(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主ゲノム配列の重複または欠失を伴うことなく宿主細胞のゲノム内の遺伝子中に異種核酸配列を安定に組込み、且つ、当該遺伝子の機能的発現を破壊しない方法であって、当該方法は当該宿主ゲノム中のＯＲＦ又はコード配列に隣接して遺伝子間領域を導入するノックインベクターを用いて当該宿主細胞を形質転換することを含み、当該遺伝子間領域は、異種タンパク質を発現する発現カセットを含み、当該遺伝子間領域は下記（ａ）又は（ｂ）、
（ａ）ノックインベクターの５’乗換え領域中のＯＲＦの終止コドンの直後にある転写ターミネーター領域（ここで、ベクターの３’乗換え領域は、ゲノム内のＯＲＦの終止コドンの後に続くヌクレオチドを５’端の起点とする。）、
（ｂ）３’乗換え領域内のＯＲＦの開始コドンの直前にあるプロモーター（ここで、ベクターの５’乗換え領域は、当該開始コドンの前に存在するヌクレオチドの３’端で終結する。）
のいずれかを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
（ａ）標的ポリヌクレオチド中の所望の組換え部位に隣接する対応ヌクレオチド配列におのおのが相同である第一および第二のヌクレオチド配列（前記第一および第二のヌクレオチド配列は、所望の組換え部位に隣接する対応ヌクレオチド配列と相同的組換えを行うことができる。）、
（ｂ）第一および第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第三ヌクレオチド配列（前記第三ヌクレオチド配列は、１つ以上の発現カセットを含み、少なくとも１つの発現カセットが選択可能または検出可能なマーカーをコードしており、また、前記第三ヌクレオチド配列は、構築物が標的ポリヌクレオチドと相同的に組換えられたときに第三ヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドに組込まれることができるように第一ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在する構築物の領域に位置している。）、ならびに
（ｃ）第一および第三のヌクレオチド配列または第二および第三のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第四ヌクレオチド配列（前記第四ヌクレオチド配列は、発現コントロール配列を含み、また、第一ヌクレオチド配列と第三ヌクレオチド配列との間または第三ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在している。）を含む、請求項１に記載の方法において使用するためのベクター。
【請求項３】
第一ヌクレオチド配列が第一ヌクレオチド配列の３’端で終結するＯＲＦを含んでおり、第四ヌクレオチド配列が第一ヌクレオチド配列と第三ヌクレオチド配列との間に局在しており、ならびに第四ヌクレオチド配列は構築物が宿主のゲノムに組込まれたときにＯＲＦの転写を終結できる転写終結配列を含む請求項２のベクター。
【請求項４】
第二ヌクレオチド配列が第二ヌクレオチド配列の５’端を起点とするＯＲＦを含んでおり、第四ヌクレオチド配列が第三ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在しており、ならびに第四ヌクレオチド配列は構築物が宿主のゲノムに組込まれたときにＯＲＦの転写を開始できるプロモーター配列を含む請求項２のベクター。
【請求項５】
（ａ）配列の３’端で読取り枠（ＯＲＦ）の終止コドンにより終結する標的ＤＮＡ配列の第一領域と相同的組換えできる第一の相同的ベクターＤＮＡ配列、
（ｂ）ＯＲＦに作動可能に連結された異種転写終結配列、
（ｃ）１つ以上の発現カセット、ならびに
（ｄ）標的ＤＮＡ配列の第二領域と相同的組換えできる第二の相同的ベクターＤＮＡ配列を含み、
前記第二の相同的ベクター配列に対する第一の相同的ベクター配列の５’−３’配向が、標的配列の第二領域に対する第一領域の５’−３’配向と同じであり、ならびに第一および第二のベクター配列が標的ＤＮＡ配列中の隣り合う第一および第二の領域に対応しており、ならびにベクターが標的ＤＮＡ配列と相同的組換えを行うことが可能な、請求項１に記載の方法において使用するためのベクター。
【請求項６】
（ａ）標的ＤＮＡ配列の第一領域と相同的組換えできる第一の相同的ベクターＤＮＡ配列、
（ｂ）１つ以上の発現カセット、
（ｃ）異種プロモーター配列、ならびに
（ｄ）５’端の読取り枠（ＯＲＦ）の開始コドンを起点としておりかつ異種プロモーターに作動可能に連結されており、標的ＤＮＡ配列の第二領域と相同的組換えできる第二の相同的ベクターＤＮＡ配列を含み、
前記第二の相同的ベクター配列に対する第一の相同的ベクター配列の５’−３’配向が、標的配列の第二領域に対する第一領域の５’−３’配向と同じであり、ならびに第一および第二のベクター配列が標的ＤＮＡ配列中の隣り合う第一および第二の領域に対応しており、ならびにベクターが標的ＤＮＡ配列と相同的組換えを行うことが可能な、請求項１に記載の方法において使用するためのベクター。
【請求項７】
ベクターが少なくとも２つの発現カセットを有しており、ならびに発現カセットの１つが検出可能または選択可能なマーカーをコードしている請求項５又は請求項６のベクター。
【請求項８】
少なくとも１つの発現カセットがシグナル配列を含む融合タンパク質をコードしている請求項７のベクター。
【請求項９】
宿主が下等真核細胞である請求項７のベクター。
【請求項１０】
宿主が、サッカロミセス・セルビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＯＲＦが、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＰＲＯ１、ＰＲＯ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ５、ＬＹＳ１、ＬＹＳ４およびＴＨＲ１から成る遺伝子群から選択される請求項９のベクター。
【請求項１１】
選択可能マーカーが逆選択可能である請求項７のベクター。
【請求項１２】
選択可能マーカーがＵＲＡ３およびＵＲＡ５から成るグループから選択される請求項１１のベクター。
【請求項１３】
（ａ）および（ｄ）のおのおのが１つ以上の制限部位を含み得る請求項５又は請求項６のベクター。
【請求項１４】
ベクターが５’から３’方向に、
（ａ）読取り枠（ＯＲＦ）を含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の５’側に相同な５’フランキング配列、
（ｂ）第一の転写終結配列、
（ｃ）（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）組込み対象配列および（ｉｉｉ）場合により第二の転写終結配列をおのおのが含む１つ以上の発現カセット、ならびに
（ｄ）標的配列中の挿入部位の３’側に相同な３’フランキング配列配置を有している請求項１に記載の方法において使用するためのベクター。
【請求項１５】
ベクターが５’から３’方向に、
（ａ）読取り枠（ＯＲＦ）までの配列を含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の５’側に相同な５’フランキング配列、
（ｂ）（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）組込み対象配列、および（ｉｉｉ）場合により第二の転写終結配列をおのおのが含む１つ以上の発現カセット、
（ｃ）ＯＲＦの発現を調節するプロモーター配列、ならびに
（ｄ）ＯＲＦとその開始コドンとを含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の３’側に相同な３’フランキング配列配置を有している請求項１に記載の方法において使用するためのベクター。
【請求項１６】
発現カセットの少なくとも１つが検出可能または選択可能なマーカーをコードしている請求項１４又は請求項１５のベクター。
【請求項１７】
請求項２から１６のベクターのいずれかを含む宿主細胞。
【請求項１８】
組換え宿主が選択される条件下で請求項２から１６のベクターのいずれか１つを宿主に導入する段階を含む組換え宿主の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学および組換え生物工学の分野に関する。より特定的には本発明は、宿主の組換え部位に局在する遺伝子の発現を殆どまたは全く妨害することなく宿主生物のゲノム内部に異種核酸を組込むための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え生物工学テクノロジイは、異種または外来遺伝子を宿主および生物に導入し、異種遺伝子によってコードされたタンパク質の産生および単離に使用できる宿主および生物を作製することを可能にした。多くの組換え発現系が、哺乳類細胞培養物、植物および昆虫細胞培養物、ならびに、酵母および細菌のような微生物中で異種遺伝子を発現させるために利用できる。しかしながら、利用できる現存の組換え発現系は、それらの用途を制約する要因に支配されている。これらの要因は、形質転換体の安定性、組換えによって形質転換されたベクターおよび宿主の生存率、ならびに、宿主ゲノム内部に取込まれたプラスミドベクターのコピー数のような要因をコントロールする能力を含む。
【０００３】
安定な組換え宿主を作製する現行の組換え生物工学の方法においては、宿主体内で発現させるべき異種遺伝子が宿主ゲノム内部の既知の遺伝子座または部位に挿入された所謂“ノックアウト”ベクターが常用されている。“ノックアウト”ベクターは、異種遺伝子が挿入される遺伝子座の部位のフランキング核酸配列に相同なフランキング核酸配列をもつ発現カセットから構成される。典型的にはフランキング核酸配列は、宿主の生存に必須でないタンパク質をコードすることが判明している既存の遺伝子またはその欠如を相補できる遺伝子に隣接する核酸配列に相同である。挿入された発現カセットは、挿入部位の遺伝子の全部または一部に置換するであろう。典型的には遺伝子の読取り枠（ＯＲＦ）領域が挿入遺伝子座として使用されるが、その理由は、一般にＯＲＦをコードする核酸配列の構造および機能に関する特性決定が進んでいるからである。宿主ゲノムの非翻訳領域は十分に理解されていないので、それらの領域への挿入は、宿主が異種タンパク質の発現に適さなくなるほど宿主の成長に致命的にまたは不利益に作用する想定外の効果を宿主に与えるおそれもある。
【０００４】
しかしながら、宿主ゲノムのコード配列またはＯＲＦ内部で非必須タンパク質をコードすることが判明している遺伝子座の数は極めて少ない。さらに、所与の組込み遺伝子座をいちど使用すると、宿主体内への以後の組込みに同じ遺伝子座を使用することはできない。さらに、“ノックアウト”形質転換方法は宿主ゲノム内部の機能単位を置換するので、ゲノムの有意な混乱が生じ、最終的に宿主の生産力または生存率に不利益な作用を示すであろう。
【０００５】
組換え宿主を構築する第二の方法は典型的には、発現カセットが単一乗換えを使用して宿主ゲノム内部の挿入遺伝子座に挿入される“ロールインベクター”の使用を含む。単一部位だけが組込みに使用されるので、遺伝子座内部のコード配列または非翻訳配列を使用することが可能である。挿入部位として既知のＯＲＦを使用するならば、“ロールイン”ベクターはまた、ＯＲＦの発現を“ノックアウト”し、これによってコードされていたタンパク質の発現を削除し、従って“ノックアウト”ベクターについて上述したような欠点を示すであろう。非翻訳配列遺伝子座に発現カセットを挿入するようにロールインベクターを設計するならば、宿主に対して最小の副作用が観察されるようにすることも可能であろう。しかしながらまた、非翻訳配列遺伝子座に必須機能が付随している可能性もあり、その場合には想定外の副作用が生じるであろう。
【０００６】
ロールインベクターの使用は別の欠点を有している。より特定的には、ロールインベクターはゲノムに組込まれるためにただ１つの組換えイベントの発生に依存するので、比較的不安定であり、また、以後の組換えイベントによってベクターが細胞から排除されることもあり得る。また、同じまたは異なる挿入部位で多重挿入が生じるので、ロールインベクターが想定外の遺伝子コピー数になる。
【０００７】
組換え発現系の操作技術を向上させ、新規な発現系の開発を促進する、例えばヒト様グリコシル化を伴う哺乳類タンパク質の発現に下等真核宿主を使用するためには、宿主生物のゲノムに対する最小の妨害を伴って多重遺伝単位を宿主体内に組込むという複雑な目標に到達できるまで当業者の技量を向上させる改良された方法および材料を設計することが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【表１】
0005424871.tif 000002
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、異種タンパク質を安定に発現する組換え宿主を産生する方法および材料を提供する。本発明によれば、異種タンパク質をコードする核酸が挿入部位またはその周囲のいずれの遺伝子の発現にも最小の影響を伴うかまたは全く影響することなく宿主のゲノム内部のどこかに挿入される。方法およびベクターは、発現カセットを宿主の遺伝子内部に組込んで遺伝子の機能を保持している組換え宿主を作製できる。本文中に開示したベクターは、宿主遺伝子を含むＯＲＦのすぐ外側の部位に発現カセットの組込みを指令しまた遺伝子の発現を維持できる発現コントロール配列を提供するので、発現カセットが遺伝子内部に挿入されても遺伝子の機能発現は破壊されない。従って、本発明の方法および材料によれば、プラスミドが組込まれた領域のゲノムの機能の最小の妨害を伴うかまたは全く妨害することなく異種核酸を宿主のゲノムに組込むことができる。
【００１０】
本文中に開示された方法およびベクターを使用すると、遺伝子間領域を創造するような相同的組換えが生じ、その結果として、多数の異種タンパク質または核酸をコードする組換えベクターは宿主ゲノムに対して最小の破壊を伴ってゲノムに組込まれ得る。本発明は、多数の異種遺伝子を宿主のゲノムに組込むことが望まれるときに特に有用である。方法は、宿主ゲノムのＯＲＦまたはコード配列に隣接して遺伝子間領域を導入するように設計されたノックインベクターを使用する。遺伝子間領域は、異種タンパク質を発現する発現カセットを含有している。発現カセットが新しく創造された遺伝間領域内部に含有されるので、宿主のＯＲＦまたはコード配列は全く破壊されない。遺伝子間領域は、ノックインベクターの５’乗換え領域中のＯＲＦの終止コドンの直後に転写ターミネーター領域を付加することによって創造される。ベクターの３’ 乗換え領域は、ゲノム内のＯＲＦの終止コドンの後に続くヌクレオチドを５’端の起点とする。ベクターは次いで、異種タンパク質、融合タンパク質、アンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡｉ分子をコードする発現カセット、および場合により、組換え宿主の選択または同定用のマーカーをコードする発現カセットを含有する。異種タンパク質をコードする核酸の挿入が挿入部位またはその周囲の遺伝子の発現に最小の影響しか与えないので、ベクターは宿主遺伝子のどの場所も挿入部位として使用できる。従って、異種タンパク質などをコードする核酸は、宿主の生存に必須でない機能をコードする遺伝子内部だけでなく宿主の生存に必須である機能をコードする遺伝子内部にも挿入でき、喪失した機能を補う必要はない。
【００１１】
従って、配列またはＯＲＦ（またはＯＲＦから産生された遺伝子産物）の重複を伴うこともまた宿主配列の欠失を伴うこともなく異種核酸配列を宿主ゲノム内部に安定に組込むための方法およびベクターが提供される。従って本発明は、宿主のゲノムを極めて特異的に修飾することを望む分子生物学者に極めて有効なツールを提供し、適切な調節配列のコントロール下に１つ以上の異種遺伝子を宿主内部に標的組換え的に挿入し安定に組込むことを可能にする。方法は、組込まれた配列が以後の組換えイベントによって破壊、除去または切除される可能性を減らすようなコントロールされたやり方で安定な標的組換え的組込みが可能であるという点で極めて有利である。さらに、本文中に開示されたベクターによる細胞の形質転換またはトランスフェクションが宿主ゲノムを破壊することは比較的少ないので、細胞の生産力および特性は、計画的に取込まれた異種配列の（１つ以上の）遺伝子産物の作用による以外に大きく影響されることはない。さらに、宿主配列の喪失が全く生じないので、全ゲノム配列が解明されていない生物の安定なコントロールされた形質転換のために方法およびベクターを使用でき、必須ゲノム配列が予定外に欠失または破壊される可能性は低減または除去されている。
【００１２】
さらに、本文中に開示した１つ以上のベクターで安定に形質転換された宿主が提供される。これらの宿主は、それぞれの異種遺伝子産物の発現をおのおのが指令する１つ以上の発現カセットを細胞ゲノム内部に安定に組込んでいるであろう。しかしながら宿主はそのほかには宿主のそれ以上の破壊をほとんどまたは全く伴うことなく先天性ゲノムを維持している。このような宿主は、異種配列が宿主に与えるインビボ効果を極めて特異的にスクリーニングする、などの用途を含む多様な用途を有している。さらに宿主は、細胞性発現系の創造および改良に特に好適である。
【００１３】
従って、方法およびベクターの利点は、分子生物学者がコピー数のコントロールや組込みの安定性が得られる手法で宿主ゲノム内部の１つ以上の発現カセットによって宿主を極めて特異的に形質転換させることができ、しかも、宿主に有害になったりまたはそのほかに宿主ゲノム内部に計画的に取込まれた１つ以上の異種配列の（１つ以上の）特異的遺伝子産物の発現という目標の妨害になったりするような宿主ゲノムの予定外の変質の危険が抑制または回避されることである。
【００１４】
方法によって検討される課題のひとつは、生物のゲノムがノックアウトまたはそのほかの遺伝子の修飾を要せずに外来ＤＮＡを安定に組込むために充分な遺伝子座を有していないことである。本発明の系の有意な利点は、選択ＯＲＦによってコードされた遺伝子の発現に影響を与えることなく組込み対象遺伝子を組込むために本質的にどの既知ＯＲＦも使用できることである。系の別の有意な利点は、ベクターが追加の転写終結配列を含有し、その結果として双方向のゲノム転写がベクターの挿入によって大きく妨害されないことである。別の有意な利点は、単一遺伝マーカーを使用する単一相同的組換えイベントを介して多数の異種遺伝子の組込みが可能なことである。
【００１５】
発明者らは、“ノックイン”ベクターまたは“ＫＩＮＫＯ”（“Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｔｔｌｅ  ｏｒ  Ｎｏ  Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ”の頭文字語）ベクターと命名した本発明のベクターを、組換え酵母菌、特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの構築に使用した。これらのベクターは、哺乳類の複合Ｎ−グリカン構造を有している糖タンパク質を産生するために必要な多くの遺伝子をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに特異的に組込むために使用されてきた。ノックインベクターは今日まで、栄養要求性マーカー遺伝子ＵＲＡ３、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＰＲＯ１、ＰＲＯ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ５、ＬＹＳ１、ＬＹＳ４およびＴＨＲ１の遺伝子座のようなＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの種々のゲノム遺伝子座のために構築および使用されてきた。しかしながら、これらのベクターは、ゲノム破壊が極めて少ないので、汎用ベクターとして有力であり、多様なタイプのノックインベクターを本文中に教示したように構築できる。
【００１６】
従って本発明は、形質転換細胞が先天性宿主ゲノムに対して最小のまたは低減された妨害を伴って多数異種遺伝子を発現できるような細胞およびウイルスの改良された形質転換の方法および材料を提供する。いくつかの実施態様において本発明は、改良された特性、すなわち、形質転換宿主、細胞系および生物の生存率および生産力に対して最小の妨害を伴ってグリコシル化に関与する多数の異種遺伝子を発現させる能力をもつ下等真核宿主、細胞系および生物のような形質転換宿主を産生でき、その結果として、所望の糖タンパク質をコードするベクターによってさらに形質転換されたときに宿主、細胞系および生物はこのような糖タンパク質を所望のＮ−連結糖形態を含む形態で産生できる。
【００１７】
従って本発明は、形質転換宿主が先天性宿主ゲノムに対して最小のまたは低減された妨害を伴って多数異種遺伝子を発現できるような宿主およびウイルスの改良された形質転換の方法および材料を提供する。いくつかの実施態様において本発明は、改良された特性、すなわち、形質転換宿主、細胞系および生物の生存率および生産力に対して最小の妨害を伴ってグリコシル化に関与する多数の異種遺伝子を発現させる能力をもつ下等真核宿主、細胞系および生物のような形質転換宿主を産生でき、その結果として、所望の糖タンパク質をコードするベクターによってさらに形質転換されたときに宿主、細胞系および生物はこのような糖タンパク質を所望のＮ−連結糖形態を含む形態で産生できる。このような糖タンパク質の分泌および単離の際に、方法および材料はこのような糖タンパク質組成物を得る能力を大いに増強し、糖タンパク質組成物は所望のＮ−連結糖形態をその主要種として含む。特定実施態様において、本発明の方法および材料は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から成るグループから選択された所望のＮ−連結グリカン構造を主として含む糖タンパク質組成物を産生できる形質転換宿主を作製し得る。
【００１８】
先に論議したように、方法およびベクターは、下等真核系だけでなく哺乳類、昆虫および植物のような高等真核系ならびに原核系を含む多様な発現系に広汎な用途を有している。以下の非限定例は、このような宿主によって産生される糖タンパク質のグリコシル化に関与する多数遺伝子を含有する下等真核宿主特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの作製、ならびにこのような宿主の作製に有用なベクターの作製に適応する本発明の方法および材料の使用を記載する。しかしながら、本発明の方法および材料はきわめて多用性であり、追加目的の宿主およびベクターを構築するために当業者の技量の範囲内の修飾および改造を加えて使用できることが当業者には理解されよう。
【００１９】
定義
ここに使用した“ベクター”という用語は、連結された別の核酸を運搬できる核酸分子を表す。ベクターの１種は“プラスミド”であり、これは付加ＤＮＡセグメントを結合できる環状二重鎖ＤＮＡループを表す。他のベクターは、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。別種のベクターはウイルスベクターであり、これは付加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに結合できる（より詳細に後述する）。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点をもつベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内部に組込まれ、これによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されたゲノムの発現を指令できる。このようなベクターを本文中で“組換え発現ベクター”（または、単に“発現ベクター”）と呼ぶ。
【００２０】
ここに使用した“対象配列”または“対象遺伝子”という用語は、宿主細胞中で正常には産生されない典型的にはタンパク質、アンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子をコードする核酸配列を表す。本文中に開示の方法は、１つ以上の組込み対象配列または組込み対象遺伝子を宿主細胞ゲノム内部に安定に組込むことができる。組込み対象配列の非限定例は、酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、例えば、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのような宿主体内のＮ−グリカン合成を左右する酵素をコードする配列を含む。
【００２１】
“遺伝子”という用語は、発現コントロール配列に作動可能に連結された読取り枠を含む転写単位を表す。
【００２２】
“作動可能に連結された”発現コントロール配列という用語は、組込み対象遺伝子をコントロールするために発現コントロール配列が組込み対象遺伝子につながっている連鎖、および、組込み対象遺伝子をコントロールするためにトランスにまたは離れた場所から作用する発現コントロール配列を表す。
【００２３】
ここに使用した“発現コントロール配列”という用語は、それらが作動可能に連結されたコード配列の発現を左右するために必要なポリヌクレオチド配列を表す。発現コントロール配列は、核酸配列の転写、転写後イベントおよび翻訳をコントロールする配列である。発現コントロール配列は、適正な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、原形質ｍＲＮＡを安定させる配列、翻訳効率を増進する配列（例えば、リボソーム結合性部位）、タンパク質安定性を増強する配列、および、所望の場合にはタンパク質分泌を増進する配列を含む。このようなコントロール配列の性質は宿主生物次第で異なる。原核生物では、このようなコントロール配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合性部位および転写終結配列を含む。“コントロール配列”という用語は、その存在が発現に必須であるすべての成分を最小限含み、また、その存在が有利な追加の成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むことができる。
【００２４】
“マーカー配列”または“マーカー遺伝子”という用語は、宿主細胞内部の配列の有無について陽性または陰性の選択ができる活性を発現できる核酸配列を表す。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子は、該遺伝子を含有する細胞がウラシル非存在下で増殖できる能力に基づいてその存在を選択できるのでマーカー遺伝子である（参照Ｕ．Ｓ．公開出願２００４０２２９３０６）。その存在はまた、該遺伝子を含有する細胞の５−ＦＯＡ存在下の増殖不能に基づいて選択できる。マーカー配列または遺伝子は必ずしも陽性および陰性の双方の選択性を示す必要はない。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のマーカー配列または遺伝子の非限定例は、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３を含む。抗生物質耐性マーカー遺伝子としては、カナマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子がこれらの抗生物質の存在下の増殖を考慮して常用されている。
【００２５】
ここに使用した“組換え宿主細胞”（“発現宿主細胞”、“発現宿主系”、“発現系”または単に“宿主細胞”）という用語は、組換えベクターが導入された細胞を表す。このような用語が特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も含意することを理解されたい。後続世代には突然変異または環境的影響によるいくつかの修飾が生じるのでこのような後代は実際には親細胞と一致しないであろうが、ここに使用した“宿主細胞”という用語の範囲になお包含される。組換え宿主細胞は、培地中で増殖された単離細胞もしくは細胞系でもよく、または、生体組織もしくは生物体内に存在する細胞でもよい。
【００２６】
“真核生物”という用語は、有核細胞または生物を表し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を含む。
【００２７】
“下等真核細胞”という用語は、酵母、真菌類、カラー−鞭毛虫類、微胞子虫類、アルベオレート（例えば、渦鞭毛虫類）、ストラメノピルス（例えば、褐藻類、原生動物）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、苔）および他の原生生物を含む。酵母および真菌類は非限定的に、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ、いずれかのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、いずれかのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、いずれかのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、いずれかのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａを含む。
【００２８】
ここに使用した“ペプチド”という用語は、短鎖ポリペプチド、例えば、典型的には約５０未満アミノ酸の長さ、より典型的には約３０未満アミノ酸の長さのポリペプチドを表す。ここに使用した該用語は、構造的に酷似しており従って生物学的機能が酷似している類似体およびミメティクスを包含する。
【００２９】
“ポリペプチド”という用語は、天然産生および天然産生でないタンパク質、ならびに、それらのフラグメント、突然変異体、誘導体および類似体を包含する。ポリペプチドは単量体または多量体でよい。さらにポリペプチドは、おのおのが１つ以上の個別の活性を有している多数の様々なドメインを含み得る。
【００３０】
“融合タンパク質”という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドを表す。融合タンパク質が有用である理由は、それらが２つ以上の異なるタンパク質に由来の２つ以上の望ましい機能要素を含有するように構築できるからである。融合タンパク質は、組込み対象ポリペプチドに由来する少なくとも１０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０個のアミノ酸、いっそう好ましくは少なくとも４０、５０または６０個のアミノ酸、もっと好ましくは少なくとも７５、１００または１２５個のアミノ酸を含む。本発明のタンパク質の完全体を含む融合物は特に有用である。本発明の融合タンパク質内部に含有された異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸の長さ、しばしば少なくとも８アミノ酸の長さであり、より有用な形態は少なくとも１５、２０および２５アミノ酸の長さである。融合物はまた、より大きいポリペプチド、さらに、特に有用な緑色蛍光タンパク質（“ＧＦＰ”）発色団含有タンパク質のような完全タンパク質を含む。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームに構築し、次いで融合タンパク質を発現させることによって組換え的に産生できる。あるいは融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを別のタンパク質に架橋させることによって化学的に製造できる。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、組込み対象異種配列を安定に発現する組換え宿主を作製するために、挿入部位またはその周囲のいずれかの遺伝子の発現に対して最小の影響を伴ってまたは全く影響を及ぼすことなく組込み対象配列を宿主のゲノム内部のどこかに挿入できる材料および方法を提供する。従って、本発明の方法および材料によれば、プラスミドが組込まれた領域のゲノムの機能に対して最小の妨害を伴ってまたは全く妨害することなく宿主のゲノム内部に異種核酸を組込むことができる。
【００３２】
方法は、宿主ゲノムのＯＲＦまたはコード配列に隣接して遺伝子間領域を導入するように設計されたノックインベクターを使用する。遺伝子間領域は、組込み対象配列をおのおのが発現する１つ以上の発現カセットを含有する。１つ以上の発現カセットは新しく創造された分子間領域内部に含有されるので、宿主のＯＲＦまたはコード領域は全く破壊されない。分子間領域がノックインベクターの５’乗換え領域のＯＲＦの終止コドンの直後に転写ターミネーター領域を付加することによって創造されかつベクターの３’ 乗換え領域が５’端のゲノムのＯＲＦの終止コドンの後に続くヌクレオチドを起点とするか、または、分子間領域がノックインベクターの３’乗換え領域のＯＲＦの開始コドンの直前にプロモーターを付加することによって創造される。このときベクターは、例えば異種タンパク質、融合タンパク質、アンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子をコードできる組込み対象配列をおのおのが含有している１つ以上の発現カセットを含有し、また場合によっては組換え宿主の選択または同定を容易にする検出可能または選択可能なマーカーをコードする第二発現カセットを含有している（例えば、図１から３参照）。検出可能または選択可能なマーカーの例は非限定的に、抗生物質耐性をコードする遺伝子、宿主体内のタンパク質の欠如を補うタンパク質をコードする遺伝子、ベータ−ガラクトシダーゼのような酵素活性をコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質、および、抗体を使用して検出可能なタンパク質をコードする遺伝子などを含む。発現カセットの挿入が挿入部位またはその周囲の遺伝子の発現に最小にしか影響しないので、ベクターは宿主遺伝子のどの場所も挿入部位として使用できる。従って、発現カセットは宿主の生存に必須でない機能をコードする遺伝子だけでなく宿主の生存に必須である機能をコードする遺伝子にも挿入でき、喪失した機能を補う必要は生じない。
【００３３】
従って、提供されるものは、組換えによって標的ポリヌクレオチドに組込むように構成されたポリヌクレオチド構築物またはベクターであり、構築物は、（ａ）標的ポリヌクレオチド中の所望の組換え部位に隣接する対応ヌクレオチドにおのおのが相同である第一および第二のヌクレオチド配列と、（ｂ）第一および第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第三ヌクレオチド配列と、（ｃ）第一および第三のヌクレオチド配列または第二および第三のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第四ヌクレオチド配列とを含み、第一および第二のヌクレオチド配列は、所望の組換え部位に隣接する対応ヌクレオチド配列と相同的組換えを行うことができ、第三ヌクレオチド配列は、１つ以上の発現カセットを含み、また、第三ヌクレオチド配列は、構築物が標的ポリヌクレオチドと相同的に組換えられたときに第三ヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドに組込まれることができるように第一ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在する構築物の領域に位置しており、第四ヌクレオチド配列は、発現コントロール配列を含み、また、第一ヌクレオチド配列と第三ヌクレオチド配列との間または第三ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在している。別の実施態様において、第三ヌクレオチド配列は少なくとも２つの発現カセットを含み、一方の発現カセットが検出可能または選択可能なマーカーをコードしている。
【００３４】
ベクターの特定実施態様においては、第一ヌクレオチド配列が第一ヌクレオチド配列の３’端で終結するＯＲＦを含んでおり、第四ヌクレオチド配列が第一ヌクレオチド配列と第三ヌクレオチド配列との間に局在しており、第四ヌクレオチド配列は構築物が宿主のゲノムに組込まれたときにＯＲＦの転写を終結できる転写終結配列を含む。ベクターの別の実施態様においては、第二ヌクレオチド配列が第二ヌクレオチド配列の５’端を起点とするＯＲＦを含んでおり、第四ヌクレオチド配列が第三ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列との間に局在しており、第四ヌクレオチド配列は構築物が宿主のゲノムに組込まれたときにＯＲＦの転写を開始できるプロモーターを含む。
【００３５】
図１は宿主のゲノム内部に発現カセットを組込むための典型的なノックインプラスミドベクターの設計図を示す。発現カセットの互いのおよびＯＲＦに対する配向はどちらの方向でもよい。図１はＯＲＦ終止コドンに隣接の転写終結配列の後に続く発現カセットを示しているが、別の実施態様においてはマーカー発現カセットがＯＲＦ終止コドンに隣接の転写終結配列の後に続いてもよい。図１は組込み対象配列を含む１つの発現カセットと検出可能マーカーをコードする１つの発現カセットとを示すが、別の実施態様においてはベクターが複数の発現カセットを含有してもよい。組込み対象配列の各々はそれ自体のプロモーターとターミネーターとを有することができる。付加的または代替的に、各々がそれ自体の開始コドンおよび終止コドンをもつ複数の組込み対象配列の発現が単一のプロモーターおよびターミネーター配列によって駆動されるポリシストロン性ベクターを使用してもよい。図１に示すように、マーカーはそれ自体のプロモーターおよび終結配列を有することができる第二の発現カセットである。特定実施態様においては、最も３’の発現カセットは３’フランキング乗換え領域の転写終結配列を使用できる。
【００３６】
図２Ａは、発現カセットが相同的組換えによって宿主のゲノム内部にどのように組込まれるかを示す。図は宿主のゲノム中のＯＲＦを５’および３’のフランキング乗換え配列と共に示す。５’ フランキング乗換え領域のＯＲＦの終止コドンが示されている。ノックインベクターは好ましくは直鎖状であるかまたは直鎖化されており、宿主ゲノムの組込み領域の下方に示されている。図示のように、ベクターは、５’および３’のフランキング乗換え領域とＯＲＦとを含有している。しかしながら、ＯＲＦの転写終結を生じさせる異種転写ターミネーター配列がＯＲＦの終止コドンの３’側に隣接する。従ってＯＲＦの機能ＲＮＡ転写物の転写および翻訳が可能である。例えば異種タンパク質、融合タンパク質、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子などをコードする転写単位を含む発現カセットが異種転写ターミネーター配列の３’側に隣接している。大抵の実施態様においては一般に、発現カセットがプロモーター、ＯＲＦおよび転写終結配列を含む。ＯＲＦに対する発現カセットの配向はどちらの方向でもよい。この図に示す発現カセットに、組込まれた配列を含む組換え宿主の選択または同定を容易にする検出可能マーカーをコードする発現カセットが隣接してもよい。検出可能マーカーをコードする発現カセットのＯＲＦに対する配向はどちらの方向でもよい。３’フランキング領域はマーカーをコードする発現カセットの３’側に隣接する。この３’発現カセットに転写終結配列を配備する代わりに、３’ フランキング乗換え領域内部に含有された転写終結配列を使用することもできる。
【００３７】
図２Ａはまた、５’および３’のフランキング配列を介する相同的組換えによってベクターがゲノム内部に組込まれた後のゲノムを示す。図示のように、ＯＲＦの転写は、ＯＲＦの後に続く異種転写終結配列で終結し、非組換え宿主中で産生されたＲＮＡ転写物と機能的に同様のＲＮＡ転写物を産生する。このように転写物が非組換え宿主中と全く同様にＯＲＦによってコードされた機能遺伝子産物を産生するので、ＯＲＦによってコードされた機能は破壊されない。従って、組込まれた配列は機能遺伝子発現を破壊しない（すなわち、配列が挿入された遺伝子の機能転写物が産生されて機能遺伝子産物に翻訳されることができる）ので、ＯＲＦが必須遺伝子産物をコードしている場合には組換え宿主体内で該遺伝子産物の産生が続けられる。しかしながら、非組換え宿主と違って、組換え宿主は今や発現カセットを含んでおり、発現カセットによってコードされたタンパク質またはＲＮＡを発現するであろう。３’フランキング領域が非組換え宿主と同様に原形で維持されていることに注目するのが重要である。従って、すべての３’フランキング機能が、機能配列、たとえば、組込み部位の下流の遺伝子の発現をコントロールする調節配列を維持している。
【００３８】
図１および２Ａ、２Ｂは発現カセットに加えて検出可能または選択可能なマーカーを有するベクターを示すが、特定実施態様においてはベクターが組込み対象配列をコードする１つ以上の発現カセットを含有するが検出可能または選択可能なマーカーをコードする発現カセットを含有しない。出願人らは、挿入遺伝子座の遺伝子に突然変異を有しておりこの突然変異の結果として挿入遺伝子座の遺伝子によってコードされた産物が欠失している宿主に本文中に開示したベクターを挿入すると、該挿入遺伝子座の遺伝子によってコードされた産物がもはや欠失していない組換え宿主が得られることを発見した。従って、挿入部位の遺伝子の突然変異の修復が選択マーカーとして役立つ。例えば、挿入部位の遺伝子が遺伝子産物の喪失を補う遺伝子産物または代謝産物を増殖条件に加えることによって相補できる必須遺伝子産物をコードしているならば、遺伝子機能の喪失を補う遺伝子産物または代謝産物が欠如した条件下で組換え体を増殖させることによって組換え宿主を同定できる。何故ならば、突然変異した遺伝子が修復された組換え宿主だけが増殖できるからである。従って、本文中に開示したベクターはさらに、５’または３’のフランキング配列が選択可能マーカーとして使用できるＯＲＦを含む実施態様を含む。
【００３９】
従って別の実施態様においては、宿主ゲノム配列を重複または欠失させることなく宿主ゲノム内部に異種核酸配列を安定に組込むベクターが提供される。一般にベクターは５’から３’方向に、（ａ）読取り枠（ＯＲＦ）を含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の５’側に相同な５’フランキング配列と、（ｂ）第一の転写終結配列と、（ｃ）（ｉ）プロモーター配列と、（ｉｉ）組込み対象配列と、（ｉｉｉ）場合により第二の転写終結配列とをおのおのが含む１つ以上の発現カセットと、（ｄ）標的配列中の挿入部位の３’側に相同な３’フランキング配列とを含む編成を有している。特定実施態様においては、発現カセットの少なくとも１つが検出可能または選択可能なマーカーをコードしている。
【００４０】
現用の好ましい実施態様においては、ベクターの５’フランキング配列（ａ）が、宿主のＯＲＦに対応する読取り枠（ＯＲＦ）の全部または一部を含み、第一転写終結配列がＯＲＦの終止コドンに隣接するようにＯＲＦの３’端の第一転写終結配列に作動可能に連結されている。該ＯＲＦは好ましくは、フランキング配列が指令する遺伝子座のＯＲＦである。このようにして、５’フランキング配列内部に含有されたＯＲＦが先天性ＯＲＦに置換し、先天性ＯＲＦは破壊され、置換したＯＲＦは先天性プロモーターと挿入ベクターの第一転写終結配列（ｂ）とのコントロール下に発現されるであろう。第一転写終結配列はＯＲＦに対して異種である。
【００４１】
従ってさらに、宿主のゲノムの標的ＤＮＡ配列に組込み対象配列を挿入するための、（ａ）３’端の読取り枠（ＯＲＦ）の終止コドンで終結しかつ標的ＤＮＡ配列の第一領域と相同的組換えできる第一の相同的ベクターＤＮＡ配列と、（ｂ）ＯＲＦに作動可能に連結された異種転写終結配列と、（ｃ）１つ以上の発現カセットと、（ｄ）標的ＤＮＡ配列の第二領域と相同的組換えできる第二の相同的ベクターＤＮＡ配列とを含み、第二の相同的ベクター配列に対する第一の相同的ベクター配列の５’−３’配向が、標的配列の第二領域に対する第一領域の５’−３’配向と同じであり、第一および第二のベクター配列が標的ＤＮＡ配列中の隣り合う第一および第二の領域に対応しており、ベクターが標的ＤＮＡ配列と相同的組換えを行うことが可能なベクターが提供される。現用の好ましい実施態様においては、ベクターが少なくとも２つの発現カセットを有しており、発現カセットの１つが検出可能または選択可能なマーカーをコードしている。特定実施態様においては、（ａ）および（ｂ）のおのおのが１つ以上の制限部位を含み得る。
【００４２】
必須要件ではないにしても、ベクター内部の選択場所、特にベクターの個別要素間および／またはフランキング領域の一端または両端に１つ以上の制限部位を含ませることによって本発明のベクターの増殖および使用が増進されることは当業者の認めるところであろう。選択場所は最適には例えば、（ａ）の５’、（ａ）と（ｂ）との間、（ｂ）と（ｃ）との間、（ｃ）と（ｄ）との間、および（ｄ）の３’端を含むであろう。多用性の優先度次第では、最大の多用性をベクターに与えるような制限部位の対を使用する。例えば、（ａ）の５’と（ｄ）の３’で所与の制限部位の対を使用すると完全な原形ベクターの結合および除去が可能である。（ｂ）と（ｃ）との間および（ｃ）と（ｄ）との間で所与の制限部位の対を使用すると、発現カセットの結合、除去および互換が可能である。また、第一発現カセット内部および／または第二発現カセット内部に１つ以上の制限部位を有しており、これによって第一および第二の発現カセットの１つ以上の成分を互換的に“交換”して追加の発現カセットを容易に創造できることも望ましい。
【００４３】
不要な開裂、結合または再編の可能性を少なくするために、現状では、使用される制限酵素が強力に部位特異的であるのが好ましい。すなわち、制限酵素は比較的頻用されない制限部位に対応し、これによってゲノム内部に想定外の制限部位が出現する機会を減らす。比較的頻用されない制限部位に対応する強力に部位特異的な制限酵素の例は非限定的に、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｇｆＩおよびＰａｃＩを含む。所望ならば、ＡｓｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩのような他の便利な制限酵素も含まれる。
【００４４】
発現カセット中の遺伝子を細胞から分泌させるかまたは小胞体もしくはゴルジ装置のような細胞内部の特異的場所に標的組換えさせたい場合には、発現カセットがさらに、発現コントロールまたはプロモーター配列と遺伝子コード配列との間に局在するシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。シグナルペプチドは隣接ペプチド配列を予定部位に標的組換えする能力に基づいて選択される。
【００４５】
５’および３’のフランキング配列のおのおのは、予定宿主の宿主ゲノム内部の１つの領域、好ましくは極めて近接のまたは隣接の領域に相補的である。例えば、予定宿主がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、フランキング配列はこのような下等真核細胞を起源とするのが好ましい。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａの場合、ベクターのフランキング配列に適した遺伝子座は非限定的に、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＰＲＯ１、ＰＲＯ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ５、ＬＹＳ１、ＬＹＳ４およびＴＨＲ１を含む。
【００４６】
また、ベクターを受容する宿主に上記遺伝子座のいずれかによってコードされた遺伝子産物が欠失しているときは上記遺伝子座のいずれかを選択可能マーカーとして使用できる。従ってベクターは、上記遺伝子座の１つに由来の産物をコードする発現カセットをマーカーとして含むことができ、該マーカーによってコードされた遺伝子産物の欠失した宿主の第二の遺伝子座にベクターが挿入されたときに該産物の欠如が相補される。ベクターは５’または３’のフランキング配列の挿入遺伝子座に１つの遺伝子座の遺伝子を含むことができ、遺伝子産物の欠失した宿主の該遺伝子座に相同的組換えによってベクターが挿入されたときに該遺伝子座の遺伝子が修復されて該遺伝子座で機能遺伝子産物が産生される。
【００４７】
別の実施態様においては選択可能マーカーが逆選択可能である。すなわち、形質転換後に検出可能マーカーを宿主ゲノムから切除でき、選択可能マーカーの欠如に基づいて選択することによって組込み対象機能配列をコードする発現カセットを有するが検出可能マーカーをコードする発現カセットを有していない宿主が同定される。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ宿主に対する現用の好ましい逆選択可能マーカーの例はＵＲＡ３およびＵＲＡ５を含む。別の実施態様においては、少なくとも１つの非反復制限部位が第一の発現カセット（ｄ）と選択可能マーカーをコードする第二の発現カセットとの間に存在する。
【００４８】
別の実施態様においては、本発明のベクターが、５’から３’方向に、（ａ）読取り枠（ＯＲＦ）までの配列を含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の５’側に相同な５’フランキング配列と、（ｂ）（ｉ）プロモーター配列と、（ｉｉ）組込み対象配列と、（ｉｉｉ）場合により第二の転写終結配列とをおのおのが含む１つ以上の発現カセットと、（ｃ）ＯＲＦの発現を調節するプロモーター配列と、（ｄ）ＯＲＦとその開始コドンとを含み宿主ゲノムの標的配列中の挿入部位の３’側に相同な３’フランキング配列とを含む編成を有している。
【００４９】
別の実施態様においては、３’フランキング配列（ｄ）が好ましくは、宿主中に存在するＯＲＦに対応する読取り枠（ＯＲＦ）を含み、これは（ｃ）のプロモーター配列に作動可能に連結されている。現用の好ましい実施態様においては、プロモーター（ｃ）がＯＲＦに対して異種のプロモーターである。ＯＲＦは好ましくはフランキング配列が指向する遺伝子座のＯＲＦである。このようにして、３’フランキング配列内部に含有されたＯＲＦが先天性ＯＲＦに置換し、先天性ＯＲＦが破壊され、置換したＯＲＦは挿入されたベクターのプロモーター配列（ｃ）と破壊されたＯＲＦの先天性転写終結配列とのコントロール下で発現されるであろう。代替実施態様は図２Ｂに示されている。
【００５０】
宿主のゲノムの標的ＤＮＡ配列に組込み対象配列を挿入するためのベクターのさらに別の実施態様は、（ａ）標的ＤＮＡ配列の第一領域と相同的組換えできる第一の相同的ベクターＤＮＡ配列と、（ｂ）１つ以上の発現カセットと、（ｃ）プロモーター配列と、（ｄ）５’端の読取り枠（ＯＲＦ）の開始コドンを起点としておりかつプロモーターに作動可能に連結されており、標的ＤＮＡ配列の第二領域と相同的組換えできる第二の相同的ベクターＤＮＡ配列とを含み、第二の相同的ベクター配列に対する第一の相同的ベクター配列の５’−３’配向が、標的配列の第二領域に対する第一領域の５’−３’配向と同じであり、第一および第二のベクター配列が標的ＤＮＡ配列中の隣り合う第一および第二の領域に対応しており、ベクターが標的ＤＮＡ配列と相同的組換えを行うことが可能である。
【００５１】
上記実施態様は他のすべての点で先の実施態様について説明した方針に沿って修飾できる。
【００５２】
いくつかの実施態様において、本発明のベクターは多数の発現カセットを５’および３’のフランキング配列内部と直列に有し得る。このような実施態様においては、各発現カセットが、プロモーター、転写単位およびターミネーター配列を含み、従って、宿主ゲノムに組込まれたときに各発現カセットがそれぞれのプロモーターおよび転写ターミネーター配列のコントロール下でそれぞれの転写単位を作動的に発現するであろう。このようにすると、本文中に開示のベクターを使用する単一組込みイベントによって宿主体内の多数の転写単位（または遺伝子）の発現が得られる。発現カセット設計図は多様な変更が可能であり、それらの使用は本発明の範囲内である。例えば所望の場合、それぞれのＯＲＦがより強力に発現するように多数プロモーターをもつ発現カセットを設計してもよく、または、多数の遺伝子の協調発現が得られるように多数の転写単位を１つ以上のプロモーターのコントロール下の１つの発現カセット内部に含有させてもよい。
【００５３】
以下の実施例では、宿主が哺乳類細胞によって産生される糖タンパク質と同様のグリコシル化パターンをもつ糖タンパク質を産生できるようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種の下等真核宿主を操作する方法に基づいて本文中に開示したベクターの使用を説明する。従って、実施例に記載した本発明の様々な成分は本発明のこれらの特定実施態様に対して最適化されている。しかしながら当業者は、本発明の多用性を認識し、このような最適化実施態様の記載が他の発現系への本発明の応用適性を全く制限しないことを認識されるであろう。
【００５４】
Ｐｉｃｈｉａ体内で作動可能なプロモーターの例は非限定的に、Ｐｉｃｈｉａ  ＧＡＰＤＨプロモーター；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＡＰＤＨプロモーター；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＭＡ１プロモーター；Ｐｉｃｈｉａ  ＴＥＦプロモーター；Ｐｉｃｈｉａ  ＡＯＸプロモーター；ＡＬＧ６プロモーター；およびＰｉｃｈｉａ  ＭＬＳ１プロモーターを含む。Ｐｉｃｈｉａ体内で作動可能な転写単位の例は非限定的に、ＡＬＧ３ターミネーター；Ｐｉｃｈｉａ  ＡＬＧ６ターミネーター；ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓシトクロムＣ（ＣＹＣ）ターミネーター；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＭＡ１ターミネーター；およびＰｉｃｈｉａ  ＴＥＦターミネーター配列を含む。Ｐｉｃｈｉａに使用するための選択可能マーカーの例は非限定的に、Ｐｉｃｈｉａ  ＵＲＡ５遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＵＲＡ３遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＨＩＳ（ＨＩＳ１からＨＩＳ６を含む）遺伝子；およびＰｉｃｈｉａ  ＡＲＧ（ＡＲＧ１からＡＲＧ３を含む）遺伝子を含む。挿入部位の例は非限定的に、Ｐｉｃｈｉａ  ＡＤＥ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＴＲＰ（ＴＲＰ１からＴＲＰ２を含む）遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＭＣＡ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＣＹＭ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＥＰ遺伝子；Ｐｉｃｈｉａ  ＰＲＢ遺伝子；およびＰｉｃｈｉａ  ＬＥＵ遺伝子を含む。Ｐｉｃｈｉａ  ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子は、Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）およびＵ．Ｓ．特許４，８１８，７００に記載されており、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１遺伝子は、Ｃｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ  １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５６１８０に記載されている。
【００５５】
実施例は、本発明の実施を現用の好ましいＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ体内の実施態様として示す。しかしながら、本発明は公的利用可能なゲノムデータベースおよび購入可能な専有権のあるゲノムデータベースを使用する広範囲の宿主細胞および発現系に応用できる。ゲノム科学の最近の進歩に伴っていまや多くの種の完全または部分ゲノムがインターネットまたは科学刊行物から入手可能である。例えば、多くの脊椎動物、昆虫、真菌類、細菌および植物のゲノムデータベースへのリンクを提供するＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ．ｏｒｇ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＰＯ  Ｂｏｘ  １６０  Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ，ＮＹ  １１５０７−０１６０）を参照できる。また、多くの微生物データベースを含むＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（２２０１  Ｗ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｐａｒｋ  ＤＲ  Ｓｔｅ  １５  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ  ６０６１２）のゲノムデータベースサービスおよび製品を参照できる。
【００５６】
以下では、完全複合シアリル化Ｎｐ結合糖形態を有する糖タンパク質を産生するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系を使用して本発明を例示しているが、この実施例は非限定的であり、本発明ははるかに広い応用適性を有している。当業者は、本発明の本質の実施から逸脱することなく多くの修正および改良が可能であり、このような修正によって本発明が実質的にいかなるタイプの発現系、宿主生物または細胞にも使用できることを認識されよう。従って本発明は、本文中に教示した発現カセットを挿入するための適当な標的配列およびＯＲＦを同定するために公的利用可能なゲノムデータベースおよび購入可能な専有権のあるゲノムデータベースを使用する広範囲の宿主細胞および発現系に応用できる。ゲノム科学の最近の進歩に伴っていまや多くの種の完全または部分ゲノムがインターネットまたは科学刊行物から入手可能である。例えば、多くの脊椎動物、昆虫、真菌類、細菌および植物のゲノムデータベースへのリンクを提供するＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ．ｏｒｇ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＰＯ  Ｂｏｘ  １６０  Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ，ＮＹ  １１５０７−０１６０）を参照できる。また、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む多くの微生物データベースを含むＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（２２０１  Ｗ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｐａｒｋ  ＤＲ  Ｓｔｅ  １５  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ  ６０６１２）のゲノムデータベースサービスおよび製品を参照できる。さらに本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系に由来の完全複合シアリル化Ｎ−グリカンをもつ組換え糖タンパク質の発現を例示しているが、本明細書を読了した当業者が容易に理解および想到できる他の多くの有力な応用および用途が可能である。このような修正、改良、応用および用途は本発明の考察範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ＯＲＦを含有する５’乗換え領域と隣接転写ターミネーター配列と発現カセットとマーカー遺伝子をコードする発現カセットと３’乗換え領域とを示すノックインベクターの実施態様の典型的な構造を示す。発現カセットとマーカー発現カセットとの互いの相対位置および配向は変更可能である。５’乗換え領域のＯＲＦの終止コドンおよび３’乗換え領域のＯＲＦの後に続く第一ヌクレオチドが示されている。
【図２Ａ】図２Ａは図１に示したノックインベクターの実施態様が内因性ＯＲＦの終止コドンの下流で相同的組換えによってゲノム内部にどのように挿入されるかを示す。ＯＲＦ−読取り枠。ＴＴ−異種転写ターミネーター配列。発現カセットの３’領域はそれ自体の転写終結配列を含有する。Ｅｘｐｒ．Ｃａｓｓ．−発現カセット。相同的組換えのためには、５’−領域、ＯＲＦおよび３’−領域が宿主体内のゲノム配列に相同である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ノックインベクターの別の実施態様が内因性ＯＲＦの開始コドンの上流で相同的組換えによってゲノム内部にどのように挿入されるかを示す。ＯＲＦ−読取り枠。Ｐｒｏｍ−異種プロモーター配列。発現カセットの３’領域はそれ自体の転写終結配列を含有する。Ｅｘｐｒ．Ｃａｓｓ．−発現カセット。相同的組換えのためには、５’−領域、ＯＲＦおよび３’−領域が宿主体内のゲノム配列に相同である。
【図３Ａ】図３Ａは、ノックインプラスミドベクターｐＳＨ８２３の概略図である。このベクターは組込み対象配列をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム内部にＴＲＰ２  ＯＲＦに隣接して挿入するために使用できる。組込み対象配列はＰｐＧＡＰＤＨプロモーター配列（ＰｐＧＡＰＤＨ）とＳｃＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）との間でプラスミドに挿入できる。プラスミドはさらに選択可能マーカーＰｐＵＲＡ５を含む。
【図３Ｂ】図３ＢはノックインプラスミドベクターｐＳＨ９２６の概略図である。このベクターは５つのＯＲＦをＴＲＰ２  ＯＲＦに隣接してＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム内部に挿入するために使用できる。これらのＯＲＦは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＳＳ）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）、および、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のアミノ酸４０から４０３とＭｎｔ１のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターゲティング領域とから成る融合タンパク質をコードしている。各ＯＲＦはそれ自体のプロモーターと終結配列とを有している。プラスミドはさらに選択可能マーカーＲｐＨＩＳ１を含む。
【図４】図４は、ヒトおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＮ−結合グリコシル化経路の比較を示す。Ｍｎｓ；α１，２−マンノシダーゼ、ＭｎｓＩＩ；マンノシダーゼＩＩ、ＧｎＴ１；β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ＧｎＴＩＩ；β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、ＧａｌＴ；β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＳｉａＴ；α２，６−シアリルトランスフェラーゼ、ＭｎＴ；マンノシルトランスフェラーゼ。
【図５】図５は、酵母ゴルジ中のシアル酸転移に必要な糖操作段階を示す。酵母細胞質に存在する内因性ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃがＣＭＰ−シアル酸に転化され、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）によってゴルジ内腔に転移される。その後、ＣＭＰ−シアル酸由来のシアル酸はシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）によって受容体グリカンに転移される。生合成経路の成分：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、シアリレート−９−Ｐホスファターゼ（ＳＰＰ）およびＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＳＳ）。グリカン構造は図４に記述されている。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌ＹＳＨ５５１株から分泌され培養上清からＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーによって精製された組換えｒＥＰＯから遊離したＮ−結合グリカンのＨＰＬＣキャラクタリゼーションを示す。ＰＮＧアーゼ−Ｆ処理によってｒＥＰＯからグリカンを遊離し、ＨＰＬＣ分析に先立って２−ＡＢで標識した。グリカン構造は図１に記述されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌ＹＳＨ５５７株から分泌された組換えｒＥＰＯから遊離したＮ−結合グリカンのＨＰＬＣキャラクタリゼーションを示す。ＰＮＧアーゼ−Ｆ処理によってｒＥＰＯからグリカンを遊離し、ＨＰＬＣ分析に先立って２−ＡＢで標識した。ＧＳ５．０に対応する市販グリカン標品の溶出時間は２４分であった。グリカン構造は図１に記述されている。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌ＹＳＨ５９７株から分泌された組換えｒＥＰＯから遊離したＮ−結合グリカンのＨＰＬＣキャラクタリゼーションを示す。ＰＮＧアーゼ−Ｆ処理によってｒＥＰＯからグリカンを遊離し、ＨＰＬＣ分析に先立って２−ＡＢで標識した。ＧＳ５．５および６．０に対応する市販グリカン標品の溶出時間はそれぞれ４０および６６分であった。グリカン構造は図１に記述されている。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６ＣのＹＳＨ５９７から分泌されたグリカンがシアル酸を含有していたことを確認するＨＰＬＣを示す。サンプルをα−２，３−／−２，６−／−２，８−シアリダーゼで処理した。ＧＳ５．０に対応する市販グリカン標品の溶出時間は２４分であった。グリカン構造は図１に記述されている。
【図７Ａ】図７はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓから得られた組換えｒＥＰＯのキャラクタリゼーションを示す。ＰＮＧアーゼ−Ｆの存在下（＋）または非存在下（−）の温置後のＹＳＨ５５１およびＹＳＨ５９７から分泌された組換えｒＥＰＯ（２．５μｇ、精製後）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）。
【図７Ｂ】ＹＳＨ５５１（青色棒グラフおよび緑色棒グラフ）およびＹＳＨ５９７（赤色棒グラフおよび黄色棒グラフ）から分泌された組換えＥＰＯの比較ヘマクリット分析（Ｂ）。初回注射の８日後（青色棒グラフおよび赤色棒グラフ）および１５日後（緑色棒グラフおよび黄色棒グラフ）に対応する値。データは、１つの用量あたりｎ＝５マウスの平均±Ｓ．Ｄ．として示した。
【実施例１】
【００５８】
上述の方針、方法および材料に従って発明者らは、全体的構成は同じであるが本発明の操作および最適化をより十分に解明するために設計上の変更を加えたいくつかのベクターシリーズを構築した。
【００５９】
第一のベクターシリーズとして発明者らは、Ｕ．Ｓ．公開特許出願２００４／０２２９３０６およびＮｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｍｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９−１２９０（２００３）に記載された構造のベクターｐＪＮ２６７を修飾した。ｐＪＮ２６７ベクターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子をコードするＯＲＦを含有している。ＡＯＸ１転写終結配列をＫＥＸ１−５’領域の後に挿入してｐＪＮ４７３を作製し、これをマスタープラスミドとして使用して第一ベクターシリーズを作製する。ＫＥＸ１をノックアウトするように設計された５’領域を選択したのでｐＪＮ４７３自体は本発明の範囲内のベクターではないことに留意されたい。本発明の範囲内の第二のベクターセットを作製するためにプラスミドｐＪＮ４７３を修飾した。第一のベクターセットは選択可能マーカーとしてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３ブラスターを使用し、第二のセットは選択可能マーカーとしてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５ブラスターを使用した。
【００６０】
表１に示すように、ｐＪＮ４７３の５’および３’のフランキングＫＥＸ１領域を切除し、５’および３’のフランキングＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４またはＴＲＰ領域で置換してそれぞれベクターｐＪＮ４９２から４９６までを作製した。５’フランキング領域は終止コドンまでのＡＤＥ１、ＡＲＧ４、Ｈ１Ｓ３、ＨＩＳ４またはＴＲＰ１  ＯＲＦを含有し、３’フランキング領域はＯＲＦの下流の配列、例えば先天性転写終結配列を含有した。従ってこれらのプラスミドベクターはＯＲＦの終止コドンに隣接のＡＯＸ１転写終結配列と選択可能マーカーとなるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３ブラスターとを含有する。
【００６１】
【表２】
0005424871.tif 000003
【００６２】
次に、プラスミド（表１に示すｐＪＮ４９２からｐＪＮ４９６）が種々の選択可能マーカーを含有するようにさらに修飾した。全部のベクターについて、ＳｗａＩ／ＸｈｏＩを使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３ブラスターを切除し、得られた末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端とした。次いで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５ブラスターを含有するＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化することによってプラスミドｐＪＮ３９６（参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２００４／０２２９３０６）から取り出した。末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端とし、フラグメントをｐＪＮ４９２からｐＪＮ４９６までに挿入し、それぞれプラスミドｐＪＮ５０７ａ／ｂからｐＪＮ５１１ａ／ｂまでを作製した。
【００６３】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３ブラスターを選択可能マーカーとして含有する別のプラスミドセットを作製するために、プラスミドｐＪＮ４９２からｐＪＮ４９６までを以下のように修飾した。全部のベクターについて、ＳｗａＩ／ＸｈｏＩを使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３ブラスターを切除し、得られた末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端とした。次いで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３ブラスターを含有するＤＮＡフラグメントを、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化することによってプラスミドｐＪＮ３１５（参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２００４／０２２９３０６）から取り出した。末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端とし、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３ブラスターを含有するフラグメントをｐＪＮ４９２からｐＪＮ４９６までに挿入し、それぞれプラスミドｐＪＮ５１３ａ／ｂからｐＪＮ５１７ａ／ｂまでを作製した。
【００６４】
ＡＯＸ１ターミネーターの代わりにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ３（ＰｐＡＬＧ３）ターミネーター領域を使用して同様のベクターセットを構築した。ＰｐＡＬＧ３遺伝子は、Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１４：３９９−４０７（２００４），ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６５３３０４およびＵ．Ｓ．公開特許出願２００５／０１７０４５２に記載されている。ベクター構築は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５ブラスター栄養要求性マーカーでマークしたマスターノックアウトプラスミドｐＧＬＹ２４を出発材料とした。プラスミドｐＧＬＹ２４は、プレースホルダーがＫＥＸ１でなくＡＲＧ３である以外はｐ２６７と基本的に同じである。５’領域の後に続く制限部位にＰｐＡＬＧ３ターミネーターを付加するとマスタープラスミドｐＧＬＹ５６６が得られる。この場合にも５’領域の選択が理由でこのベクターはそれ自体ではＫＩＮＫＯベクターでなく、ＡＲＧ３ノックアウトベクターである。５’−および３’−の領域の交換によって表２に示す以下のプラスミドが得られた。注：プラスミドｐＧＬＹ９６２は破壊されたＢａｍＨＩ部位をもつｐＧＬＹ５６６に対応する。
【００６５】
【表３】
0005424871.tif 000004
【００６６】
ＫｌＮＫＯプラスミドの組込み効率を試験するために、２つのリーダー／α−１，２−マンノシダーゼ融合タンパク質（ＢＣ１およびＢＣ１８）をコードするＤＮＡを含有する発現カセットをｐＪＮ５０７ａ／ｂからｐＪＮ５１１ａ／ｂまでおよびｐＪＮ５１３ａ／ｂからｐＪＮ５１７ａ／ｂまでにクローニングし、各プラスミドセットで２つのＵＲＡ５−酵母菌株を形質転換した。菌株ＹＪＮ１９９−１およびＹＪＮ１９９−６（参照：Ｕ．Ｓ．公開特許出願２００４／０２２９３０６）にはｐＪＮ５０７ａ／ｂからｐＪＮ５１１ａ／ｂまで（表３）を使用し、菌株ＹＪＮ２２７−１およびＹＪＮ２２７−４（ＵＲＡ３−）にはｐＪＮ５１３ａ／ｂからｐＪＮ５１７ａ／ｂまで（表４）を使用した。
【００６７】
形質転換あたり４８クローンをＰＣＲ分析した。ＰＣＲ分析は、正しい場所の正しい遺伝子座で高レベルの組込み効率を示した。
【００６８】
【表４】
0005424871.tif 000005
【００６９】
【表５】
0005424871.tif 000006
【実施例２】
【００７０】
この実施例は、哺乳類様複合Ｎ−グリカンを有している糖タンパク質を産生できる組換え酵母の構築を示す。酵母体内にシアリル化経路を構築するために必要な５つの遺伝子を含有するＫＩＮＫＯ発現ベクターを使用し、ＴＲＰ２  ＯＲＦに隣接して５つの遺伝子を挿入した。
【００７１】
方法および材料：
菌株、培養条件および試薬。ＤＮＡ組換え操作には大腸菌ＴＯＰ１０株またはＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株を使用した。ＰＮＧアーゼ−Ｆ、シアリダーゼ、制限酵素および修飾酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手し、製造業者の指示通りに使用した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から得られた。遺伝子のコドン最適化は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓコドン使用法に適応させたＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェアを使用するＧｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。金属キレート化用“ＨｉｓＢｉｎｄ”樹脂はＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。９６−ウェルの溶解液洗浄用プレートはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。タンパク質結合用９６−ウェルプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製であった。塩および緩衝剤はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。タンパク質発現は典型的には、１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムバッファ，ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチンおよび１％グリセロールから成る５０ｍｌの緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）を増殖培地として２６℃で行った。誘導は、ＢＭＧＹ中のグリセロールの代わりに１．５％のメタノールから成る５ｍｌの緩衝メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）中で行った。最少培地は、１．４％酵母窒素塩基、２％デキストロース、１．５％寒天および４×１０−５％ビオチンおよび適宜補充したアミノ酸から成る。
【００７２】
ラットＥＰＯ発現ベクターの作製
アミノ酸２７から１９２までをコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓエリトロポエチン（ｒＥＰＯ）の先端欠失形態を、ラット腎ｃＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼを製造業者の勧告通りに使用して増幅した。簡単に説明すると、プライマーｒＥＰＯ−ｆｏｒおよびｒＥＰＯ−ｒｅｖ（それぞれ５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣＧＡＣ−３’（配列１）および５’−ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣ  ＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣ−３’（配列２））を使用して、ラット腎ｃＤＮＡ由来の５１６ｂｐ産物を以下のサイクル反復条件で増幅した：９４℃で１分を１サイクル；９４℃で３０秒、７２℃で１分を５サイクル；９４℃で３０秒、７０℃で１分を５サイクル；９４℃で２０秒、６８℃で１分を２５サイクル。その後、産生物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、配列決定し、得られた構築物をｐＳＨ６０３と命名した。酵母発現ベクターを作製するために、ｐＳＨ６０３をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して５０６ｂｐフラグメントを遊離させ、このフラグメントを、同じ酵素で予め消化しておいたｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした。得られた発現ベクターをｐＳＨ６９２と命名した。
【００７３】
酵母発現カセット中のコドン最適化遺伝子の作製
ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＳＳ）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）の読取り枠およびＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−２，６−シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸４０から４０３までを、ＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェアによって解析し、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現用にコドン最適化した（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。得られたＧＮＥ、ＳＰＳ、ＣＳＳおよびＣＳＴ用の合成ＤＮＡに５’ＢｓａＩおよび３’ＨｐａＩ制限部位を形成し、シャトルベクターにクローニングし、それぞれｐＧＬＹ３６８、３６７、３６６および３６９と命名した。ＳＴ用の合成ＤＮＡに５’ＡｓｃＩおよび３’ＰａｃＩ制限部位を作製し、シャトルベクターにクローニングし、ｐＳＨ６６０と命名した。
【００７４】
ＳＰＳ、ＣＳＳおよびＣＳＴ発現カセットを作製するために、ベクターｐＧＬＹ３６７、３６６および３６９をＢｓｓＩおよびＨｐａＩで消化して１．１、１．３および１．０Ｋｂのフラグメントを切り出し、これらのフラグメントをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｅｄ．３ｒｄ，２００１））。次にこれらのフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで予め消化しておいたベクターｐＧＬＹ３５９、ならびに、いずれもＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化しておいたベクターｐＧＬＹ１７および３６３にサブクローニングし、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ＰａｃＩ制限酵素によって隣接されたＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡ１ｔｔカセット中にＳＰＳを含有するベクターｐＳＨ８１９、５’ＢｇｌＩＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位によって隣接されたＰｐＧＡＰＤＨ−ＳｃＣＹＣｔｔカセット中にＣＳＳを含有するベクターｐＳＨ８２４、および、ＲｓｒＩＩ制限部位によって隣接されたＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍ−ＰｐＰＭＡ１ｔｔカセット中にＣＳＴを含有するベクターｐＧＬＹ３７２が得られた。
【００７５】
酵母局在シグナルに融合したＳＴ触媒ドメインを作製するために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびプライマーＳｃＭｎｔ１−ｆｏｒおよびＳｃＭｎｔ１−ｒｅｖ（それぞれ５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣ  ＡＧＴＡＡＧＡＧＡＣＴ  ＧＴＴＧＡＧ−３’（配列３）および５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧ  ＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’（配列４））を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭｎｔ１ターゲティング領域をゲノムＤＮＡから増幅した。使用した条件は、９４℃で３分を１サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で２０秒、６８℃で１分を３０サイクル；６８℃で５分を１サイクルであった。５’ＮｏｔＩおよび３’ＡｓｃＩ制限部位を含有している得られた１７４ｂｐのフラグメントを、コドン最適化ＳＴの５’にインフレームでサブクローニングし、ベクターｐＳＨ８６１を創造した。次にこのベクターをＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、ＳＴ融合を含有する１．３Ｋｂフラグメントを切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化することによって調製したｐＧＬＹ３６１にサブクローニングし、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。得られたベクター、すなわち、ＳｇｆＩ制限部位によって隣接されたＰｐＴＥＦｐｒｏｍ−ＰｐＴＥＦｔｔカセット中にＳＴ−融合を含有するベクターをｐＳＨ８９３と命名した。
【００７６】
シアル酸操作ベクターの作製
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ転写ターミネーターとを含有している酵母ＫＩＮＫＯ発現ベクターｐＳＨ８２３はＴｒｐ２  ＯＲＦの下流でＰｉｃｈｉａゲノムに組込まれるように設計した。このベクターを図３Ａに示す。このＫＩＮＫＯベクターの顕著な特徴は、ＡＬＧ３転写終結配列がＴＲＰ２  ＯＲＦの終止コドンに隣接していることである。制限酵素ＲｓｒＩＩを使用してｐＧＬＹ３７２からＰＭＡ−ＣＳＴ発現カセットをコードする２．６Ｋｂフラグメントを切り出し、同じ酵素で消化したｐＳＨ８２３にサブクローニングした。得られたベクター中ではＰＭＡ−ＣＳＴ発現カセットとＧＡＰＤＨ発現カセットとが同方向で一線上に並んでおり、このベクターをｐＳＨ８２６と命名した。次いでこのベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化し、一本鎖オーバーハングをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで除去した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｅｄ．３ｒｄ，２００１））。
【００７７】
直鎖化したこのＫＩＮＫＯ構築物に、ＢｓａＩおよびＨｐａＩで消化することによってｐＧＬＹ３６８から単離しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して一本鎖オーバーハングを除去した２．２ＫｂのＧＮＥフラグメントをサブクローニングした。このベクターをｐＳＨ８２８と命名した。次いでこのベクターをＰａｃＩで消化し、これに、ＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットをコードしているｐＳＨ８１９の２．７ＫｂのＰａｃＩフラグメントをサブクローニングした。ＰＭＡ−ＳＰＳ発現カセットがＧＡＰＤＨ発現カセットと逆配向で一線上に並んでいるベクターが得られたので、ｐＳＨ８３０と命名した。この段階で、ＸｈｏＩを使用してｐＳＨ８３０から２．４ＫｂのＵＲＡ５フラグメントを切除し、同じ酵素で消化したｐＳＨ８４２由来の１．８ＫｂのＨＩＳ１フラグメントで置換することによってＵＲＡ５マーカーをＨＩＳ１で置換した。得られたベクター中ではＨＩＳ１  ＯＲＦがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥ発現カセットと同方向で一線上に並んでおり、このベクターをｐＳＨ８７０と命名した。次いでこのベクターをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化することによって単離したＧＡＰＤＨ−ＣＳＳ発現カセットを含有するｐＳＨ８２４由来の２．１Ｋｂフラグメントをサブクローニングした。
【００７８】
作製されたＫＩＮＫＯベクター、すなわち、新しく導入された発現カセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットの逆方向に配向されたＫＩＮＫＯベクターをｐＳＨ８７２と命名した。次に、ＴＥＦ−ＳＴを含有している２．２Ｋｂの発現カセットをｐＳＨ８９３由来のＳｇｆＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＳＨ８７２にサブクローニングした。ＴＥＦ−ＳＴカセットがＧＡＰＤＨ−ＧＮＥカセットの逆方向に配向されたベクターが得られたので、ｐＳＨ９２６と命名した。ＴＲＰ２  ＯＲＦの後方に創造された遺伝子間領域にＣＳＴ、ＧＮＥ、ＣＳＳ、ＳＰＳおよびＳＴ遺伝子とＨＩＳマーカーとの発現カセットを挿入するために使用するこのＫＩＮＫＯベクターを図３Ｂに示す。
【００７９】
酵母菌株の作製
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０株を電気穿孔によってベクターｐＳＨ６９２（ｒＥＰＯをコードする）で形質転換し、ＹＰＤ−Ｚｅｏｃｉｎプレート上、２６℃で選択した。上述のように、ＢＭＧＹ培地中の増殖およびＢＭＭＹ培地中の発現によるｒＥＰＯの発現に基づいていくつかのクローンをスクリーニングした。発現を示すクローンをＹＳＨ５５１と命名した。
【００８０】
ＧＳ５．０グリカンを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ糖操作細胞系ＲＤＰ７５０［Δｏｃｈ１，Δｐｎｏ１，Δｍｎｎ４Ｂ，Δｂｍｔ２，Δｈｉｓ１、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−Ｍｎｓ１、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＭｎｓＩＩ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｇａｌエピメラーゼ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ］（Ｌｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，２１０（２００６））をｐＳＨ６９２で形質転換した。ｒＥＰＯを発現する得られたクローンをＲＤＰ７６２と命名した。
【００８１】
この菌株から得られたタンパク質発現レベルを改善するために、ｐＪＮ７０２（３）で形質転換することによってヒスチジン要求性を相補し、ヒスチジン除去最少プレート上で選択した。得られた菌株をＹＳＨ５５７と命名した。
【００８２】
ＧＳ６．０グリカンをもつ菌株を作製するために、上記の菌株ＲＤＰ７６２をｐＳＨ９２６で形質転換し、ヒスチジン要求性を相補するヒスチジン除去最少プレート上で選択した。得られた菌株をＹＳＨ５９７と命名した。
【００８３】
タンパク質およびグリカンの分析
組換えｒＥＰＯを上記のように発現させ、Ｎｉ−キレートカラム精製した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１２４４（２００３））。得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０（１９７０））、可視化するためにクーマシーブルーで染色した。グリカン分析のために、ＰＮＧアーゼ−Ｆで処理することによってｒＥＰＯからグリカンを遊離させた（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１２４４（２００３））。遊離したグリカンを、ＭＡＬＤＩ／Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）質量分析法によって分析してグリカン構造を確認した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，５０２２（２００３））。存在する中性グリカンおよび帯電グリカンの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦで遊離させたグリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００８４】
使用条件は以前に記載されたものであるが（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，５０２２（２００３））、溶出プロフィルだけを以下のように変更した：中性グリカンおよび帯電グリカンをそれぞれ溶出させるために二相直線溶媒勾配（８０％Ａ：２０％Ｂから４０％Ａ：６０％Ｂまで）を３０分、（４０％Ａ：６０％Ｂから０％Ａ：１００％Ｂまで）を３０分間。次に、１００％Ｂのアイソクラチック溶出を５分間、直線溶媒勾配（０％Ａ：１００％Ｂから８０％Ａ：２０％Ｂまで）の溶出を５分間、および、（８０％Ａ：２０％Ｂ）のアイソクラチック溶出を１０分間の順序でカラムを処理して、以後のサンプルを調製した。溶媒Ａはアセトニトリル、溶媒Ｂは５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．５）であった。中性、ＧＳ５．５およびＧＳ６．０のグリカンのパーセンテージは、総ピーク面積に対する各グリカン種（それぞれ２０から３５分に溶出する種、３８から４５分に溶出する種、６２から６８分に溶出する種）のピーク面積を使用して計算した。
【００８５】
インビボキャラクタリゼーション用ｒＥＰＯの調製
菌株ＹＳＨ５５１およびＹＳＨ５９７をバフル付き振盪フラスコ中の２．４ｌのＢＭＧＹ中で増殖させ、２４０ｍｌのＢＭＭＹで誘発すると、それぞれ野生型およびＧＳ６．０グリカンを含む充分なｒＥＰＯが得られた。Ｋ９／１５カラム（０．９×１３ｃｍ；ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に詰めたＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇを使用する金属アフィニティクロマトグラフィーを使用して野生型およびＧＳ６．０菌株の上清から組換えｒＥＰＯを捕集し、５カラム容量の５０ｍＭの硫酸ニッケルを充填した。充填カラムを５カラム容量のバッファＡ（２０ｍＭのトリス，ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ）で平衡させた。１５０ｍｌの培養上清をｐＨ８に調整し、３ｍｌ／分の流速でカラムに充填した。Ａ２８０がベースラインに到達するまでカラムをバッファＡで洗浄し、１０カラム容量のバッファＡとバッファＢ（２０ｍＭのトリス，ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール）との直線勾配を使用してｒＥＰＯを溶出させた。勾配溶出画分を４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ｒＥＰＯ含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ  ５，０００）を使用してバッファを２０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０に交換した。
【００８６】
金属キレート化クロマトグラフィー段階からプールしたｒＥＰＯ画分を、Ｋ９／１５カラム（０．９×１３ｃｍ）に詰めたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを５カラム容量のバッファＣ（２０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６）で平衡させた。バッファＣ中のサンプルを流速３ｍｌ／分でカラムに充填した。次にカラムを各５カラム容量のバッファＣおよびバッファＤ（２０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、バッファＣで再度洗浄した。バッファＣとバッファＥ（２０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６、１ＭのＮａＣｌ）との直線勾配（１０カラム容量）によって組換えｒＥＰＯをカラムから溶出させた。組換えｒＥＰＯ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、プールし、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ  ５，０００）を使用してバッファをリン酸塩緩衝生理食塩水，ｐＨ７．３に交換し、４℃で保存した。
【００８７】
インビボ効力試験
健康な９週齢のＢａｌｂＣマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に週三回の注射を行った（ｎ＝５／処理群）。一回目の注射の前日にヘマトクリット基線量の値を測定した。一回目の注射の８日および１５日後にマウスから採血してヘマトクリット値を測定した。眼窩に挿入したヘパリン化毛細管を使用して血液を採取した。ヘマトクリット値は、微量ヘマトクリット遠心機中で微小毛細管を１２，０００ｒｐｍで５分間回転させる標準手順を使用して測定した。
【００８８】
結果
われわれはここに、異なる２つのマンノシダーゼ（すなわち、α−１，２−マンノシダーゼおよびマンノシダーゼＩＩ）による順次的マンノース除去、Ｎ−アセチルグルコサミンの付加（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびＩＩによる）、ガラクトースの付加（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼによる）および最後にシアリルトランスフェラーゼによるシアル酸の付加を含むヒトのグリコシル化反応の主要プロセス（図４）が酵母体内で機能的に複製できることを証明した。ヒトのグリコシル化の最終段階であるシアリル化を酵母体内で行うことは特に困難である。その理由は、野生型酵母には４つの前提要件：（ｉ）β−１，４−ガラクトースで終結するＮ−グリコシル化前駆体を産生する能力、（ｉｉ）糖ヌクレオチド前駆体ＣＭＰ−シアル酸（より特定的にはＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸，ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）を産生する生合成能力、（ｉｉｉ）ＣＭＰ−シアル酸をゴルジ体に折返し輸送する輸送体、および、（ｉｖ）新生糖タンパク質のターミナルガラクトースをシアル酸に転移させるシアリルトランスフェラーゼ、の全部が欠如しているからである（図５）。糖操作した酵母菌株中でシアリル化糖タンパク質が産生するためにはこれらの要素全部が高い効率で働かなければならない。さらに、これらの機能が協調的に生じるためにはいくつかの要素のオルガネラ特異的ターゲティングが必要である。
【００８９】
以前の研究でわれわれは、末端ガラクトシル化した二触角状複合型グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（すなわち、グリカン構造５．０，ＧＳ５．０）を産生するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの糖操作菌株を報告した（Ｌｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，２１０（２００６））。この菌株ＲＤＰ７５０［Δｏｃｈ１，Δｐｎｏｌ，Δｍｎｎ４Ｂ，Δｂｍｔ２，Δｈｉｓ１，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  α−１，２−ＭｎｓＩ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ，Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β−１，２−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＭｎｓＩＩ、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のＧａｌエピメラーゼ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ］を、ｒＥＰＯをコードする発現プラスミドで形質転換して菌株ＹＳＨ５５７を作製した（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３（２００６））。この菌株から分泌されたｒＥＰＯは主としてＧＳ５．０  Ｎ−グリカンから構成されていた（図６Ｂ）。比較のために、同じ構築物を使用して野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０を形質転換すると、菌株ＹＳＨ５５１が得られたが、この菌株は、この酵母に典型的な高マンノースのＮ−グリカンを多く含むｒＥＰＯを分泌した。（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１２４４（２００３））（図６Ａ）。双方の菌株は、分泌されたタンパク質がＮ−グリコシル化に関して有意に異なっている場合であってもｒＥＰＯをほぼ同じレベル（約２０ｍｇ／１）で発現する（図６Ａおよび６Ｂ）。
【００９０】
グリコシル化機構をもっとヒト化するためにわれわれは、ヒトグリコシル化の最終段階、すなわち末端シアル酸の付加を行うようにＧ５．０産生菌株を操作する作業に着手した。このためにわれわれはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株ＲＤＰ７６２を、ＣＭＰ−シアル酸生合成、ＣＭＰ−シアル酸輸送および新生糖タンパク質へのシアル酸転移に関与する酵素をコードする一連のＤＮＡ構築物で形質転換した。全部で５つの酵素を選択した：Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、酵母ＩＩ型膜貫通局在ペプチドに結合したシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）。
【００９１】
選択的ＣＭＰ−シアル酸経路の１２０以上の順列からＣＳＴおよびＳＴをスクリーニングした。このスクリーンからわれわれは、有意なシアリルトランスフェラーゼ活性を示し、主として複合グリカン構造を産生する少数の組合せを同定した。しかしながらこのやり方を採用したときには６０％を上回るＧＳ６．０（Ｓｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を含有するグリカン組成物を得ることはできなかった。これはシアル酸転移機構の限界を示している（データ示さず）。
【００９２】
この限界を克服するためにわれわれは、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＣＳＳ、ＣＳＴをコドン最適化し、加えてＳＴ／リーダー融合物をスクリーニングした。このようにしてわれわれは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼ１（Ｍｎｔ１）ターゲティングシグナルに融合したマウスα−２，６−ＳＴの触媒ドメインが特に有効であることを確認した。これらの成果を統合してわれわれは、５つの遺伝子全部を単一発現ベクターｐＳＨ９２６（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３（２００６））にクローニングした。このベクターでＲＤＰ７６２を形質転換すると宿主のヒスチジン要求性が相補され、しかも遺伝子クラスターがＰｉｃｈｉａゲノムのＴｒｐ２遺伝子座に標的組換えした。得られた菌株をＹＳＨ５９７と命名し、振盪フラスコで培養し、ｒＥＰＯの分泌を誘導した。ｒＥＰＯから単離したＮ−グリカンの分析は、主としてシアリル化グリカン構造ＧＳ６．０（９０．５％）およびＧＳ５．５（７．９％，ＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）から成るグリカン組成を示した（図６Ｃ）。引き続いてこのサンプルをシアリダーゼで処理すると、ＧＳ５．０への定量的転化を示した（図６Ｄ）。これはＧＳ６．０およびＧＳ５．５が末端シアル化グリカン構造であることを確認した。
【００９３】
種々のｒＥＰＯ糖形態のインビボ活性を評価するために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型（ＹＳＨ５５１）および末端シアル化菌株ＹＳＨ５９７（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３（２００６））に由来の材料を精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特性決定した（図７Ａ）。野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来のｒＥＰＯは、ＨＰＬＣ分析によって知見されたハイパーグリコシル化および高マンノース構造範囲に符合する広い異種性を示した（図６Ａ）。対照的に、ＹＳＨ５９７に由来のｒＥＰＯは、ＨＰＬＣ分析によって知見されたグリカン均一性に符合するより均一な泳動パターンを示した（図６Ｃ）。双方のサンプルをＰＮＧアーゼ−Ｆで処理してＮ−グリカンを除去すると、予想通り、脱グリコシル材料の質量および均一性は同様であった（図７Ａ）。大きく異なるこれらの２つの糖形態のインビボ機能を比較するために、それぞれのインビボ赤血球生成機能を測定する動物実験を行った。予想通り、野生型酵母で産生されたｒＥＰＯは測定可能な赤血球生成機能を有していなかったが、ＹＳＨ５９７で産生されたｒＥＰＯは生物活性形態のｒＥＰＯに符合する用量依存性応答を示した（図７Ｂ）。
【００９４】
要約すると、ＫＩＮＫＯベクターは、均一な末端シアリル化二触角状複合糖タンパク質を産生できるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母細胞系の構築を可能にした。
【００９５】
【化１】
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【００９６】
本文中では代表的実施態様に基づいて本発明を説明したが、本発明がこれらの実施態様に限定されないことは理解されよう。本文中の教示に接した平均的な当業者は本発明の範囲内の追加の修正および実施態様を容認するであろう。従って本発明は特許請求の範囲のみによって限定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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