(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
ＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹ、
ＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲ、
ＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦ、
ＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹ、
ＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳ
のうちの１つからなるペプチドの１または複数を含む、対象において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制又は阻止するための組成物。
【請求項２】
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制もしくは阻止するための医薬品の製造における、
以下の配列：
ＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹ、
ＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲ、
ＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦ、
ＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹ、
ＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳ
のうちの１つからなるペプチドの１または複数のペプチドの使用。
【請求項３】
対象において血友病を処置するための組成物であって、
以下の配列：
ＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹ、
ＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲ、
ＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦ、
ＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹ、
ＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳ
のうちの１つからなるペプチドの１または複数のペプチドを含む、組成物。
【請求項４】
前記対象が血友病Ａを有し、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしている、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記対象が後天性血友病を有しているか、これに罹患するリスクがある、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項６】
前記対象がＨＬＡ−ＤＲ２である、請求項１および３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドに関する。特に、本発明は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）から誘導可能なペプチド類に関する。これらのペプチドを用いることによって、例えば、血友病Ａの処置及び後天性血友病における第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の形成を低下又は阻止することができる。
【背景技術】
【０００２】
血友病
血友病は、血友病Ａ、血友病Ｂ（クリスマス病）及びフォン・ビレブランド病を含む一群の遺伝性血液障害に属する。
【０００３】
血友病では、必須凝固因子が部分的又は完全に欠乏しているために血液の凝固能が大幅に低下しており、その結果、出血時間が延長する。血友病Ａは第ＶＩＩＩ凝固因子の欠乏症であるのに対し、血友病Ｂは第ＩＸ凝固因子の欠乏症である。両疾患とも、Ｘ染色体上に欠陥遺伝子が見出されているので、こうした症状はＸ連鎖性である。血友病Ａは血友病Ｂよりも５倍多く認められる。
【０００４】
血友病は、生涯続く遺伝性遺伝子疾患であり、キャリアである女性及びこの疾患を遺伝で受け継ぐ男性を侵す。新規診断結果の約３分の１は家族既往歴のない場合である。この疾患は世界中でみられ、全ての人種集団で生じている。英国では約６，０００人が血友病に罹患している。
【０００５】
血友病患者は、傷害を受けた後、長時間出血する。切り傷、擦り傷などの外傷は通常は大きな問題とならず、ある程度の圧をかけて患部を（例えば、絆創膏で）覆うことにより出血を止めることが可能な場合が多い。
【０００６】
大きな問題となるのは、関節、筋肉及び軟組織内への内出血であり、これは自然発症的に起こり得る。脳内出血などの内出血は、管理が極めて困難であり、致命的となり得る。関節内に繰り返し出血が起こると、急性疼痛を生じ、関節炎及び／又は身体障害をもたらす長期関節損傷の原因となり得る。
【０００７】
血友病に対する処置は、通常、不足している凝固因子の補充によって行われている。軽症又は中等症の血友病では、出血が生じたときに注射が行われればよい（オンデマンド治療）。しかしながら、重症血友病では、血液凝固を促進し、長期関節損傷が生じる可能性をできるだけ小さくするために規則的な予防的注射が行われればよい。
【０００８】
血友病Ａに対する凝固因子置換療法の深刻な事態となる恐れのある合併症は、第ＶＩＩＩ因子の凝固促進機能を無効にする抗体の形成である。第ＶＩＩＩ因子インヒビターは、重症の血友病Ａを有する患者の約２５％に生じる。先天性血友病Ａ患者が遺伝的にＦＶＩＩＩ欠乏性であり得ることから、インヒビターの合成は、出血症状を予防又は処置するために投与された外来蛋白質に対する同種免疫反応である。
【０００９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応において中心的な役割を果たしている。ＦＶＩＩＩは、抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に取り込まれた後、蛋白質分解によりペプチド断片に分解される（非特許文献１）。その後、これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＡＰＣの表面に提示される。次いで、この複合体はＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋細胞のＴ細胞受容体によって認識される。適切な共刺激シグナルの存在下に、この認識により、最終的に、ＣＤ４＋細胞がＢ細胞による抗体の合成を誘導する。
【００１０】
インヒビター形成の発生率は、最初は第ＶＩＩＩ因子の処置回数とともに増加するが、作用させた日数が５０乃至１００日に達した後には頭打ちになるように思われる。インヒビターの形成は中等症又は軽症の血友病よりも重症の血友病においてはるかによく起こり、第ＶＩＩＩ因子軽鎖内のいくつかの分子欠損、最も明瞭には大きな欠失及びナンセンス突然変異がインヒビター形成の素因となるように思われる。補充因子の濃度、種類（精製か組換えか）などのパラメータ及び処置歴も抗体産生の可能性に影響を及ぼすと考えられる。
【００１１】
インヒビターを有する血友病患者の管理は継続的課題である。脱感作技術を用いた免疫寛容の誘導（ＩＴＩ：ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は第ＶＩＩＩ因子に対する同種抗体を有する一部の患者において奏功している。この治療的アプローチは、因子置換療法を継続的に受けることを要し、従って長期にわたる方法である。
【００１２】
ＩＴＩは奏功しうるけれども、かなりの割合（約３０％）の患者がＩＴＩに反応しない。インヒビター力価の高い患者は処置に対して極めて反応しにくい。別の重要な要因は、ＩＴＩ開始時の年齢であり、患者が２０歳を超えている場合には奏功率が大きく減少する（非特許文献２）。
【００１３】
ＩＴＩ療法が奏功しない場合、インヒビターは一般に死ぬまでずっと存続し、また、このような患者は通常高反応者であるため、活性型プロトロンビン複合体濃縮製剤（ＦＥＩＢＡ（商標））、組換え活性型ＦＶＩＩなどのＦＶＩＩＩバイパス製剤で出血症状を処置することが必要である。しかしながら、このような薬剤の使用は、播種性血管内凝固症候群、急性心筋梗塞、肺動脈塞栓及び血栓症などの有害事象を伴う（非特許文献３）。
【００１４】
ＩＴＩに反応しない患者に対しては免疫抑制療法を用いることがある。処置には、非特異的に免疫系を標的にするシクロホスファミド、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬の投与が含まれる。こうした処置は全般的な免疫抑制を伴う副作用を示すことがある。
【００１５】
Ｂ細胞ＣＤ２０抗原に対するヒト化モノクロナール抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（商標）を用いる選択的Ｂ細胞枯渇化に新たな関心が集まっている。しかしながら、この薬物で処置した一部の子供において注入反応、血清病及び日和見感染が発生している（非特許文献４）。
【００１６】
後天性血友病
後天性血友病は、百万人ごとに１乃至４人を侵す希な自己免疫疾患である。この疾患では、血友病を持って生まれたのではない該当者が第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子類のうちの１種に対して抗体を作る。妊娠及び関節リウマチなどの自己免疫疾患並びに癌は後天性血友病を発症するリスクを増大させる可能性があると考えられている。凝固因子置換療法に反応して産生されるＦＶＩＩＩインヒビターと後天性血友病で産生されるこのインヒビターとでは、そうした産生をもたらす根底にある免疫機構に違いはあるが、これらの臨床症状は類似している。
【００１７】
後天性血友病患者は、獲得インヒビターが重症の出血合併症と関連付けられることが理由の一つであるが、２５％に迫る死亡率を示す。獲得自己抗体インヒビターの治療は、生命及び四肢を脅かすことが多い急性出血性合併症を抑制又は予防し、副次的には自己抗体を根絶して正常な凝固を回復させる必要性に主として基づいたものである。
【００１８】
低力価（＜５ベセズダ単位）の自己抗体インヒビターと関連付けられる出血は、ＦＶＩＩＩ濃縮製剤を高用量で投与して効果的に処置することができる場合がある。ブタＦＶＩＩＩ濃縮製剤は、かつては後天性血友病関連の出血の重要な一次治療剤と考えられていた。何故なら、これは実験室で注入後ＦＶＩＩＩ凝固活性レベルを実際に測定する機会を与える唯一の置換療法であったからである。この製品は、ブタパルボウイルスによるブタ血漿プールの汚染のために２００４年に市場から撤去された。現在、「バイパス」剤が最もよく用いられているが、血栓形成の潜在的なリスクが存在し、各製品の有効性は約８０％に過ぎない。バイパス剤又はＦＶＩＩＩ補充が適切な止血をもたらすことができるように一時的にインヒビターの力価を十分低下させるには血漿分離交換法による血漿交換及び体外免疫吸着が必要と考えられる。
【００１９】
自己抗体インヒビターの根絶は、以下のような免疫抑制手段に依存している：（１）３乃至６週間で３０％乃至５０％の有効性を示す副腎皮質ステロイドの投与、（２）細胞毒性及び骨髄抑制化学療法剤、例えばシクロホスファミド、シクロスポリン、２−クロロデオキシアデノシンの使用、（３）免疫グロブリン静注による免疫調節及び（４）リツキシマブによる選択的Ｂリンパ球の枯渇化。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（商標）反応者はステロイドの同時使用を必要とすることがあり、再発しても再処置に反応することがある。
【００２０】
従って、血友病Ａの処置に伴う同種抗体産生及び後天性血友病における自己抗体産生を低下させる現在利用可能な全ての方法には欠点がある。このため、血友病Ａ及び後天性血友病における抗ＦＶＩＩＩ抗体の問題に対処する方法の改良が求められている。
【００２１】
本発明者らは、患者をＦＶＩＩＩ由来ペプチドで予め寛容化することによってＦＶＩＩＩインヒビター抗体の形成を阻止することが可能であることを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｒｅｄｉｎｇほか、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２００６年）１２（補遺６）３０−３６
【非特許文献２】Ｈａｙほか、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００５年）３２：１５−２１
【非特許文献３】Ａｃｈａｒｙａ及びＤｉＭｉｃｈｅｌｅ、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２００６年）１９：５１−６６
【非特許文献４】ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ（２００７年）５：１４３−５０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
従って、本発明は、ＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導又は回復させることができるＦＶＩＩＩから誘導可能なペプチドに関する。
【００２４】
本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ２結合ペプチドを生じると予測されるＦＶＩＩＩのいくつかの免疫優性領域を同定した（表１）。これらのペプチドのうち、第ＶＩＩＩ因子の領域５４５乃至５５９及び１７８８乃至１８０３は、ヒト第ＶＩＩＩ因子に対するＨＬＡ−ＤＲ２拘束性Ｔ細胞反応における免疫優性Ｔ細胞エピトープ領域であると考えられる。こうしたペプチドでマウスを処置すると、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応の実質的な抑制がもたらされることが分かった。
【００２５】
第一の態様において、本発明は、以下のコア残基配列：
【００２６】
【化１】
0005501245.tif 000002
のうちの一つを含むペプチドであって、
いずれのペプチドも、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得るものとするペプチドを提供する。
【００２７】
こうしたペプチドは、例えば、配列
【００２８】
【化２】
0005501245.tif 000003
を有することができる。
【００２９】
第二の態様において、本発明は、本発明の第一の態様のペプチドを含む医薬組成物などの組成物を提供する。
【００３０】
この組成物は複数のそのようなペプチドを含むことができる。特に、この組成物はペプチド類
【００３１】
【化３】
0005501245.tif 000004
を含むことができる。
【００３２】
この組成物は、これら複数のペプチドが個別、引き続き（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）、連続又は同時投与のために別々に設けられているキットの形にすることができる。
【００３３】
本発明のペプチド又は組成物は第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の形成を抑制、低減又は阻止するのに用いることができる。
【００３４】
また、本発明は、第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の形成を抑制、低減又は阻止するための医薬品の製造におけるそのようなペプチド又は組成物の使用を提供する。
【００３５】
また、本発明は、対象において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の形成を抑制、低減又は阻止する方法であって、この対象にそのようなペプチド又は組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３６】
この対象はＦＶＩＩＩ欠乏性であるとすることができる。具体的には、この対象は血友病Ａを有していてもよく、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしていてもよい。
【００３７】
あるいは、この対象は、後天性血友病を有しているか、これに罹患するリスクがあってもよい。
【００３８】
第ＶＩＩＩ因子インヒビターは、ＨＬＡ−ＤＲ２を発現している個体においてより高頻度に存在する。従って、本発明の方法により処置される対象はＨＬＡ−ＤＲ２陽性であるとすることができる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
以下のコア残基配列：
【化１６】
0005501245.tif 000005
のうちの一つを含むペプチドであって、
該ペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞により認識され得る、ペプチド。
（項目２）
以下のコア残基配列：
【化１７】
0005501245.tif 000006
のうちの一つを含む項目１に記載のペプチド。
（項目３）
以下のコア残基配列：
【化１８】
0005501245.tif 000007
のうちの一つを含む項目２に記載のペプチド。
（項目４）
配列
【化１９】
0005501245.tif 000008
を有する項目３に記載のペプチド。
（項目５）
配列
【化２０】
0005501245.tif 000009
を有する項目３に記載のペプチド。
（項目６）
項目１〜５のいずれか１項に記載の複数のペプチド類を含む組成物。
（項目７）
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制もしくは阻止するのに使用するための項目１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又は項目６に記載の組成物。
（項目８）
インビボにおいて第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制もしくは阻止するための医薬品の製造における項目１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又は項目６に記載の組成物の使用。
（項目９）
対象において第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体の産生を抑制又は阻止するための方法であって、該対象に項目１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又は項目６に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
（項目１０）
対象において血友病を処置するための方法であって、該対象に項目１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又は項目６に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目１１）
上記対象が血友病Ａを有し、第ＶＩＩＩ因子置換療法を受けているか、受けようとしている、項目９又は１０に記載の方法。
（項目１２）
上記対象が後天性血友病を有しているか、これに罹患するリスクがある、項目９又は１０に記載の方法。
（項目１３）
上記対象がＨＬＡ−ＤＲ２である、項目９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】図１ａは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応を示す。ＦＶＩＩＩペプチド１乃至６に対するＬＮＣ増殖。図１ｂは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応を示す。ＦＶＩＩＩペプチド７乃至１２に対するＬＮＣ増殖。
【図１−２】図１ｃは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウス由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ：ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌ）のリコール反応を示す。ＦＶＩＩＩペプチド１、３及び１１に対するＬＮＣ増殖。
【図２】図２ａは、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。図２ｂは、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図３−１】図３ａは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。図３ｂは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。
【図３−２】図３ｃは、ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡで初回刺激したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウス由来ＬＮＣのリコール反応を示す。
【図４−１】図４は、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図４−２】図４は、ＦＶＩＩＩ由来ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンの代表的な例を示す。
【図５】ａ）ＤＮＩＭＶ及びｂ）ＰＲＣＬＴに特異的なＦＶＩＩＩ−／−クローンを示す。
【図６】ｒｈＦＶＩＩＩ／ＣＦＡでの初回刺激の前にペプチドで３回ｉ．ｐ．処置したＦＶＩＩＩ＋ＤＲ２＋マウスのＦＶＩＩＩに対するＬＮＣのリコール反応を示す。
【図７−１】図７ａは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の測定結果を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。図７ｂは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の測定結果を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−２】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の測定結果を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−３】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の測定結果を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図７−４】図７ｃは、ＦＶＩＩＩ由来重複ペプチドに特異的なＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを用いた、アピトープとして機能可能なペプチドエピトープの範囲の測定結果を示す。元のアミノ酸を０と記す。Ｎ末端方向に１アミノ酸シフトを−１、Ｎ末端方向に２アミノ酸シフトを−２、などとする。Ｃ末端方向に１アミノ酸シフトを＋１、などとする。
【図８】ＦＶＩＩＩ由来ペプチドＰＲＣＬＴ、ＤＮＩＭＶ又はこれらの両者の混合物で処置したＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩに反応したリンパ節細胞のＩＦＮ−ガンマ産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
ペプチド
本発明はペプチドに関する。
【００４１】
「ペプチド」という用語は、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間で通常ペプチド結合により一方が他方に結合した一連の残基、通常、Ｌ−アミノ酸、を意味する通常の意味で用いている。この用語には改変ペプチド及び合成ペプチド類似体を含めている。
【００４２】
本発明のペプチドは、化学的方法を用いて作製することができる（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．  Ｍｉｋｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、Ｂｅｒｌｉｎ）。例えば、ペプチドは、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹほか（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）で合成し、樹脂から切断し、調製的高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）によって精製することができる。自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３  １  Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い、メーカーから提供された使用説明書に従って達成することができる。
【００４３】
あるいは、このペプチドは、組換え法又は第ＶＩＩＩ因子からの切断によって作製することができる。ペプチドの組成はアミノ酸分析又は配列決定（例えば、エドマン分解法）によって確認することができる。
【００４４】
実際的には、このペプチドが示し得る種々の他の特性がある。例えば、このペプチドは、インビボでこれを用いることを可能にする濃度で可溶性とすることができる。このペプチドは最大０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性とすることができる。
【００４５】
また、このペプチドが治療上有用であるためにインビボで十分安定であることも重要である。このペプチドのインビボでの半減期は少なくとも１０分、３０分、４時間又は２４時間とすることができる。
【００４６】
また、このペプチドはインビボで良好な生物学的利用能を示すこともできる。このペプチドは、インビボにおいて、これが然るべき障害なしに細胞表面のＭＨＣ分子に結合することを可能にする高次構造を維持することができる。
【００４７】
コア残基
適応免疫反応では、Ｔリンパ球は蛋白質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は蛋白質抗原を取り込み、これを短いペプチド断片に分解する。ペプチドは細胞内の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ又はＩＩ分子に結合して細胞表面に運ばれ得る。ＭＨＣ分子との組合せで細胞表面に提示されると、このペプチドはＴ細胞によって（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介して）認識され得、この場合、このペプチドはＴ細胞エピトープとなる。
【００４８】
このように、エピトープとは、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子のペプチド結合溝に結合し、Ｔ細胞によって認識されることが可能である、抗原から誘導可能なペプチドである。
【００４９】
最小エピトープとは、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子のペプチド結合溝に結合し、Ｔ細胞によって認識されることが可能である、エピトープから誘導可能な最短のペプチドである。所与の免疫原性領域において、全てが最小エピトープを含むが、それらのフランキング領域が異なる諸エピトープとして機能する重複ペプチドの「入れ子集合体」を生じることが通常可能である。
【００５０】
同様に、切断ペプチドに対する反応を測定することによって特定のＭＨＣ分子：Ｔ細胞組合せの最小エピトープを同定することが可能である。例えば、重複ライブラリ内の１乃至１５番目の残基を含むペプチドに対して反応が得られる場合、両端において切断された集合体（即ち、１乃至１４、１乃至１３、１乃至１２など及び２乃至１５、３乃至１５、４乃至１５など）を用いて最小エピトープを同定することができる。
【００５１】
本発明はＦＶＩＩＩの「コア残基」配列を含むペプチドを提供する。こうしたコア残基配列は、各領域の最小エピトープとなるかこれを含むように、ＨＬＡ−ＤＲ２結合アルゴリズムを用いて予測される。
【００５２】
アピトープ
本発明者らはこれまでに、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示されるペプチドの性能とインビボで寛容を誘導するペプチドの性能との間に関連があることを明らかにした（ＷＯ０２／１６４１０）。ペプチドは、更にプロセシング（例えば、トリミング）されなければ長すぎてＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合できないか、又は不適切な高次構造で結合するのであれば、インビボで寛容原性とはならないであろう。他方、このペプチドが適切な大きさ及び立体構造であることによりそのままＭＨＣペプチド結合溝に結合してＴ細胞に提示されるのであれば、このペプチドは寛容誘導に有用であると予測することができる。
【００５３】
従って、ペプチドがインビトロで更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合し、Ｔ細胞に提示されうるかどうかを調べることによって、ペプチドの寛容原性能を検討することが可能である。
【００５４】
本発明のペプチド類は、更なるプロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、第ＶＩＩＩ因子特異的Ｔ細胞からの反応を刺激することができるので、アピトープ（抗原プロセシング非依存性エピトープ）である。このようなアピトープは、ＷＯ０２／１６４１０に記載されているルールに基づいた方法に従ってＦＶＩＩＩに対する寛容をもたらすと予測することができる。
【００５５】
本発明のペプチドは、更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合することができる任意の長さとすることができる。通常、本発明のペプチドはＭＨＣクラスＩＩに結合することができる。
【００５６】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、普通７乃至１３、より普通には８乃至１０アミノ酸長である。このペプチドの結合は、ペプチドの主鎖内の諸原子と全てのＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝内のインバリアント部位との接触によって両端で安定化されている。ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端と結合する溝の両端にインバリアント部位がある。ペプチドの長さの変動については、ペプチド主鎖内の、多くの場合、必要な柔軟性を与えるプロリン又はグリシン残基におけるよじれによって説明される。
【００５７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、普通８乃至２０アミノ酸長、より普通には１０乃至１７アミノ酸長であり、さらに長くする（例えば、最大４０アミノ酸長）ことも可能である。こうしたペプチドは、（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝と異なって）両端が開いているＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合溝に沿って伸びた立体構造で横たわる。このペプチドは、主に主鎖の原子をペプチド結合溝に沿って並ぶ保存残基と接触させることによって所定の位置に保持される。
【００５８】
ペプチド配列
本発明の第一の態様は以下のコア残基配列のうちの一つを含むペプチドに関する：
【００５９】
【化４】
0005501245.tif 000010
例えば、こうしたペプチドは以下のコア残基配列のうちの一つを含むことができる：
【００６０】
【化５】
0005501245.tif 000011
特に、こうしたペプチドは以下のコア残基配列のうちの一つを含むことができる：
【００６１】
【化６】
0005501245.tif 000012
このペプチドは、得られるペプチドが更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる限り、これらのコア残基配列のうちの一つを、Ｎ及び／又はＣ末端の別のフランキング配列と共に含むことができる。
【００６２】
こうしたＮ及び／又はＣ末端のフランキング配列はヒトＦＶＩＩＩ中のコア残基配列の両端に隣接する配列から誘導可能なものとすることができる。
【００６３】
例えば、このペプチドは以下の群から選ぶことができる：
【００６４】
【化７】
0005501245.tif 000013
一部のＦＶＩＩＩ由来ペプチドはアピトープであることが既に知られている（例えば、ＰＲＣＬＴＲＹＹＳＳＦＶＮＭＥ及びＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹ）。これらのペプチドの他に、同じコア残基配列を共有するが、フランキング残基が一つ以上異なるものがあると考えられる。
【００６５】
これを検証するために、重複ペプチドのパネルを作製することができる。通常、この集合体内のペプチド群は、これらが最小エピトープを含むので、免疫反応を生じさせることができる。これらのペプチドのうち、ペプチドがアピトープとしての挙動も示すかは、抗原プロセシングのない提示系においてＭＨＣクラスＩＩに結合して適切なＴ細胞を刺激するこのペプチドの性能を調べることによって検討することができる。
【００６６】
以下の表に示したペプチドは、アピトープの役割を果たすことができるかどうかについて検証することができる：
【００６７】
【化８】
0005501245.tif 000014
【００６８】
【化９】
0005501245.tif 000015
また、恐らく、上記の表に示した１５−マーペプチドよりも僅かに長いか短いペプチドはアピトープの役割を果たし、第ＶＩＩＩ因子に対して対象を寛容化することができるであろう。このペプチドは、例えば、１０乃至２５アミノ酸長、特に、１２乃至１８アミノ酸長とすることができる。
【００６９】
ＡＰＩＰＳ
ａ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）固定ＡＰＣ、
ｂ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）クラスＩ又はＩＩ  ＭＨＣ分子含有脂質膜及び
ｃ）（ＣＤ２８に対する抗体の存在又は非存在下の）プレートに結合させた状態の精製天然又は組換えＭＨＣ
を含む種々の抗原プロセシング非依存性提示系（ＡＰＩＰＳ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が知られている。
【００７０】
これらの系は全て抗原をＭＨＣ分子との組合せで提示することができるが、抗原をプロセシングすることはできない。これらの全ての系において、このプロセシング機能は存在しないか、無効化されている。これによって、ペプチドが更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示され得るかどうかを調べることが可能となる。
【００７１】
Ｔ細胞の反応を検討するための固定ＡＰＣの使用については、当該分野では、例えば、ポリペプチド内の最小エピトープを切断ペプチドに対する反応を測定することによって調べる研究（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄほか（１９９６年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１０３５−１０４３）において公知である。ＡＰＣは、例えば、ホルムアルデヒド（通常、パラホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒドを用いて固定することができる。
【００７２】
脂質膜（平面膜でもリポソームでもよい）は、人工脂質を用いて調製することができ、又はＡＰＣからの細胞膜／ミクロソーム分画とすることができる。
【００７３】
使用に当たっては、ＡＰＩＰＳを組織培養プレートのウェルに加える。次いで、ペプチド抗原を加え、ＡＰＩＰＳのＭＨＣ部分へのこのペプチドの結合を特定のＴ細胞株又はクローンの添加によって検出する。Ｔ細胞株又はクローンの活性化については、当該分野で周知の方法のいずれかによって、例えば、３Ｈ−チミジン取り込み又はサイトカイン分泌によって測定することができる。
【００７４】
第ＶＩＩＩ因子
本発明のペプチドは第ＶＩＩＩ因子から誘導可能なものとすることができる。
【００７５】
第ＶＩＩＩ因子は血液凝固の内因性経路に関与するが、第ＶＩＩＩ因子は、Ｃａ＋２及びリン脂質の存在下に第Ｘ因子を活性型Ｘａに変換する第ＩＸａ因子の補因子である。
【００７６】
第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、選択的スプライスによる２種の転写産物を生じる。転写産物変異体１は、血漿中を循環し、フォンウィルブランド因子と結合して非共有結合複合体を形成する大きな糖蛋白質、イソ型ａ、をコードしている。この蛋白質は複数の切断事象を起こす。転写産物変異体２は、主として第ＶＩＩＩｃ因子のリン脂質結合ドメインからなる推定小蛋白質（イソ型ｂ）をコードしている。この結合ドメインは凝集活性に必須である。
【００７７】
ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の１８６，０００塩基対の完全な配列は１９８０年代半ばに解明された（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒほか（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、３２６−３３０）。同時に、アミノ酸２，３５１個の完全な配列をコードしているＤＮＡクローンを用いて培養哺乳動物細胞で生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子が作製された（Ｗｏｏｄほか（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３０−３３７）。ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸２，３５１個の完全な配列を配列番号１として示した。
【００７８】
本発明のペプチドは第ＶＩＩＩ因子から誘導可能なものとすることができる。このペプチドは、例えば、第ＶＩＩＩ因子の配列からのアミノ酸のある連続した配列で構成することができる。このペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の配列の切断から取得可能とすることができ、又は取得することができる。
【００７９】
このペプチドは、これが更なる抗原プロセシングを受けることなくＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合して関連のあるＴ細胞に認識される性能を保持する限り、野生型配列に対する付加、置換又は欠失などの突然変異を１種以上有することができる。例えば、このペプチドは、野生型配列と比較した場合、その長さにわたって５、３、２又は１箇所の突然変異を有することができる。
【００８０】
このペプチドの結合活性が維持される限り、残基間の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。
【００８１】
保存的置換は、例えば、下表に従って行うことができる。２番目のカラムの同じブロック内、好ましくは３番目のカラムの同じ行内のアミノ酸は互いに置換することができる：
【００８２】
【化１０】
0005501245.tif 000016
また、本発明は、相同的置換（本明細書では、置換及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）はいずれも、既存のアミノ酸残基を別の残基と交換することを意味して用いている）、即ち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの同種置換を行うことができることを包含している。また、非相同的置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、或いはオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸を含めることを伴う置換を行うこともできる。
【００８３】
また、以下の非天然アミノ酸によって置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することもできる：アルファ＊およびアルファ−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊などの中性アミノ酸のハライド誘導体、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、などのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。（相同的もしくは非相同的置換に関する）上記説明において、記号＊は上記誘導体が疎水性を有すること、＃は上記誘導体が親水性を有すること、＃＊は両親媒性を有することを示すために用いている。
【００８４】
１つ以上のアミノ酸残基がペプトイドの形で存在することを含む別の形の変形形態があり得ることは、当業者により十分了承されよう。不確かとならないように定義しておくが、「ペプトイドの形」とは、α−炭素置換基がα−炭素ではなく残基の窒素原子上にある変種アミノ酸残基という意味で用いている。ペプトイドの形のペプチドを調製する手順については当該分野で周知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪほか、ＰＮＡＳ（１９９２年）８９（２０）：９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５年）１３（４）：１３２−１３４に記載されている。
【００８５】
寛容
Ｔ細胞エピトープは、自己のものであれ外来性であれ任意の抗原に対する適応免疫反応において中心的な役割を果たしている。過敏性症候群（例えば、アレルギー、自己免疫疾患及び移植片拒絶反応）においてＴ細胞エピトープが果たしている中心的な役割については実験モデルを使用することによって明らかにされている。炎症性又はアレルギー性疾患は、（Ｔ細胞エピトープの構造に基づいた）合成ペプチドをアジュバントとの併用で注射することにより誘導することが可能である。
【００８６】
これに対して、特定の抗原に対する免疫寛容は、可溶型のペプチドエピトープを投与することによって誘導可能であることが分かっている。可溶性ペプチド抗原の投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ−多発性硬化症（ＭＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）のモデル）（Ｍｅｔｚｌｅｒ及びＷｒａｉｔｈ（１９９３年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１１５９−１１６５、Ｌｉｕ及びＷｒａｉｔｈ（１９９５年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１２５５−１２６３並びにＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２５１−１２６１）並びに関節炎、糖尿病及びブドウ膜網膜炎の実験モデル（上記のＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年）で概説されている）において疾患を抑制する効果的な手段であることが明らかにされている。また、これはＥＡＥにおいて進行中の疾患を処置する手段となることが明らかにされている（上記のＡｎｄｅｒｔｏｎ及びＷｒａｉｔｈ（１９９８年））。
【００８７】
寛容とは、抗原に対して反応しないことである。自己抗原に対する寛容は免疫系の本質的な特徴であり、これが失われると、自己免疫疾患が生じ得る。適応免疫系は、それ自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫性攻撃を回避しつつ膨大な種類の病原菌に対して反応する能力を維持しなければならない。これは、未熟なＴリンパ球の胸腺におけるアポトーシス細胞死に対する感受性によってかなりの程度まで制御されている（中枢性寛容）。しかしながら、全ての自己抗原が胸腺において検出される訳ではないので、自己反応性胸腺細胞の死は不完全なままである。従って、末梢組織の成熟自己反応性Ｔリンパ球によって寛容が獲得されるメカニズムも存在する（末梢性寛容）。中枢性及び末梢性寛容のメカニズムについては、Ａｎｄｅｒｔｏｎほか（１９９９年）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６９：１２３−１３７）に総説されている。
【００８８】
血友病Ａでは、患者は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子に欠陥を有する。このことは、第ＶＩＩＩ因子は免疫系によって「自己」抗原として認識されないことを意味している。従って、凝固因子置換療法時に第ＶＩＩＩ因子を投与すると、この外来遺伝子に対する同種免疫反応が生じ、ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の産生を招く。
【００８９】
本発明のペプチド類は、ＦＶＩＩＩを治療的に投与する場合にこれが免疫反応を誘導せず、ＦＶＩＩＩインヒビターが生じないように、第ＶＩＩＩ因子に対する寛容を誘導することができる。
【００９０】
後天性血友病は、第ＶＩＩＩ因子に対する寛容が機能しなくなっている自己免疫疾患である。この場合、本発明のペプチド類を投与することによりこの自己蛋白質に対する寛容を回復させ、病因となる免疫反応を抑えることができる。
【００９１】
寛容は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも一部においてアナジーが誘導されることから生じ、又はこれを特徴とすることができる。Ｔ細胞を活性化するためには、ペプチドはＴ細胞に２つのシグナルを送達することができる「プロフェッショナル」ＡＰＣと結合する必要がある。第一のシグナル（シグナル１）は、ＡＰＣの細胞表面のＭＨＣ−ペプチド複合体によって送り出され、ＴＣＲを介してＴ細胞に受け取られる。第二のシグナル（シグナル２）は、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの、ＡＰＣの表面の共刺激分子によって送り出され、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞は、シグナル２の無い状態でシグナル１を受け取ると、活性化されないばかりか、アナジーの状態になると考えられている。アナジーなＴ細胞は、その後の抗原投与に対して不応性であり、他の免疫反応を抑制できる場合がある。アナジーなＴ細胞はＴ細胞寛容の媒介に関与していると考えられている。
【００９２】
理論にとらわれることを望まないが、ＭＨＣ分子と共に提示される前にプロセシングを必要としているペプチドは、成熟した抗原提示細胞により処理される必要があるので寛容を誘導しないと、本発明者らは予測する。（マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞などの）成熟抗原提示細胞は抗原をプロセシングすることができるが、シグナル１及び２の両方をＴ細胞に送り出すこともでき、その結果、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。他方、アピトープは未熟ＡＰＣのクラスＩＩＭＨＣに結合することができると考えられる。従って、これは共刺激なしにＴ細胞に提示され、その結果、Ｔ細胞のアナジー及び寛容がもたらされると考えられる。
【００９３】
勿論、アピトープは成熟ＡＰＣの細胞表面においてＭＨＣ分子に結合することもできる。しかしながら、免疫系は成熟ＡＰＣよりも未熟ＡＰＣをより豊富に含んでいる（樹状細胞の１０％未満が活性化されると示唆されている、Ｓｕｍｍｅｒｓほか（２００１年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２８５−２９５）。従って、アピトープに対する初期状態（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、活性化ではなくアナジー／寛容であると考えられる。
【００９４】
ＦＶＩＩＩに対する寛容の誘導は、当該分野で周知の技術によって
（ｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体、
（ｉｉ）ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を分泌することができるＢ細胞
のレベルの低下を探索することによってインビボでモニターすることができる。
【００９５】
ペプチド投与によって寛容が誘導されると、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能が低下することが分かっている。また、この細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生は下方制御されるが、ＩＬ−１０の産生は増加する。ペプチドにより寛容が誘導された状態のマウスにおいてＩＬ−１０を中和すると、疾患への罹患性が完全に元に戻ることが分かっている。寛容状態では、ＩＬ−１０を産生し、免疫調節を媒介する制御性細胞集団が存続することが提唱されている（Ｂｕｒｋｈａｒｔほか（１９９９年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１６２５−１６３４）。
【００９６】
従って、寛容の誘導は、
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアナジーの誘導（これはその後のインビトロでのＦＶＩＩＩ投与によって検出することができる）
（ｂ）（ｉ）増殖の低下、
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生の下方制御、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０の産生増加
を含むＣＤ４＋Ｔ細胞集団の変化
を含む種々の方法によってモニターすることもできる。
【００９７】
本明細書に用いている「寛容原性の」という用語は寛容を誘導することができることを意味している。
【００９８】
組成物
また、本発明は、本発明によるペプチドを含む医薬組成物などの組成物に関する。
【００９９】
このペプチドは、複数のペプチド、例えば、本発明の２種、３種、４種、５種又は６種のペプチドを含むことができる。
【０１００】
この組成物のペプチド類は、それぞれ異なる最小エピトープを含むことができる。例えば、これらのペプチドはそれぞれ表１に示したペプチド類からの最小エピトープを含むことができる。
【０１０１】
この組成物は、ペプチド類
【０１０２】
【化１１】
0005501245.tif 000017
を含むことができる。
【０１０３】
本発明の組成物は予防用又は治療用とすることができる。
【０１０４】
この組成物は、予防用に投与する場合、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応の発生を低減又は阻止することができる。免疫反応のレベルは、この組成物で処置しなかった場合に患者で得られたであろうレベルより低い。「低減する」という用語は、この組成物で処置しなかった場合に患者で観察されたであろう反応に対して（又は同じ時間枠にわたって未処置の患者で観察された反応に対して）５０％、７０％、８０％又は９０％低減などの免疫反応の部分的な低減が観察されることを意味している。「阻止する」という用語は、ＦＶＩＩＩに対する測定可能な免疫反応が認められないことを意味している。
【０１０５】
治療用に投与する場合、この組成物は、ＦＶＩＩＩに対して既に進行中の免疫反応を抑制することができる。「抑制する」という用語は、ペプチド処置の前のレベル又は処置がなされなかった場合に同時点で観察されたであろうレベルと比較した場合の進行中の免疫反応のレベルの低下を意味する。
【０１０６】
本発明の組成物で処置することにより
（ｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体、
（ｉｉ）ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞
（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を分泌するＢ細胞
のうちのいずれか又は全てのレベルの低下をもたらすことができる。
【０１０７】
これらの要素全ての検出は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの、当該分野で周知の技術によって実施することができる。
【０１０８】
本発明の組成物で処置することにより、ＦＶＩＩＩに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞においてアナジーを追加的に又は代わりに、もたらすことができる。アナジーは、例えばその後にインビトロでＦＶＩＩＩを投与することにより検出することができる。
【０１０９】
ＦＶＩＩＩに対する全ての免疫反応が病因となる訳ではないことを念頭に置いておくことは重要である。インヒビターを有しない血友病患者（Ｍｏｒｅａｕほか（２０００年）Ｂｌｏｏｄ  ９５：ｐ．３４３５−４１）及び健康な献血者の約１５％（Ａｌｇｉｍａｎほか（１９９２年）８９：ｐ．３７９５−９）において非阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を見出すこともある。
【０１１０】
ＦＶＩＩＩインヒビターは、正常血漿中のＦＶＩＩＩに対する患者の血漿の不活化能を試験するベセズダ凝固アッセイのＮｉｊｍｅｇｅｎの変法によって検出することができる。ベセズダ単位は、血漿ＦＶＩＩＩ活性の５０％を中和する抗体の量と定義され、０．６ＢＵ以上の力価は抗体の存在を示す。
【０１１１】
インヒビターは、一般に、そのレベルが＜５ＢＵであれば低力価に、≧５ＢＵであれば高力価に分類される。
【０１１２】
血中ＦＶＩＩＩ阻害性抗体のレベルは、患者が処置を受けなかった場合に観察されたであろう抗体レベルの９０％、７５％、５０％、２０％、１０％、５％にまで低下させることができる。
【０１１３】
血中ＦＶＩＩＩ阻害性抗体のレベルは、５、４、３、２、１又は０．５ＢＵにまで低下させることができる。
【０１１４】
本発明のペプチド類及び組成物は、患者における凝固を助けるのに使用することができる治療的投与のＦＶＩＩＩの量及び割合を増大させることができる。これは、ある割合のＦＶＩＩＩをその治療的作用を発揮することから効果的に排除することができるＦＶＩＩＩインヒビターが低減するためである。本発明のペプチド又は組成物は、利用可能なＦＶＩＩＩの量を、例えば、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％増加させることができる。
【０１１５】
従って、本発明のペプチド類及び組成物は、患者における凝固を助けるために投与する必要のあるＦＶＩＩＩの量を低減させることができる。
【０１１６】
製剤化
この組成物は溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができ、注射に先立って液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。この製剤は乳状にすることもでき、ペプチドはリポソームに封入することができる。有効成分は、医薬用として許容可能であり、この有効成分と適合性の賦形剤と混合することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組合せである。
【０１１７】
さらに、必要に応じて、この組成物は、湿潤剤又は乳化剤及び／又はｐＨ緩衝剤などの補助剤を少量含有することができる。緩衝塩としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩が挙げられる。塩酸及び／又はナトリウムハイドリオキシドをｐＨ調製に用いることができる。安定化にはスクロース、トレハロースなどの二糖類を用いることができる。
【０１１８】
この組成物が複数のペプチドを含む場合、これらのペプチドの相対比率はほぼ等しいものとすることができる。或いは、例えば、特定のサブセットの自己反応性Ｔ細胞に寛容原性反応を集中させるために、又はあるペプチドがその他のペプチドよりも特定のＨＬＡ型において効果的に作用することが分かっている場合に、各ペプチドの相対比率を変更することができる。
【０１１９】
製剤化後に、この組成物を滅菌容器に入れ、これを密封して低温、例えば４℃で保存することができ、又はこの組成物を凍結乾燥することができる。
【０１２０】
この組成物は凍結乾燥（フリーズドライの）粉末として調製するのが好都合である。凍結乾燥によって安定化状態での長期保存が可能となる。凍結乾燥の手順については当該分野で公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／９７／０１／００６．ｈｔｍｌを参照されたい。凍結乾燥に先だって、一般に、マンニトール、デキストラン、グリシンなどの増量剤が用いられる。
【０１２１】
この組成物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、舌下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤による経路又は埋め込み（例えば、放出制御分子を使用）などの都合のよいやり方で投与することができる。
【０１２２】
この組成物は、鼻腔内、皮下又は皮内経路によって有利に投与すればよい。
【０１２３】
本発明のペプチド及び組成物はヒト対象を処置するのに用いることができる。この対象は、血友病Ａ、特に重症の血友病Ａを有する者とすることができる。この対象は遺伝的にＦＶＩＩＩを欠損している者とすることができる。この対象は後天性血友病を有する者とすることができる。この対象は阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を有する者とすることができる。
【０１２４】
この対象はＦＶＩＩＩによる凝固剤置換療法を受けているか、受けようとしている者であってもよい。
【０１２５】
この対象はＦＶＩＩＩ遺伝子による遺伝子療法を受けているか、受けようとしている者であってもよい。
【０１２６】
この対象は、阻害性抗ＦＶＩＩＩ同種抗体又は自己抗体を生じやすい素因と関連付けられるＨＬＡハプロタイプとすることができる。この対象は、ＨＬＡ−ＤＲ２を発現することができる。個体のＨＬＡハプロタイプを判断するための方法は当該分野では周知である。
【０１２７】
通常、医師は個々の対象に最も適している実際の投与量を決定することになり、これは特定の患者の年齢、体重及び反応によって様々に異なる。
【０１２８】
好ましい実施態様では、複数の用量を濃度を段階的に上げて患者に投与する「用量漸増」プロトコルに従うことができる。このような手法は、例えば、ハチ毒アレルギーに対する免疫療法用途におけるホスホリパーゼＡ２ペプチドに関して用いられている（Ｍｕｅｌｌｅｒほか（１９９８年）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：ｐ．７４７−７５４及びＡｋｄｉｓほか（１９９８年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：ｐ．９８−１０６）。
【０１２９】
キット
好都合なことに、組成物が複数のペプチド類を含む場合、これらを混合組成物又はカクテルとして一緒に投与することができる。しかしながら、これらのペプチド類をキットの形で別々に与えて同時、個別、連続又は併用投与することが好ましい状況がある場合がある。
【０１３０】
また、このキットは混合及び／又は投与手段（例えば、鼻腔内投与用吸入器又は皮下／皮内投与用注射器及び注射針）を含むこともできる。また、このキットは使用説明書を含むこともできる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物又はキットは疾患を処置及び／又は予防するために用いることができる。
【０１３２】
特に、この組成物／キットは血友病Ａ又は後天性血友病を処置及び／又は予防するために用いることができる。
【０１３３】
血友病Ａ
血友病Ａ（古典的血友病）は第ＶＩＩＩ因子の欠損に起因する。
【０１３４】
血友病Ａの推定発症率は男性では１０，０００人当たり１人であり、一方、血友病Ｂは男性では４０，０００人当たり１人の率で発症すると推定される。女性では５，０００人当たり約１人が血友病Ａの保因者であり、２０，０００人当たり１人が血友病Ｂの保因者である。
【０１３５】
血友病は、通常、血中の凝固因子のレベルに基づいて３種類、即ち、重症、中等症及び軽症に分類される。重症血友病では、凝固因子は正常値の１％未満である。重症度は何世代にもわたって一貫している傾向がある。
【０１３６】
一般に信じられているのとは反対に、小さな傷口及び創傷は血友病患者には通常は脅威ではない。むしろ、最大の危険は関節及び筋肉内に生じることがある突発性出血によってもたらされる。これは、成長の急な年齢期、通常５乃至１５歳に最も生じやすい。
【０１３７】
関節において特発性出血を繰り返すと、関節炎を生じる恐れがあり、周囲の筋肉が弱くなる。血液の蓄積によって神経への圧迫が生じると、痛み、しびれ及び患部の一時的動作不能が起こる。
【０１３８】
血友病Ａは、通常、凝固の有効性を測定し、凝固因子のレベルが異常かどうかを調べる血液テストを用いて診断される。
【０１３９】
献血された血液から単離された精製凝固因子が１９７０年代に開発されたことにより血友病患者の長期予後が著しく改善された。軽症乃至中等症の血友病患者はＦＶＩＩＩによる処置を臨時的に利用するのに対して、重症の血友病患者は定期的で無期限の処置を必要とすると考えられる。
【０１４０】
従来、患者は何千もの血漿献血からプールされた第ＶＩＩＩ因子濃縮物を投与されていた。このため、ウイルス性の病原体、特にヒト免疫不全ウイルス及び肝炎ウイルスによる汚染という深刻な問題がもたらされた。モノクロナール抗体による精製技術、熱不活化及び殺ウイルス性界面活性剤処置によって血漿由来濃縮物は比較的安全になっている。
【０１４１】
今や、組換えＤＮＡ技術によってＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（商標）などの一連の合成製品が供給されている。Ｋｏｇｅｎａｔｅは、ヒト第ＶＩＩＩ因子を発現する新生仔ハムスター腎細胞を用いて作製されている。得られた因子は高度に精製され、血漿からのウイルス感染の可能性はいずれも排除されている。
【０１４２】
本発明のペプチド又は組成物は第ＶＩＩＩ因子置換療法の施行前及び／又は施行中に投与することができる。
【０１４３】
血友病Ａは遺伝子治療の理想的な疾患標的である。何故なら、ｉ）これが特定の単一遺伝子の突然変異に起因しており、ｉｉ）インビボで凝固因子レベルを僅かに上昇させることにより重症の血友病をより軽症のものに変えることができ、ｉｉｉ）現行の置換療法が最適以下と考えられているからである。また、凝固活性の所望レベルを超過しても安全性の範囲は広い。
【０１４４】
残念なことに、現在に至るまで血友病の治療法としての遺伝子療法の将来性は実現されていない。その主な理由は、凝固因子の長期発現を可能にするのに十分非免疫原性である遺伝子送達系を見出すのが困難であることにある。
【０１４５】
本発明のペプチド類は、第ＶＩＩＩ因子による遺伝子療法に先立って対象を寛容化し、及び／又は遺伝子療法後の患者におけるＦＶＩＩＩインヒビターの形成を管理するのにも適していると考えられる。
【０１４６】
後天性血友病
後天性血友病は、以前に凝固が正常であった個体におけるＦＶＩＩＩに対する自己抗体インヒビターの存在を特徴とする。これは、年間の推定発症率が百万人当たり１乃至３人の希な疾患である。獲得自己抗体インヒビターと関連付けられる死亡率は、同種抗体を有する個体における死亡リスクが実質的により低いのに対して２５％に達する。
【０１４７】
同種抗体インヒビターを有する患者と比較して、後天性血友病は、（１）出血パターンの重症化、（２）高齢集団における発症率の上昇、（３）約５０％の症例における、根底にある特定可能な自己免疫疾患、リンパ球増殖性又は固形悪性腫瘍、妊娠及びペニシリン、スルホンアミド類などの特定の抗生物質の使用に関連した発症、並びに（４）通常、患者血漿において２％乃至１８％の範囲の残存第ＶＩＩＩ因子レベルをもたらす、その自己抗体による標的化凝固因子活性の不完全な中和を示すＩＩ型薬物動態パターンをたどるインビトロインヒビター活性、を特徴とする。
【０１４８】
本発明のペプチド又は組成物は、後天性血友病を有する患者に対して、又は、例えば、
ｉ）例えば、ペニシリンもしくはスルホンアミド類による処置が迫っていること、
ｉｉ）腫瘍もしくは他の悪性疾患が進行していること、
ｉｉｉ）妊娠が間近もしくはその早期であること
のために後天性血友病を発症するリスクがあると考えられる患者に対して、投与することができる。
【０１４９】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の実施に当たり当業者の便をはかるのに役立つものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
ＨＬＡ−ＤＲ２第ＶＩＩＩ因子ペプチドの選択
一連のＦＤＶＩＩＩ  １５マーペプチドを以下の３種のＨＬＡ−ＤＲ結合アルゴリズムを用いて比較した：
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ）
ＰｒｏＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）及び
及びＩＥＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）。
【０１５１】
これらのプログラムのうちの２種以上によってＨＬＡ−ＤＲ２結合であると予測されるペプチドを選択し、その予測されたコア残基群のフランキング配列を設計した（表１）。
【０１５２】
【化１２】
0005501245.tif 000018
実施例２
第ＶＩＩＩ因子免疫化マウスからのＨＬＡ−ＤＲ２拘束性細胞のペプチドに対する反応の検討
ＨＬＡ−ＤＲ２遺伝子導入マウスをアジュバントと混ぜたヒト第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。流入領域リンパ節細胞を採集し、表１からの１２種のペプチドを種々の濃度で用いてインビトロで再刺激した。その結果を図１に示した。
【０１５３】
第ＶＩＩＩ因子免疫化マウスからのＨＬＡ−ＤＲ２拘束性細胞は明らかにペプチドＤＮＩＭＶ（第１アミノ酸  １７８８）に対して強く反応する。ペプチド類ＰＲＣＬＴ（５４５）及びＰＰＩＩＡ（２１６１）に対する反応も見られる。
【０１５４】
実施例３
ＨＬＡ−ＤＲ２マウスからのＴ細胞のペプチドに対する反応の検討
先ず、ＨＬＡ−ＤＲ２マウスをアジュバントと混ぜた第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。免疫マウスからの脾細胞を第ＶＩＩＩ因子によりインビトロで再刺激し、得られたリンパ芽球をポリエチレングリコールを用いてＢＷ５１４７胸腺腫と融合させた。
【０１５５】
Ｔ細胞ハイブリドーマをＨＡＴ培地で選択し、こうしたハイブリドーマをクローニングして第ＶＩＩＩ因子に対する反応性について調べた。次いで、これらのハイブリドーマを上記１２種の予測ペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。スクリーニングした２７種のハイブリドーマのうち、１１種がＤＮＩＭＶに、３種がＰＲＣＬＴに、３種がＰＰＩＩＡに反応したが、ＰＰＩＩＡに対する反応はより弱く、特異性が低かった。ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴに特異的な２種のハイブリドーマの反応を図２に示した。
【０１５６】
実施例４
ＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋マウスからのリンパ節細胞のペプチドに対する反応の検討
ＨＬＡ−ＤＲ２遺伝子導入マウスを第ＶＩＩＩ因子欠損マウスと交配させてヒトＨＬＡクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現する血友病のモデルを作製した。
【０１５７】
このようにして得たＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋動物をアジュバントと混ぜた第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。流入領域リンパ節を単離し、上記ペプチドパネルに対する反応性を調べた。図３に示したように、こうした細胞はＰＲＣＬＴ及びＤＮＩＭＶによく反応した。ＧＴＬＭＶに対する反応は弱かったが、ＲＹＬＲＩに対する反応は大きかった。
【０１５８】
実施例５
ＨＬＡ−ＤＲ２マウスからのＴ細胞のペプチドに対する反応の検討
ＨＬＡ−ＤＲ２を発現する第ＶＩＩＩ因子欠損マウスをアジュバントと混ぜた第ＶＩＩＩ因子で免疫化した。この免疫化マウスからの脾細胞を第ＶＩＩＩ因子によりインビトロで再刺激し、得られたリンパ芽球を上述のようにしてＢＷ５１４７と融合させた。Ｔ細胞ハイブリドーマを上記１２種の予測ペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。さらにこの場合も、ハイブリドーマの大部分はＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴに反応した。第ＶＩＩＩ因子に特異的な１９種のハイブリドーマのうち、１０種がＤＮＩＭＶに、６種がＰＲＣＬＴに、１種がＰＰＩＩＡに、１種がＳＬＹＩＳに、１種がＤＴＬＬＩに反応した。これらのハイブリドーマによる反応の例を図４に示した。
【０１５９】
これらの実験から、２種のペプチドＤＮＩＭＶ（第１アミノ酸  １７８８番目）及びＰＲＣＬＴ（第１アミノ酸  ５４５）がヒト第ＶＩＩＩ因子に対するＨＬＡ−ＤＲ２拘束性Ｔ細胞の反応において免疫優性Ｔ細胞エピトープを構成することは明らかである。
【０１６０】
実施例６
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴはアピトープとして挙動する
アピトープであるためには、ペプチドは更なる抗原プロセシング（即ち、トリミング）を受けることなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合することができ、Ｔ細胞に提示されなければならない。この例では、固定ＡＰＣにより提示されるペプチドの性能を検討した。
【０１６１】
Ｍｇａｒ細胞は新鮮なもの又は１％パラホルムアルデヒドで固定したものとした。２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩ又はペプチドエピトープの存在又は非存在下に１００μｌのハイブリドーマ細胞を５×１０４個のＭｇａｒ細胞と共に一夜培養することによってクローンの抗原特異性を調べた。次いで、上清を採集し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生について評価した。ｒｈＦＶＩＩＩが生きたＭｇａｒ細胞によって提示されなければならないという事実は、完全な状態の蛋白質が提示されるには抗原プロセシングを受ける必要があることを示している。他方、ペプチド類ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴは生及び固定Ｍｇａｒ細胞のいずれによっても提示され、このことはこれらのペプチドがアピトープとして機能することを示している（図５）。
【０１６２】
実施例７
アピトープとして機能することができるペプチドエピトープの範囲の決定
重複ペプチドのパネル（本明細書の原文の３６乃至３７ページに示した）を調製し、実施例５と同様の方法によりＴ細胞ハイブリドーマを用いてこれらをスクリーニングすることによって、ＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴ及びその他のペプチドを取り囲む配列内のアピトープとして機能することができるペプチドエピトープの範囲を特定した（図７）。
【０１６３】
実施例８
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴは第ＶＩＩＩ因子蛋白質全体に対する寛容を誘導する
ＨＬＡ−ＤＲ２遺伝子導入マウスをアジュバントに混ぜた第ＶＩＩＩ因子による免疫化に先だってこれら２種の可溶性ペプチドのいずれか又は対照としてのＰＢＳで処置した。流入領域リンパ節を単離し、マウスの免疫状態を評価するために細胞を第ＶＩＩＩ因子蛋白質によりインビトロで再刺激した。図６に示したように、ＤＮＩＭＶ又はＰＲＣＬＴでマウスを処置すると、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応の実質的な抑制がもたらされた。
【０１６４】
実施例９
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴが第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて寛容を誘導することができるかどうかについての検討
実施例８から、これらの２種のペプチドが内因性第ＶＩＩＩ因子を発現するマウスにおいて第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応を阻止することができることが分かった。ＦＶＩＩＩ−ＤＲ２＋動物でこの実験を繰り返すことによりこれらのペプチドが第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおける第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応をも阻止するかどうかを明らかにした。
【０１６５】
実施例１０
ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの併用が第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて寛容を誘導することができるかどうかについての検討
実施例９において第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおける第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応を単独で低下させることが示された２種のペプチドを併用した。図８に示したように、ＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの両者でマウスを処置すると、ＩＦＮ−ガンマ産生の減少によって示されるように、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応の実質的な抑制がもたらされた。ＩＦＮ−ガンマは、マウスにおいて抗体を中和するのに必要とされる主要なクラススイッチリンホカインである。示された効果はいずれかのペプチドを単独で用いて観察される効果よりも大きかった。
【０１６６】
方法
（ｉ）ｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激したＤＲ２＋マウスのリコール反応
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスを、尾の基部への皮下注射により、４００μｇの加熱死菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａを補充した完全フロイントアジュバントに乳化した４０μｇのｒｈＦＶＩＩＩで免疫化した。１０日後、マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を切除した。単一細胞浮遊液を調製し、９６ウェル平底プレートにおいてウェル当たり４乃至５×１０５個のリンパ球を、示した濃度のペプチド又は対照抗原と共に７２時間インキュベートした後、さらに１６時間０．５μＣｉ／ウェルのトリチウム標識チミジンでパルスした。次いで、プレートを凍結した後、細胞をガラスフィルターマット上に採取し、放射能取込量を液体シンチレーションβ−カウンターを用いて測定した。
【０１６７】
（ｉｉ）ＤＲ２＋マウスから得られたＴ細胞ハイブリドーマのＦＶＩＩＩペプチド特異性
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスを上記のようにして免疫化した。１０日目に流入領域リンパ節を切除し、２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩの存在下の２４ウェルプレートにおいて２．５×１０６個／ｍｌのリンパ球を１ｍｌ／ウェル３日間培養した。この刺激の後に、リンパ球を回収し、洗浄して、Ｎｅｌｓｏｎほか（１９８０年）ＰＮＡＳ  ７７（５）：ｐ．２８６６の報告と同様にしてポリエチレングリコールを用い、ＴＣＲα−β−ＢＷ融合パートナー細胞と１個のリンパ球に対して４個のＢＷ細胞の割合で融合させた。融合細胞を注意深く洗浄した後、平底９６ウェルプレートで２日間平板培養し、次いで、ＨＡＴ培地を加えてＴ細胞ハイブリドーマを選択した。細胞の増殖をモニターし、約１０日後に融合を実施し、個々のクローンを選択してＨＡＴ培地中２４ウェルプレートに移した。クローンは、少なくとも２週間ＨＡＴ培地に維持した後、ＨＴ培地、次いで完全培地に移した。クローンの抗原特異性について、２０μｇ／ｍｌのｒｈＦＶＩＩＩの存在又は非存在下に１００μｌのハイブリドーマ細胞を５×１０４Ｍｇａｒ細胞と共に一夜培養することによって調べた。次いで、上清を採集してＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生について評価し、ｒｈＦＶＩＩＩに反応してＩＬ−２を産生するクローンをＦＶＩＩＩ特異性に関して陽性であるとみなした。予測されるＦＶＩＩＩペプチド類のレパートリーを検討するために、ＦＶＩＩＩ特異的クローンについて上記１２種のペプチドのそれぞれ２０μｇ／ｍｌと一夜インキュベーションした後、ＩＬ−２産生を再度調べた。
【０１６８】
（ｉｉｉ）ｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激したＦＶＩＩＩ−／−マウスのリコール反応
マウスがＦＶＩＩＩ欠損、ＨＬＡ−ＤＲ２＋及びマウスＭＨＣクラスＩＩヌルである以外は（ｉ）の場合と同じ方法に従った。
【０１６９】
（ｉｖ）ＦＶＩＩＩ−／−マウスから得られたＴ細胞ハイブリドーマのＦＶＩＩＩペプチド特異性
マウスがＦＶＩＩＩ欠損及びＨＬＡ−ＤＲ２＋である以外は（ｉｉ）の場合と同じ方法に従った。
【０１７０】
（ｖ）免疫優性ＦＶＩＩＩペプチドでの前処置によるＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩ特異的反応の寛容化
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスをＰＢＳに溶かした１００μｇのＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴもしくはＰＰＩＩＡ又は等量のＰＢＳ単独で３回処置した。ペプチドは、各投与の間隔を３乃至４日として腹腔内投与した。最後の投与の後、（ｉ）の場合のように、マウスを完全フロインドアジュバントに乳化したｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激した。１０日後、流入領域リンパ節を回収し、次いで、リンパ球をｒｈＦＶＩＩＩ又は各寛容化ペプチド及び対照抗原と共にインビトロで７２時間培養した後、（ｉ）の場合のようにトリチウム標識チミジンを加えた。
【０１７１】
（ｖｉ）免疫優性ＦＶＩＩＩペプチド類を併用した前処置によるＤＲ２＋マウスにおけるＦＶＩＩＩ特異的反応の寛容化
ＨＬＡ−ＤＲ２＋マウスＭＨＣクラスＩＩヌルマウスをＰＢＳに溶かしたＤＮＩＭＶ、ＰＲＣＬＴもしくはＤＮＩＭＶ及びＰＲＣＬＴの両者の組合せ又は等量のＰＢＳ単独で３回処置した。ペプチドは８日間にわたって腹腔内投与した。最後の投与の後、（ｉ）の場合のように、マウスを完全フロインドアジュバントに乳化したｒｈＦＶＩＩＩで初回刺激した。１０日後、流入領域リンパ節を回収し、次いで、リンパ球をｒｈＦＶＩＩＩを用いてインビトロで再刺激した。次いで、上清を採集してＩＦＮ−ガンマを測定した。
【０１７２】
上記明細書に記載した刊行物は全て、引用により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲および精神を逸脱することなく、開示した本発明の方法および系の種々の変更および改変を行うことができることは、当業者には明瞭に理解されよう。本発明については特定の好ましい実施態様に関して説明したが、本発明の特許請求の範囲がこのような実施態様に不当に限定されるべきではないことは理解されよう。それどころか、フローサイトメトリーを用いる細胞研究もしくはその関連分野の当業者には自明である、発明実施のために開示した実施態様の種々の変更は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０１７３】
【化１３】
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【０１７４】
【化１４】
0005501245.tif 000020
【０１７５】
【化１５】
0005501245.tif 000021
【図１−１】
0005501245.tif 000022
【図１−２】
0005501245.tif 000023
【図２】
0005501245.tif 000024
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
0005501245.tif 000028
【図５】
0005501245.tif 000029
【図６】
0005501245.tif 000030
【図７−１】
0005501245.tif 000031
【図７−２】
0005501245.tif 000032
【図７−３】
0005501245.tif 000033
【図７−４】
0005501245.tif 000034
【図８】
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【配列表】
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