(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アルブミン含有水溶液をｐＨ３〜６の条件下で陰イオン交換体処理して非吸着画分を回収した後、当該非吸着画分をｐＨ４〜８の条件下で陽イオン交換体処理して非吸着画分を回収し、次いで加熱処理する工程からなる血清アルブミン製剤の製造方法であって、陽イオン交換体が陽イオン交換基を有するポリアクリルアミド系担体であることを特徴とする血清アルブミン製剤の製造方法。
【請求項２】
陽イオン交換体処理をｐＨ４．５〜６．５の条件下で行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリアクリルアミド系担体がポリ（Ｎ−トリス[ヒドロキシメチル]メチルメタクリルアミド）である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
血清アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体処理した後、陽イオン交換体処理し、次いで加熱処理する工程からなる血清アルブミン製剤の製造方法であって、陽イオン交換体がカルボキシメチル基を有するポリアクリルアミド系担体であることを特徴とする血清アルブミンの製造方法。
【請求項５】
ポリアクリルアミド系担体がポリ（Ｎ−トリス[ヒドロキシメチル]メチルメタクリルアミド）である請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は血清アルブミン製剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
血清アルブミンは血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してその運搬などの機能を果たしている。上記血清アルブミンを含有する製剤は、アルブミンの喪失及びアルブミン合成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。アルブミン製剤は、そこに混入してくる懸念のあるウイルスを不活化するために、通常、アルブミン含有水溶液の状態での加熱処理が汎用されている。
【０００３】
このような方法により製造される市販のアルブミン製剤をゲル濾過分析法で分析すると、該製剤中にはアルブミンの凝集体が存在することが知られている。この凝集体（通常、ポリマーと称されるので、以下、ポリマーという）は上記の加熱処理前には殆ど存在しないことから、加熱処理により熱に不安定な夾雑蛋白質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられる。市販のアルブミン製剤は安全に広く使用されていることから、このポリマーが特に人体に害を及ぼすとは考えられていないが、加熱変性物であることより、製剤中にできるだけ含有しないことが好ましい。
【０００４】
また、アルブミン中にはトランスフェリンなどのようにアルブミンと物理化学的性質のよく似た夾雑蛋白質が含まれており、分画法等の慣用の手段では効率的に分離することが困難であり、アルブミン製剤中に夾雑蛋白質が残存するという問題がある。
【０００５】
これまでに、血清アルブミン製剤を調製する際にイオン交換体を用いた各種の精製方法が確立されている。すなわち、陰イオン交換体処理をｐＨ４．５〜４．９の条件下で行った後、陽イオン交換体をｐＨ５．２〜６．５で行う工程からなる方法（特開昭５２−４７９１５号公報）、親水性の陰イオン交換体による処理、疎水性の陰イオン交換体による処理及び親水性の陽イオン交換体による処理の３段階法からなる方法（特開昭６０−２３３２０号公報）、血清アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体処理した後、陽イオン交換体処理し、次いで加熱処理する工程からなる方法（特開平４−２３４３２６号公報）等が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、さらに精製手段を改良することにより、アルブミンを高度に精製し、かつトランスフェリン等の夾雑蛋白質含量をさらに低減させ得ると共に加熱処理してもポリマーが実質的に検出されない血清アルブミン製剤の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは種々検討を重ねた結果、陽イオン交換体処理工程でポリアクリルアミド系担体の陽イオン交換体を使用することにより、上記課題が解決されることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、血清アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体処理した後、陽イオン交換体処理し、次いで加熱処理する工程からなる血清アルブミン製剤の製造方法であって、陽イオン交換体が陽イオン交換基を有するポリアクリルアミド系担体であることを特徴とする血清アルブミン製剤の製造方法である。
【０００９】
本発明の製造方法の出発原料である血清アルブミンの由来には特に制限がなく、具体的には哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウサギ等に由来するものが挙げられ、特にヒト由来のものが使用される。血清アルブミン製剤を調製するための出発原料としては、例えば、コーンの冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分等が例示される。
【００１０】
本発明の方法において、血清アルブミン製剤は、上記の血清アルブミンを適当な精製水に溶解した血清アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体処理した後、陽イオン交換体処理し、次いで加熱処理することにより得られる。上記の工程において、血清アルブミン含有水溶液中のアルブミン含量としては、通常、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ、特に明示のない限り以下同様）程度、好ましくは約１〜１０％に調整される。
【００１１】
本発明の方法においては、まず、アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体処理に付して精製する。この陰イオン交換体処理により、ハプトグロビン、α1 −酸性糖蛋白質などのアルブミンより等電点の低い夾雑蛋白質が除去され精製される。陰イオン交換体としては、陰イオン交換基を有する不溶性担体であればいずれも使用することができる。陰イオン交換基の例としては、ジエチルアミノエチル基（通称はＤＥＡＥ）、四級アンモニウム基、例えば、ジエチル［２−ヒドロキシプロピル］アミノエチル基（通称はＱＡＥ）、（ＣＨ3 ) 3 Ｎ+ ＣＨ2 −（通称はＱ）、四級メチルアンモニウム基（ＱＭＡ）等が挙げられる。不溶性担体の例としては、デキストラン（商品名、セファデックス、ファルマシア社製）、アガロース（商品名、セファロース、ファルマシア社製）、ビニル系親水性ポリマー（商品名、トヨパール、東ソー社製）、セルロース（商品名、セルロファイン、生化学工業社製）、多孔性シリカゲル（商品名、セファロシル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）等が挙げられる。より具体的には、この分野で慣用の陰イオン交換体、例えば、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース（商品名、いずれもファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−トヨパール、ＱＡＥ−トヨパール（商品名、いずれも東ソー社製）、Ａ２００セルロファイン（商品名、生化学工業社製）、ＱＭＡ−セファロシル（商品名、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）、陰イオン交換樹脂等が例示され、夾雑蛋白質除去効率の点からしてＱ−セファロース、ＱＡＥ−トヨパール、ＱＭＡ−セファロシル等の強塩基性陰イオン交換体を用いるのが好ましい。
【００１２】
上記の陰イオン交換体を用いる処理は、アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体と接触させることにより行われ、陰イオン交換体の使用量はアルブミン含有水溶液中の夾雑蛋白質含量、陰イオン交換体の交換能等により適宜調整されるが、アルブミン１ｇ当たり、陰イオン交換体０．１〜５ｍｌ、通常３ｍｌ程度使用される。本方法はカラム法、バッチ法のいずれの方法にて行ってもよいが、夾雑蛋白質の除去効率の面からカラム法にて行うのが好ましい。
【００１３】
カラム法にて行う場合、前記のアルブミン含有水溶液をｐＨ３〜６程度、好ましくはｐＨ４．５〜５．５、より好ましくはｐＨ５．１〜５．４、塩濃度としては０．００１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム程度、好ましくは０．００１〜０．０５Ｍに調整し、緩衝液〔例えば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）〕で平衡化した陰イオン交換体カラムを通過させ、次いで同緩衝液で展開して非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制するため、低温（通常、１０℃以下）にて行うのが好ましい。また、バッチ法にて行う場合、上記条件に調整したアルブミン含有水溶液に、陰イオン交換体を添加して接触させ、１０℃以下にて、３０分〜２時間程度混和した後、遠心分離等の手段により陰イオン交換体と分離し、上清を回収することにより行われる。
【００１４】
上記の陰イオン交換体処理により精製されたアルブミン含有水溶液は、必要に応じて、ｐＨ調整、濃度調整等がされた後、陽イオン交換体処理に付してさらに精製する。この陽イオン交換体処理により、アルブミンよりも高ｐＨに等電点のあるトランスフェリンなどの夾雑蛋白質が除去されて精製される。陽イオン交換体としては、陽イオン交換基を有するポリアクリルアミド系担体であればいずれも使用することができる。陽イオン交換基としては、スルホ基、例えば、スルホプロピル基（通称はＳＰ）、カルボキシ基、例えば、カルボキシメチル基（通称はＣＭ）等が挙げられる。ポリアクリルアミド系担体は（メタ）アクリルアミドの重合体からなる不溶性担体であり、例えば、ポリ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルメタクリルアミド）（商品名、トリスアクリル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）等が挙げられる。夾雑蛋白質の除去効率の点から、スルホプロピル型のポリアクリルアミド（商品名、ＳＰ−トリスアクリル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）、カルボキシメチル型のポリアクリルアミド（商品名、ＣＭ−トリスアクリル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）等の陽イオン交換体を用いるのが好ましい。
【００１５】
上記の陽イオン交換体を用いる処理は、前記陰イオン交換体処理により精製されたアルブミン含有水溶液を陽イオン交換体と接触させることにより行われる。
陽イオン交換体の使用量はアルブミン含有水溶液中の夾雑蛋白質含量、陽イオン交換体の交換能等により適宜調整されるが、アルブミン１ｇ当たり、陽イオン交換体０．１〜５ｍｌ、通常２ｍｌ程度使用される。本方法はカラム法、バッチ法のいずれの方法にて行ってもよいが、夾雑蛋白質の除去効率の面からカラム法にて行うのが好ましい。
【００１６】
カラム法にて行う場合、前記のアルブミン含有水溶液をｐＨ４〜８程度、好ましくはｐＨ４．５〜６．５、より好ましくはｐＨ５．５〜６．０、塩濃度としては０．００１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム程度、好ましくは０．００１〜０．０５Ｍに調整し、緩衝液〔例えば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）〕で平衡化した陽イオン交換体カラムを通過させ、次いで同緩衝液で展開して非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制するため、低温（通常、１０℃以下）にて行うのが好ましい。また、バッチ法にて行う場合、上記条件に調整したアルブミン含有水溶液に、陽イオン交換体を添加して接触させ、１０℃以下にて、３０分〜２時間程度混和した後、遠心分離等の手段により陽イオン交換体と分離し、上清を回収することにより行われる。
【００１７】
かかる陰イオン交換体及び陽イオン交換体処理により精製されたアルブミン含有水溶液は夾雑蛋白質含量が著しく低く、トランスフェリン、ハプトグロビン及びα1 −酸性糖蛋白質含量は検出限界未満であり、実質的にこれらの夾雑蛋白質を含まないものである。
【００１８】
上記の陰イオン交換体処理及び陽イオン交換体処理により夾雑蛋白質含量が低減されたアルブミン含有水溶液は適当な濃度に調整し、例えば、バイアルに充填するなど所望の製剤形態に製剤化された後、加熱処理されて血清アルブミン製剤が得られる。上記の加熱処理は血清アルブミン製剤中に混入するおそれのあるウイルスを不活化するもので、アルブミン濃度５〜３０％程度、通常５又は２０〜２５％程度に調整した水溶液として行われ、加熱温度としては、夾雑ウイルスを不活化するのに十分な温度及び時間行えばよく、例えば、５０〜７０℃、好ましくは約６０℃で、５〜２０時間、好ましくは約１０時間行われる。なお、上記の加熱処理に際しては、必要に応じてアルブミンの安定化剤、例えばＮ−アセチルトリプトファンナトリウム、カプリル酸ナトリウム等を単独で又は混合して添加してもよい。これらアルブミンの安定化剤は、製剤中に含有されるアルブミン１ｇ当たり２０〜６０ｍｇ、好ましくは４０ｍｇ程度使用される。
【００１９】
かくして得られた血清アルブミン製剤は、ポリマーが実質的に含まれておらず（例えば、ゲル濾過分析法により測定した場合、アルブミンに対するポリマー含量が０．５重量％未満）、またトランスフェリンも実質的に含まれていない（例えば、一元免疫拡散法により測定した場合、アルブミンに対するトランスフェリン含量が０．００５６重量％未満）。なお、本発明の方法で得られた血清アルブミン製剤は、従来の血清アルブミン製剤と同様な用量、用法にて使用される。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
（ａ）血清アルブミン含有水溶液の調製
コーンの冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペースト（５００ｇ）を冷無菌蒸留水２．０リットルに溶解し、酢酸を用いてｐＨを４．６に調整した後、約１時間攪拌した。次いで、約−２℃にて濾過（フィルター：０．４５μｍ）し、さらに冷無菌蒸留水２．０リットルを加え、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５．１に調整し、血清アルブミン含有水溶液を得た。
（ｂ）陰イオン交換体処理
ＱＡＥ−トヨパール（５００ｍｌ）をカラム（直径８ｃｍ×長さ１５ｃｍ）に充填し、０．５Ｍ塩化ナトリウムで十分に洗浄した後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）で平衡化し、陰イオン交換体カラムを調製した。このカラムに上記（ａ）の血清アルブミン含有水溶液を通し、さらに冷０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１、２リットル）で洗浄した。通過液と洗浄液とを合わせ、１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨを５．５に調整した。
【００２２】
（ｃ）陽イオン交換体処理
ＣＭ−トリスアクリル（１００ｍｌ）をカラムに充填し、０．５Ｍ塩化ナトリウムで十分に洗浄した後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化し、陽イオン交換体カラムを調製した。このカラムに上記（ｂ）で得られた血清アルブミン含有水溶液を通し、さらに０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５、０．５リットル）で洗浄した。通過液と洗浄液とを合わせた後、ペリコンにて透析・濃縮し、Ａ280 ＝１６３（アルブミン濃度：２８％）となるように調製した。
【００２３】
（ｄ）加熱処理
上記（ｃ）で得られた血清アルブミン含有水溶液に、該水溶液１０ｍｌ当たり１．２ｍｌの安定化剤溶液（１００ｍｌ中、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム５．０１ｇ及びカプリル酸ナトリウム３．１０ｇ含有）を添加し、１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨを６．８５に調整してアルブミン濃度を２５％とし、除菌濾過した。所定量をバイアルに分注し、６０℃にて１０時間加熱処理して血清アルブミン製剤を得た。
【００２４】
比較例
実施例１において、（ｃ）の陽イオン交換体処理工程をＣＭ−トリスアクリルの代わりにＳＰ−トヨパールを用いて行う以外は、実施例１と実質的に同様にして血清アルブミン製剤を調製した。
【００２５】
(i) 血清アルブミン製剤中のポリマー含量の測定
実施例１及び比較例で得られた製剤中のポリマー含量をゲル濾過分析法により測定した。なお、ゲル濾過分析は下記の条件にて行った。
(a) サンプル：血清アルブミン製剤を、下記の緩衝液で５０倍に希釈し、濾過（フィルター：０．４５μｍ）した溶液を２０μｌ注入した。
(b) カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）を充填したカラム（直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ）を使用した。
(c) 緩衝液：０．１Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 ／０．３Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）
(d) 流速：１ｍｌ／分
(e) 検出波長：λ＝２８０ｎｍ
(f) 装置：ウォーターズＨＰＬＣシステム
測定の結果を表１に示す。本発明の方法により製造した血清アルブミン製剤は、従来法による比較例の製剤と比べて二量体含量及びポリマー含量がさらに低減されている。実施例製剤においてはポリマー含量が０．５重量％未満であり、ポリマー含量は極めて少なく、実質的に含まれていないことが明らかである。
【００２６】
(ii)血清アルブミン製剤中の夾雑蛋白質の測定
実施例１及び比較例で得られた製剤中のα1 −酸性糖蛋白質（α1 −ＡＧ）、ハプトグロビン（Ｈｐ）及びトランスフェリン（Ｔｆ）含量の測定を行った。その結果を表１に示す。なお、夾雑蛋白質の測定は、一元免疫拡散法（Mancini 法：Mancini G.ら、Immunochemistry,第２巻、第３号、第235-254 頁、1965年）により行った。この際、用いた抗α1 −酸性糖蛋白質血清、抗ハプトグロビン血清及び抗トランスフェリン血清は、ウサギを免疫動物として常法により調製したものである。これらの抗血清より作製した一元免疫拡散用ゲルを用い、それぞれに対応する夾雑蛋白質に対する沈降輪面積の標準曲線を作成した。この標準曲線によると、検出限界は、α1 −ＡＧで０．４ｍｇ／ｄｌ、Ｈｐで１．６ｍｇ／ｄｌ、Ｔｆで１．４ｍｇ／ｄｌである。下記表１に示されるように、本発明の方法で製造した血清アルブミン製剤はα1 −ＡＧ、Ｈｐ及びＴｆがいずれも検出限界未満であり、夾雑蛋白質含量は極めて少なく、実質的に含まれていないことが判明した。なお、上記のようにＴｆの検出限界は１．４ｍｇ／ｄｌであり、また実施例製剤のアルブミン含量は２５％であることから、実施例製剤中のＴｆ含量はアルブミンに対して０．００５６重量％未満であることが明らかになった。
【００２７】
【表１】
0003702474.tif 000002
【００２８】
実施例２
実施例１において、（ｃ）の陽イオン交換体処理工程をＣＭ−トリスアクリルの代わりにＳＰ−トリスアクリルを用いて行う以外は、実施例１と同様にして、血清アルブミン製剤を調製した。得られた血清アルブミン製剤について、実施例１と同様な方法でポリマー含量及び夾雑蛋白質含量を測定した。その結果、ポリマーのピークは検出されず実質的に含まれていないことが示され、またＨｐ、α1 −ＡＧ及びＴｆ含量も検出限界未満であり、実質的に含まれていないことが判明した。
【００２９】
実施例３
実施例１において、（ｂ）の陰イオン交換体処理工程をＱＡＥ−トヨパールの代わりにＱＭＡ−セファロシルを用いて行う以外は、実施例１と同様にして、血清アルブミン製剤を調製した。
【００３０】
参考例１
上記実施例１、実施例２及び比較例に示される血清アルブミン製剤の調製において、アルブミン回収率及び陽イオン交換体処理工程におけるトランスフェリン（Ｔｆ）吸着量は表２に示される通りであった。なお、アルブミン回収率は２８０ｎｍの吸光度により測定した。ポリアクリルアミド系担体の陽イオン交換体を用いる本発明の方法は、アルブミン回収率が高く、イオン交換体容量当たりのＴｆ吸着量が高い。本発明の方法は夾雑蛋白質除去効率に優れることが明らかである。
【００３１】
【表２】
0003702474.tif 000003
【００３２】
参考例２
上記実施例１、実施例３及び比較例で得られた血清アルブミン製剤について、ポリマー含量、アルブミン回収率、着色度、及びアルミニウム含量を測定した。
結果を表３に示す。表３に示すように、本発明の方法によれば、ポリマー含量がさらに低減され、着色度の低い高度に精製された血清アルブミン製剤が得られる。本発明の製造方法はアルブミン回収率が高く、精製効率に優れる。
【００３３】
【表３】
0003702474.tif 000004
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、陽イオン交換体処理工程においてポリアクリルアミド系担体の陽イオン交換体を使用することにより、従来法と比べてトランスフェリン等の夾雑蛋白質含量がさらに低減されると共に、夾雑蛋白質に起因するポリマーの生成が抑制され、高度に精製された血清アルブミン製剤が提供される。本発明の方法で製造された血清アルブミン製剤は、加熱処理によりウイルスが不活化されていると共にポリマー含量及び夾雑蛋白質含量が極めて少なく、安全性、安定性等に優れた製剤である。