(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほう酸トリアルキル、ほう酸トリアリール及びほう酸トリアルカノールアミンからなる群より選ばれる有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿素窒素を定量する方法。
【請求項２】
有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ当たり１×１０−１０〜１ｍｏｌである請求項１記載の方法。
【請求項３】
有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ−トリルエステルである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ウレアーゼにほう酸トリアルキル、ほう酸トリアリール及びほう酸トリアルカノールアミンからなる群より選ばれる有機ほう素化合物を共存させることを特徴とするウレアーゼの安定化方法。
【請求項５】
有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ当たり１×１０−１０〜１ｍｏｌである請求項４記載の方法。
【請求項６】
有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ−トリルエステルである請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
ウレアーゼとほう酸トリアルキル、ほう酸トリアリール及びほう酸トリアルカノールアミンからなる群より選ばれる有機ほう素化合物とが共存してなる定量試薬組成物。
【請求項８】
有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ当たり１×１０−１０〜１ｍｏｌである請求項７記載の定量試薬組成物。
【請求項９】
有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ−トリルエステルである請求項７または８記載の定量試薬組成物。
【請求項１０】
ほう酸トリアルキル、ほう酸トリアリール及びほう酸トリアルカノールアミンからなる群より選ばれる有機ほう素化合物を含有する、ウレアーゼの安定化剤。
【請求項１１】
有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ−トリルエステルである請求項１０記載の安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床診断に有用な尿素窒素の定量方法に関する。また、本発明はウレアーゼの安定化方法および安定化されたウレアーゼを含有する定量試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿素窒素の定量方法として、試料中の尿素窒素を、ウレアーゼと反応させた後、生じるアンモニア量を、インドフェノールを用いて測定する方法またはグルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する方法が知られている〔最新検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３年）〕。しかし、これらの方法において使用するウレアーゼが不安定であるため、定量試薬組成物を長期間、安定に保つことが困難である。
【０００３】
ウレアーゼの拮抗阻害剤であるほう酸を添加することにより該酵素を安定化し、定量性を向上させる方法が知られている（特公平３─６５１６０号）。しかし、ほう酸を添加することを特徴とするウレアーゼを用いた尿素窒素の定量方法では、多量のほう酸を添加することが必要である上、同時再現性（ＣＶ）値が悪いため、より優れた定量方法の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、保存安定性および同時再現性の優れた、ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿素窒素を定量する方法、ウレアーゼに有機ほう素化合物を共存させることを特徴とするウレアーゼの安定化方法、およびウレアーゼと有機ほう素化合物とが共存してなる定量試薬組成物に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明によると、ウレアーゼに有機ほう素化合物を共存させることにより、ウレーゼを安定化させることができる。
有機ほう素化合物としては、ほう酸トリメチル、ほう酸トリエチル等のほう酸トリアルキル、ほう酸トリフェニル等のほう酸トリアリール、ほう酸トリエタノールアミン等のほう酸トリアルカノールアミン、ほう酸トリアリールアミン、ほう酸トリ−ｏ−トリルエステル等があげられる。これらの中でほう酸トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニル、ほう酸トリ−ｏ−トリルエステル等を使用することが好ましい。これらの化合物は、単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
【０００７】
ウレアーゼとしては、E.C. 3.5.1.5に分類されるウレアーゼであればどのようなものでもよく、ナタマメ等、植物由来のウレアーゼ、細菌（Bacillus  pasteurii など）、酵母、カビ等、微生物由来のウレアーゼ、動物由来のウレアーゼ等があげられるが、好ましくは微生物由来のウレアーゼが用いられる。また、上記のウレアーゼを遺伝子工学等で改変したものを用いてもよい。
【０００８】
ウレアーゼを安定化するためには、有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ（国際単位）当たり１×１０-10 〜１ｍｏｌ、好ましくは１×１０-8〜１×１０-1ｍｏｌとなるように有機ほう素化合物を添加すればよい。
【０００９】
本発明の定量試薬組成物は、使用時の濃度として、水性媒体中にウレアーゼが１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜４５Ｕ／ｍｌ、有機ほう素化合物が０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭとなるようにそれぞれを含有する。
【００１０】
水性媒体としては、精製水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、塩酸、リン酸、炭酸、フタル酸、トリス、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マレイン酸、グリシン、ピロリン酸、マロン酸、フマル酸、DL- 酒石酸、クエン酸、フランカルボン酸、β−アラニン、β：β’−ジメチルグルタル酸、DL- 乳酸、γ−アミノ酪酸、バルビツール酸、安息香酸、コハク酸、ε−アミノカプロン酸、酢酸、プロピオン酸、DL- リンゴ酸、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、グリセロールリン酸、β−グリセロリン酸およびこれらの塩、エチレンジアミン、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、Ｎ−エチルモルホリン、５，５−ジエチルバルビツール酸、２，５（４）−ジメチルイミダゾール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、ジエタノールアミン、４−アミノピリジン、エタノールアミン、エフェドリン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＨＥＰＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミン、ヘキサメチレンジアミン、ピペリジン及びグッドバッファー等があげられ、これら緩衝剤は単独または混合して緩衝液に用いられる。緩衝剤は緩衝液の濃度が０．００５〜２ｍｏｌ／ｌとなるように添加される。緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液等があげられる。緩衝液のｐＨは、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。
【００１１】
該定量試薬組成物には、他の成分として、他の酵素、補酵素、発色剤、界面活性剤、キレート剤、他の安定化剤、他の化合物等を含有してもよい。
他の酵素としては、例えばグルタミン酸脱水素酵素〔E.C. 1.4.1.2、E.C. 1.4.1.3またはE.C. 1.4.1.4〕があげられる。
補酵素としては、例えば還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨという）があげられる。
【００１２】
発色剤としては、例えばバートレット反応に用いられるフェノールおよび次亜塩素酸ナトリウム、ジクロロイソシアヌル酸塩およびサリチル酸があげられる。界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニエステルがあげられる。
キレート剤としては、例えばＥＤＴＡがあげられる。
【００１３】
他の安定化剤としては、例えばほう酸があげられる。
他の化合物としては、例えばα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧという）があげられる。
【００１４】
該定量試薬組成物は、あらかじめ全成分が水性媒体中に溶解した液体として調製してこれを用いてもよいし、全成分または一部成分が凍結乾燥品等の固体として調製し、使用時に水性媒体で溶解して用いてもよい。
【００１５】
本発明によると、水性媒体中、有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿素窒素を定量する方法を提供することができる。
【００１６】
水性媒体としては、精製水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、上記のものが用いられる。緩衝液のｐＨはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。
有機ほう素化合物の使用濃度としては、水性媒体中０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭである。
【００１７】
アンモニアを定量する方法としては、例えばインドフェノールを用いて測定する方法、グルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する方法があげられる〔最新検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３年）〕。
【００１８】
グルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する方法とは、生成したアンモニアを、α−ＫＧとＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとの存在下、グルタミン酸脱水素酵素で作用させ、該酵素活性を測定することによりアンモニア量を定量する方法のことである。具体的には、基質であるアンモニアおよびα−ＫＧを、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの補酵素の存在下、細菌、カビ、動物等由来のグルタミン酸脱水素酵素（E.C.1.4.1.3.またはE.C.1.4.1.4.）を作用させたとき、減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ量を蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測定することにより、アンモニア量を定量する方法のことである。
【００１９】
以下に本発明の定量方法をより詳細に説明する。
（１）インドフェノールを用いた方法
ｐＨを７〜１０、好ましくは７．５〜９．５に調整した緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜４５Ｕ／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合物、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのα−ケトグルタル酸を添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションした後、試料を加え更に１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。反応終了後、反応液のアンモニア量をインドフェノールで定量し、対応する尿素窒素を定量する。
【００２０】
（２）グルタミン脱水素酵素を用いた定量方法
試料中のアンモニアを消去するためｐＨを８〜１０、好ましくは９〜１０に調整した緩衝液に、１〜１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌのグルタミン酸脱水素酵素、１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのα−ＫＧを添加した第１試薬に、試料を添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションする。
【００２１】
これとは別にｐＨを７〜１０、好ましくは８〜９に調整した緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜４５Ｕ／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合物、必要により０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのα−ＫＧを添加し第２試薬とする。必要により緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃にして１〜１０分間プレインキュベーションする。
【００２２】
試料を含有する第１試薬にｐＨが７．５〜９．５、好ましくは８．５〜９．５になるように第２試薬を加え、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。なお、このときの第２試薬と第１試薬との混合比は１：９〜９：１、好ましくは１：３である。ウレアーゼ反応により生じたアンモニアは、グルタミン酸脱水素酵素反応によりグルタミン酸へ付加されるが、同時に消費されるＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの単位時間当たりの減少量を、蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測定してアンモニア量を定量することにより、対応する試料中の尿素窒素量を定量する。
【００２３】
なお、上記方法に使用する緩衝液には検体の可溶化剤を添加してもよい。可溶化剤の例としては、ＨＳ−２１０〔商品名：日本油脂（株）製〕、ＰＧＭ−５０〔商品名：和光純薬工業（株）製〕、トリトンＸ−１００〔商品名：シグマ社製〕、ＤＦ−１６〔商品名：シグマ社製〕、エマルゲンＡ−６０〔商品名：花王（株）製〕、エマルゲンＡ−９０〔商品名：花王（株）製〕、エマルゲン７０９〔商品名：花王（株）製〕等の界面活性剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩、ＥＤＴＡナトリウム等があげられる。
【００２４】
本発明の定量方法は、尿素窒素を含有する試料であれば、いずれの試料についても適用することができる。
試料としては、例えば生体から採取した体液即ち血液、血清、尿、髄液、腹腔液、透析液等があげられる。
【００２５】
以下に、本発明の実施例を示す。
【００２６】
【実施例】
実施例１（標準血清中の尿素窒素の定量）
【００２７】
【表１】
0003729900.tif 000002
【００２８】
第１表に示された量の、α−ＫＧ、ＮＡＤＰＨ、グルタミン酸脱水素酵素を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．２）１００ｍｌに溶解し、第１試薬として調製した。一方、α−ＫＧ、ほう酸トリエタノールアミン（ナカライテスク製）、コリネバクテリウム属菌由来のウレアーゼをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００ｍｌに溶解し、第２試薬として調製した。２．２５ｍｌの第１試薬に３０μｌの標準血清を加え、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、３７℃で５分間プレインキュベーションした０．７５ｍｌの第２試薬を加え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の単位時間当たりの減少量を測定することによりウレアーゼ活性を測定した。同様の操作を２０回行い、ＣＶ値を求めた。
【００２９】
また比較例として、ほう酸トリエタノールアミンを第２試薬から除く以外は、実施例１と同様の組成の試薬を用いた対照群を、実施例１と同様の操作を２０回行い、そのＣＶ値を求めた。さらに、ほう酸トリエタノールアミンの代わりにほう酸を第２試薬に用いる以外は、実施例１と同様の組成の試薬を用い、実施例１と同様の操作を２０回行い、ＣＶ値を求めた。
【００３０】
以上各群の結果を第２表に示した。
【００３１】
【表２】
0003729900.tif 000003
【００３２】
第２表に示されるとおり、各種濃度において、有機ほう酸の添加群のほうがほう酸が添加群よりもＣＶ値が低く、定量方法として精度が高かった。
【００３３】
実施例２（ウレアーゼ活性の安定化）
実施例１の第１表に記載された組成の０．７５ｍｌの第２試薬を試薬ａとし、試薬ａをさらに３０℃で１か月間保存して試薬ｂを調製した。第１試薬２．２５ｍｌに３０μｌの１６５ｍＭ尿素を加え、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、３７℃で５分間プレインキュベーションした０．７５ｍｌの試薬ａまたは試薬ｂを加え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の単位時間当たりの減少量を測定することによりウレアーゼ活性を測定した。この操作により得られた試薬ｂを添加したときのウレアーゼ活性および試薬ａを添加したときのウレアーゼ活性から、次式に従いウレアーゼ活性の残存率を算出した。
【００３４】
【数１】
0003729900.tif 000004
【００３５】
ほう酸エタノールアミンの代わりに、ほう酸トリフェニル、ほう酸トリ−ｏ−トリルエステルおよびほう酸をそれぞれ用いて、同様の実験を行いウレアーゼ活性の残存率を算出した。
なお、ほう酸トリフェニルおよびほう酸トリ−ｏ−トリルエステルについてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した後、第２試薬に加えた。
【００３６】
結果を第３表に示す。
【００３７】
【表３】
0003729900.tif 000005
【００３８】
第３表に示されるとおり、各種濃度において、有機ほう素化合物の添加群のほうがほう酸の添加群よりもウレアーゼ活性の残存率が高かった。
【００３９】
実施例３（定量試薬組成物１）
尿素窒素の定量に用いられる、第４表に示す組成からなる定量試薬組成物を調製した。
【００４０】
【表４】
0003729900.tif 000006
【００４１】
実施例４（定量試薬組成物２）
尿素窒素の定量に用いられる、第５表に示す組成からなる定量試薬組成物を調製した。
【００４２】
【表５】
0003729900.tif 000007
【００４３】
実施例５（定量試薬組成物３）
尿素窒素の定量に用いられる、第６表に示す組成からなる定量試薬組成物を調製した。
【００４４】
【表６】
0003729900.tif 000008
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、保存安定性および定量時の再現性の優れた、ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量方法を提供することができる。