(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウイルスのコートタンパク質中の非末端部位に付加物として異種ペプチドインサートを含む植物ウイルスの集合粒子であって、前記コートタンパク質中のインサートの部位が、当該インサートに隣接する直列ヌクレオチド反復配列を含まない植物ウイルスゲノム中の部位に対応し、ここで、前記ウイルスのコートタンパク質はβ−バレル構造を有し、そして前記異種ペプチドのインサート部位は前記植物ウイルスのβシートを連結するループ内に存在し、そして前記植物ウイルスがコモウイルス（comovirus）であることを特徴とする、集合粒子。
【請求項２】
前記異種ペプチドが植物ウイルスのβシートを連結しているループのプロリンまたはヒドロキシプロリン残基の次に挿入される、請求の範囲第１項に記載のウイルス粒子。
【請求項３】
前記コモウイルスがササゲモザイクウイルス（CPMV）である、請求の範囲第１項に記載のウイルス粒子。
【請求項４】
異種ペプチドが植物ウイルスのβＢ−βＣループに挿入されている、請求の範囲第１項に記載のウイルス粒子。
【請求項５】
前記異種ペプチドが生物学的機能を有するペプチドであり、このペプチドの生物学的利用には、より大きい分子または粒子と関連したペプチドの表示を必要としまたはこれによって増強される、請求の範囲第１項に記載のウイルス粒子。
【請求項６】
前記異種ペプチドが植物ウイルスのコートタンパク質の露出表面に組み込まれている、請求の範囲第１項または第５項に記載のウイルス粒子。
【請求項７】
前記植物ウイルスがRNAウイルスである、請求の範囲第１項または第５項に記載のウイルス粒子。
【請求項８】
前記異種ペプチドが口蹄疫ウイルス（FMDV）由来の動物ウイルス抗原である、請求の範囲第１項に記載のウイルス粒子。
【請求項９】
前記異種ペプチドがヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来の動物ウイルス抗原である、請求の範囲第１項、３項または４項に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
前記異種ペプチドがヒトライノウイルス（HRV）由来の動物ウイルス抗原である、請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のウイルス粒子。
【請求項１１】
前記異種ペプチドがイヌパルボウイルス由来の動物ウイルス抗原である、請求の範囲第１項、第３項または第４項に記載のウイルス粒子。
【請求項１２】
前記異種ペプチドがスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来の動物病原体抗原である、請求の範囲第１または５に記載のウイルス粒子。
【請求項１３】
前記異種ペプチドがペプチドホルモン由来の抗原である、請求の範囲第１項または第５項に記載のウイルス粒子。
【請求項１４】
前記異種ペプチドがゴナドトロピン放出ホルモン由来の抗原である、請求の範囲第13項に記載のウイルス粒子。
【請求項１５】
前記ペプチドが抗原である、請求の範囲第１項または第５項に記載のウイルス粒子。
【請求項１６】
前記抗原がウイルス抗原である、請求の範囲第15項に記載のウイルス粒子。
【請求項１７】
前記抗原が動物ウイルス抗原である、請求の範囲第16項に記載のウイルス粒子。
【請求項１８】
請求の範囲第17項に記載のウイルス粒子をその免疫原成分として含んでなる、動物ウイルス抗原複合体。
【請求項１９】
請求の範囲第18項に記載の抗原複合体をヒト以外の動物に投与することを含んで成る病原体に対して動物を保護する方法。
【請求項２０】
請求の範囲第15項に記載の集合したウイルス粒子をその免疫原成分として含む、抗原複合体。
【請求項２１】
請求の範囲第20項に記載の抗原複合体をヒト以外の動物に投与することを含んで成る病原体に対して動物を保護する方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項または第２項に記載の植物ウイルス粒子の製造方法において、異種ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、前記コートタンパク質をコードする植物ウイルス核酸のウイルスゲノムに導入し、この導入を、導入された配列に隣接する直列反復配列の産生を回避するように行い、植物、植物組織、植物細胞、または原形質体に、改質したウイルス核酸を感染させ、そして当該ウイルスの集合粒子を回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチド配列を、コートタンパク質の露出部分をコードする植物ウイルス核酸の部分に挿入する、請求の範囲第22項に記載の方法。
【請求項２４】
２種類の異なる制限酵素部位を選択することにより異種ヌクレオチド配列を植物ウイルス核酸に挿入し；対応する制限酵素を用いて前記植物ウイルス核酸を切断し；そして切断したウイルス核酸に、異種ペプチドをコードしかつ制限酵素切断部位と適合する末端で終わる相補的オリゴヌクレオチドの対を挿入することを含んで成り、ここで、前記相補的オリゴヌクレオチドにおいて、異種ペプチドをコードする配列に植物ウイルスに特異的な配列が隣接し、異種ヌクレオチドが植物ウイルス核酸に対する付加物として挿入される、請求の範囲第22項に記載の方法。
【請求項２５】
異種ペプチドをコードするDNA配列を、コートタンパク質の露出部分をコードする植物ウイルスのRNAに相当するcDNAに導入し、このように修飾したcDNAからRNA転写体を産生させ、植物、植物組織、植物細胞、または原形質体に、転写体を接種し、改質ウイルスの集合粒子を回収する、ことを含んで成る、RNA植物ウイルスに適用される、請求の範囲第22項に記載の方法。
【請求項２６】
前記接種を、植物材料中の全ウイルス粒子の増殖および集合に要する他のRNAと一緒に行う、請求の範囲第25項に記載の方法。
【請求項２７】
異種ペプチドをコードするDNAを、植物ウイルスcDNAから摘出されたDNAフラグメントに導入し、そして修飾フラグメントを組換えて植物ウイルスcDNAを改質形態に再構成することによって改質cDNAを産生させる、請求の範囲第25項に記載の方法。
【請求項２８】
産生した改質ウイルス、またはそれから抽出されたRNAを植物に継代して改質ウイルスを更に産生させる、請求の範囲第23項に記載の方法。
【請求項２９】
前記cDNAが、前記ヌクレオチド配列の５′末端に結合したカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター配列を含む、請求の範囲第25項に記載の方法。
【請求項３０】
異種ペプチドをコードするDNA配列を含むCPMVコートタンパク質cDNAのフラグメントであって、当該cDNAは、前記異種ペプチドをコードするDNAに隣接する直列反復ヌクレオチド配列を含まないCPMVゲノム中の部位に対応する前記異種ペプチドをコードすることを特徴とする、フラグメント。
【請求項３１】
SstIフラグメントである、請求の範囲第30項に記載のフラグメント。
【請求項３２】
請求の範囲第30項に記載のフラグメントを含むベクター。
【請求項３３】
CPMVのコートタンパク質の露出表面に対応する部位で異種ペプチドをコードするDNAインサートを含むCPMV M RNAの完全長cDNAを含んでなるベクターであって、前記部位がDNAインサートに隣接する直列反復配列を含まないことを特徴とする、ベクター。
【請求項３４】
請求の範囲第30項または第31項に記載のCPMVコートタンパク質のフラグメントのRNA転写体。
【請求項３５】
請求の範囲第32項または第33項に記載のベクターのRNA転写体。
【請求項３６】
RNA転写体がキャッピングされている、請求の範囲第34項に記載のRNA転写体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、異種ペプチドの生産または提供を目的とするキャリヤー（ベクター）としてのウイルスの使用に関する。更に詳細には、本発明は、ウイルス粒子（ビリオン）でペプチドとして発現する異種核酸配列の組み込みによるウイルス核酸の遺伝子操作に関する。本明細書において、ペプチドまたはこれをコード化する核酸に適用される「異種（foreign）」という用語は、ベクターとして用いられる植物ウイルスには本来存在しないペプチドまたは核酸配列を意味する。このような配列は、外来性（exogenous）または異種（heterologous）配列として記載することもできる。「ペプチド」という用語は、小ペプチドおよびポリペプチドを包含する。
本発明者らの特許出願ＷＯ９２／１８６１８号明細書には、異種ヌクレオチド配列、すなわち天然に見いだされる植物ウイルスには含まれておらず且つ従って天然に存在する植物ウイルスに普通には見られないペプチドをコートするヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の発現のためのベクター系としての植物ウイルスの利用が記載されている。前記特許明細書に記載されている発明は、異種ペプチドを含む植物ウイルスの集合粒子からなっている。従って、本発明の植物ウイルスは元のウイルスの改質形であり、便宜上改質ウイルスと表わすことにする。
本発明者らの先行出願ＷＯ９２／１８６１８号明細書による植物ウイルスに組み込むことができる異種ペプチドは極めて多種多様な種類のものがあり、異種ペプチドの性質および大きさ、およびそれがウイルス粒子に置かれる部位はイン・ビボまたはインビトロで培養するときに改質ウイルスが集合する能力を妨げないという制限だけを受けやすい。広義には、改質ウイルスは、機能が作用するには特定の構造が必要な任意の生物学的に有用なペプチド（通常は、ポリペプチド）から形成させることができる。これは、このペプチドと、例えば特定の生物系におけるその安定性または表示様式を向上させるための、より大きな分子との会合によって達成することができる。このようなペプチドの例は、ペプチドホルモン、酵素、成長因子、原生動物性、ウイルス性、細菌性、真菌性または動物起源の抗原、抗イディオタイプ抗体、免疫レギュレーター、およびサイトカイン、例えばインターフェロンおよびインターロイキン、レセプター、アドヘジン(adhesins)、および前記タイプのペプチドのいずれかの前駆物質の部分である。このペプチドは、好ましくは５個を上回るアミノ酸を含む。
本発明者らの先行発明による植物ウイルスベクター上に現れる生物活性を有する広汎なペプチド配列の中でも、ワクチン、特に（ヒトを含む）動物のウイルスワクチンの基礎である抗原性ペプチドが特に重要である。本発明者らの先行発明の関連では、ワクチンは予防的（すなわち、疾患の防止）または治療的（すなわち、疾患の治療）用途を有することができることに留意すべきである。ワクチンの用途について、本発明者らの先行発明は、特に魅力的なエピトープ表現系を提供している。このような用途に用いるときには、抗原性ペプチド成分はウイルス粒子上に適当に配置されて免疫系によって、例えばウイルスのコートタンパク質の露出した部分に配置されることによって、容易に認識されるようになる。従って、後者に適用される際には、本発明者らの先行発明は、植物ウイルスのコートタンパク質表面の露出した位置に組み込まれる動物ウイルスのような病原体に由来する抗原を含む改質植物ウイルスの集合粒子を含んでいる。この発明は、ワクチンの免疫原性成分のような集合した改質植物ウイルス粒子の使用も包含する。抗原性ペプチドを提供するこのような集合した改質植物ウイルス粒子は、例えば（ヒトを含む）動物の病原体および疾患の検出を目的とする免疫診断法の抗原表示成分としての用途も有する。
本発明者らの先行出願に記載された系は、ウイルスコートタンパク質に挿入することができる異種ペプチドの大きさに関して極めて融通性の大きいものである。従って、３８までまたはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドを、本発明者らの継続研究の際に挿入に成功した。しかしながら、このようにして生産された改質ウイルスは非天然構造のものであり、植物で増殖するときには未改質ウイルス（野生型）と競合する欠点を有する。従って、本発明者らは、幾つかの改質ウイルスにおいて、異種ペプチドが増殖中に失われ、その結果改質ウイルスの収率が減少といった傾向を観察した。
本発明により、この問題点の原因が確認され、この問題点を回避するのに要する段階が決定された。
第一に、異種ペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することにより植物ウイルス核酸の改質に用いる方法は、インサートに隣接する（flanking）直列配列反復の存在を回避する。本発明の文脈において、直列反復配列を含む構成は、同一のオリゴヌクレオチド配列が、挿入されたヌクレオチドの両側に存在する構成である。このような構成は遺伝学的に不安定であることがあり、これは配列反復間に組換えが起こり異種ペプチドコード配列が失われ、野生型配列に逆転することがあるからである。第二に、異種オリゴヌクレオチド配列を存在する配列の一部の置換体として植物ウイルスゲノムに挿入する場合には、生成する改質ウイルスコートタンパク質はウイルス複製、キャプシド形成および植物への広がりに重要なアミノ酸配列がなくなることがある。第三に、異種配列は最適状態に及ばない部位には挿入すべきではない。
本発明は、異種ペプチドを含む植物ウイルスの集合粒子であって、対応する異種核酸が、インサートに隣接する直列反復配列の非存在下において、好ましくは存在する核酸の付加物として植物ウイルスゲノムに挿入されている集合粒子を含んでなる。
好ましい態様では、植物ウイルスはササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり、異種インサートは、低分子キャプシドタンパク質（ＶＰ２３）のβＢ−βＣループのプロリン２３（Ｐｒｏ23）の直前に挿入される。
本発明は、コートタンパク質の露出した部分をコードするウイルスゲノムの部分を確認することによって任意の植物ウイルスに適用することができる。ゲノムのこの部分では、２種類の異なる制限酵素部位を選択し、適当な制限酵素を用いて核酸を開裂する。相補的オリゴヌクレオチドの対を合成するが、これはウイルスコートタンパク質に挿入することが所望な異種ペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドは、制限酵素と両立し、従って切断したウイルス核酸に挿入できる末端で終わっている。この手順により異種ペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入され、インサートに隣接する直列配列反復の存在が回避される。好ましくは、相補的オリゴヌクレオチドは、異種アミノ酸をコードする配列に植物ウイルス特異的配列が隣接して、異種核酸が、存在する核酸への付加物として挿入されるように合成される。
好ましい態様では、植物ウイルスの三次元構造を検討して、ウイルス表面上で特別に露出しており、従って挿入に潜在的に最適な部位であるコートタンパク質の部分を同定する。もう一つの態様では、コートタンパク質の露出部分のアミノ酸配列をα−らせん構造を破壊するアミノ酸について検討するが、これらは潜在的に挿入に最適な部位だからである。好適なアミノ酸の例はプロリンおよびヒドロキシプロリンであり、これらはいずれもポリペプチド鎖中にあるときには、αヘリックスを中断し、堅い捩れを生じたり、構造が曲がったりする。
この系を証明するため、植物ウイルスササゲモザイクコモウイルス（comovirus）（ＣＰ、Ｖ）を選択した。ＣＰＭＶの三次元構造は原子分割(atomic resolution)で説明され、粒子構造を壊すことなく改質に好適な部位を同定することができた。
ＣＰＭＶは２分節系ＲＮＡウイルスであり、任意のＲＮＡウイルスのゲノムを操作して異種ペプチドを発現させるには、このＲＮＡのｃＤＮＡクローンを用いる必要がある。いずれのＣＰＭＶ  ＲＮＡ分子の完全長ｃＤＮＡクローンは、操作して異種ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を挿入することができるものを入手できる。植物ＲＮＡウイルスからのゲノムのｃＤＮＡクローンを用いて、植物に接種した際に感染性を有する転写体をイン・ビトロで生成させることができる。しかしながら、この転写体の感染力は、恐らくは転写体の末端に非ウイルス性残基が存在するため、天然のビリオンＲＮＡの感染力よりかなり低い。接種の際に転写体が分解剤に暴露されることによっても、問題が生じることがある。このため、転写体は通常はその５′末端をキャッピングすることによって安定化されるが、これは非効率的で経費がかかり、しかも時間がかかる方法である。
本発明の別の側面では、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ  ＭおよびＢのｃＤＮＡクローンであって、Ｍ  ＲＮＡのｃＤＮＡクローンが異種ペプチドをコードする挿入オリゴヌクレオチド配列を含み、ウイルスｃＤＮＡの５′末端に結合したカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター配列を用いて、植物で感染力のある転写体を生成するものを構築した。この技法により、イン・ビトロで生成した転写体を用いる際に見られる問題点の幾つかは解消し、且つ総ての植物ＲＮＡウイルスに適用できる。
本発明の広汎な適用可能性を説明するため、４種類の異なる動物ウイルスからの抗原性ペプチド、動物の１種類の細菌性病原体、および哺乳動物のペプチドホルモンを用いた。これらのウイルスの２種類は、動物ウイルスのピコルナウイルス群に属する−口蹄疫（ＦＭＤＶ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）。この群には幾つかの重要な病原体があり、とくにＦＭＤＶ、灰白髄炎（ポリオ）およびＡ型肝炎である。選択される第三のウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これはどのような既知の植物ウイルスとも類似性を持たず、これに対して有効なワクチンは現在のところ入手できない。細菌性病原体はStaphylococcus aureusであり、ウシの乳腺炎などの幾つかの動物の疾患の起因菌である。ペプチドホルモンは、ブラゴナドトロピン放出ホルモンである。
本発明を、添付図面に関して更に説明する。
第１図は、ＶＰ２３のアミノ末端４０アミノ酸をコードするＣＰＭＶ  Ｍ  ＲＮＡの領域を表わす。ヌクレオチド配列の下の数字は、Ｍ  ＲＮＡ配列に関し、ユニークＮｈｅ１部位の位置が示されている。ＶＰ２３のβＢおよびβＣ鎖の形成に関与するアミノ酸は、標準的な１字コードを用いて示されているタンパク質のアミノ酸配列の上に示されている。
第２図は、(A)ＦＭＤＡ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸残基１３６〜１６０に対応するトップ（正）鎖によってコードされるアミノ酸配列と共にｐＦＭＤＶの構築に用いられるオリゴヌクレオチドの配列、および(B)ＦＭＤＶに特異的なオリゴヌクレオチドの挿入後のＶＰ２３の構造を示す。矢印の領域は、挿入されたＦＭＤＶエピトープを示す。クローニング中に回復されないＮｈｅ１部位は、ｘＮｈｅ１によって示される。挿入された配列に存在する特徴的（diagnostic）ＢｇｌＩＩ部位も示されている。
第３図は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩにおけるＶＰ２３の構造上のＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸残基１３６−１６０をコードするＦＭＤＶに特異的なオリゴヌクレオチドの挿入の効果を表わしている。ＶＰ２３のβＢおよびβＣの形成に関与するアミノ酸は、標準的な１字コードを用いて示されるタンパク質のアミノ酸配列上に示されていている。
第４図は、部位特異的突然変異誘発による「置換」ベクターの構成を表わしている。星印は、部位特異的突然変異誘発によるＣに変化し、それによって新規なＡａｔＩＩ部位を生じるＴ残基を示す。
第５図は、(A)ＨＩＶ１のｇｐ４１からのアミノ酸残基７３５〜７５２に対応するトップ（正）鎖によってコードされるアミノ酸配列と共にｐＭＴ７−ＨＩＶの構築に用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、および(B)ＨＩＶに特異的なオリゴヌクレオチドの挿入後のＶＰ２３の構造を示す。矢印の領域は、挿入されたＨＩＶエピトープの範囲を示す。挿入配列に存在する特徴的なＰｖｕ１部位も示されている。
第６図は、(A)ＨＲＶ−１４のＶＰ１からアミノ酸残基８５〜９９に対応するトップ（正）鎖によってコードされるアミノ酸配列と共にｐＭＴ７−ＨＲＶの構築に用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、および(B)ＨＲＶに特異的なオリゴヌクレオチドの挿入後のＶＰ２３の配列を示す。矢印の領域は、挿入されたＨＲＶエピトープの範囲を示す。挿入配列に存在する特徴的Ｃｌａ１部位も示されている。
第７図は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ｌｌにおけるＶＰ２３の配列上のＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸残基１４１〜１６０をコードするＦＭＤＶに特異的なオリゴヌクレオチド（肉太タイプで表される）の挿入の結果を表わしている。
第８図：  構造体ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ｌｌ、およびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ｌｌｌに用いられるオリゴヌクレオチドの配列。用いた総てのオリゴヌクレオチドは、図の最上部に肉太で示した配列で終わっていた。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ（ＦＭＤＶ−Ｖ）、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ｌｌ（ＨＲＶ−ｌｌ）、およびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ｌｌｌ（ＨＩＶ−ｌｌｌ）の構築に用いた可変部を下に示す。プラス−センスオリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列をヌクレオチド配列の上に示し、下記のように対応する。ＦＭＤＶ−Ｖ、ＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸１４１〜１６０；ＨＲＶ−ｌｌ，ＨＲＶ−１４のＶＰ１からのアミノ酸８５〜９８；ＨＩＶ−ｌｌｌ、ＨＩＶ−ｌのｇｐ４１からのアミノ酸７３１〜７５２。
第９図：  表面上でｇｐ４１のＣＰＭＶ−ＨＩＶ−ｌキメラ発現アミノ酸７３１〜７５２の皮下注射を２回行った個々のＣ５７／ＢＬ６マウスからの血清によるＨＩＶ−１  ｌｌｌＢの中和（白抜き棒線）。マウスを１４日後に瀉血した。野生型ＣＰＭＶを接種したマウスの平行群の平均血清中和タイターも示す（黒棒線）。総ての免疫原はミョウバンアジュバント中で処方した。
ＣＰＭＶの改質
ＣＰＭＶのコートタンパク質に挿入を行うためのウイルスのゲノムを操作する方法は、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載されている。転写ベクターｐＰＭ１におけるＣＰＭＶ  Ｍ  ＲＮＡの完全長のｃＤＮＡクローンは、ＣＰＭＶ  Ｂ  ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＢＴ７−１２３）と同様に、入手可能である（ｐＰＭＭ２９０２）。ｐＰＭＭ２９０２およびｐＢＴ７−１２３からの転写物の混合物は、ササゲ原形質体（protoplasts）にエレクトロポレーションすると、完全なウイルス感染を生じる。
本発明者らは、異種ペプチドの挿入のため、ＶＰ２３のβＢ−βＣループを選択した。このループはウイルス粒子の表面上に明らかに露出しており、コンピューターモデリングではこの部位に挿入された大きなループであってもキャプシド構造および安定性にとって重要な隣接サブユニット間の相互作用を妨げるとは思われないことを示していた。このループは、異種配列を挿入することができるＭ  ＲＮＡに特異的な配列の２７０８位にユニークなＮｈｅｌ部位を有する（第１図を参照されたい）。
ピコナウイルス口蹄疫（ＦＭＤＶ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）の主要な抗原性部位、およびレンチレトロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を用いて、動物ウイルスに対するワクチンの産生における改質植物ウイルスの使用を説明した。
ｐＦＭＤＶ−ＦＭＤＶループタンパク質のセグメントをコードするＤＮＡインサートを含むＣＰＭＶ  Ｍ  ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡクローン−のデザインおよび構成は、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載されている。ＢＦＳ１８６０株であるＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸残基１３６〜１６０をコードするオリゴヌクレオチド配列を、存在する核酸への付加物としてｐＰＭＭ２９０２のユニークなＮｈｅｌ部位に挿入した。用いた手順により、インサートに隣接する直列反復配列を生じた（第２Ｂ図を参照されたい）。ｐＦＭＤＶ転写物の特性は、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載されている。ササゲ原形質体がｐＦＭＤＶおよびｐＢＴ７−１２３転写体の混合物に感染すると、改質ウイルス粒子の増殖および集合が起こる。
しかしながら、改質植物ウイルスを大規模に生産するには、全植物に直接接種でき、しかも原形質体系と同様にウイルス粒子でも複製および集合する構造体を製造する必要がある。従って、ｐＰＭＭ２９０２を改質して、ＲＮＡ合成が更に効率的なプロモーターによって行われ、５′末端に「キャップ」構造を有する転写体を生じる条件下で改質プラスミドが転写されるようにした。ｐＰＭＭ２９０２を改質してｐＭＴ７−６０１を産生させる段階は、ＷＯ９２／１８６１８に詳細に記載されている。キャッピングしたｐＭＴ７−６０１およびｐＢＴ７−１２３の混合物は、インタクトなササゲ植物に対して感染力を有することを見いだした。
ｐＭＴ７−６０１およびｐＦＭＤＶから出発するｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１のデザインおよび構築は、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載されている。ＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からのアミノ酸残基１３６〜１６０をコードするオリゴヌクレオチド配列を、存在する核酸に対する付加物としてｐＭＴ７−６０１のユニークＮｈｅｌ部位に挿入した。用いた手順により、インサートに隣接する直列反復配列を生成した（第３図を参照されたい）。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１転写体の特性は、Ushaら、Virology,(1993),197,366-374に詳細に記載されている。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１およびｐＢＴ７−１２３転写体の混合物を接種した植物は、接種した葉に病変を表わしたが、これらは野生型転写体を接種した植物の葉に見られるものより小さかった。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１に感染した植物の接種した葉からの葉のホモジネートについてのイムノソーベント電子顕微鏡法から、ＣＰＭＶ様ウイルス粒子の存在が認められた。しかしながら、接種されなかった葉に対するキメラウイルス粒子の全体的蔓延の証拠は見られなかった。
従って、本発明者らは、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１を接種した葉から抽出したＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によりｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１感染の子孫（progeny）を特性決定した。この分析から、２種類の産物の存在が明らかになり、主生成物は、約５８０ｂｐの予想された生成物に相当するものであり、少量生成物は５００ｂｐの生成物に相当した。後者の生成物は、野生型ＣＰＭＶに感染した植物から抽出されたＲＮＡから合成した生成物と同時移動した。ＰＣＲ生成物をバクテリオファージＭ１３にクローニングし、挿入の部位の回りの配列を決定したとき、２種類のクローンを見いだすことができ、全ＦＭＤＶ特異的配列を保持するもの（主クローン）と、正確には野生型ＣＰＭＶに相当する配列を含むもの（少量クローン）とであった。これらの結果は、野生型配列への復帰が、明らかに一段階法によって転写体を接種した葉に起こることを示している。
ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１転写体を接種した葉から抽出したＲＮＡを未感染ササゲで継代したところ、植物は接種した葉にｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１感染に特徴的な小さな病巣と大きな野生型のＣＰＭＶの病巣との混合からなる症状を示した。また、上方の葉は、野生型ＣＰＭＶ感染に特徴的なモザイク症状を示した。このような植物の接種した葉から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果２種類の生成物が得られたが、この場合には、主生成物は野生型Ｍ  ＲＮＡ由来のものに相当した。ＰＣＲ生成物の主要な混合物由来のクローンを分析した場合にも、前に見いだされた２種類の配列と同じものであった。しかしながら、この場合には、クローンの多くは野生型配列を表わしていた。これらの結果は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉが、恐らくはインサートに隣接する直列反復が存在することにより単一段階法で全ＦＭＤＶに特異的な配列を喪失しやすいだけでなく、野生型の子孫ウイルスはキメラウイルスに比較して重要な利点も有することを示している。インサートに隣接する直列反復配列の生成を回避するため、第二の制限酵素切断部位をＶＰ２３をコードするＣＰＭＶゲノムの領域のヌクレオチド配列に作成した。Ｍ  ＲＮＡの２７４０位での単一サイレント・ベース変化（silent base change）（ＵからＣ）により、アミノ酸バリン２７（ヌクレオチド配列の２７３５位）にユニークＡａｔＩＩ部位が作成される。これは、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載の方法を用いるＭ１３−ＪＲ−１の部位特異的突然変異誘発によって達成される（第４図を参照されたい）。ＡａｔＩＩ部位の作成により、ＣＰＭＶ中の元のβＢ−βＣループから６種類のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列をＮｈｅＩおよびＡａｔＩＩで消化することによって除去することができる。次に、この配列をＮｈｅＩ−およびＡａｔＩＩ−両立性の末端を有する任意の配列で置換することができる。
ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ、ｐＭＴ７−ＨＩＶおよびｐＭＴ７−ＨＲＶの構築
３種類の異なる配列をデザインして、突然変異したＭ  ＲＮＡ配列のＮｈｅＩおよびＡａｔＩＩ部位の間の配列の代わりに用いた。３種類の総ての場合において、異種配列を６個のアミノ酸をコードする野生型配列の代わりに用いた。ＶＰ２３に置換する第一の配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）由来のトランスメンブラン糖タンパク質ｇｐ４１からの残基７３５〜７５２をコードするオリゴヌクレオチドからなっていた。この配列を選択したのは、この領域の合成ペプチドが血清ポジティブなＡＩＤＳ患者からの抗血清によって酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で認識され、ＨＩＶ−１単離物の範囲を中和する抗体を誘発することができるからである。第二の配列は、ヒトライノウイルス１４（ＨＲＶ−１４）のＶＰ１からの残基８５〜９９をコードするヌクレオチド配列からなっている。いずれの場合にも、オリゴヌクレオチドは、制限酵素部位を含みスクリーニングが容易になるようにデザインした。オリゴヌクレオチドの配列およびＶＰ２３のアミノ酸配列に対する置換の効果を、第５図および第６図に示す。ｐＭＴ７−ＨＩＶおよびｐＭＴ７−ＨＲＶの構築に用いた方法は、ＷＯ９２／１８６１８号明細書に記載されている。
第三の配列は、ＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からの残基１４１〜１６０をコードするヌクレオチドからなっていた。ＶＰ２３のアミノ酸配列に対する置換の結果を、第７図に示す。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩの構築に用いた方法はUshaら（１９９３年）に記載されている。
ｐＭＴ７−ＨＩＶおよびｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ転写体の特性は、それぞれＷＯ９２／１８６１８号明細書およびUshaら（１９９３年）に記載されている。ｐＭＴ７−ＨＩＶ転写体をｐＢＴ７−１２３転写体と混合すると、ササゲ原形質体で複製することができ、生成する改質コートタンパク質は集合してキメラウイルス粒子となることができる。同様に、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ転写体はササゲ原形質体で複製することができるが、子孫ＲＮＡは、野生型ＶＰ２３配列を含むｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１またはｐＭＴ７−６０１からのものよりかなり低濃度で蓄積した。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩに感染した原形質体には、ウイルス粒子は全く検出されなかった。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ由来の転写体の全ササゲ植物で増殖する能力も、Ushaら（１９９３年）によって研究された。接種した植物では症状は全く現れず、子孫のＲＮＡは接種した葉または上方の葉のいずれにも検出されなかった。このｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩの感染力の減少は、生成するキメラウイルス粒子が、野生型ウイルスおよびｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ感染から生産されたキメラウイルスに存在するアミノ酸配列を欠いていることに帰因する可能性があり、この植物でのウイルスの複製および蔓延に重要である。
例１
ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩの構築
ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１の小さな病巣の表現型および野生型ＣＰＭＶと比較したのと競合する不利益から、異種配列が最適下限の部位に挿入されてしまうことがあることを示している。ＣＰＭＶの３−Ｄ構造を詳細に検討したところ、Ｓタンパク質のβＢ−βＣループの中央にあるプロリン２３（Ｐｒｏ23）が特にウイルス表面に露出しており、潜在的に任意の挿入の最適部位であることが明らかになった。この事実を用い、回復を容易にすることがある反復配列の導入を防止するため、相補的オリゴヌクレオチドの対を合成して、異種アミノ酸をコードする配列に野生型ＣＰＭＶに存在する配列が隣接してＰｒｏ23の直前に挿入されるようにした。オリゴヌクレオチドはＮｈｅＩおよびＡａｔＩＩ両立末端で終り、元のＦＭＤＶに特異的なインサートの代わりにｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ（Ushaら、１９９３年）またはその誘導体ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩ  ＡａｔＩＩのいずれかのＮｈｅＩおよびＡａｔＩＩ部位の間に挿入することができる。このような方法により、異種配列が最適部位に挿入され、インサートに直列反復が隣接しないようにすることを確実にするだけでなく、ＣＰＭＶに特異的な配列は欠失されないようにすることができ、事実はウイルス粒子を集合させることができるようにする上で重要であると思われる（Usha、１９９３年）。この方法で挿入される配列は、ＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１の残基１４１〜１６０（ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１のエピトープより若干短い型）、免疫上優勢な部位(immunodominant site)を作り上げるＨＲＶ−１４のＶＰ１の残基８５〜９８、ＮＩｍ−ｌＡ[Sherryら、J.Virology,(1986)57,246-257]、およびＨＩＶ−１のｇｐ４１からの残基７３１〜７５２を含んでなるエピトープ、いわゆる「Kennedyエピトープ」[Kennedyら、Science,(1986)231,1556-1559]からなっていた。構築に用いたオリゴヌクレオチドの配列を、第８図に示す。生成する構造体は、それぞれｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩと命名した。
プラスミドｐＢＴ７−１２３、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩおよびｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩの構築および特性は、以前に報告されている（Ushaら、１９９３年）。これらの構造体およびその誘導体を、Escherichia coil JM83株で増殖させた。オリゴヌクレオチドを、Pharmacia Gene Assembler Plus合成装置で合成した。配列分析は、E.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）またはSequenaseTM、２．０型を用いる「ジデオキシ」法によって行った。
ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖを構築するため、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩをＮｈｅＩ（Ｍ  ＲＮＡ配列の２７０８位を開裂する）で完全に消化し、Ｍ  ＲＮＡ配列内で一度（２７３５位）およびプラスミドのｐＵＣ由来部分で一度（ｐＵＣ１９マップの２６１７位）切断するＡａｔＩＩで部分的に消化した。ＣＰＭＶ  ＶＰ２３タンパク質の残基１８〜２２および２３〜２６をコードする配列が隣接したＦＭＤＶ血清型Ｏ１のＶＰ１からの残基１４１〜１５９をコードする相補的オリゴヌクレオチドの対（第８図）をホスホリル化、アニールし、ＮｈｅＩ／ＡａｔＩＩで消化したｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩに連結した。所望な構造を有する組換体は、制限酵素マッピングおよび配列分析によって同定した。
ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩを構築するため、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＩＩを最初にＡａｔＩＩで部分消化し、アガロースゲル電気泳動の後に完全長の線状分子を回収した。線状化したプラスミドを、E.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）で処理してＡａｔＩＩによって残された３′張出し（overhangs）を除去し、再環化し、E.coli JM83株に逆形質転換した。組換体はｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＡａｔＩＩと命名し、ここでプラスミドのｐＵＣ部分のＡａｔＩＩ部位が破壊されているが、Ｍ  ＲＮＡ特異的部分にＡａｔＩＩ部位を保持しているものを、制限酵素分析によって同定した。ＨＲＶ−１４のＶＰ１からの残基８５〜９８またはＨＩＶ−Ｉのｇｐ４１の残基７３１〜７５２をコードする相補的オリゴヌクレオチドであって、適当なＣＰＭＶに特異的な配列が隣接したものをホスホリル化し、アニールし、ＮｈｅＩＩ／ＡａｔＩＩで消化したｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＡａｔＩＩに連結して、それぞれｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩを生じた。
例２
全ササゲ植物で複製するｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩの能力
ＲＮＡをキメラプラスミドから転写し、ｐＢＴ７−１２３からの転写体と混合し、ササゲ植物に接種すると、それぞれの場合に、接種した葉は野生型ＣＰＭＶの感染に典型的なクロロシス病巣(chlorotic lesions)を現わした。ＲＮＡハイブリダイゼーション分析を行ったところ、これらの葉にはＭ  ＲＮＡに特異的な配列の存在が明らかになった。３種類の総ての場合に、感染は別の健康なササゲ植物に機械的に伝達することができた。ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩの場合には、感染は、感染した植物のほとんどの上葉に広がり、典型的な全身的モザイクを生じた。しかしながら、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖで誘発した感染は、接種した葉に関連しただけに止まり、全身的症状は観察されず、また植物の上葉にはウイルスに特異的なＲＮＡも検出されなかった。
総ＲＮＡをｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ転写体を接種した葉から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析したところ、インサートを保持するＲＮＡ由来の生成物に大きさが相当する単一バンドだけが観察された。３回までの連続継代（passage）後でも、同様な結果が得られた。インサートが保持されていることを確認するため、最初の接種の後および３回連続継代の後の植物から採取した試料から誘導される生成物をバクテリオファージＭ１３にクローニングし、代表的な数のクローンのヌクレオチド配列を決定した。いずれの場合にも総てのクローンは、挿入した配列を完全なまま保持するウイルスＲＮＡに相当する配列を含んでいた。これらの結果は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ  ＲＮＡの復帰は検出できるほどの頻度では起こらなかったことを示している。精製したｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩ粒子（下文を参照されたい）から抽出したＲＮＡの分析は、新規な構造体は遺伝学的に安定であることを支持しており、１０回の連続継代の後にも復帰の証拠は見られなかった。
ウイルス粒子は、標準的なＣＰＭＶ精製法［van Kammenおよびde Jager,（１９７８年）、ササゲモザイクウイルス(Cowpea mosaic virus)、CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses,197］を用いて、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩまたはｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩに感染した葉の組織から製造することができ、得られた収率（新鮮な組織１ｇ当たりウイルス１．２〜１．５ｍｇ）は野生型ＣＰＭＶで得られたものと同様であった。対照的に、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖから誘導される粒子は、標準的方法または多数のその変法を用いては得られなかった。この失敗は、多数のこれらの粒子が抗−ＣＰＭＶ血清をコートしたグリッドを用いる組織ホモジネートのイムノソルベント電子顕微鏡法（ＩＳＥＭ）によって見られたので、感染した組織内に粒子が存在しないことによるものではなかった。
例３
ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩに由来するキメラウイルス粒子の免疫学的性質
精製したｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩ粒子が、挿入した配列の抗原特性を有することを確認するため、精製ビリオンの試料をＨＲＶ−１４に対して生じたポリクローン性抗血清を用いてウェスターンブロット分析を行った。大きさが改質ＶＰ２３タンパク質に相当する生成物を検出し、挿入した配列の抗原性を確認することができた。野生型ＣＰＭＶの試料を同様の方法で分析したときには、抗血清との反応は見られなかった。
変性ウイルスの試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分析したときには、３個のバンドだけが見られた。最大のポリペプチド（Ｌ）は大きな（ＶＰ３７）ウイルス性コートタンパク質に相当し、野生型ＣＰＭＶからのＬポリペプチドと同時移動した。中央のバンド（ＳＳ）は、ＨＩＶ−１に特異的なエピトープを収容している小さな（ＶＰ２３）ウイルス性コートタンパク質に相当する。最も速く移動するバンド（Ｓ′）は、ＶＰ２３タンパク質のＣ−末端の１９２のアミノ酸を表わす。末端配列分析を行ったところ、これはインサートの２個のＣ−末端アミノ酸残基間のタンパク質分解性の開裂によりＶＰ２３タンパク質から誘導されたことを示していた。従って、Ｓ′ではなく、ＳＳがインサートを含み、予言されたように、ウェスターンブロット法によってｇｐ４１に特異的な抗体と反応する。予言されたＮ−末端の切断生成物は４３個の残基だけからなり、使用したゲル系で分割することができなかった。Ｓの要素はいずれも、ビリオンと会合したままである。一定量のＳ′タンパク質は、ウイルスを速やかに精製する方法とは関係なくＣＰＭＶ−ＨＩＶの調製物に常に含まれていたので、この開裂はイン・プランタ(in planta)で起こることが可能である。
３種類の新たなキメラ体（ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖ、ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよびｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩ）は総て、接種した葉に野生型症状を生じ、復帰の徴候は見られなかったので、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉの制限を克服する目的でデザインした方法は良好な結果を生じたことが分かった。更に、これらのキメラ体の２種類の野生型ＣＰＭＶと同様に成長し、容易に精製することができた。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖは接種した葉に野生型の病巣を生じるが全体には広がらないという事実は、これらのキメラウイルス粒子は細胞から細胞への移動には十分コンピテントであるが長距離の輸送には不十分であることを示している。この現象は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｖからの粒子が集合して細胞内の結晶性配列となり、精製を問題の多いものとすると思われる観察に関連付けることができる。これらの特徴は、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−ＶがｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩ（１４残基）とｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩ（２２残基）とに含まれるものの間の大きさが中間の（１９残基）のインサートを含むので、異種配列の長さの結果ではない。
例４
ＨＲＶに対して抗体を生成させるためのキメラｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩウイルス粒子の使用
ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩおよび野生型ＣＰＭＶの粒子を例２に記載の方法で精製し、ウサギに注射し、抗血清を集めて、変性ＨＲＶ−１４ウイルス粒子のウェスターンブロットを検討するのに用いた。ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩウイルス粒子に対して生じた抗血清を用いると、血清を１：１６，０００に希釈したときにも、ＨＲＶ−１４のＶＰ１に相当する単一のバンドを検出することができた。他のＨＲＶ−１４コートタンパク質（ＶＰ２およびＶＰ３）との反応は見られなかった。野生型ＣＰＭＶに対して生じた血清を用いてブロットを検討したときには、ＨＲＶ−１４タンパク質との反応は全く見られなかった。ｐＭＴ７−ＨＲＶ−ＩＩビリオンがＨＲＶ−１４のＶＰ１を認識する抗体を生じることができることから、ＣＰＭＶ粒子の表面上に存在するエピトープは免疫原性であることが判る。
例５
ＨＩＶに対する中和抗体を生成させるためのキメラｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩウイルス粒子の使用
ｐＭＴ７−ＨＩＶ−ＩＩＩ由来の転写体をプラスミドｐＢＴ７−１２３由来の転写体と混合し、１０日令のササゲ植物の葉に接種した。組換えウイルス粒子を高収率で得るため、ＣＰＭＶ感染の特徴的な症状を示す葉の組織の試料を１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中でホモジナイズし、短時間遠心分離して、上澄液を用いて健康なササゲ植物に接種した。植物を接種後２〜３週間で収穫し、キメラウイルス粒子を例２に記載の方法で精製した。ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉと命名した精製したキメラウイルスを、０．０５％（重量／容積）ナトリウムアジドの存在下にて、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中で４℃で保存した。調製物の品質を、電子顕微鏡法および１５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳ／還元ゲル上での変性ウイルスの部分の電気泳動によって観察した。タンパク質は、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルを染色することによって可視化した。ウイルス調製物を、マウスに注射する前に、リン酸緩衝食塩水に対して透析し、タンパク質濃度をBio-RadTMアッセイによって決定した。
成熟したＣ５７／ＢＬ６マウスを、８週齢で免疫化した。ウイルス（ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−１またはＣＰＭＶ）を、水酸化アルミニウムアジュバントと１：５の比率で室温で攪拌しながら３０分間混合した。マウス（６尾／群）を、１００μｇのウイルスを含むウイルス−アジュバント混合物を総量で１００μｌ首の裏側の５か所に皮下で免疫化した。所定の間隔で、動物の尾から採血し、血清を−２０℃に保存した。総ての血清を５６℃に３０分間加熱した後、中和抗体を分析した。
マウスに、０および３５日目にＣＰＭＶ−ＨＩＶ−１または野生型ＣＰＭＶの注射を２回して、１４日後に尾から採血した。次に、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢに対する個々の中和タイターを、下記のようにして決定した。熱処理した血清の希釈物を、ウイルス１ｍｌ当たり約２０００のシンシチウム形成単位（ｓｆｕ）と共に、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｃ１８６６細胞の半集密的細胞単層（５×１０４細胞／ウェル）を、ポリ−Ｌ−リジンで前処理した９６ウェルの組織培養プレートで調製した。培地を除き、細胞に接種源５０μｌを加えた。これらを３７℃で１時間インキュベーションした後、新鮮な培地を添加した。インキュベーション３７℃で３日間継続した後、シンシチウムを顕微鏡下にて計数し、阻害率をそれぞれのウェルについて計算した。
第９図は、中和抗体がＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉで免疫したマウスに産生し、マウスの８３％において５０％中和タイターが約１／１０００であった。１／１００に希釈した抗血清は、平均中和タイターが９７％であり、１００％のマウスが応答した。この応答（response）は極めて均一であった。第９図は、平行して野生型ＣＰＭＶを注射した対照群でもＨＩＶ−１に対する中和応答を生じることも示している。中和タイターは、ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉの場合の約１０分の１低く、５０％中和タイターは約１／１００であった。免疫化していない動物の同腹子からの血清では１／１０の希釈度でも中和はほとんど見られなかったので、これは明らかに新生（de novo）抗体応答であった。
ＣＰＭＶ−ＨＩＶキメラに対する中和抗体応答の安定性を、二回目の注射の後４８日に再度マウスから採血して検討した。これらの抗血清は１／１０の希釈度では有意な中和タイターを持たず、中和抗体のレベルは１００倍を超えて低下したことを示していた。野生型ＣＰＭＶによって刺激された中和活性も、検出されなかった。
同じマウスに、二回目の注射の３か月後に以前と同様にＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉの３回目の注射を行い、１４日後に採血した。平均中和タイターは１／１０００の希釈度では５４％であり、総てのマウスが応答を示した。野生型ＣＰＭＶで刺激したマウスからの血清では、この希釈度では中和されなかった。従って、中和活性の全体的増加はほとんどなかった。ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉに対する中和抗体応答の安定性を、５６日後に得た抗血清でチェックした。タイターは降下したが、総てのマウスからの抗血清は１／１０の希釈度でまだ有意な中和を示し、平均値は５８％であった。野生型ＣＰＭＶを接種した対照からの抗血清による中和は、ほとんど有意性を示さなかった。
三回目の注射の後に得られた抗血清による同種ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ株の中和をＨＩＶ−１  ＲＦおよびＳＦ２株の中和と比較した。株ＩＩＩＢが９２％まで中和された希釈度では、ＲＦは７８％まで、ＳＦ２は６６％まで中和された。野生型ＣＰＭＶに対して作成した抗血清も３種類総ての株を中和したが、株ＩＩＩＢに関しては、これらの抗血清のＲＦおよびＳＦ２の中和は、ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉに対して生じた抗血清より少なかった。
野生型ＣＰＭＶに対して作成した抗血清における中和抗体は、総てＣＰＭＶエピトープに特異的であったが、抗血清に精製した野生型ＣＰＭＶを吸着することによっては、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドに対しては作成されないことを確かめた。ＣＰＭＶでの３回連続吸着では、抗−ＣＰＭＶ−ＨＩＶ−Ｉ血清のＨＩＶ−１中和タイターを有意に減少しなかったが、抗−ＣＰＭＶ血清の中和タイターを５分の１に減少した。従って、本発明者らは、ＣＰＭＶ−ＨＩＶキメラに対して作成された中和抗体の大半はＨＩＶに特異的なエピトープに対して作成されたが、ＣＰＭＶはＨＩＶ−Ｉの中和エピトープと交差反応する抗体を刺激すると結論した。
例６
植物に直接接種するのに用いることができるＣＰＭＶ  ＲＮＡ  ＭおよびＢのｃＤＮＡクローンの構築
ＣＰＭＶのＲＮＡ  ＭおよびＢのｃＤＮＡクローンをｐＵＣ１８で構築して、ウイルスＲＮＡの５′末端がＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始部位に直接隣接するようにした。更に、ＲＮＡ  Ｂクローン（ｐＣＰ１）を、ユニークＭｌｕＩ部位で制限酵素消化によりウイルス配列の３′末端で精確に線状化することができ、ＲＮＡ  Ｍクローン（ｐＣＰ２）を同様にＥｃｏＲＩで処理することができる。従って、これらの酵素で消化した後、５′または３′末端のいずれかに非ウイルス配列を含まないラン・オフ(run-off)転写体を生成させることができる。
クローンは、Dessensら［Journal of General Virology,(1993),74,889-982］に記載の方法で構築した。ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターをＰＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ部位の間でクローニングしたところ、その工程中にＨｉｎｄＩＩＩ部位が消失した。このプロモーター配列にＳｓｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限部位が隣接しており、後者はブラント末端消化して、転写開始部位を露出した。ｃＤＮＡはＲＮＡ  ＭおよびＢに対して生成し、これらの５′半分をそれぞれＳｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＳｔｕＩ／ＳｓｔＩでまたはＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩで切断したＣａＭＶ  ３５Ｓベクターに連結することによって独立にクローニングした。ＲＮＡの３′の半分は、３′末端が制限酵素消化によって精確に露出するように処理した予め構築したｃＤＮＡクローン（ｐＭＴ７−６０１およびｐＢＴ７−１２３）を用いてこれらの構造体にクローニングした。ＲＮＡ  ＭをＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上でクローニングし、ＲＮＡ  ＢはＢｇＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上でクローニングした。
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは宿主植物ＤＮＡに依存するＲＮＡポリメラーゼを用いており、活性が極めて高い。従って、線状化したｐＣＰ１およびｐＣＰ２の混合物の存在下にて主要な葉の表面を摩擦するだけで、感染を植物宿主に発生させることができる。宿主ポリメラーゼは、イン・ビボおよびｐＣＰ１およびｐＣＰ２のいずれも転写される細胞でのＣａＭＶ３５ＳプロモーターからのウイルスＲＮＡの転写を支配し、野生型ＣＰＭＶで得られるものと同様な感染が発生する。従って、イン・ビトロＲＮＡ転写段階は、最早必要ない。これは、使用の容易さおよび価格のいずれについても植物に接種する従来の方法と比較してかなり有利である。
小さなキャプシドタンパク質のβＢ−βＣループにおいてＰｒｏ23残基の直前に挿入され、かつ相当する異種核酸が、インサートに隣接する直列配列反復の非存在下にておよび存在する核酸の付加物（addition）としてＣＰＭＶゲノムに挿入されている異種ペプチドを含むＣＰＭＶの集合した粒子を産生させるため、ｃＤＮＡクローンｐＣＰ２を本明細書でｐＭＴ７について前記した方法で突然変異させて、ＲＮＡ  Ｍ配列の２７３５位にユニークＡａｔＩＩ部位を作成した。
各種の異種ペプチド（第１表を参照されたい）をコードするオリゴヌクレオチド配列を、例１に記載のｐＣＰ２−ＡａｔＩＩのＮｈｅ１とＡａｔＩＩ部位との間の配列の代わりに用いた。ｐＣＰ２−ＡａｔＩＩ変異体およびｐＣＰ−１を線状化しササゲ植物の主要な葉に接種した。総ての場合に、感染が現れ、適当な異種ペプチドを発現する安定なキメラウイルス粒子が植物から回収された。
0003681753.tif 000002
【図１】
0003681753.tif 000003
【図２】
0003681753.tif 000004
【図３】
0003681753.tif 000005
【図４】
0003681753.tif 000006
【図５】
0003681753.tif 000007
【図６】
0003681753.tif 000008
【図７】
0003681753.tif 000009
【図８】
0003681753.tif 000010
【図９】
0003681753.tif 000011