(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｘ−Thr1−Thr2−Ser3−Gln4−Val5−Arg6−Pro7−Arg8−R'（ここで、１、２、５、６または７位のアミノ酸残基のいずれか１つがＤ−立体異性体であり、Ｘは水素又はＲ−（Ｃ＝Ｏ）（Ｒは低級アルキル）であり、そしてR'は水素及びアミドより成る群から選ばれる）から成るペプチドを含む、抗炎症活性を示す抗炎症用医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がＤ−Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Argである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Ｄ−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Argである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Ｄ−Val−Arg−Pro−Argである請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Val−Ｄ−Arg−Pro−Argである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Ｄ−Pro−Argである請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、本質的にアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Argから成る環化誘導体であって、該誘導体の第１のアミノ酸残基のアミン基が該誘導体の第２の非隣接アミノ酸残基のカルボキシル基に共有結合で結合されて環化したペプチドである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
アミノ酸配列Ｘ−Thr1−Thr2−Ser3−Gln4−Val5−Arg6−Pro7−Arg8−R'（ここで、１、３、４、５、６または７位のアミノ酸残基のいずれか１つがGluで置換され、Ｘは水素又はＲ−（Ｃ＝Ｏ）（Ｒは低級アルキル）であり、そしてR'は水素及びアミドより成る群から選ばれる）から成るペプチドを含む、抗炎症活性を示す抗炎症用医薬組成物。
【請求項９】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Glu−Gln−Val−Arg−Pro−Argである請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Glu−Val−Arg−Pro−Argである請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Val−Glu−Pro−Argである請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
アミノ酸配列Ｘ−Thr1−Thr2−Ser3−Gln4−Val5−Arg6−Pro7−Arg8−R'（ここで、２、４、５、６、７または８位のアミノ酸残基のいずれか１つがLysで置換され、Ｘは水素又はＲ−（Ｃ＝Ｏ）（Ｒは低級アルキル）であり、そしてR'は水素及びアミドより成る群から選ばれる）を含むペプチドを含む、抗炎症活性を示す抗炎症用医薬組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Lys−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Argである請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Lys−Val−Arg−Pro−Argである請求項12記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Lys−Arg−Pro−Argである請求項12記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドのアミノ酸配列がThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Lysである請求項12記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願のクロスレファレンス
この出願は1993年６月18日に出願された出願番号08/080,371号の一部継続出願であり、これは1993年３月24日に出願された出願番号08/037,486号の一部継続出願であり、これは現在放棄されている1990年12月21日に出願された出願番号07/631,823号の一部継続出願であり、これら全体の開示が参考として本明細書に含まれる。
1.序論
本発明は抗炎症活性を示す血小板因子４（配列番号９）に関連するペプチドおよびペプチド誘導体、並びに類似ペプチド、前記ペプチドを含む医薬組成物、並びに本発明のペプチドを使用する炎症の抑制方法に関する。
2.発明の背景
2.1.血小板因子４
70アミノ酸ヘパリン結合タンパク質である血小板因子４（PF4）（配列番号９）は活性化血小板のα顆粒から放出される。PF4（配列番号９）の正確な生物学的機能は知られていないが、PF4（配列番号９）は走化性、凝固、炎症、および細胞増殖に関与する多重遺伝子族の一員である（Eismanら,1990,Blood 76:336−344）。PF4遺伝子のゲノム配列（配列番号９）、および高度に相同の遺伝子、PF4 altが最近報告された（Eismanら，上記の文献）。PF4（配列番号９）の報告された生物学的活性の中に、マウスにおけるコンカナバリンＡ誘導免疫抑制の軽減（Zuckerら,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.86:7571−7574）；内皮細胞に結合し、侵入する能力（Rybakら,1989,Blood 73:1534−1539）；好中球走化性、リソソーム酵素放出および増大された付着性の誘発（Bebawyら,1986,J.Leukocyte Biol.39:423−434）；平滑筋細胞または内皮細胞ではなく周皮細胞の移動の刺激（Bernsteinら,1982,J.Cell.Sci.56:71−82）；および潜在的な抗血栓効果（Weerasingheら,1984,Thromb.Res.33:625−632）がある。PF4（配列番号９）の増大されたレベルが、糖尿病患者（Guastamacchiaら,1985,Boll.Soc.Ital.Biol.Sper.61:499−502;Cortellaroら,1990,Thromb.Res.58:571−576;Cellaら,1986,Folia Haematol.113:646−654）およびベーチェット病を有する患者（Schmitz−HuebnerおよびKnap,1984,Thromb.Res.34:277−286）で同定された。
2.2.炎症
皮膚炎症は、リン脂質からエンドペルオキシドひいてはシクロオキシゲナーゼによりプロスタグランジンへ、またはリン脂質から５−HETEひいてはリポキシゲナーゼによりロイコトリエンへのいずれかの変換により一部媒介される（KragballおよびVoorheees,1985,Curr.Probl.Derm.13:1−10）。これらの経路のいずれかまたは両方の抑制は、非ステロイド抗炎症剤が炎症応答を阻止する手段である。抗炎症性ステロイドは、アラキドン酸（これはその後いずれかの経路により炎症の媒介物質に変換し得る）の放出を抑制することにより作用する（Blackwellら,1980,Narure 287:147−149）。サイトカインはまた炎症プロセスを媒介し、そして炎症応答の良好な抑制、または少なくとも同等の抑制がサイトカイン産生を抑制することにより、または炎症細胞浸潤物の細胞表面におけるそれらのレセプターとのサイトカインの相互作用の抑制により得られることが提案されていた。
過去数年以内に、サイトカインの異なるドメインが、IL−１β断片の例により説明されるように異なる生理応答を誘導できることが認められていた。IL−１βのソムノゲニック（somnogen−ic）性および発熱性は断片IL−１β（208−240）にあり、一方、IL−１βのその他の異なる別の断片はＴ細胞生産を刺激する（Obalら,1990,Am.J.Physiol.259:R439−R446）。
3.発明の概要
本発明は抗炎症活性を示す血小板因子４（PF4）（配列番号９）に関連するペプチドおよびペプチド誘導体、並びに類似ベプチド、前記ペプチドを含む医薬組成物、並びに前記ペプチドを使用する。炎症の抑制方法に関する。本発明は、オタクペプチドCT−112（配列番号１）、およびCT−112（配列番号１）の誘導体および類似体が炎症のマウス耳／アラキドン酸モデルにおいて抗炎症活性を有するという発見に一部基いている。
本発明のペプチド、特にCT−112（配列番号１）は炎症応答を抑制するのに特に有益であり得る。例えば、限定のためではないが、CT−112（配列番号１）またはその類似体もしくは誘導体が自己免疫疾患、移植片対宿主病、再潅流組織損傷、アテローム性動脈硬化症、および喘息における炎症を抑制するのに使用し得る。
4.図面の説明
図1.  抗炎症性ペプチドCT−112のアミノ酸配列（配列番号１）およびWohl−２〜Wohl−８として先に表示されたペプチドのアミノ酸配列（配列番号２〜８）
図2.  成熟PF4のアミノ酸配列（配列番号９）
図3.  好中球細胞に対するCT−112（配列番号１）の効果。棒グラフは530nmで蛍光により測定された、ｆ−Met−Leu−Pheへの好中球の走化性に対するCT−112（配列番号１）の効果を示す。線グラフは、トリパンブルー排除により測定された、細胞生存度に対するCT−112（配列番号１）の効果を示す。棒グラフ値は三つのウェルの平均±SDを表す。
図4.  530nmで蛍光により測定された、ロイコトリエンB4（LTB4）への好中球の走化性に対するCT−112（配列番号１）の効果。値は三つのウェルの平均±SDを表す。
図5.  530nmで蛍光により測定された、インターロイキン−８への好中球の走化性に対するCT−112（配列番号１）の効果。値は三つのウェルの平均±SDを表す。
図6.  カラゲナン誘導炎症細胞流入に関するCT−112（配列番号１）の効果。□、正常；□、カラゲナンのみ；■、カラゲナン＋CT−112（配列番号１）。＊は同時点でのカラゲナン処理対照動物からの有意差（ｐ≦0.05）を示す。
図7.  CT−112（配列番号１）、CT−112（配列番号１）の誘導体およびその他のペプチドの、マウス耳の厚さのAA誘導増大の抑制により測定された抗炎症活性。TTSQVRPR（配列番号１）＝CT−112;VTRPTQRS（配列番号11）＝CT−120、ランダムオクタペプチド;TTSGIHPK（配列番号12）＝CT−127、結合組織活性化ペプチドIII（CTAP−III）から誘導されたペプチド;Ac−TTSQVRPR＝アセチル基ブロッキングアミノ末端を有するCT−112（配列番号１）の誘導体;TTSQVRPR−NH2＝アミド基ブロッキングカルボキシル末端を有するCT−112（配列番号１）の誘導体;Ac−TTSQVRPR−NH2＝アセチル基ブロッキングアミノ末端およびアミド基ブロッキングカルボキシル末端を有するCT−112（配列番号１）の誘導体。
図8.  CT−112（配列番号１）の切断型誘導体（配列番号３、４、６、24〜28）の、マウス耳の厚さのAA誘導増大の抑制により測定された抗炎症活性。TTSQVRPR（配列番号１）;TSQVRPR（配列番号25）;SQVRPR（配列番号３）;QVRPR（配列番号24）;VRPR（配列番号４）;TTSQVRP（配列番号26）;TTSQVR（配列番号27）;TTSQV（配列番号６）;TTSQ（配列番号28）。
図9.  CT−112（配列番号１）の類似体（配列番号25、26、29〜73）の、マウス耳の厚さのAA誘導増大の抑制により測定された抗炎症活性。
図10.  コラーゲン誘導関節炎を発症しているマウスの％に対するCT−112（配列番号１）の効果。
図11.  コラーゲン誘導関節炎を発症しているマウスにおける関係した足の累積数に対するCT−112（配列番号１）の効果。
図12.  コラーゲン誘導関節炎を発症しているマウスにおける累積関節炎指数に対するCT−112（配列番号１）の効果。
図13.  マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の組織病理学に対するCT−112（配列番号１）の効果。値は対照群からの23の足、10mgのCT−112/kgで処置を受けた群からの26の足、および100mgのCT−112/kgで処置を受けた群からの16の足の平均±SEMを表す。＊は対照群からの有意差（ｐ≦0.05）を示す。図14.  405nmにおけるO.D.により測定された、コラーゲンで免疫感作されたマウスにおける循環抗コラーゲン抗体に対するCT−112（配列番号１）の効果。
5.発明の詳細な説明
限定のためでなく、開示の明瞭化の目的で、本発明の詳細な説明が下記の細項目に示される。
（ｉ）血小板因子４（配列番号９）の調製、
（ii）本発明のペプチドおよびそれらの調製、
（iii）抗炎症性ペプチドの同定、および
（iv）抗炎症剤としての本発明のペプチドの使用。
5.1.血小板因子４の調製
血小板因子４（PF4）（配列番号９）は、当業界で知られているあらゆる方法を使用して精製し得る。本発明の好ましい実施態様において、PF4（配列番号９）は、Mediciら（1989,Thrombos.Res.54:277−287）により記載された方法の改良によりトロンビン活性化血小板抽出物から精製し得る。PF4（配列番号９）は、1.7MのNaClで因子を溶離するヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィー、続いて約15％のアセトニトリルの存在下にNaClで溶離されるポリスルホエチルアスパルトアミドカラムによる強イオン交換クロマトグラフィー、そして最後に水中約0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）中の線形アセトニトリル勾配で溶離されるVydac RPC4逆相HPLC分析カラムによる分離により単離し得る。
5.2.本発明のペプチドおよびそれらの調製
本発明のペプチドとして、（ｉ）PF4（配列番号９）（そのアミノ酸配列（配列番号９）が図２に示される）の少なくとも４アミノ酸部分、もしくは機能上均等な配列；または（ii）図２に示されるPF4配列（配列番号９）の一部に少なくとも66％相同である少なくとも６アミノ酸配列、もしくは機能上均等な配列を含むあらゆるペプチド、ペプチド誘導体若しくはペプチド類似体が挙げられる。相同性は、本明細書中で異なるペプチドにより共有されたアミノ酸残基間の同一性を言うものと解されるべきである。例えば、PF4の６アミノ酸断片に66％相同である６アミノ酸残基ペプチドは、必ずしも一緒に結合されていないPF4（配列番号９）断片と４アミノ酸残基を共有する。
本発明の好ましい実施態様において、ペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド類似体は、配列Thr−Ser−Glnおよび／またはVal−Arg−Pro、更に好ましくはThr−Thr−Ser−Gln（配列番号10）および／またはVal−Arg−Pro−Arg（配列番号４）（先に“Wohl−4"と称された）、またはThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号１）を含む。特に好ましい実施態様において、ペプチドはThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号１）（即ち、“CT−112"）である。更に別の好ましい実施態様において、ペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド類似体は、配列Val−Lys−Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号２）（先の“Wohl−2"）、またはSer−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号３）（先の“Wohl−3"）、またはThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg−His−Ile−Thr（配列番号５）（先の“Wohl−5"）、またはThr−Thr−Ser−Gln−Val（配列番号６）（先の“Wohl−6"）、またはThr−Ser−Gln−Val−Arg（配列番号７）（先の“Wohl−7"）、またはThr−Thr−Ser−Gly−Ile−His−Pro−Lys（配列番号８）（先の“Wohl−8"）（図１）を含む。
本発明のペプチドはまたPF4（配列番号９）に相同性を殆ど有しないか、または全く有しない部分（例えば、キャリヤータンパク質）を含んでいてもよい。更に、これらのペプチドは、炭水化物、脂質、ホスフェート、澱粉、抗体、Fab、Fab2、酵素、アミノ酸、ペプチド、または成長因子化合物を含むがこれらに限定されないその他の化合物に接合により誘導化されてもよい。
図２に示されるようなPF4のアミノ酸配列（配列番号９）、または機能上同等な配列は、PF4配列（配列番号９）が（ｉ）図２に示された配列（配列番号９）または（ii）或る残基がサイレント変化を生じる機能上同等なアミノ酸により置換されている、図２に示されるような配列（配列番号９）であり得ることを意味するものと解されるべきである。例えば、その配列内の一種以上のアミノ酸残基は、機能上の同等物として作用して、サイレント変化を生じ同様の極性をもつ別のアミノ酸により置換し得る。その配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択し得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に帯電される（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に帯電される（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の類似体および／または誘導体、例えば、ペプチドのアミノ末端がＲ−（Ｃ＝Ｏ）−基（Ｒは低級アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、そのアリールまたはヘテロアリールは未置換またはハロゲン、メトキシ、アミノもしくはアルキル官能基で置換されている）の付加により修飾されているもの、或いはペプチドのカルボキシル末端がR'−基（R'はアミド、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステル、アリールエステルおよびヘテロアリールエステルからなる群から選ばれ、そのアリールエステルまたはヘテロアリールエステルは未置換またはハロゲン、メトキシ、アミノもしくはアルキル官能基で置換されている）の付加により修飾されているもの、或いはペプチドの両末端がこのように修飾されているものを提供するが、但し、前記類似体および／または誘導体が、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。本明細書に使用される“低級アルキル”および“低級アルキルエステル”という用語は、１〜６個の炭素原子を含む基を包含することが意図されている。本明細書に使用される“アリール”および“アリールエステル”という用語は、６員環または７員環構造を含む基を包含することが意図されており、例えば、ピリジニウム基、イミダゾリウム基およびキノキサリン基を含む。
その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の誘導体を提供し、この場合、いずれかの一つ以上の側鎖アミノ基がアシル化またはアリール化により誘導体化され、またはいずれかの一つ以上の側鎖ヒドロキシル基がアルキルエステルもしくはアリールエステルの付加により誘導体化され、或いはアミン側鎖基およびヒドロキシル側鎖基の両方がこのように誘導体化されている。但し、前記誘導体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。
その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の誘導体を提供し、この場合、CT−112（配列番号１）、またはその一部が、非隣接残基間の共有結合により環化されている。但し、前記誘導体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。
その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の類似体を提供し、この場合、CT−112（配列番号１）のいずれかの一つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸類似体または擬体により置換されて、例えば、カルバザート（carbazates）またはターシャリーセンターを生じ、そのとり込みはペプチドのタンパク質分解的開裂を回避または低減するのに利用できる。但し、前記類似体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。
その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の切断型類似体を提供する。但し、前記切断型類似体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。
その他の実施態様において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の置換誘導体を提供し、この場合、CT−112（配列番号１）の一つ以上のアミノ酸残基が、例えば、特別なアミノ酸残基のＤ−アミノ酸形態、またはいずれかの異なるＬ−アミノ酸残基により置換されている。但し、CT−112（配列番号１）の前記置換誘導体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。例えば、本発明はアミノ酸配列Thr1−Thr2−Ser3−Gln4−Val5−Arg6−Pro7−Arg8（ここで、１位、２位、５位、６位または７位にあるいずれかの一つ以上のアミノ酸残基はＤ−立体異性体である）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Ｘ−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（ＸはＬ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Met、Ｌ−Arg、Ｌ−Ser、Ｌ−Trp、Ｌ−Tyr、Ｌ−CysおよびＬ−Hisからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ｘ−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（ＸはＬ−Glu、Ｌ−Asp、Ｌ−Asn、Ｌ−Gln、Ｌ−Cys、Ｌ−His、Ｌ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Thr、Ｌ−TrpおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Ｘ−Val−Arg−Pro−Arg（ＸはＬ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Arg、Ｌ−Asp、Ｌ−Cys、Ｌ−Glu、Ｌ−His、Ｌ−Met、Ｌ−Ser、Ｌ−ThrおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Gln−Ｘ−Arg−Pro−Arg（式中、ＸはVal以外の全ての天然産Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−Lysからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Ｘ−Pro−Arg（ＸはArg以外の全ての天然産Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−AlaまたはＬ−Gluからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Ｘ−Arg（ＸはPro以外の全ての天然産Ｌ−アミノ酸からなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
加えて、本発明はアミノ酸配列Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Ｘ（ＸはＬ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Asn、Ｌ−Asp、Ｌ−Cys、Ｌ−Glu、Ｌ−His、Ｌ−Met、Ｌ−SerおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれる）を有し、抗炎症活性を示すペプチドを提供する。
その他の実施形態において、本発明は抗炎症剤としてのCT−112（配列番号１）の類似体を提供し、この場合、CT−112（配列番号１）の一つ以上のアミノ酸残基が省かれている。但し、CT−112（配列番号１）の前記類似体は、例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示すことを条件とする。
その他の実施態様において、本発明はアミノ酸配列Ｒ−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−R"（ＲはＨまたはR'−（Ｃ＝Ｏ）−（、R'は低級アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、そのアリールまたはヘテロアリールは未置換、またはハロゲン、メトキシ、アミノまたはアルキル官能基で置換されている）であり、R"はＨ、アミド、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステル、アリールエステルおよびヘテロアリールエステルからなる群から選ばれ、そのアリールエステルまたはアリールエステルは未置換であり、またはハロゲン、メトキシ、アミノまたはアルキル官能基で置換されており、X1はＬ−Thrであり、X2はＬ−Thr、Ｌ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Met、Ｌ−Arg、Ｌ−Ser、Ｌ−Trp、Ｌ−Tyr、Ｌ−CysおよびＬ−Hisからなる群から選ばれ、X3はＬ−Ser、Ｌ−Glu、Ｌ−Asp、Ｌ−Asn、Ｌ−Gln、Ｌ−Cys、Ｌ−His、Ｌ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Thr、Ｌ−TrpおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれ、X4はＬ−Gln、Ｌ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Arg、Ｌ−Asp、Ｌ−Cys、Ｌ−Glu、Ｌ−His、Ｌ−Met、Ｌ−Ser、Ｌ−ThrおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれ、X5、X6およびX7はあらゆる天然産Ｌ−アミノ酸であり、並びにX8はＬ−Arg、Ｌ−Lys、Ｌ−Orn、Ｌ−Asn、Ｌ−Asp、Ｌ−Cys、Ｌ−Glu、Ｌ−His、Ｌ−Met、Ｌ−SerおよびＬ−Tyrからなる群から選ばれる）を有するペプチドを提供する。但し、Ｒ−X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−R"は少なくとも４アミノ酸残基を含み、Val−Arg−Pro−Arg（配列番号４）、またはThr−Thr−Ser−Gln−Val（配列番号６）、またはSer−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号３）、またはThr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg（配列番号１）ではないことを条件とし、そのペプチドは誘導体化されていてもよく、または類似体が上記のようにしてペプチドから合成されてもよく、そしてそのペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド類似体は例えば、下記の第5.3節に示されるアッセイにより測定して、抗炎症活性を示す。
全ての場合において、本発明のペプチドは下記の第5.3節に特定されるような抗炎症活性を示す。
本発明のペプチドは当業界で知られているあらゆる方法により調製し得る。例えば、限定のためではなく、ペプチドは（ｉ）大きなペプチド、例えば、PF4（配列番号９）（これに限定されない）からの開裂、（ii）組換えDNA発現方法、および（iii）BaranyおよびMerrifield（1980,“ペプチド"2巻,GrossおよびMeienhofer編集，アカデミック  プレス,N.Y.）により記載されているような固相技術を含む化学合成により合成し得る。
本発明の好ましい特別な実施態様において、PF4ペプチド断片を生産するためにPF4（配列番号９）のトリプシン消化を行ってもよい。例えば、第5.1節に記載されたようにして調製された凍結乾燥PF4（配列番号９）は、微小遠心分離管中で0.4MのNa2CO3/8M尿素（pH9）50μｌに溶解し得る。次にそのタンパク質は50℃で約15分間にわたって緩衝液（pH8）中の約45mMのジチオスレイトールの添加により還元し得る。次にそのタンパク質を0.5NのNaOH中ヨード酢酸５μｌの添加によりカルボキシメチル化し、そして暗所で室温で約15分間インキュベートし得る。次に脱イオン水約140μｌおよびシーケンサー用トリプシン（200μg/ml）の1mMのHCl溶液５μｌを添加し、その試料を37℃で約24時間インキュベートし得る。次に、得られるトリプシン消化物を適当な逆相クロマトグラフィーカラム、例えば、2.7％のアセトニトリル/0.1％のTFA/H2Oで平衡にされたVydac C18カラムに注入し、そして適当な流量、例えば、0.5ml/分でクロマトグラフィーにかけ、1.0分間の画分を回収し得る。溶離プログラムは、例えば、約10分間で緩衝液Ａ（水中0.1％のTFA）中2.7％の緩衝液Ｂ（95％のアセトニトリル）、そして123分間で約27〜95％の緩衝液Ｂの勾配であってもよい。ペプチドの溶離は、210nmの波長で分光光度計で監視し得る。好ましくは、Beckman System Gold HPLC Systemをタンパク質および消化物の両方のクロマトグラフィーに使用してもよい。上記の例として示されたクロマトグラフィープロトコルを使用して、CT−112ペプチド（配列番号１）はペプチド番号４として溶離するものと予想し得る（下記の第6.2節を参照のこと）。PF4（配列番号９）のペプチド断片は、本発明によれば、必要により化学修飾されてもよく、そして次の節に示されるようにして抗炎症活性について試験し得る。
5.3.抗炎症性ペプチドの同定
上記のペプチドは、抗炎症活性に関して因子を評価するために当業界で知られているin vitroまたはin vivoのアッセイ系を使用して、抗炎症活性を有するものと測定し得る。“抗炎症活性”という用語は、本明細書中で炎症性細胞流入および／または免疫細胞の活性化または免疫応答と関連する活性を抑制する能力を表すものと解されるべきである。こうして、“抗炎症活性”という用語は免疫調節剤または免疫変調剤として作用する能力を含むことが意図されている。
例えば、限定のためではないが、ペプチドはマウス耳モデルにおいて炎症を抑制する能力につき試験されてもよく、この場合、アラキドン酸（AA）が炎症反応を誘導するのに使用される（Youngら、1984,J.Invest.Dermatol.82:367−371;Dohertyら,1988,J.Invest.Dermatol.91:298−302）。例示の目的で、下記の第７節を参照のこと。
5.4.抗炎症剤としての本発明のペプチドの使用
本発明のペプチドは、急性または慢性のいずれかの炎症性細胞流入が生じる疾患または障害を患っており、このような治療を要する患者の組織中の炎症を抑制する方法に使用し得る。患者はヒト患者または非ヒト患者であってもよい。本発明のペプチドが治療価値を有し得る特定の症状として、望ましくない免疫応答が生じた状況が挙げられ、これらとして、自己免疫疾患、例えば、インスリン依存性糖尿病、グッドパスツール症候群（Goodpasture's syndrome）、天疱瘡および類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、強皮症、混合結合組織疾患およびエリテマトーデス、移植片対宿主病、敗血症性ショック、再潅流組織損傷（心筋梗塞または脳梗塞後の障害を含む）、アテローム性動脈硬化症、喘息および炎症性肺疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい特別な実施態様において、炎症を抑制するのに使用されるペプチドはCT−112（Thr−Thr−Ser−Gln−Val−Arg−Pro−Arg）（配列番号１）である。
本発明のペプチドは、静脈内注射、皮下注射、皮膚内注射、鼻内注射、吸入（例えば、肺エーロゾルまたは肺洗浄）、筋肉内注射、眼内注射、腹腔内注射、腹腔洗浄、心臓穿刺、心臓カテーテル注入、経口注入、髄腔内注射または心室内注射、脊柱または頭蓋腔注射、膣または直腸（例えば、座薬による）、皮膚パッチまたは局所軟骨を含む薬剤投与のあらゆる好適な認められている経路により投与されてもよく、そして水溶液、マイクロカプセル、リポソームを含むあらゆる好適な医薬担体中に含まれていてもよく、または親水性もしくは疎水性担体をベースとする移植片を含む徐放性移植片によるものであってもよい。
本発明のペプチドは、通常の技術を用いて測定して患者の炎症を抑制するのに有効である投薬量で投与し得る。“炎症の抑制”は、炎症の兆候および症候のかなりの減少を表すものと解されるべきである。例えば、限定のためではないが、患者が不快から主観的に軽減されるようになる症候軽減は、治療の多くの満足な結果のうちの一つと考えられるであろう。或る特定の限定されない実施態様において、炎症の量は約50％低減し得る。ED50は約2.5〜5.0mg/kgの投薬量であると推定された。本発明の特別な実施態様において、CT−112（配列番号１）は約2.5mg/kg〜約500mg/kgの投薬量でヒト患者に投与し得る。本発明の特定の限定されない好ましい実施態様において、ヒト患者に皮下投与される投薬量は、治療される炎症が軽度、中度、または重度／永続的であるか否かに応じて約5mg/kg、50mg/kg、または100mg/kgであってもよい。その投薬量は、例えば、限定のためではないが、毎日、または週に１回、２回、若しくはまたは３回の適当な間隔で投与し得る。
6.実施例：抗炎症性ペプチドの調製
6.1.材料および方法
6.1.1.PF4の調製
PF4（配列番号９）を、Mediciら（1989,Thrombos.Res.54:277−287）により記載された方法の改良によりトロンビン活性化血小板抽出物から精製した。PF4（配列番号９）を、1.7MのNaClを用いてその因子を溶離するヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィー、続いて15％のアセトニトリルの存在下でNaClで溶離されるポリスルホエチルアスパルトアミドカラムによる強イオン交換クロマトグラフィー、そして最後に水中0.1％のTFA中の線形アセトニトリル勾配で溶離されるVydac RPC4逆相HPLC分析カラムによる分離により単離した。
6.1.2.PF4のトリプシン消化
凍結乾燥PF4（配列番号９）を微小遠心分離管中で50μｌの0.4MNa2CO3/8Mの尿素（pH9.0）に溶解することによりトリプシン消化を行った。次にそのタンパク質を50℃で15分間にわたってpH9.0の45mMのDTT 5μｌを添加して還元した。タンパク質を0.5NのNaOH中でヨード酢酸５μｌの添加によりカルボキシメチル化し、暗所で室温で15分間インキュベートした。最後に、脱イオン水140μｌおよびシーケンサー用のトリプシン（200μg/ml）の1mMのHCl溶液５μｌを添加し、その試料を37℃で24時間インキュベートした。
トリプシン消化物を2.7％アセトニトリル/0.1％TFA/H2Oで平衡化したVydac C18カラムに注入し、0.5ml/分の流量でクロマトグラフィーにかけ、1.0分の画分を回収した。溶離パターンは以下のとおりであった。10分間にわたって緩衝液Ａ（水中0.1％のTFA）中2.7％の緩衝液Ｂ（95％のアセトニトリル）、123分間で2.7％〜95％の緩衝液Ｂ。ペプチドの溶離を210nmで監視した。Beckman System Gold HPLC Systemをタンパク質および消化物の両方のクロマトグラフィーに使用した。
6.2.結果および考察
CT−112（配列番号１）を逆相HPLCにおいて４番目のペプチドとして溶離し、そしてPortonの適当なペプチド担体への吸着後にPorton2090eシーケンサーで配列決定した。ペプチドの配列はThr−27.5pm、Thr−23.5pm、Ser−30.0pm、Gln−26.5pm、Val−22.6pm、Arg−10.5pm、Pro−9.2pm、Arg−4.7pmであった。Beckman Dabsyl Chloride方法を使用するアミノ酸分析によりペプチドの全配列が確かめられた。
7.実施例：CT−112は抗炎症活性を示す
7.1.材料および方法
抗炎症活性に関する標準化されたアッセイ、即ち、アラキドン酸（AA）を炎症反応の誘導に使用するマウス耳モデル（Youngら,1984,J.Invest.Dermatol.82:367−371;Dohertyら,1988,J.Invest.Dematol.91:298−302）を使用してCT−112（配列番号１）の抗炎症性を分析した。
7.1.1.試薬
塩化物塩またはトリフルオロ酢酸塩のいずれかであるCT−112（配列番号１）を、Multiple Peptide System（サンジエゴ、CA USA）によるペプチドの通常の有機合成スキームを使用して合成した。フェニドンおよびAAをSigma Chemical社（セントルイス、MO USA）から入手した。試験動物に皮下移植されるAlzetミニポンプ（モデル2001、７日、１μl/時間を送達するようにセットした）をAlza Corporation（パロ  アルト、CA USA）から入手した。AAを適用する前に200mg/mlで試薬用のアセトンに溶解した。
7.1.2.動物治療
雌のマウス（C57BL/6UAF、Charles River Breeding Laboratories、約15〜18g）を入手し、使用前に２週間にわたって順化した。動物は実験の開始時に生後約14週であった。移植用のミニポンプを調製するために、CT−112（配列番号１）をPBSに溶解した。その物質を毎日動物当たりCT−112（配列番号１）0.05mg（５匹の動物）、0.1mg（10匹の動物）、1mg（10匹の動物）、または2.5mg（５匹の動物）を送達するようにセットしたAlzetミニポンプに装填した。対照動物への移植用のミニポンプはPBSのみを含んでいた。陽性対照として、10匹のマウスの一組は抗炎症剤として作用する強力な５−リポキシゲナーゼインヒビターであるフェニドン100mg/kgを、AAによるチャレンジの15分前に受けた。
ミニポンプの皮下移植につき、動物をケタミン／キシラジンで麻酔した。ケタミン（Aveco Lot＃440140）を80mg/kgで注射し、キシラジン（Rugby Laboratories Lot＃26040−Ｂ）を16mg/kgで注射し、そしてAlzetポンプを背胸領域で皮下移植した。動物を回収し、次に収容し、そして５日間にわたって食物および水を随時与えた。
ポンプ移植後の６日目に、AA0.01mlを自動マイクロリットルピペットにより右の耳の内表面および外表面に適用した。AA適用の１時間後に、マウスを殺し、耳の厚さをMitsutoyo No.7300ゲージ  カリパスで測定した。また、左の耳を内部対照として測定した。
耳組織中のミエロペルオキシダーゼ活性を多形核白血球（PMN）の存在または不在のマーカーとして測定した（Baroneら,1991,J.Neurosci.Res.29:336−345）。耳の厚さの測定後に、耳をマウスから切開し、そして４℃で50mMのトリス−HCL、pH7.4中で均一にして10％（w/v）のホモジネートを得た。ホモジネートのアリコートを使用して、組織中に存在するミエロペルオキシダーゼ活性の量をｏ−ジアニシジン（Sigma Chemical社、セントルイスMO）および基質としての過酸化水素を使用し、そして460nmで発色団生成を監視して測定した（Baroneら,1991,J.Neurosci.Res.29:336−345）。
7.2結果および考察
５−リポキシゲナーゼ阻害剤フェニドンによる動物の前処理により局所AA適用に対する炎症応答が有効に抑制された。こうしてこの非ステロイドの抗炎症剤はこの実験においてAA誘発皮膚炎症の抑制の陽性対照として利用できた。
CT−112（配列番号１）によるマウスの前処理はPBS対照と較べて炎症プロセスをかなり抑制した。１日あたりCT−112（配列番号１）0.05mgでマウスを前処理することによりAAに応答して耳の膨潤のかなりの低下（43.1％、ｐ≦0.05）を生じた（表Ｉ）。CT−112（配列番号１）を１日あたり2.5mgそれぞれの動物に投与した時、AAに対する応答の最大の低下（95.6％）を得た。炎症応答のこの抑制は有意であり（ｐ≦0.01）、フェニドンに対する応答に匹敵した。
１日あたりCT−112（配列番号１）0.05〜1mgでマウスを前処理することにより、用量依存的に、AA処理された耳におけるミエロペルオキシダーゼ活性を低下した。試験中の変化が大きいために、フェニドンまたは0.1mg/日のCT−112（配列番号１）を受けたグループのみが対照ミエロペルオキシダーゼ活性と比較された場合に活性のかなり異なるレベル（ｐ≦0.05）を示した（表II）。
これらのデータは、CT−112（配列番号１）がAAの局所投与による急性皮膚炎症応答を抑制できることを示す。また、この効果は少数のPMNの存在下でミエロペルオキシダーゼ活性により測定して炎症応答を生じ得る。
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8.実施例：好中球走化性のCT−112抑制
特定の炎症プロセスを阻止するCT−112（配列番号１）の能力を好中球活性のその抑制により実証し、これを以下に記載されるようにして調べた。
8.1.材料および方法
種々の薬剤に応答する好中球の走化性を抑制するCT−112（配列番号１）の能力を、好中球走化性チャンバーを使用して分析した。これらのアッセイにつき、好中球を、細胞を1',7'−ビス（２−カルボキシエチル）−５−（６）−カルボキシフルオレセインで標識した後にCa2+およびMg2+を含むハンクス平衡塩溶液中で再度懸濁させて5x106の細胞/mlの懸濁液を得た。好中球を走化性チャンバーへの添加の前に約15分間にわたってCT−112（配列番号１）にさらした。CT−112（配列番号１）はチャンバーの上部および下部の両方に存在し、そして化学誘引物質、ｆ−Met−Leu−Phe、ロイコトリエンB4またはインターロイキン−８をチャンバーの下部に添加した。膜を通って移動した細胞を、アッセイ開始の１時間後に530nmで蛍光により測定した。
8.2.結果および考察
CT−112（配列番号１）はｆ−Met−Leu−PheおよびLTB4の両方への好中球の走化性移動を有効に抑制したが（図３、４）、インターロイキン−８への走化性移動を抑制しなかった（図５）。加えて、CT−112（配列番号１）は、トリパンブルー排除を使用する生存度試験により測定して好中球に対し細胞毒性ではなかった（図３）。この実験は、好中球と関連する少なくとも一つの活性、走化性移動の活性がCT−112（配列番号１）により少なくとも部分的に抑制されることを示す。
9.実施例:CT−112への暴露の期間の効果
9.1.材料および方法
マウスにアルゼット  ミニポンプセットを移植して７日、３日または１日にわたって60mg/kg/日を送達した。５匹のマウスの別の群はAAチャレンジの24時間、１時間そして0.25時間前にCT−112（60mg/kg/注射）の３回の腹腔内注射を受けた。CT−112（配列番号１）を、その化合物をダルベッコPBSに溶解して5mg/mlの最終CT−112（配列番号１）濃度を得ることにより注射用に調製した。対照マウスに、PBSを７日間にわたって送達するアルゼット  ミニポンプを移植した。AAチャレンジは実施例７に上記されたものと同じであった。
9.2.結果および考察
結果を表IIIに示す。炎症の抑制の差異が７日、３日そして１日の暴露の結果として検出されなかった。全ての期間は、さもなくばAAの局所適用により誘発される急性炎症を有意に抑制した（ｐ≦0.05）。腹腔内注射は炎症を抑制したが、結果は対照とは有意差がなかった。これらの結果は、CT−112（配列番号１）への長期暴露、即ち、＞１日が炎症を抑制するのに必要ではなかったことを示す。
0003645905.tif 000004
10.実施例:CT−112の腹腔内注射の効果
10.1.材料および方法
複数回の腹腔内注射によるCT−112（配列番号１）（60mg/kg/注射）の投与を、AAチャレンジ前の下記の時間に行った。
ａ）６、３、１そして0.25時間
ｂ）３、１そして0.25時間；または
ｃ）１そして0.25時間。
さらに、腹腔内注射によるCT−112（配列番号１）（60mg/kg）の１回投与の効果をAAチャレンジの１時間または３時間前に行った。対照マウスはAAチャレンジの前に７日間にわたってPBSを送達するように移植されたアルゼット  ミニポンプを有していた。AAチャレンジは実施例７に上記したものと同じであった。複数回投薬レジメおよび１時間そして３時間の１回投薬レジメの結果を、治療当たり５匹の動物を使用して60mg/kg/日を７日間送達するようにセットされたアルゼット  ミニポンプにより送達されたCT−112（配列番号１）の抗炎症活性と比較した。
別の実験において、AAチャレンジの６、３、１そして0.25時間前または16、３、１そして0.25時間前のCT−112（配列番号１）の複数回腹腔内注射の効果を分析した。両方の複数回投薬レジメの結果をフェニドン（AAチャレンジの15分前に投与された100mg/kg）およびアルゼット  ミニポンプ（７日間にわたって60mg/kg/日）により投与されたCT−112（配列番号１）の両方と比較した。この後の実験において、CT−112（配列番号１）の１回注射を受ける動物の数を５匹から10匹に増やした。
10.2.結果および考察
複数回投薬実験および１回（１時間および３時間）投薬実験の結果を表IVに示す。全ての複数回投与レジメおよび３時間の１回投与レジメは、炎症プロセスを94％抑制するアルゼット  ミニポンプによる７日間の投与と比較して炎症プロセスを約70％有意に抑制した（ｐ≦0.01）。AAチャレンジの１時間前に投与されたCT−112（配列番号１）の１回投与は炎症プロセスを有意に抑制しなかったが、43％の抑制が観察された。
AAチャレンジの６、３、１そして0.25時間前または16、３、１そして0.25時間前のCT−112（配列番号１）の複数回IP注射の投与は炎症の有意な減少（56〜61％）（ｐ≦0.01）をもたらした（表Ｖ）。しかしながら、CT−112（配列番号１）の７日間のアルゼット  ミニポンプ投与およびAAチャレンジの15分前のフェニドンの１回投与は炎症の大きな減少を生じた。
これらの結果は、腹腔内注射により投与されたCT−112（配列番号１）が急性皮膚炎症を有意に抑制し得ることを示す。
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11.実施例:CT−112の皮下注射の効果
この実施例は、皮下注射により投与されたCT−112（配列番号１）が炎症応答を抑制するのに有効であることを実証する。
11.1.材料および方法
AAチャレンジの前の複数回皮下注射によるCT−112（配列番号１）（60mg/kg/注射）のマウスへの注射を、
ａ）６、３、１そして0.25時間；
ｂ）３、１そして0.25時間；または
ｃ）１そして0.25時間に行った。
さらに、その他のマウスはAAチャレンジの３時間または１時間前にCT−112（配列番号１）（60mg/kg）の１回の皮下注射のみを受けた。対照マウスにAAチャレンジの３日間にPBSで充満されたアルゼットミニポンプを移植した。AAチャレンジは実施例７に上記したものと同じであった。これらの投薬レジメの結果を、60mg/kg/日を７日間送達するようにセットされたアルゼット  ミニポンプにより送達されたCT−112（配列番号１）の抗炎症活性と比較した。また、急性抗炎症活性に対するCT−112（配列番号１）の活性の期間をCT−112（配列番号１）の皮下注射後に分析した。
11.2.結果および考察
結果を表VIおよびVIIに示す。
皮下注射につき、複数回投薬レジメおよび１回投薬レジメの全てが、炎症プロセスを87％抑制するアルゼット  ミニポンプによる７日間の投与に較べて炎症プロセスを約70％有意に抑制した（ｐ≦0.05）（表VI）。
期間実験において、AAチャレンジの６時間前に皮下投与されたCT−112（配列番号１）による治療のみがAA誘発急性炎症を有意に抑制したが（ｐ≦0.05）（表VII）、これらの結果は活性の期間が６時間より大きいことを示唆する。この特定の実験において、アルゼット  ミニポンプによるCT−112（配列番号１）の60mg/kg/日の投与は炎症の通常観察される80〜90％の抑制を達成できなかった。これらの結果は、CT−112（配列番号１）がチャレンジの６時間前に皮下注射により投与された時に急性皮膚炎症を抑制するのに活性であったことを示す。
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12.実施例:CT−112の経口投与の効果
12.1.材料および方法
炎症を有効に抑制するように経口送達されたCT−112（配列番号１）の能力をマウスで分析した。
複数回の胃管栄養法（gavage）によるCT−112（配列番号１）（200mg/kg/回）の投与をAAチャレンジ前の下記の時間で行った。
ａ）６、３、１そして0.25時間；
ｂ）３、１そして0.25時間；または
ｃ）１そして0.25時間。
さらに、AAチャレンジの３時間または１時間前に投与されたCT−112（配列番号１）（200mg/kg）の１回胃管栄養法の効果を分析した。AAチャレンジは実施例７に上記したものと同じであった。これらの複数回投薬レジメまたは１回投薬レジメの結果を、60mg/kg/日を３日間送達するようにセットされたアルゼット  ミニポンプにより送達されたCT−112（配列番号１）の抗炎症活性と比較した。
12.2.結果および考察
結果を表IIIに示す。CT−112（配列番号１）がAAチャレンジの３、１、そして0.25時間前に投与された投薬レジメを除いて、経口投与された、複数回投薬レジメおよび１回投薬レジメの全てが炎症プロセスを有意に抑制した（52〜94％）（ｐ≦0.01または≦0.05）。この投薬レジメは炎症プロセスを44％だけ抑制し、統計上の有意差を得ることができなかった。この実験において、アルゼット  ミニポンプによる３日間の投与は炎症プロセスを88％抑制した。これらの結果は、CT−112（配列番号１）がチャレンジの少なくとも１時間前並びにチャレンジの３時間前までにマウスに経口投与される時に活性であることを示す。
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13.実施例：腹膜炎のカラゲナン誘発モデルに及ぼすCT−112の効果
炎症を抑制するCT−112（配列番号１）の能力を腹膜炎のカラゲナン誘発モデルにおいて更に調べた。このモデルはマウス耳AA誘発急性炎症モデルよりも炎症を抑制するCT−112（配列番号１）の能力の更に厳密な試験を提供する（Hannaら,1990,Drugs Exp.Clin.Res.16（４）:137−178;BrownおよびLeslie,1976,Surg.Gynecol.Obstet.143:738−740）。
13.1.材料および方法
マウス（C57BL/6UAF、雌、12週令）に、60mgのCT−112/kg/日を送達するようにセットされたアルゼット  ミニポンプを移植した。移植後６日目に、マウスにPBS中のカラゲナン（10mg/ml）0.3mlの腹腔内注射でチャレンジした。腹腔をハンクス平衡塩溶液（Ca2+およびMg2+を含まない）15mlでチャレンジの24時間、48時間そして72時間後に洗浄した。洗浄液を遠心分離（500g、５分）し、ロイコスタット固定液で固定し、そしてロイコスタット染色液で染色した。スライドを顕微鏡下で異なる型の炎症細胞、例えば、マクロファージ、リンパ球および好中球につき分析した。48時間の時点で、５匹の対照マウスも洗浄した。
別の実験において、腹腔洗浄液をチャレンジ24時間後に合計のロイコトリエンB4（LTB4）およびプロスタグランジンE2（PGE2）含量につき分析した（Griswoldら,1991,Biochem.Pharmacol.42（４）:825−831）。
13.2.結果および考察
結果を表IXおよび図６に示す。CT−112（配列番号１）はカラゲナン注射に応答する腹膜への好中球流入を減少した。この減少はチャレンジ72時間後に腹膜中の好中球の数の低下を生じ、これは統計上有意であった（ｐ≦0.05）。この実験において、マクロファージの数はCT−112（配列番号１）の投与に応答して増加するようであった。リンパ球に関する有意な効果は観察されたなかった。これらの結果は、CT−112が炎症部位でマクロファージの漸増を抑制しないことを示す。
LTB4およびPGE2の分析の結果を表Ｘに示す。CT−112（配列番号１）の投与後に、PGE2の量の統計上有意な（ｐ≦0.05）減少が腹腔洗浄液で認められ、一方、LTB4の量は影響されなかった。これらの結果は、炎症に関与するAA代謝経路の少なくとも一部が抑制されることを示す。
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14.実施例：構造と活性の関係
14.1.  CT−114およびCT−112の抗炎症活性の比較
14.1.1.材料および方法
CT−112（配列番号１）の類似体であるCT−114（Thr−Thr−Ser−Gln−Val）（配列番号６）をマウス耳の急性炎症モデルにおいて潜在的な二次薬物団として別に試験した。この実験において、CT−114（配列番号６）およびCT−112（配列番号１）をそれぞれ別々に調製し、6mgまたは60mgのペプチド/kg/日を送達するようにセットされた異なるアルゼット  ミニポンプに装填した。移植の３日後に、マウスを左の耳へのAAの適用によりチャレンジした。AAチャレンジは実施例７に上記されたものと同じであった。
14.1.2.結果および考察
結果を表XIに示す。CT−112（配列番号１）6mg/kg/日で治療されたマウスの炎症は対照とは統計上異ならなかった。CT−114（配列番号６）の6mg/kg/日の投与は対照と比較して炎症プロセスを有意に抑制し（ｐ≦0.05）、CT−112（配列番号１）により生じた炎症の抑制とCT−114（配列番号６）により生じた炎症の抑制の間に統計上の有意差（ｐ≦0.05）を生じた。CT−112（配列番号１）およびCT−114（配列番号６）の両方は60mg/kg/24時間で炎症プロセスを有意に抑制し（それぞれ、ｐ≦0.01およびｐ≦0.05）、これらの二つの群の間に統計上の差がなかった。これらの結果はCT−112（配列番号１）およびCT−114（配列番号６）が両方とも急性皮膚炎症を抑制できることを示す。
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14.2.  その他のペプチドの抗炎症活性
CT−112（配列番号１）およびCT−114（配列番号６）はα−ケモカインファミリーの一員であるPF4（配列番号９）から誘導されたペプチドであるので、またCT−112（配列番号１）およびCT−114（配列番号６）の両方はα−ケモカイン（Edgington,1993,Bio/Technology11:676−678;Broxmeyerら,1993 J.Immunol.150:3448−3458）の高度に保存されたCXC部分からカルボキシル末端の方にある二つのアミノ酸残基に位置されるので、α−ケモカインファミリーのその他のメンバーの同じ遺伝子座に見られる一連のペプチドが合成され、そしてマウス耳の急性炎症モデルにおいて抗炎症活性につき試験された。
さらに、β−ケモカインファミリーから同じ位置（CCモチーフのカルボキシル末端に向かって二つのアミノ酸残基）から誘導された一連のペプチドをまた試験した（注：α−ケモカインは好中球およびＴ細胞に特異的な活性を有し、またβ−ケモカインはマクロファージおよび単球に特異的な活性を有する）。成長因子から無関係の配列であるランダムオクタペプチド、CT−120（Val−Thr−Arg−Pro−Thr−Gln−Arg−Ser）（配列番号11）、およびアルブミンをまた試験した。
14.2.1.材料および方法
それぞれペプチドを、60mg/kg/日を送達するようにセットしたアルゼット  ポンプにより24時間にわたって投与した。この実験における多数の動物のために、化合物のグループをランダムに試験し、CT−112（配列番号１）またはPBS単独で処理された動物と比較し、そして炎症を抑制するそれらの能力につき評価した。AAチャレンジは実施例７に上記されたものと同じであった。
14.2.2.結果および考察
これらの結果を表XII〜XVに示す。活性の容易に認められるパターンが同定されなかったが、下記の結果を観察した。化合物はAA誘発炎症を抑制するのにCT−112（配列番号１）よりも有効ではなかった。最も有効な化合物（CT−112以外）はCT−119（配列番号21）、CT−164（配列番号16）およびCT−220（配列番号23）であった。これらの化合物のうち、CT−164のみがα−ケモカインファミリー（hENA78）から誘導される。アミノ酸残基のランダム配列であるCT−120（配列番号11）はAA誘発耳炎症の抑制に有効ではなかった。アルブミンは炎症の適度の抑制を生じたが、この現象は他の人達により観察されたもので、生物学上顕著とみなされない。これらの結果は、α−ケモカインおよびβ−ケモカインの両方に見られる配列から誘導された幾つかのペプチドが急性皮膚炎症を抑制し得ることを示す。しかしながら、試験した配列のうち、いずれもがCT−112（配列番号１）よりも有効ではなかった。
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14.3.CT−112のブロックされた変種、置換変種および末端切断型変種の抗炎症活性
CT−112（配列番号１）の抗炎症効果を、それらのアミノ末端もしくはカルボキシル末端でブロックされ、または両末端でブロックされ、或いは種々末端切断され、或いは特別なアミノ酸残基が置換または欠失された種々のCT−112類似体および誘導体の抗炎症効果と比較した。
14.3.1.材料および方法
CT−112誘導体化ペプチドの最初の組を化学合成した。これらはペプチドのアミノ末端に付加されたアセチル基を有するCT−112（配列番号１）オクタペプチド（Ac−TTSQVRPR）、ペプチドのカルボキシル末端に付加されたアミド基を有するCT−112（配列番号１）（TTSQVRPR−NH2）、および両末端でこうしてブロックされたCT−112（配列番号１）（Ac−TTSQVRPR−NH2）を含んでいた。加えて、第14.2節に記載されたように先に使用された、ランダムオクタペプチドであるCT−120（VTRPTQRS）（配列番号11）を、α−ケモカインファミリーの一員である結合組織活性化ペプチドIII（CTAP III）から誘導されたペプチドであるCT−127（TTSGIHPK）（配列番号12）と同様に試験した。
CT−112の全ての末端切断型ト変種であるCT−112（配列番号１）類似ペプチド（配列番号３、４、６、24〜28）の第二の組を化学合成した。
CT−112（配列番号１）類似ペプチド（配列番号25、26、29〜73）の第３の組を化学合成した。ここで、CT−112（配列番号１）を構成する８種のアミノ酸残基のそれぞれを逐次置換または欠失した。特定の残基が置換されたペプチドのそれぞれの種において、アミノ酸残基をそのＤ−アミノ酸対応物、またはアラニル残基、グルタミル残基、リシル残基もしくはロイシル残基で置換した。
三つの組のそれぞれ中のペプチドを、マウス耳の急性炎症モデルを使用して抗炎症活性につき試験した。AAチャレンジは実施例７上記されたものと同じであった。７〜10匹の動物をそれぞれの試験ペプチドにつき使用した。全ての動物はAAによるチャレンジの４時間前に１回の6mg/kgの皮下投与を受けた。耳の厚みの測定をチャレンジ１時間後に行った。
14.3.2結果および考察
結果は図７−９及び表XVI,XVIIに示す。CT−112から派生したペプチドの第一番目のセットについては、CT−112（配列番号1,IDは連続番号）の一方の末端または両端をブロックしたものでは炎症抑制能の有意の減少が認められた（図７、表XVI）。CT−120（配列番号11）はランダムなペプチドであり、以前に実験したときはほとんど活性を示さなかったが、本実験では炎症を有意に抑制した（図７）。さらに、CT−127（配列番号12）も炎症抑制に有意に有効であった。これらの結果は別のα−ケモカイン由来のペプチドが炎症抑制能を有していることを示している。
CT−112類縁のペプチドの第二番目のセット（配列番号3,4,6,24−28）については、CT−112（配列番号１）の両端のアミノ酸残基を一つまたはそれ以上切り取ったものには炎症抑制能の有意の減少が認められた（図８、表XVI）。第二セットの結果からはCT−112（配列番号１）の炎症抑制能はインタクトなオクタペプチドの状態が最も活性が高いことが示されている。
CT−112類縁のペプチドの第三番目のセット（配列番号25,26,29−73）については、アミノ酸残基のどれかをそのアミノ酸に対応するＤ−アミノ酸に置換した場合の影響はその置換された残基によって異なる結果であった（図９、表XVII）。例えば、Ｌ−Thr1またはＬ−Thr2をＤ−Thrに置換した場合、そのペプチドにはかなりの抗炎症活性が残存していたが、Gln4またはArg8の置換は活性を有意に低下させた。
Thr1またはSer3をAlaで置換した場合には活性は低下したが、Arg6をAlaで置換した場合には抗炎症活性はわずかながら増強された。
Thr2またはArg8をGluで置換した場合には活性は低下したが、Ser3またはArg6をGluで置換した場合には抗炎症活性はわずかながら増強された。
アミノ酸残基をLysで置換した場合には概してほとんど影響がないようだが、Thr1をLysで置換した場合には活性の低下が見られた。
Gln4またはArg8をLeuで置換した場合には得られたペプチドの活性の顕著な低下が見られた。
Pro7を除くどのアミノ酸についてもそれを取り除いた場合には得られたペプチドの活性の低下が認められた。
これらの結果は、CT−112（配列番号１）投与によって認められた活性は、ペプチドの非特異的な作用によるのではなく、ペプチド分子の特定の構造特性に関連があることを示している。活性はそのペプチドのアミノ酸列を特異的に変えることによって増強または、低下しうる。
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15.実施例：遅延型過敏症に対するCT−112の効果
15.1材料および方法
CT−112（配列番号１）の免疫応答調節能をマウスの遅延型過敏症モデル（Filippら,1984,Allergy,39:499−507;Diezelら,1989,J.Invest.Dermatol.93:322−326）を用いて調べた。本実験で用いたのは８週令の雌の無毛マウス（Jackson Laboratories）である。マウスは接触アレルゲン（１−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン、DNCB）を用いて感作した。感作は、0.5％DNCB溶液（75％アセトン:25％植物油に溶解したもの）50μｌを１日２回、５日間連続してマウスの背胸部に塗布することによって行った。DNCBチャレンジ前の24時間はすべてのマウスを休息させた。感作開始後６日目に50μｌのDNCB溶液を左耳に塗ることによりチャレンジした。24時間後に耳の厚さを測定し、チャレンジしていない側の耳と比較した。
処置群は次の通り
ａ）PBS対照
ｂ）プレドニゾン（25mg/kgをチャレンジの２時間前に腹腔内投与）
ｃ）７日間ポンプ投与（60mg CT−112/kg/24hr）
ｄ）CT−112（一回当たり60mg/kgをチャレンジの３時間前,1時間前,15分前及び3,6,21時間後に腹腔内投与）
ｅ）DMSO対照（チャレンジの３時間前,1時間前,15分前に50μｌを局所投与）
ｆ）CT−112のDMSO溶液（20mg/ml溶液を50μl,チャレンジの３時間前,1時間前,15分前及び3,6,21時間後に局所投与）
15.2結果および考察
結果は表XVIIIに示す。DNCBによって惹起された遅延型過敏症の抑制能に関してCT−112（配列番号１）はプレドニゾンに匹敵するものであった。CT−112（配列番号１）DMSO溶液の局所投与群と、ビヒクル（DMSO）のみの局所投与群との間には統計学的有意差が認められた。CT−112（配列番号１）の局所投与は遅延型過敏症の減少に関してPBS対照（DMSOのみの局所投与を受けていない）との間に統計学的有意差は認められなかった。
本実験の結果は、CT−112（配列番号１）は全身投与した場合には遅延型過敏症の防止に有効であることを示している。このことはCT−112（配列番号１）の活性は好中球に厳格に特異的というのではなくＴ細胞を介した免疫応答にも影響を及ぼすことを示唆している。
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16.実施例:II型コラーゲン誘発関節リウマチに対するCT−112の効果
CT−112（配列番号１）のII型コラーゲン誘発関節炎（CIA）の発症抑制に対する効果を調べた。CIAは関節炎の実験モデルであり、病理学的、免疫学的および遺伝子学的に多くの点で関節リウマチと共通するものを持っている（Wooley,1988,Meth.Enzym.162:361−373）。CIAはII型のコラーゲンでその作用を受けやすいマウスの系統を免疫することによって誘発しうる。免疫後、進行性で炎症性の関節炎が免疫された動物の大多数で発症し、それは臨床的には紅斑および浮腫で特徴づけられる。このモデルは、宿主自身の結合組織の分子群、すなわち、関節の軟骨組織に見出されるII型のコラーゲンに対して免疫応答が起こる病態をまねようと作り出されたものである（Wooley,1988同上）。
16.1材料および方法
マウス（DBA/1,10−12週令,Jackson Laboratories）は１群各12匹，計３群に無作為に割り付けた。CT−112（配列番号１）は滅菌したPBSで溶解し注射用として。CT−112（配列番号１）は次の投与スケジュールに従い連日投与した。
ａ）対照群（0.1ml滅菌PBS）（７匹）
ｂ）CT−112低投与量群（0.1ml滅菌PBS中に0.25mgのCT−112を含有する溶液を用い、10mg/kgで投与）（８匹）
ｃ）CT−112高投与量群（0.1ml滅菌PBS中に2.5mgのCT−112を含有する溶液を用い、100mg/kgで投与）（８匹）
CT−112（配列番号１）の初回投与の３日後に全てのマウスの尾の基部に100μｇのウシII型コラーゲンをフロインドの完全アジュバントとともに皮内に注入した。マウスの観察は症状の発現については毎日行い、体重は週に２回、全般的な健康状態とともに記録した。関節炎の発症が見られたマウスについては週に５回、免疫後10週間まで臨床的評価を行った。足の測定は週３回実施した。免疫後10週間経過しても関節炎の兆候が現れなかったマウスは発病なしと見なした。
すべてのマウスは実験開始前に採血し、さらに、免疫２週間後、４週間後、CIAの発症時点、及び本実験終了時点で採血を行った。血清を分離し−80℃で保存した。抗コラーゲン抗体濃度の測定はELISAで行った。脾臓とリンパ節は屠殺時に取り出し、単細胞懸濁液を作った。Con A及びLPSに対するマイトジェン反応、II型コラーゲンに対する抗原特異的反応についても調べた。
適切な統計学的解析法（カイ二乗検定、StudentのＴ検定及びノンパラメトリック中央値比較検定）をSPSS/PCソフトウエアを用いて行い、抵投与量及び高投与量CT−112（配列番号１）のコラーゲン誘発関節炎の発症率・発症時期・重篤度および進行度、コラーゲンに対する抗体形成、Ｔ細胞及びＢ細胞のマイトジェン反応、II型コラーゲンに対するＴ細胞特異的応答に及ぼす影響について調べた。
16.2結果および考察
CIAの発症率と発症時期を図10に示した。関節炎の発症時期についてはCT−112（配列番号１）の低及び高投与量群とも対照群に比べいくらか遅くなった。最終的なCIAの発症率は対照群（87.5％）は高投与量群（50％）及び低投与量群（62.5％）のいずれよりも高かった。これら２つの結果とも対照群に比し統計学的には有意差はなかったが、高投与量群における関節炎発症率においては統計学的に有意な減少までは至らなかったもののその傾向は明瞭であった（ｐ＝0.14）。
低投与量群では関節炎の病状の進行は有意に少ない数の足で見られ（ｐ＝0.035）、重篤度においては対照群に比し統計学的に有意差の認められる程度に近い減少を示した（ｐ＝0.058）。関節炎の各パラメーターを経時的に分析したところ、CT−112（配列番号１）の高、低投与量群とも今回の実験の対象となっていない方の肢への関節炎の進行を遅らせ、「病状進行度」指数、この指数は炎症性疾患から関節のびらん性障害への進行を特徴づけるものだが、これに顕著な影響を及ぼすことが示唆された（図12）。
興味深いことに、低投与量群では本実験で対象とした足の25％に実験終了時に緩解が認められたのに対し、対照群では6.3％であった。しかしこの差は統計学的には有意ではなかった。足の腫脹の最大値はCT−112（配列番号１）投与の影響を受けなかった。
CT−112（配列番号１）高投与量、低投与量の両群ともCIAの病理組織所見に影響を及ぼした（図13）。つまり、関節炎の発症によって惹起された関節のびらんの減少と、関節の構造の損傷の有意の減少（ｐ＝≦0.05）が生じた。しかしCT−112（配列番号１）は滑膜炎とパンヌスに対して有意な影響を及ぼさなかった。これはおそらくCT−112（配列番号１）が炎症細胞の全タイプに効果があるわけではないからであろう。すなわち、顆粒球、マクロファージ、線維芽細胞及びその他の炎症関連細胞の炎症刺激に対する応答についてはおそらく変わっていないのであろう。このことはCT−112（配列番号１）が炎症反応系の特定のところを抑制しているとの結論を支持している。
CT−112（配列番号１）の高、低投与量群ともマウス血清中の抗コラーゲン抗体価を低下させるようである。免疫４週後の抗体価は高投与量群では統計学的に有意に低下していた（ｐ＝0.028）（図14）。抗コラーゲン抗体価の差は発症時に最も大きなものとなったが、この時点ではサンプルサイズが小さすぎ、統計学的有意差には至らなかった。
実験終了時点では低投与量群の抗コラーゲン抗体価は対照群に比べ有意に高かった。対照群における抗体価の低下がこの差をもたらしたのだが、これはこの実験モデルに典型的な現象である。このデータは、CT−112（配列番号１）はコラーゲンに対する血清学的反応を抑制すると言うよりはむしろ遅延させることを示唆している。
リンパ節細胞におけるマイトジェン及び抗原（II型コラーゲン）に対する細胞性反応は対照群、投与群とも同様であった。CT−112（配列番号１）投与群マウスの脾臓細胞のCon A及びLPSに対する応答から見て免疫抑制も亢進も起こっていないことが示唆される。全群において繁殖性については関節炎を発症したマウスとしないマウスで同様であった。
血液学的検査値に変化は認められず、全ての被験動物は、全観察期間を通じて同程度の速さで体重の増加が見られた。
17.実施例：毒性試験
次の実施例はCT−112（配列番号１）の毒性を調べるために行った各種の実験を要約したものである。
CT−112（配列番号１）の変異原性を調べた。CT−112（配列番号１）は100−5,000μg/mlの濃度範囲でラット肝ミクロソーム酵素で活性化したものとしないもののどちらについてもサルモネラ復帰突然変異試験（Arnesら,1975,Mutation,Res.31:347−364）で復帰突然変異体（ヒスチジン非依存性の増殖を示す）の数を増加させなかった。CT−112（配列番号１）は1,260−4,990μg/mlの濃度範囲でラット肝ミクロソーム酵素で活性化したものとしないもののどちらについてもチャイニーズハムスター卵巣細胞アッセイ法（Evans,H.J.,1962,Int.Rev.Cyt.13:221−321）で染色体異常を誘発しなかった。
CT−112（配列番号１）は500−5,000μg/mlの濃度範囲でラット肝ミクロソーム酵素で活性化したものとしないもののどちらについてもヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）陽性のチャイニーズハムスター卵巣細胞に前進突然変異（フォワードミューティション）を起こさなかった。前進突然変異をこれらの細胞が起こすと、HGPRTの発現能を失い、有毒なプリン類縁体に対する感受性を失う（Hsieら,1975,Somat.Cell Genet.1:247−261）。
CT−112（配列番号１）は62.5,125及び250mg/kgの濃度でマウス骨髄多染性赤血球アッセイ法（Heddle et al.,1983,Mut.Res.123:61−118）で24,48,72時間後のいずれにおいても小核の有意な増加を誘発しなかった。
CT−112（配列番号１）の急性毒性をマウス及びラットで調べた。マウスについては100,500または1,000mg/kgを静注した。一過性の臨床症状がわずかながら見られた。それらは行動抑制と過敏症状で投与日に500mg/kgで１匹、1000mg/kgで２匹に認められたが、これらのマウスはその翌日に正常な外観に戻った。平均体重及び体重増加の平均値については対照群と投与群との間に統計学的な有意差は認められなかった。剖検ではマウスにも病変は認められなかった。
ラットに対してはCT−112（配列番号１）を100,500または1,000mg/kg投与した。一過性の臨床症状（行動抑制、過敏症状、よたつき歩行、チアノーゼ及び立ち直り反射の消失）が投与日に500mg/kg及び1,000mg/kg群の数匹のラットに認められた。これらのラットは全て翌日には正常な外観に戻った。平均体重及び体重増加の平均値については対照群と投与群との間に統計学的な有意差は認められなかった。剖検ではどのラットにも病変は認められなかった。
本発明について、上記の実施態様を特に言及しながら詳細に記述してきた。しかしながら、本発明は上記の実施態様、それは本発明のある態様を例示するものであるが、それのみに本発明の範囲を限定すべきものではないと理解するべきである。
事実、ここに記述した事柄に加えて本発明にいろいろな改変を加えることは当業者にとっては自明なことであろう。そのような改変は本発明の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本明細書中に引用された各種の参照文献は、参考としてその全体を本明細書中に組み込むことにする。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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配列
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配列番号:26
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配列番号:28
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配列の種類：ペプチド
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アンチセンス:NO
配列
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配列番号:29
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:30
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:31
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:32
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:33
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:34
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:35
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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アンチセンス:NO
配列
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配列番号:36
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
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配列
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配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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配列
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配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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配列
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配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
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配列
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配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:41
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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アンチセンス:NO
配列
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配列番号:42
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:43
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:44
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:45
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:46
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:47
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:48
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
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アンチセンス:NO
配列
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配列番号:49
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:50
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:51
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:52
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:53
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:54
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:55
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:56
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:57
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:58
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:59
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:60
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:61
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:62
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:63
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
0003645905.tif 000084
配列番号:64
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
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配列番号:65
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
0003645905.tif 000086
配列番号:66
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:1
他の情報:/label＝Ｄ−Thr/note＝“Ｘ＝Ｄ−Threonine"
配列
0003645905.tif 000087
配列番号:67
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:2
他の情報:/label＝Ｄ−Thr/note＝“Ｘ＝Ｄ−Threonine"
配列
0003645905.tif 000088
配列番号:68
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:3
他の情報:/label＝Ｄ−Ser/note＝“Ｘ＝Ｄ−Serine"
配列
0003645905.tif 000089
配列番号:69
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:4
他の情報:/label＝Ｄ−Gln/note＝“Ｘ＝Ｄ−Glutamine"
配列
0003645905.tif 000090
配列番号:70
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:5
他の情報:/label＝Ｄ−Val/note＝“Ｘ＝Ｄ−Valine"
配列
0003645905.tif 000091
配列番号:71
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:6
他の情報:/label＝Ｄ−Arg/note＝“Ｘ＝Ｄ−Arginine"
配列
0003645905.tif 000092
配列番号:72
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:7
他の情報:/label＝Ｄ−Pro/note＝“Ｘ＝Ｄ−Proline"
配列
0003645905.tif 000093
配列番号:73
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列の特徴
特徴を表す記号:Modified−site
存在位置:8
他の情報:/label＝Ｄ−Arg/note＝“Ｘ＝Ｄ−Arginine"
配列
0003645905.tif 000094
【図１０】
0003645905.tif 000095
【図１】
0003645905.tif 000096
【図２】
0003645905.tif 000097
【図３】
0003645905.tif 000098
【図４】
0003645905.tif 000099
【図５】
0003645905.tif 000100
【図６】
0003645905.tif 000101
【図７】
0003645905.tif 000102
【図８】
0003645905.tif 000103
【図９】
0003645905.tif 000104
【図１１】
0003645905.tif 000105
【図１２】
0003645905.tif 000106
【図１３】
0003645905.tif 000107
【図１４】
0003645905.tif 000108