(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モニリエラ属の単離株であって、グルコースからエリスリトールへの転換率が少なくとも約55％であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受付番号PTA-2862として寄託されたN61188-12である単離株。
【請求項２】
請求項１に記載の単離株であって、グルコースからエリスリトールへの転換率が少なくとも約60％である単離株。
【請求項３】
エリストールを製造する方法であって、
グルコースからエリスリトールへの転換率が少なくとも約55％であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受付番号PTA-2862として寄託されたN61188-12であるモニリエラ属の単離株を培養液中で増殖することにより、前記グルコースをエリスリトールに変換することと、
前記培養液からエリストールを精製することを含んでなる方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記変換率が少なくとも約60％である方法。
【発明の詳細な説明】
【背景】
【０００１】  エリスリトールは、地衣、麻の葉、およびきのこに見られる糖アルコールである。また、ワイン、醤油、または酒(saki)のような、発酵食品における風味成分でもある。(Sasaki, T.(1989) Production technology of erythritol. Nippon Nogeikagaku Kaishi 63: 1130-1132) 。エリスリトールは、４炭素ポリオールであり、甘く（ショ糖の約70-80％）、歯に優しく、カロリー値が非常に低く、発癌性がないといった幾つかの性質を有し、また他のポリオールとは異なり、胃腸の不調を引き起こすことは殆どない(Harald  and Brexelles(1993) Starch/Starke 45:400-405)。
【０００２】  エリスリトールの伝統的な工業的製造は、高温高圧下において、水素およびニッケルのような触媒を、未加工の原料ショ糖に加えることによってなされる。他の方法では、メソ−酒石酸（Kent, P. W., and Wood, K. R.(1964) J. Chem. Soc. 2493-2497）または、エリスロース（Otey, F. H. and Sloan, J. W. (1961) Ind. Eng. Chem 53:267）のような未加工原料の化学的還元を行って、エリスリトールを得ている。加えて、エリスリトールは微生物によって産生される。このような微生物は、高浸透圧酵母、たとえばピチア、カンジタ、トルロプシス、トリゴノプシス、モニリネラ、オウレバシジウム、およびトリコスポロンspを含む。(Onishi, H. (1967) Hakko Kyokaish 25: 495-506; Hajny et al. (1964) Appl. Microbiol. 12: 240-2461 Hattor, K., and Suzuki, T. (1974) Agric. Biol. Chem. 38: 1203-1208; Ishizuka, H., et al. (1989) J. Ferment. Bioeng. 68: 310-314.)
【概要】
【０００３】  本発明は、グルコースをエリスリトールに転換する能力が増強されたモニリレラ種の単離株を特徴とする。このような株は、へ少なくとも約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、または最適な条件下においてはそれ以上の転換率でで、グルコースからエリスリトールを産生することができる。
【０００４】
本発明の株は、自然界からのモニリエラ単離株、およびモニリエラ株の突然変異体、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC) に受付番号PTP-1227、PTA-1228、PTA-1229、PTA-1230、およびPTA-1232を付与されたモニリエラ単離株を含む。特別な突然変異体株の一つは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの 受付番号PTA-2862で寄託された単離株、N61188-12である。
【０００５】  ここで用いられる、「突然変異体」の用語は、基準株または親株と比較して、遺伝子構成が、少なくとも一つのヌクレオチドで異なる（たとえば置換、挿入、または欠失など）株をいう。本発明の突然変異体は、多くの方法によって作製することができる。一つの方法は、親株と比較して、エリスリトールへの変換率が高い株を選択することである。その株は、親株のランダムな突然変異誘発によって得ることができる。たとえば、化学的突然変異誘発物質、トランスポゾン、または放射線照射によるものである。加えて、本発明の突然変異体は、組換え核酸配列を含んでいてもよい。たとえば、突然変異体は、付加的な核酸配列（たとえば親株に形質転換、形質導入または挿入された配列）を宿した株であってもよい。この付加的な核酸配列は、普通に、または条件付きで発現されるポリペプチドをコードすることができる。あるいは、付加的核酸配列は、たとえば、アンチセンス、リボソーム、またはその他の核酸配列のような、細胞の生理を変えることができる核酸配列をコードしてよい。その他の例としては、挿入される核酸は、内在性遺伝子に挿入され、その機能を変える(たとえば増強または破壊する)。たとえば、挿入された核酸は、内在性遺伝子を不活化するノックアウト構築物、または内在性遺伝子の転写を増加する人工的なエンハンサー、もしくはプロモーターであってもよい。突然変異は、エリスリトールもしくはマンニトールを輸送、消化または消費する親株の能力を破壊することができる。
【０００６】  本発明は、エリスリトールの製造方法も特徴とする。この方法には、本発明のモニリエラ株、例えば培養液中の増強された突然変異体を増殖すること；および上清からもしくは細胞塊といった培養液中からエリスリトールを精製することが含まれる。
【０００７】  本発明の一以上の態様の詳細が、添付の図面および以下の説明に与えられる。本発明におけるその他の特徴、対象、有利点は、これらの説明および図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
【詳細な記述】
【０００８】  モニリエラ菌は、単純な糖を発酵させて、多くの料理法で風味付けに用いられているエリスリトールを産生することができる。スクリーニングおよび突然変異誘発は、エリスリトール産物の産生量が高効率で得られるモニリエラ改良株を同定するために用いられる。このような株は、大規模なエリスリトール産生には理想的であり、ここに例として記述された方法によって達成できる。
【０００９】  ＜エリスリトール産生が増強された株の単離＞
モニリエラの単離株は、2000年6月2日に出願された米国特許出願09/585,926号に記載されたようにして、天然資源から得ることができる。たとえば、モニリエラの単離株は、蜂蜜、果物ジャム、および花粉を含む高ショ糖含量の天然資源から得ることができる。各株は、グルコースからエリスリトールへの転換能力、並びにそのさまざまな環境的、および生理的試験に基づいて同定される。ここで用いられる、「グルコースからエリスリトールへの転換率」は、産生されるエリスリトールと消費されるグルコース量によって決定される。その結果として得られた割合は、百分率によって示される。菌株によるグルコースからエリスリトールへの転換率は、以下の方法によって算出することができる。当該株を、先ず50mlフラスコ内に収容した30%グルコースおよび1%酵母抽出液を含む10mlのブロース中において、150rpmのロータリーシェーカーにおいて30℃で6日間培養した(初期細胞濃度1. 105細胞/ml)。そして、培地中のエリスリトール濃度、および培地中のグルコース濃度の両方を測定した。1gのグルコースから0.3gのエリスリトールへの転換は、30%の転換率と称する。形態的な特徴は、4%麦芽抽出液、0.5%酵母抽出液アガー中において、20℃で10日間増殖した後に測定される。Yast, A Taxonomic Study, Editorial by Kurtzman et al。、4th Ed., page 765、Elsevier, Amsterdam(1998)を参照されたい。
【００１０】  モニリエラ株の突然変異体は、Ishizuka,et al。(1989) J. Ferment. Bioeng. 68:310-314に記載された方法、またはその変形(U.S. Patent No. 5,036,011参照)の突然変異誘発方法によって得ることができる。N-メチル-Nニトロソグアニジン(NTG)を用いた、モニリエラ細胞における突然変異誘発の一つの変形を以下に説明する。モニリエラ細胞を、30%グルコースおよび1%酵母抽出液を含むブロース中に接種し、30℃のロータリーシェーカー内において150rpmで一晩培養する。この培養液を、10mlの30%グルコースを含むブロース中に1:100で希釈さし、30℃のロータリーシェーカー内において150rpmで一日培養する。培養ブロースを3000rpmで15分間遠心して細胞塊を形成し、上清を捨てる。この細胞塊を、0.1M pH 7.0の滅菌リン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄する。上清を遠心し、上清は再び捨てる。150μg/ml NTGと共に、細胞を10分間PBS中に再懸濁する。
【００１１】  NTG処理後、モニリエラ細胞をグルコース溶解液中で3時間増殖させる。培養液を適切に希釈し、65%グルコースを含む培地中に接種し、30℃で6時間培養する。コロニーをランダムに選択し、30%グルコースを含むブロース中に接種し、150rpmのロータリーシェーカー内において30℃で一晩培養する。この一晩の培養液の1:100希釈液を用いて30%グルコース（10ml）に接種し、150rpmのロータリーシェーカー内において30℃で４日培養する。そして、この培養液の培地を12000rpmで10分間遠心する。上清を適切に希釈し、DNS法(以下参照)を用いてグルコース残量を測定する。高グルコース消費量(いいかえれば、低グルコース残量)の培養液を更に分析して、エリスリトールの産生量を決定する。以下に記載のHPLC法は、エリスリトール産生量を定量するために用いることができる。エリスリトール産生量の増加を示す培養液は、さらなる確認に付される。たとえば、培養のために個々のコロニーを得、上記のように再び増殖し、再度解析する。選択されたコロニーは、これらの工程に従って、突然変異誘発という次の段階により改善されてもよい。
【００１２】  ＜グルコース残量の測定＞
4日間培養後のブロースを回収し、12000rpmを10間遠心する。上清を適切に希釈する。1mlの各希釈溶液を、0.5mlのDNS(ジニトロサリチル酸)試薬に加える。DNS試薬(たとえば、a, 1% 3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)。b. 0.2%フェノール;c. 0.05% NaHSO3または0.025%Na2S2O3; d.1%NaOH;e. 0.5%酒石酸四水素カリウム）は、MIller, G.L.(1958)Anol. Chem.31: 425-428に記載された方法にしたがって調製および使用した。この混合物をよく混合し、100℃で5分間培養する。室温下で冷やした後、9mlの水を加え、540nmの吸光度(OD540nm)を測定する。540nmの吸光度を使用し、さまざまな濃度で純粋なグルコースを測定することによって得られた基準曲線と比較することによって、グルコースの濃度を測定した。
【００１３】  ＜エリスリトール濃度の測定＞
上清中のエリスリトール量をHPLCおよびTLCによって定量して、たとえば当該株のエリスリトール産生能を測定することができる。HPLC解析は、Ion-300クロマトグラフィーカラムを用い、0.1N硫酸を移動相とし、0.4 ml/minの流速および75℃に設定した温度において、ヒューレットパッカードH4033Aアナライザーによって行われた。TLC解析については、Neissnerらの方法に従った(Neissner, et al. 1980. Herstellung, aanalyse und DC-ternnung von fettsaure erythritpartialestern. FETTE SEIFEN ANSTRICHMITTEL. 82:10-16)。Kieselgel 60F254 (Merck)を4%ホウ酸でリンスした後、使用前に、該ゲルをインキュベーターにおいて105℃で20分間加熱する。展開溶液は、エチルメチルケトン:アセトン:水(100:10:10の量)であり、色発生試薬は、KMnO4濃硫酸溶液である。
【００１４】  HPLCまたはTLCによって上清から精製されたエリスリトールを抽出によってさらに精製し、その後、減圧下で乾燥する。該さらに精製された生成物、および基準エリスリトールを、Shindouらの方法にしたがってアセチル化する。エリスリトールは、たとえば、Merk、Germanyから商業的に入手可能である。最終生成物は、再精製された産物が基準標品と一致したかどうか測定するために、GC-MSによって解析することができる。
【００１５】  ＜エリスリトールの大規模製造＞
以下に提供された特殊な例に従って、当業者は、好ましいpH、温度、並びに育成および発酵のための炭素源を同定することによって、モニラエラ突然変異株によるエリスリトール産生量を最適化することができる。同様の解析は、エアレーション、攪拌速度、培養量、および培養時間を最適化するために用いることができる。
【００１６】  大規模にエリスリトールを産生するために、グリセロール中に維持された0.2mlのモニリエラ細胞を500mlフラスコ中の50mlブロースに加え、30℃のロータリーシェーカー内において150rpmで約24時間インキュベートする。この培養液から、2mlを第二の500mlフラスコ内の50mlブロースに接種する。第二の培養液は、150rpmのロータリーシェーカー内において30℃で48時間培養する。この第二の培養液ブロースを、5Lの発酵機(NBS.Edison, New Jersey, USA)内の 2Lのブロースに接種する。培養条件は以下の通りである。エアレーション：1VVM；攪拌速度：500rpm；温度：30℃；培養期間：5-7日。
【００１７】これらの目的では、ブロースには、30%、35%、40%、45%、50%グルコースと共に、1%酵母抽出液を含んでいてよい。加えて、消泡剤としてKM72およびKM72F (ShinEtsu, Shin-Etsu Chemocal Co., Ltd.6-1, Ohtemachi 2-Tyoume, Chiyodaku, tokyo, Japan)が用いることができる。
【００１８】  ＜エリスリトールの精製＞
発酵機からの培地を延伸して、細胞塊から培養上清を分離する。上清は、活性炭(たとえば、地域の供給者から選られるものとして、粉末炭)上にまくことによって脱色される。脱色された上清を、陽イオン交換樹脂、DAISON, WA30 (Mitubishi)および陰イオン交換樹脂、AMBERLITE IR120NA (Rohm and Company) 上を連続通過させることにより、脱塩及び脱タンパクする。選られた溶液を、次の器具によって濃縮される：EYELA Rotary Vacuum Evapolator N-N Series; EYELA Waterbath SB-450; およびEYELA, Aspirator A-3(Tokyo Rikakiki Co. LTD)。濃縮された溶液を、室温において結晶化させる。任意に、結晶を洗浄し、または水性アルコールおよび水(たとえば4℃において)中でで再結晶化して、痕跡量の不純物を除去する。
【００１９】  ＜エリスリトール純度の確認＞
精製された生成物の化学的同一性を確認するために、精製された生成物のNMRスペクトルを標準品、たとえば、Merck Co.(NJ,USA)または他の商業的供給業者から購入したエリスリトールのNMRスペクトルと比較する。サンプルを、100% D2Oに溶解し、NMRスペクトロメーター(BrukerAM-500, Germany)上に置く。次の条件を、1HNMRスペクトルについて用いる： 400.135 MHz;パルス長：4.0μs；取り込時間：1.245秒；パルスディレイ：1秒；化学シフト： D2Oを0 ppmとした。次の条件は、13C NMRスペクトルに用いられた：100.536 MHz;パルス長：5.0μs；取り込時間：0.623秒；パルスディレイ：2 秒；化学シフト：10mM DSSを0 ppmとした。当業者は、次の特定の例の手引きに基づき、本発明の突然変異菌を得てエリスリトールを製造し、広範囲にそれを使用できるが、以下の例は単に説明のためのものであって、本発明の範囲を限定しない。ここで引用されたすべての刊行物は、その全体が本明細書の一部として援用される。
【実施例】
【００２０】
【実施例】
＜モニリエラ突然変異体の単離＞
エリスリトール産生菌のモニリエラPTA-1230に対して、上記の方法により、NGTを用いて突然変異を誘発させた。一つの段階で単離された改変エリスリトール産生菌を次の段階のための親株として使用するようにして、工程を繰り返した。N61188-12突然変異株（ATCC寄託番号PTA-2862）は6段階の突然変異誘発を行った後に単離された。
【００２１】  N61188-12突然変異株、および親株のPTA-1230を、35%グルコースおよび1%酵母抽出液を含むブロース中において、25℃、30℃、34℃、および150rpmのロータリーシェーカー内において37℃で6日間培養した。【００２２】これらの各温度において、グルコースからエリスリトールへの転換率は、それぞれN61188-12突然変異株では43.9%、61.4%、17.8%、および2.2%であり、また親株のPTA-1230においては18,9%、30.5%、17.9%、および7.7%であった。25℃および30℃において、N61188-12突然変異株のエリスリトール産生量は、少なくともPTA-1230の場合の二倍は多かった。N61188-12突然変異株で観測された61.4%の産生量は、予想外であったが、それは、グルコースからエリスリトールへの完全な変換における理論値の上限値である68%にかなり近く目立ったためである。【００２３】  確認の目的で、上記の方法を用いたN61188-12突然変異株の発酵培養液から、純粋なエリスリトールを得た。N61188-12から得られた純粋なエリスリトールを、上記の核磁気共鳴によって解析した。そのスペクトルは、基準エリスリトールのスペクトルと同一であったので、回収、精製および結晶化された生成物は本物のエリスリトールであることが示された。【００２４】  ＜エリスリトール産生条件の最適化＞
エリスリトール産生量を、pH、温度(上記参照)および炭素源を変化させた条件下において、親株PTA-1230およびN61188-12株においてを同時に測定した。【００２５】  PH：
親株PTA-1230およびN61188-12株を、さまざまなpHに調節された、35%グルコースおよび1%酵母抽出液を含むブロース中において、150rpmのロータリーシェーカーを用いて30℃で6日間培養した。3.0、4.0、5.0、6.0、および7.0のｐHにおいて、PTA-1230のエリスリトールの産生量は、それぞれ31.2%、39.3%、38.4%、34.4%、および34.2%であったが、N61188-12株のエリスリトール産生量は、それぞれ56.6%、59.4%、58.5%、60.3%、および57.3%であった。【００２６】  グルコース濃度：
20%、30%、35%、40%、および50%グルコースと共に1%酵母抽出液を含む培養ブロースを調製した。PTA-1230およびN61188-12株の両者を、上記ブロース中において、150rpmのロータリーシェーカーを用いて30℃で6日間培養した。これらの各グルコース濃度において、PTA-1230のエリスリトールの産生量は、それぞれ40.6%、37.1%、34.5%、29.4%、および19.2%であったが、N61188-12株のエリスリトール産生量は、それぞれ56.6%、57.5%、62.8%、55.6%および35.8%であった(表10)。PTA-1230株における最適な産生量は、20%グルコース溶液のときであり、グルコース濃度が増加すると産生量は減少した。【００２７】N61188-12株における最適な産生量は、35%グルコースブロースのときであった。その他のグルコース濃度、たとえば20%、30%、および40%グルコース溶液の場合に得られた産生量は相互に似ているが、50%グルコース溶液から得られたものは、35.8%に減少した。高グルコース濃度、たとえば、４０％および50%の場合、N61188-12株におけるエリスリトール産生量は、PTA-1230株のほぼ二倍であった。これらの結果は、野生型PTA-1230株と比較して、N61188-12株のエリスリトール産生能力が予想外に改善されたことを示す。【００２８】  炭素源：
35％のグルコース、マルトデキストリン、マルトース、ショ糖、フルクトース、またはラクトースのいずれか、および窒素源として1%酵母抽出液を含む培養ブロースを調製した。PTA-1230およびN61188-12株の両者は、上記ブロース中において、150rpmロータリーシェーカーを用いて30℃で6日間培養した。グルコース、マルトデキストリン、マルトース、ショ糖、フルクトース、またはラクトースのそれぞれにおいて、PTA-1230株は、120.8、44.5、0、154.0、111.0、および0g/Lのエリスリトールを産生したが、N61188-12株は、220.0、15.1、22.8、239.4、211.4、および0g/Lを産生した。これらの結果は、どちらの菌株においても、ショ糖が最高の効率を持ち、次にグルコース、そしてフルクトースであることを示した。注目すべきは、PTA-1230株は、マルトースおよびラクトースを利用してエリスリトールを産生できないが、N61188-12株は、エリスリトールを産生するためにマルトースを利用できるが、ラクトースは利用できないことである。PTA-1230株において、炭素源としてショ糖を用いた場合のエリスリトール産生量は、グルコースを用いた場合よりも27.5％高かったが、PTA-1230株では、同条件下において9％だけしか高くなかった。【００２９】  副産物の蓄積：
前記の炭素源において、代謝副産物であるグリセロール、ペンチトール、およびアルコールの濃度をモニターした。たとえば、グルコースを炭素源として用いた場合、PTA-1230株の培養ブロース中のグリセロール、およびペンチトールの濃度はそれぞれ35.4および17.2g/Lであったのに対して、N61188-12株の培養ブロース中においては、グリセロールは存在せず、ペンチトールの含量は3.8g/Lであった。その他の炭素源における結果は、表1に記されている。【００３０】炭素源としてグルコースを用いたPTA-1230株の発酵の間に、アルコールは産生されなかった。しかし、その他の炭素源においては、PTA-1230株およびN61188-12株の両者とも、植え付け後5日間でアルコールを産生した。しかし、6日目には、アルコールは消費された。唯一の例外は、N61188-12株の培養にフルクトースが用いられた場合であり、6日目においても、いくらかアルコールが残留した(0.7g/L)。総合すると、これらの結果は、N61188-12株の培養においてショ糖の使用した場合には、副産物の蓄積を伴わずに、エリスリトールへの転換能力が高いという結果を示している。【００３１】
【表１】
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各炭素源は35%で存在し；窒素源は1% 酵母抽出液であり；インキュベーションは150rpmで6日間であった。【００３２】  突然変異体N61188-12株のおおまかな特性：
PTA-1230株および突然変異体N61188-12株を、さまざまな条件下で増殖させて比較した。それら細胞の形態は、実質的に同じであった。しかし、プレート上の突然変異体株は、PTA-1230株のわずか4分の1の大きさに増殖しただけであった。注目すべきことに、二つの株は異なった生理学的特性を持っている。これらの差違は、異なった糖を発酵および消化するという菌の能力が反映されている。突然変異体N61188-12株はガラクトースを発酵することができるが(表2)、PTA-1230株はできない。加えて、N61188-12株は、PTA-1230株とは対照的に、エリスリトールおよびマンニトールを消化することができない(表3)。【００３３】
【表２】
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【表３】
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細胞密度：
温度、pH、炭素源、およびグルコース濃度といったさまざまな条件下において、N61188-12株の培養ブロースの濁度(A660)は、PTA-1230株より少ない。全てにおいて(炭素源としてマルトースおよびラクトースを除く)、N61188-12株の培養ブロースの濁度は、PTA-1230株の31％から77％の間であった。ほとんどの場合、N61188-12株の濁度は、PTA-1230株の50％より少なかった。このように、N61188-12株は、細胞の成長に当てられる炭素源の比率を低下させ、その代わりに、より多くの比率の炭素源をエリスリトールに変換させたと推定される。【００３４】  ＜その他の態様＞
本発明の多くの態様を説明してきた。それでもなお、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更をなし得ることが理解されるであろう。したがって、その他の態様も特許請求の範囲内である。