(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体の存在下、環状エステル化合物を重合反応に付し、得られるω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことを特徴とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーの製造方法。
【請求項２】
カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体が、カルボキシル基が保護されたグリコール酸、カルボキシル基が保護されたL−乳酸、カルボキシル基が保護されたD−乳酸またはカルボキシル基が保護されたDL−乳酸である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸の保護基がtert-ブチル基またはベンジル基である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
カルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体がタルトロン酸ジベンジルまたは2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルである請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
環状エステル化合物が環状モノエステル化合物または環状ジエステル化合物である請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
脱保護反応が酸分解反応である請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体の存在下、環状エステル化合物を重合反応に付し、得られるω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことを特徴とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーの製造方法。
【請求項８】
脱保護反応の後、酸加水分解反応に付すことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
生体内分解性ポリマーが少なくとも約６ヶ月以上にわたり生理活性物質を放出する徐放性製剤に用いられる生体内分解性ポリマーである請求項１または請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１または請求項７記載の製造方法によって得られる、ω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーであって、当該生体内分解性ポリマーのω残基がモノカルボキシル基の場合、ポリマーの単位質量あたりの末端カルボキシル基量が４０〜９０μmol/gであり、当該生体内分解性ポリマーのω残基がジカルボキシル基の場合、ポリマーの単位質量あたりの末端カルボキシル基量が３０〜８００μmol/gである生体内分解性ポリマー。
【請求項１１】
ω端がモノカルボキシル基であるポリＤＬ−乳酸で、重量平均分子量が２０，０００〜５０，０００で、かつポリマーの単位質量あたりの遊離カルボキシル基量が５０〜９０μmol/gである請求項１０記載の生体内分解性ポリマー。
【請求項１２】
請求項１０記載の生体内分解性ポリマーを含有してなる徐放性製剤。
【請求項１３】
さらに生理活性物質を含有してなる請求項１２記載の徐放性製剤。
【請求項１４】
生理活性物質がＬＨ−ＲＨ誘導体またはその塩である請求項１３記載の徐放性製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な生体内分解性ポリマーの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＰ−Ａ−０８３９５２５号公報には、生理活性ペプチドまたはその塩と生体内分解性ポリマーとからなる徐放性製剤およびその製造法が開示されているが、該公報における生体内分解性ポリマーは公知の開環重合法により製造された生体内分解性ポリマーを自体公知の加水分解方法に付すことにより製造されている。
該開環重合法は乳酸の環状二量体を用い、加熱下、触媒を添加して行う方法が、ジェイ・エイチ・アール・ウッドランド（J.H.R.Woodland）他、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem）、16,897（1973）に記載されており、またラクチドとグリコリド等の環状ジエステル化合物からの触媒を用いて行う方法が、Encyclopedic handbook of Biomaterials and Bioengineering Part A: Materials, Volume 2, Marcel Dekker, Inc. (1995)に記載されている。
また、ＷＯ９５／０３３５６号公報には、クエン酸トリベンジルとともにラクチドを重合させることによる一本のポリラクチドと三本のデキストランがクエン酸を介して結合したブロック共重合体の製造方法が記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の公知の開環重合方法によって得られるポリマーは、得られるポリマーのω端に遊離のカルボキシル基を有しているとは限らず、徐放性製剤への生理活性物質を高率に取込むことが困難である。また、原料の仕込み段階において、目的の生体内分解性ポリマーの分子量を調節することが困難である。
従って、徐放性製剤への生理活性物質を高率に取込むことを可能にし、目的の生体内分解性ポリマーの分子量の調節を容易にする生体内分解性ポリマーの製造方法の確立が課題である。
また、少なくとも約６ヶ月以上の長期にわたって生理活性物質を放出する徐放性製剤に用いられる生体内分解性ポリマーに適した製造方法の確立も課題である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題点を解決するために鋭意研究の結果、カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体の存在下、環状エステル化合物を重合反応に付し、得られるω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことを特徴とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーの製造方法を見出し、さらに研究を継続した結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体の存在下、環状エステル化合物を重合反応に付し、得られるω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことを特徴とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーの製造方法、
（２）カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体が、カルボキシル基が保護されたグリコール酸、カルボキシル基が保護されたL−乳酸、カルボキシル基が保護されたD−乳酸またはカルボキシル基が保護されたDL−乳酸である上記（１）記載の製造方法、
（３）カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸の保護基がtert-ブチル基またはベンジル基である上記（１）記載の製造方法、
（４）カルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体がタルトロン酸ジベンジルまたは2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルである上記（１）記載の製造方法、
（５）環状エステル化合物が環状モノエステル化合物または環状ジエステル化合物である上記（１）記載の製造方法、
（６）脱保護反応が酸分解反応である上記（１）記載の製造方法、
（７）カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体の存在下、環状エステル化合物を重合反応に付し、得られるω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことを特徴とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーの製造方法、
（８）脱保護反応の後、酸加水分解反応に付すことを特徴とする上記（７）記載の製造方法、
（９）生体内分解性ポリマーが少なくとも約６ヶ月以上にわたり生理活性物質を放出する徐放性製剤に用いられる生体内分解性ポリマーである上記（１）または上記（７）記載の製造方法、
（１０）上記（１）または上記（７）記載の製造方法によって得られる生体内分解性ポリマー、
（１１）上記（１０）記載の生体内分解性ポリマーを含有してなる徐放性製剤、
（１２）さらに生理活性物質を含有してなる上記（１１）記載の徐放性製剤、および
（１３）生理活性物質がＬＨ−ＲＨ誘導体またはその塩である上記１２記載の徐放性製剤などに関する。
【０００６】
本発明で用いられる生理活性物質は、薬理学的に有用なものであれば特に限定を受けないが、非ペプチド化合物でもペプチド化合物でもよい。非ペプチド化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、酵素阻害作用を有する化合物などがあげられる。また、ペプチド化合物としては、例えば、生理活性ペプチドが好ましく、分子量約３００〜約４０，０００、好ましくは約４００〜約３０，０００、さらに好ましくは約５００〜約２５，０００、より好ましくは約５００〜２０，０００の生理活性ペプチドなどが好適である。
該生理活性ペプチドとしては、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、インスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨ−ＲＨ）、プロラクチン、エリスロポイエチン、副腎皮質ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、カルシトニン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エンケファリン、エンドルフィン、キョウトルフィン、タフトシン、サイモポイエチン、サイモシン、サイモチムリン、胸腺液性因子、血中胸腺因子、腫瘍壊死因子、コロニー誘導因子、モチリン、デイノルフィン、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、心房性ナトリウム排泄増加因子、神経成長因子、細胞増殖因子、神経栄養因子、エンドセリン拮抗作用を有するペプチド類など、およびその誘導体、さらにはこれらのフラグメントまたはフラグメントの誘導体などがあげられる。
本発明で用いられる生理活性ペプチドはそれ自身であっても、薬理学的に許容される塩であってもよい。このような塩としては、該生理活性ペプチドがアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸（例、炭酸、重炭酸、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等）、有機酸（例、コハク酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸等）などとの塩があげられる。
生理活性ペプチドがカルボキシル基等の酸性基を有する場合、無機塩基（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属など）や有機塩基（例、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類等）などとの塩があげられる。また、生理活性ペプチドは金属錯体化合物（例、銅錯体、亜鉛錯体等）を形成していてもよい。
上記した生理活性ペプチドの好ましい例としては、ＬＨ−ＲＨ誘導体であって、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫、思春期早発症、乳癌等の性ホルモン依存性の疾患および避妊に有効なＬＨ−ＲＨ誘導体またはその塩があげられる。
【０００７】
ＬＨ−ＲＨ誘導体またはその塩の具体例としては、例えば、トリートメント  ウイズ  ＧｎＲＨ  アナログ：コントラバーシス  アンド  パースペクテイブ（Treatment with GnRH analogs: Controversies and perspectives）〔パルテノン  バブリッシング  グループ（株）(The Parthenon Publishing Group Ltd.)発行1996年〕、特表平３−５０３１６５号公報、特開平３−１０１６９５号、同７−９７３３４号および同８−２５９４６０号公報などに記載されているペプチド類があげられる。
【０００８】
ＬＨ−ＲＨ誘導体としては、ＬＨ−ＲＨアゴニストまたはＬＨ−ＲＨアンタゴニストがあげられるが、ＬＨ−ＲＨアンタゴニストとしては、例えば、一般式〔Ｉ〕
X-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-A-B-Leu-C-Pro-DAlaNH2
〔式中、ＸはN(4H2-furoyl)GlyまたはNAcを、ＡはNMeTyr、Tyr、Aph(Atz)、NMeAph(Atz)から選ばれる残基を、ＢはDLys(Nic)、DCit、DLys(AzaglyNic)、DLys(AzaglyFur)、DhArg(Et2)、DAph(Atz)およびDhCi から選ばれる残基を、ＣはLys(Nisp)、ArgまたはhArg(Et2)をそれぞれ示す〕で表わされる生理活性ペプチドまたはその塩などが用いられる。
【０００９】
ＬＨ−ＲＨアゴニストとしては、例えば、一般式〔II〕
5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z
〔式中、ＹはDLeu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2NalおよびDHis(ImBzl)から選ばれる残基を、ＺはNH-C2H5またはGly-NH2をそれぞれ示す〕で表わされる生理活性ペプチドまたはその塩などが用いられる。特に、ＹがDLeuで、ＺがNH-C2H5であるペプチド（即ち、5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5で表されるペプチド、特にその酢酸塩）が好適である。
これらのペプチドは、前記文献あるいは公報記載の方法あるいはこれに準じる方法で製造することができる。
【００１０】
本明細書中で使用される略号の意味は次のとおりである。
0003716146.tif 000002
その他のアミノ酸に関し、略号で表示する場合、IUPAC-IUBコミッション・オブ・バイオケミカル・ノーメンクレーチュアー(Commission on Biochemical Nomenclature) （ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)第138巻、９〜３７頁（1984年））による略号または該当分野における慣用略号に基づくものとし、また、アミノ酸に関して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００１１】
本発明の徐放性製剤は、生理活性物質以外に、例えば分散剤（Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ−６０などの界面活性剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類；硫酸プロタミン；ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、油脂類（例えば、ゴマ油、コーン油など）、リン脂質（例えば、レシチンなど）、賦形剤（例えば、乳糖、コーンスターチ、マンニトール、セルロースなど）、結合剤（例えば、ショ糖、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリンなど）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、薬物保持剤（例えば、ゼラチン、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸など）などを含んでいてもよい。
【００１２】
本発明に用いられる生体内分解性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシモノカルボン酸（例、グリコール酸、乳酸など）のカルボキシル基が保護された誘導体（カルボキシル基が保護されたグリコール酸、カルボキシル基が保護されたＬ−乳酸、カルボキシル基が保護されたＤ−乳酸、カルボキシル基が保護されたＤＬ−乳酸など（保護基の例、tert-ブチル基、ベンジル基など）、より具体的にはＤ−乳酸tert-ブチル、Ｌ−乳酸ベンジルなど）、ヒドロキシジカルボン酸（例、タルトロン酸、２−ヒドロキシエチルマロン酸など）のカルボキシル基が保護された誘導体（例、タルトロン酸ジベンジル、２−ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルなど）などの１種以上と、環状エステル化合物（例、環状ジエステル化合物（ラクチド類）、環状モノエステル化合物（ラクトン類）など）の１種以上とから合成され、ω端に遊離のカルボキシル基を有する重合体、共重合体、またはこれらの混合物（例、ω残基がグリコール酸であるポリヒドロキシカルボン酸、ω残基がＤＬ−乳酸であるポリヒドロキシカルボン酸、ω残基がＤ−乳酸であるポリヒドロキシカルボン酸、ω残基がL−乳酸であるポリヒドロキシカルボン酸、ω残基がタルトロン酸であるポリヒドロキシカルボン酸、ω残基が２−ヒドロキシエチルマロン酸であるポリヒドロキシカルボン酸など）などが用いられる。
該「ポリヒドロキシカルボン酸」のω残基以外の部分は、ポリα−ヒドロキシカルボン酸が好ましい。
【００１３】
該「ポリα−ヒドロキシカルボン酸」の最小繰り返し単位になるα−ヒドロキシカルボン酸としては、乳酸、グリコール酸などが好ましく、それらのコポリマー（以下、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）あるいは乳酸−グリコール酸重合体と称することもあり、特に明示しない限り、乳酸、グリコール酸のホモポリマー（重合体、ポリラクチドまたはポリグリコリドとも称する）及びコポリマー（共重合体）を総称する）が汎用される。該「乳酸−グリコール酸重合体」の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル％）は本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、約１００／０〜約３０／７０のものが用いられる。該組成比の好ましい例としては、約１００／０〜約４０／６０であり、特に約１００／０〜約４５／５５のものが汎用される。該「ポリα−ヒドロキシカルボン酸」の最小繰り返し単位になるα−ヒドロキシカルボン酸が分子内に光学活性中心を有する場合は、Ｄ−体、Ｌ−体およびＤ，Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５〜約２５／７５の範囲のものが好ましい。このＤ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、特に約６０／４０〜約３０／７０の範囲のものが汎用される。
【００１４】
上記の生体内分解性ポリマーの重量平均分子量は、通常、約３，０００〜約５００，０００、好ましくは約３，０００〜約２００，０００、さらに好ましくは約３，０００〜約１００，０００が特に好ましい。また、分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、通常約１．２〜約４．０が好ましく、さらには約１．５〜３．５が特に好ましい。
上記の生体内分解性ポリマーのω残基がモノカルボキシル基である場合は、ポリマーの単位質量あたりの末端カルボキシル基量は、通常約４０〜約９０μmol/gが好ましく、さらには約５０〜約９０μmol/gが特に好ましい。
上記の生体内分解性ポリマーのω残基がジカルボキシル基である場合は、ポリマーの単位質量あたりの末端カルボキシル基量は、通常約３０〜約８００μmol/gが好ましく、さらには約６０〜約４００μmol/gが特に好ましい。
上記の重量平均分子量、数平均分子量および分散度とは、重量平均分子量が４５５６４５、３５４０００、９８９００、６６４３７、３７２００、１７１００、９８３０、５８７０、２５００、１３０３、および５０４の１１種の単分散ポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の分子量および算出した分散度をいう。測定は、高速ＧＰＣ装置（東ソー製、ＨＬＣ−８１２０ＧＰＣ）、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ×２（昭和電工製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いる。
【００１５】
上記の末端カルボキシル基量とはラベル化法による末端基定量方法により求めたものをいう。具体的には、ω残基が乳酸であるポリマーである場合には、生体内分解性ポリマーＷｍｇを５Ｎ HCl/アセトニトリル（v/v=4/96）混液２ｍｌに溶解し、0.01Ｍのo-ニトロフェニルヒドラジン（ＯＮＰＨ）溶液（５Ｎ HCl/アセトニトリル/エタノール＝1.02/35/15）２ｍｌと0.15ＭのＥＤＣ溶液（ピリジン/エタノール＝4v/96v）２ｍｌを加えて40℃で30分反応させた後溶媒を留去する。残渣を水洗（4回）した後、アセトニトリル２ｍｌで溶解し、0.5mol/lのエタノール性水酸化カリウム溶液１ｍｌを加えて60℃で30分反応させる。反応液を１．５ＮのＮａＯＨで希釈してＹｍｌとし、１．５ＮのＮａＯＨを対象として５４４nｍ吸光度Ａ（/cm）を測定する。一方、ＤＬ−乳酸水溶液を基準物質として、その遊離カルボキシル基量 Ｃ mol/LをＮａＯＨ滴定で求め、またＯＮＰＨラベル化法でＤＬ−乳酸ヒドラジドとしたときの５４４nm吸光度を Ｂ（／cm）とするとき、ω残基が乳酸であるポリマーの遊離カルボキシル基量［ＣＯＯＨ］は以下の数式で求められる。
［ＣＯＯＨ］（mol/g）=(AYC)/(WB)
また、生体内分解性ポリマーをトルエン−アセトン−メタノール混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液をアルコール性水酸化カリウム溶液で滴定して末端カルボキシル基量を算出することができる。
【００１６】
生体内分解性ポリマーの分解・消失速度は共重合組成、分子量あるいは遊離カルボキシル基量によって大きく変化するが、一般的には分子量を大きくし、かつ遊離カルボキシル基量を少なくすることによって放出期間を長くすることができる。しかし、遊離カルボキシル基量は生理活性物質の製剤への取り込み率に影響するので一定値以上必要である。この故に、長期間（例えば、少なくとも約６ヶ月以上、好ましくは約６ヶ月（26週）〜約８ヶ月（35週）、より好ましくは約６ヶ月（26週）〜約７ヶ月（30週）、より好ましくは約６ヶ月（26週）〜約６ヶ月半（28週））型徐放性製剤用の生体内分解性ポリマーとするには、ω端がモノカルボキシル基であるポリＤＬ−乳酸で、上記の重量平均分子量が約２０，０００〜約５０，０００で、かつ遊離カルボキシル基量が約５０〜約９０μmol/gが好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の生体内分解性ポリマーの製造方法を詳述する。
（１）まず、上記のカルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体（例、Ｄ−乳酸tert-ブチル、Ｌ−乳酸ベンジルなど）またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体（例、タルトロン酸ジベンジル、２−ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルなど）の存在下、重合触媒を用いて環状エステル化合物を重合反応に付す。
上記の「カルボキシル基が保護されたヒドロキシモノカルボン酸誘導体」または「カルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体」とは、例えば、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯＮＨ2）化またはエステル（−ＣＯＯＲ）化されているヒドロキシカルボン酸誘導体などがあげられるが、なかでも、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がエステル（−ＣＯＯＲ）化されているヒドロキシカルボン酸誘導体などが好ましい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、tert−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基などがあげられる。なかでも、tert−ブチル基、ベンジル基などが好ましい。
該「環状エステル化合物」とは、例えば環内に少なくとも１つのエステル結合を有する環状化合物をいう。具体的には、環状モノエステル化合物（ラクトン類）または環状ジエステル化合物（ラクチド類）などがあげられる。
【００１８】
該「環状モノエステル化合物」としては、例えば、４員環ラクトン（β−プロピオラクトン、β−ブチロラクトン、β−イソバレロラクトン、β−カプロラクトン、β−イソカプロラクトン、β−メチル−β−バレロラクトンなど）、５員環ラクトン（γ−ブチロラクトン、γ−バレロラクトンなど）、６員環ラクトン（δ−バレロラクトンなど）、７員環ラクトン（ε−カプロラクトンなど）、p-ジオキサノン、1,5-ジオキセパン−２−オンなどがあげられる。
該「環状ジエステル化合物」としては、
例えば、式
【化１】
0003716146.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ同一または異なって、水素原子またはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基を示す）で表される化合物などがあげられ、なかでも、Ｒ1が水素原子でＲ2がメチル基またはＲ1およびＲ2が水素原子であるラクチドなどが好ましい。
具体的には、たとえばグリコリド、L-ラクチド、D-ラクチド、DL-ラクチド、meso-ラクチド、3-メチル-1,4-ジオキサン-2,5-ジオン（光学活性体も含む）などがあげられる。
該「重合触媒」としては、例えば有機スズ系触媒（例、オクチル酸スズ、ジラウリル酸ジ−ｎ−ブチルスズ、テトラフェニルスズなど）、アルミ系触媒（例、トリエチルアルミニウムなど）、亜鉛系触媒（例、ジエチル亜鉛など）などがあげられる。
反応後の除去の容易さの観点からは、アルミ系触媒、亜鉛系触媒が好ましく、さらには、残存した場合の安全性の観点からは亜鉛系触媒が好ましい。
重合触媒の溶媒としては、ベンゼン、ヘキサン、トルエンなどが用いられ、中でもヘキサン、トルエンなどが好ましい。
【００１９】
「重合方法」は、反応物を融解状態にして行う塊状重合法または反応物を適当な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、デカリン、ジメチルホルムアミドなど）に溶解して行う溶液重合法を用いればよい。溶媒としては、トルエン、キシレンなどが好ましい。重合温度は特に限定されるものではないが、塊状重合の場合、反応開始時に反応物を融解状態に至らしめる温度以上、通常１００〜３００℃であり、溶液重合の場合、通常室温〜１５０℃であり、反応温度が反応溶液の沸点を越えるときは、凝縮器を付けて還流するか、または耐圧容器内で反応させればよい。重合時間は重合温度、そのほかの反応条件や目的とする重合体の物性などを考慮して適宜定められるが、例えば１０分〜７２時間である。反応後は、必要であれば反応混合物を適当な溶媒（例えば、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルムなど）に溶解し、酸（例えば、塩酸、無水酢酸、トリフルオロ酢酸など）で重合を停止させた後、常法によりこれを目的物を溶解しない溶媒（例えば、アルコール、水、エーテル、イソプロピルエーテルなど）中に混合するなどして析出させ、ω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを単離すればよい。
本願の重合方法は、従来のメタノールなどのいわゆるプロトン性連鎖移動剤の代わりにカルボキシル基が保護されたヒドロキシカルボン酸誘導体（例、Ｄ−乳酸tert-ブチル、Ｌ−乳酸ベンジルなど）またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体（例、タルトロン酸ジベンジル、２−ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルなど）などが用いられる。
このようにカルボキシル基が保護されたヒドロキシカルボン酸誘導体（例、Ｄ−乳酸tert-ブチル、Ｌ−乳酸ベンジルなど）またはカルボキシル基が保護されたヒドロキシジカルボン酸誘導体（例、タルトロン酸ジベンジル、２−ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルなど）などをプロトン性連鎖移動剤に用いることによって、▲１▼分子量を仕込み組成によって制御でき、▲２▼重合後に脱保護反応に付すことによって、得られる生体内分解性ポリマーのω端にカルボキシル基を遊離させることができる。
【００２０】
（２）次に、上記（１）の重合反応によって得られたω端に保護されたカルボキシル基を有するポリマーを脱保護反応に付すことにより目的とするω端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーを得ることができる。
該保護基は自体公知の方法により脱離できる。このような方法としては、ポリ（ヒドロキシカルボン酸）のエステル結合に影響を与えずに保護基を除去することが可能な方法であればいずれを用いてもよいが、具体的には、例えば還元、酸分解（反応）などの方法があげられる。
該還元方法としては、例えば触媒（例、パラジウム炭素、パラジウム黒、酸化白金など）を用いる接触還元、液体アンモニウム中でのナトリウムによる還元、ジチオスレイトールによる還元などがあげられる。例えば、ω端にベンジル基で保護されたカルボキシル基を有するポリマーを接触還元する場合、具体的にはポリマーを酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルムなどに溶解したものにパラジウム炭素を添加し、激しく攪拌しながら室温で水素を約２０分〜約４時間通気することで脱保護できる。
酸分解方法としては、例えば無機酸（例、フッ化水素、臭化水素、塩化水素など）あるいは有機酸（例、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸など）またはこれらの混合物などによる酸分解などがあげられる。また、必要に応じて、酸分解の際、カチオン・スカベンジャー（例、アニソール、フェノール、チオアニソールなど）を適宜添加してもよい。例えば、ω端にtert-ブチル基で保護されたカルボキシル基を有するポリマーを酸分解する場合、具体的にはポリマーをジクロロメタン、キシレン、トルエンなどに溶解したものにトリフルオロ酢酸を適当量加えて、あるいはポリマーをトリフルオロ酢酸で溶解して室温で約１時間攪拌することで脱保護できる。
好ましくは、該酸分解法は重合反応直後に行ってもよく、その場合は重合停止反応を兼ねることができる。
さらに必要に応じて、上記の脱保護反応によって得られたポリマーを酸加水分解反応に付すことにより、該ポリマーの重量平均分子量、数平均分子量あるいは末端カルボキシル基量を目的に応じて調節することができる。具体的には、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３９５２５号に記載の方法またはそれに準じた方法によって行うことができる。
前記のようにして得られた生体内分解性ポリマーは、徐放性製剤を製造するための基剤として用いることができる。
本発明の基剤に対する生理活性物質の重量比は、例えばペプチドの場合、約０．００１〜約５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０２〜約４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約０．１〜３０％（ｗ／ｗ）であり、非ペプチドの場合、約０．０１〜８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．１〜５０％（ｗ／ｗ）である。
【００２１】
（３）本発明の製造法で得られる生分解性ポリマーを含む徐放性製剤は、例えば水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法などによって製造される。
以下に、徐放性製剤として、例えばマイクロカプセル（マイクロスフェアと称する場合がある）を製造する場合の製造方法について記述する。
以下の製造工程中、必要に応じて、薬物保持剤（例えば、ゼラチン、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸など）を自体公知の方法により添加してもよい。
【００２２】
（Ｉ）水中乾燥法
（ｉ）Ｏ／Ｗ法
本方法においては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製する。本発明の徐放性製剤の製造の際に使用する有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。
該有機溶媒としては、例えば、ハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（例、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、脂肪酸エステル(例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン、トルエン、キシレン等）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール等）、アセトニトリルなどが用いられる。なかでもハロゲン化炭化水素が好ましく、特にジクロロメタンが好適である。また、これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。その場合は、ハロゲン化炭化水素とアルコール類との混液が好ましく、特にジクロロメタンとエタノールとの混液が好適である。
生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば、ジクロロメタンを有機溶媒として用いた場合、一般的には約０.５〜約７０重量％、より好ましくは約１〜約６０重量％、特に好ましくは約２〜約５０重量％から選ばれる。
また、ジクロロメタンとの混有機溶媒としてエタノールを用いた場合の両者の比率は，一般的には約０.０１〜約５０％(v/v)、より好ましくは約０.０５〜約４０％(v/v)、特に好ましくは約０.１〜約３０％(v/v)から選ばれる。
このようにして得られた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に、生理活性物質を添加し、溶解あるいは分散させる。この際、生理活性物質の添加量は、生理活性物質：生体内分解性ポリマーの重量比の上限が約１：１まで、好ましくは約１：２までとなるようにする。
次いで，得られた生理活性物質またはその塩および生体内分解性ポリマーから成る組成物を含む有機溶媒溶液を水相中に加え、Ｏ（油相）／Ｗ（水相）エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させ、マイクロカプセルを調製する。この際の水相体積は、一般的には油相体積の約１倍〜約１０，０００倍、より好ましくは約５倍〜約５０，０００倍、特に好ましくは約１０倍〜約２，０００倍から選ばれる。
上記の外水相中には乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＯ／Ｗエマルションを形成できるものであればいずれでもよい。具体的には、例えば、アニオン性界面活性剤（オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ツイーン(Tween)80、ツイーン(Tween)60、アトラスパウダー社〕、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体〔HCO-60、HCO-50、日光ケミカルズ〕など）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。これらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、好ましくは約０．０１〜１０重量％の範囲で、さらに好ましくは約０．０５〜約５重量％の範囲で用いられる。
【００２３】
上記の外水相中には浸透圧調節剤を加えてもよい。該浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合に浸透圧を示すものであればよい。
該浸透圧調節剤としては、例えば、多価アルコール類、一価アルコール類、単糖類、二糖類、オリゴ糖およびアミノ酸類またはそれらの誘導体などがあげられる。
上記の多価アルコール類としては、例えば、グリセリン等の三価アルコール類、アラビトール，キシリトール，アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール，ソルビトール，ズルシトール等の六価アルコール類などが用いられる。なかでも、六価アルコール類が好ましく、特にマンニトールが好適である。
上記の一価アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどがあげられ、このうちエタノールが好ましい。
上記の単糖類としては、例えば、アラビノース，キシロース，リボース，２ーデオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖，果糖，ガラクトース，マンノース，ソルボース，ラムノース，フコース等の六炭糖類が用いられ、このうち六炭糖類が好ましい。
上記のオリゴ糖としては、例えば、マルトトリオース，ラフィノース糖等の三糖類、スタキオース等の四糖類などが用いられ、このうち三糖類が好ましい。
上記の単糖類、二糖類およびオリゴ糖の誘導体としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸などが用いられる。
上記のアミノ酸類としては、Ｌ−体のものであればいずれも用いることができ、例えば、グリシン、ロイシン、アルギニンなどがあげられる。このうちＬ−アルギニンが好ましい。
これらの浸透圧調節剤は単独で使用しても、混合して使用してもよい。
これらの浸透圧調節剤は、外水相の浸透圧が生理食塩水の浸透圧の約１／５０〜約５倍、好ましくは約１／２５〜約３倍となる濃度で用いられる。
有機溶媒を除去する方法としては、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法が用いられる。例えば、プロペラ型撹拌機またはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエヴァポレーターなどを用いて真空度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法などがあげられる。
このようにして得られたマイクロカプセルは遠心分離または濾過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している遊離の生理活性物質、乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
【００２４】
製造工程中、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えば、マンニトール，ラクトース，ブドウ糖，デンプン類（例、コーンスターチ等）などの水溶性多糖、グリシンなどのアミノ酸、フィブリン，コラーゲンなどのタンパク質などが用いられる。なかでも、マンニトールが好適である。
また、凍結乾燥後、必要であれば、減圧下マイクロカプセルが同士が融着しない条件内で加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去を行ってもよい。好ましくは、毎分１０〜２０℃の昇温速度の条件下で示差走査熱量計で求めた生体内分解性ポリマーの中間点ガラス転移温度よりも若干高い温度で加温する。より好ましくは生体内分解性ポリマーの中間点ガラス転移温度からこれより約３０℃高い温度範囲内で加温する。とりわけ，生体内分解性ポリマーとして乳酸-グリコール酸重合体を用いる場合には好ましくはその中間点ガラス転移温度以上中間点ガラス転移温度より１０℃高い温度範囲，さらに好ましくは、中間点ガラス転移温度以上中間点ガラス転移温度より５℃高い温度範囲で加温する。
【００２５】
加温時間はマイクロカプセルの量などによって異なるものの、一般的にはマイクロカプセル自体が所定の温度に達した後、約１２時間〜約１６８時間、好ましくは約２４時間〜約１２０時間、特に好ましくは約４８時間〜約９６時間である。
加温方法は、マイクロカプセルの集合が均一に加温できる方法であれば特に限定されない。
該加温乾燥方法としては、例えば、恒温槽、流動槽、移動槽またはキルン中で加温乾燥する方法、マイクロ波で加温乾燥する方法などが用いられる。このなかで恒温槽中で加温乾燥する方法が好ましい。
【００２６】
（ii）Ｗ／Ｏ／Ｗ法
まず、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作る。
該有機溶媒としては、例えば、ハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（例、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、脂肪酸エステル(例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン、トルエン、キシレン等）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール等）、アセトニトリルなどが用いられる。なかでも、ハロゲン化炭化水素が好ましく、特にジクロロメタンが好適である。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。その場合は、ハロゲン化炭化水素とアルコール類の混液が好ましく、特にジクロロメタンとエタノールとの混液が好適である。
生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は生体内分解性ポリマーの分子量、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば、ジクロロメタンを有機溶媒として用いた場合、一般的には約０.５〜約７０重量％、より好ましくは約１〜約６０重量％、特に好ましくは約２〜約５０重量％から選ばれる。
次いで、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液（油相）に生理活性物質またはその塩の溶液〔該溶媒としては、水、水とアルコール類（例、メタノール、エタノール等）の混液〕を添加する。この混合物をホモジナイザーまたは超音波等の公知の方法で乳化し、Ｗ／Ｏエマルションを形成させる。
次いで，得られた生理活性物質および生体内分解性ポリマーから成るＷ／Ｏエマルションを水相中に加え、Ｗ（内水相）/Ｏ（油相）/ Ｗ（外水相）エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を蒸発させ、マイクロカプセルを調製する。この際の外水相体積は一般的には油相体積の約１倍〜約１０，０００倍、より好ましくは約５倍〜約５０，０００倍、特に好ましくは約１０倍〜約２，０００倍から選ばれる。
上記の外水相中に加えてもよい乳化剤や浸透圧調節剤、およびその後の調製法は前記（Ｉ）（ｉ）項に記載と同様である。
【００２７】
（II）相分離法
本法によってマイクロカプセルを製造する場合には，前記（Ｉ）の水中乾燥法に記載した生理活性物質および生体内分解性ポリマーから成る組成物を含む有機溶媒溶液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えてマイクロカプセルを析出，固化させる。該コアセルベーション剤は油相体積の約０．０１〜１，０００倍、好ましくは約０．０５〜５００倍、特に好ましくは約０．１〜２００倍から選ばれる。
コアセルベーション剤としては、有機溶媒と混和する高分子系，鉱物油系または植物油系の化合物等で生体内分解性ポリマーを溶解しないものであれば特に限定はされない。具体的には、例えば、シリコン油，ゴマ油，大豆油，コーン油，綿実油，ココナッツ油，アマニ油，鉱物油，n-ヘキサン，n-ヘプタンなどが用いられる。これらは２種類以上混合して使用してもよい。
このようにして得られたマイクロカプセルを分取した後、ヘプタン等で繰り返し洗浄して生理活性物質および生体内分解性ポリマーからなる組成物以外のコアセルベーション剤等を除去し、減圧乾燥する。もしくは、前記（Ｉ）（ｉ）の水中乾燥法で記載と同様の方法で洗浄を行った後に凍結乾燥、さらには加温乾燥する。
【００２８】
（III）噴霧乾燥法
本法によってマイクロカプセルを製造する場合には，前記（Ｉ）の水中乾燥法に記載した生理活性物質および生体内分解性ポリマーの２者から成る組成物を含有する有機溶媒溶液または分散液をノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内に噴霧し、極めて短時間内に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、マイクロカプセルを調製する。該ノズルとしては、例えば、二流体ノズル型，圧力ノズル型，回転ディスク型等がある。この後、必要であれば、前記（Ｉ）の水中乾燥法で記載と同様の方法で洗浄を行った後に凍結乾燥、さらには加温乾燥してもよい。
上述のマイクロカプセル以外の剤形としてマイクロカプセルの製造法（Ｉ）の水中乾燥法に記載した生理活性物質および生体内分解性ポリマーから成る組成物を含む有機溶媒溶液または分散液を、例えば、ロータリーエヴァポレーターなどを用いて真空度を調節しながら有機溶媒および水を蒸発させて乾固した後、ジェットミルなどで粉砕して微粒子（マイクロパーティクル）としてもよい。
さらには、粉砕した微粒子をマイクロカプセルの製造法（Ｉ）の水中乾燥法で記載と同様の方法で洗浄を行った後に凍結乾燥、さらには加温乾燥してもよい。
ここで得られるマイクロカプセルまたは微粒子は、使用する生体内分解性ポリマーまたは乳酸-グリコール酸重合体の分解速度に対応した薬物放出が達成できる。
本発明の製造法によって得られる徐放性組成物は、そのまままたはこれらを原料物質として種々の剤形に製剤化し、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
【００２９】
例えば、本発明の製造法によって得られる徐放性組成物を注射剤とするには、これらを分散剤（例、ツイーン（Tween）80，HCO-60等の界面活性剤、ヒアルロン酸ナトリウム，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウム等の多糖類など）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム，マンニトール，ソルビトール，ブドウ糖，プロリンなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とすることができる。
本発明の製造法によって得られる徐放性組成物の粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１〜３００μｍ、好ましくは約０．５〜１５０μｍの範囲、さらに好ましくは約１から１００μｍの範囲である。該平均粒子径は、例えばレーザー解析式粒度分布測定装置（SALD2000A：島津）などを用いて、自体公知の方法により測定することが可能である。
本発明の製造法によって得られる徐放性組成物を無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等があげられるが、特に限定されない。
【００３０】
本発明の徐放性組成物は、低毒性であるので、哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全な医薬などとして用いることができる。
本発明の製造法によって得られる徐放性組成物は、含有する生理活性物質の種類に応じて、種々の疾患などの予防・治療剤として用いることができるが、例えば、生理活性物質が、ＬＨ−ＲＨ誘導体である場合には、ホルモン依存性疾患、特に性ホルモン依存性癌（例、前立腺癌、子宮癌、乳癌、下垂体腫瘍など）、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫、思春期早発症、月経困難症、無月経症、月経前症候群、多房性卵巣症候群等の性ホルモン依存性の疾患の予防・治療剤、および避妊（もしくは、その休薬後のリバウンド効果を利用した場合には、不妊症の予防・治療）剤などとして用いることができる。さらに、性ホルモン非依存性であるがＬＨ−ＲＨ感受性である良性または悪性腫瘍などの予防・治療剤としても用いることができる。
【００３１】
本発明の製造法によって得られる徐放性組成物の投与量は、主薬である生理活性物質の種類と含量、剤形、生理活性物質放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、生理活性物質の有効量であればよい。主薬である生理活性物質の1回当たりの投与量としては、例えば、徐放性製剤が６カ月製剤である場合、好ましくは、成人1人当たり約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲，さらに好ましくは約０．０５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。
１回当たりの徐放性組成物の投与量は、成人１人当たり好ましくは、約０．０５ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、さらに好ましくは約０．１ｍｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。
投与回数は、数週間に１回、１ヶ月に１回、または数か月（例、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月など）に１回等、主薬である生理活性物質の種類と含量、剤形、生理活性物質放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例、比較例および実験例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３３】
実施例１  [D-乳酸tert-ブチル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるPLAの合成。
−７８℃に冷却したD-乳酸tert-ブチル  ４０．６ｍｇに、窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)のトルエン溶液を加え、その後室温で30分反応させた。これを、DL-ラクチド  ４．１４ｇを溶融したものに窒素雰囲気下で添加混合して130℃で2時間重合させた。
重合反応の停止のため、反応物をジクロロメタンに溶解し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液と混合して２０分攪拌した後、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がD-乳酸tert-ブチルであるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、乳酸残基のメチン水素(5.1-5.3ppm)、メチル基水素（1.5-1.6ppm)およびtert-ブチル基水素（1.46ppm)を確認した。また、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ、ほとんど呈色しなかった。これらの事実から、ポリマーのω残基は、カルボキシル基がtert-ブチル基で保護された乳酸であることを示している。
次いで脱保護のために、このポリマーをトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で一夜攪拌した。その後、冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がD-乳酸であるポリ(DL-乳酸)  ３．８４ｇを得た。1H-NMR分析の結果、tert-ブチル基のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。GPCの結果、重量平均分子量は４３．０ｋＤａ、数平均分子量は１５．９ｋＤａであった。
【００３４】
実施例２  [D-乳酸tert-ブチル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるPLAの合成。
−７８℃に冷却したD-乳酸tert-ブチルに、窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)のトルエン溶液を加え、その後室温で10〜30分反応させた。これを、溶融したDL-ラクチドに窒素雰囲気下で添加混合して130℃で1〜5時間重合させた。
重合反応の停止および脱保護のため、反応物をトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で１時間攪拌した。その後、冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がD-乳酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、tert-ブチル基のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。表１にDL-ラクチドとD-乳酸tert-ブチルの仕込み組成、モル比および脱保護後のポリマーの重量平均分子量とカルボキシル基量をしめす。表から明らかなように、DL-ラクチドとD-乳酸tert-ブチルの仕込みモル比によってポリマーの分子量を制御することが出来る。
【００３５】
【表１】
0003716146.tif 000004
【００３６】
実施例３  [L-乳酸ベンジル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるPLAの合成。
−７８℃に冷却したL-乳酸ベンジル  １８１．７ｍｇに窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)トルエン溶液を加え、その後室温で20分反応させた。これに、蒸留トルエン１ｍｌを加えて希釈した後、DL-ラクチド  １５．０３ｇを窒素雰囲気下で加えて130℃、1.5時間重合させた。
重合反応の停止のため、反応物をジクロロメタンに溶解し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液と混合して20分攪拌した後、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がL-乳酸ベンジルであるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、乳酸残基のメチン水素(5.1-5.3ppm)、メチル基水素（1.5-1.6ppm)およびベンジル基のフェニル水素（7.35ppm)を確認した。また、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ、ほとんど呈色しなかった。これらの事実から、ポリマーのω残基は、カルボキシル基がベンジル基で保護された乳酸であることを示している。
次いで脱保護のため、このポリマーの約半量をトリフルオロ酢酸30mlで溶解し、チオアニソール（L-乳酸ベンジルの３倍当量）を添加、１時間氷冷攪拌した。メタンスルホン酸を加えさらに２時間氷冷攪拌した。そして反応液を冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がL-乳酸であるポリ(DL-乳酸)  ７．５４ｇを得た。1H-NMR分析の結果、ベンジル基のフェニル水素のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。
【００３７】
実施例４  [L-乳酸ベンジル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるPLAの合成。
−７８℃に冷却したL-乳酸ベンジルに窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)溶液（ヘキサンまたはトルエン）を加え、その後室温で20分反応させた。これを、溶融したDL-ラクチドに窒素雰囲気下で添加混合して130℃、1.5時間重合させた。
次いで重合反応の停止および脱保護のため、反応物をトリフルオロ酢酸30mlで溶解し、チオアニソール（L-乳酸ベンジルの３倍当量）を添加、１時間氷冷攪拌した。メタンスルホン酸を加えさらに２時間氷冷攪拌した。ＱＡ２については、このまま次の工程に用いたが、ＱＡ１については、この後更に室温で１時間攪拌した。そして反応液を冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がL-乳酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、ベンジル基のフェニル水素のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。合成結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
0003716146.tif 000005
【００３９】
実施例５  [タルトロン酸ジベンジル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるタルトロン酸末端PLAの合成。
−７８℃に冷却したタルトロン酸ジベンジル  ５９２．８ｍｇに窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)のヘキサン溶液を加え、その後室温で20分反応させた。これに、DL-ラクチド  ９．６３ｇを窒素雰囲気下で添加混合して130℃、３時間重合させた。
重合反応の停止のため、反応物をジクロロメタンに溶解し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液と混合して20分攪拌した後、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がタルトロン酸ジベンジルであるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、乳酸残基のメチン水素(5.1-5.3ppm)、メチル基水素（1.5-1.6ppm)およびベンジル基のフェニル水素（7.35ppm)を確認した。また、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ、ほとんど呈色しなかった。これらの事実から、ポリマーのω残基は、カルボキシル基がベンジル基で保護されたタルトロン酸であることを示している。次いで脱保護のため、このポリマーの内  ２１５ｍｇをトリフルオロ酢酸２mlで溶解し、チオアニソール２００μｌを添加、−５℃で１時間攪拌した。メタンスルホン酸  ２ｍｌを加えさらに２０分氷冷攪拌、次いで室温で２５分攪拌した。そして反応液を冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がタルトロン酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、ベンジル基のフェニル水素のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。
【００４０】
実施例６  [タルトロン酸ジベンジル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるタルトロン酸末端PLAの合成。
−７８℃に冷却したタルトロン酸ジベンジルに窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)のトルエン溶液を加え、その後室温で20分反応させた。これに、DL-ラクチドを窒素雰囲気下で添加混合して130℃、１〜５時間重合させた。
次いで重合反応の停止および脱保護のため、反応物をトリフルオロ酢酸30mlで溶解し、チオアニソール（L-乳酸ベンジルの３倍当量）を添加、−５℃で１時間攪拌した。メタンスルホン酸を加えさらに２時間氷冷攪拌した。そして反応液を冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がタルトロン酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、ベンジル基のフェニル水素のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。また、タルトロン酸を基準物質に用いて、ＯＮＰＨラベル化法でタルトロン酸ヒドラジドとしたときの吸光度との比較から、ポリマーのω残基であるタルトロン酸量をジカルボキシル基量として求めた。合成結果を表３に示す。
【表３】
0003716146.tif 000006
【００４１】
実施例７  [2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]による2-ヒドロキシエチルマロン酸末端PLAの合成。
−７８℃に冷却した2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチル  ４８２．４ｍｇに、窒素雰囲気下でジエチル亜鉛(1/2モル当量)のトルエン溶液を加え、その後室温で30分反応させた。これを、DL-ラクチド  ３．４３ｇを溶融したものに窒素雰囲気下で添加混合して130℃で2時間重合させた。
重合反応の停止のため、反応物をジクロロメタンに溶解し、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液と混合して２０分攪拌した後、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基が2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルであるポリ(DL-乳酸)を得た。1H-NMR分析の結果、乳酸残基のメチン水素(5.1-5.3ppm)、メチル基水素（1.5-1.6ppm)およびtert-ブチル基水素（1.46ppm)を確認した。また、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ、ほとんど呈色しなかった。これらの事実から、ポリマーのω残基は、カルボキシル基がtert-ブチル基で保護された2-ヒドロキシエチルマロン酸であることを示している。
次いで実施例１と同様に脱保護反応を行い、ω残基が2-ヒドロキシエチルマロン酸であるポリ(DL-乳酸)  ２．９８ｇを得た。1H-NMR分析の結果、tert-ブチル基のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。
【００４２】
実施例８  [2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]による2-ヒドロキシエチルマロン酸末端PLAの合成。
D-乳酸tert-ブチルに換えて2-ヒドロキシエチルマロン酸ジtert-ブチルを用いて実施例２と同様に合成し、ω残基が2-ヒドロキシエチルマロン酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。
1H-NMR分析の結果、tert-ブチル基のシグナルは完全に消失しており、このことから脱保護を確認した。また原子吸光測定の結果、亜鉛の残存は検出限界（10ppm）以下であり、この方法で重合触媒が効果的に除去出来ていることがわかった。さらに、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、脱保護によるカルボキシル基の再生を確認した。また、タルトロン酸を基準物質に用いて、ＯＮＰＨラベル化法でタルトロン酸ヒドラジドとしたときの吸光度との比較から、ポリマーのω残基である2-ヒドロキシエチルマロン酸量をジカルボキシル基量として求めた。
合成結果を表４に示す。
【表４】
0003716146.tif 000007
【００４３】
実施例９  酸加水分解
実施例２で合成したポリマーＰＡ５とＰＡ６との等量混合物８００ｍｇをジクロロメタン２ｍｌに溶解し、1％乳酸水溶液１５ｍｌと混合、６５℃で攪拌した。所定時間にポリマーを採取し、水洗、乾燥後、GPC測定および末端基ラベル化定量法を行った。結果を表５に示す。表５から明らかなように、反応時間にほぼ比例してカルボキシル基量が増加しており、酸加水分解反応によってポリマーの特性を制御できる。
【表５】
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【００４４】
実施例１０
5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Dleu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5（以下、ペプチドＡと略記する）の酢酸塩0.6g/0.6ml水溶液と、実施例６で合成したω残基がタルトロン酸である(DL-乳酸)（Run No.RA4) 2.4g/7mlジクロロメタン溶液とを混合してホモジナイザーで乳化し、 Ｗ／Ｏエマルションを形成した。次いでこれを、18℃に予冷した0.1％ (w/w)ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液800ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、7,000rpmで攪拌してＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で3時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた後、７５μｍの目開きの篩いを用いて篩過し、次いで遠心分離機（05PR-22、日立製作所）を用いて2,000rpm、5分間の条件でマイクロカプセルを沈降させて捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行い、遊離薬物等を洗浄した。捕集されたマイクロカプセルは少量の蒸留水を加えて再分散後、凍結乾燥して粉末として得られた。マイクロカプセルの質量回収率は38％、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は18.9％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、９４．６％であった。
【００４５】
実施例１１
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩0.8g/0.8ml水溶液と、実施例６で合成したω残基がタルトロン酸である(DL-乳酸) (Run No.RA6) 3.2g/13mlジクロロメタン溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセルの質量回収率は69％、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は19.1％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、９５．３％であった。
【００４６】
実施例１２
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩0.6g/0.6ml水溶液と、実施例８で合成したω残基が2-ヒドロキシエチルマロン酸である(DL-乳酸)（Run No.SA1) 2.4g/4mlジクロロメタン溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は16.3％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、８１．３％であった。
【００４７】
比較例１
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩1g/1ml水溶液と、ポリ（DL-乳酸）（PLA25000、Mw 25.9k、[COOH] = 98.2μmol/g、和光純薬工業製）4g/5mlジクロロメタン溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセルの質量回収率は49％、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は11.4％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、５７．１％であった。
【００４８】
実験例１
実施例１０および実施例１２で得られたマイクロカプセル約50mgを0.3mlの分散媒（0.15 mgのカルボキシメチルセルロース，0.3mgのポリソルベート80，15mgのマンニトールを溶解した蒸留水）に分散して8週齢雄性SDラットの背部皮下に22G注射針で投与した。投与１日後にラットを屠殺して投与部位に残存するマイクロカプセルを取り出し、この中のペプチドＡを定量した結果は、それぞれのマイクロカプセルについて95.6％、87.1％であった。
実施例１０から実施例１２で得られたペプチドＡの含量は比較例１の場合よりも有意に大きいことから、本発明のポリエステルは生理活性物質を高含量で含有する徐放性製剤の基剤として優れており、また実験例１の結果より、それを使用しての製剤は投与後初期の薬物放出を非常によく抑える効果のあることが明らかとなった。
【００４９】
実施例１３
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩0.8g/0.8ml水溶液と、油相として実施例４で合成したポリマー（Run No.QA1）3.08g、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸0.12g、ジクロロメタン5mlおよびエタノール0.3mlからなる溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセルの質量回収率は46％、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は21.3％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、１０６．６％であった。
【００５０】
比較例２
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩1g/1ml水溶液と、油相としてポリ（DL-乳酸）（PLA25000、Mw 25.9k、[COOH] = 98.2μmol/g、和光純薬工業製）3.85g、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸0.15g、ジクロロメタン5.5mlおよびエタノール0.35mlからなる溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセルの質量回収率は49％、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は21.3％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、１０６．５％であった。
【００５１】
比較例３
実施例１０中のＷ／Ｏエマルションの組成を、ペプチドＡの酢酸塩0.8g/0.8ml水溶液と、油相として開環重合法で合成したポリ(DL-乳酸)（Mw 24.9k、[COOH] = 12.3μmol/g、ベーリンガー  インゲルハイム製）3.08g、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸0.12g、ジクロロメタン5.5mlおよびエタノール0.3mlからなる溶液に変更した以外は実施例１０と同様にしてマイクロカプセルを得た。マイクロカプセルの質量回収率は29％、マイクロカプセル中へのペプチドＡの封入率は54.6％で、マイクロカプセル中のペプチドＡ含量は10.9％であった。そしてこの実現含量を仕込み含量で除して求めた封入効率は、５４．６％であった。
【００５２】
実験例２
実施例１３および比較例２で得られた各マイクロカプセル約40mgを0.3mlの分散媒（0.15 mgのカルボキシメチルセルロース，0.3mgのポリソルベート80，15mgのマンニトールを溶解した蒸留水）に分散して8〜10週齢雄性SDラットの背部皮下に22G注射針で投与した。投与後ラットを屠殺して投与部位に残存するマイクロカプセルを取り出し、この中のペプチドＡを定量した結果を表６に示す。
【表６】
0003716146.tif 000009
【００５３】
実施例１３および比較例３の実験結果より、本発明のポリエステルは生理活性物質を高含量で含有する徐放性製剤の基剤に秀でており、また実験例２の結果より、それを使用しての製剤は非常に長期に渡り封入薬物を安定的に放出することが明らかとなった。
【００５４】
実施例１４  [DL-乳酸tert-ブチル／ジエチル亜鉛／DL-ラクチド]によるPLAの合成
凝縮トラップ装置を備えた容量500mLの３口フラスコ反応容器にDL-乳酸tert-ブチル1.242gを仕込み、窒素雰囲気下、室温で1.0mol/Lジエチル亜鉛ヘキサン溶液 3.8mLを添加、次いで脱水n-ヘキサン 34.2mLを加えて希釈し、さらにDL-ラクチド 100gを加え攪拌して均一に混合した。昇温を開始し、65〜70℃で留出してくるヘキサンを凝縮器で外部にトラップした。ヘキサンの留出がほとんどなくなってから150℃で1時間反応させた。
反応物をジクロロメタン 50mLで溶解した後、重合反応の停止および脱保護のため、トリフルオロ酢酸100mLを加えて室温で１時間攪拌した。その後、冷イソプロピルエーテルに混合してポリマーを析出回収、次いでジクロロメタン／冷イソプロピルエーテルで再沈殿精製を２回行った。精製した沈殿をジクロロメタンで溶解し、中性になるまで水洗を繰り返した。次いで、ジクロロメタン溶液を濃縮、真空乾燥(40℃、２日)してω残基がDL-乳酸であるポリ(DL-乳酸)を得た。GPC測定の結果、Mw=35.0kDa、Mn=13.6kDaであり、このポリマーに末端基ラベル化定量法を適用したところ紫色の強い呈色を示し、定量の結果、末端カルボキシル基量=67.7μmol/gであった。
【００５５】
【発明の効果】
徐放性製剤への生理活性物質を高率に取込むことを可能にし、純度が高く、残存触媒が非常に少ないポリマーを効率よく生産する生体内分解性ポリマーの製造方法、および目的の生体内分解性ポリマーの分子量および遊離のカルボキシル基の調製を容易にする生体内分解性ポリマーの製造方法を提供することができる。