(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び３からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
薬学的に許容できる担体、及び活性成分として配列番号１及び３からなる群から選択される少なくとも１種の単離オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項３】
癌治療用医薬品を調製するための配列番号１及び３からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４】
癌療法と組み合わせる癌治療用医薬品を調製するためのＨ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤の使用であって、該薬剤は配列番号１及び３からなる群から選択される核酸を含むｓｉＲＮＡである上記使用。
【請求項５】
Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤及び追加の抗癌剤を含む癌を治療するための製造品であって、該薬剤は配列番号１及び３からなる群から選択される核酸を含むｓｉＲＮＡである上記製造品。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡの投与が、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で実施される、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記癌が、小児固形癌、ウィルムス腫瘍、肝芽種、胎児性横紋筋肉腫、生殖細胞腫瘍及び栄養膜腫瘍、精巣生殖細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛膜癌、胎盤部位栄養膜腫瘍、上皮成人腫瘍、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頚部の扁平上皮癌、食道癌、神経原性癌、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項８】
前記癌が、膀胱癌又は肝細胞癌である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる前記薬剤が、前記追加の抗癌剤と共に共製剤化される、請求項５に記載の製造品。
【請求項１０】
配列番号１及び３のいずれか一つの配列をコードする核酸構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ１９をダウンレギュレートする核酸薬剤及び癌治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ１９は、母性対立遺伝子のみの発現を示して同定される最初のヒトインプリント非タンパク質コード化遺伝子であった。それはマウスにもインプリントされる。Ｈ１９は、マウス染色体７の領域に相同的なヒト染色体１１、バンド１５．５の短腕にマップされた。それは、タンパク質産物をコードしない可能性が極めて高い遺伝子群に属する。Ｈ１９遺伝子は、胚形成で多量に発現されるが、誕生後は大部分の組織において途絶える。しかしながら、種々の腫瘍の研究により健全な組織と比較して、Ｈ１９遺伝子の再発現又は過剰発現が示された。さらに種々の病因及び系列の癌において、対立遺伝子パターンの異常発現が幾つかの症例に見られた。Ｈ１９は、成熟のある段階における生殖細胞を除き、発達を通して大部分の組織において、及び絨毛外栄養芽細胞において、モノ対立遺伝子発現を示すが、「インプリンティングの緩和」又は「インプリンティングの喪失」（ＬＯＩ）と呼ばれるこの遺伝子の二対立遺伝子発現は、数が増加している多くの癌、例えば、肝細胞癌、アルブミンＳＶ４０Ｔ抗原−遺伝子導入ラットの肝新生物、肺腺癌、食道癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、子宮頚癌、膀胱癌、頭頚部の扁平上皮癌、大腸癌、子宮癌及び精巣生殖細胞の腫瘍に見出されている。今日、ほぼ３０タイプの癌は、健全な組織と比較してＬＯＩの有る無しのＨ１９遺伝子の調節不全発現を示す。最近のレビューに関して、Ｍａｔｏｕｋら（Ｍａｔｏｕｋら、２００５年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）を参照されたい。
【０００３】
異所性起源のＨ１９の過剰発現により、軟寒天アッセイ及び幾つかの組合せ免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスにおける乳房上皮細胞に対して増殖の利点を付与することも示された（Ｌｏｔｔｉｎら、２００２年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１、１６２５〜１６３１ページ）。絨毛膜癌由来細胞系（ＪＥＧ−３）及び膀胱癌細胞系（Ｔ２４Ｐ）の細胞注入により形成された腫瘍において、Ｈ１９レベルは、注入前の細胞中のＨ１９レベルと比較すると非常に高い［Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１、８６３〜８７０ページ］。
【０００４】
さらに、一定の既知の発癌物質は、Ｈ１９遺伝子の発現をアップレギュレートする。（ＬＯＩ）の無い喫煙者の気道上皮にＨ１９ＲＮＡレベルの劇的な上昇が検出された［Ｋａｐｌａｎら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３、１４７５〜１４８２ページ］。ＢＢＮ（膀胱の既知の発癌物質）もまた、膀胱癌のラットモデルにおいてＨ１９遺伝子の発現を誘導する［Ａｒｉｅｌら、２００４年、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ４１、６９〜７６ページ］。同様に、ジエチルニトロサミン（肝臓の既知の発癌物質）は、肝細胞癌のマウスモデルにおいてＨ１９の発現を誘導する［Ｇｒａｖｅｅｌら、２００１年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０、２７０４〜２７１２ページ］。これら全て及び他の観察は、Ｈ１９が腫瘍抑制遺伝子であるという初期の提案と矛盾する。
【０００５】
Ｈ１９ＲＮＡの存在又は不在の点でのみ異なる２つの同質細胞集団における遺伝子発現パターンを比較して、Ｈ１９ＲＮＡの多数の下流エフェクターが同定されており、これらの中には、腫瘍形成過程の幾つかの態様において重要な役割を果たすことが以前に報告された遺伝子群がある。Ｈ１９ＲＮＡの存在により、これらの経路において機能する遺伝子をアップレギュレートすることにより細胞の侵襲、遊走及び血管新生能力を増強し、したがって、少なくとも転移カスケードの最初のステップに寄与し得る。さらなる研究では、ＨＧＦ／ＳＦに対する応答性遺伝子であることから癌進行及び腫瘍転移を促進する上でＨ１９の潜在的役割が強調されている。
【０００６】
癌細胞中のＨ１９遺伝子の特異的発現により、癌診断のための臨床応用における使用が促進されている。
【０００７】
したがって、本発明者らに対する米国特許第５，９５５，２７３号は、腫瘍特異的マーカーとしてのＨ１９遺伝子の使用を教示している。
【０００８】
ＰＣＴ公開第ＷＯ９５２４５０３号は、小児性ウィルムス腫瘍の悪性度の存在／不在の検出に有用なインサイチュハイブリダイゼーションによりＨ１９遺伝子プローブを用いた悪性度の検出及びそれらの等級付けを教示している。
【０００９】
ＰＣＴ公開第ＷＯ０４０３１５９号は、癌などの血管新生に関連する疾患を治療するためにＨ１９のダウンレギュレーションを教示している。しかしながら、Ｈ１９のダウンレギュレーションは、腫瘍のサイズ又は容積の減少も示していないし、教示されたＨ１９をダウンレギュレートできるｓｉＲＮＡ薬剤は、特異性もなく、有効性もなかった。さらにＰＣＴ公開第ＷＯ０４０３１５９号は、癌を治療するための併用療法の一部としての抗Ｈ１９薬剤の使用は教示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、癌治療用にＨ１９をダウンレギュレートする方法及び組成物を有する必要性が広く認められており、このことは極めて有益になると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によれば、配列番号１、２、３及び４からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、薬学的に許容できる担体、及び活性成分として配列番号１、２、３及び４からなる群から選択される少なくとも１種の単離オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様によれば、癌治療用医薬品の調製のために配列番号１、２、３及び４からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば：
（ａ）Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤の治療的有効量を、それを必要とする対象の細胞に投与すること、又は対象の細胞において発現させること；及び
（ｂ）前記対象に癌療法を提供し、それによって癌を治療すること
を含む癌を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、癌療法と組み合わせる癌治療用医薬品を調製するためのＨ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤の使用を提供する。
【００１６】
本発明のなおさらなる態様によれば、配列番号１、２、３及び４からなる群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドの治療的有効量を、それを必要とする対象の細胞に投与すること、又は対象の細胞において発現させることを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明のなおさらなる態様によれば、Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤及び癌を治療するために同定された追加の抗癌剤を含む製造品を提供する。
【００１８】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤は核酸系薬剤である。
【００１９】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、該核酸系薬剤は：
（ａ）Ｈ１９遺伝子由来のＨ１９ＲＮＡの転写を阻害する一本鎖ポリヌクレオチド；
（ｂ）Ｈ１９ｍＲＮＡにハイブリダイズすることによってＨ１９ｍＲＮＡ活性の低下に導く一本鎖ポリヌクレオチド；
（ｃ）Ｈ１９ｍＲＮＡの分解に導く二本鎖ポリヌクレオチド；
（ｄ）Ｈ１９ｍＲＮＡを開裂させる三重鎖形成ポリヌクレオチド；
（ｅ）Ｈ１９ｍＲＮＡを開裂させる触媒ポリヌクレオチド；
（ｆ）Ｈ１９ｍＲＮＡにハイブリダイズしてその酵素的分解に導く一本鎖ポリヌクレオチド；及び
（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれか１つをコードする核酸配列
からなる群から選択される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、該核酸系薬剤は、ｓｉＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムからなる群から選択される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、該核酸系薬剤はｓｉＲＮＡである。
【００２２】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２３】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、投与はインサイチュで実施される。
【００２４】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、癌は、小児固形癌、ウィルムス腫瘍、肝芽種、胎児性横紋筋肉腫、生殖細胞腫瘍及び栄養膜腫瘍、精巣生殖細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛膜癌、胎盤部位栄養膜腫瘍、上皮成人腫瘍、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頚部の扁平上皮癌、食道癌、神経原性癌、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫からなる群から選択される。
【００２５】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、癌は膀胱癌又は肝細胞癌である。
【００２６】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる薬剤は、追加の抗癌剤と共に共製剤化される。
【００２７】
本発明は、癌の治療のためにＨ１９ＲＮＡ単独及び組合せの双方でＨ１９ＲＮＡをダウンレギュレートできるヌクレオチド薬剤を提供することによって現在知られた形態の欠点に首尾よく取り組むものである。
【００２８】
別に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する通常の当業者により一般に解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価の方法及び物質は、本発明の実施又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載された全ての刊行物、特許出願、特許、並びに他の参考文献は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含めて本特許明細書が規制する。さらに、材料、方法、及び実施例は単に例示的なものであり、限定する意図はない。
【００２９】
本発明は、添付の図面を参照として例示としてのみ本明細書に記載している。ここで図面について詳細に具体的に記述するが、示された項目は、例示目的のものであり、本発明の好ましい実施形態の考察を例示することだけが目的であり、本発明の原理及びコンセプト態様の最も有用で容易に解される説明と考えられるものを提供するという理由で提示されていることを強調する。この点において、本発明の基本的な理解に必要なもの以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す意図はなく、前記説明は、本発明の幾つかの形態を実際に具体化できる方法を当業者に対して明らかにさせる図面と共に利用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、Ｈ１９のレベル及び／又は活性をダウンレギュレートする核酸系薬剤及び医薬組成物並びにその使用方法に関する。特に本発明は、癌を治療する方法及び組成物に関する。
【００３１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に示された、又は実施例により例示された詳細への適用に限定されないことを解するべきである。本発明は、他の実施形態も可能であるし、種々の方法で実行又は実施できる。また、本明細書に使用される語句及び用語は、説明を目的とするものであって、限定するものとしてみなすべきではないことを解するべきである。
【００３２】
Ｈ１９は、母性のモノ対立遺伝子発現を示し、タンパク質をコードしない可能性が極めて高いインプリント遺伝子である。それは、胚形成及び胎児発達時に多量に発現されるが、典型的には、誕生後、大部分の組織において途絶える。しかしながら、数が増加している種々の起源の癌において、Ｈ１９ＲＮＡの発現がアップレギュレートされ、幾つかの症例では異常な対立遺伝子パターンの発現が見られ、Ｈ１９が腫瘍形成に役割を果たす可能性を示唆している。
【００３３】
本法を変形しながら、本発明者らは、生命情報科学の困難なモデリングを通してＨ１９ｍＲＮＡを効率的にダウンレギュレートできる特異的なｓｉＲＮＡ類を設計した。本発明のｓｉＲＮＡ類は、４つの異なるサーチエンジンを用いて選択し、最適のｓｉＲＮＡ類が選択されることを確実にした。
【００３４】
図３Ａに示されるように、作出された全てのｓｉＲＮＡ類は、Ｈ１９ｍＲＮＡを効率的にダウンレギュレートすることが判明した。さらに、これらのｓｉＲＮＡ類が、通常及び低酸素双方の条件下でＨ１９ｍＲＮＡをダウンレギュレートできることを本発明者らは示した（図３Ｂ〜Ｅ）。これは、腫瘍増殖が低酸素と関連し、次にＨ１９ＲＮＡのアップレギュレーションと関連することから特に関連性がある。
【００３５】
本発明のｓｉＲＮＡ類は、腫瘍形成を防止し、さらに予め確率された腫瘍容積及び重量の減少により進行中の疾患を軽減させることができた。
【００３６】
実施例４に示されるように、予めＨ１９ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ及びＵＭＵＣ３）のマウスへの投与により、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした同一の細胞の投与よりも腫瘍重量（図４Ａ及び図５Ａ）並びに容積（図４Ｂ及び図５Ｂ）において極めて有意な低下を生じた。
【００３７】
さらに、実施例６に示されるように、Ｈ１９ｓｉＲＮＡのＵＭＵＣ３細胞により誘導された腫瘍への直接注入により、約９０％の平均腫瘍容積（図７Ａ）及び約８８％の平均腫瘍重量（図７Ｂ）の極めて有意な減少を生じた。
【００３８】
Ｈｅｐ３Ｂ誘導腫瘍において、およそ４０％の腫瘍重量の減少（図７Ｃ）及び５６％の腫瘍容積の減少（図７Ｄ）が、Ｈ１９ｓｉＲＮＡの投与後に見られた。
【００３９】
要するに、これらの結果により、疑いもなく癌の予防的及び治療的処置の双方に関して現実的な候補としてＨ１９をダウンレギュレートできる薬剤が位置付けされる。
【００４０】
さらに、本発明はまた、併用療法におけるＨ１９ｍＲＮＡをダウンレギュレートできる薬剤の使用を考慮している。固形癌、特に低酸素領域に遭遇するものは、癌療法に抵抗性であることが十分に確立されている。抗Ｈ１９薬剤は、患者を、予め確立された癌療法（例えば、放射線療法、化学療法）に対し作用して高感度にさせ得ることが本発明により予想される。
【００４１】
したがって、本発明の一態様によれば、Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル及び／又は活性をダウンレギュレートできる薬剤並びに癌の治療用に同定された追加の抗癌剤を含む製造品を提供する。
【００４２】
本明細書に用いられる用語「治療」とは、癌疾患に関連する症状を予防、軽減又は減少させることである。治療は、癌と関連する症状を治し、例えば、実質的に除去することが好ましい。
【００４３】
Ｈ１９を発現するいずれの癌も、本発明のこの態様に従って治療できる。本発明の方法に従って治療された好ましい腫瘍は、腫瘍発症又は進行時にＨ１９ｍＲＮＡを発現するものである。このような腫瘍としては、限定はしないが、小児固形癌、ウィルムス腫瘍、肝芽種、胎児性横紋筋肉腫、生殖細胞腫瘍及び栄養膜腫瘍、精巣生殖細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛膜癌、胎盤部位栄養膜腫瘍、上皮成人腫瘍、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頚部の扁平上皮癌、食道癌、神経原性癌、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫が挙げられる。該腫瘍は、膀胱癌又は肝細胞癌であることが好ましい。
【００４４】
本明細書に用いられる用語「対象」とは、任意の（例えば、哺乳動物）対象、好ましくはヒト対象のことである。
【００４５】
本明細書に用いられる語句「Ｈ１９ｍＲＮＡ」とは、Ｈ１９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３２０５３−配列番号７）の転写産物のことである。
【００４６】
本発明は、ＲＴ−ＰＣＲ分析（図１Ｂ〜Ｄ）及びＲＮアーゼ保護アッセイ（図１Ｅ）により示された癌細胞ではなく、胎性組織に特異的に発現するＨ１９ＲＮＡ遺伝子の新規なスプライスイソ体を同定している。この新規なスプライスイソ体は、配列番号７に示された知られたＨ１９転写物と比較して、転写開始部位のヌクレオチド２５２から５８８まで伸長するエキソン−１の部分を欠いていることが示された。したがって、本発明のこの態様のＨ１９ＲＮＡは、Ｈ１９転写物のエキソン１を含むことが好ましく、配列番号７の核酸配列座標２５２から５８８により表示されたＲＮＡ配列を含むことがさらにより好ましい。
【００４７】
Ｈ１９は、タンパク質をコードしないことから、Ｈ１９ｍＲＮＡのレベル又は活性のダウンレギュレートは、ＲＮＡレベルで実施されることが好ましい。
【００４８】
ダウンレギュレートされるＨ１９のレベル及び／又は活性は、好ましくは１０％超、より好ましくは２０％超、より好ましくは４０％超、より好ましくは６０％超、より好ましくは８０％超、さらにより好ましくは１００％である。
【００４９】
該薬剤は核酸系薬剤であることが好ましい。該薬剤は、より好ましくはオリゴヌクレオチド、最も好ましくは二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００５０】
Ｈ１９ｍＲＮＡレベルの減少は、幾つかの機序：Ｈ１９遺伝子からＨ１９ＲＮＡへの転写を阻害することにより；ｈｎＲＮＡからｍＲＮＡまでの成熟過程の阻害により；酵素による細胞質中のｍＲＮＡの分解促進により（ＲＮＡ二重鎖及び三重鎖を形成することにより）、及び核酸ベースの酵素（ＤＮＡザイム及びＲＮＡザイム）の触媒的開裂により達成できる。
【００５１】
したがって、本発明による抗Ｈ１９ｍＲＮＡ薬剤は、以下のものから選択できる：
１）Ｈ１９遺伝子からＨ１９ＲＮＡの転写の立体的阻害用一本鎖核酸配列；
２）Ｈ１９ＲＮＡとハイブリダイゼーションし、酵素的分解（例えば、ＲＮＡアーゼにより）に導く一本鎖核酸配列；
３）Ｈ１９の分解（ｓｉＲＮＡを形成することにより）に導く二本鎖核酸配列；
４）Ｈ１９ｍＲＮＡの開裂用触媒核酸配列；
５）三重鎖形成ヌクレオチド；
６）Ｈ１９ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってＨ１９ｍＲＮＡ活性の減少に導く一本鎖核酸配列；及び
７）１）から６）のいずれか１つをコードする核酸配列。
【００５２】
本発明のこの態様の一実施形態によれば、該薬剤は上記のとおり、本発明のＨ１９ＲＮＡに特異的にハイブリダイズできる（例えば、生理的条件下の細胞において）核酸配列を含む核酸系薬剤である。
【００５３】
本明細書に用いられる用語「核酸系薬剤」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはそれらの模倣物の一本鎖又は二本鎖オリゴマー或いはポリマーのことである。この用語は、天然塩基、糖類、及びヌクレオシド間共有結合（例えば、主鎖）、並びにそれぞれ天然部分と同様に機能する非天然部分を有するポリヌクレオチド類からなるポリヌクレオチド類を含む。
【００５４】
本明細書に用いられる語句「ハイブリダイズできる」とは、核酸系薬剤の少なくとも一本鎖が、Ｈ１９ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同的である塩基対のことである。
【００５５】
本発明の核酸系薬剤は、本発明のＨ１９ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。すなわち、該薬剤は、Ｈ１９ＲＮＡとのハイブリダイズするために非関連ＲＮＡ分子（例えば、ＧＡＰＤＨ）と対比して少なくとも５倍の優先度を有する。
【００５６】
本発明の教示に従って設計された核酸系薬剤は、酵素的合成又は固相合成の双方など、当業界に知られた任意の核酸合成法に従って作出できる。固相合成を実施するための装置及び試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから商品として入手できる。このような合成のための他の任意の手段としては、以下のものも使用できる：核酸系薬剤の実際の合成は、当業者の能力の範囲内に十分に入り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら編集（１９９４、１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ボルチモア、メリーランド州；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；及びＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編集（１９８４）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」に詳述され、確立された方法論により、固相化学、例えば、シアノエチルホスホルミダイトを利用し、次いで脱保護、脱塩、及び例えば、自動トリチル−オン法又はＨＰＬＣによる精製により達成できる。
【００５７】
本発明の核酸系薬剤は、以下にさらに記載される発現ベクターを用いて作出できることも認識するであろう。
【００５８】
本発明の核酸系薬剤は、修飾されることが好ましく、核酸系薬剤は、当業界に知られた種々の方法を用いて修飾できる。
【００５９】
例えば、本発明の核酸系薬剤は、３’−から５’−ホスホジエステル結合に結合されたプリン及びピリミジン塩基からなるへテロ環式ヌクレオシドを含むことができる。
【００６０】
核酸系薬剤は、以下に広く記載されるように、主鎖、ヌクレオシド間結合、又は塩基において修飾されるものを使用することが好ましい。
【００６１】
本発明のこの態様に従って有用な好ましい核酸系薬剤の具体例としては、修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチド類又はポリヌクレオチド類が挙げられる。修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチド類又はポリヌクレオチド類としては、米国特許第４，４６９，８６３号；米国特許第４，４７６，３０１号；米国特許第５，０２３，２４３号；米国特許第５，１７７，１９６号；米国特許第５，１８８，８９７号；米国特許第５，２６４，４２３号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２７８，３０２号；米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，３２１，１３１号；米国特許第５，３９９，６７６号；米国特許第５，４０５，９３９号；米国特許第５，４５３，４９６号；米国特許第５，４５５，２３３号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７６，９２５号；米国特許第５，５１９，１２６号；米国特許第５，５３６，８２１号；米国特許第５，５４１，３０６号；米国特許第５，５５０，１１１号；米国特許第５，５６３，２５３号；米国特許第５，５７１，７９９号；米国特許第５，５８７，３６１号；及び米国特許第５，６２５，０５０号に開示されているように、主鎖においてリン原子を保持するものが挙げられる。
【００６２】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば：ホスホロチオエート類；キラルホスホロチオエート類；ホスホロジチオエート類；ホスホトリエステル類；アミノアルキルホスホトリエステル類；３’−アルキレン  ホスホネート類及びキラルホスホネート類などのメチル及び他のアルキルホスホネート類；ホスフィネート類；３’−アミノ  ホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート類などのホスホルアミデート類；チオノホスホルアミデート類；チオノアルキルホスホネート類；チオノアルキルホスホトリエステル類；及び通常の３’−５’結合、これらの２’−５’結合類縁体を有するボラノホスフェート類、並びにヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’に結合か、又は２’−５’から５’−２’に結合する逆極性を有するものが挙げられる。上記修飾物の種々の塩類、混合塩類、及び遊離酸形体もまた使用できる。
【００６３】
或いは、その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、若しくは１つ以上の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらとしては、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，２６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；及び米国特許第５，６７７，４３９号に開示されているように、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分からの一部に形成された）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他の主鎖を有するものが挙げられる。
【００６４】
本発明に従って使用できる他の核酸系薬剤は、糖及びヌクレオシド間結合の双方で修飾されるもの、すなわち、ヌクレオチド単位の主鎖が新規な基により置換されるものである。塩基単位は、適切なポリヌクレオチド標的よる相補性のために維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣物の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドとは、糖主鎖がアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖により置換されるオリゴヌクレオチドのことである。塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許は、限定はしないが、米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；及び米国特許第５，７１９，２６２号が挙げられ；それらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。本発明に使用できる他の主鎖の修飾は、米国特許第６，３０３，３７４号に開示されている。
【００６５】
本発明の核酸系薬剤はまた、塩基修飾又は置換を含むことができる。本明細書に用いられる「非修飾」又は「天然」塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。「修飾」塩基としては、限定はしないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン；５−ハロウラシル及びシトシン；５−プロピニルウラシル及びシトシン；６−アゾウラシル、シトシン及びチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びに他の８−置換アデニン類及びグアニン類；５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、並びに他の５−置換ウラシル類及びシトシン類：７−メチルグアニン類及び７−メチルアデニン；８−アザグアニン及び８−アザアデニン；７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン；並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然塩基が挙げられる。さらなる修飾塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編集（１９９０）、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」８５８〜８５９ページ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら（１９９１）、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ」、国際版、３０、６１３ページ；及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１５章、２８９〜３０２ページ、Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ及びＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年に開示されるものが挙げられる。このような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物結合親和力を増加させるために特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンなど、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、並びにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６−置換プリン類が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．ら（１９９３）、「アンチセンス研究と応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２７６〜２７８ページ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、目下のところ好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、さらにより特に好ましい。
【００６６】
本発明の核酸系薬剤は、Ｈ１９ＲＮＡと少なくとも１０、少なくとも１５、又は少なくとも１７の塩基と特異的にハイブリダイズできる。実施例１に示されるように、本発明のｓｉＲＮＡは、２つの３’オーバーハングを有する１９塩基である。
【００６７】
本発明はまた、ノックアウト薬剤などのＨ１９ＲＮＡをダウンレギュレートできる核酸系薬剤以外の薬剤を考慮していることを認識すべきである。
【００６８】
小型の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、Ｈ１９ＲＮＡをダウンレギュレートできる核酸系薬剤の例である。ＲＮＡ干渉は、２ステップ過程である。開始ステップと呼ばれる第一のステップ時に、インプットｄｓＲＮＡは、恐らくＡＴＰ依存様式で（直接又は発現ベクター、カセット又はウィルスを介して導入される）ｄｓＲＮＡを開裂する、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーであるＤｉｃｅｒの作用により２１〜２３のヌクレオチド（ｎｔ）小型干渉ＲＮＡ類（ｓｉＲＮＡ）に消化される。連続開裂事象により、ＲＮＡを１９〜２１のｂｐ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）である２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する各鎖に分解する［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５〜２３２ページ（２００２）；及びＢｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３〜３６６ページ（２００１）］。
【００６９】
エフェクターステップにおいて、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼ複合体に結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存巻き戻しは、ＲＩＳＣ活性化を必要とする。したがって、活性なＲＩＳＣは、塩基対相互作用により相同的転写を標的とし、ｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から１２のヌクレオチド断片に開裂する［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５〜２３２ページ（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄら、（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０〜１１９ページ；及びＳｈａｒｐ  Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５〜９０ページ（２００１）］。開裂の機序は未だ解明されていないが、研究により各ＲＩＳＣは、単一ｓｉＲＮＡ及びＲＮアーゼを含有することが示されている［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５〜２３２ページ（２００２）］。
【００７０】
事前ｓｉＲＮＡを提供することにより「開始ステップ」を除外することは可能である。
【００７１】
ＲＮＡｉの注目すべき効力のため、ＲＮＡｉ経路内の増幅ステップが示唆されている。さらにｓｉＲＮＡ類を作出すると思われるインプットｄｓＲＮＡ類を転写することにより、又は形成されたｓｉＲＮＡ類の複製により、増幅を生じることができた。或いは又はさらに、増幅は、ＲＩＳＣの複数ターンオーバー事象により実施できた［Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０〜１１９ページ（２００１）；Ｓｈａｒｐ  Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５〜９０ページ（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５〜２３２ページ（２００２）］。ＲＮＡｉに対するさらなる情報に関して、以下のレビューを参照されたい：Ｔｕｓｃｈｌ  ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５ページ（２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７〜５９９ページ（２００２）；及びＢｒａｎｔｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１５７５：１５〜２５ページ（２００２）。
【００７２】
本発明による使用に好適なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のとおり実施できる。第一に、Ｈ１９核酸配列標的は、ＡＡジヌクレオチド配列の下流にスキャンされる。各ＡＡ及び３’隣接１９のヌクレオチドの出現は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。
【００７３】
第二に、潜在的な標的部位は、ＮＣＢＩサーバーから入手できるＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）など、任意の配列アラインメントソフトウェアを用いて適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード化配列に対して有意な相同性を示す推定上の標的部位を取り除く。
【００７４】
適格な標的配列は、ｓｉＲＮＡ合成のテンプレートとして選択される。好ましい配列は、５５％超のＧ／Ｃ含量を有するものと比較して、遺伝子サイレンシングの媒介により有効であると証明されたものとして低含量のＧ／Ｃを含むものである。幾つかの標的部位は、評価のための標的遺伝子の長さに沿って選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡ類のより良好な評価のために、陰性対照と組み合わせて使用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成物を含むことが好ましいが、ゲノムに対して相同性を著しく欠いている。したがって、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列は、任意の他の遺伝子に対して著しい相同性を示さないという条件で使用されることが好ましい。
【００７５】
本発明のこの態様に従って使用できるＨ１９をダウンレギュレートできるｓｉＲＮＡ類の例としては、配列番号１〜４により示されるものが挙げられる。
【００７６】
これらの分子は、腫瘍サイズ及び容積を減少させるのに有効であることが示されたことから、本発明は、必ずしも組合せを必要としない、これらの分子単独を用いる癌の治療を想定している。
【００７７】
Ｈ１９ＲＮＡの発現をダウンレギュレートできる別の薬剤は、そのコード化ポリヌクレオチドを特異的に開裂できるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖及び二本鎖標的配列の双方を開裂できる一本鎖核酸系薬剤である（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５年；２：６５５ページ；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７年；９４：４２６２ページ）。ＤＮＡザイム用の一般的なモデル（「１０〜２３」モデル）が提案されている。「１０〜２３」ＤＮＡザイムは、各々７つから９つのデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインにより並べられた１５のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン結合においてその基質ＲＮＡを効果的に開裂できる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９；ＤＮＡザイムのレビューに関して、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４：１１９〜２１ページ（２００２）］を参照）。
【００７８】
一本鎖及び二本鎖標的開裂部位を認識する合成操作されたＤＮＡザイムの構築及び増幅の例は、Ｊｏｙｃｅらに対する米国特許第６，３２６，１７４号に開示されている。同様の設計のＤＮＡザイムは、ヒトに対して向けられた。ウロキナーゼ受容体は最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻止し、インビボで大腸癌細胞の転移を首尾よく阻止することが観察された（Ｉｔｏｈら、２００２年、要約書４０９ページ、Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用において、ｂｅｒ−ａｂｌ発癌遺伝子に相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞において発癌遺伝子の発現を阻止しするのに成功しており、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ急性白血病（ＡＬＬ）の症例において自家骨髄移植において再発率を減少させることに成功した。
【００７９】
Ｈ１９ＲＮＡの発現をダウンレギュレートできる別の薬剤は、そのコード化ポリヌクレオチドを特異的に開裂できるリボザイム分子である。リボザイムは、対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡ類の開裂により遺伝子発現の配列特異的阻害にますます利用されている［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６〜９６ページ（１９９８）］。任意の特異的標的ＲＮＡを開裂するためにリボザイムを設計する可能性は、基礎的研究及び治療適用の双方における手段として価値あるものにしている。治療領域において、リボザイムは、感染性疾患におけるウィルスＲＮＡ、癌における優性発癌遺伝子、及び遺伝子疾患における特定の体性変異を標的にするために開発されている［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｖｉｒｏｌ．１０：１６３〜７１ページ（１９９８）］。とりわけ、ＨＩＶ患者に対する幾つかのリボザイム遺伝子療法プロトコルは、既にフェーズ１試験中にある。ごく最近、リボザイムは、形質転換動物研究、遺伝子標的バリデーション及び経路解明に使用されている。幾つかのリボザイムは、臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験において試験するために最初の化学的合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子受容体）形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、並びに他の会社は、動物モデルにおける抗血管新生療法の重要性を示している。Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウィルスＲＮＡを減少させるのに有効であることが判明した（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｐｉ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００８０】
Ｈ１９ＲＮＡをダウンレギュレートするさらなる方法は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）類を介する。この１０年間の研究で、ＴＦＯ類は、配列特異的様式で二本鎖らせん状ＤＮＡにおけるポリプリン／ポリピリミジン領域を認識し、結合できるように設計し得ることが示されている。したがって、本発明のＨ１９ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を標的にすることによってＲＮＡ分子をダウンレギュレートできる。
【００８１】
ＴＦＯ類を調節する認識ルールは、Ｍａｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５：７２５〜７３０ページ；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：６４５〜６３０ページ；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０〜１３６３ページ；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２４１：４５６〜４５９ページ；及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．ら、欧州特許出願公開第３７５４０８号により概説されている。インターカレーターの導入及び主鎖置換などのオリゴヌクレオチドの修飾、並びに結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化は、電荷反発性及び不安定性など、ＴＦＯ活性に対する固有の障害を克服する上で役立っており、最近、合成オリゴヌクレオチド類は、特定の配列に対し標的化できることが示された（最近のレビューに関して、Ｓｅｉｄｍａｎ及びＧｌａｚｅｒ（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ；１１２：４８７〜９４ページを参照されたい）。
【００８２】
一般に、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、配列対応性を有する：
オリゴ      ３’−−Ａ      Ｇ      Ｇ      Ｔ
二重鎖      ５’−−Ａ      Ｇ      Ｃ      Ｔ
二重鎖      ３’−−Ｔ      Ｃ      Ｇ      Ａ
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣ三重鎖は、最大の三重鎖らせん状安定性を有することが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ及びＪｅｌｔｓｃｈ（２００２）、ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｓｅｐｔ１２、Ｅｐｕｂ）。同じ著者は、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣルールに従って設計されたＴＦＯ類が、非特異的三重鎖を形成しないことを立証しており、三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示した。
【００８３】
したがって、制御領域における所与の配列に関して、三重鎖形成配列を考案できる。三重鎖形成オリゴヌクレオチド類は、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０以上のヌクレオチド長で、５０ｂｐ又は１００ｂｐまでである。
【００８４】
ＴＦＯ類による細胞（例えば、カチオン性リポソーム類を介して）のトランスフェクション、引き続く標的ＤＮＡとの三重鎖らせん状構造の形成により、立体的及び機能的変化を誘導し、転写開始及び伸長をブロックし、内因性ＤＮＡにおいて所望の配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特異的ダウンレギュレーションをもたらす。ＴＦＯ類で処理された細胞のこのような遺伝子発現の抑制例としては、哺乳類動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧ１及び内因性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９９）２７：１１７６〜８１ページ、及びＰｕｒｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、（２００１）２７６：２８９９１〜９８ページ）、前立腺癌の病因に重要なＥｔｓ２転写因子の発現の配列及び標的特異的なダウンレギュレーション（Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（２００３）３１：８３３〜４３ページ）、及び炎症誘発性ＩＣＡＭ−１遺伝子（Ｂｅｓｃｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、（２００２）２７７：３２４７３〜７９ページ）が挙げられる。さらに、最近Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは、配列特異的ＴＦＯ類がｄｓＲＮＡに結合して、ＲＮＡ依存キナーゼなどのｄｓＲＮＡ依存酵素の活性を阻害できることを示している（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０００）；２８：２３６９〜７４ページ）。
【００８５】
さらに、上記の原理に従って設計されたＴＦＯ類は、ＤＮＡ修復できる定方向突然変異を誘導し、したがって内因性遺伝子の発現のダウンレギュレーション及びアップレギュレーションの双方を提供できる［Ｓｅｉｄｍａｎ及びＧｌａｚｅｒ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００３）１１２：４８７〜９４ページ］。有効なＴＦＯ類の設計、合成及び投与の詳細な説明は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらに対する米国特許出願第２００３  ０１７０６８号及び米国特許出願第２００３  ００９６９８０号、Ｅｍａｎｕｅｌｅらに対する米国特許出願第２００２  ０１２８２１８号及び米国特許出願第２００２  ０１２３４７６号、及びＬａｗｎに対する米国特許第５，７２１，１３８号に見ることができる。
【００８６】
Ｈ１９ｍＲＮＡをハイブリダイズできる核酸系薬剤は、別の下流薬剤に対するＨ１９ｍＲＮＡ結合を防止することによってその活性をダウンレギュレートできることを認識するであろう。
【００８７】
本発明の核酸系薬剤（例えば、配列番号１、２、３又は４に示されたものなどのｓｉＲＮＡ分子）は、細胞内で発現できる。
【００８８】
本発明の薬剤は、対象において直接発現できるか（すなわち、インビボ遺伝子療法）、又は細胞系（自家性又は非自家性）においてエキソビボで発現させ、次いで対象に投与できることを認識するであろう。
【００８９】
哺乳動物細胞においてこのような薬剤を発現させるために（すなわち、ＲＮＡ分子を作製するために）、本発明の薬剤をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞の発現に好適な核酸構築体に結合させることが好ましい。このような核酸構築体は、構成的又は誘導的様式で細胞のポリヌクレオチド配列の転写を方向付けるためのプロモーター配列を含む。
【００９０】
本発明による使用に好適な構成的プロモーターは、たいていの環境条件、及びサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）などのたいていのタイプの細胞下で活性であるプロモーター配列である。本発明による使用に好適な誘導的プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーターが挙げられる（Ｚａｂａｌａ  Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４年、６４（８）：２７９９〜８０４ページ）。
【００９１】
本発明の核酸構築体（本明細書で「発現ベクター」とも称される）は、原核生物、真核生物、又は好ましくは双方における複製及び組込みに、このベクターを好適にさせる追加の配列を含む。さらに、典型的なクローニングベクターはまた、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター並びにポリアデニル化シグナルを含有することができる。
【００９２】
真核生物プロモーターは、典型的に２つのタイプの認識配列、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモーター要素を含有する。転写開始部位の上流に配置される２５〜３０の塩基対のＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを方向付けることに関与すると考えられている。他の上流プロモーター要素は、転写を開始させる速度を決定する。
【００９３】
本発明の核酸構築体により利用されるプロモーターは、変換される特定の細胞集団において活性であることが好ましい。細胞タイプ特異的及び／又は組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的であるアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７ページ］、リンパ球系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅら、（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５ページ］；特にＴ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏら、（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９〜７３３ページ］；及び免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉら、（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３７２９〜７４０ページ］、神経フィラメントプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター［Ｂｙｒｎｅら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３〜５４７７ページ］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２〜９１６ページ］又は乳清プロモーターなどの乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号）などのプロモーターが挙げられる。
【００９４】
エンハンサー要素は、結合された相同的又は非相同的プロモーターから１，０００倍まで転写を促進できる。エンハンサーは、転写開始部位からの下流又は上流に置かれた場合に活性である。種々のウィルスに由来する多くのエンハンサー要素は、広範な宿主範囲を有しており、種々の組織において活性である。例えば、ＳＶ４０早期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に好適である。本発明に好適である他のエンハンサー／プロモーターの組合せとしては、ポリオーマウィルス、ヒト又はマウスサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウィルス、マウス又はラウス肉腫ウィルス及びＨＩＶなどの種々のレトロウィルスからの長期反復に由来するものが挙げられる。参照として本明細書に組み込まれている、エンハンサー及び真核生物発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州１９８３年、を参照されたい。
【００９５】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、その天然設定における転写開始部位とおよそ等距離の非相同的転写開始部位からの距離で配置されていることが好ましい。しかしながら、当業界に知られているように、この距離の何らかの変動は、プロモーター機能を損失しないで調節できる。
【００９６】
ポリアデニル化配列もまた、ＲＮＡ安定性を増加させるために発現ベクターに加えることができる［Ｓｏｒｅｑら、１９７４年；Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８８：２３３〜４５ページ］。
【００９７】
２つの相互に異なる要素は、正確且つ効率的なポリアデニル化に必要である：ＧＵ又はＵに富んだ配列は、ポリアデニル化部位から下流に配置し、６つのヌクレオチド、ＡＡＵＡＡＡの高度に保存された配列は、１１〜３０のヌクレオチド上流に配置した。本発明に好適な終結及びポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０に由来するものを含む。
【００９８】
既に記載された要素に加えて、本発明の発現ベクターは、クローン化核酸の発現レベルの増加又は組換えＤＮＡを担持する細胞の同定の促進を目的とした他の特殊化された要素を典型的に含有し得る。例えば、多くの動物ウィルスは、許容細胞型においてウィルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウィルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミド上で実施されるか、又は宿主細胞のゲノムを有する遺伝子により提供される限り、エピソーム的に複製される。
【００９９】
ベクターは、真核生物レプリコンを含んでも含んでなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、該ベクターは、適切な選択性マーカーを用いて真核細胞において増幅可能である。ベクターが、真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。その代わりとして、組換えＤＮＡは、操作細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターは、所望の核酸の発現を方向付ける。
【０１００】
哺乳動物の発現ベクターの例としては、限定はしないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手できるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手できるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手できるｐＴＲＥＳ、及びそれらの誘導体が挙げられる。
【０１０１】
レトロウィルスなどの真核生物ウィルス由来の制御要素を含有する発現ベクターも又使用できる。ＳＶ４０はｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウィルスに由来のベクターとしては、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウィルスに由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、並びにＳＶ−４０早期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核生物の発現に有効性を示す他のプロモーターの方向付けの下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１０２】
上記のとおり、ウィルスは、多くの場合、宿主防御機構を回避するために展開された極めて特殊化された感染物質である。典型的に、ウィルスは、特定の細胞型において感染し、伝播する。ウィルスベクターの標的特異性は、予め決められた細胞型を特異的に標的にするためにその天然の特異性を利用することによって、組換え遺伝子を感染細胞に導入する。変換された細胞型に従って好適なベクターを選択する能力は、通常の当業技術者の能力の範囲内に十分に入り、それ故、選択の考察の一般的な説明を本明細書に提示しない。例えば、骨髄細胞を、ヒトＴ細胞白血病ウィルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）を用いて標的化でき、腎細胞を、Ｌｉａｎｇ  ＣＹら、２００４年（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４９：５１〜６０）に記載されたバキュロウィルスオウトグラファカリフォルニア核多汗症ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する非相同的プロモーターを用いて標的化できる。
【０１０３】
組換えウィルスベクターは、側方感染及び標的特異性などの利点を提供することから、本発明のＨ１９ダウンレギュレート薬剤のインビボ発現に有用である。側方感染は、例えば、レトロウィルスのライフサイクルに固有であり、単一感染細胞が発芽し終わり、隣接細胞を感染する多くの後代ビリオンを産生する過程である。大きな領域が迅速に感染され、その大部分は、元のウィルス粒子により最初に感染されなかった結果を与える。これは、感染物質が娘後代を通してのみ拡がる垂直型感染と対照的である。側方に拡がることができないウィルスベクターも作製できる。この特徴は、所望の目的が局在数の標的細胞のみに特定の遺伝子を導入することである場合、有用であり得る。
【０１０４】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するために、種々の方法が使用できる。このような方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ボルチモア、メリーランド州（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、体性遺伝子療法（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、アンアーバー、ミシガン州（１９９５）、Ｖｅｇａら、遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、アンアーバー、ミシガン州（１９９５）、ベクター：分子クローニングベクター類の概論及びそれらの使用（Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、ボストン、マサチューセッツ州（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２ページ、１９８６年］に記載されており、例えば、安定な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔及び組換えウィルスベクターによる感染が挙げられる。さらに、陽性−陰性選択法に関して米国特許第５，４６４，７６４号及び米国特許第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０１０５】
ウィルス感染による核酸の導入は、ウィルスの感染性質のためより高い感染効率が得られることから、リポフェクション及び電気穿孔などの他の方法よりも幾つかの利点を提供する。
【０１０６】
現在、好ましいインビボ核酸移入技法としては、アデノウィルス、レンチウィルス、単純Ｉ型ヘルペスウィルス、若しくはアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）などのウィルス又は非ウィルス構築体のトランスフェクション並びに脂質ベースシステムが挙げられる。遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５ページ（１９９６）］。遺伝子療法の使用に対し最も好ましい構築体は、ウィルスであり、最も好ましくは、アデノウィルス、ＡＡＶ、レンチウィルス、又はレトロウィルスである。レトロウィルス構築体などのウィルス構築体は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は座規定要素（類）、又は、交互のスプライシング、核ＲＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後の修飾などの他の手段により遺伝子発現を調節する他の要素を含む。このようなベクター構築体はまた、ウィルス構築体に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長い末端反復（ＬＴＲ）類又はそれらの一部、並びに使用されるウィルスに適切な陽性及び陰性鎖プライマー結合部位を含む。場合によっては、該構築体はまた、ポリアデニル化並びに１つ以上の制限部位を方向付けるシグナルを含む。例えば、このような構築体は、典型的に５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起源、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含むであろう。カチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーなどの非ウィルス性である他のベクターを使用することができる。
【０１０７】
挿入されたコード化配列の転写に必要な要素を含有する以外に、本発明の発現構築体はまた、発現ＲＮＡの安定性、生産、精製、収率又は毒性を増強させるために操作された配列を含むことができる。
【０１０８】
上記のとおり、Ｈ１９ｍＲＮＡをダウンレギュレートできる薬剤は、癌を治療するために、単独で（例えば、本発明のｓｉＲＮＡ類）又はこのような疾患に対して他の確立された或いは実験的治療レジメンと組み合わせて使用できる。Ｈ１９ｍＲＮＡをダウンレギュレートできる薬剤が、追加の治療方法又は組成物と相乗的に作用でき、したがってこのような治療の効果的な臨床用量を有意に減少させる可能性があり、それによってしばしば問題となる負の副作用及び高コストの治療を軽減することを、本発明者らは想定している。これは、確立された化学療法及び放射線療法レジメンが無効である低酸素領域に関連する固形癌を治療するために特に関連し得る。
【０１０９】
本発明の薬剤は、癌療法の前に、同時に、又は後に投与できる。
【０１１０】
本明細書に用いられる語句「癌療法」とは、癌疾患に関連する症状を予防し、緩和し、又は減少させるように作用する任意の治療のことである。
【０１１１】
本発明の薬剤又はそれをコードするポリヌクレオチドとの併用に好適な癌治療のための治療的レジメンとしては、限定はしないが、化学療法、放射線療法、光療法及び光線力学的治療法、外科手術、栄養療法、切除療法、放射線療法と化学療法との組合せ、ブラキオ療法、陽子線療法、免疫療法、細胞療法並びにフォトンビーム放射線外科手術療法が挙げられる。本発明の薬剤との併用に好適な癌治療用治療的レジメンの別の形態は、癌制御又は血管新生経路に関与することが知られている遺伝子を制御できるヌクレオチド薬剤の投与である。
【０１１２】
本発明の化合物と共投与できる抗癌薬物（すなわち、化学療法薬剤）としては、限定はしないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトリキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタラビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；インターフェロン  アルファ−２ａ；インターフェロン  アルファ−２ｂ；インターフェロン  アルファ−ｎ１；インターフェロン  アルファ−ｎ３；インターフェロン  ベータＩａ；インターフェロン  ガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコル；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸プロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフイリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。さらなる抗悪性腫瘍薬としては、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎの「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第８版、５２章、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ及びＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）、及びそれへの序論、１２０２〜１２６３ページ、１９９０年、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ社（Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に開示されているものが挙げられる。
【０１１３】
本発明の薬剤は、所望の場合、本発明の薬剤を含有する１種以上の単位剤形を含有し得る、ＦＤＡに承認されたキットなどのパック又はディスペンサー装置において提供できる。該薬剤は、追加の抗癌剤と共に、単一のパッケージング内に共製剤化されてもよいし、該薬剤は、別個のパッケージングにおいて、追加の抗癌剤とは別個に製剤化されてもよい。該パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックのホイルを含んでもよい。該パック又はディスペンサー装置には、投与に関する使用説明書も添付できる。該パック又はディスペンサーには、薬剤の製造、使用又は販売を管理している政府機関によって規定された形態での容器に関連した注意書きも添付でき、該注意書きは、該組成物の形態について、或いはヒト又は家畜への投与についての該機関による承認を反映するものである。このような注意書きは、例えば、薬剤の処方に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルを有していてもよいし、承認された製品添付文書を有していてもよい。適合性の製薬担体において製剤化された本発明の薬剤を含む組成物を調製し、適切な容器内に入れて、癌の治療に関してラベル付けすることもできる。
【０１１４】
本発明の薬剤は、それ自体で、又は、好適な担体又は賦形剤と混合した医薬組成物で対象に投与できる。
【０１１５】
本明細書に用いられる用語「医薬組成物」とは、生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学的成分と一緒の本明細書に記載された１種以上の活性成分の製剤のことである。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を助けることである。
【０１１６】
本明細書における用語「活性成分」とは、抗癌作用を担う薬剤のことである。
【０１１７】
以下で、交換可能に使用できる語句「生理学的に許容できる担体」及び「薬学的に許容できる担体」とは、生物に有意な刺激をもたらさず、投与された化合物の生物学的活性及び性質を妨げない担体又は希釈剤のことである。アジュバントはこれらの語句に含まれる。
【０１１８】
本明細書における用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに助けるために医薬組成物に添加される不活性物質のことである。賦形剤の例としては、限定はしないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類及び種々のタイプの澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油並びにポリエチレングリコール類が挙げられる。
【０１１９】
薬剤の製剤化及び投与に関する技法は、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ペンシルベニア州、最新版に見ることができ、これは、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１２０】
好適な投与経路としては、例えば、経口、経直腸、経粘膜、特に経鼻、経腸管又は、筋肉内、皮下及び髄内注射などの非経口的送達、並びにくも膜下腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を挙げることができる。
【０１２１】
或いは、該医薬組成物を、全身的様式ではなく局所的様式で、例えば、該腫瘍内に直接（すなわち、インサイチュで）、注射により投与できる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、当業界によく知られた方法により、例えば、慣例的な混合法、溶解法、顆粒化法、糖衣丸作製法、湿式粉砕法、乳化法、封入法、捕捉法又は凍結乾燥法の手段により製造することができる。
【０１２３】
したがって、本発明に従って用いられる医薬組成物は、製剤内への活性成分の処理を助ける薬学的に使用できる賦形剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容できる担体を用いて、慣例的方法によって製剤化できる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１２４】
注射では、該医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液などの生理学的に適合性の緩衝液、又は生理食塩緩衝液の中に製剤化できる。経粘膜投与では、該製剤化には、透過するバリアにとって適切な透過剤が用いられる。このような透過剤は当業界に一般的に知られている。
【０１２５】
経口投与では、該活性化合物を当業界によく知られた薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって容易に製剤化できる。このような担体によって、患者による経口摂取のために、該医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。経口使用のための薬理学的製剤は、所望の場合、錠剤又は糖衣丸剤のコアを得るために好適な助剤の添加後、固体の賦形剤を用い、任意に、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して作製することができる。好適な賦形剤は、特に、乳糖、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類；例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容できるポリマーなどの増量剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸の塩などの崩壊剤を添加できる。
【０１２６】
糖衣丸剤のコアには、好適なコーティングが備えられる。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を任意に含有し得る濃縮糖溶液が使用できる。異なる組合せの活性化合物用量の同定又は特性化のために、錠剤又は糖衣丸剤のコーティングに色素又は顔料を添加できる。
【０１２７】
経口使用できる医薬組成物としては、ゼラチンから作製された押込み嵌めカプセル並びにゼラチンとグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤から作製された軟質密封カプセルが挙げられる。押込み嵌めカプセルは、乳糖などの増量剤、澱粉などの結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意に安定化剤と混合させた活性成分を含有し得る。軟質カプセルにおいて、活性成分は、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解又は懸濁できる。さらに、安定化剤を添加できる。経口投与のための全ての製剤は、選択された投与経路に好適な投与量にある。
【０１２８】
頬側投与では、該組成物は慣例的様式で製剤化された錠剤又は舐剤の形態をとり得る。
【０１２９】
経鼻吸入による投与では、本発明により使用される活性成分は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素の使用と共に、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量を送達するためのバルブを備えることによって判定できる。ディスペンサーに使用される、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、該化合物の粉末混合物及び乳糖若しくは澱粉などの好適な粉末ベースを含有して製剤化できる。
【０１３０】
本明細書に記載された医薬組成物は、非経口投与、例えば、ボーラス注入又は連続注入のために製剤化できる。注射用製剤は、単位投与量形態、例えば、任意に保存剤を添加したアンプル、又は多用量容器で提供できる。該組成物は、油性媒体又は水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳濁液であり得、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。
【０１３１】
非経口投与のための医薬組成物としては、水溶性形態における活性製剤の水溶液が挙げられる。さらに、活性成分の懸濁剤は、適切な油性又は水性ベースの注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性の溶媒又は媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド又はリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなど、該懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有し得る。該懸濁剤は、該活性成分の溶解性を高め、高濃度溶液の調製を可能にする好適な安定化剤又は試剤も、任意に含有し得る。
【０１３２】
或いは、該活性成分は、好適な媒体、例えば、滅菌した無パイロジェン水ベース溶液によって使用前に構成するための粉末形態であり得る。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、例えば、カカオバター又は他のグリセリドなどの慣例的な座剤用ベースを用いて、座剤又は保持浣腸などの直腸用組成物にも製剤化できる。
【０１３４】
本発明の文脈での使用に好適な医薬組成物は、該活性成分が意図された目的を達成する上で有効な量で含有される組成物を含む。より具体的には、治療的有効量とは、疾患（例えば虚血）の症状を予防、軽減又は寛解させるか、又は治療されている対象の生存を延長させるために有効な活性成分（核酸構築体）の量を意味する。
【０１３５】
治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供された詳細な開示を鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１３６】
本発明の方法に用いられるいずれの製剤においても、治療的有効量又は用量は、最初、インビトロ及び細胞培養アッセイから予測できる。例えば、用量は、動物モデルにおいて、所望の濃度又は力価が得られるように製剤化できる。ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を用いることができる。
【０１３７】
本明細書に記載された活性成分の毒性及び治療的有効性は、インビトロで、細胞培養で、又は実験動物において、標準的な製剤操作によって判定できる。これらのインビトロ及び細胞培養アッセイ並びに動物試験から得られたデータを、ヒトでの使用に関する投与量範囲の処方に用いることができる。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依って変化し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の病態を鑑みて、個々の医師によって選択できる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第１章、１ページを参照）。
【０１３８】
生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導又は抑制する上で十分な活性成分の血漿濃度又は脳濃度が提供されるように、投与量及び投与間隔を個々に調整できる。ＭＥＣは各製剤で変わるが、インビトロデータから予測できる。ＭＥＣを得るために必要な投与量は、個体の特徴及び投与経路に依存する。血漿濃度の判定には検出アッセイが使用できる。
【０１３９】
治療される病態の重症度及び応答性に依って、投与は単回又は複数回投与であり得、治療の過程は、数日から数週間、又は治癒がもたらされるまで、或いは疾患状態の減少が得られるまで継続され得る。
【０１４０】
投与される組成物の量は、勿論、治療されている対象、疾病の重症度、投与の様式、処方医師の判断などに依存する。
【０１４１】
本発明の組成物は、所望の場合、該活性成分を含有する１種以上の単位剤形を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパック又はディスペンサー装置において提供できる。該パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックホイルを含み得る。該パック又はディスペンサー装置には、投与に関する使用説明書を添付し得る。該パック又はディスペンサーには、薬剤の製造、使用又は販売を管理している政府機関によって規定された形態での容器に関連した注意書きも添付でき、該注意書きは、該組成物の形態について、又はヒト又は家畜への投与についての該機関による承認を反映するものである。このような注意書きは、例えば、薬剤の処方に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルを有してもよいし、承認された製品添付文書を有してもよい。適合性の製薬担体中に製剤化された本発明の薬剤を含む組成物は、上記でさらに詳述されるように、調製し、適切な容器内に入れて、指示された病態の治療に関してラベル付けすることもできる。
【０１４２】
本特許権の存続期間中に多くの関連癌療法が開発されることが予想されるため、癌療法という用語の範囲にはこのような全ての新規技法が事前に含まれることとする。
【０１４３】
本明細書に用いられる用語「約」とは、±１０％のことである。
【０１４４】
本発明のさらなる目的、利点、及び新規な特徴は、限定が意図されてはいない以下の実施例を検討すれば、通常の当業者には明らかとなろう。さらに、以下の実施例は、本明細書の上記に記述され、請求項の節で請求された本発明の種々の実施形態及び態様の各々にとって実験的な裏づけとなる。
【実施例】
【０１４５】
ここで、以下の実施例について記述を行うが、これらは上記の説明と共に、非限定的な様式で、本発明を例示するものである。
【０１４６】
一般に、本明細書に用いられる命名法及び本発明に利用される実験操作には、分子的、生化学的、微生物学的及び組換えＤＮＡの技法が含まれる。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、バルチモア、メリーランド州（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号及び米国特許第５，２７２，０５７号に記載された方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、ノルウオーク、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｅ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）を参照されたい。利用可能な免疫アッセイは、特許及び科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８５０，５７８号；米国特許第３，８５３，９８７号；米国特許第３，８６７，５１７号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；米国特許第４，０９８，８７６号；米国特許第４，８７９，２１９号；米国特許第５，０１１，７７１号及び米国特許第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅ���ｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１巻〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンジェゴ、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらは全て、本明細書に完全に記載されているように、参照として組み込まれている。他の一般的な文献も本文書を通して提供されている。それらにおける手順は、当業界ではよく知られていると考えられ、読者の便宜のために提供されている。それらに含まれる情報は全て、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１４７】
（実施例１）
ヒトの胚検体及び胎盤検体におけるＨ１９の選択的スプライスバリアントの検出
Ｈ１９のスプライスバリアントが特定の細胞型に限定されているかどうかを確認するために、以下の実験を実施した。
【０１４８】
材料及び方法
細胞培養：本試験に用いられたヒト癌細胞系は全て、米国タイプ培養コレクション（マナサス、バージニア州）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（５５℃で３０分間、不活性化）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、ペニシリン（１８０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びアムホテリシンＢ（０．２μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）中に維持した。およそ４×１０４細胞／ｃｍ２をポリスチレン培養皿（ＮＵＮＣ）に平板培養した。４日ごとに、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｂｉｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ）により１０分間、該細胞をトリプシン処理し、同じ開始濃度で再度、再平板培養した。
【０１４９】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：総ＲＮＡを組織から抽出し、製造元の使用説明書に従い、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞系を培養し、ＤＮアーゼＩ処理して、上記のとおり、ゲノムＤＮＡ混入物を除外した（Ａｙｅｓｈ及びＭａｔｏｕｋら、２００２年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７、５３５−５４１ページ）。製造元の使用説明書に従い、４００単位の逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）による５μｇの総ＲＮＡの逆転写を開始させるためにｐ（ｄＴ）１５プライマー（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国）を用いて、ｃＤＮＡの合成を実施した。Ｄｉａｚａ  ｄＧＴＰ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国）の存在下、９４℃で５分間先行させ、７２℃で５分間の最終延長で、４０サイクル（９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で４０秒間）、ＴａｑポリメラーゼによりＰＣＲ反応を実施した。該ＰＣＲ派のに使用したプライマーは、（５’−ＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＧ−３’）（配列番号８）及び（５’−ＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡ−３’）（配列番号９）であり、公開されている転写Ｈ１９開始部位から、それぞれ、１１７塩基、８１６塩基下流であった（Ｂｒａｎｎａｎら、１９９０年、ＭＯｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０、２８−３６ページ）。該プライマーの位置は図１Ａに示されている。該ＰＣＲ反応の産物は臭化エチジウム染色ゲル上で操作した。
【０１５０】
プローブ合成：組織からの小さいバンドを示しているＰＣＲ産物を、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ、ＤＮＡ及びＧｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによって該ゲルから精製し、Ｔ−ｅａｓｙ（登録商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）内にクローン化した。該挿入体の方向を制限酵素分析によって確認し、したがって、供給者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国）に従い、ジゴキシゲニンＵＴＰを用いて、標識アンチセンス鎖を合成した。得られたプローブを２単位のＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩで処理し、ペレット化し、ＤＥＰＣ処理した２倍希釈水の適切な容量に再懸濁した。４％変性アガロースミニゲル上で操作して、合成プローブのサイズを分析し、ジゴキシゲニン抗体を用いるドットブロット分析によってその標識効率を判定した（データは示していない）。
【０１５１】
ＲＮアーゼ保護アッセイ：ＲＮアーゼ保護アッセイには、種々の濃度の三半期胎盤ＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、選択的スプライスバリアントの存在を示した）を用いた。キット使用説明書ＲＰＡ  ＩＩ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）に従い、６００ｐｇのＤｉｇ標識プローブ／三半期胎盤からの１０μｇの総ＲＮＡ（ＤＮアーゼＩ処理した）及び使用したＲＮＡの最高濃度に等しい酵母ＲＮＡを用いて、４２℃で１６時間、ハイブリダイズし、ＲＮアーゼＡ／及びＲＮアーゼＴ１で消化した。ＲＮアーゼ消化から保護したＲＮＡ断片を、５％ポリアクリルアミドゲル（８Ｍの尿素を含有）上での電気泳動により分離し、製造元の使用説明書に従い、ＣＤＰ  Ｓｔａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国）を用いて検出した。
【０１５２】
ＤＮＡ配列決定：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて配列決定反応を実施した。
【０１５３】
結果
ＲＴ−ＰＣＲ分析（図１Ｂ〜Ｄ）及びＲＮアーゼ保護アッセイ（図１Ｅ）で示されるとおり、Ｈ１９の選択的スプライスバリアントは、胎盤組織及び胚組織に存在し、癌細胞系及び癌患者の検体中には存在しなかった。該選択的スプライスバリアントは、３４４ｂｐの長さであり、既知のＨ１９転写体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  Ｍ３２０５３）に比較して、転写開始部位（図１Ｆ）のｎｔ２５２から５８８までに延在しているエキソン−１の一部を欠失していることが、配列決定試験により示された。
【０１５４】
（実施例２）
Ｈ１９遺伝子発現はＣｏＣｌ２により中程度にアップレギュレートされる
Ｈ１９ＲＮＡの存在下でアップレギュレートされる幾つかの遺伝子は、低酸素症によって誘導されることも知られている（Ａｙｅｓｈ及びＭａｔｏｕｋら、２００２年、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ３５、６３〜７４ページ）。Ｈ１９ＲＮＡは、リウマチ様関節炎の組織において検出されていることも報告されている（Ｓｔｕｈｌｍｕｌｌｅｒら、２００３年、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３、９０１〜９１１ページ）。広範な血管形成の存在は通常、患部領域において増加した炎症細胞浸出液の代謝活性に部分的に起因する低酸素的及び酸化的ストレスによるリウマチ様関節炎に関連している。
【０１５５】
さらに、Ｈ１９遺伝子全体を含有するゲノムＤＮＡを安定にトランスフェクトしたヒト癌乳腺上皮細胞におけるＨ１９の過剰発現は、転写後レベルにおけるチオレドキシン遺伝子の陽性調節の原因であり、チオレドキシンは、酸化的ストレス応答及びデオキシヌクレオチド生合成の重要なタンパク質であることが、プロテオミックなアプローチによって判明している（Ｌｏｔｔｉｎら、２００２年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｓｉｓ  ２３、１８８５〜１８９５ページ）。
【０１５６】
さらに、芽細胞移植など、細胞浸潤、及び胎盤の発達を含む多くの過程は、酸素減少環境において生じる（Ｒｏｄｅｓｃｈら、１９９２年、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ８０、２８３〜２８５ページ）。これらの２つの生理学的過程では、Ｈ１９発現の強いアップレギュレーションが示される（Ａｒｉｅｌら、１９９４年、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５３、２１２〜２１９ページ）。
【０１５７】
これらの理由に基づいて、Ｈ１９遺伝子を、低酸素症に感受性であるかどうかを判定するために分析した。
【０１５８】
材料及び方法
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、ＣｏＣｌ２処理前に、通常の培地条件下で２４時間培養した。該細胞をＲＮＡ抽出前に、ＣｏＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）でさらに２２時間インキュベートした。
【０１５９】
上記の実施例１のとおり、以下のプライマー、５’−ＣＣＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＡ−３’正（配列番号１０）及び５’−ＴＴＣＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴ−３’逆（配列番号１１）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【０１６０】
結果
ＲＴ−ＰＣＲ分析により試験されたとおり、ＣｏＣｌ２（５０〜４００ｎＭ）の増加濃度の添加に応答して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、Ｈ１９遺伝子発現が中程度にアップレギュレートされる（図２Ａ〜２Ｂ）。真の低酸素条件に対する強いアップレギュレーションに比較して、この中程度のアップレギュレーションは、ＨＩＦ−αが部分的にのみ原因となっていることを示している。
【０１６１】
（実施例３）
正常と低酸素様の双方の培養条件下で、Ｈ１９ＲＮＡは種々のｓｉＲＮＡ二重鎖によりインビトロで効率的にダウンレギュレートされる
材料及び方法
ｓｉＲＮＡの調製：４種のｓｉＲＮＡ標的ヒトＨ１９及び１種の陰性対照ｓｉＲＮＡ（ルシフェラーゼｐＧＬ３を標的にしている）（本明細書の下表１に記載）を、Ｐｒｏｌｉｇｏにより即時使用二重鎖として合成し、推奨されるとおり、各鎖でｄＴｄＴ３’オーバーハングを有するように設計した。全ての配列を、国立衛星研究所のＢｌａｓｔプログラムを用い、遺伝子特異性に関して評価した。
【０１６２】
【表１】
0005383186.tif 000002
【０１６３】
各凍結乾燥ｓｉＲＮＡを入手したら、ＲＮアーゼを含まない水で再構成し、５０ｐモル／ｕｌ溶液を調製し、アリコートとして、−８０℃で保存した。
【０１６４】
細胞培養条件及びｓｉＲＮＡ類のトランスフェクション：１２ウェルプレートにおいて、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）により、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを実施した。該細胞がトランスフェクション当日に、ほぼ５０％集密になるように、トランスフェクションの前日に、該細胞をトリプシン処理し、カウントし、無抗生物質ＤＭＥＭ培地１ｍｌを含有するウェル当たり６０，０００で接種した。１００μｌの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）と共に、３μｌのリポフェクタミン２０００を１５分間インキュベートした。これを、１００μｌの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で希釈した１００ｐモルのｄｓＲＮＡに加え、処方を２０分間続けた。１９５μｌの該混合物を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＵＭＵＣ３細胞に適用し、培地を交換せずにさらに４８時間インキュベートした。低酸素模擬条件では、トランスフェクションの２４時間後に、新鮮調製したＣｏＣｌ２を１００μＭの最終濃度で加え、該細胞を、ＲＮＡ抽出前に、さらに２２時間インキュベートした。
【０１６５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ条件（ｓｉＲＮＡ）：１μｇの総ＲＮＡを使用した以外は、上記の実施例１のとおりに、総ＲＮＡ及び逆転写を実施した。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、オオツ、日本国）の存在下、９４℃で５分間を先行させ、７２℃で５分間の最終延長で、Ｈ１９に関するＰＣＲ反応を３４サイクル（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間）実施し、ＧＡＤＰＨ及びヒストンに関して実施した。ＧＡＰに関するプライマー配列：正５’−ＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１２）及び逆ＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１３）。
【０１６６】
結果
Ｈｅｐ３Ｂ細胞：正常（図３Ａ）と低酸素様（図３Ｂ）の双方の条件下で、Ｈ１９ＲＮＡの内因性濃度を減少させるｓｉＲＮＡの能力を調べた。Ｈ１９を標的にする４種の異なるｓｉＲＮＡ類（１〜４）（図３Ａ、レーン２〜５）又は４種のｓｉＲＮＡの等モルプール（図３Ａ、レーン６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析（トランスフェクション後４８時間）により、Ｈ１９発現の劇的な抑制が検出されたが、非関連のＰＧ１３二重鎖標的ルシフェラーゼ（図３Ａ、レーン１）及び擬似物（図３Ａ、レーン７）では、それぞれ検出されなかった。さらに、Ｈ１９遺伝子の発現を抑制する３種の異なるｓｉＲＮＡ（１、３及び４）の能力を、低酸素様ＣｏＣｌ２シミュレーション（図３Ｂ〜Ｃ）において試験した。ＣｏＣｌ２シミュレーションによって、Ｈ１９ＲＮＡは中程度に誘導される（双方ともＰＧ１３二重鎖をトランスフェクトされた、低酸素シミュレーションに関する図３Ｂレーン１と正常に関するレーン５を比較されたい）が、Ｈ１９転写体を標的にしている３種の異なるｓｉＲＮＡを用いて、劇的な減少が検出された（図３Ｂ、レーン２〜４）。
【０１６７】
ＵＭＵＣ３細胞：Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、低酸素条件により、Ｈ１９のメッセージ発現が増加し、ｓｉＲＮＡ  Ｈ１９（配列番号１）は、その発現を著しく減少させた（図３Ｄ〜Ｅ）。
【０１６８】
（実施例４）
Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＵＭＵＣ３細胞の双方で、Ｈ１９ＲＮＡのエクスビボダウンレギュレーションにより、インビボ腫瘍形成能が低下する
材料及び方法
エクスビボ腫瘍形成能アッセイ：Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＵＭＵＣ３細胞を、Ｈ１９ＲＮＡに対して作られた２種の異なるｓｉＲＮＡ二重鎖（Ｈｅｐ３Ｂに対しては、ｓｉＲＮＡ配列番号３、ＵＭＵＣ３に対しては、ｓｉＲＮＡ配列番号１）及び非関連の対照ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ又はＧＦＰが標的）により、それぞれ、上記のようにインビトロでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を無胸腺ヌードマウスの背側側腹領域内に皮下注入した。追加の対照群は何も処置しなかった。細胞をトリプシン処理し、カウントし、遠心分離し、約５×１０６細胞／ｍｌとなるように、滅菌ＰＢＳ（１×）中に再懸濁した。２５０μｌの懸濁液を無胸腺ヌードマウスの背側側腹領域内に注入した。注入の１５日及び３０日後、腫瘍が発現し始めるので、キャリパーを用いてそれらの容量を測定した。
【０１６９】
６ウェルプレートにおいて、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）によるｓｉＲＮＡのトランスフェクションを実施した。該細胞がトランスフェクション当日に、ほぼ５０％集密になるように、トランスフェクションの前日に、該細胞をトリプシン処理し、カウントし、無抗生物質ＤＭＥＭ培地を２ｍｌ含有するウェル当たり１００，０００で接種した。２５０μｌの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）と共に、５μｌのリポフェクタミン２０００を１５分間インキュベートした。これを、２５０μｌの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で希釈した１００ｕＭのｄｓＲＮＡに加え、処方を２０分間続けた。５００μｌの該混合物を、該細胞に適用し、培地を交換せずにさらに４８時間インキュベートした。各処理群は７匹のマウスを含んだ。
【０１７０】
結果
図４Ａ〜Ｄに示されるとおり、先にＨ１９ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞をマウスに投与すると、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞よりも腫瘍の重量（図４Ａ）及び容量（図４Ｂ）が極めて著しく低下した。図５Ａ〜Ｄに示されるとおり、Ｈ１９ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＭＵＣ３細胞も、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＭＵＣ３細胞よりも腫瘍の重量（図５Ａ）及び容量（図５Ｂ）が極めて著しく低下した。
【０１７１】
（実施例５）
Ｈ１９ｓｉＲＮＡの発癌性
Ｈ１９ＲＮＡが腫瘍関連の遺伝子産物であるか、又はそれ自体で発癌の可能性を潜在的に有するかを確認するために、以下の実験を実施した。
【０１７２】
材料及び方法
細胞増殖分析：Ｈｅｐ３Ｂ細胞を接種し、１２ウェルプレートで、抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ又はＨ１９ｓｉＲＮＡ（配列番号３）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理しカウントした。９６ウェルプレートにおいて、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中、トランスフェクトした５×１０３のＨｅｐ３Ｂ細胞を４重で接種し、２４時間さらにインキュベートしてから、ＭＴＳアッセイを実施した。ＭＴＳアッセイは、供給元（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）により提供された手順に従って実施した。ＥＬＩＳＡプレート読取り装置を用いて９４０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【０１７３】
結果
図６に示されるとおり、ｓｉＲＮＡ  Ｈ１９は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の細胞増殖の統計的に有意な減弱を誘導しなかった。
【０１７４】
さらに、低酸素回復後の軟寒天中、固定物非依存性のコロニー形成に対するＨ１９抑制の効果も、インビトロでの腫瘍形成能の追加評価として分析した。材料及び方法で記載されたとおり、トランスフェクションの４時間後に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を低酸素ストレスに曝した。低酸素条件の２４時間後、細胞を軟寒天上に接種した。Ｈ１９ｓｉＲＮＡは、低酸素回復後の固定物非依存性の増殖を著しく妨げ、コロニーの数とサイズの双方が極めて著しく減少した（図３Ｆ）。
【０１７５】
（実施例６）
Ｈ１９ｓｉＲＮＡ二重鎖のインビボ腫瘍内注入
材料及び方法
Ｈ１９ｓｉＲＮＡの調製：使用されたトランスフェクタントは、Ｐｏｌｙｐｌｕｓの濃ｊｅｔＰＥＩ（商標）（×４）であった。８５０ｐモル（およそ１１μｇのｓｉＲＮＡ）、及び１０μｌのｊｅｔＰＥＩ（Ｎ／Ｐ＝１０）を、１００μｌの５％グルコース溶液に希釈し、５分後、ｊｅｔＰＥＩ溶液をｓｉＲＮＡ溶液に加え、処方を２０分間続けてから、腫瘍内（ＵＭＵＣ３に関して）又は最初に接種した部位（Ｈｅｐ３Ｂに関して）への注入を行った。
【０１７６】
実験手順：２×１０６の膀胱癌細胞（ＵＭＵＣ３）及び肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞を、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、ＵＭＵＣ３に関して１０匹、及びＨｅｐ３Ｂに関して８匹の無胸腺オスマウスの背側に皮下注入した。
【０１７７】
ＵＭＵＣ３細胞：ＵＭＵＣ３において、腫瘍が約４〜８ｍｍの直径に達したら、マウスを２つの均一群（ｎ＝５）に分け、対照としての非関連ＧＦＰ、又はＨ１９ｓｉＲＮＡ（Ｈ１９ｓｉＲＮＡ−３、配列番号３）の第１回目の腫瘍内ｓｉＲＮＡ注入を行った。一回目の腫瘍内注入後、２日及び５日の間隔をおいて、合計３回の注入を行い、最後の注入後、マウスは何も処理せずに６日間おいた。２つの処置群に関して、キャリパーを用いて腫瘍容積を測定し、それらの最終腫瘍重量を記録した。
【０１７８】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞：Ｈｅｐ３Ｂ細胞に関して、細胞接種の４８時間後に処理を行ってから、触診可能の腫瘍を観察した。マウスを２つの群（各々ｎ＝４）に分け、最初に接種した部位に注入した。２日置きにマウスに合計５回の注入を行い、最終注入後、１週間置いてからそれらを殺処理した。
【０１７９】
等式、Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）×０．５（Ｖ、容積；Ｌ、長さ；Ｗ、幅）によって、腫瘍容積を算出した。
【０１８０】
結果
腫瘍増殖におけるＨ１９ノックダウンの機能的結果を判定するために、膀胱癌ＵＭＵＣ３細胞系から誘導した小腫瘍内に、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ複合体を注入してから、ヌードマウスにおけるＨｅｐ３Ｂ癌細胞系において、触診可能な腫瘍を観察した。ＰＥＩと共に配合した、ＧＦＰ標的の合成対照ｓｉＲＮＡを対照として用いた。図７Ａ〜Ｂに示されるとおり、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ３は、ＵＭＵＣ３細胞において、平均腫瘍容積（図７Ａ）の約９０％、及び平均腫瘍重量（図７Ｂ）の約８８％の極めて著しい減少を生じさせた。
【０１８１】
ｓｉＲＮＡ１を用いるＨｅｐ３Ｂ誘導腫瘍において、腫瘍の容積及び重量における減少レベルの著しさはより低い。腫瘍重量のおよそ４０％の減少（図７Ｃ）及び腫瘍容積の５６％の減少（図７Ｄ）が見られた。
【０１８２】
（実施例７）
ＴＡ１１細胞及びＴＡ３１細胞におけるＨ１９の関与
同一の親系Ｔ２４Ｐに由来する２種のヒト膀胱癌細胞系、ＴＡ１１及びＴＡ３１は、通常の培養条件下、インビトロで、それぞれ、Ｈ１９の陰性（ＴＡ１１Ｈ１９−ｖｅ）、又は高発現体（ＴＡ３１Ｈ１９ｈｉｇｈ）であることが示されている（Ａｙｅｓｈら、２００２年、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ３５、６３〜７４ページ）。Ｈ１９のメッセージがこれらの他の細胞系の腫瘍増殖に影響を及ぼすかどうかを判定するために、以下の実験を実施した。
【０１８３】
材料及び方法
ＴＡ１１細胞及びＴＡ３１細胞（およそ２×１０６）を、ＣＤ−１マウス（各々ｎ＝５）に皮下移植した。移植１５日後に腫瘍容積を測定した。図８Ａ〜Ｂに示されるとおり、ＴＡ１１Ｈ１９−ｖｅ細胞から誘導された腫瘍は、ＴＡ３１Ｈ１９ｈｉｇｈ細胞から誘導された腫瘍よりも有意に小さかった。さらに、ＴＡ３１Ｈ１９ｈｉｇｈ誘導の腫瘍は、有意により血管化した（図８Ｃ〜Ｄ）。ＴＡ１１Ｈ１９−ｖｅ細胞から得られた腫瘍のＲＴ−ＰＣＲ結果は、インビトロでのそれらの細胞におけるＨ１９ＲＮＡの無発現とは反対に、それらの腫瘍においてＨ１９ＲＮＡが誘導されることを示している（データは示していない）。これらの結果は、Ｈ１９ＲＮＡが腫瘍増殖を増強させることを示唆している。
【０１８４】
（実施例８）
Ｈｅｐ３Ｂ細胞系における低酸素ストレスによりＨ１９ＲＮＡが誘導され、Ｈ１９に対して作られたｓｉＲＮＡはその誘導を極めて効率的に妨害する
材料及び方法
上記のとおり、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を接種し、抗Ｈ１９ｓｉＲＮＡ又は抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＡｎｅｏｒｏｐａｃｋ角形ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社、日本国）に入れて、１時間以内に低酸素条件（１％Ｏ２、２０％ＣＯ２）を生じさせるか、又は通常の酸素濃度に置いた。ＲＮＡ抽出前に、インキュベーションを２４時間続けた。本明細書上記の実施例１に記載されたとおり、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【０１８５】
結果
図９Ａに示されるとおり、Ｈ１９ＲＮＡは、通常（図９Ａ、レーン３）及び低酸素（図９Ａ、レーン４）双方の培養条件それぞれで、特異的にダウンレギュレートされた。ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）のＰＣＲ分析は図９Ｂに示されている。ｕＰＡＲのＰＣＲ分析は図９Ｃに示されている。
【０１８６】
当然のことながら、明白にするために別個の文脈で記載されている本発明の一定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて提供することもできる。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈で記載されている本発明の種々の特徴を、別個に、又は任意の好適な副次的組合せで提供することもできる。
【０１８７】
本発明をその特定の実施形態に関連させて記載したが、多くの代替、修飾及び変型が当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、添付の請求項の精神及び広い範囲に入るこのような代替、修飾及び変型は全て包含されるものとする。本明細書に挙げられた全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願が、具体的に個々に参照として本明細書に組み込まれていることことが示されているのと同じ程度に、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれている。なお、本出願における参考文献の引用又は同定は、このような参考文献が本発明の先行技術として入手できることを認めるものとして考えられるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、ヒト胎仔及び胎盤標本におけるＨ１９の選択的スプライスバリアントの存在を示す写真及び概略図である。図１Ａは、５つのエキソン（Ｅ１−５）（ソリッドボックス）及び４つの短イントロン（ボックス間の線）からなるＨ１９遺伝子の位置を示す染色体１１を示す概略図である。ＰＣＲ反応に使用されるプライマーの位置は、水平矢印によりマークされ、転写開始部位に対して下流の１１７及び８１６塩基である。スプライス区分の欠如は、グレイボックスにより示されている。図１Ｂ〜Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲ反応に関して臭化エチジウム染色ゲルの写真である。以下の細胞が分析された：Ｈｅｐ３Ｂ及びＳＫＨｅｐ１（肝細胞癌細胞系）；ＲＴ４及びＵｍｕｃ３（膀胱癌細胞系）；胎盤標本：第一のトリム（第一のトリメスター）；奇胎、包虫状奇胎；第三のトリム（第三のトリメスター）；ＬＧ−ＢＣ、低グレード膀胱癌；ＨＧ−ＢＣ、高グレード膀胱癌；ＮＢ、正常膀胱；ＮＣ、正常大腸；ＣＣｌｙｍ、リンパ節に転移の大腸癌；ＣＣｌｉｖ、肝臓に転移の大腸癌；ＣＣ、大腸癌；図１Ｂ〜Ｄにおいて、Ｃによりマークされたレーンは陰性対照であり；Ｍはマーカー１００ｂｐラダーである。サンプルのサイズは右側に示している。図１Ｅは、ＲＮアーゼ防護アッセイの写真である。矢印は、第三のトリメスター胎盤組織内に選択的スプライスバリアント３４４塩基の存在を示す。ＲＴ−ＰＣＲ反応により検出できなかった別の選択的スプライスバリアントの存在を示すことができた２つの他の過度のさらなるバンドもまた検出された。図１Ｆは、エキソン１から３６６塩基のスキッピング領域を表示する選択的スプライスバリアントの部分的配列分析を示す図である。下線の配列は、スプライス結合を示す。（ヌクレオチドのナンバリングは、開始コドンにおいて始まる）。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内のＨ１９ＲＮＡの発現レベルに対してＣｏＣｌ２の濃度の増加効果を示す臭化エチジウム染色ゲルの写真である。図２Ａは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内のＨ１９遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。図２Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内のＲＴ−ＰＣＲ統合性に関する陽性対照としてＧＡＤＰＨ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。図２Ａ及び２Ｂについて、レーン１は未処理Ｈｅｐ３Ｂを示し；レーン２、３、４、５及び６は、それぞれ、５０、１００、２００、３００及び４００μＭのＣｏＣｌ２処理細胞を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｆは、本発明のｓｉＲＮＡ類を用いてＨ１９のインビトロダウンレギュレーションの有効性を示す棒グラフ及び写真である。図３Ａ〜Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により試験された通常の培養条件下（図３Ａ）及び低酸素模倣条件下（図３Ｂ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系内のＨ１９の発現レベルに対して異なるＨ１９ｓｉＲＮＡ二重鎖の効果を示す臭化エチジウム染色ゲルである。図３Ａにおいては、レーン１は、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする関連性のないｓｉＲＮＡ二重鎖により、レーン２〜５は４つのＨ１９ｓｉＲＮＡ二重鎖（配列番号１〜４）により、レーン６はそれらの等モル混合物をトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞を示し、レーン７は、ｓｉＲＮＡのないリポフェクタミン２０００（Ｍｏｃｋ）を示す。試験された全てのｓｉＲＮＡ剤（配列番号１〜４）は、Ｈ１９  Ｃ＝ＰＣＲブランクのｍＲＮＡを減少させるのに少なくとも５０％有効であった。図３Ｂ及び３Ｃにおいては、レーン１及び５は、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号５）を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖により、レーン２〜４は、３つの異なるＨ１９ｓｉＲＮＡ二重鎖（配列番号１、３、及び４）により通常の培地中でトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞を示す。トランスフェクション２４時間後、培地を変え、通常の培養培地中で増殖し続けた細胞を示すレーン５を除いて、培地を含有する１００μＭのＣｏＣｌ２を加えた。さらに２２時間インキュベーションを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＲＴ−ＰＣＲ統合性に関する陽性対照としてＨ１９（図３Ｂ）及びＧＡＤＰＨ（図３Ｃ）遺伝子の両方について示される。図３Ｄ〜Ｅは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により試験された通常の培養条件及び低酸素条件下、ＵＭＵＣ３細胞系内のＨ１９の発現レベルに対してＨ１９ｓｉＲＮＡ二重鎖（配列番号１）の効果を示す臭化エチジウム染色ゲルである。図３Ｆ及び３Ｇについて、それぞれ、通常の酸素条件下、レーン１は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＭＵＣ３細胞、レーン２は、プラスＨ１９ｓｉＲＮＡ−配列番号１を示し、低酸素条件下、レーン３は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵＭＵＣ３細胞、レーン４は、プラスＨ１９ｓｉＲＮＡを示す。図３Ｆは、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ対照処理細胞と比較して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にＨ１９ｓｉＲＮＡ（配列番号３）トランスフェクション後、低酸素回収後のコロニー数の減少を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の一過性Ｈ１９ＲＮＡダウンレギュレーションは、インビボ腫瘍形成能を阻止することを示す棒グラフ及び写真である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ３（配列番号３）又は抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号５）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。抗Ｈ１９ｓｉＲＮＡ３及び抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを受けた１．５×１０６細胞を、ＣＤ−１ヌードマウス（双方ともｎ＝７、偽トランスフェクトに関して４匹）の背面部分に皮下注入した。抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを一過性にトランスフェクトし、Ｈｅｐ３Ｂで接種されたマウスへの接種１５日後に、触診可能の腫瘍が観察された。腫瘍容積を追跡し、接種３０日目までキャリパーを用いて測定し、その後マウスを殺処理した。平均腫瘍重量（Ａ）（±標準誤差）及び平均腫瘍容積（ｐ＜０．０３）（Ｂ）（±標準誤差）について約８２％の有意な（ｐ＜０．０３）減少が見られた。値は、殺処理直前と殺処理後のエンドポイントを表す。腫瘍外科露出前（Ｃ）、及び腫瘍内部の露出後（Ｄ）において各群２匹のマウス（マウス１及び２は、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ３（配列番号３）処理動物、及びマウス３及び４は、抗Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号５）処理動物）の代表的な腫瘍形体を示している。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、ヒト膀胱癌細胞−ＵＭＵＣ３に対するｓｉＲＮＡ−Ｈ１９のインビボ効果を示す棒グラフ及び写真である。１００万のＵＭＵＣ３細胞を、無胸腺マウス（ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（配列番号６）に関してｎ＝３、及びｓｉＲＮＡ  Ｈ１９（配列番号１）に関してｎ＝５）に皮下注入し、ｓｉＲＮＡ類を４８時間後一過性にトランスフェクトした。抗ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡにより一過性に形質移入され、ＵＭＵＣ３を受けた３匹のマウス中２匹が６週後、触診可能の腫瘍が観察されたが、一方、ｓｉＲＮＡ  Ｈ１９を受けたマウス（ｎ＝５）には腫瘍がいずれも観察されなかった。接種８週後にマウスを殺処理した。グラフは平均腫瘍容積（Ｂ，ｐ＜０．０５）、及び平均腫瘍重量（Ａ，ｐ＜０．０６）を示す。値は、殺処理直前と殺処理後のエンドポイントを表す。写真は、抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（Ｃ）、及びｓｉＲＮＡ  Ｈ１９（Ｄ）をトランスフェクトし、ＵＭＵＣ３により接種されたマウスの腫瘍の外部形体を示している。
【図６】Ｈｅｐ３Ｂ細胞において通常の培養条件下の増殖に対するＨ１９ｓｉＲＮＡ（配列番号３）トランスフェクションの効果を示す棒グラフである。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ＣＤ−１ヌードマウスにおいて予め注入されたヒト膀胱癌細胞−ＵＭＵＣ３（図７Ａ〜Ｂ）（配列番号１）及びＨｅｐ３Ｂ細胞（配列番号３）（図７Ｃ〜Ｄ）に対するＨ１９ｓｉＲＮＡ類（配列番号１；配列番号３）又は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（配列番号６）の腫瘍内投与の効果を示す棒及び線形グラフである。ｓｉＲＮＡ−Ｈ１９（配列番号１）又は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのＵＭＵＣ−３処置マウスへの注入後の経時的腫瘍容積の変化を示す線形グラフである。図７Ｂは、ｓｉＲＮＡ−Ｈ１９又は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのＵＭＵＣ−３処置マウスへの注入後の腫瘍重量の変化を示す棒グラフである。図７Ｃは、ｓｉＲＮＡ−Ｈ１９又は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのＨｅｐ３Ｂ処置マウスへの注入後の腫瘍容積を示す棒グラフである。図７Ｄは、ｓｉＲＮＡ−Ｈ１９（配列番号３）又は抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡのＨｅｐ３Ｂ処置マウスへの注入後の腫瘍重量の変化を示す棒グラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、インビボでヒト膀胱癌細胞ＴＡ１１（Ｈ１９に対して陰性）及びＴＡ３１（Ｈ１９に対して高発現体）の増殖に対するＨ１９異所的発現の効果を示す棒グラフ及び写真であり：等量（２×１０６）のＴＡ３１Ｈ１９−ｈｉｇｈ及びＴＡ１１Ｈ１９−ｖｅ細胞を、ＣＤ−１マウス（各ｎ＝５）に皮下接種した。２週後、触診可能な腫瘍が出現し、キャリパーを用いてさらに２週間測定した。グラフは、２群の平均腫瘍容積（図８Ａ）、平均腫瘍容積動態（図８Ｂ）のエンドポイント測定値、及びＴＡ１１Ｈ１９−ｖｅ細胞（図８Ｃ）及びＴＡ３１Ｈ１９−ｈｉｇｈ細胞（図８Ｄ）から誘導された腫瘍の代表的な全体形態を示す。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、Ｈ１９ＲＮＡは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系において低酸素ストレスにより誘導されること、及びＨ１９に対して特異的なｓｉＲＮＡは、その誘導を極めて効率的に妨害することを示す写真である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を接種し、抗Ｈ１９ｓｉＲＮＡ又は抗ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を、１時間以内に低酸素様条件を創製するためにＡｎｅｏｒｏｐａｃｋ角型ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、日本国）に入れるか、又は通常の酸素濃度下に置いた。インキュベーションは２４時間続けてからＲＮＡ抽出を行った。写真は、Ｈ１９ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図９Ａ：通常（レーン１、３）及び低酸素（レーン２、４）培養条件下の双方で、それぞれ抗ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号５）（レーン１、２）及び抗Ｈ１９ｓｉＲＮＡ（配列番号３）（レーン３、４）をトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（図９Ｂ）、及びμＰＡＲ（図９Ｃ）に関するＰＣＲ分析。
【図２Ａ−Ｂ】
0005383186.tif 000003
【図７】
0005383186.tif 000004
【図８ａ】
0005383186.tif 000005
【図８ｂ】
0005383186.tif 000006
【図８ｃ】
0005383186.tif 000007
【図８ｄ】
0005383186.tif 000008
【図９Ａ−Ｃ】
0005383186.tif 000009
【図１】
0005383186.tif 000010
【図３−１】
0005383186.tif 000011
【図３−２】
0005383186.tif 000012
【図４】
0005383186.tif 000013
【図５】
0005383186.tif 000014
【図６】
0005383186.tif 000015
【配列表】
0005383186000001.app