(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子吸着層を測定する方法において、生体分子を含む水溶液に試料板を浸漬させ、該試料板に吸着した生体分子吸着量を光分析により測定し、その後、瞬時に試料板の一部を気相中に露呈させ、試料の２点間における光信号を測定し、生体分子吸着層表面を落下する液体膜の落下速度を測定することにより、上記生体分子吸着量及び上記生体分子吸着層表面の特性を測定することを特徴とする生体分子吸着層測定方法。
【請求項２】
生体分子吸着層を測定する装置において、生体分子を含む水溶液が入れられたセル、該セル内に浸漬される試料板、第１のレーザ光源、該第１のレーザ光源が発するレーザ光の偏光面を調節する光学素子、上記試料板により反射された反射光を分割するビームスプリッター、分割されたそれぞれの反射光の強度を電気的信号に変換する光デテクター、該光デテクターにより変換されたそれぞれの電気信号を測定する電圧計、上記試料板を気相に露呈した瞬間から生ずる液体薄膜の運動を観測するための第２のレーザ光源、該第２の光源が発するレーザ光が液体薄膜を有する試料板より反射された反射光強度を検出する光デテクター及び第１のレーザ光の反射強度と第２の反射光強度信号を処理する信号処理装置とからなることを特徴とする生体分子吸着量及び生体分子吸着層表面の特性を測定する装置。
【請求項３】
生体分子吸着層を測定する装置において、生体分子を含む水溶液が入れられたセル、該セル内に浸漬される試料板、第１のレーザ光源、該第１のレーザ光源が発するレーザ光の偏光面を調節する光学素子、上記試料板により反射された反射光を分割するビームスプリッター、分割されたそれぞれの反射光の強度を電気的信号に変換する光デテクター、該光デテクターにより変換されたそれぞれの電気信号を測定する電圧計、試料板を気相に露呈した瞬間から生ずる液体薄膜の運動を観測するための第２のレーザ光源、該第２のレーザ光源が発するレーザ光を分割するビームスプリッター、分割されたレーザ光の一方が上記液体薄膜を透過あるいは反射した後に分割されたレーザ光の他方と合成して干渉縞を形成するビームスプリッター及び採録された上記干渉縞より液膜の落下速度を観察する画像解析器からなることを特徴とする生体分子吸着量及び生体分子吸着層表面の特性を測定する装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質等の生体分子の吸着が課題となる多くの領域で利用されるものであり、医療・医学（歯学も含む）における予防技術、検査技術の領域、食品工業、環境関連の検査技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質などの生体分子が種々の材質表面に強固に吸着する現象は、よく知られているが、これら構造変化し易い生体物質が界面で示す濡れ性、疎水・親水性、界面張力を準非破壊的に測定する方法は、特許第2782502号（名称：生体分子吸着層の動的界面張力測定法とこれに用いる装置）において初めて開示されている。一方、生体分子の吸着量やその過程については、種々の測定法が報告されており、光学的方法においては、エリプソメトリー及びリフレクトメトリー等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
タンパク質などの吸着層表面が示す疎水・親水性、濡れ性、界面張力等の既に開示されている測定方法では、生体分子吸着層表面の全体的な特性値として情報が得られるのみで、それが吸着量の大小に由来するのか、界面吸着による分子形態の変化に由来するのかは同定できなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、吸着現象の時間変化を測定することにより吸着量を同時的に測定し、吸着層表面が示す疎水・親水性の測定値が、吸着量由来か分子形態変化由来かをはっきり区別できる方法を提供する。これにより、それぞれの分子の特性と測定値との関連付けが可能になり、分子レベルより正確な情報を得ることができる。具体的には、上記特許第2782502号に示された発明に、生体分子の吸着量及びその過程を光学的に観測する発明を組み合わせて行う。すなわち、生体分子を含む水溶液に試料板を浸漬させ、反射光の偏光状態の変化により試料板に吸着した生体分子の浸漬時よりの経時変化を測定する（リフレクトメトリーやエリプソメトリー）と同時に、浸漬後の所定の時間後に、瞬時に試料板の一部を気相中に露呈させ、レーザ光を用い、試料の２点間におけるレーザ光の反射強度変化又は干渉縞等の光学的信号の変化を測定することにより、生体分子吸着層表面を落下する液体膜の落下速度を獲得し、生体分子吸着量とその吸着層表面の濡れ性、疎水・親水性及び表面張力を同時的に測定するものである。
【０００５】
【実施の態様１】
図１に、本願発明の概要を模式的に示す。図１において、１は試料板、２は生体分子溶液が入ったセル、３はレーザ光線、４は偏光解析に使用するレーザ光線、５は生体分子吸着層、６は液体薄膜である。
まず、生体分子溶液が入ったセル２に試料板１を浸漬し、レーザ光線３，４を照射し、生体分子吸着層の厚みの変化を測定する。該吸着層の厚みが一定値に飽和してきたことを確認して、上記セルを落下させる。あるいは、試料板を急速に引き抜く。ここで、２つのレーザ光線を試料の異なった点に照射し、その反射光の反射強度あるいは干渉縞等の光学的信号の時間的変化について場所的相関とり、生体分子吸着層表面を落下する液体膜の落下速度を測定することにより、生体分子吸着量とその吸着層表面の濡れ性、疎水・親水性、表面張力を同時的に測定する。
【０００６】
【実施の態様２】
図２に、レーザ光の２光束を用いた測定装置の概念図を示す。７、８はレーザ光源、９は偏光解消板あるいは回転偏光子、１０は生体分子を含む水溶液セル、１１は試料板、１３はビームスプリッター、  １２、１４、１５は光電変換素子、１６は電圧計（２チャンネルマルチメータ）、１７はデータ取り込み装置をもつコンピュータである。
【０００７】
測定動作は、まず試料板を、生体分子溶液を含むセルに任意の時間浸漬させる。これにはセルを上昇させ、上から吊るした試料板が半分ほど浸るようにする。試料板上に形成される吸着分子の量を下方のレーザ光源とその検出系で測定する。これにはレーザ光入射面に平行な光強度の成分と垂直な成分がほぼ等しくなるように入射光を調整し、試料表面からの反射光を直交する２成分に分割するビームスプリッターにより分割し、それぞれの反射光の強度を光デテクターにより電気的信号に変換する。それぞれの電気信号の強度比および強度和の経時変化を電圧計（２チャンネルマルチメータ）を用いて測定する。強度比の時間変化から吸着量の時間変化を計算する。ある時点での吸着量をもつ試料板の疎水・親水性等を測定するためには、試料板をその時点で瞬時に気相に露呈し、その瞬間から生ずる液体薄膜の運動を観測する。これには溶液セルを瞬時に特定位置まで落下させる。液膜の落下速度を計測するためには、上部にある第二のレーザ光源と下部にある上述の第一のレーザ光とを用いる。これらの光線が液体薄膜を持つ試料より反射された反射光強度を光デテクターで検出し、第一のレーザ光の反射強度（変換された電圧の強度和）と第２の反射光強度の時間変化を測定し、信号強度の変化点のズレについて相対的時間間隔を計測する。このレーザ光が当たっている２点間の距離と落下に要した時間が得られれば、すでに報告されている理論（J. Colloid & Interface Sci., 233 (2001) 136-141）により液体薄膜の落下速度を算出後、吸着層表面の濡れ性（接触角）、さらには疎水・親水性、表面張力を計算することが可能である。
【０００８】
【実施の態様３】
図３は、液膜落下速度計測に光干渉計を用いたものの概念図を示す。１８、１９はレーザ光源、２０は偏光解消板あるいは回転偏光子、２１、２７は反射鏡、２２はスペイシャルフィルター、２３、３０はビームスプリッター、２４は試料板、２５はビームスプリッター、２６、２８は光電変換素子、２９は電圧計（２チャンネルマルチメータ）、３１はレンズ系、３２はビデオカメラ、３３はモニタテレビと記録装置、３４はコンピュータである。
【０００９】
測定動作は、まず試料板を、生体分子溶液を含むセルに任意の時間浸す。このためには、セルを上昇させ、上から吊るした試料板が半分ほど浸るようにする。試料板上に形成される吸着分子量を下方のレーザ光源とその検出系で測定する。これにはレーザ光入射面に平行な光強度の成分と垂直な成分がほぼ等しくなるように入射光を調整し、試料表面からの反射光を直交する２成分に分割するビームスプリッターにより分割し、それぞれの反射光の強度を光デテクターにより電気的信号に変換する。それぞれの電気信号の強度比について経時変化を電圧計（２チャンネルマルチメータ）を用いて測定する。強度比の時間変化から吸着量の時間変化を計算する。ある時点での吸着量をもつ試料板の濡れ性、疎水・親水性等を測定するためには、試料板をその時点で瞬時に気相に露呈し、その瞬間から生ずる液体薄膜の運動を観測する。このためには溶液セルを瞬時に所定位置まで落下させる。液膜の落下速度を計測するためには、レーザ光源１９からの光をスペイシャルフィルター（コリメータレンズ含む）を通した光ビームをビームスプリッターで二つに分岐し、一方をサンプルに当て、他方は参照光とし、別のビームスプリッターで混合し、シャリングモードによる干渉縞をビデオ画像として採録し、干渉縞の移動速度を画面で測定することにより、すでに報告した理論（J. Colloid & Interface Sci., 233 (2001) 136-141）により液体薄膜の落下速度を算出後、吸着層表面の濡れ性（接触角）、さらには疎水・親水性、表面張力を計算することが可能である。
【００１０】
【実施例】
典型的血清タンパク質であるアルブミンを使い、図２の測定装置を用いて行った実験例を示す。はじめ蒸留水で満たされた測定セルを準備する。このセルには、あらかじめ白金板を気／水表面の上方から下降させ、板の中ほどまで浸しておく。水溶液に浸してある部分にレーザ光を照射する。このとき光強度の入射面に平行な成分（Ip0）と垂直成分（Is0）が等しくなるように偏光子や偏光解消板を調整する。そこからの反射光をビームスプリッターでそれぞれの成分（Ip,Is）に分割し、それぞれをリニアアンプをもつ光電変換素子で電圧に変換し、２チャンネルボルトメータでその電圧比の時間変化をコンピュータで記録しておく。この電圧比は、Ip／Isに対応している。ある時点で、このセルにアルブミンの濃厚水溶液を加え、所定の濃度のアルブミン水溶液にする。  セル中の水溶液は常時マグネチックスターラで攪拌しておく。その後のIp／Isを連続的に測定し、コンピュータで記録する。
【００１１】
このように観測されたのが図４のデータであり、この場合のアルブミンの最終濃度は２．２ｘ１０−２ｍｇ／ｍｌである。観測の最終時点で、溶液セルを約１０ｍｍ下方まで瞬時に落下させ、白金試料板を気相に露呈し、その瞬間から板に吸着しているタンパク質層の上に生ずる液体薄膜の運動を観測する。先の第一のレーザビームとその上方４ｍｍにある第二のレーザビームの試料平面より反射された反射光強度を光デテクターで検出し、第１のレーザ光の反射強度（変換された電圧の強度和）と第２のレーザの反射光強度について時間変化を測定し、コンピュータに記憶させる。信号強度の変化点のズレについて相対的時間間隔（落下時間）を計測する（図５）。
【００１２】
図６にはこのようにして計測された２種類のタンパク質（アルブミンとリゾチーム）に関する落下時間と溶液中の濃度との関係を示す。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によれば、タンパク質など生体分子の吸着が経時的にどのように進行し、その結果として生起する吸着膜の重要な特性である濡れ性（疎水・親水性）を同一試料で同時的に観測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  測定方法の概念図
【図２】  レーザの２光束の反射法を用いた装置の概略図
【図３】  光干渉法を併用した装置の概念図
【図４】  光反射強度の偏光成分比の時間変化（吸着量測定）
【図５】  レーザ２光束の反射光強度の時間変化（疎水・親水性測定）
【図６】  液体薄膜の落下時間と溶液中のタンパク質濃度との関係
【符号の説明】
１      試料板
２      生体分子溶液が入ったセル
３      レーザ光線
４      偏光解析に使用するレーザ光線
５      生体分子吸着層
６      液体薄膜
７、８、１８、１９  レーザ光源
９、２０    偏光解消板あるいは回転偏光子
１０        生体分子を含む水溶液セル
１１、２４  試料板
１３、２３、２５、３０  ビームスプリッター
１２、１４、１５、２６、２８  光電変換素子
１６、２９  電圧計（２チャンネルマルチメータ）
１７、３４  データ取り込み装置をもつコンピュータ
２１、２７  反射鏡
２２     スペイシャルフィルター
３１     レンズ系
３２     ビデオカメラ
３３     モニタテレビと記録装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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