(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における分析物質の存在を検出するためのものであるとともに、前記分析物質の有無を知らせる可視信号が支持体上の検出サイトにおいて生成される分析デバイスであって、
単一チャネルを有するストリップデバイスであり、
前記信号は、ラベル付けされた第１結合薬剤とラベル現像手段との間の信号増強反応により、生成または増強され、
前記第１結合薬剤および前記ラベル現像手段は、前記試料の印加による単一分析ステップによって前記検出サイトへと搬送され得るよう構成され、この場合、前記第１結合薬剤および前記ラベル現像手段は、前記第１結合薬剤の方が、前記検出サイトに対して、前記ラベル現像手段よりも先に到着するような順序で搬送されることを特徴とする分析デバイス。
【請求項２】
（ａ）多孔質部材と；
（ｂ）前記第１結合薬剤であり、かつ、分析物質に対して特有的に結合するとともに、試料の印加だけによる単一ステップによる検出ゾーン内への液体の影響に基づいて前記多孔質部材を通って移動可能とされ、さらに、視認不可能なラベルを備える、前記第１結合薬剤と；
（ｃ）前記第１結合薬剤の結合と相補的に前記分析物質と特有的に結合するか、あるいは、前記第１結合薬剤との結合に関して前記分析物質と競合的であるか、のいずれかであるとともに、前記検出サイト内に固定された第２結合薬剤と；
（ｄ）前記ラベル現像手段であり、かつ、液体の影響のもとに前記第１結合薬剤の後に前記検出サイト内へと移動可能であるとともに、前記視認不可能なラベルを視認可能とすることができる、前記ラベル現像手段と；
を具備していることを特徴とする請求項１記載の分析デバイス。
【請求項３】
前記視認不可能なラベルは、微粒状金属ラベルであり、
前記ラベル現像手段は、前記金属の表面上に固体材料を成膜する薬剤を備えていることを特徴とする請求項２記載の分析デバイス。
【請求項４】
前記ラベルの前記粒子のサイズは、１〜100nmであり、好ましくは、5nmよりも小さいことを特徴とする請求項３記載の分析デバイス。
【請求項５】
前記ラベルは、微粒状金ラベルであることを特徴とする請求項３記載の分析デバイス。
【請求項６】
前記ラベル現像手段は、銀含有薬剤を備えていることを特徴とする請求項５記載の分析デバイス。
【請求項７】
前記ラベル現像手段は、前記多孔質部材に対して、前記液体の存在下における前記ラベル現像手段の前記多孔質部材からの放出が、前記第１ラベル付結合薬剤の放出よりも遅れるよう、適用されていることを特徴とする請求項２ないし６のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項８】
前記ラベル現像手段は、徐放性薬剤を含有する組成物の形態で適用されていることを特徴とする請求項７記載の分析デバイス。
【請求項９】
前記ラベル現像手段は、前記多孔質部材に対して接触している第２多孔質部材内に含有されていることを特徴とする請求項７または８記載の分析デバイス。
【請求項１０】
前記第２多孔質部材は、ガラスファイバパッドであることを特徴とする請求項９記載の分析デバイス。
【請求項１１】
前記第１結合薬剤は、徐放性薬剤を含有する組成物内に適用されていることを特徴とする請求項７ないし10のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１２】
前記多孔質部材膜からの前記可動薬剤の放出は、前記多孔質部材の撥水性を変更することにより制御されていることを特徴とする請求項２ないし６のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１３】
前記多孔質部材を通っての少なくとも前記ラベル現像手段の移動は、半浸透性障壁により禁止されていることを特徴とする請求項２ないし６のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１４】
前記ラベル現像手段は、前記多孔質部材上に存在するラベル上への材料の成膜が、前記検出ゾーンに向けての液体流を偏向させるような障壁を形成するように、まず、前記ラベルと当接するよう構成されていることを特徴とする請求項３ないし６のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１５】
さらに、試料の投与を行い得るとともに検出ゾーンの観測を行い得るよう、開放しているハウジングを具備することを特徴とする請求項１ないし14のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１６】
前記デバイスを通しての液体流通を補助し得るよう構成された少なくとも１つのウィックまたはウィック領域を具備することを特徴とする請求項１ないし15のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１７】
検出ゾーンにおける反応に先立って薬剤を均一に分散させるために、拡散手段が設けられていることを特徴とする請求項１ないし16のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１８】
反応ステージどうしの間において、前記検出ゾーンを洗浄し得るよう構成されていることを特徴とする請求項１ないし17のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項１９】
分析物質を含有しているかもしれない液体試料が、洗浄液体として使用されることを特徴とする請求項18記載の分析デバイス。
【請求項２０】
前記洗浄液体から望ましくない要素を除去するためのフィルタ手段が設けられていることを特徴とする請求項19記載の分析デバイス。
【請求項２１】
血清分析に使用するために構成され、
前記フィルタ手段は、血清試料から抗体を除去し得るような抗−抗体を備えていることを特徴とする請求項20記載の分析デバイス。
【請求項２２】
ラベル付きの前記第１結合薬剤は、ラベル付きの核酸プローブを備え、
前記分析物質は、前記検出ゾーン内に固定された核酸列を備えていることを特徴とする請求項１ないし21のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項２３】
液体試料中に分析物質が存在することを検出するための方法であって、
前記液体試料を、請求項１ないし22のいずれかに記載の分析デバイスに対して適用し、
可視信号が発生するかどうかを記録することを特徴とする方法。
【請求項２４】
診断分析のために使用され、
分析物質の有無を知らせる信号を作り出すために、液体が多孔質部材を通って移動可能とされ、
前記多孔質部材を通っての液体流通を偏向させるような物理障壁を形成するように、前記分析の途中において互いに反応し得るよう構成された第１薬剤および第２薬剤を具備することを特徴とする請求項１ないし21のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項２５】
多数の反応ステップが多孔質部材上の検出サイトにおいてもたらされ、
前記反応の少なくとも２つの間において、洗浄液体が前記サイトに対して適用され、
前記洗浄液体は、前記部材上に設けられたフィルタ手段を既に通過した試料の一部を含んでいることを特徴とする請求項１ないし21のいずれかに記載の分析デバイス。
【請求項２６】
血清分析のために使用され、
前記フィルタ手段は、前記多孔質部材の表面上において、固定された抗−抗体のバンドを備え、
このバンドは、洗浄液体として使用することを意図した試料の一部が前記検出サイトに到達するよりも前に、このバンドを通過するような位置に固定されていることを特徴とする請求項25記載の分析デバイス。
【請求項２７】
請求項26記載の分析デバイスにおいて使用するために構成された多孔質部材を備えていることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、分析デバイスに関するものであり、詳細には、感度の高い迅速テストの診断デバイスに対して特に好適な集積された１ステップ増幅分析システムに関するものである。また、分析方法に関するものであり、分析デバイスにおいて使用されるキットに関するものである。
１ステップの迅速テストシステムは、例えば、妊娠、性的感染病、食品テスト、細菌感染、抗原検出、家畜病テスト、環境制御、毒性、生物学的薬剤、等のためのテストにおけるような医学的免疫分析における幅広い応用において次第に使用されつつある。しかしながら、他の多くの場合には、現在の迅速テストからの信号は、例えば、唾液や血液からHIV抗体を検出する場合のように、あるいは、特定の病気の兆候を示す尿や糞便内の他のウイルス性感染やわずかのレベルの細菌を検出する場合のように、特に、検出すべき物質の濃度が試料内において既に極度に少ない場合には、定性的結果または定量的結果をもたらすのに十分な感度を有していない。
１ステップ分析は、操作に対する熟練をわずかしかあるいは全く必要としない、単純で、安価で、使い捨てのデバイスを使用することが好ましい。デバイスへの試料の適用は、単一のステップで行われる。この場合、使用後の洗浄や流体変更を、一切必要としないことが好ましい。分析結果は、読取の容易な可視信号として与えられ、読取のための特別な操作は不要である。
通常、このような迅速テストデバイスは、色付きラテックス、カーボン、または金のような粒子を備えており、最終信号を生成源をなすのは、これら粒子である。そのようなデバイスの周知例は、尿中のホルモンβHCGのレベルを検査する妊娠テストキットである。このようなデバイスにおいては、βHCGに対する抗体に連結された金またはラテックスが、可視信号の生成源をなす。
このタイプのデバイスの公知例は、欧州特許明細書第176799号および欧州特許明細書第291194号に開示されている。
可視信号を直接的に作り出すためには、信号生成源をなす粒子が、所定のサイズであることが重要である。金粒子の場合には、明瞭な可視信号の生成を保証するために、金粒子のサイズは、10nmを超えるべきであり、40nmを超えることが好ましい。しかしながら、粒子の有効性を制限する迅速１ステップテストには、感度において制約がある。
迅速診断テストは、非常に少量の分析物質を検出するために、より高感度であることが要望されている。唾液中の分析物質の濃度は、典型的には血液中の分析物質の濃度よりも100倍小さいけれども、非侵入型の試料採取が好ましい場合が多い。
本発明は、非常に高感度な迅速検出デバイスを提供する。
本発明においては、試料中における分析物質の存在を検出するためのものであるとともに、分析物質の有無を知らせる可視信号が支持体上の検出サイトにおいて生成される分析デバイスであって、信号は、ラベル付けされた第１結合薬剤とラベル現像手段との間の信号増強反応により、生成または増強され、第１結合薬剤およびラベル現像手段は、試料の印加による単一分析ステップによって検出サイトへと搬送され得るよう構成され、この場合、第１結合薬剤およびラベル現像手段は、第１結合薬剤の方が、検出サイトに対して、ラベル現像手段よりも先に到着するような順序で搬送されることを特徴とする分析デバイスを提供する。
とりわけ、本発明は、
（ａ）多孔質部材と；
（ｂ）分析物質に対して特有的に結合するとともに、試料の印加だけによる単一ステップによる検出ゾーン内への液体の影響に基づいて多孔質部材を通って移動可能とされ、さらに、視認不可能なラベルを備える第１結合薬剤と；
（ｃ）第１結合薬剤の結合と相補的に分析物質と特有的に結合するか、あるいは、第１結合薬剤との結合に関して分析物質と競合的であるか、のいずれかであるとともに、検出サイト内に固定された第２結合薬剤と；
（ｄ）液体の影響のもとに第１結合薬剤の後に検出サイト内へと移動可能であるとともに、視認不可能なラベルを視認可能とすることができるラベル現像手段と；
を具備する分析デバイスを提供する。
上記において「視認不可能」という用語は、分析時に反応ゾーンまたは検出サイトにおいて濃度が高い場合であってさえも、ラベルが、裸眼では通常見えない、あるいは、ほんのわずかしか見えないことを意味している。そのようなラベルの例としては、酵素ラベルあるいは微粒状ラベルがある。これらは、良好な可視信号をもたらすほど十分に多くの量が集まらないか、あるいは、サイズが例えば10nm未満、適切には5nm未満、好ましくは１〜2nmといったように、とりわけ小さなサイズである。
ラベル現像手段は、視認不可能なラベルを、視認可能とするよう、ラベルを現像することができる薬剤を備えている。現像手段の性質は、使用している視認不可能なラベルの性質に依存する。
例えば、視認不可能なラベルが酵素ラベルである場合には、ラベル現像手段は、ジアミノベンジジンあるいは他の公知の酵素現像剤を備えることができる。
ラベルが微粒状ラベルを備える場合には、現像手段は、粒子を可視とするために、粒子上に材料を成膜することができる。適切な微粒状ラベルとしては、金属ラベルがある。金属ラベルは、例えば、金、銀、セレニウム、または白金ラベル、または微粒状ラテックスラベルであり、酵素または金属コーティングのような増強し得る物質でコーティングされている場合には、増強されることができる。好ましくは、微粒状ラベルは、微粒状金属ラベルを備えており、最も好ましくは、微粒状ラベルは、微粒状金ラベルを備えている。
微粒状金属ラベルが使用された場合には、適切な現像手段は、例えば乳酸銀のような銀薬剤と、例えばハイドロキノンのような適切な現像剤と、を備えている。これについては、例えば、Holgate氏他によるJ.Hisotchem.Cytochem.31,938−944に開示されている。銀薬剤は、適切には、乾燥した形態で、多孔質部材の適切なゾーン内に維持される。銀薬剤は、検出サイトに向けてそのゾーンを通る液体により連れて行かれるまで、その場所に留まることとなる。
銀増強薬剤は、例えば、Golden  Gate,Ty  Glas  Avenue,Cardiff,UKのBritish  Biocell  International  Ltd.より商業的に入手可能である。
銀増強システムと組み合わせて微粒状金ラベルを使用して、本発明に基づいて分析テストデバイスを作ると、信号強度が100〜1000倍向上し、従来可能であったものよりも、ずっと幅広い応用に適用することができる。信号伝搬の速度は、銀溶液の組成、金粒子のサイズ、および、デバイスの幾何形状に依存することとなる。粒子サイズは、例えば、１〜100nmの範囲とすることができ、粒子は、5nm未満の小さな粒子であることが好ましい。小さな粒子を使用することの利点は、与えられた試料に対して、ずっと多くの数の粒子が、その後の増強のために検出ゾーンに集まることができることである。これは、空間的な要求が低減されたことによる。このことは、増強されない大径粒子と比較して、著しく増大した信号をもたらす。
そのような分析が１ステッププロセスとして定式化されるには、分析物質を含有しているかもしれないものであるとともに第１結合薬剤によりラベル付けされた試料が、ラベル現像手段よりも先に、検出サイトへと到達することを保証することが必要である。このような構成は、多くの物理的形態をとることができ、そのような構成の１つとしては、例えば、英国特許出願第2231150A号に記載されているような液体回路がある。１ステップ分析において、予備形成信号のために、ラベル現像手段の供給に際して、液体回路を使用することは、現在まで開示されていない。
この技術を使用すれば、異なる長さおよび／または幅のチャネルが形成され、一連の実質的に非浸透性の障壁により形成された異なるゾーンを通っての液体移動が行われる。液体回路の１つの特定の形態は、プリントされた液体回路であって、これは、実質的に非浸透性の障壁をなすワックスパターンが、上面にプリントされたフィルタペーパーまたは膜からなる、１つまたは複数の層を備えている。分析に必要な薬剤は、適切な位置において、デバイス上で乾燥させることができる。チャネル長さおよび構成は、回路の様々な部分における、特にこの場合には検出サイトにおける液体の到着時間を制御するために使用することができる。チャネル幅は、液体圧力を制御するために使用される。
分析物質を含有しているかもしれない液体試料と、第１結合薬剤と、が、ラベル現像手段よりも先に、検出サイトに到着するように、ゾーンが設けられている。分析物質を含有しているかもしれない液体試料が第１結合薬剤とは別に印加された場合には、液体試料が通り抜けるゾーンは、正確な信号が生成されることを保証するために、すべての分析物質が第１結合薬剤よりも先に検出サイトに到着し得るように構成されていなければならない。
よって、本発明のある実施形態は、
（ａ）互いに実質的に非浸透性でありかつ検出サイトにおいて交差する複数のゾーンに分割された多孔質部材と；
（ｂ）分析物質に対して特有的に結合するとともに、１つのゾーンに配置され、さらに、検出サイト内への液体の影響に基づいて多孔質部材を通って移動可能とされ、さらに、視認不可能なラベルを備える第１結合薬剤と；
（ｃ）第１結合薬剤の結合と相補的に分析物質と特有的に結合するか、あるいは、第１結合薬剤との結合に関して分析物質と競合的であるか、のいずれかであるとともに、検出サイト内に固定された第２結合薬剤と；
（ｄ）前記１つのゾーンとは異なるゾーン内に配置され、液体の影響のもとに検出サイト内へと移動可能であるとともに、視認不可能なラベルを視認可能とすることができるラベル現像手段と；
を具備する分析テストデバイスである。
好適には、第１結合薬剤およびラベル現像手段は、各々が、多孔質部材に沿って移動する薬剤の影響のもとに、検出サイトに向けて移動可能である。加えて、分析物質を含有しているかもしれない液体は、第１結合薬剤と組み合わされた状態で、あるいは、この目的のためにデバイス内に設けられたさらなるゾーンに沿って、検出サイトに向けて移動可能である。また、各ゾーンに対しては、または、ゾーンの各グループに対しては、異なる液体を印加することができ、これらは、各ゾーン内のサンプリング領域またはサンプリング井戸内へと、個別に適用することができる。
しかしながら、好ましい実施形態においては、デバイスは、少なくとも、第１結合薬剤およびラベル現像手段が、試験中の試料を含有する同じ液体の影響のもとに、検出サイトに向けて移動するように、構成されている。このことは、１ステップの迅速分析システムをもたらす。
ゾーンまたはゾーングループは、好適には、多孔質部材を通って検出サイトへと向かう試料の出発点をなす、すべてのゾーンのまたはゾーングループのサンプリング領域に対して、同じ試料が同時に適用され得るように、デバイス中において構成されている。例えば、ある１つのゾーンの非浸透性障壁の構成は、他の障壁よりもより長い液体経路を形成することができるけれども、ゾーンどうしは、実質的に隣接して並置されている。
これにより、使用する分析テストデバイスを、迅速分析１ステップシステムとすることができる。というのは、試料が、第１結合薬剤とラベル現像手段との両方を検出サイトに向けて輸送し得るからである。
しかしながら、第１結合薬剤とラベル現像手段との検出サイトに向けての順次搬送を保証するために、他の方法を使用することもできる。このような方法としては、徐放性の組成物を使用するという方法がある。この場合には、ラベル現像手段の放出を、第１ラベル付結合薬剤の放出よりも遅くするということが確実になされる。
このような放出薬剤としては、ゼラチンや他の酵素、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリジン（PVP）、および、他のポリマー、表面活性剤、アラビアゴム（gum arabic）、スクロースや他の糖類、粘土、脂質、樹脂、塩、および、薬剤産業において使用されているような他の徐放性薬剤を例示することができる。このような徐放性薬剤は、典型的には、0.1〜５％の濃度で、好ましくは、１％w/vの程度で、適用することができる。
検出ゾーンに向けて流通し得るように膜から薬剤を放出するための他の制御方法としては、検出ゾーンにおける膜の撥水性を、試料によるゾーンの湿潤を制御し得るように変更するという方法がある。このような方法においては、例えば、Triton  Ｘ  705、高い塩濃度（例えば、５％NaCl）、ある種の脂肪酸、あるいは、ポリＬトリフォファン（poly L tryphophan）（Sigma）のようなポリアミノ酸、高い撥水特性を有しかつ膜内に含浸し得るすべてのもののような、ある種の撥水性表面活性剤が使用される。
これに代えて、可動ラベル付結合薬剤およびラベル現像手段は、ゼラチン、グリセロール、ポリマー、等の半透過性障壁の内部または後方に配置することができる。これにより、可動ラベル付結合薬剤およびラベル現像手段は、試料が薬剤を溶かし出すように障壁内に侵入するにつれて、しだいに放出される。障壁材料の選択は、このように、溶出速度を決定し、そして、反応ゾーンへと向う移動に際しての薬剤の放出を決定する。
他の実施形態においては、可動ラベル付結合薬剤および／またはラベル現像手段は、多孔質材料からなる個別層上に適用される。この場合、この個別層は、多孔質部材に対して、多孔質部材を通過して移動する液体が、まず最初に個別多孔層の下を通り、そして液体が流れるにつれて次第に液体がその多孔層内に吸収され、最終的に液体がデバイスを通って流れるときにそこに適用される第１結合薬剤またはラベル現像手段を付随するというようにして、接触している。他の多孔質層としては、膜、紙、または、ガラスファイバパッドを適切に使用することができる。
さらに他の実施形態においては、ラベル付第１結合薬剤およびラベル現像手段は、多孔質部材上において、ラベル付第１結合薬剤が液体試料の薄層流に乗って検出ゾーンに向けて直接的に移動し得るように、かつ、ラベル現像手段が検出ゾーンに出くわさないようにして、配置されている。しかしながら、適切な障壁が現像手段の経路中に配置されている場合には、現像手段は、検出ゾーンに向けて偏向することができる。この場合、偏向プロセスによって、必然的に、液体進行に遅延が生じる。障壁は、本来的には、ラベル現像手段を携行する液体の経路中に配置することができる。しかしながら、ラベル現像手段自身が、障壁の構築に寄与していることが好ましい。これにより、ラベル付第１結合薬剤の到着と、ラベル現像手段の到着と、の間に、わずかの時間差だけが生じることとなる。
この実施形態は、ラベルが金のような微粒状金属であり、かつ、現像手段が銀薬剤のように金属粒子の表面上に材料成膜を行うようなタイプのものの場合には、最も好ましい。例えば、小さな金属粒子は、ラベル現像手段の経路中において多孔質部材上において、粒子が拡径したときに、これらがラベル現像手段を検出ゾーン（後述）に向けて導くような障壁を形成するようにして、固定配置されている。使用時には、ラベル現像手段は、まずこれら粒子と出会って、粒子上に成膜を形成する。成膜が進むにつれて、拡径した粒子が、ラベル現像手段を含有した液体の継続した薄層流に対して障壁を形成する。よって、ラベル現像手段は、偏向される。
この原理は、例えば順次の反応または反応ステップを行う分析の途中において液体の偏向が要望されるような、幅広い範囲の分析において使用することができる。ラベル現像手段が生成信号を増強することを要望されている必要はない。この場合には、明らかに事態は単純化される。２つの機能が要求されている場合には、２つの機能が単一のラベル現像手段内に組み込まれる。
この原理を使用した分析デバイスは、本発明の他の形態をなす。
本発明のデバイスは、「サンドイッチ」または「競合」分析方法に対して使用することができる。サンドイッチ分析においては、第２結合薬剤が、前記分析物質に対して、第１結合薬剤と相補的であるようにして、結合する。この場合、第１結合薬剤は、分析物質を含有しているかもしれない液体試料の影響に基づいて、検出ゾーン内へと移動する。分析物質に結合したものすべては、既にラベル現像手段が到着している検出サイト内に集められる。これにより、可視信号が形成されることとなる。
競合分析においては、第２結合薬剤は、第１結合薬剤との結合に際して、分析物質と競合する。この場合においても、第１結合薬剤は、テスト中の液体試料の影響に基づいて、検出ゾーン内へと移動する。しかしながら、この場合には、分析物質に結合したものすべては、検出サイト内に保持されることがない。未結合の第１結合薬剤だけが検出サイトに集められ、可視信号を形成する。この場合には、信号が大きいほど、試料中に存在する分析物質は少ない。
このタイプの分析においては、第１結合薬剤に対して特有的に結合する他の結合薬剤、あるいは、第１結合薬剤と相補的であるようにして分析物質に対して特有的に結合する他の結合薬剤を、また、使用することができる。このような他の薬剤は、検出サイトを超えた位置かつ試料経路に沿った位置に配置されたキャッチサイトに固定される。このような他の薬剤は、キャッチサイトにおいて、結合した、分析物質／第１結合薬剤の錯体または連結体を集めることとなる。そして、ラベル現像手段が到達したときに、キャッチサイトにおいて、可視信号が生成される。このようにして、未結合の第１結合薬剤と比較して結合済の第１結合薬剤により生成される信号は、テスト中の試料内に存在する分析物質のより定性的な評価をもたらす。
必要によりまたは要望により、フィルタ手段を、本発明のデバイスに設けることができる。例えば、デバイスのうちの非浸透性障壁を有するようないくつかのゾーンに設けることができる。あるいは、試料溶液の流通方向に対して、膜表面に適用される薬剤の前方側に、設けることができる。これにより、これらゾーンまたは領域内において、試料から望ましくない要素を除去することができる。このようなフィルタ手段は、物理的フィルタ、あるいは、望ましくない要素と結合する免疫学的または生化学的薬剤を備えることができる。例えば、血清試料に対して血清学的分析が行われている場合には、血清が、例えば、ラベル現像手段の第１結合薬剤に対するキャリア液体として、あるいは、後述の洗浄液体としてさえ、使用されているときには、幅広い範囲の血清抗体が存在する。そのような場合には、それらは、関連するゾーンにおいて、免疫学的障壁を設けることにより、血清から除去することができる。免疫学的障壁は、多孔質部材上において、血清が、検出サイトに到達する前にこの障壁を通過して流通することを確実になし得るようにして、固定された、例えば、抗ヒトIgG抗体のような抗IgG抗体を備えることができる。
分析中にこのようなフィルタ手段を使用することは、本発明の他の形態をなす。
液体回路技術のような技術を使用することにより、分析内に付加的なステップを組み込むことができる。例えば、１つまたは複数のゾーンを、検出サイトに向けて洗浄液体を搬送するために、設けて配置することができる。例えば、洗浄液体の搬送は、第１結合薬剤の通過後、かつ、ラベル現像手段の到着前に行うことが望ましい。これは、信号が形成される前において検出サイトに結合していないすべてのラベル付第１結合薬剤を、検出サイトから除去するという効果を有している。この洗浄液体は、試料自身を含有することができる。ここで、試料は、付加的に、汚染物および過剰薬剤を除去するために、関連するゾーンを通る際に濾過されている。
付加的な洗浄ステップは、血清分析の場合に、例えば血清試料の血清分析の場合に、特に適切である。これにより、検出サイトから、過剰の血清および非特定抗体を除去することができる。
同様に、信号生成をもたらすラベル現像は、適切であれば、最終ステップとして検出サイトに対して、この場合にも試料自身とされることが好ましい液体を搬送するための他のゾーンを設けることにより、終了させることができる。
本発明のデバイスは、一連の反応が、順次行われるように、また時間差をもって行われるように、構成することができる。この場合、時間差は、例えば液体回路の場合には多孔質部材の各液体非浸透性ゾーン内に形成された液体チャネルの長さに依存する。あるいは、徐放性の性質、あるいは、様々な薬剤に対する障壁の性質に依存する。
好ましい実施形態においては、液体または過剰の薬剤が反応に参加する前後に、これら液体または過剰の薬剤を流し込まれるウィックまたはウィックゾーンを設けることができる。これは、デバイスを通しての液体流通を改善する。
各場合における第１結合薬剤および第２結合薬剤の選択は、テスト中の分析物質の性質に依存する。分析物質がホルモン様βHCGのような抗原タンパク質またはポリペプチドを備えている場合には、第１および第２結合薬剤は、とりわけ、サンドイッチ分析または競合的分析技術においては、従来と同様に、これらタンパク質に対して特有な抗体または抗体結合フラグメントを備えることができる。これに代えて、本発明のデバイスは、分析物質自身がHIV抗体のような特定の抗体を備えているような血清学的分析に対して使用することができる。このような場合には、好適には、第２結合薬剤が、目的抗体が特有的に結合するような抗原を備えており、第１結合薬剤が、分析物質抗体に結合するような抗−抗体を備えている。このような場合、分析物質抗体は、適切には、ラベル付抗−抗体の導入前に、検出サイトに固定される。ラベル付抗−抗体は、例えば液体回路の他のゾーンに投与されることにより、いささかの時間遅れをもって検出ゾーンに到着するように適用される。
付加的に、分析物質は、RNAやDNAのような核酸とすることができる。この場合、第１および第２結合薬剤は、テスト中の核酸に混成されるようなラベル付核酸プローブといった核酸結合成分を備えることができる。
デバイス中において使用するための好適な多孔質部材としては、従来からよく知られているように、多孔質膜、および、紙がある。好適な多孔質部材の中には、ニトロセルロース膜が含まれている。
デバイスは、単純なディップスティックを備えることができる。デバイスの形状に応じて、それは、表面に対して保護体なしでプラスチック性バッキングプレートに取り付けられる従来のディップスティックよりも、少し、幅広である。これに代えて、デバイスは、プラスチック製ハウジングのような容器内に封入することができる。ハウジングには、試料印加のための開口が設けられる。これに代えて、ラミネートされたカードの形態とすることができる。この場合、試料端が、使用直前にラミネートのカットまたは引き裂きにより露出され、その後、試料に浸漬される。さらに他の形態として、フラットカードの形態とすることができる。フラットカード上に、すべての化学物質、障壁、および、回路が取り付けられる。カードは、例えばスプレー適用されたプラスチック膜のような、非浸透性膜で被覆される。
以下、本発明を、添付の概略的な図面を参照して詳細に例示する。
図１は、使用前の分析テストデバイスの構成を概略的に示す図である。
図２は、分析の終了時点における図１のデバイスを概略的に示す図である。
図３は、競合的な分析を利用した分析テストデバイスの構成を概略的に示す図である。
図４は、詳細には血清分析に適用され洗浄ステップを含む分析テストデバイスを概略的に示す図である。
図５は、血清分析において使用するためのテストデバイスの他の実施形態を概略的に示す図である。
図６は、搬送媒体として血清試料を利用する血清分析に関連して使用するためのテストデバイスを概略的に示す図である。
図７は、信号増強機能付の１ステップサンドイッチ分析を行うためのものであって、薬剤の順次放出および制御された拡散を行う分析テストデバイスを概略的に示す図である。
図８は、漏斗状のところに拡散ゾーンが設けられた、図７と同様の分析テストデバイスを概略的に示す図である。
図９は、使用時に流体流通を自動的に変更するために、検出ゾーンへの薬剤の順次の搬送が増強反応を利用して得られている分析テストデバイスを概略的に示す図である。
図10Aおよび図10Bは、サンドイッチ分析における順次の信号増強のための膜表面から、薬剤を順次に放出し直線的に流通させる分析テストデバイスを概略的に示す、それぞれ、正面図および側面図である。
図11Aおよび図11Bは、サンドイッチ分析における順次の信号増強のための膜表面および重ね合わせパッドの表面から、薬剤を順次に放出する分析テストデバイスを概略的に示す、それぞれ、正面図および側面図である。
図12は、サンドイッチ分析において順次に信号増強を行うよう次第に放出して流通させるために、ゆっくりと溶ける障壁の背後に成膜された薬剤を備えた分析テストデバイスを概略的に示す図である。
図13Aは、サンドイッチ分析において順次に信号増強を行うために、固定されたターゲット結合タンパク質を備える膜上の、重ね合わされたあるいはオーバーラップされた下側ウィック（wick）から薬剤を順次放出する分析テストデバイスを概略的に示す図であり、図13Bは、その側面図を示している。
テストデバイス（図１）は、多孔性膜１を備えている。この多孔性膜１は、不浸透性障壁２により、反応サイト５を、第１ゾーン３と第２ゾーン４とに分割している。
第１ゾーンの一端部７内には、分析物質のための抗体６が設けられている。抗体６には、5nm以下のサイズとされた金粒子８が連結されている。分析物質をも連結している反応抗体９が、反応サイト５内において、多孔性膜１上に固定されている。
乳状銀のような乾燥銀反応剤10、および、ハイドロキノン（hydroquinone）のような現像剤が、第２ゾーン４の端部７に配置されている。第２ゾーン４内には、チャネル12を形成する一連の不浸透性障壁11が設けられている。
使用時には、端部７が、分析物質を含有しているかもしれない液状試料内に浸漬される。試料は、多孔性膜１を挿通する。第１ゾーン３を通った試料は、ラベルの付けられた抗体６を収集し、抗体６を反応サイト５へと運ぶ。試料中に分析物質13（図２）がある場合には、抗体６と結合することとなる。反応サイト５内においては、分析物質−抗体からなる錯体は、反応用抗体９に対して連結されることとなる。
第２ゾーン４を通る試料は、銀反応剤10を収集した後、チャネル12を矢印のように通過する。したがって、反応サイト５に到達するまでに、より長時間を要する。分析物質が存在する場合には、第２ゾーン４を通る試料が反応サイト５に到達した時点において、反応サイト５は、金でラベル付けされた粒子を所定濃度で有している。銀反応剤10は、これら粒子と反応して、ブラウンブラックの可視信号14を発色する。
図３に示す代替可能なデバイスにおいては、競合的な分析を行うことができる。この実施形態は、多孔性カード１を備えている。この多孔性カード１上には、３つのチャネル15、16、17が形成されている。第１チャネル15は、マウス抗体のような金でラベル付けされた抗体18を有している。第２チャネル16は、乳状銀／ハイドロキノン混合物19を有している。検出サイト21には、抗体18と結合するための分析物質と競合する抗原20が、固定されている。抗−マウス抗体のような抗−抗体22が、反応サイト23に固定されている。
チャネル15、16、17は、チャネルに沿って液体が移動することにより検出サイト21へと、さらに反応サイト23へと順次到達し得るように、設けられている。液体が反応サイト23を通過した後に、液体を受容するために、ウィックゾーン24が設けられている。
使用時には、カード１の下端部25が、分析物質を含有しているかもしれない液体試料内に浸漬される。これにより、液体試料が、チャネル15、16、17内に浸入する。最短のチャネル15内の試料中のすべての分析物質は、金でラベル付けされた抗体18と結合する。その後、チャネル15に沿って移動し、検出サイト21に固定された抗原20に出くわす。分析物質が既に結合している、ラベル付けされた抗体18は、この領域を通過することとなる。これに対して、未結合のラベル付けされた抗体18は、この領域内に留まる。
検出サイト21を通過した結合済みのラベル付けされた抗体18は、抗−抗体22と出くわし、よって、反応サイト23に留まる。
２番目に長いチャネル16を通る試料は、銀／ハイドロキノン反応剤19を、検出サイト21と反応サイト23との双方に搬送する。これらサイトにおいて、銀／ハイドロキノン反応剤19は、これらサイトに留まっている金でラベル付けされた抗体18に出くわす。金ラベルは、ブラウンブラックの可視信号の生成を推進する。この場合、ブラウンブラックの可視信号の強度は、これらサイトに存在する抗体18の量に依存する。
最後に、第３チャネル17における試料搬送は、検出サイト21および反応サイト23において起こり、これらサイトにおける銀増強金結合錯体を洗浄する。すべての過剰の液体は、ウィック領域へと導かれる。
図４には、本発明の分析デバイスのさらに他の実施形態を示している。この実施形態は、詳細には、血清抗体の検出のための血清免疫分析に適用することができる。この実施形態は、多孔性サポート26を備えている。この多孔性サポート26上には、長さが徐々に長いものとされている、３つのチャネル27、28、29が形成されている。チャネルの各々には、各チャネルの端部領域に液体受容開口30、31、32が設けられている。
検出ゾーン34内には、血清抗体または分析物質が結合することとなる抗原33が、固定されている。第２チャネル28内には、金でラベル付けされた抗−抗体35が配置されている。第３チャネル29内には、乳状銀／ハイドロキノン発色剤29が乾燥されている。使用時には、血清試料が、第１チャネル27の開口30内に導入される。そして、洗浄液が、他の開口31、32内に配置される。試料は、第１チャネル27に沿って移動し、試料中の特定の抗体が連結することとなる抗原33に出くわす。試料中の特定抗体以外のものは、ウィック領域37へと進む。
それと並行して、第２チャネル28の開口31からの洗浄液は、金でラベル付けされた抗体35を、検出サイト34へと搬送する。検出サイト34において、金でラベル付けされた抗体35は、そこに固定されたすべての血清抗体に出くわして結合する。銀／ハイドロキノン36は、第３チャネル29内において開口32から洗浄液によって搬送され、遅れて到着する。そして、銀／ハイドロキノン36は、すべての結合した金錯体と反応して、試料中の血清抗体の存在を知らせる可視信号をもたらす。
図５は、図４の分析デバイスの変形形態を示している。この実施形態は、分析結合反応どうしの間における中間的な、および、分析終了後における洗浄ステップを備えている。これは、付加的なチャネル40、41、42を導入することにより得られている。すべてのチャネルは、受容領域39内に配置された洗浄液を受容し得るように配置されている。チャネル40、41、42は、洗浄液を、検出サイト34へと搬送し得るよう構成されている。これにより、（ａ）金でラベル付けされた抗体35が到着する前に、検出サイトにおいて形成された抗原／血清抗体錯体を洗浄することができ、（ｂ）銀／ハイドロキノン発色剤が到着する前に、抗原／血清抗体錯体／金でラベル付けされた抗体を洗浄することができ、（ｃ）検出サイト34において銀増強錯体を洗浄して、増強を終了させることができる。
この実施形態は、図６に示すように変形することができ、このように変形することで、必要であれば、血清試料に対する洗浄ステップを提供することができる。この場合、残りの血清を洗浄液として作用させ得る血清抗体を取り除くために、第１チャネル27内を通るもの以外のすべての血清が、固定された抗−ヒトIgGに対して接触することを保証することが必要である。固定された抗−ヒトIgG43が、関連する各チャネルを横切って延在する横方向障壁の形態で、適切に設けられている。これは、洗浄液のための個別のリザーバを設ける必要性を除去する。
代替可能な実施形態においては、デバイスは、適切な薬剤が導入された膜を備えることができる。このような薬剤は、適用された試料の影響下において、薬剤が検出ゾーンに向けて順次移動するように配置されている。そのような実施形態の１つが、図７に示されている。紙、ニトロセルロース、ガラスファイバ、または他の多孔性材料製の上記膜のような固相キャリア45は、いくつかのものが移動可能なままであって他のものが移動不可能であるようにして、薬剤で適切にコーティングされている。デバイスは、適切な形状とすることができる。例えば、検出ゾーンに向けての薬剤の流れを絞り込むために、図７の破線46で示すように、不浸透性障壁でコーティングすることができる。
試料は、下端47に対して印加することができる、あるいはこれに代えて、キャリアの下端部の多数の開口に印加することができる。この場合、試料は、毛細管作用により、金ラベル付き抗体のような可動ラベル付き結合剤48、および、銀増強剤のようなラベル発色手段すなわち可動増強剤49に向けて、移動するようになっている。試料は、キャリア45に沿って移動する。その際、可動ラベル付き結合剤48および可動増強剤49を超えて移動し、検出ゾーンにおいては、反応抗体のような固定された結合剤50に向けて直接的に移動する。部材を適切に配置するために、可動薬剤48、49は、キャリアからの時間差をつけた薬剤放出を可能とするよう、異なる放出特性の薬剤をキャリア上に成膜することができる。薬剤放出を適切に選択することにより、ラベル付き薬剤48および増強薬剤49の放出の程度と速度とを制御することができ、また、それらが一時的に固定されその後反応する環境を制御することができる。
このように、薬剤は、検出ゾーンに向けて矢印の方向に順次移動していく。そして、好ましくは、検出ゾーンを通り抜けて、毛細管作用で引かれることによって、上部ゾーン51へと移動する。可動薬剤48、49に対する結合薬剤50の適正な相互作用および一様な接触を補助するために、拡散手段52を設けることができ、この拡散手段52を、試料経路上において、検出ゾーンの直前に配置することができる。この拡散手段52は、例えば、タンパク質（例えば、牛の血清アルブミンすなわちBSA）、ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール（PVA）、PEG、PVP、等）、塩、あるいは、検出ゾーンを通る流れに対してさえも薬剤の分散が引き起こされ得るようにして膜上に成膜されたグリセロール（glycerol）、アラビアゴム、脂質のような他の適切な物質といった、固定された物質の形態をとることができる。膜は、また、拡散ゾーンにおいてそのような混合または拡散を引き起こすために、浸透性のまたは非浸透性材料からなる織込パターンを組み込むことができる。そのような非浸透性材料としては、ワックスがある。このワックスは、所望のパターンが得られるようなグラフィックコンピュータプログラムに基づいて駆動される高解像度の高温ワックスプリンタを使用して膜上に成膜される。適切な高温ワックスプリンタとしては、Tetronix  Europe,UKから利用可能なPhaser  340がある。適切なグラフィックデザインパッケージは、Autodesk  Inc,USAから利用可能なAutosketchがある。これに代えて、拡散は、拡散ゾーンにおける膜上に設けられたガラスファイバパッドのような分離材料を配置することにより得ることができる。
試料中に存在する分析物質は、まず、第１ラベル付き薬剤48と反応し、その後、検出ゾーンを通って前進する。分析物質と結合薬剤50との相互作用により、サンドイッチを形成することができる。第１結合薬剤48のラベルが見えないものである（例えば、酵素、または、小さな金、または、増強されていないラベル）ことにより、直接的な信号が検出されることはない。試料が検出ゾーンを超えて引き続いて移動すると、このサンドイッチ形成後の洗浄効果を作り出す。引き続いて増強薬剤49が放出されることにより、増強薬剤49は、検出ゾーンに向けて、さらに検出ゾーンを通って移動することができる。これにより、間接的な信号をもたらすよう、所望の信号増強を引き起こすことができる。この増強を行った後に、さらに試料が移動することにより、膜が洗浄されて、反応ゾーンの背景上に明瞭な信号を形成することができる。
上記に代えて、デバイスは、図８に示すような単一の狭いストリップからなる膜の形態をとることができる。この場合、可動薬剤48、49は、ストリップの下部において、近接して並置されている。適切な徐放性薬剤を使用することにより、各薬剤は、検出ゾーンにおける結合薬剤50に向けて、順次、移動することができる。薬剤の拡散は、拡散手段52を検出ゾーンの直前に配置することにより、検出ゾーンに到達する前になされる。この場合、薄層状の流れが、薬剤が拡散手段に順次到達する前に、薬剤どうしが混ざってしまわないことを保証している。
驚くべきことに、銀増強薬剤が、検出ゾーン内における、金ラベル付けされた結合性タンパク質上に金属銀の成膜を引き起こしたことにより、銀が、検出ゾーンを通る銀増強薬剤のさらなる流れに対して半浸透性障壁を形成したことがわかった。これにより、検出ゾーンを通る薬剤の流通経路を変更する効果をもたらし、結果、実質的に、最終反応生成物がデバイス形状を変化させることとなる。これが、検出ゾーンの全体となる。検出ゾーンの全体においては、銀イオンが均一に拡散し、銀イオンが、検出ゾーン内の金粒子の増強をさえ行うことができる。このようにして、検出ゾーンを通る薬剤の薄い流れは、自動的に、検出ゾーン全体にわたって拡散する。
さらなる試みにおいては、膜上の適切な箇所に金粒子を固定的に成膜することにより、銀増強薬剤が、膜を通る液体の流れを実質的に変更させた金属銀の形成を引き起こした。このようにして、非浸透性障壁を使用することなく、また徐放性薬剤を使用することなく、薬剤を検出ゾーンへと順次搬送し得る構成とすることができる。
そのような実施形態の１つが図９に示されている。この実施形態においては、ラベル付薬剤48は、キャリア45上において、ラベル付薬剤48が薄層状流のもとにおいて、検出ゾーンにおける結合薬剤50に向けて直接的に前進し得るように、配置されている。増強薬剤49は、増強薬剤49が薄層流に沿って前進した場合に、増強薬剤49が検出ゾーンをバイパスし得るように、配置されている。しかしながら、金粒子53は、試料がキャリアに沿って流通を続けたときに、矢印で示すようにして検出ゾーン内の流通が実質的に収束している増強薬剤49の流通経路内に、障壁が形成されるようにして、キャリア上において増強薬剤49の経路内に配置されている。
これに代えて、デバイスは、図10に示すような単純なディップスティックの形状とすることができる。この場合、すべての薬剤は、異なるゾーンにおいて横方向に成膜されている。そして、これら薬剤の制御された放出は、各ゾーンにおける適切な放出用薬剤の印加により、もたらされている。よって、試料は、ストリップの下端47に印加され、毛細管作用で引かれることにより、各ゾーンを流通してから、上部51へと流れる。試料は、即時放出を行うことなく増強薬剤49を通り、ラベル付結合タンパク質48へと流通を続ける。ラベル付結合タンパク質48のところにおいて、試料内分析物質とラベル付結合タンパク質48との間において相互作用が起こる。同時に、ラベル付結合タンパク質を放出する。ラベル付結合タンパク質は、その後、反応用結合タンパク質50のところに向けて移動する。そして、試料内に特定の分析物質が存在する場合には、その場所で、さらなる相互作用を起こして、上記のようなサンドイッチを形成する。過剰の試料溶液は、反応ゾーンを通り過ぎて、ストリップ51の上部領域51へと進む。ストリップ51の上部領域51は、試料を検出ゾーンから有効に引っ張るために、オーバーラップしたウィックまたはより大きな表面積（図示せず）を有することができる。
増強薬剤49の引き続く放出は、試料液体の連続流通により起こる。この放出は、上記のような徐放性薬剤の選択により制御される。増強薬剤49は、同様に、検出ゾーンから引かれて、視認可能な信号を形成する。
多くの引き続く反応が起こるように、多くの薬剤を、このようにして、膜の下部に成膜することができる。銀増強の後に小さな金の特別のラベルを使用することは、あるいは、色反応物質の後に酵素ラベルを使用することは、現在利用可能な従来技術による迅速テストシステムにおける大径の金または特定のラベルによりもたらされる直接的な信号と比較して、より大きな間接的な信号強度をもたらす。加えて、この方法においては、反応ゾーンにおける様々な反応どうしの間において洗浄を行うことができる。この洗浄は、試料自身によりなされる。試料から２つ以上の分析物質の同時検出を行うために、付加的に、検出ゾーン内に固定して、２つ以上の反応用結合薬剤を設けることができる。
これに代えて、可動ラベル付結合薬剤および／または増強手段は、浸透性膜、紙、またはガラスファイバ等の個別層上に成膜することができる。この場合、個別層は、デバイス膜の表面上に接触している。これにより、試料溶液は、まず最初に、反応ゾーンに向けてこの第２層の下を移動し、制御された時間経過の後、反応ゾーンを通る。よって、ラベル付結合薬剤またはラベル付現像手段を放出する。この実施形態は、図11に示されている。図において、増強薬剤49は、キャリア45の表面上に固定されたガラスファイバパッド54上に配置されている。ラベル付結合薬剤あるいはラベル現像手段の放出までの時間間隔は、第２層をなす材料の選択により、あるいは、第２層内での放出薬剤の選択により、制御することができる。デバイス膜を通しての薬剤の移動速度は、例えば、表面活性剤、ポリマー、タンパク質、糖類、樹脂、等の適切な阻害剤を単独でまたは組み合わせて使用して、膜または第２層材料を前処理することにより、制御される。
この原理を拡張すると、このような膜の複数層を、１箇所に組み込むことができる。この場合、各層は、順次溶解してデバイス膜へと搬送されるような、異なる反応物質を備えている。これら複数層は、デバイス膜上へのより正確な順序的放出をもたらし得るように、コーティングされていない膜によって隔離することもできるし、あるいは、隔離しなくても良い。このような層状構成の１つの利点は、ラベル付結合薬剤およびラベル現像手段の一方または双方が、デバイス膜のボディ内に、初期的には組み込まれていないことである。したがって、反応ゾーンへの試料溶液の流通をフリーとすることができる。
このようなデバイスは、上述のように、サンドイッチ分析において、あるいは、競合分析における液体回路構成として、使用することができる。競合分析形式においては、第２結合薬剤50は、第１結合薬剤48との結合のために、試料分析物質と競合する。第１結合薬剤48は、テスト時には、液体試料の影響のもとに検出ゾーンへと移動する。しかしながら、この例においては、試料分析物質に対して既に結合したものすべては、検出ゾーン内に保持されることがない。未結合の第１ラベル付結合薬剤48だけが、検出ゾーンに集積されて、可視信号を形成することとなる。この例においては、信号が大きいほど、試料内に存在する分析物質が少ないことになり、試料内に分析物質が欠乏していることを知らせる。即時ラベル付結合薬剤48は、検出ゾーンにおいて視認不可能となる。しかしながら、増強薬剤49の順次の到着による引き続く増強は、現在使用されている従来技術による直接型ラベルと比較して、より大きな強度にまで視認可能なラベルを低減させる。
また、本発明によるデバイスは、血清、唾液、または他の生体流体、あるいは、他のソースから準備された試料溶液中における、（複数の）特定の抗体の検出に使用することができる。この場合の特に好適な実施形態は、図12に示されている。デバイスの形態は、大まかには、図７に示すものと同様である。しかしながら、この場合、固定された反応薬剤は、検出すべき抗体に特有の抗原とすることができる。ラベル付結合薬剤48は、小さな金粒子、または、他の粒子材料、または、酵素、等によりラベル付けされた、例えば、タンパク質ＡまたはAG、または、抗ヒトIgG、等のような適切な結合タンパク質とすることができる。増強薬剤49は、上述と同様にここでも、銀増強薬剤、酵素基体、または色素、等とすることができる。これら結合薬剤を順次放出することにより、検出ゾーンにおいて、時間差をつけた反応を起こさせることができる。
特定の抗体および非特定の抗体を含有した試料は、まず最初に、障害の無いギャップ55を通って移動し、検出ゾーンにおいて、固定された抗原50aと直接的に反応する。その次に、ラベル付薬剤48を放出することにより、ラベル付薬剤48を、この時点では検出ゾーンに固定された試料抗原と反応させることができる。ラベル付結合薬剤48および増強薬剤49の制御された引き続く放出は、上述と同様の放出物質により、あるいは、上述と同様の半浸透性障壁の背後にまたは半浸透性障壁内に成膜することにより、もたらされている。試料は、可視信号をもたらす増強薬剤49のその後の放出に先立って、洗浄効果をもたらしつつ、検出ゾーンを通り過ぎてゆく。
ラベル付結合薬剤48に対しての、試料内に存在する非特定抗体の付着を低減するために、ラベル付結合薬剤48を、抗IgGからなるバンド56により部分的にシールドすることができる。この構成においては、試料は、抗IgGバンド56を通過して、ラベル付結合薬剤48の放出および流通を引き起こし、その後、増強薬剤49の放出および流通を引き起こす。しかしながら、特定のIgGおよび非特定のIgGは、試料のこの部分から濾過される。
検出ゾーンを通しての毛細管作用による試料の十分な引出しを行うために、膜の下端および上部の双方への試料印加のための所望のウィックゾーンが設けられている場合には、デバイスは、図12に示すような適切な形状とすることができ、拡散手段52、および、検出ゾーンまたは反応ゾーンを通しての、試料および薬剤の収束を行うことができる。
これに代えて、デバイスは、図10に示す形態とすることができる。この形態においては、すべての薬剤が、異なるゾーンにおいてストリップを横切って成膜されている。そして、これら薬剤の制御された放出は、各ゾーンに対しての、適切な放出材料のの印加によりもたらされている。よって、試料は、ストリップの下端に印加され、毛細管作用により、各ゾーンを通過して上部51へと、引かれる。この場合、薬剤は、試料が増強薬剤49およびラベル付結合薬剤48の双方を即座に放出させることなく、増強薬剤49およびラベル付結合薬剤48を通過し得るように、配置されている。試料は、検出ゾーンに向けて進む。この検出ゾーンのところにおいて、試料内分析物質は、反応薬剤50と特有的に結合する。さらなる試料溶液の流通は、ラベル付結合薬剤48のその後の放出を引き起こす。そして、ラベル付結合薬剤48は、反応ゾーンに向けて、さらに反応ゾーンを通過して流通する。そして、試料から抽出されて反応ゾーンに固定された特定の抗体に対して結合する。さらに、試料溶液の流通は、増強薬剤49のその後の放出をもたらす。そして、増強薬剤49は、反応ゾーンへと流通し、ラベルを増強して、可視信号を生成する。
好ましい実施形態においては、デバイスは、図13に示すような単純なディップスティックの形態をなす。この実施形態においては、可動薬剤48、49が、例えばガラスファイバを備える下部パッドあるいはウィック57上の異なるゾーンに成膜されている。可動薬剤48、49は、上述のように、例えばアラビアゴムのような徐放性材料内に含有されている。徐放性材料は、異なる薬剤の放出を適切に制御する。試料は、ストリップの下端47に印加され、毛細管作用により引かれて、各薬剤ゾーンを通過して検出ゾーンへと向かう。試料は、増強薬剤49を即座に放出させることなく、下側ウィック57を通過し、ラベル付結合薬剤48へと進む。ラベル付結合薬剤48のところにおいては、試料内分析物質とラベル付結合薬剤48との間の相互作用が起こり、同時に、ラベル付結合薬剤48を放出する。結果的に得られた溶液は、その後、膜58上を移動し、結合薬剤50に向けて移動する。試料内に特定の分析物質が存在する場合には、そこで、さらなる相互作用を起こし、上述のようなサンドイッチを形成する。過剰の試料溶液は、検出ゾーンを通過して、上部領域51へと向かって流れる。上部領域51には、試料の有効的な検出ゾーンを超えての引出しを行い得るように、オーバーラップウィック59あるいはより大きな表面積が設けられている。引き続いて試料溶液が流れると、下部ウィックから増強薬剤49が放出されて流出する。これにより、増強薬剤49は、膜に対して移動し、検出ゾーンに向けて流れる。検出ゾーンのところにおいては、増強薬剤49は、ラベルの増強を引き起こす。さらに試料が流れると、目標ゾーンからの、過剰の増強薬剤の洗浄が引き起こされる。
同様ではあるが、ラベル付結合薬剤として徐放性薬剤を使用した、より単純な構成は、上記図７〜図13に示す任意の実施形態において、可視ラベルを使用することにより形成することができる。この場合には、信号を可視化するための、引き続く増強は不要である。
本発明の分析デバイスは、完成品として提供することができる。あるいは、キットの形態で提供することができる。分析デバイスは、例えば、適切な不浸透性障壁、および／または、薬剤を印加すべき箇所を表すマーク、または、バンド、または、抗体、等をを備える多孔質部材を具備している。適切な薬剤は、キットの一部に、入れても入れなくても良い。
以下の実施例は、例示のためだけに説明されている。
実施例１
実質的に図10の形態をなすデバイスを、次のようにして構築した。ポアサイズが８μｍであって、硬いプラスチック製バッキングプレートに支持されたニトロセルロース膜は、Advanced  Micro  Devices,New  Delhi,Indiaから入手した。この膜のストリップを、5mm幅および80mm長さにカットした。本発明の単純な例示のために、ウサギのIgG（Sigma  Chemicals  Ltd,Poole,UK）を脱イオン化水中で1mg/mlに希釈した。そして、これを、診断デバイスのためのタンパク質印刷用に特別に構成された圧電性インクジェットプリンタ（Bioprinter,British  Biocell  International  Ltd,Cardiff,UK）を使用して、１μl/cmの強度で、下端から4cmのところのストリップ上にストライプ状に横方向に適用した。タンパク質ストライプを、37℃で15分間にわたって乾燥させた。その後、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  UK）からなる溶液中に浸漬することにより、ストライプをブロックした。ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。1nmの金粒子（British  Biocell,UK）が付着された山羊の抗ウサギIgGを、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  UK）からなる溶媒中において１μg/mlの抗体濃度に希釈した。５μｌを計量して、下端から約3cmのところのストリップ上に適用した。開始剤および現像剤を備えた、光マイクロスコープ銀増強キットSELK15（British  Biocell  International  Ltd）を、入手した。開始剤および現像剤は、アラビアゴム（Sigma  Chemical,UK）の水性１％溶液に対して、個別に1:1に希釈された。各薬剤について２μｌを膜ストリップ上に計量した。開始剤は、下端から1cmのところに配置し、増強剤は、下端から2cmのところに配置した。ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。そして、ストリップを、100μｌのリン酸緩働サリン（phosphate buffered saline）の微小井戸内に配置した。金でラベル付けされた山羊の抗ウサギIgGを、固定されたウサギIgGに対して移動させ、１分以内の間保持した。しかしながら、明瞭な信号は、得られなかった。さらに、２分間保持すると、開始剤および増強剤が、ストリップ上を移動し、金でラベル付けされた抗体と反応し、強いブラック信号を生成した。
実施例２
サンドイッチ分析デバイスを、尿中のベータHCGを検出するために、図10の形態で作製した。ポアサイズが８μｍであってプラスチック製バッキングプレートに支持されたニトロセルロース膜（AMD,India）に対して、Bioprinterを使用して、単一クローン系抗アルファHCG（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）の1mg/ml溶液を水中において１μl/cmの濃度でストリップを形成した。ストリップを、37℃で15分間にわたって乾燥させた。その後、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  Chemicals  ltd,UK）からなる混合溶液中に１分間浸漬することにより、膜ストリップをブロックした。そして、37℃で30分間にわたって乾燥させた。1nmの金粒子（British  Biocell,UK）が付着された単一クローン系抗アルファHCGを、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジンからなる溶媒中において１μg/mlの抗体濃度に希釈した。５μｌを計量して、下端から約3cmのところのストリップ上に適用した。
増強剤および開始剤の双方を上記ストリップに適用し、ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。そして、ストリップを、妊娠４週間の女性からの100μｌの尿を含有する微小井戸内に配置した。試料は、ストリップから反応ゾーンに向けての金錯体の移動を引き起こし、試料内のベータHCG分析物質と反応した。３分間以内に、試料は、銀増強薬剤を膜ストリップから反応ゾーンへと移動させ、分析物質の存在を示す強いブラックラインを生成した。さらなる試料の流通は、すべての背景汚れを洗浄するようにストリップを洗浄した。
実施例３
他のサンドイッチ分析デバイスを、標準試料中のＢ型肝炎表面抗原を検出するために、図10の形態で作製した。ポアサイズが８μｍであってプラスチック製バッキングプレートに支持されたニトロセルロース膜（AMD,India）に対して、Bioprinterを使用して、単一クローン系抗Ｂ型肝炎表面抗原（Genzyme,UK）の1mg/ml溶液を水中において１μl/cmの濃度でストリップを形成した。ストリップを、37℃で15分間にわたって乾燥させた。その後、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）からなる混合溶液中に１分間浸漬することにより、膜ストリップをブロックした。そして、37℃で30分間にわたって乾燥させた。1nmの金粒子（British  Biocell,UK）が付着された第２単一クローン系抗Ｂ型肝炎表面抗原を、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジンからなる溶媒中において１μg/mlの抗体濃度に希釈した。５μｌを計量して、下端から約3cmのところのストリップ上に適用した。増強剤および開始剤の双方を上記ストリップに適用し、ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。そして、ストリップを、標準濃度のＢ型肝炎表面抗原（Genzyme,UK）が加えられた100μｌのPBSを含有する微小井戸内に配置した。試料は、ストリップから反応ゾーンに向けての金錯体の移動を引き起こし、試料内のヘパタイト分析物質と反応した。３分間以内に、試料は、銀増強薬剤を膜ストリップから反応ゾーンへと移動させ、分析物質の存在を示す強いブラックラインを生成した。
実施例４
図13に示す好ましい実施形態に基づいて、デバイスを、次のようにして構築した。ポアサイズが８μｍであって、硬いプラスチック製バッキングプレートに支持されたニトロセルロース膜（Advanced  Micro  Devices,New  Delhi,India）を、5mm幅および25mm長さにカットした。上部紙ウィックを、膜上に2mmオーバーラップさせて適用した。ストリップは、Bioprinterを使用して、単一クローン系抗アルファHCG（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）の1mg/ml溶液を水中で１μl/cmの強度で、下端から4cmのところに形成した。ストリップを、37℃で15分間にわたって乾燥させた。その後、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）からなる混合溶液中に１分間浸漬することにより、膜ストリップをブロックした。そして、ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。1nmの金粒子（British  Biocell,UK）が付着された単一クローン系抗ベータHCGを、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジンからなる溶媒中において１μg/mlの抗体濃度に希釈した。５μｌを計量して、下端から約2cmのところの５×30mmガラスファイバ製個別ストリップ上に適用した。銀増強キット（SELK15、British  Biocell  International  Ltd,UK）からの増強剤および開始剤を、また、ガラスファイバ（Whatman,UK）製の個別ストリップ上に、表面上において互いに5mm離れた個別領域のそれぞれに５μｌずつ計量することにより適用した。そして、37℃で15分間にわたって乾燥させた。そして、ガラスファイバ製ストリップを、両面粘着テープの層を介して、ニトロセルロース膜を備えるプラスチック製バッキングプレート上において、ストリップが膜に対して1mmオーバーラップするようにして、所定位置に保持した。組み立てたストリップを、下端が妊娠４週間の女性からの100μｌの尿を含有する微小井戸内に位置するようにして、配置した。試料は、ガラスファイバ製ストリップから反応ゾーンに向けての金錯体の移動を引き起こし、試料内のベータHCG分析物質と反応した。３分間以内に、試料は、銀増強薬剤をガラスファイバ製ストリップからニトロセルロース膜上へと、さらに、上方に向けて反応ゾーンへと移動させ、分析物質の存在を示す強いブラックラインを生成した。
実施例５
図７に示すデバイスを、25mm幅および80mm長さのニトロセルロースストリップ（Advanced  Micro  Devices,India）を使用して作製した。ストリップは、マーカーペンを使用して、図７の破線で示すように、非溶解性インクの境界線が印刷された。この構成は、薬剤に対する個別のチャネルを形成するものではない。しかしながら、検出ゾーンに向けての薬剤の収束を可能とする。ストリップは、Bioprinterを使用して、単一クローン系抗アルファHCG（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）の1mg/ml溶液を水中で１μl/cmの濃度で、チャネルの幅全体にわたって、下端から約4cmのところの検出ゾーンに印刷した。ストリップを、37℃で15分間にわたって乾燥させた。その後、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジン（Sigma  Chemicals  Ltd,UK）からなる混合溶液中に１分間浸漬することにより、膜ストリップをブロックした。そして、ストリップを、37℃で30分間にわたって乾燥させた。1nmの金粒子（British  Biocell,UK）が付着された単一クローン系抗ベータHCGを、0.1％のTween20および１％のポリビニルピロリジンからなる溶媒中において１μg/mlの抗体濃度に希釈した。５μｌを計量して、下端から約1cmのところのちょうど中央線上において、図７における領域48のストリップ上に適用した。銀増強キット（SELK15、British  Biocell  International  Ltd,UK）からの増強剤および開始剤の双方を、符号49で示すゾーンに対して、各３μｌ計量することにより適用した。２つの薬剤は、中央線の左において、約5mmだけ隔離されている。そして、37℃で15分間にわたって乾燥させた。銀増強薬剤を、中央線の左において、下端から約2cmのところに配置した。ストリップを、下端が妊娠２週間の女性からの100μｌの尿を含有する微小井戸内に位置するようにして、配置した。試料は、ストリップから反応ゾーンに向けての金錯体の移動を引き起こし、試料内のベータHCG分析物質と反応した。３分間以内に、試料は、銀増強薬剤をガラスファイバ製ストリップからニトロセルロース膜上へと、さらに、上方に向けて反応ゾーンへと移動させ、分析物質の存在を示す強いブラックラインを生成した。下端からのさらなる試料の流通は、残った薬剤を、膜から上部ゾーンへと洗い流した。
上記デバイスは、１ステップの手続で迅速になされるべき分析を、高感度で行うことができる。実施される分析、利用可能な薬剤、および、所望の分析デバイスの種別に応じて、多くの他の構成をとることができ、これらは本発明の一部をなす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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