(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａをひとつの脱色素剤として含有することを特徴とする、脱色素活性を有する化粧用組成物。
【請求項２】
下記式で表されるヘキサペプチドをひとつの脱色素剤として含有することを特徴とする、脱色素活性を有する化粧用組成物。
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
【請求項３】
ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａを抗チロシナーゼ剤として含有することを特徴とする、抗チロシナーゼ活性を有する脱色素用の局所用薬用又は皮膚用組成物。
【請求項４】
下記式で表されるヘキサペプチドを抗チロシナーゼ剤として含有することを特徴とする、抗チロシナーゼ活性を有する脱色素用の局所的薬用又は皮膚用組成物。
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
【請求項５】
前記ペプチドが０．０１〜５重量％の範囲の濃度で含有されている請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、少なくとも部分的に、活性成分の運び手又はリポソームに取り込まれている請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
活性成分の運び手が脂質の水和ラメラ相である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
皮膚又は頭皮に適用される局所用組成物として調剤される請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
老化による皮膚の染み除去用クリームとして調剤される請求項１、２、５〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
毛髪脱色用乳液として調剤される請求項１、２、５〜８のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、基本的に、末端にリジン残基及びアラニン残基を有するペプチドの脱色素用組成物の製造のための使用、及び、このペプチドを含有する脱色素用組成物に関する。
ある種のペプチド、特に絹由来のペプチドは、メラニン生成を抑制するための化粧用組成物に使用されることが開示されている（日本国特許ＪＰ−Ａ−５７−０４９１０）。
皮膚脱色素用組成物に適用することができるコウジ酸のペプチド誘導体も知られている（ＪＰ−Ａ−０４−１８７６１８）。
本発明者らによる研究の結果、全く予期せぬことに、リジン（Ｌｙｓ）残基を末端に有し、アラニン（Ａｌａ）残基を他の末端に有するペプチドが、脱色素活性を有することが見出された。
本発明の主要な目的は、上記知見にもとづき、優れた脱色素活性を有する新規系統の化合物を提供するところにあり、また、脱色素活性を有する化粧用又は薬用組成物、特に、皮膚用組成物を提供するところにもある。本発明はまた、これら化合物や組成物を使用する新規な脱色素方法にも関する。
本発明においては、上記目的は、リジン（Ｌｙｓ）残基を末端に有し、アラニン（Ａｌａ）残基を他の末端に有するペプチドが優れた脱色素活性を有することを見出したことによって、達成された。上記リジン残基は、Ｎ末端に位置し、上記アラニン残基は、Ｃ末端に位置することが好ましい。
第一の本発明は、リジン（Ｌｙｓ）残基を一方の末端に有し、アラニン（Ａｌａ）残基を他の末端に有するペプチド鎖から構成されるペプチドの利用に関するものであって、脱色素用組成物、特に、老化による皮膚の染み等のメラニン色素による皮膚の染みを薄くするか若しくは除去するために、又は、毛髪を脱色素するために使用される組成物への使用に関する。
上記ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基数は、２〜１０が好ましい。
本発明の好ましい態様においては、上記リジン残基は、Ｎ末端に位置し、上記アラニン残基は、Ｃ末端に位置する。
上記ペプチド鎖は、当該分野で通常用いられる表記法により、下記式で表すことができる：
Ｌｙｓ．．．．．．．Ａｌａ
式中、Ｌｙｓは、Ｎ末端に位置するリジン残基を表す。Ａｌａは、Ｃ末端に位置するアラニン残基を表す。点は、両末端の間に位置するアミノ酸残基を表す。
特に有利な態様においては、上記ペプチドは、下記構造式で表されるジペプチドＬｙｓ−Ａｌａである：
0003725898.tif 000002
更に有利なペプチドは、下記式で表されるヘキサペプチドである；
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
式中、Ｃｙｓは、システイン残基を表す。Ｔｈｒは、トレオニン残基を表す。
上記ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａ及び上記ヘキサペプチドは、いずれも上市されており、例えば、フランス、シグマ社から入手することができる。
有利には、本発明における上記ペプチドは、組成物全量に対して０．０１〜５重量％の濃度で使用される。
本発明の有利な態様においては、上記ペプチドは、少なくとも部分的に、水和された脂質ラメラ相のような活性物質の運び手（ベクター）又はリポソームの中に取り込まれていることが好ましい。この場合において、これら運び手（ベクター）中への取り込みは、特にラメラ相又はリポソーム中への取り込みは、これら運び手（ベクター）中にペプチドを取り込ませる場合に通常用いられる方法によって好適に行うことができる。
上記ペプチドを、例えば、リポソーム中に取り込ませる場合においては、米国特許明細書ＵＳ−Ａ−４５０８７０３に記載されている方法により、ダイズレシチン等のりん脂質、及び、所望によりコレステロールやシトステロール等のステロールを配合して脂質粉末を調製する。上記脂質粉末は、次に、上記ペプチドを含有する水溶液中に攪拌により分散される。上述の方法により、上記ペプチドを少なくとも部分的に取り込んだリポソームの分散液を得ることができる。
上記リポソーム分散液は、例えば、超音波によるか、又は、工業的規模での生産に一層適合的な方法であるＵＳ−Ａ−４６２１０２３に記載の加圧ホモジェナイズ法等によりホモジェナイズされることが好ましい。
本発明における上記ペプチドは、脱色素剤として使用されるに際して、適宜、その他の公知の各種活性成分と併用されてもよい。
第二の本発明においては、上記ペプチドを、化粧用又は薬用として許容しうる賦形剤中に含有させて、脱色素活性を有する化粧用又は薬用組成物、特に皮膚用組成物とする。
この場合において、上記ペプチドは、組成物全量に対して上述の濃度で使用することができる。
第二の本発明の有利な態様においては、上記ペプチドは、上で詳述した活性成分の運び手（ベクター）中に、少なくとも部分的に取り込まれていることが好ましい。
第二の本発明の有利な態様においては、上記組成物は、手や顔等の皮膚又は頭皮に、局所的に、好適に適用することができる。この場合において、上記組成物は、例えば、ジェル、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
第三の本発明においては、化粧用組成物中に含有させた上記ペプチドの有効量を、脱色素すべき皮膚の領域又は頭皮に適用することにより、皮膚又は毛髪の脱色素を行う美容方法とする。
本発明に使用される上記ペプチドの脱色素活性は、以下で説明する試験及び図により明らかにすることができる。
図面において：
・図１は、ペプチドＬｙｓ−Ａｌａによるチロシナーゼのパーセント阻害を示す。横軸にとったペプチドのモル／Ｌ濃度の関数として表す。各濃度において、チロシナーゼがＬｙｓ−Ａｌａペプチドと接触した後、０分、５分後及び１５分後の各測定結果を示す；また
・図２は、ヘキサペプチドＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａによるチロシナーゼのパーセント阻害のヒストグラムを、横軸にとったペプチドのモル／Ｌ濃度の関数として表す。各濃度において、チロシナーゼがヘキサペプチドと接触した後、０分、５分後及び１５分後の各測定結果を示す。
実施例１
ペプチドＬｙｓ−Ａｌａの脱色素活性
脱色素活性は、皮膚の色に寄与する濃褐色又は淡褐色の色素であるメラニンを合成する酸素チロシナーゼの活性阻害を測定することにより、評価した。チロシナーゼと酸素の存在下、Ｌ−チロシンは、Ｌ−ドーパに酸化され、更に、ドーパキノンに酸化される。ドーパキノンは、メラニンの前駆体である。チロシナーゼは、銅を含有する４量体酵素であり、Ｌ−チロシンやＬ−ドーパ等の芳香族化合物に対する２つの活性部位を持っている。チロシナーゼは、更に、２つの調節部位を有しており、そのうちの１つは酸素が関与し、他の１つは銅が関与する。
従って、チロシナーゼが阻害されると、メラニン合成は減少し、又は停止する。皮膚中のチロシナーゼが阻害されると、皮膚表層中に存在する色素含有細胞が自然に剥離するにつれて、次第に、メラニンを含有せず、色素のない細胞に取って代わられる。その結果、皮膚が脱色素される。
脱色素活性は、以下に述べる方法によって評価された。ペプチドＬｙｓ−Ａｌａとしては、フランス、シグマ社製のものを使用し、これを予め０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解しておいた。先ず、濃度５ｍＭのＬｙｓ−Ａｌａ溶液のストック溶液を調製し、これを希釈して５ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭのそれぞれの濃度の溶液を予め調製した。
同じ０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．９）を用いて、濃度１ｍｇ／ｍｌ（２０００〜４０００ユニット／ｍｇ）の菌類由来チロシナーゼの溶液を調製し、使用時まで−２０℃で貯蔵しておいた。
Ｌ−チロシンとＬ−ドーパとをそれぞれ１ｍＭで含有する基質溶液を、同じりん酸緩衝液を用いて調製し、遮光して保存しておいた。
脱色素活性測定は、以下のとおりに行った：
脱色素活性の測定方法は、「ワージントン  アッセイ  プロシーデュア」、ワージントン  システム  インク．、フリーホールド、ニュージャージイ  ０７７２８、ＵＳＡ、所載のアッセイ方法、及び、ポムレンツ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４１、１６１（１９６６）所載の方法に基づいて行った。
これらの方法は、実施に際しては、以下のように変更して行った：
・基質溶液は、Ｌ−チロシンとＬ−ドーパの等濃度混合液とし、上記文献中のように、チロシンのみを使用することはしなかった；
・ドーパミン生成のキネティックスは、分光光度計を使用して波長４８０ｎｍにおいて追跡し、適当な波長でチロシンの消滅を追跡することはしなかった。
いくつかのシリーズの試験を行った。各シリーズの試験においては、時刻Ｔ0で、ペプチド溶液とチロシナーゼ溶液とを混合して実験を開始した。
第一のシリーズの試験においては、Ｌ−チロシンとＬ−ドーパをともに含有する基質溶液を時刻Ｔ0で混合した。各ペプチド濃度について、時刻Ｔ0の測定結果を表Ｉに示した。
第二のシリーズの試験においては、Ｔ＝５、すなわちＴ0から５分経過後にはじめて基質溶液を添加してチロシナーゼ溶液と混合した。各ペプチド濃度について、得られた結果を表ＩにＴ５分として示した。
第三のシリーズの試験においては、Ｔ0から１５分経過後にはじめて基質溶液を添加してチロシナーゼ溶液と混合した。第三のシリーズの測定結果を表ＩにＴ１５分として示した。
各シリーズのそれぞれの試験において、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパのチロシナーゼによる酸化生成物であるドーパキノンの生成キネティクスは、基質溶液をペプチド溶液及びチロシナーゼ溶液と混合した時刻からおよそ２分間にわたって追跡された。キネティクスは、分光光度計を使用して４８０ｎｍの吸収波長について、３種の溶液の混合溶液の光学密度を測定することによって観測された。
同時に、対照実験をペプチドを添加しない系について実施し、チロシナーゼの活性阻害がなく酵素活性１００％に相当する光学密度を測定した。
分光光度計は、対照及び本発明の阻害物質であるペプチドを使用した各シリーズのそれぞれの試験について、ドーパキノンの生成キネティクスを表すグラフの上り傾斜の直線部分の傾きを計算し、その後、下記式によってパーセント阻害を求めるようにプログラムされたコンピューターやマイクロコンピューター等の計算手段に結合された：
0003725898.tif 000003
全ての試験は、各試験シリーズの各試験の各濃度についてそれぞれ５回ずつ行い、その平均値を求めた。
こうして求めた平均パーセント阻害を表Ｉに示した。
図１は、試験ペプチドＬｙｓ−Ａｌａによるチロシナーゼのパーセント阻害を、横軸にとったモル／Ｌ濃度の関数として示したものである。
0003725898.tif 000004
表Ｉ及び図１から、本発明のペプチドＬｙｓ−Ａｌａは、５×１０-6Ｍの低濃度においてもチロシナーゼに対する優れた阻害活性を発揮することが明らかであり、低濃度におけるその阻害効果は、チロシナーゼが基質と接触する前に、ペプチドインヒビターとチロシナーゼとがある程度の時間接触した場合に有意に向上することが判る。この効果は、阻害ペプチドの濃度が増加するにつれて大幅に増幅される。
ペプチドＬｙｓ−Ａｌａは、高いチロシナーゼ阻害活性を有しており、それゆえ、メラニン生成を低減又は抑制することにより高い脱色素活性を発揮する。
実施例２
ヘキサペプチドＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａの脱色素活性の測定
各濃度において、ペプチドＬｙｓ−Ａｌａの代わりにヘキサペプチドを使用したこと以外は、実施例１と同様にして実施した。
結果を表ＩＩ、及び、図１と同様のヒトスグラム形式の図２に示した。
0003725898.tif 000005
表ＩＩ及び図２から、本発明のヘキサペプチドＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａは、チロシナーゼに対する優れた阻害活性を、５×１０-6Ｍにおいても発揮することが明らかである。この阻害活性は、チロシナーゼが、基質との接触以前に比較的長い時間本発明のペプチドと接触するか、又は、阻害ペプチドの濃度が高くなると、飛躍的に増大する。これらの結果は、実施例１の結果と同様の傾向を示している。更に、Ｔ１５分のシリーズの試験では、チロシナーゼの阻害により、殆ど１００％に近い（９８％）優れた脱色素効果が５×１０-4Ｍ以上の濃度において発揮されている。高濃度においては、例えば、５×１０-3Ｍの場合、Ｔ0シリーズの試験で殆ど完全な阻害（９８％）が達成されていることは、驚くべきことである。
実施例１及び２のペプチドについての試験により、末端Ｌｙｓ残基及び末端Ａｌａ残基を有するペプチドは、高い脱色素活性を有することが示され、新しい種類の脱色素物質であることが示された。
本発明は、従って、脱色素効果をもつ化粧用及び薬用組成物としての有用な用途を有しており、特に、皮膚用組成物として好適に使用することができる。脱色素効果をもつ化粧用及び薬用組成物についての実施態様を、以下に例示する。
実施例３
老化による皮膚の染み除去用クリーム
・ヘキサペプチドＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ  １．００ｇ
・香料含有乳化賦形剤                            ｑ．ｓ．ｐ．１００．００ｇ
ヘキサペプチドを香料含有乳化賦形剤に混ぜ、クリームを調製した。得られたクリームは、通常顔や手に生じ、また、首まわりのような露出部位にも生じる老化による皮膚の染みに、少なくとも１日１回適用することができた。
実施例４
毛髪脱色用乳液
・ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａ                                      ０．１ｇ
・カーボポール  ９４０（登録商標）                              ０．２ｇ
・香料含有アルコール（６０°）賦形剤          ｑ．ｓ．ｐ．１００．００ｇ
ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａは、最初にアルコール賦形剤と混合し、その後、カーボポールを添加してヘヤーローションを調製した。得られたヘヤーローションは、数日間頭皮に適用して毛髪脱色効果を得ることができた。
実施例５
脱色素用又は美白用化粧用組成物
・以下の組成よりなる本発明のジペプチド及びヘキサペプチドを含有するリポソーム：
・りん脂質                                                      １    ｇ
・ジペプチドＬｙｓ−Ａｌａ                                      ０．１ｇ
・ヘキサペプチドＬｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ  ３．０ｇ
・水                                              ｑ．ｓ．ｐ．５０．０ｇ
・ゲル状賦形剤カーボポール  ９４０（登録商標）      ｑ．ｓ．ｐ．１００ｇ
組成物の調製方法は以下のとおりである：
まず、ＵＳ−Ａ−４５０８７０３に記載の方法により、りん脂質から脂質粉末を調製し、得られた脂質粉末を０．２重量％のジペプチドと６重量％のヘキサペプチドを含む水溶液中に攪拌して分散し、ジペプチドとヘキサペプチドを含有するリポソーム分散液を得た。この分散液は、超音波又はＵＳ−Ａ−４６２１０２３所載の方法により好適にホモジェナイズされた。
ホモジェナイズされたリポソーム水分散液５０ｇをとり、５０ｇのゲル状賦形剤を添加して１００ｇのゲル状組成物を目的物として得た。
得られた組成物は、顔等の老化による皮膚の染みに適用して望ましい脱色素効果又は美白効果を得ることができた。
【図１】
0003725898.tif 000006
【図２】
0003725898.tif 000007