(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ走査式蛍光顕微鏡を用いた、試料の高分解能光学的走査方法であって、
試料（１０）は、異なるエネルギー状態（第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２）にシフト可能な物質（Ｓ１）を含み、第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は少なくとも１つの光学的性質において相互に異なり、
試料（１０）は、前記物質（Ｓ１）の第１状態Ｚ１の局部的発生のため、前記物質（Ｓ１）の励起スペクトル（１）の波長の光で照明され、
試料（１０）は前記物質（Ｓ１）の第２状態Ｚ２の発生のため、適切な脱励起波長の光で、励起の周辺焦点領域において照明され、
試料（１０）から発生し且つ残存する第１状態Ｚ１の減衰から生じる放出光（８５）が検出装置（８９）によって検出される方法において、
試料（１０）は第１状態Ｚ１’及び第２状態Ｚ２’に遷移可能な少なくとも１つの別の物質（Ｓ２）を含み、各物質（Ｓ１、Ｓ２）は少なくとも１つの性質において相互に異なると共に、少なくとも１つの別の性質において少なくとも部分的に対応しており、試料（１０）の走査時、個々の物質（Ｓ１、Ｓ２）の励起、脱励起及び検出の各ステップが相互に別々の時点で行われ、
励起、脱励起及び検出の時間的順序が、前記物質（Ｓ１、Ｓ２）の各脱励起波長の大きさに従って決められ、各走査ステップが、最も大きい脱励起波長を有する物質（Ｓ２）から開始される方法。
【請求項２】
前記物質（Ｓ１、Ｓ２）は、両物質（Ｓ１、Ｓ２）の脱励起スペクトルが少なくとも部分的に相互に重複するように選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質（Ｓ１、Ｓ２）は、両物質（Ｓ１、Ｓ２）の励起スペクトル（１、１’）が少なくとも部分的に相互に重複するように選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質（Ｓ１、Ｓ２）は、両物質（Ｓ１、Ｓ２）の放出スペクトル（２、２’）が少なくとも部分的に相互に重複するように選択される請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
１つの物質（Ｓ１）の脱励起波長による試料（１０）の照明中、照射される脱励起波長が励起スペクトル（１’）に含まれる別の物質（Ｓ２）の放出光（８５）の検出が抑制される請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１つの物質（Ｓ１、Ｓ２）の脱励起状態Ｚ２またはＺ２’を発生させるために照射される光が、別の物質（Ｓ２、Ｓ１）の励起状態Ｚ１またはＺ１’を発生させるため同時に用いられる請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記物質（Ｓ１、Ｓ２）及び／又は脱励起波長は、一方の物質（Ｓ２、Ｓ１）用の脱励起波長が残りの物質（Ｓ１、Ｓ２）の励起スペクトル（１、１’）のそれぞれ外側に位置するように選択される請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法を実施するための、試料の高分解能光学的走査装置であって、試料（１０）は、異なるエネルギー状態（第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２）にシフト可能な物質（Ｓ１）を含み、第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は少なくとも１つの光学的性質において相互に異なり、前記装置は、前記物質（Ｓ１）の第１状態Ｚ１の局部的発生のため前記物質（Ｓ１）の励起スペクトルの波長の光で試料（１０）を照明するための、及び前記物質（Ｓ１）の第２状態Ｚ２の発生のため適切な脱励起波長の光で励起の周辺焦点領域において試料（１０）を照明するための少なくとも１つの光源(４９、２３、６３、３０)と、試料（１０）から発生し且つ残存する第１状態Ｚ１の減衰から生じる放出光（８５）を検出するための検出装置（８９）とを有するものにおいて、
試料（１０）は第１状態Ｚ１’及び第２状態Ｚ２’に遷移可能な少なくとも１つの別の物質（Ｓ２）を含み、各物質（Ｓ１、Ｓ２）は少なくとも１つの性質において相互に異なると共に、少なくとも１つの別の性質において少なくとも部分的に対応しており、試料（１０）の走査時、個々の物質（Ｓ１、Ｓ２）の励起、脱励起及び検出の各ステップが相互に別々の時点で行われ、
励起、脱励起及び検出の時間的順序が、前記物質（Ｓ１、Ｓ２）の各脱励起波長の大きさに従って決められ、各走査ステップが、最も大きい脱励起波長を有する物質（Ｓ２）から開始される装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくはレーザ走査式蛍光顕微鏡を用いた、試料の高分解能光学的走査方法であって、試料は異なるエネルギー状態（第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２）にシフト可能な物質を含み、第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は少なくとも１つの光学的性質において相互に異なり、試料は前記物質の第１状態Ｚ１の局部的発生のため、前記物質の励起スペクトルの波長の光で照明され、また試料は前記物質の第２状態Ｚ２の発生のため、適切な脱励起（deexcitation）波長の光で、励起の周辺焦点領域において照明され、試料から発生し且つ残存する第１状態Ｚ１の減衰（decay）から生じる放出光が検出装置によって検出される方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、特に請求の範囲第１−１７項のいずれか１項に記載の方法を実施するための、試料の高分解能光学的走査装置であって、試料は異なるエネルギー状態（第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２）にシフト可能な物質を含み、第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は少なくとも１つの光学的性質において相互に異なり、前記装置は、前記物質の第１状態Ｚ１の局部的発生のため、前記物質の励起スペクトルの波長の光で試料を照明すると共に、前記物質の第２状態Ｚ２の発生のため、適切な脱励起の光で、励起の周辺焦点領域において試料を照明するための少なくとも１つの光源と、試料から発生し且つ残存する第１状態Ｚ１の減衰から生じる放出光を検出する検出装置とを有する装置に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここで課題とするような方法及び装置は、実際の用途において以前から知られており、例えばＳＴＥＤ（誘導放出制御）顕微鏡検査に関連して使われている。そのような課題とする光学的像形成方法及び装置によれば、使用する光の波長に依存する回折限界により、アッベの法則に基づいて決まる理論的な限界を超えた空間分解能を達成可能である。
【０００４】
ＳＴＥＤ顕微鏡検査においては、光によって励起状態にシフト可能であると共に、その励起状態から急激に脱励起可能な物質が、その目的のため検査する試料において利用可能とされる。ＳＴＥＤ顕微鏡検査では、蛍光色素がそのような物質として主に使われている。一般的に、その種の物質はまず、例えば緑色レーザパルスなどの短波長光によって励起状態に遷移される。次いでその物質が、長い波長（例えば赤色）のレーザパルスにより、励起の周辺焦点領域において制御された方法で脱励起される。周辺焦点領域においてのみ物質の脱励起を達成するため、脱励起点像関数が固有に形成される。この目的のため、一般には位相フィルタが使われる。位相フィルタは長波長レーザビームのビーム経路内に配置され、脱励起光ビームの波面を位置に依存した方法で変更する。重要なのは、周辺領域内で脱励起光ビームによって誘起される励起状態から脱励起状態への遷移が、飽和状態でつまり完全に行われ、物質が（原理上任意の）小さい中心領域においてのみ励起状態に留まることである。これにより脱励起光パルスは、回折限界励起スポットの周辺領域からの蛍光の放出を防ぐ。その結果検出される蛍光は、飽和脱励起のために、直径がアッベの法則で許容される限界よりも実質上小さい狭く限定された試料領域から得られるものとなる。
【０００５】
分解能の増大が脱励起状態の飽和によって得られるその他全ての周知な方法と同じく、ＳＴＥＤ顕微鏡検査も１色モードで行われている。このことは、ただ１つの物質、例えばただ１つの蛍光色素が試料内で利用可能とされることを意味する。逆に共焦点顕微鏡においては、数種類の異なる蛍光色素が試料内で利用できるようにし、試料の多色画像を生成するのが通常である。この方式では、試料内の異なるプロセスを同時に検査可能である。従って、通常の顕微鏡検査における多色画像によれば、周知の空間的に高分解能の画像形成方法よりも実質上多くの情報が、（より低い分解能ではあるが）得られる。
【０００６】
ここで本発明の目的は、冒頭に述べたような方法及び装置であって、回折限界を超えた高い空間分解能が、同時に高い情報歩留まり及び物理的に簡単且つ経済的な手段で達成される方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、上記の目的は、請求項に記載の各特徴を有する方法によって達成される。本発明によれば、試料は第１状態Ｚ１’及び第２状態Ｚ２’に遷移可能な少なくとも１つのさらに別の物質を含み、各物質は少なくとも１つの性質において相互に異なると共に、少なくとも１つの別の性質において少なくとも部分的に対応しており、試料の走査時、個々の物質の励起及び／又は脱励起及び／又は検出の各ステップが相互に別々の時点で行われるように方法が実施されまた改良される。
【０００８】
さらに上記の目的は、請求項に記載の各特徴を有する装置によって達成される。本発明によれば、試料は第１状態Ｚ１’及び第２状態Ｚ２’に遷移可能な少なくとも１つのさらに別の物質を含み、各物質は少なくとも１つの性質において相互に異なると共に、少なくとも１つの別の性質において少なくとも部分的に対応しており、試料の走査時、個々の物質の励起及び／又は脱励起及び／又は検出の各ステップが相互に別々の時点で行われるように装置が実施されまた改良される。
【０００９】
本発明によって認識されたことは、第１に、試料の高分解能光学的走査から得られる情報が、試料の多色画像を生成することによって増加可能なことである。この目的のため、本発明によれば、第１状態及び第２状態に遷移可能な少なくとも１つのさらに別の物質が試料内で利用可能とされ、各物質は少なくとも１つの性質において相互に異なると共に、少なくとも１つの別の性質において少なくとも部分的に対応している。各物質の「性質」とは、例えば、それらの励起波長または励起スペクトル、それらの放出スペクトル、脱励起波長、あるいは寿命と理解されるべきである。各物質が選択によって少なくとも１つの性質において相互に異なるものとなる本発明による物質の選択は、２つの物質を相互に区別するのに用いられる。本発明における、別の性質における少なくとも部分的な対応は、特に簡単な設計を可能とする。つまり、例えば照明光源や検出装置など、同じ構成部品やアセンブリを複数の物質に対し共通して使用可能とする。
【００１０】
また、複数物質の同時励起及び同時脱励起は、１つの物質の脱励起光が別の物質の励起を引き起こすことがあるのを意味することも認識された。飽和遷移を脱励起状態で発生させるためには高い出力レベルで脱励起光を照射しなければならないため、脱励起波長で励起される物質は極めて迅速に消失し、従ってそれ以後は画像用に利用不能となる。この問題を回避するため、本発明によれば、試料の走査時、個々の物質の励起及び／又は脱励起及び／又は検出の各ステップが相互に別々の時点で行われる。
【００１１】
ここで、「励起スペクトル」または「励起波長」及び「脱励起スペクトル」または「脱励起波長」という用語は、本発明において狭義に理解されてはならないこと、また本発明は誘導放出に何ら限定されないことが特に強く強調されるべきである。むしろ本発明は、可逆的な分子遷移の飽和によって分解能の増大が生じるあらゆる方法に関連している。これには例えば、固有波長の光の照射によって、蛍光発生状態と蛍光非発生状態との間で切り換えが行われる光切り換え可能なまたは光変換可能なたんぱく質の使用も含まれる。その場合蛍光は、異なる波長帯で切り換えオン及びオフされ、切り換えオフ状態の飽和によって分解能の増大が得られるようにするのが好ましい。こうした種類の高分解能の光学的像形成方法は、極めて一般的にＲＥＳＯＬＦＴ法と呼ばれている。ＳＴＥＤ顕微鏡検査における使用の他、本発明はさらにＳＴＥＤ４-pi（４p）顕微鏡検査、アップコンバーション顕微鏡検査、及び基底状態枯渇（ＧＳＤ=ground state depletion）に関連しても利用可能である。      
【００１２】
特に有利は方式として、各物質は、それぞれの物質の脱励起スペクトルが少なくとも部分的に重複し、両物質が同じ波長を用いて第２状態に遷移可能となるように選択される。設計については、この点に関連して、両物質を第２状態に遷移するのに共通な１つだけの照明光源を設けるのが有利なことが実証されている。誘導脱励起のために用いられる照明光源は一般に高い光出力レベルを供給しなければならず、それに応じて相対的に高価となるため、上記の方式により顕著なコスト削減が達成可能となる。この場合、各物質をそれぞれ異なる波長を用いて相互に別々に励起可能なように、各物質の励起スペクトルは異なるものとし得る。
【００１３】
別の好ましい実施形態によれば、各物質の励起スペクトルが少なくとも部分的に相互に重複するように、各物質の選択を行うことができる。この場合には、１つの照明光源を用いて励起を行える。各物質を第２状態に遷移させるのに、１つまたはそれより多い照明光源を設けることができる。
【００１４】
さらに、各物質の放出スペクトルが少なくとも部分的に相互に重複するように、各物質の選択を行うことも考えられる。このような実施形態は、その場合放出光の検出を特に容易に扱える点で有利なことが実証されている。
【００１５】
具体的な実施形態に関連して、励起及び／又は脱励起及び／又は検出の時間的順序が、各物質の各脱励起波長の大きさに従って決められるようになされる。特に有利な方式として、各走査ステップが、最も大きい脱励起波長を有する物質から開始される。この手順は、物質から発生する放出光を別の物質の影響を受けずに検出できるという利点を有する。つまり、別の物質の脱励起光による当該物質の励起は、その励起は放出光の検出よりも時間的に早期の時点で行われるために回避される。
【００１６】
好ましくは、第１のエネルギー状態は蛍光発生可能な状態である。蛍光は検出の観点から非常に扱い易く、試料の標識付けを行うのに多くの異なる物質を利用可能である。蛍光の量子収量は低いため、場合によっては次の物質へ移行する前に、複数の励起、脱励起及び／又は検出の各サイクルを実施する方が、つまり１つの物質について励起及び／又は（飽和）脱励起及び／又は放出光の検出の各ステップを数回実施する方が有利なこともある。
【００１７】
個々の物質の逐次像形成は、スポット、ライン、フレーム、さらにはスタックベース方式でも行なうことができる。例えば、スポットベース方式での像形成の場合には、走査動作が次のスポットで継続して行われる前に、試料中に存在する全ての物質がまず上記した方法で検査される。フレームベース方式での像形成の場合には、検査すべき試料領域がまず完全に走査され、第１の物質だけが上記した方法で検査される。検査すべき試料領域の次の完全走査で、別の物質だけが排他的に検査される等となる。
【００１８】
具体的な実施形態においては、試料から発生する放出光を検出するための検出装置が、波長依存要素を有する検出器を含む。波長依存要素は、例えばフィルタとして実施可能である。また検出装置は、複数の検出器を含むこともでき、特に有利な方式では、検出装置の１つまたはそれより多い検出器が各物質に対してそれぞれ配分可能である。
【００１９】
さらに有利な方式では、検出装置の複数の検出器が個々に及び／又はグループ単位で動作オフ可能である。これにより、１つの物質を別の物質の脱励起波長の光で励起することによって生じる当該物質の放出光が検出されるのを防止可能である。この動作オフは、脱励起波長による照射の持続に対し行うことができる。あるいはもしくは上記に加えて、阻止フィルタ及び／又はダイアフラムを上流側に配置して、検出を回避することもできる。
【００２０】
特に高い効率を得る観点から、１つの物質の脱励起状態を発生させるために照射される光が、別の物質の励起状態を発生させるため同時に用いられるようにすることもできる。脱励起状態を発生させるためには、１００ｐｓまたはそれより長い範囲のパルス幅を有する光を用いるのが好ましい。それによって、脱励起パルスのホトダメージポテンシャルは最小化される。
【００２１】
個々の物質の相互に対する影響を特に包括的に回避するため、各物質及び脱励起波長は、特に有利な方式において、各物質の脱励起波長が残りの物質の励起スペクトルのそれぞれ外側に位置するように選択可能である。
【００２２】
大きいフレキシビリティ及び良好なユーザ利便性を得るため、励起波長及び脱励起波長は各物質毎に自由に選択可能とすることもできる。これにより、各物質の励起及び誘導脱励起を最適化可能である。特に好ましい方式では、ユーザが励起波長及び脱励起波長を選択するのを可能とするソフトウェアインタフェースが利用可能とされる。例えば各波長が、ユーザによって自由に調整または入力可能である。あるいはもしくは上記に加えて、励起波長及び／又は脱励起波長をそこから選択できるテーブルをユーザに提供することもできる。
【００２３】
本発明の教示を有利に実施し改良する方法は各種存在する。その点を理解するためには、一方において請求の範囲第１及び１８にそれぞれ従属する各請求の範囲を、また他方において図面を参照した本発明の好ましい例示実施形態の以下の説明を参照のこと。図面を参照した本発明の好ましい例示実施形態の説明に関連して、本発明の教示の一般的に好ましい実施形態及び改良形態についても説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
概略的に示した各図面において：
【図１】図１は、個々の蛍光色素の励起スペクトル及び放出スペクトルのスペクトル分布を示す；
【図２】図２は、本発明による方法の第１の例示実施形態に基づいて用いられる２つの蛍光色素のスペクトルを示す；
【図３】図３は、本発明による方法の第２の例示実施形態に基づいて用いられる２つの蛍光色素のスペクトルを示す；
【図４】図４は、特に図２に示したスペクトル状況に関連して使用可能な、本発明による装置の例示実施形態を示す；
【図５】図５は、特に図３に示したスペクトル状況に関連して使用可能な、本発明による装置の別の例示実施形態を示す；及び
【図６】図６は、２つの蛍光色素について別々の励起及び別々の脱励起を用いた、本発明による装置の例示実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１は物質Ｓ１の励起スペクトル１と放出スペクトル２のスペクトル分布を示し、この場合の物質Ｓ１は具体的には蛍光色素である。図示したスペクトル分布を有する蛍光色素の使用は、周知の従来技術における１色ＳＴＥＤ顕微鏡検査において典型的なものである。ここで、検査すべき試料は励起波長３の短波長レーザパルスで照明され、このパルスはパルス状レーザダイオードから得られるのが好ましい。次いで、励起焦点の周辺における蛍光分子の脱励起が、脱励起波長４の長波長レーザパルスを注入することによって行われる。焦点周辺においてのみ蛍光分子の脱励起を達成するため、脱励起光ビームの波面を位置に依存した方法で変更する位相フィルタを、長波長レーザビームのビーム経路内に挿入することによって、脱励起点像関数が固有に形成される。蛍光分子が極めて小さい中心領域においてのみ励起状態に留まるように、蛍光分子の脱励起は飽和状態で行われる。最後に、残った励起状態の自然減衰から生じる放出光が、高い位置分解能で検出される。
【００２６】
図２は、本発明による方法の第１の例示実施形態に基づいて使用可能な２つの物質Ｓ１及びＳ２の各励起スペクトル１、１’及び各放出スペクトル２、２’を示す。図示した例示実施形態においては、異なる励起波長で励起されるが、同じ脱励起波長で誘導的に脱励起される２つの蛍光色素がそれぞれ物質Ｓ１、Ｓ２として使われている。
【００２７】
上記２つの蛍光色素を分離するために、それらの色素は順次励起される。つまり、例えば初めに、波長λ１のレーザパルスで一方の色素が励起され、波長λ３のレーザパルスでその色素が脱励起される。この手順が、その色素から充分な量の蛍光が収集されるまで、数回繰り返される。その後、もう一方の色素が波長λ２のレーザパルスで励起され、波長λ３のレーザパルスで脱励起される。この第２の手順も、充分な量の蛍光が収集されるまで、数回繰り返される。
【００２８】
あるいは、次のようなパルス順序を用いることもできる：すなわち、波長λ１のレーザパルス、波長λ３のレーザパルス、波長λ２のレーザパルス、波長λ３のレーザパルス…の順序である。このように選択されたパルス列は、それぞれのレーザ光源として、波長λ３のレーザ光源として波長λ１及び波長λ２のレーザ光源の２倍のパルス反復周波数を有するものを用いることができるため、特に好ましいことが実証されている。上記したパルス順序の混合方式も、使用可能である。
【００２９】
各種カラーチャネルの逐次像形成は、例えばスポット、ライン、フレーム、またはスタックベース方式などで達成可能である。各色素を分離するためには、パルス列を検出と同期化させ、第１手順の照射中に検出された光を１つの色素に割り当て、第２手順の照射中に検出された光を別の色素に割り当てできるようにするのが有利である。各レーザパルスも、同じく相互に同期化される。特に、１つの色素に属する励起及び脱励起両パルスが相互に同期化される。パルス間隔は一般に、第１手順と第２手順において異なる。２つの色素の放出スペクトルがスペクトル上で充分異なれば、波長感応素子（フィルタ）によって蛍光を分離することもできる。この場合には、例えばパルス順序として波長λ１、波長λ２、波長λ３などの使用も可能となる。波長λ３の脱励起パルスを発生させるのに使われるレーザ光源は、励起状態からの飽和脱励起を達成するために高いレーザ出力レベルを供給しなければならず、それに応じて相対的に高価となる。この点に関しても、両物質Ｓ１及びＳ２に対して共通の脱励起波長を用いるここで説明するケースは、１つの脱励起レーザが必要なだけなので特に好ましい。図４は、物理的な実施形態の観点から、ここで説明した状況に適合する走査顕微鏡の１つの可能な構成を示している。
【００３０】
図３に示した別の例示実施形態では、各ケースにおいて同じ波長λ４による励起を可能とするようにそれぞれの励起スペクトル１、１’が選択された蛍光色素が、物質Ｓ１，Ｓ２として使われる。逆に、異なる波長λ５及びλ６が誘導脱励起用に使われる。それら２つの色素の蛍光スペクトル２、２’が充分に異なれば、２つの色素の蛍光は波長感応素子（フィルタ）によって分離でき、２つの色素の各蛍光は１つの検出器を用いて記録可能である。
【００３１】
２つの色素の励起状態の寿命は一般に異なるため、励起パルスと第１脱励起パルスとの間及び励起パルスと第２脱励起パルスとの間で、異なるパルス間隔を選択するのが特に有利である。この場合、各パルスは時間的に相互に同期化される。特に、１つの色素に属する励起及び脱励起両パルスが相互に同期化される。さらに、パルス列を検出に対して同期化することもできる。この点は特に、２つの色素の蛍光スペクトル２、２’が相互にわずかにだけ異なる場合に有用である。選択されるパルス順序は、励起パルス（λ４）、第１脱励起パルス（λ５）、第２脱励起パルス（λ6）などの順序であるのが好ましい。この順序が、充分な量の蛍光が収集されるまで数回繰り返される。図５は、物理的な実施形態の観点から、ここで説明した状況に適合する走査顕微鏡の１つの可能な構成を示している。
【００３２】
図４は、(詳しくは図示してないが)２つの色素Ｓ１及びＳ２で標識付けされた試料１０を高分解能で光学走査するための、本発明による装置の例示実施形態を概略的に示す。走査顕微鏡として実施される図示の装置は、図２に示したようなスペクトル特性を有する色素の使用と適応している。この走査顕微鏡は、第１励起光束５１を放出するパルス状レーザ５３として実施される光源４９を含む。第１色素Ｓ１の励起用の波長λ１を有する励起光束５１はピンホール５５を通ってレンズ配列２０に入射し、レンズ配列２０によって平行にされる。その後励起光束５１はビーム分割器２６及び７３さらに主ビーム分割器５７に入射し、主ビーム分割器５７は励起光束５１を、ジンバル装着型の走査ミラー６１を含むビーム偏向装置５９に向かわせる。
【００３３】
走査顕微鏡は更に、第２色素Ｓ２の励起用の波長λ２を有する第２の励起光束２２を放出する第２光源２１を含む。第２光源２１は、同じくパルス状レーザ２３として実施される。励起用ピンホール２４を通過した後、第２の励起光束２２は光学系２５に入射し、光学系２５によって平行にされ、さらに光学要素２６によって第１の励起光束５１と組み合わされる。
【００３４】
最後に、走査顕微鏡はパルス状レーザ６５として実施される第３光源６３を含み、この第３光源６３に第１光源４９と第２光源２１が同期化される。第３光源６３は、以後誘導光束６７と称する光束１９を放出する。誘導光束６７は波長λ３の光を含み、この光によって両色素Ｓ１及びＳ２が誘導的に脱励起可能である。誘導光束６７は光学系５によって平行にされ、位相フィルタ６９に入射する。位相フィルタ６９から出射した誘導光束６７は二色ビーム分割器７３に入射する。位相フィルタ６９は光学系９によって、対物レンズの瞳に像形成される。二色ビーム分割器７３は、先に合流された２つの励起光束５１及び２２と誘導光束６７を、１つの共通のビーム経路に組み合わせる。誘導光束６７も主ビーム分割器５７によって、ビーム偏向装置５９に向かわされる。ビーム偏向装置５９は励起光束５１及び２２と誘導光束６７を一緒に、走査光学系７５、チューブ光学系７７、及び集束光学系７９つまり顕微鏡対物レンズ８１を介して送り、さらに試料１０上にまたはそれを通過するように導く。
【００３５】
励起光束５１と２２の焦点が試料１０を試料位置において光学的に励起する一方、誘導光束６７の焦点が励起された試料領域の外側域を誘導的に脱励起する。誘導光束６７の焦点は、上記の脱励起に適合するように、つまり内側中空の焦点として実施される。この変形例では、位相フィルタ６９が顕微鏡対物レンズ８１の焦点面と共役の関係にある面（フーリエ面）に配置される。
【００３６】
試料１０から発生した検出光８５は顕微鏡対物レンズ８１、チューブ光学系７７、及び走査光学系７５を通過してビーム偏向装置５９に至り、ビーム偏向装置５９から主ビーム分割器５７に向かって主ビーム分割器５７及びその下流側の検出用ピンホール８７を通過し、マルチバンド検出器９１として実施される検出装置８９に最終的に到達する。検出器９１は検出光８５の光出力に比例した電気信号を発生し、この電気信号がビーム偏向装置５９の位置信号と一緒に、像表示用の処理装置（図示せず）に送られる。
【００３７】
図５は、２つの色素Ｓ１及びＳ２用の本発明による走査顕微鏡の別の例示実施形態で、図３に示したような色素のスペクトル特性に適応した例示実施形態を示している。図５に示した走査顕微鏡は、図５に示した走査顕微鏡と極めて類似している。同等の構成要素は、同じ参照符号で示してある。図５に示した走査顕微鏡と異なり、ここに示す走査顕微鏡は、励起光束５１を発生する光源４９を１つだけ含む。励起光束５１は波長λ４を有する光を含み、この光が第１色素Ｓ１及び第２色素Ｓ２両方を励起する。
【００３８】
図４による走査顕微鏡と同じく、図５による走査顕微鏡も、パルス状レーザ６５として実施される光源６３を含み、この光源６３は第１光源４９と同期化される。第２光源６３は、以後誘導光束６７と称する光束１９を放出する。このケースにおいて、誘導光束６７は波長λ５の光を含み、この光によって第１色素Ｓ１が誘導的に脱励起される。誘導光束６７は光学系５によって平行にされ、位相フィルタ６９に入射する。
【００３９】
走査顕微鏡はさらに、パルス状レーザ３１として実施される第３光源３０を含み、この第３光源３０に前記光源４９が同期化される。第３光源３０は、以後誘導光束３２と称する光束３５を放出する。誘導光束３２は波長λ６の光を含み、この光によって第２色素Ｓ２が誘導的に脱励起される。誘導光束３２は光学系３３によって平行にされ、位相フィルタ３４に入射する。位相フィルタ６９及び３４から出射した誘導光束６７及び３２は、二色ビーム分割器７３及び３７によってそれぞれ偏向される。位相フィルタ６９及び３４はそれぞれ光学系９及び３６によって、対物レンズの瞳に像形成される。両光束は主ビーム分割器５７によって、ビーム偏向装置５９に向かわされる。ビーム偏向装置５９は励起光束５１と誘導光束６７及び３２を一緒に、走査光学系７５、チューブ光学系７７、及び集束光学系７９つまり顕微鏡対物レンズ８１を介して送り、さらに試料１０上にまたはそれを通過するように導く。
【００４０】
励起光束５１と誘導光束６７及び３２の焦点、並びに検出光８５の検出については、図４を参照した上述の説明がここにも同様に適用される。
【００４１】
光学要素２０，２５，５及び３３を軸方向に位置合わせすることにより、対物レンズ８１の軸上（縦）色収差が補償可能となり、励起及び脱励起の焦点を重ね合わせ可能である。
【００４２】
最後に、図６は、図４及び図５に示した走査顕微鏡の構成と極めて類似対応した構成を有する、本発明による走査顕微鏡の例示実施形態を示す。相違点は、２つの物質Ｓ１及びＳ２の励起用に２つの別々の光源４９及び２３が設けられ、また誘導脱励起用にも２つの別々の光源６３及び３０が設けられている点だけである。
【００４３】
反復を避けるため、装置の更なる好ましい実施形態については、本明細書の全般的な説明部分及び添付の請求の範囲の記載を参照のこと。
【００４４】
終わりに、上述した本発明による装置の例示実施形態は、請求の範囲に記載の教示を論じることだけを意図しており、その教示を例示実施形態に限定するものではないことに特に留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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