(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８４Ｐ２Ａ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス発現ベクターであって、ここで該ポリヌクレオチドは：
配列番号２のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；又は
配列番号１に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る、ポリヌクレオチド
である、組換えウイルス発現ベクター。
【請求項２】
配列番号２に示されるポリペプチド配列をコードする、請求項１に記載の組換えウイルス発現ベクター。
【請求項３】
前記ウイルスベクターが、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する請求項１又は２に記載の組換えウイルス発現ベクター。
【請求項４】
前記ウイルスベクターが、カナリア痘ウイルスに由来する請求項３に記載の組換えウイルス発現ベクター。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスに由来する請求項３に記載の組換えウイルス発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年１月２６日に出願された米国仮特許出願番号６０／１７８，５６０の利益を主張し、この内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載された発明は、新規な遺伝子およびそのコードするタンパク質（８４Ｐ２Ａ９と称される）に関し、そして８４Ｐ２Ａ９を発現する種々の癌、特に前立腺癌の管理において有用な診断および治療の方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ガンは、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、第２の主なヒトの死亡原因である。全世界的に、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡原因であり、毎年１４０万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患での死亡は、有意に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加の傾向にある。来世紀の初期には、癌は死亡の主原因になると予測されている。
【０００４】
全世界で、いくつかの癌が主要な死亡原因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、主要な癌の死亡原因の代表である。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通する致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、初期の段階ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてすら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性を承知しているために駆り立てられる、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。さらに、多くの癌患者は、再発を経験している。
【０００５】
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も一般的な癌である。北部アメリカおよび北欧では、はるかに、最も一般的な男性の癌であり、そして男性における癌による死亡の２番目の主原因である。米国単独では、肺癌のみに次いで、４０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くに対して有効でなく、かつしばしば、所望されない結果を付随する。
【０００６】
診断現場において、初期ステージの局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、依然としてこの疾患の診断および管理における大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的利用性は、いくつかの重要な点が欠如していると広く考えられている。
【０００７】
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の異なるステージを再現し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける経過を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を模倣する能力を示した前立腺癌異種移植片である（非特許文献１）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（非特許文献２）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（非特許文献３、非特許文献４）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（非特許文献５）。
【０００８】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断し、そしてこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２
【非特許文献２】Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７２５２
【非特許文献３】Ｐｉｎｔｏら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｓｅｐ；２（９）：１４４５−５１
【非特許文献４】ＳＴＥＡＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９  Ｄｅｃ  ７；９６（２５）：１４５２３−８
【非特許文献５】Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１７３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定することにより、前立腺癌および関連する癌の診断および治療を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、新規の、広く前立腺および精巣に関連した、８４Ｐ２Ａ９と称する遺伝子に関する。この遺伝子は、前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸、リンパ球および肺の癌を含む複数の癌において過剰発現する。正常な組織における８４Ｐ２Ａ９遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成体の組織における前立腺および精巣に関連した高度な発現パターンを示す。正常な前立腺および前立腺腫瘍異種移植片における８４Ｐ２Ａ９発現の分析は、ＬＡＰＣ−４およびＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍異種移植片において過剰発現を示す（ＬＡＰＣ−９において最も高い発現）。８４Ｐ２Ａ９のヌクレオチド（配列番号１）配列およびアミノ酸（配列番号２）配列を、図２に示す。８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列の位置は、ｄｂＥＳＴデータベース中のＥＳＴにいくらかの相同性を示す。８４Ｐ２Ａ９の、正常な成体組織におけるこの前立腺および精巣関連の発現プロフィールは、前立腺腫瘍異種移植片において観察される過剰発現と共に、８４Ｐ２Ａ９が、少なくともいくつかの癌において異常に過剰発現し、従って、癌（例えば、前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸、リンパ球および肺の癌）のための有用な診断および／または治療の標的として作用することを示す（例えば、図４〜８を参照のこと）。
【００１１】
本発明は、８４Ｐ２Ａ９の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質および４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のアミノ酸のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子、８４Ｐ２Ａ９の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的かまたは少なくとも９０％の相同性を有する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに８４Ｐ２Ａ９の遺伝子、ｍＲＮＡもしくは８４Ｐ２Ａ９をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離された形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、または一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。８４Ｐ２Ａ９をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた、提供する。８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の発現のための、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換した細胞または形質導入した細胞、ならびに宿主ベクター系をまた、提供する。本発明はさらに、８４Ｐ２Ａ９タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全なヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体を含む）を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよび８４Ｐ２Ａ９タンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような増殖を調節できないいくつかの形態を有するかまたはこのような形態を有することが疑われる組織サンプルまたは血液学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物をモニターするための方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、前立腺癌のような８４Ｐ２Ａ９を発現する癌を処置するための種々の免疫原性組成物または治療組成物およびストラテジーを提供する。これらの組成物およびストラテジーとしては、８４Ｐ２Ａ９の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療、ならびに癌ワクチンが挙げられる。
【００１４】
本発明はさらに、以下を提供する。
（項目１）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、このポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）図２に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｂ）ヌクレオチド残基番号１６５からヌクレオチド残基番号１６７６の、図２に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｃ）８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、その配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号ＰＴＡ−１１５１として寄託されたｐ１２９．１−ＵＳ−Ｐ１と命名されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（ｄ）８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、この８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質が、その全長にわたって図２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的である、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
（項目２）  図２に示されるポリペプチド配列をコードする、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）  項目１に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、以下：
（ａ）ヌクレオチド残基番号７２０からヌクレオチド残基番号１３９２の、図２に示される配列を有する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも１０ヌクレオチド塩基長の（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントである、ポリヌクレオチド；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド
を含む、フラグメント。
（項目４）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、そのポリペプチドが、ＫＫＲＫ、ＮＱＴＮ、ＮＣＳＶ、ＴＮＫ，ＳＲＲ、ＳＳＫ、ＳＶＲ、ＧＬＦＴＮＤ、ＧＧＡＣＧＩ、ＧＧＴＰＴＳ、ＧＴＰＴＳＭおよびＧＳＬＣＴＧからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目５）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、そのポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩ  Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ５８、Ｂ６２スーパーモチーフ、ＨＬＡクラスＩＩ  Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＤＲスーパーモチーフまたはＡｌｅｘａｎｄｅｒ汎ＤＲ結合エピトープスーパーモチーフあるいはＨＬＡ  ＤＲ３モチーフを含む、ポリヌクレオチド。
（項目６）  検出可能なマーカーで標識されている、項目１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７）  項目１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
（項目８）  項目７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目９）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を産生するためのプロセスであって、このポリペプチドの産生に十分な条件下で、項目８に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
（項目１０）  産生された上記８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を回収する工程をさらに包含する、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）  項目１０に記載のプロセスによって産生された、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質。
（項目１２）  単離された８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質。
（項目１３）  配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、項目１２に記載の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質。
（項目１４）  単離された８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質であって、以下：
（ａ）図２に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｂ）ヌクレオチド残基番号１６５からヌクレオチド残基番号１６７６の、図２に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る、ポリヌクレオチド；
（ｃ）８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、その配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号ＰＴＡ−１１５１として寄託されたｐ１２９．１−ＵＳ−Ｐ１と命名されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、ポリヌクレオチド；
（ｄ）図２に示されるアミノ酸配列を有する８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的である、ポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に正確なアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（項目１５）  項目１４に記載の単離された８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質であって、以下：
（ａ）ヌクレオチド残基番号７２０からヌクレオチド残基番号１３９２の、図２に示される配列を有する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも１０ヌクレオチド塩基長の（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントである、ポリヌクレオチド；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される、タンパク質。
（項目１６）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に免疫特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目１７）  モノクローナルである、項目１６に記載の抗体またはそのフラグメント。
（項目１８）  項目１７に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む、組換えタンパク質。
（項目１９）  検出可能なマーカーで標識されている、項目１７に記載の抗体またはそのフラグメント。
（項目２０）  検出可能なマーカーで標識されている、項目１８に記載の組換えタンパク質。
（項目２１）  Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｆｖフラグメントである、項目１６に記載の抗体フラグメント。
（項目２２）  ヒト抗体である、項目１６に記載の抗体。
（項目２３）  マウス抗原結合領域残基およびヒト定常領域残基を含む、項目２０に記載の組換えタンパク質。
（項目２４）  項目２０に記載のモノクローナル抗体を産生する、非ヒトトランスジェニック動物。
（項目２５）  項目２２に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
（項目２６）  項目１７に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。
（項目２７）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２８）  生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、それぞれ、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドに特異的に結合する、それぞれ、抗体またはポリヌクレオチドを、このサンプルに接触させる工程、およびそれらに対するこのサンプル中の、それぞれ、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドの結合を検出する工程を包含する、アッセイ。
（項目２９）  ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、サンプルを得る工程、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドの存在下でこのサンプルを評価する工程を包含し、それによって、この評価手段が、それぞれ、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはポリヌクレオチドの存在または量を示す結果を生じる、アッセイ。
（項目３０）  生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの存在を検出するための項目２９に記載のアッセイであって、以下：
（ａ）図２に示されるアミノ酸配列を有する８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを、このサンプルに接触させる工程；および
（ｂ）このサンプル中での８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドとのこのプローブのハイブリダイゼーションによって形成されたハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程
を包含し、このハイブリダイゼーション複合体の存在は、このサンプル中の８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの存在を示す、アッセイ。
（項目３１）  生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの存在を検出するためのアッセイであって、以下：
（ａ）少なくとも１つのプライマーを使用する逆転写によって、このサンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
（ｂ）そのように生成されたｃＤＮＡを、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅し、その中の８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを増幅する工程；
（ｃ）この増幅された８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡの存在を検出する工程
を包含し、ここで、センスプローブおよびアンチセンスプローブとして使用したこの８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号ＰＴＡ−１１５１として寄託されたプラスミドに含まれる８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを増幅し得る、アッセイ。
（項目３２）  ８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物をモニターするための項目３１に記載の方法であって、以下：
個体由来の試験組織サンプル中の細胞によって発現される８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態を決定する工程；
そのように決定された状態を、対応する正常サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態と比較する工程；および
この正常サンプルと比較したこの試験サンプル中の異常な８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の存在を同定する工程
を包含する、方法。
（項目３３）  項目３２に記載の方法であって、上記８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物は、上記試験組織サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物のポリヌクレオチド配列を、対応する正常サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物のポリヌクレオチド配列と比較することによってモニターされる、方法。
（項目３４）  項目３２に記載の方法であって、上記８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物は、上記試験組織サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物のレベルを、対応する正常サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物のレベルと比較することによってモニターされる、方法。
（項目３５）  個体における癌の存在を診断するためのキットであって、以下：
（ａ）この個体から得た試験サンプル中で発現された８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定するための手段；および
（ｂ）そのように決定されたこのレベルを、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現される８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較するための指示書
を含み、これによって、この正常組織サンプルと比較したこの試験サンプル中での上昇された８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、癌の存在の指標を提供する、キット。
（項目３６）  項目３５に記載のキットであって、上記癌は、白血病、ならびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸および肺の癌からなる群より選択され、そして上記試験組織サンプルおよび正常組織サンプルが、血清、血液または尿、ならびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸および肺の組織からなる群より選択される、キット。
（項目３７）  ８４Ｐ２Ａ９を発現する癌を有する患者を処置するための組成物の調製のための、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはその免疫学的部分、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、８４Ｐ２Ａ９コード配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、または８４Ｐ２Ａ９コード配列を有するポリヌクレオチドを切断し得るリボザイムの使用。
（項目３８）  項目３７に記載の使用であって、上記癌が、白血病、ならびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸、リンパ球および肺の癌からなる群より選択される、使用。
（項目３９）  薬学的組成物であって、この組成物は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド、８４Ｐ２Ａ９コード配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドまたは８４Ｐ２Ａ９コード配列を有するポリヌクレオチドを切断し得るリボザイム、および必要に応じて、生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目４０）  ８４Ｐ２Ａ９を発現する癌を有する患者を処置するための薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、その結果、このベクターが、この単鎖モノクローナル抗体コード配列をこの癌細胞に送達し、そしてこのコードされる単鎖抗体が、その中で細胞内発現される、薬学的組成物。
（項目４１）  ８４Ｐ２Ａ９を発現する癌の処置のためのワクチン組成物であって、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の免疫学的部分および生理学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
（項目４２）  患者における８４Ｐ２Ａ９を発現する癌の発生（発達）を阻害するための、項目４１に記載のワクチン組成物。
（項目４３）  哺乳動物において免疫応答を生じるためのキットであって、項目４１に記載の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の免疫学的部分、およびこの哺乳動物の免疫系にこの８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の免疫学的部分を曝露するための手段を含み、その結果、免疫応答が、８４Ｐ２Ａ９に対して生成される、キット。
（項目４４）  ８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞に対して細胞傷害剤を送達する方法であって、この細胞傷害剤を、８４Ｐ２Ａ９エピトープに特異的に結合する項目１６に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化する工程、およびこの抗体−薬剤結合体にこの細胞を曝露する工程を包含する、方法。
（項目４５）  ８４Ｐ２Ａ９タンパク質に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、このキットは、以下：
８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質エピトープ；
このエピトープと、免疫系Ｔ細胞またはＢ細胞とを接触させるための手段であって、それによって、この免疫系Ｔ細胞またはＢ細胞が誘導される、手段
を含む、キット。
（項目４６）  項目４５に記載のキットであって、上記免疫系細胞が、Ｂ細胞であり、それによって、誘導されたＢ細胞が、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、キット。
（項目４７）  項目４５に記載のキットであって、上記免疫系細胞が、Ｔ細胞であって、このＴ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であり、それによって、活性化されたＣＴＬが、上記８４Ｐ２Ａ９タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、キット。
（項目４８）  項目４５に記載のキットであって、上記免疫系細胞が、Ｔ細胞であって、このＴ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であり、それによって、活性化されたこのＨＴＬが、ＣＴＬの細胞傷害活性またはＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する、キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、前立腺癌の診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的として８４Ｐ２Ａ９を同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
他に規定しない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語、表記、および他の科学技術用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび／または迅速な参照のために本明細書中で定義され、そしてこのような定義の本明細書中への包含は、当該分野において一般に理解されるものを制して実質的な相違を表すとは必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載または参照される技術および手順の多くは、一般に、従来の方法論（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載の広く使用される分子クローニングの方法論のような）を使用して、当業者によって十分に理解され、そして一般的に用いられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、他に注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコルおよび／またはパラメーターに従って実行される。
【００１７】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」および「局所的に進行した疾患」とは、前立腺被膜を通して伸長した前立腺癌を意味し、そして米国泌尿器学会（ＡＵＡ）システムの下でのステージＣ疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステムの下でのステージＣ１−Ｃ２疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）システムの下でのステージＴ３−Ｔ４およびＮ＋疾患を含むことが意味される。一般に、手術は、局所的に進行した疾患を有する患者のためには推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化している（器官に限定された）前立腺癌を有する患者と比較して、実質的により好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超える硬化の触診可能な証拠、または前立腺基部上の不均衡もしくは硬化によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺被膜に侵入するかもしくは浸透するか、外科的な境界まで伸長するか、または精嚢に侵入する場合、現在、徹底的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００１８】
用語「抗体」は、広い意味で使用される。従って、「抗体」は、天然に存在し得るか、または慣用的なハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のような人工物であり得る。抗８４Ｐ２Ａ９抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１以上の相補性決定領域を含むフラグメントを含む。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域（すなわち、抗原結合領域）の少なくとも一部として定義される。１つの実施形態において、特に、単一の抗８４Ｐ２Ａ９抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）、およびポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗８４Ｐ２Ａ９抗体組成物を含む。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、この集団を含む抗体は、少量で存在する天然に存在する潜在的な変異を除いて、同一である）から得られた抗体をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するかまたは妨げ、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法試薬、および毒素（例えば、低分子の毒素、あるいはフラグメントおよび／またはその改変体を含む細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素）を含むことが意図される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの文脈において使用される、用語「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば、５０％  ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーションをいうことが意味される。ここで、ハイブリダイゼーションのための温度は、３７℃より高い温度であり、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での洗浄のための温度は、５５℃より高い。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、８４Ｐ２Ａ９遺伝子以外の遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入物ポリヌクレオチド、あるいは８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入物ポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを獲得し得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、物理的方法、機械的方法または化学的方法を使用して、８４Ｐ２Ａ９タンパク質に通常関連する細胞成分からこの８４Ｐ２Ａ９タンパク質を取り出した場合に、タンパク質が「単離された」といわれる。当業者は、標準的な精製方法を使用して、単離された８４Ｐ２Ａ９タンパク質を容易に獲得し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「哺乳動物」は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物をいう。本発明の１つの好ましい実施形態において、この哺乳動物は、マウスである。本発明の別の好ましい実施形態において、この哺乳動物は、ヒトである。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患」は、局所的なリンパ節、または離れた部位に拡がった前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステム下でのステージＤ疾患、およびＴＮＭシステム下でのステージＴｘＮｘＭ＋を包含することが意味される。局所的に進行した前立腺癌の場合、手術は一般的には転移性疾患を有する患者には指示されず、そしてホルモン（アンドロゲン除去）治療が好ましい治療様式である。転移性前立腺癌を有する患者は、最終的に、処置の開始から１２〜１８ヶ月以内にアンドロゲン抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者のおよそ半数がアンドロゲン抵抗性状態の発症の後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移についての最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、しばしば特徴的に、溶骨性ではなく骨芽細胞性である（すなわち、正味の骨の形成を生じる）。骨への転移は、脊椎において最も頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋、および上腕骨が続く。転移のための他の一般的な部位としては、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、切開または腹腔鏡的な骨盤（ｐｃｌｖｉｃ）のリンパ節切除術、全身の放射性核種スキャン、骨格のラジオグラフィー、および／あるいは骨病変生検によって診断される。
【００２５】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載され、同定されるが記載されたものに限定されず、そして洗浄溶液および上記の条件よりも低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下である：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％  硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における３７℃での一晩のインキュベーションであり、次いで約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄である。当業者は、プローブ長などのような因子を適応させるのに必要なように温度、イオン強度などを調整する方法を認識する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の生物学的モチーフにおけるような「モチーフ」は、特定の機能または改変（例えば、リン酸化されるか、グリコシル化されるか、またはアミド化される）に関連する、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のセット（これは連続的であるか、または一般的に不変または保存された特定の位置に配置され得る）を言う。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基または１０塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。本明細書中で議論される場合、ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチミン（Ｔ）（例えば、配列番号１に示されるような）はまたウラシル（Ｕ）であり得る。この説明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的構造間の違い、特に４つの主な塩基のうち１つがＲＮＡでは、チミンの代わりにウラシルであるという知見に関連する。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。当該分野において、この用語は、しばしば「ペプチド」と相互に使用される。
【００２９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験による計算である。一般に、長いプローブほど、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、短いプローブほど、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、融解温度より下の環境において相補鎖が存在する場合の、変性した核酸配列が再アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間の所望される相同性の程度が高いほど、使用され得る相対的な温度が高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度ではそのようなことがより少ない、ということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅrｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００３０】
本明細書中に規定されるように、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件によって同定され得るが、これらに限定されない：（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度を使用する条件（例えば、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用する条件（例えば、５０％  （ｖ／ｖ）ホルムアミドおよび０．１％  ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）および７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、４２℃）；または（３）５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％  硫酸デキストラン、４２℃、さらに以下の洗浄工程、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド、５５℃、続いて、高ストリンジェンシー洗浄（ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、５５℃）を使用する条件。
【００３１】
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前（例えば、胚段階）でその動物の祖先に導入される。「導入遺伝子」は、細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡであり、トランスジェニック動物は、その細胞から発生する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、８４Ｐ２Ａ９遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載される８４Ｐ２Ａ９遺伝子およびタンパク質、ならびに他の８４Ｐ２Ａ９にコードされたタンパク質またはペプチドに対応する遺伝子およびタンパク質、および前述の構造的に類似の改変体を含むことが意味される。このような他の８４Ｐ２Ａ９ペプチドおよび改変体は、一般的に、８４Ｐ２Ａ９コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸相同性（ＢＬＡＳＴ基準を使用して）、そして好ましくは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の核酸相同性、そして少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ基準を使用して）、より好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ基準を使用して）。
【００３３】
本発明の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質は、本明細書中で詳細に同定された８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質、ならびに対立遺伝子、保存的置換改変体およびホモログを含み、これらは、本明細書中で概略される方法または当該分野において容易に利用可能な方法に従う過度の実験なしに単離／生成および特徴付けされ得る。異なる８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそれらのフラグメントの一部を合わせる融合タンパク質、ならびに８４Ｐ２Ａ９タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このような８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、まとめて８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質、本発明のタンパク質、または８４Ｐ２Ａ９として言われる。本明細書中で使用される場合、用語「８４Ｐ２Ａ９関連ポリペプチド」は、ポリペプチドフラグメントまたは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸の８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列を言う。
【００３４】
（８４Ｐ２Ａ９の構造および発現）
以下に詳細に議論されるように、雄ＳＣＩＤマウスにおいてＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片を用いる実験は、アンドロゲン依存性（ＡＤ）前立腺癌からアンドロゲン非依存性（ＡＩ）癌への進行に関連する遺伝子の同定をもたらした。簡単には、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片を有するマウスを、腫瘍の大きさが直径１ｃｍに達した時に去勢した。腫瘍の大きさが退行し、そして一時的にアンドロゲン依存性タンパク質ＰＳＡ産生が停止した。去勢後７〜１５日で、ＰＳＡレベルは、マウス血中において再び検出可能であった。最終的に、このような腫瘍は、ＡＩ表現型を発現し、そして去勢マウスにおいて再び増殖を開始する。去勢後、異なる時点で腫瘍を収集し、アンドロゲン非依存性への移行の間に開始および停止される遺伝子を同定した。
【００３５】
次に抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９６、ＰＮＡＳ  ９３：６０２５）を使用して、種々のアンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ異種移植片由来のｃＤＮＡを比較することによって新規な遺伝子（例えば、前立腺癌において過剰発現される遺伝子）を同定した。このストラテジーは、組織および癌特異的発現を示す新規な遺伝子の同定をもたらした。これらの遺伝子の１つ（８４Ｐ２Ａ９と称される）が、去勢３日後のＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍に由来するｃＤＮＡを、インタクトな雄で増殖したＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍に由来するｃＤＮＡから差し引いた、差し引き（サブトラクション）から同定された。約４２５ｐｂのＳＳＨ  ＤＮＡ配列（図１）は、新規であり、そしてｄｂＥＳＴデータベースにおける発現配列タグ（ＥＳＴ）にのみ相同性を示す。
【００３６】
８４Ｐ２Ａ９は、前立腺および精巣に関連した発現を示す推定核タンパク質をコードする。８４Ｐ２Ａ９の最初の特徴付けは、それが前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳の癌、骨の癌、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ球の癌および肺癌を含む複数の癌において異常に発現されることを示す。前立腺癌における８４Ｐ２Ａ９の発現は、このタンパク質が、腫瘍進行において機能的な役割を有する証拠を提供する。転写因子としての８４Ｐ２Ａ９機能が、腫瘍形成に関連する遺伝子の活性化または腫瘍形成をブロックする遺伝子の抑制に関連する可能性がある。
【００３７】
以下の実施例でさらに記載されるように、８４Ｐ２Ａ９遺伝子およびタンパク質は、多くの分析的アプローチを使用して特徴付されている。例えば、ヌクレオチドコードおよびアミノ酸配列の分析を、潜在的に関連する分子、および認識可能な構造ドメイン、位相的特徴、ならびに８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡおよびタンパク質構造内の他のエレメントを同定するために行った。８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ発現のノザンブロッド分析を、８４Ｐ２Ａ９メッセージを発現する正常組織および癌性組織の範囲を確立するために行った。
【００３８】
２３４５塩基対の全長８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡクローン（クローン１）（配列番号１）を、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からクローン化した（図２）。このｃＤＮＡは、５０４アミノ酸（配列番号２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。配列分析は、６つの潜在的な核局在化シグナルの存在を明らかにし、そしてＰＳＯＲＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ：８８００／ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を使用して核にあることが予想された。このタンパク質配列は、ヒト脳タンパク質ＫＩＡＡ１１５２（配列番号５）と幾分の相同性（３３７アミノ酸領域にわたって３９．５％の同一性）を有し、ＬＵＣＡ１５腫瘍サプレッサータンパク質（配列番号６）に相同であるドメインを含む（４２アミノ酸領域にわたって６４．３％の同一性）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ５２７５６）（図３）。
【００３９】
８４Ｐ２Ａ９発現は、正常成体ヒト組織において前立腺および精巣に関連するが、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳の癌、骨の癌、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ球の癌および肺癌を含む特定の癌においても発現される（例えば、図４〜８を参照のこと）。ヒト前立腺腫瘍の異種移植片は、高レベルの８４Ｐ２Ａ９を発現する重度の転移性前立腺癌を有する患者に元々由来した（図４）。
【００４０】
本明細書中に開示されるように、８４Ｐ２Ａ９は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）および抗ポリペプチド抗体が、例えば、癌（特に前立腺癌）における調節されない細胞増殖に関連する状態の試験に関連する周知の診断的アッセイに使用される、遺伝子のファミリーに見出される特性と類似である特定の特性を示す（例えば、実施例３に例として記載されるような、その非常に特異的な組織発現パターンおよび前立腺癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと）。このクラスの最も知られたメンバーは、ＰＳＡ（何年もの間前立腺癌の存在を同定およびモニターするために医者によって使用されてきた典型的なマーカー）である（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３〜５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３〜３０６（１９９９）およびＦｏｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５〜１６４０（１９９９）を参照のこと）。ｐ５３およびＫ−ｒａｓを含む種々の他の診断マーカーもまた、この状況において使用される（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｊｕｌ；４（１）：９９〜１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ  ２０００；２４（１）：１〜１２）。従って、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびにこれらの分子の存在を同定する使用される８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドプローブおよび抗８４Ｐ２Ａ９抗体を）およびこれらの特性のこの開示は、当業者が、例えば、癌に関連した状態の検査に関連した種々の診断的アッセイにおいて使用される方法と類似である方法においてこれらの分子を使用することを可能にする。
【００４１】
本明細書中に記載された８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する診断方法の代表的な実施形態は、ＰＳＡポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来のこれらの方法と類似する。例えば、ＰＳＡ過剰発現および前立腺癌の転移をモニターする方法においてＰＳＡ  ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するためにＰＳＡヌクレオチドを、プローブ（例えば、ノザン分析において（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）：５６７〜７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマー（例えば、ＰＣＲ分析において（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９〜１１９０（２０００）を参照のこと））として使用されるように、本明細書中に記載された８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドは、８４Ｐ２Ａ９の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺および他の癌の転移を検出するために同様に使用され得る。あるいは、ＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、次にこの抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５５（４）：５６０〜３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３〜７（１９９６）を参照のこと）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはレベルを観察するために使用し得るように、本明細書中で記載された８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドは、８４Ｐ２Ａ９過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌の細胞の転移の検出に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
【００４２】
具体的に、転移は、元々の器官（例えば、精巣または前立腺など）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動に関係するので、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、８４Ｐ２Ａ９発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９（それぞれ、リンパ節および骨転移から単離された異種移植片）に見られる８４Ｐ２Ａ９発現のような８４Ｐ２Ａ９発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は、転移を示す。
【００４３】
あるいは、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、例えば、通常８４Ｐ２Ａ９を発現しないかまたは異なるレベルで８４Ｐ２Ａ９を発現する生物学的サンプル中の細胞が、８４Ｐ２Ａ９を発現するかまたは８４Ｐ２Ａ９の増加した発現を有することが見出された場合に、癌の証拠を提供するために使用され得る（例えば、図４〜１０に示される、腎臓、肺および結腸癌の細胞ならびに患者サンプルなどにおける８４Ｐ２Ａ９の発現を参照のこと）。このようなアッセイにおいて、当業者は、生物学的サンプルを、第二の組織制限マーカー（８４Ｐ２Ａ９に加えて）（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなど）の存在について試験することによって転移の補足的な証拠を生成することをさらに望み得る（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）。
【００４４】
ＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレオチド改変体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって使用されるように、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレチド改変体が、類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ  ｃＤＮＡ配列のフラグメントからなるプローブまたはプライマーである。これを例示すると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように全ＰＳＡ配列未満を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は、一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔｏｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が実施例３に提供され、ここで、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドフラグメントが、癌細胞における８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの過剰発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、医療従事者によるそれらの使用を容易にするために、改変体ポリヌクレオチド配列は、代表的に、ＰＣＲおよびノーザン分析における対応するｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら，Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  ２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら，編，１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、代表的に、それらが、高いストレンジェンシーの条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に示される８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド）に結合し得る共通の性質および特徴を有する限り、この状況において有用である。
【００４５】
ＰＳＡポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体が、ＰＳＡ分子をモニターする方法における使用のために当業者によって使用されるように、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体が、類似の様式で使用され得る。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリペプチドは、ＰＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって認識され得る抗体エピトープを含むＰＳＡタンパク質のフラグメントである。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体またはＴ細胞）を生成するこの実施は、代表的に、当業者によって使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野にある（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら，編，１９９５を参照のこと）。この状況において、目的のタンパク質の各エピトープは、抗体またはＴ細胞が反応性である構造を提供するように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な抗体を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを一般に生成する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で利用可能な８４Ｐ２Ａ９生物学的モチーフの１つを含むポリペプチドを利用することが、好ましくあり得る。ポリペプチドフラグメントおよび改変体またはアナログは、代表的に、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、配列番号２に示される８４Ｐ２Ａ９ポリペプチド）に特異的な抗体またはＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限り、この状況において有用である。
【００４６】
本明細書中に示されるように、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドプローブおよび抗８４Ｐ２Ａ９抗体またはＴ細胞）は、それらを前立腺の癌を診断する際に有用にする特定の特性を示す。前立腺癌のような、本明細書中に記載の特定の疾患状態を存在または発症を評価するために、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、予防的基準についての患者の同定またはさらなるモニタリングのために有用であり、このことは、ＰＳＡを用いて首尾良くなされている。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断が、ＰＳＡのみの試験に基づいてなされ得ない状況における、ＰＳＡに対して類似または相補的特性を有する分子についての当該分野での必要性を満足する（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６））。その結果、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドプローブおよび抗８４Ｐ２Ａ９抗体）は、前立腺起源の転移を確認するために使用される。
【００４７】
最後に、診断アッセイにおける使用に加えて、本明細書中に開示される８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドは、１ｑ３２．３におけるオンコジーン関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の特異的な有用性を有する。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される８４Ｐ２Ａ６関連タンパク質およびポリヌクレオチドは、未知の起源の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のようなタンパク質の利用性を有する（Ｔａｋｅｈａｍａ  Ｋ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ  １９９６  Ｊｕｎ  ２８；８０（１−２）：６３−９）。
【００４８】
（８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド）
本発明の一つの局面は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的な、ポリヌクレオチド（好ましくは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、８４Ｐ２Ａ９遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに８４Ｐ２Ａ９遺伝子、ｍＲＮＡもしくは８４Ｐ２Ａ９をコードするポリヌクレオチド（集合的に、「８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）を提供する。
【００４９】
８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの一つの実施形態は、配列番号１に示される配列を有する８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドである。８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるようなヒト８４Ｐ２Ａ９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る）；８４Ｐ２Ａ９タンパク質のすべてまたは一部分をコードするポリヌクレオチド；前述のポリヌクレオチドに相補的な配列；あるいは前述のうちのいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、配列番号１に示されるような、ヌクレオチド残基番号１６３〜ヌクレオチド残基番号１６７４の配列を有するか、または残基番号７１８〜残基番号１３９０の配列を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る。別の実施形態は、その配列が、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、登録番号ＰＴＡ−１１５１として寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に示されるヒト８４Ｐ２Ａ９ｃＤＮＡまたはそのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
【００５０】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ配列（およびこのような配列に相補的な配列）の特定の一部分をコードする８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上連続するアミノ酸のタンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：図２（配列番号２）に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸位置１〜およそアミノ酸位置１０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸１０〜およそアミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸２０〜およそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸３０〜およそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸４０〜およそアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸５０〜およそアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸６０〜およそアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸７０〜およそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸８０〜およそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸９０〜およそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームに従って、８４Ｐ２Ａ９タンパク質のアミノ酸１００〜５０４のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０個の核酸の）は、本発明の代表的な実施形態である。
【００５１】
８４Ｐ２Ａ９タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜およそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野に周知の種々の技術によって生成され得る。このようなポリヌクレオチドの例示の実施形態は、図２に示されるような配列を有するヌクレオチド残基番号７１８からヌクレオチド残基番号１３９０のポリヌクレオチドからなる。
【００５２】
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードする８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドフラグメントを含む。一つの実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で開示される１つ以上の核局在化配列をコードし得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、ＬＵＣＡ  １５および／またはＫＩＡＡ１１５２および／またはＮＹ−Ｌｕ−１２肺癌抗原（ＡＦ  ０４２８５７）に対する相同性を示す、８４Ｐ２Ａ９の１つ以上の領域（これらは、ジンクフィンガーモチーフおよびＲＮＡ結合モチーフを示す）をコードし得る（例えば、Ｇｅｒｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（５）：１０３４−１０４１を参照のこと）。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中の８４Ｐ２Ａ９タンパク質およびポリペプチドを議論する主題において、より詳細に開示されるような、以下の１つ以上をコードし得る：８４Ｐ２Ａ９  Ｎグリコシル化部位、ｃＡＭＰおよびｃＣＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位またはＮ−ミリストイル化部位およびアミド化部位。本発明のなお別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上の８４Ｐ２Ａ９選択的スプライシング改変体（例えば、図４に示されるような前立腺癌において過剰発現される４．５ｋＢ転写物を生成するスプライス改変体）に独特である配列をコードし得る。
【００５３】
前記の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の用途を有する。例えば、染色体１ｑ３２．３に対するヒト８４Ｐ２Ａ９遺伝子マッピングによって、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドを用いて、染色体１バンドｑ３２（種々の癌と関連して同定される）上の細胞発生異常が特徴づけされ得る。詳細には、１ｑ３２における種々の染色体異常（転座および欠失を含む）が、多数の異なる癌における頻繁な細胞発生異常として同定された（例えば、Ｂｉｅｃｈｅら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍａｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２４（３）：２５５〜２６３（１９９９）；Ｇｏｒｕｎｏｖａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２６（４）：３１２〜３２１（１９９９）；Ｒｅｉｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２２）：５４１５〜５４２３（１９９５）を参照のこと）。従って、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、新しいツールを提供し、このツールを用いて、以前に可能であったよりも正確に、染色体１のこの領域における細胞発生異常の特異的性質（悪性の表現型に寄与し得る）を描写し得る。この文脈では、これらのポリヌクレオチドは、よりわずかでかつ共通性が少ない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感度の増大に関して当該分野における必要性を満足する（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７１（４）：１０５５〜１０５７（１９９４）を参照のこと）。
【００５４】
あるいは、８４Ｐ２Ａ９は、前立腺癌において高度に発現されることが示されるので（図４）、これらのポリヌクレオチドは、癌性組織に対する正常な組織における８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを使用して、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の特定の領域（核局在化シグナルを含むような領域）において、混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異、または変異（抗原の消失を生じる）など）の存在を評価し得る。例示的なアッセイとしては、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられ、これらの両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれらの領域を試験する。
【００５５】
本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された核酸に関連する実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、あるいは他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または塩基対依存様式でＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的に結合する非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、本明細書中で開示される８４Ｐ２Ａ９のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
【００５６】
アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を必然的に伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、８４Ｐ２Ａ９）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明の８４Ｐ２Ａ９アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子で置換されている。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫酸転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）を参照のこと。本発明のさらなる８４Ｐ２Ａ９アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１６９〜１７５を参照のこと）。
【００５７】
本発明の８４Ｐ２Ａ９アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、８４Ｐ２Ａ９ゲノム配列または対応するｍＲＮＡの最初の１００Ｎ末端コドンまたは最後の１００Ｃ末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性（コンプリメンタリティー）（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）は必要ではないが、高い程度の相補性（コンプリメンタリティー）が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてプロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを不可能にする。好ましくは、本発明の８４Ｐ２Ａ９アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、８４Ｐ２Ａ９アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８４Ｐ２Ａ９の、最初の１０のＮ末端コドンおよび最後の１０のＣ末端コドンにおける領域に相補的な３０マーオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、８４Ｐ２Ａ９発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。Ｌ．Ａ．ＣｏｕｔｕｒｅおよびＤ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５１０−５１５（１９９６）。
【００５８】
本発明のこの局面のさらなる特定の実施形態は、プライマーおよびプライマーペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーが、サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得、そして８４Ｐ２Ａ９タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。
【００５９】
このようなプローブの例としては、図２に示されるヒト８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。８４Ｐ２Ａ９
ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、以下の実施例において記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡを、有効に増幅および／または検出するために使用され得る。
【００６０】
本発明の８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。この目的としては、８４Ｐ２Ａ９遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用；前立腺癌および他の癌の、診断および／または予後予測のための試薬としての使用；８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用；８４Ｐ２Ａ９遺伝子の発現および／または８４Ｐ２Ａ９転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用；ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
（８４Ｐ２Ａ９をコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載される８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡ配列は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに８４Ｐ２Ａ９の遺伝子産物のホモログ、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。８４Ｐ２Ａ９遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る（例えば、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。８４Ｐ２Ａ９遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて調べることにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡ（図２）またはその一部分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、８４Ｐ２Ａ９遺伝子に対応する重複するｃＤＮＡおよび８４Ｐ２Ａ９遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを回収し得る。８４Ｐ２Ａ９遺伝子自体は、８４Ｐ２Ａ９  ＤＮＡプローブまたはプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などをスクリーニングすることによって単離され得る。
【００６２】
（組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくはアナログもしくはホモログを含む組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。このような分子を生成するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
【００６３】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくはアナログもしくはホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス感染可能細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞）））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＤＵ１４５、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、８４Ｐ２Ａ９のコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくはアナログもしくはホモログを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系を用いて、８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
【００６４】
８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広範な宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、８４Ｐ２Ａ９は、好ましくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ  ３Ｔ３、およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、８４Ｐ２Ａ９および８４Ｐ２Ａ９の変異またはアナログの機能的特性を研究するために使用され得る。
【００６５】
組換えヒト８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントは、８４Ｐ２Ａ９をコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって産生され得る。実施例に記載した例示的な実施形態において、２９３Ｔ細胞は、８４Ｐ２Ａ９またはそのフラグメントもしくはアナログもしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、この８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはその関連タンパク質は、２９３Ｔ細胞において発現され、そして組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、標準的な精製方法（例えば、抗８４Ｐ２Ａ９抗体を使用するアフィニティ精製）を使用して単離され得る。本明細書中の実施例において同様に記載される別の実施形態では、８４Ｐ２Ａ９コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、そして種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３およびｒａｔ−１）に感染するために使用されて、８４Ｐ２Ａ９発現細胞株を樹立する。当該分野において周知の種々の他の発現系もまた使用され得る。８４Ｐ２Ａ９コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質の分泌形態の産生のために使用され得る。
【００６６】
８４Ｐ２Ａ９遺伝子またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体の産生、および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断および予後アッセイにおいて、ならびに８４Ｐ２Ａ９タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（前立腺および精巣の癌を含むが、これに限定されない）の管理における画像化方法において有用であり得る。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。８４Ｐ２Ａ９タンパク質の検出のために有用な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体が、標識され得、そして８４Ｐ２Ａ９発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として使用され得る（例えば、ラジオシンチグラフィ（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）。８４Ｐ２Ａ９タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンの生成において特に有用であり得る。
【００６７】
（８４Ｐ２Ａ９ポリペプチド）
本発明の別の局面は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特定の実施形態は、図２に示されるようなヒト８４Ｐ２Ａ９のアミノ酸配列の全てまたは部分を有するポリペプチドを含む。あるいは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の実施形態は、図２に示されるヒト８４Ｐ２Ａ９のアミノ酸配列における変異を有する改変体ポリペプチドを含む。
【００６８】
一般的に、ヒト８４Ｐ２Ａ９の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の同一性）を共有する。代表的に、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される８４Ｐ２Ａ９配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または８４Ｐ２Ａ９ホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。８４Ｐ２Ａ９対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定の８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するタンパク質であるが、この配列とは根本的な背反（例えば、非保存的置換、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々異なる意味を有する。さらに、オーソロジー（Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）およびパラロジー（Ｐａｒａｌｏｇｙ）は、１つの生物体における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物体の同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する、重要な概念である。
【００６９】
保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能も変更することなく、タンパク質中でなされ得る。このような変化としては、以下が挙げられる：イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれか、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸についての置換；グルタミン酸（Ｅ）に対するアスパラギン酸（Ｄ）、およびその逆の置換；アスパラギン（Ｎ）に対するグルタミン（Ｑ）、およびその逆の置換；ならびに、スレオニン（Ｔ）に対するセリン（Ｓ）、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であり得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置において、交換可能である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る（本明細書における表２；頁１３〜１５「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版。Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ編（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら．，ＰＮＡＳ  １９９２第８９巻１０９１５〜１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９５  ５月１９日；２７０（２０）：１１８８２〜６を参照のこと）。
【００７０】
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の、当該分野で認められた８４Ｐ２Ａ９タンパク質の改変体（例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換を有するポリペプチド）を含む。８４Ｐ２Ａ９改変体は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８７）］、カセット式変異誘発［Ｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）］、制限選択的変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６）］または他の公知技術を、クローン化されたＤＮＡにおいて実施し、８４Ｐ２Ａ９改変体ＤＮＡを産生し得る。
【００７１】
走査型アミノ酸分析もまた、タンパク質間の相互作用のような特定の生物学的活性に関与する、連続配列に沿った１以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用され得る。
【００７２】
上記で規定したように、８４Ｐ２Ａ９の改変体、アナログまたはホモログは、配列番号２のアミノ酸配列を有する８４Ｐ２Ａ９タンパク質と共通して少なくとも１つのエピトープを有するという特有の特徴を有する。この結果、８４Ｐ２Ａ９改変体に特異的に結合する抗体またはＴ細胞はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有する８４Ｐ２Ａ９タンパク質に特異的に結合する。ポリペプチドが、８４Ｐ２Ａ９タンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって認識され得るエピトープをもはや含まない場合、このポリペプチドは、配列番号２に示されるタンパク質の改変体ではなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異なるサイズのエピトープに結合することを理解する。約４または５アミノ酸（連続してもしなくても）の数のグループ分けは、最小エピトープにおけるアミノ酸の代表的な数とみなされる。例えば、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６５（１２）：６９４９〜６９５５；Ｈｅｂｂｅｓら．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５〜７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３５（４）：２５９８〜６０８を参照のこと。別の特定のクラスの８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質改変体は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントと９０％以上の同一性を共有する。別の特定のクラスの８４Ｐ２Ａ９タンパク質改変体またはアナログは、以下に記載されるか、または当該分野で以前に公知であった、８４Ｐ２Ａ９の生物学的モチーフの１つ以上を含む。従って、開始フラグメントに対して機能（例えば、免疫原性）特性が変化した８４Ｐ２Ａ９フラグメントのアナログ（核酸またはアミノ酸）は、本発明によって包含される。当該分野の技術範囲であるかそうなっているモチーフが図２の核酸またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
【００７３】
本明細書中で考察したように、特許請求された本発明の実施形態は、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の５０４未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：図２（配列番号２）に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のうち４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上連続するかのいずれかのアミノ酸を有するペプチド／タンパク質。さらに、本明細書に開示される本発明の例示的な実施形態としては、８４Ｐ２Ａ９配列の全体にわたって、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸１０〜約アミノ酸２０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸７０〜約アミノ酸８０からなるポリペプチド、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸８０〜約アミノ酸９０からなるポリペプチド、および図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸９０〜約アミノ酸１００からなるポリペプチドなどが挙げられる。このスキームに従って、８４Ｐ２Ａ９タンパク質のアミノ酸１００〜５０４のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。８４Ｐ２Ａ９タンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、図２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質の約アミノ酸１（または、２０もしくは３０もしくは４０など）個〜約アミノ酸２０（または、３０もしくは４０もしくは５０など）個からなるポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。この段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびその位置プラスマイナス（±）５残基をいうことが理解されるべきである。
【００７４】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、図２に示されるように、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を含む。１実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９核局在配列（例えば、配列番号２の残基４２−４５のＲＫＲＲ、配列番号２の残基４７−５０のＲＫＲＲ、配列番号２の残基１０１−１０４のＫＲＲＰ、配列番号２の残基１３５−１３９のＲＲＲＲＲＫ、および／または配列番号２の残基１８６−１８９のＫＫＲＫ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９  Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号２の残基１３１−１３４のＮＲＴＬ、配列番号２の残基２１２−２１５のＮＱＴＮおよび／または配列番号２の残基３９４−３９７のＮＣＳＶ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、ＬＵＣＡ  １５および／またはＫＩＡＡ１１５２に対して相同性を示す８４Ｐ２Ａ９の１以上の領域を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９  ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２の残基４８−５１のＫＲＲＳおよび／または配列番号２の残基１０２−１０５のＲＲＰＳ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９タンパク質キナーゼＣリン酸化部位（例えば、配列番号２の残基１３３−１３５のＴＬＲ、配列番号２の残基１５２−１５４のＳＮＫ、配列番号２の残基１７１−１７３のＳＤＲ、配列番号２の残基２１４−２１６のＴＮＫ、配列番号２の残基３１３−３１５のＳＲＲ、配列番号２の残基３２８−３３０のＳＳＫおよび／または配列番号２の残基３９６−３９８のＳＶＲ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号２の残基１０−１３のＳＡＬＥ、配列番号２の残基７０−７３のＳＳＬＥ、配列番号２の残基７１−７４のＳＬＥＥ、配列番号２の残基９１−９４のＳＤＳＤ、配列番号２の残基２１４−２１７のＴＮＫＤ、配列番号２の残基２３２−２３５のＳＥＳＤ、配列番号２の残基２４０−２４３のＳＳＴＤ、配列番号２の残基２４８−２５１のＴＮＤＥ、配列番号２の残基２８７−２９０のＴＥＬＤおよび／または配列番号２の残基３７４−３７７のＴＥＨＤ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上のＮ−ミリストイル化部位（例えば、配列番号２の残基６７−７２のＧＳＤＳＳＬ、配列番号２の残基２４５−２５０のＧＬＦＴＮＤ、配列番号２の残基２６９−２７４のＧＧＡＣＧＩ、配列番号２の残基３３６−３４１のＧＧＴＰＴＳ、配列番号２の残基３３７−３４２のＧＴＰＴＳＭ、配列番号２の残基４０９−４１４のＧＳＬＣＴＧ、配列番号２の残基４５９−４６４のＧＳＧＬＧＲおよび／または配列番号２の残基４８１−４８６のＧＬＧＬＧＦ）を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上のアミド化部位（例えば、配列番号２の残基４５−４８のＲＧＲＫおよび／または配列番号２の残基１１３−１１６のＲＧＫＲ）を含む。このようなポリペプチドの例示的な実施形態は、以下からなる群から選択される２以上の（配列番号２において、上で同定されるような）アミノ酸配列を含む：ＫＫＲＫ、ＮＱＴＮ、ＮＣＳＶ、ＴＮＫ、ＳＲＲ、ＳＳＫ、ＳＶＲ、ＧＬＦＴＮＤ、ＧＧＡＣＧＩ、ＧＧＴＰＴＳ、ＧＴＰＴＳＭおよびＧＳＬＣＴＧ。好ましい実施形態において、このポリペプチドは、３または４または５または６またはそれより多くの以下の（配列番号２において、上で同定されるような）アミノ酸配列を含む：ＫＫＲＫ、ＮＱＴＮ、ＮＣＳＶ、ＴＮＫ、ＳＲＲ、ＳＳＫ、ＳＶＲ、ＧＬＦＴＮＤ、ＧＧＡＣＧＩ、ＧＧＴＰＴＳ、ＧＴＰＴＳＭおよびＧＳＬＣＴＧ。
【００７５】
別の実施形態において、本発明のタンパク質は、例えば、表１に示されるような、本明細書中に記載されるプロセスによって同定される１以上の免疫活性エピトープを含む。ＨＬＡ分子に対して親和性を有するペプチドおよびアナログ（これらは、免疫原性エピトープとして関連する）を同定するためのプロセスは、当該分野で周知である。免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナログを産生するための原理がまた、開示される。種々の参考文献は、このような分子の同定において有用である。例えば、以下を参照のこと：ＷＯ  ９７３３６０２（Ｃｈｅｓｔｎｕｔら）；Ｓｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ５０（３−４）：２０１−２１２；Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６（２）：１３８９−１３９７；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１８（２）：７９−９２；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５８（ｌ）：１２−２０；Ｋｏｎｄｏら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９７  ４５（４）：２４９−２５８；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  １５７（８）：３４８０−９０；およびＦａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４））；Ｋａｓｔら，１９９４  １５２（８）：３９０４−１２；Ｂｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ６１（３）：２６６−２７８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，ＰＭＩＤ：７８９５１６４，ＵＩ：９５２０２５８２；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  １４７（８）：２６６３−２６６９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １（９）：７５１−７６１およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８．１８（２）：７９−９２。これによって、これらの刊行物の開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００７６】
本発明の関連する実施形態は、本明細書中で議論される異なるモチーフの組み合わせを含むポリペプチドを含み、ここで、特定の実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれか内に、挿入、欠失または置換を含まない。さらに、これらのモチーフのいずれかの部位に、多数のＮ末端アミノ酸残基および／またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかを含む、実施形態が、（例えば、このモチーフが配置されるポリペプチド構築物のより大きな部分を含むために）所望され得る。代表的に、モチーフのいずれかの部位における、Ｎ末端アミノ酸残基および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基、好ましくは、５〜約５０アミノ酸残基である。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、本発明のタンパク質は、１以上の８４Ｐ２Ａ９の選択的スプライシング改変体（例えば、前立腺癌で過剰発現される４．５ＫＢの転写物によってコードされるスプライシング改変体（図４に示される）に対して固有であるアミノ酸配列を含む。８４Ｐ２Ａ９の選択的スプライシング改変体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシングにおける変化は、癌の進行を導く一連の事象における１つの工程として示唆されるからである（例えば、Ｃａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５（２５０：３０５９−３０６５（１９９７）を参照のこと）。結果として、８４Ｐ２Ａ９の選択的スプライシング改変体のモニタリングは、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物における摂動に関連する症候群（例えば、癌）を評価するためのさらなる手段を提供する。
【００７８】
本明細書中で議論された１以上の８４Ｐ２Ａ９モチーフを含むポリペプチドは、本明細書中で議論された８４Ｐ２Ａ９モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点から、そして８４Ｐ２Ａ９が癌において過剰発現されるので（図４）、悪性疾患表現型の特異的特性の解明に有用である。従って、これらの酵素または分子に関連するモチーフのタンパク質の存在は、明らかである。例えば、カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰおよびｃＣＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、ならびにタンパク質キナーゼＣは、例えば、悪性疾患表現型の発生に関連することが公知の酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．，７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）；Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（４６）：６３２２−６３２９（１９９９）およびＯ’Ｂｒｉａｎ，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９（１９９８）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリスチル化の両方は、癌および癌進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。アミド化は、癌および癌進行に関与する別のタンパク質の改変である（例えば、Ｔｒｅｓｔｏｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．（１３）：１６９−１７５（１９９２）を参照のこと）。さらに、核局在配列は、悪性の細胞の能力に影響を与えると考えられる（例えば、Ｍｉｒｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１０）：２１２９−２１３４（１９９５）を参照のこと）。
【００７９】
本発明のタンパク質は、多くの異なる特異的用途を有する。８４Ｐ２Ａ９は、前立腺癌において高度に発現されることが示されるので（図４）、これらのペプチド／タンパク質は、正常組織  対  癌性組織における８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態を評価するための方法、および悪性疾患表現型を解明するための方法において使用され得る。代表的に、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特定の領域をコードするポリペプチドは、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の特定の領域（例えば、核局在シグナルを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用され得る。例示的アッセイは、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を標的化する抗体またはＴ細胞を利用して、正常組織  対  癌性組織における、この領域の特性を評価し得る。あるいは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドは、８４Ｐ２Ａ９のこの領域と相互作用する因子をスクリーニングするために使用され得る。
【００８０】
本明細書中で議論されるように、遺伝コードにおける縮重は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子配列における変更を可能にする。特に、当業者は、特定の宿主種によって特定のコドンの好ましさを認識し、そして所望の宿主に好ましいように、開示された配列を適応させ得る。例えば、好ましいアナログコドン配列は、代表的に、希少コドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において、約２０％未満の使用頻度を有するコドン）が、高頻度のコドンで置換されている。特定の種についてのコドンの好ましさは、例えば、以下のアドレスの、ＩＮＴＥＲＮＥＴ上で利用可能なコドン使用表を利用することによって算出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ。約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって、特定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「コドン最適化配列」と呼ばれる。
【００８１】
さらなる配列改変が、細胞宿主におけるタンパク質発現を増強するのに公知である。これらとしては、偽性のポリアデニル化シグナル、エキソン／イントロンスプライシング部位シグナル、トランスポゾン様反復、をコードする配列の排除、および／または遺伝子発現に有害である、他のこのような、よく特徴付けられた配列の排除が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞宿主について、その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照して算出されるように、平均レベルに調整され得る。可能な場合、この配列は、予測されるヘアピンｍＲＮＡ二次構造を回避するように改変され得る。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載のように、オープンリーディングフレームの開始における、翻訳開始コンセンサス配列の付加が挙げられる。当業者は、排他的に５’近位ＡＵＧコドンにおいて、真核生物のリボソーム開始翻訳が希少条件下でのみ排除される一般法則を理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ  ＰＮＡＳ９２（７）：２６６２−２６６６、（１９９５）およびＫｏｚａｋ  ＮＡＲ  １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。コドン最適化に加えて、偽性のポリアデニル化配列の排除、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの排除、トランスポゾン様反復の排除、および／またはＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現を最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で、「発現増強配列」と呼ばれる。
【００８２】
８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化される。精製された８４Ｐ２Ａ９タンパク質分子は、８４Ｐ２Ａ９の抗体または他のリガンドへの結合を損なう、他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。８４Ｐ２Ａ９タンパク質の実施形態として、精製された８４Ｐ２Ａ９タンパク質、および機能的な可溶性８４Ｐ２Ａ９タンパク質が挙げられる。１実施形態において、このような機能的な可溶性８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドによって結合されるべき能力を保持する。
【００８３】
本発明はまた、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント（図２に示される８４Ｐ２Ａ９のアミノ酸配列の部分に対応する）を含む、８４Ｐ２Ａ９タンパク質を提供する。本発明のこのようなタンパク質は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特性（例えば、８４Ｐ２Ａ９タンパク質に関連するエピトープと特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；このような抗体によって結合されるべき能力；ＨＴＬもしくはＣＴＬの活性化を惹起する能力；および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬによって認識されるべき能力）を示す。
【００８４】
８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質は、当該分野において周知の、標準的なペプチド合成技術または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を使用して、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質をコードする核酸分子を生成し得る。１実施形態において、本明細書中に記載される８４Ｐ２Ａ９コード核酸分子は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の規定のフラグメントを生成するための手段を提供する。８４Ｐ２Ａ９タンパク質フラグメント／配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）の生成および特徴付け、８４Ｐ２Ａ９またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、ならびに種々の治療状況（癌ワクチンまたはこのようなワクチンを調製する方法を含むが、これらに限定されない）において、特に有用である。
【００８５】
特定の興味深い構造を含む８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドは、例えば、以下：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗８４Ｐ２Ａ９抗体もしくはＴ細胞の生成、または８４Ｐ２Ａ９に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。
【００８６】
このことを例示する際に、８４Ｐ２Ａ９タンパク質からのペプチドのヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２への結合を、予測した。具体的には、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の完全なアミノ酸配列を、ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において見出されるＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力した。このＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子および特にＨＬＡ−Ａ２の溝における特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｄｒ．Ｋｅｎ  Ｐａｒｋｅｒによって開発された（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４））を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および多数の他のＨＬＡクラスＩ分子との予測された結合に関して、完全なタンパク質配列の８量体、９量体、および１０量体ペプチドの配置および順位付け（ｒａｎｋｉｎｇ）を可能にする。多くのＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８量体、９量体、１０量体または１１量体である。例えば、クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２に関して、このエピトープは、好ましくは、２の位置にロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）およびＣ末端にバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）を参照のこと）。ペプチドと結合すると予測された８４Ｐ２Ａ９の選択された結果は、以下の表１に示される。ＤＩＭＡＳサイトによって予測されるか、または適用されるべき当該分野で適用可能なＨＬＡクラスＩまたはクラスＩモチーフ（例えば、視覚的もしくはコンピュータに基づいた方法、または関連分野の当業者によって理解される）によって特定されるか、または当該分野の一部となった、いずれのエピトープも、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。表１において、各ファミリーメンバーの候補物に順位付けするトップ１０は、それらの配置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および見積もられた結合スコアと共に示される。この結合スコアは、３７℃、ｐＨ６．５でペプチドを含む複合体の分離に関する、見積もられた半減期に対応する。最も高い結合スコア（すなわち、６３．０４（８４Ｐ２Ａ９））を有するペプチドは、細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も長期間最も堅く結合すると予測され、従って、Ｔ細胞認識について最良の免疫原性標的を提示する。ペプチドのＨＬＡ対立遺伝子との実際の結合は、抗原処理欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現の安定化によって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特定のペプチドの免疫原性は、樹状細胞のような細胞を提示する抗原の存在下で、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によってイン��トロで評価され得る。
【００８７】
以下の例において記載される実施形態において、８４Ｐ２Ａ９は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６ＸＨｉｓおよびＭＹＣタグを有する、８４Ｐ２Ａ９をコードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＴａｇ５、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ  ＴＮ））を用いてトランスフェクトされた細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）において、従来発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、トランスフェクトされた細胞中で、分泌された８４Ｐ２Ａ９タンパク質の産生を容易にするために使用され得る、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供する。培養培地中で分泌されたＨＩＳ−標的８４Ｐ２Ａ９は、例えば、標準的な技術を使用するニッケルカラムを使用して、精製され得る。
【００８８】
８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の改変（例えば、共有結合性改変）は、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有結合性改変としては、８４Ｐ２Ａ９の選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤との、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内に含まれる８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの別の型の共有結合性改変としては、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンの変更が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的を意図し、ネイティブ配列８４Ｐ２Ａ９に見い出される１以上の炭水化物部分の欠失（基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および／または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／またはネイティブ配列８４Ｐ２Ａ９に存在しない、１以上のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。８４Ｐ２Ａ９の別の型の共有結合性改変としては、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つへの、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの連結が挙げられる。
【００８９】
本発明の８４Ｐ２Ａ９はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された８４Ｐ２Ａ９を含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。このようなキメラ分子は、化学的または組換え的に合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し得るか、または８４Ｐ２Ａ９配列のフラグメントの融合体（アミノ酸または核酸）を含み得、図２（配列番号２）のアミノ酸配列または核酸配列のそれぞれに対して、その長さを通じて直接的に相同性でない分子が、産生され；このようなキメラ分子は、複数の８４Ｐ２Ａ９の同一の配列を含み得る。キメラ分子としては、ポリヒスチジンエピトープタグを有する８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の融合体が挙げられ得、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般に、８４Ｐ２Ａ９のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態での置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日公布）もまた参照のこと。
【００９０】
（８４Ｐ２Ａ９抗体）
本発明の別の局面は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質に特異的に結合し、そして非８４Ｐ２Ａ９タンパク質と結合しない（または、弱く結合する）。別の実施形態において、抗体は、８４Ｐ２Ａ９抗体関連タンパク質およびそのホモログと結合する。
【００９１】
本発明の８４Ｐ２Ａ９抗体は、前立腺癌の診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに画像化方法において特に有用であり得る。同様に、このような抗体は、８４Ｐ２Ａ９が他の型の癌でもまた発現または過剰発現される限り、他の癌の処置、診断および／または予後に有用である。さらに、細胞内で発現された抗体（例えば、単鎖抗体）は、８４Ｐ２Ａ９の発現に関与する癌（例えば、進行した前立腺癌および転位性前立腺癌）を処置する際に治療学的に有用である。
【００９２】
本発明はまた、８４Ｐ２Ａ９および変異体８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切には、８４Ｐ２Ａ９または変異体８４Ｐ２Ａ９タンパク質を認識および結合し得る、１以上の８４Ｐ２Ａ９抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。
【００９３】
本発明の、関連する免疫的だが非抗体性のアッセイはまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイを含む。さらに、８４Ｐ２Ａ９を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る画像化方法がまた、本発明によって提供され、この方法には、標識化８４Ｐ２Ａ９抗体を使用する、ラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、８４Ｐ２Ａ９を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用である。
【００９４】
８４Ｐ２Ａ９抗体はまた、８４Ｐ２Ａ９および変異体８４Ｐ２Ａ９のタンパク質およびポリペプチドの精製、ならびに８４Ｐ２Ａ９ホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１つの実施形態において、８４Ｐ２Ａ９タンパク質を精製する方法は、８４Ｐ２Ａ９抗体（これは、固体マトリックスに結合されている）を、８４Ｐ２Ａ９を含有する溶解物または他の溶液と共に、この８４Ｐ２Ａ９抗体が８４Ｐ２Ａ９に結合するのを可能にする条件下でインキュベートする工程；固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程；および８４Ｐ２Ａ９をその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明の８４Ｐ２Ａ９抗体の他の用途としては、８４Ｐ２Ａ９タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の産生が挙げられる。
【００９５】
抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫結合体化された形態の、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質、ペプチドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ編、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、８４Ｐ２Ａ９の融合タンパク質（例えば、８４Ｐ２Ａ９  ＧＳＴ融合タンパク質）もまた使用され得る。特定の実施形態において、図２のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が産生され、そして適切な抗体を産生するための免疫原として使用される。別の実施形態において、８４Ｐ２Ａ９ペプチドが合成され、そして免疫原として使用される。
【００９６】
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術を（精製された８４Ｐ２Ａ９タンパク質または８４Ｐ２Ａ９発現細胞を用いるか、または用いずに）使用して、そのコードされる免疫原に対する免疫応答を産生し得る（概要については、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
【００９７】
図２に示されるような８４Ｐ２Ａ９のアミノ酸配列を使用して、抗体を産生するために８４Ｐ２Ａ９タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、８４Ｐ２Ａ９構造の親水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示す８４Ｐ２Ａ９タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同定され得る：例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析。従って、これらのプログラム／方法のいずれかによって同定された領域は、本発明の範囲内にある。８４Ｐ２Ａ９抗体の産生のための方法はさらに、本明細書中に提供される実施例によって例示される。
【００９８】
免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とのタンパク質の免疫原性結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体化が使用され；他の例において、連結試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される連結試薬）が、効果的である。８４Ｐ２Ａ９免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を用いた注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力（ａｄｅｑｕａｃｙ）を決定することによって理解され得る。
【００９９】
８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般に公知のように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または産生性（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）Ｂ細胞を不死化する改変を使用して調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、これらの細胞を拡大してインビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
【０１００】
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用する、組換え手段によって産生され得る。８４Ｐ２Ａ９タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種の起源のキメラ抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化８４Ｐ２Ａ９抗体またはヒト８４Ｐ２Ａ９抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられる（総説については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。
【０１０１】
完全なヒト８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して産生され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日公開）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【０１０２】
８４Ｐ２Ａ９抗体の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質との反応性は、適切には、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質、８４Ｐ２Ａ９ペプチド、８４Ｐ２Ａ９発現細胞またはその抽出物を使用する、多数の周知の手段（ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む）によって確証され得る。
【０１０３】
本発明の８４Ｐ２Ａ９抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識されるか、または第２の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、２以上の８４Ｐ２Ａ９エピトープに特異的な二重特異性的抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して産生され得る。ホモダイマー性の抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって産生され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【０１０４】
（８４Ｐ２Ａ９トランスジェニック動物）
８４Ｐ２Ａ９またはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術に従って、８４Ｐ２Ａ９をコードするｃＤＮＡは、８４Ｐ２Ａ９コードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、８４Ｐ２Ａ９をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を生成するための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および米国特許第４，８７０，００９号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーと共に８４Ｐ２Ａ９導入遺伝子の組み込みのために標的化される。
【０１０５】
８４Ｐ２Ａ９をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を使用して、８４Ｐ２Ａ９をコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験し得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明のこの局面に従って、動物を試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
【０１０６】
あるいは、８４Ｐ２Ａ９の非ヒトホモログを使用して、８４Ｐ２Ａ９「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、８４Ｐ２Ａ９をコードする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入された８４Ｐ２Ａ９をコードする改変ゲノムＤＮＡと間の相同組換えの結果として、８４Ｐ２Ａ９をコードする欠損性または８４Ｐ２Ａ９をコードする改変遺伝子を有する。例えば、８４Ｐ２Ａ９をコードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術に従って、８４Ｐ２Ａ９をコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。８４Ｐ２Ａ９をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的に、数キロベースの変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、そのベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射し、凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。ノックアウト動物は、例えば、８４Ｐ２Ａ９ポリペプチドの非存在に起因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生について、特徴付けられ得る。
【０１０７】
（８４Ｐ２Ａ９の検出のための方法）
本発明の別の局面は、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチド、ならびに８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質およびその改変体を検出するための方法、そして８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞を同定するための方法に関する。８４Ｐ２Ａ９は、前立腺癌のリンパ節転移および骨転移に由来するＬＡＰＣ異種移植片において発現されるようである。８４Ｐ２Ａ９の発現プロフィールは、それを転移された疾患についての潜在的な診断マーカーにする。この状況において、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態は、進行した段階の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の凝集性を含む、種々の因子を予測するために有用な情報を提供する。以下で詳細に議論されるように、患者サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態は、以下を含む当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得る：免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーションを含む種々のノザンブロット技術、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザ捕捉微小分析サンプルに対して）、ウエスタンブロット分析および組織アレイ分析。
【０１０８】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドとしては、例えば、８４Ｐ２Ａ９遺伝子またはそのフラグメント、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ、選択的スプライシング改変体８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ、および８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドの存在を検出するための多くの方法は、当該分野において周知であり、そして本発明のこの局面の実施に用いられ得る。
【０１０９】
１つの実施形態において、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを産生する工程；その中の８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを使用して、そのように産生されたｃＤＮＡを増幅する工程；ならびに増幅された８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、増幅された８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。
【０１１０】
別の実施形態において、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子を検出する方法は、サンプルからゲノムＤＮＡを最初に単離する工程；その中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子を増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；ならびに増幅された８４Ｐ２Ａ９遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任意の多くの適切なセンスプローブおよびアンチセンスプローブの組合せが、８４Ｐ２Ａ９について提供されるヌクレオチド配列（図２）から設計され、そしてこの目的のために使用され得る。
【０１１１】
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺、および他の組織、尿、細胞調製物など）中の８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、１つの実施形態において、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９タンパク質の存在を検出する方法は、８４Ｐ２Ａ９抗体、その８４Ｐ２Ａ９反応性フラグメント、または８４Ｐ２Ａ９抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と、サンプルとを最初に接触させる工程；ならびに次いで、それに対するサンプル中の８４Ｐ２Ａ９タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【０１１２】
８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される。１つの実施形態において、８４Ｐ２Ａ９遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの存在を検出する工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された８４Ｐ２Ａ９リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノザンブロットおよび関連技術）ならびに種々の核酸増幅アッセイ（例えば、８４Ｐ２Ａ９に特異的な相補プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどのような他の増幅型検出方法）が挙げられる。あるいは、８４Ｐ２Ａ９遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の８４Ｐ２Ａ９タンパク質または細胞によって分泌された８４Ｐ２Ａ９タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種々の方法が、当該分野において周知であり、そして８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質および８４Ｐ２Ａ９発現細胞の検出のために用いられる。
【０１１３】
８４Ｐ２Ａ９発現分析はまた、８４Ｐ２Ａ９遺伝子発現を調節する薬剤を同定かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、８４Ｐ２Ａ９発現は、前立腺癌で有意に上方制御され、そしてまた、他の癌（前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ性癌および肺癌を含む）において発現される。癌細胞での８４Ｐ２Ａ９発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的薬剤の同定は、治療上の価値がありる。例えば、このような薬剤は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合によって８４Ｐ２Ａ９発現を定量するスクリーニングを使用して、同定され得る。
【０１１４】
（８４Ｐ２Ａ９およびその産物の状態のモニタリング）
個体における８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成能力に関する情報を提供し得る。例えば、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡは、正常前立腺組織に比べて前立腺癌（ならびに、例えば図４〜８に示される他の癌組織）においてかなり多く発現されるので、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ転写物または８４Ｐ２Ａ９タンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、８４Ｐ２Ａ９調節不全と関連する疾患（例えば、癌）を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定するに有用である予後情報を提供し得る。
【０１１５】
８４Ｐ２Ａ９は、例えば種々の前立腺癌異種移植組織および癌細胞株、および癌患者サンプル中で発現するので、８４Ｐ２Ａ９の発現状態は、形成異常細胞、前癌性細胞および癌性細胞の存在、段階および位置を含む情報を決定するため、種々段階に対する疾患の感受性を予測するため、および／または腫瘍攻撃性を判断するために有用な情報を提供する。さらに、この発現プロフィールは、転移した疾患の画像化試薬として有用にする。従って、本発明の重要な局面は、生物学的サンプル（例えば、癌のような調節不能の細胞増殖によって特徴付けられる病理に罹患しているか、または罹患していると疑われる個体由来のもの）における８４Ｐ２Ａ９の状態を試験するための種々の分子予後方法および診断方法に関する。
【０１１６】
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不能になり、そして細胞が正常な病理状態から前癌状態、次いで癌状態に進行する、複数段階プロセスであることが公知である（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７〜４３８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．２３：１９〜３２（１９９５）を参照のこと）。この状況において、調節不能な細胞増殖（例えば、前立腺癌における異常な８４Ｐ２Ａ９発現）の証拠について生物学的サンプルの試験をすることは、癌のような病理が治療選択肢がより限定される段階に進行する前の、このような異常な細胞病理の早期検出を可能にし得る。このような試験において、目的の生物学的サンプル（例えば、調節不能な細胞増殖を有することを疑われるヒト）における８４Ｐ２Ａ９の状態は、例えば、対応する正常サンプル（例えば、病理によって影響されていない個体（またあるいは別の個体）（例えば、調節不能な細胞増殖を有すると疑われない人）由来のサンプル）における８４Ｐ２Ａ９の状態と比較され得る。目的の生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９の状態における変化（正常サンプルと比較して）は、調節不能な細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルとして、病理によって影響されていない生物学的サンプルを使用することに加えて、所定の基準値（例えば、ｍＲＮＡ発現の、所定の正常レベル（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６  Ｄｅｃ  ９、３７６（２）：３０６〜１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）もまた使用して、正常サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９と対比して疑わしいサンプルにおける８４Ｐ２Ａ９を比較し得る。
【０１１７】
この文脈における用語「状態」とは、その分野で許容される意味に従って使用され、そして遺伝子およびその産物の状況または状態をいう。代表的に、当業者は、遺伝子およびその産物の状況または状態を評価するための多くのパラメーターを使用する。これらには、発現される遺伝子産物の位置（８４Ｐ２Ａ９発現細胞の位置を含む）、ならびに発現される遺伝子産物（例えば、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げられるがこれらに限定されない。８４Ｐ２Ａ９の状態における変化は、当該分野で周知の、多種多様の方法論（代表的に本明細書中に記載されるもの）によって評価され得る。代表的に、８４Ｐ２Ａ９の状態における変化は、８４Ｐ２Ａ９および／または８４Ｐ２Ａ９発現細胞の位置、ならびに／あるいは８４Ｐ２Ａ９
ｍＲＮＡ発現における上昇および／またはタンパク質発現における上昇を含む。
【０１１８】
本明細書中で詳細に議論されるように、調節不能な細胞増殖に関連した状況または現象を同定する目的で、生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９の状態が、当業者によって利用される多くの方法（ゲノムサザン分析（例えば、８４Ｐ２Ａ９遺伝子における摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を検査するため）、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列または発現レベルの変化を検査するため）、およびウエスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列、サンプル中のポリペプチド位置の変化、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の発現レベルの変化および／または８４Ｐ２Ａ９タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの関連を検査するため）が挙げられるがこれらに限定されない）によって評価される。検出可能な８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドには、例えば、８４Ｐ２Ａ９遺伝子またはそのフラグメント、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ、選択的スプライス変異体８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ、および８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。
【０１１９】
８４Ｐ２Ａ９の発現プロフィールは、８４Ｐ２Ａ９を局所的疾患および／または転移した疾患についての診断マーカーにする。特に、８４Ｐ２Ａ９の発現状態は、特定の疾患の状態、進行および／または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供する。本発明は、８４Ｐ２Ａ９状態を決定し、そして８４Ｐ２Ａ９を発現する癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および肺癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。患者サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９状態は、当該分野で周知の多数の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ精査（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｓｓｅｃｔｅｄ）サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって分析され得る。８４Ｐ２Ａ９遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｕｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  ２［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，４［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，１５［Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ］および１８［ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ］に見出され得る。
【０１２０】
上記に記載されるように、生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９の状態は、当該分野における多くの周知の手順によって検査され得る。例えば、身体の特定の部位から採取した生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９の状態は、８４Ｐ２Ａ９発現細胞（例えば、８４Ｐ２Ａ９のｍＲＮＡまたはタンパク質を発現する細胞）の存在または非存在を、サンプルを評価することによって検査され得る。この検査は、例えば、８４Ｐ２Ａ９発現細胞が、通常はこのような細胞を含まない生物学的サンプル（例えば、リンパ節）において見出された場合、調節不能な細胞増殖の証拠を提供し得る。生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９の状態のこのような変化は、しばしば調節不能な細胞増殖に関係する。詳細には、調節不能な細胞増殖の１つの指標が、起源の器官（例えば、精巣または前立腺）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この状況において、調節不能な細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば潜在的なリンパ節の転移が、前立腺癌の患者のかなりの割合において検出され得、そしてこのような転移は、疾患進行の既知の予測物と関連があるからである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４２（４）：３１５〜３１７（２０００）；Ｓｕら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：１７〜２８（２０００）およびＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ａｕｇ，１５４（２Ｐｔ  １）：４７４〜８を参照のこと）。
【０１２１】
１つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現される８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのように決定された状態を、対応する正常サンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の状態に対して比較することによって８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物をモニターする方法であって、正常サンプルと比較して試験サンプルにおける異常な８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在を指標を提供する、方法を提供する。
【０１２２】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルと比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。８４Ｐ２Ａ９の存在は例えば、前立腺組織、精巣組織、腎臓組織、脳組織、骨組織、皮膚組織、卵巣組織、乳組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ組織および肺組織を含むがこれに限定されない中で評価され得る（例えば、図４〜８を参照のこと）。これらの任意の組織における８４Ｐ２Ａ９の有意な発現の存在は、癌の発生、存在および／または重篤度を示すために有用である。なぜなら対応する正常組織は８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡを発現しないか、またはより低いレベルで発現するからである。
【０１２３】
関連する実施形態において、８４Ｐ２Ａ９状態は、核酸レベルではなくタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現される８４Ｐ２Ａ９のレベルに対して比較する工程を包含する。１つの実施形態において、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。８４Ｐ２Ａ９タンパク質発現を検出し得る８４Ｐ２Ａ９抗体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用される。
【０１２４】
他の関連する実施形態において、これらの分子の構造における摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の状態を評価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、１９９９、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９〜３７８を参照のこと）。例えば、８４Ｐ２Ａ９の配列における変異は、腫瘍の存在または促進の指標であり得る。従って、このようなアッセイは、８４Ｐ２Ａ９における変異が機能の潜在的損失または腫瘍増殖の増加を閉める、診断的および予測的価値を有する。
【０１２５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における摂動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定プロトコルによって観察され得る。さらに、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における摂動を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
【０１２６】
別の実施形態において、生物学的サンプル中における８４Ｐ２Ａ９遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域におけるＣｐＧ島の異常な脱メチル化および／または過メチル化は、不死化細胞および形質転換細胞において頻繁に起こり、そして種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、ｐｉ−クラスグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常前立腺において発現するが前立腺癌腫の９０％より多くで発現しないタンパク質）のプロモーターの過メチル化は、この遺伝子の転写を永続的に止めるようであり、そしてこれは前立腺癌腫におけるもっとも頻繁に検出されるゲノム変異である（Ｄｅ  Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５〜１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高悪性度の前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）の症例の少なくとも７０％において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．、１９９８、７：５３１〜５３６）。別の実施形態において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは正常前立腺において発現しないが、前立腺癌の２０〜２５％において発現する）は、デオキシ−アザシチジンによってリンパ芽球様細胞において誘導され、これは腫瘍の発現が脱メチル化に起因することを示唆する（Ｌｅｔｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（６）：９０３〜９０８（１９９８）。この状況において、遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイは、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧ島の全体的なメチル化状態を評価する目的で、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断できないメチル化感受性制限酵素を利用し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧ島に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を容易に概略描写し得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これは全ての非メチル化シトシンをウラシルに変更する）によるＤＮＡの最初の修飾、それに続くメチル化ＤＮＡ対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを使用した増幅を包含する。メチル化法を包含するプロトコールはまた、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ  １２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら編、１９９５において見出され得る。
【０１２７】
遺伝子増幅は、８４Ｐ２Ａ９（１ｑ３２．３（種々の癌において摂動が示される領域）にマッピングされる遺伝子座、）の状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列に基づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、またはｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１〜５２０５）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に測定される。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識する抗体が用いられる。次いで、この抗体が、標識され、そして二重鎖が表面に結合され、その結果、この表面上での二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得るアッセイが、行われ得る。
【０１２８】
上記で議論される組織に加えて、生検組織または末梢血が、８４Ｐ２Ａ９発現を検出するために例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、癌細胞（前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ癌および肺癌を含むがこれに限定されない）の存在について従来通りにアッセイされ得る（図４〜８を参照のこと）。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅可能な８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について現在評価されている。前立腺癌の分野において、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３〜３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５〜２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７〜１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。
【０１２９】
本発明の関連する局面は、個体における癌の発症の感受性の推定に関する。１つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプル中の８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質を検出する工程であって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在する８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ発現の程度が感受性の程度に相関する、工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組織または他の組織中の８４Ｐ２Ａ９の存在が、試験され、ここでこのサンプル中の８４Ｐ２Ａ９の存在は、前立腺癌の感受性（または前立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における摂動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中の８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物における１以上の摂動の存在が、癌の感受性（または腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。
【０１３０】
本発明の別の関連する局面は、腫瘍攻撃性を測定するための方法に関する。１つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現される８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現される８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質発現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、８４Ｐ２Ａ９が腫瘍細胞中に発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における摂動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の摂動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１３１】
本発明のなお別の関連する局面は、個体の悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法に関する。１つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現される８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時間に採取された等価な組織サンプル中に発現される８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプルにおける経時的な８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡまたは８４Ｐ２Ａ９タンパク質発現の程度が、癌の進行に関する情報を提供する、工程を包含する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞における８４Ｐ２Ａ９発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、癌の進行を示す。また、これらの分子の構造における摂動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中の８４Ｐ２Ａ９ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の摂動の存在は、癌の進行を示す。
【０１３２】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の種々多様な予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定する手段として、８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の発現（または８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物における摂動）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況において、悪性疾患に関連する種々多様なの因子（例えば、悪性疾患と関連する遺伝子の発現（例えば、前立腺癌などについてのＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現））および肉眼的細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４、Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４〜８８；Ｅｐｔｓｅｉｎ、１９９５、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．２６（２）：２２３〜９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３〜５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８〜２４を参照のこと）が、利用され得る。８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の発現（または８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物における摂動）と、悪性疾患に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法が有用である。なぜなら、例えば、疾患と一致する一組の特定の因子の存在は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供するからである。
【０１３３】
代表的な実施形態において、８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物の発現（または８４Ｐ２Ａ９遺伝子および８４Ｐ２Ａ９遺伝子産物における摂動）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法は、組織サンプルにおいて、８４Ｐ２Ａ９のｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプルにおいてＰＳＡのｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、ならびに８４Ｐ２Ａ９のｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現とＰＳＡのｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組織における８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡの発現が、試験される。好ましい実施形態において、サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ  ｍＲＮＡ過剰発現との一致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは状態の指標を提供する。
【０１３４】
８４Ｐ２Ａ９のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載され、そして標準的な核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法としては、標識された８４Ｐ２Ａ９リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、８４Ｐ２Ａ９ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、８４Ｐ２Ａ９に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、ならびに他の増幅型検出方法（例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、以下の実施例に記載されるように、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ発現を検出および定量するために使用され得る。８４Ｐ２Ａ９を増幅し得る任意の数のプライマー（本明細書中に詳細に記載される種々のプライマーセットを含むがこれらに限定されない）が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用される。特定の実施形態において、野生型８４Ｐ２Ａ９タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
【０１３５】
（８４Ｐ２Ａ９と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列により、当業者は、当該分野で受け入れられた種々のプロトコルのいずれか１つを通じて、８４Ｐ２Ａ９と相互作用するタンパク質、小分子および他の因子、ならびに８４Ｐ２Ａ９によって活性化される経路を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系（「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、相互作用する分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子を再構成し、次いで、そのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。代表的な系は、真核生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定し、そしてこれは例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号および同第６，００４，７４６号に開示されている。
【０１３６】
あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法において、選択されたレセプター分子（例えば、８４Ｐ２Ａ９）に結合するペプチドが、アミノ酸の無作為収集物または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。
【０１３７】
従って、種々多様な使用（例えば、治療用試薬または診断用試薬）を有するペプチドが、予期されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関するいかなる予備情報を必要することなく同定され得る。８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７７３，７３１号に開示されている。
【０１３８】
あるいは、８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞株が、８４Ｐ２Ａ９によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６１：６４６〜５１）を使用して試験され得る。代表的には、８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、抗８４Ｐ２Ａ９抗体を使用して、８４Ｐ２Ａ９を発現している前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対する抗体が、（上記のベクターを使用して）８４Ｐ２Ａ９を発現するように操作された細胞株において使用され得る。免疫沈降した複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質微量配列決定、銀染色および２次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の会合に対して試験され得る。
【０１３９】
このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を介して、８４Ｐ２Ａ９と相互作用する低分子が同定され得る。例えば、リン酸化および脱リン酸化、第２メッセンジャーのシグナル伝達ならびに腫瘍形成を媒介する８４Ｐ２Ａ９の能力と干渉する分子を含む、タンパク質の機能と干渉する低分子が同定され得る。代表的な方法には、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッドリガンドは、細胞中に導入され、次いでこの細胞は、第１および第２の発現ベクターを含む。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。細胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第１および第２のハイブリッドタンパク質の互いに対する近接性に依存し、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、この事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
【０１４０】
本発明の代表的な実施形態は、図１（配列番号２）に示される８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法からなる。この方法は、分子集団と８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列とを接触させる工程、相互作用を促進する条件下で、分子集団と８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列とを相互作用させる工程、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列と相互作用する分子から８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列と相互作用しない分子を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態において、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触される。
【０１４１】
（治療方法および組成物）
通常前立腺および精巣関連のタンパク質であり、そして、また、前立腺の癌（および他の癌）において発現される８４Ｐ２Ａ９の同定は、このような癌の処置に対する多くの治療アプローチを展開する。本明細書中で議論されるように、転写因子としての８４Ｐ２Ａ９の機能は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関与する可能性がある。
【０１４２】
８４Ｐ２Ａ９の発現プロフィールは、癌−精巣（ＣＴ）抗原またはＭＡＧＥ抗原を連想させ、これらは、黒色腫および他の癌にてアップレギュレートされる、精巣関連遺伝子である（Ｖａｎ  ｄｅ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ  Ｊ
Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１〜８６、１９９７）。癌におけるそれらの組織特異的発現および高発現レベルに起因して、ＭＡＧＥ抗原は、癌ワクチンについての標的として現在調査されている（Ｄｕｒｒａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ８：７２７〜７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９７２〜９７６、１９９７）。８４Ｐ２Ａ９の発現パターンは、８４Ｐ２Ａ９が同様に、前立腺癌に対する癌ワクチンアプローチのための理想的な標的であるという証拠を提供する。その構造的特徴は、８４Ｐ２Ａ９が転写因子であり得ることを示し、そして８４Ｐ２Ａ９が、低分子標的であることの証拠を提供する。
【０１４３】
従って、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチが、前立腺癌、精巣癌、および８４Ｐ２Ａ９を発現する他の癌に罹患する患者に有用であることが予期される。これらの治療アプローチは、一般的に、２つの種類に分類される。１つの種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質との、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を包含する。別の種類は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子の転写または８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
【０１４４】
（抗体に基づく治療のための標的としての８４Ｐ２Ａ９）
８４Ｐ２Ａ９の構造的特徴は、この分子が、抗体に基づく治療ストラテジーのための魅力的な標的であることを示す。細胞外および細胞内分子の両方を標的化するための多数の典型的な抗体ストラテジー（例えば、補体およびＡＤＣＣ媒介死滅ならびに本明細書中で議論される内部抗体の使用）が当該分野で公知である。８４Ｐ２Ａ９は対応する正常細胞によってではなく、種々の系統の癌細胞によって発現されるので、８４Ｐ２Ａ９免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官および非標的組織に対して、その免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果なしで、優れた感受性を示すことが予期される。８４Ｐ２Ａ９のドメインと特異的に反応性である抗体は、毒素または治療薬剤との結合体、あるいは細胞の増殖または機能を阻害し得る裸の抗体のいずれかとして、８４Ｐ２Ａ９を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
【０１４５】
８４Ｐ２Ａ９抗体は患者に導入され得、その結果、抗体が８４Ｐ２Ａ９に結合し、そして結合パートナーとの相互作用のような機能を調節または阻害し、結果として、腫瘍細胞の増殖阻害および／または破壊を媒介しそして／または腫瘍細胞の増殖を阻害する。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞の細胞傷害、８４Ｐ２Ａ９の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを誘導することを包含し得る。
【０１４６】
当業者は、抗体を使用して、図１に示される８４Ｐ２Ａ９配列の免疫原性領域のような免疫抗原分子を特異的に標的化および結合し得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害性薬剤に結合体化することが日常的であることを理解する。この状況において、細胞毒性薬剤および／または治療剤が、その細胞（例えば、８４Ｐ２Ａ９）によって発現される分子に特異的な抗体にそれらを結合体化することによって直接細胞に送達される場合、細胞傷害性薬剤は、これらの細胞に対して、その既知の生物学的効果（例えば、細胞傷害性）を発揮することを予期することが妥当であることを、当業者は理解する。
【０１４７】
広範な種々の組成物および細胞を死滅するための細胞傷害性薬剤に結合体化された抗体を使用するための方法が、当該分野で公知である。癌の状況においては、代表的な方法は、細胞表面上への結合または局在化に利用可能な発現されたマーカー（例えば、８４Ｐ２Ａ９）に結合する標的化薬剤（例えば、抗８４Ｐ２Ａ９抗体）に連結した、選択された細胞傷害性および／または治療剤を含む結合体の生物学的に有効な量を、腫瘍を有する動物に投与する工程を包含する。代表的な実施形態は、細胞傷害性および／または治療剤を８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞に送達する方法からなり、この方法は、８４Ｐ２Ａ９エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害薬剤を結合体化する工程および抗体−薬剤結合体に細胞を曝露する工程を包含する。別の特定の例示的な実施形態は、転移した癌に罹患することが疑われる個体を処置する方法からなり、この方法は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤に結合体化した抗体の治療的有効量を含む薬学的組成物を上記患者に非経口的に投与する工程を包含する。
【０１４８】
抗８４Ｐ２Ａ９抗体を使用する癌免疫治療法は、以下を含むがこれらに限定されない、他の型の癌の処置にて首尾良く使用されている種々のアプローチから得られた教示に従い得る：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体への１３１Ｉの結合（例えば、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との）同時投与を含む。前立腺癌の処置のために、例えば、８４Ｐ２Ａ９抗体が、照射、化学療法またはホルモン除去と組み合わせて、投与され得る。
【０１４９】
８４Ｐ２Ａ９抗体治療は癌のすべての病期について有用であり得るが、抗体治療は、進行性または転移性の癌にて特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用いる処置は、１回以上の化学療法を受けたことのある患者に示され得、一方、化学療法レジメンまたは照射レジメンと本発明の抗体療法を組み合わせることが、化学療法処置を受けていない患者に好ましい。さらに、抗体療法は、特に、化学療法薬剤の毒性を許容しない患者にとって、非常に良好に併用する化学療法の減少した投薬量の使用を可能にし得る。
【０１５０】
好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的８４Ｐ２Ａ９画像化、または８４Ｐ２Ａ９発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、何人かの癌患者が８４Ｐ２Ａ９発現の存在およびレベルについて評価されることは、望ましい。腫瘍生検または外科的検体の免疫組織化学分析が、この目的について好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法が、当該分野で周知である。
【０１５１】
前立腺癌および他の癌を処置する際に有用な抗８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得る抗体、または直接細胞傷害性である抗体が挙げられる。これに関して、抗８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂが、本発明の実施にて有用である。このような直接的な細胞傷害性のｍＡｂが作用し得る可能な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＳＭＣＣ、補体媒介性細胞溶解、その他のような細胞死を決定するように設計された多くのインビトロアッセイを使用して、評価される。
【０１５２】
マウスまたは他の非ヒトモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラｍＡｂの使用が、何人かの患者で、中程度の免疫応答から強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの場合において、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も重症な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の大規模な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的８４Ｐ２Ａ９抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
【０１５３】
本発明の治療法は、単一の抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂの投与、ならびに異なるｍＡｂの組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂを含むか、異なるエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるのと同じ程度に、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、および免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と組み合され得る。抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂは、それらの「裸」の形態または非結合体化形態で投与されるか、またはそれらに結合体化した治療薬剤を有し得る。
【０１５４】
抗８４Ｐ２Ａ９抗体処方物は、腫瘍部位にその抗体を送達し得る任意の経路を介して投与される。投与の潜在的に有効な経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、受容可能な投与経路（例えば、静脈注射（ＩＶ））を介する、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量での、抗８４Ｐ２Ａ９抗体調製物の反復投与を包含する。１０〜５００ｍｇ  ｍＡｂ／週の範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０１５５】
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、抗８４Ｐ２Ａ９  ｍＡｂ調製物の初回負荷用量約４ｍｇ／ｋｇ患者体重のＩＶに引き続く、毎週の用量約２ｍｇ／ｋｇのＩＶが、受容可能な投薬レジメンを示し得る。好ましくは、この初回負荷量が、９０分以上の注入として投与される。周期的維持用量は、３０分以上の注入として投与されるが、ただし、その初回量が十分に許容される場合に限る。しかし、当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響する。このような因子としては、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者における８４Ｐ２Ａ９発現の程度、循環する放出された（ｓｈｅｄ）８４Ｐ２Ａ９抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤の影響ならびに特定の患者の健康状態が、挙げられ得る。
【０１５６】
必要に応じて、患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連因子の決定を補助するために、所定のサンプル中の８４Ｐ２Ａ９のレベル（例えば、循環する８４Ｐ２Ａ９および／または８４Ｐ２Ａ９発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じモニターする目的のために使用され、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組み合わせて、治療の成功を判断するために有用である。
【０１５７】
（８４Ｐ２Ａ９タンパク質機能の阻害）
第１の種類の治療アプローチ内で、本発明は、その結合パートナーへの８４Ｐ２Ａ９の結合または他のタンパク質との８４Ｐ２Ａ９の結合を阻害するための、種々の方法および組成物、ならびに８４Ｐ２Ａ９機能を阻害するための方法を包含する。
【０１５８】
（細胞内抗体を用いる８４Ｐ２Ａ９の阻害）
１つのアプローチにおいて、８４Ｐ２Ａ９に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞中へと遺伝子移入技術を介して導入され得、その遺伝子移入技術において、そのコードされる単鎖抗８４Ｐ２Ａ９抗体が細胞内発現され、８４Ｐ２Ａ９タンパク質に結合し、そしてそれにより８４Ｐ２Ａ９タンパク質の機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され得、その処置の阻害活性が焦点となる制御を提供する。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、別の豊富な細胞表面レセプターの発現を事実上除去することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと。
【０１５９】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより結合された、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に結合された単鎖可変領域フラグメントとして発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、発現される内部抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じてＣ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作され得る。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分が、原形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に結合される。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化される。例えば、細胞質内部抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し得、それによりそれらの因子がその天然での細胞での終着点に輸送されることを防ぎ得る。
【０１６０】
１つの実施形態において、内部抗体を使用して、核中で８４Ｐ２Ａ９を捕捉し、それにより核内でその活性を阻害する。核標的化シグナルは、所望の標的化を達成するために、８４Ｐ２Ａ９のような内部抗体に操作される。このような８４Ｐ２Ａ９内部抗体は、特定の８４Ｐ２Ａ９ドメインを特異的に結合するように設計される。別の実施形態において、８４Ｐ２Ａ９タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体を使用して、８４Ｐ２Ａ９が核へのアクセスを得ることを妨げ、それにより、核内での任意の生物学的活性を発揮することを妨げる（例えば、８４Ｐ２Ａ９が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
【０１６１】
このような内部抗体の発現を特定の腫瘍細胞に特異的に指向するために、その内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置される。内部抗体発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０１６２】
（組換えタンパク質を用いる８４Ｐ２Ａ９の阻害）
別のアプローチにおいて、８４Ｐ２Ａ９に結合し、それにより８４Ｐ２Ａ９がその結合パートナーに接近／結合することまたは他のタンパク質と結合することを妨げる、組換え分子が、８４Ｐ２Ａ９機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、８４Ｐ２Ａ９特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の実施形態において、８４Ｐ２Ａ９結合パートナーの８４Ｐ２Ａ９結合ドメインが、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つの８４Ｐ２Ａ９リガンド結合ドメインを含む、二量体融合タンパク質へと操作される。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＧＨ２ドメインおよびＧＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＧＨ１ドメインは含み得ない。このような二量体融合タンパク質は、可溶性形態で、８４Ｐ２Ａ９の発現と関係する癌（前立腺癌および精巣癌を含むがこれらに限定されない）に罹患する患者に投与され得、ここでこの二量体融合タンパク質は８４Ｐ２Ａ９に特異的に結合し、それにより８４Ｐ２Ａ９の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質は、公知の抗体連結技術を使用してさらに組み合わされて、多量体タンパク質に合わされる。
【０１６３】
（８４Ｐ２Ａ９の転写または翻訳の阻害）
第２の種類の治療アプローチにおいて、本発明は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子の転写を阻害するための、種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための、方法および組成物も提供する。
【０１６４】
１つのアプローチにおいて、８４Ｐ２Ａ９遺伝子の転写を阻害する方法は、８４Ｐ２Ａ９遺伝子を８４Ｐ２Ａ９アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、８４Ｐ２Ａ９特異的リボザイムが、８４Ｐ２Ａ９メッセージを切断するために使用され、それにより翻訳を阻害する。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、８４Ｐ２Ａ９遺伝子の調節領域（例えば、８４Ｐ２Ａ９プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、８４Ｐ２Ａ９遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ転写を阻害するために使用され得る。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０１６５】
８４Ｐ２Ａ９転写活性化を妨害することを介して８４Ｐ２Ａ９の転写を阻害する他の因子もまた、８４Ｐ２Ａ９を発現する癌の処置に有用であり得る。同様に、８４Ｐ２Ａ９のプロセシングと干渉し得る因子は、８４Ｐ２Ａ９を発現する癌の処置に有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内にある。
【０１６６】
（治療ストラテジーについての一般的な考慮）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術は、８４Ｐ２Ａ９を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチドおよび他の８４Ｐ２Ａ９阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。８４Ｐ２Ａ９アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、８４Ｐ２Ａ９転写と干渉し得る因子などをコードする組換えベクターは、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０１６７】
上記の治療アプローチは、広範な種々の外科的化学療法または放射線療法のレジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。これらの治療アプローチは、全ての患者、特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者についての利点である、化学療法の投薬量の減少、および／またはより低頻度の投与の使用を可能にし得る。
【０１６８】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロおよびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療の可能性を評価するためのインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへの８４Ｐ２Ａ９の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０１６９】
インビボでは、８４Ｐ２Ａ９治療用組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌の外植片または継代された異種移植組織が、免疫無防備動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）は、前立腺癌に関して適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８，Ｓａｗｙｅｒｓら（１９９８年４月２３日公開）は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および後期段階の疾患の骨芽細胞性転移の形成特性を再現し得るヒト前立腺癌の種々の異種移植モデルを記載する。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例もまた参照のこと。
【０１７０】
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが、治療用組成物の評価において有用である。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、この組成物の治療効力の指標を提供する。
【０１７１】
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と一般に非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０１７２】
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。潜在的に効果的な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、眼内などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の治療用組成物溶液を含み、そして／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリドまたはポリエチレンバッグに希釈される。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で貯蔵され得、次いで注射する前に、例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む静菌水中に、または滅菌水中に再溶解され得る。
【０１７３】
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変化し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の因子に依存する。
【０１７４】
（癌ワクチン）
上記のように、８４Ｐ２Ａ９の発現プロフィールにより、８４Ｐ２Ａ９が、進行した前立腺癌および転移した前立腺癌で高度に発現されることが示される。この発現パターンは、癌−精巣（Ｃａｎｃｅｒ−Ｔｅｓｔｉｓ）（ＣＴ）抗原またはＭＡＧＥ抗原（黒色腫および他の癌において上方制御される、精巣特異的遺伝子である）を連想させる（Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１〜８６，１９９７）。８４Ｐ２Ａ９の組織特異的発現および癌での高い発現レベルに起因して、ＭＡＧＥ抗原は、現在癌ワクチンの標的として検討されている（Ｄｕｒｒａｎｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ８：７２７〜７３３，１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９７２〜９７６，１９９７）。
【０１７５】
本発明はさらに、８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質またはそのフラグメントを含む癌ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンを提供する。８４Ｐ２Ａ９の発現を考慮すると、癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生じることなく、８４Ｐ２Ａ９を発現している癌の特異的な予防および／または処置に効果的である。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトＰＳＭＡおよびげっ歯類ＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３〜３１１７）。
【０１７６】
このような方法は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質もしくはそのフラグメント、または８４Ｐ２Ａ９をコードする核酸分子、および８４Ｐ２Ａ９免疫原（これは、代表的に多数の体液性またはＴ細胞エピトープ免疫反応性エピトープを含む）を発現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され得る。この文脈において、当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広範な種々の異なるワクチンシステムが公知であることを理解する（例えば、Ｈｅｒｙｌｎら、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｆｅｂ；３１（１）６６〜７８；Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００  Ｊｕｎ；４９（３）：１２３〜３２）。要するに、このような技術は、哺乳動物において免疫応答（例えば、体液および／または細胞媒介性応答）を生じる方法から構成され、哺乳動物の免疫系を免疫反応性エピトープ（例えば、配列番号２に示される８４Ｐ２Ａ９タンパク質のエピトープ）に曝露する工程を包含する。これにより、哺乳動物は、そのエピトープに特異的な免疫応答を生じる（例えば、そのエピトープを特異的に認識する抗体を生成する）。好ましい方法において、８４Ｐ２Ａ９免疫原は、生物学的モチーフを含む。非常に好ましい実施形態では、８４Ｐ２Ａ９免疫原は、当該分野で周知の適切な分析技術の１つを用いて同定された１つ以上のアミノ酸配列（例えば、表１に示される配列）を含む。
【０１７７】
哺乳動物において免疫応答を生成するための広範な種々の方法が、当該分野で周知である（例えば、ハイブリドーマの生成における第一工程として）。哺乳動物において免疫応答を生成する方法は、哺乳動物の免疫系をタンパク質上の外因性免疫原性エピトープ（例えば、配列番号２の８４Ｐ２Ａ９タンパク質）に曝露し、それによって免疫応答を生じる工程を包含する。代表的な実施形態は、宿主を十分な量の８４Ｐ２Ａ９またはＢ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞が惹起したエピトープまたはそのアナログと接触させて；そしてその後少なくとも一定の間隔でこの宿主をさらなる８４Ｐ２Ａ９またはＢ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞が惹起したエピトープまたはそのアナログと接触させることによって、宿主における８４Ｐ２Ａ９に対する免疫応答を生成する方法からなる。特定の実施形態は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはマルチエピトープペプチドに対する免疫応答を生じる方法からなる。この方法は、ワクチン調製物中の８４Ｐ２Ａ９免疫原（例えば、８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそのペプチドフラグメント、８４Ｐ２Ａ９融合タンパク質など）をヒトまたは動物に投与する工程を包含する。代表的には、このようなワクチン調製物は、さらに適切なアジュバントを含む。（例えば、米国特許第６，１４６，６３５号を参照のこと）。これらの方法における代表的改変は、８４Ｐ２Ａ９免疫原に対して、個体中で免疫応答を生成する方法からなる。この方法は、インビボで個体の体の筋肉または皮膚に対して、以下からなる群より選択されるような遺伝子ワクチン促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）を投与する工程を包含する：陰イオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；および尿素；ならびにＤＮＡ分子（感染性因子から解離し、そして８４Ｐ２Ａ９免疫原をコードするＤＮＡ配列を含む。このＤＮＡ配列は、このＤＮＡの発現を制御する調節配列に作動可能に連結されており；ここでこのＤＮＡ分子は、細胞に取り込まれ、このＤＮＡ配列は、細胞中で発現され、そして免疫応答がこの免疫原に対して生成される）。（例えば、米国特許第５，９６２，４２８号を参照のこと）。
【０１７８】
免疫応答を生成するための特定の方法の例示的な例において、ウイルス遺伝子送達系が、８４Ｐ２Ａ９をコードする核酸分子を送達するために用いられ得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系は、以下を包含するが、これらに限定されない：ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達系もまた使用され、８４Ｐ２Ａ９タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＤＮＡを用いて、抗腫瘍応答を誘導するために患者に導入され得る（例えば筋内または皮内に）。１つの実施形態において、全長ヒト８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを用いる。別の実施形態では、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする８４Ｐ２Ａ９核酸分子が用いられ得る。ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る、８４Ｐ２Ａ９タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され得る。
【０１７９】
種々のエキソビボストラテジーが、用いられ得る。１つのアプローチは、患者の免疫系に８４Ｐ２Ａ９抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、Ｂ７共同刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、およびＩＬ−１２を発現し、そして従って、高度に分化された（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されつつある（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の場合において、Ｔ細胞に対して８４Ｐ２Ａ９ペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施形態では、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に結合し得る８４Ｐ２Ａ９ペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全８４Ｐ２Ａ９タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））を用いて樹状細胞における８４Ｐ２Ａ９遺伝子の過剰発現を操作することを包含する。８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞は、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【０１８０】
抗イディオタイプ抗８４Ｐ２Ａ９抗体もまた、抗癌療法において、８４Ｐ２Ａ９タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり、そして８４Ｐ２Ａ９タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗８４Ｐ２Ａ９抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１８１】
遺伝子免疫法は、８４Ｐ２Ａ９を発現する癌細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡおよび適切な調節配列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされた８４Ｐ２Ａ９タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質を含む。８４Ｐ２Ａ９タンパク質免疫原の発現は、骨癌、結腸癌、膵臓癌、精巣癌、子宮頸癌および卵巣癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技術が使用され得る（概説については、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
【０１８２】
（キット）
上記で記載された診断適用および治療適用において使用するために、本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、１つ以上のコンテナ（容器）（例えば、バイアル、チューブなど）を厳重に閉じ込めて受容するように区画化されるキャリアを備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において、使用されるべき別々の要素の１つを含む。例えば、コンテナは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ８４Ｐ２Ａ９関連タンパク質または８４Ｐ２Ａ９遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識）に結合されるレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を含むコンテナを有し得る。
【０１８３】
本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市販および使用者の観点で所望の物質（緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む）を含む１つ以上の他のコンテナを含む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用（例えば、上記の使用）についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
【０１８４】
ｐ８４Ｐ２Ａ９−１は、ブダペスト条約の要件の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、２０００年１月６日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５１が確定されている。
【０１８５】
（実施例）
本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの実施例によってさらに記載および例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【０１８６】
（実施例１：８４Ｐ２Ａ９遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片およびヒト組織）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈｅａｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載のように生成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：４０２−４０８）。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４  ＡＤおよびＡＩ）ならびにＬＡＰＣ−９  ＡＤおよびＡＩ異種移植片を雄性ＳＣＩＤマウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４  ＡＩおよびＬＡＰＣ−９  ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍またはＬＡＣＤ−９腫瘍からそれぞれ誘導した。ＡＤ腫瘍を有する雄性マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育した。腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいてまたは雌性ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。ＲＮＡおよびタンパク質の分析のためのヒト組織をＵＣＬＡ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）のヒト組織リソースセンター（Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＨＴＲＣ）およびＱｕａｌＴｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）から得た。良性の前立腺過形成組織サンプルは患者由来であった。
【０１８７】
（細胞株）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中で維持した。
【０１８８】
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織および細胞株を、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０８細胞を用いてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）においてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ  ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ．  ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０１８９】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【０１９０】
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）：
５’ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴ３０３’（配列番号７）（ここで、ＧＡＴＣは太文字表記）
アダプター１：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧ３’（配列番号８）
３’ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号９）（ここで、ＣＴＡＧは太文字表記）
アダプター２：
５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧ３’（配列番号１０）
３’ＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧ５’（ここで、ＣＴＡＧは太文字表記）（配列番号１１）
ＰＣＲプライマー１：
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号１２）
ネスト化プライマー（ＮＰ）１：
５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＡ３’（配列番号１３）（ここで３’末端のＧＡは太文字表記）
ネスト化プライマー（ＮＰ）２：
５’ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡ３’（配列番号１４）（ここで、３’末端のＧＡは太文字表記）。
【０１９１】
（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌で示差的に発現され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。ＳＳＨ反応は２つのＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片からのｃＤＮＡを利用した。詳細には、８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨ配列を差引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）から同定した。ここで、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍（去勢後３日）由来のｃＤＮＡを、インタクトな雄で増殖したＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍由来のｃＤＮＡから差引き（サブトラクト）した。インタクトな雄において増殖したＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片腫瘍をを「テスター」ｃＤＮＡの供給源として使用し、一方、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍（去勢後３日）由来のｃＤＮＡを、「ドライバー」ｃＤＮＡの供給源として使用した。
【０１９２】
テスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、およびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮを使用して、上記のように、関連の異種移植片組織から単離された２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載のように実施した。得られたｃＤＮＡをＤｐｎＩＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【０１９３】
ドライバーｃＤＮＡを、１：１比で、関連の異種移植片供給源からのＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（上述を参照のこと）と、ヒト良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、ヒト細胞株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ２０５、およびマウス肝臓由来の消化ｃＤＮＡの混合物とを組み合わせることにより生成した。
【０１９４】
テスターｃＤＮＡを、５μｌの水中に関連の異種移植片供給源（上記を参照のこと）からの１μｌのＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。次いで、希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、総容量１０μｌで１６℃で一晩、４００ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、別の連結反応中で、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡで、そして７２℃で５分間加熱して終結させた。
【０１９５】
第一のハイブリダイゼーションは、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１連結のおよびアダプター２連結のテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１９６】
（ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌの１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ  ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで２７サイクルの以下：９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分。５つの別の第一のＰＣＲ反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、プールし、そして希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いたものと同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの以下：９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１９７】
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを青／白選択およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅をＰＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて１ｍｌの細菌培養物において実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１９８】
９６ウェルフォーマットで２０％グリセロール中に細菌クローンを貯蔵した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０１９９】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングによって１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコルを使用し、そしてこれは、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、続いて３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ  Ｈ処理を包含した。反応を完了した後、この容積を、標準化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織由来の第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０２００】
複数の組織由来の第一鎖ｃＤＮＡの標準化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号１５）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号１６）を用いてβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）、および１×Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む総容量５０μｌで増幅した。１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて１８サイクル、２０サイクル、および２２サイクルの以下：９４℃で１５、６５℃で２分、７２℃で５秒、である。７２℃での最終伸長を２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を可視検査によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈因数を算定した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３ラウンドの標準化が必要であった。
【０２０１】
８４Ｐ２Ａ９遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの標準化された第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる２５、３０、および３５サイクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析し得る。これらプライマーは、（ＭＩＴ；詳細については、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕを参照のこと）の補助により設計し得る。
【０２０２】
半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でＰＣＲ産物を比較することにより達成し得る。
【０２０３】
（結果）
上述の材料および方法に記載の２つのＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローン（ＳＳＨクローン）の単離に至った。全ての候補クローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供し、そして示差的な発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くのを補助するために、主な公的な遺伝子およびＥＳＴデータベース中の全配列に対する相同性分析に供した。一般に、検索したデータベースのいずれかにおいていかなる公知の配列とも相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析によってディファレンシャル（示差的）発現分析に供した。
【０２０４】
約４２５ｂｐを含む、ＳＨＨクローンの１つは、いくつかの精巣由来のＥＳＴに有意な相同性を示すが、既知の遺伝子のいずれに対しても相同性は示さなかった、そして８４Ｐ２Ａ９と名づけられた。
【０２０５】
１６の正常な組織由来の第一鎖ｃＤＮＡのノーザン発現分析は、生体組織における高度な前立腺および精巣の関連発現パターンを示した（図４）。
【０２０６】
（実施例２：全長８４Ｐ２Ａ９ｃＤＮＡのクローニング）
２３４７塩基対（ｂｐ）の全長８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡクローン（クローン１）を、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇａｎｅ）からクローニングした（図２）。このｃＤＮＡは、５０４アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。配列分析によって、６つの可能性のある核局在化シグナルの存在が示され、そしてＰＳＯＲＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ：８８００／ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて核であることが予測される。タンパク質配列は、ヒト脳タンパク質ＫＩＡＡ１１５２（３３７アミノ酸領域にわたって３９．５％同一性）と相同であり、そしてＬＵＣＡ１５腫瘍サプレッサータンパク質と相同であるドメインを示す（４２アミノ酸領域にわたって６４．３％同一性）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃Ｐ５２７５６）（図３）。８４Ｐ２Ａ９
ｃＤＮＡは、プラスミドｐ８４Ｐ２Ａ９−１として、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に２０００年１月５日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ−１１５１を割り当てられた。
【０２０７】
８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、いずれの公知のタンパク質とも相同性を有さないが、この配列は、精巣由来のいくつかのＥＳＴと重複する。
【０２０８】
（実施例３：８４Ｐ２Ａ９遺伝子発現分析）
正常ヒト組織における８４Ｐ２Ａ９  ｍＲＮＡ発現を、プローブとして標識された８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメント（実施例１）を用いる、全部で１６の異なる正常ヒト組織を含む、２つの多重組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のノーザンブロッティングによって分析した。ＲＮＡサンプルを、βアクチンプローブを用いて定量的に標準化した。この結果は、正常精巣および前立腺における、２．４ｋｂおよび４．５ｋｂの転写物の発現を実証した（図４）。
【０２０９】
前立腺癌組織における８４Ｐ２Ａ９発現を分析するために、ノーザンブロッティングを、ＬＡＰＣ異種移植片由来のＲＮＡにおいて実施した。結果は、全ての異種移植片において高いレベルの８４Ｐ２Ａ９発現を示し、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＩにおいて最高レベルが検出された（図４および５）。これらの結果は、８４Ｐ２Ａ９が、前立腺癌において上方制御されることの証拠を提供する。
【０２１０】
さらに、最高レベルの発現が、脳（ＰＦＳＫ−１、Ｔ９８Ｇ）、骨（ＨＯＳ、Ｕ２−ＯＳ）、肺（ＣＡＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ８２，ＮＣＩ−Ｈ１４６）、および腎臓（７６９−Ｐ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＳＷ８３９）の癌細胞株において検出された（図５）。中度の発現レベルが、いくつかの膵臓（ＰＡＮＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＨＡＰＣ、ＣＡＰＡＮ−１）、結腸（ＳＫ−ＣＯ−１、ＣＡＣＯ−２、ＬＯＶＯ、ＣＯＬＯ−２０５）、骨（ＳＫ−ＥＳ−１、ＲＤ−ＥＳ）、乳房（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ）および精巣癌（ＮＣＣＩＴ）の細胞株で検出された（図５）。
【０２１１】
さらに、前立腺癌患者サンプルは、前立腺組織の正常部分および腫瘍部分の両方における８４Ｐ２Ａ９の発現を示す（図６）。これらの結果は、８４Ｐ２Ａ９が、前立腺癌および可能性としては他の癌で上方制御される、非常に精巣特異的な遺伝子であることを示唆する。ＭＡＧＥ抗原と同様に、このように８４Ｐ２Ａ９は、癌−精巣抗原としてみなされ得る（Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１〜８６，１９９７）。
【０２１２】
正常組織における８４Ｐ２Ａ９の発現は、異なるサンプル（主に正常組織および数個の癌細胞株を代表する）を含むマルチ組織ＲＮＡドットブロットを用いてさらに分析され得る。
【０２１３】
（実施例４：８４Ｐ２Ａ９ポリクローナル抗体の生成）
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤および所望の場合アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物中で惹起できる。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数の物質または腹膜注射によって哺乳動物に注射される。代表的に、ペプチドは、８４Ｐ２Ａ９のコード領域から設計され得る。代替的に（あるいは）、免疫剤は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質の全てもしくは一部、またはそれらの融合タンパク質を含み得る。例えば、８４Ｐ２Ａ９アミノ酸配列は、当該分野で周知の種々の公知の融合タンパク質パートナーのいずれか１つ（例えば、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシンまたは免疫グロブリン定常領域）に融合され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、１６ユニット、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら、編．，１９９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｗ．，Ｕｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｍａｉｒｅ，Ｌ，Ｄａｍｌｅ，Ｎ．，およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４．５６１−５６６）。他のこのような組換え細菌タンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、および８４Ｐ２Ａ９のＨＩＳタグ化融合タンパク質（適切なアフィニティーマトリックスを用いて誘導細菌から精製され得る）が挙げられる。
【０２１４】
免疫されている哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に対して免疫剤を結合体化することは有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル  ＬｉｐｉｄＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート）が挙げられる。
【０２１５】
代表的なプロトコールでは、最初にウサギを完全フロイントのアジュバント中に混合した約２００μｇの融合タンパク質またはＫＬＨ−ペプチドを用いて皮下に免疫した。次いで、約２００μｇの免疫原を含有する不完全フロイントアジュバントを２週間毎に皮下注射した。各免疫の後約７−１０日に採血して、ＥＬＩＳＡによる抗血清の力価モニタリングに用いる。
【０２１６】
遺伝子操作した細胞または内因性８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞の溶解物を用いて、ウェスタンブロット分析および免疫沈降分析によって、抗血清の特異性を試験する。８４Ｐ２Ａ９を発現するために、細胞を遺伝子操作するために、全長８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを発現ベクター（カルボキシ末端で６Ｈｉｓタグを提供する）中にクローニングし得る（ｐＣＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−ｈｉｓ，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）。２９３Ｔ細胞への構築物のトランスフェクション後、細胞溶解物を、免疫沈降し、そして抗−Ｈｉｓまたはｖ５抗エピトープ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗８４Ｐ２Ａ９血清を用いてウエスタンブロットし得る（図１１を参照のこと）。Ｈｉｓタグ化タンパク質およびペプチドで免疫したウサギ由来の血清、ならびに枯渇したＧＳＴおよびＭＢＰタンパク質血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合したそれぞれの免疫原からなるアフィニティーカラムを通過させることによって、精製する。
【０２１７】
（実施例５：細菌および哺乳動物系における組換え８４Ｐ２Ａ９の産生）
（細菌構築物）
（ｐＧＥＸ構築物を用いる組換え８４Ｐ２Ａ９の産生）
細菌細胞において、８４Ｐ２Ａ９を発現するために、８４Ｐ２Ａ９の一部を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中にクローニングすることによって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に、融合した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）。全ての構築物を作製してＮ末端で融合したＧＳＴおよびＣ末端の６つのヒスチジンエピトープとともに組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列を精製した。ヒスチジンコドンをＯＲＦの３’末端でクローニングプライマーに付加することによって、６つのヒスチジンエピトープタグを生成した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位によって、８４Ｐ２Ａ９からＧＳＴタグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点によってＥ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持が可能になる。この構築物において、８４Ｐ２Ａ９のアミノ酸１〜１５１を含有するフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にクローニングした。さらなる構築物を８４Ｐ２Ａ９タンパク質のｐＧＥＸ−６Ｐ−１にまたがる領域（例えば、アミノ酸１〜５０４およびアミノ酸１５１〜５０４）中に作製し得る。
【０２１８】
（哺乳動物構築物）
哺乳動物系において組換え８４Ｐ２Ａ９を発現するために、完全長の８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを、例えば、Ｃ末端に６Ｈｉｓタグを提供する発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１  ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し得る。これらの構築物は、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解液は、ウェスタンブロットにおいて上記実施例４に記載された抗−８４Ｐ２Ａ９ポリクローナル血清でプローブされ得る。
【０２１９】
８４Ｐ２Ａ９遺伝子をまた、レトロウイルス発現ベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローン化し得、そして以下のように８４Ｐ２Ａ９発現細胞株０確立するために用い得る。８４Ｐ２Ａ９コード配列（翻訳開始ＡＴＧ〜停止コドンまで）は、８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡからｄｓ  ｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ産物を、ベクター上のＥｃｏＲ１（平滑末端化）およびＸｂａ１制限部位を介してｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローン化し、そしてＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換する。コロニーを釣り上げ、ｃＤＮＡ上の特有の内部制限部位をもつクローンをスクリーニングする。陽性のクローンは、このｃＤＮＡ挿入片の配列決定により確認する。その後、レトロウイルスを、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３またはｒａｔ−１細胞を用いる、種々の細胞株の感染および生成のために用い得る。
【０２２０】
特定の哺乳動物系を本明細書において考察する。
【０２２１】
（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ構築物を用いる組換え８４Ｐ２Ａ９の産生）
哺乳動物細胞において８４Ｐ２Ａ９を発現するため、１５１２ｂｐ（５０４アミノ酸）の８４Ｐ２Ａ９  ＯＲＦを、完全な翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサス配列をとともに、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、Ｖ５エピトープおよび６つのヒスチジン（Ｃ末端に融合された）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターはまた、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列（ｍＲＮＡの安定性を強化する）を含み、そしてエピソーム複製のためのＳＶ４０起点およラージＴ抗原を発現する細胞株中の単一ベクターレスキューを伴う。ネオマイシン耐性遺伝子が、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点が、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０２２２】
（ｐＳＲａ構築物）
構成的に８４Ｐ２Ａ９を発現する哺乳動物細胞株を生成するために、１５５１ｂｐ（５１７アミノ酸）ＯＲＦをｐＳＲａ構築物中にクローニングする。ｐＳＲａ構築物の２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのトランスフェクション、または２９３細胞中のｐＳＲａおよびヘルパープラスミド（φ  ）の同時トランスフェクションによって、それぞれ、アンホトロピックおよびエクトトロピックなレトロウイルスを生成する。このレトロウイルスを用いて、種々の哺乳動物細胞株を感染し得、これによってクローニングした遺伝子８４Ｐ２Ａ９の宿主細胞株への組み込みを生じる。タンパク質発現は、長末端反復配列（ＬＴＲ）から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子が、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点が、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。さらなるｐＳＲａ構築物を作製して、Ｎ末端およびＣ末端の両方のＧＦＰおよび全長８４Ｐ２Ａ９タンパク質のｍｙｃ／６ＨＩＳ融合タンパク質を生成する。
【０２２３】
（実施例６：バキュロウイルス系における組換え８４Ｐ２Ａ９の産生）
バキュロウイルス発現系における組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質を生成するために、８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡを、Ｎ末端にＨｉｓ−タグを提供する、バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングする。詳細には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−８４Ｐ２Ａ９を、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞中に同時トランスフェクトし、組換えバキュロウイルスを生成する（詳細についてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
【０２２４】
次いで、組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質を、精製バキュロウイルスを用いたＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により生成する。組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、抗−８４Ｐ２Ａ９抗体を用いて検出され得る。８４Ｐ２Ａ９タンパク質は、精製され、そして種々の細胞を基礎にしたアッセイにおいて、または８４Ｐ２Ａ９に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。
【０２２５】
（実施例７：８４Ｐ２Ａ９遺伝子の染色体マッピング）
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４照射ハイブリッドパネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：２２）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＩ）を用いて、８４Ｐ２Ａ９の染色体局在化を決定した。以下のＰＣＲプライマーを用いて、９４Ｐ２Ａ９を局在化した：
８４Ｐ２Ａ９．１  ｇａｃｔｔｃａｃｔｇａｔｇｃｇａｔｇｇｔａｇｇｔ（配列番号１７）
８４Ｐ２Ａ９．２  ｇｔｃａａｔａｃｔｔｔｃｃｇａｔｇｃｔｔｔｇｃｔ（配列番号１８）
９３照射ハイブリッドパネルＤＮＡについて得られたマッピングベクターは以下であった：
００００１０００１１００１０１１００１０００００１１０００１００１００１００００１０００１０１００１１０００１０００００００１００１００１００１０１０００００００１００００００１００００。このベクターおよびマッピングプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌで、染色体１ｑ３２．３上の８４Ｐ２Ａ９に位置する（Ｄ１Ｓ１６０２−Ｄ１Ｓ２１７）。
【０２２６】
（実施例８：潜在的なシグナル伝達経路の同定）
８４Ｐ２Ａ９が細胞中の既知のシグナル伝達経路を直接的または間接的に活性化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を基礎にした転写レポーターアッセイを、８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞中で実施する。これらの転写レポーターは、良く特徴付けられたシグナル伝達経路の下流にある、既知の転写因子のためのコンセンサス結合部位を含む。これらのレポーターおよびそれらの関連転写因子、シグナル伝達経路、および活性化刺激物の例を、以下に列挙する。
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；成長／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；成長／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；成長／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド類／ＭＡＰＫ；成長／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；成長／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；成長／アポトーシス／ストレス
８４Ｐ２Ａ９媒介効果は、ｍＲＮＡ発現を示す細胞中でアッセイされ得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、脂質媒介トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）により導入され得る。相対的転写活性であるルシフェラーゼ活性の指標は、細胞抽出物のルシフェリン基質とのインキュベーションにより測定され、そして反応の化学発光がルミノメーター中でモニターされる。
【０２２７】
（実施例９：８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体の生成）
８４Ｐ２Ａ９にＭＡｂを生成するために、代表的には、Ｂａｌｂ  Ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中に混合された、約１０〜５０μｇのタンパク質免疫原を用いて腹腔内に免疫する。タンパク質免疫原としては、細菌およびバキュロウイルスが産生した組換え８４Ｐ２Ａ９タンパク質および哺乳動物が発現したヒトＩｇＧ  ＦＣ融合タンパク質が挙げられる。次いでマウスに、フロイントの不完全アジュバント中に混合された１０〜５０μｇの抗原で２〜４週間毎に、引き続いて免疫を行う。あるいは、Ｒｉｂｉアジュバントを最初の免疫に用いる。さらに、ＤＮＡベースの免疫プロトコールを用いる。このプロトコールでは、８４Ｐ２Ａ９  ｃＤＮＡ単独もしくはＩｇＧ  ＦＣ融合をコードするｐＣＤＮＡ３．１のような哺乳動物発現ベクターを用いて、プラスミドＤＮＡの直接注射によってマウスを免疫する。このプロトコールを単独で、そしてタンパク質免疫原と組み合わせて用いる。免疫後７〜１０回採血をして、免疫応答の力価および特異性をモニタリングする。一旦、適切な反応性および特異性（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよび免疫沈降分析によって決定）を得ると、次いで、当該分野で周知の確立された手順で融合およびハイブリドーマ生成を行う（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）。
【０２２８】
代表的な特定のプロトコールにおいて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質（８４Ｐ２Ａ９タンパク質を包含する）を合成して、免疫原として用いる。ＢａｌｂＣマウスを、最初に、完全フロイントアジュバント中に混合された、１０〜５０μｇのＧＳＴ−８４Ｐ２Ａ９融合タンパク質を用いて腹腔内に免疫する。引き続いて、フロイントの不完全アジュバント中に混合された１０〜５０μｇのＧＳＴ−８４Ｐ２Ａ９タンパク質で２週間毎に、全部で３回マウスに免疫を行う。全長８４Ｐ２Ａ９タンパク質に対する、免疫マウス由来血清の反応性を、２９３Ｔ細胞から発現されたＨＩＳタグ化８４Ｐ２Ａ９タンパク質の部分的精製調製物を用いて、ＥＬＩＳＡによってモニタリングする（実施例５）。最強の反応性を示すマウスを、３週間休息させ、そしてＰＢＳ中の融合タンパク質の最後の注射をし、次いで４日後に屠殺する。次いで屠殺マウスの脾臓を回収し、そして標準的な手順を用いてＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。ＨＡＴ選択の後、増殖ウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによりスクリーニングし、８４Ｐ２Ａ９特異的抗体産生クローンを同定する。
【０２２９】
８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体の結合親和性は、標準的な技術を用いて測定し得る。親和性測定は、エピトープ結合に対する抗体の強さを定量し、そしてどの８４Ｐ２Ａ９モノクローナル抗体が診断または治療使用に好適であるかを規定するのを補助するために用いられ得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するための好適な方法である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、生体分子相互作用をリアルタイムでモニターするために、表面プラスモン共鳴を用いる（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ．１９９１、Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ、１９９８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９５：２６８）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を首尾良く生成する。
【０２３０】
（実施例１０：８４Ｐ２Ａ９機能のインビトロアッセイ）
前立腺癌における８４Ｐ２Ａ９の発現は、この遺伝子が腫瘍進行において機能的役割を有するという証拠を提供する。８４Ｐ２Ａ９は、腫瘍形成または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制するのに関与する活性化合物遺伝子に関与する転写因子として機能する可能性がある。８４Ｐ２Ａ９機能は、インビトロアプローチを用いて哺乳動物細胞中で評価され得る。哺乳動物発現については、８４Ｐ２Ａ９は、ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−タグ（実施例５）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）を含む多くの適切なベクター中にクローン化され得る。このような発現ベクターを用い、８４Ｐ２Ａ９は、ＮＩＨ３Ｔ３、ｒａｔ−１、ＴｓｕＰｒ１および２９３Ｔを含むいくつかの細胞株で発現され得る。８４Ｐ２Ａ９の発現は、抗−８４Ｐ２Ａ９抗体を用いてモニターされ得る（実施例４および９を参照のこと）。
【０２３１】
８４Ｐ２Ａ９を発現する哺乳動物細胞株は、いくつかのインビトロおよびインビボアッセイで試験され得、これには、組織培養中の細胞増殖，アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成、および膜侵襲培養系を用いるインビトロ侵襲（ＭＩＣＳ）（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：４４９−４５７）が含まれる。８４Ｐ２Ａ９細胞表現型を、８４Ｐ２Ａ９の発現を欠く細胞の表現型と比較する。８４Ｐ２Ａ９の転写効果は、遺伝子アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および転写レポーターアッセイ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて遺伝子発現上の８４Ｐ２Ａ９の効果を評価することによって試験され得る。
【０２３２】
８４Ｐ２Ａ９を発現する細胞株はまた、マトリゲルでコートされた多孔性膜チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通る細胞の通過を測定することにより、侵襲および遊走性質の改変についてアッセイされ得る。対辺への膜を通じる細胞の通過は、カルセイン−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を負荷したインジケーター細胞を用いる蛍光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃４２８）を用いてモニターされる。分析された細胞株は、親および８４Ｐ２Ａ９過剰発現ＰＣ３、ＮＩＨ３Ｔ３ならびにＬＮＣａＰ細胞を含む。８４Ｐ２Ａ９発現細胞が化学誘引物質の性質を有するか否かを決定するために、インジケーター細胞を、コントロール培地に比較して８４Ｐ２Ａ９馴化培地の勾配に向かう多孔性膜を通じる通過についてモニターする。このアッセイをまた使用して、候補の癌治療組成物による８４Ｐ２Ａ９で誘導される効果の特異的中和を定性および定量し得る。
【０２３３】
８４Ｐ２Ａ９の機能は、上記の種々の機能的アッセイ（例えば、成長、侵襲および移動）と連結された抗アンチセンスＲＮＡ技術を用いて評価され得る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを、８４Ｐ２Ａ９発現細胞中に導入し得、それによって８４Ｐ２Ａ９の発現を防ぐ。コントロールおよびアンチセンス含有細胞を、増殖、侵襲、移動、アポトーシスおよび転写能力について分析し得る。８４Ｐ２Ａ９発現の損失の局所および全身効果が評価され得る。
【０２３４】
（実施例１１：８４Ｐ２Ａ９腫瘍成長促進に対するインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する８４Ｐ２Ａ９タンパク質の影響は、腫瘍を保有するマウス中の遺伝子過剰発現によりインビボで評価され得る。例えば、ＳＣＩＤマウスに、各脇腹上に、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたは８４Ｐ２Ａ９を含む、ＰＣ３、ＴＳＵＰＲ１、またはＤＵ１４５細胞のいずれかの１×１０６を皮下注射し得る。少なくとも以下の２つのストラテジーが用いられ得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、（アデノウイルス２のような）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリザルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、または例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で）の異種哺乳動物プロモーターから得られた構成的プロモーターのようなプロモーターの調節下の、構成的８４Ｐ２Ａ９発現、ならびに（２）（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で）ｅｃｄｙｓｏｎｅ、ｔｅｔなどのような、誘導性ベクター系の制御下の調節発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な腫瘍の出現時にモニターし、そして、経時的に、８４Ｐ２Ａ９発現細胞が、より速い速度で成長するか否か、および８４Ｐ２Ａ９発現細胞により生成される腫瘍が、改変された病原性の特徴（例えば、増大した転移、血管形成、化学的治療薬物に対して減少した応答性）を示すか否かを決定する。さらに、マウスに、１×１０５の同じ細胞を同所的に移植し得、８４Ｐ２Ａ９が、前立腺における局所成長に対する影響、または特に肺、リンパ節、および骨髄に特異的に転移する細胞の能力に対する影響を有するか否かを決定する。
【０２３５】
このアッセイはまた、（例えば、８４Ｐ２Ａ９内部抗体、８４Ｐ２Ａ９アンチセンス分子およびリボザイムのような）候補治療組成物の８４Ｐ２Ａ９阻害効果を決定するために有用である。
【０２３６】
（実施例１２：細胞の小画分中の８４Ｐ２Ａ９発現のウェスタン分析）
８４Ｐ２Ａ９の配列分析は、核局在化シグナルの存在を示した。８４Ｐ２Ａ９の細胞位置は、細胞生物学で広く用いられる細胞下分画技法を用いて評価され得る（Ｓｔｏｒｒｉｅ  Ｂら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８２：２０３−２５）。前立腺細胞株または精巣細胞株は、核、細胞質ゾルおよび膜画分に分離され得る。異なる画分中の８４Ｐ２Ａ９発現は、ウェスタンブロッティング技法を用いて試験され得る。
【０２３７】
あるいは、８４Ｐ２Ａ９の細胞下局在化を決定するために、２９３Ｔ細胞を、ＨＩＳタグ８４Ｐ２Ａ９をコードする発現ベクター（ＰＣＤＮＡ  ３．１  ＭＹＣ／ＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトし得る。このトランスフェクト細胞を回収し、そして先に記載のように（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、Ｐ．Ａ．ら、１９９７、Ｊ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１６９７−１７０６）、差示的細胞下分画プロトコルに供し得る。このプロトコルは、細胞を、核、重膜（リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリア）、軽膜（原形質膜および小胞体）、および可溶性タンパク質について濃縮された画分に分割する。
【０２３８】
本出願を通じて、種々の刊行物が（例えば、括弧内に）参照されている。これらの刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【０２３９】
本発明は、本明細書に開示の実施の形態により範囲を限定されるべきではなく、これらは、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価である任意のものは、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のこれらに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、先行する記述および教示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内に同様に入ることが意図される。このような改変またはその他の実施の形態は、本発明の真の範囲および思想から逸脱することなく実施され得る。
【０２４０】
（表）
（表１：８４Ｐ２Ａ９タンパク質由来のペプチドの、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２に対する推定結合）
【０２４１】
【表１】
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表３〜１６は、８４Ｐ２Ａ９タンパク質由来のペプチドの、種々のＨＬＡ分子に対する推定結合のさらなる分析を提供する。
【０２４２】
（表２：アミノ酸置換マトリックス）
ＧＣＧソフトウェア  ９．０  ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（ブロック置換マトリックス）から改作した。値が高いほど、置換は関連する天然のタンパク質中に見出される可能性が高い。
【０２４３】
【表２】
0005501550.tif 000003
【０２４４】
【表３】
0005501550.tif 000004
（表３Ａ）
【０２４５】
【表４】
0005501550.tif 000005
（表３Ｂ）
【０２４６】
【表５】
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（表４Ａ）
【０２４７】
【表６】
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（表４Ｂ）
【０２４８】
【表７】
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（表５Ａ）
【０２４９】
【表８】
0005501550.tif 000009
（表５Ｂ）
【０２５０】
【表９】
0005501550.tif 000010
（表６Ａ）
【０２５１】
【表１０】
0005501550.tif 000011
（表６Ｂ）
【０２５２】
【表１１】
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（表７Ａ）
【０２５３】
【表１２】
0005501550.tif 000013
（表７Ｂ）
【０２５４】
【表１３】
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（表８Ａ）
【０２５５】
【表１４】
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（表８Ｂ）
【０２５６】
【表１５】
0005501550.tif 000016
（表９Ａ）
【０２５７】
【表１６】
0005501550.tif 000017
（表９Ｂ）
【０２５８】
【表１７】
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（表１０Ａ）
【０２５９】
【表１８】
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（表１０Ｂ）
【０２６０】
【表１９】
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（表１１Ａ）
【０２６１】
【表２０】
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（表１１Ｂ）
【０２６２】
【表２１】
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（表１２Ａ）
【０２６３】
【表２２】
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（表１２Ｂ）
【０２６４】
【表２３】
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（表１３Ａ）
【０２６５】
【表２４】
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（表１３Ｂ）
【０２６６】
【表２５】
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（表１４Ａ）
【０２６７】
【表２６】
0005501550.tif 000027
（表１４Ｂ）
【０２６８】
【表２７】
0005501550.tif 000028
（表１５Ａ）
【０２６９】
【表２８】
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（表１５Ｂ）
【０２７０】
【表２９】
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（表１６Ａ）
【０２７１】
【表３０】
0005501550.tif 000031
（表１６Ｂ）
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１は、長さ約４２５ヌクレオチドの、８４Ｐ２Ａ９の抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＳＨ）ＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。この配列は、種々のアンドロゲン依存性ＬＡＰＣ異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ異種移植片由来のｃＤＮＡの比較において同定された。
【図２Ａ】図２は、８４Ｐ２Ａ９のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。下記の実施例２を参照のこと。開始ＡＴＧ（ＡＡＣ  ＡＴＧ  Ｇ）（配列番号４）の周辺の配列は、Ｋｏｚａｋ配列（Ａは−３位、そしてＧは＋１位）を示す。Ｋｏｚａｋ配列の開始メチオニンを太字で示し、核局在シグナルを四角で囲んだ。
【図２Ｂ】図２Ａの続き。
【図２Ｃ】図２Ｂの続き。
【図２Ｄ】図２Ｃの続き。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、８４Ｐ２Ａ９（配列番号２）とＫＩＡＡ１５５２（配列番号５）およびＬＵＣＡ１５（配列番号６）のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。図３Ａは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列（下線）が、ヒト脳タンパク質ＫＩＡＡ１１５２に対するいくらかの相同性を有することを示す（３３７アミノ酸領域にわたり３９．５％同一性、スコア：４０７．０；ギャップ頻度：５．９％）。図３Ｂは、８４Ｐ２Ａ９タンパク質配列（下線）が、ＬＵＣＡ１５癌抑制遺伝子タンパク質の一部に対して相同なドメインを含むことを示す（４２アミノ酸領域にわたり６４．３％同一性、スコア：１３８．０；ギャップ頻度：０．０％）。
【図３Ｂ】図３Ａの続き。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、種々の正常ヒト組織（プローブとして８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントを使用）およびＬＡＰＣ異種移植片における、８４Ｐ２Ａ９の限定された発現のノーザンブロット分析を示す。複数の組織の２つのノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（図４Ａおよび４Ｂ）ならびに異種移植片ノーザンブロット（図４Ｃ）は、８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントで検査した。図４Ａのレーン１〜８は、それぞれ心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のｍＲＮＡからなる。図４Ｂのレーン１〜８は、それぞれ脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および白血球由来の総ＲＮＡからなる。図４Ｃのレーン１〜５は、それぞれ前立腺、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＩ由来のｍＲＮＡからなる。キロベース（ｋｂ）でのサイズ標準を、脇に示す。各レーンは、正常組織について２μｇのｍＲＮＡを、そして異種移植片組織について１０μｇの総ＲＮＡを含む。この結果は、８４Ｐ２Ａ９の精巣および前立腺ならびにＬＡＰＣ異種移植片における発現を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、種々の正常ヒト組織（プローブとして８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントを使用）およびＬＡＰＣ異種移植片における、８４Ｐ２Ａ９の限定された発現のノーザンブロット分析を示す。複数の組織の２つのノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（図４Ａおよび４Ｂ）ならびに異種移植片ノーザンブロット（図４Ｃ）は、８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントで検査した。図４Ａのレーン１〜８は、それぞれ心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のｍＲＮＡからなる。図４Ｂのレーン１〜８は、それぞれ脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および白血球由来の総ＲＮＡからなる。図４Ｃのレーン１〜５は、それぞれ前立腺、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＩ由来のｍＲＮＡからなる。キロベース（ｋｂ）でのサイズ標準を、脇に示す。各レーンは、正常組織について２μｇのｍＲＮＡを、そして異種移植片組織について１０μｇの総ＲＮＡを含む。この結果は、８４Ｐ２Ａ９の精巣および前立腺ならびにＬＡＰＣ異種移植片における発現を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、種々の正常ヒト組織（プローブとして８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントを使用）およびＬＡＰＣ異種移植片における、８４Ｐ２Ａ９の限定された発現のノーザンブロット分析を示す。複数の組織の２つのノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（図４Ａおよび４Ｂ）ならびに異種移植片ノーザンブロット（図４Ｃ）は、８４Ｐ２Ａ９  ＳＳＨフラグメントで検査した。図４Ａのレーン１〜８は、それぞれ心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のｍＲＮＡからなる。図４Ｂのレーン１〜８は、それぞれ脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および白血球由来の総ＲＮＡからなる。図４Ｃのレーン１〜５は、それぞれ前立腺、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＩ由来のｍＲＮＡからなる。キロベース（ｋｂ）でのサイズ標準を、脇に示す。各レーンは、正常組織について２μｇのｍＲＮＡを、そして異種移植片組織について１０μｇの総ＲＮＡを含む。この結果は、８４Ｐ２Ａ９の精巣および前立腺ならびにＬＡＰＣ異種移植片における発現を示す。
【図５】図５は、前立腺および複数の癌細胞株における８４Ｐ２Ａ９発現のノーザンブロット分析を示す。レーン１〜５６は、それぞれＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ、ＬＡＰＣ−９  ＡＩ、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＴｓｕＰｒ１、ＬＡＰＣ−４  ＣＬ、ＨＴ１１９７、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ−ＵＣ−３、ＴＣＣＳＵＰ、Ｊ８２、５６３７、２３９Ｔ、ＲＤ−ＥＳ、ＰＡＮＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＨＡＰＣ、Ｃａｐａｎ−１、ＳＫ−ＣＯ−１、ＣａＣｏ−２、ＬｏＶｏ、Ｔ８４、Ｃｏｌｏ−２０５、ＫＣＬ  ２２、ＰＦＳＫ−１、Ｔ９８Ｇ、ＳＫ−ＥＳ−１、ＨＯＳ、Ｕ２−ＯＳ、ＲＤ−ＥＳ、ＣＡＬＵ−１、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１４６、７６９−Ｐ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＳＷ８３９、ＢＴ２０、ＣＡＭＡ−１、ＤＵ４４７５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＮＴＥＲＲＡ−２、ＮＣＣＩＴ、ＴＥＲＡ−１、ＴＥＲＡ−２、Ａ４３１、ＨｅＬａ、ＯＶ−１０６３、ＰＡ−１、ＳＷ６２６およびＣＡＯＶ−３における発現を示す。高レベルの８４Ｐ２Ａ９発現は、脳（ＰＦＳＫ−１、Ｔ９８Ｇ）、骨（ＨＯＳ、Ｕ２−ＯＳ）、肺（ＣＡＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１４６）、および腎臓（７６９−Ｐ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＳＷ８３９）癌細胞株において検出された。中程度の発現レベルは、膵臓（ＰＡＮＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＨＰＡＣ、ＣＡＰＡＮ−１）、結腸（ＳＫ−ＣＯ−１、ＣＡＣＯ−２、ＬＯＶＯ、ＣＯＬＯ−２０５）、骨（ＳＫ−ＥＳ−１、ＲＤ−ＥＳ）、乳房（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ）および精巣癌（ＮＣＣＩＴ）細胞株のいくつかにおいて検出された。
【図６】図６は、前立腺癌患者サンプルにおける８４Ｐ２Ａ９発現のノーザンブロット分析を示す。前立腺癌患者サンプルは、前立腺組織の正常な部分および腫瘍部分の両方における８４Ｐ２Ａ９の発現を示す。レーン１〜７は、それぞれ正常前立腺、患者１の正常隣接組織、患者１のグリーソン９腫瘍、患者２の正常隣接組織、患者２のグリーソン７腫瘍、患者３のグリーソン７腫瘍を示す。これらの結果は、８４Ｐ２Ａ９が、前立腺癌において、そして潜在的には他の癌においてアップレギュレートされる、まさに精巣特異的遺伝子であるという証拠を提供する。従って、ＭＡＧＥ抗原と同様に、８４Ｐ２Ａ９は癌の精巣の抗原として適当であり得る（Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１−８６、１９９７）。
【図７】図７は、腎臓癌患者から得られた腎臓癌（Ｔ）およびその隣接正常組織（Ｎ）から単離されたＲＮＡを示す。レーン１〜１５は、それぞれ７６９−Ｐ−クリアな細胞型；Ａ４９８−クリアな細胞型；ＳＷ８３９−クリアな細胞型；正常腎臓；患者１、Ｎ；患者１、腫瘍：患者２、Ｎ；患者２、腫瘍、クリアな細胞型、分類ＩＩＩ；患者３、Ｎ；患者３、腫瘍、クリアな細胞型、分類ＩＩ／ＩＶ；患者４、Ｎ；患者４、腫瘍、クリアな細胞型、分類ＩＩ／ＩＶ；患者５、Ｎ；患者５、腫瘍、クリアな細胞型、分類ＩＩ；および患者６、腫瘍、胸部への転移、を示す（Ｎ＝正常な隣接組織およびＣＬ＝細胞株）。ノーザン分析を、各サンプルについて１０μｇの総ＲＮＡを使用して実施した。８４Ｐ２Ａ９の発現は、試験した６つの腫瘍サンプル全て、ならびに３つの腎臓細胞株７６９−Ｐ、Ａ４９８およびＳＷ８３９において観察された。
【図８】図８は、結腸癌患者から得られた結腸癌組織（Ｔ）およびその隣接する正常組織（Ｎ）から単離されたＲＮＡを示す。レーン１〜１１は、Ｃｏｌｏ２０５；ＬｏＶｏ；Ｔ８４；Ｃａｃｏ−２；患者１、Ｎ；患者１、腫瘍分類２、Ｔ３Ｎ１Ｍｘ（リンパ節転移について陽性）；患者２、Ｎ；患者２、腫瘍、分類１、Ｔ２Ｎ０Ｍｘ；患者３、Ｎ；患者３、腫瘍、分類１、Ｔ２Ｎ１Ｍｘ（リンパ節転移について陽性）；および患者４、腫瘍、分類２、Ｔ３  Ｎ１  ＭＸ（リンパ節転移について陽性）をそれぞれ示す（Ｎ＝正常な隣接組織およびＣＬ＝細胞株）。ノーザン分析を、各サンプルについて総ＲＮＡの１０μｇを使用して実施した。８４Ｐ２Ａ９の発現は、試験された４つの腫瘍サンプル全てにおいて、ならびに４つの結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５、ＬｏＶｏ、Ｔ８４およびＣａｃｏ−２において観察された。
【図９】図９は、アッセイされた８４Ｐ２Ａ９の発現を、ヒト癌（Ｔ）およびそのそれぞれに対応する正常組織（Ｎ）のパネルにおけるＲＮＡドットブロットで示す。癌細胞株は、左から右に、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、Ｋ５６２（ＣＭＬ）、ＨＬ−６０（ＰＭＬ）、Ｇ３６１（黒色腫）、Ａ５４９（肺癌）、ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）、ＳＷ４８０（結腸直腸癌）およびＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）である。８４Ｐ２Ａ９発現は、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、子宮頸癌および直腸癌において観察された。８４Ｐ２Ａ９はまた、癌細胞株、特にＭＯＬＴ−４リンパ芽球性白血病細胞株およびＡ５４９肺癌腫細胞株のパネルにおいて高度に発現することが見出された。発現は、（疾患組織から単離した）正常な隣接組織において検出されたが、健康なドナーから単離した正常な組織においては検出されなかった。この発現は、これらの組織が完全には正常でないこと、そして８４Ｐ２Ａ９が腫瘍の初期段階において発現され得ることを示し得る。
【図１０】図１０は、膀胱癌患者の検体における８４Ｐ２Ａ９の発現を示す。８４Ｐ２Ａ９の発現は、試験された膀胱癌患者の４つの検体において、ならびに３つの膀胱細胞株（ＣＬ）、ＵＭ−ＵＣ−３（レーン１）、Ｊ８２（レーン２）およびＳＣＡＢＥＲ（レーン３）において観察された。ＲＮＡは、６人の膀胱癌患者（Ｐ）から得られた正常な膀胱（Ｎｂ）、膀胱腫瘍（Ｔ）およびその隣接組織（Ｎ）から単離された。Ｐ１由来の腫瘍は、遷移性癌腫、分類４；Ｐ２は、浸襲性扁平上皮癌腫；Ｐ３は、遷移性癌腫、分類３；Ｐ４は、非浸襲性乳頭状癌腫、分類１／３；Ｐ５は、乳頭状癌腫、分類３／３；およびＰ６は、遷移性癌腫、分類３／２である。ノーザンブロット分析を、各サンプルについて１０μｇの総ＲＮＡを使用して実施した。
【図１１】図１１は、２９３Ｔ細胞における８４Ｐ２Ａ９タンパク質の発現を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｖ５−ＨＩＳエピトープタグ化８４Ｐ２Ａ９プラスミドまたは空のコントロールベクターのいずれかで、一過的にトランスフェクトし、そして２日後に回収した。細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶解し、そしてその溶解産物を１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、次いでニトロセルロースに移した。このブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）＋２％無脂肪乳中でブロッキングし、次いでマウス抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＢＳ＋０．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％乳での１：３，０００希釈で探査した。このブロットを洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化二次抗体の１：４，０００希釈と共にインキュベートした。洗浄後、抗Ｖ５エピトープ免疫反応性バンドを、増強された化学発光によって発光させ、そしてオートラジオグラフィーフィルムに曝露することによって可視化した。矢印によって示されるのは、トランスフェクトした細胞におけるエピトープタグ化８４Ｐ２Ａ９タンパク質の発現に対応する、約８７Ｋｄの特異的抗Ｖ５免疫反応性バンドである。
【図１】
0005501550.tif 000032
【図２Ａ】
0005501550.tif 000033
【図２Ｂ】
0005501550.tif 000034
【図２Ｃ】
0005501550.tif 000035
【図２Ｄ】
0005501550.tif 000036
【図３Ａ】
0005501550.tif 000037
【図３Ｂ】
0005501550.tif 000038
【図４Ａ】
0005501550.tif 000039
【図４Ｂ】
0005501550.tif 000040
【図４Ｃ】
0005501550.tif 000041
【図５】
0005501550.tif 000042
【図６】
0005501550.tif 000043
【図７】
0005501550.tif 000044
【図８】
0005501550.tif 000045
【図９】
0005501550.tif 000046
【図１０】
0005501550.tif 000047
【図１１】
0005501550.tif 000048
【配列表】
0005501550000001.app