(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス茸(Agaricus blazei Murill)菌糸体抽出物を含有して成る、皮膚老化症状防止改善剤。
【請求項２】
アガリクス茸(Agaricus blazei Murill)菌糸体抽出物を含有して成る、創傷治癒促進剤。
【請求項３】
アガリクス茸(Agaricus blazei Murill)菌糸体抽出物を含有して成る、保湿剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、真皮線維芽細胞の代謝活性を活性化し、さらに紫外線による線維芽細胞の損傷を防止することにより、加齢や紫外線などの種々のストレスによるシワ，シミの発生，皮膚の弾性の低下といった皮膚老化症状の防止或いは改善に有効で、抗炎症作用，創傷治癒促進作用，保湿作用をも有する皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
加齢や紫外線等外来ストレスにより生じるしわ，シミの発生、皮膚弾性の低下といった皮膚の老化症状には、皮膚真皮の線維芽細胞の機能低下やマトリックス線維の減少又は分解が重要な要因となっている。従って、皮膚の老化防止，改善作用を有する皮膚外用剤を得るため、線維芽細胞の賦活或いは増殖促進作用を有する成分の検索と配合が試みられている。
【０００３】
例えば、ビワ抽出物（特公平５−１７２０６号公報），α−ヒドロキシ酢酸（特開平５−１１２４２２号公報），α−ヒドロキシ酸のステロールエステル（特開平８−１０４６３２号公報），６−ベンジルアミノプリン（特開平７−２３３０３７号公報），特定のリボヌクレアーゼ（特開平７−３０９７７８号公報），Ｌ−リシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−ヒスチジン（特開平７−３１６１９２号公報），乳汁由来線維芽細胞増殖因子（特開平８−１１９８６７号公報），酸化型コエンザイムＡ（特開平８−１７５９６１号公報）等が開示されている。
【０００４】
しかしながら、上記の真皮線維芽細胞賦活効果を有する成分等の中には、作用効果が不十分であったり、安定性が悪かったりして、皮膚外用剤基剤中に含有させた場合、有効な効果を得るにはかなりの量を含有させなければならないものも存在していた。また、好ましくない副作用や刺激性などを有していたり、製剤安定性に悪影響を及ぼすものや、臭いや色の点で外用剤に配合しにくいもの、一定の作用，品質を維持することの困難なものも多かった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明においては、真皮線維芽細胞の代謝活性を向上させる細胞賦活作用に優れる新規成分を探求し、それを皮膚外用剤に含有させることにより、紫外線などの外来ストレスにより生じる皮膚の傷害や老化を、有効に防止或いは改善する作用に優れる皮膚外用剤を得ることを目的とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者は真皮線維芽細胞の代謝活性促進効果を指標として、有効な活性化作用を有する物質のスクリーニングを行った。その結果、培養したアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の抽出物及びアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体培養濾液が、高い真皮線維芽細胞の代謝促進効果、及び紫外線による線維芽細胞の傷害を防止する効果並びに保湿効果を有することを見いだした。この培養したアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の抽出物及びアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体培養濾液においては、皮膚刺激性，接触感作性といった皮膚への悪影響もなく、また老化防止用皮膚外用剤に配合したときも、真皮線維芽細胞賦活作用の不活性化は起こらずに、品質も安定していた。
【０００７】
アガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）は、担子菌類ハラタケ目ハラタケ科ハラタケ属の一種で、カワリハラタケやヒメマツタケとも呼ばれる。アガリクス茸は北米の南東部及び南米に分布し、ブラジル東南部においては昔から住民が食用にしていた茸の一種である。このアガリクス茸の有効性は、特にその抗腫瘍活性について多くの報告がなされている。例えば、アガリクス茸の子実体或いは菌糸体を水性溶媒で抽出することにより抗腫瘍作用を有する多糖類が得られること（特開昭５５−７４７９７号公報，特開昭５５−１０８２９２号公報，特開昭６４−６７１９４号公報，特開平１−６７１９５号公報，特開平６−１２８１６４号公報等）、アガリクス茸の子実体から抗腫瘍作用を有する核酸成分が得られること（特開平１−６６１２７号公報）、アガリクス茸の熱水抽出残さから抗腫瘍活性を有する蛋白多糖体が単離されること（特開平２−７８６３０号公報）、アガリクス茸の８５％エタノール抽出残さから抗腫瘍活性を有する糖蛋白質が得られること（特開平６−９４２３号公報）、アガリクス茸子実体中に存在する抗腫瘍活性を有するエルゴステロール誘導体（特開平１−２４６２９９号公報）等が開示されている。またアガリクス茸の生理活性として、アガリクス茸子実体抽出物を有効成分とする肝機能改善剤（特開平２−１２４８２９号公報）、アガリクス茸菌糸体培養抽出物の抗アレルギー作用（特開平１−２２８４８０号公報）、アガリクス茸子実体抽出物の免疫能低下改善作用（特開平７−２５８１０７）等が報告されている。今回本発明者は、アガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の抽出物及びアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体培養濾液において、顕著な線維芽細胞賦活作用と，真皮線維芽細胞に対する紫外線による傷害を防止する効果を新たに発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。
【０００９】
本発明で用いられるアガリクス茸（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）は、すでに広く知られており、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号、生命研菌寄第４７３１号として寄託されている。
【００１０】
アガリクス茸菌株の培養法としては、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法及び液体培養法のいずれでも良いが、後者の方法が生産性の点から好ましく用いられる。培養の培地としては、菌の発育に必要な諸栄養が含まれていれば良く、通常の培地処方でよい。すなわち、炭素源としては、例えばグルコース，シュークロース，マルトース，でんぷんなど資化し得る炭素源であれば利用できる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム塩，硝酸アンモニウム塩，尿素等、天然の複合栄養源としては、例えばじゃがいもエキス，ニンジンエキス，麦芽エキス，ペプトン，コウジエキス，酵母エキス，酵母末等を用いることができ、その他成長に必要な微量元素無機塩類，ビタミン類などを適宜添加して用いる。
【００１１】
培養は、通常好気的条件下が良く、例えば振とう培養法或いは通気攪拌培養法が用いられる。培養中の攪拌は、２４時間毎に数分間往復振とう又は回転振とうすればよいが、連続振とうしても良い。培養温度は１５℃〜４０℃好ましくは２０℃〜３０℃前後で培養する。培養ｐＨは、３．０〜９．０、さらには４．５〜７．０で生育が良好である。また、培養中は照光しないほうが好ましいが、１日１１〜１４時間程度の照光は可能である。
【００１２】
培養日数は物理的環境，培養組成などの培養条件によって異なるが、菌糸体の生育があれば良く、通常は２〜１２０日間、特に好ましくは５〜９０日で、最大の菌糸体の生産される時期がよい。
【００１３】
培養終了後培養液を遠心分離或いは濾過することにより菌糸体と培養濾液を分離する。遠心分離は１００〜５０００Ｇ、好ましくは８００〜３０００Ｇの重力加速度を与える遠心操作により行うことが出来る。また、濾過は、３．５〜２００メッシュ、特に好ましくは４〜１６メッシュのメンブランフィルターなどを用いて濾別する。
【００１４】
アガリクス茸の菌糸体から抽出物を得る場合、上記の通り培養した培養液から得られた生の菌糸体をそのまま、或いは乾燥して用いることが出来る。菌糸体からの抽出溶媒としては、親水性溶媒が好ましく用いられる。例えば、水、エタノール，メタノール，イソプロパノール，イソブタノール，ｎ−ヘキサノール，メチルアミルアルコール，２−エチルブタノール，ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類、グリセリン，エチレングリコール，エチレングリコールモノメチルエーテル，エチレングリコールモノエチルエーテル，プロピレングリコール，プロピレングリコールモノメチルエーテル，プロピレングリコールモノエチルエーテル，トリエチレングリコール，１，３−ブチレングリコール，ヘキシレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体などから選択される１種又は２種以上の混合溶媒が使用できる。また、親水性溶媒に無機塩類，界面活性剤などを添加して用いても良い。これらの親水性溶媒の中でも、エタノール，メタノール，１，３−ブチレングリコール，水から選択される１種の溶媒又は２種以上の混合溶媒、及びこれらの溶媒に無機塩，界面活性剤を添加した溶媒が好ましく用いられる。
【００１５】
さらに、抽出方法としては、室温，冷却又は加温した状態で含浸させて抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生のアガリクス茸菌糸体を直接圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示され、これらの方法を単独で又は２種以上を組み合わせて抽出を行う。
【００１６】
抽出の際のアガリクス茸菌糸体と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、アガリクス茸菌糸体１に対して溶媒０．５〜１０００重量倍、特に抽出操作、効率の点で０．５〜１００重量倍が好ましい。また、抽出温度は、常圧下で室温から溶剤の沸点以下の範囲とするのが便利であり、抽出時間は抽出温度などによって異なるが、２時間〜２週間の範囲とするのが好ましい。
【００１７】
また、このようにして得られたアガリクス茸菌糸体抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、真皮線維芽細胞賦活作用、及び紫外線による細胞傷害防御作用を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えて用いることもできる。これらの抽出物やその精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに精製水などの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で皮膚外用剤に添加することができる。
【００１８】
また、濾別した菌糸体培養濾液は、そのまま皮膚外用剤に配合することが出来るが、培養濾液をその効果を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮などの精製操作を加えて用いることも出来る。これらの培養濾液やその精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに精製水などの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で皮膚外用剤に添加することができる。
【００１９】
これらのアガリクス茸菌糸体抽出物及び菌糸体培養濾液の皮膚外用剤への配合量は、その効果や添加した際の匂い，色調の点から考え、０．００１〜２０重量％の濃度範囲とすることが望ましい。配合量が０．００１重量％未満であると、十分な真皮線維芽細胞賦活作用、紫外線による細胞傷害防御作用及び老化防止効果が得られないが、あまり多量に配合する必要もなく、２０重量％を超えると皮膚外用剤の安定性等に影響を及ぼすこともある。
【００２０】
本発明においては、上記のアガリクス茸菌糸体抽出物及び菌糸体培養濾液を含有する皮膚外用剤を提供し得るが、皮膚外用剤としては、ローション，乳剤，クリーム，軟膏等の形態をとることができる。またさらに、柔軟性化粧水，収れん性化粧水，洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム，モイスチュアクリーム，マッサージクリーム，クレンジングクリーム，メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液，モイスチュア乳液，ナリシング乳液，クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック，ピールオフパック，洗い流しパック，粉末パック等のパック類、美容液、及び洗顔料といった種々の製剤形態の化粧料としても提供することができる。
【００２１】
本発明においてはさらに、他の細胞賦活剤や美白成分，保湿剤，抗炎症剤，紫外線吸収剤等、他の有効成分を併用することもでき、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、美白化粧料等の化粧料或いは医薬部外品等として提供することもできる。
【００２２】
【実施例】
本発明の実施例に使用したアガリクス茸菌糸体抽出物及びアガリクス茸菌糸体培養濾液の製造例を、まず示す。
【００２３】
［製造例１］アガリクス茸菌糸体抽出物１
特公昭６１−４７５１８号公報，実施例１に記載の方法によりアガリクス茸菌糸体抽出物１を得た。すなわち、グルコース４ｇ，酵母エキス４ｇ，麦芽エキス１０ｇ，及び精製水１リットルからなるｐＨ５．５の培地を１２０℃で２０分間滅菌し、寒天培地に培養したアガリクス茸菌糸体を接種し、３０℃で３０日間、ときどき攪拌しながら静置で前培養した。グルコース２０ｇ，酵母末５ｇ，消泡剤２０ｐｐｍ及び精製水１リットルからなるｐＨ５．０の本培養培地２．０リットルを１２０℃で２０分滅菌した。これに前培養した培地２００ｍｌを接種し、培養温度３０℃で往復振とう機にて培養した。３０日間培養後培養を停止し、遠心分離により菌糸体を培養物より分離し、菌糸体を得た。菌糸体に対して７倍量の水を加え９５℃で２時間加熱抽出した。遠心分離により残さを除去して得た上澄液をアガリクス茸菌糸体抽出物１（製造例１）とした。
【００２４】
［製造例２］アガリクス茸菌糸体抽出物２
アガリクス茸菌糸体抽出物１を１／２量に濃縮し、エタノールを等容量加えて４℃で一昼夜放置、沈殿を生じさせた。この沈殿を遠心分離で集め、アセトン，次いでエーテルで洗浄し乾燥後、淡褐色粉末を得た。これをアガリクス茸菌糸体抽出物２（製造例２）とした。
【００２５】
［製造例３］アガリクス茸菌糸体抽出物３
特公昭６１−４７５１８号公報，実施例２に記載の方法によりアガリクス茸菌糸体抽出物３を得た。すなわち、グルコース２０ｇ，酵母エキス５ｇ，及び精製水１リットルからなるｐＨ５．０に調整した培地を１２０℃で２０分間滅菌した。これに寒天培地に培養したアガリクス茸菌糸体を接種し、３０℃，３週間静置で前培養した。グルコース５０ｇ，酵母末１０ｇ，消泡剤２０ｐｐｍを１リットルの精製水に溶解し、ｐＨを５．０に調整して本培養培地とした。この培地を１２０℃で２０分滅菌した、これに前培養した培地５００ミリリットルを接種し、培養温度３０℃，通気量０．５ＶＶＭ，攪拌速度２００〜３００ｒｐｍの条件にて培養した。１０日間培養後、培養を停止し、濾過して菌糸体を分離後、更に１００００ｒｐｍ，１５分の条件で遠心分離し、菌糸体を得た。この菌糸体に精製水３リットルを加え５０℃で１時間加熱抽出した。冷却後、１００００ｒｐｍで３０分遠心分離し、残さを除去した上澄液をアガリクス茸菌糸体抽出物３（製造例３）とした。
【００２６】
［製造例４］アガリクス茸菌糸体抽出物４
アガリクス茸菌糸体抽出物３をロータリーエバポレーターで濃縮し、１リットルとした。これにエタノール１リットルを加え、１昼夜４℃に放置して沈殿を生じさせた。ついで固液分離し、得られた沈殿物をアセトン，エーテルで洗浄した後乾燥して淡灰白色の粉末を得た。さらにこれを純水に溶解し、透析チューブにて精製水に対して透析し、生じた沈殿物を遠心分離で除去後、上澄液を凍結乾燥し、白色粉末を得、これをアガリクス茸菌糸体抽出物４（製造例４）とした。
【００２７】
［製造例５］アガリクス茸菌糸体培養濾液１
製造例１にて本培養したアガリクス茸菌糸体の菌糸体を除去した培養液をアガリクス茸菌糸体培養濾液１（製造例５）とした。
【００２８】
［製造例６］アガリクス茸菌糸体培養濾液分画物１
アガリクス茸菌糸体培養濾液１をロータリーエバポレーターで６分の１まで濃縮し、これに等容量のエタノールを添加して４℃で一昼夜放置、沈殿を生じさせた。遠心分離で沈殿を集め、アセトンついでエーテルで洗浄し、乾燥後、淡褐色粉末を得、アガリクス茸菌糸体培養濾液分画物１（製造例６）とした。
【００２９】
［製造例７］アガリクス茸菌糸体培養濾液２
製造例３にて本培養したアガリクス茸菌糸体の菌糸体を除去した培養液をアガリクス茸菌糸体培養濾液２とした。
【００３０】
［製造例８］アガリクス茸菌糸体培養濾液分画物２
アガリクス茸菌糸体培養濾液２をロータリーエバポレーターにて１０分の１量まで濃縮し、等容量のエタノールを添加して１昼夜４℃で放置し、沈殿を生じさせた。ついで、固液分離し得られた沈殿物をアセトン，エーテルで洗浄した後、乾燥して、淡褐色粉末を得た。これを精製水に溶解し、透析チューブにて精製水に対して透析し、生じた沈殿物を遠心分離にて除去後、上澄液を凍結乾燥し、白色粉末を得、アガリクス茸菌糸体培養濾液分画物２（製造例８）とした。
【００３１】
［真皮線維芽細胞代謝活性化作用］
ヒト由来真皮線維芽細胞を１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、２４時間後に前記製造例１〜８を含有する１．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最小必須培地にて、３７℃で４８時間培養した。次いで２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を０．４ｍｇ／ｍｌ含有する前記培地に交換して３７℃で２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを、２−プロパノールにて抽出し５５０ｎｍにおける吸光度により測定した。なお、１．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最小必須培地のみで培養した系を対照とし、５．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最小必須培地で培養した系を陽性対照とした。結果は対照における吸光度を１００．０％として表した活性化指数により表１に示した。
【００３２】
【表１】
0003630388.tif 000002
【００３３】
その結果、表１に示したとおり、アガリクス茸菌糸体抽出物，アガリクス茸菌糸体培養濾液を添加して真皮線維芽細胞を培養することにより、活性化指数の上昇が認められ、有意な線維芽細胞代謝活性化が認められていた。
【００３４】
［紫外線による細胞傷害防御作用］
ヒト由来真皮線維芽細胞を１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、２４時間後に製造例１〜８を含有する５．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最小必須培地に交換し、３７℃で２４時間培養した。次いで培地をＨａｎｋｓ液に交換し、紫外線を０．５Ｊ／ｃｍ２量照射した。再度、５．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最小必須培地に交換し、３７℃で２４時間培養した後、培地をニュートラルレッドを２０μｇ／ｍｌ含有する前記培地に交換して３７℃で２時間培養し、培地中に含まれるニュートラルレッドをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを、０．１Ｎ塩酸含有３０％エタノール水溶液で抽出し、抽出液の５５０ｎｍの吸光度を測定した。ニュートラルレッドは、生細胞の細胞膜だけを透過し、リソゾームに沈着するので、生細胞だけを特異的に染色することができる。なお、製造例を添加せず、５．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ最少必須培地のみで培養した系を対照とし、それぞれの紫外線照射後の細胞生存率を表２に示した。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
その結果、表２に示したとおり、アガリクス茸菌糸体抽出物，アガリクス茸菌糸体培養濾液を添加して真皮線維芽細胞を培養することにより、紫外線による真皮線維芽細胞の傷害に対し、有意な防御作用が認められていた。
【００３７】
次に、先に示した製造例を用いて調製した実施例を示し、更に本発明について詳細に説明する。
【００３８】
［実施例１〜８］Ｏ／Ｗ乳化型美容液
表３に示した配合量で製造例１〜製造例８を配合し、下記の処方によりＯ／Ｗ乳化型美容液をそれぞれ調製し、実施例１〜実施例８とした。
0003630388.tif 000004
製法：（１）〜（５）の油相成分を混合し７５℃に加熱して溶解，均一化する。一方（６）〜（８）の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱し、油相成分を添加して予備乳化する。（９）を添加した後ホモミキサーにて均一に乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整する。冷却後４０℃にて（１１）〜（１３）を添加，混合，均一化する。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
前記実施例１〜実施例８を用いて、紫外線によるしわの発生に対する防止効果を評価した。なお製造例を精製水に代替したものを比較例１とした。しわ発生防止効果は、ヘアレスマウス５匹を１群とし、各群について実施例及び比較例をそれぞれ１日１回背部に塗布し、１Ｊ／ｃｍ２／週の長波長紫外線（ＵＶＡ）を５０週間照射し、ヘアレスマウスにおけるしわの発生状況を観察し、表４に示す判定基準に従って点数化して行った。この際、精製水のみを塗布した群を対照とした。結果は各群の平均値を算出し、ＵＶＡ照射日数との関係により表５に示した。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
【表５】
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【００４３】
表５に示されるように、対照群においては、ＵＶＡ照射日数が４０週を越える頃には形成されたしわの深さが中程度にまで達し、５０週後には深いしわの発生が認められていた。これに対し、本発明の実施例塗布群では、いずれにおいても５０週後に微小ないし軽微なしわが認められた程度で、しわの発生は顕著に抑制されていた。一方比較例塗布群では、有意なしわの発生抑制或いは軽減は認められなかった。
【００４４】
続いて、本発明の実施例１〜実施例８及び比較例１について、抗炎症作用及び創傷治癒促進効果を評価した。人工的に炎症又は創傷を形成した１群５匹のマウスを用い、各群に実施例及び比較例をそれぞれ０．５ｇずつ１日２回７日間塗布し、７日目に炎症部位及び創傷部位の状態を観察した。抗炎症作用については「有効」，「やや有効」，「無効」、創傷治癒促進効果については「完全治癒」，「ほぼ治癒」，「治癒不完全」の３段階でそれぞれ評価し、各評価を得たマウスの数にて表６に示した。
【００４５】
【表６】
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【００４６】
表６より明らかなように、抗炎症作用については、本発明の実施例塗布群ではいずれにおいても無効と評価されたマウスは見られず、２例以上のマウスにおいて有効な抗炎症作用が認められていた。また創傷治癒促進効果についても、本発明の実施例塗布群では創傷治癒の不完全なマウスはいずれにおいても認められておらず、２例以上のマウスで完全な治癒を認めていた。これに対し比較例１塗布群では、やや有効な抗炎症作用の認められたマウスが１例見られたが、残り４例では炎症の改善は全く認められなかった。また比較例１塗布群すべてにおいて、創傷治癒は不完全であった。
【００４７】
次に本発明の実施例１〜実施例８及び比較例１について、６ヶ月間の実使用試験を行った。パネラーとして、顕著なしわの発生等の皮膚症状を有する４０歳〜６０歳代の女性を用い、１群２０名とした。使用試験は、各群に実施例及び比較例のそれぞれをブラインドにて使用させて行った。使用試験前および使用試験終了後の皮膚の状態を観察し、しわの改善状況について、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の３段階にて評価した。なお、しわの程度については写真撮影及びレプリカにより評価した。結果は、各評価を得たパネラー数にて表７に示した。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
表８に示されるように、しわの改善状況については、本発明の実施例使用群ではすべてにおいて改善傾向が認められていた。特に、実施例２及び実施例７使用群では、８０％のパネラーで明確な改善を認めていた。これに対し、比較例使用群では、明確な改善を認めたパネラーは見られず、７５％のパネラーで症状の改善を認めなかった。
【００５０】
実施例１〜実施例８及び比較例１を用いて保湿作用試験を行った。保湿作用は、気温２０℃、相対湿度５０％の恒温恒湿室内で、前腕内側部に実施例を０．０１ｍｌ／ｃｍ２塗布し、３０分後の表皮水分量を高周波インピーダンスメータ（ＩＢＳ社製，Ｓｋｉｃｏｎ２００）を用いて測定した。なお、ブランクとして実施例及び比較例を塗布していない部分の表皮水分量を測定し、その差を保湿作用試験結果として、各試料とも１０名のパネラーの平均値を算出した。
【００５１】
【表８】
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【００５２】
保湿作用試験結果を表８に示した。実施例１〜実施例８は、比較例１より３０μＳ以上表皮水分量の上昇量が多くなっており、アガリクス茸菌糸体抽出物，アガリクス茸菌糸体培養濾液を配合することにより表皮の保湿性が向上することが示された。
【００５３】
なお、本発明の実施例１〜実施例８については、上記使用試験期間中に含有成分の析出，分離，凝集，変臭，変色といった状態変化は全く見られなかった。また、各実施例使用群において、皮膚刺激性反応や皮膚感作性反応を示したパネラーは存在しなかった。
【００５４】
続いて本発明の他の実施例の処方を示す。
【００５５】
［実施例９］皮膚用ローション
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製法：（１）〜（５）を混合し均一とする。
【００５６】
［実施例１０］皮膚用乳剤
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製法：（１）〜（６）の油相成分を混合，加熱して均一に溶解し、７０℃に保つ。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合，加熱して均一とし、７０℃とする。この水相成分に前記油相成分を攪拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却した後４０℃にて（１１）を添加，混合する。
【００５７】
［実施例１１］皮膚用ゲル剤
0003630388.tif 000013
製法：（１）に（２）を均一に溶解した後、（３）に（４）を溶解して添加し、次いで（５）を加えて増粘させ、（６）を添加する。
【００５８】
［実施例１２］皮膚用クリーム
0003630388.tif 000014
製法：（１）〜（７）の油相成分を混合，溶解して７５℃に加熱する。一方、（８）〜（１０）の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後４０℃にて（１１）を添加，混合する。
【００５９】
［実施例１３］水中油型乳剤性軟膏
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製法：（１）〜（４）の油相成分を混合，溶解して均一とし、７５℃に加熱する。一方、（５）を（６）に溶解して７５℃に加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（７）を添加，混合する。
【００６０】
［実施例１４］化粧水
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製法：（１）〜（４）を順次（５）に添加して均一に混合，溶解する。
【００６１】
［実施例１５］エモリエントクリーム（油中水型）
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製法：（５），（６）を（９）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に攪拌しながら徐々に添加する。これをあらかじめ混合し７０℃に加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散し、これに（７），（８）を（９）の残部に溶解して７０℃に加熱したものを攪拌しながら添加し、ホモミキサーにて乳化する。冷却後、４０℃にて（１０），（１１）を添加，混合する。
【００６２】
［実施例１６］メイクアップベースクリーム
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製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とする。一方（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃に加熱，溶解して均一とし、これに（８）〜（１０）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて乳化した後冷却し、４０℃にて（１１），（１２）を添加，混合する。
【００６３】
［実施例１７］乳液状ファンデーション
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製法：（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とする。一方（６）〜（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱，溶解して均一とし、これに（１０）〜（１４）の顔料を添加しホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて均一に乳化した後冷却し、４０℃にて（１５），（１６）を添加，混合する。
【００６４】
［実施例１８］ハンドクリーム
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製法：（１）〜（６）の油相成分を混合，溶解して７５℃に加熱する。一方、（７）〜（９）の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱する。ついで、この水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化して冷却し、４０℃にて（１０）を添加，混合する。
【００６５】
【発明の効果】
以上詳述したように、アガリクス茸菌糸体抽出物，アガリクス茸菌糸体培養濾液は、真皮線維芽細胞賦活作用及び真皮線維芽細胞に対する紫外線による傷害を防御する作用を有し、これを含有する本発明の老化防止用皮膚外用剤は、シワ，シミの発生、皮膚弾性の低下といった皮膚老化症状の防止或いは改善に有効で、抗炎症作用，創傷治癒促進作用，保湿作用をも有し、さらに安定性，安全性も良好であった。