(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド３７５または３９０から７０４まで；
（ｂ）配列番号：１０のヌクレオチド７６０または７７５から１０８６まで；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸１または６から１０９までをコードしているヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：１１のアミノ酸１または６から１０９までをコードしているヌクレオチド；および
（ｅ）緊縮条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチドにハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を示す蛋白をコードしている配列
からなる群より選択されるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項３】
ＢＭＰ−１１活性を示すＢＭＰ−１１蛋白をコードしている配列を有する単離ＤＮＡ分子であって、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド３７５から７０４まで；
（ｂ）配列番号：１０のヌクレオチド７６０から１０８６まで；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対する天然に存在する対立遺伝子配列および等価な縮重コドン配列
からなる群より選択されるＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
作動するように発現調節配列に連結された請求項１または３記載のＤＮＡ分子からなるベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
ＢＭＰ−１１蛋白をコードしている単離ＤＮＡ分子であって、配列番号：１のヌクレオチド３７５から７０４までまたは配列番号：１０のヌクレオチド７６０から１０８６までからなるＤＮＡ分子。
【請求項８】
作動するように発現調節配列に連結された請求項７記載のＤＮＡ分子からなるベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
以下の工程（ａ）、（ｂ）：
（ａ）請求項１、３、５、７または８に記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで
（ｂ）培地からＢＭＰ−１１蛋白を回収し、精製する
からなる精製ＢＭＰ−１１蛋白の製造方法。
【請求項１１】
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド３７５から７０４まで；
（ｂ）配列番号：１０のヌクレオチド７６０から１０８６まで；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対する天然に存在する対立遺伝子配列および等価な縮重コドン配列
からなる群より選択されるＤＮＡ暗号配列からなるＤＮＡ分子で該宿主細胞が形質転換される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該宿主細胞が哺乳動物細胞であり、さらにＤＮＡ分子が、適当なプロペプチドの５'側の配列をコードしているＤＮＡであってＤＮＡ暗号配列の読み取り枠に連結しているＤＮＡ配列からなるものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：２に示すアミノ酸１から１０９までのアミノ酸配列からなる精製ＢＭＰ−１１ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：１１に示すアミノ酸１から１０９までのアミノ酸配列からなる精製ＢＭＰ−１１ポリペプチド。
【請求項１５】
以下の工程（ａ）、（ｂ）：
（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド３７５から７０４のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養し；次いで
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸１から１０９までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製する
により製造される精製ＢＭＰ−１１蛋白。
【請求項１６】
以下の工程（ａ）、（ｂ）：
（ａ）配列番号：１０に示すヌクレオチド７６０から１０８６までのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養し；次いで、
（ｂ）配列番号：１１に示すアミノ酸１から１０９までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製する
により製造される精製ＢＭＰ−１１蛋白。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ＢＭＰ−１１と命名された新規なファミリーの精製蛋白、それらをコードしているＤＮＡ分子、およびそれらを得る方法に関する。本発明者らは、以前、ＢＭＰ−１１蛋白をアクティビン・ダブリュシー（Activin WC）と命名していた。ＢＭＰ−１１蛋白は、骨および／または軟骨形成の誘導および傷の治癒ならびに組織の修復、あるいは他の骨形態形成蛋白の活性の増大に有用でありうる。さらに、ＢＭＰ−１１蛋白は、避妊のための卵胞刺激ホルモンの産生調節、神経細胞の生存促進、増結の刺激、および卵巣癌の発達抑制に有用でありうる。
米国特許第４,７９８,８８５号には、プレプロインスリンαおよびβ鎖をコードしているＤＮＡが開示されている。米国特許第５,０７１,８３４号には、医薬上許容される担体中に処方される、２本のベータB鎖を有するアクティビンの医薬組成物が開示されている。
米国特許第５,１０２,８０７号には、黄体形成ホルモンの産生を抑制することなくＦＳＨ産生を抑制する精製インヒビン蛋白が開示されている。
発明の概要
ＢＭＰ−１１蛋白は、蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリー（superfamily）の一員である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）として知られる蛋白のファミリー（family）ならびにインヒビン−βと呼ばれる蛋白の群を包含する。さらに本明細書で議論するように、もう１つのＢＭＰ−１１とともに二量体化（ホモ二量体）した場合、ＢＭＰ−１１蛋白は、さらに本明細書に記載するように、ＢＭＰ−１１活性を示すことが期待され、該活性は本明細書実施例記載の分析により測定できる。インヒビン−α蛋白または他のインヒビン−β蛋白とともにヘテロ二量体として二量体化した場合、インヒビン−β／ＢＭＰ−１１ヘテロ二量体は、さらに本明細書に記載するように、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の産生に対する影響を示すことが期待される。さらに、ホモ二量体形態または骨形態形成蛋白ファミリーの別のメンバーとのヘテロ二量体形態において、ＢＭＰ−１１はＢＭＰ活性、すなわち、骨、軟骨および／または他の結合組織の形成誘導能を示すと期待される。よって、ＢＭＰ−１１の周囲の環境によっては、アクティビンもしくはインヒビン活性、あるいは骨、軟骨および／または他の結合組織誘導活性のいずれかの活性を示す二量体が形成されうる。したがって、ＢＭＰ−１１活性は、本明細書実施例８記載の分析におけるＦＳＨ産生調節能、または本明細書実施例５〜７記載の分析における骨、軟骨および／または他の結合組織の形成誘導能として定義される。
インヒビンおよびアクティビンと呼ばれる蛋白は、性腺で産生され、自然の状態では卵胞液中に存在する。これらの蛋白は、下垂体前葉のレベルにおいて、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出の抑制（インヒビン）あるいは刺激（アクティビン）を行う［レビューのため、例えば、イング,エス・ワイ（Ying,S.-Y.）ら,エンドクリ・レビュ（Endocr.Rev.）,第９巻：２６７〜２９３頁（１９８８年）またはリング,エヌ（Ling,N.）ら,ビタミンズ・アンド・ホルモンズ（Vitamins and Hormones）,第４４巻：１〜４６頁（アカデミック・プレス（Academic Press）１９８８年）参照］。簡単に説明すると、１本のインヒビンα鎖と１本のインヒビンβ（βAまたはβB）鎖とからなる二量体蛋白はインヒビンと呼ばれ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を抑制する能力により特徴づけられており、一方、２本のインヒビンβ鎖（βAまたはβB）からなる他の二量体蛋白はアクティビンと呼ばれ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激する能力により特徴づけられている［例えば、リング（Ling）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７９〜７８２頁（１９８６年）またはベイル（Vale）ら,ネイチャー(Nature),第３２１巻：７７６〜７７９頁（１９８６年）もしくはマンソン（Manson）ら,ネイチャー（Nature）,第３１８巻：６５９〜６６３頁（１９８５年）、あるいはフォレイジ（Forage）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第８３巻：３０９１〜３０９５頁（１９８６年）参照］。
ＦＳＨは、哺乳動物卵巣における卵子の発達を刺激すること（ロス（Ross）ら,テキストブック・オブ・エンドクリノロジー（Textbook of Endocrinology）（ウィリアムズ（Williams）編）中、３５５頁（１９８１年））、ならびにＦＳＨでの卵巣に対する過剰な刺激は複数の排卵を誘発するであろうということが認識されている。さらに、ＦＳＨは睾丸機能においても重要である。よって、インヒビンαファミリーのメンバーとのヘテロ二量体となっている場合、ＢＭＰ−１１は、メスの動物における受精能を低下させ、オスの動物における精子産生を減少させる能力により、避妊薬として有用でありうる。十分量の他のインヒビンの投与は、これらの動物の不妊を誘導しうる。ホモ二量体またはインヒビン−β群の他の蛋白サブユニットとのヘテロ二量体としてのＢＭＰ−１１は、下垂体前葉の細胞から放出されるＦＳＨを刺激することにおけるアクティビン分子の能力に基づく受精能誘導治療薬として有用でありうる。例えば、米国特許第４,７９８,８８５号参照。さらに、ＢＭＰ−１１は、性的に未熟な哺乳動物における受精を推進するのに有用である可能性があり、その結果、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家畜の生殖可能期間を延長することとなる。さらに、ＢＭＰ−１１は神経細胞の生存促進［例えば、シューバート（Schubert）ら,ネイチャー(Nature),第３４４巻：８６８〜８７０頁（１９９０年）参照］、赤芽細胞の分化を誘導することによる造血機能の調節［例えば、ブロクスメイヤー（Broxmeyer）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,第８５巻：９０５２〜９０５６頁］（１９８８年）またはエトー（Eto）ら,バイオケミ・バイオフィジ・リサ・コミュ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）,第１４２巻：１０９５〜１１０３頁（１９８７年）参照］、性腺腫瘍の発達抑制［例えば、マトズク（Matzuk）ら,ネイチャー（Nature）,第３６０巻：３１３〜３１９頁（１９９２年）参照］、あるいは骨形態形成蛋白の活性増大［例えば、オガワ（Ogawa）ら,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,第２６７巻：１４２３３〜１４２３７頁（１９９２年）参照］において有用でありうると考えられる。
さらに、ＢＭＰ−１１蛋白を、記載されたように［例えば、ベイル（Vale）ら,エンドクリノロジー（Endocrinology）,第９１巻：５６２〜５７２頁（１９７２年）；リング（Ling）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７９〜７８２頁（１９８６年）またはベイル（Vale）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７６〜７７９頁（１９８６年）参照］、ラット・下垂体前葉細胞を用いるインビトロにおける確立されたバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を調節する能力により特徴づけることができる。本発明ＢＭＰ−１１蛋白は、ホモ二量体または他のインヒビンβ鎖とともにヘテロ二量体として構成された場合、記載されたように［リング（Ling）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７９〜７８２頁（１９８６年）またはベイル（Vale）ら,ネイチャー(Nature),第３２１巻：７７６〜７７９頁（１９８６年）］、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモンの放出に対する刺激効果を示すであろうと考えられる。さらに、本発明ＢＭＰ−１１蛋白は、インヒビンα鎖とともにヘテロ二量体として構成された場合、記載されたように［例えば、ベイル（Vale）ら,エンドクリノロジー（Endocrinology）,第９１巻：５６２〜５７２頁（１９７２年）参照］、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を抑制するであろうと考えられる。それゆえ、個々の構成に応じて、本発明ＢＭＰ−１１蛋白は、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に対して対照的で相反する効果を有しうると期待される。
アクティビンＡ（インヒビンβAのホモ二量体の構成）は、造血機能刺激活性を有することが示されている［例えば、エトー（Eto）ら,バイオケミ・バイオフィジ・リサ・コミュ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）,第１４２巻：１０９５〜１１０３頁（１９８７年）ムラタ（Murata）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,第８５巻：２４３４〜２４３８頁（１９８８年）およびユー（Yu）ら,ネイチャー（Nature）,第３３０巻：７６５〜７６７頁（１９８７年）参照］。本発明ＢＭＰ−１１蛋白は、同様の造血機能刺激活性を有すると考えられる。さらに、ロジオ（Lozzio）ら,ブラッド（Blood）,第４５巻：３２１〜３３４頁（１９７５年）および米国特許第５,０７１,８３４号により記載されたように、ヒト・Ｋ−５６２細胞系を用いて行われる生物学的分析におけるＢＭＰ−１１蛋白のエリスロポエチン活性を示す能力により、ＢＭＰ−１１のこの活性を特徴づけることができる。
ＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−９と命名されたいくつかの蛋白の構造は、すでに調べられている。これらの蛋白が骨に存在することに伴うユニークな誘導活性は、これらの蛋白が骨の修復過程における重要な調節剤である可能性があり、骨組織の正常な維持において必要とさる可能性があることを示唆している。本発明ＢＭＰ−１１蛋白は上記ＢＭＰ蛋白に関連しており、骨、軟骨および／または腱もしくは靭帯のごとき他の結合組織を誘導する能力のようなＢＭＰ活性ならびにＢＭＰの傷治癒活性を共有していると期待される。さらに、本発明蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と共同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、下記共有特許ならびに出願に開示された治療量の他のＢＭＰ蛋白のうちの少なくとも１種と混合された少なくとも１種の治療量の本発明ＢＭＰ−１１蛋白からなる。かかる混合は、別々のＢＭＰ蛋白分子または異なるＢＭＰ部分からなるヘテロ分子よりなる。さらに、ＢＭＰ−１１蛋白を、骨および／または軟骨の欠損、傷、または問題となる組織の治療に有益な他の薬剤と混合してもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにｋ−線維芽細胞成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）を包含する。これらの薬剤の部分も、本発明組成物に使用することができる。
ウシ・ＢＭＰ−１１ＤＮＡ配列（配列番号：１）ならびにアミノ酸配列（配列番号：２）およびヒト・ＢＭＰ−１１のＤＮＡ配列（配列番号：１０）ならびにアミノ酸配列（配列番号：１１）を本明細書の配列表に示す。アクティビン蛋白は卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の産生を調節する能力があり、よってＢＭＰ−１１は、避妊または受精誘発治療薬として有用でありうる。ホモ二量体またはインヒビン−β群の蛋白とのヘテロ二量体の形態において、精製ＢＭＰ−１１蛋白はアクティビン活性を示すと期待され、ＦＳＨ刺激に使用することができる。さらに、精製ＢＭＰ−１１蛋白を、骨、軟骨および／または結合組織の誘導に使用することができる。
配列番号：１に示すヌクレオチド３７５ないしヌクレオチド７０４からなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで、配列番号：２に示すアミノ酸１ないしアミノ酸１０９からなるアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白であって同時に産生される蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、ウシ・ＢＭＰ−１１を製造することができる。
ヒト・ＢＭＰ−１１はウシ・ＢＭＰ−１１と相同であると期待される。それゆえ、本発明は、ヒト・ＢＭＰ−１１をコードしているＤＮＡ配列、これらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびこれらのＤＮＡ配列によりコードされるヒト・蛋白を得る方法を包含する。この方法は、標準的方法を用いてヒト・遺伝子またはそのフラグメントをスクリーニングするためのプローブを設計するために、ウシ・ＢＭＰ−１１ヌクレオチド配列またはその一部を用いることを包含する。ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白の一部をコードしているＤＮＡ配列（配列番号：３）および対応するアミノ酸配列（配列番号：４）を配列表に示す。さらに、これらの配列を用いて、標準的方法により完全なヒト・ＢＭＰ−１１遺伝子を得るためのプローブを設計してもよい。ヒト・ＢＭＰ−１１を、該ＤＮＡで形質転換された細胞を培養し、次いで、培地からＢＭＰ−１１を回収し精製することにより製造することができる。精製された発現蛋白は、同時産生される他の蛋白性物質ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。
回収され精製された蛋白は、ＦＳＨ産生を調節する能力を示すと期待される。さらに、ラット・下垂体前葉細胞を用いる確立されたインビトロでのバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の産生を調節する能力により、本発明蛋白を特徴づけることができる。さらに、例えば、下記ラット・骨形成分析において、骨、軟骨および／または他の結合組織の形成を誘導する能力により、ＢＭＰ−１１蛋白を特徴づけることができる。
本発明の別の態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の治療上有効量のＢＭＰ−１１蛋白を含有する医薬組成物を提供する。本発明ＢＭＰ−１１組成物は、卵胞刺激ホルモンの調節に有用である可能性があり、避妊に有用である可能性がある。さらに本発明組成物が、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ならびにＢＭＰ−７；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９；さらに１９９３年５月１２日出願の同時係属特許出願第０８／０６１,６９５号に開示のＢＭＰ−１０のごとき少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤を含有していてもよい。またＢＭＰ−１１組成物を、避妊をはじめとする卵胞刺激ホルモンの産生調節を含む多くの使用に用いることもできる。本発明によれば、これらの方法は、かかる治療を必要とする患者に有効量のＢＭＰ−１１を投与することを包含する。
本発明組成物は、ＢＭＰ−１１のほかに、インヒビン−β群の蛋白またはインヒビン−α群の蛋白の他のメンバー、ならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにインスリン様成長因子（ＩＧＦ）を包含する他の治療上有用な薬剤からなっていてもよい。
本発明ＢＭＰ−１１組成物は、多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周病ならびに種々の形態の傷の治療にも有用である。本発明によれば、これらの方法は、かかる骨および／または軟骨形成、傷の治癒あるいは組織の修復を必要とする患者に有効量のＢＭＰ−１１蛋白を投与することを包含する。さらに、これらの方法は、上記共有特許および出願に開示された少なくとも１種の新規ＢＭＰ蛋白と混合された本発明蛋白を投与することを包含する。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦを包含する他の成長因子とともにＢＭＰ−１１蛋白を投与することを包含する。
本発明のさらなる態様は、ＢＭＰ−１１蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１に示された５'から３'方向のヌクレオチド配列であるか、緊縮条件下で配列番号：１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。結局、配列番号：１の配列の対立遺伝子変異種または他の変種もまた、ヌクレオチド変化がペプチドの配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、本発明に包含される。
本発明のさらなる態様は、ＢＭＰ−１１蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１または配列番号：１０に示された５'から３'方向のヌクレオチド配列、および遺伝暗号の縮重を除いて配列番号：１または配列番号：１０のＤＮＡ配列と同じであり配列番号：２または配列番号：１１の蛋白をコードしているＤＮＡ配列である。さらに、緊縮条件下で配列番号：１または配列番号：１０のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列も本発明に包含される。結局、配列番号：１または配列番号：１０の対立遺伝子変異体または他の変種も、かかるヌクレオチドの変化がペプチド配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、ペプチド配列がなおＢＭＰ−１１活性を有する場合には、本発明に包含される。
本発明のさらなる態様は、作動するように発現調節配列と連結された上記ＤＮＡ配列からなるベクターである。
作動するように発現調節配列と連結されたＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、そこからＢＭＰ−１１蛋白を回収し精製する、本発明の新規ＢＭＰ−１１蛋白製造方法にこれらのベクターを使用することができる。この方法には、該ポリペプチド発現用宿主細胞としての原核および真核双方の多くの知られた細胞を使用することができる。
さらに本発明は、本発明ＤＮＡ配列およびベクターの遺伝子治療への適用を包含する。かかる使用において、インビトロでベクターを患者の細胞中にトランスフェクションさせ、次いで、細胞を患者に再導入することができる。別法として、標的トランスフェクションにより、インビボでベクターを患者に導入してもよい。
本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明ならびにその好ましい具体例を考慮すれば明らかとなろう。
配列の説明
配列番号：１は、成熟ウシ・ＢＭＰ−１１ポリペプチドをコードしているウシ・ＢＭＰ−１１の部分ヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、配列番号：１によりコードされる部分プロペプチドおよび完全な成熟ウシ・ＢＭＰ−１１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ヒト・ＢＭＰ−１１の部分ヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、配列番号：３によりコードされるヒト・ＢＭＰ−１１ポリペプチドの部分アミノ酸配列である。
配列番号：５および６は、ヒト・ＢＭＰ−１１または他のＢＭＰ−１１蛋白を単離するのに用いるウシ・ＢＭＰ−１１プライマーである。
配列番号：７は、ＳＶ４０・複製開始点の近傍にＸｈｏＩ認識部位を付加するためにｐＭＴ２  ＣＸＭ中に挿入されるＤＮＡ配列である。
配列番号：８は、ＤＨＦＲ遺伝子の上流にＸｈｏＩ認識部位を付加するためにｐＭＴ２１中に挿入されるＤＮＡ配列である。
配列番号：９は、ＥＭＣウイルス・リーダー配列の一部からなるＤＮＡ配列である。
配列番号：１０は、部分プロペプチドおよび完全な成熟ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列である。
配列番号：１１は、配列番号：１０によりコードされる部分プロペプチドおよび完全な成熟ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白のアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
ＢＭＰ−１１
ウシ・ＢＭＰ−１１ヌクレオチド配列（配列番号：１）ならびにコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）、およびヒト・ＢＭＰ−１１ヌクレオチド配列（配列番号：１０）ならびにコードされるアミノ酸配列（配列番号：１１）を本明細書の配列表に示す。配列番号：１のヌクレオチド３７５ないし７０４のＤＮＡ暗号配列または配列番号：１０のヌクレオチド７６０ないし１０８６のＤＮＡ暗号配列からなるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し、次いで、配列番号：２のアミノ酸１ないし１０９または配列番号：１１のアミノ酸１から１０９により示される配列もしくはこれと実質的に相同な配列を有する蛋白を培地から回収し精製することにより、本発明の精製ウシ・ＢＭＰ−１１蛋白を製造する。哺乳動物細胞におけるＢＭＰ−１１蛋白の製造について、ＤＮＡ配列は、さらにＢＭＰ−１１に対する上記ＤＮＡ暗号配列の読み取り枠に連結された適当なプロペプチドからなる。プロペプチドは、生のＢＭＰ−１１のプロペプチドであってもよく、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーの別のメンバー由来のプロペプチドであってもよい。
本発明のヒト・ＢＭＰ−１１配列を、ウシ・ＢＭＰ−１１ＤＮＡ配列の全体もしくはフラグメント、または配列番号：３の部分ヒト・ＢＭＰ−１１配列をプローブとして用いて得る。よって、ヒト・ＢＭＰ−１１ＤＮＡ配列は配列番号：３のヌクレオチド２８ないし１８５のＤＮＡ配列からなる。ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白は、配列番号：４のアミノ酸１ないし５２のアミノ酸配列からなる。
ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現されたＢＭＰ−１１は、種々のＮ末端を有するＢＭＰ−１１蛋白の活性種の不均一な細胞集団として存在すると考えられる。活性種は、少なくとも、配列番号：１または配列番号：１０のアミノ酸６のシステイン残基あるいはさらにアミノ末端方向から開始するアミノ酸配列からなるであろうと考えられる。よって、活性のあるＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド３７５または３９０から７０１まで、あるいは配列番号：１０のヌクレオチド７６０または７７５から１０８６までからなり、配列番号：１または配列番号：１０の５'方向のさらなるヌクレオチド配列からなっていてもよいであろう。
イー・コリ（E.coli）において発現させることにより、ヒト・ＢＭＰ−１１のＮ末端を実験的に以下のように決定した：［Ｍ］ＮＬＧＬＤＸＤＥＨＳＳＥ、ここにＸは明確なシグナルが得られないアミノ酸残基であって、その位置におけるシステインの位置と矛盾しない。よって、ＢＭＰ−１１のこの種は配列番号：１または配列番号：１０のアミノ酸１におけるＮ末端を有し、この種をコードしているＤＮＡ配列は配列番号：１（ウシ）のヌクレオチド３７５ないし７０１あるいは配列番号：１０（ヒト）のヌクレオチド７６０ないし１０８６からなるであろうと考えられる。ヒト・ＢＭＰ−１１単量体の見かけの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１２ｋｄと決定した。ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白は、０.１％トリフルオロ酢酸中、無色透明溶液として存在する。
培地から回収されたＢＭＰ−１１蛋白を、同時産生された他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することにより培地から精製する。
ＢＭＰ−１１蛋白を、ＦＳＨの産生を調節する能力により特徴づけることができる。さらに、ＢＭＰ−１１蛋白を、記載されたように［例えば、ベイル（Vale）ら,エンドクリノロジー（Endocrinology）,第９１巻：５６２〜５７２頁（１９７２年）；リング（Ling）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７９〜７８２頁（１９８６年）またはベイル（Vale）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７６〜７７９頁（１９８６年）参照］、ラット・下垂体前葉細胞を用いるインビトロにおける確立されたバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を調節する能力により特徴づけることができる。さらに、骨、軟骨および・または他の結合組織の形成を誘導する能力によりＢＭＰ−１１蛋白を特徴づけることもできる。さらに、ＢＭＰ−１１のかかる組織誘導活性を、下記実施例において記載される分析における骨、軟骨および・または他の結合組織の形成を誘導する能力により特徴づけることもできる。
本発明により提供されるＢＭＰ−１１蛋白は、配列番号：１または配列番号：１０と同様の配列によりコードされる因子をも包含するが、該因子には修飾が自然に行われているか（例えば、ポリペプチドのアミノ酸変化をもたらす可能性のあるヌクレオチド配列における対立遺伝子変異）あるいは人工的に誘導されている。例えば、合成ポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：１１のアミノ酸残基の全体的または部分的に複製された連続した配列であってもよい。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンホーメーションの特徴を配列番号：２または配列番号：１１のインヒビン−βポリペプチドと共有することにより、それらに共通したＢＭＰ−１１活性を有することができる。よって、それらを、天然のＢＭＰ−１１ポリペプチドに対する生物学的に活性のある代替物として治療プロセスに使用することができる。
本明細書に記載のＢＭＰ−１１蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかである（通常、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）。グリコシレーション認識部位における第１または第３のアミノ酸の位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列におけるグリコシレーションを生じさせない。さらに、細菌細胞におけるＢＭＰ−１１蛋白の発現は、グリコシレーション認識部位を変化させずにグリコシレーションされていない蛋白を生じる。
さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列と結合していない、ＢＭＰ−１１蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１または配列番号：１０に示された５'から３'方向への配列、および緊縮条件下、例えば、６５℃における０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ［マニアティス（Maniatis）ら,「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Molecular Cloning(A Laboratory Manual）」,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年）,３８７〜３８９頁］においてそれらの配列にハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。さらにこれらのＤＮＡ配列は、配列番号：３のＤＮＡ配列からなる配列、および緊縮条件下において配列番号：３の配列にハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。
同様に、配列番号：１または配列番号：１０の配列によりコードされるＢＭＰ−１１蛋白をコードするＤＮＡ配列であるが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異（特異的な集団における天然に生じる塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある）によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増強するための、点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換）により引き起こされる配列番号：１または配列番号：１０のＤＮＡ配列における変化も、本発明に包含される。
本発明の別の態様は、ＢＭＰ−１１蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明ＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された宿主細胞を培養し、ＢＭＰ−１１蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。
適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター・卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野において知られている。例えば、ゲシング（Gething）およびサムブルック（Sambrook）,ネイチャー（Nature）,第２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）、あるいは、カウフマン（Kaufman）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,第５巻（７）：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）もしくはホウリー（Howley）ら,米国特許第４,４１９,４４６号参照。付記した実施例に記載した別の適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当でありうる。
細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することができる。
当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞として使用することもできる。例えば、ミラー（Miller）ら,ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering）,第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス（Plenim Press）１９８６年）およびその中で引用されている文献参照。
本発明の別の態様は、これらの新規ＢＭＰ−１１ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードしている上記の新規ＤＮＡ配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、ＢＭＰ−１１蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記修飾配列を含むベクターも、本発明の具体例である。さらに、配列番号：１または配列番号：１０もしくはＢＭＰ−１１蛋白コードしている他の配列を操作して、ＢＭＰ−１１をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、それらを他のＢＭＰ蛋白、アクティビン蛋白もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列に置換することにより成熟ＢＭＰ−１１を発現するようにすることもできよう。
ベクターを細胞系の形質転換方法に使用することができ、該ベクターは選択された宿主細胞において本発明ＤＮＡ配列の複製および発現を指令しうる、作動するように本発明配列に連結されている選択された調節配列を有している。かかるベクターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は通常行われることであり、本発明の一部分を形成することはない。
哺乳動物宿主細胞における発現に関しては、ベクターは、宿主細胞による蛋白の分泌に適したプロペプチドをコードしている配列であって成熟ＢＭＰ−１１蛋白の暗号配列の正しい読み取り枠に連結された配列からなっていてもよい。適当なプロペプチドをコードしている配列を、蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白、例えば、ＢＭＰ−２ないしＢＭＰ−９をはじめとする蛋白をコードしているＤＮＡから得てもよい。例えば、米国特許第５,１６８,０５０号参照。該開示を（該開示においては、ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤＮＡが成熟ＢＭＰ−２蛋白をコードしているＤＮＡに融合されている）参照により本明細書に取り入れる。かくして、本発明は、蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列であってＢＭＰ−１１ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み取り枠に連結されたＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ分子を包含する。「キメラ」なる用語は、プロペプチドがＢＭＰ−１１以外の異なるポリペプチドに由来することを意味するために用いられる。
ＦＳＨの産生を調節する本発明蛋白は、ホモ二量体またはインヒビン−βファミリーの他の蛋白とのヘテロ二量体として発現されるは場合には、受精能の向上への適用が可能である。さらに本発明蛋白は、インヒビン−αファミリーの蛋白とのヘテロ二量体の構成の場合には、避妊に有用である可能性がある。
骨が正常に形成されない環境における軟骨および／または骨の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷に適用される。ＢＭＰ−１１蛋白を用いるかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨原性薬剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷、あるいは腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さらに美容整形手術にも有用である。ＢＭＰ−１１蛋白を歯周病の治療、およびその他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せるための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することができる。本発明ＢＭＰ−１１ポリペプチドは骨粗鬆症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨融合性および骨誘導性因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第１４８,１５５号および第１６９,０１６号参照。
本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。傷のタイプは、熱傷、切り傷、潰傷を包含するが、これらに限定しない（傷の治癒および関連組織の治療の議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。
本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および／または骨の欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物からなる。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１１蛋白からなる。
さらに、ＢＭＰ−１１蛋白を用いるかかる標品は神経の生存率を高めることができ、それゆえ、移植および神経の生存率の低下を示す症状において有用でありうる。
本発明ＢＭＰ−１１蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と協同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記共有特許ならびに出願に開示された治療量の少なくとも１種のＢＭＰ蛋白もしくは成長因子を伴った、治療量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１１蛋白からなる。かかる混合物は、個々の分子または異なる部分よりなるヘテロ分子からなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−１１蛋白サブユニットおよびインヒビン−α蛋白由来のサブユニットからなるジスルフィド結合した二量体、インヒビン−β蛋白またはＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−１０のごときＢＭＰ蛋白からなっていてもよい。ＢＭＰ−１１と一緒になって有用である薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子を包含しうる。本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記共有特許ならびに出願に開示された治療量の少なくとも１種のＢＭＰ蛋白を伴った、治療量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１１蛋白からなる。かかる混合物は、ＢＭＰ蛋白の個々の分子または異なるＢＭＰ部分よりなるヘテロ分子からなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−１１蛋白サブユニットおよび上記「ＢＭＰ」のうちの１種由来のサブユニットよりなるジスルフィド結合した二量体からなっていてもよい。かくして、本発明は、一方のサブユニットが少なくとも配列番号：２または配列番号：１１のアミノ酸１からアミノ酸１０９までのアミノ酸配列からなり、もう一方のサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８ならびにＢＭＰ−９からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列からなるヘテロ二量体である精製ＢＭＰ−１１ポリペプチドを包含する。さらなる具体例はＢＭＰ−１１部分のヘテロ二量体からなっていてもよい。さらに、ＢＭＰ−１１蛋白を、骨および／または軟骨の欠損、傷、もしくは問題となっている組織の治療に有益な他の薬剤と混合してもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにｋ−線維芽細胞成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）を包含する。これらの薬剤の部分も、本発明組成物に使用することができる。
本発明ＢＭＰ−１１蛋白を、骨形態形成蛋白と混合した組成物中に使用してもよい。例えば、オガワ（Ogawa）ら,ＷＯ９２／１４４８１（１９９２年）；オガワ（Ogawa）ら,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,第２６７巻：１４２３３〜１４２３７頁（１９９２年）参照。かかる組成物に使用する骨形態形成蛋白は、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ならびにＢＭＰ−７；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９；さらに１９９３年５月１２日出願の同時係属特許出願第０８／０６１,６９５号に開示のＢＭＰ−１０を包含する。
ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当該分野の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、ＢＭＰおよびＴＧＦ蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、人以外には家畜およびサラブレッドのウマが、本発明ＢＭＰ−１１での治療に関する望ましい患者である。
本発明治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、あるいは移植もしくはデバイスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位に送達するためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に所望により含有されていてもよい、ＢＭＰ−１１蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において、ＢＭＰ−１１組成物と同時または逐次的に、ＢＭＰ−１１組成物に変えて、あるいは付加的に投与してもよい。
好ましくは、骨、軟骨または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷を受けて修復を必要とする組織の部位にＢＭＰ−１１または他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に再吸収されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、ＢＭＰ−１１および／または他の骨誘導蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の湿潤のための正しい構造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他の移植される医療器具に使用する材料から作られる。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。ＢＭＰ−１１組成物のそれぞれの適用により適切な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、骨、腱または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分からなる。他の有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三石灰のごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなっていてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中においてバイオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分解性を変化させてもよい。
骨の成長および／または修復を定期的に評価することにより、進行をモニターすることができる。例えば、Ｘ線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン標識により、進行をモニターすることができる。
ＢＭＰ−１１蛋白の作用を変化させる種々の因子、例えば、患者の年齢、性別ならびに食事、感染があればその程度、投与期間、および他の臨床的因子を医師が考慮することにより、投与規則が決定されよう。組成物中のＢＭＰ蛋白または成長因子のタイプに応じて用量を変更してもよい。使用するマトリックスのタイプに応じて用量を変化させてもよい。
以下の実施例は、ウシ・ＢＭＰ−１１蛋白の回収ならびに特徴付け、およびヒトならびに他のＢＭＰ−１１蛋白を回収するためのウシ・ＢＭＰ−１１蛋白の使用、さらにヒト・蛋白を得ることならびに組み換え法による該蛋白の発現における本発明の実施を説明する。
実施例１
ウシ・ＢＭＰ−１１
ベクターλＥＭＢＬ３中に構築されたウシ・ゲノムライブラリーの８００,０００個の組み換え体を、プレート１枚あたり８０００個の組み換えバクテリオファージプラークの密度で、１００枚のプレートに撒く。これらのプレートから組み換えバクテリオファージのプラークをニトロセルロースでレプリカし、増幅する。ヌクレオチド１０８１からヌクレオチド１４０３に対応するヒト・ＢＭＰ−７のフラグメント（米国特許第５,１４１,９０５号の図４）を、ファインベルグ（Feiberg）ら［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）,第１３２巻：６〜１３頁（１９８３年）］のランダムプライミング方法により32Ｐ標識し、標準的なハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＨＢ）（５ｘＳＳＣ,０.１７０ＳＤＳ,５ｘデンハーツ,１００μｇ／ｍｌ  サケ・精子ＤＮＡ）中の１セットのフィルターに、６０℃において２ないし３日間ハイブリダイズさせる。緊縮性を減じた条件で（４ｘＳＳＣ,０.１％ ＳＤＳ,６０℃）、フィルターを洗浄する。多数の陽性のハイブリダイズしている組み換え体が見られる。５２個の陽性のハイブリダイズしている組み換えバクテリオファージプラークを選択し、２次スクリーニングに用いる。これら５２枚のプレートから組み換え体のプラークをニトロセルロースでレプリカし、増幅する。１セットのニトロセルロースフィルターを上記ヒト・ＢＭＰ−７ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせ、緊縮性を減じた同じ条件で洗浄する。他のセットのフィルターを、ＳＨＢ中、６５℃において、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７プローブの混合物とハイブリダイズさせ、６５℃において０.１ｘＳＳＣ,０.１％ ＳＤＳで洗浄する（緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件）。混合プローブは、相対的に等量の、ヒト・ＢＭＰ−５配列のヌクレオチド１４５２から２０６０まで（米国特許第５,１０６,７４８号の図４）からなる32Ｐ標識したＤＮＡフラグメント、ヒト・ＢＭＰ−６配列のヌクレオチド１３９５から１６９８まで（米国特許第５,１８７,０７６号の図４）からなる32Ｐ標識したＤＮＡフラグメント、およびヒト・ＢＭＰ−１７配列のヌクレオチド１０８１から１４０３まで（米国特許第５,１４１,９０５号の図４）からなる32Ｐ標識したＤＮＡフラグメントからなる。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のＤＮＡフラグメントを、ランダムプライミング法により32Ｐ標識し、１分間あたりのカウント数（ｃｐｍｓ）が同じである各プローブを混合し、５２枚の２次プレートの他のセットのニトロセルロースフィルターを入れたＳＨＢに添加する。緊縮性を減じた条件下でヒト・ＢＭＰ−７プローブにハイブリダイズ陽性であり、高い緊縮性の条件下においては混合されたＢＭＰ−５／６／７プローブに弱くハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしない１４個の組み換え体をさらなる分析のために選択する。これらのハイブリダイゼーション特性を示す１４個すべての組み換え体をプラーク精製し、それぞれからバクテリオファージＤＮＡを調製する。上記ハイブリダイゼーション特性を示す１４個の組み換え体のうちの１個のハイブリダイズ陽性の領域を、λ７ｒ−３０と命名し、０.５ｋｂのＳａｃＩ制限フラグメントに配置する。このフラグメントをプラスミドベクタ��（ｐＧＥＭ−３）中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行う。クローンλ７ｒ−３０の部分ＤＮＡ配列（配列番号：１）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。
１９９３年４月７日にバクテリオファージλ７ｒ−３０をＡＴＣＣに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５４３９を得た。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に要求に合致するものである。
このλ７ｒ−３０クローンは、少なくとも本発明ウシ・ＢＭＰ−１１蛋白の一部をコードしている。クローンλ７ｒ−３０のヌクレオチド配列は、配列番号：１のヌクレオチド２４６〜７０１の４５６個のヌクレオチドの読み取り枠を含んでいる。配列番号：１の３２４から７０１までのヌクレオチド配列は３７８個のヌクレオチドの読み取り枠を示し、他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白と並べて比較することにより決定されるように、ウシ・ＢＭＰ−１１蛋白のＣ末端部分の少なくとも１２６個のアミノ酸をコードしている。２４６から３２３までのヌクレオチド配列は、推定される１２６個のアミノ酸のＢＭＰ−１１ペプチドをコードしている配列に隣接した読み取り枠を示すが、この領域のＤＮＡ配列（２４６ないし３２３）は、他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白との同一性が低く、多数のスプライスを受ける可能性のあるコンセンサス配列が、ウシ・ＢＭＰ−１１遺伝子のこのエキソンの５'末端を決定することを困難にしている。ヌクレオチド位置２４３ないし２４５におけるフレーム中（in-frame）の停止コドンの存在は、クローンλ７ｒ−３０のヌクレオチド配列は、ウシ・ＢＭＰ−１１遺伝子の少なくとも１個のエキソン／イントロン境界を含んでいることを示す。
ＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白に関する知識によると、ＢＭＰ−１１前駆体ポリペプチドは、認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ−Ｘ−ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＡＲＧ−ＡＲＧにおいて開裂されると予想される。ＢＭＰ−１１前駆体ポリペプチドの開裂は、位置１のアミノ酸ＡＳＮから始まる１０９個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ＢＭＰ−１１の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Moll.& Cell.Biol.）,第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら,ネイチャー（Nature）,第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］と同様の様式での、二量体化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。
それゆえ、ＢＭＰ−１１の成熟活性種は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットはアミノ酸１ないし１０９からなり、その予想分子量は約１２,０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は、アミノ酸６ないし１０９からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。蛋白のＴＧＦ−βの他のメンバーと同様に、ＢＭＰ−１１蛋白のカルボキシ末端領域は、アミノ末端領域より保存性が高い配列を示す。ＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の対応する領域に対するＢＭＰ−１１蛋白のシステインに富むＣ末端ドメイン（アミノ酸６ないし１０９）のアミノ酸同一性は以下のとおり：ＢＭＰ−２,３９％；ＢＭＰ−３,３７％；ＢＭＰ−４,３７％；ＢＭＰ−５,４２％；ＢＭＰ−６,４５％；ＢＭＰ−７,４２％；ＢＭＰ−８,３９％；ＢＭＰ−９,４０％；Ｖｇ１,３９％；ＧＤＦ−１,３４％；ＴＧＦ−β１,３６％；ＴＧＦ−β２,３８％；ＴＧＦ−β３,３８％；インヒビンβ(Ｂ),４１％；インヒビンβ（Ａ）,３９％。
実施例２
ヒト・ＢＭＰ−１１
ウシおよびヒトのＢＭＰ−１１遺伝子は有意に相同的であると考えられ、それゆえ、ウシ・暗号配列またはその一部を、ヒト・ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いるか、あるいは類似のヒト・蛋白を合成するヒト・細胞系または組織を同定するためのプローブとして用いる。ストラタジーン（Stratagene）カタログ番号９４４２０１のごときヒト・ゲノムライブラリーをかかるプローブでスクリーニングし、陽性と推定されるものを単離し、ＤＮＡ配列を得ることができる。この組み換え体がヒト・ＢＭＰ−１１の一部をコードしているという証拠は、ウシ／ヒト・蛋白および遺伝子構造の相同性による。
ヒト・ＢＭＰ−１１分子の一部をコードしているＤＮＡを含む組み換えバクテリオファージが得られたならば、ヒト・暗号配列をプローブとして用いて、ＢＭＰ−１１ｍＲＮＡを合成するヒト・細胞系または組織を同定することができる。別法として、ウシ・ＢＭＰ−１１の暗号配列をプローブとして用いてかかるヒト・細胞系または組織を同定することもできる。簡単に説明すると、選択された細胞または組織を源としてＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動してニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ウシまたはヒト・ＢＭＰ−１１の暗号配列由来のプローブとハイブリダイズさせる。別法として、ウシ・ＢＭＰ−１１暗号配列を用いて、特異的増幅反応を行うのに用いられるプライマー間に位置する領域に位置するＢＭＰ−１１暗号配列の一部を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ウシおよびヒトのＢＭＰ−１１配列は、ｍＲＮＡ由来の対応するヒト・ＢＭＰ−１１をコードしている配列、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型を特異的に増幅することを可能にするであろう。上記方法の１つにより可能性のある源が確認された場合、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立された方法により（トール（Toole）ら,上記）、λｇｔ１０または当業者に知られた他のλバクテリオファージベクター（すなわち、λＺＡＰ）中にクローン化する。増幅反応に指向される上記オリゴヌクレオチドプライマーを、すでに確立されたヒト・ｃＤＮＡまたはλバクテリオファージベクター中にクローン化されているゲノムライブラリーに対して直接用いることも可能である。かかる場合、ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白の一部をコードしている特異的に増幅されたＤＮＡ産物を生じるライブラリーを、ＢＭＰ−１１をコードしている増幅されたＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて直接スクリーニングすることができよう。
ウシ・ＢＭＰ−１１ゲノムクローンλ７ｒ−３０のＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト・ＢＭＰ−１１をコードしている配列の特異的増幅を可能にすると考えられている。配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド５０１から５２１までに基づいて以下のヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。
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プライマーＣの最初の９個のヌクレオチド（下線）は、本発明ＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために用いられる制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列（よって、この配列は配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない）を含む。
配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド７０１から６７８までに基づいて以下のヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。
0003681069.tif 000003
プライマーＤの最初の９個のヌクレオチド（下線）は、本発明ＢＭＰ−１１蛋白をコードしているＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために用いられる制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列（よって、この配列は配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない）を含む。
上記プライマーにおける標準的なヌクレオチドのシンボルは以下のとおり：Ａ,アデノシン；Ｃ,シトシン；Ｇ,グアニン；およびＴ,チミン。
上記プライマーＣおよびＤを、ヒト・ゲノムＤＮＡ由来の特定のヌクレオチドの増幅を行うためのプライマーとして使用する。
ヒト・ゲノムＤＮＡ（源：末梢血リンパ球）を１００℃で５分間変性させ、次いで、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）,１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.３,５０ｍＭ  ＫＣｌ,１.５ｍＭ  ＭｇＣｌ2,０.００１％ゼラチン,１.２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ,１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーＣおよび１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーＤを含有する反応混合物を添加する前に氷で冷却する。次いで、この反応混合物を以下の様式の温度循環に供する：９４℃で３分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを１回、次いで、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３９回。
製造者の指示する条件下のプロトコールによるＤＮＡ精製樹脂を使用することにより、この反応により特異的に増幅されたＤＮＡを、増幅を開始するために用いた過剰のオリゴヌクレオチドプライマーＣおよびＤから分離する。得られたＤＮＡ生成物を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、フェノール抽出し、次いで、クロロホルム抽出する。緩衝液交換およびＳｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限的消化により生じたＤＮＡの小フラグメントの除去を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１ｍＭ  ＥＤＴＡで消化ＤＮＡ生成物を希釈し、次いで、セントリコン（centricon）TM３０マイクロコンセントレーター（microconcentrator）（マサチューセッツ州ビバリー（Beverly）のダブリュ・アール・グレイス・アンド・カンパニー（W.R.Grace & Co.）,製品番号４２０９）により遠心分離を行うことにより行う。得られたＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ消化され増幅されたＤＮＡ生成物をプラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のポリリンカー領域のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位間にサブクローン化する。得られたサブクローンのＤＮＡ配列分析は、特異的に増幅されたＤＮＡ配列は本発明ヒト・ＢＭＰ−１１蛋白の一部をコードしていることを示す。この特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：４）を配列表に示す。
この配列のヌクレオチド１から２７までは、オリゴヌクレオチドプライマーＣの一部からなり、ヌクレオチド１８６から２１３までは特異的増幅反応を行うために用いたオリゴヌクレオチドプライマーＤの一部からなる。増幅反応の開始におけるオリゴヌクレオチドプライマーＣおよびＤ（ウシ・ＢＭＰ−１１配列に基づいて設計）の機能により、それらは、ヒト・ＢＭＰ−１１をコードしている実際の配列に正確には一致していなくてもよく、それゆえ、上記アミノ酸配列の派生物に翻訳されない。ヒト・ゲノムＤＮＡ鋳型から特異的に増幅された配列番号：３のヌクレオチド２８から１８５までのヌクレオチド由来のＤＮＡ配列またはその一部をブローブとして用いて、当業者に知られた標準的ハイブリダイゼーション／スクリーニング法により、さらなるヒト・ＢＭＰ−１１をヒト・ゲノムまたはヒト・ｃＤＮＡライブラリーから同定することができる。
ベクターλＺＡＰII中に構築されたヒト・胎児の脳のｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社製,カタログ番号９３６２０６）の１２０万個の組み換え体を、プレートあたり２４０００個の組み換えバクテリオファージプラークの密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージのプラークのニトロセルロースでのレプリカをこれらのプレートから作成する。配列番号：３のオリゴヌクレオチド５３ないし８２に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを自動ＤＮＡ合成装置により合成する。このオリゴヌクレオチドプローブをγ32Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、ＳＨＢ中、６５℃においてニトロセルロースのレプリカの両方のセットにハイブリダイズさせる。９個の陽性のハイブリダイズしている組み換え体が見られる。陽性のハイブリダイズしている組み換え体の１つをλＦＢ３０.５と命名し、プラーク精製する。精製λＦＢ３０.５のｃＤＮＡクローンのバクテリオファージのプレートストックを調製し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。供給者（ストラタジーン）により記載されたインビボ切断プロトコールにより得られ、λＦＢ３０.５バクテリオファージｃＤＮＡクローン全体の挿入断片として有するＦＢ３０.５と命名された細菌プラスミドは、ブダペスト条約の要請に基づき米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ ６９６１９と命名されている。クローンＦＢ３０.５のＤＮＡ配列の一部を配列番号：１０に示す。
ベクターλＦＩＸ中の構築されたヒト・ゲノムライブラリー（ストラタジーン社製,カタログ番号９４４２０１）の１００万個の組み換え体を、プレートあたり２００００個の組み換えバクテリオファージのプラークの密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークのニトロセルロースでのレプリカをこれらのプレートから作成する。配列番号：１０のヌクレオチド５９〜６１のＧＣＧがＣＡＣに偶然に置き換わっていることを除き、配列番号：１０のヌクレオチド５７〜８６に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡ合成装置により合成する。このオリゴヌクレオチドプローブをγ32Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、ＳＨＢ中、６５℃において、ニトロセルロースのレプリカの両方のセットにハイブリダイズさせる。５個の陽性のハイブリダイズしている組み換え体が見られる。陽性のハイブリダイズしている組み換え体の１つを３０ＧＥＮ.４と命名し、プラーク精製する。精製３０ＧＥＮ.４ゲノムクローンのバクテリオファージのプラークストックを調製し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。このゲノムクローンのバクテリオファージストックは、ブダペスト条約の要請に基づき米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ ７５７７５と命名されている。クローン３０ＧＥＮ.４のＤＮＡ配列の一部を配列番号：１０に示す。ゲノムクローン３０ＧＥＮ.４のＤＮＡ配列の一部を、ｃＤＮＡクローンＦＢ３０.５のＤＮＡ配列の一部と同一であると決定した。配列番号：１０のこの重複配列（ヌクレオチド１〜１９８）の伸長部分を、ＢＭＰ−１０蛋白配列の部分暗号配列を編集するための基礎として用いた。ゲノムクローン３０ＧＥＮ.４は、ＢＭＰ−１１前駆体ポリペプチドの残りの部分をコードしていると考えられるヒト・ＢＭＰ−１１蛋白のさらなる５'側の暗号配列を有し、さらに開始メチオニンを有していると考えられる。ヒト・ＢＭＰ−１１の部分配列を配列番号：１０に示してあり、ヌクレオチド１〜１９８が３０ＧＥＮ.４ゲノムクローンおよびＦＢ３０.５  ｃＤＮＡクローンの両方に存在するが、その一方、ヌクレオチド１９９〜１２７０はすべてｃＤＮＡクローンＦＢ３０.５由来であることに留意すべきである。配列番号：１０は、少なくとも３６２個のアミノ酸のヒト・ＢＭＰ−１１前駆体蛋白を示唆する。他のＢＭＰおよびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の関する知識に基づけば、前駆体ポリペプチドは、提案され認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ−Ｘ−ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＡＲＧ−ＡＲＧ（配列番号：１１のアミノ酸−４〜−１）において開裂されるであろうと予測される。この位置でのヒト・ＢＭＰ−１１前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：１１の位置１におけるアミノ酸ＡＳＮから始まる１０９個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・ＢＭＰ−１１の成熟形態へのプロセッシングは、二量体化および関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシングと類似の様式でのＮ末端領域の除去（エル・イー・ジェントリー（L.E.Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molec.& Cell.Biol.）第８巻：４１６２頁（１９８８年）；ア���ル・デリンク（R.Derynck）ら,ネイチャー（Nature）第３１６巻：７０１頁（１９８５年））を包含すると考えられる。ヒト・ＢＭＰ−１１の成熟活性形態は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットは配列番号：１１のアミノ酸１〜１０８からなり推定分子量１２,０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は配列番号：１１のアミノ酸７〜１０８からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を有していると考えられる。ＢＭＰ−１１の１つのサブユニットおよびＢＭＰ／ＴＧＦ−βスーパーファミリーの別のメンバーであるもう１つのサブユニットからなるヘテロ二量体も考えられる。
実施例３
ＢＭＰ−１１の発現
ウシ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−１１を製造するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換え型ヒト・ＢＭＰ−１１の好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。
当業者は、配列番号：１または配列番号：１０の配列、もしくはＢＭＰ−１１蛋白をコードしている他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾された配列およびｐＣＤ［オカヤマ（Okayama）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell Biol.）,第２巻：１６１〜１７０頁（１９８２年）］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ゴウ（Gough）ら,ＥＭＢＯ  Ｊ．，第４巻：６４５〜６５３頁（１９８５年）］ならびにｐＭＴ２  ＣＸＭのごとき知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。
哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２  ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）（ウォング（Wong）ら,サイエンス（Science）第２２８巻：８１０〜８１５頁,１９８５年）の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を有することにおいてｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２  ＣＸＭの機械的エレメントは記載されており（カウフマン,アール・ジェイ（Kaufman,R.J.）,１９８５年,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：６８９〜６９３頁）、アデノウイルス・ＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０・複製開始点、５'スプライス部位ならびにアデノウイルス・後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス・大後期プロモーター、３'スプライス受容部位、ＤＨＦＡ挿入断片、ＳＶ４０・初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。
ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭを得る。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託されている。
ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切り出され、連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる直鎖状のｐＭＴ２が得られる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン変異誘発［モリナガ（Morinaga）ら,バイオテクノロジー（Biotechnology）第８４巻：６３６頁（１９８４年）］を用いてｐＭＴ２  ＣＸＭを構築する。これにより、ｐＭＴ２のＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄIII部位に対応する塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらにそのヌクレオチド１１４５の位置に以下の配列：
0003681069.tif 000004
を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２  ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭおよびｐＭＴ２３  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。
ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切り出され、連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる直鎖状のｐＭＴ２が得られる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。
ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。最初に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６ｂｐの５'非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に以下の配列：
0003681069.tif 000005
を得る。
次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、単一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０ｂｐの断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１［エス・ケイ・ジュング（S.K.Jung）ら,ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol）第６３巻：１６５１〜１６６０頁（１９８９年）］から得られ、これは２７５２ｂｐのフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。以下の配列を有する５'ＴａｑＩ突出末端および３'ＸｈｏＩ突出末端：
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を用いて６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を合成する。
この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。
ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣ２β１を得る。
このベクターは、ＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス・大後期プロモーター、アデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０・ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルス・ＶＡ  Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。
ベクターの構築はＢＭＰ−１１のＤＮＡ配列の修飾を包含する。例えば、暗号領域の５'および３'末端上の非暗号ヌクレオチドを除去することにより、ＢＭＰ−１１のＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非暗号ヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、ＢＭＰ−１１蛋白の発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、ＢＭＰ−１１をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、他のＢＭＰ蛋白、アクティビン蛋白またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列に置き換えることにより成熟ＢＭＰ−１１蛋白を発現させるように、配列番号：１または配列番号：１０の配列、あるいはＢＭＰ−１１蛋白をコードしている他の配列を操作することができよう。
当業者は、暗号配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、配列番号：１または配列番号：１０の配列を操作することができる。例えば、暗号配列をさらに操作することができる（例えば、他の既知リンカーに連結する、あるいはその非暗号配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる）。次いで、ティー・タニグチ（T.Taniguchi）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,第７７巻：５２３０〜５２３３頁（１９８０年）に記載されたような方法を用いて修飾されたＢＭＰ−１１暗号配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的なな細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−１１蛋白を発現させる。細菌細胞においてＢＭＰ−１１蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ  １７７,３４３参照。
昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うための操作を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５,４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法参照］。
高レベルの本発明ＢＭＰ−１１蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種ＢＭＰ−１１遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,第１５９巻：６０１〜６２９頁（１９８２年）の方法により、メトトレキサート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。
例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＢＭＰ−１１の発現を可能にする他のプラスミドの配列と機能的に連結された本発明ＢＭＰ−１１に対するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp）,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.biol.）,第２巻：１３０４頁（１９８２年）］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢII中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、カウフマン（Kaufman）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,第５巻：１７５０頁（１９８３年）記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるＢＭＰ−１１の発現を、下記実施例５〜８記載の１種またはそれ以上のＢＭＰ−１１活性分析によりモニターする。ＢＭＰ−１１の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［35Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、ＢＭＰ−１１ポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連ＢＭＰ−１１蛋白を製造することができる。
実施例４
発現されたＢＭＰ−１１の生物学的活性
上記実施例３において得られた発現されたＢＭＰ−１１蛋白の生物学的活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋白性物質ならびに他の汚染物質からＢＭＰ−１１蛋白を単離することにより精製する。下記実施例５〜８記載のＢＭＰ−１１活性の分析により精製蛋白を分析することができる。
実施例５
Ｗ−２０バイオアッセイ
Ａ．Ｗ−２０細胞の説明
インジケーター細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ蛋白での処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく［シース（Thies）ら，ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of Bone and Minaral Research）,第５巻：３０５頁（１９９０年）；およびシース（Thies）ら，エンドクリノロジー（Endocrinology），第１３０巻：１３１８頁（１９９２年）］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's Hospital）のディー・ナサン（D.Nathan）博士の研究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。ある種のＢＭＰ蛋白でのＷ−２０細胞の処理は、（１）アルカリ性ホスファターゼ産生増加、（２）ＰＴＨにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン（osteocalcin）合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、我々は、ＢＭＰで処理した場合のみ起こるＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察してきた。この様式において、ＢＭＰ処理されたＷ−２０細胞により示されるインビトロ活性は、ＢＭＰについて知られているインビボでの骨形成活性と相関がある。
新規骨誘導分子のＢＭＰ活性を比較することにおいて有用な２種のインビトロでの分析を以下に説明する。
Ｂ．Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコール
Ｗ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ2のインキュベーター中３７℃において細胞を一晩付着させる。
マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。
試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。
Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。
ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に供する。
５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０.０５％トリトンＸ−１００、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ リン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０.３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。
３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０.２Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。
各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準として各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。
0003681069.tif 000007
既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。
0003681069.tif 000008
次いで、これらの値を用いて既知量のＢＭＰ−１１の活性をＢＭＰ−２活性と比較する。
Ｃ．オステオカルシンＲＩＡプロトコール
Ｗ−２０細胞を、２４ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに、２ｍｌのＤＭＥ（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンを含有）中１０6個となるように撒く。９５％空気、５％ＣＯ2中３７℃において細胞を一晩付着させる。
翌日、培地を、２ｍｌの全体積中１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥに交換する。各試験物質を３系のウェルに入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間（４８時間目に同じ培地で培地交換）インキュベーションする。
９６時間のインキュベーションの終わりに、各ウェルから５０μｌの試験培地を取り、マウス・オステオカルシンについてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分析の詳細は、マサチューセッツ州０２０７２、スタウトン（Stoughton）、ペイジ・ストリート３７８のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Biomedical Techologies Inc.）により製造されたキットに説明がある。分析のための試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウス・オステオカルシン標準）、ＢＴ−４３２（ヤギ・抗−マウス・オステオカルシン）、ＢＴ−４３１Ｒ(ヨウ素化されたマウス・オステオカルシン)、ＢＴ−４１５（正常ヤギ・血清）およびＢＴ−４１４（ロバ・抗−ヤギＩｇＧ）として見いだされる。ＢＭＰ処理に応答したＷ−２０細胞により合成されたオステオカルシンについてのＲＩＡを、製造者により提供されるプロトコールに記載されたようにして行う。
試験試料に関して得られた値をマウス・オステオカルシンの既知標準に関する値と比較し、既知量のＢＭＰ−２での処理に応答してＷ−２０細胞により産生されたオステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０によるオステオカルシン合成量を表IIIに示す。
0003681069.tif 000009
実施例６
ローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析（Rosen-Modified Sampath-Reddi Assay）サムパスおよびレディ,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ,第８０巻：６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラット・骨形成分析の変更バージョンを用いて、骨、軟骨および／または他の結合組織に対するＢＭＰ−１１蛋白の誘導活性を評価する。この変法分析を、本明細書においてはローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析と呼ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈澱工程を、分析すべきフラクションの水に対する透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）に置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに対して平衡化する。得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。蛋白処理していない模擬ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結乾燥し、得られた粉末を５番のゼラチンカプセルに封入する。カプセルを、２１〜４９日齢のオスのロング・エバンズ・ラット（Long Evans Rat）の腹胸部の皮下に移植する。各移植物の半分をアルカリ性ホスファターゼ分析に用いる［レディらプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ,第６９巻：１０６１頁（１９７２年）参照］。
各移植物のもう半分を固定し、組織学的分析用に加工する。１μｍのグリコールメタクリラート切片をフォン・コッサ（Von Kossa）および酸性フクシンで染色して、各移植物に見られる誘導された骨および軟骨の形成量について評点をつける。＋１ないし＋５の評点は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマトリックスにより占められている移植物の各組織学的切片の面積を示す。評点＋５は、移植物の５０％を上回る部分が移植物中の蛋白の直接的結果として産生された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１はそれぞれ、移植物が４０％、３０％、２０％および１０％を上回る新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。
本発明ＢＭＰ−１１蛋白を、この分析における活性に関して評価することができる。
実施例７
発現されたＢＭＰ−１１の生物学的活性
上記実施例３で得られた発現されたＢＭＰ−１１蛋白の生物学的活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時産生された他の蛋白性物質ならびに他の汚染物質からＢＭＰ−１１蛋白を単離することにより精製を行う。精製蛋白を、実施例６記載のラット・骨形成分析により分析することができる。
当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。
銀染色［オウクリー（Oakley）ら,アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０５巻：３６１頁（１９８０年）］で染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［レムリ（Laemmli）,ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）］およびイムノブロット［トウビン（Towbin）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：４３５０頁（１９７９年）］のごとき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。
以上の説明は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うことが想定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含されると確信する。
実施例８
ＢＭＰ−１１のアクティビン活性を測定するための試験
当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の蛋白と同様に、精製にヘパリンセファロースを使用しうると考えられる。
銀染色［オウクリー（Oakley）ら,アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０５巻：３６１頁（１９８０年）］で染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［レムリ（Laemmli）,ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）］およびイムノブロット［トウビン（Towbin）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：４３５０頁（１９７９年）］のごとき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。
例えば、ベイル（Vale）ら,エンドクリノロジー(Endocrinology),第９１巻：５６２〜５７２頁（１９７２年）；リング（Ling）ら,ネイチャー（Nature）,第３２１巻：７７９〜７８２頁（１９８６年）またはベイル（Vale）ら,ネイチャー,第３２１巻：７７６〜７７９頁（１９８６年）に記載のラット・下垂体前葉細胞を用いるインビトロでのバイオアッセイにおいて確立された卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出調節能により、ＢＭＰ−１１蛋白をさらに特徴づけることができる。これらの開示を参照により本明細書に取り入れる。
別法として、ロジオ（Lozzio）ら,ブラッド（Blood）,第４５巻：３２１〜３３４頁（１９７５年）および米国特許第５,０７１,８３４号第１５欄により記載されたように、ヒト・Ｋ−５６２細胞におけるエリスロポエチン活性刺激能により、ＢＭＰ−１１を特徴づけてもよい。これらの開示を参照により本明細書に取り入れる。
さらに、シューバート（Schubert）,ネイチャー第３４４巻：８６８〜８７０頁（１９９０年）に記載のごとく、細胞生存分析における活性により、ＢＭＰ−１１を特徴づけてもよい。
以上の説明は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うことが想定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含されると確信する。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド（GENETICS INSTITUTE,INC.）
（Ｂ）通り名：ケンブリッジパーク・ドライブ８７番
（Ｃ）都市名：ケンブリッジ
（Ｄ）州名：マサチューセッツ
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０２１４０
（Ｇ）電話番号６１７  ８７６−１１７０
（Ｈ）テレファックス：６１７−８７６−５８５１
（ｉｉ）発明の名称：ＢＭＰ−１１組成物
（ｉｉｉ）配列の数：１１
（ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１.０（PatentIn Release #1.0）、バージョン＃１.２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ボス・タウルス（Bos Taurus）
（Ｂ）株名：ウシ・アクティビン  ＷＣ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３２４..７０４
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：３２２..３２３
（Ｄ）他の情報：／注＝「推定上のイントロン３'末端」
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）存在位置：３７５..７０１
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
0003681069.tif 000010
0003681069.tif 000011
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１２６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
0003681069.tif 000012
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo Sapiens）
（Ｂ）株名：ヒト・アクティビン  ＷＣ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：２８..１８３
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１８４..１８５
（Ｄ）他の情報：／注＝「部分クローンの末端におけるコドンの３分の２」
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：
0003681069.tif 000013
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：
0003681069.tif 000014
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ウシ・アクティビン  ＷＣに対するプライマーＤ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１..９
（Ｄ）他の情報：／注＝「ＸｂａＩ制限部位」
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
0003681069.tif 000015
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ウシ・アクティビン  ＷＣに対するプライマーＣ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１..９
（Ｄ）他の情報：／注＝「ＢａｍＨＩ制限部位」
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
0003681069.tif 000016
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｐＭＴ２  ＣＸＭ中に挿入されたＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
0003681069.tif 000017
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｐＭＴ２１中に挿入されたＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１..６
（Ｄ）他の情報：／注＝「Ｐｓｔ制限部位」
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１５..２６
（Ｄ）他の情報：／注＝「ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位」
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
0003681069.tif 000018
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＥＭＣウイルス・リーダー配列の一部
（ｘ）公表の情報：
（Ａ）著者：ジュング,エス・ケイ（Jung,S.K.）
（Ｃ）雑誌名ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol）
（Ｄ）巻：第６３巻
（Ｆ）頁：１６５１〜１６６０
（Ｇ）日付：１９８９年
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
0003681069.tif 000019
（２）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１２７０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト・ＢＭＰ−１１
（ｖｉｉ）直接の起源
（Ｂ）クローン：ＦＢ３０.５
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１..１０８６
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）存在位置：７６０..１０８６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：
0003681069.tif 000020
0003681069.tif 000021
（２）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：
0003681069.tif 000022
0003681069.tif 000023