(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有する、ポリヌクレオチド、
を含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記発現ベクターが導入された植物細胞を、前記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病原性細菌が、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記植物が単子葉植物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イネ科植物がイネである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
を含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記発現ベクターが導入された植物細胞を、前記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原性細菌が、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物が単子葉植物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記イネ科植物がイネである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有する、ポリヌクレオチド、
を含有しかつ発現し得る発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含し、
該少なくとも２つの病原体は、少なくとも１つの病原性真菌および少なくとも１つの病原性細菌または少なくとも２つの病原性細菌を含む、方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターが導入された植物細胞を、前記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記病原体が、病原性真菌および病原性細菌を含む、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも２つの病原体が、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも２つの病原体が、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物が単子葉植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記イネ科植物がイネである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
を含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含し、
該少なくとも２つの病原体は、少なくとも１つの病原性真菌および少なくとも１つの病原性細菌または少なくとも２つの病原性細菌を含む、方法。
【請求項２５】
前記発現ベクターが導入された植物細胞を、前記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原体が、病原性真菌および病原性細菌を含む、請求項２４または２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つの病原体が、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも２つの病原体が、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物が単子葉植物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記イネ科植物がイネである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法によって作出された、植物組織。
【請求項３４】
カルスおよび芽条原基からなる群から選択される、請求項３３に記載の植物組織。
【請求項３５】
請求項２に記載の方法によって作出された植物体であって、前記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する、植物体。
【請求項３６】
請求項３５に記載の植物体から得られる、植物組織。
【請求項３７】
前記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される、請求項３６に記載の植物組織。
【請求項３８】
請求項８に記載の方法によって作出された、植物組織。
【請求項３９】
カルスおよび芽条原基からなる群から選択される、請求項３８に記載の植物組織。
【請求項４０】
請求項９に記載の方法によって作出された植物体であって、前記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する、植物体。
【請求項４１】
請求項４０に記載の植物体から得られる、植物組織。
【請求項４２】
前記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される、請求項４１に記載の植物組織。
【請求項４３】
請求項１５に記載の方法によって作出された、植物組織。
【請求項４４】
カルスおよび芽条原基からなる群から選択される、請求項４３に記載の植物組織。
【請求項４５】
請求項１６に記載の方法によって作出された植物体であって、前記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する、植物体。
【請求項４６】
請求項４５に記載の植物体から得られる、植物組織。
【請求項４７】
前記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される、請求項４６に記載の植物組織。
【請求項４８】
請求項２４に記載の方法によって作出された、植物組織。
【請求項４９】
カルスおよび芽条原基からなる群から選択される、請求項４８に記載の植物組織。
【請求項５０】
請求項２５に記載の方法によって作出された植物体であって、前記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する、植物体。
【請求項５１】
請求項５０に記載の植物体から得られる、植物組織。
【請求項５２】
前記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される、請求項５１に記載の植物組織。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新しい育種素材・新品種の開発に利用できる有用遺伝子の新規の機能を明らかにし、この機能を利用して病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性の植物を作出する方法、ならびにこの遺伝子を含み、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物に関する。さらに詳細には、本発明は、酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子を用いて病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性の植物を作出する方法、ならびに酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子を含み、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネは日本を含むアジアの主作物であり、そのためアジア諸国では古くからイネの収量増加のための研究が行われてきた。イネの収量を減少させる主要な原因の一つに病害がある。植物の病原体としては、糸状菌を含む真菌類、細菌、ウイルス、ウイロイド、ファイトプラズマ、線虫、昆虫などが知られており、これらの病原体は単独でも病因となり得るが、実際には、複数の病原体が関与することが多い。
【０００３】
イネに深刻な被害をもたらす病害の例としては、例えば、いもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）や白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）などが挙げられる。いもち病は日本で最も恐れられている病害であり、主に日本の中部から北部にかけて長雨、冷害に伴って発生する。いもち病は糸状菌病の一種である。いもち病に冒されたイネは黒色の斑点型病斑を生じ、イネの成長を停止し、症状が進むと枯死する。白葉枯病は細菌病の一種であり、九州から東南アジアにかけて深刻な被害をもたらす病害である。白葉枯病に冒されたイネは、白褐色の病斑が葉縁に沿って拡大し、葉全体が枯死する（Ｏｈａｔａ，１９８９，Ｚｅｎｋｏｋｕ  Ｎｏｓｏｎ  Ｋｙｏｉｋｕ  Ｋｙｏｋａｉ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．５６３頁）。
【０００４】
植物は病原体の侵入シグナルを認識すると、植物を防御するために感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）を誘導発現し防御応答を行う（Ｂｏｗｌｅｓ，  １９９０，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  ８７３）。ＰＲタンパク質はその機能、性質から現在１４種類に分類されており、それらの多くは抗菌活性を有するタンパク質である。この様に病原体の感染によって誘導されるＰＲタンパク質は、病原体に直接作用することによって植物の防御機構に関わっていると考えられている（Ｖａｎ  Ｌｏｏｎ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．１２，２４５；Ｖａｎ  Ｌｏｏｎ，１９９９，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．５５，８５）。これまでにＰＲタンパク質の性質を利用して、ＰＲ２（グルカナーゼ）やＰＲ３（キチナーゼ）を遺伝子組換えする事によって、植物に病害抵抗性をもたらした報告が成されている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，１９９９，Ｋａｇａｋｕ  ｔｏ  Ｓｈｅｉｂｕｔｓｕ  ３７，２９５）。
【０００５】
タウマチン様タンパク質はＰＲ５に属するタンパク質であり、その等電点から塩基性型、酸性型、および中性型に大別される。塩基性型と酸性型のタウマチン様タンパク質は、発現する細胞学的位置、誘導因子、および抗菌性を示す病原性真菌に対して特異性があることが知られている（Ｉｂｅａｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２０００）２３（３）：３７５−３８３；Ｇｒｅｎｉｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９９）１９（４）：４７３−４８０；Ｎｉｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８）３９（５）：５００−５０７；Ｓｉｎｇｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７）８５：５２９−５３６を参照のこと）。詳細には、塩基性型タウマチン様タンパク質は、液胞に局在して発現し、主に創傷（ｗｏｕｎｄｉｎｇ）によって発現が誘導されることが公知である。また、塩基性型タウマチン様タンパク質は、人為的なジャスモン酸処理によっても発現が誘導されることが公知である。一方で、酸性型タウマチン様タンパク質は、細胞外に分泌されることが公知であり、主に感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によって誘導される。また、酸性型タウマチン様タンパク質は、人為的なサリチル酸処理によっても発現が誘導されることが公知である。さらに、塩基性型タウマチン様タンパク質と酸性型タウマチン様タンパク質が示す真菌抵抗性には特異性があることも公知である。詳細には、インビトロにおいて、塩基性型タウマチン様タンパク質によって生育が抑制された病原性真菌が、酸性型タウマチン様タンパク質によっては生育に影響を受けず、同様に、酸性型タウマチン様タンパク質によって抑制された病原性真菌が、塩基性型タウマチン様タンパク質によっては抑制されなかったという報告が成されている（Ｖｉｇｅｒｓ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８３，１５５）。
【０００６】
塩基性型タウマチン様タンパク質はその抗菌性に関して早くから研究がなされており、病原菌の細胞壁に存在する糖鎖を認識して抗菌性をもたらすことが分かっている（Ｉｂｅａｓ，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２３，３７５）。また塩基性型タウマチン様タンパク質の遺伝子導入によって病害抵抗性が付与された結果も複数報告されている（Ｌｉｕ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１８８８；Ｍａｌｅｈｏｒｎ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６，１４７１；Ｌｉｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１２１，１２３）。
【０００７】
一方、酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子に関する研究は、これまでほとんど進展していない。これまでに、酸性型タウマチン様タンパク質は、真菌類（例えば、糸状菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、および酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））に対して抗菌性を示すことがインビトロで確認されているのみであった（Ｈｕ，Ｘ．およびＲｅｄｄｙ，Ａ．Ｓ．Ｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４：９４９−９５９（１９９７）；Ｖｉｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８３：１５５−１６１（１９９２）；およびＧｒｅｎｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：１２７７−１２８３（１９９３）を参照のこと））。そして、過去に酸性型タウマチン様タンパク質の植物への遺伝子導入実験が行われたが、組換え体は病害抵抗性をもたらさなかった（表１を参照のこと）。
【０００８】
【表１】
0003716302.tif 000002
そのため、酸性型タウマチン様タンパク質は、少なくとも単独では病害抵抗性に関与しないのではないかという議論も成されていた（Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １，２８５）。これまでに、本発明者らによって、酸性型タウマチン様タンパク質の１つであるナシのＰｓＴＬ１をイネで発現させて、糸状菌病であるいもち病に対する抵抗性を付与しようとする試みがなされている（青木ら、第２３回  日本分子生物学会年会講演要旨集、５０７頁（２０００年１１月２５日発行））。しかしこれまで、酸性型タウマチン様タンパク質を植物に導入して病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性の付与に成功した研究は発表されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、イネ新育種素材・新品種の開発のために、酸性型タウマチン様タンパク質を用いて病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性病害耐性の植物を作出する方法を提供することである。本発明の他の目的は、酸性型タウマチン様タンパク質を含み、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物、およびこの植物から得られる植物組織を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、酸性型タウマチン様タンパク質を植物に導入し、この酸性型タウマチン様タンパク質を恒常的に発現する植物体を作出することに成功した。また、この植物は、病原性真菌病のみならず病原性細菌病に対しても病害抵抗性を有したことから、本発明に従って酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子を導入することによって植物に複合病害抵抗性を付与し得ることが明らかとなった。
【００１１】
病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有するポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１２】
別の実施形態では、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法は、発現ベクターが導入された植物細胞を、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、上記病原性細菌が、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が、単子葉植物または双子葉植物である。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が単子葉植物である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、上記単子葉植物がイネ科植物である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、上記イネ科植物がイネである。
【００１９】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜２４４位に記載されるアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｂ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は酸性でありかつ抗真菌活性を有するポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含する方法に関する。
【００２０】
別の実施形態では、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための本発明の方法は、以下の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド残基３５〜７６６位に記載されるヌクレオチド配列を含む、ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）該ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しかつ発現し得る発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法は、上記発現ベクターが導入された植物細胞を、上記酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、上記病原体が、病原性真菌、病原性細菌、および病原性ウイルスからなる群より選択される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、上記少なくとも２つの病原体が、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、上記少なくとも２つの病原体が、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせである。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が、単子葉植物または双子葉植物である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物が単子葉植物である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、上記単子葉植物がイネ科植物である。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、上記イネ科植物がイネである。
【００２９】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された、植物組織に関する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織は、カルスおよび芽条原基からなる群から選択される。
【００３１】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された植物体であって、上記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして病原性細菌に対して抵抗性を有する、植物体に関する。
【００３２】
さらに本発明は、病原性細菌に対して抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された上記植物体から得られる、植物組織に関する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される。
【００３４】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された、植物組織に関する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織は、カルスおよび芽条原基からなる群から選択される。
【００３６】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された植物体であって、上記酸性型タウマチン様タンパク質を発現し、そして少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する、植物体に関する。
【００３７】
さらに本発明は、少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性を有する植物を作出するための上記方法によって作出された上記植物体から得られる、植物組織に関する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物組織が、葉、茎、根、花粉、種子胚、および種子からなる群より選択される。
【００３９】
【発明の実施の形態】
発明の理解を容易にするために、本明細書において使用する用語を説明する。
【００４０】
本発明において用いられる「酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、当該ポリヌクレオチドが導入された植物に、以下に説明するような病害抵抗性を与え得る。ここで、用語「植物」とは、他に特に示さない限り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉、塊茎、花粉、種子胚、種子、プロトプラスト、カルス、および芽条原基など）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。
【００４１】
本明細書において使用する用語「酸性型タウマチン様タンパク質」は、ＰＲ５に属するタンパク質であって、等電点が酸性（ｐＩ＜７．０）のタンパク質を意味する。酸性型タウマチン様タンパク質の具体例としては、ナシのＰｓＴＬ１、タバコのＰＲ−ＲおよびＰＲ−Ｓ、シロイヌナズナのＡＴＬＰ−１およびＡＴＬＰ−３、オオムギのＩＦＷ１５（Ｇｒｅｎｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：１２７７−１２８３（１９９３）を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。精製された酸性型タウマチン様タンパク質は、インビトロにおいてＣｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのような真菌類に対して抵抗性を示し得る（例えば、Ｖｉｇｅｒｓら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８３、１５５；およびＨｕら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４、９４９を参照のこと）。
【００４２】
アミノ酸配列に基づいた酸性型タウマチン様タンパク質間の配列比較を、図２に示す（配列整列プログラムｃｌｕｓｔａｌｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を使用）。ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア株式会社、東京）配列解析ソフトを使用して計算した場合、ＰｓＴＬ−１と他の酸性型タウマチン様タンパク質との間の配列相同性は、アミノ酸配列に基づいて４０．８９〜５１．３９％であり、そして塩基配列に基づいて５４．２１〜５９．０３％であった。しかし図２において示されるように、酸性型タウマチン様タンパク質は配列保存性の高い領域を数カ所共有しており（例えば、ＰｓＴＬ−１配列に基づいて、２９残基目のＮから３６残基目のＷまで、７２残基目のＲから９４残基目のＣまで、１２４残基目のＤから１３５残基目のＮまで、１５８残基目のＩから１６３残基目のＰまで、１９１残基目のＣから２４４残基目のＰまで）、このことは、これらの酸性型タウマチン様タンパク質が、この保存領域において共通の機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性）を担う可能性が高いことを示唆する。
【００４３】
本発明で使用され得る、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、既知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に示したアミノ酸配列を有するナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１））のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、既知の酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（すなわち、短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。
【００４４】
酸性型タウマチン様タンパク質の改変体において、目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換」とは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限りにおいて、任意の数（例えば、１または数個）のアミノ酸が上記アミノ酸配列において欠失、付加、および／もしくは置換していることを意味する。アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかである。本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限りにおいて、好ましくは以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、置換および／もしくは付加された改変体をコードする。
【００４６】
さらに、本発明で使用される「酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできる遺伝子を意味する。例えば、図１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを縮重異性体と呼ぶこととする。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドに組み込まれたタウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いても良い。
【００４７】
本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００４８】
さらに、上記に示したように、酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列において、機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性（例えば、本明細書中に開示された、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性））を担う可能性が高い保存領域は明らかである（図２を参照のこと）。従って、このような保存領域を考慮することによって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列に対して、全体としてはより低い配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いても、本願発明と等価な効果が得られることは、当業者に容易に明らかである。従って、例えば、配列表の配列番号２の２９残基目のＡｓｎから３６残基目のＴｒｐまで、７２残基目のＡｒｇから９４残基目のＣｙｓまで、１２４残基目のＡｓｐから１３５残基目のＡｓｎまで、１５８残基目のＩｌｅから１６３残基目のＰｒｏまで、１９１残基目のＣｙｓから２４４残基目のＰｒｏまでのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）の部分配列に対する高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性）を含む限りにおいて、アミノ酸配列全体としては、少なくとも４０％、好ましくは４５％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは５５％、なおさらに好ましくは６０％、さらにより好ましくは６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本願発明において使用され得る。
【００４９】
本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の３５位のＡから７６６位のＴまでに示されるヌクレオチド配列）と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００５０】
さらに、上記に示したように、酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列において、機能的活性（例えば、植物の病原体感染防御機構に関わる活性（例えば、本明細書中に開示された、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性））を担う可能性が高い保存領域は明らかである（図２を参照のこと）。従って、このような保存領域を考慮することによって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２４４位のＰｒｏまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の３５位のＡから７６６位のＴまでに示されるヌクレオチド配列）に対して、全体としてはより低い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いても、本願発明と等価な効果が得られることは、当業者に容易に明らかである。従って、例えば、配列表の配列番号１の１１９位のＡから１４２位のＧまで、２４８位のＣから３１６位のＣまで、４０４位のＧから４３９位のＣまで、５０６位のＡから５２３位のＴまで、６０５位のＴから７６６位のＴまでのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）の部分配列に対する高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性）を含む限りにおいて、アミノ酸配列全体としては、少なくとも４０％、好ましくは４５％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは５５％、なおさらに好ましくは６０％、さらにより好ましくは６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本願発明において使用され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００５３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性％を算定するためにＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ整列において、一般的には、デフォルトパラメーターが使用され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００５６】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーター（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して、記載されるかさもなくば公知のアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされる対応するタンパク質の同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、対応するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００５７】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列同一性を共有する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を与える酸性型タウマチン様タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明で使用される酸性型タウマチン様タンパク質の全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２４４アミノ酸）をコードする。ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＰＣＲプライマーについて）として用いるための、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質のフラグメントは、一般に、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００５９】
ナシ（Ｐｙｒｕｓ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）以外の他の植物に由来する、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を与える酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドホモログもまた、本願発明において使用され得る。そのようなポリヌクレオチドホモログは、例えば、公知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されたナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１））の全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、公知の酸性型タウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されたナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。とりわけ、図１に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって特に好ましく使用される。
【００６０】
ハイブリダイゼーション技術において、公知の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、32Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製およびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築の方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００６１】
例えば、本明細書中に示された病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードするヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質の遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を付与する酸性型タウマチン様タンパク質をコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：  ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：  １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００６２】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００６３】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な高ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェントな条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な低ストリンジェントな条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。
【００６４】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔmは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔmは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔmは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔm）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴmを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参��のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００６５】
本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、代表的には、既知の酸性型タウマチン様タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に記載されるナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）のアミノ酸配列）の情報またはそれをコードするヌクレオチド配列情報に従って得られるが、それらの既知の配列情報を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００６６】
さらに他の実施形態では、本発明で使用される酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する１つの方法としては、核酸合成の手法に従ってそのポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＢＡＣクローンライブラリー、ＰＡＣクローンライブラリー、ＹＡＣクローンライブラリーなどから、慣用されている方法（例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーション法など）により取得する方法を挙げることができる。上記の方法に用いるいくつかのプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類としては市販のものを使用し得る。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養および培養物からのＤＮＡ，ＲＮＡ等の回収は文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ））に準じて行い得る。
【００６７】
さらに別の実施形態では、以下の様にして、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。まず、既知のタウマチン様タンパク質（例えば、図１に記載されるナシの酸性型タウマチン様タンパク質）中の２種類のアミノ酸部分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーと上記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作製し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なライブラリーおよびＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７）（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７，４５３））を行う。その後、ＰＣＲ反応生成物の中から、増幅が予想される特定の長さの増幅断片を取り出し、これらの塩基配列を決定する。得られた増幅断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、上記のライブラリーからタウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを獲得する。
【００６８】
得られたポリヌクレオチドの塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法マキサムーギルバート法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９）やジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８２，Ｇｅｎｅ  １９，２６９））、または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。決定された塩基配列から、取得されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の等電点を決定する方法は、当該分野において周知である。例えば、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列情報を用いて、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア株式会社、東京）などの配列解析ソフトを使用することにより、取得されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の等電点を容易に推測し得る。
【００６９】
また、得られたポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すること、そして適切な宿主においてポリペプチドを発現させることによって、コードされるタンパク質を容易に組換え的に発現させ得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、組換えタンパク質を発現させ得る。組換えタンパク質の発現は、取得されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞などが挙げられる。好ましくは、用いられる宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物の細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）である。この様式で発現されるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、天然に存在するポリペプチドの一部分、またはそれらの他の改変体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌する適切な宿主／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、アフィニティーマトリクスまたはイオン交換樹脂のような適切な精製マトリクスに供され得る。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣの工程が用いられ、組換えポリペプチドは、さらに精製され得る。
【００７０】
このようにして精製されたタンパク質の等電点は、ｐＩマーカー（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）と共に等電点電気泳動を行い、そして目的のタンパク質のバンドの位置が、どのマーカーと一致するかを調べることによって容易に決定され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＨＡＰＴＥＲ  １０、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【００７１】
上記のように取得されたポリヌクレオチドが、抗真菌活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。例えば、タンパク質の抗菌活性を測定する方法としては、阻止円法（佐藤昭二ら、植物病理学実験法、第２１９−２２３頁、講談社を参照のこと）が挙げられる。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、病原菌胞子などを混合した寒天培地上に、この組換え生成タンパク質を染み込ませた濾紙ディスクを載せて、所定時間培養する。組換え生成タンパク質が、使用された病原菌に対して抗菌性を有している場合、この濾紙の周りに生育阻止円が形成される。さらに、タンパク質濃度に応じて阻止円の大きさを測定することによって、抗菌性の強さを測定し得る。
【００７２】
本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドの代表的形態は、プラスミドまたはファージＤＮＡなどの中に構成員の一部としてこのポリヌクレオチドが挿入された形態、並びに、ゲノムＤＮＡの中にこのポリヌクレオチドが挿入された形で微生物またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。本明細書中で使用される微生物の一例として、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’−末端側に接して少なくとも１個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を有することが望ましい。
【００７４】
さらに本発明に用いる酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望により５’−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニンをコードするＡＴＧ配列、その５’−側上流および３’−下流に非翻訳領域として適当な長さの他のポリヌクレオチドが結合しても良い。
【００７５】
本発明における使用に有用な発現ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）などが挙げられる。酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物中で安定に発現しうるように、このポリヌクレオチドに、種々のプロモーター、エンハンサー、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ）またはターミネーターを、適宜組み合わせて付加することが好ましい。
【００７６】
上記のプロモーターとしては、本発明のタンパク質を恒常的あるいは誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。
【００７７】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ  ＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ  ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，ｎａｔｕｒｅ  ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ  １９９３，Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用い得る。特に好ましい実施形態では、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーターを使用し得る。
【００７８】
誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、病原体の感染や侵入、光、傷害、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現を誘導することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターの例としては、例えば、光照射によって発現を誘導するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスなどの病原体の感染や侵入によって発現を誘導するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）およびタバコのＰＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２，９５）、低温によって発現を誘導するイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって発現を誘導するイネのｈｓｐ７２，ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ  Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ  １９３，５７）、乾燥によって発現を誘導するシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１４０６）、紫外線の照射によって発現を誘導するトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、上記のイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターおよびタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターは、サリチル酸またはジャスモン酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導されることが公知である。
【００７９】
本発明で使用され得るターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｇｉｅｌｅｎ，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３，８３５）などを用い得る。
【００８０】
植物細胞および植物体への遺伝子導入法としては、通常公知の方法、例えば「Ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｄｒａｐｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９」記載の方法を用いて行うことができる。その例としては、生物的方法（例えば、ウイルスを用いる方法またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（Ｈｏｏｄ，１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２，２１８、Ｔｏｋｉ  Ｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １５，１６．）など）、物理・化学的方法（例えば、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，４７５）、ポリエチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，４３７）、パーティクル・ガン法（ｓａｎｆｏｒｄ，１９８７，Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５，２７）など）などが挙げられる。
【００８１】
ポリヌクレオチド導入に使用するための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択し得る。植物細胞としては特に制限はないが、植物体への再分化の系が確立されている、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの植物細胞が特に好ましい。適当な導入法および植物材料を選択することは、当業者によって容易になされ得る。
【００８２】
植物培養細胞へポリヌクレオチドを導入する場合、材料として代表的にはプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってポリヌクレオチドの導入が行われる。植物組織へポリヌクレオチドを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など（好ましくは葉、茎、カルス）を用いて、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法、好ましくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法によって、ポリヌクレオチドの導入が行われる。
【００８３】
上記方法により、酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地またはホルモンフリーのＭＳ培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ  ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００８４】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、実施例４に記載のように、特定のイネ品種にその品種に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。また例えば、白葉枯病の場合は、実施例８に記載のような、枯病細菌懸濁液中に抵抗性を検定する植物の組織（例えば、成葉）を浸漬し、病斑の進行距離を測定する方法、または噴霧接種法、針接種法が挙げられる。いずれの方法においても、葉全体の病斑面積率を測定することによって、発病程度を評価する（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００８５】
上記のような方法で酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を導入し、発現させることにより、病原体に対する抵抗性を付与または増強することができる「植物」としては、病原体に感染するあらゆる植物を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明の方法に従って形質転換される植物は、単子葉植物または双子葉植物である。より詳細には、本発明の方法に従って形質転換される植物の例としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマトなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の方法に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原体」としては、植物に感染可能なあらゆる病原体、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００８７】
病原性真菌としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌、カンキツにせ黄斑病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
病原性ウイルスとしては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の方法に従って得られる植物が示す「少なくとも２つの病原体に対する複合病害抵抗性」とは、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどの分類群から選択される少なくとも２つの異なる分類に属する少なくとも２つの病原体に対する抵抗性を意味する。例えば、少なくとも２つの病原体に対する抵抗性としては、病原性真菌と病原性細菌との組み合わせに対する抵抗性、病原性細菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性、病原性真菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性などが挙げられる。
【００９１】
本発明により、植物に導入された酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したポリヌクレオチド配列が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明の酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原菌に対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、病害抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【００９２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９３】
【実施例】
本発明者らは、酸性型タウマチン様タンパク質の一例としてナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）（表２）をコードするポリヌクレオチドをアグロバクテリウム形質転換法を用いてイネに形質転換を行い、植物体内で発現させることに成功した。本発明者らは、さらに、この遺伝子の解析を進めた結果、この酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子の発現と植物の病害抵抗性との間に顕著な相関関係が認められることを見いだした。本発明で使用され得る酸性型タウマチン様タンパク質および植物が、以下に記載の特定の例に限定されず、類似の酸性型タウマチン様タンパク質および植物によっても同様の効果が得られ得ることは、当業者に容易に明らかである。
【００９４】
（実施例１．ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）遺伝子を発現させる発現ベクターの構築）
ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）遺伝子は横浜市立大学木原生物学研究所でクローニングされ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされた形で供与された（表２、図１、Ｓａｓｓａ，１９９８，Ｐｌａｎｔａ  ２０５，５１４）。
【００９５】
【表２】
0003716302.tif 000003
（表２：ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）の特徴）
本研究で使用したタウマチン様タンパク質はナシの花柱で発現するｐＩ４．８の酸性型である。アミノ酸配列から推測される分子量は２２．９ｋＤａであるが、細胞中では糖鎖が付加されるため３２．０ｋＤａに増加する。
【００９６】
形質転換用バイナリーベクターはｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）を用いた。発現ベクター作製の際の基本的実験操作は実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に順じて行った。形質転換の際に用いたプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌はＤＨ５α（東洋紡）を用いた。ｐＰＺＰ２０２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）をライゲーションした。ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＮＯＳターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）をライゲーションした。ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＰｓＴＬ１のｃＤＮＡをセンスに組み込んだ。最後にＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｇｒｉｔｚ，１９８３，ｇｅｎｅ  ２５，１７９）にＣａＭＶ３５Ｓプロモ−タ−（Ｏｄｅｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，８１０）とＮＯＳターミネーターを連結させた遺伝子を選抜マーカーとして導入した。以上の方法でＰｓＴＬ１が高発現する発現ベクターを構築した（図３）。
【００９７】
（実施例２．ＰｓＴＬ１遺伝子導入イネ系統の作出）
ナシの酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子（ＰｓＴＬ１）を高発現させる形質転換植物の作出はアグロバクテリウムによる方法を用いた（Ｔｏｋｉ  Ｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １５，１６．Ｈｉｅｉ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６，２７１）。アグロバクテリウムの系統はＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，１２９１）を用いた。
【００９８】
上記実施例１で構築した発現ベクターをエレクトロポレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポレーション装置はＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲａＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振とう培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０  ｇ／ｌトリプトン、５  ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調製）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。
【００９９】
遺伝子導入したアグロバクテリウムを水稲品種「どんとこい」胚盤由来カルス（４週間）に感染させた。「どんとこい」種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで１分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。さらに、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で４０分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この玄米を、カルス誘導培地（３０ｇ／ｌシュクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを添加し、ｐＨ５．８に調製し、４  ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕ，１９７４，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ  １８，６５９））上に置床した。玄米は２８℃明所で生育させカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いた。
【０１００】
２０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地に２８℃で培養したアグロバクテリウム０．５ｃｍ四方をミクロスパテルでかき取り、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（Ｔｏｒｉｙａｍａ，１９８５，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４１，１７９）に懸濁した。この懸濁液をカルスに注ぎ、２分間浸漬させた。このカルスを水切りした後、１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上で２８℃で３日間培養した。感染後のカルスを滅菌蒸留水で５回洗浄し、余分なアグロバクテリウムを除去した。
【０１０１】
アグロバクテリウムを除去したカルスを選抜培地（５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地）に２８℃で２週間培養し、再び同じ培地に移し替えさらに２週間培養した。その結果、遺伝子組換えされたカルスがハイグロマイシン耐性になり、選抜培地上で増殖した。
【０１０２】
増殖したカルスを５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む再分化培地（３０ｇ／ｌシュクロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２０μｇ／ｌ  ＮＡＡ、２．２ｍｇ／ｌカイネチンを添加し、ｐＨ５．８に調製し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５，４７３））上に移植した。再分化培地では２８℃で２週間の培養を２回行い、再分化固体を選抜した。
【０１０３】
再分化したイネを鉢上げし、２００系統の再分化個体（Ｔ0）を隔離温室内で生育させた。これを図４に示す。左側が原品種「どんとこい」であり、右側が酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子導入系統（ＴＬ１９２）の生育個体である。生育したタウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統では不稔、矮性化などが生じず、外見上、原品種「どんとこい」と大きな差異は認められなかった（図４）。これらの組換え系統からＴ1種子を採種した。
【０１０４】
（実施例３．Ｔ1世代の非組換え個体の除去）
遺伝の法則からＴ1種子には組換え個体と非組換え個体が、３：１の割合で混合していることが示唆された。このうち、組換え個体はハイグロマイシンに対して抵抗性を有することが推測された。
【０１０５】
そこで採種したＴ1種子と原品種の「どんとこい」種子を５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含み４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５，４７３）上で発芽させ、２８℃で１週間培養した。培養後のＴ1種子および原品種「どんとこい」種子を図５に示す（Ａ：原品種「どんとこい」、Ｂ：組換え系統）。実験に使用したハイグロマイシン濃度において、原品種「どんとこい」種子はすべて、ハイグロマイシンの影響を受けて、発芽後黒変し枯死した（図５Ａ）。タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統から採種したＴ1種子は正常に生育した個体と枯死した個体に分離した（図５Ｂ）。その比率は約３：１であった（図４）。
【０１０６】
以上の結果から、この選抜方法によってＴ1世代の非組換え個体を除去し得た。また後に行ったゲノミックサザン法による分析の結果、正常に生育したＴ1個体にはＰｓＴＬ１遺伝子が導入されていることが確認できた。正常に生育したＴ1世代系統をシードリングケースに鉢上げし、４．５葉期になるまで生育させた。
【０１０７】
（実施例４．病原性真菌抵抗性検定）
本実施例では、病原性真菌として、糸状菌であるいもち病菌を用いて、本発明の方法によって得られた植物の病原性真菌抵抗性検定を行った。いもち病菌の接種は噴霧接種法を用いた（Ｙａｅｇａｓｈｉ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３７）。
【０１０８】
いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ  Ｃａｖ．：レース００７）を粉末オートミール培地に移植し、２６℃で培養した。菌叢がシャーレ全面を覆った段階で殺菌水を加え、絵筆で培地表面をこすり気中菌糸を取り除いた。その後シャーレの蓋を外し、近紫外光を照射して胞子形成を行った（Ｆｕｒｕｔａ，１９６７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ２１，１６０）。
【０１０９】
４．５葉期まで生育した原品種個体と組換え体（Ｔ1）の幼苗に、いもち病菌胞子の懸濁液（胞子数５×１０8／ｍｌ）を噴霧し、接種箱内で２６℃で２４時間接種した。接種後の原品種及び組換え系統を隔離温室に移動し、病斑を観察した。この噴霧接種検定の結果を図６に示す。写真中、左の植物群が原品種（接種せず）、中の植物群が原品種（接種後２０日）、右の植物群がＴＬ１９２（接種後２０日）を示す。耐病性検定は病斑の形状の判定と、病斑面積率の測定を行い、以下に示す病斑指数を用いていもち病菌接種後の日数と病状の解析を行った（Ａｓａｇａ，１９８１，Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔｎ．３５，５１）。
【０１１０】
病斑指数      病状                                          病斑面積率
０．罹病性病斑が全く認められない                              ０％
１．罹病性病斑がわずかに認められる                            １％
２．罹病性病斑が一見して認められる                            ２％
３．罹病性病斑が中程度に認められる                            ５％
４．罹病性病斑が多く認められる                              １０％
５．罹病性病斑がはなはだしいか、枯死葉がわずかに認められる  ２０％
６．枯死葉が一見して認められる                              ４０％
７．枯死葉が中程度に認められる                              ６０％
８．枯死葉が多く認められる                                  ８０％
９．全葉ほとんど枯死                                        ９０％
１０．全茎葉枯死                                            １００％
この耐病性検定の結果を図７に示す。図７中、横軸は接種後日数、縦軸は病斑指数を表す。また図中、黒菱形はＷＴ（野生型）、白四角は組換え体（１９２−１）、黒三角は組換え体（１９２−２）、Ｘは組換え体（１９２−３）、黒丸は組換え体（１９２−４）を示す。
【０１１１】
この結果、組換え体では原品種と変わらない罹病性病斑が認められた。また、組換え体の中に、原品種と比較していもち病の進行が遅延する系統が見つかった（図６，７；Ｔ1世代：ＴＬ１９２）。これらの個体はいもち病の罹病性病斑が認められるものの、病斑面積率は非常に小さかった。従って、ＰｓＴＬ１組換え系統はいもち病に対して圃場抵抗性型の抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１１２】
（実施例５．ゲノミックサザン法によるＰｓＴＬ１遺伝子導入の確認）
原品種及び病害抵抗性が確認されたＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1）の葉身からＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍｕｒｒａｙ，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４３２１）を用いてゲノミックＤＮＡを抽出した。イネ地上部１０ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１．５×ＣＴＡＢ液（１．５％ＣＴＡＢ、  ７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８．０、１．０５Ｍ塩化ナトリウム）と混合し、５６℃で２０分間軽く浸透してＤＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢ、１．５容の沈殿溶液（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えＤＮＡを析出した。このＤＮＡを１Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＡでＲＮＡを分解した後、エタノール沈殿を行ってゲノミックＤＮＡを抽出した。
【０１１３】
抽出したゲノミックＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＶ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、１．２％アガロ−スゲルで１８時間電気泳動を行った。泳動後のゲルを加水分解液（０．２５Ｍ  ＨＣｌ液）に１０分間、アルカリ変性（１．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に３０分間浸漬して軽く振とうした。その後、アルカリ転写液（０．４Ｍ  ＮａＯＨ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））に転写した。ゲノミックＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間ベーキングしてＤＮＡを固定した後、ＰｓＴＬ１のｃＤＮＡ（約０．９ｋｂｐ）をプローブに用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。サザンハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた。洗浄条件は、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合には、０．２×ＳＳＣ濃度の洗浄液を使用し、Ａｌｋｐｈｏｓ（アルカリホスファターゼ）の場合には、供給業者の推奨するプロトコールに記載された洗浄液を用いて、５５℃で洗浄を行った。
【０１１４】
この結果を図８に示す。図８中、レーン１は原品種  ＥｃｏＲＶ、レーンＭは１ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ、レーン２はＴＬ１９２  ＥｃｏＲＶ、レーン３はＴＬ１９２  ＰｓｔＩ、レーン４はＴＬ１９２  ＨｉｎｄＩＩＩを示す。
【０１１５】
サザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＰｓＴＬ１プローブとハイブリダイゼーションしたバンドが全く確認されなかったのに対し、いもち病接種検定に用いた酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１９２）からは１本のバンドが検出された（図８）。従って、これらの組換え系統には１コピーのＰｓＴＬ１遺伝子が導入されていることが明らかになった。
【０１１６】
（実施例６．ノ−ザン法によるＰｓＴＬ１のｍＲＮＡ発現の確認）
原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1）の葉身から、ＣＴＡＢ／ＬｉＣｌ法で全ＲＮＡを抽出した（Ｃｈａｎｇ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ  １１，１１３）。イネ地上部２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１０容の２×ＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．４Ｍ塩化ナトリウム，１％メルカプトエタノール）と混合し、６０℃で１０分間軽く浸透してＲＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／４容の１０Ｍ塩化リチウムを加えＲＮＡを析出した。ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させ、フェノール／クロロホルム抽出理を行った後、上記方法で塩化リチウム抽出をもう一度行い、全ＲＮＡを単離した。
【０１１７】
単離した全ＲＮＡ（３０μｇ）を６．３％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロ−ス変性ゲルで電気泳動し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物）を用いて全ＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））に転写した。全ＲＮＡが転写されたナイロンメンブレンに、ＰｓＴＬ１  ｃＤＮＡ（約０．９ｋｂｐ）をプロ−ブに用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った（Ａｌｗｉｎｅ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４，５３５０）。ノーザンハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた。
【０１１８】
これらの結果を、図９に示す。Ａは、全ＲＮＡ像であり、Ｂはノーザンハイブリダイゼーション像を示す。ＡおよびＢの両方とも、レーン１〜４で順に、原品種、ＴＬ１８３、ＴＬ１９２、ＴＬ１９４を示す。
【０１１９】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＰｓＴＬ１プローブとハイブリダイゼーションしたバンドが確認されなかったのに対し、いもち病接種検定において抵抗性を示した酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１８３、１９２、および１９４）から約１，５００ｂｐのバンドが確認できた（図９、矢印）。従って、これらの組換え系統にはＰｓＴＬ１  ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【０１２０】
（実施例７．ウェスタン法によるＰｓＴＬ１タンパク質発現の確認）
ウェスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，４３５０−４３５４）によるタンパク質の発現解析の際の基本的実験操作は実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に順じて行った。ウサギ由来のナシ酸性型タウマチン様タンパク質に対する一次抗体は横浜市立大学木原生物学研究所で作製されたものを供与された（Ｓａｓｓａ，１９９８，Ｐｌａｎｔａ  ２０５，５１４）。二次抗体はＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。抗体の検出にはＡＰ発色キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。また、その他の汎用溶液としてＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ７．４）、ＴＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）、リン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．０（リン酸水素二ナトリウム：リン酸二水素ナトリウム＝３９：６１）、Ｄｉｓｓ溶液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％ＳＤＳ、４０％グリセロール、８０μｇ／ｍｌブロムフェノールブルー）を用いた。
【０１２１】
原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1）の葉身０．２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを８００μｌのタンパク質抽出液（１００  ｍＭリン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％２−メルカプトエタノール、１％ＰＶＰ、４％コンプリート（ロシュ））と８００μｌのサンプル溶液（Ｄｉｓｓ溶液：２−メルカプトエタノール＝９２：８）に溶解させた。その後１００℃で５分間加熱し、遠心して上清をサンプルとして用いた。
【０１２２】
イネの葉から抽出したサンプル１００μｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル、トリスグリシン溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、２００ｍＭグリシン、１％ＳＤＳ）を用いて電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをメタノールで前処理したＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）にエレクトロブロット（ＮＡ−１５１３：日本エイドー）した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦメンブレンを、一次ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０％スキムミルク）に浸して１時間、二次ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）に浸して３０分間振とうし、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ−Ｔ溶液（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０，０００倍希釈したナシの酸性型タウマチン様タンパク質抗体を一次抗体に用いて一晩ウェスタンハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、二次ブロッキング溶液に浸して３０分間振とうし、さらに二次抗体溶液（二次抗体、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で４０分間ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄液で３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ発色キット（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ：ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて検出した。
【０１２３】
この結果を図１０に示す。図１０中、レーン１はナシ花柱から抽出した総タンパク質を示し、レーン２は原品種、レーン３はＴＬ１８３、レーン４はＴＬ１９２、レーン５はＴＬ１９４を示す。
【０１２４】
ウェスタン法による解析を行った結果、原品種からはＰｓＴＬ１の発現が確認されなかったのに対し、いもち病の接種検定において抵抗性を示した酸性型タウマチン様タンパク質組換え系統（ＴＬ１８３、１９２、および１９４）から約３２ｋＤａの位置にバンドが確認できた（図１０、矢印）。従って、これらの組換え系統にはＰｓＴＬ１タンパク質が発現していることが明らかになった。また、組換え系統から検出されたバンドが３２ｋＤａであったことから、イネの細胞内でもタウマチン様タンパク質に糖鎖付加が行われていることが示唆された。
【０１２５】
（実施例８．病原性細菌抵抗性検定）
本実施例では、病原性細菌として白葉枯病菌を用いて、本発明の方法によって得られた植物の病原性細菌抵抗性検定を行った。上記実施例４において、いもち病菌に対して抵抗性が確認されたＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1）を成苗に生育させた。また白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ：レース３−Ａ）を馬鈴薯半合成培地（馬鈴薯３００ｇ、硝酸カルシウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物２ｇ、ペプトン５ｇ、ショ糖１５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ｌ）で増殖させた。試験管の中に蒸留水１０ｍｌを入れ、白葉枯病菌０．５ｃｍ四方を懸濁させ、接種用の懸濁液を作製した。原品種及びＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1）の成葉の先端を白葉枯病菌の懸濁液に浸したハサミで切り取り、白葉枯病の接種を行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２８）。
【０１２６】
２０日後、葉の先端から白葉枯病が進行した距離を測定することによって、白葉枯病に対する抵抗性を検定した。この結果を図１１に示す。図中、ＷＴは原品種の葉であり、ＴＬ１９２−２、ＴＬ１９２−８は、それぞれ組換え系統（Ｔ1）（接種後２０日）の葉である。原品種（ＷＴ）に比べてＰｓＴＬ１組換え系統（Ｔ1世代：ＴＬ１９２−２，８）は白葉枯病斑の進展の遅延が観察された。原品種１個体（６葉）と、タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統（ＴＬ１９２）のＴ1世代９個体（それぞれ１０−２１葉）に対して、白葉枯病の進行程度を測定し、グラフにまとめた（図１２）。図１２において、横軸は、試験に供した植物個体（ＷＴ：野生型、ＴＬ１９２−１〜９：組換え系統）を、縦軸は、白葉枯病罹病進度（ｃｍ）を表す。多くのＴＬ１９２の各系統が原品種と比べて白葉枯病の進行が遅延した。従って、ＰｓＴＬ１組換え系統は白葉枯病に対して抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１２７】
【発明の効果】
今回の報告から、酸性型タウマチン様タンパク質が植物における病害抵抗性に重要な役割を担っていることが示唆された。酸性型タウマチン様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを本発明の方法に従って植物細胞、特に高等植物細胞に導入して発現させることにより、病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を植物に付与し得る。本発明の方法に従って作出された病原性細菌抵抗性または複合病害抵抗性を有する植物は、各種病原菌に対する抵抗性を有するために生産性の向上、収量の安定化、品質の向上、農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の軽減に効果があると期待される。また、病害抵抗性の性質から、有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できると考えられる。
【０１２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ナシの酸性型タウマチン様タンパク質（ＰｓＴＬ１）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】アミノ酸配列に基づいた酸性型タウマチン様タンパク質間の配列比較を示す図である。
【図３】ＰｓＴＬ１遺伝子の発現ベクター（ｐＰＺＰ２０２）の構築を示す図である。
【図４】タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統（ＴＬ１９２）の形態を示す生物形態写真である。
【図５】組換え系統Ｔ1種子のハイグロマイシン選抜の様子を示す生物形態写真である。
【図６】いもち病（レース００７）の噴霧接種検定の結果を示す生物形態写真である。
【図７】組換え系統（ＴＬ１９２）のいもち病に対する抵抗性程度を示すグラフである。
【図８】ゲノミックサザン法による導入遺伝子の確認を示す電気泳動図である。
【図９】ノーザン法によるＰｓＴＬ１  ｍＲＮＡの発現調査を示す電気泳動図である。
【図１０】ウェスタン法によるＰｓＴＬ１タンパク質発現の確認を示すブロット図である。
【図１１】白葉枯病の接種検定の結果を示す生物形態写真である。
【図１２】酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子組換え系統の白葉枯病に対する抵抗性程度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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