記の化学式（１）で示されるサーモルビンからなるアルドースレダクターゼ阻害剤を要旨とするものである。
【０００５】
【化２】
0003681188.tif 000002
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるサーモルビンは、上記の化学式（１）で示されるものであって、サーモアクチノミセス属に属する放線菌によって生産されることが知られている抗菌性を持つ公知の化合物である〔クリニカル  メデイスン（Clin. Med.) ７１，５１１（１９６４）〕が、アルドースレダクターゼ活性を阻害することは知られていない。
【０００７】
本発明に用いられるサーモルビンとしては、医薬として許容される塩基と共に形成される塩、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム、カルシウム塩）、アミン塩（例えば、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、トロメタミンの塩）等の形であってもよい。
【０００８】
本発明に用いられるサーモルビンを得るには、サーモルビン生産能を有する微生物、例えばサーモアクチノミセス属に属する放線菌を培養することによって得ることができる。具体的には、サーモアクチノミセス  エス・ピー（Thermoactinomyces sp. ）ＵＡＴ−８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３３７２）や、サーモアクチノミセス  サルホフィラス（Thermoactinomyces thalphopilus）ＡＴＣＣ  １４５７０等が挙げられる。
【０００９】
これらの微生物を培養するための培地としては、放線菌の培養に用いられる一般的培地であればよく、液体培地、固体培地どちらを用いてもよい。この培地の栄養源において炭素源としては、D-マンニトール以外の糖（例えば、グルコース、シュクロース、フルクトース、アラビノース等）が使用でき、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、ファーマメディア等が使用できる。また、無機塩類としては、例えば、各種りん酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄等が使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも添加を必要としない。さらに、栄養要求を必要とする変異株を用いる場合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなければならない。
【００１０】
この培地のｐＨとしては、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ４〜８、最適にはｐＨ５〜７．５に調節すればよい。
【００１１】
これらの微生物を培養する条件としては、３５〜６５℃、好ましくは４０〜５５℃、最適には４５〜５０℃で、３〜７日間振とう培養又は通気撹はん培養すればよい。このときの培養中の通気量としては、０．２〜２ｖ／ｖ／ｍ、好ましくは０．５〜１．５ｖ／ｖ／ｍ、より好ましくは０．７５〜１ｖ／ｖ／ｍである。このようにして得られた培養物から、本発明に用いられるサーモルビンを単離する方法としては、一般の有機化合物の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。例えば、培養物を遠心分離、ろ過又は分相等に付して、培養濾液を分取し、疎水性吸着剤ＨＰ−２０（三菱化成社製）カラムクロマトグラフィー等により活性物質を吸着させ、水洗後エタノール等により溶出することにより濃縮する。次いでこの濃縮液から酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出し、この抽出物から逆層分配クロマトグラフィー等の方法により、不純物を取り除いた後、さらに、高速液体クロマトグラフィー等の方法により分別精製することができる。
【００１２】
本発明のアルドースレダクターゼ阻害剤を糖尿病性合併症の予防あるいは治療に使用する場合、投与経路としては、経口、皮下注射、静脈注射、局所投与等のいずれでもよい。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加材を用いた、散剤、錠剤、細粒剤、丸剤、カプセル材、顆粒剤等の経口剤、点眼剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加材としては、グルコース、ラクトース、ゼラチン、マンニトール、でんぷんペースト、トリケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ等があり、さらには、安定剤、増量剤、着色剤、及び芳香剤の様な補助剤も含有していてもよい。
【００１３】
この場合のアルドースレダクターゼ阻害剤中に配合するサーモルビンの含有量としては、０．０１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜４０重量％であり、２〜３０重量％が好適である。
【００１４】
また、その投与量としては、使用目的、投与回数、剤形、あるいは被投与者の症状、年齢、体重等により異なるが、通常０．１〜５００mg／kg／日であることが好ましく、これを一日１〜５回に分けて投与すれことができる。
【００１５】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
参考例１
サーモアクチノミセス  エス・ピー  ＵＡＴー８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３３７２）のスラント培養から１００ミリリットルの培地（可溶性デンプン  １０ｇ、シュクロース  １０ｇ、グルコース  １０ｇ、ファーマメディア  １０ｇ、ペプトン  ５ｇ、大豆粉  ５ｇ、炭酸カルシウム  ２ｇ、蒸留水  １リットル、ｐＨ６．７）を入れた５００ミリリットル坂口フラスコに植菌し、培養温度４５℃で、２４時間振とう培養した。この培養液１リットルを２０リットルの培地〔可溶性デンプン  １０ｇ、シュクロース  １０ｇ、グルコース  １０ｇ、ファーマメディア  １０ｇ、ペプトン  ５ｇ、大豆粉  ５ｇ、炭酸カルシム  ２ｇ、ＫＭ−７３Ｆ（信越シリコーン社製）  ０．１ｇ、蒸留水  １リットル、ｐＨ６．７〕を入れた３０リットルのジャーファーメンターに植菌し、通気量０．７５ｖ／ｖ／ｍ、培養温度４５℃、回転数３００ｒｐｍで９６時間培養し、１２リットルの培養液を得た。この培養液を遠心分離し、得られた培養菌体を３リットルのメタノールで抽出した後、減圧留去した。得られた残査を３リットルの水に溶解し、４ＮのＨＣｌでｐＨ３．５に調整した後、等量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧乾個して粗抽出物を１．１ｇ得た。
【００１６】
得られた粗抽出物１．１ｇを５ミリリットルの５０容量％メタノール水溶液に溶解し、オーデエス  デーエム  ２０３５ＭＴ（富士デヴィッドソン社製）５００ｇを充填した中圧液体カラムクロマトグラフィー（φ３×３０ｃｍ）に通液した。このカラムを１リットルの２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）：メタノールが８０：２０の混合液で洗浄した後、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）：メタノールが８０：２０から０：１００のリニアグラジェントにより溶出した。得られた溶出液からサーモルビンを含む画分を回収し、回収液を減圧濃縮して粉末９３ｍｇを得た。
この粉末をメタノールで平衡化したセファデックス  ＬＨ−２０（ファルマシア社製）を充填したカラム（φ３．５×７０ｃｍ）に通液した後、メタノールで溶出を行ない、アルドースレダクターゼ阻害活性画分を得た。この画分を、分取用高速液体クロマトグラフィー〔逆相系カラム、φ２５×１００ｃｍ（ノバ  パック  Ｃ１８、ウォーターズ社製）〕に通液した後、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）：アセトニトリルが４０：６０の混合液で溶出を行い、目的のサーモルビン２．０ｍｇを得た。
【００１７】
得られたサーモルビンの構造を 1Ｈ−ＮＭＲ（日本電子社製）、13Ｃ−ＮＭＲ（日本電子社製）、マススペクトル（日立社製）、赤外線吸収スペクトル（パーキンエルマ社製）により測定した。
その結果を以下に示す。
【００１８】
Ｎ．Ｍ．Ｒ．（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）
（１） 1Ｈ−ＮＭＲ
δ：３．７９（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，６Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），
７．０１（ｍ，３Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｓ，２Ｈ），
７．８４（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｓ，１Ｈ）
（２）13Ｃ−ＮＭＲ
δ：３８．６，５２．７，６３．７，６４．１，９９．２，１０３．３，
１１４．１，１１６．３，１１７．４，１１７．８，１１９．０，
１１９．３，１１９．６，１２３．０，１２６．３，１２７．９，
１２９．４，１２９．６，１３３．０，１３４．５，１３５．７，
１３６．６，１４０．４，１５３．８，１５７．５，１５８．８，
１６０．０，１６４．５，１６６．２，１７１．６，１８３．５，
１８７．２
（３）マススペクトル
Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ６０１（Ｍ＋Ｈ）．
（４）赤外線吸収スペクトル
Ｉ．Ｒ．ν KBr  ｃｍ-1：１７３３，１６７４，１６１１
この結果より，得られたサーモルビンの構造式は，化学式（１）で示されるものであった。
【００１９】
参考例２
参考例１で得たサーモルビンのマウスに対する急性毒性を以下のようにして測定した。
１群３匹のウィスターラット(Wistar-Inamichi rat，雄，６週齢）にカルボキシメチルセルロースに混合したサーモルビン（参考例１で得たもの）を０．５、１．０、３．０ｇ／ｋｇ体重となるように経口投与し、２４時間にわたり死亡例を観察したが、いずれの群においても、死亡例は認められなかった。以上の結果から、サーモルビンのＬＤ50値（経口）は３．０ｇ／ｋｇ体重以上であることがわかる。
【００２０】
実施例１（アルドースレダクターゼ阻害活性の測定）
牛眼球より水晶体を摘出し、３倍量の冷純水でホモゲナイズした後、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。その上澄みを０．０５Ｍの塩化ナトリウム水溶液で一夜透析したものをアルドースレダクターゼ液とした。以上の操作は４℃で行い、酵素液は−８０℃で保存した。
【００２１】
アルドースレダクターゼの活性測定はハイマンとキノシタ（Hayman and kinoshita）の方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（The journal of Biological Chemistry),240, 877, 1965 〕に基づいて、一部改変して行った。すなわち、硫酸リチウム水溶液（最終濃度４００ｍＭ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（最終濃度０．１５ｍＭ）、上記アルドースレダクターゼ液及び実施例１で得たサーモルビン（最終濃度１０-5Ｍ，１０-6Ｍ，１０-7Ｍ及び１０-8Ｍ）を含むように調製した１００ｍＭのナトリウムカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）０．９ミリリットルにＤＬ−グリセルアルデヒド（最終濃度１０ｍＭ）０．１ミリリットルを加えて、２８℃で５分間反応を行った。その間の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に測定し、そのときのｔａｎθを求めた。阻害剤を添加したときのｔａｎθ値をＡとし、阻害剤を添加していないときのｔａｎθ値をＢとして、次式によって阻害率（％）を求めた。
【００２２】
【数１】
0003681188.tif 000003
【００２３】
その結果、実施例１で得られたサーモルビンの阻害率５０％のときの阻害濃度（ＩＣ50）は、５９×１０-9Ｍであった。
【００２４】
製剤例１（内服用剤）
（イ）錠剤
参考例１で得たサーモルビン            ５０ｍｇ
乳糖                                １２０ｍｇ
結晶セルロース                        ６０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム    ７ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                ３ｍｇ
【００２５】
この錠剤は通常行われるフィルムコーテイングを行っても差し支えなく、更に糖衣を行うこともできる。
【００２６】
（ロ）顆粒剤
参考例１で得たサーモルビン              ３０ｍｇ
ポリビニルピロリドン                    ２５ｍｇ
乳糖                                  ３８５ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース            ５０ｍｇ
タルク                                  １０ｍｇ
【００２７】
（ハ）散剤
参考例１で得たサーモルビン              ３０ｍｇ
乳糖                                  ２４０ｍｇ
デンプン                              ４８０ｍｇ
コロイダルシリカ                        ３０ｍｇ
【００２８】
（ニ）カプセル剤
参考例１で得たサーモルビン              ５０ｍｇ
乳糖                                  １０２ｍｇ
結晶セルロース                          ５６ｍｇ
コロイダルシリカ                          ２ｍｇ
【００２９】
製剤例２（注射液）
蒸留水にサーモルビンを１〜３０mg／mlとなるように溶解した (pH６．５〜７．０）。
【００３０】
製剤例３（点眼液）
５ｍｌ中に次の成分含量を含有させた。
参考例１で得たサーモルビン                    ５０ｍｇ
パラオキシ安息香酸プロピル                  ０．７ｍｇ
パラオキシ安息香酸メチル                    １．３ｍｇ
水酸化ナトリウム                          適量（ｐＨ６．０）
【００３１】
製剤例４（軟膏）
参考例１で得たサーモルビン                    ２０ｍｇ
白色ワセリン                            ８８９．８ｍｇ
流動パラフイン                              １００ｍｇ
パラオキシ安息香酸ブチル                    ０．２ｍｇ
【００３２】
製剤例５（坐剤）
参考例１で得たサーモルビン                    ５０ｍｇ
ポリエチレングリコール１０００              ８００ｍｇ
ポリエチレングリコール                      １５０ｍｇ
【００３３】
【発明の効果】
本発明のアルドースレダクターゼ阻害剤は，安全で，かつ強いアルドースレダクターゼ阻害活性を有しており、糖尿病性合併症の予防及び治療薬として有用である。