(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪の白髪化及び／又は薄毛化の程度を評価する方法であって、被験対象より採取した毛髪の毛幹部のＧＯＳＲ１及び／又はＡＬＧ５の遺伝子発現量を白髪化の指標とし、被験対象より採取した毛髪の毛幹部のＰＧＦ及び／又はＡＬＤＯＡの遺伝子発現量を薄毛化の指標とする評価方法。
【請求項２】
前記遺伝子発現量が、前記毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として解析した遺伝子発現量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）被験対象の特定部位の毛髪より採取した毛幹を用意するステップ、
（２）前記毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として遺伝子発現解析を行い、前記遺伝子の発現量を算出するステップ、及び
（３）ステップ（２）で算出した発現量を用いて毛髪の白髪化及び／又は薄毛化の程度を評価するステップ、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（３）において、ステップ（２）で算出した発現量を基準発現量に照合して毛髪の白髪化及び／又は薄毛化の程度を評価する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現解析がマイクロアレイ法又はＰＣＲ法によって行われる、請求項３〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
被験対象に対してトリートメント手段を施す前および後にそれぞれ、請求項１〜５のいずれかに記載の方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該トリートメント手段の有効性を評価することを特徴とする、毛髪に対するトリートメント手段の有効性を評価する方法。
【請求項７】
被験対象に対して抗白髪剤を施す前および後にそれぞれ、請求項１〜５のいずれかに記載の毛髪の白髪化の程度を評価する方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該抗白髪剤の有効性を評価することを特徴とする、毛髪に対する抗白髪剤の有効性を評価する方法。
【請求項８】
被験対象に対して抗薄髪剤を施す前および後にそれぞれ、請求項１〜５のいずれかに記載の毛髪の薄毛化の程度を評価する方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該抗薄髪剤の有効性を評価することを特徴とする、毛髪に対する抗薄髪剤の有効性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は毛髪の状態を評価する方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の状態を的確に把握することは、健康的な毛髪を維持するため、また、白髪や薄髪といった毛髪の悩みに対する適切なヘアケアをする上で重要である。化粧品、整髪剤や育毛剤、養毛剤などによるヘアケアを実施するに際しては、例えば目視的な問診などを通じて、製品使用者の髪質が評価されてきた。最近では、毛髪の状態または機能をより客観的に評価するために、各種の計測機器を利用して髪質を機器固有のパラーメーターで表記する方法や、髪質に関与するタンパク質の発現レベルあるいは酵素の活性を測定する生化学的・分子生物学的方法なども取り入れられている。また、遺伝学的な検討も行われている。一例として、毛髪に関与する遺伝子の遺伝学的検査を化粧品の提供、毛髪の治療又は診断に応用する方法が提案されている（特許文献１）。これらの方法では、皮膚または毛髪関連遺伝子に注目し、その情報（ＤＮＡ配列情報）を基に毛髪の状態等を評価する。確かに皮膚または毛髪関連遺伝子の遺伝子情報は毛髪の性状を特徴付ける重要な一因となる。しかしながら、ＤＮＡ配列情報が毛髪機能に貢献又は影響するためには遺伝子の発現が必要であること、および遺伝子によっては個人の生活習慣などの内的要因や気候などの外的要因のために生涯発現しない可能性も考えられること等を考慮すれば、毛髪関連遺伝子のＤＮＡ配列情報だけでは、様々な要因が絡み合った結果として形成される、毛髪の状態を的確に捉えることはできず、特に外的な要因による毛髪の状態変化を理解することは不可能である。
【０００３】
ところで、毛髪は、皮表に出た毛幹と皮膚内に埋没した毛根に分けられる。毛幹は外側より毛小皮・毛皮質・毛髄質の３層よりなる。毛根は皮膚内に陥没した鞘状の毛包に包まれて固着し、下端は球状に膨らんで毛球を形成し、毛球の下面は凹んで毛乳頭が入り、毛球側の毛母と接している。毛包は、コラーゲン鞘と毛髪組織として最終分化を遂げる以前の細胞である外毛根鞘により構成されており、これらが、毛乳頭と相互作用することにより、複雑な成熟のプロセスを受け、結果として最終分化組織である毛幹になり皮表へと出る。
【０００４】
毛包部に注目した検討として、毛包を含む毛髪全体を用いて、チロシナーゼが起因する白髪およびそれらに対する抗白髪剤を評価する方法は報告されている（特許文献２）。また、毛包を含む全体の毛髪を用いて、ヘアケラチンなどを指標にすることにより、毛質の違いを評価する方法が報告されている（特許文献３）。また、皮膚に含まれる遺伝子の発現を解析することにより、薄毛化する部分を予測し、適切な育毛剤・養毛剤を適応する評価方法が報告されている（特許文献４）。これらの特許文献に開示された方法では、皮下に埋没した毛包部や皮膚組織に存在する生細胞から抽出したｍＲＮＡを利用する。従って、その実施に際しては、外毛根鞘を含む毛髪を採取するために大量の毛髪を抜くまたは皮膚組織を比較的深層まで採取する必要があり、被験者の苦痛を伴い、しかも傷が残る危険性がある。また、抜去した毛髪の毛包部や切除した皮膚組織には線維芽細胞、神経細胞、血管細胞などの複数の種類の細胞が存在している。つまり、毛包を含む毛髪全体には毛髪の最終分化組織である毛幹を形成する細胞とは異なる細胞が多く含まれてくるため、それらに含まれる細胞を使用して白髪、薄毛等の要因を正確に評価できない問題があった。
【０００５】
一方、皮表に出た毛幹部に注目した検討も行われている。即ち、毛髪の状態を評価する方法として、毛幹部のコレステロール、カルボキシル基、アミノ基、ＤＮＡの量を測定することで毛髪の損傷度を評価する方法（特許文献５）などが考案されている。このような特定のタンパク質を指標にして毛髪の状態を評価する方法は、毛髪の表現形質からアプローチしたものであるため、毛髪の状態変化の根本的な原因が何かについての詳細な検討がほとんどなされていないのが現状である。したがって、いかにして白髪や薄髪が発生するのか明確でない状況で、その原因に応じた毛髪のトリートメント方法や薬剤などを見つけることは、非常に困難であった。
【特許文献１】特開２００３−２７１７２８号公報
【特許文献２】特開２０００−３００２９８号公報
【特許文献３】特開２００６−１４７２１号公報
【特許文献４】特開平１０−１６５３７４号公報
【特許文献５】特開平９−１２７１０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毛髪の毛幹に存在する細胞は脱核していることから、そこでは新生ｍＲＮＡの合成は行われず、ｍＲＮＡは存在しないと考えられていた。実際、毛幹に存在するｍＲＮＡを利用した遺伝子発現解析の報告はない。一方、毛幹以外、つまり皮膚の中に埋没した毛包や毛根部分に存在する有核細胞組織についてはその遺伝子発現解析が行われている（特許文献２〜４等）。しかしながら、上記の通り、毛幹以外の有核細胞組織を利用した遺伝子発現解析には侵襲性の問題や美容上の問題が伴う。例えば、頭皮は毛髪研究において重要な解析対象の組織であるが、これを利用するためには医師の施術が必要であることを考慮すれば、毛幹以外の有核細胞組織を利用した遺伝子発現解析は、ヘアケアないし美容の目的で毛髪の状態を評価する方法としては適切といえない。さらに、最終分化組織である毛幹を形成する細胞とは異なる細胞が多く含まれてくるため、白髪、薄毛等の要因を正確に評価できない問題があった。尚、上記の通りいくつかの研究報告はあるものの、遺伝子レベル又は遺伝子発現レベルでのアプローチから毛髪の状態変化の解明を図る研究は十分にはなされていなかった。
本発明は以上の背景に鑑み、非侵襲的であり、且つ客観性の高い評価結果が得られる、毛髪の状態を評価する方法を提供することを主たる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上の課題の下、本発明者らは毛幹に注目して鋭意検討した。その結果、毛幹中から十分な量のｍＲＮＡを抽出できることが判明した。一方、抽出したｍＲＮＡを用いた遺伝子発現解析の結果、毛髪の状態と関連する複数の遺伝子が見出された。このように、毛幹から抽出されるｍＲＮＡを用いた遺伝子発現解析が毛髪の状態を評価する方法として有効であるとの知見が得られるとともに、遺伝子発現解析において注目すべき具体的な遺伝子を同定することにも成功した。本発明は主として当該知見および成果に基づくものであり、以下に列挙する、毛髪の状態を評価する方法等を提供する。
［１］毛髪の状態を評価する方法であって、被験対象より採取した毛髪の毛幹部の遺伝子発現量を指標とする評価方法。
［２］前記遺伝子発現量が、前記毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として解析した遺伝子発現量である、［１］に記載の方法。
［３］（１）被験対象の特定部位の毛髪より採取した毛幹を用意するステップ、
（２）前記毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として遺伝子発現解析を行い、毛髪の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、および
（３）ステップ（２）で算出した発現量を用いて毛髪の状態を評価するステップ、
を含む、［２］に記載の方法。
［４］ステップ（３）において、ステップ（２）で算出した発現量を基準発現量に照合して毛髪の状態を評価する、［３］に記載の方法。
［５］前記遺伝子発現解析がマイクロアレイ法又はＰＣＲ法によって行われる、［３］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記遺伝子が、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１、ＧＯＳＲ１、ＬＩＰＴ１、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ２５３、ＳＣＡＮＤ２、ＲＦＸ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＡＬＧ５、ＬＲＲＣ４１、ＲＡＢＬ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｃ、ＡＢＣＣ９、ＴＲＰＶ１、Ｐ４ＨＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＰＡＲＰ３、ＭＯＧ、ＨＩＡＴＬ２、ＭＩＣＢ、およびＤＦＦＢからなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記遺伝子が、ＫＲＴＡＰ２−２、ＫＲＴＡＰ４−９、およびＨＩＡＴ１からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［８］前記毛髪の状態が、白髪に関する状態である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記遺伝子が、Ｃ２２ＯＲＦ２９、ＲＳ２５＿ＨＵＭＡＮ、ＫＲＴ１０、ＲＳ２７Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＳ１３＿ＨＵＭＡＮ、ＯＲ２Ｋ２、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＴＢＣＡ、ＫＲＴ１、ＲＨＯＴ２、ＲＰＬ３６、ＷＤＲ４５Ｌ、ＵＳＰ２、ＭＡＤＣＡＭ１、ＣＢＸ８、ＡＫＲ７Ａ２、ＧＹＰＣ、ＣＣＬ３、ＡＰＯＬ３、ＰＶＲＬ１、ＮＲ２Ｆ６、ＣＤＣ２Ｌ５、ＰＧＦ、ＬＹＰＤ２、ＥＴＦＡ、ＡＣＡＡ１、ＷＮＴ３Ａ、ＵＳＰ２２、ＡＬＤＯＡおよびＩＬ３２からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記遺伝子が、ＫＲＴＨＢ６、ＳＬＡＭＦ１、ＫＲＴＡＰ３−１およびＣＨＲＮＡ１０からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記毛髪の状態が、薄毛に関する状態である、［１］〜［５］並びに［９］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］被験対象に対してトリートメント手段を施す前および後にそれぞれ、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該トリートメント手段の有効性を評価することを特徴とする、毛髪に対するトリートメント手段を評価する方法。
［１３］前記トリートメント手段が、抗白髪剤の効果を判定する方法である［１２］記載の方法。
［１４］前記トリートメント手段が、抗薄髪剤の効果を判定する方法である［１２］記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第１の局面は毛髪の状態を評価する方法（以下、「毛髪状態評価法」ともいう）を提供する。本発明の毛髪状態評価法では、被験対象より採取した毛髪の毛幹部の遺伝子発現量を指標として毛髪の状態を評価する。毛髪の中で皮表に出た毛幹を遺伝子発現解析の試料として用いることから、本発明の毛髪状態評価法は非侵襲的であり且つ容易に実施可能なものとなる。
被験対象は典型的にはヒトである。但し、イヌやネコなどのペット動物のように体毛のトリートメントの対象となる動物を被験対象としてもよい。つまり、ヘアケア等の対象となる限り、毛髪をもつヒト又はヒト以外の動物に対して本発明の毛髪状態評価法を適用することが可能である。ヒト以外の動物の具体例として、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等を挙げることができる。
【０００９】
毛髪からの毛幹の採取方法は特に限定されないが、例えば、切り取った毛髪や自然脱落した毛髪から毛幹を採取することができる。非常に簡便に実施できる点において前者の方法は特に好ましい。
【００１０】
毛髪を採取する部位は特に限定されない。原則的には、そこでの毛髪の状態を評価したい部位より毛幹を採取する。例えば、頭部の毛髪の状態を評価するためには頭部の毛髪より毛幹を採取するとよい。但し、ある部位の毛髪の状態を評価する場合に、他の部位から採取した毛幹を用いることを妨げるものではない。
様々な部位の中でも頭部はヘアケアの対象として最も重要であることから、本発明の好ましい一態様では頭部の毛髪より毛幹の採取を行う。
【００１１】
本発明における「遺伝子発現量」とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ量であり、遺伝子発現解析により遺伝子の発現状態を調べることにより測定することができる。又は、遺伝子の発現産物であるタンパク質の量の解析を行うようにしてもよい。
【００１２】
ｍＲＮＡ量の測定には、マイクロアレイ解析や、逆転写反応を行った後にポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を行う方法などを用いることができる。これらの方法は常法に従って実施すればよい。各方法について様々なプロトコールが報告されており、当業者であれば公知のプロトコールに従い、又は公知のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールによって、適切な測定系を構築し、そして実施することができる。尚、ｍＲＮＡ量の測定による遺伝子発現解析の詳細については後述する。
【００１３】
一方、タンパク質量の測定であれば、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウエスタンブロット法、免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法）などを用いることができる。これらの方法についても常法に従って実施すればよい。各方法について様々なプロトコールが報告されており、当業者であれば公知のプロトコールに従い、又は公知のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールによって、適切な測定系を構築し、そして実施することができる。
【００１４】
本発明において「毛髪の状態」とは、白髪、薄髪、くせ毛、柔軟性、太さ、光沢、色調、滑らかさ、櫛通り、伸び率、引っ張り強度、吸水率、毛周期の長さ、成長速度、含水量に関わる指標の程度をいう。本発明の毛髪状態評価法では、これらの中の１種又は２種以上について評価する。好ましくは、白髪の指標及び薄髪の指標に関して評価する。
【００１５】
本発明の毛髪評価法は好ましくは以下の一連のステップ（１）〜（３）によって実施される。
（１）被験対象の特定部位の毛髪より採取した毛幹を用意するステップ、
（２）前記毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として遺伝子発現解析を行い、毛髪の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、および
（３）ステップ（２）で算出した発現量を用いて毛髪の状態を評価するステップ。
【００１６】
ステップ（１）では、被験対象の特定部位より採取した毛幹を用意する。上記の通り、毛幹の採取部位は特に限定されない。好ましくは頭部より毛幹を採取する。以下に、毛幹の採取法およびｍＲＮＡの抽出法の具体例を示す。
（ａ）皮膚などを傷つけないように毛髪の一部を切って採取する。例えば、皮表に出た毛髪をはさみで切って毛幹部分を採取する。
（ｂ）採取した毛幹を細切し、ＳＤＳやβ−メルカプトエタノール、グアニジンイソチオシアネートなどを含む溶解性緩衝液に浸した後、タンパク質分解酵素を加え反応させる。
（ｃ）反応終了後、例えば超音波破砕機等の物理的な力によって毛幹を破砕する。
（ｄ）上清にエタノール溶液を加え、周知の核酸抽出法に準じた方法や市販されたキットを用いた方法によりｍＲＮＡを抽出する。例えばグアニジンイソチオシアネート、フェノールおよびクロロホルムを用いたＲＮＡ抽出法やニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ、インビトロジェン社のＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、あるいはＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ  ＫｉｔやＡｍｂｉｏｎ社のＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｋｉｔなどを用いる方法などでｍＲＮＡを抽出する。
（ｅ）必要に応じて、ＤＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素を用いることで混在するＤＮＡを除去する。
（ｆ）エタノール沈殿等の核酸濃縮法を用いてｍＲＮＡを濃縮する。
【００１７】
ステップ（１）に続くステップ（２）では、採取した毛幹から抽出したｍＲＮＡを試料として遺伝子発現解析を行う。そして、当該遺伝子発現解析により特定の遺伝子の発現量を算出する。このように本発明の一態様では、毛幹中に残存するｍＲＮＡの量を指標とした遺伝子発現解析を行う。ところで、毛幹は、毛母でできた新しい細胞が上に押し上げられながら角化し、核などの細胞成分を失い主にケラチン繊維の塊へと変化したものであり、死細胞の塊であるので通常新生ｍＲＮＡは生成されない。分解されずに毛幹部に残存したｍＲＮＡを用いる点が本発明の最大の特徴の一つである。尚、遺伝子発現解析では、「遺伝子の発現量」は絶対値又は相対値（比較対象又は標準の発現量との比率や差など）として算出される。
【００１８】
遺伝子発現解析でその発現量が調べられることになる「特定の遺伝子」とは、毛髪の状態に関連する遺伝子である。毛髪の状態に関連する遺伝子である限り、任意の遺伝子を解析対象とすることができる。毛髪の状態に関連する遺伝子は、後述の実施例に示すように、マイクロアレイなどを用いた実験によって同定することが可能である。本発明者らは、白髪の程度の評価において特に有効な複数の遺伝子、即ち、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１、ＧＯＳＲ１、ＬＩＰＴ１、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ２５３、ＳＣＡＮＤ２、ＲＦＸ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＡＬＧ５、ＬＲＲＣ４１、ＲＡＢＬ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｃ、ＡＢＣＣ９、ＴＲＰＶ１、Ｐ４ＨＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＰＡＲＰ３、ＭＯＧ、ＨＩＡＴＬ２、ＭＩＣＢ、およびＤＦＦＢ（以上、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群。「第１遺伝子群」とも呼ぶ）、並びにＫＲＴＡＰ２−２、ＫＲＴＡＰ４−９、およびＨＩＡＴ１（以上、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群。「第２遺伝子群」とも呼ぶ）、並びにＣ２２ＯＲＦ２９、ＲＳ２５＿ＨＵＭＡＮ、ＫＲＴ１０、ＲＳ２７Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＳ１３＿ＨＵＭＡＮ、ＯＲ２Ｋ２、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＴＢＣＡ、ＫＲＴ１、ＲＨＯＴ２、ＲＰＬ３６、ＷＤＲ４５Ｌ、ＵＳＰ２、ＭＡＤＣＡＭ１、ＣＢＸ８、ＡＫＲ７Ａ２、ＧＹＰＣ、ＣＣＬ３、ＡＰＯＬ３、ＰＶＲＬ１、ＮＲ２Ｆ６、ＣＤＣ２Ｌ５、ＰＧＦ、ＬＹＰＤ２、ＥＴＦＡ、ＡＣＡＡ１、ＷＮＴ３Ａ、ＵＳＰ２２、ＡＬＤＯＡおよびＩＬ３２（以上、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群。「第３遺伝子群」とも呼ぶ）、並びにＫＲＴＨＢ６、ＳＬＡＭＦ１、ＫＲＴＡＰ３−１およびＣＨＲＮＡ１０（以上、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群。「第４遺伝子群」とも呼ぶ）を同定することに成功した（実施例の欄を参照）。本発明では、好ましくは、第１遺伝子群より選択される１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ量、又は第２遺伝子群より選択される１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ量、又は第３遺伝子群より選択される１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ量、又は第４遺伝子群より選択される１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する。一般に、解析する遺伝子の数が増加するほど信頼性の高い評価を得ることができるといえる。その一方で、解析する遺伝子の数の増加はデータ処理を複雑にし、簡便性および迅速性を損ないかねない。また、解析に要する費用の増大をも引き起こす。そこで、解析する遺伝子の数は好ましくは１〜３０個、更に好ましくは３〜２０個、更に更に好ましくは５〜１０個である。
尚、上記の各遺伝子のＲｅｆＳｅｑ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）での番号および説明と、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）でのアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を図１、２、６及び７に示す。
【００１９】
ここで、毛幹から抽出したｍＲＮＡを用いた遺伝子発現解析法の具体例を以下に示す。１．マイクロアレイを用いた方法
（ａ）毛幹の微量ＲＮＡからマイクロアレイ用ターゲットあるいはサンプルプローブを調製するために、ＰＣＲ法あるいはＴ７リニア増幅法に基づいた方法でｍＲＮＡを増幅する。例えば、Ｔ７  リニア増幅法を利用したＥｘｐｒｅｓｓ  Ａｒｔ  Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｒｔｕｓ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行うことができる。参照ＲＮＡ（リファレンスＲＮＡ）や比較対照とする毛幹の微量ＲＮＡの増幅反応も並行して行う。参照ＲＮＡは、市販されているマイクロアレイリファレンス用ＲＮＡを用いることができる。
（ｂ）目的の毛幹から得られた増幅したｍＲＮＡと、参照ＲＮＡまたは比較対照ＲＮＡを２種類の蛍光色素でラベル化した後にアルカリ条件下で断片化する。蛍光色素は、２種類のターゲットを識別できる蛍光波長を発するものならばどのような組み合わせでも使用可能であるが、Ｃｙ３とＣｙ５、Ａｌｅｘａ５５５とＡｌｅｘａ６４７などの組み合わせが好ましい。
（ｃ）断片化した蛍光標識ＲＮＡを、マイクロアレイにハイブリダイゼーションする。
（ｄ）マイクロアレイを洗浄したのち、スキャニングを行い、各スポットの発現量を測定する。
【００２０】
２．ＲＴ−ＰＣＲを用いた方法
（ａ）抽出したｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製する。
（ｂ）ｃＤＮＡを鋳型に、ターゲットとなる遺伝子に対応するプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応を行い、目的の遺伝子に対応するＤＮＡ断片を得る。
（ｃ）内部標準となるような遺伝子（ＧＡＰＤＨやβ−アクチンなど）の反応も並行して行う。
（ｄ）得られたＤＮＡ断片の電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドなどで染色し、バンドの強度を測定し、その遺伝子の発現量とする。
（ｅ）必要に応じて、Ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素やＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅなどの蛍光プローブを用いて定量ＰＣＲ反応を行い、発現量を定量する。
（ｆ）内部標準となる遺伝子の発現量に対する目的の遺伝子の発現量の比率を算出する。
【００２１】
ステップ（３）では、ステップ（２）で算出した発現量を用いて毛髪の状態を評価する。例えば、算出した発現量を、予め設定した基準発現量に照合して毛髪の状態を評価する。具体的には例えば、毛髪の状態に関する評価と、当該評価に対応する発現量の範囲とが関連付けられた複数の区分を設定しておき、算出した発現量がいずれの区分に該当するのかを調べる。区分の設定に関する具体例（毛髪の状態の指標として「白髪化の進行度」並びに「薄髪化の進行度」を評価する場合の例）を以下に示す。
（例１：遺伝子発現量の増加が白髪の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例）
白髪化の進行度１（低度）：発現量＜ａ、白髪化の進行度２（中程度）：ａ≦発現量＜ｂ、白髪化の進行度３（高度）：ｂ≦発現量
（例２：遺伝子発現量の減少が白髪の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例）
白髪化の進行度１（２０代相当）：ａ＜発現量、白髪化の進行度２（３０代相当）ｂ＜発現量≦ａ、白髪化の進行度３（４０代相当）：ｃ＜発現量≦ｂ、白髪化の進行度４（５０代相当）：ｄ＜発現量≦ｃ、白髪化の進行度５（６０代相当）：発現量≦ｄ
（例３：遺伝子発現量の増加が薄髪の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例）
薄髪化の進行度１（低度）：発現量＜ａ、薄髪化の進行度２（中程度）：ａ≦発現量＜ｂ、薄髪化の進行度３（高度）：ｂ≦発現量
（例４：遺伝子発現量の減少が薄髪の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例）
薄髪化の進行度１（２０代相当）：ａ＜発現量、薄髪化の進行度２（３０代相当）ｂ＜発現量≦ａ、薄髪化の進行度３（４０代相当）：ｃ＜発現量≦ｂ、薄髪化の進行度４（５０代相当）：ｄ＜発現量≦ｃ、薄髪化の進行度５（６０代相当）：発現量≦ｄ
【００２２】
本発明の一態様では二つの部位から毛幹を採取することにし、各毛幹の遺伝子発現解析を行う。そして、各毛幹に関して算出された発現量を比較し、比較結果に基づき毛髪の状態を評価する。即ち、この態様の毛髪状態評価法では、以下の一連のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が実施されることになる。
（ｉ）被験対象の第１部位から採取した毛幹と、該被験対象の第２部位から採取した毛幹とを用意するステップ
（ｉｉ）前記各毛幹について、そこから抽出したｍＲＮＡを試料とした遺伝子発現解析を行い、毛髪の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で算出した二つの発現量を比較し、第１部位の毛髪の状態を評価するステップ。
【００２３】
ステップ（ｉｉｉ）では算出した二つの発現量が比較される。例えば、第２発現量に対する第１発現量の比率、又は第１発現量と第２発現量の差（第１発現量−第２発現量）を計算する。そして、計算値が、毛髪の状態に関する評価が関連付けられた複数の区分の中のいずれに該当するのかを調べる。区分の設定に関する具体例（第２発現量に対する第１発現量の比率を用い、毛髪の状態の指標として「白髪化の進行度」並びに「薄髪化の進行度」を評価する場合の例）を以下に示す。
（例５：発現量の比率の増加が白髪化の進行度と相関する遺伝子を利用した場合の例）
白髪化の進行度１（低度）：比率＜ａ、白髪化の進行度２（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、白髪化の進行度３（高度）：ｂ≦比率
（例６：発現量の比率の減少が白髪化の進行度と相関する遺伝子を利用した場合の例）
白髪化の進行度１（２０代相当）：ａ＜比率、白髪化の進行度２（３０代相当）ｂ＜比率≦ａ、白髪化の進行度３（４０代相当）：ｃ＜比率≦ｂ、白髪化の進行度４（５０代相当）：ｄ＜比率≦ｃ、白髪化の進行度５（６０代相当）：比率≦ｄ
（例７：発現量の比率の増加が薄髪化の進行度と相関する遺伝子を利用した場合の例）
薄髪化の進行度１（低度）：比率＜ａ、薄髪化の進行度２（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、薄髪化の進行度３（高度）：ｂ≦比率
（例８：発現量の比率の減少が薄髪化の進行度と相関する遺伝子を利用した場合の例）
薄髪化の進行度１（２０代相当）：ａ＜比率、薄髪化の進行度２（３０代相当）ｂ＜比率≦ａ、薄髪化の進行度３（４０代相当）：ｃ＜比率≦ｂ、薄髪化の進行度４（５０代相当）：ｄ＜比率≦ｃ、薄髪化の進行度５（６０代相当）：比率≦ｄ
【００２４】
以上の例１〜８では区分の数を３（例１、３、５、７）又は５（例２、４、６、８）としているが、区分の数は特に限定されるものではない。例えば、区分数を２〜１０のいずれかにすることができる。区分の数、および各区分に関連付けられる基準値の範囲は、予備実験の結果を基に任意に設定可能である。
【００２５】
本発明は第２の局面として、毛髪に対するトリートメント手段を評価する方法（以下、「トリートメント手段評価法」ともいう）を提供する。本発明のトリートメント手段評価法では、本発明の毛髪状態評価法を利用する。具体的には、被験対象に対してトリートメント手段を施す前と後にそれぞれ、本発明の毛髪状態評価法を実施し、得られた評価結果を比較することによって、当該トリートメント手段の有効性を評価する。本発明のトリートメント手段評価法は、毛髪の状態に関連する遺伝子の発現量という科学的根拠に基づいた評価を行うことから、その客観性および信頼性が高い。
「トリートメント手段」とは、毛髪の状態の改善又は回復を目的として毛髪や皮膚に施される手段をいい、その代表例は抗白髪剤、整髪料、育毛剤、養毛剤、化粧品の使用である。用語「トリートメント手段」が表す概念の中にヘアケア方法、トリートメント方法、スキンケア方法が含まれる。
【実施例】
【００２６】
１．毛幹に含まれるｍＲＮＡの抽出
被験者の頭部毛髪より、皮表に出ている毛幹部分を３本はさみで切り、毛幹を得た。得られた毛幹に含まれるｍＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ社製、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。すなわち、得られた毛幹を細切し、３５０μＬのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、５６℃で１６時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて、分散させた後、３５０μＬの６４％エタノールを加えて攪拌し、毛幹抽出液を得た。付属のＦｉｌｔｅｒ  ＣａｒｔｒｉｇｅにｍＲＮＡを吸着させた後に、１００μＬの溶出液でｍＲＮＡを溶出した。得られた溶出液にＤＮａｓｅＩを加え、残存しているＤＮＡを完全に除去した後、エタノールを用いてｍＲＮＡを沈殿させてｍＲＮＡを濃縮した。得られたｍＲＮＡのペレットを必要量の水に溶解して、毛幹に含まれる残存ｍＲＮＡを得た。
【００２７】
２．毛幹に含まれるｍＲＮＡのマイクロアレイ解析（１）
（１）材料および方法
被験者６名の頭頂部の白髪および黒髪の毛幹より上記１．の方法で残存ｍＲＮＡを得た。当該各ＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓ  Ａｒｔ  Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｒｔｕｓ社、  Ｇｅｒｍａｎｙ）により増幅し、Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光色素でラベル化した後にアルカリ条件下で断片化した。次に、断片化したターゲットをヒトオリゴヌクレオチドマイクロアレイＨｕｍａｎ  ３５Ｋ  （フィルジェン社、名古屋）に４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、洗浄し、マイクロアレイスキャナースキャンアレイＧｘ（パーキンエルマー）で画像データを読み取った。画像データから、各スポットのシグナル強度をマイクロアレイ解析ソフトウエアであるスキャンアレイエクスプレスで数値化した。白髪と黒髪の毛幹サンプル６人分のマイクロアレイデータを解析し、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率（ｌｏｇ（黒髪の発現値）／（白髪の発現値））を算出した。実験は、一組の比較でｍＲＮＡを標識する蛍光色素を入れ替えて２回ハイブリダイゼーションさせるＤｙｅスワップ法で行った。マイクロアレイデータは、シグナル値からバックグランド値を引いた後に総シグナルの総和で正規化した。Ｃｙ３／Ｃｙ５値を計算し、ｌｏｇ変換および標準得点化した。そして、蛍光色素を入れ替えることで発現比率が、プラスからマイナスへ、あるいはマイナスからプラスへ入れ替わっている遺伝子を、蛍光色素によるノイズの影響を受けずに発現変動しているものとして選択した。
【００２８】
（２）解析結果（１）
クラスタリングの結果、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子を２４個、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子を３個、同定することができた（図３および４）。このように、白髪化に関与する有用な遺伝子を見出すことに成功した。これらの遺伝子の発現量に注目すれば毛髪の白髪化の程度を評価できるといえる。
【００２９】
白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群（第１遺伝子群）の中には、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１、ＧＯＳＲ１、ＬＩＰＴ１、ＺＮＦ６６、ＺＮＦ２５３、ＳＣＡＮＤ２、ＲＦＸ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＡＬＧ５、ＬＲＲＣ４１、ＲＡＢＬ２Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｃ、ＡＢＣＣ９、ＴＲＰＶ１、Ｐ４ＨＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＰＡＲＰ３、ＭＯＧ、ＨＩＡＴＬ２、ＭＩＣＢ、およびＤＦＦＢが含まれていた（図１を参照）。また、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群（第２遺伝子群）の中には、ＫＲＴＡＰ２−２、ＫＲＴＡＰ４−９、およびＨＩＡＴ１が含まれていた（図２を参照）。
【００３０】
３．毛幹に含まれるｍＲＮＡのマイクロアレイ解析（２）
（１）材料および方法
被験者６名の頭頂部の薄髪および後頭部の太髪の毛幹より上記１．の方法で残存ｍＲＮＡを得た。当該各ＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓ  Ａｒｔ  Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｒｔｕｓ社、  Ｇｅｒｍａｎｙ）により増幅し、Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光色素でラベル化した後にアルカリ条件下で断片化した。次に、断片化したターゲットをヒトオリゴヌクレオチドマイクロアレイＨｕｍａｎ  ３５Ｋ  （フィルジェン社、名古屋）に４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、洗浄し、マイクロアレイスキャナースキャンアレイＧｘ（パーキンエルマー）で画像データを読み取った。画像データから、各スポットのシグナル強度をマイクロアレイ解析ソフトウエアであるスキャンアレイエクスプレスで数値化した。薄髪と太髪の毛幹サンプル６人分のマイクロアレイデータを解析し、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率（ｌｏｇ（太髪の発現値）／（薄髪の発現値））を算出した。マイクロアレイデータは、シグナル値からバックグランド値を引いた後に総シグナルの総和で正規化した。Ｃｙ３／Ｃｙ５値を計算し、ｌｏｇ変換した。そして、６人に共通してｌｏｇ２(Ｃｙ３／Ｃｙ５)が−１以下の遺伝子を太髪で発現が低下していたもの、１以上の遺伝子を太髪で発現が上昇したものとして選択した。
【００３１】
（２）解析結果（２）
クラスタリングの結果、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子を３０個、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子を４個、同定することができた（図５および６）。このように、薄髪化に関与する有用な遺伝子を見出すことに成功した。これらの遺伝子の発現量に注目すれば毛髪の薄髪化の程度を評価できるといえる。
【００３２】
薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群（第３遺伝子群）の中には、Ｃ２２ＯＲＦ２９、ＲＳ２５＿ＨＵＭＡＮ、ＫＲＴ１０、ＲＳ２７Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＳ１３＿ＨＵＭＡＮ、ＯＲ２Ｋ２、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＴＢＣＡ、ＫＲＴ１、ＲＨＯＴ２、ＲＰＬ３６、ＷＤＲ４５Ｌ、ＵＳＰ２、ＭＡＤＣＡＭ１、ＣＢＸ８、ＡＫＲ７Ａ２、ＧＹＰＣ、ＣＣＬ３、ＡＰＯＬ３、ＰＶＲＬ１、ＮＲ２Ｆ６、ＣＤＣ２Ｌ５、ＰＧＦ、ＬＹＰＤ２、ＥＴＦＡ、ＡＣＡＡ１、ＷＮＴ３Ａ、ＵＳＰ２２、ＡＬＤＯＡおよびＩＬ３２が含まれていた（図５を参照）。また、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群（第４遺伝子群）の中には、ＫＲＴＨＢ６、ＳＬＡＭＦ１、ＫＲＴＡＰ３−１およびＣＨＲＮＡ１０が含まれていた（図６を参照）。
【００３３】
４．毛幹に含まれるｍＲＮＡのＰＣＲ解析（１）
被験者６名の頭頂部の白髪および黒髪の毛幹より上記１．の方法で残存ＲＮＡを得た。各ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ）を用いた定量ＰＣＲ反応に供し、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１およびＧＯＳＲ１の発現量を定量した。すべての遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で規格化（ノーマライズ）した。尚、各遺伝子の発現の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００３４】
ＣＤＣ４２用のプライマーセット
GAGCCTCCAGAACCGAAGAA（配列番号１）
CGACACCAGCTGTGCAGAAA（配列番号２）
ＦＳＩＰ２用のプライマーセット
GCATTACCATTCGGGACATAGG（配列番号３）
TGCTGTGCAGAAGCTCTTTAGTTT（配列番号４）
ＣＥＰＴ１用のプライマーセット
CGCCCTAACTATCCTGTGTGAGA（配列番号５）
TGGCCCAAACCCTGCAT（配列番号６）
ＧＯＳＲ１用のプライマーセット
TCTCCTTTTTTGCTGTCCTCCTT（配列番号７）
CTTCTGACCTCCTGGCTGTGA（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
TGCACCACCAACTGCTTAGC（配列番号９）
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG（配列番号１０）
【００３５】
定量化はΔΔＣｔ法にて行い、白髪の毛幹の遺伝子発現量に対する黒髪の毛幹の遺伝子発現量（ｌｏｇ（黒髪の発現値）／（白髪の発現値））を算出した。その結果を図５に示す。図示の通り、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１およびＧＯＳＲ１は、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い。このように、ＣＤＣ４２、ＦＳＩＰ２、ＣＥＰＴ１およびＧＯＳＲ１の遺伝子発現量が白髪化の程度の評価・予測に有用であることが示された。
【００３６】
５．毛幹に含まれるｍＲＮＡのＰＣＲ解析（２）
被験者６名の頭頂部の薄髪および太髪の毛幹より上記１．の方法で残存ＲＮＡを得た。各ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ）を用いた定量ＰＣＲ反応に供し、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＦの発現量を定量した。すべての遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で規格化（ノーマライズ）した。尚、各遺伝子の発現の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００３７】
ＡＬＤＯＡ用のプライマーセット
GTCCCTTCCCCCAAGTTATCAA（配列番号１１）
TGGGTGGTAGTCTCGCCATT（配列番号１２）
ＰＧＦ用のプライマーセット
CAGCCACTTCCCCCTCTTC（配列番号１３）
GCCCCCAGGCAACCA（配列番号１４）
【００３８】
定量化はΔΔＣｔ法にて行い、薄髪の毛幹の遺伝子発現量に対する太髪の毛幹の遺伝子発現量（ｌｏｇ（太髪の発現値）／（薄髪の発現値））を算出した。その結果を図１０に示す。図示の通り、ＡＬＤＯＡ、およびＰＧＦは、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い。このように、ＡＬＤＯＡ、ＰＧＦの遺伝子発現量が薄髪化の程度の評価・予測に有用であることが示された。
【００３９】
以上のようにＰＣＲ解析の結果はマイクロアレイ解析の結果と同様の傾向を示した。これによって、マイクロアレイ解析によって見出された遺伝子群の有用性が裏付けられると同時に、マイクロアレイ解析での知見は解析法の種類に依存したものではないことが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の毛髪状態評価法によれば、顧客に苦痛を与えることなく、非侵襲的に毛髪の状態を評価することができる。また、形態的な観察からはわからない毛髪の状態が遺伝子発現により評価できるため、客観性の高い評価結果を得ることができる。本発明は、遺伝子発現により評価した指標を用いて、顧客の毛髪に適合した整髪料、育毛剤、養毛剤、化粧品の選択やその使用法など、トリートメントないしスキンケア方法の選択を可能とする。
【００４１】
この発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、および特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】マイクロアレイ解析で同定された、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群。
【図２】マイクロアレイ解析で同定された、白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群。
【図３】白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群についてのマイクロアレイ解析の結果。
【図４】白髪に対する黒髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群についてのマイクロアレイ解析の結果。
【図５】マイクロアレイ解析で同定された４種の遺伝子を用いたＰＣＲ解析の結果。
【図６】マイクロアレイ解析で同定された、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群。
【図７】マイクロアレイ解析で同定された、薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群。
【図８】薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が高い遺伝子群についてのマイクロアレイ解析の結果。
【図９】薄髪に対する太髪の遺伝子発現比率が低い遺伝子群についてのマイクロアレイ解析の結果。
【図１０】マイクロアレイ解析で同定された２種の遺伝子を用いたＰＣＲ解析の結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005501570.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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