(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）で表される、新規ペプチド。
【請求項２】
血圧降下作用を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血圧降下剤として有用な新規ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
わが国における高血圧患者数は３０００万人を超えると言われており、経口投与で有効な安全な血圧降下物質が求められている。既知の血圧降下物質としては交感神経遮断剤、アドレナリンアルファおよびベータブロッカー、カルシウム拮抗剤、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびアンジオテンシンＡＴ１レセプターアンタゴニスト等がある。
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、食品中に含まれる生理活性物質の探索研究を行う中で、卵白を酵素で加水分解した組成物中に、動脈弛緩作用を持ち、血圧降下作用を有する物質が含まれることをつきとめ、その物質がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ｏｖｏｋｉｎｉｎＩＩＩ）であることを示した（特開平１０−３６３９４号）。その知見より、上記ペプチドと類似するペプチドにつき、その生理活性を検討してきたところ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅという配列を有するペプチドが血圧降下作用を有することを見出した（特開２０００−１４３６９５号）。上記のＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅから成るペプチドは優れた降圧ペプチドであるが、本発明者らはそのペプチドを改変することにより、更に強力な降圧ペプチドを得る事を試みた。即ち、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを改変した種々のペプチドを得て、より降圧作用が強力な新規ペプチドを得ることが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記のストラテジーに従い、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを改変したペプチドを多数合成した。６番目のアミノ酸であるＰｈｅをＴｒｐに、３番目のアミノ酸であるＰｈｅをＬｅｕにそれぞれ改変することにより、降圧作用が既知のＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅと比べて約３倍強まることを見出した。４番目のアミノ酸については、ＨｉｓをＬｙｓ又はＡｒｇに変換しても、降圧活性を維持していた。即ち、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）からなる新規のペプチドが、より強い降圧活性を有している事を見出した。本発明のペプチドは高血圧者に対しては作用を示すが、正常血圧には影響を及ぼさない安全な降圧物質である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）で表される、新規ペプチドである。本発明のペプチドは血圧降下作用を有するために、当該ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血圧降下剤を作成することが可能であり、そのようなペプチドもまた本発明の範囲内である。上記でいうＡｒｇはアルギニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｌｅｕはロイシン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｌｙｓはリジンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００６】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【０００７】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【０００８】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【０００９】
次に医薬品として用いる場合について説明する。
本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい。本発明の降圧剤は、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１０】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１１】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１２】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１３】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１４】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００１５】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１６】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００１７】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００１８】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のように合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。
【００１９】
得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２０】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを得た。
本品をプロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。尚、同様の方法で、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ及びＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを得た。
【００２１】
（血圧変動の測定）
１５〜２０週令の自然高血圧ラットに、卵黄でエマルジョン化したペプチドをゾンデ針を使用して強制経口投与した。そして尾静脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により経時的に測定した。無麻酔下血圧測定方法の概略を示す図を、図１に示す。また、本発明のペプチドを高血圧ラットに、０．３ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合の血圧降下作用を表１に示す。尚、表１の値は、経口投与４時間後の値である（ｎ＝５）。比較として、ｏｖｏｋｉｎｉｎＩＩＩ及び既知ペプチドであるＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（特開２０００−１４３６９５号）を投与した結果を表１に併せて記載する。
【００２２】
【表１】
0003716298.tif 000002
【００２３】
この結果、本発明の新規ペプチド（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｘ＝Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）は、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に対して０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与を行うことにより、１０〜１５ｍｍＨｇの血圧降下作用をもたらした。この結果は、本発明の新規ペプチドを用いることにより、ｏｖｏｋｉｎｉｎＩＩＩと比べて数十分の１から１００の１の用量で、また既知のＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅと比べて約１／３の用量で、同等の降圧効果が得られたことを示すものである。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、既知の機能性ペプチドより更に強力な降圧作用を有し、経口投与が可能な新規ペプチド（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｘ＝Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）が与えられた。