(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下面より供給されるブロッティング溶液をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの内部に浸透させ、これをその上面に密着重合させたブロッティング膜を介して毛管現象により上方に吸引除去する過程で、上記アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル内に電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を前記ブロッティング膜へ移動・吸着させる場合において、前記ブロッティング膜の上面には、粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにしたことを特徴とする高吸水性樹脂を利用したブロッティング方法。
【請求項２】
ブロッティング膜の上面には、１又は複数枚の濾紙を介して粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにしたことを特徴とする請求項１に記載の高吸水性樹脂を利用したブロッティング方法。
【請求項３】
下面より供給されるブロッティング溶液を内部に浸透させるアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルと、該アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの上面に密着重合させるところの、上記アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル内に電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を毛管現象により吸引除去する過程で上方に移動・吸着させるためのブロッティング膜と、該ブロッティング膜上に載置される箱状の枠体と、該枠体内に撒かれる粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂とからなるブロッティング装置。
【請求項４】
ブロッティング膜の上面には、１又は複数枚の濾紙を介して箱状の枠体を載置するとともに、該枠体内に粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにしたところの請求項３に記載のブロッティング装置。
【請求項５】
ブロッティング膜の上面には、１又は複数枚の濾紙を介して箱状の枠体を載置するとともに、該枠体内に粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにし、しかも前記枠体下部には濾紙を挟持・固定するためのスリットが形成されていることを特徴とした請求項３に記載のブロッティング装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生化学、分子生物学等の研究分野、特に組替えＤＮＡ技術を利用した各分野において汎用される核酸および蛋白質のブロッティング方法および装置に関し、ブロッティング作業時間の著しい短縮化をはかるとともに、大量に使い捨て使用されるペーパータオルの不要化をはかることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
ブロッティングとは、電気泳動によりアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル中に分画された核酸あるいは蛋白質試料を、毛管現象により、ゲル中からゲル表面に密着させたニトロセルロース膜又はナイロン膜へ移動させる技法である。  この技法は、生化学、分子生物学等の研究において、又、遺伝子組替え技術において、基本的且つ重要な技法の一つであり、特に、最近国家的プロジェクトとして進められている各種生物の全ゲノム解析研究においては必須の技法である。
【０００３】
現在行われているブロッティングの方法は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎの報告した方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８；５０３，１９７５）に基づくもので、即ちゲルに密着させたニトロセルロース膜上に、紙タオルを数センチメートルの高さに積み上げ、この紙タオルに吸水させることによりゲル中の核酸を、上記ニトロセルロース膜（ブロッティング膜）に効率的に移動させるというものである。  最近では、吸水に真空ポンプを用い、あるいは核酸・蛋白質を電気的にゲルから溶出させ、これをニトロセルロース等のブロッティング膜へ移転させる方法等が開発され、そのための器機が市販されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法の問題点は、試料の移動におびただしい時間を要するということである。  例示すれば、数千塩基対程度のＤＮＡの場合の所要時間は数時間、ゲノムＤＮＡのように大きな分子になると十数時間から二十時間以上に及ぶ。  また吸水を効率的におこなうためには水分を含んだ多量の紙タオルを新しいものと交換しなければならない。  このために、一度に使用する紙タオルはかなりの量にのぼり、その費用は無視できないものとなる。
【０００５】
一方、電気泳動的に試料をゲルから膜へ移動させる方法や、真空ポンプを利用する方法は、短時間でブロッティングを完了させることができるが、これらの方法を実施するための装置が高価であり、またその操作についても前記したＳｏｕｔｈｅｒｎの方法にと比較しても煩雑である。  さらに真空ポンプを用いる方法では、圧力の設定を誤った場合、ゲルが破損し、折角の試料が損失するおそれがある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明は、下面より供給されるブロッティング溶液をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの内部に浸透させ、これをその上面に密着重合させたプロッティング膜を介して毛管現象により上方に吸引除去する過程で、上記アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル内に電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を前記プロッティング膜へ移動・吸着させる場合において、前記ブロッティング膜の上面には、粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにしたことを特徴とする高吸水性樹脂を利用したブロッティング方法に関する。
【０００７】
また本発明は、下面より供給されるブロッティング溶液を内部に浸透させるアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルと、該アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの上面に密着重合させるところの、上記アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル内に電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を毛管現象により吸引除去する過程で上方に移動・吸着させるためのブロッティング膜と、該ブロッティング膜上に載置される箱状の枠体と、該枠体内に撒かれる粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂とからなるブロッティング装置にも関する。
【０００８】
【作用】
上記の手段によれば、既述したＳｏｕｔｈｅｒｎの方法のように、試料の移動に長時間を要することなく、また紙タオルを大量に消費することなく、粒状若しくは粉末状の高吸水性樹脂とこれに載置する簡単なブロッティング補助装置とによって、操作が簡単になり、きわめて短時間でブロッティングを完了させることができる。
【０００９】
【実施例】
まず図１により本発明で用いるブロッティング装置について説明する。  溶液槽１にブロッティング溶液２となる適量のＳＳＣ溶液（０．０３Ｍ〜０．３Ｍクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ〜３Ｍ塩化ナトリウム）、又はアルカリブロッティング溶液を入れ、溶液槽１の中央に支持台３を載置する。  この支持台３に濾紙４を、両端が溶液２に浸るように被せる。  濾紙４がブロッティング溶液２を十分に吸収したところで、その上にアガロースゲル５を密着するように置く。  このアガロースゲル５は、すでに公知の方法により電気泳動後、変性、中和処理がおこなわれている。
【００１０】
このアガロースゲル５の上面にはブロッティング膜６が密着重合して置かれる。  すなわちブロッティング膜６としては、上記アガロースゲル５よりも１〜２ｍｍ大きく切った後、適切な前処理をおこなったニトロセルロース膜、またはナイロン膜が用いられる。  さらにこのブロッティング膜６の上には、後記する粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を直接に撒いてもよいが、好ましくはブロッティング終了後における吸水膨潤した上記高吸水性樹脂の後処理を容易にするために、適当な溶液で湿らせておいたゲル大の濾紙（一般にブロッティングに使用されるものならば何でもよい）７を１〜複数枚重ねて置く。
【００１１】
つぎに図２に示すようなブロッティング補助装置８を予め用意しておく。  これは底面積が汎用される電気泳動ゲルよりもひと周り大きく、高さが１〜２センチメートルの枠９からなる。  この枠９だけのブロッティング補助装置８を、上記により１〜複数枚重ねた濾紙７の上に直接載せ、濾紙７をブロッティング膜６に密着させる。  さらに枠９で囲まれた濾紙７の上には粒状若しくは粉末状の高吸水性樹脂１０が撒かれる。
【００１２】
高吸水性樹脂は低価格で供給され、一般的には農・園芸用、土木建築用、又は衛生材料として、多くはシート状に加工・形成たものが知られる。  しかし高吸水性樹脂をシート状に加工するには、紙や樹脂フィルム等他の材料との結合が必要で、必然的にある程度のコスト上昇は避けられない。  そこで本発明においてはこれを敢えてシート状に加工せずに、かえって使い勝手のよい粒状若しくは粉状体のまま使用するようにした。  ここで使用される高吸水性樹脂としては、デンプン系ポリマー、セルロース系ポリマー、又は合成ポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム架橋体、酢酸ビニルマレイン酸エステル共重合体等の粒状体若しくは粉末体が望ましく、平均粒径１５０〜３００μｍの粒状のものが最も好ましい。
【００１３】
また図３に示すブロッティング補助装置８は、向かい合う２組の枠９の下縁部が夫々内側に水平対向方向に張り出して縁１１を形成し、その１組の縁１１に濾紙１２の両端部を図４のように挟んで固定するためのスリット１３が形成されている。  このスリット１３に濾紙１２を挟んで固定し、しかもこの濾紙１２が前記したアガロースゲル５の上に重ねた濾紙７に密着するようにブロッティング補助装置８を置く。
【００１４】
枠９内の濾紙１２が濡れてきたら、濡れた部分の全体に、デンプン系ポリマー、セルロース系ポリマー、又は合成ポリマー等の高吸水性樹脂粒子若しくは粉末１０を均一に撒く。  濾紙１２はブロッティング補助装置８の重さにより周囲の縁１１の下面に押しつけられるばかりでなく、枠９により吸水して膨潤した高吸水性樹脂粒子若しくは粉末１０がこぼれ落ちるのを阻止する。
【００１５】
さらに、図５、図６に示すブロッティング補助装置８は、略相似形をなす内枠１４と外枠１５からなる。  外枠１５の向かい合う２組の枠１６の下部は、夫々内側水平方向に張り出して周囲を取り囲む縁１７を形成してある。  この縁１７上には、必要に応じて外枠１５の内側にすっぽり収まる寸法に裁断した濾紙１２が載せられ、さらにその上から内枠１４を嵌め込むことにより、濾紙１２をブロッティング補助装置８に固定することができる。  なお上記した何れのブロッティング補助装置８においても、耐塩性、対アルカリ性に優れた素材により構成するのが望ましい。
【００１６】
したがってこのブロッティング補助装置８を、前記した濾紙７上に載せ、枠９内の濾紙１２が濡れてきたら、濡れた部分の全体にデンプン系ポリマー、セルロース系ポリマー、又は合成ポリマー等の高吸水性樹脂の粒子若しくは粉末１０を均一に撒く。  この状態で室温下において、３０分〜１時間３０分間静置してブロッティングをおこなう。  ブロッティング終了後のブロッティング膜６は、表面に付着したアガロースゲル５の破片を洗い流し、適切な処理を経た後、ハイブリダイゼーション等の実験に供することができる。
【００１７】
つぎにＤＮＡのブロッティング（サザンブロッティング）の具体例について、以下において実施例をもとに説明する。
【００１８】
〔実施例１〕
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ニッポンジーン製）により分解したラムダファージＤＮＡ２μｇをエタノール沈殿により回収し、得られたＤＮＡ沈殿物を０．１ｍＭＥＤＴＡ５μｌに溶解した。  暗所において、このＤＮＡ溶液に１ｍｇ／ｍｌの酢酸フォトビオチン（Ｂｒｅｓａ製）５μｌを加え、混合した。  この混合液を水銀ランプ（東芝ケミカルランプ：ＦＬ２０Ｓ−ＢＬ）の下、光源から８ｃｍ離れた場所に置き、３５０〜３７０ｎｍの光を３時間照射した。  この後、滅菌蒸留水４０μｌと１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）５０μｌを加え、さらに２−ブタノール１００μｌを加え、混和した。
【００１９】
５０００ｒｐｍで１分間の遠心をおこない、次いでブタノール層を除去し、同様のブタノール抽出を再度繰り返した。  最後にブタノール層を除去後、水層についてエタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収した。  得られたＤＮＡ沈澱を０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２０μｌに溶解した。
【００２０】
ここで得られたビオチン標識ラムダファージＤＮＡを適宜希釈し、その一部（０．２５ｎｇ，０．５ｎｇ，１ｎｇ，２ｎｇ）について、０．７％アガロースゲルを用いて、電気泳動を行った。  泳動終了後、このゲル（大きさ５ｃｍ×６ｃｍ）を０．４Ｍ  ＮａＯＨ，０．６Ｍ  ＮａＣｌ中に移し、室温で３０分間振とうした。  このゲルを１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウムを吸収させたワットマン３ＭＭ濾紙（図１の４）の上に密着させて置き、さらにゲルの周囲を薄膜樹脂シートで覆った。
【００２１】
このゲルよりも１〜２ｍｍ大きめに切り、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで湿らせておいたブロッティング膜、Ｇｅｎｏ  ＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ製）を、ゲルの上に密着するように置き、更にこの上に０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで湿らせておいた、ゲルと同大のワットマン３ＭＭ濾紙（図１の７）を２枚重ねた。  次いで図４のようにブロッティング補助装置８の底面に濾紙１２を固定し、この濾紙１２の部分が図１の濾紙７に密着するように置き、この上にアクアリックＣａ  Ｋ−４（日本触媒化学製）０．５〜０．６ｇを濾紙全体の上に均一に撒いた。  この状態にて室温下で１時間３０分放置した。
【００２２】
この後、ブロッティング膜を取り出し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウム中で５分間振とうすることにより、膜表面に付着したゲルの破片等を除去した。  この膜をペーパータオル、又は濾紙等に挟み、室温下で十分に乾燥させた後、紫外線を照射することによりＤＮＡをブロッティング膜に固定させることができた。  さらにこの膜をウシ血清アルブミン３％を含むバッファー１（１００ｍＭ  トリス塩酸ｐＨ７．５，１Ｍ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣ１２，０．０５％  トリトンＸ−１００）２ｍｌとともに、ポリエチレン袋中に封入し、１時間、６５℃に保温した。
【００２３】
この後、ブロッティング膜をストレプトアビジンーアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）０．４ユニットを含むバッファー１  ２ｍｌ中で、室温、１０分間反応させた。  この膜は、７５ｍｌのバッファー１中で、室温にて２０分間振とうすることにより洗浄した。  この洗浄操作は３回繰り返した。  更に７５ｍｌのバッファー２（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ９．５  １Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、室温にて２０分間振とうすることにより洗浄し、これを２回繰り返した。
【００２４】
この後、ブロッティング膜を、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム塩、０．２ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモー４−クロロー３−インドリルリン酸を含むバッファー３（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ９．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ  ２）２ｍｌとともにポリエチレン袋に封入し、暗所に４０〜５０分間静置することにより発色させた。  ブロッティング膜を袋から取り出し、１５ｍｌのバッファー４（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、室温にて５分間振とうし、これを３回繰り返すことにより発色反応を停止させた。  この膜には図６に示すようにラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解物に相当する、２３ｋｂ，９．４ｋｂ，６．６ｋｂ，４．４ｋｂ，２．３ｋｂ，２．０ｋｂのバンドが観察され、高吸水性樹脂の粒子が溶液を急速に吸収した結果、ＤＮＡがゲルからブロッティング膜へきわめて短時間で移動したことが確認された。
【００２５】
〔実施例２〕
制限酵素Ｈｉｎｆ１（ニッポンジーン製）により分解したプラスミドｐＵＣ１９  ２μｇをエタノール沈殿により回収し、得られたＤＮＡ沈殿物を０．１ｍＭＥＤＴＡ５μｌに溶解した。  暗所において、このＤＮＡ溶液に１ｍｇ／ｍｌの酢酸フォトビオチン（Ｂｒｅｓａ製）５μｌを加え、混合した。  この混合液を水銀ランプ（東芝ケミカルランプ：ＦＬ２０Ｓ−ＢＬ）の下、光源から８ｃｍ離れた場所に置き、３５０〜３７０ｎｍの光を３時間照射した。
【００２６】
この後、滅菌蒸留水４０μｌと１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）５０μｌを加え、さらに２−ブタノール１００μｌを加え、混和した。  ５０００ｒｐｍで１分間の遠心をおこない、次いでブタノール層を除去し、再度２−ブタノール１００μｌを加え、混和した後、水層についてエタノール沈澱をおこない、ＤＮＡを回収した。  得られたＤＮＡ沈澱を０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２０μｌに溶解した。
【００２７】
こうして得られたビオチン標識ｐＵＣ１９を適宜希釈し、その一部（０．５ｎｇ，１ｎｇ，２ｎｇ，４ｎｇ）について、１．５％アガロースゲルを用いて、電気泳動を行った。  泳動終了後、このゲル（大きさ５ｃｍ×６ｃｍ）を０．４ＮＮａＯＨ，０．６Ｍ  ＮａＣｌ中にて、３０分間室温で振とうし、ゲル中のＤＮＡを変性せしめた。  この後、ゲルを０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）１．５Ｍ  ＮａＣｌ中に移し、室温で３０分間振とうした。  このゲルを図１の４に示すように、１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウムを吸収させたワットマン３ＭＭ濾紙の上に、密着するように置き、ゲルの周囲をサランラップで覆った。
【００２８】
このゲルよりも１〜２ｍｍ大きめに切り、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで湿らせておいたブロッティング膜、Ｇｅｎｏ  ＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ製）を、ゲルの上に密着するように置き、更にこの上に図１の７に示すように、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで湿らせておいた、ゲルと同大のワットマン３ＭＭ濾紙７を２枚重ねた。  次いで図４に示すように、ブロッティング補助装置８の底面に濾紙１２を固定し、この濾紙１２の部分が図１の濾紙７に密着するように置き、この上にアクアリックＣＡ  Ｋ−４（日本触媒化学製）０．５〜０．６ｇを濾紙７全体の上に均一に撒いた。  この状態にて室温下で１時間放置した。
【００２９】
この後、ブロッティング膜を取り出し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウム中で５分間振とうすることにより、膜表面に付着したゲルの破片等を除去した。  このブロッティング膜をペーパータオル、又は濾紙等に挟み、室温下で十分に乾燥させた後、紫外線を照射することによりＤＮＡを膜に固定させることができた。  さらにこのブロッティング膜をウシ血清アルブミン３％を含む、バッファー１（１００ｍＭ  トリス塩酸ｐＨ７．５，１Ｍ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０５％  トリトンＸ−１００）２ｍｌとともに、ポリエチレン袋中に封入し、１時間、６５℃に保温した。
【００３０】
この後、ブロッティング膜をストレプトアビジンーアルカリフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）０．４ユニットを含むバッファー１  ２ｍｌ中で、室温、１０分間反応させた。  この膜は、７５ｍｌのバッファー１中で、室温にて２０分間振とうすることにより洗浄した。  この洗浄操作は３回繰り返した。  更に７５ｍｌのバッファー２（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ９．５  ５．１Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、室温にて２０分間振とうすることにより洗浄し、これを２回繰り返した。
【００３１】
この後、ブロッティング膜を、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム塩、０．２ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモー４−クロロー３−インドリルリン酸を含むバッファー３（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ９．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２ｍｌとともにポリエチレン袋に封入し、暗所に４０〜５０分間静置することにより発色させた。  ブロッティング膜を袋から取り出し、１５ｍｌのバッファー４（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、室温にて５分間振とうし、これを３回繰り返すことにより発色反応を停止させた。  このブロッティング膜には図７に示すようにｐＵＣ１９のＨｉｎｆｌ分解物のうち、１．４ｋｂ，０．５ｋｂ，０．４ｋｂ，０．２ｋｂのバンドが観察され、高吸水性樹脂の粒子が溶液を急速に吸収した結果、ＤＮＡがゲルからブロッティング膜へきわめて短時間で移動したことが確認された。
【００３２】
【発明の効果】
以上詳述したように本発明は、核酸あるいは蛋白質のブロッティング作業を実施する際、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルの上面に密着重合されるブロッティング膜の上面に、吸水効率の高い粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにしたために、ブロッティングに要する時間が、これまでの大量のペーパータオルを使用していた場合の作業時間（１２時間から１５時間）に比して、３０分から１時間程度と、少なくとも１２分の１以下の画期的な短縮化をはかることができるばかりでなく、これまで大量に使い捨て使用されてきたペーパータオルを不要とすることができる。
【００３３】
さらに上記ブロッティング作業に際し、ブロッティング膜上には補助装置である箱状の枠体を載置するとともに該枠体内に粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒くようにした場合には、粒状若しくは粉末状の高吸水性樹脂が撒きやすくなり、またブロッティング作業中に次第に吸水膨潤して数十倍から数百倍の体積となった高吸水性樹脂がブロッティング膜上からこぼれ落ちるのを阻止することができ、ブロッティング作業を容易にするとともに作業効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で利用するブロッティング装置の断面図。
【図２】本発明のブロッティング補助装置の斜視図。
【図３】ブロッティング補助装置の別の実施例をあらわした斜視図。
【図４】図３のブロッティング補助装置に濾紙を固定し、その上に粒状もしくは粉末状の高吸水性樹脂を撒いた状態をあらわす斜視図。
【図５】更に別のブロッティング補助装置の実施例をあらわす斜視図。
【図６】ビオチン標識ランダファージＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ分解物のブロッティングＬａｎｅを示すクロマトグラフの写真。
【図７】ビオチン標識ｐｕｃ１９ＤＮＡ−Ｈｉｎｆ  Ｉ分解物のブロッティングを示すクロマトグラフの写真。
【符号の説明】
５        アガロースゲル
６        ブロッティング膜
７        濾紙
８        ブロッティング補助装置
９        枠
１０      高吸水性樹脂の粒子若しくは粉末
１１      縁
１２      濾紙
１３      スリット
１４      内枠
１５      外枠
【図１】
0003681179.tif 000002
【図２】
0003681179.tif 000003
【図３】
0003681179.tif 000004
【図４】
0003681179.tif 000005
【図５】
0003681179.tif 000006
【図６】
0003681179.tif 000007
【図７】
0003681179.tif 000008