(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維の製造方法であって、
ａ）第１の高分子溶液及び第２の高分子溶液を得；
ｂ）前記第１の高分子溶液及び前記第２の高分子溶液の比率を連続的に変化させながら混合して前記第１及び第２の高分子溶液の混合物を得るとともに前記混合物を凝固浴槽に押し出す
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記第１の高分子溶液及び前記第２の高分子溶液の少なくとも一方が、活性な生物分子を含む水相及び生分解性高分子溶液中の界面活性剤を含有する油中水型エマルションである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
繊維が生理活性分子の線形勾配を有している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生分解性高分子溶液の生分解性高分子が合成生分解性高分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
高分子溶液が、高分子に良好な溶媒であり、水と混合せず、凝固浴槽溶媒と高度に混和性である高分子溶媒を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリ(ビニルアルコール)、プルロニクス、又は天然由来界面活性剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤が天然由来界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
天然由来界面活性剤がリン脂質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
凝固浴槽溶媒が高分子の非溶媒であり、高分子溶媒と高度に混和性である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
高分子が、ポリ(Ｌ-乳酸)、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリカプロラクトン、又はポリアンヒドリドである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
高分子が、ポリ(Ｌ-乳酸)、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリカプロラクトン、及びポリアンヒドリドの任意の共重合体又は混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
高分子溶媒がクロロホルム又は塩化メチレンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
凝固浴槽溶媒がヘキサン、アルコール又はアセトンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
凝固浴槽溶媒がイソプロピルアルコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
良溶媒がクロロホルム又は塩化メチレンであり、貧溶媒がトルエンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
凝固浴槽溶媒が高分子溶媒を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
凝固浴槽溶媒が２０％ｖ／ｖまでの高分子溶媒を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
凝固浴槽溶媒が粘性溶媒を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
粘性溶媒がグリセロールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
グリセロール濃度が８％から２０％ｖ／ｖの間である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２の高分子溶液が界面活性剤を含有して活性生物分子を含まないか、又は異なる活性生物分子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の高分子溶液及び前記第２の高分子溶液の比率が、バタフライ弁を用いて制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
第１の高分子溶液及び第２の高分子溶液が別々のポンプに収容され、混合チャンバー内で混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
高分子溶液の少なくとも一方が、キトサン及び塩酸を含有し、凝固浴槽がトリス塩基を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
トリス塩基の濃度は５％から１５％の間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
押出しに先だって、キトサンに少なくとも１つの生物分子を含む微小球を添加する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
微小球が、純粋な重合体からなるか、又はポリ(Ｌ-乳酸)、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリカプロラクトン、及びポリアンヒドリドポリ(Ｌ-乳酸)からなる群から選択される重合体の共重合体又は混合物である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、1999年8月6日に出願された仮出願番号60/147,827に基づく優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、医薬及び組織加工、特に薬剤放出性の生分解性インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織加工は、動物における外傷、疾患又は先天的欠陥による機能不全に換えて生きている細胞が使用される研究分野である。これらの置換細胞は、自家、同種、又は限られた環境では異種でありうる。組織加工の分野は医療の新たな領域であり、最適な手法は未だ解明されていない。
【０００３】
現在、組織を加工するために研究者が使用している幾つかの主要な道が存在する。一つは健常ドナー、好ましくは同一の個体から、又は少なくとも同種の適切なドナーから細胞を収集し、それらの細胞をインビトロの骨格(scafford)上で成長させることである。この骨格は、典型的には三次元高分子ネットワークであり、多くは生分解性繊維からなる。高分子ネットワークへの細胞接着は、次いで典型的には増殖を誘発される。この骨格を満たした細胞は障害を持つ宿主に埋め込むことができ、最終目的は、細胞がそれらの生理学的機能を発揮し、宿主の免疫系による破壊を回避することである。この最後に至るまで、精製された細胞系を使用することが重要であり、非−自己免疫細胞の導入が強力な宿主の免疫攻撃をアップレギュレートしうる。この方法の困難さは、酸素及び滋養分の供給源から２ミリメートルより遠くでは細胞が生存できないために、骨格形成を小さくしなければならないことである。従って、骨格がその内部領域に細胞を確保するために適時に十分な血管新生をできないので、大きな骨格を使用できない。
【０００４】
他の方法では、空の三次元生分解性骨格が患者に直接埋め込まれ、最終目的は宿主身体から正しい型の細胞が高分子骨格に泳動することである。この利点は、血管新生が細胞のマトリクスへの泳動と同時に起こることである。主な問題点は、適切な細胞型の骨格への泳動を確実にする方法が存在せず、患者の生理学的必要性を提供するために機械的及び生物学的特性が維持されることである。
【０００５】
上記の方法ではともに、骨格が生分解性であってよく、長期間に渡ってそれらは化学的及び機械的に破壊される。この破壊が起こると、細胞はそれら自身の細胞外マトリクスを分泌し、それは細胞生存及び機能における重要な役割を果たす。正常組織では、組織の構造細胞と周囲の細胞外マトリクスとの間で活動的かつ動的な相互交換が存在する。細胞外マトリクスは細胞の形態学的特性及び表現型特質を調節し、分裂、分化又は細胞死さえも誘発する化学的シグナルを提供する。さらに、細胞は定常的に細胞外マトリクスを再構成している。細胞は、細胞外マトリクスを破壊及び再構築し、マトリクス内に化学物質を分泌して、当該細胞自身又はその領域に泳動しうる他の細胞によって後に使用される。また、細胞外マトリクスは胚の発育における最も重要な成分の一つであることもわかっている。先駆的細胞は、それに続く適当な最終的な表現型への細胞分裂を助ける化学的シグナルを分泌する。例えば、そのような化学的シグナルは、神経細胞の軸策、平滑筋細胞又はニューロンへの分化を生じさせる。
【０００６】
細胞外マトリクスと組織細胞との間の一体化された関係は、細胞外マトリクスを組織加工における重要なパラメータとして確立した。細胞が特定の方法で振る舞うことを望まれる場合、細胞外マトリクスは、当該細胞型にその挙動を誘発する適切な環境と適切な化学的／生物学的シグナルを提供しなければならない。現在、生物学的に活性な細胞外マトリクスを正確に再現することは不可能である。従って、細胞がそれら自身の細胞外マトリクスを内因性マトリクスが分解したときに製造することを可能にする生分解性マトリクスを使用する研究者もいる。
【０００７】
組織加工のための上記の方法において、高分子骨格は唯一の機械的支持体のみでなく、新たな組織又は器官に望まれる三次元形状も提供する。細胞は、生存し機能するために酸素及び滋養分の供給源の近くになければならないので、現在の主要な制約は血液供給である。現在の殆どの方法論は、高分子マトリクス全体に血管を導入することを積極的に補助する特定の手段を提供していない。このことは、高分子マトリクスに物理的サイズ及び形状の制約を付加する。現在広範な臨床に使用させる唯一の組織加工装置は人工皮膚であり、それは制限された厚みで定義されている。本発明は、適切な細胞型の加工された細胞外マトリクスに向けての泳動を促進する組成物及び方法を提供する。特定の三次元的細胞泳動及び機能パターンを制御することにより、制御された血管新生が誘発され、それは高分子インプラントに対する現在の形状及びサイズに関する制限を解消する。また、適切な細胞型がマトリクス中の特定の位置に物理的に配置されることも確認された。時間及び空間の関数として表現型発現を変調させる組成物及び方法が提供される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、インビトロ及びインビボ用途のための細胞成長用の三次元マトリクスが調製される組織加工組成物及び方法を提供する。マトリクスは、治療薬の制御された送達を可能にする生分解性高分子繊維を含む。放出される治療薬の空間的及び時間的分布は、予め設定された高分子繊維の不均一パターンの使用により制御され、一又は複数の治療薬の時間の関数としての放出を可能にする。また「骨格」、「骨格マトリクス」及び「繊維骨格」という用語は、ここで本発明の三次元マトリクスを記述するためにも使用される。本出願の文脈における「所定の不均一パターン」は、骨格マトリクス内で一又は複数の治療薬の望まれる三次元的分布が達成されるような、特定の繊維の骨格マトリクスへの導入を意味する。マトリクス繊維内の治療薬の分布は、高分子繊維からの薬剤の放出に続いて、その後のマトリクス間質媒体内の空間的分布を制御する。このようにして、三次元的マトリクス構造内及びマトリクスの中間的周辺領域における望ましい濃度勾配の空間的制御が生成される。時間的分布は、繊維の高分子組成物により、そして繊維内の同軸層の使用により制御される。
【０００９】
本発明の一態様は、生分解性高分子繊維の骨格を含む生分解性インプラントである。本発明の種々の実施態様において、繊維間の距離は約５０ミクロン、約７０ミクロン、約９０ミクロン、約１００ミクロン、約１２０ミクロン、約１４０ミクロン、約１６０ミクロン、約１８０ミクロン、約２００ミクロン、約２２０ミクロン、約２４０ミクロン、約２６０ミクロン、約２８０ミクロン、約３００ミクロン、約３２０ミクロン、約３４０ミクロン、約３６０ミクロン、約３８０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロン、又は約５００ミクロンであってよい。種々の実施態様では、繊維は約５００ミクロン未満又は約５０ミクロンより大きい。
【００１０】
さらに、本発明の種々の実施態様では、繊維は約２０ミクロン、約４０ミクロン、約６０ミクロン、約８０ミクロン、約１００ミクロン、約１２０ミクロン、約１４０ミクロン、約１６０ミクロン、約１８０ミクロン、約２００ミクロン、約２２０ミクロン、約２４０ミクロン、約２６０ミクロン、約２８０ミクロン、約３００ミクロン、約３２０ミクロン、約３４０ミクロン、約３６０ミクロン、約３８０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロン、又は約５００ミクロンの直径を有する（中間の長さを含む）と考える。種々の実施態様では、繊維の直径は約２０ミクロン未満又は約５００ミクロンより大きくてもよい。好ましくは、繊維の直径は約６０ミクロンから約８０ミクロンであろう。
【００１１】
この文脈における「約」は、１−１０ミクロンの範囲を意味することを意図しており、その範囲の中間の長さを包含する。「中間の長さ」とは、この文脈では、引用された範囲の間の任意の長さ、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９等；３０、３１、３２等；５０、５１、５２、５３等；１００、１０１、１０２、１０３等；１５０、１５１、１５２、１５３等を意味し、２００−５００の範囲に渡る全ての整数を含む。
【００１２】
また本発明者等は、マトリクスは、織られた、織られていない、網目状の、編まれたもの、又はそれらの調製物の２つ又はそれ以上の組み合わせであってよいと考える。例えば、人工血管等の潜在的な応用は、織られた、織られていない及び編まれた調製物の組み合わせあるいは全て４つの調製物の組み合わせを良好に使用できる。本発明の或る実施態様では、網目状の組成物は、腱及び靱帯での使用に特別な有用性が見出された。このような編み目は、例えば、優れた強度を提供する。
【００１３】
本発明の或る実施態様では、一又は複数の治療薬を含む繊維が、骨格マトリクス内に、所定の不均一パターンで分布される。一実施態様では、繊維は一又はそれ以上の繊維のサブセットを含み、それらは生分解性高分子の含有量において相違している。繊維又は繊維のサブセットは、複数の同軸の生分解性高分子層を含んでもよい。
【００１４】
本発明の他の実施態様では、繊維又は繊維のサブセットは、一又は複数の治療薬を含み、一又は複数の治療薬の濃度が前記繊維又は繊維のサブセットの長軸に沿って変化する。活性薬の濃度は、繊維の長軸に沿う距離の関数として、線形的、対数的、又は任意の望ましい方法で変化してよい。変化は一方向性、即ち、一又は複数の治療薬の含有量が繊維又は繊維のサブセットの第１の末端から繊維又は繊維のサブセットの第２の末端に向けて減少してもよい。含有量は２方向的、即ち、治療薬の含有量が繊維又は繊維のサブセットの第１の末端から最大値まで増加し、次いで繊維又は繊維のサブセットの第２の末端に向けて減少してもよい。
【００１５】
本発明の或る実施態様では、骨格を含む繊維のサブセットの一つが治療薬を含まなくてもよい。一又は複数の治療薬を含む繊維について、薬剤は、成長因子、免疫調整薬、血管新生を促進する化合物、血管新生を阻害する化合物、抗-炎症性化合物、抗生物質、サイトカイン、抗−凝固剤、凝固促進剤、化学向性剤、アポトーシスを促進する薬剤、アポトーシスを阻害する薬剤、分裂促進剤、放射活性剤、画像検査の造影剤、ウイルスベクター、ポリヌクレオチド、治療薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、炭水化物、糖タンパク質を含んでもよい。また治療薬は、患者の長時間維持のために投与されるような薬剤、例えば血圧、ペーシング、抗−不整脈、ベータ−ブロック薬、及びカルシウムチャンネルベースの薬剤を含む心臓血管薬なども含む。また本発明の治療薬は、抗−腫瘍及びてんかん又は他の運動性障害のための他の薬剤も含む。これらの薬剤は、避妊薬及び排卵促進薬などの長期間医薬も含む。これらは、ドーパミン及び関連薬剤などの神経薬並びに心理学的又は他の行動性薬を含んでもよい。また治療薬は、キレート剤等の化学的捕捉剤、及び酸化防止剤を含んでもよい。治療薬が血管新生を促進する場合、薬剤は血管内皮細胞成長因子であってもよい。治療薬は、合成又は天然の薬剤、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞（遺伝的に変化した又はしていない）であってもよい。明細書及び請求の範囲で使用されるとき、長年の特許法実務に従って、「ａ」及び「ａｎ」は、「含む(comprising)」又は「含む(imcluding)」と共に使用されるときは一又は複数を意味する。
【００１６】
一般的に、本発明は、本発明の生分解性高分子繊維に組み込まれた任意の薬剤の使用を考慮する。ここで使用される「薬剤」という単語は、生物に投与することのできる、生物の生理を変調又は変化させる化学物質として定義される。より好ましくは、ここで使用される「薬剤」という単語は、疾患の治療又は防止に使用することを意図された任意の物質として定義される。薬剤は、合成及び天然の毒素及び生物活性物質、並びに「The Physicians Desk Reference」471st edition, pages 101-321; 「Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」 8th Edition (1990), pages 84-1614 and 1655-1715;及び「The United States Pharmacopeia, The National Formulary」, USP XXII NF XVII (1990)に記載されているもの等の認定された製薬剤を含み、これらの参考文献の化合物は参考としてここに取り入れるものとする。また「薬剤」という用語は、未だ発見されていない又は米国で入手不可能な表示された特性を有する化合物も含む。「薬剤」という用語は、薬剤のプロ−活性、活性化、及び代謝された形態を包含する。
【００１７】
生分解性高分子は、単独重合体、共重合体、又は高分子の混合物であってよく、ポリ(Ｌ-乳酸)、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸)、ポリアンヒドリド、キトサン、又は硫酸化キトサン、又は再生セルロース又はクモの糸などの天然高分子又はポリペプチドを含みうる。
【００１８】
本発明の一態様は、一又は複数の治療薬を含む生分解性高分子を含んでなる薬剤送達繊維組成物である。一実施態様では、繊維内の一又は複数の治療薬の含有量が、前記繊維の長軸に沿って変化し、治療薬の含有量が繊維の第１の末端から繊維の第２の末端に向けて減少するようにされる。他の実施態様では、繊維が、複数の生分解性高分子の同軸層を含む。薬剤送達背に組成物は、皮膚組織、血管組織、軟組織、神経、骨、及び眼を含む身体の多くの部位に埋め込んでよい。眼の埋め込みは、白内障、糖尿病誘発性増殖性網膜症及び非増殖性網膜症、例えば緑内障、黄斑変性症、色素症XXXXなどの治療のための特別な用途を有する。
【００１９】
本発明の他の態様は、繊維骨格インプラントでの一又は複数の治療薬の空間的及び時間的濃度を制御する方法であり、繊維骨格を宿主に埋め込むことを含んでなる。空間的濃度は、複数の繊維を横切って、あるいは繊維の長さに沿って濃度勾配をつけることにより単一の繊維に沿って与えられる。繊維骨格は典型的には一又は複数の治療薬を含む生分解性高分子繊維を含み、治療薬は繊維骨格内に所定の形態学的パターンで分布する。宿主は典型的には動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００２０】
本発明のさらに他の態様では、一又は複数の治療薬の空間的及び時間的濃度の制御が可能なインプラントを調製するための繊維骨格の製造方法である。この方法は一般的に、生分解性高分子繊維を三次元繊維骨格に成形することを含んでなる。生分解性高分子繊維は一又は複数の治療薬を含む。治療薬は、繊維骨格内に所定の不均一なパターンで分布する。
【００２１】
さらに、本発明の骨格は、組織構造、細胞泳動及びマトリクス蓄積を制御し、一般的な創傷治癒に参画又は促進するために使用されうることも考えられる。
【００２２】
本発明の他の実施態様では、溶媒としての塩酸及び凝固浴槽としてのトリス塩基を使用することを含んでなる、キトサンから薬剤放出繊維を製造する方法が提供される。塩酸濃度は、例えば、約０．２５％〜約５％、又は約１％〜約２％であってよく、これらの範囲の全ての濃度を包含する。この方法では、トリス塩基濃度は、例えば、約２％〜約２５％、約４％〜約１７％、又は約５％〜約１５％であってよく、これらの範囲の全ての濃度を包含する。この方法は、本発明の一実施態様において、異なるアセチル化度を持つキトサン類を含む不均一混合物を含んでよい。またこの方法は、異なるアセチル化度を持つキトサンのセグメントを含む薬剤放出繊維の製造を含んでもよい。
【００２３】
本発明の薬剤放出繊維は、例えば、キトサン及び細胞外マトリクスから製造してもよい。本発明による薬剤放出繊維の製造において、キトサン濃度は、例えば、約０．５重量％〜約１０重量％、約１重量％〜約７重量％、約２重量％〜約５重量％、約３重量％〜約４重量、又は約３．５重量％であってよい。本発明の一実施態様では、マトリゲル(Matrigel)である。細胞外マトリクス濃度は、約１容量％〜約２０容量％、約２容量％〜約１５容量％、約３容量％〜約１０容量％、又は約４容量％〜約６容量％であり、約５容量％を含む、この方法では、繊維を前記細胞外マトリクスで被覆してもよい。
【００２４】
本発明のキトサンは硫酸化されていても硫酸化されていなくてもよい。本発明の一実施態様では、硫酸化キトサンが用いられる場合、その濃度は、約０．０２５重量％〜約２重量％、約０．０５重量％〜約１重量％、約０．１重量％〜約０．５重量％、又は約０．１５重量％〜約０．３重量％であり、約０．２重量％を含む。この方法では、キトサン及び硫酸化キトサンを繊維に押出してもよい。
【００２５】
本発明のさらに他の実施態様では、薬剤放出繊維を製造する方法が提供され、この方法は、ポリ(Ｌ-乳酸)微小球を酸中のキトサン及び凝固浴槽に添加することを含む。この方法では、酸は、例えば、酢酸又は塩酸であってよい。酸が塩酸である場合、その濃度は、例えば、約０．２５％〜約５重量％、又は約１％〜約２％であり、約１．２容量％及びこの範囲の他の全ての濃度を含む。キトサン濃度は、例えば、約０．５重量％〜約１０重量％、約１重量％〜約７重量％、約２重量％〜約５重量％、約３重量％〜約４重量、又は約３．５重量％であってよい。凝固浴槽は水酸化ナトリウムを、例えば、約１容量％〜約２０容量％、約２容量％〜約１５容量％、約３容量％〜約１０容量％、約４容量％〜約７容量％、又は約４容量％〜約６容量％であり、約５容量％を含む。本発明の一実施態様では、この方法はポリ(Ｌ-乳酸)微小球を約１容量％塩酸から約２容量％酸中の約３．５重量％のキトサン溶液に添加し、約５容量％トリス塩基から約１５容量％トリス塩基を含む凝固浴槽を使用することを含む。この方法は、アルブミンを含む界面活性剤、例えば、約３重量％を含む約１重量％〜約５重量％の前記アルブミンを添加することを更に含んでもよい。本発明の更に他の実施態様では、第２の高分子の微小球を含むキトサン繊維の組成物が提供され、前記微小球は一又は複数の生物学的分子を含む。この組成物は、生物学的分子である界面活性剤を含有してもよい。
【００２６】
本発明のさらに他の実施態様では、キトサンを含む繊維と細胞外マトリクスとを含んでなる組成物が提供される。キトサンは硫酸化されていても硫酸化されていなくてもよい。
【００２７】
本発明のさらに他の実施態様では、三次元骨格を含んでなる組成物が提供され、前記骨格が織られた、織られていない、又は編まれた繊維を含み、前記繊維がここに上記した任意の組成物を含んでいる。本発明の組成物は、一実施態様では、キトサンを含む繊維、細胞外マトリクス及び生物学的分子を含む。キトサンは硫酸化されていても硫酸化されていなくてもよい。
【００２８】
本発明のさらに他の実施態様では、上記の繊維と生物学的分子の不均一な骨格を含む組成物が提供され、生物学的分子は骨格の全ての繊維について同一ではない。この組成物では、脱アセチル化度は繊維に沿った距離の関数として変化する。組成物は細胞外マトリクスであってもよい。また組成物は、本発明の或る実施態様では、硫酸化された又は非硫酸化キトサンを含む。
【００２９】
添付の図面は本明細書の一部をなし、本発明の或る態様を更に示すために包含される。本発明は、ここに提示する特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の一又は複数を参照することにより更に良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】パターンを有する複雑な三次元の織られた骨格に配置された繊維を示す図である。各繊維は一又は複数の治療薬を負荷していてよい。
【図２】パターンの無い三次元の織られていない骨格に配置された繊維を示す図である。各繊維は一又は複数の治療薬を負荷していてよい。全ての繊維は、同じ治療薬（類）を含んでもよく、又は種々の異なる薬剤を同じ骨格の他の繊維に使用してもよい。
【図３Ａ】繊維は、ステントなどの用途において短期間の機械的支持体を持つ本体を提供できる。図３Ａは、一本の高分子繊維が、動脈、静脈、又は管などの管状体の管腔を維持できることを示す図である。
【図３Ｂ】繊維は、ステントなどの用途において短期間の機械的支持体を持つ本体を提供できる。図３Ｂは、複数の高分子繊維が管状体の管腔を維持できることを示す図である。
【図４】繊維は被覆されて同軸繊維を形成しうる。図４は、繊維が複数成分の被覆を持ち、各成文が異なる治療薬を負荷できることを示す図である。
【図５】図４に示された、２成分被覆を有し、各成文が異なる治療薬を負荷した被覆繊維の放出速度を示すグラフである。
【図６】繊維はその長さに沿った治療薬の線形勾配を含んでもよい。図６Ａは、その長さに沿った治療薬の線形勾配を含む繊維を示す図である。図６Ｂは、線形勾配を示すグラフである。
【図７】その長さに沿って濃度が変化しうる１以上の治療薬を有する縞状の繊維を示す図である。分布及び縞の頻度は、望み通りに変化させることができる。
【図８】治療薬を含む高分子繊維を製造するための装置を示す図である。
【図９】凝血槽への高分子エマルションの注入速度の旋盤の巻き取り速度に対する比率を変化させることにより、機械的特性の極めて驚くべき変化が観察された。図９Ａは、注入速度に対する巻き取り速度の比率を変化させたときの極限強さ［ＭＰａ］の変化を示すグラフである。結果は、１０重量％、８重量％、及び７．５重量％を有するポリマーについて示した。図９Ｂは、注入速度（Ｖｉ）に対する巻き取り速度（Ｖｗ）の比率を変化させたときの伸長％を示すグラフである。
【図１０】繊維の機械的特性は、高分子溶媒（類）、凝固浴槽溶媒（類）、溶媒系の相互作用、注入速度に対する巻き取り速度の比率、凝固浴槽中の全時間、エマルション中の高分子溶液相に対する水相の比率、及び界面活性剤の質の関数として変化する。図１０Ａは、注入速度に対する巻き取り速度の比率（Ｖｗ／Ｖｉ）が２６．８２及び２３．４９の場合の、高分子濃度（重量％）での極限強さの変化を示すグラフである。図１０Ｂは、同じ比率についての高分子重量パーセントでの弾性の変化を示すグラフである。
【図１１】繊維は種々の表面構造で製造される。図１１Ａは、平滑な表面構造を持つ繊維を示す。図１１Ｂは、ベロア表面構造を持つ繊維を示す。図１１Ｃは長さ方向に溝を持つ表面構造を有する繊維を示す。
【図１２】注入速度に対する巻き取り速度の比率（Ｖｗ／Ｖｉ）及び重量パーセントの関数としての繊維の直径の変化を示すグラフである。
【図１３】２つの溶液の比率を徐々に変化させて繊維の長さ方向に低下する濃度勾配を達成するための「Ｙ」結合部におけるバタフライ弁の使用を示す図である。
【図１４】センチメートル当たりの濃度の既知の変化を持つ良好に制御された勾配を確立するための独立ポンプ及び混合チャンバーの使用を示す図である。
【図１５】他の適当な材料の管のシリコーンゴムに収容され、軸策成長のためのニュートロフィン(neutrophin)を負荷された繊維の平行な配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、組織加工用途における細胞成長のための、不均一な、織られた、編まれた、又は織られていない又は網目状の三次元的マトリクスを製造するための組成物及び方法を提供する。これらの骨格はインビトロ及びインビボで使用することができ、それらの不均一性により治療薬の空間的及び時間的分布の両方を生成できる。この発明において、治療薬は、薬物、タンパク質、ペプチド、一及び二糖類、多糖類、糖タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、又は対象とする他の生物学的分子を含んでよい。この発明における治療薬という用語は、局所領域における腫瘍などの悪性組織の破壊を助けるため、又は現在のステント用途等における健常組織の成長を阻害するため；あるいは画像検査で使用されるマーカーに使用される放射活性材料も含む。
【００３２】
Ａ．三次元繊維マトリクス
本発明の不均一骨格を製造するために、治療薬は、ここに記載する方法によりマトリクスの個々の繊維にカプセル化される。治療薬は、個々の繊維から徐々に、制御された方法で放出される。繊維という形式は、微小球、多孔質の栓又はパッチといったこの分野で馴染み深いことが知られた他の徐放薬剤を越える薬剤送達基盤としての利点を有する。繊維の主な利点は、それらが複雑な織られた（図１）、又はパターンの無い織られない（図２）骨格を提供し、細胞が接着し、拡散し、分化し、成熟して適当な機能細胞となることを可能にすることである。それらはパターンを形成できるので、「気の利いた織物」を織って、放出される特定の化学向性因子により特定タイプの細胞の骨格の特定領域への泳動を誘発することができる。この骨格は、胚性発達の間及び胚後期組織の両方で細胞外マトリクスの機能を模倣する。さらに、単繊維は、それは天然様構造から想起されない組織修復又は再構築のための成長物質を提供する独特の骨格に成形することができる。
【００３３】
パターンを織って適当な細胞タイプを特定領域に誘導する能力のために、血管の繊維内への形成を誘導する糸に組み込むことが可能である。これは、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）等の成長因子を放出する繊維を提供することにより達成される。ＶＥＧＦ含有繊維を織られたパターンに適当な間隔で入れることにより、大きな組織を加工することができ、そのような組織における細胞は十分な血液供給が与えられ、それにより酸素及び滋養分を受け取って老廃物を除去することができる。
【００３４】
また繊維は、ステント（図３Ａ及び３Ｂ）としての用途などにおいて短期間の機械的支持体を持つ本体を提供するという利点を有し、高分子繊維は動脈、静脈、管（例えば胆管、尿管、尿道、気管など）の任意の管状体の管腔、食道、腸、大腸などの消化管の器官、及び腱、靱帯、筋肉及び骨などの結合組織を保持できる。繊維は、治癒過程の間の機械的強度及び張力を支えるための有用な構造を与える。また繊維は神経再生又は神経又は脊髄の再構成を促進するのにも有用である。
【００３５】
さらに、繊維は被覆され、図４に示すような同軸繊維を形成しうる。各被覆は異なる高分子材料、又は高分子の組み合わせとすることができ、各層は異なる治療薬又は治療薬の組み合わせを放出できる。また被覆は、複数の部分に物理的に分割することもでき、望まれるならば、異なる治療薬を種々の方向に放出することもできることを意味する。例えば、図４に示すように、繊維は、各々が異なる治療薬を負荷された２成分被覆を有してもよい。従って、上記のように、異なる治療薬の空間的分布が可能なばかりでなく、これらの治療薬は異なる放出速度を有してもよく、よって治療薬の時間的分布を生み出すこともできる。このような被覆繊維の放出速度は図５で特徴づけられる。例えば、繊維がコア高分子の上に２つの被覆を持つ場合、３つの異なる治療薬又は治療薬の組み合わせを放出させることができる。外側被覆がその治療薬を放出した後に内側被覆材料、そして最後にコア繊維からである。従って、各高分子系はそれ自身の放出速度プロフィールを持ち、それは高分子のタイプ及びその特定の被覆層に対する処理条件によって調節できる。各被覆は異なる高分子からなると同時に異なる分子を負荷されうる。このことは、各層における放出速度の制御を与える。迅速に分裂する細胞は同じクラスの同型の非分裂細胞の特徴的な機能を示さないことが多いので、異なる時間に異なる薬剤を放出する能力は、組織加工において特に重要である。本発明では、適切な治療薬の放出により、細胞を最初に特定位置に泳動させ、次いで迅速分裂相に入れて組織空間を満たし、次に機能的形態に分化させることを誘導することができる。
【００３６】
さらに、細胞は濃度勾配に従うことが知られている。制御された細胞泳動に重要であることがわかったのは、特定の因子の濃度における変化である。従って、本発明は繊維の長さに沿って治療薬の勾配を達成する方法を提供する。線形勾配は図６A及び６Bに示した。本発明で開示した方法により、この濃度勾配は、線形的、対数的、又は繊維の長さに沿う距離の関数としての他の任意の形状でありうる。また、それは二方向でもよく、例えば両端では低く、中間点で最大に達してもよいことを意味する。これは、細胞が繊維に沿った特定の方向へ泳動して成長することを誘発する。拡張すれば、本発明で開示した方法により、図７に示すような縞模様の繊維も製造できる。これらの縞の分布及び頻度は必要に応じて変化できる。従って、本発明の治療薬送達の態様は、単純な薬剤送達微小球又は栓を遙かに越え、繊維に基づく「気の利いた骨格」は典型的な繊維ベースのマトリクスを生存可能な組織の発達に統合し、三次元の生物学的構築物並びに機械的支持体を提供する。
【００３７】
Ｂ．生分解性高分子
本発明での使用に適した高分子は、ポリ(Ｌ-乳酸)、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸)、ポリアンヒドリド、キトサン、又は硫酸化キトサンの単独重合体、共重合体又は重合体の混合物を含む。再生コラーゲン又は天然シルクなどの天然由来の高分子も使用してよい。当業者は、これらの高分子が、この発明で使用できる生分解性高分子マトリクスのクラスの単なる例であることを理解するであろう。さらなる生分解性マトリクスは、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、及びポリ(アミノ酸)を含む（Peppas and Langer, 1994）。これらのマトリクスの任意のもの、この発明において使用するための制御された特性を持つ生分解性高分子マトリクスの製造に利用される。非毒性分解生成物を生じる更なる生分解性高分子を表１に列挙する。
【００３８】
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【００３９】
Ｃ．血管新生を促進する薬剤
本発明の高分子繊維でカプセル化される治療薬の一つのクラスは血管新生を促進する治療薬である。新たな組織の奏効する加工は血管ネットワークの確立を必要とする。血管新生の誘導は種々の因子によって媒介され、その任意のものが本発明と組み合わせて使用されうる（Folkman and Klagsbrun, 1987, 及びそこに列挙された引用文献、それら各々の全体を参考として取り入れる）。血管新生因子の例は、限定されないが、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）又は血管透過因子（ＶＰＦ）；酸性繊維芽成長因子（ａＦＧＦ）及び塩基性繊維芽成長因子（ｂＦＧＦ）を含む繊維芽成長因子ファミリーのメンバー；インターロイキン-８（ＩＬ-８）；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）又は血小板誘導上皮細胞成長因子（ＰＤ-ＥＣＧＦ）；トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β）；腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ-α）；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）；インシュリン成長因子-１（ＩＧＦ-１）；アンギオゲニン；アンギオトロピン(angiotropin)；フィブリン及びニコチンアミドを含む（Folkman, 1986, 1995; Auerbach and Auerbach, 1994; Fidler and Ellis, 1994; Folkman and Klagsbrun, 1987; Nagy等, 1995）。
【００４０】
Ｄ．サイトカイン
或る実施態様では、本発明の高分子繊維に組み込まれた特定のサイトカインの使用が考慮される。下記の表２は、本発明での使用が考えられるサイトカイン及び関連因子のリストの例であり、限定するものではない。
【００４１】
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0005383757.tif 000004
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【００４２】
Ｅ．ポリヌクレオチド
本発明の高分子繊維に導入されるポリヌクレオチドは、核酸分子の全ての種類まで拡張される。即ち核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、Ｚ-ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び他のＲＮＡを含む。ＤＮＡ分子は、ＤＮＡがリボザイム又はアンチセンスＲＮＡ等の治療的ＲＮＡを発現するために使用される場合であっても、一般に好ましい。
【００４３】
分泌タンパク質又はＲＮＡをコードする「遺伝子」又はＤＮＡセグメントは、一般に分泌タンパク質又はＲＮＡをコードする配列を含むＤＮＡセグメントと呼ばれるが、当該ＤＮＡが得られた種の全ゲノムＤＮＡから単離され、精製されている。「遺伝子」及び「ＤＮＡセグメント」という用語に含まれるのは、ＤＮＡセグメント及びそのようなセグメントの小さな断片であり、また、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、レトロウイルス、アデノウイルス等を含む組換えベクターでもある。
【００４４】
「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質又はペプチドコード化単位を指すための単純化のために使用される。当業者に理解されるように、この機能的な用語は、ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列の両方を含む。「他のコード化配列から実質的に単離された」とは、対象とする遺伝子がＤＮＡセグメントのコード化領域のかなりの部分を形成すること、及びＤＮＡセグメントが天然由来のコード化ＤＮＡの大きな部分、例えば大きな染色体断片又は他の機能的遺伝子又はｃＤＮＡコード化領域などを含まないことを意味する。当然のことながら、これは最初に単離されたＤＮＡセグメントを指し、リーダー配列又は標的化配列などの、人手によって後にセグメントに添加される遺伝子又はコード化領域を排除するものではない。
【００４５】
本発明は、採用される任意のコード化セグメントが分泌タンパク質又はＲＮＡをコードし、標的細胞に重大な逆効果を有する任意のコード化又は調節配列を含まない限り、高度に精製されたＤＮＡ又はベクターを使用することを要求するものではない。従って、有用な核酸配列は、付加的な残基、例えばコード化領域の５'又は３'部分のいずれかに隣接する付加的な非コード化配列を含んでいてもよく、遺伝子内に生ずることが知られた種々の内部配列、例えばイントロンを含んでいてもよい。
【００４６】
多くの適切なＤＮＡセグメントは、商業的供給源を含む現存するものから得ることができる。また、当業者に一般に知られた種々の分子生物学的技術の一又は複数を用いて対象とするタンパク質をコードする新たなＤＮＡを得てもよい。例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリは、所定の配列を持つプライマー又はプローブを用いてスクリーニングしてもよい。また、対象とするタンパク質をコードするＤＮＡ断片を生成するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してもよい。
【００４７】
適切な選択された遺伝子又はＤＮＡ分子を同定した後、それを当該分野で現在知られた多くのベクターの一つに挿入し、標的細胞に導入した際の選択したタンパク質の発現及び生産を制御してもよい。組換え発現ベクターでは、ＤＮＡセグメントのコード化部分はプロモータ／エンハンサ成分の制御下に位置する。プロモータは、例えば、組換えクローニング及び／又はＰＣＲ技術を用いてコード化セグメント又はエクソンの上流に位置する５'非コード化配列を単離することにより得られるので、選択した遺伝子に天然に付随するプロモータの形態であってよい。
【００４８】
他の実施態様では、コード化ＤＮＡセグメントを組換え、又は異種のプロモータの制御下に配置することにより或る利点が得られることを考える。ここで使用される場合の組換え又は異種プロモータは、自然環境にある選択した遺伝子には通常付随しないプロモータを指すことを意図している。このようなプロモータは、他の分泌遺伝子及び／又は任意の他の細菌、ウイルス、真核生物、又は哺乳動物細胞から単離下プロモータに通常付随するものを含む。当然ながら、選択した標的細胞におけるＤＮＡセグメントの発現を有効に制御するプロモータを採用するのが重要であろう。
【００４９】
タンパク質発現を達成するために組換えプロモータを使用することは、分子生物学の当業者には一般に知られている、例えば、Sambrook等（1989; ここに参考として取り入れる）を参照。採用するプロモータは構成性又は誘導性であってよく、導入ＤＮＡセグメントの高レベル又は調節された発現を制御するための適切な条件下で使用される。構成プロモータの制御下での遺伝子発現は、遺伝子発現を誘発する特定の物質の存在を必要とせず、細胞成長の全ての条件下で起こる。対照的に、誘導性プロモータによって制御された遺伝子発現は、誘導剤の存在又は不存在に応答する。
【００５０】
哺乳動物細胞で成長するウイルスのゲノムから単離したプロモータ、例えば、ＲＳＶ、ワクシニアウイルス７．５Ｋ、ＳＶ４０、ＨＳＶ、アデノ有為するＭＬＰ、ＭＭＴＶ ＬＴＲ及びＣＭＶプロモータは、ここで使用でき、プロモータは組換えＤＮＡ又は合成技術によって製造される。現在好ましいプロモータは、ＣＭＶ、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＳＶ４０プロモータ単独、及びＳＶ４０エンハンサと組み合わせたＳＶ４０プロモータ等のものである。
【００５１】
例示的な組織特異的なプロモータ／エンハンサ成分及び組織特異性を示す転写制御領域は、限定されないが、膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓細胞で活性なインシュリン遺伝子制御領域；リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域；肝臓で活性なアルブミン、ｌ-アンチトリプシン及び-フェトプロテイン遺伝子制御領域；骨髄細胞で活性な-グロビン遺伝子制御領域；脳のオリゴ樹状細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域；骨格筋で活性なミオシン軽鎖-２遺伝子制御領域；及び視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域を含む。1996年4月12日に出願された米国特許出願第08/631,334号及び1997年4月11日に出願されたＰＣＴ出願番号PCT/US97/07301は共に、上記の成分を更に詳細に記述した参考を取り入れることを目的として、参考のためにここに取り入れる。
【００５２】
挿入されたタンパク質コード化配列の十分な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。開始コドン及び隣接配列を含む全コード化配列が適切な発現ベクターに導入された場合、付加的な翻訳制御シグナルは必要ない。しかしながら、コード化領域の一部のみが導入された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを供給しなければならない。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンはタンパク質コード化配列の読み枠を持つ相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の供給源、天然及び合成の両方であってよい。発現の効率及び制御は、転写減衰配列、エンハンサ成分などを含めることにより促進される。
【００５３】
種々のベクターを使用することができ、限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡから誘導されるものを含む。例えば、プラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９、及びＭ１３ｍｐシリーズのベクターを使用してよい。バクテリオファージベクターは、ｇｔ１０、ｇｔ１１、ｇｔ１８-２３、ＺＡＰ／Ｒ及びＥＭＢＬシリーズのバクテリオファージベクターを含む。使用できるコスミドベクターは、限定されないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６及びｃｈａｒｏｍｉｄ９シリーズのベクターを含む。ＳＰ６ベクターのような、ＲＮＡのインビトロ転写が可能なベクターも、マトリクスに導入できる大量のＲＮＡを生産する溜めに使用される。
【００５４】
また、選択した遺伝子及びＤＮＡセグメントは、組換えウイルス、例えば組換えヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はウシ乳頭腫ウイルス等のゲノム内に位置するＤＮＡ挿入物の形態としてもよい。集積(integrating)ベクターを使用してもよいが、多くの世代について遺伝子産物を娘細胞に伝達しない非-集積系が好ましいことも多い。このように、遺伝子産物は所定の生物学的プロセス、例えば創傷治癒過程の間に発現され、遺伝子は子孫生成で希釈されるので、発現された遺伝子の量は減少する。
【００５５】
このような実施態様において、遺伝子を標的細胞に接触させるために、ゲノムが遺伝子挿入物を含む組換えウイルス粒子を調製し、本発明の高分子繊維からの放出を介して標的細胞又は組織に接触させ、それによりウイルスを細胞に感染させて遺伝子材料を伝達する。以下の米国特許は、ウイルス遺伝子治療の更なる例示として各々を参考としてここに取り入れる：アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルス遺伝子治療に関する米国特許第5,747,469号；アデノウイルス遺伝子治療に関する米国特許第5,631,236号；及びヘルペスウイルス遺伝子治療に関する米国特許第5,672,344号。
【００５６】
文献に記載されたものから変化した配列を持つ遺伝子も、変化又は修飾された遺伝子が所望の方法（直接的又は間接的）で標的細胞に影響するように機能するタンパク質をコードする限り、本発明での使用が考慮される。これらの配列は、点突然変異により生じたもの、遺伝子コードの変性又は天然由来の対立遺伝子変異、及び例えば人手による遺伝子操作により導入された更なる修飾によるものを含む。
【００５７】
コードされるタンパク質又はポリペプチドの機能的特性を変化させることを意図してヌクレオチド配列に変化を導入する技術は、この分野で良く知られており、例えば参考としてここに取り入れる米国特許第4,518,584号であり、その技術はここに更に詳細に記載される。そのような修飾は、塩基の欠失、挿入又は置換を含み、よってアミノ酸配列が変化する。変化は、タンパク質の活性を向上させるため、その生物学的安定性又は半減期を向上させるため、そのグリコシル化パターンを変化させ、温度感受性を付与するため、又はタンパク質の発現パターンを変化させるためになされる。ヌクレオチド配列に対するそのような修飾は全て本発明で考慮される。
【００５８】
一又は複数の選択した遺伝子が遺伝子移送方法及び組成物において使用できることは本発明の利点である。よって核酸送達方法は、１、２、３、又はそれ以上の選択した遺伝子の投与を必然的に伴う。適用できる遺伝子の最大数は、多数の遺伝子構築物の同時調製に伴う努力、又は有害な細胞毒性効果の誘発の可能性といった実務的な思考によってのみ制限される。遺伝子の特定の組み合わせは、生化学的経路を同じように、又は異なるように変化させるために選択できる。例えば、成長因子遺伝子は、ホルモン遺伝子と組み合わせてもよく；第１のホルモン及び／又は成長因子遺伝子を第１の遺伝子のポリペプチド生成物と相互作用することのできる細胞表面レセプターをコードする遺伝子と組み合わせてもよい。
【００５９】
多数の遺伝子の使用において、それらは一又は複数のプロモータの制御下で単一の遺伝子構築物上で組み合わせてもよく、それらを同じ又は異なる別の構築物として調製してもよい。よって、遺伝子及び遺伝子構築物の殆ど際限のない組み合わせを採用することができる。或る遺伝子の組み合わせは、細胞刺激及び組織成長に対する相乗効果を達成するために設計され、又はそれらの使用がその結果をもたらしてもよいが、そのような組み合わせの任意のもの及び全てが本発明の範囲内に入るものとする。確かに、多くの相乗効果が化学的文献に記載されており、当業者は相乗的な遺伝子の組み合わせ、又は遺伝子−タンパク質の組み合わせさえも容易に同定することができるであろう。
【００６０】
また、望まれるならば、核セグメント又は遺伝子は、更なる薬剤、例えばタンパク質又はポリペプチド又は種々の製薬活性剤などと組み合わせて投与することができる。遺伝子材料が組成物の一部を形成する限り、含まれうる他の組成物に事実上の制限は無いが、付加的な薬剤は標的細胞又は組織との接触に対して重大な悪影響を生じないものとする。よって核酸は種々の他の薬剤とともに送達され、例えば、或る実施態様では血管新生因子の投与を望んでもよく、それは米国特許第5,270,300号に記載され、参考としてここに取り入れる。
【００６１】
遺伝子、即ちヌクレオチドの鎖としての化学的性質は実質的に不変であり、遺伝子移送及び発現のプロセスは基本的に同じであるので、本発明の繊維マトリクスによって移送される遺伝子の型は、事実上制限されないと理解される。これは、ＤＮＡワクチン接種で使用するための血管新生性又は免疫原性断片を発現する遺伝子材料の混合物の移送から；創傷治癒としての細胞機能の刺激まで；腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスオンコジーン又はアポトーシス誘発遺伝子の癌細胞への移送におけるような細胞殺傷の態様まで拡張される。
【００６２】
例示のみとして、本発明で供給される遺伝子は、限定されないが、ホルモン、成長因子、成長因子レセプター、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、コロニー刺激因子及び化学向性因子；転写及び伸長因子、キナーゼ及びホスファターゼを含む細胞周期制御タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、アポトーシス誘発遺伝子；アポトーシス阻害遺伝子；オンコジーン、アンチセンスオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子；血管新生及び抗-血管新生タンパク質；免疫反応刺激及び変性タンパク質、細胞表面レセプター、副次シグナル伝達分子及び輸送タンパク質；酵素；及び抗-細菌及び抗-ウイルスタンパク質をコード及び発現するものを含む。
【００６３】
Ｆ．キット
本発明の種々の態様で必要とされる全ての必須材料及び試薬は、ともにキットとして集合させることができる。また本発明のキットは、典型的には、商業的販売のために近接して入れられた所定の成分を含むバイアルを収容する手段、例えば、中に所定のバイアルが保持される射出又はブロー成形されたプラスチック容器等を含む。容器の数又はタイプに関わらず、本発明のキットは典型的にはキット成分の使用のための指示書をともに梱包する。
【００６４】
Ｇ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために含まれている。当業者は、以下の実施例で開示される技術が本発明の実施において良く機能することを本発明者等が発見した技術を示し、その実施のための好ましい形態を構成するために考慮されうることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、この開示に照らして、開示される特定の実施態様において多くの変更が可能であり、本発明の精神及び範囲から離れることなく同様又は類似の結果が得られることを理解すべきである。
【００６５】
実施例１
治療薬を含む高分子繊維の製造
本発明の一実施態様では、薬剤放出繊維を製造するのに以下の方法が使用される。装置は図８に示す。第１に、生分解性高分子、例えばポリ(Ｌ-乳酸)（ＰＬＬＡ）、ポリ(ＤＬ-乳酸)、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール酸)、ポリアンヒドリド、又はこれら及び他の生分解性高分子の共重合体又は混合物を、幾つかの適当な溶媒（Ａ）に高分子のタイプに応じて５〜３０重量％の範囲の濃度、ＰＬＬＡについては１０重量％が好ましい、で溶解させる。この実施態様では、溶媒（Ａ）は水との混和性が低く、凝固浴槽溶媒（Ｂ）とは非常に混和性である。溶媒（Ａ）の好ましい選択は、キトサン及び塩化メチレンを含む。高分子が溶解したら、対象とする生物分子と界面活性剤の両方を含有する水性溶液を高分子溶液に添加する。水性エマルションの濃度は、典型的には１〜５０％v/vの高分子溶液であり、ＰＬＬＡ繊維単繊維については４−１０％が最も典型的である。界面活性剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリ(ビニルアルコール)、プルロニクス、又はリン脂質ファミリ等の生物学的界面活性剤といった当業者に馴染み深い物質の一つ又は組み合わせとすることができる。ここで特に述べないが当業者に知られた他の界面活性剤は、拡張により包含される。典型的な使用では、ＢＳＡが界面活性剤として対象とする生物学的分子の約１０倍から１００倍高い範囲の濃度で使用され、典型的な濃度は水相の１０重量％〜５０重量％の範囲である。
【００６６】
超音波、ボルテックス、又は小型のオリフィスに液体を強制的に通すことにより生ずる剪断力などの幾つかの形態の機械的エネルギーを用いることにより、水相及び有機相の間で油中水型エマルションを形成する。このエマルションは、押出しのために必要な時間を遙かに超える期間に渡って安定でなければならない。分散された水相滴のサイズは主に界面活性剤の質及びエマルションの形成において系に付加される機械的エネルギーの量に依存する。水相サイズは、繊維の放出速度及び機械的特性の両方において重要な変数である。
【００６７】
次いでエマルションは溶媒（Ｂ）を含む凝固浴槽中に押し出される。高分子エマルションは、１６ゲージから３０ゲージまでの範囲のサイズのディスペンサ先端を通して凝固浴槽に押し出される。溶媒（Ｂ）は溶媒（Ａ）と高度に混和性であり、高分子に対しては非溶媒でなければならず；イソプロピルアルコールが最も典型的な選択であるが、高分子には非溶媒であり溶媒（Ａ）と高度に混和する任意の溶媒が作用する。例えばヘキサンは、塩化メチレンと極めて混和性であり、なおかつ高分子に対して非溶媒であり、従って塩化メチレン及びヘキサンは良好な溶媒及び凝固浴槽の組み合わせを形成する。溶媒（Ａ）は凝固浴槽溶媒（Ｂ）と高度に混和するので、それは高分子溶液流から凝固浴槽に自由に拡散する。しかしながら高分子は溶媒（Ｂ）に溶解しないので、それ自身が析出して繊維の外側シースを形成し、エマルションの分散された水相の事実上全てを、形成される繊維内部に捕捉する。このようにして、繊維は対象とする薬剤又はタンパク質を負荷される。固定された経路長が望ましい場合、形成される繊維を凝固浴槽内の一連のローラに通過させ、凝固浴槽を通して固定された経路長を与えることもできる。繊維は凝固浴槽から所定速度で引き出される。実験室では、発明者等は、回転速度を正確に維持できる改変された可変速旋盤に連結したシリンダーを使用した。引き出され押し出された繊維は、次いでシリンダーから外し、負荷された生物分子の推奨される貯蔵条件に応じて凍結乾燥し、冷凍し、あるいはオーブン乾燥してデセクレータ(desecrator)又は冷凍庫に配置した。
【００６８】
高分子エマルションの凝固浴槽への注入速度の旋盤の線形巻き取り速度に対する比率を変化させることにより、図９Ａ及び９Ｂに示すように、繊維の機械的特性における非常に驚くべき変化が見出された。繊維の機械的特性は以下の変数の関数として変化する：高分子溶液、凝固浴槽溶媒、溶媒系の内部混和性、注入速度に対する巻き取り速度の比率、凝固浴槽中の合計時間、エマルションにおける水相の高分子溶液相に対する比率、及び界面活性剤の質。これらの変数の幾つかの関数としての機械的特性の変化を図１０Ａ及び１０Ｂに示した。
【００６９】
他の驚くべき発見は、仕上げられた繊維の表面構造も溶媒及び高分子系の適切な選択により制御できることである。本発明者等は、図１１Ａ−１１Ｃに示すような、平滑から、ベロアまで、長さ方向の溝まで変化する表面構造を持つ繊維を製造した。これらの表面構造の変化は、ベロア構造の場合にはより大きな接着特性、そして長さ方向の溝構造の場合はより良い接触案内を提供することにおいて、細胞成長への特別な用途を有する。機械的特性及び表面構造における変化は全て治療薬の放出速度に有意な影響を与える。
【００７０】
繊維の直径は図１２に示すように処理条件によって制御した。機械的特性、表面構造、直径、及び放出速度を制御する処理パラメータがわかったので、特定用途のための特定の性質を持つ繊維を誂えることができる。
【００７１】
この製造プロセスを通して生物学的治療薬が生物学的活性を維持することは、繊維に負荷された薬剤がマウスＩｇＧのＦａｂ断片であるサンドウィッチＥＬＩＳＡで示すことができる。Ｆａｂ断片の存在を検出するＥＬＩＳＡのために、両方の結合エピトープの生物学的活性が維持されなければならない。
【００７２】
製造プロセスの他の実施態様では、トルエンなどの高分子に対する貧溶媒が高分子溶液に添加される。貧溶媒の添加は繊維の機械的特性を変化させる。
【００７３】
他の製造の実施態様では、２０％v/vまでの高分子溶媒が凝固浴槽に添加される。高分子溶媒の添加は繊維内部から繊維の外側への濃度勾配を小さくする。これは拡散速度、従って繊維の外側シースが形成される場所における速度を変化させる。この外側シース形成の速度は繊維の表面構造及び繊維の機械的特性、そして生物分子の放出速度にとって重要である。
【００７４】
他の製造の実施態様では、グリセロールなどの増粘溶液が凝固浴槽に添加される。これは凝固浴槽の粘性を向上させ、凝固浴槽の比重を変化させる。これらの変数は共に負荷繊維形成の可能性を有意に増加させる。グリセロールの濃度は８から２０％v/vまで変化する。
【００７５】
あるいは、押出成形の当業者に馴染み深い方法により単一工程で同軸繊維を製造することもできる。これらの技術を使用して、種々の高分子及び生物分子を同軸繊維の各層に添加することができる。
【００７６】
実施例２
種々の濃度の治療薬を含む高分子繊維の製造
他の製造の実施態様では、プロセスは、繊維の長さに沿って下降する濃度勾配を付加する以外は実施例１に記載したものと類似している。これは２つの溶液を有することにより達成される。一方は対象とする治療薬を含む高分子エマルションであり、他方は治療薬を含まないか、又は異なる生物分子を含む。勾配は、押出しプロセスの間に２つの溶液の比率を連続的に変化させることにより達成される。これは、図１３に示す「Ｙ」結合部におけるバタフライ弁及び図１４に示すような混合チャンバー有又は無の独立ポンプの使用を含む多くの方法で達成される。このようにして、良好に制御された勾配が確立され、センチメートル長当たりの濃度変化が知られる。
本発明の他の実施態様は、「縞模様」繊維の製造である。縞模様繊維では幾つかの可能な配置があり；第１の実施態様では、両方の高分子溶液は異なる生物分子を含むエマルションである。これは勾配と同様の方法で達成され、勾配がエマルションＡとエマルションＢとを交互にスイッチングするステップ関数の連続である。
【００７７】
第２の実施態様では、縞の一方は、ここに記載する他の実施態様のように一又は複数の生物分子を含む高分子エマルションからのものである。他方の縞はシーラントとして作用する高分子セグメントであり、仕上げられた繊維を所定の長さに切断することができ、仕上げ繊維の各末端を両末端において密封する。これらの実施態様の各々では、縞の長さは独立に調節可能である。これらの勾配及び縞模様繊維は、次の実施例で記載する同軸被覆有又は無で使用してよい。
【００７８】
実施例３
同軸被覆を持つ高分子繊維の製造
さらに他の製造の実施態様では、既に存在する繊維が紡糸口金を通し、かつ凝固浴槽を通して負荷される。液体の高分子エマルションが「Ｔ」又は「Ｙ」結合部に添加され凝固浴槽に入る前に被覆される。よって、同軸被覆が繊維に施され、各被覆は図４に示すように異なる治療薬を含有する能力を有する。被覆高分子はコア高分子と同一でも相違していてもよい。被覆高分子の接着性を向上させるためにコア繊維に結合した分子を存在せしめてもよい。例えば、ＢＳＡの薄層は、キトサンのポリ(Ｌ-乳酸)への接着性を向上させる。複雑な紡糸口金により、各々が異なる生物分子を含有する二又はそれ以上の高分子エマルションを被覆することができる。これは、全ての被覆材料を、バッフルで各被覆高分子流を分離しながら紡糸口金に入れることにより達成される。これにより、繊維が異なる分子を繊維周囲の角度位置の関数として放出することを可能になる。或る実施態様では、紡糸口金は非環状としてもよく、それにより繊維を望ましい断面形状にすることができる。このことは、コア繊維にも被覆高分子にも言える。
【００７９】
これに代わる技術は、特に設計された多穴紡糸口金を使用して、コアとシース、海中の島などの当該分野で馴染み深い標準的繊維構造を形成することである。
【００８０】
実施例４
環境応答性高分子ゲル繊維の製造
異なる製造の実施態様では、環境応答性の高分子ヒドロゲルが、乳化重合又は他の方法によりナノ球サイズで形成される。これらのナノ球は、次いで繊維に導入される。「環境応答性ゲル」とは、ゲルを取り囲む環境が比較的小さな変化を受けたとき、それらの物理的特徴に有意な変化を示す高分子ゲルを表すことを意図する。本発明で有用であることがわかった高分子ヒドロゲルは、ポリ(Ｎ-イソプロピルアクリルアミド)（ＮＩＰＡ）及びポリ(アクリル酸)（ＰＡＡ）ゲルを含む。例えば、ＮＩＰＡゲルは、小さな（２-３Ｃ）の温度変化に応答して１００倍の劇的な容積変化を受ける能力を持つ。これらのナノ球は、それを生物分子の水溶液に浸漬することにより生物学的分子を負荷することができる。これらの負荷ナノ球は、次いで乾燥され、エマルションの形成有又は無で高分子溶液に添加される。他の全ての製造プロセスは同様である。このプロセスは、次いで温度感受性の繊維を生成する。ＮＩＰＡ相転移は、当業者により３９-３９Ｃで起こるように調節される。これは現在、患者の生理学的状態に応答する繊維を提供している。患者が発熱すると放出速度が劇的に上昇し、これは可逆的現象であるので、体温が平常に戻れば放出速度は再び低下する。
【００８１】
実施例５
キトサンベースの繊維
他の製造の実施態様では、上述したエステルベースの合成高分子ではなく、キトサンなどの天然由来の多糖類を高分子系として使用する。当該分野で知られているように、キトサン繊維は、キトサンを３％酢酸に溶解し、凝固浴槽として５％水酸化ナトリウムを使用することにより製造される。本発明者等は、キトサンを溶解するために１％塩酸を使用できること、キトサン濃度を２．５重量％まで低下させることが可能であること、そして凝固浴槽が５〜１５％の範囲の濃度のトリス塩基からなる場合に良好な繊維が得られることを見出した（図１）。これは、キトサン繊維がこのような条件下で押出しできることの最初の報告である。
【００８２】
キトサンは生分解性高分子である。キトサンは、血清、腸液、並びに又は細胞内に存在するリゾチームにより酵素的に分解される。リゾチームのキトサンに対する作用はポリマー骨格におけるアセチル基の存在に依存しており、特定の環境下では、２つの代替的方法によって上記の繊維の放出速度を変えることができ：ａ）一方は、各々が異なるアセチル化度を持つキトサン高分子からなる不均一混合物から上記の繊維を押し出すことである。このようにして、放出薬剤のレベルを必要な期間に渡って最適範囲に維持することが可能であり；ｂ）他の可能性は、キトサンの分節された繊維を押し出すことであり、各セグメントは図１に示すように異なるアセチル化度を持つキトサンから製造される。この後者の方法は、繊維に沿って時間的な勾配を形成することにより泳動細胞に対する応用が可能である。
【００８３】
また本発明者等は、再構成した基底膜抽出物（マトリゲル(matrigel), Becton Dickinson, Bedford, MA）を塩酸に溶解させたキトサンと混合し、１０〜１５％の濃度範囲のトリス塩基からなる凝固浴槽を用いて良質の繊維を押し出す可能性を示した。この場合、軸策伸長はキトサン単独より向上した。ＥＬＩＳＡにより、繊維内にマトリゲルの２つの主要なタンパク質（ラミニン及びＩＶ型コラーゲン）の存在を確認した。これらのタンパク質は、インビトロのニューロン接着及び軸策伸長により示されるように、生物学的活性も維持していた。他の可能性は、同じトリス塩基に押出しされたキトサン繊維をマトリゲルで被覆することである。
【００８４】
驚くべき発見だが、本発明者等がマトリゲルの添加に先立ってキトサンを硫酸化した場合、ニューロン接着及び軸策伸長は、マトリゲル及び非処理キトサンの場合に比較して劇的に向上した（図３、図４）。同じ化学的押出しを使用して、本発明者等は、同時押出し物質としてのマトリゲル有又は無で、０．２％硫酸化キトサンと３．２％未修飾キトサンで高分子繊維を押出すことができた。
【００８５】
硫酸化キトサンが、その化学構造の類似によりヘパリン様の抗凝固特性を有することは当該分野で知られている。塩酸に溶解してトリス塩基に押出した非修飾キトサンから製造した繊維は、硫酸化キトサン又はマトリゲルと硫酸化キトサンで被覆することができる。これにより、本来的に抗凝固特性を持ちながら、活性薬剤も負荷できる繊維を製造できる。これは、血液に接触し、機械的強度及び／又は薬剤送達能が要求される血管ステント及び他の医療器具の製造において重要な臨床的応用性を有する。
【００８６】
上記のキトサン繊維が押出される比較的過酷な酸性及び塩基性環境は、繊維に導入されうる生物分子の範囲を、非常に大きなｐＨ変化に耐えられるような生物分子のみに制限する。従って、この固有の制約を解消するため、本発明者等は、キトサン繊維に負荷される最も過敏な生物分子でも生物活性を保持する新たな方法を開発した。この実施態様では、対象とする過敏な生物分子が、溶媒蒸発又は薬剤送達文献で知られた他の技術を用いてＰＬＬＡ微小球に負荷される。これらのＰＬＬＡ微小球は、次いで３．５％キトサン溶液と混合され、上記のように押出される。ＰＬＬＡ微小球を負荷したキトサン繊維は、この混合物を酢酸及び水酸化ナトリウム又は１．２％塩酸及び１０〜１５％トリス塩基を用いて押し出すことにより形成される。ＰＬＬＡ微小球は、過敏な生物分子をキトサン繊維の過酷な処理条件から保護する。
【００８７】
実施例６
神経組織の加工
本発明のこの態様では、図１５に示すように、繊維の平行列がシリコーンゴム又は他の適当な材料の管に充填され、軸策成長のためのニュートロフィンが負荷される。これらの繊維の束は、切断した末梢又は中枢神経に配される。ニューロトロフィンは線形又は他の適当な勾配で負荷される。この器具は、神経残根の末端間の間隙を橋渡しするように埋め込まれる。繊維がニューロトロフィンを放出すると、軸策が近接末端から繊維束を横切って遠位神経末端へ泳動を開始する。遠位末端に到達すると、存在するシュワン細胞又はグリア細胞によって案内合図が与えられ、次いで再接続がなされる。非負荷繊維を用いて、軸策がこれらの束による接触案内を受容し、ラットの座骨神経において１．８ｃｍ移動可能であることが既に立証されている。管における非負荷繊維の最適密度は、ラット座骨神経成長については１．５ｍｍ径管中に約３２繊維である。
【００８８】
実施例７
高分子繊維ステントの調製及び使用
他の実施態様では、繊維に対象とする薬剤を負荷し、機械的強度が要求されるステント又は他の医療器具に使用できる。ステントは、機械的特性が必要な場合は、負荷繊維が非負荷繊維と混じり合うような方法で織ることができる。
【００８９】
また繊維は、薬剤を埋め込み位置に送達するために市販のステントと組み合わせて使用できる。この場合、繊維は如何なる機械的支持体も提供せず、薬剤送達リザーバとしてのみ働く。
【００９０】
実施例８
創傷被覆材の調製及び使用
他の実施態様では、これらの繊維からガーゼ又は被覆材が製造される。この被覆材は２つの面を持ち、上面は再上皮形成のための分子を放出して、これらの細胞のための基質を供給する。下面は皮膚組織の再生を促進する。この被覆材は、火傷、全層皮膚損傷及び慢性又は治癒困難な創傷及び痛みを含む皮膚創傷の治癒のために設計される。各繊維は、皮膚創傷治癒の３つの相に対応する薬剤又は因子の一時的放出のために被覆することができる。
【００９１】
例えば、被覆材が外傷患者である場合、放出されるべき第１の薬剤は出血を停止させる凝固促進薬である。次の層は、創傷治癒の次の相のための好中球及びマクロファージの補充を補助するサイトカインを放出する。最後に、過剰な瘢痕組織の低減を補助し、特に火傷患者を無力にする収縮を阻止する因子の放出である。
【００９２】
実施例９
人工動脈の製造
ここに記載した技術を用いて人工動脈を構成することもできる。種々の生物学的薬剤を負荷した繊維で非織物技術を用いて、中空の円筒形の部材の連続体を、編む、織る、混合する、又は製造することができる。最も内側の円筒は、好ましくは織られており、未変性の上皮細胞層の泳動、拡散及び機能化を促進するための医薬又は薬剤を含んでいる。次の円筒は織られた又は編まれた構造物からなり、主に内側の円筒の周囲を囲むように織られている。この層は、平滑起因繊維の泳動及び増殖を誘発し、エラスチンの発現を促進して内部弾性媒体の生成を促進する。次の円筒は編まれた又は不織の繊維からなり、繊維芽細胞、マクロファージの内殖及び細胞外マトリクスの生成を促進する。最後の層は、長繊維からなり、動脈の脈管を介して動脈細胞の血管化を促進し、ＶＥＧＦ放出繊維、又は他の血管新生促進剤から製造される。
【００９３】
実施例１０
薬剤送達骨格
他の応用の実施態様では、これらの繊維は、その場での薬剤送達骨格のために使用され、繊維の形式は微小球のものであるのが好ましい。例えば、薬剤の血流への直接送達のためには、繊維は血管壁に良く接着し、血管内に全部が含まれることができる。微小球は、幾つかのレベルで捕捉され、潜在的に下流組織と和合するので、循環系を通って流動できない。しかしながら、繊維は薬剤を放出でき、繊維は不活性を保つ限りは下流の枝の閉塞を伴う問題を生じない。繊維が微小球より意味がある他の場所は眼を含み、そこでは球が患者の視野を妨げやすい。繊維はタック止めでき視野に流れ込まない。繊維は微小球より、特に繊維がコイル状になる空間で、その場に止まりやすい。このようにして、繊維内部の機械的張力が生じ、組織空間の側面を押し、よってその位置に止まる。
【００９４】
実施例１１
インサイツ動脈形成
実施例９と同様の視点で、インサイツの動脈形成である。この実施態様では、ＶＥＧＦ又は類似の弛緩物質を含む繊維の束が体内に配され、繊維束の両末端は存在する血管の近傍又にあるか又は接触する。繊維がＶＥＧＦ又はその弛緩物質の放出を開始すると、存在する血管からの内皮細胞が、通常の血管新生のプロセスに従って、存在する血管からの泳動が誘発される。先行する内皮細胞は、繊維束の経路を横切り、繊維束の経路に沿って新しい血管が生成される。この繊維束は幾つかの形態を持ち、それはＶＥＧＦ及びその置換物質のみを放出する単一又は少量の繊維が存在してもよいし、あるいは内部の内皮細胞及び外部の平滑筋の異なる因子に化学向性であるＶＥＧＦ又は類似の成長因子を持つ管であってよい。このようにして、生成される血管のサイズが決定される。この出願では、細胞は当初は細胞の無い骨格に細胞特異的な成長因子によって案内される。
【００９５】
実施例１２
骨折の治癒
他の創傷治癒の実施態様では、骨折治癒を促進することが知られたタンパク質が繊維に負荷される。この繊維は、次いで骨のおれた部位の周囲に巻かれ、成長因子を放出して骨折修復を促進する。
これらの繊維は螺旋構造（単独又は多重螺旋）であるか、又は目の粗い開放された編み目のいずれかとすることができる。螺旋又は織られた形式の何れでも、繊維は骨断片の周囲に配され、それらをその場に保持すると共に成長因子を放出する。
【００９６】
骨折部位への血液供給が無い又は少ないために治癒困難な骨折の場合、ＶＥＧＦ又はその等価物を含む繊維又は繊維の組が骨折領域への血液供給の促進のために使用される。
この実施態様では、骨折は、非処理骨折に比較して促進された速さで治癒され、癒着不能なものも治癒される場合がある。
【００９７】
実施例１３
皮膚潰瘍治癒
皮膚創傷治癒の一形態を記載した実施例８と同様に、この技術の他の重要な例は、種々の原因の慢性皮膚潰瘍、例えば糖尿病性脚潰瘍、静脈性潰瘍及び一般的な圧痛などの治癒の可能性である。状態及び潜在的な他の類似の状態は、皮膚創傷を治癒を促進することが知られた因子、例えば血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-ベータ）、及びＶＥＧＦ又は類似のタンパク質を放出する不織網の製造に基づいて治癒されうる。この不織網は潰瘍又は創傷に直接挿入又は包むことができ、これらの因子が創傷治癒プロセスの促進を補助する。これらの被覆材は、皮膚の痛み及び潰瘍を治癒するために設計されうる。この場合、特に糖尿病勢潰瘍の患者の最も大きな要求の一つが創傷部位への血液供給の欠如であるが、出血を減少させる必要は殆ど無い。従って、血管新生を誘導する因子は循環を増加させ、痛み又は潰瘍部位における組織の回復を補助する。
各被覆材は、放出される生物分子、及びそれらが放出される速度を変化させることにより、種々のタイプの創傷又は痛みの特定の要求のために設計される。
【００９８】
実施例１４
筋肉移植
他の実施態様において、繊維の平行列は筋肉幹細胞を負荷されてもよい。これらの幹細胞は、心臓、平滑又は骨格筋由来とすることができる。これらの幹細胞が繊維列に種付けされると、繊維はインビトロで機械的に延伸されて細胞の整列と分化特性を補助する。また整列は極めて小径の繊維を使用して達成してもよい。軸策での我々の経験は、５０μｍオーダーの径の繊維は、繊維の軸に平行な細胞の整列を助長する傾向がある。この束の他の繊維は、血管新生因子を放出して筋肉細胞のための血管を生成する。骨格又は平滑筋組織の場合は、神経筋接合部の形成を誘導するための神経成長のための繊維も含まれうる。これらの幹細胞を収集し、単離し、再生産し、そして分化させる種々の実験条件は、当業者に知られており、この特許の一部ではない。
【００９９】
実施例１５
代替的繊維製造方法１
１００μｌの高分子溶液上で小容量の高分子を製造するために、以下の方法が開発された。エマルションを実施例１で記載したように作製する。このエマルションを1mlＦＡＬＣＯＮ(登録商標)管等の小型の容器に添加するが、これは、２０〜３０ゲージ、最も典型的には２３ゲージの針を管の底面に貫通させることにより改変してある。この管を、凝固浴槽溶媒で満たした改変した５０ｍｌ管に配する。管を遠心分離器に配置し、５００〜１２００ｒｐｍ、最も典型的には７００ｒｐｍで回転させる。遠心力は小容量の高分子エマルションを針を通して凝固液に押し出す。実施例１に記載したのと類似の溶媒交換により、繊維が形成される。この方法は有意に少量の高分子エマルションを使用し、廃棄されるエマルションが殆ど無い。
【０１００】
実施例１６
代替的繊維製造方法２
代替的な製造方法として、凝固浴槽溶媒は長い垂直管を通って所定速度で流れ、高分子溶液は凝固浴槽溶媒の流れの中に押し出される。管からの流れは浴槽に出る。繊維は一又は複数のボビンを通過し、浴槽から取り出されてスプールに巻かれる。溶媒の流速、高分子押出し速度、高分子溶液／エマルションの組成、凝固浴槽溶媒の組成、繊維が巻き取られる速度、連続するボビン間で起こりうる引張り、及びあらゆる付加的な溶液又は処理が、繊維の機械的及び化学的特性並びに負荷された生物学的材料の放出速度に影響するであろう。
【０１０１】
実施例１７
緑内障の治療
実施例１０に記載した眼における薬剤送達、実施例６に簡単に述べた神経ステントと同様に、緑内障は眼内薬剤送達と視神経に適用される神経治療とを組み合わせることにより治療される。網膜神経節細胞はアポトーシスを受けて視神経の軸策の死亡を導く。細胞が眼並びに視神経の経路の両方で支持される場合、細胞は生存できるとの仮説を立てる。ＮＴ-４、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦなどの成長因子を放出する繊維束は、視神経の外側に局所適用される。同時に、アポトーシス阻害剤、又は網膜神経節細胞を支持する因子を放出する繊維が眼内に埋め込まれる。この複合効果は、緑内障を罹患した者の視力を延長又は確保しうる。
【０１０２】
上記の実施例に見られるように、他の組織、器官、又は構造は、基本的な生理構造を一度織り込むことができると理解される。これは、消化系、筋骨格系、尿生殖系、循環系、神経系に拡張できる。
【０１０３】
ここに開示し請求する全ての組成物及び方法は、この開示を参照することにより過度の実験をすることなく作製し実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施態様によって記載したが、組成物及び方法に、及びここに記載した方法の工程又は工程の順序において、この発明の精神及び範囲から逸脱することなく、変更を施してもよいことは当業者には明らかであろう。より特定には、化学的及び生理学的の両方で関連する或る薬剤は、ここに記載した薬剤で置換されうるが、同じ又は類似の結果が達成されるであろう。これらの類似の置換物及び変形物の全てが当業者に明らかであり、添付する請求の範囲によって特定される発明の精神、範囲及び概念に含まれるものとする。
【０１０４】
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載したものに例示的手法又は他の詳細な捕捉を与える範囲で、特に参考としてここに取り込むものとする。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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