(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示すヌクレオチド配列のbp−354〜−288を含む、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
0003725536.tif 000002
【請求項２】
下記に示すヌクレオチド配列のbp−354〜−238を含む、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
0003725536.tif 000003
【請求項３】
下記に示すヌクレオチド配列のbp−384〜−206を含む、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
0003725536.tif 000004
【請求項４】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−809〜−663を含まない、請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項５】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−809〜−385を含まない、請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−74〜−1を含まない、請求項１から５の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項７】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−207〜−1を含まない、請求項１から５の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項８】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列の、ヒトｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子の転写開始部位から上流の810ｂｐの領域の一部からなる、請求項１から７の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項９】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−354〜−288のポリヌクレオチドからなる、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
【請求項１０】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−354〜−238のポリヌクレオチドからなる、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
【請求項１１】
請求項１から３の何れかに示すヌクレオチド配列のbp−384〜−206のポリヌクレオチドからなる、ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター。
【請求項１２】
請求項１〜４の何れか１項に記載のプロモーターを製造する方法であって、
下記に示すヌクレオチド配列の、ヒトｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子の転写開始部位から上流の810ｂｐの領域に包含され、下記に示すヌクレオチド配列のbp−354〜−288の又はbp−384〜−206を含み、下記に示すヌクレオチド配列のbp−809〜−663を含まない、ポリヌクレオチドを調整し、
得られた該ポリヌクレオチドを、任意に適当な制御配列とともにベクターへ挿入し、
該ベクタ−を、適当な原核生物株に挿入し、
該原核生物株を培養し、
該プロモーターを単離する、
プロモーターの製造方法。
0003725536.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５５腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ-Ｒ）に対するプロモーター配列、その製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦは広範囲の細胞機能に影響する多機能前炎症サイトカインである。一方では、ＴＮＦは生物体の保護に関与するが、他方では、過剰産生した場合には、いくつかの疾患において主要な病因的役割を果たすことがある。ＴＮＦは、炎症過程に関与し、敗血症ショック1（非特許文献１）、移植片対宿主反応2（非特許文献１）およびリウマチ疾患3（非特許文献１）において組織への損傷のメディエーターとなることが知られている。
【０００３】
ＴＮＦはこれらの作用を２つの別個の細胞表面受容体への結合により発揮する。これらの受容体は大きさが異なり（約55および75kDa）、構造的に類似しない細胞内ドメインを有し、それらは異なる信号を発することが示唆されている4-11（非特許文献４〜１１）。ほとんどすべての細胞がＴＮＦ受容体（ＴＮＦ-Ｒ）を発現するが、その量および２つの受容体の相対的比率は細胞の種類で変動する。これらの変動は一部分は発生的に制御されている。すなわち、その変動は、細胞の表現型およびその分化の段階に関連し、また一部は、サイトカインおよび病原体の免疫刺激成分によって一過性に誘導されることができる12-22（非特許文献１２〜２２）。２つのＴＮＦ-Ｒの機能の検討から、それらの活性は異なるが相互に作用し23-28（非特許文献２３〜２８）、それらの活性レベルは細胞によるそれらの発現の程度に相関すること29,30（非特許文献２９、３０）が明らかである。これらの所見は、２つのＴＮＦ-Ｒの量および相対的比率に影響する機構がＴＮＦに対する細胞性応答の性質および程度の両者に有意に影響できて、したがって、このサイトカインの機能の生理学的ならびに病理学的発現の重要な決定因子を構成することを意味する。
【非特許文献１】Tracey,J.T.ら(1987) Nature,330: 662-664.
【非特許文献２】Piquet,P.F.ら(1987) J.Exp.Med.,166: 1280-89.
【非特許文献３】Beutler,B. & Cerami,C.(1987) NEJM,316: 379-385.
【非特許文献４】Hohmann,H.-P.ら(1989) J.Biol.Chem.,264: 14927-14934.
【非特許文献５】Engelmann,H.ら(1990) J.Biol.Chem.,265: 1531-1536.
【非特許文献６】Brockhaus,M.ら(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87: 3127-3131.
【非特許文献７】Loetscher,H.ら(1990) Cell,61: 351-359.
【非特許文献８】Schall,T.J.ら(1990) Cell,61: 361-370.
【非特許文献９】Nophar,Y.ら(1990) EMBO J.,9: 3269-3278.
【非特許文献１０】Smith,C.A.ら(1990) Science,248: 1019-1023.
【非特許文献１１】Heller,R.A.ら(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87: 6151-6155.
【非特許文献１２】Aggarwal,B.B.ら(1985) Nature,318: 665-667.
【非特許文献１３】Israel,S.ら(1986) Immunol.Lett.,12: 217-224.
【非特許文献１４】Tsujimoto,M.ら(1986) Biochem.Biophys.Res.Commun.,137: 1094-1100.
【非特許文献１５】Ruggiero,M.ら(1986) J.Immunol.,136: 2445.
【非特許文献１６】Holtmann,H. & D.Wallach(1987) J.Immunol.,139: 1161-1167.
【非特許文献１７】Ding,A.H.ら(1989) J.Biol.Chem.,264: 3924.
【非特許文献１８】Porteu,F. & Nathan,C.(1990) J.Exp.Med.,17: 599-607.
【非特許文献１９】Porteu,F.ら(1991) J.Biol.Chem.,266: 18846.
【非特許文献２０】Ware,C.F.ら(1991) J.Immunol.,147: 4229.
【非特許文献２１】Erikstein,B.K.ら(1991) Eur.J.Immunol.,21: 1033.
【非特許文献２２】Winzen,R.ら(1992) J.Immunol.,148: 3454.
【非特許文献２３】Espevik,T.ら(1990) J.Exp.Med.,171: 415-426.
【非特許文献２４】Engelmann,H.ら(1990) J.Biol.Chem.,265: 14497-14504.
【非特許文献２５】Thoma,B.ら(1990) J.Exp.Med.172: 1019-1023.
【非特許文献２６】Tertaglia,L.A.ら(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88: 9292-6.
【非特許文献２７】Gehr,G.ら(1992) J.Immunol.,149: 911.
【非特許文献２８】Heller,R.A.ら(1992) Cell,70: 47.
【非特許文献２９】Brakebusch,C.ら(1992) ENBO J.,11: 943-950.
【非特許文献３０】Vandenabeele,P.ら(1992) J.Exp.Med.,176: 1015.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＮＦの有害な作用を阻止するため、ＴＮＦのその受容体への結合を妨害する方法が探索された。たとえばＴＮＦに対する中和抗体が産生された（EP186833）。ＴＮＦの作用を阻害する他のアプローチとしては、ＴＮＦの結合に対して細胞表面のＴＮＦ-Ｒと競合する可溶性ＴＮＦ受容体の提供が行われた（EP308378およびEP398327）。
【０００５】
ＴＮＦには、その受容体への結合がその作用を発揮するために要求されるので、細胞表面受容体がわずかしかまたはまったく発現されなければ、ＴＮＦの有害作用を減少または阻止できるはずである。同様の根拠により、ある場合にはＴＮＦの有益な作用を増強することが望ましく、このような場合、これは細胞表面受容体の発現量を増大させることによって達成できるものと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子の５'末端上流に位置し、976bp配列内に含まれるそのヒト遺伝子のプロモーター配列を提供する。
【０００７】
本発明は、その好ましい実施態様においては、ヒトｐ５５ＴＮＦ-Ｒをコードする完全長ゲノムクローンのＮheＩ-ＰstＩフラグメントを提供する。本発明はまた、上記ＮheＩ-ＰstＩフラグメントのＮheＩ-ＥcoＲＩフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記ＮheＩ-ＥcoＲＩフラグメントのＢglII-ＥcoＲＩフラグメントを提供する。
【０００８】
本発明のプロモーター配列は、疾患の病因となるこのプロモーター領域における先天的および後天的突然変異の診断に使用することができる。
【０００９】
他の態様においては、本発明は、上述のプロモーター配列中に存在する配列モチーフを提供する。これらのモチーフは、プロモーター活性に必要で、このプロモーターの調節に関与すると考えられるある種の転写因子を結合することが明らかにされている。
【００１０】
これらのモチーフは、全配列中における所望のモチーフの上流および／または下流の不要の配列の欠失により、すなわち完全プロモーターを所望のモチーフに到達するように切断する制限酵素を使用することにより欠失させることによって製造され、得られたモチーフはついで、適当な制御配列および、適当な原核生物種への挿入時にその種の培養により所望のモチーフの発現を可能にするベクターを得るために必要な他の慣用手段とともにベクター中に挿入することができる。
【００１１】
このようにして得られたモチーフは、それらに結合する因子たとえば転写因子について、ヒトゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。これらの因子が、何らかの慣用手段で単離、精製および同定されたならば、それらの阻害はＴＮＦ-Ｒの形成を阻害し、一方、それらの産生の増加はＴＮＦ-Ｒの発現の増大を生じて、結局、所望のＴＮＦ機能修飾効果、すなわちその受容体へのＴＮＦ結合の阻害または増強を招来するものと考えられる。
【００１２】
インビボに存在する特異的転写因子の量は無限ではないので、ＴＮＦ-Ｒ発現の阻害そして結局、有害なＴＮＦ作用の阻害はまた、多数のモチーフまたはモチーフ領域の発現によっても達成できるものと思われる。これらは、転写因子の結合に関してこのようなモチーフまたはモチーフ領域を含有するプロモーターと競合する。「モチーフ領域」とは、モチーフそれ自体とその両側に隣接する配列とから、または全プロモーター配列の部分によって連結され配列部分によって両側が隣接された数個のモチーフから構成される。
【００１３】
本発明はまた、本発明の配列モチーフからなる医薬組成物を提供する。
【００１４】
他の態様においては、本発明は、本発明のモチーフ領域からなる医薬組成物を提供する。
【００１５】
図面の説明
図１は、ｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子５'隣接領域、第一のエキソンおよび第一のイントロンの部分のヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧ翻訳開始部位のＡを＋１と定義する。Ｓ１ヌクレアーゼマッピングによって決定された転写開始部位（図３）は矢印で指示されている。転写因子結合部位の候補は配列に上線によって指示する。コンセンサスイントロンドナー部位には下線を付す。
【００１６】
図２は、ｐ５５プロモーター構築体のＨeＬa細胞における活性を示す。左側：プロモーター構築体の図式的表示。図式上の数字は図１におけるヌクレオチド番号に相当する。構築体５中の点線は欠失を表示する。右側：一過性トランスフェクション後に構築体から得られたＣＡＴ活性の相対値。100はＣＡＴの４％アセチル化に相当する。
【００１７】
図３は、ｐ５５ＴＮＦ受容体ｍＲＮＡの転写開始部位のＳ１ヌクレアーゼマッピングを示す。ＨeＬa、Ｕ937もしくはＡ９細胞の総ＲＮＡ（100μg）、または酵母ｔＲＮＡ（100μg）を、５'末端標識 ds（二重鎖）ＤＮＡプローブを用いてＳ１ヌクレアーゼ分析に付した。矢印は保護されたフラグメントを示し、それらの長さはヌクレオチドで与える。273塩基における矢印は非消化ＳtyＩプローブを示す。様々なプローブで得られた相当するバンドは線によって連結する。線上の数字は図１の場合と同様にヌクレオチド位置を示す。分子量マーカーとして使用したシーケンシングラダー（左側Ａ-Ｃ-Ｇ-Ｔ上に示す）は、鋳型としてゲノムクローンおよびＳtyＩ-ＢglIIプローブの３'末端の５ヌクレオチド上流に位置するオリゴヌクレオチド５'ＧＧＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＡＧＡＣＴを用いて得られた。レーン１：ＳmaＩ-ＢglIIプローブ。レーン２〜５：ＳmaＩ-ＢglIIプローブを用いたＳ１ヌクレアーゼ分析。レーン６および７：ＳtyＩ-ＢglIIプローブを用いたＳ１ヌクレアーゼ分析。レーン２および７：Ａ９ＲＮＡ；レーン３および６：ＨeＬa ＲＮＡ；レーン４：Ｕ937  ＲＮＡ；レーン５：酵母ｔＲＮＡ。
【００１８】
図４の上部はｐ５５遺伝子５'領域のヌクレオチド含量を示す。Ｇ/ＣとＣ/Ｔの百分率、およびＣpＧジヌクレオチドカップルの頻度は、図１に示した配列について200ヌクレオチドのウインドウで計算した。図４の下部は５'領域の図式表示である。矢印は主要な転写開始部位を意味する。
【００１９】
発明の詳細な記述
ヒトｐ５５ＴＮＦ-Ｒの全長ゲノムクローンはヒトゲノムライブラリーから単離した。このクローンはＴＮＦ-Ｒの翻訳開始部位の上流810塩基対（bp）に及ぶことが明らかにされた。このクローンの1.16kbＮheＩ-ＰstＩフラグメントをサブクローニングし、その数種の欠失構築体を調製した。
【００２０】
1.16kbフラグメントは、ヒトＨeＬa細胞およびマウスＡ９細胞の両者におけるＣＡＴ受容体遺伝子の効率的な発現を誘導するその能力によって示されるプロモーター活性を有する。このクローンの欠失構築体は、プロモーター活性が、大部分の転写開始点を包含する150bp  ＢglII-ＥcoＲＩフラグメントに局限されることを示した。さらに分析を行い、70bpの最小プロモーターでもなお活性を発揮することが示された。
【００２１】
ＤＮＡプローブを用い、ＨeＬaおよびＵ937細胞のＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼ消化分析を行ったところ、両細胞系において、転写の多重開始部位が明らかにされた。これらの開始部位の位置は、使用したすべてのプローブについて同一であった。
【００２２】
本発明のプロモーター配列は、ハウスキーピング遺伝子のプロモーターに類似することが見出された（たとえば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ61、ＥＧＦ受容体62、ＮＧＦ受容体60、またはｐ５５インターロイキン-１受容体63）。それはＴＡＴＡボックスおよびＣＣＡＡＴモチーフを欠き、その３'末端は比較的ＧおよびＣ残基に富んでいる。近接して位置する第一のイントロンの５'末端にも同様の高いＧおよびＣ残基の含量が認められる。この領域はまた、ジヌクレオチドカップルＣpＧにも富み、これは、これらのヌクレオチドのメチル化の程度の関数として、プロモーター活性における分化関連変化を可能にする。
【００２３】
上述の特徴は、ｐ５５ＴＮＦ受容体遺伝子に対する転写開始部位の多重性と一致する。それらはまた、この遺伝子が調節方法に関する最近の知識とも一致する。すなわち、様々の異なる細胞、たとえば線維芽細胞5,6において、受容体蛋白がわずかに検出される細胞、たとえばＵ937細胞（比較9および5）を含めて、それらの分化状態に相関して変動する範囲で22構成的発現を示す。ｐ５５ＴＮＦ受容体をコードする遺伝子のこれらのハウスキーピング特性に反して、ＴＮＦ自体は、誘発物質に厳密に依存して、わずかな細胞種のみによって一過性に形成される。したがって、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ両遺伝子のプロモーターは、誘導可能な遺伝子の特徴的な性質を表す65（総説66）。ＴＮＦおよびその受容体の発現の調節におけるこれらの差はＴＮＦの生理学的役割と矛盾しない。とくに病原体の侵襲時に「警告シグナル」として働き、このサイトカインの形成は必要時に限定される。一方、ＴＮＦ受容体の発現に完全に依存するそれへの応答能は常に維持されているのである。サイトカインに対する受容体は一般に、サイトカイン自体に比較して、その発現時期およびそれが発現する細胞種の両者に関して、それほど厳密ではない様式で発現されることが期待される。ＮＧＦ受容体に対するプロモーターは、その細胞外ドメインがＴＮＦ受容体のそれと進化論的に関連するが、同じくハウスキーピングの特徴を示している。ｐ５５ＴＮＦ-Ｒに対するプロモーターと同様に、それはＴＡＴＡ成分を欠き、多重転写開始部位を有し、Ｇ/Ｃ残基に富んでいる。しかしながら、他の点では、２つのプロモーターの構造はまったく異なっている。たとえば、ＮＧＦ受容体遺伝子では５'隣接配列はＧ/Ｃ残基に極めて富んでいる（71％）のに対し、ｐ５５ＴＮＦ-Ｒでは高頻度のＧ/Ｃは転写開始部位の下流領域に限定され、とくに第一のイントロンの５'末端において顕著である（70％Ｇ/Ｃ、bp 40〜200）。
【００２４】
上述のように、既知の受容体の一部はハウスキーピングの特徴を有する。多数の既知受容体の遺伝子は一過性にも修飾され、このような調節に必要な調節成分を含有する（たとえばＩＬ-２受容体α鎖67）。ｐ５５受容体のプロモーター配列を検討すると、ＡＰ２およびＮＦ-kＢに対するコンセンサス配列を包含する誘導因子によって影響される転写因子への応答を同様に可能にする配列モチーフが明らかである。これらの調節要素は、誘導された一過性変化が、多分、炎症部位において形成されるある種のサイトカインの作用によって、受容体の構成的発現のパターン上に重なることを可能にするものと考えられる。一部はｐ５５ＴＮＦ-Ｒの発現の変化によるＴＮＦ結合における一過性の変化は、多くの研究12-19で観察されているが、これらの変化が転写レベルまたは転写後レベルのいずれで起こるかは、まだ確立されていない。
【００２５】
プロモーター領域内に認められるモチーフ候補中、bp−330〜−311に見出される配列、ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣはとくに興味がある。このモチーフ内の配列、ＴＣＣＴＣＣＴＣＣはまた、ＥＧＦ受容体のプロモーター中にも存在し、そのプロモーター活性に必須である。すなわち、それはヌクレアーゼＳ１過敏性の部位を構成し、ＳＰ-１様因子を結合する61。これらの要素に囲まれた領域は全体的に、染色体においてＤＮアーゼ過敏性および活性転写部位に関連づけられてきた特徴、Ｃ/Ｔの高頻度を示す。したがって、この領域はまた、ｐ５５ＴＮＦ受容体のプロモーター活性にも必須と推定される。
【００２６】
本発明はまた、医薬的に許容される担体および本発明の配列モチーフまたはモチーフ領域からなる医薬組成物に関する。これらの組成物は、内因的に存在するかまたは外因的に投与された過剰のＴＮＦによって引き起こされる疾患に対して使用できる。これらの疾患の例には、敗血症ショック、移植片対宿主反応、リウマチ性疾患および他の自己免疫疾患がある。
【００２７】
投与方法は類似の薬剤について容認されている任意の様式により、処置すべき状態に従い、その場合に応じて、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、局所注射または局所適用によって、行うことができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、配列モチーフまたはモチーフ領域を生理学的に許容される担体、安定剤および賦形剤と混合して投与用に製造され、たとえば投与バイアル中で凍結乾燥して投与剤形に調製される。投与される活性化合物の量は、投与経路、処置すべき疾患および患者の状態によって決定されることになる。たとえば局所注射の場合は、たとえば静脈注射の場合に比較して、体重あたりの用量は低くてよい。
【実施例】
【００２９】
本発明を以下に、非限定的な実施例によって例示する。
細胞系および培養条件
ヒトＨeＬa31およびマウスＡ９32細胞系はダルベッコ改良イーグル培地中で増殖させた。ヒト組織細胞系Ｕ93733はＲＰＭＩ1640培地中で増殖させた。両培地とも、10％ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した。細胞培養体は５％ＣＯ2大気中37℃に保持した。
【００３０】
例１：クローニングおよび配列決定
ｐ５５遺伝子をコードする全長ゲノムクローンのクローニングおよびいくつかの特徴はすでに報告されている34。ｐ５５遺伝子の第一のイントロンの部分、第一のエクソン、５'隣接遺伝子配列およびラムダファージの180bp左腕からなる、このクローンの1.16kbＮheＩ-ＰstＩフラグメントを、ＸbaＩおよびＰstＩで消化したpBluescriptベクターにサブクローニングした。この構築体はＮＰと命名した。この構築体の部分欠失は、内部制限部位ＥcoＲＩおよびＢglIIを用いて行った。３'欠失構築体、ＮＲ（図２Ｂ参照）は、ＮＰ構築体をＥcoＲＩで消化して挿入体のbp−211〜＋168（番号はＡＴＧ翻訳開始部位から開始、図１参照）を切断し、ついで3.69kbベクターフラグメントを単離し、再リゲートして創製した。他の３'欠失構築体、ＮＢは、ＮＰ構築体をＢglIIおよびＥcoＲＩで消化して挿入体のbp−368〜＋168を切断し、末端をクレノウポリメラーゼでブラント化し、ついで、3.55kbベクターフラグメントを単離したのち再リゲートして創製した。５'欠失構築体、ＢＰは、ゲノムファージの0.54kbＢglII-ＰstＩフラグメント（bp−368〜＋168）をＢglIIおよびＰstIIIで消化したpBluescriptベクターにクローニングして得られた。プロモーターフラグメントはpBluescriptからＳacＩおよびＳalＩで切り出して、ＳacＩおよびＳalＩで消化したＣＡＴ発現ベクターpGEMCAT（J.Chebath博士から恵与された36）にクローニングした。ＤＮＡの配列決定はチェーンターミネーション法36を用いて実施した。上述の構築体の配列はpBluescriptのＴ３およびＴ７プライマーを用いて決定した。その他の配列情報はクローン化配列内から、オリゴヌクレオチドプライマー、５'ＣＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴおよび５'ＧＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡを用いて得られた。図１においてbp−810に始まる後者のオリゴヌクレオチドはまた、ラムダファージに連結しないプロモーターフラグメントを発生させるために、pBluescriptベクターのＴ３プライマーとともにＰＣＲ反応に使用した。
【００３１】
例２：ｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子中５'配列のプロモーター活性
ｐ５５ＴＮＦ-Ｒの全長ゲノムクローンは、その受容体の部分ｃＤＮＡクローンをプローブとして用いてヒトゲノムライブラリーから単離した34。そのクローンの５'末端の分析により、それはその蛋白質の翻訳開始部位の上流810ヌクレオチドまで達していることが明らかにされた。コード領域と異なり40、５'延長領域はイントロンによる破壊を欠くように思われた。
【００３２】
クローン化された配列がプロモーター活性をもつかどうかを測定するため、ラムダファージの左腕内のＮheＩ部位から遺伝子配列内のpos.＋168のＰstＩ部位までのフラグメント、およびこのフラグメントの部分を、pBluescript中にクローン化した。翻訳開始コドンＡＴＧ上流からの配列（bp−809〜−１）をＰＣＲ法を用いてサブクローニングし、この配列ならびにそれらの欠失体について、一過性トランスフェクションアッセイによりＣＡＴ活性の発現を調べた。図２Ａに示すように、全長フラグメントＰ１はヒトＨeＬa細胞中で、ＣＡＴ遺伝子の効率的な発現を誘導した。
【００３３】
そのフラグメントの３'末端からの207bpの欠失（構築体Ｐ２）はＣＡＴの発現をある程度増強した。この増大は、欠失領域中の、インフレーム停止コドンが後に続く２つのＡＴＧコドン（bp−141および−31）の存在に関係するものと思われ、これらが翻訳の効率的な開始を阻害していたものと考えられる。実際、リーダー中の３'ＡＴＧコドンに対する停止コドンを除去するＰ１の３'末端からの74bpのみの欠失でＣＡＴ発現の低下を招いた（構築体Ｐ３）。Ｐ１の５'末端の425bpを欠失させた場合（構築体Ｐ４）には有意な上昇が観察され、欠失領域における負の調節要素の存在が示唆された。同様に高いプロモーター活性が、Ｐ１からの５'425bpおよび３'207bp配列、両者の欠失で観察された（構築体５）。内部欠失構築体Ｐ６（bp−663〜−379の欠失）もＰ２と同じ活性を示し、負の調節要素はbp−809とbp−663の間にあることが示唆された。425bp５'領域自体はプロモーター活性をもたない（図２の構築体７）。
【００３４】
さらに150bpフラグメントの欠失分析により（図２の構築体Ｐ５）、その活性はbp−238〜−206の欠失では影響されないが、さらに３'配列（bp−287まで）を欠失させると低下した。しかしながら、bp−306〜−206の欠失ではプロモーター活性は完全に消失した。したがって、bp−287〜−238の配列は増強活性を有するが、コアプロモーターはbp−287の上流に存在する。150bpフラグメント（図２のＰ５）の５'末端では、bp−385〜−355は欠失させても影響はなかったが、さらにbp−335までの欠失ではプロモーター活性は約1/5に低下した。したがって、コアプロモーターの境界はbp−355と−287の間にある。
【００３５】
例３：転写開始部位の同定
ｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子の転写開始部位はＤＮＡプローブとしてｐ５５ＴＮＦ受容体遺伝子の５'領域のＳmaＩ-ＢglII（308bp）およびＳtyＩ-ＢglII（274bp）フラグメント（ＳmaＩおよびＳtyＩ部位でＴ４キナーゼにより５’32Ｐ-末端標識）を用いて、ヌクレアーゼＳ１プロテクションアッセイ37によってマッピングした。プローブは、McDonaldら38に従って調製された総ＲＮＡ100μgのＨeＬa、Ｕ937またはＡ９細胞に、52℃で一夜ハイブリダイズした。200単位のＳ２ヌクレアーゼ（Boehringer, Mannheim）により37℃で１時間消化したのち、反応生成物をエタノールで沈殿させ、６％シーケンシングゲル上で分析した。オリゴヌクレオチドプライマー、５'ＧＧＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＡＧＡＣＴ（bp−113〜−135に相補性）とのシーケンシング反応が分子量マーカーとして利用された。プライマーの５'末端はＳtyＩプローブ（bp−108）の５'末端の５ヌクレオチド上流にある。ＨeＬaおよびＵ937細胞のＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼ消化分析により、両細胞系に転写の多重開始部位が明らかにされた。最も顕著な部位はＧ-268に存在する（図３および図１の矢印、ヌクレオチド番号は翻訳開始コドンＡＴＧから開始、図１参照）。−112から−368に及ぶプローブ（ＳtyＩ-ＢglII）によって決定された開始部位の位置は、−78から−368に及ぶプローブ（ＳmaＩ-ＢglII）によって明らかにされた位置と同一であった。ＨeＬaおよびＵ937細胞における開始部位の配置は同じで、使用の比率も同様であった。
【００３６】
例４：一過性トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイ
ＨeＬaおよびＡ９細胞を９cmの皿に接種し（500,000細胞/皿）、16時間増殖させた。ＤＮＡのＣaＰＯ4-沈殿物39を培地に加え、細胞上に12時間放置した。ついで、細胞を洗浄し、新鮮な培地中で48時間増殖させ、再び洗浄して、プレートから掻き取った。抽出物を調製し、サンプルあたり蛋白質20〜25μgを用いて記載されているようにして39ＣＡＴアッセイを行った。インキュベーション時間は４〜12時間の範囲とした。各アッセイは少なくとも２回実施し、各試験構築体について二重にトランスフェクションを行った。
【００３７】
例５：配列モチーフ
ｐ５５プロモーター、第一のエクソン、および第一のイントロンの一部分におけるヌクレオチド配列を図１に示す。いずれの転写開始部位の近位にもＴＡＴＡ配列はない。位置−356には効率は低いが代替物として役立つと思われる配列41ＴＡＣＡＡＡがあるものの、機能すべき部位からは遠すぎる。
【００３８】
ゲノムクローンの５'末端も機能性ＣＣＡＡＴモチーフを欠くように思われる。hsp70遺伝子プロモーターのＣＣＡＡＴボックス42に類似の配列ＡＴＴＧＧは３回、すなわち−632、−537および−414に存在する。しかしながら、この３つの要素はいずれも、ＣＣＡＡＴ要素について通常認められる距離32の転写開始部位から60〜80ヌクレオチド内には位置しない。
【００３９】
ＧＣＧプログラムパッケージ44を用いて実施した転写因子結合部位に対する配列モチーフのコンピューター検索によって、位置−805（逆）、−76（逆）および192におけるＮＦ-ＫＢの３つのコンセンサス部位45；−408における転写因子ＡＰ-２に対する一つの部位42；ならびに−237におけるＡＰ-１様配列47を含めた数個の既知モチーフが明らかにされた。普遍的な転写因子ＳＰ-１のコア配列であるＧＧＣＧＧＧ48またはＣＣＧＣＣＣ49は、−323、311および362に見出される。しかしながら、可能性のあるこれらのＳＰ-１結合部位のいずれも、コンセンサス配列、Briggsら50によって提案されたＧ/ＴＧ/ＡＧＧＣＧＧ/ＴＧ/ＡＧ/ＡＣ/Ｔに完全にはマッチしない。位置−323におけるＳＰ-１部位の候補は２つのヌクレアーゼＳ１過敏性コンセンサス配列（Ｓ１ＨＳ51）に隣接している。アデノシン−211におけるマイナーな開始部位の下流配列（ＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴ）は、リンパ球特異的末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に最初に同定された「イニシエーター」モチーフにおける相当する配列（ＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣ）52と高いホモロジーを示す。しかしながら、この部位の上流の配列はこのモチーフと類似性を示さない。イントロン内には、いくつかの転写抑制要素中に存在する配列（ＮＲＥ、POS.120におけるＡＧＣＣＴＣＴＣ）53が見出された。
【００４０】
多数のウイルスエンハンサーモチーフも識別可能であった。位置−805におけるＮＦ-ｋＢ部位は、転写因子Ｅ２aＥ-Ｃbに対する結合部位として同定されたアデノウイルスＥ２Ａプロモーター中に見出された配列54と重複する。ＪＣおよびＢＫ型ポリオーマウイルスのエンハンサーならびにＳＶ40エンハンサー、またいくつかの細胞遺伝子の調節領域に見出される他のコンセンサス配列、ＧＧＧＸＧＧＰuＰu（ＪＶＣ）55は、108、347、−328（逆）および−258（逆）に存在する。
【００４１】
例６：ヌクレオチド頻度
ＣおよびＴヌクレオチドの高含量はＤＮアーゼ過敏性と関連づけられてきて、染色体における活性転写の部位に見出される56。ジヌクレオチドＣpＧの高頻度およびＣpＧ領域のメチル化パターンの変化は遺伝子発現に対する分化機構の効果と関連づけられ57、一方、プロモーター配列における全体的なＧ/Ｃの高頻度はハウスキーピング遺伝子の制御に関連づけられてきた（たとえば58-60）。したがって、本発明者らはＴＮＦ受容体遺伝子の５'末端について、この領域に沿って幅200ヌクレオチドのウインドウによりＣ/Ｔ、Ｇ/ＣおよびＣpＧの含量をコンピューターで計算して、これらの特徴を検討した。
【００４２】
図４に示すように、この配列内のほぼヌクレオチド−400〜−100に及ぶ特定の領域がＣおよびＴヌクレオチドの高い含量を示す。その領域は転写開始部位が群集する領域と重複する。とくにＣ/Ｔに富む配列、ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣは最も遠い５'開始部位（ヌクレオチド−334および−311）の上流に近接して２回起こる。
【００４３】
ＣおよびＴ残基に富む領域の下流には、高いＣpＧ含量を有する領域が存在し、最も高い含量は第一のイントロンの５'末端に認められる。ＣおよびＧヌクレオチドの全体的な高頻度はほぼヌクレオチド−331下流から認められ、この場合も、ｐ５５遺伝子の第一のイントロンの５'末端（nt.40〜200）で最高となり、ここではＧおよびＣヌクレオチドは両者で配列の70％を占める。
【００４４】
例７：プロモーター領域に結合する因子の同定のための初期工程
与えられた配列に結合する因子を同定するための簡単な方法は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）であり、この場合もこの方法が用いられた。150bpフラグメントＢglII-ＥcoＲＩ（図２の構築体Ｐ５に相当）を、クレノウポリメラーゼおよび32Ｐ-ｄＣＴＰを用いる充填反応により５'末端で標識した。標識フラグメント10,000cpmを総蛋白５μgのＨeＬa細胞核抽出物中、様々な緩衝液条件下でインキュベートし、3.5％ネイティブアクリルアミドゲル上で分離した。実験により以下のことが明らかにされた。
(1) ＢglII-ＥcoＲＩフラグメントに結合する、可能性ある転写因子に相当する数個のマイナーなバンドおよび１個のメイジャーなバンドを観察された。
(2) 核抽出物を非標識ＢglII-ＥcoＲＩフラグメントの過剰とインキュベートすると結合が完全に消失し、観察された相互作用は特異的であることを示した。
(3) 非特異的コンペティターＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ）の添加はバックグランドを低下させたが、メイジャーバンドの出現は消失しなかった。
(4) 250mMのＮa+およびＫ+までの塩濃度は結合に影響せず、非特異的結合が多くの場合、塩濃度の上昇によって低下または消失することから、これも相互作用の特異的性質を示すものであった。
(5) Ｍg++濃度の10mMまでの上昇は、すべての観察された複合体への結合を低下させたが、消失はさせなかった。
(6) 20℃および０℃で同一の結合パターンが観察された。
(7) ＨeＬa細胞の細胞質抽出物を用いた場合には、結合は認められなかった。これは、活性転写因子には細胞の核への局在が期待されることから、同様に結合の特異的性質を示すものである。
【００４５】
これらのデータを合せて考えると、少なくとも一つの因子は、ｐ５５ＴＮＦ受容体上流遺伝子配列のプロモーター活性に必須の領域に特異的に相互作用することが示唆される。
【００４６】
例８：プロモーター領域に結合する転写因子の精製
プロモーター領域における機能性モチーフは、慣用方法（Erase-a-Base kit,Promega Corp.）によるプロモーターの３'および/または５'末端からの核酸配列の段階的欠失によって確認できる。次に、欠失されたプロモーターフラグメントについて活性を試験した。同様に、内部配列は、インビトロ突然変異またはリンカー走査39によって欠失または変化させることができる。活性化転写因子を結合するモチーフは、欠失または変異させた場合のプロモーター活性の消失によって明らかにされる。逆に、プロモーター活性を抑制する転写因子に結合するモチーフは、野性型プロモーターに比較して活性を上昇させた変異または欠失プロモーターフラグメントによって確認される。これらのモチーフの詳細な分析はついで、元のモチーフと同じ配列をもつオリゴヌクレオチドおよびその変異型を化学合成して行われる。これらのオリゴヌクレオチドは相当するモチーフを欠くプロモーターフラグメントに連結させ、得られた構築体についてプロモーター活性を試験する。最初の活性が再現されたならば、そのモチーフは機能的に変化しなかった、すなわちそのモチーフに導入された変異がその機能に影響しないとみなされる。一方、変異モチーフでプロモーター活性の低下が認められた場合には、野性型モチーフに比べて変化したヌクレオチドはその機能に必須であると結論できる。
【００４７】
転写因子結合モチーフが同定されたならば、相当する転写因子が単離される。この目的には、数種の起源からの抽出物についてその転写因子の高い発現をスクリーニングする。存在する転写因子の量は、５'-末端標識ds-ＤＮＡプローブとして機能性モチーフの配列を含有する上述のオリゴヌクレオＴドを用いたゲルシフトアッセイによって測定できる。
【００４８】
転写因子に富む起源が同定されたならば、至適結合に必要な条件が決定できる。様々な化学的パラメーター、たとえばpＨ、各種１価および２価カチオンの存在、塩濃度および還元剤たとえばＤＤＴまたはメルカプトエタノールの存在が、この目的を達成できるように調整される。
【００４９】
転写因子の至適結合条件が確立されたならば、慣用の方法たとえば塩沈殿、ホスホセルロースおよび/またはＤＥＡＥクロマトグラフィーによって精製を行う。転写因子が濃縮された沈殿をついで、相当するモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを不溶性マトリックスに結合させたＤＮＡアフィニティーカラムでさらに精製し、転写因子含有溶液を結合に至適な条件下にカラムを通過させる。夾雑物を洗い流したのち、精製された転写因子を、ＤＮＡの結合を許容しない条件、たとえばpＨのシフト、塩濃度の変化、またはＤＮＡの結合に必要な２価塩（通常はＺn++）のキレーションによって溶出する。
【００５０】
転写因子が精製されたならば、その分子に対する「逆遺伝学」、すなわち、蛋白質の配列決定、蛋白配列に相当する縮退オリゴヌクレオチドを用いるｃＤＮＡクローニング、および最後にそのｃＤＮＡをプローブとして用いるゲノムライブラリーのスクリーニングによる転写因子をコードする遺伝子のクローニングの適用が可能になる。存在する転写因子の量は、５'-末端標識ds-ＤＮＡプローブとして機能性モチーフの配列を含有する上述のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲルシフトアッセイによって測定できる。
【００５１】
これらのすべての材料、すなわちゲノムクローン、ｃＤＮＡおよび精製転写因子があれば、次の手段の一つ、(1)そのプロモーターへの影響、(2)ｐ５５遺伝子プロモーター内の標的へのその結合への影響、または(3)その活性の修飾により、転写因子の活性を調節する方法を決定することが可能になる。
【００５２】
(1)の詳細な操作は例８に示す。方法(2)および(3)は、多数の薬剤についてこの転写因子の機能への影響をスクリーニングすることによって達成できる。
【００５３】
例９：特異的配列領域によるプロモーター活性の修飾
プロモーターの活性は、蓄積のわずかな転写因子を除去することによって調節できる。これは、転写因子が結合する相当するモチーフの多重コピーの発現によって行うことができる。この機構は最近、ハムスターＣＨＯ細胞系において、c-mycプロモーターの負のプロモータードメインを発現させ増幅させたPaiら68によって明らかにされた。それに続いて、その著者らは、ハムスターc-mycの発現の上昇ならびにmyc蛋白によって誘導される相当する細胞増殖および形態の変化を観察した。ほぼ同様に、プロモーター活性を活性化し増大させるプロモーター領域の増幅、およびそれによる相当する蛋白質の発現の低下が可能である。
【００５４】
ｐ５５プロモーターについては、全プロモーターまたは負もしくは正の調節ドメインとして同定されたその部分を、プロモーター配列から、関連配列の制限消化またはエキソヌクレアーゼ欠失によって切リ出すことができる。得られたフラグメントをついで、遺伝子増幅を可能にするベクターに連結し、増幅ベクター配列の選択を可能にする細胞系たとえばＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。選択および増幅後に、得られたＣＨＯ細胞のクローンを、ｐ５５遺伝子の発現についてｍＲＮＡおよび蛋白質レベルでチェックする。さらに、受容体の機能をＴＨＦもしくはハムスター受容体と交叉反応するＴＨＦ模倣抗体（たとえば、αマウスｐ５５抗体）によって細胞毒性アッセイでチェックする。
【００５５】
この系における増幅でｐ５５受容体の活性を修飾するプロモーター領域が確立されたならば、これらと同じ領域を、増幅された遺伝子産物の選択を許容しない細胞中に以下の２つの方法で導入する。
1)ウイルスの複製の起源（たとえばＳＶ40またはＥＢＮＡ）を含むベクターに連結したプロモーター領域の、Ｔ抗原（ＳＶ40の）またはＥＢＮＡ抗原を発現するベクターとの共発現。これは、標的細胞の核において、導入されたプロモーターフラグメントのエピゾームコピーの高い数の複製を可能にし、したがって、挿入配列のＤＮＡ増幅の効果が模倣される。
2)プロモータードメインからなるdsオリゴヌクレオチドの化学合成およびそのオリゴヌクレオチドの十分な量の細胞への適用により、相当する転写因子の除去およびその結果としてプロモーター活性への影響が同様に可能になる。オリゴヌクレオチドは、(a)細胞質膜を通過できるように、そのオリゴヌクレオチドをより疎水性とする、および(b)分解を最小限にするためにその安定性を増大させるために、化学的に変化させなければならない。これは慣用方法により、たとえばホスホチオエート結合オリゴヌクレオチドの使用により行われる
【００５６】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ｐ５５ＴＮＦ-Ｒ遺伝子５'隣接領域、第一のエキソンおよび第一のイントロンの部分のヌクレオチド配列。
【図２】ｐ５５プロモーター構築体のＨeＬa細胞における活性（一過性トランスフェクション後のＣＡＴ活性の相対値）。
【図３】ｐ５５ＴＮＦ受容体ｍＲＮＡの転写開始部位のＳ１ヌクレアーゼマッピングの結果。
【図４】ｐ５５遺伝子５'領域におけるヌクレオチド含量（Ｇ/ＣとＣ/Ｔの百分率およびＣpＧジヌクレオチドカップルの頻度）とその５'領域の主要な転写開始部位。
【図１】
0003725536.tif 000006
【図２】
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【図４】
0003725536.tif 000008
【図３】
0003725536.tif 000009