(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚幹細胞が投与されていない患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するための、創傷後４日目までに投与される薬剤の調製における、（ｉ）１６，１６−ジメチルＰＧＥ、および（ｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の使用。
【請求項２】
皮膚幹細胞が投与されていない患者であって、１６，１６−ジメチルＰＧＥが投与されている患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するための、創傷後４日目までに投与される薬剤の調製における、ＧＭＣＳＦの使用。
【請求項３】
皮膚幹細胞が投与されていない患者であって、ＧＭＣＳＦが投与されている患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するための、創傷後４日目までに投与される薬剤の調製における、１６，１６−ジメチルＰＧＥの使用。
【請求項４】
薬剤が抗菌剤をさらに含んでなるか、または患者が抗菌剤を投与されている患者である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
抗菌剤が、抗バクテリア剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗バクテリア剤が、ゲンタマイシン、アンピシリン、ベンジペニシリン、ベネタミンペニシリン、ベンザチンペニシリン、フェネチシリン、フェノキシ−メチルペニシリン、プロカインペニシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリンナトリウム、アモキシシリン、塩酸バカンピシリン、シクラシリン、メズロシリン、ピバンピシリン、塩酸タランピシリン、カルフェシリンナトリウム、ピペラシリン、チカルシリン、メシリナム、ピルメシリナン、セファクロール、セファドロキシル、セフォタキシム、セフォキシチン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフロキシム、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフラジン、セフピロム、ラタモキセフ２ナトリウム、アズトレオナム、グリシルサイクリン類、塩酸クロルテトラサイクリン、クロモサイクリンナトリウム、塩酸デメクロシジン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、アミカシン、硫酸フラマイセチン、硫酸ネオマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、コリスチン、フシジン酸ナトリウム、フピロシン、硫酸ポリミキシンＢ、スペクチノマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、スルファルオキサートカルシウム（calcium sulphaloxate）、スルファメトピラジン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファグアニジン、スルファウレア、カプレオマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、シノキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、ニトロフラントイン、ヘキサミン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、コリスチメタート、ポリミキシンＢ、フラゾリドン、ナリジクス酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、リンコマイシン、シクロセリン、イソニアジド、エタンブトール、エチオナミド、ピラジンアミド、メロペネム、およびイミペネムから選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
抗真菌剤が、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシン、フルシトシン、グリセオフルビン、ナタマイシン、およびニスタチンから選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
抗ウイルス剤が、アシクロビア、ＡＺＴ、ｄｄＩ、塩酸アマンタジン、イノシンプラノベクス、およびビダラビンから選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、患者の創傷部位への局所投与用に調剤されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
薬剤が鎮痛剤または麻酔剤をさらに含んでなるか、または患者が鎮痛剤または麻酔剤を投与されている患者である、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
鎮痛剤がサルチル酸メチル、サリチル酸、ジクロニンおよびアロエベラから選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
麻酔剤がベンゾカイン、リドカイン、キシロカインおよびブタンベンピクラート（butamben picrate）から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
薬剤が皮膚透過性エンハンサーをさらに含んでなるか、または患者が皮膚透過性エンハンサーを投与されている患者である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
皮膚透過性エンハンサーがＤＭＳＯである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
薬剤がゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレーとして調剤されているか、またはフィブリン接着剤といった組織シーラントとして調剤されているか、または創傷包帯または包帯として調剤されている請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
（ｉ）１６，１６−ジメチルＰＧＥ、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦを含んでなる、皮膚幹細胞が投与されていない患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するために使用するための、創傷後４日目までに投与される組成物。
【請求項１７】
ＧＭＣＳＦを含んでなる、１６，１６−ジメチルＰＧＥを投与された患者であって皮膚幹細胞が投与されていない患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するために使用するための、創傷後４日目までに投与される組成物。
【請求項１８】
１６，１６−ジメチルＰＧＥを含んでなる、ＧＭＣＳＦを投与された患者であって皮膚幹細胞が投与されていない患者の外傷の治癒を、治癒プロセスを加速することにより促進するために使用するための、創傷後４日目までに投与される組成物。
【請求項１９】
（ｉ）１６，１６−ジメチルＰＧＥ、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦを含んでなり、かつ皮膚幹細胞を含まない、治癒プロセスを加速することによる患者の外傷の治癒の促進に用いるための、創傷後４日目までに投与される創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物。
【請求項２０】
（ｉ）１６，１６−ジメチルＰＧＥ、（ｉｉ）ＧＭＣＳＦ、および（ｉｉｉ）抗菌剤、鎮痛剤または麻酔剤の少なくとも一つを含んでなり、かつ皮膚幹細胞を含まない、治癒プロセスを加速することによる患者の外傷の治癒の促進に用いるための、創傷後４日目までに投与されるゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレー。
【請求項２１】
抗菌剤をさらに含んでなる、請求項１６から１８のいずれかに記載の組成物、または請求項１９に記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物。
【請求項２２】
抗菌剤が請求項５から８のいずれかに記載のものである、請求項２１に記載の組成物、請求項２１に記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物、または請求項２０に記載のゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレー。
【請求項２３】
鎮痛剤または麻酔剤をさらに含んでなる、請求項１６から１８、２１及び２２のいずれかに記載の組成物、または請求項１９、２１及び２２のいずれかに記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物。
【請求項２４】
鎮痛剤または麻酔剤が請求項１１または１２に記載のものである、請求項２３に記載の組成物、または請求項２３に記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物、または請求項２０に記載のゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレー。
【請求項２５】
皮膚透過性エンハンサーをさらに含んでなる、請求項１９または２１から２４のいずれかに記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物、または請求項２０、２２及び２４のいずれかに記載のゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレー。
【請求項２６】
皮膚透過性エンハンサーが請求項１４に記載のものである、請求項２５に記載の創傷包帯、包帯または組織シーラント組成物、または請求項２５に記載のゲル、クリーム、ローション、ペーストまたはスプレー。
【請求項２７】
組織シーラントがフィブリン接着剤を含んでなる、請求項１９、２１から２４及び２６のいずれかに記載の組織シーラント組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は治療用組成物、方法および使用、特に創傷治癒のための方法および組成物に関する。
【０００２】
創傷治癒のプロセスは、一般的に、炎症／浸出段階、増殖段階、そして分化段階の３段階からなると考えられる。およそ４日目まで続く最初の段階は、重要な意味を持ち、出血の防止、サイトカインおよび透過性エンハンサーの放出（局所浮腫をもたらす）、および細胞浸透を含む。最初に出現する主な細胞型はＶＥＧＦを分泌する血管形成好中球である（Gargett他, 2001; Mueller他, 2000）。主な好中球誘引剤ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）もまた、必ずしも直接的でないが血管形成に関与する（Strieter他, 1992; Strieter他, 1995）。血管形成は創傷修復に不可欠であり、血管新生は修復プロセスの後期と関連するが、ＣＸＣＬ８の遅発効果が必須と考えられる（Engelhardt他, 1998）。
【０００３】
好中球浸潤はマクロファージ数のより長期的な増加を伴う。ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）の発現は、実験的創傷後、最初の２４時間で上昇し、一旦損傷部位に出現した後マクロファージに分化する血中単球の流入と関連する（Engelhardt他, 1998）。これは、創傷修復が欠損したＣＣＬ２ノックアウトマウスで確認されている（Low他, 2001）。
【０００４】
ケモカインＣＣＬ−３（ＭＩＰ−１α）もまた、マウスモデルに見られたように創傷修復に重要な役割を果たすようである（DiPietro, 1998）が、ノックアウトマウスは修復になんら明白な欠損がなかった（Low他, 2001）。
【０００５】
ケモカインＣＸＣＬ７（ＮＡＰ−２）、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ（ＣＴＡＰＩＩＩ）、およびβトロンボグロブリン（ＢＴＧ）はそれぞれ共通前駆体、翻訳後タンパク質分解による血小板塩基性タンパク（ＰＢＰ）に由来する。ＣＸＣＬ７およびＣＴＡＰＩＩＩはいずれも創傷治癒の早期段階に関与し（Proudfoot他, 1997）、ＢＴＧは繊維芽細胞について走化性が高く、やはり創傷治癒に重要である（Senior他, 1983）。
【０００６】
ケモカインは通常、前炎症性とみなされる。しかし、損傷への免疫応答において、ケモカインは関連する食細胞およびサイトカイン分泌細胞を誘発し、デブリドマンおよび創傷修復の両方において極めて重要な役割を果たす。プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）は、好中球の組織内への誘引においてＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）と相乗作用するため、ケモカインとの相互作用において複数の役割を果たすようである。ケモカイン合成において、ＰＧＥはＣＣＬ３とＣＣＬ４のリポ多糖体誘発合成を抑制するとして報告されており（Jing他, 2004）、ＰＧＥはケモカイン合成において抑制作用を有すると期待されうる。
【０００７】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、顆粒球とマクロファージ系列の成熟において重要な役割を持つ。ＧＭＣＳＦは治療薬とも治療の標的とも見なされてきた。組み換えヒトＧＭＣＳＦは、いくつかの癌の治療、および骨髄移植後の造血再構成の促進に用いられてきた（Leukine（登録商標）, Package Insert Approved Text, February 1998, and Buchsel et al, 2002）。一方、他の最近の報告では、ＧＭＣＳＦを、炎症性および免疫疾患（Hamilton, 2002）および喘息（Ritz他, 2002）の治療の潜在的標的とする記述もある。
【０００８】
本発明者は以前、ＩＬ−１０合成の刺激とＩＬ−１２の阻害における、ＧＭＣＳＦと、単球においてｃＡＭＰレベルを上昇させるプロスタグランジン、例えばＰＧＥとの強制的な相乗作用を実証した（Grant et al, 2005; WO 2004/035083）。この相乗作用は、ＥＰ２および／またはＥＰ４レセプターを介してｃＡＭＰレベルを上昇させるＰＧＥの能力によるものであった。ＰＧＥとＧＭＣＳＦの作用に応答して適切にプログラムされた単球／マクロファージによって提供された、ＩＬ−１０が高くＩＬ−１２が低い環境は、免疫寛容を誘発する。加えて、本発明者は以前、免疫寛容を誘発するこのＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせは、幹細胞と共に様々な治療目的で使用できることを実証した（Grant et al, 2005; WO 2005/044298）。
【０００９】
Sheibanie他（2004）は、樹状細胞におけるＰＧＥとＧＭＣＳＦとの相乗作用を報告し、関節リウマチといった自己免疫疾患に対する併用療法を提案した。この論文は、比較的新しく発見されたサイトカインであるが他の何よりもＩＬ−１２のように見えるＩＬ−２３との組み合わせの効果をテーマにしている。
【００１０】
ヒトの精漿中にＥシリーズのプロスタグランジンが多く含まれていることから、これらの物質は精液沈着後の女性生殖器官の細胞の免疫プログラミングへの重要な寄与因子らしいことが認識されてきた。明らかに精子は種の存続に重要であるゆえに、進化的圧力により、致死的な免疫応答がこれらの同種異系の侵入者に向けられることがないことが保証されたのだろう。実際、免疫認識と精子の受容はまた、栄養膜への侵入による母体の血管の十分なコロニー形成を容易にしうる（Robillard他, 1994）。精子の免疫学的受け入れは、進化のどこかの時点で、男性または女性生殖管のいずれかで慢性感染が現れたとき、または繰り返されたとき、特に困難であっただろう。（精液および他のどこかからの）プロスタグランジンのさらに微妙な作用は、上皮細胞と固有層（lamina propria）の細胞とによって引き起こされた、ＧＭＣＳＦとの相互作用に伴って生じる。精液沈着した場合、ＧＭＣＳＦ合成は、ヒト精漿において高レベルで見られるＴＧＦβの作用によってより良く刺激されうる（Robertson & Seamark, 1990）。
【００１１】
この免疫学的受精試験の延長で、本発明者はヒト精漿（ＨＳＰ）とＧＭＣＳＦの組み合わせの、単球細胞モデル（ＭＬ１細胞）における３２，８００の遺伝子の発現に対する影響を調査した。予期せぬことに、本発明者は単球細胞からのケモカイン放出の顕著な刺激があることを発見した。驚くべきことに、発現が最も増加した３つの遺伝子はＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびｐｒｏ−ＰＢＰであった（表２参照）。本発明者は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦを用いてマイクロアレイ発現試験を繰り返し、単球細胞からのケモカイン放出の刺激に類似パターンを発見した。この試験において、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびｐｒｏ−ＰＢＰは、発現レベルが上昇した上位８個の遺伝子に含まれた（表３参照）。ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびｐｒｏ−ＰＢＰの発現増加は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの相乗効果に起因するタンパク質放出試験とＲＴ−ＰＣＲによって確認された（実施例１参照）。
【００１２】
表２はまた、ＧＭＣＳＦとの組み合わせにおけるｃＡＭＰ上昇剤ホルスコリンに対する応答の相対的欠如を示す（３列目、５列目参照）。よって、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびｐｒｏ−ＰＢＰの発現増加は、第一に細胞内ｃＡＭＰの増加によるものではなく、したがって、ｐｒｏ−耐性サイトカインＩＬ−１０の発現増加を引き起こすものとは異なるメカニズムの結果であるように見える。
【００１３】
ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによるケモカイン誘発パターンは、創傷修復の第一段階の終期に似ているため、本発明者は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせが創傷修復の加速または促進に利用できることを、創傷治癒のラットモデルにおいて理解した。学説に縛られることなく、本発明者は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦは単球を、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ７放出の増加を特徴とするｐｒｏ−創傷治癒表現型に極性化すると考える。加えて、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの効果は、これらの物質の除去後、延長および持続し、よって細胞は選択的に分化する。
【００１４】
特に、治癒の遅い創傷、例えば血管新生に乏しい皮膚部分の創傷の治癒が、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの局所投与によって加速または促進されうる。また、老人など、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ７等のサイトカイン分泌能が最適でないため白血球を誘引せず、創傷組織から治癒誘発サイトカインが奪われる患者の創傷は、この治療が有益である。実際、それ以外は健康な患者において皮膚創傷および外科手術による創傷など、より広い範囲の用途で、創傷治癒の加速に適用されている。また、クローン病または潰瘍に関連するような胃腸障害での創傷修復を加速または促進できるとも考えられる。
【００１５】
本発明者が認識する限り、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせが、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２およびＰＢＰ−ＣＸＣＬ７の発現、および／または単球細胞での放出を刺激するために利用可能であるという示唆はこれまでに一度もなく、この組み合わせを用いてＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２およびＰＢＰ−ＣＸＣＬ７を刺激する処方計画を示唆するものもなかった。
【００１６】
さらに、本発明者が認識する限り、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせが、創傷治癒に治療的に有用でありうるという示唆もこれまでなかった。
【００１７】
また、本発明者は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせが、単球細胞においてＣＯＸ−２、ＣＤ１４およびカルグラヌリンＡおよびＢの発現を増加することを示す。ＣＯＸ−２は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦ除去後のｐｒｏ−創傷治癒表現型の持続に関与すると考えられる一方で、ＣＤ１４は分化マーカーであり、より分化した状態の証拠である。カルグラヌリン（Ｓ１００タンパク質）はまた、天然の抗菌剤であり、天然の抗菌作用がうまく創傷治癒を助けると思われるため、創傷治癒に適切である。さらに、本発明者は、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの組み合わせが、いずれも創傷治癒プロセスの要素である血管形成とＮｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子の発現を促進するという証拠をここで提供する。
【００１８】
本発明の第一の態様は、（ｉ）プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）またはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）またはその誘導体を患者に投与することを含んでなる、患者における創傷治癒を促進する方法を提供する。
【００１９】
「創傷治癒を促進する」とは、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの局所濃度または効果を増加する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体が、創傷の治癒を加速または促進する創傷部位においてサイトカイン環境を提供することを意味する。言い換えれば、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの局所濃度または効果を増加する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、創傷治癒の第一段階に必要なＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ７といったサイトカインの放出を刺激し、よって創傷治癒を促進する。創傷治癒の第一段階は、およそ４日目まで続く。したがって、最初の４日目までに創傷治癒を加速することで、創傷治癒が促進される。
【００２０】
さらに、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体の組み合わせによって誘引された白血球もさらにＰＧＥに富んだ環境により分化され、好中球の低減または活性化の変化がもたらされ、これは創傷治癒に有利である。
【００２１】
プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）は、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を意味する。ＰＧＥ２は、例えばPharmacia and UpjohnからProstin E2として市販されている。
【００２２】
ＰＧＥアゴニストは、そうである必要はないが、ＥＰ２またはＥＰ４レセプター等のＥＰレセプターに結合するプロスタノイドであってよい。ＧＭＣＳＦと、アデニル・シクラーゼとタンパク質キナーゼＡ経路の刺激因子であるホルスコリンとの組み合わせは、表２に示すようにｐｒｏ−創傷治癒サイトカインのレベルの上昇に全く役立たないので、ＰＧＥとＧＭＣＳＦの効果は、ｃＡＭＰレベルの上昇だけによるものではない。よって、ＰＧＥまたはそのアゴニストは、必ずしも、通常ＰＧＥ類に用いられるレセプターであるＥＰ２またはＥＰ４レセプターを介して作用するわけではないだろう。学説に縛られることなく、本発明者は、ＰＧＥが一度に一以上のＥＰレセプター（ＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ４レセプターを含む）に、または異なるプロスタグランジンレセプターを介して、または異なる経路を介してＥＰ２またはＥＰ４レセプターに作用しうると考える。
【００２３】
ＰＧＥアゴニストとは、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３またはＥＰ４レセプターといった、プロスタグランジンＥレセプターに対してＰＧＥアゴニストとして作用する任意の化合物を意味する。好ましくは、ＰＧＥアゴニストはＰＧＥ２の類似体である。合成類似体は、メチル基の追加によって位置１５または１６で修飾されたもの、またはヒドロキシルが位置１５から１６に転位したものを含む。好ましくはＰＧＥの類似体は、例えば１６，１６−ジメチルＰＧＥおよび１９−ヒドロキシＰＧＥ（１９−ＯＨ  ＰＧＥ１および１９−ＯＨ  ＰＧＥ２の両方）である。誤解を避けるために、ＰＧＥなる用語は、合成ＰＧＥ類似体と同様に天然由来のＰＧＥ類も含む。
【００２４】
適切なＰＧＥ類またはそのアゴニストとしては、ジノプロストン（欧州のFerringおよび米国のForestからPropessとして販売；PharmaciaからプロスチンＥ２として販売）、ミソプロストル（Searle and PharmaciaからCytotecとして販売）、アルプロスタジル（PharmaciaからCaverject、SchwarzからViridal、そしてAstraZenecaからMUSEとして販売）、およびリマプロストが挙げられる。
【００２５】
ミソプロストルは、ＥＰ２およびＥＰ３アゴニスト効果を持つＰＧＥ類似体である。その化学構造は（±）メチル１１α，１６−ジヒドロキシ−１６−メチル−９−オクソプロスト−１３−エノアートである。
【００２６】
好適なＰＧＥアゴニストはＥＰ１０９７９２２およびＥＰ１１１４８１６に記載されており、参照によりここに組み込む。他の適切なＰＧＥアゴニストとしては、ＵＳ特許第4,127,612号に記載の１９−ＯＨ  ＰＧＥ類似体のいずれかが挙げられ、参照によりここに組み込む。
【００２７】
ＰＧＥの局所濃度を上昇させる作用剤とは、例えば酵素活性またはＰＧＥ前駆体の局所濃度を上昇することでＰＧＥの合成を増強する作用剤、ＰＧＥの異化を阻害する作用剤、またはＰＧＥの創傷部位への誘引に役立つ作用剤を意味する。ＰＧＥの効果を増大する作用剤とは、例えばＰＧＥレセプターの数を増加する作用剤である。
【００２８】
ＰＧＥの合成を増強する適切な作用剤としては、シクロオキシゲナーゼ１および２のアクチベーター、および全てのプロスタグランジンの前駆体であるアラキドン酸を生成するホスホリパーゼのアクチベーターが挙げられる。ＰＧＥの異化を阻害する適切な作用剤としては、プロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤＨｓ）のインヒビターが挙げられる。作用剤はＰＧＤＨのインヒビターであることが好ましい。適切なＰＧＤＨのインヒビターとしては、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Mann他, 2006）およびペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）アゴニスト（Cho and Tai, 2002）がある。ＰＰＡＲアゴニストの創傷治癒への関与は最近立証された。特に、ピオグリタゾンが胃保護および潰瘍治癒特性を示すことが明らかとなった（Brzozowski他, 2005）。加えて、ＥＧＦは創傷治癒を加速することが実証され（Tanaka他, 2005）、足の糖尿病性壊疽の治癒を増強することが示された（Hong他, 2006）。
【００２９】
「ＧＭＣＳＦ」には、ヒトＧＭＣＳＦ遺伝子の遺伝子産物とその天然由来の変異体が含まれる。ヒトＧＭＣＳＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００７５８で見られ、図１（それぞれ配列番号：１および２）に示す。いくつかのＧＭＣＳＦ天然由来変異体もＮＭ＿０００７５８に記載されている。ＧＭＣＳＦはまたコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても知られる。
【００３０】
本発明は、野生型ＧＭＣＳＦの生物活性を保持する、つまりそれらの前駆細胞から顆粒球およびマクロファージの産生を刺激し、そしてＰＧＥの存在下で相乗的に単球のＣＸＣＬ−８（ＩＬ−８）発現を引き起こすＧＭＣＳＦ誘導体を使用することを含む。
【００３１】
ＧＭＣＳＦの「誘導体」とは、その類似体のフラグメント、融合または修飾、またはそのフラグメントの融合または修飾を含む。
【００３２】
ＧＭＣＳＦの「フラグメント」とは、それらの前駆細胞から顆粒球およびマクロファージの産生を刺激し、そしてＰＧＥの存在下で相乗的に単球のＣＸＣＬ−８（ＩＬ−８）発現を引き起こす糖タンパク質のいずれかの部分を意味する。典型的には、フラグメントは、全長ＧＭＣＳＦの少なくとも３０％の活性を有する。好ましくは、フラグメントは、全長ＧＭＣＳＦの活性の少なくとも５０％、より好適には少なくとも７０％、さらに好適には少なくとも９０％を有する。最も好適には、フラグメントは全長ＧＭＣＳＦの１００％かそれ以上の活性を有する。
【００３３】
誘導体は、タンパク質化学技術を用いて、例えば部分的タンパク質分解によって、またはデノボ合成によって製造できる。あるいは、誘導体は組み替えＤＮＡ技術によって製造できる。核酸のクローニング、操作、修飾および発現、および発現したタンパク質の精製のための適切な技術は当業者にはよく知られており、例えばSambrook他 (2001) “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, 3rd edition, Sambrook他（編）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されており、参照によりここに組み込む。
【００３４】
本発明はまた、それらの前駆細胞から顆粒球およびマクロファージの産生を刺激し、そしてＰＧＥの存在下で相乗的に単球のＣＸＣＬ−８（ＩＬ−８）発現を引き起こす、全長ＧＭＣＳＦまたはそのフラグメントの修飾体を含む。
【００３５】
このような修飾体は、糖タンパク質の完全または部分的な脱グリコシルを含む。他の修飾体は、天然由来のヒトＧＭＣＳＦに見られるものと異なる糖鎖付加パターンを持つ、全長ＧＭＣＳＦまたはそのフラグメントを含む。
【００３６】
全長ＧＭＣＳＦまたはそのフラグメントの他の修飾体は、一以上の位置での、保存的または非保存的なアミノ酸挿入、欠失、および置換を含む。こういった修飾体はＧＭＣＳＦの類似体と呼ばれうる。「保存的置換」とは、Ｇｌｙ， Ａｌａ； Ｖａｌ，Ｉｌｅ， Ｌｅｕ； Ａｓｐ， Ｇｌｕ； Ａｓｎ， Ｇｌｎ； Ｓｅｒ， Ｔｈｒ； Ｌｙｓ， Ａｒｇ；およびＰｈｅ， Ｔｙｒといった組み合わせを指す。このような修飾体は、Sambrook他, 2001, 上掲に記載のように、タンパク質工学法および部位特異的突然変異誘発法を利用して製造できる。好ましくは、修飾ＧＭＣＳＦまたは修飾ＧＭＣＳＦフラグメントは、全長ＧＭＣＳＦまたは各ＧＭＣＳＦフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を保持する。より好ましくは、修飾ＧＭＣＳＦまたは修飾ＧＭＣＳＦフラグメントは、全長ＧＭＣＳＦまたは各ＧＭＣＳＦフラグメントと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の配列同一性を持ち、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を保持する。好適には、修飾ＧＭＣＳＦまたは修飾ＧＭＣＳＦフラグメントは、全長ＧＭＣＳＦの少なくとも３０％の活性を有する。好ましくは、修飾ＧＭＣＳＦまたは修飾ＧＭＣＳＦフラグメントは、全長ＧＭＣＳＦの活性の少なくとも５０％、より好適には少なくとも７０％、さらに好適には少なくとも９０％を有する。最も好適には、修飾ＧＭＣＳＦまたは修飾ＧＭＣＳＦフラグメントは全長ＧＭＣＳＦの１００％かそれ以上の活性を有する。
【００３７】
本発明はまた、全長ＧＭＣＳＦまたはそのフラグメントの他の化合物への融合を使用することを含む。好ましくは、融合は全長ＧＭＣＳＦの活性の少なくとも３０％を有する。より好ましくは、融合は全長ＧＭＣＳＦの活性の少なくとも５０％、より好適には少なくとも７０％、さらに好適には少なくとも９０％を有する。最も好適には、融合は全長ＧＭＣＳＦの１００％かそれ以上の活性を有する。
【００３８】
ＧＭＣＳＦおよびその類似体は、以下の出版物に記載されており、それぞれを参照によりここに組み込む：ＵＳ特許第5,229,496号（Deeley他）；ＵＳ特許第5,391,485 号（Deeley他）；ＵＳ特許第5,393,870号（Deeley他）；ＵＳ特許第5,602,007号（Dunn他）；Wong他, 1985；Lee他, 1985；Cantrell他, 1985；およびMiyatake他, 1985。
【００３９】
上述したようにＧＭＣＳＦはヒトＧＭＣＳＦであることが好ましいが、ＧＭＣＳＦとは他種由来のＧＭＣＳＦも含む。ＧＭＣＳＦをヒト以外の対象に投与する場合、ＧＭＣＳＦはその対象と同種由来のものであることが好ましい。ＧＭＣＳＦがヒトを対象として投与される場合、そのＧＭＣＳＦはヒトＧＭＣＳＦまたはその誘導体であることが好ましい。
【００４０】
本発明の実施に好適なＧＭＣＳＦは、Peprotech EC Ltd., 29 Margravine Road, London, W6 8LL, カタログ番号300-03から入手可能である。
【００４１】
本発明の実施に好適なＧＭＣＳＦは、サルグラモスティム（sargramostim）、Immunex, Inc.により製造されＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）の商品名で販売されている酵母由来の組み換えヒトＧＭＣＳＦの正式名称、である。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、Ｓ．セレヴィシエ発現系で産生される組み換えヒトＧＭＣＳＦである。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、１９，５００、１６，８００および１５，５００ダルトンの分子量を有する３プライマリー分子種を特徴とする１２７アミノ酸のグリコプロテインである。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）のアミノ酸配列は、位置２３でロイシンに置換されて天然ヒトＧＭＣＳＦと異なり、炭水化物成分が天然タンパク質と異なりうる。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、皮下または静脈投与に適している（Leukine（登録商標）Package Insert Approved Text, February 1998）。
【００４２】
本発明の実施に適した他のＧＭＣＳＦは、モルグラモスティム（molgramostim）、Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）（Schering-Plough）の商品名で販売されている大腸菌由来の組み換えヒトＧＭＣＳＦの正式名称、である。Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）は、大腸菌発現系で産生される組み換えヒトＧＭＣＳＦである。Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）は、水溶性の、１４，４７７ダルトンの分子量を有する１２７アミノ酸の非グリコシル化タンパク質である。Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）のアミノ酸配列は、位置１００でイソロイシンに置換されて天然ヒトＧＭＣＳＦと異なる。Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）は、粉末として利用可能であり、一旦再構成されると皮下または静脈投与に適している（Leukomax（登録商標） Data Sheet, November 2002）。
【００４３】
本発明の実施に適したさらなるＧＭＣＳＦは、レグラモスティム（regramostim）、ＣＨＯ由来の組み換えヒトＧＭＣＳＦの正式名称、である。レグラモスティムは、サルグラモスティムより高くグリコシル化された１２７アミノ酸の組み換えヒトＧＭＣＳＦである。
【００４４】
典型的には、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体が組み換え技術によって産生される場合、それは産生元の細胞から精製されてできる。よって、本発明の実施形態では、細胞が患者に投与されることはない、つまり創傷治癒を促進するために投与される治療用組成物に細胞は存在しない。
【００４５】
ＧＭＣＳＦおよびその誘導体は、ポリペプチド（グリコシル化されているか否かは問わず）として患者に投与される。あまり好ましくない実施形態では、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体をコード化するポリヌクレオチドの形態で患者に投与してよい。あるいは、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体をコード化するポリヌクレオチドの形態で患者に投与されない。
【００４６】
そうでないことを示さない限り、「ＧＭＣＳＦ」なる用語を使用している場合、ここで定義したような誘導体が含まれる。
【００４７】
投与するＰＧＥまたはそのアゴニストの適切な用量は、典型的に０．０１〜１００μｇの範囲である。好ましくは、ＰＧＥまたはそのアゴニストの量は、０．０５〜５０μｇの範囲である。典型的には、０．１〜５μｇ、または５〜２０μｇ、または２０〜５０μｇが投与されうる。ＰＧＥの効果または局所濃度を増大する適切な用量の作用剤が医師により投与されてもよい。典型的には、その量は０．０１〜１００μｇの範囲である。
【００４８】
投与するＧＭＣＳＦまたはその誘導体の適切な用量は、典型的に０．０１〜４００μｇの範囲である。好ましくは、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体の量は、０．０５〜２００μｇの範囲である。典型的には、０．１〜５μｇ、または５〜５０μｇ、または５０〜２００μｇが投与されうる。
【００４９】
好ましくは、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体の一方または両方が、患者の創傷部位に局所投与される。より好ましくは、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体が患者の創傷部位に局所投与される。
【００５０】
好適な実施形態で、治療する創傷は、無菌創傷である、つまり創傷は感染性でない。創傷が感染性である場合、例えば抗菌剤の投与によって殺菌できる。しかしながら、もちろん、無菌創傷の治療でも感染を防ぐために抗菌剤を使用できる。
【００５１】
よって、典型的には、本方法はさらに、患者に抗菌剤を投与することを含んでなってよい。ある実施形態で、抗菌剤は患者の創傷部位に局所投与される。適切な抗菌剤には、当業者には周知のように、抗バクテリア剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤が含まれる。抗バクテリア剤としては、例えば、天然および合成ペニシリンおよびセファロスポリン、スルホンアミド、エリスロマイシン、カナマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシンが挙げられ、および、ゲンタマイシン、アンピシリン、ベンジペニシリン、ベネタミンペニシリン、ベンザチンペニシリン、フェネチシリン、フェノキシ−メチルペニシリン、プロカインペニシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリンナトリウム、アモキシシリン、塩酸バカンピシリン、シクラシリン、メズロシリン、ピバンピシリン、塩酸タランピシリン、カルフェシリンナトリウム、ピペラシリン、チカルシリン、メシリナム、ピルメシリナン、セファクロール、セファドロキシル、セフォタキシム、セフォキシチン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフロキシム、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフラジン、セフピロム、ラタモキセフジソジウム、アズトレオナム、グリシルサイクリン系のもの、塩酸クロルテトラサイクリン、クロモサイクリンナトリウム、塩酸デメクロシジン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、アミカシン、硫酸フラマイセチン、硫酸ネオマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、コリスチン、フシジン酸ナトリウム、フピロシン、硫酸ポリミキシンＢ、スペクチノマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、スルファルオキサートカルシウム（calcium sulphaloxate）、スルファメトピラジン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファグアニジン、スルファウレア、カプレオマイシン、メトロニダソール、チニダゾール、シノキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、ニトロフラントイン、ヘキサミン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、硫酸コリスチン（colistimethate）、ポリミキシンＢ、フラゾリドン、ナリジクス酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、リンコマイシン、シクロセリン、イソニアジド、エタンブトール、エチオナミド、ピラジンアミド、メロペネム、イミペネムなどを含み；抗真菌剤としては、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシン、フルシトシン、グリセオフルビン、ナタマイシン、ニスタチンなどが挙げられ；そして、抗ウイルス剤としては、アシクロビア、ＡＺＴ、ｄｄＩ、塩酸アマンタジン、イノシンプラノベクス、ビダラビンなどが挙げられる。
【００５２】
本方法はまた、患者の創傷部位に、鎮痛剤または麻酔剤を局所投与することを含みうる。適切な鎮痛剤としては、サルチル酸メチル、サリチル酸、ジクロニン、およびアロエベラがある。適切な局所麻酔剤としては、ベンゾカイン、リドカイン、キシロカイン、またはブタンベンピクラート（butamben picrate）がある。
【００５３】
好適な実施形態において、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、ここで記述した他の任意の活性剤のいずれかと共に、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤（その組み合わせを含む）を含む医薬組成物として投与される。担体、希釈剤、または賦形剤は、本発明の活性作用剤と適合し、受容体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。典型的に、担体は無菌で発熱物質のない生理食塩水または水である。治療的に使用する許容可能な担体または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, 2005, ISBN: 0-7817-4673-6)に記載されている。医薬担体、賦形剤、または希釈剤は、意図する投与ルートおよび標準的な薬務を考慮して選択できる。
【００５４】
医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適切なバインダー（類）、潤滑剤（類）、懸濁化剤（類）、コーティング剤（類）、または可溶化剤（類）からなってよい。保存料、安定剤、染料、および着香料でさえ医薬組成物の形態で提供されうる。保存料としては、例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびパラオキシ安息香酸エステル類がある。抗酸化剤および懸濁化剤も使用できる。
【００５５】
典型的に、本方法は、外傷の治癒の促進に使用できる。
【００５６】
当該実施形態で、本方法はさらに、患者の創傷部位に皮膚透過性エンハンサーを局所投与することを含んでなってよい。皮膚透過性エンハンサーとは、活性剤（類）の経皮トランスファー、デリバリー、または浸透の増加を可能にする作用剤、または分散剤を意味する。適切な皮膚透過性エンハンサーは、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）などである。適切な皮膚透過性エンハンサーは、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／または、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体と適合するもの（例えばその溶剤）である。
【００５７】
本発明の実施形態においては、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体、および任意で、抗菌剤および／または鎮痛剤および／または麻酔剤および／または皮膚透過性エンハンサーを、創傷治癒の促進のための単独活性剤として投与する。
【００５８】
通常、上述した活性剤のいずれかまたは全て（ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体、および任意の皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および麻酔剤）を創傷治癒および健常な皮膚発生のために局所投与することができる。活性剤は、スプレー、泡、粉末、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、または溶剤として、選択された組織に直接または間接的に任意の手段によって局所投与されうる。ローション、クリーム、ゲル、およびペーストなる用語には、粘性の塗り広げることができる組成物および軟膏、例えば多くの場合皮膚に直接適用されるもの、または包帯や創傷包帯に塗り広げられるもの、が含まれる。活性剤は、皮膚被覆材または創傷包帯に共有結合しているか、安定的に吸収されているか、そうでなければ塗布されていてよい。外科手術後の治癒を容易にするために、活性剤は標的組織または人工器官に直接適用されてもよい。組成物は、泡または霧状で他の薬剤と共に皮膚または創傷に直接エアロゾル投与できる。
【００５９】
医薬剤形でのＰＧＥまたはそのアゴニストの適切な濃度は、典型的には０．０１〜１００μｇ／ｍｌの範囲である。好ましくは、ＰＧＥまたはそのアゴニストの濃度は０．０５〜５０μｇ／ｍｌの範囲である。より好ましくは、０．１〜１μｇ／ｍｌ、または１〜１０μｇ／ｍｌ、または１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度が採用されうる。ＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤の適切な濃度は、典型的には０．０１〜１００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００６０】
医薬剤形でのＧＭＣＳＦまたはその誘導体の適切な濃度は、典型的には０．０１〜５０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましくは、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体の濃度は０．０５〜２５μｇ／ｍｌの範囲である。より好ましくは、０．１〜１μｇ／ｍｌ、または１〜１０μｇ／ｍｌ、または１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度が採用されうる。
【００６１】
スプレー、泡、粉末、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、および溶剤の薬剤調製は当業者に極めて周知である（例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, 2005, ISBN: 0-7817-4673-6参照）。
【００６２】
ＵＳ特許第6,251,423号（Smith & Nephew）には、患者に局所適用、または包帯または創傷包帯の表面に塗布できる殺菌可能なペーストまたはクリーム剤形が記載されている。
【００６３】
適切な創傷包帯は当業者に極めて周知で、いくつかが例えばＵＳ特許第6,191,335号；5,792,089号；5,662,924号および4,460,369号（Smith & Nephew）に記載されており、それぞれを参照によりここに組み込む。創傷包帯は、例えばHarvey 2005；Vermeulen他, 2005；Menaker, 2004；およびLionelli & Lawrence (2003)にて確認され、それぞれを参照によりここに組み込む。
【００６４】
他の実施形態において、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、他の任意の活性剤のいずれかと共に、フィブリン接着剤などの組織シーラントの成分として投与されうる。フィブリン接着剤は一般的に：（１）フィブロネクチン、ＸＩＩＩ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子を含む濃縮フィブリノゲン；（２）乾燥ヒトまたはウシトロンビン；および（３）カルシウムイオンから調製される。市販のフィブリン接着剤は多くはウシ成分を含みうる。濃縮フィブリノゲンは、寒冷沈降反応とその後の分画によって血漿から調製でき、トロンビンおよびカルシウムイオンといったトロンビンアクチベーターと混合してシーラントまたは血栓を形成する組成物を産出する。濃縮フィブリノゲンおよびトロンビンは、凍結乾燥の形態で調製され、使用直前に塩化カルシウム溶液と混合される。混合後、当該成分が組織に適用されると、組織表面上で凝固し、架橋フィブリンを含む血栓を形成し、よってＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体を創傷部位に保持する。フィブリン接着剤や添加フィブリン接着剤を含む適切な組織シーラント組成物は、当業者に極めて周知で、Spotnitz & Prabhu (2005)、MacGillivray (2003)、Clark (2003)、およびAlbala (2003)で確認され、それぞれを参照によりここに組み込む。
【００６５】
他の実施形態において、一または複数の活性剤が、典型的には活性剤の放出制御のために、活性剤（類）を創傷に送達する埋め込み型装置で投与されうる。適切な埋め込み型装置は当業者に周知で、例えばＵＳ特許出願第2004/0034357号（Smith & Nephew）に記載されている。活性剤、特にＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、ミクロスフィアに内包でき、活性剤の同時放出制御のために投与できる。
【００６６】
さらなる実施形態において、一または複数の活性剤は注射によって投与される。
【００６７】
好ましくは、任意の二つ以上の活性剤が同時に投与される。
【００６８】
また、好ましくは、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、同一ルートで投与される。
【００６９】
本方法は、内部外科創傷の治癒促進にも使用できる。しかしながら、他の創傷治癒治療の形態と異なって、本方法は、創傷ができる前に治癒促進環境をもたらすのに役立つ。よって、本方法は手術を受けようとする患者に局所的な治癒促進環境をもたらすのに有用である。手術中または完了後の投与の継続がさらに効果的であろう。
【００７０】
特定の患者に治療の有効性が見込めるか否かは、医師によって決定されうる。
【００７１】
本方法はまた、クローン病に関連するような胃腸障害または潰瘍と闘うことに有用であるのが好ましい。特定の疾患または状態と「闘う」とは、その特定の疾患または状態の症状を治療、予防または改善することを含む。
【００７２】
このような実施形態において、経口で、特に放出制御製剤で投与されてよい。あるいは、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体の一方または両方は、坐薬またはカプセルとして投与されてもよい。座薬またはカプセルは、患者の腸で活性剤が放出されるように腸溶コーティングされていてよい。
【００７３】
妊娠は、本発明に禁忌でありうる。実際に、妊娠は、ミソプロストールを含むいくつかのプロスタグランジンに禁忌である。サイトテック（Cytotec）（ミソプロストール）は、低血圧を引き起こさないが、本発明の方法によって起こりうるリスクである。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明は、皮膚幹細胞といった幹細胞を患者に投与することを含まない。
【００７５】
別の特定の実施形態において、本発明は、ＧＭＣＳＦを発現するように遺伝子組み換えされた複数の脊椎動物細胞と；固体基質と関連するＰＧＥ１またはＰＧＥ２と；複数のマイクロキャリアとを含むコラーゲン基質を含んでなる固体基質の形態で、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体を投与することを含まない。
【００７６】
また別の特定の実施形態において、本発明は、ＧＭＣＳＦを発現するように遺伝子組み換えされた複数の脊椎動物細胞と；複数のマイクロキャリアと；ＰＧＥ１またはＰＧＥ２とを含んでなる組成物の形態で、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体を投与することを含まない。
【００７７】
本発明の第二の態様は、患者の創傷治癒を促進するための薬剤の調製において、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を使用することを提供する。よって、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、患者に投与する前に同一の薬剤に混合されていてよい。
【００７８】
本発明の第三の態様は、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤が投与されている患者の創傷治癒を促進するための薬剤の調製において、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を使用することを提供する。よって、患者は、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体の投与前に既にＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤が投与されていてもよく、またはＧＭＣＳＦまたはその誘導体と同時にＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤が投与されてもよく、またはＧＭＣＳＦまたはその誘導体の投与後にＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤が投与されてもよい。
【００７９】
本発明の第四の態様は、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体が投与されている患者の創傷治癒を促進するための薬剤の調製において、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤を使用することを提供する。よって、患者は、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤の投与前に既にＧＭＣＳＦまたはその誘導体が投与されていてもよく、またはＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤と同時にＧＭＣＳＦまたはその誘導体が投与されてもよく、またはＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤の投与後にＧＭＣＳＦまたはその誘導体が投与されてもよい。
【００８０】
本発明の第二、第三、第四の態様について、ＰＧＥ、そのアゴニスト、およびＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤の選択、ＧＭＣＳＦおよびその誘導体の選択、投与ルート、用量などは、本発明の第一の態様に関して上記で定義されたとおりである。
【００８１】
好ましくは、本発明の第二、第三、第四の態様において上述された薬剤もまた、皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および／または麻酔剤を含んでなっていてよい。さらに好ましくは、本発明の第二、第三、第四の態様において上述された薬剤は、皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および／または麻酔剤が投与された患者の創傷治癒を促進するためのものであってよい。皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および／または麻酔剤は、本発明の第一の態様について上述したように選択される。
【００８２】
好適には、本発明の第二、第三、第四の態様において上述された薬剤は、患者の創傷部位に局所投与するために調剤される。薬剤は、上述したようにゲル、クリーム、ローション、ペースト、パッチ、またはスプレーの形態で調剤されてよい。あるいは、薬剤は、上述したように創傷包帯、包帯、または組織シーラントの形態で形成されてよい。さらには、薬剤は注射によって投与されるように調剤されてよい。
【００８３】
薬剤は、外傷または内部外科創傷の治癒の促進に適しうる。
【００８４】
薬剤はまた、クローン病に関連する創傷または潰瘍といった内部創傷の治癒の促進にも適しうる。よって、本発明は、クローン病または潰瘍と闘う薬剤の調製において、本発明の第二、第三、第四の態様において定義した（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体、および、任意で上述した他の活性剤のいずれかを使用することを含む。この実施形態において、薬剤は、上述したように経口投与用に、または坐薬またはカプセルとして調剤されてよい。
【００８５】
本発明の第五の態様は、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を含んでなる創傷包帯、包帯、または組織シーラントを提供する。
【００８６】
ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体は、本発明の第一の態様について上記で定義したように選択される。
【００８７】
ある実施形態では、創傷包帯、包帯、または組織シーラント組成物はさらに、皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および／または麻酔剤のいずれか一または複数を含んでなる。皮膚透過性エンハンサー、抗菌剤、鎮痛剤および／または麻酔剤は、本発明の第一の態様について上記で定義したように選択される。
【００８８】
典型的には、創傷包帯、包帯、または組織シーラント組成物は、上述したように、外傷への適用に適している。別の実施形態では、創傷包帯、包帯、または組織シーラント組成物は、上述したように、内部外科創傷への適用に適していてよい。
【００８９】
本発明の第六の態様は、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体、および（ｉｉｉ）抗菌剤、鎮痛剤および麻酔剤から選択された少なくとも一のさらなる作用剤を含んでなるゲル、クリーム、ローション、ペースト、またはスプレーを提供する。
【００９０】
ＰＧＥまたはそのアゴニスト、ＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体、抗菌剤、鎮痛剤、および麻酔剤は、本発明の第一の態様について上記で定義したように選択される。
【００９１】
ある実施形態において、ゲル、クリーム、ローション、ペースト、またはスプレーは、抗菌剤、鎮痛剤、および麻酔剤のいずれか二つまたは複数を含んでなる。
【００９２】
ある実施形態において、ゲル、クリーム、ローション、ペースト、またはスプレーはさらに、本発明の第一の態様について上記で定義したような皮膚透過性エンハンサーを含んでなる。
【００９３】
典型的には、ゲル、クリーム、ローション、ペースト、またはスプレーは、外傷への適用に適している。別の実施形態では、ゲル、クリーム、ローション、ペースト、またはスプレーは、内部外科創傷への適用に適していてよい。
【００９４】
本発明者は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦが、マクロファージ／単球系列の細胞でＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＰＢＰ−ＣＸＣＬ７の発現を増進することを示した。「マクロファージ／単球系列の細胞」には、単球前駆体由来の細胞が含まれ、マクロファージおよび単球が含まれる。
【００９５】
本発明の第七の態様は、マクロファージ／単球系列の細胞でＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＰＢＰの発現を増進または刺激する方法を提供し、当該方法は、細胞に（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を投与することを含んでなる。
【００９６】
本発明はまた、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を投与することによって、マクロファージ／単球系列の細胞からのＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＣＸＣＬ７の分泌を増進または刺激する方法を含む。
【００９７】
本方法は、インビトロまたはエクスビボで実施できる。あるいは、本方法はインビボで実施してもよい。
【００９８】
本発明の当該態様は、マクロファージ／単球系列の細胞でＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＰＢＰの発現を増進または刺激するための薬剤の調製において、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を使用することを含む。
【００９９】
同様に、本発明は、マクロファージ／単球系列の細胞でＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＣＸＣＬ７の分泌を増進または刺激するための薬剤の調製において、（ｉ）ＰＧＥまたはそのアゴニストおよび／またはＰＧＥの効果または局所濃度を増大する作用剤、および（ｉｉ）ＧＭＣＳＦまたはその誘導体を使用することを含む。
【０１００】
ここで参照した文献の全てを、参照により完全にここに組み込む。
【０１０１】
本明細書での公開済みの文献の列挙または考察は、必ずしも、その文献が最新技術の一部または一般的な常識であるとの認識として捉えられるべきではない。
【０１０２】
本発明は、これより、以下の図および実施例を用いてより詳細に説明する。
【０１０３】
実施例１：サイトカイン誘発に対するプロスタグランジンＥ／ＧＭＣＳＦの相乗作用
要約
ヒト単球モデル系における、ヒト精漿（ＨＳＰ）およびＧＭＣＳＦ、およびＰＧＥおよびＧＭＣＳＦを用いた遺伝子発現アレイ試験の結果は、サイトカイン遺伝子発現の予期せぬパターンを示した。ＨＳＰ／ＧＭＣＳＦ処方計画を用いた第一のアッセイでは、いくつかのケモカイン（走化性サイトカイン）の発現に千倍の増加が見られ、コントロールと比べて最も多く増加した３つのｍＲＮＡはケモカインであった。ケモカインの発現はｃＡＭＰ非依存性であるように見えた。ＨＳＰ／ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥ／ＧＭＣＳＦ処方計画を用いた第二のアッセイでは、いくつかのケモカインの発現に数百倍の増加が見られた。コントロールと比べて最も多く増加した８つのｍＲＮＡのうち４つがケモカインであり、これには第一のアッセイでの上位３つが含まれた。ＨＳＰ／ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥ／ＧＭＣＳＦに応答してのケモカインパターンは、創傷治癒の第一段階で見られたパターンと非常に類似していた。これらの結果は、局所投与したＰＧＥまたはその局所濃度を増大する作用剤と、ＧＭＣＳＦの介入は、創傷治癒に治療的に有用であることを示唆する。
【０１０４】
実験の詳細
遺伝子発現アレイ
Ｕ９３７またはＭＬ１（ヒト単球細胞株）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（PAA Laboratories）を添加したＲＰＭＩ（PAA Laboratories）培地で増殖させた。第一のアッセイについては、添加物なし、５ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを加えたホルスコリン（２５μＭ）または細菌ろ過した（０．２２μＭ）１％ヒト精漿（ＨＳＰ）で細胞を４８時間処理した（結果を表２に示す）。第二組のアレイは、複製の点で異なる。この第二のアッセイは、２つの複製コントロール培養物、１０−６Ｍ  ＰＧＥ＋５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦで処理した２つの培養物、そして１％ＨＳＰ＋５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦで処理した４つを含んだ（表３の結果は複製の平均値である）。
【０１０５】
細胞をペレットし、ｍＲＮＡをＴｒｉ試薬（Sigma, Poole, UK）で抽出した。クロロホルムを添加し、それに続くイソプロパノール沈殿によって全ＲＮＡを採取した。３２，８００の遺伝子からなるＡＢＩ／Ｃｅｌｅｒａアレイを用いてサンプルを分析した。
【０１０６】
全ＲＮＡの濃度と質を、分光光度法（Nanodrop）およびバイオアナライザー（Agilent）で評価した。続いて、全てのサンプルについて、Applied Biosystems Chemiluminescent RT-IVTナノアンプ（１サイクル）ラベリングプロトコルに従ってＲＴ−ＩＶＴを実施した。ｃＲＮＡサンプルに対してＱＣプロシージャ（NanodropおよびAgilentバイオアナライザー）を実施し、ｃＲＮＡの質と量を確認した。サンプルを断片化し、続いて１６時間、Applied BiosystemsのHuman Genome Survey Microarray（Version 2）にハイブリダイズした。ハイブリダイズ後、アレイを染色し、Applied BiosystemsのChemiluminescence検出キットを用いて洗浄した。最後に、Applied BiosystemsのChemiluminescent Microarray Anlyzerを用いてアレイをスキャンした。MRC Gene-services, Cambridge, UKでアレイ試験を実施した。
【０１０７】
最初のアッセイで、発現した遺伝子（処理した細胞からのシグナルをコントロール細胞からのシグナルで除算）を順位付けし、最も多く発現した３２の遺伝子を表２に載せた。第二のアッセイで、発現した遺伝子（処理した細胞からのシグナルをコントロール細胞からのシグナルで除算）を順位付けし、最も多く発現した３２の遺伝子を表３に載せた。第二のアッセイは、統計分析を行い、コントロールに対する増進確率に従って遺伝子を順位付けした（遺伝子が異なって発現する確率の対数［塩基２］に相当するＢ値により特定）。４を超えるＢ値を有する遺伝子だけを表５および６に記載した。遺伝子発現を、遺伝子発現の増加（対数［塩基２］増加を「Ｍ」として示す）で順位付けした。また、異なって発現した遺伝子が関与した経路を表７に記載した。Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌｔｄ（Cambridge UK）が独自に開発したプログラムを用いて経路分析を行った。
【０１０８】
サイトカイン発現測定のためのＲＴ−ＰＣＲ
順位の高い遺伝子を、さらにＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎシステムを用いた定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって試験した。ＩＬ−８および複数の他の分子の増幅および検出のためのプローブとプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystems）を用いて設計した。これらの試験において、細胞のインキュベーションは上記と同一であり、純粋なＰＧＥの効果を決定し、ヒト精漿で見られた効果と同じであることがわかった。
【０１０９】
特定の遺伝子についてのｍＲＮＡを、プローブにＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ染色を用いて４０サイクル、Ｔａｑｍａｎ  ７７００装置で増幅した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットを用いて、同一の反応チューブで内在性コントロールとしてリボソーム（１８Ｓ）ＲＮＡを増幅および検出した（ＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ染色を使用）。４０サイクルの後、ＦＡＭおよび１８Ｓ（ＶＩＣ）についてＣｔ（シグナル出現のサイクル数に関連）を記録し、式２−ΔΔＣｔを用いて相対定量を行った。ここでΔは、各実行に含まれる標準的なコンパレータに関連するＦＡＭおよびＶＩＣシグナルの間の差異である。
【０１１０】
使用したプライマーは以下のとおりである：
Ｐｒｏ−ＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）登録番号ＮＭ＿００２７０４
フォワード：5’-CCAAAAACATCCAAAGTTTGGAA-3’
（配列番号３）
リバース：5’-CAGTGTGGCTATCACTTCGACTTG-3’
（配列番号４）
プローブ：5’-TGATCGGGAAAGGAACCCATTGCA-3’
（配列番号５）
ＣＯＸ−２（登録番号Ｄ２８２３５）
フォワード：5’-GTGTTGACATCCAGATCACATTTGA-3’
（配列番号６）
リバース：5’-GAGAAGGCTTCCCAGCTTTTGTA-3’
（配列番号７）
プローブ：5’-TGACAGTCCACCAACTTACAATGCTGACTATGG-3’
（配列番号８）
ＣＸＣＬ８（ＣＣＬ８，ＩＬ−８）（登録番号ＮＭ＿０００５８４)
フォワード：5’-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3’
（配列番号９）
リバース：5’-TTAGCACTCCTTGGCAAAACTG-3’
（配列番号１０）
プローブ：5’-CCTTCCTGATTTCTGCAGCTCTGTGTGAA-3’
（配列番号１１）
ＩＬ−１０
フォワード：5’-CTACGGCGCTGTCATCGAT-3’
（配列番号１２）
リバース：5’-TGGAGCTTATTAAAGGCATTCTTCA-3’
（配列番号１３）
プローブ：5’-CTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCC-3’
（配列番号１４）
【０１１１】
サイトカイン放出測定のためのＥＬＩＳＡ
培地を細胞から除去し、ＥＬＩＳＡで分析した。モノクローナル捕捉抗体を９６ウェルプレートにコーティングし、各ウェルに培養培地を添加した。組み換えタンパク質を用いて検量線を作成した。インキュベーションおよび洗浄の後、ビオチンで標識したモノクローナル抗体を添加した。さらなるインキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを添加した。洗浄後、テトラメチル・ベンジジン基質を加えて、元のサンプル／スタンダードのサイトカインの濃度に比例して発色させた。プレート光度計（Labsystems, Multiskan）を用いて色度を読み取った。
【０１１２】
下記の表１に示すように、ＣＤ１４、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、およびＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）について対を成す抗体および組み換えスタンダードをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ, Abingdon UKから得て、ＩＬ−１０について抗体をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（BD Bioscience, Erembodegem, Belgium）から得た。
表１
0005383198.tif 000002
【０１１３】
結果
表２は、コントロールと比較して発現の増加が最も高レベルであった３２の遺伝子を示す。３列目はコントロールの発現レベル；４列目はＨＳＰおよびＧＭＣＳＦでの処理後の発現レベル；５列目は３列目のレベルに対する４列目のレベルの比率である。ケモカインを太字で示す。
【０１１４】
表３のデータは、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦで刺激された遺伝子のパターンはＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦで刺激されたものと僅かに異なるが、依然としてケモカイン刺激が優位であることを示す。コントロール（３列目）に対するＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦ（４列目）のシグナル強度によって順位付けした遺伝子の上位２９個の中に１０のケモカインがランクインした。ケモカインＰＢＰ−ＣＸＣＬ７、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ８は全て、上位８つの中に入っている。
【０１１５】
これらの結果が、ＭＬ１細胞の異なるバッチと異なる処方計画を用いた、32,000の遺伝子に対する発現試験から導き出されたことを考慮すると、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦ（表３）で誘発される発現とＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦ（表２）で誘発される発現との間には非常に高い相関関係がある。
【０１１６】
このデータの別の見方は、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦ／コントロール（表３より）から最も高い順位の３２の遺伝子を取り出して、それらをＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦ／コントロールの総強度に基づいて順位付けすることである。このデータを表４に示す。これにより、増加率は高いがコントロールでは全く発現しない遺伝子の重要度が排除される。この分析は、ケモカインだけでなくカルグラニュリンの重要度も明らかにする。実際、この順位付けによると、上位１３個の遺伝子のうち７つがケモカインである。
【０１１７】
データを分析するさらなる方法は、統計的問合せ（statistical interrogation）により、コントロールに対する倍増の対数であるＭ値に従って、コントロールと比べて上方に異なって発現した遺伝子を順位付けすることである。４を超えるβ値を持つ遺伝子だけが含まれた。ここでβ値とは、遺伝子が異なって発現した確率の対数［塩基２］である。このデータを、ＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦで処理した細胞についてそれぞれ表５および６に示す。データは、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦで刺激された遺伝子のパターンはＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦで刺激されたものと僅かに異なるが、ＰＢＰ−ＣＸＣＬ７が各処理で第一位に位置する遺伝子であり依然としてケモカイン刺激が優位であることを示す。
【０１１８】
図２は、処理グループＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥ［処理１］およびコントロール（グループ２−グループ１）；ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰ［処理２］およびコントロール（グループ３−グループ１）；ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰ［処理２］およびＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥ［処理１］（グループ３−グループ２）の間で異なって発現する遺伝子の重複を表すベン図である。コントロールと比べてＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥで処理したＭＬ１細胞で異なって発現した遺伝子の殆ど（７４６遺伝子のうち７１２）は、コントロールと比べてＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰで処理したＭＬ１細胞でも異なって発現した。実際、２つの処理グループＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥとＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰで異なって発現したのは９８の遺伝子のみで、そのうち４０の遺伝子はコントロールで処理した場合と異なって発現した。総合すると、これらの観察結果は、ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰとＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥの両方の処理で誘発される発現プロファイルに高い同一性があることを明確に示す。
【０１１９】
表７は、表５および６で特定した上方に異なって発現する遺伝子が関与する経路を、有意性によって順位付けしたリストである。この表は、ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰとＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥの両方の処理について、炎症性ケモカインおよびサイトカインシグナル伝達が、異なって発現する遺伝子が関与していた最も有意な経路であることを示す。さらに、ＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥで処理した細胞で異なって発現する遺伝子が関与する１３の経路のうち１２に、ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰで処理した細胞で同定した異なって発現する遺伝子も同様に関与し、このこともまた２つの処理間の発現プロファイルの同一性を明らかにする。
【０１２０】
図３は、ＣＸＣＬ８（ＣＣＬ８、ＩＬ−８）でＧＭＣＳＦと組み合わせたときの、ＰＧＥおよびヒト精漿の両方のＣＸＣＬ８（ＣＣＬ８、ＩＬ−８）に対する相乗作用を示すグラフである。ＣＣＬ８  ｍＲＮＡ発現と、４８時間にわたる細胞からのＣＣＬ８タンパク質の放出が、この相乗作用を示す。
【０１２１】
図４は、ヒト精漿（ＨＳＰ）およびＧＭＣＳＦの低分子量分画の、培養物における４８時間後の単球ＭＬ１細胞からのケモカイン／タンパク質放出に対する相乗作用を示すグラフである。ヒト精漿の低分子量分画は、タンパク質を欠失するが、高レベルの可溶ＣＤ１４を含む。このことは、ＨＳＰ分画のみで処理した後、比較的高レベルのＣＤ１４が測定されたことを説明する。
【０１２２】
図５は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの、培養物における４８時間後の単球Ｕ９３７細胞からのケモカイン／タンパク質放出に対する相乗作用を示すグラフである。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのケモカインＣＸＣＬ８およびＣＣＬ２の放出は、ヒト精漿によるＧＭＣＳＦの相乗効果がＰＧＥによって再現されることを示す。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥはまた、可溶ＣＤ１４およびＩＬ−１０の放出に対して相乗効果を持つ。ＩＬ−１０（サイトカイン合成阻害タンパク質としても知られる）は、それが「阻害」サイトカインであり、例えばマスト細胞から放出されるヒスチミンなどの不要な興奮性物質の抑制が見込まれる点で関連性がある。ＣＤ１４はマクロファージ系列のマーカーである。
【０１２３】
図６は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによる前処理の、ＭＬ１細胞におけるＩＬ−８およびＣＯＸ−２の発現に対する効果を示すグラフである。細胞を、ＧＭＣＳＦと共にＰＧＥを添加してまたは添加なしで、４８時間インキュベートした。前処理物を取り除き、細胞を洗浄し、その後３つのさらなる処理物：コントロール、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦ、およびホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ、単球の安定した分化作用剤）を加えた。さらに４８時間インキュベーションを続けた。ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによる前処理の効果は、ＰＭＡに露出した後４日間の最後の時点で持続している。ＣＯＸ−２の発現は、これがさらなるＰＧＥを産生し、比較的不安定なＰＧＥへの露出を持続させる点で関連性がある。
【０１２４】
図７は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの、培養物における４８時間後の単球ＭＬ１細胞からのｐｒｏ−ＰＢＰ遺伝子の発現に対する相乗作用を示すグラフである。（図６では、ｐｒｏ−ＰＢＰを、その遺伝子産物の一つであるＣＸＣＬ７と称している。）ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのｐｒｏ−ＰＢＰ発現は、発現アレイにおいて見られた効果が本当の相乗効果であることを表す。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのｐｒｏ−ＰＢＰ発現は、コントロールの３７２５倍増加した。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥはまた、ＩＬ−１０発現に対しても相乗効果を持つが、ｐｒｏ−ＰＢＰの場合よりも程度が低い。
【０１２５】
考察
どの遺伝子が、ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応じて変化する発現レベルを有しているのかを同定するために、本発明者がアレイ実験を行ったところ、いくつかの予期せぬ発見があった。本発明者は、単球細胞モデル（ＭＬ１細胞）におけるヒト精漿（ＨＳＰ）およびＧＭＣＳＦの組み合わせの効果を試験し、最大限に発現する遺伝子を調べた（表２）。表２は、３２，８００の遺伝子のうち、ＨＳＰおよびＧＭＣＳＦでの処理後、発現が最も増加した３２の遺伝子を示す。
【０１２６】
本発明者は以下のことを発見した：
●ＨＳＰおよびＧＭＣＳＦは、いくつかのケモカインのｍＲＮＡレベルの大きな上昇を誘発する。
●ＨＳＰおよびホルスコリンの効果は、両者を別々にＧＭＣＳＦと組み合わせると異なり、これは発現の増大が必ずしもｃＡＭＰレベルに依存するわけではないことを示す。
●ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦは、ＨＳＰおよびＧＭＣＳＦと同様に、いくつかのケモカインのｍＲＮＡレベルの大きな上昇を誘発する。
●追跡調査は、ケモカインｍＲＮＡの誘発とタンパク質の放出が、ＥシリーズのプロスタグランジンとＧＭＣＳＦの真の相乗作用であることを示す。
【０１２７】
驚くべきことに、ＨＳＰおよびＧＭＣＳＦに応答して遺伝子発現が増大した上位３つは、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８（１５４９倍の増加）、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１（１０７１倍の増加）、およびＰＢＰ  ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２（９１８倍の増加）であった。これらの結果は、続く定量ＰＣＲと、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦを別々ではなく共に使用する、真の相乗効果を示唆するタンパク質放出試験で再現された。ｍＲＮＡでの増大は、タンパク質放出の増加に反映される。ケモカイン発現におけるこれらの増加は、ｐｒｏ−耐性サイトカインＩＬ−１０について見られた増加に付随して起こる。
【０１２８】
アレイ試験は、ＰＧＥへの全応答が、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇によってのみ介されるわけではないことを示し、よってＰＧＥそのもの、または１６，１６−ジメチルＰＧＥといったそのアゴニストの重要性を示唆する。ｃＡＭＰレベルの上昇は、ＩＬ−１０の刺激における主な経路であると思われるため、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの作用の重要な部分である。リポソーム、ＩＶ型ホスホジエステラーゼ・インヒビター、がＰＧＥおよびＧＭＣＳＦに誘発されるＩＬ−８放出を増進することが示されたので、ｃＡＭＰレベルは、単球からのケモカイン放出において何らかの役割を果たしうる。
【０１２９】
ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによるケモカイン誘発パターンは、創傷修復の第一段階の終期に似ており、よって、こういった組み合わせは創傷修復の加速に利用されうる。
【０１３０】
例えば、血管新生に乏しい皮膚部分の創傷や老人の創傷など、治癒の遅い創傷の治癒が、ＰＧＥまたはそのアゴニスト、およびＧＭＣＳＦまたはその誘導体の局所投与によって加速または促進されうる。実際、この組み合わせは、それ以外は健康な患者の皮膚創傷および外科手術による創傷など、より広い範囲の用途で、創傷治癒の加速または促進に治療的に有用でありうる。この組み合わせはまた、クローン病に関連するような胃腸障害での創傷修復でも有用でありうる。
【０１３１】
ｐｒｏ−血小板塩基性タンパク（ｐｒｏ−ＰＢＰ）遺伝子の発現は、ＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦに応答した三番目に高い上昇（表２）と、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦに応答した最も高い上昇（表３）を示し、これは図７のＲＴ−ＰＣＲデータで裏付けられた。ｐｒｏ−ＰＢＰ遺伝子は、ＣＸＣＬ７（ＮＡＰ−２）、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ（ＣＴＡＰＩＩＩ）、およびβトロンボグロブリンを含む複数のポリペプチドの前駆体である血小板塩基性タンパク（ＰＢＰ）をコード化する。Proudfoot他（1997）は、ＣＸＣＬ７およびＣＴＡＰＩＩＩの両方が創傷治癒の早期段階に関与することを記述しており、ＢＴＧは繊維芽細胞について走化性が高く、やはり創傷治癒に重要である（Senior他, 1983）。これは、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦへの応答がｐｒｏ−創傷治癒応答であることを強調する。ケモカインＣＸＣＬ７レベルの上昇は、創傷治癒の促進に非常に重要であろう。いずれにせよ、学説に縛られることなく、本発明者は、ＣＸＣＬ７、ＣＴＡＰＩＩＩ、およびＢＴＧのそれぞれのレベルが、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦに応答して上昇することは蓋然性が高いと考える。
【０１３２】
ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）とＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）はどちらも創傷治癒に関連性があることで知られている。図８は、好中球と単球の、治療中の組織への到達を示す。これは、創傷治癒に重要であるＩＬ−８（好中球を誘引）とＭＣＰ−１（単球を誘引）の産生と一致する。また、創傷治癒における血管形成の要素もあり、文献中にはこのプロセスにおけるＩＬ−８とＭＣＰ−１の役割がよく説明されている。ＩＬ−８の文献：（Koch他, 1992；Sunderkotter他, 1994；Arenberg他, 1996）およびＭＣＰ−１の文献：（Goede他, 1999；Kim他, 2005）。
【０１３３】
ＧＭＣＳＦは複数の作用を有し、最も重要かつ明瞭なのは、造血促進能力、白血球の増大である。これは、概して骨髄で起こる。他の作用としては、白血球の分化と不明瞭な走化性作用がある。ＧＭＣＳＦは、特に潰瘍の創傷治癒の促進に関連する（Siddiqui他, 2000）。この効果は、好中球および単球の組織への誘導に関与するようであるが、白血球の血中濃度とは無関係であると思われる（Jyung他, 1994）。ここでは、ＧＭＣＳＦについてほど一貫性はないが、ＰＧＥと創傷治癒について時折言及されている。Mirio他（2005）には、ＰＧＥ１は潰瘍の治癒を促進するが、この効果は、ＰＧＥの血管作用性およびＶＥＧＦ生成特性によるものだと考えていることが示されている。
【０１３４】
一方、本発明者は、ＧＭＣＳＦは、ＣＸＣＬ８およびＣＣＬ２といった走化性サイトカインの刺激によって間接的に走化性であると考える。この場合、ＰＧＥとＢＭＣＳＦ間の相乗作用は非常に重要であろう、というのは、これら２つの物質を局所用製剤として加えることによってその相乗作用を最大限に引き出すことは、白血球誘引の速度と効果を増大し、よって確実に創傷治癒を加速することになるからである。
【０１３５】
単球細胞は、比較的分化の乏しい組織に進入する。組織内でのサイトカイン環境は、単球の分化に深く関与する。本発明者は、治療後の創傷部位にＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体のリザーバを構築することが特に有用で、これにより、創傷内に移入するよう誘引された細胞をＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによって調節することが可能になる。特に効果的であろう一つのＰＧＥアゴニストは、１６，１６−ジメチルＰＧＥであり、これは主な異化酵素１５−ヒドロキシ・プロスタグランジン・デヒドロゲナーゼに耐性を示す（Ohno他, 1978）。この化合物は、全ての周知のＰＧＥレセプターを活性化すると報告されている。
【０１３６】
また、ＰＧＥまたはそのアゴニストおよびＧＭＣＳＦまたはその誘導体の相乗的混合に応答して単球により産生される走化性サイトカインは、それ自体がＰＧＥと相乗的に作用し、よって白血球の侵入を促進する（Foster他, 1989；Colditz, 1990）。さらに、走化性シグナルに応答して組織に進入する白血球は、比較的分化が乏しく、ＰＧＥの影響下で成熟し、これは好中球による遊離基の放出を減少させ、よって創傷治癒促進環境をもたらす。
【０１３７】
ケモカインシグナル伝達に加えて、表７の経路分析は、血管形成およびノッチ経路を、ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答しての識別的遺伝子発現パターンの有効成分として同定した。これらはまた、いずれも創傷治癒に関係がある。血管形成は、創傷修復に絶対不可欠であり、炎症細胞とサイトカインの損傷部位への浸潤を容易にし、ノッチシグナル伝達もまた、最近、創傷治癒に関連し、上皮細胞の分化に関与するとされた（Thelu他, 2002）。
【０１３８】
さらに、表２で遺伝子発現の増大レベルが７番目と９番目に高い遺伝子は、いずれもカルグラヌリンである。これらは、天然の抗菌剤であるため、創傷治癒に非常に関係がある。天然の抗菌剤であれば創傷治癒に大きく役立つ。
【０１３９】
実施例２：創傷治癒のラットモデルへのＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの影響
要約
創傷治癒のラットモデルで行った実験から得られた結果は、創傷治癒の加速におけるＰＧＥアナログとＧＭＣＳＦ間の相乗作用を示した。創傷面積および創傷の色をモニターして創傷治癒を評価した。ＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦの組み合わせの投与によって、手術後３日までに創傷面積が有意に縮小したが、いずれか一方のみを投与する処理では有意な差異は見られなかった。さらに、創傷の色の観察では、１０日目にＰＧＥアナログとＧＭＣＳＦ間の相乗作用が示された。これらの結果は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの局所投与がラットにおける創傷治癒の加速に有用であることを裏付ける。
【０１４０】
実験の詳細
使用した動物
体重２５０〜３００ｇの雄のＳＤ（Sprague Dawley）ラットを創傷治癒モデルとして使用し、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの効果を評価した。コントロールと処理グループの間での統計比較に十分なデータを提供するために各処理グループにつき６匹のラットを分析した。合計２４匹の動物を使用した（６匹のラットを４グループ）。４つのグループとは、コントロール、１６，１６−ジメチルＰＧＥ、ＧＭＣＳＦ、および１６，１６−ジメチルＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦのグループである。動物は処理するまでグループ毎に飼育し、その後、（寝床と糞便が、開いた創傷部位に入るのを防ぐため）スチール製上床を備えたマイクロアイソレータ・ポリカーボネート展示ボックスケージで、（動物が互いの創傷を舐めたり噛んだりしないように）一匹ずつ飼育した。各動物に２箇所の創傷を作り、その結果、１グループあたりの創傷の数「ｎ」は１２となった。
【０１４１】
プロトコル
環境順化（５〜６日）後、ラットに、グリコピロレート（０．０２ｍｇ／ｍＬで０．０１ｍｇ／ｋｇ）、一回分量０．５ｍＬ／ｋｇを皮下注射し、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を４５ｍｇ／ｍＬ（ケタミン）および５ｍｇ／ｍＬ（キシラジン）、一回分量０．８８ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与して麻酔した。手術開始前に足指をつねって十分な麻酔深度を確かめ、何らかの動きが認められた場合はその動物に麻酔を足した。手術は、動物が十分に麻酔されてから開始した。一旦麻酔が完全にかかると、背面部を６×８ｃｍの広さでした。剃毛後、剃毛部分に除毛剤（Ｎａｉｒ）を適用し、約５分間皮膚上に放置した。この後、Ｎａｉｒを切れないヘラで皮膚から優しくすくい取り、脱イオン化した蒸留水で皮膚を洗い流し、ガーゼのスポンジで拭き取ることで残留物を全て取り除いた。その後、剃毛部分をクロルヘキシジンとアルコールで消毒し、手術に備えた。
【０１４２】
続いて、ラットをうつ伏せにし、肢がリラックスして脊椎が真っ直ぐになるように置いた。Ｔ字形の鋳型を、Ｔ字の軸が脊椎に沿い、Ｔ字の横木が肩甲骨の下角に沿うように背に当てた。ラットの右側に逆さまの「Ｌ」が現れ、動物の左側に逆さまで反転した「Ｌ」が現れるようにＴ字の内側の縁をシャーピーペンでなぞった。これらは、各創傷の頭側縁を肩甲骨角の後方約３ｃｍに指定し、各創傷の内側縁を正中線から約０．２５ｃｍに指定するものである。
【０１４３】
創傷鋳型を作成するために、コーニング１５ｍｌ円錐管のキャップの縁をその部分に置き、殺菌した手術用マーカーでなぞって上述した逆さまのＬの一つの内側に２ｃｍの円を作った。各円の内側縁に＃１０手術用メスで最初の切開を施した。皮筋を通って皮下疎性結合組織層を切開した。深筋膜層を傷つけないように注意しながら、鉗子とメッツェンバウム曲剪刀を使用して円の全周に沿って切開を続けた。皮膚を取り除き円形の創傷を作った。必要に応じて、無菌ガーゼで圧迫し止血を行った。
【０１４４】
試験物質、またはコントロールとしてビヒクルを、創傷床の３箇所の異なる部位に投与した。各処理での一回量のレベルとグループの割り当ては表８に詳述したとおりである。一回量のレベルは体重に基づいた。
表８
0005383198.tif 000003
【０１４５】
創傷は、いかなる種類の包帯も付けなかった。覚醒（胸を地面につけて腹ばいになる姿勢および正常な動きで判断）後、約３０分してから、動物にブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、ステンレスのスチール製上床を備えた個別のケージに移した。必要に応じて６〜８時間毎にブプレノルフィンを追加投与し、その後７２時間、必要に応じて６〜１２時間毎に０．０５ｍｇ／ｋｇを投与した。
【０１４６】
創傷の感染およびストレスの表れについて動物を常にモニターするとともに、食欲減退、活性低下、だらりとした外観、および正常な水分補給ができないかしたがらないなど、いかなる疼痛および／または苦痛の表れについても動物をモニターした。不断給餌および給水した。
【０１４７】
手術後３、７および１０日目にイソフルランで動物を麻酔し、創傷の幅および長さをカリパスで測定した。その後、測定した幅と長さを乗じて創傷面積を算出し、各処理ついて平均創傷面積と平均値の標準誤差を決定した。創傷治癒の、コントロールでの処理との有意な差異を調べるために、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を平均創傷面積に実施した。創傷面積に加えて、毎日創傷の色を観察して創傷治癒を評価した。創傷を、赤、茶、２つの事例で黒、または２つの事例でかさぶたの黄、のいずれかとして採点した。ここで、赤は茶よりも治癒の程度が低い。
【０１４８】
１０日目に創傷を評価した後、安楽死溶液（Beuthanasia solution）（１５０ｍｇ／ｋｇ）を心臓注射して安楽死させた。創傷部位を収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間保存し、その後８０％エタノールに移した。
【０１４９】
結果
表９は、手術後３、７および１０日後の、各処理グループについての平均創傷面積を示す。同じデータを図８にグラフで示す。二元配置ＡＮＯＶＡ試験を用いたデータの分析によって、ＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦの、創傷治癒への相乗作用が明らかとなった（表１０）。ＰＧＥアナログ（１６，１６−ジメチルＰＧＥ）およびＧＭＣＳＦの組み合わせによる処理を受けて、創傷面積は術後３日目でコントロールに比べて有意に縮小した。創傷をＰＧＥアナログまたはＧＭＣＳＦ単独で処理した場合、創傷面積に有意な差異は観察されなかった。
【０１５０】
図９は、４つの処理のそれぞれについての手術後３日目の創傷面積の差異を示す。二元配置ＡＮＯＶＡ分析によって決定したように、ＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦの組み合わせの結果のみが、創傷面積が有意に縮小した。
【０１５１】
図１０は、４つの処理物のそれぞれを投与したラットについて、創傷の色を毎日観察した結果を示す。ＰＧＥアナログ、ＧＭＣＳＦ、またはアナログおよびＧＭＣＳＦの組み合わせを投与した場合、全て創傷治癒が加速され、３〜５日目はコントロールで処理した場合に比べてより一貫して茶の採点が多かった。さらに、ＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦ間の相乗作用が、９および１０日目に明らかになった。９および１０日目は、グループ３（＝３）およびグループ１および２（＝２）と比較して処理グループ４（＝９）において、より一貫性のある茶の採点が見られた。
【０１５２】
表９
創傷治癒の経過における、処理の比較。平均創傷面積および標準誤差を、３、７および１０日目に測定し、各処理について一覧にした。使用したＰＧＥアナログは１６，１６−ジメチルＰＧＥである。
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【０１５３】
表１０
ＰＧＥアナログ、ＧＭＣＳＦ、またはＰＧＥアナログとＧＭＣＳＦの組み合わせのそれぞれを創傷に投与したとき、コントロールと比べて創傷治癒の進行に何らかの有意な差異があるか調査する、表９の平均創傷面積の二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）による分析結果。３、７および１０日目の創傷面積のコントロールとの差異、ＡＮＯＶＡ分析からのｔ値、およびその結果に対応する有意性を、各処理について一覧にした。
0005383198.tif 000005
【０１５４】
考察
ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦがインビボで創傷治癒に与える影響を決定するために、本発明者は、創傷治癒のラットモデルに実験を行った。本発明者は、異なる処方、つまりＰＧＥアナログ（１６，１６−ジメチルＰＧＥ）、ＧＭＣＳＦ、およびＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦの組み合わせを創傷に投与したときの効果を調査し、手術後３、７および１０日目にコントロールと比較して創傷面積を検討した。また、創傷の色を赤または茶として毎日採点し、赤い創傷は茶色の創傷よりも治癒の程度が低い。
【０１５５】
本発明者は、３日目にＰＧＥアナログとＧＭＣＳＦ間に著しい相乗作用があり、コントロールと比べて創傷面積に有意な縮小が見られることを発見した。ＰＧＥアナログまたはＧＭＣＳＦを単独で使用した場合、創傷面積に有意な差異は見られなかった。手術後７または１０日目のいずれかでは、コントロールと比べて創傷面積に有意な差異は観察されなかった。使用したモデルは健常なラットの創傷治癒モデルであったため、７および１０日目には非処理ラットの創傷治癒が十分に進み、いかなる差異も隠れてしまったものだろうと本発明者は考える。一方、３日目、創傷治癒の第一段階の間、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦで処理した創傷の治癒プロセスは、通常のラットのそれと比較してはるかに進行が早く、創傷面積に有意な差異が見られた。
【０１５６】
同様に、本発明者の色の観察による創傷治癒の評価においても、創傷治癒の加速におけるＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦ間の相乗作用が示された。特に、手術後９および１０日目に、ＰＧＥアナログおよびＧＭＣＳＦの組み合わせを投与された創傷は、より一貫した茶の採点を受け、したがって、いずれかの処理物のみで処理された創傷よりも治癒の程度が高かった。
【０１５７】
総合すると、これらの結果は、創傷へのＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの組み合わせの投与が治癒プロセスを加速することを裏付ける。本発明者は、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの投与は、実施例１で実証したように創傷修復の第一段階に似たケモカイン誘引によって構築される創傷治癒促進環境を作り出すことによって、創傷治癒を加速すると考える。
【０１５８】
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【０１５９】
表２
何の処理も受けなかったコントロールｍＲＮＡで、１％ヒト精漿（ＨＳＰ）＋ＧＭＣＳＦで処理したＭＬ１細胞からのｍＲＮＡを除した、発現の順位付け。３２，８００の遺伝子のうち上位３２の遺伝子を順に示す。ケモカインは太字で記す。
３列目の発現「Ｆ」は、ホルスコリン＋ＧＭＣＳＦの存在下での発現である。４列目の「コントロール」は、処理なしでの発現である。５列目の「処理」とは、ＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦでの処理である。８列目の「種類」は、ケモカインの種類である。９列目の「α種類」とは、αケモカインの種類である。
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0005383198.tif 000007
【０１６０】
表３
コントロール（処理なしのｍＲＮＡ発現）で、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦおよび１％ＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦで処理したＭＬ１細胞からのｍＲＮＡを除した、発現の順位付け。３２，８００の遺伝子を、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦ／コントロールによって順位付けした上位３２の遺伝子を示す。ケモカインは太字で記す。
３列目の「コントロール」は処理なしでの発現である。４列目の処理「Ｐ」は、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦで処理したときの平均的な発現である。５列目の処理「Ｈ」は、ＨＳＰ＋ＧＭＣＳＦで処理したときの平均的な発現である。６列目の比率「Ｐ」は、処理ＰＧＥ／コントロールである。７列目の比率「Ｈ」は、処理ＨＳＰ／コントロールである。９列目の「種類」は、ケモカインの種類である。１０列目の「α種類」とは、αケモカインの種類である。
0005383198.tif 000008
0005383198.tif 000009
【０１６１】
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0005383198.tif 000011
表３に示したデータと同じであるが、ＰＧＥ＋ＧＭＣＳＦで処理した後の発現レベルによって順位付けした。
【０１６２】
表５
ヒト精漿およびＧＭＣＳＦで処理したＭＬ１細胞において上方に異なって発現した遺伝子。一覧に挙げた遺伝子は全て、１６から４の間のＢ値（異なって発現する確率の対数）を有する。遺伝子を、コントロールに対する対数［塩基２］の倍増によって順位付けした。ケモカインは太字にしている。
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【０１６３】
表６
ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦで処理したＭＬ１細胞において上方に異なって発現した遺伝子。一覧に挙げた遺伝子は全て、１６から４の間のＢ値（異なって発現する確率の対数）を有する。遺伝子を、コントロールに対する対数［塩基２］の倍増によって順位付けした。ケモカインは太字にしている。
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【０１６４】
表７
処理１対コントロール、処理２対コントロール、および処理１対処理２に関する、ＭＬ細胞において上方に異なって発現した遺伝子が関与する経路。
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【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００７５８から取得したｃＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ図１Ａ（配列番号１）および図１Ｂ（配列番号２））。
【図２】ＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥ［処理１］およびコントロール（グループ２−グループ１）と、ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰ［処理２］およびコントロール（グループ３−グループ１）と、ＧＭＣＳＦ＋ＨＳＰ［処理２］およびＧＭＣＳＦ＋ＰＧＥ［処理１］（グループ３−グループ２）の処理間で異なって発現した遺伝子における重複を示すベン図。
【図３】ＧＭＣＳＦと組み合わされたときのＰＧＥおよびヒト精漿の両方のＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）に対する相乗作用を示すグラフ。ＣＸＣＬ８（ＣＣＬ８）ｍＲＮＡ発現と、４８時間にわたる細胞からのＣＸＣＬ８タンパク質の放出が、この相乗効果を示す。
【図４】ヒト精漿（ＨＳＰ）およびＧＭＣＳＦの低分子量分画の、培養物における４８時間後の単球ＭＬ１細胞からのケモカイン／タンパク質放出に対する相乗作用を示すグラフ。
【図５】ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの、培養物における４８時間後の単球Ｕ９３７細胞からのケモカイン／タンパク質放出に対する相乗作用を示すグラフ。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのケモカインＣＸＣＬ８およびＣＣＬ２の放出は、ヒト精漿によるＧＭＣＳＦの相乗効果がＰＧＥによって再現されることを示す。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥはまた、可溶ＣＤ１４およびＩＬ−１０の放出に対して相乗効果を持つ。
【図６】ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによる前処理の、ＭＬ１細胞におけるＩＬ−８およびＣＯＸ−２の発現に対する効果を示すグラフ。細胞を、ＧＭＣＳＦと共にＰＧＥを添加してまたは添加なしで、４８時間インキュベートした。前処理物を取り除き、細胞を洗浄し、その後３つのさらなる処理物：コントロール、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦ、およびホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ、単球の安定した分化作用剤）を加えた。さらに４８時間インキュベーションを続けた。ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦによる前処理の効果は、ＰＭＡに露出した後４日間の最後の時点で持続している。
【図７】ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの、培養物における４８時間後の単球ＭＬ１細胞でのｐｒｏ−血小板塩基性タンパク（ＰＢＰ）遺伝子（ＣＸＣＬ−７と称する）の発現に対する相乗作用を示すグラフ。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのｐｒｏ−ＰＢＰ発現は、発現アレイにおいて見られた効果が本当の相乗効果であることを表す。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥに応答してのｐｒｏ−ＰＢＰ発現は、コントロールの３７２５倍増加した。ＧＭＣＳＦおよびＰＧＥはまた、ＩＬ−１０発現に対しても相乗効果を持つが、ｐｒｏ−ＰＢＰの場合よりも程度が低い。
【図８】ヒトの創傷における創傷治癒の特徴としての好中球および単球の両方の出現を示すEngelhardt他（1998）に基づくグラフ。
【図９】創傷治癒のラットモデルにおいて、手術後３、７および１０日に４つの異なる処理物を投与したときの創傷面積の測定結果を示すグラフ。
【図１０】創傷治癒のラットモデルにおいて、手術後３日に４つの異なる処理物を投与したときの創傷面積の測定結果を示すグラフ。アステリスクは、コントロールで処理したラットと比較して、ＰＧＥおよびＧＭＣＳＦの組み合わせで処理したラットにおいて創傷面積が有意に縮小したことを示す。ＰＧＥまたはＧＭＣＳＦがいずれか一方が投与されたラットにおいては、有意な縮小は見られなかった。
【図１１】４つの処理物のそれぞれを投与したラットにおける創傷の一日毎の色観察結果を示す表。創傷は赤（Ｒ）、茶（Ｂ）、黒またはかさぶたの黄（Ｙ）のいずれかで採点され、ここで、赤は茶より治癒の程度が低いことを示す。この表は、９および１０日目のＰＧＥおよびＧＭＣＳＦ（処理４）の効果を示し、コントロールで処理したラット（処理１）、またはＰＧＥまたはＧＭＣＳＦのいずれか一方が投与されたラットよりも、茶の採点が多かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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