(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒耐性を有し、ポリ塩化ビフェニールを分解するシュードモナス・プチダ  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７２。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、有機溶媒耐性を有し、ポリ塩化ビフェニール類（以下ＰＣＢｓという）を資化し、分解する新規微生物に係り、特に、強い毒性を有するコプラナーＰＣＢｓを分解するとともに、高濃度のＰＣＢｓを短時間で分解する新規微生物に関するものである。
この新規微生物は、環境中にあって土壌もしくは水質を汚染しているＰＣＢｓの分解除去、又は保管されているＰＣＢｓの無害化処理に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＢｓは、化学的に安定で熱特性も良いことからコンデンサやトランス等に多く用いられたが、人体に対する毒性を有することから１９７０年代に有害な環境汚染物質として製造が禁止された。そして、これまでに製造又は使用されたＰＣＢｓは回収して保管されることとなった。しかし、既に環境中に放出されたもの、２０数年が経過するうちに散逸してしまったものもある。このようなＰＣＢｓは、環境中においても安定で分解し難く、環境中から検出されるＰＣＢｓの濃度は減少していない。このため、環境中のＰＣＢｓを効率よく分解・処理する方法が求められている。
また、保管されているＰＣＢｓの処分方法として焼却することが行われている。しかし、焼却処分の際にダイオキシン等の有害な副産物が生じる危険があり、処理が制限されるという問題がある。
【０００３】
このような状況下において、微生物を用いてＰＣＢｓを分解することが考えられており、いくつかのＰＣＢｓ分解性を有する菌について報告がなされている。これらによると、ＰＣＢｓを分解する微生物としてシュードモナス属、フラボバクテリューム属、アルカリゼネス属が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来から知られているＰＣＢｓ分解性微生物には次のような問題点がある。
ＰＣＢｓは脂溶性であるため、普通の液体培養では分解に長時間を要するが、微生物に有機溶媒に対する耐性を有していると、この有機溶媒にＰＣＢｓを溶解し、連続的に分解させることが可能となる。しかし、トルエンやキシレン等の芳香族炭化水素は一般に微生物にとって有害であり、これらの有機溶媒に対する強い耐性を有するＰＣＢｓ分解性微生物はこれまで報告されていない。
【０００５】
また、従来から知られている微生物ではＰＣＢｓの分解能力が弱く、高濃度のＰＣＢｓ（例えば１００ｐｐｍ程度）を分解するのに長い時間を要してしまうという問題がある。
さらに、ＰＣＢｓの中でも毒性の強いコプラナーＰＣＢｓを短い時間で分解する微生物は報告されていない。
【０００６】
本発明は上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、大量の有機溶媒存在下で生育するとともに、高濃度のＰＣＢｓを分解することができ、ＰＣＢｓの中でも強い毒性を示すコプラナーＰＣＢｓ類の分解能力にも優れた新規微生物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、本発明は新規微生物として、    有機溶媒耐性を有し、ポリ塩化ビフェニールを分解するシュードモナス・プチダ  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７２を提供するものである。
【０００８】
この微生物は、天然から分離したものであり、次のような工程によって抽出されたものである。
全国各地１２５ケ所から土壌、埋め立て浸出水、汚泥、海水等のサンプル約２００点を採取し、これらに含まれる菌を検索した。まず、試験管に１０ｍｌの改良ＰＡＳ培地と０．１ｇのビフェニールとを入れ、減菌した後の採取資料１ｇまたは１ｍｌを加えて攪拌する。これを３０日間静置培養し、試験管内における培養液の色や濁度の変化を観察して、ビフェニールを分解する菌を検索する。なお、改良ＰＡＳ培地については後述する。
上記培養で抽出した菌はＬＢ寒天培地でコロニーを単一化する。この単一菌をＬＢ液体培地で２４時間前培養し、改良ＰＡＳ培地１００ｍｌと１０ｐｐｍのＰＣＢｓが入った培養フラスコ（容量２００ｍｌ）に、上記培養液１００μｌを加え、振盪培養する。これらの菌株からＰＣＢｓの分解性を有するものとして５６株が得られた。これらの中から、ＰＣＢｓの分解能力が高い１１株を選択し、有機溶媒を重層したシャーレに植菌して生育を調べたところ、有機溶媒がヘキサンであるときには、ほとんどの菌に生育が認められたが、有機溶媒にトルエンを用いると１１株中４株のみに生育が認められた。これら４株のうちの最もＰＣＢｓ分解性が高いものが本発明に係る新規微生物であり、シュードモナス・プチダＳＮ−４９９２と命名する。
この菌株は、神奈川県内で採取されたサンプル（土壌）から分離されたもので、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７２である。
【０００９】
本菌の細菌学的性質を以下に示す。
Ａ．形態
（１）桿菌
（２）芽胞：（−）
（３）大きさ（μｍ）：幅０．８〜１．２、長さ１．２〜４．０
Ｂ．培地における生育状態
（１）生育温度範囲：至適発育温度範囲は２０〜３０℃
Ｃ．生理・生化学的性質
（１）  グラム反応            ：    陰性
（２）  運動性                ：    ＋
（３）  好気性での発育        ：    ＋
（４）  嫌気性での発育        ：    −
（５）  カタラーゼ反応        ：    ＋
（６）  オキシダーゼ反応      ：    ＋
（７）  蛍光色素産生          ：    ＋
（８）  ＯＦ培地              ：    酸化
（９）  ４１℃での生育        ：    −
（１０）４℃での生育          ：    ＋
（１１）ＧＣ含量（mol ％）    ：    ６３．０
（１２）糖類からの酸の生成
グルコース    ：    ＋
マンニトール  ：    −
アドニトール  ：    −
アラビノース  ：    −
イノシトール  ：    −
ラムノース    ：    −
ソルビトール  ：    −
マルトース    ：    −
シュクロース  ：    −
【００１０】
以上の諸性質をバージェイのマニュアル  オブ  ディターミナティブ  バクテリオロジー  第８版(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition)  に基づいて検索したところ、上記性質から本菌はシュードモナス属に属し、シュードモナス・プチダに該当すると認められる。しかし、本菌はシュードモナス・プチダに属する公知の菌株とは糖の分解性、ＧＣ含量等に差異があり、新規な菌株と考えられる。
なお、本菌は、例えば下記の条件で保存することができる。
ＬＢ培地で生育させた後、２００μリットルのグリセリンに１００μリットルの生育菌を入れ、よく撹拌した後−８０°Ｃで保存する。または、スキムミルクを入れ凍結乾燥して保存する。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明に係る新規微生物の性質を試験の結果に基づいて説明する。
（１）有機溶媒耐性
有機溶媒耐性は次のような試験により判定した。
ＬＢ寒天平板培地に菌株を植菌し、平板培地上に各溶媒を２０ml入れ重層後、３０℃で９６時間培養する。
９６時間培養した後に菌の生育の良否を観察し、耐性能力の有無について判定する。
【００１２】
試験の結果は、表１に示すとおりであり、本発明に係る菌株シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ＳＮ−４９９２は、ベンゼン中での生育は認められないが、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｐ−キシレン、ｏ−キシレン、トルエン、ｎ−ヘプタノール中では生育が認められる。したがってほとんどの有機溶媒に対して耐性を有し、既に知られている他の菌より優れた有機溶媒耐性を有することが解る。なお、表１中においてＬｏｇ  Ｐow  は、各有機溶媒の分配係数を対数表示したものである。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
（２）ＰＣＢｓの分解性
ＰＣＢｓの分解試験を行なう際の条件は、次のように設定する。
温度は、使用する微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。ＰＣＢｓの種類、培地の組成、ｐＨ及びその他の条件によって異なるので一様に規定できないが、例えば１０〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃に設定することができる。反応系のｐＨは通常６．０〜７．５の範囲に設定すればよい。培養は、通常好気的条件がよく、振盪培養法または通気攪拌法などが利用できる。培養時間は、ＰＣＢｓの量や種類より異なるがＰＣＢｓが１０ｐｐｍ以上含有する場合は、通常１０日以上、好ましくは１５〜３０日間である。培地に無機塩として添加する物質はリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用いられる。窒素源として添加する物質は、使用菌が資化し得るものであればよく、例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、各種アミノ酸等である。これらの窒素源は１種でもよく、また２種以上組み合わせて用いてもよい。さらに、使用菌の成長を促進するための栄養源としてビタミン、酵母エキス、麦芽エキスなどの適量を添加してもよい。
【００１５】
また、菌は上記のような培地で培養した後に試験を行ってもよいし、試験に使用する菌を、それが資化し得る炭素源、例えばグルコース、ラクトース、サッカロース、マルトース、廃糖蜜、でんぷん等を含む培養液で予め培養し、得られる菌体を上述した培地と同様な組成の物質を含む液に添加して試験を行ってもよい。
【００１６】
（ａ）本発明に係る菌と標準菌とのＰＣＢｓ分解性の比較
本発明に係る菌シュードモナス・プチダＳＮ−４９９２と一般に知られている菌とを用いてＰＣＢｓの分解性を比較する試験を以下の通りに行った。
菌をシャーレから３白金耳取り、ＬＢ液体培地を用いて４８時間の前培養を行う。一方、容量が２００ｍｌの培養フラスコに改良ＰＡＳ培地を１００ｍｌと１０ｐｐｍのＰＣＢｓとを入れ、上記培養液を１００μｌ加える。これを３０℃で３０日間振盪培養（１２０ｒｐｍ）する。
【００１７】
上記改良ＰＡＳ培地は、１リットル中にＫ2 ＨＰＯ4 ：０．４５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．２０ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ：０．２５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．０２０ｇ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．００５ｇ、ＦｅＳＯ・７Ｈ2 Ｏ：０．００１０ｇ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ：０．０００５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸：０．００１０ｇを含むものである。また、これに加えたＰＣＢｓは唯一の炭素源となっている。
【００１８】
３０日間の培養後、培養液は１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、上清部分と沈殿部分に分ける。上清部分には２５ｍｌのｎ−ヘキサンを加えてＰＣＢｓを抽出し、これを３回繰り返す。沈殿部分には硝酸２ｍｌと硫酸２ｍｌとを入れ菌体を完全に分解し、上清液と同様にｎ−ヘキサンを２５ｍｌ加えてＰＣＢｓを抽出する（３回繰り返す）。各々の抽出液を合量し、エバポレターで濃縮して２ｍｌとする。この液中のＰＣＢｓをエレクトロンキャプチュア検出器付ガスクロマトグラフ（ＥＣＤ−ＧＣ）［（株）島津製作所製１５Ａ−ＧＣ、２ｍカラムＯＶ−１７、カラム温度２００℃、Ｎ2 ガス４０ｍｌ／ｍｉｎ）で測定し、ＰＣＢｓ濃度を求める。これを、培養液に加えたＰＣＢｓの量と比較することにより分解量を算出する。
このような試験の結果は表２に示すとおりである。
【００１９】
【表２】
0003725918.tif 000003
この表に置いて、ＫＣ−２００、ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００はＰＣＢｓの種類を示すものであり（鐘淵化学（株）製、カネクロール）、それぞれ、分子中に含まれる塩素数が２、３、４、５のものを主に含んでいる。
【００２０】
この表に示されるように、本発明に係る菌であるシュードモナス・プチダＳＮ−４９９２は、他の既に知られている菌に比べて著しく高いＰＣＢｓの分解性を有している。シュードモナス・プチダＳＴ−２９９２は、ＫＣ−２００に対してかなり高い分解性を有するが、ＫＣ−５００に対しては分解性は大きく低下し、シュードモナス・プチダＳＮ−４９９２の分解性と著しい差異がある。
【００２１】
（ｂ）高濃度ＰＣＢｓの分解試験
本試験は高濃度で存在するＰＣＢｓの分解性を調査するために行ったものであり、次のような手順による。
本発明に係る菌(Pseudomonas putida SN-4992)をシャーレから３白金耳採取し、ＬＢ液体培地５０ｍｌを入れた培養フラスコ（容量１００ｍｌ）に添加する。これを３０℃で７２時間振盪培養（１２０ｒｐｍ）する。
この培養液を１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離にかけ、菌体を集めて生理食塩水で３回洗浄する。そして、改良ＰＡＳ培地１００ｍｌが入った培養フラスコ（容量２００ｍｌ）に、唯一の炭素源として１００ｐｐｍのＰＣＢｓを入れ、上記菌体を加える。これを３０℃で１０日間振盪培養する。
【００２２】
培養後におけるＰＣＢｓの分解量の測定は、（ａ）で説明したＰＣＢｓの分解性を比較する試験と同様に行う。
この試験の結果は表３に示す通りであり、分子中の塩素数が多くなる程、分解率は低下する傾向にあるが、高い分解性を有していることが解る。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
（ｃ）コプラナーＰＣＢｓの分解試験
コプラナーＰＣＢｓは毒性が特に強い異性体であり、下記のような分子構造を有するものである。
【化１】
0003725918.tif 000005
このコプラナーＰＣＢｓの分解性について本発明に係る菌および既に知られている菌を用いて試験を行ない、その結果を以下に示す。
【００２５】
ＬＢ液体培地に菌を３白金耳採取し、４８時間の前培養を行なう。その後、この培養液を遠心分離し、増殖菌を集める。この菌を、培養瓶（容量２００ｍｌ）中の改良ＰＡＳ培地５０ｍｌ中に懸濁させ、１０００ｐｐｍのＰＣＢｓ（鐘淵化学（株）製カネクロールＫＣ−４００、１Ｋｇ中にコプラナーＰＣＢｓが約４ｇ含まれる）を溶かしたトルエン５ｍｌを加え、３０°Ｃで振盪培養（１００ｒｐｍ）を行なう。培養後遠心分離を行ない上清液部分と沈殿部分とに分離する。上清液については、等量のｎ−ヘキサンを加えて未分解のＰＣＢｓを抽出する操作を３回繰り返す。また沈殿部分については、濃硫酸を１０ｍｌと濃硝酸５ｍｌとを加え、菌体を完全に分解した後、蒸留水を３５ｍｌ入れて冷却する。その後、等量のｎ−ヘキサンを加え未分解のＰＣＢｓを抽出する操作を３回繰り返す。
上清液および沈殿部分から抽出したｎ−ヘキサンは合量し、エバポレーターで濃縮して最終量を２ｍｌとする。
【００２６】
一方、クロマトグラフィ用のカラムに活性炭／シリカゲル混合物０．５ｇをｎ−ヘキサンによる湿式法で充填し、無水硫酸ナトリウム２．０ｇを積層する。このカラムに上記の工程で濃縮した分析用試料２ｍｌを流入させ、ｎ−ヘキサン１ｍｌで分析試料の容器である試験管およびカラム内を洗いながら流入させる操作を２回行ない、分析用試料の全量をカラム内に流入させる。そして、２％ベンゼン・ｎ−へキサン混液２００ｍｌを流入し、コプラナーＰＣＢｓ以外のＰＣＢｓ等低極性妨害物質を溶出除去する。この後、トルエン３０ｍｌを加え、コプラナーＰＣＢｓを溶出する。この試料にｎ−デカン０．２ｍｌを添加し、エバポレーターで５０°Ｃに維持してトルエンを除去した後、ｎ−ヘキサンを溶媒として加え、３ｍｌの試料とする。
【００２７】
コプラナーＰＣＢｓの分解率の測定は磁場型ガスクロマトグラフ・マススペクトル（ＧＣ／ＭＳ）［日本電子（株）製ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ］を用いた分析により行なう。この分析には、カラムとしてヒューレットパッカード（株）製ＵＬＴＲＡ１（４０ｍ×０．２ｍｍ×０．１１μｍ）を用い、以下の条件で昇温させてスプレットレス法を用いる。なお、コプラナーＰＣＢｓの分解成分の同定および定量にはおのおの市販の標準品を用いることができる。
昇温条件
・１００°Ｃで１分間保持する。
・１００〜２００°Ｃまで２５°Ｃ／分で昇温させる。
・２００〜２８０°Ｃまでは２°Ｃ／分で昇温させる。
・その後、５分間２８０°Ｃに維持する。
【００２８】
上記のような試験による結果は、表４に示すとおりであり、本発明に係る菌はコプラナーＰＣＢｓについても高い分解性を有していることが解る。
【表４】
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【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る新規微生物は、強い有機溶媒耐性を有するとともに、高いＰＣＢｓの分解能力を有しているので、有機溶媒に溶解した状態のＰＣＢｓはより速やかに分解することができる。したがって、河川水、海水、下水等を汚染するＰＣＢｓの分解・処理、ＰＣＢｓによって汚染された土壌等の浄化に用いることができる。また、この新規微生物は高い濃度、例えば１００ｐｐｍ程度のＰＣＢｓに対しても高い分解性を有し、高濃度の汚染水または汚染土壌の処理に用いることができるし、保管されているＰＣＢｓの処理に用いることも考えられる。さらに、高い毒性を持ち分解し難いコプラナーＰＣＢｓの分解処理に用いることもできる。