(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞の拡大のための細胞培養物を得；
ｂ）該細胞培養物から複数の細胞を選択し；
ｃ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定し；次いで
ｄ）ＭＦＡＰ５の平均発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、方法。
【請求項２】
さらに、複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを決定し、工程（ｄ）において、軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよびＭＦＡＰ５の平均発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭＦＡＰ５マーカーおよび軟骨細胞マーカーが、軟骨細胞におけるそれらの（ＭＦＡＰ５マーカーに対する軟骨細胞マーカーの）発現レベルの比率が皮膚の線維芽細胞または滑膜細胞と同等のまたは５倍高い比率であるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項２記載の方法。
【請求項７】
発現レベルが、ＰＣＲを用いて決定される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
発現レベルが、比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される場合、０．２５より高いＭＦＡＰ５に対する軟骨細胞マーカーの発現レベルの比率が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
０．５５より高いＭＦＡＰ５に対する軟骨細胞マーカーのモル比が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養物が、軟骨の生検から得られた細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
軟骨の生検が、膝関節から取得されるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養物の評価後の細胞培養物由来の細胞が、それを必要とする患者に投与されるためのものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
培養物由来の細胞が、自家培養軟骨細胞の移植に用いられるためのものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞の拡大のための細胞培養物を得；
ｂ）該細胞培養物中のＭＦＡＰ５の発現レベルを決定し；次いで
ｃ）ＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて細胞培養物の組成を決定すること
を含むものである方法。
【請求項１６】
さらに、細胞培養物中の軟骨細胞マーカーの発現レベルを決定し、工程ｃ）において、軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて細胞培養物の組成を決定することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）哺乳動物由来の軟骨の生検から細胞を単離し；
ｂ）該単離された細胞を細胞培養物中で培養して軟骨細胞を生産し；
ｃ）前記細胞培養物から得られた複数の細胞におけるＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルを決定し；次いで
ｄ）ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定すること
を含むものである方法。
【請求項２１】
ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
発現レベルがＰＣＲを用いて決定される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される場合、０．２５より高いＭＦＡＰ５に対するＨＡＰＬＮ１の発現レベルの比率が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
０．５５より高いＭＦＡＰ５に対するＨＡＰＬＮ１のモル比が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）哺乳動物由来の軟骨の生検から細胞を単離し；
ｂ）該単離された細胞を細胞培養物中で培養して軟骨細胞を生産し；
ｃ）前記細胞培養物から得られた複数の細胞におけるＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルを決定し；次いで
ｄ）ＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルに基づいて該細胞培養物の軟骨細胞の存在を決定すること
を含むものである方法。
【請求項２７】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨または滑膜由来の細胞を含む細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｂ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、方法。
【請求項３０】
軟骨細胞培養物の組成を評価して、線維芽細胞および／または滑膜細胞の存在を同定する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｂ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より高いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が線維芽細胞および／または滑膜細胞を含むことを示す、方法。
【請求項３１】
細胞培養物の組成を評価して、線維芽細胞および／または滑膜細胞に対する軟骨細胞の比率を決定する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞培養物の細胞カウントを行い；
ｂ）該細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｃ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より高いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞より、線維芽細胞および／または滑膜細胞を多く含むことを示し、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が線維芽細胞および／または滑膜細胞より、軟骨細胞を多く含むことを示す、方法。
【請求項３２】
さらに、複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを決定し、軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて線維芽細胞および／または滑膜細胞に対する軟骨細胞の比率を決定することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年４月６日提出の仮出願６０／９１０，５７４の優先権を主張するもので、その内容を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、細胞培養物の組成物を調べる方法、より詳細には、軟骨細胞と線維芽細胞を区別する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節軟骨への損傷は、一部には軟骨における血液供給の不足により低い修復率を示す（非特許文献１）。膝関節への外傷は、例えば、軟骨および骨軟骨の損傷を生じ得、かかる損傷は骨関節炎を進行しうる（非特許文献２）。骨関節炎の深刻な場合には、人工膝関節置換術が必要となりうる。しかしながら、膝関節置換術で用いられる人工装具は寿命が限られており、それゆえ膝関節置換は特に高齢ではない患者にとって最善の手段ではない（Brittberg et al., 前掲）。
【０００４】
ある場合では、関節軟骨の損傷は、自家培養軟骨細胞の移植により修復されうる（非特許文献３）。この手法では、軟骨細胞が患者から採取され、細胞培養で広げて軟骨細胞数を増加させ、次いで患者の損傷部位に戻される。軟骨細胞は損傷部位を塞ぐために骨膜弁で覆われる。培養された軟骨細胞は培養中に脱分化する傾向を示すが、成功した移植では、脱分化した軟骨細胞は分化能を保持しており、移植により硝子軟骨を産生する軟骨細胞に再分化する。
【０００５】
マトリックス誘導性自家培養軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ（商標）移植法）として知られる改良技術において、培養された軟骨細胞は、それらが患者移植される前にコラーゲンマトリックス上に載せられる（Basad et al., 前掲）。さらに、コラーゲンマトリックスは、縫合よりむしろフィブリン糊で固定することができ、より簡単な外科的技術で行われる。
【０００６】
軟骨細胞を培養するために、異なる技術および培地を用いることができる。軟骨細胞の培養のための血清を含まない培地および軟骨細胞の単離と増殖のための方法の例は、例えば、出典明示により本明細書に援用される、特許文献１〜３に記載されるもので、その内容を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００７】
線維芽細胞または（滑膜細胞のごとき）線維芽細胞様の細胞は、軟骨細胞と一緒に共単離され、それにより軟骨細胞の移植片を調製する過程において細胞培養で共増殖されうる。軟骨細胞は、それらが培養中に脱分化する時に線維芽細胞の外見をとることが知られている（非特許文献４）。それにもかかわらず、それらは、分化能力を維持し、すなわち、それらは、移植時に軟骨細胞の表現形を再発現することができる。結果として、外見に基づいて、培養された脱分化した軟骨細胞を、共培養した線維芽細胞または線維芽細胞様の細胞から区別することは困難でありうる。
【０００８】
さらに、培養され、脱分化した軟骨細胞における遺伝子発現パターンは、天然の軟骨の軟骨細胞のものとは異なる。例えば、天然の軟骨の軟骨細胞で高度に発現される多くのマーカーは、培養した軟骨細胞では減少したレベルで発現される（非特許文献５）。したがって、かかる軟骨細胞マーカーの発現は、脱分化した軟骨細胞を細胞培養中に存在しうる他のタイプの細胞から必ずしも区別しうるわけではない。さらに、多くの公知の線維芽細胞マーカーは、レベルは異なるとしても、脱分化した軟骨細胞および天然の軟骨の軟骨細胞の両方で発現される。したがって、かかる線維芽細胞マーカーの発現レベルは、必ずしも、サンプル中に存在する細胞が脱分化した軟骨細胞、線維芽細胞、または線維芽細胞様の細胞であるかどうかを示しうるわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，１５０，１６３号
【特許文献２】米国特許第７，１６９，６１０号
【特許文献３】米国仮出願第６０／８０５，３０７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Basad et al., In: Hendrich et al., Cartilage Surgery and Future Perspectives, Thieme Verlag, 49-56 (2003)
【非特許文献２】Brittberg et al., New England Journal of Medicine, 331 (14): 889-895 (1994)
【非特許文献３】Brittberg et al., Clin. Orthopaed. ReI. Res., 367S: S147-S155 (1999)
【非特許文献４】Benya and Shaffer, Cell, 30: 215-224 (1982)
【非特許文献５】Binette et al., J. Orthopaed. Res., 16: 207-216 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
軟骨細胞、線維芽細胞および線維芽細胞様の細胞を同定する方法、特に細胞培養に適用可能な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一定の態様において、本発明の方法は、（例えば、線維芽細胞から軟骨細胞を区別するために）細胞培養物の組成物を評価する方法および（軟骨細胞としての）各細胞の表現形を評価する方法が開示される。本発明の方法は、例えば、軟骨欠失の処置に用いられる軟骨細胞の培養を評価するために用いられうる。いくつかの具体例において、本発明は、線維芽細胞マーカーの発現レベルに基づいた細胞培養組成物の同定または細胞の同定に関する。その他の具体例において、本発明は、細胞培養サンプルまたは各細胞における少なくとも１つの軟骨細胞マーカーおよび少なくとも１つの線維芽細胞マーカーの発現レベルを比較することに関する。実施例において、軟骨細胞マーカーは、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＨＡＰＬＮ１）であり、線維芽細胞マーカーは、ミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）である。
【００１３】
本発明は、少なくとも部分的に、線維芽細胞および滑膜細胞のごとき一定の非軟骨細胞の細胞タイプで高度に発現される一方で、軟骨細胞で極めて低いレベルで発現される細胞表現形マーカーとしてのＭＦＡＰ５の同定に基づく。本発明はさらに、少なくとも部分的に、ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１のごとき軟骨細胞マーカーの発現レベルの比率が軟骨の生検に由来する培養物における信頼性のある指標であることを見出したことに基づく。いくつかの条件下で、（細胞培養物の組成物または各細胞の表現形を確認するために）両タイプのマーカー（すなわち、線維芽細胞および軟骨細胞マーカー）を用いることが所望されうる一方で、本発明はまた、ＭＦＡＰ５マーカー単独の標準化された発現レベルを調べることがこの目的に十分でありうる具体例を提供する。
【００１４】
いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、ＭＦＡＰ５以外であり、その標準化発現レベルが線維芽細胞レベルより軟骨細胞においてより低いものである。いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、その標準化発現レベルが線維芽細胞および／または滑膜細胞より軟骨細胞（例えば、初代および／または継代軟骨細胞）においてより低いものである。いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、線維芽細胞および／または滑膜細胞より軟骨細胞において、少なくとも２、５、８、１０倍低く発現される。
【００１５】
それゆえ、１の態様において、本発明は、細胞培養物、例えば、暫定的に軟骨細胞を含む細胞培養物の組成物を評価する方法（方法１）；ならびに各細胞の表現形を評価する方法（方法２）を提供する。方法１の具体例において、各マーカーの発現レベルは、複数の細胞（培養サンプル）におけるそのマーカーの平均発現レベルとして調べられる。方法１の具体例において、細胞培養物の組成物は、それが軟骨細胞を含むかどうかを調べて全体として評価されうる。方法２の具体例において、マーカーの発現レベルは、評価される各細胞におけるそのマーカーの発現レベルとして調べられる。方法１が細胞培養物の組成物を同定する一方で、方法２は、各細胞の表現形、例えば、細胞が軟骨細胞であるかどうかを同定する。
【００１６】
いくつかの具体例において、方法１は：
ａ）複数の細胞を細胞培養物から得；
ｂ）細胞培養物に由来する複数の細胞における本発明の線維芽細胞マーカーの平均発現レベルを調べ；次いで
ｃ）発現レベルに基づいて培養物の組成物を調べること；
を含み、ここで、所定の閾値より低い発現レベルは、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す。別に、所定の閾値より高い発現レベルは、細胞培養物が軟骨細胞を含まないこと（例えば、培養物が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の軟骨細胞を含まないこと）を示す。
【００１７】
いくつかの具体例において、方法１は、線維芽細胞マーカー（ＭＦＡＰ５または別の線維芽細胞マーカー）および軟骨細胞マーカー（例えば、ＨＡＰＬＮ１）の発現レベルを対照と、または相互に比較することに関する。いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーおよび軟骨細胞マーカーは、初代および／または継代軟骨細胞における（軟骨細胞マーカーの線維芽細胞マーカーに対する）それらの発現レベルの比率が、培養された線維芽細胞における発現比率と同等であるか、または５、１０、２０、３０、５０、７５、１００倍またはそれ以上の発現レベルであるものである。
【００１８】
特に、いくつかの具体例において、方法１は：
ａ）複数の細胞を細胞培養物から得；
ｂ）この複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを調べ；
ｃ）複数の細胞における線維芽細胞マーカーの平均発現レベルを調べ；次いで
ｄ）軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの平均発現レベルに基づいて培養物の組成物を調べることを含む。
いくつかの具体例において、培養物は、軟骨細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より高い一方で、線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より低い場合に軟骨細胞を含むものとして同定される。別に、所定の閾値より高い線維芽細胞マーカーの発現レベルは、細胞培養物が軟骨細胞を含まないこと（例えば、培養物が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の軟骨細胞を含まないこと）を示す。
【００１９】
いくつかの具体例において、培養組成物を調べる工程は、軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの平均発現レベルを比較することを含む。いくつかの具体例において、マーカーの発現は相互に相対的に比較される（それゆえ、閾値は、例えば、２つのマーカーの発現レベル間の一定の差異、またはその比率として定義されうる）。例えば、いくつかの具体例において、所定の閾値より高い、例えば、０．２５、０．５５、１、２、２．２、５、１０、２５、５０またはそれ以上である、軟骨細胞マーカー（例えば、ＨＡＰＬＮ１）の発現レベルの線維芽細胞マーカー（例えば、ＭＦＡＰ５）の発現レベルに対する比率は、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す。
【００２０】
方法１のいくつかの具体例において、軟骨細胞および線維芽細胞マーカーの発現レベルが、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲの検量線法によるか、あるいは（線維芽細胞マーカーおよび軟骨細胞マーカーに必要とされる閾値サイクル数の差異を測定する）定量ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により、ＲＮＡレベルで調べられる。
【００２１】
関連の態様において、本発明は、例えば、フローサイトメトリーまたはｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて、各細胞の表現形を評価する方法（方法２）を提供する。前記方法は、軟骨または滑膜に由来する細胞培養物、軟骨細胞培養物、線維芽細胞培養物、滑膜細胞培養物、あるいはいずれかの他の適当な培養物を含む細胞培養物に由来する各細胞を同定するのに有用である。前記方法はまた、軟骨サンプル、滑膜サンプル、線維芽細胞サンプルなどを含む各細胞を同定することが望ましいところの、いずれかの適当な生物学的サンプルに由来する各細胞を同定するのに有用である。方法２における線維芽細胞および軟骨細胞マーカーは、方法１で記載されるごとく選択され、評価されてもよい。
【００２２】
いくつかの具体例において、方法２は：
ａ）細胞における本発明の線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べ；次いで
ｂ）線維芽細胞マーカーの発現レベルに基づいて細胞の表現形を調べること
を含み、ここで、所定の閾値より低い発現レベルは、細胞が軟骨細胞であることを示す。別に、所定の閾値より高い発現レベルは、細胞が軟骨細胞ではないこと（例えば、線維芽細胞または滑膜細胞）を示す。いくつの具体例において、方法２は：
ａ）細胞における軟骨細胞マーカーの発現レベルを調べ；
ｂ）細胞における線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べ；次いで
ｃ）軟骨細胞マーカーの発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの発現レベルに基づいて細胞の表現形を評価すること
を含む。
いくつかの具体例において、軟骨細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値レベルより高い一方で、線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値レベルより低い場合に、細胞は、軟骨細胞として同定される。別に、軟骨細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より低い一方で、線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より高い場合に、細胞は、軟骨細胞ではない。
いくつかの具体例において、細胞の表現形を評価する工程ｃ）は、軟骨細胞マーカーの発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの発現レベルを比較することを含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、以下の記載で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、軟骨細胞の生検から培養された軟骨細胞を産生するのに用いられる典型的な製造プロセスの段階を示すフロー図である。
【図２】図２は、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられたいくつかの細胞株におけるＨＡＰＬＮ１発現レベルを示す。発現レベルは、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化された。初代軟骨細胞（ＰＣ）における発現レベルが１とされ；それに合わせて他の比率が縮尺された。
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられるように、図２で示されるものと同一の細胞株におけるＭＦＡＰ５の発現レベルを示す。発現レベルは、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化された。初代軟骨細胞（ＰＣ）における発現レベルが１とされ；それに合わせて他の比率が縮尺された。
【図４】図４は、図２および図３からのＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。初代軟骨細胞（ＰＣ）における比率が１とされ；それに合わせて他の比率が縮尺された。
【図５】図５は、図２で示されるものと同一の株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられ、比率が２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図６】図６は、多くのさらなる軟骨細胞および滑膜細胞株におけるＨＡＰＬＮ１発現レベルを示す。発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられ、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化された。初代軟骨細胞（ＰＣ）における発現レベルは１とされ；それに合わせてその他の比率が縮尺された。使用した細胞株が表３に記載される。
【図７】図７は、図６に示されるものと同一の株におけるＭＦＡＰ５発現レベルを示す。発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられ、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化された。初代軟骨細胞（ＰＣ）における発現レベルが１とされ；それに合わせて他の比率が縮尺された。
【図８】図８は、図６および７からのＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。初代軟骨細胞（ＰＣ）における比率が１とされ；それに合わせてその他の比率が縮尺された。
【図９】図９は、図６に示されるものと同一の株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられ、比率が２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図１０】図１０Ａは、図２および６で示されるものと同一の株、ならびに表４で同定されるさらなる軟骨細胞、滑膜細胞、および皮膚の線維芽細胞株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。発現レベルは、実施例３に示されるごとき特注設計のプライマーとプローブを用いるＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられた。ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５比率は、２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。図１０Ｂは、表５で同定されるさらなる細胞株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。発現レベルは、図１０Ａに記載されるものと同一の方法を用いて調べられた。
【図１１】図１１は、単層およびコラーゲン足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）培養におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率間の比較を示す。使用した細胞株は表７に記載される。ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルはＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられた。発現レベルは１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化された。初代軟骨細胞（ＰＣ）の単層培養における比率が１とされ；それに合わせてその他の比率が縮尺された。
【図１２】図１２は、図１１に示されるものと同一の株を用いる単層およびコラーゲン足場培養におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率間の比較を示す。ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられ、比率は２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図１３】図１３は、培養レベルに応じたＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率の変化を示す。３つの滑膜細胞株は、図に示されるように、初代培養（培養レベル１）から４回の継代（培養レベル５）を通して培養された。ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられ、比率は２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、培養レベルによるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率の変化を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂにおいて、軟骨細胞株は、図で示されるように、軟骨から採取され（培養レベル０）、次いで初代（培養レベル１）から第二継代（培養レベル３）を通して培養された。発現レベルは、実施例５に記載されるごとき特注設計のプライマーとプローブを用いるＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられた。ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５比率は２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図１５】図１５は、軟骨細胞および滑膜細胞の混合した集団の培養におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルの比率を示す。３回の実験が実施され、各々、２つの細胞タイプの様々な割合で行われた。発現レベルは、実施例６に記載されるごとき特注設計のプライマーとプローブを用いるＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べられた。ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５比率は２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出された。
【図１６】図１６は、絶対量測定法により調べられるマーカーの絶対的なコピー数を用いて、表１２に記載される様々な細胞株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルのモル比を示す。２μｌのｃＤＮＡが１３μＬのＰＣＲ反応あたりに用いたことを除いて、ＲＴ−ＰＣＲは、実施例３に記載されるとおりに行われた。検量線は、１０３、１０４、および１０５コピー／反応における合成ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５  ＲＮＡ転写標準物を実行することから調製された。各試験サンプルに存在するＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５  ｍＲＮＡコピー量はこれらの検量線から調べられた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部において、線維芽細胞および滑膜細胞のごとき一定の非軟骨細胞型において高度に発現される一方で、軟骨細胞では極めて低く発現される遺伝子としてのＭＦＡＰ５の同定に基づく。したがって、いくつかの具体例において、本発明は、細胞の表現形マーカーとしてＭＦＡＰ５を用いる方法を提供する。ＭＦＡＰ５は、フィブリリンに結合し、Ｉ型プロコラーゲンの安定化に関与されることが報告されたセリン−スレオニンリッチタンパク質である（Lemaire et al., Arthritis & Rheumatism, 52(6):1812-1823 (2005)）。ヒトＭＦＡＰ５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受入番号ＮＭ＿００３４８０で見出すことができ；そのヌクレオチド配列はまた、配列番号１として提供される。ＭＦＡＰ５に加えて、または代えて、その他の線維芽細胞マーカーもまた、以下に記載されるように、本発明の方法に用いることができる。
【００２６】
したがって、１の態様において、本発明は、軟骨細胞を含む細胞培養物の組成物を評価する方法（方法１）および各細胞の表現形を評価する方法（方法２）を提供する。
【００２７】
方法１に関する具体例において、各マーカーの発現レベルは、複数の細胞におけるマーカーの平均発現レベルとして調べられる。方法１の具体例において、細胞培養物の組成物は、それが軟骨細胞を含むかどうかを調べるために全体として評価されてもよい。方法２の具体例において、マーカーの発現レベルは、評価される各細胞におけるマーカーの発現レベルとして調べられる。それゆえ、方法１は細胞培養物の組成物を同定する一方で、方法２は、各細胞の表現形、例えば、細胞が軟骨細胞であるかどうかを同定する。
【００２８】
いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、ＭＦＡＰ５以外であり、その標準化された発現レベルは線維芽細胞より軟骨細胞においてより低いものである。いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、その標準化された発現レベルが線維芽細胞（例えば、皮膚の線維芽細胞）および／または滑膜細胞におけるより軟骨細胞（例えば、初代軟骨細胞、培養した脱分化軟骨細胞）においてより低いものである。いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーは、線維芽細胞および／または滑膜細胞におけるより軟骨細胞において少なくとも２−、５−、８−、１０倍低いか、またはそれより低く発現される。かかるさらなるマーカーは、例えば、Leung et al., Trends in Genetics, 19(11): 649-659 (2003)に記載されるごとき遺伝子アレイ解析を用いて同定されうる。
【００２９】
いくつかの具体例において、方法１は、細胞培養物から複数の細胞における本発明の線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べ、所定の閾値より低い発現レベルが、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示すことを含む。別に、所定の閾値より高い発現レベルは、細胞培養物が軟骨細胞を含まないこと（例えば、培養物が少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の軟骨細胞を含まないこと）を示す。
【００３０】
実施態様において、線維芽細胞マーカーはＭＦＡＰ５であり、細胞培養物によるＭＦＡＰ５の閾値より高い発現は、培養物が相当な数の非軟骨細胞を含むことを示す。いくつかの具体例において、所定の閾値レベルは、１）純粋な線維芽細胞の培養物におけるＭＦＡＰ５発現と同等またはそれより低い（例えば、２、３、４、または５倍低い）か、あるいは２）純粋な軟骨細胞（例えば、軟骨の生検から得られた初代軟骨細胞）の培養におけるＭＦＡＰ５発現のレベルと同等またはそれより高い（例えば、２、３、４、または５倍より高い）。ＭＦＡＰ５以外の線維芽細胞マーカーについて、所定の閾値は、純粋な線維芽細胞および／または軟骨細胞における各マーカーの発現レベルに基づいて、類似性で選択されうる。「所定の」レベルは、マーカー発現レベルを調べる前に選択されている必要はなく、発現レベルが調べられた後に、例えば、発現結果の統計的解析に基づいて調べられてもよい。
【００３１】
評価中の培養物からの複数の細胞は、その培養物から得られたサンプルまたは一定分量により示されてもよい。例えば、コラーゲンマトリックス上で増殖された培養物の場合には、パンチサンプリングが実施例に記載されるごとき用いられうる。複数の細胞は、典型的に、少なくとも、一定の方法の発現解析を実施するのに十分な細胞数、またはそれ以上を含む。例えば、ＰＣＲについては、通常わずか１０−１，０００個の細胞で十分であるが、より少ない数であっても用いることができる。
【００３２】
いくつかの具体例において、方法１および方法２は、コントロールまたはお互いに対して、線維芽細胞マーカー（ＭＦＡＰ５または別の線維芽細胞マーカー）および軟骨細胞マーカー（例えば、ＨＡＰＬＮ１または別の軟骨細胞マーカー）の発現レベルを比較することに関する。いずれのマーカーの発現レベルが調べられる順番は変更することができる。例えば、１つは、最初に軟骨細胞マーカーの発現レベルを調べ、次に線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べることができ、あるいはその逆もありうる。いくつかの具体例において、マーカーの両方のタイプの発現レベルは、同時に調べることができる。
【００３３】
本発明の方法で有用ないくつかの軟骨細胞マーカーの例は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号および配列番号を含み、表１で供される。それゆえ、いくつかの具体例において、軟骨細胞マーカーは、ＨＡＰＬＮ１、ＭＧＰ、ＥＤＩＬ３、ＷＩＳＰ３、ＡＧＣ１、ＣＯＭＰ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＬＥＣＴ１、Ｓ１００Ｂ、ＣＲＴＡＣ１、ＳＯＸ９、およびＮＥＢＬから選択される。
【表１−１】
0005383654.tif 000002
【表１−２】
0005383654.tif 000003
【００３４】
さらなる軟骨細胞マーカーは、例えば、Leung et al., Trends in Genetics, 19(11): 649-659 (2003)に記載されるごとく、例えば、遺伝子アレイ解析を用いて同定することができる。一般的に、軟骨細胞マーカーは、標準化された発現レベルが、線維芽細胞（例えば、皮膚の線維芽細胞）および／または滑膜細胞におけるより軟骨細胞（例えば、初代軟骨細胞、培養した脱分化軟骨細胞）においてより高い遺伝子またはタンパク質である。いくつかの具体例において、軟骨細胞マーカーは、線維芽細胞および／または滑膜細胞におけるより軟骨細胞マーカーにおいて、少なくとも２、４、５、８、１０、５０、７５、１００倍またはそれより高く発現される。
【００３５】
いくつかの具体例において、線維芽細胞マーカーおよび軟骨細胞マーカーは、初代軟骨細胞および／または継代軟骨細胞における発現レベルの比率が、皮膚の線維芽細胞および／または滑膜細胞における発現レベルの比率と同等、あるいは５、１０、２０、３０、５０、７５、１００倍またはそれ以上となるような方法で選択される。
【００３６】
特に、いくつかの具体例において、方法１は：
ａ）細胞培養物から複数の細胞を得；
ｂ）複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを調べ；
ｃ）複数の細胞における線維芽細胞メーカーの平均発現レベルを調べ；次いで
ｄ）軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの平均発現レベルに基づいて培養物の組成物を調べること
を含む。
いくつかの具体例において、培養物は、軟骨細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より高く、一方で線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より低い場合に、軟骨細胞を含むものと同定される。代替的に、培養物は、軟骨細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値より低く、一方で線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値レベルより高い場合に、軟骨細胞を含まない（例えば、培養物は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の軟骨細胞を含まない）。
【００３７】
方法１のさらなる具体例において、本発明は、細胞培養物の組成物を評価する方法を含み、前記方法が：
ａ）哺乳動物から軟骨の生検を得；
ｂ）生検から細胞を単離し；
ｃ）工程ｂ）で単離された細胞を細胞培養物中で培養し；
ｄ）細胞培養物のサンプルを得；
ｅ）サンプルから１つまたはそれ以上の細胞におけるＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルを調べ；次いで
ｆ）ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルに基づいて培養物の組成物を調べること
を含むものである。
【００３８】
いくつかの具体例において、培養物の組成物を調べる工程は、軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの平均発現レベルを比較することを含む。いくつかのかかる具体例において、細胞培養物は、ＨＡＰＬＮ１発現のＭＦＡＰ５に対する比率が０．２５より高い場合に軟骨細胞を含むことと評価される。特定の具体例において、この比率は、細胞培養物が少なくとも５０％の軟骨細胞を含むことを示す。
【００３９】
いくつかの具体例において、マーカーの発現レベルは、互いに相対的に比較される（それゆえ、閾値は、例えば、２つのマーカーの発現レベル間の一定の差異またはその比率として定義されてもよい）。例えば、いくつかの具体例において、所定の閾値、例えば、０．２５、０．５５、１、２、２．２、５、１０、２５、５０またはそれ以上より高い、軟骨細胞マーカー（例えば、ＨＡＰＬＮ１）の発現レベルの線維芽細胞マーカー（例えば、ＭＦＡＰ５）の発現レベルに対する比率は、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す。
【００４０】
方法１のいくつかの具体例において、軟骨細胞および線維芽細胞マーカーの発現レベルは、例えば、（線維芽細胞マーカーおよび軟骨細胞マーカーに必要とされる閾値サイクル数の差異を測定する）定量ＲＴ−ＰＣＲの検量線法または定量ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法によりＲＮＡレベルで調べられる。
【００４１】
関連する態様において、本発明は、例えば、フローサイトメトリーを用いて、各細胞の表現形を評価する方法（方法２）を提供する。この方法は、軟骨または滑膜に由来する細胞培養物、軟骨細胞培養物、線維芽細胞培養物、滑膜細胞培養物、あるいはいずれか他の適当な培養物を含む細胞培養物から各細胞を同定するのに有用である。この方法はまた、軟骨サンプル、滑膜サンプル、線維芽細胞サンプルなどを含む、各細胞を同定することが所望されるいずれか適当な生物学的サンプルに由来する各細胞を同定するのに有用である。いくつかの具体例において、方法２は、細胞における本発明の線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べ、所定の閾値より低い発現レベルは、細胞が軟骨細胞であることを示すことを含む。代替的に、所定の閾値より高い発現レベルは、細胞が軟骨細胞ではないこと（例えば、細胞が線維芽細胞または滑膜細胞であること）を示す。いくつかの具体例において、方法２は：
ａ）細胞における軟骨細胞マーカーの発現レベルを調べ；
ｂ）細胞における線維芽細胞マーカーの発現レベルを調べ；次いで
ｃ）軟骨細胞マーカーの発現レベルおよび線維芽細胞マーカーの発現レベルに基づいて細胞の表現形を評価すること
を含む。
いくつかの具体例において、細胞は、軟骨細胞の発現レベルが所定の閾値レベルより高く、一方で線維芽細胞マーカーの発現レベルが所定の閾値レベルより低い場合に、軟骨細胞として同定される。方法２の具体例における線維芽細胞および軟骨細胞マーカーは、上記の方法１に関して記載されるごとく選択され、評価されてもよい。
【００４２】
フローサイトメトリーは、市販されている抗体を用いて行われうるか、あるいはかかる抗体は、例えば、Linsenmeyer et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 92(2): 440-6 (1980)に記載されるごとく調製されてもよい。
【００４３】
本発明の方法により評価される細胞および培養物は、軟骨細胞を含んでいてもよく、あるいは含んでいなくてもよい、いずれの組織、細胞培養物、またはその他の物質を含む、いずれの生物学的サンプルから得られてもよい。いくつかの具体例において、評価される細胞または培養物は、哺乳動物、特に、ヒトを起源とするものである。いくつかの具体例において、細胞培養物は、軟骨の生検から解離された細胞から増殖される。例えば、自家培養軟骨細胞移植において、この方法のための軟骨細胞は、通常、移植を受ける患者の軟骨の生検から培養される。Ｃａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨製品（マサチューセッツ州、ケンブリッジのＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、培養した軟骨細胞製品の一例である。本発明のいくつかの具体例において、細胞培養物は、軟骨細胞を載せたコラーゲンマトリックスを含む。かかる軟骨細胞は、軟骨の生検から得られ、例えば、ＭＡＣＩ（商標）移植製品中で用いられるごときマトリックス上に載せられる前に培養されてもよい。本発明の方法は、マトリックスを移植する前にコラーゲン支持体上に載せられた細胞を同定し、および／または同定を確認するのに有用である。
【００４４】
細胞培養物の判定方法の用途の一例を示すために、図１が参照される。この図は、Ｃａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を用いるごとく自家培養軟骨細胞移植のために培養した軟骨細胞産物を産生すること、あるいはＭＡＣＩ（商標）移植法のために培養した軟骨細胞産物を産生することに関する工程を示す。工程１において、自家培養軟骨細胞移植を受ける患者からの軟骨の生検は、加工（工程２）のために輸送される。生検の物質は、工程３で消化されて軟骨から軟骨細胞が解離され、採取される。解離された細胞は、組織培養フラスコに置かれ、工程４で初代培養において広げられ、必要であれば、継代培養される。細胞が適切な数に達すると、それらは、患者が移植を受ける準備ができるまで、任意選択的に、工程５で凍結保存されうる。患者が細胞を受ける準備ができると、それらは溶解され、組織培養フラスコ内に載せられ、増殖されて集合培養物が調製される（工程６）。
【００４５】
自家培養軟骨細胞移植における使用について、十分な数の細胞が集合培養で得られる場合、細胞は細胞沈殿物まで遠心分離され、出荷培地中に再懸濁され、それはＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞製品のごとき「最終製品」である（工程８）。この「最終製品」は、例えば、滅菌テスト、細胞生存テスト、エンドトキシンテスト、マイコプラズマテスト、および培養組成物テストを含む、多くのＱＣテスト（明細書に記載されるごとき工程９「ＱＣ同一性」）にかけられることにより、培養した細胞が十分な数の軟骨細胞を含むことが確認される。培養した細胞が全てのＱＣテストを通過した場合、それらは移植の患者に向けて出荷される（工程１１）。
【００４６】
代替的に、工程６からの集合培養物がＭＡＣＩ（商標）移植に用いられる際、細胞は、培地中に再懸濁され、コラーゲン足場上に播種され、次いで４日間培養される（工程７）。培養期間の終結時に、細胞は、出荷用培地で洗われてＭＡＣＩ（商標）移植用の最終製品が産生される。この製品はまた、上記に概説したＱＣテストにかけられる。したがって、最終製品がＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞のごとき培養した軟骨細胞の懸濁液であろうと、あるいは最終製品がＭＡＣＩ（商標）移植用の足場に播種された産物であろうと、本発明は、培養物の出荷前に軟骨細胞を含むものとして細胞培養物の組成物を確認する、多くの同定アッセイまたは解離アッセイとして有用である。例えば、「ＱＣ同一性」（工程９）は、最終製品の組立前、例えば、工程４、５、６、７、または８前のいずれかの工程で行われうる。
【００４７】
遺伝子またはタンパク質の発現レベルを調べる多くの方法は、Sambrook et al. (eds.)
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989； Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al. (eds.) New York:
John Wiley and Sons, 1998）に記載されるごとく当業者に知られている。かかる方法の例は、（ＰＣＲによる絶対量測定、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ、多重または単一ＰＣＲを含む）ポリメラーゼ鎖反応、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ＰＣＲ、ノザンブロットアッセイ、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、ゲルまたはキャピラリーのごとき電気泳動アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈殿アッセイ、ＨＰＬＣまたはゲルクロマトグラフィーのごときクロマトグラフィーに基づいたアッセイ、質量分析アッセイ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、ＤＮＡメチル化アッセイ、およびヒストン修飾解析アッセイを含む。
【００４８】
本発明の全ての方法において、ＲＮＡまたはタンパク質レベルにおける発現レベルは、従来の方法のいずれか１つを含むいずれかの適当な方法を用いて調べることができる。ＲＮＡレベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロッティング、またはＲＮＡレベルを調べるためのいずれか他の方法により、あるいは実施例に記載されるごとく調べられてもよい。タンパク質レベルは、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、酵素活性アッセイ、またはタンパク質レベルを調べるためのいずれか他の方法を用いることにより調べられてもよい。発現レベルは、サンプルおよび／またはコントロールにおけるＲＮＡまたはタンパク質の総量あたりに縮尺および／または標準化されてもよく、コントロールは、典型的に、ベータ−アクチンまたはグリセルアルデヒド−３−ホスホデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、または１８Ｓ  リボソームＲＮＡなどのごときハウスキーピング遺伝子であってもよい。標準化は、典型的に、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡの投入量における変動の割合を計算することで行われる。例えば、実施例では、発現レベルは検量線を用いて１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化される。
【００４９】
実施態様において、線維芽細胞および軟骨細胞マーカーの発現レベルは、相対的な定量化のための検量線によるか、または比較ＣＴ法による、ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べられる。いくつかの具体例において、マーカーコピー数の絶対量測定は、マーカーの公知な量を用いる検量線を作製することにより調べることができる。かかるアッセイを実施するための一般的な方法は、例えば、Real-Time PCR Systems: Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 7300/7500 Real-Time PCR Systems, Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005,Part No. 4348358 Rev. Eに記載される。
【００５０】
比較ＣＴ法を用いて２つのマーカーを比較する場合、線維芽細胞マーカーの発現レベルの軟骨細胞マーカーの発現レベルに対する比率量は、（１＋Ｅ）＾（ＣＴ，ｆ−ＣＴ，ｃ）［式中、ＣＴ，ｆは、線維芽細胞マーカーの閾値サイクル数であり、ＣＴ，ｃは、軟骨細胞マーカーの閾値サイクル数であり、ただし、増幅の効率（Ｅ）は、両方のマーカーで同一であり、両方のマーカーの開始量が（例えば、２つずつのサンプルにおける）内在性コントロールと同一量に標準化されるものとする］として算出することができる。Ｅ＝１の場合、実施例で示されるように、比率は２＾（ＣＴ，ｆ−ＣＴ，ｃ）に近似されうる。別の方法では、計算は、リアルタイムＰＣＲシステム：Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 7300/7500 Reai-Time PCR Systems, Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005, Part No. 4348358 Rev. Eの付録Ａに記載されるごとく行われうる。
【００５１】
本発明のさらなる具体例は以下の実施例で示されるが、それらは例示とされ、発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
実施例１：軟骨細胞、滑膜細胞および線維芽細胞におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現
細胞の単離および培養――ヒト軟骨細胞培養物を、Ｃａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法または培養した軟骨細胞を産生するプロテアーゼ法を用いて軟骨から単離した。Ｃａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて、軟骨組織から骨と滑膜を取り除き、第１の消化にかけ、組織をコラゲナーゼ溶液を用いて３７℃で１８時間酵素学的に処理した。第１の消化から解離された細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびゲンタマイシンを含む培地（ＥＧＨＸＸ）の入った組織培養フラスコに置いた。次いで、細胞を第２の消化にかけ、第１の消化からの残りの組織を、コラゲナーゼ／トリプシン溶液を用いて３７℃で２．５時間処理した。第２の消化により解離された細胞を、ＥＧＨＸＸの入った組織培養フラスコに置いた。第２の消化後に残っている組織片を、ＥＧＨＸＸの入った組織培養フラスコに置いた。プロテアーゼ単離法を用いて、軟骨組織から骨と滑膜を取り除き、プロナーゼＥ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液中で３７℃において１．５時間第１の消化にかけた。次に、プロナーゼ溶液を取り除き、軟骨の第２の消化を、コラゲナーゼ溶液中で３７℃において１８時間行った。次いで、解離された細胞をＥＧＨＸＸの入った組織培養フラスコに置いた。単離後の細胞培養方法は、いずれの単離方法から得た細胞に関して同一である。初代細胞培養物に、２から４日ごとに新鮮なＥＧＨＸＸを提供した。それらを単一細胞の懸濁液へとトリプシン化し、ＥＧＨＸＸで中和してトリプシンを不活性にし、細胞のカウントを行った。次いで、生じた細胞懸濁液をサンプリングし、さらに継代培養により広げ、あるいは長期保存用に凍結保存した。初代培養の継代培養は、二次培養または第一継代と呼ばれる。後の継代培養は、第二継代、第三継代、第四継代などと呼ばれる。継代培養を、細胞をＥＧＨＸＸの入った組織培養フラスコ中に置き、新鮮なＥＧＨＸＸを２から４日ごとに提供することにより行った。継代培養物が８０％から１００％のコンフルエンスに達した際に、それらを単一細胞の懸濁液までトリプシン処理し、ＥＧＨＸＸで中和してトリプシンを不活性にし、細胞のカウントを行った。生じた細胞懸濁液をサンプリングし、さらに広げ、あるいは長期保存用に凍結保存した。
【００５３】
ヒト滑膜細胞培養物（滑膜線維芽細胞としても知られる、滑膜由来の細胞培養物）Ｓ１およびＳ２を、凍結保存された初代培養細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ）から得た。滑膜細胞を、ＥＧＨＸＸ培地の入った組織培養フラスコに入れ、上述のごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて培養した。ヒト皮膚の線維芽細胞培養物を、凍結保存した初代培養細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から購入した。皮膚の線維芽細胞を、上述のごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて培養した。
【００５４】
この実施例で用いた細胞培養物を表２に列挙する。
【表２】
0005383654.tif 000004
【００５５】
ＲＮＡとｃＤＮＡ調製――ＲＮＡを、ＴＲＩスピン法（Reno et al., Biotechniques 22: 1082-6 (1997)）を用いて細胞培養物から単離した。単離したＲＮＡ濃度を分光測定で調べた。サンプルＰＣ、Ｃ１、Ｃ２、Ｓ１、Ｓ２、Ｆ１、およびＦ２に由来するｃＤＮＡの調製においては、ランダム六量体プライマーを用いる、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（インディアナ州、インディアナポリスのＲｏｃｈｅ）を、製造業者の説明書に従って実行した。生じたｃＤＮＡを解析まで−２０℃または−８０℃で保存した。
【００５６】
遺伝子発現解析――遺伝子発現解析を、検量線法または比較ＣＴ法のいずれかを用いる定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。リアルタイムＰＣＲ法は、標的配列の配列特異的プライマー増幅を表す二重標識オリゴプローブの５’ヌクレアーゼ切断に基づいた（「ＴａｑＭａｎ（商標登録）アッセイ」）。軟骨連結タンパク質（ＨＡＰＬＮ１）およびミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）をコードする遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｈｓ００１５７１０３＿ｍ１およびＨｓ００１８５８０３＿ｍ１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いてそれぞれアッセイした。リアルタイムＰＣＲをＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて調製し、ｎｏ  ＵＮＧ（カタログ番号４３２４０１８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、適当なＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびサンプルｃＤＮＡを、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍｉｘのプロトコルに従って使用した。一般的なＴａｑＭａｎ（登録商標）サイクリングおよびこの構成に関するデータ収集プログラムを用いる、ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）において増幅を実行した。２つずつの２５μＬの反応液を、１ウェルあたり５ｎｇまでのインプットｃＤＮＡで行った。０．１単位の閾値を全てのアッセイで用いた。
【００５７】
検量線法――検量線法を、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｓｓａｙ（カタログ番号４３１９４１３Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて実施し、１８Ｓ  ｒＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ結果を標準化する内部コントロールとして用いてインプット変動を計算した。各遺伝子の発現の相対的なレベルの定量に関して、初代軟骨細胞（ＰＣ）ｃＤＮＡの希釈を行い、７５００システムソフトウェアを用いて検量線を作成した。各試験サンプルの発現レベルを検量線から調べ、生じた初代軟骨細胞コントロール（ＰＣ）に対するｍＲＮＡ比率を、サンプルのＰＣに対する１８Ｓ  ｒＲＮＡ比率により分けてｃＤＮＡローディングを標準化した。
【００５８】
比較ＣＴ法――比較ＣＴ解析を行うことにより、上述のごとく作成されたリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析の生データに由来する様々なサンプルにおける、ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する相対的な遺伝子発現比率を調べた。比較Ｃｔ法は、基準、検量線解析、または実際の標準物質を必要としない試験サンプル間の直接の比較を可能にする、ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する比率の相対的な測定を提供する。この方法は、以下の４つの条件に適合したため、本実施例で用いられるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５アッセイの場合に適用することができる：１）分析性能が実行ごとに一貫していた；２）同等量のＲＮＡをＨＡＰＬＮ１、ＭＦＡＰ５、および内在性コントロールアッセイにおいて実行した；３）同等量のＲＮＡを各アッセイで実施した場合、内在性コントロール遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡに関するＣＴ値は、ＨＡＰＬＮ１  ＣＴまたはＭＦＡＰ５  ＣＴのどちらかより常に低く、それゆえＨＡＰＬＮ１  ＣＴまたはＭＦＡＰ５  ＣＴのどちらかが定量化できる場合に常に１８Ｓ  ＣＴを定量化できた；ならびに４）この方法は、上述のその他の３つの条件が適合した際にＭＦＡＰ５  ＣＴ値と同等なＨＡＰＬＮ１  ＣＴ値を生じさせる比率のＨＡＰＬＮ１／ＭＦＡＰ５を含む理論上のサンプルと定義される任意選択した理論上の標準物質を用いた。この比較ＣＴ法に用いられる微分方程式は以下のとおりである。サンプル中の標的遺伝子の量は、内在性コントロール遺伝子で標準化され、標準物質と比較され：
（１＋Ｅ）＾（−ΔΔＣＴ，標的遺伝子）
［式中、
Ｅ＝増幅効率
であり、
ΔΔＣＴ，標的遺伝子＝サンプルΔＣＴ，標的遺伝子−標準物質ΔＣＴ，標的遺伝子
であり、
ΔＣＴ，標的遺伝子＝ＣＴ，標的遺伝子−ＣＴ，内在性コントロール遺伝子
である］
により付与される（Liu, W. and Saint, D.A., Analytical Biochemistry, 302: 52-59 (2002); Livak, K.J, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, User Bulletin 2, ABI publication 4303859, 1997を参照）。次に、ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する比率を：
（１＋Ｅ）＾（−ΔΔＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）／（１＋Ｅ）＾（−ΔΔＣＴ，ＭＦＡＰ５）
のごとく記載することができ、それは、
（１＋Ｅ）＾（−｛［サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１−サンプルＣＴ，内在性コントロール遺伝子］−［標準物質ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１−標準物質ＣＴ，内在性コントロール遺伝子］｝）／（１＋Ｅ）＾（−｛［サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５−サンプルＣＴ，内在性コントロール遺伝子］−［標準物質ＣＴ，ＭＦＡＰ５−標準物質ＣＴ，内在性コントロール遺伝子］｝）
として表せる。同一量のサンプルを各アッセイで実施する場合、サンプル内在性コントロール遺伝子のＣＴは単語ｘにより表すことができる。同一量の標準物質を各アッセイで実施する場合、標準物質内在性コントロール遺伝子のＣＴは単語ｙにより表すことができる。これらの単語で置き換えると、該式は、
（１＋Ｅ）＾（−｛［サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１−ｘ］−［標準物質ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１−ｙ］｝）／（１＋Ｅ）＾（−｛［サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５−ｘ］−［標準物質ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ｙ］｝）
に誘導され、それは、
（１＋Ｅ）＾（［ｘ−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１］−［ｙ−標準物質ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１］）／（１＋Ｅ）＾（｛［ｘ−サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５］−［ｙ−標準物質ＣＴ，ＭＦＡＰ５］）
として表せる。標準物質が、同等量の標準物質を各アッセイで実施する際にＣＴ，ＭＦＡＰ５値と同等のＣＴ，ＨＡＰＬＮ１値を生じるＨＡＰＬＮ１／ＭＦＡＰ５の比率を含む理論上のサンプルと定義される場合、次に、単語ｚは、標準物質ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１および標準物質ＣＴ、ＭＦＡＰ５に置き換えることができる。次いで、該式は、
（１＋Ｅ）＾（［ｘ−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１］−［ｙ−ｚ］）／（１＋Ｅ）＾（［ｘ−サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５］−［ｙ−ｚ］）
に誘導され、それは、
（１＋Ｅ）＾（［ｘ−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１］−［ｙ−ｚ］−［ｘ−サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５］＋［ｙ−ｚ］）
として表せ、
（１＋Ｅ）＾（［ｘ−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１］−［ｘ−サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５］）
として表せ、
（１＋Ｅ）＾（サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）
として表せる。
そして、Ｅ＝１（１００％効率）であるならば、ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する相対的な比率は：
２＾（サンプルＣＴ，ＭＦＡＰ５−サンプルＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）
に誘導される。
上記式は、未知として２つの変数、サンプルＨＡＰＬＮ１  ＣＴおよびサンプルＭＦＡＰ５  ＣＴのみを残す最終式となる。この式を、上述の条件下でアッセイする場合に適用し、適用する理論上の標準物質を上述のごとき設定する。
【００５９】
図２は、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられるように、数種の細胞株におけるＨＡＰＬＮ１発現レベルを示す。図３は、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べられるように、図２に示されるものと同一の細胞サンプルにおけるＭＦＡＰ５の発現レベルを示す。ＨＡＰＬＮ１は、滑膜細胞および線維芽細胞の細胞培養より軟骨細胞の細胞培養において高く発現された。ＭＦＡＰ５は、軟骨細胞の細胞培養より滑膜細胞および線維芽細胞の細胞培養において高く発現された。
【００６０】
図４は、図２と図３からのＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。初代軟骨細胞（ＰＣ）における比率を１に縮尺し；それに合わせてその他の比率を縮尺した。
【００６１】
図５は、図２で示されるものと同一の株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示し、発現レベルをＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べた。ＣＴ法の結果は検量線法により得られた結果と同様であった。
【実施例２】
【００６２】
実施例２：軟骨細胞、滑膜細胞および線維芽細胞のさらなる株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現
ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルをさらなる細胞培養物において調べて軟骨細胞と滑膜細胞培養の間を分化させる方法の信頼度を確認した。本実施例で用いられる培養物を表２に列挙する。
【表３】
0005383654.tif 000005
【００６３】
細胞の単離および培養物――ヒト軟骨細胞の細胞培養物Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７を、実施例１に記載されるごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて、単離し、培養した。ヒト滑膜細胞培養物（滑膜線維芽細胞としても知られる滑膜に由来する細胞培養物）を、Ｇｅｎｚｙｍｅで単離するか、またはＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ）から取得した。株Ｓ４、Ｓ６、およびＳ７を、様々な方法を用いてＧｅｎｚｙｍｅで単離した。Ｓ４を、刻んだ滑膜組織をコラゲナーゼ溶液中において３７℃で３．５時間消化させ、次いでトリプシン溶液中において３７℃で１時間２番目の消化にかけることにより単離した。株Ｓ６を、刻んだ滑膜組織をコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含む溶液中において３７℃で２時間消化にかけることにより単離した。株Ｓ７を、刻んだ滑膜をＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法にかけることにより単離した。単離後、滑膜由来の細胞をＥＧＨＸＸ培地の入った組織培養フラスコに置き、実施例１に記載されるごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて培養した。株Ｓ３およびＳ５を、冷凍保存された第一継代細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から取得した。融解後、株Ｓ３およびＳ５に由来する細胞をＥＧＨＸＸ培地の入った組織培養フラスコに置き、実施例１に記載されるごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて培養した。
【００６４】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製――軟骨細胞の細胞培養物Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７および滑膜細胞の培養物Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７に関するＲＮＡの調製を実施例１に記載されるごとく行った。これらのサンプルに由来するＲＮＡを、製造業者の説明書に従い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｃＤＮＡに逆転写させた。実施例１に由来するＰＣ  ｃＤＮＡを本実施例で使用した。ｃＤＮＡを解析するまで−２０℃または−８０℃で保存した。
【００６５】
遺伝子発現解析――遺伝子発現解析を、実施例１に記載されるごとくＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。
【００６６】
図６は、多くのさらなる軟骨細胞および滑膜細胞株におけるＨＡＰＬＮ１発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べ、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化した。
【００６７】
図７は、図６に示されるものと同一株におけるＭＦＡＰ５発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べ、１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化した。
【００６８】
図８は、図６および７に由来するＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。初代軟骨細胞（ＰＣ）における比率を１に縮尺し；それに合わせてその他の比率を縮尺した。
【００６９】
図９は、図６に示されるものと同一株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルにおける比率を示す。発現レベルをＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べ、その比率を２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出した。
【００７０】
さらなる細胞株におけるＲＴ−ＰＣＲの結果は、実施例１で得られた結果と一致した。
【実施例３】
【００７１】
実施例３：特注設計のプライマーおよびプローブを用いた軟骨細胞、滑膜細胞および線維芽細胞におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現
様々な軟骨細胞、滑膜細胞、および皮膚の線維芽細胞培養物のテストを、公知のオリゴヌクレオチド配列のプライマーおよびプローブを用いて行った。
【００７２】
細胞の単離および培養――本実施例で用いられる細胞株を以下の表４および５に列挙する。ヒト軟骨細胞の細胞培養物Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ２６、Ｃ２８、Ｃ３０、およびＣ３４を、実施例１に記載されるごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて（プロテアーゼ法を用いて）単離し、培養した。ヒト滑膜細胞培養物Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、およびＳ７に関する細胞の単離および培養方法を、実施例１および２に記載した。滑膜細胞物Ｓ９を、刻んだ滑膜組織をコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含む溶液中において３７℃で２時間消化にかけることにより単離した。滑膜細胞の培養物Ｓ１０を、刻んだ滑膜組織をコラゲナーゼ溶液中において３７℃で３．５時間消化にかけ、続いてトリプシン溶液中において３７℃で１時間２番目の消化にかけることにより単離した。滑膜細胞株Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＳ１８を、凍結保存された第一継代細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から取得した。皮膚の線維芽細胞株Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、およびＦ１１を、凍結保存された初代培養細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から取得した。全ての細胞培養物を、実施例１に記載されるごとくＣａｒｔｉｃｅｌ（商標）自家培養軟骨細胞を産生する方法を用いて培養した。
【表４】
0005383654.tif 000006
【表５】
0005383654.tif 000007
【００７３】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製――軟骨細胞株Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、滑膜細胞株Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、ならびに皮膚の線維芽細胞株Ｆ１およびＦ２に由来するＲＮＡの調製を実施例１および２に記載した。軟骨細胞株Ｃ８、滑膜細胞株Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、皮膚の線維芽細胞株Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６、ならびに表５に列挙する全ての株について、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）ＲＮＡ単離法を用いた。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）単離では、３６０μＬの溶解溶液を１００万個以下の細胞を含む細胞沈殿物に添加した。サンプルをすぐに最大速度で３０秒間ボルテックスし、次いで３７℃で５分間静置した。インキュベーション後、サンプルを手で１０秒振り、さらに最大速度で３０秒ボルテックスした。各チューブの内容物を収集し、溶解物をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（登録商標）ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）に通した。３５０μＬのＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒを通した溶解物を、動物細胞に由来するＲＮＡの単離に関する製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）法を用いた。カラムを３０μＬの水からなる１回の溶出で溶出した。ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。生じたｃＤＮＡを解析まで−２０℃または−８０℃で保存した。
【００７４】
遺伝子発現解析――ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５  ｍＲＮＡの領域に特異的な特注設計プライマーおよびプローブを用いて行った。特注プライマーおよびプローブに関する配列情報を表６に示す。略記：６ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン、ＶＩＣ（登録商標）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．の商標であり、蛍光色素分子である、ＭＧＢＮＦＱ＝副溝結合蛍光消光剤（Ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈａｒ）。プライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州、カールズバッド）から取得した。プローブをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から得た。ＨＡＰＬＮ１に関しては、フォワードプライマーの標的はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１８８４．２（配列番号２）で寄託されたＨＡＰＬＮ１配列のヌクレオチド５４３から５７０であり、リバースプライマーの標的はヌクレオチド６０３から６２２であり、プローブの配列は同一配列のヌクレオチド５８４から６０１である。ＭＦＡＰ５に関しては、フォワードプライマーの標的はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００３４８０．２（配列番号１）で寄託されたＭＦＡＰ５配列のヌクレオチド３０１から３２２であり、リバースプライマーの標的はヌクレオチド３５３から３７２であり、プローブの配列は同一配列のヌクレオチド３３４から３５０である。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ．ｎｏ  ＵＮＧ（カタログ番号４３５２０４２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、９００ｎＭ  プライマー、２５０ｎＭ  プローブ、および５ｎｇのサンプルｃＤＮＡを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍｉｘプロトコルに従って行った。反応体積は１３μＬであり、増幅を、初期設定Ｆａｓｔ  ＴａｑＭａｎ（等速商標）サイクリングおよびこの設定に関するデータ収集プログラムを用いてＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）において行った。０．１単位の閾値を全てのアッセイで用いた。発現レベルを、実施例１に記載されるＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べた。
【表６】
0005383654.tif 000008
【００７５】
表１０Ａは、表２および６で示されるものと同一の株、ならびに表４に由来するさらなる軟骨細胞、滑膜細胞、および皮膚の線維芽細胞株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。表１０Ｂは、表５からの株におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比率を示す。特注設計のプライマーおよびプローブを用いて得られた結果は、実施例１および２に記載される結果と同様であった。
【実施例４】
【００７６】
実施例４：単層およびコラーゲン足場中の軟骨細胞、滑膜細胞および線維芽細胞培養物におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルの比較
ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルを、単層およびコラーゲン足場における培養物の様々なタイプにおいて比較した。
【００７７】
細胞単離および培養――軟骨細胞培養物Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、およびＣ１８を、実施例１に記載されるプロテアーゼ法を用いて単離し、実施例１に記載されるごとく培養した。滑膜細胞培養物Ｓ７を、実施例１および２に記載されるごとく単離し、培養した。皮膚の線維芽細胞培養物Ｆ２およびＦ７を、凍結保存された初代培養細胞としてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，から取得し、実施例１に記載されるごとく培養した。第二継代培養（培養物Ｓ７に関する第三継代）の完了後に、サンプルをＲＮＡ単離し（「０日目」または単層サンプル）、次いで細胞をＥＧＨＸＸ培地中で再懸濁し、２０ｃｍ２のＭＡＩＸ（登録商標）足場（ＡＣＩ−ＭＡＩＸ（登録商標）コラーゲン膜、ＣＥ、ドイツ、ヘルツォーゲンラートＤ−５２１３４のＭａｔｒｉｃｅｌ  ＧｍｂＨ）上に播種した。細胞を３７℃で１時間接着させ、次いで足場にさらなるＥＧＨＸＸを供し、４日間培養した。滑膜細胞および皮膚の線維芽細胞を含む足場培養も同一の方法で調製した。足場培養の４日後、培養物を８ｍｍ生検パンチを用いて培養をサンプリングし（「４日目」または足場サンプル）、ＲＮＡ単離を行った。
【００７８】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製――ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）単離について、３６０μＬの溶解溶液をＭＡＣＩ（登録商標）移植サンプル（１回の調製あたり２つの８ｍｍ  ＭＡＣＩ（登録商標）移植パンチまで）に添加した。サンプルを迅速に最大速度で３０秒間ボルテックスし、次いで３７℃で５分間静置した。インキュベーション後、サンプルを手で１０秒間振って膜を広げ、続いて最大速度でさらに３０秒ボルテックスした。各チューブの内容物を収集し、溶解物をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）に通した。３５０μＬのＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒを通した溶解物を、動物細胞に由来するＲＮＡの単離に関する製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）法で使用した。カラムを３０μＬの水からなる１つの溶出液を用いて溶出した。サンプルＲＮＡからのｃＤＮＡの調製を、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて製造業者の説明書に従って行った。ｃＤＮＡを−２０℃または−８０℃で保存した。
【００７９】
表７は、使用した細胞培養物および本実施例で使用した構成を列挙する。
【表７】
0005383654.tif 000009
【００８０】
遺伝子発現解析――単層およびＭＡＣＩ（商標）移植ｃＤＮＡの遺伝子発現解析を、上記の実施例１で概略した方法で実施した。
【００８１】
図１１は、単層およびコラーゲン足場培養におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率間の比較を示す。ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの検量線法により調べた。発現レベルを１８Ｓ  リボソームＲＮＡで標準化した。初代軟骨細胞（ＰＣ）の単層培養における比率を１に縮尺し；これに合わせて他の比率を縮尺した。
【００８２】
図１２は、図１１に示されるものと同一の株を用いて、単層およびコラーゲン足場培養におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率間の比較を示す。ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べ、比率を２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出した。
【００８３】
足場培養で得た結果は単層培養で得たものと同様であった。
【実施例５】
【００８４】
実施例５：継代数によるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現
様々な培養レベルにおけるＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する比率を調べた。
【００８５】
細胞の単離および培養――軟骨細胞培養物Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ３１、Ｃ３２、およびＣ３３を、実施例１に記載されるごとくプロテアーゼ法を用いて単離し、実施例１に記載されるごとく培養した。滑膜細胞培養物Ｓ６およびＳ７を、実施例１および２に記載されるごとく単離し、培養した。滑膜細胞培養物Ｓ８を、刻んだ滑膜組織をコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含む溶液中において３７℃で２時間消化にかけることにより単離した。Ｓ８の細胞培養物を、実施例１に記載されるごとく行った。軟骨細胞培養物Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ３１、Ｃ３２、およびＣ３３について、（図１４Ａと１４Ｂにおいて「１」と表示した）軟骨由来の細胞、（図１４Ａと１４Ｂにおいて「２」と表示した）第一継代細胞、および（図１４Ａと１４Ｂにおいて「３」と表示した）第二継代細胞のサンプルを取得した。滑膜細胞培養物Ｓ７について、（図１３において「１」と表示した）初代培養、（図１３において「２」と表示した）第一継代、（図１３において「３」と表示した）第二継代、（図１３において「４」と表示した）第三継代、および（図１３において「５」と表示した）第四継代細胞のサンプルを取得した。滑膜細胞培養物Ｓ６およびＳ８について、（図１３において「２」と表示した）第一継代、（図１３において「３」と表示した）第二継代、（図１３において「４」と表示した）第三継代、および（図１３において「５」と表示した）第四継代の細胞のサンプルを取得した。
【００８６】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製――ＲＮＡおよびｃＤＮＡを、実施例３に記載されるごとくＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて調製した。
【００８７】
遺伝子発現解析――滑膜細胞サンプルの遺伝子発現解析を実施例１に記載されるごとく行った。軟骨細胞サンプルの遺伝子発現解析を実施例３に記載されるごとく行った。
【００８８】
図１３、１４Ａ、および１４Ｂは、継代数によるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関する発現レベル比率の変化を示す。発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べた。ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５比率を、２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出した。
【００８９】
ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する比率は、軟骨細胞サンプルに対する滑膜細胞サンプルについて、全ての培養レベルで一貫して低かった。ＨＡＰＬＮ１のＭＦＡＰ５に対する比率は、滑膜細胞サンプルに対する軟骨細胞サンプルについて、全ての培養レベルで一貫して高かった。
【実施例６】
【００９０】
実施例６：混合した細胞培養物におけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現
遺伝子発現解析を軟骨細胞と滑膜細胞の混合した培養の細胞に適用することにより、混合した培養物における方法の感受性レベルを評価した。ヒト軟骨細胞およびヒト滑膜細胞の細胞混合物を用いて以下の特性の２つの細胞タイプの混合物：
１）０％  軟骨細胞／１００％  滑膜細胞；
２）２５％  軟骨細胞／７５％  滑膜細胞；
３）５０％  軟骨細胞／５０％  滑膜細胞；
４）７５％  軟骨細胞／２５％  滑膜細胞；および
５）１００％  軟骨細胞／０％  滑膜細胞
を調製した。
【００９１】
細胞の単離および培養――軟骨細胞株Ｃ５、Ｃ６、およびＣ８を実施例１および２に記載されるごとく単離し、培養した。滑膜細胞の培養物Ｓ６、Ｓ７、およびＳ９を、実施例１、２、および３に記載されるごとく単離し、培養した。混合実験１においては、軟骨細胞株６（Ｃ６）および滑膜細胞株６（Ｓ６）の第二継代培養物を用いた。混合実験２においては、軟骨細胞株８（Ｃ８）および滑膜細胞株７（Ｓ７）の第一継代培養物を用いた。混合実験３においては、軟骨細胞株５（Ｃ５）および滑膜細胞株９（Ｓ９）の第一継代培養物を用いた。
【００９２】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製――ＲＮＡおよびｃＤＮＡを、実施例３に記載されるごとく、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて調製した。
【００９３】
遺伝子発現解析――遺伝子発現解析を、実施例３に記載されるごとく行った。
【００９４】
遺伝子レベルを、ＲＴ−ＰＣＲの比較ＣＴ法により調べた。ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５比率を、２＾（ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１）として算出した。混合実験の結果を図１５において提供し、この図は、軟骨細胞および滑膜細胞の混合集団からなるサンプルにおけるＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の発現レベルの比率を示す。７５％またはそれより少ない軟骨細胞および２５％またはそれより多い滑膜細胞を含んだ培養物において、ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５発現レベル比率は、約１またはそれより低かった。より高い比率は、テストしたサンプルにおけるより高い割合の軟骨細胞に相当する。細胞培養物の混合物を識別するアッセイの能力は、平均して、サンプルが、陽性ＣＴ，ＭＦＡＰ５−ＣＴ，ＨＡＰＬＮ１を産生する滑膜線維芽細胞からなる平衡を有する少なくとも６７％の軟骨細胞からなることを示した。皮膚の線維芽細胞のごとき他の細胞タイプによる混入もこのアッセイで検出することができる。
【実施例７】
【００９５】
実施例７：アッセイ応答とマーカーの分子比間の関連解析
ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５の合成ＲＮＡ転写物を用いてテストサンプルにおけるアッセイ応答とマーカーの分子比間の関連を調べた。まず、最初のＰＣＲ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３０６−０１６）を、表８に列挙したプライマーを用いてヒトｃＤＮＡにおいて行った。ＨＡＰＬＮ１について、これらのプライマーを、ＨＡＰＬＮ１遺伝子（受入番号ＮＭ＿００１８８４．２）の位置２５６から１１７１までのヌクレオチドで増幅した。ＭＦＡＰ５について、これらのプライマーを、ＭＦＡＰ５遺伝子（受入番号ＮＭ＿００３４８０．２）の位置３２から７２８までのヌクレオチドで増幅した。ＰＣＲ産物を、１００塩基対の分子サイズラダー（１００ｂｐ  ＰＣＲ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ、ＢｉｏＲａｄカタログ番号１７０−８２０６）を対照に用いて１．５％トリス−酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロースゲルおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｓ−７５６３）ゲル染色で解析した。生じた最初の増幅産物を、４％天然トリス−ホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲルを用いてゲルで精製し、表８に列挙したプライマーを用いて２番目のＰＣＲに鋳型として用いた。二番目のＭＦＡＰ５増幅において、ゲル精製した最初の増幅産物の鋳型を、２番目の反応の２００μＬあたり０．５６ｎｇでロードした。２番目のＨＡＰＬＮ１増幅において、ゲル精製した最初の鋳型を、２番目の反応の９００μＬあたり２．５ｎｇでロードした。２番目の増幅産物を、記載のとおり、天然ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルから精製し、Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔを用いるインビトロ転写における鋳型として使用した。２番目の増幅産物の鋳型の１．３μｇまでを、２０μＬあたりの転写反応で用いた。生じた転写物を、６％ＴＢＥ−尿素（ＴＢＵ）ポリアクリルアミドゲルを用いてゲルで精製し、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で再懸濁し、次いで４０ｎｇ／μＬ  ＲＮＡの濃度に相当する１Ａ２６０単位の変換因子を用いて２回実施した読み取りで分光光度的に定量した。ゲル精製した転写物を６％ＴＢＵゲル上で解析して純度を評価した。ＰＡＧＥ解析による純度の決定および分光光度測定による定量後、μＬあたりの転写物のコピー数を表９に列挙する変換因子を用いて調べた。これらの変換因子は、３４３ダルトンの平均塩基分子量を想定する。アボガドロ定数を６．０２×１０２３／モルとした。また、転写された最初の塩基は、Ｔ７プロモーター、続いて標的配列から＋１Ｇであると想定した。転写物を、１０３から１０８コピー／μＬの範囲である濃度の酵母ＲＮＡキャリア緩衝液（ヌクレアーゼフリー水中の酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７１２０Ｇ）の２０ｎｇ／μＬの溶液）で希釈した。次に、希釈液を、２μＬのｃＤＮＡを１３μＬのＰＣＲ反応ごとに用いることを除いて、親出願の実施例３で供されるＲＴ−ＰＣＲ法を用いてテストした。次いで、ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５の比率を、親出願の実施例４に記載されるごとく比較Ｃｔ法を用いて各希釈液について算出した。
【００９６】
コピー数の標準物質を用いるアッセイ応答を公知の分子比と比較した。これらの結果を表１０に示す。決定したアッセイ応答と分子比間の関連をもって、様々なアッセイ応答における正確な分子比を算出した。表１１に示すこれらの結果は、比較Ｃｔで決めた受容境界値（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）が１に等しい場合（例えば、ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５＝１）、これがＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５の正確な分子比の２．２１２に相当することを示す。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【実施例８】
【００９７】
実施例８：軟骨細胞および線維芽細胞マーカーの絶対量測定解析
絶対量測定法を用いて遺伝子発現解析を行った。様々な培養物を、上記の実施例に記載されるごとく単離し、培養した。細胞培養物からのＲＮＡを、実施例３に記載されるごとくＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いて単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、  ２μｌのｃＤＮＡを１３μＬのＰＣＲ反応ごとに使用したことを除いて、実施例３に記載されるごとく細胞培養物において行った。（実施例７に記載されるごとく調製した）ＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５に関するインビトロ転写したＲＮＡ標準物質を希釈して１μＬあたり５×１０２、５×１０３、および５×１０４コピーの最終濃度のｃＤＮＡを得た。検量線を、ｙ軸に標準物質からのＣｔの結果を、ｘ軸に１反応あたりのコピー数（１０３、１０４、および１０５）の対数をグラフで表すことにより作成した。線形のトレンドラインをデータに合わせ、各テストサンプルに存在するＨＡＰＬＮ１およびＭＦＡＰ５  ｍＲＮＡコピー数量を数学的に調べた。この定量方法は、例えば、Real-Time PCR Systems: Applied Biosystems
7900HT Fast Real-Time PCR Systemおよび7300/7500 Real-Time PCR Systems,
Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005, Part No. 4348358 Rev. Eに記載されている。次に、ＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５のモル比を各サンプルについて算出した。図１６は、様々な細胞培養物におけるＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５のモル比を示す。これらの結果は、軟骨細胞におけるＨＡＰＬＮ１：ＭＦＡＰ５のモル比が滑膜細胞および皮膚の線維芽細胞と比較して高いことを示す。
【表１２】
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【００９８】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許文献は、出典明示により全体が本明細書に援用される。出典明示により援用される物質が本明細書に矛盾するか、または不一致となる範囲まで、かかる物質のいずれのものも本明細書は優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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