(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲルの表面のシラノール基の水素原子の一部又は全部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］
【化１】
0003653798.tif 000029
［式中、ｎは３以上の整数を表し、Ｒ1及びＲ2は何れか一方が水素原子で、他方は−（ＣＨ2）ｍＯＨ（式中、ｍは２以上の整数を表す。）を表す。］で示される基で置換された変性シリカゲル。
【請求項２】
シリカゲルの表面のシラノール基の水素原子の一部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］
【化２】
0003653798.tif 000030
［式中、ｎは３以上の整数を表し、Ｒ1及びＲ2は何れか一方が水素原子で、他方は−（ＣＨ2）ｍＯＨ（式中、ｍは２以上の整数を表す。）を表す。］で示される基で置換され、残りの一部又は全部が、ケイ素原子を介して、アルキル基又は置換基を有するアルキル基で置換された変性シリカゲル。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変性シリカゲルを含んでなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
請求項３に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いる生体試料中の成分の分析方法。
【請求項５】
請求項３に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いる成分分析用生体試料の前処理方法。
【請求項６】
請求項３に記載のクロマトグラフィー用充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、特に高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用の充填剤として有用な変性シリカゲル、及び該変性シリカゲルを含んでなるクロマトグラフィー用充填剤、並びにこれを用いた生体試料（血清、尿等）中の各種成分の分析方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
HPLCは、生体試料中の各種成分（薬物、代謝物等）の分析手段として広く利用されている。しかしながら、血清等のタンパク質成分を多量に含有する生体試料中の薬物や代謝物等をHPLCを用いて定量する場合には、タンパク質のカラム充填剤への吸着等による弊害を除去するため、従来は除タンパク質処理等の前処理を必要とした。
【０００３】
しかし、このような前処理操作は、多大の時間と労力を要し、且つ分析誤差及び再現性の悪さの原因となっている。そこで、除タンパク質処理を行うことなく、直接生体試料を分析するためのクロマトグラフィー用充填剤が種々開発されている。しかしながら、いずれの充填剤も一長一短があり満足できるものではない。
【０００４】
それらのいくつかの例を以下に示す。
このような特性を有する充填剤の先駆けとしては、H.Yoshida,I.Morita and G.Tamai, Chem.Pharm.Bull.,30,3827(1982)やH.Yoshida,I.Morita,G.Tamai,T.Masujima,T.Tsuru,N.Takai and H.Imai, Chromatographia,19,466(1984).に記載のタンパク質 コート オクタデシルシリル(protein-coated ODS)充填剤がある。この充填剤はオクタデシルシリル基（ODS基）を有するシリカ表面を変性した血漿タンパク質でコートしたものであり、この充填剤を使用することにより、血清試料の直接注入による薬物の分析が可能であることが示されている。しかしながら、これら充填剤では、使用が長期にわたると、吸着させた変性血漿タンパク質が溶離してくる等の耐久性の面での問題点や高分離効率のカラムが得られない等の分離能の面での問題点を有している。
【０００５】
これらの問題点を解決することを目的として、多孔性担体の内表面に疎水性基、外表面に親水性基を導入した充填剤、所謂、内面逆相(internal-surface reversed phase)充填剤が開発された。この充填剤を用いると、巨大分子である血清中のタンパク質（アルブミンやグロブリン）は充填剤の細孔内に入らず且つ親水性の外表面に吸着されることなくカラムを素通りし、しかも比較的小さな薬物等の分子は疎水性の内表面に吸着させて分離することが可能となる。このような内面逆相の充填剤としては、例えばI.H.Hagestam,T.C.Pinkerton, Anal.Chem.,57,1757(1985).や特開昭61-65159号公報等に掲載されているPinkertonカラムと呼ばれているものがある。これは、グリセリルプロピルシリル基を導入した多孔性シリカゲルを原料として、これにカルボニルジイミダゾールを介してオリゴペプチド（グリシル−フェニルアラニル−フェニルアラニン等）を結合させた後、タンパク質加水分解酵素であるカルボキシペプチダーゼＡを作用させて外表面のフェニルアラニル側鎖を切断することにより得られる。即ち、充填剤の内表面には、疎水性リガンドであるグリシル−フェニルアラニル−フェニルアラニンを有し、外表面には、親水性リガンドであるグリシル−グリセリルプロピルシリル基を有する充填剤がそれである。しかしながら、この充填剤は、疎水性が低いため、親水性薬物や代謝物の分離には不向きである。また、外表面のグリシル残基のカルボキシル基の解離のために使用可能な移動相のpH範囲がpH６〜7.5と限定されるという問題点、更には製造に酵素反応を利用しているため、工程が複雑化し、且つ品質がばらつき易い等の問題点も有している。
【０００６】
また、類似の原理で製造された充填剤として、特開平1ー123145号公報に記載のものがある。これは、アミノプロピルシリル基を導入した多孔性シリカを出発原料として、トリエチルアミン存在下、オクタノイルクロライドを反応させることによりアミド結合を介して疎水性基を導入し、次に、ポリミキシンアシラーゼにより外表面のアシル基を加水分解して、外表面にアミノ基を生成させ、これをグリシドールと反応させて外表面を親水性とすることにより得られる充填剤である。しかしながら、この充填剤も、製造に酵素反応を利用しているため、工程が複雑化し、且つ品質がばらつき易いという問題点がある。
【０００７】
更にまた、類似の原理で製造された充填剤として、特開平5ー203636号公報記載のものがある。これは、グリセリルプロピルシリル基を導入した多孔性シリカゲルを原料とし、トリエチルアミン存在下、脂肪酸塩化物と反応させて、脂肪酸エステルからなる疎水性基を導入した後、リパーゼにより外表面のアシル基を加水分解する方法により得られる（内表面には疎水性の脂肪酸エステルが残り、外表面には、親水基であるグリセリルプロピルシリル基を有する充填剤）。しかしながら、この充填剤も製造に酵素反応を利用しているため、工程が複雑化し、且つ品質がばらつき易いという問題点がある。
【０００８】
このような問題点を解決するために酵素の代わりにプラズマを用いて充填剤を製造することも試みられている（特公平4ー68244号公報、特公平4ー61809号公報等）。即ち、例えば疎水性基（ODS基等）を導入した多孔性シリカをプラズマ処理して、外表面のODS基を選択的に脱離させ、次に外表面にγ−グリシドキシプロピルシリル基を導入して、酸によりエポキシ環を開環させてグリセリルプロピルシリル基としてシリカ外表面に親水性のグリセリルプロピルシリル基、内表面に疎水性のODS基を導入した内面逆相の充填剤を製造する方法がそれである。しかしながら、このような製造方法も前記の酵素を用いた製造方法と同様に、工程が複雑化し、且つ品質がばらつき易いという問題点を依然として有している。
【０００９】
また、プラズマの代わりに酸を用いて充填剤を製造する方法も試みられている（特開平2ー59415号公報等）。即ち、ODS基を導入した多孔性シリカを酸処理することにより、選択的に外表面のODS基を脱離させ、次にγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いてシリカ外表面に親水性のグリセリルプロピルシリル基を導入するという方法である。この製法は、簡便であるという利点は有しているものの、依然として充填剤の品質がばらつき易いという問題点を有してい る。
【００１０】
また、シリル化剤の反応性の差を利用した内面逆相充填剤の製造も試みられている（特開昭64ー16962号公報等）。即ち、シリカ細孔内への拡散速度に比べて、反応速度が大であるシリル化剤（例えば脱離基としてN-メチルアセトイミド基を持つ非常に反応性に富んだペルフルオロブチルエチレンジメチルシリル-N-メチルアセトイミド）を用いることにより細孔外表面だけを選択的にシリル化し、次に、オクタデシルジメチルシリルクロライドで内表面を修飾することにより外表面に親水性のペルフルオロブチルエチレンジメチルシリル基、内表面にODS基を有する充填剤を製造する方法である。しかし、この製法についても得られる充填剤の品質がばらつき易いという問題点が依然としてある。
【００１１】
多孔性担体の内表面と外表面の反応性の差を利用した内面逆相充填剤の製造方法としては特開平3ー107759号公報記載のものもある。即ち、先ず多孔性シリカに緩和な条件（無触媒）でγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを反応させて実質的に外表面のみに修飾を行い、次いで、N,Nージイソプロピルエチルアミン（縮合触媒）存在下の強い反応条件で、フェニルトリメトキシシランを内表面に導入し、更に、これを酸で処理してエポキシ環を開環させ、外表面に親水性のグリセリルプロピルシリル基、内表面に疎水性のフェニル基を導入した内面逆相の充填剤を製造する方法がそれである。しかしながら、この方法に於ても、細孔の内外表面における反応性の差が少ないために反応条件設定が難しく、得られる充填剤の品質にばらつきが生じ易いという問題点がある。
【００１２】
以上に述べた如く、内面逆相充填剤は、親水性基と疎水性基とを内表面及び外表面に別々に導入して製造される為、得られる充填剤の品質がばらつき、その結果これらの充填剤を用いても再現性の良いデータを得難いという問題点があっ た。
【００１３】
そこで、多孔性担体の内表面及び外表面に親水性基相と疎水性基相が存在する混成機能相（mixed functional phase）充填剤が開発された。この種の充填剤では、タンパク質のような巨体分子は親水性基には吸着されずに素通りし、薬物等の比較的小さな分子は疎水性基に分離吸着されることになる。
【００１４】
このような混成機能相充填剤としては、特開平4ー40366号公報記載のものがある。これは、多孔性シリカの内表面及び外表面に親水性のγ−グリシドキシプロピルシリル基を導入し、次に、疎水性のアルキル基（ブチル基、オクチル基等）やフェニル基を導入する。そして、グリシドキシ基を加水分解してジオール基を生成させた後、再度、グリシドキシ基を酸加水分解させながら、γ−グリシドキシプロピルシリル基を導入している。しかしながら、この方法に於ても、疎水基と親水基の導入量を調製することが困難であるという問題点はかなり改善されてきてはいるが、得られる充填剤の分離能等がよくないという問題点が残る。
【００１５】
また、シリコンポリマーで被覆された多孔性担体に親水性基と疎水性基が導 入された混成機能相充填剤として特開平5ー72190号記載のものもある。これは、多孔性担体をSiH基を有するポリマーで被覆し、このポリマーのSiH基に二重結合を有する疎水性基（スチレン、1ーオクテン、1ーオクタデセン等）、及び親水性基（ポリオール）を反応させて製造する。しかしながら、この方法に於ても、製造時の操作が複雑であること、親水性基と疎水性基の導入量を調製するのが困難であること、且つ、多孔性担体のSiH基を有するポリマーでの被覆率を上げるのが困難なため得られる充填剤の塩基性物質の分離等がよくないこと等の問題点が ある。
【００１６】
一方、多孔性単体を、親水性基としての機能と疎水性基としての機能という異なった二つの機能を併せ持つアルキルシリル基で修飾した充填剤、即ち、二村等によりBinary-Layered Phase充填剤と呼ぶことが提案されている充填剤がある〔第36回液体クロマトグラフィー研究会講演要旨集ｐ.68（1993）．〕。この種の充填剤は、タンパク質等の巨大分子は、親水性部分には吸着されず素通りし、薬物等の比較的小さな分子は、疎水性部分に吸着され分離されるという機能を有するものである。このような充填剤としては例えば特開昭64ー16961号公報記載の充填剤がある。即ち、多孔性担体にリービング原子団としてN-メチルアセタミド基等を有するシリル化剤を用いて、グリセリルプロピルジメチルシランのジオールをケタール型に修飾した官能基を導入した充填剤を得ている。しかし、この充填剤の性能は、上記公開公報中に記載された如く特開昭64ー16962号公報記載の親水性基と疎水性基を別々に導入した充填剤（二区域逆相充填剤）より劣るというものであった。
【００１７】
また、多孔性シリカの内表面及び外表面に、親水性基としての機能と疎水性基としての機能と異なった二つの機能を併せ持つ基を導入し、且つその親水性基としての機能を有する部分がジオールの形になっている充填剤として、特開平2ー45758号公報記載の充填剤がある。これは、例えばシリカゲルに5、6-エポキシヘキシルシリル基等を導入した後、酸処理することにより得られる、5、6-ジヒドロキシヘキシルシリル基で修飾した充填剤である。また、Y.Sudoらにより、従来から使われていたγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのプロピル部分をブチル、メチルブチル、ヘキシルに変えたものを合成し、これを用いてγ−グリシドキシアルキル基を多孔性シリカに導入した後、酸でエポキシ環を開環することにより得られる充填剤も報告されている（Y.Sudo,M.Akiba,T.Sakaki and Y.Takahata,J.Liq.Chromatogr.17,1743(1994)）。これらの充填剤は疎水性基と親水性基の導入量の調整が簡単であるという利点はあるが、親水性薬物の分析に於て、薬物のピークの分離か良好でないという問題点を有している。
【００１８】
【発明の目的】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、製造が容易でしかも分離能、再現性及び耐久性がすぐれた、生体試料（血清、尿等）中の各種成分の分析に用いられるカラムクロマト用充填剤として有用な変性シリカゲルと、該変性シリカゲルを含んでなるクロマトグラフィー用充填剤及びこれを用いた生体試料中の成分の分析方法並びに該充填剤を含んでなるクロマトグラフィー用カラムを提供することを目的とする。
【００１９】
【発明の構成】
本発明は、（１）シリカゲルの表面のシラノール基の水素原子の一部又は全部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］
【００２０】
【化３】
0003653798.tif 000002
【００２１】
［式中、ｎは３以上の整数を表し、Ｒ1及びＲ2は何れか一方が水素原子で、他方は−（ＣＨ2）ｍＯＨ（式中、ｍは２以上の整数を表す。）を表す。］で示される基で置換された変性シリカゲルの発明である。
【００２２】
また、（２）本発明は、シリカゲルの表面のシラノール基の水素原子の一部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］
【００２３】
【化４】
0003653798.tif 000003
【００２４】
［式中、ｎは３以上の整数を表し、Ｒ1及びＲ2は何れか一方が水素原子で、他方は−（ＣＨ2）ｍＯＨ（式中、ｍは２以上の整数を表す。）を表す。］で示される基で置換され、残りの一部又は全部が、ケイ素原子を介して、アルキル基又は置換基を有するアルキル基で置換された変性シリカゲルの発明である。
【００２５】
更に、本発明は、（３）上記（１）又は（２）に記載の変性シリカゲルを含んでなるクロマトグラフィー用充填剤の発明である。
【００２６】
更にまた、本発明は、（４）上記（３）に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いる生体試料中の成分の分析方法の発明である。
【００２７】
また、本発明は、（５）上記（３）に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いる成分分析用生体試料の前処理方法の発明である。
【００２８】
更に、本発明は、（６）上記（３）に記載のクロマトグラフィー用充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用カラムの発明である。
【００２９】
即ち、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、シリカゲルの表面（内表面及び外表面）のシラノール基の水素原子の一部又は全部を、ケイ素原子を介して、本発明に係る上記一般式［１］で示される基で置換させる、又はシリカゲルの表面（内表面及び外表面）のシラノール基の水素原子の一部をケイ素原子を介して、本発明に係る上記一般式［１］で示される基で置換させ、残りの一部又は全部を置換基を有していてもよいアルキル基で置換させることにより、生体試料（血清、尿等）中のタンパク質と薬物との分離能が高く、且つ、薬物間の分離能も高いクロマトグラフィー用充填剤として有用な変性シリカゲルが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３０】
本発明の変性シリカゲルの原料として用いられるシリカゲルは、最終的に得られる本発明の変性シリカゲルのクロマトグラフィー用充填剤としての機能に影響を与えるものでなければ特に限定されないが、例えば粒子径２〜50μm、比表面積300〜800m2/g、細孔径50〜100オングストロームの球形、或は破砕形のシリカゲルが好ましく挙げられる。
【００３１】
本発明の変性シリカゲルに於て、ケイ素原子を介して導入される一般式［１］
【００３２】
【化５】
0003653798.tif 000004
【００３３】
で示される基のＲ1及びＲ2は、何れか一方が水素原子で、他方は−（ＣＨ2）ｍＯＨを表わす。ここで、ｍは２以上の整数を表し、好ましくは２〜15の整数を表す。また、上記一般式［１］に於て、ｎは３以上の整数を表し、好ましくは３〜５の整数を表す。
【００３４】
本発明の変性シリカゲルに於て、ケイ素原子を介して導入される置換基を有していてもよいアルキル基のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等のアルキル基が挙げられ、（直鎖状、分枝状の何れでも可。）、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等の低級アルキル基が挙げられる。置換基としては例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基等の芳香族の基が好ましく挙げられる。
また、導入される置換基を有していてもよいアルキル基は、１種類に限定されることなく複数種の基が導入されていてもよい。
【００３５】
本発明の変性シリカゲルの製法は、特に限定されるものではないが、例えば、下記のような製法が挙げられる。
【００３６】
・製法１
先ず、上述した如きシリカゲルと一般式［２］
【００３７】
【化６】
0003653798.tif 000005
【００３８】
［式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は夫々独立して炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5の少なくとも１つはアルコキシ基である。また、ｎは３以上の整数を表す。］で示されるシランカップリング剤とを酸性又は塩基性触媒存在下で反応させる。
【００３９】
次いで、得られた変性シリカゲルを酸性又は塩基性触媒存在下で炭素数２以上のジオール化合物と反応させれば、シリカゲルの内表面及び外表面のシラノール基の水素原子の一部又は全部が、ケイ素原子を介して一般式［１］で示される基で置換された本発明の変性シリカゲルが得られる。
【００４０】
これを更に、アルキル基を有するシランカップリング剤と反応させ、然る後、一般式［１］で示される基の水酸基に結合したアルキルシリル基を酸で加水分解させれば、シリカゲルの内表面及び外表面のシラノール基の水素原子の一部がケイ素原子を介して本発明に係る一般式［１］で示される基で置換され、残りの一部又は全部がアルキル基で置換された本発明の変性シリカゲルが得られる。
【００４１】
シラノール基の水素原子の一部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］で示される基で置換され、残りの一部又は全部がアルキル基で置換された変性シリカゲルは、また、下記の方法でも製造することができる。
【００４２】
・製法２
即ち、先ず、上述した如きシリカゲルとアルキル基を有するシランカップリング剤とを反応させる。
【００４３】
次いで、得られた変性シリカゲルに酸性又は塩基性触媒存在下、一般式［２］
【００４４】
【化７】
0003653798.tif 000006
【００４５】
［式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びｎは前記と同じ。］で示されるシランカップリング剤を反応させる。
【００４６】
得られた変性シリカゲルを酸性又は塩基性触媒存在下に炭素数２以上のジオール化合物と反応させれば目的の変性シリカゲルを得ることができる。
【００４７】
これら製造方法に於て用いられる試薬類についてさらに詳細に説明すると下記の通りである。
【００４８】
上記製法１及び製法２で用いられる一般式［２］で示されるシランカップリング剤の具体例としては、例えばグリシドキシプロピルトリメトキシシラン、ジエトキシグリシドキシプロピルメチルシラン、ジメチルグリシドキシプロピルエトキシシラン等の市販品が挙げられるが、市販されていないものについては、例えばY.Sudo, M.Akiba,T.Sakaki and Y.Takahata, J.Liq.Chromatogr.17,1743(1994)等に記載の方法により容易に得ることができる。
【００４９】
即ち、例えば一般式［３］
【００５０】
【化８】
0003653798.tif 000007
【００５１】
［式中、ｎは３以上の整数を示す。］で示されるアルコールとエピクロロヒドリンとを例えば濃硫酸、三フッ化ホウ素エーテラート等の酸性触媒存在下で縮合させ、一般式［４］
【００５２】
【化９】
0003653798.tif 000008
【００５３】
［式中、ｎは前記と同じ。］で示される化合物とする。
【００５４】
次いで、一般式［４］で示される化合物を水酸化ナトリウムで処理し、一般式［５］
【００５５】
【化１０】
0003653798.tif 000009
【００５６】
［式中、ｎは前記と同じ。］で示されるエポキシ体とする。
このエポキシ体と一般式［６］
【００５７】
【化１１】
0003653798.tif 000010
【００５８】
［式中、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記と同じ。］で示されるシラン化合物とを塩化白金酸等を触媒として縮合させることにより容易に一般式［２］で示されるシランカップリング剤を得ることができる。
【００５９】
シリカゲルと一般式［２］で示されるシランカップリング剤との反応は、一般には日本分析化学会関東支部編、“高速液体クロマトグラフィーハンドブック”丸善、東京（1985）p.195記載の様に無水の溶媒中で行われる。シランカップリング剤の導入量は使用するシランカップリング剤の種類や、反応条件等より任意に変えることが可能である。
【００６０】
この際に用いられる塩基性触媒としては、ピリジン、トリエチルアミン等が挙げられ、また、酸性触媒としては、p-トルエンスルホン酸、三フッ化ほう素エーテラート等が挙げられる。
【００６１】
反応溶媒としてはベンゼン、トルエン、キシレン等が好ましいものとして挙げられる。反応温度は通常室温から200℃が好ましい範囲である。
【００６２】
また、製法１及びは製法２に於て用いられる炭素数２以上のジオール化合物としては、具体的にはエチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ウンデカンジオール、ドデカンジオール、トリデカンジオール、テトラデカンジオール、ペンタデカンジオール等が挙げられる。
【００６３】
また、該ジオールを反応させる際に使用される酸性触媒としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸、三フッ化ほう素エーテラート等のルイス酸が挙げられ、また、塩基性触媒としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、炭酸カリウム等が挙げられる。
【００６４】
尚、村橋俊一、“新実験化学講座14(Ｉ)”日本化学会編、丸善、東京（1977）p.582に記載されているようにオキシラン（エポキシ）化合物とアルコールを酸性又は塩基性触媒の存在下反応させて、β-ヒドロキシエーテルを製造することは、この技術分野においてよく知られている。また、非対称オキシランでは、酸性と塩基性条件とで環の開環方向が異なってくるので、酸性触媒を用いることにより、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1に置換基、Ｒ2に水素原子を導入することができ、一方、塩基性触媒を用いることにより、本発明に係る一般式［１］のＲ1に水素原子、Ｒ2に置換基を導入することができる（下記式１参照。）。
【００６５】
【式１】
0003653798.tif 000011
【００６６】
変性シリカゲルとジオールとの反応は、無溶媒で行なってもよいが、適当な溶媒を使用して行なってもよい。この際に用いられる好適な溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2ージクロロエタン、1,1,1ートリクロロエタン、N,Nージメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。また、この際の反応温度は通常室温から200℃の範囲から適宜選択される。この様にして容易にシリカゲルの内表面及び外表面のシラノール基の水素原子の一部又は全部が、ケイ素原子を介して、一般式［１］で示される基で置換された本発明の変性シリカゲルを製造することができる。
【００６７】
また、製法１及び製法２で用いられるアルキル基を有するシランカップリング剤としては、ヘキサメチルジシラザン、ヘキサメチルシクロトリシラザン、オクタメチルシクロテトラシラザン、一般式［７］
【００６８】
【化１２】
0003653798.tif 000012
【００６９】
［式中、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8は夫々独立して炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又はハロゲン原子を表す。但し、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8の少なくとも１つはアルコキシ基又はハロゲン原子である。Ｒ9は炭素数１〜６のアルキル基を表し、また、置換基として芳香族基が置換していてもよい。］で示されるシランカップリング剤等が挙げられる。
【００７０】
尚、一般式［７］で示されるシランカップリング剤の具体例としては、トリメチルクロロシラン、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルーn-プロポキシシラン、ジメチルジクロロシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、メチルトリクロロシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリーn-プロポキシシラン、トリエチルクロロシラン、ジエチルジクロロシラン、ジエチルジエトキシシラン、エチルジメチルクロロシラン、エチルメチルジクロロシラン、エチルトリクロロシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、トリーn-プロピルクロロシラン、ジーn-プロピルジクロロシラン、n-プロピルジメチルクロロシラン、メチルーn-プロピルジクロロシラン、n-プロピルトリクロロシラン、n-プロピルトリメトキシシラン、トリイソプロピルクロロシラン、ジイソプロピルジクロロシラン、イソプロピルジメチルクロロシラン、メチルイソプロピルジクロロシラン、トリーn-ブチルクロロシラン、ジーn-ブチルメチルクロロシラン、ジーn-ブチルジクロロシラン、n-ブチルジメチルクロロシラン、n-ブチルメチルジクロロシラン、n-ブチルトリクロロシラン、iーブチルトリクロロシラン、i-ブチルトリメトキシシラン、ジーt-ブチルメチルクロロシラン、ジーt-ブチルジクロロシラン、t-ブチルジメチルクロロシラン、t-ブチルトリクロロシラン、ペンチルトリクロロシラン、ペンチルトリメトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリクロロシラン、ヘキシルメチルジクロロシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、ベンジルトリクロロシラン、ベンジルジメチルエトキシシラン、βーフェネチルトリクロロシラン、メチルーβーフェネチルジクロロシラン等が挙げられる。
【００７１】
アルキル基を有するシランカップリング剤との反応は、一般には無水条件下で実施されるが、少量の水を加えるのは任意である。また、この反応に使用される好適な反応溶媒の例としてはベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられる。また、反応温度としては通常室温から200℃の範囲である。尚、シリカゲルに一般式［１］で示される基を導入した後に、アルキル基を有するシランカップリング剤を反応させると、一般式［１］で示される基の水酸基もアルキルシリル化されるので、この水酸基に結合したアルキルシリル基を、例えばアセトニトリル、メタノール、エタノール等を含む酸の水溶液で処理する等により除去する必要がある。この処理に用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、過塩素酸、燐酸、p-トルエンスルホン酸等が挙げられ、反応温度は通常室温から200℃の範囲である。この様にして容易にシリカゲルの内表面及び外表面のシラノール基の水素原子の一部が本発明に係る一般式［１］で示される基で置換され、残りの一部又は全部がアルキル基で置換された変性シリカゲルを製造することができる。
【００７２】
本発明の変性シリカゲルに於て、シラノール基の水素原子にケイ素原子を介して前記一般式［１］で示される基あるいは置換されていてもよいアルキル基が導入される態様としては、例えば下記式２〜式５に示される態様等が挙げられる。これらは、使用するシランカップリング剤の種類や反応条件等により左右され る。
【００７３】
【式２】
0003653798.tif 000013
【００７４】
【式３】
0003653798.tif 000014
【００７５】
【式４】
0003653798.tif 000015
【００７６】
【式５】
0003653798.tif 000016
【００７７】
尚、Ｚは前記一般式［１］又は置換されていてもよいアルキル基を示す。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、上述した如き本発明の変性シリカゲルを含んでなることを特徴とする。
【００７８】
本発明の変性シリカゲルを含んでなる充填剤は一般の逆相カラム充填剤と同様に用いることができるが、特にタンパク質成分を多量に含有する生体試料中の成分の分析及び濃縮に有効である。
【００７９】
本発明のクロマトグラフィー用カラムは上記本発明のクロマトグラフィー用充填剤を充填してなることを特徴とする。
【００８０】
本発明のクロマトグラフィー用カラムは、例えば、内径（φ）１〜10mm、好ましくは２〜６mm、長さ10〜500mm、好ましくは10〜300mmのステンレス製のカラムに本発明の変性シリカゲルをスラリー法等、常法に従って充填することにより得られる。
【００８１】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いて生体試料中の成分を分析する際の移動相としては、タンパク質が変性しない溶媒、好ましくは有機溶媒含有量が30％以下のアセトニトリル、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、エタノール等や水溶媒等が好ましく挙げられ、特に好ましいものとしてはアセトニトリルと水との混合溶媒又は水が挙げられる。また、移動相には、有機溶媒や水以外に必要に応じて例えばリン酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等、通常この分野で用いられる緩衝剤が入っていても良い。また、グラジエント操作を行うことにより有機溶媒の濃度を順次変えることも任意である。
また、移動相のpHは目的物質を分析し得る範囲であれば特に限定されないが、カラムライフを考慮するとpH２〜7.5が好ましい範囲として挙げられる。
【００８２】
本発明の充填剤を用いた分析方法に於て、溶出時の流速は、通常、0.1〜５ml/min、好ましくは0.5〜２ml/minの範囲から適宜選択される。カラム温度は、通常、０〜60℃、好ましくは20〜50℃の範囲から適宜選択される。
【００８３】
上記した如き条件下で分析を行うことにより、タンパク質成分を大量に含有する生体試料中の薬物等（例えば、フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトイン、リドカイン、プリミドン、イミプラミン、インドメタシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、ニトラゼパム、フロセミド、エテンザミド、サリチルアミド、イブプロフェン、トルブタミド、アセトアミノフェン等）の成分を除タンパク質処理することなく容易に且つ簡便に分析することが可能となる。即ち、シリカゲルに本発明に係る一般式［１］で示される置換基を導入することにより、タンパク質等の巨大分子は、本発明に係る一般式［１］で示される基中の末端水酸基及びエーテル部分構造によって、変性することなく素通りし、そのままカラム外に排出される。一方、比較的分子の小さい化合物（薬物等）は、本発明に係る一般式［１］で示される基、又は本発明に係る一般式［１］で示される基とアルキル基によって、疎水性の差に従い、分離溶出される。尚、この際、本発明に係る一般式［１］で示される基とアルキル基とが共に導入された本発明の変性シリカゲルを含んでなる充填剤を用いた場合の方が薬物等の分離能が高い。
【００８４】
本発明の変性シリカゲルを含んでなる充填剤は、また、タンパク質が変性せずに素通りし、薬物等の低分子化合物は保持されるということを利用して、除タンパク質用前処理カラム充填剤としても、用いることが出来る。
【００８５】
即ち、本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムに生体試料を通すことにより、生体試料中の薬物等の微量成分を濃縮すると共に、タンパク質成分をカラム外に排除する。次に、本発明のカラム内で濃縮された薬物等の微量成分を一般の逆相カラム（分析用カラム）に導き分析を行うのである。この時カラムスイッチング法として知られている移動相の流路を高圧六方バルブ等を用いて自動的に切り換える手法等を用いることも任意である。
【００８６】
以上のように本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムを除タンパク質用前処理カラムとし、一般の逆相系カラムを分析用カラムとしてこれらを組合せて用いることにより、生体試料中等の濃度の低い薬物等を高感度に分析することができる。勿論、本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムをそのまま分析用カラムとして用いても良いことは言うまでもない。
【００８７】
次に本発明を実施例及び参考例によって具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００８８】
【実施例】
参考例１  3ーグリシドキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
細孔径約80オングストローム、平均粒子径 ５μmの球形シリカゲル 20gにトルエン 400mlを加え、共沸により水を除いた後、水 0.82ml、3ーグリシドキシプロピルトリメトキシシラン 19.67g及びトリエチルアミン ６mlを加えて８時間還流させた。冷却後、得られたシリカゲルを濾取し、トルエン 400ml、メタノール 400ml、水 1000ml、アセトン 400ml及びメタノール 400mlの順で洗浄した後、真空乾燥機にて85℃で乾燥し、3ーグリシドキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 25.8gを得た。
【００８９】
参考例２  2,3-ジヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例１で得られた変性シリカゲル ４gに0.7％過塩素酸水溶液 180ml及びアセトニトリル 20mlを加え、６時間還流させた。冷却後、得られたシリカゲルを濾取し、メタノール 200ml、水 500ml、アセトン 200ml及びメタノール 200mlの順で洗浄した後、真空乾燥機にて85℃で乾燥し、2,3-ジヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 2.7gを得た。
【００９０】
参考例３  5,6ージヒドロキシヘキシルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
細孔径約80オングストローム、平均粒子径 ５μmの球形シリカゲル 7.5g、トルエン 150ml、水 0.46ml、5,6ーエポキシヘキシルトリメトキシシラン 6.9g、 トリエチルアミン 2.25mlを用いて参考例１と同様に処理を行って5,6-エポキシヘキシルシリル基を有するシリカゲル 9.6gを得た。このシリカゲル 8.0g、0.7％過塩素酸水溶液 360.45ml及びアセトニトリル 40.05mlを用いて参考例２と同様に処理を行って5,6-ジヒドロキシヘキシルシリル基を有するシリカゲル 7.9gを得た。
【００９１】
実施例１  2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例１で得られた変性シリカゲル 3.5gにクロロホルム ５ml、エチレングリコール 4.34g、及びBF3・Et2O 0.2gを加え、４時間還流させた。冷却後、得られたシリカゲルを濾取し、メタノール 200ml、水 500ml、アセトン 200ml及びメタノール200mlの順で洗浄した後、真空乾燥機にて85℃で乾燥し、2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.3gを得た。
【００９２】
実施例２  2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例１で得られた変性シリカゲル 2.3gにトルエン 11.5ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 4.6mlを加え、８時間還流させた。冷却後、得られたシリカゲルを濾取し、トルエン 200ml、メタノール 200ml、水 500ml、アセトン 200ml及びメタノール 200mlの順で洗浄した後、真空乾燥機にて85℃で乾燥した。このシリカゲルに0.7％過塩素酸水溶液 93.15ml及びアセトニトリル 10.35mlを加え、２時間還流させた。冷却後、得られたシリカゲルを濾取し、メタノール 200ml、水 500ml、アセトン 200ml及びメタノール 200mlの順で洗浄した後、真空乾燥機にて85℃で乾燥し、2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル1.7gを得た。
【００９３】
実施例３  2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例１で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム ５ml、ブタンジオール 6.31g、及びBF3・Et2O 0.2gを用いて実施例１と同様に処理を行い2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.3gを得た。
【００９４】
実施例４  2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例３で得られた変性シリカゲル 2.2gにトルエン 11ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 4.4mlを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル 1.8gを得た。
【００９５】
実施例５  2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例１で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム ５ml、ヘキサンジオール8.27g、及びBF3・Et2O 0.2gを用いて実施例１と同様の処理を行って2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.3gを得た。
【００９６】
実施例６  2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム  、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例５で得られた変性シリカゲル 2.3gにトルエン 11.5ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 4.6mlを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル 1.9gを得た。
【００９７】
参考例４  2-ブトキシー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約80オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例１で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム ５ml、ブタノール  5.19g、及びBF3・Et2O 0.2gを用いて実施例１と同様の処理を行って2ーブトキシー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.4gを得た。
【００９８】
参考例５  3ーグリシドキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmの球形シリカゲル 20g、トルエン 400ml、水 1.03ml、グリシドキシプロピルトリメトキシシラン 26.14g、トリエチルアミン 6mlを用いて参考例１と同様の処理を行って3-グリシドキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 27.7gを得た。
【００９９】
参考例６  2,3-ジヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例５で得られた変性シリカゲル 3.5g、0.7％過塩素酸水溶液 157.5ml及びアセトニトリル 17.5mlを用いて参考例２と同様の処理を行って2,3-ジヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.4gを得た。
【０１００】
参考例７  5,6ージヒドロキシヘキシルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmの球形シリカゲル 7.5g、ト ルエン 150ml、水 0.59ml、5,6ーエポキシヘキシルトリメトキシシラン 13.0g、トリエチルアミン 2.25mlを用いて参考例１と同様の処理を行って5,6-エポキシヘキシルシリル基を有するシリカゲル 10.6gを得た。このシリカゲル 8.7g、   0.7％過塩素酸水溶液 390.6ml及びアセトニトリル 43.4mlを用いて参考例２と同様の処理を行って5,6-ジヒドロキシヘキシルシリル基を有するシリカゲル 8.5gを得た。
【０１０１】
参考例８  2ー（3,4ージヒドロキシシクロヘキシル）エチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmの球形シリカゲル 5.0g、トルエン 100ml、水2.0ml、2-（3,4-エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン 5.0g、トリエチルアミン 1.50mlを用いて参考例１と同様の処理を行って2-（3,4-エポキシシクロヘキシル）エチルシリル基を有するシリカゲル 6.2gを得た。このシリカゲル 2.0g、0.7％過塩素酸水溶液 80.0ml及びアセトニトリル 20.0mlを用いて参考例２と同様の処理を行って2-（3,4-ジヒドロキシシクロヘキシル）エチルシリル基を有するシリカゲル 1.9gを得た。
【０１０２】
実施例７  2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例５で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム 5.0ml、エチレングリコール 5.65g、及びBF3・Et2O 0.26gを用いて実施例１と同様の処理を行って2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.4gを得た。
【０１０３】
実施例８  2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例７で得られた変性シリカゲル 2.3gにトルエン 11.5ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 4.6mlを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(2ーヒドロキシエトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル 1.9gを得た。
【０１０４】
実施例９  2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
参考例５で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム ５ml、ブタンジオール 8.20g、及びBF3・Et2O 0.26gを用いて実施例１と同様の処理を行って2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.3gを得た。
【０１０５】
実施例１０  2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例９で得られた変性シリカゲル 2.3gにトルエン 11.5ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 2.3mlを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(4ーヒドロキシブトキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル 1.9gを得た。
【０１０６】
実施例１１  2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μｍのシリカゲルを用いた場合）
参考例５で得られた変性シリカゲル 3.5g、クロロホルム ５ml、ヘキサンジオール10.75g、及びBF3・Et2O 0.26gを用いて実施例１と同様の処理を行って2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基を有するシリカゲル 3.3gを得た。
【０１０７】
実施例１２  2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例１１で得られた変性シリカゲル 2.4gにトルエン 12ml及び1,1,1,3,3,3ーヘキサメチルジシラザン 4.8mlを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びトリメチルシリル基を有するシリカゲル 2.0gを得た。
【０１０８】
実施例１３  2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びジメチルシリル基を有するシリカゲルの合成（細孔径約60オングストローム、平均粒子径５μmのシリカゲルを用いた場合）
実施例１１で得られた変性シリカゲル 4.0gにトルエン 20ml及び1,1,3,3,5,5ーヘキサメチルシクロトリシラザン 8.4gを用いて実施例２と同様の処理を行って2ー(6ーヒドロキシヘキシルオキシ)ー3ーヒドロキシプロポキシプロピルシリル基及びジメチルシリル基を有するシリカゲル 3.7gを得た。
【０１０９】
実施例１４  牛血清アルブミンの回収試験
実施例１、３、５及び参考例２、３、４で製造した変性シリカゲルを内径4.6mm、長さ50mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填した。
各カラムを用いて下記に示した分析条件で牛血清アルブミン（以下、BSAと略記する。）を処理し、その回収率を求めた。表１にその結果を示す。
【０１１０】
〔分析条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝90/10(v/v)
流速：0.5ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
試料：BSA 15mg/mlを上記移動相に溶解した液
注入量：20μl
【０１１１】
0003653798.tif 000017
【０１１２】
表１の結果から、実施例１、３及び５の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムに於けるBSA回収率は従来の充填剤、即ち参考例２及び３で得られた親水性基の部分が従来のジオール形になっている充填剤を充填したカラムと同様に良好なBSA回収率を示した。尚、実施例１、３及び５の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムで得られたクロマトグラムのBSAのピーク形状は従来の参考例２及び３の充填剤を充填したカラムで得られるそれよりテーリングが少なく良好な形状であった。また、実施例３の変性シリカゲルを充填剤として用いた場合のBSA回収率と、これと炭素数が同数の修飾シリル基が導入された参考例４のシリカゲル（但し、末端には１つしか水酸基が導入されていない。）を充填剤として用いた場合のBSA回収率を比較すると、実施例３の変性シリカゲルを充填剤とした場合の方が極めて高い回収率を示していることが判る。このことから良好なタンパク質回収率を得るためには、本発明に係る充填剤にように一般式［１］で示される基のＲ1の末端に水酸基が導入されていることが必要であることが判る。
【０１１３】
実施例１５  ウラシル、ベンゼン、ナフタレンの分析試験
実施例１４で調製した各カラムを用いて下記の条件でウラシル、ベンゼン及びナフタレンの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表２にその結果を示 す。
〔分析条件〕
移動相：CH3CN／H2O=30/70(v/v)
流速：0.5ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
試料：ウラシル 0.77mg、ベンゼン 145μl及びナフタレン 20mgを60%CH3CN水溶液  100mlに溶解した液
注入量：２μl
【０１１４】
0003653798.tif 000018
【０１１５】
表２の結果から、実施例１、３及び５の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムを使用することにより、ウラシル、ベンゼン、ナフタレンを参考例２、３及び４の充填剤を充填したカラムと同様に良好に分離し得ることが判る。また、本発明に係る充填剤の場合は、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることによりベンゼン及びナフタレンの保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例１：炭素数２、実施例３：炭素数４、実施例５：炭素数６）。
【０１１６】
実施例１６  フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験
実施例１４で調製した各カラムを用いて下記の条件でフェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表３にその結果を示す。
〔分析条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝90/10(v/v)
流速：0.5ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
試料：フェノバルビタール ２mg、カルバマゼピン 0.5mg及びフェニトイン ４mgを上記移動相100mlに溶解した液
注入量：20μl
【０１１７】
0003653798.tif 000019
【０１１８】
表３の結果から、実施例１、３及び５の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムは、フェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインを良好に分離していることが判る。一方、従来の充填剤である参考例２及び３の充填剤（シリカゲルの内表面及び外表面に導入された親水性基の部分が従来のジオール形になっている充填剤）を充填したカラムでは、同じ条件でカルバマゼピンとフェニトインのピークが一部重なり、これらを良好に分離することはできなかった。これらのことから、実施例１、３及び５の変性シリカゲルを充填した充填剤には本発明に係る一般式［１］で示される基が導入されているために上記３種の薬物を良好に分離することができると考えられる。また、表３の結果から、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることによりこれら薬物の保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例１：炭素数２、実施例３：炭素数４、実施例５：炭素数６）。
【０１１９】
実施例１７  牛血清アルブミンの回収試験
実施例２、４、及び６で製造した変性シリカゲルを内径4.6mm、長さ50mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填した。
これらのカラムを用いて実施例１４と同様の条件でBSAの回収率を求めた。表４にその結果を示す。
【０１２０】
0003653798.tif 000020
【０１２１】
表４の結果から、シリカゲルに本発明に係る一般式［１］で示される基とトリメチルシリル基とを導入した本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムは良好なBSA回収率を示すことが判る。
【０１２２】
実施例１８  ウラシル、ベンゼン、ナフタレンの分析試験
実施例１７で調製したした各カラムを用いて実施例１５と同様の条件でウラシル、ベンゼン及びナフタレンの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表５にその結果を示す。
【０１２３】
0003653798.tif 000021
【０１２４】
表５の結果から、実施例２、４及び６で調製された本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムにより、ウラシル、ベンゼン及びナフタレンを良好に分離することができることが判る。また、表２と表５のデータの比較から、トリメチルシリル基が導入されていない本発明に係る充填剤（実施例１、３及び５）の代わりにトリメチルシリル基が導入された本発明に係る充填剤（実施例２、４及び６）を使用すると各化合物の保持時間が長くなることも判る。また、表５の結果から、トリメチルシリル基が共存する場合であっても、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の素数を変えることにより、ベンゼン及びナフタレンの保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例２：炭素数２、実施例４：炭素数４、実施例６：炭素数６）。
【０１２５】
実施例１９  フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験
実施例１７で調製した各カラムを用いて実施例１６と同様の条件でフェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表６にその結果を示す。
【０１２６】
0003653798.tif 000022
【０１２７】
表６の結果から、実施例２、４及び６で調製された本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムを用いることにより、それぞれの薬物を良好に分離し得ることが判る。また、表３と表６のデータの比較から、トリメチルシリル基が導入されていない本発明に係る充填剤（実施例１、３及び５）を使用した場合よりも、トリメチルシリル基が導入された本発明に係る充填剤（実施例２、４及び６）を使用した場合の方が各薬物の保持時間が長くなることも判る。また、表６の結果から、トリメチルシリル基が導入された場合でも、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることにより各薬物の保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例２：炭素数２、実施例４：炭素数４、実施例６：炭素数６）。
【０１２８】
実施例２０  牛血清アルブミンの回収試験
実施例７、９、１１及び参考例６、７、８で製造したシリカゲルを内径4.6mm、長さ50mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填した。
各カラムを用いて実施例１４と同様の条件でBSAの回収率を求めた。表７にその結果を示す。
【０１２９】
0003653798.tif 000023
【０１３０】
表７の結果から、実施例７、９及び１１の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムに於けるBSA回収率は、従来のジオール形の充填剤、即ち参考例６、７及び８で調製された充填剤を充填したカラムに於けるそれと同様に良好であることが判る。また、実施例７、９及び１１の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムで得られたクロマトグラムのBSAのピーク形状はテーリングが少ない良好な形状であった。
【０１３１】
実施例２１  ウラシル、ベンゼン、ナフタレンの分析試験
実施例２０で調製した各カラムを用いて実施例１５と同様の条件でウラシル、ベンゼン及びナフタレンの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表８にその結果を示す。
【０１３２】
0003653798.tif 000024
【０１３３】
表８の結果から、実施例７、９及び１１の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムにより、ウラシル、ベンゼン及びナフタレンを、参考例６、７及び８の従来の充填剤（シリカの内表面及び外表面に導入された親水性基の部分が従来のジオールの形になっている充填剤）を充填したカラムと同様に良好に分離できることが判る。また、本発明に係る充填剤に於て本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることにより保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例７：炭素数２、実施例９：炭素数４、実施例１１：炭素数６）。
【０１３４】
実施例２２  フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験
実施例２０で調製した各カラムを用いて実施例１６と同様の条件でフェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表９にその結果を示す。
【０１３５】
0003653798.tif 000025
【０１３６】
表９の結果から、実施例７、９及び１１の本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムにより、各薬物を参考例６、７及び８の充填剤を充填したカラムを使用した場合と同等以上に良好に分離し得ることが判る。特に、実施例１１の充填剤を充填したカラムを用いると、参考例６、７及び８の充填剤を充填したカラムを用いた場合よりもカルバマゼピンとフェニトインをより良好に分離し得ることが判る。
また、表９の結果から本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることにより、各薬物の保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例１：炭素数２、実施例３：炭素数４、実施例５：炭素数６）。
【０１３７】
実施例２３
牛血清アルブミンの回収試験
実施例８、１０、１２及び１３で製造したシリカゲルを内径4.6mm、長さ50mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填した。
各カラムを用いて実施例１４と同様の条件でBSAの回収率を求めた。表１０にその結果を示す。
【０１３８】
0003653798.tif 000026
【０１３９】
表１０の結果から、実施例８、１０、１２及び１３の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムに於けるBSA回収率は何れも良好であることが判る。
【０１４０】
実施例２４  ウラシル、ベンゼン、ナフタレンの分析試験
実施例２３で調製した各カラムを用いて実施例１５と同様の条件でウラシル、ベンゼン及びナフタレンの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表１１にその結果を示す。
【０１４１】
0003653798.tif 000027
【０１４２】
表１１の結果から、実施例８、１０及び１２の本発明の変性シリカゲルを充填剤（トリメチルシリル基が導入されている）として充填したカラムと、実施例１３の本発明の変性シリカゲルを充填剤（ジメチルシリル基が導入されている）として充填したカラムの何れを用いた場合でも、ウラシル、ベンゼン及びナフタレンを良好に分離し得ることが判る。また、表８と表１１のデータの比較から、トリメチルシリル基やジメチルシリル基が導入されていない本発明に係る充填剤（実施例７、９及び１１の充填剤）に比較して、トリメチルシリル基等が導入された本発明に係る充填剤（実施例８、１０、１２及び１３の充填剤）を用いた方が、各化合物の保持時間が長くなることも判る。また、表１１の結果から、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることにより保持時間を容易に調整することができることも判る（実施例８：炭素数２、実施例１０：炭素数４、実施例１２：炭素数６）。
【０１４３】
実施例２５    フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験実施例２３で調製した各カラムを用いて実施例１６と同様の条件でフェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインの分析を行い、それぞれの保持時間を求めた。表１２にその結果を示す。
【０１４４】
0003653798.tif 000028
【０１４５】
表１２の結果から、実施例８、１０及び１２の本発明の変性シリカゲルを充填剤（トリメチルシリル基が導入されている）として充填したカラムと、実施例１３の本発明の変性シリカゲルを充填剤（ジメチルシリル基が導入されている）として充填したカラムの何れを用いても、それぞれの薬物を良好に分離し得ることが判る。また、表９と表１２のデータの比較から、トリメチルシリル基やジメチルシリル基が導入されていない本発明に係る充填剤（実施例７、９及び１１の充填剤）を用いた場合よりも、トリメチルシリル基等が導入された本発明に係る充填剤（実施例８、１０、１２及び１３の充填剤）を用いた場合の方が、各薬物の保持時間を長くすることができることや、実施例８、１０、１２及び１３の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムを用いると、従来の充填剤（参考例６、７及び８の充填剤）を充填したカラムを用いた場合よりもカルバマゼピンとフェニトインをより良好に分離することができることも判る。また、表１２のデータから、本発明に係る一般式［１］で示される基のＲ1のメチレン鎖の炭素数を変えることにより保持時間を容易に調整することができることや（実施例８：炭素数２、実施例１０：炭素数４、実施例１２：炭素数６）、表１２の実施例１２及び１３の変性シリカゲルを充填剤として用いた場合のデータの比較から、トリメチルシリル基をジメチルシリル基に変えると保持時間は減少するが、薬物の分離は良好であることも判る。
【０１４６】
実施例２６  血清試料の直接注入によるフェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験
実施例１２で製造したシリカゲルを内径4.6mm、長さ150mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填した。
このカラムを用いて下記に示した分析条件で牛胎児血清、及び牛胎児血清にフェノバルビタール 20μg/ml、カルバマゼピン ５μg/ml及びフェニトイン 40μg/mlを添加したものを試料として分析した。
【０１４７】
〔分析条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝90/10(v/v)
流速：1.2ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
試料注入量：20μl
【０１４８】
得られたクロマトグラムを図−１及び図−２に示す。図−１は牛胎児血清を試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークが注入後直ちに出現すること、即ち、牛胎児血清タンパク質は、カラムに吸着されることなく溶出することが判る。図−２は、牛胎児血清に上記３種（フェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトイン）の薬物を添加したものを試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークの後に、フェノバルビタール、カルバマゼピン及びフェニトインの各ピークが溶出し、良好に分離されることが判る。尚、図２中、１はフェノバルビタールのピークを、２はカルバマゼピンのピークを３はフェニトインのピークを夫々示す。
【０１４９】
実施例２７  血清試料の直接注入によるリドカインの分析試験
実施例２６で調製したカラムを用いて下記に示した分析条件で牛胎児血清、及び牛胎児血清にリドカイン 150μg/mlを添加したものを試料として分析した。
〔分析条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝95/5(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
試料注入量：20μl
【０１５０】
得られたクロマトグラムを図−３及び図−４に示す。図−３は牛胎児血清を試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークが注入後直ちに出現すること、即ち、牛胎児血清タンパク質はカラムに吸着されることなく溶出することが判る。図−４は、牛胎児血清にリドカインを添加したものを試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークの後に、リドカインのピーク（↓印）が溶出し、血清成分と良好に分離されることが判る。
【０１５１】
実施例２８  血清試料の直接注入によるプリミドンの分析試験
実施例２６で調製したカラムを用いて下記に示した分析条件で牛胎児血清及び牛胎児血清にプリミドン 100μg/mlを添加したものを試料として分析した。
〔分析条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝98/2(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
検出波長：230nm
試料注入量：20μl
【０１５２】
得られたクロマトグラムを図−５及び図−６に示す。図−５は牛胎児血清を試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークが注入後直ちに出現することが判る。図−６は、牛胎児血清にプリミドンを添加したものを試料としたもので、牛胎児血清タンパク質のピークの後に、プリミドンのピーク（↓印）が溶出し、血清成分と良好に分離されることが判る。
【０１５３】
実施例２９  カラムスイッチング法による血清試料中のフェノバルビタール、カルバマゼピン、フェニトインの分析試験
実施例１２で製造したシリカゲルを内径4.6mm、長さ35mmのHPLC用ステンレスカラムにスラリー法によって充填し前処理用カラムとした。図−７に示す装置を用いてカラムスイッチング法によって試料（人血清にフェノバルビタール 20μg/ml、カルバマゼピン ５μg/ml及びフェニトイン 40μg/mlを添加したもの）を分析した。即ち、前処理用移動相をバルブの点線で示す流路に流すことにより前処理用カラムにより試料中の薬物を濃縮すると共に血清タンパク質をカラム外に排除した。次に、バルブを切り替えて、試料注入後４分から５分の間、分析用移動相をバルブの実線で示す流路に流すことにより前処理用カラム中の薬物を分析用カラムに導入して分析を行った。尚、前処理条件及び分析条件を下記に示す。
【０１５４】
〔前処理条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
試料注入量：20μl
【０１５５】
〔分析条件〕
分析用カラム：WakosilーII 5C18RS,4.6φ×250mm（和光純薬工業(株)製）
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝65/35(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
【０１５６】
得られたクロマトグラムを図−８に示す。図−８から明から如く、１．フェノバルビタール、２．カルバマゼピン、及び３．フェニトインの各ピークが順に良好に分離して出現し、それぞれの薬物を良好に定量し得ることが判る。
【０１５７】
実施例３０  カラムスイッチング法による血清試料中のイミプラミンの分析試験実施例２９で調製した前処理用カラムを用い、図−９に示す示す装置によるカラムスイッチング法によって試料（人血清に塩酸イミプラミン 200ng/mlを添加したもの）を分析した。即ち、前処理用移動相をバルブの点線で示す流路に流すことにより前処理用カラムにより試料中の薬物を濃縮すると共に血清タンパク質をカラム外に排除した。次に、バルブを切り替えて、試料注入後６分から１１分の間、前処理用移動相をバルブの実線で示す流路に流すことにより前処理用カラム中の薬物を分析用カラムに導入した。再び、バルブを切り替えて分析用移動相をバルブの点線を示す流路に戻し分析を行った。尚、前処理条件及び分析条件を下記に示す。
【０１５８】
〔前処理条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝98/2(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
試料注入量：100μl
【０１５９】
〔分析条件〕
分析用カラム：Wakosil-II 5C18RS,4.6φ×250mm（和光純薬工業(株)）
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=2.5)/アセトニトリル＝65/35(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
【０１６０】
得られたクロマトグラムを図−１０に示す（イミプラミンのピーク：↓印）。この結果から、本発明の変性シリカゲルを充填剤として含んでなるカラムを血清試料の前処理カラムとして利用することにより血清中の微量成分を容易に濃縮できるので、本発明に係るカラムは血清中の微量成分の分析に有用であることが判る。
【０１６１】
実施例３１  カラムスイッチング法による血清試料中のインドメタシンの分析試験
実施例２９で調製した前処理用カラムを用い、図−９に示す装置によるカラムスイッチング法によって試料（人血清にインドメタシン １μg/mlを添加したもの）を分析した。即ち、前処理用移動相をバルブの点線で示す流路に流すことにより前処理用カラムにより試料中の薬物を濃縮すると共に血清タンパク質をカラム外に排除した。次に、バルブを切り替えて、試料注入後4.5分から8.5分の間、前処理用移動相をバルブの実線で示す流路に流すことにより前処理用カラム中の試料を分析用カラムに導入した。再びバルブを切り替えて分析用移動相をバルブの点線で示す流路に戻し分析を行った。尚、前処理条件及び分析条件を下記に示した。
【０１６２】
〔前処理条件〕
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=6.9)/アセトニトリル＝87/13(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
試料注入量：20μl
【０１６３】
〔分析条件〕
分析用カラム：Wakosil-II 5C18RS,4.6φ×250mm
移動相：100mM リン酸緩衝液(pH=2.5)/アセトニトリル＝45/55(v/v)
流速：1.0ml/min
測定温度：30℃
検出波長：254nm
【０１６４】
得られたクロマトグラムを図−１１に示す（インドメタシンのピーク：↓印）。この結果から、本発明の変性シリカゲルを充填剤として含んでなるカラムを血清試料の前処理カラムとして利用することにより血清中の微量成分を容易に濃縮できるので、本発明に係るカラムは血清中の微量成分の分析に有用であることが判る。
【０１６５】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、血清等のタンパク質成分を多量に含有する生体試料中の薬物や代謝物を分析するためのクロマトグラフィー用充填剤として有用な、変性シリカゲルと、該変性シリカゲルを含んでなるクロマトグラフィー用充填剤及びこれを用いた生体試料中の成分の分析方法並びに該充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用カラムを提供するものであり、本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムを用いて血清等の生体試料の分析を行えば、タンパク質等の巨大分子は変性することなく素通りしてカラム外に排出され、一方試料中の薬物等の比較的低分子の化合物は濃縮、分離溶出されるため、除タンパク質操作を行うことなく生体試料中の薬物等の分析を行うことができるという効果を奏する。また、本発明の変性シリカゲルを充填剤として充填したカラムは、上記した如き性質を利用して、試料の除タンパク質用前処理カラムとしても有用なものであり、これと一般の逆相系カラムとを組合せることにより、血清等の生体試料中の低濃度の薬物等を高感度に分析することを可能とする、という効果を奏する。
【０１６６】
更に、本発明の変性シリカゲルは、シリカゲルの内表面及び外表面に同一の修飾基を導入することにより得られるものであるため、製造が容易で且つ同一の品質の充填剤を再現性良く得ることが可能である。更にまた、本発明の変性シリカゲルは、導入する修飾基のメチレン鎖の長さを調整することにより、目的の分析対象物の保持時間を適宜調整することができるという効果をも奏する。
【０１６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例２６で得られた、牛胎児血清を試料とした場合のクロマトグラムを示す。
【図２】図２は実施例２６で得られた牛胎児血清に各種薬物を添加したものを試料とした場合のクロマトグラムを示す。
【図３】図３は実施例２７で得られた牛胎児血清を試料とした場合のクロマトグラムを示す。
【図４】図４は実施例２７で得られた牛胎児血清にリドカインを添加したものを試料とした場合クロマトグラムを示す。
【図５】図５は実施例２８で得られた牛胎児血清を試料とした場合のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は実施例２８で得られた牛胎児血清にプリミドンを添加したものを試料とした場合クロマトグラムを示す。
【図７】図７は実施例２９のカラムスイッチング法で用いた装置を示す。
【図８】図８は実施例２９で得られたクロマトグラムを示す。
【図９】図９は実施例３０及び実施例３１のカラムスイッチング法で用いた装置を示す。
【図１０】図１０は実施例３０で得られたクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は実施例３１で得られたクロマトグラムを示す。
【０１６８】
【符号の説明】
１・・・フェノバルビタールのピーク、２・・・カルバマゼピンのピーク、３・・・フェニトインのピーク。
【図１】
0003653798.tif 000031
【図２】
0003653798.tif 000032
【図３】
0003653798.tif 000033
【図４】
0003653798.tif 000034
【図５】
0003653798.tif 000035
【図６】
0003653798.tif 000036
【図７】
0003653798.tif 000037
【図８】
0003653798.tif 000038
【図９】
0003653798.tif 000039
【図１０】
0003653798.tif 000040
【図１１】
0003653798.tif 000041