(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薄い透明な導波層（ｂ）を施した透明な基材（ａ）よりなり、励起光の入力結合のための結合用回折格子を備え、該基材（ａ）の屈折率が該導波層（ｂ）の屈折率より低い、平面の誘電体光センサー載台を用いて、液体の試料を上層として該層（ｂ）に接触させ、該試料中の発光性を有する物質又は該層（ｂ）に固定された発光性を有する物質が生成する発光を、該結合用回折格子で励起光を該平面的導波管へと結合し、その結果、それが該導波層を横切り、それにより該発光性を有する物質を該導波層の漸減場で励起して発光させることにより、電気光学的に測定する方法であって、励起放射線の波長λより小さい厚さを有し、該励起放射線の波長でのその屈折率が1.8以上である材料よりなる導波層を用い、該導波層から結合を解き、第一の結合用回折格子から空間的に隔離された第二の結合用回折格子で、導波層（ｂ）へと戻り結合した発光放射線を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
λ/2より小さい厚さを有する導波層を用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
導波層の厚さが、40〜160nmである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
回折格子の深さ変調が、３〜60nmである請求項１記載の方法。
【請求項５】
励起放射線が、発光放射線のそれとは異なる角度のもとに結合を解く、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
励起放射線が、逆方向で導波管へ結合し、該導波管によって伝導された励起光と、該導波管内を輸送された発光との双方を前方向で結合を解く、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
励起放射線が、約１〜−50゜の範囲の角度のもとに導波管へ結合する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
導波管へと戻り結合した発光放射線が、約１〜50゜の範囲の角度のもとに結合が解かれる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
基材の発光が、抑制される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
実質的に平行な光が、発光を励起するために用いられる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
分析対象物を検出するために用いられる発光しうる物質が、導波層の表面に直接固定される、請求項１〜10のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
その途上で分析対象物が部分的工程の一つで結合される多工程の検定において、特異的結合のパートナーを、該分析対象物自体にか、又は該結合のパートナーのうち一つについての化学若しくは生化学的検出剤物質として、センサー載台の表面に固定することを含む、請求項１〜11のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
照射された励起光の吸収が、同時に測定される、請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
励起光が、連続波（cw）モードで導波管へと入力結合される、請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
調時されたパルスの形態で励起光を入力結合し、時間分解された発光を検出することを特徴とする、請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
パルス長が、１ピコ秒〜100秒に調整される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
励起光を、一つ又は二つ以上の周波数で変調された強度で入力結合し、得られた試料発光の相移動及び変調を測定することを特徴とする、請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
検出されるべき試料が、卵黄、血液、血清、血漿又は尿である請求項１〜17のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
検出されるべき試料が、表面水、土壌若しくは植物の抽出物、生体加工ブロス又は合成ブロスである、請求項１〜18のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
親和性検知での生化学的物質の定量的測定のための、請求項１〜19のいずれか１項記載の方法の用途。
【請求項２１】
抗体又は抗原の定量的測定のための、請求項１〜19のいずれか１項記載の方法の用途。
【請求項２２】
受容体又はリガンド、オリゴヌクレオチド、DNA又はRNA鎖、DNA又はRNAの類似体、酵素、酵素の基質、酵素補因子又は阻害剤、レクチン及び炭水化物の定量的測定のための、請求項１〜19のいずれか１項記載の方法の用途。
【請求項２３】
光学的に混濁した流体中の発光成分の選択的な定量的測定のための、請求項１〜19のいずれか１項記載の方法の用途。
【請求項２４】
請求項１〜23のいずれか１項記測定の方法により発光放射線を測定するための光学センサー載台（１）であって、薄い導波層（４）を施した平面的な光学的に透明な基材（５）を実質的に含み、該センサー載台（１）が、励起放射線の入力結合のための結合用回折格子（２）を具備し、基材の屈折率が導波層（４）の屈折率より小さく、該導波層（４）の厚さが、励起放射線の波長λより小さく、該導波層（４）が、励起光の波長でのその屈折率が＞1.8である材料よりなり、センサー載台（１）が、導波層へと戻り結合された発光放射線の結合を解くために、第一の結合用回折格子（２）から空間的に隔離された第二の結合用回折格子（３）を含み、
導波層（４）の厚さが、λ/2より小さく、
回折格子の深さ変調が、３〜60nmであるセンサー載台。
【請求項２５】
導波層（４）の厚さが、40〜160nmである、請求項24記載のセンサー載台。
【請求項２６】
励起放射線の入力結合のための第一の結合用回折格子（２）の格子定数が、発光放射線の出力結合のための第二の結合用回折格子（３）の格子定数と異なる、請求項24〜２５のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項２７】
回折格子の距離が、Ｂ≦・Ｘ1/e（ここで、Ｘ1/eは、付随する入射放射線の強度がI0がI0/eに低下する長さである）である、請求項22〜24のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項２８】
回折格子の距離が、Ｂ≧0.2・Ｘ1/eである、請求項２７記載のセンサー載台。
【請求項２９】
基材の発光を抑制するための低屈折率の中間層が、基材（５）と導波層（４）との間に具備されている、請求項24〜28のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項３０】
低屈折率の中間層が、実質的にSiO2又はSiOxCyHzよりなる、請求項29記載のセンサー載台。
【請求項３１】
中間層の厚さが、≦1,000nmである、請求項29又は３０記載のセンサー載台。
【請求項３２】
微細構造化された有機基材が、用いられる請求項24〜３１のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項３３】
微細構造化された有機被覆が、用いられる請求項24〜３２のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項３４】
平面的な透明な導波層（４）が、Ta2O5又はTiO2よりなる、請求項22〜３３のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項３５】
接着促進層が、導波層（４）と試料との間に存在する、請求項24〜３４のいずれか１項記載のセンサー載台。
【請求項３６】
接着促進層が、≦50nmの厚さを有する、請求項３５記載のセンサー載台。
【発明の詳細な説明】
本発明は、漸減的に励起された発光を、導波管を基づく平面の誘電体光センサー載台で検出する方法に関する。本発明は、定性的な親和性検知における該方法の使用、及び光学的に混濁した溶液中の発光成分の選択的定量的測定のためのその使用にも関する。本発明は、更に、該方法を実施するのに適したセンサー載台にも関する。
光が導波管を伝搬する場合、光波は、実際の導波管に完全に局限されるわけではなく、つまり、光波のある分画は、隣接する光学的に薄い媒体中を伝搬する。この分画は、漸減場（evanescent field）と呼ばれ、検知技術における光学的導波管の多彩な用途の根拠である。
漸減場によって、特に、光学的に薄い媒体中の発光を励起することができる。この励起は、導波管の境界面の直接的環境に局限される。したがって、漸減発光励起は、分析の目的には非常に興味深いものである。
平面型センサーは、最も簡単な事例では、三層系：すなわち、基材、導波層、及び検定するための試料を通常に構成する上層よりなる。導波層の厚さが光の波長より小さい、薄い導波管の場合は、特に、伝搬できる光の場の拡散可能なモードの数は、少数の別個の導波モードに限定される。
厚い導波管の場合は、多数のモードを案内できる。この場合、基材のために必要なものは、例えば10分の数mm及びそれ以上の範囲の厚さのものについては、しばしば除外できることが多い。
漸減励起された発光を検出する先行技術の方法は、検出できる放射線の分画の選択に従って区分できる：
・「塊発光（volume luminescence）」の検出：案内された波が励起した蛍光の分画が、全空間角度に放出され、この分画を光学的に記録し、検出系に送り込むことができる。
・「漸減発光」の検出：空間に放出される発光を補足して、この漸減発光は、案内された波として導波管へと戻り結合（back−couple）され、そこで輸送され、次いで、導波管の末端平面を経由して結合が解かれる（coupled out）。
発光染料で標識した抗体又は抗原の、漸減励起された発光を検出する方法及び装置は、知られており、とりわけ、米国特許第4,582,809号明細書に記載されている。そこに請求された配置は、光ファイバー、及び漸減発光励起のためのエンドフェース結合を用いている。そのような光ファイバーは、一般に、1mmまでの直径を有し、レーザー光をそれに結合したとき、多数のモードを伝導する。漸減励起された発光は、ファイバー内へ抜けて戻る分画によるのみの簡単な方式で測定できるにすぎない。装置の極めて大きい寸法、及び比較的大きい試料体積を必要とすることが、更なる欠点である。この装置は、実質的に縮小するか、又は集積光センサーへと小型化することさえできない。感度の増大には、装置の大きさの増加が付随するのを常とする。
更なる欠点は、エンドフェースの出力結合（output−coupling）によって限定される感度であって、励起及び発光放射線が、共線的に走行し、ビームスプリッター及びフィルター（例えば、カットオフフィルター又は帯域−透過フィルター）によって分離されなければならないため、フィルターユニットの識別特性が、検出感度を限定する。
厚い平面型多重モード導波管の利用は、D.Christensen,D.Deyer,D.Fowers,J.Herron:「Analysis of Excitation and Collection Geometries for Planar Waveguide Immunosensors」,SPIE 1886,2（1993）（Fiber Optic Sensors in Medical Diagnostics）に記載されている。ここでは、励起放射線を、エンドフェースを経由して導波管へと結合し、空間角度に放出された発光光を検出する。これに代えて、エンドフェースでの出力結合を用いることも可能である。この後者の場合、必要なビームスプリッター及びフィルターに起因する感度の限界は、上記の配置と同じ点で欠点となる。ここでの更なる欠点は、やはり、センサーの大きな寸法、及びそれに付随する大量の試料である。
国際公開特許第90/06503号公報には、薄い平面の、好ましくは単一モードの導波管を用いる、全内部反射蛍光（TIRF）により発光を励起する方法が開示されている。この方法での導波管は、センサー表面での光の場の強さを増大させるのに用いられ、励起放射線は、下側から絞り込まれ、センサーで全反射される。空間角度に放出された体積発光を検出する。この方法では、励起光と、発光性を有する分子との相互作用帯域は、励起がビーム径の部域でのみ発生するため、センサー上に限定される。したがって、ビーム径を介してセンサーの寸法を決定できる限られた可能性のみがあるにすぎず、ビーム径及び発散における制約は、非常に狭く制限された共鳴角度に帰される。
案内された波の入力結合又は出力結合（input−or output−coupling）のために１個又はそれ以上の結合用回折格子を先行技術で用いることは、K.Tiefenthaler and W.Lukosz:「Sensitivity of grating couplers as integrated−optical chemical sensors」,J.Opt.Am.B6,209（1989）;W.Lukosz.Ph.M.Nellen,Ch.Stamm and P.Weiss:「Output Grating Couplers on Planar Waveguides as Integrated Optical Chemical Sensors」,Sensors and Actuators,B1,585（1990）;T.Tamir and S.T.Peng:「Analysis and Design of Grating Couplers」,Appl.Phys.,14,235−254 1977）に記載されている。Tiefenthalerらが記載した方法は、（屈折率の変化を介しての）直接検出法による親和性検知には役立つ。屈折率の変化のために分子の吸着又は結合に支配される、結合角共鳴の変位が測定される。
漸減励起発光の感度を高め、集積光学センサーを製作するために、様々な試みがなされている。すなわち、例えば、Biosensors ＆ Bioelectronics,6（1991）,595〜607は、平面型単一モード又は低モード導波管について報告しているが、これは、二工程のイオン交換法で製作され、励起波への光の結合が、プリズムによって遂行される。用いられる親和系は、ヒト免疫グロブリンG/フルオレセイン標識化プロテインＡであり、ここでは、抗体を導波管に固定し、リン酸緩衝液中の、検出すべきフルオレセイン標識化プロテインＡを、ポリビニルアルコールの薄膜に加え、導波管の測定領域をそれで被覆している。この方法の実質的な欠点は、導波層と基材層との間の屈折率の僅かな差のみが達成できるにすぎず、そのために相対的に低い感度となることである。
この感度は、プロテインＡに結合したフルオレセインイソチオシアナート中で、20nmであると言われている。これは、微量痕跡物質を検出するには依然として不充分であり、感度の更なる増強が必要である。更に、プリズムによる励起波への光の結合の再現性及び実用可能性は、プリズムと導波管との間の接触部域の質及び大きさに、結合効率が著しく依存しているので、困難であると思われる。
この発明で請求されるような、発光検出に回折格子を用いることは、米国特許第5,081,012号明細書に記載されている。この米国特許は、励起光を導波管へ結合するための回折格子構造とともに、励起波が導波管を何回も横切るのを可能にする、特別な反射回折格子を開示している。この手段によって、高められた感度が達成されると言われている。塊発光が空間角度へと放出される。更に、２回の横断後に入力結合用回折格子から結合を解かれた励起放射線は、参照信号として用いることができる。この方法の欠点は、反射回折格子が生起し、発光信号とともに空間角度へと放出される、バックグラウンド放射線強度の強烈な増加である。必要なフィルターの特性も、やはり検出感度を限定する。
本発明は、平面型光学的導波管で発光を測定する方法であって、簡単かつ経済的に実用可能であり、特に少ない試料量が必要であるにすぎない方法を提供することを、その目的としている。該方法を実施するための平面型光学的導波管に基づいて、小型化できるセンサー載台を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
この目的は、薄い透明な導波層（ｂ）を施した透明な基材（ａ）よりなり、励起光の入力結合（input−coupling）のための結合用回折格子を備え、該基材（ａ）の屈折率が該導波層（ｂ）の屈折率より低い、平面の誘電体光センサー載台を用いて、液体の試料を上層として該層（ｂ）に接触させ、該試料中の発光性を有する物質又は該層（ｂ）に固定された発光性を有する物質が生成する発光を、励起光を該平面導波管へと該結合用回折格子で結合し、その結果、それが該導波層を横切り、それによって該発光性を有する物質を該導波層の漸減場で励起して発光させることにより、電気光学的に測定する方法であって、励起放射線の波長λより小さい厚さを有し、励起放射線の波長でのその屈折率が1.8以上である材料よりなる導波層を用い、該導波層から結合を解き（coupled out）、第一の結合用回折格子から空間的に隔離した第二の結合用回折格子で、導波層（ｂ）へと戻り結合した（coupled back）発光放射線を検出することを含む方法によって達成される。
該方法の好適な利用は、請求項20〜23の主題を形成する。本発明の方法を実施するのに特に適しているセンサー載台、及びその好適実施態様は、請求項24〜38に記載される。該方法の好適実施態様は、請求項２〜19の主題を形成する。
本発明の実施の際は、励起放射線は、結合用回折格子で導波管へ結合され、案内された波として導波層内を伝搬する。発光の効率的な漸減励起のために、波長のパラメータ（屈折率、層の厚さ）の選択によって、センサー表面、又はその付近での高い場の強さを達成することができる。
意外にも、以下に述べる導波管の寸法を決定するために、発光放射線の実質的な分画が、導波管内に漸減的に戻り結合され、励起波とともに導波管によって輸送される。したがって、発光放射線は、第一の結合用回折格子から空間的に隔離された、第二の結合用回折格子を経由して導波管から結合が解かれ、検出系に伝搬される。先行技術の「塊検出」に優るこの「漸減発光の回折格子による検出」の利点は、センサー載台及びそれに付属する検出系の小型化についての簡単化された可能性にある。
可能な限り最も効率的な発光励起のための平面導波管の寸法決定は、平面型導波管の理論に基づいて遂行できる。これに関しては、下記の寸法を遵守しなければならない［W.Lukosz,「Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for directaffinity sensing and immunosensing」,Biosensors ＆ Bioelectronics,6,215−255 1991）;D.G.Hall,「Optiical waveguide diffraction gratings:coupling between guided modes」,Progress in Optics XXIX,ed.E.Wolf,Elsevier,New York（1991）］：
平面導波管の漸減場の上層への貫通深度は、実効モードの屈折率Neff、上層屈折率nsuper及び作動波長λについて、式：
0003645907.tif 000002
で表される。上式で、ｚは、導波管の表面に垂直な座標を示し、ｘは、導波管の伝搬の座標を示す。導波管表面での電場の強さについての標準化因子f:
0003645907.tif 000003
［式中、nfilmは、導波管の屈折率であり、nsubは、基材の屈折率である］を計算に入れると、式：
0003645907.tif 000004
に比例する、導波管の上方の漸減場の強度曲線IEが得られる。
導波管表面に垂直な励起している漸減場のこの強度曲線は、導波管の層の厚さ及び屈折率の寸法決定のための、基本的な尺度要因を決定する。導波層の近辺での発光分子の検出のための分析に活用するには、導波管を寸法決めするときに、導波管表面からの該分子の距離を計算に入れることが必要である。
発光の検出については、薄い、高屈折率の平面型導波管のためには、発光の漸減する戻り結合が効率的な方法であることが、現在では判明している。層の厚さ及び屈折率の選択は、（計算できる）励起の効率と漸減する戻り結合との双方に効果を有する。後者の場合、導波管表面の近辺の結合分子の放射線分画の入力結合と、試料体積からの未結合分子の入力結合との間に競合が存在する。
導波管表面の近辺の発光性を有する分子の、本発明の方法による効率的な検出のためには、導波管パラメータは、下記の範囲内でなければならないことが判明している：
・屈折率nfilm≧励起波長λの1.8倍
・層の厚さtfilm≦励起波長λ、好ましくはtfilm≦λ/2。
該方法の特に好都合な実施態様は、層の厚さが40〜160nmの範囲内から選ばれ、同時に、回折格子の深度変調が３〜60nmであり、層の厚さに対する深度変調の比が0.5より小であるときのものである。
これらの波長は、ｍ≦３という低次の導波モードの伝搬のみを許すにすぎないのが一般的であることを特徴とすることもできる。
導波管へと漸減的に戻り結合される発光は、その中に輸送され、したがって、案内される波の減衰係数Γが特徴的である。低いストークスシフトが与えられると、励起及び発光放射線についての同一の減衰データが仮定できる（導波減衰の可能な原因は、導波管の境界面での散乱損失、及び導波層又は基材若しくは上層での吸収である。際立った狭い吸収帯域が存在しないならば、一般的には10〜50nmであるストークスシフトによって生じる減衰の顕著な変化は、散乱と吸収との双方について予期されるものとする。そのようなスペクトル上の狭い部域の吸収効果は、センサー載台の材料を選ぶ際に避けなければならない）。
導波管内に輸送されたこの発光放射線は、結合が解かれ、検出系へと案内されなければならない。末端平面の出力結合は、好都合ではなく、一方では、高品質の波長辺縁、及び、ある場合には、液浸又はゲル浸漬による光学的検出手段の接触を必要とするが、他方では、センサー要素の流体セルとの統合が、それによって妨げられる。
発光放射線の結合を解くための、励起放射線の入力結合のための結合用回折格子から空間的に隔離された、第二の結合用回折格子の使用は、末端平面の問題を完全に回避することができる。更なる利点は、ｘ方向での（すなわち、案内される波の方向での）回折格子の距離Ａを、自由に選べることである。それによって、センサー及び液体セルの外側の寸法を変える必要のない、各波長についての減衰への距離Ａの最適な調整の可能性が与えられる。更に、センサー要素の外縁は、いかなる光学的品質の必要条件に合致する必要がないため、それらの配置は、流体セルへと、特に、用いられる密閉機構の配置へと調整できることが好都合である。
回折格子の距離Ｂの最適値は、Ｂ＝ｘ1/eであり、Ｂ≒（0.2−３）＊ｘ1/e（ｘ1/e：方向ｘでの案内された励起波の強度の低下に対する1/eの長さ）という範囲で変動できることが判明している。
（変換：Γ［dB/cm］→ｘ1/e［1/mm］:x1/e＝100/（In10＊Γ））。
より大きい距離については、励起光及び案内された発光光の双方は、強く減衰され、強い信号減少へと導く。下方限界は、励起及び戻り結合によっては主として表されず、むしろ入力結合用回折格子に対してなされる、回折格子及び励起放射線の双方の位置決定の、それに付随する必要性によって表される。ここで、下記の入力結合用回折格子の幅及び入力結合用回折格子の辺縁での励起放射線の光の直径の寸法決めも考慮すると、100μｍ未満の間隔は、好都合ではない。
本発明を、図面を用いて、より詳細に下記に説明する。
図１は、本発明の方法を実施するのに特に適した光学センサー載台の模式的側面図を、あり得る放射線の曲線とともに示す。
図２は、図１のセンサー載台の平面図を示す。
図１では、１はセンサー載台であり、２は、励起放射線での結合のための結合用回折格子であり、３は、発光の結合を解くためのそれであり;4は、導波層であり、５は基材である。
図１は、センサー載台への、及びそれからの、励起及び発光放射線の入力結合及び出力結合のための光線のあり得る経路を示す。方向ｘでの伝搬を伴う案内された波は、波ベクトルのｘ成分についての条件が、
kWL＝kein±ｍ＊kG＝kein±ｍ＊２π／ΛＧ、m:整数、kG:逆数の回折格子ベクトル
kWL＝２π／λ＊Neff＝ko＊Neff:すなわち、実効モデルの屈折率Neffを有する波ベクトルで案内される波に合致するときに、センサー平面内に結合用回折格子２によって、励起される。
図１では、負の角度υは、kin＝kO＊cosυ（kO:図面の平面での波ベクトルの大きさ）での入力結合について示されるため、案内された波は、励起とは「反対の方向」に走行する（いわゆる「逆行結合」）。正の角度は、励起波（koutで）及び発光放射線（koutで）の結合を解かれるように選ばれる。
反射された入射光及び結合を解かれた光について著しく異なる方向を有する、そのような入力及び出力結合の配置によって、高度のバッックグラウンドの自由度が達成される。異なる放射線分画の空間的隔離は、発光検出の際に最適の信号対雑音比を保証する：すなわち、結合を解かれた励起放射線及び発光放射線は、光線の共通経路を走行しないため、フィルター（カットオフ又は帯域−透過フィルター、図１には示さず）は、散乱光を抑制するために用いられるにすぎず、結合を解かれた励起放射線の充分な強度のためには用いられない。
出力結合用回折格子を用いることのもう一つの利点は、発光放射線の異なるスペクトル成分が、異なる方向で結合を解かれることである。したがって、検出しようとする分子、及び試料媒体の発光がスペクトル的に異なっている場合も、放射線の手段によって、弱く発光する試料媒体中の分子も追加のフィルターなしでさえ検出することができる。
入力及び出力結合についての角度の調整は、回折格子数Λ１及びΛ２の選択によって可能である。入力及び出力結合間の方向の分離を伴う、図１に示した好適な事例については、回折格子定数を、顕著な差を有するように選択しなければならない。
これに代えて、センサーの製作を簡単化するために、回折格子２及び３に同一の回折格子定数を用いることができる。このことは、回折格子製作のためにホログラフィー構造を用いるとき、多数の工程工程が省略されるので、センサーの可能な限り費用効果の良い製作のために重要であることがある。同一の回折格子定数を用いるときは、結合を解かれる励起放射線と、発光放射線との方向の空間的隔離は、依然として保証されている。反射された入力結合された放射線の方向の安全な隔離のみが割愛されるため、例えば開口又は光トラップを用いる、遮蔽のための追加の手段が必要である。
｜υ｜≒１゜〜50゜（角度の大きさについて）の範囲内の回折格子定数の選択によって、結合角度を好都合に設定できる。より小さい値は、ブラッグ反射のために避けなければならないが、それは、さもないと、センサーの調整又は一様性の低い許容差でさえ、入力又は出力結合の不発と連動してこの反射が発生するからである。ほとんど90゜までの、より大きい角度は可能であるが、センサーについての正常なそれをはるかに超える角度は、光線の経路の適正な達成のためには避けなければならない。
回折格子の深さの寸法決定は、先行技術［T.Tamir,S.T.Peng,「Analysis and Design of Grating Couplers」,Appl.Phys.,14,235−254（1979）;T.Tamir,「Beam and waveguide couplers」,in「Integrated Optics」,T.Tamir ed,Springer,Berlin（1979）］に従うことができる。いわゆる「リークパラメータ」αは、ここでは特徴として用いられる：すなわち、αは、その境界面が深さtgratingの結合用回折格子を与えられた導波管での、案内された波の強度の1/eの減少を記述する。したがって、1/αは、放射エネルギーを案内された波から、自由に伝搬する波へと伝達し、またその逆を行うための特徴的長さである。
入力回折格子の深さの選択に重要なのは、必ずしもリークパラメータの絶対値ではなくて、入射光のリークパラメータ及び放射パラメータ（ビーム径及び発散）の調整である。空間的に限定された回折格子を超える、ガウス断面を有するレーザービーム（ガウスパラメータwO）の最適入力結合のためには、リークパラメータ、ビーム径、及び回折格子辺縁に対するビームの定置についての下記の条件を遵守することが必要である：
・α＊wO＝1.36、
・xc/wO＝0.733。
値xcは、回折格子辺縁の位置に向けての光点の中心の移動を記述する。この移動は、辺縁から構成された部域へと向かうように生じなければならない。この条件を遵守することによって、80％を上回る入力結合効率を達成することができる。
出力結合についての類似の遵守は、ここでも、80％以上という高い結合効率を達成できる結果へと導く。前提は、方向ｘへの回折格子の側面拡張が、リークパラメータより顕著に大きいことがある。しかし、結合を解かれた自由に伝搬する光のビームの強度像は、とりわけ、回折格子中を案内される波の減衰のために、非対称である。
入力結合についてリークパラメータを設定するときは、下記の状況を遵守するものとする：
・回折格子辺縁に関して光点を定置すること、
・センサーの要素を小型化すること。
小さいリークパラメータ（α＜＜1/mm）、及び対応する大きいビーム径（wO＞＞1mm）は、定置を簡単化するが、Ａ＝3mmより実質的に大きい回折格子の幅の場合には、センサーの小型化の可能性は、著しく制約される。回折格子の幅は、完全な結合を遂行するにはＡ＞３＊wOでなければならない。加えて、回折格子及び導波管の不均等性は、結合効率に負の効果を有する。wO＜10μｍのビーム径を伴う大きいリークパラメータ（α＞10/mm）は、非常に小さい回折格子の寸法を許すが、＜＜100μｍの定置の精度も許す。更に、この場合には、結合効率は、とりわけ、ビームの発散が結合共鳴の角度範囲を著しく上回ることによって限定される。
本発明者らは、α＝（0.2〜５）/1mmのリークパラメータの範囲は、調整の必要条件、定置の許容差及び小型化の間の良い兼ね合いであることを見出した。上記の導波層の厚さについて、基材−導波管境界面に正弦波変調を用いるときは、回折格子の深さについてtgrating＝３〜60nm、特に３〜40nmの範囲が、一般的に、この範囲に対応する。リークパラメータは、回折格子の輪郭の形態に大きく依存するため、センサー機能に重要な寸法は、幾何学的な深さではなく、リークパラメータである。
センサー載台の基材は、励起及び放射の波長で透明でなければならない。また、基材は、例えばヨーロッパ公開特許出願第0533074号に記載のとおり、プラスチック材料であってよい。
基材は、異なる材料の複合系、例えば、支持プレートなどに担持される層系よりなってもよい。この場合、導波層に直接隣り合う材料の屈折率は、導波層の屈折率より小さいことのみを必要とするにすぎない。
センサー載台の費用効果の良い製作は、特に、導波管被覆のための基材として、微細構造化された重合体を用い得るときには、常に可能である。この場合、検出感度は、基材に固有の発光の励起により、限定されることがある。この固有発光の励起、及び漸減する戻り結合は、導波管−上層境界面での上記の機序と同様にして、導波管−基材材料境界面で発生する。この基材発光は、導波管の被覆前に基材に施される低屈折率の（すなわち、導波管のそれより低いか、又は同一の屈折率を有する）非発光性中間層によって回避できる。特に適切な中間層の材料は、実質的にSiO2であるか、又は、低級炭化水素基を追加的に挿入してもよいSiOxHyCzという組成を有するSiO2よりなる。この中間層の厚さtbufferは、基材側の案内される波の漸減場によって輸送されるエネルギーが中間層内に局在するように、選ぶものとする。この条件は、tbufferが、漸減場の貫通深度zevaの値の６倍より大きいならば、実用上満たされる。５倍の値は、漸減発光の検出の際の最適の信号対雑音比に適切である。この条件は、tbuffer≦2,000nmに対して安全に満たされる。
中間層の使用のもう一つの利点は、基材の表面粗さの低下でもあることもある。それによって、導波減衰Γが、漸減発光検出の際の信号対雑音比に対する正の効果を伴って減少する。
発光の励起には、基本的に平行な光のみが適するにすぎない。本発明の範囲内で、「実質的に平行」という表現は、５゜未満の発散を意味するとして理解されるものとする。これは、光が僅かに発散するか、又は僅かに収斂してよいことを意味する。より大きい発散は、入力結合角度の調整を簡単化するが、発光信号を減少させる。それは、入力結合の共鳴の幅が、そうして発散角度より著しく小さくなり、そのため、発光の励起のための衝突エネルギーの小分画のみが利用できるにすぎなくなるからである。
本発明の範囲内で、平面の誘電体光センサー載台は、該載台が、肉眼で平面的であると認められる限りは、細片、板、円板又はいかなるその他の幾何学的形態の形態でもあることを意味する。平面性からの逸脱は、案内された波が導波層中を伝搬でき、図１のそれに類似する入出力結合の体制を実現できるならば、決定的に重大ではない。選ばれた幾何学的形態は、センサー載台を構築する装置全体の構成によって支配できる。好適な配置は、実質的な小型化を許すそれである。
有機質の微細構造化基材の上記の使用に加え、ガラス又は石英のような無機基材を用いることもできる。これらは、低い固有発光の重合体に優る利点を有する。しかし、センサー載台の費用効果の良い製作には、これらの基材に低屈折率の被覆を与え、これに、ヨーロッパ公開特許第0533074号公報に記載のとおり、結合用回折格子のための回折格子構造体を挿入するのが好都合である。
更に、結合用回折格子は、導波管／上層境界面に位置させることができる。
そのような回折格子を製造する方法は、知られている。それらの製造には、とりわけChemical,Biochemical and Environmental Fiber Sensors V,Proc.SPIE,Vol.2,068,1−13,1994に記載のとおり、主として写真平版又はホログラフィーの方法及びエッチングの手法を用いる。
格子構造は、基材上に形成し、その後、そうして格子構造を写像する導波層に移転するか、又は導波層自体に格子を形成することができる。
格子の周期は、200〜1,000nmであることができるが、好都合には、格子は、ただ一つの周期性を有する、すなわち単回折性である。
本発明の範囲内で、用語「試料」は、検出されるべき物質−分析対象物を含有してよい、検定されるべき溶液全体を意味するものとする。検出は、一工程又は多工程の検定でなされることができ、その途上で、センサー載台の表面を１種類又はそれ以上の溶液と接触させる。用いられる溶液のうち少なくとも１種類は、本発明の実施の際に検出できる発光性を有する物質を含有できる。
発光性を有する物質が、導波層（ｂ）に既に吸収されているならば、試料は、発光性成分を含まなくてもよい。試料は、それ以上の成分、一般的にはpH緩衝剤、塩類、酸、塩基、界面活性物質、粘度に影響する改質剤又は染料を含有できる。特に、生理食塩水溶液を溶媒として用いることができる。発光性成分自体が液体ならば、溶媒の添加を除外できる。この場合、試料は、発光性を有する100％までの成分を含有できる。
試料は、生物学的媒体、例えば卵黄、体液又は体成分、特に血液、血清、血漿又は尿を更に含有してよい。更に、試料は、表面水、土壌若しくは植物の一部のような天然若しくは合成媒体の抽出物の溶液、生体加工ブロス、又は合成ブロスよりなっていてもよい。
試料は、希釈されていないか、又は溶媒を追加して用いるかのいずれであることもできる。
適切な溶媒は、水、緩衝剤及びタンパク質の水溶液、並びに有機溶媒である。適切な有機溶媒は、アルコール、ケトン、エステル及び脂肪族炭化水素である。水、水性緩衝剤、又は水と水に混和できる有機溶媒との混合物を用いるのが好ましい。
しかし、試料は、溶媒に溶けない成分、例えば顔料粒子、分散剤、天然及び合成のオリゴマー又は重合体も含有できる。この場合、試料は、光学的に混濁した分散又は乳濁液の形態で存在する。
適切な発光化合物は、ローダミン、フルオレセイン誘導体、クマリン誘導体、ジスチリルビフェニル類、スチルベン誘導体、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、ポリピリジル−ルテニウム錯体、例えばトリス（2,2'−ビピリジル）ルテニウム＝クロリド、トリス（1,10−フェナントロリン）ルテニウム＝クロリド、トリス（4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン）ルテニウム＝クロリド、及びポリピリジル−フェナジン−ルテニウム錯体、白金−ポリフィリン錯体、例えばオクタエチル−白金−ポルフィリン、長寿命ユーロピウム及びテルビウム錯体、又はシアニン染料を一般的には包含する、330nm〜1,000nmの範囲の波長の発光を有する発光染料である。血液又は血清中の分析に特に適しているのは、600nm〜900nmの範囲の吸収及び放出波長を有する染料である。
特に適切な発光成分は、共有結合できる官能基を有する、フルオレセイン誘導体のような染料、例えばフルオレセイン＝イソチオシアナートである。
やはり非常に適切なのは、Biological Detection Systems Inc.から入手できる機能的発光染料、例えば、とりわけClinical Chemistry,40（９）:1,819−1,994,1994にも記載された、単及び二官能性Cy5.5（商品名）染料である。
好適な発光は蛍光である。入力結合回折格子での共鳴条件を、それによって高効率に合致させられるため、コヒーレント光を励起に用いるのが好ましい。そのために用いられるレーザー光源は、発光性又は蛍光性分子の吸収波長に従って選ばれることになる。
これに関連して特に重要なのは、レーザーダイオード又は超発光ダイオードであるが、それは、そのような光源は、検出系の高度の小型化をセンサー載台に割り当てるのを可能にするからである。
用いるのに適格な発光染料は、重合体に、又は生化学的親和系での結合相手、例えば、抗体又は抗体フラグメント、抗原、タンパク質、ペプチド、受容体又はそれらのリガンド、ホルモン又はホルモン受容体、オリゴヌクレオチド、DNA鎖及びRNA鎖、DNA又はRNA類似体、プロテインＡやＧのような結合タンパク質、アビジン又はビオチン、酵素、酵素補因子又は阻害剤、レクチン、又は炭水化物のうち一つに化学的に結合してもよい。最後に述べた共有発光性標識化は、可逆的又は不可逆的な（生）化学的親和性検定のための好適な活用である。発光性標識したステロイド、脂質及びキレート化剤を用いることが、更に可能である。発光性染料の挿入も、DNA鎖又はヌクレオチドとのハイブリダイゼーション検定には、特に、異なるルテニウム錯体のように、挿入の際にそれらが増進された発光を示すならば、特に興味深い。これらの発光性標識した化合物を、センサー載台の表面に固定されたそれらの親和性のパートナーと接触させるならば、測定された発光の強度から、結合を定量的に測定できる。試料が、例えば、酵素による発光の消光、又はタンパク質の高次構造の改変による発光の増進の形態で、発光団と作用し合うときの発光の変化を測定することによって、分析対象物の定量的測定も可能である。
導波層の形成に適した材料は、一般的には、無機材料、好ましくは、TiO2、ZnO、Nb5O5、a2O5、HfO2又はZrO2のような無機金属酸化物である。
Ta2O5及びTiO2が好ましい。
本発明の方法では、試料を、固定状態で導波層と接触させることも、その上を連続的に案内することもでき、その周期は、まばらであるか、又は密であることができる。
該方法の特定の実施態様は、導波層（ｂ）の表面で、直接、分析対象物を検出するために用いられる発光性を有する物質を固定することにある。発光性を有する物質は、例えば、タンパク質に結合され、それにより、導波層の表面でこのようにして励起して発光させることができる発光団であることができる。タンパク質に対する親和性を有するパートナーが、この固定層上を案内されるならば、発光を変化させ、該パートナーの量をこのようにして測定することができる。特に、親和性複合体の両方のパートナーを発光団で標識することもできるため、例えば、発光の消光の形態での、両者間のエネルギー移動からの濃度の測定を遂行することができる。
化学又は生化学的親和性検定を実施する方法の、もう一つの好適実施態様は、センサー載台の表面に、瓶積対象物自体、又は結合パートナーの一方に対する化学又は生化学的検出剤物質としての特異的結合パートナーを固定することにある。検定は、一工程又は多工程の検定であることができ、その途上で、連続的な工程で、センサー載台の表面に固定された検出剤物質の結合パートナーを含有する１種類又はそれ以上の溶液を案内し、分析対象物は、部分的な工程の一つの中で結合される。分析対象物の検出は、親和性検定への発光性標識した参加物質によって遂行される。用いられる発光性標識化物質は、親和性検定の１種類若しくはそれ以上の結合パートナー、又は発光団を備えた分析対象物の類似体よりなってもよい。唯一の基準は、分析対象物の存在が、選択的に発光信号へと、又は選択的に発光信号の変化へと導くことである。
検出剤物質の固定は、一般的には、直接導波層上での、又は表面の、例えばシラン化、若しくは重合体層を施したことによる化学的変性後の、疎水性吸収又は共有結合によって実施してよい。更に、例えばSiO2よりなる薄い中間層を、接着促進層として導波層に直接施して、検出剤物質の固定を導波管の上で直接促進できる。この中間層の厚さは、50nm、好ましくは20nmを超えてはならない。
適切な検出剤物質は、一般的には、抗原に対する抗体、免疫グロブリンに対する、プロテインＡ及びＧのような結合タンパク質、リガンドに対する受容体、相補的な鎖に対するRNAやオリゴヌクレオチド及び一本鎖、ビチオンに対するアビジン、酵素基質に対する酵素、酵素の補因子又は阻害剤、炭水化物に対するクレチンである。それぞれの親和性のパートナーのいずれをセンサー載台の表面で固定するかは、検定の構成に依存することになる。
検定自体は、一工程の複合化工程、例えば競合的検定であるか、又は多工程の工程、例えばサンドイッチ検定であることができる。
競合的検定の最も簡単な場合では、未知の濃度の分析対象物及び発光性標識以外は類似する既知量の化合物を含有する試料を、センサー載台の表面に接触させ、そこで、発光性標識化分子と未標識化分子とが、それらの固定検出剤物質の結合部位について競合する。この検定の配置では、試料が分析対象物を全く含有しないときに、最大の発光信号が達成される。検出すべき物質の濃度の増加とともに、観測下の発光信号が低下する。
競合的免疫検定では、固定するのは、必ずしも抗体である必要はなく：抗原も、検出剤物質としてセンサー載台の表面に固定できる。通常、化学又は生化学的親和性検定の際に、どちらかのパートナーを固定するかは、重要ではない。これは、発光に基づく検定の、表面プラズモン共鳴又は干渉測定のような、導波層の漸減場での吸収される質量の変化に基づく方法に優る、基本的利点である。
更に、競合的検定の場合、競合は、センサー載台の表面の結合部位に限定される必要はない。例えば、既知量の抗原も、センサー載台の表面に固定し、次いで、検出されるべき未知量の、分析対象物としての同じ抗原及び発光性標識化抗体も含有する試料に接触させることができる。この場合、表面に固定された抗原と、溶液中に存在するそれとの間の競合が、抗体の結合に対して生じる。
多工程検定の最も簡単な場合は、一次抗体をセンサー載台の表面に固定する、サンドイッチ免疫検定である。検定すべき抗原、及び検出を実施するのに用いられる発光性標識した二次抗体の、抗原の第二のエピトープとの結合は、該抗原を含有する溶液、及び発光性標識化抗体を含有する第二の溶液への連続的接触、又はこれら二液を予め結合することのいずれかによって遂行でき、その結果、最終的には、抗原及び発光性標識化抗体よりなる部分的複合体が結合される。
親和性検定は、追加の結合工程を更に含んでもよい。例えば、サンドイッチ免疫検定の場合、プロテインＡは、免疫グロブリンにそれらのいわゆるFc部で特異的に結合し、次いで、その後の、上記のとおりに実施されるサンドイッチ検定で、それらが一次抗体として作用するが、プロテインＡは、最初の工程で、センサー載台の表面に固定できる。
一般的に既知のアビジン−ビオチン親和系を用いる。親和性検定のその他の非常に多くの類型が存在する。
親和性検定の類型の例は、J.H.Rittenburg:「Fundamentals of immunoassay,Development and Application of Immunoassay for Food Analysis」,J.H.Rittenburg ed.,Elsevier,Essex,1990,又はP.Tijssen,「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」,R.H.Burdon,P.H.van Knippenberg ed.,Elsevier,Amsterdam 1985に見出されることになる。
更に、センサー載台の表面を、単一の用途にばかりでなく、それを再生するためにも用いることができる。適切な条件下、例えば、低いpH、高い温度で、有機溶媒、又はいわゆるカオトロピック試薬（塩類）（chaotropic reagents（salts））を用いて、固定検出剤物質の結合能を実質的に損なうことなく、親和性複合体を選択的に解離させることができる。現実の条件は、個別的親和系に強く依存する。
該方法のもう一つの不可欠の実施態様は、一方では信号の生成（戻り結合の場合、これは信号の検出にも該当する）を導波管の漸減場に限定することと、他方では平衡過程としての親和性複合体形成の可逆性とにある。適切な流量を連続流の系で用いて、漸減場での結合した発光性標識した親和性のパートナーの結合、又は脱着若しくは解離を実時間で監視できる。したがって、この方法は、異なる会合又は解離定数を決定する速度論的研究に、又は置換検定にも適している。
漸減的に励起された発光の検出は、既知の方法によって実施できる。光ダイオード、光電池、光電子増倍管、CCDカメラ及び検出器装置、例えばCCD電池を適切に用いてよい。発光は、鏡、プリズム、レンズ、フレネルレンズ及びそれに取り付けた勾配屈折率レンズのような光学素子で撮像できる。放射波長を選ぶには、フィルター、プリズム、単色フィルター、二色鏡及び回折格子のような既知の素子を用いることができる。
本発明の方法の一つの利点は、発光の検出に加えて、照射励起光の吸収も測定できることである。光ファイバー又は平面構成のマルチモード型導波管と比較すると、実質的に、より優れた信号対雑音比がこの場合に達成される。発光と吸光の同時測定は、発光消光効果を高感度で測定することを可能にする。
本発明の簡単な実施態様では、該方法は、連続波（cw）モードで励起光を照射すること、すなわち、時間的に一定の光の強度で励起を遂行することによって、実施できる。
しかし、該方法は、調時されたパルスの形態で、例えば１ピコ秒〜100秒のパルス長での励起光の照射によって、及び時間分解された（短いパルス長の場合）、又は数秒〜数分の間隔での発光の検出によっても、実施できる。この方法、例えば、結合形成の速度を分析的に監視すること、又は短い露出時間を用いての光化学的褪色に起因する、発光信号の減少を防ぐことが望まれる場合は常に、特に好都合である。適切な短いパルス長、及び検出の適切な時間分解を用いることによって、散乱光、ラマン発光、及び試料やセンサー材料の望ましくないいかなる発光性成分の短寿命の発光をも、この場合は好ましくは長寿命の、標識する分子の発光から識別することが、この短寿命の放射線が減衰した後にのみ、分析対象物の発光を検出することによって、更に可能である。その上、時間分解型発光検出は、変調された励起及び検出にまさに類似して、パルス化された励起の後に、分子発光の減衰に対する分析対象物の結合の影響の研究を可能にする。固定検出剤物質による分析対象物の特異的認識、及び導波管の漸減場への信号生成の空間的限定に加えて、分子発光の減衰時間を、選択性のもつ一つの基準として活用できる。
本方法は、変調された強度を有する、一つ又は二つ以上の周波数の励起光を入力結合し、試料発光の得られた相移動及び変調を検出することによっても、実施できる。
本発明は、既知の親和性のパートナー及び検定構成を有する化学又は生化学的親和性検定において、発光しうる標識した結合パートナーの発光を検出するか、又は分析対象物との相互作用による、固定された、発光性の標識した親和性のパートナーの発光性の変化を検出することにより、分析対象物を定量的に測定するための、本発明の方法の使用にも関する。
信号の生成及び検出が、導波管の化学又は生化学的検出表面に限定され、媒体からの干渉信号が識別されるため、固定された検出剤の要素への物質の結合は、実時間で監視できる。したがって、適切な流量を有する連続流の系での会合及び解離率の直接の検定によって、特に製薬学上の生成物の開発のための、親和性スクリーニング又は置換測定に、本発明の方法を用いることもできる。
そのもう一面では、本発明は、抗体又は抗原の定量的測定のための本発明の使用に関する。
本発明の方法の更にもう一つの活用は、受容体又はリガンド、オリゴヌクレオチド、DNA又はRNA鎖、DNA又はRNAの類似体、酵素、酵素の基質、酵素補因子又は阻害剤、レクチン及び炭水化物の定量的測定を目的とする。
更にもう一面では、本発明は、光学的に混濁した流体中の発光成分の定量的測定のための本発明の方法の使用に関する。
光学的に混濁した流体は、一般的には、卵黄のような生物学的流体、血液、血清又は血漿のような体液、及び表面水、溶解した土壌抽出物及び溶解した植物抽出物を包含する、環境的分析からの試料であってよい。適切な流体は、化学的生成の際に得られる反応液、特に染料液、又は蛍光増白剤の製造に由来する反応液でもある。すべての類型の分散剤、及び、１種類又はそれ以上の発光成分を含有するならば、繊維工業に一般的に用いられる配合物も適切である。したがって、該方法は、質の良い安全防護にも用いることができる。
下記の実施例によって、より詳細に本発明を例示する。濃度のＭは、１リットルあたりのモルを示す。
実施例
光学系
用いた光源は、λ＝670nmのレーザーダイオード（Oz Optics社）である。結合用回折格子の線に垂直に0.4nm、かつ回折格子の線に平行に2.5mmのセンサー平面での直径を有する光点への調整は、撮像系を用いて実施する。
入力結合角度、及び回折格子辺縁に対する光点の位置決めの調整は、機械的調整ユニットを用いて実施する。センサーチップ上のレーザー出力は、Ｐ＝０・・・3mWの範囲で選んでよいが、回折格子の特徴付けのための下記の実験については、Ｐ＝1.2を選び、蛍光測定のためにはＰ＝0.2mWを選ぶ。TE又はTMの方向付けの線形の偏光は、回転できる偏光生成要素を用いて入力結合できる。
０リングによってセンサーに対して密閉したフローセルを、センサー載台の上端側に取り付ける。セルの試料体積は、約８μｌである。異なる溶液を、ジェットポンプ及び逆転弁を用いて、セルに導入できる。
励起及び検出は、センサー載台の下側から、図１に模式的に示したとおり実施する。
検出には、出力結合用回折格子で結合を解かれる蛍光及び励起光（図１によるk'out及びkoutの方向）、並びにビームスプリッタ−を経由する入射光のために３本の測定チャンネルが利用できる。
蛍光放射線のための検出器としては、インパルス形成用電子装置（Hamamatsu C3 866）を備えた単一光子計数モードでの増倍管（Hamamatsu R 4632 SEL）を用いる。そのTTL出力信号は、慣用のインパルスカウンター（Hewlett−Packard 53131A）によって計数する。角度セクターのための蛍光放射線は、集束レンズ系を経由して、検出器に集束できる。散乱光を抑制するための干渉フィルター（半幅が25nmのλ＝725nmでの帯域、Omega）を検出器の前に定置する。
直列に接続した測定用増幅器（UDU 101 C）を備えたSiダイオード（UDT PIN 10D）を、結合を解かれる入射及び励起放射線のための参照検出器として用いる。
３本の測定チャンネルはすべて、慣用のデータ入力装置系を用いて、下記の検定を実施しつつ、同時に評価できる。
センサー載台
入力及び出力結合のための２個の回折格子とともに、下記の方式で微細構成したポリカーボネートを、基材として用いる：
周期Λ１＝（299.5±0.7nm）、深さt1＝6.9〜12.3nmを有する入力結合用回折格子、周期Λ２＝（489.5±0.6nm）、深さt1＝8.2〜12.8nmを有する出力結合用回折格子、両格子ともほぼsin4の外形を有する。
センサーの回折格子の配置は、図２に従い、下記の幾何学的値を有する：格子の間隔Ａ＝4mm、格子幅（線に垂直）B1＝B2＝2mm、格子の高さ（線に平行）4mm、センサー載台の寸法は12×20mm2である。
ポリカーボネートの自己蛍光を抑制するため、この基材を、屈折率ｎ＝1.46及び厚さtbuffer＝（100±10nm）を有するSiO2の中間層で、その後、λ＝670nmでの高屈折率nfilm＝2.35及び層の厚さtfilm＝（170±5nm）のTi02の導波層で被覆する。
励起光によって、ｍ＝０の程度のモードを、この回折格子−導波管の組合せに対して導波管中に励起できる:TE0に対して、Θ＝（−10±1.6）゜の角度、これに代えて、TM0に対して、Θ＝（−22.7±3.7）゜の角度のもとに入力結合を実施する。
蛍光放射線は、Θ＝31゜・・・40゜の角度の範囲内でのTEの偏光で結合を解き、励起光は、Θ＞42゜の角度で結合を解く、約685・・・715nmのλのスペクトル領域。TMの偏光形成のためには、出力結合角度は、蛍光についてはΘ＝17゜・・・25゜であり、励起放射線のためにはΘ＞27゜である。TEの偏光形成のためには、出力結合用回折格子の後で、Ｐ＝1.2mWの入射レーザー強度に対してＰ＝30・・・50μＷの光効率を検出する。
Cy5.5（商品名）標識化免疫グロブリンの検出
Cy5.5染料による免疫グロブリンの標識化：
二官能性染料のFluoroLink（商品名）Cy5.5（Biological Detection Systems,Pittsburgh PA 15238 USA）を用い、製造者が記載したのと同じにして、ウサギ免疫グロブリン（ウサギIgG、Sigma Chemicals）を標識した：
1.染料1mlへのウサギIgG2.5mgの溶液、45分間温置、10分ごとに溶液を振盪。
2.染料1mlをこの溶液に添加、45分間温置、10分ごとに溶液を振盪。
3.タンパク質を結合した染料、及び末結合のそれを、前もってpH7のリン酸緩衝役50mlで平衡させたセファデックス（商品名）Ｒ  G25カラム（Pharmacia LKB,Biotechnology AB,Uppsala,Sweden）越しに分離：
−1mlを棄却。
−ある数の分画を捕集。
4.678nm（染料の吸収帯域）及び280nm（タンパク質の吸収帯域）での光学的密度から、染料／タンパク質比を決定。これから１染料分子対２タンパク質分子の比を決定した。
用いた溶液
１）（0.041MのNa2HPO4＋0.028MのKH2PO4）、0.151MのNaCl、200mg/リットルのアジ化ナトリウム、メタノール50ml、蒸留水で１リットルに増量；
２）プロテインＡ（Sigma Chemicals）を固定するための溶液:1mg/mlの蒸留水；
３）中和溶液：緩衝液１）＋10mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA:Sigma Chemicals）；
４）洗浄液：バックグラウンド信号を決定するのにも用いる、緩衝液１）＋1mg/mlのBSA;
５）試料液:1mg/mlのBSAを含む緩衝液１）への100-8M;10-9M;3・10-10M;1・10-10Mの異なる濃度のCy5.5標識化免疫グロブリン；
６）再生液：グリシン緩衝液、pH2.5。
プロテインＡの生化学的指示薬層の適用
光学センサー載台を溶液２）とともに10時間温置して、プロテインＡを固定する。いかなる自由な吸着部位も中和するために、センサー載台を蒸留水で洗浄し、次いで、10g/リットルBSAを含有する中和液中で、再び１時間温置する。
測定手順／検定
手順全体の間、活性センサー表面上に0.25ml/分の流れを維持する：
工程は、下記の個々の工程よりなる：
−洗浄液４）で４分間洗浄、バックグラウンド信号を記録；
−試料液５）を４分間にわたって添加；
−洗浄液４）を４分間洗浄；
−再生液６）を４分間にわたって添加；
−洗浄液４）で４分間洗浄。
第二の回折格子を経由して結合を解かれた蛍光信号を、工程全体にわたって測定する。異なる濃度で、信号の下記の変化を、試料の添加の終了時に記録し、最初のバックグラウンド信号と比較する（信号／雑音比は、毎秒50〜100インパルス（cps）：
0003645907.tif 000005
回折格子の出力結合による蛍光の検出に対する検出限度は、明らかに、３・10-10M未満であり、Cy5.5標識化IgGの３・10-13Mという分析対象物の濃度に対応する。
【図１】
0003645907.tif 000006
【図２】
0003645907.tif 000007