(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌の外膜蛋白質に含まれるインティミンの部分配列である配列番号１に示すアミノ酸配列の３８〜１５７位または３８〜２３５位からなるペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＩＮＴＮ２１５（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２９）により産生されるモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２１５、又はハイブリドーマＩＮＴＮ２２８（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７３０）により産生されるモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２２８である請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いた腸管出血性大腸菌の検出方法。
【請求項５】
検出方法が免疫測定方法である請求項４に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原性大腸菌に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９９６年、日本では、病原性大腸菌Ｏ−１５７による食中毒が散発し、死亡者も含めて患者数は９０００人にも上がった。病原性大腸菌Ｏ−１５７は、腸管出血性大腸菌の一種で、赤痢菌の毒素に類似したベロ毒素を産生し、出血性大腸炎や溶血性尿毒症症候群等を引き起こす。重症となった場合は死亡率が高いため、感染初期での確定診断や早期治療等が必須である。
【０００３】
しかしながら、病原性大腸菌、特にＯ−１５７の検出手段としては、Ｏ−１５７がソルビトール非分解性または遅分解性である性質を利用したソルビトール添加の選択培地にて、患者検体を培養するという古典的な方法が一般的に取られており、時間と手間を要するため、緊急の検査には間に合わないことがあった。また、患者からの臨床分離株では、ベロ毒素産生株としてＯ−１５７ばかりではなく、Ｏ−２６やＯ−１１１が散発している事が報告され（Acta Paediatr. Jpn.: 37, 469-473, (1995)、日本臨牀：55, 651-654, (1997))、大腸菌培養にＯ−１５７選択培地を用いる培養では、他の菌株の検出には問題を生じる可能性が危惧される。
【０００４】
一方、培養法における選択培地の問題を解消するために、大腸菌膜表面の糖鎖によって大腸菌のＯ抗原型を判別する方法も取られてきた。すなわち、膜表面に存在する糖鎖に対する抗血清を用い、培養によって増殖させた大腸菌との反応の有無によりＯ抗原型の同定を行うものである。この方法によれば、選択培地を用いる方法よりは正確に同定することができるものの、１７０種類以上が知られているＯ抗原型別分類のうち日本国内で市販されているＯ抗原型別抗血清は４０種程度であり、非常に数多くの株に対応した抗血清を常備しておく事は、抗血清の特異性、再現性、費用等の面で問題が多い。また、この方法を用いた場合でも、感度の点で大腸菌の培養が必要となるため、迅速な対応を必要とする毒素産生病原性大腸菌の同定には不向きであった。
【０００５】
近年では、ベロ毒素産生の有無を検出するために、ベロ毒素遺伝子のＰＣＲ法による遺伝子増幅法も用いられている。ＰＣＲ法による遺伝子増幅は、検出感度は優れているものの、疑似遺伝子の増幅等による疑陽性を防ぐためには、検体の前処理を必要とするため、多数検体の測定に当たっては煩雑さが否めない。
また、前培養後にＯ−１５７に対する抗血清を固定した磁性粒子を用いて、大腸菌Ｏ−１５７だけを検体中から集菌し、選択的にＯ−１５７を検出する方法も確立された（J. Med. Microbiol.: 40, 424-427, (1994) 、 J. Med. Microbiol.: 44, 267-271, (1996)、Appl. Environ. Microbiol.: 62, 587-592, (1996)) 。しかしながら、上述したように大腸菌Ｏ−１５７だけがベロ毒素産生株では無く、抗血清の特異性にも問題があるため、より広くかつ見逃しの無い反応性を持った病原性大腸菌の検出方法が望まれていた（日本臨牀：55, 651 - 654 (1997)）。
【０００６】
これらの方法は、Ｏ抗原による型分類別の病原性大腸菌を検出するものであるが、他方では、病原性大腸菌に共通する構造を認識する抗体を作製し、ベロ毒素を産生する危険性の高い病原性大腸菌を一括して検出しようとする試みもなされ、その中でも腸管出血性大腸菌の外膜蛋白質であるインティミンが注目されている。インティミンは、大腸粘膜の腸管粘膜上皮細胞に強い粘着性を示す粘着因子として知られており、腸管出血性大腸菌はこのインティミンを介して腸管粘膜上皮細胞に取りつき、ＡＥ障害（Attaching & Effacing）と呼ばれる一連の細胞骨格構造障害を引き起こして、感染を成立させる。
【０００７】
しかしながら、感染部位への粘着因子として作用するインティミンは、Ｏ抗原型毎の構造が解明されつつある段階で、未だその全容が明らかにはなってないない。M.Louie 等のグループは、Ｏ−１５７のインティミンのＣ末端側２６６アミノ酸残基をＧＳＴと融合さた蛋白質を発現させ、これを免疫原として作製した抗血清により、Ｏ−５、Ｏ−２６、Ｏ−５５、Ｏ−１１１、Ｏ−１２７、Ｏ−１５７等の種々の大腸菌の交差反応性を認めたとする報告（Infect. Immun., 61, 4085 - 4092 (1993)）をしている。
【０００８】
一方で、ヒトへの感染株として恐れられているＯ−１５７（ＥＨＥＣ）のインティミンと兎への感染株として最も良く解明されているＯ−１２７（ＥＰＥＣ）のインティミンとを比較すると、インティミンのＣ末端側は非常に変異が激しく株特異的な配列を有しており、Ｎ末端側は比較的ホモロジーが高い領域が存在している事が推測される。T.S.Agin等のグループも、Ｏ−２６とＯ−１１１のインティミンの遺伝子解析において、株特異的なＣ末端領域の解析を試みており、Ｎ末端領域に関する遺伝子解析はなされていない (Infect. Immun., 65, 320 - 326 (1997)）。
【０００９】
これらの報告では、インティミンを用いた場合の病原性大腸菌の共通認識部位が明らかではなく、また、抗血清は量が限られるため、研究材料としても充分ではなかった。
よって、病原性大腸菌を広く認識し、集団感染の検査においても潤沢に再現性良く供給し得るようなモノクローナル抗体を作製することが望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、病原性大腸菌を直接認識できるようなモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の免疫測定方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の課題を解決すべく、病原性大腸菌に関する研究を重ねた結果、ベロ毒素を産生する主な病原性大腸菌のインティミンを共通に認識するモノクローナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方法により病原性大腸菌の免疫測定をする事に成功して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、病原性大腸菌を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の免疫測定方法を提供するものである。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、病原性大腸菌を短時間で直接検出する事ができ、病原性大腸菌感染の確定診断、食中毒発生の原因解明等に広く応用する事が出来る他、不溶性物質等に固定化したモノクローナル抗体を用いた腸管出血性大腸菌の集菌或いは体内からの排除等の病原性大腸菌感染後の対応にも応用することが出来る。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に於て病原性大腸菌とは、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）等の病気を引き起こす大腸菌を言い、好ましくは腸管出血性大腸菌、更に好ましくはベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌、特に好ましくは外膜蛋白質としてインティミンを有する大腸菌を意味する。
【００１４】
ベロ毒素を産生する大腸菌としては、Ｏ−２、Ｏ−５、Ｏ−８、Ｏ−２２、Ｏ−２６、Ｏ−３８、Ｏ−６９、Ｏ−８４、Ｏ−９８、Ｏ−１０３、Ｏ−１１１、Ｏ−１１３、Ｏ−１１６、Ｏ−１３２、Ｏ−１４５、Ｏ−１５３、Ｏ−１５６、Ｏ−１５７等、インティミンを有する大腸菌としては、Ｏ−５、Ｏ−２６、Ｏ−６９、Ｏ−８４、Ｏ−９８、Ｏ−１０３、Ｏ−１１１、Ｏ−１４５、Ｏ−１５６、Ｏ−１５７等が挙げられる。これら病原性大腸菌はウシを媒体としてヒトに感染すると考えられているが、ヒトから臨床分離された病原性大腸菌株のほとんどは、インティミンを有していると言う見方もある。
【００１５】
大腸菌Ｏ−１５７のインティミンの分子量は、９４〜９７ｋＤａで、その塩基配列はG.Beebakhee やJ.Yue & J.B.Kaoer 等によって明らかにされている（FEMS Microbiol. Lett.: 91, 63-68, (1992)、Mol. Microbiol.: 6, 411-417, (1992) ）。また、これまでに牛から単離された腸管出血性大腸菌株について、インティミンの遺伝子であるｅａｅＡ  ｇｅｎｅの有無を検討した報告もなされている(Epidemiol. Infect., 116, 1 - 7 (1996)) 。
【００１６】
病原性大腸菌を認識するモノクローナル抗体を取得するには、免疫原として、病原性大腸菌体そのものを用いても良いが、病原性大腸菌の特異的外膜蛋白質であるインティミンを用いることが望ましい。免疫原としてのインティミンは、その全体を用いても、一部分を用いてもよいが、どのような免疫原として用いたとしても、モノクローナル抗体を確立する際にインティミンに特異的なモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫原はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
上記のような免疫原を、マウス、ラット、ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従って行うことができ、免疫原は単独でまたはアジュバンドと共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して抗体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリエチレングリコール等のような融合剤で融合してハイブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡＴ培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析し、目的とする病原性大腸菌に特異的なモノクローナル抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際には、インティミン、病原性大腸菌、病原性を示さない大腸菌等の反応性の有無を基準にして選択することが好ましい。
【００１８】
これらのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 256 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 446 1980 ）等の方法により行うことができる。また上述の手法により作製したモノクローナル抗体は、プリスタン処理したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清から、塩折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティークロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収することができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、病原性大腸菌の検出方法に様々に用いることができる。例えば、大腸菌の集菌、免疫測定方法等である。
検出方法が集菌の場合は、例えば本願発明のモノクローナル抗体を不溶性担体等に固定化し、モノクローナル抗体を介して不溶化された病原性大腸菌を不溶性担体ごと集めることができる。これを体内にて行えば、感染した体内から病原性大腸菌のみを排除することもできる。
【００２０】
検出方法が免疫測定方法の場合は、公知の免疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体を蛍光標識した組織免疫染色法、ウエスタンブロット法、本発明のモノクローナル抗体を２種類用いたサンドイッチ免疫測定法、本発明のモノクローナル抗体と抗大腸菌抗体とを用いたサンドイッチ免疫測定法、標識インティミンを用いた競合免疫測定法等を挙げることができるが、本発明の免疫測定法はこれらに限定されるものではない。
なお、測定する検体には制限が無く、例えば便、組織抽出液、組織、食品、血清等の病原性大腸菌の測定に適応できる。
【００２１】
【実施例】
本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
参考例１  病原性大腸菌Ｏ−１５７からのインティミン遺伝子の単離並びにその解析
報告されているインティミン遺伝子の塩基配列（FEMS Microbiol. Lett.:91, 63-68, (1992) ) を参考にして、Ｏ−１５７ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ法にてインティミン遺伝子３２ａａ−９３５ａａ領域を増幅した。増幅した断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで水解した後、図１に示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡｅａｅＡ９００を作製した。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を調べたところ、配列番号１に示すＤＮＡ配列を有し、該ＤＮＡ配列は配列番号１に示すアミノ酸配列をコードしていた。さらにプラスミドｐＷ６ＡｅａｅＡ９００を鋳型としてＰＣＲ法にてインティミン遺伝子の３８ａａ−５２２ａａ領域を増幅した。増幅した断片は制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで水解した後、発現用プラスミドｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐを作製した。次いでｐＷ６ＡｅａｅＡ９００とｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐをそれぞれ用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Brookhaven National Laboratoryより入手）を形質転換させ、インティミンポリペプチド３２ａａ−９３５ａａ及び３８ａａ−５２２ａａを発現するアンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００とＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐを得た。
【００２２】
参考例２  組換え蛋白質の発現と解析
参考例１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し発現誘導をおこない、さらに２時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とする。
【００２３】
菌体試料８μｌに３倍濃度のポリアクリルアミドゲル緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、２４％グリセリン、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＰＢ）４μｌを加え、十分撹拌した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後ポリアクリルアミドゲルをタンパク染色し、菌体試料に含まれるタンパクの展開像を観察した。形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐ試料中には、非形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）では認められない分子量約９４〜９７ｋＤａ及び約５５ｋＤａのポリペプチドが存在した。これはプラスミドｐＷ６ＡｅａｅＡ９００及びｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐからの発現産物と考えられる。発現産物はそれぞれインティミン９００及びインティミンＮｐと名付けた。
【００２４】
参考例３  インティミンＮｐの精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐをＬＢ培地３７℃条件下で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを約０．７の濃度にした後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。４時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、２Ｍ尿素を２００ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現したインティミンＮｐは、遠心後不溶性画分に回収された。不溶性画分を６Ｍ尿素、２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液ｐＨ１２．０で可溶化し直ちに１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０を添加してｐＨ９．０とし遠心を行い上清画分を回収した。この上清を、６Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．０で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシア社製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムを含むカラム平衡化緩衝液で溶出したところで約０．３Ｍ塩化ナトリウム溶出画分にインティミンＮｐを回収した。セントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮を行ったＱＦＦ溶出画分を６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．６で平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）で精製し、分子量約５５ｋＤａのインティミンＮｐを得た。
【００２５】
実施例１  抗インティミンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
参考例３で調製したインティミンＮｐをフロイント完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に２００μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約２週間の間隔をおいて更に２回、インティミンＮｐをフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗体価の上昇を確認した後、最終免疫としてインティミンＮｐ約４０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（大日本製薬から購入）とを３：１の細胞数の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞はＨＡＴ（１ｘ１０-4Ｍヒポキサンチン、４ｘ１０-7Ｍアミノプテリン、１．６ｘ１０-5Ｍチミン）及び１０％ウシ胎仔血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地（以下、本明細書においてＨＡＴ培地と記載する）に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を以下のＥＬＩＳＡ法により調べ、インティミンに反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。すなわち、参考例３で調製したインティミンＮｐをリン酸緩衝液（以下、本明細書においてＰＢＳと記載する）で希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩放置して固相に結合させた。次に、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以下、本明細書においてＰＢＳＴと記載する）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを分注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清を分注し、１時間、３７℃に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、本明細書においてＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を１０００倍希釈したものを分注し、１時間、３７℃に放置した。同様の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温、１０分間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養し、インティミンに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＩＮＴＮ２０２、ＩＮＴＮ２０３、ＩＮＴＮ２１５、ＩＮＴＮ２１６及びＩＮＴＮ２２８を樹立した。これらのハイブリドーマは大量培養し、それぞれマウス腹腔内に投与し、腹水を回収した。さらに、アフィ−プレッププロテインＡマップスＩＩキット（バイオラド社製）を用いて腹水より抗体を精製し、モノクローナル抗体を得た。これらの抗体をモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２８と命名した。
尚、樹立したハイブリドーマのうち、ＩＮＴＮ２１５とＩＮＴＮ２２８は生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２９、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７３０である。
【００２６】
実施例２  抗インティミンモノクローナル抗体の反応性
（１）発現誘導した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００に対する反応性
参考例２と同様の方法で発現誘導させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＰＢＳで３回洗浄後、６６０ｎｍで１．０のＯＤになるようにをＰＢＳで稀釈した。これを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、３７℃で一晩放置して乾固させた。次に、ＰＢＳＴで洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを加え、３７℃で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６、ｉｎｔｎ２２８及び陰性コントロール抗体としてインティミンに反応しないモノクローナル抗体をそれぞれ加え、３７℃で１時間反応させた。続いて同様に洗浄後、１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を加え、３７℃で１時間反応させた。同様の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温、１０分間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収を測定した。。結果を表１に示す。抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２８は通常の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）には反応しないが、インティミン９００を発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＷ６ＡｅａｅＡ９００には反応することが確認できた。
【００２７】
【表１】
0003681537.tif 000002
【００２８】
（２）ウエスタンブロットによる病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１に対する反応性の確認
病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１及び遺伝子工学の分野で用いられている大腸菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地で３７℃一晩培養した。１ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１５０μｌのポリアクリルアミドゲル緩衝液（２０％グリセリン、１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８、１％  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＰＢ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。沸騰水中で加熱した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、更にニトロセルロース膜に転写した。転写膜を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２８を室温、１時間反応させた。ＰＢＳＴによる洗浄後、３００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）と室温、１時間反応させた。更にＰＢＳＴによる洗浄を行った後、ＰＯＤ不溶性基質（４クロロナフトール−過酸化水素系）を加えて、発色させた。結果を図２に示す。病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１では分子量９４ｋＤａ付近にバンドを生じたが、大腸菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）では同様のバンドが認められなかった。抗インティミンモノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２８は病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１のインティミンに反応することが確認できた。
【００２９】
実施例３  抗インティミンモノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）エピトープ解析用のペプチド作製
エピトープ解析用のペプチドとして、免疫原として用いたインティミンＮｐの部分ペプチドを作製した。まず、参考例１で作製したｐＷ６ＡｅａｅＡＮｐを鋳型として用いてＰＣＲ法にて特定の部分ペプチド領域をコードする遺伝子領域を増幅した。増幅した断片は、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで水解した後、図２に示すチオレドキシン融合発現プラスミドｐＷＴ８ＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。次いで、それぞれの組み換えプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Brookhaven National Laboratoryより入手）を形質転換した。形質転換体は、参考例２と同様の方法でチオレドキシン融合蛋白として発現させた。発現させた特定の部分ペプチド領域は、配列表１に示すインティミンのアミノ酸番号で、３８〜２３５、２３７〜５２２、１５８〜３５１、３８〜１５７、１５８〜２３６、３８〜９０、９１〜１５７、８２〜９９の計８種類である。これらの部分ペプチドは、ＮｐＡ、ＮｐＢ、ＮｐＣ、ＮｐＤ、ＮｐＦ、ＮｐＨ、ＮｐＩ、ＮｐＮと命名した。
【００３０】
（２）実施例３−（１）で作製した部分ペプチド８種類を用いて、ウエスタンブロットにより、実施例１で作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行った。ウエスタンブロット法は、実施例３−（１）で作製した部分ペプチド８種をＳＤＳ−ＰＡＧＥした他は、実施例２−（２）に記載の方法にて行った。結果を表２に示す。表２に示すように、モノクローナル抗体ｉｎｔｎ２０２、ｉｎｔｎ２０３、ｉｎｔｎ２１５、ｉｎｔｎ２１６及びｉｎｔｎ２２８はいずれも、インティミンの３８〜１５７アミノ酸領域に結合することが明らかとなった。
【００３１】
【表２】
0003681537.tif 000003
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、病原性大腸菌に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた病原性大腸菌の免疫測定方法を提供し、病原性大腸菌を簡便に測定することができる。
【００３３】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２７１２
配列の型：核酸
トポロジー：二本鎖
配列の種類：核酸
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】発現用プラスミドｐＷ６Ａの制限酵素地図である。
【図２】発現用プラスミドｐＷＴ８Ａの制限酵素地図である。
【図３】ウエスタンブロットによる病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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