(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生され、一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応をすることを特徴とする抗アネキシンＶモノクローナル抗体。
【請求項２】
微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されるハイブリドーマ細胞系であって、アネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有し、且つ一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生する能力を有するものであることを特徴とするハイブリドーマ細胞系。
【請求項３】
微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生される第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を含む第一試薬と、前記グループから選択された他のハイブリドーマ細胞系によって産生され、標識されている第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を含む第二試薬とを備えており、前記両試薬の抗体は、人間の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応するものであり、ここで、アネキシンＶ抗原は一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶであることを特徴とする心筋梗塞及び狭心症の診断剤。
【請求項４】
第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系によって産生される抗アネキシンＶモノクローナル抗体であり、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識することによって作られたものである抗アネキシンＶモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３に記載の心筋梗塞および狭心症の診断剤。
【請求項５】
第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体であり、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識することで産生されたものである抗アネキシンＶモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３に記載の心筋梗塞および狭心症の診断剤。
【請求項６】
採取された試料中のヒトアネキシンＶと、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生された第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体とを抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成する段階、形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体のヒトアネキシンＶの抗原部位に、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を結合させて、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と結合した前記アネキシンＶ抗原抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体の標識体を形成する段階、及び前記複合体の標識体を定量的に分析する段階を備えており、
ここで、前記標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体とは異なる第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識させて作られ、且つ微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されるハイブリドーマ細胞系によって産生されたものであることを特徴とする試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法。
【請求項７】
第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系によって産生され、ヒトアネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有することを特徴とする請求項６に記載の試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法。
【請求項８】
第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系によって産生され、ヒトアネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有することを特徴とする請求項６に記載の試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法。
【請求項９】
標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識することにより作られ、ヒトアネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有することを特徴とする請求項６に記載の試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法。
【請求項１０】
標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識することにより作られ、ヒトアネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有することを特徴とする請求項６に記載の試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒト及び哺乳動物の血液、血漿及び／又は血清中に存在する蛋白質アネキシンＶの蛋白質上の抗原決定部位に対し結合特異性を有する抗アネキシンＶモノクローナル抗体に関し、特に、ヒト心筋に存在し、心筋梗塞及び狭心症のマーカーであるヒトアネキシンＶの血液、血漿及び／又は血清中の濃度を、免疫測定法により測定することが可能な、ヒトアネキシンＶ測定用の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関し、特に、心筋梗塞及び狭心症のマーカーであるヒト心筋アネキシンＶの検出及び定量に使用されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
さらに、本発明は、試料中のアネキシンＶの検出方法に関し、特に、血漿及び／又は血清中の心筋梗塞及び狭心症のマーカーであるヒト心筋アネキシンＶを検出または定量する方法に関する。さらにまた、本発明は、血漿及び／又は血清中のヒト心筋アネキシンＶならびにこれらの検出及び定量に用いられるモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
また、本発明は、ヒト及び哺乳動物のアネキシンＶ測定用の抗アネキシンＶモノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系についの開発及びその利用に関するものであり、特に、例えば、心筋梗塞などの急激な細胞壊死を起こす疾患及び虚血性障害を示す狭心症についての迅速な診断を、細胞又は血液中のタンパク質のアネキシンＶ濃度を測定することによって行うことができるヒトアネキシンＶ診断用の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の開発及びその利用に関するものである。
背景技術
アネキシンは、ヒトや種々の動物の組織及び細胞に存在するカルシウム結合タンパク質で、細胞質の可溶成分に存在する。このタンパク質は、アミノ酸配列よりファミリーを形成しており、現在、アネキシンＩ〜XIIが知られている。このタンパク質は、リン脂質やアクチンとカルシウム濃度に依存して結合し、抗炎症作用及び抗血液凝固作用があることが知られている。
組織又は細胞が壊死を起こした患者の場合、例えば心筋梗塞の場合、壊死した心筋細胞内に含まれる種々の物質が血液内に漏出する。現在、このように血中に漏出した種々の物質、所謂心筋梗塞マーカーを測定して、急性心筋梗塞の診断が行われている。
このような急性心筋梗塞の診断に使用される生化学的検査法の測定対象の心筋梗塞マーカーは、ＬＤ−１、ＡＳＴ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、クレアチンキナーゼＭＢ分画（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ミオシン軽鎖Ｉ及びトロポニン−Ｔ（ＴｎＴ）などであるが、心筋梗塞の診断には、これら心筋梗塞マーカの検出結果又は定量値を単独又は組み合わせて用いられ、特に組み合わせて用いられるのが主流となっている。
虚血性心疾患の例えば急性心筋梗塞においては、発症後数時間で不整脈が現れ、不整脈死に至る虞れがあるために、心筋梗塞及び狭心症の治療は、早期診断及び早期治療が必要とされている。
しかし、これらの急性心筋梗塞の診断についての生化学的検査法の検査対象となる上記各種心筋梗塞マーカーは、何れも心筋から血中に逸脱するものであるが、該各種心筋梗塞マーカーの濃度が血液中の濃度がピークに達するまでに要する時間は、心筋梗塞の発作から８〜７８時間と報告されている。さらに、心筋梗塞マーカーの血中濃度が最も高値（ピーク）になるまでの時間は、被検者によっては、その時間がかなり相違し一定しないために、これらの心筋梗塞マーカーによる心筋梗塞の診断では、早期の心筋梗塞の診断が困難であり、患者に対する治療法を選択する際に、迅速に対応することができず、問題とされていた。
また、心筋梗塞の診断の確度を上げるために、複数の上記心筋梗塞マーカーの測定値を用いる場合には、上記の各種心筋梗塞の診断は、心筋梗塞マーカーの血中濃度が最も高値（ピーク）になるまでの時間が、かなり要する上に、被検者によって一定しないために、到底、心筋梗塞の患者を早期に治療することができず、問題とされていた。
心筋梗塞患者の治療には、早期診断及び早期治療が望まれるために、心筋梗塞の発作後、短時間で、血液、血漿及び／又は血清中の濃度がピークに達する心筋梗塞マーカー及び迅速な測定方法の出現が望まれていた。
また、狭心症については、生化学的検査法の検査対象となる狭心症のマーカー物質が、未だに確定されていないので、狭心症についての生化学的検査法による診断は、一般に困難とされており、狭心症についての生化学的検査法による診断が望まれていた。
本発明は、従来の心筋梗塞及び狭心症の早期の診断に係る生化学的検査法の問題点を解決することを目的としている。
発明の開示
本出願人は、ヒトの心筋に存在するタンパク質のアネキシンの中で、心筋細胞の可溶成分に存在し、クレアチンキナーゼの分子量（８１，０００）より小さい分子量を有するヒトアネキシンＶ（３５，０００）が、一般に、心筋梗塞及び狭心症の患者の早期の段階で、壊死した心筋から漏出するので、このヒトアネキシンＶに特異的に交差する新規なイヌ心筋アネキシンＶポリクローナル抗体を使用して、人の血液、血漿及び／又は血清中のヒトアネキシンＶ濃度を測定する方法並びに心筋梗塞及び／又は狭心症の診断方法を既に公開している（特開平７−７２１４７号公報参照）。
このように、ヒトアネキシンＶは、心筋梗塞による発作後、１乃至数時間で血液、血漿及び血清中の濃度がピークに達する新規心筋梗塞マーカーである。
そこで、本発明者らは、ヒトアネキシンＶを特異的に認識し、ヒトアネキシンＶを感度良く、簡便に、迅速に測定することが可能な測定法に適用しうる抗体を提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、従来の細胞融合の技術を応用して、抗ヒトアネキシンＶ抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを細胞融合させて得たハイブリドーマ細胞が安定した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生し、その抗体が前記の目的を達成できることを見いだし本発明を完成した。
本発明は、上記出願の発明を改良するものであり、心筋梗塞又は狭心症の発作後、短時間で心筋梗塞又は狭心症の診断を高い確度で行うことができる心筋梗塞及び／又は狭心症の診断剤及び診断法を提供すると共に、心筋梗塞マーカー又は狭心症マーカーを検出及び定量する検出物質並びにその製造方法及び利用方法を提供することを目的としている。
即ち、本発明は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生され、一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応をすることを特徴とする抗アネキシンＶモノクローナル抗体にあり、また、本発明は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されるハイブリドーマ細胞系であって、アネキシンＶ抗原蛋白質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有し、且つ一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生する能力を有するものであることを特徴とするハイブリドーマ細胞系にあり、さらに、本発明は、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生される第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を含む第一試薬と、前記グループから選択された他のハイブリドーマ細胞系によって産生され、標識されている第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を含む第二試薬とを備えており、前記両試薬の抗体は、人間の心臓に存在するアネキシンＶと交差反応するものであり、ここで、アネキシンＶ抗原は一種または二種以上の哺乳動物の心臓に存在するアネキシンＶであることを特徴とする心筋梗塞及び狭心症の診断剤にある。
また、本発明は、採取された試料中のヒトアネキシンＶと、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生された第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体とを抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成する段階と、形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体のヒトアネキシンＶの抗原部位に、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を結合させて、標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と結合した前記アネキシンＶ抗原抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体の標識体を形成する段階、及び前記複合体の標識体を定量的に分析する段階を備えており、ここで、前記標識された第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体とは異なる第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を標識させて作られ、且つ微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系からなるグループから選択されるハイブリドーマ細胞系によって産生されたものであることを特徴とする試料中のヒト心筋関連アネキシンＶの分析方法にある。
本発明において、抗原であるヒトアネキシンＶは、例えば３２〜３５Ｋダルトンの分子量を有する蛋白質であり、例えばヒト心臓に存在する蛋白質のヒトアネキシンＶである。
本発明において、ヒト心臓は、ヒト屍体のヒト心臓から摘出したものであり、活性を有するものが使用される。
このヒト心臓に存在するヒトアネキシンＶ蛋白質、即ち抗原蛋白質のヒトアネキシンＶは、心臓の可溶画分に存在し、ヒト屍体の心臓組織から、結合組織及び脂肪などを除去し精製される。本発明において、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は、リンパ球系細胞であり、ヒト心臓細胞から抽出され精製された抗原蛋白質のヒトアネキシンＶで免疫されたマウス等の哺乳動物のリンパ系の器官の脾臓（例えば、脾細胞、白脾髄等）やリンパ節（例えばリンパ小節）から調製された形質細胞への分化段階にある形質芽細胞を、骨髄腫細胞、即ちミエローマ細胞と細胞融合させて形成される。
本発明において使用されるミエローマ細胞株は、通常、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株、チミシンキナーゼ（ＴＫ）欠損株であり、ＨＧＰＲＴ欠損株としては、例えば、８−アザグアニン（８−ＡＧ）耐性株又は６−チオグアニン（６−ＴＧ）耐性株が使用することができ、またＴＫ欠損株としては、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）耐性株を使用することができる。
本発明において、細胞融合は、細胞融合促進剤を使用して行われる。本発明においては、主としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による細胞融合法が使用される。
しかし、本発明において使用することができる細胞融合促進剤（物質名又は商品名）としては、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ６０００、グルカム（Glucam）TMＥ−１０、グルカムTMＥ−２０、グルカムTMＰ−１０、ポリエチレングリコールメチルエステル（ＰＥＧ metyhl ester）（分子量：３５０、２０００及び５０００）、ＰＥＧ１０００、ポリグリコール（polyglycol）Ｐ１５−２００、プルロニクＦ３８ポリオールプリルド（Pluronic Ｆ３８ polyol Prilled）、デカグリセロール（Decaglycerol）、カプマル１０１ブチラート（Capmul １０１ Butyrate）、テトロニク３０４ポリオール（Tetronic ３０４ polyol）、トリグリセロール（Triglycerol）、ポリビニルピロリドン（Polyvinylpyrrolidone）（分子量：１０００）、グリセリンなどがある。
本発明において、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、抗原蛋白質のアネキシンＶで免疫されたマウス等の他の動物種のリンパ系器官から取り出されたリンパ球の形質芽細胞球とミエローマ細胞とを融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成し、この形成されたハイブリドーマ細胞を、例えばＨＡＴ培地を使用して培養することにより、前記得られたハイブリドーマ細胞系、例えば、微生物の寄託の国際寄託当局（工業技術院生命工業技術研究所）の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４及び受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７を産生するハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株及びＨＤＡ−９０７を選択的に増殖することにより得られる。
このような、ハイブリドーマ細胞系の選択法としては、ＨＡＴ選択法やウワバイン選択法等がある。
本発明において、前記抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、前記ハイブリドーマ細胞クローンを、通常の培養方法、例えば高密度培養方法又はスピンナーフラスコ培養方法等による培養し、その培養上清より、プロテインＡ結合担体又は抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することにより得られる。
また、本発明において、前記抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、前記培養して得られたハイブリドーマ細胞系を、予めプレステン処理した同系マウスの腹腔内に注射し、このハイブリドーマ細胞系により誘発された腹水を、硫安または硫酸ナトリウムにより塩析した後、ＤＥＡＥセルロースによるイオン交換クロマトグラフィーにより免疫グロブリン（ＩｇＧ）画分として精製することにより、得ることができる。
本発明において、ハイブリドーマ細胞系とは、細胞融合されたハイブリドーマ細胞はもとより、初代培養以後のハイブリドーマ細胞を意味するものである。
本発明において、得られるハイブリドーマ細胞系のスクリーニングは、ハイブリドーマが培養液中に分泌する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を、例えばイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エライザ（ＥＬＩＳＡ）法等により検出することにより行われる。
本発明において、得られるハイブリドーマ細胞系のスクリーニングの過程で、ヒトアネキシンＶ抗原に対し、異なる特異的反応性を有する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体が複数種得られることが分かった。
抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を得るのと同様な方法で、イヌ等の哺乳動物のアネキシンＶ抗原を、哺乳動物に免疫し、このリンパ細胞とミエローマ細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞系を得ることにより、イヌ等の哺乳動物のアネキシンＶ抗原の抗原決定部位に対し特異的反応性を有する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明において、抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体以外に、これら哺乳動物の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を意味する。
このようにして、スクリーニングにより抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体が分泌することが確認されたハイブリドーマ細胞系について、クローニングが行われる。
本発明において、ハイブリドーマ細胞系のクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、セルソータ法等により行うことができる。
このようにして抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が得られたところで、この得られたハイブリドーマ細胞系をインビトロ（in vitro）で大量培養を行い、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生する。
本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、蛋白質抗原のヒトアネキシンＶの抗原決定部位に対し特異的反応性を有しており、前記抗原蛋白質のヒトアネキシンＶに対して抗原抗体反応を行う性質を有する抗体であり、人の血液、血漿及び／又は血清中に存在する抗原蛋白質のヒトアネキシンＶに結合して、例えばイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エライザ（ＥＬＩＳＡ）法等により、人の血液、血漿／及び又は血清中のヒトアネキシンＶを、高い特異性及び感度で検定及び／又は定量することができる。
本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、人の心臓に存在するタンパク質のヒトアネキシンＶの抗原決定部位に対し特異的反応性を有しており、人の血液、血漿及び／又は血清中に存在する抗原蛋白質のヒトアネキシンＶに結合して、例えばイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エライザ（ＥＬＩＳＡ）法等により、人の血液、血漿及び／又は血清中のヒトアネキシンＶを、高い特異性及び感度で検定及び／又は定量することができる。
本発明において、健康正常人の血漿中のヒトアネキシンＶ濃度は、例えば高くて５．６ｎｇ／ｍｌであるのに対して、心筋梗塞では、ＣＫ値が正常値を示している段階でも、ヒトアネキシンＶ値は、例えば９０ｎｇ／ｍｌと高く、また狭心症においても、ＣＫ値が正常値を示している段階でも、ヒトアネキシンＶの値は２９ｎｇ／ｍｌと高く、ＣＫ値による診断に比して、早期の段階の診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−１５５Ｈにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−２９０により産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図２は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する他の一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−１５５Ｈにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−５７ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図３は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１及び図２に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−１５５Ｈにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−２９３ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図４は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１ないし図３に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−１５５Ｈにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−３５０ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図５は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１ないし図４に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６６０ＨＤにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−２９０ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図６は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１ないし図５に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６６０ＨＤにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−５７ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図７は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１ないし図６に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６６０ＨＤにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−２９３ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、縦軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図８は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法により８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの濃度を測定する図１ないし図７に示す実施例とは異なる一実施例における検量線図であり、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６６０ＨＤにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗体ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−３５０ＨＤＲにより産生され、ヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図９は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法によりネイティブなヒトアネキシンＶの濃度を測定する一実施例における検量線図であり、抗イヌ３２ＫＰポリクローナルのＨＲＰＯ標識抗体と、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７により産生され、ネイティブなヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図１０は、本発明の一実施例の、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７を一次抗体とし、抗マウスイムノグロブリンのＨＲＰＯ標識抗体を二次抗体として適用する間接酵素抗体法によるヒト心筋組織の特異染色を示し、組織染色されたヒト心筋組織を２００倍に拡大して示す顕微鏡写真であり、突然死したヒト心臓において、ヒトアネキシンＶが細胞質で不均一な凝集となって染色されていることを示す。
図１１は、図１０の実施例に対する比較例を示すヒト心筋組織の２００倍に拡大した顕微鏡写真である。抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＣＡ−６２７を使用しない場合には、ヒトアネキシンＶが染色されないので、その局在を確認することができないことを示す。
図１２は、本発明の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を適用するエライザ法によりネイティブなヒトアネキシンＶ濃度を測定する一実施例における検量線図であり、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６の抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＤＡ−９０７により産生され、アネキシンＶと特異的に反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７により産生され、ネイティブなヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法の検量線図である。
本図において、縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた吸光度を示し、横軸にネイティブヒトアネキシンＶ濃度を示しており、○印は４回測定における差吸光度の平均値を示し、○印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図１３は、本発明の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を適用し、ネイティブなヒトアネキシンＶ濃度を測定するエライザ系（抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＤＡ−９０７（微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６）により産生され、アネキシンＶと特異的に反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７（微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４）により産生され、ネイティブなヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせ）を用いて実施した血漿検体の希釈試験の一例を示す。
本図において、縦軸に各血漿検体の原液及びその希釈系列を資料として測定したヒトアネキシンＶ抗原濃度を示し、横軸に各検体の１／希釈倍数を示している。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施の態様について、以下に例を挙げて説明するが、本発明は、以下の例示及び説明により何等限定されるものではない。
以下の実施例において、記号Ｍはモル濃度を意味し、混合物溶液においては、各Ｍ（モル濃度）は混合物溶液１リットル中のモル濃度を意味する。
例１．ハイブリドーマの作製方法
（１）ヒトアネキシンＶの精製
ヒト成人の屍体から心臓を摘出し、血液を除いた後、左心室心臓を取出し、結合組織及び脂肪を取り除いた。これらの操作は、氷上又は４℃の温度下で行われた。この心臓に、心臓重量当たり１０倍量の次の組成の緩衝液Ａ：
濃度２５０ｍＭ（ミリモル）のスクロース、
濃度０．５ｍＭのエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸塩（ＥＧＴＡ）、
濃度１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、
濃度１０ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ＨＣｌ、ｐＨ７．４
を加えて、ホモジナイザーによりホモジナイズし、このホモジネートを３０００×ｇで１５分間遠心分離した。この分離された上清に、最終濃度が２ｍＭになるように、濃度１ＭのＣａＣｌ2溶液を加えて混合し、この混合後、２８，０００×ｇで、１時間遠心分離し、その沈殿に、濃度１０ｍＭのＥＧＴＡを２ｍｌ加えて、該沈殿を懸濁させた。この沈殿の懸濁液を２８，０００×ｇで１時間遠心分離した。
この上清を、ゲル濾過カラムのファーマシア（Pharmacia）社製のセファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００（商品名）にかけて、濃度０．１ＭのＮａＣｌ及び濃度３０ｍＭのトリスＨＣｌを含むｐＨ７．４の緩衝液Ｂで溶出した。分子量が３５Ｋダルトン（Ｄａ）の蛋白質を含む画分を集めて、陰イオン交換カラム（バイオゲルアガロース：商品名）にかけ、濃度０乃至０．３Ｍの濃度範囲内のＮａＣｌを含有する濃度１０ｍＭのトリス塩酸溶液（ｐＨ：７．４）を溶離液として、ＮａＣｌ濃度に段階的に勾配をかけてグラジエント溶離することにより分離精製した。
このようにして精製されたヒトアネキシンＶは、二分して、一方は、凍結乾燥の後、濃度８Ｍの尿素（urea）を含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）で溶解し、他方は、凍結乾燥の後、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）で溶解し、共に、４℃で保存した。これらの精製ヒトアネキシンＶについては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により純度を測定し、蛋白濃度を定量した。
また、このようにして精製された蛋白質ヒトアネキシンＶを同定するために、リシルエンドペプチダーゼを加え、３７℃の温度下で、１５時間放置し、蛋白質ヒトアネキシンＶとリシルエンドペプチダーゼの反応により得られたペプチドを、島津製作所製ＰＰＳＱ−１０プロテインシークエンサー（protein sequencer）を使用して、エドマン法（Edman P.著『A method for the determination of the amino acid sequense in peptides』Arch Biochem Biophys、１９４９年発行、第２２巻、第４７５頁参照）によるアミノ酸配列分析を行い、二つのペプチド部分のアミノ酸配列を求めた。
前記精製された蛋白質のペプチドの二つの部分のアミノ酸配列は、一方が、Ｎ末端から、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕのアミノ酸配列であり、他方が、Ｎ末端から、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒであるところから、アネキシンＶと同定した。
（２）マウス
５乃至８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（温度２３＋１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
（３）免疫方法
上記例１で調製した精製ヒトアネキシンＶを１００μｇ／０．５ｍｌ取り、これに前記精製ヒトアネキシンＶと同量のフロイント完全アジュバント（Freund's complete adjuvant）を混合して乳化した。この乳化状のヒトアネキシンＶを抗原として、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に、精製ヒトアネキシンＶが１匹あたり１５〜４０μｇとなるように投与し、この投与を、２週間毎に、２カ月間続けて行いマウスを免疫した。この免疫の後、マウスの抗体価を測定し、抗体価の高いマウスを選んで、さらに３週間後に、精製ヒトアネキシンＶの５０μｇをマウス尾静脈より追加投与して最終免疫した。
（４）細胞融合
最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、この摘出した脾細胞をＥＭＥＭ培養液中に浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。
ついで、この脾細胞をＥＭＥＭ培養液（日水社製）で４回洗浄した後、細胞数を算定した。得られた脾細胞の生細胞数は、７×１０8個であった。
細胞融合は、２−アミノ−６−オキシ−８−アザプリン（８−アザグアニン）（2-amino-6-oxy-8azapuraine(8-Azaguanine)）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫由来培養細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。Ｘ６３細胞は、対数増殖期のＸ６３細胞を行い、非働化したウシ胎児血清（fetal calf serum）（インタジュン（Intergen）社製）（以下、ＦＣＳという）を濃度１０％で含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（濃度２０μｇ／ｍｌで８−アザグアニン含有）（ギブコ（GIBCO）社製）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない濃度１０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養した。この場合も、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定した。得られたＸ６３細胞の生細胞の細胞数は７×１０7個であった。
シグマ（Shigma）社製のポリエチレングリコールー４０００を、ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、濃度が５０％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して、細胞融合に使用した。
脾細胞とＸ６３細胞の比が１０：１となるように、脾細胞とＸ６３細胞を混合し、１５００ｒｐｍの回転数で５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞のペレットをよくほぐし、細胞融合に使用した。細胞融合は、前記調製の、３７℃に保温したポリエチレングリコールを用いて、ケーラー及びミルシュタイン共著：ネイチュア（Nature）第２５６巻、第４９５−４９７頁，１９７５年及びヨーロピアンジャーナルオブイムノロジ（Eur.J.Immunol）第６巻、第５１１−５１９頁，１９７６年）の方法により行われた。
ハイブリドーマが形成された細胞融合後の細胞系は、１０％濃度のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に濃度１×１０-4Ｍのヒポキサンチン、濃度４×１０-7Ｍのアミノプテリン及び濃度１．６×１０-5Ｍのチミジンが含有されているＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０6個／ｍｌとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μｌ宛、９６穴ウエルのマイクロテストプレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ2無菌培養器において、温度３７℃、湿度９５％、８％濃度のＣＯ2雰囲気で培養を行った。培養開始後、１日目と２日目に、ＨＡＴ培地を各ウエルに１滴ずつ添加し、また培養開始後７日目と９日目に、ＨＡＴ培地を各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日ないし２週間後に、濃度８Ｍの尿素処理したヒトアネキシンＶ（８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶ）及び／又は濃度８Ｍの尿素処理されていないヒトアネキシンＶ（ネイティブなヒトアネキシンＶ）と特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンを、抗原蛋白質の広アネキシンＶ吸収試験及び抗原蛋白質のヒトアネキシンＶを固相に吸着させたマイクロプレートを用いてエライザ法によるスクリーニングによって検索した。
また、樹立した総ての抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローン及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体を固相化し、さらに該クローンから産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体をビオチン化標識し、これらの得られたクローン及びポリクローナル抗体の固相と、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体のビオチン化標識抗体を組み合わせて構成されるヒトアネキシンＶ測定用エライザ法を、種々組み合わせることにより、８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶ、ネイティブなヒトアネキシンＶ及び濃度８Ｍの尿素処理されていないヒト血液、血清又は血漿中のネイティブなヒトアネキシンＶと特異的に反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するクローンの組み合わせを検索した。
（５）スクリーニング
培養開始後、１０日目より細胞のクローンが出現し、抗体産生の有無を確認するため、ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用いて、抗原蛋白質のヒトアネキシンＶの吸収試験をエライザ法により行った。
本発明者等は、ヒトアネキシンＶの抗原活性が、濃度８Ｍの尿素溶液により処理するすることによって、ネイティブなヒトアネキシンＶに比べ、後述の抗３２ＫＰポリクローナル抗体に対する抗原活性が有意に上昇することを見出したので、このヒトアネキシンＶの吸収試験には、８Ｍ濃度の尿素により処理したヒトアネキシンＶ抗原（以下、８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶという）及びこの尿素処理を施していないヒトアネキシンＶ抗原（以下、ネイティブなヒトアネキシンＶという）の両抗原を用いて吸収試験を行った。
即ち、８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶ抗原液（８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌとハイブリドーマ細胞系の培養上清の５０μｌとを複数のＵボトムのマイクロタイタープレートに入れた第１の組と、ネイティブなヒトアネキシンＶ抗原液（ネイティブなヒトアネキシンＶ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌとハイブリドーマ細胞系の培養上清の５０μｌとを他の複数のＵボトムのマイクロタイタープレートに入れた第２の組の夫々に、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体を結合させたセファロース４Ｂの濃度２０％懸濁液を５０μｌを加えて、室温で１時間撹拌した後１０分間静置する。次に、夫々の組について、抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂがウエルの底に完全に沈むのを確認して、その上清２５μｌを用いて該上清中に残存するヒトアネキシンＶの濃度を、ヒトアネキシンＶ−エライザ法で測定した。
この測定時に、ハイブリドーマ細胞系の培養上清中に、ヒトアネキシンＶに対する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体が存在する場合には、ヒトアネキシンＶと抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体とが反応し、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂが反応することによって、抗原抗体複合体が形成されて沈降し、上清中に残存するヒトアネキシンＶの濃度が減少するので、上清中に残存するヒトアネキシンＶの濃度を測定することにより、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の存在を確認することができる。
このようにして、抗原蛋白質のヒトアネキシンＶに対して反応する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体がスクリーニングされたところで、次に、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の反応するエピトープの相異を調べる試験を行った。
つまり、抗原液として１μｇ／ｍｌの濃度に調製した８Ｍ濃度尿素処理ヒトアネキシンＶ及びネイティブなヒトアネキシンＶを、夫々、各ウエル当たり、５０μｌづつ１マイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれらを、トゥイーン（Tween）系界面活性剤のＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％濃度で含む洗浄液のリン酸緩衝溶液（以下、ＰＢＳという）で３回洗浄し、さらに濃度１％のＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングして、ヒトアネキシンＶ抗原の固相化プレートを調製した。
このヒトアネキシンＶ抗原の固相化プレートと、上記ヒトアネキシンＶ吸収試験のスクリーニングの結果、ヒトアネキシンＶに反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系の培養上清とを、室温で１時間に亙って反応させた後、生成する抗原抗体複合物を、洗浄液で３回洗浄し、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰＯという）標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ由来）と室温で３０分反応させた。この反応の後、生成した抗原抗体複合物を洗浄液で４回洗浄し、この抗原抗体複合物を、濃度０．１Ｍのリン酸クエン酸緩衝液に、濃度２ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン及び濃度４ｍＭのＨ2Ｏ2を含ませたＯＰＤ基質液と室温で５分間反応させた後、この反応を濃度２ＮのＨ2ＳＯ4溶液で停止させ、その吸光度を、エライザ用プレートリーダーを使用して、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍを使用する二波長法により測定した。
主波長４９２ｎｍでは、結合した標識抗体により生成された基質の吸光度が測定され、また副波長によりマイクロタイタープレートの傷や汚れによる吸光度が検出される。したがって、主波長の吸光度より副波長の吸光度を差し引くことにより、固相に結合した抗原量に比例して結合した標識抗体の酵素量に応じた吸光度を測定することができる。
（６）各種臓器及び動物由来アネキシンＶ抗原感作固相との反応性の検討
次いで、このようにして得られた抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体について、人の各種臓器及び動物種由来のアネキシンＶに対する種特異性の検討を上記ヒトアネキシンＶ抗原の感作固相との反応性により検討した。
ヒトの各種臓器及び動物より精製したアネキシンＶについて、夫々、ｐＨ７．５の０．１Ｍ濃度のリン酸緩衝液で１μｇ／ｍｌとなるように調製し、各抗原液を９６穴ウエルのマイクロタイタープレートに５０μｌずつ分注し、４℃の温度下に一晩吸着させた後、洗浄液で２回洗浄し、ブロッキング液でブロッキングを行った。このようにして得られた各種アネキシンＶ抗原感作固相を、本実施例において得られた抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と反応させて、その反応生成物をスクリーニング方法と同様にエライザ法により測定して、夫々のアネキシンＶ抗原に対する本実施例において得られた抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の反応性を測定した。
（７）ウエスタンブロット法による反応特異性の検討
ヒト心筋、ヒト肝臓、ヒト腎臓、ヒト肺臓組織、ビーグル犬及びラット心筋のホモジネートした標品を１０〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、蛋白質画分を分画し、分画された蛋白質画分をニトロセルロースメンブレンに転写した後、３％濃度のスキムミルク（skim milk）、１％濃度のＲＳＡを含むＰＢＳでブロキングを行った。次いでこの蛋白質画分が固定されたメンブレンを各モノクローナル抗体と反応させて、各組織由来及び動物由来の反応する蛋白質画分について検討した。
（８）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系の樹立
上記の検討より、ヒト心筋アネキシンＶを用いた吸収試験により、８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶに反応するハイブリドーマ細胞系クローンが８４株スクリーニングされた。このうち、各種臓器由来のアネキシンＶ及び動物種由来のアネキシンＶに反応性の異なるクローン２１株を厳選し、その反応性に基づいて、２１株のクローンを次の（１）〜（５）の５グループに区分けした。即ち、
（ｉ）８Ｍ尿素処理ヒト心筋アネキシンＶの吸収試験で強い反応性を示し、何れの抗原感作固相とも反応を示さないクローン：５株（クローンＨＣＡ−２１２、クローンＨＣＡ−２９０、クローンＨＣＡ−６５６、クローンＨＣＡ−７１３及びクローンＨＣＡ−８０５）、
（ii）８Ｍ尿素処理ヒト心筋アネキシンＶの吸収試験で強い反応性を示し、かつヒトアネキシンＶ抗原感作固相と強い反応性を示し、ビーグル犬及びラット心筋由来のアネキシンＶ抗原感作固相と殆ど反応しないかあるいは弱い反応性を示すクローン：８株（クローンＨＣＡ−６９Ｈ、ＨＣＡ−１５５Ｈ、クローンＨＣＡ−２３１Ｈ、クローンＨＣＡ−６７１Ｈ、クローンＨＣＡ−７７０Ｈ、クローンＨＣＡ−７８４Ｈ、クローンＨＣＡ−８０３Ｈ及びクローンＨＣＡ−８３８Ｈ）、
（iii）８Ｍ尿素処理ヒト心筋アネキシンＶの吸収試験、各種人臓器由来アネキシンＶ及びビーグル犬、ラット心筋由来のアネキシンＶ抗原感作固相何れとも強い反応性を示すクローン：４株（クローンＨＣＡ−５７ＨＤＲ、クローンＨＣＡ−２９３ＨＤＲ、ＨＣＡ−３５０ＨＤＲ、クローンＨＣＡ−８０５ＨＤＲ）
（iv）８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの吸収試験及び人心筋、肺臓、肝臓、腎臓由来のアネキシンＶ抗原感作固相と強い反応性を示すが、ビーグル犬及びラット心筋由来のアネキシンＶ抗原感作固相と弱い反応性を示すクローン：３株（ＨＣＡ−５０７ＨＤ、クローンＨＣＡ−６６０ＨＤ、クローンＨＣＡ−６４６ＨＤ）、
（ｖ）８Ｍ尿素処理ヒト心筋アネキシンＶ及びネイティブなヒト心筋アネキシンＶの何れとも吸収試験で強い反応性を有するクローン：１株（ＨＣＡ−６２７）
このようにして、上記（１）〜（５）の５グループの反応性の異なるモノクローナル抗体を得た。
これらモノクローナル抗体の反応特異性を、次頁以下の表１に示す。
0003673522.tif 000002
0003673522.tif 000003
0003673522.tif 000004
（９）クローニング
上記に示した５群のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を、限界希釈法によってクローニングを行い、単一クローンとした。クローニングにあたっては、供給細胞（Feeder cell）として、ＢＡＬＢ／ｃマウスより調製した胸線細胞を、ＨＴ培地に浮遊させて、１ウエルあたり１×１０6個となるように加えた。
（１０）マウスイムノグロブリンサブフラスの同定
上記クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ細胞系の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを決定した。マウスイムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用い、チムド（Zymed）社製のモノアブタイピングキット（MONOAb typing kit）を用いた。
その結果、各クローンのマウスイムノグロブリンサブクラスは、Ｈ鎖に付いては、ＩｇＧ１タイプが７クローン、ＩｇＧ２ａタイプが１１クローン、ＩｇＧ２ｂタイプが３クローンであることが明らかになった。また、Ｌ鎖については、全てのクローンがｋ鎖であることが明かとなった（表１）。
以下、５グループに区分けされた各クローンを次の表１に示す。
例２．モノクローナル抗体の製造
（１）腹水の採取
高濃度の抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体を得るため、前記例２に記載の方法により得られた各種ハイブリドーマ細胞を増殖させ、得られた各クローンを、ＥＭＥＭ培養液で３回洗浄し、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プレステン）を、予め、腹腔内に投与されているＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔へ注射した。ハイブリドーマ細胞系を腹腔内投与してから、７ないし１４日後に腹水を得た。このように得られた腹水を遠心分離器により細胞成分及び沈殿成分を除去し、上清画分をプールし、４℃で保存した。
（２）腹水から抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体の精製
前記腹水から抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体は、該腹水と塩析法とイオン交換クロマトグラフィ分離法の組み合わせにより、そのＩｇＧ精製画分を精製した。
即ち、前記各クローン２０ｍｌに等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、無水硫酸ナトリウムを最終質量濃度で２０％（ｗ／ｖ）になるように撹拌しながら加え室温（２５℃）でさらに１時間撹拌した。
次に、高速遠心機（日立製作所製）により、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿画分を約１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で溶解した。この溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を外液として３回透析した。透析終了後、透析された溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、内径１．５ｃｍ、長さ８ｃｍのＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチルセルロース）カラムＤＥ−５２（ワットマン社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより、素通り画分又は濃度３０ｍＭないし５０ｍＭのＮａＣｌを含む濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＮａＣｌ濃度を、濃度３０ｍＭないし５０ｍＭの範囲内で段階的に上げた溶出画分として抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を精製した。精製した各クローンのＩｇＧ画分の純度は、東ソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ分析装置及びファルマシア社製ファーストシステムを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。その純度は９５％以上であった。
例３．ヒト心筋アネキシンＶ測定用エライザ分析系の検討
（１）抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体の調製
前記例２に示したごとく、ヒト心筋アネキシンＶ測定用エライザ法への応用検討のため、クローンＨＣＡ−１５５Ｈ及びＨＣＡ−６６０ＨＤのＩｇＧ画分を精製した。
（２）ＨＲＰＯ標識された抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体の調製方法
（Ａ）抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2の調製抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を標識に用いるために、各抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体１０ｍｇを、遠心分離機用濃縮器（セントリコン（Centricon）１０（アミコン社製））を用いて、容量が１ｍｌになるように、遠心濾過により濃縮した。次いで、濃縮された抗体を、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を溶媒にして透析した。
この透析されたＩｇＧ溶液に、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したペプシン（シグマ社製）溶液を、ペプシンがＩｇＧ量の４％になるように添加し、３７℃の温度下で６ないし１６時間反応させた。反応終了後、濃度０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されている、直径１．６ｃｍ、長さ６３ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックス（Sephadex）Ｇ−１５０カラム（ファルマシア社製）を用いた分子篩クロマトグラフィーにより、抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体のＦ（ａｂ'）2のフラグメントを得た。
（Ｂ）抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナルＦａｂ'−ＳＨの調製方法
前記（Ａ）により調製した抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2を、さらに、遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2濃縮画分を調製した。
この濃縮画分１ｍｌに、濃度１００ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ添加し、３７℃で９０分反応させた。反応終了後、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて、Ｆａｂ'−ＳＨフラクションを分画精製し、遠心分離機用濃縮器セントリコン１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮し、クローンＨＣＡ−１５５Ｈ及びクローンＨＣＡ−６６０ＨＤの抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ濃縮画分を調製した。
（Ｃ）ＨＲＰＯマレイミドの調製方法
一方、ＨＲＰＯ（ベーリンガー社製）を、蛋白質量として１０ｍｇ秤量し、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の１ｍｌに溶解した。この溶液に、最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌになるように、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（キシダ化学社製）に、Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステル（N-Hydroxysuccinimide ester）（ジーベンケミカル社製）を溶解した溶液の１００μｌを添加し、３０℃で６０分間反応させることによって、ＨＲＰＯをマレイミド化した。この反応後、溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清を、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて、ＨＰＲＯマレイミドを精製した。このＨＲＰＯマレイミドの精製画分を、さらに遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、ＨＲＰＯマレイミド濃縮画分を調製した。
（Ｄ）抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体の調製方法
このようにして得られた抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨの濃縮画分とＨＲＰＯマレイミドの画分を、モル比で１：１となるように混合し、４℃の温度下で１５ないし２４時間反応させた。反応後、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中に２ｍＭの濃度になるように添加し、３７℃の温度下で２０分間反応することによって、未反応のＨＲＰＯマレイミドのブロックを行った。次に、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウムークエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化した、直径１．６ｃｍ及び長さ６５ｃｍのウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣＡ４４カラム（ファルマシア社製）を用いた分子篩ゲルクロマトグラフィにより、未反応の抗ヒトＰアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ及びＨＲＰＯマレイミドを除去し、抗ヒト心筋アネキシンＶモノポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体ＨＲＰＯ標識抗体という）の精製を行った。
（３）抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体ＩｇＧの画分の調製
イヌ心筋由来の精製３２ＫＰアネキシンＶ抗原を免疫して得られたウザギ抗イヌアネキシン３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗血清３ｍｌに等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、無水硫酸ナトリウムを最終濃度２０％になるように撹拌しながら加えた後、室温でさらに１時間撹拌した。次に、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿画分を約３ｍｌのＰＢＳで溶解した。この溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を溶媒にして透析した。透析終了後、透析された溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、直径１．５ｃｍ及び長さ６ｃｍのＤＥＡＥセルロースＤＥ−５２カラム（ワットマン社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにかけて、抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体のＩｇＧ画分の精製を行った。３ｍｌの抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体抗血清より精製ＩｇＧ画分が１３ｍｇ得られた。
（４）ＨＲＰＯ標識抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体の作製方法
（Ａ）抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2の調製
抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体の精製ＩｇＧ画分を標識用に用いるため、該抗体１２ｍｇを、遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０（アミコン社製）を用いて、容量が１ｍｌに濃縮した後、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を溶媒にして透析した。
この透析により得られた抗体溶液に、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解したペプシン（シグマ社製）を、ＩｇＧ量に対して４％になるように添加し、３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、濃度０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ及び長さ６５ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックスＧ−１５０カラム（ファルマシア社製）を用いた分子篩クロマトグラフィーにより、該抗体のＦ（ａｂ'）２のフラクションを分画し精製した。得られたフラクションを、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶媒にして透析した。透析後、この透析された溶液を、遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮した。この濃縮液を、抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2としての標識抗体の作製に用いた。このようにして得られた１２ｍｇの抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体のＩｇＧ画分より、約７ｍｇのＦ（ａｂ'）2画分を調製した。
（Ｂ）抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナルＦａｂ'−ＳＨの調製方法
前記（Ａ）の方法で調製した抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）2画分の濃度７ｍｇ／１ｍｌの溶液に、濃度１００ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ添加し、３７℃で９０分反応させた。反応終了後、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ及び長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用い、Ｆａｂ'−ＳＨフラクションを精製し、遠心分離機用濃縮器１０を用いて容器が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮して、抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ濃縮画分を調製した。該抗体７ｍｇのＦ（ａｂ'）２より、６．１ｍｇのＦａｂ'−ＳＨ画分を得た。
（Ｃ）ＨＲＰＯマレイミドの調製方法
一方、ＨＲＰＯ（ベーリンガー社製）は、蛋白質量として１０ｍｇを秤量し、１ｍｌの濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。この溶液に、最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌになるように、ジメチルホルムアミド（キシダ化学社製）に溶解したＮ−ヒドロキシサクシニイミドエステル（ジーベンケミカル社製）溶液の１００μｌを添加し、３０℃で６０分間反応させることによって、ＨＲＰＯをマレイミド化した。反応後、この溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清を、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ及び長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて処理することにより、ＨＲＰＯマレイミドを精製した。このＨＲＰＯマレイミドの精製画分を、さらに遠心分離機用濃縮器セントリコン１０を用いて遠心分離により濃縮して、ＨＲＰＯマレイミドの画分を調製した。
（Ｄ）抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナルＦａｂ'−ＦＲＰＯ標識抗体の調製方法
このようにして得られた抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ画分とＨＲＰＯマレイミド画分をモル比で１：１となるように混合し、４℃の温度下で１５ないし２４時間反応させた。その後、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中に２ｍＭの濃度になるように添加し、３７℃の温度下で２０分間反応することによって、未反応のＨＲＰＯマレイミドのブロックを行った。次に、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化した、直径１．６及び長さ６５ｃｍのウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣＡ４４カラム（ファルマシア社製）を用いたゲルクロマトグラフィにより、未反応の抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ及びＨＲＰＯマレイミドを除去し、抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、ＨＲＰＯ標識抗体という）の精製を行った。
（Ｅ）ＨＲＰＯの活性測定法
ＨＲＰＯ標識抗体のＨＲＰＯ酵素活性の測定は、濃度０．２％のフェノール、濃度０．５ｍＭの過酸化水素及び濃度０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピリンを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．９８ｍｌにＨＲＰＯ標識抗体２０μｌを加えて、合計３．０ｍｌとし、３７℃の温度下で５分間反応させ、波長５００ｎｍにおける吸光度をレート法（Rate Assay）により測定した。１分間当たりの吸光度の差（ΔＡｂｓ）を測定することによりＨＲＰＯ活性を求めた。
（５）抗ヒト心筋アネキシンＶモノクローナル抗体固相の調製
ヒト心筋アネキシンＶ測定用エライザ法を用いる固相用のモノクローナル抗体として、クローンＨＣＡ−２９０、クローンＨＣＡ−６２７、クローンＨＣＡ−５７ＨＤＲ、クローンＨＣＡ−２９３ＨＤＲ及びクローンＨＣＡ−３５０ＨＤＲを選択し、前記例３に記載の方法により、腹水より、各クローンの１ｇＧ画分を精製した。
この各抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を、０．１％濃度のアジ化ナトリウムを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、エライザ法用マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃の温度下で一晩感作した。次に、このマイクロタイタープレートの各ウエルを、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％濃度で含むリン酸緩衝生理緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄液として使用して、３回洗浄し、１％濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング液）を各ウエルに３００μｌ分注した後、４℃の温度下でさらに一晩ブロッキングし、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体感作抗体プレート（以下、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体プレートという）を調製した。
（６）抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を用いた測定用エライザ系の検討
上記のごとく調製した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体プレートのブロッキング液を捨て、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを各ウエルに分注した後、８Ｍ濃度尿素処理することにより調製した８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶ抗原及び８Ｍ尿素処理をしないで調製したネイティブなヒトアネキシンＶを、夫々、１．５６２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、夫々、標準抗原液を、各ウエルに２０μｌずつ加え混和し、室温で１時間反応させた。反応後、各ウエルを洗浄液で３回洗浄した。この洗浄された各ウエルに、至適濃度に調製した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（クローンＨＣＡ−１５５Ｈ及びＨＣＡ−６６０ＨＤ）を各々１００μｌずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウエルを洗浄液で６回洗浄した。次に、濃度０．１Ｍのリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミンを２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、また濃度４ｍＭのＨ2Ｏ2を含むＯＰＤ基質液を１００μｌ加えて、３０分間反応させた後、濃度２ＮのＨ2ＳＯ4溶液を各ウエルに１００μｌずつ加えて反応を止め、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍとして、エライザ用プレートリーダーにより、二波長法により吸光度を測定した。
吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６２９ｎｍの吸光度を差し引くことにより求めた。
測定された８Ｍ濃度尿素処理されたヒトアネキシンＶ標準抗原液についての吸光度を次頁以下の表２に示す。
0003673522.tif 000005
0003673522.tif 000006
0003673522.tif 000007
0003673522.tif 000008
0003673522.tif 000009
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0003673522.tif 000012
横軸にヒトアネキシンＶ抗原濃度をとり、縦軸に、測定された４９２ｎｍの吸光度値と６９０ｎｍの吸光度値の差の吸光度値をとった図表に、表２−１〜表２−８に示される測定結果をプロットして作成したヒトアネキシンＶの検量線を図１ないし図８に示す。
この検量線は、ヒトアネキシンＶの濃度に依存して吸光度が上昇し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度までほぼ直線を示す良好な検量線である。この検量線を用いることにより検体（血漿及び血清）中のヒトアネキシンＶ濃度を正確に読み取ることができる。また、図１からも明らかなようにヒトアネキシンＶ濃度が、１ｎｇ／ｍｌの低い濃度値においても再現性が良く、ヒトアネキシンＶの濃度を測定することができる。したがって、図１ないし図８に示す検量線は、ヒトアネキシンＶ濃度測定用エライザ系に充分使用可能である。
しかし、８Ｍ尿素処理がされないネイティブなヒトアネキシンＶ抗原を標準抗原とする場合には、得られた吸光度は８Ｍ濃度尿素処理されたヒトアネキシンＶ抗原を用いた場合の約５％ないし１０％の吸光度を示し、ネイティブなヒトアネキシンＶ抗原に対する反応性が低かった。
例４  抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体によるヒトアネキシンＶ濃度測定法（エライザ法）
一方、ヒトアネキシンＶの吸収試験において、濃度８Ｍ尿素処理されていないネイティブなヒトアネキシンＶに強い反応性を有する抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７を用いて、抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナル抗体との組み合わせによるエライザ法によるヒトアネキシンＶの濃度測定を行った。
即ち、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７株から産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７の３０μｇ／ｍｌの１００μｌを個々のウエルに分注して、前記例４の（５）の固相調製法に従って、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相ウエルを形成する。
この固相ウエルに、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム反応緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μｌ分注する。
反応緩衝液が分注された固相ウエルに、標準液２０μｌを分注する。本例において、標準液としては、８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの抗原標準液及びネイティブなヒトアネキシンＶの抗原標準液が使用された。したがって、これら標準液の分注は、一方の固相ウエルに８Ｍ尿素処理ヒトアネキシンＶの抗原標準液が分注され、他方の固相ウエルにネイティブなヒトアネキシンＶの抗原標準液が分注される。標準液分注後、室温において、１時間撹拌して、各ウエル内で抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で４回洗浄する。洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々、抗イヌ３２ＫＰポリクローナル・Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（反応緩衝液１ｍｌ当たり１００ｍＵ）を１００μｌ加え、室温において、３０分間撹拌して抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で８回洗浄する。洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々ＯＰＤ基質溶液を１００μｌ加えて、室温で３０分間発色反応を行わせる。
発色反応時間が経過したところで、各ウエルに、夫々、反応停止液（濃度の２ＮのＨ2ＳＯ4溶液）を１００μｌを加えて発色反応を停止させ、主波長４９２ｎｍ及び副波長６９０ｎｍで、エライザ用プレートリーダにより、夫々の吸光度を測定して検体又は標準液についての抗原蛋白質のヒトアネキシンＶ濃度を測定した。
吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引いた吸光度差として求められた。即ち、標準液の抗原蛋白質のヒト心筋アネキシンＶの濃度毎に測定した吸光度差をプロットして、検量線を作成し、この検量線に基づいて、検体中の抗原蛋白質のヒトアネキシンＶ濃度を求める。
抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法によるネイティブヒトアネキシンＶ標準抗原の吸光度を次の表３に示す。
0003673522.tif 000013
また、表３に測定結果に基づいて得られた検量線を図９に示す。抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法において、ネイティブなヒトアネキシンＶ抗原濃度に依存した良好な検量線が得られた。
例５  抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を使用するエライザ法による心筋梗塞患者から採取した検体中のヒトアネキシンＶの検出及び定量
上記のごとく調製したネイティブなヒトアネキシンＶを感度良く測定できる組み合わせの抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及び抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を使用するエライザ法による心筋梗塞等の患者から採取された臨床検体中のヒトアネキシンＶ濃度の測定が可能か否かを検討した。
即ち、プレートのブロッキング液を捨てた抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７固相に、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを各ウエルに分注した。次に、ネイティブなヒトアネキシンＶの標準抗原（１．５６２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）及びヒト血漿検体を各ウエルに２０μｌづつ加えて混和し、室温で１時間抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、各ウエルを洗浄液で３回洗浄した。さらに至適濃度に濃度に調製した抗イヌ３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（反応緩衝液１ｍｌ当たり１００ｍＵ）を夫々１００μｌ加え、室温において、３０分間撹拌して抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で各ウエルを８回洗浄した。
洗浄後、この洗浄された各ウエルに、ＯＰＤ基質溶液（０．１Ｍ濃度のリン酸クエン酸緩衝液にｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ／ｍｌ及び４ｍＭ濃度のＨ2Ｏ2を含む）を各ウエルに夫々１００μｌ加えて、室温で３０分間発色反応を行わせた。
発色反応時間が経過したところで、各ウエルに反応停止液の２Ｎ濃度のＨ2ＳＯ4溶液を夫々１００μｌ加えて発色反応を停止させ、各ウエルの発色を、主波長４９２ｎｍ及び副波長６９０ｎｍを使用して測定した。この測定は、主波長４９２ｎｍ及び副波長６９０ｎｍの夫々の波長の吸光度をエライザ用プレートリーダーにより測定し、測定された主波長４９２ｎｍの吸光度から副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引いて、検体又は標準液の吸光度とし、検体又は標準液中の抗原蛋白質のヒト心筋アネキシンＶの濃度を測定した。
ヒト血漿検体の測定値は、各濃度に調製したヒトアネキシンＶの標準抗原の吸光度より検量線を作製し、この検量線より各血漿検体中に存在するネイティブなヒトアネキシンＶの濃度を読み取った。
例６．血液検体についての本発明の酵素抗体法による分析の応用例
（１）心筋梗塞の診断
７５歳の男性：午前６時に胸痛があり、同日、午前８時３０分、胸痛及び心電図の変化から急性心筋梗塞の疑いとして入院した。同日午前９時、発症３時間後のＣＫ（クレアチン燐酸酵素）値は１０８Ｕ／Ｌと正常範囲であったが、アネキシンＶは９０．４ｎｇ／ｍｌと上昇していた。発症３日後において、アネキシンＶは、１３．１ｎｇ／ｍｌと減少した。この例の心電図変化は急性心筋梗塞の所見を呈し、採血された血漿中のヒトアネキシンＶ濃度の測定が心筋梗塞早期の診断に有用であることが分かった。
心筋梗塞の患者の血漿中のヒトアネキシンＶの濃度は、比較的高く、血漿中のヒトアネキシンＶの濃度が５０ｎｇ／ｍｌ以上と測定された事例では、その後、７０％の患者が心筋梗塞と診断された。
（２）狭心症の診断
５８歳の男性、午前２時３０分、午前６時３０分に２回、１０ないし１５分の胸痛あり、同日午前７時３０分、比較的短い胸痛及び心電図の変化から、狭心症の疑いとして入院した。ＣＫ値は８３Ｕ／Ｌと正常値であったが、アネキシンＶは２９．９ｎｇ／ｍｌと上昇していた。１２時では、アネキシンＶは１５．１ｎｇ／ｍｌと減少し、同日１５時では、８．９ｎｇ／ｍｌとさらに低下して、正常に戻ったことを示した。この例は臨床症状から狭心症が疑われ、その後の心電図変化より、狭心症と診断されたが、血漿中のヒトアネキシンＶの濃度が狭心症でも上昇していることが分かった。
狭心症の患者の血漿中のヒトアネキシンＶの濃度は、心筋梗塞よりは比較的低いが、正常値に比して遥かに高く、血漿中のヒトアネキシンＶの濃度が２０〜５０ｎｇ／ｍｌと測定された事例では、その後、その７０％の患者が狭心症と診断された。
（３）正常健康人のアネキシンＶの血漿濃度
２４歳乃至７６歳の正常健康の男性のアネキシンＶの血漿濃度は０．９乃至１１．３ｎｇ／ｍｌであり、２４歳乃至７６歳の正常健康の女性のアネキシンＶの血漿濃度は０．８乃至１０．６ｎｇ／ｍｌであり、平均値は６．２ｎｇ／ｍｌであり、最高値は１１．３ｎｇ／ｍｌであり、最低値は０．８ｎｇ／ｍｌであった。しかし、男女共に加齢による変化はみられなかった。
例７．酵素抗体法による心筋組織特異染色への応用例
（１）例３により得た抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、エライザ法のみならず、心筋組織中のヒトアネキシンＶの局在あるいは分布を間接酵素抗体法により特異的に染色することができる。
また、例４で調製した抗ヒトアネキシンＶ−ＨＲＰＯ標識抗体を用いた場合には、間接酵素抗体法によりより短時間で心筋組織を特異的に染色することが可能である。
以下、間接酵素抗体法の例を示す。つまり、心筋組織のパラフィンまたは凍結切片をスライドグラス上に固定し、脱パラフィン又はブロッキングした後、至適濃度に調製した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体（ＩｇＧ濃度：５００ないし１０００μｇ／ｍｌ）を１次抗体として、湿潤箱の中で、室温で１時間反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、３回、５分間ずつ洗浄した。次に、抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰＯ標識抗体を２次抗体として、湿潤箱中で３０分間反応させ、同様に、３回５分間ずつ洗浄した後、４−アミノアンチピリン系基質溶液又はジアミノベンジジンを加えて、さらに３０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳでスライドグラスを洗浄し、グリセロール等の封入剤を用い、カバーグラスでスライドグラスを封入した後、顕微鏡で染色された部位を調べた。
その結果を図１０及び図１１に示した。心筋組織中のヒトアネキシンＶの局在分布が茶褐色に染色されているのが黒色に示されており、エライザ系のみならず酵素抗体法による心筋組織の組織染色にも応用可能であることが判明した。
例８．ハイブリドーマの作製方法
（１）マウス
５乃至８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３＋１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
（２）免疫方法
イヌ心筋より抽出精製したイヌアネキシンＶ（特開平７−７２１４７号公報参照）および前記例１で人心筋より精製したヒトアネキシンＶをそれぞれ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）で溶解した後、同緩衝液で透析した。透析後、各アネキシンＶ抗原を１ｍｇ／ｍｌになるよう調製し、５０μｌづつエッペンチューブに小分け分注した後、−４０℃で凍結保存し、免疫用のネイティブなイヌ及びヒトの心筋由来精製ヒトアネキシンＶ抗原を調製した。
上記で調製したイヌアネキシンＶを０．２ｍｌ（２００μｇ）取り、さらに生理食塩水を０．３ｍｌを加えて０．５ｍｌとした。この抗原液に０．５ｍｌのフロイント完全アジュバント（Freund's complete adjuvant）を混合して良く乳化した。この乳化状のイヌアネキシンＶを抗原として、５周齢の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に、精製イヌアネキシンＶが１匹あたり４０μｇとなるように投与し、初回免疫とした。
次に、上記調製のイヌアネキシンＶ抗原を０．２ｍｌ（２００μｇ）を試験管に取り、生理食塩水を０．３ｍｌ加えて０．５ｍｌに調製した。この溶液に、１バイアル当たり生理食塩水１ｍｌで溶解したＲＩＢＩアジュバントシステム（ADJUVANT SYSTEM）（ＲＡＳ）ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョンＲ−７００（TDM Emulsion、R-700）（RIBI.Immuno Chem. Research、Inc. Hamilton、MT.、USA）０．５ｍｌを添加した後、この混合液をボルテックスミキサー上で激しく約３分間攪拌して乳化した。この乳化状のイヌアネキシンＶ抗原を用いて、上記のマウスに初回免疫より２週間後、４週間後及び６週間後に、マウス当たり５０μｇとなるように追加免疫を実施した。さらに初回免疫より２３週間後に、上記のＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＡＳ）ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョン、Ｒ−７００で同様にして調製したイヌアネキシンＶ抗原を、マウス当たり３０μｇとなるように追加免疫を実施した。この追加免疫の後、経時的に各マウスより採血して血清を調製し、これら血清中に産生されたネイティブなイヌ心筋及びヒトアネキシンＶアネキシンＶに対する抗体価を前述の吸収試験により測定することにより、特異抗体産生状況を確認した。抗体価測定の結果より抗体価の高いマウスを選び、初回免疫より２６週間後、上記調製のネイティブなヒトアネキシンＶを５０μｇ／ｍｌとなるように生理食塩水１ｍｌに溶解し、マウス尾静脈から静脈注射により追加免疫を実施した。この時点で、再度マウス血清中の抗体価を調べ、抗体価の高いマウスを選択した後、さらに前回の追加免疫から１週間後に、同様の方法にて生理食塩水で１００μｇ／ｍｌとなる様に調製したネイティブなヒトアネキシンＶ抗原を１ｍｌ用いて、ゆっくり同マウスの尾静脈より静脈注射により追加免疫を実施し最終免疫とした。
（３）脾細胞の調製
例１と同様の方法で、最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスより摘脾を行ない、摘出した脾細胞をＥＭＥＭ培養液（日水社製）中に浮遊させて、脾細胞の浮遊液を調製した。この脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、脾細胞の数を算定した。得られた脾細胞は４．７×１０8個であった。
（４）親株の調製
細胞融合には、２−アミノ−６−オキシ−８−アザプリン（８−アザグアニン）（2-amino-6-oxy-8-azapurine(8-Azaguanine)）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫由来培養細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。
Ｘ６３細胞は、対数増殖期のＸ６３細胞を用い、非働化したウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという）（インタージェン（Intergen）社製）を濃度１０％で含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（濃度２０μｇ／ｍｌで８−アザグアニンを含有する）（ギブコ（GIBCO）社製）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない濃度１０％のＦＣＳ含有のＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の増殖能を維持した。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定した。得られたＸ６３細胞の生細胞は１．５×１０8個であった。
（５）細胞融合
シグマ（Ｓｈｉｇｍａ）社製ポリエチレングリコール−４０００を、ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、濃度が５０％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した後３７℃で加温して使用した。
脾細胞とＸ６３細胞の比が１０：１となるように脾細胞とＸ６３細胞を混合し、１５００ｒｐｍの回転数で５分間遠心して、上清を除去し、細胞のペレットをよくほぐし、細胞融合に使用した。細胞融合は、前記調製の、３７℃に保温したポリエチレングリコールを用いて、ケーラー及びミルシュタイン共著:ネイチャ（Nature）第２５６巻、第４９５〜４９７頁，１９７５年及びヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー（Eur.J.Immunol.第６巻、第５１１−５１９頁、１９７６年）の方法より行なわれた。
細胞融合後の細胞系は、１０％濃度のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に、濃度１×１０-4Ｍのヒポキサンチン、濃度４×１０-7Ｍのアミノプテリン及びおよび濃度１．６×１０-5Ｍのチミジンを含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０6個／ｍｌとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液の５０μｌ宛、９６ウエルのマイクロテストプレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ2無菌培養器において温度３７℃、湿度９５％及び濃度８％のＣＯ2雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、培養開始後約１０日〜１３日後に、ネイティブなヒトアネキシンＶ及びネイティブなイヌアネキシンＶに共通して反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生するクローンを、ネイティブなヒトアネキシンＶ及びイヌアネキシンＶ抗原蛋白質抗原を用いたアネキシンＶ吸収試験によりスクリーニングすることにより選択し、一次スクリーニングとした。
さらに、この選択されたクローンは、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４として国際寄託されたハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７株が産生するところのモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７とサンドイッチエライザ系において使用可能であり、且つアネキシンＶ測定における組合せとして良好な感度を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クローンの選択を、モノクローナル抗体のキャプチャー法による二次スクリーニングで選択した。
（６）スクリーニング
（ｉ）一次スクリーニング
培養開始後、１０日目より細胞のクローンが出現し、抗体産生の有無を確認するため、ハイブリドマ細胞の培養上清を用いて、ネイティブなイヌアネキシンＶ及びヒトアネキシンＶを抗原として用いたアネキシンＶの吸収試験をエライザ法により実施した。
本発明者等は、前記モノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７の固相ウエルと抗イヌ３２ＫＰアネキシンＶポリクローナルＨＲＰＯ標識抗体の組合せにおけるエライザ法は、ネイティブなヒトアネキシンＶ及びイヌアネキシンＶ抗原について測定が可能なエライザ系であることを見い出しており、本例の細胞融合における、ネイティブなアネキシンＶと効率良く反応する特性を持つモノクローナル抗体のスクリーニング系に応用した。
即ち、本例の細胞融合で得られたハイブリドーマ細胞系クローンの培養上清５０μｌと、ネイティブなヒトアネキシンＶ抗原液（１００ｎｇ／ｍｌ）とを５０μｌずつＵボトムノマイクロタイタープレートに入れた第１の組と、同ハイブリドーマ細胞系クローンの培養上清５０μｌとネイティブなイヌアネキシンＶ抗原液（１００ｎｇ／ｍｌ）とを５０μｌを他の複数のＵボトムのマイクロタイタープートに入れた第２の組の夫々に、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体を結合させたセファロース４Ｂの２０％懸濁液を５０μｌを加えて、室温で１時間撹拌した後、１０分間静置する。次に夫々の組について、抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂがウェルの底に完全に沈むのを確認して、その上清５０μｌを用いて該上清中に残存するネイティブなヒトアネキシンＶ又はイヌアネキシンＶの濃度を、上述のアネキシンＶ−エライザ法で測定した。
（ii）一次スクリーニングによるモノクローナル抗体の選定
この測定時に、ハイブリドーマ細胞系の培養上清中に、ネイティブなイヌアネキシンＶ及びヒトアネキシンＶに対する抗心筋アネキシンＶモノクローナル抗体が存在する場合に、ネイティブなイヌアネキシンＶ及びヒトアネキシンＶ抗原と抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体とが反応し、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂとが抗原抗体複合体を形成して沈降し、上清中に残存する該アネキシンＶの濃度が減少し、抗アネキシンＶモノクローナル抗体の存在を確認することができる。
（iii）二次スクリーニング
このように、一次スクリーニングにて、ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶ抗原に対して反応性を有する抗アネキシンＶモノクローナル抗体がスクリーニングされたならば、次に、ハイブリドーマ細胞系が、国際寄託の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株が産生するモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７と高感度でアネキシンＶ測定用サンドイッチ系エライザ法が成立するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クローンを、下記のキャプチャーエライザ法により選択した。
（iv）キャプチャーエライザ法
ヤギ由来抗マウスイムノグロブリンＧのＦｃ部分に特異的なポリクローナル抗体のＩｇＧ画分（ノルディック（Nordic）社製）を０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）で５０μｇ／ｍｌに調製し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）社製）に５０μｌづつ分注して、４℃にて一晩吸着させた。
次いでこれらを、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤のＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％濃度で含む洗浄液のリン酸緩衝液（以下、洗浄液という）で３回洗浄し、さらに濃度１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング液）でブロッキングして、抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃポリクローナル抗体の固相ウエルを調製した。
（ｖ）前述のネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶの吸収試験の結果
ネイティブなイヌ及びヒトアネキシンＶ抗原と強い反応を示すモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系の培養上清を、上記の抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃポリクローナル抗体固相の各ウエル中のブロッキング液を捨てて、これに５０μｌづつ添加し室温で１時間反応させた。反応の後、各ウエルを洗浄液で３回洗浄し、ネイティブなヒトアネキシンＶ抗原を、濃度１％のＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（以下反応用緩衝液を略す）で１００ｎｇ／ｍｌとなるよう調製し、その５０μｌを添加してさらに１時間反応させ、洗浄液で３回洗浄した。次いで、ＨＲＰＯ標識したＨＣＡ−６２７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を反応用緩衝液で至適濃度に調製した後、各ウエルに添加して更に３０分間反応させた。この場合のＨＲＰＯ標識抗体の希釈には、マウスイムノグロブリンが１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、ＨＲＰＯ標識抗体の抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃポリクローナル抗体の固相ウエルへの吸着をブロックした。反応終了後、洗浄液で各ウエルを３回洗浄し、ＯＰＤ基質液（０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ／ｍｌ及び４ｍＭのＨ2Ｏ2を含む）を室温で５分間反応させた後、この反応を２ＮのＨ2ＳＯ4で停止させ、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。主波長４９２ｎｍでは、結合した標識抗体により生成された基質の色原体が測定され、また、副波長によりマイクロタイタープレートの傷や汚れが検出される。
この主波長の吸光度より副波長の吸光度を差し引くことにより、固相に結合した抗原量に比例して結合した標識抗体の酵素による真の色原体の変化量に応じた吸光度が測定される。
この二次スクリーニング法においては、ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶ抗原と反応性を有し、抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＣＡ−６２７とのサンドイッチエライザ系において最適の組合せを提供する、同一アネキシンＶ抗原分子上で、抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＣＡ−６２７とは異なる抗原決定基を認識する抗アネキシンＶモノクローナル抗体が得られる。つまり、アネキシンＶ抗原を測定するために必要とされ、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７とのサンドイッチエライザ系が可能な最適なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クローンが得られる。
（７）各種動物由来ネイティブなアネキシンＶ抗原感作固相との反応性の検討
次いで、上記のスクリーニングで特定された各種抗アネキシンＶモノクローナル抗体の動物種に対する反応性を各種動物より抽出精製したアネキシンＶ抗原を固相化したマイクロタイタープレートと反応させ、その反応性について検討した。
（８）ネイティブなアネキシンＶ抗原固相化マイクロタイタープレートの調製
ネイティブなヒト心臓、イヌ心臓、ラット心臓及びウシ肺臓より抽出、精製したアネキシンＶ抗原について、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５で１μｇ／ｍｌとなるように調製し、各抗原液を９６ウエルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μｌ分注し、４℃で一晩吸着させた後、洗浄液で３回洗浄し、ブロッキング液でさらに４℃一晩ブロッキングを行った。これら各種アネキシンＶ抗原感作固相ウエルとして用いた。
前述のスクリーニング得られた各種ハイブリドーマ細胞系クローンより産生される抗アネキシンＶモノクローナル抗体の反応性を、各種動物由来のネイティブなアネキシンＶ抗原を吸着させた各種アネキシンＶ抗原固相化プレートとの反応性を検討した。すなわち、得られた各種抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンの培養上清（原液）、または精製ＩｇＧ画分（終濃度１μｇ／ｍｌに調製）と、上記各種動物由来のネイティブなアネキシンＶ抗原感作固相の各ウェルとを室温で１時間反応させた後、洗浄液で３回洗浄した。さらにＨＲＰＯ標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ｇｏａｔ由来）を室温で３０分反応させた後、洗浄液で４回洗浄し、ＯＰＤ基質液（０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ／ｍｌ及び４ｍＭのＨ2Ｏ2を含む）を室温で３０分間反応させた。次いで、この反応を２ＮのＨ２ＳＯ4溶液で停止させ、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。主波長４９２ｎｍでは、結合した標識抗体により生成された基質の色原体が測定され、また、副波長によりマイクロタイタープレートの傷や汚れが検出される。
この主波長の吸光度より副波長の吸光度を差し引くことにより、固相に結合した抗原量に比例して結合した標識抗体の酵素による真の色原体の変化量に応じた吸光度が測定される。
（９）クローニング
ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶを用いた吸収試験、及び上記キャプチャーエライザ系において、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４の受託番号で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株が産生する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を使用したサンドイッチエライザ系において、高感度でネイティブなアネキシンＶの測定が可能なエライザ系を提供する抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クローンを限界希釈法によるクローニングを実施し、単一クローンとした。クローニングにあたっては、供給細胞（Feeder cell）として、ＢＡＬＢ／ｃマウスより調製した胸線細胞を、ＨＴ培地に浮遊させて、１ウエルあたり１×１０6個となるように加えた。
（１０）マウスイムノグロブリンサブクラスの同定
上記、クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ細胞系クローンより産生されるモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを決定した。マウスイムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用い、ザイメッド（Zymed）社製モノアブタイピングキット（MONOAb typing kit）を用い、ザイメッド社の操作手順に従って実施した。
（１１）抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系の樹立
本例における細胞融合についての一次スクリーニングの結果、ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶ抗原を用いた吸収試験法での陽性のクローンは２００株以上得られた。さらに上記のキャプチャーエライザ系における二次スクリーニングにおいて、ハイブリドーマ細胞系が、国際寄託の受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株が産生する抗アネキシンＶモノクローナル抗体とサンドイッチエライザ系で組み合わせが成立するクローンを８クローン厳選するに至った。さらに、限界希釈法によるクローニングの後、上記８クローンの総てのハイブリドーマ細胞系クローンを樹立した。今回の細胞融合番号２で得られた抗アネキシンＶモノクローナル抗体の反応特異性を、次の表４に示した。
0003673522.tif 000014
0003673522.tif 000015
0003673522.tif 000016
表４には、例１において、前回の細胞融合で得られたクローンＨＣＡ−６２７、ＨＣＡ−１５５Ｈ、ＨＣＡ−５０７ＨＤ及びＨＣＡ−２９３ＨＤＲをクローンの反応性の対照として示した。
例１において樹立したクローン群（ＨＣＡ−１５５Ｈ、ＨＣＡ−５０７ＨＤ及びＨＣＡ−２９３ＨＤＲ）とは異なり、本例で樹立したハイブリドーマ細胞系クローンの産生する抗アネキシンＶモノクローナル抗体は何れも、ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶと強い反応を示すことが明らかとなった（表４の吸収試験の項参照）。
また、キャプチャーエライザ系によるスクリーニング法において、先に樹立したハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７株、（国際寄託の受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４）が産生する抗アネキシンＶモノクローナル抗体とサンドイッチエライザ系において効率良く、高感度に組み合わせが可能なクローンであることが判明した（表４、キャプチャー法の項参照）。
さらに、ヒト及び各種動物由来のアネキシンＶ抗原を固相化した反応系における検討の結果、本例において樹立したハイブリドーマ細胞系クローンは、ネイティブなアネキシンＶとは吸収試験、つまり液状の抗原とは強い反応を示すものの、各種動物由来のアネキシンＶを固相化した抗原とは全く反応を示さないクローンであることが判明し（表４参照）、例１で樹立したクローンの内のＨＣＡ−１５５Ｈ、ＨＣＡ−５０７ＨＤ及びＨＣＡ−２９３ＨＤＲモノクローナル抗体とは全く異なる反応性を有していることが判明した。
以上のことから、本例の細胞融合により得られた抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生クローンの８株は、キャプチャーエライザ系でのスクリーニングにより何れもモノクローナル抗体クローンＨＣＡ−６２７とサンドイッチエライザ系において組み合わせが成立するクローンであり（表４）、クローンＨＣＡ−６２７とは全く異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンであることが明らかとなった。
表４に示した様に、本例において樹立した８株のハイブリドーマ細胞系クローンが産生する抗アネキシンＶモノクローナル抗体のイムノグロブリンサブタイプは、Ｈ鎖については、全てＩｇＧ１タイプであった。また、Ｌ鎖については、全てのクローンがκ鎖タイプであることが明らかとなった（表４参照）。
例９．モノクローナル抗体の製造
（１）腹水の採取
高濃度の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を得るため、得られた各種ハイブリドーマ細胞系を増殖させた後、ＥＭＥＭ培養液で３回洗浄し、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プレステン）を予め腹腔内投与されているＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔へ注射した。ハイブリドーマ細胞系を腹腔内投与してから、７〜１４日後に腹水を得た。得られた腹水は、遠心分離機により細胞成分及び沈殿成分を除去し、上清画分をプールして０．１％の終濃度となる様にアジ化ナトリウムを防腐剤として加えた後、４℃で保存した。
（２）腹水から抗アネキシンＶモノクローナル抗体の精製
該モノクローナル抗体のＩｇＧ画分は、上記、該ハイブリドーマ細胞系より得られた腹水より、ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００装置及びプロテインＡカラム（パーセプチィブ社）を用いたアフィニティー精製法により得られた。さらに精製された各クローンのＩｇＧ画分は、トーソー（TOSO）社製ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムを用いたＨＰＬＣ法及びファーストシステム（ファルマシア社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその純度を確認した。その結果、いずれのハイブリドーマ細胞系クローンのモノクローナル抗体も９８％以上の純度を示してることが判明した。
例１０．ヒトアネキシンＶ測定用エライザ系の検討
（１）抗アネキシンＶモノクローナル抗体−ＨＲＰＯ標識抗体の調製
前述のごとく、今回樹立したモノクローナル抗体をネイティブなヒトアネキシンＶ測定用サンドイッチエライザ系へ応用可能かどうかを検討した。
すなわち、該抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンより産生される抗アネキシンＶモノクローナル抗体ＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７を代表して選択し、上記のＣｏｎＳｅｐＬＣ１００装置及びプロテインＡカラム（パーセプチィブ社）を用いたアフィニティー精製法により各クローンのＩｇＧ画分を精製した。
（２）Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ）標識モノクローナル抗体の作製方法
（Ａ）抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）２の調製
抗アネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を標識に用いるため、ＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７（工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６の受託番号で国際寄託されている）、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７の各抗アネキシンＶモノクローナル抗の精製ＩｇＧ画分１０ｍｇを、遠心分離機用濃縮器（セントリコン（Centricon）１０（アミコン社製））を用いて１ｍｌに濃縮した。次いで、０．２ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）を溶媒として透析した。この透析されたＩｇＧ溶液に、ペプシンをＩｇＧ量の４％となるように添加し３７℃の温度下で２〜４時間加温して反応させた。この反応終了後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したファルマシア（Pharmacia）社製のセファデックス−Ｇ１５０を用いたカラム（直径１．６ｃｍ、長さ６３ｃｍ）による分子篩ゲルクロマトグラフィーにより抗アネキシンＶモノクローナル抗体のＦ（ａｂ'）２フラグメントを得た。いずれのクローンとも１０ｍｇのＩｇＧ画分より約５ｍｇのＦ（ａｂ'）２画分を得ることが出来、各クローン間でのＦ（ａｂ'）２の収率には、殆ど差は認められず良好であった。
（Ｂ）抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨの調製方法
前記（Ａ）の方法で調製したＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７の各抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）２をさらに遠心分離器用濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）２画分を１ｍｌとなるように濃縮した。
この濃縮画分１ｍｌに、１００ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ添加し、３７℃で９０分間反応させた。反応終了後、１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（ファルマシア社製）を用い、Ｆａｂ'−ＳＨフラクションを分画、精製した。分画後、得られた精製画分をプールし、遠心分離機用濃縮機器セントリコン１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮して、クローン：ＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７の抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ濃縮画分をそれぞれ調製した。
（Ｃ）ＨＲＰＯマレイミドの調製方法
一方、ＨＲＰＯ（ベーリンガー社製）は、蛋白質量として２０ｍｇを秤量し、１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。この溶液に、濃度が２５ｍｇ／ｍｌになるようにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（キシダ化学社製）で溶解したＮ−ヒドロキシサクシニイミドエステル（N-Hydroxysuccinimide ester）（ジーベンケミカル社製）１００μｌを添加し、３０℃で６０分間反応させることによってＨＲＰＯをマレイミド化した。反応後、この溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた後、この上清を０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過溶セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて、ＨＲＰＯマレイミドを精製した。このＨＲＰＯマレイミド精製画分を、さらに遠心分離器用濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、ＨＲＰＯマレイミド濃縮画分を調製した。
（Ｄ）抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体の調製方法
このようにして得られた抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ濃縮画分とＨＲＰＯマレイミド濃縮画分をモル比で１：１となるように混合し、４℃で１５〜２５時間反応させた。反応後、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中に終濃度が２ｍＭとなるように添加し、３７℃の温度下で２０分間反応することによって、未反応のＨＲＰＯマレイミドのブロックを行った。次に、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化したウルトロゲル（Ultrogel ACA 44）カラム（直径１．６ｃｍ、長さ６５ｃｍ、ファルマシア社製）を用いた分子篩ゲルクロマトグラフィーにより未反応の抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＳＨ及びＨＲＰＯマレイミト゛を除去し、抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、抗アネキシンＶモノクローナルＨＲＰＯ標識抗体という）の精製を行った。
（Ｅ）ＨＲＰＯ標識抗体の活性測定法
ＨＲＰＯ標識抗体のＨＲＰＯ酵素活性の測定は、０．２％フェノール、０．５ｍＭ過酸化水素及び４−アミノアンチピリン０．１５ｍｇ／ｍｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．９８ｍｌにＨＲＰＯ標識抗体２０μｌを加えて合計３．０ｍｌとし、３７℃で５分間反応させ、波長５００ｎｍにおける吸光度をレート法（Rate Assay）により測定した。１分間当りの吸光度の差（ΔＡｂｓ）を測定することによりＨＲＰＯ活性を求めた。
（６）抗アネキシンＶモノクローナル抗体の固相ウエルの調製
ヒトアネキシンＶ測定用エライザ法に用いる固相用のモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ細胞系が微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号（以下国際受託番号という）がＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株が産生するモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７を、前記で記載の方法（ＣｏｎＳｅｐＬＣ−１００装置及びプロテインＡカラム（パーセプチィブ社）を用いたアフィニティー精製法）により腹水よりＩｇＧ画分を精製した。
この抗アネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７のＩｇＧ画分を０．１％のアジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、エサイザ用マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃で一晩感作した。次に、このマイクロタイタープレートの各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含む洗浄液で３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング液）を各ウエルに３００μｌ分注した後、４℃でさらに一晩ブロッキングし、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体感作抗体プレート（以下抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体プレートという）を調製した。
（７）抗アネキシンＶモノクローナル抗体を用いた測定用エライザ系の検討
上記のごとく調製した抗アネキシンＶモノクローナル抗体プレートのブロッキング液を捨て、１％ＢＳＡ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（反応用緩衝液）１００μｌを各ウエルに分注した後、ネイテイブヒトアネキシンＶ標準抗原をそれぞれ１．５６３ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、それぞれの標準抗原液を各ウエルに、２０μｌずつ加え混和し、室温で１時間反応させた後、各ウエルを洗浄液で３回洗浄した。さらに、至適濃度に調製した前述の抗アネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体（クローン：ＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７）を各々１００μずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた後、洗浄液で各ウエルを６回洗浄した。次に、ＯＰＤ基質液（０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液にｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ／ｍｌ、及び４ｍＭのＨ2Ｏ2を含む）を１００μｌ加え３０分間反応させた後、２ＮのＨ2ＳＯ4を各ウエルに１００μｌずつ加えて反応を止め、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍとしてエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。
吸光度は主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍの吸光度を差し引くことにより求めた。
代表的なネイティブヒトアネキシンＶ標準抗原液についての吸光度を次の表５に示す。
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ヒトアネキシンＶ抗原液に対して測定された標準抗原液についての吸光度を縦軸にとり、横軸にヒトアネキシンＶ抗原濃度を表した図にプロットして作成したヒトアネキシンＶの検量線を図１２に示す。
この図１２に示す検量線は、ネイティブなヒトアネキシンＶの濃度に依存して吸光度が上昇し、低値から１００ｎｇ／ｍｌの濃度までほぼ直線を示しており、良好な検量線である。
また、本例における検量線は、国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７株から得られたモノクローナル抗体の固相ウエルと抗３２ＫＰポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体との組合せにおけるネイティブなヒトアネキシンＶ標準抗原を用いた検量線と比較して、ダイナミックレンジが大きくなり、遥に高感度となった。
しかし、前記抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＣＡ−６２７固相ウエルと抗イヌ３２ＫＰ抗アネキシンＶポリクローナルＦａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体との組合せにおいても、アネキシンＶの測定には何ら感度的に問題とならない水準である。
本例においては、国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株から産生されるモノクローナル抗体と、同じく国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系ＨＤＡ−９０７株から産生されるモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体の組合せで得られた検量線（第１２図）を用いることにより、血液、血漿及び血清中のアネキシンＶ濃度を低濃度領域から高濃度領域まで再現良く、正確に読み取ることができた。
また、図１２の検量線を作成するにあたっては、例えば、３〜４ｍＵ／ｍｌのＨＲＰＯ活性を有する、非常に低濃度の抗アネキシンＶモノクローナル抗体クローンＨＤＡ−９０７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を使用しており、さらに高感度化も可能である。
表５及び図１２の標準抗原を用いた検量線からも明らかなように、ヒトアネキシンＶ濃度が１ｎｇ／ｍｌ程度の低値から１００ｎｇ／ｍｌの高値範囲においても、標準抗原の４回の測定における測定値のＣＶは３．６％以内を示し、再現良くアネキシンＶの濃度を測定することが可能であった。以上のことより、今回、開発した上記のモノクローナル抗体を使用したアネキシンＶ測定用エライザ系は、ヒト血液中に存在するネイティブなアネキシンＶ濃度測定用エライザ系への使用において充分満足できることが予想される。
さらに、図１〜８に示したように、抗アネキシンＶモノクローナル抗体同士のエライザ系において、例１のごとく８Ｍ尿素で非処理のネイテイブヒトアネキシンＶ抗原を標準抗原として用いた場合には、８Ｍ尿素処理抗原を用いた場合の約５％乃至１０％の吸光度しか示さなかった組合せの場合と比較して、本例で得られたモノクローナル抗体クローンを用いたエライザ系は、ネイテイブなヒトアネキシンＶ抗原に対する反応性が格段に改良されている。
また本例、スクリーニングより選択したネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶに反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体クローン：ＨＤＡ−６７６、ＨＤＡ−９０７、ＨＤＡ−１６０６及びＨＤＡ−１９３７の−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体はいずれもヒトアネキシンＶに良好な反応性を有するモノクローナル抗体クローンであり、いずれを用いても、例１のＨＣＡ−６２７との組合せにおいて、ネイテイブなヒトアネキシンＶ抗原濃度に依存した良好な検量線が得られることが判明した。
（８）抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体（ＨＣＡ−６２７）及び抗ネイティブなヒト及びイヌアネキシンＶモノクローナル抗体クローン：ＨＤＡ−９０７を用いたサンドイッチエライザ法による検体中ヒトアネキシンＶの検出及び定量の可能性
上記のごとく調製したモノクローナル抗体同士の組合せを用いたヒトアネキシンＶ測定用サンドイッチエライザ法において、ネイテイブなヒトアネキシンＶを感度よく測定可能なモノクローナル抗体の組み合わせの内、代表例として、抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＣＡ−６２７固相ウエルと抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＤＡ−９０７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体とを選択したエライザ法により、臨床検体の測定が可能かどうかを検討した。
即ち、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７プレートのブロッキング液を捨て、反応用緩衝液（１％ＢＳＡ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））１００μｌを各ウエルに分注した。次に、ネイテイブなヒト心筋由来アネキシンＶ標準抗原（０ｎｇ／ｍｌ、１．５６３ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）及びヒト血漿検体を各ウエルに２０μｌずつ加え混和し、室温で１時間反応させた後、各ウエルを洗浄液で４回洗浄した。さらに、ＨＲＰＯ酵素活性値で４ｍＵ／ｍｌの濃度に調製した抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＤＡ−９０７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を１００μｌずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた後、洗浄液で各ウエルを４回洗浄した。洗浄後、ＯＰＤ基質液（０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液にｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ／ｍｌ、及び４ｍＭのＨ2Ｏ2を含む）を各ウエルに１００μｌ加え、室温で３０分間反応させた後、２ＮのＨ2ＳＯ4を各ウエルに１００μｌずつ加えて反応を停止させ、主波長４９２ｎｍ、副波長６９０ｎｍとしてエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。
ヒト血漿検体の測定値は、各濃度に調製したヒト心筋由来アネキシンＶの標準抗原の吸光度より検量線を作製し、この検量線より各血漿検体中に存在するネイテイブなヒトアネキシンＶの濃度を読み取った。
検量線は表５及び図１２に示した。前述の如く、ネイティブなヒトアネキシンＶ標準抗原の各濃度に依存した吸光度の上昇を示した（表５及び図１２）
（９）検体の希釈試験
正常血漿に精製アネキシンＶ抗原を添加した血漿検体（検体１）、アネキシンＶ低値の血漿検体（検体２）及びアネキシンＶ濃度の高値の血漿検体（検体３）を被検試料とし、各検体の希釈試験を実施した。各検体は、反応用緩衝液で２倍連続希釈系列を作製し、検体原液も含めて試験試料として、上記のモノクローナル抗体クローンＨＣＡ−６２７固相ウエルとモノクローナル抗体クローンＨＤＡ−９０７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体とを組合せたアネキシンＶ測定用エライザ系によりアネキシンＶ濃度を測定した。
その結果を次の表６、表６−１〜３及び図１３に示す。
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検体１は正常血漿にアネキシンＶを添加して調製した添加検体であるが、希釈倍数に応じた血中アネキシンＶ濃度を示し、原点に向かう希釈直線を示した。また、検体２及び検体３は、アネキシンＶ濃度が高値の検体であるが、いずれの例に於ても希釈倍数に相関したアネキシンＶの測定値を示し、この場合においても原点に向かうほぼ直線状の希釈直線を示した。
以上の検討より、アネキシンＶ添加無添加の何れの検体を用いた場合においても、希釈倍数に応じたアネキシンＶの測定値を示し、且つ原点を通る希釈直線が得らることから、本測定系は血漿中の成分の干渉を殆ど受けず、定量的に検体中のアネキシンＶの濃度が測定できる測定系であることを示していると言える。
更に、臨床検体測定に際しての本測定系の信頼性を確認するために、血漿及び血清中に精製アネキシンＶ抗原としてヒトアネキシンＶを添加することによる添加回収試験を実施した。
（１０）ヒトアネキシンＶ測定用エライザ系でのヒトアネキシンＶの添加回収試験
さらに、本例において検討した抗アネキシンモノクロナル抗体ＨＣＡ−６２７固相ウエルと、抗アネキシンＶモノクロナル抗体ＨＤＡ−９０７−Ｆａｂ'−ＨＲＰＯ標識抗体を用いたエライザ系において、精製アネキシンＶ抗原を、血漿又は血清に添加して測定した場合、血漿又は血清中の成分によりアネキシンＶの測定値が影響をけることが無く回収されるかどうかを、ヒトアネキシンＶ抗原の添加回収試験により実施し検討した。
（１１）添加回収試験の方法
ヒト血漿検体３例及び血清検体２例に、それぞれ４０.８ｎｇ／ｍｌ、１４.６ｎｇ／ｍｌ及び４.７ｎｇ／ｍｌとなるよう調製した高、中、低の３濃度の精製ヒトアネキシンＶ抗原を検体９容量に対して１容量となるように添加し、各検体中のアネキシンＶ濃度を実測した。次に、上記、添加したヒトアネキシンＶ抗原の代わりに緩衝液を同様の比率で添加して測定した検体を、検体自身のもつアネキシンＶ濃度として求めた。さらに、添加したヒトアネキシンＶ抗原濃度は、検体の代わりとして反応用緩衝液に、同様の容量比で添加したものを検体として実測し、添加したアヒト心筋ネキシンＶ濃度とした。
回収されたアネキシンＶ濃度は、添加した検体のアネキシンＶ濃度の実測値から検体自身の持つアネキシンＶ濃度の実測値を差し引くことにより次の式１により求めた。
回収されたアネキシンＶ抗原濃度（ｎｇ／ｍｌ）＝各濃度で添加した検体のアネキシンＶ濃度の実測値（ｎｇ／ｍｌ）−検体自身のアネキシンＶ濃度の実測値（ｎｇ／ｍｌ）・・・（１）
また、回収されたアネキシンＶ濃度における添加回収率は次の式２により求めた。
添加回収率（％）＝（各濃度における回収されたヒトアネキシンＶ濃度／各濃度で添加したヒトアネキシンＶ濃度）×１００・・（２）
上記の検討より得られた添加回収試験の成績を表７に示した。
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血漿自身のアネキシンＶ値の低値（１．２７ｎｇ／ｍｌ）から高値（４２．０ｎｇ／ｍｌ）までの血漿検体を用いた添加回収試験においても、添加したヒトアネキシンＶ抗原濃度範囲（４．７ｎｇ／ｍｌ〜４０．８ｎｇ／ｍｌ）においては何れも９６％〜１０９％の抗原の回収率を示し、極めて良好な成績を示した。
また、検体として血清を用いた場合にもおいても、添加したヒトアネキシンＶ抗原濃度の低値（４．７ｎｇ／ｍｌ）から高値（４０．８ｎｇ／ｍｌ）の濃度範囲において、その回収率は９１％〜１０６％の範囲であり、極めて良好な添加回収率を示した。
以上のことから、今回検討したアネキシンＶ測定用サンドイッチエライザ系は血漿及び血清の成分による測定値への影響はほとんど無く、その定量性の面での信頼性が示されたといえ、臨床検体の測定においても充分応用可能であることが示された。
例１１血液検体についての本発明の酵素抗体法による分析の応用例
（１）採血された血液の前処理
静脈血を採血後、直ちに、３.８％クエン酸ナトリウム０.２ｍｌを含む採血管に１．８ｍｌの全血を入れ、静かに混和後、２５００回転／分で１０分間遠心し、血漿を分離した。分離した血漿は、直ぐに、又は凍結保存した後にアネキシンＶ濃度を測定した。
クエン酸ナトリウムの代わりにＥＤＴＡの塩を使用する場合には、３〜５ｍＭ濃度のＥＤＴＡ・２カリウム又はＥＤＴＡ・２ナトリウムを採血管に入れ、遠心後、血漿を分離してもよい。
（２）心筋梗塞の診断
７２才の女性の発症３時間後に採血された、溶血の認められない血液で、ＣＫ（クレアチン燐酸酵素）値は５０Ｕ／Ｌと正常範囲にあったが、血漿アネキシンＶ濃度は１６．４ｎｇ／ｍｌと上昇していた。この例はその後、ＣＫ値は１１０８Ｕ／Ｌまで上昇し、心電図も典型的変化を示し心筋梗塞と確定診断された。血漿アネキシンＶは発症後第３病日に正常値に戻った。
この例は、初回に採血された、溶血の認められない血液の血漿アネキシンＶ濃度の測定が、心筋梗塞の診断に有用であることを示すものである。心筋梗塞患者の血漿中アネキシンＶ濃度は発症早期（発症６時間内）で比較的高く、胸痛発作を認めた例では、溶血の認められない血液検体で、血漿アネキシンＶ濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上と測定された事例ではその後７０％が心筋梗塞と診断された。
（３）狭心症の診断
５５才の男性で、最初の胸痛の３時間後に再度胸痛があり、その３時間３０分後に採血された溶血の認められない血液の血漿アネキシンＶ濃度は、５．８ｎｇ／ｍｌであり、その後採血された血液のＣＫ値は、いずれも正常範囲（１４０Ｕ／Ｌ）以下であった。その後、この症例は、冠動脈造影で右冠動脈に高度狭窄性変化を認め、臨床症状と併せて狭心症と確定診断された。
この例は、前記採血された溶血の認められない血液の、血漿アネキシンＶ濃度の測定が、狭心症の診断に有用であることを示すものである。
狭心症の患者の血漿アネキシンＶ濃度は、心筋梗塞より比較的低いが、胸痛を主訴とし、その後のＣＫ値から心筋梗塞ではないと診断された例で、血漿アネキシンＶ濃度が５ｎｇ／ｍｌ以上と測定された事例では約７０％が狭心症と診断された。
（４）正常健康人のアネキシンＶ濃度
２２才〜７５才までの正常健康の男性で、溶血のない血液の血漿アネキシンＶ濃度は０．６〜１．９ｎｇ／ｍｌであり、２４才〜７８才までの正常健康の女性で、溶血のない血漿アネキシンＶ濃度は０．５〜１．７ｎｇ／ｍｌであり、平均値は１．０ｎｇ／ｍｌ、最大値１．９ｎｇ／ｍｌ、最小値０．５ｎｇ／ｍｌであった。性別、年齢による差はみられなかった。
溶血が起こった血液では、破壊された白血球、血小板、赤血球からアネキシンＶが血漿中に溶出し、分析値はその分高くなるので、血液検体の採血後の処理は溶血が起こらないように、例えば、細い採血針を使用しない、また採血された血液を激しく振らないなどの注意をすることが望ましい。軽度の溶血があった場合では、血漿アネキシンＶ濃度の測定に影響がなく、測定は可能である。心筋梗塞あるいは、狭心症の診断に血漿アネキシンＶ濃度測定は有用である。
（５）例７との比較
例７の場合は、例９に比して、正常値等の分析値が高めに出ているが、これは、例７で分析に提供された血液検体に検体処理の段階で溶血があり、この溶血により溶出したアネキシンＶが測定されたことによるものである。
したがって、例７は、このように溶血があった場合でも、同一の手法で血液検体に処理される限り、血漿アネキシンＶ濃度測定が、心筋梗塞、狭心症の診断に有用であることを示すものである。また、これらの標準血液検体を使用したり、又は溶血を測定するなどして補正することにより、より精度の高い安定した分析値を得ることができる。
（６）本発明より明かなごとく、本発明より得た抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体（ＨＣＡ−６２７）及び抗アネキシンＶモノクローナル抗体（ＨＤＡ−９０７）はアネキシンＶ抗原分子を特異的に認識するモノクローナル抗体であり、同一アネキシンＶ分子上の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である。
上記、両モノクローナル抗体を用いて作製したアネキシンＶ測定用サンドイッチエライザ系は感度良くアネキシンＶ抗原を測定可能で、検体の希釈試験、添加回収試験の成績も良好であり、その定量性に優れていることが示された。
また、両モノクローナル抗体はヒトアネキシンＶ抗原及びイヌアネキシンＶ抗原ともに交叉反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体である。これら交叉反応性の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、アネキシンＶ蛋白質分子上に存在する共通の抗原決定基を認識すると考えられ、アネキシンＶ測定系における標準抗原を提供するにあたり、抽出、精製が倫理的に問題とされるヒト由来のアネキシンＶを用いることなく、イヌからの安価な抗原の提供を可能にすることができ、その有用性が高いと言える。
産業上の利用可能性
本発明においては、ヒト心臓より得た抗原蛋白質のヒトアネキシンＶで免疫されたマウス等の哺乳動物のリンパ器官から取り出したリンパ球形質芽細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマ細胞を形成し、このハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７株（微生物の寄託の国際寄託当局の日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月６日に国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８４）及びハイブリドーマ細胞系ＨＤＡ−９０７株（微生物の寄託の国際寄託当局の日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月７日に国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８６）を培養して、新規な抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を産生するものである。
本発明において、得られる抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、ヒトアネキシンＶ抗原分子を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
また、本発明においては、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のほかに各種動物由来（ビーグル犬及びラット）の抗原蛋白質のアネキシンＶとも交叉反応する抗アネキシンＶモノクローナル抗体が得られる。
これら交叉反応性の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、アネキシンＶ蛋白質分子上に存在する共通の抗原決定基を認識すると考えられる。このようなアネキシンＶ蛋白質分子上に存在する共通の抗原決定基を有する部位は、動物種間で保持されたアネキシンＶ分子の構造を維持するうえで重要な部位と考えられる。
本発明においては、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を用いて、虚血性心疾患の心筋梗塞及び狭心症患者について、エライザ（ＥＬＩＳＡ）法により、例えば血漿中のヒトアネキシンＶ濃度を測定することができ、心筋梗塞及び狭心症の診断において困難とされていた、発症早期における高い精度の心筋梗塞及び狭心症の診断を迅速に行うことができ、しかも、リウマチ因子などの影響を受けずに、高い精度で心筋梗塞及び狭心症の診断を行うことができる。
また、本発明においては、例えば、剖検において、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を用いて、心筋組織の組織染色を行うことにより、心筋組織中のヒトアネキシンＶの分布を知ることができる。
本発明における、例えば反応性の異なる抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、夫々、ヒトアネキシンＶ抗原分子上の異なる抗原決定基を認識するものであり、これらの抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体群より選択した互いに認識する抗原決定基の異なる２種類の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を組合わせて、エライザ法によりヒトアネキシンＶを高感度に再現良く測定することができる。
したがって、これらの抗原決定基の異なる抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体を組み合わせることにより、確度が高いヒトアネキシンＶ測定用試薬及び心筋梗塞及び狭心症の診断用試薬を調製することができる。
また、本発明においては、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、ヒトアネキシンＶ測定用エライザ系に使用する以外に、組織染色に使用することができ、これにより、例えば、ヒト心臓の心筋組織のヒトアネキシンＶ局在部位、分布及び虚血による該心筋組織からのヒトアネキシンＶ逸脱部位の特定等が組織染色において検索することが可能となり、ヒトアネキシンＶの分子論的研究等に役立つものである。
さらにまた、本発明においては、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及び抗アネキシンＶモノクローナル抗体を用いた組織抽出液からアフィニティー精製により純度の高いアネキシンＶ抗原分子を精製することができる。またウエスタンブロット法によりアネキシンＶ抗原分子を同定することができる。
以上のように、本発明による抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及び各種動物のアネキシンＶモノクローナル抗体は、人及び各種動物に存在するアネキシンＶの分子学的及び生理学的研究に用いることができ、臨床医学分野のみならず、基礎医学分野等の広範囲な研究に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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