(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌性タンパク質であって、
配列番号３のアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質、
もしくは、前記配列番号３の配列に対して、１〜３個のアミノ酸の挿入、欠失、または置換による相違を有してなるアミノ酸配列を有する、その抗菌性変異体。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質。
【請求項３】
配列番号３の配列に対して、１〜３個のアミノ酸の挿入、欠失、または置換による相違を有してなるアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質。
【請求項４】
殺菌性である請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して殺菌性がある請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現することができる微生物を含んでなる抗菌性組成物。
【請求項７】
（ｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質、または
（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現することができる微生物を、
希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる治療用調剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を、希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる請求項７に記載の治療用調剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現することができる微生物を、希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる請求項８に記載の治療用調剤。
【請求項１０】
経口的に投与可能な薬剤である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の治療用調剤。
【請求項１１】
該経口的に投与可能な薬剤は、カプセル、トローチ剤、シロップ、口内洗浄剤、含漱剤、歯磨き粉、およびマウス・スプレーからなる群から選択されている、請求項１０に記載の治療用調剤。
【請求項１２】
単位投与剤形である、請求項１０に記載の治療用調剤。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現することができる生物を単位投与量含んでなるトローチ剤またはカプセルである、請求項１１に記載の治療用調剤。
【請求項１４】
該経口的に投与可能な薬剤の単位投与剤形は、トローチ剤である、請求項１２に記載の治療用調剤。
【請求項１５】
前記タンパク質または生物は、食品または飲料中に含有されてなる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の治療用調剤。
【請求項１６】
前記食品または飲料は、乳製品をベースとする食品または飲料である、請求項１５に記載の治療用調剤。
【請求項１７】
前記タンパク質または微生物は、粉乳、ミルクビスケット、ミルク、ヨーグルトまたはチーズ中に含有されてなる、請求項１６に記載の治療用調剤。
【請求項１８】
前記タンパク質または微生物は、味付けミルク中に含有されてなる、請求項１６に記載の治療用調剤。
【請求項１９】
前記タンパク質または微生物は、糖菓子中に含有されてなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の治療用調剤。
【請求項２０】
前記糖菓子は、チューインガムである、請求項１９に記載の治療用調剤。
【請求項２１】
１つまたはそれ以上の副次的抗菌剤をさらに含んでなる、請求項８〜２０のいずれか一項に記載の治療用調剤。
【請求項２２】
前記副次的抗菌剤がバクテリオシン様抑制物質（ＢＬＩＳ）から選択される、請求項２１に記載の治療用調剤。
【請求項２３】
サリバリシンＡ、サリバリシンＡを発現することができる微生物、または、配列番号５のアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質、該配列番号５のアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質を発現することができる微生物、その一方または双方を含有してなる、請求項２１に記載の治療用調剤。
【請求項２４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号２のコード配列を含んでいるポリヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、受託番号ＤＳＭ１３０８４で寄託されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２のゲノムの一部であり、
請求項１に記載の抗菌性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性タンパク質を発現する能力を有する、実質的に純粋状態の微生物。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが異種である、請求項２７に記載の微生物。
【請求項２９】
Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物である、請求項２７に記載の微生物。
【請求項３０】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、受託番号ＤＳＭ１３０８４で寄託されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３１】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、受託番号ＤＳＭ１３０８５で寄託されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ３０の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３２】
請求項３０または請求項３１において特定される、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２（寄託番号  ＤＳＭ１３０８４）またはＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ３０（寄託番号  ＤＳＭ１３０８５）を含んでなる治療用調剤。
【請求項３３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質、または、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現することができる生物を、抗菌性調剤の調製において使用する方法であって、
前記抗菌性調剤は、上気道における有害な連鎖球菌属細菌の成長を少なくとも抑制するために個体を処置する目的に適用可能な該タンパク質または該生物を含有してなり、
前記処置は、前記個体に有効量の該タンパク質あるいは該生物を経口的に投与する工程を含んでなることを特徴とする使用方法。
【請求項３４】
前記個体に該タンパク質を経口的に投与するために利用される該抗菌性調剤は、請求項７〜２３および３２のいずれか一項に記載の治療用調剤であることを特徴とする、請求項３３に記載の使用方法。
【請求項３５】
該抗菌性調剤は、前記タンパク質を発現する生育可能な生物を含み、
個体の上気道の少なくとも一部における、かかる生育可能な生物によるコロニー形成によって前記抑制効果が引き起こされることを特徴とする、請求項３３に記載の使用方法。
【請求項３６】
該抗菌性調剤は、薬剤、食品または飲料、あるいは、糖菓子であり、その一部として、前記生物が投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の使用方法。
【請求項３７】
前記生物は、菌株Ｋ１２（寄託番号  ＤＳＭ１３０８４）およびＫ３０（寄託番号  ＤＳＭ１３０８５）から選択されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株である、請求項３５または３６に記載の使用方法。
【請求項３８】
少なくとも前記上気道に存在する細菌の個体数を減少させるため前処置を施された、前記個体に、該抗菌性調剤は、投与されることを特徴とする、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項３９】
前記前処置は、前記個体に抗生物質を経口的に投与することで施されることを特徴とする、請求項３８に記載の使用方法。
【請求項４０】
ＢＬＩＳを産生することができるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物を、抗菌性調剤の調製において使用する方法であって、
前記抗菌性調剤は、連鎖球菌性生物に起因する上気道の感染症に対する患者の治療に適用可能な該Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物を含有してなり、
前記治療は、
（ｉ）存在する連鎖球菌属の数を減少させるのに有効な量の抗生物質を前記患者に経口的に投与する工程と、
（ｉｉ）得られる除菌された環境に対して、前記抗菌性調剤の一部として、ＢＬＩＳを産生するＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物を投与して、前記環境に再び植え付ける工程とを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項４１】
配列番号５のアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質。
【請求項４２】
配列番号４のコード配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４１に記載の抗菌性タンパク質を、希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる治療用調剤。
【請求項４４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性タンパク質と、請求項４１に記載の抗菌性タンパク質とを含む治療用調剤。
【請求項４５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性タンパク質を発現する、少なくとも１種のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物と、請求項４１に記載の抗菌性タンパク質を発現する、少なくとも１種の他のＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物とを含む治療用調剤。
【請求項４６】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターで形質転換され、かつ請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性タンパク質を発現する能力を有する、形質転換微生物。
【請求項４７】
該宿主微生物は、原核生物である、請求項４６に記載の形質転換微生物。
【請求項４８】
該宿主微生物は、細菌、酵母菌、真菌からなる群より選択される、請求項４６に記載の形質転換微生物。
【請求項４９】
該宿主微生物は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌である、請求項４８に記載の形質転換微生物。
【請求項５０】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターで形質転換され、かつ請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性タンパク質を発現する能力を有する、形質転換された宿主細胞。
【請求項５１】
該宿主細胞は、細菌、酵母菌、真菌、昆虫、動物および植物細胞からなる群より選択される、請求項５０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項５２】
該宿主細胞は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌細胞である、請求項５０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項５３】
経口的に投与可能な薬剤である、請求項３２に記載の治療用調剤。
【請求項５４】
該経口的に投与可能な薬剤は、カプセル、トローチ剤、シロップ、口内洗浄剤、含漱剤、歯磨き粉、およびマウス・スプレーからなる群から選択されている、請求項５３に記載の治療用調剤。
【請求項５５】
該経口的に投与可能な薬剤は、トローチ剤またはカプセルである、請求項５４に記載の治療用調剤。
【請求項５６】
スキムミルク粉末や同等の粉乳組成物に、凍結乾燥された前記Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株を配合し、トローチ剤の形状に成型されている、請求項５４に記載の治療用調剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はランチバイオティック、かかるランチバイオティックを産生する生物、およびその生物ならびにそれから産生されるランチバイオティックの双方の使用に関する。
【０００２】
（背景）
ヒトでの細菌感染は、相当な個人的な関心と経済的な重要性をともに有する健康の分野の問題である。
【０００３】
連鎖球菌性感染は、特には、虫歯や軽度の咽喉部の感染から、猩紅熱、リューマチ熱、および急性糸球体腎炎などの重篤な疾患までの、広範な疾病の伝染原因である。
【０００４】
連鎖球菌性感染の頻度を減少させるためには、有害な病原性細菌の成長を抑制または防止することが望ましい。これに対する１つの方法は、連鎖球菌に対して活性である、バクテリオシンや類似物質（ランチバイオティックを含めて）、あるいは、かかる物質の生成能を有する生物を投与することであり、それらは有害な連鎖球菌細菌の成長の抑制または防止の用途に適している。
【０００５】
一群のバクテリオシンが知られている。グラム陽性菌に由来するバクテリオシンの例が、Ｔａｇｇ  他、 Bacteriol Rev. Vol.40、 pp722-756 (1976) 中に与えられている。このようなバクテリオシンのさらなる例は、Lactobacillus lactis 由来のラクチシン（ｌａｃｔｉｃｉｎ）４８１（Ｐｉａｒｄ  他、 Applied and Environmental Microbiology、 Vol.58、 pp279-284 (1992)）、Micrococcus varians 由来のバリアシン（ｖａｒｉａｃｉｎ）（米国特許第５，９８１，２６１号）およびＥＰ０６４３１３６に記載のStreptococcus thermophilus 由来のバクテリオシンである。
【０００６】
Streptococcus salivarius もまた、ランチバイオティック産生の頻度が高いことが以前から知られている（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ  ＲＰ他、 Arch. Oral Biol. 27:151 (1982)）。Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  由来と特定されている、１つのランチバイオティックは、サリバリシンＡ（ｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ  Ａ）である（Ｒｏｓｓ  他、 Appl. Envir. Microbiol. 59:2014 (1993)）。しかしながら、多くの連鎖球菌種に対して抑制活性を示すものの、その活性は、殺菌性ではなく静菌性であった。したがって、サリバリシンＡならびにそれを産生する微生物は、連鎖球菌性感染の抑制に対する完璧な解答を提供してはいない。
【０００７】
ここに、出願人らは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来の、更なる抗菌性タンパク質を同定した。出願人らが、それは、単なる静菌性ではなく、殺菌効果を有することを見出した、このタンパク質が、本発明の第一の中心である。
【０００８】
（発明の概要）
したがって、一の形態では、本発明は、
Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２ならびにＫ３０から単離でき、
イオンスプレー質量分光法によって測定した際、分子質量約２７３３Ｄａを有し、かつＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−ＧｌｎのＮ末端アミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質、ならびに、その抗菌性断片、もしくは、かかる変異体は該タンパク質と８０％を超える相同性を有するアミノ酸配列を有する変異体にあると概説することができる。
【０００９】
図２に、リーダーペプチドの部分の配列とともに、完全な塩基およびアミノ酸配列を挙げている、本発明のタンパク質は、本出願人によって「サリバリシンＢ」と名づけられている。
【００１０】
都合のよいことに、サリバリシンＢは、宿主細胞中でそれをコードするＤＮＡ配列を発現させること、あるいは、産生菌株Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ｋ１２またはＫ３０を培養することによって得られる。
【００１１】
他の態様では、本発明は、前に規定されたタンパク質、または、前に規定されたタンパク質を発現することができる生物を含んでいる抗菌性組成物を提供する。
【００１２】
また、他の態様では、本発明は、前に定義したサリバリシンＢ、またはその抗菌性断片もしくは変異体を、希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる治療用調剤を提供する。
【００１３】
更に、他の態様では、本発明は、前に定義したサリバリシンＢ、またはその抗菌性断片もしくは変異体を発現する能力を有する生物を、希釈剤、担体および／または賦形剤と配合して、含有してなる治療用調剤を提供する。
【００１４】
前記生物は、サリバリシンＢを単独で、あるいは、副次的抗菌剤と組み合わせて、発現する能力があることが好ましい。
【００１５】
前記副次的抗菌剤は、より好ましくＢＬＩＳであり、サリバリシンＡ２であることが最も好ましい。サリバリシンＡ２に関して、完全な塩基およびアミノ酸配列は、リーダーペプチドの配列と共に、図３に与えられる。
【００１６】
好適には、前記生物は、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０から選択される。
【００１７】
個別的な好ましい態様において、かかる治療用調剤は、食品または飲料の形状であり、乳製品をベースとする食品または飲料の形状であることが最も好ましい。
【００１８】
もう一つの形状は、薬剤および糖菓子である。
【００１９】
また、他の形態では、本発明はサリバリシンＢを発現する生物を提供する。
【００２０】
好ましくは、前記生物は、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０から選択される。
【００２１】
また、本発明の他の形態では、個体を処置する方法であり、少なくとも上気道における有害な連鎖球菌細菌の成長を阻害するため、前記個体に有効量のサリバリシンＢを経口的に投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【００２２】
好ましくは、前記サリバリシンＢは、治療用組成物の一部として投与される。
【００２３】
好適には、前記方法において、前記抑制効果は、個体の上気道の少なくとも一部に、サリバリシンＢを発現する、生育可能な非病原性生物によるコロニー形成によって引き起こされる。
【００２４】
好ましくは、前記生物は、食品または飲料の一部として投与される。
【００２５】
より好ましくは、前記生物は、Ｋ１２およびＫ３０株から選択されるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株である。
【００２６】
なお、他の態様では、前記方法は、少なくとも前記上気道に存在する細菌の個体数を減少させる、前記個体の前処置を行う予備的工程を含む。
【００２７】
好ましくは、前記前処置は、抗生物質、好ましくはエリスロマイシンを、前記個体に経口的に投与する工程を含む。
【００２８】
さらに、他の態様において、本発明は、
連鎖球菌性生物に起因する上気道の感染症に対する患者の治療方法であって、
（ｉ）存在する連鎖球菌属の数を減少させるのに有効な量の抗生物質を前記患者に経口的に投与する工程と、
（ｉｉ）得られる除菌された環境に対して、ＢＬＩＳを産生するＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物を投与して、前記環境に再び植え付ける工程とを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明は、大まかには上述の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではなく、以下の記述にその例を示され、また、添付の請求の範囲中に完全に定義されるその形態をも具える、態様をも包含することは、当業者には理解されよう。
【００３０】
添付の図面を参照することができる。
【００３１】
（発明の説明）
ＢＬＩＳ（バクテリオシン様抑制物質）は、その産生細胞は、それに対してある程度の特異的免疫を示すという機構で、低濃度において、ある種の他の近縁関係にある細菌を殺すことができる、細胞外に放出される細菌性ペプチドまたはタンパク質である。
【００３２】
ランチバイオティックという用語は、ランチオニンを含む抗生物質に由来する用語である（Ｓｃｈｎｅｌｌ  他、 Nature 333:276、 1988）。ランチバイオティックは、ＢＬＩＳの１つのカテゴリーである。ランチバイオティックは、該分子の成熟体（生物学的に活性型）の形成中に、プロセッシング酵素によって開裂される、Ｎ末端の延長部（リーダーペプチド）を有する、プレランチバイオティックとしてリボゾームでは合成される。１つの独特な特徴は、それらは、そのペプチド鎖内にチオエーテル橋を形成する、ランチオニンおよび／またはβ−メチルランチオニンを含んでいる多環式ポリペプチドであることである。これまで報告されたランチバイオティックを、ＡおよびＢの２つのタイプに分類することが、Angewandte Chemie 30:1051-1192、 1991 に、Ｊｕｎｇによって提案されている。
【００３３】
出願人による以前の研究は、ある他種の連鎖球菌属に対する活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの一群のＢＬＩＳ産生株に向けられた。ある１種の菌株（菌株２０Ｐ３）によって産生されたＢＬＩＳを単離し、部分的な精製を行い、そして、予備的な特定がなされた。この予備的な特定は、産生されたＢＬＩＳは、３５００〜８０００Ｄａの範囲の分子質量を有する、比較的に熱安定性のタンパク質であることを示唆している。このＢＬＩＳに、ＳＡＬ  ２０Ｐ３という名称を付けた。
【００３４】
引き続く研究は、その分子質量とともに、ＳＡＬ  ２０Ｐ３のアミノ酸配列を解明した。かかる具体的な同定がなされたランチバイオティックは、サリバリシンＡと名称を付け換えられた（Ｒｏｓｓ  他、 Appl. Envir. Microbiol. 59:2014）。
【００３５】
本発明のＢＬＩＳは、サリバリシンＡとは区別される。この区別は、その分子質量（サリバリシンＡの２３１６Ｄａと比較して２７３３Ｄａ）に関して、および図２に示される、そのアミノ酸配列に関しての双方にある。サリバリシンＡおよびＢは、その抑制活性の点でも異なる。具体的には、サリバリシンＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの大部分の菌株に対する静菌剤として効果的であることが判明しているが、サリバリシンＢは、殺菌性であると決定された。さらに重要なことに、サリバリシンＢに対して耐性であるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの菌株は、未だ検出されていない。
【００３６】
サリバリシンＢは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０によって発現される。Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０は、１９９９年１０月８日付けで、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １  ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ  に寄託された。菌株Ｋ１２は、ＤＳＭ１３０８４という受託番号を割り当てられており、一方、菌株Ｋ３０はＤＳＭ１３０８５という受託番号を割り当てられている。
【００３７】
したがって、第１の形態では、本発明は、抗菌性タンパク質、サリバリシンＢを対象とする。本発明は、機能的な均等性を示す、サリバリシンＢの断片または変異体をも提供する。
【００３８】
少なくともその生物学的活性をなお実質的に保持しつつ、タンパク質ならびにその活性断片の双方とも、その本来のアミノ酸配列に改変を施すことができることは、さらに理解されるはずである。具体的には、変異体タンパク質が、天然のサリバリシンＢのアミノ酸配列と８０％を超える相同性を持つ配列を有するまたは含むならば、１個、２個、または３個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失をもたらす、天然アミノ酸配列のそのような改変は、本発明の技術的範囲内である。
【００３９】
それを達成できる限り、アミノ酸のさまざまな置換が可能であることは、勿論理解されるはずである。保存性の置き換えは、たとえば、米国特許第５，２６４，５５８号または第５，４８７，９８３号などの特許文献中に記載されている。したがって、たとえば、非極性の脂肪族中性アミノ酸；グリシン、アラニン、プロリン、バリン、およびイソロイシンの間での交換を行うことが可能であろうと予期される。同様に、極性の脂肪族中性アミノ酸；セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間での置換を行うことが可能であろう。電荷を帯びた酸性アミノ酸；アスパラ酸およびグルタミン酸の間での置換を行うことがおそらく可能であろうし、同様に、電荷を帯びた塩基性アミノ酸、リジンおよびアルギニンの間の置換が可能であろう。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む、芳香族アミノ酸の間での置換もおそらく可能であろう。この種の置換および交換は、当業者には周知である。他の置換体もまた可能かもしれない。当然ながら、変異体タンパク質の天然タンパク質との相同性のパーセンテージ、すなわち配列類似性が、８０％のしきい値を上回るにつれて、活性の保持もより大きいと期待される。
【００４０】
本発明のタンパク質ならびに断片は、種々の方法によって調整できる。たとえば、天然起源（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２および／またはＫ３０など）からの単離、任意の適切な公知の技法（Ｗａｋａｍｉｙａ  他、 「Nisin and Novel Lantibiotics」 ed. G. Jung and H.G. Shal、 189-203、Escom、 Leiden (1991) 中のニシン合成のために記載された技法、あるいは、Merrifield、 J. Am. Chem. Assoc. 85、 2149-2154 (1964)に記載されているような固相合成、または、Ｈｏｕｂｅｎｗｙｃｌ、 Methods of Organic Chemistry、 Vol I and II (1987)に記載されているような均質溶液中での合成など）、あるいは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他、Molecular cloning: A Laboratory Manual、 Cold Spring Harbour Press、 New York、USA (1989)に記載されるような組換えＤＮＡ技法の利用による。
【００４１】
当分野において既知のこれら技法のいずれかによって、天然タンパク質およびその活性断片、双方の変異体を同様に作製することができる。たとえば、Ａｄｅｌｍａｎ  他、 DNA 2、 183 (1983)に記載されるように、天然アミノ酸配列をコードするＤＮＡの部位特異的変異導入法によって、変異体を作製することができる。
【００４２】
ＢＬＩＳを作製するために組換え技法を使用する際、第１のステップとして、所望の産物をコードするＤＮＡを取得することが必要である。かかるＤＮＡも、本発明の一形態を構成する。
【００４３】
サリバリシンＢをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を図２に示す。
【００４４】
本発明のＤＮＡは、天然のタンパク質、あるいはその活性断片をコードすることができる。
【００４５】
かかるＤＮＡは、たとえば、サリバリシンＢの決定された塩基配列に基づく、プローブおよび／または増幅プライマーを使用して、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０から単離することができる。こうして同定されたＤＮＡは、従来の技法を使用して、イントロンを含まないｃＤＮＡとして作製されてもよい。ＤＮＡは、たとえば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  他、 J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191、 1981 のリン酸トリエステル法を使用して、活性断片の大きさが許容する限り、合成オリゴヌクレオチドの形態に作製することもできる。さらに、ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒなどの、適当な市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して、ＤＮＡを作製することができる。
【００４６】
本発明は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、置換、または欠失により、天然のアミノ酸配列とは異なる、タンパク質ならびにその断片の変異体も予期している。このような変異体が望まれる場合、天然のＤＮＡの塩基配列は適切に改変される。この改変は、ＤＮＡの選択的合成を介して、または、たとえば、部位特異的またはカセット変異導入による天然のＤＮＡの修飾によって施すことができる。
【００４７】
ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの一部に、配列の変異を必要とする場合、好ましくは、部位特異的なプライマー指定変異導入を使用する。現在、この技法は、当分野において標準である。
【００４８】
一旦、取得された後、改変されたＤＮＡは、適切なクローニングおよび／または発現ベクター中への挿入に適するように処理される。この目的で、ＤＮＡは、必要に応じて、開裂、調整、ならびに再連結される。
【００４９】
開裂は、適合する緩衝液中で制限酵素による処理によって行われる。製造者が指定した方法に従って、多数の市販されている制限酵素のうち、任意のものを使用することができる。開裂の後、核酸は、たとえば、エタノールによる沈殿によって回収される。
【００５０】
切断ＤＮＡの調整は、従来的な技法を使用して行われる。たとえば、平滑端が必要とされる際には、ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させることができる。
【００５１】
正しい連結に適するように調整され、ほぼ等モル量の所望の構成成分を準備し、適当なリガーゼ（たとえば、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ）で処理することによって、再連結を行うことができる。
【００５２】
このようにして取得されたＤＮＡ分子を、それがコードするタンパク質生成物の発現を可能となる位置に、クローニングベクター中に挿入する。
【００５３】
適合するクローニングベクターは、周知の技法によって構築することができ、あるいは、当分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。ＢＬＩＳをコードするＤＮＡを発現するために使用される宿主細胞に応じて、この選択されるクローニングベクターは様々であってよいものの、有用なクローニングベクターは、一般に以下の諸特性を有するはずである。
【００５４】
（ｉ）  自己複製するための能力；
（ｉｉ）  任意の個々の制限エンドヌクレアーゼに対して、単一の標的を有する；ならびに
（ｉｉｉ）  望ましくは、抗生物質耐性などの容易に選択できるマーカー用の遺伝子を保持する。
【００５５】
前述の特性を有するクローニングベクターの２つの主なタイプは、プラスミドおよび細菌性ウイルス（バクテリオファージまたはファージ）である。適切なクローニングベクターの例には、大腸菌由来の、ｐＵＣ１８、Ｍｐ１８、Ｍｐ１９、ｐＲＢ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、およびｐＣＲ１；  ＲＰ４、ｌａｍｂｄａおよびＭ１３などのファージＤＮＡ、およびｐＳＡ３やｐＡＴ２８などのシャトルベクターを含む、広い宿主範囲のプラスミドがある。
【００５６】
宿主内でＢＬＩＳをコードするＤＮＡを発現するためには、クローニングベクターは、発現制御配列も組み込まなければならない。典型的な発現制御配列は、５つの要素として、記載することができる。遺伝子中に現れる順番に従って、要素は以下の通りである。
【００５７】
（ａ）プロモーター領域；
（ｂ）５’非翻訳領域（シグナルまたはリーダー配列）；
（ｃ）タンパク質をコードしている配列；
（ｄ）３’非翻訳領域；ならびに
（ｅ）転写終結領域
これら要素のそれぞれの機能は、よく認識されている。
【００５８】
例えば、リポタンパク質遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、トリプトファン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、およびファージｌａｍｂｄａ由来のものを含め、広範囲なその種の制御配列のいずれかを使用することができる。
【００５９】
要素（ｃ）として、上述のやり方で、ランチバイオティックをコードするＤＮＡ配列がクローニングベクター制御配列中に挿入される。
【００６０】
次いで、クローニングベクターをその中に挿入するに、適切な宿主が選択される。潜在的に有用な宿主には、細菌、酵母菌、真菌、昆虫、動物および植物細胞が含まれる。本発明には、原核生物の宿主が一般に好ましい。非病原性の細菌性宿主が特に適当である。
【００６１】
一般に、細菌性宿主は、グラム陽性菌の中から選択される。本発明における用途には、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）宿主が好ましい。
【００６２】
理解されるように、選択された宿主系では、宿主と適合性を有する種に由来する複製部位および制御配列を保持するプラスミドベクターが使用される。
【００６３】
前述のように形成されたクローニングベクターは、また、当分野で周知の技法、たとえば、Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．Ｎ．、 Proc. Nat. Acad. Sci. 69、 2110、 1972に記載されるような塩化カルシウム処理を使用して、選択された宿主を形質転換するために使用される。
【００６４】
クローニングベクターにより選択された宿主を形質転換すると、宿主細胞を培養することによって、場合によっては融合タンパク質として、コードされているタンパク質または断片を生産することができる。次いで、外因性タンパク質産物または断片は、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィなど）、電気泳動、ならびに最後に、結晶化を含む、通常の方法を使用して単離される（一般的には、Methods in Enzymology、 22、 233-577 (1971)の「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」を参照）。精製は、必要に応じて従来の技法を使用して実施される。
【００６５】
組換え法を使用する際には、本発明のＤＮＡは、抗菌性タンパク質または断片、および単離および精製の手助けをするベクタータンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードすることもできる。一般に、このベクタータンパク質は、公知の技法に従って、抗菌性タンパク質または断片から化学的または酵素的に切り離すことができる。
【００６６】
特異的なキメラ型のタンパク質も応用できる可能性がある。それぞれの完全なタンパク質、またはタンパク質の一部、をコードするＤＮＡ配列は、たとえば、サリバリシンＡ２などの他のＢＬＩＳをコードしている配列と連結することもでき、その結果、そのＤＮＡ配列の発現は、抗菌性活性のスペクトルが拡大している、キメラタンパク質を産生される。
【００６７】
一旦精製した後、タンパク質は使用に供することができる。その使用には、治療的なものに、一般的な抗菌剤（たとえば、食品中の防腐剤）をも含む。この意味では、「治療的な」には、予防的処置を含むことが理解されるはずである。
【００６８】
したがって、他の態様では、本発明は、微生物感染、特に連鎖球菌性感染の治療又は予防の用途に適した治療用調剤を対象とする。この調剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する使用に特に適している。これら治療用調剤は、サリバリシンＢあるいは断片またはその変異体を、当分野で知られているような、希釈剤、担体または賦形剤と配合して、含有する。その中でサリバリシンＢを使用することができる治療用調剤に含まれる例は、カプセル、トローチ剤、シロップ、口内洗浄剤、含漱剤、歯磨き粉、およびマウススプレーなどの経口的に投与可能な薬剤であるが、それだけには限らない。さらなる例には、皮膚上での細菌の成長を抗するための、モイスチャリングクリームや化粧品などの塗布投与可能な調剤がある。
【００６９】
他の態様では、本発明は、希釈剤、担体および／または賦形剤と組み合わせて、上気道またはその一部でコロニー形成し、本発明のランチバイオティックを発現する能力を有している、非病原性な生育可能な生物を、希釈剤、担体または賦形剤と配合して、含有する治療用調剤を提供する。
【００７０】
一態様では、その生物は、本発明に従って作製される形質転換された宿主生物である。しかしながら、その生物は、本来の産物としてサリバリシンＢを産生する生物であることが好ましい。このような生物の例は、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０である。
【００７１】
Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０は、サリバリシンＢだけでなくサリバリシンＡ２をも発現すると確定されている。サリバリシンＡ２は、サリバリシンＡとは関係があるが同一ではない。サリバリシンＡ２に関する、完全な配列（ポリヌクレオチドおよびアミノ酸）は、図３に示される。
【００７２】
この態様では、本発明の治療用調剤は、食品、糖菓子または飲料の形状であることが好ましい。特には、その食料品または飲料は、たとえば、ヨーグルト、チーズ、ミルク、ミルクビスケット、味つきミルクを含む、乳製品をベースとする食品または飲料であることが好ましい。糖菓子の場合、治療用調剤は、ＷＯ  ００／０５９２７に記載されるチューインガムのような、チューインガムであってもよい。
【００７３】
特には、好ましい調剤では、Ｂｉｆｉｄｕｓ  Ｍｉｌｋ  Ｐｏｗｄｅｒの調製に関して、既に報告したのと（Ｎａｇａｗａ  他、 J. Dairy Sci． 71:1777-1782、 (1988)）と同様のやり方で、サリバリシンＢを産生するＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの凍結乾燥された菌株は、粉乳組成物中に含まれる。
【００７４】
以下に、本発明のさまざまな形態を、非限定的に続くの実験セクションを参照しつつ、例示説明する。
【００７５】
（実験）
サリバリシンの抽出
二酸化炭素５％の大気雰囲気中、３７℃で１８時間、Ｄａｖｉｓ寒天０．５％、スクロース０．５％、ヒト血漿０．５％、および炭酸カルシウム０．１％を補ったＭ１７培地上で生育させた、試験用菌株Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株Ｋ１２およびＫ３０の菌叢培養物からサリバリシンＢを精製した。産生菌株の１８時間３７℃のＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔブロス培養からの寒天培地の表面に移し採ることによって、菌叢培養物を接種した。寒天プレートを−７０℃で凍結させ、その後室温で解凍して寒天ゲルを破壊することによって、サリバリシンＢ活性を抽出し、次に遠心分離によって抽出した液体を清澄にした。これらの凍結／解凍抽出物の抑制活性価は、一般に２〜４ＡＵ／ｍｌである。
【００７６】
サリバリシン活性の評価
寒天表面アッセイを使用してサリバリシン活性を評価する。Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天ベース上のＭｉｃｒｏｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  Ｔ−１８に対して、サンプルの倍系列の食塩水希釈液を数滴（２０ｕｌ）アッセイする。明確な指標菌叢の増殖抑制域が得られる最高希釈の逆数が、１ｍｌ当たりの任意の単位（ＡＵ／ｍｌ）で示す、サリバリシン活性価である。
【００７７】
サリバリシンＢの精製
２リットルの体積の凍結・解凍抽出物を、ＸＡＤ−２カラム（直径５．０ｃｍ、ベッドボリューム１５０ｍｌ；Ｓｅｒｖａ）に載せ、ベッドボリュームの７倍量の５０％（ｖ／ｖ）メタノールで洗浄した。サリバリシン活性体を、ベッドボリュームの５倍量の９０％（ｖ／ｖ）メタノール（１１．６ＭのＣＨ１でｐＨ２に調整）で溶離し、５０℃で減圧下溶媒留去により濃縮した。この材料のアリコート（１ｍｌ）を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したＢｒｏｗｎｌｅｅ  Ｃ８逆層カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ  ３００、孔径  ７μｍ、３０×４．６ｍｍ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に載せた。Ｐｈａｒｍａｃｉａの高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）システムを使用し、１分当たり１ｍｌの流量、１０分間勾配（ＴＦＡを０．０８５％含む０〜２８％アセトニトリル）、続く８０分間のイソクラティック（２８％アセトニトリル）溶離を使用して、この材料を分画する。このイソクラティック溶離中に、サリバリシンＡ（４０分付近で溶離が始まる）およびサリバリシンＢ（６０分付近で始まる）の相分離がなされる。各１ｍｌ分画を、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ  Ｔ１８に対する抑制活性に関して、試験した。サリバリシンＡならびにサリバリシンＢに対応する各領域の活性分画を、バクテリオシンの部分的に精製された調製物として別々にプールした。各プールを凍結乾燥し、次いで０．１％ＴＦＡに溶解させた。そして、これら調製物それぞれのアリコートを、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ18逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ18；１０μｍ、２５０．０×４．６ｍｍ）に載せ、さらに、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＰＬＣシステムを使用し、アセトニトリルの適当な勾配を適用して分画した。
【００７８】
サリバリシンＡ２は、アセトニトリル３４〜３５％で、また、サリバリシンＢは、アセトニトリル３８〜４０％で、均質なピークとして溶離した。２１４ｎｍでの吸光度を測定し、様々なピークに対応する画分を手作業で回収した。指標菌としてＭ．ｌｕｔｅｕｓ  Ｔ１８を使用し、スポット拡散試験によって抑制活性を検出した。各ランからの活性画分をプールし、凍結乾燥し、０．１％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ  Ｑ（商標）精製水１ｍｌに再溶解させた。抑制活性を有する画分（精製されたサリバリシン）をプールし−２０℃で保存した。
【００７９】
イオンスプレー質量分光法において、サリバリシンＢの分子質量は２７３３Ｄａであることが示された。精製サリバリシンＢのＥｄｍａｎ分析により、そのＮ末端配列；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎを明らかにした。
【００８０】
サリバリシンＢのクローニング
精製およびシークエンシングによって導出されたペプチドのアミノ酸配列は、共通的なコドン使用に基づき、縮重オリゴヌクレオチドのＤＮＡプローブの設計を可能とした。使用した特異的プローブ（ＣＦ４８１）は、アミノ酸配列：Ｓ  Ｗ  Ｑ  Ｆ  Ｌ  Ｆ  Ｔに基づいた。その対応する塩基配列は、ＴＣＮＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＲＴＴＴＡＣＴであった。
【００８１】
ＳｐａｎｉｅｒおよびＣｌｅａｒｙの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３０：５１４−５２２  （１９８３））によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株、Ｍｉｎ５から染色体ＤＮＡを単離した。制限酵素ＥｃｏＲ１とＨｉｎｄIIIの両方を使用して消化を行い、次いで、切断ＤＮＡを１％アガロースゲルで４０Ｖ／ｃｍ、１８時間の泳動で、分離させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989）。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用説明に従って、サザンブロット法によって、このＤＮＡをナイロン膜に移した。Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼを使用して、ガンマＰ32ＡＴＰでプローブＣＦ４８１を標識した。プローブＣＦ４８１とのハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション用チューブ中で３８℃、１８時間実施した。この膜を、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で５分間、２回の洗浄し、次いで、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で２０分間、２回の洗浄を行った。そして、この膜を、−７０℃、１８時間、Ｘ線フィルムにさらした。
【００８２】
サザンブロットにおける、ＣＦ４８１のハイブリダイゼーション部位と対応する、ゲルの部分をゲルから切り出し、そして、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してＤＮＡを抽出した。連結のため、制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄIIIにより切断された、１μｌのベクターｐＵＣ１９に、浄化済みのＭｉｎ５  ＤＮＡ断片１５μｌ、連結用バッファー２μｌ、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１μｌを混合した。インキュベーションを、１５℃で１８時間行った。
【００８３】
連結されたｐＵＣ１９を用いたエレクトロポーションによる形質転換のため、大腸菌株ＤＨ１０βを使用した。形質転換された細胞は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  １ｍｌ中で１時間生育させ、次いで、アンピシリン（１００μｌ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ  ２０ｍｇ／ｍｌを添加した、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  寒天上に平板蒔種した。３７℃で一晩培養した後、白いコロニーを選別し、継代培養して、ＣＦ４８１プローブによりスクリーニングを行った。スクリーニングは、大腸菌のコロニーを５％ＳＤＳ１０％グリセロール溶液中で６５℃、３０分かけて破砕して行った。次いで、このコロニーを、アガロースゲルで泳動し、サザンブロットし、そして、上述と同様の方法で、膜をＣＦ４８１プローブとハイブリダイズさせた。次いで、陽性コロニーを、１００μｌ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  中で３７℃、１８時間振とう培養した。次いで、ｐＵＣ１９プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、ｐＵＣ１９のフォワードならびにリバース・プライマーを用いて配列を決定した。
【００８４】
その結果を図２に示す。
【００８５】
サリバリシンＢの抗菌性活性
パート１
サリバリシンＡ（サリバリシンＢではない）を産生する２０Ｐ３および５などのＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓの菌株は、指標菌３以外の９つの標準指標菌全てを抑制する。コード書式において、この抑制のパターンは、産物（Ｐ）タイプ６７７として知られている。対照的に、サリバリシンＡ２とサリバリシンＢの両方を産生する菌株Ｋ１２およびＫ３０は、９つの標準指標菌すべての生育を抑制し、この活性はＰタイプ７７７と呼ばれる。Ｐタイピングの試験は、最初に試験菌株を直径方向に沿った画線培養物として、血液寒天培地上で生育することを含んでいる。この培養物を取り除いた後、寒天表面をクロロホルム蒸気で滅菌し、乾かし、９つの標準指標菌（４つのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓを含む）を、本来の試験株を接種した線と交叉させて、ジグザグに画線する。インキュベーション後、本来の産生菌画線の近傍における、指標菌成長の阻害を、バクテリオシン活性の指標とする。菌株２０Ｐ３および５（サリバリシンＡの産生菌）の場合、その抑制活性は、静菌性であることを示すことができ、すなわち、スワブで採取し、細胞を新鮮な（バクテリオシンを含まない）寒天培地に移すことによって、生育可能な指標細胞を抑制域から多数回収することができる。対照的に、Ｐタイプ７７７菌株（サリバリシンＢをも産生することが判明している）の効果は、標準指示菌に対して殺菌性であり、すなわち、繰り延べの拮抗試験によっても、生菌を抑制域から回収することができない。さらに、サリバリシンＡならびにサリバリシンＢの精製された調製物を使用する試験（データは示されていない）でも、サリバリシンＡのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する作用は静菌性であり、一方、サリバリシンＢのそれは殺菌性であることが確認された。
【００８６】
パート２
細胞にサリバリシンの調製物を混合した後、感受性指標菌ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌株ＦＦ２２）の懸濁液のコロニー形成単位（ＣＦＵ）数の経時的な減少を測定することによって、サリバリシンの抑制活性を決定した。指標菌ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ブロス  対数増殖培養物由来の２回洗浄した細胞を、０．０６７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に再懸濁させ、元の培地の体積とした。次いで、部分的に精製されたサリバリシン（力価  １６Ａｕ／ｍｌ）の一部、またはリン酸緩衝液（コントロール）の一部を、同じ体積の洗浄した細胞の懸濁液と混合し、３７℃で培養を続けた。試験体ならびにコントロールの混合物の、適切な１０倍希釈液（冷Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ブロス中）をＣｏｌｕｍｂｉａ寒天ベース上に平板蒔種し、３７℃で２４時間培養することによって、時間間隔をおいて、生存細胞を測定した。１ｍｌ当たりのＣＦＵの総数として、生菌数を表した。
【００８７】
力価１６の部分的に精製されたサリバリシンＢの調製物は、３７℃、４時間以内に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌株ＦＦ２２のＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ブロス  対数増殖培養物のＣＦＵの９９％超を死滅させることが分かった。対照的に、同じ条件を使用して試験を行った場合、力価１６の部分的に精製されたサリバリシンＡ２の調製物は、菌株ＦＦ２２の細胞を１０％未満しか殺さなかった。上記の寒天表面アッセイを使用して、部分的に精製されたサリバリシンＡ２ならびにサリバリシンＢ調製物の抑制スペクトルのさらなる試験を行った。力価が１６Ｕａ／ｍｌの調製物数滴（２０μｌ）を、該菌株の１８時間Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ブロス培養物を生理食塩水で１／１００に希釈した液を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天ベースプレートの表面に刷け接種して新たに培養した、試験菌株の菌叢培養物上にスポットした。３７℃、１８時間、これらのプレートをインキュベートした際の、試験菌株の成長が抑制された明確なゾーンの生成は、サリバリシンに対するその菌株の感受性を示すと考えた。
【００８８】
その結果を表１に示す。
【００８９】
【表１】
0003673497.tif 000002
【００９０】
（産業上の利用）
上の結果は、サリバリシンＢならびにこのＢＬＩＳを産生する生物の抑制性および殺菌性効果を示す。したがって、サリバリシンＢおよび／またはそれを産生する生物は、口を含む、上気道における連鎖球菌性感染の有害な影響に対する個体の治療法に適用できる。これらの方法には、連鎖球菌による咽頭炎（主にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに起因）および虫歯（部分的にＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに起因）などの症状の治療法が含まれる。
【００９１】
現状において、好ましい経口的に投与可能な調剤は、風味の向上のため、味付けした、スキムミルク粉末などに、凍結乾燥されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株を配合したものである。
【００９２】
水を加えて還元し、１日に３〜４回すするようにして飲むと、したがって、合計５０ｍｌの味付け製品（凍結乾燥されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ生物を約２×１０7個／ｍｌ含む）が摂取されると、かかる調剤は有効であることがこれまでのところ示唆されている。
【００９３】
凍結乾燥されたＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ菌株がＫ１２およびＫ３０から選択されるならば、サリバリシンＢがサリバリシンＡ２と共に発現されるというさらなる利点がある。この２つのＢＬＩＳの共発現が、調剤を、一群の他の細菌に関してと、同様に、特には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに関しても殺菌性とする。
【００９４】
以上の記述は、単に例示のために提供されており、また、当業者に周知のように、材料ならびに使用法の双方における変更は予期されることが理解されるはずである。保護される技術的範囲は、付される請求の範囲によってのみ、制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  サリバリシンＢの構造的特徴を示す図である。
【図２】  リーダーペプチド部分を含んだ、サリバリシンＢに関する、塩基およびアミノ酸配列を示す図である。
【図３】  リーダーペプチドを含み、サリバリシンＡ２に関する、塩基およびアミノ酸配列を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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