(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基板上に対極並びに参照電極とともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挾み込んで対向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能とすることを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法。
【請求項２】
超常磁性ビーズの径は、２０μｍ以下であることを特徴とする請求項１の微量タンパク質の高感度分析方法。
【請求項３】
一対の櫛型電極における互いに挾み込んだ歯の対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴とする請求項１または２の微量タンパク質の高感度分析方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかの方法であって、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量することを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、微量タンパク質の高感度分析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、分析時間を短縮し、分析感度を著しく高めることができ、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能とする、新しい酵素標識免疫分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、肝臓ガン、大腸ガン、前立腺ガン等の診断においては腫瘍マーカーと呼ばれる各々のガンに特有なタンパク質の血中濃度の変化を観察することが行われている。また、感染症の場合にも、各々の抗体タンパク質が体液中に増えることから、このようなタンパク質の濃度変化が診断において有用な情報として取扱われている。
【０００３】
たとえば、このように有益な生体情報を与えるタンパク質の分析については、従来より、微量のタンパク質の定量分析法として、酵素標識免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）が知られている。この方法では、分析の対象としてのタンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識として結合し、抗原タンパク質の濃度に対応して濃度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原としてのタンパク質の濃度を求めている。
【０００４】
また、従来より、タンパク質の定量分析方法としては、前記の酵素標識免疫分析法以外にも各種のものが知られているが、生体情報を与えるタンパク質は、通常、その濃度がｐｇ／ｍＬオーダーからμｇ／ｍＬ程度までと低濃度であることから、どうしてもその分析には複雑で面倒な操作や、大型の装置と、長時間が必要とされる場合が多い。
【０００５】
実際、たとえば、現状での臨床検査による腫瘍マーカーの速度測定は、デスクトップ装置での長時間にわたる測定が必要とされている。このため、酵素標識免疫分析法をはじめとする従来の方法によっては、腫瘍マーカーや前記の感染症についてのタンパク質測定の場合だけでなく、今後その臨床的ニーズがさらに高まることが予想される、心筋梗塞や脳卒中での血液凝固に関連するタンパク質の分析の場合のように、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での小型装置による、簡便で高感度、かつ、迅速な分析測定が必要とされる状況には対応することが困難であった。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点を解消し、分析時間を短縮し、分析感度を高めることができ、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析をも可能とする、改善された新しい微量タンパク質の高感度分析方法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基板上に対極並びに参照電極とともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挾み込んで対向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能とすることを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第２には、超常磁性ビーズの径は、２０μｍ以下であることを特徴とする上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供し、第３には、一対の櫛型電極における互いに挾み込んだ歯の対向間隔は、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズの径と同等もしくはそれ以下であることを特徴とする上記の微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【０００９】
さらに具体的にも、この出願の発明は、第４には、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微量タンパク質を１０秒以内の応答速度で定量することを特徴とする微量タンパク質の高感度分析方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１１】
この出願の発明の方法では、前記のとおりの酵素標識免疫分析法が前提とされている。すなわち、従来と同様に、分析対象タンパク質を抗原とする抗体に酵素を標識として結合しておき、抗原濃度に対応して温度変化する標識酵素によって基質の化学反応を促進し、生成物の生成速度あるいは生成量を測定することによって抗原濃度を求めることになる。このような方法として、たとえばサンドイッチ法が周知である。
【００１２】
そしてこのような抗原−抗体の酵素標識免疫反応について、この出願の発明では、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズが用いられる。
【００１３】
酵素標識免疫分析法では免疫抗体を固体表面に固定したり、抗原−抗体反応を進行させるのに一晩程度インキュベーションすることが多いが、このインキュベーションを短縮する方法として超常磁性微粒子を内部に含む有機ポリマー球形粒子コロイドを用いる方法が知られている。このような方法のための粒子コロイドが市販されていることから、この出願の発明においては、このものを、前記の酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズとして使用することができる。ここで「超常磁性」とは磁場が印加された場合のみに磁性を有することとして定義される。
【００１４】
一方、微小の櫛型電極は、微量の生成物を分析電気化学の手法で高感度に測定する方法に有効であることが知られているものであるが、この出願の発明のように、免疫反応による分析に利用することはこれまでほとんど考えられていない。分析のためのこの微小櫛型電極は、その構造として、二個の櫛型電極が互いに歯を挟み込んでμｍオーダーの狭い対向間隔で配列され、二個がそれぞれ独立した電位を与え得る作用電極として機能する構造を持つことを特徴としている。このような構造は、石英等の適宜な基板上に、対極(counter electrode, CE)並びに参照電極(reference electrode, RE)とともに、半導体や電子デバイスにおける微細加工技術によって形成可能とされる。
【００１５】
この出願の発明においては、抗原タンパク質と抗体との免疫反応にともなう標識酵素と基質との反応により発生する対向する微小電極間の電位差から、タンパク質の濃度を電流値として検出する。
【００１６】
この発明の櫛型電極には、前記のとおりの抗原としてのタンパク質を付着させた超常磁性ビーズ（微粒子の集合としてのコロイド）を接触させればよい。
【００１７】
櫛型電極との関係で、磁性ビーズ、つまり超常磁性ビーズを用いることを特徴とするこの出願の発明方法についてさらに説明すると、磁石により磁場を働かせて超常磁性ビーズを電極に引き寄せることによって、超常磁性ビーズ表面に固定化された酵素（標識として免疫抗体に結合させてある酵素）が生成する反応物が迅速かつ高濃度で電極に到達する。
【００１８】
この場合、基質と超常磁性ビーズ、反応性生物を含む溶液が基板表面を覆い、櫛形電極の上部は、雲のように超常磁性ビーズコロイドにより覆われる。たとえば、後述の実施例では、基板の下に小さな永久磁石（２〜４ｍｍφ×１０ｍｍ長さ、表面磁束密度３５００ガウス程度）を置いて超常磁性ビーズコロイドを電極に引き寄せている。
【００１９】
この発明の超常磁性ビーズは、抗体を固定化したり、抗体に抗原を結合させる度に洗浄する。普通のビーズの場合、ビーズは、洗浄液と溶液の全体に広がってしまい希釈状態になるが、超常磁性ビーズの場合は洗浄・攪拌したあと、ビーズを磁石で引き寄せることができる。ビーズを含まない部分の液は不要であるから廃棄して、超常磁性ビーズが濃縮されたコロイドを使うことができる。重力による自然沈下などより迅速に洗浄→廃液＝再濃縮できることが大きな特徴である。
【００２０】
測定分析における電気化学的分析法には種々のものが知られており、たとえばアンペロメトリー法や、微分パルスボルタンメトリー法などがあるが、たとえぱ短時間測定には、アンペロメトリー法が適している。この出願の発明では、高感度と迅速性を両立させることができるが、このためには、分析のための櫛型電極を備えたチップの設計と抗体の選択について次のことが考慮される。
【００２１】
１）電気化学的検出器を利用する酵素標識免疫分析法では、標識酵素による酵素反応で生成する反応生成物Ｐの生成量ｎｐ（ｔ）と、電極表面における生成物Ｐの濃度Ｃｐ（ｔ）が比例することを前提にしている｛ｔは時間を表す｝。
【００２２】
２）１０秒以内、望ましくは数秒程度の迅速測定をするためには、生成物が電極に到達する時間遅れが０．１秒程度以下であることが望ましい。（時間遅れ／測定時間）比が誤差を決めるからである。
【００２３】
３）電気化学的検出器を利用する酵素標識免疫分析法でよく用いられる酵素反応生成物の代表的化合物がパラアミノフェノール（ＰＡＰ、分子量１０９）である。この程度の小さな分子量の化合物では水溶液中の拡散速度Ｄは１０-5ｃｍ2ｔのオーダーである。拡散時間を０．１ｓ以下とすると、拡散距離ＬはＬ＝（Ｄ・ｔ）1/2＝１０-3ｃｍ＝１０μｍ以下であることが必要である。
【００２４】
４）単分散に近い、狭い粒度分布幅を持つ球形の超常磁性ビーズを使うことが望ましい。
【００２５】
ビーズ表面の酵素の作用で生成する生成物が密着した電極に到達する平均所要時間は、拡散距離がビーズの半径に等しくなる程度の時間である。上記３）のことから、ビーズの半径は１０μｍ以下であることが時間遅れが０．１秒以下になるための必要条件である。また、単分散の球は空隙率が大きく、その空隙を生成物分子が拡散しやすい。微小櫛型電極のアノードとカソードの間のredoxサイクルが起りやすい。これは高感度になるための必要条件を充たす。
【００２６】
５）感度の向上という目的からすると、微小櫛型電極から１０μｍ程度以内の領域に、できるだけ高密度に酵素標識抗体が存在することが望ましい。このために、発明者は抗体分子ＩｇＧから余分なタンパク質を取り除いたＦ（ａｂ1）2を使って良い結果を得ている。
【００２７】
６）電極から離れた所にある標識酵素による生成物は、電極に到達する比率が小さく、残りは電極から離れた空間に拡散していく。上記１）〜５）のように、電極から１０μｍ以内の距離に高い密度で酵素標識抗体を集めることで高い感度が得られる。
【００２８】
この出願の発明においては、以上のことから、超常磁性ビーズの径は２０μｍ（つまり半径１０μｍ）以下とすることを具体的に好ましい形態として提供する。そして、さらには、櫛型電極の対向する歯の間の間隔は、前記の超常磁性ビーズの径と同等、もしくはそれ以下とすることも好ましい形態としている。たとえば、好適には、超常磁性ビーズの径を３μｍ以下とし、前記電極の対向間隔もこれ以下として、かつ超常磁性ビーズの径よりも小さくすることである。
【００２９】
たとえば以上のような形態において、この出願の発明では、アンペロメトリー法により、１ｎｇ／ｍＬの極微量タンパク質を、１０秒以内の応答速度で定量する方法も具体的に提供される。
【００３０】
この方法は、肝臓ガンの腫瘍マーカー（ＡＦＰ）検出に必要な目標性能に適している。ＡＦＰの分子量は約６８，０００であるから、１ｎｇ／ｍＬは１５ｐｍｏｌ／Ｌに相当する。
【００３１】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく発明の実施の形態について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【００３２】
【実施例】
１．櫛型電極作成
石英基板上にＥＢ露光装置（ＥＬＳ７７００）で櫛型パタニングを行った。現像処理後、下地にＣｒ、その上にＰｔを真空蒸着した。図１にその平面図を示したように、リフトオフしたＰｔパタンにリード線（Ｗ１）（Ｗ２）、参照電極（ＲＥ）、対電極（ＣＥ）、絶縁部を作成した。参照電極になる部分に銀メッキを施した後、塩化銀メッキ処理を行いＡｇ／ＡｇＣｌにして櫛型白金電極（Ｗ）を作成した。
【００３３】
Ｐｔ櫛型電極の幅は３μｍ、歯の対向間隔は２μｍとした。
２．磁性ビーズ上への抗体の固定化
粒径２．８±０．２μｍの磁性ビーズ(Dynal社，dynabeads（登録商標）：M270Amine)に抗原−抗体をサンドイッチ法により固定した。固定化する際、磁石で攪拌することと温度を調節することで免疫反応時間の短縮を図った。
【００３４】
なお、測定対象にはＡＦＰ（α−fetoprotein、癌マーカー蛋白質）を使用した。
３．アンペロメトリー法による測定
デュアルポテンショスタットＡＬＳ８３２ａを使用し、アンペロメトリー法で電流値を測定した。
【００３５】
電極電位のコントロールには多機能のポテンショスタットである電気化学ワークステーションを使い、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。標識酵素による反応生成物を電気化学的に検出するとき、生成物によって最適電位が異なるが、実施例ではパラアミノフェノールが生成する基質を選んでいる。この場合、櫛型電極の一方の歯を作用電極Ｉとして＋０．４Ｖを印加してアノード酸化を行わせ、櫛型電極の他方の歯を−０．１Ｖに設定し、カソード還元を行わせた。
４．結  果
図２は、前記の磁性ビーズに濃度の異なる抗原タンパク質と抗体を付着させて電流を測定した結果を時間との関係で例示したものである。この図２より、ＡＦＰ濃度と電流との比例関係が確認される。
【００３６】
また、図３は、ＡＦＰ濃度と電流との関係を初期時間の観点で示したものである。１０ｎｇ／ｍＬ以下の濃度でも電流値との比例関係が得られ、１０秒以下でも比例関係が確認できた。
【００３７】
また、ＡＦＰ高濃度領域での阻害が生起しないことも確認された。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、分析時間を短縮し、微量タンパク質の高感度分析が可能となり、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例を示した平面図である。
【図２】実施例としての時間と電流値との関係をＡＦＰ濃度について例示した図であ  る。
【図３】ＡＦＰ濃度と電流との関係を初期時間の観点で例示した図である。
【図１】
0003693578.tif 000002
【図２】
0003693578.tif 000003
【図３】
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