(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中の蛋白質とクレアチニンの検定方法において、
ａ）実質的に水平な回転軸を有する反応容器、
第一および第二反応域を有する分析反応チャンネル（ここで第二反応域は、第一反応域と所定の距離をおいて位置付けられ、かつ、液体が通じる関係にあり、これらにより、該反応チャンネルに導入された液体試験試料は、これら反応域間の反応チャンネルに沿って、回転軸まわりの反応容器の回転によって、重力により移動され得る）、
液体試験試料の単一方向の流れを反応容器に与えるための供給手段、および
供給手段と液体が通じる関係にあり、供給手段中に液体試験試料を導入するための入口手段
を提供する工程（ここで、第一反応域はその中に乾燥した抗体試薬を有し、第二反応域はアルカリ性条件下でクレアチニンと反応して有色の反応生成物を形成し得る乾燥した有機酸のリチウム塩と、その再水和がクレアチニン／有機酸反応のために必要なアルカリ性値を与える乾燥したアルカリ性物質とを含有し、また反応容器は、第一と第二反応域間に位置した観察口をも有する）；
ｂ）蛋白質やクレアチニンを含有する疑いのある尿を、液体試験試料として、供給手段を通して反応容器に導入し、また、第一反応域中で乾燥した抗体試薬と特異的に結合する高分子凝集剤を含有する反応液体を導入する工程（これにより、抗体試薬が可溶化し、かつ、観察口を通しての読み取りにより定量化し得る凝集反応をもたらす）；並びに
ｃ）反応容器をその回転軸まわりに回転させ、液体試験試料／反応液体を共に、該有機酸のリチウム塩とアルカリ性物質に接触させ（これにより、それらを溶解し、該有機酸のアニオンと液体試験試料中に存在するすべてのクレアチニンとの間に有色の応答が生ずる）、尿試料中のクレアチニンの関数としてこの有色応答の強度を測定する工程
を含む検定方法。
【請求項２】
該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香酸、ピクリン酸または１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該有機酸が、３，５−ジニトロ安息香酸である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該アルカリ性物質が、アルカリ金属の水酸化物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アルカリ金属の水酸化物が、カリウム、ナトリウムまたはリチウムの水酸化物である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
尿中の蛋白質及びクレアチニンの測定における請求項１〜５のいずれか１項記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
クレアチニンは、クレアチンがクレアチンリン酸になり、筋収縮のエネルギー源として使用されるときの最終代謝物である。このクレアチニンは、腎臓の糸球体によってろ過され、再吸収なしに尿中に排泄される。体液中のクレアチニンの検出は、筋肉の疾患、或いは腎炎や腎不全のような腎臓の疾患を診断するために有効である。
【０００２】
Ｊａｆｆｅ  法として知られている、尿中のクレアチニン検出のための最初の実践的な試験は、アルカリ溶液中でのピクリン酸とクレアチニンとの結合によって黄褐色のピクリン酸クレアチニンの生成を伴う。クレアチニン検出のためのより最近の方法は、ＢｅｎｅｄｉｃｔとＢｅｈｒｅ  （Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  １１３：５１５（１９３６））  によって報告されており、その方法は、アルカリ媒体中でのクレアチニンと３，５−ジニトロ安息香酸との反応を伴う。クレアチニンの比色測定では、クレアチニンを脱プロトン化して有色の反応生成物の形成を可能にするために、約１１．５〜１２．５のオーダーの高いｐＨが要求される。アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物のような強塩基性物質が、試薬系において適当な高いｐＨを維持するために典型的に用いられる。
【０００３】
共同でなされた米国特許出願第１６０，２３９号明細書には、単一の尿試料中の、尿中の蛋白とクレアチニンを検出するための単一法が開示されている。この種の検出法において、クレアチニンの検出は、蛋白質／クレアチニン比を用いることによる、尿の高い流動という問題を極小化するために行われ、その結果、尿中濃度が正常化される。この開示には、尿中の蛋白とクレアチニンの単一検出法が記載されており、この方法においては、尿試料が、第一および第二反応域を含む反応容器中に導入される。第一反応域には、尿蛋白に特異的な、乾燥した免疫試薬が組み込まれており、第二反応域には、これら反応域に導入された反応液のｐＨをクレアチニンを検出するのに適したレベルに高め得る、乾燥した塩基性試薬が組み込まれている。尿試料を第一反応域に導入して免疫試薬と接触させるとき、免疫試薬と尿蛋白との相互作用により、反応液の濁りを増大させながら免疫試薬が溶解し、この濁りの増大が尿中蛋白の濃度を決定するために利用される。次に、クレアチニン検出のための試薬を含有するその反応液を、第二反応域中の、乾燥した塩基性試薬と接触させ、それにより塩基性試薬が溶解し、クレアチニンの比色検定のために要求されるレベルにその反応液のｐＨを上げる。別の手段としては、クレアチニン検出試薬を塩基性試薬と共に第二反応域上にあらかじめ乾燥させる。単一分析のこのシステムを最高の効率で作動させるためには、乾燥したクレアチニン反応試薬を、十分な量で第二反応域の表面上に乾燥させることが必須であり、これによりこの試薬の再水和を伴うクレアチニン検出反応が容易になる。
【０００４】
分析方法全般において、リチウム塩類の使用は既知である。例えば、米国特許第５，１５１，３６９号明細書において、リチウム塩類、とくにチオシアン酸リチウムを使用して、溶血およびヘモグロビンを変性させる方法が開示されている。
【０００５】
本発明は、水溶液中のクレアチニンの検定の改良法であって、アルカリ性条件下でクレアチニンと反応して有色の反応生成物を形成する有機酸試薬を、クレアチニンを含有する水溶液と接触させ、この溶液に溶解させる。この改良法は、このクレアチニン反応性試薬のリチウム塩を含む。
【０００６】
ジニトロ安息香酸リチウム（ＬｉＤＮＢＡ）、ピクリン酸リチウムおよび１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸リチウム等の有機酸のリチウム塩の、クレアチニン検出試薬としての使用は、乾燥試薬を使用するいかなる種の分析計画においても有効である。例えば、このリチウム塩は、乾燥試薬試験片フォーマットにおいて使用され得、このフォーマットにおいては、例えばＬｉＤＮＢＡのようなその塩の浸液およびＬｉＯＨ（または他の塩基）が、試験片マトリックスに含浸させるために使用される。この試薬試験片は、試料中のクレアチニンと反応して、有色の応答を生む。また別の手段としては、この試験片は、２つの浸せきフォーマットを用いて調製され得、このフォーマットにおいて、第一の浸せきフォーマットはそのリチウム塩を含有し、第二の浸せきフォーマットはアルコール／水の混合物中にアルカリ性試薬を含有する。例えば尿のような、クレアチニン濃度を測定すべき水性液体に後に溶解させるためにクレアチニン反応性試薬が支持材料上に乾燥した、クレアチニン検出のためのいかなる分析技術も本発明を使用することにより利益を得ることができる。クレアチニン試薬として最も知られているＤＮＢＡの場合、文献中に、沸騰水５３部では遊離酸の溶解度が約１ｇであること（０．０８９Ｍ）および冷水中では極めて低い溶解度であることが報告されている。当業者は、ＤＮＢＡがその塩の形態ではより可溶であると期待するであろう。実験結果は、室温でのＤＮＢＡのカリウム塩の溶解度が約０．０５Ｍであり、室温でのそれのナトリウム塩の溶解度が約０．１１Ｍであることを示した。意外にも、室温でのＤＮＢＡのリチウム塩の溶解度が約１．８９Ｍであることが判明した。ＤＮＢＡ塩の混合物もまた、適度な溶解度を有する；例えば、そのナトリウム塩とそのカリウム塩の混合物は、室温で０．５８Ｍの溶解度を示し、他方、そのナトリウム塩とそのリチウム塩の混合物は０．９２Ｍの溶解度を有し、そのカリウム塩とそのリチウム塩の混合物は０．９１Ｍの溶解度を示した。その高い溶解度のため、そのリチウム塩は、クレアチニン試薬が固体支持体上に乾燥しているタイプでの分析における使用においてより好ましい。クレアチニン反応性基質の塩の濃度が大きくなるにつれて、特定量のその溶液から析出し得るその塩の量が大きくなるからである。その上、ＤＮＢＡまたは別のクレアチニン反応性物質を溶解すべき場合、そのような溶解は、そのリチウム塩の使用によって容易となる。
【０００７】
前述のように、本発明は、同時係属出願である米国出願第１６０，２３９号明細書において開示された、尿中の蛋白とクレアチニンの単一測定のための装置との組み合わせにおいて特に有効である。試験されるべき尿が第一および第二反応域を含む反応容器に導入される系において、第一反応域に、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に向けられた乾燥したヤギ抗血清を取り込み得る。この材料は市販されており、また、二倍に濃縮しかつ乾燥の間および乾燥後長期保存中にその抗体が安定化するように２〜５％のスクロース／トレハロースの混合物を添加することを除き、付加的な処理なしに使用され得る。添加剤もまた、物理的安定性を提供し、乾燥試薬のはがれ落ちや凝結を防止する。典型的には、その抗体溶液の１５μＬ分を、第一反応域上で乾燥させ、１５分間６０℃で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾燥させる。
【０００８】
アルカリ性試薬およびクレアチニン反応試薬を、第二反応域の表面上に、典型的にはこれらの溶解前においてそれらを分離させ続けるように第二反応域の異なる面上に乾燥させる。クレアチニン検出のためのアルカリ性試薬は、アルカリ金属の水酸化物溶液（例えば２．５ＭのＫＯＨ）、或いはアルカリ金属の水酸化物と、リン酸塩、ホウ酸塩またはグアニジン誘導体のようなアルカリ性緩衝物質との混合物のいずれかからなる。典型的には、１Ｍのリン酸塩と４．０Ｍの水酸化カリウムとの混合物並びに１０％の上記添加剤が使用される。この試薬を、例えば１５μＬのその濃縮溶液を第二の反応室の１表面に塗布して乾燥させることによって、第二反応域の１表面上に乾燥させる。クレアチニン反応性試薬、典型的には水中の３，５−ジニトロ安息香酸リチウムは、かなり飽和した、例えば１．４Ｍの溶液として与えられる。ＬｉＤＮＢＡの溶解限界まで十分に飽和した溶液を使用し得るが、製造工程の間は望ましくはない。濃度や温度における微妙な変化によって、固体物質が容易に析出するからである。この溶液を、通常は上述のようなタイプの安定化剤で処理し、１５μＬの溶液で第二反応域の適当な表面上に塗布し、続いて乾燥させる。
【０００９】
操作において、緩衝液（例えば、４％ポリエチレングリコール、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のアジ化ナトリウムおよび０，１％のゼラチン、ｐＨ＝８．５）、並びに、ＨＳＡ、クレアチニンまたはＨＳＡとクレアチニンとの混合物を含む３０μＬの試料をその装置に導入して反応を開始させる。ブランクを測定後、抗体試薬を溶解し、５３１ｎｍでの吸光度を２分間測定した。吸光度の増加の割合は、試料中のＨＳＡの濃度に比例する。次に、そのアルカリ性試薬とＬｉＤＮＢＡを溶解し、５３１ｎｍでの吸光度を３分間再び測定した。試料中のクレアチニンの濃度に比例して吸光度が増加した。
本発明は、さらに以下の例によって示される。
【００１０】
【実施例】
実施例Ｉ
ＫＯＨ、ＮａＯＨおよびＬｉＯＨ水溶液中でのＤＮＢＡの溶解度を、以下にしたがって決定した：
不溶のＤＮＢＡが観察されるまで、ジニトロ安息香酸を、１．５、２．０、２．５または３．０Ｍの水酸化カリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウム溶液に加えた。その結果物を攪拌し、室温で１時間放置し、ＤＮＢＡの飽和した上澄液を取り出し、溶液中のアルカリ金属塩の濃度を３４０ｎｍでのＵＶ吸収により決定した。
この実験での結果を図１に図示したが、この図から、水酸化カリウムや水酸化ナトリウムを使用した場合よりも、５〜１０倍以上濃度の高い溶液が、水酸化リチウムとＤＮＢＡから調製されたことがわかる。
【００１１】
実施例ＩＩ
尿中の蛋白とクレアチニンの併合分析は、湿式分析フォーマットでよく実施され、米国特許第４，９９０，０７５号明細書に開示されているような連続分析的検定を実施するための反応容器への適用に特に適している。この特許は、実質的に水平な回転軸、並びに、液体試験試料中の被検体と相互作用してその被検体の関数として検出可能な応答を発する第一および第二の分析試薬を取り込ませた第一および第二反応域を含む分析試薬反応チャンネル、を有する反応容器を開示している。この第二反応域は、第一反応域から所定の距離をおいて位置付けられ、かつ液体が通じる関係にある。そのために、その反応チャンネルに導入された液体試験試料は、その回転軸の回りにその反応容器を回転させることにより、これら反応域の間の反応チャンネルに沿って、重力により移動させ得る。この反応容器は、反応容器内へ液体試験試料の単一方向の流れを与えるための液体試験試料供給手段、および、その供給手段と液体が通じる関係にある、その供給手段中へその液体試験試料を導入するための入口手段を有する。
【００１２】
図２を参照しながら説明すると、抗体と、単糖類、二糖類またはオリゴ糖等の添加剤とを、反応容器１０の第一反応室２４中の第一反応部位２８上に乾燥させる。前述の特性に加えて、この添加物はまた、乾燥試薬のはがれ落ちや凝結を防止するような物理的安定性を与える。この装置は内壁１４を有するが、この壁は、この装置内への、少量の尿のような液体試験試料の導入を許容する供給室２３を形成する。また、この供給室は、反応室２１と液体が通じる関係にあるので、液体試験試料は、その供給室を通ってその反応室に入りその反応チャンネルに入ることができ、かつ、水平方向の回転軸に沿ったこの装置の時計回りの回転によって、その反応チャンネルに沿って流され得る。その試験試料は、便利にも、図２に示される入口手段および供給手段のように、毛管ディスペンサー１２を通して供給される。少量の尿のみが供給チャンネルを通して導入されるので、適当な緩衝剤を含む付加的反応液体は、供給チャンネルを通して、或いは、本発明の分析検定操作を行うために、緩衝剤および／または液体試薬を含有するよう調整された液体供給貯槽２６のような別の源から導入され得る。典型的に、その反応液体は、第一反応域中に存在する抗体試薬と特異的に結合して凝集型免疫検定を提供する、高分子凝集剤を含有する。この液体供給貯槽は、要求されるまで液体を保持する液体貯槽として働く、くぼみを有する貯槽ボディ２７を含む。この貯槽２６は、膜（図示せず）によってカバーされるが、この膜は除去され得、貯槽２６中の液体が、反応チャンネル２１中へ流出することを可能にする。この装置の単純な操作は、液体貯槽２６からの液体によって運ばれた試験試料の、観察口４２を通して観察する位置への流入をもたらす。
【００１３】
第一反応域は、第一反応部位２８において乾燥した抗体試薬を含むが、この試薬は、典型的には図３中の１８ａおよび１８ｂで示される側面の１つか、或いは、反応容器の内壁１６に付着している。この装置の適当な回転は、反応溶液を部位２８における乾燥した抗体試薬に接触させてその溶解を容易にし、その結果、凝集免疫検定における凝集剤と反応することができる。抗体試薬を、尿試験試料を含む反応液体中に適当に溶解させる場合、この装置１０を時計回りに４５°回転させて図４に示すようにその液体が観察口４２を覆うようにし、ここで分光光度的な読み取りを行い、これから時間を関数とした濁度の変化を測定する。これら読み取りと、既知量の蛋白質を含む尿試料を用いて準備したグラフとを比較することによって、試験試料中の蛋白質濃度を決定する。
【００１４】
このシステムにおいては、この時点で、クレアチン濃度の測定という分析操作の第二段階の準備が完了している。適当なクレアチニン試薬、例えばＬｉＤＮＢＡを、第二反応域３４に位置する第二の試薬部位３２ａ上に乾燥させる。アルカリ性試薬を、試薬部位３２ａとは反対側の容器の壁上にある第三の試薬部位３２ｂ上に乾燥させる。これにより、それらは互いに物理的に分離される。蛋白質検定が完了した後、その容器を右に更に１３５°回転させて元の位置からひっくり返し、図５に示すように、その緩衝液を、試薬部位３２ａにおける乾燥したクレアチニン検出試薬と、試薬部位３２ｂにおけるアルカリ性試薬と接触させてこれらを溶解させる。これは結果的に、緩衝液のｐＨを、クレアチニン検出反応が起こるのに必要な約１１．５〜１２．５のレベルに引き上げる。クレアチニン試薬と尿中のクレアチニンとの相互作用から生ずるこの色の変化は、分光光度的に測定される。これは、反時計回りに反応容器を１３５°回転させ、かつ、観察口４２を介して読み取ることによりなされ得る。この読み取りの結果を、既知のクレアチニン濃度で読み取ったものと比較する。
【００１５】
クレアチニン検出試薬のリチウム塩の使用は、そのクレアチニン検出試薬の溶解速度を増加させ、また、この試薬のより濃度の高い溶液の生成を許容するであろう。上記装置の第二反応域で使用される、この乾燥したクレアチニン検出試薬とアルカリ性物質は、以下のように調製される：
【００１６】
Ａ．乾燥したＬｉ−ＤＮＢＡ試薬の調製
ジニトロ安息香酸（ＤＮＢＡ，３．４ｇ）を水酸化リチウム（６．２ｍｌの２．５Ｍ溶液）と混合した。ＤＮＢＡのすべてを溶解させて、約４．７のｐＨを有するやや明黄色の溶液を得た。この溶液を、０．５４ｍｌの蒸留水で希釈し、その混合物４．５ｍｌをスクロース０．５グラムと混合して１０％スクロース溶液を作成した。この混合物の一部（１５μｌ）を、この試薬カートリッジの第二反応域の部位３２ａに析出させ、かつ、６０℃において乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾燥させた。
【００１７】
Ｂ．乾燥したアルカリ性試薬の調製
第二リン酸カリウムの三水和物（２２．８ｇ）を水酸化カリウム（２．５Ｍ）と混合して、全量を水酸化カリウムで１００ｍｌにした。その混合物のアリコート４．５ｍｌを０．５ｇのスクロースと混合して１０％のスクロース溶液を作成した。この混合物（１５μＬ）を試薬カートリッジの第二反応域の部位３２ｂ上に析出させ、かつ、６０℃において乾燥時間１５分で作動させたトンネル乾燥機を用いて乾燥させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】様々な濃度の各種アルカリ溶液における、ＤＮＢＡの溶解度を示した図である。
【図２】本発明で使用される反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図である。
【図３】本発明で使用される反応容器の、回転軸に対して平行する面で切断した図である。
【図４】図２の状態から、時計回りに４５°回転させた反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図である。
【図５】図４の状態から、時計回りに１３５°回転させた反応容器の、回転軸に対して直交する面で切断した図である。
【符号の説明】
１０  反応容器
２１  反応室
２３  供給室
２４  第一反応室
２６  液体放出貯槽
２７  貯槽ボディ
２８  第一反応部位
３４  第二反応域
４２  観察口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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