(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料を保持したノズルチップと、このノズルチップの一端を空気にて加圧して前記液体試料を前記ノズルチップの吐出口から吐出させるポンプとを含んだピペット装置において、
前記ノズルチップ内の圧力を測定する圧力センサと、
前記吐出口での気泡の成長が始まる試料吐出終了タイミングを前記測定された圧力の変化形状に基づいて検出する圧力変化解析部と、
前記試料吐出終了タイミングが検出されると、前記ポンプによる前記加圧を停止して前記気泡の吐出を抑止するポンプ制御部と、
を有することを特徴とするピペット装置。
【請求項２】
請求項１記載のピペット装置において、
前記圧力変化解析部は、前記試料の吐出時の前記圧力の低下とこれに続く前記気泡の成長時の前記圧力の上昇とにより生じる前記圧力の極小点を前記試料吐出終了タイミングとして検出することを特徴とするピペット装置。
【請求項３】
請求項２記載のピペット装置において、
前記圧力変化解析部は、前記圧力の時間微分に基づいて前記極小点を検出することを特徴とするピペット装置。
【請求項４】
請求項３記載のピペット装置において、
前記圧力変化解析部は、前記時間微分を前記圧力の時間的な差分により近似することを特徴とするピペット装置。
【請求項５】
請求項２記載のピペット装置において、
前記圧力変化解析部は、前記圧力の所定閾値以下にて前記極小点を検出することを特徴とするピペット装置。
【請求項６】
請求項５記載のピペット装置において、
圧力の所定閾値は、前記吐出口の外部の液圧に応じて定められることを特徴とするピペット装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体の吸引・吐出を行うピペット装置に関し、特に吐出量を正確に制御し気泡の発生を防止することができ、ＤＮＡシーケンシングなどに使用される装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡシークエンサでは、ＤＮＡ解析を行うため、ＤＮＡの分離媒体である薄厚のゲル板の上部に形成された複数の小溝に微量（例えば１．２μｌ）のサンプルＤＮＡを注入する必要がある。その小溝の厚みは０．２５〜０．４ｍｍ程度しかなく、またその深さは数ｍｍ、例えば７ｍｍ程度である。
【０００３】
このような溝にサンプルＤＮＡを注入する場合には、一般的には、ディスポーザブルチップ（ノズルチップ）を装着させたマイクロピペットが使用される。図６は、従来のマイクロピペット装置の模式的な構成図である。このマイクロピペット装置は、ピストン２とシリンダ４とで構成されるシリンジポンプ６を有し、シリンジポンプ６は配管８を介してノズルチップ１０に圧力を供給する。図７はノズルチップ１０の正面図及び側面図である。ノズルチップ１０の先端ノズル２０は、上記小溝の形状に合わせた極薄形状である。ノズルチップ１０は接続端２２を配管８に接続され、内部の空気圧がシリンジポンプ６によって制御されて、吐出口２４からサンプルＤＮＡの吸引・吐出を行う。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のように注入対象である小溝はその形状及び容積が極めて小さく、マイクロピペット装置から所定量のサンプルＤＮＡを正確かつ確実にその小溝に注入するのは困難であり、また熟練を要していた。
【０００５】
すなわち、先端ノズル２０の断面開口の面積が極めて小さいこと、及び上記の小溝にバッファー液が満たされていることに起因して、流体抵抗が大きく、このため吐出コントロールが困難であるという問題があった。すなわち、あまりゆっくりピストン２を押し込むと、吐出力が不足気味となってピストン２を完全に押し込んでもノズルチップ１０内などにサンプル液が残りやすく、その一方、勢い良くピストン２を押し込むと、吐出力が過剰となって上記の小溝からサンプル液が溢れたり、吐出口２４から空気が吐出し小溝に気泡が生じるという事態を引き起こすことがあった。このような事態はＤＮＡシーケンシングの分離パターンに悪影響を与え、その後の解析が困難になるという問題があった。
【０００６】
また、一般的なピペット装置においても、実際の吐出量をできる限り正確に設定したいとの要望がある。
【０００７】
本発明は上記問題点を解消するためになされたものであり、その目的はノズルチップからのサンプル液の吐出量を正確にコントロールできるピペット装置を提供すること、特に微量であり貴重なサンプルＤＮＡをできるだけ小溝に吐出し、かつ気泡の発生を防止し、精度の高いＤＮＡシーケンシングを可能とするピペット装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明に係るピペット装置は、ノズルチップ内の圧力を測定する圧力センサと、吐出口での気泡の成長が始まる試料吐出終了タイミングを前記圧力の変化形状に基づいて検出する圧力変化解析部と、前記試料吐出終了タイミングが検出されると前記ポンプによる前記加圧を停止して前記気泡の吐出を抑止するポンプ制御部とを有することを特徴とする。
【０００９】
本発明によれば、圧力センサは試料の吐出時におけるノズルチップ内の圧力を測定し、圧力変化解析部はこの測定値の時間変化を解析する。試料の吐出が終了するとノズルチップ内の空気が吐出口から押し出され、吐出口に気泡が成長し、もしさらに圧力を加えるとついには気泡は吐出口から分離する、すなわち吐出されてしまう。圧力変化解析部はこの気泡成長過程に特徴的なノズルチップ内の空気の圧力変化から試料吐出終了タイミングを検知すると、ポンプ制御部に信号を出力する。ポンプ制御部はこの信号を受けるとポンプのノズルチップに対する加圧動作を停止する。このとき、ポンプ制御部はさらにポンプに微小な吸引動作を行わせ気泡の吐出の抑止を確実としてもよい。
【００１０】
この発明に係るピペット装置においては、前記圧力変化解析部は、試料の吐出時の前記圧力の低下とこれに続く前記気泡の成長時の前記圧力の上昇とにより生じる前記圧力の極小点を前記試料吐出終了タイミングとして検出することを特徴とする。本発明によれば、吐出によりノズルチップ内の試料が減少して流体抵抗が減少することによる圧力の低下と、これに続く気泡の成長、すなわち気泡表面が拡大して表面張力エネルギーが増大することによるノズルチップ内の圧力の上昇とで形成される圧力変化の極小点が圧力変化の特徴とされ、これを圧力変化解析部が検知する。
【００１１】
この発明に係るピペット装置においては、前記圧力変化解析部は、前記圧力の時間微分に基づいて前記極小点を検出することを特徴とする。本発明によれば、圧力変化の極小点では、圧力の時間微分値が原理的には０になることが圧力変化の特徴とされ、圧力変化解析部はこの特徴に基づいて試料吐出終了タイミングを検知する。
【００１２】
この発明に係るピペット装置においては、前記圧力変化解析部は、前記時間微分を前記圧力の時間的な差分により近似することを特徴とする。本発明によれば、前記極小点の判定を行う際の前記時間微分を時間的な差分により近似的に求めることにより、現実の圧力変化に起こりうる微小な圧力変動が平滑化されその悪影響が除去される。すなわち、圧力変動により試料吐出終了タイミングと無関係なミクロな極小点が生じても、それらの時間スケールより大きな時間間隔にて差分処理を行うことにより、それらミクロな極小点が誤って試料吐出終了タイミングとして検知されることがない。
【００１３】
この発明に係るピペット装置においては、前記圧力変化解析部は、前記圧力の所定閾値以下にて前記極小点を検出することを特徴とする。本発明によれば、試料吐出が終了する時の圧力の付近に所定の閾値が設定され、その閾値以下においてのみ極小点が検知されるので、その閾値に達する前に圧力変動などにより極小点が生じても、それらが誤って試料吐出終了タイミングとして検知される可能性が低くなり、装置の制御の精度が向上する。
【００１４】
この発明に係るピペット装置においては、圧力の所定閾値は、前記吐出口の外部の液圧に応じて定められることを特徴とする。本発明によれば、試料吐出終了タイミング、すなわち極小点での圧力は、原理的にはノズルチップの吐出口が挿入されている液体の吐出口での圧力になることに基づいて、前記閾値が定められ、装置の制御の精度が向上する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。図１は、本発明を実施したＤＮＡシークエンサー用自動マイクロピペット装置の模式的な構成図である。この図において、図６と同様の構成要素には同じ符号を付し説明を省略する。本装置では、ピストン２はモータ３０によって進退駆動される。モータ３０には、例えば正確な駆動制御が可能なパルスモータが用いられる。配管８の途中に接続された圧力センサ３２はノズルチップ１０内の空気圧を測定する。圧力センサ３２には例えば小型軽量な半導体圧力センサが用いられる。この圧力の測定結果は制御ユニット３４に入力される。制御ユニット３４は、この測定結果を解析する圧力変化解析部３６と、この圧力変化解析部３６の解析結果に基づいてモータ３０を制御するポンプ制御部３８とを含んでいる。
【００１６】
次に、本装置が利用する吸引・吐出時での圧力変化の特徴を説明する。図２は、吸引動作及び吐出動作におけるノズルチップ１０内の圧力変化を示す模式的なグラフである。図において横軸は時間であり、縦軸は圧力であってＰ０は大気圧、上が高圧、下が低圧である。吸引動作では、ノズルチップ１０の吐出口２４を液体中に挿入して、ピストン２を時刻ｔ０からｔ１まで直線的に引く。このｔ０からｔ１までの時間は例えば１００ｍＳ程度と短時間であるので、このときノズルチップ１０の液体吸引に対する抵抗により、直ちには液体はノズルチップ１０に流入せず、ノズルチップ１０内の圧力は大気圧Ｐ０からピストン２の移動量に応じた点Ａまで圧力が低下する。この後、液体は次第にノズルチップ１０に吸引され圧力は上昇し、ある値で平衡する（範囲Ｂ）。このときの大気圧との圧力差γｈは、ノズルチップ１０に吸い上げられた液柱高さなどの要因で定まり、ノズルチップ１０に吸い込まれた液体の量に対応する。
【００１７】
次にピストン２が時刻ｔ２から押し込まれ始め、吐出動作が開始される。ノズルチップ１０内部の液体抵抗などの抗力によりピストン２が押し込まれても、直ちには液体はノズルチップ１０から吐出せず、ノズルチップ１０内の圧力は点Ｃまで上昇する（時刻ｔ３）。さらにピストン２を押し込むと、ノズルチップ１０内の圧力が抗力に優って、吸引された液体が吐出口から吐出し始める。抗力は液体の吐出とともに減少するので、吐出速度は次第に速まる。吐出が終了すると圧力は極小点Ｄに達する（時刻ｔ４）。この時の大気圧との圧力差γｇは、吐出口２４での液体の圧力、すわなち吐出口２４の液体内への挿入深さにより定まる。
【００１８】
吐出終了後もピストン２を押し込むと、吐出口２４にはノズルチップ１０から押し出される空気によって気泡が成長する。ノズルチップ１０内の圧力は、気泡の表面積の拡大に応じて上昇し（範囲Ｅ）、気泡が吐出口２４から遊離すると再び、時刻ｔ４における吐出終了状態と同じ状態となる（時刻ｔ５）。以降、気泡の成長、遊離の反復に対応して、圧力の上昇、下降が繰り返される。
【００１９】
図３は、吐出動作におけるノズルチップ１０内の圧力変化の微分を示す模式的なグラフである。図において横軸は時間であり、縦軸は圧力の時間微分であって時間軸より上が正すなわち圧力の上昇時、下が負すなわち圧力の下降時である。微分値が０となる点Ｆ（時刻ｔ３）、Ｇ（時刻ｔ４）はそれぞれ、図２の圧力が極大となる点Ｃ、極小となる点Ｄに対応する。なお、時刻ｔ４以降の気泡の吐出過程では、図に大まかに示すように微分値の変動は、正負に振動するなど大きくなる。
【００２０】
本装置は、図２、図３に示す圧力の変化形状の特徴を用いてノズルチップからのサンプルＤＮＡの吐出終了タイミングを検出してノズルチップ１０への加圧を停止し気泡の吐出を抑止することを特徴とする。圧力変化解析部３６は、原理としては時刻ｔ２からの吐出動作において、サンプルが吐出される時刻ｔ３からｔ４までの圧力低下とこれに続く時刻ｔ４からｔ５までの気泡成長による圧力上昇とで形成される圧力の極小点Ｄを検出する。その極小点検出の方法として、圧力変化解析部３６は図３に示す圧力の微分、すなわち圧力の変化率を監視し、時刻ｔ４における微分値の負から正への０クロス点Ｇによって極小点Ｄを検知する。
【００２１】
但し、現実には圧力は滑らかに変化せず、ピストン２を進退させるモータ３０の駆動精度、外部の機械的振動など様々な原因によって揺らいだり、ノイズが生じたりし得る。図４は、この揺らぎやノイズが重畳された圧力変化の様子を示すグラフである。このように現実には、極小点Ｄに達するまでに目的としないミクロなフェイク（fake）極小点が生じ得る可能性がある。本装置の圧力変化解析部３６は、以下に説明するように、極小点Ｄを検知するが、フェイク極小点を検知しないという選択性を有しており、これにより吐出終了タイミングを精度よく検出する。
【００２２】
図５は、吐出時の圧力変化の模式図である。圧力変化解析部３６における選択性を確保するための第１の特徴は、圧力Ｐの各時刻における時間微分値dP/dt を、所定時間τの間隔を有する２時刻t3+(n-1)τ、t3+nτ、（ｎ：自然数）での圧力の差分平均で近似する点にある。つまり、時刻t3+nτでの微分値dP/dt を次式で求める。
【００２３】
dP/dt ＝｛Ｐ(t3+n τ) −Ｐ(t3+(n-1) τ) ｝／τ
ここでτを圧力Ｐのミクロな変動の周期よりやや大き目に設定すれば、このミクロな変動は平滑化されるので、フェイク極小点５０によって、微分値の負から正への０クロス点は発生しない。よって、圧力変化解析部３６はフェイク極小点を誤って検出することがない。
【００２４】
圧力変化解析部３６において選択性を確保する第２の特徴は、所定の閾値以下の圧力において極小点を検出する点にある。検出対象とする極小点Ｄでの圧力γｇは上述したように、吐出口２４での外部の液圧に応じた値であり、これは吐出口２４の小溝中のバッファー液への挿入深さにより定まる。本装置はサンプルＤＮＡを自動的に分注するものであり、この挿入深さは所定の精度範囲δで制御することができる。よって、極小点の検知を開始する圧力の閾値は（γｇ＋δ）とすればよい。これにより時刻ｔ２から始まる吐出動作の大半の過程で生じるフェイク極小点５０が検知対象から除外され、装置の信頼性が向上する。
【００２５】
本装置では、圧力変化解析部３６は、圧力Ｐの微分値を求めて、これに基づいて極小点の判定を行うが、その本質は圧力Ｐの変化率の変化を監視する点にあり、微分値を明示的に使用しない構成も可能である。例えば、圧力Ｐを所定時間間隔でサンプリングして、隣接する２時刻ｔとｔ’（ｔ＞ｔ’）での圧力値の大小関係を比較するという構成が可能である。この構成では、Ｐ(t) ＜Ｐ(t')からＰ  (t) ＞Ｐ(t')に遷移したタイミングを極小点Ｄとして検知する。
【００２６】
また、上記構成では、微分値を時間間隔τにわたる差分平均で近似して、時間τごとに求めたが、この差分平均を連続的に出力する構成として、制御の時間分解能を向上することもできる。この場合には、時刻ｔ（ｔは任意）での微分値dP/dt を、dP/dt ＝｛Ｐ(t) −Ｐ(t- τ) ｝／τで求める。
【００２７】
以上のように、圧力変化解析部３６は、圧力の変化形状に基づいてノズルチップに保持された試料の吐出終了タイミングを精度良く検出することができる。圧力変化解析部３６は、試料吐出終了タイミングを検出すると、信号をポンプ制御部３８に出力する。ポンプ制御部３８はこの信号を受信すると、モータ３０を制御してピストン２の押し込み動作を中止する。このときノズルチップ１０内の空気の余圧によって気泡が吐出してしまうことも考えられる。これを防ぐため、ポンプ制御部３８はモータ３０を逆方向に駆動してピストン２をわずかに引き出すように制御し、余圧を吸収することとしてもよい。なお、シリンジポンプ６の代わりに他のポンプを用いてもよい。
【００２８】
ＤＮＡシークエンサーでは、ＤＮＡを構成する４つの塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を１セットとしてシーケンシング処理が行われる。そのため、ＤＮＡシークエンサーは、試料であるサンプルＤＮＡが注入される小溝をゲル板の上部に複数有している。従来は、１つ１つの溝に熟練者が気泡を生じないように注意深く試料を注入していたため、１つの溝への注入に数秒程度かかることもあった。本ＤＮＡシークエンサー用マイクロピペット装置は、この作業を自動化するものであり複数の溝に同時に注入を行う多連の装置を容易に実現でき、作業スピードが格段に向上する。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のピペット装置によれば、ノズルチップからのサンプル液の吐出量を正確にコントロールできるという効果がある。特に微量かつ貴重な試料をできるだけ吐出し、かつ気泡の発生を防止するという微妙な吐出動作の制御が可能となる。これにより、ＤＮＡシークエンサーに対するサンプルＤＮＡの吐出動作において試料ができるだけ小溝に吐出されシーケンシングの精度が向上するとともに、シーケンシングの障害となる気泡の発生が防止されるという効果が得られる。また、本発明によれば、吐出動作の制御を自動化できるので、吐出作業の時間が短縮されるという効果がある。また自動化できるので多連のピペット装置として構成することができ、吐出動作を並列同時処理することにより一層の時間短縮が図られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施形態であるＤＮＡシークエンサー用自動マイクロピペット装置の模式的な構成図。
【図２】  吸引・吐出動作におけるノズルチップ内の圧力変化を示す模式的なグラフ。
【図３】  吐出動作におけるノズルチップ内の圧力変化の微分を示す模式的なグラフ。
【図４】  揺らぎを有した圧力変化の様子を示すグラフ。
【図５】  吐出時の圧力変化の模式的なグラフ。
【図６】  従来のマイクロピペット装置の模式的な構成図。
【図７】  ノズルチップの正面図及び側面図。
【符号の説明】
２  ピストン、４  シリンダ、６  シリンジポンプ、８  配管、１０  ノズルチップ、２４  吐出口、３０  モータ、３２  圧力センサ、３４  制御ユニット、３６  圧力変化解析部、３８  ポンプ制御部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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