(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組み換え法により調製された又はネギ科植物から単離されたLFS(催涙成分生成酵素)を含有する溶液にアリイナーゼを添加して凍結乾燥又は熱風乾燥させることを特徴とする乾燥LFSを含有する組成物の製造方法。
【請求項２】
さらに、糖、又は糖並びに塩及び/又はピリドキサールリン酸からなる成分であるアリイナーゼ保護剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥LFSを含有する組成物におけるアリイナーゼとLFS（催涙成分生成酵素）の存在比率が、アリイナーゼ0.02Units：LFS（催涙成分生成酵素）1μgからアリイナーゼ200Units：LFS（催涙成分生成酵素）1μgの範囲である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
以下の(１)及び（２）を含む、催涙成分発生キット。
（１）遺伝子組み換え法により調製された又はネギ科植物から単離されたLFS(催涙成分生成酵素)を含有する溶液にアリイナーゼを添加して凍結乾燥又は熱風乾燥させて調製した乾燥LFSを含有する組成物。
（２）PRENCSO。
【請求項５】
以下の(１)及び（２）を混合することを特徴とする催涙成分の発生方法。
（１）遺伝子組み換え法により調製された又はネギ科植物から単離されたLFS(催涙成分生成酵素)を含有する溶液にアリイナーゼを添加して凍結乾燥又は熱風乾燥させて調製した乾燥LFSを含有する組成物。
（２）PRENCSO。
【請求項６】
PRENCSOがpH3.5以下の酸性のPRENCSO溶液である、請求項４記載の催涙成分発生キット、又は請求項５記載の催涙成分発生方法。
【請求項７】
アリイナーゼと遺伝子組み換え法により調製された又はネギ科植物から単離されたLFS（催涙成分生成酵素）を、アリイナーゼ0.02Units：LFS（催涙成分生成酵素）1μgからアリイナーゼ200Units：LFS（催涙成分生成酵素）1μgの存在比率で含有する、乾燥LFSを含有する組成物。
【請求項８】
前記溶液が更に糖、又は糖並びに塩及び/又はピリドキサールリン酸からなる成分であるアリイナーゼ保護剤を含むものである、請求項７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、催涙成分を利用する医療及び食品衛生の技術分野に関する。また、本願発明は、催涙成分を用いるドライアイの防止及び食品の保存の分野に関する。更に具体的には、本願発明は乾燥LFSを含有する組成物の製造方法、並びに室温保存可能な催涙成分発生キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タマネギの催涙成分（LF）であるthiopropanal S-oxideは、前駆物質のPRENCSO（S-1-プロペニル-システインスルフォキシド）に酵素アリイナーゼが作用し、スルフェン酸（E-1-propensulfenic acid)となり、スルフェン酸が催涙成分生成酵素（LFＳ）により異性化されることにより生じる。
【０００３】
催涙成分は、産業上、有用な化合物である事が知られている。例えば、催涙成分は、涙液分泌検査用試薬及び涙液分泌検査方法、言い換えればドライアイ検査用にも利用できることが知られている（特許文献1）。
【０００４】
また、本願出願人の先の未公開出願（特願2006-95146号）において、催涙成分が抗菌剤として利用できることを明らかにしている。
【０００５】
催涙成分は、化学合成することもできる。例えば、下記式１の反応１及び反応２により製造することができることが知られている。(非特許文献１)
【０００６】
【化１】
0005383075.tif 000002
【０００７】
なお、反応１及び反応２は、それぞれ具体的には、以下の表１及び表２に示される工程により調製することができる。
【０００８】
【表１】
0005383075.tif 000003
【０００９】
【表２】
0005383075.tif 000004
【００１０】
しかしながら、化学合成した催涙成分は保存安定性が悪いため、室温での保存はできなかった。
【００１１】
また、生化学的合成方法としては、例えば、特許第3330305号記載(特許文献２)の方法によることができる。具体的は、例えば、 (1) 催涙成分の合成に必要な酵素と基質、具体的には、アリイナーゼ、LFS及びPRENCSOの３つを混合する方法（非特許文献2）又は(2)生のタマネギを粉砕する方法などがある。
【特許文献１】WO2005/067907号
【特許文献２】特許第3330305号
【非特許文献１】J.Am.Chem.Soc.118,7492-7501(1996)
【非特許文献２】Nature,419,685(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
催涙成分を産業的に利用しようとする場合、上述のように催涙成分自体はすぐに分解してしまうので、催涙成分を利用しようとする現場で、催涙成分を発生させることが考えられる。この場合上記の生化学的合成法が好ましい。ただし生化学的合成方法であっても、例えば、生のタマネギを用いる方法では、タマネギの品種や個体間のバラツキ、季節変動などによってPRENCSOの含有量も変動するため、催涙成分の発生量をコントロールするのは難しいので、ロットごとに催涙成分量が異なることとなり、製品管理上好ましくないという問題がある。
【００１３】
他方、アリイナーゼ、LFS及びPRENCSOを用いる酵素的合成法では、アリイナーゼについては、NaClと2糖類を添加して凍結乾燥すると安定性が増す事が報告されている（Pharmazie,54,289-293(1999)）ものの、LFSが安定性にかけるという問題があった。
【００１４】
そこで、LFSの保存安定性を向上させることを第1の課題とする。更に、LFSの保存安定性を向上させる事によって、催涙成分を発生させることができ、室温での保存が可能なキットを提供することを第２の課題とする。
【００１５】
また、ドライアイの治療やドライアイの程度の測定などのために、催涙成分を発生させる場合には、催涙成分が、一定の保存期間を経た後も定量発生することが必要である。
【００１６】
さらに、催涙成分は、食品など様々な製品の殺菌又は静菌に使用することもできるが、催涙成分を、殺菌又は静菌を行なう現場で、定量的に発生させる手段がなかった。
【００１７】
そこで、LFSの保存安定性を向上させることによって、例えば、室温で一定期間の保存が可能で、必要な時に、一定量の催涙成分を発生することができるキットを提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本願発明は、室温で不安定なLFS(催涙成分生成酵素)を含有する溶液をアリイナーゼの存在下で乾燥させることにより安定に保存できる方法を提供する。
【００１９】
更に本願発明は、アリイナーゼとLFSを含有する混合溶液として乾燥して調製した乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）とPRENCSOを含む催涙成分発生キットを提供する。
【００２０】
なお本発明に用いられるLFS、アリイナーゼおよびPRENCSOは、それぞれ、精製されたものであってもよく、粗精製のものであってもよい。また、精製されたものと粗精製のものが混在していてもよい。具体的にはLFSは精製されており、アリイナーゼおよびPRENCSOは粗精製であってもよく、LFS、アリイナーゼおよびPRENCSOの全部が精製又は粗精製されたものであってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
LFSとアリイナーゼを共存させて乾燥させることにより、活性を維持しつつ両酵素を保存することが可能となる。
【００２２】
本発明の催涙成分発生キットは、室温における長期保存が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
１．LFS及びアリイナーゼ
本願発明で用いるLFSは、遺伝子組み換え法により産生したネギ科に属する植物由来のもの及びこれらの変異体酵素、例えば、再公表公報02/020808号、及び再公表公報03/074707号に記載のものを包含する。好適には、再公表公報02/020808号（WO 02/020808）に記載の遺伝子組み換え法により調製されたLFSが挙げられる。また当然ながら、ネギ科植物からLFSを単離して本発明に使用することができる。
【００２４】
粗精製LFSは、例えばタマネギから簡易な方法で抽出したものである。ここでいう簡易な粗精製LFSの調製方法には、「加水して粉砕したタマネギの抽出液を陰イオン交換樹脂で処理し、吸着させた後、溶出させる方法」がある。なお、抽出する素材は、タマネギに限定されるものでないことは当然である。
【００２５】
また、アリイナーゼとしては、ネギ科植物由来のものが挙げられ、好適には、ニンニク由来のアリイナーゼが挙げられる。
【００２６】
粗精製アリイナーゼは、例えばニンニクから簡易な方法で抽出したものである。ここでいう簡易な粗精製アリイナーゼの調製方法には、「加水して粉砕したニンニクの抽出液に酸を加え、アリイナーゼを等電点沈殿させた後、沈殿物を回収し、再溶解する方法」がある。なお、抽出する素材は、ニンニクに限定されるものでないことは当然である。
【００２７】
本発明は、催涙成分の発生に関与する、アリイナーゼ、LFS、PRENCSOの３つを、その精製度に拘わらず、室温条件下で安定的に保存可能にするという、驚くべき技術の発明に基づくものである。
【００２８】
２．LFSの保存条件
催涙成分の生成に必要な酵素の内、アリイナーゼについては、NaClと二糖類を添加して凍結乾燥すると安定性が増す事が報告されおり（Pharmazie,54,289-293(1999)）、その方法を用いることで、本願発明者らは、アリイナーゼが室温で一ヶ月以上安定であることを確認している。
【００２９】
そこで、本願発明者らは、はじめに、LFSについてもNaClや二糖類を添加して凍結乾燥することにより、保存性の向上を試みた。しかしながら、LFSについては、アリイナーゼと異なり、室温で1日保管しただけでも活性の75%は失われ、保存性の向上は少なかった。
【００３０】
発明者等が、たまたま、LFS溶液にアリイナーゼを添加してから凍結乾燥を行なうと、予想に反して、LFSの室温での安定性は画期的に改善された（室温で5日保管しても活性の低下は観察されなかった）。
【００３１】
溶液中のLFS濃度としては、LFSが溶解する限り任意の濃度を用いることができるが、水溶液として、例えば、1.0×10-1μg/mLから1.0×104μg/mLの範囲内とすることができる。また、LFSに対するアリイナーゼの量としては、例えば、0.005Unit/LFSμgから50Unit/LFSμgの範囲内にすることができる。 具体的には、LFS 1μgに対して、アリイナーゼ0.005Units〜50Unitsを混合することができる。また、ここでいうLFSは、後述するrLFSと同一であり、比活性は、6.0×106area/μgのものである。
【００３２】
つぎに、LFSとアリイナーゼの混合酵素液の乾燥方法として、凍結乾燥、熱風乾燥の２つの方法がある。なお、熱風乾燥の場合は、上記酵素が熱によって失活することがない温度域で乾燥することが好ましく、例えば40℃〜80℃、好ましくは55℃〜65℃という条件を挙げることができる。作製したキットを使い催涙成分発生試験を行った結果、凍結乾燥や熱風乾燥では、催涙成分の安定した発生が達成できた。
【００３３】
凍結乾燥は、当業者に公知の任意の方法である。典型的には、試料を-80℃から-20℃で予備凍結し、その後減圧乾燥するが、乾燥温度は任意の適当な温度を使用することができる。凍結は、当業者に公知の任意の方法で行なわれ、例えば、液体窒素へ浸漬する方法、-4℃から-80℃のフリーザーに入れる方法、およびドライアイスとアルコール凍結浴に入れる方法があるが、これらに限定されない。周囲温度または高温での乾燥の場合は、凍結温度より高い任意の温度が使用できるが、酵素が変性するほど高い温度ではない。好ましくは温度は80℃未満であり、より好ましくは65℃未満であり、最も好ましくは20℃から50℃の範囲である。
【００３４】
熱風乾燥の場合は、LFSとアリイナーゼの混合物を吸水体に吸わせて表面積を広げた上で熱風乾燥させることが好ましいが、これに限定されるものではない。熱風の温度範囲は、40℃から80℃であり、好ましくは60℃程度である。例えば、LFSとアリイナーゼの混合溶液30μlを直径8mm、厚さ0.6mmの吸水体に吸収させ、60℃で熱風乾燥した場合、10分間の乾燥で、ほとんど完全に乾燥させることができる。ある程度の水分または他の水性溶媒が組成物中に残存しても良いが、好ましくは乾燥物に含まれる酵素、賦形剤、塩の合計重量に対して、水分量が約0％から20％である。
【００３５】
本明細書において、「乾燥」、「乾燥した」とは、乾燥物に含まれる水が全くない絶乾状態ではなく、約0％から20％の水を含有する組成物を包含する。すなわち、乾燥物に含まれる酵素、賦形剤、塩の合計重量に対して、好ましくは20％未満の水が存在し、より好ましくは10％未満の水が存在し、最も好ましくは約5％未満の水が存在する。このような状態の時の乾燥物の概観は、ほとんど乾いたものである。そして、水分含量の測定は、乾燥後の組成物の重量を、乾燥前の組成物の重量と比較したときの増加量から算出する。ただし、ここでいう乾燥前の組成物の重量とは、乾燥前の組成物から水分の重量を除いて算出した、酵素、賦形剤、塩の合計重量、すなわち理論重量のことである。
【００３６】
３．PRENCSOから催涙成分を生成することができる乾燥LFSを含有する組成物（乾燥混合酵素）の調製
（１）PRENCSOから催涙成分を生成させるためには、アリイナーゼ及びLFSが必要である。LFSを乾燥保存するためには、上記のとおり、LFSとアリイナーゼが共存する溶液を乾燥させることが必要であるが、他方、アリイナーゼの場合、乾燥保存には保護剤がある方が好ましい。したがって、LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させる場合も、糖などの保護剤を含ませることが望ましい。
【００３７】
（２）アリイナーゼの保護剤としては、糖、糖に好適には二糖類が挙げられる。二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、又はセルビオースから選ばれる1種以上の二糖類を挙げることができる。当該保護剤は、糖に加えて、塩を含んでもよい。塩としては、任意の塩が挙げられるが、例えば、KCl、MgCl2、NaClなどが挙げられるが、1価の金属塩が好適で、具体的には、NaClが好適である。更に、当該保護剤は、ピリドキサールリン酸を含むこともできる。つまり、保護剤は、（イ）糖、あるいは（ロ）糖並びに塩及び/又はピリドキサールリン酸からなる成分である。
【００３８】
（３）LFSの乾燥保存には、アリイナーゼをLFSに共存させる必要があるが、アリイナーゼとLFSの存在比率としては、例えば、アリイナーゼ0.02Units:LFS 1μgからアリイナーゼ200Units:LFS 1μgの範囲とすることができる。好ましくは、アリイナーゼ10Units:LFS1μg程度である。また、ここでいうLFSは、後述するrLFSと同一であり、比活性は、6.0×106area/μgのものである。
【００３９】
（４）LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させて乾燥混合酵素を調製する場合には、乾燥手段としては、前述のとおり凍結乾燥又は熱風乾燥が挙げられ、凍結乾燥が特に望ましい。なお、LFSとアリイナーゼの混合物を溶液からそのまま乾燥させることもできるが、例えば、吸水体や高吸水性担体にLFSとアリイナーゼの混合溶液を吸わせ、その後乾燥させることもできる。
【００４０】
（５）また、乾燥混合酵素は、粉末で使用することが望ましいが、容易に再水和できるような形態であれば、顆粒、散剤とすることもできる。
【００４１】
製剤化には、賦形剤、結合剤、及び崩壊剤など、製剤化のために常用される補助剤を添加することができる。賦形剤としては、例えば、デンプン、乳糖、白糖、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、ハイドロキシプロピルスターチ（HPS）などがある。 また、結合剤としては、デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（PVP）、アラビアゴム末、ゼラチン、ブドウ糖、白糖などの水溶液、又はそれらの水・エタノール溶液などがある。崩壊剤としては、デンプン、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ハイドロキシプロピルスターチ、リン酸カルシウムなどがある。
【００４２】
散剤または顆粒として用いる場合に補助剤としては、アリイナーゼの保護剤、例えばマルトースなどを用いることができる。
【００４３】
４．催涙成分を発生させるためのキット
食品製造の現場や医療の現場で、催涙成分を定量的に発生させるためのキットとしては、例えば、（１）LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させて得られる乾燥LFSを含む組成物及びPRENCSOからなるキット、更には、（２）LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させて得られる乾燥LFSを含有する組成物、及びPRENCSO溶液からなるキットが含まれる。
【００４４】
LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させて得られる乾燥LFSを含有する組成物としては、上記「３.PRENCSOから催涙成分を生成することができる乾燥LFSを含有する組成物（乾燥混合酵素）の調製」で説明したものが挙げられる。例えば、LFSとアリイナーゼを二糖類の存在下で凍結乾燥した混合酵素が挙げられる。
【００４５】
PRENCSOとしては、イオン交換樹脂や逆相クロマトグラフィーによって精製された、粉末又は水溶液に溶解したPRENCSOを用いることができる。キットの構成要素としてPRENCSO溶液を用いる場合、該溶液のpHを酸性に調製してもよい。本発明者らは驚くべきことに、PRENCSOは、例えばPH3.5以下の酸性溶液に溶解させることにより当該PRENCSOの純度に関係なく安定的に保存可能であるという知見を得た。本発明によれば、長期保存可能な催涙成分発生キットを得ることができる。
【００４６】
５．催涙成分発生キットを用いた催涙成分の発生
上記「４．催涙成分を発生させるためのキット」を用いて、乾燥混合酵素とPRENCSOを水溶液に添加するか、又は、乾燥混合酵素とPRENCSO溶液を混合することにより、催涙成分を発生させることができる。
【実施例】
【００４７】
１．以下の実施例では、次の方法で、LFS、アリイナーゼ、PRENCSOを次のように調製した。
【００４８】
（１）LFSの調製
rLFS作成・精製方法
WO 02/020808 A1に記載された方法により、遺伝子組み換え法によりLFSを作成した。
【００４９】
概要は次のとおりである。コンピテント法により、LFSタンパクを発現するプラスミド（pGEX-4T-3-E2-3-1）を大腸菌に導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で37℃で振盪培養した。培地にイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して生産誘導するとGSTとE2‐2-3-1の融合タンパク質（以下、GST-E2-3と称す）が菌体内に蓄積した。
【００５０】
上記のようにして形質転換体を培養し、菌体を遠心分離によって集めた後、超音波破砕した。遠心によって回収した上清をグルタチオンセファロース４ Fast Flowカラム（アマシャムファルマシア製）に流し、GST融合タンパク質をカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、還元型グルタチオンを含む溶出バッファーで、融合タンパク質を溶出し、E2-3融合タンパク質試料の精製物を得た。
【００５１】
融合タンパク質試料をHiTrap Desaltingカラム（アマシャムファルマシア）製に流し、還元型グルタチオンを除去し、再度グルタチオンセファロース4 Fast Flowカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、トロンビンを含むバッファーでカラムを満たし、室温で２時間プロテアーゼ処理をおこなって、GSTタグを融合タンパク質から切り離した。GSTタグを除いた組換えE2-3をカムから溶出させ、さらに、この溶出液にBenzamidine Sepharose 6を加え混合し、遠心分離することによって溶出液中のトロンビンを除き、組換えE2-3試料を得た（これをrLFSとしている）。
【００５２】
（２）アリイナーゼの調製
（２−１）ニンニクを粉砕・酸沈    
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やした。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を４℃にセットして冷却した。ニンニク片（100g）に等量のバッファー Aを加えて、ミキサーで粉砕した。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめ、粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾した。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞った。得られたろ液を12000rpmで10 分間 ４℃で遠心分離し、遠心上清を回収した。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、ｐHをモニターしながら、酢酸を加えていき、ｐHを4.0にする。ｐHが4.0になったら、そのまま5min静置した。沈殿の出てきたサンプルを12000rpm×10min at４℃で遠心分離し、遠心ペレットを回収した。（バッファー Aを使う）。
【００５３】
回収したペレットを50ml〜100mlにして（バッファー A）、そのまま、５℃で30min静置した。サンプルを12000rpmで10分間４℃で遠心分離した。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のｐHを6.5に調製した。これをアリイナーゼ粗抽出液とする。
【００５４】
（２−２）ハイドロキシアパタイトカラム処理
上記アリイナーゼ粗抽出液（遠心上清）をバッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにアプライした。ハイドロキシアパタイトカラムに黄色のバンドとなって吸着された。サンプルをアプライしたハイドロキシアパタイトカラムを300mlのバッファーAで洗浄した。洗浄の終了したハイドロキシアパタイトカラムに300mlのバッファーCを流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って10 mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００５５】
（２−３）ConAカラムによるアリイナーゼの精製
集めたフラクション（20ml）の1/20量の20mM塩化カルシウム,塩化マグネシウム溶液を加えて、サンプル溶液のカルシウムイオン,マグネシウムイオン濃度を上げた。そうした上で、再生し、startingバッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）で平衡化したConAカラムにアプライした。サンプルをアプライした後のConAカラムを50mlのstartingバッファーで洗浄した。洗浄の終了したConAカラムに50mlのConA溶出バッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って2mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００５６】
（２−４）精製したアリイナーゼの濃縮方法
ConAカラム精製によって得られた黄色い溶出液（アリイナーゼ溶液）10mlをCENTRIPLUSCONCENTRATORS(up to 15ml,No.4421)（ミリポア社製）に入れた。CENTRIPLUS CONCENTRATORSを、４℃に冷却した遠心機にセットし、3000rpmで30分間遠心し、中身を一度確認した後、もう一度、3000rpmで30分間遠心した。濃縮が完了したアリイナーゼ溶液の活性を下に示す方法に従って測定し、必要な濃度になっていることを確認した。
【００５７】
なお、上記バッファーA(pH7.0)（アリイナーゼ精製用50mMバッファーA）は次のように調製した。50mMリン酸水素２カリウム溶液（5.22gを600mlに溶解）と50mMリン酸二水素カリウム溶液（3.4gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9vol.に対して、グリセロールを1vol.加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1リットルに対して、5.3 mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーにラベルして、低温実験庫（10℃）で保存した。
【００５８】
また、バッファーC(pH7.0)（アリイナーゼ精製用500mMバッファーC）は、次のように調製した。500mMリン酸水素２カリウム溶液（43.6gを500mlに溶解）と500mMリン酸二水素カリウム溶液（34.0gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、ｐHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9vol.に対して、グリセロールを1vol.加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1リットルに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーにラベルして、低温実験庫（10℃）で保存した。
【００５９】
（２−５）アリイナーゼ活性の測定方法
アリイナーゼの活性は、アリイナーゼがPRENCSOを分解したときに生成するピルビン酸の生成量を測定する方法で算出した。
【００６０】
100mMリン酸バッファー（pH 6.5）を用いて、0.16 mg/mlピリドキサールリン酸溶液，3.8 mg/ml NADH溶液，6.0μg/ml LDH溶液，20 mg/ml PRENCSO溶液をそれぞれ調製した。また、上述のピリドキサールリン酸溶液を用いて、試料とするアリイナーゼ溶液を100倍希釈した。ここで、100mMリン酸バッファー（pH 6.5）2500μlに、0.16 mg/mlピリドキサールリン酸溶液100μl，3.8 mg/ml NADH溶液100μl，6.0μg/ml LDH溶液100μl，20 mg/ml PRENCSO溶液100μlを加えて混合した。この混合溶液に、試料とするアリイナーゼ溶液を100μl加えて、酵素反応を開始させ、反応開始直後より反応液の吸光度の経時変化を3分間測定した。得られた吸光度変化の結果から、吸光度減少速度を算出し、吸光度減少速度が0.02〜0.19の範囲に収まることを確認した。吸光度減少速度がこの範囲に収まらなかった場合は、アリイナーゼ溶液の希釈率を変更して再測定を実施した。得られた吸光度減少速度、すなわち、1分間あたりの吸光度変化量から、アリイナーゼ活性（Unit）を算出した。
【００６１】
（３）PRENCSOの調製
（３−１）加熱タマネギからPRENCSOの抽出
生タマネギ３玉（1000ｇ）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで12分間加熱した。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えてから粗砕し、粗砕液を8000rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、陽イオン交換樹脂（IR120BH+）を加えて攪拌したのち、吸引濾過により、樹脂を回収した。回収した樹脂に蒸留水1Lを加え、これに濃アンモニア水を加えてpH8.5に調製した。吸引濾過により、上清を回収し、残った樹脂に再度pH8.5のアンモニア水を加えた。再度、吸引濾過により、上清を回収した。得られた溶液に1N塩酸を加えてpH7.0に中和した。エバポレーターを用いて溶液を濃縮乾固した。
【００６２】
（３−２）PRENCSOの精製
残留物に蒸留水50mlを加えて溶解させた。得られた粗精製PRENCSO溶液を中圧逆相クロマトグラフィーによって精製した。必要に応じて、さらにHPLC（カラム：ODS，移動相：酸性水pH3.3，温度：35℃，UV：230nm）によって精製した。カラムから得られた溶出液をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて乾固し、精製PRENCSO粉末（約100mg）を得た。
【００６３】
２．また、以下の実施例でLFSの活性及び催涙成分の生成量は、次のようにして測定した。
【００６４】
（１）LFS活性の測定方法
凍結乾燥が完了したrLFSサンプルに、蒸留水10μlを添加して溶解させた後、50U/mlアリイナーゼ溶液（バッファーC）を40μl添加し、さらに20mg/mlPRENCSO溶液20μlを添加して、酵素・基質反応を開始させた。3分後に、反応液1μlをHPLCへインジェクションした。
【００６５】
生成した催涙成分量を、島津製作所クロマトパック（HPLC）を用いて測定した。検出波長は、254nm，インジェクション量は1μlとし、目的とする催涙性分は、保持時間9.6分に検出された。このHPLCで検出された催涙成分のピークエリアから、催涙成分の生成量を測定し、凍結乾燥前に測定した値を100としたときの、凍結乾燥後室温で７日間保存した後に測定した値をLFS残存活性（％）とした。
【００６６】
また、rLFSの比活性（area/ng）については、上記の方法で検出される催涙成分のピークエリアをもとに算出することとした。今回使用したｒLFS溶液の比活性を算出すると、6.0×106area/μgであった。
【００６７】
（２）催涙成分生成量の測定方法
（A）凍結乾燥が完了したサンプル（rLFS＋アリイナーゼ）に、5.7mg/mlのPRENCSO溶液35μlを添加して酵素基質反応を開始させた。3分後に、反応液1μlをHPLCへインジェクションした。HPLCで検出される催涙成分のピークエリアから、催涙成分の生成量を測定した。凍結乾燥前に測定した値を100としたときの、凍結乾燥後室温で７日間保存した後に測定した値を催涙成分生成比率とした。
【００６８】
（B）凍結乾燥が完了したサンプル（rLFS＋PRENCSO）に、蒸留水15μlと、250U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース、1％NaCl、25μMピリドキサールリン酸）を20μlを添加して酵素基質反応を開始させた。3 分後に、反応液1μlをHPLCへインジェクションした。HPLCで検出される催涙成分のピークエリアから、催涙成分の生成量を測定した。凍結乾燥前に測定した値を100としたときの、凍結乾燥後室温で７日間保存した後に測定した値を催涙成分生成比率とした。
【００６９】
以下の実施例で使用する乾燥酵素は次のようにして調製した。
［調製例１］
0.02mg/ml rLFS溶液（PBS）（以降のｒLFS溶液の濃度も全て、0.02mg/ml,比活性6.0×106area/μgとした）50μlに、50 U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）を得た。この混合酵素粉末は、後述する催涙成分精製キット『１』の作成に用いた。
【００７０】
［調製例２］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、活性濃度が50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『２』を得た。
【００７１】
［調製例３］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、6mm×6mmにカットした吸水紙（ニップンテクノクラスタ社；イムノクロマト部材#470）に20μlずつ吸収させた後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『３』を得た。
【００７２】
［調製例４］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、6mm×6mmにカットした吸水紙（ニップンテクノクラスタ社； イムノクロマト部材#470）に20μlずつ吸収させた後、大気圧下８０℃で熱風乾燥をおこない、熱風乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『４』を得た。
【００７３】
［調製例５］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、29.5U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『５』を得た。
【００７４】
［調製例６］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、3.3U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『６』を得た。
【００７５】
［調製例７］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、活性濃度が3.3U/mlのアリイナーゼ溶液（100mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5））120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『７』を得た。
【００７６】
［調製例８］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、活性濃度が25U/mlのアリイナーゼ溶液（100mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5））120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『８』を得た。
【００７７】
［調製例９］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、25U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『９』を得た。
【００７８】
［調製例１１］
0.02mg/ml rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％シュクロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）を得た。この混合粉末は、後述する催涙成分精製キット『１１』の作成に用いた。
【００７９】
［調製例１２］
0.02mg/ml rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％マルトース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）を得た。この混合粉末は、後述する催涙成分精製キット『１２』の作成に用いた。
【００８０】
［調製例１３］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、活性濃度が50U/mlのアリイナーゼ溶液（100mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5））120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『１３』を得た。
【００８１】
［調製例１４］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、25U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロースを含むが、ピリドキサールリン酸とNaClは含まない）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『１４』を得た。
【００８２】
［調製例１５］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、25U/mlのアリイナーゼ溶液（10％シュクロースを含むが、ピリドキサールリン酸とNaClは含まない）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『１５』を得た。
【００８３】
［調製例１６］
0.02mg/ml rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，25μMピリドキサールリン酸を含むが、NaClは含まない）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）を得た。この混合粉末は、後述する催涙成分精製キット『１６』の作成に用いた。
【００８４】
［調製例１７］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、25U/mlの粗精製アリイナーゼ溶液120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20 μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『１７』を得た。
【００８５】
［調製例１８］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、3.3U/mlの粗精製アリイナーゼ溶液120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）『１８』を得た。
【００８６】
［比較調製例１］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸を含むが、アリイナーゼは含まない、水溶液120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、凍結乾燥rLFS『比１』を得た。
【００８７】
［比較調製例２］
0.02mg/ml rLFS溶液120μlに、100ｍMリン酸カリウムバッファー（pH6.5）120μlを加えて混合した。この混合溶液を、20μlずつエッペンドルフチューブに分注し、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、凍結乾燥rLFS『比２』を得た。
【００８８】
［比較調製例３］
0.02mg/ml rLFS溶液50μlに、5.7mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5））を350μl加えて混合した。この混合溶液を40μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、酵素基質混合粉末を得た。さらに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）を調製し、これらの酵素基質混合粉末とアリイナーゼ溶液（20 μl／１キット）を催涙成分生成キット『比３』とし、酵素基質混合粉末は室温にて保存し、アリイナーゼ溶液は-80℃で保存した。
【００８９】
［実施例１］
LFSの乾燥による酵素活性の失活と、賦形剤による改善
下表に示す、調製例２、７、８及び１３で調製した乾燥LFSを含有する組成物並びに比較調製例１及び２で調製したLFS乾燥粉末を用いた。
【００９０】
上記凍結乾燥rLFSサンプルを、室温にて７日間放置した後、前述したLFS活性測定方法に従い、LFS活性残存率（％）を測定した。
【００９１】
≪結果≫
結果を下記表に示す。
【００９２】
【表３】
0005383075.tif 000005
【００９３】
比較調製例２は、活性が著しく低下したことから、LFSを乾燥するときには工夫が必要であることがわかった。また、アリイナーゼで効果が確認されているような、通常の保護剤を加えても、比較調製例1の様にLFSの活性保持にはほとんど効果が無かった。
【００９４】
しかし、LFSとアリイナーゼを混合して乾燥すると、調製例２、７、８、及び１３に示すように、LFSの活性を保持したLFS乾燥物(乾燥混合酵素粉末)を得ることができた。
【００９５】
また、調製例７、８、及び１３の結果から、添加するアリイナーゼ量が多いほどLFSの残存活性も高くなることが分かった。
【００９６】
［実施例２］
異なる乾燥方法での実施例
乾燥方法を、凍結乾燥と熱風乾燥で比較するために、調製例３及び４で調製した２種類の乾燥LFSを含有する組成物を、室温にて７日間放置した後、前述したLFS活性測定方法に従い、LFS活性残存率（％）を測定した。
【００９７】
≪結果≫
結果を以下の表に示す。
【００９８】
【表４】
0005383075.tif 000006
【００９９】
調製例３及び４とも良好なLFS残存活性だったので、乾燥方法は、凍結乾燥に限定されないことが分かった。
また、酵素液を保持材に染み込ませて乾燥することもできることが分かった。
【０１００】
［実施例３］
共存させるアリイナーゼが、粗精製アリイナーゼである場合と、トレハロース以外の糖で比較
調製例９、１４、１５、１７及び１８で調製した５種類の乾燥LFSを含有する組成物（混合酵素粉末）を使用した。
【０１０１】
上記各調製例の乾燥LFSを含有する組成物を、室温にて７日間放置した後、前述したLFS活性測定方法に従い、LFS活性残存率（％）を測定した。
【０１０２】
≪結果≫
結果を以下の表に示す。
【０１０３】
【表５】
0005383075.tif 000007
【０１０４】
調製例１４も調製例１５も良好なLFS残存活性だったので、アリイナーゼと共に添加する糖はトレハロースに限定されないことが分かる。また、調製例９と調製例１４ともに良好なLFS残存活性だったので、NaClとピリドキサールリン酸が無くても、LFSの活性は変わらず保持されることが分かる。更に、調製例１７及び１８ともに良好なLFS残存活性だったので、LFS活性を保持するアリイナーゼは、単離精製されたものに限定されないことが分かる。
【０１０５】
［実施例４］
共存させるアリイナーゼの量とLFS残存活性の関係
調製例２、５、６、７、８および１３で調製された６種類の乾燥LFSを含有する組成物を用いた。
【０１０６】
凍結乾燥rLFSサンプルを、室温にて７日間放置した後、前述したLFS活性測定方法に従い、LFS活性残存率（％）を測定した。
【０１０７】
≪結果≫
結果を以下の表に示す。
【０１０８】
【表６】
0005383075.tif 000008
【０１０９】
アリイナーゼ以外の賦形剤を添加しない場合、調製例７、調製例８、及び調製例１３では、LFS残存活性が添加するアリイナーゼ量に依存した。
【０１１０】
つまり、含有するアリイナーゼ量が多いほどLFS残存活性が高いことが分かる。また調製例６、５及び２の結果から、アリイナーゼだけでなく、トレハロース，NaCl，ピリドキサールリン酸も一緒に添加すると、全体的にLFS残存活性が上がることが分かる。
【０１１１】
［実施例５］
催涙成分発生キットの安定性
以下の(１)-(５)のキットの保存安定性を測定した。
【０１１２】
（１）調製例１を用いた催涙成分発生キット
ｒLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、混合酵素粉末を得た。さらに、5.7mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5））を調整し、混合粉末と基質溶液（35μl／１キット）を催涙成分発生キット『１』とした。
【０１１３】
（２）調製例１１を用いた催涙成分発生キット
rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％シュクロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、混合酵素粉末を得た。さらに、5.7mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5））を調整し、混合粉末と基質溶液（35μl／１キット）を催涙成分発生キット『１１』とした。
【０１１４】
（３）調製例１２を用いた催涙成分発生キット
rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％マルトース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、混合酵素粉末を得た。さらに、5.7 mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.5））を調整し、混合粉末と基質溶液（35μl／１キット）を催涙成分発生キット『１２』とした。
【０１１５】
（４）調製例１６を用いた催涙成分発生キット
rLFS溶液50μlに、50U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，25μMピリドキサールリン酸を含むが、NaClは含まない）200μlを加えて混合した。この混合溶液を、25μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、混合酵素粉末を得た。さらに、5.7 mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.5））を調整し、混合粉末と基質溶液（35μl／１キット）を催涙成分生成キット『１６』とした。
【０１１６】
（５）比較調製例比３を用いた催涙成分発生キット
rLFS溶液50μlに、5.7mg/mlのPRENCSO基質溶液（100ｍMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.5））を350μl加えて混合した。この混合溶液を40μlずつエッペンドルフチューブに分注した後、大気圧下、‐80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下‐10℃で凍結乾燥をおこない、酵素基質混合粉末を得た。さらに、50 U/mlのアリイナーゼ溶液（10％トレハロース，1％NaCl，25μMピリドキサールリン酸）を調製し、これらの酵素基質混合粉末とアリイナーゼ溶液（20μl／１キット）を催涙成分発生キット『比３』とし、酵素基質混合粉末は室温にて保存し、アリイナーゼ溶液は-80℃で保存した。
【０１１７】
上記調製例１、１１、１２又は１６を用いる催涙成分発生キットを、室温にて７日間放置した後、前述した催涙成分生成量測定方法（A）に従い、催涙成分生成比率（％）を測定した。
【０１１８】
また、上記比較調製例３を用いる催涙成分発生キットについては、酵素基質粉末を室温にて７日間放置した後、前述した催涙成分生成量測定方法（B）に従い、催涙成分生成比率（％）を測定した。
【０１１９】
≪結果≫
結果を以下の表に示す。
【０１２０】
【表７】
0005383075.tif 000009
【０１２１】
催涙成分発生キット『１』，『１１』，『１２』，及び『１６』では、７日間の保存後にどれも良好な催涙成分生成比率を示したことから、添加する二糖の種類は限定されることはないことが分かる。また、NaClの添加も催涙成分生成比率に影響を与えていない。
【０１２２】
催涙成分発生キット『１』，『１１』，『１２』については、継続して催涙成分の生成量の測定をおこない、室温で３ヶ月間は安定な催涙成分生成比率を示した（図１）。
【０１２３】
基質溶液とLFS溶液とで乾燥粉末を調製すると、安定した催涙成分の生成は困難になるため、LFS溶液とアリイナーゼ溶液とで乾燥粉末を調製することが効率的である。
【０１２４】
［実施例６］
粗精製PRENCSOの安定性
市販のタマネギを厚みが5〜8mmになるように包丁で切ったり、適当なビニール袋に入れ、-80℃で30分間凍結処理を行った。凍結後、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器に30g量り取った。次に容器に30mlの50% (v/v) の含水エタノールを加え、タマネギ試料が浸漬された状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の抽出を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。
【０１２５】
回収した抽出溶液に液量の1/4倍volの100mMリン酸バッファー（pH6.5）を加え、塩濃度の調整を行った。その後、塩濃度の調整を行った抽出溶液に20mMのリン酸バッファー（pH6.5）で平衡化した陰イオン交換樹脂(DE52:Cl-)を抽出液の液量の1/2倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着したLFSの溶出は、まず樹脂に2倍volの水を加えバッチ式で洗浄した後、樹脂の2倍volの500mMリン酸バッファー(pH6.5)を加えバッチ式で溶出させ、その上澄みを回収した。溶出操作は2度行った。このようにして得た上澄みを粗精製LFS溶液として回収し、実施例７に用いた。
【０１２６】
その後、陰イオン交換樹脂をパスした画分とLFSの溶出前に陰イオン交換樹脂を洗浄した水を適当な容器に集め、液量の1/4倍volの陽イオン交換樹脂(IR-120BH+)を加えてバッチ式でPRENCSOの吸着を行った。吸着したPRENCSOの溶出は、まず樹脂を2倍volで洗浄した後、樹脂に2倍volの水を加え、さらに濃アンモニア水を加えてpH8.5になるように調整し、その上澄みを回収した。また溶出後は直ちに1N塩酸でpH6.5へ中和した。溶出操作は2回行った。このようにして得られた溶液を粗精製PRENCSO溶液とした。
【０１２７】
次に粗精製PRENCSO溶液が室温でも安定に保存できる条件の検討を行うため、以下の処理を粗精製PRENCSO溶液に行った。
(1)粗精製PRENCSO溶液に何の処理も行わない。
(2)粗精製PRENCSO溶液をクリーンベンチ内で0.2μmの無菌フィルターで無菌濾過し、その後、粗精製PRENCSO溶液150μlに対して0.1N塩酸を10μlの割合で加えて溶液を酸性状態（pH3.0）にした。
(3)粗精製PRENCSO溶液をクリーンベンチ内で0.2μmの無菌フィルターで無菌濾過した。
(4)粗精製PRENCSO溶液150μlに対して0.1N塩酸を10μlの割合で加えて溶液を酸性状態（pH3.0）にした。
【０１２８】
上記(1)〜(4)の処理を行った各粗精製PRENCSO溶液を室温で2ヶ月間保存し、保存安定性の確認を行った。
【０１２９】
その結果、粗精製PRENCSO溶液は酸性状態で保存することで室温でも安定に保存できることが確認された。
【０１３０】
粗精製PRENCSO溶液の測定は以下に示した方法で行った。（図２）
＜PRENCSOの測定方法＞
PRENCSOは抽出溶液1μlをHPLCにインジェクションした。 HPLC条件はカラム：Pegasil ODS  4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） ,  移動相：酸性水pH3.3 , 温度：35℃ , 検出波長：230nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間は9分に検出された。検出されたPRENCSOのピークエリアから、PRENCSO量を測定した。
【０１３１】
［実施例７］
粗精製LFSと粗精製アリイナーゼの安定性
実施例６の実験で得られた粗精製LFS溶液を用いて、粗精製LFS溶液の室温での保存安定性の検討を行った。LFSはAlliinaseと混合して凍結乾燥することで、室温でも安定に保存できることが確認されている。そこで、本実験でも粗精製LFS溶液と粗精製Alliinase溶液を混合した後、凍結乾燥する方法を試みた。
【０１３２】
8×108 Peak area/μlの粗精製LFS溶液 4.5μlに別途ニンニクから抽出した30Unit/mlの粗精製アリイナーゼ溶液（5mMリン酸バッファー in 10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）25μlを加えてエッペンチューブ内で混合した。この混合液を、6mm×6mmにカットした吸水紙（ニップンテクノクラスタ社；イムノクロマト部材＃470）に吸収させた後、大気圧下、-80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下-10℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後の吸水紙は500μlのエッペンチューブ内に入れて保存した。凍結乾燥後のLFS及びアリイナーゼの活性量をそれぞれ100%として、室温で1ヶ月間保存した時の残存しているLFSの活性量（%）及びアリイナーゼの活性量（%）の確認を行った。 
【０１３３】
凍結乾燥後のLFSの活性量の測定は、はじめに凍結乾燥した吸水紙に50mMリン酸バッファー(pH6.5、25μMピリドキサルリン酸、10%グリセロール) 200μl加え、吸水紙からバッファー中へLFSを再溶解させた。その後、再溶解させたLFS溶液を20倍〜40倍希釈したもの10μlに、50Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。 HPLC条件はカラム：Pegasil ODS  4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。催涙成分のピークは保持時間9.6分に検出された。
【０１３４】
凍結乾燥後のアリイナーゼの活性量の測定は、前記方法により行なった。すなわち、アリイナーゼの活性は、アリイナーゼがPRENCSOを分解したときに生成するピルビン酸の生成量を測定する方法で算出した。
【０１３５】
100mMリン酸バッファー（pH 6.5）を用いて、0.16 mg/mlピリドキサールリン酸溶液，3.8 mg/ml NADH溶液，6.0μg/ml LDH溶液，20 mg/ml PRENCSO溶液をそれぞれ調製した。また、上述のピリドキサールリン酸溶液を用いて、試料とするアリイナーゼ溶液を100倍希釈した。ここで、100mMリン酸バッファー（pH 6.5）2500μlに、0.16 mg/mlピリドキサールリン酸溶液100μl，3.8 mg/ml NADH溶液100μl，6.0μg/ml LDH溶液100μl，20 mg/ml PRENCSO溶液100μlを加えて混合した。この混合溶液に、試料とするアリイナーゼ溶液を100μl加えて、酵素反応を開始させ、反応開始直後より反応液の吸光度の経時変化を3分間測定した。得られた吸光度変化の結果から、吸光度減少速度を算出し、吸光度減少速度が0.02〜0.19の範囲に収まることを確認した。吸光度減少速度がこの範囲に収まらなかった場合は、アリイナーゼ溶液の希釈率を変更して再測定を実施した。得られた吸光度減少速度、すなわち、1分間あたりの吸光度変化量から、アリイナーゼ活性（Unit）を算出した。凍結乾燥した吸水紙にバッファーを添加し、再溶解させたアリイナーゼ溶液が30秒間に分解するPRENCSOの量より、活性量を算出した。
【０１３６】
具体的には、はじめに凍結乾燥した吸水紙に50mMリン酸バッファー(pH6.5、25μMピリドキサルリン酸、10%グリセロール) 200μl加え、吸水紙からバッファー中にアリイナーゼを再溶解させた。再溶解させたアリイナーゼ溶液40μlを1.5mlエッペンドルフチューブに取り、室温で1分間静置した。その後、20 mg/ml精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。30秒後、反応液に120μlのメタノールを添加し、20秒間ボルテックスで攪拌して、酵素基質反応を停止させた。反応液中に残っているPRENCSOを安定化させるため、0.2N 塩酸20μlを反応液に添加し、反応液を酸性にした。検出は、反応液3μlをHPLCへ注入し、アリイナーゼで分解したPRENCSO量を測定した。
【０１３７】
HPLC条件はカラム：Pegasil ODS  4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを17対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：230nm , 流速：0.6ml/minで行った。PRENCSOの保持時間は5.8分であった。
【０１３８】
＜粗精製LFS溶液に混合する粗精製アリイナーゼ溶液の調整方法＞
前記に示されているアリイナーゼ粗抽出液の作製方法に従って調整を行った。ニンニクに等量の5mMリン酸バッファー(pH7.0,、10%グリセロール、25μMピリドキサルリン酸)  を加えて粉砕し、その後、酢酸によりタンパクの酸性沈殿でアリイナーゼを沈殿させた。次に、遠心（12000rpm、10min、4℃）により沈殿したアリイナーゼを回収した。回収したアリイナーゼの沈殿に5mMリン酸バッファー(pH7.0, 10%グリセロール,25μMピリドキサルリン酸)を加え、さらに1N 水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH6.5に調整し、Alliinaseを再溶解させた。再溶解させたアリイナーゼ溶液を粗精製アリイナーゼ溶液とした。
【０１３９】
今回はこの粗精製アリイナーゼ溶液のバッファーを5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）に変換し用いた。バッファーの置換はEcono-Pac 10DG Column 30×10ml（BIO-RAD）を用い、マニュアルの推奨方法で行った。元々カラムに入っている溶液をデカンテーションで捨てた後、カラムを5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸） 20mlで平衡化した。その後、粗精製アリイナーゼ溶液3mlをカラムにアプライした。その後、5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）でカラムからアリイナーゼを溶出し、粗精製アリイナーゼ溶液（10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）として回収した。
【０１４０】
［実施例８］
実施例７と同様の実験において、乾燥方法を凍結乾燥から熱風乾燥に変更した場合について検討した。
【０１４１】
8×108 Peak area/μlの粗精製LFS溶液 4.5μlに別途ニンニクから抽出した30Unit/mlの粗精製アリイナーゼ溶液（5mMリン酸バッファー in 10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）25μlを加えてエッペンチューブ内で混合した。この混合液を、直径8mm、厚さ0.6mmのペーパーディスク（ADVANTEC社製）に吸収させた後、60℃で10分間熱風乾燥した。熱風乾燥後の吸水紙は1500μlのエッペンチューブ内に入れて保存した。熱風乾燥前のLFS及びアリイナーゼの活性量をそれぞれ100%として、室温で３週間保存した時の残存しているLFSの活性量（%）及びアリイナーゼの活性量（%）の確認を行った。（図４）
【０１４２】
熱風乾燥後のLFSの活性量およびアリイナーゼの活性量の測定は、実施例７と同じ方法を用いた。（図４）
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】長期間室温保存後の催涙成分生成比率（％）
【図２】粗精製PRENCSOの安定性
【図３】凍結乾燥後のLFS、アリイナーゼの残存活性推移
【図４】熱風乾燥後のLFS、アリイナーゼの残存活性推移
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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