(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックウシのミルクにおいてラクトフェリンを産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
トランスジーンを含むトランスジェニックウシを提供する工程であって、該トランスジーンは、
少なくとも約３０ｋｂのヒトゲノムフラグメントに作動可能に連結されたウシαＳ１カゼインプロモーターを含み、該フラグメントは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコードし、そして該ヒトラクトフェリン遺伝子、該ゲノムフラグメントの３’隣接配列の少なくとも約７ｋｂを含み、
ここで、該トランスジェニックウシは、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度で該トランスジェニックウシのミルク中に該タンパク質を分泌する、工程；ならびに
該トランスジェニックウシからミルクを収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プロモーターは、ウシαＳ１カゼインプロモーターであり、そして６．２ｋｂまたは１４．５ｋｂのウシαＳ１カゼインフラグメント上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミルクから前記タンパク質を精製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質を食品処方物中に取り込ませる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、トランスジェニックウシ種による組み換えポリペプチドの製造及び所望の表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法に関する。
発明の背景
下等生物例えば、単細胞バクテリア、酵母及び糸状菌、及び高等細胞タイプ例えば哺乳動物細胞中での異種遺伝子の発現に関する極めて多くの文献がある。また、トランスジェニック動物の製造についての非常に多くの報告があり、それらの大部分は、トランスジェニックマウスの製造に関するものである。例えば、米国特許第4736866号明細書（活性化されたオンコジーンを含むトランスジェニックマウス）；Andres,A.ら1987年Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第84巻、第1229〜1303頁（乳漿酸タンパク質プロモーター制御下でのHA-RASオンコジーン）；Schoenberger,C.A.ら、1987年、Experientia、第43巻、第644頁、及び1988年、EMBO.J.、第７巻、第169〜175頁（乳漿酸タンパク質プロモーターの制御下でのＣ−ｍｙｃオンコジーン）；及びMuller,W.J.ら、1988年、Cell、第54巻、第105〜115頁（マウス乳ガンウィルスプロモーターの制御下でのＣ−ｍｙｃオンコジーン）を参照。また、いくつかの研究室では、トランスジェニックブタ種（Muller,K.F.ら、1989年、J.Endocrin、第120巻、第481〜488頁（トランスジェニックブタでのヒト又はウシ成長ホルモン遺伝子の発現）；Vize,P.D.ら、1988年、J.Cell Sci.、第90巻、第295〜300頁（トランスジェニッックブタでのブタ成長ホルモン融合遺伝子）；及びEbert,K.ら、1988年、Mol.Endocrin.、第２巻、第277〜283頁（トランスジェニックブタでのＭＭＬＶ−ラット  ソマトトロピン融合遺伝子））、トランスジェニックヒツジ（Nancarrowら、1987年、Theriogenology、第27巻、第263頁（ウシ成長ホルモン遺伝子を含むトランスジェニックヒツジ）、Clark A.J.ら、1989年、Bio/Technology、第７巻、第487〜482頁及びSimon,J.ら、1988年、Bio/Technology、第６巻、第179〜183（ヒツジ種でのヒト因子IX及びα−１抗トリプシン  ＣＯＮＡ）及びウサギ（Hanover,S.V.ら、1987年、Deutche Tierarztliche Wochenschrift、第94巻、第476〜478頁（受精ウサギ卵母細胞中へのウテログロブリン−プロモーター−ＣＡＴ融合遺伝子の注入によるトランスジェニックウサギの製造）の製造を報告している。多くの報告はまたトランスジェニックウシの製造を示唆しており（Wangerら、1984年、Theriogenology、第21巻、第29〜44頁）、その一つはマイクロインジェクション技術（Lohse,J.K.ら1985年、Theriogenolony、第23巻、第205頁）の進歩を報告している。しかしながら、トランスジェニック乳牛の製造の成功は、たとえあったとしても、ほとんどない。異種のタンパク質を製造できるトランスジェニック乳牛の実際の製造を明らかに示している科学的な論文は現在、知られていない。ヒトβ−インターフェロンを発現するトランスジェニック乳牛ウシが、カナダで製造された（Van Brunt,J.、1988年、Bio/Technology、第６巻、第1149〜1155頁）、そして、肝臓及び血液中でのヒトα−フェトプロテインの一時的発現がある場合に得られた（Church,R.B.,1986年、Biotechnology News Watch,第６巻（15）、第４頁）という記述にもかかわらずにである。ある文献は、ウシパピローマウィルスがトランスジェニック乳牛中に明らかに組み込まれたが発現されなかったことを報告している（Roschlauら、1988年、Arch.Tierz、ベルリン、第31巻、第３〜８頁）。ある最近の論文は、家畜の遺伝工学を要約している（Pursel,V.G.ら、1989年、Science、第244巻、第1281〜1288頁）。
多くの研究室が、乳腺での種々のタンパク質をエンコードするＤＮＡの組織特異的発現又はトランスジェニックマウス及びヒツジのミルク中での種々のタンパク質の製造を報告している。例えば、Simmons,J.P.ら、1987年、Nature、第328巻、第530〜532頁は、４kbの５′配列、4.9kbのＢＬＧ転写単位及び7.3kbの３′フランキング配列を含むβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）をエンコードする16.2kbのゲノムフラグメントの、受精したマウス卵へのマイクロインジェクションを報告している。これらの著者に従えば、ヒツジＢＬＧは、乳房組織中で発現され、そしてトランスジェニックマウスのミルク中に約3.0〜約23mg/mlの範囲の濃度にてＢＬＧを製造した。しかしながら、ヒト因子IX又はヒトα１−抗トリプシンをエンコードするｃＤＮＡが、ＢＬＧ遺伝子の５′非翻訳領域中に挿入され、そして、ヒツジ中へマイクロインジェクションされた（Simmons,J.P.ら、1988年、Bio/Techonology、第６巻、第179〜183頁）場合は、因子IX又はα１−抗トリプシンの製造は非常に減少している（因子IXは25ng/ml及びα１−抗トリプシンは10mg/ml、Clark,A.J.ら、1989年、Bio/Techonology、第７巻、第487〜492頁参照）。
伝えられるところによると、類似のアプローチで、3.5kbの５′フランキングＤＮＡ及び3.0kbの３′フランキングＤＮＡとともに無傷の7.5kbのラットβ−カゼインを含む14kbのゲノムクローンが受精マウス卵母細胞中にマイクロインジェクションされた。Leeら、1988年、Nucl.Acids Res.、第16巻、第1027〜1041頁。このケースでは、また、トランスジェニックマウスの乳分泌乳腺中のラットβ−トランスジーンの発現レベルは、内在性マウスβ−カゼイン遺伝子の0.01〜１％のレベルにあると報告された。
伝えられるところによると、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）をエンコードするｃＤＮＡがその内在性分泌配列とともに、乳漿酸タンパク質遺伝子の2.6kbの５′配列の制御下で発現されると、ヒトｔ−ＰＡは、トランスジェニックマウスミルク中に、0.2〜約0.4μg/mlのレベルで製造された。Gordon,K.ら、1987年、Bio/Techonology、第５巻、第1183〜1187頁。伝えられるところによると、同じ又は類似の構築物を用いたそれに続く実験により、種々のマウスの系統において、ミルク１ml当たり20ng未満から50μg/mlまでの範囲でｔ−ＰＡが製造された。Pittius,C.W.ら、1986年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、第85巻、第5874〜5878頁。
1989年10月10日発行の米国特許第4873316号明細書は、成熟ｔ−ＰＡ配列に融合されたカゼインシグナルペプチド及びいくつかのカゼインコドンを含むウシαＳ１カゼイン遺伝子からの９kbの５′配列の使用を開示している。伝えられるところによると、この構築物によって得られたトランスジェニクマウスは、ミルク中に約0.2〜0.5μg/mlのｔ−ＰＡ融合タンパク質を製造した。
更に、うわさによれば多くの特許出願が、トランスジェニックマウス及びヒツジのミルク中においての特定のタンパク質の製造を述べている。例えば、1988年４月20日発行のヨーロッパ特許公開第0264166号公報（マウスでの乳房組織特異的発現のための乳漿酸プロモータータンパク質の制御下での肝炎Ｂ表面抗原及びｔ−ＰＡ遺伝子）；1988年１月14日発行のＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／００２３９号公報（ヒツジでの乳漿タンパク質プロモーターの制御下での因子IXをエンコードするトランスジーンの組織特異的発現）；1988年３月10日発行のＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０１６４８号公報（インターロイキン−２に融合されたウシα−ラクトアルブミン遺伝子を含む組み換え発現系を取り込んでいる乳房分泌細胞を有するトランスジェニックマウス）；1988年、８月24日発行のヨーロッパ特許公開第0279582号公報（トランスジェニックマウスでのラットβ−カゼインプロモーターの制御下でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの組織特異的発現）；1988年、12月29日発行のＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／１０１１８号公報（ｔ−ＰＡに融合されたウシαＳ１カゼインプロモーター及びシグナル配列をエンコードするトランスジーンを含むトランスジェニックマウス及びヒツジ）を参照。
トランスジェニックの技術の状況を考えると、トランスジェニック哺乳動物、特にトランスジェニックマウス以外のトランスジェニック哺乳動物の効率的な製造を可能にする方法が必要であることが明らかである。
更に、このようなトランスジェニック哺乳動物のミルク中に、組み換えポリププチド、例えばヒトミルクタンパク質及びヒト血清タンパク質を製造できるトランスジェニックウシ種を製造するための方法が必要であることが明白である。
従って、本発明は、着床に先立ち受精卵母細胞のトランスジェネシス（transgenesis）を検出する方法を提供することが一つの目的である。
更に、本発明は、細胞内に維持されるか又は細胞外に分泌される組み換えポリペプチドを製造できるトランスジェニックウシ種を提供することが一つの目的である。
また本発明は、このようなトランスジェニック動物のミルク中に、組み換えポリペプチド例えば、ヒトミルクタンパク質及びヒト血清タンパク質を製造できるトランスジェニックウシ種を提供することが一つの目的である。
更に、本発明は、このような組み換えポリペプチドを含むトランスジェニックウシ種からのミルクを提供することが一つの目的である。
更にまた、本発明は、このようなトランスジェニックミルクからの組み換えポリペプチドが補われた食品処方例えばヒトラクトフェリンが補われたヒト乳児用処方を提供することが一つの目的である。
更に、本発明は、トランスジェニックウシ種のミルク中での組み換えポリペプチドの製造を導くことができるトランスジーンを提供することが一つの目的である。
本明細書中で述べた文献は、本出願の出願日以前の開示のためにのみ提供されるものである。本明細書は、先に出願された出願に基づいた優先権によって、このような開示よりも日付が先であるとする権利が発明者にはないということを認めるものであると解釈されるものではない。
発明の概要
上記目的に従って、本発明は、トランスジェニックウシ種のミルク中に組み換えポリペプチドを製造するためのトランスジーンを含む。本発明はヒトの消費のために精製がほとんど必要ないかいらないマトリックス（基質）を提供するので、１以上の組み換えポリペプチドを含むこのようなトランスジェニックウシミルクの製造は望ましい。トランスジーンは、目的のウシ種の乳房分泌細胞中で機能する分泌シグナル配列をエンコードする分泌ＤＮＡ配列及び組み換えポリペプチドをエンコードする組み換えＤＮＡ配列を含む。これらの配列は、分泌−組み換えＤＮＡ配列を形成するために、操作可能に（operably）連結される。ウシ種の乳房分泌細胞中で機能する少なくとも一つの発現調節配列は、分泌−組み換えＤＮＡ配列に操作可能に連結されるる。このように構築されたトランスジーンは、トランスジーンを含むウシ種の乳房分泌細胞中での分泌−組み換えＤＮＡ配列の発現を導くことができる。このような発現は、トランスジェニックウシ種の乳房分泌細胞からミルク中へ分泌される組み換えポリペプチドの形の物を製造する。
更に、本発明は、このようなトランスジェニックウシ種を製造するための方法を含む。該方法は、上記トランスジーンをウシ種の胚標的細胞中に導入し、それにより形成されたトランスジェニック胚標的細胞を宿主のウシ親中へ移植し、そして、組み換えポリペプチドをそのミルク中に製造できる少なくとも一つの雌の子孫を同定することを含む。
本発明はまた、トランスジェニックウシ種の乳分泌をする雌のミルク中に組み換えポリペプチドを製造できる該トランスジェニックウシ種、このような組み換えポリペプチドを含むこのようなトランスジェニックウシ種からのミルク、及び液体又は乾燥形態のトランスジェニックミルクを含む食品処方、並びにこのようなトランスジェニックミルクからの１以上の組み換えポリペプチドを補われた食品処方を含む。
前記に加え、本発明は、トランスジーン及び組み換えポリペプチドを製造できるトランスジーンを含むトランスジェニックウシ種を含む。このようなトランスジーンは、ミルク分泌のための前記のトランスジーンと類似であり、そして、特定の細胞又は組織タイプに対して、組み換えポリペプチドをエンコードするＤＮＡの発現、例えば、トランスジェニックウシ種の肝臓でのヒト血清アルブミンの発現を目的とする発現調節配列を有することによって特徴づけられる。組み換えポリペプチドがこのような、標的細胞又は組織から分泌されるべき場合は、特定の標的細胞又は組織で機能する分泌シグナル配列をエンコードする分泌ＤＮＡ配列が、組み換えポリペプチドをエンコードする組み換えＤＮＡ配列へと操作可能に連結される。例えば、ウシ肝臓からのウシ循環系へのヒト血清アルブミンの分泌。
更に、本発明は、所望の表現型を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造するための方法を含む。該方法はまず、トランスジェニック非ヒト動物の細胞中に取り込まれた場合に所望の表現型を与えることができるトランスジーンのメチル化を例えば、適当なバクテリア例えばE.coli MM 294を上記トランスジーンを含むプラスミドで形質転換することによって引き起こすことを含む。メチル化されたトランスジーンは、次いで、切り出され、そして、非ヒト動物の受精卵母細胞中へ導入されて、ゲノム中への取り込みを可能にする。次いで、卵母細胞を培養して着床前胚を形成し、それによりそれぞれの受精卵母細胞のゲノムを複製する。その後、少なくとも１つの細胞がそれぞれの着床前胚から取出され、そして、その中に含まれているＤＮＡを遊離するために処理される。次いで、遊離されたＤＮＡのそれぞれを、メチル化されたトランスジーンを切断できるが、ゲノムＤＮＡへの組込み及びその複製後に形成されたメチル化されていない形態のトランスジーンは切断できない、制限エンドヌクレアーゼで消化する。トランスジーンを組込んでいるそのような着床前胚は、制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して耐性であるＤＮＡをトランスジーンを含む領域に含む。ＤＮＡのＰＣＲ増幅後の消化物の電気泳動及びトランスジーンのための標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出されうる消化に対するこの耐性は、成功したトランスジェネシスの同定を容易にする。
本発明はまた、同じ表現型を有するトランスジェニック子孫の集団を製造する方法を含む。この方法は、早期トランスジェネシスを検出するための上記方法の特定の具体例を利用する。この方法においては、メチル化されたトランスジーンは、着床前胚へと培養される受精卵母細胞中に導入される。その後、それぞれの着床前胚を分割して、第１及び第２の半胚を形成する。次いで第１の半胚のそれぞれは、上記の如くトランスジェネシスについて分析される。少なくとも一つの第１の半胚において成功したトランスジェネシスが同定された後に、組込まれたトランスジーンを含む第２の未処理の半胚は、それぞれが同じ表現型を有する多数のクローントランスジェニック胚盤胞又は半胚盤胞を形成するためにクローン化される。その後、トランスジェニック胚は、同じ遺伝子型を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の集団を製造するために１以上の宿主雌親中に移植される。
【図面の簡単な説明】
明細書に取り込まれそして一部をなす添付の図面は本発明の実施例を説明し、そして、詳細な説明と一緒になって本発明の本質を説明するのに役立つ。図面において図１は、ヌクレオチド1557〜1791及び2050から2119の間の配列が公知の配列（Radoら、1987年、Blood、第70巻、第989〜993頁）に対応すること以外は本明細書中に記したヒト乳房cDNAライブラリー由来のヒトラクトフェリンクローンのDNA（配列番号：１）及びアミノ酸（配列番号：２）配列を描いている。
図２は、５′及び３′の非翻訳配列並びに完全なヒトラクトフェリンシグナル配列を含むヒトラクトフェリンの完全なＤＮＡ（配列番号：３）及びアミノ酸（配列番号：４）配列を描いている。
図３は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子の５′−フランキング領域のクローンの制限地図である。
図４は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子の３′−フランキング領域のクローンの制限地図である。
図５Ａ、５Ｂ及び５ＣはpSI3′5′CAT及びpSI5′CATの構築を描いている。
図６は、pMH-1を描いている。
図７Ａから７Ｆは、ヒトラクトフェリンをエンコードする配列を含む発現ベクターの構築を描いている。
図８は、ヒト血清アルブミンのゲノム、このゲノムＤＮＡ中に含まれるトランスジェニックマウスを作成するのに用いたフラグメント、及び制限酵素BstE-IIとNco-I又はNco-IとHind-IIIでのトランスジェニックマウスからのゲノムＤＮＡの消化後に得られるであろうフラグメントサイズの同定を描いている。
図９は、ヒトラクトフェリンをエンコードする本発明のトランスジーンの構築のための別の経路を描いている。
図１０は、プロテインＣをエンコードするトランスジーンを含むプラスミドpPCの構築を描いている。
図１１は、本発明の好ましい実施例に用いたハイブリッド介在配列のためのＤＮＡ配列を描いている。このハイブリッド配列は、ウシαＳ１カゼインの介在配列からの５′部分及びIgG介在配列の介在配列からの３′部分を含む。５′及び３′部分の連結は、示されているHindIII部位である。
図１２Ａは、ウシαＳ１カゼインプロモーター  ｈＬＦｃＤＮＡトランスジーンの制限地図である。
図１２Ｂは、ｈＬＦ  ｃＤＮＡプローブを用いた種々のウシ及びマウス組織から単離されたＤＮＡのサザンブロット分析を示す。
図１３は、ｈＬＧゲノムクローン13.1及び13.2の制限地図を描いている。
図１４は、プラスミドpUC19中にサブクローン化されたゲノムｈＬＦからのBamHIフラグメントを描いている。
図１５Ａは、８又は16kbのαＳ１カゼインプロモーター、ClaI-ApaI合成リンカー及び９kb（すなわち8.9kb）のApaI-SalIゲノムｈＬＦフラグメントを含む8hLFgen9k又は16hLFgen9k構築物の制限地図を描いている。
図１５Ｂは、図１５Ａに示されたClaI-ApaI合成配列のＤＮＡ配列を描いている。
図１５Ｃは、１ＶＳ及び図１５Ａから図１７に示されたゲノムｈＬＦ構築物のエキソン１及びエキソン２の一部の構造を描いている。
図１６は、（図１５Ａに示された）8hLFgen9k又は16hLFgen9k構造物からのNotI-SalIフラグメントとゲノムhLFの3′ClaIフラグメントとのコインジェクション（coinjection）を描いている。
図１７は、（図１５Ａに示された）8hLFgen9k構築物からのNotI-MluIフラグメント、図１３に描かれたクローン13.2からのMluI-ClaIフラグメント及びClaI-NotIリンカーを連結することによるゲノム8hLFトランスジーンの作成を描いている。図１７はまた、ClaI-NotIリンカーのＤＮＡ配列を描いている。
図１８〜２０は、βLG-hLFgen及びβLG-hLFgen37構築物の作成を描いている。
図２１は16,8ｈＬＺ発現ベクターの設計を描いている。
図２２は16,8ｈＬＺ３発現ベクターの設計を描いている。
図２３Ａ〜２３Ｅは、プラスミドｐ16,8ｈＬＺの構築のため別の経路を描いている。
図２４は、ウシβＬＧ及びヒツジβＬＧのＤＮＡ間の比較を描いている。上段の配列は、ウシの配列を表している。
図２５は、リンカーGP278/279を示している。
図２６は、ｐ16,8ＡｈｌＺ３発現ベクターを描いている。
図２７は、16,ＡｈＬＺ３発現ベクターを描いている。
発明の詳細な説明
本発明の“非ヒト哺乳動物”とは、“所望の表現型”を有する“トランスジェニック非ヒト哺乳動物”を製造できるすべての非ヒト哺乳動物を含む。このような哺乳動物は、非ヒト霊長類、ネズミ種、ウシ種、イヌ種等を含む。好ましい非ヒト動物は、ウシ、ブタ及びヒツジ種を含み、特に好ましくはウシ種である。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物のための所望の表現型は、雌のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のミルク中での組み換えポリペプチドの製造、病気の研究のための動物モデルの製造、病気（例えば、乳腺の病気例えば、乳腺炎）に高耐性の動物の製造及び血液、尿或いは、他の適した体液又は動物の組織中での組み換えポリペプチドの製造を含むが、これらには限定されない。好ましい実施例においては、組み換えヒトラクトフェリン、ヒト血清アルブミン及びヒトプロテインＣを乳を分泌する雌のミルク中に、又は、ヒト血清アルブミンをトランスジェニック動物の肝臓中に製造することができるトランスジェニックウシ種が開示されている。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、“トランスジーン”を選択された動物の胚標的細胞中へ導入することによって製造される。本発明の一面においては、トランスジーンは、トランスジェニック非ヒト動物の細胞のゲノム中に含まれたときに所望の表現型を生み出すことができるＤＮＡ配列である。特定の実施例においては、トランスジーンは、“組み換えポリペプチド”をエンコードする“組み換えＤＮＡ配列”を含む。このような場合では、トランスジーンは、組み換えポリペプチドを製造するために発現されうる。
本明細書中で用いている“組み換えポリペプチド”（又はこれをエンコードする組み換えＤＮＡ配列）は、“異種ポリペプチド”又は“同種ポリペプチド”のいずれかである。異種ポリペプチドは、トランスジェニック動物によっては通常製造されないポリペプチドである。異種ポリペプチドの具体例は、ヒトミルクタンパク質例えばラクトフェリン、リゾチーム、分泌免疫グロブリン、ラクトアルブミン、胆汁酸塩に刺激されたリパーゼ等；ヒト血清タンパク質例えばアルブミン、免疫グロブリン、因子VIII、因子IX、プロテインＣ等及び、原核及び真核供給源からの工業酵素例えばプロテアーゼ、リパーゼ、キチナーゼ、及びリギナーゼ（liginase）を含む。組み換えＤＮＡ配列は、組み換えポリペプチドをエンコードするゲノム及びｃＤＮＡ配列を含む。
異種ポリペプチドをエンコードする組み換えＤＮＡ配列が用いられる場合は、トランスジーンはトランスジェネシスのために用いられる種のゲノム中にランダムな様式で取り込まれ得る。実施例中に開示した如く、ヒトラクトフェリン、ヒト血清アルブミン及びヒトプロテインＣをエンコードするトランスジーンは、αＳ１カゼイン発現調節配列の制御下で、αＳ１カゼイン分泌シグナル配列と共同して、これらの異種ポリペプチドを製造し、そして乳分泌トランスジェニック哺乳動物の乳腺からそのミルク中へ分泌するように設計されている。
本明細書中で用いている同種ポリペプチドは、特定のトランスジェニック種に対して内在性であるところのポリペプチドである。ウシ種からの内在性ポリペプチドの具体例は、ウシミルクタンパク質、例えばαＳ１、αＳ２、β−及びκ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、リゾチーム、コレステロール加水分解酵素、血清タンパク質例えば血清アルブミン、及びタンパク質性ホルモン例えば成長ホルモンを含む。同種ポリペプチドをエンコードする組み換えＤＮＡ配列が用いられる場合は、トランスジーンは好ましくは、トランスジェネシスのために用いられる種のゲノム中にランダヌな様式で組み込まれる。このようなランダムな組み込みは、内在性ポリペプチドをエンコドするトランスジーンばかりでなく対応する内在性ゲノムＤＮＡ配列をも含むトランスジェニック動物をもたらす。従って、このようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、内在性ポリペプチドをエンコードする遺伝子のコピー数の増加によって容易に特徴づけられる。更に、トランスジーンは一般に内在性遺伝子とは異なった位置に配置される。
同種ポリペプチドをエンコードするＤＮＡが発現された場合、例えば、ウシ種においては、トランスジェニック動物は、それが通常見い出されるところの内在性組織又は液体のいずれか中での同種ポリペプチド量の増加及び／又は、通常同種ポリペプチドを含まないか或いはそれを著しく低いレベルで製造するかのいずれかであるところの組織及び／又は体液中でのそれの存在によって特徴づけられる。
このように例えば、ウシコレステロール加水分解酵素は、通常授乳期のおおよそ最初の15〜20日間の初乳中に存在する。この本来発生する内在性ポリペプチドは、子ウシの体重を増加させる。しかしながら、例えば、乳房分泌細胞中でのその発現が、同種ポリペプチドが通常存在する授乳期間を越えて同種ポリペプチドの発現を容易にする発現調節配列例えばウシカゼイン遺伝子から得られた発現調節配列の制御下に置かれた場合には、このタンパク質もまた同種ポリペプチドである。このように、本発明の一つの面に従って、コレステロール加水分解酵素組み換えＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はゲノムのいずれか）の発現がウシαＳ１カゼイン発現調節配列の制御下に置かれることにより、トランスジェニックウシミルク中でウシコレステロール加水分解酵素が発現され続ける。ゲノム組み換えＤＮＡが用いられる場合は、それが適当なトランスジーンゲノムカセット（例えば、実施例１５に記したｐ−１６ｋｂ、ＣＳ）中に挿入されうるために、構造遺伝子の５′及び３′末端においてそれが適当な制限部位（例えば、ＣｌａＩ及びＳａｌＩ）を有するように設計される。あるいは、ｃＤＮＡ由来のウシコレステロール加水分解酵素をエンコードする組み換えＤＮＡは、プラスミッド例えばｐ16,8ＨＬＦ３（ハイブリッド介在配列を含む）又はｐ16,8ＨＬＦ４（同種αＳ１カゼイン介在配列を含む）中でヒトラクトフェリン配列と置き換えることにより、ウシαＳ１カゼイン発現調節配列の制御下に置かれうる。これらの特定のプラスミッドが用いられる場合は、ｃＤＮＡクローンは、それが組みかえＤＮＡの末端において適当なＣｌａＩ及びＳａｌＩ制限部位を有するように設計される。
更なる実施例として、ウシラクトフェリンは通常乳牛ミルク中に、ほんの微量しか存在しない。しかしながら、ウシラクトフェリンが例えばαＳ１カゼイン遺伝子から得られた他の調節配列の制御下で発現された場合は、より多量のラクトフェリンがトランスジェニックウシ種のミルク中で得られる。他の実施例においては、同種ウシ成長ホルモンをエンコードするＤＮＡを含むトランスジーンは、ウシゲノム中に取り込まれて、トランスジェニック動物に、非常に優れた成長特性を与える。他の例においては、同種ポリペプチドは、例えば、通常、特定の種では細胞内に維持されるが、トランスジェニック種のミルク又は他の細胞外区画例えば循環系中には分泌されるポリペプチドを含む。
それぞれの異種又は同種ポリペプチドは、特定のアミノ酸及び核酸配列によって特徴づけられる。しかしながら、このような配列は、それの自然発生する対立遺伝子変異及び組み換え法により生み出される変異体を含むと理解されるべきであり、ここで、このような核酸及びポリペプチド配列は、組み換えポリペプチド中に１以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失を引き起こす、このような核酸中の１以上の核酸の置換、挿入及び／又は欠失によって修飾されている。
トランスジーンのＤＮＡの発現が、所望の表現型を生じるため、例えば組み換えポリペプチドを製造するために必要な場合は、トランスジーンは、典型的には、以下に定義した組み換え又は分泌−組み換えＤＮＡにそれぞれ操作可能に連結された少なくとも一つの５′及び好ましくは更に３′の“発現調節配列”を含む。このような発現調節配列はまた、転写を制御することに加えて、少なくともそれらがまた転写される程度に、ＲＮＡの安定性及びプロセシングにも貢献する。
このような発現調節配列は、組み換え又は分泌−組み換えＤＮＡの組織特異的又は細胞タイプ特異的発現を生じるために選ばれる。組織又は細胞タイプが発現のために選ばれるとすぐに、５′及び場合により３′発現調節配列が選ばれる。一般に、このような発現調節配列は、選ばれた組織又は細胞タイプ中で主に発現される遺伝子由来である。他の組織及び／又は細胞タイプ中の二次的発現は、このような組織又は細胞タイプ中でのトランスジーン中の組み換えＤＮＡの発現がトランスジェニック動物に対して有害でなければ許容されるが、好ましくは、これらの発現調節配列が得られるところの遺伝子が、選ばれた組織又は細胞タイプ中でのみ実質的に発現される。特に好ましい発現調節配列は、処理されるべき動物種に対して内在性のものである。しかしながら、他の種からの発現調節配列例えばヒト遺伝子からのものもまた用いられ得る。特に好ましいヒト遺伝子からの発現調節配列は、ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）配列である。ある例においては、発現調節配列及び組み換えＤＮＡ配列（ゲノム又はｃＤＮＡのいずれか）は、同種由来、例えばそれぞれウシ種由来又はヒト供給源由来である。このようなケースでは、発現調節配列及び組み換えＤＮＡ配列は、互いに同種である。或いは、発現調節配列及び組み換えＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ又はゲノムのいずれか）は、異なった種から得られる。（例えば発現調節配列はウシ種由来で、そして組み換えＤＮＡ配列はヒト供給源由来である）。このようなケースでは、発現調節及び組み換えＤＮＡ配列は、互いに異種である。以下に、内在性遺伝子由来の発現調節配列を定義する。このような定義はまた、非内在性の異種遺伝子由来の発現調節配列にも適用できる。
一般に、５′発現調節配列は、翻訳開始配列（５′非翻訳領域又は５′ＵＴＲ）から上流の内在性遺伝子の転写される部位、及びそれらから上流の、機能的プロモーターを含むフランキング配列を含む。本明細書中で用いられている、“機能的プロモーター”は、転写を促進するためにＲＮＡポリメラーゼを内在性遺伝子へ結合させる必須の転写されないＤＮＡ配列を含む。このような配列は、典型的には、一般に転写開始部位から約25〜30ヌクレオチドのところに配置されているＴＡＴＡ配列又はボックスを含む。ＴＡＴＡボックスはまたときどき、近位シグナルと言われる。多くの例においては、プロモーターは、近位シグナル（ＴＡＴＡボックス）から上流に配置されており、転写を開始するのに必要な、１以上の遠位シグナルを更に含む。このようなプロモーター配列は、一般に、転写開始部位から上流に位置する最初の100〜200ヌクレオチド中に含まれるが、転写開始部位から500〜600ヌクレオチドまで伸びうる。このような配列は、本技術分野の当業者にとっては明白であるか或いは標準法により容易に同定できる。このようなプロモーター配列は単独で、又は５′非翻訳領域と組み合わせて、本明細書中で“近位５′発現調節配列”と言われる。
このような近位５′発現調節配列に加えて、追加的な５′フランキング配列（本明細書中で、“遠位５′発現調節配列”という）がまたトランスジーン中に含まれることが好ましい。このような遠位５′発現調節配列は、内在性遺伝子の発現を容易にする１以上のエンハンサー及び／又は他の配列を含み、そしてその結果、遠位及び近位５′発現調節配列と操作可能に連結された組み換え又は分泌−組み換えＤＮＡ配列の表現を容易にすると信じられている。遠位５′発現調節配列の量は、発現調節配列が由来するところの内在性遺伝子に依存する。しかしながら、一般にこのような配列は、約１kb、更に好ましくは16kbの５′フランキング領域及び最も好ましくは約30kbの５′フランキング配列を含む。任意の特定の内在性遺伝子からの用いられる遠位５′発現調節配列の最適量の決定は、最高の発現を得るべく遠位５′発現調節配列の量を変化させることにより容易に決定される。一般に、遠位５′発現調節配列は、隣接遺伝子中に伸びるほどは大きくないであろうし、そして、トランスジーン発現のレベルに不都合に影響するＤＮＡ配列を含まないであろう。
更に、３′発現調節配列はまた組織又は細胞タイプ特異性の発現を補うために含まれることが好ましい。このような３′発現調節配列は、適当な内在性遺伝子からの３′近位及び３′遠位発現調節配列を含む。３′近位発現調節配列は、組み換えＤＮＡ配列中の翻訳停止シグナルから下流に位置する転写されるが翻訳されないＤＮＡ（これはまた３′非翻訳領域又は３′ＵＴＲと呼ばれる）を含む。このような配列は、一般に、（内在性遺伝子又は他の供給源例えばＳＶ４０のいずれかからの）ポリアデニル化配列及びＲＮＡの安定性に影響しうる配列で終わる。一般に、３′ＵＲＴは、３′調節配列が由来するところの遺伝子中の翻訳停止シグナルから下流約100〜500ヌクレオチドを含む。遠位３′発現調節配列は、近位３′発現調節配列から下流のフランキングＤＮＡ配列を含む。これらの遠位配列のいくつかは転写されるが、ｍＲＮＡの一部を形成しない。一方この遠位３′発現調節配列中の他の配列は全く転写されない。このような遠位３′発現調節配列は、発現を増強するエンハンサー及び／又は他の配列を含むと信じられている。このような配列は、効率的なポリアデニル化のために必要であり、そして、転写終結配列を含んでいると信じられている。好ましくは、このような配列は、約２kb、更に好ましくは、８kb、最も好ましくは、約15kbの３′フランキング配列を含む。
好ましい３′フランキング配列は、ヒトラクトフェリン（ｈＬＧ）遺伝子の３′フランキング配列である。約９kbのｈＬＦ３′フランキング配列を含むトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、この領域に配置されたエンハンサー又は他の増強配列のために、１kb又はそれ以下のｈＬＦ３′フランキング配列を含むトランスジーンを有する動物に比べて、ミルク中で増幅された組み換えポリペプチドの発現を示す。通常、ヒトラクトフェリン３′フランキング配列は、少なくとも長さが１kbから長さが約９kb又はそれ以上であり、典型的には３〜７kb、更に好ましくは４〜５kbである。また、組み換えポリペプチドの乳腺発現を増強する９kbの３′フランキング配列中に含まれる領域を同定するために標準法（例えば、欠失分析）を用いることも可能であり、時には好ましい。これらのエンハンサー又は増強配列は、単離され、そして、種々の量の同種又は異種配列と組み合わせて用いられることができる。典型的には、増強配列は長さが約50塩基対から約２kb、更に典型的には約100塩基対から約500塩基対の範囲であり得る。
しばしば、同一の遺伝子から由来する５′発現調節配列及び３′フランキング配列を有するトランスジーンを用いることが望ましい。好ましい実施例においては、５′発現調節配列及び３′フランキング配列は、ウシαＳ１−カゼイン遺伝子由来である。
他の実施例においては、ゲノム配列例えばヒトゲノムの単一クローン又は複数のクローンは、動物中に導入されて、５′発現調節配列のすべて或いは一部、コーディング配列、イントロン、及び３′非翻訳及びフランキング配列を含むヒト遺伝子の配列を有しするトランスジーンを含むトランスジェニック動物を製造する。好ましい実施例においては、ヒトラクトフェリンゲノム配列は、そっくりそのまま用いられるが、種々の成分が他の乳腺特異的遺伝子由来の成分により置換されうる。
５′及び３′発現調節配列の両方を用いるのが好ましいけれども、本発明のいくつかの実施例においては、内在性３′調節配列が用いられていない。このようなケースでは、組み換えＤＮＡ配列によってエンコードされるゲノムＤＮＡと共に３′近位発現調節配列は、ポリアデニル化を監督するために用いられる。更に、組み換えポリペプチドをエンコードするゲノムＤＮＡ由来の遠位３′調節配列は、また、好ましくは、内在性３′発現調節配列のために前記したのと同じ量で用いられうる。このようなケースでは、トランスジーンによってエンコードされる組み換えポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ又はｃＮＤＡ由来の二本鎖ＤＮＡのいずれかを含みうると理解されるべきである。５′発現調節配列と同様、３′発現調節配列の最適量は、組み換えポリペプチドの最大発現を得るために３′フランキング配列の量を変えることによって容易に決定され得る。一般に、遠位３′調節配列（これは、内在性遺伝子又は異種遺伝子由来である）は、それが由来するところに隣接遺伝子までは延長せず、そしてトランスジーン発現のレベルに不都合に影響するいずれの配列も排除しているであろう。
発現調節配列の例を表Ｉに表わす。
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５′及び３′発現調節配列及び組み換えＤＮＡ（ゲノム又はｃＤＮＡ由来のいずれか）に加えて、本発明のトランスジーンはまた、好ましくは、転写されるが翻訳されないトランスジーンの５′領域を分断する“組み換え介在配列”を含む。このような介在配列は、例えばウシαＳ１カゼイン及びヒトラクトフェリン由来でありうる。本明細書で用いられるこのような配列は、“相同組み換え介在配列”であり、そこでは、このような組み換え介在配列中の５′及び３′ＲＮＡスプライスシグナルが内在性又は外来性遺伝子由来の介在配列中に通常見い出される。しかしながら、組み換え介在配列はまた、“ハイブリッド介在配列”を含みうる。このようなハイブリッド介在配列は、種々の供給源からの介在配列由来の５′ＲＮＡスプライスシグナル及び３′ＲＮＡスプライスシグナルを含む。本発明のある面においては、このようなハイブリッド介在配列は、少なくとも一つの“許容されうるＲＮＡスプライス配列”を含む。本明細書中で用いている、許容されうるＲＮＡスプライスシグナルは、細胞分化の間に再配列を受ける生殖細胞系ＤＮＡセグメントのレパートリー中に含まれるイントロン由来のＲＮＡスプライスシグナル配列、好ましくは、３′ＲＮＡスプライスシグナルである。このような遺伝子レパートリーの具体例は、免疫グロブリン及びＴ−細胞抗原受容体並びに主要組織適合性複合体（ＭＭＣ）遺伝子のレパートリー及びその他を含む免疫グロブリン超遺伝子ファミリーを含む。特に、好ましい許容されうるスプライス配列は、免疫グロブリンレパートリー、好ましくは、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンレパートリー、更に好ましくは、Ｉｇ重鎖及び軽鎖、最も好ましくは重鎖のＪ−Ｃセグメント再配列と関連された３′スプライスシグナル配列から得られる。特に好ましい許容されうるスプライス配列は、図１１中のHindIII部位の下流に示された配列の部分を含む。特に好ましいハイブリッド介在配列は、ウシαＳ１カゼイン由来の介在配列の５′部分及びＩｇＧ重鎖介在配列の３′配列部分を含む図１１に示された全配列を含む。
許容されうるＲＮＡスプライスシグナルを含むこのようなハイブリッド介在配列は、好ましくは、組み換えＤＮＡがｃＤＮＡ配列に一致する場合に用いられる。実施例中に示される如く、αＳ１カゼイン分泌シグナル配列に操作可能に連結されたヒトラクトフェリンｃＤＮＡを発現するために、αＳ１カゼイン遺伝子由来の16kbの５′発現調節配列をαＳ１カゼイン−ＩｇＧハイブリッド介在配列と連結して用いた場合、約1330μg/mlのｈＬＦをトランスジェニックミルク中で製造するトランスジェニックマウスが得られた。組み換えポリペプチドのこの量は、トランスジェニックマウスミルク中での種々のタンパク質の製造に関して従来報告された量、すなわち一般には10μg/ml未満、一つの場合では約50μg/mlを、はるかに超えている。それはまた、ハイブリッド介在配列以外の相同ウシ介在配列を含む同じトランスジーンを用いた場合に製造された最大量である８μg/mlのｈＬＦをも超えている。
しかしながら、このようなハイブリッド介在配列は、ｃＤＮＡ配列を利用するトランスジーンに限定されない。それどころか、ハイブリッド介在配列はまた、組み換えポリペプチドがゲノム配列によってエンコードされる場合に有用である。ｃＤＮＡ組み換えＤＮＡによって得られた結果及び、ゲノムＤＮＡ配列はｃＤＮＡ由来の配列より高いレベルで発現するという一般的予測に基づいて、ゲノム組み換えＤＮＡと連結して用いられるこのようなハイブリッド介在配列が、別のやり方でゲノム配列単独にて得られる発現レベルを超えて発現レベルを更に増強する。
前記に基づいて、好ましいトランスジーンは、多量の５′及び３′発現調節配列を含むことが明らかである。更に好ましくは、組み換えＤＮＡは、数十〜数百キロベースの長さでありうるゲノムクローン由来である。ＤＮＡをクローニングして操作する現在の技術に基づくと、トランスジーンの構築及びマイクロインジェクションは、事実上、約50kb以下の長さを有する線状化されたＤＮＡに限定される。しかしながら、本発明のトランスジーン、特に、約50kbより大きい長さを有するトランスジーンは、所望のトランスジーンの２以上のオーバーラップグラグメントを胚標的細胞中へ導入することによって容易に作られうる。このように導入された場合、オーバーラップフラグメントは、完全に再構築されたトランスジーンの標的細胞のゲノム中への組み込みを引き起こす相同組み換えを受ける。一般に、このようなオーバーラップトランスジーンフラグメントはオーバーラップする領域において100％相同性を有するのが好ましい。しかしながら、効率的な相同組み換えが起こるのであれば、より低い相同性も許容されうる。もし非相同性が相同配列部分間に存在するのであれば、非相同性は、相同配列部の至る所に拡がるよりは分離した領域に配置されることが好ましい。100％相同性がたった14の塩基対程度と少なくても、哺乳動物細胞中での相同組み換えには十分である（Rubnitz,J.とSubramani,S.,1984年、Mol.Cell Biol.,第４巻、第2253〜2258頁）が、より長い相同配列部分が好ましく、例えばそれぞれの相同配列部分が500bp、更に好ましくは1000bp、つぎに好ましくは2000bp、そしてもっとも好ましくは2000bp超である。
実施例に示された如く、ヒト血清アルブミン遺伝子の３つのオーバーラップフラグメントが、ほぼ同じモル部で、マウス接合体の前核中にマイクロインジェクトされる。これらのフラグメントの成功した組み換え及びマウスゲノム中への取り込みは、サザンブロット法による組み込まれたＤＮＡの分析及び、ＲＮＡ転写及びトランスジェニックマウスの血清中でのヒト血清アルブミンの検出によって確認される。このように作られたトランスジーンは、38kbの単位長を有するが、より長い／又はより多数のオーバーラップトランスジーンフラグメントを用いて形成されたトランスジーンの大きさの実質的な限界は未知である。特に、このアプローチにより、約50〜1000kb、更に好ましくは50〜500kbの長さを有するトランスジーンが形成されうることが期待される。更に、オーバーラップフラグメントの相同組み換えを用いることは、別の方法では、前核中に取り込まれてトランスジェニック動物を形成することをできないゲノムＤＮＡを含む組み換えＤＮＡを取り込んでいるトランスジーンを含む、より大きいトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウシ種の創造において有益であると期待される。このようなゲノムトランスーンは、トランスジェニック乳牛において、組み換えｃＤＮＡをエンコードするトランスジーンによって製造されるものに比べてより高い発現レベルを生じると期待される。
最終目的が組み換えポリペプチドを分泌させることである場合は、トランスジェニック動物中の１以上の細胞タイプからの組み換えポリペプチドの分泌を導くために、機能的分泌シグナルペプチドをエンコードする“分泌ＤＮＡ配列”はまたトランスジーン中に操作可能に連結される。一般に、分泌ＤＮＡ配列は、トランスジェニック動物と同じ種の分泌されるタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。このような分泌ＤＮＡ配列は、乳房分泌細胞中での発現及びそれからの分泌のために、好ましくは、組織特異的発現のために標的とされた細胞タイプから分泌されるポリペプチド、例えば、分泌されるミルクタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。しかしながら、分泌ＤＮＡ配列は、このような配列に限定されない。トランスジェニック動物の種の中の他の細胞タイプから分泌されるタンパク質からの分泌ＤＮＡ配列例えば、乳腺中以外に分泌されるタンパク質をエンコードする同種遺伝子の天然シグナル配列もまた用いられ得る。更に、トランスジェニック動物以外の種からのシグナル分泌ペプチドをエンコードする“非相同分泌ＤＮＡ配列”、例えばヒトｔ−ＰＡ、ヒト血清アルブミン、ヒトラクトフェリン及びヒトラクトアルブミン、及び例えば酵母、糸状菌及びバクテリアから分泌されるポリペプチドをエンコードする微生物遺伝子からの分泌シグナルもまた用いられうる。一般に、分泌ＤＮＡ配列は、機能的に、組み換えポリペプチドの分泌を引き起こすことができるシグナルペプチドをエンコードする組み換えＤＮＡ配列に操作可能に連結された任意のＤＮＡ配列として、定義され得る。
好ましい実施例の一つにおいて、ウシ種の乳房分泌細胞中で機能する分泌シグナル配列をエンコードする分泌ＤＮＡ配列が、ウシ乳房分泌細胞からの組みかえポリペプチドの分泌を引き起こすために用いられる。分泌ＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡ配列に操作可能に連結される。このような分泌ＤＮＡ配列の具体例は、ウシαＳ１カゼイン、マウスラクトフェリン及びヒトトランスフェリンのためのシグナル分泌配列をエンコードするＤＮＡ配列を含む。好ましい分泌ＤＮＡ配列は、ウシ種からのαＳ１カゼインの分泌配列をエンコードする配列である。この分泌ＤＮＡ配列の使用は、実施例中に更に詳細に記してある。
組み換えＤＮＡ配列に分泌ＤＮＡ配列を連結するという文脈での“操作可能に連結された”とは、分泌ＤＮＡ配列（分泌シグナルペプチド配列をエンコードするコドンを含む）が共有結合的に組み換えＤＮＡ配列と連結され、得られた分泌−組み換えＤＮＡ配列が分泌シグナル配列及び組みかえポリペプチドの５′から３′をエンコードすることを意味する。従って、分泌配列及び組み換えＤＮＡ配列のためのリーディングクレームは、転写及び第一次ＲＮＡ転写物のプロセッシング後に形成されるｍＲＮＡの５′末端からオープンリーディングフレームが存在するように、共有結合的に組み合わされる。ＲＮＡ中のこのオープンリーディングフレームは、分泌シグナルペプチドをエンコードする５′配列部分及び組み換えポリペプチドをエンコードする３′配列部分を含む。このように構築された場合、分泌−組み換えＤＮＡ配列の発現下で製造された組み換えポリペプチドは、ＤＮＡ配列を発現する標的細胞から分泌され得る形である。シグナルペプチドは、組み換えポリペプチドの細胞外の形を製造するために、分泌の間に、一般にインビボで除かれる。
本発明の好ましい実施例においては、分泌−組み換えＤＮＡ配列は、主に、トランスジェニックウシ種の乳房分泌細胞中で発現される。このような組織特異的発現は乳房特異的発現調節ＤＮＡ配列を上記分泌−組み換えＤＮＡ配列に操作可能に連結することによって得られる。このような乳房特異的調節配列は、ウシ種の乳房分泌細胞中で優先的に発現される様々なウシ遺伝子中に含まれる上記調節配列を含む。このような乳房特異的遺伝子は、αＳ１カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを含む。好ましい発現調節配列は、実施例中に更に詳細に記載された如く、αＳ１カゼイン由来である。
一般に、トランスジェニックウシミルク中に組み換えポリペプチドを分泌するために設計された本発明のトランスジーンは、トランスジェニックマウス及びヒツジについて従来報告されているそれよりも著しく高いレベルでこのような分泌を引き起こすことができる。組み換えポリペプチドが、ｃＤＮＡに相当するか又はｃＤＮＡ由来の組み換えＤＮＡによってエンコードされている場合は、組み換えポリペプチドのモル濃度は好ましくは、約1.0μMより大きく、更に好ましくは、約100μMより大きく、そして最も好ましくは１００μMより大きい。トランスジェニックミルク中に存在する組み換えポリペプチドのレベルの観点から見ると、組み換えポリペプチドの量は、好ましくは50μg/mlより大きく、もっと好ましくは約500μg/mlより大きく、最も好ましくは約約1000μg/ml（１mg/ml）より大きい。
本発明のトランスジーンがゲノムＤＮＡ由来の又はゲノムＤＮＡに相当する（又はこのようなゲノム配列が実質的に含まれる、例えば、組み換えポリペプチドをエンコードするコドンの約50％超、更に好ましくは約75％超、最も好ましくは90％超がゲノム配列由来である）組み換えＤＮＡによってエンコードされる組み換えポリペプチドをエンコードする場合は、ウシトランスジェニックミルク中のモル濃度及びタンパク質レベルはｃＤＮＡのそれと同じか又はそれ以上である。一般に、このようなトランスジェニックミルク中の組み換えポリペプチドのモル濃度は、好ましくは約50μMより大きく、更に好ましくは約150μMより大きく、最も好ましくは約500μMより大きい。トランスジェニックミルク中のタンパク質のレベルから見ると、そのレベルは好ましくは約10mg/mlより大きく、更に好ましくは約2.5mg/mlより大きく、最も好ましくは約５mg/mlより大きい。
前述のウシトランスジェニックミルク中のモル濃度及びタンパク質レベルは、特定の組み換えポリペプチドの分子量に依存して変化する。ウシトランスジェニックミルク中で組み換えポリペプチドを製造することの特定の利点は、他の系例えば原核発現系において多量に製造することが困難である、比較的大きな分子量のポリペプチドが製造され得るということである。本発明に従って、いずれの組み換えポリペプチドもウシトランスジェニックミルク中で製造され得るが、一般には、このような組み換えポリペプチドは約10,000ダルトンを超える分子量を有するのが好ましい。しかしながら、15,000超、20,000超そして60,000超ダルトンの分子量を有する他の組み換えポリペプチドも、トランスジェニックウシミルク中で発現され得る。例えば、17,000ダルトンの分子量を有するヒトリゾチーム及び79,000ダルトンの分子量を有するラクトフェリンも、本発明の開示に従ったウシ種のトランスジェニックミルク中で容易に製造され得る。このように、本発明の組み換えポリペプチドは、広い範囲の分子量を有する。
従って、高分子量の組み換えポリペプチドが製造される場合には前述の好ましい組み換えポリペプチドのモル濃度は調節される。このような調節は、モル濃度を、製造されるタンパクの量に換算し、そして、組み変えタンパク質のレベルが、以下の好ましい濃度内になるようにモル濃度を調節することによって成される。
トランスジェニックミルク中のポリペプチドの製造に関する従来の報告のほとんどは、トランスジェニックマウスを含む。しかしながら、マウスは通常、ミルク１ml当り55〜80ミリグラムのタンパク質を製造する。一方、乳牛は通常、ml当たり30〜34ミリグラムのタンパク質を製造する。非常に高いレベルでの組み変えポリペプチド製造は、内在性ミルクタンパク質の製造に不都合に影響し、及び／又は乳分泌腺に不都合に影響するので、組み換えポリペプチドの濃度は、通常のウシミルクタンパク質濃度の約３〜50％（すなわち、トランスジェニックミルクのml当たり約１〜17ミリグラムの組み換えポリペプチド）、が好ましく、更に好ましくは、ウシミルク中に製造されるタンパク質の通常量の10〜20％（すなわち、ml当たり３〜約７ミリグラム）そして最も好ましくは10〜15％（すなわち、ml当たり約３〜５ミリグラム）である。このような好ましい範囲はまた、前記した、トランスジェニックウシミルク中に製造されるタンパク質レベルの好ましい最大限度を与える。
本発明のトランスジーンを形成するための、上述した種々のＤＮＡ配列の連結は、本技術分野の当業者に公知の又は本明細書中に記した標準法によって達成される。トランスジーン又はトランスジーンをエンコードするオーバーラップ同種フラグメントが、記載のようにして構築されると、トランスジェニック非ヒト動物を作るために用いられる。
トランスジーン又はオーバーラップトランスジーンフラグメントを胚標的細胞に導入する方法は、非ヒト動物の受精卵母細胞の前核又はＥＳ細胞の核中へのトランスジーンのマイクロインジェクションを含む。マウス種のためのこのような方法は、本技術分野の当業者によく知られている。或いは、トランスジーンは、トランスジーンを含んだレトロウィルスを接合体に感染させることにより動物中に導入されうる。（Jaenish,R.、1976年、Proc.Acad.Sci.U.S.A.,第73巻、第1260〜1264頁）。好ましい方法は、受精卵母細胞のマイクロインジェクションである。好ましい実施例においては、受精卵母細胞は、最初に標準法によりマイクロインジェクトされる。その後、それらを、“着床前胚”が得られるまで、インビトロで培養する。
このような着床前胚は好ましくは、約16〜150の細胞を含む。胚の16〜30細胞段階は、通常桑実胚と呼ばれる。32より多い細胞を含むそれらの着床前胚は通常、胚盤胞と呼ばれる。一般に、それらは、典型的には64細胞段階において、細胞胚腔の発生を示すことにより特徴づけられる。受精卵母細胞を着床前段階まで培養する方法は、Gordonら、1984年、Methods in Enzynology、第101巻、第414頁、Hoganら、1986年、Manipulation the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Habor,N.Y.、（これらはマウス胚のための方法）、及びHammerら、1985年、Nature、第315巻、第680頁、（これはウサギ及びブタ胚のための方法）、Gandolfiら、1987年、J.Reprod.Fert.、第81巻、第23〜28頁、Rexroadら、1988年、J.Anim.Sci.、第66巻、第947〜953頁、（これらはヒツジ胚のための方法）、及びEyestone,W.H.ら、1989年、J.Reprod.Fref.、第85巻、第715〜720頁、Camousら、1984年、J.Reprod.Fert.、第72巻、第779〜785頁及びHeyman Y.ら、1987年、Theriogenology、第27巻、第5968頁（これらは、ウシ胚のための方法）を含む。その後このような着床前胚は、標準法により適当な雌に移植され、トランスジーンが導入された場合に、発生段階に依存してトランスジェニック動物又はキメラ動物の誕生を可能にする。よく知られているように、真性生殖細胞系トランスジェニック動物を作るためにモザイク動物が生育されうる。
トランスジーンの取り込みの頻度はしばしば低いので、着床前胚中へのトランスジーンの組み込みを検出することが非常に望ましい。本発明の一つの面において、胚の中でトランスジェネシスが起こっており、そしてトランスジェニック動物を作成するためにトランスジェニック胚の着床を可能にする胚を同定するための方法が提供される。この方法において、１以上の細胞が着床前胚から取り出される。等分割が用いられる場合には、胚は好ましくは、桑実胚段階（32細胞）を過ぎて培養されない。着床前胚の分割（Williamsら、1986年、Theriogenology、第22巻、第521〜531頁によってレビーされている）は、２つの“半胚”（半桑実胚又は半胚盤胞）をもたらし、そのうちの一つは適当な雌への着床後に発達することができ、子宮内で出産まで発生できる。着床前胚の等分割が好ましいけれども、このような胚は通常、意図的に或いは意図的でなく、等しい細胞数である必要がない２つの半胚に分割されうると理解されるべきである。要するに、要求されることの全ては、以下に記載のように分析がなされていない胚の一つが、子宮内で出産までの間発達するのに十分な細胞数であるということである。特定の実施例においては、本明細書に記載の分析がなされていない半胚は、もしトランスジェニックであることが示されればトランスジェニック非ヒト動物のクローン集団を作るために用いられる。
前着床胚の分割によって形成された半胚のいずれかの一つはトランスジーンが生物のゲノム中に組み込まれているかどうかを決定するために分析される。他の半胚のそれぞれは、次に行う宿主であるその種の雌への着床のために維持される。胚発達のこの初期段階におけるトランスジーン検出のための好ましい方法は、制限エンドヌクレアーゼDpn Iの特有の性質との関連においてこれらの半胚を用いる。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ中の配列ＧＡＴＣを、この配列中のそれぞれの鎖のアデニンがＮ−６でメチル化されているときにのみ、認識する。この好ましい方法を用いる場合には、配列ＧＡＴＣを含むトランスジーンはマイクロインジェクションに先立って、適当なプラスミド上のトランスジーンを微生物、例えばE.coli MM294のＤＡＭ＋株を通して移動する又は、ｄａｍメチラーゼを用いてトランスジーンを直接メチル化することによってメチル化される。次いで、メチル化されたトランスジーン（好ましくは、外来性配列例えばプラスミドベクターなしに）は、受精卵母細胞中へマイクロインジェクトされる（前核当り約１０から５００コピー、更に好ましくは前核当り５０から１００コピー）。このようにして得られた受精卵母細胞は、着床前段階へとインビトロで培養される。この初期成長及び細胞分割段階の間に、ゲノムＤＮＡが複製される。従って受精卵母細胞のゲノム中に組み込まれたメチル化されたトランスジーンのコピーは複製後に脱メチル化され、一方、複製後もそのまま存在している組み込まれていないトランスジーンは、メチル化されたままである（Lacks,Sら、1977年、J.Mol.Biol.、第114巻、第153頁）。組み込まれていないトランスジーンに対する組み込まれたトランスジーンのこの異なったメチル化の様式は、ゲノム中にトランスジーンを組み込んだ受精卵母細胞の同定を可能にする。
組み込まれたトランスジーンを含む着床前胚の同定は、それぞれの半胚からのＤＮＡを分析することにより達成される。このような、ＤＮＡは、典型的には、半胚を溶解し、そしてNinomiy,T.ら、1989年、Molecular Reproduction and Development、第１巻、第242〜248の記載の如く、処理した後のこのような遊離されたＤＮＡを分析することにより得られる。ＤＮＡ試料のそれぞれは、Dpn Iによって処理される。その後、トランスジーンの全て、或いは一部を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Saikiら、1985年、Science、第230巻、第1350〜1354頁）を行う。無傷のトランスジーンが増幅される場合には、トランスジーンの対立する末端において、対立する２本の鎖にそれぞれ相補的な２つの伸長プライマーが増幅のために用いられる。しかしながら、無傷なトランスジーンより小さいものが増幅される場合には、このような伸長プライマーは、増幅される遺伝子製造物がトランスジーン中のDpn I部位に及ぶように選ばれる。もし、Dpn I切断が起こっていなければ、ＰＣＲ増幅は前もって決定された大きさを有する増幅された配列をもたらし、一方切断されているトランスジーンのためのプライマー伸長は、指数関数的増幅を引き起こさない。一般に、半胚からのDpn I／ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、電気泳動され、引き続いて、２つの伸長プライマーの間のトランスジーンの領域に相補的な標識プローブとハイブリダイゼーションされる。これは、増幅したＤＮＡ配列の大きさの決定を容易にし、もしあれば、半胚（以下、“トランスジェニック半胚”と呼ぶ）がそれから得られるところの着床前胚中にトランスジーンが組み込まれているか否かの指標を提供する。もし有していれば、残りの非処理トランスジェニック半胚は、宿主親中に移植される。子宮内での発達後、組み込まれたトランスジーンによって与えられる所望の表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物は、子宮内で又は出産後に適当な方法により同定される。もちろん、認識配列がメチル化されたＤＮＡ配列は切断できるが、メチル化されていない形は切断できない他の制限エンドヌクレアーゼを、上記方法において用いることができる。
Dpn Iを用いる上記方法においては、目的のトランスジーン中に配列ＧＡＴＣが存在することが必要である。そのような配列が存在しない場合には、その配列は特定部位の突然変異誘発（kunkel,T.A.,1985年、Proc.Natl.Acad.Sci.、第82巻、第488頁）又はカセット突然変異（Well,J.A.ら、1985年、Gene、第34巻、第315頁）によって、トランスジーン中に容易に導入される。但し、そのような突然変異は、トランスジーンによってエンコードされるアミノ酸配列を変えない（又はアミノ酸配列の重要でない変化を引き起こす）こと及びそのように作られたいずれのコドンも目的のトランスジェニック非ヒト動物中で機能すること。
着床前胚におけるトランスジェネシスを検出するための上記の方法は、トランスジェニック動物を製造するために要求される妊娠数を著しく減少し、そして着床された胚がトランスジェニック非ヒト動物を製造する可能性を大幅に増加させているので、トランスジェニック非ヒト動物を作るための、経済的で時間を節約した方法を提供する。このような方法は、非常に低いか又は存在しないトランスジェネシスの頻度しか得られない動物、例えばウシ種にとって特に重要である。他の実施例においては、着床前胚のトランスジェネシスを検出するための上記の方法は、トランスジェニック胚のクローン集団を作るための胚クローニング工程と組み合わせられ、該トランスジェニック胚は、その後、同じ遺伝子型を有するトランスジェニク非ヒト動物のクローン集団を製造するために宿主雌中へ着床される。この点においては、同じ“遺伝子型”を有するトランスジェニック胚及び／又は非ヒトトランスジェニック動物とは、個々の胚及び／又はトランスジェニック動物集団の間でゲノムＤＮＡが、実質的に同一であることを意味すると理解されるべきである。しかしながら、有糸分裂の間に種々の体細胞突然変異が起り得、そして、１以上の細胞及び／又は動物の遺伝子型に変異が生じ得るということが理解されるべきである。このように、同じ遺伝子型を有する集団は、個々の又は副次集団変異を示し得る。
半胚はトランスジェニック半胚であると同定された後に、クローン化される。このような胚クローニングは、いくつかの異なった方法により達成される。一つのクローニング方法においては、トランスジェニック半胚は個々の卵母細胞を着床前段階まで培養するために用いられるのと同じ又は類似の培地中で培養される。次いで、このようにして形成された“トランスジェニック胚”（好ましくは、トランスジェニック桑実胚）は、その後２つのトランスジェニック非ヒト動物のクローン集団を形成するために宿主雌中へ着床されるところの“トランスジェニック半胚”へと分割される。或いは、得られた２つのトランスジェニック半胚は、再び、着床前段階まで培養され、分割され、そしてトランスジェニック胚段階まで再培養されうる。この手順は、所望の数の同じ遺伝型を有するクローントランスジェニック胚が得られるまでくり変えされる。次いで、このようなトランスジェニック胚は、トランスジェンック非ヒト動物のクローン集団を製造するために宿主雌中へと着床されうる。
好ましいクローニング方法においては、トランスジェニック胚は、Pratherら、1988年、Biol Reprod.第37巻、第59〜86頁、Robleら、1987年、J.Anim.Sci.、第64巻、第642〜６６４頁の方法に従って、核移入によりクローン化される。この方法に従って、トランスジェニック胚の核は、脱核した卵母細胞中へと移植され、その後、それらのそれぞれは胚盤胞まで培養される。この時点で、トランスジェニック胚は、核移植によるクローニングのもう一つの過程に再び置くことができ、又は、同じ遺伝型をもったトランスジェニック子孫を製造するために宿主親へ移入されることもできる。
初期トランスジェネシス検出のための上記方法に加えて、トランスジェネシスを検出するために他の方法を用いることができる。このような方法としては、組織の子宮内及び分娩後分析を含む。子宮内分析は、いくつかの方法により行われる。一つにおいては、羊膜腔の経膣穿刺ガ、エコスコープ案内下で行われる（Bowagoら、1975年、Bet.Res.、第96巻、第124〜127頁、Rumseyら、1974年、J.Anim.Sci.、第39巻、第386〜391頁）。このことは、妊娠約35日から100日の間に約15〜20ミリリットルの羊水を回収することを含む。この羊水の量は、ml当りに、尿生殖管、皮膚及び発達している胚の恐らく肺由来の約1,000〜12,000の細胞を含む。これらの細胞のほとんどは死んでいる。しかしながら、このような細胞は、成功したトランスジェネシスの指標としてトランスジーンのためのＰＤＣＲ分析に付されるゲノムＤＮＡを含む。或いは、胎児細胞が、絨毛膜穿刺により回収され得る。この方法はまた、経膣的に及びエコスコープの案内下で行なわれ得る。この方法においては、宿主動物の胎盤、特に膣壁に固定された胎盤組織を穿刺するために針が用いられる。このような試料採取は、ウシでは妊娠60日付近で行われる。もし必要ならば、絨毛膜細胞を母親の組織から分離し、成功したトランスジェネシスの指標としてのトランスジーンのためのＰＣＲ分析に付す。
また、トランスジェネシスは出産後に検出されることもできる。このな場合は、トランスジーンの組み込みは、適当な組織生検例えば、推定されるトランスジェニック動物の耳又は尾からの組織生検を行うことにより検出されうる。尾の約１〜２センチメートル又は耳の約５〜10平方ミリメートルを取り、引き続き、Hoganらの方法（1986年、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Sabratoy）に従って、トランスジーンのためのプローブを用いてサザンブロッティングを行う。
トランスジェネシスはまた、他の組織から得られたＤＮＡを用いたサザンブロット法を用いることによって決定されうる。特に、組み変え雄牛からの精液はトランスジェニック動物を同定するのに有用である。
トランスジェネシスはまた、組織、分泌液（例えば、唾液）又は他の体液中での組み換えポリペプチドの発現を分析することによって検出され得る。乳牛ミルク中での組み換えポリペプチドの発現が最終目標である場合は、発現レベルのために雄牛の唾液を分析するのが特に有用である。これは、いくつかの乳房特異的プロモーターが、低いレベルではあるが、唾液腺の発現をも引き起こすからである。例えば、Archibaldら、1990年、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.、第872巻、第5178〜5182頁を参照。
組み換えポリペプチドが発現され、そしてトランスジェニックウシ種のミルク中に分泌される実施例においては、そのようにして得られたトランスジェニックミルクは、そのまま用いられるか又は組み換えポリペプチドを精製するために更に処理されるかのいずれかでありうる。これは、ある程度、トランスジェニックミルク中に含まれる組み換えポリペプチド及び該タンパク質の最終的な使用に依存する。ウシミルクの栄養価を増加させるために組み換えポリペプチドがトランスジェニックミルク中に分泌される場合には、通常、更なる精製は必要ない。このような状況の一つの例は、ヒトラクトフェリンが新生ヒト乳児の腸管感染を制御しそして鉄吸収を改善するための補足としてウシ種のミルク中に製造されるところの好ましい実施例の一つを含む。他の状況では、特定の組み換えポリペプチドをその栄養価値ゆえに、部分的な精製が望まれうる。従って、例えば、トランスジェニックウシミルク中に製造されるヒトラクトフェリンは、ミルクを約pH４〜５に酸性化して、カゼインを沈殿させることによって部分的に精製されうる。可溶分画（乳漿）は、部分的に精製されたヒトラクトフェリンを含む。
ウシトランスジェニックミルク中に含まれる組み換えポリペプチドは、食品処方中に用いられうる。特に有用な食品処方は、栄養又は他の有用価値のいずれかを有するトランスジェニックウシミルクからの１以上の組み換えポリペプチドを含む乳児処方を含む。例えば、本発明に従って作られたトランスジェニックウシミルクからのヒトラクトフェリンを含む乳児処方は、新生児の下痢を制御することを助ける静菌効果を提供する。同様に、組み換えポリペプチド例えばヒトカゼイン及びヒトリゾチームはまた、栄養価値を提供するために、トランスジェニックウシミルク中に作られうる。表２は、代表的な乳児処方の成分を説明している。そこに示されるごとく、タンパク質含有量は、処方100キロカロリー当たり、約1.8〜4.5mgの間で変化する。すなわち、組み換えポリペプチドを含む全タンパク質は、少なくとも米国における規定（表２の処方はそれに基づく）に基づく値の間にあるべきである。もちろん、組み換えポリペプチドを含む全タンパク質量は、前記の如く、特定の処方を用いるところの地域の規定に依存して変化し得る。
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乳児処方に加えて、他の食品処方もまた、トランスジェニックウシミルクからの組み換えポリペプチドによって補われうる。例えば、このような組み換えポリペプチドは、普通のダイエット処方を補うために用いられうる。
組み換えポリペプチドを、製薬として用いようとする場合には、そのような適用と一致した精製法が要求される。このような精製法は、精製されるべき特定の組み換えポリペプチドに依存し、そして一般的には、本技術分野の当業者に公知である。このような方法は、典型的には、カゼイン分画及びそれに続く、組み換えポリペプチドを含む適当な分画のクロマトグラフィーによる部分精製を含む。このようなクロマトグラフィーは、アフィニティクロマトグラジー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラジー及びＨＰＬＣを含む。
本発明の特定の実施例においては、トランスジーンは、トランスジェニックウシ種のミルク中にヒトラクトフェリンを製造するために提供される。ヒトラクトフェリン（ＨＬＦ）は、２つに第２鉄イオンを結合する一本鎖の糖タンパク質である。外分泌線によって（Masonら、1978年、J.Clin.Path.第31巻、第316〜327頁、Tenovuoら、1986年、Infect.Imnun.、第51巻、第49〜53頁）及び多核形好中球顆粒（Masonら、1969年、J.Exp.Med.第130巻、第643〜658頁）によって分泌されたこのタンパク質は、広い種類の細菌の成長を阻害することにより、宿主の非特異的防御系の一部として機能する。ＨＬＦは、培地中の利用可能なイオンをキレートし、この必須金属が侵入した細菌に近づけないようにすることにより静菌効果を示す。（Bullenら、1972年、Br.Med.J.、第１巻、第69〜75頁、Griffithsら、1977年、Infect,Immun.、第15巻、第396〜401頁、Spikら、1978年、Immunology、第８巻、第663〜671頁、Stuartら、1984年、Into J.Biohem.、第16巻、第1043〜1947頁）。もしタンパク質が第２鉄イオンで飽和されると、この効果はブロックされる。いくつかの研究は、ＨＬＦがある種の微生物に対して直接の細菌効果を示すと示唆している。（Arnoldら、1980年、Infect.Immun.第28巻、第893〜898頁；Arnoldら、1977年、Science、第197巻、第263〜265頁；Arnoldら、1981年、Infect.Immun.、第32巻、第655〜660頁；Arnoldら、1982年、Infect.Immun.、第35巻、第792〜797頁；Bortnerら、1986年、Infect.Immun.、第51巻、第373〜377頁）。細菌効果はまた、タンパク質の鉄飽和によって、阻害される。ＨＬＦの細菌効果の機構は、それがグラム陰性細菌の外膜にダメージを与えそして外膜の透過性を変えるということが示されているが、未だに仮説が立てられていない（Ellisonら、1988年、Infect.Zmmun.、第56巻、第2274〜2781頁）
ラクトフェリンは、ヒトミルク中で鉄を結合する主なタンパク質であり（約1.5〜1.7mg/mlの濃度で存在する）、小腸による鉄の吸収において役割を果たしうる。母乳中に存在するすべての鉄は、ｈＬＦに結合されていると考えられており、処方と比べて非常に高い効率で取り込まれる（Hide,D.W.ら、1981年、Arch.Dis.Child.、第56巻、第172頁）。ｈＬＦに結合された鉄の高い取り込みは、空腸中の受容体のためで、そしてアカゲサルにおいて受容体の存在を示唆するデータが示されている（Coxら、1979年、BBA、第588巻、第120頁；Davidson.L.A.ら、1985年、Fed.Proc.、第18巻、第901頁）。また、成人のヒトの小腸の粘膜細胞上の特定のラクトフェリン受容体を示す証拠もある（Coxら、1979年、Biochem.Biophys.Acta.、第588巻、第120〜128頁）。遊離鉄のレベルは、腸微生物叢の制御下に関係づけられている（Mevissen-Verhageら、1985年、Eur.J.Clin.Microbiol.、第４巻、第14頁）。母乳で育った乳児は、添加された鉄を含む及び含まない牛のミルクで育った乳児に比べて、相当に減少した腸内細菌を有し、そして便中に増加したビフィドバステリア及びクロストリジアの数を有することが示された。インビトロの研究において、ヒトミルクは、E.coli.に対して特定の阻害効果を有することが示されている（Brockら、1983年、Infect.and Immunit.、第40巻、第453頁）。ヒトミルクはまた、鉄結合性タンパク質、主にｈＬＦの高含量のために、小腸においてE.coli.に対して特定の阻害効果を有することが示されている（Bullenら、1972年、British Med.J.、i、第69頁）。
このように、トランスジェニックウシ種のミルク中のヒトラクトフェリンの製造は、ヒトラクトフェリンの供給原を提供する。このようなラクトフェリンは、処方目的のためにトランスジェニックミルクから精製されうる。或いは、全トランスジェニックミルクが、好ましくは低温殺菌後に溶液又は乾燥形態で用いられうる。更に、ヒトラクトフェリンの有益な作用は、ヒトラクトフェリン又はヒトラクトフェリンを含むトランスジェニックミルクをヒトリゾチームと組み合わせることができるということである。ヒトリゾチームは、トランスジェニックミルク中に１以上の組み換えポリペプチドを製造しうるトランスジェニック乳牛を製造するためにＨＬＦトランスジーンと同時に第２のトランスジーンを導入することによりトランスジェニック乳牛中に同時に製造されうる。或いは、トランスジーンは、順次ウシ種中に導入されうる。このようなケースでは、トランスジーンの一つを含んでいるトランスジェニックウシ種が得られる。その後、胚細胞、例えば卵がトランスジェニック雌から得られ、第２のポリペプチドをエンコードする第２のトランスジーンを取込むために処理される。好ましくは、卵を受精させ、引き続いてそのようにして得られた接合体の前核にマイクロインジェクションする。前記トランスジェニックウシミルク中の２以上の組み換えポリペプチドの組み合わせは、前述のヒトラクトフェリン及びリゾチームの組み合わせに限定されないと理解されるべきである。このように本発明は、トランスジェニックウシ種の製造を意図しており、このようなトランスジェニック動物によってトランスジェニックミルク中に１以上の組み換えポリペプチドが含まれるところのトランスジェニックミルクを意図している。
ＨＬＦの完全アミノ酸配列が決定されている（Metz-Boutigueら、1984年、Eur.J.Biochem.、第1451巻、第659〜676頁）。ＨＬＦは２つのドメインを含み、それぞれが一つの鉄結合部位及び一つのＮ−結合グリコシル化部位を含む。これらのドメインは、互いに相同性を示し、祖先遺伝子重複及び融合結果の徴候を示す。更に、ＨＬＦは、トランスフェリンファミリーの他のものと広い範囲で相同である（Metz-Boutigue、上記、Pontecostら、1987年、J.Biol.Chem.、第262巻、第10134〜10139頁）。鉄結合部位中に含まれるアミノ酸の配置は、ｘ−線結晶学によって決定されている（Andersonら、1987年、Proc.Natl.Acad.Sci.、第84巻、第1769〜1773頁）。好中球ＨＬＦの部分ｃＤＮＡ配列がRadoら、1987年、Blood、第70巻、第989〜993頁によって発表されている。ｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列と、ヒトミルクからのラクトフェリンの直接の分析によって決定されたアミノ酸配列とは、＞98％一致していた。ヒトラクトフェリンの鉄で飽和した構造及び、鉄が遊離した形は、すでに発表されている（Andersonら、1989年、J.Mol.Biol.、第209巻、第713〜787頁、Andersonら、1990年、Nature、第784  787頁）。
本明細書中で用いる“ヒトラクトフェリン”は、Metz-Boutigueら、1984年、Eur.J.Biochem.、第1451巻、第659〜676頁の記載及び図２に示されたものと実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。しかしながら、ヒトラクトフェリン配列の初期の部分配列においては、発表された配列と本明細書中で得られた配列の間で多くの不一致が明らかになったということを述べておく。特に、以下の不一致が存在している（アミノ酸番号は、図１の配列からのものであり、括弧内はＤＮＡの位置である）。
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従って、ヒトラクトフェリンはまた、本明細書中で示された配列の違いと発表されている配列を組み合わせた図１に示された配列によって定義される。ヒトラクトフェリンという言葉はまた、これらの配列のいずれかの対立変異又は１以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって１以上のアミノ酸が修飾されている組み換えヒトラクトフェリンの変異を含む。いくつかの場合には、ヒトラクトフェリンは、それに共有結合的に結合されている全ての又は部分的な分泌シグナル配列とともにミルク中に製造されうる。
本明細書中でいう“ヒトラクトフェリンＤＮＡ配列”とは、上記の定義されたヒトラクトフェリンをエンコードするＤＮＡ配列である。このようなヒトラクトフェリンＤＮＡ配列は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから得られうる又は、ヒトゲノム由来でありうる。本明細書の実施例２は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリー由来のヒトラクトフェリンのクローニング及びヌクレオチド配列を示している。このヒトラクトフェリンのＤＮＡ配列を図１及び図２に示す。そしてこのヒトラクトフェリンのＤＮＡ配列はRadoら、1987年、Blood、第70巻、第989〜993頁に示されたそれと実質的に同じである。ｈＬＦをエンコードする発現可能なトランスジーンを含むプラスミドの構築を、実施例中に記載した。これらのプラスミドの１つは、ウシ乳房分泌細胞中で組織特異的に発現するために設計されたトランスジーンを含むｃＧＰ１ＨＬＦ（これはまた時々16,8ＨＬＦ３と言われる）である。
本発明の第２の実施例においては、トランスジーンは、トランスジェニックウシ種のミルク中でヒト血清アルブミンを製造するために提供される。ヒト血清アルブミンは、584アミノ酸残基を含む血清タンパク質である（Minghettiら、1986年、J.Biol.Chem.、第261巻、第6747頁）。それは、ヒト血清中で、最も豊富なタンパク質であり、そして２つの重要な生理的機能を果たす。血清アルブミンは、血液のモル浸透圧濃度の約80％を担っており、そして脂肪組織間で脂肪酸を移送する。
ヒト血清アルブミンは、主として、循環系の浸透圧を回復することによって血漿容量を増やすために用いられる。最近、ｈＳＡ分画由来の熱処理された血清が、大手術を受けるほとんどの患者を含む、ショック及び外傷にあった者に注入される。ＨＳＡは、現在のところ、希少な血液タンパク質、例えば因子VIII及びIXを得るための血液分画方法の副産物としてヒト血漿由来である。しかしながら、遺伝工学手段によってこのような因子を製造するために最近開発された技術は、ヒト血清アルブミンの供給源をおびやかしている。
本明細書中で用いる“ヒト血清アルブミン”は、Minghettiら（同書）；Lawnら、1981年、Nucl.Acids Res.、第９巻、第6103頁に記載されたアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。１以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって修飾されている１以上のアミノ酸をその中に含む組み換えヒト血清アルブミン変異体を含むそれの変異もまた含まれる（Minghettiら、1986年、J.Bio.Chem.、第261巻、第6747〜6757頁）。いくつかの場合には、ヒト血清アルブミンは、ｈＳＡの分泌シグナル配列をエンードするＤＮＡを含むトランスジーンを発現することによりミルク中で製造されうる。或いは、ヒト血清アルブミンは、５′発現調節配列をエンコードするヒトゲノムＤＮＡ，ヒト血清アルブミンの分泌シグナル及び構造遺伝子、及び３′発現調節配列を含む完全な異種トランスジーンを利用してトランスジェニック動物の肝臓細胞中で製造され、そして肝臓細胞から分泌されうる。実施例中に示されたように、この異種配列を含むトランスジーンは、オーバーラップトランスジーンフラグメントのインビボでの相同組み換えによって形成され、トランスジェニック動物でｈＳＡを再構築する。このように形成されたトランスジェニック動物は、その循環系中にヒト血清アルブミンを製造した。
本明細書で用いる“ヒト血清アルブミンＤＮＡ配列”とは、上記で定義したヒト血清アルブミンをエンコードするＤＮＡ配列である。このようなヒト血清アルブミンＤＮＡ配列は、Uranoら、1986年、J.Biol.Chem.、第261巻、第3244〜3251頁及びUranoら、1984年、Gene、第32巻、第255〜261頁、及び本明細書の実施例中に記載された、λＨＡＬ−ＨＡＩ、λＨＡＬ−３Ｗ及び、λＨＡＬ−ＨＩ４から得られうる。
ヒト血清アルブミンＤＮＡ配列は、本明細書の実施例10の記載のようにしてクローン化され、そして引き続き、プラスミドのｃＧＰ１ＨＬＦ（これはまたp16,8ＨＬＦ４とも言われる）中にエンコードされたヒトラクトフェリン遺伝子の構築のために操作される。このプラスミドから、ウシのαＳ１カゼイン遺伝子の16kbの５′発現調節配列、ヒト血清アルブミンＤＮＡ配列及びαＳ′１カゼインウシ遺伝子の約８kbの３′フランキング領域を含むトランスジーンが得られる。このトランスジーンは、ウシ種からの受精卵母細胞へのマイクロインジェクションのために用いられる。トランスジェネシスの初期検出の後、ｈＳＡトランスジーンを含む胚盤胞は、宿主雌ウシ種中へ着床され、出産まで保持される。
以下実施例を示すが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。
実施例１：ウシαＳ１カゼイン配列に特異的なプローブの構築
Ａ．染色体ＤＮＡの単離
胎盤組織は、と場より得た。周囲の結合組織を除き、約30グラム毎の部分にして、液体窒素中ですばやく凍結した。染色体ＤＮＡは以下のようにして単離した：
30グラムの組織を、300mMスクロース、60mM KCl、15mM NaCl、60mM Tris:HCl、（pH8.2）、0.5mMスペルミジン、0.15mMスペルミン、２mM EDTA、0.5mM EGTAを含む緩衝液１の35mlを用いて、（氷上で）ホモジナイズした。１％NP40を含む氷冷した65mlの緩衝液１を加え、混合物を、氷上にて５分間保温した。3000xgにて５分間遠心した後、ペレットを１％のNP40を含む緩衝液１でさっと洗った。遠心工程をくり返した後、ペレットを５mlの緩衝液１に懸濁した。５mlの0.5M EDTAをすばやく加えた。最終容量は15mlとなった。0.15mlの10％SDS溶液を加えた。混合後、ＲＮＡｓｅ及びＴ１を最終濃度がそれぞれ0.4mg/ml及び６u/mlとなるように加えた。37℃で３時間保温後、プロテイナーゼＫを最終濃度が0.1mg/mlとなるように加えた。この混合物を37℃で15時間保温した。次いで、混合物を注意してフェノールで抽出した。水相を分離し、1/30容量の３M NaOAc pH5.2及び等容量のイソプロピルアルコールを加えた。沈殿物（ＤＮＡ）を、70％エタノールでさっと洗い、0.5mlの10mM Tris.HCl pH8.0、１mM EDTAにて４℃でゆっくり溶解した。
Ｂ．αＳ１カゼイン遺伝子の５′フランキング領域からの配列の増幅
２つのＤＮＡプライマーを、Yu-Leeら、1986年、Nucl.Acids.Res.、第14巻、第1883〜1902頁で発表された配列に基づいて合成した。プライマー１は、主要な転写開始部位に関係する位置-681に位置されており、以下の配列：
0003670003.tif 000005
を有した。
プライマー＃２は、主要な転写開始部位に関係する位置+164に位置されており、以下の配列；
0003670003.tif 000006
を有した。このプライマーの最初の８ヌクレオチドは、ウシゲノムによってエンコードされていないが、次のクローニング工程を容易にするためのMindIII制限部位を含む。これらのプライマーは、染色体ＤＮＡにアニールされ、そしてデオキシヌクレオチドの存在下で、ＴＡＱポリメターゼによって伸長された。３分後に、混合液を92℃にて１分間変性させ、50℃にて1.5分間再アニールさせ、そして、再び伸長温度（68℃）にて２分間保温した。このサイクルを30回くり返した。最終サイクル後に、期待されるEcoRI部位が存在するかどうかを確かめるためにＤＮＡを検査した。フラグメントの大きさ及びEcoRI部位の存在は期待のとおりであった。次いで、フラグメントを、オーバーハンギング（overhanging）末端を修復するためにクレノウ酵素で処理し、フラグメントの末端にホスフェート残基を結合させるためにキナーゼで処理し、キナーゼとクレノウ酵素を失活させるために65℃にて10分間保温し、そして最後にHindIIIで消化した。次いで、このフラグメントを、SmaＩ及びHindIIIで消化されたpUC19（Yanisch-Peroonら、1985年、Gene、第33巻、第103〜109頁）中にサブクローン化した。このフラグメントの同定の正式な証明は、このサブクローンの部分を（M13ベクター中へ再クローニングした後に）配列決定することによって得られた。決定された配列は、発表されている配列と同一であった。次いで、このプローブを、αＳ１−カゼイン遺伝子の５′フランキング領域に特異的なクローンを得るために、ウシゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いた。
Ｃ．αＳ１カゼイン遺伝子の３′フランキング領域からの配列の増幅
同様のアプローチを上記と同じように行なった。２つのプライマーを、Stewartら、1984年、Nucl.Acids Ros.、第12巻、第3895〜3907頁によって発表されている配列に基づいて設計した。５′プライマーはｃＤＮＡ配列の位置713にて開始されるコード配列のすぐ下流に位置された。それは以下の配列
0003670003.tif 000007
を有する。
他のプライマーは、ｃＤＮＡ配列の位置1070に位置され、以下の配列：
0003670003.tif 000008
を有した。これらのプライマーは、染色体ＤＮＡにアニールされ、これらのプライマーの間の領域は、上記のようにして増幅された。得られたフラグメントは予想より約900bp長かった。配列分析は、この大きさの介在配列は、ｃＤＮＡのヌクレオチド737〜738の間に存在することを示していた。増幅されたフラグメントは、在りうるオーバーハンギング末端を修飾するためにクレノウポリメラーゼで処理され、そしてフラグメントの末端にホスフェート残基を結合させるためにキナーゼで処理された。次いで、フラグメントを、前もってSmaＩで切断されたpUC19中に連結した。
Ｄ．αＳ１カゼインフランキング配列のためのウシファージライブラリーのスクリーニング
EMBL３中に構築されたウシゲノムライブラリーを、Dr.M.Groenen,（Agricultural University Wageningen、オランダ）から得、以下の方法によりスクリーニングした。バイテリオファージ粒子力価は、Escherichis coli MB406許容される宿主株（Strantagene Inc.）上で決定した。このことのために、ファージストックを、SM緩衝液（50mM Tris.HCl.pH7.5、100mM NaCl、10mM MgSO4、0.01％ゼラチン）で、いくつかに希釈し、200μlのMB406（O.D.550＝0.9）と混合した。37℃、20分間ののちに、３mlのトップアガロース（Luria-Bertani培地、0.8％アガロース、10mM MgCl2）を加え、そしてこれをLBプレート上に塗布し、そして37℃で一晩保温した。
次いで、400μlのMB406にファージストックの要求された量を加えることにより、約600,000ファージを塗布した。それに続く塗布は、上記と同じである。次の工程は、ニトロセルロースフィルターへのファージの移送であった。プレートを１時間４℃に置いた。ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ）を、トップアガロース層の上に置き、正確な位置をマークした。フィルターを持ち上げたのち、フィルターを（１）変性緩衝液（1.5M NaCl、0.5M NaOH）中にて30分間、（２）中和緩衝液（1.5M NaCl、0.5M Tris.HCl、pH8.0）中にて５分間、浸した。２倍のSSPE（360mM NaCl、20mM NaH2PO4、2mM EDTA）でさっと洗ったのち、フィルターを、80℃にて２時間、真空下で焼いた。
フィルターのプレハイブリダイゼーションを、50％ホルムアミド、５倍のデンハート溶液（0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）、５倍のSSPE、0.1％SDS及び100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、42℃にて２時間行った。ハイブリダイゼーションは、同じ緩衝液中で、振とう水浴中、42℃にて一晩行った。前述したようにして作ったプローブを、ベーリンガーマンハイムのランダムプライムド標識キットを用いて標識した。一晩のハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２倍のSSC、0.1％SDSで、室温にて３回洗った。
増幅スクリーン（デユポン）を用いて、-70℃でコダックXARフィルムを一晩照射した。陽性と推定されるものをプレートから取り出し、そしてSM緩衝液中で４℃にて一晩置いた。これらを上記のようにしてプレートに塗布し、ＤＮＡをプレート溶菌法（Maniatis,T.ら、1982年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor,N.Y.）に従って、単離した。５mlのSM緩衝液をトップアガロース層に加えた。２時間の穏やかな振とう後、緩衝液を除き、４℃にて、4000rpmで10分間回した。上清を、減菌管に移し、RNase及びDNasＩ（共に最終濃度１μg/ml）を加え、これを37℃で30分間保温した。等容量の20％ポリエチレングリコール、2.5M NaCl溶液を加え、氷上に１時間置いた。４℃にて、4000rpmで30分間遠心することにより、沈殿したバイテリオファージ粒子が残った。これらを、500mlSM緩衝液に懸濁し、SDS（最終濃度0.1％）及びEDTA（最終濃度５mM）を加え、これを68℃で15分間保温した。タンパク質をフェノール抽出及びクロロフォルム抽出の各工程で除いた。ファージＤＮＡの沈殿操作は、等量のイソプロパノールを用いて行った。ファージＤＮＡを１回、70％エタノールで洗い、50ml Tris.HCl、pH7.5、１mM EDTA緩衝液に溶解した。
制限酵素分析、アガロースゲル電気泳動、ゲルからニトロセルロースフィルタへのＤＮＡの転移及びサザンブロティングは、すべて、標準法（Maniatis、1982年、Molecular CLonig；A Laboratory Manual）に従って行った。プローブを用いたハイブリダイゼーション（後述する）は、上記のスクリーニング条件と同じ方法に従って行った。
Ｅ．ウシＳ１カゼインの５′フランキング領域を含むクローンの単離
３つの推定クローンを上述のプローブ及び方法を用いて同定した。もう一つの一連のスクリーニングの後、純粋な組み換えバクテリオファージを分析した。クローン化されたＤＮＡのSalＩ、EcoRＩ及びSalＩ/EcoRＩ（二重消化）による消化及び前述のプローブを用いたハイブリダイゼーションは、３つのすべてのクローンにおける挿入が同一であることを示した。挿入は、18kb（ SalＩで削除された、部分的Sau3Aフラグメント）からなっていた。クローンの転写方向は、（１）上述したプローブ１及び（２）プローブ１のNcoＩ-NsiＩフラグメントを用いた上述した制限フラグメントのハイブリダイゼーションによって決定した。これは、転写開始の上流約16kbの領域を示した。転写開始から下流は、他の1.9kbpであった。後者の領域の部分の配列決定は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子のエキソン２及びイントロン２の一部分の存在を示した。領域-103〜+300の追加の配列決定は、クローンの同一性を確認した。示された制限フラグメントの臭化エチジウムパターンはまた、EMBLベクター中のクローンの配向を示した。引き続く、以下の制限酵素（NcoＩ,PstＩ,KpnＩ,BamHＩ,HindIII,BglII）を用いたクローンの分析により、図３に示されるウシＳ１カゼイン遺伝しの５′フランキング領域の制限地図が得られた。
Ｆ．ウシＳ１カゼインの３′フランキング領域を含むクローンの単離
５′クローンを単離するために用いられた開始のファージの塗布からの重複したニトロセルロースフィルターを、先に述べたのと同じハイブリダイゼーション条件を用いて、３′αＳ１カゼインプローブを用いスクリーニングした。８の陽性なクローンが、２回のスクリーニングの後同定された。ファージＤＮＡを記載のようにして調製した。続いて、SalＩ、EcoRＩ及びSalＩ/EcoRＩを用いて制限消化し、そして３′αＳ１プローブを用いてハイブリダイゼーションを行ったところ、８つのクローンのうちの７つに、同一の挿入が示された。18.5kb EcoRＩ挿入を含む一つのクローンを、制限酵素BsteII及びBamHＩを用いて更に分析した。そのクローンの制限地図を図４に示す。
実施例２：ヒトラクトフェリン遺伝子のクローニング
Ａ．材料
制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ及びＴ７ポリヌクレオチドキナーゼは、Beringer-Mannheim,New England Biolabs又は、Bethesda Research Laboratoriesより得た。ラジオアイソトープは、Amershamより購入した。バクテリオファージλgt11中のヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーは、Clontech Inc.,Palo Alto,Calif.より得た。
Ｂ．ヒトラクロフェリン遺伝子の単離
ヒト乳腺ライブラリーを、標準プラークハイブリダイゼーション方法（Maniatisら、1982年、Molecular Cloning；A Laboratory Manual）によって、３つの合成オリゴマーを用いてスクリーニングした。オリゴマーの２つは、Radoら（上記）のｃＤＮＡ配列とアミノ酸位置435〜445及び682〜691において一致する30-マ-であった。第３のものは、ヒトコドン偏りに基づいた21-マ-の“最良の予測”プローブであり、アミノ酸残基18から24の間ＨＬＦのアミノ酸配列をコードした。それぞれは
0003670003.tif 000009
0003670003.tif 000010
0003670003.tif 000011
プローブを放射線標識し（Crouseら、1983年、Methods Enzynol.、第101巻、第78〜98頁）、そして重複フィルターをスクリーニングするために用いた。フィルターを最後に厳格に２倍のSSC、37℃にて洗浄した。
Ｃ．ヌクレオチド配列分析
ＤＮＡフラグメントを、低融点アガロースを用いて単離し（Crouseら、上記）そして、バクテリオファージM13mp18又はM13mp19（Messingら、1983年、Method Enzymol.、第101巻、第20〜78頁）中へサブクローン化した。配列は、シークエナーゼ酵素（修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）（Taborら、1987年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、第84巻、第4767〜4711頁）を用いて決定した。全ての反応を、製品仕様書（US Biochemiclas）に従って行った。配列を図１に示す。ｈＬＦ配列を、HindIII及びEcoRＩ（ファージ配列の周囲に存在）を用いて消化し、そしてｐＵＣ19のHindIII及びEcoRＩ部位中にサブクローン化し、ｐＵＳ１19Lacto4.1を形成した。このクローンは、成熟した形のｈＬＦの無傷なコーティング配列を含むが、完全なシグナル配列を欠いている。
実施例３：ウシαＳ１カゼインＣＡＴベクターの構築
実施例１で得られたαＳ１カゼインフラグメントが、異種遺伝子を発現するために必要とされるプロモーター及び他の性質を有するか否かを決定するために、αＳ１カゼイン遺伝子からの種々の量の５′及び３′フランキング領域を含む発現プラスミドを構築した。クロラムフェニコールアセチルトランスラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）をこれらのベクター構築物中に異種遺伝子として用いた。ＣＡＴ遺伝子は、通常哺乳類細胞中には存在せずかつ、発現可能遺伝子を含む細胞又は動物中で定量されうる検出容易な酵素活性（Gorman,C.N.ら、1983年、Mol.Cell.Biol.、第２巻、第1044〜1051参照）を与えるので、異種遺伝子構築物の発現レベルを検出するために有用である。
Ａ．ＤＮＡ配列
681bpのαＳ１カゼインプロモーター＋最初の非コーディングエキソン＋約150bpの最初の介在配列（ＩＶＳ）を、ＰＣＲ増幅により、実施例１の５′フランキングゲノムクローンから、NcoＩ−HindIIIフラグメント（約830bp）として単離した。このフラグメントは、図５Ａのフラグメント１と同定された。プライマー配列は
0003670003.tif 000012
及び
0003670003.tif 000013
から成り、
それらは、Yu-Leeら、1986年、Nuc.Acids Res.第14巻、第1883〜1902頁により発表された配列から設計された。
αＳ１カゼイン３′フランキング配列の約1.6kb（フラグメント２、図５Ａ）を、ＰＣＲ増幅により、実施例１のウシ３′フランキングゲノムクローンから単離した。この領域は、αＳ１カゼイン遺伝子の３′非翻訳領域中の前述したスプライスを含んでいた。フラグメント２をｐＵＣ19のＳｍａＩ部位中へサブクローン化した。プライマー配列は、
0003670003.tif 000014
及び
0003670003.tif 000015
から成り、
それらは、Stewartら、1984年、Bucl.Acids.Res.、第12巻、第3895〜3907頁）により発表された配列から設計された。
免疫グロブリン遺伝子（Bothwellら、1981年、Cell、第24巻、第625〜637頁）の３′スプライス部位を含むハイブリッドスプライスシグナルは、合成的に調製され、両端に位置する、ユニーク制限部位とともにｐＵＣ18中に挿入され、ｐＭＨ-１を製造した。このプラスミドを図６に示す。NcoＩ及びHindIII部位はウシ５′ゲノムクローンからのフラグメント１との連結が、機能的なハウリッドスプライス配列を生じるように設計された。図11参照。
ポリアデニル化配列は、ＳＶ40ウィルスより、pRSVcat（Gorman,C.M.ら、1982年、Proc.Natl.Acad.Sci.、第79巻、第6777〜6781頁）から単離されたBamHＩ-DraＩフラグメント（図５Ａ中のフラグメント３）として得られた。
細菌ＣＡＴコーティング配列を、PstＩ-BamHＩフラグメントとしてpUC19中へサブクローン化した。
Ｂ．ｐＳ１３′５′ＣＡＴの構築
αＳ１カゼインプロモーターのフラグメント１を、NcoＩ及びHindIII部位の間にて、pMH-1（図６）中へサブクローン化し、pMHS15′フランクを形成した。
SV40ポリアデニル化配列（フラグメント３）を、BamHＩ-DraＩフラグメントとしてpUC19中に、３′αＳ１カゼインフランキング配列（フラグメント２）に対して３′側のすぐのところにサブクローン化し、pUC193′UTR/SV40を形成した。これは、pMH-1中にサブクローン化されてpMHS13′UTR（図５Ｂ）を派生する（３′フランキング配列及びポリ（Ａ）配列を含む）連続的EcoRＩ-SalＩフラグメントの除去を可能とし、該pMHS13′UTRは、後にヒトラクトフェリンをエンコードする配列を含むpMHSＩ3′UTRhlfを構築するために用いられる。
EcoRＩ-SalＩ配列（フラグメント２及び３）を、pMHS15′フランクのEcoRＩ-SalＩ部位中へサブクローン化し、pS13′5′フランクを形成した。
クレノウを用いてBamHＩ部位をブラント化（blunting）したのち、PstＩ-BamHＩ ＣＡＴフラグメント（図５Ｂ中のフラグメント４）を、PstＩ及びSmaＩ部位の間にて、pS13′5′フランク（図５Ｂ）中にサブクローン化し、pS13′5′ＣＡＴを形成した。
Ｃ．pS15′ＣＡＴの構築
ＣＡＴフラグメント（図５Ｂのフラグメント４、PstＩ-BamHＩ）及びSV40ポリアデニル化フラグメント（図５Ａのフラグメント３、BamHＩ-DraＩ）を、pMHS15′フランクのPstＩ及びSmaＩ部位中にサブクローン化し、pS15′ＣＡＴ（図５Ｃ）を形成した。
Ｄ．ＣＡＴ生産の検定
これらのＣＡＴプラスミドのそれぞれを、リン酸カルシウム共沈降法（Gorman,C.M.ら、1983年、Science、第221巻、第551頁；Graham,F.L.ら、1973年、Virology、第52巻、第456〜467頁）によりヒト293S細胞（Graham,F.L.ら、1977年、J.Gen.Virol.、第36巻、第59〜72頁）中へトランスフェクトした。トランスフェクションの44時間後に細胞を集め、そして細胞抽出物を、ＣＡＴ活性について検定した（Gorman,C.M.ら、1982年、Mol.Cell.Biol.、第２巻、第1011頁；de Crombrugghe,B.ら、1973年、Nature[London]、第241巻、第237頁〜251頁、Nordeen,S.K.ら、1987年、DNA、第６巻、第173〜178頁によって改良された方法）。サイトメガロウウィルスイミディエイト（Immediate）初期プロモータによって促進されたＣＡＴを発現する対照プラスミド（Boshart,M.ら、1985年、Cell、第41巻、第521頁）を、トランスフェクション効率を検定するためにヒト293S細胞中へトランスフェクトした。
pS13′5′ＣＡＴは、これらの細胞中で対照プラスミドの約30〜100分の１のレベルで発現されたが、バックグランドよりは著しく高かった。プライマー伸長分析は、転写が、予期された領域中で主に開始しているということを示した。
pS15′ＣＡＴが、293S細胞中にトランスフェクトされた場合もまた、発現が検出された。
実施例４：ウシαＳＩカゼイン／ヒトラクトフェリン発現コスミドcGP1ＨＬＦ
Ａ．ＤＮＡ配列の構築
実施例１の16kbウシαＳ１カゼイン５′フランキング配列を、SalＩ-BglIIフラグメントとしてウシゲノムライブライー（ファージGP1）から単離した。BglII部位は、αＳ１カゼイン遺伝子の最初のイントロン及び第２のエキソンの結合部にある。
ウシαＳ１カゼインシグナル配列（Stewartら、1984年、Nucl.Acid.Res.、第12巻、第3895頁）は、Cyclone Plus ＤＮＡシンセサイザー（Millgen/Biosearch Ｉ）上で合成した合成ＤＮＡから調製し、無傷のスグナル配列＋５′末端に結合したXhoＩ及びClaＩ部位、及び３′末端に結合したNaeＩ部位を含む（フラグメント８、図７Ｂ）。
EaeＩを用いてのpUC119Lacto4.1の切断は、成熟ｈＬＦの最初のアミノ酸のためのコドンの場所において、正確にプラスミドを開環した。クレノウによる処理を、オーバーハンギング５′末端を満たすために用いた。更にAccＩ及びEcoRＩを用いた切断は、２つのフラグメント（ａ）成熟ｈＬＦの最初の243bpを含むEaeＩ-AccＩフラグメント（フラグメント５、図７Ｃ）及び（ｂ）残りのコーディング配列の５つの末端コドン以外のすべてを含む1815bpの近接AccＩ-EcoRＩフラグメント（フラグメント６、図７Ｃ）を与えた。
EcoRＩ部位から始まり、停止コドンを４塩基超えて伸びているｈＬＦの最後の５つのコドンを含む合成リンカーを調製した。KpnＩ部位を３′末端に加えた（図７Ｃ中のフラグメント７）。
αＳ１カゼインのコーティング領域のすぐ下流から始まる配列及び５′末端から約350bpのところにBstEII部位を含む8.5kbのEcoRＩ3′フラグメントを、ウシゲノムライブライーから単離した（図４）。このフラグメントを、EcoRＩ部においてpMH-1中にサブクローン化してpMH3′E10を形成した（図７Ａ）。SalＩ部位は、pMH3′E10の3′EcoRＩ部位に隣接している。
Ｂ．ｃＧＰ１ＨＬＦの構築
ｈＬＦ３′リンカー（フラグメント７、図７Ｃ）を、pMH3′UTR（図７Ａ）のEcoRＩ−KpnＩ部位中にサブクローン化して、pMH3′UTRhLF2リンカー（図７Ａ）を製造した。
次いで、合成ウシαＳ１カゼインシグナル配列（フラグメント８）をpMH3′UTRhLF2リンカーのXhoＩ及びSmaＩ部位中にサブクローン化して、pS13′hLF1/2L（図７Ｂ）を作成した。
２つのｈＬＦコーディングフラグメント（図７Ｃ中のフメント５及び６）をpS13′hLF1/2L（図７Ｂ）のNaeＩ及びEcoRＩ部位中にサブクローン化してpS13′UTRhLF（図７Ｃ）を作成した。
pMH3′E10（図７Ａ）からの巨大なαＳ１カゼイン３′ＵＴＲフラグメントをBstEII-SalＩフラグメントとして単離し、そしてpS13′UTRhLFの同じ部位中にサブクローン化して、phLF3′10kb（図７Ｄ）を形成した。
コスミドcGP1HLFを３系連結（3-way ligation）（図７Ｆ）から調製した：
（１）ファージＧＰ１（実施例１、図３）からの16kbの５′フランキング配列を２つのリンカーアダプターを結合することによって修飾した。５′末端のSalＩ部位を、NotＩ-ＳａｌＩリンカーに連結させた。３′末端のBglII部位をBglII-XhoＩリンカーに連結させた；
（２）５′末端がαＳ１カゼインシグナル配列により及び３′末端が約8.5kbのαＳ１カゼイン３′フランキング配列により隣接されたｈＬＦコーディング領域を、ｐｈＬＦ３′10kbからXhoＩ-SalＩフラグメントとして単離した。５′末端のSalＩ部位をSalＩ-NotＩリンカーに連結させた；
（３）コスミドpWE15（Stratagene,Inc.）は、NotＩを用いて直線状とした。
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からのフラグメントを互いに連結させ、市販のラムダパッケージング抽出物（Stratagene,Inc.）を用いて、細菌中へトランスフェクトし、cGP1HLFを製造した。
実施例５：ウシαＳ１カゼイン／ｈＬＦ発現プラスミド
Ａ．pS13′5′hLFの構築
pS13′UTRhLFのHindIII-SalＩフラグメントを、pMHS15′フランク中の同じ部位中にサブクローン化して、pS13′5′hLF（図７Ｅ）を作った。このプラスミドは、681bpのウシαカゼインプロモーター配列、αＳ１カゼイン／ＩｇＧハイブリットイントロン、αＳ１カゼインシグナル配列、ｈＬＦコーディング領域、約1.6kbのαＳ１カゼイン３′フランキング配列及びＳＶ40後期領域ポリアデニル化配列を含む。
Ｂ．pS15′hLF
プラスミドpS13′5′hLF（図７Ｅ）を、αＳ１カゼインの1.6kbの3′フランキング配列に隣接するKpnＩ及びBamHＩで切断した。比較的大きなベクターフラグメントを精製して、クレノウでブラント末端とし、そして自己連結によりpS15′hLFを形成した。
Ｃ．hLFのラジオイムノアッセイ
ウシ又はマウスのタンパク質に交叉反応しない、ヒトラクトフェリンに対するモノクローナル抗体の腹水液の免疫グロブリンに富んだ分画を、50％硫安沈殿により調製して、CNBr-活性化セファロース４Ｂに結合させた（１ｇのセファロースに対してタンパク質20mg）。セファロースビーズを10mM EDTA、0.1％（w/v）ポリロレン及び0.02％（w/v）NaN3を含むリン酸塩緩衝塩類溶液（PBS;10mMリン酸ナトリウム、0.14M NaCl）、pH7.4に懸濁した（2mg/ml）。セファロース懸濁液（0.3ml）を、２mlのポリスチレン管中に試料（通常50μl）と共に入れて、垂直方向（head-over-head）回転によって室温にて５時間保温した。次いで、セファロースビーズを生理食塩水で洗い（1.5mlで５回）、0.5mlのPBS、0.1％（w/v）のトゥイーン−20とともに、50μl（1kBq）の125Ｉ−標識アフィニティー精製したポリクローナルウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体といっしょにして16時間室温にて保温した。その後、セファロースを再び生理食塩水で洗い（1.5mlで４回）、結合された放射能を測定した。結果は、加えた標識した抗体の結合％として表わした。試料中のラクトフェリンのレベルは、標準として精製したヒトミルクラクトフェリン（PBS,10mM EDTA,0.1％（w/v）トゥイーン20で一連の希釈）を用いて、ナノモルで表わした。
別々の機会における標準のくり返しの試験より、このＲＩＡは非常に再現性がよく、変動の内部及び相互（inter）検定係数は、５〜10％の範囲であったことが示された。0.1ナノグラムと少ないヒトラクトフェリンもこのＲＩＡにより容易に検出されうる。
Ｄ．293S細胞中での発現
293S細胞に、上述のｈＬＦプラスミドをトランスフェクトした（トランスフェクション効率のための対照として１μgのＣＭＶ−ＣＡＴプラスミドをコトランスフェクトした）。トランスフェクションの44時間後に、培地を細胞から除去し、上記のようにしてｈＬＦの検定をし、ＲＮＡをStrykerら、1988年、EMBO J.、第８巻、第2669の記載のようにして単離した。結果は以下のように要約される：
１．トランスフェクション効率は、２つのｈＬＦプラスミドで同じであった；
２．ｈＬＦは細胞中で発現されて、培地中へ分泌された。いずれの場合でも、そのレベルは、約３×106細胞を用いて約0.4μg/ml培地である；
３．タンパク質は、用いた試料の関数として、結合された125１−抗ラクトフェリンの量を測定する投与量−応答検定においてヒトミルク試料中でｈＬＦと同じに挙動する。
４．タンパク質は、ウエスタンブロッティングによって判断すると、ヒトミルク中のものとはほぼ同じ大きさ（80kb）を有している。
５．細胞中で製造されるｈＬＦＲＮＡは、正しい大きさを有しており、そのレベルは、ノーザンブロッティングによて判断すると、いずれのプラスミドも類似であった。
これらのデータは、これらの２つの発現プラスミドがｈＬＦを発現できるということを示している。今までのところ用いたすべての標準によると、タンパク質は、ヒトミルク中に存在するｈＬＦと同じである。異種シグナル配列は、細胞から培地中へのタンパク質の分泌を促進する機能を果たす。更にこれらのプラスミドに用いられたカゼイン調節配列は、異種遺伝子の発現を促進できる。
実施例６：ウシ卵母細胞のインビトロ成熟、受精及び培養
未成熟卵母細胞は、畜殺場で得た卵巣の卵炉胞を吸引することにより大量に得られる（400〜500/day）。未成熟卵母細胞が受精を受ける能力をもつまで、それをある期間インビトロで培養する。“成熟化”するとすぐに、卵母細胞は、すでに成熟されているか又はインビトロで“受精能獲得した”精子によって受精される。次いで、受精卵母細胞の前核に、ヒトラクトフェリンの発現及び分泌をエンコードするトランスジーンを注入する。次いで、このインビトロの受精及びマイクロインジェクションにより得られた接合体は、調製された又は卵管組織によって、“順化された”培地中で後期桑実胚又は胚盤胞段階まで培養される（５〜６日）。次いで、胚盤胞は、残りの妊娠のために宿主ウシに非外科手術的に移入されるか、又は本明細書中に記したトランスジーンの組み込みについて分析される。
インビトロ成熟（ＩＶＭ）
卵巣を、地元の畜殺場でと殺の直後に得て、卵母細胞を回収する。或いは、卵母細胞は、生きているウシより、外科手術、エンドスコープ又は、経膣超音波方法により得られる。すべての場合において、卵母細胞は、卵巣の卵炉胞（直径２〜10mm）より吸収される。洗浄後、卵母細胞を、10％牛胎児血清が補われたM199から成る成熟培地中に置き、39℃で24時間培養した。Sirardら、1988年、Biol.Reprod.、第39巻、第546〜552頁。
インビトロ受精成熟（ＩＶＦ）
成熟した卵母細胞を、新鮮な又は解凍された精子で受精させる。精子は、第一に“泳ぎのぼる（swim-up）”分離方法（Parrishら、1986年、Theriogenology、第25巻、第591〜600頁）により、自動力に富んだ精子の集団を得ることによって、受精のために調製される。次いで、自動力のある精子を、精子の受精能獲得を引き起こすヘパリンを補なった修飾Tyrode溶液（Parrishら、1986年、上記）から成る受精培地に加える（Parrishら、1988年、Biol.Reprod.、第38巻、第1171〜1180頁）。受精能獲得は、受精に必須の最終の精子成熟プロセスの一部を成す。精子及び卵母細胞を18時間、共培養（co-culture）する。このＩＶＦ方法の有用な特徴は、（解凍した精子の場合でも）特定の精液のための最適な受精条件が、いったん最適にされれば、安定した再現性のある結果が得られることである。（Parrishら、1986年、上記）。
インビトロ培養（ＩＶＣ）
マウス、ウサギ又はヒトの卵の発生を支持する慣用の培養系は、８〜16細胞段階を過ぎたウシ胚の発達は支持しない。この問題は、卵管組織で前もって条件化された培地によって克服された。卵管−条件化された培地は、インビトロで８〜16細胞段階を過ぎたウシ胚を胚盤胞段階まで支持する。（EyestoneとFirst、1989年、J.Reprod.Fert.、第85巻、第715〜720頁）。
ウシ胚は、インビトロ培養に対して無反応であると証明された。このことは部分的に、８〜16細胞段階においてインビトロでの分割に対する“ブロック”の存在から起る。このブロックは、ウサギ（Bolandによるレビュー、1984年、Theriogenology、第21巻、第126〜137頁）又はヒツジ（Willadeen、1982年、Mammalian Egg Transfer（E.Adams編、第185〜210頁）；Eyestoneら、1987年、Theriogenology、第28巻、第１〜７頁）の卵管中で胚を培養することにより、軽減されうる。しかしながら、これらのインビボでの代わりの方法は、理想より低いものであった。そこでは（１）それらは、大多数の宿主動物の維持を必要とする。（２）それらは、移入のために卵管に接近するための外科手術及び胚を回収するための第２の外科手術（又は犠牲）を必要とする。（３）すべての移入された胚は、ほとんど回収されない。そして（４）観察又は処理のための培養の間での胚への接近は全く不可能である。インビトロ培養系が無いことは、ウシの発達のタイムテーブル及び個体発生の基礎的情報の蓄積を妨げ、そして、非外科的胚移送及び冷凍保存技術と適合する段階（例えば、後期胚盤胞段階）へと胚を培養する方法を複雑化することにより様々な操作技術（例えば前核注入による遺伝子移送）の開発を阻止している。
胚を栄養膜組織と共培養した場合に216細胞まで分割されるということをCowanら、（1984年、J.Reprod.Fert.、第72巻、第470〜485頁）が論証するまで、ウシ胚をインビトロで８〜16細胞の“ブロック”過ぎまで培養するという試みは成功しなかった。
共培養方法は、同種又は異種卵管が接合体から胚盤胞への発生を支持するという能力に基づいて卵管組織にまで拡げられた。このように、卵管組織と共培養された又は卵管組織によって順化された培地中で培養されたウシ胚は、インビトロで接合体から胚盤胞へと発生した（EyestoneとFirst、1989年、J.Reprod.Fert.、第85巻、第715〜720頁；Eyestone W.H.、1989年、“インビボ及びインビトロでの初期ウシ胚の発生に影響する因子”、ph.D.Thesis,Wisconsin大学）。胚盤胞は、この系で、過排卵及び人工授精の後、又は未成熟卵母細胞のインビトロ成熟（ＩＶＭ）及び授精（ＩＶＦ）により製造された。この方法によって製造された胚盤胞は、宿主動物に移入された後妊娠を引き起こし、子牛を生み出した。得られた結果は以下の通りである：
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それ故、初めの毎日の500卵母細胞の収集から、約55の妊娠が生じると期待される。
卵管組織の共培養及び順化培地の調製
１．と殺後又は、卵管排除によってウシ卵管を得る。
２．無傷の卵管を穏やかにガラススライドでこすることにより管腔組織を集める。
３．10mlの修飾チロデス（tyrodes）ヘペス溶液（Parrishら、1988年、Biol.Reprod.、第38巻、第1171〜1180頁）で組織を５回洗浄する。
４．最終の組織ペレットを、Ｍ199（10％牛胎児血清を追加）中に、組織１容量：培地50容量の比で懸濁した。
５．組織懸濁液を胚共培養のために用いることができる。
６．或いは、培地を48時間順化して、懸濁液を遠心したのち、上清を胚培養培地として用いることができる。順化培地は、所望により-70℃で保存されうる。順化培地は、胚培養のためにそのままで用いられるべきである（希釈なしで）（Eyestone、1989年、同書）
実施例７：ウシ卵前核中へのｈＬＦトランスジーンのマイクロインジェクション
ｈＬＦ発現単位を含むＤＮＡフラグメントを適当な制限酵素で消化することによりベクターから切り出して、アガロースゲル上で分離した。フラグメントを電気溶出、フェノール及びクロロホルム抽出、及びエタノール沈降（Maniatisら）により精製した。ＤＮＡフラグメントを、１〜２μg/mlの濃度にて、10mMtris、0.1mM EDTA、pH7.2に溶解し、そしてその溶液で透析する。マイクロインジェクション針を透析したＤＮＡ溶液で満たす。
インビトロ授精前に、最大スピードで２分間、ボルテックスにかけるか、又は標準マイクロピペット中で、数回上下にピペッティングすることのいずれかにより卵丘細胞を卵から除去する。前核を見えるようにするための遠心工程を加え、ウシ前核（引用例でいうマウス前核として）は注入される（Mogan,B.ら、1986年、マウス胚の操作、Cold Spring Harbor Laboratory）。注入は、受精の18〜24時間後に行った。時間は、精液の供給源として用いた雄牛に依存して変化する。精液の異なる処理単位は、異なる時間において、核を可視化させた。
インビトロで成熟されそして受精されたウシ卵母細胞をエッペンドルフチューブ中で、チロデスヘペス溶液（Parrish、1987年）1ml中にて、14,500gで８分間回した（Wallら、1985年、Biol.Reprod.、第32巻、第645〜651頁）。胚を、パラフィンオイルで覆った顕微鏡スライド上の一滴のチロデスヘペス溶液の滴に移入した。液圧系を用いて、前核がともに見れるようにして卵母細胞を卵ホルダーに固定した（干渉−コントラスト又は相−コントラスト光学系を用いた。）必要であれば、卵母細胞をころがし、卵ホルダー上での位置を変え、前核を見えるようにする。注入針を、前核の一つの同じはっきりした焦点の中へ持っていく。次いで、針は、透明帯、細胞質体を通され、前核中へ進められる。ＤＮＡ溶液の、針の外への一定の流れ又はパルス流れ（スウィッチを用いる）のいずれかにより１〜３p1の少量が、前核中に注入される（20〜100ＤＮＡコピーを含む）。或いは、２細胞段階の胚を、記載の如く回し、両割球の核は、記載の如く、注入される。次いで、注入された胚は、桑実胚又は胚盤胞段階へ発生させるために実施例６に記載の如く、共培養培地の一滴へ移入される。
実施例８：ｈＬＦトランスジーンでのトランスジェネシスの初期検出
構築物をマイクロインジェクションした後、卵母細胞を培養した。それぞれの胚の適した部位を割り、そして溶解（King,D.ら、1988年、Molecular Reproduction and Development、第１巻、第57〜62頁）、タンパク質の加水分解（Higuchi R.、1989年、“増幅（ＰＣＲユーザーのためのフォーラム）、第２巻、第１〜３頁）及びＤＰＮＩ消化を行った。ＰＣＲは、２つのプライマー（１つはαＳ１ｃＤＮＡ配列中、他はｈＬＦｃＤＮＡ配列中）のセットを用いて前述のようにして（Ninomiy,T.ら、1979年、Molecular Reprod.and Devel.、第１巻、第242〜248頁）を行った。例えば、ＰＣＲ中で、前進プライマー（30mer）αＳ１配列は、
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そして、ｈＬＦ配列中の逆行プライマー（30mer）は、
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（図１の971〜1,000）、
であり、990bpフラグメントが作られる。このフラグメントは、前進プライマーの開始から934bp離れたところに、アデノシン−メチル化の欠失のために今のところ不活性な、DpNＩ部位を含む。
実施例９：ウシ種ミルク中でのｈＬＦの製造
マイクロインジェクトされた卵母細胞から発生したウシ桑実胚をDonahue（Donahue,S.、1986年、Genetic Engineering of Animals,J.Warren Evansら編、Plenum）の方法に従って、割る。桑実胚の半分を胚盤胞へと発生させるために培養する。他の半分は、実施例８に記載の如く、ＤＮＡ分析に付す。この分析の結果が判った時には、培養に置かれた桑実胚は、胚盤胞へと発生しているか又は脱核接合体への核移入の供給源となる。同期させた乳牛中への胚盤胞の移入は、Betteridgeの方法（Betteridge,K.J.、1977年；農場動物の胚移入、技術及び適応のレビュー）に従って行った。
ｈＬＦは、実施例５のＲＩＡを用いて、乳分泌トランスジェニック子孫のミルク中に検出された。
実施例10：ウシαＳ１カゼイン／ｈＳＡ発現プラスミド
完全なｈＳＡ遺伝子を含む３つのオーバーラップファージクローンをｈＳＡの発現ベクターの構築のために用いた。それらは、消化されたλＨＡＬ−ＨＡ１、λＨＡＬ−３Ｗ及びλＨＡＬ−Ｈ14である。それらは、Uranoら、1986年、J.Biol Chem.、第261巻、第3244〜3251頁及びUranoら、1984年、Gene、第32巻、第255〜261頁に記載されている。遺伝子及び周辺領域の配列は、Minghettiら、1986年、J.Biol.Chem.、第261巻、第6747〜6757頁に発表されている。完全なｈＳＡ遺伝子を含む単一のファージは、以下のようにして構築された：
クローンＨＡ−１を、BstEII及びAhaIIで切断する。位置1784（最初のエキソン中で、ＡＴＧのすぐ下流）から3181に及び約1400bpのフラグメントを単離して、合成リンカーを、BstIIで切り出される最初の数アミノ酸並びにＡＴＧ付近の配列並びに少しの慣用の制限部位を含むところの５′末端にて、BstII部位に結合させた。このフラグメントはフラグメント＃１と呼ばれる。
クローン３ＷをAhaII及びSacＩで切断して、位置3181から16322まで及ぶ約13.1kbのフラグメントを単離して、そして、合成リンカーをSacＩ部位に結合して、ファージEMBL3中へのクローニングを容易とした。このフラグメントはフラグメント＃２と呼ばれる。
これらの２つのフラグメントは、連結され、ファージEMBL3中にクローン化される。正しいファージの同定後に、クローンＨ−14から単離したSacＩ〜SalＩフラグメント（位置16322から約21200に及ぶ）から、BstEII部位（そこにユニーク制限部位が導入されている）のすぐ上流からSacＩ部位まで及ぶフラグメントを単離し、そして、連結する。次いで、これらの２つのフラグメントは連結され、EMBL4中でクローン化される。
ClaＩ（BstEII部位のすぐ上流、新しく導入された）及びBamHＩ（ファージＤＮＡ中のSalＩ部位のすぐ下流）で切断後に、約2.5kbの3′フランキング配列を伴なった完全なｈＳＡ遺伝子を含むフラグメントがこの新しいクローンから得られた。
hSAの発現ベクターを構築のために、コスミドcGpＩHLFを部分的に、ClaＩ及びBamHＩで消化した。これは、シグナル配列、ｈＬＦのコーディング配列、αＳ１カゼインの3′-UTR及びポリ（Ａ）付加領域並びにカゼイン遺伝子の小領域３′が除去されている。
これを上述のhSAフラグメントと連結した。得られたコスミドはcGPＩHSAと呼ばれる。
このように形成された発現ベクターは、（１）αＳ１カゼイン遺伝子由来の16kbのプロモーター配列、（２）ともにGPI中に存在するこの遺伝子の最初のエキソン及び介在配列、（３）hSA遺伝子のシグナル配列（完全なゲノム遺伝子は該遺伝子の下流2.5kbを含むhSAをエンコードする）及び（４）αＳ１カゼイン遺伝子由来の約８kbの３′フランキング配列を含む。
このトランスジーンは、ウシ種のミルク中にｈＬＦを製造するために用いた方法とほぼ同じ方法でミルク中にｈＳＡを製造するトランスジェニックウシ種を製造するために用いられる。
実施例11：ウシ種のミルクからのＨＳＡの精製
ミルクからの異種タンパク質の精製は、以下の事実により容易である。カゼイン沈降のあとでは、これらのタンパク質のほとんどは、乳漿分画中に見られ、それは微生物又は細胞に基づいた系で用いられる生産培地に比べて混入が少ない。
クロマトグラフィー法が、乳牛ミルクからのｈＳＡの精製に好ましい。この方法は、エタノール分画と比べて、良好な回収及び高アルブミン純度並びに低いアルブミンポリマーの含量をもたらす。（Curling、1980年、“血清タンパク質分画の方法”、Curling編、Academick Press London,UK,Curlingら、1982年、J.Parenteral Sci.Technol.、第36巻、第59頁；BerglotらとMartinacheら、1982年、Joint Meeting IHS-ISBT,Budapest）。ｈＳＡの特異的な輸送の役割並びに脈管内の浸透圧の維持という主要な役割はまた、クロマトグラフィー精製の後も良好に保存されうる（Steinbrach、1982年、Joint Meeting ISH-ISBT,Budapest）。
以下の工程をトランスジェニック乳牛のミルク中で製造されたｈＳＡを回収するために用いた：
１．pH4.5で及び／又はキモシンを加えることによるカゼイン（ミルクタンパク質の約80％）及び本質的に全てのミルク脂肪の沈降。乳漿分画はアルブミンを含む；
２．シバクロンブルー３ＧＡ−セファロースＣＬ−６Ｂでのアルブミンのアフィニティクロマトグラフィー（Harvey、1980年、血清タンパク質分画の方法、既に引用）：この工程によりアルブミン以外のタンパク質が除かれ、そして、操作容量を約1/30に減少できる。アルブミンは、0.15M NaCl及び20mMサリチル酸ナトリウム、pH7.5でこのマトリックスより溶出される；
３．セファデックスＧ−25での緩衝液交換：0.025M酢酸ナトリウムへと脱塩して、pHを5.2に調節し、続いて濾過した；
４．DEAE-セファロースCL-6Bでのアニオン交換クロマトグラフィー。アルブミンの脱着はpH4.5；
５．CM-セファロースCL-6Bでのカチオン交換クロマトグラフィー。アルブミンは0.11M酢酸ナトリウム、pH5.5で溶出し、限外濾過によりアルブミンの濃度を６％（w/v）溶液とする；そして
６．セファクリルS-200でのゲル濾過。高分子量タンパク質の分画（例えば、アルブミンポリマー、発熱物質）を捨てる。主要分画（アルブミンモノマー）を限外濾過により濃縮して、処方した。
工程３〜６は、血漿からのｈＳＡの精製のための、Curling他により記載されている方法（Curling、1980年、既に引用；Curlignら、1982年、既に引用；
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1982年、既に引用）と本質的には同一である。
実施例12：相同組み換えによって作られたヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）トランスジーンを含むトランスジェニックマウス
３つのオーバーラップゲノムｈＳＡクローンを、トランスジェニックマウス中でｈＳＡ遺伝子を作るために用いた。λＨＡＬ−ＨＡＩ、λＨＡＬ−Ｈ14及びλＨＡＬ−３Ｗを図８に示す。これらは、Uranoら、1984年、Gene、第32巻、第255〜261頁、及びUranoら、1986年、J.Boil.Chem.、第261巻、第3244〜3251頁によって報告されている。要すれば、ゲノムライブラリーは、ヒト繊維芽細胞ＤＮＡの部分的EcoRＩ消化から構築された。クローンλＨＡＬ−Ｈ14及びλＨＡＬ−３Ｗのために、このライブラリーを、３倍のＳＣＣ及び10倍のデンハート溶液中でプレハイブリダイゼーションした後に、1M NaCl、50mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM EDTA、0.1％SDS、100μg/mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ及び10倍のデンハート溶液中で、65℃にて一晩、32p標識ヒトアルブミンゲノムクローンを用いてハイブリダイゼーションすることによりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションに引き続き、フィルターを、0.2倍のＳＳＣ及び0.1％ＳＤＳ中で65℃にて洗浄した。λＨＡＬ−ＨＡ１クローンの単離は、λＨＡＬ−３Ｗの５′末端からの0.9kbBglII-EcoRＩフラグメントを、ヒト繊維芽細胞ライブラリーをスクリーニングするために用いたこと以外は、同じであった。
これら３つのｈＳＡファージクローンは、全ＨＳＡ遺伝子及びフランキング領域を複合して含む３つのオーバーラップ直線状ＤＮＡフラグメントを作るために用いた。最も５′側のフラグメントＩは、λＨＡＬ−ＨＡＩから単離されたEcoRＩ-EcoRＩフラグメントであり、中間のフラグメントIIは、λＨＡＬ−３ＷのAcyＩ（=AhaII）-SacＩフラグメントであり、そして最も３′側のフラグメントIIIは、λＨＡＬ−Ｈ14のXhoＩ-SalＩフラグメントであった。（図７）。フラグメントをクレノウＤＮＡポリメラーゼ及びdNTPで処理してオーバーハンギング付着末端を満たした。いくつかの実験においては、次いでブラント末端フラグメントを細菌アルカリホスファターゼで処理して、それぞれのフラグメントから５′ホスフェート残基を除いた。オーバーラップＤＮＡフラグメントを次に濃縮して、発表されている方法（Hoganら、1986年、“マウス胚の操作：A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Laboratory）に従って受精マウス卵の雌性前核中へ共注入した。注入された分子の数は卵細胞当たり約25から約100の間を変化したが、個々のフラグメントの比は、約１：１：１であった。胚を、Hoganら、（上記）の方法に従って、擬妊娠雌マウスの子宮中に着床させた。
３つのオーバーラップフラグメントの正しい相同組み換え及び新生トランスジーンのマウスゲノム中への組み込みを検定するために、新生子からのゲノムＤＮＡを以下の特定の消化に付し、引き続き、ＨＳＡｃＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションした：
BstEII：もし正しい組み換えが起っていれば、ＨＳＡ遺伝子領域の外側で切断し、18kbのバンドが生じる；
NcoＩ：もし正しい組み換えが起っていれば、オーバーラップ領域の外側で切断し、8.0及び9.3kbのバンドを生じる；
NcoＩ＋HindIII：オーバーラップ領域の外側のいくつかの位置で切断し、無傷のフラグメントの存在を示す；
HincII：オーバーラップ領域中で切断し、これらの領域中の正しい再配列を示すいくつかのバンドを生じる。
28のトランスジェニック動物が生まれた最初の実験において、22が、正しく組み換えられたすべての３つのフラグメントを持っていた。それら22の動物のうちの20から、血液を採取して、ラジオイムノアッセイを用いてｈＳＡタンパク質の存在を検定した。それら20の動物のうちの15が、0.5〜５μg/mlのレベルでｈＳＡの発現を示した。組み換えが起こっていない又はトランスジェニックでない動物は発現を示さなかった。ＲＮＡブロットを用いた場合、たった２つ（最も高いタンパク質レベルの２つ）がバンドを示した。我々は最近、ｍＲＮＡの存在のために富化されたＲＮＡ（例えばポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）のブロットを行っている。ｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素を用い、引き続きＰＣＲを行うことにより、ＲＮＡとタンパク質の存在間の完全な関係を観察した。しかしながら、この実験では、我々は、ＲＮＡの大きさを決定することはできなかった。
実施例13
ｈＬＦをエンコードするトランスジーンの別の構築
この実施例は、２つのｈＬＦトランスジーンの構築を記述し、そこでは第一のものは約16kbのαＳ１カゼイン５′発現調節配列（ｐＧＰlhＬＦ（16kb）、またｐ16,８ＨＬＦ４とも云われる）を含み、第二のものは約7.9kbのαＳ１カゼイン５′発現調節配列（ｐＧｐlhＬＦ（８kb）、またｐ8.8ＨＬＦ４とも云われる）を含む。これらの構築の全体的戦略を図９に示す。
1.8kb ＥcoＲＩ−ＢglIIフラグメント（図９中のフラグメントＣ）が、ファージクローンＧＰ１から分離された。このフラグメントは、転写開始部位の−100位置から、αＳ１カゼイン遺伝子の第二エキソン中まで続く。ＢglII部位は、αＳ１カゼイン遺伝子の第一イントロンと第二エキソンの結合点に在る。ＢglII部位を含む３′末端が合成ＢglII−ＣlaＩリンカーにリゲート（連結）され、プラスミドｐＵＣ19中にサブクローンされた。得られたプラスミドは、ｐＥＢＳと呼ばれる。
図９中のフラグメントＢは、ＥcoＲＩフラグメントとして分離され、ｐＥＢＳのＥcoＲＩ部位中にクローンされた。フラグメントＢは、αＳ１カゼイン遺伝子中の転写開始部位の−7500位置から−100位置の配列を含む。このように形成されたプラスミドはｐＥＢ３Ｓと呼ばれ、フラグメントＢとＣの組合せを含み、転写開始部位の−7500位置から＋1400位置に続く8.9kb ＥcoＲＩ−ＣlaＩフラグメントである。ＣlaＩによる完全消化及びＥcoＲＩによる部分消化により得られた、ｐＥＢ３からの8.9kb ＥcoＲＩ−ＣlaＩフラグメントは、分離され、そしてＥcoＲＩ−ＣlaＩ切断ｐＫＵＮ２（ＮotＩ制限部位を含む、ｐＫＵＮ；Gene （1986）46,第269〜276頁の誘導体）中にサブクローンされて、ｐＮＥ３ＢＳを形成した。
転写開始部位の−16000位置から−7500位置に続く8.5kb ＣlaＩ−ＥcoＲＩフラグメント（図９中のフラグメントＡ）が、ファージＧＰ１から分離された。これは次に、ｐＵＣ19中にサブクローンされて、ｐＳＥを形成した。合成オリゴヌクレオチドを用いて、ユニークＮotＩ部位がＣlaＩ部位中に導入され、これによりそれを破壊する。得られたプラスミドは、ｐＮＥと呼ばれる。
ｐＮＥからのインサート（挿入）がＮotＩ−ＥcoＲＩフラグメントとして分離され、ｐＮＥ３ＢＳからのＥcoＲＩ−ＣlaＩインサートと共に、クローニングベクターｐＫＵＮ２中にリゲートされた。得られたプラスミドｐＧＰ１（Δ２ex）は、16kbのαＳ１カゼインプロモーター、及び第二エキソンの境界におけるＢglII部位へのジーンの５′末端を含む。
トランスジーンを含む出来上ったプラスミド（16.8ＨＬＦ４）は、クローンｐＧＰＩ（Δ２ex）からのＮotＩ−ＣlaＩフラグメント及びクローンｐＨＬＦ３′10kbからのＸho−ＮotＩフラグメントを用いてアセンブルされた。このトランスジーンの構築は、上記と同じである。
このプラスミドへの小さな修飾として、ＳalＩによる切断及びＮotＩ部位を含む（しかしＳalＩ部位を含まない）リンカーの挿入によって、このプラスミドのＳalＩ部位を取除いた。続いて、下記のリンカーを加える位置として、ＫpnＩ部位を切断することによりＳalＩ部位をｈＬＦ配列の直下流に導入した。
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事実上、ｈＬＦ配列は今や、２つのユニーク制限部位（ＣlaＩ及びＳalＩ）により取囲まれ、５′末端にＣlaＩ部位及び３′末端にＳalＩ部位を有する任意の組み換えＤＮＡ配列により置き換えられることができる。
もう１つのトランスジーンが構築された。それは、約８kbの５′αＳ１カゼイン発現調節配列のみを含むことを除いて、上記と同じである。それは、ｐＮＥ３ＢＳからＮotＩ−ＣlaＩフラグメントを取り、これをクローンｐＨＬＦ３′10kbからのＸho−ＮotＩフラグメント中に直接に融合することにより構築された。得られたプラスミドはｐＧＰＩｈＬＦ（７kb）と呼ばれた（ｐ8.8ＨＬＦ４とも云われる）。
プラスミド16,８ｈＬＦ４は、実施例３及び５で述べられたハイブリッドスプライスシグナル（αＳ１カゼイン−ＩｇＧ）を含むように修飾された。得られたプラスミドは、16,８ｈＬＦ３と呼ばれ、５′−ＵＴＲにおける「天然」カゼインイントロンに対してハイブリッドイントロンの存在を除いて16,８ｈＬＦ４に同じである。
ｈＬＦシグナル配列はまた、カゼインシグナル配列の代りに、本明細書で開示されるｃＤＮＡ構築物のすべてにおいて用いられうる。これは、下記のようにして行うことができる。完全なｈＬＦシグナル配列（図２参照）に加えて、５′末端におけるＣlaＩ制限部位及び３′末端におけるＥagＩ制限部位を含む合成オリゴが作られた。これら制限部位はまた、他のプラスミド（たとえばｐ16,８ｈＬＦ４）中のカゼイン−シグナル配列と隣り合う。ＣlaＩ及びＳalＩ部位により囲まれたｈＬＦ−ｃＤＮＡを含むフラグメントが、ＣlaＩ及びＳalＩ部位を含むｐＧＥＭ７（Stratagene,Inc）中にクローン化された。得られたプラスミドは、ＣlaＩ及びＥagＩで消化され、ｈＬＦ配列を含むＣlaＩ−ＥagＩフラグメントを収容するためにベクターとして用いられた。ポジティブクローンから、それ自身の配列を持つｃＣＮＡがＣlaＩ−ＳalＩフラグメントとして切出され、ＣlaＩ−ＳalＩ消化されたｐ16,８ｈＬＦ４に挿入されて、ｐ16,８ｈＬＦ５を生じた。同様に、ｈＬＦ−ｃＤＮＡ及びｈＬＦシグナル配列を含むこのＣlaＩ−ＳalＩフラグメントは、任意のｈＬＦｃＤＮＡベクターに挿入されうる。
実施例14
トランスジェニックマウスのミルクにおける組み換えヒトラクトフェリン及びヒト血清アルブミンの産生
本明細書の実施例で同定されたトランスジーンのいくつかを用いて、トランスジェニックマウスを発生させた。用いられたトランスジーンは、表３及び４で同定されている。各々の場合に、５′及び３′発現調節配列は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子からであり、５′非翻訳領域におけるＲＮＡスプライスシグナルは、αＳ１カゼイン遺伝子からの同種であるか、又はハイブリッドカゼイン−ＩｇＧ介在配列であった。各々の場合における組み換えＤＮＡは、ｃＤＮＡクローンから導かれた。
26kbの５′αＳ１カゼイン発現調節配列を含むトランスジーンが、オーバーラップフラグメントのインビボ相同組み換えにより発生された。短く云えば、約14kbＳalＩインサートを含むファージクローンが同定された。このインサートは、16,８ｈＬＦ４に含まれた５′カゼイン配列から上流の約11.5kbの配列、及び約2.5kbのオーバーラップ配列を含む。16,８ｈＬＦ４からのＮotＩインサート及びＳalＩファージインサートがコインジェクトされて、26,8ｈＬＦ４マウスが作られた。
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表３及び４のデータは、ハイブリッドイントロン＋異種スプライスアクセプター部位が、有意な数の場合（５／13）において発現レベルを劇的に増大することを示す。
構築物16,８ｈＬＦ４は高レベルで（16,８ｈＬＦ３と同じ範囲で）発現される。しかし、（マウスにおいて）このことは少ない数の場合においてのみ起り、８，８ｈＬＦ４及び26,８ｈＬＦ４が含まれる場合に１／16である。同様の結果が、ｈＳＡ  ｃＤＮＡを用いて得られた。
短く云えば、１６，８ｈＳＡ４トランスジーンは、ｐ16,８ｈＬＦ４をＣlaＩ及びＳalＩで消化してｈＬＦ  ｃＤＮＡ配列を取除くことにより構築された。ｈＳＡ  ｃＤＮＡは、ＥcoＲＩによりクローンから切出された。ＣlaＩ合成リンカーが５′（上流）末端に、ＳalＩリンカーが３′（下流）末端に加えられた。ＣlaＩ／ＳalＩ消化された16,８ｈＬＦ４ベクター中への挿入の後、16,８ｈＳＡ４が形成され、これからＮotＩインサートが切出され、マイクロインジェクションのために用いられた。
16,８ｈＳＡ４構築物は、９つの系統を与える。９つの系統の１つが、高レベル発現（100μｇ／ml）を与えた。一方、９つのうちの残り８つは、低レベル発現（0.01〜0.05μｇ／ml）を与えた。このことは、マウス乳腺におけるｈＬＦ発現のレベル及び頻度が用いられた特定のｃＤＮＡにより決定されるのでなく、16,８×４構築物（すなわち、異種ＩＶＳを結合されたαＳ１カゼイン遺伝子の16kb５′及び８kb３′フランキング領域）の固有の特徴であることを示している。
データはまた、0.7kbの５′αＳ１カゼインフランキング配列が高レベル発現を導かないこと、及び８（6.2）,16（14.5）及び26kbがより効果的であることを示している。これに関して、８kbは、16又は26kbの５′フランキング配列より少しだけより効果的である。
また、ＲＮＡ分析は、ｃＤＮＡ構築物の発現が組織特異的かつ場所特異的（すなわち、発現が乳を出す乳腺でのみ観察される）であること、転写物は正確に大きさを決められる（sized）こと、及びＲＮＡレベルと蛋白質レベルが相関することを示した。
実施例15
ｈＬＦトランスジェニックウシの発生
ウシ系におけるトランスジェネシスは、実施例13で記述されたｐ16,８ｈＬＦ４トランスジーンを用いて得られた。
卵母細胞成熟及び受精
ウシ卵母細胞は、と殺所から得た卵巣上に存在した卵胞の吸引により集められ、30〜32℃の断熱コンテナー中に移された。卵母細胞は、卵胞液と共に、２〜８mm直径の卵胞から吸引され、50mlの円錐管中にプールされた。卵丘−卵母細胞コンプレックス（ＣＯＣ）は、沈降してペレットとなることを許され、その後、上清を捨て、ペレットを50mlのＴＬ−Hepes（Vander Shawsら,1991,Theriogenology,35,288頁（アブストラクト））中で洗った。いくつかの無傷の完全な、膨脹していない卵丘細胞層を含むＣＯＣを15倍の解剖顕微鏡下で選択し、分離し、10mlのＴＬ−Hepes中で４度、２〜３mlのＴＣＭ  199＋10％胎児ウシ血清（Ｍ199）中で１度、そしてパラフィンオイル（20ＣＯＣ／１滴）で洗った。ＣＯＣを、39℃の空気中で、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で23時間インキュベートした。
合計約2500個の卵母細胞が用いられた。平均して、1週間当り２回の吸収を行った。吸引された卵母細胞の収量は、日によって大きく変り、平均して１日に約150であった。成熟及び受精は、細胞学的分析により分析された。成熟は、核膜の破壊、第一極体及び中期プレートの出現として定義された。卵母細胞は、遺伝子的背景、現場での挙動及び子を産むことの容易性の点で優れた特徴を持つ三頭の雄牛から得られた凍結解凍した精子によりインビトロで受精された。精子受精能獲得は、ヘパリンにより促進された。Parrish,J.ら（1986）Theriogenology25:519-600。個々の雄牛からの精子は、特定の受精条件に異って応答するので、各ロットからの精子は正常受精の頻度を最大にし、多精子進入を最小にするために要求される最適ヘパリン及び精子濃度を決定するために、予めテストされた。所与の雄牛のための受精条件は、0.0,1.0及び10.0mgヘパリン／mlのヘパリン濃度、及び1.0,2.0及び4.0×106運動性精子／mlでスクリーンした後に選択された。凍結及び解凍後に生き残る精子の割合は雄牛ごとに異る（雄牛について約30〜60％がここで用いられた）ので、精子調製物は、スイムアップ（Swim-up）法（Parrish,j.ら,上述）により、生きた運動能力のある精子に富むようにされた。あるいは精子は、パーコール勾配中で遠心分離された。運動能力ある部分の分離後に、精子は血球計で計算され、25倍濃縮された貯蔵物を得るために適当な濃度に希釈された。受精媒体は、2.0〜10.0mg／mlヘパリン（ブタ腸粘膜から、177IU／mg；シグマ社）及び、もし卵丘が受精前に除去されたなら、１mMのハイポタウリン、10mMのペニシルアミン、20mMのエピネフリン及び２mMのメタ重亜硫酸ナトリウムを捕われたＴＡＬＰ媒体（Banister,Bethal Biol.Reprod.28：235-247）より成った。成熟したＣＯＣは、受精のための膨脹した卵丘大きさ（mass）に基づいて選択され、10mlの受精媒体で１度洗われ、受精小滴に直接加えられるか、又は初めに、小さな孔の、炎で磨いたピペットを通す穏やかなピペッティングによりその卵丘埋没材（インベストメント）を取除き、そして次に小滴に加えられた。最後に、精子細胞が、１×106〜2.0×106／mlの最終濃度に加えられた。
16〜24時間後に、発生予定の受精卵（接合子）が受精小滴から取出された。この時点で、各実験について20〜30個の受精卵が、３：１のメタノール：酢酸中で24時間固定され、１％アセトオルセイン（40％酢酸中）で染色され、受精頻度（２つの前核と１つの精子尾を持つサンプルのパーセント）を測定するために調べられた。精液の各バッチについて、上記したように、２つの前核と１つの精子尾の存在により決定するときに50〜70％の正常受精率を得るように、インビトロ受精条件（ヘパリン濃度及び精子数）を最適化した。スイムアップ法とパーコール勾配中の遠心分離の２つの方法のうち１つを、運動能力ある精子の選択のために用いた。これら方法の間に、受精率の有意な差は記録されなかった。これら及び下記の工程の効率を表５に示す。次に、残りの卵母細胞をマイクロインジェクションのために準備した。
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マイクロインジェクション      マイクロインジェクションに用いられた26kbpのカゼイン−ｈＬＦトランスジーン（ｐ16,８ｈＬＦ４から）は、ＮotＩ消化により遊離され、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出により精製された。最終のＤＮＡ濃度は2.5μｇ／mlに調節された。50個の卵丘−完全な受精した卵母細胞のバッチを、上記したようにして、又は10ml容の円錐管中の２mlＴＬ−hepes媒体中で２分間渦巻きさせることにより、裸にした。前核を可視化するために、卵丘のない卵母細胞を、エッペンドルフ遠心分離機で１mlのＴＬ−hepes媒体中で14,500ｇで８分間遠心分離した。Wall,R.ら，Biol.Reprod.32:645-651。マイクロインジェクションは、Hogan B.ら（1985）マウス胚の取扱い：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー  ラボラトリー  プレス，コールドスプリング  ハーバー，ニューヨークに記載されるのと本質的に同様に行われた。
胚培養      胚は、卵管組織コンディション化（順化）媒体中で受精卵からコンパクト桑実胚又は胚盤胞段階まで培養された。Eyestoneら、（1991）J.Reprod.Fert.92:59-64。卵管がと殺場で得られ、環境温度で輸送された。２〜４の卵管（１〜２頭の雌牛）から内腔組織が、ガラススライドで無傷の（完全な）卵管の外側を穏やかにこすることにより収穫された。押出された物質を10mlＴＡＬＰ−Hepesで５度洗い、１：50の組織：媒体比にＭ199で希釈した。媒体を、卵管組織懸濁物５mlを含む50mlＴフラスコ中でコンディショニングした。コンディションされた媒体はしばしば、解凍後に蛋白質様沈澱物を含み、これは遠心分離により除去された。小滴（複数）がパラフィンオイルで覆われ、受精卵を加える前にpHを平衡化させるために、２時間インキュベートされた。受精卵は、マイクロインジェクション後２時間以内に、培養小滴中に置かれた。最初の卵割（＞２細胞）は、精子を加えた後42時間アセスされた。媒体は、インキュベーションの過程で変えられなかった。正常発達の判断基準は、コンパクト桑実胚又は胚盤泡段落の達成より成った。
胚移入      同期化スケジュールは、卵母細胞がと殺場の卵巣から吸引されたのと同じ日（すなわち成熟開始は第１日）に宿主が発情するように設定された。宿主ウシにおける発情は、９日ノルジェスタメット（Norgestamet）（Intervert,Boxmeer,オランダ）処置（製造者に従い耳インプラントに投与された）、及びノルジェスタメット処置の第７日に与えられたクロプロスタノール（cloprostanol）500μｇ投与によって同期化された。インプラント除去の２〜３日内に発情が起った。発情の５〜７日後に、胚が宿主の若い雌牛に非外科的に移入された（１〜２つの胚／子宮ホーン）。宿主は、９日齢の胚を受け、この時点でそれらはコンパクト桑実胚又は初期胚盤胞段階に発達していた。これら胚は、宿主の発情サイクルの段階に比べて発達が１日先行している。後の日における２つのマイクロインジェクションの場合に、集められた卵母細胞の第一バッチと同期していた宿主の一群が用いられた。発条開始の日に吸引された卵母細胞から発達した胚の移入は、１日後に得られた卵母細胞からの胚よりも良い結果を与えた。マイクロインジェクトされた胚の幾分遅れた発達の故に、宿主と胚の第一グループとの間に、より良い同期性があるように見えた。質等級（Linder及びWrightに従う、Theriogenology20：407-416）がまあまあ乃至不良（fair to poor）であるとき宿主は２つの胚を受け、質等級が優乃至良（excellent togood）であるとき唯一つの胚を受けた。２つの胚を受けた夫々の妊娠した宿主は、唯一つの胎児を出産予定日まで育てた。全体としての妊娠率は21％であった。これは、インビボで発達したマイクロインジェクションされない胚に関して他人により報告された率より著しく低い（LinderとWright,上述、及びMassyら（1984）Theriogenology21：196-217）。ここで述べた実験において、インジェクションされない胚を用いる移入は行われなかった。
妊娠は、妊娠の45〜60日に直腸触診により決定された。合計21の妊娠が確立された（移入後45〜460日の直腸触診により確認された）。妊娠の間、２つの胎児が失われた。１つの宿主が、妊娠の7.5ヶ月に理由不明で自発的に流産した。出産の予定日の３週後に宿主を殺して回収された第２の胎児は、シストソーマ  リフレクサム（schistosoma reflexum）と呼ばれる異常胚発達を持つ完全に成長した死んだ子牛であった。２つの場合に、完全な無傷のＤＮＡを分析のために分離することが出来なかった。19の子牛が正常妊娠後に生まれた。これら子牛の１つは分娩中に死に、第２の子牛はミルクの吸入事故に続く肺炎のため出産24時間後に死んだ。10ヶ月の妊娠後に体重70kgで生まれた第３の子牛は、３週齢で安楽死させられた。病理学的分析によると、この動物は、慢性的臍動脈炎の故に敗血症を患っていた。３つの死んだ子牛から分析できた組織は、組込まれたヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）配列を含んでいなかった。従って、それらの死の原因は、トランスジーン組込みに関係ないと考えられる。残る16の子牛は優れて健康である。
トランスジーンの構造      図12Ａに、ｈＬＦ  ｃＤＮＡのコーディング配列を、斜線を付した箱により示す。翻訳開始及び停止コドンの位置が示されている。５′及び３′非翻訳領域は、αＳ１カゼインエキソン（空の箱により示される）によりエンコードされる。これらエキソンを中断する介在配列は、細線により示されている。発現単位は、ウシのＳ１カゼイン遺伝子（太線により示される）から導かれたフランキング配列により囲まれている。制限酵素部位の位置は、下記の記号により示される：Ｒ，ＥcoＲＩ；Ａ，Ａsp718；Ｎ，ＮotＩ。ＮotＩ部位は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子自体中の示された位置に存在せず、合成リンカーにより導入された。黒い棒は、トランスジーンの存在を検出するために用いられたプローブの位置を示す。ＥcoＲＩ又はＡsp718での消化後に得られたフラグメントのサイズ（kbp）は、下方に示されている。
ＤＮＡ分析      ＤＮＡは、すべての子牛からの胎盤、血液及び耳組織から分離された。抽出されたＤＮＡのサザンブロット分析を図12Ｂに示す。１レーン当り10μｇのＤＮＡを与えた。フラグメントサイズメーカーはkbpで示され（ラムダＤＮＡのＨind III消化）、左に表示されている。レーン１は、ＥcoＲＩ消化されたヒトＤＮＡ（血液から分離された）；レーン２は、血液から分離された子牛No.４からの、ＥcoＲＩ消化されたＤＮＡ；レーン３は、血液から分離された子牛No.４からのＡsp718消化されたＤＮＡ；レーン４は、子牛No.４からのＥcoＲＩ消化された胎盤ＤＮＡ；レーン５は、子牛No.４からのＡsp718消化された胎盤ＤＮＡ；レーン６は、血液から分離された子牛No.15からのＥcoＲＩ消化されたＤＮＡ；レーン７は、血液から分離された子牛No.15からのＡsp718消化されたＤＮＡ；レーン８は、耳組織から分離された子牛No.15からのＥcoＲＩ消化されたＤＮＡ；レーン９は、耳組織から分離された子牛No.15からのＡsp718消化されたＤＮＡ；レーン10は、子牛No.15からのＥcoＲＩ消化された胎盤ＤＮＡ；レーン11は、子牛No.15からのＡsp718消化された胎盤ＤＮＡ；レーン12は同じ構築物を宿すトランスジェニックマウスの尾から分離されたＥcoＲＩ消化されたＤＮＡである。
ＤＮＡ抽出、サザンブロット分析及びハイブリダイゼーションは、標準手順に従って行われた。サザンブロット実験で用いられたプローブは、図２のｈＬＦ  ｃＤＮＡの３′部分をカバーする758bpＥcoＲＶ−ＥcoＲＩフラグメントであった。プローブとしてｈＬＦ  ｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析は、２つの子牛（No.４と15）の組織においてトランスジーン配列が宿主ゲノム中に組込まれていたことを示した。子牛No.15（雌）は、トランスジーンの組込みについてモザイクであった。胎盤組織はポジティブであり、一方、血液及び耳組織においてはｈＬＦ配列は検出されなかった。胎盤中のコピー数は１〜２であった。トランスジーンの制限酵素マップは、カゼイン−ｈＬＦプラスミド（図12Ａ）のマップに基づいて及び多数の個々のトランスジェニックマウスにおいて得られたパターン（データを省略）に基づいて予測されるものと異っていた。明らかに、ＤＮＡ構築物の一部の削除を含む再配列が起っていた。この再配列事象が、トランスジーンがすべての組織では検出され得なかった事実と関連あるかどうかは明らかではない。マウスにおいて、すべての生まれたトランスジェニック動物の30％越がモザイクであることが示された。
子牛No.４（雄）は、３つのすべての組織において、予期されたものと同じである、同一のハイブリダイゼーションパターンを示した。種々の酵素による制限消化は、無傷の完全なコピーの頭尾連続物（concatamer）が取込まれ、再配列の徴候はないことを示した。コピー数は、トランスジェニックバンドの強度を、ヒトＤＮＡへのｈＬＦプローブのハイブリダイゼーションから得られたバンドと比較することにより推定された（図12Ｂ）。子牛No.４において、トランスジーンの５〜10コピーが、調べられた３つの総ての組織において取込まれていた。
子牛No.４により作られた精子の分析は、異常を検出しなかった。次にＤＮＡが精子から分離され、ｈＬＦトランスジーンの存在について分析された。トランスジーンのコピー数（２〜３）は、精子中と他の組織中とで同じであることが判った。これは子牛No.４がモザイクでなく、彼の子の50％にトランスジーンを渡しうることを示している。
実施例16
ゲノム組み換えＤＮＡのためのトランスジーン
カセットの構築
ここまでに記述したプラスミドはすべて、ウシαＳ１カゼイン非翻訳領域（介在配列を含め）から導かれた領域を含む。高い発現を許す非翻訳領域及び介在配列をすでに含むゲノム遺伝子が発現されるべきである場合に、αＳ１カゼイン遺伝子の翻訳開始部位を含むフランキング領域が、発現されるべき遺伝子の非翻訳領域に操作可能に（operably）結合されているところの発現カセットを用いることが好ましい。そのような発現カセットはｐ−16kb,ＣＳであり、下記のようにして構築された。プラスミドｐＳ１  ３′５′ｈＬＦが、ＰＣＲ実験におけるテンプレートとして用いられた。このプラスミドは、αＳ１カゼイン遺伝子のプロモーター配列の680bpならびにその初めのエキソンを含む。このプラスミドの残部は、この実験において関連しない。上流プライマーは、プラスミド部分中のインサートの直上流（ＮotＩ制限部位の直上流）に位置された。その配列は、５′−ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧＧ−３′である。
下流プライマーは、エキソン１中に位置された。その配列は、エキソンの初めの19bpと正確にマッチし、またＣlaＩ及びＳalＩ部位を含む17bpの非ハイブリッド化領域を有する。それは、下記の配列を有する。
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増幅されたフラグメントは、ＮotＩ及びＳalＩにより消化され、ｐＫＵＮ２中にリゲートされた（実施例13参照）。従って、得られたプラスミド（ｐ−680ＣＳ）は、−680〜＋19の近位プロモーターフラグメント、及びこれら19bpの直下流の２つの制限部位を含む。
このプラスミドは、ＮotＩ（−680の直上流）及びＮsiＩ（−280で）により消化され、ｐ16,８ｈＬＦ４から分離された、ＮotＩ部位（−16kbの直上流）からＮsiＩ（−280）まで続くフラグメント（実施例13）にリゲートするためにベクターとして用いられる。従って、このプラスミド（ｐ−16kb,ＣＳ）は、約−16,000〜＋19のプロモーターフラグメントを含む。それは、ゲノム遺伝子自身のＵＴＲ及びポリ（Ａ）シグナルを有するゲノム遺伝子をインサートするために用いられうる。ＣlaＩ−ＳalＩフラグメントとしてのゲノム遺伝子の挿入後に、αＳ１カゼイン３′−フランキング領域は、ＳalＩフラグメントとして挿入されうる。
実施例17
プロテインＣの産生のためのトランスジーンの構築
プロテインＣのゲノム配列は、文献にある。Fosterら（1985）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,4673-4677。しかし、この配列は、Beckmanら（1985）Nucl.Acids Res.13,5233-5247により発表されたｃＤＮＡ配列を介して同定された初めのエキソンを含まない。プロテインＣの初めのエキソンは、Foster配列中の−1499乃至−1448位置に位置される。ウシ種のミルク中にプロテインＣを発現し分泌するためのトランスジーンは、図10に示される。このトランスジーンは下記のように構築された。
ＥＭＢＬ−３（Clonotech）中のヒトゲノムライブラリーが、プロテインＣに対して特異的な配列によりプローブされる。完全なプロテインＣ遺伝子を含む精製されたファージＤＮＡ調製物が分離される。ファージは、Ｄam表現型を持つＥ．coli株たとえば株ＧＭ113から分離される。これは、メチルされていないクローン化されたＤＮＡをもたらし、そのままですべてのＣlaＩ制限部位が切断されうる。
＋1333位置から11483位置に続くＣlaＩ  ＮheＩフラグメントが分離される。これはフラグメントＩと呼ばれる。
ｐＧＥＭ７（Stratogene,Inc.）がＳphＩ及びＳmaＩにより消化される。中間の領域は、プラスミドｐＫＵＮ（Gene（1986）46,269-276）の対応する領域により置き換えられる。得られたプラスミドは、ｐＧＥＮ７Ａと呼ばれ、問題の領域において下記の制限マップを有する。
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２つのプライマーが合成される。プライマーＧＰ125は、下記の配列を有する。
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プライマーＧＰ126は下記の配列を有する。
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プライマーＧＰ125は、エキソン０（プロテインＣ遺伝子の654〜675位）とのオーバーラップを有し、５′非翻訳領域中にＣlaＩ部位を導入する。エキソン０は、Fosterらにより同定されなかったエキソンである。プライマーＧＰ126は、プロテインＣ遺伝子中の1344〜1315の領域とオーバーラップする。この領域は、ＣlaＩ部位を含む。
654と1344位の間の領域は、テンプレートとしてヒトＤＮＡ又はファージＤＮＡを用いて増幅される。そのように増幅された物質は、ＣlaＩで消化され、ベクターｐＧＥＮ７ａ中でクローンされて、ｐＰＣＣＣを形成する。このベクターは、ｄａｍネガティブ株たとえばＧＭ113中で増殖され、そしてＣlaＩで部分的に切断され（1340位でＣlaＩにより１度切断されたプラスミドのみが興味ある）、かつＸbaＩで完全に切断される。ＣlaＩ  ＮheＩフラグメント（フラグメントＩ）は、このベクター中にクローンされる。得られたプラスミドは、ｐＰＣと呼ばれる。その構造を図10に示す。このプラスミドから、プロテインＣトランスジーンがＣlaＩ−ＳalＩフラグメントとして分離され、ｐ16kb,ＣＳ（実施例15参照）中にリゲートされて、ウシミルク中にプロテインＣを発現できるトランスジーンを発生する。このプラスミドは、ｐ16kb,ＣＳ，ＰＣと呼ばれる。
ｐ16kb,ＣＳ，ＰＣ中に含まれるトランスジーンは、ＮotＩにより切出され、上述のようにトランスジェニックウシ種を発生させるために用いられる。そのようなトランスジェニック動物は、そのミルク中にプロテインＣを作ることができる。
実施例18
インビボ相同組み換えにより形成されたヒトラクトフェリントランスジーン：２つのオーバーラップするＤＮＡフラグメントのマイクロインジェクション
全体のｈＬＦゲノムクローンを得るために、プローブとして本明細書に記述されるｈＬＦ  ｃＤＮＡクローンを用いて、２つのヒトゲノムコスミドライブライーをスクリーンした。最初の及び最後（第17番）のｈＬＦエキソンに対し特異的なプライマーとのハイプリダイゼーション及びＤＮＡ配列決定により決定すると、分離された14のクローンのうち、２つのクローン（13.1及び13.2と呼ばれ、一つは各ヒトコスミドライブラリーから）が全ｈＬＦ遺伝子を含んでいた。これらｈＬＦゲノムクローンのインサート大きさは、クローン13.1については42kbp、クローン13.2については43kbpであった。クローン13.1及び13.2は夫々、5kbp及び13kbpの5′フランキング配列を含む。クローン13.2の3′フランキング領域は、１kbpと3kbpの間である。クローン13.1は、7kbpの追加的3′フランキング配列を含む。構造的ｈＬＦ遺伝子（＝イントロン＋エキソン）の大きさは、約30kbである。
ｈＬＦクローンの同定は、いくつかのエキソン（最初及び最後を含め）を配列決定し、これら配列及びプロモーター領域を図2に示されるｈＬＦ  ｃＤＮＡ配列と比べることにより確認された。加えて、クローンは、ヒト腎臓293細胞中に移植され、ｈＬＦ発現が検出された。これは、二つのクローンが機能しうることを示す。
制限マッピング及びサザンブロットによる13.1及び13.2クローン（独立のライブライリーから導かれた）の比較は、対応する領域（すなわち構造的ｈＬＦ遺伝子）において差を示さなかった。サザンブロット実験は、ｈＬＦ遺伝子がヒトゲノムにおいて単一コピー遺伝子であることを示した。図13〜図16は、αＳ１カゼイン／ゲノムｈＬＦトランスジーンを発生させるための全体手順を示す。
構造的ｈＬＦ遺伝子中の最も5′側のApaI部位は、エキソンＩ中、ｈＬＦシグナル配列中に位置される。エキソンＩのすぐ5′側の400bp領域が配列決定された。この領域は、ｈＬＦ遺伝子の翻訳開始部位及びTATA−ボックスを含む。この領域はまた、BamHI制限部位を含む。
乳腺特異的発現ベクターを構築するために、8(6.2)kbp又は１６(14.5)kbpのαＳ１ウシカゼインプロモーター領域をゲノムｈＬＦクローンに融合させることが必要であった。しかし、約50又は60kb（カゼイン遺伝子プロモーターからの6.2又は14.5kb＋コスミドベクターからの8kbおよびｈＬＦゲノムクローンからの35〜40kb、すなわち約50〜63kb）のそのような構築物の全サイズは、慣用のクローニングベクターの使用を困難にする。従って、8kbp又は16kbpのαＳ１5′カゼインプロモーター及びフランキング配列は、構造的ｈＬＦ遺伝子の5′遺伝子の9kbの5′領域に融合され、このフラグメントは、ClaI消化により得られた一般的(generic)ｈＬＦクローン13.1の3′配列の約33〜34kbpを含むオーバーラップするｈＬＦフラグメントと共にインジェクトされた。図13及び16参照。
クローン13.2からのBamHIフラグメント（エキソンＩを含む）は、プラスミドpUC19中へサブクローニングされた（図14）。このクローンから、ApaI（部分的消化）及びSalI消化により8.9kbpのApaI-SalIフラグメントが分離された。このフラグメントは、ｈＬＦシグナル配列の殆ど及びhLF5′UTRの全てを欠く。この失われた領域を示す合成配列（図15Ｂ）は、5′ApaI部位からｈＬＦ  TATA−ボックスからの下流領域中へ続く、２つの相補的ＤＮＡストランド（68量体及び62量体）を合成することにより得られた。これらプライマーをアニーリングした後に、5′ClaIオーバーハング及び3′ApaIオーバーハングを有するＤＮＡフラグメントが発生された。ClaI-ApaIフラグメントの引続く配列決定は、それが図15Ｂに示す配列（これは天然の配列とは１位置で異なる）を持つことを示した。この合成ClaI-ApaIフラグメント及び上述の8.9kbp ApaI-SalIフラグメントは、p-16kbpCS及び類似のプラスミド（αＳ１カゼインプロモーターの16kbpの代りに8kbpを含む）中にリゲートされた。これは、ｈＬＦゲノム遺伝子の5′部(9kbp)に融合された16kbp又は8kbpのウシαＳ１カゼインプロモーターを含む２つのプラスミドを与える。図15Ａ参照。これらフラグメントは切出され（NotI-SalI）、そしてｈＬＦコスミドクローン13.1からの3′の33〜34kbpClaIフラグメントと共にインジェクトされた。コインジェクトされたフラグメントは5.4kbpのオーバーラップを持った。
8kbpのαＳ１カゼインプロモーターを含む構築物のコインジェクションの後に、8つの独立したトランスジェニックマウスを、尾−ＤＮＡブロッティングにより同定した。相同的組み換えが起ったがどうかを決定するために、染色体ＤＮＡ（始祖及び子孫の尾から）をApaIで消化し、サザンブロットにより分析した。オーバーラップ中に位置された2.7kbのClaI-MluIフラグメント（図13又は17参照）をプローブとして用いた。相同的組み換えが起ったとき、7.5+0.3=7.8kbのバンドが発生され、このプローブで検出される。このバンドはまた、ヒト染色体ＤＮＡ中にも存在し、それは分析において対照として用いられた。もし相同的組み換えが起らなかったなら、プローブは、組込みの部位近傍のApaI部位の位置に依存して、種々のサイズのバンドを検出する。
診断的な7.8kbバンドは、8つの全てのトランスジェニックマウスにおいて検出された。これは各トランスジェニックマウスが組み換えられたフラグメントを含んだことを示す。こらら8つのマウス系統（始祖No.936,937,950,951,982,983,984及び985）について、乳を出す雌からミルクを集め、ｈＬＦ蛋白質発現について評価した。7つのマウス系統についてのデータを下記に示す。
0003670003.tif 000029
ｈＬＦ発現の組織特異性は、多数の組織から全ＲＮＡを分離し、トランスジーン由来のｍＲＮＡの存在及びレベルを分析することにより決定された。この分析に基づくと、ｈＬＦ ｍＲＮＡは乳分泌する乳腺中でのみ起り、発現は組織及び段階特異的である。
ＲＮＡレベルは、系950及び951では検出限界より下であったが、高発現性系統においては高く、ウシαＳ１カゼイン発現レベルと相関する。これは、ウシ乳分泌乳腺ＲＮＡと乳分泌トランスジェニックマウスからの乳腺ＲＮＡ両者のノーザンブロットにより決定された。ウシαＳ１カゼインＲＮＡの5′UTRにおいて及びトランスジーンＲＮＡにおいて正確に同じ配列にハイブリダイズする24bp合成オリゴマーを、プローブとして用いた。発現レベルは、トランスジーン−及びαＳ１ＲＮＡにハイブリダイズしたラベルされたプローブの量の定量化により直接に比べられた。ウシαＳ１カゼイン(20kD)とｈＬＦ(80kD)の間のサイズ差について較正が行われたとき、ｍＲＮＡと蛋白質の比は、ウシαＳ1カゼイン及びｈＬＦについて同じ範囲にあった。このことは、トランスジーン由来のｈＬＦの翻訳及び分泌が損われないことを示す。ｈＬＦ ｍＲＮＡの長さは、予測されたようであり（約2.5kb）、しかしマウス系統937においては少し小さい強度の、より長いバンド（3〜3.5kb）も観察された。このバンドの発生は、相同組み換えプロセスに関係づけられるかも知れない。このＲＮＡが、真にすばらしい(bona fine)ｈＬＦへと翻訳されるかを決めることが残っている。
カゼインプロモーターは、他のミルク特異的プロモーターに比べて、高レベル発明を得るのに好都合でないことが示唆されていた。しかし、今般のデータは、これが正しくないことを示す。発現レベル及び発現する動物のパーセントの両者に関して、αＳ１カゼイン配列を含むトランスジーンは、報告された他のいかなる乳腺特異的トランスジーンよりも良好に挙動する。
上記データを、ｈＬＦ ｃＤＮＡを含む構築物で得られたデータと比べると、下記の観察が得られる。本明細書で最良のｃＤＮＡ発現ベクター(16,8hLF3)は、ゲノムｈＬＦ構築物に比べて常にはるかに低いレベルで発現する。発生された13のｃＤＮＡ系統のうち、8つが非常に低いレベル（１〜5μg/ml）で発現し、5つは40〜200μg/mlで発現した。ゲノムｈＬＦ（同じフランキング配列を含む）について観察されたレベルと比べて、これら比較的低いレベル（ｃＤＮＡ発現については高いけれど）は、ゲノム配列が一貫してより高い発現レベルを作ることを示す。
実施例19
慣用のコスミドリゲーション法によるゲノムヒトラクトフェリントランスジーンの作成
ｈＬＦゲノムトランスジーンもまた、コスミド中の慣用のリゲーションにより作製された。第一の構成物8hLFgenは、コインジェクションにより発生されたトランスジーンと類似であるが、しかしｈＬＦクローン13.2からの3′ClaIフラグメントを含む。このフラグメントのサイズは、約26〜27kbである。第２の構築物16hLFgenは8hLFgenと同じであるが、しかしαＳ１カゼインプロモーター配列のより大きいストレッチを含む。
構成の詳細
図15Ａに書かれた構築物からのNotI-M1uIフラグメント（8hLFgen9kと呼ばれる）が、8hLFgen構築物を作るために用いられた。このNotI-M1uIフラグメントは、図15Ｂに書かれた合成ClaI-ApaIフラグメントを含む。この合成配列は、hLF5′-UTRの24bpを含み、ｈＬＦシグナル配列の殆どをエンコードする（図15Ｃ参照）。このNotI-M1uIは、図17に示されるように、クローン13.2からの3′M1uI-CalIフラグメント及びCalI-NotIリンカーとリゲートされた。クローニングベクターは、NotIで切断されたコスミドpWE15（これから、内部CalI及びSalI部位が削除されていた）であった。
ｈＬＦ遺伝子の第1のイントロンは、シグナル配列中のApaI部位の4bp下流に位置される。その結果、19aaシグナル配列をエンコードするＤＮＡ配列は部分的にエキソン１（43bp,14aa及び１コドンを部分的にエンコードする）中に及びエキソン２（初めの14bp、４aa及び１コドンを部分的にエンコードする）中に位置される。ｈＬＦイントロン１の正確な位置は、ＤＮＡ配列決定及びゲノム配列をｈＬＦ ｃＤＮＡ配列と比べることにより決定された。翻訳開始部位の上流の配列（355bp,hLF5′UTR及び5′フランキング領域を含む）もまた配列決定された。
ｈＬＦ転写開始部位は、示されたゲノムｈＬＦ構築物中に含まれなかった。代りに、それらは、ウシαＳ１カゼイン遺伝子転写開始部位を含む。ｈＬＦ“キャプ”部位の正確な位置は、決定されていないが、それはおそらく、真核遺伝子の極めて多数の場合と同じく、“TATA”ボックスの約30bp下流にある。加えて、マウスLF遺伝子について転写開始部位がマップされている（Shirsatら（1992）Gene110,229-234;LiuとTeng（1991）J.of Boil.Chem.32,21880-21885）。mLFとhLF5′UTRの間の相同性に基づいて、ここでのゲノムhLF構築物は、ｈＬＦ転写開始部位を含まないと結論される。
ｃＤＮＡは、aa位置130にThrコドン(ACA)を含む（図２参照）。ゲノムｈＬＦクローン13.1及び13.2における対応する領域（エキソン4、及びイントロン3と4の部分）が配列決定された。これらクローンは、配列ATAを含み、それはイソロイシンをエンコードする。ｃＤＮＡはまた、位置404にCysコドン(TGC)を含む（図２参照）。ｈＬＦクローン13.1及び13.2において、これはGGCであり、グリシンをエンコードする。
8hLFgen9kの代りに16hLFgen9kからのNotI-M1uIフラグメントを用いることにより、16hLFgenが作製された。
8hLFgen37の構築
図15Ａに書いた構築物（8hLFgen9kと呼ばれる）からの5′NotI-M1uIフラグメントは、CalI-NotIリンカーを組み合わせて、クローン13.1からの3′M1uI-ClaIフラグメントに連結された（図17と対比させよ：13.2の代りに13.1と読み替える）。クローニングベクターはコスミドpWE15であり、これから予め内部ClaI及びSalI部位が除去されて、NotIで切断された。マイクロインジェクションの前に、ベクター配列はNotI消化により除去された。すべての構築物は、NotIを用いてベクターから切断され、そしてマイクロインジェクションされた。
発現データ
8hLFgenを含む３つのマウス及び16hLFgenを含む5つのマウスが作製された。ミルク中での予備的発現データは下記の通りである。
0003670003.tif 000030
実施例20
ウシβLG/ヒトラクトフェリントランスジーン
ウシβLG-プロモーター(β-ラクトグログリン)が、ｈＬＦの発現をエンコードするトランスジーンを構築するために用いられた。簡単に言えば、ゲノムｈＬＦ構築物8hLFgen及び8hLFgen37中のαＳ１プロモーターが、ウシβLG-プロモーターで置き代えられた。得られた構築物は、βLG-hLFgen及びβLG-hLFgen37と呼ばれる。これら構築の全体的戦略を図18〜20に示す。
ウシβLG-プロモーターの単離
Silvaら(1990)Nucl.Acids.Res.18:3051により記述されたシャロン28ファージクローンλβLG-13が、Carl A.Batt博士から得られた。このクローンは、βLG ｃＤＮＡプローブでスクリーンニングすることにより、ウシゲノムライブラリーから単離された。それは、構造βLG遺伝子及び約8kbの5′フランキング領域を含む。このクローンから、標準的手法を用いて4.3kb EcoRIフラグメントが単離され、プラスミドpKUN5中にサブクローンされた（図18参照）。
このプラスミドから、3.2kb NotI-SacIフラグメントが単離された。NotI部位は、クローニングベクターのポリリンカーに由来した。SacI部位は、BLG転写開始部位の15bp下流にある。PvuII部位は、翻訳開始部位の5bp上流にある。SacI部位及びPvuII部位の間の領域（これら部位を含む）を表わすフラグメントは、図18に書かれた30量体及び37量体ＤＮＡオリゴマーを合成し、アニーリングすることにより作製された。このフラグメントはまた、PvuII部位の直下流に１つのClaI及び１つのSalI部位を含む（図18）。3.2kbNotI-SacIフラグメント及び合成SacI-SalIフラグメントが、pKUNプラスミド(pKUN1deltaC)（これから、ClaIによる切断及び続くクレノウ酵素による切断ベクターの処理により内部ClaI部位が予め除去されていた）中に連結された。この連結化は、プラスミドpBLG3.2をもたらした。
翻訳開始部位の直上流の734bp領域が配列決定され、ヒツジBLGプロモーターの発表されている配列の対応する領域と比べられた（図24参照）。全体的相同性は91％であり、ヒツジとウシのBLG-プロモーターが極めて似ていることを示す。
βLG-hLF構築物の作製
構築物8hLFgen9k（実施例15A）からの8.9ClaI-SalIフラグメントが単離され、pβLG3.2中に、このベクターをClaI及びSalIで切断した後に、クローンされた。この連結化は、構築物pβLGhLFgen9kをもたらした（図19）。この構築物から、9.4kbNotI-M1uIフラグメントが単離され、8hLFgenから単離された23〜24kbM1uI-NotIフラグメントと共に、NotI切断されたpWE15コスミド中に連結され、pβLG-hLFgenをもたらした（図19）。34kbNotIインサートが、NotI消化によりこのコスミドから単離され、標準的手順に従ってマイクロインジェクトされた。
pβLG-hLFgen37の作製のために、pβLGhLFgen9kからの9.4kbNotI-M1uIフラグメントが、NotI切断されたpWE15コスミドベクター中へClaI-NotIリンカーを結合してクローン13.1からの30kb3′M1uI-ClaIフラグメントと連結された。
βLG-hLFgenインサートが、標準的手順に従って単離され、マイクロインジェクトされた。
発現データ
βLG-hLFgen（２つの構築物の短い方）がインジェクトされ、7つの独立したマウス系統が作られた。ミルク中のｈＬＦ生成物の発現データは、下記の系統について入手できる。
0003670003.tif 000031
実施例21
構造遺伝子及びhLFプロモーターの両者を含むゲノムhLFフラグメントの単離
ｈＬＦは通常、ヒトミルク中に比較的高いレベル（１〜２mg/ml）で発現される。ｈＬＦプロモーターがトランスジェニック動物のミルク中の高レベルｈＬＦ発現を促進できるかどうかを決定するために、それ自身のプロモーターの制御下の無傷のｈＬＦ遺伝子を標準的手順によりマイクロイアンジェクトした。
構築の詳細
2つの重要な点が、構築ルートを決定した。ゲノムｈＬＦクローンを含むコスミドベクターC2RB（図13）は、ｈＬＦインサートをフランクするユニーク制限部位を含まないので、無傷のインサートをこのコスミドから直接に単離できなかった。ｈＬＦクローン13.1及び13.2中に存在する5′及び3′フランキング配列のすべてをトランスジーン中に含めることが望まれた。クローン13.2（図13）は5′フランキング配列（13kb）の殆どを含み、クローン13.1は3′フランキング配列（13.2よりも7kb多い）の殆どを含むので、13.2の5′部が13.1の3′部と結合された。
コスミド13.2が、ｈＬＦインサートの5′領域の0.5〜0.8kb上流のPvuI部位で直線化され（図20）、続いてエキソヌクレアーゼBal31で処理され、それによりコスミドの約１kb及び5′ｈＬＦ配列の0.2〜0.5を除いた。続いて、該ＤＮＡをT4ポリメラーゼで処理して、ブラント末端を作り、そしてM1uIで切断した。約19kb（12.5kbの5′フランキング配列+6.2kbのｈＬＦ遺伝子）ブラント末端-M1uI切断プラスミドベクター(pKUN6 deltaCla,SmaI-M1uI)は、プラスミドphLF5′Mgene37をもたらした。このプラスミドは、SmaI部位の直接5′側にNotI部位を含む。このプラスミドから、19kbNotI-M1uIフラグメントが単離され、構築物8hLFgen37からの30kb M1uI-NotI3′フラグメントと共に、NotI切断pWE15コスミド中に連結されて、p5′hLFgen37をもたらした（図20）。
49kbNotIインサートは、標準的手順に従って、単離され、マイクロインジェクトされた。
構築物p5′hLFgen37についての発現データ
p5′hLFgen37構築物に関して8つの独立の祖先マウスが作製された。発現データは6つの系統について入手できる。
0003670003.tif 000032
実施例22
乳腺特異的hLZ発現カセットの作製
ヒトリゾチーム遺伝子の構造及び配列が記載されている（Petersら(1989)Eur.J.Biochem182:507:516）。構造ｈＬＺ遺伝子は、4つのエキソンを含み、5.3kbのサイズを持つ。
プローブとして、ｈＬＺ遺伝子のエキソン２の部分に相補的な91量体合成ＤＮＡ配列を用いて、いくつかの独立のｈＬＺクローンをヒトゲノムファージライブラリーから単離した。クローンλ7.2.1は、8.7kbの5′フランキング配列及び5.3kbのゲノムｈＬＺ遺伝子を含む14kbのインサートを含む。エキソン4は、部分的にのみ含まれる：クローンλ7.2.1は、位置5333及び5350(Petersら、前述)に従って、番号付けする）のSau3A部位の一つで停止する。位置5333/5350の下流の領域（エキソン4配列の532又は549bp）は失われている。これら配列は非コーティングであり、ｈＬＺ遺伝子の3′UTRの部分を表す。すべてのｈＬＺコーディング配列は、λ7.2.1中に存在する。
発現ベクター16,8hLZ
図21に示す発現ベクター16,8hLZの設計は下記の通りである。ｈＬＺ遺伝子の5′フランキング領域（プロモーターを含む）が除かれ、実施例16に述べられているプラスミドp-16kbCS中にサブクローニングすることによりウシαＳ１カゼイン遺伝子プロモーターで置き代えられた。融合部位は、ｈＬＺ遺伝子の5′UTR(エキソン１)中に位置され、従って、カゼイン5′UTRの23bpに加えてhLZ5′UTRの殆どが存在する。この構築物中のすべてのコーディング配列（シグナル配列を含め）は、ｈＬＺクローンλ7.2.1に由来する（図23A）。
クローンλ7.2.1中のｈＬＺ遺伝子の3′UTRは、上述したウシαＳ１カゼイン遺伝子の3′UTR+フランキング領域に融合された。構築物16,8hLZの得られた3′UTRは従って、ｈＬＺ遺伝子から部分的に（エキソン4、bp4761からbp5333/5350に続く）、及びウシαＳ１カゼイン遺伝子から部分的に（エキソン8の一部及びエキソン9のすべてを含み）由来する。3′フランキング領域（8kb）は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子に全面的に由来する。
16,8hLZの構築の詳細
16,hLZ
ｈＬＺエキソン１中のAUGコドンへ直接5′側の6bpは、HincII部位を成す。Sa1Iファージポリリンカー部位は、λ7.2.1インサートの直接3′側に位置される。これら部位は、5.3kb HincII-Sa1Iインサートを単離するために用いられた（図23）。+3(+1における転写開始部位に対して）からHincII部位に続く配列は、図23Aに書かれている31量体及び35量体をアニーリングすることにより合成された。得られた合成ＤＮＡフラグメントは、人工的な5′-KpnI-HincIIフラグメントを有し、5.3kb HincII-Sa1Iフラグメントは、KpnI-Sa1I切断pKUN-1プラスミド中にサブクローンされた（図23A）。得た9.3kbプラスミド（pKHLys3′5.3）から、5.3kb C1AI-Sa1Iフラグメントが単離され、ClaI-Sa1I切断p-0.7kbCSプラスミド（p-16CSの等価物だが、より小さい5′フランキング配列を含む）中にサブクローンされて、pKhLZ0.7をもたらした。
3′カゼインUTR及びフランキング配列の約6.6kbを含む8kbウシαＳ１カゼイン遺伝子EcoRIフラグメントが、8kb5′-HhoI-Sa1I-3′フラグメントとして、プラスミドpke3′E10（上述）から単離された（図23B）。このフラグメントは、pKhLZ0.7のSa1I部位中にサブクローンされて、p0.7,8hNLZをもたらした。この後、p0.7,8hLZのSa1I部位を、リンカーS1/S2の挿入によりNotI部位で置き代えて、プラスミドp0.7、8hLZNtを得た（図23D）。このプラスミドから、13.3kb C1AI-NotIフラグメントを単離し、p-16CSからの14.5kbNotI-C1AIフラグメントと共に、NotI切断pWE15コスミド中へと連結した（図23E）。得た構築物（図23Eで16,8hLZと名付けた）から、27.8kb NotIインサートを、標準的手順に従って単離し、精製し、ネズミ及びウシ受精卵中にマイクロインジェクトした。
発現ベクター16,8hLZ3
図22に示す発現ベクター16,8hLZ3の設計は下記の通りである。上述の発現ベクター16,8hLF3を、16,8hLZ3の構築に用いた。ベクター16,8hLZ3は、ウシαＳ１カゼイン遺伝子プロモーターのみでなく、ウシαＳ１遺伝子の完全な最初のエキソン及び最初のイントロンの一部を含む。加えて、それは、免疫グロブリン遺伝子の最初のイントロン及びスプライスアクセプター部位を含む。シグナル配列及び3′UTRの一部及び完全な3′フランキング領域がまた、ウシαＳ１カゼイン遺伝子に由来する。ｈＬＦ ｃＤＮＡ及びαＳ１カゼインシグナル配列が、C1AI-Sa1I二重消化によりこのベクターから切出される。C1AI部位は、翻訳開始コドンに対し5bp5′側に位置される。
5.3bp C1AI-Sa1I hLZフラグメントが、プラスミドpKhLZ0.7から単離され、C1AI-Sa1I切断16,8hLF3ベクター（これからｈＬＦ ｃＤＮＡがC1AI-Sa1I二重消化により除かれていた）中にサブクローンされた。
16,8hLZ発現カセットベクター配列は、NotI消化により除去され、続いて標準的手順により精製され、そしてマウス受精卵にマイクロインジェクトされた。
発現データ
構築物16,8hLZ
構築物16,8hLZに関して7つのトランスジェニックマウスが発生された。発現データは、6つの独立マウス系統について入手できる（ミルクサンプルについて我々の標準的ｈＬＺ評価法を用いて、乳分泌する子孫からのデータ）。
0003670003.tif 000033
上記のデータは、16,8hLZが比較的高レベルで発現することを示す。ヒトミルクにおいて、ｈＬＺレベルは、50μg/ml（最大）のみである。ｈＬＺは15kD蛋白質であるから、0.26mg/ml hLZのレベルはｈＬＦの約1.3mg/mlに相当する（ｈＬＦは80kDである）。
構築物16,8hLZ3
コバレント16,8hLZ3について、4つの独立のトランスジェニックマウスが発生された。下記の発現のデータがマウス系統905及び907から入手できる。
0003670003.tif 000034
このデータは、16,8hLZ3が比較的高いレベルで発現されうることを示す（0.36mg/mlが約1.8mg/ml ｈＬＦに相当する）。しかし、示されるように、16,8hLZ3が常に高レベルで発現する訳ではない。分析されたマウスの数は極めて少いが、構築物16,8hLAと16,8hLZ3は、発現の頻度及び発現レベルに関して、多かれ少なかれ似ているように見える。しかし、16,8hLZについてトランスジェニックなマウスの他の7系統も、16,8hLF3構築物を含むことに留意しなければならない（下記参照）。これら系統のどれも、0.36mg/mlのような高レベルで発現しなかった。従って、16,8hLZ3は、16,8hLZよりも効率的な構築物であるように見える。これは、異種の（非相同的な）スプライス部位（これはｈＬＦ  ｃＤＮＡ発現レベルを高めない）により起されうる。
実施例23
ゲノムhLZ及びhLZ cDNAをエンコードするトランスジーンを含むトランスジェニックマウス
16,8hLZF3及び16,8hLZのコインジェクション
トランスジェニック動物のミルクにおいてｈＬＦとｈＬＺを同時に発現することの可能性を評価するために、適当な単離され精製された16,8hLF3及び16,8hLZ構築物を、マウス受精卵中にコインジェクトした。
２つの構築物についてトランスジェニックな7つの独立のマウス系統が発生された。各系統について入手できる発現データは下記の通りである。
0003670003.tif 000035
結論
系649のみ（7分の１）が、比較的高いレベルでｈＬＺを発現する。系統649及び660（7分の2）が高レベルでｈＬＦを発現する。
単一の構築物のインジェクションから得られたデータとの比較
16,8hLZについて
16,8hLF3及び16,8hLZ発現カセットをコインジェクトされたマウス系統649のhLZ発現レベルは、16,8hLZのみをインジェクトされた系統661のそれと同等である。
多くの場合に、ｈＬＺの高レベル発現はコインジェクション後に得られない（７分の１で高発現（系統649）；７分の２（系統650と660）で中程度の低発現；７分の４で低発現）。ｈＬＺトランスジーン単独のインジェクション後に、同様のデータが得られる（４分の１で高い発現（系統661）；４分の１で中程度；４分の２で低発現）。従って、16,8hLZトランスジーンの挙動は、16,8hLF3トランスジーンの存在によって、測定可能な程に影響されない。
７系統のどれも系統905（構築物16,8hLZ3）ほど高いレベルで発現せず、但し649のレベルは同じ範囲にあることに留意されたい。
結論として、これら構築物は比較的高レベル（0.2〜5mg/mL範囲）で発現されることができ、得られたトランスジェニックマウスの約20〜25％がこれら高レベルで発現する（13分の3;7つがコインジェクション+6つが単独インジェクション）。また、16,8hLF3とのコインジェクションは、16,8hLZの発現に影響するとは見えない。
16,8hLF3について
16,8hLF3の単独インジェクションは、13の独立のトランスジェニックマウス系統をもたらした。これらは２群に分けることができる。
（１）0.1〜5μg/mlのレベルを作った低発現体(13分の8)、及び
（２）40〜200μg/mlのレベルを作った高発現体(13分の5)。
コインジェクトされたフラグメントを持つマウスのうち、7分の２が高レベルで発現する。これは、一つのフラグメントのインジェクション後に観察された高レベル発現の頻度(5/13)と類似である。しかし、16,8hLF3/16,8hLZマウス系統(649と660)は、先に観察されたのよりはるかに高レベルでhLFを発現する。これは、ｈＬＺ構築物の存在が16,8hLF3構築物の発現を刺激することを示す。系統649において、高hLFレベルは、高hLZレベルを伴なう。系統660について、hLZレベルが中程度なので、このことはあまり明瞭でない。しかし、下記で示すように、ＲＮＡ分析によると、系統660中の16,8hLZトランスジーンは、ｈＬＦトランスジーンと比べて少なくとも同程度に転写的に活性である。
mRNAレベルにおける発現分析からの結果
ウシ乳分泌乳腺全ＲＮＡ及び乳分泌トランスジェニックマウス（ゲノムｈＬＦ、16,8hLF3及び16、8hLF3+16,8hLZについてトランスジェニックなマウスを含め）からの乳腺全ＲＮＡの両者に対してノーザンブロット分析を行った。ウシαＳ１カゼインＲＮＡの5′UTRにおいて及び全てのトランスジーン由来ＲＮＡにおいて正確に同じ配列にハイブリッドする24bp合成オリゴマーがプローブとして用いられた。発現レベルは、トランスジーン-及びウシαＳ１ＲＮＡにハイブリッドした標識されたプローブの量の定量化により直接に比較された。
hLZ-mRNAとhLF−mRNAの比、及びhLZ-mRNAとウシαＳ１ｍＲＮＡの比は、ｈＬＺ及びｈＬＦ蛋白質レベルから予測されるよりもはるかに高かった。たとえば、系統649は、〜0.2mg/mlのｈＬＺ、及び〜１−２mg/mlのｈＬＦを発現した。蛋白質サイズについて較正（因子５）した後、ｈＬＺ及びｈＬＦ ｍＲＮＡレベルは同じ範囲にあって、ｈＬＦレベルがｈＬＺ  ＲＮＡレベルより約２倍高いと予測される。しかし、系統649において、ｈＬＺ ｍＲＮＡレベルはは、ｈＬＦ ｍＲＮＡレベルより20倍高かった。系統650,661,662及びウシ乳腺ＲＮＡの比較ＲＮＡ分析は、これらデータを確認した。
従って、ｈＬＺ発現の転写的に極めて高いレベルは、本発明の発現系に基づくゲノムｈＬＺ配列及びウシαＳ１カゼイン遺伝子を用いて得られると結論されうる。ゲノムｈＬＺ構築物は、ｈＬＦ ｃＤＮＡ構築物よりもはるかに高いレベルで転写され、ゲノムｈＬＦ構築物と同じ範囲で発現される。
様々のｈＬＦ及びｈＬＺトランスジーンの挙動を翻訳レベルで比較するために、20倍較正がなされねばならない。0.25mg/mlで発現するｈＬＺトランスジーンの転写活性は、５mg/mlの蛋白質レベルと同等であり、50μg/mlのレベルが１mg/mlに等しい。加えて、マウス系統649hLZ mRNAレベルは、ウシαＳ１ｍＲＮＡレベル（これは10倍希釈されていた）を数倍超えた。ウシαＳカゼインは〜12mg/mlで発現され（そしてｈＬＺと類似のサイズである）から、これらhLZRNAレベルは、数mg/mlの発現レベルに等しいであろう。
実施例24
16,8A hLZの作製
構築物16,8A hLZは、16,8 hLZ3の誘導体である。16,8A hLZ3において、hLZ5'UTR配列及びhLZシグナル配列が、ウシαS1カゼイン遺伝子からの対応する配列で置き代えられた。
構築物16.A hLZ3は、16,8A hLZ3の誘導体である。16.A hLZ3において、ウシαS1カゼイン遺伝子3'UTR及びフランキング配列は、hLZ3'UTR及び4.5kbのhLZ3''フランキング配列により置き代えられた。
構成の詳細
ベクターp07,8hLZ（図23B）が、ClaIおよびSa1Iで消化された。4.7kbフラグメント（0.7kbのαS1カゼイン5'フランキング配列及びプラスミドベクターを含む）が単離され、リンカーGP278/279に連結された（図25）。このDNA配列は、ウシαS1カゼイン5'UTRの一部、完全なウシαS1カゼインシグナル配列及び25kbのhLZ配列（成体hLZのＮ末端領域をエンコードする）を含む。連結化生成物は単離され、pKHLys3'5.3からの5.3kb Ba1I-Sa1Iフラグメント（図23Aに書かれている）に連結された。得られた構築物は、p0.7AhLZΔ3'である。この構築物から、5.3kb ClaI-Sa1Iフラグメントが単離され、p16,8hLF3由来のC1aI-Sa1Iベクター（16,8hLZ3の構築でも用いられた）中に挿入された。得られた構築物は、p16,8A hLZ3と呼ばれる（図26）。
16,A hLZ3の構築のため、ベクターp0.7AhLZΔ3'がXba1及びSa1Iで消化され、Xba1-NotI-Sa1Iリンカーが挿入された（図27）。このベクターは、Xba1で線形化され。λHLYS1（Petersらにより記述されている。Eur.J.Ciochem.182,507-516,1989）からの6.5kb Xba1フラグメントが、センスオリエンテーションに挿入された。これは、ベクターp0.7AhLZをもたらした。このベクターから、9.8kb ClaI-NotI hLZフラグメントが単離され、16,8 hLZ3からの14.5kb NotI-ClaIフラグメントと共に、NotI消化されたpWE15コスミドベクター中に挿入された。
両場合に、プラスミド配列のないトランスジーンがNotIフラグメント（16,8A hLZ3;27.8kb;AhLZ3;24.3kb）として単離され、精製され、標準的手順に従って受精したマウス母卵細胞中にマイクロインジェクトされた。
４つの独立したトランスジェニック祖先マウスが構築物16,8A hLZ3を有して発生され、６つのマウスが構築物16AhLZ3を有して発生された。予備的な発現データは下記の通りである。
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これら結果から、構築物16A hLZ3は、テストされた他のhLZ構築物のいずれよりもはるかに高い発現を与えると結論される。
hLZ蛋白質発現レベルのデータと結び付けた予備的な定量的ノーザンブロットデータは、構築物16,8hLZと16,8hLZ3について観察されたようなRNAレベルと蛋白質レベルとの差違が構築物16AhLZ3では起きないことを示す。
実施例25
子牛No.4での伝達実験
牛繁殖で用いられる通常の手順を用いて、３頭の若雌牛が過剰排卵された（Diekman,S.J.ら（1989）Theriogenology31:473-487）。次に、これら動物を、実施例15で記載したように子牛No.4からの精子で受精させた。子牛No.4は、実施例15で記載したようにトランスジェニックであると判定された。受精は、２つの妊娠を結果した。
これら２頭の動物を受精の４週後に殺し、胚を子宮から回収した。全DNAを、Maniatisら（1982）に記載された手順に従って、これら胚から分離し、EcoRIで消化し、サザンブロット法で分析した。ブロットは、hLF遺伝子に対し特異的なプローブにハイブリッド化された（実施例15と同じプロトコール）。回収された12の胚のうち、６つ（50％）がhLF特異的バンドを示した。すべての場合に、バンドは、予期されたサイズ及び強度を有した。これは下記を示している。
（ａ）約50％の効率でのトランスジーン伝達。
（ｂ）コピー数は、祖先におけると同じ（〜３）である。
（ｃ）伝達の間に、大きな再配置は起きなかった。
ウシＹ染色体リピートに対して特異的なプライマーを用いるPCR分析によると、６つのトランスジェニック胚のうち、５つが雄であり、１つが雌であった。これらデータは、トランスジーンが雄にも雌にも伝達されることができ、Ｙ染色体中に組込まれなかったことを示す。
Ｙ染色体特異的なプライマーの配列は、下記の通りである。
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実施例26
子ウシ唾液中での組み換え蛋白質の発現
hLFトランスジーン（実施例18で記載）及びhLZトランスジーン（16,8 hLZ、実施例22で記載）でコインジェクトされた卵母細胞から10の動物が生まれた。サザンブロットで判定すると、これら動物のどれもトランスジェニックでなく、しかし、それらの４つ（すべての雄）は、血液及び耳からの0.5μｇDNAでのPCR実験によると、モザイクであると判定された。これらPCR実験のためのプライマーは、hLF遺伝子のエキソン８中に位置された。プライマーの配列は、下記の通りである。
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10頭の動物のすべてが、唾液中のhLF及びhLZ発現についてテストされた。唾液腺中の上皮細胞は、乳腺中の上皮細胞と構造的及び機能的に類似であり、いくつかの乳蛋白遺伝子は唾液腺中でも発現されうる（乳腺におけるよりもはるかに低いレベルであるとはいえ）。
唾液の約２mlを動物の口から集め、実施例５に記載されるラジオイムノアッセイを用いてこれら試料中の蛋白質のレベルを決定した。10頭の動物のうち、３頭が検出下限より上のhLF発現を示した。３頭すべては、モザイクであると判定された４頭の動物の群の一部であった。
発現レベルは下記の通りであった。
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10頭すべての動物が、hLZ発現についてもテストされた。動物9772のみが、唾液中のhLZ発現を示した。検出された量は、２ng/mlであった。
実施例15で記載した実験で生まれた21の動物のうち、１つの動物（雄）が、hLFに対して免疫寛容である事実に基づいて、モザイクであると判定された。この動物は、唾液中で100ng/mlのhLF発現を示した。
これらデータは、用いられたトランスジーンがウシ中でhLF（及びhLZ）を発現できることを示す。
本発明の好ましい態様を記載したが、開示された実施態様に種々の変更を行いうること、及びその様な変更は本発明の範囲内にあると意図されることが、当業者にとって明らかであろう。
本明細書で述べられたすべての引用文献は、引用することにより本明細書に組込まれるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１２Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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