(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）神経栄養因子タンパク質が生産されるような細菌発現系において神経栄養因子をコードする遺伝子を発現させ；
ｂ）尿素中で、上記神経栄養因子を可溶化し；
ｃ）上記神経栄養因子をスルホニル化し；
ｄ）スルホニル化された神経栄養因子を単離精製し；
ｅ）スルホニル化された神経栄養因子を200-300の間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で再生して、生物学的に活性な神経栄養因子を与え；さらにｆ）生物学的に活性な神経栄養因子を精製すること、を含んでなる、上記神経栄養因子がＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＮＴ３またはＮＴ４からなるグループから選択される、生物学的に活性な組換え神経栄養因子を製造するための方法。
【請求項２】
上記神経栄養因子遺伝子がヒトＮＧＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記神経栄養因子遺伝子が動物ＮＧＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
神経栄養因子遺伝子が第１図の配列（配列番号１）を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
神経栄養因子遺伝子がヒトＢＤＮＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
神経栄養因子遺伝子が第１図の配列（配列番号２）を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記神経栄養因子が８Ｍ尿素で可溶化される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＰＥＧが15-20%（重量／容量）の濃度で存在し、尿素が4.5-5.5Mの濃度範囲で存在し、神経栄養因子の最終タンパク質濃度が約0.1mg/mlであって、再生段階が約１０℃の温度で行われる、請求項１記載の再生段階。
【請求項９】
Ｌ−システインまたはシステアミンの一方を添加することによって再生を開始する、請求項１または７記載の再生段階。
【請求項１０】
スルホニル化神経栄養因子が陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離精製される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
スルホニル化神経栄養因子が濃縮および透析濾過を利用して単離精製される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
生物学的に活性な神経栄養因子が陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ａ）大腸菌発現系に神経栄養因子の生産を指示するための合金神経栄養因子ＤＮＡ遺伝子を構築すること；
ｂ）大腸菌発現系において上記神経栄養因子を発現させること；
ｃ）上記神経栄養因子を可溶化し、スルホニル化すること；
ｄ）完全な生物学的活性のために必要な正しい三次構造が得られるように、スルホニル化された神経栄養因子を200-300の間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で再生すること；
ｅ）完全な生物学的活性を有する神経栄養因子を精製すること；
を含んでなる、上記神経栄養因子がＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＮＴ３またはＮＴ４からなるグループから選択される、生物学的に活性な組換え神経栄養因子を製造するための方法。
【請求項１４】
上記神経栄養因子遺伝子がヒトＮＧＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記神経栄養因子遺伝子が動物ＮＧＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
神経栄養因子遺伝子が第１図の配列（配列番号１）を含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
神経栄養因子遺伝子がヒトＢＤＮＦをコードするＤＮＡを含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
神経栄養因子遺伝子が第１図の配列（配列番号２）を含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
上記神経栄養因子が８Ｍ尿素で可溶化される、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
ＰＥＧが約20%（重量／容量）の濃度で存在し、尿素が4.5-5.5Mの濃度範囲で存在し、神経栄養因子の最終タンパク質濃度が約0.1mg/mlであって、再生段階が約１０℃の温度で行われる、請求項１３記載の再生段階。
【請求項２１】
Ｌ−システインまたはシステアミンの一方を添加することによって再生を開始する、請求項１３または１９記載の再生段階。
【請求項２２】
スルホニル化神経栄養因子が陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離精製される、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
スルホニル化神経栄養因子が濃縮および透析濾過を利用して単離精製される、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
生物学的に活性な神経栄養因子が陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する組換え神経増殖因子を生産するための方法に関する。特に、本発明は生物学的に活性な組換えＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＮＴ３およびＮＴ４を生産するための方法を記述する。
発明の背景
神経栄養因子は天然に存在するタンパク質であって、神経系または神経系によって支配される非神経組織に見いだされ、その機能は、神経および／またはグリア細胞の生存を助け、その表現型分化を維持することである（Varon and Bunge（1978）Ann.Rev.Neurosc.1:327;Thoenen and Edgar（1985）Science 229:238）。In vivoでの研究により、様々な内因性および外因性神経栄養因子が、虚血性、低酸素性、またはその他の疾病によって引き起こされた損傷を受けた後の神経細胞に対して栄養効果を示すことが明らかになった。明確な神経栄養因子の例は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、およびインスリン様増殖因子Ｉ及びII（ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−II）を包含する。
ｂＦＧＦおよびＣＮＴＦのような一部の神経栄養因子は、広範な栄養結果を有すると考えられ、多くの異なったタイプの神経細胞の生存を助け、機能を維持する。他の神経栄養因子は、もっと狭い、より特異的な栄養効果を有し、上記より少ないタイプの細胞の生存を助ける。たとえば、末梢神経系において、ＮＧＦは感覚神経および交感神経といった、ある特定の神経細胞タイプのニューロンの生存および軸索の伸長を増進する（Ebendalら、（1984）Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development,Ch.15,.Black,I.B.編）。しかしながら、中枢神経（ＣＮＳ）において、ＮＧＦは大脳基底核のコリン作動性ニューロンの生存も維持する（Whittemoreら、（1987）Brain Res.Rev.12:439-464）。
分子量12,300の塩基性のタンパク質、ＢＤＮＦは、ＮＧＦに対して反応しないある種の感覚神経ニューロンを維持する（Bardeら、（1982）EMBO J.1:549-553、およびHoferおよびBarde（1988）Nature 331:261-262）。ニューロトロフィン３（ＮＴ３）は、後根神経節ニューロンおよび三叉神経中脳路核の刺激感受性ニューロンの生存を維持する。分子量約23,000のタンパク質、ＣＮＴＦは、副交感神経の毛様体神経節ニューロン、交感神経ニューロン、感覚神経の後根神経節ニューロン、およびＣＮＳにおける運動ニューロンを維持する（Kandelら、（1991）Principles of Neural Science,第３版、Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,NY）。
いくつかの神経栄養因子は、約５０％のアミノ酸相同性によって特徴づけられる一つの神経栄養因子ファミリーを構成する。こうしたファミリーの一つがＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーであって、これはＢＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ３およびＮＴ４を包含する（Hohnら、WO91/033569;米国特許出願番号第07/680,681号）。ＮＧＦおよびＢＤＮＦはいずれも、おそらく後でタンパク質加水分解切断によるプロセシングを受けて成熟神経栄養因子を生じるような、成熟分子より大きな前駆体として合成される（Edwardsら、（1986）Nature 319:784;Leigrockら、（1989）Nature 319:149）。成熟ＮＧＦ（複数）および成熟ＢＤＮＦには、アミノ酸配列に有意な類似性があり、その類似性は全６個のシステインアミノ酸残基の相対的な位置を包含する。システイン残基の位置は、調べたすべての動物種の成熟ＮＧＦ（複数）およびＢＤＮＦにおいて同一である（Leigrockら、(1989)上記）。ヒトＢＤＮＦ（配列番号３）およびＮＧＦ（配列番号４）の類似性を比較し強調する第２図を参照のこと。上記は、ジスルフィド結合の位置によって推定されるように、成熟タンパク質の三次構造が類似していることを示唆する。成熟ＮＧＦ（複数）およびＢＤＮＦタンパク質は塩基性等電点（ｐＩ）も共通である。
ＮＧＦは少なくとも大脳基底核におけるコリン作動性ニューロンに対する神経栄養因子である（HeftiおよびWill(1987) J.Neural Transm.[Suppl](AUSTRIA)24:309）。アルツハイマー病の経過において、ＮＧＦに反応する大脳基底核コリン作動性ニューロンの機能上の不活化および変性が、この疾病にともなう認識および記憶の欠損の主因であると考えられる（HeftiおよびWill（1987）上記）。アルツハイマー病に関する動物モデルにおいて、ＮＧＦが大脳基底核コリン作動性ニューロンの変性を防ぎ、機能を回復させることが明らかになり、これに基づいて、アルツハイマー病において上記ニューロンの変性を防ぎ、機能を回復させるための治療法としてＮＧＦが提案された（Williamsら．（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9231;Hefti（1986）J.Neuroscience 6:2155;Kromer（1987）Science 235:214;Fischerら、（1987）Nature 329:65）。
ＢＤＮＦは末梢神経における感覚ニューロンに対する神経栄養因子である（Barde（1989）Neuron 2:1525）。これに基づいて、様々な末梢神経障害で起こる感覚神経細胞に対する損傷にともなう感覚喪失の治療にＢＤＮＦが有用であることが判明するかもしれない（Schaumbergら、(1983)Disorders of Peripheral Nervesより，F.A.Davis Co.,Philadelphia,PA）。
特定の神経栄養因子が可能性として神経損傷の治療において有用となるためには、薬物治療に使用するに十分な量入手できなければならない。また、神経栄養因子はタンパク質であるので、異種タンパク質に対する免疫学的な反応を避けるために、ヒトの患者にはヒト型のタンパク質のみを投与することが望ましい。神経栄養因子は一般に組織中には極微量しか存在せず（例、HoferおよびBarde（1988）Nature 331:261;Linら（1989）Science 246:1023）、さらに人の組織を抽出するために入手するのは容易ではないため、薬剤としての量のヒトの神経栄養因子を直接ヒト組織から調製することは不都合であると考えられる。そのかわりに、単離されたヒト神経栄養因子の遺伝子を用いて、組換え発現系においてヒトタンパク質を可能性としては量的に無制限に生産することが望ましい。
ヒトまたは動物神経栄養因子遺伝子が真核細胞発現系で発現される場合には、成熟した生物学的に活性な神経栄養因子を生産することができる（例、Edwardsら、（1988）Molec.Cell.Biol.8:2456）。このような系においては、完全な長さを有する神経栄養因子前駆体をまず合成し、次にタンパク質加水分解によってプロセシングとして、正確な３次元の折りたたみ構造を有し、完全に生物学的に活性な成熟神経栄養因子を生産する。しかしながら、真核細胞発現系が生産するタンパク質は細胞グラム当たり比較的低収量であることが多く、製造に使用するには比較的経費がかかる。
これに対して、細菌のような原核細胞を用いる発現系は、一般に細胞グラム当たり比較的大量の発現タンパク質を生産し、製造に使用するには比較的経費がかからない。しかしながら、生物学的活性を有する、細菌−発現神経栄養因子を得ることは、この分野においてこれまできわめて困難であった。細菌は、正しい小さな成熟タンパク質を生産するために、ＮＧＦの前駆体タンパク質のような前駆体タンパク質を、適当なタンパク質加水分解切断を行うことによって正しくプロセシングすることができない。したがって、細菌において成熟神経栄養因子を生産するためには、大きな前駆体分子のＤＮＡ配列ではなく、成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列のまさにその部分だけを発現させる必要がある。これが大腸菌（E.coli）において達成された場合、比較的大量の成熟ヒトＮＧＦタンパク質が生産された（参照例、iwaiら、（1986）Chem.Parm.Bull.34:4724;Dicouら、（1989）J.Neurosci.Res.22:13;European Patent Application 121,338）。残念ながら、この細菌で発現されたタンパク質は明白な生物学的活性を有していなかった。
組換え哺乳動物タンパク質の細菌による生産は、封入体を形成して生物学的に不活性なタンパク質に帰着することが多い。このため、封入体を他の細胞成分から分離し、封入体を可溶化してタンパク質をほぐすことが必要になる（Spalding（1991）Biotechnology 9:229）。上記のような生物学的活性の欠落について考えられる理由は、成熟タンパク質が自然発生的に正しい三次構造をとることができず、完全な生物学的活性に必要とされる正しい分子内ジスルフィド結合パターンを形成することができないことである。プロセシングは、封入体を分離および可溶化すること、タンパク質をほぐすこと、次に、正しい、生物学的活性を有する三次構造にタンパク質を再生することを包含する。しかしながら、再生しているときに、タンパク質が再凝集し、活性タンパク質の収量が減少し、精製過程がさらに複雑化することが考えられる（Spalding（1991）上記）。
ＮＧＦをほぐし、再生工程のプロトコルが記載されている（例、欧州特許出願第336,324号、米国特許第4,511,503号および第4,620,948号）。しかしながら、上記のプロトコルは、重大な欠点を有する。多くのプロトコルは、間違って形成されたジスルフィド結合を切断するためにＮＧＦの高ｐＨへの暴露を利用し、次に、正しい分子内ジスルフィド結合を形成させるために低いｐＨに暴露する。ＮＧＦを高いｐＨに曝すと、結果として、グルタミンやアスパラギンのアミン側鎖（成熟ヒトＮＧＦ中に７個存在する）の脱離を包含するタンパク質の多くの修飾、およびアスパラギン−グリシン、アスパラギン−セリン、およびアスパラギン−スレオニン隣接対（成熟ヒトＮＧＦ中に２個存在する）の多くの化学変化に帰着することが知られている。こうした化学修飾に加えて、再生処理はＮＧＦの生物学的な活性のわずか１０分の１程度しか回復させないと思われた。タンパク質を再生し、復元するための、過酷な条件をともなわない多数の工程記録が存在するが、そうした工程はいずれも、ＮＧＦにうまく当てはめられなかった。再生工程の総説に関しては、Kohno（1990）Methods Enzymol.185:187を参照のこと。
細菌の発現系で生産される生物学的に活性なタンパク質の回収率を向上させるために様々な方法が利用されてきた。間違って形成されたジスルフィド結合を切断するための方法の一つは、亜硫酸分解によって得られるＳ−スルホン化タンパク質の利用である（米国特許出願第4,421,685号；GonzalezおよびDamadaran（1990）J.Agric.Food Chem.38:149;欧州特許出願第361,830号）。タンパク質に亜硫酸を添加することによって、まず、その溶液に曝されたジスルフィド結合を切断し、その結果、切断されたジスルフィド結合それぞれについて一つのＳ−ＳＯ3-誘導体および一つの遊離のＳＨ基が形成される。酸化剤の存在下で、遊離のＳＨ基を酸化してジスルフィドに戻し、系に存在する亜硫酸によって再び切断する。タンパク質中のすべてのジスルフィド結合およびスルフヒドリル基がCys−ＳＯ3-に変換されるまで、このような反応サイクルを反応する。一般に、上記によりほとんどのタンパク質を完全に可溶化することができる（欧州特許出願第361,830号）。
細菌の発現系からの生物学的に活性なタンパク質の回収率を向上させるためのもう一つの方法は、再生混合物におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の利用を包含する。再生過程で疎水性中間体の会合に起因するタンパク質の凝集をＰＥＧの添加が防ぐことが提示された。Clelandら、（1990）Biotechnology 8:1274および（1992）J.Biol.Chem.267:13327は、再生過程の間のＰＥＧを添加することによって、生物学的に活性なウシカルボニックアンヒドラーゼＢ（ＣＡＢ）の回収率が向上することを報告した。活性タンパク質の回収率の増加を達成するために必要なＰＥＧの濃度は、総タンパク質濃度の２倍であり、分子量1000-8000のＰＥＧが必要とされた（Clelandら、(1992)上記）。
ＮＧＦ生産のための細菌発現系は、カナダ特許第1,220,736号および米国特許第5,169,762号に開示されている。しかしながら、発現されたタンパク質を再生するための方法は、何も示されていない。薬剤としての利用に適した大量の生物学的に活性な組換えＮＧＦを生産するための方法は、Production of Biologically Active,Recombinant Members of the NGF/BDNF Family of Neurotrophic Proteinsとの表題で、Collinsらにより1993年7月6日に出願された米国特許出願第08/071,912号に記述されている。タンパク質を塩酸グアニジンまたは尿素のような変性剤、およびβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、またはシステインのような十分な還元剤に曝して、タンパク質を変性させ、非共有結合相互作用を途絶し、ジスルフィド結合を還元する。次に、還元されたタンパク質中の遊離のチオールを酸化し、タンパク質が正しいジスルフィド結合を形成するようにさせる。再生混合物は、望ましいことに、２５％までのＰＥＧ200または300を含有した。
米国特許出願第08/087,912号に記述された方法によって、生物学的に活性なＮＧＦの収率の向上が達成されるが、ＮＧＦを再生するためのもっと有効な方法がまだなお必要である。組換えタンパク質の細菌による生産の結果、細菌細胞内に封入体として見いだされる生物学的に不活性なタンパク質を生じる。封入体を他の細胞成分から分離し、封入体を可溶化してタンパク質をほぐすための改良された処理方法が必要とされる。さらに、タンパク質の化学的な修飾を減少させる一方で、間違って形成されたジスルフィド結合を破壊し、完全に活性なタンパク質の最大収率のために必要な正しい三次構造になるようにタンパク質を再生するための改良法が必要である。
本明細書は、細菌で発現され、生物学的活性を有する、神経栄養因子のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する因子を生産するための拡張し改良された方法を提示するが、これは神経栄養因子を可溶化し、化学的に修飾するための、最初の亜硫酸分解プロセスの利用を包含する。
本発明の簡単な要約
本発明は、
ａ）神経栄養因子タンパク質が生産されるような細菌発現系においてその神経栄養因子をコードする遺伝子を発現させ；
ｂ）尿素中で、当該神経栄養因子を可溶化し；
ｃ）当該神経栄養因子をスルホニル化し；
ｄ）スルホニル化された神経栄養因子を単離精製し；
ｅ）スルホニル化された神経栄養因子を再生して、生物学的に活性な神経栄養因子を与え；さらに
ｆ）生物学的に活性な神経栄養因子を精製すること、
を含んでなる、治療への利用に適した、完全に生物学的に活性な状態のＮＧＦ／ＢＤＮＦ群に属する成熟タンパク質を生産するための方法を開示する。
スルホニル化された神経栄養因子は陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製された、２０％ポリエチレングリコール300（ＰＥＧ300）の存在下で、これを再生する。再生した神経栄養因子を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
前記の一般的な記述と以下の詳細な記述はいずれも例証し説明するためだけのものであり、請求項のように本発明を限定するものではないと理解されるべきである。添付の図面は明細書に編入され、その一部を構成するものであるが、それらは本発明の様々な実施態様を説明し、さらに本文の記述とともに本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトＢＤＮＦ（配列番号１）およびＮＧＦ（配列番号２）の核酸配列を比較する。ダッシュで示されるギャップは、アミノ酸配列を整列させるために使われるギャップの位置に相当する。
第２図は、ヒトＢＤＮＦ（配列番号３）およびＮＧＦ（配列番号４）のアミノ酸配列を比較する。成熟タンパク質の推定配列を太字で示す。ダッシュで示されるギャップは、配列を増やすために、配列中に配置された。ＢＤＮＦおよびＮＧＦに見られる６個のシステインは、同一位置に見いだされ、一緒に示される。
第３図は、大腸菌に挿入されて、成熟ＮＧＦタンパク質として発現される、合成ＮＧＦ配列（配列番号５）を示す。
第４図は、ＮＧＦ配列を修正するために使用される、Mut１（配列番号６）、Mut２（配列番号７）、およびMut３（配列番号８）オリグヌクレオチド配列を示す。
第５図は、ＮＧＦの発現を増殖するために用いられるSyn ＮＧＦ５Ｐオリゴヌクレオチド（配列番号９）を示す。
第６図は、ＴＰ（ＴＮＦ結合タンパク質）ＮＧＦＲＥＰ構築物を作成するために使用されるＴＰＮＧＦ（配列番号１０）およびＲＥＰＮＧＦ（配列番号１１）オリゴヌクレオチド配列を示す。
第７図は、ＴＰΔ５３核酸配列（配列番号１２）を示す。
第８図は、ＴＰＮＧＦ（２スタート−）ＲＥＰ構築物を作成するために使用されたオリゴヌクレオチド配列を示す。
第９図は、本発明の工程に関するプロセスフローチャートを示す。
望ましい実施態様の説明
ここで本発明の現時点で望ましい実施態様に詳細に論及するが、これは、下記の実施例とともに、本発明の原理を説明するために有用である。
本発明は、引用として特にここに編入される先出願、米国特許出願第08/087,912号に開示される内容から範囲を拡張し、改良された、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属し、細菌で発現され、生物学的活性を有する神経栄養因子を生産するための方法である。
ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属し、完全な生物学的活性を有する成熟ヒト組換え神経栄養因子を得るための本発明の製造方法は下記を含んでなる：
ａ）細菌発現系において神経栄養因子を発現させること；
ｂ）神経栄養因子を可溶化し、スルホニル化すること；
ｃ）完全な生物学的活性のために必要な正しい三次構造が得られるように、スルホニル化された神経栄養因子を再生すること；および
ｄ）完全な生物学的活性を有する神経栄養因子を精製すること。
本発明は、神経増殖因子（ＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ファミリーに属する組換え神経栄養因子を効率的に生産するための改良された方法に関する。本文に記載された発明は、ある「ファミリー」の神経栄養増殖因子を、治療用途に適した、不純物を含まず生物学的活性を有する形で生産する方法である。ＮＧＦは、生物における生理的な役割は異なるらしいが構造的に関連性のある一群の神経栄養タンパク質の一つであって、そのファミリーを構成する個々のタンパク質は異なるタイプの反応ニューロンに作用する。ＮＧＦファミリーを構成する公知のタンパク質は、ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＮＴ３およびＮＴ４を包含する。これらのそれぞれは、有意な相同性を有し、システイン残基の数および位置が同一である。本発明は、ヒトＮＧＦまたはＢＤＮＦと同一ではないが、そのファミリーを定義づけることのできる特徴に関して明白にＮＧＦまたはＢＤＮＦと関連づけられるようなタンパク質をコードする組換えタンパク質を包含する。こうした特徴は、下記の一つまたはそれ以上を包含する：適当なバイオアッセイにおける神経栄養活性：アミノ酸の同一性および保存的な置換を包含するアミノ酸配列の有意な相同性；アミノ酸配列におけるシステイン残基の位置の保存；タンパク質の分泌に関する疎水性シグナル配列；成熟型へのタンパク質加水分解的プロセシングに関するシグナル配列；および／またはプロセシングを受けたタンパク質の塩基性等電点。
本文で使用されるように、「生物学的活性」という用語は、ＮＧＦに適用される場合には、ＮＧＦの生物学的活性、すなわち、たとえば、実施例３に記載のバイオアッセイにおいてニワトリ胚交感神経および後根神経節ニューロンの生存を助ける活性を有するタンパク質を意味する。ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの他のタンパク質については、「生物学的活性」は適当なバイオアッセイにおける神経栄養活性を意味する。
本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養タンパク質と生物学的に等価なあらゆる起源の神経栄養タンパク質の生産を包含する。望ましい実施態様において、本発明は、成熟ヒト神経栄養タンパク質を包含する。本明細書を通じて、神経栄養タンパク質に対するあらゆる論及は、神経栄養タンパク質のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーを構成するタンパク質と同定された本文に記載されるタンパク質に言及することであると解釈されるべきである。
明細書および請求の範囲を通じて使用される「生物学的に等価な」とは、神経またはグリア細胞の生存を助け、その表現型分化を維持することができるが、その程度が本文に記載された天然の神経栄養タンパク質と必ずしも同一ではない、本発明の組成物を意味する。生物学的に等価な組成物は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリー−様神経栄養活性を示すタンパク質の断片を包含する。さらに、本発明は、第２図に示されるアミノ酸配列、および神経栄養活性を実質的に変化させない１、２、３、または４アミノ酸残基の変化または欠失を有する実質的に相同な配列を包含する。また本発明は、第２図に示す配列と実質的に相同な、たとえばポリエチレングリコールの付加によって、化学的に修飾された配列を包含する。
以下の明細書および請求の範囲を通じて使用される「実質的に相同な」とは、これまでに報告された神経栄養タンパク質によって示された以上の、天然神経栄養タンパク質に対する相同性の度合いを意味する。相同性の度合いは、７０％以上であることが望ましく、８０％以上が最も望ましいが、９０％、９５％、または９９％以上であることがさらに望ましい。神経栄養タンパク質の特に望ましいグループは、天然タンパク質と９５％相同である。本文記載の相同性のパーセンテージは、DayhoffによってAtlas of Protein Sequence and Structure Vol.5,P.124(1972),National Biochemical Research Foundation,Washington,D.C.（引用として特にここに編入される）に説明しているように、配列を補うために１００アミノ酸の長さにおいて四つのギャップを導入する場合に、比較される配列において同一のアミノ酸残基で配列した二つの配列のうち小さい方に見いだされるアミノ酸残基のパーセンテージとして算出される。また、記載のタンパク質に対する抗体との交差反応性によって単離される神経栄養タンパク質、またはその遺伝子が記載のタンパク質の遺伝子、またはそのセグメントとのハイブリッド形成によって単離されるような神経栄養タンパク質も、実質的に相同であるとして包含される。
神経栄養タンパク質のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属するタンパク質は、天然では大きな前駆体分子として生産され、その後タンパク質加水分解切断によってプロセシングを受け、「成熟」タンパク質を生じる（Edwardsら、(1986)上記；Leibrockら、(1989)上記）。細菌発現系は前駆体型タンパク質を正確にプロセシングすることができないため、成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列のまさにその部分だけが、細菌発現系において発現される。
本発明のある実施態様において、大腸菌発現系における生産に最適な合成ＮＧＦＤＮＡ配列が構築される。ヒトまたは動物ＮＧＦをコードするＤＮＡ配列を用いて、合成ＮＧＦ遺伝子を構築することができる。宿主細胞に移入し、その細胞内で複製が可能なベクターに合成ＮＧＦ遺伝子をクローン化するが、こうしたベクターは、ＤＮＡ配列の発現に必要な作動要素を含有する。望ましい合成ＮＧＦ遺伝子の構築および大腸菌発現系への移入に適したベクターへのクローニングを実施例１に述べる。本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する合成神経栄養因子遺伝子、ならびにＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する遺伝子に実質的な相同性を有する合成遺伝子の利用を包含する。
ＮＧＦ生産を行わせるために、天然または合成ＤＮＡ配列を使用することができる。実施例１に記載され、第３図に示す合成ＮＧＦ遺伝子（配列番号５）は細菌発現系における成熟ヒトＮＧＦの発現を指示するために特にデザインされた。特定のアミノ酸に関するコドンは大腸菌での発現のために、また以後のクローニングステップを容易にするための制限サイトを設けるために、最適となるようにした。全般的な発現方法は下記を含んでなる：
１．大腸菌に成熟ヒトＮＧＦ生産を指示することのできるＤＮＡ配列の調製；
２．大腸菌に移入することができ、大腸菌において複製することが可能で、ＮＧＦ配列を発現するために必要な作動要素を含有するベクターへの、上記ＤＮＡ配列のクローニング；
３．合成ＤＮＡ配列および作動要素を含有するベクターの大腸菌宿主細胞への移入；
４．ベクターを増幅しＮＧＦを発現する条件での、大腸菌宿主細胞の培養。
宿主細胞をＮＧＦ発現に適した条件で培養する。こうした条件は一般に宿主細胞に特異的であって、このような細胞の生育条件に関する刊行された文献および本文に含まれる教示に照らして当業者により容易に決定される。たとえば、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,8th ed.,Williams & Wilkins Company,Baltimore,Maaryland,は、引用により本文に特に編入されるが、細菌の培養に関する情報を含有する。本発明の望ましい実施態様において、ＮＧＦは大腸菌発現系において生産される。本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属するあらゆる神経栄養因子を生産するための、このような生産方法の利用を包含する。
神経栄養タンパク質のヒトＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する組換え体を生物学的活性を有する形で生産するための方法が、米国特許出願番号第08/087,912（Collinsら）に記載される。Collinsらは、神経栄養タンパク質のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する組換えヒト成熟タンパク質を再生し、復元するための方法を明らかにしている。微生物で生産された成熟神経栄養タンパク質に関して生じた、あらゆる分子内または分子間ジスルフィド結合および／またはあらゆる非共有結合相互作用を最初に破壊する。これを行うために、タンパク質を塩酸グアニジンや尿素のような十分な変性剤、およびβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、またはシステインのような十分な還元剤に曝し、タンパク質を変性させ、非共有結合相互作用を破壊し、ジスルフィド結合を還元する。成熟タンパク質を変性、還元した後、還元タンパク質中に存在する遊離のチオールを、大過剰の、グルタチオンやシステインのようなジスルフィド含有試薬を添加することによって酸化する。この反応は、成熟神経栄養タンパク質中の個々のシステイン残基が酸化剤の単量体とジスルフィド結合を形成するような、混合したジスルフィド結合を生じる。次に変性剤および酸化剤を一定濃度まで希釈し、ジスルフィド交換を触媒するためにシステインのようなチオール−含有試薬を添加する。このことは、変性剤の濃度が十分に低下して神経栄養タンパク質が様々な三次元配置をとることが可能になるような環境、および酸化／還元電位が調整されてジスルフィド結合の形成および切断が可能になるような環境をつくる。神経栄養タンパク質の有意な一部は正しい分子内ジスルフィド結合パターン、したがって正しい３次元構造を形成し、生物学的活性を獲得することが想定される。Collinsらは、さらに、２５％までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）200,300,または1000を最終再生混合物に添加して利用することを開示している。ＰＥＧの存在下では、正しく再生された生物学的活性を有するＮＧＦの量が３０％以上増加するCollinsらの方法は、先行技術の方法の荒っぽい条件に比べて改良を示し、５０％まで生物学的活性を有するタンパク質を達成する。
本発明の生産方法は、幾つかの方法において、Collinsらによって記載された方法に比べて、拡張および改良を示す。亜硫酸分解プロセスを大腸菌で生産された不溶性タンパク質の可溶化に使用する。亜硫酸分解は、あらゆる先行技術の方法に比べて幾つかの重大な利点をＮＧＦ精製プロセスに分け与える。亜硫酸ナトリウムは、強力な還元剤であって、洗浄された固体からＮＧＦを可溶化するに際して、少なくとも２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールと同様に機能する。尿素の存在下で完全に還元されたＮＧＦは、クロマトグラフィー樹脂上できれいなピークとして分離しない。これに対して、スルホニル化−ＮＧＦはイオン交換樹脂上での分離において顕著な向上を示す。さらに、亜硫酸分解は、修飾された個々のシステインについて、タンパク質に負電荷を与える。ＮＧＦの単量体はそれぞれ６個のシステイン残基を含有し、したがって完全にスルホニル化された単量体は、追加の６個の負電荷を含有する。これは幾つかの利点を意味する：１）各単量体の総電荷の増加は、単量体の親水性および溶解性を高める；２）追加の負電荷は、タンパク質の有効等電点を引き下げる。これによって、タンパク質を完全に還元した場合に可能であるよりさらに低いｐＨで陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることが可能となる。さらに、これは、見かけのｐＩが約７．５である尿素−可溶化されたタンパク質の精製と、それに続く、理論上のｐＩが約１０．４である可溶性の再生タンパク質の精製も可能にする。異なった見かけの等電点を示す同一タンパク質の二つの形を精製することが可能であることは、混入している大腸菌タンパク質からＮＧＦを高レベルに分離するための基盤を与えた。
実施例２は、大腸菌発現系におけるＮＧＦの発現後の、本発明の再生および精製プロセスを説明する。大腸菌宿主細胞を溶解し、ＮＧＦ含有画分を「ＮＧＦ洗浄固体懸濁液」として分離する。
尿素および亜硫酸の存在下で、ＮＧＦを可溶化し、スルホニル化する。
幾つかの異なる手順によって、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、スルホニル化ＮＧＦを捕捉し、精製することができる。ある実施態様において、実施例２で詳細に説明するように、スルホニル化ＮＧＦをバッファーＡ（８M尿素、２０mM Tris-HCl,pH 9.0）で希釈し、陰イオン交換カラムにかけ、バッファーB（８M尿素、３６mM MES,pH 6.0）で溶出する。別の実施態様において、スルホニル化ＮＧＦはバッファーＡからバッファーＢへの直線濃度勾配によってカラムから溶出された。本発明の望ましい実施態様において、スルホニル化ＮＧＦを限外濾過カートリッジ内でバッファーＡに対して透析濾過し、陰イオン交換カラムにかけ、バッファーＡからバッファーＢへの直線濃度勾配によって溶出した。別の好ましい実施態様において、スルホニル化ＮＧＦを攪拌セル内で限外濾過膜を用いて濃縮し、透析濾過し、陰イオン交換カラムにかけ、上記のように溶出した。
実施例２の記載のように、精製されたスルホニル化ＮＧＦを幾つかの方法によって再生することができる。尿素およびＰＥＧを箱入りガラスビンに入れ、溶液を冷却した。ＮＧＦを添加し、ｐＨを調整し、固体システインを添加した。次にそのガラスビンを１０℃で４日間保存した。
正しく再生されたＮＧＦを陽イオン交換クロマトグラフィーによって捕捉した。再生されたＮＧＦは、幾つかの荷電の異なるタイプのＮＧＦを含有するタンパク質の単一のピークとして回収された。間違った電荷を有するタイプのＮＧＦを、ＮＧＦ主要ピークから分離して精製し濃縮した。
以下の実施例は、生物学的活性を有するＮＧＦを生産するための本発明の方法の各段階を説明するものであるが、本発明は、ＢＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ３，およびＮＴ４、ならびに実質的な相同性および類似の生物学的活性を有する神経栄養因子を包含する。ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属する生物学的活性を有する神経栄養因子の生産を包含する。アミノ酸配列およびジスルフィド結合の位置を包含する。神経栄養因子のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属するタンパク質間に存在する相同性の度合いは、これらのタンパク質が類似の３次元構造を有することを示唆する。さらに、ジスルフィド結合の誤った形成に関する問題、および細菌で生産されたタンパク質を再生し、復元するための改良法の必要性は、神経栄養因子のＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーに属するすべてのタンパク質について同様である。
実施例１．合成ＮＧＦ遺伝子の構築および大腸菌における発現
合成ＮＧＦ遺伝子は、大腸菌における発現のためにコドンを最適化するとともに、それに続くクローニング工程を容易にする独特の制限酵素部位を創出するように設計された。
このＮＧＦ遺伝子は、２つの部分に分けて構築された。すなわち、１）セクションＡ-Applied Biosystemd 380A ＤＮＡシンセサイザーにより合成された３対の相補的オリゴヌクレオチドからなる218塩基対(bp)のBamHI-SalI ＤＮＡ断片；２）セクションＢ-２対の相補的合成オリゴヌクレオチドからなる168bpのSalI-KpnI ＤＮＡ断片（図３参照）（配列番号：５）である。
Ａ．各セクションの構築。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて各オリゴヌクレオチドをリン酸化した。次に、リン酸化オリゴヌクレオチドを80℃に加熱し、ゆっくりと35℃に冷却することにより、アニーリングさせ相捕体とした。オリゴヌクレオチドの対（セクションＡでは３対およびセクションＢでは２対）を連結し、次にBamHI-SalI（セクションＡ）またはSalI-KpnI（セクションＢ）で消化し、多重挿入(multiple insertions)を最小限にした。5%ポリアクリルアミドゲルを用いて得られた断片を単離し、溶出した。各断片を適当な酵素（セクションＡについてはBamHIおよびSalI；セクションＢについてはSalIおよびKpnI）で消化したpUC18断片に連結した。ＪＭ１０９を形質転換し、100μg/mlの濃度でアンピシリンを添加したLuria培地(Luria broth)で分離株を増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素消化分析により適当な大きさの断片を有していることを確認した。
Ｂ．合成ＮＧＦ遺伝子全体の構築。上記のように5%ポリアクリルアミドゲルを用いて、BamHI-SalI 218bp断片をセクションＡ pUC18より単離し、また168bp SalI-KpnI断片をセクションＢ pUC18より単離した。これらの断片を、BamHI-KpnIで切断したpUC18に連結した（IPTGとXGalを用いて、挿入断片を有する白色のコロニーと比色して、挿入断片を有するコロニーを決定した。）。白色のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。BamHI-KpnIで消化すると387bpの断片が放出され、これを1%アガロースゲルより単離した。この387bpの断片を、プラスミドTP NGF(2start-)REP pT2XI-2の消化より得た、約７キロベース(Kb)のBamHI-KpnIベクター断片であるREP pT3XI-2に連結した。REPは反復遺伝子パリンドローム配列であり、3'-5'エキソヌクレオリティック(exonucleolytic)活性を防止することによりメッセンジャーＲＮＡを安定化させると報告されている［Merinoら、（1987）Gene 58:305］。形質転換細胞を、10μg/mlの濃度でテトラサイクリンを含有するLuria培地で増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、BamHI-KpnIで消化した。387bpの断片が観察されたが、この断片が合成遺伝子であることを確かにするために、BamHI-EvoRVを用いて第２の消化を行った（EcoRV部位は合成遺伝子のコード領域から除去される）。構築物を配列決定すると、３つの領域が誤った配列を有していることが分かり、これらをBioradより購入したMutageneキットを用いてin vitro突然変異誘発により訂正した。これに関係のある領域は、ヌクレオチド83〜91の間(Mut1)（図４、配列番号：６）、ヌクレオチド191(Mut2)（図４、配列番号：７）ならびにヌクレオチド258および259の２個のＣの欠失(Mut3)（図４、配列番号：８）であった。突然変異誘発用の鋳型として使用するBamHI-KpnI断片として、合成ＮＧＦ遺伝子をBamHI-KpnIで切断してmp18に連結した。突然変異誘発は２段階工程で実施した。まず最初に二重変異誘発のためオリゴヌクレオチドMut1およびMut2を用いた。正しい配列を有する２つの分離株を、32Ｐで標識したMut1およびMut2オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより選択した（Mut1,2AおよびMut2,2Bと呼ぶ）。次に、第２工程において、Mut3オリゴヌクレオチドを用いてこれらの分離株を突然変異させ、そして32Ｐで標識したMut3プローブとのハイブリダイゼーションにより各プレートから１つの分離株を選択した(Syn NGF MutAおよびSyn NGF MutB)。これらの分離株は両方とも正しい配列を有していた。複製可能な形態（RE-二本鎖ＤＮＡ）を調製し、BamHI-KpnIで消化し、そして1%アガロースゲルより387bpの断片を単離した。Syn NGF MutA断片を、TP NGF REP pT3XI-2より単離した７KbのBamHI-KpnI断片であるREP pT3XI-2に連結した。MCB00005を形質転換し、分離株を10μg/mlの濃度でテトラサイクリンを含有するLuria培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した。BamHI-KpnI消化による分析を実施して、挿入配列の存在を確認した。
Ｃ．増大させた合成ＮＧＦ。合成遺伝子の発現を増大させる手段として、in vitro突然変異誘発により、オリゴヌクレオチドSyn NGF 5P(図5)(配列番号：9)を用いて、開始メチオニンとBamHI部位との間の領域を、高度に発現するT7バクテリオファージタンパク質の領域、すなわち遺伝子10に似るように変更した。Syn NGF MutA mp18を鋳型として使用した。32Ｐで標識したSyn NGF 5Pオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより、４個のプラークを選択した。RF ＤＮＡを調製し、BamHI-KpnIで消化した。全てが適切な大きさの断片を有し、それぞれの配列は正しいものであった。BamHI-KpnI 387bp断片を1%アガロースゲルより単離し、そして約７KbのBamHI-KpnIベクター断片であるREP pT3XI-2（上記のBamHI-KpnIで消化したSyn NGF A REP pT3XI-2より単離したたもの）に連結した。MCB00005を形質転換した。32Ｐで標識したSyn NGF 5Pオリゴヌクレオチドを用いてコロニーをスクリーニングし、プローブにハイブルダイズさせた２つのコロニーを10μg/mlの濃度でテトラサイクリンを含有するLuria培地で増殖させた。分離株は両方とも正しい配列を有していた。
Ｄ．TP NGF REP pT3XI-2およびTP NGF（2start-）REP pT3XI-2の構築
（１）TP NGF REP pT3XI-2。British Biotechnology NGF遺伝子(British Biotechnology,Limited,Oxford,England)のBamHI-HindIII断片を担持するDH5αをBamHI-HindIIIで消化し、380塩基対の断片を単離し、BamHI-HindIIIで消化したmp18に連結した。ＤＮＡを２段階工程によりin vitroで突然変異させた。第１工程は、遺伝子の5'末端のHindIII部位の3'末端の直ぐ隣へのBamHI部位の挿入、ならびに開始メチオニンコドンとの間に効率的な発現のための「最適な」距離をとったシャイン・ダルガーノ(S/D)配列の挿入を含んでいた（図６、TP NGFオリゴヌクレオチド参照）(配列番号：10)。32Ｐで標識したTP NGFオリゴヌクレオチド（図６）(配列番号：10)にハイブリダイズさせた後、１つのプラークを選択した。突然変異誘発の第２工程は、オリゴヌクレオチドREP NGF（図６）(配列番号：11)を用いて実施した。32Ｐ標識REP NGFオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、１つのプラークを選択した。RE ＤＮＡを調製し、約470KbのBamHI-HindIII断片を単離し、これをBam TPΔ53 pT3XI-2（図７）(配列番号：12)より単離した約7KbのBamHI-HindIIIベクター断片に連結した。MCB00005株を形質転換し、分離株を選択し、配列決定して正しい配列を有することを見いだした。
（２）TP NGF（2start-）pT3XI-2。NGF遺伝子内の推定上の第２の開始領域を除去するため、2start-オリゴヌクレオチド（図８）(配列番号：13)およびTP NGF REP mp18を鋳型として用いて、in vitro突然変異誘発を実施した。32Ｐ標識2start-オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした分離株を配列決定し、正しい配列を有することを見いだした。RF ＤＮＡを調製し、約470bpのBamHI-HindIII断片を1%アガロースゲルより単離し、これを約7KbのBamHI-HindIII断片であるpT3XI-2［Bam TPΔ53 pT3XI-2より単離、図7参照（配列番号：12）］。MCB00005を形質転換し、制限酵素消化分析により正しい分離株を選択した。
実施例２．生物的に活性なＮＧＦの単離
Ａ．細胞溶解。実施例１のヒト組換えＮＧＦ遺伝子構築物を、化学的に内容の明らかな培地で33℃で増殖させた大腸菌細胞中に発現させた。新鮮な、または凍結させた細胞スラリーを50mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH 8.5を用いて最終固形物濃度が約20%(重量／容量)となるまで希釈した。>8000PSIの圧力でGaulinまたはRannieホモジナイザーを4回通過させることにより細胞を溶解させた。溶菌液を冷却コイルに通し、温度を15℃未満に維持した。
Ｂ．ＮＧＦを含有する細胞固形物の捕集および洗浄。Westphalia遠心分離機を用いて細胞固形物を捕集した。捕集後、固形物の百分率を測定した。十分に冷たい洗浄／希釈緩衝液(20mM Tris-HCl,pH 7.5)を加え、固形物の割合を5%に下げた。穏やかに混合した後、溶菌液を２回目の遠心にかけた。最終的な「ＮＧＦ洗浄済細菌懸濁液」を固形物の百分率について分析した。開始時の細胞１ｋｇにつき、約80gの洗浄済固形物が回収された。「ＮＧＦ洗浄済固形物懸濁液」は直ちに使用するか、または次の使用のために-20℃で凍結させた。
Ｃ．ＮＧＦの可溶化および化学修飾。洗浄済固形物中に存在するＮＧＦを、８M尿素およびスルフィト分解混合物(sulfitolysis mixture)を用いることにより可溶化した。これは、システイン残基がcys-SO3-混合ジスルフィドとして存在する、可溶化され、変性された、化学修飾ＮＧＦをもたらした。
使用した洗浄済固形物懸濁液の容量の２倍に等しい最終容量で、尿素の最終濃度が8Mとなるように、十分な固体尿素および水を「ＮＧＦ洗浄済固形物懸濁液」に加えた。尿素が溶解した後、下記の最終濃度の試薬をスルフィト分解工程のために添加した。すなわち、10mM Tris緩衝液、100mM亜硫酸ナトリウム、および10mM四チオン酸ナトリウムである。HClを用いてこの混合物の最終pHを約7.5にし、室温で少なくとも約２時間攪拌した。
Ｄ．スルホニル化ＮＧＦの捕集および精製。スルフィト分解混合物からアニオン交換クロマトグラフィーによりスルホニル化ＮＧＦを捕集し、精製した。幾つかのローディング(loading)および溶出方法を使用した。
本発明の１つの実施態様において、スルフィト分解混合物を緩衝液Ａ（8M尿素、20mM Tris-HCl、pH9.0）で10倍に希釈し、NaOHを用いて最終pH9.0となるように調整した。この溶液を、緩衝液Ａで平衡化した、Pharmacia Q-Sepharose大ビーズ樹脂を充填したカラムに加えた。25gのＮＧＦ洗浄済固形物に相当する容量を樹脂１リットルに対して加えた。カラムを３カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ｂ(8M尿素、36mM MES,pH6.0)を用いてpHを下げることによりスルホニル化ＮＧＦを溶出した。本発明の別な実施態様においては、約10カラム容量の緩衝液Ａから緩衝液Ｂへのリニアグラジエントを用いてスルホニル化ＮＧＦを溶出した。
本発明の好ましい実施態様においては、別のローディング手順がAmicon S1Y10またはS10Y10スパイラルラップ限外濾過カートリッジを用いたスルフィト分解混合物のダイアフィルトレーションを利用した。約４カラム容量の緩衝液Ａを用いて、スルフィト分解混合物をダイアフィルトレーションした。このダイアフィルトレーションしたスルフィト分解混合物をpH9.0に調整し、Q-Sepharose大ビーズ樹脂を充填したカラムに直接加えた。125gのＮＧＦ洗浄済固形物に相当する容量を樹脂１リットルに対して加えた。カラムを洗浄し、スルホニル化ＮＧＦを上記のように溶出した。
上記のいずれの方法によっても、カラムから溶出したタンパク質は、主としてスルホニル化ＮＧＦであった。溶出タンパク質のピークを集め、吸光係数1.44を用いて280nmにおける吸光度によリタンパク質濃度を測定した。ＮＧＦ洗浄済固形物１グラムあたり約5mgまでのタンパク質というカラム収量が典型的であった。
Ｅ．ＮＧＦ再生。Q-Sepharoseで精製した、スルホニル化ＮＧＦを幾つかの方法によって再生することができる。好ましい実施態様においては、スルホニル化ＮＧＦを0.1mg/mlの最終タンパク質濃度で再生した。必要とされる最終再生容量を、再生すべきタンパク質の量に基づいて計算した。濾過し脱イオン化した8M尿素、ポリエチレングリコール300(PEG300)、二塩基性リン酸カリウムおよび水を、最終再生容量で最終濃度が5M尿素、20% PEG300および100mM二塩基性リン酸カリウムとなるようにカーボイ(carboy)中で混合した。この溶液を約10℃まで冷却した。スルホニル化ＮＧＦを最終濃度0.1mg/mlまで穏やかに添加した。5M HClを用いてこの混合物のpHを約8.7にした。攪拌を一旦停止して、L-システインを最終濃度3mMまで添加した。アルゴンの激しい流れを用いて、ガス相を約５分間散乱させ、カーボイを密閉した。L-システインが溶解するまで溶液を攪拌し、カーボイを約10℃で約４日間保存した。
0.02〜0.2mg/mlの範囲のＮＧＦタンパク質濃度について、再生効率を試験した。タンパク質濃度の低下とともに再生効率は向上した。しかし、要求される容量と再生試薬のコストとから、収量のみに基づく最適化を前もって除外した。4.5〜5.5Mの尿素濃度が再生に最適であった。尿素濃度が約4Mより下がると、収量は急激に低下した。一方、5.5Mを上回ると実用的でないことが立証された。
最適の再生は、約20%のPEG300を用いて達成された。PEG200はPEG300とほぼ同じくらい良く機能した。PEG300またはPEG200のレベルが下がると、あるいはPEGをエチレングリコールに代えると、再生効率は大幅に低下した。
０から0.5Mの範囲のリン酸塩濃度について、再生効率を調べた。ＮＧＦ再生はリン酸塩濃度100〜200mMの間で幅広く最適であった。一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、および二塩基性リン酸カリウムの比較は、ＮＧＦ再生効率において些細な差異を示したのみであった。二塩基性リン酸カリウムが、溶液中における初期pHおよび比較するナトリウム塩よりも高い溶解性のゆえに、好ましかった。
4℃から15℃の範囲の温度もほぼ同じくらい良好に作用したが、ＮＧＦは約10℃で最適に再生された。15℃以上では再生は急激に低下し、室温ではごく少量の再生しか起こらなかった。再生溶液のpHの上昇は再生速度に大きい変化をもたらした。例えば、pH8.3では再生がほぼ完了するまでに８〜９日かかったが、pH8.7では４日後に再生がほぼ完了した。再生溶液中に存在する尿素、再生の長さ、およびpHが上昇するとタンパク質がカルバミル化しやすくなる、という理由のため、より高いpHは避けた。
ＮＧＦ再生を開始するため、L-システインまたはシステアミンを使用し、効果は同等であった。システアミン塩酸塩は少し効果が劣った。最終濃度が約3mMのL-システインが最適であった。L-システイン濃度が2mMを下回るか、または5mMを超えると、再生の実質的低下をもたらした。
Ｆ．再生されたＮＧＦの捕集。再生溶液中に存在する適切に再生されたＮＧＦを、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて捕集した。カラムの大きさは、樹脂のタンパク質ローディング能力に基づいてではなく、要求される流量および大量の粘性再生混合物を加えた際に遭遇する背圧を調整するカラムの能力に基づいて選択した。750mlの樹脂床容量を用いて、典型的には70リットルの再生物を捕集にかけた。
再生ＮＧＦの捕集のための好ましい実施態様においては、約10℃で４日間保管後カーボイを開け、5M HClまたは酢酸を用いて再生溶液のpHを5.0にした。この溶液を、あらかじめ20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）で平衡化しておいたPharmacia SP-Sepharose大ビーズ樹脂のカラムに加えた。ローディング後、４カラム容量の20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）でカラムを洗浄した。20mM酢酸ナトリウムおよび750mM NaCl（pH5.0）を用いて、可溶性の再生されたＮＧＦをカラムから溶出した。流量は平衡化、ローディングおよび洗浄の間は１分あたり0.5カラム容量(c.v./分)で、溶出の間は0.25c.v./分に低下させた。
適切に再生されたＮＧＦからなるタンパク質の単一ピークを回収した。この物質はサイジング(sizing)、SDS-PAGEおよび標準的逆相HPLCによるとほぼ同質であるように思われたが、その後、等電点電気泳動およびカチオン交換HPLCによりＮＧＦの幾つかの変化した電荷を帯びた種を含有することが示された。カチオン交換HPLCにより分離された主な種は、エレクロトスプレー質量分光法を用いて、端部を切られたまたはカルバミル化されたＮＧＦの変種であると同定された。したがって、これらのＮＧＦ変種を除去するため、精製工程に付加的カラムをもうけることが必要となった。
Ｇ．イオン交換クロマトグラフィーによるＮＧＦ変種の除去。本発明の好ましい実施態様においては、S-Sepharose大ビーズカラムより溶出したタンパク質を集めたものを、20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）を用いて２倍に希釈し、そして20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）で平衡化したPharmacia SP-Sepharose高性能樹脂カラムに加えた。カラムには、樹脂１mlあたり約5mgのＮＧＦを加えた。カラムをまず約２カラム容量の20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）で洗浄し、次に約２カラム容量の20mM Tris-HClおよび75mM NaCl（pH7.5)で洗浄し、そして20mM Tris-HCl（pH7.5）中で125から300mMまでのNaClの12カラム容量のリニアグラジエントを用いて溶出した。本発明の別な実施態様においては、カラムを約３カラム容量の20mMリン酸ナトリウム緩衝液および150mM NaCl（pH7.0）で洗浄した。20mMリン酸ナトリウム緩衝液および150mM NaCl（pH7.0）から20mM Tris-HClおよび150mM NasCl（pH8.0）までの10カラム容量のpHグラジエントを用いてタンパク質を溶出した。上記の溶出方法は両方とも、正しくない電荷形態のＮＧＦのＮＧＦ主要ピークからの分離を可能とした。
本発明のさらなる実施態様は、Pharmacia Mono-S等の他のカチオン交換樹脂の使用、または異なる緩衝液系および／または異なるpHを用いたタンパク質の溶出を包含する。これらには、20mMグリシルグリシン（pH8.5）、50〜200mM NaClグラジエント；20mMホウ酸塩（pH8.0〜8.5）、50〜300mM NaClグラジエント；20mM Tris-HCl（pH7.0〜8.5）、50〜400mM NaClグラジエント；および20mMリン酸ナトリウム（pH7.0）、100〜500mM NaClグラジエントが含まれた。また、ＮＧＦは上記カラムから20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）、450〜800mM NaClグラジエント、および20mMクエン酸ナトリウム（pH5.0）、400〜700mM NaClグラジエントを用いても溶出された。
Ｈ．濃縮／ダイアフィルトレーション。SP-Sepharose HPカラムからの精製ＮＧＦを含有する画分を集め、濃縮し、そして攪拌されているセル(cell)中でAmicon YM10膜を用いて、クエン酸およびNaClをpH5.2で含有する最終バルク組成物とした。この工程は室温で、タンパク質濃度を5mg/ml未満に保ちながら実施した。
Ｉ．ＮＧＦの沈殿。精製ＮＧＦは特定の条件下で沈殿する傾向を示した。沈殿を増大させる因子は、タンパク質濃度の増大、NaCl濃度の増大、pHの上昇、および温度の低下を含んでいた。したがって、本発明の好ましい実施態様においては、ＮＧＦ溶液のタンパク質濃度を5mg/ml未満に保ち、また精製して調製したバルクを凍結する場合を除き、ＮＧＦ溶液を約10℃以下には冷却しない。
実施例３．生物活性の測定
ヒヨコ胚交感神経鎖ニューロンの生存をin vitroで促進する能力を試験することにより、精製ＮＧＦの生物活性を測定した。ヒヨコ胚交感神経鎖および後根神経節の培養物を、以前に記述されたように調製した(CollinsおよびLile（1989）Brain Research 502:99)。すなわち、湿った空気中で38℃で8〜11日間インキュベートした病原体を含まない受精鶏卵より、交感神経または後根の神経節を摘出した。これらの神経節を、先ず二価のカチオンを含まず10mM HEPES緩衝液(pH7.2)を含むハンクス液に37℃で10分間浸積し、次に上記のように修正したハンクス液に溶解した0.125%のバクトトリプシン1:250（Difco,Detroit,Michigan）溶液に37℃で12分間浸積することにより、化学的に解離させた。ウシ胎児血清を最終濃度10%まで添加することにより、トリプシン化を停止させた。この処理の後、重炭酸塩を含まず10%ウシ胎児血清および10mM HEPES（pH7.2）を含むダルベッコ高グルコース変法イーグル培地からなる溶液に神経節を移した。そして、開口部を火で仕上げて、充填するのに２秒を要する直径に狭めたガラス製パスツゥールピペットを介して約10回粉砕することにより機械的に神経節を解離させた。次に、解離させた神経節を、直径100mmの組織培養皿（１皿あたり40個の解離神経節）中の培養培地（10%ウシ胎児血清）、4mMグルタミン、60mg/Lペニシリン-Gおよび25mM HEPES（pH7.2）を加えたダルベッコ変法イーグル培地）に３時間平板培養した。この平板培養の前処理は、非ニューロン性細胞（これは皿に接着する）を神経細胞（これは接着しない）から分離するために行われた。３時間後に、接着しない神経細胞を遠心により集め、培養培地中に再懸濁し、そして、96ウエルマイクロタイター組織培養プレートの半分の面積に、１ウエルあたり神経細胞1500個の密度で１ウエルあたり50μlを平板培養した。上記のマイクロタイターウエルは、10mMホウ酸ナトリウム（pH8.4）に溶解したポリ-L-オルニチンの1mg/ml溶液に前もって一晩４℃で暴露し、蒸留水で洗浄し、風乾しておいた。
神経栄養作用活性についてアッセイすべきサンプルを連続的に希釈したもの10μlを各ウエルに加え、プレートを7.5%ＣＯ2を含む湿った空気中で37℃で20時間インキュベートした。18時間後に、重炭酸塩を含まず10mM HEPES（pH7.2）を含むダルベッコ高グルコース変法イーグル培地に溶解したテトラゾリウム染料MTTの1.5mg/ml溶液を１ウエルあたり15μl添加し、培養物を37℃で４時間再びインキュベートした。次に、イソプロパノール１リットルあたり6.7mlの12M HClを含有する溶液を75μl添加し、各ウエルの内容物を30回粉砕し、細胞を破壊して上記の染料を懸濁させた。自動マイクロタイタープレートリーダー(Dynatech,Chantilly,Virginia)を用いて、690nmにおける各ウエルの基準値と比較して570nmにおける吸光度を、測定した。神経栄養作用物質を何ら投与さらなかったウエル（陰性対照）の吸光度を、サンプルを含有するウエルの吸光度から引き算した。得られた吸光度は、染料を減少させることのできる神経細胞と定義される各ウエルの生存細胞の数に比例している。１ミリリットルあたりの栄養単位(trophic unit)(TU)で表される栄養活性の濃度は、神経細胞の最大生存の50%をもたらす希釈度と定義された。例えば、もしサンプルが1:100,000に希釈された時に50%最大生存をもたらしたならば、その力価は100,000TU/mlと定義された。１ミリリットルあたりの栄養単位数を、希釈していないサンプル中の１ミリリットルあたりのタンパク質濃度で割ることにより、比活性を決定した。
図９は、本発明の工程をフローチャートで示す。
配列表
（２）配列番号：１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：７４２塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す名称／記号：ヒトＢＤＮＦの核酸配列
（xi）配列：
0003673278.tif 000002
（２）配列番号：２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：７２５塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す名称／記号：ヒトＮＧＦの核酸配列
（xi）配列：
0003673278.tif 000003
（２）配列番号：３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：２４７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す名称／記号：ヒトＢＤＮＦの推定アミノ酸配列
（xi）配列：
0003673278.tif 000004
（２）配列番号：４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：２４１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す名称／記号：ヒトＮＧＦの推定アミノ酸配列
（xi）配列：
0003673278.tif 000005
（２）配列番号：５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３８９塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000006
（２）配列番号：６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３２塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000007
（２）配列番号：７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：２１塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000008
（２）配列番号：８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：２２塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000009
（２）配列番号：９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３５塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000010
（２）配列番号：１０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：４３塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000011
（２）配列番号：１１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１９塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000012
（２）配列番号：１２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：６９１塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000013
（２）配列番号：１３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３３塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003673278.tif 000014
【図１】
0003673278.tif 000015
【図２】
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0003673278.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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