(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖が、図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９４）を含み、重鎖が、図２８に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９６）を含む、抗ＥＧＦＬ７抗体。
【請求項２】
前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記二重特異性抗体が血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記二重特異性抗体がベバシズマブ又はラニビズマブと同じＶＥＧＦエピトープに結合する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸又は請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含有する組成物。
【請求項９】
組成物が担体を含有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的組成物である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）請求項６に記載のベクターを適切な宿主細胞において発現させ、（ｂ）抗体を回収することを含む、抗ＥＧＦＬ７抗体の製造方法。  
【請求項１２】
宿主細胞が原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療が必要である個体における腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患の治療において使用するための医薬であって、請求項１から４の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＬ７抗体を含む医薬。
【請求項１４】
癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵癌及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
細胞増殖性疾患が癌である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
有効量の第二薬剤が個体に投与され、このとき抗ＥＧＦＬ７抗体が第一薬剤である、請求項１３から１５の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１７】
第二薬剤が、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害性放射線療法、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖阻害性剤である、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
第二薬剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
第二薬剤がベバシズマブである、請求項１８に記載の医薬。 
【請求項２０】
第二薬剤が、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前、その後又は同時に投与される、請求項１６から１９の何れか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における血管新生を低減又は阻害するための薬剤であって、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含む薬剤。
【請求項２２】
前記病理学的状態が腫瘍性状態及び非腫瘍性状態からなる群から選択される、請求項２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
非腫瘍性状態が、糖尿病及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における抗血管形成剤の効率を増強するための薬剤であって、請求項１から４の何れか一項の抗体を含み、前記抗体は抗血管形成剤と併用して被験体に投与され、これにより前記抗血管形成剤の阻害活性を増強する薬剤。
【請求項２５】
血管新生を伴う病理学的状態が（ａ）腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患；及び（ｂ）非腫瘍性状態からなる群から選択される、請求項２４に記載の薬剤。
【請求項２６】
非腫瘍性状態が、糖尿病及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される、請求項２５に記載の薬剤。
【請求項２７】
被験体における腫瘍の灌流及び透過性を低減又は阻害するための薬剤であって、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含む薬剤。
【請求項２８】
前記抗体が、抗血管形成剤と共に投与される、請求項２７に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記抗血管形成剤が、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前、その後又は同時に投与される、請求項２４から２６及び２８の何れか一項に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記抗血管形成剤が抗ＶＥＧＦ薬剤である、請求項２４から２９の何れか一項に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記抗ＶＥＧＦ薬剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３０に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブ及びラニビズマブからなる群から選択される、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３４】
化学療法剤と組み合わせてなる、請求項１３から２０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項３５】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸである、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
前記化学療法剤がカルボプラチン及びパクリタキセルである、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３７】
化学療法剤と組み合わせてなる、請求項２１から３３の何れか一項に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸである、請求項３７に記載の薬剤。
【請求項３９】
前記化学療法剤がカルボプラチン及びパクリタキセルである、請求項３７に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法規則１．５３（ｂ）（１）に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、２００９年５月８日に出願の仮出願番号６１／１７６８１７の優先権を主張し、出典明記によりここにその内容が援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、抗ＥＧＦＬ７抗体とその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脈管供給の発達は、多くの生理学的及び病理学的なプロセスに基本的に必要である。胚及び腫瘍のような活発に発達する組織は十分な血液供給を必要とする。これは、血管新生と一般に呼ばれるプロセスにより現存する血管から；又は脈管形成と呼ばれるプロセスを通して前駆細胞から新規な脈管形成を促すプロ血管新生因子を生産することによってこの必要性が満たされる。管形成は、脈管発達において欠かせない工程である。脈管形成は、以下の工程のすべて又は多数を伴う複雑であるが、規則正しい生物学的現象である：a) 内皮細胞(ＥＣ)が既存のＥＣから増殖するか又は始原細胞から分化する；b) ＥＣが移動する；c) ＥＣが合体し索状構造を形成する；d）次いで脈管性索が管形成をして中央に内腔を有する脈管を形成する、e) 既存の索又は脈管から出芽して二次脈管を形成する（血管形成）；f) 原始脈管叢がさらに再造形及び再構築する；そして、g) 周囲に内皮細胞が集まり、内皮管を覆い、脈管に維持及び調節的な機能を与える；このような細胞には、小毛細管のための周細胞、より大きな脈管のための平滑筋細胞及び心臓の心筋細胞が含まれる。Hanahan, D. Science 277, 48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112, 19-28 (2003)。
【０００４】
既存の内皮細胞からの新しい血管の形成を含む、血管新生が様々な疾患の病因に関係することは、現在証明されている。これらには、固形腫瘍及び転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後線維増殖、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症などの眼内新生血管症候群、例えば糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)、新血管性緑内障、移植した角膜組織及び他の組織の免疫拒絶反応、関節リウマチ及び乾癬が含まれる。Folkman等, J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)；Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)；及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
【０００５】
腫瘍増殖の場合、血管新生は、過形成から腫瘍形成への変化に、そして、腫瘍の増殖及び転移のために栄養を提供するために重要であると思われる。Folkman等, Nature 339:58 (1989)。血管新生によって、腫瘍細胞は正常細胞よりも増殖優位性と増殖自立性を獲得しうる。通常、腫瘍は利用できる毛細管床から離れているため、数立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できない単一の異常細胞として始まり、更なる増殖及び転移をせずに長期間「休止中の」ままで存在しうる。次いで、腫瘍細胞の中には血管新生の表現型に切り替わるものがあり、内皮細胞を活性化し、その内皮細胞が増殖して、新規な毛細血管の血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は原発性腫瘍の連続した増殖を促すだけでなく、転移性腫瘍細胞の転移及び再コロニー形成化を促す。したがって、腫瘍切片の微小血管の密度と乳癌並びに多様な他の腫瘍における患者生存との間に相関性が観察されている。Weidner等, N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991)；Horak等, Lancet 340:1120-1124 (1992)；Macchiarini等, Lancet 340:145-146 (1992)。血管新生の切り替わりを制御する正確なメカニズムは十分にわかっていないが、腫瘍質量の血管新生は多数の血管新生刺激因子及びインヒビターの最終的なバランスから生じる(Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31)。
【０００６】
脈管発達のプロセスは厳密に調節されている。今日まで、有意に多くの分子、主に周辺細胞によって産生される分泌因子が、索状構造におけるＥＣ分化、増殖、移動及び合体を制御することが示されている。例えば、血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)は、血管新生を刺激する際及び、血管透過を誘導する際に伴う重要な因子として同定されている。Ferrara等, Endocr. Rev. 18: 4-25 (1997)。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子でさえ欠失すると胚性致死になるという発見は、この因子が脈管系の発達及び分化において代替不可能な役割を果たしていることを示唆する。さらに、ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内疾患と関係する血管新生の重要なメディエーターであることが示されている。上掲のFerrara等, Endocr. Rev. 。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡは、調べた大多数のヒト腫瘍によって過剰発現される。Berkman等, J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993)；Brown等, Human Pathol. 26:86-91 (1995)；Brown等, Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993)；Mattern等, Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996)；Dvorak等, Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)。
【０００７】
脈管形成の間のいくつかの工程は依然として十分に明らかとされていない。特に、管形成がどのように制御されるか−脈管索がどのように管になるのか、そしてどの因子がこの移行を制御するのかについてはほとんど知られていない。多くの疾患及び疾病における血管新生の役割からみて、これらのプロセスを引き起こしている一又は複数の生物学的効果を低減又は阻害する手段を有することが望ましい。ここに引用されている全ての文献は、特許出願及び刊行物を含め、出典明記によりそれらの内容全体が援用される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、一つにはＥＧＦＬ７に対する抗体の多様性に基づく。ＥＧＦＬ７は、重要且つ有利な治療標的として存在し、本発明は、ＥＧＦＬ７の発現及び／又は活性に伴った病理学的状態を標的とする使用のための治療薬及び診断薬としての抗体を提供する。従って、本発明は、ＥＧＦＬ７に関連した方法、組成物、キット、及び製造物を提供する。
例えば、幾つかの実施態様では、本発明は抗ＥＧＦＬ７抗体を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、（ｉ）ＫＸ１ＳＸ２ＳＸ３ＤＹＸ４ＧＤＳＹＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１はＡ又はＲであり、Ｘ２はＨ又はＱであり、Ｘ３はＧ又はＶであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、及びＷからなる群から選択され、そしてＸ５はＭ又はＶ（配列番号：２１０）であるＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）ＧＡＳＸ１Ｘ２ＥＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１はＮ又はＹであり、Ｘ２はＬ、Ｒ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＱ又はＳ（配列番号：２１１）であるＨＶＲ−Ｌ２；（ｉｉｉ）ＱＱＮＮＥＸ１ＰＸ２Ｔを含んでなるＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１はＤ又はＥであり、そしてＸ２はＦ又はＹ（配列番号：２１２）であるＨＶＲ−Ｌ３；（ｉｖ）ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＹＧＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｈ１であって、Ｘ１はＨ又はＶであり、Ｘ２はＲ又はＴであり、Ｘ３はＦ、Ｇ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＤ、Ｇ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、そしてＸ５はＭ又はＹ（配列番号：２１３）であるＨＶＲ−Ｈ１；（ｖ）ＧＷＩＮＸ１Ｘ２ＳＧＶＰＴＸ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２であって，Ｘ１はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ２はＨ又はＲであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＤ又はＨであり、Ｘ５はＤ、Ｍ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ６はＦ又はＹであり、Ｘ７はＫ又はＳであり、そしてＸ８はＧ又はＲ(配列番号：２１４）であるＨＶＲ−Ｈ２、及び；（ｖｉ）ＡＸ１ＬＧＳＸ２ＡＶＤＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３であって、Ｘ１はＮ又はＲであり、Ｘ２はＣ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＡ又はＹ（配列番号：２１５）であるＨＶＲ−Ｈ３、からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含んでなる可変ドメインを含んでなる抗ＥＧＦＬ７抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＬ７抗体は、前述のＨＶＲの６つ全てを含む。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：３１及び３７−４３から選択されるアミノ酸配列を含み，ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：３２及び４４−４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：３３及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：３４及び４９−５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：３５及び５８−７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及びＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：３６及び７４−７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｈ１はＥＸ１ＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳを含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２１６）であり；ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ１を含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２１７）であり；ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＸ１ＳＸ２ＤＸ３ＳＸ４Ｘ５ＴＸ６ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＸ７ＣＡＲを含み、Ｘ１はＦ又はＩであり、Ｘ２はＬ又はＲであり、Ｘ３はＮ又はＴであり、Ｘ��はＡ、Ｅ、Ｋ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ５はＮ又はＳであり、Ｘ６はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、そしてＸ７はＦ又はＹ（配列番号：２１８）であり；そしてＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２１９）を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み；ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）を含み；ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＩＳＸ１ＤＮＳＫＮＴＸ２ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲを含み、Ｘ１はＬ又はＲであり、Ｘ２はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、及びＶ（配列番号：２２０）からなる群から選択され；及びＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｌ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）を含み、ＦＲ−Ｌ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）を含み、ＦＲ−Ｌ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）を含み、ＦＲ−Ｌ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２２１）又はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２０４）を含む。 幾つかの実施態様では、軽鎖は、図１５に示される４Ｆ１１．Ｖ１７又は４Ｆ１１．Ｖ２２（配列番号：８２及び８３）の可変ドメイン配列を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は、図１６に示される４Ｆ１１．Ｖ１７又は４Ｆ１１．Ｖ２２（配列番号：８４及び８５）の可変ドメイン配列を含む。幾つかの実施態様では、本発明は、軽鎖が図１５に示される４Ｆ１１．Ｖ１７（配列番号：８２）の可変ドメイン配列を含み、及び重鎖が図１６に示す４Ｆ１１．Ｖ１７  配列番号：８４）の可変ドメイン配列を含む抗体を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、軽鎖が図１５に示される４Ｆ１１．ｖ２２（配列番号：８３）の可変ドメイン配列を含み、及び重鎖が図１６に示す４Ｆ１１．ｖ２２  配列番号：８５）の可変ドメイン配列を含む抗体を提供する。
【０００９】
幾つかの実施態様では、本発明は、（ｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＶＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＩＴＹＬＸ１１を含み、Ｘ１はＬ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＰ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ３はＨ又はＳであり、Ｘ４はＤ又はＱであり、Ｘ５はＧ又はＳであり、Ｘ６はＬ又はＶであり、Ｘ７はＨ又はＰであり、Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ９はＮ、Ｑ又はＳからなる群から選択され、Ｘ１０はＡ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され、そしてＸ１１はＧ又はＨ（配列番号：２２２）であるＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）ＲＶＳＮＸ１Ｘ２Ｓを含み、Ｘ１はＤ又はＲであり、そしてＸ２はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｉ、及びＴ（配列番号：２２３）からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２；（ｉｉｉ）Ｘ１ＱＳＸ２Ｘ３ＶＰＬＴを含み、Ｘ１はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２はＣ又はＴであり、そしてＸ３はＦ又はＨ（配列番号：２２４）であるＨＶＲ−Ｌ３；（ｉｖ）ＧＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４ＹＸ５Ｎを含み、Ｘ１はＮ又はＴであり、Ｘ２はＦ又はＶであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＹ、Ｑ、及びＫからなる群から選択され、そしてＸ５はＩ又はＭ（配列番号：２２５）であるＨＶＲ−Ｈ１；（ｖ）ＧＤＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＨＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含み、Ｘ１はＡ、Ｌ、Ｎ、及びＰからなる群から選択され、Ｘ２はＤ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、Ｘ３はＧ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＧ又はＳであり、Ｘ５はＧ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ６はＧ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ７はＩ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ８はＮ又はＳであり、Ｘ９はＡ、Ｎ、及びＱからなる群から選択され、Ｘ１０はＫ又はＶであり、Ｘ１１はＦ又はＱであり、Ｘ１２はＫ又はＴであり、そしてＸ１３はＧ、Ｈ、Ｒ、及びＳ（配列番号：２２６）からなる群から選択されるであるＨＶＲ−Ｈ２、及び；（ｖｉ）Ｘ１ＲＥＧＶＹＨＸ２ＹＤＤＹＡＸ３ＤＹを含み、Ｘ１はＡ、Ｎ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＤ又はＰであり、そしてＸ３はＭ又はＷ（配列番号：２２７）であるＨＶＲ−Ｈ３、からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つのＨＶＲを含んでなる可変ドメインを含んでなる抗ＥＧＦＬ７抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＬ７抗体は、前述のＨＶＲの６つ全てを含む。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１００及び１０６−１２４から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１０１及び１２５−１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１０２及び１３０−１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１０３及び１４６−１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１０４及び１５４−１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及びＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１０５及び１８８−１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み；ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ１を含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２２８）；ＦＲ−Ｈ３はＲＸ１ＴＸ２ＳＸ３ＤＸ４ＳＸ５Ｘ６ＴＸ７ＹＸ８ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣを含み、Ｘ１はＦ又はＶであり、Ｘ２はＩ又はＬであり、Ｘ３はＬ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ４はＫ又はＮであり、Ｘ５はＫ、Ｎ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ６はＮ又はＳであり、Ｘ７はＡ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され、そしてＸ８はＬ又はＭ（配列番号：２２９）であり；及びＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む。幾つかの実施態様では、重鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み；ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）を含み；ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＩＳＲＤＸ１ＳＫＮＴＸ２ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲを含み、Ｘ１はＮ又はＫであり、そしてＸ２はＡ、Ｌ、及びＶ（配列番号：２３０）からなる群から選択され；及びＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖は以下のフレームワーク配列を含み：ＦＲ−Ｌ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）を含み、ＦＲ−Ｌ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）を含み、ＦＲ−Ｌ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）を含み、ＦＲ−Ｌ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２２１）又はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２０４）を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖は図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６又は１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列を含む（配列番号：１９３及び１９４）。幾つかの実施態様では、重鎖は図２８に示す１８Ｆ７．Ｖ６又は１８Ｆ７Ｖ６Ｋの可変ドメイン配列を含む（配列番号：１９５及び１９６）。幾つかの実施態様では、本発明は、軽鎖が図２７に示す１８Ｆ７．Ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９３）を含み、重鎖が図２８に示す１８Ｆ７．Ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９５）を含む抗体を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、軽鎖が図２７に示す１８Ｆ７．Ｖ６Ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９４）を含み、重鎖が図２８に示す１８Ｆ７．Ｖ６Ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９６）を含む抗体を提供する。
【００１０】
幾つかの実施態様では、本発明は、フレームワーク配列の少なくとも一部がヒト共通フレームワーク配列である抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗体はヒトκサブグループ1共通配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、重鎖ヒトサブグループＩＩＩ共通フレームワーク配列を含む。
幾つかの実施態様では、本発明は、二重特異性抗体である抗ＥＧＦＬ７抗体を提供する。幾つかの実施態様では、該二重特異性抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し、例えばベバシズマブ又はラニビズマブと同じＶＥＧＦエピトープに結合する。
幾つかの実施態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、例えば核酸等を含んで成るベクターを提供する。幾つかの実施態様では、本発明は、核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
幾つかの実施態様では、本発明は、本発明の抗体を含んでなる組成物を提供する。幾つかの実施態様では、組成物は担体を含む。幾つかの実施態様では、組成物は薬剤的組成物である。
幾つかの実施態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を含んでなるベクターを、適切な宿主細胞において発現させることによって抗ＥＧＦＬ７抗体を作り、該抗体を回収するための方法を提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は原核細胞である。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。
【００１１】
幾つかの実施態様では、本発明は、腫瘍、癌、又は細胞増殖性疾患を治療するための方法を提供し、該方法はこのような治療が必要である個体に本発明の抗ＥＧＦＬ７抗体を有効量投与することを含んでなる。幾つかの実施態様では、本発明は、腫瘍、癌、又は細胞増殖性疾患の治療での使用のための抗ＥＧＦＬ７を提供する。幾つかの実施態様では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、及び肝細胞癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、又は肺癌である。幾つかの実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
幾つかの実施態様では、治療は、有効量の第二医薬も含み、抗ＥＧＦＬ７抗体は第一医薬である。幾つかの実施態様では、第二医薬は別の抗体、化学療法剤、細胞障害剤、抗血管新生剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害放射線療法、コルチコステロイド、制吐薬、癌ワクチン、鎮痛剤、又は増殖阻害剤である。幾つかの実施態様では、第二医薬は、例えばベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ抗体である。幾つかの実施態様では、第二医薬は、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前又は後に投与される。幾つかの実施態様では、第二医薬は、抗ＥＧＦＬ７抗体と同時に（concurrently）投与される。
【００１２】
幾つかの実施態様では、本発明は、血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における血管新生を低減又は阻害する方法を提供し、本発明の抗体を被験体に投与することを含んでなり、これにより被験体の血管新生を低減又は阻害する。幾つかの実施態様では、本発明は、血管新生を伴う病理学的状態の治療での使用のための、本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様では、病理学的状態は腫瘍性状態である。幾つかの実施態様では、病理学的状態は、非腫瘍性状態である。幾つかの実施態様では、非腫瘍性状態は、糖尿病、及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される。
【００１３】
幾つかの実施態様では、本発明は、血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における抗血管新生剤の効率を増強する方法を提供し、有効量の本発明の抗体を抗血管新生剤と併用して被験体に投与することを含んでなり、これにより前記抗血管新生剤の阻害活性を増強する。幾つかの実施態様では、本発明は、血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における抗血管新生剤の効率を増強する際における使用のための、本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様では、血管新生を伴う病理学的状態は、腫瘍、癌、又は細胞増殖性疾患である。幾つかの実施態様では、血管新生を伴う病理学的状態は、非腫瘍性状態である。幾つかの実施態様では、非腫瘍性状態は、糖尿病、及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前又は後に投与される。幾つかの実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＥＧＦＬ７抗体と併用して投与される。幾つかの実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ剤であり、抗ＶＥＧＦ抗体であり、例えばベバシズマブ又はラニビズマブである。
幾つかの実施態様では、本発明は、被験体における腫瘍のパーフュージョン（perfusion）及び透過性を低減又は阻害する方法を提供し、本発明の抗体を被験体に投与することを含んでなる。幾つかの実施態様では、本発明は、被験体における腫瘍のパーフュージョン及び透過性を低減又は阻害する際における使用のための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様では、該方法又は使用は、例えば抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ抗体）等の抗血管新生剤を投与することを更に含む。
本発明は、例えば、以下の実施態様を提供する。
実施態様１
(i)  ＫＸ１ＳＸ２ＳＸ３ＤＹＸ４ＧＤＳＹＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１はＡ又はＲであり；Ｘ２はＨ又はＱであり、Ｘ３はＧ又はＶであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、及びＷからなる群から選択され、そして、Ｘ５はＭ又はＶ（配列番号：２１０）である、ＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) ＧＡＳＸ１Ｘ２ＥＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１はＮ又はＹであり、Ｘ２はＬ、Ｒ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＱ又はＳ（配列番号：２１１）である、ＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)ＱＱＮＮＥＸ１ＰＸ２Ｔを含んでなるＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１はＤ又はＥであり、そしてＸ２はＦ又はＹ（配列番号：２１２）である、ＨＶＲ−Ｌ３、
(iv) ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＹＧＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｈ１であって、Ｘ１はＨ又はＶであり、Ｘ２はＲ又はＴであり、Ｘ３はＦ、Ｇ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＤ、Ｇ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、そしてＸ５はＭ又はＹ（配列番号：２１３）である、ＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  ＧＷＩＮＸ１Ｘ２ＳＧＶＰＴＸ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２であって、Ｘ１はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ２はＨ又はＲであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＤ又はＨであり、Ｘ５はＤ、Ｍ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ６はＦ又はＹであり、Ｘ７はＫ又はＳであり、そしてＸ８はＧ又はＲ(配列番号：２１４）である、ＨＶＲ−Ｈ２、及び、
(vi) ＡＸ１ＬＧＳＸ２ＡＶＤＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３であって、Ｘ１はＮ又はＲであり、Ｘ２はＣ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＡ又はＹ（配列番号：２１５）である、ＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの高頻度可変領域（ＨＶＲ）配列を含んでなる可変ドメインを含んでなる抗ＥＧＦＬ７抗体。
実施態様２
以下の配列、
(i)  ＫＸ１ＳＸ２ＳＸ３ＤＹＸ４ＧＤＳＹＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｌ１であって、Ｘ１はＡ又はＲであり、Ｘ２はＨ又はＱであり、Ｘ３はＧ又はＶであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、及びＷからなる群から選択され、そして、Ｘ５はＭ又はＶ（配列番号：２１０）である、ＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) ＧＡＳＸ１Ｘ２ＥＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２であって、Ｘ１はＮ又はＹであり、Ｘ２はＬ、Ｒ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＱ又はＳ（配列番号：２１１）である、ＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)ＱＱＮＮＥＸ１ＰＸ２Ｔを含んでなるＨＶＲ−Ｌ３であって、Ｘ１はＤ又はＥであり、そしてＸ２はＦ又はＹ（配列番号：２１２）である、ＨＶＲ−Ｌ３、
(iv) ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＹＧＸ５Ｓを含んでなるＨＶＲ−Ｈ１であって、Ｘ１はＨ又はＶであり、Ｘ２はＲ又はＴであり、Ｘ３はＦ、Ｇ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＤ、Ｇ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、そしてＸ５はＭ又はＹ（配列番号：２１３）である、ＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  ＧＷＩＮＸ１Ｘ２ＳＧＶＰＴＸ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２であって、Ｘ１はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ２はＨ又はＲであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＤ又はＨであり、Ｘ５はＤ、Ｍ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ６はＦ又はＹであり、Ｘ７はＫ又はＳであり、そしてＸ８はＧ又はＲ(配列番号：２１４）である、ＨＶＲ−Ｈ２、及び、
(vi) ＡＸ１ＬＧＳＸ２ＡＶＤＸ３を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３であって、Ｘ１はＮ又はＲであり、Ｘ２はＣ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、そしてＸ３はＡ又はＹ（配列番号：２１５）である、ＨＶＲ−Ｈ３
を含む可変ドメインを含んでなる、実施態様１に記載の抗ＥＧＦＬ７抗体。
実施態様３
ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：３１及び３７−４３から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：３２及び４４−４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：３３及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：３４及び４９−５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：３５及び５８−７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及びＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：３６及び７４−７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１又は２に記載の抗体。
実施態様４
重鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｈ１はＥＸ１ＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳを含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２１６）であり、ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ１を含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２１７）であり、ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＸ１ＳＸ２ＤＸ３ＳＸ４Ｘ５ＴＸ６ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＸ７ＣＡＲを含み、Ｘ１はＦ又はＩであり、Ｘ２はＬ又はＲであり、Ｘ３はＮ又はＴであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、Ｋ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ５はＮ又はＳであり、Ｘ６はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、そしてＸ７はＦ又はＹ（配列番号：２１８）であり、そして、ＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２１９）を含む、実施態様１から３の何れか一に記載の抗体。
実施態様５
重鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み、ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）を含み、ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＩＳＸ１ＤＮＳＫＮＴＸ２ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲを含み、Ｘ１はＬ又はＲであり、Ｘ２はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、及びＶ（配列番号：２２０）からなる群から選択され、そして、ＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む、実施態様４に記載の抗体。
実施態様６
軽鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｌ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）を含み、ＦＲ−Ｌ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）を含み、ＦＲ−Ｌ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）を含み、ＦＲ−Ｌ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２２１）又はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２０４）を含む、実施態様４又は５に記載の抗体。
実施態様７
軽鎖が、図１５に示される４Ｆ１１．ｖ１７の可変ドメイン配列（配列番号：８２）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様８
軽鎖が、図１５に示される４Ｆ１１．ｖ２２の可変ドメイン配列（配列番号：８３）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様９
重鎖が、図１６に示される４Ｆ１１．ｖ１７の可変ドメイン配列（配列番号：８４）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様１０
重鎖が、図１６に示される４Ｆ１１．ｖ２２の可変ドメイン配列（配列番号：８５）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様１１
軽鎖が、図１５に示される４Ｆ１１．ｖ１７の可変ドメイン配列（配列番号：８２）を含み、重鎖が、図１６に示される４Ｆ１１．ｖ１７の可変ドメイン配列（配列番号：８４）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様１２
軽鎖が、図１５に示される４Ｆ１１．ｖ２２の可変ドメイン配列（配列番号：８３）を含み、重鎖が、図１６に示される４Ｆ１１．ｖ２２の可変ドメイン配列（配列番号：８５）を含む、実施態様１に記載の抗体。
実施態様１３
フレームワーク配列の少なくとも一部が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、実施態様１から３の何れか一に記載の抗体。
実施態様１４
ヒトκサブグループ１コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施態様１３に記載の抗体。
実施態様１５
重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む、実施態様１３に記載の抗体。
実施態様１６
(i)  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＶＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＩＴＹＬＸ１１を含み、Ｘ１はＬ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＰ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ３はＨ又はＳであり、Ｘ４はＤ又はＱであり、Ｘ５はＧ又はＳであり、Ｘ６はＬ又はＶであり、Ｘ７はＨ又はＰであり、Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ９はＮ、Ｑ又はＳからなる群から選択され、Ｘ１０はＡ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され、そしてＸ１１はＧ又はＨ（配列番号：２２２）である、ＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) ＲＶＳＮＸ１Ｘ２Ｓを含み、Ｘ１はＤ又はＲであり、そしてＸ２はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｉ、及びＴ（配列番号：２２３）からなる群から選択される、ＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)Ｘ１ＱＳＸ２Ｘ３ＶＰＬＴを含み、Ｘ１はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２はＣ又はＴであり、そしてＸ３はＦ又はＨ（配列番号：２２４）である、ＨＶＲ−Ｌ３、
(iv) ＧＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４ＹＸ５Ｎを含み、Ｘ１はＮ又はＴであり、Ｘ２はＦ又はＶであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＹ、Ｑ、及びＫからなる群から選択され、そしてＸ５はＩ又はＭ（配列番号：２２５）である、ＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  ＧＤＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＨＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含み、Ｘ１はＡ、Ｌ、Ｎ、及びＰからなる群から選択され、Ｘ２はＤ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、Ｘ３はＧ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＧ又はＳであり、Ｘ５は  Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ６はＧ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ７はＩ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ８はＮ又はＳであり、Ｘ９はＡ、Ｎ、及びＱからなる群から選択され、Ｘ１０はＫ又はＶであり、Ｘ１１はＦ又はＱであり、Ｘ１２はＫ又はＴであり、そしてＸ１３はＧ、Ｈ、Ｒ、及びＳ（配列番号：２２６）からなる群から選択される、ＨＶＲ−Ｈ２、そして、
(vi) Ｘ１ＲＥＧＶＹＨＸ２ＹＤＤＹＡＸ３ＤＹを含み、Ｘ１はＡ、Ｎ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＤ又はＰであり、そしてＸ３はＭ又はＷ（配列番号：２２７）である、ＨＶＲ−Ｈ３、
からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つのＨＶＲ配列を含む可変ドメインを含んでなる抗ＥＧＦＬ７抗体。
実施態様１７
以下の配列、
(i)  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＶＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＩＴＹＬＸ１１を含み、Ｘ１はＬ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＰ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され、Ｘ３はＨ又はＳであり、Ｘ４はＤ又はＱであり、Ｘ５はＧ又はＳであり、Ｘ６はＬ又はＶであり、Ｘ７はＨ又はＰであり、Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ９はＮ、Ｑ又はＳからなる群から選択され、Ｘ１０はＡ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され、そしてＸ１１はＧ又はＨ（配列番号：２２２）である、ＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) ＲＶＳＮＸ１Ｘ２Ｓを含み、Ｘ１はＤ又はＲであり、そしてＸ２はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｉ、及びＴ（配列番号：２２３）からなる群から選択される、ＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)Ｘ１ＱＳＸ２Ｘ３ＶＰＬＴを含み、Ｘ１はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２はＣ又はＴであり、そしてＸ３はＦ又はＨ（配列番号：２２４）である、ＨＶＲ−Ｌ３、
(iv) ＧＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４ＹＸ５Ｎを含み、Ｘ１はＮ又はＴであり、Ｘ２はＦ又はＶであり、Ｘ３はＩ、Ｍ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＹ、Ｑ、及びＫからなる群から選択され、そしてＸ５はＩ又はＭ（配列番号：２２５）である、ＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  ＧＤＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＨＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含み、Ｘ１はＡ、Ｌ、Ｎ、及びＰからなる群から選択され、Ｘ２はＤ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、Ｘ３はＧ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４はＧ又はＳであり、Ｘ５は  Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ６はＧ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ７はＩ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ８はＮ又はＳであり、Ｘ９はＡ、Ｎ、及びＱからなる群から選択され、Ｘ１０はＫ又はＶであり、Ｘ１１はＦ又はＱであり、Ｘ１２はＫ又はＴであり、そしてＸ１３はＧ、Ｈ、Ｒ、及びＳ（配列番号：２２６）からなる群から選択される、ＨＶＲ−Ｈ２、及び、
(vi) Ｘ１ＲＥＧＶＹＨＸ２ＹＤＤＹＡＸ３ＤＹを含み、Ｘ１はＡ、Ｎ、及びＴからなる群から選択され、Ｘ２はＤ又はＰであり、そしてＸ３はＭ又はＷ（配列番号：２２７）である、ＨＶＲ−Ｈ３
を含む可変ドメインを含んでなる、実施態様１６に記載の抗ＥＧＦＬ７抗体。
実施態様１８
ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１００及び１０６−１２４から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１０１及び１２５−１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１０２及び１３０−１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１０３及び１４６−１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１０４及び１５４−１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及びＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１０５及び１８８−１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１６又は１７に記載の抗体。
実施態様１９
重鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み、ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ１を含み、Ｘ１はＩ又はＶ（配列番号：２２８）であり、ＦＲ−Ｈ３はＲＸ１ＴＸ２ＳＸ３ＤＸ４ＳＸ５Ｘ６ＴＸ７ＹＸ８ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣを含み、Ｘ１はＦ又はＶであり、Ｘ２はＩ又はＬであり、Ｘ３はＬ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ４はＫ又はＮであり、Ｘ５はＫ、Ｎ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され、Ｘ６はＮ又はＳであり、Ｘ７はＡ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され、そしてＸ８はＬ又はＭ（配列番号：２２９）であり、そして、ＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む、実施態様１６から１８の何れか一に記載の抗体。
実施態様２０
重鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含み、ＦＲ−Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）を含み、ＦＲ−Ｈ３はＲＦＴＩＳＲＤＸ１ＳＫＮＴＸ２ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲを含み、Ｘ１はＮ又はＫであり、そしてＸ２はＡ、Ｌ、及びＶ（配列番号：２３０）からなる群から選択され、そして、ＦＲ−Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含む、実施態様１９に記載の抗体。
実施態様２１
軽鎖が以下のフレームワーク配列を含み、ＦＲ−Ｌ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）を含み、ＦＲ−Ｌ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）を含み、ＦＲ−Ｌ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）を含み、ＦＲ−Ｌ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２２１）又はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２０４）を含む、実施態様１９又は２０に記載の抗体。
実施態様２２
軽鎖が、図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９３）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２３
軽鎖が、図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９４）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２４
重鎖が、図２８に示す１８Ｆ７．ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９５）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２５
重鎖が、図２８に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９６）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２６
軽鎖が、図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９３）を含み、重鎖が、図２８に示す１８Ｆ７．ｖ６の可変ドメイン配列（配列番号：１９５）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２７
軽鎖が、図２７に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９４）を含み、重鎖が、図２８に示す１８Ｆ７．ｖ６ｋの可変ドメイン配列（配列番号：１９６）を含む、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２８
フレームワーク配列の少なくとも一部が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、実施態様１６に記載の抗体。
実施態様２９
ヒトκサブグループ１コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施態様２８に記載の抗体。
実施態様３０
重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む、実施態様２８に記載の抗体。
実施態様３１
前記抗体が二重特異性抗体である、実施態様１から３０の何れか一に記載の抗体。
実施態様３２
前記二重特異性抗体が血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する、実施態様３１に記載の二重特異性抗体。
実施態様３３
前記二重特異性抗体がベバシズマブ又はラニビズマブと同じＶＥＧＦエピトープに結合する、実施態様３２に記載の二重特異性抗体。
実施態様３４
実施態様１から３３の何れか一に記載の抗体をコードする核酸。
実施態様３５
実施態様３４に記載の核酸を含むベクター。
実施態様３６
実施態様３４に記載の核酸又は実施態様３５に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施態様３７
実施態様１から３３の何れか一に記載の抗体を含有する組成物。
実施態様３８
組成物が担体を含有する、実施態様３７に記載の組成物。
実施態様３９
薬学的組成物である、実施態様３７又は３８に記載の組成物。
実施態様４０
(a) 実施態様３５に記載のベクターを適切な宿主細胞において発現させ、(b) 抗体を回収することを含む、抗ＥＧＦＬ７抗体の製造方法。  
実施態様４１
宿主細胞が原核生物性である、実施態様４０に記載の方法。
実施態様４２
宿主細胞が真核生物性である、実施態様４０に記載の方法。
実施態様４３
腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患を治療するための方法であって、このような治療が必要である個体に実施態様１から３３の何れか一に記載の抗ＥＧＦＬ７抗体を有効量投与することを含む方法。
実施態様４４
癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵癌及び肝細胞癌からなる群から選択される、実施態様４３に記載の方法。
実施態様４５
癌が乳癌、結腸直腸癌又は肺癌である、実施態様４４に記載の方法。
実施態様４６
細胞増殖性疾患が癌である、実施態様４３に記載の方法。
実施態様４７
さらに、有効量の第二医薬を個体に投与することを含み、このとき抗ＥＧＦＬ７抗体が第一医薬である、実施態様４３から４６の何れか一に記載の抗体。
実施態様４８
第二医薬が、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害性放射線療法、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖阻害性剤である、実施態様４７に記載の方法。
実施態様４９
第二医薬が抗ＶＥＧＦ抗体である、実施態様４８に記載の方法。
実施態様５０
第二医薬がベバシズマブである、実施態様４９に記載の方法。 
実施態様５１
第二医薬が、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前又はその後に投与される、実施態様４７から５０の何れか一に記載の抗体。
実施態様５２
第二医薬が抗ＥＧＦＬ７抗体と同時に投与される、実施態様４７から５０の何れか一に記載の抗体。
実施態様５３
血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における血管新生を低減又は阻害する方法であって、実施態様１から３３の何れか一に記載の抗体を被験体に投与することを含み、これにより被験体の血管新生を低減又は阻害する方法。
実施態様５４
前記病理学的状態が腫瘍性状態である、実施態様５３に記載の方法。
実施態様５５
前記病理学的状態が非腫瘍性状態である、実施態様５３に記載の方法。 
実施態様５６
非腫瘍性状態が、糖尿病及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される、実施態様５５に記載の方法。
実施態様５７
血管新生を伴う病理学的状態を有する被験体における抗血管新生剤の効率を増強する方法であって、有効量の実施態様１から３３の何れか一に記載の抗体を抗血管新生剤と併用して被験体に投与することを含み、これにより前記抗血管新生剤の阻害活性を増強する方法。
実施態様５８
血管新生を伴う病理学的状態が腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患である、実施態様５７に記載の方法。
実施態様５９
血管新生を伴う病理学的状態が非腫瘍性状態である、実施態様５７に記載の方法。
実施態様６０
非腫瘍性状態が、糖尿病及び他の増殖性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、網膜／脈絡叢血管新生からなる群から選択される、実施態様５９に記載の方法。
実施態様６１
前記抗脈管形成剤が、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前又はその後に投与される、実施態様５７から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６２
前記抗脈管形成剤が抗ＥＧＦＬ７抗体と同時に投与される、実施態様５７から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６３
前記抗血管形成剤が抗ＶＥＧＦ薬剤である、実施態様５７から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６４
前記抗ＶＥＧＦ薬剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、実施態様６３に記載の方法。
実施態様６５
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、実施態様６４に記載の方法。
実施態様６６
前記抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、実施態様６４に記載の方法。
実施態様６７
被験体における腫瘍の灌流及び透過性を低減又は阻害する方法であって、実施態様１から３３の何れか一に記載の抗体を被験体に投与することを含み、それによって被検体の腫瘍の灌流及び透過性が低減又は阻害される方法。
実施態様６８
さらに、抗脈管形成剤を投与することを含む、実施態様６７に記載の方法。
実施態様６９
前記抗脈管形成剤が、抗ＥＧＦＬ７抗体の投与の前又はその後に投与される、実施態様６８に記載の方法。
実施態様７０
前記抗脈管形成剤が抗ＥＧＦＬ７抗体と同時に投与される、実施態様６８に記載の方法。
実施態様７１
前記抗血管形成剤が抗ＶＥＧＦ薬剤である、実施態様６７から７０の何れか一に記載の方法。
実施態様７２
前記抗ＶＥＧＦ薬剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、実施態様７１に記載の方法。
実施態様７３
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、実施態様７２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウス(配列番号：１)及びヒト(配列番号：２)のＥＧＦＬ７のアミノ酸配列を表す。ＥＭＩ１、ＥＭＩ２、ＥＧＦ及びコイルドコイルドメインの位置を示す。切断型ＥＧＦＬ７はコイルドコイルドメインを欠いている。ペプチド：ＥＭＩ１(配列番号：３)、ＥＭＩ２(配列番号：４)及びｐ２(配列番号：５)、Ｐ４(配列番号：６)、ｐ５(配列番号：７)及びｐ６(配列番号：８)の配列を下線で示す。
【図２】ヒトカッパＩコンセンサス(配列番号：９)及び４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１０)の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度変異領域を囲みで示す。
【図３】ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス(配列番号：１１)及び４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１２)の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度変異領域を囲みで示す。
【図４】フレームワークＴｏｇｇｌｅライブラリのｔｏｇｇｌｅ位置に用いたオリゴヌクレオチドを表す。４Ｆ１１.ｖ１のＤＮＡ配列及びフレームワークｔｏｇｇｌｅを生成するために用いたオリゴヌクレオチドを示す。また、オリジナル及びいくつかの結果として生じたフレームワークｔｏｇｇｌｅ領域のアミノ酸配列も示す。場合によって、縮重コドンがどのように設計されるかに基づいて、更なるアミノ酸残基が組み込まれた。配列識別番号は、対応する配列(配列番号：１３−２８)の右に括弧で示す。
【図５】ＥＧＦＬ７へのｍｕ４Ｆ１１結合は、ペプチド２(配列番号：５)によってブロックされうるが、オーバーラップするペプチド１又は３(それぞれ配列番号：２９及び３０)又はランダムなコントロールペプチドによってブロックされないことを示す結果を表す。
【図６】マイクロタイタープレートに固定した切断型ＥＧＦＬ７に対する、４Ｆ１１.ｖ１ Ｆａｂを表出するファージの結合を表す。４Ｆ１１.ｖ１ファージの両試料は、ファージ濃度の増加につれて、固定したＥＧＦＬ７への結合増加を示す。コントロールファージは、低いファージ濃度の４Ｆ１１.ｖ１ファージのレベルと類似するバックグラウンド結合を示す。これは非特異的なファージ-ＥＧＦＬ７相互作用がいくらかあることを示唆する。
【図７】遊離アミノ又は遊離チオールによりビオチン化したＥＭＩ２ドメイン又はｐ２ペプチドに対する、４Ｆ１１.ｖ１ Ｆａｂを表出するファージの結合を表す。
【図８】フレームワークＴｏｇｇｌｅの各フレームワーク位置に観察される残基の量を表す。フレームワークＴｏｇｇｌｅの各フレームワーク位置に導入されるアミノ酸を挙げる。
【図９】３つのフレームワーク各々について６つの「単一位置ライブラリ」(ＳＰＬ)各々に観察されるＣＤＲ配列変化を表す。ライブラリは、使用したフレームワーク(４Ｆ１１.ｖ１、４Ｆ１１.ｖ２及び４Ｆ１１.ｖ３)によって分けた。特定のＣＤＲ配列に対する各々のＳＰＬから得た変化を強調する。これらの変化以外のＶＬ及びＶＨ配列は、対応するフレームワークと同一であり、ここに示す。配列識別番号は、対応する配列(配列番号：３１−７７)の右に括弧で示す。二度以上出現する個々の配列に、必ずしも対応する配列識別番号を付していない。
【図１０】限界ライブラリ１及び２の可変軽鎖ドメインに関するフレームワーク及びライブラリ設定を表す。ヒトのカッパＩコンセンサス(配列番号：９)及び４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１０)のアミノ酸配列は、ライブラリ１(配列番号：７８)及びライブラリ２(配列番号：７９)に用いた鋳型と比較して示す。２０のアミノ酸すべてに対してランダムであった位置は、アミノ酸にスラッシュを付して示す。
【図１１】限界ライブラリ１及び２の可変重鎖ドメインに関するフレームワーク及びライブラリ設定を表す。ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス(配列番号：１１)及び４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１２)のアミノ酸配列は、ライブラリ１(配列番号：８０)及びライブラリ２(配列番号：８１)に用いた鋳型と比較して示す。２０のアミノ酸すべてに対してランダムであった位置は、アミノ酸にスラッシュを付して示す。
【図１２】限界ライブラリ１及び２のランダム化した位置に観察される変化の頻度を表す。軽鎖の位置５３及び５４と、重鎖の２９、５２及び９８で選択されるアミノ酸の優先度を示す。任意のアミノ酸の優先度(Sigma)は、ライブラリ内の所定の残基のランダムな偶然の発生を上回る標準偏差の数として報告し、アミノ酸の二項分布を求める。この方法によるスコア付けは、予想されるコドンバイアスと、コンセンサスを構築するときのサンプリング統計学を表す。
【図１３】ヒト化４Ｆ１１変異体による、インビトロでの固定したヒト又はマウスのＥＧＦＬ７へのＨＵＶＥＣ接着の阻害を表す。ＨＵＶＥＣ(２００００細胞／ウェル)を、漸増濃の抗体の存在下で、５μｇ／ｍｌのヒト又はマウスのＥＧＦＬ７にてコートした９６ウェルプレートに接着させた。洗浄後のプレートに接着したままとなった細胞の数を計数し、各ウェルに播いた総細胞の割合として算出した。
【図１４】ヒト化４Ｆ１１変異体による、インビトロでの固定したヒト又はマウスのＥＧＦＬ７へのＨＵＶＥＣ接着の阻害を表す。ＨＵＶＥＣ(２００００細胞／ウェル)を、漸増濃の抗体の存在下で、５μｇ／ｍｌのヒト又はマウスのＥＧＦＬ７にてコートした９６ウェルプレートに接着させた。洗浄後のプレートに接着したままとなった細胞の数を計数し、各ウェルに播いた総細胞の割合として算出した。
【図１５】ヒトカッパＩコンセンサス(配列番号：９)、４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１０)、４Ｆ１１.ｖ１７(配列番号：８２)、及び４Ｆ１１.ｖ２２(配列番号：８３)の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を示す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度可変領域を囲みで示す。
【図１６】ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス(配列番号：１１)、４Ｆ１１.ｖ１(配列番号：１２)、４Ｆ１１.ｖ１７(配列番号：８４)及び４Ｆ１１.ｖ２２(配列番号：８５)の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度可変領域を囲みで示す。
【図１７】ヒトカッパＩコンセンサス(配列番号：９)及び１８Ｆ７−グラフト(配列番号：８６)の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度可変領域を囲みで示す。
【図１８】ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス(配列番号：１１)及び１８Ｆ７−グラフト(配列番号：８７)の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度可変領域を囲みで示す。
【図１９】フレームワークＴｏｇｇｌｅライブラリのｔｏｇｇｌｅ位置に用いたオリゴヌクレオチドを表す。１８Ｆ７−グラフトのＤＮＡ配列及びフレームワークｔｏｇｇｌｅを生成するために用いたオリゴヌクレオチドを示す。また、オリジナル及びいくつかの結果として生じたフレームワークｔｏｇｇｌｅ領域のアミノ酸配列も示す。場合によって、更なるアミノ酸残基が、縮重コドンがどのように設計されたかに基づいて組み込まれた。配列識別番号は、対応する配列(配列番号：８８−９９)の右に括弧で示す。
【図２０】ＥＧＦＬ７に対するｍｕ１８Ｆ７結合は、ＥＭＩ１(配列番号：３)又はペプチドＰ５(配列番号：７)によってブロックされうるが、ペプチドＰ４又はＰ６(それぞれ配列番号：６及び８)によってはブロックされないことを示す結果を表す。ニワトリ胎仔の線維芽細胞は、ＨＡタグ付加完全長ヒトＥＧＦＬ７ ｃＤＮＡを含むプラスミドにて形質移入した。形質移入した細胞から調製される細胞溶解物は、２００倍の過剰な競合ペプチドの存在下で、ｍｕ１８Ｆ７にて免疫沈降した。免疫沈降物は、抗ＨＡ抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。
【図２１】マイクロタイタープレートに固定した切断型ｈｕＥＧＦＬ７に対する、１８Ｆ７−グラフトＦａｂを表出するファージの結合を表す。１８Ｆ７−グラフトファージの両試料は、ファージ濃度の増加につれて、固定したＥＧＦＬ７への結合増加を示す。コントロールファージは、低いファージ濃度の１８Ｆ７−グラフトファージのレベルと類似するバックグラウンド結合を示す。これは非特異的なファージ-ＥＧＦＬ７相互作用がいくらかあることを示唆する。
【図２２】遊離アミノ又は遊離チオールによりビオチン化したＥＭＩ１ドメイン又はｐ５ペプチドに対する、１８Ｆ７−グラフト Ｆａｂを表出するファージの結合を表す。
【図２３】フレームワークＴｏｇｇｌｅの各フレームワーク位置に観察される残基の量を表す。フレームワークＴｏｇｇｌｅの各フレームワーク位置に導入されるアミノ酸を挙げる。
【図２４】３つのフレームワーク各々について６つのＳＰＬ各々に観察されるＣＤＲ配列変化を表す。ライブラリは、用いたフレームワーク(１８Ｆ７−グラフト、１８Ｆ７−Ｋ、１８Ｆ７−ＫＶ及び１８Ｆ７−ＫＡ)によって分けた。特定のＣＤＲ配列に対する各々のＳＰＬから得た変化を強調する。これらの変化以外のＶＬ及びＶＨ配列は、対応するフレームワークと同一であり、ここに示す。配列識別番号は、対応する配列(配列番号：１００−１９２)の右に括弧で示す。二度以上出現する個々の配列に、必ずしも対応する配列識別番号を付していない。
【図２５】ヒト化１８Ｆ７変異体による、インビトロでの固定したヒト又はマウスのＥＧＦＬ７へのＨＵＶＥＣ接着の阻害を表す。ＨＵＶＥＣ(２００００細胞／ウェル)を、漸増濃の抗体の存在下で、５μｇ／ｍｌのヒト又はマウスのＥＧＦＬ７にてコートした９６ウェルプレートに接着させた。洗浄後のプレートに接着したままとなった細胞の数を計数し、各ウェルに播いた総細胞の割合として算出した。
【図２６】ＨＵＶＥＣトランスウェル移動の阻害を表す。ＨＵＶＥＣ(１ウェルにつき５００００細胞)をトランスウェルプレートの上部チャンバ中で１６時間増殖させ、上部チャンバの膜を５μｇ／ｍｌの組換えヒトＥＧＦＬ７タンパク質にてコートした。様々な濃度のコントロール抗体(抗ＩｇＥ)又は１８Ｆ７の異なる変異体を上部及び下部チャンバ中の培養液に加え、一方、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ-１６５を下部ウェルに加えてＨＵＶＥＣ移動を刺激した。上部チャンバの下面に移動した細胞を計数し、治療群(抗体及び濃度)に対してプロットした。
【図２７】ヒトカッパＩコンセンサス(配列番号：９)、１８Ｆ７.ｖ６(配列番号：１９３)、及び１８Ｆ７.ｖ６ｋ(配列番号：１９４)の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度変異領域を囲みで示す。１８Ｆ７.ｖ６ｋの配列を示さない場合(アライメントの第二及び第三の一部)、対応する配列は１８Ｆ７.ｖ６の配列と同一である。
【図２８】ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス(配列番号：１１)、１８Ｆ７.ｖ６(配列番号：１９５)及び１８Ｆ７.ｖ６ｋ(配列番号：１９６)の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を表す。位置はカバットに従って番号付けし、高頻度変異領域を囲みで示す。１８Ｆ７.ｖ６ｋの配列を示さない場合(アライメントの第二及び第三の一部)、対応する配列は１８Ｆ７.ｖ６の配列と同一である。
【図２９】ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ単独及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋと抗ＶＥＧＦ抗体との併用を用いたＨ１２９９異種移植片腫瘍増殖の阻害を表す。
【図３０】ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ単独及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋと抗ＶＥＧＦ抗体との併用を用いたＬＸＦＬ１６７４異種移植片腫瘍増殖の阻害を表す。
【図３１】ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ単独及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋと抗ＶＥＧＦ抗体との併用を用いた新生仔脈管化の阻害を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
【００１６】
本発明は、抗ＥＧＦＬ７抗体の方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
これら方法、組成物、キット及び製造品の詳細をここに示す。
【００１７】
一般的な技術
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
【００１８】
定義
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)ローリー法で測定した場合９５％を超える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００１９】
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「抗ＥＧＦＬ７抗体」又は「ＥＧＦＬ７に結合する抗体」なる用語は、ＥＧＦＬ７を標的とする診断用薬及び／又は治療剤として有用である、十分な親和性でＥＧＦＬ７に結合することが可能である抗体を意味する。ある実施態様では、ＥＧＦＬ７に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００２０】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【００２１】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScintＴＭ-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００２２】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組換えベクター」又は「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００２３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００２４】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００２５】
本願明細書において用いられるように、「ＥＧＦＬ７」なる用語(「ＥＧＦ様ドメイン、multiple７」なる用語と交換可能)は、特別に又は文脈上別途示されない限り、任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＥＧＦＬ７ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、特に天然に生じる切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「野生型ＥＧＦＬ７」なる用語は、一般に、天然に生じるＥＧＦＬ７タンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＥＧＦＬ７配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＥＧＦＬ７においてみられるアミノ酸配列を指す。
【００２６】
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００２７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域又は高頻度可変領域(ＣＤＲ又はＨＶＲ、ここでは互換的に使用される)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００２８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００２９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のＦｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Ｆｖ種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００３０】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３１】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００３２】
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００３３】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット    ＡｂＭ      Chothia     接触
L1      L24-L34     L24-L34     L26-L32     L30-L36
L2      L50-L56     L50-L56     L50-L52     L46-L55
L3      L89-L97     L89-L97     L91-L96     L89-L96
H1      H31-H35B    H26-H35B    H26-H32     H30-H35B  (カバット番号付け)
H1      H31-H35     H26-H35     H26-H32     H30-H35   (Chothia番号付け)
H2      H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58
H3      H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101
【００３４】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３５】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また例としてVaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号も参照のこと。
【００３６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
【００３７】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
【００３８】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合できる既定の抗原である。標的抗原はポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の自然に生じる又は合成化合物である。
【００３９】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００４０】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００４１】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
カバット番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基を指す場合に用いられる(軽鎖のおよそ残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３)(例えばKabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、イムノグロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる(例えば上掲のKabat et al.において報告されたＥＵインデックス)。「カバットにおけるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けする残基を意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する(例えば、米国特許仮出願第６０／６４０３２３のＥＵ番号付けに関する図を参照のこと)。
「ブロック(遮断)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。あるブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的ないしは完全に阻害する。
【００４２】
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に低減する」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
【００４３】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中の定義に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
【００４４】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の配列同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【００４５】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)を結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 例としてRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。今後同定されるものも含め、他のＦｃＲも本明細書中の「ＦｃＲ」なる用語に包含される。
【００４６】
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)：国際公開２００４／９２２１９(Hinton et al.)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００４７】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００４８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号又は同第６７３７０５６号(Presta)に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００４９】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更して(変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド)Ｃ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、例として米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００５０】
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合を包含しうる。
【００５１】
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５以下及び好ましくは４以下、又は３以下の、既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみ起こり、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００５２】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
【００５３】
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部又は全部を含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）-Ｈ１-ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）-Ｈ２-ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号：１９９-Ｈ３-ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）。
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）-Ｌ１-ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）-Ｌ２-ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）-Ｌ３-ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２２１）。
【００５４】
「生体試料」(「試料」又は「組織ないし細胞試料」と交換可能に称される)は、個体から入手した様々な種類の試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに用いられうる。この定義には、血液及び生体起源の他の液体試料、生検標本や組織培養物やそれらに由来する細胞などの固形組織試料、及びこれらのプロジェニーが包含される。また、この定義には、入手後何らかの方法、例えば試薬で処理する、可溶化する、又はタンパク質やポリヌクレオチドなどの特定の成分について濃縮する、又は切片化のために半流動性基質ないしは固形基質に包埋することによって操作してある試料が含まれる。「生体試料」なる用語は臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清物、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又は血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。いくつかの実施態様では、生体試料は原発性腫瘍又は転移性腫瘍から得られる。生体試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【００５５】
本明細書中の組織試料の「切断部分」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。組織試料の複数の切断部分は採取され、本発明の分析に供されうることが理解される。いくつかの実施態様では、組織試料の同じ切断部分は形態学的及び分子的レベルで分析されるか、タンパク質及び核酸の両方に関して分析される方法を含む。
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
「医薬」とは、問題としている疾病又はそれ症状又は副作用を治療するための活性薬物である。
【００５６】
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
【００５７】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、下垂体癌、食道癌、星状細胞腫、軟組織肉腫、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮体癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢カルチノーマ、胃癌、メラノーマ、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。血管新生の調節不全により、本発明の組成物及び方法により治療されうる多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性及び腫瘍性の両方の状態が含まれる。腫瘍性状態には上記のものが含まれるが、これに限定されるものではない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖的な網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、角度(ルベオーシス)の血管新生、眼性新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性の炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化(myositis)、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)の第３の間隔、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、出血性関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)及び胸水が含まれる。
【００５８】
「萎縮性(wasting)」疾患(例えば萎縮性症候群、カヘキシ、筋肉減少症)なる用語は、体重の望ましくない及び／又は不健康な喪失又は体細胞量の喪失によって生じる疾患を指す。年配者並びにエイズ及び癌患者では、萎縮性疾患により、脂肪部位及び除脂肪部位を含む体重が不要に喪失する。萎縮性疾患は、不十分な摂食量及び／又は疾患及び／又は加齢に関連する代謝の変化の結果でありうる。癌患者及びＡＩＤＳ患者、並びに広範囲な外科手術後の患者又は慢性感染症、免疫疾患、甲状腺機能亢進症、クローン病、心因性疾患、慢性心不全ないしは他の重篤な外傷を有する患者は、しばしば、カヘキシ、代謝性疾患、及び時には摂食障害とも称されることが多い萎縮性疾患を患う。カヘキシは、さらに代謝亢進及び異化亢進に特徴がある。カヘキシ及び萎縮性疾患は萎縮性状態を指すために相互に交換可能に用いられることが多いが、除脂肪体重、特に体細胞量の喪失などの少なくとも一の体重調査によりカヘキシを萎縮性症候群から区別する(Mayer, J. Nutr. 129(1S Suppl.): 256S-59S (1999))。老化個体に影響しうる他の疾患としての筋肉減少症は、一般的に筋肉量の喪失に特徴がある。上記の末期萎縮性疾患は、カヘキシ又は筋肉減少症を患う個体で発達しうる。
【００５９】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
【００６０】
「抗血管形成剤」又は「血管形成(血管新生)インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義したように血管形成剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)／ＳＵ１１２４８(sunitinib malate)、ＡＭＧ７０６)である。また、抗血管形成剤には、天然の血管形成インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例えば、Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179(例えば、悪性メラノーマにおける抗血管形成療法の一覧を示す表３)；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364；Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556(例えば、抗血管形成因子の一覧を示す表２)；及び、Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206(例えば、臨床試験において使用される抗血管形成剤の一覧を示す表１)を参照のこと。
「個体」、「被検体」、又は「患者」とは脊椎動物である。ある実施態様では、脊椎動物は哺乳類動物である。哺乳類動物は、家畜（例えば、牛）、スポーツアニマル、ペット（例えば、猫、犬、馬）、霊長類、マウス、及びラットを含むがこれに限らない。ある実施態様では、哺乳類動物はヒトである。
【００６１】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回る量を包含する。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００６２】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞の破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な影響を有する任意の物質である。
【００６３】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、��ソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)及びドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシスプ��チン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロネート(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロネート(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)(例えばエルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))；及び細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリホシン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；ティピファニブ(Ｒ１１５７７)；オラフェニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２インヒビター、例えばオブリメルセンナトリウム(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲインヒビター（下記定義を参照）；チロシンキナーゼインヒビター（下記定義を参照）；セリン-スレオニンキナーゼインヒビター、例えばラパマイシン(シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標))；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、例えばロナファーニブ(ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
【００６４】
本明細書中に定義される化学療法剤には、癌の成長を促しうるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働く、「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが：タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標))、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３等の選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）を含むアゴニスト／アンタゴニスト混合プロファイルを有する抗エストロゲン；アゴニスト特性の無い純抗エストロゲン、例えばフルベストラント(fulvestrant)（ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))及びＥＭ８００（このような薬剤はエストロゲンレセプター（ＥＲ）二量化をブロック、ＤＮＡ結合を阻害、ＥＲターンオーバーを増加、及び／又はＥＲレベルを抑制し得る）；アロマターゼ阻害剤、ホルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））等のステロイド性アロマターゼ阻害剤、及びアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミド等の非ステロイド性アロマターゼ阻害剤を含み、及び他のアロマターゼ阻害剤はボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、メゲストロール酢酸エステル（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）−イミダゾールを含む；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリンを含む；性ステロイド、メゲストロール酢酸エステル及びメドロキシプロゲステロン酢酸エステル等のプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリン等のエストロゲン、及びフルオキシメステロン、オールトランスレチノイン酸（all transretionic acid）及びフェンレチニド等のアンドロゲン／レチノイドを含む；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤｓ）；フルタミド、ニルタミド、及びビカルタミド等の抗アンドロゲン；及び上記のものの何れかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体；並びに上記のものの２又は複数の組合せが含まれる。
【００６５】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞（例えば、ＥＧＦＬ７を発現している細胞）の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。従って、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞（例えばＥＧＦＬ７を発現している細胞）の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、例えば１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００６６】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００６７】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシン(下記の定義を参照)のようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド集団、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合集団を包含しうる。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、言及された整数又は整数組を含むが、他の整数又は整数の組を除外するものではないことを理解されたい。
【００６８】
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損を示す変異体抗体の生成
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損は、適切な治療薬の臨床開発の重要な態様である。例として、Khaxzaeli 等, J. Natl. Cancer Inst., 80:937 (1988)、Jaffers 等, Transplantation, 41:572 (1986)、Shawler 等, J. Immunol., 135:1530 (1985)、Sears 等, J. Biol. Response Mod., 3:138 (1984)、Miller 等, Blood, 62:988 (1983)、Hakimi 等, J. Immunol., 147:1352 (1991)、Reichmann 等, Nature, 332:323 (1988)、Junghans 等, Cancer Res., 50:1495 (1990)を参照。本明細書において、本発明は、ＨＡＭＡ応答が減弱されるか又は欠損されるようにヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変異体がさらに、当分野で公知の慣例的な方法を使用して得られてもよい。その方法のいくつかを後述する。
【００６９】
例えば、本明細書において記述されるように、抗体のアミノ酸配列はフレームワーク及び／又は超可変配列（一又は複数）を多様化させるために開始（親）配列として働きうる。開始超可変配列が連結される選択されたフレームワーク配列は、本明細書において、アクセプターヒトフレームワークと称する。アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン（そのＶＬ及び／又はＶＨ領域）のものかあるいはそれに由来するものであってよいが、好ましくはヒトコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものであり、これはそのようなフレームワークがヒト患者においてごく小さい免疫原性あるいは全く免疫原性を示さないことが証明されているためである。
【００７０】
アクセプターがヒト免疫グロブリンから得られる場合、場合によっては、ドナーフレームワーク配列を一まとまりのヒトフレームワーク配列の様々なヒトフレームワーク配列に合わせること、及びアクセプターとして最も相同性のあるフレームワーク配列を選択することによって、ドナーフレームワーク配列に対するその相同性に基づくヒトフレームワーク配列を選択してもよい。
【００７１】
一実施態様では、本明細書中のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループＩＩＩ及び／又はＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものである。
【００７２】
故に、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含有してなるＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（配列番号：１９８）を含有してなるＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＸ１ＤＸ２ＳＫＮＴＸ３ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号：２０５）を含有してなり、Ｘ１はＡ又はＲ、ＸはＴ又はＮ、及びＸ３はＡ又はＬであるＦＲ３、及び
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含有してなるＦＲ４。
一実施態様では、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有する：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：１９７）を含有してなるＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号：１９８）を含有してなるＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号：２３１）、ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号：２０６）、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：２０７）、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳ（配列番号：２０８）、又は
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲ（配列番号：２０９）を含有してなるＦＲ３、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２００）を含有してなるＦＲ４。
【００７３】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：２０１）を含有してなるＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号：２０２）を含有してなるＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２０３）を含有してなるＦＲ３、及び
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２２１）を含有してなるＦＲ４。
【００７４】
アクセプターが、ヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワークからのものか否かにかかわらず、配列において、選択されたヒトフレームワーク配列と同一でもよい一方で、本発明では、アクセプター配列はヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に関して既存のアミノ酸置換を含有しうると考えられる。これらの既存の置換は、ヒト免疫グロブリン配列又はコンセンサスに関して、最小限、通常、４つ、３つ、２つ又は一つだけのアミノ酸の相違であることが好ましい。
【００７５】
超可変領域残基は、ＶＬ及び／又はＶＨアクセプターヒトフレームワークに組込まれる。例えば、ＫａｂａｔＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基、ＡｂＭ残基、及び／又は接触残基に対応する残基を組込んでもよい。場合によって、以下のような伸展したＣＤＲ領域残基が組み込まれる：２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。
【００７６】
超可変領域残基の「組込み」がここに記載されているが、様々な方法で達成可能であり、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、そのフレームワーク残基がアクセプターヒトフレームワーク残基に変化するようにマウス可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、又は、超可変領域残基が非ヒト残基に変化するようにヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、又は、所望の配列をコードする核酸を合成することによってなどして生成できる。
【００７７】
ここに記載される実施例では、超可変領域グラフト変異体は、各ＣＤＲについて別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法により生成された。Kunkel 等, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)。慣例的な技術を用いてフレームワーク及び／又は超可変領域の中に適当な変異を導入して、適正な超可変領域-抗原相互作用を修正及び再確立できる。
【００７８】
ファージ（ファジミド）ディスプレイ（また本明細書中ではファージディスプレイとも称する）は、配列のランダム化により生成されたライブラリ中の、多くの異なる潜在的な変異体抗体の生成及びスクリーニングのための簡便で迅速な方法として用いることができる。しかしながら、変更された抗体の作製及びスクリーニングのための他の方法も当業者に有用である。
【００７９】
ファージ（ファジミド）ディスプレイ技術は、抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成して選別するための強力な手段を提供している。ファージ（ファジミド）ディスプレイ技術を用いると、高い親和性で標的分子と結合する配列について迅速に選別できるタンパク質変異体の大きなライブラリを生成できる。変異体ポリペプチドをコードする核酸は、通常、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質などのウィルスコートタンパク質をコードする核酸配列に融合する。タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合されている一価性ファジミドディスプレイシステムが開発されている。（Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)、Lowman及びWells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)）。一価性ファジミドディスプレイシステムにおいて、遺伝子融合は低レベルで発現され、粒子の感染力が保持されるように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現される。ペプチドライブラリを生成する方法及びそれらのライブラリのスクリーニング方法は、多くの特許に開示されている（例えば米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、及び同第５４９８５３０号）。
【００８０】
抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入することによって、単一遺伝子を変更すること、又は、関連した遺伝子のファミリをクローニングすることなどを含む、多くの方法により調製されている。ファージ（ファジミド）ディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片のディスプレイ方法は、米国特許第５７５０３７３号、同第５７３３７４３号、同第５８３７２４２号、同第５９６９１０８号、同第６１７２１９７号、同第５５８０７１７号、及び同第５６５８７２７号に記述されている。次いでライブラリは、所望の特徴を有する抗原結合タンパク質又は抗体の発現についてスクリーニングされる。
鋳型核酸に選択のアミノ酸を置換する方法は当分野で確立されており、その内いくつかがここに記載されている。例えば、超可変領域残基は、Kunkel method. See, e.g., Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)を使用して置換されることが出来る。
【００８１】
オリゴヌクレオチド配列は、変更する超可変領域残基の一又は複数の設計されたコドンセットを含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、ＩＵＢコードによって以下に示すように、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの等モル混合物を示す符号を使って表される。
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（Ａ又はＧ）
Ｙ（Ｃ又はＴ）
Ｍ（Ａ又はＣ）
Ｋ（Ｇ又はＴ）
Ｓ（Ｃ又はＧ）
Ｗ（Ａ又はＴ）
Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ）
Ｂ（Ｃ又はＧ又はＴ）
Ｖ（Ａ又はＣ又はＧ）
Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ）
Ｎ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）
【００８２】
例えば、コドンセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡ又はＧ又はＴであり；ＶはＡ又はＧ又はＣであり；ＫはＧ又はＴであってよい。このコドンセットは１８の異なるコドンを示し、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ及びＣｙｓをコードする。
【００８３】
オリゴヌクレオチド又はプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての可能な組合せを表し且つ所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、又は市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本明細書中で使用されるように、本発明に従い使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメインの核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００８４】
一つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、オリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はZoller等, Nucleic Acids Res.10:6487-6504 (1987)が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、所望の制限コドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変領域核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の完全二次相補鎖を合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを組込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供される制限コドンセットを含むようになる。
【００８５】
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチド（一又は複数）の片側が鋳型と完全に相補性である少なくとも１２から１５個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばCrea等, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA, 75:5765 (1978)に記載の手法を使って容易に合成される。
【００８６】
ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当）に由来するベクター、又はViera等, Meth.Enzymol., 153:3 (1987)に記載の一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの一つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等, 上掲のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【００８７】
天然のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡ重合酵素、例えば、通常はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの一つの鎖が遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元の鋳型）が遺伝子１の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２Ｐリン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
【００８８】
直前で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物を鋳型-オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成される。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ-（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ又は別の適当なヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使って形成される。このホモ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
【００８９】
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは、鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、又はViera等（Meth.Enzymol., 153:3 (1987)）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成できる。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの一つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等, 上掲のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【００９０】
別の方法によると、ライブラリは上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持ち、異なる配列はオリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立される。上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いてＰＣＲ産物の「ライブラリ」を作製することができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、又は無関係な核酸配列、例えばウィルスのコートタンパク質及び二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
【００９１】
ＰＣＲプライマー配列は、超可変領域において溶媒に露出し且つ非常に多様な位置に一又は複数の設計コドンセットを含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
【００９２】
標準的な組み換え技術を用いて、好適なスクリーニング／選別工程を介して選択された、所望の基準を満たす抗体選択物を単離してクローニングすることができる。
【００９３】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素的消化によって、あるいは組換え法によって生産することができる。ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さなサイズの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。ある種の抗体断片の概説については、Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照のこと。
【００９４】
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。ある実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されうる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００９５】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を含む。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が従来技術に既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、一般に「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９６】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖いずれも、抗原性を減らすために重要である。いわゆる「最良に適合する(ベストフィット)」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。ついで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(例としてSims等(1993)J. Immunol. 151:2296；Chothia等(1987)J. Mol. Biol. 196:901を参照)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用することができる。例としてCarter等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等(1993)J. Immunol., 151:2623を参照。
【００９７】
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、ありそうな三次元立体配置的構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的に且つ最も実質的に関わっている。
【００９８】
ヒト抗体
本発明のヒト抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
【００９９】
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の投与によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)；Bruggermann等, Year in Immunol., 7: 33 (1993)を参照のこと。
【０１００】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖パートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照）。伝統的なＨＶＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＨＶＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０１０１】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一つはＥＧＦＬ７に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある実施多様では、他の抗原は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、例えば抗体ベバシズマブ及びラニビズマブによって結合されるエピトープである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、本発明の抗体のＨＶＲ配列を含んでなる第一アーム、及びベバシズマブ又はラニビズマブのＨＶＲ配列を含んでなる第二アームを持つ。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列を含む。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＥＧＦＬ７の２つの異なるエピトープに結合しうる。ある実施態様では、二重特異性抗体はＥＧＦＬ７を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＥＧＦＬ７結合アーム及び細胞傷害剤、例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテンと結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１０２】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１０３】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある実施態様では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させる。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０４】
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１０５】
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１０６】
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
【０１０７】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１０８】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳房腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１０９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１１０】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１１１】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。ある実施態様では、二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオでは、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ある実施態様では、多価抗体は３から約８の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。かかる一実施態様では、多価抗体は４つの抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここでの多価抗体は、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここでの多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。ここで考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはＣＬドメインを更に含む。
【０１１２】
単一ドメイン抗体
ある実施態様では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
【０１１３】
抗体変異体
ある実施態様では、ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列中に導入されうる。
【０１１４】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に開示されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１１５】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
【０１１６】
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増加又は減少させるために改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
【０１１７】
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)の一又は複数が作製され又は取り除かれるように変化させることによって簡便に達成される。該変化はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、欠失、又は置換によってなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【０１１８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変更してもよい。哺乳動物細胞によって生産される天然の抗体は典型的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合させられる分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」としてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含みうる。ある実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾を、ある種の改善された性質を有する抗体を作り出すためになしてもよい。
【０１１９】
例えば、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する抗体変異体が提供される。かかる変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業）を参照のこと。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体変異体に関する文献の例には以下のものが含まれる：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコシル化欠損Ｌｅｃ１３  ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願番号２００３／０１５７１０８号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８，ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号)などがある。
【０１２０】
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。かかる抗体変異体は低減したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。かかる抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体もまた提供される。かかる抗体変異体は、例えば国際公開第９７／３００８７号（Patel等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１２１】
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを更に改善する一又は複数のアミン酸置換を含むＦｃ領域を含み、例えばＦｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥｕ番号付け）の置換である。かかる置換は上述の変異の何れかとの組合せで起こりうる。
【０１２２】
ある実施態様では、本発明は、これをインビボでの抗体の半減期が重要であるがある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）が不必要であるか有害である多くの用途のための望ましい候補にする、エフェクター機能の全てではないが幾らかを有する抗体変異体を考慮する。ある実施態様では、所望の性質のみが維持されるようにする抗体のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認できる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（よってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞のＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現がRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３にまとめられている。興味ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及び Hellstrom, I 等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号(Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えばフローサイトメトリーのためのACTITM非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ (Promega, Madison, WI)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、興味ある分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばClynes等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA  95:652-656 (1998)に開示されているもののような動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイをまた実施して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定はまた当該分野で知られている方法を使用して実施することもできる(例えばPetkova, S.B. 等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
【０１２３】
一又は複数のアミノ酸置換を有する他の抗体が提供される。置換突然変異について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。「例示的置換」と名前を付けたより実質的な変化が「アミノ酸置換表」に提供され、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載される。アミノ酸置換を、興味有る抗体中に導入し、例えば所望される活性、例えば改善された抗原結合性、免疫原性の低減、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ等について生成物をスクリーニングできる。
【０１２４】
0005383905.tif 000002
【０１２５】
抗体の生物学的性質における修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成されうる。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）無極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１２６】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基も、保存的置換部位か、更に好ましくは残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
【０１２７】
一つの種類の置換による変異体は、親抗体(例えばヒト化抗体又はヒト抗体)の一以上の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる開発用に選択される得られた変異体は、それらが生産された親抗体に対して変更された（例えば改善された）生物学的特性を有しているであろう。例示的な置換変異体は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟法を使用して簡便に生産されうる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６〜７の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状のファージ粒子から表示される。ついで、ファージディスプレイされた変異体は、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、系統的変異導入法(例えばアラニンスキャニング)を行って、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに説明するものを含む当該分野で知られている技術による置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されたら、ここに記載のものを含む当該分野で知られている技術を用いて変異体パネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一又は複数の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を選択することができる。
【０１２８】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明の抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一以上のアミノ酸位置に一のアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域)を含みうる。
【０１３０】
本明細書及び従来技術の教示によれば、ある実施態様では、本発明の抗体は、対応する野生型の抗体と比較した場合、例えばＦｃ領域内に、一又は複数の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体は、その野生型の同等物と比較した場合、治療的有効性に必要なほぼ同一の特性を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号等に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)に変化(つまり効果の改善又は低減)をもたらす特定の変更を実施することが考慮される。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関し、Ducan及びWinter, Nature 322:738-40 (1998)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。国際公開第００／４２０７２号(Presta)及び国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman)はＦｃＲへの結合が改善された又は低減された抗体変異体を記載している。またShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。増加した半減期と新生児型Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が改善された抗体は、母体ＩｇＧの胎児への移動の原因であるが(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号(Hinton等)に記載されている。これらの抗体はＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸と増加又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。またIdusogie等, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【０１３１】
他の態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含み、該修飾がヘテロ二量体化を容易にし及び／又は促進するむ抗体を提供する。これらの修飾は、第一のＦｃポリペプチド内に突部を、第二のＦｃポリペプチド内にキャビティを導入することを含み、ここで、第一及び第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するように突部がキャビティに位置させ得る。これらの修飾を有する抗体の生産方法は当該分野で知られており、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている。
【０１３２】
また他の態様では、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は抗体の接近可能部位で生じる。その残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に位置させられ、ここで更に記載されるように、薬剤部分又はリンカー-薬剤部分のような他の部分に抗体をコンジュゲートさせるために使用されうる。ある実施態様では、次の残基の何れか一又は複数がシステインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。
【０１３３】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１３４】
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
【０１３５】
活性のアッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。
ある態様では、アッセイが、生物学的活性を有する抗ＥＧＦＬ７抗体を識別するために提供される。生物学的活性は、例えば、ＥＧＦＬ７が関与する効果の一又は複数の態様の調節を含み、限定はされないが、ＥＧＦＬ７結合、低酸素ストレスにおける内皮細胞のＥＧＦＬ７介在による保護、及び内皮細胞接着を仲介するＥＧＦＬ７の能力を含む。
【０１３６】
本発明の特定の実施態様では、本明細書で生産された免疫グロブリンは、その生物学的活性について分析される。いくつかの実施態様では、本発明の免疫グロブリンは、その抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。実例となる抗原結合アッセイが下記の実施例セクションに提供されている。
【０１３７】
精製された抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ、及びパパイン消化を含む一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。
【０１３８】
幾つかの実施態様では、本発明は全てではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体について考察し、このことによって、該抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であるがある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要又は有害な多くの用途の望ましい候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性のみが維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（つまり、おそらくＡＤＣＣ活性を欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣをもたらす第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
幾つかの実施態様では、本発明は、増加されたエフェクター機能及び／又は増加された半減期を有する、変更された抗体を提供する。
【０１３９】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
【０１４０】
a. 原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
【０１４１】
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０１４２】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
【０１４３】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０１４４】
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１４５】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
【０１４６】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１４７】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０１４８】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC（登録商標）31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC（登録商標）31,537)及び大腸菌RV308(ATCC（登録商標）31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１４９】
ii. 抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
【０１５０】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０１５１】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
【０１５２】
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１５３】
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【０１５４】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０１５５】
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０１５６】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１５７】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０１５８】
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０１５９】
iii. 抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex（登録商標）G-75を用いたゲル濾過法。
【０１６０】
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
【０１６１】
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１６２】
b. 真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
【０１６３】
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
【０１６４】
(ii) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０１６５】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１６６】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC（登録商標）CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１６７】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ（配列番号：２３２）領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ（配列番号：２３３）配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０１６８】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１６９】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１７０】
(vi) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１７１】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１７２】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１７３】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１７４】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０１７５】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含んで成る、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
【０１７６】
イムノコンジュゲートは、癌の治療において、細胞障害剤、つまり細胞の成長又は増殖を殺す又は阻害する薬剤の局所的運搬のために使用されてきた（Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu 等 (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; 米国特許第４９７５２７８号）。イムノコンジュゲートは、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能とし、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体双方がこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１７７】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃、及び他の癌などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１７８】
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体及び化学療法剤又は他の毒素を含む。免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１７９】
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０１８０】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235 B1号に開示されている。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１８１】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０１８２】
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【０１８３】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１８４】
アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。
【０１８５】
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784；２００４年１１月５日出願の、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、米国特許出願番号１０／９８３３４０(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)も参照のこと。
【０１８６】
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１８７】
他の細胞障害剤
抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
【０１８８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１８９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第5208020号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【０１９０】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。
【０１９１】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０１９２】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
【０１９３】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第5362852号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０１９４】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１９５】
薬剤的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９６】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１９７】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１９８】
用途
本発明の抗体は、例えばインビトロ、エクスビボ、及びインビボ治療法において使用され得る。
本発明は、例えば、増加した発現及び／又は活性又は望まない発現及び／又は活性等の、ＥＧＦＬ７の発現及び／又は活性に伴う疾病状態を調節するために有用な方法及び組成物を提供し、前記方法は、このような治療が必要である個体に有効量の抗ＥＧＦＬ抗体を投与することを含んでなる。
一態様では、本発明は、腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患を治療又は防止するための方法を提供し、該方法は、このような治療が必要である個体に有効量の抗ＥＧＦＬ抗体を投与することを含んでなる。
一態様では、本発明は、血管形成を阻害するための方法を提供し、該方法は、このような治療が必要である個体に有効量の抗ＥＧＦＬ抗体を投与することを含んでなる。
一態様では、本発明は別の抗血管新生剤の効果を増強するための方法を提供し、該方法は、このような治療が必要である個体に有効量の抗ＥＧＦＬ抗体を投与することを含んでなる。幾つかの実施態様では、個体は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患を有する。幾つかの実施態様では、他の抗血管新生剤はＶＥＧＦを標的とし、例えば抗ＶＥＧＦ抗体等である。
治療の方法において、何れの適切な抗ＥＧＦＬ７抗体が使用されてもよいことが理解され、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、及び／又は抗体断片を含む。幾つかの実施態様では、ここに記載される何れの抗ＥＧＦＬ７抗体が治療のために使用される。
【０１９９】
ここに記載される何れの方法のおいて、治療を必要とする被験体の状態を治療することが可能な別の活性剤である第二の医薬（本明細書の抗体は第一医薬）を有効量、本明細書の抗体と共に被験体又は患者に投与してもよい。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを含む）、抗血管新生剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、及び／又は増殖阻害剤と共に併用投与されてもよい。このような第二医薬のタイプは、疾患のタイプ、疾病の重症度、患者の状態及び年齢、使用される第一医薬のタイプ及び投与量等を含む様々な要因に依存する。
本発明の抗体は腫瘍成長を阻害するが、例えば、腫瘍の成長を阻害する一又は複数の他の療法剤と組み合わせることが特に望まれ得る。例えば、本発明の抗体は、例えば、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌及び／又は膵臓癌を含む、本明細書に記載される何れの疾病の治療における治療スキームにおいて、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））及び／又は抗ＥＲＢＢ抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）トラツズマブ抗ＨＥＲ２抗体又はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗ＨＥＲ２抗体、例えばＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭパーツズマブ抗ＨＥＲ２抗体）等の抗血管新生剤と併用されてもよい。幾つかの例では、前述の組合せは二重特異性抗体を使用して成されうる。別法では、又は更には、患者は、放射線療法（例えば、遠隔照射、又は抗体等の放射線標識された薬剤を用いた治療）を組み合わせて受けてもよい。上記のこのような組合せ両方は、組合せ投与（二又は複数の薬剤が同じ又は別の製剤に含まれる）、及び個別投与、この場合は、本発明の抗体の投与はアジュバント療法又は複数のアジュバント療法の実施の前及び／又は後に行われ得る、を含む。更に、本発明の抗体を、比較的否細胞障害性の薬剤、例えば、別の抗体等の別の生物学的分子と組み合わせることが、抗体を、細胞に高い毒性である他の薬剤の化学療法剤と組み合わせることと比べ、細胞傷害性を低減するのに期待される。
【０２００】
本明細書に記載の抗体と一又は複数の第二医薬との組合せによる治療は、癌のサイン又は症状において好ましくは改善となる。例えば、このような療法は、第二医薬のみ（例えば化学療法剤のみ）を用いて治療された患者と比較して、生存率（全生存率及び／又は無増悪生存率）が改善される結果となり得、及び／又は客観的奏効（objective response）*（部分又は完全、好ましくは完全）となり得る。更には、本明細書に記載の抗体と一又は複数の第二医薬との組合せによる治療は、患者に対して、好ましくは相加的、及びより好ましくは相乗的（相加的より大きい）な治療的利点となる。好ましくは、この組合せ法において、第二医薬の少なくとも一回の投与と、本明細書に記載の抗体の少なくとも一回の投与との間の時間は、約１ヶ月以下、より好ましくは約２週間以下である。
癌の治療では、第二医薬は好ましくは別の抗体、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを含む）、抗血管新生剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害性放射療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、抗血管剤（antivascular agent）、及び／又は増殖阻害剤である。細胞障害剤は、ＤＮＡと相互作用する物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、又はスピンドル阻害剤（spindle inhibitor）又はスタビライザー（例えば、好ましくはビンカ・アルカロイド、より好ましくは、ビンブラスチン、デオキシビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビネピジン、ビンフォシルチン、ビンゾリジン、及びビンフニンから選択される）、又は例えば、５-ＦＵ、タキサン、ドキソルビシン、又はデキサメタゾン等の化学療法で使用される何れかの薬剤を含む。
幾つかの実施態様では、第二医薬は、癌を治療するために使用される別の抗体であり、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターの細胞外ドメインに指向されるもの、例えばトラツズマブ、又はその機能的断片、ｐａｎ-ＨＥＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、又はＥＧＦＲ阻害剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するもの）であり、好ましくは、マウスモノクローナル抗体２２５、それのマウス-ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５、又は該抗体２２５に由来するヒト化抗体又は由来の自然物質（natural agent）、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロ又はピロロピリドピリミジン、キナゾリン、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＦＧ、カネルチニブ、ＥＫＢ−５６９及びＰＫＩ−１６６）、又は二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ-２阻害剤、例えばラパチニブである。更なる第二医薬は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ）、ＦＡＶＩＤ（ＩＤＫＬＨ）、変更グリコシル化のＣＤ２０抗体、例えば、ＧＡ−１０１／ＧＬＹＣＡＲＴＴＭ、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥＴＭ）、サリドマイド及びその類似体、例えばレナリドミド （ＲＥＶＬＩＭＩＤＴＭ）、イマチニブ、ソラフェニブ、オファツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ）、抗ＣＤ４０抗体、例えばＳＧＮ−４０、及び抗ＣＤ−８０抗体、例えばガリキシマブを含む。
【０２０１】
制吐剤は、好ましくは、塩酸オンダンセトロン、塩酸グラニセトロン、メトクロプラミド、ドンペリドン、ハロペリドール、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、又はトロピセトロンである。ワクチンは、好ましくはＧＭ-ＣＳＦ  ＤＮＡ及び細胞に基づいたワクチン（cell-based vaccines）、樹状細胞ワクチン、組換えウィルス性ワクチン、熱ショックタンパク（ＨＳＰ）ワクチン、同種又は自己腫瘍ワクチンである。鎮痛剤は好ましくは、イブプロフェン、ナプロキセン、コリンマグネシウムトリサリチル酸、又はオキシコドン塩酸塩である。抗血管剤は、好ましくはベバシズマブ又はＲＨＵＭＡＢ-ＶＥＧＦである。更なる第二医薬は、抗増殖剤、例えば、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤、抗ＶＥＧＦ阻害剤、ｐ５３阻害剤、又はＰＤＧＦＲ阻害剤である。また、ここでの第二医薬は、例えば抗体を用いた治療等の生物学的標的療法（biologic-targeted therapy）、並びに例えば特定のレセプターに対して等の小分子標的療法を含む。
多くの抗血管新生剤が当該分野で同定され知られており、ここに挙げられているもの、例えば定義の下に挙げられているもの、及び例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004);及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)によるもの等を含む。US Patent Application US20030055006も参照。一実施態様では、抗ＥＧＦＬ抗体は、抗ＶＥＧＦ中和抗体（又は断片）及び／又は別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニストと組み合わせて使用され、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン（例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２））断片、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断可能なアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の低分子量阻害剤、ＶＥＧＦに対するアンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、；及びこれらの組合せを含む。別法では、又は更には、二又はそれ以上の血管新生阻害剤が、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び他の薬剤に加えて、場合によっては患者に共投与され得る。ある実施態様では、例えば抗癌剤等の一又は複数の更なる治療剤が、抗ＥＧＦＬ７抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、及び抗血管新生剤と組み合わせて投与されることが出来る。
ここで使用される化学療法剤は上記、例えば「化学療法剤」の定義に記載されている。
【０２０２】
このような第二医薬は、本明細書の抗体が投与された後４８時間以内に、又は前記薬剤の後２４時間以内に、又は１２時間以内に、又は３〜１２時間以内に投与され得、又は所定の期間、好ましくは約１から２日にわたって投与され得る。更には、このような薬剤の投与は、サブ治療的であり得る。
ここでの抗体は、第二医薬と同時に、連続的に、又は交互に、又は他の療法で非反応性の際に投与されることが出来る。このように、第二医薬の併用投与は、個別の製剤又は単一の薬剤的製剤を使用しての同時投与(並行投与)、及び何れかの順番での連続投与、ここでは好ましくは両方（又は全て）の医薬がそれらの生物学的活性を同時に行使する一定期間がある。これらの全ての第二医薬は、お互いに組み合わせて、又は第一医薬とそれらのみによって使用されてもよく、従ってここで使用される「第二医薬」の表現は、それぞれ、第一医薬に加えてそれが唯一の医薬という意味ではない。従って、第二医薬は一つの医薬である必要はなく、一以上のこのような薬剤を構成又は含み得る。
ここに記載のこれらの第二医薬は、一般的には第一医薬と同じ用量及び同じ投与ルートで、又は第一医薬の用量の約１から９９％で使用される。このような第二医薬が使用される場合は、特に第一医薬による初回投与の後の連続的投与においては治療による副作用を除く又は低減するために、好ましくは第一医薬が存在しない場合より少ない量で使用される。
【０２０３】
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌増殖を阻害又は防止するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な療法(例えば癌療法、例として化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療的投薬計画)を受けたか又はそれによって治療された患者が臨床上治療に適さないか、又は患者が治療からもはや利益を得ておらずこれらの患者に他の有効な療法が必要とされている状態を表すために用いられる。ここで使用されるように、該表現は、「非応答性／難治性」患者の状態も意味し、例えば、治療には反応するが副作用を受ける、耐性を示す、治療に反応しない、治療に満足に反応しない等の患者を指す。様々な実施態様では、癌は、再発性の腫瘍増殖又は再発性の癌増殖であり、癌細胞の数が著しくは減少しない、又は増加する、又は腫瘍サイズが著しくは減少しない、又は増加する、又は癌細胞のサイズ又は数における何れの更なる減少に失敗する。癌細胞が、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖であるかの決定は、インビボ又はインビトロにおいて、癌細胞の治療の効果を分析するための当該分野で公知である何れかの方法によって成され、このような場では、分野で容認された「再発」、又は「難治性」、又は「非応答性」の意味を使用する。抗ＶＥＧＦ抗体に対する腫瘍耐性は、再発性腫瘍増殖の一例である。
【０２０４】
本発明は、被験体において再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖をブロック又は低減するために、抗ＥＧＦＬ７抗体を投与することによって、被験体における再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖をブロック又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、抗ＥＧＦＬ７抗体は癌治療と同時に投与される。別法では、又は更には、抗ＥＧＦＬ７抗体療法は、別の癌治療と交互になされ、これは何れの順番で実施されてもよい。本発明は、また、癌を有し易い患者において癌の発生又は再発を防ぐために、一又は複数の阻害性抗体を投与する方法を包含する。一般的に、被験体は、癌治療を受けた又は同時に受けている。一実施態様では、癌治療は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストを用いた治療である。抗血管新生剤は、当該分野で知られるもの、本明細書の定義に記載のものを含む。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体、又は断片（例えば、ヒトＡ４．６．１、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３等）である。米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８Ｂ１号、米国特許出願第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９等を参照。更なる薬剤が、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖をブロック又は低減するために、ＶＥＧＦアゴニスト及び抗ＥＧＦＬ７抗体と併用で投与されることが出来る。
【０２０５】
本発明の抗体(及びアジュバント治療剤)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
【０２０６】
抗体の調製及び投与において、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明の特定の実施態様では、結合標的が位置する細胞に導入される抗体ないしその抗原結合断片が提供される。一実施態様では、本発明の抗体は、細胞内に細胞内抗体として発現させることができる。本明細書で使用する「細胞内抗体(intrabody)」という用語は、Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)；Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)；米国特許第６００４９４０号及び同第６３２９１７３号；米国公開特許第２００３／０１０４４０２号及び国際公開第２００３／０７７９４５号に記載のように、標的分子に選択的に結合することができる、細胞内で発現される抗体ないしその抗原結合タンパク質を指す。例として、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関しては１９９６年３月１４日に公開の国際公開９６／０７３２１も参照のこと。
【０２０７】
細胞内抗体の細胞内発現は、標的細胞内に、所望の抗体ないしその抗原結合タンパク質をコードする核酸(当該抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子に通常関連付けられる野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠いている)を導入することにより達成することができる。本発明の抗体のすべて又は一部をコードする一又は複数の核酸は標的細胞に運搬され、細胞内標的ポリペプチドに結合し、標的ポリペプチドの活性を調節することができる一又は複数の細胞内抗体が発現される。細胞に核酸を導入するための何らかの標準的方法を使用することができ、これらの方法には、限定するものではないが、微量注入、弾道的注入、電気泳動、リン酸カルシウム沈降、リポソーム、及び対象の核酸を保因するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びワクシニアベクターによる形質移入が含まれる。
ある実施態様では、核酸(場合によってベクターに含まれている)は患者の細胞内へインビボ及びエクスビボの方法によって導入されてよい。インビボ運搬の一例では、患者の例えば治療的介入を必要とする部位に核酸が直接注入される。インビボ運搬の更なる例では、核酸は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）による形質移入を用いて細胞内に導入される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson  et al., Science, 256:808-813 (1992)、及び国際公開９３／２５６７３及びそこに引用された参考文献を参照のこと。エクスビボ治療の例では、患者の細胞が取り除かれ、核酸がこれら単離した細胞内に導入され、変更した細胞が直接又は、例えば、患者内に着床される多孔性膜内に被包して患者に投与される(例として米国特許第４８９２５３８号及び同第５２８３１８７号を参照)。核酸のエクスビボ運搬のために一般的に用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０２０８】
別の実施態様では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の運搬を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている(例えば、米国特許第６７０３０１９号参照)。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質に特異的に結合する最小の抑制性断片が有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成する、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。例としてMarasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
標的細胞への抗体の移入は、当分野で公知の他の方法によって増強することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来の配列のような特定の配列は、細胞膜全体に異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例としてChen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329を参照。
【０２０９】
抗体の結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横切る抗体を提供する。血液脳関門を越えて分子を搬送するためには複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、幹細胞に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体を搬送する物理的方法には、限定するものではないが、血液脳関門を完全に包囲すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。包囲法には、限定するものではないが、脳への直接注入(例えば、Papanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002))、間質性注入／対流強化送達(例えば、Bobo等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)参照)、及び脳への送達装置の移植(例えば、Gill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceutical参照)が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定するものではないが、超音波(例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８０８６号参照)、浸透圧(例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化(例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号参照)、及び抗体をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入(例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号)が含まれる。
【０２１０】
血液脳関門を越えて抗体を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体を封入すること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号参照)、又はアポリポタンパク質Ｅ(例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号参照)中の抗体をコーティングすることが含まれる。
血液脳関門を越えて抗体を搬送する幹細胞に基づく方法は、対象の抗体を発現するように神経前駆細胞(ＮＰＣ)を遺伝的に操作し、次いで、治療する個体の脳に幹細胞を移植することを伴う。詳細なオンライン文献であるBehrstock等 (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005(神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作したＮＰＣが齧歯類及び霊長類のモデルの脳に移植した場合にパーキンソン病の症状を低減したことを報告している)を参照。
【０２１１】
血液脳関門を越えて抗体を搬送するレセプター及びチャネルに基づく方法には、限定するものではないが、グリココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増大させること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号参照)、カリウムチャネルを活性化させること(例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号参照)、ＡＢＣ薬の搬送を抑制すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号参照)、抗体をトランスフェリンでコーティングし、一以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照)、及び抗体のカチオン化(例えば、米国特許第５００４６９７号参照)が含まれる。
本発明の抗体は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
【０２１２】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０２１３】
診断方法及び検出の方法
本発明の抗ＥＧＦＬ７抗体は、特定の細胞又は組織におけるＥＧＦＬ７の発現を検出するアッセイ(例えば診断アッセイ又は予後のアッセイ)に有用であり、このアッセイでは抗体は後述のように標識され、及び／又は不溶性の基質に固定される。
別の態様では、本発明は、試料中のＥＧＦＬ７-抗ＥＧＦＬ７抗体複合体を検出することを含む、ＥＧＦＬ７の検出方法を提供する。本明細書において、用いられる「検出」なる用語は、コントロールに対する参照の有無にかかわらず、定性的及び／又は定量的な検出(測定レベル)を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗ＥＧＦＬ７抗体を提供するものであって、この抗ＥＧＦＬ７抗体は検出可能な標識を含んでなる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗ＥＧＦＬ７抗体とＥＧＦＬ７の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＥＧＦＬ７抗体は検出可能に標識される。
【０２１４】
抗ＥＧＦＬ７抗体（例えば、本明細書に記載される何れかのＥＧＦＬ７抗体）は、多くの良く知られた診断的アッセイ法の任意の１つにおいて、ＥＧＦＬ７の検出に利用することができる。
例えば、所望する起源から試料を得て、抗体が混合物中に存在する任意のＥＧＦＬ７と抗体／ＥＧＦＬ７複合体を形成するように試料と抗ＥＧＦＬ７抗体を混合させ、混合物に存在する任意の抗体／ＥＧＦＬ７複合体を検出することによって、ＥＧＦＬ７に関して生物学的試料をアッセイすることができる。特定の試料に適した当該分野で知られた方法によって、アッセイのために生物学的試料を調製することができる。用いられるアッセイの型によって、抗体と試料を混合させる方法、及び抗体／ＥＧＦＬ７複合体を検出する方法を選択する。そのようなアッセイには、免疫組織化学法、競合及びサンドイッチアッセイ、及び立体阻害アッセイが含まれる。試料の調製のために、哺乳類動物（典型的にはヒト患者）からの組織又は細胞試料が使用され得る。試料の例は、限定するものではないが、例えば結腸、前立腺、卵巣、肺、胃、膵臓、リンパ腫、及び白血病癌細胞等を含む。また、ＥＧＦＬ７は血清で測定されてもよい。試料は、当該技術で知られる様々な手順によって得られ、限定するものではないが、外科的切除、吸引（aspiration）、生検を含む。組織は、フレッシュ又は冷凍であり得る。一実施態様では、試料は、パラフィン又は同様なものに固定及び包埋される。組織試料は、一般的な方法 (例えば“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,” 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.を参照)によって固定（つまり保存）され得る。当業者であれば、試料が、組織学的に染色されるか、又は他の方法で分析されるかといった目的により、固定剤の選択が決定されると理解しているであろう。また、当業者であれば、固定長さが、組織試料の大きさ及び使用した固定剤に依存していることを理解しているであろう。例を挙げると、中性の緩衝ホルマリン、ブアン、又はパラホルムアルデヒドを、試料の固定に使用することができる。一般的に、試料をまず固定し、ついで、上昇列のアルコールを介して脱水され、浸潤させ、組織試料を切片化可能なように、パラフィン又は他の切片用培地に包埋される。また、組織を切片化し、得られた切片を固定することもできる。例として、組織試料は包埋し、一般的な方法により、パラフィンにおいてプロセシングすることができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲を参照)。使用可能なパラフィンの例には、限定されるものではないが、Paraplast、Broloid、及びTissuemayが含まれる。ひとたび組織試料が包埋されると、試料はミクロトーム等により切片化することができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲を参照)。この手順の例として、切片は、約３ミクロンから約５ミクロン厚の範囲とすることができる。切片化すると、切片はいくつかの標準的な方法により、スライドに付着させられる。スライド用付着剤の例には、限定されるものではないが、シラン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン等が含まれる。例として、パラフィン包埋切片は、正に帯電したスライド及び／又はポリ-���-リジンでコーティングされたスライドに付着させることができる。パラフィンが包埋物質として使用されているならば、組織切片は、一般的に脱パラフィン化され、水に再水和される。組織切片は、いくつかの一般的な標準方法により、脱パラフィン化することができる。例えば、キシレン及び徐々に下降列のアルコールを使用することができる(例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」, 上掲)。また、商業的に入手可能な脱パラフィン用の非有機剤、例えばホモ-Ｄｅ７(CMS, Houston, Texas)が使用可能である。
ＥＧＦＬ７についての分析法では、すべて、１つ又はそれより多い次の試薬を用いる：標識ＥＧＦＬ７アナログ、固定化ＥＧＦＬ７アナログ、標識抗ＥＧＦＬ７抗体、固定化抗ＥＧＦＬ７抗体及び立体コンジュゲート。標識試薬は、「トレーサー」としても知られている。
【０２１５】
利用される標識は、ＥＧＦＬ７と抗ＥＧＦＬ７抗体の結合を妨害しない任意の検出可能な機能性である。免疫アッセイでは、多くの標識が知られており、その例には、直接に検出することができる分子、例えば蛍光色素、化学発光剤、及び放射性標識、並びに分子、酵素等の検出されるように反応又は誘導体化されるべきものが含まれる。
用いられる標識はＥＧＦＬ７と抗ＥＧＦＬ７抗体の結合を干渉しないいくらか検出可能な機能がある。イムノアッセイでの使用のための多くの標識が公知であり、例えば、直接検出されうる成分、例えば、蛍光色素、化学発光、及び放射性標識、並びに検出されるように反応される又は誘導体化される酵素などの成分がある。このような標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシェフェリン、２,３-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０２１６】
これら標識を共有的にタンパク質又はポリペプチドと結合させるために、常套的方法が利用可能である。例えば、カップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン等が、上記の蛍光剤、化学発光剤、酵素標識で抗体をタグするのに利用することが可能である。例えば、米国特許第3,940,475号(フルオロメトリー)及び3,645,090号(酵素)；Hunter等, Nature, 144: 945(1962); David等, Biochemistry, 13: 1014-1021(1974)；Pain等, J. Immunol. Methods, 40: 219-230(1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412(1982)を参照せよ。ここでの好ましい標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼ等の酵素である。抗体への酵素を含むそのような標識のコンジュゲーションは、免疫アッセイ技術における通常の技術の１つにとって標準的な操作法である。例えば、O'Sullivan等, "Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, "  in Methods in Enzymology, 編 J. J. Langone & H. Van Vunakis, 73巻(Academic Press, ニューヨーク, ニューヨーク, 1981), 147-166頁を参照せよ。
【０２１７】
あるアッセイ法では、試薬の固定化を必要とする。固定化は、溶液で遊離に存在するあらゆるＥＧＦＬ７から抗ＥＧＦＬ７抗体を分離することを伴う。水不溶性基質又は表面への吸着による(Bennich等, 米国特許第３７２０７６０号)、共有結合による(例えば、グルタルアルデヒド架橋を利用して)、又は例えば免疫沈降による、後に抗ＥＧＦＬ７抗体又はＥＧＦＬ７アナログを不溶化することによるように、アッセイ法の前に抗ＥＧＦＬ７抗体又はＥＧＦＬ７アナログの何れかを不溶化することによって、これは常套的に完遂される。
試料におけるタンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて試験しうる。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「ＩＨＣ」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。試料の調整では、哺乳動物(典型的にはヒト患者)の組織又は細胞試料を用いてもよい。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引又は生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい。当分野の通常の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の通常の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。
【０２１８】
ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光発光インサイツハイブリダイゼーションなどの付加的な技術と組み合わせて行ってもよい。ＩＨＣの直接アッセイ及び間接アッセイの２つの一般的な方法が有用である。第一のアッセイでは、標的抗原(例えばＥＧＦＬ７)に対する抗体の結合は、直接的に測定される。この直接アッセイは、更なる抗体相互作用を必要とせずに可視化されうる酵素標識一次抗体又は蛍光タグ付加一次抗体などの標識された試薬を用いる。代表的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原と結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体と結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原を視覚化させるために色素生産性基質ないしは蛍光発生基質が加えられる。二次抗体の中には一次抗体上の異なるエピトープと反応するものもあるので、シグナルの増幅が起こる。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び／又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。多くの標識が利用可能である。
【０２１９】
上記の試料調整手順以外に、ＩＨＣ前、ＩＨＣの間又はＩＨＣ後に組織切片の更なる処置が所望されてもよい。例えば、クエン酸塩バッファ中で組織サンプルを加熱するなどのエピトープ検索方法が実施されてもよい(例として、Leong 等 Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)を参照)。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、３,３'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばＨＲＰＯ)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
このようにして調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。
【０２２０】
競合アッセイ又はサンドイッチアッセイとして知られている他のアッセイ方法は十分に確立されており、市販の診断法産業において、広く使われている。
競合アッセイは、限られた数の抗ＥＧＦＬ７抗体抗原結合部位について試験試料ＥＧＦＬ７と競合するトレーサーＥＧＦＬ７類似体の能力に依存する。一般的に、抗ＥＧＦＬ７抗体は、競合の前又は競合の後に不溶化して、次いで抗ＥＧＦＬ７抗体に結合したＥＧＦＬ７とトレーサーを結合していないトレーサーとＥＧＦＬ７から分離する。この分離は、別の容器へ移す(結合パートナーが予め不溶化された場合)か、又は遠心分離する(結合パートナーが競合反応の後で沈殿した場合)ことにより達成される。マーカー物質の量で測定されるように、試験試料ＥＧＦＬ７の量は結合したトレーサーの量に反比例する。ＥＧＦＬ７の既知量による用量-反応曲線を作成して、試験結果と比較して試験試料に存在するＥＧＦＬ７の量を量的に決定する。検出可能なマーカーとして酵素が用いられる場合に、これらのアッセイはＥＬＩＳＡシステムと呼ばれている。
「均質な」アッセイと称される競合アッセイの他の種類は、相分離を必要としない。ここで、ＥＧＦＬ７と酵素とのコンジュゲートが調製され、抗ＥＧＦＬ７抗体がＥＧＦＬ７に結合する場合に抗ＥＧＦＬ７抗体の存在により酵素活性が修飾されるように用いられる。この場合、ＥＧＦＬ７又はその免疫学的に活性な断片は、二機能性有機架橋によって、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされる。抗ＥＧＦＬ７抗体の結合が標識の酵素活性を阻害するか又は強化するために、抗ＥＧＦＬ７抗体により使用についてコンジュゲートを選別する。この方法自体は、ＥＭＩＴという名前で広く実施される。
【０２２１】
立体的コンジュゲートは、均質なアッセイの立体障害方法で用いられる。ハプテンに対する抗体は抗ＥＧＦＬ７抗体と同時にコンジュゲートを結合することが実質的にできないので、これらのコンジュゲートは低分子のハプテンを小さいＥＧＦＬ７断片に共有結合することにより合成される。このアッセイ手順で、試験試料に存在するＥＧＦＬ７は抗ＥＧＦＬ７抗体を結合し、それによって、抗ハプテンはコンジュゲートを結合できる。その結果、コンジュゲートハプテンの特徴の変化、例えばハプテンが蛍光体である場合の蛍光の変化が生じる。
サンドイッチアッセイは、ＥＧＦＬ７又は抗ＥＧＦＬ７抗体の測定のために特に有用である。一連のサンドイッチアッセイにおいて、固定された抗ＥＧＦＬ７抗体を用いて、試験試料ＥＧＦＬ７を吸着し、洗浄によって、試験試料を除去し、結合したＥＧＦＬ７を用いて第二の標識した抗ＥＧＦＬ７抗体を吸着して、次いで結合した材料を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、試験試料ＥＧＦＬ７に正比例する。「同時」サンドイッチアッセイにおいて、試験試料は、標識した抗ＥＧＦＬ７を加える前に分離されない。一抗体として抗ＥＧＦＬ７モノクローナル抗体を、他方の抗体としてポリクローナル抗ＥＧＦＬ７抗体を用いる一連のサンドイッチアッセイは、試料をＥＧＦＬ７について試験する際に有用である。
前述は、単にＥＧＦＬ７のための例示的な検出アッセイにすぎない。ＥＧＦＬ７の測定のために抗ＥＧＦＬ７抗体を用いる、現在の他の方法又は今後開発される方法は、本明細書に記載のバイオアッセイを含め、本願の権利内に包含される。
【０２２２】
ある態様では、本発明は、個体、例えばヒト被験者からの生体試料中のポリヌクレオチド(一又は複数)(例えばＥＧＦＬ７ポリヌクレオチド)(例えばポリヌクレオチドの有無又は量)を検出するための方法を提供する。様々なポリヌクレオチドの検出方法を行うことができ、例えばＲＴ-ＰＣＲ、タックマン、増幅法、ポリヌクレオチドマイクロアレイなどが含まれる。
ポリヌクレオチド(例えばｍＲＮＡ)の検出方法は周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識したＥＧＦＬ７のリボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション)、ノーザンブロット及び関連した技術、及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、ＥＧＦＬ７に特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲ及び、他の増幅型の検出法、例えば枝分れＤＮＡ、ＳＰＩＡ、Ｒｉｂｏ-ＳＰＩＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど)が含まれる。
【０２２３】
哺乳動物の生体試料は、例えばノーザンブロット、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いて、ＥＧＦＬ７のｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのＲＴ-ＰＣＲアッセイは公知技術である。本発明の例示的実施態様では、生体試料中のＥＧＦＬ７のｍＲＮＡの検出方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によって、試料からｃＤＮＡを生成し、該ＥＧＦＬ７のｃＤＮＡを増幅するために、ＥＧＦＬ７のポリヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて産生された該ｃＤＮＡを増幅し、そして、増幅されたＥＧＦＬ７のｃＤＮＡの有無を検出することを含む。加えて、このような方法は、生体試料中のＥＧＦＬ７のｍＲＮＡの量(レベル)を決定し得る一ないし複数の工程(例えば、アクチンファミリメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子のコントロールｍＲＮＡ配列と該レベルを同時に検討すること)を含んでもよい。場合によって、増幅されたＥＧＦＬ７のｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
プローブ及び／又はプライマーは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素にて標識されてもよい。このようなプローブ及びプライマーを、試料中のＥＧＦＬ７のポリヌクレオチドの存在を検出するため、及び、ＥＧＦＬ７のタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として用いることができる。技術者に理解されるように、多数の異なるプライマー及びプローブは、(例えば、本願明細書中で示される配列に基づいて)調製されてもよく、ＥＧＦＬ７のｍＲＮＡの有無及び／又は量を増幅、クローン化及び／又は決定するために効率的に用いてもよい。
【０２２４】
本発明の任意の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織又は細胞試料中のポリヌクレオチド、例えばＥＧＦＬ７ポリヌクレオチドの検出を含む手順が含まれる。例えば、核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロールの組織試料から得た試験及びコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写させて、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。次いで、プローブを、固形支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの配列及び各々のメンバーの位置がわかるように、アレイを設定する。例えば、特定の疾患状態において発現されうる選択した遺伝子を、固形支持体上に配列してもよい。特定のアレイメンバーと標識プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供する。マイクロアレイ技術は、単一の実験で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現性質を評価するために、核酸ハイブリダイゼーション技術及び演算技術を利用する。(2001年10月11日公開の国際公開公報０１／７５１６６を参照、(例えば米国特許第５７００６３７号、同第５４４５９３４号及び同第５８０７５２２号、Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996))、アレイ製作の考察のためにはCheung, V.G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上で染色されるか直接合成される遺伝子断片を含有する微小なアレイである。何千もの遺伝子は、通常単一のアレイ上に現れる。代表的なマイクロアレイ実験は以下の工程を伴う：（１）試料から単離したＲＮＡからの蛍光性標識標的の調製、（２）マイクロアレイへの標識した標的のハイブリダイゼーション、（３）洗浄、染色及びアレイのスキャニング、（４）走査画像の分析、そして（５）遺伝子発現性質の生成。一般に、ＤＮＡマイクロアレイには２つの主要な種類、ｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ(通常２５〜７０mer)が用いられる。アレイを形成する際に、オリゴヌクレオチドは、事前に作製して表面にスポットしても、(インサイツで)表面上で直接合成してもよい。
【０２２５】
Affymetrix GeneChip(登録商標)システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製造されるアレイを含んでなる市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド(「オリゴ」)(通常２５mer)は、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術との組合せによって、ガラスウェーハ上へ直接合成される。各々のアレイは最高４０００００の異なるオリゴを含有し、各々のオリゴヌクレオチドは何百万ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の位置で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Affymetrix Microarray Suiteソフトウェアによる遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えて解釈できる。各々の遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって、アレイ上に表される。各々のプローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチドと、不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して完全に相補的な配列を有するため、遺伝子の発現を測定する。不一致プローブは、中心塩基位置での単一塩基置換によって、完全一致プローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これによって、完全一致オリゴヌクレオチドを決定するシグナルの一因となるバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定できる。Microarray Suiteソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を減算して、それぞれのプローブセットの絶対値又は特異的強度の値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）及び他のヌクレオチド貯蔵所の当時の情報に基づいて選択される。この配列は遺伝子の３'末端の特定の領域を認識すると思われている。GeneChip（登録商標）ハイブリダイゼーションオーブン(「回転式(rotisserie)」オーブン)を用いて、一度に最高６４アレイのハイブリダイゼーションを行う。fluidics stationでは、プローブアレイの洗浄と染色が行われる。これは完全に自動化しており、４つのモジュールを含有しており、その各々のモジュールが一つのプローブアレイを保持している。各々のモジュールは、事前にプログラム化されたfluidicsプロトコールを用いたMicroarray Suiteソフトウェアにより個々に制御される。スキャナは、プローブアレイ結合した標識ｃＲＮＡにより発される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光発光スキャナである。Microarray Suiteソフトウェアを有するコンピュータワークステーションがfluidics stationとスキャナを制御する。Microarray Suiteソフトウェアは、プローブアレイについて事前にプログラム化したハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコールを用いてfluidics stationを８つまで制御できる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを得て、適切なアルゴリズムを使用して各々の遺伝子の存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、テキストファイルに出力する。このファイルは更なるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに用いることができる。
【０２２６】
幾つかの実施態様では、治療は、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、下垂体癌、膵臓癌、乳房線維腺腫、前立腺癌、頭頸部扁平上皮癌、軟部肉腫、乳癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、胸部癌（breast carcinoma）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、上皮癌、脳癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管細胞癌、胆嚢癌、肝細胞癌からなる群から選択される癌のための治療である。
生物学的試料は、本明細書、例えば生物学的試料の定義に記載されている。幾つかの実施態様では、生物学的試料は血清又は腫瘍である。
【０２２７】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が喘息のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２２８】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示す一般的な説明により、様々な他の実施態様が実施しうることは理解される。
【実施例】
【０２２９】
実施例において参照される市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って用いた。
実施例１：ヒト化ｍｕ４Ｆ１１抗体の生成
この実施例は、ＥＧＦＬ７に対するマウス抗体４Ｆ１１(ｍｕ４Ｆ１１)のヒト化を示す。残基番号は、カバット(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))に従う。一文字アミノ酸略号を用いる。 
材料及び方法
完全長ヒトＥＧＦＬ７と、ＥＭＩ及び２つのＥＧＦドメインを含むヒトＥＧＦＬ７(残基１−１８２)の切断型(２つのコイルドコイルドメインを欠く)を、ＣＨＯ細胞に発現させ、従来の手段によって精製した(図１)。ｐ２(ＲＰＲＹＡＣＣＰＧＷＫＲＴ；配列番号：５)及びＥＭＩ２(ＰＡＲＰＲＹＡＣＣＰＧＷＫＲＴＳＧＬＰＧＡＣＧＡＡＩＣＱＰＰ；配列番号：４)と称する、ＥＧＦＬ７上の４Ｆ１１エピトープを含むペプチドを合成した。
マウス抗体４Ｆ１１を発現するハイブリドーマは、Ｅｇｆｌ７ノックアウトマウスを、大腸菌で発現させリホールドさせた組換え完全長ヒトＥＧＦＬ７タンパク質にて免疫化することによって得た。抗体は、組換えヒト又はマウスのＥＧＦＬ７コートプレートを用いたＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。機能遮断抗体のパネルは、ＥＧＦＬ７コートプレートへのＨＵＶＥＣ接着を遮断する能力によって同定した。一つの所定の４Ｆ１１を含み、異種間機能遮断抗体としていくつかの抗体が同定されている(２００７年３月１６日に出願、２００７年９月２０日に公開された、共同出願の国際特許出願ＷＯ２００７／１０６９１５号を参照)。
【０２３０】
マウス４Ｆ１１可変ドメインのクローニングとキメラ４Ｆ１１抗体の生成−  標準的な方法を用いて４Ｆ１１を産生するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。可変軽鎖(ＶＬ)及び可変重鎖(ＶＨ)ドメインは、重鎖及び軽鎖に対する変性プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅した。フォワードプライマーは、ＶＬ及びＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、ＬＣ及びＨＣのリバースプライマーを設定し、定常軽鎖(ＣＬ)及び定常重鎖ドメイン１(ＣＨ１)内の領域にアニールさせた。これらの領域は種間で非常に保存されている。増幅したＶＬ及びＶＨを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、キメラ抗体ｃｈ４Ｆ１１を生成した。挿入物のポリヌクレオチド配列は、慣例的な配列決定法を使用して決定した。
【０２３１】
アクセプターヒトコンセンサスフレームワークへの直接高頻度可変領域移植−  この作業に用いたファジミドは一価性Ｆａｂ−ｇ３ディスプレイベクターであって、単一ｐｈｏＡプロモーターの制御下の２つのオープンリーディングフレームからなる。第一オープンリーディングフレームは、ｓｔＩＩシグナル配列とそれに融合したアクセプター軽鎖のＶＬ及びＣＨ１ドメインからなり、第二オープンリーディングフレームは、ｓｔＩＩシグナル配列とそれに融合したアクセプター重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、それに続くマイナーファージコートタンパク質Ｐ３からなる。 
ＣＤＲグラフトを製造するために、ｍｕ４Ｆ１１の高頻度可変領域をｈｕＫＩ及びｈｕＩＩＩコンセンサスアクセプターフレームワークに接合させ、直接的にＣＤＲ−グラフト(４Ｆ１１.ｖ１)を生成した(図２及び３)。ＶＬドメインにおいて、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプターに接合させた。位置２４−３４(Ｌ１；配列番号：３１)、５０−５６(Ｌ２；配列番号：３２)、及び８９−９７(Ｌ３；配列番号：３３)。ＶＨドメインにおいて、位置２６−３５(Ｈ１；配列番号：３４)、４９−６５(Ｈ２；配列番号：３５)、及び９５−１０２(Ｈ３；配列番号：３６)を接合した。MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))は、抗体及び抗原複合体結晶構造を分析し、重鎖の位置４９が接触（コンタクト）領域の一部であることを明らかにしたので、抗体をヒト化する場合、この位置はＣＤＲ-Ｈ２の定義に当然含まれる。
各々の高頻度可変領域に対して異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ファージ上に表出されたＦａｂ及びＩｇＧとして、キュンケル突然変異誘発によって４Ｆ１１.ｖ１を生成した。適切なクローンは、ＤＮＡ塩基配列決定によって識別した。
【０２３２】
フレームワークＴｏｇｇｌｅ−  結合に重要なフレームワーク位置を識別するために、フレームワークｔｏｇｇｌｅファージライブラリを生成し、ＶＬの位置４と、ＶＨの位置２、４８、６９、７１、７３、７５、７６、７８及び９１にマウス又はヒトのアミノ酸を与えた。図４に概説するように、鋳型として使用した４Ｆ１１.ｖ１を変異させるために５つのオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発によって、これらの位置を多様化した。
【０２３３】
高頻度可変領域のランダム化−  キュンケル突然変異誘発を使用して高頻度可変領域の位置に配列多様性を導入した。単一の位置ライブラリ(ＳＰＬ)を生成するために、各々の高頻度可変領域の各位置は、ＮＮＳをコードするオリゴヌクレオチドを使用してありうるすべての２０のアミノ酸について別々にランダム化した。これにより７６のサブライブラリが生じ、それぞれのサブライブラリは、高頻度可変領域のうちの一つの中に単一の変異を有する変異体を包含するプールした「単一位置ライブラリ」（ＳＰＬ）と組み合わせた２０の多様性を有する。突然変異誘発に使用する６つの鋳型は、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３の中央に１つの停止コドン(ＴＡＡ)を有し、野生型配列が再選択されないようにした。ＳＰＬを生成する場合、多様性を導入するために使用したオリゴヌクレオチドは対応する鋳型の停止コドンも修復した。 
限界ライブラリのために、停止コドン(ＴＡＡ)を修復して、ＣＤＲ-Ｌ２の位置５３及び５４、ＣＤＲ-Ｈ１の２９、ＣＤＲ-Ｈ２の５２、及びＣＤＲ-Ｈ３の９８にＮＮＳを導入した４つのオリゴヌクレオチドを、同時に組み込んだ。
【０２３４】
ファージライブラリの生成−  先に概説したように、フレームワーク位置又は高頻度可変領域に多様性を導入するために設定したオリゴヌクレオチドは、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴ及び５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの反応液中で、３７℃で１時間かけて別々にリン酸化した。
フレームワークｔｏｇｇｌｅ又は限界ライブラリを生成するために、多様性を導入するためのすべてのリン酸化したオリゴヌクレオチドを突然変異誘発反応物に同時に加えた。ＳＰＬのために、７６別々のキュンケル突然変異誘発反応は、９６ウェルＰＣＲプレートにおいて実行した。リン酸化したオリゴヌクレオチド反応物(上記)から、２μｌを、３００ｎｇの対応する停止コドン含有キュンケル鋳型を含む５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２に加え、終体積１０μｌにした。混合物は、９０℃で２分間、５０℃で５分間アニーリングし、その後氷上で冷ました。次いで、アニールした鋳型を、０．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々１０ｍＭ) 、１μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０×ＴＭバッファ(０．５Ｍ トリス ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２)、８０ＵのＴ４リガーゼ、及び４ＵのＴ７ポリメラーゼを総体積２０μｌになるように添加することによって満たし、室温に２時間置いた。次いで、これらの満たしてライゲートした生成物を、ＸＬ１-ブルー細胞にそれぞれ形質転換させ、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンとＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージ(ＭＯＩ１０)を含む０．５ｍｌの２ＹＴ中で生育させ、次いでプールし、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５００ｍｌの２ＹＴに移して、３７℃で１６時間生育させた。
【０２３５】
ファージ選別−  ファージ選別のために抗原の複数型を用いた。完全長又は切断型のＥＧＦＬ７(５μｇ／ｍｌ)は、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ９．６中で、４℃で終夜かけてＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート(Nunc)上に固定した。また、ＥＭＩ２及びｐ２ペプチドは、それらの遊離システイン(マレイミドＰＥＯ２-ビオチンを使用；Pierce)により又はそれらのアミノ末端上の遊離アミン(ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用、Pierce)によりビオチン化した。ビオチン化反応のために、２倍のモル過剰量のビオチン試薬をＰＢＳに用いた。ビオチン化したＥＭＩ２及びｐ２ペプチドは、４℃で終夜かけてＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート(Nunc)上に５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ９．６中で固定したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)(２μｇ／ｍｌ)上に捕獲した。すべてのプレートはＢｌｏｃｋｅｒＴＭカゼイン(Pierce)を用いて少なくとも１時間かけてブロックした。
ファージは、培養液上清から回収し、５％の粉乳及び０．０５％のツイーンＴＭ２０(ＰＢＳＢＴ)を含有するＰＢＳに懸濁した。ファージライブラリの添加と１時間のインキュベートの後に、マイクロタイターウェルは、０．０５％ツイーンＴＭ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳにて十分に洗浄し、結合したファージは、２０ｍＭ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌを含むウェルを３０分間培養することによって溶出した。溶出したファージは、１Ｍ トリス ｐＨ８にて中和し、ＸＬ１-ブルー細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で３７℃で終夜生育させた。標的を含有するウェルから溶出したファージの力価は、標的を含有しないウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。
溶液中で漸減濃のビオチン化ｐ２ペプチドに結合したファージを捕獲してその後ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)上で１０分間捕獲し（結合係数選別）、弱い結合のファージが洗い流される洗浄時間と温度を上げることによって（解離係数選別）、選別ストリンジェンシーを上げた。
【０２３６】
ＩｇＧ産生−  スクリーニングのために、まずＩｇＧ変異体を２９３細胞において産生させた。ＶＬ及びＶＨをコードするベクター(２５μｇ)は、ＦｕＧＥＮＥ(登録商標)システムを使用して２９３細胞に形質移入した。５００μｌのＦｕＧＥＮＥ(登録商標)は、ＦＢＳを含有していない４．５ｍｌのＤＭＥＭ培地と混合し、室温で５分間インキュベートした。各鎖(２５μｇ)をこの混合物に加え、室温で２０分間インキュベートし、次いで、５％ＣＯ２、３７℃、終夜の形質移入のために５つのＴ-１５０フラスコへ移した。次の日、形質移入混合物を含む培地を取り除き、０．１ｍｌ／Ｌの微量元素(Ａ０９３４)及び１０ｍｇ／Ｌのインスリン(Ａ０９４０)を有する２３ｍｌのＰＳ０４培地に置き換えた。細胞は、培地を１０００ｒｐｍで５分間かけて回収した後さらに５日間インキュベートし、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルタを使用してフィルター滅菌した。試料は、１２５ｍｌの培地につき２．５ｍｌの０．１％ＰＭＳＦを添加した後、４℃に保存できる。
【０２３７】
親和性測定−  親和性測定は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００を使用した表面プラスモン共鳴によって実行した。切断型ＥＧＦＬ７又はｐ２ペプチドは、ＣＭ５センサーチップ上に１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８で固定した(およそ５０−２００ＲＵ)。精製したＩｇＧ変異体は、３０μＬ／分の流量で注入した(ＰＢＳＴ中０．５〜１０００ｎＭの２倍階段希釈物を使用)。各試料は、３分毎の会合と３．５分毎の脱会合を用いて分析した。各々の注入後、チップは、１０ｍＭ グリシン ｐＨ１．７を使用して再生した。
結合応答は、コントロールフローセルをＩｇＧ変異体フローセルから減算することによって修正した。動態分析には、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１ラングミュアモデルを用いた。
【０２３８】
細胞接着アッセイ−  ５μｇ／ｍｌのマウスＥＧＦＬ７(ｍＥＧＦＬ７-ＣＢ-Ｈｉｓ)又はヒトＥＧＦＬ７(ＥＧＦＬ７-ＣＢ-Ｈｉｓ)を炭酸ナトリウムバッファ中で、４℃で終夜をかけてマイクロタイタープレート上にコートし、その後１％ＢＳＡを含むＰＢＳにてブロックした。抗ＥＧＦＬ７抗体を加え(０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ)、その後２００００のヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)／ウェルを含む適切な細胞成長培地(EGM Lonza)を加えた。コントロール細胞を抗体を含まないウェルに播き、１００％の播種細胞を算出した。各々の抗体濃度を３通り試験した。プレートは、１４０ｇで５分間遠心し、細胞と基質を作用させ、次いでＣＯ２培養器中で３０分間インキュベートし、ＰＢＳにて３回洗浄した。プレートに接着した細胞は、ＣｙＱＵＡＮＴ(登録商標)バッファ(Molecular Probes)を使用して計数し、播いた全細胞のうちの割合として算出した。プレートに結合した細胞の割合は、各々の抗体の濃度に対してプロットした。
【０２３９】
結果及び考察
４Ｆ１１のヒト化−  ｍｕ４Ｆ１１のヒト化に使用したヒトのアクセプターフレームワークは、コンセンサスヒトκＩ ＶＬドメイン、及びコンセンサスヒトサブグループＩＩＩ ＶＨドメインを基にした。ｍｕ４Ｆ１１の各相補性決定領域(ＣＤＲ)を同定し、ヒトアクセプターフレームワークに接合させて、ファージ上のＦａｂとして表出されるＣＤＲグラフト(４Ｆ１１.ｖ１)を生成した(図２及び３)。
【０２４０】
ファージ選別のための抗原評価−  ＥＧＦＬ７上の４Ｆ１１エピトープは、競合ウエスタンブロット分析を用いて第二ＥＭＩドメインとより特異性の高いペプチドｐ２にマッピングした(図１及び５)。４Ｆ１１.ｖ１をディスプレイするファージは固定した完全長及び切断型ＥＧＦＬ７に結合したが、コントロールファージを用いた場合にも有意な非特異的なファージ結合が観察された(図６)。したがって、切断型ＥＧＦＬ７への４Ｆ１１結合を遮断するｐ２及びＥＭＩ２ペプチドをファージ選別に用いた。ペプチドは、その遊離システインによってビオチン化されてｐ２Ｓ及びＥＭＩ２ｃが生成されるか(マレイミドＰＥＯ２-ビオチンを使用；Pierce)、又はそのアミノ末端上の遊離アミンによってビオチン化されてｐ２Ｎ及びＥＭＩ２.ｎが生成された(ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチンを使用；Pierce)。結合を評価するために、ビオチン化されたペプチドを、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)にてコートしたマイクロタイターウェルに捕獲した。４Ｆ１１.ｖ１を表出するファージを用いて、捕獲されたビオチン化ＥＭＩ２及びｐ２ペプチドへの結合を評価した。４Ｆ１１.ｖ１ファージはｐ２Ｓに最も結合した(図７)。５０ｎＭの濃度のビオチン化されたペプチドをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)コートウェルへの結合に用いた場合に、捕獲されるファージの量が最も大きくなった。
【０２４１】
フレームワーク位置のスクリーニング−  フレームワークｔｏｇｇｌｅライブラリは、固定したビオチン化ｐ２Ｓペプチドを用いた４ラウンドの選別のためにパニングした。最終ラウンドから得た９６クローンのＤＮＡ配列決定分析を用いて、量に基づき、各ｔｏｇｇｌｅ位置でのアミノ酸重要性を評価した(図８)。４ラウンドの選別の前と後のアミノ酸量から、Ｔｈｒ(Ｌ７８Ｔ)又はＶａｌ(Ｌ７８Ｖ)によるＬ７８の置換が結合の向上を引き起こしうることが示唆された。
【０２４２】
ＣＤＲ位置のスクリーニング−  更なる改善を同定するために、３つのフレームワーク：
最初のＣＤＲグラフト(４Ｆ１１.ｖ１)、Ｌ７８Ｔを有する４Ｆ１１.ｖ１(４Ｆ１１.ｖ２)及びＬ７８Ｖを有する４Ｆ１１.ｖ１(４Ｆ１１.ｖ３)を用いて、単一位置ライブラリを生成した。各ＳＰＬのために、各々のＣＤＲの位置は、すべての可能なアミノ酸について個々にランダム化した(合計７６のライブラリ、各々２０のメンバーを含有、各フレームワークについて１つのＳＰＬにプール)。６つの４Ｆ１１.ｖ１ ＤＮＡ鋳型(適切なＣＤＲに停止コドンを含有)を用いて、３つのＳＰＬを生成した。ＳＰＬ生成中に、適切なフレームワーク変化(Ｌ７８Ｖ又はＬ７８Ｖ)をコードする突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いることによって、ＶＨの位置７８にフレームワーク変化を導入した。こうして、フレームワーク及び個々のＣＤＲ位置を同時に変異させた。ＳＰＬは、表１で概説するように、固定したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)を使用して捕獲された可溶性ｐ２Ｓペプチド上でパニングした。
【０２４３】
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選別ストリンジェンシーは、ｐ２Ｓペプチドの濃度を減少させ、結合時間を減らし、洗浄時間及び温度を増やすことによって、徐々に上げた。４Ｆ１１.ｖ２及び４Ｆ１１.ｖ３に基づいたＳＰＬにより、選別の最後の３ラウンドの間に最も高いファージ回復が得られた。
最終ラウンドから得たクローンをＤＮＡ配列決定分析のためにピックアップした。各ＣＤＲにおいて個々の配列変化を同定した(図９)。最も多くのＳＰＬクローンが、ＶＬにおいてＣＤＲ-Ｌ２の位置Ｎ５３Ｙで変化していた。しばしば及び２以上のＳＰＬにおいて見られた変化が４Ｆ１１.ｖ３に組み込まれた。これらの変異体(.ｖ１２から.ｖ４)、４Ｆ１１−グラフト(.ｖ１)及びＶＨフレームワークに対する変化(４Ｆ１１.ｖ２及び４Ｆ１１.ｖ３)は、ＩｇＧとして発現させ、精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ及び細胞接着アッセイを用いて固定したｐ２Ｓに対する結合について試験した(表２)。ｍｕ４Ｆ１１と比較して４Ｆ１１.ｖ６及び４Ｆ１１.ｖ１０について細胞接着の弱い阻害が観察されたことから、更なる親和性改善が望ましかったことを示した。
0005383905.tif 000004
【０２４４】
フレームワーク位置の再評価−  更なるフレームワーク変化を条件に組み込んだ。表３に概説するように、変異体はＩｇＧとして発現させ(変異体１３から１６)、ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより試験した。
0005383905.tif 000005
これらのうち、４Ｆ１１.ｖ１４は、ｍｕ４Ｆ１１と比較して最も高い親和性を有していた。
【０２４５】
限界ライブラリ−  鋳型としての４Ｆ１１.ｖ１３に基づいて２つの限界ライブラリを生成した。ライブラリ１は、４Ｆ１１.Ｖ１３と同じフレームワーク変化(ＬＣ：Ｍ４Ｌ及びＨＣ：Ｒ７１Ｌ, Ｌ７８Ａ)を含有したのに対して、ライブラリ２は重鎖に２つの更なる変化：Ｎ７６Ｓ及びＹ９１Ｆを含有した(図１０及び１１)。また、両ライブラリのＬ１及びＬ３にＣＤＲ変化(Ｄ２８Ｓ及びＤ９４Ｅ)を組み込んだ。多様化は、ＳＰＬの選別後にすでに変化が観察された位置に限られていた(図１０及び１１)。これらの位置(軽鎖の５３及び５４と重鎖の２９、５２、９８)は、２０すべてのアミノ酸を含むように多様化し、表４に概説するように、固定したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを使用して捕獲された固定ｐ２Ｓペプチドに対してパニングした。
0005383905.tif 000006
【０２４６】
各ライブラリについてランダム化された位置の異なるアミノ酸残基の優先度を、図１２に表す。軽鎖において、両ライブラリは５３Ｙ及び５４Ｒを優先的に選択していたのに対して、重鎖においては、２９Ｆ及び５２Ｔの選択性があった。重鎖のＣＤＲ-Ｈ３において、両ライブラリでは位置９８に３つのアミノ酸(９８Ｙ、９８Ｈ及び９８Ｒ)が選択された。これらの変化のうち最良の組合せを同定するために、ＩｇＧとして、変異体１７から２６(表５)を構築し、発現させ、特徴付けした。いくつかの変異体は、ｃｈ４Ｆ１１と同じかより良好な親和性を有していた。変異体は、ヒト又はマウスのＥＧＦＬ７を用いた細胞移動アッセイにおいてさらに特徴付けした(表５及び図１３及び１４)。
0005383905.tif 000007
ｈｕ４Ｆ１１.ｖ１７及び４Ｆ１１.ｖ２２のＶＬ及びＶＨドメインを、ｍｕ４Ｆ１１及び４Ｆ１１.ｖ１と比較して、それぞれ図１５及び１６に示す。
【０２４７】
実施例２：ヒト化ｍｕ１８Ｆ７抗体の生成
この実施例は、ＥＧＦＬ７に対するマウス抗体１８Ｆ７(ｍｕ１８Ｆ７)のヒト化を示す。
残基番号はカバットに従った((Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。一文字アミノ酸略号を用いる。
【０２４８】
材料及び方法
完全長ヒトＥＧＦＬ７と、ＥＭＩ及び２つのＥＧＦドメインを含むヒトＥＧＦＬ７(残基１−１８２)の切断型(２つのコイルドコイルドメインを欠く)を、ＣＨＯ細胞に発現させ、従来の手段によって精製した(図１)。ｐ５(ＲＡＣＳＴＹＲＴＩＹＲＴＡ；配列番号：７)及びＥＭＩ１(ＬＴＴＣＤＧＨＲＡＣＳＴＹＲＴＩＹＲＴＡＹＲＲＳＰＧ；配列番号：３)と称する、ＥＧＦＬ７上の１８Ｆ７エピトープを含むペプチドを合成した。
マウス抗体１８Ｆ７を発現するハイブリドーマは、Ｅｇｆｌ７ノックアウトマウスを、大腸菌で発現させリホールドさせた組換え完全長ヒトＥＧＦＬ７タンパク質にて免疫化することによって得た。抗体は、組換えヒト又はマウスのＥＧＦＬ７コートプレートを用いたＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。機能遮断抗体のパネルは、ＥＧＦＬ７コートプレートへのＨＵＶＥＣ接着を遮断する能力によって同定した。一つの所定の１８Ｆ７を含み、異種間機能遮断抗体としていくつかの抗体が同定されている(２００７年３月１６日に出願、２００７年９月２０日に公開された、共同出願の国際特許出願ＷＯ２００７／１０６９１５号を参照)。
【０２４９】
マウス１８Ｆ７可変ドメインのクローニングとキメラ１８Ｆ７抗体の生成−  標準的な方法を用いて１８Ｆ７を産生するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。可変軽鎖(ＶＬ)及び可変重鎖(ＶＨ)ドメインは、重鎖及び軽鎖に対する変性プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅した。フォワードプライマーは、ＶＬ及びＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、ＬＣ及びＨＣのリバースプライマーを設定し、定常軽鎖(ＣＬ)及び定常重鎖ドメイン１(ＣＨ１)内の領域にアニールさせた。これらの領域は種間で非常に保存されている。増幅したＶＬ及びＶＨを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、キメラ抗体ｃｈ１８Ｆ７を生成した。挿入物のポリヌクレオチド配列は、慣例的な配列決定法を使用して決定した。
【０２５０】
アクセプターヒトコンセンサスフレームワークへの直接高頻度可変領域移植−  この作業に用いたファジミドは一価性Ｆａｂ−ｇ３ディスプレイベクターであって、単一ｐｈｏＡプロモーターの制御下の２つのオープンリーディングフレームからなる。第一オープンリーディングフレームは、ｓｔＩＩシグナル配列とそれに融合したアクセプター軽鎖のＶＬ及びＣＨ１ドメインからなり、第二オープンリーディングフレームは、ｓｔＩＩシグナル配列とそれに融合したアクセプター重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、それに続くマイナーファージコートタンパク質Ｐ３からなる。
ＣＤＲグラフトを製造するために、ｍｕ１８Ｆ７の高頻度可変領域をｈｕＫＩ及びｈｕＩＩＩコンセンサスアクセプターフレームワークに接合させ、直接的にＣＤＲ−グラフト(１８Ｆ７−グラフト)を生成した(図１７及び１８)。ＶＬドメインにおいて、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプターに接合させた。位置２４−３４(Ｌ１；配列番号：１００)、５０−５６(Ｌ２；配列番号：１０１)、及び、８９−９７(Ｌ３；配列番号：１０２)。ＶＨドメインにおいて、位置２６−３５(Ｈ１；配列番号：１０３)、４９−６５(Ｈ２；配列番号：１０４)、及び、９５−１０２(Ｈ３；配列番号：１０５)を接合させた。MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))は、抗体及び抗原複合体結晶構造を分析し、重鎖の位置４９が接触（コンタクト）領域の一部であることを明らかにしたので、抗体をヒト化する場合、この位置はＣＤＲ-Ｈ２の定義に当然含まれる。
各々の高頻度可変領域に対して異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ファージ上に表出されたＦａｂ及びＩｇＧとして、キュンケル突然変異誘発によって１８Ｆ７−グラフトを生成した。適切なクローンは、ＤＮＡ塩基配列決定によって識別した。
【０２５１】
フレームワークＴｏｇｇｌｅ−  結合に重要なフレームワーク位置を識別するために、フレームワークｔｏｇｇｌｅファージライブラリを生成し、ＶＬの位置８７と、ＶＨの位置４８、６７、６９、７１、７３、７５、７６、７８及び８０にマウス又はヒトのアミノ酸を与えた。図１９に概説するように、鋳型として使用した１８Ｆ７−グラフトを変異させるために３つのオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発によって、これらの位置を多様化した。
【０２５２】
高頻度可変領域のランダム化−  キュンケル突然変異誘発を使用して１８Ｆ７−グラフトの高頻度可変領域の各位置に別々に完全配列多様性を導入し、一緒にプールした単一位置ライブラリを生成した。１８Ｆ７−グラフトの各々の高頻度可変領域の各位置は、各位置で、ＮＮＳをコードするオリゴヌクレオチドを使用してありうる２０すべてのアミノ酸について完全にランダム化した。十分にランダム化した高頻度可変領域のうちの１つの領域内に単一の位置を有する２０のメンバーからなるライブラリを複数作製した。高頻度可変領域内の各位置をカバーするために、７６のこの種のライブラリを生成し、各高頻度可変領域の全体にわたって単一の変異を包含するプールした「単一位置ライブラリ」（ＳＰＬ）と組み合わせた。各ＣＤＲの真ん中に停止コドン（ＴＡＡ）を導入し、野生型のＣＤＲ移植配列を再選択しないようにした。これはキュンケル突然変異誘発によって実施し、異なるＣＤＲに停止コドンが導入されている各１８Ｆ７−グラフトのための６つの異なる鋳型を得た。また、ライブラリを生成するときに、多様性を導入するために使用するオリゴヌクレオチドは対応する鋳型の停止コドンを修復した。
【０２５３】
ファージライブラリの生成−  先に概説したように、フレームワーク位置又は各高頻度可変領域に多様性を導入するために設定したオリゴヌクレオチドは、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴ及び５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの反応液中で、３７℃で１時間かけて別々にリン酸化した。
フレームワークｔｏｇｇｌｅライブラリを生成するために、多様性を導入するための３つすべてのリン酸化オリゴヌクレオチドを突然変異誘発反応物に同時に加えた。ＳＰＬのために、７６の別々のキュンケル突然変異誘発反応は、９６ウェルＰＣＲプレートにおいて実行した。リン酸化したオリゴヌクレオチド反応物(上記)から、２μｌを、３００ｎｇの対応する停止コドン含有キュンケル鋳型を含む５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２に加え、終体積１０μｌにした。混合物は、９０℃で２分間、５０℃で５分間アニーリングし、その後氷上で冷ました。次いで、アニールした鋳型を、０．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々１０ｍＭ) 、１μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０×ＴＭバッファ(０．５Ｍ トリス ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２)、８０ＵのＴ４リガーゼ、及び４ＵのＴ７ポリメラーゼを総体積２０μｌになるように添加することによって満たし、室温に２時間置いた。次いで、これらの充填しライゲートした生成物はそれぞれ、ＸＬ1-ブルー細胞に形質転換し、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージ（ＭＯＩ１０）を含有する０．５ｍｌの２ＹＴ中で３７℃で２時間生育させ、その後プールし、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する５００ｍｌの２ＹＴに移し、３７℃で１６時間生育させた。
【０２５４】
ファージ選別−  ファージ選別のために抗原の複数型を用いた。完全長又は切断型のＥＧＦＬ７(５μｇ／ｍｌ)は、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ９．６中で、４℃で終夜かけてＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート(Nunc)上に固定した。また、ＥＭＩ１及びｐ５ペプチドは、それらの遊離システイン(マレイミドＰＥＯ２-ビオチンを使用；Pierce)により又はそれらのアミノ末端上の遊離アミン(ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用、Pierce)によりビオチン化した。ビオチン化反応のために、２倍のモル過剰量のビオチン試薬をＰＢＳに用いた。ビオチン化したＥＭＩ１及びｐ５ペプチドは、４℃で終夜かけてＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート(Nunc)上に５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ９．６中で固定したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)(２μｇ／ｍｌ)上に捕獲した。すべてのプレートはＢｌｏｃｋｅｒＴＭカゼイン(Pierce)を用いて少なくとも１時間かけてブロックした。
ファージは、培養液上清から回収し、５％の粉乳及び０．０５％のツイーンＴＭ２０(ＰＢＳＢＴ)を含有するＰＢＳに懸濁した。ファージライブラリの添加と１時間のインキュベートの後に、マイクロタイターウェルは、０．０５％ツイーンＴＭ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳにて十分に洗浄し、結合したファージは、２０ｍＭ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌを含むウェルを３０分間培養することによって溶出した。溶出したファージは、１Ｍ トリス ｐＨ８にて中和し、ＸＬ１-ブルー細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で３７℃で終夜生育させた。標的を含有するウェルから溶出したファージの力価は、標的を含有しないウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。
溶液中で漸減濃のビオチン化ｐ５ペプチドに結合したファージを捕獲してその後ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)上で１０分間捕獲し（結合係数選別）、弱い結合のファージが洗い流される洗浄時間と温度を上げることによって（解離係数選別）、選別ストリンジェンシーを上げた。
【０２５５】
ＩｇＧ産生−  スクリーニングのために、まずＩｇＧ変異体を２９３細胞において産生させた。ＶＬ及びＶＨをコードするベクター(２５μｇ)は、ＦｕＧＥＮＥ(登録商標)システムを使用して２９３細胞に形質移入した。５００μｌのＦｕＧＥＮＥ(登録商標)は、ＦＢＳを含有していない４．５ｍｌのＤＭＥＭ培地と混合し、室温で５分間インキュベートした。各鎖(２５μｇ)をこの混合物に加え、室温で２０分間インキュベートし、次いで、５％ＣＯ２、３７℃、終夜の形質移入のために５つのＴ-１５０フラスコへ移した。次の日、形質移入混合物を含む培地を取り除き、０．１ｍｌ／Ｌの微量元素(Ａ０９３４)及び１０ｍｇ／Ｌのインスリン(Ａ０９４０)を有する２３ｍｌのＰＳ０４培地に置き換えた。細胞は、培地を１０００ｒｐｍで５分間かけて回収した後さらに５日間インキュベートし、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルタを使用してフィルター滅菌した。試料は、１２５ｍｌの培地につき２．５ｍｌの０．１％ＰＭＳＦを添加した後、４℃に保存できる。
【０２５６】
親和性測定−  親和性測定は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００を使用した表面プラスモン共鳴によって実行した。切断型ＥＧＦＬ７又はｐ５ペプチドは、ＣＭ５センサーチップ上に１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８で固定した(およそ５０−２００ＲＵ)。精製したＩｇＧ変異体は、３０μＬ／分の流量で注入した(ＰＢＳＴ中０．５〜１０００ｎＭの２倍階段希釈物を使用)。各試料は、３分毎の会合と３．５分毎の脱会合を用いて分析した。各々の注入後、チップは、１０ｍＭ グリシン ｐＨ１．７を使用して再生した。
結合応答は、コントロールフローセルをＩｇＧ変異体フローセルから減算することによって修正した。動態分析には、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１ラングミュアモデルを用いた。
【０２５７】
結果及び考察
１８Ｆ７のヒト化−  ｍｕ１８Ｆ７のヒト化に使用したヒトのアクセプターフレームワークは、コンセンサスヒトκＩ ＶＬドメイン、及びコンセンサスヒトサブグループＩＩＩ ＶＨドメインを基にした。ｍｕ１８Ｆ７の各ＣＤＲを同定し、ヒトアクセプターフレームワークに接合させて、ファージ上のＦａｂとして表出されうるＣＤＲグラフトを生成した(図１７及び１８)。
【０２５８】
ファージ選別のための抗原評価−  ＥＧＦＬ７上の１８Ｆ７エピトープは、競合ウエスタンブロット分析を用いて第一ＥＭＩドメインとより特異性の高いペプチドｐ５にマッピングした(図１及び２０)。１８Ｆ７−グラフトをディスプレイするファージは固定した完全長及び切断型ＥＧＦＬ７に結合したが、コントロールファージを用いた場合にも有意な非特異的なファージ結合が観察された(図２１)。したがって、切断型ＥＧＦＬ７への１８Ｆ７結合を遮断するｐ５及びＥＭＩ１ペプチドをファージ選別に用いた。ペプチドは、その遊離システインによってビオチン化されてｐ５Ｓ及びＥＭＩ１ｃが生成されるか(マレイミドＰＥＯ２-ビオチンを使用；Pierce)、又はそのアミノ末端上の遊離アミンによってビオチン化されてｐ５ｎ及びＥＭＩ１ｎが生成された(ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチンを使用；Pierce)。結合を評価するために、ビオチン化されたペプチドを、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)にてコートしたマイクロタイターウェルに捕獲した。固定した切断型ＥＧＦＬ７にて２ラウンドの選別を行った後、フレームワークｔｏｇｇｌｅライブラリファージプールを用いて、捕獲されたビオチン化ＥＭＩ１及びｐ５ペプチドへの結合を評価した。ファージプールは、ｐ５ｎ及びＥＭＩ１ｎに結合したがｐ５ｃ又はＥＭＩ１ｃには結合しなかった(図２２)。５０ｎＭの濃度のビオチン化ペプチドをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)コートウェルへの結合に用いた場合に、捕獲されるファージの量が最も大きくなった。
固定された切断型ＥＧＦＬ７に対して２ラウンドの選別を行った後、フレームワークｔｏｇｇｌｅライブラリは、固定したビオチン化ｐ５ｎペプチドにての２ラウンドの選別のためにさらにパニングした。最終ラウンドから得た９６クローンのＤＮＡ配列決定分析を用いて、量に基づき、各ｔｏｇｇｌｅ位置でのアミノ酸重要性を評価した(図２３)。４ラウンドの選別の前と後のアミノ酸量から、Ｎ７３Ｋ及びＬ７８Ａの変化が結合の向上を引き起こすことが示唆された。あまり顕著ではないが、Ｌ７８Ｖ及びＶ４８Ｉもまた同様であり、Ｌ７８Ｖをさらに調べた。
【０２５９】
フレームワークｔｏｇｇｌｅライブラリ結果から得た４つのフレームワークを用いて、更なる改善を同定するために、ＳＰＬを調べた。４つのフレームワークは、最初のＣＤＲグラフト(１８Ｆ７−グラフト)、Ｎ７３Ｋを有する１８Ｆ７−グラフト(１８Ｆ７.ｖ２)、Ｎ７３Ｋ及びＬ７８Ａを有する１８Ｆ７−グラフト(１８Ｆ７.ｖ３)、及びＮ７３Ｋ及びＬ７８Ｖを有する１８Ｆ７−グラフト(１８Ｆ７.ｖ４)を含む。各フレームワークのために、各々のＣＤＲの位置が、すべての可能なアミノ酸について個々にランダム化したＳＰＬを生成した(合計７６のライブラリ、各々２０のメンバーを含有、１つのＳＰＬにプール)。６つの１８Ｆ７−グラフトＤＮＡ鋳型(適切なＣＤＲ内に停止コドンを含有)を用いて、４つすべてのＳＰＬを生成した。ＳＰＬ生成中に、適切なフレームワーク変化をコードする突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いることによって、ＶＨの位置７３及び７８にフレームワーク変化を導入した。こうして、フレームワーク及び個々のＣＤＲ位置を同時に変異させた。４つのＳＰＬは、表６で概説するように、固定した切断型ＥＧＦＬ７に対して２ラウンドの後、固定したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ(登録商標)を使用して捕獲された可溶性ビオチン化ｐ５ｎペプチドにて３ラウンドの選別をすることによって、パニングした。
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選別ストリンジェンシーは、ビオチン化ｐ５ｎペプチドの濃度を減少させ、結合時間を減らし、洗浄時間及び温度を増やすことによって、徐々に上げた。１８Ｆ７.ｖ３及び１８Ｆ７.ｖ４に基づいたＳＰＬにより、選別の最後の３ラウンドの間に最も高いファージ回復が観察された。
【０２６０】
最終ラウンドから得たクローンをＤＮＡ配列決定分析のためにピックアップした。各ＣＤＲにおいて個々の配列変化を同定した(図２４)。最も多くのＳＰライブラリクローンが、ＶＬの位置Ｓ８９で変化していた。しばしば及び２以上のＳＰライブラリにおいて見られた変化が１８Ｆ７.ｖ３に組み込まれた。これらの変異体(.ｖ５から.ｖ１０)、１８Ｆ７−グラフト(.ｖ１)及びＶＨフレームワークに対する変化(.ｖ２、.ｖ３及び.ｖ４)は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭによる更なる分析のためにＩｇＧとして発現させた(表７及び８)。
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これら１０の変異体のＢｉａｃｏｒｅＴＭ分析は、すべてが固定したｍＥＧＦＬ７又はｐ５ペプチドに十分に結合したことを示した。１８Ｆ７.ｖ６は、最も遅い解離速度(ｋｄ)を有し、ＨＵＶＥＣ接着アッセイに有効であった(図２５)。
【０２６１】
１８Ｆ７.ｖ６のポリッシュ−  １８Ｆ７.ｖ６のＣＤＲ-Ｌ１内の潜在的イソ-アスパラギン酸形成部位(Ａｓｎ−Ｇｌｙ)(Ｎ２８、Ｇ２９)及びＣＤＲ-Ｈ２内の潜在的イソ-アスパラギン酸形成部位(Ｎ５４、Ｇ５５)は、これらの位置で代替アミノ酸を試験することによって取り除いた(表９)。
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Ｈ２(.ｖ６Ｂ及び.ｖ６Ｄ)内のＳＧ配列はあまり発現しなかったが、Ｌ１(.ｖ６Ａ)内のこの配列は解離速度を増やした。対照的に、Ｈ２(.ｖ６Ｃ)内のＮＳ配列は、動態にほとんど影響がなかった(表８及び９)。Ｈ２：ＮＳ(.ｖ６Ｃ)と組み合わせたＬ１内の抽出した他の変化の中で、変化ＮＳ(.ｖ６Ｊ)及びＮＡ(.ｖ６Ｋ)は、解離速度に対してわずかな影響しかなかった(表８及び９、図２５)。これらの変化は、１８Ｆ７.ｖ６の安定性を向上させるために用いられうるが、依然としてマウス１８Ｆ７と比較して所望の生物学的性質を維持する(図２５及び２６)。ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ＫからのＶＬ及びＶＨドメインをそれぞれ、図２７及び２８に示す。
【０２６２】
実施例３：腫瘍保持マウス又は新生仔マウスのヒト化抗ＥＧＦＬ７抗体による治療
本発明者等は、様々なモデルにおいて脈管形成及び／又は腫瘍成長を阻害する、本発明のヒト化抗ＥＧＦＬ７抗体(単独及び抗ＶＥＧＦ療法との併用)の能力を調査した。本発明者等は、抗ＥＧＦＬ７抗体が抗ＶＥＧＦ療法の有効性を上げるのを確認した。
ＨＲＬＮ雌ｎｕ／ｎｕマウスの皮下に、１×１０７のＨ１２９９ヒト非小細胞肺癌腫瘍細胞を注射し、８０〜１２０ｍｍ３に腫瘍を発達させた。次いで、腫瘍保持マウスを４つのグループに無作為に分け（各１２マウス）、各グループの平均腫瘍サイズが１２２ｍｍ３になるようにした。次いでこれらのマウスを以下の通りに治療した。グループ１：抗ＶＥＧＦ抗体の腹膜内(ｉｐ)注射(Ｂ２０-４．１；国際公開２００５／０１２３５９及び国際公開２００５／０４４８５３)、週に１回、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２：ネガティブコントロール抗体抗ブタクサＩｇＧのｉｐ注射、週１回、１０ｍｇ／ｋｇ、及び抗ＥＧＦＬ７抗体(ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋ)、週２回、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ３：Ｂ２０-４．１のｉｐ注射、週１回、１０ｍｇ／ｋｇ、及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋ、週２回、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ４：治療なし。腫瘍はカリパスにて週２回測定し、腫瘍体積は(ｗ２×ｌ)／２(ｗ＝腫瘍幅ｍｍ、ｌ＝腫瘍長ｍｍ)として算出した。それらの腫瘍が１０００ｍｍ３に達したときマウスを安楽死させた(「マウスがエンドポイントに達した」と定義する)。マウスの５０％以上がエンドポイントに達するまで、グループ平均腫瘍体積±ＳＥＭを時間に対してプロットした。この実験からのデータは、ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋによる治療は増殖を低減する傾向を示したが、Ｂ２０.４-１又はｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋ単独による治療はいずれも未治療コントロールより有意には腫瘍増殖を低減しなかったことを示した(図２９)。これに対して、Ｂ２０.４-１及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋによる治療は、有意に腫瘍増殖を阻害した(図２９)。
【０２６３】
Ｂａｌｂ-ｃヌードマウスの右側腹部の皮下に、５×１０６のＨＭ７カルシノーマ細胞を含む０．１ｍｌのマトリゲルＴＭを注射した。平均腫瘍サイズが８０〜１５０ｍｍ３に達したときに、マウスを各々１０匹の４つのグループに分けて、すべてのグループの平均腫瘍サイズがおよそ等しくなるようにし、以下のように治療した。グループ１：抗ブタクサＩｇＧのｉｐ注射、週２回、５ｍｇ／ｋｇ；グループ２：Ｂ２０-４.１.１(ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３２４８)のｉｐ注射、週２回、５ｍｇ／ｋｇ；グループ３：抗ＥＧＦＬ７抗体(ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ)のｉｐ注射、週２回、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ４：Ｂ２０-４.１.１のｉｐ注射、週２回、５ｍｇ／ｋｇ、及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ、週２回、１０ｍｇ／ｋｇ。腫瘍は、カリパスにて週２回測定し、幅と長さを記録した。腫瘍が１０００ｍｍ３より大きくなったとき、又は、腫瘍増殖又は潰瘍化が動物の健康を害する場合に、マウスを安楽死させた。本発明者等は、グループ１及び３の腫瘍が類似の増殖速度を有するのに対して、グループ２の腫瘍はグループ１のそれらよりゆっくり増殖し、グループ４の腫瘍は負の増殖を表したことを観察した。
Ｂａｌｂ-ｃヌードマウスの右側腹部の皮下に、一次ヒト大細胞肺癌腫瘍移植片(ＬＸＦＬ１６７４)を注射した。この実験には、ヒトＩｇＧ(ｈＩｇＧ)及びマウスＩｇＧ(ｍＩｇＧ)コントロール抗体を投与する参照グループ(グループ１)、ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ及びｍＩｇＧを摂取したグループ２、Ｂ２０-４.１.１及びｈＩｇＧを摂取したグループ３、及びｈｕ１８Ｆ７.ｖ６Ｋ及びＢ２０-４.１.１を摂取したグループ４が含まれる。すべての治療は、１０ｍｇ／ｋｇ／用量のｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ(又はｈＩｇＧ)、その４時間後５ｍｇ／ｋｇ／用量のＢ２０(又はｍＩｇＧ)を週２回ｉｐ投与した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を上回るときに、マウスを別々に屠殺した。グループ１のコントロールマウスの５０％より多くが生存している限り(１４日目)、グループを有効性について評価した。投薬の開始時のグループサイズは、マウスにつき各々直径５〜１０ｍｍの腫瘍を１つ保持する１０匹のマウスとした。Ｂ２０-４.１.１単一療法を上回る併用療法の利点は、統計学的に有意であった(図３０)。
【０２６４】
また、本発明者等は、マウス新生仔臓器脈管形成アッセイにおいて、ヒト化抗ＥＧＦＬ７抗体ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ及びその親抗体マウス１８Ｆ７を試験した。生後１及び３日目の新生仔マウスに抗体を注射し、臓器は５日目に回収した。多臓器における脈管構造は血管内皮細胞マーカーＣＤ３１にて染色し、血管密度を定量化した。グループは以下の通りとした。１５ｍｇ／ｍｌの抗ブタクサ抗体を摂取したグループ１(ｎ＝３／実験)、５ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体(Ｇ６.３１；ＷＯ２００５／０１２３５９及びＷＯ２００５／０４４８５３；ｎ＝３／実験)及び１０ｍｇ／ｍｌのブタクサ抗体を摂取したグループ２、５ｍｇ／ｍｌのＧ６.３１及び１０ｍｇ／ｍｌのマウス１８Ｆ７を投与したグループ３(ｎ＝４／実験)、及び５ｍｇ／ｍｌのＧ６.３１及び１０ｍｇ／ｍｌのｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋを投与したグループ４(ｎ＝４／実験)。３つの独立した実験から集めた結果を図３１に示す。これは、抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６.３１は有意な抗脈管形成活性を有し、Ｇ６.３１のｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ又はマウス１８Ｆ７との併用は有意にＧ６.３１の活性を上げたことを示す。腸管の絨突起脈管構造において同様な抗脈管形成活性が観察された。これらの結果は、ｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋ及びマウス１８Ｆ７がこのモデルにおいて類似の抗脈管形成活性を有することを裏付けるものである。
【０２６５】
実施例４：ヒト被検体における抗ＥＧＦＬ７抗体による腫瘍の灌流及び透過性の阻害
我々は、抗体に応答した腫瘍脈管構造の変化を調べるために、２サイクルの３ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇのｈｕ１８Ｆ７.ｖ６ｋを投与したヒト被検体での動的なコントラスト磁気共鳴画像法(ＤＣＥ-ＭＲＩ)評価を行った。ＤＣＥ-ＭＲＩは、腫瘍微小循環の機能解析を得る画像形態である。部分的な血管外及び細胞外漏出体積であるＶｅ、及び体積移動定数であるＫｔｒａｎｓのような血管パラメータの変化は、腫瘍灌流及び透過性の変化を反映する。２つの基準前処置スキャンをおよそ５〜７日間隔で得(しかし少なくとも２４時間間隔) 、その後サイクル１において投薬した(例えば抗体の投与に対して１日目及び７日目)。後処置スキャンは、サイクル１の１５日目と、サイクル２の８日目(計画通りが難しい場合は±２日)に得た。評価可能な転移性病変は、少なくとも一辺が肝臓では３ｃｍ以上、他の部位では２ｃｍ以上を測定しなければいけないとした。各被検体につき同じ画像取得操作の間に、ＤＣＥ−ＭＲＩ取得配列に加え、拡散強調像及びＴ１−ないしＴ２−強調像などの他のＭＲＩ取得配列を得た。表１０に示すように、本発明者等は、抗ＥＧＦＬ７抗体による治療がいくつかの固形腫瘍において最大およそ４０％Ｋｔｒａｎｓを低減したことを観察した。 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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