(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーからの溶離液が流入し、質量分析用マトリックスが導入され、前記溶離液と前記マトリックスとを混合させて質量分析装置へ導入するＴ字管であって、
前記Ｔ字管の一部が同心円状の二重構造を有し、その二重構造を構成する管であって、前記溶離液が流れる内側の管と、
前記二重構造を構成する管であって、前記内側の管の外側にあり、前記マトリックスが流れる外側の管と、を備え、
前記内側の管および前記外側の管の略同一の位置にある終点に近づくにつれ、前記外側の管の内径が前記内側の管の外径に近づくように円錐状に形成され、前記内側の管および前記外側の管の終点との間で前記溶離液と前記マトリックスとの混合が十分に行われない微小な空間を設けるようにフィルターが配設され、さらに前記フィルターの下流側との間で、前記溶離液中の分離された目的物質を拡散させない微小な空間を設けるように配設され、前記溶離液と前記マトリックスの混合液を前記質量分析装置へ導く管、を備えるＴ字管。
【請求項２】
液体クロマトグラフィーと質量分析装置とを、請求項１に記載のＴ字管により接続した液体クロマトグラフィー/質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、二種の溶媒を混合するＴ字管およびそれを接続した液体クロマトグラフィー／質量分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィー／質量分析装置において、液体クロマトグラフィーにより分離された目的成分は、質量分析装置に導入され測定されるが、その際目的成分はイオン化されることが必要である。
このため、例えば、高速原子衝撃法(fast atom bombardment；以下ＦＡＢ法と略す) によるイオン化にはグリセリンやトリエタノールアミンなどのマトリクスの存在が必須であり、そのため従来は液体クロマトグラフィーにおける溶離液にこれらのマトリクスを添加する方法が一般に取られている。
一方、溶離液にこれらのマトリクスを添加しない方法としてはポストカラムによるマトリクス添加法がある。この方法は、カラムにより分離された目的成分と溶離液に、質量分析装置に導入する直前でマトリクスを含んだ溶媒を混合する方法である。
【０００３】
【本発明が解決しようとする問題点】
従来広く用いられている溶離液にマトリクスを添加する方法は次の欠点がある。
（１）マトリクスにより溶離液の性質が変化し、液体クロマトグラフィーにおける最適な分離を示す溶離液を選択できない。
（２）マトリクスの中にはトリエタノールアミンやジエタノールアミンなどの塩基性のマトリクスがあるが、分離カラムの多くはシリカゲルをベースとしているため、塩基性マトリクスによりシリカゲルが溶出しカラムの耐久性及び分離能力を著しく損なう。
（３）マトリクスの中にはｍ−ニトロベンジルアルコールなどのＵＶ吸収を有するマトリクスがあり、液体クロマトグラフィーにおいて分離状態をモニターする場合にＵＶ検知器が使用できない。
【０００４】
ポストカラムによるマトリクス添加法では、Ｔ字管接合部における二種の溶媒の混合が十分に行われないという欠点がある。二種の溶媒の混合が不十分だと質量分析装置中でのイオン化が不十分となり、安定した質量分析ができずまた十分な感度が得られない。混合を十分に行えるようにＴ字管の内径を太くすると、目的成分が拡散し質量分析装置に導入される時に十分な分離が得られず、また感度も低下する。
本発明者らは、上記の欠点を解決するため鋭意検討した結果、下記の構成により課題を解決できることを見いだし本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、液体クロマトグラフィーからの溶離液が流入し、質量分析用マトリックスが導入され、前記溶離液と前記マトリックスとを混合させて質量分析装置へ導入するＴ字管であって、前記Ｔ字管の一部が同心円状の二重構造を有し、その二重構造を構成する管であって、前記溶離液が流れる内側の管と、前記二重構造を構成する管であって、前記内側の管の外側にあり、前記マトリックスが流れる外側の管と、を備え、前記内側の管および前記外側の管の略同一の位置にある終点に近づくにつれ、前記外側の管の内径が前記内側の管の外径に近づくように円錐状に形成され、前記内側の管および前記外側の管の終点との間で前記溶離液と前記マトリックスとの混合が十分に行われない微小な空間を設けるようにフィルターが配設され、さらに前記フィルターの下流側との間で、前記溶離液中の分離された目的物質を拡散させない微小な空間を設けるように配設され、前記溶離液と前記マトリックスの混合液を前記質量分析装置へ導く管、を備えるＴ字管を提供する。また、本発明は、液体クロマトグラフィーと質量分析装置とを、前記Ｔ字管により接続した液体クロマトグラフィー/質量分析装置を提供する。
【０００６】
本発明にかかるＴ字管は液体クロマトグラフィー／質量分析装置において液体クロマトグラフィーにより分離した目的成分を質量分析装置に導入する際に接続することができる。したがって、本発明は液体クロマトグラフィーと質量分析装置を、Ｔ字管の一部が同心円状の二重構造であり、内側の管の終点近くにフィルターを設けたＴ字管により接続した液体クロマトグラフィー／質量分析装置である。
【０００７】
本発明にかかるＴ字管を接続した場合は、Ｔ字管の一方には液体クロマトグラフィーから流出する目的成分を含んだ溶離液が流入し、他の一方からは質量分析用マトリックス物質が導入され両者が混合され質量分析装置へと導入される。したがって、本発明は液体クロマトグラフィー／質量分析装置において、液体クロマトグラフィーと質量分析装置の間に、Ｔ字管の一部が同心円状の二重構造であり、内側の管の終点近くにフィルターを設けたＴ字管を接続し、Ｔ字管の一方から質量分析用マトリックス物質を導入することを特徴とする液体クロマトグラフィー／質量分析装置である。
【０００８】
本発明にかかるＴ字管を図面により更に詳細に説明する。図１において、本発明にかかるＴ字管はＡ〜Ｇが一体となったＴ字管を意味し、各部分はねじにより結合される。各部分の材質は特に限定されないが、通常はステンレスである。
【０００９】
液体クロマトグラフィーからの溶離液は▲１▼を通って▲２▼へ導入される。一方、質量分析用マトリックス物質は▲３▼を通って▲４▼へ導入される。▲２▼と▲４▼は同心円状になっており、溶離液とマトリックス物質は混じり合うことはない。同心円状の内側の管の終点、すなわち▲２▼の終点▲５▼において溶離液とマトリックス物質は混合されるが、▲５▼の容積は非常に小さいため十分な混合は行われない。次に溶離液とマトリックス物質はフィルター▲６▼を通過し、▲７▼へ導入される。フィルターを通過する際に溶離液とマトリックス物質は十分に混合される。▲５▼及び▲７▼の容積は非常に小さいので液体クロマトグラフィーにより分離された目的物質はほとんど拡散されない。次いで十分に混合された溶離液とマトリックス物質はその一部が▲８▼を通って質量分析装置に導入され、他は▲９▼を通って排出される。
【００１０】
液体クロマトグラフィーから流出する溶離液の流量は通常約１０〜数１００μl ／min であり質量分析装置に導入される流量は通常約１〜１０μl/min であるためスプリッターＨにより流量が調整される。
▲６▼のフィルターの材質は特に限定されず、例えばテフロンやステンレス等を用いることができる。またフィルターの細孔のサイズは特に限定されず任意に選ぶことができるが、通常は１μ〜２μである。
【００１１】
Ｔ字管内の同心円状の部分の内径は、特に限定されず任意に選ぶことができるが、通常は図２に示したＴ字管の断面図におけるＩが 1／16インチであり、Ｊが 1／32インチである。
【００１２】
本発明にかかるＴ字管を液体クロマトグラフィー／質量分析装置に接続した場合の概念図を図３に示す。
図３において▲１▼は液体クロマトグラフィーの送液ポンプ、▲２▼はインジェクター、▲３▼は分離カラム、▲４▼はマトリクス送液ポンプ、▲５▼は本発明にかかるＴ字管、▲６▼はスプリッター、▲７▼は質量分析装置、▲８▼は液体クロマトグラフィー用溶離液、▲９▼はマトリクスを意味する。各部分はステンレスカラムもしくはテフロンチューブ等により結合される。
▲１▼の液体クロマトグラフィーの送液ポンプは１台でも良いし、２台以上を接続してグラジエント分析を行うこともできる。
【００１３】
本発明にかかるＴ字管は、高速液体クロマトグラフィーに接続することにより、高速液体クロマトグラフィーによって分離された目的物質をより高感度で検出することができる。すなわち、高速液体クロマトグラフィーにより最適分離条件で目的物質を分離した後、本発明によるＴ字管の一方から最適分離条件とは異なる組成の溶媒を流入することにより目的物質の吸光度や蛍光強度を変化させ、より高感度な検出をすることができる。
【００１４】
【実験例】
本発明にかかるＴ字管を接続した液体クロマトグラフィー／質量分析装置により、消炎酵素であるリゾチームをトリプシンで消化した試料を分析した例を示す。
液体クロマトグラフィーによる試料の分離は２種の溶離液によるグラジエント法を用いた。液体クロマトグラフィー条件は次のとおりである。
【００１５】
溶離液１：トリフルオロ酢酸−水−アセトニトリル（0.2:99:1)
溶離液２：トリフルオロ酢酸−水−アセトニトリル (0.2:60:40)
溶離液１及び溶離液２を用いたグラディエント溶出法
マトリクス溶液：グリセロール−メタノール (2:100)
溶離液１の流量：1.0ml/min
溶離液２の流量：20μl/min
マトリクス溶液流量：10μl/min
分離カラム：イナートジル (Inertsil) ＯＤＳ−２（0.7mm id，150mm)
試料注入量：リゾチームとして200pmol
質量分析法：ＦＡＢ法
【００１６】
上記条件で測定した結果を図４に示す。
図４から明らかなように、本発明にかかるＴ字管を接続した液体クロマトグラフィー／質量分析装置システムによりリゾチームのトリプシンによる分解物質の１つがシャープでかつ安定したクロマトグラムとして得られた。
【００１７】
［比較例］
図５に示すＴ字管を液体クロマトグラフィー／質量分析装置に接続したシステムにより、従来のポストカラムマトリクス添加法によりリゾチームをトリプシンで消化した試料を分析した例を示す。
液体クロマトグラフィー条件は前記実験例と同様に行った。
【００１８】
結果を図６に示す。
図５におけるｌが１０ｍｍまでは、質量分析装置においてマトリクスが検出されなかった。
すなわち、マトリクスは液体クロマトグラフィーの溶離液と混合せずにスプリッターから流出したものと考えられる。
【００１９】
図５におけるｌが２０ｍｍ以上の場合は、マトリクスは質量分析装置に導入された。その時のクロマトグラムを図６に示した。
図６より明らかなように、得られたマスクロマトグラムのピークはブロードとなり、しかもクロマトグラムは安定していなかった。ピークがブロードとなったのは液体クロマトグラフィーにより分離された目的成分がマトリクスと混合される際に拡散を生じたためであり、クロマトグラムが安定しなかったのはマトリクスが十分に混合されなかったためであろうと考えられる。
【００２０】
一方、液体クロマトグラフィーの溶離液にマトリクスを添加する従来の方法により、前記実験例に用いたペプチドを測定した結果を図７に示した。
図７より明らかなように得られたクロマトグラムはシャープでありしかも安定していた。この方法は質量分析にとっては理想的であるが、前述のように液体クロマトグラフィーによる目的物質の分離に使用できる溶離液の使用が限定されるなどの欠点がある。
【００２１】
以上の実験例および比較例から本発明がポストカラムによる理想的なマトリクス添加装置および方法であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明にかかるＴ字管の構造を示す図である。
図２は、本発明にかかるＴ字管の一部（図１におけるａ）の断面図である。
図３は、本発明にかかるＴ字管より接続された液体クロマトグラフィー／質量分析装置である。
図４は、本発明にかかる装置により得られたクロマトグラムである。
図５は、従来のポストカラム添加法に用いたＴ字管の断面図である。
図６は、従来のポストカラム添加法により得られたクロマトグラムである。
図７は、従来の溶離液にマトリクスを添加する方法により得られたクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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