(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列で表されたＯｓｐＣエピトープからなる、ボレリアブルグドルフェリのＯｓｐＣの単離された免疫原製ポリペプチド断片。
【請求項２】
配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  １の４３３から５８２のヌクレオチドに示すヌクレオチド塩基対配列からなる、請求項３に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５】
５’末端にＤｒａＩ認識部位と３’末端にＳｍａＩ認識部位とをさらに含む、請求項３に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
ヒトを含む哺乳類におけるボレリア感染に対してワクチン接種させ、前記ボレリア感染を治療するための薬学組成物であって、配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを、哺乳類におけるボレリア感染を予防する又は治療するのに有効な量を含む薬学組成物。
【請求項８】
薬学的に適する担体をさらに含む、請求項７に記載の薬学組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の薬学組成物。
【請求項１０】
薬学的に適する担体をさらに含む、請求項７に記載の薬学組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の薬学組成物。
【請求項１２】
ヒトを含む哺乳類のボレリア感染の検出方法であって、
ａ）  配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドと、ボレリア感染を患っている疑われている哺乳類宿主の体液とを接触させる接触工程と、次いで、
ｂ）  前記哺乳類宿主の体液に存在する抗体と前記単離ポリペプチドが結合している否かを検査する検査工程とを含み、結合体の存否が前記宿主においてボレリア感染の有無を示す検出方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）にて、前記宿主の体液を配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドと接触させる、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記工程ｂ）にて、結合体の存否は酵素結合免疫吸着アッセイを利用する、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１５】
ヒトを含む哺乳類におけるボレリア感染を診断するキットであって、適正な容器に配置させた、配列番号ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２の１４５から１９４残基に示すアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドと、前記キットの使用のためのインストラクションとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９８年７月３１日に出願された仮出願番号６０／０９４，９５５号の優先権を主張する。
【０００２】
引用文献
括弧付きの番号にて表示される本願で参照する文献の全引用は、最後の引用文献のセクションに記載される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ヒト及び他の動物のライム病の予防、治療及び早期診断に有用な組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、哺乳類宿主にてライム病を診断し、ライム病の感染の完全な撲滅を期待し、又はライム病の保護に有効である、特異的免疫応答の形成を患者にて誘発させることができる外部表面タンパク質（以下、「Ｏｓｐ」という）ポリペプチドに関する。また、本発明は、アンチＯｓｐボレリアシダル抗体活性と、ＯｓｐＣのＤｒａＩ−ＳｍａＩ断片によりコードされたタンパク質断片と反応する抗体を検出するスクリーニング方法にも関する。さらに、本発明の範囲内で、Ｏｓｐポリペプチドに対する抗体、その抗体又はそのポリペプチドを含む診断キット、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＢ又はＯｓｐＣのボレリアディダルエピトープ、又はワクチン担体とともに、または無い保存ＤＮＡ配列断片を利用したワクチンにも関する。
【０００４】
先行技術の説明
ライム病（ライムボレリオシス）は、感染ダニからのかみ傷から拡散し、欧州及びアフリカにて広く報告されているダニ由来の感染である（１）。このマルチシステム疾患により世界中にかなりの罹患率を引き起こしている。
【０００５】
ライム病は、マダニ属のｓｓｐダニの血液摂取中に主に伝染されるスピロヘータボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂ．ｂ．））により発症する。当初、スピロヘータは皮膚に感染し、初期の多くの場合、紅斑移動障害が発症する（２）。発症者は数週間体調は悪くならず、中枢神経症状（頭痛、めまい、聴覚障害、チクチク痛む及び集中不足）は数週間または数ヶ月発生しない。現在では、感染は中枢神経又は関節へ拡散することが公知であり、神経及び関節合併症の危険が増し、その病気が長期間未治療のままである。感染は無症候性であり、障害のある組織の左右して、必要とする臨床の範囲があり、感染中、免疫システムの危険度のような宿主因子や免疫原性因子は、患者にある合併症の発症を受け易くする。
【０００６】
病気の症状のある患者の治療は、ある範囲の抗生物質、例えば、テトラサイクリン、ペニシリン及びセファロスポリンにより現在行われているが、多くの研究から多くの結果が示されている。未治療のまま放置すると、バクテリアは中枢神経、心臓、脳又は関節に拡散し、関節炎、心臓感染及び神経問題を引き起こし、稀に死に至る（３‐６）。
【０００７】
ボレリアに感染すると、体内のＢ細胞は、外来生物体を認識する抗体を産出し始める。少なくとも二つの機能タイプの抗体が、ボレリア感染に応答して産出された。一の応答では抗原を「マーク」する非特異的結合／オプソニン作用（コーティング）応答であり、食細胞によりＢ．ｂの消化が生じる。上記の非特異抗体は多くのバクテリア種（すなわち、４１ｋＤａから多くのバクテリアベン毛）間に共通のタンパク質に対して産出される。よって、上記抗体は他のバクテリアの類似の抗原を認識し、その抗原に付く。このため、上記の非特異結合／オプソニン作用抗体を検出する診断試験は、通常、非特異的である。
【０００８】
第二の機能的抗体応答は、Ｂ．ｂ生物体の数多の個々のタンパク質のエピトープを具体的に認識するボレリアシダル（致死）抗体の産出である。Ｂ．ｂ生物体へ上記抗体の付着後、その抗体との相補的相互作用により、食細胞による排除の必要性なく、Ｂ．ｂ生物体を殺す膜攻撃複合体が生じる。この高度に特異的ボレリアシダル抗体応答は。感染後の最初の２週間以内にしばしば検出可能である。ボレリアシダル抗体をうまく検出することとその誘導は、ライム病診断及び予防器具では重要性が増大してきている。
【０００９】
ライムボレリオシスの発見直後に、研究者たちは、全Ｂ．ｂによる実験動物のワクチン接種により攻撃に対する保護が得られると考えた（７、８）。さらなる研究により、抗体仲介保護の役割が確立され、Ｂ．ｂ感染に対する保護を与える抗体を誘発する、Ｂ，ｂによるワクチン接種の能力が確認された（９から１１）。今日まで、Ｂ．ｂ、特にＯｓｐＡ（１２から１４）、ＯｓｐＢ（１２、１４）及びＯｓｐＣ（１４から１６）のＯｓｐ類により動物のワクチン接種により、ライムスピロヘータによる感染に対する保護がもたらされた。ＯｓｐＡ及びＯｓｐＢによるワクチン接種後の保護は、Ｂ．ｂ．生物体を特に殺すボレリアシダル抗体の誘導に起因していことが判明した（１３、１４、１７から２４）。対照的に、アンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体はワクチン接種後に検出されず（１４から１６）、研究者たちはＯｓｐＣによるワクチン接種後の保護は他の機構に起因している仮定した（１６）。
【００１０】
今日までの多くの努力は、主に、多くのＢ．ｂ．の研究室単離体の表面に発現されたＯｓｐＡが大量であるため、ＯｓｐＡワクチンを開発することに集中していた。今日まで、多くのボレリアスピロヘータは、ＯｓｐＡから主になる外部表面を有していた。したがって、ＯｓｐＡに対してボレリアシダル抗体を誘発することは、そのスピロヘータに対する保護をもたすことと考える。スミスクラインビーチャム社（ペンシルバニア州、フィラデルフィア）とパスツールメリオイックコノート社（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）（フランス国リヨン）は、ＩｓｐＡへのボレリアシダル抗体の発生に基づくワクチンを開発した。スミスクライン社のワクチンは一般使用には承認され、パスツールメリオイックコノート社のワクチンは、現在、米国食料医薬品局により評価されている。予想されたように、動物が針攻撃された際に、ＯｓｐＡワクチンは動物モデルでは有効であることが判明した。加えて、ＯｓｐＡワクチン接種はＢ．ｂ．により感染したダニに対して保護を与えた。しかしながら、ダニ攻撃に対する保護は、アンチ‐ＯｓｐＡボレリアシダル抗体の高レベルの有無に依存した。最近、Ｓｃｈｗａｎ他は、感染したダニ中のスピロヘータは血液接種の消化中に、その表面のＯｓｐＡをダウンレｗギュレートされることを例証した（２８）。よって、ＯｓｐＡワクチンは高力価のアンチ‐ＯｓｐＡボレリアシダル抗体を誘導し、ＯｓｐＡをダウンレギュレートさせるないうちに、感染ダニの中腸のスピロヘータを破滅させなければならない。したがって、アンチ‐ＯｓｐＡボレリアシダル抗体の高力価の持続期間は、ＯｓｐＡワクチンの長期間の効能の重要な決定因子である。
【００１１】
最近、出願人らは、市販のＯｓｐＡワクチン接種はヒトのアンチＯｓｐＡのボレリアシダル抗体の十分なレベル維持させることができないことを証明した（２３）。また、感染ダニからのＢ．ｂ．生物体を排除するのに十分に速く既往応答は起こらないようである。裏付けとして、Ｂ．ｂ．による感染はＯｓｐＡワクチン接種されたヒト及びイヌでは報告されている（２６、２７）。上記の結果から、他のライムボレリアワクチン成分を評価する必要性が強調された。
【００１２】
加えて、ライム病は、通常、血液または脳脊椎液中の抗体を検出することにより診断しているが、多くの場合に利用される試験は、しばしば不正確である。誤った陰性、通常誤った陽性な結果により、ライム病の血清学的診断を悩ませ続ける。従来の診断アッセイを利用した数多のスキームが開発され、ライム病をより正確に検出した。残念ながら、ほとんど改良されず、診断ミスが続いて起こり、経済的及び健康的にも重大な影響をもたらした。また、ＯｓｐＡライム病ワクチンの最近の承認では、従来の診断試験をさらに混乱させている。よって、市販キットとして、幅広く利用可能で、感度よく、特異的であり、ワクチン接種した個体とライム病を患っている患者を峻別するライム病試験が、今だに必要である。
【００１３】
また、ボレリアシダル抗体の検出により、本問題が解決される。ボレリアシダル抗体は、感度よく、しかもすこぶる特異的に血清学的診断試験の基礎となる役目を果たすことが判明した（１７、２５から２７）。実際に、上記の抗体応答を検出するライム病の診断アッセイは、従前から開発され、特許取得されており（３７）、市販されている。本試験は、感染直後の数多のＢ．ｂ．Ｏｓｐ類により誘発されるすこぶる特異的なボレリアシダル抗体の検出を基礎とする。十分に高レベルなボレリアシダル抗体がワクチン接種により誘発されるか否かに注目することは重要であり、被ワクチン接種体は保護される。しかしながら、仮に、個体がボレリアシダル抗体が存在しないうちに感染すると、最終的な高濃度のボレリアシダル抗体の有無に関係なく、その個体はライム病を患うことになる。本試験により、ライム病の確認するための、一層感度よく、特異的である代替手法が利用できることになる。さらに、ボレリアシダル抗体試験により検出された抗体は、従来のアッセイにより検出された抗体とは相関がない。ハムスターを利用した研究では、ボレリアシダル抗体の検出は宿主からのＢ．ｂ．を排除すると低下する（４３）。対照的に、従来のアッセイにより検出された抗体応答は、高度のままであり、拡大を継続している。上記結果は、ボレリアシダル試験はスピロヘータの浄化の予知インディケータであることを示唆している。
【００１４】
最近、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ他は、表面にＯｓｐＡ若しくはＯｓｐＢを含有しない試験抗原（Ｂ．ｂ．５０７７２）の使用により、正確な特異性を維持させながら、ボレリアシダル抗体の感度を増大させる能力を示した（３０）。Ｂ．ｂ．５０７７２による増大感度は、出願人らにより提案され、ＯｓｐＣまたは他のＯｓｐ類の対するボレリアシダル抗体の検出に起因している。上記結果から、本願の参考文献として援用されるＳｃｈｅｌｌ他らへの米国特許第５，３８５，８２６号に開示されたボレリア抗体試験法の有用性が大きく増す。
【００１５】
また、多くの研究者たちは、針攻撃及び天然感染に対する実験動物を保護するＯｓｐＣによるワクチン接種能力を証明した（１６）。さらに、最近の研究から、関節炎、心臓炎、及びＢ．ｂ．による感染を解消させるＯｓｐＣへの免疫血清の受身移入を示した（４４）。上記結果は、ＯｓｐＣによるワクチン接種はＯＳｐＡによるワクチン接種よりもより有効であることを証明する。しかしながら、高濃度のアンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体はヒト血清中では検出されないので（１４から１６）、別の機構がＯｓｐＣ仲介保護の原因であるという推測があった。機能が未知であるで、ＯｓｐＣライム病のワクチンを追跡することを一層困難にする。さらに、ＯｓｐＣは免疫原性的、遺伝学的にＯｓｐＡとは異質であり、広いＯｓｐＣワクチンは経済的に実行可能ではないという推測を研究者に抱かせたので、ライムボレリオシスワクチン候補としてのＯｓｐＣの追跡は妨げられた。しかしながら、最近、Ｓｃｈｗａｎ他は、哺乳類宿主への感染ダニの付着直後に、Ｂ．ｂ．により相対的に大量のＯｓｐＣが急速に合成され、しかもＯｓｐＡはＢ．ｂ．の表面では高濃度では全く発現されないことを示した（２８）。
【００１６】
スピロヘータによる宿主のダニ接種直前に、Ｂ．ｂ．生物体はＯｓｐＣをアップレギュレートさせ、同時にＯｓｐＡをダウンレギュレートさせると、最近報告された（３１、３２）。これにより、アンチＯｓｐＣ抗体がなぜ早期のライムボレリオシスの患者にて検出された第一の抗体応答内に存在しているかが説明される。応答では、数多の研究者が、全体の組換えＯｓｐＣタンパク質を利用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発し、または開発している（３８から４２）。上記診断アッセイは妥当な感度であったが、特異性が欠如し続けた。さらに、上記アッセイにより検出されたアンチ‐ＯｓｐＣ抗体応答は、宿主からのＢ．ｂ．浄化直後に、高度なままである、または拡大し続けた。特に注目すべきは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はエプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）のような他の病気を患っている患者からの血清中の抗体と交差反応し、誤った陽性反応を示すＯｓｐＣの性向である。重要な特異性の欠如及び予知可能性の欠如のため、ＯｓｐＣ  ＥＬＩＳＡｓは理想以下のままである。
【００１７】
発明の要約
本発明は、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有するＯｓｐＣのエピトープを本質的に含むボレリアブルグドルフェリのＯｓｐＣの単離された免疫原性ポリペプチド断片に関する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドにも関する。
【００１９】
さらに、本発明は、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子にも関する。
【００２０】
さらに、本発明は、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離ＤＮＡを含む発現ベクターにも関する。
【００２１】
さらには、本発明は、ヒトを含む哺乳類のボレリア感染に対してワクチン接種させ、その感染を治療する薬学的組成物と、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を本質的に含む単離ポリペプチドを、哺乳類のボレリア感染を予防若しくは治療するのに有効な量を含む組成物とに関する。
【００２２】
また、本発明は、ヒトを含む哺乳類のボレリア感染の予防及び治療方法であって、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を本質的に含む単離ポリペプチドの、患者のボレリア感染を予防及び治療に有効な量を、必要としている患者に投与することを含む予防及び治療方法に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、ヒトを含む哺乳類のボレリア感染を診断するキットであって、適正な容器中に配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドと、そのキット使用のインストラクションを含むキットに関する。
【００２４】
さらに、本発明は、ヒトを含む哺乳類のボレリア感染の検出方法であって、ボレリア感染を患っていることが疑われる哺乳類宿主の体液を、配列番号ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドで接触させる工程と、その単離ポリペプチドが哺乳類宿主の体液に存在する抗体と結合するか否かを決定する決定工程を含み、結合の存在が宿主中にボレリア感染の存在を示す検出方法に関する。
【００２５】
好ましくは、本発明のポリペプチドはライム病に対して従前のワクチン接種により混乱させない。Ｄｒａ断片に対するアンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体の検出は、世界中の至る所からの患者のライム病を診断するのに有用であり、乗れリアｓｓｐにより発症するライム病に対するワクチン接種として有用である。ライム病スピロヘータには公知な３つの主要な種、Ｂ．ｂ．、Ｂ．ガリニイ（ｇａｒｉｎｉｉ）及びＢ．アフゼリイ（ａｆｚｅｌｉｉ）がある。発明者らはＢ．アフゼリイにより感染したスロベニアからの患者にアンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体を検出した。彼らはＢ．ｂ．５０７７２を利用してアンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体を検出し、その単離体をＢ．ｂ．により感染した患者の応答を検出するために利用した。よって、ＯｓｐＣのＤｒａ断片は、ボレリアのすべての種に保存されているようである。
【００２６】
Ｄｒａ断片に基づくＥＬＩＳＡは、ボレリアシダル抗体試験に対する優れた相補的試験である。より重要なことは、Ｄｒａ断片ヲ基礎トするＥＬＩＳＡは市販キットして容易に製造可能であり、早期のライム病によりワクチン接種された患者間を峻別する。
【００２７】
ＯｓｐＣのほかに、ＯｓｐＡ及びＤｓｐＢのボレリアシダルエピトープに対するボレリアシダル抗体を検出する試験は、交差反応性を低下させ、特異性、性各ドを増大させ、誤った陽性診断の数を低減させる。アンチ‐ＯｓｐＣボレリアシダル抗体の検出はアンチ‐ＯｓｐＡ及びアンチ‐ＯｓｐＢボレリアシダル抗体ができない早期に診断することが好ましい。しかしながら、また、ＯｓｐＢ及びＯｓｐＡのボレリアシダルエピトープの確認は、診断試験には付加的価値がある。
【００２８】
さらに、ＯｓｐＣのＤｒａ断片によるＯｓｐＡ及びＯｓｐＢのボレリアシダルエピトープの包接により、総合的なライムボレリオシスワクチンが産出される。
【００２９】
本発明のさらなる目的及び硬化は、添付表及び図面とともに、発明の好適な実施例の以下の詳細な説明から十分に明らかとなる。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｂ．ｂ．による感染直後にボレリア抗体を誘発の原因であるＯｓｐＣのエピトープの発見及びキャラクタリゼーションに関する。本抗原決定因子は、早期のライム病感染を検出する優れた診断抗原をもたらし、宿主からの生物体をうまく根絶させることを予測し、ライム病に感染した個体とＯｓｐＡライム病ワクチンをワクチン接種された個体とを峻別する。加えて、ボレリアシダルＯｓｐＣエピトープは、Ｂ．ｂ．による感染に対するワクチンとして有用であり、ＯｓｐＣエピトープに対して発生したボレリアシダル抗体は、確率したＢ．ｂ．感染及びその病気を克服するための治療として有用である。
【００３１】
発明者らは、アンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体を発見した。遺伝子がＯｓｐＡ又はＯｓｐＢを作出しないダニ単離体、Ｂ．ｂ．５０７７２（下記記載）を特に殺すライム病血清中の抗体の発見により、発明者らは表面タンパク質はＯｓｐＣであり、すこぶる特異なボレリアシダル抗体応答が本タンパク質に生じることを推測した。
【００３２】
初期の研究では、Ｓｃｈｗａｎ他らは、ダニはヒトへ移動し、血液消化によりＢ．ｂ．生物体はＯｓｐＡ及びＯｓｐＢをダウンレギュレートし、ＯｓｐＣをアップレギュレートさせる。したがって、出願人らは、これはダニからヒトへ伝わるスピロヘータの能力と関係があるであろうと推測した。その仮定は、スピロヘータは新しい宿主中にて生存するためにＯｓｐＣは必要であるにちがいないというものであった。よって、仮に、スピロヘータがＯｓｐＡをＯｓｐＢを機能停止させ、その表面で置換されれば、アンチＯｓｐＣ抗体はＢ．ｂ．による感染を予防するには一層有効である。
【００３３】
本当にＯｓｐＣが早期にＢ．ｂ．ボレリアシダル抗体応答を誘発する限り、当然の結果として、すこぶる特異な抗体応答の検出はより正確にライム病を検出し、アンチ‐ＯｓｐＣボレリアシダル抗体を検出しない診断アッセイ以外の治療後の生物体の排除を監視することが可能になる。
【００３４】
Ｄｒａ断片
次の段階では、出願人はボレリアシダルエピトープがＯｓｐＣタンパク質の小さな断片に位置していることを発見した。ＯｓｐＣタンパク質遺伝子は、全長約６００個の塩基対（ｂｐ）を有する。ボレリアシダル断片をコードするＤＮＡは、約１５１ｂｐである。その断片はボレリアに固有である。例２に関して、ＣｒａＩ‐ＳｍａＩ  ｏｓｐＣ遺伝子断片（ＯｓｐＣ  Ｄｒａ断片）のＤＮＡ配列を図４に示す。また、切除されたＯｓｐＣ融合タンパク質のコードされたアミノ酸配列も図４に示す。
【００３５】
酵素認識部位を表わす特定の流れの塩基にて、ＤｒａＩがＤＮＡ配列を切断するために利用される制限酵素であることが主な理由で、その断片はＤｒａ断片と呼ぶ。ボレリアシダルエピトープを含有するｏｓｐＣ遺伝子のある部分を利用して、感度を大きく低下させずに、具体的で、予知潜在性のある診断試験が完全される。
【００３６】
また、ＯｓｐＣタンパク質のＤｒａ断片は、全長のＯｓｐＣタンパク質と比較して、より重要なワクチン成分である。ＯｓｐＣタンパク質の残余を排除することにより、ワクチン接種問題を最小化させる。なぜなら、他の部分のタンパク質が存在せず、よってワクチン接種の副作用を制限し、有効な防御抗体応答の誘発、維持及び監視を容易にする。加えて、免疫応答を高めさせる破傷風トキソイド又は他のワクチンアジュバントのようなアジュバントとＤｒａ断片を組合せることにより、ＯｓｐＣタンパク質の保護部分のみに対して、免疫応答は容易に高められ得る。さらに、ＯｓｐＣ  Ｄｒａ断片は、従来からの液相又は固相ペプチド科学を利用して、新規に合成され得る。
【００３７】
ワクチン候補
アンチ‐ＯｓｐＡボレリアシダル抗体のレベルを監視するためのボレリアシダル試験を利用することにより、現在のＯｓｐＡライムボレリアシダルワクチンの効能に重要な知見を得ることができる（１３、２１、２３）。実際に、ボレリアシダル抗体試験は保護を与えるＯｓｐＡライム病ワクチンの能力を監視する顕著な特徴である。また、ＯｓｐＣによるアレチネズミ及びマウスのワクチン接種により、実験的攻撃及び／又は同族Ｂ．ｂ．単離体によるダニ由来の感染に対する完全な保護をもたらす。加えて、ＯｓｐＡによるワクチン接種とは異なり、たとえＢ．ｂ．による感染後に投与されても、ＯｓｐＣによるワクチン接種によりスピロヘータが浄化され、症状が和らげられる。よって、Ｏｓｐワクチンは、ライム病の衝撃を改善させるための努力に付加的価値を与える。
【００３８】
初めに述べたように、研究者たちは、ＯｓｐＣワクチンがボレリア抗体を誘発させることにより保護をもたらす証拠を従前には発見していなかった。他の研究者たちも、保護を誘発するＯｓｐＣワクチン接種の能力に関係なく、ワクチン接種後にアンチ‐ＯｓｐＣボレリアシダル抗体を検出しなかった。しかしながら、本願の発明者らの結果は、ＯｓｐＣは実際にボレリアシダル抗体を誘発することを確認し、他の研究者たちはアンチ‐ＯｓｐＣボレリアシダル抗体を検出できないであろうと、即座に理解した。なぜなら、表面にＯｓｐＣを発現させなかった試験をＢ．ｂ．生物体に利用していたからである。
【００３９】
現在のワクチンは、ボレリアシダルエピトープを全く利用していない。本発明は、診断試験として、並びにライム病に対するワクチンとして、ＯｓｐＣのボレリアシダルエピトープ（類）の利用を説明する。
【００４０】
薬学組成物
薬学組成物として、本発明は薬学的に許容な担体と、治療に有効な量の本発明のＯｓｐＣ  Ｄｒａポリペプチドとを有する。「治療に有効な量」とは、動物に投与する際のポリペプチド又は抗体の量を意味し、Ｂ．ｂ．感染のよる深刻度をある期間予防若しくは低減させるのに有効な免疫応答を導出する。
【００４１】
本発明のポリペプチド若しくは抗体の動物への投与には、多様な標準的手法により行われる。ポリペプチドが利用される限り、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激結合体）のような薬学的に許容なアジュバントとともに投与されることが好ましい。かかるアジュバントは、局所付着から隔離することにより、ポリペプチドを急速分散から保護する、または免疫システムのマクロファージ及び他の成分の走化性因子を宿主が分泌するように刺激する物質を含有する。ポリペプチドが投与されると、免疫スケジュールはポリペプチドの２以上の投与が関係し、数週間以上にわたり拡散する。
【００４２】
薬学組成物は、ヒトを含む多様な動物のライム病を治療する若しくは予防する為に利用されうる。その薬学組成物は、本技術分野では周知である錠剤、ピル、粉末、液体若しくは懸濁液、カプセル、坐薬、注射可能及び注入可能溶液のような多くの従来の形態で利用できる。好適な形態は目的とした投与経路及び予防適用に左右される。しかしながら、多くの利用では投与の好適な経路は非経口であり、筋肉内投与が最も好ましい。
【００４３】
また、本発明はＢ．ブルグドルフフェリ若しくはライム病の治療又は予防方法であって、上記の薬学組成物の治療に有効な量を患者に投与することを含む方法に関する。
【００４４】
本発明はヒトを含む哺乳類のボレリア感染を診断するキットをも提供する。そのキットは、適正な容器に配置させた、配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残余部１４５から１９４に示すアミノさん配列を有する単離ポリペプチドと、キットの使用のインストラクションとを含む。単離ポリペプチドは配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示すアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００４５】
例
本発明を十分に例示するために、以下の例を利用する。添付図面を参照する例は、説明目的だけであり、発明のより完全な理解を助ける。例は、開示する発明の範囲を制限するものではなく、特許請求の範囲を裏付けるものである。
【００４６】
例  １
本例は、Ｂ．ｂ．感染直後に投与される際、高レベルのボレリアシダル抗体を誘発させるＢ．ｂ．ＯｓｐＣの能力を例証する。
【００４７】
材料及び方法
生物体  Ｂ．ｂ．センスストリクト（ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ）単離体２９７（ＡＴＣＣ受託番号第５３８９９号として、２０１１０  バージニア州マナサスにあるユニバーシティ通りにあるアメリカンタイプコレクションカルチャーコレクションに寄託）は、ヒト脊髄液から単離させた。Ｂ．ｂ．センスストリクト単離体５０７７２（ブタベスト条約の規定により、１９９９年６月３０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託）は、Ｉ．スカプラリス（ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）ダニから元来単離され、ジョンＦ．アンダーセン（コネチカット州ニューヘブンにあるコネチカット農業実験ステーション）から入手した。そのスピロヘータはＯｓｐＡ／Ｂオペロンが欠如しており、よって、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢを発現させない（２５）。そのスピロヘータのオリジナル懸濁液は、単一の生物体からの成長を支援することができるバーバー‐ストエンナー‐ケリー（Ｂａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｅｒ、以下、「ＢＳＫ」という）培地にて連続して１０倍に希釈した（４６）。次いで、そのスピロヘータの集団を３０℃若しくは３５℃のフレッシュなＢＳＫ培地にて１０回継代培養させ、１．５ｍｌのスクリュキャップの管（ノースキャロライナ州ニュートンにあるサルステット社製）、２００μｌアルコートを分散させ、大腸菌ＪＭ１０９（ウイスコンシン州マディソンにあるプロメガコーポレーション社製）を全てのクローニング実験で利用するまで、−７０℃で保存した。
【００４８】
動物  生後１０週間のメスのＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（メーン州バーハーバーにあるジャクソンカボラトリーズ社製）を、室温でかご毎に３匹飼育した。食べ物と水は無制限に与えた。
【００４９】
血清  ライムボレリオシス血清は、ウイスコンシン州ラクロッセにあるガンダーセンルセラン医療センタの患者から入手した。１０個のライムボレリオしス血清サンプルは臨床家による一回又は多数回の紅斑ミグラン病斑のある個体からのものである。二つの血清サンプルは、正常な血清コントロールとして利用したＢ．ｂ．センスラト（ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ）に晒されていない個体からのＢ．ｂ．血清に対して陽性である皮膚培養のある患者から採取した。本血清サンプルはウイスコンシン州の衛生研究所とアメリカ病理学大学により支援された国立ライム進歩研究に酸化した５１６の研究所により試験し、Ｂ．ｂ．に対する交代は陰性であると報告された。
【００５０】
ウエスタンブロッティング  ウエスタンブロッティングは前述したようニ行った（１７）。簡単に説明すれば、Ｂ．ｂ．５０７７２細胞をサンプル緩衝液で５分間煮沸し、１５０μｇの全体タンパク質を０．１％のＳＤＳ‐１２％ポリアクリルアミドゲル（くし無しの４％のポリアクリルアミド積層ゲル）に負荷させた。タンパク質濃度は、製造者取扱説明書に従い、バイオ‐ラドタンパク質決定キット（カリフォルニア州リッチモンドにあるバイオ‐ラドインク社製）により算出した。二つのゲルを、ラエンミリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（３２）の緩衝液システムにて、３時間５５まで、同時に電気泳動ユニットにて実行した（カリフォルニア州サンフランシスコにあるホーファサイエンティフィックインストルメント社製のＳＥ６００）。電気泳動後、Ｔｏｗｂｉｎ他により説明された条件下（３３）、３００まで３時間にわたりタンパク質をニトロセルロースへ移動させた。そのニトロセルロースをストリップに切除し、２２℃で３０分間、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）‐０．３％ＴＷＥＥＮ ２０デタージェントにてブロックした。ストリップを１：１００に希釈したヒト血清で、２２℃、１時間にわたりインキュベートさせ、ＰＢＳ‐０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０デタージェントで３回洗浄した。西洋ワサビ標識化アンチヒトＩｇＭ若しくはＩｇＧ（重鎖及び軽鎖：ペンシルバニア州マルベルンにあるオルガノンテクニカキャペル社製）を添加し、ストリップを２２℃で３０分間にわたりインキュベートさせた。インキュベート後、ストリップを洗浄し、展開させた（メリーランド州ガイサースベルグにあるカーケガード＆ペリーラボラトリーズ社製ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質システム）。
【００５１】
ｏｓｏＣ遺伝子のクローニングと増幅  プラスミドの豊富なＤＮＡは、Ｂ．ｂ．センスストクト単離体Ｓ‐１‐１０から単離した（１３）。ＤＮＡはＧｅｎｅＡｍｐキット（コネチカット州ノーワークにあるパーキンエルマーセタス社製）を利用して、ｏｓｏＣ遺伝子の増幅のためテンプレートとして利用した（３４）。プライマーを１．５ｍＭのＭｇＣｌ２の濃度中にて最終濃度１．０μＭで利用した。サーマルサイクルパラメータは９５℃で５分間、その後、１）９５℃で３０秒間、２）５０℃で３０秒間、３）７２℃で９０秒間の３５サイクルを行った。最終のエクステンションは７２℃で７分間行い、切除されたＤＮＡ鎖を完全に拡張させた。アミノ‐末端プライマーＣ１（５’‐ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＧＡＴＡ‐３’）とカルボキシ‐末端プライマーＣ２（５’‐ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＣ‐３’）とを増幅のために利用した。下線部はプライマーにより認識された領域を示す。増幅させたＤＮＡはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（カリフォルニア州ラジョラにあるバイオ１０１社製）を利用して精製した。ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩ（メリーランド州ガイサースベルグにあるギブコＢＲＬ社製）により消化させたあと、精製ＤＮＡ断片をＰｉｎＰｏｉｎｔｐＸａベクター（ウイスコンシン州マディソンにあるプロメガ社製）へ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（メリーランド州ロックビルにあるギブコＢＲＬ社製）によりライゲートさせた。ライゼーション混合物は受容能力のある大腸菌ＬＭ１０９を形質転換させるために利用した。形質転換大腸菌をアンピシリン（１ｍｌ当たり１００μｇ、ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社製）を含有する２ｘＴｙ培地へ載置させ、３７°で２４時間インキュベートさせた。ストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ギブコ  ＢＲＬ社製）とアンチ‐ＯｓｐＣ抗体を含有する早期のライム病血清とをを利用して、ＯｓｐＣを発現するコロニーをウエスタンブロット分析により検出した。
【００５２】
ｏｓｏＣ遺伝子のＤＮＡ配列を二重鎖配列決定法により求めた（ウイスコンシン州マディソンにあるプロメガ社製のＴａｑＴｒａｃｋ）。解析及びＢＬＡＳＴ研究を、ＧＣＧソフトウェアシステムを利用して行った（ウイスコンシン州マディソンにあるＧＣＧ社製）。Ｂ．ｂ．センスストリクトＳ‐１‐１０のｏｓｏＣ遺伝子はＢ．ｂ．センスストリクトＢ３１と７８．５％同様であった（３５）。加えて、Ｓ‐１‐１０ＯｓｐＣヌクレオチド配列はＢ．ｂ．センスストリクトにより３つの塩基が異なっていた（３６）。
【００５３】
組換えＯｓｐＣの精製  ｏｓｏＣ遺伝子を含有する大腸菌を、アンピシリンを含有する１００ｍＬの２  Ｘ  ＴＹブロス中にて成長させた。培養は２ｘＴｙブロスで１：１０に希釈し、さらに１時間インキュベートさせた。イソプロピル‐Ｂ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（最終濃度０．１ｍＭ、シグマ社製）を培養にに添加し、さらに４時間インキュベートさせた。その懸濁液を、４℃、１５分間、１０，０００ｘｇで遠心分離させ、精製緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて再懸濁させ、音波処理機（コネチカット州ダンベリにあるブランソンソニックパワー社製のモデルＷ３５０）で溶解させた。音波処理した大腸菌を１０，０００  ｘｇで１５分間遠心分離させ、その上澄液をソフトリンク樹脂（ウイスコンシン州マディソンにあるプロメガ社製）を含有するカラムに、４℃で分速０．５ｍＬで通した。次いで、カラムを精製緩衝液の５カラム分の体積で洗浄した。ＯｓｐＣを５ｍＭのビオチン（シグマ社製）で溶出させ、回収した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【００５４】
ＯＳｐＣ  ＥＬＩＳＡ  組換えＯｓｐＣをコーティング緩衝液で７５０ｎｇ／ｍＬへ希釈し、１００μｌ量を個々のフラット底マイクロタイターウェル（バージニア州チャンティリリにあるダイナテックラボラトリーズ社製）て添加した。マイクロタイタープレートを４時間３５℃でインキュベートさせ、その後、一晩４℃でインキュベートさせた。インキュベーション後、プレートを、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンを含有するリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、密閉して４℃で保存した。使用前に、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ‐０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェントで、２２℃にて３０分間にわたりプレートをブロックし、ＰＢＳ‐０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェントで２回洗浄し、ＰＢＳ中の正常若しくはライムボレリオシス血清の連続２倍希釈液の１００μｌを個々のウェルに添加した。プレートを２２℃で１時間インキュベートさせ、続いてＰＢＳ‐０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェントで洗浄した。ＰＢＳ‐０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェント中で１：３０００に希釈されたアンチヒトＩｇＭ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体（オレガノンテクニカキャペル社製）の１００μｌを添加し、プレートを２２℃で１時間インキュベートさせた。インキュベーション後、１００μｌのｏ‐フェニレンジアミンホスフェート（０．４ｍｇ／ｍＬ，シグマ社製）を各ウェルに添加し、２２℃で３０分間にわたりインキュベートさせた。１００μｌの１ＮのＨ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させ、直ぐに４９０ｎｍでの吸光度を求めた（バーモント州ウィノスキにあるバイオ‐結句インストルメント社製のモデルＥＬ３０７）。正常な血清コントロールの０．２００以上の光学濃度（以下、「ＯＤ」という）は陽性とみなした。
【００５５】
ボレリアシダル抗体の検出  ボレリアシダル抗体のフロー血球計算試験は、Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ他による方法により行われた（２９、３０）。簡単に説明すれば、Ｂ．ｂ．単離体５０７７２若しくは２９７の凍結した２００μｌのアリコートを解凍し、６ｍＬのフレッシュなＢＳＫ培地へ接種させ、培養を３５℃で７２時間インキュベートさせた。インキュベーション後、スヒロヘータの濃度は、ペトロフ‐ハウザーカウンティングチャンバーを利用して算出させ、フレッシュなＢＳＫ培地中にて希釈させて、ｍｌ当たり１０６生物体の濃度にした。血清サンプルをフレッシュなＢＳＫ培地にて１：２０に希釈し、０．２μｍのマイクロフュージフィルタ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）（マサチューセッツ州ケンブリッジにあるコースター社製）に通過させて殺菌した。１００μｌのアリコートを１．５ｍＬのスクリュキャップマイクロフュージ管（サルステット社製）へ移し、希釈せっけいを５６℃の１０分間で熱による不活性化を行った。その熱による不活性化に続いて、１００μｌアリコートのＢ．ｂ．５０７７２と１５μｌの無菌モルモット血清（シグマ社製のｍｌ当たり５０％溶血補体単位）を希釈血清へ添加した。緩やかに攪拌した後、アッセイ懸濁液を３５℃で１６から２４時間インキュベートした。
【００５６】
インキュベートに続き、１００μｌのアッセイ懸濁液を、アクリジンオレンジ（最終濃度５．４ｘ１０９モル／ｌ）を含有するＰＢＳ（０．０１モル／Ｌ、ｐＨ７．２）で１：５に希釈した。ボレリアシダル抗体をＦＡＣＳｃａｎシングルレーザフロー血球計算器（カルフォルニア州サンジョーズにあるベクトン‐ディキンソンイムノサイトメトリシステムズ社製）で検出した。低速度（１０μｌ／分）で測定を１から２分間で行い、ＦＡＣＳｃａｎ  Ｌｙｓｙｓ ＩＩリサーチソフトウェアにて解析した。側散乱パラメータと蛍光強度パラメータを利用して、Ｂ．ｂ．をＢＳＫ及び補体粒子と識別した。データ獲得中にスピロヘータを集め（ｇａｔｅｄ）、蛍光シグナル強度を対数的に増幅させて線形スケールに変換した。正常血清と比較して蛍光強度において１３％以上の増加は陽性とみなした。すべてのアッセイは２回または３回行った。
【００５７】
マウスのワクチン接種とアンチ‐ＯｓｐＣ血清の回収  筋肉を介して、１００μｌのフロイント完全アジュバント（シグマ社製）中の７５μｇの精製ＯｓｐＣで、マウスをワクチン接種された。その後、初期のワクチン接種後、２及び４週間で、１００μｌのフロイント不完全アジュバント（シグマ社製）中の７５μｇ量のＯｓｐＣでマウスを促進させた。第二の促進後２週間で、血液を心臓内の穿刺にて収集した。血液を凝結させ、５分間、３５００ｒｐｍで、血清を遠心分離により分離させた。血清を取出し、使用するまで‐７０℃で５０μｌ量で保存した。
【００５８】
フローサイトメトリック免疫蛍光アッセイ  アンチＯｓｐＣ抗体を含有するマウス血清サンプルを、ＢＳＫ培地中で連続して希釈した（１：２０から１：４０９６０）。１０５個の生存するＢ．ｂ．２９７又は５０７７２生物体を含有する１００μｌのＢＳＫ培地を各希釈液に添加した。懸濁液を緩やかに渦巻き回転させ、３０分間３５℃でインキュベートさせた。インキュベーション後、無菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１：２０に希釈した、１０μｌのフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）複合体のヤギアンチマウスＩｇＧ（オハイオ州オーロラにあるＩＣＮ／キャペル社製）抗体を、各アッセイに添加した。アッセイは緩やかに渦巻き状に攪拌させ、さらに３０分間３５℃でインキュベートさせた。インキュベーション後、各懸濁液の１００μｌのアリコートを４００μｌの０．２２マイクロ濾過無菌ＰＢＳと一まとめにした。その後、上記の懸濁液はＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器を利用して解析した。
【００５９】
ボレリア活性の中和  ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の除去後の血清ボレリア活性は、前述したように求めた（１７）。簡単に説明すれば、１２５μｌの透析ヤギアンチヒトＩｇＭ又はＩｇＧ（重鎖及び軽鎖；ミネソタ州チャスカにあるＫａｌｌｅｓｒａｄ Ｄｉａｇｏｎｓｔｉｃｓ社製）を２５μｌの正常な、又はライムボレリオシスへ添加し、その混合物を３７℃で２時間インキュベートした。１０分間、５０００ｘｇにて遠心分離させたのち（テキサス州ビューモントにあるへレナラボラトリーズ社製Ｓｕｒｅｓｐｉｎ）、上澄液をフレッシュなＢＳＫ培地で２倍希釈させ、０．２μｍのマイクロフュージフィルタ（コスター社製）を介して無菌化し、ボレリア死だｒｙ活性をアッセイした。アンチ−ＩｇＭ又はアンチ−ＩｇＧのない正常及びライムボレリアシダル血清ボレリアシダル活性は、１２５μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）の添加後に求めた。
【００６０】
ＯｓｐＣによるライムボレリオシス血清の吸着  ライムボレシオシス血清からのアンチ−ＯｓｐＣ抗体の吸着は、前述した手順（１７）を変形させて行った。テトラリンクテトラメリックアビジンレジン（プロメガ社製）をＯＢＳで洗浄し、１ｍＬ体積をカラムに載せた。１ｍｌ体積中の３μｇの透析ビオチン化ＯｓｐＣをカラムに通し、２８０ｎｍでの吸収（ＯＤ）を監視して、カラムへのＯｓｐＣの結合を確認した。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１０倍に希釈した各１０のヒトライムボレリオシス血清１ｍＬの１ｍＬサンプルを、４℃でカラムに１０回から１５回通過させ、アンチＯｓｐＣ抗体を除去した。アンチ−ＯｓｐＣ抗体の除去はウエスタンブロッティングにより確認した。
【００６１】
本研究により、ＯｓｐＣによるマウスのワクチン接種は高濃度のアンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体を誘発し、Ｂ．ｂ．による感染に対する保護をもたらすＯｓｐＣの能力を評価するのに大きな効果を導いた。なぜなら、ライム病に対する保護若しくは治療するため、ＯｓｐＣワクチン接種能力を説明するもっともらしい免疫機構を提供するからである。さらに、単一の生物体Ｂ．ｂ．５０７７２が試験抗原として利用されるならば、高濃度のアンチ−ＯｓｐＣボレリアシダル抗体は、全米位中の患者の血清にて容易に検出可能であり、ＯｓｐＣボレリアシダルエピトープ（類）が保存されることを示す。よって、ＯｓｐＣ不均一性が総合的ＯｓｐＣワクチンの開発の効果を阻害するものではない。
【００６２】
上記の発見は他の刊行物の観察とはまさに対照的なものである。以前の報告では、検出はＢ．ｂ．表面の高レベルのＯｓｐＣの存否に左右した。上記のアンチ−ＯｓｐＣボレリアシダル抗体は、Ｂ．ｂ．単離体はその表面に高レベルのＯｓｐＣを発現し、利用したときのみ検出された。
【００６３】
例  ２
本例は、ＯｓｐＣのボレシアシダルエピトープはＤｒａ断片内に位置することを例示する。
【００６４】
工程ａ：ｏｓｐＣ遺伝子のプラスミドの単離、クローニング及び増幅：
プラスミド豊富なＤＮＡを標準的技法を利用して、Ｂ．ｂ．センスストリコ単離体Ｓ‐１‐１０から単離した（１３）。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（３４）を利用して、ＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐプロトコール（コネチカット州ノーウォークにあるパーキンエルマーセタス社製）によりｏｓｐＣ遺伝子の増幅のテンプレートとして利用した。プライマーは１．５ｍＭのＭｇＣｌ２により最終濃度が１．０μＭで利用した。サーマルサイクリングパラメータは、９５℃で５分間と、次の１）９５℃３０秒、２）５０℃３０秒、３）７２℃９０秒を３５回行った。最後のエクステンションは７２℃で７分間行い、任意の切除ＤＮＡ鎖を全長に拡大させた。アミノ末端プライマーＣ１  ５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＧＡＴＡ‐３’とカルボキシ末端プライマーＣ２  ５’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＣ‐３’を増幅のために利用した。増幅ＤＮＡをＧｅｎｅＣｌｅａｎ（カルフォルニア州ラジョーラにあるバイオ１０１社製）を利用して精製した。ＳｍａＩ及びＢａＭＨＩ（メリーランド州ゲイスベルグにあるベセスダリサーチラボラトリーズ社製）により消化させたあと、精製ＤＮＡ断片をＰｉｎＰｏｎｉｔｐＸａ‐３ベクター（ウイスコンシン州マディソンにあるプロメガ社製）へライゲートさせた。挿入体及びプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社製）でリゲートし、そのリゲート混合物を能力大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させるために利用した。その後、生物体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ、ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社製）を含有する２ｘトリプトン酵母（ＴＹ）培地にて平板培養させ、３７°で２４時間インキュベートさせた。ＯｓｐＣ融合タンパク質を発現するコロニーは、ストレプトアビジン−アルカリン酸複合体（ベセスダリサーチラボラトリーズ社製）とアンチ−ＯｓｐＣ抗体を含有する早期のライム病血清とを利用して、ウエスタンブロット解析により検出された。本プラスミドはｐＸ３‐２２で表わされ、図１に示す。
【００６５】
工程ｂ：ｏｓｐＣ遺伝子切頭の創製．  ＯｓｐＣタンパク質のカルボキシ末端断片を作出するために、プラスミドｐＸ−３３を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ（ギブコ社製）により消化させた。次いで、ＯｓｐＣ遺伝子を含有する〜０．６ｋｂＢａｍＨＩ‐ＳｍａＩ断片を、図２に示す制限酵素ＤｒａＩ（ギブコ社製）で消化させた。この消化により、ＯｓｐＣタンパク質のアミノ末端部に対してコードする〜０．４ｋｂＢａｍＨＩ‐ＤｒａＩ断片と、カルボキシ末端部に対するコードする〜０．２ｋｂＤｒａＩ‐ＳｍａＩ断片が生じる。次いで、このＤｒａＩ‐ＳｍａＩ断片をＳｍａＩ消化ＰｉｎＰｏｉｎｔベクターｐＸａ‐２（ウィスコンシン州マディソンにあるプロメガコーポレション社製）でライゲートし、生じた切頭タンパク質の正確なリーディングフレームを保存した。ライゲーション混合物を能力大腸菌ＪＭ１０９を形質変換するために利用した。制限消化を行いｏｓｐＣ遺伝子断片挿入の正しい動作によるクローンを確認した。本プラスミドはｐＸ２‐２２‐Ｄｒａと称され、図３に例示する。
【００６６】
工程ｃ：ｏｓｐＣ遺伝子断片の分子解．  ｐＸ２‐２２‐ＤｒａのＤＮＡ配列は二重鎖配列決定法により求めた。増幅用に構築されたプライマーＣ２（例２の工程ａを参照）と、ＰｉｎＰｏｉｎｔ配列決定法によるプライマー（プロメガ社製）とを利用した。ＤｒａＩ‐ＳｍａＩｏｓｐＣ遺伝子断片（ＯｓｐＣＤｒａ断片）の配列を図４に示す。この切頭ＯｓｐＣ融合タンパク質の予想されたアミノ酸配列も、図４に示す。
【００６７】
工程ｄ：Ｄｒａ断片ＯｓｐＣの精製．  ｐＸ３‐２２及びｐＸ２−２２−Ｄｒａのいずれかを含有する形質転換させた大腸菌生物体を、アンピシリンを含有する１００ｍｌの２ｘＴｙブロス中で、３７°１２時間成長させた。培養液を２ｘＴＹブロスで１：１０に希釈し、さらに１時間インキュベートさせた。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（最終濃度０．１ｍＭ、シグマ社製）を培養液に添加し、さらに４時間インキュベートさせた。次いで、バクテリアの懸濁液を遠心分離させ（１０，０００ｘｇ、４℃で１５分間）、精製緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」緩衝液）中で再懸濁させ、音波装置（コネチカット州ダンベリにあるブランソンソニックパワー社製のモデルＷ３５０）により５ｘ３０秒パルスに溶菌させた。音波処理大腸菌生物体を１５分間１０，０００ｘｇで遠心分離させて不溶材料を排除し、上澄液をソフトリンク樹脂（プロメガ社製）のカラムに、４℃で分速０．５ｍｌの速度で通過させた。次いで、カラムを精製緩衝液の５カラム体積で洗浄した。カラム結合ＯｓｐＣＤｒａ断片融合タンパク質を、５ｍＭのビオチン（シグマ社製）を含有する精製緩衝液を利用して溶出させた。フラクションを硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。
【００６８】
工程ｅ：全体及びＤｒａ断片ＯｓｐＣによるライムボレリオシス血清の吸着．  ライムボレリオシス血清からのアンチ又はＤｒａ断片抗体の吸着は、前記した手順（１７）を変形させて行った（１７）。テトラリンクテトラメリックアビジンレジン（プロメガ社製）をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ体積をカラムに載せた。次いで、１ｍｌ体積中の３μｇの透析ビオチン化全体ＯｓｐＣ（ｐＸ３−２２からの融合タンパク質）又はＤｒａ断片ＯｓｐＣ（ｐＸ２‐２２‐Ｄｒａからの融合タンパク質）をカラムに通過させ、２８０ｎｍの吸収を監視して、カラムへのタンパク質の結合を確認した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）により１０倍に希釈された各血清の１ｍｌサンプルを、１０から１５回カラムに通し、アンチ−ＯｓｐＣ又はアンチ−Ｄｒａ断片抗体を除去した。
【００６９】
例１及び例２の材料及び方法を利用して、まず、高力価のアンチＯｓｐＣボレリア子ダル抗体を含有する７つの早期のライム病血清サンプルを試験し、ボレリアシダル抗体が本願で説明したＤｒａ断片内のＯｓｐＣタンパク質の特定領域に対するものであることを確認した。
【００７０】
ＯｓｐＣ又はＤｒａ断片融合タンパク質はアガロースビーズに結合しており、分離イムノアフィニティカラムが調製された。ライム病血清はそのカラムを通過し、アンチ−ＯｓｐＣ又は又はアンチ−Ｄｒａ断片抗体を、それぞれＯｓｐＣ又はＤｒａ断片融合タンパク質に吸着させることにより除去した。Ｂ．ｂ．５０７７２に対するボレリアシダル活性は、抗体除去の前後で求めた。早期のライム病血清からのアンチ−ＯｓｐＣ及びアンチ−Ｄｒａ断片抗体により、表１に示すボレリアシダル活性の殆ど完全な除去をもたらした。
【００７１】
【表１】
0003631960.tif 000002
表１は、全体ＯｓｐＣ融合タンパク質又はＯｓｐＣＤｒａ断片に対する抗体除去後の早期のライム血清のボレリアシダル抗体力価を示す。表１を参照するに、ボレリアシダル抗体はＤｒａ断片内に位置するＯｓｐＣタンパク質の特定領域に対するものであることが分かる。上記結果は、アンチＯｓｐＣボレリアシダル抗体は、ＯｓｐＣのＤｒａ断片内のエピトープにより殆ど完全に誘発されていることを例証する。
【００７２】
例  ３
本例は、ＥＬＩＳＡにより検出されうるＯｓｐＣのＤｒａ断片領域に特異なアンチＯｓｐＣ抗体を例示する。
【００７３】
Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡ  精製ＯｓｐＣＤｒａ断片はコーティング緩衝液（０．０１５ＭのＮａ２ＣＯ３、０．０３５ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）にて７５０ｎｇ／ｍｌと希釈し、平坦底のＮ−オキシす苦心イミド表面のアミノ結合マイクロタイターウェルへ添加した。ＥＬＩＳＡプレートを３５℃で４時間インキュベートし、その後、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンを含有するＰＢＳで３回洗浄し、密閉して４℃で保存した。使用前に、プレートを１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ−０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンで３０分間室温でブロックした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンで２回洗浄し、ＰＢＳ中の血清の連続２倍希釈液を個々のマイクロタイターウェルに添加した。プレートは２２℃で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ−０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンで３回洗浄した。アンチ−ヒトＩｇＭ又はＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体（ペンシルベニア州マルバーンにあるオラノンテクニカキャッペル社製）をＰＢＳ−０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェン中で１：３０００又は１：５０００へと希釈した。前記複合体のアリコート（１００μｌ）をウェルに希釈し、２２℃で１時間インキュベートした。しかる後に、１００μｌのｏ−フェニレンジアミンリン酸（シグマ社製）を添加し、プレートを２２℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加させて反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸収を求めた。
【００７４】
７つの早期のライム病血清サンプルに存在するアンチ−Ｄｒａ断片抗体は、Ｄｒａ断片ＩｇＭ又はＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを利用して容易に検出されうること求めた。Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡプレートを調製し、血清が０．０５％ＴＷＥＥＮ２０デタージェンを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）により１：２００に希釈したときに検出されたＤｒａ特異抗体の量を測定するため利用した。これは、ＥＬＩＳＡアッセイを行う際の研究室診断として、通常、利用される希釈である。表２に例示するすべての７つの早期のライム病血清サンプル中にて、有意なレベルのＩｇＭアンチ−Ｄｒａ断片抗体が検出可能であった。また、ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡにより、７つの早期の血清サンプル中の３つ（４２％）のサンプルにて、アンチ−Ｄｒａ断片抗体が検出された。表２は、アンチ−ＯｓｐＣ及び安置−Ｄｒａボレリアシダル抗体を含有する早期のライム病血清（ｎ＝７）を利用して、ＯｓｐＣ（全体のタンパク質）とＤｒａ断片ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ反応性を例示する。表２は、Ｄｒａ‐断片ＥＬＩＳＡが、０．０２吸光度と１：２００希釈で早期のライム病血清中にてアンチＤｒａ断片抗体を検出することができることを示す。
【００７５】
【表２】
0003631960.tif 000003
例  ４
本例は、ライム病を検出するためのＢ．ｂ．ＯｓｐＣ  ＥＬＩＳＡ及びＤｒａ断片ＥＬＩＳＡの特異性を例証するように計画された。
【００７６】
正常な血清と、ＥＢＶ及びＣＭＶ感染した患者からの血清とを検査することにより、Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡはＯｓｐＣＥＬＩＳＡよりも一層特異的であることが判明した。また、リウマチ因子と梅毒の患者からの血清サンプルとを含有する血清サンプルを試験した。なぜならば、上記タイプの血清は従来のライム病試験にて激しく反応することが公知であるからである。加えて、以前にＯｓｐＡライム病ワクチンによりワクチン接種させた個体からの血清サンプルを試験した。双方のＥＬＩＳＡでは、ライム病に対する以前のワクチン接種による影響はなかった。リウマチ因子よ歯毒血清とを含有する同様に小さな数の正常な血清サンプルは、ＩｇＭＯｓｐＣ又はＤｒａ断片ＥＬＩＳＡを利用して陽性であった。しかしながら、ＯｓｐＣ  ＥＬＩＳＡは、ＥＢＶ及びＣＭＶを含有うする他の病気に患っている患者からの血清を利用し、ＩｇＭに対して主に試験すると、しばしば誤って陽性となった。ＩｇＭ抗体は早期のライム病の間では高濃度で存在するので、これは驚くべきことではない。ＩｇＧ抗体は、通常、病気の遅い段階まで出現しなかった。対照的に、ＩｇＭＤｒａ断片ＥＬＩＳＡはＣＭＶ及びＥＢＶを有する患者からの血清を利用してもそれ程反応性はなかった。以下の表３を参照するとよい。よって、Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡは、全体のＯｓｐＣタンパク質を含有するＥＬＩＳＡよりも顕著に特異的であった。
【００７７】
表３は、ライム病交差反応血清（血清希釈１：２００）対ＩｇＭ  ＯｓｐＣ（全体のタンパク質）及びＤｒａ断片ＥＬＩＳＡを示す。表３を参照するに、Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡはＯｓｐＣ  ＥＬＩＳＡよりも一層特異的であった。
【００７８】
【表３】
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例  ５
本例は、ＯｓｐＣ及びＤｒａ断片ＥＬＩＳＡが類似の反応性を有することを示すように計画された。Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡの感度は、培養規定したライム病を有する患者からの２０の血清サンプルを検査することにより、ＯｓｐＣ  ＥＩＳＡと比較した。また、上記血清は異なるレベルのアンチ−ＯｓｐＣボレリアシダル抗体を含有していいた。ＯｓｐＣ及びＤｒａ断片ＥＬＩＳＡは類似の感度を有した。ＯｓｐＣとＤｒａ断片ＥＬＩＳＡは、表４に示すように、それぞれ２０の早期のライム病血清のうち１２（６０％）と１０（５０％）にて、ＩｇＭ抗体を検出した（０．２００以上の吸光度）
【００７９】
【表４】
0003631960.tif 000005
その他に、アンチ−ＯｓｐＣ又はアンチ−Ｄｒａ断片抗体の検出能力は、アンチ−Ｂ．ｂ．ボレリアシダル活性と密接に相関関係がある。数例の例外があるものの、高濃度のアンチ−ＯｓｐＣ又はアンチ−Ｄｒａ断片ＩｇＭ抗体は、高濃度のボレリアシダル抗体をも含有する早期のライム病血清にて検出された。ボレリアシダル活性が低いとき、両ＥＬＩＳＡはしばしば陰性であった。ボレリアシダル抗体試験は市販のＥＬＩＳＡとりも約３倍高感度であることが判明したので（３０）、これは予想外ではなかった。
【００８０】
例  ６
現在、出願人らは、試験した血清の希釈を低下させることによりＤｒａ断片ＥＬＩＳＡの感度を改善させることを研究中である。Ｄｒａ断片抗体応答がすこぶる特異的性質であるので、これは容易なことである。Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡ試験手順の改善（例えば、血清希釈、抗原／ウェル濃度）は、アンチ−Ｂ．ｂ．５０７７２ボレリアシダル抗体検出感度と密接に関連したレベルへ顕著に向上させることを予測している。
【００８１】
例  ７
本例は、Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡを利用して試験した２つの早期のライム病患者からのＤｒａ断片ＥＬＩＳＡ多重血清サンプルの予診能力を確認する。血清サンプルを抗菌剤による処置前、処置中及び処置後に収集した。アンチ−５０７７２ボレリアシダル活性をＤｒａ断片ＥＬＩＳＡで監視した。特に、アンチ−ＯｓｐＣ抗体が感染５日後と、抗生物質処置を開始した６日と１１日後に検出された。アンチ−５０７７２ボレリアシダル抗体及びアンチ−Ｄｒａ断片抗体は、感染５日後と処置６日後に検出されたが、１１日後には全く検出されなかった。同様に、アンチ−ＯｓｐＣ抗体は感染７日後と、患者２からの血清にて抗生物質処置後１０日と２４日後に検出された。しかしながら、ボレリアシダル抗体及びアンチ−Ｄｒａ断片抗体は抗生物質処置前のみで検出された。上記結果は、Ｂ．ｂ．による感染と相関関係があるＤｒａ断片ＥＬＩＳＡの能力を例証するものである。したがって、Ｄｒａ断片ＥＬＩＳＡは「治療の試験」としても有用である。
【００８２】
例  ８
ボレリアシダル抗体を惹起させるＯｓｐＣ能力により、活性を誘発する原因であるエピトープ（類）の同定が可能となった。ＯｓｐＡによりワクチン接種後の保護は高レベルのアンチ−ＯｓｐＡボレリアシダル抗体の誘導と維持とに依存するので、感染個体からのＢ．ｂ．の保護及び浄化もアンチ−ＯｓｐＣボレリアシダル抗体の誘導に依存するであろう。アンチ−ＯｓｐＣボレリアシダル抗体は早期のライム病血清から、Ｄｒａ断片への吸着により除去され得るので、Ｄｒａ断片によりワクチン接種もボレリアシダル抗体を惹起する。組換えＯｓｐＣによりワクチン接種されたマウスも、実際にはボレリアシダル抗体を産出する。
【００８３】
例１の方法を利用して、マウスはＢ．ｂｌ．５０７７２によりワクチン接種され、ボレリアシダル抗体のレベルは、ワクチン接種後さまざまな時間間隔で求めた。ボレリアシダル活性は初期のワクチン接種後１４日後に検出され、表５に示すように５６日後にピークを向かえた。
【００８４】
【表５】
0003631960.tif 000006
関連実験にて、アンチ−Ｄｒａ断片抗体は、アンチ−Ｄｒａ断片癒合タンパク質への吸着により除去される。次いで、ボレリアシダル抗体レベルが、吸着及びアンチ−Ｄｒａ断片抗体の除去の前後で測定した。よって、Ｄｒａ断片によるワクチン接種では、保護的ボレリアシダル抗体は誘発される。
【００８５】
例  ９
例では、Ｄｒａ断片が全体のＯｓｐＣタンパク質よりも良好なワクチン候補であることを示すことを計画する。動物がＯｓｐＣによりワクチン接種され、高レベルなボレリアシダル活性のある血清を収集する。その血清を分割し、アンチ−Ｄｒａ断片抗体の除去により、１のサンプルからのボレリアシダル活性を排除する。レシピエント動物を分けるために、ボレリアシダル抗体（アンチ−Ｄｒａ断片）を有する又は有しない動物に、Ｂ．ｂ．による攻撃の前に、感染後にさまざまな間隔で、受動的に投与した。アンチ−Ｄｒａ断片ボレリアシダル抗体を含有する血清は、感染後に生物体に対して保護し、その生物体を排除し、臨床的徴候を示す。対照的に、ボレリアシダル抗体のないアンチ−ＯｓｐＣ血清は、感染の予防若しくは治療には有効ではないと予測する。よって、重要なライム病ワクチン成分として、Ｄｒａ断片の有用性を明確に証明する。
【００８６】
例  １０
また、ライム病はイヌ及びネコにかなりの罹患率及びある程度の罹患率を引き起こす。間関節へのスピロヘータの移動を含むヒト及びイヌの病気と、ライム関節炎の発症との間には類似性がある。興味深いことに、最近、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ他はヒトとは異なり、自然に感染したイヌはボレリアシダル抗体を産出しないことを報告した。
【００８７】
しかしながら、最近、出願人らは自然に感染したイヌは、実際には、高濃度おのボレリアシダル抗体を発生させることを報告した。当然に、１０匹のメスと６匹のオスのＩｘｏｄｕｓ ｓｃａｏｕｌａｒｔｉｓダニを動物に付着させることにより、１５匹の１２から１２４週齢の病原性のないビーグルを感染させ、餌を与えて満腹にさせた。約４４％のダニはＢ．ｂ．により感染した。高濃度のアンチ−Ｂ．ｂ．５０７７２ボレリアシダル抗体が、ダニを付着させた後１週間後に、１５匹の内の８匹のイヌで検出された。結果を表６に示す。
【００８８】
【表６】
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感染後、２から９週間後から、８６％以上のイヌで高濃度のボレリアシダル抗体をその血清中に有していた、加えて、８３％の感染イヌは、ライム病と関連した臨床的サイン及び徴候を示し、Ｂ．ｂ．生物体は動物の皮膚及び９０％以上の関節から回収された。また、アンチ−ＯｓｐＣ及びアンチ−Ｄｒａ断片抗体を、アンチ−Ｂ．ｂ．５０７７２ボレリアシダル抗体の高力価のある３匹のイヌの血清から除去した。上記抗体の除去により、ボレリアシダル活性を殆ど完全に除去した。上記の発見は、ヒトの結成を利用した結果と殆ど一致した。よって、ＯｓｐＣＤｒａ断片は前述のヒトと同じ方法でペット動物に対しても有用である蓋然性が高い。
【００８９】
本発明は、本願にて例示し説明した特定の構成及び成分配置には限定されず、特許請求の範囲内にある変形態様もを包含するものであることは理解できる。
【００９０】
引用文献
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Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ Ｒ． Ｋ． 他  （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｏｉｌ． ３３： ２７４５−５１．
Ｓｃｈａｗｎ Ｔ． Ｇ 他 （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： ２９０９−１３．
Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ Ｓ． Ｍ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｏｌ． ２９： １７７３−６．
Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ Ｓ． Ｍ． 他 （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｄｉａｇｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３： ３９９−４０２．
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Ｌａｅｍｍｌｉ Ｉ． Ｋ． （１９７０） Ｎａｔｕｉｒｅ ２２７： ６８０−５．
Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． 他 （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６： ４３５０−４．
３４．  Ｌｅｃｋ Ｋ 他 （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ．
３５．  Ｐａｄｕｌａ Ｓ． Ｊ． （１９９３） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１： ５０９７−１０５．
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Ｓｃｈｅｌｌ Ｒ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｓｐｉｒｏ． Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｄｉｓ． ４： ４−６．
Ｒａｕｓｅｒ Ｓ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ． ３６： ８５７−８６１２．
Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ Ｌ． 他 （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂ． ３４： ２３７−２４０．
Ｆｕｎｇ Ｂ． 他 （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２： ３２１３‐３２２１．
Ｇｅｒｂｅｒ Ｍ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７１： ７２４−７２７．
Ｐａｄｕｌａ Ｓ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ． ３２： １７３３−１７３８．
Ｃｒｅｓｓｏｎ Ｊ． 他 （１９９６） Ｃｌｉｎ． ＆ Ｄｉａｇ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎ． ３／２： １８４−１９０．
Ｚｈｏｎｇ Ｗ． 他 （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９： ９４６−９４７．
Ａｐｐｅｌ Ｍ 他 （１９９３） Ｊ． Ｉｎｆ． Ｄｉｓ． ６７： ６５１−６５４．
Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ Ｓ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８： ３６３−５．
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＸ３‐２２の制限地図である。陰の部分はＢ．ｂ．Ｓ−１−１０ｏｓｐＣ遺伝子をが入する領域を表わす。
【図２】ＯｓｐＣ  Ｄｒａ断片融合タンパク質をコードするプラスミドｐＸ２−２２−Ｄｒａを生じさせるために利用した工程の模式図である。
【図３】プラスミドｐＸ２−２２−Ｄｒａの制限地図である。陰の部分は、Ｂ．ｂ．Ｓ−１−１０  ｏｓｐＣ  Ｄｒａ断片遺伝子を含有する領域を表わす。
【図４】ＤＮＡと、Ｄｒａ断片融合タンパク質のコードされたアミノ酸配列である。ボックス領域はＤＮＡであり、Ｂ．ｂ．  Ｓ−１−１０のＯｓｐＣ  Ｄｒａ断片に固有な予測されたアミノ酸配列である。配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を参照せよ。
【配列表】
0003631960.tif 000008
0003631960.tif 000009
0003631960.tif 000010
0003631960.tif 000011
【図１】
0003631960.tif 000012
【図２】
0003631960.tif 000013
【図３】
0003631960.tif 000014
【図４】
0003631960.tif 000015