(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）発現生成物がDol−Ｐ−Man供与体からセリン又はトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基へのマンノシル残基の転移に関与する遺伝子の１以上のコーディング領域、または
（ｂ）該遺伝子の発現および／もしくは転写調節を支配するか関与している１以上の領域
に位置する遺伝学的変異をそのDNA配列中に有しており、それにより、Ｏ−グリコシル化に対する許容性が少なくとも低減している菌類細胞。
【請求項２】
上記変異が、分離の間も安定および／または非復帰性および／または非漏出性である、請求の範囲第１項に記載の菌類細胞。
【請求項３】
外来DNA配列が導入された、請求の範囲第１項または第２項に記載の菌類細胞。
【請求項４】
外来DNA配列が、菌類細胞中で発現および／または分泌すべき所望のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する、請求の範囲第３項に記載の菌類細胞。
【請求項５】
上記DNA配列が、所望のタンパク質をコードする上記DNA配列の5'末端に連結した転写および翻訳開始領域を含む発現カセットに含まれるものである、請求の範囲第４項に記載の菌類細胞。
【請求項６】
上記転写及び翻訳開始領域が、菌類細胞の遺伝子由来のプロモーターから選ばれたものである、請求の範囲第５項に記載の菌類細胞。
【請求項７】
上記発現カセットが、さらに、所望のタンパク質をコードするDNA配列の3'末端に転写および翻訳停止領域を含む、請求の範囲第５項に記載の菌類細胞。
【請求項８】
上記発現カセットが、新生タンパク質を上記菌類細胞の分泌経路に誘導する目的で、さらに所望のタンパク質配列のＮ末端にシグナルペプチド（プレ配列）を含む請求の範囲第５項に記載の菌類細胞。
【請求項９】
外来DNA配列が、上記菌類細胞中で自律的に複製し得るか、又は細胞自体のDNA配列（染色体）に組み込まれ得るベクターの一部である、請求の範囲第３項から第８項のいずれか１項に記載の菌類細胞。
【請求項１０】
菌類細胞が、糸状菌又は酵母から選ばれるものである、請求の範囲第１項から第９項のいずれか１項に記載の菌類細胞。
【請求項１１】
糸状菌が、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ムコール（Mucor）、ノイロスポラ（Neurospora）、フザリウム（Fusarium）からなる群から選ばれる請求の範囲第10項に記載の菌類細胞。
【請求項１２】
酵母が、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）からなる群から選ばれる請求の範囲第10項に記載の菌類細胞。
【請求項１３】
酵母が、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、およびカンジダ（Candida）からなる群から選ばれる請求の範囲第12項に記載の菌類細胞。
【請求項１４】
酵母が、クルイベロミセス（Kluyveromyces）またはサッカロミセス（Saccharomyces）から選ばれる請求の範囲第12項に記載の菌類細胞。
【請求項１５】
請求の範囲第３項から第14項のいずれか１項に記載の菌類細胞を、外来DNA配列が発現され、かつ、生成物が回収される条件下で培養する、組換え生成物の製造方法。
【請求項１６】
上記生成物が培養液中に分泌されるものである、請求の範囲第15項に記載の方法。
【請求項１７】
上記生成物が菌類細胞によるＯ−グリコシル化を受けやすいものである、請求の範囲第15項または第16項記載の方法。
【請求項１８】
サッカロミセス属由来で、配列番号１に示された塩基配列を有するか、または配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードする、Dol−Ｐ−Man:タンパク質（Ser/Thr）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA分子。
【請求項１９】
クルイベロミセス属由来で、配列番号３に示された塩基配列を有する、Dol−Ｐ−Man:タンパク質（Ser/Thr）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA分子。
【請求項２０】
Dol−Ｐ−Man:タンパク質（Ser/Thr）マンノシルトランスフェラーゼの性質を具備するタンパク質をコードし、配列番号１に示された塩基配列または請求の範囲第19項に記載のDNA配列と、100mlの５×デンハート溶液、６×NET、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA中で44℃でハイブリダイズするDNA配列を含む遺伝子。
【請求項２１】
菌類細胞の相同な遺伝子を得るために変異型表現型を補うにあたっての、請求の範囲第18項もしくは第19項記載のDNA分子、または請求の範囲第20項記載の遺伝子の使用方法、またはハイブリダイゼーションのプローブとしての、配列番号１に示された塩基配列もしくは請求の範囲第19項に記載のDNA配列の17bp以上の断片の使用方法。
【請求項２２】
0003630424.tif 000010
であるDNA断片。
【発明の詳細な説明】
本発明は、優れた菌類細胞、ならびに優れた品質の組換え生成物を高収率で生成する方法に関するものである。より詳細には、本発明は、細胞のDNA配列中に、少なくとも、同種および／または異種のタンパク質のＯ−グリコシル化に対する低減した許容性を示すような遺伝学的変異を有している菌類細胞、ならびに、組換え生成物を高収率で生成するに際しての、そうした細胞の宿主細胞としての使用に関するものである。
組換えDNA技術の発展によって、異種の生成物をコードする外来のDNA配列を導入した宿主細胞中で、異種の生成物を生成することが可能となった。こうした技術の利点は、生成物を、高収率かつ高度に精製された形態で、汚染、たとえばウイルスによる汚染（エイズ、Ｂ型肝炎等）の危険性なしに生成しうることにある。こうした組換え技術は、組換えタンパク質を原核生物ならびに真核生物の宿主細胞中で生成するにあたって、広く使用されている。原核生物の宿主細胞としては、大腸菌〔Nagata et al.,Nature 284,316,1980;EP 001 929〕、枯草菌〔Saunders et al.,J.Bacteriol.169,2917,1987〕、ストレプトミセス、ならびにコリネバクテリウム（EP 433 117）がある。真核生物の宿主細胞としては、植物細胞、動物細胞、ならびに菌類細胞がある。
しかし、こうした技術による組換え生成物の大規模な製造は、こうした外来のDNA配列の発現効率、ベクターの不安定性、ならびに組換え生成物の生成が行われる宿主による組換え生成物の細胞内での分解といった問題ゆえに、いまだに限定されている。発現効率については、強力なプロモーターを単離し、外来のDNA配列の発現レベルを上昇させることによって、組換え生成物の生成レベルを上昇させる努力がなされている。宿主細胞中でベクターの安定性を上昇させる目的で、各種の系も開発されてきており、最もよく行われるのは、ベクターに抗生物質耐性の遺伝子を挿入して、組換え宿主細胞が選択培地中で生存、成長しうるようにすることである。細胞内での分解については、いくつかの変異型細胞が開示されており、こうした変異型細胞では、プロテアーゼ活性を喪失させたり低減させたりすることによって、その細胞が組換え生成物を分解する能力を制限している。
しかし、組換え生成物の大規模な製造や製剤への使用は、もっと別の問題によっても制限されている。こうした問題の一つは、組換えによって生成した生成物が、対応する天然物質と往々にして異なっているという事実から派生する。たとえば、細菌の宿主細胞は、哺乳動物のポリペプチドが成熟するうえで必要とされる翻訳後の機構をすべて有しているわけではない。したがって、細菌中で生成された哺乳動物のポリペプチドは、往々にして未成熟で、正しく再生されないこととなる。さらに、細菌の宿主細胞では、通常、生成物のＮ末端に余分なメチオニンが導入されてしまう。
異種の真核生物の宿主中で生成された組換え生成物も、大抵は、グリコシル化物の含量が、天然に生じた対応物と異なっている。このことは、炭水化物構造の存否、こうした炭水化物構造の生成物中での位置、ならびに炭水化物の性質と関係してくる。もっと具体的に述べると、酵母由来の組換え生成物は、対応する天然物質と比べると、天然には存在しない余分なＯ−グリカンを有していることが多い。たとえば、ヒト血清インシュリン様増殖因子Ｉ（IGF−Ｉ）はグリコシル化されていないのに、S.セレビシエ中で生成した組換え形態のものは、Ｏ−グリコシル化、より厳密には、Ｏ−マンノシル化されていることが示されている〔Hard et al.,FEBS Letters 248,111,1989〕。同様に、ヒトの血小板由来の成長因子（PDGF）ならびにヒトのGM−CSFも、S.セレビシエ中で生成すると、天然には存在しないＯ−マンノシル構造を示すことが示されている〔Biomedic.Environ.Mass Spectrometry 19,665,1990;BIO/TECHNOLOGY 5,831,1987〕。こうした異常なＯ−グリコシル化は、哺乳動物（ヒト）の細胞のグリコシル化機構と、哺乳動物以外の真核生物の細胞、たとえば酵母のグリコシル化機構とでは、重要な差異がある結果生じるものである。この点に関しては、種々の菌類細胞（酵母ならびに糸状菌を含む）中でのＯ−グリコシル化が、これまで他の生物では観察されたことのない、互いに類似した、しかも独特な過程で進行することが観察されている。
こうした望ましくないＯ−グリコシル化が菌類由来の組換え生成物で生じることは、こうした技術の、薬剤を製造するうえでの重要な欠点となる。
第一の理由は、菌類に特有のグリカンによって、タンパク質上に新たな免疫決定基が導入されてしまう可能性が有り、したがって、こうした天然に存在しない炭水化物を有する糖タンパク質は、ヒトへの投与時に、抗原となる可能性があることである。この点に関しては、たとえば、大抵のヒトが、Ｎ結合型の酵母のマンナン鎖に対して誘導された抗体を有することが知られている〔Feizi and Childs,Biochem.J.245,1,1987〕。
もう一つの理由は、適切な炭水化物構造を有さないタンパク質は、薬物動態学的特性にも変化をきたしている可能性があることである。糖タンパク質の炭水化物構造は、糖タンパク質のインビボでのクリアランス速度の決定に影響を及ぼし、関与していることが示されており、このクリアランス速度は、薬剤の効率を決定するうえで必須のものである。もっと詳しく述べると、肝上皮細胞ならびに滞留マクロファージ上ではマンノースの受容体が特定されており、このマンノース受容体は、マンノース型のオリゴ糖を示す糖タンパク質を除去する手段に他ならない〔Stahl,Cell.Mol.Biol.2,317,1990〕。したがって、タンパク質上に、天然には存在しない余分なマンノース構造が存在すると、タンパク質のクリアランス速度が上昇し、その結果、血漿中での半減期が低減してしまいかねない。
さらに別の理由は、糖タンパク質の生物学的活性が、糖タンパク質の炭水化物の含量、位置、ならびに性質によっても左右されることが示されていることである。たとえば、グリコシル化が、組換え型のヒトEPOの生物学的特性に影響を及ぼすこと〔Takeuchi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,7819,1989〕、そして組換え型のヒトtPAの生物学的特性に影響を及ぼすこと〔Parekh et al.,Biochemistry 28,7644,1989〕が示されている。
以上に述べたような理由から、菌類由来の組換え生成物の天然には生じないＯ−グリコシル化が、生成物の免疫学、生物学、ならびに薬物動態学上の特性に重大な影響を及ぼす可能性があり、したがって、そうした組換え組成物のヒトの治療用途への開発を阻みかねないことが明らかである。
本発明は、細胞のDNA配列中に遺伝学的変異を有している変異菌類細胞を提供することによって解決するものであり、細胞は、この遺伝学的変異によって、少なくとも、固有の、あるいは外来のタンパク質のＯ−グリコシル化に対する低減した許容性を有するようになっている。
出願人は、Ｏ−グリコシル化に対する許容性は低減しているものの、依然として生存可能で、工業的醗酵条件下で良好な成長特性を示す。遺伝学的に変異させた菌類細胞を得ることができることを見いだした。予期せざることに、出願人は、上記のような遺伝学的変異によっても、外来のDNAによる形質転換を行った際のこうした菌類細胞の安定性が影響を受けないことも明らかとした。本発明の変異菌類細胞は、高品質で、不要なＯ−グリカンを全く、あるいは少量しか有さない組換え生成物を生成する際の宿主細胞として、有利に使用することができる。
本発明の一つの目的は、細胞のDNAの配列中に遺伝学的変異を有しており、その変異によって、少なくとも細胞のＯ−グリコシル化に対する許容性が低減している菌類細胞である。
本発明の菌類細胞は、糸状菌および酵母から選ぶことができる。本発明で想定している糸状菌の属の例としては、アスペルギルス、トリコデルマ、ムコール、ノイロスポラ、フザリウムなどが挙げられる。酵母の属としては、クルイベロミセス、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、カンジダ、シゾサッカロミセスなどが挙げられる。より好適なのは、クルイベロミセス、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、およびカンジダよりなる群から選ばれる属であり、特に好適なのは、クルイベロミセスおよびサッカロミセスから選ばれる属である。本発明の好適実施態様を構成するクルイベロミセスの株の例としては、K.ラクティス、K.フラジリス、K.ワルティー、K.ドロソフィラルムなどがある。サッカロミセスの好適な株は、S.セレビシエである。
本発明の趣旨では、遺伝学的変異とは、好ましくは、菌類細胞のDNA配列の１つ以上の塩基あるいは断片の任意の抑制、置換、欠失、あるいは付加を意味する。こうした遺伝学的変異は、（単離したDNA上で直接）インビトロで生じさせることも、遺伝工学的手法を用いたり、菌類細胞を突然変異誘発剤に暴露したりすることによってインシトゥで生じさせることもできる。突然変異誘発剤としては、たとえば、物理的誘発剤、たとえばエネルギー線（Ｘ線、χ線、紫外線等）、あるいはDNAの各種の官能基と反応しうる化学的誘発剤、たとえばアルキル化剤（EMS、NQO等）、ビスアルキル化剤、インターカレート剤等を挙げることができる。遺伝学的改変は、たとえば、Rothstein et al.Meth.Enzymol.194,281−301,1991に開示された方法にしたがって、遺伝学的破壊によって行うこともできる。
この方法をインビトロ用に改変して実施する場合には、遺伝子の一部あるいは全部が相同組換えによって置換される。
遺伝学的変異は、DNA配列に任意の突然変異を生じるような挿入を行うことによっても、たとえば、トランスポゾン、ファージ等を挿入することによっても生じさせることができる。
また、変異のうちのあるもの、たとえば点突然変異は、細胞の機構によって、復帰あるいはアテニュエーションされてしまうことがあることも知られている。こうした変異は、表現形質があまり安定ではない可能性があるので、本発明の変異菌類細胞の最も有用な形態をもたらすものではない。本発明は、変異（すなわち表現形質）が分離の間も安定で、そして／または非復帰性で、そして／または非漏出性である変異菌類細胞の製造方法も提供するものである。こうした変異菌類細胞は、組換え生成物を生成する際の宿主として特に有利である。
したがって、本発明の好適実施態様は、分離の間も安定で、そして／または非復帰性で、そして／または非漏出性である遺伝学的変異を有する菌類細胞である。こうした変異は、一般に、欠失あるいは破壊によって得られる。
本発明の菌類細胞が有する遺伝学的変異は、細胞のDNA配列のコード領域に位置させることも、遺伝子の発現および／または転写の調節を支配、あるいはそれらに関与している領域に位置させることもできる。もっと詳しく述べると、上記変異は、一般に、その発現生成物がＯ−グリコシル化経路の酵素であるような１つ以上の遺伝子のコード領域、あるいは、その発現および／または転写の調節を支配したり、それらに関与したりしている領域に影響を及ぼすものである。
したがって、本発明の菌類細胞が、タンパク質のＯ−グリコシル化に対して低い許容性を有しているのは、構造上および／またはコンホメーションの変化によって不活性な酵素が生成したり、生物学的特性に変化をきたした酵素が生成したり、こうした酵素が生成されなかったり、生成されても生成のレベルが低かったりする結果である可能性がある。
菌類細胞のＯ−グリコシル化経路では、第一のマンノシル残基が、タンパク質あるいはペプチドのセリンおよび／またはトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基に結合し、その後、さらにマンノシル残基が付加することによって第一のマンノシル残基が延長されて、Ｏ−結合型の二糖あるいはオリゴ糖が生成する。第一のマンノシル基は、ドリコール一リン酸マンノース（Dol−Ｐ−Man）から、小胞体中のタンパク質へと転移され、追加のマンノシル残基は、ゴルジ体中でGPD−Manから転移される。これとは対照的に、高等真核細胞（非菌類細胞）のＯ−グリコシル化は、第一の工程がＮ−アセチルガラクトースアミンのセリンあるいはトレオニンへの共有結合である点、この第一の反応に脂質結合オリゴ糖供与体が関与していない点、はじめの工程がゴルジ体で生じる点、炭水化物の構造が異なっている点などで、菌類細胞とは異なったメカニズムにしたがって進行する。
本発明の好適な実施態様では、変異菌類細胞は、その発現生成物が、セリンあるいはトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基へのマンノシル残基の結合に関与しているような少なくとも１つの遺伝子に、遺伝学的変異を有している。
本発明のさらに好適な実施態様では、変異菌類細胞は、その発現生成物が、Dol−Ｐ−Man前駆体から、セリンあるいはトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基への、マンノシル残基の転移に関与しているような少なくとも１つの遺伝子の遺伝学的変異を有している。
さらに好ましくは、こうした遺伝子の一つは、Dol−Ｐ−Man:タンパク質（Ser/Thr）マンノシルトランスフェラーゼをコードしている、配列を図４に示す遺伝子〔DPM2−PMT1とも称される〕、あるいは以下に記載する活性と同一の活性をコードしている任意の相同な遺伝子である。
セリンあるいはトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基へのマンノシル残基の結合に関与している１つの遺伝子の変異に加えて、本発明の菌類細胞は、二糖あるいはオリゴ糖を生じるその後のマンノシル残基の付加、あるいはマンノシル残基の供与体（Dol−Ｐ−Man）の合成に関与している遺伝子の変異も有することができる。
こうした菌類細胞の具体的な例は、実施例に開示してある。
本発明のもう一つの目的は、外来のDNA配列が導入された、以上に開示したような菌類細胞にある。
本発明の趣旨では、外来のDNA配列という用語は、上記細胞中に発現および／または分泌しようとしている所望のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含む任意のDNA配列を包含するものである。こうしたDNA配列は、菌類細胞中での上記タンパク質の合成を可能とする発現カセットに包含された、相補的DNA配列（cDNA）、人工DNAの配列、ゲノムDNAの配列、ハイブリッドDNAの配列、または合成あるいは半合成DNAの配列とすることができる。発現カセットは、上記の所望のタンパク質をコードする配列の5'末端に結合した転写ならびに翻訳開始領域を含有するものとして、上記配列の転写ならびに翻訳を誘導し、場合によっては調節できるようにするのが好ましい。こうした領域の選択は、使用した菌類細胞に応じて変化しうるものである。一般に、こうした配列は、菌類細胞の遺伝子に由来するプロモーターおよび／またはターミネーターから選択し、酵母の宿主で発現しようとする場合には、酵母の遺伝子から選択する。特に重要なのは、菌類細胞の解糖遺伝子、たとえば、酵母に関しては、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GDP）、エノラーゼ（ENO）、あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）をコードする遺伝子、また糸状菌に関しては、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）をコードする遺伝子に由来する特定のプロモーターおよび／またはターミネーター領域である。プロモーターおよび／またはターミネーター領域は、他の強力に発現される遺伝子、たとえば酵母に関しては、ラクトース遺伝子（LAC4）、酸ホスファターゼ遺伝子（PHO5）、アルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX）、あるいはメタノールオキシダーゼ遺伝子（MOX）、また糸状菌に関しては、セロビオヒドラーゼ遺伝子（CBHI）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（alcA、alcC）、グルコアミラーゼ遺伝子（GAM）、あるいはアセトアミダーゼ遺伝子（amds）などに由来するものとすることもできる。こうした転写ならびに翻訳開始領域は、たとえば、インビトロでの突然変異誘発を行ったり、制御因子あるいは合成配列をさらに導入したり、欠失を生じさせたりすることによって、さらに変異させることもできる。たとえば、別のプロモーターに由来する転写調節因子、たとえばいわゆるUASを使用してハイブリッドのプロモーターを構築することもでき、このハイブリッドプロモーターを使用すると、菌類細胞の培養の成長局面を、所望のタンパク質をコードする配列の発現局面と分離することが可能となる。使用する菌類細胞中で機能する転写ならびに翻訳終止領域は、コード配列の3'末端に位置させることもできる。また、タンパク質の配列のＮ末端にシグナルペプチド（プレ配列）を導入して、新生タンパク質を、使用している菌類細胞の分泌経路に誘導することもできる。このプレ配列は、タンパク質を天然に分泌させる場合には、このタンパク質の天然のプレ配列に対応するものとすることができるが、もっと別の起原のもの、たとえば別の遺伝子から得たものとすることも、場合によっては人工のものとすることもできる。
外来のDNA配列は、使用した菌類細胞中で自律的に複製するか、あるいは菌類細胞自体のDNA配列（染色体）に組み込まれるベクターの一部とするのが好ましい。自律的に複製するベクターは、菌類細胞の染色体DNA、あるいは天然に生じる菌類細胞のプラスミド、たとえばpGK1−１〔de Louvencourt et al.,J.Bacteriol.154,737,1982〕、pKD1（EP 241 435）、２μｍのプラスミド（Broach,Cell 28,203−204,1982）などに由来する自律的に複製する配列（ARS）を含有することができる。組み込まれるベクターは、通常、菌類細胞の染色体の領域と相同な配列を含有しており、この配列によって、菌類細胞への導入後に、インビボでの組換えによって組み込みが可能となる。本発明の具体的な実施態様では、上記の相同な配列は、菌類細胞中での変異を生じさせようとしている染色体領域と対応しているので、一工程での変異−組み込み機構が実現される。組み込みは、非相同な組換えによって生じることもある。
外来のDNA配列は、当業界で公知の任意の技術によって、菌類細胞に導入することができ、たとえば、組換えDNA技術、遺伝学的交差、プロトプラストフュージョン等によって行うことができる。組換えDNA技術に関しては、形質転換、電気穿孔法をはじめとする文献に開示された任意の技術を使用することができる。さらに詳しく述べると、菌類細胞が酵母細胞である場合には、形質転換は、Ito et al.,J.Bacteriol.153,163,1983あるいはDurrens et al.,Curr.Getet.18,7,1990の方法、またはEP 361 991に開示された方法にしたがって行うことができる。電気穿孔法は、Karube et al.,FEBS Letters,82,90,1985にしたがって行うことができる。
本発明の菌類細胞は、組換え生成物、たとえば製剤および／または農業−食糧上重要な異種タンパク質を生成する際の宿主細胞として有利に用いることができる。本発明の菌類細胞は、高品質の生成物を生成および／または分泌することが可能であり、菌類細胞の遺伝学的変異によって、上記生成物の発現ベクターの有糸分裂時の安定性あるいは遺伝上の安定性に影響が及ぶことがないので、特に有用である。本発明の細胞は、ヒトの治療上の用途を有していて、かつ、宿主細胞によるＯ−グリコシル化を受けやすいタンパク質を生成するうえで特に適当である。
したがって、本発明のさらに別の目的は、組換え生成物を生成するにあたって、上述の菌類細胞の培養を、外来のDNA配列が発現され、生成物が回収されるような条件下で行う方法にある。好適な実施態様では、上記生成物は、培養液中に分泌される。別の好適な実施態様では、上記生成物は、宿主細胞によるＯ−グリコシル化を受けやすいものである。
本発明の菌類細胞を用いて生成することのできる異種タンパク質の例として、以下のタンパク質を挙げておく。酵素（たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等、またはそれらの任意の断片あるいは誘導体）、血液誘導体（たとえば、ヒト血清アルブミン、α−あるいはβ−グロビン、因子VIII、因子IX、フォンビルブラント因子、フィブリノネクチン、α−１アンチトリプシン等、またはそれらの任意の断片あるいは誘導体）、インシュリンならびにその変種、リンホカイン（たとえば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−CSF、GM−CSF、Ｍ−CSF等）、TNF、TRF等、またはそれらの任意の断片あるいは誘導体）、成長因子（たとえば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、FGF、EGF、PDGF、TGF等、またはそれらの任意の断片あるいは誘導体）、アポリポタンパク質、ワクチン（肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バー、ヘルペス等）製造用の抗原性ポリペプチド、または任意の融合ポリペプチド、たとえば、活性部分と、それに連結された安定化部分とから構成される融合体。
本発明のさらに別の目的は、タンパク質のセリンあるいはトレオニンアミノ酸のヒドロキシル基への、マンノシル残基の結合に関与する酵素をコードするDNA断片にある。出願人は、こうした酵素をコードするDNA断片を、はじめて提供するものである。さらに好ましくは、上記のDNA断片は、配列を図４に示すDol−Ｐ−Man:タンパク質（Ser/Thr）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、任意の相同な遺伝子、またはそれらの誘導体あるいは断片を含むものである。
本発明の趣旨では、ある遺伝子と相同な遺伝子とは、任意の菌類細胞の当該遺伝子以外の任意の遺伝子で、要求される活性を有する酵素をコードしている遺伝子を意味する。こうした当該遺伝子以外の遺伝子は、たとえば、上記活性を有さない変異型菌類細胞を、上記活性を有している菌類細胞から生成したDNAで補い、活性を回復した形質転換体を選びだし、その形質転換体に挿入されているDNA配列を単離することによって得ることができる。こうした当該遺伝子以外の遺伝子は、図４に示す配列の全部あるいは一部を含むプローブ（たとえばPCRプライマー）とのハイブリダイゼーションによって、DNAライブラリーから単離することもできる。この点では、菌類細胞の相同な遺伝子を得るにあたって、得られたDNA断片あるいはその任意の一部を、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用したり、変異型の表現型を補う際に使用したりすることも本発明の一つの目的である。
誘導体という用語は、上述の遺伝子に任意の遺伝学的および／または化学的な変異を生じさせることによって生成した任意の上述の遺伝子以外のDNA断片のことを意味するものである。この遺伝学的および／または化学的な変異は、変異が生じた結果、菌類宿主細胞での形質転換時に、酵素活性が上昇したり、同一レベルであったり、低減したり、全く無くなったりするような、上記遺伝子の１つ以上の塩基あるいは領域の抑制、置換、欠失、あるいは付加とすることができる。
図面の説明
図1.  プラスミドpDM3、pMT4、およびpMT1の制限地図。
図2.  プラスミドpDM3のサブクローニング。
図3.  PMT1遺伝子の配列決定戦略。
図4a.  PMT1遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）。
図4b.  PMT1遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）。
図5.  pMT1.1/URA3の構築ならびに制限地図。
図6.  S.セレビシエの野生型（パネルＡ）ならびに突然変異型（パネルＢ）のＯ−グリコシル化活性。
図7.  K.ラクティスのPMT1遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号３）。
図8.  S.セレビシエのPMT1遺伝子（上側の配列）と、K.ラクティスのゲノムDNAをPCRで増幅することによって単離したK.ラクティスの相同な配列（下側の配列）の、ヌクレオチド配列（パネルＡ）と推定アミノ酸配列（パネルＢ）での比較。点は、配列が同一であることを表し、疑問符は、配列がはっきりしないことを示す。プライマーSq3910と相補的なヌクレオチド配列に下線を付してある。
実施例
実施例1:S.セレビシエからの高度に精製されたマンノシルトランスフェラーゼの単離、ならびにペプチドの生成
Strahl−Bolsinger and Tanner,Eur.J.Biochem.196,185,1991にしたがって、全酵母膜からマンノシルトランスフェラーゼ活性部分を可溶化し、ヒドロキシルアパタイト上で精製した。タンパク質は、（NH4）2SO4で沈殿させて、さらに濃厚にしてから、アフィニティクロマトグラフィーによるさらなる精製を行わなければならなかった。アフィニティクロマトグラフィーの溶出物を、SDS−PAGEで分離した。生じた92kDaのバンドを、ゲルから切り出した。トリプシンによる消化を（ゲル中で）行うと、重複していないペプチドがいくつか得られ、プローブを設計することが可能となった。
実施例1.1  （NH4）2SO4による沈殿
マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するヒドロキシルアパタイトのカラムの100mlの分画を、最終濃度が30％（w/v）となるまで（NH4）2SO4と混合し、氷／塩浴中で１時間にわたって緩やかにかきまぜた。混合物を30分間（8000×ｇ）遠心分離した。得られたペレットを、8mlのAB緩衝液（10mMトリス/HCl（pH7.5）、15％グリセロール（溶液％）、0.1のラブロール（容量％）、150mMのNaCl）中に再度懸濁させ、同じ緩衝液に対して１時間透析した。
保存：−20℃。
実施例1.2  アフィニティクロマトグラフィー
実施例1.2.1  アフィニティクロマトグラフィー用のカラムの調製
プロテインＡ−セファロースCl4B（Protein A−Sepharose Cl 4B）の凍結乾燥粉末0.5gを、10mlの100mMNaPi（pH7.0）中で15分間にわたって膨潤させ、焼結ガラスフィルター（G3）上で、200mlの同じ緩衝液で洗浄した。プロテインＡ−セファロースCl4Bを、10mMNaPi（pH7.0）中で平衡化させた。約３−6mlの抗マンノシルトランスフェラーゼ血清を、1lのNaPi（100mM）（pH7.0）に対して、２時間にわたって透析した。透析した血清を、カラム物質とともに、４℃にて16時間インキュベートした。焼結ガラスフィルター（G3）を使用して、この血清を除去した。カラム物質を、10mlの10mMNaPi（pH8.5）で２回洗浄し、50mlの同じ緩衝液中に再度懸濁させた。
共有結合させる目的で、0.75mg/mlのジメチルスベリミデートを加えた。５−６滴の1MNaOHを加えることによって、pHをpH8.5に調整した。材料を室温で１時間インキュベートした。再度、ジメチルスベリミデートを加え、1MNaOHで、pHをpH8.5に調整した。このカラム物質を、焼結ガラスフィルター（G3）上で、
ａ）50mlの100mMNaPi（pH8.0）、
ｂ）25mlの100mMNaPi（pH8.0）、3Mロダン化アンモニウム、
ｃ）100mlの100mMNaPi（pH8.0）
を用いて順次洗浄した。
この物質を、AB緩衝液中で洗浄し、平衡化させた。
実施例1.2.2  92kDaのタンパク質の精製
（NH4）2SO4で沈殿させ、透析したタンパク質（実施例1.1）8mlを、アフィニティカラムの物質（実施例1.2.1）とともに、緩やかにかきまぜながら、４℃で16時間にわたってインキュベートした。カラム（2cm×0.5cm）を充填し、15mlのAB緩衝液で洗浄した。カラムを、100mMグリシン/HCl（pH3.0）、0.05％ラブロール（容量％）、15％グリセロール（容量％）で溶出させた。0.9mlの分画を集め、ただちに、1Mトリス（15μl/0.9mlの分画）で中和した。
92kDaのタンパク質を検出する目的で、40μｌの各溶出分画を、Strahl−Bolsinger and Tanner（1991）に記載されたようにして、SDS−PAGEならびにウェスタンブロット分析によって分析した。92kDaのタンパク質を含有する分画（分画２−６）をプールし、5000×ｇで遠心分離を行うことにより、マイクロコンセントレーター（セントリコン／アミコン（Centricon/Amicon））で100μｌまで濃縮した。0.9mlの98％EtOHを加え、−20℃にて16時間にわたってタンパク質を沈殿させた。30分間にわたって10,000×ｇで遠心分離を行うことによって、沈殿したタンパク質をペレット化した。
実施例1.3  SDS−PAGE
沈殿したタンパク質（実施例1.2.2）を、150μｌのSDS−サンプル緩衝液（0.07MNa2CO3、0.07％β−EtSH、２％SDS、12％サッカロース、0.07％ブロムフェノールブルー）に再度懸濁させた。
0003630424.tif 000002
にしたがって、バイオラッド−ミニ−プロティーンセル（Biorad−Mini−Protean cell）を使用して、SDSゲル電気泳動を50−70Vで行った。タンパク質の標準：ギブコ（Gibco）BRLのHMW−スタンダーズ（HMW−Standards）。
タンパク質は、0.05％クーマシーR250（w/v）、25％イソプロパノール（容量％）、10％酢酸（容量％）を用いて染色し、7.5％酢酸（容量％）で脱染することによって検出した。
実施例1.4  トリプシンによる消化、ならびにオリゴヌクレオチドの設計
SDS−PAGE（実施例1.3）を行った後、92kDaのタンパク質のバンドを切り出した（約10μｇのタンパク質）。ゲルの断片を小片に刻み、5mlの50％メタノール/10％酢酸中で30分間にわたって３回、5mlの50％メタノール中で30分間にわたって１回振とうした。ゲルを３時間にわたって凍結乾燥した。トリプシンによる消化を、0.3mlの0.2M炭酸水素アンモニウム/2μｇのトリプシン中で、37℃にて16時間行った。上清を除去した。ペプチドの溶出を、0.2mlの0.2M炭酸水素アンモニウム中で、37℃にて１時間にわたって３回、0.2mlの0.2M炭酸水素アンモニウム/30％アセトニトリル中で37℃にて１時間にわたって１回行った。溶出物質をプールし、凍結乾燥し、0.2mlの1M塩酸グアニジン/50mMトリス/HCl（pH7.5）に再度溶解した。0.13％TFA中で平衡化させた逆相RP18カラムを使用して、ペプチドを分離した。ペプチドは、アセトニトリル（０−70％）で溶出させた。40以下の互いに異なるペプチドのピークを検出することができた。主要なピークのうちの５つの配列を、エドマン法（G.Allen in:Sequencing of proteins and peptides,Laboratory Techniques in Biochem.and Mol.Biol.9 ed.:Burdon,R.H.and Knippenberg,P.H.,Elsevier,1989）にしたがって、自動化配列解析によって解析した。得られた配列のうち、３種がオリゴヌクレオチドを設計するうえで適当であった。それらを下記の表１に示す。
0003630424.tif 000003
これらの配列にもとづいて、S.セレビシエのコドンの用法を使用して、オリゴヌクレオチドＡ−Ｃを化学的に合成した（Guthrie and Abelson in:The molecular biology of the yeast saccharomyces;eds.J.N.Strathern,E.W.Jones,J.R.Broach,1982）。オリゴヌクレオチドＡ−Ｃは以下の性質を有している。
−オリゴヌクレオチドＡ
ピーク:23
アミノ酸配列:GFDGDA
オリゴデオキシヌクレオチド:5'−GT/CGTCACCGTCGAANCC−3'
８倍縮重、コード鎖、17ヌクレオチド
−オリゴヌクレオチドＢ
ピーク:34
アミノ酸配列:EPHVYE
DNA配列:5'−C/TTCGTAGACG/ATGA/TGGT/CTC−3'
16倍縮重、コード鎖、18ヌクレオチド
−オリゴヌクレオチドＣ
ピーク:15
アミノ酸配列:ISYKPASFISK
DNA配列:5'−ATTTCT/ATAT/CAAA/GCCA/TGCTTCT/ATTT/AAAA−3'
16倍縮重、コード鎖、18ヌクレオチド
実施例2:酵母のゲノムDNAのプラスミドライブラリーのスクリーニング
化学的に合成したオリゴヌクレオチドＡ−Ｃ（実施例1.4）を使用して、酵母のゲノムDNAのプラスミドライブラリーpCS19（Sengstag and Hinnen,Nucl.Acids Res.15,233,1987）をスクリーニングした。このライブラリーは、酵母のゲノムDNAをSau3Aで消化し、ベクターpCS19のBcl I制限部位にクローニングすることによって調製されたものである。
実施例2.1  オリゴデオキシヌクレオチドの標識
オリゴヌクレオチドＡ−Ｃを、Maniatisら（T.Maniatis,J.Sambrook,E.F.Fritsch,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,C.S.H.Press,1989）にしたがってキナーゼ反応を実施することによって標識した。40ピコモルのオリゴデオキシヌクレオチドを、50μCiの〔γ−32P〕ATPを使用して標識した。「NUCトラッププッシュカラム（NUC Trap Push Column）」（ストラタジーン（Stratagene））を製造業者の取扱説明書にしたがって使用することによって、遊離放射性ヌクレオチドを除去した。
実施例2.2  ライブラリーのスクリーニング
DNAライブラリー（4992の互いに異なった単一コロニー）を、マイクロタイタープレートからニトロセルロースに移した。コロニーハイブリダイゼーションを、下記の条件下で、Grunstein and Hogness,PNAS,72,3961,1975にしたがって実施した。
−予備ハイブリダイゼーション：フィルターを、200mlの５×デンハート溶液、６×NET、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA中で、44℃で少なくとも４時間にわたってインキュベートした（５×デンハート溶液:0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％BSA;6×NET:0.9MNaCl、90mMトリス−HCl（pH8.3）、6mMEDTA（pH8.0））。
−ハイブリダイゼーション：フィルターを、100mlの５×デンハート溶液、６×NET、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA、標識オリゴデオキシヌクレオチドＡおよびＢ（それぞれ40ピコモル）中で、44℃でインキュベートした。ハイブリダイゼーションは、16時間にわたって行った。
−洗浄条件：フィルターを、50mlの６×SSC、0.1％SDS（w/v）中で、０℃にて15分間にわたって３回洗浄した。
陽性のコロニーを検出するために、フィルターを、−70℃にて16時間、Ｘ線フィルムに暴露した。こうした条件下で、12の陽性に反応するクローンを同定することができた。
実施例3:12の陽性クローンのサザン分析
12の陽性クローンを、３種の異なったオリゴデオキシヌクレオチドを使用して、サザンブロットで分析した。この分析によって、３種のオリゴヌクレオチドのすべてと反応する１つの陽性クローンを同定することができた。このクローンを、pDM3と称することとした。
12の陽性クローンを、アンピシリンを加えた5mlのLB培地中で生育させ、そのDNAを、Birnbaum and Doly,Nucl.Acid.Res.7,1513,1979の方法にしたがって単離した。
単離した各プラスミドDNA（プラスミド:pDM1−pDM12）の1/10を、制限酵素EcoR I−Xho I（各5U）、１×「ワン・フォア・オール（one for all）」緩衝液（ファルマシア（Pharmacia））（合計容量、20μｌ）で、37℃で１時間にわたって消化した。DNA断片を１％アガロースゲル上で分離し、Maniatisら（上掲）にしたがってニトロセルロースにブロットした。オリゴＡおよびＢを使用し、ライブラリーのスクリーニングについて述べたのと同一の条件を用いて、サザン分析を行った。オリゴＡのハイブリダイゼーション温度は48℃とし、オリゴＢについては42℃とした。クローン１、２、３、５、６、７、および11が、両方のオリゴデオキシヌクレオチドと陽性に反応した。これらの７つのクローンを、サザンブロット分析でさらに分析した。すなわち、３つの同一のブロットを調製し、クローン１、２、３、５、６、７、および11のDNAをEcoR I−Xho Iで消化し、上述したようにしてニトロセルロースにブロットした。ブロット１、２、および３は、20mlの５×デンハート溶液、６×NET、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA中で、50℃で４時間にわたって予備的にハイブリダイズさせた。次に、各ブロットを、10mlの５×デンハート溶液、６×NET、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA、40ピコモルの標識オリゴデオキシヌクレオチド中で、16時間にわたってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの温度は、下記の表２に示す。洗浄は、50mlの２×SSC、0.1％SDS（w/v）中で、各温度で10分間にわたって行った。
0003630424.tif 000004
クローン３が、オリゴＡ、Ｂ、およびＣと反応する唯一のクローンであった。このクローンをpDM3と称することとし、さらに分析を行った。
実施例4:pDM3の分析
実施例4.1  方法
実施例4.1.1  制限エンドヌクレアーゼによる消化
分析のためのエンドヌクレアーゼを用いた消化を、１×「ワン・フォア・オール（one for all）」緩衝液（ファルマシア）、0.2−0.5μｇのDNA、１−5Uの制限酵素（合計容量、20μｌ）中で、37℃で１時間にわたって行った。
分取用消化を、合計容量40−80μｌの、１−10μｇのDNA、５−20μｌの制限酵素,1×「ワン・フォア・オール」緩衝液中で、37℃で２時間にわたって行った。
実施例4.1.2  DNA−ゲル電気泳動
DNA断片の分離を、Maniatisら（上掲）にしたがって行った。
実施例4.1.3  DNA断片の単離
DNA断片の分離の後、「ジーン・クリーン・キット（Gene−clean kit）」（ストラタジーン（Stratagene））を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して、分離した断片を単離した。
実施例4.1.4  アルカリホスファターゼによる処理
DNA断片を、Maniatisら（上掲）にしたがって、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化した。
実施例4.1.5  ライゲーション
DNA断片を、1UのT4−DNAリガーゼを含有する１×T4ライゲーション緩衝液（50mMトリス/HCl（pH7.5）、10mM  MgCl2、5mM  DTT、1mM  ATP）（合計容量10−15μｌ）中でライゲーションした。ベクター：挿入断片のモルDNA比は、1:4又は1:8であった。DNAの絶対量は、20−50ngであった。インキュベーション時間:14℃で16時間、又は25℃で５時間。
実施例4.1.6  大腸菌の形質転換
コンピテント大腸菌DH5α細胞を、Hanahan（J.Mol.Biol.166（1983）,557）にしたがって調製した。Maniatisら（上掲）に記載されたようにして形質転換を行った。
実施例4.1.7  DNAの調整
プラスミドDNAを、Birnbaum and Doly（上掲）にしたがって調製した。
実施例4.1.8  サザンブロット分析
サザンブロット分析を、実施例３で述べたのと同一の条件を使用して実施した。
実施例4.1.9  DNA配列の分析
Sangerら（PNAS,74（1977）,5463）の方法にしたがって、DNAの配列決定を行った。プラスミドDNAのみの配列を調べた。T7−DNAポリメラーゼ・シークエンシング・キット（T7−DNA polymerase sequencing kit）（ファルマシア）を使用した。放射性ヌクレオチドは〔α−35S〕−dATP（比活性600Ci/mmol）を使用した。
実施例4.2  ORFの同定
この実施例は、pDM3の制限分析、オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、又はＣによって認識される各種DNA断片の同定、及びそれらのサブクローニングを開示する。これらのサブクローンの配列を決定することによって、ORFを同定することが可能となった。
実施例4.2.1  オリゴＡ、Ｂ、又はＣとハイブリダイズするpDM3DNA断片のサブクローニング
pDM3DNAを、EcoR I、Xho I、およびEcoR I−Xho Iで消化した。オリゴＡ、Ｂ、又はＣを標的として用い、サザンブロット分析を行った。
オリゴＡは3.0kbのEcoR I断片を認識し、オリゴＢおよびＣは1.1kbのEcoR I−Xho I断片を認識する。3.0kbのEcoR I断片（EcoR Iで直鎖状とし、脱リン酸化したもの）を、pUC19にサブクローニングした。1.1kbのEcoR I−Xho I断片（EcoR I−Sal Iで直鎖状とし、脱リン酸化したもの）を、pUC18にサブクローニングした。制限分析、及びオリゴＡ又はオリゴB/Cをそれぞれ使用したサザンブロット分析によって、適当なサブクローンを同定した。
3.0kbのEcoR Iサブクローンを、pMT4と称し、1.1kbのEcoR I−Xho Iサブクローンを、pMT1と称することとした。さらに、いくつかの互いに異なった制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、Pst I、Hind IIIおよびBgl II）を使用して、pMT4及びpMT1を制限分析した。オリゴＡ又はオリゴB/Cを使用してサザンブロット分析を行うことにより、ORFとなりうる正確な領域を特定した。
図１に、pDM3、pMT4及びpMT1の制限地図を示す。
実施例4.2.2  配列の分析
プラスミドpMT4及びpMT1のDNA挿入断片の配列を、pUC19/pUC18のポリリンカーに隣接してプライミングする普遍プライマー及び逆プライマーを使用して両端から決定した。オリゴＡ、ＢおよびＣも、配列決定用プライマーとして使用した。配列決定のデータから、pMT1の挿入断片の両側に、約400bpのORFが存在することがわかった。逆プライマーを用いて配列決定したところ、pMT4も約200bpのORFを示した。こうした配列決定のデータを使用することにより、アミノ酸配列を推定することができた。このアミノ酸配列は、92kDaのタンパク質のペプチドの分析によってわかっていたペプチド配列を示した（ピーク15、23、34と対応するペプチドが見いだされた）。これらのデータから、遺伝子の5'/3'の向きを予測することができた。
pUC18/19の普遍及び逆プライマーを使用して、これら以外にもいくつかのサブクローンを構築し、配列決定を行った（図２）。
配列決定に際しては、以下のオリゴデオキシヌクレオチドも使用した。
0003630424.tif 000005
これらのオリゴデオキシヌクレオチドは、新たに配列決定したDNA断片の一部を表すものである。
遺伝子の5'末端領域の配列を決定するため、ベクターpMT4のexo III/緑豆欠失を作製した。pMT4を、Sph Iを用いて直鎖状とした（3'重複）。次に、BamH Iを用いてプラスミドを切断した（5'重複）。
エキソヌクレア−ゼIIIによる欠失は、Roberts and Lauer（Meth.Enzymol.68,（1979）,473）、Henikoff（Meth.Enzymol.155（1987）,156）にしたがって実施した。
重複末端は、緑豆ヌクレアーゼによって取り除いた。得られたプラスミドを、Hind IIIおよびEcoR Iを使用した、制限分析によって分析した。
クローンの配列分析は、pUC19の逆プライマーを使用して実施した。図３に配列決定戦略を示す。図４に配列データを示す。
実施例5:ノーザンブロット分析：マンノシルトランスフェラーゼをコードしているmRNAの同定
実施例5.1  方法
実施例5.1.1  RNAの単離
全RNAを、Domdeyら（Cell 39（1984）、611）にしたがって、酵母の系統SEY2101（Mat  ａ、ade2−１、leu2−３、112、ura3−52）
0003630424.tif 000006
から単離した。
実施例5.1.2  ノーザンブロット
全RNAを、ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用して分離し、Maniatisら（上掲）に記載されたようにして、ニトロセルロースにブロットした。
実施例5.1.3  DNA−標的
pTM1の1.1kbの挿入断片を、EcoR I−Pst Iでの消化によって単離した。断片を、「ジーン・クリーン・キット」（ストラタジーン）を使用して精製した。
200ngのDNA断片を、「メガプライム（megaprime）」標識キット（アマシャム）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して、〔α32P〕−dCTP（50μCi）で標識した。
実施例5.2  結果
ニトロセルロースフィルターを、20mlの５×デンハート溶液、２×SSC、0.1％SDS（w/v）、50％ホルムアミド（v/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA中で、42℃で２時間にわたって予備的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを、10mlの１×デンハート溶液、２×SSC、0.1％SDS（w/v）、50％ホルムアミド（v/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA、200μｇの〔α32P〕−dCTPで標識したpMT1の1.1kbのEcoR I−Pst I断片中で、42℃で16時間にわたって行った。洗浄は、50mlの0.1×SSC、0.1％SDS（w/v）中で、室温で２回、50℃で２回行った。標的のハイブリダイゼーションは、Ｘ線フィルムへの暴露（−70℃、16時間）によって検出した。長さ3kbの単一のmRNAが検出された。
当業者であれば、図４の配列に由来する別のプローブと、別の起原（別の菌類細胞）から得たRNAとを使用して、以上の過程を容易に繰り返すことができる。
実施例6:O−グリコシル化活性を有さないS.セレビシエ細胞の調整
コード配列の1595塩基対に位置する、同定したORFのHind III制限部位にURA3遺伝子を挿入することにより、Ｏ−グリコシル化活性を有さないS.セレビシエ細胞を遺伝子破壊により調製した。
実施例6.1  遺伝子破壊に使用するプラスミドの構築
pMT1の1.1kbの挿入断片を、EcoR I−Pst I断片として単離し、pUC18ベクター（EcoR I/Pst Iで直鎖状とし、脱リン酸化。ポリリンカーにHind III部位を有さない。）にサブクローニングした。得られたベクターをpMT1.1と称することとした。
pMT1.1を、Hind IIIで直鎖状とし、脱リン酸化した。S.セレビシエのURA3遺伝子を含有するYEp24（Julius et al.,Cell 37（1984）,1075）の1.1kbのHind III断片を単離し、Hind IIIで直鎖状とし、脱リン酸化したベクターpMT1.1にサブクローニングした。クローンを制限分析で同定し、pMT1.1/URA3と称することとした（図５）。
pMT1.1/URA3は、URA3遺伝子の一方の側に隣接して0.24kbのpMT1のコード配列を有しており、他方の側に隣接して、0.86kbのpMT1のコード配列を有している。pMT1.1/URA3のCsCl−DNAを、Maniatisら（上掲）にしたがって調製した。
実施例6.2  酵母の形質転換
40μｇのpMT1.1/URA3のCsCl−DNAを、Sph I/EcoR Iで消化した。完全に消化されているかどうかを調べるために、消化したDNAの一部を、DNAアガロースゲル上で分析した。次に、消化物をフェノール化し、98％のEtOHでDNAを沈殿させた（Maniatisら、上掲）。DNAを、10μｌのTE（pH8.0）に再度溶解した。
S.セレビシエの系統であるSEY2101/2102（Mat  a/α、ura3−52、leu2−３、112、）（Emrら、上掲）及びSEY2101（Mat  ａ、ura3−52、leu2−３、112、ade2−１）を、Itoら（J.Bacteriol.153（1983）,163）の方法にしたがって、５μｌのEcoR I/Sph Iで消化したベクターpMT1.1/URA3で形質転換した。
SEY2101/2102の形質転換体を、最小培地＋Leu上で選択し、SEY2101の形質転換体を、最小培地＋Leu,＋Ade上で選択した。
30℃で３−４日後形質転換体を拾いだし、同じ培地上で２回目の平板培養を行うことができた。
実施例6.3  形質転換体のゲノムのサザンブロット
３種の半数体の形質転換体と野生型細胞のゲノムDNAを、Hoffmann and Winston（Gene,57（1987）,267）に記載されたようにして単離した。１μｇのゲノムDNAをXho I/EcoR Iで消化し、アガロースゲル上で分離し、Maniatisら、（上掲）に記載されたようにしてニトロセルロースにブロットした。
ブロットを、20mlの５×デンハート溶液、２×SSC、0.1％SDS（w/v）、0.1mg/mlのサケ精子DNA、50％ホルムアミド（w/v）中で、42℃で４時間にわたって予備的にハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーションを、10mlの同一の溶液中で、〔α32P〕−dCTPで標識したpMT1の1.1kbのEcoR I/Pst I断片（実施例5.1.3参照）200ngを加えて、42℃で16時間にわたって行った。洗浄は、50mlの２×SSC、0.1％SDS（w/v）中で室温で２回、50mlの１×SSC、0.1％SDS（w/v）中で68℃で２回行った。Ｘ線フィルムによって信号を検出した。野生型の細胞は1.1kbで単一の信号を示し、EcoR I/Xho I断片がURA3挿入断片を有していないことが示された。破壊した系統ではこの信号は検出されず、この信号のかわりに、新たな2.2kbの断片が1.1kbの標的によって認識され、1.1kbのEcoR I/Xho I断片が1.1kbのURA3断片を担持していることが示された。
実施例7:変異体の特徴づけ
実施例7.1  生育
SEY2101の野生型の細胞を、YPD（10g/lの酵母エキス、10g/lのペプトン、20g/lのデキストロース）、又は最小培地＋Ade,＋Leu,＋Uraのいずれかの上で生育させた。SEY2101のPMT1:URA3変異型細胞を、YPD及び最小培地＋Ade,＋Leu,上のいずれかで生育させた。細胞は、水浴振とう装置中で30℃にて生育した。細胞を超音波処理してから、30分おきにOD578を測定した。野生型の細胞と変異型の細胞は、双方の培地上でほぼ同一の生育を示すが、変異型の細胞は、場合によっては互いに付着する。しかし、付着した細胞は、超音波処理（30秒、水浴を超音波処理）によって容易に分離することができる。これらの細胞の生育特徴を下記に示す。
・世代時間
野生型:99分
変異型:93分
・細胞数
野生型:1  OD＝1.9×107
変異型:1  OD＝1.9×107
・倍加速度
野生型:0.61/時
変異型:0.65/時
対数成長している培養では、野生型の細胞の54.7％と、変異型の細胞の56％が出芽を示す。YPD上で24時間生育させたところ、野生型の細胞は、ODが578が11.4に達し、変異型の細胞は、12.3に達した。
実施例7.2  インビトロでのマンノシルトランスフェラーゼの活性及びウェスタンブロット
実施例7.2.1  膜粗製物の調製
SEY2101を、100mlの最小培地＋Ade＋Leu＋Ura上で、OD578＝0.5となるまで生育させた。SEY2101のPMT1::URA3を、100mlの最小培地＋Ade,＋Leu上で、OD578＝0.5となるまで生育させた。
各系統について二重に調製を行った。作業は氷浴上で行い、緩衝液は、いずれも４℃とした。40ODの細胞をペレット化し、25mlのTMA（50mMトリス/HCl（pH7.5）、7.5mM  MgCl2）中で洗浄した。細胞を、100μｌのTMAに再度懸濁し、バイオラックスチューブに移した。0.3gのガラスビーズを加え、ボルテックス上で、30秒間にわたって４回、（破砕の合間には氷浴上で冷却しつつ、）細胞を破砕した。パスツールピペットを使用して、抽出物をガラスビーズから除去した。ガラスビーズは、250μｌのTMAで３回洗浄した。洗浄液は、すべてエッペンドルフカップにプールした。溶液を、15秒間遠心分離した（10,000×ｇ）。上清を取り除き、ペレットを40μｌのTMAに再度懸濁した（1OD＝１μｌ）。
実施例7.2.2  マンノシルトランスフェラーゼの検定（インビトロ）
１μｌおよび５μｌの膜粗製物（実施例7.2.1）の酵素活性を、Strahl−Bolsinger and Tanner（上掲）に記載されたようにして調べた。野生型及び変異型の細胞の、２つの並行な試料を測定した。下記に示すのは、これらの２つの独立した測定の平均値である。
膜（μｌ） cpm/インキュベーション1)
野生型      １                 2786
野生型      ５                10289
変異型      １                  563
変異型      ５                 1135
1)  （ペプチド非含有の）コントロールの値は、それぞれ、506ならびに1031であった。
野生型の細胞とは対照的に、変異型の細胞は、インビトロでのマンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない。
実施例7.2.3  ウェスタンブロット分析
膜（実施例7.2.1の生成物、１μｌ）を、20μｌのSDS試料緩衝液中で、室温にて１時間インキュベートした。次に、Strahl−Bolsinger and Tanner（上掲）に記載されたようにして、SDS/PAGE及びウェスタンブロットを実施した。抗体を検出するにあたっては、ペルオキシダーゼECLキット（Peroxidase ECL kit）（アマシャム）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用した。92kDaのタンパク質に対する抗体が、野生型の膜の92kDaのタンパク質と特異的に反応する。変異型の膜では、この92kDaの信号が検出されない。
実施例7.3  インビボでのＯ−グリコシル化
インビボでのＯ−グリコシル化について調べる目的で、野生型及び変異型の細胞を、〔3H〕−マンノースの存在下で生育させた。次に、粗製の細胞壁＋膜の分画を単離し、β脱離によって、Ｏ−グリコシル化した物質を放出させた。
実施例7.3.1  〔3H〕−マンノースによる処理
野生型及び変異型の細胞を、スクロースを唯一の炭素源として含有する最小培地で一晩生育させた。7.5ODの培養物（OD578＝１−２）をペレット化し、5mlの水（30℃に予熱）で洗浄した。細胞を、5mlのYP/0.5％のスクロース/250μCi〔3H〕−マンノース中で、水浴振とう装置中で、30℃にて２時間生育させた。
実施例7.3.2  細胞壁及び膜粗製物分画の単離
5ODの〔3H〕−マンノース処理細胞を遠心分離し、1mlのTMAで３回洗浄した。細胞を200μｌのTMAに再度懸濁し、実施例7.2.1に記載したようにして、ガラスビーズで破砕した（取り込まれた物質全体に対応する放射活性をカウントするため、10μｌの試料を使用した）。次に、抽出物を15分間遠心分離（10,000×ｇ）し、上清を除去した（可溶性物質に対応する放射活性をカウントするため、100μｌの試料を使用した）。
実施例7.3.3  β−脱離
得られたペレットを、1mlの0.1N  NaOHに再度懸濁した（β脱離が生じる前の物質に対応する放射活性をカウントするため、10μｌの試料を使用した）。インキュベーションは、30℃で24時間維持した。
実施例7.3.4  β−脱離を生じた物質の分析
β−脱離を生じた物質を、ドウェックス（Dowex）50WS8/H+カラム（0.5cm×6cm）によって脱塩した。カラムを、0.5Mのマンノースで飽和させ、H2O中で平衡化させた。β脱離を生じた試料をカラムに充填し、1.5μｌのH2Oで洗浄した。流出物を集め（β脱離を生じた物質に対応する放射活性をカウントするため、100μｌの試料を使用した）、スピードバック（speed−vac）中で10μｌまで濃縮した。70:15:15のアセトン：ブタノール:H2Oにおける、シリカゲル60（メルク（Merck））上で薄層クロマトグラフィーを行った。標品：マンノース、スクロース、スタキオース、ラフィノース。クロマトグラフィーをもう一度繰り返した。糖は、100mlの1N  NaOH中の0.5gKMnO4を用いて検出した。放射活性は、薄層スキャナー（バーソルド（Berthold））によって検出した（図６）。
0003630424.tif 000007
変異型の細胞は、野生型の細胞と比べて、低減したグリコシル化を示す。変異型細胞でのＯ−グリコシル化は、野生型細胞でのＯ−グリコシル化より、約40−50％低い。
実施例8:クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のPMT1相同物のクローニング
菌類の宿主細胞中で異種タンパク質の製造を望むときは、酵母であるS.セレビシエを選択の系として使用した。しかし、近年になって、特に生成物を培養液中に分泌させることが要求されているときは、パン酵母の生産性が往々にして限定されることが示された。したがって、多くの事例で、S.セレビシエ以外の菌類の系を使用することが好適となっている〔Romanos et al.,Yeast 8（1992）,423−488;Fleer,Curr.Opinion Biothechnol.3（1992）486−496を参照〕。パン酵母を代替しうる酵母宿主の一つが、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属によって代表され、このクルイベロミセス属は、商業上重要ないくつかのタンパク質について、分泌量が優れていることが見いだされている〔たとえば、Van den Berg et al.,Bio/Technology 8（1990）,135−139〕。以下の実施例が例証するのは、S.セレビシエから単離されたPMT1遺伝子の配列は、他の菌種で同様の酵素活性をコードしている遺伝子を同定するために有利に使用することができるので、本発明はパン酵母に限定されるものではないということである。さらに、本発明で明らかとなった配列情報は、S.セレビシエ中の、マンノシルトランスフェラーゼをコードする関連遺伝子を同定するためにも使用することができる。
実施例8.1  PMT1関連遺伝子を増幅するための縮重PCRのプライマーの設計
相同な遺伝子を増幅する際のPCRプライマー〔Polymerase−catalyzed Chain Reaction,Saiki et al.,Science,230（1985）1350−1354;Mullis ＆ Faloona,Meth,Enzymol.155（1987）335−350〕を設計するため、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質の中央の親水性の領域に対応する、PMT1のヌクレオチド配列の領域を選択した。増幅に際しては、これらの合成オリゴヌクレオチドを、標的DNAとハイブリダイズ（アニーリングとも称される）させることが必要となる。ゲノムDNAの個々の領域を増幅するに際しての特異性は、PCRの反応条件、及び増幅を行うべきヌクレオチド配列とプライマーとの間の相同性の程度に依存する。アニーリング工程に引き続いて、熱に安定なDNAポリメラーゼを使用してプライマーを伸長させる。一旦相補鎖が重合されると、２本鎖を熱変性によって分離し、新たなアニーリング及び重合のサイクルを開始し得る。
PMT1相同物をPCRで増幅するためのプライマーとして適したオリゴヌクレオチドの４つの例を、下記の表２に示す。
0003630424.tif 000008
これらの「縮重」オリゴヌクレオチドを設計するにあたっては、同一のアミノ酸の新生ポリペプチド鎖への取り込みに関する情報を、数種のコドンが担っている可能性があり、トリプレットの第３番目の（「ゆらぎ」）位置で変異が生じていることが最も多いことを考慮した。したがって、各プライマーは、各種のオリゴヌクレオチドの混合物を示し、配列中のＹはＣ又はＴを表し、ＲはＡ又はＧを表し、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを表すものである。
実施例8.2  K.ラクティスのゲノムDNAのPCRによる増幅
K.ラクティスの系統であるCBS2359のゲノムDNAを、Shermanら〔“Methods in Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Laboratory Press（1986）p127〕に記載されたようにして調製した。10ngのゲノムDNAを、標準的なPCR反応〔Sambrock et al.,“Molecular Cloning−A Laboratory Manual",Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）〕に、１μｇの各プライマー及び５％の脱イオン化ホルムアミドの存在下で使用した。増幅は、「DNAサーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler）（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus））、及び「アンプリタックDNAポリメラーゼ（AmpliTag DNA Polymerase）（パーキン・エルマー・シータス、５単位／反応チューブ）を使用することによって実施した。変性、アニーリング、及び重合（30サイクル）の条件は、最初のサイクルで変性を５分間行った以外は、それぞれ、91℃（１分）、42℃（２分）、及び72℃（３分）とした。上掲のプライマーを使用したPCRによる増幅の結果を、下記の表３に示す。
0003630424.tif 000009
これらの結果は、S.セレビシエのPMT1遺伝子と相同なK.ラクチスの遺伝子について期待されたサイズと同一のサイズを示す断片を得ることができるばかりでなく、さらに、密接に関連した酵素活性をコードしている別の遺伝子に対応する可能性が高いDNA断片を、高い特異性をもって増幅しうることも示す。
実施例8.3  K.ラクティスのPMT1相同物の部分配列の特徴づけ
Sq3908＋Sq3910のプライマーの組み合わせによって増幅された400bpの断片を、ベクターpCR II（TAクローニング（TA Cloning）（登録商標）、インビトロゲン社（Invitrogen Corp.））に、供給業者の説明書にしたがってサブクローニングし、普遍プライマーを用いて、実施例4.1.9に記載した方法にしたがって部分的に配列を決定した。得られた配列を図７に示す。S.セレビシエのPMT1遺伝子と、PCRによる増幅によりK.ラクチスのゲノムDNAから単離した断片との間で配列を比較すると、ヌクレオチド及びアミノ酸のレベルで、それぞれ、75％及び80.5％の同一性が示された（図８）。増幅した400bpのDNA断片は、選択可能なマーカー遺伝子を、K.ラクチスのPMT1染色体遺伝子座に、実施例６に記載した実験と同様にして送達し、それによって破壊された遺伝子を得る際に使用することができる。この過程によって、Ser/Thr特異的なマンノシルトランスフェラーゼ活性が低減したK.ラクチスの遺伝子が得られる。また、増幅した断片は、K.ラクチスの全PMT1遺伝子を標準的手法を使用してクローニングするため、相同ハイブリダイゼーションのプローブとして使用し得る。
【図１】
0003630424.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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