(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントラサイクリン薬とヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメントとの複合体を含んでなる組成物であって、
該アントラサイクリン薬と該抗体またはそのフラグメントとがヒドラジドおよびマレイミドを含んでなるリンカーを介して連結されており、
該抗体がＣＤ７４への結合においてＬＬ１抗体と競合するものであり、
該リンカーが４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドであり、
該アントラサイクリン薬が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンからなる群から選択されるものである、組成物。
【請求項２】
アントラサイクリン薬とヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメントとの複合体を含んでなる組成物であって、
該アントラサイクリン薬と該抗体またはそのフラグメントとがヒドラジドおよびマレイミドを含んでなるリンカーを介して連結されており、
該抗体またはそのフラグメントがヒト化ＬＬ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
該リンカーが４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドであり、
該アントラサイクリン薬が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンからなる群から選択されるものである、組成物。
【請求項３】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アントラサイクリン薬が１３−ケト部分により抗体と連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
癌を治療するための医薬組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、種々の抗原をターゲッティングできる治療複合体に関する。これらの複合体はターゲッティング部分と化学療法薬を含む。このターゲッティング部分と化学療法薬は、細胞内で切断可能な部分を含んでなるリンカーを介して連結されている。
【０００２】
背景技術
長年、ヒトの癌に化学療法薬を特異的に送達するために抗体が使用できるということが、特異的にターゲッティングされた薬物療法の分野の科学者の目標であった。このような目標の実現はついに、癌の化学療法に魔法の弾丸の概念をもたらすことができた。この目標の達成に向けた著しい進歩は、Kohler and Milstein in 1975のハイブリドーマ技術の到来、および、その後、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製が可能となったこととともに現実のものとなった。過去２５年の間、ｍＡｂは癌細胞で過剰発現される多くの抗原性標的に対して惹起されてきた。単独、または薬物、毒素、放射性核種もしくはその他の治療薬との複合体として、多くのｍＡｂが、前臨床試験、そして次に臨床試験に供されてきた。一般に、ｍＡｂ自体（裸のｍＡｂと呼ばれる）は、長期間の生存を固形腫瘍を有する患者の標準とするには不十分であったが、後に、乳癌および結腸癌の双方に向けられたｍＡｂ治療（それぞれＨＥＲ２−ｎｅｕおよび１７−１Ａに対するｍＡｂ）において生存の優位性が認められた。血液悪性疾患では、とりわけＢ細胞リンパ腫に対する裸のｍＡｂ（Ｂ細胞の表面上のＣＤ２０およびＣＤ２２に対するｍＡｂ）を用いてより大きな成功が達せられつつある。
【０００３】
しかし、腫瘍関連ｍＡｂと好適な有毒薬との複合体の使用が、癌のほとんどの臨床例に対して裸のｍＡｂよりも効果が高いのは自明である。この場合、ｍＡｂは、メカニズムを細胞溶解を招く作用へと向かわせる本来の毒性、すなわち、補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）などの、ｍＡｂのＦｃ部分によってもたらされる天然または再操作されたエフェクター機能による毒性に加え、罹患組織へ特異的に有毒薬を運ぶ。しかし、ｍＡｂフラグメントの場合のように、アポトーシス、脈管形成の阻害、転移活性の阻害、および／または腫瘍細胞接着への影響などの他のメカニズムは働き得るので、Ｆｃ部分は治療機能には必要でない可能性がある。有毒薬は、最も一般的には化学療法薬、粒子放出放射性核種、または細菌もしくは植物毒素である。各種複合体は特定の独自の利点を有する。透過性放射性核種ならびに細菌および植物毒素は極めて毒性が高く、通常、標準的な化学療法薬よりも数オーダー毒性が高い。臨床の状況下ではｍＡｂの罹患組織への取り込みは極めて低いので、前者２つはｍＡｂとともに用いるのが有用となる。臨床現場で腫瘍のｍＡｂ取り込みが低いことと、癌の化学療法薬の毒性特性が比較的低いことは、これまでｍＡｂ−薬物複合体がなぜその有望性に応えることができなかったかという主な理由となっている。
【０００４】
ヒトの癌を研究するために設定された前臨床動物異種移植モデルでは、それらの腫瘍を完全に退縮させ、あるいは動物を治癒させることもできる多くのｍＡｂ複合体が報告されている。しかし、これらの動物異種移植モデルの多くでは腫瘍のｍＡｂ複合体取り込みは組織１グラム当たり注射量の１０〜５０％の範囲である場合が多く、一方、臨床状況下では、腫瘍の取り込みは組織１グラム当たり注射量の０．１〜０．０００１％というのが通常である。通常、より毒性の高い放射性核種および毒素を用いて作製したｍＡｂ複合体は、標準的な化学療法薬を用いた、対応するｍＡｂ−薬物複合体よりも臨床上いくらかよい成果をもたらしてきたのも驚くことではない。しかしながら、放射性核種ｍＡｂ複合体は、腫瘍局在活性に比べて大過剰の循環中の崩壊放射活性の存在のために、甚大な毒性をもたらす可能性がしばしばある。毒素−ｍＡｂ複合体には、非標的組織の損傷が大きいことと、通常用いられる植物または細菌のタンパク質に対する免疫反応性が大きいことの二重の欠点がある。ｍＡｂは現在、ヒトまたはヒト化（相補性決定領域がグラフト化されている）形態で作製することができるが、どんな複合体であれ、毒素部分の脱感作は依然として進展が著しく阻まれているものと思われる。
【０００５】
これまで臨床の場では必要な効力を欠くことが分かっているにもかかわらず、ｍＡｂ−薬物複合体はなお、注目に値する理論的利点を有する。薬物自体は構造的に十分に定義されており、イソ型では存在せず、十分に定義された複合化化学を用いて、ｍＡｂタンパク質と、多くの場合ｍＡｂの抗原結合領域から離れた特定の部位で連結させることができる。ＭＡｂ−薬物複合体はｍＡｂと毒素を含む化学複合体よりも再現性よく作製することができ、それ自体、商業的開発および規制認可に従いやすい。このような理由で、ｍＡｂの薬物複合体への関心は不利なことに出くわすにもかかわらず、継続してきた。しかし、最近のいくつかの例では、前臨床結果が極めて有望となってきた。複合化化学の改良を継続し、ｍＡｂの免疫原性を除去または軽減することができれば、臨床癌治療に有用なｍＡｂ−薬物複合体のとらえどころのない有望性が新たに考えられる。
【０００６】
ｍＡｂ−薬物複合体に関する関連の初期の研究では、in vitroおよびin vivo前臨床試験中に、用いた化学結合が薬物の効力の欠如を招く場合が多いことが分かった。従って、何年も前に、有用な治療薬とするためには、ｍＡｂ成分により標的細胞によってひと度インターナライズされた後に、薬物をもとの形で放出させる必要があるということが分かっていた。そして、１９８０年代と１９９０年代のはじめの研究は、主として薬物とｍＡｂの間の化学リンカーの性質に注がれた。腫瘍内のｐＨが通常の生理学的ｐＨよりも低い場合が多いという所見に基づき、弱酸で切断可能なリンカーを用いて作製された複合体が開発されたことは注目に値する（米国特許第４，５４２，２２５号；同第４，５６９，７８９号；同第４，６１８，４９２号；および同第４，９５２，３９４号）。このアプローチは、好適なリンカーを用いて作製されたｍＡｂ−ドキソルビシン（ＤＯＸ）複合体を用いて、前臨床試験で種々のヒト腫瘍異種移植片を有するマウスを治癒させることができたことを示すTrail et al. (Science 261 : 212-215 (1993))の画期的な論文で最高潮に達した。この有望な結果はターゲッティングされる腫瘍細胞上に非常に多数の受容体を持った抗体（ＢＲ９６と呼ばれる）を用いて達成され、このｍＡｂ−薬物複合体は高度に置換されており（ｍＡｂ１単位当たりＤＯＸ残基６〜８個）、この複合体は反復して多量に投与された。
【０００７】
臨床状況下では、腫瘍のｍＡｂ取り込みはずっと低く、この変動には必ず取り組まねばならなかったので、望みの治療作用を得るためには、より毒性の高い薬物が必要となった。数種の異なるｍＡｂ−薬物複合体の開発に、より毒性の高い薬物が使用された（米国特許第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第５，８７７，２９６号；および同第６，０１５，５６２号）。これらの試みでは、標準的な化学療法では本質的に毒性が高すぎて使用できないマイタンシノイドおよびカリチェアミシンの誘導体などの薬物を用いる。ｍＡｂとの複合化により、化学療法単独の場合に非特異的細胞−タンパク質結合がしばしば見られるのに対し、比較的多くの薬物が腫瘍にターゲッティングできる。これらのもののような薬物の強い毒性は、通常腫瘍標的上には低いレベルの抗原結合部位しか見られないがために臨床上腫瘍にターゲッティングされるｍＡｂのレベルが低いという点を克服する可能性がある。前臨床試験では、ヒト腫瘍異種移殖を有するマウスの治癒は、従前にＤＯＸなどの標準的な薬物を用いたｍＡｂ−薬物複合体で見られたものより遙かに低用量のｍＡｂ−薬物複合体で見られた(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8616-8623 (1996) and Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))。メイタンシノイド−ｍＡｂ複合体（Ｌｉｕ）の場合、治療に必要な複合体の量は、ＤＯＸ複合体で従前に必要であったものの５０分の１を超えるものであった（Trail,  前掲）。
【０００８】
これらの複合体の開発の際、in vitroおよびin vivoの双方で良好な抗腫瘍活性を保持するには、薬物とｍＡｂとの間のリンカーが重要であると思われた。例に挙げられた複合体は細胞内で切断可能な部分（ヒドラゾン）と、還元の影響を受けやすい薬物とｍＡｂの間の（ジスルフィド）結合を用いて作製されたものであった。ヒドラゾン結合はin vivo血清条件において明らかに安定であるが、通常のジスルフィド結合は実用に耐えるほど安定でないことが分かった。標準的なジスルフィド結合を、カルチェアミシンの場合には障害型（ジェミナルジメチル）ジスルフィド結合で、あるいはメイタンシノイドの場合にはメチルジスルフィドで置換した複合体が作製された。この研究とは別に、新たなアントラサイクリン置換ｍＡｂ複合体についての別の研究が継続された。新たなＤＯＸ複合ｍＡｂの場合では、切断可能な単位としてまさにヒドラゾンを組み込み、ジスルフィドの代わりにチオエーテル基を介してＤＯＸをｍＡｂに結合させることにより、優れた結果が得られることが分かった（米国特許第５，７０８，１４６号）。このような方法で、しかも、ＭＡｂ置換部位１カ所当たりのＤＯＸ単位の数を二倍にし得る分枝型リンカーを用いて連結させれば、新たなＤＯＸ−ＭＡｂ複合体の効力にほぼ１オーダーの増強が得られた(King et al., Bioconjugate Chem. 10:279-288, (1999))。
【発明の概要】
【０００９】
本発明はアントラサイクリン薬の新規なインターナライジング(internalizing)抗体複合体に関するものである。特定の実施態様の例を挙げると、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、および２−ピロリノ−ドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）がある。２−ＰＤＯＸは特に有毒で、その構造中にエナミンを含み、インターカレーターおよびトポイソメラーゼ阻害剤として作用するだけでなく、高い毒性を有するアルキル化剤としても働く。ＤＯＸ同様、２−ＰＤＯＸも比較的優れた水溶性を持ち、これはｍＡｂを沈殿させることなく置換量を倍増させてｍＡｂと結合させることができることを意味する。以下に詳細に記載する薬物は一貫して、ｍＡｂ１分子当たり平均８（通常、７〜９と評価される）の薬物部分で置換される。しかし、薬物数はｍＡｂ１分子当たり６〜１０分子の間であり得る。
【００１０】
一つの態様では、本発明は、ターゲッティング部分、アントラサイクリン薬、およびチオール基を介してターゲッティング部分と結合し、かつ、細胞内で切断可能な部分を介してアントラサイクリン化学療法薬と結合するリンカーを含んでなる免疫複合体に関する。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、ターゲッティング部分はｍＡｂであり、アントラサイクリン化学療法薬はＤＯＸ、２−ＰＤＯＸ、モルホリノ−ＤＯＸおよびモルホリノシアノ−ＤＯＸであり、細胞内で切断可能な部分はヒドラゾンである。
【００１２】
他の態様では、本発明は、疾病ターゲッティング抗体とアントラサイクリン化学療法薬とを含んでなる免疫複合体に関する。ここ３０〜４０年のうちに何百もの例のアントラサイクリン薬が合成されており、それらについては他所で述べられている（Anthracycline Antibiotics; New Analogs, methods of Delivery, and Mechanisms of Action, Waldemar Priebe, Editor, ACS Symposium Series 574, American Chemical Society, Washington DC, 1994参照）。このような類似体も本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００１３】
好ましい実施態様では、本発明は、疾病ターゲッティング抗体、式ＩおよびＩＩ：
【化１】
0005501927.tif 000002
［式中、Ａは存在しないか、またはＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、０、Ｓ、およびＣＨ２からなる群から選択されてよく；波線は単結合または二重結合を表し；かつ、ＲはＨまたはＣＮである］のアントラサイクリン化学療法薬、およびスルフィド基を介してターゲッティング部分と結合し、かつ、細胞内で切断可能な部分を介してアントラサイクリン化学療法薬と結合するリンカーを含んでなる免疫複合体に関する。Ａが「存在しない」場合、各側でＡに隣接する炭素原子は単結合で連結されて５員環となっている。
【００１４】
本明細書において「アルキル」とは、１〜２０個の炭素原子からなる直鎖および分枝鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素基をさす（本明細書で数値の範囲、例えば１〜２０という場合、その基、この場合にはアルキル基が炭素原子１個、炭素原子２個、炭素原子３個など、炭素原子２０個までの（２０個を含む）を含み得ることを意味する）。１〜４個の炭素原子を含むアルキル基は低級アルキル基と呼ぶ。より好ましくは、アルキル基は１〜１０個の炭素原子を有する中程度の大きさのアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルなどである。最も好ましくは、それは１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルなどである。
【００１５】
本明細書において「シクロアルキル」とは、３〜８員が全て炭素の単環式環、全て炭素の５員／６員または６員／６員が縮合した二環式環、または１以上の環が１以上の二重結合を含み得るが、完全に共役されたｐｉ電子系を有する環がない多環式縮合環（「縮合環系」は、系内の各環が系内の互いの環と隣接する炭素原子対を共有していることを意味する）基をさす。シクロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、アダマンタン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンなどがある。シクロアルキル基は置換されていてもされていなくともよい。
【００１６】
他の好ましい実施態様では、細胞内で切断可能な部分はヒドラゾンである。
【００１７】
好ましい実施態様では、ｍＡｂは腫瘍関連抗原をターゲッティングするｍＡｂである。腫瘍関連抗原は腫瘍細胞またはそれらの血管構造によって、正常細胞におけるよりも高い量で発現される抗原と定義される（なお、正常細胞は患者の生存に不可欠な細胞機能が活発である）。腫瘍関連抗原は、造血系細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞または骨髄細胞の系列抗原など、種々の正常細胞に関連する抗原であってもよく、それにより該正常細胞の一時的、選択的低下により患者が生存でき、一方、同じ抗原を発現する悪性細胞は、患者の症候を軽減し、患者の症状を改善するために十分に破壊される。また、ｍＡｂは造血系悪性疾患に関連する抗原と反応性を有するものであってもよい。
【００１８】
さらに別の実施態様では、ｍＡｂはＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞、およびその他の造血細胞関連抗原、例えばＢ細胞のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３；骨髄細胞のＣＤ３３、ＣＤ４５、およびＣＤ６６；Ｔ細胞のＩＬ−２（ＴＡＣまたはＣＤ２５）；種々の造血系腫瘍のＭＵＣ１、テネイシン、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０；  種々の癌腫のＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、Ｌｅ  （ｙ）、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥ、Ｓ１００、テネイシン、およびＴＡＧ−７２；神経膠腫のテネイシン、ならびに血管細胞および内皮細胞によって発現される抗原、およびある種の癌の支持間質からなる群から選択される。
【００１９】
さらに別の実施態様では、ｍＡｂはＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＡ２０およびリツキシマブ（抗ＣＤ２０）、Ｍ１９５（抗ＣＤ３３）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、１７−１Ａ（抗ＥＧＰ−２）、ＰＡＭ−４、ＢｒＥ３、およびＫＣ４（総て抗ＭＵＣ１）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ））、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗αフェトタンパク質）、抗ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）抗Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、ＢＣ−２（抗テネイシン抗体）およびＧ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ｍＡｂ）からなる群から選択される。これらの複合体を用いてターゲティングされ得る他の有用な抗原としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、ｃＡ２０、１Ｆ５  Ｍａｂｓ）ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ８０、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）、ＩＬＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＳＭＡ、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ｉｉ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、Ｔｈｏｍａｓ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍脈管形成抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２（ＣＤ２５）、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、ＣＤ６６、ＣＥＡ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０またはこれらの組合せが挙げられる。
【００２０】
特に好ましい実施態様では、ターゲッティングｍＡｂは表面抗原に対するものとされ、この表面抗原は次にその抗体とともに速やかにインターナライズされる。
【００２１】
特に好ましい実施態様では、ターゲッティングｍＡｂはＣＤ７４抗原に対するものとされる。
【００２２】
さらに別の好ましい実施態様では、リンカーは４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−ｌ−カルボキシルヒドラジド基である。
【００２３】
また、本発明の組成物の製造方法も、該組成物の使用方法とともに記載する。
【好ましい実施態様の詳細な説明】
【００２４】
本明細書において特に断りのない限り、単数形で表される用語は「１以上」のものを意味する。
【００２５】
緒論
上述のような化学療法薬は、いくつかの方法により抗体と結合させてｍＡｂ−薬物複合体を形成することができる。例えば、化学療法薬は、ｍＡｂ分子内(inter-chain)ジスルフィド結合を還元した後、ｍＡｂまたはそのフラグメントと結合させることができる。このアプローチにより抗体１分子当たり平均８〜１０個（ＩｇＧのタイプによる）の遊離チオール基が生じ、これは、還元反応で用いられるチオールの制限レベルにおいて再現性のある様式でなされる。この化学療法薬の結合方法は以下のような理由で有利である。第一に、結合された化学療法薬はｍＡｂまたはそのフラグメントの分子内または半分子内に配置され、親水性リジン残基上に露出していない。これにより、化学療法薬が配置されているｍＡｂの領域がより疎水性が高いために、それらはより安定に維持される。第二に、このような部位はｍＡｂ、またはそのフラグメント全体の電荷を変えない。第三に、分子内チオール上に配置されていることによってＡＤＣＣおよび補体作用が妨害されにくくなり、このことは裸のｍＡｂを用いる場合には特に重要である。このように、結合部位は、薬物送達ビヒクルとしての役割を妨害しないように、従って、ＡＤＣＣおよび補体結合がｍＡｂまたはｍＡｂフラグメントと相補的となるように選択される。第四に、分子内のチオール位置に配置されると、露出したリジン基上に多数の化学療法薬分子が配置されている場合に比べ、化学療法薬に対する免疫応答に至りにくくなる。いくつかの実施態様では、Ａｂ−薬物複合体における抗体の全体の電荷は、複合化する前の抗体の電荷に比べて変化していない。これがリジン残基を複合体形成反応に用いない理由であり、従って、遊離の正電荷アミノ酸基を改変して、例えば中性アミド結合を形成させることはない。
【００２６】
抗体
本明細書において抗体とは、全長（すなわち、天然に存在する、または通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に有効な（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。
【００２７】
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは完全な抗体により認識される同じ抗原と結合し、従って、その抗体の抗原結合フラグメントである。
【００２８】
「抗体フラグメント」はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質をも含む。例えば、抗体フラグメントとしては、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離されたフラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが挙げられる。Ｆｖフラグメントは多価および／または多重特異性結合型を得るために種々の方法で構築することができる。多価結合型は特定のエピトープに対して１を超える結合部位において反応するが、多重特異性型は１を超えるエピトープ（その抗原の、または特定の抗原および異なる抗原に対してさえ）と結合する。
【００２９】
本明細書において、抗体融合タンパク質とは、特異性が同じかまたは異なる二以上の同じかまたは異なる天然抗体、単鎖抗体もしくは抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換え生産された抗原結合分子である。融合タンパク質は少なくとも１つの特異的結合部位を含んでなる。
【００３０】
融合タンパク質の価数は、この融合タンパク質が抗原またはエピトープに対して有している結合アームまたは結合部位の総数を示し、すなわち、一価、二価、三価または多価などである。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、従って、その抗原に、または異なる抗原に結合する結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの異なるタイプの抗原またはエピトープに結合できるかを示し、すなわち、一重特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性などである。これらの定義により、例えばＩｇＧのような天然の抗体は、結合腕を二本持つために二価であるといえるが、この抗体は一つのタイプの抗原またはエピトープにしか結合しないので一重特異性である。一重特異性、多価融合タンパク質は、同じ抗原またはエピトープに対して一を超える結合部位を有する。例えば、一重特異性ダイアボディーは同じ抗原と反応性のある二つの結合部位を有する融合タンパク質である。この融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組合せ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含んでもよい。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様では、標的細胞において高いレベルで発現し、かつ、正常細胞に比べて罹患細胞で優先的に発現するか、罹患細胞でしか発現しないマーカーまたは腫瘍関連抗原を認識する、またはそれと結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの抗体、および速やかにインターナライズされる抗体を用いる。本発明の範囲内で有用な抗体としては、上記のような特性を有する（かつ、細胞および微生物への種々のレベルのインターナリゼーションの識別可能な特性を示す）抗体などの、腫瘍関連抗原に対する抗体が挙げられ、限定されるものではないが、癌における、以下のｍＡｂ：ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、Ｍ１９５（抗ＣＤ３３）、ＭＮ３（抗ＮＣＡ９０）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ−４、ＢｒＥ３およびＫＣ４（総て抗ＭＵＣｌ）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ））、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α−フェトタンパク質）、抗ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、抗Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｍ１９５（抗ＣＤ３３）およびＧ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ｍＡｂ）の使用を意図する。これらの複合体を用いてターゲッティングできる他の有用な抗原およびそれら抗原の種々のエピトープとしては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  Ｍａｂ）ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＰｌＧＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＴｎまたはＴｈｏｍａｓ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍脈管形成抗原、Ｇａ７３３、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、またはそれらの組合せが挙げられる。上述の抗原のいくつかは、２００２年１１月１５日出願の「治療薬のターゲッティング送達のための多重特異性非共有結合複合体の使用」と題された米国仮出願第６０／４２６，３７９号に開示されている。
【００３２】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、速やかにインターナライズされ、次に細胞表面で再発現する抗体を用いて、細胞による循環中の抗体−化学療法薬複合体の取り込みと融合を可能とする。好ましい実施態様では、薬物はアントラサイクリンであり、抗体−アントラサイクリン複合体が標的細胞中にインターナライズされ、次に、その細胞表面上に再発現される。最も好ましい抗体／抗原対の一例はＬＬ１とＣＤ７４（定常鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）である。ＣＤ７４抗原はＢ細胞リンパ腫、ある種のＴ細胞リンパ腫、黒色腫およびある種の他の癌で高度に発現される(Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999))。
【００３３】
好ましい実施態様では、ヒト疾病の治療に用いる抗体は、ヒトまたはヒト化（ヒト枠組み構造にＣＤＲをグラフト化したもの）型の抗体であるが、マウス、キメラおよび霊長類化型の抗体も使用できる。獣医学的使用では、同種ＩｇＧが最も有効なベクターである可能性があるが、イヌにおけるマウス抗体の使用（例えば、イヌリンパ腫を治療するためのＬ２４３抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ）などの交差種ＩｇＧもなお有用である。送達因子としての同種免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子は免疫応答を最小とするのに最も好ましい。これは反復処置を考えた場合に特に重要である。ヒトのためのヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は患者の抗ＩｇＧ免疫応答を生じにくい。インターナライズする抗原をターゲッティングすると、ｈＬＬｌおよびｈＬＬ２などの抗体が標的細胞との結合後に速やかにインターナライズするが、これは結合した化学療法薬が速やかに細胞にインターナライズされることを意味する。
【００３４】
サイトカインなどの免疫調節剤もまたモノクローナル抗体−アントラサイクリン薬に結合させることができるし、あるいは本発明の好ましい実施態様のキメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体−アントラサイクリン薬複合体に結合させずに投与することもできる。免疫調節剤は本発明の好ましい実施態様のモノクローナル抗体−アントラサイクリン薬複合体を投与する前、投与と同時、または投与した後に投与することができる。免疫調節剤はまた、異なる抗原に結合する１以上の抗体からなるハイブリッド抗体と結合させることができる。このような抗原もまた、免疫調節剤であり得る。例えば、ＣＤ４０またはその他の免疫調節剤は、抗ＣＳＡｐまたは抗ＣＳＡｐ／非ＣＳＡｐ抗体の組合せと組み合わせて、抗体の組合せとともに、または前に、または後に投与する。このモノクローナル抗体−アントラサイクリン薬複合体はまた、ＣＤ４０に対するものなどと組み合わせて、または結合させて、または融合タンパク質として使用できる。
【００３５】
本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および造血因子、例えばインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンが挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。
【００３６】
本発明における免疫調節剤は、存在する場合に身体の免疫系を変更、抑制または刺激するものとして定義される治療薬である。通常、本発明で有用な免疫調節剤は、マクロファージ、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞などの免疫応答カスケードにおいて免疫細胞を刺激して増殖または活性化させる。本明細書に記載の免疫調節剤の例としてはサイトカインがあり、これは特定の抗原と接触した際にある細胞集団（例えば、刺激されたＴリンパ球）によって放出される約５〜２０ｋＤの可溶性の小タンパク質であり、細胞と細胞の間で細胞間メディエーターとして働く。当業者ならば分かるであろうが、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、およびいくつかの関連のシグナル伝達分子、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェロンが挙げられる。ケモカインはサイトカインの一種である。ある種のインターロイキンおよびインターフェロンはＴ細胞またはその他の免疫細胞増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様では、免疫調節剤はアントラサイクリン薬−抗体複合体の有効性を高めるが、いくつかの例ではこれは宿主の刺激因子であるエフェクター細胞による。
【００３８】
抗体−化学療法薬複合体
本発明はアントラサイクリン薬と抗体との複合体に関するものであり、ここで、アントラサイクリン薬と抗体とは、ヒドラジドおよびマレイミドを含んでなるリンカーを介して連結されている。このリンカーは、好ましくは４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドである。複合体は、好ましくは式：
【化２】
0005501927.tif 000003
（式中、ｎは６〜１０である）
を有する。
【００３９】
さらに、この抗体は腫瘍関連抗原に対するものであるか、またはそれを認識する。抗体はモノクローナル抗体であっても、その抗原結合フラグメントであっても、あるいは抗体融合タンパク質であってもよい。抗体融合タンパク質は、多価かつ／または多重特異性である。複合体中の抗体融合タンパク質は２以上の同じもしくは異なる天然または合成の抗体、単鎖抗体、または特異性が同じもしくは異なる抗体フラグメントセグメントを含んでなってもよい。融合タンパク質の抗体または抗体フラグメントは、ＬＬ１、ＬＬ２、Ｍ１９５、ＭＮ−３、ＲＳ７、１７−１Ａ、ＲＳ１１、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＢｒＥ３、ＭＮ−１４、Ｍｕ−９、Ｉｍｍｕ３１、ＣＣ４９、Ｔｎ抗体、Ｊ５９１、Ｌｅ（ｙ）抗体およびＧ２５０からなる群から選択することができる。
【００４０】
この腫瘍関連抗原はインターナライジング抗体によりターゲッティングできる。この複合体は癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、神経膠腫または皮膚癌（例えば、黒色腫）を治療するのに有用である。腫瘍関連抗原は、好ましくはＣＤ７４、ＣＤ２２、ＥＧＰ−１、ＣＥＡ、結腸特異的抗原−ｐムチン（ＣＳＡｐ）、炭酸脱水素酵素ＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６６、ＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＤ８０、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＰｌＧＦ，ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３，ＭＵＣ４、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−Ｄ−ＤＲ、ＣＤ３０，Ｉａ、Ｉｉ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＴｎおよびＴｈｏｍａｓ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍脈管形成抗原、Ｇａ  ７３３、ＩＬ−２、ＭＡＧＥ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、腫瘍関連抗原はＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＥＧＰ−１、ＭＵＣ１、ＣＥＡおよびＡＦＰからなる群から選択される。これらの腫瘍関連抗原はＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞の系列抗体（ＣＤ）、または血液悪性疾患に関連する抗原であり得る。
【００４１】
複合体の抗体部分はマウス、キメラ、霊長類化、ヒト化、またはヒト抗体とすることができる。抗体は、ＩｇＧまたはそのフラグメントなど、完全な免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメントであってよい。好ましくは、抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１，ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原など、Ｂ細胞に対するものである。抗体、その抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、好ましくは、ＬＬ１、ＬＬ２、Ｌ２４３、Ｃ２Ｂ８、Ａ２０、ＭＮ−３、Ｍ１９５、ＭＮ−１４、抗ＡＦＰ、Ｍｕ−９、ＰＡＭ−４、ＲＳ７、ＲＳ１１および１７−１Ａからなる群から選択される。より好ましくは、抗体はＬＬ１、ＬＬ２、Ｌ２４３、Ｃ２Ｂ８、またはｈＡ２０である。さらには、この抗体は、抗体上の分子内ジスルフィド結合であり得る、抗体上の還元されたジスルフィド結合と結合するリンカーを介して薬物と連結される。
【００４２】
複合体のアントラサイクリン薬部分は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンからなる群から選択される。さらに、このアントラサイクリン薬は１３−ケト部分を介して抗体と連結させることができる。好ましくは、抗体１分子につき６〜１０分子のアントラサイクリン薬が存在する。さらに、この抗体−アントラサイクリン複合体は標的細胞中にインターナライズされ、次にその抗原はその細胞表面で再発現される。
【００４３】
本発明は本明細書に記載の複合体の製造方法に関するものであり、該方法では、まず、リンカーをアントラサイクリン薬と結合させ、それにより、アントラサイクリン薬−リンカー複合体を製造し、次にこのアントラサイクリン薬−リンカー複合体をチオール還元モノクローナル抗体または抗体フラグメントと結合させる。このアントラサイクリン薬−リンカー複合体はチオール還元モノクローナル抗体または抗体フラグメントと結合させる前に精製してもよいが、必ずしもその必要はない。従って、好ましくは、チオール還元モノクローナル抗体または抗体フラグメントとの結合の前にアントラサイクリン薬−リンカー複合体を精製する必要はない。この複合体の製造方法では、アントラサイクリン薬上の第二の反応性官能基が影響を受けないようにしなければならない。さらに、この複合体の製造方法では、アントラサイクリン薬のアルキル化基が影響を受けないようにしなければならない。この複合体のアントラサイクリン薬は、好ましくは２−ピロリノ−ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシンまたはシアノモルホリノ−ドキソルビシンである。
【００４４】
これらの化学療法薬分子は中性ｐＨでチオール反応に特異的な遊離マレイミド基を含むよう、抗体との結合のために個々に活性化させる。化学療法薬が反応性ケトンを有する場合、このケトンは、以下のスキームＩに示すように、市販のリンカー４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ；  Pierce Chemical Co., Rockford. IL）［また、Molecular Biosciences, Inc., Boulder, COによりトリフルオロ酢酸塩としても供給されている］を用いてヒドラゾンに変換することができる。
【００４５】
スキームＩでは、ＤＲＵＧは化学療法薬、好ましくはアントラサイクリン薬であり、Ｒ基は水素原子か、または所望によりヒドロキシル基（−ＯＨ）で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基のいずれかである。
【化３】
0005501927.tif 000004
【００４６】
特定の理論に縛られるものではないが、リンカーＭ２Ｃ２Ｈは、２つの理由から、本発明の好ましい実施態様に関して特に有用なリンカーであると考えられる。第一に、リンカー中のシクロヘキシル基はヒドラゾン官能基を安定化させると考えられる。用いるヒドラゾン結合は血清条件に対して実質的に安定であるのが重要で、形成されたヒドラゾンに近接するシクロヘキシル基は、より標準的な直鎖アルキル基に比べ、より安定なヒドラゾン結合をもたらす。第二に、ケトンとこのカルボキシルヒドラジドとの反応から生じたヒドラゾンは、化学療法薬−ｍＡｂ複合体がひと度細胞内にインターナライズされると切断される
【００４７】
マレイミド置換化学療法薬は、還元型ｍＡｂ上の利用可能なチオール基に対して若干過剰量（１〜５倍モル）で、還元型ｍＡｂと水溶液中で混合する。この反応は中性、中性付近または中性より低いｐＨ、好ましくは約ｐＨ４〜約ｐＨ７で行う。これらの成分を約５〜約３０分の短い反応時間で反応させる。しかし、当業者ならば、反応条件が反応時間およびｐＨに関して至適化できることが分かるであろう。以下に模式的に示されている化学療法薬−ｍＡｂ複合体（ｎは１〜１０、好ましくは１〜８の整数である）を、サイズ排除および疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムによるクロマトグラフィーにより化学療法薬およびその他のバッファー成分から分離する。好ましい実施態様では、この薬物はアントラサイクリンであり、ｎは６〜１０の整数である。
【化４】
0005501927.tif 000005
【００４８】
上記の条件は２−ＰＤＯＸの場合に最適である。この反応条件は、遊離型として生じたｍＡｂのチオール基のみがマレイミド活性化化学療法薬と反応し、一方、２−ＰＤＯＸのエナミンはこの反応条件に影響を受けないことが保証されるので最適である。驚くことに、エナミン基によって本明細書で例示されるように、チオール−マレイミドカップリングはアルキル化可能な基の存在下で行うことができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、用いる化学療法薬はアントラサイクリン薬である。これらの薬物は、その群のもとのメンバーの１つ、ドキソルビシン（以下に示されるＤＯＸ）、およびその異性体であるエピルビシンに代表される大きな誘導体種を含む。
【化５】
0005501927.tif 000006
【００５０】
ドキソルビシンおよびエピルビシンは癌治療に広く用いられている。本発明の他の好ましい実施態様では、化学療法薬は毒性の高い２−ＰＤＯＸの類似体、すなわちモルホリノ−およびシアノモルホリノ−ドキソルビシン（それぞれモルホリノ−ＤＯＸおよびシアノモルホリノＤＯＸ）を含む。他の実施態様では、化学療法薬はダウノルビシンを含む。
【００５１】
当業者ならば、本発明の好ましい実施態様のアントラサイクリン薬は反応性基のいくつかを含み、これは、この薬物とリンカーとの結合の前、かつ／または薬物−リンカー複合体とｍＡｂの結合の前に当技術分野で周知の保護基で保護する必要のある場合がある第二の反応性官能基と呼ぶことがあり；保護は反応性基の完全性を損なわないために必要となる。Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley & Sons 2d ed. 1991)参照。反応性基としては、特定の条件下で求核試薬と反応し得る基である、アントラサイクリン薬のアントラキノンコア中のカルボニル基が挙げられる。他の反応性基としては、特定の条件下で求核試薬と反応し得る基である、アントラサイクリン薬分子の至る所にある種々のアルコール基が挙げられる。最後に、他の反応性基としては、ＤＯＸ中に存在するアミン基および２−ＰＤＯＸ中のエナミン基が挙げられ、双方とも求電子試薬と反応し得る。アルキル化基（例えば、２−ＰＤＯＸのエナミン）を有するアントラサイクリン薬の場合、アルキル化基の完全性を損なわないように反応条件を制御する必要があり得る。
【化６】
0005501927.tif 000007
【００５２】
アントラサイクリン薬では、個々の薬物の毒性は１〜１０，０００倍（３〜４オーダー）の範囲で様々であり、それらの毒性の違いに基づき相互変化して多かれ少なかれ有毒な免疫複合体を得ることができる。アントラサイクリンは、ＤＮＡトポイソメラーゼ２（ｔｏｐ２）の阻害、ＤＮＡ中へのインターカレーション、酸化還元反応およびある種の細胞内タンパク質または膜タンパク質への結合をはじめとするいくつかのメカニズムにより、標的細胞に対して有毒作用を発揮する。さらに、類似体は、アルキル化の潜在能など、細胞死滅の付加的メカニズムを有するように設計することができる。類似体の例としては、２−ＰＤＯＸ類似体の場合などのように、アルキル化部分を有するアントラサイクリンがある。この場合、アルキル化部分はエナミン基である。２−ＰＤＯＸ類似体では、ピロリノ環のエナミン基は生理条件下で求核試薬と反応性が高い。
【００５３】
医薬組成物および投与方法
本発明のいくつかの実施態様は、本発明のｍＡｂ−薬物複合体と医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。「医薬上許容される担体」とは、限定されるものではないが、無毒の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、カプセル化剤または当業者に公知のいずれかの種の製剤補助剤を意図する。ポリオール、ポリエチレングリコールおよびデキストランなどの希釈剤を用いて複合体の生体半減期を引き延ばすこともできる。
【００５４】
本発明はまた、本明細書に記載のような抗体とアントラサイクリン薬との複合体を投与することを含む哺乳類の疾病の治療方法に関するものである。本発明はまた、他の標準的な治療法の前、同時または後にその総ての組合せで本明細書に記載の抗体−アントラサイクリン複合体を投与することを含み、ここで、該標準的な治療法は放射線療法、外科術および化学療法からなる群から選択される。
【００５５】
本発明は、同じ罹患細胞上の異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープをターゲッティングする抗体とアントラサイクリン薬の２種以上の複合体を投与することを含む哺乳類の疾病の治療方法を包含するものとする。さらに本発明は、第二の抗体治療における第二の抗体が罹患細胞上の、複合体の抗体とは異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープをターゲッティングするように、第二の抗体治療の前、同時または後に抗体とアントラサイクリン薬との複合体を投与することを含む、哺乳類の疾病の治療方法も包含するものとする。
【００５６】
いくつかの実施態様では、治療上有効な量の本発明のｍＡｂ−薬物複合体を投与することを含む被験体の治療法において、ｍＡｂ−薬物複合体単独、または本発明のｍＡｂ−薬物複合体と医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる医薬上許容される医薬組成物を用いることができる。
【００５７】
好ましい実施態様では、被験体は哺乳類である。哺乳類の例としては、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、イヌ、ネコ、ウシなどが挙げられる。本発明のｍＡｂ−薬物複合体で治療できる疾病としては癌が挙げられ、例えば皮膚癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、脳癌、胃癌、膵臓癌、リンパ系癌が治療できる。ＢまたはＴ細胞癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ性または骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肉腫および黒色腫の患者が、治療用量の本発明のｍＡｂ−薬物複合体の投与により治療することができる。
【００５８】
本発明のｍＡｂ−薬物複合体は、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、嚢内、または腫瘍内投与することができる。この複合体は反復および／または周期的にボーラスとして、または点滴として投与してもよい。点滴は薬物用量および副作用に関する複合体の許容度にもよるが、２回以上反復することができ、担当医師により決定される。当業者ならば、本発明のｍＡｂ−薬物複合体の有効量が経験的に決定できることが分かるであろう。これらの薬剤は、癌の治療を必要とする被験体に、１以上の医薬上許容される賦形剤と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。ヒト患者に投与する場合、本発明の薬剤または組成物の１日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断内で主治医によって決定される。特定の患者の具体的な治療上有効な用量レベルは種々の因子：達成される細胞応答の種類および程度；用いる特定のｍＡｂ−薬物複合体または組成物の活性；用いる特定のｍＡｂ−薬物複合体または組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食生活；投与時間、投与経路および薬剤の排泄速度；治療期間；特定の薬剤と組み合わせて、または同時に用いる薬物；ならびに医療分野で周知の因子によって異なる。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低レベルの薬剤用量で開始し、所望の治療効果が達成されるまで徐々に用量を増すことは十分当技術分野の範囲内である。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様では、抗体−アントラサイクリン複合体は、放射線療法、外科術または化学療法をはじめとする他の標準的な治療法の前、同時または後に投与する。
【００６０】
他の好ましい実施態様では、抗体とアントラサイクリン薬との２種以上の複合体を投与するが、これらの複合体は、同じ罹患細胞上の異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープをターゲッティングする。さらに別の好ましい実施態様では、抗体とアントラサイクリン薬との複合体は、別の抗体治療の前、同時、または後に投与される。このさらなる抗体治療は２種以上の抗体治療の適用を含み、抗体が、単独で、または抗体と複合化されて、または複合化されずに投与される別の治療薬と組み合わせて投与される裸の治療法を含む。この複合体には、今回開示されているリンカーまたは別のタイプのリンカーを用いてよい。２つの抗体治療が適用される場合、これらの治療は、どの抗体が投与される場合でも、第二のものが罹患細胞上の異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープをターゲッティングする。この第二の抗体はまた、別の（異なる）薬物または治療用同位元素と結合させ、抗体に基づく組合せ療法を提供することができる。この治療法は抗腫瘍作用を高めるか、または治療複合体の骨髄抑制作用を防止または緩和するサイトカインの投与前、投与と同時、または投与後に組み合わせることができることも分かるであろう。
【００６１】
上記で示される治療方法の各々は、１種以上の免疫調節剤の投与をさらに含んでよい。これらの免疫調節剤はインターフェロン、サイトカイン、幹細胞増殖因子、結腸刺激因子、リンホトキシンおよび他の造血因子からなる群から選択される。インターフェロンは好ましくは、α−インターフェロン、β−インターフェロンまたはγ−インターフェロンであり、造血因子はエリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択することができる。インターロイキンはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択することができる。免疫調節剤または造血因子は、免疫複合体療法の前、同時または後に投与し得る。免疫調節剤は投与される本発明の複合体の有効性を高めるために投与される。
【００６２】
キット
本発明の好ましい実施態様はまた、好適な容器内にモノクローナル抗体とアントラサイクリン薬との複合体を含んでなるキットに関する。この複合体は、好ましくはヒドラジドとマレイミドを含んでなるリンカーを含む。モノクローナル抗体−アントラサイクリン薬複合体は、液体、冷凍または凍結乾燥形態にて無菌容器で提供される。モノクローナル抗体−アントラサイクリン薬複合体は、それを必要とする患者に投与する前に希釈または再構成することができる。
【００６３】
さらなる実施態様では、アントラサイクリン薬と抗体との複合体は、アントラサイクリン薬と抗体とがヒドラジドおよびマレイミドを含んでなるリンカーを介して連結されており、この抗体に少なくとも１つの免疫調節剤がさらに結合されている。この複合体は次に、本明細書に記載のような治療法を必要とする患者に、複合体単独または他の治療法と組み合わせて投与することができる。
【００６４】
以下、本発明の範囲を限定するものではないが、実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【００６５】
全般
２−ピロリノ−ドキソルビシンはNagy et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 93:2464-2469 (1996))の原著論文を基にした改良法を用いて製造した。モルホリノ−ＤＯＸおよびシアノモルホリノ−ＤＯＸはいずれも、公開されている方法(Acton et al., J. Med. Chem. 27:638-645 (1984))を用いてドキソルビシンから合成した。
【００６６】
実施例１：２−ＰＤＯＸの合成
２−ピロリノ−ドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）の合成：４−ヨードブチルアルデヒド：２−（３−クロロプロピル）−１，３−ジオキソラン（１．３ｍＬ；１０ｍＭ）を、３０ｇのヨウ化ナトリウム（２００ｍｍｏｌ；２０倍過剰）を含有する２００ｍＬのアセトンに溶解した。この溶液を２４時間還流した後、蒸発乾固させた。この粗混合物を次の反応で用いる。塩酸ドキソルビシン（５５０ｍｇ，９４６μｍｏｌ）を６．５ｍＬのＤＭＦに溶解し、３．８６ｇ（１９．４８ｍｍｏｌ、２０倍過剰）の４−ヨードブチルアルデヒド、次いで５００μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加える。５分後、この材料を、勾配溶出を用い、Ｗａｔｅｒｓ  ＮｏｖａＰａｋ  Ｃ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製する。勾配は９０：１０溶離液Ａ〜７０：３０溶離液Ｂ、１分当たり７５ｍＬ、４０分間とし、ここで、溶離液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、溶離液Ｂは０．１％ＴＦＡを含有する９０％アセトニトリルである。生成物の同定はエレクトロスプレー質量分析  Ｍ＋Ｈ＋＝５９６により行った。
【００６７】
実施例２：２−ＰＤＯＸの、抗ＣＤ２２抗体ヒト化ＬＬ２（ｈＬＬ２）への結合
ａ）２−ＰＤＯＸの活性化：２−ＰＤＯＸ（５．９５ｍｇ；１×１０−５ｍｏｌ）を、０．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、１モル当量の市販のリンカー４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ； Pierce Chemical Co., Rockford, IL） （２．８８ｍｇ；１×１０−５ｍｏｌ）と混合する。この反応混合物を減圧下５０〜６０℃で３０分間加熱する。目的生成物を、０．３％酢酸アンモニウムおよび９０％アセトニトリル中０．３％酢酸アンモニウム，ｐＨ４．４からなる勾配を用い、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、大部分の反応していない２−ＰＤＯＸ（０．５分速く溶出）から、および反応していないＭ２Ｃ２Ｈ（かなり速く溶出）から目的生成物を分離する。回収された量はサンプル（４９６ｎｍ）とアセトニトリル／酢酸アンモニウムバッファー中の２−ＰＤＯＸ標準溶液のＵＶ吸収レベルを参照して評価する。マレイミド活性化２−ＰＤＯＸは、すぐに使用しない場合には冷凍および凍結乾燥する。抗体とのさらなる反応に必要な場合は、これを最少量のＤＭＳＯにとる。
【００６８】
ｂ）ｈＬＬ２  ＩｇＧの還元：４℃のＬＬ２抗体の１ｍＬサンプル（８〜１２ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬの１．８Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーで、次いで３μＬの２−メルカプトエタノールで処理する。還元反応を１０分間進行させ、還元された抗体を、抗酸化剤として１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で平衡化した２本の連続したＧ−５０−８０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムを通して精製する。生成物は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により、また、抗体１分子当たりのチオール基の数を求めるために４１０ｎｍで検出するエルマン反応によりアッセイする。これらの還元条件で１抗体当たりおよそ８〜１２個のチオール基が生成されるが、これは抗体の分子内ジスルフィド結合の完全な還元に相当する。
【００６９】
ｃ）活性型２−ＰＤＯＸと還元型ｈＬＬ２との結合：上記のｂ）から得られたチオール還元抗体を、ＤＭＳＯの終濃度が水性／ＤＭＳＯ混合物中２５％を超えないように、マレイミド活性化２−ＰＤＯＸで処理する。４℃で１５分間反応させた後、０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．４中で平衡化したＧ−５０−８０スピンカラムで溶出し、その後、同じバッファー中で平衡化したＳＭ−２  Ｂｉｏ−ビーズに浸透させることにより、反応していない遊離型のマレイミド−ＤＯＸを含まない目的生成物が得られる。生成物をＵＶスキャンにより２８０および４９６ｎｍにて分析し、それによりｍＡｂに対する２−ＰＤＯＸのモル比を評価する。絶対的２−ＰＤＯＸ／ＭＡｂ比を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により決定する。ＵＶおよびＭＳ分析の双方は、この反応条件のセットでは、ｈＬＬ２抗体１モルにつき７〜８単位の２−ＰＤＯＸの置換比が得られることを示す。ＵＶ検出器セットを用い、４９６ｎｍにて、０．２Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．０中１ｍＬ／分で行うサイズ排除ＨＰＬＣ（ＧＦ−２５０カラム、Bio-Rad, Hercules CA）により分析したところ、実質的に総てのピークがＬＬ２抗体の保持時間付近に溶出する。これは、生成物中に極めてわずかな遊離薬物しか存在していないことを示す。２−ＰＤＯＸ−ｈＬＬ２複合体のサンプルは単一画分、通常０．１〜１．０ｍｇに分割し、使用時まで冷凍するか、あるいは凍結乾燥させる。それらはさらなる試験のための必要に応じて解凍または再構成する。
【００７０】
実施例３：２−ＰＤＯＸと抗ＣＤ７４抗体ヒト化ＬＬ１（ｈＬＬ１）との結合
ａ）２−ＰＤＯＸの活性化：２−ＰＤＯＸ（５．９５ｍｇ；１×１０−５ｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯ中、１モル当量の市販のリンカー４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ； Pierce Chemical Co., Rockford, IL） （２．８８ｍｇ；１×１０−５ｍｏｌ）と混合する。この反応混合物を減圧下５０〜６０℃で３０分間加熱する。目的生成物を、０．３％酢酸アンモニウムおよび９０％アセトニトリル中０．３％酢酸アンモニウム，ｐＨ４．４からなる勾配を用い、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、大部分の反応していない２−ＰＤＯＸ（０．５分速く溶出）から、および反応していないＭ２Ｃ２Ｈ（かなり速く溶出）から目的生成物を分離する。回収された量はサンプル（４９６ｎｍ）とアセトニトリル／酢酸アンモニウムバッファー中の２−ＰＤＯＸ標準溶液のＵＶ吸収レベルを参照して評価する。マレイミド活性化２−ＰＤＯＸは、すぐに使用しない場合には冷凍および凍結乾燥する。抗体とのさらなる反応に必要な場合は、これを最少量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＤＭＳＯにとる。
【００７１】
ｂ）ｈＬＬ１  ＩｇＧの還元：４℃のＬＬ１抗体の１ｍＬサンプル（８〜１２ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬの１．８Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーで、次いで３μＬの２−メルカプトエタノールで処理する。還元反応を１０分間進行させ、還元された抗体を、抗酸化剤として１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で平衡化した２本の連続したＧ−５０−８０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムを通して精製する。生成物は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により、また、抗体１分子当たりのチオール基の数を求めるために４１０ｎｍで検出するエルマン反応によりアッセイする。これらの還元条件で１抗体当たりおよそ８〜１０個のチオール基が生成されるが、これは抗体の分子内ジスルフィド結合の完全な還元に相当する。
【００７２】
ｃ）活性型２−ＰＤＯＸと還元型ｈＬＬ１との結合：上記のｂ）から得られたチオール還元抗体を、上記ａ）から得られたマレイミド活性化２−ＰＤＯＸで、水性／ＤＭＳＯ混合物中ＤＭＳＯの終濃度が１５％となるように処理する。４℃で１５分間反応させた後、０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．４中で平衡化したＧ−５０−８０スピンカラムで溶出し、その後、同じバッファー中で平衡化したＳＭ−２  Ｂｉｏ−ビーズに浸透させることにより、反応していない遊離型のマレイミド−ＤＯＸを含まない目的生成物が得られる。生成物をＵＶスキャンにより２８０および４９６ｎｍにて分析し、それによりｍＡｂに対する２−ＰＤＯＸのモル比を評価する。絶対的２−ＰＤＯＸ／ＭＡｂ比を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により決定する。ＵＶおよびＭＳ分析の双方は、この反応条件のセットでは、ｈＬＬ１抗体１モルにつき７〜８単位の２−ＰＤＯＸの置換比が得られることを示す。ＵＶ検出器セットを用い、４９６ｎｍにて、０．２Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．０中１ｍＬ／分で行うサイズ排除ＨＰＬＣ（ＧＦ−２５０カラム、Bio-Rad, Hercules CA）により分析したところ、実質的に１つのピークがＬＬ１抗体の保持時間付近に溶出する。これは、生成物中に極めてわずかな量の遊離薬物しか存在しないか、あるいは全く存在しないことを示す。２−ＰＤＯＸ−ｈＬＬ１複合体のサンプルは単一画分、通常０．１〜１．０ｍｇに分割し、使用時まで冷凍するか、あるいは凍結乾燥させる。それらはさらなる試験のための必要に応じて解凍または再構成する。
【００７３】
実施例４：ＤＯＸと抗ＣＤ７４抗体ｈＬＬ１との結合
ａ）ＤＯＸの活性化：ＤＯＸ（１×１０−５ｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯ中、１モル当量の市販のリンカー４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ； Pierce Chemical Co., Rockford, IL） （２．８８ｍｇ；１×１０−５ｍｏｌ）と混合する。この反応混合物を５０〜６０℃で３０分間加熱する。以下に示す目的中間体を、０．３％酢酸アンモニウムおよび９０％アセトニトリル中０．３％酢酸アンモニウム，ｐＨ４．４からなる勾配を用い、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、反応していないＤＯＸ（〜０．５分速い溶出）から、および反応していないＭ２Ｃ２Ｈ（かなり速く溶出）から目的生成物を分離する。
【００７４】
【化７】
0005501927.tif 000008
【００７５】
反応していないＤＯＸの量はサンプル（４９６ｎｍ）とアセトニトリル／酢酸アンモニウムバッファー中のＤＯＸ標準溶液のＵＶ吸収レベルを参照して評価する。マレイミド活性化ＤＯＸは、すぐに使用しない場合には冷凍および凍結乾燥する。抗体とのさらなる反応に必要な場合は、これを最少量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＤＭＳＯにとる。
【００７６】
ｂ）ｈＬＬ１  ＩｇＧの還元：４℃のＬＬ１抗体の１ｍＬサンプル（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬの１．８Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーで、次いで３μＬの２−メルカプトエタノールで処理する。還元反応を１０分間進行させ、還元された抗体を、抗酸化剤として１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で平衡化した２本の連続したＧ−５０−８０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムを通して精製する。生成物は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により、また、抗体１分子当たりのチオール基の数を求めるために４１０ｎｍで検出するエルマン反応によりアッセイする。これらの還元条件で１抗体当たりおよそ８〜１０個のチオール基が生成されるが、これは抗体の分子内ジスルフィド結合の完全な還元に相当する。
【００７７】
ｃ）活性型ＤＯＸと還元型ｈＬＬ１との結合：上記のｂ）から得られたチオール還元抗体を、上記ａ）から得られたマレイミド活性化ＤＯＸで、水性／ＤＭＳＯ混合物中ＤＭＳＯの終濃度が１５％となるように処理する。４℃で１５分間反応させた後、０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．４中で平衡化したＧ−５０−８０スピンカラムで溶出し、その後、同じバッファー中で平衡化したＳＭ−２  Ｂｉｏ−ビーズに浸透させることにより、反応していない遊離型のマレイミド−ＤＯＸを含まない目的生成物が得られる。生成物をＵＶスキャンにより２８０および４９６ｎｍにて分析し、それによりｍＡｂに対するＤＯＸのモル比を評価する。絶対的ＤＯＸ／ＭＡｂ比を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により決定する。ＵＶおよびＭＳ分析の双方は、この反応条件のセットでは、ｈＬＬ１抗体１モルにつき７〜８単位のＤＯＸの置換比が得られることを示す。ＵＶ検出器セットを用い、４９６ｎｍにて、０．２Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．０中１ｍＬ／分で行うサイズ排除ＨＰＬＣ（ＧＦ−２５０カラム、Bio-Rad, Hercules CA）により分析したところ、実質的に１つのピークがＬＬ１抗体の保持時間付近に溶出する。この痕跡（図１参照；ＤＯＸを検出するために設定した４９６ｎｍにおけるＵＶ検出器）は、９分前後の保持時間に、タンパク質種または遊離型ＤＯＸ（保持時間は１４分前後）の凝集のない実質的に単一ピークとしてのドキソルビシン−ＬＬ１複合体を示す。これは、生成物中に極めてわずかな量の遊離薬物しか存在しないか、あるいは全く存在しないことを示す。ＤＯＸ−ｈＬＬ１複合体のサンプルは単一画分、通常０．１〜１．０ｍｇに分割し、使用時まで冷凍するか、あるいは凍結乾燥させる。それらはさらなる試験のための必要に応じて解凍または再構成する。
【００７８】
実施例５：ドキソルビシンとｈＬＬ１との結合およびｄｏｘ−ｈＬＬ１複合体の形成
ａ）ドキソルビシンとＳＭＣＣヒドラジドとの反応
１：２のメタノール：エタノール（無水）１３ｍＬ中、９０ｍｇのドキソルビシン（１．５６×１０−４ｍｏｌ）および６０．２３ｍｇのＳＭＣＣヒドラジドを混合し、１０．４μＬのトリフルオロ酢酸を加える。この混合物を暗所、室温で４時間攪拌する。次に、この反応溶液を０．２２ミクロンのシリンジフィルターに通し、１００ｍＬの丸底フラスコ中へ濾過する。７５μＬのジイソプロピルエチルアミンを加え、３００℃のロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させる。残渣を４×４０ｍＬのアセトニトリル、次いで１×４０  ｍＬのジエチルエーテルでトリチュレートし、真空下ロータリーエバポレーターで乾燥させて粉末とする。この粉末を５ｍＬの無水メタノールに溶解し、再び上記のように蒸発乾固させた後、必要となるまで−２００℃で保存する。
【００７９】
ｂ）ジチオトレイトールによるｈＬＬ１−ＩｇＧの還元
２０ｍＬの丸底フラスコ中、８．４ｍＬのｈＬＬ１−ＩｇＧ（１０．３ｍｇ／ｍＬ、５．７８×１０−７ｍｏｌ）、１６０μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５、５００μＬの０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、および２９０μＬの脱イオン水を混合する。真空とアルゴン雰囲気下の間で溶液を６回循環させることにより、混合物を脱酸素化する。新しく調製した水中、４０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（水２．４ｍＬ中０．０１５ｇ、２．３×１０−５ｍｏｌ；ＩｇＧに対して４０倍モル過剰）の溶液を、１０分間アルゴン気泡を通じることにより脱酸素化し、このＤＴＴ水溶液６４０μＬを、先の脱酸素化ｈＬＬ１抗体溶液に加える。得られた混合物を３７℃で１時間インキュベートする。還元抗体は、脱酸素化した１０ｍＭ  ＰＢＳ／１００ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンｐＨ７．４バッファーに対して限外ろ過することにより（３０Ｋ一重フィルター、アルゴン下、４℃）精製する。全濾液量が３００ｍＬになるまでバッファーを連続的に加える。還元ｈＬＬ１溶液（ｈＬＬ１−ＳＨ）の容量を１０ｍＬに減少させる。
【００８０】
ｃ）ドキソルビシン−ＳＭＣＣとｈＬＬ１−ＳＨとの結合および複合体の精製
活性化ドキソルビシン（１．９ｍＬ、２．０９×１０−５ｍｏｌ、ＩｇＧの３６倍過剰）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に取った後、アルゴン下室温でｈＬＬ１−ＳＨ  抗体溶液（４０ｍＬ）にゆっくり加える。ＤＭＳＯの終濃度は５％である。４℃で４０分間穏やかに攪拌しながら反応を進行させる。この反応混合物をバイオビーズＴＭ(Bio-Rad, Richmond CA)カラム（径１．５ｃｍ×長さ３４ｃｍ、１０ｍＭＰＢＳ／１００ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンｐＨ７．４バッファーで平衡化）にのせ、２ｍＬ／分で流す。生成物複合体をＡｍｉｃｏｎ濾過装置で濃縮し、０．２２ミクロンシリンジフィルターで濾過した後、凍結乾燥する。
【００８１】
ｄ）複合体の配合および凍結乾燥
４０ｍＬの上記ｈＬＬ１−ｄｏｘ溶液に、８ｍＬの０．５Ｍマンニトール水溶液および０．４８ｍＬの１％ポリソルベート２０を加えると、終濃度１．６４ｍｇ／ｍＬｈＬＬ１−ｄｏｘ、８２．５ｍＭマンニトール、および０．０１％ポリソルベート−２０となる。ｄｏｘ−ｈＬＬ１量１ｍｇおよび１０ｍｇ（それぞれ３および１０ｍＬバイアル）でサンプルを凍結乾燥し、ドライアイス上で凍結させ、真空下で４８時間凍結乾燥する。真空下でバイアルに栓をし、使用するまで暗所、−２０℃で密閉保存する。
【００８２】
実施例６：抗体のモルホリノ−ＤＯＸおよびシアノモルホリノ−ＤＯＸ複合体の製造
モルホリノ−ＤＯＸおよびシアノモルホリノ−ＤＯＸは、Acton, et al. (J. Med. Chem. 27:638-645 (1984))の手順を用い、２，２’−オキシ−ビス［アセトアルデヒド］によるドキソルビシンの還元的アルキル化により製造する。
【００８３】
これらのＤＯＸ類似体を、ＤＯＸおよび２−ＰＤＯＸ類似体に関して上記したものと同様に、Ｍ２Ｃ２Ｈとカップリングさせた。シアノモルホリノ−ＤＯＸは、室温で一晩、無水メタノール（ＤＭＳＯの代わり）中にて、１０％モル過剰のヒドラジドとカップリングさせた。溶媒を除去した後、フラッシュクロマトグラフィーに付したところ、ヒドラゾンが得られた。エレクトロスプレー質量スペクトル分析：Ｍ＋Ｈ  ｍ／ｅ  ８７２、Ｍ＋Ｎａ８９４；Ｍ−Ｈ８７０。同様にして、モルホリノ−ＤＯＸは、無水メタノール中で１．５当量の試薬を４時間用い、ＳＭＣＣ−ヒドラジドを用いてそのヒドラゾンへと誘導体化し、生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。エレクトロスプレー質量スペクトル：Ｍ＋Ｈ  ｍ／ｅ  ８４７、Ｍ−Ｈ  ｍ／ｅ  ８４５、Ｍ＋Ｃ１  ｍ／ｅ  ８８１。
【００８４】
上記実施例２〜４に記載のように、抗体の分子内ジスルフィド結合を還元して遊離チオールとしてジスルフィド還元ｍＡｂを生成させ、実施例２、３および４の各々のｃ）節に記載したものと同じ方法を用い、複合体を製造した。以下のモルホリノ−ＤＯＸおよびシアノモルホリノ−ＤＯＸのｍＡｂ複合体を製造した。
【００８５】
モルホリノ−ＤＯＸ−抗体複合体：
ｍＲＳ７複合体：薬物対ｍＡｂ置換比：６．４：１
ｍＭＮ−１４複合体：薬物対ｍＡｂ置換比：８．９：１
シアノモルホリノ−ＤＯＸ−抗体複合体：
ｍＲＳ７複合体：薬物対ｍＡｂ置換比：５．３：１
ｍＭＮ−１４複合体：薬物対ｍＡｂ置換比：７．０：１
【００８６】
実施例７：アントラサイクリン−抗体複合体のin vitro効力
Ｒａｊｉ  Ｂリンパ腫細胞はAmerican Type culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から入手し、１２．５％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)を含有するＲＰＭＩ１６４０培地にグルタミン、ピルビン酸塩、ペニシリンおよびストレプトマイシン(Life Technologies, Grand Island, NY)を添加したもので増殖させた。要するに、３．７５×１０５細胞を、２４穴プレートの各ウェルで１．５ｍL組織培養培地中、示された濃度の薬物−ｍＡｂ複合体とともに２日間培養した。次に、これらの細胞を培地２０ｍＬの入ったＴ２５フラスコに移し、最大２１日間、または細胞が１６倍に増えるまで培養した。トリパンブルーを用いて生存細胞の総数を０日目、２日目、およびその後は３〜５日おきに計数した。非処理細胞の増殖速度から二倍増殖時間を算出し、処理細胞が１６倍に増えるのに要する時間から生存分率を算出したところ、二倍増殖時間は処理によって影響されないものと思われた。単独でまだ生存している細胞は容易に検出できた。薬物−ｍＡｂ複合体濃度１μｇ／ｍＬで、ＤＯＸ−ＬＬ１複合体は、ＤＯＸ−ＭＮ−１４複合体に比べて生存細胞分率において３オーダーの差を示す。図２参照。
【００８７】
実施例８：アントラサイクリン−抗体複合体による腫瘍担持動物の治療
ａ）固形腫瘍異種移殖モデルにおける治療  無胸腺ヌードマウス群にＤＵ１４５ヒト  前立腺癌細胞を皮下注射した。およそ２週間後、動物に触知可能な前立腺腫瘍異種移植片が増殖したところで、半分を単回用量の薬物−抗体複合体２−ＰＤＯＸ−ＲＳ７で治療し、半分は非治療（対照）とした。図３は非治療マウスにおける腫瘍異種移植片の増殖と２−ＰＤＯＸ−ＲＳ７で治療したマウスにおける異種移殖片の増殖を示している。これは、異種移植片の増殖の遅延という点では薬物−抗体複合体で治療した動物で治療効果を示す。
【００８８】
ｂ）動物モデルにおける全身性癌の治療  各群１０個体のＮＣｒ−ＳＣＩＤマウスに、尾静脈注射により、ヒトBurkitt's Ｂ細胞リンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ２．５×１０６細胞の懸濁液を静注した。５日後、動物を非治療とするか、または単回用量３５０μｇＤＯＸ−ＬＬ１もしくは１５０μｇ２−ＰＤＯＸ−ＬＬ１のいずれかで治療した。図４はその試験結果を示している。非治療動物は麻痺を起こし、Ｒａｊｉ細胞の注射後２３日前後で全身性癌から死に至った。ＬＬ１抗体のＤＯＸ−および２−ＰＤＯＸ複合体で治療した動物は長期間生存し、これは２−ＰＤＯＸ−ＬＬ１治療動物の平均余命では４倍前後の延長、そしてＤＯＸ−ＬＬ１治療動物ではいっそう長い平均余命に相当した。
【００８９】
ｃ）動物モデルにおける全身性癌の治療  各群１０個体のＮＣｒ−ＳＣＩＤマウスに、尾静脈注射により、ヒトBurkitt's Ｂ細胞リンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ２．５×１０６細胞の懸濁液を静注した。５日後、動物を非治療とするか、または単回用量１５０μｇ２−ＰＤＯＸ−ＬＬ１もしくは１５０μｇ２−ＰＤＯＸ−ＭＮ−１４（非特異的対照抗体複合体）のいずれかで治療した。図５はその試験結果を示している。非治療動物は麻痺を起こし、Ｒａｊｉ細胞の注射後２３日前後で全身性癌から死に至り、２−ＰＤＯＸ−ＭＮ−１４複合体で治療した動物も同様であった。２−ＰＤＯＸ−ＬＬ１抗体複合体で治療した動物は長期間生存した。
【００９０】
以上の記載から、当業者ならば、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、過度な実験を行わずとも、本発明の種々の変更および改変を行って種々の使用および条件に適合させることができよう。本明細書で引用されている特許、特許出願および刊行物は、引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる。
【００９１】
参照文献
米国特許公報：
Arcamone et al., 米国特許第4,125,607号明細書
Greenfield et al., 米国特許第5,122,368号明細書
Janaky et al., 米国特許第6,214,969号明細書
Kaneko et al., 米国特許第5,349,066号明細書
Kaneko et al., 米国特許第5,137,877号明細書
McKenzie et al., 米国特許第5,798,097号明細書
King et al., 米国特許第6,307,026号明細書
King et al., 米国特許第5,824,805号明細書
King et al., 米国特許第5,162,512号明細書
Moreland et al., 米国特許第5,241,078号明細書
Schally et al., 米国特許第6,184,374号明細書
Schally et al., 米国特許第5,843,903号明細書
Willner et al., 米国特許第5,708,146号明細書
Willner et al., 米国特許第5,622,929号明細書
Willner et al., 米国特許第5,606,017号明細書
【００９２】
その他の参照文献：
【表１】
0005501927.tif 000009
0005501927.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本明細書に記載の方法を用いて製造されたアントラサイクリン−抗体複合体の代表的なサイズ排除ＨＰＬＣの結果を示す。
【図２】Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫Ｒａｊｉ細胞に対するＤＯＸ−ＬＬ１複合体と非ターゲッティングＭＮ−１４抗体のＤＯＸ複合体の、薬物ｍＡｂ複合体濃度１μｇ／ｍＬにおけるin vitro効力を示す。ＤＯＸ−ＬＬ１複合体は、ＤＯＸ−ＭＮ−１４複合体と比較して生存細胞画分に３オーダーの差を示す。
【図３】ヌードマウスにおけるＤＵ１４５前立腺異種移殖モデルにおける、単回１００μｇ用量の２−ＰＤＯＸ−ＲＳ７複合体の効力を示す。
【図４】急速進行性ＲＡＪＩ／ＳＣＩＤマウス全身腫瘍モデルにおける、ＬＬ１抗体の２−ＰＤＯＸ−およびＤＯＸ−複合体単回用量の効力を示す。動物にＲａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞を静注し、５日後に図で示した複合体で処理した。
【図５】複合体を投与していない非処置対照または非ターゲッティング対照複合体２−ＰＤＯＸ−ＭＮ−１４を投与した動物群と比較した、急速進行性ＲＡＪＩ／ＳＣＩＤマウス全身系腫瘍モデルにおける、単回用量の２−ＰＤＯＸ−ＬＬ１抗体の効力を示す。
【図１】
0005501927.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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