(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物又は植物細胞内で発現されるときその植物又は植物細胞のトレハロース含量を増加させる核酸であって、配列内に：
（ａ）上記植物又は植物細胞内で機能する転写開始領域；及び
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列により表される大腸菌（E.coli）トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードするDNA配列；
を含む前記核酸。
【請求項２】
以下の：
（ｃ）前記植物又は植物細胞内で機能する転写終結領域、
をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記DNA配列が配列番号２に示すヌクレオチド酸配列により表される、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記DNA配列が、受託番号430.93の下、Centraal Bureau voor Schimmelculturesに寄託された、pMOG799内に存在する、大腸菌のotsA遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含む大腸菌トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記転写開始領域が、カリフラワー・モザイク・ウイルスのDNAをコードする35S RNAのプロモーター領域を含み、そして前記転写終結領域が、アグロバクテリウム・チュームファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン・シンターゼ遺伝子に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
バイナリー・ベクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含むクローニング・ベクター。
【請求項７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する、請求項６に記載のベクターを含む微生物。
【請求項８】
増加したトレハロース生産能力をもつ植物を取得する方法であって、以下のステップ：
ａ）上記植物の受容細胞内に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸又は請求項６に記載のクローニング・ベクター；及び上記植物内で機能する選択マーカー遺伝子をコードするDNA配列を導入し；そして
ｂ）上記選択マーカー遺伝子の存在についての選択を許容する条件下、形質転換された細胞から上記植物を再生する、
を含み、
ここで、上記植物は、双子葉植物、イネ又はトウモロコシである、前記方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え植物DNAゲノム。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え植物DNAゲノムを有する植物細胞。
【請求項１１】
請求項10に記載の植物細胞を含む植物細胞培養物。
【請求項１２】
請求項10に記載の細胞を含む双子葉植物、イネ又はトウモロコシ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、組換えDNA技術を使用する植物炭水化物代謝の修飾、それにおける使用のための組換えDNA、並びに修飾遺伝子構成をもつ植物及び植物部分に関する。これらの植物は、特定の炭水化物化合物を抽出するために使用されることができ、あるいは、それらは、例えば加工の間に、上記炭水化物化合物の存在により改良された特性をもつ、食品、飼料、又はそれらの成分として加工されることができる。
技術水準
トレハロースは、２つのα−，α，β−、及びβ，β−結合グルコース分子に基づく二糖類を含んで成るＤ−グルコシル−Ｄ−グルコシドに与えられた一般的名称である。トレハロース（trehalose）、特にα−トレハロース１−（Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−１′−（Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノース）は広く天然にある二糖類である。
トレハロースの化学合成は、（保護基が必要であり）困難であり、かつ、非効率である。トレハロースの最近の天然源は、キノコと酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、これらはトレハロースとして10％を上廻る乾燥重量を蓄積することができる。しかしながら、生産は、トレハロースの速い代謝を引き起こす高いトレハロース活性により妨害される。Elbein A.D.（1974,Adv.Carbohydrate Chem.and Biochem.30,277−256）は、生きた生物における二糖類トレハロース、特にα，α−トレハロースの発生と代謝のレビューを考える。植物においては、トレハロースの存在は、いくつかの下等植物種、並びにスペルマトフィタ（Spermatophyta）；エチノプス・ペルシカス（Echinops persicus）；カレックス・ブルンセンス（Carex brunescens）；ファガス・シルバチカス（Fagus silvaticus）に属する多数の高等植物種において報告されている。しかしながら、これらの結果は、他の著者によってはしっかりと確立されてはいない（例えば、Kendall et al.,1990,Phytochemistry 29,No.8,2525−2528）。例えば、Kendall et al、前掲は、種子植物におけるトレハロースの発生に関して、その存在がキャラウェー（Caraway seed）（Carum carvi）についてのみしっかりと記載されていると述べてた。Cegla et al.によるヒマワリにおけるトレハロースの存在の報告（1977,J.Am.Oil Chem.Soc.54,150 et seq.）は、Kendall et al,1990、前掲に従って（The Biochemistry of Plants Vol.3 Carbohydrates:Structure and Function;Preiss,J.,ed.,p.228.Academic Press:中において）Kandlerにより問題とされた。ブナ（beech）（Eagus sylraticus）とキャベツにおけるトレハロースの報告は、他の著者により証明されることができなかった（Kendall et al.,1990、前掲、及びその中の文献）。
高等植物におけるトレハロースの明らかにまれなことにも拘らず、トレハロース分解活性の存在は、その調査された植物の科のかなりの数について報告された。安定した高トレハロース活性が３つの小麦系統、バンクスマツ（jack pine）、及びセラジネラ・レピドフィラ（Selaginella lepidophylla）において見つかった。安定した低トレハロース活性は、アルファルファ、ブラック・メキシカン・スウィート・コーン及び白トウヒ（white spruce）において見つかった。不安定な、中程度の活性がcanolaの２つの異なる懸濁液中に発見されたが、これらは、おそらく特定のトレハロース活性に帰されることはできないであろう。大麦、スズメノチャヒキ（brome grass）、大豆及び黒トウヒ（black spruce）は、トレハロース活性を全く含まないと報告された（Kendall,1990前掲）。
その生産が可能である生物においては、トレハロースは、その６−ホスフェートとして生合成されると信じられている。一方、その保存形態は遊離の糖である。それ故、トレハロースを生産し、そして／又は保存する生物は、トレハロース６−ホスフェートを解裂することができるホスファターゼを含むと信じられる（Elbein,1974、前掲）。高等植物における特定のトレハロース・ホスフェート・ホスファターゼの存在についてはほとんど知られていない。
1993年９月２日に公開された国際特許出願第WO 93/17093 A1号は、トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする酵母遺伝子にトランスジェニックな酵母内でのトレハロースの生産について記載している。トレハロースは、これらの酵母遺伝子を使用して、高等植物においても生産されることができると示唆されたが、植物におけるトレハロース生産の実際の開示は全く存在しない。WO 93/17093 A1が本出願日前であるが本出願の優先日後に公開されたことに留意すべきである。
本発明の要約
本発明は、その植物宿主内での、
（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ（trehalose phosphate synthase）活性をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子の存在により、植物内でのトレハロースの生産方法を提供する。
本発明の他の態様は、その植物宿主内での、
（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｅ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに
（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｂ）その植物宿主内で天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素（SPS）をコードするRNA配列に少なくとも部分的に相補的であるRNA配列をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、
の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。
本発明のさらに他の態様は、その植物宿主内での、
（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｅ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに
（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｂ）その植物宿主内で天然にあるADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードするRNA配列に少なくとも部分的に相補的であるRNA配列をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。
本発明のさらに他の態様は、その植物宿主内での、
（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに
（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｅ）その植物宿主内に天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素をコードするRNA配列に少なくとも部分的に相補的なRNA配列をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止領域、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに
（ｇ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｈ）その植物宿主内に天然にあるADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードするRNA配列に少なくとも部分的に相補的なRNA配列をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｉ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、
の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。
また、本発明は、トレハロースの生産方法において使用される植物発現性遺伝子、並びに植物発現性遺伝子の組合せ、並びにクローニング・プラスミド、形質転換ベクター、微生物、本発明に係る植物発現性遺伝子を宿す個々の植物細胞、に拡大される。
また、本発明は、その中には天然に存在しない植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を含む組換え植物DNAゲノムをも提供する。本発明は、その中には天然に存在しない植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子及びさらにSPS活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、及び／又はAGPase活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る組換え植物DNAゲノムをも含んで成る。
本発明は、トレハロースを生産することができる植物を得るための方法であって、以下の段階、
（１）配列内に：
（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするDNA配列、
（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、
を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に、
（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、
（ｅ）その植物宿主内で機能する選択マーカー遺伝子をコードするDNA配列、及び場合により、
（ｆ）その植物内で機能する転写終止配列、
を含んで成る植物発現性遺伝子、
を受容体植物細胞内に導入し、
（２）その選択マーカー遺伝子の存在についての選択を許容する条件下で形質転換された細胞から植物を作出する、を含んで成る方法をも提供する。
本発明は、遺伝子修飾の結果としてトレハロースの（増加されたレベル）を作り出す植物をも含んで成る。
本発明はさらに、本発明に係る植物発現性遺伝子を含む組換えDNAゲノムをもつ植物をも含んで成る。
本発明は、本発明に係る植物発現性遺伝子を含む組換えDNAゲノムをもつ植物であってトレハロースを生産するものをも含んで成る。
本発明は、本発明に係る組換えDNAゲノムをもつ植物であって増加された渇水（drought）耐性を示すものをも含んで成る。
また、本発明は、本発明に係る植物の部分、例えば細胞又はそれらのプロトプラスト又はカルチャー、花、果実、葉、花粉、（毛状根カルチャーを含む）根、種、茎、（いわゆるmicrotubersを含む）塊茎その他に拡大される。
本発明は、トレハロースの存在中植物又は植物部分を保存する方法であって、以下の段階：
（１）トレハロースを生産する本発明に係る植物を成長させ、
（２）トレハロースを含む植物又は植物部分を収穫し、そして
（３）その植物又は植物部分を風乾し、あるいは
（４）その植物又は植物部分を凍結乾燥する、
を含んで成る方法に拡大される。
本発明はさらに、本発明に係る方法により保存された植物及び植物部分を含んで成る。
本発明は、トレハロースの生産方法であって、以下の段階：
（１）組換え植物DNAゲノムにより、トレハロースの（増加されたレベルを）作り出すことができる植物を成長させ、
（２）その植物又は植物部分を収穫し、
（３）その植物又はその植物部分からトレハロースを単離する、
を含んで成る方法をも含む。
本発明はさらに、トレハロースの生産方法であって、以下の段階：
（１）組換え植物DNAゲノムにより、トレハロースの（増加されたレベルの）を作り出すことができる植物細胞を培養において成長させ、
（２）その植物細胞カルチャーからトレハロースを単離する、を含んで成る方法を含む。
本発明はさらに、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする単離された核酸配列を提供する。好ましい単離された核酸配列は、大腸菌（E.coli）から得られたものである、そしてより好ましいものは、配列番号:2中に表す単離核酸配列である。他の好ましい態様は、配列番号:3におけるようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る。
以下の図はさらに本発明を説明する。
図面の説明
図１  植物sink組織内のスクロースとデンプン生合成経路の一部を図示したものである。この図は、光合成により葉内で生産された炭水化物がスクロースの形態で篩部（phloem）組織を介して輸送されることを示している。このシンクに入る間それは膜結合インベルターゼ活性により処分（unload）され、単糖類グルコースとフルクトースを生じる。多数の酵素段階の働きにより、これらの単糖類は図に概略を示すようにデンプン及び／又はスクロースに変換される。グルコースはG6Pに代謝され、そしてUDPGは、植物発現性otsＡ遺伝子の導入により上記植物内に遺伝子操作されたTPS−酵素のための基質として使用されると信じられている。この図は、基質として利用されることができるUDPGとG6Pの一定量が酵素SPSとAGPaseのレベルを減少させることによりどのように増加されるかを示している。それらの阻害を十字によりマークした。
図２  大腸菌（E.coli）からのotsBAオペロンを含む、Kohara et al.（1987）からのEMBL4クローン7F11の略マップである。otsＡ遺伝子をクローン化するために使用された酵素EcoR VとHind IIIについての制限部位、並びにその挿入の左側に対してのkbにおけるそれらの距離を示す。otsＡとＢ遺伝子も示され、矢印は転写の方向を示す（図８、拡大マップ参照）。
図３  クローン化されたポテトSPS cDNAの配列。Ｔ線:PCR増幅反応におけるオリゴヌクレオチドとし使用されたメイズSPS cDNA配列。
図４  バイナリー・ベクターpMOG664の略図。
図５  pMOG579内でクローン化された２つの断片を示すpTiB6の一部の制限マップ。
図６  アグロバクテリウム（Agrobacterium）株MOG101内のＴ−領域をもたないヘルパー・プラスミドの構築のために使用されたpMOG579の略図。
図７  発現ベクターpMOG180の略図。
図８  大腸菌（E.coli）からのotsBAオペロンを含む、Kohara et al.（1987）からのEMBL4クローン7F11の拡大マップ。TPSオープン・リーディング・フレーム（ORF）の位置を示す。（＊:Kohara et al.，以下、のマップ内には存在しないHind III部位）
図９  バイナリー・ベクターpMOG799の略図。
図10  バイナリー・ベクターpMOG801の略図。
図11  バイナリー・ベクターpMOG802の略図。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様は、配列内に、
（ａ）ダブル・エンハンサーにより上流に隣接されたCaMVの35S RNAから得られた転写開始領域、
（ｂ）大腸菌（E.coli）のotsBAオペロン内に位置するotsＡ遺伝子のコード領域であるトレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードするDNA配列、
（ｃ）アグロバクテリウム（Agrobacterium）のノパリン・シンターゼ（nopaline synthase（nos））遺伝子から得られた転写終止配列、
を含んで成る植物発現性遺伝子のポテト植物内での存在により塊茎（tubers）内でトレハロースを生産することができるポテト植物を含んで成る。植物発現性TPS遺伝子を含むトランスジェニック植物の塊茎はトレハロースを生産し、一方、この遺伝子を欠く対照植物はそうではなかった。明らかに、トランスジェニック塊茎により生産されるトレハロース・ホスフェートがトレハロースに変換される。明らかに、トレハロース・ホスフェート・ホスファターゼ活性を提供することは必要ではない。なぜなら、それはポテト内に存在するようであるからである。
図１中に、TPSについての基質利用能を改良するためのアプローチをも示す。このために、グルコース−６ホスフェート（G6P）とUDPGの基質利用能に影響を及ぼす２つの遺伝子がある。これに対して、アンチセンスSPS遺伝子とアンチセンスAPGaseが植物宿主内での発現のためのCaMV 35Sプロモーターの制御下でクローン化されている。本発明に従って植物発現性TPS遺伝子を含む植物宿主内に導入される場合、これは、TPSについての基質利用能及びそれ故トレハロース合成を増加させるであろう。それは、基質利用能を改良するために、スクロース又はデンプンの合成を遮断するために他のアンチセンス遺伝子をも使用されることができることは当業者に容易に想到するであろう。
本発明を、転写開始領域としてCaMV 35Sプロモーターの制御下で大腸菌（E.coli）からの植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を発現するポテト植物について詳細に記載するけれども、他の種子植物宿主もトレハロースの生産に等しく好適であるということが当業者に明らかであろう。spermatophytaの中で好ましい植物宿主は、Angiospermae、特に代表的な科としてとりわけSolanaceaeを含んで成るDicotyledoneae、並びに代表的な科としてとりわけGromineaeを含んで成るMonocotyledoneaeである。好適な宿主植物は、本発明の文脈中で定義されるように、植物（並びにその植物の部分と細胞）及びそれらの子孫であって組換えDNA技術を使用して遺伝子操作されて、所望の植物又は植物器官内で着目のトレハロースの生産を生じさせ又は強化するようなものを含み；これらの植物は、直接的に（例えば、食用部分を作り出す植物種）、又はそのトレハロースが（食用及び非食用植物宿主由来である）宿主から精製された後に、使用されることができる。本発明に得る食用部分をもつ穀物は、花をもつもの、例えばカリフラワー（Brassica oleracea）、アーティチョーク（Cynara scolymus）、果物、例えばリンゴ、（Malus、例えばdomesticus）バナナ（Musa、例えばacuminata）、イチゴ（例えばスグリ、Ribes、例えばrubrum）、チェリー（例えばスウィートチェリー、Prunus、例えばavium）、キュウリ（Cucumis、例えばsativus）、グレープ（Vitis、例えばvinifera）、レモン（Citrus limon）、メロン（Cucumis melo）、ナッツ（例えばウォルナッツ、Juglans、例えばregia；ピーナッツ、Arachis hypogeae）、オレンジ（Citrus、例えばmaxima）、もも（Prunus、例えばpersica）、ナシ（Pyra、例えばcommunis）、コショウ（Solanum、例えばcapsicum）、プラム（Prunus、例えばdomestica）、ストロベリー（Fragaria、例えばmoschata）、トマト（Lycopersicon、例えばesculentum）、葉、例えばアルファルファ（Medicago sativa）、キャベツ（例えばBrassica oleracea）、エンダイブ（Cichoreum、例えばendivia）、リーキ（Allium porrum）、レタス（Lactuca sativa）、ホウレンソウ（Spinaciaoleraceae、タバコ（Nicotiana tabacum）、根、例えばクズウコン（Maranta arundinacea）、ビート（Beta vulgaris）、ニンジン（Daucus carota）、カッサバ（Manihot esculenta）、カブ（Brassica rapa）、ハツカダイコン（Raphanus sativus）、ヤマノイモ（Dioscorea esculenta）、スウィートポテト（Ipomoea batatas）並びに種、例えばインゲン豆（Phaseolus vulgaris）、エンドウ豆（Pisum sativum）、大豆（Glycin max）、小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、トウモロコシ（Zea mays）、米（Oryza sativa）、茎、例えばコールラビ（Brassica oleraceae）、ポテト（Solanum tuberosum）、その他を含む。
上記食用部分は、植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子の存在により、その中で生産された強化されたトレハロース・レベルの存在中での乾燥により保存されることができる。植物器官又は組織特異的プロモーターの制御下にTPS活性をコードするDNAを配置することにより、トレハロースの強化されたレベルを作り出すことが有利であることができ；その選択は当業者により容易に決定されることができる。
植物細胞内でのDNAの発現に必要な調節要素の制御下のいずれかのトレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を、特異的にか又は構成的にかのいずれかにおいて、それが活性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を生産することができる限り、使用することができる。配列番号:2中に表された核酸配列、実際には本発明に係るトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするいずれかのオープン・リーディング・フレームが、それによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更する必要性を伴わずに変更されることができる。この事実は、遺伝子コードの縮重により引き起こされる。従って、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするオープン・リーディング・フレームは、選ばれた宿主植物におけるコドンの用い方に改作されることができる。
配列番号:2により表された単離核酸配列も、大腸菌（E.coli）遺伝子から獲得できるDNA−又はRNA断片と他の源からのDNAとのハイブリダイジングにより、他の生物内でトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を同定し、そしてその後それらを単離するために使用されることができる。好ましくは、このようなDNA配列は、ストリンジェント条件（例えば、ハイブリダイゼーション混合物の温度とイオン強度）の下でのハイブリダイジングによりスクリーニングされる。条件がストリンジェントであるかどうかも、ハイブリダイゼーション、すなわちDNA:DNA,DNA:RNA,RNA:RNAの性質並びに最も短いハイブリダイジング断片の長さに依存する。当業者は容易にストリンジェントなハイブリダイゼーション様式を確立することができる。
トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を単離するための源は、微生物（例えば、バクテリア、酵母、真菌）、植物、動物その他を含む。他の源からのトレハロース・ホスフェート活性をコードする単離DNA配列も同様に本発明に係るトレハロースの生産方法において使用されることができる。
また、本発明は、そのアミノ酸配列がトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を完全に廃止しない限り、それが、コードされたタンパク質内でのアミノ酸変化をもたらすように１以上のコドンを突然変異させることにより配列番号:2中に表された核酸配列を修飾することにより得られた核酸配列を包含する。
原則として、植物宿主のいずれも、各植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子との組合せにおいて好適である。他の源からのトレハロース遺伝子が利用可能になるとき、これらは本明細書中に記載するような植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子の組合せを得るための類似の方法において使用されることができる。
内因性スクロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子とADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子の阻害により本明細書中に例示されるような、トレハロース・ホスフェート・シンターゼについての基質利用能を強化するための、内因性遺伝子の阻害は、その選択が本発明に決定的ではない多くの方法においていわれることができる。好ましくは、遺伝子阻害は、いわゆる“アンチセンス・アプローチ”を通じて達成される。ここでは、遮断されるべき酵素活性（例えば実施例におけるAGP−ase又はSPS）をコードするRNAに少なくとも部分的に相補的であるRNAを作り出すDNA配列が発現される。相同アンチセンス遺伝子を使用することが好ましい。なぜならこれらが異種遺伝子よりも効率的であるからである。プローブとしてメイズSPS−遺伝子配列を使用したポテトからのアンチセンスSPSの単離は、この戦略の実行可能性を説明するのに役立つ。本発明の実施のために、相同アンチセンス断片の使用が必要であるということを示すことは意味されない。不所望の酵素活性の合成を遮断する他の方法は、植物宿主内に存在する内因性遺伝子の追加のコピーの植物宿主のゲノム内への導入である。このような遺伝子の追加のコピーはその内因性遺伝子を静まらせることがしばしば観察され；この効果は、同時−抑制的効果（co−suppressive effect）、又は同時抑制（co−suppression）として文献中に言及されている。原則として、双子葉と単子葉植物の両方であって形質転換を受けることができるものが、本発明に係る植物発現性遺伝子を受容体細胞内に導入し、そしてその植物発現性遺伝子を宿し、そして発現する新たな植物を生長させることにより修飾されることができる。好ましい本発明に係る植物は、トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換することができるものであって、かつ、トレハロース分解活性をほとんど又は全く含まないようなものである。トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換する能力を欠く植物も本発明に包含されるということが理解されるであろう。これらの植物は、トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換することができるホスファターゼをコードする追加の遺伝子を導入することによりさらに修飾されることができる。原則として、トレハロースを含む植物も構想される。なぜなら、これらの植物は、このような酵素の活性を阻害することにより、例えば、上記アンチセンス・アプローチを使用してこのような酵素をコードする遺伝子の発現を阻害することにより、トレハロースの生産に好適なものに作られることができるからである。
受容体植物細胞内への植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を導入する方法は、その植物細胞のゲノム中に遺伝子が安定して取り込まれる限り、決定的でない。属アグロバクテリウム（Agrobacterium）の株の使用に加えて、さまざまな他の技術が、植物細胞内へのDNAの導入、例えばカルシウム／ポリエチレン・グリコール法、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション又は（コートされた）粒子ボンバードメント（Potrykus,1990,Bio/Technol.８,535−542）を使用したプロトプラストの形質転換のために利用されることができる。
これらのいわゆる直接DNA形質転換法に加えて、形質転換系関連ベクター、例えばウイルス・ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）由来）とバクテリア・ウイルス（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属由来）が、広く入手可能である（Potrykus,1990,Bio/Technol.８,535−542）。選択及び／又はスクリーニングの後、形質転換されたプロトプラスト、細胞又は植物部分が、本分野において公知の方法（Horsch et al.,1985,Science 225,1229−1231）を使用して、植物全体に再生（regenerate）されることができる。単子葉植物は、形質転換を受けることができ、そして稔性トランスジェニック植物が形質転換された細胞から再生されることができる。植物細胞内への遺伝子材料の導入のための強力な方法と共に、これらの穀物のための再生可能な組織培養系の開発は、形質転換を容易にした。現在、単子葉植物の形質転換の好ましい方法は、体外移植物又は懸濁細胞のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントと直接的DNA取り込み又はエレクトロポレーション（Shimamoto,et al.,1989,Nature 338,274−276）である。トランスジェニック・メイズ植物は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメントにより、メイズ懸濁カルチャーの胚形成細胞内に、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin acetyltransferase）（除草剤ホスフィノトリシンを失活させる酵素）をコードする、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbar−遺伝子を導入することにより得られている（Gordon−Kamm,1990,Plant Cell,２,603−618）。他の単子葉穀物、例えば小麦と大麦の糊粉（aleurone）プロトプラスト内への遺伝子材料の導入も報告されている（Lee,1989,Plant Mol.Biol.13,21−30）。小麦植物は、その胚形成懸濁カルチャーの樹立のために加齢のコンパクト、かつ、こぶ状の胚形成カルス組織だけを選択することにより胚形成懸濁液カルチャーから再生された（Vasil,1990 Bio/Technol.８,429−434）。これらの穀物のための形質転換系との組合せは、単子葉植物への本発明の適用を可能にする。これらの方法は、双子葉植物の形質転換と再生のために適用されることもできる。商業的に重要な穀物、例えばコーンを含む単子葉植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株によるDNA伝達を受け易い（欧州特許第159 418 B1;Gould J,Michael D,Hasegawa O,Ulian EC,Peterson G,Smith RH,（1991）Plant.Physiol.95,426−434）。
宿主植物の選択に関しては、トレハロース分解活性をほとんど又は全くもたない植物種を選択することが好ましい。しかしながら、トレハロース活性を示す植物はトレハロースの生産に好適な宿主植物であることから排除されない。但し、これがトレハロースの蓄積を一緒になって防ぐ場合にはトレハラーゼ活性の阻害を提供することが必要であることができる。このような阻害は、本分野においてよく知られており、そして本明細書中他の目的のために説明されるアンチセンス・アプローチを使用して達成されることができる。
本発明が転写開始領域としてのCaMV 35Sプロモーターの使用に限定されないということも理解されるべきである。マーカー遺伝子、例えば転写開始領域、エンハンサー、非転写リーダーその他を含む植物発現性遺伝子の発現の制御に好適なDNA配列は、植物細胞内で発現されるいずれかの遺伝子、例えば、外因性植物遺伝子、植物細胞内で天然に発現された遺伝子、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）の野生型Ｔ−DNA上に位置するもの、植物ウイルスの遺伝子、並びに真核転写開始のためのコンセンサス配列に一致する転写開始領域を含む他の真核細胞遺伝子から得られることができる。各種プロモーターの機能部分を組合せたハイブリッド・プロモーター、又はそれらの合成等価物も意図される。構成的プロモーターとは別に、誘導プロモーター、又は、それらの発現パターン、例えば発達により又は細胞型に特異的に調節された他のプロモーターは、それらがTPSについての基質を含む植物部分内で発現される限り、本発明に係る植物発現性遺伝子の発現を制御するために使用されることができる。
形質転換された細胞を選択し又はスクリーニングするために、植物細胞に伝達されるべき本発明に係る植物発現性遺伝子に連絡されたマーカー遺伝子を含むことが好ましい。植物形質転換における好適なマーカー遺伝子の選択は、平均的な熟練者の範囲内に十分にあり；定常的に使用されるマーカー遺伝子のいくつかの例は、カナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（EP−B 131 623）、グルタチオン誘導除草剤に対する耐性を付与するラット肝からのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（EP−A 256 223）、グルタミン・シンテターゼ阻害剤、例えばホスフィノトリシン（phosphinothricin）に対して過剰発現の間に耐性を付与するグルタミン・シンテターゼ（WO 87/05327）、選択剤、ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトミセス・ビリドクロモジェン（Streptomyces viridochromogenes）からのアシル・トランスフェラーゼ遺伝子（EP−A 275 957）、Ｎ−フォスホノメチルグリシンに対する耐性を付与する５−エノールシキメート−３−ホスフェート・シンターゼ（５−enolshikimate−３−phosphate synthase（EPSPS））をコードする遺伝子、Bialaphosに対して耐性を付与するbar遺伝子（例えば、WO 91/02071）その他である。マーカーの実際の選択は、それが選ばれた植物細胞との組合せにおいて機能的である（すなわち、選択的である）限り、決定的ではない。
着目のマーカー遺伝子（単数又は複数）は、連結される必要はない。なぜなら、連絡されていない遺伝子の同時−形質転換も植物の形質転換において効率的なプロセスであるからである。
特に双子葉植物についての、形質転換に好ましい植物材料は、容易に形質転換され、そして良好な再生能力をもつことができる葉−皿（leaf−discs）である（Horsch R.B.et al.，（1985）Science 227,1229−1231）。
トレハロースの生産は、単独の炭水化物修飾遺伝子として植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子により達成されることができるけれども、本発明は、トレハロース・ホスフェート・シンターゼについての基質の利用能の増加を行うことができる追加の植物発現性アンチセンス遺伝子の例によりさらに説明される。このような遺伝子の特定の例は、メイズとポテトからのSPSのための植物発現性アンチセンス遺伝子及びポテトからのAGPaseである。アンチセンス・アプローチを使用した炭水化物修飾酵素のダウン・レギュレートは、特定の実施例により限定されない。例えば、部分的に相補的な植物発現性アンチセンス遺伝子は、その標的遺伝子の転写物に十分相補的であり、そしてその標的遺伝子の発現を十分に長く阻害する転写物をその植物発現性アンチセンス遺伝子が作り出す限り、標的遺伝子の発現を阻害するために使用されることができる。
同一植物内の２以上の遺伝子の存在がどのように行われるかは本発明にとっては重要でない。これはとりわけ以下の方法の中の１により達成される：
（ａ）導入されるべき１以上の遺伝子を含む多遺伝子構築物による植物系統の形質転換、
（ｂ）同一植物系統に異なる構築物を同時に同時−形質転換すること、
（ｃ）導入されるべき遺伝子による同一植物の形質転換のその後のラウンド、
（ｄ）各々が、同一植物内に導入されるべき異なる遺伝子を含む、２つの植物の交配。
本発明の適用の分野は、例えば、修飾された植物の改良された特性による、農業と園芸、並びにトレハロースが適用される又はされるであろう産業のいずれかの形態の両方にある。トレハロース・ホスフェートとトレハロースは、そのまま、例えば、精製形態又は混合物において、又は植物部分内の保存生成物の形態において使用されることができる。トレハロース・ホスフェート又はトレハロース（の増加レベル）を宿す植物部分は、トレハロースを添加する必要性を伴わずにそのまま使用されることができる。
また、トレハロースは、それを生産する植物又は植物部分から精製され、そしてその後工業的過程において使用されることができる。食品産業においては、トレハロースは、乾燥前の食品にトレハロースを添加することにより使用されることができる。食品の乾燥は、その産業における重要な保存方法である。トレハロースは、慣用の風乾を通じて食品製品を保存し、そして高品質製品の水の添加の間の速い再構築を可能にするのに特に有用であるようである（Roser et al,July 1991,Trends in Food Science and Technology,pp.166−169）。これらの利点は、天然フレーバー／芳香剤の保持、新鮮製品の味、及び栄養価（タンパク質とビタミン類）を含む。トレハロースがタンパク質と膜を安定化し、そして化学的に不活性で、安定なガラスを形成する能力をもつことが示されている。
上記のように十分に乾燥された食品製品の低い水分活性は、損傷を引き起こすことができるであろう化学反応を防ぐ。
農作物（Field crops）、例えばトウモロコシ（corn）、カッサバ、ポテト、サトウダイコン（sugar beet）とサトウキビ（sugar cane）は、バルク炭水化物製品（デンプンとスクロース）のための天然源として長い間使用されてきている。これらの植物種内のトレハロース−生合成経路の遺伝子操作により容易にされる、上記穀物におけるトレハロースの生産は、トレハロース生産についてこのように遺伝子操作された穀物の市場性開発（exploitation）を可能にするであろう。
本明細書中に引用する文献の全ては、本発明の属する分野における技術水準を示すものである。本明細書中の先又は後に言及された特許その他の刊行物の全てを、あたかもその各々を個々に引用により取り込むように、引用により本明細書中に取り込む。
以下に与える実施例は、実行可能性の目的をもって与えるものであり、本発明の範囲をいかなる方法によるかを問わず限定することを意図されていない。
実験
DNA操作
全DNA手順（大腸菌（E.coli）からのDNA単離、制限酵素処理、ライゲーション、形質転換、等）を標準的なプロトコール（Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York）に従って行った。
株
全実施例において、大腸菌（E.coli）Ｋ−12株DH5αをクローニングのために使用する。植物形質転換実験のために使用されたアグロバクテリウム・チュームファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株は、スペクチノマイシン耐性マーカーによるＴ−DNAの置換によりLBA1010（Koekman et al.（1982）Plasmid 7,119）から誘導された非癌遺伝子オクトピン型ヘルパー株であるMOG101である。
アグロバクテリウム株MOG101の構築
バイナリー・ベクター系（Hoekema A.,Hirsch,P.R.,Hooxkaas,P.J.J.,and Schilperoort,R.A.（1983）Nature 303,179）をポテトとタバコ植物内への遺伝子構築物の伝達のために使用する。Agrobacterium tumefaciens毒性作用を付与するヘルパー・プラスミドはオクトピンTi−プラスミドpTiB6から得られた。MOG101は、Ｔ−領域の全体が欠失され、そしてトランスポゾンTn1831（Hooykaas et al.,1980 Plasmid ４,64−75）からそのバクテリアのスペクチノマイシン（Spectinomycin）耐性マーカーにより置換された非癌遺伝子Ti−プラスミド（Koekman et al.1982、前掲）を担持するAgrobacterium tumefacience株である。
このTi−プラスミドpTiB6は、２つの隣接Ｔ−領域、TL（Ｔ−左）とTR（Ｔ−右）を含む。このTL−とTR−領域を欠く誘導体を得るために、我々は中間体ベクターpMOG579を構築した。プラスミドpMOG579は、（図５と６中で暗くした）pTiB6のＴ領域の外側の左と右に位置する断片に相同な２つのTi−プラスミド断片を含むpBR322である。この２つの断片は、スペクチノマイシン耐性マーカーを担持するトランスポゾンTn1831（Hooykaas et al.,1980 Plasmid ４,64−75）からの2.5kb BamH I−Hind III断片によりpMOG579内で分離される（図６）。このプラスミドを、Agrobacterium tumefaciens株LBA1010〔C58−C9（pTiB6）ヘルパーとしてHB101 8pRK 2013を使用して大腸菌（E.coli）からの３親交配（triparental mating）によりpTiB6が導入されている（Koekman et al.（1982）、前掲）治癒C58株〕内に導入する。トランス接合体を、リファマイシン（20mg/l）とスペクチノマイシン（250mg/l）に対する耐性について選択される。pMOG579とpTiB6との間の２重組換えは、カルベニシリン（carbenicillin）耐性（pBR322マーカー）の損失とＴ−領域全体の欠失をもたらした。カルベニシリン（100mg/l）上にレプリカプレートされた5000のスペクチノマイシン耐性トランス接合体の中で、２つが感受性であることが見つかった。サザン分析（図示せず）は、事件の間の２重交配がＴ領域を完全に欠失させたことを示した。得られた株をMOG101といわれる。この株とその構築物は株GV2260に近似する（Deblaere et al.1985,Nucl.Acid Res.13,4777−4788）。
MOG101のための他のヘルパー株は、例えばLBA4404であり；この株も、バイナリー・プラスミド、例えばpMOG799の導入及びその後の植物形質転換のために好適に使用されることができる。他の好適なヘルパー株も容易に入手可能である。
発現ベクターpMOG180は、pMOG18（EP 0 479 359 A1、実施例2b）の誘導体であって、GUSをコードする遺伝子が除去され、そして他の遺伝子がAlMV RNA4リーダーと３′nosターミネーターの間にBamH I断片として挿入されることができるものである。
この目的のために、35SプロモーターとAlMV RNA4リーダー配列を含む、pMOG18からのEcoR I/Nco I断片を、プライマー・セット５′GTTTCTACAGGACGGAGGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA 3′と５′CAGCTATGACCATGATTACG 3′によるPCR技術により合成し、このようにそのNco I部位をBamH I部位に突然変異させた。pMOG18ベクターを次にEcoR IとBamH Iにより切断し、その後新たに合成されたEcoR I/BamH I断片をこれらの制限部位間にライゲートすることができる。このプロモーター配列中のPCR−誘導ランダム突然変異を回避するために、PCR合成EcoR I/BamH I断片内のEcoR I/EcoR V断片をpMOG18からの野生型配列により置換する。この短いEcoR V/BamH Iを配列決定により突然変異についてチェックする。得られた発現ベクターはプラスミドpMOG180（図７）である。
３親交配（Triparental matings）
上記バイナリー・ベクターを、プラスミドpRK2013（Ditta G.,Stanfield,S.,Corbin,D.,and Helinski,D.R.et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,7347）を含む大腸菌（E.coli）株HB101との３親交配によりアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101内に移動性をもたせ（mobilized）、そして形質転換のために使用した。
タバコ（Nicotiana tabacum SR1）の形質転換
タバコを、記載したような着目のバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101（Hoekema et al.1983,Nature 303,179−180）との植物組織の同時培養により形質転換する。形質転換を、Horsch et al.1985,Science 227,1229−1231により記載されたようなタバコ（Nicotiana tabacum品種Petit Havana SR1）葉皿（leaf disks）の同時培養を使用して行う。トランスジェニック植物を、バイナリー・プラスミド中に存在する耐性遺伝子に依存してカナマイシン又はハイグロマイシンのいずれかを含む選択培地上で生長する菌条（shoots）から再生し、根付けさせ、そして土壌に移す。
ポテトの形質転換
ポテト（Solanum tuberosum品種、
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を、記載したように着目のバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101により形質転換する（Hoekema A.,Huisman,M.J.,Molendijk,L.,Vanden Elzen,P.J.M.,and Cornelissen,B.J.C.（1989）Bio/technology 7,723）。塩基性培養基は、30g/Lスクロース、R3ビタミン（Oohs et al.G.,Burrell,M.M.,Karp,A.,Bevan,M.,and Hille,J.（1989）Theor.Appl.Genet.73,744）、５μＭゼアチン・リボシド（zeatin riboside（ZR））、及び0.3μＭインドール酢酸（LAA）を補ったMS培地（Murashige,T.,and Skoog,F.（1962）Physiol.Plan.14,473）から成るMS30R30である。この培地を適宜0.7g/L Daichin寒天により固化させる。
Solanum tuberosum品種
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の塊茎を皮剥ぎし、そして0.1％Tween−20を含む0.6％次亜塩素酸塩溶液中で20分間、表面滅菌する。これらのポテトを少なくとも２時間大容量の滅菌水中で十分に洗浄する。約2mm厚のディスクを、コルク穴（corkbore）により調製した塊茎組織の筒からスライスした。ディスクを、バイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウムMOG101 106−107バクテリア/mlを含むZRとIAAを含まないMS30R3から成る懸濁液中で20分間インキュベートする。これらのディスクをその後滅菌濾紙上に乾燥ブロットし、ZRとIAAを含む固体MS30R3培地に移転する。ディスクを２日後に100mg/Lセフォタキシム（cefotaxim）と50mg/Lバンコマイシン（vancomycin）を含む新鮮培地に移す。１週間後、ディスクを再び同一培地に移すが、この時、100mg/Lカナマイシンがトランスジェニック菌条について選択するために用いられる。４−８週間後、これらのディスクから生じた菌条を摘出し、そして根付け培地（ZRとIAAを含まないが100mg/Lセフォタキシンと100mg/Lのカナマイシンを含むMS30R3培地）上に植える。これらの菌条を、分裂組織（meristem）切断物により純培養により（axenically）増殖させ、そして根の顕出後に土壌に移す。適宜、10mg/Lのハイグロマイシンを、100mg/Lカナマイシンの代わりに選択のために使用する。
ポテト、品種Kardalの形質転換と本質的に品種
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のためのものと本質的に同様に行った。但し、以下の修飾があった：
塩基性培養基中の植物ホルモン：ゼアチン・リボシド3.5mg/l;IAA（インドール酢酸）0.03mg/l。形質転換において使用されるアグロバクテリウム懸濁液は、１ミリリッター当り105〜106バクテリアを含む。この根付け培地中のカナマイシンの濃度は50mg/lであった。
トレハロース検定
トレハロースをHottiger et al.により本質的に記載されたように測定した（Hottiger at al.（1987）J.Bact.169,5518）。ポテト塊茎組織を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒により粉末化し、そして約３容量の500mMのトリクロロ酢酸中で室温において60分間抽出する。遠心分離の後、ペレットを同一の方法でもう一回抽出する。この２つの抽出からの併合上清をアンスロン（anthrone）陽性材料について検定する（Spiro R.G.（1966）Meth.Enzymol.8,3）。トレハロースをTLCにより定性的に測定する。抽出物を脱イオン化し（Merck,Ion exchanger V）、そしてSilica Gel 60プレート（Merck）上にコードする。クロマトグラフィーの後、プレートをｎ−ブタノール−ピリジン−水（15:3:2、v/v）により顕色する。スポットを濃H2SO4中の5mg/mlバニリンによりスプレーし、そして130℃において加熱することにより可視化する。商業的に入手可能なトレハロース（Sigma）を標準として使用する。
あるいは、トレハロースをパルス・アンペア計（amperometric）検出によりアニオン交換クロマトグラフィーにより定量的に測定した。抽出物を、1gの凍結材料に1mlの沸騰水を添加することにより調製し、これをその後、100℃において15分間加熱した。サンプル（25μｌ）を、４×250mm Dionex 35391 carbopac PA−１カラムと４×50mm Dionex 43096 carbopac PA−１プレカラムを備えたDionex DX−300液体クロマトグラフ上で分析した。溶出は、1ml/分における100mM NaOHによった。糖をパルスアンペア計検出装置（Dionex,PAD−２）を用いて検出した。商業的に入手可能なトレハロース（Sigma）を標準として使用した。
酵素検定
全測定において、非トランスジェニック塊茎材料又は非トランスジェニック・タバコ材料を対照として使用した。全サンプル中のタンパク質含量をBradfordにより記載されたように測定する（Bradford（1976）Anal.Biochem.72,248）。塊茎抽出物についての検出のために、約100mgの冷凍ポテト塊茎スライスを100μl 20mM HEPES pH7.4中でホモジェナイズし、遠心分離した（Eppendorf、最大速度で５分間）。この上清を活性検定のために使用する。
SPS活性−SPS活性をAmir,J.and Preiss,J.（1982）,Plant Physiol.69,1027−1030により本質的に記載されたように測定した。反応混合物の組成を変えることにより、SPSの活性の２つの異なる形態;VmaxとVselを測定することができる。Vmax反応混合物は、50μｌの全容量中、3.2mM UDP−グルコース、81μＭ〔14C〕−UDP−グルコース、3.2mMフルクトース−６−ホスフェート、16mMグルコース−６−ホスフェート、100mM Hepes pH7.4、20mM MgCl2と5mM EDTAを含んでいた。Vsel反応混合物中では、フルクトース−６−ホスフェートとグルコース−６−ホスフェートの濃度は半分であり、そして5mM無機リン酸塩を添加する。対照として、SPS活性を、フルクトース−６−ホスフェートとグルコース−６−ホスフェートを含まないVmax反応混合物中で測定する。反応を30分間室温において行い、そして95℃において５分間加熱することにより終らせる。反応の生成物をアルカリ性ホスファターゼにより処理し、そして得られた〔14C〕−スクロースをイオン交換クロマトグラフィーにより基質から分離する。反応において形成される放射標識されたスクロースの量をシンチレーション−カウンター内で計測する。
TPS活性−TPS活性をSPSについて記載したのと同様の方法で測定した。イオン交換クロマトグラフィー後、サンプルは脱リン酸化されたスクロース及びトレハロースを含んでいた。形成された生成物のどれくらいがトレハロースであるかを測定するために、サンプルを上記のようにTLCにより分離した。抽出物を脱イオン化し（Merck,Ion exchanger V）、そしてSilica Gel 60プレート（Merck）上にロードした。クロマトグラフィー後、〔14C〕−スクロースと〔14C〕−トレハロースを含むスポットを剥ぎ落とし、そしてシンチレーション−カウンター内で計測した。
AGPase活性−AGPase活性を
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により記載されたように測定する
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ADP−グルコースからのグルコース−１−ホスフェートの生産をNAD−ノンリンクしたグルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ系において測定する。この反応検定は、80mM HEPES pH7.4、10mM MgCl2、1mM ADP−グルコース、0.6mM NAD、10μＭグルコース−1,6−ジホスフェート、3mM DTT、0.02％ウシ血清アルブミン、ウサギ筋からの1Uホスホグルコムターゼ（Sigma）、Leuconostoc mesenteroides及び塊茎抽出物からの2.5U NAD−リンク・グルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼを含んでいた。反応を最終濃度2mMまでのピロリン酸ナトリウムの添加により開始した。NAD還元を340nm及び30℃において分光光度計により計測する。AGPase活性のユニットを30℃において１分間に生成した1nモルのグルコース−１−ホスフェートとして定義する。
実施例Ｉ
完全長大腸菌（E.coli）otsA遺伝子のクローニング
大腸菌（E.coli）においては、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ（TPS）は、オペロンotsBA内に位置するotsＡ遺伝子によりコードされている。大腸菌（E.coli）染色体上のこのオペロンの転写の位置と方向は知られている
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こotsＡ遺伝子は、42′に位置し、そしてKaasen et al.によれば、Kohara.et al.（Kohara,Y.,Akiyama,K.,and Isono,K.（1987）Cell 50,495）によるマップの7F11と名付けられたEMBL4ゲノム・クローン内に存在する18.8kb断片上に限定される。DNAをラムダ・クローン7F11の溶解物から調製し、そしてHind IIIにより消化した。単離された2.9kbのHind III断片（挿入物中の14.3kbにおける“右手”のHind III部位は、Kaasen et al.により既に記されたように、Kohara et al.によるマップ上に省略（omitted）された。）をHind IIIにより線状化されたpUC18内でクローン化する。pMOG674と命名された、得られたプラスミドからの2.9kb Hind III挿入物について配列決定する。この配列は、アラビノース輸送オペロンのaraＨ遺伝子（Scripture,J.B.,Voelker,C.,Miller,S.,O'Donnell,R.T.,Polgar,L.,Rade,J.,Horazdovsky,B.F.,and Hogg,R.W.（1987）J.Mol.Biol.197,37）の一部、Kaasen et al.により位置決めされるようなTPPをコードするotsＢ遺伝子、及びTPSをコードするotsＡ遺伝子の一部を含むことが判明した。このotsＡは、Kaasen et al.により記載されたような2.9kb Hind III断片に限定されないことが見つかった。その配列を完成させるために、重複するBamH I/EcoR I断片を単離し、そして部分的に配列決定する。otsＡ遺伝子の完全TPS−コード配列を配列番号:2に示す。使用された制限酵素部位と共に、クローン7F11上のotsＡ遺伝子の位置を図８に示す。Kohara et al.により公開されたマップ上に存在しない追加のHind III部位は、2.9kb Hind III断片の“左手”部位上にある。pMOG180内のHind III部位を以下のオリゴヌクレオチド２本鎖：
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を、Hind IIIにより切断されたpMOG180内にクローニングすることにより、Sst I部位により置換する。得られたベクターをpMOG746と名付ける。以下のオリゴヌクレオチド２本鎖：
0003645260.tif 000009
を、BamH Iにより線状化されたベクターpMOG746内にクローン化する。（制限酵素消化によりチェックされた）所望の方向においてオリゴヌクレオチド２本鎖をもつベクターをpMOG747と名付ける。プラスミドpMOG674の2.9kb Hind III断片を、Hind IIIにより線状化されたpMOG747内にクローン化して、ベクターpMOG748を得る。pMOG748の約2.4kb EcoR V/Sst Iと約3.5kbのSst I/Sma I断片を単離し、ライゲートし、そして大腸菌（E.coli）内に形質転換し、このように、2.9kbのHind III断片の３′末端を欠失させる。得られたプラスミドをpMOG749と名付ける。otsＡ遺伝子の５′末端を鋳型としてpMOG749を用いて、合成オリゴヌクレオチドTPS1とTPS2を使用するPCRにより合成する。
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配列決定により、この0.4kb PCR断片が正しい配列をもつことが確かめられる。pMOG749の1kb BamH I/Hind III断片を、Xma IとHind IIIにより線状化されたpMOG747内の0.4kb Xma I/BamH I PCR断片と一緒にクローン化する。Hind IIIとSst Iにより消化されて得られたプラスミド内において、合成オリゴヌクレオチド２本鎖TPS 6/7をクローン化し、TPSの３つのＣ−末端アミノ酸をコードする。
0003645260.tif 000011
Hind IIIとSst Iにより消化されて得られたプラスミドにおいて、プラスミドpMOG749の0.25kb Hind III/Sst I断片をクローン化し、これは、アグロバクテリウム・チュームファシエンス・ノパリン・シンターゼ（NOS）遺伝子由来のターミネーターを含んで成り、プラスミドpMOG798をもたらす。このプラスミドは、ダブル・エンハンサーをもつカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35Sプロモーターの制御下に正しい方向で大腸菌（E.coli）のotsＡ遺伝子（Guilley et al.（1982）Cell 30,763）、アルファルファ・モザイク・ウイルス（AMV）RNA4リーダー配列（Brederode et al.（1980）Nucl.Acids Res.8,2213）とアグロバクテリウム・チュームファシエンス由来のノパリン・シンターゼ転写ターミネーター配列を含む。発現カセット全体が、EcoR IとSst Iにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG23内に2.5kbのEcoR I/Sst I断片としてクローン化される。得られたバイナリー・ベクター、pMOG799（図９）をポテトとタバコを形質転換するために使用する（pMOG799を宿す大腸菌（E.coli）株を、受託番号CBS 430.93の下、1993年８月23日に、Centraal Bureau voor Shimmelcultures,Phabagen collections,Padualaan 8,Utrecht,The Netherlandsに寄託されている;pMOG23は、受託番号CBS 102.90の下、1990年６月29日に、上記CBSに寄託されている。）。
実施例II
pMOG799により形質転換されたタバコにおけるトレハロース生産
タバコの葉のディスクをAgrobacterium tumefaciensを使用してバイナリー・ベクターpMOG799により形質転換する。多数の20の独立したトランスジェニック菌条をトレハロース・ホスフェート・シンターゼ（TPS）活性について分析する。インビトロにおいて生長させたいくつかのタバコ植物が、形質転換された植物に比べてかなり太い根をもつことが見つかった。これらのトランスジェニック・タバコ植物の根の分析は、非トランスジェニック対照植物と比較するときトレハロースの上昇レベルを示す。
実施例III
pMOG799により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産
ポテト塊茎ディスクはアグロバクテリウム・チュームファシエンスを使用してバイナリー・ベクターpMOG799により形質転換された。トランスジェニック菌条をカナマイシンに対して選択する。多数の20の独立したトランスジェニック菌条をトレハロース・ホスフェート・シンターゼ（TPS）活性について分析する。この酵素を含むことが判明している菌条を成熟植物に生長させる。これらのトランスジェニック・ポテト植物の成熟塊茎の分析は非形質転換対照植物に比較するときトレハロースの上昇レベルを示す。トランスジェニック植物系統MOG799.1をさらなる研究のために増やした。
実施例IV
pMOG664の構築
ポテト塊茎品種
0003645260.tif 000012
からのADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ（AGPaseB）の小サブユニットのcDNA配列に一致するオリゴヌクレオチド
0003645260.tif 000013
を合成する：
0003645260.tif 000014
これらのオリゴヌクレオチドは、これらの酵素による消化後にアンチセンス方向において発現カセット内でのアセンブリーを可能にするようにそれらの末端において好適な制限酵素部位（BamH IとNco I、下線）を含むように改作される。約1kbの断片を、鋳型として２月齢の葉組織から調製したポテト品種
0003645260.tif 000015
からのcDNAライブラリーから単離されたDNAを使用して、これらのオリゴヌクレオチドを用いてPCR増幅する。配列決定により、この断片がポテト品種
0003645260.tif 000016
からのAGPaseB配列と同一であることが示される
0003645260.tif 000017
BamH IとNco Iによる消化の後、断片を、BamH IとNco Iにより線状化されたpMOG18内でクローン化する。得られたプラスミドから、（アンチセンス方向において、CaMV 35Sプロモーター、AMV RNA4リーダー、及びAGPase断片を含む）1.85kb EcoR I/BamH I断片、並びにアグロバクテリウム・チュームファシエンスからのノパリン・シンターゼ（NOS）遺伝子からのターミネーターを含むBamH I/Hind III断片を、EcoR IとHind IIIにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG22内で３方向ライゲーションにおいてクローン化する。このバイナリー・ベクターpMOG22は、トランスジェニック植物内のハイグロマイシン選択のための植物発現性HPTII遺伝子を含む（pMOG22は、受託番号101.90の下、1990年１月29日に、Centraal Bureau voor Schimmelculturesにおいて寄託されている）。得られたバイナリー・ベクターpMOG664（図４）をポテト形質転換のために使用する。
実施例Ｖ
pMOG801の構築
メイズ・スクロース・ホスフェート・シンターゼ（SPS）cDNAの配列に相補的なオリゴヌクレオチドのセット（Worrell,A.C.,Bruneau,J−M.,Summerfalt,K.,Boersig,M.,and Voelker,T.A.（1991）Plant Cell 3,1121）を合成する。それらの配列は以下のようなものである：
0003645260.tif 000018
これらのオリゴヌクレオチドを、鋳型として２月齢の葉組織（Clontech）から調製したポテト品種
0003645260.tif 000019
ライブラリーから単離したDNAを使用して370塩基対のDNA断片をPCR増幅するために使用する。この断片の配列決定により、それがメイズのSPS配列に相同であることが示される（図３及びWorrell et al.（1991）参照）。このPCR断片を、２月齢の葉組織（Clontech）から調製したポテト品種
0003645260.tif 000020
ライブラリーのラムダgt10ライブラリーをスクリーニングするために使用する。１の陽性ハイブリダイジング・クローンの挿入物を配列決定する。654塩基対のDNA断片の配列は、メイズSPS配列の対応部分と65％同一であることが判明している（Worrell et al.（1991）中の図11中のヌクレオチド番号349から始まる。）。このクローンのEcoR I挿入物を、以下の合成オリゴヌクレオチド２本鎖との３方ライゲーションにおいて、BamH Iにより消化されたpMOG180内でクローン化する。
0003645260.tif 000021
CaMV 35Sプロモーターに対してアンチセンス方向においてSPS断片をもつプラスミドをpMOG787と命名する。プラスミドpMOG787のEcoR I/Hind IIIを以下の合成リンカー：
0003645260.tif 000022
との３方ライゲーションにおいて、EcoR Iにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG22内にクローン化する。このバイナリー・ベクターpMOG22はトランスジェニック植物内にハイグロマイシン選択についての植物発現性HPTII遺伝子を含む（pMOG22は受託番号101.90の下、1990年１月29日に、Centraal Bureau voor Schimmelculturesに受託されている。）。得られたバイナリー・ベクターpMOG801（図10）をポテト形質転換のために使用する。
実施例VI
pMOG802の構築
アンチセンスSPS発現カセットを含む、プラスミドpMOG801のEcoR I断片を、EcoR Iにより線状化された、（アンチセンスAGPaseカセットを含む）バイナリー・ベクターpMOG664内でクローン化する。得られたバイナリー・ベクターをpMOG802という（図11）。
実施例VII
pMOG799とpMOG664により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産
TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンスAGPase発現カセットを含む、バイナリー・ベクターpMOG664により形質転換する。10mg/Lハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRによりTPS及びアンチセンスAGPase配列の存在について分析する。両方を含むトランスジェニック植物をTPSとAGPase活性について分析する。
AGPase活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、AGPaseのためのmRNAレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そしてAGPaseの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。
実施例VIII
pMOG799とpMOG801により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産
TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンスSPS発現カセットを含む、バイナリー・ベクターpMOG801により形質転換する。10mg/Lハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRによりTPS及びアンチセンスSPS配列の存在について分析する。両方を含むトランスジェニック植物をTPSとSPS活性について分析する。
SPS活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、SPSのためのmRNAレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そしてSPSの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。
実施例IX
pMOG799とpMOG802により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産
TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンスSPS及びAGPase発現カセットを含む、バイナリー・ベクターpMOG802により形質転換する。10mg/Lハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRによりTPS、アンチセンスAGPase及びアンチセンスSPS配列の存在について分析する。３つの構築物の全てを含むトランスジェニック植物をTPS,AGPaseとSPS活性について分析する。
AGPaseとSPS活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において両酵素についての活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、AGPaseとSPSのためのmRNAレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そしてSPSの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。
受託された株
pMOG22 ;受託番号CBS 101.90（23頁18−21行;24頁21−23行）
pMOG23 ;受託番号CBS 102.90（22頁11行）
pMOG799;受託番号CBS 430.93（22頁６行）
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称:MOGEN International N.V.
（Ｂ）街  :Einsteinweg 97
（Ｃ）市  :LEIDEN
（Ｄ）州  :Zuid−Holland
（Ｅ）国  :The Netherlands
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:NL−2333 CB
（Ｇ）電話：（31）．（71）.258282
（Ｈ）ファックス：（31）．（71）.221471
（ii）発明の名称：植物におけるトレハロースの生産
（iii）配列の数:17
（iv）コンピュータ読込み形態：
（Ａ）媒質型：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換性
（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25（EPO）
（Ｖ）本出願データ：
出願番号:WO PCT/EP93/02290
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:370塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:2本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名:Solanum tuberosum
（Ｂ）株  名:Desiree
（Ｆ）組織の種類：葉
（xi）配列番号:1:
0003645260.tif 000023
（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:1446塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:2本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名:Escherichia coli
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン:7F11
（viii）ゲノム内での位置：
（Ｂ）染色体上の位置:41−42′
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）位置:19..1446
（Ｄ）他の情報:/生成物＝“trehalose phosphate synthase"
／遺伝子＝“otsA"
（xi）配列番号:2:
0003645260.tif 000024
0003645260.tif 000025
0003645260.tif 000026
（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:476アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列番号:3:
0003645260.tif 000027
0003645260.tif 000028
0003645260.tif 000029
（２）配列番号:4の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:22塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:4:
0003645260.tif 000030
（２）配列番号:5の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:22塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:5:
0003645260.tif 000031
（２）配列番号:6の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:33塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:6:
0003645260.tif 000032
（２）配列番号:7の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:35塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:7:
0003645260.tif 000033
（２）配列番号:8の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:18塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:8:
0003645260.tif 000034
（２）配列番号:9の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:18塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:9:
0003645260.tif 000035
（２）配列番号:10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:24塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:10:
0003645260.tif 000036
（２）配列番号:11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:24塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:11:
0003645260.tif 000037
（２）配列番号:12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:23塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:12:
0003645260.tif 000038
（２）配列番号:13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:25塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:13:
0003645260.tif 000039
（２）配列番号:14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:16塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:14:
0003645260.tif 000040
（２）配列番号:15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:16塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:15:
0003645260.tif 000041
（２）配列番号:16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:13塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:16:
0003645260.tif 000042
（２）配列番号:17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ:13塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（xi）配列番号:17:
0003645260.tif 000043
【図１】
0003645260.tif 000044
【図２】
0003645260.tif 000045
【図３】
0003645260.tif 000046
【図４】
0003645260.tif 000047
【図５】
0003645260.tif 000048
【図６】
0003645260.tif 000049
【図７】
0003645260.tif 000050
【図８】
0003645260.tif 000051
【図９】
0003645260.tif 000052
【図１０】
0003645260.tif 000053
【図１１】
0003645260.tif 000054