(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する新規中性キシラナーゼ。
（ａ）作用および基質特異性：各種キシランおよびキシロテトラオース以上のキシロオリゴ糖に特異的に作用し、そのｂ−キシロシド結合をエンド型の機作により切断して、主にキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどの低分子量のキシロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨは約７．０である。
（ｃ）安定ｐＨ：安定ｐＨは３７℃、１５分間の処理条件において、ｐＨ６．０〜１０．０で安定である。
（ｄ）最適温度：最適作用温度は５０℃である。
（ｅ）  安定温度：ｐＨ７．０で、２０分間の処理条件において、４０℃まで安定であるが、８０℃においても１５％程度の活性が残存する。
（ｆ）  分子量：約２２，５００（ＳＤＳ電気泳動法）である。
（ｇ）  等電点：約４．７である。
【請求項２】
アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属菌から得られる、請求項１記載の新規中性キシラナーゼ。
【請求項３】
アクレモニウム  エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０４（ＦＥＲＭＰ−１３６３９）株から得られる、請求項１記載の新規中性キシラナーゼ。
【請求項４】
アクレモニウム属に属し、請求項１記載のキシラナーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られた培養物より該キシラナーゼを分離する工程とを含んでなる、新規中性キシラナーゼの製造法。
【請求項５】
前記微生物の培養がｐＨ５．０〜１０．０で行なわれる、請求項４記載の新規中性キシラナーゼの製造法。
【請求項６】
前記微生物がアクレモニウム  エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０４（ＦＥＲＭＰ−１３６３９）株である、請求項４記載の新規中性キシラナーゼの製造法。
【請求項７】
請求項１記載のキシラナーゼ産生能を有する、アクレモニウム  エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０４（ＦＥＲＭＰ−１３６３９）株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な中性キシラナーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しくは、アクレモニウム属に属する微生物より得られる新規なエンド型中性キシラナーゼおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシランはヘミセルロースの一種で、キシロースがｂ−１，４−結合した主鎖に種々の側鎖が結合したヘテロ多糖であり、広葉樹、イネ科植物などでは２０〜４０％も含まれている。この内、稲ワラ、麦ワラ、サトウキビバガス、小麦フスマなどの農産廃棄物はキシランを多量に含有するにもかかわらず、産業的には未利用でありそのほとんどが廃棄されている。このキシランをエンド的に加水分解する酵素がキシラナーゼであり、細菌類およびカビ・キノコ等の糸状菌類が生産することが知られている。
【０００３】
このうち、強力なキシラナーゼ生産菌としては糸状菌であるトリコデルマ属菌が従来知られていたが、近年になってタラロミセス属菌（特開昭５７−１４６５７６）、アクレモニウム属菌（特公平１−２１９５７）、ケトミウム属菌（特開平２−１１９７９０）、ファネロケーテ属菌（特開平３−４０８８７）、ヒラタケ（特開平７−１６０９３）等の糸状菌由来のキシラナーゼが開示されている。
【０００４】
しかしながら、これら糸状菌由来のキシラナーゼは全てその最適ｐＨを４．５〜６．０に示す酸性キシラナーゼであり、中性において活性を示す中性キシラナーゼは糸状菌からは発見されていなかった。
【０００５】
一方、上記のような農産廃棄物を家畜等の飼料として利用する場合に、消化を促進させるためのキシラナーゼ処理が提案されている（特開昭５３−６９１７８、特表平５−５００８０７）。このような処理を行う場合に使用する酵素は、処理溶液に特別なｐＨ調整の不要な水道水等が利用できる中性キシラナーゼが有利であり、サイロ内などでも直接処理を行うことが可能である。
【０００６】
また最近、植物組織内で繊維成分であるセルロースと粘着材としてのリグニンが、キシランを介して結合していることが分かり、パルプ産業においてキシラナーゼがにわかに脚光を浴びている。これは、キシラナーゼを用いてキシランを切断すれば、セルロースからの脱リグニンを容易に行えるため、パルプの漂白性が格段に向上するためである。このような目的のために、近年種々の性質のキシラナーゼおよびその処理方法が提案されている（特開平２−２６４０８７、特開平３−４０８８７、特開平４−２８１０８９、特開平４−３１６６８９、特表平５−５０００８７、特開平６−６２８３９、特開平６−２６１７５０、特表平６−５０６５９３）。
【０００７】
キシラナーゼ処理により、従来の漂白剤を低減あるいは全く使用せずにパルプ漂白が可能であるならば、環境保全の観点からも非常に有益である。ここで使用され得るキシラナーゼは、中性からアルカリ領域において強い活性を示す酵素が望ましく、また漂白条件により多種類のキシラナーゼから条件に適した酵素を選択できれば、より好都合である。
【０００８】
さらに近年、キシラナーゼを利用したキシロオリゴ糖の製造方法が提案されている（特開平４−５３４９６、特開平６−２６１７５０）。これは、食品のテクスチャー、抗う触性および乳酸菌等の腸内細菌フロラの改善などに、キシロオリゴ糖がマルトオリゴ糖と同様に期待されているためである。
【０００９】
一方、キシロオリゴ糖の原料としてのキシランは、上記農産廃棄物をアルカリ処理を行うことにより容易に可溶化して得ることができる。処理後のキシラン溶液は、添加したアルカリ成分が消費されており中性〜弱アルカリ性であることから、この溶液を直ちに無処理で加水分解するためのキシラナーゼとしては、中性〜アルカリキシラナーゼが有利である。
【００１０】
このような用途に対して、先述のように種々のキシラナーゼが提示されているものの、その多くが酸性あるいはアルカリキシラナーゼである。また特に強力なキシラン加水分解活性の期待できる糸状菌からは、中性以上のｐＨ領域で有効なキシラナーゼは見出されていなかった。
【００１１】
上記のような観点から、発明者らは中性付近で強力なキシラン分解力を有する中性キシラナーゼを生産する微生物を主にカビ等の糸状菌を中心に検索したところ、耐アルカリ性のアクレモニウム属に属する糸状菌１株が、好気的培養により目的とする新規中性キシラナーゼを効率良く生産する事を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、産業的に有望な未利用キシランを中性付近で強力に分解することのできる、新規な中性キシラナーゼを提供することを目的としている。
【００１３】
また本発明は、上記新規中性キシラナーゼを生産する新規微生物、およびその微生物を利用した上記新規中性キシラナーゼの製造法を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明による新規中性キシラナーゼは、以下のような理化学的性質を有するものである。
（ａ）作用および基質特異性：各種キシランおよびキシロテトラオース以上のキシロオリゴ糖に特異的に作用し、そのｂ−キシロシド結合をエンド型の機作により切断して、主にキシロース、キシロビオース、キシロトリオースなどの低分子量のキシロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨは約７．０である。
（ｃ）安定ｐＨ：安定ｐＨは３７℃、１５分間の処理条件において、ｐＨ６．０〜  １０．０で安定である。
（ｄ）最適温度：最適作用温度は５０℃である。
（ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、２０分間の処理条件において、４０℃まで安定であるが、８０℃においても１５％程度の活性が残存する。
（ｆ）分子量：約２２，５００（ＳＤＳ電気泳動法）である。
（ｇ）等電点：約４．７である。
【００１５】
また、本発明による上記中性キシラナーゼの製造法は、耐アルカリ性アクレモニウム属に属し、上記中性キシラナーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られた培養物より該新規中性キシラナーゼを分離する工程を含んでなるものである。さらにまた、本発明による上記新規中性キシラナーゼ産性能を有する新規菌株は、アクレモニウム  エスピーＴＯＴＯ−９３０４株（ＦＥＲＭ
ｐ−１３６３９）である。
【００１６】
本発明による新規中性キシラナーゼは中性付近に最大活性を有し、ｐＨ９．０においても５０％以上の相対活性を示す。また特に、ｐＨ６．０〜１０．０のアルカリ領域でも安定であり、同領域においてキシランを強力に加水分解する。したがって、家畜等の飼料を消化促進するための酵素処理に使用したり、パルプ製造の際の漂白促進剤として利用すれば極めて効果的である。
【００１７】
また、機能性食品素材として注目されているキシロオリゴ糖の製造にも応用が可能であり、広範囲の産業分野で利用することができる。また本発明による菌株は、上記中性キシラナーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる点で有利である。
【００１８】
新規中性キシラナーゼ産生菌株
本発明の新規中性キシラナーゼは、微生物を用いて生産することができる。より好ましくは、本発明による中性キシラナーゼは、アクレモニウム属、特に耐アルカリ性アクレモニウム  エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）  ＴＯＴＯ−９３０４株により生産される。この菌株は発明者らにより、北九州市の一般家屋浴室のスノコ上より分離されたものである。この菌株は耐アルカリ性であり、その菌学的性質は下記の通りである。
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
以上の性状より、カーマイケルらのジェネラ  オブ  ハイフォマイセテス（Ｊ．Ｗ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔａｌ．”Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ”（１９８０））およびガムスらのセファロスポリウム−アルチゲシンメルピルツ（Ｗ．Ｇａｍｓｅｔａｌ．”Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｍ−ａｒｔｉｇｅ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｉｌｔｚｅ”（１９７１））を参照して検索した結果、本菌株はアクレモニウム属に属する一菌種であることが判明した。しかしながら、本菌株ＴＯＴＯ−９３０４株のようにｐＨ１０以上で生育し、かつ中性キシラナーゼ産生能を有する菌種は本属中には知られていない。
【００２３】
したがって、本菌株はアクレモニウム属に属する新種であるものと判断し、本菌株をアクレモニウム  エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０４と命名した。なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号第１３６３９号（ＦＥＲＭ  ｐ−１３６３９）のもと寄託されている。
【００２４】
培養条件
上記菌株を培養するための培地は格別である必要はなく、通常の培地を用いることができる。炭素源として各種セルロース・ヘミセルロース（紙、パルプ、キシラン粉末、綿など）、キシロース誘導体、キシラン加工品（アルカリ膨潤キシランなど）、あるいは天然性基質のアルカリ加工品（アルカリ処理稲ワラ、アルカリ処理麦ワラ、アルカリ処理サトウキビバガスなど）、および小麦フスマ、木粉などの天然性基質、またはグルコース、キシロースやそのオリゴ糖などを使用することができる。
【００２５】
窒素源としては各種硝酸塩、アンモニウム塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カゼイン、肉エキス、各種アミノ酸などが用いられる。これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩等を必要に応じて添加しても良い。さらに、別に殺菌した炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウムなどを添加して培地をアルカリ性としても良い。
【００２６】
培養は、このような培地中で培養温度２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で３日〜７日間好気的に攪拌または振とうしながら行う。また、小麦フスマ等を炭素源として用いた場合には、静置培養（麹培養）を行っても良い。
【００２７】
本発明による新規中性キシラナーゼは、上記のような条件のもとでの培養により、主として培養液中に分泌され、蓄積される。
【００２８】
酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するためには、既知の精製法を単独もしくは併用して利用することができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除去することにより、容易に粗酵素液を得ることができる。
【００２９】
こうして得られた粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安等による塩析；メタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒による沈殿法；不溶性キシランによる吸着法；限外濾過；イオン交換クロマトグラフィー；ゲル濾過クロマトグラフィー；その他各種クロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製することができる。
【００３０】
好ましい精製法を示せば次の通りである。まず培養液に５５％以上の飽和硫安を添加して塩析を行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いで、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社）によりイオン交換クロマトグラフィーを２回繰り返して行う。ここで得られた活性画分を濃縮後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＦＰＬＣ：ファルマシア社）を用いたイオン交換クロマトグラフィーを２回繰り返して行うことにより、回収率２０％以上でＳＤＳ電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００３１】
酵素の性質
本発明による新規中性キシラナーゼの性質は次に示される通りである。なお、以下において活性測定法とは次の方法を言うものとする。
【００３２】
（活性測定法）
１％濃度の可溶性キシラン（シグマ社製）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌに、同じ緩衝液に適当に希釈した酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃、１０分間反応させ銅試薬１．０ｍｌを添加して反応を停止した。それに０．８ｍｌの同緩衝液を加えて全量を２．０ｍｌとし、生成した還元糖をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で測定した。すなわち、これを１００℃、１５分間加熱した後、流水で急冷し次いでＮｅｌｓｏｎ液１．０ｍｌを加え室温で２０分間静置して発色させた。
【００３３】
そこへ、純水７．０ｍｌを加えて不溶物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）により除去した後、５００ｎｍの吸光度を測定した。還元糖量は、キシロースを同様の系で測定して作成した検量線により求めた。なお、酵素液を加える前に銅試薬をあらかじめ加えて同様に発色させたものをブランクとした。また酵素活性単位は、１分間に１ｍｍｏｌの還元糖（キシロースとして）を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００３４】
（１）作用および基質特異性
キシロオリゴ糖およびキシランを基質として、活性測定法に準じて酵素反応を行い、その還元糖の生成量および反応生成物をペーパークロマトグラフィーにより求めた。その結果、本酵素はキシロテトラオース以上のキシロオリゴ糖およびキシランに作用し、そのｂ−１，４−キシロシド結合をエンド的に特異的に切断し、主にキシロトリオース以下のキシロオリゴ糖を生成した。主な最終生成物はキシロビオースであり、次いでキシロトリオースが生成した。また、僅かながらキシロースの生成も認められた。
【００３５】
（２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ
本酵素を用いて、ｐＨ２．０〜１０．０の範囲で活性測定法に準じて酵素反応を行った。なお、緩衝液としてｐＨ２．０−３．０；酢酸・塩酸緩衝液、ｐＨ４．０−５．０；酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−８．０；リン酸緩衝液、ｐＨ９．０；トリス・塩酸緩衝液、ｐＨ１０．０−１２．０；ホウ酸ナトリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（濃度はいずれの緩衝液についても１００ｍＭ）を使用した。第１図に活性の最大値を１００とした場合の各ｐＨにおける相対活性を示した。第１図から本キシラナーゼの最適ｐＨ３７℃において７．０であることがわかる。
【００３６】
同様に本酵素のｐＨ安定性について第２図に示した。本酵素を各ｐＨの緩衝液中に３７℃で１５分間処理した後、その残存活性を未処理のｐＨ７．０における酵素活性を１００とした場合の相対値として示した。第２図より、本酵素は上記条件下においてｐＨ６．０〜１０．０で安定であり、特にアルカリ側で安定性の高いことが分かる。
【００３７】
（３）最適温度および安定温度
上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を調べた。第３図に最大活性を１００とした場合の各温度における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温度は５０℃であることがわかる。
【００３８】
また、本酵素を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加し、３０〜８０℃の範囲の各温度条件下で２０分間保持した後、その残存活性を測定した。その結果を第４図に示した。第４図より、本キシラナーゼは４０℃まで安定であるが、８０℃においても１５％以上の活性が残存することがわかる。
【００３９】
（４）分子量
本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法により測定したところ、本酵素の分子量は約２２，５００であった。
【００４０】
（５）等電点
本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したところ、本酵素の等電点は約４．７であった。
【発明の実施の形態】
【００４１】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
実施例１  粗酵素粉末の調製
アクレモニウム  エスピーＴＯＴＯ−９３０４株の前培養液各２ｍｌ  （３０℃、４８時間培養）を、キシラン；１．０％、酵母エキス；０．５％、トリトンＸ−１００；０．１％、硝酸ナトリウム；０．２％、リン酸二カリウム；０．１％、硫酸マグネシウム（７水塩）；０．０５％、硫酸第一鉄（７水塩）；０．００１％、塩化カリウム；０．０５％、炭酸水素ナトリウム；１．０％を含む培地（ｐＨ９．０）１００ｍｌを入れた坂口フラスコ（５００ｍｌ容）２０本に植菌し、３０℃で５日間、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い菌体を分離した。得られた上清液１８０５ｍｌを凍結乾燥して、０．０７３単位／ｍｇの粗酵素粉末５．１ｇを得た。
【００４３】
実施例２  精製酵素の調製
実施例１と同様の培地２０Ｌを入れたジャーファメンターに、アクレモニウムエスピー  ＴＯＴＯ−９３０４株の前培養液１００ｍｌを植菌した。これを実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上清液１７．８Ｌを得た。この上清液のｐＨ７．０における活性は０．２単位／ｍｌであった。
【００４４】
次いで、この上清液に硫安粉末を５５％飽和になるように加え、一夜放置の後８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い沈殿を回収した。この沈殿を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析を行った。得られた透析液を、あらかじめ同緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ（東ソー）によりイオン交換クロマトグラフィーを行った。酵素の溶出は０〜０．５Ｍ  Ｎａ  Ｃｌの濃度勾配法により行った。
【００４５】
さらに、回収した活性画分について上記と全く同条件でＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍにより再クロマトグラフィーを行った。上記イオン交換クロマトグラフィーで得られた部分精製標品について、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅによるＦＰＬＣ（ファルマシア）を行った。平衡化のための緩衝液系および酵素の溶出は、上記のＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーと同様の系、方法により行った。
【００４６】
さらに純度を上げるため、再度全く同一条件でＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅによるＦＰＬＣクロマトグラフィーを行い、１２．２単位／ｍｌの精製酵素液６０ｍｌを得た。このものは、ＳＤＳ電気泳動法において単一のバンドを示し、酵素タンパク質として均一であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による新規中性キシラナーゼの最適ｐＨを示すグラフ
【図２】本発明による新規中性キシラナーゼの安定ｐＨを示すグラフ
【図３】本発明による新規中性キシラナーゼの最適温度を示すグラフ
【図４】本発明による新規中性キシラナーゼの安定温度を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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