(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前処理としてファフィア（Phaffia）属酵母菌体懸濁液にストレプトマイセス・ロシェイ（Streptomyces rochei）により生産される酵素（酵素１４２８４）を作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法であって、該酵素１４２８４が、ストレプトマイセス・ロシェイ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２８４）を放線菌用液体培地にファフィア属酵母菌体を誘導基質として添加した培地にて培養し、得られた培養上清を濃縮または凍結乾燥して得られるものである方法。
【請求項２】
前処理としてファフィア属酵母の培養終了後の培地中に酵素１４２８４を直接添加して作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法であって、該酵素１４２８４が、ストレプトマイセス・ロシェイ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２８４）を放線菌用液体培地にファフィア属酵母菌体を誘導基質として添加した培地にて培養し、得られた培養上清を濃縮または凍結乾燥して得られるものである方法。
【請求項３】
ファフィア属酵母菌体懸濁液に酵素１４２８４および抽出溶剤を直接添加して作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法であって、該酵素１４２８４が、ストレプトマイセス・ロシェイ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２８４）を放線菌用液体培地にファフィア属酵母菌体を誘導基質として添加した培地にて培養し、得られた培養上清を濃縮または凍結乾燥して得られるものである方法。
【請求項４】
酵素１４２８４を作用させるに際して処理液pＨを３．０〜１０．０、液温度を１０〜５０℃とし、１時間以上溶菌反応を行うことを特徴とし、該酵素１４２８４が、ストレプトマイセス・ロシェイ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２８４）を放線菌用液体培地にファフィア属酵母菌体を誘導基質として添加した培地にて培養し、得られた培養上清を濃縮または凍結乾燥して得られるものである、請求項１、２または３に記載のファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はカロチノイド系天然色素として有用な赤色色素のファフィア属酵母菌体からの抽出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ファフィア属酵母は菌体内に赤色色素を蓄積することで知られており、この赤色色素の主体はカロチノイド色素のアスタキサンチンである。アスタキサンチンは発色性、耐光性、耐熱性、着色性に優れた天然色素として、また養殖魚の色揚げ剤として有用であり、さらに抗酸化剤としても注目されている。その分離源としては天然物が求められており、天然のアスタキサンチン源としてはファフィア属酵母の他にカニ、エビなどの甲殻類、オキアミなどの動物プランクトン、ヘマトコッカス（Haematococcus）属の緑藻などが挙げられるが、カニ、エビなどの甲殻類は、大量生産が難しい上に硬い殻からの抽出が困難であり、オキアミなどの動物プランクトンは大量生産が難しい、等の問題点がある。ファフィア属酵母およびヘマトコッカス属緑藻は共に大量培養が可能であるが、ヘマトコッカスは藻体内にクロロフィルを含むため、アスタキサンチン抽出時にクロロフィルの除去が必要になるという欠点を有する。これらの現状から、ファフィア属酵母は赤色色素アスタキサンチン源として有望と期待される。
【０００３】
ファフィア属酵母から赤色色素を抽出するにあたっては、有機溶剤などで抽出を行う際に前処理として細胞壁の破砕、もしくは溶解という前処理が必要となる。前処理の手法としては、物理的手法であるフレンチプレス、ガラスビーズ、超音波などによる破砕、化学的手法である酸による分解、生物学的手法である酵素による溶解等が考えられるが、物理的手法は、大量に処理するには特別な装置が必要となるためあまり実用的とはいえず、酸による分解は、処理に危険を伴うことや廃液の処理の問題などを抱えている。したがって、特別な装置を必要とせず、穏和な条件で処理を行うことができる酵素処理が最も実用性の高い前処理法といえる。しかし酵素処理については、これまでの状況では色素の抽出率という点で満足できるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来の色素抽出における問題を解決し、抽出効率の高い色素抽出のための酵素による前処理方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、ファフィア属酵母菌体からの有機溶剤等による赤色色素抽出効率は、前処理として菌体懸濁液に作用させる酵素によって異なり、ストレプトマイセス・ロシェイの一菌株により生産される酵素を作用させたときに限り抽出効率が著しく高くなることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、
【０００７】
（１）前処理としてファフィア属酵母菌体懸濁液にストレプトマイセス・ロシェイにより生産される酵素（酵素１４２８４）を作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法、
（２）前処理としてファフィア属酵母の培養終了後の培地中に酵素１４２８４を直接添加して作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法、
（３）ファフィア属酵母菌体懸濁液に酵素１４２８４および抽出溶剤を直接添加して作用させることを特徴とするファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法、および
（４）酵素１４２８４を作用させるに際して処理液pＨを３．０〜１０．０、液温度を１０〜５０℃とし、１時間以上溶菌反応を行うことを特徴とする上記（１）、（２）または（３）に記載のファフィア属酵母からの赤色色素の抽出法
を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いるファフィア属酵母としては、色素産生能等の点からファフィア・ロドジマが好ましい。この酵母菌体を、例えば、通常の酵母に適する液体培地（例えば、グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、リン酸二水素カリウム０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．２％、ｐＨ５．５）を用い、常法により振盪培養または通気撹拌培養することにより得ることができる。
【０００９】
本発明に用いる溶菌酵素は酵素１４２８４である。該酵素の生産菌はストレプトマイセス・ロシェイである。この菌株は、平成６年４月２１日より工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２８４の下に寄託されている。該酵素は、このストレプトマイセス・ロシェイを、例えば、通常の放線菌用液体培地にファフィア属酵母菌体を誘導基質として添加した培地（例えばファフィア属酵母菌体０．３％、グルコース０．１％、ＹＮＢ０．６７％、リン酸二水素カリウム０．６８％、ｐＨ６．８）を用い、常法により振盪培養または通気撹拌培養して得られた培養上清を濃縮または凍結乾燥等することにより得ることができる。
【００１０】
ファフィア属酵母菌体を、培養終了後遠心分離または濾過等公知の方法により回収し、緩衝液または蒸留水等で洗浄した後、緩衝液または蒸留水等に懸濁して酵素１４２８４による溶菌を行う。また、培養終了後、培地に直接酵素１４２８４を添加して溶菌を行うこともできる。溶菌反応の条件としては、ｐＨは、酵素の至適条件であり、かつ色素が酸化されない条件が望ましく、３．０〜１０．０、好ましくは５．０〜７．０が適当である。緩衝液を用いる場合には、マキルベイン（McIlvaine）緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が適当である。温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃が適当である。反応液中の菌体濃度は１〜１０％程度が好ましい。反応時間は酵素の添加量に応じて適宜十分な時間行えばよいが、酵素を十分添加した場合、１時間以上、好ましくは４時間以上の溶菌反応で色素の抽出効率を著しく高めることができる。溶菌反応終了後は処理菌体を再度遠心分離等により回収し、有機溶剤を添加して色素を抽出する。この場合、有機溶剤を加えて撹拌するだけで容易に色素を抽出することができる。用いる有機溶剤としては、アセトン、メタノール等水溶性のものが好ましく、その添加量は、乾燥菌体重量の２０〜５０倍が適当である。また、上記ファフィア属酵母菌体懸濁液に酵素１４２８４および抽出溶剤を直接添加することにより色素抽出工程の簡略化を図ることもできる。
【００１１】
【実施例】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ファフィア・ロドジマを、グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、リン酸二水素カリウム０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．２％からなる液体培地、ｐＨ５．５中にて３〜４日、２５℃で振盪培養した後、遠心分離により菌体を集め、蒸留水で２〜３回洗浄した。この菌体を、５０mＭのリン酸緩衝液(pＨ６．０)またはマキルベイン緩衝液(pＨ７．５)に乾燥菌体濃度５％となるように懸濁し、沸騰水浴中１０分間の加熱処理を行った。冷却後、菌体懸濁液を２０mlずつ分注し、酵素１４２８４、市販の細胞壁溶解酵素であるＹＬ−１５(天野製薬株式会社製)、ツニカーゼＦＮ(大和化成株式会社製)をそれぞれ作用至適pＨの懸濁液に、乾燥菌体に対し１％濃度となるよう添加し、酵素１４２８４、ツニカーゼＦＮは３０℃、ＹＬ−１５は５０℃でそれぞれ２０時間溶菌反応を行った。その後沸騰水浴中１０分間の加熱処理を行い、冷却後遠心分離して集めた菌体に乾燥菌体重量の５０倍量のアセトンを添加、撹拌し、色素を抽出した。色素抽出率の比較は波長４７０nmの吸光値の測定により行い、酵素１４２８４の吸光値を１００としたときの吸光値の割合を表１に示した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
酵素１４２８４を用いた場合の抽出率が、他の市販の細胞壁溶解酵素を用いた場合よりも極めて高いことがわかった。
【００１４】
実施例２
実施例１と同様にして集めたファフィア・ロドジマ菌体を、５０mＭのリン酸緩衝液(pＨ６．０)に乾燥菌体濃度５％となるように懸濁し、沸騰水浴中１０分間の加熱処理を行い、冷却後、以下の処理をそれぞれ行った。
▲１▼酵素処理:酵素１４２８４を用い、実施例１と同様に溶菌反応を行った。
▲２▼塩酸処理:菌体懸濁液を遠心し、集めた菌体を、１Ｎ−ＨＣlに乾燥菌体重量  ５％となるよう懸濁し、沸騰水浴中１０分間の加熱処理を行った。
▲３▼フレンチプレス処理:菌体懸濁液を、ＡＭＩＮＣＯ  Ｔhe  ＦＲＥＮＣＨ    Ｐressure  Ｃell  Ｐress、目盛りＨigh−１０００(約１０００気圧)で    ５回処理を行った。
▲４▼ガラスビーズ処理:菌体懸濁液に、液と同量の酵母破砕用ビーズ(φ０．４５    mm）を加え、タッチミキサーで５分間破砕を行った。
▲５▼超音波処理:菌体懸濁液を、ＴＯＭＹ  ＵＤ−２００、目盛り１０で２０分間破砕を行った。
いずれも、処理後遠心分離して集めた菌体に乾燥菌体重量の５０倍量のアセトンを添加、撹拌し、色素を抽出した。色素抽出率の比較は波長４７０nmの吸光値の測定により行い、酵素１４２８４を用いて抽出した場合の吸光値を１００としたときの吸光値の割合を表２に示した。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
酵素１４２８４処理を行った場合の色素抽出率が、他の処理のものと比べて高いことがわかった。
【００１７】
実施例３
実施例１と同様にして集めたファフィア・ロドジマ菌体に、それぞれ、実施例１と同様の酵素処理、および実施例２と同様の塩酸処理を行った。処理後遠心分離して集めた菌体に乾燥菌体重量の５０倍量のアセトンを添加、撹拌して色素を抽出し、色彩色差計で色調を測定した測定値を表３に示した。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
色相角度Ｈ°は以下の式によって算出される。
Ｈ°＝tan-1(b／a)
色相角度Ｈ°は０なら赤味のみ、９０なら黄味のみであることを示す。値が小さいほど赤系の色合いが強い。
色相角度Ｈ°を比較すると、酵素１４２８４を用いた場合の抽出色素の色合いが最も赤味が強かった。
【００２０】
実施例４
ファフィア・ロドジマ菌体からそれぞれ酵素処理およびＨＣl処理を行い抽出した色素と、市販のカニ色素、合成アスタキサンチンをＴＬＣにより比較した結果を図１に示す。いずれもアセトンで抽出し、薄層プレート(メルク（MERCK）社製、Kieselgel  ６０、０．２５mm)にスポット後、アセトン:石油エーテル＝２:８展開溶媒で遮光下で展開を行った。カロチノイドの同定はＴＬＣプレート上でのＲf値を測定し、文献値と比較することによって行い、カロチノイドの組成比は、展開分離後の色素の、アセトン中の吸光値の測定によって行った。ファフィア・ロドジマ菌体から抽出した色素のＴＬＣプレート上でのＲf値は、アスタキサンチンの文献値と一致し、合成のアスタキサンチンのＲf値とも一致した。酵素処理によるものはその構成比が、トランス型が約８５％、シス型が約１５％で、合成のアスタキサンチンの構成比とほぼ同じであった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ファフィア属酵母菌体から有用赤色色素を抽出する際の前処理として簡単な酵素処理を行うことにより、従来法と比べて極めて高い抽出率で赤色色素を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  酵素処理およびＨＣl処理を行い抽出した色素と、市販のカニ色素、合成アスタキサンチンをＴＬＣにより比較した模写図である。
【図１】
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