(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）及びｂ）：
ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む5’遺伝子トラップカセット：
１）スプライスアクセプター；
２）該スプライスアクセプターの3’側に位置する第１エキソン配列であって、該第１エキソンは該エキソンを発現する細胞の同定を可能とするマーカーをコードする；および
３）該第１エキソンの3’末端を定めるポリアデニル化配列；
ｂ）該ポリアデニル化配列の3’側に位置し、そして機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット：
１）プロモーター；
２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現される第２エキソン配列であって、該第２エキソンは天然に存在する真核生物遺伝子由来であり、抗生物質耐性を付与する活性をコードせず、かつレポーター遺伝子ではない；および
３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列であって、該スプライスドナー配列は天然に存在する真核生物遺伝子由来である；
を含んでなる遺伝子操作されたベクターであって、該ベクターは該第１エキソンの発現を媒介するプロモーターをコードせず、かつ該ベクターは該第２エキソン配列によってコードされ該プロモーターによって発現されるmRNA転写産物のポリアデニル化を媒介する配列をコードしない、該ベクター。
【請求項２】
上記第１エキソンが上記スプライスアクセプターと該第１エキソンの開始コドンとの間に機能的に配置された内部リボソームエントリー部位をさらにコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記スプライスアクセプター部位の上流に機能的に配置されたリコンビナーゼ認識配列をさらに組み込んでいる、請求項1に記載のベクター。
【請求項４】
上記ポリアデニル化配列と上記プロモーターとの間の領域に第２のリコンビナーゼ認識配列をさらに組み込んでいる、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
上記第１エキソンが、抗生物質耐性を付与するマーカー、抗生物質感受性を付与するマーカー、酵素マーカー、リコンビナーゼおよび蛍光的に検出可能なマーカーよりなる群より選択されるマーカーをコードする、請求項1に記載のベクター。
【請求項６】
上記マーカーがネオマイシン耐性をコードする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
以下のａ）及びｂ）：
ａ）ベクターによってコードされる第1プロモーターによって発現されるマーカー遺伝子；および
ｂ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット：
１）第２プロモーター；
２）該第２プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現されるエキソン配列であって、該エキソンは天然に存在する真核生物遺伝子由来であり、抗生物質耐性を付与する活性をコードせず、かつレポーター遺伝子ではない；および
３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列であって、該スプライスドナー配列は天然に存在する真核生物遺伝子由来である；
を含んでなる遺伝子操作されたベクターであって、該ベクターは該エキソン配列によってコードされるmRNA転写産物のポリアデニル化を媒介する配列をコードしない、該ベクター。
【請求項８】
以下のａ）及びｂ）：
ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む5’遺伝子トラップカセット：
１）スプライスアクセプター；
２）該スプライスアクセプターの3’側に位置する第１エキソン配列であって、該第１エキソンは該エキソンを発現する細胞の同定を可能とするマーカーをコードする；および
３）該第１エキソンの3’末端を定めるポリアデニル化配列；
ｂ）該ポリアデニル化配列の3’側に位置し、そして機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット：
１）プロモーター；
２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現される第２エキソン配列であって、該第２エキソンは非原核生物起源であり、抗生物質耐性を付与する活性をコードせず、かつレポーター遺伝子ではない；および
３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列であって、該スプライスドナー配列は天然に存在する真核生物遺伝子由来である；
を含んでなる遺伝子操作されたベクターであって、該ベクターは該第１エキソンの発現を媒介するプロモーターをコードせず、かつ該ベクターは該第２エキソン配列によってコードされ該プロモーターによって発現されるmRNA転写産物のポリアデニル化を媒介する配列をコードしない、該ベクター。
【請求項９】
請求項１、７または８のいずれか１項に記載のベクターを含む感染性レトロウイルス。
【請求項１０】
標的非ヒト真核細胞中の遺伝子をトラップする方法であって、請求項９に記載のレトロウイルスを該細胞に導入することを含む、該方法。
【請求項１１】
標的非ヒト真核細胞中の遺伝子をトラップする方法であって、請求項１、７または８のいずれか１項に記載のベクターを該細胞に導入することを含み、該ベクターはエレクトロポレーション、ウイルス感染、レトロ転位(retrotransposition)、マイクロインジェクションおよびトランスフェクションからなる群より選択される方法によって該標的細胞に導入される、該方法。
【請求項１２】
ゲノム中に組み込まれた請求項１、７または８のいずれか１項に記載のベクターを有する真核細胞。
【請求項１３】
請求項１、７または８のいずれか１項に記載のベクターを自身の１以上の細胞のゲノム中に組み込むように遺伝子的に改変された非ヒト動物。
【請求項１４】
非ヒト細胞中の天然に存在する遺伝子の発現を活性化する方法であって、請求項１、７または８のいずれか１項に記載のベクターを該細胞に導入することを含む、該方法。
【請求項１５】
上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記哺乳動物細胞がマウス細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非ヒト真核細胞中の遺伝子の発現を変更する方法であって、3’遺伝子トラップカセットベクターを該細胞に導入することを含み、該3’遺伝子トラップカセットは機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含み：
１）プロモーター；
２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現されるエキソン配列であって、該エキソンは天然に存在する真核生物遺伝子由来であり、抗生物質耐性を付与する活性をコードせず、かつレポーター遺伝子ではない；および
３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列であって、該スプライスドナー配列は天然に存在する真核生物遺伝子由来である；
該カセットは非相同的に標的真核細胞のゲノム中に組み込まれ、そして該エキソンによってコードされる転写産物の該スプライスドナー配列は該非ヒト真核細胞中の遺伝子のスプライスアクセプター配列にスプライシングにより連結される、該方法。
【請求項１８】
上記非相同的に組み込まれるカセットが、上記標的真核細胞のゲノムにランダムに組み込まれたレトロウイルスベクターの一部である、請求項1７に記載の方法。
【請求項１９】
上記エキソンが、標的細胞ゲノムによってコードされていないエキソンおよび標的細胞ゲノムによって通常は発現されないエキソンからなる群より選択される、請求項1８に記載の方法。
【請求項２０】
新規な真核生物ポリヌクレオチド配列情報を得る方法であって、
ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセットを非ヒト真核細胞に導入し；
１）プロモーター；
２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現されるエキソン配列であって、該エキソンは天然に存在する真核生物遺伝子由来であり、抗生物質耐性を付与する活性をコードせず、かつレポーター遺伝子ではない；および
３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列であって、該スプライスドナー配列は天然に存在する真核生物遺伝子由来である；
ｂ）該遺伝子トラップカセットの細胞ゲノムへの非特異的な又は標的設定されていない組み込みを可能とする条件下で該細胞を維持し；
ｃ）該3’遺伝子トラップカセット由来の該エキソンの、該真核細胞ゲノムによってコードされる第２エキソンへのスプライシングによる連結から生じるキメラ転写産物を獲得し；そして
ｄ）該キメラ転写産物のポリヌクレオチド配列を決定する；
ことを含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
1.0.発明の属する技術分野
本発明は、いったんベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたならば、同定することが可能で、かつ効果的に突然変異させることが可能な細胞性遺伝子の数を増大させる構造エレメントを組み込んだ組換えベクターに関する。このベクターは、遺伝子発見、遺伝子クローニング、遺伝子突然変異、遺伝子調節、核酸配列のゲノム内シャトリング(shuttling)、ならびに遺伝子活性化および過剰発現のための重要な手段である。
【０００２】
2.0.発明の背景
遺伝子トラップ法は、遺伝子の突然変異と同定を同時に行うための強力なアプローチを提供する。遺伝子トラップベクターは、標的細胞のゲノム中に非特異的に挿入されうる。したがって、遺伝子トラップベクターが遺伝子に挿入されて該遺伝子を突然変異させる現象を選択する遺伝子トラップベクターが構築されてきた。細胞性スプライシング機構を利用することにより、これらのベクターの選択的性質は、ベクターが遺伝子内に組み込まれない、大きなバックグラウンドとなる挿入を取り除く。
【０００３】
殆どの哺乳動物遺伝子はエキソンおよびイントロンに分けられる。エキソンとは、mRNAにスプライシングされて遺伝子のタンパク質産物をコードする遺伝子の部分である。ゲノムDNAにおいては、これらのコード性エキソンは非コード性イントロン配列によって分断されている。RNAポリメラーゼはイントロンおよびエキソン配列の両方を転写するが、得られるmRNAがタンパク質に翻訳されるようにイントロン配列は転写産物から除去されなければならない。したがって、すべての哺乳動物細胞および殆どの真核生物細胞はエキソンをmRNAにスプライシングする機構を有する。遺伝子トラップベクターは、細胞性スプライシング機構がベクターによってコードされるエキソンを細胞性mRNAに連結するのを可能とするように、イントロンまたは遺伝子中に組み込まれるように設計されてきた。しばしば、そのような遺伝子トラップベクターは強力なスプライスアクセプター配列の後に位置し、先行するプロモーターを持たない選択マーカー配列を含有する。したがって、そのようなベクターが遺伝子に組み込まれると、細胞性スプライシング機構はトラップされた遺伝子由来のエキソンを選択マーカー配列の5’末端にスプライシングにより連結する。典型的には、このような選択マーカー遺伝子は該遺伝子をコードするベクターがイントロン中に組み込まれた場合にのみ発現されうる。次に、選択培養で生存する細胞を選択することによって、遺伝子トラップ現象が同定される。
【０００４】
遺伝子トラップ法は多数の遺伝子を突然変異させる非常に効率的な方法であることが示された。遺伝子トラップベクターの挿入は、トラップされた遺伝子に突然変異を創出し、そしてまた該トラップされた遺伝子を同定するのに用いることができる分子タグを提供する。ROSAβgeoを用いて遺伝子をトラップした場合、マウスを用いて調べると、生じた突然変異の少なくとも50%は表現型をもたらすことが示された。これは遺伝子トラップ挿入ベクターが有用な変異原であることを示している。遺伝子を突然変異させる強力な手段であるが、この方法の可能性はトラップした遺伝子の同定が困難であることにより限定されていた。トラップ現象を同定するために用いられてきた方法は、トラップされた遺伝子由来のエキソン配列の該遺伝子トラップベクターによってコードされる配列とのスプライシングによる連結によって生じる融合転写産物に依存している。これらの融合転写産物由来の配列を得るために用いられる一般的な遺伝子同定プロコトールには、5’RACE、cDNAクローニング、およびベクター組み込み部位周辺のゲノムDNAのクローニングが含まれる。しかし、これらの方法は労働集約的であり、自動化が困難で、一般に大量処理には実用的でないことが示されている。
【０００５】
3.0.発明の概略
最近、先行するプロモーターを有し、そして後ろにはポリアデニル化配列の代わりにスプライスドナー配列を有する選択マーカー遺伝子を含有するベクターを用いる、遺伝子トラップ法の新しい戦略に依存するベクターが開発された。これらのベクターは、遺伝子中に組み込まれて、該選択マーカーの発現に必要なポリアデニル化配列を提供する下流エキソンをトラップしない限り、選択を提供しない。このようなベクターの染色体への組み込みは、トラップされた遺伝子の3'エキソンへの選択マーカー遺伝子のスプライシングによる連結をもたらす。これらのベクターはいろいろな利点を有する。すなわちこれらのベクターは、ベクターが組み込まれた細胞型において通常発現されるものであるかどうかに関わりなく遺伝子をトラップするのに使用することができる。さらに、このようなベクターを担持する細胞は、3’RACE等の自動化された（例えば、96ウエルプレートフォーマット）遺伝子同定アッセイを用いてスクリーニングすることができる（総論については、Frohman, 1994, PCR Methods and Applications, 4:S40-S58参照）。これらのベクターを用いて、多数の突然変異を創出し、そして突然変異させた、すなわちトラップされた遺伝子を迅速に同定することが可能である。しかし、本発明以前には、このようなベクターの商業的規模における活用は、それらを用いて効率的にトラップできる標的遺伝子の数によって限定されていた。
【０００６】
第１世代3’遺伝子トラップベクターの相対的な非効率性は、迅速かつ実用的にトラップし、同定し、分析し、そして効果的に突然変異させることができる遺伝子の総数を限定した。この非効率性は、トラップされ、DNA配列分析などによって迅速に同定される標的細胞ゲノム中の遺伝子の百分率をより大きくする3’遺伝子トラッピングの一層効率的な方法の開発を促進した。
【０００７】
本発明は、高効率の3’遺伝子トラッピングを可能とする3’遺伝子トラップカセットを含む新規ベクターの構築に関する。本発明の3’遺伝子トラップカセットは、機能しうる組み合わせで、プロモーター領域、エキソン（典型的には翻訳開始コドンおよびオープンリーディングフレームおよび／または内部リボソームエントリー部位によって特徴づけられる）、スプライスドナー配列、および場合によりイントロン性配列を含む。上記スプライスドナー(SD)配列は、3’遺伝子トラップカセットのエキソンがスプライシングにより下流エキソンまたは細胞的にコードされるエキソンのスプライスアクセプター(SA)部位に連結されるように機能的に配置されている。それゆえ、本発明の3’遺伝子トラップカセット（またはこれを組み込んでいる遺伝子トラップベクター）には、遺伝子トラップカセットのSD配列の下流に機能的に配置されたスプライスアクセプター(SA)配列およびポリアデニル化部位は組み込まないものとする。好ましい実施形態においては、3’遺伝子トラップカセットのエキソン構成部分（これもまた配列獲得カセットとして役立つ）は、エキソン配列および真核細胞に天然に存在する遺伝子物質に由来するスプライスドナー配列を含む。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、感染させた１または複数の標的細胞の遺伝子トラップされたエキソンから新規なDNA配列情報を得るための上記ベクターの使用である。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態は、上記3’遺伝子トラップカセットを組み込むように遺伝子操作された組換えベクター、特にウイルスベクターを含む。必ずしもそうでなくてよいが好ましくは、これらのベクターは標的細胞中でベクター配列の維持および検出を可能とする選択マーカーをさらに組み込んでいる。この選択マーカーは、3’遺伝子トラップカセットの上流に同じ方向を向いて配置された5’遺伝子トラップカセットとして利用することができる。本発明のさらなる実施形態は、標的細胞または組織の集団中の遺伝子をin vivoまたはin vitroで突然変異させ、トラップするため、および／または未知遺伝子のポリヌクレオチド配列を得るため（すなわち、新しい遺伝子を発見するため）の新規な3’遺伝子トラップカセットまたはこれを含むベクターの使用である。したがって、上記3’遺伝子トラップカセットおよびこれを含むベクターを用いる、遺伝子突然変異、同定および表現型スクリーニングの一般的な方法が記述される。
【００１０】
本発明の別な実施形態は、標的細胞における遺伝子発現を活性化するための本明細書に記述するベクター（例えば、上記3’遺伝子トラップカセットを含むウイルスベクター）の使用である。好ましくは、これらのベクターは標的細胞ゲノムに（ウイルス組み込み機構を用いて）非特異的に組み込まれるレトロウイルスベクターである。さらに、新しい遺伝子を活性化し、遺伝子的または表現型的に選択し、そして同定するために上記の3’遺伝子トラップカセットまたはこれを含むベクターを用いるアッセイが記述される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、上記のベクターを用いて同時に（上記の１以上の変異原性構成要素によって）突然変異させ、そして（上記の3’遺伝子トラップカセットを用いて）同定された遺伝子を有する真核細胞のライブラリー、および／または上記ベクターのターゲッティング頻度および配列獲得特性を利用して作製したcDNAライブラリーを含む。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、標的細胞からDNA配列情報を得る方法である。この方法は以下の工程を含んでなる。すなわち、3’遺伝子トラップカセットを非特異的に組み込む工程、該遺伝子トラップカセットが標的細胞の内在性スプライシング機構によってスプライシングされて標的細胞ゲノム内でコードされている内在性エキソンに連結された場合に生じるキメラRNA転写産物を得る工程、そして標的細胞ゲノム由来の内在的にコードされたエキソンの配列情報を得る工程である。
【００１３】
4.0.図面の簡単な説明
（図面の説明については下記参照）
5.0.発明の詳細な説明
現代のゲノム学において、遺伝子トラップ法は遺伝子配列を機能的なカテゴリーに分けるため、および新規遺伝子を同定するための両方にとって強力なアプローチであることが実証された。例えば、初期の成果は、これまでに特徴づけられた胚性幹細胞に由来する遺伝子トラップ現象の約半分が伝統的なcDNAライブラリー技法によっては発見されなかった遺伝子配列を同定することを示した。
【００１４】
遺伝子トラップ法（プロモータートラップを用いる）は、種々の細胞型において、誘導性シグナル、分化現象、または目的の表現型によって誘導される遺伝子を遺伝学的にスクリーニングするために（すなわち、遺伝子発見に）使用されてきた。さらに、そのようなスクリーニングは腫瘍抑制遺伝子、造血および筋肉細胞の分化などの細胞分化プロセスによって誘導される遺伝子、Ｂ細胞活性化またはアポトーシスなどの細胞現象を誘導するシグナルによって誘導される遺伝子、および小分子または他の化合物によって活性化される遺伝子を同定するために用いられてきた。これらの研究は、遺伝子トラップ法は重要な細胞性および生理学的プロセスにおける機能に基づいて遺伝子を分類するのに用いることができることを示している。しかし,これらのスクリーニングのより広い利用は、トラップされた遺伝子の同定が困難であるために制限されていた。
【００１５】
遺伝子トラップベクターを設計する際に一般に取り組まなければならない問題のいくつかは、限定するものではないが、１）特定のベクターによって効果的にトラップされ得る標的細胞ゲノムの百分率（「標的サイズ」）；２）標的細胞のゲノムに挿入した後のベクターの変異原性；および３）遺伝子トラップ現象により生じるキメラ転写産物の配列決定による突然変異した遺伝子の同定、を含む。本発明のベクターは、例えば、ベクター中に存在するスプライスアクセプターおよびスプライスドナーの効果を最大にする特徴を組み込むことにより、上記の問題点に対処するように作製された。
【００１６】
5.1.本発明のベクターの広い利用可能性
本発明のベクターは、細胞ゲノム中に遺伝子トラップベクターを挿入する操作が可能な事実上任意の種類の真核細胞に用いることができる。例えば、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、一次動物組織ならびに酵母、糸状菌、真菌および植物を含むがそれらだけに限定されない他の任意の真核細胞または生物から遺伝子をトラップするため、および／または配列情報を得るために用いることができる。特に興味深い植物としては、双子葉植物及び単子葉植物、被子植物（ケシ、バラ、ツバキ等）、裸子植物（マツ等）、モロコシ属植物、イネ科植物（grasses）、ならびに農業上重要な植物が含まれる。農業上重要な植物には、限定するものではないが、穀物植物（コメ、コムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ等）、堅果植物、レンズマメ、ヒヨコマメ、塊茎植物（ジャガイモ、ヤマノイモ、タロイモ等）、草本植物、綿、麻、コーヒー、カカオ、タバコ、ライムギ、ビート、アルファルファ、ソバ、干し草用牧草、ダイズ、バナナ、サトウキビ、果実（柑橘類およびその他）、ブドウ、野菜、および真菌（キノコ類、フランスショウロ等）、ヤシ、カエデ、セコイア、ナタネ、サフラワー、サフラン、ココヤシ、セイヨウイチイ、カシおよび他の落葉樹および常緑樹が含まれる。または、ヌクレオチドデリバリーのための通常の方法を用いて、線状化した3’遺伝子トラップカセットを標的細胞に導入することができる。
【００１７】
適切な動物標的細胞のさらなる例としては、限定するものではないが、ヒトを含む哺乳動物またはトリの内皮細胞、上皮細胞、小島、神経細胞または神経組織、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚、等）の細胞、外分泌および／または内分泌細胞、胚性または他の全能性または多能性幹細胞、繊維芽細胞、および上記細胞の培養物および／または形質転換細胞が挙げられ、上記のベクターと共に用いることができる。さらに、腫瘍形成性細胞系または他の細胞系を本発明のベクターによって標的とすることができる。
【００１８】
上記ベクターを用いた遺伝子トラッピングの好ましい標的細胞は、胚性幹細胞(ES細胞）である。ES細胞は多能性または全能性である。したがってin vitroで遺伝子操作されたES細胞を次に発生しつつある胎児または胚（例えば、桑実胚または胚盤胞）に導入し、キメラ動物をもたらすことができる。次にこれらのキメラ動物を飼育し、遺伝子操作した対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である子孫を得ることができる。哺乳動物の場合は、ES細胞は典型的には胚盤胞にマイクロインジェクションされる。次に、この胚盤胞を偽妊娠した宿主動物に移植する。
【００１９】
上記のES細胞技術がうまく適用された多数の動物系において、該技術の広い利用可能性が示されている。例えば、限定するものではないが、トリ系（米国特許第5,656,479号）、ブタ（米国特許第5,523,226号）、非マウス多能性細胞（米国特許第5,690,926号）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびミンク(Whiteらによって出願された米国特許出願第60/007689号またはWO1996US00189/88号、およびWO1997EP0002323号)およびヒトES細胞（Roblらによって出願された米国特許出願第08/699,040号）において、ES細胞および/またはトランスジェニック動物が記述されている。これらのすべては参照により本明細書に組み入れる。
【００２０】
典型的には、本明細書に記述する特徴を組み込んだベクターは、当技術分野で公知の種々の方法のうち任意の方法によって標的細胞に導入することができる。そのような方法の例としては、限定するものではないが、カチオン性脂質複合体として、または非パッケージ化／複合体化DNAまたは「裸の」DNAとしての、エレクトロポレーション、ウイルス感染、レトロ転位（retrotransposition)、転位、微粒子衝撃法（microparticle bombardment）、マイクロインジェクション、リポフェクション、トランスフェクションが含まれる。
【００２１】
本発明のベクターは、事実上任意の種類の表現型または遺伝子スクリーニングプロトコールと共にin vitroおよびin vivoの両方で用いることも可能である。そして、本発明のベクターはトラップした遺伝子のDNA配列の迅速な同定を可能とするというさらなる利点を提供する。
【００２２】
本発明のベクターの構造的特徴は、得られる構築物が真核細胞のゲノムに実質的に非特異的な様式で、そして好ましくは完全に非特異的な様式で統合され得るように、任意のベクター骨格に組み込むことができる。当技術分野で公知の多数のベクターを用いることができる。使用できるベクターとしては、限定するものではないが、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合性のものでなければならない。そのようなベクターには、限定するものではないが、λ誘導体等のバクテリオファージ、またはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体もしくはBluescriptベクター（Stratagene USA, La Jolla, California)等のプラスミドが含まれる。以下に記述する特徴に対応するDNA断片の適切なベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有する選択されたベクターに適切なDNA断片を連結することによって達成することができる。しかし、該DNA断片の相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、DNA分子の末端を酵素的に改変することができる。または、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結することによって任意の所望部位を作製することができる。これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特殊な、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを構成する。
【００２３】
5.2.本発明のベクターの構造的特徴
5.2.1.マーカー遺伝子
本発明により意図されているベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含むように作製することができる。一般にそのような選択マーカーは、該選択マーカーを組み込み、それによってコードされるタンパク質を発現する真核細胞を同定および選択する容易な方法を可能とする。そのような選択方法の例としては、遺伝子トラップ事象を統合した細胞の抗生物質、比色分析、酵素および蛍光による選択が挙げられる。そのような選択マーカー遺伝子の1例はβgeoであるが、多数の他の選択マーカーのうち任意のマーカーを用いることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,464,764号参照）。植物選択マーカーの1例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００２４】
したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んでいる標的細胞の追跡および同定を容易にするマーカー遺伝子を組み込み、そして場合により発現するように作製されたベクターを意図している。そのようなマーカーとしては、限定するものではないが、抗生物質耐性遺伝子、比色分析マーカー遺伝子、酵素（例えば、β-ラクタマーゼ）、または、例えば緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの蛍光マーカー遺伝子の直接または間接発現、またはそれを検出するためのアッセイを媒介する他のマーカー遺伝子が含まれる。これらは、特に参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,625,048号に記述されている。本発明を開示する目的上、生物学的または生化学的関連で用いられる場合の「直接（的に）」という用語は、通常は1つの分子と別の分子（これは同一種類の分子または異なる種類の分子でありうる）との接触または結合によって引き起こされる、中間工程を必要としない、プロセスを直接的に引き起こすこと(causation)を指す。例えば、分子Ａが分子Ｂと接触し、これが分子Ｂに生物学的プロセスの一部である効果Ｘを発揮させる。本発明の目的上、生物学的または生化学的関連で用いられる場合の「間接(的に）」という用語は、通常2以上の直接的工程によって引き起こされる、中間工程を必要とする間接的引き起こしを指す。例えば、分子Ａが分子Ｂと接触して効果Ｘが発揮され、これが次に効果Ｙを引き起こす。また本発明の目的上、「遺伝子」という用語は、細胞ゲノムの個々のコード領域の任意の及び全てのもの、ならびに関連する非コード領域および調節領域を指すものとする。または、特定の機能性タンパク質産物または活性をコードする領域を指すものとする。さらに、「機能しうるように配置された」という表現は、制御エレメントまたは制御遺伝子が該制御エレメントまたは制御遺伝子の所望の又は必要とされる機能を提供するのに適切な配向および間隔で存在するという事実を指すものとする。また、本発明の目的上、遺伝子は、細胞中の制御エレメントが該遺伝子によって、または該遺伝子に挿入された選択マーカーによってコードされるmRNAの機能的レベルまたは検出可能レベルの産生を媒介する場合に、「発現」される。該mRNAは次にスプライシング／プロセシングされ、適切な場合には、翻訳されて活性な産物を生成することができる。上記適切な制御エレメントが、細胞中に存在しない、不活性化された、あるいは該遺伝子によって、または該遺伝子に挿入された選択マーカーによってコードされるmRNAの機能的および／または検出可能レベルでの産生を媒介しない場合は、遺伝子は発現されない。本発明の目的上、mRNAは、翻訳後に対応する遺伝子座と正常に関連するサイズ及び活性を有するタンパク質を生成する場合、mRNAは「機能的」レベルで産生されるという。
【００２５】
マーカー遺伝子は、機能しうる組み合わせでマーカー、該マーカーを発現するためのプロモーター、リボソーム結合／翻訳開始部位およびポリアデニル化配列を含む完全に独立した発現カセットとして本発明のベクターに組み込むことができる。さらに、上記マーカーは、ベクターのプロモーターから発現されるようにベクター中に配置することが可能で、そして場合によりマーカー発現を容易にする独立したリボソームエントリー部位(IRES)を機能性に組み込むように遺伝子操作することができる。
【００２６】
5.2.2. 5’遺伝子トラップカセット
本発明のベクターは、5’遺伝子トラップカセットを含むように遺伝子操作することができる。このカセットは、典型的には、機能しうるように配置されたポリアデニル化配列を後ろに有するエキソン（これは選択マーカー遺伝子をコードすることができる）の5’側に位置するスプライスアクセプター部位を含有する。典型的には、5’遺伝子トラップを組み込んだベクターは、該5’遺伝子トラップカセット内でコードされるエキソンを発現するプロモーターを含有しない。また、このベクターは該5’遺伝子トラップカセットのエキソンのスプライスアクセプターの5’側に機能しうるように配置されたスプライスドナー配列をコードしない。その結果、このベクターが細胞染色体に組み込まれた後、該5’遺伝子トラップカセットは上流遺伝子の正常なスプライシングを妨害し、末端エキソンとして作用する。その最終効果は、該5’遺伝子トラップカセットによって細胞性転写産物は破壊され、効果的に突然変異誘発されるということになる。5’遺伝子トラップカセットは、エキソン構成要素としてマーカー遺伝子を組み込むことが可能で、したがって第5.2.1.節に記述するマーカー遺伝子の代わりに、またはそれに加えて用いることができる。
【００２７】
5’遺伝子トラップカセットの構造的特徴もまた、該5’遺伝子トラップが細胞ゲノムのどこに組み込まれたかについて一方に片寄る遺伝子トラップ事象を生じるように操作することができる（限定するものではなく説明の目的上、以下の議論では、5’遺伝子トラップカセットのエキソンは選択マーカーをコードすると想定するものとする）。例えば、プロモーターが全く存在しないとすると、5’遺伝子トラップカセット（IRESなしで作製された）によってコードされるマーカーは、典型的には、内在性遺伝子の翻訳開始部位の5’側に位置するイントロン中に該カセットが組み込まれた場合にのみ発現されうる。IRESが存在しないとすると、そのような5’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターが、内在性遺伝子の翻訳開始部位の下流に位置するイントロンに組み込まれた場合、マーカーは、選択マーカー活性を示す融合タンパク質を生じる正しいリーディングフレームで存在する場合にのみ発現されうる。したがって、そのような5’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、同定された遺伝子トラップされた配列が翻訳開始部位の5’側に位置する配列から始まるという確率を選択的に増大させることができる。
【００２８】
類似の効果をもたらす別の方法は、5’遺伝子トラップカセットのSAと選択マーカーの翻訳開始コドンの間の領域に存在する(または遺伝子操作してそこに存在させた）１セットのネステッド（nested)終止コドンを組み込んだベクターを用いる。または、そのような終止コドンは選択マーカーのコード領域の末端とポリアデニル化配列との間に配置することができる。選択マーカーは、ベクターが標的ゲノムに組み込まれた位置と主として独立した様式でマーカーが発現されるように、独立したリボソームエントリー部位(IRES)を含むように作製することも可能である。必ずそうとは限らないが典型的には、IRESは上記の１セットのネステッド終止コドンと共には使用されない。
【００２９】
特に好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、スプライスアクセプター配列によって先行され、そして後ろにポリアデニル化(pA)配列が続く選択マーカー遺伝子を含む5’遺伝子トラップカセット（SAβgeopA、図２）を用いる。または、βgeo遺伝子の上流に内部リボソームエントリー部位をさらに組み込んだSAIRESβgeopAを用いることができる。または、SAneopA（これはβ-gal活性を不要にする）を用いることができる。上記の5’遺伝子トラップカセットは、遺伝子を効率的に突然変異させることが可能で、またトラップされた遺伝子の発現を追跡するのに用いることができる。使用するSA配列の最適化は、5’遺伝子トラップカセットの効率をさらに増進する、または調節することができる。適切なSA配列の例としては、限定するものではないが、以下のものが含まれる：
0003725782.tif 000002
上記SA配列の任意のものを、例えば、SAneopAまたはSAIRESneopAと共に用いることができる。
【００３０】
場合により、5’遺伝子トラップカセットの両側に適切なリコンビナーゼ部位（例えば、lox P、frt、等）を配置することができる。そのような実施形態の１つにおいては、リコンビナーゼ部位を両側に配置した5’遺伝子トラップカセットを、検出可能なマーカー、異なる選択マーカー、または酵素マーカー（緑色蛍光タンパク質、β-ラクタマーゼ、TK、ブラストサイジン、HPRT、等）をコードする第２の5’遺伝子トラップカセット（3’リコンビナーゼ部位の下流に存在する）であって、好ましくは第１の5’遺伝子トラップカセットと同一のリコンビナーゼ部位を両側に配置していない該トラップカセットと共に用いる。２つの5’遺伝子トラップカセットの両方が（選択的スプライシングにより）許容可能なレベルで発現されない場合は、適切なリコンビナーゼ活性（すなわち、cre、 flp、等）をin vitroまたはin vivoで用いて第１の5’遺伝子トラップカセット（両側にリコンビナーゼ部位を有する）を除去することにより、第２の5’遺伝子トラップカセット（検出可能なマーカーをコードしている）を「活性化する」ことができる。
【００３１】
5.2.3. 3’遺伝子トラップカセット
本発明の3’遺伝子トラップカセットは、機能しうる組み合わせで、エキソンの発現を媒介するプロモーター領域、および該エキソンの3’末端を定める機能性のスプライスドナー(SD)配列を含む。標的細胞染色体に組み込まれた後、3’遺伝子トラッププロモーターによって発現された転写産物は、組み込まれた3’遺伝子トラップカセットの下流に位置するトラップされた細胞性エキソンのスプライスアクセプター（SA）配列にスプライシングされる。その結果、3’遺伝子トラップカセットのエキソンおよび任意の下流細胞性エキソン（その3’最末端はポリアデニル化シグナルを有する）を含む融合転写産物が生成される。
【００３２】
この融合転写産物は、当業者に公知の種々の方法によって、任意の発現レベルで、すなわち異種核RNA、メッセンジャーRNA、タンパク質などとして同定することができる。例えば、3’遺伝子トラップカセットのエキソンおよび転写産物のポリＡテールに特異的な１対のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施することができる。または、例えば、抗体スクリーニング（すなわち、エピトープタグ付け(tagging)）によって同定することができるエピトープをコードする3’遺伝子トラップカセット中のエキソンを用いることができる。当技術分野で公知の他のスクリーニング法としては、限定するものではないが、3’遺伝子トラップカセットのエキソンに特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション（固体支持体上または溶液中、等）が挙げられる。タンパク質レベルでスクリーニングする場合は、任意の細胞位置でスクリーニングすることができる。例えば、上記融合転写産物によってコードされる分泌されたタンパク質をスクリーニングすることができる。または、例えば、分泌シグナルをコードする第１エキソンを用いて、それによって融合転写産物によってコードされる多数のまたは全部の融合ペプチドを宿主細胞に分泌させることができる。全てのスクリーニング方法を改変して、トラップされたエキソン、ならびにそれによってコードされるタンパク質およびポリペプチドに対して特異的にすることもできる。すなわち、PCRプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、または特定の遺伝子もしくは遺伝子クラスに特異的な抗体を用いてスクリーニングすることができる。または、例えば、翻訳後修飾に基づいてスクリーニングすることができる。例えば、特定のまたは全ての糖タンパク質に特異的な抗体を用いてスクリーニングすることができる。
【００３３】
上述のように、3’遺伝子トラップカセットは、スプライスドナー配列が後ろ続いている１以上のエキソン（場合により１以上のオープンリーディングフレームをコードする）の発現を導くプロモーターを含有する（図１）。下記のものを含むがそれらだけに限定されない、任意の数の転写プロモーターおよびエンハンサーを3’遺伝子トラップカセットに組み込むことができる。すなわち、細胞または組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、PGKプロモーター、調節性プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター）、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、トリ（すなわち、ニワトリ等）β-グロビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンH3-614、等）、β-アクチンプロモーター(好ましくはニワトリ）、メタロチオネインプロモーター（好ましくは、マウスメタロチオネインI および II）、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター等、ならびに十分確立された分子生物学的技法を用いて作製することができるそれらの置換形および変形を含む（総論としては、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, 第I-III巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New YorkおよびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1989, John Wiley & Sons, 全巻およびそれらの定期更新を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れる。）プロモーター／エンハンサー領域もまた組織特異的発現または誘導発現をもたらすように選択することができる。
【００３４】
好ましくは、3’遺伝子トラップカセットのエキソン(または複数のエキソン）は、遺伝子のエキソン、好ましくは第1エキソンを模倣して設計されている。一般に、エキソンまたは複数のエキソン(および該エキソンの後に続くイントロンの一部）およびスプライスドナー配列は、天然に存在する遺伝子に由来する。しかし、本物のエキソンを模倣して設計された合成エキソンも用いることができる。例えばそのようなエキソンは、新規に、あるいは既存のエキソンを改変して、高い効率もしくはコンセンサスなリボソーム結合部位を組み込むことによって、またはIRES配列をオープンリーディングフレームまたはエキソンの翻訳開始コドンの5’側に付加することによって、またはオープンリーディングフレームを創出することによって、コドン使用法を最適化することによって、またはオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列を変更しない1以上の制限部位を作製することによって、または選択的もしくはコンセンサスなスプライスドナー配列をエキソン内に作製することによって、設計し、構築することができるであろう。
【００３５】
本発明のベクターは、非原核生物起源のエキソン、すなわち真核生物から得たエキソンを用いた3’遺伝子トラップカセットを使用する。本発明の3’遺伝子トラップカセットに有用なエキソンは、抗生物質耐性活性または他の選択マーカー活性(例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードしない。本明細書に論じるように、非真核生物起源のオープンリーディングフレームを組み込んだ3’遺伝子トラップカセットは、典型的に3’エキソントラップの著しい効率低下を示す。したがって、本発明の3’遺伝子トラップカセットを採用したベクターは、トラップし、そして遺伝子トラップ配列タグ付けによって迅速に同定することができる標的遺伝子の数を大幅に増大させる。
【００３６】
したがって、3’遺伝子トラップカセット（SD部位を含む）のエキソンは、好ましくは、真核細胞または恐らく動物ウイルスもしくは植物ウイルスにとって天然のものである、あるいは標的細胞中、または近縁の種、属、目、綱、門、もしくは界由来の細胞のゲノム中に天然に存在する、ヌクレオチド配列に類似した又は相同なヌクレオチド配列に由来する。例えば、ヒト遺伝子由来のエキソンを、マウス細胞に使用する3’遺伝子トラップカセットに用いることができる。また、マウス遺伝子由来のエキソンを、ヒト細胞に使用する3’遺伝子トラップカセットに用いることができる。本発明の目的上、相同配列とは、例えば0.5 M NaHPO4、7% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中65℃におけるフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーションおよび0.1xSSC／0.1% SDS中68℃における洗浄などの高ストリンジェンシー条件下（Ausubel, F.M.ら(編), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, 第I巻, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3)、またはよりストリンジェンシーの低い条件、例えば、0.2xSSC／0.1% SDS中42℃における洗浄（Ausubelら, 1989, 前出）などの中程度にストリンジェントな条件下で、標的配列と結合することができる核酸配列と定義される。場合により、エキソンは標的細胞ゲノム中の配列に対してアイソジェニックである。
【００３７】
本発明の3’遺伝子トラップカセットに適切なエキソンは、天然に存在するエキソンを組み合わせることによって、または天然に存在するエキソンの断片を組み合わせることによって、または天然に存在するエキソンの断片を天然に存在するエキソンのコンセンサス配列である合成配列と組み合わせることによって、得ることもできる。例えば、真核生物のゲノム中に見いだされるエキソンであって遺伝子の第1エキソンではないエキソンを用いる場合は、該エキソンの5’末端に適切な転写開始配列を付加することによって該エキソンを本発明の3’遺伝子トラップカセットに有用とすることができる。
【００３８】
標的細胞ゲノムが3’遺伝子トラップカセットのエキソンと同一の(またはそれに対応する）遺伝子をコードする場合、好ましくは、該天然に存在する遺伝子は、該標的細胞中のトラップされたエキソン配列の増幅および配列決定を実質的に妨げるレベルでは、該標的細胞によって発現されない。本発明の開示の目的上、「増幅および配列決定を実質的に妨げる」という表現は、天然に存在するエキソンの内因性発現は、3’RACEプロトコルまたは場合により通常のクローニングおよび配列決定法によって、トラップされたエキソン配列の増幅および配列決定を妨げる場合があるが、それらを阻止しない、という事実を指すものとする。起りうるこの厄介な問題を回避するさらなる方法としては、3’遺伝子トラップカセットの天然に存在するエキソン内にPCRプライミング部位として用いうる独特の配列を組み込むこと、または標的細胞ゲノム中に天然には存在しないエキソンを有する3’遺伝子トラップカセットを用いることが挙げられる。起りうるこの厄介な問題を回避する、さらに別の方法は、誘導遺伝子(例えば、ストレス遺伝子）から得たエキソンを3’遺伝子トラップカセットに用いることである。この実施形態においては、該誘導遺伝子が3’遺伝子トラップカセットの使用対象である細胞中に存在する場合は、好ましくはそれらの細胞は、該エキソンがそこに由来する該遺伝子が全くまたは殆ど誘導されない条件下に維持されるであろう。
【００３９】
本発明の3’遺伝子トラップカセットのエキソンは、翻訳開始部位および／またはオープンリーディングフレームを含んでいても、含んでいなくてもよい。場合により、該エキソン中に存在してよい任意のオープンリーディングフレームを、宿主細胞に好まれているコドン使用法を反映するように最適化されたコドンを組み込むように遺伝子操作することができる。
【００４０】
本発明の3’遺伝子トラップカセットのエキソンが好ましくは真核細胞(または好ましくは哺乳動物細胞）にとって天然の配列を含むとすると、該エキソンは抗生物質耐性活性を有するタンパク質をコードするマーカー（neo、ampなど、例えばβ-ラクタマーゼ、tet、kanなど）を典型的には構成しないし、または他の方法で宿主細胞に選択可能な薬剤耐性または感受性を付与することもしない（そのようなマーカーを、場合により例えば該エキソンの5’末端領域に付けることは可能であるが）。本発明の目的上、ある遺伝子が抗生物質耐性遺伝子を発現する原核または真核細胞に、適切な濃度の対応する抗生物質を含む培地中で選択的増殖をもたらす活性を有する遺伝子産物をコードする場合、該遺伝子または遺伝子産物は抗生物質耐性を「付与する」ことができる。
【００４１】
または、上記エキソンは一般に、周知の通常の発色または蛍光アッセイによる選択的検出を媒介する、標的細胞(好ましくは哺乳動物細胞）にとって天然のものではない酵素活性またはリポーター遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）をコードしない。さらに、本発明のベクターは、好ましくは、本発明の3’遺伝子トラップカセットの両側に位置するターゲッティングDNA配列（すなわち、相同組換えによる3’遺伝子トラップカセットの、特定の遺伝子座への遺伝子ターゲッティングを導くための配列）の領域を含まないものとする。
【００４２】
さらに、スプライスドナーの効率が、該スプライスドナー部位の下流に位置するイントロン配列によって影響されうるとすると、本発明の3’遺伝子トラップカセットは、場合により約１塩基から約数千塩基のイントロン配列を上記スプライスドナー配列の近隣かつ3’側に含むように遺伝子操作することができる。
【００４３】
5.3.本発明のベクターの応用
上記3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、3’遺伝子トラップの効率の顕著な改善によって特徴づけられる。したがって、本発明の別の実施形態は3’遺伝子トラップカセット、および以下のことによって特徴づけられる、該カセットを組み込んだベクターである。すなわち、同様に位置しているSAβgeo 5’遺伝子トラップカセット（またはSAneo 5’遺伝子トラップカセット）が5’エキソンをトラップする効率の少なくとも約15%、好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約60%、そして最も好ましくは少なくとも約85%の効率で3’エキソンをトラップする能力によって特徴づけられる。本発明の目的上、同様に位置している遺伝子トラップカセットとは、類似のベクター内に類似の配向で存在するカセットをいう。または、同様に位置している遺伝子トラップカセットが両方とも同一のベクター内に存在してもよい。
【００４４】
種々の定量測定法のうち任意のものが当業者には利用可能であり、それらを用いて3’および5’遺伝子トラップカセットのそれぞれの相対的効率ならびに効果的にトラップされうる遺伝子の数を計算することが可能である。例えば、SAβgeoまたはSAneoなどの5’遺伝子トラップによって同定され、そして例えば抗生物質G418を用いて選択された標的遺伝子に対する、本発明の3’遺伝子トラップカセットによって同定された標的遺伝子の百分率を決定することができる。または、同定可能な3’遺伝子トラップ事象の百分率を、SAβgeoによって媒介される5’遺伝子トラップ事象によって抗生物質耐性となった、または色素原的に同定可能となった標的細胞の百分率と比較することができる。
【００４５】
本発明の3’遺伝子トラップカセットの機能効率は、本発明のベクターを用いて特徴づけられる独立した遺伝子トラップ事象の絶対数によっても定量することができる。一般に、本発明のベクターは少なくとも約1から約数百個の遺伝子、典型的には少なくとも約1000個の異なる遺伝子、より典型的には少なくとも約3000個、好ましくは少なくとも約10,000個、より好ましくは少なくとも約25,000個、より好ましくは少なくとも約50,000個、そして最も好ましくは少なくとも約55,000個から特定の細胞または細胞型に存在する最大数の遺伝子までの好都合なトラップを可能とする。例えば、マウス細胞は約60,000から100,000個またはそれ以上の遺伝子をコードすると考えられる。
【００４６】
遺伝子トラップ効率の別の基準は、トラップされうる別個の細胞性エキソンの数である。典型的には、本発明の3’遺伝子トラップカセットは、少なくとも約10,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞性エキソン（一般に、約7,500から9,500個の異なる遺伝子に相当する。同一遺伝子内の異なるイントロン／エキソン内で独立した組み込み事象が起りうるので、この数字は典型的にはより小さい）、好ましくは少なくとも約15,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞性エキソン、より好ましくは少なくとも約25,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞性エキソン、そして最も好ましくは少なくとも約50,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞性エキソンから哺乳動物ゲノムに存在する遺伝子の約70〜約100％までの容易な検出、スクリーニング、および同定を可能とするに十分な効率で細胞性3’エキソンをトラップする。
【００４７】
5.3.1.細胞の遺伝子トラップされたライブラリー
本発明のベクターを用いて迅速に特性評価できる遺伝子の数を前提として、本発明のさらなる実施形態は本発明の3’遺伝子トラップカセットを安定に組み込む培養動物細胞の遺伝子トラップされたライブラリーを含む。本明細書に記述するライブラリーは、以下の工程を含む方法によって構築することができる。すなわち、細胞集団を処理して（感染、トランスフェクション、レトロ転位、またはポリヌクレオチドを細胞に導入する事実上任意の他の方法による）3’遺伝子トラップカセットを含有するベクターを安定に組み込ませ、安定に形質導入された細胞を同定し、または他の方法で選択し、そしてトラップされた3’細胞性エキソンを同定する工程である。好ましい実施形態においては、動物細胞ライブラリーは哺乳動物細胞を含み、そして特に好ましい実施形態においては、該哺乳動物細胞は胚性幹(ES)細胞である。好ましくは、そのようなライブラリーはライブラリー中の突然変異した各細胞が1個の同定可能な3’遺伝子トラップベクター／現象を担持するように構築される。（複数の遺伝子トラップベクターを担持する突然変異細胞もまた本発明の意図するところである。）
本発明のさらなる実施形態においては、ライブラリー中の個々の突然変異細胞を分離し、クローン的に増殖させる。次に、単離し、クローン的に増殖させた突然変異細胞を分析して、挿入的に突然変異させた宿主の遺伝子のDNA配列または部分DNA配列を突き止める。したがって、本発明はライブラリー中の突然変異させた各遺伝子の少なくとも一部の配列決定をさらに提供する。次に、得られた配列データベースはライブラリーの索引として役立つ。本質において、ライブラリー中のクローン的に増殖させた各グループはそれぞれ部分配列情報を用いてカタログに載せられる。本方法は3’遺伝子トラップカセットにスプライシングされて連結されたエキソンから配列情報を得るように設計されているので、得られた配列は突然変異させた遺伝子に特異的である。得られた配列データベースは興味のある突然変異させた遺伝子を同定するために用いることができる。または、このデータベースは新規遺伝子の同定のための強力な手段である。一旦遺伝子が同定されたならば、対応する突然変異細胞をライブラリーから取り出し、以下に記述するようにさらに研究することができる。
【００４８】
一般に、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターによって突然変異させた単離された細胞または各細胞型（例えば、ES細胞）の索引付きライブラリーは、少なくとも約50の異なる単離された突然変異細胞培養系 (culture line)、典型的には少なくとも約100、より典型的には少なくとも約500、好ましくは少なくとも約1,000、より好ましくは少なくとも約5,000、より好ましくは少なくとも約10,000、より好ましくは少なくとも約25,000、そしてさらにより好ましくは少なくとも約40,000から約100,000-500,000までの異なる単離され特性評価された突然変異細胞培養系またはそれ以上からなる集団を含む。好ましくは、所与のライブラリーに存在する異なる突然変異細胞培養物のゲノムは、挿入された遺伝子トラップカセットまたはそれを組み込んだベクターの位置を除いて、本質的に同一である（例えば、共通の供給源または同系繁殖系統に由来する）。
【００４９】
理想的には、突然変異誘発の範囲は、標的細胞系においてトラップすることができる遺伝子の全セットである。ライブラリーの富化(redundancy)を増大させることによって、得られる配列データベースは、理想的には標的細胞中のトラップされうる遺伝子の本質的に完全な代表を含むことになるであろう。本発明の目的上、「本質的に完全な代表（representation)」という用語は、ライブラリーの構築に用いた細胞のゲノムが、標的細胞ゲノム中のトラップされうる遺伝子の少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約85%、そして最も好ましくはトラップされうる遺伝子の少なくとも約95%（標準ポアソン分布により決定される）（所与のベクターはゲノム中に非特異的に組み込まれると仮定している）の中に、全体として安定に挿入された3’遺伝子トラップカセットを含む確率が一般に少なくとも約80-95％ある、統計学的状況を指すものとする。
【００５０】
本発明のベクターによって提供される広いゲノム範囲は、標的細胞ゲノムの大規模な突然変異誘発をも可能とする。典型的には、突然変異させた標的細胞の上記のようなライブラリーは、標的細胞ゲノム中に存在する各染色体中に少なくとも１つの3’遺伝子トラップ突然変異（上述の3’遺伝子トラップカセットまたはこれを含むベクターによって媒介される）を全体として表わす、突然変異細胞またはその単離された培養物の集団を含む。好ましくは、染色体あたり少なくとも約２から３個の独立した遺伝子トラップ突然変異がライブラリー中に全体として存在する。より好ましくは、染色体あたり少なくとも約10個の独立した遺伝子トラップ突然変異が現われており、そして最も好ましくは、常染色体（性染色体を除いた）あたり少なくとも約500個の独立した遺伝子トラップ突然変異、および／または約70〜90％までの、もしくは本質的に完全なゲノム内の遺伝子の代表がライブラリー中に全体として現われるであろう。
【００５１】
本発明は、本発明のベクターによって形質導入されうる、または培養された細胞系の存在する任意の生物／細胞のゲノムの大規模な遺伝子分析を可能とする。したがって、上記のライブラリーは、標準的技法によって、または本発明の3’遺伝子トラップカセットを担持する組換えベクターを用いてトランスフェクションすることができる任意の細胞型から構築することができる。それゆえ、本明細書に記述する突然変異させた動物細胞のライブラリーを作製し、整理し、および索引をつける方法もまた、遺伝子操作することができ、培養下で増殖させることが可能な事実上任意の真核細胞に広く適用可能である。
【００５２】
ライブラリーの構築にマウスES細胞、好ましくは初期継代のES細胞を用いる場合は、該ライブラリーはマウスゲノムの総合的機能研究のための遺伝子的手段となる。ES細胞を胚盤胞に注入して正常な発生に組み込み、最終的には生殖系列に組み込むことが可能なので、ライブラリーの突然変異させたES細胞は突然変異トランスジェニックマウス系統の集団を効果的に表わす（総論としては、参照により本明細書に組み入れる、1995年11月7日発行の米国特許第5,464,764号参照）。
【００５３】
類似の方法を用いて事実上任意の非ヒトトランスジェニック動物（もしくは、トランスジェニックにされうる動物）、またはトランスジェニック植物を作製することができる。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、およびその他当技術分野で公知のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が含まれる。さらに、ウシ、ヒツジ、およびブタ種、齧歯類動物の他のメンバー（ラットならびにウサギおよびモルモット、およびチンパンジーなどの非ヒト霊長類動物）を用いて本発明を実施することができる。
【００５４】
本明細書に記述するライブラリーおよび／またはベクターを用いて作製されたトランスジェニック動物および細胞は、基礎的な生物学的プロセスの研究、および老化、癌、自己免疫疾患、免疫障害、脱毛、腺障害、炎症性障害、毛細管拡張性運動失調、糖尿病、関節炎、高血圧、アテローム硬化、心臓血管性疾患、肺疾患、神経および骨格系の変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、喘息、発育障害または異常、不妊、上皮潰瘍、ならびにウイルス性および微生物性の病原性および感染性疾患（これらの病原の比較的総合的な総論が、特に参照により本明細書に組み入れる、Mandellら,1990, Principles and Practice of Infectious Disease,第３版, Churchill Livingstone Inc., New York, N.Y. 10036に提供されている）を含むがこれらだけに限定されない疾患の治療剤および診断剤の開発に有用である。それゆえ、上述の動物および細胞は機能ゲノム学の実施に特に有用である（類似のライブラリーならびにその作製およびスクリーニング方法は、1997年10月2日に出願の米国特許出願第08/942,806号で考察されている。その開示は参照により全体を本明細書に組み入れる。）
5.3.2.DNA配列情報の獲得
cDNAライブラリーの配列決定は幾十万の発現配列タグ(EST)を提供してきた。これらの配列タグは典型的には遺伝子またはDNAのコード領域を同定するものと考えられている。遺伝子は全部でないにしろ殆どの可能性のある薬物標的をコードすると考えられるので、全ての哺乳動物遺伝子を同定するESTを獲得しようと殺到が起こった。しかし、これまでに作製された膨大な配列データにかかわらず、多数の遺伝子が、確立されたcDNA法を用いて同定するのは困難であることが示された。なぜなら、多くの遺伝子は発現されないか、非常な低レベルで発現されるか、特定の細胞型のみで発現されるか、または一過性にのみ発現されるからである。遺伝子トラップ法は内因性発現レベルに関係なく遺伝子を同定できるとすると、遺伝子トラップ法は（上述のベクターを用いて同定された多数の新規配列によって示されるように）、遺伝子発見のための重要な手段である。EST技術と同じく、5’遺伝子トラップベクター(5’エキソンをトラップするために設計されたベクター）の考えうる1つの制限は、発現された遺伝子のみが典型的にトラップされることである。したがって、特に遺伝子発見のためには、ES細胞は特に好ましい標的細胞である。なぜなら、ES細胞は殆どの遺伝子の発現が一般に入り混じっていると考えられるからである。この入り混じった状態であるとすると、ES細胞中の殆どの遺伝子は本発明のベクターを用いてトラップできるであろう。ES細胞中で発現されていると検出しうる遺伝子の比率を調べるため、GenBank dbestデータベース由来の23個のESTを無作為に選択し、遺伝子をPCRにより同定するプライマーを合成した。これらのプライマーをES細胞RNAを用いたRT-PCRアッセイに用いると、23セットのプライマーの全部が生成物をもたらした。これは、全23遺伝子の転写産物がES細胞中に検出できたことを示す。スクリーニングされた上記23個のESTが無作為に選択されたとすると、それらは遺伝子全般を大いに代表していて、他の細胞型で、従来のcDNAライブラリーの配列決定で同定されるに十分な高いレベルで発現される遺伝子の大半もまたES細胞で発現され、したがってSA選択マーカーポリＡ(5’遺伝子トラップ）ベクターを用いておそらく同定可能であることを示しているようである。
【００５５】
しかし、遺伝子が発現されないか、またはごくわずかしか発現されない場合、そのような遺伝子をトラップし同定するためには3’遺伝子トラップカセットを利用しなければならない。さらに、3’遺伝子トラップカセットはトラップされた遺伝子由来のDNA配列データの自動化手段による迅速な獲得を可能とする。
【００５６】
3’エキソンをトラップするように設計されたベクターは、多数の突然変異を生成し、そして突然変異させた遺伝子を迅速に同定することを可能とした。しかし、そのようなベクターの初期のものは、3’遺伝子トラップに用いられる選択マーカー遺伝子が殆どの真核細胞のスプライシング機構によって効率的に利用されない、という制限をもつ。その結果、抗生物質耐性を付与する活性をコードするエキソンを用いた3’遺伝子トラップカセットを採用したベクターは、ゲノム中の遺伝子の比較的小部分の容易かつ効率的な遺伝子トラッピングおよび同定(3’RACEによる）を可能とするのみである。さらに、トラップされた3’エキソンの選択における固有の非効率性は、そのような方法を用いて分析できる遺伝子の総数を限定する。したがって本発明以前には、細胞ゲノムの小部分しか、抗生物質選択媒介3’エキソントラッピングを用いて効果的にトラップ／突然変異させられなかった。
【００５７】
本発明のベクターは、選択マーカー活性をコードするエキソンを用いた初期の3’遺伝子トラップベクターと比較して、数倍から２桁以上大きい数の遺伝子のエキソン配列によるトラッピングおよび同定を可能とする。
【００５８】
本発明のベクターには、3’遺伝子トラップカセットおよび／または遺伝子のオープンリーディングフレームの5’末端を同定する確率を増大させるように作製された5’遺伝子トラップカセットを組み込むことも可能である。遺伝子の5’末端はしばしば分泌および膜貫通タンパク質に見いだされるシグナル配列をコードするので、これは重要である。このグループの遺伝子には、可能性のあるタンパク質治療剤および薬剤標的の遺伝子が多数含まれる。5’非コード配列の長さの平均が約100 bpであり、平均長遺伝子トラップ配列が約500 bpであるとすると、本発明のベクターを用いて作製される遺伝子トラップされた配列は、典型的にはタグをつけたオープンリーディングフレームの5’部分を同定する。これは特に重要である。なぜなら、遺伝子の5’末端は高いGC含有量、二次構造、および逆転写酵素のプロセッシビリティーの欠如などの複雑な因子のために、得ることが困難な場合があるからである。
【００５９】
上記のベクターを用いて公知遺伝子の多数の遺伝子トラップを作成し、同定した場合、GenBankのcDNA配列とマッチした遺伝子トラップ配列タグの93%は、同一の、または付加的5’配列を含んでいた。このことにより、本発明の3’遺伝子トラップカセットは遺伝子の5’末端を同定し、特性評価するために使用できることが確認される。実際、本発明の遺伝子トラップ法は今日までに記述されている他の方法よりも良好に、または同等に遺伝子の5’末端を同定する。
【００６０】
ゲノム学の分野における主要なチャレンジの1つは、依然として全ての遺伝子の全長cDNAの単離およびクローニングである。今日まで、これは種々の組織に由来するcDNAの作製、およびそれに続く個々のcDNAの配列決定を必要とした。上述のように、そのような方法を用いるとcDNAの5’末端を得ることが非常に困難な場合がある。さらに、cDNAの完全なレパートリーを得るためには、本質的に全ての分化した細胞型から、そして全ての発生時点において、それぞれのcDNAライブラリーを作製しなければならないという問題が存在する。なぜなら、ESTとしてクローン化するためには遺伝子を発現させなければならないからである。
【００６１】
上に考察したように、本発明のベクターはcDNAライブラリーの構築に用いることができる。培養下の細胞に導入した場合、3’遺伝子トラップカセットはその細胞型において通常発現されるか否かにかかわりなく、遺伝子の転写産物を産生する。種々のトラップされた遺伝子の発現レベルは、非常に低いレベルでしか発現されない遺伝子も同定されるように挿入されたプロモーターによって標準化される。本発明の方法およびベクターを用いるならば、複数の条件下で増殖させた複数の細胞型に由来する複数のcDNAライブラリーを別々に作製する必要なしに、1つのライブラリーから標的細胞ゲノムの広いcDNA範囲を得ることができる。
【００６２】
本発明の3’遺伝子トラップカセットは、例えば組織培養細胞のゲノムに挿入することができる。そして、トラップされた遺伝子から生じるcDNAのみをcDNAライブラリーにサブクローン化することを可能とする方法(例えば、PCR）を用いることができる。これらの方法は、ライブラリーの作製に要する労力を実質的に低下させる一方、作製されるcDNAの範囲を増大させる。上に考察したように、本発明の方法は遺伝子の5’末端を得るためにも特に有用であり、したがって全長cDNAを得る機会を最大化することができる。本発明のベクターを用いて作製されたトラップされたcDNAの多様性および数を変更するために用いることができる変数の例としては、限定するものではないが、感染多重度の調整、および外因性に導入された選択マーカーを組み込んで発現する細胞を選択するために一定期間の選択培養にかけなかった感染標的細胞からのcDNAの作製が挙げられる。その結果得られる遺伝子トラップされたcDNAライブラリーを配列決定し、複数の遺伝子トラップされた遺伝子のコード領域を作製することができる。これらのコード領域は、バイオインフォーマティクス(bioinformatics)、in situ およびin vitroの両方における遺伝子発現研究（すなわち、ハイブリダイゼーション研究、遺伝子チップ（これはトラップされた遺伝子配列に対応するオリゴヌクレオチド配列を用いることもできる）、等）および種々の動物および植物由来の遺伝子トラップ配列データベースの作製に用いることができる。これらの遺伝子トラップ配列は、プローブとして直接利用することができる。または、これらの遺伝子トラップ配列に対応するオリゴヌクレオチド配列を用いて、ハイブリダイゼーションまたはPCRによってライブラリーをスクリーニングすることができる。また、本発明のベクターを用いて同定された遺伝子トラップ配列は、該遺伝子トラップ配列の発現を指令するクローニングベクター中に組み込むことができる。本発明の開示の目的上、このような遺伝子トラップ配列(またはそれに由来するオリゴヌクレオチド配列)を有するか、含むか、または組み込んだ単離されたポリヌクレオチド配列とは、上記cDNA遺伝子トラップ配列(またはそれに由来するオリゴヌクレオチド配列)の連続したストレッチを、任意の付加的な天然または組換え配列（かかる単離されたポリヌクレオチドまたはベクター内に存在する上記遺伝子トラップ配列に隣接してよい）を含めて最小限に組み込んだ、または含む、任意および全ての単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを意味するものとする。
【００６３】
本発明の方法およびベクターを用いてDNA(および対応するアミノ酸）配列情報が得られる速度および効率を考えるならば、本発明の方法およびベクターはスプライシング機構およびイントロンを含む遺伝子を含有する任意の細胞（初代および二代細胞を含む）または細胞系において遺伝子スクリーニングを実施するための重要な手段を提供することが明らかである。本発明の遺伝子トラップベクターは特に重要な技術的大躍進を表わす。なぜなら、本明細書に記述する3’遺伝子トラップカセットは、抗生物質選択によって検出される遺伝子トラッピングに依存する従来の3’遺伝子トラップベクターを用いて効率的に得られる遺伝子より、およそ13倍（これは経験的に決定される）の数の遺伝子の迅速な同定を可能とするからである。新規遺伝子配列を得る頻度と組み合わせると、同定可能な遺伝子トラップ標的において観察された増大は、多数の新規遺伝子および遺伝子配列の配列情報を提供するであろう。さらに、ES細胞を標的とすると、これらの新規配列のそれぞれは新たに同定された遺伝子（および可能性のある薬剤または薬剤標的）ならびに「ノックアウト」細胞および可能性のある「ノックアウト」胚または動物のいずれをも表わす。
【００６４】
本明細書に記述する方法、ライブラリー、細胞および動物の迅速な配列獲得特性は、疾患ならびに遺伝的に決定される有利な点の分子的／遺伝子的基礎を迅速に同定するのによく適している。遺伝的に決定される有利な点とは、長い寿命、低コレステロール、低血圧、癌への耐性、糖尿病の低い発生率、肥満の欠如、または全ての炎症性障害（冠状動脈性疾患、多発性硬化、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および炎症性腸疾患を含むが、これらだけに限定されない）の軽減または予防、などである。多数の標的遺伝子によって提供される広い範囲を前提とするならば、本明細書に記述する技法の特に有用な用途はコード領域単一ヌクレオチド多型(cSNP)の特性評価および分析を包含する。
【００６５】
5.4.導入方法
本発明の3’遺伝子トラップカセットは、好ましくは、標的細胞ゲノム中に特異的または非特異的に挿入されうる広範なベクターのうち任意のものの構造成分として標的細胞に導入される（3’遺伝子トラップカセットを導入するためにリコンビナーゼ系を使用することもできる）。本発明が開示する特徴と共に用いることができる適切なベクターとしては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルスベクター、α-ヘルペスウイルスベクター、などが含まれる。ウイルスベクター、特に非複製性細胞を改変するのに適するウイルスベクター、およびそのようなベクターをどのようにして目的のポリヌクレオチドの発現と結びつけて用いるか、についての徹底した総論が Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, CaplittおよびLoewy（編), Academic Press, San Diego (1995)に見いだされる。
【００６６】
本発明の3’遺伝子トラップカセットを送達するためにレトロウイルスベクターを用いる場合は、該レトロウイルスベクターを1995年9月12日発行の米国特許第5,449,614号（「614特許」）（参照により本明細書に組み入れる）に記述されるようなレトロウイルスパッケージング細胞系と共に用いることができる。上記ライブラリーを構築するための標的として非マウス動物細胞を用いる場合は、宿主細胞の広範な感染を可能とするため、両種向性エンベロープを有するレトロウイルスを産生するパッケージング細胞が一般に用いられる。または、限定されるものではないが、細胞系293/GPG (Oryら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11400-11406; および米国特許出願第08/651,050号：これらは参照により本明細書に組み入れる）等の向汎性パッケージング細胞系を用いて上記のベクターをパッケージングすることができる。または、適切なウイルス(例えば、レトロウイルス）の受容体遺伝子を非マウス(例えば、ヒト）の標的細胞中にトランスフェクションすることができる。
【００６７】
さらに、上記のレトロウイルスベクターを米国特許出願第08/907,598号(参照により本明細書に組み入れる）に記述されているキメラインテグラーゼ分子と共にパッケージングすることができる。典型的には、パッケージング細胞系の構築に用いられるLTRは自己不活性化性である。すなわち、エンハンサーエレメントは感染により生じたプロウイルスがどちらのLTRにもエンハンサーを持たないように3’U3配列から除かれる。そうでなければ、プロウイルス中のエンハンサーは突然変異させた遺伝子またはその近傍の遺伝子の転写に影響を及ぼしうる。典型的には、上記レトロウイルスベクターの遺伝子トラップカセットは、レトロウイルスLTRの正常に機能する向きとは逆の向きで存在する。
【００６８】
特に3’遺伝子トラップカセットを組み込んだ組換えウイルスベクターを送達するためにウイルス、特にレトロウイルス感染（例えば、生物学的方法）を用いるさらなる利点は、遺伝的物質を標的細胞に送達する標準的非生物学的方法よりもウイルス感染の方が効率的であるということである。組換え遺伝的物質をレトロウイルス感染によって送達する場合、該レトロウイルスの組換えRNAゲノムは標的細胞内で逆転写され、次に該感染性ウイルス内にパッケージングされているレトロウイルスインテグラーゼがベクター（および3’遺伝子トラップカセット）の標的細胞ゲノムへの本質的に非特異的な組み込みを媒介する。したがって、本発明のさらなる実施形態は、標的細胞に外因的に付加されたものであるか、または標的細胞内では天然に存在しないインテグラーゼまたはリコンビナーゼ活性によって媒介される、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだ組換えベクターの挿入方法を含む。
【００６９】
本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込むように適合させることができる代表的なレトロウイルスベクターは、特に米国特許第5,521,076号ならびに1997年10月2日に出願された米国特許出願第08/942,806号および1997年8月8日に出願された米国特許第08/907,598号に記述されている（これらは特異的遺伝子トラップ現象を生化学的または表現型的にアッセイするために用いることができるスクリーニングプロトコールをさらに開示している）。これらの開示は参照により本明細書に組み入れる。
【００７０】
典型的には、レトロウイルスベクターに組み込まれる遺伝子トラップカセットの方向は、正常なレトロウイルス転写の方向の逆である。しかし、1個以上の遺伝子トラップカセットが正常なレトロウイルス転写の方向と同じ方向に組み込まれているレトロウイルスベクターもまた意図される。典型的には、遺伝子トラップカセットをLTRに対して逆方向に配置する理由は、ポリアデニル化シグナル、スプライス部位およびプロモーターなどの遺伝子操作された制御エレメントの存在がパッケージング細胞系のレトロウイルスゲノムの正しい転写を妨げ、その結果レトロウイルス力価を減少させる可能性があるからである。
【００７１】
さらに、逆向きのLTR中に「潜在」スプライスドナー配列が見いだされるので、このスプライスドナーがトラッピングに関連したスプライシング現象に悪影響を及ぼさないように、これを部位特異的突然変異誘発によって除去することができる。場合により、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列の全部または一部を削除することによってLTRプロモーターおよび/またはエンハンサー機能を不活性化することができる。
【００７２】
5.5.  分子遺伝学的応用
5.5.1.  遺伝子の活性化
本発明のもう一つの実施形態は、動物、たとえばマウス、および培養細胞における機能の獲得または損失の両方をスクリーニングするために3'遺伝子トラップカセットを使用することである。翻訳開始部位を欠くエキソンを有する3'遺伝子トラップを取り込んだベクターを用いる場合、与えられた標的遺伝子は、ベクターが遺伝子の中のどこに組み込まれたかに依存して、過剰発現されるか挿入不活化（変異）するかのいずれかとなる。翻訳開始前にベクターがイントロンの中に着地した場合、細胞タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム全体の過剰発現が生じる。これらのタイプのトラッピング事象を用いて、遺伝子の過剰発現に基づく遺伝スクリーニングをおこなうことができる。これらのスクリーニングは、たとえば、疾病の過程において重要な役割を果たす遺伝子を発見するために、細胞培養中またはマウス中でおこなうことができる。たとえば、これらのスクリーニングは、3'遺伝子トラップカセットを初代胚線維芽細胞に導入し、軟寒天中における増殖能力により選択することによって、ガン細胞を識別するために用いることができる。あるいは、細胞の老化を免れることができる細胞をアッセイすることによっても、がん遺伝子の可能性のあるものが識別できる。
【００７３】
本発明のベクターを、遺伝子発現（または過剰発現）をもたらすトラッピング事象を選択するために用いることができることを証明するために、ES細胞の分化を促進する因子を発現させる遺伝子がトラップされるかどうかを決定するための実験をおこなった。数多くの遺伝子が組織培養プレート上の培養細胞にトラップされた。多数のプレートを平行して感染させ、得られたプレートについて、ES細胞の分化を観察した。いくつかのプレートではほとんど分化が見られないのに対して、いくつかのプレートでは100%分化したES細胞が見られた。この分化は、分化因子である遺伝子、または、ES細胞に分化因子を産生させ、それを培地中にくみ出させて、その結果として皿上のすべての細胞を分化させる遺伝子のいずれかの発現の結果であると思われる。重要なことに、これは、3'遺伝子トラップ系を、遺伝子トラッププールの上清を試験することによって、特定の生物学的応答を引き起こす分泌される分子を活性化またはスクリーニングするために用いることができることをも示している。ES細胞分化因子のスクリーニングは一つの例であるが、この技術は、興味あるすべての細胞応答に関与する分泌される分子を同定するために用いることができる。たとえば、アポトーシスまたは造血細胞の分化を誘導する分泌された分子をスクリーニングすることができる。
【００７４】
本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットによってもたらされる発現の増加を考えると、本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットのもう一つの応用は、遺伝子の活性化である。たとえば、適当な動物細胞を、前記の3'遺伝子トラップカセットを取り込むベクターで処理または感染させた後、ベクターが本来休止状態の遺伝子の5'イントロンに組み込まれた場合、この遺伝子は「活性化」され、調節性要素、たとえば、3'遺伝子トラップカセットに取り込まれたエンハンサー/プロモーター要素によって過剰発現され得る。このような標的のない、非特異的な、または偏った非特異的な（米国特許出願番号第08/907,598号参照）遺伝子活性化を用いて、さまざまな天然の細胞産物のいずれかを過剰発現する、改変した動物細胞（ヒト細胞を含む）を作ることができる。
【００７５】
このような応用に特に有用であると思われる産物には、エリトロポエチン(epo)、tPA、サイトカイン、インターロイキン、腫瘍サプレッサー、ケモカイン、分泌された分子、G-CSF、GM-CSF、神経成長因子(NGF)、繊毛性神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、インターロイキン1-2および4-14、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、αまたはγインターフェロン等、レプチン(leptin)および因子VIIIおよびIXのような、けれどもこれらに限定されない、正常に分泌される分子またはホルモンが含まれる。
【００７６】
3'遺伝子トラップカセットによる休止状態の遺伝子の活性化、過剰発現、または遺伝子の異常な発現はまた、生物体の中での遺伝子の機能を研究するためにも用いることができる。遺伝子の過剰発現は遺伝子の機能を研究するために用いられ、3'カセットで遺伝子をトラップすることにより、遺伝子を生物体中で過剰発現させることができる。過剰発現によって生物体に生じた表現型によって、その遺伝子の機能を解明することができる。たとえば、具体的に記載されたレトロウイルスベクターは、遍在して発現されるPGKプロモーターを含む。遺伝子がES細胞にトラップされ、それに続いてES細胞をマウスを作るために用いる場合、マウスはトラップされた遺伝子を遍在的に過剰発現する。この方法は、たとえば、トラップされた遺伝子を組織特異的な方式で過剰発現するために、PGKプロモーターではなく組織特異的なプロモーターを使うというように、さらに改変することができる。アルブミンプロモーターは肝臓特異的過剰発現のために用いることができる。さらに、トラップされた遺伝子のタンパク質産物の、細胞から細胞外空間へ、血流または乳汁中への分泌を生じさせるために、3'トラッピングカセットにシグナル配列を加えることができる。これは遺伝子機能の理解を促すであろう。
【００７７】
過剰発現は、3'遺伝子トラップカセットを用いた遺伝子トラップ事象の一つの可能性な結果なので、3'トラップ/過剰発現構成要素を除去することができることは有用であることが証明される。これは、3'トラップカセットの必要不可欠な構成要素（必要不可欠な構成要素にはプロモーター、エキソン、スプライス供与体、イントロン配列またはカセット全体が含まれる）のいずれかを、flpまたはcreリコンビナーゼによって認識されるもののようなリコンビナーゼ部位と隣接させることによって達成することができる。この方法で、リコンビナーゼを対応する細胞または生物体に加えることによって、希望通りに過剰発現の条件を逆転させるか、過剰発現をなくすことができる。
【００７８】
遺伝子の活性化のために、標的細胞に本来備わっているエキソンか、あるいは標的細胞に生物学的に適合したエキソンを取り込む包括的な3'遺伝子トラップカセットを用いることができる。または、公知の遺伝子から得た特定のエキソンおよびスプライス供与体部位を利用する特定の3'遺伝子トラップカセットを構築することができる。場合によっては、3'遺伝子トラップを用いた遺伝子の活性化が、典型的には活性化された遺伝子の翻訳開始部位から上流(5')のベクターの組込みまたはインサートを必要とすることを考えると、遺伝子活性化エキソンは、好ましくは、機能的翻訳開始部位(IRESまたはKozak配列）を取り込まない、または付随的なレベルの翻訳活性のみを仲介することができる名目上機能的（または陰性の）翻訳開始部位のみを取り込む。別の方法では、エキソンへの内部リボソーム侵入部位の取り込みは、3'遺伝子にトラップされた、または活性化された遺伝子の過剰発現をもたらす。
【００７９】
3'遺伝子トラップエキソンと下流の細胞にコードされたエキソン（たとえば、「活性化された」遺伝子のタンパク質産物に特有のドメインのみをコードする）の間の融合産物が望まれる場合は、典型的には、遺伝子トラップベクターは機能的翻訳開始部位または内部リボソーム侵入部位および翻訳開始部位を取り込む。
【００８０】
あるいは、前記のベクターが翻訳開始部位から下流を組み込む場合には、遺伝子は変異し、そのような機能の喪失を検出するスクリーニングをおこなうことができる。このアプローチの例としては、線維芽細胞を、たとえば、本発明のベクターで変異させ、軟寒天中で増殖することができるヒットについてスクリーニングすることである。この方法で、腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子を同定することができる。典型的には２つの対立遺伝子のうち１つのみがトラップされるが、培養中の細胞のゲノムは不安定なことが多く、選択を通じて、第２の対立遺伝子が喪失したものが見いだされる。これによって劣性の表現型をもスクリーニングすることが可能になる。
【００８１】
5.5.2.  機能に基づく遺伝子の発見
本明細書に記載されたベクターの遺伝子活性化能力は、さらに選択的な遺伝子の発見に応用できる。たとえば、増殖欠陥細胞（たとえば、腫瘍サプレッサーまたはDNA修復ノックアウト細胞等）に、本明細書に記載した遺伝子活性化ベクターを感染させることができる。これに続いて、感染した細胞を、部分的にまたは完全に修正された増殖表現型を示す細胞/コロニーについてスクリーニングすることができる。修正された表現型を示す細胞が同定されれば、増殖欠陥表現型の修正に寄与する「活性化された」遺伝子は、たとえば3' RACEを用いるDNA配列決定によって迅速に同定することができる。典型的には、DNA修復変異（動物およびヒトにおける癌にしばしば伴う変異）を部分的にまたは完全に修正する遺伝子は、腫瘍サプレッサー活性またはおそらく癌遺伝子活性をコードすると思われる（一般的には、Seltenら、1985、EMBO J., 4(7):1793-1798を参照されたい）。
【００８２】
反対に、癌性のまたはトランスフォームされた細胞（または細胞系）を前記の遺伝子活性化ベクターに感染させた後、増殖するまたは迅速に増殖する細胞に毒性を有するさまざまな細胞毒性剤で処理することができる（一般的に、Wilsonら、1986, Cell, 44:477-487; Stephensonら、1973, J. Virol., 11:218-222; Sacksら、1979, Virology, 97:231-240; Inoueら、1983, Virology, 125:242-245; Nortonら、1984, J. Virol., /50:439-444; Choら、1976, Science, 194:951-953; Steinbergら、1978, Cell, 13:19-32; Maruyamaら、1981, J. Virol., 37:1028-1043; Varmusら、1981, Cell, 25:23-26; Varmusら、1981, Virology, 108:28-46; Mathey-Prevotら、1984, J. Virol. 50:325-334; およびRyanら、1985, Mol. Cell. Biol., 5:3477-3582を参照されたい）。好ましくは、感染した細胞を、トランスフォームされていない表現型に戻った細胞が接触阻害され、培養培地中に存在する細胞毒性剤の影響を受けにくいような条件下で、細胞毒性剤または化学療法剤に曝す。これはさらに、迅速に増殖するまたはトランスフォームされた細胞の優先的な脱離、および数サイクル後に、結果としておこる非癌性のまたはトランスフォームされていない表現型に部分的にまたは完全に復帰した細胞の単離に寄与する。これに続いて、トランスフォームされた表現型の修正、または腫瘍化表現型の抑圧に寄与する「活性化された」遺伝子を、前記の3' RACEプロトコールを用いたDNA配列決定によって迅速に同定することができる。
【００８３】
本明細書に記載された方法はまた、癌の遺伝的基礎を同定するために有用である。本明細書に記載される方法を用いて研究され、治療される可能性のある癌には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（鱗状細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋腫）、膵臓（管腺腫、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、類癌腫、VIP産生腫瘍）、小腸（腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、繊毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖器管：腎臓（腺癌、ヴィルムス腫[腎芽細胞腫]、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（鱗状細胞癌、移行性細胞癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間隙細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫(osteochondroma)（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液腫、類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形膠芽腫、乏突起膠腫、神経線維腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄：（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科系：子宮（子宮内膜癌）、頸部（頚癌、前腫瘍子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌[漿液嚢胞腺腫、ムチン嚢胞腺腫、子宮内膜腫瘍、腹芽腫、明細胞癌、未分類癌]、顆粒層包膜細胞癌、セルトーリ-ライディヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（鱗状細胞癌、上皮癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、腟（明細胞癌、鱗状細胞癌、ブドウ状肉腫[胎児性横紋筋肉腫]、ファローピウス管（癌）；血液：血液（骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄芽球病、多発骨髄腫、骨髄形成異常症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫]；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、鱗状細胞癌、カポジ肉腫、色素性母斑、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；乳房：癌および肉腫；および副腎：神経芽腫。
【００８４】
上記の研究の変更には、レトロウイルス遺伝子をトラップするベクターを、特定の制御配列または転写因子によって調節される遺伝子へのレトロウイルスの組込みを標的とするまたはこれに偏らせるキメラインテグラーゼと共に用いることが含まれる。たとえば、本明細書に記載されたレトロウイルス遺伝子活性化ベクターを、この公知の腫瘍サプレッサー活性により調節される遺伝子に対するベクター介在型遺伝子活性化を優先的に標的とするp53-キメラインテグラーゼを取り込んだウイルス（米国特許出願番号第08/907,598号に記載されるような）にパッケージングすることができる。
【００８５】
適切に変更されると、本明細書に記載されたベクターは、さらに、実質的にすべてのDNA配列を、標的細胞のゲノム全体のどこにでも配置し、どこにベクターが組み込まれたかを速やかに同定するためのベヒクルを提供する。ゲノム全体のどこかに配置したいと考えるDNA配列は、ますます数多く同定されてきている。このような配列の例には、それぞれflpおよびcreリコンビナーゼにより同定されたfrt部位またはlox P部位のような組換え部位が含まれる。これらの部位は相同組換えまたは他の形質転換法によってゲノム全体のどこにでも配置することができるが、本発明によれば、自動化された方法を用いた組み込み部位の迅速な同定および目録作成が可能になる。これらの組換え部位は、特定のDNAの挿入に、または他の位置における挿入と同時に用いることができ、また、これらは、逆位、欠失および転座のような染色体の再配列を引き起こすために用いることができる。このように、本明細書に記載されたベクターは、染色体の再配列を通じて遺伝子の機能を研究するために特に有用である。ゲノム全体のどこかに配置したいと考えられる他の配列には、tet、エクジソン、またはエストロゲン受容体DNA結合部位または応答要素が含まれるが、これらに限定されない。これらの部位は、一般に遺伝子発現の誘導または抑制のために用いられており、これらの部位をゲノム全体のどこかに、好ましくは何千もの異なる遺伝子のうちの何十かの遺伝子に配置することによって、遺伝子発現の条件的または組織特異的な調節を引き起こす機会を提供するであろう。
【００８６】
前記の変異誘発法のもう一つの特徴は、ベクターにコードされる配列および構造的な特徴を、組み込まれた遺伝子トラップ構築物と直接隣接するゲノムDNAの迅速な同定をおこなうために利用することができることである。このアプローチは、構築物が組み込まれた遺伝子を識別するエキソン配列は、3'遺伝子トラップカセットの配列獲得能力を介してアクセス可能であるという事実を利用している。（生物情報科学によって）適切に同定された細胞エキソンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、クローン化され得る鋳型を作るPCR反応において、または組込み部位を同定するために直接配列決定された、ベクターにコードされる配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと共に用いることができる。PCRが完全に適切であると証明されない場合には、比較的まれな切断制限部位、たとえば、Sfi I等を取り込むように遺伝子操作されたベクターを用いることによって、PCR反応を増大することができる。このような制限部位は、PCR産物を、またはベクターにフランキングするゲノム配列さえも、適当なクローニングベクターまたはそのライブラリーにサブクローニングするために利用することができ、それに続いて、たとえば、確立された方法、たとえばPCR、ロングレンジPCR、サイクル配列決定等を用いてベクター組込み部位を同定するために用いることができる。
【００８７】
本発明の別の態様において、リコンビナーゼ活性をコードする遺伝子を（たとえば、flpまたはcre等、米国特許第5,654,182号および第4,959,317号を参照されたい。この文献を参照により本明細書に組み入れる）、前記の3'遺伝子トラップカセットを含むベクターに配置する。このリコンビナーゼ遺伝子は、前述のマーカー遺伝子についての記載と同様の方法で発現させることができる。簡単に述べると、リコンビナーゼは、独立した発現カセットから発現することができ、5'遺伝子トラップに取り込むことができ、またはベクタープロモーターから発現することができる。リコンビナーゼを発現するために用いられる戦略に依存して、リコンビナーゼは別々の構築物上に、または3'遺伝子トラップカセットの5'または3'のどちらかでベクターに存在し得る。リコンビナーゼ遺伝子を前記の遺伝子トラップベクターに取り込むことによって、さまざまなトラップされた遺伝子と本質的に同じパターンのリコンビナーゼを発現する変異した細胞の収集物またはライブラリーが得られる。上記の考察には、本明細書に記載されたベクターを用いて、ベクターが標的細胞のゲノムの中のどこに組み込まれたかを迅速に同定することができる方法によって、如何にしてゲノム全体にわたって任意のDNA配列を配置するかを示す少数の例しか記載されていない。当業者は、前記のベクターが真核生物の分子遺伝学の分野に広い応用可能性を有する技術を構成することを理解するであろう。さまざまなベクターおよび遺伝的応用のすべてが本発明の開示の範囲に含まれることが意図されている。たとえば、他の前述した特徴を持たない3'遺伝子トラップカセットを含むレトロウイルスベクターをデザインすることができる。さらに、3'遺伝子トラップは、プロモーターの一つが誘導性である縦列プロモーターを有するようにデザインすることができる。あるいは、たとえば、前記の5'遺伝子トラップから得たSAneoが、好ましくは枠内で、前記の3'遺伝子トラップカセットのエキソンに融合した（すなわち、pAおよびプロモーター配列が欠失している）ハイブリッド遺伝子トラップもまた本発明の範囲に含まれることも意図する。このような構築物は、前記の遺伝子トラップカセットの増大したSAおよびSD機能の両方で有利であり、与えられた標的細胞に発現された遺伝子の自動化された同定を可能にする。
【００８８】
5.5.3.  条件変異誘発
本発明の別の態様は、細胞内で、または生物体あるいは動物の中で、時間的および空間的にオンおよびオフを切り替えることができる変異を作る能力である。特定の場所または特定の時間においてのみ遺伝子を変異させる能力は、遺伝子機能の理解に重要な影響を与える。たとえば、イントロン内のSAβgeoの配向はそのトラップする能力を調節し、それによって、トラップされた遺伝子によって作られる正常な転写物を変異させる。適切に配向したfrtリコンビナーゼ部位は、flpリコンビナーゼと共に用いて上のゲノム再配列に影響を与えることができる（すなわち、遺伝子トラップカセットを「フリップ」またはさらに除去することにより、変異の「オン」または「オフ」を切り替える）。あるいは、与えられた変異原性構築物がcreリコンビナーゼを発現する組織または細胞中のみで選択的に改変される（置換、フリップ、欠失等）ような条件変異を作り出すために、たとえば、cre/lox系を用いることもできる。
【００８９】
上記の概念を立証するために、二つの逆転したlox部位内にSAβgeoカセットを配置したベクターを構築した。これらの部位は、lox部位の間に位置するDNA配列を効果的にフリップすることができるcreリコンビナーゼによって認識される。逆方向lox部位が隣接するSAβgeoを含むレトロウイルスベクターを、相同組換えによってHPRT遺伝子のイントロンの中に組み入れた。SAβgeoが順方向の配向で存在したとき、6-チオグアニンの存在下での細胞の生存によって証明されるように、HPRT機能は廃止された。ところが、creリコンビナーゼがこれらの細胞に発現されたとき、SAβgeoの配向は逆向きの配向にフリップして、HATを含む培地における細胞の増殖によって示されるように、HPRT機能が回復した。このように、HPRT遺伝子は、SAβgeoの配向をフリップすることによって効果的にオフまたはオンに切り替えることができる。したがって、本発明のもう一つの実施形態は、遺伝子発現の選択的および可逆的な調節を可能にするベクターに関する。同様の方法論を用いて、遺伝子トラップ変異もまた、リコンビナーゼ発現、およびそれによる、たとえばさまざまな刺激/制御要素に対するSAβgeoのフリップと結合させることによって、条件的または組織特異的におこなうことができる。中または外に「交換」するリコンビナーゼが介在する戦略を用いて対立遺伝子系を操作すること、または、さまざまなより大きいまたは小さい変異原性構築物（好ましくはloxまたはfrt部位とフランキングしている）のいずれかを操作することも可能である。
【００９０】
本明細書に記載したベクターを組織特異的または調節可能な発現に用いるための別の方法は、LTR内にfrtまたはlox部分のような特異的DNA結合部位を配置することである。LTRにlox部位を有する場合、一旦挿入がおこなわれ同定されると、たとえば、creリコンビナーゼを加えて、単一のfrtまたはlox部位を含む一つのLTRを除くインサート全体を除去するために用いることができる。さらに、調節可能な遺伝子発現を可能にするDNA応答要素を、全体としてまたは部分的に、リコンビナーゼ部位と共に取り込むことができる。ベクターまたは遺伝子トラップインサートがリコンビナーゼ活性によって除去された場合、単一のLTRの産生をもたらす同じ組換え事象はまた、機能的DNA応答要素を産生する。この単一のLTRは遺伝子機能を妨害しないが、DNA要素は遺伝子発現を調節するために用いることができる。真核生物の遺伝子発現を調節するために用いられる典型的なDNA要素またはオペレーターには、tet、エクジソンまたはエストロゲンDNA結合部位が含まれる。tetオペレーターがtetリプレッサータンパク質と結合して存在すると、遺伝子の発現を増加または減少するように調節することが可能になる。これはマウスにおいて、LTR挿入物を有するマウスの系統を、tetリプレッサーを遍在してまたは特定の組織のみにおいて発現するマウスの系統と交配することによって実施することができる。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、flpリコンビナーゼが、たとえば、frt隣接組込みベクター配列の、外因的に加えたfrt隣接配列との置き換えを仲介することができるという事実に基づいている。そこで、適切に構築されたベクター（フランキングするリコンビナーゼ部位を取り込む）が標的細胞のゲノムの所与の領域に取り込まれると、同じ隣接するリコンビナーゼ部位を取り込む実質的にすべてのさまざまなDNA配列（すなわち、プロモーター、エンハンサー、IRES、応答要素等）は、適切なリコンビナーゼタンパク質を使用することによって上記ベクターの中に入れたり外に出したりの切り替えをおこなうことができる。
【００９２】
5.5.4.  生物学的アッセイ
明らかなように、本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットを取り込んだベクター、特にレトロウイルスベクターは、さまざまな真核生物標的細胞の内因性遺伝子の発現を、変異誘発、活性化、または制御するために用いることができる。したがって、本明細書に記載されたベクターは、植物、および鳥類、魚類および哺乳類のような高等な真核生物における分子遺伝学的技術を実施するために特に有用である。このような分子遺伝学的技術の例には、遺伝子の活性化、変異、および調節のin vitroおよびin vivo両方のスクリーニングが含まれる。
【００９３】
たとえば、CD4陽性ヒトT細胞をin vitroで本明細書に記載されたベクターに感染させた後、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の細胞変性株に感染させる。HIV感染から生き残ることができた細胞を単離し、HIV耐性に関与した遺伝的変異を迅速にスクリーニングする。
【００９４】
in vitroで使用できる別のスクリーニング法は、前記の遺伝子トラップベクターによって形質転換された細胞を変異し、形質転換された細胞の速い増殖を妨げる変異を選択することである。この戦略は、癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子を同定するために用いることができる。細胞の変異後に、さまざまな化学物質を迅速に分裂する細胞を殺すために用いて、細胞増殖および形質転換された表現型に役割を果たす遺伝子への挿入物を選択する。迅速に増殖する細胞を殺す化学物質の一つの例は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、PestovおよびLau、1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(26):12549-12553である。BrdUは迅速に分裂する細胞のDNA中に優先的に入り込み、そしてHoechst 33258を加えた後、蛍光で処理すると迅速に分裂する細胞を陰性選択し、同時にゆっくり増殖する細胞を選択する。
【００９５】
前記のベクターを形質導入された細胞の別の応用法は、ヘテロ接合細胞を用いて、またはこのようなスクリーニングアッセイの前に培養された、または（たとえば、適用可能な遺伝子トラップベクターに取り込まれた対応する選択可能なマーカー遺伝子のホモ接合表現を選択するために高濃度の抗生物質を用いて）ホモ接合性に操作された細胞を用いて実施することができる、細胞ベースのin vitro表現型スクリーニングである。
【００９６】
本発明が意図するin vivoのアッセイには、動物をin vivoで変異誘発しスクリーニングするために3'遺伝子トラップカセットを用いるベクターの使用が含まれる。これらのアッセイにおいて、本発明のベクターは、たとえばENU（一般的には、Vitaternaら、1994, Science, 264:719-725を参照されたい）のような典型的な化学的変異誘発物質の代わりに、またはこれに加えて用いられる。たとえば、試験動物をさまざまな位置で、さまざまな濃度の本明細書に記載されたウイルスベクターに感染させる。投与の好ましい方法には、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋内、皮下、皮内、頭蓋内、鞘内等が含まれる。次に、これらの変異誘発性刺激に起因する異常な細胞表現型を同定し、単離し、スクリーニングする。腫瘍細胞が観察され単離された場合、腫瘍化表現型に伴う変異を迅速に同定するために3' RACEを用いて、これによって腫瘍サプレッサー遺伝子の候補または癌遺伝子の可能性のあるものを同定することができる。
【００９７】
本明細書に記載されたベクターの別のin vivoの応用は、感染症に関連する病原体による感染に対して異常に耐性のあるまたは感染しやすい、変異体トランスジェニックおよび体細胞トランスジェニックの細胞、動物、ならびに植物の作出に関する。
【００９８】
本発明のもう一つの強力な応用は、ヒト以外の変異体トランスジェニック動物の大規模な作出である。このようなヒト以外のトランスジェニック動物には、たとえば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、および、鳥類および魚類、特に哺乳類の種のような当業者に公知の他のトランスジェニック動物種が含まれる。これに加えて、ウシ、ヒツジ、およびブタの種、齧歯類の他の科、たとえば、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒト以外の霊長類、たとえば、チンパンジーが、本発明を実施するために用いられる。特に好ましい動物はラット、ウサギ、モルモットで、最も好ましいのはマウスである。体細胞トランスジェニック動物（上記参照）、および生殖系列トランスジェニック動物の両方が特に意図されている。さらに、このような動物は、培養細胞を用いてさらに遺伝子トラッピングの研究をする際に組織および細胞の供給源となる。
【００９９】
相同組換えによってマウス胚性幹細胞に変異をおこすことは十分に確立されており、哺乳類系における遺伝子機能を研究するために有用であることが証明されている。けれども、相同な遺伝子を標的とすることには多くの制限がある。このような制限の一つは、ゲノム配列のエキソン/イントロン構造を決定するために、遺伝子が知られており、且つ、マッピングされている必要があることである。遺伝子およびその構造が知られている場合でも、標的とするベクターは変異させようとする個々の遺伝子それぞれについて作らなければならない。これは、数多くの遺伝子を相同組換えによって変異させる速さを制限するものである。本明細書に記載された非相同、または非特異的な3'遺伝子トラッピングおよび変異の方法は、上記の制限を受けない。一般的に、非特異的にインサートされた、または標的指向されないベクターは、このようなベクターは相同組換えによる配列を挿入するためにデザインされたDNAベクターに典型的な相同標的指向性配列の（しばしば広範囲の）フランキング領域を欠いているという事実によって、相同組換えのためにデザインされたベクターと区別できる（たとえば、米国特許第5,733,761号を参照されたい。この文献を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１００】
マウスに変異をおこさせるために他の方法を用いることもできる。これらには、化学物質または放射線によって誘導される変異が含まれるが、これらは、遺伝子についてあらかじめ何も知識がなくても遺伝子を変異させるために用いることができる。これらの変異は大規模におこなうことができるが、変異した遺伝子を同定するために、たとえば位置クローニングのような非常に長い関連過程を必要とすることが多い。それに加えて、これらの変異は数多くのマウスを表現型についてスクリーニングした後に初めて同定される。これは、大きなマウスのコロニーを必要とし、このコロニーを維持するのに多大の費用と動物を繁殖させるための時間を必要とする。あらかじめ遺伝子についての知識が必要なく、遺伝子の迅速な変異が可能で、遺伝子が容易に同定可能であるような方法が必要である。本発明に記載されるような遺伝子トラッピングは、数多くの遺伝子を変異させ、まだ胚性幹細胞期にある間に（ほとんど）同時に変異の同定ができる能力を与える。これによって、大規模にマウスを作る費用を負担することなく前もって実質的な分析が可能になり、また、前述の通り、強力な遺伝子発見構成要素を提供する。これに続いて、選択された遺伝子中に遺伝子トラップ変異を含むES細胞からマウスが作られ、得られた表現型を迅速に同定し、特徴づけることができる。これに続いて、得られたノックアウトマウスを他のマウス株と交配し、異なる遺伝的背景における遺伝子トラップ変異の評価を可能にするコンジェニックまたは組換えコンジェニック動物を作るために戻し交配する。上記の本発明の態様を実施するために用いることができるさまざまな株および遺伝子操作の代表的なリスト（ES細胞ライブラリーを含む）は、「実験マウスの遺伝的変種および株」(“Genetic Variants and Strains of the Laboratory Mouse”) 第３版、第１および２巻、1996, Lyonら編、Oxford University Press, NY, NY(この文献全体を参照により本明細書に組み入れる)に記載されている。
【０１０１】
変化した細胞の表現型を本明細書に記載された遺伝子トラッピングおよび活性化の方法と組み合わせることができることを考えると、本発明の別の態様は、変化した細胞のおよび動物の表現型を検出するためのスクリーニングアッセイの使用である。変化した表現型はまた、変異した細胞および動物を外因性の物質および化合物に曝すことによっても検出することができる。さらに、変異表現型と会合した遺伝子/タンパク質を単離して、さらに、タンパク質の正常の機能を、改変、置換、相互作用、阻害または増大することができる薬物の候補を同定するための生化学的分析をおこなう。
【０１０２】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、これはいかなる方法でも本発明を限定するものではない。
【０１０３】
6.0.  実施例
SAβgeo (5'エキソントラップとして)およびPGKpuroSD (3'エキソントラップとして)の両方を含むベクターを試験すると、puro耐性コロニーと比較して13倍多いG418耐性コロニーが得られることが見いだされた。これは、多くの場合、SAβgeoが遺伝子をトラップすると、遺伝子トラップベクターのpuro SD部分は同じ遺伝子の3'部分を効果的にトラップすることができなかったことを示している（標的細胞にピューロマイシン耐性を与えることができなかったことにより証明される）。これに加えて、G418耐性コロニーを単離して、puroが下流エキソンにスプライシングしたがpuro選択を与えるのに十分な高レベルではなかったのかどうかを決定するために3' RACEをおこなったところ、コロニーの約10%しか3' RACE産物を産生しないことが判明した。さらに、配列データは、ほとんどの場合、スプライシングがおこっていなかったことを示していた。これらのデータは、PGKpuroSD 3'遺伝子トラップカセットは、限られた効率で遺伝子の下流エキソンにスプライシングしてこれをトラップすることができるのみであったことを示している。同様の非効率は、puroに加えてさまざまな他の選択マーカーを用いても観察された。これはほとんどの選択マーカーは微生物に由来するという事実に起因すると考えられる。たとえば、puro遺伝子はStreptomyces albonigerに由来し、そのため、哺乳類細胞によって典型的に用いられるものとは異なるコドン使用を取り込む。
【０１０４】
コドン使用が、観察されたスプライシングの非効率の原因であるかどうかを試験するために、最適の哺乳類のコドン使用を取り込むpuro遺伝子を合成した。けれども、改変したpuroエキソンをを取り込んだ3'遺伝子トラップカセットは効率的にスプライシングされなかった。不十分なスプライシングの別の理由として考えられるのは、第１エキソンの平均の長さが約100bpしかないのに対して、ピューロマイシンマーカーは700bpの長さを有することである。そのため、さらに、選択マーカー遺伝子をプロモーターの隣に配置することが、スプライシング機構によるpuroエキソンおよびスプライス供与体配列の最適の認識を妨げたという可能性が残った。
【０１０５】
細胞RNAスプライシング機構は、puro遺伝子エキソンを限られた効率でしかプロセシングできなかったという重要な知見に基づいて、天然の哺乳類エキソンを取り込む3'遺伝子トラップカセットは、著しく増大したスプライシング効率、およびそれによるトラッピング効率を示すことが推定された。この仮説を試すために、3'遺伝子トラップカセットを遺伝子操作して、puroエキソンおよびスプライス供与体部位を、天然のスプライス供与体配列とスプライス供与体部位に続く天然のイントロン配列部分とを有する天然のマウスエキソンと置き換えた（マウスbtk遺伝子の第１エキソン、GenBank登録番号MMU58105のヌクレオチド40,043から40250）。これに続いて、このカセットを、ウイルス遺伝子トラップベクターの中のSAβgeo遺伝子の3'に挿入した。マウスbtk遺伝子の第１エキソンは、これが平均的な哺乳類の第１エキソンとほぼ同じ大きさであるため、および重要なことには、これはマウスゲノム中に天然に存在するが、btk遺伝子はマウスのES細胞には発現されないことがあらかじめ決定されていたために選択された。これがES細胞に発現されたとすると、3' RACE産物には常に内因性遺伝子からのbtk配列が混入し、トラップした遺伝子を識別する能力を妨げる可能性があるので、この特徴は重要である。したがって、3'遺伝子トラップカセットエキソンの好ましい特徴は、これが、正常な状態では標的細胞によって発現されない、または外部の刺激または操作を加えないと発現されない、天然に存在する遺伝子に由来することである。
【０１０６】
本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットに取り込まれ得るエキソンは、さまざまな真核生物（たとえば、酵母、昆虫、真菌、植物、鳥類、は虫類、魚類等）のいずれかに天然に存在する配列から取られた、またはこれに由来するものであってよいが、典型的には、動物細胞、特に哺乳類細胞が好ましい。あるいは、エキソンは、真核生物標的細胞のmRNAプロセシング（たとえば、スプライシング、キャップ形成、ポリアデニル化、輸送、および分解）によって効率的および機能的にプロセシングされるようにデザインされ、それを合成することができる（たとえば、「コンセンサス」エキソン）。
【０１０７】
ここではbtkの第１エキソンについて特に例示したが、本発明はこのエキソンに限定されるものではない。実際に、すべての天然に存在する真核生物遺伝子のエキソン、１以上の真核生物遺伝子からの一連のエキソン、コンセンサスエキソン、または合成エキソン、あるいは標的細胞RNAプロセシングおよび発現機構によって容易に認識され、効率的にプロセシングされるようなエキソンは、本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットに取り込み可能である。典型的には、第１エキソンの長さは、約1,000bpより短く、より好ましくは約700bpより短く、さらに好ましくは約500bpより短く、最も好ましくは300bpより短い。このような第１エキソンの例は、たとえば、GenBankに見いだすことができ、ヒト成長ホルモンの第１エキソン、エリトロポエチン、hprt、メタロチオネインIおよびII、トウモロコシ、コムギ、またはダイズリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシレート、ラットプレプロインスリン、雄不稔性２(MS2)遺伝子、プロリフェラ(prolifera;PRL)遺伝子等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
典型的な抗生物質耐性マーカーは動物または哺乳類細胞に天然に存在しないことを考えると、哺乳類標的細胞に抗生物質耐性または感受性（ヘルペスチミジンキナーゼ）を与えるマーカーは、一般的に本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットへの取り込みには好ましくない。同様に、遺伝子トラップ事象の検出および選択のための色素産生(chromogenic)アッセイに用いられる典型的に利用可能な酵素マーカー（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、細菌アルカリホスファターゼ等）もまた哺乳類のゲノムに天然に存在しないことを考えると、このような遺伝子は本発明の実施には好ましくない。けれども、上記の選択マーカーおよび酵素マーカーをコードする転写物の哺乳類細胞によるプロセシングおよび発現の効率を増加するような適切な遺伝子操作が見いだされれば、このようなマーカーを特許請求の範囲に記載された発明を実施するために用いることができる。上記の選択マーカーおよび酵素リポーターは好ましくは本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットの一部ではないけれども、これらは、前記の3'遺伝子トラップカセットと結合して5'遺伝子トラップ構成成分の一部として用いることができる。
【０１０９】
6.1.  ベクターの構築
マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子由来のプロモーターを、天然に存在するマウスbtk遺伝子（マウスbtk遺伝子のヌクレオチド40,043から40,250）の第１エキソンの上流に配置した。btk遺伝子の第１エキソンは翻訳開始部位およびコードした配列の5'領域を示す開始コドンを含まないが、これらのものは必要ならばエキソンの中に遺伝子操作により入れることができる。第１エキソンのコード領域の3'末端を、スプライス供与体配列によって印をつける。スプライス供与体認識配列はイントロン配列の中に延長できることから、イントロンDNAの103塩基はbtk第１エキソンの末端の後ろに保持された。PGKbtkSDカセットは3'ポリアデニル化シグナルを欠いている。したがって、このカセットによって産生された転写物はすべて適切にプロセシングされず、そのため、転写物がポリアデニル化され得る3'エキソンにスプライシングされない限り、3' RACEによって識別される。
【０１１０】
上記の3'遺伝子トラップカセットを、3'遺伝子トラップカセットのPGKプロモーターの5'のポリアデニル化部位を取り込んだレトロウイルスベクターに（フランキングするLTR領域に対して反対向きの配向で）配置し、neo遺伝子をポリアデニル化部位の5'に配置し、スプライス受容体(SA)部位をneoコード領域の5'に配置して、機能的SAneopA、または必要に応じてSAIRESneopA 5'遺伝子トラップカセットを作製した。このベクターはまた、操作可能な組み合わせで、PGKbtkSDカセットにフランキングする１対のリコンビナーゼ認識部位をも取り込む（図２参照）。このベクターは、典型的には、標的細胞がトラップした遺伝子を自然に発現することを要求するが、この要求は選択マーカーの発現を独立して制御するプロモーターを加えることによって克服できる。
【０１１１】
6.2. 3’遺伝子トラッピング
標準的技法を用いてbtkベクターを胚性幹細胞に導入した。すなわち、GP+Eパッケージング細胞由来の上清を約2x106個の胚性幹細胞に16時間添加し（標的細胞1個あたりウイルス約0.1個のインプット比で）、次にG418を用いて細胞を10日間選択した。次にG418耐性細胞を単離し、96ウエルプレート上で増殖させ、そして自動RNA単離、逆転写、PCRおよび配列決定プロトコールにかけ、遺伝子トラップされた配列を得た。
【０１１２】
RNA単離は、50 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.6中の5’-アミノ(dT)42 (GenoSys Biotechnologies)を用いて処理し、室温で一晩静置したDNA結合プレート(Corning/Costar)を用いて実施した。使用の直前にこのプレートをPBSで３回、TEで２回すすいだ。細胞をPBSですすぎ、DEPC処理水中に100 mM Tris-HCl, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDSおよび5 mM DTTを含む溶液を用いて溶解させ、そしてDNA結合プレートに移し、ここでmRNAが捕獲された。15分間インキュベートした後、DEPC処理水中に10 mM Tris-HCl, 150 mM LiCl, 1 mM EDTA, および0.1% LiDSを含む溶液を用いてRNAを2回洗浄した。次に同一溶液からLiDSを除いたものを用いてRNAを3回すすいだ。DEPC処理水中に2 mM EDTAを含む溶出バッファーを添加してプレートを５分間70℃に熱した。2X 第1鎖バッファー、100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM KCl, 6 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, RNAGuard (1.5単位／反応, Pharmacia), 20 mM DTT, QTプライマー(3 pmol/rxn, GenoSys Biotechnologies, 配列：
5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT3’、
配列番号12) およびSuperscript II酵素(200単位/rxn, Life Technologies)を含有するRTプレミックスを添加した。プレートをサーマルサイクラーに移し、RT反応（37℃5分間、42℃30分間、および50℃10分間）を行った。
【０１１３】
6.2.1.PCR産物の生成
２ラウンドのPCRを用いてcDNAを増幅した。PCRプレミックスは、1.1X MGBIIバッファー(74 mM Tris, pH 8.8, 18.3 mM 硫酸アンモニウム, 7.4 mM MgCl2, 5.5 mM 2ME, 0.011% ゼラチン), 11.1% DMSO (Sigma), 1.67 mM dNTPs, Taq (5単位   /rxn),  水およびプライマーを含む。第１ラウンドプライマーの配列は、
Po 5’AAGCCCGGTGCCTGACTAGCTAG3’、配列番号13；
BTKo  5’GAATATGTCTCCAGGTCCAGAG3’、配列番号14；および
Qo 5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGAC3’、配列番号15 (pmol/rxn)である。第２ラウンドプライマーの配列は、
Pi 5’CTAGCTAGGGAGCTCGTC3’、配列番号16；
BTKi  5’CCAGAGTCTTCAGAGATCAAGTC3’、配列番号17；および
Qi  5’GAGGACTCGAGCTCAAGC3’、配列番号18 (50 pmol/rxn)である外部プレミックス(outer premix)をcDNAのアリコートに添加し、17サイクル（95℃1分間、94℃30秒間、58℃30秒間、65℃3.5分間)反応を実施した。この産物のアリコートを内部プレミックス(inner premix)に添加し、上記と同じ温度で40サイクル反応させた。
【０１１４】
ネステド（nested, 入れ子）3’RACE産物を96ウエルマイクロタイタープレートフォーマットで２工程プロトコールを用いて下記のように精製した。すなわち、25μlの各PCR産物を、STEバッファー（150 mM NaCl, 10 MM Tris-HCl, 1 mM ETDA, pH 8.0)を用いて前もって平衡化したSephacrylTM  S-300 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)の0.25 ml樹脂床に加えた。1200 x gで5分間遠心することによって産物を回収した。この工程は、組み込まれていないヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびプライマーニ量体を除去する。次に産物をMilliQ H2O中で平衡化したSephadexTM G-50 (DNA級、Pharmacia Biotech AB)の0.25 ml樹脂床に加え、そして上記のように遠心して回収した。PicoGreen (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)を用いて、製造者の指示にしたがって蛍光により精製PCR産物を定量した。
【０１１５】
7 pmolのプライマー(オリゴヌクレオチドOBS; 5’CTGTAAAACGACGGCCAGTC3’、配列番号19)および約30-120 ngの3’RACE産物を用いて、AmpliTaqTM FS DNA ポリメラーゼ (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いたダイ(dye, 色素）ターミネーター法サイクルシークエンシング反応を実施した。反応は、95℃10秒間、55℃30秒間、60℃2分間を35サイクル実施した。G-50カラムを先に記述したように使用して、完了したシークエンシング反応液から組み込まれていないダイターミネーターを除去した。真空下で反応液を乾燥させ、ローディングバッファーに再懸濁し、そしてXLアップグレード(upgrade)付きのABI PrismTM377を製造者の指示にしたがって用いて6% Long Rangerアクリルアミドゲル(FTC BioProducts, RockLand, ME)中で電気泳動にかけた。
【０１１６】
配列情報を得るために自動化96ウエルフォーマットを用いた。70%のコロニーからデータが得られた。検討の結果、btkの第1エキソン由来の配列は、その後にbtkスプライス部位が続いていることが同定された。このスプライス部位の後には、それぞれ別個の遺伝子トラップ事象に由来するユニークな配列が続いていた。これらの配列は、長さの平均が500 bpで、高品質であり、しばしば長いオープンリーディングフレームを含んでいた。さらに、blast検索を用いて、これらの配列の80%をGenBankデータベースに見いだされる配列とマッチさせることができた。これは転写されたエキソン配列が同定されたことを示す。これらの遺伝子トラップ配列タグは、従来の遺伝子トラップ設計によってもたらされたものよりも長さおよび質が非常に良い。これらの新しいタグは長さおよび質の両方において改善されており、そして80%のタグがGenBankの配列とマッチするという事実は、それらが効率的に遺伝子をトラップすることを示唆している。
【０１１７】
これらのデータは、スプライシング機構は下流エキソンにスプライシングする場合にプロモーターに隣接する、または比較的近くに位置するエキソン型配列をより良く認識できることを示している。また、これらのデータはG418耐性コロニーの大半が遺伝子トラップ配列タグを用いて同定可能であることを示している。PGKpuroSD 3’遺伝子トラップカセットをpuro選択と共に組み込んだベクターによってトラップされた約7,000個の異なる遺伝子を表わすDNA配列データがすでに得られた。そのようなベクターは典型的にpuroコロニーの13倍のG418耐性コロニーをもたらすことがすでに確立されていることを考えると、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは非常に大きい標的サイズ、恐らく遺伝子70,000個を上回るサイズをもつ。この標的は、抗体選択の感受性を増大させるため、SAβgeo融合よりむしろSAneopAを用いることによってさらに拡大することができる。そして、任意の他の選択マーカーまたは他の方法で同定可能なマーカーをneoの代わりに5’遺伝子トラップカセットに用いることもできるであろう。IRESneoの使用は、G418耐性コロニーの数をpuro耐性コロニーの数の15倍以上に増大させ、その増強された感受性を実証した。他の可能性のある5’トラッピングマーカーとしては、限定するものではないが、抗生物質耐性遺伝子(例えば、β-ラクタマーゼ）、比色定量マーカー遺伝子、リコンビナーゼ活性をコードする遺伝子（例えば、flpまたはcreなど）、酵素、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子など蛍光マーカー遺伝子（例えば、細胞性蛍光を直接または間接に媒介する活性をコードする遺伝子）、およびこれらを検出するアッセイが含まれる。これらは参照により本明細書に組み入れる、特に米国特許第5,625,048号に記述されている。
【０１１８】
典型的には、選択マーカーがより感受性になるほど、トラップされうる標的遺伝子の数が多くなる。G418耐性コロニーの3’エキソンから遺伝子トラップ配列タグを得るためにbkt第１エキソンを用いる能力は、従来のベクターを用いて突然変異させ迅速に配列決定することが可能であった細胞数よりも約13倍多い突然変異させた細胞をもたらした。そしてその結果、遺伝子トラップ技術における重大な改善となっている。
【０１１９】
上記の結果を前提とするならば、これまでに報告されたいずれの3‘遺伝子トラップカセットと比較しても1桁の改良をもたらした驚くべき予期せぬ特性は、われわれの確立された遺伝子トラップのための選択マーカー規範から逸脱することによってのみ実現されたことが明白である。
【０１２０】
6.3.薬理ゲノム学
上に論じたように、本発明のベクターおよび構築物の標的サイズを増大させるさらなる方法は、選択を全て不要とし、そして別の（すなわち、分子遺伝学的）手段を用いてトラップしたエキソンを単離することである。そのようなアプローチを用いることは、遺伝子配列情報の迅速な生成および分析を可能とする。配列獲得の速度に関して明白な利点を提供するのに加えて、遺伝子トラップされたライブラリーの配列決定は実質的なコスト節約を可能とする。なぜなら、従来のcDNAライブラリーと比較して、反復配列の比率が低下しているからである。本明細書に記述する配列獲得系に固有の経済学は、個体のゲノムまたは個体ゲノムの集合の広域調査を迅速に得て、疾患と関連している可能性がある（調査した固体の一部が共通の疾患特性または症状を表わす場合）、中でも遺伝子多型、特にSNPおよび cSNPを同定することを実践的にする。さらに、ヒトおよび非ヒト動物において行動特性、薬物感受性、薬物過敏性、薬物アレルギー、などの遺伝的基礎を同定する広域ゲノムアッセイに類似の方法を採用することができる。
【０１２１】
そのような方法においては、上述の3‘遺伝子トラップカセットを含む高濃度から飽和濃度までの構築物を確立された方法を用いて適切な標的細胞（一次ヒトまたは非ヒト細胞を含む）（例えば、白血球およびリンパ球などの核をもつ一次血液細胞）に導入することができる。3’配列獲得カセットが標的細胞ゲノムに組み込まれた後、標的細胞からRNAを単離し、cDNAが作製され(そして場合により上記のようにPCR増幅を行い)、そしてcDNAライブラリーが構築される。次にこのライブラリーを配列決定し、そしてカタログ化し、対照ライブラリーならびに他の「実験」ライブラリーと比較する。SNPとしては、cSNPまたは「実験」もしくは「疾患」グループと相関する他のより著しい多型が同定される。多遺伝子座分析  を提供し、ならびに特定疾患と相関するゲノム領域を強調する、または他の方法でさらなる研究および分析を保証する、遺伝子多型のカタログが開発されるであろう。そのような情報もまた、薬物有効性(または有害な薬物反応）と関連する遺伝子多型の同定ならびに診断アッセイの設計にとって貴重であることが判明しうる。
【０１２２】
7.0.微生物寄託への言及
下記のプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約により米国ヴァージニア州マナサス所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託され、維持されており、そしてブダペスト条約の規定にしたがって利用可能とされる。このようなプラスミドの利用可能性は、任意の政府の権力下にその特許法にしたがって与えられる権利に反して本発明を実施するための許諾と解釈されてはならない。
【０１２３】
寄託されたプラスミドは、下記のATCC寄託番号を割り当てられた：
プラスミド ATCC番号
pbtK                                            209712
本明細書に述べた全ての刊行物および特許は、参照によりここに組み入れる。本発明の範囲から逸脱しない、記述された発明の種々の改変および変法が当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と結びつけて説明してきたが、請求された発明がそれらの特定の実施例に不当に限定されてはならないことが理解されなければならない。実際、動物遺伝学および分子生物学またはそれらの関連分野における当業者には自明である、上記の発明を実施するための形態の種々の改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０１２４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の3’遺伝子トラップカセットが、標的細胞ゲノム中に組み込まれた後にどのようにスプライシングされて細胞性エキソンに連結されるかを模式的に示す。
【図２】  5’トラップ内の選択マーカーおよび本発明の3’遺伝子トラップを組み込んだ二元的な（5’および3’）遺伝子トラップベクターを示す。図２はまた、例えば3’遺伝子トラップカセットのプロモーターの5’側および3’遺伝子トラップカセットのSDの3’側に位置させることができる、リコンビナーゼ認識（例えば、frt またはlox）部位の位置を示す。図示した特徴物(features)は、両側に位置するLTRに対して逆方向を向いている。
【図１】
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【図２】
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