(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状を緩和するための組成物であって、該症状を緩和するのに十分な量のＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含み、該薬剤が、ＨＳ０１４である、組成物。
【請求項２】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記哺乳動物が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記被験体が、成体、若年者または思春期前の哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１つ以上の成長因子と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記被験体がまた、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗てんかん薬、抗アルツハイマー薬、抗パーキンソン薬、ＭＡＯインヒビター、セロトニン取り込みブロッカー、ノルアドレナリン取り込みブロッカー、ドーパミン取り込みブロッカー、ドーパミンアゴニスト、Ｌ−ＤＯＰＡ、トランキライザー、鎮静薬およびリチウムからなる群より選択される１つ以上の薬剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
全身に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
経口、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内、頭蓋内、口腔内、粘膜、経鼻、肺および直腸の経路からなる群より選択される経路によって投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
経鼻スプレーまたは経鼻坐剤として処方されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
乾燥粉末吸入器または水性ベースの吸入器によって投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤が前記被験体の中枢神経系に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含む、パーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の少なくとも１つの症状を示す被験体において、中枢神経系細胞増殖の促進を誘導するための組成物であって、該薬剤が該被験体において中枢神経系細胞の増殖を誘導し、該薬剤が、ＨＳ０１４である、組成物。
【請求項１３】
ＭＣ４Ｒアンタゴニストを含む、パーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害を有する被験体においてパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状を軽減するための長時間作用性の組成物であって、該組成物は、該被験体がパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状における所望の軽減を示すまで所定の期間、投与されることを特徴とし、かつ該ＭＣ４Ｒアンタゴニストの投与を停止した後に少なくとも２週間にわたってパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状の継続的な軽減を示すことを特徴とし、該アンタゴニストが、ＨＳ０１４である、組成物。
【請求項１４】
０．１ｎｇ／ｋｇ／日と１０μｇ／ｋｇ／日との間、１μｇ／ｋｇ／日と１００μｇ／ｋｇ／日との間、または１０μｇ／ｋｇ／日と１０００μｇ／ｋｇ／日との間の投薬量で投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＭＣ４Ｒアンタゴニストが、前記被験体の中枢神経系に投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＭＣ４Ｒアンタゴニストが、０．１ｎＭ〜５００ｎＭの組織濃度を得るように投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
ＭＣ４Ｒアンタゴニストを含む、パーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害および脳におけるドーパミン作動性ニューロンの減少を有する被験体におけるパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状を軽減するための長時間作用性の組成物であって、該組成物は、該被験体がパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状の所望の軽減を示すまでの期間、投与されることを特徴とし、かつ該ＭＣ４Ｒアンタゴニストの投与を停止した後に少なくとも２週間にわたってパーキンソン病またはパーキンソン症候群の障害の症状の継続的な軽減を示すことを特徴とし、該アンタゴニストが、ＨＳ０１４である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年１２月１４日に出願された、米国仮特許出願第６０／８７５，１４０号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
数年間にわたって、神経幹細胞が成体の哺乳動物の脳で生きているということが確認されている。新しいニューロンが成体の哺乳動物の脳で発生したという最初の示唆は、１９６０年代に行われた研究に由来した［１、２］。しかし、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）内の神経発生が、胚発生および周産期に限定されるという理論を克服するには、さらに３０年の月日と洗練された技術的手順を要した（概説については［３］、［４］を参照のこと）。神経の疾患および損傷の処置は伝統的に、既存の生きているニューロンの維持に集中していたが、現在では、神経学的な障害および疾患の治療的処置のための神経形成を開発するという可能性がある。
【０００３】
新しいニューロンの供給源は、例えば、側脳室を裏打ちする上衣層および／または脳室下帯（ＳＶＺ）内［５］、［６（非特許文献１）］および海馬形成の歯状回内［７］に位置する、成体の神経幹細胞（ＮＳＣ）である。他の研究で、成体のＣＮＳ内のＮＳＣのいくつかのさらなる位置の可能性が明らかになっている［８］。さらに、神経系細胞を生じ得る幹細胞がＣＮＳの外側から生じ得るということも示されている。例えば、Ｍｅｚｅｙ，Ｅら「Ｔｕｒｎｉｎｇ  Ｂｌｏｏｄ  ｉｎｔｏ  Ｂｒａｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｅａｒｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ．」  Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２９０巻、２０００年１２月１日、第１７７９〜１７８２頁、およびＢｒａｚｅｌｔｏｎ，Ｔ．Ｒ．ら「Ｆｒｏｍ  Ｍａｒｒｏｗ  ｔｏ  Ｂｒａｉｎ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９０巻、２０００年１２月１日、第１７７５〜１７７９頁を参照のこと。ＮＳＣは非対称性分裂によってその数を維持し、一方で急速に分裂する前駆体、または前駆体細胞の集団を生成する［６（非特許文献１）］。この前駆体は、それらが分化する細胞タイプ、およびそれらが最終的に脳内で占める位置の両方に関して、その増殖の程度、生存およびそれらの運命を命令する、ある範囲の合図に対して応答する。
【０００４】
成体の脳における心室系のＮＳＣは、神経管を裏打ちする胚性脳室帯幹細胞の対応物である可能性が高く、その前駆体が遊走して分化したニューロンおよびグリアとしてＣＮＳを形成する。ＮＳＣは成体の側脳室壁（ＬＶＷ）で生き残り、神経前駆体を生じ、これが吻側細胞移動経路（ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）を嗅球まで遊走し下って、ここで顆粒細胞および糸球体周辺ニューロンに分化する［９］。実質的なニューロンの死は嗅球で生じ、失われたニューロンの連続的な置換の必要性（ＬＶＷ由来の遊走する前駆体によって満たされる要件）が生じる［１０］。嗅球ニューロンのこの継続中の再増殖に加えて、他の脳領域から失われたニューロンがＬＶＷ由来の前駆体（これは、適切なニューロン投射およびシナプスを正確な標的細胞タイプとともに備えた失われたニューロンの表現型に分化する）によって置換され得ることが強力に示されている［１１］；［１２］。
【０００５】
インビトロの培養技術が、ＮＳＣの増幅および分化の調節に関与する外部シグナルを特定するために確立されている［６（非特許文献１）］、［１３］。分裂促進因子ＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦによって、神経前駆細胞（脳室壁および海馬から単離される）を培養物中で大きく増殖することが可能になる［１４］、［１３］。この分裂する前駆体は、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）として公知の細胞の大きいボールに成長する未分化状態のままである。血清の追加と組み合わせた分裂促進因子の使用中止によって、脳の３つの細胞系列、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトへの前駆体の分化が誘発される［５、６（非特許文献１）］。特定の成長因子の適用によって、各々の細胞タイプの割合を一方向または他に偏向することができる。例えば、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）は神経前駆体をアストログリア細胞の運命に仕向けるように作用する［１５、１６（非特許文献２）］が、甲状腺ホルモン、トリヨードチロニン（トリヨードサイロニン）（Ｔ３）は、オリゴデンドロサイト分化を促進することが示されている［１６（非特許文献２）］。ＰＤＧＦによる神経前駆体の神経分化の強化も、実証されている［１６（非特許文献２）］；［１７］。
【０００６】
神経前駆体を増殖し、次いでその細胞の運命を操作する能力は、特定の細胞タイプが失われる神経学的疾患（例えば、ＣＮＳ変性障害）の処置のために多大な意味を有する。
【０００７】
ニューロン細胞の損失によって特徴付けられる疾患の例は、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レヴィー小体疾患、多発脳梗塞性認知症、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭葉変性（ＦＬＤ、前頭側頭認知症または非特異的前頭葉認知症とも呼ばれる）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、進行性核上麻痺、フリードリッヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ）、オリーブ橋小脳萎縮症（ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅ／ｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）（ＯＰＣＡ）、および他のＣＮＳ変性疾患、脳卒中、脳外傷、てんかん／ＬＷおよび統合失調症である。
【０００８】
グリア細胞の消失によって特徴付けられる疾患の例としては、シャルコー・マリー・ツース病、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳障害、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ＨＩＶ脳炎、橋中央ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、クラッベ球様細胞（Ｋｒａｂｂｅ’ｓ  ｇｌｏｂｏｉｄ  ｃｅｌｌ）、および異染性白質萎縮症、アレクサンダー病、カナバン病、コケーン症候群およびペリツェウス・メルツバッハー病が挙げられる。グリア細胞の消失を生じる他の障害としては、過剰な照射、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、シス−プラチン、シトシンアラビノシド（ＡＲＡ−Ｃ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびチオテパ）の副作用、および免疫抑制療法（例えば、サクリスポリンＡ）による副作用が挙げられる。
【０００９】
さらに、未分化の神経幹／前駆体の免疫抑制効果によって処置され得る多発性硬化症（ＭＳ）などのさらなる疾患がある。例えば、Ｐｌｕｃｈｉｎｏ  Ｓら［１８］を参照のこと。ＭＳは、おそらく自己免疫の原因による、ニューロンではなくオリゴデンドロサイトの消失によって特徴付けられる。
【００１０】
前駆体細胞は、インビトロで増殖されてもよく、引き続き患者に移植されてもよい。この開示の目的について、「患者」および「被験体」とは、同じ意味を有する。ＰＤ患者の以前の移植処置は、黒質ドーパミン作動性ニューロンが末梢分化を受けている時点で中脳腹側から採取された胎児組織を用いている［１９］。この細胞は、線条体上に移植され、ここでホストの線条体ニューロンとのシナプス接合を形成し、それらの正常なシナプス標的は、ドーパミン代謝回転を修復して、患者にとって重要な機能的利点を有する正常なレベルまで遊離する［１９］（概説については、［２０］）。移植のかなり好ましい代替は、脳に直接または末梢に投与される、医薬（すなわち、成長因子、ペプチドまたは低分子量化合物）を用いるインビボでの内因性の前駆体の増殖および分化の刺激のストラテジーである。このストラテジーを用いれば、移植に関するいくつかの問題、例えばドナー組織の欠乏、および胎児組織を用いて生じる倫理的問題は、回避され得る。
【００１１】
ＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦのラットの脳への脳室内インフュージョンは、脳室壁細胞集団を増殖することが示されている。ＦＧＦの場合、隣接する線条体実質への前駆体細胞の過剰な遊走が示されている［２１、２２］。前駆体の分化は、優先的にグリア系列へ向かい、ニューロンの発生は減少した［２１］。成体ラット中のＢＤＮＦの脳室内注入は、嗅球および吻側細胞移動経路（ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）における、ならびに実質構造（線条体、中隔、視床および視床下部を含む）における、新しく発生されるニューロンの数の増大を促進することが示されている［２３（非特許文献３）］。これらの研究によって、ＬＶＷのＳＶＺ内の前駆体の増殖が、刺激され得ること、およびそれらの系列が、神経およびグリアの運命を促進するように操作され得ることが実証される。
【００１２】
多数の成長因子、例えば、ＥＧＦおよびｂＦＧＦは、神経幹細胞の強力な分裂促進因子として特定されている。側脳室への注入は、正常な哺乳動物におけるインビボの神経形成を刺激し、決定的には虚血のラットにおいて損傷の上方制御神経形成を有意に増強して、機能的な利得を与える。血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は神経形成を促進する別の成長因子である。脳由来の栄養素（ＢＤＮＦ）はまた、脳室内注入後の線条体における新しいニューロン発生を刺激することが示されている［２３（非特許文献３）］。ＥＧＦと同様、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）は、神経幹細胞増殖を刺激するＥＧＦレセプターを通じて機能する。ＴＧＦαの効果は、ＰＤのラット６−ヒドロキシドーパミンモデルで研究されており、これは魅力的な結果であった［２４］。６−ヒドロキシ−ドーパミンは、最も広く受け入れられる「古典的な」毒素誘発性のパーキンソン病モデルのうちの１つである。神経毒の効果は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンを破壊することによってパーキンソン病でみられる重篤な症状に関連する細胞消失を模倣する。病変の線条体へのＴＧＦ−αの注入（線条体へのＳＮｐｃドーパミン作動性神経投射軸索の消失）は、脳室下帯幹細胞の急速な増殖、続いて、注入／病変部位に向かう神経細胞前駆体およびグリアの前駆体の突起部の移動を誘発した。興味深いことに、これは、病変のある動物においてのみ明白であった。引き続き、漸増数の分化したニューロンが線条体で観察されその多くの数が、ドーパミン作動性ニューロンマーカー、チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミントランスポーターで陽性に染色された。行動実験では、ＴＧＦα処理動物において、アポモルフィン誘発性の回転の有意な減少が観察された。これらの結果によって、神経幹細胞は、げっ歯類ＰＤモデルにおいて、線条体で新規な機能的ニューロンを促進する（パーキンソン症状を減少する）ように刺激され得ることが示されている。この実験では、ニューロンの置換は、直接ではなく、言い換えれば、ＳＮｐｃニューロンの消失は、ＳＮｐｃにおいてではないが線条体において、ドーパミン作動性ニューロンによって置き換えられた。有益な行動上の効果は、おそらく、失われた線条体のドーパミン作動性の阻害の状態（正常にはＳＮｐｃドーパミン作動性ニューロンによって提供されるが、今は新規な線条体ドーパミン作動性ニューロンによって遊離される）の回復を通じていた。
【００１３】
一般には、現在のパーキンソン病薬療法が関与する薬物は一時的かつ短期間の効果を有しており、薬物療法の休止を超えて続かない。現在のところ、インビボでの神経形成に影響することが公知の因子の数は少なく、その作用はしばしば、常にではないが、望ましくない副作用の誘引を包含する。神経幹細胞活性、神経前駆体の増殖、および所望のニューロン細胞タイプへの前駆体の分化を選択的に刺激し得る因子の長年にわたる切実な必要性がある。インビボの神経形成（および／または新生）を刺激するため、および移植療法のために細胞を培養するための新規な方法が必要である。
【００１４】
神経変性疾患におけるニューロンの喪失を置き換えるためには、前駆体のサブセットは、ニューロンの運命ではなく、グリア細胞の運命に順応する場合が有益であり得る。神経形成（および／または新生）プロセス自体および得られたニューロンに対する正の効果に加えて、新生のグリア細胞は、既存のニューロンに対して栄養の支持および神経保護を提供し得る。これは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦもしくはＰＤＧＦなどの成長因子、またはＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＧＬＰ１もしくはケモカインなどの神経ペプチド、およびニューロンにこれらの効果を与えるサイトカインの分泌を通じ得る。新しいグリア細胞からのこれらの因子の分泌からの神経ネットワークに対する有益な影響はまた、ニューロンの樹枝状分岐の増大、シナプス形成、またはシナプス伝達の効率に重要な輸送因子および受容体の調節の形態をとってもよい。
【００１５】
脳の炎症は、慢性神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病の病因に重要な役割を果たす。炎症によって生じる神経変性は、脳の常在性免疫細胞であるミクログリア（多数の炎症促進性神経毒性因子を生じる）の活性化に関与する。また、急性の脳発作（例えば、脳卒中およびてんかん発作）は、神経病理学的事象の伝播に寄与する炎症に関連する。脳実質への新規なグリア細胞分泌因子の形成によって脳は免疫応答を調節し得、従って、炎症の有害な影響を減らし、かつ有益な効果を促進する。未熟な神経前駆体は、免疫誘発性の特性を有する（初期のコメントにおける引用文献を参照のこと）。
【００１６】
医薬は、神経幹細胞子孫が神経回路網に有益な因子またはプロセスを生じることを促進し得る。これは、新生グリアの場合であっても、またはついでに言えば既存のグリア／細胞（栄養性、神経保護性、免疫調節性の因子を産生および／または分泌するように誘導される）の場合であっても、または新生のニューロンもしくは既存のニューロン（その機能を改善するように刺激される）の場合であってもよい。
【００１７】
これらの作用機序の全ての結果、本発明者らは、神経系の疾患または損傷を有する患者に有益であると提唱する。
【００１８】
（メラノコルチンレセプター）
ＡクラスのＧＰＣＲスーパーファミリーに属する、メラノコルチンレセプターの５つのサブタイプであるＭＣ１〜５Ｒが特定されクローニングされている［２５］。これらのレセプターは、多数の機能に関与する。ＭＣＲ１は、皮膚組織沈着および免疫系を調節する。ＭＣ２Ｒ（ＡＣＴＨレセプター）は、ステロイド産生をコントロールする。ＭＣ３Ｒは、中枢の性的行動の調節に関与し得、ＭＣ５Ｒは、外分泌腺分泌を調節する役割を有するが、ＭＣ４Ｒは主に、摂食行動を制御する［２６］。ＭＣ４Ｒに対するアゴニストは、食物摂取を減らすが、アンタゴニストは、食物摂取を増大する。ＭＣ４Ｒの他の機能は、勃起能、痛覚、不安／抑うつおよび視床下部・下垂体・副腎系軸の調節に関与する（［２７（非特許文献４）］に概説される）。
【００１９】
ＭＣ４Ｒは、ノーザンブロットによって評価されるとおり主に脳で発現される［２８］。インサイチュハイブリダイゼーション技術を用いれば、ＭＣ４Ｒは脳において、皮質、視床、視床下部および脳幹を含む複数の部位で、広範に分布されることが示されている［２９］、［３０］。さらに、中程度から広範囲な標識がまた、扁桃体、海馬および内嗅皮質層（ｅｎｔｈｏｒｈｉｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）にもみられる［３０］。
【００２０】
メラノコルチンレセプターの天然のリガンド（アゴニスト）は、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）α、βおよびγ、ならびに副腎皮質刺激ホルモンＡＣＴＨからなる。全てのメラノコルチンレセプターは、ＡＣＴＨによって活性化されるが、ＭＣ２Ｒを除く全てのメラノコルチンレセプターが、以下のチャートで示されるとおりＭＳＨで活性化される。
【００２１】
【化１】
0005383498.tif 000002
さらに、２つの内因性アンタゴニスト、アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）−タンパク質およびアグーチ関連タンパク質（ａｇｏｕｔｉ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＧＲＰ）が特定されている［３１］。アグーチは、ヒトの脂肪組織、精巣、卵巣、心臓において、ならびに低レベルで包皮、腎臓および肝臓において発現される。ＡＧＲＰは、アグーチに対するその相同性に基づいてクローニングされた（ヒトアグーチと２５％同一性）。ＡＧＲＰは、中枢神経系に極めて明確な分布を有し、これはプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）発現ニューロンに近接している視床下部後部の神経細胞体で発現されている。アグーチは、ＭＣ１ＲおよびＭＣ４Ｒで競合的アンタゴニストであるが、ＭＣ３ＲおよびＭＣ５Ｒには結合しない。対照的に、ＡＧＲＰは、ＭＣ３ＲおよびＭＣ４Ｒに結合して、これを拮抗して、ＭＣ４Ｒでインバースアゴニストとして作用する（［２７（非特許文献４）］で概説される）。メラノコルチン系の現在の研究は、肥満の可能な処置についてＭＣ４Ｒアゴニストに集中しており、ＭＣ４Ｒアンタゴニストは、悪液質の可能な処置に用いられている（疾患によって生じる体重および筋肉の質量の消失を伴う身体的消耗）。ＭＣ４Ｒの遮断は、不安疼痛の症状および乱用薬物の習慣性を緩和する有用な方法であり得るということも示されている（［２７（非特許文献４）］に概説される）。中枢神経系の神経変性疾患または損傷を処置するためのＭＣ４Ｒの活性を低下させる薬剤の使用は以前には記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９９）９６（１）：ｐ．２５〜３４
【非特許文献２】Ｊｏｈｅ，Ｋ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９９６）１０（２４）：ｐ．３１２９〜４０
【非特許文献３】Ｐｅｎｃｅａ，Ｖ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００１）２１（１７）：ｐ．６７０６〜１７
【非特許文献４】Ｃｈａｋｉ，Ｓ．およびＳ．Ｏｋｕｙａｍａ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００５）２６（１０）ｐ．１９５２〜６４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
発明の簡単な説明
本発明の一実施形態は、ＣＮＳ細胞の新生を調節する方法に関する。この方法では、ＣＮＳ細胞は、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤と、ＣＮＳ細胞の新生を調節するのに十分な量で接触される。
【００２４】
本発明の方法は、インビトロで行われてもよい。すなわち、本発明の任意の方法は、一次培養物、樹立された培養物、または患者から収集された細胞懸濁物として培養されるＣＮＳ細胞に適用され得る。さらに、本発明の方法は、インビボにおいて、例えば、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤を直接被験体に投与することによって、行われてもよい。
【００２５】
ＣＮＳの、またはＣＮＳ由来の任意の細胞は、本発明の方法によって調節されてもよい。これらの細胞としては以下が挙げられる：神経幹細胞、神経前駆細胞、幹細胞およびグリア細胞。さらに、調節とは細胞の直接調節、または細胞子孫の調節を包含し得る。
【００２６】
新生を調節することは、細胞またはその子孫の多くの特徴を変化させること（増大または減少させること）を包含し得る。これらの特徴は、少なくとも、増幅、生存、分化、脱分化、遊走および薬剤（例えば、タンパク質）の産生または分泌を包含する。新生を調節することが、ある薬剤の発現または分泌を変化させることに関与する場合、この薬剤は、神経系細胞またはその子孫の栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、免疫調節因子、神経保護因子、ニューロン樹枝状分岐因子（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｒｂｏｒｉｓａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、シナプス形成促進因子、またはシナプス伝達促進因子（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）であってもよい。さらに、ＣＭＳ新生を調節することは、神経系細胞またはその子孫の免疫調節効果を調節することに関与し得る。
【００２７】
本発明の方法の任意の１つは、任意の哺乳動物由来のＣＮＳ細胞に適用可能である。従って、この方法は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよび他の市販の有用な哺乳動物由来のＣＮＳ細胞に適用可能である。ＣＮＳ細胞は、成体ＣＮＳ細胞、若年ＣＮＳ細胞、思春期前のＣＮＳ細胞、新生ＣＮＳ細胞、および胚性細胞を含むＣＮＳ細胞を含む、哺乳動物の寿命の任意の段階であってもよい。これらの細胞の例としては、少なくとも、成体神経幹細胞、胚性幹細胞および非胚性幹細胞が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法における薬剤として用いられ得るＭＣ４Ｒアンタゴニストおよびアナログとしては、少なくともＨＳ０１４、ＨＳ０２８、化合物１０、化合物Ｐｏｎｔｉｌｌｏ１４ｃ、化合物Ｘｉ１４ａ、化合物Ｘｉ１４ｂ、化合物Ｘｉ１４ｃ、化合物Ｘｉ１４ｄ、化合物Ｘｉ１４ｅ、化合物Ｘｉ１４ｆ、化合物Ｘｉ１４ｇ、化合物Ｘｉ１４ｈ、化合物Ｘｉ１４ｉ、化合物Ｘｉ１４ｊ、ＳＨＵ９１１９、ＨＳ０２４、化合物１０ｄ、化合物１８ｖ、化合物１３ｂ−２、化合物Ｔｒａｎ１２ｅ、Ａｇｏｕｔｉ（１−４０）アミド、Ａｇｏｕｔｉ（８７−１３２）、ならびにそれらのアナログおよび低分子量アナログおよび組み合わせが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法はさらに、細胞と１つ以上の成長因子との接触という任意の工程を含んでもよい。これらの成長因子は、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、Ｅｐｏ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、ＶＥＧＦまたはそれらの組み合わせであってもよい。これらの成長因子は、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤（単数または複数）の適用の前、間、または後に適用されてもよい。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＣＮＳ障害の症状を緩和する方法に関する。この方法は、この被験体に対してＭＣ４Ｒの活性を低下させる薬剤を含む組成物を、この症状を緩和するのに十分な量で投与する工程を包含する。この方法によって処置され得る障害としては、被験体におけるニューロンの異常な減少、またはグリア細胞の異常な減少によって特徴付けられる障害が挙げられる。このような障害の例としては以下が挙げられる：パーキンソン病、パーキンソン症候群の障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄虚血、虚血性脳卒中、脊髄損傷、ガン関連脳損傷、およびガン関連脊髄損傷、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上麻痺、脳卒中、脳梗塞、多発脳梗塞性認知症、老人性認知症、レヴィー小体疾患、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭葉変性、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、進行性核上麻痺、フリードリッヒ運動失調症、およびオリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、多発性硬化症およびてんかん。
【００３１】
別の例としては、この方法によって処置され得る障害としては、神経変性障害、神経幹細胞障害、神経前駆体障害、虚血性障害、神経学的外傷および損傷、情動障害、精神神経性障害、網膜の変性疾患、網膜損傷および外傷、学習および記憶の障害、神経変性に関連する運動失調、ウマ変性脳脊髄障害、小脳性無生活力（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｂｉｏｔｒｏｐｈｙ）、ウマ運動ニューロン疾患；胃スピロヘータ病（ウマ自律神経障害）、麻酔後脊髄軟化症、およびウマ白質脳軟化症が挙げられる。
【００３２】
任意の工程としては、投与は、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤の投与の前、後、または間に投与される１つ以上の薬剤を包含し得る。この薬剤は、上記で列挙される成長因子のうちの１つであってもよい。さらに、この薬剤は、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗てんかん薬、抗アルツハイマー薬、抗パーキンソン薬、ＭＡＯインヒビター、セロトニン取り込みブロッカー、ノルアドレナリン取り込みブロッカー、ドーパミン取り込みブロッカー、ドーパミンアゴニスト、Ｌ−ＤＯＰＡ、トランキライザー、鎮静薬およびリチウムであってもよい。
【００３３】
本発明の組成物は、任意の投与方法を用いて投与され得る。これらの方法としては、全身投与および中枢投与が挙げられる。全身投与の方法としては、経口、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、口腔内、粘膜、経鼻、肺および直腸の投与が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、経鼻スプレーまたは経鼻坐剤（ｎａｓａｌ  ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ）によって投与される。例えば、経鼻投与は、乾燥粉末吸入器または水性ベースの吸入器を用いて行われてもよい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体のＣＮＳに対する投与（中枢投与）、例えば、側脳室内、実質内、髄腔内および頭蓋内投与を包含する。これは、例えば、注射または注入によって行われてもよい。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、中枢神経系障害のうち少なくとも１つの症状を示す患者において、ＣＮＳ新生を誘導する方法に関する。この方法は、患者に対して、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤を、この患者においてＣＮＳ新生をこの薬剤が誘導するのに十分な量で投与する工程を包含する。ＣＮＳ新生は、神経系細胞の乏突起神経膠細胞への変換を誘導する工程を包含する。この変換はさらに、（ａ）神経系細胞を幹細胞（例えば、単能性、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）、または多能性の幹細胞）に変換する工程と、（ｂ）この幹細胞を乏突起神経膠細胞に変換する工程とを包含し得る。さらに、この変換工程は、インビトロで行われてもよい。すなわち、この神経系細胞は、患者から取り出されて、ＭＣ４Ｒの活性を低下させる薬剤で処理されて、乏突起神経膠細胞に変換されてもよい。次いで、この乏突起神経膠細胞は、患者に再移植されてもよい。
【００３５】
投与されるべきＭＣ４ＲアンタゴニストのようなＭＣ４Ｒの活性を低下させる薬剤の有効量の決定は、当業者の技術の範囲内であって、当業者には慣用的である。投与されるべきＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の量は患者の正確な大きさおよび状態に依存するが、０．００１〜１０ｍｌの容積中に少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも５ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも２０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、または１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。別の投与方法では、この薬剤は、標的組織が、０．０００１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．００１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．０１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、または少なくとも１ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、または少なくとも５００ｎＭというこの薬剤の濃度を達成するように投与され得る。好ましい投薬量としては、少なくとも１０ｍｇを１日２回、もしくは少なくとも２５ｍｇを１日２回という全身投与；少なくとも０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．２４ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３６ｍｇ／ｋｇ／日、もしくは少なくとも４８ｍｇ／ｋｇ／日という全身投与；少なくとも２２μｇを１日２回、少なくとも４４μｇを１日２回という全身投与；または少なくとも３〜１０ｍｇ／ｋｇを週に１回という全身投与が挙げられる。特に好ましい投薬量範囲は、０．０４ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。これらの投薬量は、経皮適用または局所適用において１０×、１００×または１０００×増大されてもよい。
【００３６】
本開示の任意の方法については、投与は、達成されるべき結果の性質に依存する多数の経路によってであってもよい。投与は、経口であっても、経鼻であっても、局所であっても、または注射もしくは注入によってもよい。非経口投与の経路は、注射または注入によってもよく、これには静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内または髄内（すなわち、髄腔内）注射および脳室内（ＩＣＶ）が挙げられる。投与されるべき薬剤は、液体であっても、固体であっても、丸剤であっても、坐剤であっても、経鼻スプレーであっても、または患者（当然ながらヒトを含む任意の哺乳動物であってもよい）に送達するための任意の公知の形式であってもよい。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、多数の工程を含む被験体中の変性ＣＮＳ障害の症状を緩和するための方法に関する。第一の工程では、ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含む組成物の１つ以上の有効用量を、一定期間この被験体に投与する。第二の工程では、この被験体中の新生の指標を、非侵襲性の方法を用いることによって、モニタリングして、上記用量が十分であるか否かを決定する。第三の工程では、投薬量（すなわち、用量）は、上記新生の兆候が最少閾値より低い場合、増大され、上記新生の兆候が最大閾値を上回る場合、減量される。
【００３８】
モニタリング工程、第二の工程は、多数の方法によって行い得る。本発明者らは、薬剤の有効性の１つの信頼できて、かつ予測可能な指標が体重増加であることを見出した。さらに、本発明者らは、体重増加が、ある程度のＣＮＳ障害を有する被験体（例えば、パーキンソン病、または臨床的に誘発されるパーキンソン病疾患のモデル）で特に信頼できるということを見出した。体重増加を測定することによって、十分な用量は、同様のＣＮＳ障害の症状を有するが、上記組成物を投与されない第二の被験体に比較して、設定閾値を上回る上記被験体の体重の増大を生じる最小用量として決定される。上記閾値は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、４０％または５０％という体重増加であってもよい。体重の増大は、なんらかの体重増加が、利用される食物の質または量の変化に起因しないように、同じ食物および飲料を被験体に自由に提供することによって最も容易に測定される。自然には、これらの管理条件下で、患者は、試験されるべき薬剤（ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤）を除いて食欲または体重に影響する薬剤を投与されてはならない。
【００３９】
従って、体重増加または減少は、同じ程度のＣＮＳ障害および症状を有するが、本発明の薬剤を投与されていない、第二の被験体と比較することによって決定され得る。別の有用な比較は、処置の前の被験体の体重と、処置の間の被験体の体重を比較することである。すなわち、もとの被験体および第二の被験体は、異なる時点の同じ被験体であってもよい。
【００４０】
新生をモニタリングするための別の非侵襲的方法は、プロトン核磁気共鳴によって被験体のＣＮＳ中の神経幹細胞および前駆体細胞のレベルをモニターすることである。刊行物［３２］では、著者らは、インビボでヒト脳における神経前駆細胞（ＮＰＣ）の検出および定量のための代謝性バイオマーカーを記載している。著者らは、プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＭＲＳ）を用いて、バイオマーカー（ＮＰＣが富化されて、その用途が新生をモニタリングするための参照として実証される）を特定および特徴づけした。インビボで低濃度のＮＰＣを検出するために、著者らは、シグナル処理方法を開発した。この方法によって、げっ歯類の脳および生きたヒトの海馬の両方でＮＰＣバイオマーカーの分析のための核磁気共鳴分光法の使用が可能になる。バイオマーカーの正確な分子性質は、確立されていないが、著者らによって記載される「１．２８−ｐｐｍスペクトル・ピーク」バイオマーカーは、飽和されるかおよび／または不飽和の脂肪酸、ならびに関連の化合物の複雑な混合物であるということが強力に示された。従ってこれらの知見によって、非侵害的な方式において広範な種々のヒト脳障害におけるＮＰＣおよび神経形成の役割を検討することの可能性が開かれる。
【００４１】
上で言及されるとおり、本発明の方法は、ある程度のＣＮＳ障害を有する被験体に特に有効である。例えば、この被験体は、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、および少なくとも９９％という健常な被験体に比較したドーパミン作動性ニューロンの減少を有し得る。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、被験体が変性ＣＮＳ症状の所望の軽減を示すまで、一定期間、この被験体に対してＭＣ４Ｒアンタゴニスト活性低下薬剤を投与することによって、変性ＣＮＳ障害を有する被験体で変性ＣＮ症状を軽減するための長時間作用性の処置に関する。本発明者らは、驚くべきことに、この方法は、このＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の投与の停止後少なくとも２週間にわたって変性ＣＮＳ障害を軽減し得るということを見出した。変性ＣＮＳ障害は、パーキンソン病であってもよく、この変性ＣＮＳ症状は、パーキンソン病の症状であってもよい。このパーキンソン病の症状は、ＣＮＳにおけるドーパミン作動性ニューロンの減少であってもよい。他の変性ＣＮＳ疾患は例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体疾患、多発脳梗塞性認知症、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭葉変性、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、進行性核上麻痺、フリードリッヒ運動失調症、オリーブ橋小脳萎縮症、脳卒中、脳外傷、てんかん、統合失調症、シャルコー・マリー・ツース病、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳障害、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ＨＩＶ脳炎、橋中央ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、クラッベ球様細胞、および異染性白質萎縮症、アレクサンダー病、カナバン病、コケーン症候群、およびペリツェウス・メルツバッハー病、過剰な照射、化学療法剤の副作用、および免疫抑制療法による副作用であってもよい。この方法は、変性ＣＮＳ障害を処置するのに多数の有用性を有する。例えば、この方法は、側脳室壁の成体の神経幹細胞の増殖を増大するために用いられ得る。このＭＣ４Ｒアンタゴニスト活性低下薬剤は、０．１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｎｇ／ｋｇ／日、１〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、または１０ｎｇ／ｋｇ／日〜１０００ｎｇ／ｋｇ／日という投薬量で投与され得る。投与は、被験体のＣＮＳに対するこの薬剤の注射または注入による直接投与を含む、本開示で言及される任意の方法を包含し得る。投薬量を測定する別の方法は、被験体が０．１ｎＭ〜５００ｎＭという組織濃度を達成するような投薬量を提供することである。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ＣＮＳ細胞の新生を調節するための方法であって、このＣＮＳ細胞と、このＣＮＳ細胞の新生を調節するのに十分なＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含む組成物の有効量とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目２）
上記薬剤がＭＣ４Ｒのアンタゴニスト、ＭＣ４Ｒのインバースアゴニスト、ＭＣ４Ｒのインヒビター、またはＭＣ４Ｒの発現レベルを低下させる薬剤である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記方法が、培養細胞上においてインビトロで行われる、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記方法が哺乳動物においてインビボで行われる、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記接触工程が、ＣＮＳ新生を調節するのに十分な量で哺乳動物に対して上記組成物を投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記ＣＮＳ細胞が神経幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記ＣＮＳ細胞が、ニューロン、前駆体細胞、幹細胞、胚性神経幹細胞、非胚性神経幹細胞およびグリア細胞からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ＣＮＳ新生を調節する工程が、神経系細胞またはその子孫の活性を調節し、この活性が、増殖、生存、分化、脱分化、遊走、タンパク質の分泌または発現、この神経系細胞またはその子孫の栄養素の分泌または発現、この神経系細胞またはその子孫の免疫調節因子の分泌または発現、この神経系細胞またはその子孫の神経保護因子の分泌または発現、この神経系細胞またはその子孫のニューロン樹枝状分岐因子の分泌または発現、この神経系細胞またはその子孫のシナプス形成促進因子の分泌または発現、およびこの神経系細胞またはその子孫のシナプス伝達促進因子の分泌または発現からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記細胞が、非胚性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、成体神経幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記薬剤が、ＨＳ０１４、ＨＳ０２８、化合物１０、化合物Ｐｏｎｔｉｌｌｏ１４ｃ、化合物Ｘｉ１４ａ、化合物Ｘｉ１４ｂ、化合物Ｘｉ１４ｃ、化合物Ｘｉ１４ｄ、化合物Ｘｉ１４ｅ、化合物Ｘｉ１４ｆ、化合物Ｘｉ１４ｇ、化合物Ｘｉ１４ｈ、化合物Ｘｉ１４ｉ、化合物Ｘｉ１４ｊ、ＳＨＵ９１１９、ＨＳ０２４、化合物１０ｄ、化合物１８ｖ、化合物１３ｂ−２、化合物Ｔｒａｎ２ｅ、Ａｇｏｕｔｉ（１−４０）アミド、Ａｇｏｕｔｉ（８７−１３２）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記薬剤が低分子量化合物である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記被験体が成体、若年者または思春期前の人である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記細胞がまた、１つ以上の成長因子と接触される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記成長因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、Ｅｐｏ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦおよびＣＳＦからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
被験体におけるＣＮＳ障害の症状を緩和するための方法であって、この被験体に対してＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含む組成物を、この症状を緩和するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
（項目１６）
上記ＣＮＳ障害が、上記被験体におけるニューロンの異常な減少によって生じる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記ＣＮＳ障害が、上記被験体におけるグリア細胞の異常な減少によって生じる、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
上記ＣＮＳ障害が、パーキンソン病、パーキンソン症候群の障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄虚血、虚血性脳卒中、脊髄損傷、ガン関連脳損傷、ガン関連脊髄損傷、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上麻痺、脳卒中、脳梗塞、多発脳梗塞性認知症、老人性認知症、レヴィー小体疾患、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭葉変性、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、フリードリッヒ運動失調症、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、多発性硬化症およびてんかんからなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記神経系の障害が、神経変性障害、神経幹細胞障害、神経前駆体障害、虚血性障害、神経学的外傷および損傷、情動障害、精神神経性障害、網膜の変性疾患、網膜損傷および外傷、ならびに学習および記憶の障害からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記被験体が哺乳動物である、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
上記哺乳動物が、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギおよびヒツジからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記被験体が、成体、若年者または思春期前の哺乳動物である、項目１５に記載の方法。
（項目２３）
上記神経系の障害が、神経変性に関連する運動失調、ウマ変性脳脊髄障害、小脳性無生活力、ウマ運動ニューロン疾患；胃スピロヘータ病（ウマ自律神経障害）、麻酔後脊髄軟化症、およびウマ白質脳軟化症からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
上記被験体がまた、１つ以上の成長因子を投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２５）
上記被験体がまた、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗てんかん薬、抗アルツハイマー薬、抗パーキンソン薬、ＭＡＯインヒビター、セロトニン取り込みブロッカー、ノルアドレナリン取り込みブロッカー、ドーパミン取り込みブロッカー、ドーパミンアゴニスト、Ｌ−ＤＯＰＡ、トランキライザー、鎮静薬およびリチウムからなる群より選択される１つ以上の薬剤を投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２６）
上記組成物が全身に投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２７）
上記組成物が、経口、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、脳室内、実質内、髄腔内、頭蓋内、口腔内、粘膜、経鼻、肺および直腸の経路からなる群より選択される経路によって投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２８）
上記組成物が、経鼻スプレーまたは経鼻坐剤として処方される、項目１５に記載の方法。
（項目２９）
上記組成物が、乾燥粉末吸入器または水性ベースの吸入器によって投与される、項目１５に記載の方法。
（項目３０）
上記ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤が上記被験体の中枢神経系に投与される、項目１５に記載の方法。
（項目３１）
中枢神経系障害のうち少なくとも１つの症状を示す被験体において、ＣＮＳ新生を誘導する方法であって、この被験体に対してＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を投与する工程を包含し、この薬剤がこの被験体においてＣＮＳ新生を誘導する、方法。
（項目３２）
ＣＮＳ新生が、神経系細胞の乏突起神経膠細胞への変換を誘導する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記変換が、
ａ．上記神経系細胞を幹細胞へ変換する工程、および
ｂ．この幹細胞を乏突起神経膠細胞へ変換する工程
を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記変換がインビトロで行われる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記幹細胞が単能性、少能性、または多能性の幹細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
被験体中の変性ＣＮＳ障害の症状を緩和するための方法であって、以下の工程：
ａ）ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤を含む組成物の１つ以上の有効用量を一定期間、この被験体に投与する工程と；
ｂ）非侵襲性の方法によってこの被験体の新生の兆候をモニタリングしてこの用量が十分であるか否かを決定する工程と、
ｃ）この新生の兆候が不十分である場合、この用量を増大する工程か、またはこの新生の兆候が過度である場合、この用量を減少する工程と、
を包含する方法。
（項目３７）
上記モニタリング工程が上記被験体の体重をモニタリングする工程を包含し、上記十分な用量が、上記ＣＮＳ障害の同様の症状を有するが、上記組成物を投与されない第二の被験体に比較して、設定閾値を上回るこの被験体の体重の増大を生じる最小用量として決定される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記閾値が、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、４０％および５０％からなる群より選択される体重の増大である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記方法が、上記被験体の食事を変更することなく、かつ上記ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤以外の任意の体重に影響を与える薬剤（ｗｅｉｇｈｔ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の投与なしに行われる、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
上記被験体が、上記工程（ａ）の前に健康な被験体に比較してドーパミン作動性ニューロンの数が低下している、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
上記ドーパミン作動性ニューロンの数の減少が：少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、および少なくとも９９％、からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記モニタリング工程が、プロトン核磁気共鳴によって上記被験体のＣＮＳにおける神経幹細胞および前駆細胞のレベルをモニタリングする工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
変性ＣＮＳ障害を有する被験体において変性ＣＮＳ症状を軽減するための長時間作用性の処置であって：この被験体に対して、ＭＣ４Ｒアンタゴニストを、この被験体が変性ＣＮＳ症状における所望の減少を示すまで所定の期間、投与する工程を包含し、この被験体がこのＭＣ４Ｒアンタゴニストの投与が停止した後に少なくとも２週間にわたって変性ＣＮＳ症状の継続的な軽減を示す、処置。
（項目４４）
上記変性ＣＮＳ疾患がパーキンソン病であり、かつ上記変性ＣＮＳ症状がパーキンソン病の症状である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記変性ＣＮＳ疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体疾患、多発脳梗塞性認知症、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭葉変性、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、進行性核上麻痺、フリードリッヒ運動失調症、オリーブ橋小脳萎縮症、脳卒中、脳外傷、てんかん、統合失調症、シャルコー・マリー・ツース病、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳障害、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ＨＩＶ脳炎、橋中央ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、クラッベ球様細胞、および異染性白質萎縮症、アレクサンダー病、カナバン病、コケーン症候群およびペリツェウス・メルツバッハー病、過剰な照射、化学療法剤の副作用、および免疫抑制療法による副作用からなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
上記投与は、上記方法が上記側脳室壁の成体の神経幹細胞の増殖を増大する、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
上記投与が、０．１ｎｇ／ｋｇ／日と１０μｇ／ｋｇ／日との間、１μｇ／ｋｇ／日と１００μｇ／ｋｇ／日との間、または１０μｇ／ｋｇ／日と１０００μｇ／ｋｇ／日との間という投薬量の投与である、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
上記ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤が、上記被験体の中枢神経系に投与される、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
上記ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤が、０．１ｎＭ〜５００ｎＭの組織濃度を得るように投与される、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
脳に変性ＣＮＳ障害およびドーパミン作動性ニューロンの減少を有する被験体における変性ＣＮＳ症状を軽減するための長時間作用性の処置であって：この被験体が変性ＣＮＳ症状の所望の減少を示すまでの期間、ＭＣ４Ｒアンタゴニストをこの被験体に投与する工程を包含し、ここでこの被験体が、上記ＭＣ４Ｒアンタゴニストの投与が停止される後、少なくとも２週間にわたって変性ＣＮＳ症状の継続的な減少を示す、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ａ）は、１〜１００ｎＭの濃度内のＭＣ４ＲアンタゴニストＨＳ０１４またはＨＳ０２８が、成体神経幹細胞の懸濁培養物中のＡＴＰ値を増大することを；およびＢ）は、１〜１００ｎＭの濃度内のＨＳ０１４が、成体神経幹細胞の付着培養物中のＢｒｄＵ組み込みを増大することを示す。
【図２】Ａ）は、ＳＶＺ中の増殖に対するＨＳ０１４の効果。２週間にわたってラットの右の側脳室に浸透圧ミニポンプを通じて投与された；Ｂ）体重に対するＨＳ０１４の効果。２週間にわたってラットの右の側脳室に浸透圧ミニポンプを通じて投与された。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３】いくつかのＭＣ４Ｒアンタゴニストの構造を示す。
【図４】パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ−病変ラットモデルにおけるアンフェタミンによって誘発される正味の向同側回転に対するＨＳ０１４の効果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１（対ベースライン）；反復測定一元配置（ｏｎｅ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ試験。＃Ｐ＜０．０５（対それぞれのビヒクル）；対応のないｔ検定。
【図５】体重に対するＨＳ０１４の効果を示す。ｘ軸の時間は週数である。投与の期間は、影付きのボックスである。処置群の平均体重は、四角で示すが、プラセボ群は、ひし形で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
定義
幹細胞とは、単能性、少能性、または多分化能（多能性）の幹細胞を含む任意の神経幹細胞をいう。単能性、少能性、または多分化能（多能性）の幹細胞は、１つまたは多数の細胞タイプに分化され得る細胞として規定される。天然には、幹細胞は、神経系細胞に分化し得る前駆体細胞を包含する。幹細胞はまた、神経系細胞の任意の前駆体を意味する新生の前駆体（ｎｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｅｓｕｒｓｏｒｓ（ＮＧＰ））を包含し、これには、神経幹細胞、系統に限定されない神経前駆細胞、および系統に限定される神経前駆体細胞が挙げられる。ＣＮＳに遊走できるＣＮＳ起源でない任意の前駆体細胞はまた、ＮＧＰ細胞に含まれる。「幹細胞」および「神経幹細胞」という用語は、少なくとも、成体の神経幹細胞、若年の神経幹細胞、非新生神経幹細胞、および非胚性神経幹細胞を包含することが理解される。
【００４５】
神経系細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ）（ニューロン細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）に対向して）とは、神経系の任意の細胞であって、これには、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（グリア）、および分化または分裂によって脳の新しい細胞を生じる任意の細胞を包含する。神経幹細胞は、子孫として神経系細胞を生じ得る細胞である。この場合、子孫は、直接の子孫、例えば、娘細胞またはより遠い子孫、例えば、孫娘細胞、ひ孫娘細胞などであってもよい。「神経系細胞」の定義は、少なくとも全ての主な成熟ＣＮＳ細胞タイプ、例えば、ニューロン、アストログリア（星状膠細胞）、ＮＧ２陽性グリア、および乏突起神経膠細胞、ならびに神経系列の細胞を生じる幹細胞を包含する。
【００４６】
本発明によるレセプターのアンタゴニストとは、本発明によるレセプターに結合可能であり、かつ天然のリガンドを含むリガンドのこのレセプターに対する結合をブロックできる分子または分子の群を意味する。例えば、レセプターの「アンタゴニスト」とは、天然のリガンドと同じ部位でレセプターに競合的に結合するが、レセプターの活性型によって初期化された細胞内応答を活性化せず、それによってこの天然のリガンドによって誘発される細胞内応答を阻害するリガンドであってもよい。アンタゴニストは例えば、このアンタゴニストの非存在下における天然のリガンドの存在における細胞内応答に比較して、化合物に対する細胞の細胞性応答を少なくとも１０％、好ましくは１５〜２５％、より好ましくは２５〜５０％、最も好ましくは５０〜１００％まで、減じ得る。アンタゴニストアナログとは、このアンタゴニストアナログが、細胞、細胞培養物、または細胞を含む組織と接触されるとき、アンタゴニストの細胞応答を誘導し得る化合物である。アナログは、標的細胞上のレセプターに結合することによって直接作用してもよい。あるいは、アナログは、近接する細胞に結合または影響すること、および標的細胞が同様の結果を得るように影響すること（あたかもアンタゴニストが適用されるように）によって間接的に作用してもよい。アンタゴニストアナログは、多くの機構で作用し得る。例えば、アンタゴニストアナログは、細胞内シグナル伝達をブロックし得、その結果、たとえリガンドが細胞上のレセプターに結合されても、この細胞は、このアンタゴニストアナログの存在下では、この結合されたリガンドとは反応しない。
【００４７】
本発明の方法で用いられ得るＭＣ４Ｒアンタゴニストの例は本明細書では、２つの環状ペプチドＨＳ０１４およびＨＳ０２８によって例示される。ＨＳ０１４は、以下のアミノ酸配列を有する：
［アセチル基］−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−（Ｄ−２−Ｎａｌ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−［アミド基］（配列番号３；ＣＡＳ番号２０７６７８−８１−７，ＭＤＬ番号ＭＦＣＤ０２１７９６５４）
このリストは、Ｎ末端からＣ末端に書いており、上記で示されるとおり、Ｎ末端にはアセチル基が、Ｃ末端にはアミド基がある。他に規定しない限り、全てのペプチドおよびタンパク質は、この開示において従来の形態でアミノ末端で開始してカルボキシル末端に列挙される（すなわち、アミノ末端−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−カルボキシル末端）。環の閉鎖を形成するアミノ酸には下線しており、Ｎａｌはβ−ナフチルアラニンをいう。Ｋａｓｋら［３３］を参照のこと。ＨＳ０２８は、アミノ酸配列
［アセチル基］−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−（ｄｉＣｌ−Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−［アミド基］（配列番号４）
を有し、ここで「ｄｉＣｌ−Ｄ−Ｐｈｅ」とは、ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニンをいう。ＭＣ４Ｒのこれらの２つのアンタゴニストは、悪液質／食欲不振の研究におけるツールとして用いられている。１つの検討では、ＨＳ０１４を、１日２回の注射（２×１ナノモル）によって６日間、または浸透圧ミニポンプ（１時間あたり０．１６ナノモル）での持続注入によって２週間ｉ．ｃ．ｖ．注入した。この結果、なんらタキフィラキシーの兆候なしに両方の処置後に食物摂取および体重のかなりの増大が示された［３４］。他の有用なＭＣ４Ｒアンタゴニストは以下のとおりである：
化合物１４ｃ（本明細書ではＰｏｎｔｉｌｌｏ１４ｃと呼ばれる）：
【００４８】
【化２】
0005383498.tif 000003
Ｐｏｎｔｉｌｌｏ１４ｃは、Ｐｏｎｔｉｌｌｏ，Ｊら［３５］に記載されている。メラノコルチン−４レセプターの強力かつ選択性の非ペプチドアンタゴニストは、満腹したマウスで食物摂取を誘発する、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，第１５巻、Ｉｓｓｕｅ  １０，２００５年５月１６日、２５４１〜２５４６頁。
【００４９】
４−｛（２Ｒ）−［３−アミノプロピオニルアミド］−３−（２，４−ジクロロフェニル）プロピオニル｝−１−｛２−［（２−チエニル）エチルアミノメチル］フェニル｝ピペラジン（本明細書において化合物１０と呼ばれる）：
【００５０】
【化３】
0005383498.tif 000004
この化合物は、Ｃｈｅｎ，Ｃら［３６］に、化合物１０であって、４−｛（２Ｒ）−［３−アミノプロピオニルアミド］−３−（２，４−ジクロロフェニル）プロピオニル｝−１−｛２−［（２−チエニル）エチルアミノメチル］フェニル｝ピペラジンとして、強力かつ選択性のメラノコルチン−４レセプターアンタゴニストとしてデザイン、合成および特徴が挙げられる。
【００５１】
図３の化合物１４ａ〜１４ｊ（本明細書においては化合物Ｘｉ１４ａ〜Ｘｉ１４ｊと呼ばれる）はＸｉ  Ｎ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅ  ｃｏｒｅ［３７］に記載されるとおり。（Ｘｉの化合物は、同じ名称を有する（すなわち、化合物１４）が、それらは、上記のＰｏｎｔｉｌｌｏ  １４ｃには関係しない）。
【００５２】
本発明の方法に有用な他の公知の化合物としては、ＳＨＵ９１１９、ＨＳ０２４、化合物１０ｄ、化合物１８ｖ、化合物１３ｂ−２、化合物Ｔｒａｎ１２ｅ、Ａｇｏｕｔｉ（１−４０）アミドおよびＡｇｏｕｔｉ（８７−１３２）が挙げられる。言及された化合物、それらの特性およびこれらの化合物を詳細に記載する関連の引用文献のまとめは、下の表１に示す。
【００５３】
表１：本発明の方法に有用な選択された化合物のまとめの表
【００５４】
【表１】
0005383498.tif 000005
上記で列挙されたＭＣ４Ｒアンタゴニストは、本発明の方法に有用な化合物の例である。多くの他の有用な化合物が当該分野内で公知である。例えば、特許／特許出願  欧州特許１４６８９９９、欧州特許１４６００７０、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３１１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００１５９５、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２９０７、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２８９６、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２９０８、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２９０９、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３２２８２、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００４４５５、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１４６２８、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０９３１、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３５３４３、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３４９５１、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２３９２６、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２３６１６、および学術的な刊行物［４７、４４、４８、４９、５０］を参照のこと。
【００５５】
本発明の任意の方法については、ＭＣ４Ｒアンタゴニストの投薬量は、（１）単独であって、０．００１ｎｇ／ｋｇ／日〜５００μｇ／ｋｇ／日の投薬量範囲で、好ましくは０．０５〜１５０または最大３００ｎｇ／ｋｇ／日の投薬量範囲であっても、（２）透過性増大因子と組み合わされても、または（３）局所的にもしくは全身に同時投与される薬剤と組み合わされてもよい。例えば、１〜１０ｎｇ／ｋｇ／日、１０〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日〜２０００ｎｇ／ｋｇ／日および１００ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日という投薬範囲が、本発明の方法に特に有効であることが見出されている。投与は、約０．０００１ｎＭ〜５０００ｎＭという薬剤の組織濃度をもたらし得る。この投与はまた、約０．００１ｎＭ〜１００００ｎＭ、好ましくは０．１〜１０００ｎＭ、さらに好ましくは１ｎＭ〜１００ｎＭ、それより好ましくは３ｎＭ〜３０ｎＭ、最も好ましくは約１０ｎＭという脳脊髄液濃度をもたらし得る。
【００５６】
当業者は、本開示の教示を用いて、さらなるＭＣ４Ｒアンタゴニスト、インヒビター、インバースアゴニストまたは本発明の方法の他の有用な薬剤を選択できる。
【００５７】
さらなるＭＣ４Ｒアンタゴニストを選択する１方法は、それが同じ効果を有するか否かを確認するためにアンタゴニストの改変体を作成することである。改変体を産生する方法は公知である。例えば、ペプチドのアミノ酸配列改変体は、合成されてもよいし、またはクローニングおよび変異を通じて作製されてもよい。このような改変体としては、例えば、ペプチド内の残基の欠失、または挿入、または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせは、最終のペプチド／アンタゴニストが所望の特徴（実施例の節で開示される方法を用いて試験され得る）を有するという条件であれば、この最終のペプチド／アンタゴニストで達成され得る。さらに他の改変体は、アンタゴニストに糖基を導入または移動することによって作製され得る（例えば、グリコシル化部位）。
【００５８】
「ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＭＣ４Ｒ）」は、下に規定されるとおり、アンタゴニストであっても、インバースアゴニストであっても、インヒビターであっても、またはＭＣ４Ｒの発現レベルを低下する薬剤であってもよい。ＭＣ４Ｒの活性を低下する任意の化合物または薬剤は、この用語に包含される。この開示の目的に関して、「化合物」および「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、同じ意味を有する。
【００５９】
本発明に有用である化合物を特定することは、本明細書に提示される開示に基づいて当業者に公知である。ＭＣ４Ｒレセプターに対するリガンド結合を測定するためのアッセイキットは市販されている（例えば、メラノコルチンＭＣ４１２５Ｉ−ＳＰＡ  ＧＰＣＲキットカタログ：ＭＲＰ００７０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。このようなキットを用いて、当業者は、所定の化合物がＭＣＲ４レセプターに結合可能か否かを容易に決定できる。所定の化合物がＭＣ４Ｒレセプターの活性に対して効果を有することを決定するための方法はまた、当該分野で周知である。最も一般に利用される方法は、細胞株に対して組み換えＤＮＡ技術を介してレセプターを導入する工程と、試験化合物がｃＡＭＰ産生またはレセプター転位に有する影響を測定する工程とを包含する。これらおよび他の公知の技術は、公的な文献、例えば、Ｓｃｈｉｏｅｔｈら［５１］、および国際特許出願ＷＯ２００５１０３７１５およびＷＯ２００５１０３６８９に開示される。所定の化合物についてこのような測定を得ることはまた、Ｃｅｒｅｐ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ，ｗｗｗ．ｃｅｒｅｐ．ｃｏｍ）、ＭＣ４Ｒのアゴニストおよびアンタゴニストについてそれぞれカタログ番号７５８−１８ａおよび１８ｂ、などから業務として商業的に可能である。
【００６０】
これらの公知の方法を利用して、当業者は、ＭＣ４Ｒ−レセプターに結合する所定の化合物がレポーターの活性を増大するか、または低下するかを決定し得る。公知のアゴニストの非存在下で化合物の活性をアッセイする場合、アゴニストは、活性において用量依存性の増大という結果を生じるが、インバースアゴニストは、活性の低下を生じる。公知のＭＣ４Ｒ−アゴニスト、例えば、α−ＭＳＨの存在下での化合物の活性をアッセイする場合、アンタゴニストおよびインヒビターはレセプターの活性において用量依存性の低下を生じる。
【００６１】
標的細胞中の利用可能なＭＣ４Ｒ−レセプターの数を減らすことは、本発明の所望の効果、すなわちＭＣ４Ｒ−活性を低下することを達成する別の方法である。この効果を達成するために当該分野で公知の薬剤としては、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイムおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が挙げられ、ここでこの薬剤は、ＭＣ４Ｒ−ポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列に対して相補的であるか、またはそれから操作された核酸配列を含む。アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはセンダイウイルスのベクターなどのベクターが、この薬剤を発現するために用いられ得る。
【００６２】
リガンドの機能的なアナログとは、そのアナログが細胞と接触されるとき（そのアナログの作用機序にかかわらず）リガンドとして細胞中で同じかまたは同様の活性を誘発する化合物である。
【００６３】
機能的なアナログはまた、「インバースアゴニスト（ｉｎｖｅｒｓｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）」を含む。本明細書において用いる場合、化合物の「インバースアゴニスト」とは、それがレセプターに結合するとき、細胞表面レセプターの構成的な活性を低下するリガンドをいう。本発明によるインバースアゴニストは、インバースアゴニストの非存在下で、かつアゴニスト活性を有する任意の化合物の非存在下における細胞内応答に比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは１００倍以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍など）まで、レセプターによって媒介される構成的な細胞内応答を低下し得る。
【００６４】
本発明による「インヒビター」化合物は、レセプターに対するリガンドの結合をその化合物の存在下において、その化合物の存在下、かつインヒビターの非存在下における結合に比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５〜２５％、さらに好ましくは２５〜５０％、最も好ましくは５０〜１００％まで低下する、レセプターに対する、またはレセプターについての天然のリガンドに対する分子である。本発明の「インヒビター」化合物は、アゴニストによって誘発される細胞内応答を少なくとも１０％、好ましくは１５〜２５％、さらに好ましくは２５〜５０％、最も好ましくは５０〜１００％まで低下し得る。例えば、インヒビターは、化合物に結合し得、かつこの化合物がレセプターに結合することを妨げ得る。
【００６５】
本明細書において用いる場合、「天然のリガンド」とは、レセプターに結合する、天然に見出される、天然に存在するリガンドをいう。「天然のリガンド」とは、天然には見出されず、かつレセプターに結合するように操作されている、操作されたリガンドのことは言わない。
【００６６】
中枢神経系組織（ＣＮＳ）における新生を誘発するための方法
この開示は、ＣＮＳ組織における新生を調節する（増大または減少する）ための新規な方法、化合物および組成物を提供する。「新生」という用語は、この開示における「ＣＮＳ新生」と同じ意味を有し、かつＣＮＳ中の新規な細胞の増殖を指す。中枢神経系組織は、周知であって、これには少なくとも、脊髄、髄質、脳橋、中脳、小脳、間脳、大脳半球およびこれらの大分類の各々の全ての組織が挙げられる（例えば、Ｋａｎｄｅｌ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第４版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）２０００を参照のこと）。
【００６７】
新生を誘導するための方法とは、少なくとも以下を含む任意の機構による出生後の哺乳動物における、さらなる神経系細胞および組織の発達をいう：（１）成長（増殖）（２）新規な神経系細胞の分化、（３）既存のまたは新しい神経系細胞の必要な領域への遊走、（４）１つの神経系細胞タイプの異なる神経系細胞タイプへの変換、（５）神経系でない細胞タイプ（例えば、非ＣＮＳ組織由来の幹細胞）への神経系細胞タイプの変換（６）ＣＮＳ中の非神経系細胞への神経系細胞の変換を妨げること；（７）神経系細胞の神経系または疾患誘発性の死滅を妨げること、（８）神経系細胞によって分泌または発現される因子を通じた増殖または分化の活性化、（９）処置のための末梢神経系へ遊走するための、例えば、ＮＧＰ、神経系細胞およびグリア細胞など、新生の必要である領域に対する神経系細胞の移入の誘導（例えば、ＭＳにおける）。ＣＮＳ新生の１形成は、神経系細胞および神経幹細胞の増殖、分化、生存または遊走を調節する工程を包含する。
【００６８】
本発明の任意の方法では、新生を調節することはまた、被験体に対してＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤を投与する工程と、新生を間接的に調節する工程とを包含し得る。新生を調節する間接的な方法としては、例えば、神経系細胞または非神経系細胞が新生を支持するための成長因子を発現および／または分泌するようにさせる工程を包含し得る。別の例では、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤は、グリア細胞が成長因子を発現および／または分泌して、ニューロンの増殖を支持するように誘導してもよいし、あるいはＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤は、ニューロンが成長因子を発現および／または分泌して、グリア細胞の増殖を支持するように誘導してもよい。さらなる例としては、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤は、非神経系細胞が成長因子を発現および／または分泌するようにさせて、神経系細胞の成長または増殖を支持し得る。成長因子は、１つの細胞の細胞表面上の発現によって、および細胞間の接触を通して、その機能を媒介し得、第二の細胞の新生を誘導することが理解される。このシナリオでは、成長因子は、その機能を媒介するために分泌される必要はない。細胞がそれ自体の用途のために、または同様のタイプの細胞の用途のために成長因子を分泌および／または発現すること、ならびにこのような分泌または発現も本発明の方法によって包含されることも理解される。
【００６９】
ＣＮＳ新生の例としては、特定の細胞タイプに関する新生のプロセスが以下の段落に考察される。幹細胞（または任意の個々の神経系細胞タイプ）に関しては、新生とは、例えば、幹細胞をより多くの幹細胞に増殖させることを包含し得る。この場合、新生は、ＮＧＰ細胞の増殖活性を調節する工程を包含する。新生はまた、幹細胞の神経系細胞への分化経路を調節する工程を包含し得る。調節は、分化後に産生された子孫細胞の分化の方向および数の両方を変化させる工程を包含し得る。さらに、ＮＧＰ細胞は、有益な神経系細胞タイプヘ分化してもよし、または未分化細胞として有益な効果を誘発してもよい。この例に加えて、新生はまた、ＣＮＳの必要な領域（例えば、脳）へ神経系細胞または幹細胞の遊走の誘導（ＮＧＰ細胞の遊走を調節することによる）を包含し得る。別の例では、新生は、ＮＧＰ細胞またはその子孫の生存を調節（例えば、促進および増大）し得る。
【００７０】
新生はまた、ある系列の細胞（例えば、ニューロン、アストログリアまたはオリゴデンドログリア）の第二の異なる系列への変換によっても生じ得る。１つの細胞系列の別の系列への変換のためには多くの機構がある。これらの機構の各々は、下に考察される。最も直接的な機構では、ある系列の細胞は、第二の系列に直接変換され得る。例えば、ニューロンがアストログリア細胞に変換されてもよいし、またはアストログリア細胞がニューロンに変換されてもよい。あるいは、変換は、中間の細胞タイプ、例えば、幹細胞（単能性、少能性、または多能性）へのニューロンの変換、続いて、オリゴデンドログリアへの幹細胞の変換を含んでもよい。別の機構では、完全に分化した神経系細胞はＮＧＰ細胞に脱分化し戻り得る。ＮＧＰ細胞はさらに、もとの神経系細胞タイプまたは新しい神経系細胞タイプに分化し得る。新生はまた、神経系細胞の脱分化を調節する工程を包含し得る。
【００７１】
一実施形態では、新生は、このような調整の必要な患者におけるＮＧＰ細胞の機能を調整する工程を包含し得る。調整される機能としては、少なくとも以下を挙げることができる：（１）新生、または任意の神経系細胞の成長および保存を支持するあめの例えば、さらなる成長因子を分泌し得るＮＧＰ細胞の分泌活性を調整すること、（２）ＮＧＰ細胞の免疫抑制活性を調整すること、（３）ＮＧＰ細胞の増殖活性を調整すること、（４）ＮＧＰ細胞の分化を調整すること、（５）ＮＧＰ細胞の遊走を調整すること、（６）ＮＧＰ細胞またはそれらの子孫の生存を調整すること、および（７）ＮＧＰ細胞への神経系細胞の脱分化を調整すること。
【００７２】
ＮＧＰおよび幹細胞に関する新生の例は、上記で考察されているが、新生は、任意の他の神経系細胞タイプに適用できることが理解される。従って、上の段落は、「ＮＧＰ」および「幹細胞」という用語が任意の他の神経系細胞タイプで置換される場合、等しく適用可能である。
【００７３】
本発明者らは本明細書において、ＭＣ４Ｒアンタゴニストを用いる本発明者らの実験、およびＭＣ４Ｒの活性を低下させる薬剤（例えば、ＨＳ０１４およびＨＳ０２８によって例示される）がインビトロおよびインビボにおいて成体の神経系前駆体細胞の増殖を誘導するという驚くべき知見を記載している。本発明者らはまた、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤が、パーキンソン病の６−ＯＨＤＡラットモデルで神経回復性効果を与えることも示している。
【００７４】
本発明の任意の方法について、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤（単数または複数）の投与は、所望の疾患の処置のために有効な投薬範囲であり得る。投与されるべきこのような薬剤の有効量の決定は、当業者に技術の範囲内であって、本明細書に開示される教示に基づいて当業者に慣用的である。投与されるべきＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の量は、患者の正確な大きさおよび条件に依存するが、０．１〜１０ｎｇ／ｋｇ／日、１〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、５〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、２０〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、１００〜１０００ｎｇ／ｋｇ／日、０．５〜２０μｇ／ｋｇ／日、２〜５０μｇ／ｋｇ／日、５〜１００μｇ／ｋｇ／日、５０〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日またはそれ以上であってもよい。投薬の別の方法では、ＭＣ４Ｒは、標的組織が０．０００１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．００１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．０１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、または少なくとも１ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、もしくは少なくとも５００ｎＭというモジュレーター濃度を達成するように、投与され得る。好ましい投薬としては、少なくとも１０ｍｇを週２回、もしくは少なくとも２５ｍｇを週２回という全身投与；少なくとも０．０４ｍｇ／ｋｇ／週、少なくとも０．０８ｍｇ／ｋｇ／週、少なくとも０．２４ｍｇ／ｋｇ／週、少なくとも３６ｍｇ／ｋｇ／週、もしくは少なくとも４８ｍｇ／ｋｇ／週という全身投与；少なくとも２２μｇを週２回、少なくとも４４μｇを週２回という全身投与；または少なくとも３〜１０ｍｇ／ｋｇを週に１回という全身投与が挙げられる。特に好ましい投薬量範囲は、０．０４ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。これらの投薬量は、経皮適用または局所適用において１０×、１００×または１０００×増大されてもよい。
【００７５】
ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤の投与に応答する被験体の体重増大は、ＣＮＳ新生の刺激および所望の疾患、例えば、パーキンソン病などの神経変性疾患の処置のための有効な用量の代理マーカーとして用いられ得る。有意な体重増大をもたらし得る最低用量の薬剤でさえＣＮＳ新生の刺激およびＣＮＳ障害の処置には有効な用量である。この用量から、最適な有効用量は、被験体の症状および任意の副作用の出現を観察することによって、容易に、高くまたは低く微調整してもよい。体重増加は、投与の間一定間隔で被験体を秤量することによってモニターされ得る。有意な体重増加は、プラシーボ化合物を投与された群の平均体重増加に対して、被験体の処置群における平均体重増加を比較することによって決定され得る。体重増加はまた、同じ被験体で投与前体重に対して決定され得る。体重増加は、コントロールまたは最初の体重に対する増加割合として表してもよい。有意な体重増加についての好ましい閾値は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または１０％より多く、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％および５０％である。体重増大はまた、スチューデントｔ検定のような統計学的方法によって検出してもよい。好ましい有意な体重増加閾値は、ｐ≦０．０５、またはｐ≦０．２、例えば、０．２、０．１、０．０５、０．０１および０．００１というｐ値である。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
ＬＶＷの調製およびニューロスフェア培養手順
５週齢のマウスの側脳室壁（ＬＶＷ）の前側壁を、０．８ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼおよび０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシンが含有されるＤＭＥＭ（４．５ｍｇ／ｍＬグルコースおよび８０単位／ｍＬのＤＮａｓｅを含む）中において３７℃で２０分間、酵素的に解離させた。その細胞を５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｂ２７補充物、１２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  Ｐｈ  ７．４、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有）中で希釈した。７０ミクロンのストレーナーを通過させた後、その細胞を２４０×ｇで５分間ペレットにして、洗浄し、遠心分離した。その上清を引き続き取り出して、その細胞を２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充した培地中に再懸濁して、培養皿にプレートして、３７℃でインキュベートした。ニューロスフェア培養物をプレート後約７日で分けるように準備した。
【００７７】
ニューロスフェア培養物を分けるために、ニューロスフェアを、２４０×ｇで５分間の遠心分離によって収集した。その上清を廃棄して、ニューロスフェアを、０．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡが含有されるＨＢＳＳ（１×）中に再懸濁して、３７℃で２分間インキュベートした。この期間の間、そのニューロスフェアを穏やかに砕いて、解離を助けた。３７℃でのさらに２分のインキュベーション、および粉砕の後、２容積のＤＭＥＭ−Ｆ１２＋Ｂ２７培地を添加した。その細胞を２２０×ｇで４分間ペレットにして、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよび５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｂ２７−培地中で再懸濁した。引き続きその培養物をプレートして、３７℃でインキュベートした。
【００７８】
（実施例２）
ＭＣ４Ｒの発現；ＲＴ−ＰＣＲ分析
ニューロスフェアは、上記の実施例１に言及されるようにＬＶＷから調製した。最初に分けた３日後、そのニューロスフェアを収集して、総ＲＮＡを、製造業者の指示に従いＱＩＡＧＥＮ’ｓ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて単離した。ＬＶＷおよび脳の総ＲＮＡの残りをニューロスフェアの総ＲＮＡのと同一の方式で調製した。ＲＴ−ＰＣＲの前に、総ＲＮＡを３７℃で１５分間、ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）処理し（総ＲＮＡの各々５μｇについて１単位）、続いて７５℃で１０分間熱不活化した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて、ＭＣ４Ｒに対応するｍＲＮＡの存在を検出した。要するに、１２．５ｎｇの総ＲＮＡを各々の反応に用いて、このとき５８℃というアニーリング温度とした。総ＲＮＡのゲノム混入が偽陽性の結果を生じないことをさらに保証するため、Ｔａｑポリメラーゼ単独での同一の反応を実験のＲＴ−ＰＣＲと並行して行った。その反応物を、臭化エチシウムを含む１．０％のアガロースゲルで電気泳動して、バンドをＵＶ光の下で可視化した。所望の遺伝子のＰＣＲ産物の推定の長さに対応するバンドを、クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ中にクローニングした。培養物を配列決定して、その同一性を確認した。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＭＣ４Ｒのプライマー配列を下に示す。
【００７９】
【化４】
0005383498.tif 000006
これらの研究によって、成体マウス脳中のＭＣ４ＲのｍＲＮＡ発現パターンを検討した。この結果、ＭＣ４Ｒは成体マウス脳の神経形成領域で発現されることが示された。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＭＣ４Ｒ  ｍＲＮＡが、側脳室壁組織（上衣層を含む）、およびこの組織由来の培養された神経幹細胞（ＮＳＣｓ）由来のニューロスフェアの両方において発現されることを見出した（表２）。
【００８０】
表２：神経形成組織中のＲＴ−ＰＣＲによって見積もられた成体マウス脳のＭＣ４Ｒ  ｍＲＮＡの発現（１〜３スケール）
【００８１】
【表２】
0005383498.tif 000007
（実施例３）  懸濁培地中で、または接着培養物として増殖される実施例１由来の細胞のＭＣ４Ｒアンタゴニスト処理
ＨＳ０１４およびＨＳ０２８はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００８２】
細胞を実施例１と、培地中の増殖因子の脱落以外は同様に、分けて回収し、懸濁細胞として、１、１０もしくは１００ｎＭのＭＣ４Ｒアンタゴニストを補充するか、または補充しない（コントロール細胞）ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、９６ウェルのプレートで１０，０００細胞／ウェルの密度に播種した。あるいは、接着性細胞を１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中でポリ−Ｄ−リジン−コーティングした９６ウェルプレート上で３０，０００細胞／ウェルの密度に播種した。細胞が接着した場合（４時間後）、培地を無血清培地に変えて、１、１０、または１００ｎＭのＨＳ０１４、ＨＳ０２８または他の試験化合物を添加した。
【００８３】
（インビトロ増殖アッセイ）
細胞内のＡＴＰ値は細胞数と相関することが以前に示されている［５２］。以下の実験は４通りに行った。ＨＳ０１４またはＨＳ０２８を添加して、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。細胞を連続して溶解した。製造業者の指示に従ってＣｅｌｌ  ＶｉａｂｉｌｉｔｙキットＳＬ（♯１８８−４４１，ＢｉｏＴｈｅｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて細胞内のＡＴＰを測定した。結果は反復可能であって、統計学的に有意であった。ＡＴＰアッセイを懸濁培養設定で行った（上記を参照のこと）。
【００８４】
ＤＮＡ合成を普通に用いて、細胞増殖を測定した。このような測定については、３Ｈ−チミジンを伝統的に用いて分裂期活性細胞のＤＮＡを標識する。この実験では、３Ｈ−チミジンを５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で置き換え、１０μＭ濃度の化合物と一緒に添加した。ＢｒｄＵアッセイは、接着細胞培養設定（上記を参照）で行い、その細胞を化合物とともに３日間インキュベートした。チミジンアナログがＤＮＡに組み込まれた後、イムノアッセイによってＢｒｄＵを検出した。ＥＬＩＳＡキットはＲｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。
【００８５】
ＭＣ４ＲアンタゴニストであるＨＳ０１４およびＨＳ０２８は、成体の神経幹細胞のインビトロ増殖を誘導することが見出された。ＡＴＰアッセイを用いて、細胞内ＡＴＰ値（従って、細胞数）の増大が、ＭＣ４Ｒアンタゴニスト処理した懸濁培養物中でみられた（１〜１００ｎＭ濃度）（図１ａ）。増殖を確認するため、増殖マーカーＢｒｄＵを用いる取り込み研究を行った。ＢｒｄＵ取り込みの増大は、ＭＣ４Ｒアンタゴニスト処理した接着細胞培養物中でみられた（１〜１００ｎＭ濃度）図１Ｂ。ＡＴＰおよびＢｒｄＵ取り込みにおける増大は、スチューデントの両側の、対応のないｔ検定によって統計学的に有意であることが確認された（図１ａおよび図１ｂ）。同じＡＴＰアッセイでは、内因性のＭＣ４Ｒアンタゴニストペプチドアナログアグーチ（Ａｇｏｕｔｉ）（１−４０）アミドおよびアグーチ（８７−１３２）での処置は同様に、増殖の統計学的に有意な増大を生じた（それぞれ、１００ｎＭでコントロールの１．３−１．４倍、４００ｎＭでコントロールの１．６倍）。
【００８６】
結論として、ＭＣ４Ｒの活性を低下する化合物は、細胞数を増大し、かつ神経幹／前駆細胞のインビトロでの増殖を誘導し得る。
【００８７】
（実施例４）
インビボの増殖実験
新生のＭＣ４Ｒアンタゴニスト刺激をさらに特徴付けるため、インビボ研究を行った。増殖に対するＨＳ０１４の効果（ＢｒｄＵ取り込み）を、２週間にわたって、６．２５〜６２５ｎｇ／２４時間におよぶ用量で試験した。投与は、右側脳室へのｉ．ｃ．ｖ．注入によって行った。ＢｒｄＵは、ＨＳ０１４ｉ．ｃ．ｖ．と一緒に投与した。動物の体重を、実験全体を通じて測定した。実験の終了後、ＢｒｄＵ発現は、側脳室壁の上衣下層由来の脳の切片に対する、ならびに歯状回におけるサブ顆粒細胞（ｓｕｂ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｅｌｌ）に対する免疫組織化学によって検出した。
【００８８】
これらの研究のために、ＨＳ０１４を、人工ＣＳＦ（１４８ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４（使用前に滅菌濾過）また１ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵ、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および１００μｇ／ｍＬのラット血清アルブミンも含む）中で３．３３μＭに溶解した。人工ＣＳＦ中のＢｒｄＵ  １ｍｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、ラット血清アルブミン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、ＨＳ０１４の溶液を調製した。ポンプを配管から０．９％ＮａＣｌで充填し、流量調節器（ｆｌｏｗ  ｍｏｄｅｒａｔｏｒｓ）に接続して、３７℃で一晩保管した。
【００８９】
ＨＳ０１４およびＨＳ０２８の両方の１〜１００ｎＭの用量範囲は、インビトロアッセイにおいてコントロールに比較して成体の神経幹細胞の数を増大するのに有効であることが見出された（実施例３を参照のこと）。成体ラットの側脳室中にＨＳ０１４を連続注入によって投与することによってインビボで神経幹細胞数を増大するのに有効である用量を評価するため、脳脊髄液（ＣＳＦ）の容積および代謝回転の速度を用いて、１〜１００ｎＭの範囲でＣＳＦ濃度を得て、これによって、６．２５、６２．５および６２５ｎｇ／日というポンプ濃度送達を得た。中枢神経系によって制御される応答を惹起するのに有効である用量を理解するためのさらなるマーカーとして、動物を秤量することによってこの実験を通じて体重増加もモニターした。ＭＣ４Ｒアンタゴニストは、体重増加を誘発し［５３］、食物取り込みおよび代謝に影響することが公知の脳の領域、特に弓状、脳室周囲、側方および視床下部の腹側正中の核に対して作用する［５３、５４］。
【００９０】
約２９０グラムと秤量される成体ラットをイソフルランで深く麻酔して、カニューレを右側脳室への注入のために定位的に移植した（座標：ＡＰ−０．８ｍｍ；Ｌ−１．７ｍｍおよびＤＶ−４．０ｍｍ、十字縫合に対して）（ＡＬＺＥＴ脳注入キットＩ）。このカニューレを固定スクリューで歯科セメントを用いて頭蓋に固定した。この注入キットは、動物の肩甲骨中線領域に置いた皮下移植したミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ２００２）に接続した。ラット（それぞれの処置群における５、６および６匹の動物（コントロールでは６匹））に、２週間にわたって０．５μＬ／時間の溶液（処置群については６．２５、６２．５または６２５ｎｇ／日のＨＳ０１４）を与え、引き続いて屠殺した。
【００９１】
実験の終りに、ラットをペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔して、９０ｍｌの０．９％のＮａＣｌおよび４％のＰＦＡ溶液で心臓を介して灌流させた。脳を取り出して、イソペンタン中で−４０℃で凍結し、凍結切片にするまで−２０℃で保管した。脳をクリオスタット（凍結切片作製器）で１２μｍの冠状に切片にし、これは側脳室の両方、十字縫合１．６ｍｍ（各々のガラス上の３つの隣接する切片）および歯状回、Ｐａｘｉｎｏｓのラット脳アトラスに従う、十字縫合−２．５６〜−４．１６ｍｍにまたがる領域（各々のガラス上の２つの隣接する切片）であった。この切片をスーパーフロスト顕微鏡スライド上に解凍装填して、必要になるまで−２０℃で保管した。ＢｒｄＵ免疫組織化学のために、スライドを２Ｍ  ＨＣｌ中で変性して、１０％ヤギ血清とのインキュベートによって非特異的な結合を一晩ブロックした。この後、ラットモノクローナル抗ＢｒｄＵ（Ｈａｒｌａｎ）１／１００を０．１％のｔｗｅｅｎ−２０およびＰＢＳとともに適用し、加湿チャンバで９０分インキュベートした。ＰＢＳ中での洗浄後、二次抗体抗ラットＩｇＧビオチン化（Ｖｅｃｔｏｒ）１／２００を加えて、室温で１時間インキュベートした。検出として、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ）１／１００を用いて、最終的に、発色は、顕微鏡でモニターするＳｉｇｍａファーストＤＡＢタブレットによって行い、次いで切片をＨＴＸによって、続いて脱水および掃除によって対比染色した。
【００９２】
定量は、４０×の倍率でＮｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６０００顕微鏡を用いて行った。処理条件に関して観察者は盲検で分析を行った。十字縫合１．６ｍｍのＳＶＺの向同側に由来する３つの隣接する切片を評価した。上衣下層内の全てのＢｒｄＵ陽性細胞をカウントした。全てのカウントをお互いのラットについて一緒にプールして、１平方あたりの細胞の平均数として報告する。
【００９３】
ＢｒｄＵカウントの結果を図２Ａに示す。神経幹／前駆体細胞増殖に対するＨＳ０１４の効果は、６２．５ｎｇ／日の用量で最大であった。しかし、体重増加（図２Ｂ）は、用量依存的な方式で増大し、６２．５ｎｇ／日の用量で最初に有意であって、６２５ｎｇ／日では最大であった。この体重増加は、海馬における生理学的効果も示す。
【００９４】
結論として、ＭＣ４Ｒの活性を低下する薬剤は、インビボにおいて神経幹／前駆細胞の増殖を増大し得る。顕著なことに、本発明者らは予想外に、ＭＣ４Ｒ活性の減少を生じる薬剤で被験体を処置したとき、体重増大が薬理学的なＣＮＳ効果の代理のマーカーとして用いられ得るということを見出す。適度な体重増加を起こす用量でさえ、神経幹細胞／前駆細胞の増殖を誘導するには十分である。
【００９５】
（実施例５）
インビボのパーキンソン病モデル実験
この研究では、ＨＳ０１４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の神経回復作用を、パーキンソン病の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）病変ラットモデル（動物は、ドーパミン作動性ニューロンの部分的な片側の喪失がある）において検討した。この病変は、内側前脳束における６−ＯＨＤＡの単回注射によって誘発される（下を参照のこと）。アンフェタミン刺激の際、病変の動物は、ドーパミン作動性細胞の片側の喪失から生じるドーパミン放出における不均衡に起因して向同側回転性行動を示す。これによって、このモデルで試験される化合物の機能的効果を、アンフェタミン誘発性回転の回数をカウントすることによって定量することが可能になる［５５］。完全な病変を有する動物は、アポモルフィン刺激後、向反側回転行動を示し、これによって、この研究からいずれの完全に病変した動物も排除することが可能になる。
【００９６】
パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ病変ラットの調製。
【００９７】
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（秤量２８０〜３２０ｇ）を食物および水に自由にアクセスさせて、１２時間明／暗のサイクルのもとで温度管理した部屋で飼育する。手術の３０分前、動物にパーギリン（５ｍｇ／ｋｇ）およびデシプラミン（２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。次いでラットを全身麻酔（ハロタン）下で定位固定フレームに入れた。小さい掘削孔を頭蓋の右側に作製した。各々の動物に４μｇの６−ＯＨＤＡ（０．１％のアスコルビン酸を含む２μｌの滅菌水中）を、ＰａｋｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎのアトラス［５６］に従って、十字縫合から−２．８ｍｍ、正中線に対して側方２ｍｍ、および頭蓋下８．６ｍｍの座標で、右の内側前脳束中に与えた。５μｌのハミルトン注射器を用いて５分にわたって、６−ＯＨＤＡ注射を行った。ラットをこの損傷の後５週間回復させた。次に、この動物にカニューレに接続されたＡｌｚｅｔミニポンプを移植して、２週間にわたって右側脳室にＨＳ０１４またはビヒクルを注入させた。Ａｌｚｅｔミニポンプは１週後に取り除いた。
【００９８】
ポンプの準備
材料：脳注入キットＩＩ（ＡＬＺＥＴ，Ｃｕｐｅｒｔｉｏｎｏ，ＣＡ）；ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ミニポンプモデル２００２（ポンプの容積：２００μｌ、ポンピング速度：０．５μｌ／ｈ（＝１２μｌ／ｄ）１４日間）。ビヒクル（１４８ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのラット血清アルブミン）または化合物溶液（ビヒクルに加えて５．２１μｇ／ｍｌのＨＳ０１４、６２．５ｎｇ／日の用量を生じる）のいずれかを含有する２００μｌの溶液でポンプを充填し、流量調節器に配管で接続し、水浴（３７℃）中でＮａＣｌ（０．９％）溶液中で２〜５時間、移植の前にインキュベートした。
【００９９】
研究のデザイン
２４匹のラットを２群に分けて、個々のラットは、等しく分布されるように、そのベースラインの回転（病変後５週）に基づいて処置群に無作為に割り当てた。従って、１群あたり１２匹の部分的に病変のラットがいた。この群には、２週間にわたって、移植されたＡｌｚｅｔミニポンプを介してビヒクルまたは薬物処理を与えた。次いでこのラットを処置なしでさらに２週間おいて、その後にそれらを屠殺した。この研究の間、動物には０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）アポモルフィンおよび５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）アンフェタミンを、ポンプ移植の前に与え、次いで１週ごとに１回、回転反応を測定した。回転活動は、実験の期間（すなわち、アポモルフィンまたはアンフェタミン投与後６０分）にわたって回転の総数をカウントすることによって測定した。体重も毎週記録した。
【０１００】
投薬理論
コントロールの動物よりも側脳室の脳室下帯における神経幹細胞数の増大を刺激し、体重増加の増大を誘発した用量を（実施例４）、投与する用量として選択した。
【０１０１】
アンフェタミン誘発性の回転に対するＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の効果
アンフェタミン刺激後の回転行動によって決定した、いかなる完全に病変の動物も除外した。ポンプ移植の前に、アンフェタミンは、それぞれ、ビヒクル処置した群およびＨＳ０１４群において、正味の向同側回転を３６５．７５±４８および３００．４１７±４４（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）誘発した。この群のベースライン値の間の相違は有意ではなかった（Ｐ＞０．０５；対応のないｔ検定）。ビヒクル群では、毎週のアンフェタミンチャレンジは、ポンプ前の応答に比較して、研究の経過にわたって正味の向同側回転の減少はなんら示さなかった（全てＰ＜０．０５；反復測定一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定、図４）。
【０１０２】
しかし、ＨＳ０１４群では、毎週のアンフェタミンのチャレンジは、ポンプ前の応答に比較して１〜４週（包括的）で正味の向同側回転の有意な減少を示す（全てＰ＜０．０１；反復測定一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定、図４）。４週での減少の大きさは、ポンプ前のレベルに比較して回転が約３０％に低下するものであった。ＨＳ０１４群とのビヒクル群の比較によって、２週で向同側の回転の有意な減少が示された（Ｐ＜０．０５；対応のないｔ検定；図４）。
【０１０３】
この結果、ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤（ＭＣ４ＲアンタゴニストＨＳ０１４）の投与がパーキンソン病のモデルにおける有意な改善を誘発することが示された。顕著なことに、改善は、化合物の投与が停止された後、少なくとも２週間維持された。回転行動の長期にわたる正規化は、神経回復効果に帰せられ得る。言い換えれば、この効果は、一過性効果というよりも可塑性とみられ、ＭＣ４アンタゴニストは、症候性の効果および急性の効果を発揮するだけでなく、病状の経過を改善することによって脳の安定な変化を誘発するとみなされることが示唆された。同じ化合物がインビトロおよびインビボにおいて神経幹細胞の増殖を誘発できたという事実を、このパーキンソン病モデルで観察された持続性の効果と一緒にすれば、ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤でのパーキンソン病の処置は、ＣＮＳ新生の機構を介して作用することが示された。
【０１０４】
化合物投与は、動物の体重の小さいけれども注目すべき増大を生じ、これは事実上、一過性であった（図５）。この結果、体重のわずかな増大が変性ＣＮＳ障害の処置に有効なＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の用量の代用マーカーとして用いられ得ることが示される。
【０１０５】
（実施例６）
インビボでのパーキンソン病モデル実験＃２
この研究では、Ｔｒａｎ１２ｅおよびＸｉ１４ｇの神経回復作用を、パーキンソン病の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）病変ラットモデル（ここで動物は、部分的な片側のドーパミン作動性ニューロンの喪失がある）で検討した。この病変は、内側前脳束中の６−ＯＨＤＡの単回注射によって誘発された（下を参照）。アンフェタミン刺激の際、この病変動物は、ドーパミン作動性細胞の片側の喪失から生じるドーパミン放出の不均衡に起因して同側回転行動を示す。これによって、このモデル中で試験した化合物の機能的な効果は、アンフェタミン誘発性の回転数をカウントすることによって定量可能になる［５５］。完全な病変を有する動物は、アポモルフィン刺激後に向反側回転行動を示し、これによって、この研究からいかなる完全に病変の動物も除外することが可能になる。
【０１０６】
パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ−病変ラットモデルの準備
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（秤量２８０〜３２０ｇ）を食物および水に自由にアクセスさせて、１２時間明／暗のサイクルのもとで温度管理した部屋で飼育する。手術の３０分前、動物にパージリン（５ｍｇ／ｋｇ）およびデシプラミン（２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。次いで、ラットを全身麻酔（ハロタン）下で定位固定フレームに入れる。小さい掘削孔を頭蓋の右側に作製した。各々の動物に４μｇの６−ＯＨＤＡ（０．１％のアスコルビン酸を含む２μｌの滅菌水中）を、ＰａｋｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎのアトラス［５６］に従って、十字縫合から−２．８ｍｍ、正中線に対して側方２ｍｍ、および頭蓋下８．６ｍｍの座標で、右の内側前脳束中に片側注射した。５μｌのハミルトン注射器を用いて５分にわたって、６−ＯＨＤＡ注射を行った。ラットをこの損傷の後５週間回復させた。
【０１０７】
投与溶液の調製
試験化合物を、投与の直前に滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水からなるビヒクルに溶解して、０．２２μｍのフィルターで滅菌ろ過する。
【０１０８】
研究のデザイン
３６匹のラットを３群に分けて、個々のラットは、等しく分布されるように、そのベースラインの回転（病変後５週）に基づいて処置群に無作為に割り当てた。従って、１群あたり１２匹の部分的に病変のラットがいる。この群には、２週間にわたって、全身投与を介してビヒクルまたは薬物処置を与える。次いで、このラットを処置なしでさらに２週間おいて、その後にそれらを屠殺した。この研究の間、動物には０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）アポモルフィンおよび５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）アンフェタミンを、ポンプ移植の前に、次いで１週ごとに１回与え、回転反応を測定した。回転活動は、実験の期間（すなわち、アポモルフィンまたはアンフェタミン投与後６０分）にわたって回転の総数をカウントすることによって測定する。体重も毎週記録した。
【０１０９】
投薬理論
実施例４と同様の事前研究を行って、処置群において有意な体重増大を誘発する各々の化合物についての最低の用量を見い出す。各６匹のラットを有する１０の群に、２週間の間、群間で１０倍の相違のある１０ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｐｇ／ｋｇ／日の化合物を全身投与する。有意な体重増大を誘発する最低用量を６−ＯＨＤＡモデルについて選択する。
【０１１０】
アンフェタミン誘発性の回転に対するＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の効果
アンフェタミン刺激後の回転行動によって決定した、いかなる完全に病変の動物も除外する。処置の前に、アンフェタミンは、それぞれ、ビヒクル群および処置群において、ほぼ同様の正味の向同側回転を誘発する。この群のベースライン値の間の相違は有意ではない（Ｐ＞０．０５；対応のないｔ検定）。ビヒクル群では、毎週のアンフェタミンチャレンジは、処置前の反応に比較して研究の経過にわたって正味の向同側回転の減少はなんら示さない（全てＰ＜０．０５；反復測定一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定）。
【０１１１】
しかし、処置群では、毎週のアンフェタミンのチャレンジは、処置前の応答に比較して１〜４週（包括的）で正味の向同側回転の有意な減少を示す（Ｐ＜０．０５；反復測定一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定）。４週での減少の大きさは、処置前のレベルに比較して回転が約３０％〜５０％に低下するようなものである。処置群とのビヒクル群の比較によって、２週で向同側の回転の有意な減少が示される（Ｐ＜０．０５；対応のないｔ検定）。
【０１１２】
この結果、ＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の投与がパーキンソン病のモデルにおける有意な改善を誘発することが示される。顕著なことに、改善は、化合物の投与が停止された後、少なくとも２週間維持される。回転行動の長期にわたる正規化は、神経回復効果に帰せられ得る。言い換えれば、この効果は、一過性効果というよりも可塑性とみなされ、ＭＣ４アンタゴニストは、症候性の効果および急性の効果を発揮するだけでなく、病状の経過を改善することによって脳の安定な変化を誘発するとみなされることが示唆され、このことは、ＣＮＳ新生を介する効果を示している。
【０１１３】
化合物投与はまた、動物の体重の小さいけれども注目すべき増大を生じ、これは事実上、一過性である。この結果、体重のわずかな増大が変性ＣＮＳ障害の処置に有効なＭＣ４Ｒ活性低下薬剤の用量の代用マーカーとして用いられ得ることが示される。
【０１１４】
（実施例７）
さらなるインビボのパーキンソン病モデル実験
この実験は、本質的に実施例５〜６の反復として、ただしＭＣ４Ｒレセプターの活性を実質的に低下する異なる化合物をその天然の設定で用いて行う。この化合物は、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、インヒビターおよび／または本明細書で特定される他の薬剤である。用いられる化合物は、表１に例示される。血液脳関門に浸透し得る化合物については、投与は、実施例６のように全身投与される。血液脳関門を通過しない化合物については、実施例５のように脳室内投与が用いられる。
【０１１５】
実施例５および６と同様の結果が得られ、このことは、パーキンソン病での効果が実質的なＭＣ４Ｒ活性低下特性を有する化合物に一般的であるということを示す。
【０１１６】
本開示における全ての特許、特許出願および引用文献は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０１１７】
参考文献
【０１１８】
【化５】
0005383498.tif 000008
【０１１９】
【化６】
0005383498.tif 000009
【０１２０】
【化７】
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【０１２１】
【化８】
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【０１２２】
【化９】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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