(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）静脈転移の非転移ＨＣＣに対する検出を補助する方法であって、以下：
対象からの試験試料中のｍｉＲサインのレベルを測定することを含み、
ここでｍｉＲ遺伝子産物サインが以下：ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−３０ｃ、ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−１２４ａ、アップレギュレーションされたｍｉＲ−２０７及びアップレギュレーションされたｍｉＲ−２１９、のｍｉＲ遺伝子産物を含む；そして
ここで、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの、非転移ＨＣＣの対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した変化が、対象におけるＨＣＣ静脈転移の指標である、前記方法。
【請求項２】
ｍｉＲ遺伝子産物サインがｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、ｍｉｒ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］およびｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象におけるＨＣＣ静脈転移の非転移ＨＣＣに対する検出を補助する方法であって、以下：
（１）対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；
（２）ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること、ここで当該マイクロアレイは、ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−３０ｃ、ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−１２４ａ、アップレギュレーションされたｍｉＲ−２０７およびアップレギュレーションされたｍｉＲ−２１９のｍｉＲ遺伝子産物を含むｍｉＲ遺伝子産物サインについてのｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む；および
（３）試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを、非転移ＨＣＣの対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較すること；
を含み、ここで、当該対照試料と比較した少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化が、対象におけるＨＣＣ静脈転移の指標である、前記方法。
【請求項４】
マイクロアレイがｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、ｍｉｒ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］およびｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］に対するｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対象における１つ以上の有害な予後予測マーカーに関連するＨＣＣ静脈転移、または当該疾患を発症するリスクの検出を補助する方法であって、以下：
（１）対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；
（２）ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること、ここで当該マイクロアレイは、ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−３０ｃ、ダウンレギュレーションされたｍｉＲ−１２４ａ、アップレギュレーションされたｍｉＲ−２０７およびアップレギュレーションされたｍｉＲ−２１９のｍｉＲ遺伝子産物を含むｍｉＲ遺伝子産物サインについてのｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む；および
（３）試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを、非転移ＨＣＣの対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較すること；
を含み、当該対照試料と比較した、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化が、対象におけるＨＣＣ静脈転移の指標である、前記方法。
【請求項６】
マイクロアレイがｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、ｍｉｒ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］およびｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
初期ステージ疾患の患者を含む、多結節性または孤発性腫瘍を有するＨＣＣ患者の生存および再発を予測することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
初期ステージ疾患の患者を含む、多結節性または孤発性腫瘍を有するＨＣＣ患者の生存および再発を予測することを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項９】
初期ステージ疾患の患者を含む、多結節性または孤発性腫瘍を有するＨＣＣ患者の生存および再発を予測することを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
試料についてのｍｉＲＮＡプロファイルを生み出すことにより肝細胞癌（ＨＣＣ）またはＨＣＣを発症するリスクの検出を補助するためのキットであって、適切な容器手段中に２以上のｍｉＲＮＡプローブを含む、ここで当該プローブはｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、ｍｉｒ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］およびｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ならびにその組み合わせのｍｉＲＮＡコーディング配列を有する、前記キット。
【請求項１１】
試料中のｍｉＲＮＡを標識するための試薬をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者
Ｃａｒｌｏ  Ｍ．Ｃｒｏｃｅ，Ｘｉｎ  Ｗ．Ｗａｎｇ，Ａｎｕｒａｄｈａ  Ｂｕｄｈａ，Ｚｈａｏ−Ｙｏｕ  Ｔａｎｇ
関連する出願に対する相互参照および保証された研究に関する声明
本発明は２００７年１１月１日に出願された仮特許出願第６０／８５５，８９５号の利益を主張する。本発明はＮＣＩグラント第ＲＯ１  ＣＡ１２８６０９号のもとでの政府援助により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は極めて予後が不良な癌を表し、依然として世界中で最も一般的な、侵襲性ヒト悪性腫瘍の一種である（１；２）。思わしくない予後は、ＨＣＣの主要な特徴である肝臓内転移または手術後の再発に起因している。新規な腫瘍コロニーはしばしば門脈本幹、およびおそらく肝臓の他の部分に浸潤する（３〜６）。切除または肝臓移植は、潜在的な治癒のための最適な選択肢であるが、相対的に正常な肝臓機能のパラメータによって定義される約２０パーセントのＨＣＣ患者、および利用可能な臨床ステージングシステムによって確定される処理しやすい腫瘍病変だけが現在外科的介入にふさわしい。その上、切除された患者はしばしば高い頻度で転移／再発を起こし、術後５年の生存はわずか３０〜４０パーセントである。
【０００３】
ＨＣＣ患者のための肝臓移植は、臓器ドナーの不足、および特に初期の疾患ステージにおいて、適切な候補を選択することにおける現行のステージングシステムの手順の欠陥により依然として論争の的である。これらのシステムは、とりわけ悪性疾患において非常に重要であり、患者へのアドバイスならびに査定および治療のための指針を提供する。ＨＣＣにおける臨床評価および治療決断は、それらが癌蔓延の等級（腫瘍ステージング）および残存する肝臓機能（慢性肝臓疾患ステージ）の両方に依存するため複雑である。十分に定義され、一般に受け入れられたステージングシステムはほとんどすべての癌に利用可能であるが、ＨＣＣは例外であり、多くの異なるステージングシステムが疾患のそれぞれの階層に適合するように広範に導入され、現在どれが最適であるかに関する合意が欠如している（７〜１２）。従って、正確な予後予測因子およびＨＣＣ患者に適応可能な、合理的な治療決断のための良識ある選択基準は依然として難しい課題である。
【０００４】
予後予測分子バイオマーカーの最近の確認は、ＨＣＣの事前の診断に対する期待を提供する。ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用して、発明者らはＨＣＣの予後および転移を予言するための独特の遺伝子発現サインを開発した（１３）。原発ＨＣＣ臨床標本における分子予後予測サインの存在はいくつかの最近の研究によって確証された（１４；１５）。ＨＣＣは通常炎症を起こした肝臓に存在するため、発明者らはまたＨＣＣ患者の肝臓微小環境における遺伝子の発現に基づいた、腫瘍の予測因子とは著しく異なった独特の予測因子を開発した（１６）。ｃＤＮＡ遺伝子発現プロファイリングに基づいた多くの他の予後予測サインのように、腫瘍および微小環境サインは共に数百の細胞コーディング遺伝子を含む。従って、臨床業務において関連のあるバイオマーカーまたは潜在的薬理学的標的を確認し、遺伝子のスコアを調べることは困難な課題である。
【０００５】
最近の研究は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）として公知の低分子非コーディングＲＮＡ遺伝子産物（‐２２ｎｔ）を持つ発現プロファイリングが、癌サブタイプ分類および予後予測のための優れた方法であることを示す（１７〜１９）。ｍｉＲＮＡは多くの生物に存在し、主に３′非翻訳領域における、ｍＲＮＡの部分的に相補的な部位との塩基対形成により、ｍＲＮＡ翻訳および分解において重要な調節的役割を果たす（２０〜２２）。ｍｉＲＮＡは細胞ヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによりプロセッシングされる長い前駆体ＲＮＡとして発現され、その後Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５−依存的機序により細胞質に輸送される（２３；２４）。ｍｉＲＮＡはその後ＤＩＣＥＲ酵素によって開裂され、結果としてＲＮＡ‐誘発サイレンシング様複合体に結合した１７〜２４ｎｔのｍｉＲＮＡを生じる（２５；２６）。正常および腫瘍性ヒト細胞におけるｍｉＲＮＡの発現パターン、機能および調節は大部分未知であるが、明らかになりつつあるデータおよびそれらの脆弱部位における頻繁な配置、増幅の一般的な中断点もしくは領域、またはヘテロ接合性欠失は、それらがヒト発癌において重要な役割を果たす可能性があることを明らかにする。
【０００６】
Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫における高められた前駆体ｍｉＲＮＡ‐１５５発現およびいくつかのｍｉＲＮＡの頻繁な欠失またはダウンレギュレーションは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において、ならびに乳房、肺、卵巣、頸部、結腸直腸、前立腺、およびリンパ系を含む多くの癌型において観察されている（１７；１８；１７〜３４）。機能的解析はまた、ｍｉＲ‐２１によるＰＴＥＮのダウンレギュレーション、ｌｅｔ−７ファミリーの腫瘍抑制機能およびｍｉＲ１７−９２クラスターの腫瘍形成機能を明らかにしている（３５〜３７）。ｍｉＲＮＡ発現パターンの生物学的および臨床的妥当性は、ヒトＢ細胞ＣＬＬおよび乳癌を含む固形腫瘍において示されている（１８；３０；３８）。それぞれのｍｉＲＮＡは独特の能力を有し、非常に多くのコーディング遺伝子の発現を潜在的に制御し、それによって増殖、アポトーシスおよびストレス反応を含むいくつかの細胞経路を改変する（３９）。この現象はｍｉＲＮＡを優れた分子マーカーおよび照合（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）のための標的にし、そのようなものとして、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングはがん診断のための手段として利用されうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
広範な側面において、本明細書ではＨＣＣ静脈転移と非転移ＨＣＣを明確に識別することができる独特のｍｉＲＮＡサインが提供される。ＨＣＣステージングシステムとは対照的に、このサインは初期ステージ疾患の患者を含む、多結節性または孤発性腫瘍を有するＨＣＣ患者の生存および再発を予測することが可能である。その上、このサインは他の利用可能な臨床パラメータに比較して、患者の予後および再発の独立した重要な予測因子である。このｍｉＲＮＡサインはＨＣＣ予後予測を可能にするために有用であり、転移／再発傾向のあるＨＣＣ患者の事前の確認に対して臨床的有用性を有する。
【０００９】
本明細書では慢性肝細胞癌（ＨＣＣ）確認のシステムである、正常対照細胞に比較して異なって発現されるｍｉＲＮＡの癌‐特有サインが提供される。
【００１０】
従って、本明細書では対象に由来する試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、対象がＨＣＣに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が提供され、ここでは試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化が、対象がＨＣＣに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあることを表す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
少なくともｍｉＲ遺伝子産物のレベルは当業者に公知である多様な技術を使用して測定することができる。一態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット解析を使用して測定される。別の態様では、試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより少ない。また別の態様では、試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより多くなりうる。
【００１２】
本明細書ではまた、対象に由来するＨＣＣ試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、対象における１つ以上の予後予測マーカーに関連するＨＣＣを診断する方法が提供され、ここでは試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化が、対象が１つ以上の予後予測マーカーに関連するＨＣＣに罹患していることを表す。
【００１３】
一態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写し、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較することによって測定される。少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化は、対象がＨＣＣに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００１４】
本明細書ではまた、対象におけるＨＣＣを治療する方法が提供され、ここでは少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが、対照試料から生み出されたシグナルに比較して脱制御（たとえばダウンレギュレーションおよび／またはアップレギュレーション）される。
【００１５】
ある態様では、マイクロアレイは図１１に示すようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含み、そしてある特定の態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
【００１６】
本明細書ではまた、対象における１つ以上の有害な予後予測マーカーに関連したＨＣＣに対象が罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が提供され、診断は対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較することによる。シグナルにおける変化は対象が癌に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００１７】
本明細書ではまた、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、対照細胞に比較して対象の癌細胞においてダウンレギュレーションされているか、またはアップレギュレーションされている、ＨＣＣに罹患している対象のＨＣＣを治療する方法が提供される。１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてダウンレギュレーションされている場合、方法は有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与し、その結果対象における癌細胞の増殖が阻害されることを含む。１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップレギュレーションされている場合、方法は少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することを含む。ある態様では、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａならびにその組み合わせから選択される。
【００１８】
本明細書ではまた、対象のＨＣＣを治療する方法が提供され、該方法はＨＣＣ細胞における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の量を対照細胞に比較して確定すること；および癌細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より少ない場合、有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与すること；または癌細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することによって、ＨＣＣ細胞に発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることを含む。ある態様では、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａならびにその組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
本明細書ではまた、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物および薬剤的に受容できるキャリアを含む、ＨＣＣを治療するための医薬組成物が提供される。特定の態様では、医薬組成物は、適切な対照細胞に比較して、ＨＣＣ細胞においてダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に対応する少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を含む。
【００２０】
別の特定の態様では、医薬組成物は少なくとも１つのｍｉＲ発現レギュレーター（例えば、阻害剤）化合物および薬剤的に受容できるキャリアを含む。
【００２１】
本明細書ではまた、適切な対照細胞に比較してＨＣＣ細胞においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に特有の少なくとも１つのｍｉＲ発現レギュレーター化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００２２】
本明細書ではまた、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＨＣＣ細胞において減少した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗ＨＣＣ剤を確認する方法が提供され、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験薬剤が抗ＨＣＣ剤であることを表す。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示すようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
【００２３】
本明細書はまた、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＨＣＣ細胞において増加した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗ＨＣＣ剤を確認する方法が提供され、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験薬剤が抗ＨＣＣ剤であることを表す。
【００２４】
ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示すようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
【００２５】
本発明の種々の目的および利点は、添付の図面の観点から読む場合、以下の好ましい態様の詳細な説明から当業者には明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
特許または出願ファイルはカラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を持つこの特許または出願公報のコピーは、要請および必要な報酬の支払い時に事務所によって提供される。
【図１】ＨＣＣ予後を予測することが可能なｍｉＲＮＡサインの検索の図解。
【図２Ａ】ＨＣＣ患者に由来する転移性対非転移性肝臓組織において有意に異なって発現されたｍｉＲＮＡ。予測精度を確立するために１個抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）交差検定を利用する４つの異なるアルゴリズム（化合物共分散予測因子、線形判別分析、最近傍法およびサポートベクターマシーン）を使用したクラス予測分析に由来する、転移性（Ｍ；青色線；ｎ＝３０）および非転移性試料（ＮＭ；黄色線；ｎ＝１０４）において発現が有意（ｐ＜０．００１）に変化した２０ｍｉＲＮＡ遺伝子の階層的クラスタリング。それぞれの横の列は個々の遺伝子を表し、それぞれの縦の行は個々の組織試料を表す。遺伝子の平均量に対して標準化された正常肝臓組織プール（ｎ＝８）に比較したそれぞれの組織試料における量の比に従って、遺伝子はセンター相関（ｃｅｎｔｅｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）および完全連結法（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）により配置された。シュードカラー（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）（それぞれ緑色、黒色および赤色）は平均より少ない、平均に等しい、または平均より多い転写レベルを示す。目盛りはｌｏｇ２目盛りにおける−４〜４までの遺伝子発現比を表す。
【図２Ｂ】ＨＣＣ患者に由来する転移性対非転移性肝臓組織において有意に異なって発現されたｍｉＲＮＡ。２０ｍｉＲＮＡの予測結果に基づいた、転移性および非転移性試料のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析。
【図３−１】試験コホートまたは初期ステージＨＣＣにおける２０−ｍｉＲＮＡまたは４−ｍｉＲＮＡサインの分類能力の解析。２０−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ａ）；４−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ｂ）により予測された分類に基づいた１１０人のＨＣＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存分析。
【図３−２】試験コホートまたは初期ステージＨＣＣにおける２０−ｍｉＲＮＡまたは４−ｍｉＲＮＡサインの分類能力の解析。２０−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ｃ）；４−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ｄ）により予測された分類に基づいた８９人の初期ステージＨＣＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存分析。２０−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ｅ）；４−ｍｉＲＮＡ予測因子（図３Ｆ）による予測された分類に基づいた８９人の初期ステージＨＣＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無再発生存分析。
【図４】表１−実施例１の患者の臨床的特徴を示す。
【図５】表２−生存および再発に関連する因子の単変量および多変量解析を示す（ＴＭＭステージＩおよびＩＩ）。
【図６】表３−ＨＣＣ生存を予測するための予後予測値を持つ２０のマイクロＲＮＡの概要。
【図７】表４−十分に定義されない組の臨床ステージング。
【図８】表５−生存および再発に関連する因子の単変量および多変量解析（ＢＣＬＣステージ０およびＡ）。
【図９】表６−生存および再発に関連する因子の単変量および多変量解析
【図１０】試験コホートにおけるステージングシステムの分類能力の解析。（図１０Ａ）ＴＮＭステージング（図１０Ｂ）ＯＫＵＤＡステージング（図１０Ｃ）ＣＬＩＰステージングまたは（図１０Ｄ）ＢＣＬＣステージングにより予測された分類に基づいた１１０人のＨＣＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析。
【図１１】ＨＣＣを予測するために有用な２２のｍｉＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２）の組を含む表。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明は共に、代表的で説明的であるだけであり、現行の教示の範囲を限定することを意図しない。本出願では、特記しない限り、単数の使用は複数も含む。
【００２８】
特許請求の範囲および／または明細書において「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語と共に使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語の使用は「１つ」を意味するが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多い」の意味と一致する。
【００２９】
また、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、および「ｉｎｃｌｕｄｅ」の使用、または、たとえば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」に限らないこれらの語根（ｒｏｏｔ  ｗｏｒｄ）の改変は限定することを意図しない。「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、前後の用語を一緒に、または別個に解釈できることを意味する。実例のためであり、限定するものではないが、「Ｘおよび／またはＹ」は「Ｘ」もしくは「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味しうる。
【００３０】
ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。この点において、「遺伝子」という用語を使用して、一定のｍｉＲＮＡに対する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を簡単に表す。しかし、本発明の態様はプロモーターまたは他の制御配列のような、発現に関連するｍｉＲＮＡのゲノム配列を含んでいてもよい。
【００３１】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は一般に１本鎖分子を表すが、特有の態様では、本発明に提供される分子はまた、同じ１本鎖分子の別の領域または別の核酸に部分的に（鎖の長さにわたり１０〜５０％相補的）、実質的に（鎖の長さにわたり５０％より多いが１００％より少なく相補的）または十分に相補的である領域または付加的な鎖を包含することになる。従って、核酸は分子を含む特定の配列の１つ以上の相補的もしくは自己相補的鎖、または「相補物」を含む分子を包含してもよい。たとえば、前駆体ｍｉＲＮＡは１００％に至るまで相補的である自己相補的領域を有していてもよく、本発明のｍｉＲＮＡプローブはそれらの標的に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的であり得るか、または相補的である。
【００３２】
本明細書で使用する「その組み合わせ」という用語は、用語に先行する記載された項目のすべての変形および組み合わせを表す。たとえば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は少なくとも：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、そして特定の状況において順序が重要な場合、同様にＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図する。
【００３３】
本明細書で使用する段落の見出しは系統化のためだけであって、いずれのやり方でも記載された主題を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、記事、本、論文、およびインターネットウェブページを含む、本出願に引用されたすべての参考文献および類似の資料はいずれの目的にもそのまま参照として特に援用される。１つ以上の援用された参考文献および類似の資料が、本出願における用語の定義に矛盾するようなやり方でその用語を定義するか、または使用する場合、本出願が操作する。
【００３４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は新規なクラスの低分子非コーディングＲＮＡ遺伝子の転写物であり、それらは肝細胞癌（ＨＣＣ）を含むいくつかの型の侵襲性癌をそれらの通常の等価物と識別することができる。ＨＣＣ患者は転移速度が高いため、極めて予後不良であり、現行のステージングシステムは、特に該疾患の初期ステージにおいて、患者の予後を正確に確定することができない。発明者らは独特のｍｉＲＮＡがＨＣＣの予後および転移に関連するかどうかを検討した。
【００３５】
発明者らは２４４人のＨＣＣ患者の根治切除から得た４９０の標本のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを調査した。発明者らは１３４の臨床的に十分に定義された転移性および非転移性ＨＣＣ標本に基づいて独特のｍｉＲＮＡサインを発見した。独特のサインは１１０の独立したＨＣＣ標本の予後の結果を予測するために使用された。
【００３６】
２０の独特のオリゴヌクレオチドからなるｍｉＲＮＡサインは、トレーニングコホートにおける交差検定により、静脈転移を伴う３０の原発ＨＣＣ組織を１０４の非転移孤発性ＨＣＣと有意に（ｐ＜０．００１）識別することができる。しかし、かなりのｍｉＲＮＡは対応する非癌性肝臓組織から確認することができなかった。
【００３７】
腫瘍転移ｍｉＲＮＡサインは患者生存（ｐ＜０．００２３）の有意な予測因子であり、再発（ｐ＝０．００２）は８９の初期ステージＨＣＣである。４種の選択されたｍｉＲＮＡからなる厳密なサインは類似の予測力を有した。注目すべきことは、高いｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］およびｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］ならびに低いｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］およびｍｉＲ‐１２４ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］発現は静脈転移および生存不良に相関した。ＣＯＸ比例ハザードモデルはまた、このサインが患者の生存を予測するための既知のステージングシステムを含む他の臨床変数より優れていることを明らかにした。
【００３８】
独特のｍｉＲＮＡサインは、とりわけ慣用のステージングシステムにより予後を予測することが困難な患者においてＨＣＣ予後予測のために有用である。本明細書における実施例は、ＨＣＣにおけるある種のｍｉＲＮＡレベルの測定が、転移を起こしやすい患者の事前確認に対して臨床的有用性を有し、その後に患者を適切な治療に対して分類することを示す。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者は、代表的な技術に従う実施例において開示された技術は、発明者らによって発見され、本発明の実施において十分に機能し、従ってその実施に対して好ましい様式を構成すると見なせることを認識すべきである。しかし、本発明の開示の観点において、開示された特有の態様において多くの変更が行われ、そして依然として本発明の意図および範囲から逸脱せずに同じまたは類似の結果を得られうることを当業者は認識すべきである。
実施例Ｉ
ＨＣＣおよび関連する状態
肝臓組織はＬｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＺｈｏｎｇｓｈａｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）において２００２〜２００３年に根治手術を受けた患者からインフォームドコンセントにより得た。研究はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＮＩＨによって認可された。遺伝子発現プロファイルは２４４人の中国人ＨＣＣ患者から得た原発ＨＣＣおよび対応する非癌性肝臓組織において実施された。それらの中で、９３％は内在する肝硬変を有し、６８％は血清アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルが＞２０ｎｇ／ｍｌであった（図４‐表１）。
【００４０】
症例を分け、ｍｉＲＮＡサインを試験するための一般的な方法は図１に概説する。全部で１３４の十分に定義された症例はトレーニング群として使用された。それらの中で、３０は、門脈本幹（ｎ＝２５）、下大静脈（ｎ＝２）または総胆管（ｎ＝４；１症例は下大静脈にも腫瘍塞栓を持つ）に見いだされた腫瘍塞栓を伴う原発ＨＣＣ病変を有し、そして１０４はフォローアップ（３年）後に見いだされた転移／再発の無い孤発性ＨＣＣを発症した。
【００４１】
検証解析では、発明者らはいくつかのＨＣＣステージングシステムにより切除時に正確に予後を確定することができない独立した１１０症例（図１：定義が不十分な組）の試験群を使用した。試験症例には４３の多結節性および６７の孤発性ＨＣＣが含まれた。４３の多結節性ＨＣＣ症例の中で、１８は肝臓内再発を発症し、１症例は肝臓内再発に加えて、肝臓外転移を発症した。６７の孤発性ＨＣＣ症例の中で、４患者は凝集した結節像を有する孤発性腫瘍を有し、１０は肝臓内および／または肝臓外転移を発症したが、４９はフォローアップ（３年）後に確証された肝臓内再発を発症した。その上、無疾患患者［（１６）に記載］に由来する８つの正常肝臓組織が正常対象として含まれた。
ＲＮＡ単離およびｍｉＲＮＡアレイ：
ＲＮＡ単離およびｍｉＲＮＡアレイ法は本質的に先に記載の通りであった（１３；１７）。２４４ＨＣＣ症例の解析では、ＲＮＡは腫瘍または非腫瘍組織から対様式で単離し、試料はグループ分けのバイアスを避けるためにｍｉＲＮＡ解析に対して無作為の順番で選択した。全部で４８８のマイクロアレイが実施された（実施例ＩＩを参照されたい）。
統計解析：
教師無し（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）階層的クラスタリング解析は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｔｕｒｍによって開発されたＧＥＮＥＳＩＳソフトウェア１．５版（ＩＢＭＴ−ＴＵＧ，Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって実施された。ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓソフトウェアＶ３．３は先に記載（１３；１６）のように、教師あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）解析に対して使用された。Ｅｘｃｅｌを基礎にしたＷｉｎＳＴＡＴソフトウェア（http://www.winstat.com）を使用し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を使用して予測結果に基づいた患者生存を比較した。統計上のｐ値はＣｏｘ−Ｍａｎｔｅｌログランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）検定により求めた。ＳＴＡＴＡ９．２（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を使用し、Ｃｏｘ比例ハザード回帰を使用して患者生存または再発に関する１６の臨床変数の効果を分析した（実施例ＩＩを参照されたい）。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ解析はＢｅｎ  Ｌｅｗｉｓにより開発されたウェブサイトツール（http://genes.mit.edu/targetscan/index.html）に基づいて行った（実施例ＩＩを参照されたい）（４１）。
結果：
ＨＣＣ組織におけるｍｉＲＮＡ転移サインの検索
２４４ＨＣＣ症例のコホートにおいて、発明者らは教師ありクラス比較法（実施例ＩＩの方法を参照されたい）により静脈転移（Ｍ）のある３０症例および非転移（ＮＭ）の１０４症例に由来する原発ＨＣＣまたは非癌性組織を比較した（図１、および図４‐表１）。発明者らはＭの腫瘍組織をＮＭの症例と識別しうる２０ｍｉＲＮＡを確認した（図２Ａおよび図６‐表３）。
【００４２】
非癌性組織ｍｉＲＮＡ発現データを使用した場合、発明者らは同じ統計的有意性レベルにおいてＭとＮＭを識別可能ないずれかのｍｉＲＮＡを確認することができなかった（データは示さない）。従って、腫瘍細胞のｍｉＲＮＡ発現には肝臓微小環境のそれに比較していっそう測定可能な変化が存在し、そのことが腫瘍組織におけるｍｉＲＮＡ発現の解析がＨＣＣ患者群の識別にいっそう都合よく適していてもよいことを示唆する。
【００４３】
その上、多結節状態、微小血管浸潤および４種の臨床ステージングシステムを含む他の臨床変数によりこれらの組織の比較が行われた場合、重要なｍｉＲＮＡは確認することができなかった（データは示さない）。従って、大血管浸潤が明白な場合だけ、ある種のｍｉＲＮＡの発現が転移と相関するように見えた。２０ｍｉＲＮＡの中で、４はＭにおいて過剰発現され、１６はＮＭにおいて過剰発現された。
【００４４】
厳密なｍｉＲＮＡ転移サインの組成および予測値
２０−ｍｉＲＮＡサインが患者の予後に関連するかどうかを確定するために、発明者らは初めに１０％交差検定および１０００の並べ替えを伴う多変量最近隣者クラス予測を実施した。この分析は全体精度７６％（ｐ＝０．００１）で統計的に有意に転移を予測した。２０−ｍｉＲＮＡ予測結果に基づいたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、非転移群に比較した場合、予測された転移群は有意に短い生存期間を有する（ｐ＜０．０４２）ことを明らかにした（図２Ｂ）。従って、このサインは患者の予後に関連する。
【００４５】
ｍｉＲＮＡサインのロバストネスをさらに試験するために、発明者らは交差検定トレーニングセットの結果に基づいて独立したＨＣＣ症例の組を予測するその能力を試験した（図１）。発明者らは、予測されたＭ群はＮＭ群より有意に低い生存率を有する（ｐ＝０．００９）ことを見いだした（図３Ａ）。
【００４６】
種々のｍｉＲＮＡ組み合わせによる遺伝子縮小法を使用して、発明者らは有意な生存の予測が依然として４種のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］だけにより達成されうる（ｐ＝０．００３）ことを見いだした（図３Ｂ）。
【００４７】
ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］およびｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］の増加した発現、ならびにｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］およびｍｉＲ‐１２４ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の減少した発現はＨＣＣ静脈転移および予後に関連するように見えた（図６−表３）。
【００４８】
対照的に、４種のＨＣＣ予後予測ステージングシステム（すなわち、ＴＮＭ、ＯＫＵＤＡ、ＣＬＩＰまたはＢＣＬＣ）はこの試験コホートにおいて患者生存を予測することが不可能であった（図６−図３、図７−表４、および図８−表５）。
【００４９】
ＨＣＣの初期ステージにおいて癌蔓延のリスクを予測する能力は重要な臨床的影響を与えうるため、発明者らはまた、初期ステージＨＣＣ患者の２０−または４ｍｉＲＮＡサインの予後予測能力をアッセイした（ＴＮＭステージＩまたはＩＩ；ｎ＝８９）。全試験セットと同様に、初期ステージコホートにおいて２０−または４−ｍｉＲＮＡサインの両方により、ＮＭに対して有意に悪い生存が予測されたＭ患者に観察された（ｐ＝０．０２２またはｐ＝０．０２７）（図３ＣおよびＤ）。
【００５０】
その上、発明者らはまた、初期ステージコホートにおいて再発を予測するためのサインの能力を試験し、２０または４ｍｉＲＮＡサインに基づいて予測されたＭ群がＮＭ群より高い再発率（ｐ＝０．００２またはｐ＝０．０２０）を有することを見いだした（図３ＥおよびＦ、図５−表２）。
【００５１】
一方、臨床ステージングシステムはこのコホートにおける全体的または無疾患生存を予測することが不可能であった（図５−表２）。従って、確認されたｍｉＲＮＡサインはＨＣＣ患者予後、とりわけ初期ステージ疾患にとっての優れた予測因子である。
ｍｉＲＮＡ予測因子と公知の臨床ステージングシステムの比較
次に、発明者らはＣｏｘ比例ハザード回帰分析を実施し、ｍｉＲＮＡ予測因子が初期ステージコホート内の潜在的臨床状態によって混乱したかどうかを確定した。単変量解析は、ｍｉＲＮＡサインが生存および再発の重要な予測因子であることを明らかにした（それぞれｐ＝０．０２７またはｐ＝０．００２）（図５−表２）。
【００５２】
潜在的に交絡する共変量を管理する多変量節減生存モデルは、ｍｉＲＮＡ予測因子がＮＭに対して、Ｍ発現プロファイルを持つ患者の死亡リスクの有意な３倍増加に関連することを証明した（図５−表２）。
【００５３】
多変量節減再発モデルは、潜在的交絡因子を管理する場合、ｍｉＲＮＡ予測因子がＮＭに比較して、Ｍの発現プロファイルを持つヒトの再発リスクの有意な２．８倍増加に関連することを証明した（図５−表２）。発明者らはまた、ＢＣＬＣステージング（ステージ０およびＡ）によって確定された初期ステージコホートおよび全試験コホートにＣｏｘ回帰分析を実施し、類似の結果を見いだした（図８表５および図９−表６）。
【００５４】
対照的に、臨床ＨＣＣステージングシステムは試験コホート内の患者の予後および再発を予測することが不可能であった（図５−表２および図８−表５）。従って、ｍｉＲＮＡサインは生存および再発両方にとって独立した予測因子である。
実施例Ｉの考察
大部分のＨＣＣ患者は後期ステージにおいて診断され、少ない割合だけが切除または移植基準に適合する。ＨＣＣ患者の予後は、とりわけ初期ステージ患者にとって、および結局転移または再発に至る孤発性または多結節性ＨＣＣ患者にとって、大部分はロバストな予測力を持つ、簡単で実証された普遍的な臨床ステージングシステムの欠如のために満足のいくものでは決してない。従って、ＨＣＣ患者の予後を改善するための重要な難題は初期の検出および分類である。
【００５５】
発明者らは２０ｍｉＲＮＡ、それどころか４ｍｉＲＮＡの発現が転移／再発を発症する孤発性または多結節性腫瘍を有するＨＣＣ患者の生存を明確に予測可能であり、そしてこの疾患の初期ステージにある比較的小さな腫瘍を有するＨＣＣ患者においても効果的にそのように予測しうることを示している。対照的に、臨床ステージングシステムはこれらの患者の予後を識別することが不可能であった。
【００５６】
サインにおいて極めて重要な４ｍｉＲＮＡは、報告されたいずれのヒト悪性腫瘍の進行にも関連せず、従って転移性ＨＣＣと独自に関連してもよい。発明者らは、このコホート内の孤発性ＨＣＣ患者より多結節性ＨＣＣ患者は生存および再発率が高かったため、これらの予後との関連は結節型と逆に関連していたことに注目する。
【００５７】
ｍｉＲＮＡの単離、増幅および発現解析は迅速に進歩し、臨床組織における実行可能なｍｉＲＮＡプロファイリングの可能性を増している。ｍｉＲＮＡを使用して、サブタイプ分類においてより高度な精度を提供することが可能であり、本明細書における実施例が古典的に予測不良なＨＣＣ患者コホートを識別する優れた能力を示すため、ｍｉＲＮＡサイン発現に従った患者のグループ分けが臨床的有用性を有していてもよい。ｍｉＲＮＡサインによる予後不良患者（Ｍ）の事前の確認が、予後良好群（ＮＭ）に分類された患者より、いっそう個別化された、直接的または積極的な治療計画を可能にしてもよい。
【００５８】
利用可能なドナーの供給量不足および適切な割り当てシステム欠如のために、ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡサインはまた、肝臓移植を受けるためのＨＣＣ患者の優先順位決定に使用されてもよい。
【００５９】
別の利点は、最適な臨床用途および潜在的にいっそう効率的な診断にとって、疾患の侵襲性の高い形態を発症しやすい患者を区別することができる遺伝子数が最少であることは適切であるということである。発明者らは、たった４つのｍｉＲＮＡが予後不良のＨＣＣ患者を明確に区別できることを証明している。従って、これらのｍｉＲＮＡはとりわけ初期ステージ患者にとってＨＣＣ診断を促進してもよい前途有望なツールであり、適切な臨床的勧告および治療を可能にする。
【００６０】
ｍｉＲＮＡおよび／またはＭｉｒサインは、転移／再発を発症する患者において異なって発現されるｍｉＲＮＡ標的候補を確認するためにも有用でありうる。
【００６１】
その上、これらのｍｉＲＮＡはＨＣＣにおけるｍｉＲＮＡ変化の生物学的成り行きに見通しを提供するために有用である。ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡサインは、ｍｉＲＮＡ分類によって定義された予後不良サインを持つ患者の潜在的予後を逆転させるための治療標的を開発する、および／または治療標的としての役割を果たすためにも有用である。
【００６２】
別の利点は、ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡサインが疾患の経過を逆転させるための方法および／または組成物の開発に有用なことである。そのような逆転の可能性は、たとえば、ｍｉＲＮＡまたはそれらの標的の発現を変化させるための遺伝子治療選択肢によって起きてもよい。他の限定的でない例としては、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドによる腫瘍形成性表現型の不活性化、ｍｉＲＮＡ／標的遺伝子相互作用を阻止する特有の阻害剤の生成またはウイルスもしくはリポソーム送達を使用した腫瘍抑制性表現型の過剰発現が挙げられる。
【００６３】
ｍｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡサインは初期の診断および関連する介入的治療に有用であり、それらを使用してかなり諦観的なＨＣＣの研究方法を変更することができる。本明細書に開示されたｍｉＲＮＡサインはそのように使用して初期ステージにおいてＨＣＣ患者を分類することができ、そのような患者の診断を可能にし、そして臨床結果を改善する。
実施例ＩＩ
ＨＢＶおよび関連する肝臓状態
試料登録基準には、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ感染またはＨＢＶ‐関連肝硬変の病歴、２人の独立した病理学者により診断されたＨＣＣ、臨床的な提示に関する詳細な情報および病理学的特徴；ならびに少なくとも３年間の詳細なフォローアップデータを持つ患者が含まれ、フォローアップデータには肝臓内再発、肝臓内静脈転移、リンパ節関与、肝臓外転移、無疾患および全体的な生存、ならびに死亡の原因が含まれた。
【００６４】
最新のＴＮＭ分類は切除を受けるＨＣＣ患者のためのＣＬＩＰおよびＯＫＵＤＡを含む他のステージングシステムより優れ、従ってｍｉＲＮＡ予測能力の分析のための初期ステージ患者（ＴＮＭステージＩおよびＩＩ）の階層化に選択された（１；２）。前向き研究は、ＢＣＬＣシステムが２００２年に改訂された新規なＴＮＭ分類システムより優れていることを明らかにしたため、発明者らはまたＢＣＬＣによって分類された初期ステージ患者（ステージ０およびＡ）に基づいたＣｏｘ比例ハザードモデリングを実施した。
ｍｉＲＮＡアレイ：
ｍｉＲＮＡマイクロアレイプラットフォーム（Ｖ２．０）は２５０の非重複ヒトおよび２００のマウスｍｉＲＮＡからなり、アレイはＯｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施された。ｍｉＲＮＡアレイプラットフォームのロバストネスを調査するために、発明者らは初めに、それらと対をなす周辺の非癌性肝臓組織に由来する２４４のＨＣＣ組織を区別できるかどうかを分析した（図４−表６）。
【００６５】
信頼限界９９％での対のある単変量ｔ−検定、および＜１までの偽陽性率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）セットを持つクラスラベルの１０００の並べ換えを伴う多変量検定による教師有りクラス比較法を使用して、発明者らはＨＣＣ腫瘍組織（Ｔ）とそれらの対となる非腫瘍組織（ＮＴ）を明確に区別することができる２０９の非重複ｍｉＲＮＡを確認した（データは示さない）。
【００６６】
これらの重要なｍｉＲＮＡは、階層的クラスタリング分析（データは示さない）によって例示されたＴおよびＮＴ試料を明確に分離する。１０％交差検定および１００の無作為並べ換えを伴う多変量クラス予測アルゴリズム分析は、これらのｍｉＲＮＡが最近傍予測因子によって＞９７％の精度でＴおよびＮＴ試料の統計的に有意な予測（ｐ＜０．０１）を提供できることを示した。これらの初期分析は、ｍｉＲＮＡアレイがロバストであり、腫瘍および非癌性肝臓組織間の有意な差を確認できることを示した。同じ方法を使用して転移（Ｍ）および非転移（ＮＭ）症例を比較した。
統計解析：
Ｃｏｘ比例ハザード回帰を使用して、年齢、性、ＨＢＶ活動状態、切除前アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝硬変、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア、腫瘍サイズ、腫瘍カプセル化、結節型、微小血管浸潤状態、Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ等級、およびＢＣＬＣステージング（３）、ＣＬＩＰ分類（４）、Ｏｋｕｄａステージング（５）、またはＴＮＭ分類（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣ、６版）を含むいくつかのＨＣＣ予後ステージングシステムを含む、患者の全体的および無再発生存に対する臨床変数の効果を分析した（６）。単変量検定を使用して、全試験セット（ｎ＝１１０；図８−表５および図９−表６）または初期ステージＨＣＣ（ｎ＝８９；図５−表２）の患者生存または再発に対するｍｉＲＮＡ予測因子またはそれぞれの臨床変数の影響を調査した。
【００６７】
有意差セットｐ＜０．０５を持つ前進付加（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）および後進選択ルーチン（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｒｏｕｔｉｎｅ）の両方を使用した、スッテプワイズ選択プロセスから確認された臨床変数を管理しながら、多変量解析を実施してｍｉＲＮＡ予測因子のハザード比を見積った。さらに、ｍｉＲＮＡ予測因子に対するハザード比だけを臨床変数のそれぞれを伴うｍｉＲＮＡ予測因子に対するハザード比と比較した。単一共変数の付加により予測因子ハザード比の１０％変化が観察された場合、この変数は最終Ｃｏｘ比例ハザードモデルに対して管理された。
【００６８】
全試験セットの場合、最節約生存モデルには、２０ｍｉＲＮＡ予測因子、腫瘍サイズ、多結節状態およびＴＮＭステージングが含まれ、一方最節約再発モデルには２０のｍｉＲＮＡ予測因子、多結節状態、ＴＮＭステージング、ＢＣＬＣステージングおよびＯｋｕｄａステージングが含まれた。初期ステージＨＣＣセットの場合は、最節約生存モデルには、２０のｍｉＲＮＡ予測因子、ＡＦＰ、肝硬変、腫瘍サイズ、多結節状態、微小血管侵潤およびＴＮＭステージングが含まれ、一方最節約再発モデルには２０のｍｉＲＮＡ予測因子、腫瘍サイズ、多結節状態およびＴＮＭステージングが含まれた。
【００６９】
共変量の多重共線性は査定され、存在することが見いだされず、すべての最終モデルは比例ハザード仮説に適合することが確定された。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義された。発明者らは、単変量解析においてＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈクラスは、このコホートにおける他の査定された臨床変数に比較してこの共変量内の試料サイズが小さいため、正確に分析できなかったことに注目する。
【００７０】
ＴａｒｇｅｔＳｃａｎバイオインフォマティックス法から生み出された潜在的なｍｉＲＮＡ標的リスト出力における信頼感を提供するために、発明者らは最近確認された静脈転移の１５３−遺伝子ＨＣＣ腫瘍サインの一部であり（７）、低いＦＤＲスコアを有する（＜０．３）潜在的なｍｉＲＮＡ標的に焦点を当てることにより検索を制限した。
【００７１】
発明者らはさらに、転移性ＨＣＣにおける発現が対応するｍｉＲＮＡの発現と逆に相関する、潜在的な細胞標的だけに出力を限定した。先に記載の検索基準に基づいたこれらの宿主標的の概要は図６−表３に含まれる。
【００７２】
図１０は、試験コホートにおけるステージングシステムの分類能力の分析を示す。１１０人のＨＣＣ患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、（Ａ）ＴＮＭステージング（Ｂ）ＯＫＵＤＡステージング（Ｃ）ＣＬＩＰステージングまたは（Ｄ）ＢＣＬＣステージングにより予測された分類に基づいた。
実施例ＩＩＩ
特定の一側面では、対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が本明細書に提供される。該方法は一般に、対象に由来する試験試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、および試験試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した変化が、対象がＨＣＣに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表すかどうかを確定することを含む。ある態様では、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット解析を使用して測定される。また、ある態様では、試験試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対象試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより少なく、および／または試験試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対象試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより多い。
【００７３】
ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
実施例ＩＶ
ｍｉＲ遺伝子産物の測定
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写し、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによって測定することができる。少なくとも１つのｍｉＲのシグナルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
実施例Ｖ
診断的および治療的適用
別の側面では、対象においてＨＣＣを治療する方法が本明細書に提供され、ここでは少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが対象試料から生み出されたシグナルに比較して脱制御（たとえばダウンレギュレーション、および／またはアップレギュレーション）される。
【００７４】
ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］ならびにその組み合わせの１つ以上を含む。
【００７５】
本明細書ではまた、対象から得られた試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供すること；ｍｉＲＮＡ‐特有プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズし、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；および試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生み出されたハイブリダイゼーションプロファイルに比較することによって、対象における１つ以上の有害な予後マーカーに関連したＨＣＣに対象が罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が提供される。シグナルにおける変化は対象が癌に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがあるかのいずれかであることを表す。
【００７６】
本明細書ではまた、ＨＣＣに罹患している対象のＨＣＣを治療する方法が提供され、ここでは、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が対照細胞に比較して対象の癌細胞において、ダウンレギュレーションされているか、またはアップレギュレーションされている。１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてダウンレギュレーションされている場合、方法は有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することを含む。１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップレギュレーションされている場合、方法は少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与して、対象における癌細胞の増殖を阻害することを含む。ある態様では、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａならびにその組み合わせから選択される。
【００７７】
本明細書ではまた、対象においてＨＣＣを治療する方法が提供され、該方法は対照細胞に比較して、ＨＣＣ細胞における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の量を確定すること；および癌細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より少ない場合、有効量の少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与すること；または癌細胞に発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現されたｍｉＲ遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための有効量の少なくとも１つの化合物を対象に投与することによって、ＨＣＣ細胞に発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることを含む。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］ならびにその組み合わせの１つ以上を含む。
実施例ＶＩ
組成物
本明細書ではまた、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物および薬剤的に受容できるキャリアを含む、ＨＣＣを治療するための医薬組成物が提供される。特定の態様では、医薬組成物は適切な対照細胞に比較してＨＣＣ細胞においてダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に対応する少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を含む。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
【００７８】
別の特定の態様では、医薬組成物は少なくとも１つのｍｉＲ発現レギュレーター（たとえば、阻害剤）および薬剤的に受容できるキャリアを含む。
【００７９】
本明細書ではまた、適切な対照細胞に比較してＨＣＣ細胞においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされているｍｉＲ遺伝子産物に特有の少なくとも１つのｍｉＲ発現レギュレーター化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００８０】
本明細書ではまた、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＨＣＣ細胞において減少した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗ＨＣＣ剤を確認する方法が提供され、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験薬剤が抗ＨＣＣ剤であることを表す。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］ならびにその組み合わせの１つ以上を含む。
【００８１】
本明細書ではまた、細胞に試験薬剤を提供すること、およびＨＣＣ細胞において増加した発現レベルに関連した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む、抗ＨＣＣ剤を確認する方法が提供され、ここで適切な対照細胞に比較した該細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験薬剤が抗ＨＣＣ剤であることを表す。特定の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａならびにその組み合わせからなる群から選択される。
実施例ＶＩＩ
キット
本明細書に記載の組成物のいずれかがキットに含まれていてもよい。限定的でない例では、キットにはｍｉＲＮＡを単離する、ｍｉＲＮＡを標識する、および／またはアレイを使用してｍｉＲＮＡ集団を評価するための試薬が含まれる。キットはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製するか、または合成するための試薬を含んでいてもよい。キットは従って、適切な容器手段中に、標識されたヌクレオチドまたは後で標識される非標識ヌクレオチドを組み込むことによってｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含むことになる。また、それは１以上のバッファー、たとえば反応バッファー、標識バッファー、洗浄バッファー、またはハイブリダイゼーションバッファー、ｍｉＲＮＡプローブを作製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための要素を含んでいてもよい。他のキットは、ｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作るための要素を含んでいてもよく、従ってたとえば固体支持物を含んでいてもよい
アレイを含むいずれかのキット態様の場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２のいずれかのすべて、または一部に同一であるかまたは相補的である配列を含む核酸分子が存在しうる。
【００８２】
キットの要素は水性媒体中、または凍結乾燥した形状のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段には一般に少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が含まれることになり、その中に要素が入れられ、そして好ましくは適切に等分されていてもよい。キット（標識試薬および標識が一緒に包装されていてもよい）中に１種より多い要素が存在する場合、キットはまた一般に付加的な要素が別個にその中に入れられてもよい第２、第３または他の付加的な容器を含むことになる。しかし、要素の種々の組み合わせがバイアル中に含まれていてもよい。本発明のキットはまた、典型的には核酸を含むための手段、および市販用のぴったりと閉まったいずれか他の試薬容器を含むことになる。そのような容器は、所望するバイアルが保持される射出または吹き込み成型されたプラスチック容器を含んでいてもよい。
【００８３】
キットの要素が１種および／またはそれ以上の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水性溶液であり、滅菌水性溶液は１種の好ましい溶液である。キットに含まれてもよい他の溶液は混合試料からｍｉＲＮＡを単離する、および／または濃縮することに関与する溶液である。
【００８４】
しかし、キットの要素は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加により溶解されうる。溶媒はまた、別の容器手段中に提供されてもよいことが予見される。キットはまた、標識されたｍｉＲＮＡの単離を促進する要素を含んでいてもよい。それはまた、ｍｉＲＮＡを保存するか、もしくは維持する、またはその分解から保護する要素を含んでいてもよい。要素はＲＮアーゼフリーであってもよく、またはＲＮアーゼから保護してもよい。
【００８５】
その上、キットは一般に適切な手段中に、それぞれ個々の試薬または溶液のための別個の容器を含むことができる。キットはまた、キット要素を利用すること、およびキットに含まれないいずれか他の試薬の使用のための説明書を含むことができる。説明書は実行可能な変型を含んでいてもよい。そのような試薬は本発明のキットの態様であることが企図される。さらに、キットは先に確認した特定の事項に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特徴付けに使用されるどんな試薬を含んでいてもよい。
【００８６】
また、ｍｉＲＮＡアレイに関して論じられたいずれかの態様が、本発明のスクリーニングもしくはプロファイリング法またはキットにおいてより一般的に利用されてもよいことが企図される。言い換えると、何が特定のアレイに含まれてよいかを記載するいずれかの態様は、ｍｉＲＮＡプロファイリングに関してより一般的に実行することができ、アレイ自体を含む必要がない。
【００８７】
また、いずれかのキット、アレイもしくは他の検出技術もしくは手段、またはいずれかの方法はこれらのｍｉＲＮＡのいずれかのプロファイリングを含みうることが企図される。さらに、ｍｉＲＮＡアレイの状況において論じられたいずれかの態様は本発明の方法においてアレイフォーマットと共に、またはアレイフォーマット無しに実行されうることが企図され；言い換えると、ｍｉＲＮＡ中のいずれかのｍｉＲＮＡが当業者に公知のいずれかの技術に従った本発明のいずれかの方法においてスクリーニングされるか、評価されてもよい。アレイフォーマットは実行されることになるスクリーニングおよび診断方法にとって必要ではない。
【００８８】
本明細書では、治療的、予後予測的、または診断的適用のためにｍｉＲＮＡアレイを使用するためのキットおよびそのような使用が発明者らによって企図される。キットはｍｉＲＮＡアレイ、およびアレイ上のｍｉＲＮＡに関する標準または標準化されたｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報を含むことができる。さらに、ある態様では対照ＲＮＡまたはＤＮＡがキットに含まれうる。対照ＲＮＡは標識および／またはアレイ分析のための陽性対照として使用されうるｍｉＲＮＡでありうる。
【００８９】
現行の教示に由来する方法およびキットは広範に、そして包括的に本明細書に記載されている。包括的な開示に含まれるより狭い種および亜属の分類のそれぞれも現行の教示の一部を形成する。これは、削除された資料が明確に本明細書において説明されるかどうかにかかわらず、類概念からいずれかの主題を除去する但し書きまたは否定的な限定を伴った現行の教示の包括的な記載を含む。
実施例ＶＩＩＩ
アレイ作製およびスクリーニング
本明細書ではまた、ｍｉＲＮＡアレイの作製および使用が提供され、そのようなアレイは複数のｍｉＲＮＡ分子または前駆体ｍｉＲＮＡ分子に完全にもしくはほとんど相補的であるか、もしくは同一であり、そして空間的に区分された構造の支持材料上に配置される、順序よく並べられた核酸分子（プローブ）のマクロアレイまたはマイクロアレイである。マクロアレイは典型的にはニトロセルロースまたはナイロンのシートであり、その上にプローブが配置されている。マイクロアレイは核酸プローブをいっそう密に配置し、その結果１０，０００に至る核酸分子を典型的には１〜４平方センチメートルの領域にはめ込むことができる。マイクロアレイは、たとえば遺伝子、オリゴヌクレオチドなどのような核酸分子を基質上に配置するか、または基質上にｉｎ  ｓｉｔｕでオリゴヌクレオチド配列を製作することによって製作される。配置されるか、または製作された核酸分子は、平方センチメートルにつき約３０までの、またはいっそう多い、たとえば平方センチメートルにつき約１００、もしくはさらに１０００までの非同一核酸分子の高密度マトリックスパターンで用いることができる。フィルターアレイのニトロセルロースを基礎とした材料とは対照的に、マイクロアレイは典型的には固体支持物としてコーティングされたガラスを使用する。ｍｉＲＮＡ−相補性核酸試料の順序よく並べられたアレイを有することにより、それぞれの試料の位置は追跡され、元の試料に関連付けることができる。複数の別個の核酸プローブが固体支持物の表面に安定して結合する多様な異なるアレイデバイスは当業者に公知である。アレイに有用な基質には、ナイロン、ガラス、およびシリコンが挙げられる。アレイは、平均プローブ長、プローブの配列または型、プローブとアレイ表面間の結合の性質、たとえば共有または非共有などを含む、いくつもの異なる点で変化していてもよい。本明細書に記載の標識およびスクリーニング法、ならびにアレイは、プローブがｍｉＲＮＡを検出すること以外のいずれのパラメータに関してもその有用性を限定されず；結果として方法および組成物は多様な異なる型のｍｉＲＮＡアレイと共に使用されてもよい。ある態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は図１１に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２２の１つ以上を含む。特定のある態様では、１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ‐２１９［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］、ｍｉＲ‐２０７［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、ｍｉＲ‐３０ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびｍｉＲ‐１２４Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］の１つ以上を含む。
【００９０】
特許法の条項に従って、本発明の原理および実施の様式はその好ましい態様において説明され、実証されている。しかし、本発明はその意図および範囲から逸脱することなしに特に説明され、実証されたものと違って実行されてもよいことは理解されなければならない。
参考文献
先に論じられた参考文献および以下の参考文献は、それらが本明細書において説明されたものに補足する代表的な手順上の、または他の詳細を提供する程度に、参照として本明細書に特に援用される。
実施例Ｉの参考文献
【００９１】
【表１】
0005501766.tif 000002
【００９２】
【表２】
0005501766.tif 000003
【００９３】
【表３】
0005501766.tif 000004
【００９４】
【表４】
0005501766.tif 000005
【００９５】
実施例IＩＩの参考文献
【００９６】
【表５】
0005501766.tif 000006
【００９７】
【表６】
0005501766.tif 000007
【図１】
0005501766.tif 000008
【図２Ａ】
0005501766.tif 000009
【図２Ｂ】
0005501766.tif 000010
【図３−１】
0005501766.tif 000011
【図３−２】
0005501766.tif 000012
【図４】
0005501766.tif 000013
【図５】
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【図６】
0005501766.tif 000015
【図７】
0005501766.tif 000016
【図８】
0005501766.tif 000017
【図９】
0005501766.tif 000018
【図１０】
0005501766.tif 000019
【図１１】
0005501766.tif 000020
【配列表】
0005501766000001.app