(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）23−mer  ５′−TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC−３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な23−mer;
（ii）前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された23−merであって、該ヌクレオチド置換が異なったHPV株間に起こる置換から成る23−mer;そして、
（iii）前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する23+−mer:
以上から成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
23−mer  ５′−TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC−３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な23−merであることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された23−merであり、該ヌクレオチド置換が異なったHPV株間に起こる置換から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する23+−merであり、その５′末端が制限酵素部位から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する23+−merであり、その５′末端がプロモータ配列から成ることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
50以下のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
（ｖ）25−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な25−mer;
（vi）前記（ｖ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された25−merであって、該ヌクレオチド置換が異なったHPV株間に起こる置換から成る25−mer;
（vii）前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する25+−mer;
（viii）28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCTTC−３′（配列番号10）または配列番号10に相補的な28−mer;
（ix）28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC−３′（配列番号18）または配列番号18に相補的な28−mer;
（ｘ）前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された28−merであって、該ヌクレオチド置換が異なったHPV株間に起こる置換から成る28−mer;そして
（xi）前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する28+−mer:
以上から成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
25−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な25−mer;
28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCTTC−３′（配列番号10）または配列番号10に相補的な28−mer;そして
28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC−３′（配列番号18）または配列番号18に相補的な28−merから成る群より選ばれることを特徴とする請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記（ｖ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された25−mer、または前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された28−merであり、該ヌクレオチド置換が異なったHPV株間に起こる置換から成ることを特徴とする請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
0003659646.tif 000069
そしてこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とする請求項９記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する25+−merであるか、あるいは前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する28+−merであり、その５′末端が制限酵素部位から成ることを特徴とする請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する25+−merであるか、あるいは前記（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する28+−merであり、その５′末端がプロモータ配列から成ることを特徴とする請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
50以下のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
生殖器HPV遺伝子型のDNAの増幅のためのPCRまたはNASBAのような核酸増幅方法に用いるプライマー対であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項７に定義される（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするプライマー対。
【請求項１５】
生殖器HPV遺伝子型のDNAの増幅のためのLCRのような核酸増幅方法に用いるプライマーセットであって、第１のプライマーが請求項１〜13のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成り、第２のプライマーが第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成り、第３のプライマーが第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するHPVゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成り、そして第４のプライマーが第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１６】
生殖器HPV遺伝子型のDNAを核酸増幅方法を用いて増幅する方法であって、請求項１〜13のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いることを特徴とするDNA増幅方法。
【請求項１７】
生殖器HPV遺伝子型のDNAをPCRにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項７に定義される（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするDNA増幅方法。
【請求項１８】
生殖器HPV遺伝子型のDNAをNASBAにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが請求項１に定義される（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが請求項７に定義される（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、ただしプライマーの１つがプロモータ配列から成る５′末端を有することを特徴とするDNA増幅方法。
【請求項１９】
生殖器HPV遺伝子型のDNAをLCRにより、プライマーセットを用いる増幅する方法であって、該プライマーセットが請求項１〜13のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから成る第１のプライマーと、第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第２のプライマーと、第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するHPVゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成る第３のプライマーと、第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第４のプライマーとから成ることを特徴とするDNA増幅方法。
【請求項２０】
核酸増幅方法におけるプライマーのアニーリング段階が30〜50℃の温度で行われることを特徴とする請求項16〜19のいずれかに記載のDNA増幅方法。
【請求項２１】
核酸増幅方法がMg2+の２〜10ミリモルの濃度で行われることを特徴とする請求項16〜20のいずれかに記載のDNA増幅方法。
【請求項２２】
検体中、生殖器HPV遺伝子型の存在を分析する方法であって、請求項16〜21のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いて検体中に存在する生殖器HPVのDNAを増幅し、続いて増幅の産物を検出することを特徴とする分析方法。
【請求項２３】
検体は子宮頸部スミアであることを特徴とする請求項22記載の分析方法。
【請求項２４】
増幅の産物は、HPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるDNAハイブリダイゼーションによって検出され、プローブのオリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とする請求項22または23記載の分析方法：
0003659646.tif 000070
およびこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記HPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別々のプローブ混合物として適用され、一方の混合物がHPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まない、そして他方の混合物がHPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とする請求項24記載の分析方法。
【請求項２６】
前記プローブは、ラベルとしてジゴキシゲニンを含むことを特徴とする請求項24または25記載の分析方法。
【請求項２７】
請求項24〜26のいずれかに記載の分析方法に有用なHPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、該オリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ：
0003659646.tif 000071
およびこれらの配列に相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項25記載の分析方法に有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であり、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの混合物。
【請求項２９】
請求項25記載の分析方法に有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であり、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まないことを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの混合物。
【請求項３０】
請求項25記載の分析方法に有用なプローブ混合物のアセンブリであり、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まない混合物から成り、さらにHPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的プローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まない混合物を含んで成ることを特徴とするプローブ混合物のアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、たとえば、普遍プライマー（general primer;GPs）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような核酸増幅方法で検体中に存在するヒト乳頭腫ウィルス（HPV）DNAを増幅することによってHPV遺伝子型の存在を決定するための検体分析の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、子宮頸部癌関連の診断および予後を可能にする子宮頸部スミヤの分析に関し、その分析は、検体がHPVを含むかどうか、続いて存在するHPV遺伝子型の型分けを決定するためのGP−核酸増幅方法、たとえばGP−PCRから成る。
発明の背景
HPVは、70以上の異なった上皮向性の遺伝子型を含み、そのうち30以上が粘膜向性である。これらの粘膜向性HPV遺伝子型の約3/1は子宮頸部癌から単離されるかまたは子宮頸部癌に関連付けられてきた（De Villiers,1989;zur Hausen,1991）。
PCR法は、臨床標本中のHPV  DNAの検出のための最も感度の高い方法として導入されてきた。しかしながら、ヌクレオチドレベルでのかなりの不均一性が異なったHPV遺伝子型の間に見いだされている。このため全てのHPV遺伝子型の検出のための簡単で普遍的なPCR試験の開発を妨げてきた。にもかかわらず、主に粘膜向性のHPV遺伝子型の幅広いスペクトルにわたっての検出を可能にするHPV−PCR方法が開発された（Manosら,1989;Gregoireら,1989;Snijdersら,1990）。
HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV31およびHPV33（Snijdersら,1990;国際公開91/10675）の配列情報に基づきHPV  L1領域からもともと、選ばれた普遍プライマーGP5およびGP6の組合せは、ミスマッチアクセプタンスを許容する条件下で少なくとも27の粘膜向性HPV遺伝子型の標的DNAを増幅することが見いだされた（Van den Bruleら,1990a,1992;de Roda Husmanら,1994a）。このGP5/6仲介PCR法の効力は、オランダ国で細胞形態学的にPap IV（癌中）およびPap V（癌）と分類されている子宮頸部切屑の100％中にHPV  DNAが検出されたことによってさらに確かめられた。これはオランダ国の住民中、全てのハイリスクな生殖器HPVsがこのアッセイによって検出され得ることを示している。
しかし、GP−PCRを通常の診断に用いると、臨床検体の少数は、50〜100SIHA細胞（細胞あたりHPV16の１コピーを含む;Van den Bruleら,1990a）から得られる信号より弱いGP−PCR信号を反映して不明瞭な結果を与えることが見いだされている。現在のところ、弱い信号が細胞配列間の交差反応を示すか、GP−PCR法で減少された感度を示すHPV遺伝子型の存在を示すか解かっていないので、これはスクリーニング結果の解釈を複雑にする。以前に、HPV30のようなある腫のHPV型は、GP−PCR法において減少された感度で検出されることが示された（Snijdersら,1990）。また最近配列が決定されたHPV型、HPV39およびHPV51は、プライマーの１つと３以上のミスマッチを示すので、GP−PCR感度の減少が見られた（データを示さず）。さらに加えて、ある種のHPV型（たとえばHPV18）は、GP5/6PCR法において別のバンドをもたらす（Snijdersら,1990）。
最近、いくつかのグループは、プライマー／テンプレートミスマッチの存在にかかわらず、プライマーの３′末端における完全にマッチングするヌクレオチドの存在によって、PCRによる増幅がうまくゆくことが確かめられることを見いだした（Newtonら,1989;SommerおよびTautz,1989;EvanderおよびWadell,1991）。
加えて、プライマーの長さを増加することにより、おそらくプライマー−テンプレート複合体の安定性を増加させることによって、より効率のよい増幅に貢献することが見いだされた（MackおよびSninsky,1988）。
異なるHPV遺伝子型のGP5/6PCR産物の配列分析によって、GP5およびGP6の３′末端に直接隣接するHPV−特異的アミノ酸の共通配列の存在が明らかとなった（Van den Bruleら,1992）。本発明者らは、３′末端において高い保存性（conserved）の配列によって伸長したGP5/6プライマーの有用性を検討した。これらの伸長されたプライマー（GP5+およびGP6+と称する）はクローンされたHPV  DNAのモデル系を用いてPCR中で試験され、そして続いて以前に、オリジナルのGP5/6アッセイで不明瞭なまたは陰性の結果を示した子宮頸部スミア上で評価された。
驚くべきことに、これらの結果から３′末端を保存性配列で伸長したGP5およびGP6は、プライマー／ターゲットミスマッチの数に関係するであろうPCRの減少した効率を克服でき、そしてプライマー−テンプレート安定性を増大することが明らかとなった。加えて、延ばされたGP5/6をPCR法に使用すると、従来不明瞭なまたは陰性のGP−PCR結果を示した細胞形態学的に正常な子宮頸部の切屑中でのHPV状態を明瞭にするという結果がもたらされた。HPV検出の分野における別の切実な要求は、ハイリスクおよびローリスクHPV型を迅速に区別する方法である。今まで、個別のHPV型分けは、HPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはクローンされたHPV型から成るプローブを用いるハイブリダイゼーション分析によって、あるいは付加的な型特異的PCRによって核酸増幅の産物について実施されてきた。この種の分析は、特に臨床医が通常、子宮頸部癌のリスクが高いか低いかのみを知りたいということを考慮すれば多大な仕事量を要求する。現在では、15のHPV型の制限されたグループのみ（16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56,58,59,66および68）が子宮頸部癌および癌そのものに関連があることが知られている（De Villiers,1989の総説を参照）。最近の研究では、10の異なったHPV型（6,16,18,31,33,45,51,52,54および58）がGP−PCRで試験されたPAP IV切屑中に存在することが発見された（De Roda Husmanら,1994b）。さらに、追跡研究からの予備的な結果は、ハイリスクHPV型のみが細胞学的に正常な子宮頸部から上皮間新形成（CIN）IIIへの進行を示すことを明らかにする。個別HPVの型分けの代わりに異なった生物学的挙動を有するHPVグループに分類することはより混乱が少なく、そして臨床医にとっては有り難いことであるであろう。ハイリスクHPVプローブのパネルを用いるHPV検出アッセイはほとんどのHPVに誘起された癌を検出する。したがって、子宮頸部癌を早期に検出するためには、全ての知られているハイリスクおよびローリスクHPV型の迅速な区別を許すHPV検出アッセイの必要がある。
本発明者らは、ハイリスクおよびローリスクのHPV遺伝子型についてのGP5+/6+仲介DNA増幅産物をスクリーニングするために別々に用いられるかあるいはまたカクテルの形で用いられるかする特異的オリゴヌクレオチドプローブの設計および性能をここに記載する。
発明の要約
HPV  GP5/6仲介PCR産物の配列分析によって、両方のプライマーの３′末端に隣接する短い、保存性の高い配列の存在が明らかになった。３′プライマー端の完全なマッチングが効率的なPCRには不可欠であり、そしてプライマーを伸長するとプライマー／テンプレート複合体の安定性が増すので、これらの配列の一部は、GP5およびGP6の３′末端を延ばすのに用いられた。分子的に異なるクローンされたHPVでの再構築実験を用いると、延ばされたプライマー（GP5+およびGP6+と称する）は特に一方または両方のプライマーと３以上のミスマッチを有するHPV遺伝子型の検出で明らかに改善を示した。この方法の効力は、元のHPV  GP5/6仲介PCRでは不明瞭な結果を示した細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑においてHPV検出が改善されることによってさらに確かめられた。また、HPV  GP5/6仲介PCRでもともとHPV陰性であった細胞学的に正常な切屑の小さいパーセントが延ばされたGP5/6プライマーを適用した後、陽性となった。
したがって本発明は、隣接する保存性の高い配列で３′末端が延ばされた普遍プライマー対GP5/6を提供し、子宮頸部切屑中のHPV検出を改善する。
さらに、GP5/6およびGP5+/6+PCRによって得られた約150bpの長さを有する増幅産物のコンピュータによる配列分析から、本発明者らは、24の異なったHPV遺伝子型に対して特異的な30−merオリゴヌクレオチド（GP5/6領域の内部から）を選択した。これらの新規なオリゴヌクレオチドは、たとえばジゴキシゲニン（digoxygenine）で適切にラベルされると、同一のHPV型に由来するハイコピーPCR産物のサザンブロット分析でHPV−特異的プローブとして有用であることが証明された。交差ハイブリダイゼーションは見られなかった。本発明者らは、子宮頸部癌を発生するハイリスク（16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58）およびローリスク（6,11,34,40,42,43および44）のHPV型を特異的に、しかも感度よく区別することが可能な２つのカクテルを調製した。これらのカクテルは、GP−PCRに基づく子宮頸部切屑のHPVスクリーニングにおいてハイリスクHPVの迅速な同定に、成巧裡に応用される。
発明の詳細な説明
本発明は、以下のヌクレオチド配列より成る群から選ばれるオリゴヌクレオチドを提供する：
（ｉ）23−mer  ５′−TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC−３′（配列番号１）または配列番号１に相補的な23−mer;
（ii）前記（ｉ）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された23−mer;
（iii）前記（ｉ）または（ii）から成る３′末端配列を有する23+−mer;
そして
（iv）８〜18ヌクレオチドの長さを有する前記（ｉ）または（ii）の断片。
オリゴヌクレオチド（ｉ）は、HPVのL1領域の比較的保存性の高い部分から誘導される。配列番号１の23−merは、国際公開WO91/10675に記載されているように、プライマー−GP5および３′末端での３つの付加的なヌクレオチドTACの延長から成る。前記３′延長を考慮して、ここではGP5+と称される。
本発明は、たとえばLCR（リガーゼチェイン反応、Barany  1991を参照）のようなある種の核酸増幅反応に有用である相補的な配列をも含む。LCR技術を使用する可能性を考慮して、本発明は、８〜18ヌクレオチドから成る配列（ｉ）の断片をも含む。好ましくは、前記断片は、配列（ｉ）の５′末端または３′末端のいずれかに対応する。本発明は、配列（ii），（ｖ），（vi），（viii），（ix）および（ｘ）の８〜18ヌクレオチドから成るこのような断片をも含み、これらは以下で説明される。
LCRにおいては、熱的に安定なリガーゼがお互いに実質的に隣接する２つのオリゴヌクレオチドを環状連結するのに用いられる。「実質的に隣接する」とは、２つのオリゴヌクレオチドの距離が充分に小さく、リガーゼ酵素が２つのオリゴヌクレオチドを結合できることを指す。好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドがお互いにすぐ接している。LCR環化は、PCR法と同様に、変性化、アニーリングおよび連結反応段階から成る。このようにして、連結反応の後、新たに形成されたオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結反応の標的として働き、そしてその結果、指数関数的なエンリッチメント（濃度）が達成される。
HPV検出に関して、LCR技術を用いることができる。LCR法でプライマー、すなわち本発明の普遍プライマーの１つを、それに対して相補的なオリゴヌクレオチドとともに、さらに、隣接配列に基づくプライマーをそれに対して相補的なオリゴヌクレオチドをともに用いることによって、これら後者のプライマー配列の選択によるが、特定のHPV型または、HPV型のグループの存在に基づく増幅を可能にする。
別法として、LCR法は、本発明の一対の普遍プライマーに加えてそれに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよい。ここで、本発明の一対の普遍プライマーは、同一の普遍プライマーの２つの異なった断片から成る。好ましくは、一方の断片は、前記普遍プライマーの３′末端に対応し、他方の断片は同じ普遍プライマーの５′末端に対応するが、２つの断片は重なり合わず、実質的に隣接する配列である。それら断片は、８〜18ヌクレオチドの長さを持つべきである。同一の普遍プライマーのこのような断片の使用に基づくLCR法は、一般に生殖器HPV遺伝子型の検出に有用である。
オリゴヌクレオチド（ii）は、配列番号１またはそれに相補的な配列から１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、前記置換は異なったHPV株間に起こる置換に関する。たとえばある株では４番目のヌクレオチド（Ｇ）はＣによって置換され（HPV32,HPV39,HPV57）、別の株ではＴによって置換され（HPV42）、さらに他の株ではＡによって置換される（HPV51）。したがって、本発明は、これらのうちのいずれか、または同様な置換を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチド分子の自己アニーリングやヘアピンループ形成を起こすヌクレオチド置換は避けた方がよい。たとえば、21番目のヌクレオチド（Ｔ）のＣによる置換は好ましくない。なぜなら、たとえば、得られる分子が以下に示すような自己アニーリングまたはヘアピンループ形成を生じやすいからである。
0003659646.tif 000002
オリゴヌクレオチド（iii）は、23+−mer、すなわち23ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドである。３′末端配列は、オリゴヌクレオチド（ｉ）またはオリゴヌクレオチド（ii）から成る。５′末端での延長は、いかなる長さを有していてもよい。しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチドの全長が50以下のヌクレオチドであり、さらに好ましくは40以下のヌクレオチドである。正確に23ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドのようなより短いオリゴヌクレオチドは、好収率で合成することができるが、より長いオリゴヌクレオチドは、PCR法での効率の高さの観点からまたは５′末端に追加した配列が実用的な利点をもたらすので好ましいかもしれない。
たとえば、５′末端に追加した配列は、BamH I,EcoR I,Hind III部位のような１つ以上の制限酵素認識配列（制限酵素部位）を含んでもよい。このようなプライマーは、ここで、Resプライマーと呼ばれる。PCR法における効率の高さという利点に加えて、これらの延長されたオリゴヌクレオチドには、PCR法で得られた増幅物（amplimer）をたとえばプラスドドpBR322へおよびそれに由来するpGeminiベクターのようなプラスミドへの直接クローニングを容易にするという実用的利点がある。こうして、増幅物は従来の２本鎖配列決定（100bpから数Kbのクローニング能）に適させることができる。増幅物は、また、１本鎖配列決定（100−500bpのクローニング能）のためにファージM13（mp18および19）にクローンすることもできる。配列決定手法のめざましい進歩により、増幅物の直接配列決定も１つの選択である。増幅物の直接配列決定は、ウィルスの最善の同定法でさえあるかもしれない。全文を参考文献として組み入れるが国際公開WO91/10675を参照のこと。
別の例として、５′末端に追加された配列は、たとえばT7プロモータ配列：
0003659646.tif 000003
またはT3プロモータ配列：
0003659646.tif 000004
またはSP6プロモータ配列：
0003659646.tif 000005
以上のようなプロモータ配列から成っていてもよい。
用いるポリメラーゼの活性を改善するために、プロモータ配列と３′末端配列（オリゴヌクレオチド（ｉ）またはオリゴヌクレオチド（ii）から成る）との間に１つ以上のヌクレオチドの挿入部分を含んでいてもよい。これらのプライマーは、ここでPolプライマーと称される。これらのプライマーには、RNA種を合成するためRNAポリメラーゼの開始を許すという別の利点がある。そのため、プライマーは、RNA分子として標的核酸配列の増幅を可能にする。このようなRNA分子は、たとえばNASBA（核酸配列基準増幅）のようなRNA増幅システムに利用できる。
NASBA法（Kievitsら,1991を参照）は、AMV逆転写酵素のような逆転写酵素、T7RNAポリメラーゼのようなRNAポリメラーゼ、そしてRNase  ＨのようなRNase等の同時的酵素活動によって達成される標的RNAまたはDNAの増幅のための等温的方法である。たとえば、RNA  NASBA法は、RNA/DNAテンプレートに逆転写酵素（RT）を作用させて、T7,T3またはSP6プロモータ配列を含む前向き（または後向き）プライマーの延長すること、RNA鎖をRNase  Ｈにより（DNA  NASBA法の場合、形成されたdsDNAを熱変性する）分解すること、AMV−RTで後方（または前方）プライマー延長し、およびT7,T3またはSP6ポリメラーゼによるRNA合成して第２のDNA鎖を合成することから成る。RNA合成が完了して、システムは前述の原理に従いサイクルする。
HPV検出目的のためには、前方プライマーは、Pol  GP5+プライマーまたはPol  GP6+プライマーのいずれでもよいが、GP6+およびGP5+は、それぞれ後向きプライマーとして使用できる。
本発明は、以下のヌクレオチド配列のような群から選ばれるオリゴヌクレオチドを提供する：
（ｖ）25−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC−３′（配列番号２）または配列番号２に相補的な25−mer;
（vi）前記（iv）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された25−mer;
（vii）前記（iv）または（ｖ）から成る３′末端配列を有する25+−mer;
（viii）28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCTTC−３′（配列番号10）または配列番号10に相補的な28−mer;
（ix）28−mer  ５′−GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC−３′（配列番号18）または配列番号18に相補的な28−mer;
（ｘ）前記（viii）または（ix）に１〜５ヌクレオチドの置換をほどこして誘導された28−mer;
（xi）前記（vii），（viii）または（ix）から成る３′末端配列を有する28+−mer;そして
（xii）８〜18ヌクレオチドの長さを有する前記（ｖ），（vi），（viii），（ix）または（ｘ）の断片。
オリゴヌクレオチド（ｖ）は、HPVのL1領域の比較的保存性の高い部分から誘導される。配列番号２の25−merは、国際公開WO91/10675に記載されているように、プライマー−GP6および３′末端での５つの追加ヌクレオチドTATTCの延長から成る。前記３′延長を考慮して、ここではGP6+と称される。
本発明は、たとえばLCRのような核酸増幅反応に有用である相補的な配列をも含む。同じことは、８〜18ヌクレオチドの長さを有する断片にも当てはまる。
オリゴヌクレオチド（vi）は、配列番号２またはそれに相補的な配列から、１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、オリゴヌクレオチド（ii）の場合、前記置換は異なったHPV株間に起こる置換に関する。
たとえば、多くの株では11番目のヌクレオチド（Ｃ）がＴによって置換される（HPV6B,HPV13,HPV31,HPV39,HPV42,HPV51,HPV52,HPV53,HPV56）。幾つかの株では、21番目のヌクレオチド（Ｔ）がＡによって置換される（HPV11,HPV13,HPV31,HPV52）。幾つかの株では、23番目のヌクレオチド（Ｔ）がＣによって置換される（HPV6B,HPV11,HPV39,HPV51）。したがって本発明は、これらの置換および同様な置換を含むオリゴヌクレオチドを包含し、たとえばそれらの例である25−merは以下のとおりである。
0003659646.tif 000006
しかしながら、好ましくはオリゴヌクレオチド分子の自己アニーリングやヘアピンループ形成を起こすヌクレオチド置換は避けた方がよい。
オリゴヌクレオチド（viii）は、配列番号２の配列および３のヌクレオチドTTCから成る３′末端の延長部分から成る配列番号10の28−merであるか、あるいは配列番号10の配列に相補的な配列である。オリゴヌクレオチド（ix）は、配列番号２の配列および３つのヌクレオチドCTCから成る３′末端の延長部分から成る配列番号18の28−merであるか、あるいは配列番号18の配列に相補的な配列である。L1領域の関連する保存性の高い部分は、グルタミン酸コドンをさらに含むので、３′末端での追加的な延長は可能である。
オリゴヌクレオチド（ｘ）は、配列番号10の配列、その相補的な配列、配列番号18の配列、またはその相補的な配列から１〜５ヌクレオチド置換によって誘導される。好ましくは、オリゴヌクレオチド（ii）および（vi）の場合と同様に、置換は異なったHPV株間に起こる置換に係わる。オリゴヌクレオチド（ｘ）の代表例は以下のとおりである。
0003659646.tif 000007
オリゴヌクレオチド（vii）は、配列（ｖ）または（vi）から成る３′末端配列を有する25+−merであり、オリゴヌクレオチド（xi）は配列（viii），（ix）または（ｘ）から成る３′末端配列を有する28+−merである。オリゴヌクレオチド（iii）の場合と同様に、５′末端での延長はいかなる長さでもよいが、オリゴヌクレオチドの全長は、好ましくは、たかだか50ヌクレオチドに抑えられ、さらに好ましくは40ヌクレオチド以下である。５′末端での延長は、１つ以上の制限酵素部位（Resプライマー）またはプロモータ（Polプライマー）を含むことが好ましい。
本発明は、さらに生殖器HPV遺伝型のDNA増幅のためのPCRまたはNASBAのような核酸増幅方法に用いる一対のプライマーであって、第１のプライマーが（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであるプライマーを提供する。
本発明はまた、生殖器HPV遺伝子型のDNAの増幅のためのLCRのような核酸増幅方法に用いるプライマーセットであって、第１のプライマーが（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、第２のプライマーが第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成り、第３のプライマーが第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するHPVゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成り、そして第４のプライマーが第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを提供する。
本発明は、さらに、核酸増幅方法によって生殖器HPV遺伝子型のDNAを増幅する方法であって、（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いることを特徴とする方法に具体化される。
さらに詳しくは、本発明は、生殖器HPV遺伝子型のDNAを一対のプライマーを用いるPCRにより増幅する方法であって、第１のプライマーが（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであるDNA増幅方法を提供する。
同様に本発明は、生殖器HPV遺伝子型のDNAをNASBAにより、一対のプライマーを用いて増幅する方法であって、第１のプライマーが（ｉ），（ii）および（iii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成り、そして第２のプライマーが（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ）および（xi）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドであり、ただしプライマーの１つがプロモータ配列から成る５′末端を有するDNA増幅方法を提供する。
さらに本発明は、生殖器HPV遺伝子型のDNAをLCRにより、１個のプライマーを用いて増幅する方法であって、該１組のプライマーが（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成る第１のプライマーと、第１のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第２のプライマーと、第１のプライマーが誘導される領域に実質的に隣接するHPVゲノムの領域に対応するオリゴヌクレオチドから成る第３のプライマーと、第３のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチドから成る第４のプライマーとから成るDNA増幅方法を提供する。
本発明は、子宮頸部スミアのような検体中、生殖器HPV遺伝子型の存在について検体を分析する方法であって、核酸増幅方法を用いて検体中に存在する生殖器HPVのDNAを増幅すること、（ｉ），（ii），（iii），（iv），（ｖ），（vi），（vii），（viii），（ix），（ｘ），（xi）および（xii）から成る群より選ばれるオリゴヌクレオチドから成るプライマーを用いること、そして続いて増幅の産物を検出することから成る分析方法に具体化される。再び、用いられる核酸増幅方法は、たとえばPCR、NASBAまたはLCRから成る。増幅方法で用いられるプライマーは、増幅方法の種類によって適切に選択されるべきである。
本発明に従えば、核酸増幅方法におけるアニーリング段階は、好ましくは30〜50℃の温度、さらに好ましくは35〜45℃の温度、最も好ましくは38〜42℃の温度で行われる。
さらに本発明に従えば、核酸増幅方法は、好ましくはMg2+の２〜10ミリモル濃度、さらに好ましくはMg2+の2.5〜５ミリモル濃度、最も好ましくは、Mg2+の3.0〜4.0ミリモル濃度で行われる。
本発明に従えば、最良の結果は、約40℃（通常55℃）のアニーリング温度と、約3.5ミリモル（通常1.5ミリモルMg2+）のMg2+濃度で得られる。
本発明の新規なプライマーは、配列がすでに知られている生殖器HPV型のみならず、配列がまだ知られていないか、あるいは新しいHPV型の検出をも可能にする。
本発明に従えば、国際公報WO91/10675に開示された子宮頸部スミアをスクリーニングする一般的手法を採用することが好ましい。その手法は、本発明のHPV普遍プライマーと、以前に記載されたHPV型特異的汚染防止用プライマーとを組合わせて使用することに基づく。このPCR手法は、WO91/10675に記載されており、ここに文献として組み入れられる。
本発明の別の側面に従えば、増幅方法の産物は、HPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるDNAハイブリダイゼーションによって検出され、プローブのオリゴヌクレオチドが以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれる。
0003659646.tif 000008
およびこれらの配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド。
本発明の方法の好適な実施の形態では、前記HPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別々のプローブ混合物として適用され、一方の混合物がHPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まない。そして他方の混合物がHPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まない。
前記の好適な実施の形態に従えば、HPVハイリスクプローブ混合物は、12の異なったHPV−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは、12全て）を含む。混合物は、必ずしも完全である必要はない。しかしながら、たとえばHPV59,HPV66およびME180のような他のハイリスクHPV型のために型特異的プローブを追加することが望ましい。上記の好ましいローリスクプローブ混合物は、７つの異なったHPV−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは、７つ全て）を含む。このローリスクHPVプローブ混合物は、確かに不完全である。しかしながら、オランダ国の住民にしばしば存在するHPV型のみが含まれる。したがって、ハイリスクおよびローリスクプローブのカクテルは、将来新しいハイリスクHPVやしばしば存在するローリスクHPVが見つかったときに補完される必要がある。特に、ハイリスクHPVを検出するカクテルプローブは、子宮頸部癌のスクリーニングに重要であり、そのためできるだけ完全であるべきである。
プローブ混合物を用いることは好ましいが、そう要求されるわけではない。その代わり、個別のプローブを別々に用いることも可能である。１つのハイリスクプローブと１つのローリスクプローブのカクテルを作ることが最も実用的であるが、たとえば、全てのハイリスクHPV型をともに網羅する２つの異なったハイリスクプローブ混合物を調製することもまた可能である。同じことがローリスクカクテルプローブでもできる。それは、２つの（またはそれ以上の）異なったプローブ混合物に分割できる。
プローブは、いかなる適切なプローブラベル（たとえば放射性ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル等）をも運搬できるが、好ましくはジゴキシゲニン（digoxygenine）をラベルとして含む。
本発明は、さらに上記の方法に有用なHPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブに具体化され、該プローブのヌクレオチドは以下のオリゴヌクレオチドから成る群より選ばれる。
0003659646.tif 000009
およびこれらの配列に対して相補的なヌクレオチド。
本発明は、前記の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であるHPVハイリスクカクテルプローブを含む。前記混合物は、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まない。前記のとおり、ハイリスクカクテルプローブは、できるだけ完全であることが好ましい。したがって、好ましくは別のハイリスクHPV型のプローブを含む。ハイリスクプローブ混合物は、１つの完全な混合物として準備されてもよいし、代わりに合わさってできるだけ完全にハイリスクHPV型を網羅する２以上の異なったプローブ混合物として準備されてもよい。
また本発明は、前記の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブの混合物であるHPVローリスクカクテルプローブを含む。前記混合物は、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まない。ハイリスクカクテルプローブに関してなされた観察は、ローリスクカクテルプローブに関しても有効である。
また本発明は、HPVハイリスクカクテルプローブおよびHPVローリスクカクテルプローブのアセンブリを含む。前記アセンブリは、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含むが、HPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含まない混合物から成り、さらにHPV型6,11,34,40,42,43および44に対して特異的なプローブを含むが、HPV型16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56および58に対して特異的なプローブを含まない混合物を含んで成る。
本発明は、使用された原料および方法に続いて記載される以下の実施例によって説明される。実施例は、単に例示のためだけのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
原料と方法
HPVクローンおよび子宮頸部の切屑
6b,11,16,18および30型のHPVクローンはDrs.H.Zur Hausen and L.Gissmann（Heidelberg,Germany）より、13,32および40HPV型のHPVクローンはDr.E.−M.De Villiers（Heidelberg,Germany）より、31および35型のHPVクローンはDr.A.Lorincz（Gaithersburg,MD）より、33,39,54,55および66型のHPVクローンはDr.G.Orth（Paris,France）より、45型のHPVクローンはDr.K.V.Shah（Baltimore,MD）より、51型のHPVクローンはDr.G.Nuovo（New York,NY.）より、また59型のHPVクローンはDr.T.Matsukura（Tokyo,Japan）より快く提供していただいた。クローン化HPV43および56型は、American Type Culture Collection（Rockville,MD）より入手した。子宮頸部の切屑よりMY11/09（Manosら,1989）で誘導した、GP5/6領域を含むHPV52および58型のPCR産物を当研究室においてクローン化し、配列比較を行った。
222人の女性より採取した全264の子宮頸部の切屑に対してHPV  PCRを実施した。これらの女性は、HPVの有無と頸部細胞の形態とを頸部障害の臨床的挙動と関係づけるための予期追跡検査に参加した。HPVの検出および細胞形態学的分析の両方を行うために、頸部切屑は２つずつ採取した。１つは細胞形態学的検査に使用した。形態学的分類は、オランダで用いられているPap法をわずかに修正したものに従って行った（Vooijs,1987;修正KOPAC分類、簡単に説明すると、Pap Iが正常細胞;Pap IIが炎症;Pap II aが温和な中等度の異形成;Pap III bが重篤な異形成;Pap IVがその中における癌;Pap Vが侵入性の癌である）。分析した切屑は、Pap I（120検体）、Pap II（73検体）、Pap III a（59検体）、Pap III b（12検体）の各ケースを含んでいた。最初のスパーテルで残った細胞と２つ目の切屑細胞とを0.05％mertiolateを含有するリン酸緩衝生理食塩水中（Van den Bruleら,1991;Walboomersら,1992）に集めた。切屑には、以前に報告された（Van den Bruleら,1990b）凍結解凍加熱プロトコールに従って前処理を行った。簡単に説明すると、細胞を3,000g,10分間の遠心分離で沈澱させ、1mlの10mM  Tris−HCl,pH8.1に再懸濁した。各PCRのために、10μｌのアリコートをスクリューキャップ付きの新しい反応チューブ（Sarstedt,Etten−Leur,the Netherlands）に移した。各アリコートは、−70℃で保存し、その後室温で解凍した。続いてアリコートを100℃で５分間加熱し、氷上で冷却（10分間）した後、3,000gで１分間遠心分離を行った。
プライマーの設計と合成
HPV  DNAのホモロジー検索は、多重配列アライメントのためのCLUSTALコンピュータープログラム（Higgins and Sharp,1988）を用いるPC/GENE（Intelli−Genetics,Inc.,Release 6.7）によって実施した。EMBLのデータベースより得られるかまたは、Dr.H.Delius,Heidelberg,Germanyより快く提供された、23の粘膜向性HPV遺伝子型のL1領域の塩基配列を、約150塩基対の領域を挟んで位置するオリジナルのG5プライマーおよびG6プライマーを修飾するために使用した。プライマー配列は表1A/1Bに示されており、各プライマーはメトキシホスホラミダイト法を用いて、アプライドバイオシステムズ社（Perkin−Elmer Nederland B.V.,The Netherlands）で商業的に合成された。
ポリメラーゼ連鎖反応
100ngのヒト胎盤DNAと混合したクローン化HPV  DNAまたは、10μｌの子宮頸部切屑の粗細胞懸濁液に対して、普遍プライマー仲介PCR（Snijdersら,1990）を実施した。β−グロビン特異的プライマー（Saikiら,1990）を用いるPCRによる予備スクリーニングの結果、全ての子宮頸部切屑が陽性を示し、検体の質が適正であることが示された。
GP5/6およびGP5+/6+によるPCR分析も同様の条件で行った。50μｌの反応混合液には、50mM  KCl,10mM  Tris−HCl  pH8.3,200μＭ  各dNTP,3.5mM  MgCl2,1ユニットの耐熱性DNAポリメラーゼ（Amplitaq;Perkin Elmer Cetus）およびGP5/6またはGP5+/6+のいずれかのプライマーの組合わせで、各プライマー50pmolずつが含まれていた。混合液に数滴のパラフィン油を重層し、DNA変性のために94℃で５分間インキュベートし、続いてPCRプロセッサー（Bio−med,Theres,Germany）を使用して40サイクルで増幅させた。各サイクルは、94℃で１分間の変性段階、40℃で２分間のアニーリング段階および72℃で1.5分間の鎖長伸長段階から成る。増幅されたDNAを完全に伸長させるために、最後の伸長段階は４分間に延ばした。
GP−PCR産物は、以前に報告されたように（Van den Bruleら,1990b;Walboomersら,1992）、ゲル電気泳動に続いて拡散ブロッティングおよび、HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV31およびHPV33特異的GP−PCR産物で構成される混合プローブとの低厳密性サザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV31およびHPV33に対する種特異的PCRは、Van den Bruleら（1990）によって以前に報告されているように、HPV6,HPV16,HPV33およびHPV11,HPV18,HPV31の各組合わせで各HPV特異的プライマーを用いて実施した。PCRの条件は、各プライマーを25pmolずつとし、1.5mM  MgCl2とし、アニーリング温度を55℃としたことを除いては、GP−PCRに関して先に述べたものと同じである。
実施例1:GP5+プライマーおよびGP6+プライマーの設計
以前より、側方がGP5とGP6とによって占められる24の粘膜向性HPV由来のL1領域の推定アミノ酸配列のアライメントによって、GP5（前向きプライマー）領域のすぐ下流のThrArgSerThrAsn（TRSTN）およびGP6（後向きプライマー）領域の上流のArgHisXGluGlu（RHXEE）の両共通配列が明らかになっていた（Van den Bruleら,1992）。これらのアミノ酸の保存性はヌクレオチドレベルにおけるコドンの保存性を反映するので、GP5,GP6の両者を３′末端側で伸長するためにこれらの配列の一部を使用することが可能であった。プライマーの３′末端をHPV目的配列と完全に一致させるために、延長したG5とG6の３′末端に、少なくとも２つの明白に保存されているヌクレオチドを含む配列を付加しようと試みた。
23の粘膜向性遺伝子型におけるGP5領域の３′境界域の配列比較からは、アミノ酸配列ThrThrArgをコードする保存性ヌクレオチドが明らかになり、該配列の１番目のスレオニンをコードする最初の２つのヌクレオチド（CA）はGP5（表1A）に含まれる。GP5の修飾には、Ｔ残基（１番目のスレオニンのコドン中のヌクレオチド第３位置に、HPV16配列に対応させて）および、２つめのスレオニンをコードする最初の２つの不変ヌクレオチド（CA）をGP5の３′末端に付加した。アルギニン残基が６種の異なるコドンでコードされ得ること、そのためにこのコドンの第１および第３ヌクレオチドが変動的であるということから、GP5のこれ以上の延長が妨げられた。
23の粘膜向性HPVのGP6領域３′境界域の相補的配列は、アミノ酸共通GluGluTyr/Pheをコードするヌクレオチド配列であることが明らかになり、該配列のチロシン／フェニルアラニンをコードする３番目のヌクレオチドはGP6（表1B）に含まれる。GP6の修飾には、プライマーの３′末端に５つのヌクレオチドを付加した。このようにして、修飾プライマーの２つの３′末端ヌクレオチドの相補的配列が、グルタミン酸をコードする不変塩基（GA）を表す。
伸長された23−merのGP5（GP5+と呼ぶ）および25−merのGP6（GP6+と呼ぶ）のプライマー配列は、20の粘膜向性HPV遺伝子型のL1領域の対応する配列と並べて、表１に示す。
実施例2:PCR実験
1.クローン化HPV  DNAのモデル系における延長GP5/6プライマー（GP5+/6+）の使用
GP5/6およびGP5+/6+によるPCR分析は、クローン化HPV  DNA上で比較した。100ngのヒト胎盤DNAに、HPV型HPV6,HPV11,HPV13,HPV16,HPV18,HPV30,HPV31,HPV32,HPV33,HPV35,HPV39,HPV40,HPV43,HPV45,HPV51,HPV52,HPV54,HPV55,HPV56,HPV58,HPV59およびHPV66型の粘膜向性HPVのDNA1ngを混合してなる再構成物群をこの目的のために使用した。
いずれの普遍プライマーによる分析でも、すべてのHPV遺伝子型に対して好結果の増幅物が得られた。しかしながら、HPV30,HPV32,HPV39,HPV51およびHPV66型のGP5/6PCR産物をゲル電気泳動した結果、弱いバンドしか検出されなかった。このDNA増幅効率の低下は、HPV遺伝子型HPV30,HPV32,HPV39およびHPV66のGP5/6PCR産物と、HPV特異的混合プローブとの低厳密性ハイブリダイゼーションを行った際にも見られた。一方、延長プライマー対GP5+/GP6+を用いると、ゲル電気泳動およびハイブリダイゼーションのいずれを行った際にも強い陽性のシグナルが生じた。さらに一般的にGP5/6による増幅では、GP5+/GP6+によるPCRと比較して、細胞のバックグラウンドシグナルの増大を招いた。GP5+およびGP6+が非特異的結合を起こさないことが、HPV  DNAの検出レベルを高めるのに寄与しているのかもしれない。
GP5/6およびGP5+/6+によるPCR分析の感度の比較は、ヒト胎盤DNA中に希釈された、異なる濃度を持つHPV16,HPV39およびHPV51のクローン化DNAを両分析にかけることにより行った。これらのHPV型を選択したのは、これらがGP5/6との間に異なる数（それぞれ2,6および９個）のミスマッチを有するからであり、このことがプライマーの感度範囲に影響し得るからである。
HPV16はGP5+/6+によって、GP5/6に比べて10倍高い感度で検出が可能であることが判明した。HPV16のGP5+/6+産物の、HPV混合プローブとのハイブリダイゼーションの結果、100ngのヒト胎盤DNAのバックグラウンド中に検出レベル1fgのクローン化HPV16DNAを検出することができた。これは細胞20,000個あたり約70コピー数のウイルスゲノムに相当する。
HPV39およびHPV51は、延長された普遍プライマーを用いると、GP5/6の場合と比べて10倍から100倍高い感度で検出されることができた。しかしながら、これらのHPV遺伝子型はHPV16よりは低い感度でしか検出されるなかった。HPV39およびHPV51はともに、10pgレベルで検出された。これらの遺伝子型に対してGP5+/6+の組合わせを用いると、細胞20,000個当たりウイルスDNA約700,000コピー数の感度レベルが認められた。
2.細胞系上および細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑上でのGP5+/6+PCRの評価
４つの子宮頸部癌細胞系および100の子宮頸部切屑に対して、GP5/6およびGP5+/6+の両PCR分析を実施した。
子宮頸部癌細胞系SihaおよびCaskiを含むHPV16ならびに、HPV18子宮頸部癌細胞系C4−１およびHeLa  100ngを増幅させるために、GP5/6およびGP5+/6+プライマー対を使用した。
Siha（１〜10コピー数）、C4−１（１〜５コピー数）、HeLa（10〜50コピー数）などの低HPVコピー数の細胞系では、GP5/6PCRにおいてGP5+/6+PCRよりも増幅効率が低かった。Caski細胞系（500コピー数）は、いずれの不変プライマー対を用いても同等に効率よく増幅された。
ゲル電気泳動の結果、試験された４つすべての細胞系のGP5+/6+産物を目で見ることができた。これらの増幅産物のHPV混合プローブとのハイブリダイゼーションの結果、予想されたように試験されたすべての細胞系において強い陽性のシグナルが見られた。また、クローン化HPV再構成実験でHPV18に対して見られたのと同じバックグラウンドシグナルが、GP5/6PCRにおいてもHPV18に見られた。
GP5/6PCR分析では陰性を示した100の細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑をスクリーニングすることにより、新しいGP−PCR分析のさらなる臨床的評価を行った。GP5+/6+PCRによって、７つのGP5/6PCR陰性の子宮頸部切屑に対して新たにHPV陽性を検出することができた。GP5/6PCRでは検出されず、GP5+/6+PCRで検出されたHPV型を同定するために、HPV型特異的プローブとの厳密性経時ハイブリダイゼーションおよび、（自動）配列決定を実施した。HPV30,HPV32,HPV39（２つ）およびHPV66を検出することができた。また、延長された普遍プライマーを用いて２つの潜在的に新奇な型を検出することもできた。
3.異なるGP6+プライマーの比較
第２のプライマーとしてオリゴヌクレオチド配列番号２またはオリゴヌクレオチド配列番号４のいずれかを用いる再構成実験において、これらの異なる２つのプライマーは同一の効率を示した。
4.結果の考察
少数の子宮頸部切屑が不明瞭な結果を示し、粘膜向性HPVの数個についてGP5/6PCRによる感度の低下が見られたことから、HPV検出分析の最適化の見込みを評価した。十分なプライマー鎖長およびプライマーの３′末端における相同性が、DNAポリメラーゼ結合効率および安定なプライマー／鋳型複合体の形成に重要であることは既に知られている。また、GP5/6に隣接する領域が向粘膜性HPV群において高度に保存されているため、オリジナルのGP5/6プライマーを３′末端においてそれぞれ３および５塩基対で延長することで、GP5/6PCR効率を上げるのに好適な結果がもたらされるのかもしれない。
実際、GP5/6プライマーの伸長は、両プライマー対をクローン化HPV  DNAおよび臨床検体上で比較することで立証されたように、HPV検出レベルを高める結果となった。GP5+/6+を用いてテストされたすべてのHPV型がより高い感度で検出された。しかしながら、HPV57のような型でさえ、非常に低い感度ではあるが検出されたという事実は、普遍プライマーよりも多数のミスマッチを有することからは説明がつかない（GP5/6とは８個のミスマッチを有し、GP5+/6+とは９個のミスマッチを有する）。
驚くべきことに、ターゲットDNAとプライマーDNAとの間により多くのミスマッチ（たとえば、HPV39はGP6との間に２個のミスマッチ、GP6+との間に３個のミスマッチを有する）が導入される場合でも、延長プライマーを利用すると感度が上昇することが我々の実験結果より明らかになった。このことは、今回使用した条件において、ミスマッチの数はPCR効率に絶対的に重要なものではないことを示す。
一般に、オリジナルのプライマーGP5/6を用いたときに見られたバックグラウンドシグナルは、伸長された普遍プライマーを用いたときには検出されなかったが、このことがGP5+/6+でみられる感度の上昇を少なくとも部分的に説明するかもしれない。感度の上昇はさておき、GP5+/6+アッセイはHPVをさらに普遍的な方法で検出するための指示も与えた。これは、HPV型HPV30、HPV32、HPV39およびHPV66の検出が高められたこと、ならびにたとえばHPV39やHPV51（GP5/6との間に多くのミスマッチを有する）を検出する際の感度の上昇がHPV16に比べて大きいことに反映される。
明確な患者の母集団から採取した細胞形態学的に正常な子宮頸部切屑を両GP−PCR分析によってスクリーニングすることにより、この新しいシステムの長所がさらに実証された。伸長された普遍プライマーを用いると、有病率がわずかに上昇した。追加で検出されたHPV遺伝子型の分析を行っている間に、これらが高危険度および低危険度の型であることが判明した。
さらに、おそらくは新奇なものであると思われる２つのHPV遺伝子型が検出された。細胞形態学的に正常な切屑における追加のHPVの検出は、発癌性HPV型の有病率が約５％にまで上昇することを示す。さらに、GP5+/GP6+は、たとえばaerodigestive tractなどの外性器（extragenital）部位において潜在的に新奇なHPV型を検出する際に価値が大きい。したがって、改良generalプライマー系であるGP5+/6+は、HPVの研究において大きな価値をもつ。
一般的に、本発明者らは、GP5+/6+プライマーを用いることにより、GP5/6プライマー場合よりも高感度かつより普遍的に向粘膜性HPVを検出することが可能となると結論づけることができる。
実施例3:HPV型特異的プローブの使用
1.GP5+/GP6+領域内の型特異的HPVオリゴプローブの選択
HPVのGP5/6配列の多重アライメントは、CLUSTALコンピュータープログラム（PC/Gene,Release 6.7;Intelli−Genetics,Inc.）を用いて実施した。HPV6,11,16,28,26,31,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,54,56,58,59,61,66およびME180に特異的なオリゴヌクレオチド（30−mer）を選択するために、不均一な領域（Van den Bruleら,1992）が使用された（ヌクレオチド配列については表２を参照）。これらの内在オリゴヌクレオチドの特異性を予め決定するために、QSEARCHプログラム（PC/GENE）を用いて、これらと、L1オープンリーディングフレーム（ORF）特異的なGP5/6領域を含む、71種のパピローマウィルス（PV）特異的ヌクレオチド配列とのアライメント検索を行った。この配列を有するグループは、61の完全に配列が決定されているクローン化ゲノムと、配列が決定されている既知のHPVのPCR産物（GPまたはMY−PCR）とで構成され、該PCR産物のうち３つは配列が決定されている未同定HPV（HPV−Ｘ）のGP−PCR産物であり、７つはヒトを起源としないものである。ほとんどのオリゴヌクレオチドが、他のHPV配列との間に５個以上のミスマッチを含んでいた。HPV40特異的オリゴヌクレオチドのみが、分析したPV型の中の１つとの間に５個以下のミスマッチしか有しなかった（HPV7との間に４個のミスマッチ）。アライメントにおいて10個までのミスマッチを許容すると、有意に多くのオリゴヌクレオチド（15個）が、他のHPV配列（30個）に対してアライメントを示した。配列比較において15個までのミスマッチ（オリゴヌクレオチドの50％）を許容すると、オリゴプローブとPV配列との間のホモロジー数は莫大なものとなった。さらに、混合して使用する際に互いに交差ハイブリダイズする可能性のあるオリゴプローブは、配列分析によって取り除いた。
2.オリゴプローブの標識化
型特異的オリゴヌクレオチド（30−mer）は、メトキシ−ホスホラミダイト法を用いて、Pharmacia（Sweden）によって合成された。ターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim,Germany）を用いての、100pmolの各オリゴヌクレオチドのジオキシゲニン−11−ddUTP（DIG）標識化は、製造業者のプロトコールに従って実施した。混合液中に各プローブが等量で含まれるようにするために、各標識化オリゴヌクレオチドの相対濃度をスポットブロットを用いて評価した。
3.HPV特異的PCR産物のサザンブロット分析
各メンブレンは、５＊SSC,0.2％  SDS,0.1％  サルコシル（１＊SSCとは、0.15M塩化ナトリウム/0.015M  クエン酸ナトリウムのことであり、SDSはドデシル硫酸ナトリウムを指す）を含むハイブリダイゼーション混合液中で２時間プレハイブリダイズさせた。続いて、メンブレンを異なるDIG−標識化オリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーション混合液25mlにプローブ100pmolを含む）と、あるいはDIG−標識化オリゴプローブの混合液とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは55℃で一晩行った。メンブレンを55℃において３＊SSC,0.5％  SDS中で30分間、３回にわたって洗浄した。DIG−標識化オリゴヌクレオチドの検出は、LumigenTM−PPDを用いた化学発光法により、製造業者のプロトコール（Boehringer Mannheim,Germany）に従って行った。続いて、メンブレンを室温で60分間Kodac Royal X−Omatフィルムに露光させた。さらに何枚かのメンブレンは、van den Bruleら（1990b）によって記述があるように、クローン化され配列が決定されている6,11,16,18,31および33型HPVに由来するGP−PCR産物のα32P  dCTP標識化プローブともハイブリダイズさせた。オートラジオグラフィーは、Kodak Royal X−Omatフィルムおよび増感紙を用いて−70℃で18時間かけて実施した。
4.DIG−標識化HPV型特異的オリゴプローブの特異性
6,11,16,18,26,31,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,54,56,58,61およびME180型HPVに対するPCRにおけるオリゴヌクレオチドプローブの特異性をサザンブロット分析により実験的に決定した。この目的のために、HPVテストパネル（HPV6,11,34,40,42,43,44,16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56,58,59,および66）のGP−PCR産物を約100pg含むメンブレンを異なるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。全てのプローブが各自に関連するHPV遺伝子型に対して特異的であることが判明し、55℃で使用した場合、他のHPV型との交差ハイブリダイゼーションは一切見られなかった。選択されたオリゴヌクレオチドプローブは、高いアンプリマーコピー数であるときでさえ交差ハイブリダイゼーションを起こさず、特異的HPVの分類に使用できることが証明された。
5.DIGオリゴヌクレオチドプローブの感度
選択された番号のHPVに対して、オリゴプローブのハイブリダイゼーション感度を、対応するHPVのGP5+/6+PCR産物を10倍希釈してサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより決定した。HPVの型には、GP5+/GP6+PCRによって増幅され易いもの（HPV6,16,18,42,45,51）あるいは増幅されにくいもの（HPV35,39）を選択した。これらの型のうちのいくつか（HPV6,16,18）については、日常的に使用されるランダムプライマーで標識された混合プローブの中に、対応するPCR産物が存在する。ほとんどのプローブに対して、検出レベル1ngでPCR産物が認められた。型特異的オリゴプローブ個別での能力と、オリゴプローブ混合液の一部として使用される場合での能力とを比較するために、メンブレンをハイリスク混合プローブまたはローリスク度混合プローブのいずれかともハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン標識化オリゴプローブの感度は、混合中で使用しても（有意には）低下しないことが判った。個々のジゴキシゲニン標識化オリゴプローブおよびDIG混合プローブの感度もまた、本発明者らの研究室で現在でも日常的に使用しているランダムプライマーで標識したα32P  dCTP  GP5+/6+PCR産物プローブと比較した。DIG−標識化オリゴプローブ全体としての感度が、α32P  dCTP標識感度はGP−PCR産物プローブの感度に匹敵することが判明した。
6.HPVの検出
クローン化HPVのDNA1ngまたは子宮頸部切屑の粗細胞懸濁液10μｌのいずれかをDe Roda Husmanら（1994b）による報告があるように、GP5+/6+PCRにかけた。簡単に説明すると、PCR反応は、50mM  KCl,10mM  Tris−HCl  pH8.3,各dNTP  200μM,3.5mM  MgCl2,耐熱性DNAポリメラーゼ（Amplitaq;Cetus,USA）１ユニットおよびGP5+,GP6+プライマー25pmolを含む50μｌ中で行った。DNA変性のために94℃で５分間処理した後、PCRプロセッサーを使用して40サイクルで増幅させた。各サイクルは、94℃で１分間の変性段階、40℃で２分間のプライマーアニーリング段階および72℃で1.5分間の鎖長伸長段階から成る。増幅されたDNAを完全に伸長させるために、最後の伸長段階は４分間に延長した。ゲルレベルで同じ強度をもつサンプルを次段階に向けて選択した。これらのサンプルの、全量５μｌのPCR産物を1.5％アガロースゲル上に25倍で重層し、0.5N  NaOH,0.6M  NaCl中で核酸ブロッティングにより、正に荷電させたナイロンメンブレン（Qiabrane,Westburg）に転移させた。
7.HPVハイリスクおよびローリスクDIG−標識化カクテルプローブの分析
HPV型特異的DIGオリゴプローブの特異性と感度が確立したので、群特異的カクテルプローブを調製し、HPV型パネル上のGP5+/6+PCR産物に対するそれらの反応効率を調べた。ハイリスクHPVカクテルプローブは、以下のDIG−標識化オリゴプローブすなわち、16,18,31,33,35,39,45,51,52,54,56,58,68,各100pmolを同時に加えて調製した。ローリスクカクテルプローブは、各100pmolのプローブ6,11,34,40,42,43,44から成る。いずれの群特異的HPVカクテルプローブも、それぞれハイリスク遺伝子型と、ローリスク遺伝子型とを明瞭に同定することが判った。さらに、予想されたとおり、交差ハイブリッドハイブリダイゼーションは検出されなかった。
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