(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質としてマルトースを含有する水溶液を用い、当該マルトース含有水溶液に、マルトースを基質としてこれをトレハロースに変換し、且つ、グルコース・１−リン酸とグルコースは基質としない酵素を作用させることにより行われる酵素反応により、グルコースリン酸を経由することなくマルトースをトレハロースに変換する工程と、得られるトレハロース含有糖質を採取する工程とを含んでなるトレハロース含有糖質の製造方法。
【請求項２】
基質としてマルトースを含有する水溶液が、澱粉にβ−アミラーゼ又はβ−アミラーゼとともに澱粉枝切酵素を作用させて得られるものである請求項１記載のトレハロース含有糖質の製造方法。
【請求項３】
マルトースを基質としてこれをトレハロースに変換し、且つ、グルコース・１−リン酸とグルコースは基質としない酵素反応が、下記（１）乃至（３）のいずれかのマルトース・トレハロース変換酵素を用いて行われる請求項１又は２記載のトレハロース含有糖質の製造方法；
（１）マルトースをトレハロースに変換しトレハロースをマルトースに変換する作用を有し、部分アミノ酸配列として、トリプトファン−フェニルアラニン−アルギニン−トレオニン−アラニン−バリン−フェニルアラニンを有し、且つ、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で、５７，０００乃至６７，０００ダルトンの分子量を有する、ピメロバクター属に属する微生物より得ることのできるマルトース・トレハロース変換酵素、
（２）マルトースをトレハロースに変換しトレハロースをマルトースに変換する作用を有し、部分アミノ酸配列として、トリプトファン−プロリン−アルギニン−プロリン−アラニン−アラニン−フェニルアラニンを有し、且つ、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で、１１０，０００乃至１２０，０００ダルトンの分子量を有する、シュードモナス属に属する微生物より得ることのできるマルトース・トレハロース変換酵素、
（３）マルトースをトレハロースに変換しトレハロースをマルトースに変換する作用を有し、部分アミノ酸配列として、アラニン−バリン−イソロイシン−チロシンを有し、且つ、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で、１００，０００乃至１１０，０００ダルトンの分子量を有する、サーマス属に属する微生物より得ることのできるマルトース・トレハロース変換酵素。
【請求項４】
マルトースのトレハロースへの変換率が、６０％を超えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のトレハロース含有糖質の製造方法。
【請求項５】
得られるトレハロース含有糖質に、さらにグルコアミラーゼ及び／又はα−グルコシダーゼを作用させる工程を含む請求項１乃至４のいずれかに記載のトレハロース含有糖質の製造方法。
【請求項６】
得られるトレハロース含有糖質を、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハロースの含量を向上させる工程を含む請求項１乃至５のいずれかに記載のトレハロース含有糖質の製造方法。
【請求項７】
さらに、トレハロースを結晶化する工程を含む請求項１乃至６のいずれかに記載のトレハロース含有糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する新規マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法、それを産生する微生物、並びに、このマルトース・トレハロース変換酵素を用いて製造されるトレハロース、又はこれを含む糖質、更には、これら糖質を含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、古くからトレハロース（α，α−トレハロース）が知られており、その存在は、非特許文献１及び非特許文献２などにも記載されているように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広範囲に及んでいる。トレハロースは、非還元性糖質ゆえにアミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起こさず、アミノ酸含有物質を損なわないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が望まれている。
【０００３】
トレハロースの製造方法としては、例えば、特許文献１で報告されている微生物を用いる方法や、特許文献２で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロース・ホスホリラーゼとの組合わせでマルトースを変換する方法などが知られている。しかしながら、微生物を用いる方法は、菌体を出発原料とし、これに含まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当たり１５質量％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、質量％を％と略称する。）未満と低く、その上、これを抽出・精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及びトレハロース・ホスホリラーゼなどホスホリラーゼを用いる方法は、いずれもグルコースリン酸を経由しており、その基質濃度を高めることが困難であり、また、反応系が平衡反応で目的物の生成率が低く、更には、反応系を安定に維持して反応をスムーズに進行させることが困難であって、未だ、工業的製造方法として実現するに至っていない。
【０００４】
一方、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元基を有し、固形物当たりの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）として表している。この値の大きいものは、一般的に、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。このような還元性澱粉部分分解物の種々の特性は、ＤＥの大小に依存しており、澱粉部分分解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられてきた。
【０００５】
これに関係して、非特許文献３の「オリゴ糖」の項において、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には不可能であるといわれている。」と記載されているように、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを製造することは、従来、学術的にも不可能であると考えられてきた。
【０００６】
しかしながら、本発明者等は、当業界のこの常識を覆し、特許文献３及び特許文献４で開示したように、澱粉を原料として製造されるグルコース重合度が３以上の還元性澱粉部分分解物に、その末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素を作用させて該非還元性糖質を生成せしめ、次いで、これにグルコアミラーゼ、又はトレハロース遊離酵素を作用させることにより、還元性澱粉部分分解物からトレハロースを酵素的に生産することに成功している。しかしながら、この非還元性糖質生成酵素を用いるトレハロース製造方法では、グルコース重合度が３以上の比較的高分子の澱粉糖質を原料とするものであり、その粘度も比較的高く、酵素の種類も２種以上を必要とし、得られる反応物の糖組成も比較的複雑でトレハロース製造におけるコスト高が懸念される。そこで、澱粉から工業的に製造され、安定供給されているグルコース重合度２の澱粉部分分解物、マルトースをトレハロースに変換するトレハロースの新規製造方法の確立が望まれる。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５０−１５４４８５号公報
【特許文献２】特開昭５８−２１６６９５号公報
【特許文献３】特願平４−３６２１３１号明細書
【特許文献４】特願平５−１５６３３８号明細書
【非特許文献１】『アドバンシズ・イン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６３年）アカデミック・プレス社（米国）
【非特許文献２】『アプライド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２１３乃至３２１５頁（１９９０年）
【非特許文献３】『月刊フードケミカル』、８月号、第６７乃至７２頁、「澱粉利用開発の現状と課題」（１９９２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、澱粉から工業的に製造され、安定供給されているマルトースをトレハロースに変換するマルトース・トレハロース変換酵素と該酵素を利用したトレハロース、又は、これを含む糖質の新規製造方法並びにその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するためにマルトースからトレハロースを生成する全く新しい変換酵素を求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、岡山県岡山市の土壌から分離したピメロバクター（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物Ｒ４８、兵庫県西宮市の土壌から分離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する新規な微生物Ｈ２６２、並びに公知のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物がマルトースをトレハロースに変換する新規マルトース・トレハロース変換酵素を産生することを見いだし、本酵素をマルトース含有溶液に作用させ得られるトレハロース及びこれを含む糖質の製造方法を確立し、併せて、これら糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立して本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースをトレハロースへ高変換率で転換する。従って、本発明の確立は、安価で無限の資源である澱粉に由来するマルトースから、トレハロースとこれを含む糖質を、工業的に大量かつ安価に供給する全く新しい道を拓くものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のピメロバクター属に属する微生物Ｒ４８、並びにシュードモナス属に属する微生物Ｈ２６２の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準拠して行った。
【００１２】
＜ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８の同定試験結果＞
＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃：
通常、０．５乃至０．９×１．５乃至４．０μｍの桿菌。単独、希にＶ型の対をなし、連鎖した細胞も観察される。運動性なし。無胞子。非抗酸性。グラム陽性。
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、２７℃：
培養１日の細胞の大きさは、０．６乃至１．０×１．３乃至４．２μｍ、培養３日で０．６乃至１．０×１．０乃至２．５μｍとなり、球菌に近い細胞もみられ、多形性が認められる。また、単独、希にＶ型の対をなし、連鎖した細胞も観察される。
【００１３】
＜Ｂ：培養的性質＞
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃
形状    ：円形  大きさは２４時間で０．５ｍｍ。３日で１．５乃至２ｍｍ。
周縁    ：波状
隆起    ：半レンズ状
光沢    ：なし
表面    ：しわ状
色調    ：不透明、クリーム色。
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、２７℃
形状    ：円形  大きさは３日で約１乃至１．５ｍｍ。
周縁    ：波状
隆起    ：半レンズ状
光沢    ：なし
表面    ：粗面
色調    ：不透明、クリーム色。
（３）肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育度    ：良好
形状      ：糸状
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
：液化
【００１４】
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）硝酸塩の還元性        ：陽性
（２）脱窒反応              ：陰性
（３）メチルレッド試験      ：陰性
（４）ＶＰ試験              ：陰性
（５）インドールの生成      ：陰性
（６）硫化水素の生成        ：陽性
（７）澱粉の加水分解        ：陰性
（８）クエン酸の利用        ：陽性
（９）無機窒素源の利用      ：アンモニウム塩及び硝酸塩ともに利用できる。
（１０）色素の生成          ：陰性
（１１）ウレアーゼ          ：陰性
（１２）オキシダーゼ        ：陰性
（１３）カタラーゼ          ：陰性
（１４）生育の範囲          ：ｐＨ５乃至９、温度１５乃至４０℃。
（１５）酸素に対する態度    ：好気性
（１６）炭素源の利用と酸生成の有無
利用性          酸生成能
Ｄ−グルコース        利用する          陰性
Ｄ−ガラクトース      利用しない        陰性
Ｄ−マンノース        利用する          陰性
Ｄ−フラクトース      利用する          陰性
Ｌ−アラビノース      利用する          陰性
Ｄ−キシロース        利用する          陰性
Ｌ−ラムノース        利用する          陰性
マルトース            利用する          陰性
スクロース            利用する          陰性
ラクトース            利用しない        陰性
トレハロース          利用する          陰性
ラフィノース          利用する          陰性
マンニトール          利用しない        陰性
デキストリン          利用する          陰性
ズルチトール          利用しない        陰性
（１７）アミノ酸の脱炭酸試験：Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。
（１８）アミノ酸の利用：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムいずれも利用する。
（１９）ＤＮａｓｅ                ：陰性
（２０）３−ケトラクトースの生成  ：陰性
（２１）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量        ：７２％
（２２）細胞壁の主要ジアミノ酸    ：ＬＬ−ジアミノピメリン酸
【００１５】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第２巻（１９８６年）、及び、『ジャーナル・オブ・ジェネラル・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第２９巻、第５９乃至７１頁、（１９８３年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、ピメロバクター属に属する菌株で、新規マルトース・トレハロース変換酵素を産生する新規微生物であることが判明した。
【００１６】
これらの結果から、本発明者等は、本微生物をピメロバクター・スピーシーズ（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｒ４８と命名し、平成５年６月３日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１５として受託された。
【００１７】
＜シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２の同定試験結果＞
＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃：
通常０．５〜０．７×１．０〜２．０μｍの桿菌で胞子は形成しない。極鞭毛による運動性あり。グラム陰性。非抗酸性。
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、２７℃：
培養１日の細胞の大きさは、０．６〜０．８×２．０〜４．０μｍ
【００１８】
＜Ｂ：培養的性質＞
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃
形状    ：円形、大きさは２４時間で１〜２ｍｍ。３日で３．５〜４ｍｍ
周縁    ：全縁
隆起    ：半レンズ状
光沢    ：湿光
表面    ：平滑
色調    ：不透明、白〜うすい黄色
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、２７℃
形状    ：円形  大きさは３日で約４〜５ｍｍ
周縁    ：全縁
隆起    ：半レンズ状
光沢    ：湿光
表面    ：平滑
色調    ：不透明、白〜クリーム色
（３）肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育度    ：良好
形状    ：糸状。隆起は薄く、表面は平滑で湿光、不透明でやや黄味がかったクリーム色
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
：液化しない
【００１９】
＜Ｃ：生理学的性質＞
（１）硝酸塩の還元性        ：陽性（コハク酸培地）
（２）脱窒反応              ：陰性
（３）メチルレッド試験      ：陰性
（４）ＶＰ試験              ：陰性
（５）インドールの生成      ：陰性
（６）硫化水素の生成        ：陰性
（７）澱粉の加水分解        ：陰性
（８）ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積    ：陰性
（９）プロカテク酸の分解    ：オルト型
（１０）クエン酸の利用      ：陽性
（１１）無機窒素源の利用    ：アンモニウム塩及び硝酸塩ともに利用できる。
（１２）色素の生成          ：うすい黄色の色素生成
（１３）蛍光性色素の生成    ：陽性
（１４）ウレアーゼ          ：陽性
（１５）オキシダーゼ        ：陽性
（１６）カタラーゼ          ：陽性
（１７）生育の範囲          ：ｐＨ５乃至９、温度１０乃至３７℃
（１８）酸素に対する態度    ：好気性
（１９）炭素源の利用と酸生成の有無
利用性          酸生成能
Ｄ−グルコース        利用する          陰性
Ｄ−ガラクトース      利用しない        陰性
Ｄ−マンノース        利用する          陽性
Ｄ−フラクトース      利用する          陽性
Ｌ−アラビノース      利用する          陽性
Ｄ−キシロース        利用する          陽性
Ｌ−ラムノース        利用しない        陰性
マルトース            利用しない        陰性
スクロース            利用しない        陰性
ラクトース            利用しない        陰性
トレハロース          利用しない        陰性
ラフィノース          利用しない        陰性
マンニトール          利用しない        陰性
ソルビトール          利用しない        陰性
ズルチトール          利用しない        陰性
グリセロール          利用する          陽性
（２０）アミノ酸の脱炭酸試験  ：Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチンに対して陰性。Ｌ−アルギニンに対して陽性。
（２１）アミノ酸の利用    ：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリン、Ｄ−アラニンいずれも利用する。Ｌ−トリプトファンを利用しない。
（２２）ＤＮａｓｅ            ：陰性
（２３）３−ケトラクトースの生成  ：陰性
（２４）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量    ：６３％
【００２０】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第１巻（１９８４年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、シュードモナス・プチダに属する菌株であることが判明した。
【００２１】
これらの結果から本発明者らは、本微生物をシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２と命名し、平成６年２月２３日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７９として受託された。
【００２２】
本発明では、上記菌株のみならず、ピメロパクター属及びシュードモナス属に属し、マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用することができる。
【００２３】
また、本発明に用いられる微生物としては、前記の新規微生物だけでなく、公知のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物、例えば、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２５１０４、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ４３２８０、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ４３８１４、及びサーマス・スピーシーズ  ＡＴＣＣ４３８１５なども有利に利用できる。
【００２４】
本発明の微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化できる物であればよく、例えば、グルコース、フラクトース、糖蜜、トレハロース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、培養液のグルコースの濃度は、４０ｗ／ｖ％以下が望ましく、微生物の生育及び増殖からは１０ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。
【００２５】
培養は、微生物が生育し、本発明の酵素を産生する温度が適しており、通常、温度約４乃至８０℃、好ましくは約２０乃至７５℃、ｐＨ約５乃至９、好ましくはｐＨ約６乃至８．５から選ばれる条件で、好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは約１０乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、約０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、酸素を使用したり、また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００２６】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、培養物の菌体外培養液及び菌体のいずれにも認められ、菌体外培養液及び菌体を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用いることができるが、好ましくは通常の手段で濃縮する。例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用される。
【００２７】
菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽出し、粗酵素液として用いることができる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。
【００２８】
更に、菌体外培養液及びその濃縮物又は菌体抽出液は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養物から分離した菌体をそのまま粗酵素として用いることができるが、固定化菌体として用いてもよい。一例として、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させる。この粒状化菌体をさらにポリエチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理した固定化酵素として用いてもよい。
【００２９】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、モノＱ  ＨＲ５／５樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、トヨパールＨＷ−５５樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどを組合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００３０】
このようにして得られるマルトース・トレハロース変換酵素は、下記の理化学的性質を有する。
（１）作用
マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２０，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至５．１。
（４）活性阻害
１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害を受ける。
（５）起源
微生物により産生された酵素である。
【００３１】
由来微生物の違いによる具体例を示せば次の通りである。
＜ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８由来のマルトース・トレハロース変換酵素＞
（１）作用
マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトースを生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至６７，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至５．１。
（４）活性阻害
１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害を受ける。
（５）至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応で、２０℃付近。
（６）至適ｐＨ 
２５℃、６０分間反応で、約７．０乃至８．０。
（７）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０℃付近まで安定。
（８）ｐＨ安定性 
２０℃、６０分間保持で、約６．０乃至９．０。
【００３２】
＜シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２由来のマルトース・トレハロース変換酵素＞
（１）作用
マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトースを生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１１０，０００乃至１２０，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至５．１。
（４）活性阻害
１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害を受ける。
（５）至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応で、３７℃付近。
（６）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、約７．３乃至８．３。
（７）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、４０℃付近まで安定。
（８）ｐＨ安定性
３５℃、６０分間保持で、約６．０乃至９．５。
【００３３】
＜サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３由来のマルトース・トレハロース変換酵素＞
（１）作用
マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトースを生成する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１００，０００乃至１１０，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約３．８乃至４．８。
（４）活性阻害
１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害を受ける。
（５）至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応で、６５℃付近。
（６）至適ｐＨ 
６０℃、６０分間反応で、約６．０乃至６．７。
（７）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８０℃付近まで安定。
（８）ｐＨ安定性
６０℃、６０分間保持で、約５．５乃至９．５。
【００３４】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルトース２０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃、３５℃あるいは６０℃とし、６０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応液を正確に５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で１１倍に希釈し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５℃、１２０分間インキュベートした後、この反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液及びトレハラーゼを用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成するトレハロース量を求め、その活性１単位は、１分間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義する。
【００３５】
なお、反応温度は、マルトース・トレハロース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来の場合に２５℃とし、シュードモナス属に属する微生物由来の場合に３５℃とし、サーマス属に属する微生物由来の場合に６０℃とした。
【００３６】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換できるので、基質は目的に適うものを選べばよい。トレハロースを製造しようとする目的のためには、マルトースを基質にすればよい。
【００３７】
マルトースとしては、本発明のマルトース・トレハロース変換酵素が作用してトレハロースを生成するものであればよく、一般的には、できるだけ高純度の、望ましくは純度７０％以上のマルトース高含有物が用いられる。市販のマルトースを用いることも、また、常法に従って、澱粉を糖化して調製したマルトースを用いることも有利に実施できる。
【００３８】
マルトースを澱粉から調製する方法としては、例えば、特公昭５６−１１４３７号公報、特公昭５６−１７０７８号公報などに開示されている糊化又は液化澱粉にβ−アミラーゼを作用させ、生成するマルトースを高分子デキストリンから分離し、マルトース高含有物を採取する方法、又は、例えば、特公昭４７−１３０８９号公報、特公昭５４−３９３８号公報に開示されている糊化、又は液化澱粉にβ−アミラーゼとともにイソアミラーゼ、プルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を作用させてマルトース高含有物を採取する方法などがある。
【００３９】
更に、これら方法で得られるマルトース高含有物に含まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、例えば、特公昭５６−２８１５３号公報、特公昭５７−３３５６号公報、特公昭５６−２８１５４号公報などに開示されている酵素を作用させてマルトース含量を高めるか、更には、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去するなどの方法によりマルトース含量を更に高めることも好都合である。
【００４０】
本発明の基質濃度は特に限定されない。例えば、基質溶液としてマルトースを０．１％で用いた場合でも、５０％で用いた場合でも、本酵素の反応は進行し、トレハロースを生成する。また、基質溶液中に完全に溶けきれない基質を含有する高濃度溶液であってもよい。反応温度は酵素が失活しない温度、すなわち８０℃付近までで行えばよいが、好ましくは約０乃至７０℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、約５．５乃至９．０の範囲に調整すればよいが、好ましくはｐＨ約６．０乃至８．５の範囲に調整する。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約０．１乃至１００単位の酵素使用量で０．１乃至１００時間程度である。
【００４１】
このようにして得られる反応液は、基質マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、最大で約７０乃至８５％にも達することが判明した。
【００４２】
反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品とすることも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には結晶製品にすることも随意である。
【００４３】
必要ならば、更に、高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、アルカリ処理による還元性糖質の分解除去などの方法で精製することにより、高純度のトレハロース製品を得ることも容易である。また、カラムクロマトグラフィーなどにより分離し得られるマルトースを、再び、本発明のマルトース・トレハロース変換酵素の基質に用いてトレハロースへの変換反応を行うことも有利に実施できる。
【００４４】
このようにして得られた本発明のトレハロース含有糖質を、必要により、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼなどで加水分解したり、澱粉部分分解物などを加え、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで糖転移したりして、甘味性、還元力、粘性などを調整することも、また、アルカリ処理して還元性糖質を分解除去したり、酵母により還元性糖質を発酵除去すること、更には、水素添加して還元性糖質を糖アルコールにして還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施すことも随意である。これを、前述の精製方法、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取し、これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース含水結晶又は無水結晶トレハロースを得ることも有利に実施できる。
【００４５】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去してトレハロース高含有画分を採取する方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００４６】
トレハロース含水結晶を製造するには、例えば、純度６０％以上、濃度６５乃至９０％のトレハロース含有液を助晶機にとり、必要に応じて、約０．１乃至２０％の種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で、撹拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。また、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用することも有利に実施できる。マスキットからトレハロース含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００４７】
分蜜方法の場合には、通常、マスキットをバスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適である。
【００４８】
噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度約６０乃至８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温度、例えば、約６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで３０乃至６０℃程度の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
【００４９】
また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分約１０乃至２５％、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを数時間乃至３日間程度静置して全体をブロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
【００５０】
また、無水結晶トレハロースを製造するには、トレハロース含水結晶を乾燥して変換生成させることもできるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度トレハロース高含有溶液を助晶機にとり、種晶共存下で５０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で撹拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法、押し出し造粒方法などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【００５１】
このようにして製造される本発明のトレハロースは、還元力がなく、安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸又はアミノ基を含有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、それ自身が良質で上品な甘味を有している。更に、トレハロースは、体内のトレハラーゼにより容易にグルコースに分解されることから、経口摂取した場合、容易に消化吸収され、カロリー源として利用される。また、虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００５２】
また、安定な甘味料であることより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性などの性質も具備している。
【００５３】
従って、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５４】
本発明のトレハロース及びこれを含む糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５５】
また、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することも随意である。
【００５６】
また、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５７】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００５８】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳飲料、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物への甘味付けに呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００５９】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００６０】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン２などのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の健康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００６１】
以上述べたような各種組成物にトレハロース及びこれを含む糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、０．１％以上、望ましくは、１％以上含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００６２】
＜実験１：酵素の生産＞
グルコース２．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１１５℃、３０分間滅菌し、冷却して、ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１５）を接種し、２７℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６３】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約４０時間通気撹拌培養した。
【００６４】
培養液のマルトース・トレハロース変換酵素活性は、０．５５単位／ｍｌであった。培養液の一部を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、０．５単位／ｍｌの活性が、培養液上清には、０．０５単位／ｍｌの活性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を２５℃にして測定した。
【００６５】
＜実験２：酵素の精製＞
実験１で得た培養液を遠心分離して湿質量約０．５ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約５ｌをヴィブローゲン  セルミル（エドモンドビューラー社製）にかけ、菌体を破砕し、この破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することにより、約４．５ｌの上清を得た。その上清液に飽和度０．３になるように硫安を加え溶解させ、４℃、４時間放置した後、遠心分離することにより上清を回収した。
【００６６】
更に、その液に飽和度０．８になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離することにより硫安塩析物を回収した。
【００６７】
得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００６８】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチルトヨパール  ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００６９】
続いて、モノＱ  ＨＲ５／５  カラム（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0003725148.tif 000002
【００７１】
精製した酵素標品を７．５％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００７２】
＜実験３：酵素の性質＞
実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約５７，０００乃至６７，０００ダルトンであった。
【００７３】
精製マルトース・トレハロース変換酵素標品を２％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約４．１乃至５．１であった。
【００７４】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ７．０、６０分間反応で２０℃付近、至適ｐＨは、２５℃、６０分間反応で約７．０乃至８．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で２０℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は３０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．０であった。なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【００７５】
＜実験４：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、基質になりうるかどうかの試験をした。グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、可溶性澱粉、アミロース（平均重合度１８）、トレハロース、ネオトレハロース、ゲンチオビオース、コージビオース、イソマルトース、セロビオース、マルチトール、シュクロース、マルツロース、ツラノース、パラチノース、トレハルロース、あるいはラクトースの溶液、更に、α−グルコース・１−リン酸と等量のグルコース、又は、β−グルコース・１−リン酸と等量のグルコースとを含む溶液を調製した。
【００７６】
これらの溶液に、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を５ｗ／ｖ％になるよう調整し、これを２０℃、ｐＨ７．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製、アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称する。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回展開した。発色は２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で１０分間加熱しておこなった。結果を表２に示す。
【００７７】
【表２】
0003725148.tif 000003
【００７８】
表２の結果から明かなように、本発明の酵素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハロースにのみ作用し、その他の糖質、とりわけ、α−グルコース・１リン酸とグルコースとを含む系や、β−グルコース・１−リン酸とグルコースとを含む系に作用しないことから、従来知られているマルトース・ホスホリラーゼやトレハロース・ホスホリラーゼなどのホスホリラーゼとは違い、新規な酵素であることが判明した。
【００７９】
＜実験５：マルトース又はトレハロースからの生成物＞
最終濃度５％のマルトース水溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たり２単位加え、２０℃、ｐＨ７．０で２４時間作用させた。酵素反応液の糖組成は、ガスクロマトグラフィー（以下、ＧＬＣと略称する。）で分析した。酵素反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後トリメチルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグラフ装置はＧＣ−１６Ａ（株式会社島津製作所製）、カラムは２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出は水素炎イオン検出器を用いた。その結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
0003725148.tif 000004
【００８１】
表３の結果から明かなように、反応生成物Ｘが多量に生成し、その保持時間が市販トレハロースのそれと一致していることが判明した。反応生成物Ｘを同定するために次の確認試験を行った。すなわち、前述のマルトースを基質とした酵素反応液を糖濃度２％になるよう２０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で希釈し、この０．５ｍｌにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）０．１単位を加え４０℃で２０時間反応させた。
【００８２】
また、同様に酵素反応液を糖濃度２％になるよう２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．０で希釈し、この０．５ｍｌにトレハラーゼ０．５単位を加え４０℃で２０時間反応させた。マルトースを基質とした酵素反応液、そのグルコアミラーゼ処理液及びトレハラーゼ処理液をＧＬＣで分析、比較したところ、グルコアミラーゼ処理によりマルトースは完全にグルコースに分解され、反応生成物Ｘは分解されずに残存していた。
【００８３】
一方、トレハラーゼ処理によりマルトースは残存していたが、反応生成物Ｘは完全にグルコースに分解された。グルコアミラーゼ及びトレハラーゼの反応特性を考慮すると、本発明の新規酵素によって生成するマルトースからのオリゴ糖はトレハロースであると判断される。
【００８４】
更に、トレハロースを基質として、マルトースの場合と同様の条件で精製酵素を作用させ、その反応液も同様にＧＬＣ分析したところ、本発明の酵素によってトレハロースからはマルトースが生成することが判明した。以上のＧＬＣ分析結果をまとめて表４に示す。
【００８５】
【表４】
0003725148.tif 000005
【００８６】
表４の結果から明かなように、本発明の酵素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、約７０％以上になることが判明した。
【００８７】
＜実験６：トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の影響＞
マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２０％あるいは４０％で、温度２０℃、ｐＨ７．０にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。
【００８８】
この反応液の全糖量をアンスロン硫酸法で、還元糖量をソモギー・ネルソン法でグルコース換算で定量し、全糖量に対する還元糖量の割合を還元力として算出した。
【００８９】
また、この反応液を糖濃度約１％になるよう希釈し、少量限外濾過器モルカットＩＩ  ＬＧＣ（日本ミリポアリミテッド製）にて除蛋白を行い、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する。）にて糖組成を分析した。ＨＰＬＣの装置はＣＣＰＤシステム（東ソー株式会社製）、分析カラムはＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＰＡ−０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィー製）、溶離液はアセトニトリル：水＝７８：２２（容積比）を流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで、検出は示差屈折計で行った。それらの結果を表５に示す。
【００９０】
【表５】
0003725148.tif 000006
【００９１】
表５の結果から明かなように、基質のマルトース濃度に関係なく、マルトースからのトレハロースへの変換反応はよく進行し、トレハロースへ約８０％変換した。
【００９２】
＜実験７：トレハロース生成に及ぼす温度の影響＞
マルトース濃度２０％で、ｐＨ７．０にして、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて、温度５℃、１０℃、１５℃、２０℃あるいは２５℃で反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。この酵素反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣにて糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロース含量を表６に示す。
【００９３】
【表６】
0003725148.tif 000007
【００９４】
表６の結果から明かなように、反応温度が高いほどトレハロース生成速度は高くなる傾向にあったが、温度５℃でもマルトースからのトレハロースへの変換反応はよく進行し、トレハロースへ約８２％変換した。
【００９５】
＜実験８：マルトースからのトレハロースの調製＞
マルトース（株式会社林原生物化学研究所製）１０質量部を水４０質量部に溶解し、温度１５℃、ｐＨ７．０にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約７４％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約７８％に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として固形物当たり０．１％添加し、室温に一夜放置したところ、結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結晶に少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度９９．８％の極めて高純度のトレハロース含水結晶約３．０質量部を得た。
【００９６】
＜実験９：酵素の生産＞
グルコース２．０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１１５℃で、３０分間滅菌し、冷却して、シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７９）を接種し、２７℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養したものを種培養とした。
【００９７】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０時間通気撹拌培養した。
【００９８】
培養液のマルトース・トレハロース変換酵素活性は、０．１２単位／ｍｌであった。培養液の一部を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、０．１１単位／ｍｌの活性が、培養液上清には、０．０１単位／ｍｌの活性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を３５℃にして測定した。
【００９９】
＜実験１０：酵素の精製＞
実験９で得た培養液を遠心分離して湿質量約０．４５ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約２ｌを超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社販売）で処理し、菌体を破砕し、この破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することにより、約１．７ｌの上清を得た。その上清液に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離することにより硫安塩析物を回収した。
【０１００】
得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【０１０１】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を回収した後、同緩衝液に対して透析し、再度、ＤＥＡＥ−トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を食塩０．１Ｍから０．３Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【０１０２】
続いて、トヨパール  ＨＷ−５５Ｓ（東ソー株式会社製造）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量４００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活性、収率を表７に示す。
【０１０３】
【表７】
0003725148.tif 000008
【０１０４】
精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１０５】
＜実験１１：酵素の性質＞
実験１０の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１０，０００乃至１２０，０００ダルトンであった。
【０１０６】
精製マルトース・トレハロース変換酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約４．１乃至５．１であった。
【０１０７】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ７．０、６０分間反応で３７℃付近、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約７．３乃至８．３であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で３５℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．５であった。なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【０１０８】
＜実験１２：各種糖質への作用＞
反応温度を３５℃とした以外は、実験４の方法に準じて、実験１０で得たシュードモナス・プチダ  Ｈ２６２の精製酵素を各種糖質に作用させて、基質になりうるかどうかの試験をした。その結果、シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２の酵素は、ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８の酵素と同様、マルトースとトレハロースにのみ作用しマルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換した。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、約７０％になることが判明した。
【０１０９】
＜実験１３：トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の影響＞
マルトース濃度を５％、１０％、２０％あるいは３０％で、温度３５℃、ｐＨ７．０にて、実験１０の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。
【０１１０】
この反応液を用いて、実験６と同様に還元力及び糖組成を測定した。それらの結果を表８に示す。
【０１１１】
【表８】
0003725148.tif 000009
【０１１２】
表８の結果から明らかなように、基質のマルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生成した。
【０１１３】
＜実験１４：マルトースからのトレハロースの調製＞
マルトース（株式会社林原生物化学研究所販売）１０質量部を水４０質量部に溶解し、温度３５℃、ｐＨ７．０にして、本発明の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約６９％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約７８％に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として固形物当たり０．１％添加し、室温に一夜放置したところ、結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結晶に少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度９９．７％の極めて高純度のトレハロース結晶約２．３質量部を得た。
【０１１４】
＜実験１５：酵素の生産＞
ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．０７ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．０１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０２ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．０１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．５に調整した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で、２０分間滅菌し、冷却して、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養したものを種培養とした。
【０１１５】
容量３０ｌのファーメンター２基に種培養の場合と同組成の培地をそれぞれ約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度６０℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０時間通気撹拌培養した。
【０１１６】
培養液のマルトース・トレハロース変換酵素活性は０．３５単位／ｍｌであった。培養液の一部を採り、遠心分離して菌体と培養上清液とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養上清液のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には０．３３単位／ｍｌの酵素活性が、また、培養液上清には０．０２単位／ｍｌの酵素活性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を６０℃にして測定した。
【０１１７】
＜実験１６：酵素の精製＞
実験１５で得られた培養液を遠心分離して湿質量約０．２８ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．９ｌを、超音波破砕機  モデルＵＳ３００（株式会社日本精機製作所製）で処理し、菌体を破砕した。この破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することにより、約１．８ｌの上清を得た。その上清に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫安塩析物を回収した。
【０１１８】
得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（１５６０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量５３０ｍｌ）を３回に分けて行った。
【０１１９】
本発明のマルトース・トレハロース変換酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、次に、ブチルトヨパール  ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【０１２０】
次に、トヨパール  ＨＷ−５５Ｓ（東ソー株式会社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【０１２１】
続いて、モノＱ  ＨＲ５／５  カラム（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１．０ｍｌ）を行い、食塩０．１Ｍから０．３５Ｍのリニアグラジエントにより溶出した酵素活性画分を回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活性、収率を表９に示す。
【０１２２】
【表９】
0003725148.tif 000010
【０１２３】
精製した酵素標品を５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【０１２４】
＜実験１７：酵素の性質＞
実験１６の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１００，０００乃至１１０，０００ダルトンであった。
【０１２５】
精製マルトース・トレハロース変換酵素標品を２％ｗ／ｖアンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約３．８乃至４．８であった。
【０１２６】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ７．０、６０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨは、６０℃、６０分間反応で６．０乃至６．７であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で６０℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約８０℃付近までであり、ｐＨ安定性は５．５乃至９．５であった。なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ＋＋、Ｈｇ＋＋又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【０１２７】
＜実験１８：各種糖質への作用＞
反応温度を５０℃とした以外は、実験４の方法に準じて、実験１６で得たサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の精製酵素を各種糖質に作用させて、基質になりうるかどうかの試験をした。その結果、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の酵素はピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８の酵素、あるいは、シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２の酵素と同様、マルトースとトレハロースにのみ作用しマルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換した。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、マルトースからトレハロースへの変換率が高く、７０％以上になることが判明した。
【０１２８】
＜実験１９  トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の影響＞
マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２０％あるいは４０％で、温度６０℃、ｐＨ６．５にて、実験１６の方法で得たサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２．５単位加えて反応させ、７２時間目に反応液を採取し、１００℃で３０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を用いて、実験６と同様に還元力及び糖組成を測定した。その結果を表１０に示した。
【０１２９】
【表１０】
0003725148.tif 000011
【０１３０】
表１０の結果から明らかなように、基質のマルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生成した。
【０１３１】
＜実験２０：トレハロース生成に及ぼす温度の影響＞
マルトース濃度２０％で、ｐＨ６．５にして、実験１６の方法で得たサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２．５単位加えて、温度４０℃、５０℃、６０℃、あるいは７０℃で反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で３０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣにて糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロース含量を表１１に示す。
【０１３２】
【表１１】
0003725148.tif 000012
【０１３３】
表１１の結果から明らかなように、マルトースからのトレハロースへの変換率は反応温度が低いほど高く、４０℃においてトレハロースへ約８０％変換した。
【０１３４】
＜実験２１：他の微生物からのマルトース・トレハロース変換酵素の生産とその性質＞
公知微生物のうち、本発明のマルトース・トレハロース変換酵素産生能の確認された特定の微生物を、実験１５の場合に準じて三角フラスコにて４８時間培養した。培養液の酵素活性を調べた後、実験１６の方法に準じて、培養液を破砕装置にかけ、その上清を透析して、部分精製酵素を得、実験１７の方法に従って、その性質を調べた。結果を表１２に示した。
【０１３５】
【表１２】
0003725148.tif 000013
【０１３６】
表１２に示すこれらサーマス属に属する公知微生物由来の部分精製酵素を用いて、実験１８の方法に従って、各種糖質への作用を調べたところ、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素の場合と同様に、マルトースとトレハロースにのみ作用し、マルトースからトレハロースを生成することが判明した。
【０１３７】
また、サーマス・ルーバー  ＡＴＣＣ３５９４８のマルトース・トレハロース変換酵素は、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の酵素に比し、その至適温度、安定温度は低かったが、他のサーマス属の酵素は、サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３の酵素とほぼ同じ性質を示し、耐熱性の高いことが判明した。
【０１３８】
＜実験２２：マルトース・トレハロース変換酵素の部分アミノ酸配列＞
実験２の方法で得られたピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８由来の精製酵素標品、実験１０の方法で得られたシュードモナス・プチダ  Ｈ２６２由来の精製酵素標品及び実験１６の方法で得られたサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３由来の精製酵素標品の一部を、それぞれ蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、プロテインシーケンサーモデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製造、米国）を用いて分析した。それぞれ得られたＮ末端配列を表１３に示す。
【０１３９】
【表１３】
0003725148.tif 000014
【０１４０】
すなわち、ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８由来の酵素は配列表における配列番号１、シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２由来の酵素は配列表における配列番号２、及びサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素は配列表における配列番号３でそれぞれ示されるＮ末端アミノ酸配列を有していた。表１３の結果から明かなように、ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８由来の酵素と、シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２由来の酵素及びサーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素とは、相同性の極めて高い部分アミノ酸配列を有していることが判明した。すなわち、ピメロバクター属微生物由来酵素のＮ末端側から第１０番目のトリプトファンから第１６番目のフェニルアラニンまでの部分アミノ酸配列とシュードモナス属微生物由来酵素のＮ末端側から第３番目のトリプトファンから第９番目のフェニルアラニンまでの部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、トリプトファン−Ｘ１−アルギニン−Ｘ２−アラニン−Ｘ３−フェニルアラニン（但し、Ｘ１はフェニルアラニン又はプロリンを意味し、Ｘ２はトレオニン又はプロリンを意味し、Ｘ３はバリン又はアラニンを意味する。）で表すことができる。また、ピメロバクター属微生物由来酵素のＮ末端側から１４番目のアラニンから１７番目のチロシンまでの部分アミノ酸配列とサーマス属微生物由来酵素のＮ末端側から９番目のアラニンから１２番目のチロシンまでの部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、アラニン−バリン−Ｘ４−チロシン（但し、Ｘ４はフェニルアラニン又はイソロイシンを意味する。）で表すことができる。
【０１４１】
＜実験２３：調製したトレハロースの理化学的性質＞
実験８の方法で調製したトレハロースの高純度標品を用いて理化学的性質を調べた。融点は９７．０℃、比旋光度は［α］２０Ｄ＋１９９゜（ｃ＝５）、融解熱は５７．８ＫＪ／ｍｏｌｅ、溶解度は２５℃の水に対し、無水物として７７．０ｇであった。これらの物性値は、同時に測定した市販トレハロース含水結晶（和光純薬工業株式会社製）の値とよく一致した。
【０１４２】
＜実験２４：生体内での利用試験＞
厚治等が、『臨床栄養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９７２年）で報告している方法に準じて、実験８において調製した高純度トレハロース標品（純度９９．８％）３０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア３名（健康な２６才、２７才、３０才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採血して、血糖値及びインスリン値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。その結果、トレハロースは、グルコースの場合と同様の挙動を示し、血糖値、インスリン値ともに、投与後、約０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハロースは、容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になることが判明した。従って、本発明の方法で得られるトレハロース及びこれを含む糖質は、エネルギー補給用糖源として好適である。
【０１４３】
＜実験２５：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験８において調製した高純度トレハロース標品（純度９９．８％）を経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、トレハロースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇ以上であった。
【０１４４】
以下、本発明のマルトース・トレハロース変換酵素とそれを利用したトレハロースとこれを含む糖質の製造方法を実施例１乃至１４で、トレハロースとこれを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例１５乃至３７で示す。
【実施例１】
【０１４５】
ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１５）を、培地成分中のグルコース濃度を４．０ｗ／ｖ％とした以外は実験１と同じ培地組成で、実験１の方法に準じてファーメンターで約６０時間、通気撹拌培養した。この培養液のマルトース・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ｍｌ当たり０．７５単位であった。また、その一部を遠心分離により、菌体と培養上清とに分離し、活性を測定したところ、菌体にその約６５％が、培養上清に約３５％の活性が検出された。この菌体を含む培養液約３５ｌを、超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社製）で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約１５単位有する濃縮酵素液約１．２ｌを回収した。１０％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．５）にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名スピターゼＨＳ）を澱粉グラム当たり２単位加えて撹拌下、加熱糊化・液化させ、ただちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間行った後、温度５０℃、ｐＨ５．０に調整した。これにβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位及びイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反応液を１００℃で２０分間加熱した後、温度１０℃、ｐＨ７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１単位の割合になるよう加え、９６時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６９％含有していて還元力がＤＥ１８．２と低く、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例２】
【０１４６】
実施例１の方法で得たマルトース・トレハロース変換酵素反応停止液に、固形物当たり１０単位のグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名グルコチーム）をｐＨ５．０、５０℃で２４時間作用させ、次いで、加熱失活、脱色、脱塩精製して得られる糖液を原糖液とし、トレハロースの含量を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ−１０１６、Ｎａ＋型、架 橋度４％、東京有機化学工業株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ、樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して、５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１５で流して分画し、グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース高含有粉末を固形物当たり、約５５％の収率で得た。本品は、トレハロースを約９７％含有しており、極めて低い還元性、まろやかで上品な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０１４７】
実施例２の方法で得たトレハロース高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥塔の上部 より送風して底部に設けた移送金網コンベア上に捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、金網コンベア上に捕集した結晶粉末を乾燥塔外に徐々に移動させ取り出した。この取り出した結晶粉末を、熟成塔に充填して温風を送りつつ１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結晶粉末を原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物当たり約９０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０１４８】
実施例２の方法で得たトレハロース高含有画分を、実施例３と同様に精製し、次いで、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約３．０％のシラップとした。次いで、助晶機に移し、これに種晶として無水結晶トレハロースをシラップ固形物当たり１％加え、１２０℃で撹拌助晶し、次いで、アルミ製バットに取り出し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、流動乾燥して、水分約０．３％の無水結晶トレハロース粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して、固形物当たり約８５％の収率で得た。本品は、食品、化粧品、医薬品、その原材料、又は加工中間物などの含水物の脱水剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉末甘味料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０１４９】
ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１５）を実験１と同様の方法で培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体１００ｇ（約８００単位）を１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（３００乃至４００ｃｐ、和光純薬工業株式会社製）１００ｍｌに混練した。この菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで撹拌している０．１ＭＣａＣｌ２溶液中に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状のゲル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ２溶液中に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付きガラスカラムに充填し、温度を２０℃に保温した。この固定化菌体カラムにｐＨ６．８のマルトース４０％溶液をＳＶ０．２にて下向流で通液し、トレハロース含量約７０％の糖液を得た。本糖液を実施例１の方法に準じて、精製、濃縮して、濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、低還元性、温和な甘味、適度の保湿性を有し、実施例１の場合と同様に各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０１５０】
３３％とうもろこし澱粉乳に濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２％になるよう加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）を３０分間行った後、５５℃に冷却し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり３０単位の割合になるように加え、４８時間反応させマルトース含量約８４％の糖液を得た。その反応液を、１００℃で１０分間加熱し、次いで１５℃に冷却し、実施例１の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５単位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その反応液を１００℃で１５分間加熱して酵素を失活させた後、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６４％を含有しており、低還元性、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、実施例１の場合と同様に、各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【０１５１】
実施例５の方法で得たシラップを濃度約８２％に濃縮して助晶機にとり、種晶約１％を混合した後、バットにとり、２０℃で４日間静置して晶出固化させ、次いで切削機にて粉砕し、乾燥して含蜜型トレハロース含水結晶粉末を固形物収率約９５％で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、実施例１の場合と同様に、各種組成物に有利に利用できる。
【実施例８】
【０１５２】
実施例６の方法で得たシラップを濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶粉末約１％を加え、撹拌しつつ徐冷、晶出させた。次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して高純度のトレハロース含水結晶を固形物収率約２０％で得た。本品は、実験２３と同様の理化学的性質を示し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。更には、工業試薬、化学原料などに利用することも有利に実施できる。
【実施例９】
【０１５３】
シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７９）を、実験９の方法に準じてファーメンターで約２０時間、通気撹拌培養した。この培養液約１８ｌを遠心分離にかけ、湿質量約０．４ｋｇの菌体を得た。これを４ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕機モデルＵＳ３００（株式会社日本精機製作所製）で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり３．８単位有する濃縮酵素液約４００ｍｌを回収した。１０％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．５）にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名スピターゼＨＳ）を澱粉グラム当たり２単位加えて撹拌下、加熱糊化・液化させ、ただちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間行った後、温度５０℃、ｐＨ５．５に調整した。これにプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反応液を１００℃で２０分間加熱した後、温度４０℃、ｐＨ７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５単位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９７％で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６５％含有していて還元力がＤＥ１６．２と低く、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【０１５４】
実施例９の方法で得たマルトース・トレハロース変換酵素による反応終了液を９５℃で１０分間保って酵素を失活させた後、ｐＨ５．０、５５℃に調整して、グルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名グルコチーム）を固形物グラム当たり１０単位加えて２４時間反応させた。反応液を常法に従って、加熱して酵素を失活させ、脱色、脱塩して精製し、濃度５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウエックス９９、Ｃａ＋＋型、架橋度６％、ダウケミカル社製）を用いて、実施例２と同様にカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハロース高含有画分を採取した。更に、これを精製し、濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄して高純度のトレハロース含水結晶を固形物収率約２５％で得た。本品は、実験２３と同様の理化学的性質を示し、実施例８と同様に、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などに有利に利用できる。
【実施例１１】
【０１５５】
シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７９）を実験９と同様の方法で培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体１００ｇ（約４００単位）を１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（３００〜４００ｃｐ、和光純薬工業株式会社販売）１００ｍｌに混練した。この菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで撹拌している０．１ＭＣａＣｌ２溶液 中に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状のゲル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ２溶液中に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付きガラスカラムに充填し、温度を３５℃に保温した。この固定化菌体カラムにｐＨ６．８のマルトース４０％溶液をＳＶ０．１にて下向流で通液し、トレハロース含量６７％の糖液を得た。本糖液を実施例９の方法に準じて、精製、濃縮し、これを助晶し、噴霧乾燥して含蜜型トレハロース含水結晶粉末を固形物収率約９０％で得た。本品は、低還元性、温和な甘味、適度の保湿性を有し、実施例９の場合と同様に各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１２】
【０１５６】
サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３を、実験１５の方法に準じてファーメンターで約２０時間、通気撹拌培養した。この培養液のマルトース・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ｍｌ当たり０．３２単位であった。この培養液約１８ｌから回収した湿質量０．１８ｋｇの菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．５ｌを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約１０単位有する濃縮酵素液約５００ｍｌを回収した。１５％とうもろこし澱粉乳（ｐＨ５．５）にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名スピターゼＨＳ）を澱粉グラム当たり２単位加えて撹拌下、加熱糊化・液化させ、ただちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間行った後、温度５５℃、ｐＨ５．０に調整した。これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり３００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反応液を１００℃で２０分間加熱した後、温度５０℃、ｐＨ７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５単位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６４％含有していて還元力がＤＥ１８．０と低く、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１３】
【０１５７】
実施例１２の方法で得たシラップを濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、実施例８と同様に晶出、分蜜して高純度のトレハロース含水結晶を固形物収率約２０％で得た。本品は、実験２３と同様の理化学的性質を示し、実施例８と同様に、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物、更には、工業試薬、工業原料、化学原料などに有利に利用できる。
【実施例１４】
【０１５８】
サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３を実験１５と同様の方法で培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体５０ｇ（約１，５００単位）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（３００乃至４００ｃｐ，和光純薬工業株式会社製）１００ｍｌに混練した。この菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで撹拌している０．１ＭＣａＣｌ２溶液中に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状のゲル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ２溶液中に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付きガラスカラムに充填し、温度を６０℃に保温した。この固定化菌体カラムにｐＨ６．５のマルトース４０％溶液をＳＶ０．２にて下向流で通液し、トレハロース含量約６６％の糖液を得た。本糖液を常法に従って、精製、濃縮し、噴霧乾燥してトレハロース含有粉末を固形物収率約９０％で得た。本品は、低還元性で、温和な甘味を有し、実施例１２の場合と同様に各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１５】
【０１５９】
＜甘味料＞
実施例８の方法で得たトレハロース含水結晶粉末１質量部に、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社製、商品名αＧスイート）０．０１質量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名アスパルテーム）０．０１質量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２．５倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリーは、蔗糖の約１／２．５に低下している。本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好適である。
【実施例１６】
【０１６０】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例１の方法で得たトレハロース含有シラップ３０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１質量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャンディーである。
【実施例１７】
【０１６１】
＜チューインガム＞
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに結晶マルチトール粉末３質量部及び実施例３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４質量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。また、本品は、低う蝕性乃至難う蝕性チューインガムとして好適である。
【実施例１８】
【０１６２】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例７の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末５０質量部、蔗糖１０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、プルラン０．５質量部、粉末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃、風量１５０ｍ３とし、これに、実施例６の方法で得たトレハロース含有シラップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースで、異味、異臭がなく、高品質を長期に保った。
【実施例１９】
【０１６３】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例９の方法で得たトレハロース含有シラップ１３０質量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されているラクトスクロース高含有粉末５０質量部を水１，１５０質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【実施例２０】
【０１６４】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例６の方法で得たトレハロース含有シラップ１００質量部、マルトース８０質量部、蔗糖２０質量部及び食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０００質量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【実施例２１】
【０１６５】
＜ういろうの素＞
米粉９０質量部に、コーンスターチ２０質量部、蔗糖４０質量部、実施例１１の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末８０質量部及びプルラン４質量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【実施例２２】
【０１６６】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二精油株式会社製造、商品名ハイニュートＳ）１質量部に、実施例１０の方法で得たトレハロース含水結晶２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。
【実施例２３】
【０１６７】
＜粉末味噌＞
赤味噌１質量部に実施例４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末３質量部を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、これを室温下で一夜静置して固化し、離型して１個当たり約４ｇの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調味料としてだけでなく味噌菓子などにも利用できる。
【実施例２４】
【０１６８】
＜粉末卵黄＞
生卵から調製した黄卵をプレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得られる液状卵黄１質量部に対して、実施例４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末４質量部の割合で混合した後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。また、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用できる。
【実施例２５】
【０１６９】
＜あん＞
原料あずき１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶ生あん約２１質量部を得た。この生あんに、蔗糖１４質量部、実施例１２の方法で得たトレハロース含有シラップ５質量部及び水５質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあんを約３５質量部得た。本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として、好適である。
【実施例２６】
【０１７０】
＜パン＞
小麦粉１００質量部、イースト２質量部、砂糖５質量部、実施例１４の方法で得たトレハロース含有粉末１質量部及び無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例２７】
【０１７１】
＜ハム＞
豚もも肉１，０００質量部に食塩１５質量部及び硝酸カリウム３質量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを、水５００質量部、食塩１００質量部、硝酸カリウム３質量部、実施例３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０質量部及び香辛料適量からなる塩漬液に冷室で７日間漬込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【実施例２８】
【０１７２】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例５の方法で得たトレハロース含有シラップ３質量部及び蔗糖１質量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例２９】
【０１７３】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例７の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末２質量部、α−グリコシルルチン１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部及び防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１，３−ブチレングリコール５質量部及び精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、安定性に優れ、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例３０】
【０１７４】
＜粉末薬用人参エキス＞
薬用人参エキス０．５質量部に実施例４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末１．５質量部を混捏した後、バットに移し、２日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量のビタミンＢ１及びビタミンＢ２粉末とともに顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用できる。また、育毛剤などとしても利用できる。
【実施例３１】
【０１７５】
＜固体製剤＞
天然型ヒトインターフェロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製、コスモ・バイオ株式会社販売）を、常法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含まれる天然型ヒトインターフェロン−αを吸着させ、安定剤である牛血清アルブミンを素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、天然型ヒトインターフェロン−αを実施例２の方法で得たトレハロース高含有粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量の無水結晶マルトース粉末（株式会社林原商事製、商品名ファイントース）に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たり天然型ヒトインターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用できる。本品は、トレハロースと共にマルトースが安定剤として作用し、室温で放置してもその活性を長期間よく維持する。
【実施例３２】
【０１７６】
＜糖衣錠＞
質量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０質量部、プルラン（平均分子量２０万）２質量部、水３０質量部、タルク２５質量部及び酸化チタン３質量部からなる下掛け液を用いて錠剤質量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハロース含水結晶粉末６５質量部、プルラン１質量部及び水３４質量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【実施例３３】
【０１７７】
＜練歯磨＞
配合      
第２リン酸カルシウム                              ４５．０％
プルラン                                            ２．９５％
ラウリル硫酸ナトリウム                              １．５％
グリセリン                                        ２０．０％
ポリオキシエチレンソルビタンラウレート              ０．５％
防腐剤                                              ０．０５％
実施例１４の方法で得たトレハロース含有粉末        １２．０％
マルチトール                                        ５．０％
水                                                １３．０％
上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として好適である。
【実施例３４】
【０１７８】
＜流動食用固体製剤＞
実施例８の方法で製造したトレハロース含水結晶５００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例３５】
【０１７９】
＜輸液剤＞
実施例１０の方法で製造した高純度トレハロース含水結晶を水に濃度約１０ｗ／ｖ％に溶解し、次いで、常法に従って、精密濾過してパイロジェンフリーとし、プラスチック製ボトルに無菌的に充填し施栓して製品を得た。本品は、経日変化もなく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などに投与するのに好適である。本品は濃度１０ｗ／ｖ％で血液と等張で、グルコースの場合の２倍濃度でエネルギー補給できる。
【実施例３６】
【０１８０】
＜輸液剤＞
実施例１３の方法で製造した高純度トレハロース含水結晶と下記の組成のアミノ酸配合物とがそれぞれ５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％になるように水に混合溶解し、次いで実施例１０と同様に精製してパイロジェンフリーとし、更に、プラスチック製バックに充填し施栓して製品を得た。
アミノ酸配合物の組成（ｍｇ／１００ｍｌ）
Ｌ−イソロイシン          １８０
Ｌ−ロイシン              ４１０
Ｌ−リジン塩酸塩          ６２０
Ｌ−メチオニン            ２４０
Ｌ−フェニルアラニン      ２９０
Ｌ−スレオニン            １８０
Ｌ−トリプトファン          ６０
Ｌ−バリン                ２００
Ｌ−アルギニン塩酸塩      ２７０
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩      １３０
グリシン                  ３４０
本品は、糖質とアミノ酸との複合輸液剤にもかかわらず、トレハロースが還元性を示さないため、経日変化もなく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などへ投与するのに好適である。本品は、生体へのエネルギー補給のみならず、アミノ酸補給のためにも有利に利用できる。
【実施例３７】
【０１８１】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例２の方法で製造したトレハロース高含有粉末２００質量部及びマルトース３００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから、治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０１８２】
上記から明らかなように、本発明の新規マルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースからトレハロースへ高変換率で転換する。この酵素反応で得られるトレハロースとこれを含む糖質は、安定であり、良質でさわやかな甘味を有しており、また、経口摂取により消化吸収され、カロリー源となる糖質である。これら糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、化粧品、医薬品、など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８３】
従って、本発明の確立は、安価で無限の資源である澱粉に由来するマルトースから、トレハロースとこれを含む糖質を、工業的に大量かつ安価に供給できる全く新しい道を拓くことになり、それが与える影響の大きさは、澱粉科学、酵素化学、生化学などの学問分野は言うに及ばず、産業界、とりわけ、食品、化粧品、医薬品分野は勿論のこと、農水畜産業、化学工業にも及び、これら産業界に与える工業的意義は、計り知れないものがある。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】ピメロバクター・スピーシーズ  Ｒ４８のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図８】シュードモナス・プチダ  Ｈ２６２のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図９】サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１２】サーマス・アクアティカス  ＡＴＣＣ３３９２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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