(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、個人についての慢性関節リウマチ治療薬スルファサラジンの副作用の危険性を判定する方法。
（ａ）N-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、以下のハプロタイプの2個の組み合わせからなるディプロタイプを有する個人に対して、慢性関節リウマチ治療薬スルファサラジンの副作用の危険性があるものと判定する工程。
・NAT2遺伝子の塩基配列において、(1)191位がＧ、(2)282位がＴ、(3)341位がＴ、(4)481位がＣ、(5)590位がＡ、(6)803位がＡ、(7)857位がＧであるハプロタイプ
【請求項２】
ディプロタイプ形の決定が以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によって行われる請求項１に記載の方法。
（ａ）集団における各個人のN-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する工程、
（ｂ）工程（ａ）により算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する工程。
【請求項３】
ハプロタイプ頻度の算出が、ＥＭアルゴリズムにより行われる請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、慢性関節リウマチ患者のスルファサラジン、およびそれを含む薬剤投与の副作用の危険性を判定する方法に関する。
背景技術
スルファサラジン（SASP）が、慢性関節リウマチ（RA）を治療するための、有効な抗リウマチ薬（DMARD）であることは、いくつかのプロスペクティブ無作為臨床試験から示されている（Hannonen P et. al., Arthritis Rheum 36: 1501-1509, 1993; Pinals RS et. al. Arthritis Rheum 29: 1427-1434, 1986; Ebringer R et. al., J. Rheumatol 19: 1672-1677, 1992）。SASPは、世界中で一次、あるいは二次選択薬として広く用いられている（McConkey B et. al., Br. Med. J. 280: 442-444, 1980; Neumann VC et. al., Br. Med. J. 287: 1099-1102, 1983; Pullar T et. al., Be. Med. J. 287: 1102-1104, 1983; Farr M et. al., Clin. Rheumatol. 3: 473-481, 1984; Bax DE and Amos RS Ann. Rheum. Dis. 44: 194-198, 1985）。
SASPを経口投与した後、10〜30％が上部胃腸管から吸収され、尿中に未変化体として排泄される。吸収されない残りは、遠位小腸および結腸に達し、そこでSASPは、細菌のアゾレダクターゼの作用によってサルファピリジン（SP）と5-アミノサリチル酸（5-ASA）とに分解される（Rains CP et. al., Drugs 50: 137-156, 1995）。SPは結腸からほぼ完全に吸収され、肝臓でアセチル化されるが、グルクロン酸抱合とヒドロキシル化も起こる（Rains CP et. al., Drugs 50: 137-156, 1995）。SPのアセチル化代謝物は主に尿に排泄される（Rains CP et. al., Drugs 50: 137-156, 1995）。対照的に5-ASAは、便の経路によって直接排泄されるか、または結腸から吸収される。吸収された5-ASAは肝臓でアセチル化された後、主に尿から排泄される（Rains CP et. al., Drugs 50: 137-156, 1995）。
SASPまたはSPの作用機序はなおも議論が分かれている（Rains CP et. al., Drugs 50: 137-156, 1995）。提唱されるメカニズムには、免疫調節作用、葉酸関連酵素の阻害、抗細菌作用および滑膜血管新生の阻害が含まれる。RAに有効なSASPの部分に注目した研究がいくつかある（Neumann VC et. al., J. Rheumatol. 13: 285-287, 1986; Pullar T et. al., Br. Med. J. 290: 1535-1538, 1985; Farr M. et. al., Rheumatol Int. 5: 247-251, 1985; Samanta A. et. al., Br. J. Rhumatol. 31: 259-263, 1992; Astbury C et. al., Br. J. Rhumatol. 29: 465-467, 1990）。SPまたはアセチル化SP（またはその双方）が活性部分であることを示唆した研究もあるが（Neumann VC et. al., J. Rhumatol. 13: 285-287, 1986; Pullar T et. al., Br. Med. J. 290: 1535-1538, 1985; Farr M. et. al., Rhumatol Int. 5: 247-251, 1985）、別の研究は、無傷のSASPが活性部分であると提唱した（Samanta A. et. al., Br. J. Rhumatol. 31: 259-263, 1992; Astbury C et. al., Br. J. Rhumatol. 29: 465-467, 1990）。一方、炎症性腸疾患に用いた場合には5-SASPが活性部位であることを示唆した研究もあった（Peppercorn MA Ann. Intern. Med. 101: 377-386, 1984; Azad Khan AK et. al., 2: 892-895, 1977）。
RA患者におけるSASP治療の転帰はかなり多様で、予測不可能であった。SASPの使用は時に、副作用の発生のために制限される。SASPによる副作用の発生率は、RA患者の約20〜30％であると報告されている（Amos RS et. al., Br. Med. J. 293: 420-423, 1986; Donovan S et. al., Br. J. Rhumatol. 29: 201-204, 1990; Felson DT et. al., Arthritis Rheum 35: 1117-1125, 1992）。
SASPの有効性または副作用と、患者のアセチル化表現型との関係を調べた研究がいくつかあった。ほとんどの研究において、アセチル化表現型（速いまたは遅いアセチル化）は、血清または尿のいずれかにおけるアセチル化SP対遊離SPの比を測定することによって決定した。多様な研究から、SASPまたはその代謝物の血漿濃度と、SASPの有効性または毒性のいずれかとの間に相関を認めないことが報告されている（Ropes MW et. al., Bull. Rheum Dis. 9: 175-176, 1958; Pullar T et. al., Br. J. Rheumatol. 24: 269-276, 1985; Taggart AJ et. al., Scand J. Rheumatol. Suppl. 64: 29-36, 1987）。アセチル化表現型とSASPの有効性または毒性との関係を除外した研究も多くあった（Pullar T et. al., Ann. Rheum. Dis. 44: 831-837, 1985; Kitas GD et. al., Scand J. Rheumatol. 21: 220-225, 1992; Bax DE et. al., Br. J. Rheumatol. 25: 282-284, 1986; Chalmers IM et. al., J. Rheumatol. 17: 764-770, 1990）。しかし、特定の副作用が、アセチル化が速い人よりアセチル化が遅い人においてしばしば発生することを記述した報告もいくつかある（Pullar T et. al., Ann. Rheum. Dis. 44: 831-837, 1985; Kitas GD et. al., Scand. J. Rheumatol. 21: 220-225, 1992; Laversuch CJ et. al., Br. J. Rheumatol. 34: 435-439, 1995）。
SASPのアセチル化は、肝臓のN-アセチルトランスフェラーゼ（NAT、BC 2.3.1.5）によって媒介される。ブルム（Blum）ら（1990）は、アリールアミンNATに対するウサギcDNAを用いて、ヒト白血球DNAからヒトNAT遺伝子３個をクローニングした（Blum M. DNA Cell Biol. 9: 193-203, 1990）。それらのうち２つ、NAT1とNAT2はいずれも870 bpのオープンリーディングフレームを有し、８pter-q11にマッピングされるが、これらは機能的であることが示された。第３の遺伝子は偽遺伝子であるように思われた。
NAT2遺伝子はいくつかの単ヌクレオチド多形性（SNPs）を有する。デグチ（Deguchi）らは、ヒト肝臓の試料を用いてNAT遺伝子の配列と共に多型性を初めて報告した（29）。対立遺伝子５個、野生型対立遺伝子（WT）１個および変異型対立遺伝子４個（M1、M2、M3、およびM4）を記述した。NAT2遺伝子に異なる７個のSNPの部位を認め（Blum M. DNA Cell Biol. 9: 193-203, 1990; Deguchi T et. al., J. Biol. Chem. 265: 12757-12760, 1990; Bell DA et. al., Carcinogenesis 14: 1689-1692, 1993; Vatsis KP et. al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 6333-6337, 1991）、その中の５個ではアミノ酸の変化が起こった。それは、ヌクレオチド191位でGからA（SNP1、アルギニンからグルタミン酸）、ヌクレオチド341位でTからC（SNP3、イソロイシンからトレオニン）、ヌクレオチド590位でGからA（SNP5、アルギニンからグルタミン）、ヌクレオチド803位でAからG（SNP6、リジンからアルギニン）、およびヌクレオチド857位でGからA（SNP7、グリシンからグルタミン酸）（図１）である。ヌクレオチド282位（SNP2）、および481位（SNP4）での残りの２つのCからTへの置換は、アミノ酸の変化を引き起こさなかった（それぞれ、チロシンとロイシン）（図１）。最も一般的な対立遺伝子（WT）の他に、彼らは異なる４個の対立遺伝子M1、M2、M3およびM4を同定し、そのそれぞれが７個の多型部位で独自の組み合わせのヌクレオチド変化を含む。WT、M1、M2、M3の制限酵素消化パターンを図２に示す。それぞれの対立遺伝子は多数の部位でのSNPsの組み合わせであるため、ハプロタイプであると解される。NAT2遺伝子のそれぞれの被検者の遺伝子状態は、２つのハプロタイプの組み合わせ、すなわちディプロタイプ形であると表現するのが最も適切である（Bell DA et. al., Carcinogenesis 14: 1689-1692, 1993; Blum M et. al., 88: 5237-5241, 1991）。
ある被検者のNAT2活性は、ディプロタイプ形に関連している。これまでのいくつかの研究から、被検者に少なくとも１つのWT対立遺伝子が存在すれば、速いアセチル化表現型となるが、変異体対立遺伝子が２個存在すれば、遅いアセチル化表現型となることが報告されている（Deguchi T et. al., J. Biol. Chem. 265: 12757-12760, 1990; Bell DA et. al., Carcinogenesis 14: 1689-1692, 1993; Blum M et. al., 88: 5237-5241, 1991; Hickman D and Sim E Biochem. Pharmacol. 42: 1007-1014, 1991; Cascorbi I et. al., Am. J. Hum. Genet. 57: 581-592, 1995）。これらのアセチル化型はSASP、イソニアジド、フェネルジン、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、フェネルジン、およびニトラゼパムのような薬剤の代謝において重要な役割を有することが知られている（Lunde PK et. al., Disease and acetylator polymorphism. Adis Health Science Press, 1983; Timbrell JA et. al., Clin. Pharm. Therap. 22: 602-609, 1977）。
NAT2アセチル化表現型に関していくつかの報告があった。ティンブレル（Timbrell）らは、イソニアジドによる肝毒性は、アセチル化が速い人より遅い人において発生率が高いことを報告した（Harmer D et. al., J. Med. Genet. 23: 155-156, 1986）。NAT2遺伝子に関する遅いアセチル化表現型はまた、膀胱癌のより高いリスク、そして結腸直腸癌のより低いリスクに関連している（Roberts-Thomson IC et. al., Lancet 347: 1372-1374, 1996）。最近、イナトミ（Inatomi）らは、NAT2遺伝子に関する遅いアセチル化ハプロタイプが日本人における膀胱癌の高いリスクに関連していることを報告した（Inatomi H et. al., Int. J. Urol. 6: 446-454, 1999）。SASPによる全身性エリテマトーデス（SLE）に関しては、アセチル化表現型とリスクとの関連は議論が分かれていた（Laversuch CJ et. al., Br. J. Rheumatol. 34: 435-439, 1995; Baer AN et. al., Arthritis Rheum. 29: 508-514, 1986）。
このように、RA患者におけるSASPの毒性とアセチル化表現型との相関に関してはいくつかの報告があるものの、実際のRA患者におけるSASP投与の副作用の危険性と、NAT2遺伝子についての個人のディプロタイプ形との関連性については、これまでのところ知られていなかった。この関連性が解明されれば、RA患者に対するSASP投与の可否の判断や、有効な治療法の選択のための重要な情報となるものと考えられる。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、慢性関節リウマチ患者におけるスルファサラジン投与の副作用の危険性と、NAT2遺伝子についての個人のディプロタイプ形との関連性を明らかにし、この関連性に基づいて、個人のSASPによる治療の副作用の危険性を判定する方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく、NAT2遺伝子についてのディプロタイプ形が慢性関節リウマチ(RA)患者におけるRA治療薬の副作用に関連しているか否かの検討を行った。まず本発明者らは、RA患者についてNAT2遺伝子上の多型部位における遺伝子型情報から、NAT2遺伝子のディプロタイプ形（2つのハプロタイプの組み合わせ）を決定した。その結果、スルファサラジン(SASP)で治療した野生型ハプロタイプを有しない患者は、62.5％の発生率で副作用を経験した。これは野生型ハプロタイプを有する患者の発生率（8.1％）より有意に高い（P＜0.001）ことを示していた。従って、野生型ハプロタイプを持たない個人に対して、SASPの副作用の危険性が高いものと判定することが可能である。これにより、各個人のSASP投与に対する副作用の危険性を予め知ることができ、RA患者へのSASP投与の可否や、SASPの投与量等を適切に判断することができる。
本発明者らは上記の如く、NAT2遺伝子のディプロタイプ形と、RA患者におけるSASP投与の副作用の危険性との関連性を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、NAT2遺伝子についての個人のディプロタイプ形を決定することにより、個人のSASPの副作用の危険性を判定する方法に関し、より具体的には、
〔１〕  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、個人についての慢性関節リウマチ治療薬の副作用の危険性を判定する方法、
（ａ）N-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、野生型ハプロタイプを持たない個人に対して、慢性関節リウマチ治療薬の副作用の危険性があるものと判定する工程、
〔２〕  ディプロタイプ形の決定が以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によって行われる〔１〕に記載の方法、
（ａ）集団における各個人のN-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する工程、
（ｂ）工程（ａ）により算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する工程、
〔３〕  ハプロタイプ頻度の算出が、ＥＭアルゴリズムにより行われる〔２〕に記載の方法、
〔４〕  遺伝子型情報が一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型、および挿入・欠失多型からなる群より選択される多型である、〔２〕または〔３〕に記載の方法、
〔５〕  慢性関節リウマチ治療薬がスルファサラジンである〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、を提供するものである。
本発明者らにより、N-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子についての個人のディプロタイプ形において、そのディプロタイプ形を構成する２つのハプロタイプのうち、野生型のハプロタイプを持たない個人は、RA治療薬であるスルファサラジン(SASP)に対して副作用の危険性があることが明らかとなった。従って、本発明は、NAT2遺伝子についての個人のディプロタイプ形を決定することによる、個人のRA治療薬の副作用の危険性を判定する方法を提供する。本発明により危険性の判定が可能な副作用としては、例えば、皮疹、発熱、肝臓機能異常、胃腸障害、骨髄抑制、口内炎、および浮腫等を挙げることができるが、特にこれらに限定されない。
本発明においては、まず、N-アセチルトランスフェラーゼ２(NAT2)遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定する（工程（ａ））。
本発明において「ハプロタイプ」とは、連鎖する複数の多型等の部位について、それぞれの部位の対立遺伝子の１つずつの組み合わせをいう。通常、どのような遺伝子領域についても、複数の１塩基置換(SNP; single nucleotide polymorphism)、マイクロサテライト、挿入／欠失等の多型部位が近接して存在し、連鎖しており、ハプロタイプを形成する。常染色体上の遺伝子部位については、個人は２つのハプロタイプを保有し、それぞれは、父、母に由来する。このような個人が保有する２つのハプロタイプの組み合わせを「ディプロタイプ形」という。
本発明においてディプロタイプ形の決定を行うNAT2遺伝子は、その塩基配列が既に公知である（GenBankアクセションナンバーNM000015、AF348074; MIMナンバーMIM243400）。
本発明の方法により副作用の危険性の判定が可能なRA治療薬としては、例えば、スルファサラジン(sulphasalazine)、およびスルファサラジンの分解産物のサラジン等が挙げられる。スルファサラジンは、サラゾスルファサラジンとも呼ばれ、腸溶剤としてアザルフィジンENという商品名でRA治療に一般的に使用される。従って、本発明の方法により、例えば、スルファサラジンを腸溶剤として服用した際の副作用の危険性の判定を行うことができる。また、該薬剤は潰瘍性大腸炎に使用されることもあり、本発明は、このような疾患の治療のための使用に伴う副作用の判定も可能である。スルファサラジンの分解産物のサラジンも同様に潰瘍性大腸炎に用いられ、本発明によって、副作用の危険性の判定が可能である。なお、本発明の副作用の危険性の判定方法において、上記薬剤の投与形態は、特に限定されるものではない。
本発明の上記工程におけるNAT2遺伝子における個人のディプロタイプ形の決定は、例えば、個人の遺伝子型情報からハプロタイプ頻度を算出し、それに基づいて個人のディプロタイプ形を決定する方法、集団の遺伝子型情報を基にして既に算出されたハプロタイプ頻度を基に個人のディプロタイプ形を決定する方法、およびNAT2遺伝子をクローニングした後に、シーケンシングにより決定する方法等により行うことができる。
好ましくは、以下の方法により、NAT2遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定することができる。まず、集団における各個人のN-アセチルトランスフェラーゼ２（NAT2）遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する。次いで、算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する。
「遺伝子型」とは一般に、ある遺伝子座におけるある個人の２つの対立遺伝子の組み合わせを言う。例えば、ある遺伝子座に多型部位が存在する場合、該多型部位に相当する２つの対立遺伝子上の当該部位についての遺伝子の個人についての特徴を指す。本発明における遺伝子型情報とは、このような遺伝子型についての情報を意味する。本発明においては、NAT2遺伝子についての遺伝子型情報を言う。本発明における遺伝子型情報は、複数の遺伝子型についての情報を含んでいてもよい。
本発明の遺伝子型情報となる遺伝子の特徴としては、例えば１塩基多型、マイクロサテライト、挿入／欠失等の変異を挙げることができる。本発明の遺伝子型情報には、前記の多型または遺伝子変異のうち、１つの種類に限定されず、複数の種類の多型または遺伝子変異が含まれていてもよい。本発明の方法における遺伝子型情報は、NAT2遺伝子上の下記の多型部位に関する遺伝子型情報であることが好ましい。しかし、それ以外の座位の遺伝子型であっても良い。数字はNAT2遺伝子における位置を表す。
（１）191位のG、（２）282位のC、（３）341位のT、（４）481位のC、
（５）590位のG、（６）803位のA、（７）857位のG
本発明における「集団」とは、遺伝子型情報を提供する個人の集まりを意味する。集団の人数は、本発明により決定されるディプロタイプ形の信頼性を高めるために、なるべく多くの人数から構成されることが好ましい。例えば、集団の人数が25名（ハプロタイプ数は50）以上であれば、希少なハプロタイプが集団に含まれない場合は、本発明の方法により比較的正確に個人のディプロタイプ形の決定を行うことができる。従って、本発明の集団は、25名以上であることが好ましいが、集団を構成する人数は、特に制限されない。
また、集団は均一（遺伝的背景が近接）であることが好ましい。例えば、ディプロタイプ形の決定を行う個人が日本人であるならば、遺伝子型情報を取得すべき「集団」は、日本人から構成される集団であることが好ましい。集団が均一か否かについては、それぞれの遺伝子座において、ハーディー・ワインバーグ平衡が達成されているか否かを検定することにより調べることができる。本発明における「集団」は、RA患者から構成される集団であることが好ましい。しかしながら、必ずしも均一ではなく、ハーディー・ワインバーグ平衡が保たれていない集団であってもほとんどの場合、正確にハプロタイプ頻度および個人のディプロタイプ形を推定できることが経験的に分かっていることから、遺伝子型情報を取得すべき集団は上記に限定されない。即ち、本発明における「集団」は、特定の集団に限定されない。
ハプロタイプは狭い遺伝子領域に含まれる場合は、世代交代によっても変化することは少ない。ハプロタイプは、その遺伝子領域内に交差が起きることにより変化するが、狭い遺伝子領域内に交差が起きる確率は極めて低い（１世代あたり、100,000kbに１回に過ぎない）からである。そのため特定の集団内、例えば日本人では、それぞれのハプロタイプの頻度が決まっている場合が多い。これをハプロタイプ頻度という。このハプロタイプ頻度は、集団ごとに異なる場合が多い。
本発明のハプロタイプ頻度の算出には、公知の方法を利用することができる。ハプロタイプ頻度の算出のための好ましい方法としては、例えば、EMアルゴリズムに基づいた最尤法（Excoffier and Slatkin 1995; Hawley and Kidd 1995; Long et al. 1995; Fallin et al. 2000）、分析的解決法(analytical solutions; Elandt-Johnson 1971; Hill 1974; Yasuda 1978; Imanishi et al. 1991)、および逐次的ハプロタイプ推測アルゴリズム（Clark 1990）等の方法を挙げることができる。
EMアルゴリズムを使用した場合、遺伝子型情報からハプロタイプ頻度を、例えば以下のようにして算出することができる。
nを座位数、aiをi番目の座位の対立遺伝子の数とすると、n個の座位に関して、考えられるハプロタイプの総数はNとなる。ここで、
0003675803.tif 000002
である。ｇを全員家系情報が無いn個の連鎖する座位の遺伝子型データが得られた個人の数とする。各個人について与えられた遺伝子型データについては、最大2n-1個のディプロタイプ形が存在する可能性がある。fi, (i=1,2,…,N)を集団内のi番目のハプロタイプの頻度とすると、fi≧, (i=1,2,..,N)であり、
0003675803.tif 000003
である。個人の遺伝子型データを与えると、集団がHardy-Weinberg平衡を満たす場合、ディプロタイプ形の尤度を算出することができる。
fiの最尤推定値、
0003675803.tif 000004
を算出するためのExpectation-Maximization（EM）アルゴリズムの手順は次の通りである。
（１）集団の可能なハプロタイプを格納する記憶領域を設定し、可能な全てのハプロタイプ数をTとする。最初の状態ではT=0である。
（２）各個人について、すべての座位の与えられた遺伝子型を考慮し、可能なディプロタイプ形（２つのハプロタイプの組み合わせ。同じハプロタイプの組み合わせが１つのディプロタイプ形を形成することもあり得る）をリストアップする。
（３）この結果、個人に存在する可能なハプロタイプも決定される。このハプロタイプが集団の可能なハプロタイプを收納する記憶領域に無い場合は、これを新たな可能なハプロタイプとして追加し、集団のハプロタイプに番号をつけ、その上でTを適当に増やす。
（４）次に、この個人について、既にリストアップした可能なディプロタイプ形を、集団の可能なハプロタイプの番号の組み合わせで表し（ディプロタイプ形は２つのハプロタイプの組み合わせ）、個人毎の可能なディプロタイプ形の記憶領域に記憶させる。
（５）全ての個人についての可能なディプロタイプ形と集団の可能なハプロタイプのリストアップが終わったら、ランダムな正の実数を変数としてfi, (i=1,2,..,T)に与える。ただし、
0003675803.tif 000005
前記のようにTは集団について可能な全てのハプロタイプの数である。
（６）（４）で各個人について、リストアップした可能なすべてのディプロタイプ形（前記のように番号のついた集団の可能な２つのハプロタイプの組み合わせとして与えられている）については、それぞれを構成する２つのハプロタイプがある。個人のそれぞれのハプロタイプの事前確率を、そのハプロタイプに相当するfiとする。個人の特定の可能なディプロタイプ形が、i,j番目のハプロタイプにより構成されるとし、Hardy-Weinberg平衡を仮定すると、個人のディプロタイプ形の尤度は、i≠jの時、2fifj, i=jの時fi2である。個人についての可能な全てのディプロタイプ形の尤度よりベイズの定理から、それぞれのディプロタイプ形の事後確率を算出する。
（７）それぞれの個人について、可能な全てのディプロタイプ形の尤度よりベイズの定理から、それぞれのディプロタイプ形の事後確率を算出する。
（８）それぞれの個人について、可能なディプロタイプの事後確率、および結合尤度を、全ての個人について算出する。
（９）個人についての結合尤度を、全ての個人について乗じ、全ての個人のディプロタイプ形の尤度を算出する。
（１０）個人の可能なディプロタイプ形の事後確率より、それぞれのディプロタイプ形を形成するハプロタイプの番号を考慮して、それぞれのハプロタイプの集団全体での数の期待値を算出する。
（１１）このように算出されたそれぞれのハプロタイプの数の期待値を2gで除し、集団内の各ハプロタイプの頻度の期待値を算出する。
（１２）算出されたハプロタイプの頻度のうち、極めて頻度の低いものを（例えば、＜10-4）集団の可能なハプロタイプを格納する記憶領域より除き、リストを作り直し、新たな集団の可能なハプロタイプ数Tを設定する。
（１３）fi,(i=1,2..,T)に（１１）で算出した各ハプロタイプの集団内での頻度の期待値を代入する。
（１４）（１３）の値を集団内でのハプロタイプの頻度として、（６）のステップに移行し、（６）から（１３）のステップをサイクルとして繰り返す。最終的に、あるサイクルで計算された全ての個人のディプロタイプ形の尤度が前のサイクルで計算された値より極めて小さい場合は、例えば、10-5だけ上昇したに過ぎないような場合には、ここで終了し、尤度が近似的に収束したと判断する。
（１５）上記の計算の結果として、集団内でのハプロタイプの頻度の最尤推定値が得られる。これは即ち、最終サイクルでのステップ（１１）で算出される集団内での各ハプロタイプの頻度の期待値である。
本発明におけるディプロタイプ形の決定には、上記の方法により算出されたハプロタイプ頻度を使用する以外に、既に推定または決定されたハプロタイプ頻度を利用することができる。
本発明における「ディプロタイプ形の決定」とは、ディプロタイプ形を１つに決定すること以外に、個人の遺伝子型情報を基に、個人のディプロタイプ形を確率的に予測し、個人毎に可能な全てのディプロタイプ形の確率（事後確率）を表したディプロタイプ分布を算出することも含まれる。
上記ディプロタイプ分布の算出には、公知の方法を利用することができる。ディプロタイプ分布の算出のための方法としては、例えば、ベイズの定理、または事後確率計算法等を挙げることができる。具体的には、ディプロタイプ分布の算出のための方法として、以下の方法を例示することができる。即ち、上記の方法により算出された各ハプロタイプ頻度を事前確率として、ステップ（６）から（７）までのステップの計算を行い、各個人の可能なディプロタイプ形の事後確率を計算し、それをその個人のディプロタイプ分布とする。
例えば、個人の可能なk番目のディプロタイプ形をDkとし、このディプロタイプ形を形成するハプロタイプの組み合わせをHi/Hjとする。ここで、Hi,Hjはそれぞれ集団内のi,j番目のハプロタイプである。集団内のi,j番目のハプロタイプの集団内の頻度の最尤推定値を
0003675803.tif 000006
とすると、この個人について、このディプロタイプ形Dkの尤度Lkを、以下のように算出する。
0003675803.tif 000007
この個人について可能な全てのディプロタイプ形の数をMとする。この個人についてのm番目のディプロタイプ形Dmの事後確率Pmを以下のように算出する。
0003675803.tif 000008
り
これをm=1,2,..,Mについて算出し、これをこの個人についてのディプロタイプ分布とする。
一般にディプロタイプ分布は１つのディプロタイプ形に集中する場合が多いことが示されている。従って、上記工程（ｂ）により算出されるディプロタイプ分布が１つのディプロタイプ形に集中する場合には、個人の有するディプロタイプ形は、この１つに集中したディプロタイプ形であるものと決定される。ディプロタイプ形が１つに集中しない場合には、複数のディプロタイプ形のそれぞれについて、個人が有する確率がディプロタイプ分布として算出される。例えば、ある個人についてディプロタイプ形Ａを有する確率はＸであり、ディプロタイプ形Ｂを有する確率はＹであると算出される。
また本発明におけるディプロタイプ分布の算出には、上記の方法により集団における各個人の遺伝子型情報から算出されるハプロタイプ頻度を用いる以外に、既に推定または決定されたハプロタイプ頻度を用いることもできる。
「既に推定または決定された集団のハプロタイプ頻度」は、ディプロタイプ形の決定（ディプロタイプ分布の算出）を行う個人を含む集団についてのハプロタイプ頻度であることが望ましいが、該個人の遺伝子型情報が算出に使用されていないハプロタイプ頻度であってもよい。即ち、本発明の方法においては、予め推定または決定された集団のハプロタイプ頻度を用いることで、任意の個人について、該個人の遺伝子型情報のみで、ディプロタイプ形の決定（ディプロタイプ分布の算出）を行うことができる。
「既に推定または決定された集団のハプロタイプ頻度」は、前記の本発明の方法、例えば、個人の遺伝子型情報からEMアルゴリズムに基づいた最尤法等により推定または決定されたものを使用することも可能である。
本発明においては、次いで、工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、野生型ハプロタイプを持たない個人に対して、RA治療薬の副作用の危険性があるものと判定する（工程（ｂ））。
本発明において、NAT2についての野生型ハプロタイプとは、NAT2遺伝子の塩基配列において(1)191位がG、(2)282位がC、(3)341位がT、(4)481位がC、(5)590位がG、(6)803位がA、(7)857位がGであるような配列を言う。野生型以外のハプロタイプとは、上記のいずれかの位置が野生型とは異なった塩基を持つような配列のことである。
野生型ハプロタイプをＷ、野生型ではないハプロタイプをＭとすると、個人におけるディプロタイプ形は、Ｗ／Ｗ、Ｗ／Ｍ、Ｍ／Ｍの３通りの可能性が考えられる。野生型ではないハプロタイプとは、上記の野生型ハプロタイプ以外のハプロタイプを言う。
本発明においては、上記の方法によって決定された個人のディプロタイプ形がＭ／Ｍ（野生型ハプロタイプを持たない）であった場合、該個人（野生型ハプロタイプを持たない個人）に対して、RA治療薬の副作用の危険性があるものと判定される。個人のディプロタイプ形が一つに集中しなかった場合、その個体のディプロタイプ形の事後確率分布において、Ｍ／Ｍの事後確率が高いほどRA治療薬の副作用の危険性が高いと判定される。
本発明の上記判定方法によって、各個人のRA治療薬投与に対する副作用の危険性を予め知ることができる。従って、本発明の方法によって得られた情報を基に、RA患者に対するRA治療薬の投与の可否や、投与量等を個人単位で適切に判断することが可能となる。これにより、個人の遺伝的基盤に応じて、SASPに対して副作用の少ない、有効な治療を施すことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、NAT2遺伝子の構造を模式的に示す図である。
図２は、４つの異なるNAT2のハプロタイプについて、３つのSNP部位における制限酵素消化パターンを示す図である。矢印は制限部位を示す。各ハプロタイプは、特有の制限酵素パターンを示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  慢性関節リウマチ(RA)患者の遺伝子型およびハプロタイプの決定RA治療薬であるスルファサラジン(SASP)を投与したRA患者144人（全て日本国籍；女性119人、男性25人）を、東京女子医大のリウマチ研究所の外来部門で1992年から1999年のあいだに無作為に選択した。患者全員が、その臨床過程においてアメリカリウマチ学会（正式にはAmerican Rheumatism Association）の1987年RAの分類基準に従ってRAと診断された（Arnett FC et. al., Arthritis Rheum. 31: 315-324, 1988）。
インフォームドコンセントを得た後、各患者から末梢血試料を採取して、ウィザードゲノムDNA精製キット（プロメガ社、カタログ番号A1620）を用いて端核球からゲノムDNAを抽出した。図１はNAT2遺伝子の略図を示す。PCRプライマー（5'-CTT CTC CTG CAG GTG ACC AT-3'／配列番号：１、5'-AGC ATG AAT CAC TCT GCT TC-3'／配列番号：２）を用いてPCRを１回実施した。NAT2遺伝子のヌクレオチド481位（SNP4）、590位（SNP5）、および857位（SNP7）のSNP部位３箇所での遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）−制限断片長多形（RFLP）法を用いて決定した（図１）。PCRによって増幅した815 bp DNA断片にKpn I、Taq I、またはBam HI消化のいずれかを行った。481位にCを含む対立遺伝子は、Kpn Iによって消化させると659 bpおよび156 bp断片を生じ、一方Tを含む対立遺伝子は同じ酵素によって消化されなかった。815 bp断片は、Gが590位に存在する場合、41 bp、226 bp、170 bp、および377 bp断片に消化され、同じ位置にAが存在する場合は41 bp、396 bp、および377 bp断片に消化された。857位でGを有する対立遺伝子は、Bam HI部位を生じ、この酵素による消化によって536 bpおよび279 bp断片を生じたのに対し、同じ位置のAは、消化に対して対立遺伝子を抵抗性にした。このようにして、NAT2の481位、590位、および857位（SNP4、5および7）での遺伝子型に関するデータを得た。
３つのSNP部位の他に、被検者をさらに４つの部位（SNP1、2、3および6）で遺伝子タイピングした。ヌクレオチド191位（SNP1）、282位（SNP2）、341位（SNP3）、および803位（SNP6）でのSNP部位４個での遺伝子型は、カスコルビ（Cascorbi）ら（Cascorbi I et. al., Am. J. Hum. Genet. 57: 581-592, 1995）の方法に従ってPCRによって増幅した1211 bp DNA断片を用いて決定した。
対立遺伝子WT、M1、M2、M3、およびM4は、それらには多数の多型性部位が存在することから、ハプロタイプとして解される。ハプロタイプという観点から、被検者に関する情報は、ディプロタイプ形、すなわちハプロタイプ２個の組み合わせとして記述することができる。当初、ディプロタイプ形の構築は、SNP4、6、および7での遺伝子型データを基に実施し、ハプロタイプWT、M1、M2、およびM3と呼ぶ。
次に、以下のような最尤法を用いた。ある被検者の遺伝子型が全ての多形部位でハプロタイプに関与するものとすれば、ディプロタイプ形はヘテロ接合座が２個未満の場合に限って決定することができる。これは、遺伝子型データのみを利用した場合には位相情報がないためである。血統情報が利用できれば、各被検者についてディプロタイプ形を決定することができる。ディプロタイプ情報が利用できない場合、集団のハーディ・ワインベルク平衡を仮定した期待値最大化アルゴリズムに基づいて最尤法による推定方法を用いる。この方法は、試料が得られる集団におけるハプロタイプ頻度を推定するものである。推定したハプロタイプ頻度に基づいて、各被検者に関するディプロタイプ形の事後分布を計算することができる。最近の研究から、推定したハプロタイプ頻度がディプロタイプ形と共に正確であることが示された。
次に、LDSUPPORTプログラム（上述した手法）に遺伝子型データを適用して、集団におけるハプロタイプ頻度を推定すると共に、各患者のディプロタイプ分布の事後確率を計算した。
〔実施例２〕  RA患者のディプロタイプ形とSASP治療の副作用との関連性の検討
SASPによる治療は、初回用量500mg〜1,000mg/日で開始した。その後、厳密な基準を伴わずに各医師の決定に従って、SASPの用量を維持するか、または1,500mg/日まで増加した。通常、用量は、臨床および検査データによって判断してSASPの効果が十分でない場合に増加した。臨床記録は注意深く調査して薬物の副作用を調べた。
群による差を評価するための統計分析は、フィッシャーの直接確率検定（Fischer's exact probability test）またはカイ二乗検定のいずれかによって行った。オッズ比および95％信頼区間（CIs）は可能であれば計算した。
これまでに報告されたハプロタイプと、アミノ酸の変化を表１に示す。
（表１）
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また、SASPで治療したRA患者144人の初期値特徴を表２に示した。
（表２）
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平均年齢は49.9±13.4歳であり、RAの発病からSASP治療の開始までの平均期間は51.1±65.7ヶ月であった。SASPによる治療開始と最後のデータが得られた時期までの期間は１日から97ヶ月（27.8±26.8ヶ月、中央値；18ヶ月）であった。最後のデータが得られた2000年６月までに、RA患者83人（57.6％）において、効果が不十分であったか、または副作用のいずれかのためにSASPによる治療を中止した。SASPによる治療開始時に、I、II、IIIおよびIV期であると分類されたRA患者数はそれぞれ、22人（20.7％）、76人（52.9％）、16人（11.3％）、および22人（15.1％）であった。当時、患者39人（27.1％）は、１つ以上のDMARDによって治療していた。患者は、患者98人および46人において初回用量500mgおよび1,000mgで治療していた（表３）。
（表３）
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治療の過程において、SASPの最高用量は500mg（患者39人）、1,000mg（患者100人）、そして15,00mg（患者５人）であった。SASPによる治療の際、SASPが無効であったために、他のDMARDsを患者41人（28.5％）に追加した。
本実施例は、副作用を示した患者と副作用を示さなかった患者を個別に選択しなかったため、ケースコントロール試験というよりはコホート試験として解される。さらに、SASPの使用は、如何なる遺伝情報によっても影響を受けず、すなわち、医師は患者にSASPを投与する際に、患者の遺伝情報を知らない。従って、副作用を示す被検者と副作用を示さない被検者は、当初は単一のグループに属すると考えるべきである。この集団がハーディ・ワインベルクの平衡におおよそ由来する可能性は低い。副作用を示す被検者からなる群は、副作用の発生が遺伝情報によって影響を受けるのであれば、もはやハーディ・ワインベルクの平衡にはないものと考えられる。
当初、SNP部位３箇所での多形性（SNP4、5および7）を患者144において決定し、SNP部位３箇所での遺伝子型データ（SNP4、5および7）と報告されたハプロタイプ（従来の方法）とを組みあわせることによって、ディプロタイプ形を構築した。次の段階では、同じデータをLDSUPPORTプログラム（最尤法）に適用することによって、各被検者のディプロタイプ形を構築した。最尤法を用いる場合、各個人のディプロタイプ形の確率分布は全ての被検者において単一の形態に集中した。
表４は、副作用を示した患者、副作用を示さない患者、そして合わせた群の数および百分率を示す。
（表４）
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結果から、ハプロタイプのうち、４個は既発表のM1、M2、M3ハプロタイプの頻度は、それぞれ0.3%、19.1％、7.6％であった。２つのハプロタイプは、表４に示すような対立遺伝子の組み合わせであった。これを仮にMx、Myとする。非野生型ハプロタイプの複合頻度は、27.8%であった。144人すべてにおいて各人のディプロタイプ分布は、１つのディプロタイプ形に集中した。ここで、野生型のハプロタイプをW、それ以外のハプロタイプをMで表すと、ディプロタイプ形が、W/W、W/M、M/Mはそれぞれ72、64、8であった。これらのディプロタイプ形の分布は、ハーディー・ワインバーグ平衡と矛盾しなかった(P>0.05)（表４）。表５は、異なるディプロタイプ形を示す被検者数を示す。
（表５）
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本コホート試験は、異なるディプロタイプ形を示すRA患者におけるSASPの副作用発生率のいかなる差も検出することをねらいとする。従って、初期値特徴が、異なるディプロタイプ形を有する患者において異なる可能性を除外することが重要である。表１は、異なるディプロタイプ形を有する患者の初期値特徴に有意差を認めなかったことを示している。表２は、異なるディプロタイプ形を有する患者間で用いたSASPの初回および最終的な量に有意差を認めなかったことを示している。
SASPの副作用は患者16人に起こった（11.1％）。表６はそれぞれの副作用を経験した患者数を示している。何人かの患者が多数の副作用を経験したことに注目されたい。
（表６）
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表７では、副作用を示した患者16人についての正確な臨床データと共にディプロタイプ形を示す。
（表７）
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副作用のほとんどはSASP治療の開始後２週間以内に発生した（表７）。NAT2遺伝子のハプロタイプの比率を、副作用を示した患者と副作用を示さない患者のあいだで比較すると、WTとM2の比率において、副作用を示した患者と示さなかった患者間で差が見られた。即ち、副作用を示した患者群で有意にM2の比率が高かった。（表４）。表８は、患者144人においてW/W、W/M、およびM/Mのディプロタイプ形を有する患者数、ならびに副作用を示した患者と副作用を示さなかった患者の数を示す。
（表８）
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非野生型ハプロタイプは全てMで表すのに対し、Wは野生型ハプロタイプを表すことに注意されたい。患者全体において、ディプロタイプ形W/W、W/MおよびM/Mを示す被検者数はそれぞれ、73、63および８人であった。それらのデータはハーディ・ワインベルクの平衡からの解離を示さなかった（p＞0.05、カイ二乗検定）。次に、ディプロタイプ形の比率を２群で比較した。表７は、ディプロタイプ形M/Mを示す患者が、W/W（p＜0.01、フィッシャーの直接確率検定）およびW/M（p＜0.001、フィッシャーの直接確率検定）を示す患者により高い発生率で副作用を示したことを示している。副作用の発生率は、W/WおよびW/Mのディプロタイプ形を示す患者において差を示さなかった（p＝0.357、フィッシャーの直接確率検定）。患者を野生型ハプロタイプを有する患者と有しない患者に分類すると、副作用を示す患者の割合は前者では62.5％であるのに対し、後者では8.1％であった（p＜0.001、フィッシャーの直接確率検定、RR＝7.73、95％CI＝3.54〜16.86）（表８）。
患者４人の副作用は重度であったため、彼らは入院してコルチコステロイドによって治療した（表７）。重度の副作用を示した患者の割合は、野生型ハプロタイプ（W/WまたはW/M）の患者では非常に少数（1.5％）であるが、野生型ハプロタイプを有しない患者（M/M）ではかなり高かった（25.0％）（表９）。差は統計学的に有意であった（p＜0.05、フィッシャーの直接確率検定、RR＝17.0、95％CI＝2.74〜105.5）。異なるディプロタイプ形を有する被検者間での副作用の発生率に明白な差が見られた。
（表９）
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産業上の利用の可能性
本発明により、個人についてのRA治療薬であるスルファサラジン(SASP)の副作用の危険性を判定する方法が提供された。本発明の判定方法によって、各個人のSASP投与に対する副作用の危険性を予め知ることができる。従って、医師がSASPを投与する前に、NAT2遺伝子について遺伝子タイピングして、RA患者のディプロタイプ形を決定することにより、SASPの投与の可否や、投与量等を適切に判断することができる。これにより、副作用の危険を低下させることができ、RA患者にとって有効な治療を施すことが可能となった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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