(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースまたはマルトース残基がα-1、4結合によりサイクロイソマルトヘプタオースに結合した分岐サイクロイソマルトヘプタオース。
【請求項２】
グルコースまたはマルトースとサイクロイソマルトヘプタオースとの混合物とに、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて、請求項1記載の分岐サイクロイソマルトヘプタオースを製造することを特徴とする分岐サイクロイソマルトヘプタオースの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分岐サイクロイソマルトヘプタオース及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
先に本発明者等は、デキストランから生成される３種類のサイクロイソマルトオリゴ糖を見出し、該物質、該物質合成酵素及び該物質の製造法を開発した（特開平6-197783号公報及び特開平7-8276号公報）。
サイクロイソマルトオリゴ糖は、７〜９個のグルコースがα-1、6結合により環状に連結した環状オリゴ糖であり、夫々、サイクロイソマルト-ヘプタオース、-オクタオース、-ノナオースと呼称されるものである。
【０００３】
しかし、分岐サイクロイソマルトヘプタオースは、従来全く知られていない物質である。
そして、本物質は、包接作用を有しており、従来のサイクロデキストリンにより安定化される物質とは異なったサイズの物質の安定化、可溶化等に寄与する物質である。そして、具体的には医薬品、食品等の包接剤として用いられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、分岐サイクロイソマルトヘプタオース及びその製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、サイクロイソマルトオリゴ糖から酵素法によりその分岐誘導体を製造すべく種々検討した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、グルコースまたはマルトース残基がα-1、4結合によりサイクロイソマルトヘプタオースに結合した分岐サイクロイソマルトヘプタオースである。
【０００６】
さらに、本発明は、グルコースまたはマルトースとサイクロイソマルトヘプタオースとの混合物とに、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて、請求項1記載の分岐サイクロイソマルトヘプタオースを製造することを特徴とする分岐サイクロイソマルトヘプタオースの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
先ず、本発明の原料として使用するサイクロイソマルトヘプタオースは、グルコースがα-1、6結合で環状化したオリゴ糖であり、グルコースの7量体である。該環状体を得る方法は、該環状体を生成する方法であれば、如何なる方法でも良く、例えば、デキストランから該環状体を生成する微生物を、デキストランを含んだ培地で培養し、培養物から環状体を分離精製する方法、デキストランから該環状体を生成するサイクロイソマルトオリゴ糖合成酵素の作用により、酵素的にデキストランから生成させた後、反応液より環状体を分離精製する方法等が挙げられる。
【０００８】
本発明において用いられる環状体のサイクロイソマルトヘプタオースは、次の理化学的性質を有するものである。
１．元素分析の結果は次の通りである。
Ｃ42Ｈ70Ｏ35・3Ｈ2Ｏとして
計算値  Ｃ:42.43％  Ｈ:6.44 ％
測定値  Ｃ:42.78％  Ｈ:6.33 ％
２．分子量は、日立製作社製の質量分析計 80Bにより分析したマススペクトル分析のデータから１１３４であった。
【０００９】
３．融点は、やなぎもと社製の融点測定機により測定した結果、明確に融解せず分解温度が234〜238℃であった。
４．紫外線吸収スペクトルは、日立製作社製の分光光度計 775で測定した結果、いずれも特徴的な吸収は認められなかった。従って、アミノ基、カルボキシル基等の官能基は持っていないことが示唆された。
【００１０】
５．赤外線吸収スペクトルは、日本分光社製IRスペクトルメーターモデルFT／IR-7300 で測定した。結果を図１に示す。図１において、α−１、６結合に特有の917±２cm-１と768±１cm-１に吸収ピークが示されている。従って、該オリゴ糖がα−１、６結合を有していることが示唆された。
６．溶剤に対する溶解性は、室温で最低２０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で水に溶解した。
【００１１】
７．呈色反応は、ソモギーネルソン法で発色しなかったことから、還元末端が存在していないことを強く示唆している。
８．該物質は、中性の白色物質である。
９．NMR スペクトルは、日本電子社製のNMR スペクトルメーターモデルNM-FX200により測定し、13Ｃ−ＮＭＲ分析の結果から６本のシグナルが認められただけであって、環状構造を支持していた。また、イソマルトヘプタオースの解析から、該物質の結合様式がα−１、６結合であることが強く示唆された。
【００１２】
次にサイクロイソマルトヘプタオースの各酵素に対する挙動は次の通りである。
10. 図２に示すように、１％濃度の該物質に対してエキソ型デキストラナーゼであるグルコデキストラナーゼを40℃で24時間作用させたが、全く水解されなかった。なお、同条件下でイソマルトヘキサオース及びイソマルトヘプタオースは、完全に水解された。
【００１３】
11．１％濃度の該物質に対してエンド型デキストラナーゼを作用させたところグルコース及びイソマルトースにまで分解された。従って、これらのオリゴ糖は、グルコースを唯一の構成糖としており、かつα−１、６結合のみからなることを示唆している。
以上1.〜11.までの結果より、該物質は、いずれもグルコース７〜９分子がα−１、６結合した、環状オリゴ糖であることが判る。そして、その構造式は、次の通りである。
【００１４】
【化１】
0003673302.tif 000002
【００１５】
次に、上記サイクロイソマルトヘプタオースの調製法について説明する。
上記サイクロイソマルトヘプタオースは微生物によって製造することができる。使用する微生物としては、バチルス属に属し、デキストランからサイクロイソマルトヘプタオースを生成するものであれば、如何なる菌株でもよく、例えば、Ｔ−３０４０菌株が挙げられる。
【００１６】
このＴ−３０４０株は、土壌中から、取得した野性株である。以下に本菌株の菌学的性質を示す。
0003673302.tif 000003
【００１７】
(2) 生育状態
a.肉汁寒天平板培養
平滑、色素生産せず
b.肉汁寒天斜面培養
平滑、周辺なめらか、色素生産せず
【００１８】
0003673302.tif 000004
0003673302.tif 000005
【００１９】
このＴ−３０４０菌株は、胞子を形成するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属する細菌であると同定し、バチルス属・エスピー. Ｔ−３０４０株とした。
なお、バチルス・エスピー.（Bacillus sp.) Ｔ−３０４０株は、工業技術院微生物工業技術研究所に FERM BP-4132 として寄託されている。
【００２０】
菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気攪拌培養法等が用いられる。
培地としては、通常の微生物の培養に用いられる窒素源、炭素源、ビタミン、ミネラル等を含み更に本物質の原料となるデキストラン等を含んだものが用いられる。
【００２１】
ｐＨは、本菌が成育するｐＨ域ならばいずれでもよいが、通常は、６〜８の範囲が好ましい。
培養条件は、例えば、通常20〜40℃、好ましくは30℃で、16時間〜６日間、好ましくは３日間振盪培養または通気攪拌培養を行なう。
以上の如くして得た培養物を用いて例えば、以下に示すオリゴ糖採取工程により本サイクロイソマルトオリゴ糖の精製品を得る。
【００２２】
上記培養物からオリゴ糖を得るには遠心分離、膜濃縮等により除菌したのち、通常のオリゴ糖分離方法であれば如何なる方法でもよいが、本製造法の場合、除菌液を公知のサイクロデキストリンの精製法に従って処理することにより、高純度のサイクロイソマルトオリゴ糖画分を得ることが出来る。
更に必要に応じて分配吸着モードのカラムを用いたＨＰＬＣ等の精製手段を用いて各々の高純度品を得ることが出来る。除菌液からの、サイクロイソマルトオリゴ糖の精製法としては例えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、あるいは特異的に環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方法で分離除去することができる。
【００２３】
次に、サイクロイソマルトヘプタオースから分岐サイクロイソマルトヘプタオースを酵素的に合成する方法について記載する。
分岐サイクロイソマルトヘプタオースを合成する方法は、それが可能である方法であれば如何なる方法でも良く、具体的にはサイクロイソマルトヘプタオースとグルコース又はマルトースとの混合物をサイクロデキストリン合成酵素であるサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase）の存在下、ｐＨ4.0〜9.0、温度10〜70℃で0.5〜72時間そのままもしくは撹拌しつつ作用させて分岐サイクロイソマルトヘプタオースを得ることにより行われる。
【００２４】
かかる方法において、CGTase、サイクロイソマルトヘプタオース及びグルコース又はマルトースの濃度範囲は、夫々0.1〜50U/ml、0.05〜20％及び0.05〜20％が好ましい。CGTaseは市販〔天野製薬（株）製〕のものが用いられる。
次いで、生成物の反応液から分離精製は、該分岐サイクロイソマルトヘプタオースを精製できる方法であれば如何なる方法でも良く、具体的には、通常のオリゴ糖の分離精製法が用いられる。
【００２５】
次にサイクロイソマルトヘプタオースの生合成例を説明する。
生合成例
１％デキストランＴ２０００、１％ペプトン、0.5％ ＮａＣｌ及び0.1％イーストエキスからなる液体培地（水道水使用、ｐＨ 7.0）３mlを15ml容試験管に入れ、120℃で20分間、殺菌処理を行なった。これに、バチルス・エスピー. Ｔ−３０４０菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−4132) 保存スラントより１白金耳接種し、30℃で１日間振盪培養した。本培養液３mlを上記と同様の培地組成と殺滅菌条件により調製した２L の培地を含有する３L 容ミニジャ−に接種し、30℃、0.25vvm 、350r.p.m.の条件で２日間通気攪拌培養を行ない、培養終了後、培養液から8000r.p.m.で20分間の遠心分離処理により菌体を分離し、除菌液を得た。
【００２６】
除菌液を活性炭カラムに通液してサイクロイソマルトオリゴ糖を吸着させ、エタノールにより５％ずつ、段階的に溶出した。20％エタノール溶出画分に目的の環状オリゴ糖が最も多く含まれていた。本溶出液をロータリーエバポレーターで濃縮後、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ80カラム（東ソ−社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充填カラム）を用いたＨＰＬＣにより分析した結果を図３−Ａに示した。次に該粗サイクロイソマルトオリゴ糖溶液をロータリーエバポレーターで濃縮後、ＹＭＣ  ＰＡ４３カラム（山村化学社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充填カラム、分取用）を用いたＨＰＬＣに供し各々のサイクロイソマルオリゴ糖を分離精製した。
【００２７】
各々の画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、不純物として混入している直鎖イソマルトオリゴ糖を除去するためにエキソ型デキストラナーゼであるグルコデキストラナーゼを添加して40℃で１晩反応させた。反応液を煮沸することにより反応を停止後、遠心分離により変性蛋白質を除去した後、再度、ＹＭＣ  ＰＡ43カラムを用いたＨＰＬＣにより各々のサイクロイソマルトオリゴ糖を分離精製した。各々の画分をロータリーエバポレーターで濃縮後、濃縮液中のオリゴ糖の純度をＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ80カラム（東ソ−社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充填カラム）を用いたＨＰＬＣにより分析した（図３−Ｂ）。各々のオリゴ糖の純度は、98％以上であった。更に、これらのオリゴ糖画分を凍結乾燥し、サイクロイソマルトヘプタオースを約60mg得た。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
〔実施例１〕
1%デキストラン40（名糖産業社製）、1%ペプトン（極東製薬工業社製）、0.5% NaCl及び0.1%イーストエキス（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使用、pH7.0)100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20分間、殺菌処理を行なった。これに、バチルス・エスピーT-3040菌株（FERM BP-4132)保存スラントより１白金耳接種し、30℃で1日間振盪培養した。本培養液1000mlを上記と同様の培地組成と殺菌条件により調製した300Lの培地を含有する500L容タンクに接種し、30℃、0.25vvm、70r.p.m.の条件で3日間通気撹拌培養を行ない、培養終了後、培養液300Lをマイクローザを用いた膜処理により除菌し、得られた除菌液を更に分子量6000カットのフォロファイバーにより6.31Lにまで濃縮した後、濃縮液を900mlずつ-20℃に凍結保存した。
【００２９】
濃縮液の一部を、デキストラン40（名糖産業社製）100gを10mMリン酸緩衝液(pH6.5)10Lに溶解した水溶液と混合し、40℃で48時間インキュベーションを行なった。活性炭を加えて煮沸することにより反応を停止させ、かつ未反応のデキストランを吸着させた。
活性炭を除去した上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラムにアプライし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾配により吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画分を集め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したODSカラムにアプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾配によりオリゴ糖を溶出し、サイクロイソマルトヘプタオース画分を集め、凍結乾燥した。得られた画分の純度は、HPLC分析からは98%以上であった。
【００３０】
〔実施例２〕
実施例１で得られたサイクロイソマルトヘプタオース1.0g及びマルトース4.5gを、100mM酢酸緩衝液（pH5.5）10ml、脱イオン水85mlと混和し、これにコンチザイム〔天野製薬社製、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase）〕300U/mlを3.0ml加え、40℃で40時間反応させた。
【００３１】
HPLCで反応液を分析し、サイクロイソマルトヘプタオースよりも高重合度と考えられる2種類のオリゴ糖が新たに生成していることを確認した。この反応液を減圧濃縮し、残留物を脱イオン水2.0mlに溶解し、遠心分離で不溶物を除去した後、上清液を分配吸着カラムPA-43(YMC Column,φ2.0cm x 25.0cm)を用いたHPLCにかけ、2つの画分を分取した。  得られた画分を凍結乾燥し、精製標品 F-a、F-b とした。
【００３２】
〔実施例３〕
構造決定を以下のようにして行なった。
2つの精製標品をグルコアミラーゼ（東洋紡社製）で処理したところ、F-a は、等モルのグルコースとサイクロイソマルトヘプタオースに完全に分解され、F-b もグルコースとサイクロイソマルトヘプタオースに完全に分解されたが、そのモル比は、2:1であった。従って、F-a とF-b は各々グルコース及びマルトースがα-1、4結合でサイクロマルトヘプタオースに結合している可能性が強く示唆された。
【００３３】
次いで、質量分析計（Hitachi 80B）によりF-a は1297[M+H]+、1319[M+Na]+、F-b は1459[M+H]+、1481[M+Na]+の分子イオンピークを与え、これはグルコシルサイクロイソマルトヘプタオース（1296）、マルトシルサイクロイソマルトヘプタオース（1458）の推定分子量に一致した。
更に、F-a 、F-b の13C-NMR分析により、夫々、α-1、4結合に由来すると考えられる1位と4位のカーボンシグナルのケミカルシフトが観察された。
以上の結果より、F-a は4-O-α-グルコシルサイクロイソマルトヘプタオース、F-b は4-O-α-マルトシルサイクロイソマルトヘプタオースであると同定した。
【００３４】
〔実施例４〕
サイクロイソマルトヘプタオース、4-O-α-グルコシルサイクロイソマルトヘプタオース、及び4-O-α-マルトシルサイクロイソマルトヘプタオースを夫々1 mgずつ100μlに溶解し、水溶液30mlを100mMリン酸緩衝液（pH6.0）6μl及びエンド型デキストラナーゼ（シグマ社製）（333U/ml)6μlと混和し、37℃で16時間反応させた。
反応液中の残存する環状オリゴ糖をHPLCにより定量した結果を表１に示した。
【００３５】
0003673302.tif 000006
【００３６】
【発明の効果】
本発明により医薬品、食品等の包接剤として有用なグルコースまたはマルトース残基がα-1、4結合により1残基結合した分岐サイクロイソマルトヘプタオース及び分岐サイクロイソマルトヘプタオースを酵素法により高純度かつ効率良く製造する方法を提供するものであって、本発明は、産業上極めて有意義である。
そして、本発明化合物は、通常のサイクロイソマルトオリゴ糖よりエンド型デキストラナーゼの作用に対して抵抗性があり、かつ安定性が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイクロイソマルトヘプタオースの赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図２】サイクロイソマルトヘプタオースの酵素的解析結果を示す図である。
【図３】サイクロイソマルトヘプタオースの溶出液及び生成した該化合物をＨＰＬＣにより分析した結果を示す図である。
【図１】
0003673302.tif 000007
【図２】
0003673302.tif 000008
【図３】
0003673302.tif 000009