(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６レセプター抗体を有効成分とする、ＶＬＡ−５−ＭＰＣ−１−の表面抗原を有する未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【請求項２】
前記インターロイキン−６レセプターがヒトインターロイキン−６レセプターであることを特徴とする請求項１の未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【請求項３】
前記インターロイキン−６レセプター抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１の未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【請求項４】
前記インターロイキン−６レセプター抗体がヒト型化抗体であることを特徴とする請求項１の未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【請求項５】
前記インターロイキン−６レセプター抗体がＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項１の未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【請求項６】
前記インターロイキン−６レセプター抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項１の未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はインターロイキン６レセプター抗体を有効成分とする化学療法剤抵抗性である未熟型骨髄腫細胞治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨髄腫は形質細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場として複数の部位で発生する腫瘍である。骨髄腫細胞の主要な増殖因子として、インターロイキン６（ＩＬ−６）が有力な候補として考えられている（Ｋａｗａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３，１９８８：Ｋｌｃｉｎら、Ｂｌｏｏｄ，７３，５１７，１９８９）。
【０００３】
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはインターフェロンβ２等と呼称されたサイトカインである。
ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３，１９８６）、その後種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかとなった（Ａｋｉｒａら、Ａｄｖ，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５４，１，１９９３）。
【０００４】
ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０ＫＤのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）である。ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）として存在する。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ＫＤのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次いでもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：９６７，１９８７）。
【０００５】
Ｋａｗａｎｏらは、ＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５あるいはＭＰＣ（ｍａｔｕｒｅ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ）−１（Ｈｕａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８２，３７２１，１９９３、特開平６−８６６８８）等の骨髄腫細胞上の表面抗原により、骨髄腫細胞がＶＬＡ−５陰性（−  ）ＭＰＣ−１−  の未熟型骨髄腫細胞、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１陽性（＋  ）の中間型骨髄腫細胞およびＶＬＡ−５＋  ＭＰＣ−１＋  成熟型骨髄腫細胞に分けられることを報告した（Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）。
【０００６】
また、このうち未熟型骨髄腫細胞が、化学療法剤に治療抵抗性を示す細胞集団の主体であることが知られている（Ｋａｗａｎｏら、第５６回日本血液学会総会要旨集、２６１頁、６４１，１９９４）。
これまで、ＩＬ−６Ｒ抗体を加えることにより、一般的に骨髄腫細胞の増殖が抑制されること（Ｇｏｔｏら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ７，６５５，１９９３）およびＩＬ−６が未熟型骨髄腫細胞の増殖を刺激すること（Ｋａｗａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）が知られていた。
【０００７】
しかしながら、これら知見は骨髄腫細胞の増殖を指標としており、骨髄腫の治療において重要であると考えられている化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞の根絶を示唆するものではなかった。また、これまでＩＬ−６Ｒ抗体が未熟型骨髄腫細胞の根本的な治療剤に有用であるかについてはなんらデータもなく、未熟型骨髄腫細胞の生存自体に直接関与しているか否かは依然として不明であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞に対し、これまでその根本的な治療に有効である薬剤は見出されておらず、未熟型骨髄腫細胞を根絶する効果を有する薬剤の登場が待たれていた。従って本発明は未熟型骨髄腫細胞に対する治療剤を提供しようするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６Ｒ抗体が化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞の生存を阻害することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、未熟型骨髄腫細胞を根本的に治療する新しい未熟型骨髄腫細胞治療剤を提供するものである。より詳しくは、本発明はＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞の生存阻害作用を有する未熟型骨髄腫細胞治療剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤を提供する。
【００１０】
【具体的な説明】
本発明で使用されるＩＬ−６レセプター抗体は、未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。この抗体はＩＬ−６Ｒと結合することにより、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害して、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
【００１１】
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
【００１２】
このようなＩＬ−６レセプター抗体としては、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２９００−２９０６，１９８９），ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。
モノクローナ抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、ＩＬ−６Ｒを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００１３】
より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としては、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒタンパク質を感作抗原として用いればよい。
【００１４】
ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱している可能性のもの（ｓＩＬ−６Ｒ）が抗原として使用できる。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異なっている。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。
【００１５】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量併用して、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００１６】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３：１５４８，１９７８），ｐ３−Ｕ１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８１：１−７，１９７８），ＮＳ−１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６），ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１５，１９７６）：ＳＰ２／０（Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８），ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３５：１−２１，１９８０），Ｓ１９４（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９７８），Ｒ２１０（Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）等が好適に使用される。
【００１７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００１８】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００１９】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ通常、培養液に３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００２０】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。
【００２１】
このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２２】
さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル漉過法、アフィニテイークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。
このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。
【００２３】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
【００２４】
さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。
【００２５】
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：１−６，１９９３）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
【００２６】
さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり抗体の断片、たとえばＦａｂあるいはＦｖ，Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Ｂｉｒｄら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９：１３２−１３７，１９９１；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８を参照）。
【００２７】
本発明のＩＬ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤は、未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６により生存が維持された未熟型骨髄腫細胞の生存が阻害される限り、それらの未熟型骨髄腫細胞の根絶に有効である。
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００２８】
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、およそ１−１０００ｍｇ／患者の範囲で４回以下の分割容量を選択することができる。しかしながら、本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００２９】
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製されたＩＬ−６Ｒ抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、参考例、実験例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１．  ヒトＩＬ−６レセプター抗体ＰＭ−１の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
【００３１】
すなわち、ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１ｍＭｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
【００３２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０９  個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブイドーマを作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×１０７  個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
【００３３】
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍｌ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍｌのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。０．０５ｍｌのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。
【００３４】
洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍｌの３５Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、ＩｇＧｌκ型のサブタイプを有する。
【００３５】
ハイブイドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＭＡ）により  １２５Ｉ標識した（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，１９８７）。
【００３６】
４×１０５  個のＵ２６６細胞を、１００倍量の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清及び１４０００ＣＰＭ  の  １２５Ｉ標識ＩＬ−６とともに培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロフユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。
その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害することが明らかとなった。
【００３７】
参考例２． ヒト型抗体ｈＰＭ−１の作成
ヒト型化抗体ｈＰＭ−１を国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９に記載の方法により得た。
参考例１で作成されたハイブリドーマＰＭ−１から常法で全ＲＮＡを調製し、これより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウスＰＭ−１のＶ領域のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法に使用するプライマーは、Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１に記載されたものを用いた。
【００３８】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を精製し、マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、及びマウスガンマ型Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンビテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、常法にしたがい決定し、さらに各Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。
【００３９】
キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡをＨＣＭＶ発現ベクターに挿入した。
ヒト型化ヒトＰＭ−１抗体を作成するために、ＣＤＲ移植法によりマウスＰＭ−１のＶ領域ＣＤＲをヒト抗体へ移植した。ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換した。
【００４０】
このようにして作成したヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を哺乳類細胞中で発現させるために、ヒトエロンゲーションファクターＩα（ＨＥＦ−１α）プロモーターを含有するベクターに各々導入し、ヒト型化ＰＭ−１抗体Ｌ鎖およびＨ鎖を発現するベクターを作成した。これら二つの発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時に挿入することにより、ヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）を産生する細胞株を樹立した。得られたヒト型化抗体のヒトＩＬ−６Ｒへの結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６Ｒへの結合を阻害した。
【００４１】
実験例
（１）骨髄腫細胞の分類
骨髄腫患者から得た骨髄腫細胞を、フローサイトメトリー法を用い、表面抗原に基づく骨髄腫細胞の同定および分類を行った。
骨髄液を、リンパ球分離液Ｓｅｐａｒａｔｅ−Ｌ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．）により遠心分離し、単核細胞を分離した。
【００４２】
これらの骨髄細胞を２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％  ＮａＮ３  を含むＰＢＳに５×１０５  個／２０μｌとなるように懸濁し、はじめに各々２０μｌの抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ｍＡＢ）（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）、抗ＣＤ５６ｍＡＢ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、抗ＶＬＡ−５ｍＡＢ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）あるいは抗ＭＰＣ−１ｍＡＢ（特開平６−８６６８８参照）を加え、４℃にて３０分間反応させた後、２０ｍＭ    Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で二回洗浄した。
【００４３】
次いで、１００倍希釈した４０μｌのＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）にて染色（４℃、３０分間）し、前記ＰＢＳにて二回洗浄の後、１５μｌのマウス血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を加え、４℃、２０分間インキュベートし、さらに２０μｌの前記ＰＢＳ中で５μｌのＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）結合抗ＣＤ３８ｍＡＢ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）を添加して染色し（４℃、３０分間）、前記ＰＢＳにて二回洗浄した。
【００４４】
これら二重染色された骨髄細胞をフローサイートメーター（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ，Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にて蛍光を測定することにより解析した。骨髄腫細胞の特徴であるＣＤ３８強陽性の画分に出現する細胞の表面抗原を解析した結果、骨髄腫細胞は、ＶＬＡ−５＋  ＭＰＣ−１＋  の成熟型、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１＋  の中間型およびＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熟型に分けられた（Ｋａｗａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）。
【００４５】
（２）骨髄腫細胞のアポトーシス誘導
骨髄腫細胞の生存率および死細胞のアポトーシスの判定を、ＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．製）およびＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ社）を用いた二種染色フローサイトメトリー法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９，３７７６，１９８９）にて解析し、図１にアポトーシス誘導した細胞の分布を機械的に示した。
【００４６】
ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５（Ｏｈｔｓｕｋｉら、Ａｃｔｏ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｊｐｎ．，５１，１０５２，１９８８）を（１×１０６  ）個／ｍｌとなるように１０％  ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培養液培養液中で調製し、アポトーシスを誘導するｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）を１×１０−７Ｍとなるよう添加した。３７℃にて培養２４時間後にＫＭＳ−５細胞をＦＤＡ／ＰＩにて二重染色し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。その結果、図２に示すように、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ処理により生細胞画分（ＦＤＡ＋  ＰＩ−  ）に加え、アポトーシスが誘導された細胞の画分（ＦＤＡ−  ＰＩ−  ）が出現した。
【００４７】
ＦＤＡ＋  ＰＩ−  画分およびＦＤＡ−  ＰＩ−  画分の細胞をフローサイトメトリーにて分取し、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７１，３４３，１９８８の方法にしたがい、ＤＮＡを抽出した。このように調製したＤＮＡを１．２％アガロースゲル電気泳動にて分析した。その結果、図３に示すようにＦＤＡ＋  ＰＩ−  画分の細胞由来のＤＮＡは分解していなかったが、ＦＤＡ−  ＰＩ−  画分の細胞は、アポトーシスの特徴であるＤＮＡの明らかな分解およびｌａｄｄｅｒ状のバンドがみられた。
【００４８】
実施例
実験例に記載のＦＤＡ／ＰＩ二重染色フローサイトメトリー法により患者骨髄腫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生存率の変化を検討した。
上記実施例と同様の方法にて、ＰＥ結合抗ＶＬＡ−５抗体およびＰＥ結合抗ＭＰＣ−１抗体により、骨髄腫細胞を染色し、以下の細胞群を分取した。
分取したＶＬＡ−５＋  ＭＰＣ−１＋  の成熟型、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１＋  の中間型およびＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熟型の骨髄腫細胞を１×１０６  個／ｍｌとなるよう１０％  ＦＣＳおよび１×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培養液中に浮遊させ、３５×１０ｍｍのｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ
ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ社）に分注した。
【００４９】
これらの細胞を、２０Ｕ／ｍｌの組換型ヒトＩＬ−６（ｒＩＬ−６；Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３，１９８６）、５０μｇ／ｍｌのヒト型化抗ｈＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）存在あるいは非存在下にて３７℃で３日間培養した後、ＦＤＡ／ＰＩを用いてフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ，Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により蛍光を測定し、生細胞の比率を求めた。なお、コントロールは、ｒＩＬ−６およびｈＰＭ−１非存在下で培養した。その結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
さらに、これらの結果から、成熟型、中間形および未熟型の骨髄腫細胞の生存率にｒＩＬ−６が及ぼす影響を図４に示す。ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の表面抗原を有する未熟型骨髄腫細胞のｒＩＬ−６反応性とそれに対するｈＰＭ−１抗体の作用を図５に示した。ＶＬＡ−５＋  ＭＰＣ−１＋  の成熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１−９）は培養液のみでも比較的高い生存率を保った。これら成熟骨髄腫細胞は、ｒＩＬ−６にほとんど反応せず、ｈＰＭ−１抗体による生存阻害効果もみられなかった。一方、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１３−１８）は培養液のみでは生存が維持できず、アポトーシスに陥り易いことが示された。
【００５２】
これらの細胞はＩＬ−６に対する反応性が高く、ｒＩＬ−６により生存率が上昇した。この時、ｒＩＬ−６による未熟型骨髄腫細胞の生存維持効果は、ｈＰＭ−１抗体により明らかに阻害された（図５）。コントロール、ｒＩＬ−６，ｈＰＭ−１およびｒＩＬ−６とｈＰＭ−１各存在下における未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１７）のＦＤＡ／ＰＩ二重染色像を図６に示す。
【００５３】
コントロールに比べ、ｒＩＬ−６添加群では、アポトーシスを誘導した像（左下、Ｄ）の強度が低く、生細胞（右下、Ｅ）の割合が大きかった。これに対し、ｒＩＬ−６およびｈＰＭ−１存在下では、アポトーシスを誘導した細胞の画分（左下、Ｄ）の強度が高かった。ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１＋  を示す中間型骨髄腫細胞も、未熟型と同程度ではなかったが、ｒＩＬ−６に反応して生存率が上昇することおよびこの作用がｈＰＭ−１により阻害されることが示された。
【００５４】
【発明の効果】
治療抵抗性を示すことが多い骨髄腫細胞集団の主体をなす、表面抗原ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熟型骨髄腫細胞の生存維持にはＩＬ−６が深く係わっている。ＩＬ−６レセプター抗体による未熟型骨髄腫細胞の生存阻害作用が、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  未熟型骨髄腫細胞で強く認められたことから、本発明のＩＬ−６レセプター抗体は未熟型骨髄腫細胞治療剤としての有用性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、二重染色フローサイトメトリー法による、アポトーシスを誘導した骨髄腫細胞の分布を模式的に示す。Ｅは生細胞（ＦＤＡ＋  ＰＩ−  ）、Ｄはアポトーシス誘導細胞（ＦＤＡ−  ＰＩ−  ）、Ｃはアポトーシスの特徴を有さない死細胞の像である。
【図２】図２は、デキサメタゾン処理によりアポトーシスが誘導された骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５のフローサイトメトリー像である。
【図３】図３は、ＦＤＡ＋  ＰＩ−  （Ｅ）およびＦＤＡ−  ＰＩ−  （Ｄ）画分の細胞のＤＮＡアガロースゲル電気泳動図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＦＤＡ＋  ＰＩ−  （Ｅ）画分、レーン３はＦＤＡ−  ＰＩ−  （Ｄ）画分である。レーン３でＤＮＡの分解およびアポトーシスの特徴であるｌａｄｄｅｒ状のバンドがみられる。
【図４】図４は、骨髄腫細胞の生存率にＩＬ−６が及ぼす影響を示す。ＩＬ−６存在下において、感熱型骨髄腫細胞（ＶＬＡ−５＋  ＭＰＣ−１＋  ）はほぼその存在に影響を受けない（約１．１倍）。一方、中間型（ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１＋  ）および未熟型骨髄腫細胞（ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  ）は各々約２．４倍、３．５倍の生存細胞数の増加がみられる。
【図５】図５は、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熱型骨髄腫細胞のＩＬ−６に対する反応性と、それに対するｈＰＭ−１抗体の作用を示す。○は表１中の患者由来骨髄腫細胞１３、□は同１４、△は同１５、●は同１６、×は同１７、▼は同１８を示す。これらの未熟型骨髄腫細胞の生存はＩＬ−６により支持され、その生存支持効果をｈＰＭ−１抗体が明らかに阻害する。
【図６】図６は、ＶＬＡ−５−  ＭＰＣ−１−  の未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１７）のコントロール、ｒＩＬ−６，ｈＰＭ−１およびｒＩＬ−６とｈＰＭ−１の各存在下におけるＦＤＡ／ＰＩ二重染色像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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