(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＩＶ３６の、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＬＫ６タンパク質。
【請求項２】
ヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＩＶ３７の、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＬＫ７タンパク質。
【請求項３】
ヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＶ３８の、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＬＫ８タンパク質。
【請求項４】
ヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８から順次構成される、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＬＫ６８タンパク質。
【請求項５】
請求項１のＬＫ６タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２のＬＫ７タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３のＬＫ８タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項８】
請求項４のＬＫ６８タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項７のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９の組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物。
【請求項１４】
請求項１０の組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物。
【請求項１５】
請求項１１の組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物。
【請求項１６】
請求項１２の組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物。
【請求項１７】
作用成分としてＬＫ６、ＬＫ７、ＬＫ８及びＬＫ６８からなる群から選択されるタンパク質および薬学的に受容される担体からなる抗癌剤。
【請求項１８】
作用成分としてＬＫ６、ＬＫ７、ＬＫ８及びＬＫ６８からなる群から選択されるタンパク質を含む血管形成関連疾患の治療剤。
【請求項１９】
血管形成関連疾患が、癌、慢性関節リウマチ、乾癬、眼球血管原性疾患である請求項１８記載の血管形成関連疾患の治療剤。
【請求項２０】
配列番号３で表される請求項５記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号５で表される請求項６記載のｃＤＮＡ。
【請求項２２】
配列番号７で表される請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項２３】
配列番号１で表される請求項８記載のｃＤＮＡ。
【請求項２４】
ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ６である請求項９記載の組換え発現ベクター。
【請求項２５】
ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ７である請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項２６】
ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ８である請求項１１記載の組換え発現ベクター。
【請求項２７】
ｐＥＴ１１ａ／ＬＫ６８である請求項１２記載の組換え発現ベクター。
【請求項２８】
寄託番号ＫＣＴＣ０６５５ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＬＫ６であることを特徴とする、請求項１３記載の組換え微生物。
【請求項２９】
寄託番号ＫＣＴＣ０６５６ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＬＫ７であることを特徴とする、請求項１４記載の組換え微生物。
【請求項３０】
寄託番号ＫＣＴＣ０６３４ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１／ＬＫ８であることを特徴とする、請求項１５記載の組換え微生物。
【請求項３１】
寄託番号ＫＣＴＣ０６３３ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１／ＬＫ６−８であることを特徴とする、請求項１６記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、そのアミノ酸配列がヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８と同一である新規の血管形成阻害剤ＬＫ６８に関するもので、さらに詳しくは、ＬＫ６８のアミノ酸配列、ＬＫ６８をコード化するｃＤＮＡ配列、該ｃＤＮＡからなる組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物、抗癌剤としてのＬＫ６８の新規の用途、および血管形成関連疾患の治療法に関する。
【０００２】
従来の技術
血管形成とは、組織または臓器の中に新しい血管を発生させる生物学的過程のことである。正常な生理学的条件下では、ヒトや動物は非常に特殊な限定状況でのみ血管形成を行う。たとえば、血管形成は、通常は、創傷治癒、胎児および胚の成長、黄体、子宮内膜、胎盤の形成の際に観察される。新血管の成長は多くの血管由来の制御物質によって厳しく制御され（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１：２７−３１，１９９５ａ参照）、血管形成表現型の切り替えは血管由来刺激物質のアップレギュレーションと血管由来抑制物質のダウンレギュレーションとのあいだの正味の平衡によって左右されることが報告されている。
血管形成過程の不平衡は、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬のような病的障害に寄与していることが証明されている（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１：２７−３１、１９９５ａ参照）。とくに、原発性腫瘍も転移性腫瘍もその増殖に血管形成による血管の補充を必要とする（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５：１１８２−１１８６，１９７１；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４，１９９２参照）。この血管形成活性を抑えたり排除できれば、腫瘍は存在しても増殖はしないであろう。腫瘍の血管形成を阻害することがこの疾患の長期抑制の実際的な方法であることを示唆する多くの報告がある。血管形成を抑制するために血管形成の正の制御物質を遮断するか、負の制御物質を利用すると、実験的腫瘍の遅滞または退行がみられる。血管形成活性を抑えたり排除できれば、腫瘍は存在しても増殖はしないであろう。さらに、この病態では血管形成の防御は新しい微小血管系の侵襲によって生ずる損傷を効果的に避けることができるであろう。したがって、血管形成過程の制御を狙った療法は、これらの疾患を消滅させ軽減させうるであろう。
【０００３】
したがって、血管の望ましくない増殖、とくに腫瘍内への増殖を阻害することができる新規の血管形成阻害剤が必要とされている。血管形成阻害剤からなる抗癌剤は、転移前腫瘍内の内因性成長因子の活性に打ち勝ち、腫瘍内の毛細管形成を防ぐことによって、腫瘍の成長を阻害することができるはずである。そのような抗癌剤は、たとえば創傷治癒や再生のような他の血管形成過程における毛細管の形成を調節することもできるはずである。最後に、そのような抗癌剤および血管形成阻害方法は無毒でありほとんど副作用をもたらさないものであるのが望ましい。
現在まで、少なくとも１０の内因性血管形成阻害剤が同定されている（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，８８：２７７−２８５、１９９７参照）。そのような分子の一つはアンジオスタチンであり、これはプラスミノーゲンクリングルＩ〜ＩＶからなる（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，７９：３１５−３２８、１９９４参照）。全身投与すると、アンジオスタチンは原発性腫瘍の成長と転移の両者を、毒性を示さずに強力に阻害し、ｂＦＧＦによって誘発される血管形成も同様に阻害する（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：６８９−６９２、１９９６参照）。このような抗腫瘍効果に伴って腫瘍塊内の微小血管密度が顕著に低下したが、これは、血管形成の抑制が腫瘍増殖の阻害と関係していることを示している。
【０００４】
クリングルとは、約８０のアミノ酸と３つの分子内ジスルフィド結合とから構成されるタンパク質構造ドメインのことである。クリングル構造は、プロトロンビン（Ｗａｌｚ，Ｄ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：１９６９−１９７３，１９７７参照）、プラスミノーゲン（Ｐｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．＆  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，３：６０５−６１４，１９９２参照）、ウロキナーゼ（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０１：５７９−５８２，１９８３参照）、肝細胞成長因子（Ｌｕｋｋｅｒ，Ｎ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：８９５−９０３，１９９４）、アポリポタンパク質（“ａｐｏ”）（ａ）（ＭｃＬｅａｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：１３２−１３７、１９８７参照）などの多くのタンパク質中に見出される。これらのドメインは独立した折りたたみ単位のようであるが、それらの機能的役割は未知である。これまでの報告は、クリングル構造は、血管形成時の内皮細胞の移動および増殖の阻害剤として作用することができるということを示している。明確にいえば、プロトロンビンのクリングル２およびプラスミノーゲンのクリングル１−４、および５は抗血管形成作用があることが証明されている（Ｊｉ，Ｗ．Ｒ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１５：１７３１−１７３８，１９９８ａ；Ｊｉ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４７：４１４−４１９，１９９８ｂ；Ｃａｏ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９４６１−２９４６７，１９９６；Ｃａｏ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２２９２４−２２９２８，１９９７；Ｂａｒｅｎｄｓｚ−Ｊａｎｓｏｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，３５：１０９−１１４，１９９８；Ｌｅｅ，Ｔ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２８８０５−２８８１２，１９９８参照）。
【０００５】
クリングル構造を持つタンパク質の一つであるアポリポタンパク質（ａ）は、新規の血管形成阻害剤の候補物質である。Ａｐｏ（ａ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の主要タンパク質成分であるａｐｏＢ−１００に共有結合で結合しリポタンパク質（ａ）を形成している（Ｆｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：８７１２−８７１８，１９８６参照）。Ｌｐ（ａ）の血漿中濃度増加はアテローム性硬化症の主要な独立リスク要因である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｖ．Ｗ．ら、Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，６２：２４９−２５７，１９８６；Ａｓｓｍａｎｎ，Ｇ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７７：１１７９−１１８４，１９９６；Ｂｏｓｔｏｍ，Ａ．Ｇ．ら、ＪＡＭＡ，２７６：５４４−５４８，１９９６参照）。いくつかの病原的活性が報告されているが、ａｐｏ（ａ）の生理学的役割はまだ確立されていない（Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３１３６７−３１３７１、１９９６；Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．およびＦｌｅｓｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８５：１７０９−１７１５，１９９０；Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：０９０４−９１０，１９８９参照）。
Ａｐｏ（ａ）は２種類のクリングルドメインと不活性なプロテアーゼ様ドメインを含んでいる。最初の３７クリングルドメインはプラスミノーゲンクリングルＩＶと約７５％同一であり、最後のクリングルドメインはプラスミノーゲンクリングルＶと９０％同一である。興味深いことに、クリングルＩＶ−様ドメインはａｐｏ（ａ）遺伝子の様々なヒト対立遺伝子中１５〜４０コピー存在する。この点で、Ａｐｏ（ａ）クリングル構造を用いて腫瘍血管形成および増殖の阻害剤を開発することができる。
【０００６】
発明の要約
本発明によれば、本発明者たちは組換えタンパク質ＬＫ６８としてＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８を含むヒトａｐｏ（ａ）クリングルをクローニングして発現させ、次のことを発見した。すなわち、ＬＫ６８タンパク質およびその単一クリングルであるＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８は、ｂＦＧＦのような内因性成長因子の血管形成活性にｉｎ  ｖｉｔｒｏで打ち勝つことができること、これらのクリングルを抗癌剤の作用成分として使用できることを発見した。
【０００７】
したがって、本発明の第一の目的は、ヒトａｐｏ（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８からなる新規のＬＫ６８タンパク質ならびにＬＫ６８タンパク質をコード化するｃＤＮＡを提供することである。
本発明の第二の目的は、ヒトａｐｏ（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８をコード化するｃＤＮＡを含む新規の組換えベクターを提供することである。
本発明の第三の目的は、ＬＫ６８タンパク質またはその単一クリングルＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８を活性成分として含んだ抗癌剤を提供することである。
本発明の第四の目的は、血管形成関連疾患をＬＫ６８タンパク質を使用することによって治療するための方法を提供することである。
本発明の上記およびその他の目的および特徴は、添付した図面と関連して掲載したつぎの記載事項から明らかになるであろう。その図面とはつぎのとおりである。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は新規のタンパク質ＬＫ６８を提供する。このタンパク質はヒトアポリポタンパク質（“ａｐｏ”）（ａ）クリングルから組換えタンパク質としてクローニングして発現させることができる。ＬＫ６８タンパク質はヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメインＩＶ３６（アミノ酸８〜８０）、ＩＶ３７（アミノ酸１２２〜１９４）、Ｖ３８（アミノ酸２２６〜３００）のアミノ酸配列で順次構成されている（配列番号２参照）。ＬＫ６８の最初の２つのクリングルドメイン（すなわちＩＶ３６およびＩＶ３７）はヒトプラスミノーゲンクリングルＩＶと相同であり、第三のクリングルドメインＶ３８はヒトプラスミノーゲンクリングルＶと相同である。本発明はまたＬＫ６８タンパク質をコード化するｃＤＮＡ（配列番号１参照）と、該ｃＤＮＡからなる組換えベクターならびにｐＥＴベクターシリーズのような発現ベクターを提供する。
本発明のクリングルドメインを記述するとき、ヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングルＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８は、それぞれＫＩＶ３６、ＫＩＶ３７、ＫＶ３８と略記する。ＬＫ６８はこの３つのクリングルドメインより成る組換えタンパク質を意味するために使う。ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８はそれぞれＫＩＶ３６、ＫＩＶ３７、ＫＶ３８の組換えタンパク質を意味するために使う。
【０００９】
アポリポタンパク質（ａ）はプラスミノーゲン型ＩＶおよびＶクリングルドメインを含んでいるため、アポリポタンパク質（ａ）は抗血管形成活性を有するのではないかと考えた。アポリポタンパク質（ａ）が腫瘍血管形成および成長の阻害剤としての生物学的活性を含んでいることを示唆する実験的証拠がある（Ｔｒｉｅｕ，Ｖ．Ｎ．およびＵｃｋｕｎ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５７：７１４，１９９９参照）。ＬＬ／２（Ｌｅｗｉｓ肺癌）腫瘍増殖はａｐｏ（ａ）形質転換マウスでは遅滞し、ａｐｏ（ａ）形質転換マウスからのＬＬ／２腫瘍の微小血管密度は、対照である野生型マウスからのものより低いことが報告されている。
このような状況のもと、本発明者たちは、ＬＫ６８タンパク質、その単一クリングルまたはそれらの機能的同等物が抗血管形成活性を有すると仮定した。この抗血管形成活性を実証するために、組換えＬＫ６８およびその単一クリングル（すなわち、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもやはり強力な抗血管形成因子であるかどうかを調べた。その結果、ＬＫ６８、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８は、培養内皮細胞増殖に対しても、内皮細胞移動に対しても、阻害活性を示す。ＬＫ６８およびその単一クリングルはニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）における毛細管の正常な発達も阻害する。ＬＫ６８の全身投与は、原発性腫瘍増殖を阻害することも証明され、これは腫瘍誘発血管形成の抑制と相関関係を示す。単一クリングルタンパク質ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８のそれぞれが抗血管形成活性を示したため、これらが原発性腫瘍増殖や転移をも阻害すると予想される。
【００１０】
したがって、ＬＫ６８タンパク質、その単一クリングルまたはそれらの機能的同等物は、慢性関節リウマチ、乾癬、眼球血管原性疾患を含めた血管形成関連疾患に対して非常に有効で、強力な抗癌剤の開発に応用できる。
またＬＫ６８タンパク質、その単一クリングルまたはそれらの機能的同等物は、疾患の治療に他の組成物および技法と組み合わせて使用することができるであろう。たとえば、腫瘍は、従来は手術、放射線照射、化学療法をＬＫ６８、その単一クリングルまたはそれらの機能的同等物と組合せて治療し、その後ＬＫ６８、その単一クリングルまたはそれらの機能的同等物を患者に投与して微小転移の休止状態を拡大し、残存原発性腫瘍があればその成長を安定化させ阻害する。
本発明をさらに以下の実施例で説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。
【００１１】
実施例１  組換えＬＫ６８のクローニングおよび発現
ヒトａｐｏ（ａ）クリングルの抗血管形成活性を実証するために、本発明者たちはＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８を含む最後の３つのクリングルを組換えタンパク質ＬＫ６８としてクローニングし発現させた。ヌクレオチド１２，０５２から１２，９７５にわたるａｐｏ（ａ）のＤＮＡフラグメント（ＭｃＬｅａｎ  Ｊ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：１３２，１９８７参照）をヒト肝臓ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、得られた９２４−ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを大腸菌発現ベクターｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に結合させた。オリゴヌクレオチドプライマーＡ（配列番号９）およびＦ（配列番号１４）（表１参照）を標準ＰＣＲプロトコールのもとでのＰＣＲ増幅に使用した。このクローンは「ｐＥＴ１１ａ／ＬＫ６８」と命名し、これはヒトａｐｏ（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８を含む３０８のアミノ酸をコード化する（（配列番号２参照）。このクローンの最初の２つのクリングルドメインであるＩＶ３６およびＩＶ３７は、ヒトプラスミノーゲンクリングルＩＶと相同であり、第三のクリングルドメインＶ３８はヒトプラスミノーゲンクリングルＶと相同である。
【００１２】
このクローンのヌクレオチド配列は両方向とも確認された。このクローンのヌクレオチド配列をヒトａｐｏ（ａ）の同一領域（ＭｃＬｅａｎＪ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：１３２，１９８７参照）と比較すると、ヌクレオチド配列はヌクレオチド５５４における１塩基の変化以外は同一である。我々のクローンはこの位置にシトシンを含むのに対して、ＭｃＬｅａｎらの報告した配列ではチミジンであり（ＭｃＬｅａｎＪ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：１３２，１９８７参照）、その結果アミノ酸がＭｅｔからＴｈｒに変化した。この置換は他の研究グループによっても報告されており（Ｖａｎ  ｄｅｒ−Ｈｏｅｋ，Ｙ．Ｙ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２：３６１−３６６、１９９３；ＬｏＧｒａｓｓｏ，Ｐ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２１８２０−２１８２７、１９９４参照）、ａｐｏ（ａ）にとって優勢な対立遺伝子のようである。
【００１３】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現プラスミドｐＥＴｌｌａ／ＬＫ６８で形質転換させ、組換えＬＫ６８タンパク質を次の条件下で発現させた。アンピシリン含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス１リットルにｐＥＴ１１ａ／ＬＫ６８プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一夜培養液１０ｍｌを接種し、３７℃で振盪培養した。培養液のＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭで添加した。細胞は誘導後さらに４時間増殖させた。細胞を８０００×ｇ、４℃で３０分間の遠心によって回収した。この細胞ペレットを超音波処理し、過剰表現タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１参照）。図１では、Ｍｒは分子量マーカーである（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）。レーン１、ＩＰＴＧ誘導なしの組換えＬＫ６８タンパク質の発現、レーン２、ＩＰＴＧ誘導を行った組換えＬＫ６８タンパク質の発現である。分子量が３７ｋＤａの組換えＬＫ６８タンパク質は大腸菌中良好に発現され、走査したゲルの画像解析によって証明されるように、総タンパク質の約２０〜３０％まで蓄積した。このように調製した形質転換体を「大腸菌  ＢＬ２１／ＬＫ６−８」と表し、国際的な保存機関である韓国基準株保存機関（＃５２  Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ、Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ、Ｔａｅｊｏｎ  ３０５−３３３、大韓民国）に照合Ｎｏ．ＫＣＴＣ０６３３ＢＰとして１９９９年６月９日預託した。
【００１４】
単一クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８のそれぞれを上記のようにして発現ベクターｐＥＴ１５ｂに別々にクローニングした。クローニングに使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表１に列挙した。すなわち、ＫＩＶ３６クローニングにはＡ（配列番号９）およびＤ（配列番号１２）を、ＫＩＶ３７クローニングにはＢ（配列番号１０）およびＥ（配列番号１３）を、ＫＶ３８クローニングにはＣ（配列番号１１）およびＦ（配列番号１４）を使用した。この３対のオリゴヌクレオチドプライマーを標準ＰＣＲプロトコールのもとでＰＣＲ増幅に使用し、その結果得られたクローンを「ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ６」、「ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ７」、「ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ８」と命名し、それぞれＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８の単一ヒトａｐｏ（ａ）クリングルドメインを含んでいる。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）適格細胞を、発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ６、ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ７、ｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ８のそれぞれで形質転換させた。このようにして作成したプラスミドｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ６による形質転換体は「大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＬＫ６」と表し、国際的な保存機関である韓国基準株保存機関（＃５２  Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ、Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ、Ｔａｅｊｏｎ  ３０５−３３３、大韓民国）に照合Ｎｏ．ＫＣＴＣ０６５５ＢＰとして１９９９年９月３日預託した。このようにして作成したプラスミドｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ７による形質転換体は「大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＬＫ７」と表し、国際的な保存機関である韓国基準株保存機関（上記と同じ住所）に照合Ｎｏ．ＫＣＴＣ０６５６ＢＰとして１９９９年９月３日預託した。このようにして作成したプラスミドｐＥＴ１５ｂ／ＬＫ８による形質転換体は「大腸菌ＢＬ２１／ＬＫ８」と表し、国際的な保存機関である韓国基準株保存機関（上記と同じ住所）に照合Ｎｏ．ＫＣＴＣ０６３４ＢＰとして１９９９年６月９日預託した。
組換えＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８タンパク質は、Ｎ末端Ｈｉｓ標識を含む融合タンパク質と同じ条件下で発現させた。過剰発現組換えＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８タンパク質のそれぞれはｐＥＴ  Ｈｉｓ標識系を用いて製造者の推薦条件下で精製した。
表１  ＰＣＲクローニングに使用したオリゴヌクレオチドプライマー
【００１５】
【表１】
0003725473.tif 000002
【００１６】
＊制限部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩをクローニングの利便のために添加する（下線部）。
＊＊ヌクレオチド配列についてはＭｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：１３２、１９８７参照（照合番号はＸ０６２９０）
【００１７】
実施例２  組換えＬＫ６８の精製
組換えＬＫ６８を作成するために、５Ｌ容のＢｉｏｆｌｏｗ  IIIバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）の中で次の培地中高細胞密度発酵を実施した。すなわち、４％（ｗ／ｖ）酵母エキス、４％（ｗ／ｖ）グリセリン、１％（ｗ／ｖ）二塩基性リン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）一塩基性リン酸カリウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリンからなる培地中で実施した。細胞が６００ｎｍにおいて１００の吸光度に達したとき、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したのち、Ｄｏ−ｓｔａｔ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈを栄養補給培地（２９％（ｗ／ｖ）酵母エキス、３９％（ｗ／ｖ）グリセリン、０．５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム）を用いて９時間行った。細胞は８０００×ｇで３０分間の遠心により回収した。各発酵過程の収率は細胞約８０ｇ／Ｌ（湿重量）であった。
【００１８】
ＬＫ６８が大腸菌細胞の可溶性画分と不溶性画分のどちらに発現されているかを判定するために、本発明者たちはこれらの画分中のＬＫ６８発現を分析した。この分析により、ＬＫ６８は不溶性細胞画分に局在していることが判明した。したがってＬＫ６８のジスルフィド結合を変性し、再生し、再酸化することが必要であった。デオキシコレート及びその他の界面活性剤を使用することによって、不溶性ＬＫ６８タンパク質を封入体として純度＞９５％まで精製した。つぎにこの封入体を７Ｍの尿素で可溶化し、急速希釈および平衡透析法を用いて未変性コンフォメーションに折りたたんだ。折りたたみ緩衝液中では、精製封入体は、検知できるほどのタンパク質凝固を示すことなく、容易に再生された。透析後、このタンパク質をリシン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂアフィニティクロマトグラフィによって精製した。リシン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したタンパク質はε−ＡＣＡ（ε−アミノ−ｎ−カプロン酸）によって特異的に溶出された。このことから、再生タンパク質のＫＩＶ３７クリングルに局在するリシン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合部位が、完全に機能していると考えられた。０．１Ｍε−ＡＣＡによるＬＫ６８のアフィニティ溶出によって約３ｍｇ／ｇ細胞（湿重量）のタンパク質が得られた。その後ポリミキシン−Ｂビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いるクロマトグラフィを行って内毒素があればそれを除去し、残留内毒素活性をＬｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解産物分析キット（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で測定した。この精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、必要になるまで−２０℃で保存した。ＬＫ６８タンパク質のｐＩ計算値は６．１３である。この精製ＬＫ６８のＮ末端アミノ酸配列はアミノ酸配列決定によって確認した。
【００１９】
実施例３  ニワトリ絨毛尿膜分析
ＬＫ６８がｉｎ  ｖｉｖｏ抗血管形成作用があるかどうかを調べるために、本発明者たちは、ＬＫ６８が絨毛尿膜（「ＣＡＭ」）の毛細血管発育を阻害する能力を検査した（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２８８０５−２８８１２，１９９８参照）。授精後３日の受精卵を３７℃で培養し、オボアルブミン抽出後、ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）を作った。２日培養後、組換えＬＫ６８タンパク質を含有するＴｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を個々の胚のＣＡＭに乗せた。４８時間後、２０％脂肪エマルジョンを胚の漿尿膜内に注射し、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ周囲の血管形成を調べた（図２参照）。図２では、左の写真はＣＡＭ内での毛細管の正常な発育を示し、右写真はＣＡＭに対するＬＫ６８による血管形成阻害を示す。
【００２０】
ＬＫ６８を３〜５μｇの用量範囲でＣＡＭに投与した場合、調べた１００個の卵のうち６０％以上が、投与試料周囲に無血管帯を示したが、これは毛細管の成長が阻害されていることを表している。各クリングルドメインの組換えタンパク質、たとえばＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８のいずれかを用いると、調べた卵の６０〜７０％が１μｇ／ＣＡＭの用量範囲で阻害作用を示した（図３（Ａ）および３（Ｂ）参照）。このｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ａｐｏ（ａ）クリングルドメインが抗血管形成活性を有すること、ＬＫ６８は単一クリングルタンパク質と同様に血管形成の強力な阻害物質であることを証明した。調べたニワトリ胚のどれにも毒性の証拠は認められなかった。
【００２１】
実施例４  内皮細胞増殖の阻害
組換えＬＫ６８、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８タンパク質が、ｂＦＧＦで刺激したウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞の増殖に及ぼす阻害活性を次の条件下で分析した。ＢＣＥ細胞を１０％の仔ウシ血清（ＢＣＳ）および３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。約３０００個の細胞を９６ウエル組織培養プレートの各ウエルに添加し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。１８時間インキュベーション後、該培地を０．５％ＢＣＳ含有ＤＭＥＭと交換し、被検試料を各ウエルに添加した。３０分間インキュベーション後、ｂＦＧＦを終濃度１ｎｇ／ｍｌまで添加した。細胞数は［３Ｈ］チミジン取込み法によって測定した。実験は１試料３点方式で行った。
図４に見られるように、ＬＫ６８、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８は、用量依存性にＢＣＥ細胞増殖を特異的に阻害することが判明した。アンジオスタチンを陽性対照として添加すると、調べたすべてのＡｐｏ（ａ）クリングルタンパク質は今回の実験で使用した条件下ではさらに有効のようであった。最大阻害の半分に達する濃度（ＥＤ５０）は、ＬＫ６８については約２００〜２５０ｎＭ、ＬＫ６については約１４０〜１７０ｎＭ、ＬＫ７については約１０〜２０ｎＭ、ＬＫ８については約１０〜２０ｎＭである（図４（Ａ）および４（Ｂ）参照）。
【００２２】
組換えＬＫ６８およびＬＫ８タンパク質については、ｂＦＧＦで刺激したヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞の増殖に対する阻害活性を次の条件下で分析した。ＨＵＶＥＣ（米国基準株保存機関、ＵＳＡ）を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）、３０μｇ／ｍｌの内皮細胞増殖補充剤（ＥＣＧＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）、１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を含有するＦ１２Ｋ培地中で増殖させた。これらの細胞を９６ウエル組織培養プレートで２０００個／ウエルの密度で平板培養した。これらの細胞は３７℃、５％ＣＯ２、１８時間インキュベートし、血清不含培地で１回洗浄し、０．５％ＦＢＳ含有Ｆ１２培地を添加した。これらの細胞を様々な濃度の試料で処理し、３０分間インキュベートした。その後ＥＣＧＳ、ヘパリン、ｂＦＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を終濃度それぞれ３０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌで細胞内に添加した。４８時間インキュベーション後、５−ブロモ−２‘−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＵＳＡ）を用いる細胞増殖ＥＬＩＳＡによって細胞数を測定した。実験は１試料３点方式で行った。
【００２３】
図４（Ｃ）からわかるように、ＬＫ６８はＬＫ８と同様にＨＵＶＥＣ細胞増殖を用量依存性に特異的に阻害することが判明した。
ＬＫ６８またはＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８のような単一クリングルタンパク質の存在下では、ＢＣＥまたはＨＵＶＥＣ細胞の形態は未処理細胞のものと類似しているようであった。さらに、細胞増殖はＬＫ６８除去後ｂＦＧＦ刺激で救助することができる。これらの結果は、ＬＫ６８は、単一クリングルタンパク質と同様に、毛細血管内皮細胞に対して細胞毒性ではないことを示している。さらに、この阻害活性は、ＢＣＥおよびＨＵＶＥＣ細胞のような内皮細胞に特異的のようである。さらにまた、ＬＫ６８はＬＫ８と同様に、ＣＨＯ細胞、マウス皮膚線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞、マウス副腎腫瘍Ｙ１細胞、マウス胚肝臓／ＳＶ４０形質転換細胞系ＴＩＢ７４のような非内皮細胞型の増殖の阻害を示すことはできなかった（図５Ａ〜５Ｆ参照）。図５Ａ〜図５Ｃは、ＬＬＣ、Ｙ１、ＴＩＢ  ７４のような様々な腫瘍細胞の感度を示し、図５Ｄ〜図５ＦはＣＨＯ、ＭＳＦ、ＮＩＨ３Ｔ３のような様々な正常細胞系の感度を示したものである。
【００２４】
実施例５  内皮細胞移動の阻害
細胞移動分析は８ｍｍ孔のＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）で行った。簡潔に述べると、ウエルをフィブロネクチン（２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）で一夜コーティングし、ＨＵＶＥＣを０．４％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地１００μｌ中２０００個／ウエルの密度で上部チャンバーで平板培養した。０．４％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ５００μｌを下部チャンバーに添加して３７℃１時間インキュベートした。１μＭ濃度の被検試料を上部チャンバーに添加し、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを下部チャンバーに添加した。５時間インキュベーション後、フィブロネクチン平板培養膜を横断した細胞を、上部チャンバー内の細胞を綿棒で拭き取った後に、定量した。膜を横断した細胞はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セットで製造者の説明（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に従って染色し、１００×倍率で計数した。実験は１試料２点方式で行った。
【００２５】
塩基性ＦＧＦ（２５μｇ／ｍｌ）を用いてＨＵＶＥＣ細胞の移動を刺激した。１μＭの用量では、ＬＫ６８は、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８のような単一クリングルタンパク質と同様に、ｂＦＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ細胞移動を、非誘導対照の水準まで完全に阻害した（図６Ａおよび６Ｂ参照）。図６では（−）ＣＯＮは非誘導対照を表し、（＋）ＣＯＮはｂＦＧＦ−誘導陽性対照を表す。
ＢＣＥ細胞を用いる移動分析を上記と同様にして行った。投与した２種類の濃度のＬＫ６８または単一クリングルタンパク質と、検査したすべてのＡｐｏ（ａ）クリングルタンパク質はＢＣＥ細胞移動に対して阻害作用を示した。さらに、ＬＫ６８およびその単一クリングルタンパク質のほうが、アンジオスタチン（ＡＳ）よりも、ＢＣＥ細胞移動の阻害に対して有効であった（図７参照）。
【００２６】
実施例６  原発性腫瘍増殖の抑制
実施例６−１  Ｌｅｗｉｓ肺癌
６〜８週令のオスＣ５７ＢＬ６／ＪマウスにＬｅｗｉｓ肺癌を移植した。マウス皮下背部の近位正中線に食塩水０．１ｍｌ中１×１０６個の細胞を注入した。腫瘍が直径約５ｍｍに達したとき、腫瘍保有マウスにＬＫ６８（１００ｍｇ／ｋｇ体重）をＰＢＳ中懸濁液として腫瘍から遠位の部位に皮下注入した。マウス対照群には見せかけの手技を施し、ＰＢＳのみ投与した。腫瘍の大きさは投与期間中毎日測定した。また容積は、式、幅２×長さ×０．５２を用いて求め、対照動物と比較した処置動物の腫瘍容積の比率（Ｔ／Ｃ）は最終時点で求めた。投与は８日間続けて行い、その時点ですべてのマウスを屠殺し、腫瘍を摘出した（図８参照）。図８からわかるように、ＬＬＣ原発性腫瘍の増殖は全身ＬＫ６８療法によって強力に抑制されることが明確に示された。１００ｍｇ／ｋｇの用量のＬＫ６８はわずか７日間投与で腫瘍負荷を有意に後退させた。
組織学的分析も行い、投与マウスと対照マウスの腫瘍の血管密度および出血ならびに形態学的外見について比較した（図９Ａ〜図９Ｃ参照）。図９Ａ〜図９Ｃでは、図９ＡがＰＢＳ投与対照、図９Ｂが１０ｍｇ／ｋｇ体重のＬＫ６８を投与したＬＬＣ腫瘍、図９Ｃが１００ｍｇ／ｋｇ体重のＬＫ６８を投与したＬＬＣ腫瘍をそれぞれ示した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ／Ｅ）染色によってＬＫ６８投与腫瘍に明白な組織学的相違が観察された。すなわち、腫瘍細胞は無傷ではなく、形態学的に生育可能ではなかった。つぎに、腫瘍周囲で区域壊死の有無を調べた。やはりＬＫ６８投与腫瘍内の血管密度が低下していた。組換えＬＫ６８投与マウスのいずれにも炎症や出血の証拠は認められなかった。
【００２７】
実施例６−２  ヒト肺癌
本実験に使用した４週令の異系交配メスｎｕ／ｎｕヌードマウスを滅菌環境下に収容した。ケージ、床敷き、飼料、水はすべて蒸気滅菌した。これらのマウスを１２時間毎の明暗サイクルで飼育した。ヒト肺癌細胞（韓国基準細胞系バンクから購入したＡ５４９）を、１０％加熱不活性化ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持培養した。約２×１０７個のＡ５４９ヒト肺癌細胞を、ヌードマウスの背部近位正中線に皮下注射した。腫瘍移植後７日目に腫瘍が触知できたとき、マウスに１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量でＬＫ６８処理を行った。対照群はＰＢＳのみで処理した。この処理は１７日間継続した。腫瘍の大きさを隔日に測定した。
【００２８】
腫瘍増殖はＬＫ６８処理によって退行した。すなわち、ＬＫ６８処理Ａ５４９腫瘍は対照群動物の腫瘍より約５７．５％小さかった（図１０参照）。処理マウスのいずれにもいかなる毒性の証拠もなかった。継続療法によって投与されているかぎり腫瘍は休止状態が保たれた。これらのデータはＬＫ６８の抗血管形成作用が非常に広範囲の原発性悪性疾患を標的として使用することができることを強く示唆している。
上記に明確に説明し証明したように、本発明は、アミノ酸配列が、ヒトａｐｏ（ａ）クリングルドメインＩＶ３６、ＩＶ３７及びＶ３８と同一の新規の血管形成阻害剤ＬＫ６８、ＬＫ６８をコード化するＤＮＡ配列、該ＤＮＡより成る組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換させた組換え微生物、抗癌剤としてのＬＫ６８の使用、血管形成関連疾患を治療する方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】    大腸菌に発現させた組換えＬＫ６８タンパク質の分析のためのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図２】    ニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）上ＬＫ６８による血管形成阻害を示す写真である。
【図３】    図３Ａは、ＬＫ６８の関数としてＣＡＭにおける血管増殖の阻害を示したグラフである。図３Ｂは、単一クリングルＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８、対照の関数としてＣＡＭにおける血管増殖の阻害を示したグラフである。
【図４】    図４Ａは、組換えＬＫ６８およびアンジオスタチンによるＢＣＥ細胞増殖の阻害を示すグラフである。図４Ｂは、組換えＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８によるＢＣＥ細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図５】    図４Ｃは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８によるＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図６】    図５Ａは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＬＬＣ細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。図５Ｂは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＹ１細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。図５Ｃは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＴＩＢ７４細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。
【図７】    図５Ｄは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＣＨＯ細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。図５Ｅは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＭＳＦ細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。図５Ｆは、組換えＬＫ６８およびＬＫ８存在下のＮＩＨ３Ｔ３細胞のＢｒｄＵ標識指標を示すグラフである。
【図８】    図６Ａは、組換えＬＫ６８、ＬＫ８、ＰＫ５によるＨＵＶＥＣ細胞移動の阻害を示すグラフである。図６Ｂは、組換えＬＫ６８、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８によるＨＵＶＥＣ細胞移動の阻害を示すグラフである。
【図９】    図７は、アンジオスタチン、組換えＬＫ６８、ＬＫ６、ＬＫ７及びＬＫ８、単一クリングルの組合せによるＢＣＥ細胞移動の阻害を示すグラフである。
【図１０】    図８は、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞移植マウスに対するＬＫ６８投与の、総容積に対する影響を時間の関数として示している。
【図１１】    図９Ａ〜９Ｃは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ／Ｅ）染色によるＬｅｗｉｓ肺癌細胞の組織学的分析を示す写真である。
【図１２】    図１２は、ヒト肺癌Ａ５４９細胞移植ヌードマウスに対するＬＫ６８投与の、総容積に対する影響を時間の関数として示している。
【配列表】0003725473.tif 000003
0003725473.tif 000004
0003725473.tif 000005
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0003725473.tif 000012
0003725473.tif 000013
【図１】
0003725473.tif 000014
【図２】
0003725473.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0003725473.tif 000019
【図７】
0003725473.tif 000020
【図８】
0003725473.tif 000021
【図９】
0003725473.tif 000022
【図１０】
0003725473.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
0003725473.tif 000025