(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID No.6に示されたアミノ酸配列からなるサイトカインCC−１、並びにそのアミダイズ化（amidized）、アセチライズ化（acetylized）、ホスホリライズ化（phosphorylized）及び／又はグリコシライズ化（glycosylized）誘導体。
【請求項２】
請求項１のサイトカインCC−１をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
カチオン交換抽出、次いで吸着物質の溶出である、ヘモ濾過物の抽出、上記溶出液に存在するペプチド及びタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿、上記沈殿物の水溶液への溶解及び低級アルコールを用いた再度の沈殿及びカチオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー、による請求項１のサイトカインCC−１の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はサイトカイン類の１種であるサイトカインCC−１、並びにその生物学的に活性なフラグメント及び／又は誘導体由来のポリヌクレオチド、前記サイトカインCC−１又はその生物学的に活性なフラグメント、特にcDNAをコードするポリペプチド、本発明のベプチドを含有する医薬、診断薬、第２医薬（second medical indication）へのサイトカインCC−１の使用、及びサイトカインCC−１又はそのフラグメントの１つをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸プローブに関する。
驚くべきことに、サイトカインCC−１はヒトヘモ濾過物（hemofiltrate）から単離できることが示された。このサイトカインはSEQ ID No.6に示されたアミノ酸配列を有する。
サイトカインCC−１のフラグメントは生物活性も有する。このフラグメントは当業者に知られた方法、例えば、ペプチダーゼ、特にエンドプロテアーゼ、による消化により得ることができる。ペプチド結合を開裂する化学薬剤、特に臭化シアンによる本発明のペプチドのフラグメント化によっても生物活性フラグメントが得られる。
本発明によるペプチドは、ヒトヘモ濾過物から出発する単離操作によって得ることができる。
ヒトヘモ濾過物は、任意で、水で希釈し、酸性化される。pH値は好ましくは1.5から3.5、特に2.5から3.0である。次いでヘモ濾過物はカチオン交換体、例えば、スルホン酸基で修飾された支持物質（メルクのフラクトゲル（Fractogel）媒体SO3-）で処理する。カチオン交換体に結合したペプチドは、上記pHに対応する範囲の酸性pHの比較的高濃度生理食塩水で溶出させる。溶出液のイオン強度は0.7−1.3Mの塩化ナトリウム溶液にほぼ相当する。
回収された溶出液は、ペプチド沈殿剤、例えば、硫酸アンモニウムで処理される。ペプチドの沈殿は、好ましくは低温、特に４−10℃の範囲で行う。得られた沈殿物は上清から分離し、水に溶解し、次いでペプチドを沈殿させるイソプロパノールのような低級アルコールを添加する。次いで、さらにカチオン交換クロマトグラフィーを行う。このクロマトグラフィーは、好ましくは、低イオン強度から約0.7−1.3MのNaClのイオン強度に相当する、より高いイオン強度のバッファーを用いる勾配溶出クロマトグラフィーである。
生物活性フラグメントは、貯蔵され、かつC4で修飾された支持物質上での分取用逆相クロマトグラフィーによりさらに精製される。必要により、さらにクロマトグラフィー精製工程を行ってもよい。
クロマトグラフィー精製により得られる物質は、構造決定に付される。配列分析はABI 473 Aシークエンサーを用いる開裂生成物及びペプチドのエドマン分解により行った。
本発明によるペプチド配列から、SEQ ID No.8のＣ−末端フラグメントとそこに結合したSEQ ID No.9の核酸配列を有するサイトカインCC−１（図１）をコードするポリヌクレオチドを誘導できる。
特に、上記ポリヌクレオチドはサイトカインCC−１の遺伝子工学による製造の出発点とこのペプチドをコードするDNA又はmRNAの存在を検出する分析道具の両方として使用できるかもしれないcDNAである。
適当な誘導体はハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。例えば、本発明によるペプチドのフラグメントをコードするcDNAはSEQ ID No.7の配列を有する。
遺伝子工学による製造に加えて、メリーフィルド合成について常用される固相上での段階的全合成も可能である。合成の戦略及び相応して保護されたアミノ酸を用いるペプチドの構築は当該分野で知られている。
本発明のペプチドは医薬としても使用できる。その生物活性はサイトカインのそれである。従って、請求項７に記載の治療のための医薬として使用できる。本発明のペプチドは、ペプチドについて普通である、非経口、静脈内、若しくは筋肉内、または鼻内若しくは？内に投与できる。投与されるべきペプチド量は、投与単位当たり10〜3000μｇの間である。
本発明による診断薬は、それ自身知られたELISA又はRIAアッセイに用いられる、任意で蛍光標識されたまたは放射性標識された、本発明のペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
500リットルのヒトヘモ濾過物を2000リットルの水で希釈し、かつ濃縮HClでpH値を2.7に調整した。アミコンバンテージ（Amicon Vantage）カラム（充填材：メルクのフラクトゲル（Fractogel）媒体SO3-）に供給し、結合したペプチドは1M NaCl,pH3.0で溶出した。
溶出液（７リットル）は硫酸アンモニウムで処理し、ペプチドを４℃で１晩沈殿させた。ペプチド沈殿物はブフナー漏斗で濾過した。
得られた沈殿物は２リットルの水に溶解し、4.5倍のイソプロパノールを添加した。沈殿したペプチドを再度ブフナー漏斗で濾過した。
イソプロパノール沈殿後の沈殿物を４リットルの水に溶解し、HClでpHを3.0に調整した。カチオン交換体（カラム：アミコンバンテージ（Amicon Vantage））に供給した後、カラムを溶出し、フラクションを回収した（クロマトグラムは図２参照）。
クロマトグラフィー条件
バッファーA:10mMリン酸２水素ナトリウム,pH3.0
バッファーB:1M NaClを含むバッファーＡ
勾配:60分間で０から100％のＢ
速度:40ml/min
検出:280nm
クロマトグラフィー機器：バイオパイロット（Biopilot）（Pharmacia）
フラクション：勾配の開始から２分毎
フラクション31から34をさらに処理するために貯蔵した。
貯蔵したフラクション31から34を分取用逆相カラム（クロマトグララムは図3aとｂ参照）による２回のクロマトグラフィー処理で連続的に分離した。
クロマトグラフィー条件
カラム:3cm×12.5cmスチールカラム
充填材：パーコジル（Parcosil）RP−C4 25−45,300A
バッファーA:0.01N HCl
バッファーB:30％のメタノールと50％のイソプロパノールを含むバッファーＡ
勾配:60分間で０から100％のＢ
流速:15ml/min
検出:280/254nm
クロマトグラフィー機器：バイオキャド（BioCAD）（Perseptive）
フラクション：勾配の開始から１分毎
第１の分取処理におけるフラクション22と23及び第２の分取処理におけるフラクション24を貯蔵し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。次いで、これらのフラクションをセミ分取用RP−C4カラム（クロマトグララムは図４参照）により分離した。
クロマトグラフィー条件
カラム:1cm×12.5cmスチールカラム
充填材：パーコジル（Parcosil）RP−C4 5μ,300A
バッファーA:0.1％TFA
バッファーB:80％のアセトニトリルを含むバッファーＡ
勾配:60分間で０から30％のＢ
流速:2ml/min
検出:214nm
クロマトグラフィー機器：コントロン（Kontron）322
フラクション：勾配の開始から１分毎
フラクション33と34が物質を含み、これを95％以上に精製し、その構造を以下に明らかにした。
実施例２
配列決定
開裂生成物及びペプチドのエドマン分解は、100〜400pmolの量でポリブレン（Polybrene）メンブランに供給した後、標準プログラムを用いてABI 473 Aシークエンサーで行った。
システインの決定
14Cカルボキシメチル化及び分析用ビダック（Vydac）C18 PRカラム（4.6mm×25cm）を用いる後続の精製。放射性検出器でのカルボキシメチル化フラクションの検出。
次いで、エンドペプチダーゼ、Lys−Ｃを用いる50％のカルボキシメチル化ピークのLys−Ｃ開裂。開裂は製造元（ベーリガー、マンハイム）により提供されたバッファー中37℃で３時間、1:25の酵素とペプチド比で行った。開裂生成物は分析用ビダック（Vydac）C18カラムによるRPクロマトグラフィーで分離した。個々のピークの貯蔵及び配列の完全決定のためのシークエンス。
Ｃ−末端の決定
製造元（ベーリガー、マンハイム）により提供されたバッファー中、1:25の酵素とペプチド比でキモトリプシンを用いて残り50％のカルボキシメチル化ペプチドの開裂を行い、次いで、分析用ビダック（Vydac）C18 RPカラム（4.6mm×25cm）により精製を行う。個々のピークを貯蔵し、配列の完全決定のために分析される。
モル質量の決定
全ペプチドのモル質量（molar mass）の決定をSciex API IIIにより行い、次いでフラグメンドはLys−Ｃ及びキモトリプシンにより開裂する。
シークエンシング及びモル質量の決定から8689ダルトンのモル質量を有する上記配列を得る。
スイス−プロト（Swiss−Prot）及びEMBL−ペプチド及びヌクレインサウレデーテンバンク（Nukleinsauredatenbank）についてデータバンク比較を行った。配列相同性を、マクロファージ炎症タンパク質MIP Iα及びMIP Iβに最大相同性を有するインタークライン（intercrines）の上科の種々のメンバーについて確立した。
実施例３
cDNAの決定
部分ヒトサイトカインCC−1 cDNAフラグメントのクローニング及び特性決定ヒト副腎組織から完全RNAを自動核酸抽出法（ABI,340）により調整した。
このRNA 5μｇからのmRNAをMMLV RTase（Gibco−BRL）及び合成オリゴ（dT）プライマー（UNIP−2,CCTGAATTCTAGAGCTCA（Ｔ）17）を用いてcDNA第一ストランドに転写した。同時に、２つの「変性した」PCRプライマー対を、相応するアミノ酸配列（別紙「CC−１アミノ酸配列及びそれから誘導したPCRプライマー」参照）の全てのコーディングの可能性を含む既知のペプチド配列から出発して合成した。第１のプライマー対（CC−１−2/1,CC−１−2/2）はアミノ酸配列に関してＮ−末端よりに局在し、一方、第２のプライマー対（CC−１−2/3,CC−１−2/4）の位置はＣ−末端にシフトしていた。これは、反応の特異性を増加させるために、２工程での増幅（前増幅、再増幅）が可能であることを意味する。以下の反応を行った。
1.  ２つの異なる反応において、1/15の各cDNA産物を、それぞれ（前増幅、２バッチ）CC−１−2/1/UNIP−２及びCC−１−2/2/UNIP−２のプライマーの組み合わせを用いる40PCRサイクルに付した。１サイクルは以下を含む。
95℃  30秒  変性
48℃  30秒  プライマーハイブリダイゼーション
72℃  ３分  伸長
2.  1/30の各２つの産物をそれぞれ（前増幅、４バッチ）CC−１−2/3/UNIP−２及びCC−１−2/4/UNIP−２のプライマーの組み合わせを用いる20PCRサイクルで再増幅した。
95℃  30秒  変性
42℃  30秒  プライマーハイブリダイゼーション
72℃  ２分  伸長
CC−１−2/4/UNIP−２を用いる再増幅により、均質PCR産物が得られた（「PCRフラグメントのアガロースゲル電気泳動」参照）。このPCR産物はセントリコン（Centrikon）Ｃ−100（Amicon）遠心分離により未反応プライマーを除去し、50ngのpBluescript Eco−R I（このPCR産物はクローニングを容易にするためにECO−R I制限酵素部位が付与されている）で切断し、次いで結合した。結合産物は大腸菌XL−1 Blue中で増殖させ、クイアジェンカラム（Diagen）を用いて白色コロニーのプラスミドDNAを調製し、蛍光シークエンサーでシークエンシングした。クローンされたcDNAは、cDNA又はジーンライブラリーのスクリーニング用の高特異性ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。さらに、ヒトcDNAライブラリーの全DNAから残りのcDNAの直接増幅のための特異的プライマーをこの配列から誘導することもできる。
GAP−２アミノ酸配列及びそこから誘導されたPCRプライマー
プライマー
CC−１−2/4  SEQ ID No.1,＋＋＋!48変異
CC−１−2/1  SEQ ID No.2,768変異
CC−１−2/3  SEQ ID No.3,24変異
（フラグメントSEQ ID No.4GAP−2AA配列のコーディング）
CC−１−2/2  SEQ ID No.5,384変異
CC−１−2/3  SEQ ID No.6,24変異
配列表
（１）  一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：プロフェッサー  ドクター  ウルフ−ゲオルグ  フォースマン
（Ｂ）ストリート：ブリュッケルシュトラーセ  ５
（Ｃ）都市：ハノーファー
（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:30175
（ii）発明の名称：ヒト循環サイトカインCC−１
（iii）配列の数:9
（iv）コンピューター読み出し可能フォーム：
（Ａ）媒体の形式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC  コンパチブル
（Ｃ）オペレーションシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0,Version＃1.30（EPA）
（２）  SEQ ID NO:1:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"PCR−プライマー”
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:1:
0003630685.tif 000002
（２）  SEQ ID NO:2:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"PCR−プライマー”
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:2:
0003630685.tif 000003
（２）  SEQ ID NO:3:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"PCR−プライマー”
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:3:
0003630685.tif 000004
（２）  SEQ ID NO:4:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:12アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ:4:
0003630685.tif 000005
（２）  SEQ ID NO:5:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"PCR−プライマー”
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:5:
0003630685.tif 000006
（２）  SEQ ID NO:6:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:74アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:6:
0003630685.tif 000007
（２）  SEQ ID NO:7:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:123塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:7:
0003630685.tif 000008
（２）  SEQ ID NO:8:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:47アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:8:
0003630685.tif 000009
（２）  SEQ ID NO:9:についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:330塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列の記載:SEQ ID NO:9:
0003630685.tif 000010
【図１】
0003630685.tif 000011
【図２】
0003630685.tif 000012
【図３ａ】
0003630685.tif 000013
【図３ｂ】
0003630685.tif 000014
【図４】
0003630685.tif 000015