(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的吸着性のある蛋白質が固定化された微小粒子と被測定物質との反応によって、被測定物質の濃度を分析する方法であって、圧電振動子の共振周波数および共振抵抗の時間変化を測定し、前記微粒子と前記被測定物質とが結合した凝集体の沈降を圧電振動子の共振周波数の変化と共振抵抗の変化の割合から識別し、前記凝集反応に基づく共振周波数または共振抵抗の変化量から被測定物質の濃度を検出する免疫分析法。
【請求項２】
前記圧電振動子が底面に配置された試料チャンバーに前記微粒子溶液を添加し、前記圧電振動子の共振周波数および共振抵抗の変化を測定する工程（Ａ）と、前記試料チャンバーにさらに被測定物質溶液を添加し、前記圧電振動子の共振周波数および共振抵抗の変化を測定する工程（Ｂ）とを有し、前記工程（Ａ）における共振周波数と共振抵抗との変化の割合に対し、前記工程（Ｂ）における共振周波数と共振抵抗との変化の割合が異なる場合に凝集反応が進行したと判定し、前記凝集反応に基づく共振周波数または共振抵抗の変化量から被測定物質の濃度を検出することを特徴とする請求項１記載の免疫分析法。
【請求項３】
少なくとも底面に圧電振動子を配置した液体保持チャンバー、温度制御手段、前記圧電振動子の共振周波数および共振抵抗の時間変化を測定する測定回路を有するとともに、特異的吸着性のある蛋白質が固定化された微小粒子と被測定物質との反応によって前記微粒子と被測定物質とが結合した凝集体と前記微粒子の沈降を、共振周波数と共振抵抗の変化の割合から識別し、前記凝集反応に基づく共振周波数または共振抵抗の変化量から被測定物質の濃度を得るデータ処理手段を有する免疫分析装置。
【請求項４】
前記圧電振動子が、ずり振動モードの水晶振動子であることを特徴とする請求項３記載の免疫分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機分子、蛋白質、オルガネラ、微生物などの濃度を免疫的な反応を利用して、検出する免疫分析法および免疫分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、免疫分析法のなかで、免疫凝集を利用した手法が、比較的簡便な手法として用いられている。この免疫凝集法の中で、ラテックス粒子などの微小球に抗体を修飾して、反応を行わせることによって、より汎用的に免疫凝集法の手法が応用できることが知られている。この免疫凝集法は、基本的に目視による判定であるため、定量性の点で問題がある。また、凝集パターンが形成されるまでに数時間を要する場合もあり時間的な問題もあった。
【０００３】
この凝集反応を水晶振動子によって、検出しようとする試みが、Ｍｕｒａｔｓｕｇｕら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，２４８３−）によって、開示されている。水晶振動子を用いる免疫計測法としては、これに先立ち、水晶振動子表面に抗体を固定化し、抗体に抗原が結合することによって生じる重量変化に伴う共振周波数変化をもとに免疫計測を行う方法が開示されている。さらに、本発明者らによって、酵素反応に基づく凝固反応を水晶振動子の共振周波数あるいは共振抵抗によって測定し、生化学検出に用いる手法も開示されている。この場合、微粒子の沈降によって、凝固反応による共振周波数変化を高める手法についても開示されている。また、共振周波数と共振抵抗の変化の比を比較することによって、水晶振動子表面の物質の粘弾性的な変化を検出できることも本発明者らによって開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
Ｍｕｒａｔｓｕｇｕらの手法では、水晶振動子に接した溶液中の免疫凝集反応の際の水晶振動子の共振周波数変化のみを計測するため、周波数変化の要因が、凝集によるものなのか、別の要因によるものなのかを判断する明確な判断基準がないという問題があった。したがって、凝集反応に基づく、変化量を明確に検出可能にする分析法と分析装置を提供することが本発明の課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
抗体、レクチンなど特異的吸着性のある蛋白質の固定化された微小粒子と被測定物質である対象物質の反応によって、被測定物質の濃度を分析する方法において、微粒子単独で、水晶振動子上に堆積した場合と、微粒子と対象物質とが結合した凝集体が水晶振動子上に堆積した場合では、粘弾性的な性質が異なるため、共振周波数の変化と共振抵抗の変化の割合が異なることを利用して、沈降物質の違いを判定して、凝集体が沈降した際の変化量から被測定物質の濃度を検出する免疫分析法を考案した。
【０００６】
この手法を実現する装置として、すくなくとも底面に水晶振動子を配置した液体保持チャンバー、温度制御手段、水晶振動子の共振周波数および共振抵抗の測定回路を有するとともに、抗体、レクチンなど特異的吸着性のある蛋白質の固定化された微小粒子と被測定物質である対象物質の反応によって微粒子と抗原物質とが結合したマトリクス粒子と微粒子の沈降を識別し共振周波数と共振抵抗の変化の割合および変化量を検出して被測定物質の濃度に変換するデータ処理手段を有する免疫分析装置を考案した。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて、本発明の実施例について説明する。
図１は、本発明の免疫分析法の原理を測定操作手順に沿って説明したものである。図１（ａ）は、水晶振動子１を底面にした液体保持チャンバー２であり、この中に、図１（ｂ）で示した抗体、レクチンなど特異的吸着性のある蛋白質の固定化されたラテックスビーズなどの微小粒子４の懸濁液を入れる（Ｓｔｅｐ１）。この微小粒子は、底面に堆積を始め、図１（ｄ）の中のＡで示した堆積層を形成する（Ｓｔｅｐ２）。続いて、図１（ｅ）で示した被測定物である特異的吸着性を持つ物質を含む溶液をチャンバー内に加える（Ｓｔｅｐ３）。これによって、図１（ｆ）に示すように特異吸着反応が、開始され、微粒子と被測定物質５の免疫凝集体が形成されるようになる。この免疫凝集体は、沈降を始め、図１（ｇ）で示すように、免疫凝集体の堆積層Ｂの堆積が始まる（Ｓｔｅｐ４）。
【０００８】
この堆積層をさらに詳しく見ると図２のようになる。微粒子のみが堆積したＡ層は、比較的粒子が密に堆積しており、粘性的には比較的高い状態になる。免疫凝集体の堆積したＢ層は、免疫凝集体が、構造的に粗な状態で結合しているため、粘性的には比較的小さい状態で堆積している。さらに、被測定物質の種類によっては、免疫反応の初期過程で、Ａ層の堆積物表面に密な状態で、Ｃ層として示すような、免疫凝集層が形成することもある。Ｃ層は、結合が密になり粘性的性質は、高くなる。
【０００９】
ラテックス粒子に硝化細菌抗体を固定化し、硝酸菌試料に対して測定を行った際の測定結果をもとに、以上で説明した工程における水晶振動子の共振周波数と共振抵抗の変化を以下に対応させて説明する。図３（ａ）は、共振周波数の時間変化を示したもので、図３（ｂ）は、共振抵抗の時間変化を示したものである。まず、Ｓｔｅｐ１（Ｓ１）の微粒子懸濁液のチャンバーへの注入によって、液体の粘性のため、共振周波数は大きく減少し、共振抵抗は、増加する。次に、Ｓｔｅｐ２（Ｓ２）の微粒子の堆積によって、水晶振動子表面の重量変化が生じ、共振周波数は、ゆっくり減少し、共振抵抗は、堆積層の粘性的な性質によって、徐々に増加する。さらに、被測定物質の溶液を加えると（Ｓｔｅｐ３：Ｓ３）、この後のＳｔｅｐ４（Ｓ４）の免疫凝集体の堆積において、堆積による重量変化によって、共振周波数は急速に減少した後、沈降の収束に伴い緩やかな減少となる。これは、免疫凝集体の沈降が比較的短時間で起こるからである。共振抵抗も免疫凝集体の堆積による粘性的性質の増加によって、急速に増加した後、緩やかな増加になる。最終的には、どちらもほとんど増加は見られなくなる。
【００１０】
以上の変化を、図３（ｃ）に示す共振周波数と共振抵抗をプロットしたグラフにおいて説明すると、Ｓｔｅｐ２の部分の傾きとＳｔｅｐ４の部分の傾きが異なることがわかる。この傾きの違いは、重量変化を反映する共振周波数変化に対して、表面の粘性変化を反映する共振抵抗の変化の程度の違いを示しており、この違いによって堆積物の違いを識別することができる。すなわち、Ｓｔｅｐ２の部分は、微粒子のみの堆積によるもので、Ｓｔｅｐ４の部分が、免疫凝集体の堆積によるものである。図３（ｃ）のＳｔｅｐ４の部分には、さらに２つの傾き部分Ｓｔｅｐ４ａとＳｔｅｐ４ｂが存在することがわかる。このＳｔｅｐ４ａが、図２で示した密な免疫凝集体のＣ層に相当するものであり、Ｓｔｅｐ４ｂの部分が、図２のＢ層に相当するものである。Ｓｔｅｐ４ａの部分の傾きは、Ｓｔｅｐ２の傾きより大きくなっており、Ｓｔｅｐ４ｂの部分の傾きは、Ｓｔｅｐ２よりも小さくなっていることがわかる。変化量の指標としては、このＳｔｅｐ４の部分の共振周波数または共振抵抗の変化量を求め、あらかじめ求めた検量線から濃度を算出することができる。
【００１１】
次に、被測定物質のブランク溶液を用いた場合の共振周波数−共振抵抗プロットを図３（ｄ）に示す。図３（ｄ）において、微粒子の堆積を表すＳｔｅｐ２の部分の傾きは、図３（ｃ）と同様に観察されるが、Ｓｔｅｐ４の部分が大きく異なることがわかる。このＳｔｅｐ４の部分の傾きは、Ｓｔｅｐ２の傾きに近い値であり、ここでは、免疫凝集体が形成されず、微粒子の堆積が継続していることがわかる。ここで、Ｓｔｅｐ２とＳｔｅｐ４で傾きがわずかに異なるのは、溶液の組成の変化などによるものである。
【００１２】
次に、図４は、本免疫分析を行うためのめの免疫分析装置の模式図を示したものである。図４において、免疫分析装置は、底面に水晶振動子を配置した液体保持チャンバー２１、温度制御手段２２、水晶振動子の共振周波数および共振抵抗の測定回路２３、抗体、レクチンなど特異的吸着性のある蛋白質の固定化された微小粒子と被測定物質である抗原物質の反応によって前記微粒子と対象物質とが結合したマトリクス粒子と前記微粒子の沈降を識別し共振周波数と共振抵抗の変化の割合および変化量を検出して被測定物質の濃度に変換するデータ処理手段２４、表示装置２５、キースイッチ２６によって構成されている。チャンバー２１とそれに対応する測定回路２３を複数個設置することで、複数の試料の同時測定を可能にすることもできる。
【００１３】
実際の試料として、ラテックス粒子に硝化細菌抗体を固定化し、硝酸菌試料に対して、Ｓｔｅｐ４部分の共振周波数変化と硝化細菌濃度の関係を測定した結果を図５に示す。測定は、３０分程度で終了し、従来数時間かかっていたのに対して大幅に測定時間を低減することができた。また、測定感度も目視に比べて向上させることができた。
【００１４】
さらに、本実施例では、ずり振動モードの水晶振動子を用いて説明を行ったが、水晶振動子以外のずり振動モードの圧電素子を用いることも可能である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の免疫分析法および免疫分析装置によって、免疫凝集体の堆積を明確に見分けることができるようになり、確度および精度の高い免疫凝集法の測定を行えるようになった。さらに、本発明によって、測定時間が大幅に短縮でき、測定の定量化が可能になり、測定感度を感度を向上させることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫分析法の原理の説明図である。
【図２】本発明の免疫分析法の原理の説明図である。
【図３】本発明の免疫分析法の原理の説明図である。
【図４】本発明の免疫分析装置の構成図である。
【図５】本発明の免疫分析法の測定例を示す図である。
【符号の説明】
１    水晶振動子
２    液体保持チャンバー
４    蛋白質固定化微小粒子
５    被測定物質
２１  液体保持チャンバー
２２  温度制御手段
２３  共振周波数および共振抵抗の測定回路
２４  データ処理手段
２５  表示装置
２６  キースイッチ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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