(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1に示したアミノ酸配列からなる抗真菌性タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の抗真菌性タンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含有する生物系であって、生物系が細菌、培養細胞及び植物からなる群から選択され、DNAが組換え異種DNAである前記生物系。
【請求項４】
請求項１に記載の抗真菌性タンパク質を発現する組換え異種DNAを含有する、真菌性病原体に対する改良された抵抗性を有する形質転換植物。
【請求項５】
真菌を請求項１に記載の抗真菌性タンパク質に曝露することを含む、真菌の攻撃方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗微生物性タンパク質、それらの製造および使用方法、ならびにそれらをコードするDNA配列に関するものである。特に本発明は、HeucheraまたはAesculusの種子から単離しうる抗微生物性タンパク質に関するものである。
これに関して抗微生物性タンパク質は、以下の活性のうち少なくとも１つを備えたタンパク質であると定義される：抗真菌（antifungal）活性（抗酵母活性を含む）、抗菌（antibacterial）活性。活性には、広範な拮抗作用、たとえば部分的阻害または死が含まれる。それらのタンパク質はオリゴマーであってもよく、または単一ペプチドサブユニットであってもよい。
Heuchera属はユキノシタ科（Saxifragaceae）植物の一部である。ユキノシタ科は主として多年生の草本および潅木を含む大きな広範な科であり、アカスグリ（currants）およびスグリ（gooseberries）ならびに多くの一般的な庭園の花がこれに含まれる。
Aesculus属はトチノキ科（Hippocastanaceae）植物の一部である。トチノキ科は２層を含む樹木の小さな科である。Aesculus属はその観賞用樹木、特にその褐色の種子が子供たちの好む“トチの実”であるセイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum）によって最も良く知られている。
植物は予想される侵入体と戦うために広範な一連の抗真菌性化合物を産生しており、ここ10年にわたって、抗真菌活性をもつタンパク質がこれらの防御の重要な部分を構成することが明らかになった。チオニン類、β−1,3−グルカナーゼ類、リボソーム不活性化タンパク質、ゼーマチン類、キチン結合性レクチン類、およびキチナーゼ類を含めた幾つかの群のこのようなタンパク質が記載されている。これらのタンパク質は生物制御物質として利用しうる可能性があるので、かなりの感心がもたれている。
国際特許出願番号PCT/GB92/01570号明細書（1993年３月18日に公開番号WO93/05153号として公開、その記載内容を参考として本明細書に引用する）には、抗真菌性タンパク質（AFP）および抗微生物性タンパク質（AMP）を含むタンパク質群が記載されている。この群には以下のタンパク質が含まれる：ダイコン（Raphanus sativus）から単離しうるRs−AFP1およびRs−AFP2（Terras  FRGら,1992,J  Biol  Chem,267:15301−13309）、ハクサイ（Brassica napus）から単離しうるBn−AFP1およびBn−AFP2、カブ（Brassica rapa）から単離しうるBr−AFP1およびBr−AFP2、Sinapsis albaから単離しうるSa−AFP1およびSa−AFP2、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から単離しうるAt−AFP1、Dahlia merckiiから単離しうるDm−AMP1およびDm−AMP2、Cnicus benedictusから単離しうるCb−AMP1およびCb−AMP2、Lathyrus ciceraから単離しうるLc−AFP、Clitoria ternateaから単離しうるCt−AMP1およびCt−AMP2。このタンパク質群を以下において“Rs−AFP−タイプタンパク質”とよぶ。これら、および他の、植物由来の抗微生物性タンパク質は、特に農業目的用の殺真菌薬または抗生物質として有用である。これらのタンパク質を植物もしくはその周囲に適用するか、または植物内において発現させることができる。
本発明者らは今回２種類の新規かつ有効な抗微生物性タンパク質を精製した。
本発明者らはHeuchera sanguineaの種々から新規な抗微生物性タンパク質を精製した。以下、これをHs−AFP1（Heuchera sanguinea−抗真菌性タンパク質１）とよぶ。Hs−AFP1は5kDaのポリペプチドであり；それらのポリペプチドは二量体として結合する場合がある。Hs−AFP1は広範な抗真菌活性を示す。
本発明者らは、セイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum）の種子から新規な抗微生物性タンパク質を精製した。以下、これをAh−AMP1（Aesculus hippocastanum−抗微生物性タンパク質１）とよぶ。Hs−AFP1と同様にAh−AMP1も5kDaのポリペプチドである。Ah−AMP1は広範な抗真菌活性を示す。
本発明によれば、配列番号:1もしくは配列番号:2に示すアミノ酸配列をもつ抗微生物性タンパク質、または配列番号:1もしくは配列番号:2に示すアミノ酸配列と実質的に相同（好ましくは少なくとも60％の配列同一性をもつ）であって、そのタンパク質が抗微生物活性をもつものが提供される。
本発明による抗微生物性タンパク質はHeucheraもしくはAesculusの種子から単離することができ、関連種もしくは非関連種両方の種子から単離することもでき、またはいずれか適切な方法で製造もしくは合成することができる。
本発明の抗微生物性タンパク質は植物材料から抽出および精製するか、その既知のアミノ酸配列から標準的なペプチド合成装置を用いる化学合成により製造するか、または適切な生物（たとえば微生物または植物）内で組換えDNAの発現により産生させることができる。本発明の抗微生物性タンパク質は殺真菌薬または抗生物質として有用であり、農業用または薬剤用として用いられる。
Hs−AFP1およびAh−AMP1のアミノ酸配列決定によれば、それらはRs−AFPタイプのタンパク質と相同である（国際特許出願公開WO93/05153号明細書）ことが示される。Hs−AFP1のアミノ酸配列を配列番号:1として示す;Ah−AMP1のアミノ酸配列を配列番号:2として示す。
図５はHs−AFP1（配列番号:1）およびAh−AMP1（配列番号:2）と、Rs−AFPタイプ抗真菌性／抗微生物性タンパク質であるRs−AFP1（配列番号:3）、Rs−AFP2（配列番号:4）、Dm−AMP1（配列番号:5）、Cb−AMP1（配列番号:6）、Ct−AMP1（配列番号:7）、Lc−AFP（配列番号:8）（国際特許出願公開WO93/05153号明細書に記載）との配列並列（alignment）を示す。Sorghumからのタンパク質Siα２（配列番号:9）およびTriticumからのg1−Ｐ（配列番号:10）、ならびにpSAS10（Vigna）（配列番号:11）、pI230（Pisum）（配列番号:12）およびp322（Solanum）（配列番号:13）の推定遺伝子産物の配列の一部をも示す（後に議論する）。点線は最適な並列を得るために配列に挿入された。
Rs−AFPタンパク質は共通の構造モチーフをもち、これがHs−AFP1およびAh−AMP1の配列中にも見られる。Hs−AFP1およびAh−AMP1とRs−AFP1タイプのタンパク質との配列並列により、それらが図５に示すコンセンサス−システイン−グリシン−モチーフを共有することが示される。図５から、保存されたシステインとグリシン間のアミノ酸残基の数は示した異なる配列および部分配列においてわずかに異なることが明らかである：最適並列を得るために配列に点線を導入した。Hs−AFP1の配列に対比して残基に番号を付けると、８個すべてのシステイン残基は残基番号６、17、23、27、39、48、50および54の保存位置をもち、位置番号15および37に２個の保存グリシンがある。さらに保存芳香族残基が位置13に、保存グルタミン酸残基が位置31にある。
Hs−AFP1配列はRs−AFP1と48％の配列同一性を示す。Ah−AMP1配列はRs−AFP1と54％の配列同一性を示す。Hs−AFP1はアミノ酸配列水準でAh−AMP1と52％の配列同一性を示す。Heucheraタンパク質（Hs−AFP1）、Aesculusタンパク質（Ah−AMP1）およびRs−AFP1タイプタンパク質間には類似性があるにもかかわらず、全体的なアミノ酸の含量および配列において相異がある。
Hs−AFP1の抗真菌活性は、特定の種の真菌菌糸を著しく分枝させる（高次分枝、hyper−branching）。この形態学的作用はRs−AFP1またはRs−AFP2により生じるものと類似する。タンパク質Ah−AMP1は真菌増殖を阻害するが、菌糸の高次分枝は生じない。この活性はタンパク質Dm−AMP1、Cb−AMP1、Ct−AMP1、およびLc−AFPの活性の方により類似する。
Hs−AFP1、Ah−AMP1およびRs−AFPタイプのタンパク質は、ChiangおよびHadwiger（1991,Mol  Plant  Microbe  Interact,4:324−331）が記載する、エンドウマメ（Pisum sativum−マメ科（Fabaceae）の一員）のFusarium誘導遺伝子pI39およびpI230の推定タンパク質産物と部分的に相同である。この相同性は、Ishibashiら（1990,Plant  Mol  Biol,15:59−64）が記載するササゲ（Vigna  unguiculata−他のマメ科）由来のpSAS10遺伝子の推定タンパク質産物とも共有される。これらのタンパク質はStiekemaら（1988,Plant  Mol  Biol,11:255−269）が記載するバレイショ（Solanum tuberosum−ナス科（Solanaceae）の一員）の遺伝子p322の推定タンパク質産物とも部分的に相同である。最近、アミノ末端アミノ酸配列がp322によりコードされる成熟タンパク質のものとほとんど同一であるタンパク質がバレイショ塊茎から精製され、抗微生物活性をもつことが示された（Morenoら,1994,Eur  Ｊ  Biochem,233:135−139）。cDNAが研究されたにすぎないので、遺伝子pI39、pI230、pSAS10またはp322によりコードされるタンパク質の生物学的特性については、全く知られていない。しかしpI39とpI230遺伝子は、病害その他のストレスによる植物への攻撃の後にスイッチがオンになる。pSAS10遺伝子は発芽に関与するタンパク質をコードすることが提唱されている。
Hs−AFP1、Ah−AMP1およびRs−AFPタイプのタンパク質配列はイネ科（Gramineae）の下記メンバーに見られる一群の小型のα−アミラーゼ阻害物質の配列とは、より低度の部分的相同性を示す：モロコシ（BlochおよびRichardson,1991,FEBS  Lett,279:101−104）、コムギ（Colittaら,1990,FEBS  Lett,270:191−194）、およびオオムギ（Mendezら,1990,Eur  Ｊ  Biochem,194:533−539）。モロコシ由来のSiα２およびコムギ由来のｇ−１−ピューロチオニン（ｇ−1P）を含めて、これらのタンパク質は昆虫α−アミラーゼを阻害することが知られており、また昆虫幼生に対しても有毒である可能性があるが、ただしこれは示されていない。これらのα−アミラーゼの阻害物質が抗真菌活性または他の抗微生物活性を示すか否かは知られていない：それらの生物学的活性については他のデータは報告されていない。
抗微生物性タンパク質またはその一部の一次構造を知ることにより、標準的なペプチド合成装置を用いてそれを化学合成により製造することが可能となる。これにより、その抗微生物性タンパク質をコードするDNA構築物を製造することも可能である。
本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質をコードするDNA配列を提供する。DNA配列はcDNA配列またはゲノム配列であってもよく、またcDNAクローン、ゲノムDNAクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて製造されたDNAに由来するものであってもよい。
DNA配列は既知のアミノ酸配列から推定することができ、そのタンパク質をコードするDNAは標準的な核酸合成装置を用いて製造することができる。あるいはDNA配列は植物由来のDNAライブラリーから単離することができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブを既知のアミノ酸配列から誘導し、そのタンパク質の一部または全部をコードするcDNAクローンにつきcDNAライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。これらの同じオリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAクローンを用いて、ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングによって実際の抗微生物性タンパク質遺伝子（単数または複数）を単離することができる。それらのゲノムクローンは、植物ゲノムにおいて作動する調節配列を含みうる。たとえば抗微生物性（その他の）タンパク質の発現を駆動するために用いうるプロモーター配列を単離することも可能である。これらのプロモーターは環境条件（たとえば真菌性病原体の存在）に対して特に応答性であり、任意の標的遺伝子の発現を駆動するために使用しうる。
抗微生物性タンパク質をコードするcDNA配列を適切な調節配列（プロモーター、ターミネーターなど）と組み合わせて、DNA構築物またはベクター中へ取り込ませることができる。DNAを構成性または誘導性のプロモーター（たとえば環境条件、病原体の存在、化学物質の存在により刺激される）の制御下に置くことができる。このようなDNA構築物を、コードされたタンパク質またはそのタンパク質の活性部分の発現を可能にする生物系内へクローン化または形質転換することができる。適切な生物系には微生物（たとえば細菌、たとえば大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、および内部寄生性生物（endophytes）、たとえばクラビバクター・キシリ亜種サイノドンチス（Clavibacter xyli  subsp.cynodontis）（Cxc）；酵母；ウイルス；バクテリオファージ；など）、培養細胞（たとえば昆虫細胞、哺乳動物細胞）、ならびに植物が含まれる。場合によっては、発現したタンパク質を使用するために、次いで抽出し、単離することができる。
本発明による抗微生物性タンパク質（たとえばHs−AFP1またはAh−AMP1）は殺真菌薬または抗生物質として有用である。本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質に暴露することにより真菌または細菌を攻撃する方法を提供する。
薬剤としての用途に関しては、本発明の抗微生物性タンパク質を哺乳動物感染症の治療のための（たとえばカンジダ（Candida）などの酵母を攻撃するための）殺真菌薬または抗菌薬として使用しうる。
本発明による抗微生物性タンパク質は、防腐薬として（たとえば食品添加物として）も使用しうる。
農業用としては、本発明の抗微生物性タンパク質を、植物生育中の作物の病害抵抗性もしくは病害耐性を改良するために、または収穫後の作物の保護のために使用しうる。タンパク質に暴露された病原体は阻害される。本発明の抗微生物性タンパク質は植物において既に確立している病原体を根絶することができ、または将来の病原体の攻撃から植物を保護することができる。タンパク質の根絶作用は特に有利である。
抗微生物性タンパク質への植物病原体の暴露は、以下のような種々の方法で行うことができる：例えば、
（ａ）単離されたタンパク質を含む組成物を標準的な農業手法（たとえば噴霧）により植物の部分または周囲の土壌に付与することができる；タンパク質は植物組織から抽出したり、または化学的に合成したり、またはそのタンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物から抽出することができる；
（ｂ）抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物を含む組成物を植物に、または植物が生育している土壌に付与することができる；
（ｃ）抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内部寄生性生物を植物組織に導入することができる（たとえば種子処理法により）；
［内部寄生性生物とは、植物宿主との非病原性内部共生関係に入ることができる微生物であると定義される。内部寄生性生物による増強された植物保護の方法はクロップ・ジェネティックス・インターナショナル・コーポレーションにより一連の特許出願明細書に記載されている（たとえば国際特許出願公開WO90/13224号、欧州特許公告EP−125468−B1号、国際特許出願公開WO91/10363号、国際特許出願公開WO87/03303号）。農業用化学物質を産生するように内部寄生性生物を遺伝的に修飾することができる。国際特許出願公開WO94/16076号明細書（ゼネカ・リミテッド）には、植物由来の抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内部寄生性生物の使用が記載されている。］
（ｄ）抗微生物性タンパク質をコードするDNAを植物ゲノムに導入し、これにより植物体内でそのタンパク質を発現させることができる（DNAはcDNA、ゲノムDNA、または標準的な核酸合成装置により製造されたDNAのいずれであってもよい）。
植物細胞を既知の種々の方法（アグロバクテリウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルガンなど）に従って組換えDNA構築体により形質転換することができる。次いで適切な場合、形質転換細胞を新たな核物質がゲノム内へ安定に取り込まれた全植物体に再生することができる。形質転換した単子葉植物および双子葉植物の両方をこの方法で得ることができるが、通常は後者の方が再生しやすい。これらの一次形質転換体の子孫のうちあるものは抗微生物性タンパク質（単数または複数）をコードする組換えDNAを受け継ぐであろう。
本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質を発現する組換えDNAを含む、真菌性または細菌性病原体に対する改良された抵抗性を有する植物を提供する。それらの植物を標準的な植物育種交配における親として用いて、改良された真菌または細菌抵抗性を備えた雑種または系統を開発することができる。
組換えDNAは、植物またはその祖先に形質転換により導入された異種DNAである。組換えDNAは病原体攻撃部位（たとえば葉）へ付与するために発現される抗微生物性タンパク質をコードする。このDNAは抗微生物性タンパク質の活性サブユニットをコードするものであってもよい。
病原体は植物上、植物内またはその付近で増殖しているいかなる真菌または細菌であってもよい。これに関して改良された抵抗性は、野生型植物と比較して真菌性または細菌性病原体に対して増強された耐性であると定義される。抵抗性は、病原体の作用に対する耐性のわずかな増大（この場合は病原体が部分的に阻害される）から、植物が病原体の存在により影響されないほどの全体的な抵抗性（この場合は病原体は著しく阻害されるか、または死滅する）にまで及ぶものであってもよい。特定の病原体に対する抵抗性またはより広域スペクトルの病原体に対する抵抗性双方の水準の増大が抵抗性改良を構成しうる。改良された抵抗性を示すトランスジェニック植物（またはそれに由来する植物）は、植物形質転換法またはその後の交配により選択される。
抗微生物性タンパク質がトランスジェニック植物またはその子孫において発現すると、真菌または細菌は植物に病原体が攻撃した部位においてそのタンパク質に暴露される。特に、適宜な遺伝子調節配列の採用により、タンパク質をインビボで、最も効果的な時点および部位において産生させることができる。たとえばタンパク質を、それが普通は多量に発現されない植物部分であるが、病害抵抗性が重要である部位（たとえば葉）内で産生させることができる。
形成しうる遺伝的に修飾された植物の例には、栽培作物、穀物、果実および野菜、たとえばカノラ（canola）、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、バレイショ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギが含まれる。
例示にすぎないが、本発明を以下に図面を参照して説明する：
図１は、Hs−AFP1の精製に関するカチオン交換クロマトグラムおよびそれに付随する真菌増殖阻害のグラフを示す；
図２は、精製Hs−AFP1の逆相クロマトグラムを示す；
図３は、Ah−AMP1の精製に関するカチオン交換クロマトグラムおよびそれに付随する真菌増殖阻害のグラフを示す；
図４は、精製Ah−AMP1の逆相クロマトグラムを示す；
図５は、Hs−AFP1、Ah−AMP1その他のタンパク質のアミノ酸配列並列を示す；
また配列表を参照する：
配列番号:1はHs−AFP1のアミノ酸配列である；
配列番号:2はAh−AMP1のアミノ酸配列である；
配列番号:3はRs−AFP1のアミノ酸配列である；
配列番号:4はRs−AFP2のアミノ酸配列である；
配列番号:5はDm−AMP1のアミノ酸配列である；
配列番号:6はCb−AMP1のアミノ酸配列である；
配列番号:7はCt−AMP1のアミノ酸配列である；
配列番号:8はLc−AFPのアミノ酸配列である；
配列番号:9はSiα２のアミノ酸配列の一部である；
配列番号:10はg1−Ｐのアミノ酸配列の一部である；
配列番号:11はpSAS10遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である；
配列番号:12はpI230遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である；
配列番号:13はp322遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である。
実施例１
抗真菌活性および抗菌活性のアッセイ
抗真菌活性は、先に記載された顕微分光測光法により測定された（Broekaert,1990,FEMS  Microbiol  Lett,69:55−60）。通常通り、20μｌの（フィルター滅菌した）被験溶液、および80μｌの真菌胞子の半濃度バレイショ−デキストロースブロス（1/2  PDB）中の懸濁液（２×104胞子/ml）を用いて試験を実施した。合成増殖培地（SMF）は以下のものからなっていた:K2HPO4（2.5mM）、MgSO4（50μＭ）、CaCl2（50μＭ）、FeSO4（５μＭ）、CoCl2（0.1μＭ）、CuSO4（0.1μＭ）、Na2MoO4（２μＭ）、H3BO3（0.5μＭ）、KI（0.1μＭ）、ZnSO4（0.5μＭ）、MnSO4（0.1μＭ）、グルコース（10g/l）、アスパラギン（1g/l）、メチオニン（20mg/l）、ミオイノシトール（2mg/l）、ビオチン（0.2mg/l）、チアミン−HCl（1mg/l）、およびピリドキシン−HCl（0.2mg/l）。対照ミクロ培養物は20μｌの無菌蒸留水および80μｌの真菌胞子懸濁液を含有していた。
別途指示しない限り被験生物はフザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）（株IMI  180420）であり、インキュベーションを25℃で48時間行った。増殖阻止率％は、595nmにおける対照ミクロ培養物の補正済み吸収値に対する、対照ミクロ培養物の補正済み吸収値マイナス被験ミクロ培養物の補正済み吸収値の比の、100倍として定義される。補正済み吸収値は、48時間後に測定した595nmにおける培養物の吸収値マイナス30分後に測定した595nmにおける吸収値である。
抗微生物活性は以下の記載に従って顕微分光測光法により測定された。軟栄養アガロース（トリプトン,10g/l;シープラーク（Seaplaque）アガロース（FMC）,5g/l）に接種することにより細菌懸濁液を調製した。アリコート（80μｌ）の細菌懸濁液（105コロニー形成単位/ml）を平底96ウェルミクロプレート中でフィルター滅菌試料（20μｌ）に添加した。595nmにおける培養物の吸収値を、ミクロプレート読み取り装置により、28℃で30分および24時間のインキュベーション後に測定した。抗真菌活性アッセイにつき先に記載したものに従って増殖阻止率を計算した。
実施例２
Heuchera sanguinea種子
からの抗真菌性タンパク質の精製
20gのＨ sanguinea種子（Okkerse,ベルギー、Mechelenから入手）をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を４℃で２時間、10mMのNaH2PO4,15mMのNa2HPO4,100mMのKCl,2mMのEDTA,2mMのチオ尿素および1mMのPMSFを含有する氷冷した抽出用緩衝液100mlで抽出した。ホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（7,000×ｇで30分）により清澄化した。分画分子量2,000Daのベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ）を用いて、上清を蒸留水に対して十分に透析した。透析後に溶液を10倍濃度の緩衝液の添加により50mM（NH4）Ac（pH9）に調整し、次いで50mMのNH4Ac（pH9）で平衡化したＱ−セファロース・ファスト・フロー（Ｑ−Sepharose  Fast  Flow）（スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア）カラム（12×5cm）に導通した。カラムを通過したタンパク質画分を凍結乾燥し、最後に50mlの20mMのNH4Ac（酢酸アンモニウム）pH6、に再溶解した。
この画分を、予め20mMのNH4Ac緩衝液で平衡化したＳ−セファロース高性能（ファルマシア）カラム（10×1.6cm）に付与した。カラムを1ml/分で120mlの20から500mMのNH4Ac（pH6）直線濃度勾配により溶離した。溶出液を280nmにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視し（結果を図１の下側パネルに示す）、7.5mlの画分で採取した。
画分を凍結乾燥し、蒸留水に再溶解した。これらの画分のうち５μｌを、実施例１に記載した顕微分光測光−抗真菌活性アッセイ法によって、1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した合成増殖培地を用いて試験した（結果を図１の上側パネルにヒストグラムとして示す）。すべての抗真菌活性が、約300mMのNH4Acで溶離した主ピーク（図１に矢印で示す）に含まれていた。
最高の抗真菌活性を示す画分をさらに逆相クロマトグラフィーにより精製した。この画分を、0.1％TFAを含有する10％アセトニトリルで平衡化したPep−Ｓ（多孔質シリカC2/C18、ファルマシア）カラム（25×0.93cm）に装填した。カラムを4ml/分で200mlの10％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）から95％アセトニトリル/0.1％TFAまでの直線濃度勾配により溶離した。溶出液を280nmにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視した。2ml画分の溶出液を採取し、真空乾燥し、最後に0.5mlの蒸留水に溶解し、そのうち10μｌを、実施例１に記載した1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した合成増殖培地を用いる顕微分光測光−抗真菌活性アッセイに使用した。
図２は、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した活性画分の逆相クロマトグラムを示す。下側パネルは溶出液を280nmにおける吸収の測定によりタンパク質につき監視したものを示す。上側パネルは顕微分光測光アッセイにより試験した抗真菌活性を示す。このクロマトグラムは３ピークを示し、それらのうち25％アセトニトリルで溶出する第１のものがすべての抗真菌活性を含む。このピーク（図２に矢印で指示する）から単離した活性因子をHs−AFP1（Heuchera sanguinea−抗真菌性タンパク質１）とよぶ。
実施例３
Aesculus hippocastanum種子
からの抗真菌性タンパク質の精製
セイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum）の種子をセイヨウトチノキの樹木から採取した。種子の皮をむき、皮をむいた種子100gを凍結乾燥した。凍結乾燥した種子をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を氷冷した抽出用緩衝液（実施例１参照）100mlで抽出した。ホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（7,000×ｇで30分）により清澄化した。ベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、上清を蒸留水に対して十分に透析した。透析後に溶液を10倍濃度の緩衝液の添加により50mMのNH4Ac（pH9）に調整し、50mMのNH4Ac（pH9）で平衡化したＱ−セファロース・ファスト・フロー（スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア）カラム（12×5cm）に導通した。カラムを通過したタンパク質画分を凍結乾燥し、最後に50mlの20mMのNH4Ac（pH6）に再溶解した。この画分を、50mMのNH4Ac、pH6.0、で平衡化したＳ−セファロース高性能（ファルマシア）カラム（10×1.6cm）に付与した。カラムを1ml/分で20から500mMのNH4Ac、pH6、直線濃度勾配により210分間にわたって溶離した。溶出液を280nmにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視し（結果を図３の下側パネルに示す）、7.5mlの画分で採取した。それぞれの画分からの試料を凍結乾燥し、7.5mlの蒸留水に再溶解した。これらの画分のうち５μｌを、顕微分光測光−抗真菌活性アッセイ法により、1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した合成増殖培地を用いて試験した（結果を図３の上側パネルに示す）。クロマトグラフィーにより、抗真菌活性は約300mMのNH4Acで溶離した主ピーク（図３に矢印で示す）と共に溶出した。最高の抗真菌活性を示す画分をさらに逆相クロマトグラフィーにより精製した。この画分を、0.1％TFA（トリフルオロ酢酸）で平衡化したPEP−Ｓ（多孔質シリカC2/C18、ファルマシア）カラム（25×0.4cm）に装填した。カラムを1ml/分で0.1％TFAから50％アセトニトリル/0.1％TFAまでの直線濃度勾配により50分間にわたって展開した。溶出液を280nmにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視した（結果を図４の下側パネルに示す）。1ml画分を採取し、真空乾燥し、0.5mlの蒸留水に溶解した。それぞれの画分からの５μｌを抗真菌活性につきアッセイした（結果を図４の上側パネルに示す）。この物質は25％アセトニトリルで溶出する単一の活性ピークを与えた。これは精製タンパク質Ah−AMP1（Aesculus hippocastanum−抗真菌性タンパク質１）を表す。
実施例４
精製した真菌性タンパク質
Hs−AFP1およびAh−AMP1の分子構造
精製した抗真菌性タンパク質の分子構造をさらにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分析した。SDS−PAGEは市販のプレキャストゲル（ファルマシアからのファストゲル・ハイデンシティー（PhastGel  High  Density））上でファストシステム（PhastSystem）（ファルマシア）電気泳動装置を用いて実施された。試料緩衝液は200mMのトリス−HCl（pH8.3）、１％（w/v）のSDS、1mMのEDTA、0.005％のブロモフェノールブルー、および別途指示しない限り１％（w/v）のジチオエリトリトール（DTE）を含有していた。200ngのタンパク質をゲル上で分離した。以下の大きさのミオグロビンフラグメントを分子量マーカーとして用いた（ファルマシア）:17kDa、14.5kDa、8kDa、6kDa、および2.5kDa。12.5％グルタルアルデヒド中での電気泳動後にタンパク質を固定し、銀染色した:HeukeshovenおよびDernick（1985,Electrophoresis,6,103−112）に従う。
システイン残基をDTEで還元したのち、Hs−AFP1は見掛け分子質量約5kDaの単一バンドを示す。非還元Hs−AFP1は約10kDaの単一バンドとして泳動する。これらの結果は、天然Hs−AFP1がオリゴマータンパク質である可能性があり、5kDaのポリペプチドの二量体からなる可能性が極めて高いことを示す。オリゴマー構造はジスルフィド結合によって安定化されると思われる。
実施例５
抗真菌性および抗菌性効力
精製タンパク質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法により、種々の植物病原体につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収穫、ならびに菌糸フラグメントの調製は先の記載に従って行われた（Broekaertら,1990,FEMS  Microbiol  Lett,69:55−60）。抗真菌性タンパク質の系列希釈液を、増殖培地SMF−（実施例１の合成増殖培地）、培地SM＋（1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した培地SMF−）、増殖培地1/2  PDB−（実施例１に記載した半濃度バレイショ−デキストロースブロス）、または増殖培地1/2  PDB＋（1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した培地1/2  PDB−）を用いて真菌に適用した。増殖阻止率％を顕微分光測光法により測定した。48時間のインキュベーション後に50％の増殖阻止を得るために必要な濃度（IC50値）を用量応答曲線から計算した。
Hs−AFP1およびAh−AMP1に関する結果を表１に示す。用いた略号は以下のとおりである:IC50＝実施例１の記載に従って測定した、50％の増殖阻止を得るために必要な濃度;ND＝測定しなかった;Sp＝胞子;PrSp＝培地中で予め24時間発芽させた胞子;MF＝タンパク質の添加前に培地中で48時間プレインキュベートした菌糸フラグメント;BHR＝広い宿主範囲;SF＝腐生真菌;SMF−＝実施例１に記載した合成増殖培地;SMF＋＝1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した培地SMF−;1/2  PDB−＝実施例１に記載した半濃度バレイショ−デキストロースブロス;1/2  PDB＋＝1mMのCaCl2および50mMのKClを補充した培地1/2  PDB−。
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表１の結果は、Ah−AMP1およびHs−AFP1タンパク質が保有する広範な抗真菌活性を表す。表１の結果は、Hs−AFP1とAh−AMP1が若干異なる活性スペクトルをもつことも示す。たとえばAh−AMP1は1/2  PDB＋中でレプトスペリア・マキュランス（Leptospaeria maculans）に対して活性が高いが、Hs−AFP1はそうでなく、一方Hs−AFP1は1/2  PDB＋中でフザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）に対して活性が高いが、Ah−AMP1はそうでない。したがってこれら２タンパク質は互いに補足するために組み合わせ抗微生物薬として使用することができ、これによってより広範な病害をより効果的に撲滅することができる。
培地SMF＋および1/2  PDB＋（植物組織中における生理学的条件のイオン濃度を反映するために塩類添加物を含有する）においては、両タンパク質の活性とも培地SMF−および1/2  PDB−におけるそれらの活性と比較して低下する。塩類依存性の活性の低下は、明らかに被験生物により左右される。たとえばAh−AMP1に関して、培地SMF＋に対比した培地SMF−における活性低下はアルテルナリア・ブラシカ（Alternaria brassicae）については２倍、グレオスポリウム・ムザラム（Gloeosporium musarum）については10倍以上である。
Hs−AFP1およびAh−AMP1は両方とも、菌糸の長さの低下により示されるように真菌の増殖過程を阻害する。Hs−AFP1はフザリウム・カルモラムの菌糸の高次分枝をも生じる。同様な作用がダイコン（Raphanus sativus）種子由来の抗真菌性タンパク質Rs−AFP1およびRs−AFP2によっても生じる（Terras  FRGら,1992,J  Biol  Chem,267:15301−15309）。Ah−AMP1はフザリウム・カルモラムの菌糸の高次分枝を生じない；それの菌糸成長阻害様式は、それぞれDahlia、Cnicus、ClitoreaおよびLathyrus由来の抗真菌性タンパク質Dm−AMP1、Cb−AMP1、Ct−AMP1、およびLc−AFPのものに極めて類似する（国際特許出願公開WO93/05153号明細書）。
Ah−AMP1およびHs−AFP1の抗菌活性を、４種類のグラム陽性細菌（枯草菌（Bacillus subtilis）JHCC  553331;マイクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）ATCC  93411;黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ATCC  25923;大便連鎖球菌（Streptococcus feacolis）ATCC  29212）、および２種類のグラム陰性細菌（大腸菌HB101および尋常変形菌（Proteus vulgaris）JHCC  558711）につき測定した。Hs−AFP1はこれらの被験細菌の増殖を200μg/mlの割合で阻害しなかったが、Ah−AMP1は枯草菌の増殖を100μg/mlで阻害した。
実施例８
α−アミラーゼの阻害
ゴキブリ（Blatta orientalis成体の切断した腸から、20mMトリス/HCl、pH7.5、10mM  CaCl2中でホモジナイズし、細胞屑を遠心分離により除去することによって、粗製α−アミラーゼ抽出物を調製した。ヒトおよびブタのα−アミラーゼはシグマから購入された。コムギ由来のタイプ１−α−アミラーゼ阻害物質（シグマから購入）を陽性対照として用いた。アミラーゼ抽出物をペプチドと共に30℃で20分間インキュベートしたのち、デンプンを添加し、酵素活性をBernfeld法（1955,Methods  Enzymol,ColwickおよびKaplan編,vol  1:149−158）により検出した。
Hs−AFP1およびAh−AMP1のα−アミラーゼ阻害活性を、これら３種類の供給源から得たα−アミラーゼにつき、昆虫の腸α−アミラーゼを阻害することが以前に報告されたモロコシ（Sorgum bicolor）相同体SIα３（BlochおよびRichardson,1991,FEBS  Lett,279:101−104）のものと比較した。SIα３は昆虫の腸およびヒトの唾液由来の酵素の活性を５μg/ml程度の低い割合で70％以上阻害した。コムギ由来のタイプ１−α−アミラーゼ阻害物質の市販製品10U/mlを用いて、匹敵する阻害が得られた。SIα３は、BlochおよびRichardson（1991）が先に報告したようにブタ膵臓由来の酵素に対しては本質的に不活性であった。
これに対し、前記３種類の酵素に関して試験したHs−AFP1またはAh−AMP1については、200μg/mlという高い割合で含有された場合ですら、α−アミラーゼ活性阻害は観察されなかった。
実施例７
Hs−AFP1およびAh−AMP1のアミノ酸配列決定
抗真菌性タンパク質のシステイン残基をFullmer法（1984,Anal  Biochem,142,336−341）でＳ−ピリジルエチル化することにより修飾した。試薬をPep−Ｓ（多孔質シリカC2/C18、ファルマシア）カラム（25×0.4cm）上でのHPLCにより除去した。カラムを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）から0.1％TFAを含有するアセトニトリルまでの直線濃度勾配で溶離することにより、Ｓ−ピリジルエチル化タンパク質が回収された。得られたタンパク質画分を、120Aアナライザー（アプライド・バイオシステムズ）によるフェニルチオヒダントインアミノ酸のオンライン検出を用いて、477Aプロテイン・シーケンス（477A  Protein  Sequence）（アプライド・バイオシステムズ）によりアミノ酸配列分析した。
Hs−AFP1およびAh−AMP1のアミノ酸配列をＮ−末端自動エドマン分解により決定した。Hs−AFP1に関する完全アミノ酸配列を配列番号:1として、Ah−AMP1に関する完全アミノ酸配列を配列番号:2として提示する。
Hs−AFP1は長さ54のアミノ酸であり、Ah−AMP1は長さ50のアミノ酸である。両タンパク質とも８個のシステインを含有し、塩基性アミノ酸残基が比較的豊富である。
Hs−AFP1は位置41にチロシン残基、位置43にフェニルアラニン残基、および位置44にプロリン残基を含む。Rs−AFP1とRs−AFP2の対応する位置に同一アミノ酸が見られる（Ｙが位置38、Ｆが位置40、Ｐが位置41に）が、Ah−AMP1および他のRs−AFPタイプタンパク質においては非相同アミノ酸残基で置換されている。コムギ種子由来の関連タンパク質の三次元折りたたみの研究（Bruixら,1993,Biochemistry,32:715−724）は、これらの保存アミノ酸が２つの逆平行β−シートを連結するタンパク質ループ上に位置することを示した。このループは真菌菌糸上の推定受容体との相互作用に関与する活性部位の一部である可能性がある。
Rs−AFP1、Rs−AFP2およびHs−AFP1がすべて真菌の高次分枝を生じるのに対し、Ah−AMP1、Dm−AMP1、Dm−AMP2、Cb−AMP1、およびCb−AMP2は生じないことは注目すべきである。これは各群のタンパク質が真菌内の異なる標的と、または同一標的と異なる様式で相互作用する可能性があることを示す。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:54アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Hs−AFP1
配列：
0003631492.tif 000005
配列番号:2
配列の長さ:50アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Ah−AMP1
配列：
0003631492.tif 000006
配列番号:3
配列の長さ:51アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Rs−AFP1
配列：
0003631492.tif 000007
配列番号:4
配列の長さ:51アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Rs−AFP2
配列：
0003631492.tif 000008
配列番号:5
配列の長さ:50アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Dm−AMP1
配列：
0003631492.tif 000009
配列番号:6
配列の長さ:50アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Cb−AMP1
配列：
0003631492.tif 000010
配列番号:7
配列の長さ:49アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Cb−AMP1
配列：
0003631492.tif 000011
配列番号:8
配列の長さ:47アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Lc−AFP
配列：
0003631492.tif 000012
配列番号:9
配列の長さ:47アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:pSAS10
配列：
0003631492.tif 000013
配列番号:10
配列の長さ:45アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:pI230
配列：
0003631492.tif 000014
配列番号:11
配列の長さ:48アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:Sia3
配列：
0003631492.tif 000015
配列番号:12
配列の長さ:47アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:y1P
配列：
0003631492.tif 000016
配列番号:13
配列の長さ:47アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名:p322
配列：
0003631492.tif 000017
【図１】
0003631492.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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