(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．７５Ｍ以上の濃度でスクロースを含んでなる、ｐＨ８〜９の水溶液中で感染性組換えウイルスを保存する、凍結した形態または液体の形態で感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２】
スクロースの濃度が０．７５Ｍ〜１．５Ｍである、請求項１に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項３】
スクロースの濃度が１Ｍである、請求項１に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項４】
水溶液のｐＨが８．５である、請求項１に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項５】
前記ウイルスがアデノウイルスまたはレトロウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項６】
前記水溶液が緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項７】
前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ホウ酸塩／ＨＣｌ、グリシン／ＮａＯＨ、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン）酸］、ビシン、ＴＡＰＳ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］およびトリシン溶液の中から選択されるものである、請求項６に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項８】
前記緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である、請求項６に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項９】
前記水溶液が、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、およびＭｎＣｌ2の中から選択される２価のカオチンの少なくとも１種の塩をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１０】
２価のカオチンの少なくとも１種の塩がＭｇＣｌ2である、請求項９に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１１】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に０．１〜５ｍＭの濃度で存在する、請求項９または１０に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１２】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に０．５〜２ｍＭの濃度で存在する、請求項９または１０に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１３】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に１ｍＭ程度の濃度で存在する、請求項９または１０に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１４】
前記水溶液が、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５、を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１５】
前記水溶液が、塩、アミノ酸および界面活性剤の中から選択される少なくとも１種の安定剤を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１６】
前記塩が１価の塩である、請求項１５に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１７】
前記１価の塩が、ＮａＣｌおよびＫＣｌの中から選択されるものである、請求項１６に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１８】
前記１価の塩がＮａＣｌである、請求項１６に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項１９】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．０５〜１Ｍの濃度で存在する、請求項１７または１８に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２０】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．１〜０．５Ｍの濃度で存在する、請求項１７または１８に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２１】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．１〜０．３Ｍの濃度で存在する、請求項１７または１８に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ８０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００である、請求項１５に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２３】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００１〜０．５重量％の濃度で存在する、請求項２２に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２４】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００２〜０．２重量％の濃度で存在する、請求項２２に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２５】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００５重量％程度の濃度で存在する、請求項２２に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２６】
前記水溶液が、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０および１Ｍのスクロース、ｐＨ約８．５、を含んでなる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２７】
保存温度が＋４℃またはそれより低い、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２８】
前記溶液中のウイルスを次いで凍結乾燥する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法。
【請求項２９】
ｐＨが８〜９である０．７５Ｍ以上の濃度の水性スクロース溶液を含んでなる、感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３０】
水性スクロース溶液のｐＨが８．５である、請求項２９に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３１】
水性スクロース溶液の濃度が０．７５Ｍ〜１．５Ｍである、請求項２９に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３２】
水性スクロース溶液の濃度が１Ｍである、請求項２９に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３３】
前記ウイルスがアデノウイルスまたはレトロウイルスであることを特徴とする、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３４】
前記水溶液が緩衝液である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３５】
前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ホウ酸塩／ＨＣｌ、グリシン／ＮａＯＨ、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン）酸］、ビシン、ＴＡＰＳ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］およびトリシン溶液の中から選択されるものである、請求項３４に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３６】
前記緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である、請求項３４に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３７】
前記水溶液が、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、およびＭｎＣｌ2の中から選択される２価のカオチンの少なくとも１種の塩をさらに含んでなる、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３８】
２価のカオチンの少なくとも１種の塩がＭｇＣｌ2である、請求項３７に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項３９】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に０．１〜５ｍＭの濃度で存在する、請求項３７または３８に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４０】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に０．５〜２ｍＭの濃度で存在する、請求項３７または３８に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４１】
前記２価のカオチンの塩が、前記水溶液中に１ｍＭ程度の濃度で存在する、請求項３７または３８に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４２】
前記水溶液が、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５、を含んでなる、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４３】
前記水溶液が、塩、アミノ酸および界面活性剤の中から選択される少なくとも１種の安定剤を含んでなる、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４４】
前記塩が１価の塩である、請求項４３に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４５】
前記１価の塩が、ＮａＣｌおよびＫＣｌの中から選択されるものである、請求項４４に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４６】
前記１価の塩がＮａＣｌである、請求項４４に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４７】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．０５〜１Ｍの濃度で存在する、請求項４５または４６に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４８】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．１〜０．５Ｍの濃度で存在する、請求項４５または４６に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項４９】
前記１価の塩が、前記水溶液中に０．１〜０．３Ｍの濃度で存在する、請求項４５または４６に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５０】
前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ８０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００である、請求項４３に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５１】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００１〜０．５重量％の濃度で存在する、請求項５０に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５２】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００２〜０．２重量％の濃度で存在する、請求項５０に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５３】
Ｔｗｅｅｎ８０が、前記水溶液中に合計の溶液に基づいて０．００５重量％程度の濃度で存在する、請求項５０に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５４】
１０6〜１０13ｐｆｕ／ｍｌの感染性組換えウイルスを含んでなる、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５５】
前記水溶液が、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０および１Ｍのスクロース、ｐＨ約８．５、を含んでなる、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液。
【請求項５６】
請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法を使用して得られた感染性組換えウイルスの水性懸濁液と、薬学上許容されるベヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項５７】
遺伝病、癌、ウイルス性疾患または再発性疾患の治療または予防を目的とする薬剤を製造するための、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスの水性懸濁液、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載の感染性組換えウイルスを保存する方法を使用して得られた感染性組換えウイルスの水性懸濁液の使用。
【請求項５８】
血友病、嚢胞性繊維症、糖尿病、ジュシェーヌ病またはベッカー病の治療または予防を目的とする薬剤を製造するための、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
肝炎またはエイズの治療または予防を目的とする薬剤を製造するための、請求項５７に記載の使用。
【請求項６０】
ヘルペスウイルスまたはヒト乳頭腫ウイルスによる感染症の治療または予防を目的とする薬剤を製造するための、請求項５７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、感染性組換えウイルスの保存方法、水性ウイルス懸濁液、および薬剤としての使用に関する。
生きているウイルスは種々の目的に、特にワクチンとして、使用される。それらはそれらの複製に有用な情報を含有するＤＮＡまたはＲＮＡの形態のゲノムを有する粒子であるが、それらが必要とするタンパク質を合成するためには宿主細胞に感染することが必要である。
外来遺伝物質をウイルスゲノムへ組み込むことができるので、いわゆる組換えウイルスに治療上重要な遺伝子を担持させ、かつこの遺伝子を欠陥のある患者の特定の細胞の中に転移させることができる。これは遺伝子治療の原理である。
遺伝子治療によりヒトの疾患を治療する可能性は、数年以内に理論的考察の段階から臨床的応用の段階に進んだ。処置すべき細胞の中に治療遺伝子を転移しかつ発現させるために、今日まで記載されたプロトコルの大部分においてウイルスベクターが使用されている。
レトロウイルスベクターは、それらのゲノムが簡単であるために、クローニング許容性が多少制限されているものの、現在最も頻繁に使用されているベクターである。
アデノウイルスはいくつかの利点を有するために、広い範囲の用途のために選択されるベクターである。実際に、アデノウイルスは種々の細胞に感染し、非組込み性であり、低い病原性を有し、そして分裂する細胞または休止細胞の中で複製することができる。アデノウイルスのゲノムはほぼ３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子から構成されており、約３０以上の遺伝子を担持し、これらの遺伝子は同時にウイルスの複製に要求される初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４；初期についてＥ）および後期構造遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５；後期についてＬ）である。
遺伝子治療の目的に使用される組換えアデノウイルスは、環境および宿主生物へ拡散することを避けるために複製能力をもたない。一般に、組換えアデノウイルスはＥ１領域の大部分を欠如し、あるいは残りのウイルス遺伝子の発現に関係する情報を欠如する。組換えアデノウイルスは、それらが欠如するアデノウイルスの機能の相補性転換（transcomplementation）によってのみ、増殖させることができる。現在、本質的に相補的系統２９３（Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.36,59-72）またはそれに由来する系統（Yeh et al.,1996,J.Virol.70,559-565; Wang et al.,1995,Gene Therapy 2,775-783; Krougliak and Graham,1995,Human Gene Therapy 6,1575-1586）が使用されている。
特に、アデノウイルスは遺伝子治療による膵嚢胞性繊維症の治療に使用される（Pavirani et al.、1996、medecine/sciences 12、25-33）。
しかしながら、組換えウイルスの生活能力および感染性が貯蔵期間全体にわたって適切に保存される場合にのみ、組換えウイルスは使用可能である。
精製されたアデノウイルスは、伝統的には、１０〜３０％のグリセロールを含有する生理食塩水中で保存される（Graham et al.,1991, Methods in Molecular Biology, vol.7, chapter 11, p.109-127；Murrey Ed.,,The Human Press Inc. ;Precious and Russel,Virology, a Practical Approach, 1985, chapter 9, p.193-205; BW Mahy Ed., IRL Press, Washington DC; Kanegae et al., Jpn. J. Med.Sci.Biol.47, 157-166, 1994 Green et al., Methods in Enzymology, vol. LVIII,p.425-435）。しかしながら、グリセロールは肺上皮を刺激するという欠点を有し、これは気管内および肺内の投与の場合において微妙であることがある（例えば、嚢胞性繊維症または肺道の癌の治療のために）。さらに、この溶液は凍結された状態でアデノウイルスを保存することができるが、＋４℃においてアデノウイルスの活性を１週間以上維持することができない。
低濃度（１〜５％）のスクロースを生理食塩水に添加することも記載された（Precious et al., 上記を参照のこと; Huyghe et al.,Human Gene Therapy 6:1403-1416, November 1995, および Hehir, Process Development and Production Issues for Viral Vectors & Vaccines,The Williamsburg Bio Processing Conference,2nd annual meeting, November 6-9、1995）。これは凍結された形態のアデノウイルスの長期間の安定性を可能とするが、＋４℃において安定性の維持は短期間である（Ｈｅｈｉｒ、上記を参照のこと）。
凍結された形態のウイルスの保存は貯蔵および輸送の問題を生ずるので、また、凍結乾燥された形態でウイルスおよびウイルスのワクチンを保存することが試みられた。しかしながら、この技術はウイルスの活性の喪失をしばしば伴うという欠点を有する。このため、賦形剤、例えば、糖（スクロース、グルコース、トレハレース）を添加すると、凍結乾燥された形態でウイルスの活性の維持することができる（ＷＯ９５／１０６０１−ＶｉａｇｅｎｅおよびＥＰ−０  ３５７  ７０９−Ｑｕａｄｒａｎｔ）。凍結乾燥された形態の弱毒化された生きているウイルスの保存のために低濃度（２．５〜５％）のラクトースまたはスクロースを使用することが、また、推奨された（特開昭６３−５５５４６５−Ｋｉｔａｓａｋｏ  Ｉｎｓｔ．）。
今日までに提案された解決法のいずれも、アデノウイルスの活性を満足すべきレベルに６カ月以上の間維持させず、しかも二次的問題、例えば、刺激のような問題を回避することができなかった。
本発明は先行技術の欠点を克服する。本発明は、液体の形態および凍結された形態の双方において、感染性組換えウイルスを長期間保存する方法に関し、この方法において、スクロースを高い濃度で含んでなる水溶液中で組換えウイルスを保存する。
実際に、スクロースを高い濃度で使用することはタンパク質または他の生物学的産物について（Timasheef et al., In Protein Structure, a Practical Approach, 1989, Creighton Ed., chapter 14, p.331-345,IRL Press,Oxford;Doebbler,Cryobiology, vol.3, No.1, 1966）または液体窒素中の生きている細胞の低温保存（cryopreservation）について（Grout et al.,Tibtech, October 1990, vol.8,p.293-297）長期間にわたって知られているにもかかわらず、ウイルスの保存について全く提案されてきていない。
本発明による方法を使用して得られる結果によれば、異なる貯蔵温度（−８０℃、−４０℃、−２０℃および＋４℃）におけるスクロースの低温保護効果が示され、これはスクロース濃度がより高くなるほどいっそう顕著である。
本発明が関係する感染性組換えウイルスは、好都合にはポックスウイルス、アデノウイルス、アデノウイルスに関連するウイルスおよびレトロウイルスである。
本発明の範囲内において、高い濃度、すなわち、０．７５Ｍ以上、好ましくは０．７５Ｍ〜１．５Ｍの濃度、より好ましくは１Ｍの濃度において、スクロースを含んでなる水溶液中で、ウイルスを保存する。
本発明による方法の好都合な態様によれば、使用する水溶液が８〜９、好ましくは８．５の塩基性ｐＨを有するとき、感染性組換えウイルスは安定性を獲得する。
本発明の範囲内で使用する水溶液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、およびトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ホウ酸塩／ＨＣｌ、グリシン／ＮａＯＨ、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン）酸］、ビシン、ＴＡＰＳ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］およびトリシン溶液の中から選択される緩衝液であることができる。
好都合には、さらに、使用する水溶液に、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、およびＭｎＣｌ2の中から選択される２価のカオチンの少なくとも１種の塩、好ましくはＭｇＣｌ2を添加することによって、本発明に従いウイルスのキャプシドまたはウイルスのコートを安定化することができる。
本発明の範囲内において、２価のカオチンの塩を０．１〜５ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ程度の濃度において使用する。
本発明による方法の好都合な態様によれば、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５、を含んでなる緩衝液中でウイルスを保存する。
塩、好ましくは１価の塩、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ（これらは溶液にイオン強度を付与する）、アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、および表面張力に作用する化合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００の中から選択される少なくとも１種の安定剤を使用することによって、ウイルスの保存をなおさらに改良することができ、後者の物質を単独で、または塩の存在において使用することができる。
安定剤として、ＮａＣｌは好都合には０．０５〜１Ｍ、好ましくは０．１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．１〜０．３Ｍの濃度において使用し、最適であると考慮される濃度は０．１５Ｍであり、そしてＴｗｅｅｎ８０は合計の溶液に基づいて０．００１〜０．５重量％（すなわち、１０ｍｇ／１〜５ｇ／１）、好ましくは０．００２〜０．２重量％、より好ましくは０．００５重量％の程度の濃度において使用する。
好ましい態様によれば、本発明による方法は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．９％（または１５０ｍＭ）のＮａＣｌ、５０ｍｇ／ｌ（０．０５％）のＴｗｅｅｎ８０および１Ｍのスクロース１を含んでなるほぼ８．５ｐＨの水溶液を使用する。
さらに、本発明による方法に従い保存される感染性組換えウイルスは凍結乾燥することができる。
本発明は、さらに、前述したように高い濃度における水性スクロース溶液中の感染性組換えウイルスの水性懸濁液に関する。
本発明による水性懸濁液は、好都合には、１０6〜１０13ｐｆｕ／ｍｌの感染性組換えウイルスを含んでなる。
本発明は、また、前述したような、または本発明による保存方法を使用して得られた、感染性組換えウイルスの水性懸濁液と、薬学上許容されるベヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。それは全身の経路、特に皮下、静脈内、心臓内、筋肉内、腹腔内、胃内、腫瘍内、肺内、鼻内または気管内の経路により投与することができる。投与は単一の投与で、またはある時間間隔後に１回または２回以上の反復される投与であることができる。また、処方物は他の化合物、例えば、アジュバントまたは薬学上許容される賦形剤を含むことができる。特に、本発明による組成物は、疾患、例えば、遺伝病（血友病、嚢胞性繊維症、糖尿病、ジュシェーヌ病およびベッカー病、筋障害）、癌、ウイルス性疾患（種々の形態の肝炎、エイズ）および再発性疾患（ヘルペスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスにより誘発された感染）予防または治療における使用が意図される。
最後に、遺伝子治療によるヒトまたは動物の体の治療に意図される薬剤を製造するための、前述した、または本発明による保存方法を使用して得られた感染性組換えウイルスの水性懸濁液の治療的または予防的使用に関する。水性懸濁液は直接的にｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる（例えば、静脈内注射、筋肉内注射により、アクセス可能な腫瘍の中に、エーロゾルにより肺の中に）。ｅｘ  ｖｉｖｏのアプローチを適用することもでき、そしてこれは患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞）を取り出し、この分野において知られている技術に従い本発明による水性懸濁液で細胞を感染させ、そして感染した細胞を患者に再投与することにある。
第１図は、ウイルスの安定性に対するスクロース溶液のｐＨ効果を示す。
第２図は、スクロース溶液に対するＴｗｅｅｎ８０およびＮａＣｌの添加の効果を示す。縦座標の単位はｐｆｕ／ｍｌである。
本発明の他の特徴は、下記の実施例に照らして明らかとなるであろう。
材料および方法
下記の実施例において、下記の遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターを使用する：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼをコードするマーカー遺伝子ｌａｃＺ、およびＣＦＴＲ（膵嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター）タンパク質（これは膵嚢胞性繊維症の患者が欠如するタンパク質である）をコードする治療遺伝子ＣＦ。領域Ｅ１およびＥ３が欠失されており、そしてＥ１領域の代わりに組込まれたマーカー遺伝子および治療遺伝子の発現カセットを含んでなる、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ゲノムからベクターを得た（Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630；Rosenfeld et al., 1992, Cell 68, 143-155）。それは系統２９３において増殖させることができ（Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72）。これはウイルスの複製のために必須であるＥ１機能を補足する。系統２９３はヒト胚性腎臓から誘導され、そしてその染色体、Ａｄ５ゲノムの５’末端の中に組込まれた結果である（１１％）。２９３−細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ１５７３）から入手可能であり、そして供給業者の推奨に従い、または文献において推奨されているようにして培養される。
前述のアデノウイルスベクターでトランスフェクションされた２９３−細胞中で、慣用法に従い、一次ウイルスストックを構成する。細胞溶解後に収穫された感染性ウイルス粒子の産生は、連続的凍結／解凍サイクルによりチェックされる：寒天法によりウイルス調製物の力価（Graham and Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol.7, p.109-128；E. J. Mrey Ed., The Human Press Inc.）およびＳａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（1986, EMBO J. 5, 3133-3142）の方法のような発色法、すなわち、Ｘｇａｌ（４−クロロ−５−ブロモ−３−インドリル−β−ガラクトシダーゼ）によるマーカー遺伝子の発現または特異的抗体によるウェスタンブロットによるＣＦ−遺伝子の発現（Daleman et al., 1992, Experimental Cell Research 201, 235-240）。ウイルスの調製を使用する前に、それを密度勾配濃度および精製に付すことができる。
実施例１：ウイルス安定性に対するｐＨの効果
ウイルス懸濁液を下記のようにして調製する：
２９３−細胞をセルキューブ（ＣｅｌｌＣｕｂｅ）（Ｃｏｓｔａｒ）において７％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＧＭＥＭ−培地中で培養する。コンフルエンスに到達したとき、２のｍ．ｏ．ｉ．（感染の多重度）においてＣＦ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの一次ストックのアリコートで細胞を感染させる。感染の３０時間後、弱化した細胞を機械的撹拌によるか、または化学的物質により分離し、そして低速遠心（３５００ｒｐｍ（回転／分）、８分間）により収穫する。それらを溶解し、ウイルス粒子を３回の凍結／解凍サイクルにより遊離させ、そして細胞破片を遠心（３５００ｒｐｍ、８分間）により排除する。ウイルスを上清から塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を使用する２回の超遠心分離により精製する：第１回、それぞれ、密度ｄ＝１．２５およびｄ＝１．４０のＣｓＣｌクッション上（１４１，０００ｇ、２時間）、および第２回、密度ｄ＝１．３４のＣｓＣｌ溶液を使用する自律的に形成した勾配上（２３１，０００ｇ、１８時間）。
ウイルスのバンドを回収し、その力価を決定し（２×１０11ｐｆｕ）、そして調製物を４つのバッチに分割し、これらを４℃において２５０ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％のグリセロール（増加するｐＨ：それぞれ、ｐＨ７．４、８、８．５および９を有する）に対して４回透析する。処方物の異なる緩衝液中のウイルス安定性を平行に試験する（加速された安定性の試験）。このために、各バッチを各場合において１００μｌの懸濁液を含有する１ｍｌのクライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅｓ）の中に包装する。試料を３７℃においてインキュベートし、ｔ0において、並びに、４、２４および７２時間後に取り出す。それらを滴定まで−２０℃において保存する。寒天法により２９３−細胞を被験試料の異なる希釈物で再感染させることによって、ウイルス力価を測定する。結果をｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌで与える。
第１図に示す結果により示されるように、アルカリ性ｐＨを有する処方物はアデノウイルスの感染活性を保存する。実際に、ｐＨ８．５および９の緩衝液中で処方された調製物の力価は３７℃において２４時間にわたって安定であり、次いで継時的に漸進的に減少する。他方において、ｐＨ７．４および８の緩衝液の中に入れたウイルスは、３７℃におけるインキュベーションの開始からの感染ポテンシャルを喪失する。２４時間後、力価は既に非常に低く（開始における１０10程度に対して１０3〜１０4ｐｆｕ／ｍｌ）そして７２時間後、ウイルスは事実上感染性をもはやもたない。
実施例２：ウイルス安定性に対するスクロース溶液の効果
下記の変更を加えて実施例１に記載するように、ウイルス懸濁液を調製する：
・  ｌａｃＺ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターで、細胞を感染させる；
・  感染した細胞を機械的に溶解する（シルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）ホモジナイザー；参照番号Ｌ４Ｒ）；
・  固定角度のローターにより、ＣｓＣｌ勾配の超遠心分離を実施する（第１のものについて、２３５，０００ｇ、２時間、および第２のものについて、４３５，０００ｇ、１８時間）；
・  トリサクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）ＧＦ０５  ＬＳマトリックス（Ｂｉｏｓｅｐｒａ、参照番号２５９１６１）の助けによる濾過クロマトグラフィー工程により透析を実施し、次いでＣｓＣｌの排除により溶液を脱塩する；
・  ウイルスを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、および１Ｍのスクロースの溶液ｐＨ８．５中で処方し、次いで下に示す緩衝液（多孔度０．２２μｍの膜上で前以て濾過した）中でそれらを１／２０に希釈することによって５つのバッチに分割した。
バッチ１）１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５
バッチ２）１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．７５Ｍのスクロース、ｐＨ８．５
バッチ３）１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５Ｍのスクロース、ｐＨ８．５
バッチ４）１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２５Ｍのスクロース、ｐＨ８．５
バッチ５）１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０Ｍのスクロース、ｐＨ８．５
バッチの各々はほぼ１０10ｐｆｕ／ｍｌの出発力価を有する。規則的時間間隔において取り出したアリコートについて、加速された条件（３７℃）下に、ウイルス安定性を測定する。
結果を下記表１に示す。
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この試験において、スクロース濃度がより高くなるほど、ウイルス活性の保存はよりよくなる（バッチ１はバッチ２より安定であり、バッチ２はバッチ３より安定であり、およびその他）ことが示される。スクロースの非存在（バッチ５）において、感染性ポテンシャルは非常に急速に低下する（８時間のインキュベーション後において、５０００倍の減少）。０．２５Ｍ（バッチ４）の存在において、力価は急速に減少するが、その程度は低い（３７℃において８時間のインキュベーション後において、１０倍の減少）。スクロース濃度をさらに上昇させる（バッチ１、２および３）ことによって、力価は８時間以上にわたって維持され、次いでインキュベーションとともに漸進的に減少する。しかしながら、スクロース濃度が１Ｍに到達するとき（バッチ１）減少は最小である。
実施例３：処方緩衝液１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５についての長期間の安定性の安定性
この試験は実施例２において得られたウイルス懸濁液を使用して実施し、＋４℃および−２０℃における長期間の条件下のその安定性を試験する。ウイルス力価を経時的に寒天滴定によりモニターし、下記表２に示す結果は１Ｍのスクロースの存在下にｐＨ８．５において処方されたウイルス調製物の少なくとも６カ月の安定性を示す。
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１Ｍのスクロースを含む処方物を、また、慣用の緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）と比較した。２つのタイプの緩衝液中でほぼ１０10ｐｆｕ／ｍｌの最終力価に希釈したウイルス懸濁液について、この試験を＋４℃において実施した。結果を下記表３に示す。
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処方緩衝液が１Ｍのスクロースを含むとき、およびｐＨが弱アルカリ性緩衝液であるとき、ウイルス力価は＋４℃において６カ月以上にわたって安定であるが、１０％のグリセロールの存在において中性のｐＨにおいてウイルスを入れるとき、ウイルス力価は第１カ月から減少する。
実施例４：処方緩衝液の最適化
実施例２において得られたウイルス懸濁液を２つのバッチに分割し、これらをバッチ１）について使用した処方緩衝液中で、非補充であるか、または５０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０（０．００５％）および１５０ｍＭのＮａＣｌの存在において、１／２０に希釈する。安定性を３７℃および４℃において分析する。
加速された安定性の結果（第２図）は、Ｔｗｅｅｎ８０および塩のような保存剤の添加が１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５中で処方されたウイルスの安定性をさらに改良することを示す。これらが存在するとき、感染活性は、３７℃において、これらの非存在における８時間の代わりに２４時間にわたって維持される。
さらに、力価は６カ月以上にわたって安定であるため２つの保存剤の存在は＋４℃におけるウイルス調製物の安定性に悪影響を及ぼさない。
実施例５：処方緩衝液１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．９％のＮａＣｌ、５０ｍｇ／ｌのツイーン８０および１Ｍのスクロース、ｐＨ８．５中
の安定性
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2および１Ｍのスクロースの溶液中で処方した、実施例２に記載するようなウイルス懸濁液を、下記の処方緩衝液中で１／２０に希釈した：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ              １０ｍＭ
ＭｇＣｌ2                    １ｍＭ
ＮａＣｌ                      ０．９％（１５０ｍＭ）
Ｔｗｅｅｎ８０                ５０ｍｇ／ｌ
スクロース                    １Ｍ
ｐＨ８．５
試料を１ｍｌのクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）の中に包装し、クリオチューブの各々は１００μｌのウイルス懸濁液を含有する。クリオチューブを＋４℃において保存し、ウイルス力価をｔ0において、規則的に経時的に１年にわたって測定する。滴定まで、試料を−２０℃に保持する。結果を下記表４に示し、そしてこれらの結果が示すように、ウイルスは少なくとも１年にわたって安定である。
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【図１】
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【図２】
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