(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
0003681750.tif 000024
から成るフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）由来の43kDエンドグルカナーゼの変異体であって、下記のアミノ酸の変更のいずれか：
（１）8位のTyrのPheへの変更；
（２）62位のTrpのGluへの変更；
（３）147位のTyrのSerへの変更；
（４）158位のArgのGluへの変更；
（５）162位のAlaのProへの変更；
（６）221位のValのSerへの変更、222位のAsnのSerへの変更および223位のGlnのThrへの変更；
（７）252位のArgのPheへの変更；
（８）252位のArgのPheへの変更および280位のTyrのPheへの変更；
（９）280位のTyrのPheへの変更；または
（10）219位のSerおよび235位のThrの欠失；
を有するエンドグルカナーゼ変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のエンドグルカナーゼ変異体をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含んでなるベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のDNAを含んでなる発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程を含んでなる、請求項１に記載のエンドグルカナーゼ変異体の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載のDNAにより形質転換された宿主細胞を培養する工程を含んでなる、請求項１に記載のエンドグルカナーゼ変異体の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のエンドグルカナーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
【請求項９】
前記エンドグルカナーゼ変異体が、洗浄溶液1L当りエンドグルカナーゼ変異体タンパク質0.001〜100mgの濃度に相当する濃度で存在する、請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
粉末組成物である、請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
強力粉末組成物である、請求項10に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
コンパクト強力粉末組成物である、請求項11に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
液体組成物である、請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
強力液体組成物である、請求項13に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
コンパクト強力液体組成物である、請求項14に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ・タイプII、オキシダーゼおよびアミラーゼから成る群から選択される１種または複数種の酵素を更に含んで成る、請求項８〜15のいずれか１項に記載の洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、改良された性質を有するセルラーゼ変異体に関する。
発明の背景
セルロースを分解できる酵素（以下、「セルロース分解酵素」又は「セルラーゼ」と言う）は、セルロースの非晶質部を除去するため製紙用パルプの加工において使用でき、従ってパルプ中の結晶質セルロースの割合を増加させ、そしてグルカンの消化能を改善するため動物飼料中で用いられる。セルロース分解酵素の更に重要な使用は、繊維処理のため、例えば綿含有布帛の手粗さを軽減するため（注、例えば英国特許1368 599又は米国特許4,435,307）、土壌の除去および布帛の色彩明澄化のため（注、例えばヨーロッパ特許220 016）又は布帛に「ストーン−ウオッシット（Stone−Washed）」、外観を与えるため色彩に局存化変化を与えるため（注、例えば、ヨーロッパ特許307 564）である。
セルロース分解酵素の実際的利用は、或る程度、公知のセルラーゼ調製品の性質により妨げられてきたが、その調製品はしばしば多様の単一セルラーゼ成分の複合体混合物であり、そして相当に低い特異的活性を有し得る。多様な酵素系において単一成分の製造を最適化することそして従ってセルロース分解酵素を工業的にコスト的に有効に生産することは困難でありそしてそれらの実際の使用は所望の効果を達成するため相当量の酵素を用いる必要性から生じる困難性により妨げられてきた。
これまで示されてきたセルロース分解酵素の欠点は、高い比活性に対して選ばれた単一成分酵素を用いることにより救済できるかもしれない。単一成分セルラーゼは、例えば国際公開（WO）91／17243，WO 91／17244およびWO 91／10732に記載されている。
発明の要約
更に研究を重ね次の知見を得た；すなわちセルラーゼの改善された性質が、そのような改善された性質を示すセルラーゼ変異性を得るため特異的セルラーゼを発現するDNA配列において１種又はそれ以上の特異的突然変異により得ることができる。
従って、本発明はセルロース結合ドメイン（CBD）、触媒的に活性なドメイン（CAD）およびセルロース結合ドメインと触媒的に活性なドメインを連結する領域（連結領域）を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体に関し、ここにおいて、セルラーゼ変異体の性質を改善するため、CBD，CAD又は連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失されているか、又は１個又は複数のアミノ酸残基により置換されているか、および／または１個又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられているか、および／またはもう一つのCBDが触媒的に活性なドメインの対向末端で加えられている。
本発明のセルラーゼ変異体は、洗剤組成物例えば粉末組成物、液体組成物および強力液体組成物中に通常存在する他の成分との増加せしめられた適合性並びに増加せしめられたアルカリ活性を示す。
更に、本発明のセルラーゼ変異体は、洗剤組成物中で用いられると、粒質土壌除去、色彩明澄化、脱毛羽立ち、脱ピリングおよび手粗さ軽減に関し改善された性質を示しそして本発明のセルラーゼ変異体は、アニオン界面活性剤に対する感受性の減少並びに酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対する感受性の減少を示す。
以下の内容が考えられる；すなわち、本発明のセルラーゼ変異体の改善された性質は、繊維処理のためおよびデニム、特にジーパンの如き布帛の「ストーン−ウオッシュト（stone-washed）」外観を与えるため、例えば製紙用パルプ加工中、および動物飼料中に用いられるとき、セルラーゼ変異体を公知のセルラーゼよりも更により有用にする。
本発明のセルラーゼ変異体の改善された性質は、本発明の種々の面および態様に対し更に以下に説明されるように、連結領域において又はCBDにおいて又はCADにおいてまたはこれらの領域およびドメインの如何なる組合せにおいて親セルラーゼを改善することによって得ることができる。
本発明の一つの面において、セルラーゼ変異体が与えられここにおいて、１個又は複数のアミノ酸残基が連結領域から欠失されているか、又は１個又は複数のアミノ酸が連結領域に加えられているか、又はここにおいてタンパク質分解に対するセルラーゼ変異体の感受性が、プロテアーゼによる加水分解に対し感受性がある該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより、挿入することにより、又はプロテアーゼによる加水分解に対し感受性がある該連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基を、プロテアーゼによる加水分解に抵抗する１個又は複数のアミノ酸残基により置換することによって減少せしめられている。
本発明の他の面において、セルラーゼ変異体が得られ、ここにおいてセルラーゼ変異体の結合特性が次の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質された結合親和力を得ること、
（ｂ）CBDの静電荷を、CBDの１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠失することにより、挿入することにより、又はCBDの１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基により置換させること、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を正に荷電したアミノ酸残基により置換すること、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換すること、又は１個又は複数の中性アミノ酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することに変化させること、
（ｃ）触媒活性ドメインの対向末端でもう一つのCBDを加えること、
（ｄ）１個又は複数のアミノ酸残基をプロリンにより置換すること、
により改質される。
このような改質の目的は、基質に対する酵素の結合親和力を改質することによりセルラーゼ処理布帛の引張り強さに対する好ましい割合の酵素性能をセルラーゼに付与することである。
本発明の更に他の面において触媒活性ドメイン（CAD）を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体が提供され、これは触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト（cleft）、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至る少なくとも１個のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域および所望によりトンネルを形成するため触媒的に活性な部位上で閉じることのできる柔軟な表面ループ領域を含んでなり、ここにおいて基質は開裂され、ここにおいて、好ましくはアルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改質するため該クレフト、チヤンネル又は表面領域の１個又は複数のアミノ酸残基は１個又は複数の他のアミノ酸残基により置換されている。
本発明の更に別の面において触媒活性ドメイン（CAD）を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体が提供され、これは触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至る少なくとも１個のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んでなり、ここにおいて、アニオン界面活性剤（特に線状アルキルスルホネート）に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CADの表面上の１個又は複数の中性アミノ酸残基が、１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基により置換され、又はCADの表面上の１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基が、１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換され、又はここにおいて１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の非−疎水性アミノ酸残基により置換され、又はここにおいて１個又は複数のアミノ酸残基がプロリンで置換されている。
本発明の更に他の面において、CBD、CADおよび連結領域を含んでなる親セルラーゼのセルラーゼ変異体が提供され、ここにおいて、酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CAD、CBD又は連結領域の表面上の１個又は複数のアミノ酸残基が、酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対し感受性のより少ない１個又は複数のアミノ酸残基により置換されている。
本発明は又、本発明のセルラーゼ変異体を含んでなる洗剤組成物に関する。
図面
本発明を更に図面により説明する。
図１は、フミコラ  インソレンス（Humicola insolens）、フサリアム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）およびシュードモナス  フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens)由来のそれぞれ３種の43kDセルラーゼ配列整列を示す。
図２はpCaHj170の構築を示す。
図３は43K遺伝子の部位特異的変異誘発を示す。
図４はpCaHj171の構築を示す。
図５はpCaHj201の構築を示す。
図６はpCaHj416およびpCaHj417の構築を示す。
図７は鋳型としてpCaHj201を用いた変異体の構築を示す。
図８はダイド  アビセル（Dyed Avicel）分析における標準曲線およびサンプル応答を示す。
図９は液体洗剤中の43kD変異体(V221S＋N222S＋Q223T)の貯蔵安定度を示す。
図10はpH7.5でのLAS（線状アルキルスルホネート）阻害を示す。
発明の詳細な開示
本明細書および請求の範囲において、次の略字が用いられる。
アミノ酸
Ａ＝Ala＝アラニン
Ｖ＝Val＝ハツン
Ｌ＝Leu＝ロイシン
Ｉ＝Ile＝イソロイシン
Ｐ＝Pro＝プロリン
Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン
Ｗ＝Trp＝トリプトファン
Ｍ＝Met＝メチオニン
Ｇ＝Gly＝グリシン
Ｓ＝Ser＝セリン
Ｔ＝Thr＝スレオニン
Ｃ＝Cys＝システイン
Ｙ＝Tyr＝チロシン
Ｎ＝Asn＝アスパラギン
Ｑ＝Gln＝グルタミン
Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸
Ｅ＝Glu＝グルタミン酸
Ｋ＝Lys＝リシン
Ｒ＝Arg＝アルギニン
Ｈ＝His＝ヒスチジン
本発明に係るセルラーゼ変異体の記載にあたって、次の命名を用いて参照を容易にする：
原アミノ酸（複数）：位置（複数）：置換アミノ酸（複数）
この命名に従い、例えば221位のセリンをバリンで置換するとV221Sとして示され、同じ位置におけるバリンの欠失はV221＊として示され、そしてスレオニンの如き追加のアミノ酸残基の挿入はV221STの如く示される。
多数の変異は、プラスによって分離され、すなわち：
V221S＋N222S＋Q223T
これらは221，222および223位でセリンおよびスレオニンをそれぞれバリン、アスパラギンおよびグルタミンで置換していることを示す。
本発明において、語句「セルロース結合ドメイン」（以下CBDと略す）は、セルロース基質に対するセルラーゼ変異体の結合を行なわしめることのできるアミノ酸配列（例えば、クラリス，Ｐ.，クローレ，Ｇ．Ｍ．ニルゲス、Ｍ．ジョーンズ，Ｔ．Ａ．，パターソン，Ｇ．，クルス，Ｊ．およびグロネンボルン，Ａ．Ｍ．に記載の如く；Determination of the three-dimensional structure of the C terminal domain of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei.A study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometrydynamical simulated annealing..Biochemistry 28 : 7241-7257，1989）を示すことを意味している。
語句「触媒的に活性なドメイン」（以下において、CADと略す）は、酵素の触媒部位を含有する酵素のコア領域を示すことを意味する（例えば、ギデオン等，Nature（1993）365，p.363-364参照）。
語句、「連結領域」は、CBDを結びつけそしてそれを酵素のCADに結合させる領域を示すことを意図する。これまで確認された連結領域は優先的に親水性でありそして変化していないことを特徴としそして配列に柔軟性を付与する短い繰り返し単位を形成するため幾つかのアミノ酸に富んでいることを特徴とする。連結領域の柔軟構造は、CBDによってセルロース基質に結合する酵素の触媒活性ドメインの作用を促進するものと考えられる。連結領域の例は、Ｎ．Ｒ．ギルケス等、Microbiol.Rev.55，1991，pp303-315に示されている。
語句「結合特性」は、CBDがセルロース基質に結合する親和力、並びにCBDが異なる条件下で結合する方法を示すものと意図される。例えば、CBDは異なるpH値で異って結合し得る。異なる条件下でのこの挙動は、例えば前記の如く静電荷を変化させることにより改質されうる。
語句「もう一つのCBD」は、他のセルラーゼ由来のCBDを含めしめることを意図し；追加のCBDは、「生来の（native）」CBDがＣ末端に位置しているとき、触媒的に活性なドメインのＮ末端に位置することができ、そして逆も又同じである。プロリンによる特異的置換は、酵素の熱的およびプロテアーゼ安定性に影響すると考えられている。
親セルラーゼは好ましくは微生物セルラーゼである。そのようなものとして、セルラーゼは細菌セルラーゼ、例えばシュードモナスセルラーゼ又はバシラス、例えば米国特許4,822,516米国特許5,045,464又はヨーロッパ特許468 464に記載のバシラス株、又はＢ．ラウタス（lautus）(注WO 91／10732)セルラーゼから選択することができる。より好ましくは、親セルラーゼは菌類セルラーゼ、特にフミコラ、トリコデルマ、イルペックス、アスペルギルス、ペニシリウム、マイセリロフトラ又はフサアムセルラーゼであってよい。適当な親セルラーゼの例は、例えばWO 91／17244に記載されている。適当なトリコデルマセルラーゼの例は、Ｔ．Ｔ．テリー，Gene 51,1987，pp43-52に記載されたセルラーゼである。好ましくは、親セルラーゼは科45に分類される酵素、ヘンリサット，Ｂ等，Biochem.j.，293，p.781-788に記載される如く、例えば酵素EG B（シュードモナスフルオレセンス）およびEGV（フミコラ・インソレンス）から選ばれる。
特に好ましいセルラーゼは、フミコラインソレンス株から由来するセルラーゼであり、例えばＨ．インソレンスエンドグルカナーゼ、特にWO 91／17243に記載の如くＨ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又はその相同体である。
本発明において、語句「相同体」は、セルラーゼのアミノ酸配列が43kDエンドグルカナーゼに少なくとも45％の同一性である該セルラーゼ、又は両者がＨ．インソレンス（insolense）由来の43kDエンドグルカナーゼと同じ全体的三次元（３Ｄ）折りたたみを有しそして触媒内に含まれそして活性部位クレフト内に配置された２個の酸残基および所望により触媒内に含まれそして活性部位クレフトに面する柔軟性ループ内に配置されたセルラーゼを示すことを意図する。
配列の比較は、公知のアルゴリズム、例えばリパーアンおよびピアソン，Scilnce 227，1985，p.1435に記載のものによって行うことができる。
タンパク質の骨格は、構造分析および相同タンパク質の整列によって柔軟性および構造的に保護された領域に分割することができる。柔軟性領域（FR）は折りたたみタンパク質部分でありそしてそこは骨格のコンホメーシヨンは、進展中に変化しそうである。保護領域（SCR）は折りたたみタンパク質の一部であり、そこは骨格のコンホメーシヨンは非常に未変化のままであろう。すなわち同じ折りたたみを有する他のタンパク質において保護されることが期待される。加えてSCRは特異的に公知の触媒の、又は重要な他の残基である。
タンパク質Ａは、もしも次の条件の一つが満たされる場合、タンパク質Ｂと同じ全体的折りたたみを有するものと定義される：
１．Ａの３Ｄ構造が、４Å以下、好ましくは３Å以下、より好ましくは２Å以下のルート平均２乗差を有するＢに定義されたSCRsと重なる。ルート平均２乗は、Ｂに対して定義されたSCRs中の全数の残基によって割られたSCRsにより同等化した残基間のオイグルジアン（Euclidididn）距離として算出される。
２．アミノ酸配列はＢの折りたたみを定義するSCRsと両方する。両立性を測定するため、Wodak，S.J．等：Curr.Opin.Struct.Biol.1993，3，p.247-249に記載された反対の折りたたみの問題およびそこに記載されている文献が用いられている。
相同体の例は、Ｈ．Ｊ．ギルベルト等、同上により記載されたシュードモナスフルオレセンスセルラーゼ、およびWO／91 17243に記載されたフサリアムオキシスポラムセルラーゼであり、３種のセルラーゼの配列整列を示す添付された図１を参照のこと。
本発明において、語句「伸びたクレフト」は、活性部位に接近しやすいβー１，４−グルカンポリマー基質の少なくとも３個のグルコース単位を許容する寸法を有するクレフトを言及する。本発明で用いられる語句の改善された理解のため、１つの特異的親セルラーゼを参照のこと、この触媒活性ドメインは上記の全体的トポロージーを有し、すなわち、以下においてWO 91／17243中に記載されているセルラーゼはEG V（エンドグルカナーゼＶ）と呼ばれる。本発明はいかなる場合もこの特定のセルラーゼの変異体に制限されないことは理解されるべきである。
これらの結晶構造は、Ｘ−線結晶学によりEG Vに対して解決されている。三種の構造は天然酵素（ギデオン等；Nature(1993)365，p362-364）を記載し、この天然酵素はセロビロース（ゼギデン等、同上）と複合体化しそして活性部位変異体DIONは２個のセロトリオース単位（ギデン等、私信）から成る生成物と複合体化する。
酵素の全体的コンホメーシヨンは柔軟性表面ループを除いて全ての３種の構造において同じであり、そしてそのループは天然構造において見につかず、セルロビオースを有する構造中に開口位置においておよびセロトリオース生成物を有する構造中に閉じた位置において固定されている。
EG Vにおいてクレフトは、約30Åの長と、約９Åの幅および約７Åの深さを有する。クレフトの寸法はβ−１，４−グルカンの７個のグルコース単位の結合を許容するのに十分である。これらの部位は、ラベルされたＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇであり、裂け目が部位ＤおよびＥ間において生じる。以下の表１において、異なる部位Ａ−Ｇでグルコース単位と相互作用するEG V中の原子が定義される。EVの裂け目パターンの分析は、部位Ｃ−Ｆに対する結合が触媒にとって必要であること並びに他の部位への結合が触媒を高めることを示した。セロトリオース生成物に関する構造において、生成物の一つは部位Ａ−Ｃに結合しそして他の生成物は部位Ｅ−Ｇに結合しており、部位Ｇは弱く結合した部位でありそして十分には定義されていない。部位Ｄでのグルコース単位をわずかに立体の重なりを有するように設計することは可能である。酵素が触媒中位置Ｄでグルコース単位の普通のコンホメーシヨンをゆがめることが企図される。
基質が結合していないとき、活性部位クレフトはその中のグルカンポリマーのドツキング（docking）を許容する表面で開口する。柔軟性表面ループ領域をドツキング中、残基111-119は、コンホメーシヨンを変化させ、Leu115は暴露された溶剤から埋められた位置まで約１３Å動き、その結果部位ＤとＥ間の裂け目でトンネル内のグルカンポリマーを閉じる。
活性部位は２個のアスパラギン酸、Asp10およびAsp121を含んでなる。
機械的研究および結晶構造は、EG Vが触媒中一般塩素として機能するAsp10を有する転化酵素である理論を支持する。加えて、Asp14およびHis119は触媒に対し重要であることが見出された。Asp114は部位Ｄでグルコース単位の結合をもたらしそしてIle131共にそれはグルコースポリマーを閉じそしてクレフトをトンネルに向ける。トンネルの目的はAsp121の周囲から水を追い出しそしてこれによりAsp121のプロトン化された酵素を安定化させる。次の内容が見出された；すなわち、His119はThr6を通ってAsp121の他の酸素までの水素結合網目中に含まれる。この水素結合網目は又、Asp121のプロトン化形の安定化を助け得る。His119が正に荷電すると、他の近くの正に荷電した表面残基と共に、それは活性部位が負に荷電しているのでAsp121を超える強い静電場を誘発する。グルカンポリマーを用いると、この場は分極をひきおこしそしてこれによりグルコース単位間の裂け目（cleavage）を促進する。
同様の静電場はリゾチーム中の対応する活性酸上に見出される。
表面からクレフトに至る「チヤンネル」（この特定の場合、２個のそのようなチヤンネルがある）は、グルカンポリマーの加水分解に対しAsp10に対し水を供給すると信じられている。加えて、チヤンネルは基質のドツキング中該クレフトから水を追い出す手段として用いられ得る。
0003681750.tif 000002
0003681750.tif 000003
0003681750.tif 000004
表１において、原子の命名のための標準PD13表示法（バースタイン等、（1977）：Insightll, Biosym Technulogies Inc.）が用いられる。水素が強く結合せしめられている水素に注目のこと、何故なら水素は構造中に存在しないからである。分析は、部位Ａ−Ｃおよび部位Ｅ−Ｇでセロトリオース結合を有する構造に基づいている。結合に関与する構造中に存在する水分子は、明白に（HOHとして）参照される。距離は、オングストローム単位である。
表１の参照記号において、「PI−相互作用」は二つの芳香族環の間の相互作用を示し；「水を通して」は構造中に水が存在しない場合を示すが、しかし基質との相互作用は水分子を通して生起し得る；「可能な」は原子が他の結合形式で基質と相互作用をし得ることを示し；「立体の」はそれよりも他の明白な相互作用がないことを示し；「触媒の」は触媒的残基を示す。
本発明によれば、セルラーゼ変異体は、好ましくは連結領域の１個又は複数のアミノ酸が、細胞中変異体の発現の際Ｏ−グリコシル化に対する部位を与える１個又は複数のアミノ酸残基により置換されたものである；何故なら、Ｏ−グリコシル化アミノ酸残基でタンパク質分解開裂は、存在する炭水化物基のために立体的に障害される。特に、バリン、リシン、アスパラギン又はグルタミンは、セリン又はスレオニンによって置換され得る。択一的に連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基は、（洗剤の存在中に含められる）プロテアーゼによる加水分解に抵抗するプロリンによって置換され得る。
この態様において、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く
V221S，T，P
N222S，T，P
Q223S，T，P
V240S，T，P
Q241S，T，P
置換される。
また、１種又はそれ以上の置換基を次の如く
V221S＋N222S＋Q223T
V240S＋Q241T
置換することが好都合である。
更に、所望の効果を達成するため、連結領域の１個又は複数のアミノ酸残基、特にVal，Gln，Lys又はAsn又は特にこれらのアミノ酸の１種又はそれ以上を含有する配列が欠失されていてよい。
そのような修飾の目的は、基質に対する酵素の結合親和力を改質することにより、セルラーゼ処理布帛の引張り強度に対する酵素性能の好ましい割合をセルラーゼに与えることである。セルラーゼ変異体のセルロース基質、例えば布帛に対する減少せしめられた結合を得るため、連結領域はそのアミノ酸残基の半分まで欠失されてよい。セルロース基質、例えば布帛、に対するセルラーゼ変異体の増加せしめられた結合を得るため、１種又はそれ以上のアミノ酸残基が連結領域に加えられてもよい。これらの追加のアミノ酸（１種又は複数）の少なくとも１種は、好都合にはプロリンであってよい。
次のように理解すべきである；すなわち、本発明のセルラーゼドメインは、前記の如き連結領域を前記の如きセルロース結合ドメインおよび／又は、連結領域を与える親セルラーゼとは異なる親セルラーゼ由来の触媒活性ドメインと結合させることによって得ることもできる。
本発明によれば、好ましいセルラーゼは、セルラーゼ結合特性が次の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）セルロース結合に関与する１個又は複数のアミノ酸残基を置換して改質された結合親和力を得ること、
（ｂ）CBDの静電荷を、CBDの１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を欠失することにより、挿入することにより、又はCBDの１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基を中性又は正に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は中性又は正に荷電したアミノ酸残基を正に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を、中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の中性アミノ酸残基を負に荷電したアミノ酸残基により置換することによって変化させること；
（ｃ）触媒的に活性なドメインの対向末端でもう一つのCBDを加えること、又は
（ｄ）１個又は複数のアミノ酸をプロリンによって置換することによって改質されたセルラーゼである。
本発明の好ましい態様において、CBDの１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換される；
E251S，Q，N，P
R252L，Q，H
V268E
A269E，R
T265R，E
W253Y，F
A254S，D，G
Q255E，R，K
W261R，Y，F
S262A，N，D
T274R
K275R，Q
I276D，Q，N
N277Q，D
D278P
W279Y，F
Y280W，F
H281S
Q282N，R
Y280F＋Q282N。
触媒的に活性なドメインの対向末端でCBDが加えられたセルラーゼ変異体を含んでなる態様において、追加のCBDは次の文献中に記載されるセルラーゼの１種から例えば由来できる；WO 91／10732又はWO 91／17244、又はペンチラ、Ｍ．Ｅ．，レトバラ，Ｐ．，ネバライネン，Ｈ．，ビクハビハリ，Ｒ．およびクノーレス，Ｊ．Homologybetween cellulase genes of Trichoderma reesei : completenucleotide sequence of the endoglucanase I gene..Gene45 : 253-263, 1986；又はサロヘモ，Ｍ．，レトバラ，Ｐ．，ベントラ，Ｍ．Ｅ．，テリー，Ｔ．Ｔ．，スクルベルク，Ｊ．，ヤンソン，Ｇ．，ペターソン，Ｇ．，クラセンス，Ｍ．およびトミー，Ｐ．EG III, a new endoglucanase from Trichoderma reesei. the characterization of both gene and enzyme,,Gene 63 : 11-23, 1988；又はテリー，Ｔ．Ｔ．，レトバラ，Ｐ．，クピネン，Ｓ．，サロブリ，Ｉ．およびクルス，Ｊ．Homologous domains in Trichoderma reesei cellulolytic enzymes : gene sequence and expression of Cellobiohydrolase II..Gene 51 : 43-52, 1987；又はシム，Ｐ．，ジェームス，Ｃ．およびブロダ，Ｐ．The identification, molecular cloning and characterization of a gene from Phanerochaete chrysosporium that shows strong homology to the exocellobiohydrolase i gene from Trichoderma reesei..Gene 74 : 411-422, 1988；又はDeオリベラ  アルベド，Ｍ．andラドフォード，Ａ．Sequence of CBH I of Humicola grisea var.thermoider..Nucleic Acid Research 18 : 668, 1990；orラグズ，Ｓ．，ヤグエ，Ｅ．，ウッド，Ｄ．Ａ．およびターソン，Ｃ．Ｆ．Isolation and Characterization of a Cellulose-Growth-Specific Gene from Agaricus-Bisporus.Gene.119 : 183-190, 1992：又はコッホ，Ａ．およびシュルツ，Ｇ．Cloning, sequencing, and heterologous expression of a cellulase-encoding cdna (CBH1) from penicilliumjanthinellum.Gene.124 : 57-65 1993。
本発明によれば、次のものが好ましいセルラーゼ変異体であり、ここにおいて、セルラーゼ変異体の酵素活性を改質するため、触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト（creft）、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１個のチヤンネルおよび活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んでなる触媒活性ドメイン（CAD）の１個又は複数のアミノ酸残基が欠失され、又は１個又は複数の他のアミノ酸により置換されている。
他の好ましい態様において、アルカリ条件下でセルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位の近くの静電荷は、該クレフトの１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基を、１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の中性アミノ酸残基を１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基により置換することにより、又は１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基をより負に荷電した（１又は複数の）アミノ酸残基により変化され得る。
更に他の好ましい態様において、次のセルラーゼ変異体が好ましく、ここにおいて触媒的に活性なドメインは、柔軟性表面ループ領域を更に与えられる。アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、該ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基又は活性部位のアミノ酸残基に対する水素結合網目内に含まれる１個又は複数のアミノ酸が、該水素結合網目を改質するように１個又は複数のアミノ酸残基により置換される。
アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性は又、ループの柔軟性に対し変化するように柔軟性ループ領域の１個又は複数のアミノ酸残基を１個又は複数のアミノ酸残基により置換することにより、すなわち活性部位のアミノ酸残基に対する水素結合網目に関与すべきループの能力を保護することによっても改善できる。
また、アルカリ条件下、セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、活性部位クレフトの表面の１個又は複数のアミノ酸残基は、基質と相互作用するための表面の能力を改質するように、１個又は複数のアミノ酸に残基によって置換される。
更に、アルカリ条件下でのセルラーゼ変異体の酵素活性は，活性部位クレフトに至るチヤンネルの表面の１個又はそれ以上のアミノ酸残基を、チヤンネル内を通る水の流れを改質するように１個又は複数のアミノ酸残基により置換することによって改善され得る。
更に好ましい態様において、次のセルラーゼが好ましい、ここにおいて、アルカリ条件下セルラーゼ変異体の酵素活性を改善するため、正に荷電した領域の１個又は複数の中性又は負に荷電したアミノ酸残基が、領域の正の正味の荷電を増加させるため１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基によって置換される。
以下に示す領域Ｉ−Ｘは、43kDエンドグルカナーゼ配列中の次の位置に対応する。
0003681750.tif 000005
変異体H.インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラーゼの一つの態様において、該クレフト、チヤンネル（１個又は複数）および／又はループの表面コンホメーシヨン、上記の領域I−VII又はIX−Xの１種又は複数における、又は位置28，37，又は90の一種又は複数における１種又は複数のアミノ酸残基を置換することによって改質され得る。
より特異的には、該クレフトの表面コンホメーシヨンは、43kDエンドグルカナーゼの位置4，5，6，7，8，10，25 11，12，13，15，18，20，21，44，45，48，74，110，114，117，119，121，128，131，132，147，176，178or179の１種又は複数において、１種又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化され得る。相同性セルラーゼの対応する位置におけるアミノ酸残基も同様に置換され得ることが期待される。
他の態様において、表面コンホメーシヨンおよび／又はループ領域の水素結合特性は前記の領域VII中の１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し得る。より詳しくは、該ループ領域の表面コンホメーシヨンは、位置111，112，113，114，115，116，117，118又は119中の１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し得る。相同性セルラーゼの対応する位置内の複数のアミノ酸残基は同様に置換されることが期待される。
別の面において、該チヤンネル（１個又は複数）の表面コンホメーシヨンは、領域Ｉ，III，Ｖ又はVII−IXの１個又は複数において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し得る。より詳しくは、該チヤンネルの（１個又は複数）表面コンホメーシヨンは、位置9，14，28，37，55，58，59，60，63，72，78，109，118，123，129，131，132，133，136，142，145，146，158，163，176，179，186又は196の１個又は複数において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し得る。相同性セルラーゼの対応する位置におけるアミノ酸残基も同様に置換されることが期待される。
更に別の態様において、正荷電表面領域の正の静電荷は、領域IV，Ｖ又はＸの１個又は複数において、又は位置２において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化されうる。より特異的には、正の静電荷は、位置2，13，20，44，65，66，67，90，20 95，96，97，98，100，102，103，175，176，178，179，180，183又は185において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化され得る。相同性セルラーゼの対応する位置においてアミノ酸残基は同様に置換され得ることが期待される。
更に他の態様において、該クレフトの負静電荷は、位置55，74，90又は123の１個は複数において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することによって変化し得る。相同性セルラーゼの対応する位置におけるアミノ酸残基が同様に置換され得る。相同性セルラーゼの対応する位置においてアミノ酸残基は同様に置換され得ることが期待される。
より特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換される：
D2N
S5A
T6S
Y8F
W9S，G
D10E
K13R
S15N，A，D
W18H
K20R
V28T
R37N，S，A
K44R
S45N，D
E48D，Q，A
S55E，D
D58N，S，A
Q59S，A，G
N65R
D66R，N
D67R，N
A74S，D，N
Y90F
S96R
A100R
K102R
K103R
S11ON，A，D
T111G，A，S
G112A
G113A
L115I，V，F，H，T，N，Q，G
G116A
S117G，A，D，E，N，Q
N118G，A，S，D，R
H119Q，K
N123D，E，Y
K175R
N179D，H，A
S185R，K
C11A＋C135A
C12A＋C47A
R37N＋D58A
本発明は又、セルラーゼ変異体に関し、ここにおいてアニオン界面活性剤に対応するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CADの表面上の１個又は複数の中性アミノ酸残基が、１個又は複数の負に荷電したアミノ酸残基により置換されるか、又はCADの表面上の１個又は複数の正に荷電したアミノ酸残基が１個又は複数の中性の又は負に荷電したアミノ酸残基により置換されるか、又はここにおいて１個又は複数の疎水性アミノ酸残基が１個又は複数の非−疎水性アミノ酸残基より置換されるか、又はここにおいて１個又は複数のアミノ酸残基がプロリンにより置換され、CADが触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト、セルラーゼ分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分解のため該クレフトに水を供給する少なくとも１つのチヤンネル、および活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くの正電荷表面領域を含んでなる。
アニオン界面活性剤（特に線状アルキルスルホネート）は、セルラーゼ活性を阻害し得ることが見出された。今日次のように考えられている；すなわち、そのような阻害は、セルラーゼ分子表面上で正に荷電したアミノ酸残基に結合する界面活性剤の負に荷電した頭部並びにセルラーゼ分子の表面上で疎水性アミノ酸残基に結合する界面活性剤の疎水性尾部により引き起こされる。この結合パターンはタンパク質の局所的未折りたたみの原因となり従って活性を損失すると考えられる。前記の如く、アニオン界面活性剤によるセルラーゼの阻害は、タンパク表面上の中性又は正に荷電した残基を、負に電荷したアミノ酸残基により置換することにより、又はタンパク質表面の疎水性アミノ酸残基を親水性残基で置換することにより矯正できる。しかし、活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くの表面領域内で正に荷電したアミノ酸残基を置換することは今日余り適当でないと考えられている。何故ならこのことはCADの静電位に対し不都合な作用をもたらし得るからである。更に、プロリンによる置換は骨格の剛性を増加させることによって酵素を安定化させる。
変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラーゼの一態様において、該親タンパク質の表面コンホメーシヨンは、前記の領域VIII−Ｘの１個又は複数領域において又は相同性セルラーゼはそれに対応する領域において、又は位置37，62，63，78，118，158，163，179，186又は196において、１個又は複数のアミノ酸基により置換することによって改質される得る。
この態様において、１個又はそれ以上のアミノ酸残基は位置37，62，63，78，118，129，131，133，136，142，146，158，163，175，176，179，186又は196の１個又は複数において置換され得る。
更に特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換され得る。
R37N，S，A
W62E，F
A63D，T，R
A78D
N118D
V129D，T，S
I131L，V，T，N，Q，H，G
D133Q
T136D
L142D，T，S
R146E，Q，S
R158D
L163N
N176D
N179D
N186D
R196D。
択一的に、１個又は複数のアミノ酸は次の如く置換され得る。
A78P
A162P
K175G，S
本発明は又、セルラーゼ変異体に関し、ここにおいて酸化又は漂白剤の存在に対するセルラーゼ変異体の感受性を減少させるため、CAD，CBD又は連結領域の表面上の１個又は複数のアミノ酸残基を、酸化又はペルオキシダーゼ漂白系の存在に対し感受性がより少ない１個又は複数のアミノ酸によって置換され；CADは触媒的に活性な部位を含有する伸びたクレフト、セルロース分子の表面から該クレフトに至りそして活性部位でセルロースの加水分解に対し該クレフトに水を供給する少なくとも１つのチヤンネル、該活性部位の少なくとも１個のアミノ酸残基の近くで正に荷電した表面領域を含んでなる。
本発明によれば、以下の内容が見出された；すなわち一定のアミノ酸、例えばメチオニンは例えばハイポクロライトによる酸化に感受性であり、一方他のもの、例えばトリプトファン又はチロシンは漂白剤、例えばペルオキシダーゼ系の存在に感受性であり、酵素の不活性化をもたらす。本発明において、語句「ペルオキシダーゼ系」はペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼに対する基質および漂白促進剤（例えばWO 89／19813又はWO 91／05839に記載される如く）を含んでなる漂白系を示すことを意図する。更に以下の内容が見出された；すなわちこの問題はより少ない感受性のアミノ酸残基、例えばセリン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸又はグリシンによって適当に置換することにより軽減できる。
変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼ又は相同性セルラーゼの一つの態様において、酵素の表面コンホメーシヨンは、前記領域IX又はＸの１個又は複数において、又は位置62又は104の１個又は複数において１個又は複数のアミノ酸残基を置換することにより改質され得る。
変異体Ｈ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼの一つの態様において、１個又は複数のアミノ酸残基は8，9，18，62，104，147又は175において置換され得る。
より特異的には、１個又は複数のアミノ酸残基は次の如く置換される。
Y8F
W9F，H，S，A
W18H，F，A
W62F，E
M104S，N，Q
Y147F，H，S，Q，N，E，D。
本発明のセルラーゼ変異体の製造方法
遺伝子に突然変異を導入するための幾つかの方法は、当業者に公知である。セルラーゼをエンコードするDNA配列をクローニングすることについて簡単に論議した後、セルラーゼをエンコードする配列内の特異的部位で突然変異を発生させる方法が議論されるであろう。
セルラーゼをエンコードするDNA配列のクローニング
親セルラーゼをエンコードするDNA配列を、当業者に周知の種々の方法により対象のセルラーゼを生産する微生物又は任意の細胞から単離できる。第一にゲノムDNAおよび／又はcDNAライブラリーは染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用い研究されるべきセルラーゼを生産する生物から構築されるべきである。次いで、もしもセルラーゼのアミノ酸配列が公知であると、相同性の、標識したオリゴヌクレオチドプローブは合成されそして細菌DNAのゲノムライブラリーから、又は菌類cDNAライブラリーからセルラーゼをエンコードするクローンを同定するために用いられる。択一的に、細菌又は菌類の他の株由来のセルラーゼに相同性の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブは、より低い厳重さの洗浄条件およびハイブリッド形成を用い、セルラーゼをエンコードするクローンを同定するためプローブとして用いることができる。
セルラーゼ−生産クローンを同定するための他の方法は、ゲノムDNAの断片を発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られたゲノムDNAライブラリーを用いセルラーゼ−ネガチブ細菌を形質転換し、次いで形質転換した細菌をセルラーゼに対する基質を含有する寒天上でプレート培養することを含む。セルラーゼ−含有プラスミドを含むこれらの細菌は、分泌されたセルラーゼによる基質の消化により、澄んだ寒天のハローにより囲まれたコロニーを形成するであろう。
択一的に、酵素をコードするDNA配列は確立された方法、例えばＳ．Ｌ．ベカージーおよびＭ．Ｈ．カルテルスにより記載されるホスホアミダイト法、Teteraheron Letters 22，1981，pp．1859-1869,又はマテス等に記載された方法、The EMBO J．3，1984，pp801-805により合成的に製造できる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドが例えば自動DNA合成器中で合成され、精製され、アニールされ、結合されそして適当なベクター中でクローン化される。
最後にDNA配列は合成の、ゲノム又はcDNA源（適当なものとして）の断片を結合することにより作成された、混合されたゲノムおよび合成、混合された合成およびcDNA又は混合されたゲノムおよびcDNA又はcDNA源から作られることができ、断片は標準技術に従って全DNA配列の種々の部分に相当する。DNA配列は、又例えば米国特許4,683,202又はＲ．Ｋサイキ等、Science 239，1988，pp.487-491に記載される如く特異的プライマーを用いポリメラーゼ鎖反応（PCR）によっても製造できる。
セルラーゼをエンコードする配列の部位特異的変異誘発
一度、セルラーゼをエンコードするDNA配列を単離し、そして突然変異のための望ましい部位が同定されたら、突然変異は合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位の側面にあるヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特異的方法において、セルラーゼをエンコードする配列を橋かけするDNAの一本鎖ギャップをセルラーゼ遺伝子を有するするベクター中で作る。次いで、所望の突然変異を有する合成ヌクレオチドを、一本鎖DNAの相同部分にアニールする。次いで残りのギャップをDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて充てんしそして構築体をT4リガーゼを用いて連結する。この方法の特異的例は、モリナガ等（1984，Biotechnology 2 : 646-639）に記載されている。米国特許4,760,025（エステル等による、７月26，1988年発行）はカセットの小変更を行うことにより、多くの突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示しているが、しかしより多種類の突然変異はモリナガ法により任意に１回導入できる；何故なら種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入できるからである。
セルラーゼをコードする配列への突然変異の導入のための他の方法は、ネルソンおよびロング、Analytical Biochemistry，180，1989，147-151に記載されている。その方法は、PCR反応においてプライマーの一つとして化学的に合成されたDNA鎖を用い導入された所望の突然変異を含有するPCR断片の３工程の作成を含む。PCRで作成した断片から、突然変異を有するDNA断片は制限エンドヌクレアーゼを用いて切断することにより単離されそして発現プラスミドに再挿入されてよい。
カレザイム（Carezyme）（Ｈ．インソレンス由来の43kDセルラーゼ）の部位特異的変異誘発に対するシステムの構築
アスペルギルスオリゼ中、フミコラインソレンス〜43kDエンドグルカナーゼ（カルヨゾーメ（karyosome）の発現を可能しなしめるプラスミド（pSX200）は、先の特許PCT／DK91／00123）に記載されていた。カルヨゾーメをコードする遺伝子をpSX320からpUCにサブクローンした（Ｃ．セニチーベロン等（1985）。遺伝子（33，103-119）は図２に記載される如くである。Cla1制限部位を、537位内にサイレント部位特異的突然変異として43K遺伝子中のpCaHj170に導入した。
部位特異的変位誘発は、ネルソンおよびロープのPCR法を用いて行った。（Ｒ．Ｍ．ネルソン，Ｇ．Ｌ．ロング（1989）Anal.Biuchem.180, 147-151）。詳細は図３に示される。プラスミドpCaHj171およびpCaHj201を図４および図５に示す如くpCaHj170から構築した。
変異体の構築に対しpCaHj201の使用を可能にさせる２つのプラスミド、pCaHj416およびpCaHj417は、アスペルギルス発現プラスミドpHD414から作成された。これらのプラスミドの構築は図６に要約される。pCaHj201は図７に示す如く変異体の構築に対して用いられた。突然変異した43K遺伝子を有する発現プラスミドを、親特許出願（PCT／DK／00123）に記載される如くpToC90と同時形質転換によりアセタミド上で選択することによりアスペルギルスオリゼIF04177に形質転換した。
変異体CC234およびCC248の構築
V221S，cN222S，Q223Tから成る変異体をオリゴヌクレオチド4214を用いて構築した。
0003681750.tif 000006
突然変異を図６に記載される如く導入し、変異したHind III−SalＩ断片をpCaHj416にサブクローンした。
A162Pから成る変異体のCC248をオリゴヌクレオチド4271を用いて構築した。
0003681750.tif 000007
突然変異を図６に示す如く導入し、変異したBamHＩ−Hind II断片をpCaHj417にサブクローンした。
以下において、添付図面２〜７を更に説明する。
図２．pCaHj170の構築：
pSX320をACCＩで消化した。消化は、フェノール／クロロホルム抽出、エタノールによる沈殿および真空中での乾燥により停止した。陥凹３′末端をクレノ−ポリメラーゼを用いて埋めそして反応を前記の如く停止させた。DNAを再溶解しそしてBamHＩで消化した。カルヨゾーメ遺伝子を含有する920bp断片を、アガロースゲルから単離した。pUC19をSaIで消化し、陥凹３′末端をクレノ−ポリメラーゼを用いて埋め次いでDNAを前記の如くBamHＩで消化した。形成された2675bp断片をアガロースゲルから単離した。
920bp pSX320断片を、2675bp pUC19断片に結合させそして常法によりｒ-ｍ+に仕上げたＥ．コリーMT172,E．コリーMC1000株（カサダバンおよびコーヘン（1980），J.Mol.Biol.,138，179-207）に形質転換した。
図３．43K遺伝子の部位特異的変異誘発：
プラスミドpCaHj170，pCaHj171又はpCaHj201を、対象の突然変異に依存する鋳型として用いた。
えり抜きの鋳型を変異誘発プライマー（星印とともに矢印として示される）およびプライマー2834，３′末端で鋳型に対合Ｃ（２個のヌクレオチド）および５′末端で鋳型に誤対合する（２個のヌクレオチド）42個のヌクレオチドプライマーを用い増幅した。
0003681750.tif 000008
温度サイクルプロフィルは、製造者の指示に従いパーキン−エレマーシータス（Perkin-Elemer Cetus）（アンプリタック（amplitaq）（商標）からtaqポリメラーゼを用い図面上に示す如くであった。PCR生成物をアガロースゲルから単離し、次いで上記の如く同じ鋳型を用いPCRサイクルにおいて伸長した。温度プロフィルは、アンプリタク（amplitaq）（商標）および標準PCR条件を用い図面上に示す如くであった。伸長後、PCRプライマー2833および2832を直接伸長混合物に加え、次いで図面上に示される温度サンクルプログラムを行い、そして突然変異を有する得られたPCR断片をアガロースゲルから単離した。
PCRプライマー2833は2834の５′末端に相当する：
0003681750.tif 000009
プライマー2832は鋳型に相当する：
0003681750.tif 000010
図４．pCaHj171の構築：
43K遺伝子のサイレント突然変異（Argコドンの第３位におけるＧからＡへの変異）を、鋳型および突然変異プライマー2831としてpCaHj170を用い、43k遺伝子内に導入した：
0003681750.tif 000011
突然変異PCR断片をNcoＩおよびXhoＩを用いて消化し次いでNcoＩおよびXhoＩで消化されたpCaHj170に結合させた。結合混合物をＥ．コリーMT172内に形質転換したNcoＩ−XhoＩ挿入物は、製造者の指示に従いUnited States Biochemicals市販のセキュナーゼ（Sequenase）（商標）を用い組換え体プラスミドから配列決定された。配列は所望の突然変異体を除きpCaHj170の配列と同一であった。このプラスミドはpCaHj171と呼ばれた。
図５．pCaHj201の構築：
43k遺伝子（Proコドンの第３位におけるＧからＡへの変異、内のサイレント突然変異を、鋳型および突然変異プライマー847としてpCaHj171を用い43k遺伝子内に導入した；
0003681750.tif 000012
突然変異PCR断片をClaＩおよびXhoＩで消化し次いでClaＩおよびXhoＩで消化されたpCaHj171に結合させた。結合混合物をＥ．コリーMT172内に形質転換した。ClaＩ−XhoＩ挿入物は、製造者の指示に従いUnited States Biochemicals市販のセキュナーゼ（Sequenase）（商標）を用い組換え体プラスミドから配列決定された。配列は所望の突然変異体を除きpCaHj170の配列と同一であった。このプラスミドはpCaHj201と呼ばれた。
図６．pCaHj416およびpCaHj417の構築：
pCaHj416の構築：pCaHj201をBamHＩおよびBamH IIIで消化し、次いで612bp断片をBamHＩおよびBamH IIIで消化されたpHD414内に結合させた。
pCaHj417の構築：pCaHj201をHind IIIおよびSalＩで消化し、次いで317bp断片をHind IIIおよびXhoＩで消化したpHD414内に結合させた。
図７．鋳型としてpCaHj201を用い変異体の構築：
部位特異的変異誘発を、図２に記載した如く行った。改変物がHind III部位（1-612位）の上流に位置するとき、突然変異PCR断片をBamHＩおよびHind IIIで消化し、そして発生した612bp断片BamHＩおよびHind IIIで消化したpCaHj417に結合させ突然変異遺伝子に対する発現プラスミドが生成する。
改変物がHind III部位（612-928位）の下流に位置したとき、突然変異PCR断片をHind IIIおよびSalＩで消化し、そして発生した316bp断片をhind IIおよびXhoＩで消化したpCaHj416に結合させ突然変異した遺伝子に対する発現プラスミドを生成した。プラスミドのサイズと制限部位の位置は、置換にのみ相当する。欠失又は挿入の場合においては、サイズと部位の位置は示された図面と異なる。
セルラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上記方法により又は公知の択一的方法により生産された突然変異したセルラーゼをコードする配列は、プロモーターをエンコードするコントロール配列、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび所望によりレプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子を典型的に含む発現ベクターを用い、酵素の形で発現され得る。発現せしめられたタンパク質の分泌を許容せしめるため、「シグナル配列」をエンコードするヌクレオチドが、セルラーゼをコードする配列の前に挿入され得る。コントロール配列の方向の下での発現に対し、本発明に従って処理されるべき標的遺伝子は、適当な読み枠内のコントロール配列に実施可能に結合される。プラスミドベクター内に組み入れられることができ、そして変異体セルラーゼ遺伝子の転写を支援し得るプロモーター配列が含まれるが、原核β−ラクタマーゼプロモーター（ヴラ−カマロフ等、1978，Proc．Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731）およびtacプロモーター（デボエル等、1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25）に制限されない。更に、「Useful proteins from recombinant bacteria」in Scientific American, 1980, 242：74-94の文献を見出すことができる。
一つの態様において、Ｂ．サブチリス(subtilis)が突然変異DNAを有する発現ベクターにより形質転換される。もしも発現が分泌性微生物、例えばＢ．サブチリス(Subtilis)内でおこるとき、シグナル配列は翻訳開始シグナルに従いそして対象のDNA配列に先行する。シグナル配列は発現生成物を細胞壁（ここではそれは分泌により生成物から開裂される）に輸送する作用をする。先に定義した語句「コントロール配列」は、存在する場合シグナル配列を含むことを意図する。
本発明セルラーゼ変異体を生産する、容易に好ましい方法において、線維状菌類が宿主生物として用いられる。線維状菌類宿主生物は、好都合には、組換えタンパク質を生産するための宿主としてこれまで用いられたものでよく、例えばアスペルギルス（Aspergillus）SP.,例えばＡ．ニガー(niger),Ａ．ニドランス(nudulans)又はＡ．オリゼ(oryzae)である。組換えタンパク質の生産におけるＡ．オリゼ(oryzae)の使用は、例えばヨーロッパ特許238 023に広範囲に記載されている。
アスペルギルス（Aspergillus）におけるセルラーゼ変異体の発現のため、セルラーゼ変異体をコードするDNA配列はプロモーターにより先行せられる。プロモーターは、アスペルギルス（Aspergillus）において強い転写活性を示すいかなるDNA配列であってよくそして細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をコードする遺伝子から由来することができる。
適当なプロモーターの例は、Ａ．オリゼ(oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコールマイヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー（niger）ノイトラルα−アミラーゼ，Ａ．ニガー（niger）酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（niger）グルコアミラーゼ、リゾムコールマイヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ，Ａ．オリゼ(oryzae)アルカリプロテアーゼ又はＡ．オリゼ(oryzae)トリオースホスフェートイソメラーゼから由来ものである。
特に、宿主生物がＡ．オリゼ(oryzae)である場合、本発明方法で使用するための好ましいプロモーターはＡ．オリゼ(oryzae)TAKAアミラーゼプロモーターである；何故ならそれがＡ．オリゼ(oryzae)において強い転写活性を示すからである。TAKAアミラーゼプロモーターの配列は、ヨーロッパ特許238 023に示されている。
終結およびポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ起源から適当に由来することができる。
菌類宿主細胞を形質転換するために用いられる技術はヨーロッパ特許238 023に適当に記載されている如くである。
宿主細胞からセルラーゼ変異体の分泌を確保するため、セルラーゼ変異体をエンコードするDNA配列はシグナル配列によって先行されることができ、このシグナル配列は天然シグナル配列又はその機能部分又は細胞からタンパク質の分泌を与える合成配列であってよい。特に、シグナル配列は、アスペルギルス(Aspergillus)SP．アミラーゼ又はグルコアミラーゼをエンコードする遺伝子、リゾムコールマイヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ又はプロテアーゼをエンコードする遺伝子、又はフミコラ(Humicola)セルラーゼ、キシラナーゼ又はリパーゼをエンコードする遺伝子から由来することができる。シグナル配列はＡ．オリゼ(oryzae)TAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー（niger）ノイトラルα−アミラーゼ、Ａ．ニガー（niger）酸−安定α−アミラーゼ又はＡ．ニガー（niger）グルコアミラーゼをエンコードする遺伝子から好ましく由来する。
形質転換された宿主細胞を培養するために用いられる培地は、アスペルギルス（Aspergillus）を増殖させるのに適したいかなる通常の培地であってよい。形質転換体は通常安定でありそして選択圧の非存在下で培養できる。しかし、もしも形質転換体が不安定であることが見出されると、細胞に導入される選択マーカーは選択に対し使用できる。
宿主細胞から分泌される成熟セルラーゼタンパク質は、遠心分離により培地から細胞を分離し又は濾過し、および硫酸アンモニウムの如き塩を用い培地のタンパク質成分を沈殿し、引き続きイオン交換クロマトグラフィー，アフィニティクロマトグラフィー等の如きクロマトグラフィー手順を含む周知手順により培養基から好都合に回収できる。
本発明によれば、セルラーゼ変異体は洗剤組成分の成分として典型的に添加できる。そのようなものとして、セルラーゼ変異体は無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体又は保護された酵素の形態で洗剤組成物中に含ましめることができる。無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4,106,991および4,661,452（ノボ  インダストリーＡ／Ｓ社へ付与）に記載の如く生産できそして当業者に公知の方法により所望によりコートされ得る。液体酵素調製品は、例えば、ポリオール、例えばポリプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を確立された寸法に従って添加することにより安定化できる。他の酵素安定化剤は、当業者に周知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特許238 216に開示された方法に従って製造できる。洗剤組成物は、１種又はそれ以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ又はアミラーゼを更に含有することができ、好都合には洗剤用添加剤中に含まれる。
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合の形態で例えば粉末、顆粒又は液体として存在してよい。液体洗剤は、水性であってよく、典型的には90％までの水と０〜20％の有機溶剤を含有する。
洗剤組成物は、アニオン、非イオン、カチオン、両性又はこれらのタイプの混合物であってより界面活性剤を含んでなる。洗剤は、通常０〜50％のアニオン、界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AES）又は石けんを通常含有するであろう。洗剤組成物は又、０〜40％の非イオン界面活性剤、例えばノニルフェノールエトキシレート又はアルコールエトキシレートを含有できる。更に洗剤組成物はポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤（例えばWO 92／06154に記載）を含有できる。
洗剤組成物は追加的に１種又はそれ以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、タイプII又はプロテアーゼを含んでいてもよい。
pH（水性洗剤液中で測定）は、通常中性又はアルカリ性、例えば７〜11である。洗剤は、１〜40％の洗剤用ビルダー、例えばゼオライト，ホスフェート，ホスホネート，シトレート，NTA，EDTA又はDTPA，アルケニル無水コハク酸、又はシリケートを含むことができ、又は洗剤はビルドされていなくてもよい（すなわち、本質的に洗剤用ビルダーを有しない）。洗剤は又、他の通常の洗剤成分、例えば塗布コンディショナー、フォームブースター、漂白剤、例えばパーボレート、パーカーボネート、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、酵素用安定剤、フォームデプレッサー、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含有することができる。
本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は次のものを含む。
ａ）ホスフェートビルダー、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、シリケート、使用時に所望pHに調節するためのアルカリおよび中性無機塩を含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成分。
ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル又は同等のポリマー、シリケート、使用時に所望pHに調節するためのアルカリおよび中性無機塩を含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。
ｃ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、有機塩、苛性アルカリを含んでなり、使用の際７〜119値に調節されたpHを有する洗剤液体として配合された洗剤組成物。
ｄ)線状、アルコキシレート化第一アルコールから本質的に成る液体非イオン界面活性剤、ホスフェートビルダー、苛性アルカリを含んでなり、使用時に７〜11の値に調節されたpHを有する非水性洗剤組成物として配合された洗剤組成物。
ｅ）アニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤、低又は実質的に零の中性無機塩、ホスフェートビルダー、およびケイ酸ナトリウムを含有する、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物の形態の洗剤粉末として配合された洗剤組成物。
ｆ）アニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤、低又は実質的に零の中に中性無機塩、ゼオライトビルダーおよびケイ酸ナトリウムを含有する、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物の形で洗剤粉末として配合された洗剤組成物。
ｇ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリルポリマー、脂肪酸石けん、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、粘土粒子およびケイ酸ナトリウムを含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。
ｈ）５〜65重量％の界面活性剤、０〜50重量％のビルダーおよび０〜30重量％の電解質を含有する液体コンパクト洗剤。
これらの成分とは別に、洗剤組成物ａ）〜ｈ）は、本発明のセルラーゼ変異体のおよび所望により前記の如く１種又は複数の他の酵素を含有する。
今日、次のように企図されている；すなわち本発明の洗剤組成物において、セルラーゼは洗液１ｌ当たり0.001〜100mgに相当する量で添加され得る。
次の実施例は本発明を説明するものであるがいかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。
例１
残留活性に関する連結領域中の変異の効果
プロテアーゼ酵素を含有する液体洗剤中で貯蔵後、セルラーゼ変異体の残留活性を２つの異なる方法で評価した。
S-CEVU分析は、カルボキシメチルセルロース（CMC）の溶液の粘度を減少せしめるサンプルの能力を測定することによりサンプル中に存在する触媒活性の量を定量する。この活性は、酵素コアにのみ関しそして連結領域およびCBD領域の存在又は非存在により影響されない。
S-CEVU分析は、基質（CMC）の粘度を減少させるため相対的酵素標準物を用い、40℃、pH7.5で行なわれる。この方法は、要求によりNo．AF302／2GBとして出願人から入手可能である。
ダイド  アビセル（Dyed Avicel）分析（DAA）は、不溶性セルロースに結びつくことのできそしてセルロース粉末の表面に結合した染料を解放し得るセルラーゼの量を定量する。連結領域とCBD領域を有しないセルラーゼはこの基質に対し低活性を示しそして分析はそさ故無傷のセルラーゼの酵素コアへのタンパク分解を監視するために使用できる。
連結領域とCBD粒子を有しないセルラーゼの洗浄能力は無傷の酵素に対するよりも低いので、DAAは（１又は複数の）プロテアーゼ酵素を含有する洗剤中で貯蔵されたセルラーゼの洗浄能力とある程度相関関係にある。
本発明の係る次のセルラーゼ変異体を残留活性に対して試験した：
変異体  I：V221S＋N222S＋Q223T
変異体  II：V240P＋Q241P
WO 91／17243に記載されたＨ．インソレンス43kDエンドグルカナーゼを対照（親）セルラーゼとして用いた。
ダイド  アビセル（DYED AVICEL）分析（DAA）
レマゾールブリリアントブルー(Remazol Brilliant Blue)で染色したセルロース粉末とセルラーゼの酵素反応は、セルロースの活性に関連した染料の量を解放する。
反応条件：
0003681750.tif 000013
染色セルロースの調製
50gのシグマセルタイプ20セルロース粉末を、2000mlのガラスビーカー中の500mの脱イオン水に加え次いで電磁かくはん機でかくはんした。４ｇのレマゾールブリリアントブルーR19染料（C.I.61200リアクチブブルー19）を350mlの脱イオン水に溶解した。染料濾液をシグマセルの懸濁液に加え次いで約55℃に加熱した。100ｇの無水硫酸ナトリウムをゆっくり加えながら、混合物を30分間撹拌した。
20ｇのリン酸三ナトリウムに水和物200mlの脱イオン水に溶解した。シグマセル／染料溶液のpHを約150mlのリン酸三ナトリウム溶液を加えることにより11.5に調節した。
混合物を55℃で60分間かくはんした。混合物を1000mlのブフナーロートおよびワトマンNo．54濾紙を用いて真空濾過した。フィルターケークを、濾液（廃水）の590nmでの光学濃度（OD590）が0.03未満になるまで70℃〜80℃で脱イオン水を用いくりかえし洗浄した。フィルターケークを100mlの50％エタノールですすぎ青色の更なる除去が生じ次いで引き続き100mlの96％エタノールですすいだ。セルラーゼをロートから除きそして乾燥させた（クリーンベンチ中で）。
分析試薬
0.1Mホスフェート緩衝液
0003681750.tif 000014
非イオン停止試剤
0003681750.tif 000015
染色セルラーゼ基質
毎日新たに調製されなければならない。乾燥粉末を秤量し、そして0.1Mホスフェート緩衝液（記載の如く）に溶解した10％（Ｗ／Ｗ）溶液を調製する。分析前に少なくとも30分間撹拌する。
0.1M緩衝液中に希釈した酵素サンプル
サンプルを0.1Mホスフェート緩衝液中、例えば4，8，12，16 S-CEVU／mlの濃度に希釈した。
酵素標準物
適当な酵素標準物、又は対照非−貯蔵サンプルを0.1Mホスフェート緩衝液中で希釈し標準曲線を得た。
標準物の濃度は例えば0，1／2，1，2，4，8，12，16 S／CEVU／mlであった。
装置
40℃の水浴
分光光度計（590nm）
バリオマグ  テレシステム（Variomag Telesystem)HP 60p、水中用電磁かくはん器
プレート（60ポイント）
バリオマグ試験管ラック（Rack）HP 60 16mm試験管に対し、試験管、16mmφ
電磁かくはん棒、３×８mm
濾紙  φ９cm、ムンクテル（Munktell）１Ｆ
濾過用ロート
ファインピペット  １−５ml
試験管および濾液を集めるためのラック
電磁かくはん機プレートおよび基質懸濁のための磁石
方法
水浴の温度は40℃でなければならない。標準溶液のサンプル２mlをラック内に設けられた試験管に秤量して入れた。全ての試験管が準備できたら、ラックを水浴内に設けた。電磁かくはん棒を全ての試験管に加え、かくはん機プレートを600rpmで開始した。10秒の間隔で、２mlの染色セルロース基質を定速かくはんしながらピペッティング中に添加した。非イオン停止試剤を各試験管に加えた。40℃で十分混合したサンプルを、濾過用ロート内の濾紙上に注ぎ、そして明澄な濾液を集めた。もしも濾液が未明澄である場合、濾過をくりかえさなければならない。濾液の590nmでの吸光度を測定した。酵素なしの標準物0 S/CEVU／mlの吸光度をサンプルおよび他の標準物の吸光度から引いた。590nmで得られたデルタ吸光度を、S-CEVU／mlで測定したサンプル溶液中の酵素活性に対してプロットした。用量−応答曲線は直状でなく（図８）、そして標準物に関するサンプルの活性、（又は非貯蔵サンプルに関する貯蔵サンプルの活性）は示される如く計算できる。
実験、貯蔵安定性
高精製セルラーゼの2475 S-CEVUを凍結乾燥した。
1.65ｇの液体洗剤を加え次いでセルラーゼが溶解するまで攪拌した。0.165 KNPU（S）サビナーゼ（Savinase）プロテアーゼを加え次いで完全に混合した。酵素を有する100μｌの洗剤を（最大）７個の１mlのナンク（Nunc）−管にピペットで移した。管の一つを直ちに参照のためディープフリーザー（−18℃）内に入れた。残りの（６個）管を25℃、および35℃で、１日、２日又は５日間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを作動濃度に希釈し、次いで非貯蔵対照に関する貯蔵サンプルの残留活性をダイドアゼセル（Dyed Avicel）分析で測定した。S-CEVU／gでの活性に関する対照に関してのサンプルの残留活性をも測定した。
0003681750.tif 000016
図９はセルラーゼ変異体Ｉに対するダイドアゼセル分析からの曲線の例を示す。
例２
非晶質セルロースに対するセルラーゼ吸着
85％リン酸中で膨潤させることによって非晶質化したアビセル（Avicel）（商標）（アサヒケミカル社、日本）を、試験吸着剤として用いた、詳細は下記の例５参照。
試験吸着剤を蒸留水中懸濁液として貯蔵し、乾燥セルロースの含量（典型的には15g／l）を乾燥しそして別途の実験でアリコートを秤量することにより測定した。吸着剤は封止され得るプラスチック管内に容量（０−0.5ml）で入れ、０−８mgの範囲内のセルロース乾燥質量の含量とした。商業上のコンパクト粉末洗剤であるアリエル  カラー（Ariel Color）を、洗剤を電子オーブン中で85℃で８分間インキュベートすることにより粉末洗剤中に存在する酵素を不活性化するために予備処理した。1MのGly-NaOH緩衝液（pH10）中に溶解した0.3mlの予備処理したアリエル  カラー溶液（21.67g/l）を各管に加え、次いで0.2mlの酵素（５IU／ml）のアリコートを加え、約１IU／mlの混合物中初期EG活性を得た。
懸濁液を、スウェラボ  インストラメント（Swelab Instrument）440ミキサー上で20℃で60分間振とうし、次いで吸着された酵素と共に基質を2500ｇ、20℃で５分間遠心分離することにより沈降させた。
上澄みを通常の技術、例えばRed CMC分析（Tikhomirov D.F.等、Biotechnologia（モスクワ）、プラナム社により英語にほん訳、1989，vol.5，No.4，p.518-524）を用い未結合エンドグルカナーゼに対し分析した。
100μlの酵素アリコートを狭いガラス管内の１mlの１％のレッド（Red）CMC基質（Fermentas Co., Vilnius, Lithuania）、pH7.5（0.05MのTris緩衝液）に加え、混合物を40℃の水サーモスタットに40分間移した。１以上の管をブランクとして酵素アリコートの代りに緩衝液を有するサーモスタットに加えた。酵素反応を、0.1MのCaCl2を含有する80％エタノール１mlを加え、引き続き激しく振とうすることによって停止させた。未加水分解基質を、同じ管を4000ｇで10分間遠心分離することにより分離し次いで490nmで上澄みの吸光度を水に対して測定した。
吸着の程度を、Ao／Asuper比対吸着剤濃度を用いてプロットしたが、これは線状法でありこの方法は吸着特性に従い単一エンドグルカナーゼイソ型同質性の場合に直線を与える（Klyosov A.A.等、Bioorgan．Chem．（モスクワ）、プレナム社により英訳、1982，Vol.8，No.5，p.643-651）。分布定数、Kd＝Abound／（Asupper・[S]）は、線の傾きとしてこのプロットから測定される。
次のKd値がアリエルカラーにおいて得られた：
カレザイム（Carezyme）  0.6l／g
Y280F                   2.9 l／g
R252F                   4.3 l／g
Y280F ＋R252F           3.3 l／g
例３
洗浄試験
Ａ．条件
装置：トルグ−ロートメーター
液体量：150ml
攪拌：100回運動／分
洗浄時間：30分
すすぎ時間：水道水で５分
洗浄温度：40°
線維：100％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、５×６cm
乾燥：ライン乾燥
くり返し：３回
商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中85℃で８分間インキュベーション
評価：パネルの数は、色彩明澄性およびぼやけのレベルに関して実験の範囲で相対的評価を与えることが求められる。
１．カレザイム（Carezyme）対Y280F
洗剤：商業上のヨーロッパのコンパクトカラー粉末
粒質物：6.5g／l，pH10.2
水硬度：３mM Ca++
0003681750.tif 000017
データーは変異体が試験された条件下で改善された性能を有することを示す。
２．カレザイム対
１）V221S-N222S-Q223T，
２）Y8F，
３）Del(S219-T235)
洗剤：商業上の米国の重質コンパクト粉末粒質物、１g／l，pH10
水硬度：１mM Ca++
0003681750.tif 000018
データーは全ての三種の変異体は試験された条件下、改善された性能を有することを示す。
Ｂ．条件
装置：トルグ−ロートメーター
液体量：800ml
洗浄時間：12分
すすぎ時間：水道水で４分
洗浄温度：35°
繊維：100％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、10×15cm
乾燥：タンブル乾燥
くりかえし：11回
商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中85℃で８分間インキュベーション
評価：パネルの数は、測定されたスケールに従い可視的外観（色彩明澄性およびぼやけ）に関し表面処理酵素対酵素なしを等級づけすることが求められる。
等級：
０＝利益なし
１＝認め得る利益
２＝容易に認め得る利益
３＝大きな利益
４＝非常に大きな利益
５＝新規な繊維
１．カレザイム対A162P
洗剤：商業上の米国のコンパクトカラー粉末粒質物、１g／l，pH8.1
水硬度：１mMのCa++および0.35mMのMg
0003681750.tif 000019
Ｃ．条件
装置：トルグ−ロートメーター
液体量：800ml
攪拌：100回の運動／分
洗浄時間：30分
すすぎ時間：水道水で10分
洗浄温度：40°
繊維：100％熟成された黒色綿の２個のスワッチ、10×15cm
乾燥：タンブル乾燥
くりかえし：４回
商業上の洗剤の予備処理：電子オーブン中で85℃で８分間インキュベーション
評価：パネルの数は、測定されたスケールに従い可視的外観（色彩明澄性およびぼやけ）に関し表面処理酵素対酵素なしを等級づけすることが求められる。
等級：
０＝利益なし
１＝認め得る利益
２＝容易に認め得る利益
３＝大きな利益
４＝非常に大きな利益
５＝新規な繊維
１．カレザイム対W62E
洗剤：商業上のヨーロッパの粉末粒質物、6.5g／l，pH10.2
水硬度：３mM Ca++
0003681750.tif 000020
例４
ペルオキシダーゼ安定化43kDセルラーゼ変異体
コプリナス  シネレウス  ペルオキシダーゼ（Cip，ヨーロッパ特許出願179,486に従って得る）、過酸化水素、およびペルオキシダーゼ促進剤としてのｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート（pHBS）を含んでなる、染料移動阻止（DTI）のため用いられるペルオキシダーゼ系（POD系）を、ブリトン−ロビンソン緩衝液（pH8.5）中でシミュレートした：
［pHBS]：50μM，［H2O2]：200μM，[Cip]：２PODU／ml，[-セルラーゼ]：1.4ECU／ml，10mMブリトン−ロビンソン緩衝液，pH8.5．43kDのセルラーゼおよびセルラーゼ変異体Y147Sを、35℃で10分間POD系と共にインキュベートした。サンプルを取り出しそして氷冷の0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）で５回希釈した。セルラーゼの残留活性を、フェリシアン化物検出原理を用いるCMCU法により測定した。
結果を下記の表に示すが、表は置換Y147SがPOD系に対し安定であるセルラーゼ変異体に勝れていることを示す。
0003681750.tif 000021
例５
非晶質セルロースに対するアルカリセルラーゼ活性の測定
方法：
基質調製：20ｇの酸で膨潤させたアビセル（AVICEL）（商標）ストック溶液（１ケ月間貯蔵できる調製品に対し下記参照）を、5000rpmで20分間遠心分離し、上澄みを流し出し、そして沈降物を30mlの緩衝液中に再懸濁させた。次いで、5000rpmで20分間遠心分離し、上澄みを流し出し、そして沈降物を緩衝液中に再懸濁させ合計30ｇとした。これは、10ｇのアビセル／lの基質濃度に相当する。
緩衝液：pH8.5の0.1Mのバルビタール又はpH10.0の0.1Mのグリシン
酵素溶液：
酵素をpH8.5で0.5 S/CEVU／ml又はpH10.0で0.75 S-CEVU／mlの活性に希釈した。
試薬：
２％NaOH，PHBAH−試薬：1.5ｇのｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドおよび5.0ｇの酒石酸ナトリウムを２％NaOHの100mlに溶解した。
基質、緩衝液および酵素溶液を次の如く混合した：
0003681750.tif 000022
基質／緩衝液溶液を40℃で５分間予備処理した。次いで、酵素溶液を加え、溶液を５秒間回転混合し、次いで40℃で20分間インキュベートした。
反応を、500μlの２％NaOH溶液を加え、次いで５秒間回転混合することによって停止した。サンプルを5000rpmで20分間遠心分離した。1000μlの上澄みを試験管から新しい試験管に移し、そして500μlのPHBAH−試剤を加え、次いで10分間沸とうさせた。
サンプルの吸光度を分光光度計を用い410nmで測定した。
標準グルコース曲線：
300mg／lを含有する原液を5，10，15および25mg／lに希釈した。
1000μlの希釈標準物を500μlのPHBAH−試剤と混合し、次いで他のサンプルと同様に処理した、上記参照。
還元グルコース当量の放出を、標準曲線を用いて計算した。
酵素濃度を43kDエンドグルコースに対する613000のモル吸光度（ε）を用いて計算した。Km,VmaxおよびKcatを異なる基質濃度を用いるCineulaver-Burkプロットから計算した。置換チロシンおよびトリプトファンを有するセルラーゼ変異体のモル吸光度を、トリプトファンに対する吸光度値5690（ε）およびチロシンに対する吸光度値λ280（ε）およびシスティンに対する吸光度値120（ε）を用い適宜に調節した。
吸光係数（ε）は、グル、s.c.およびヒピエル、
P.H.：Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data; Analytical Biochemistry vol 182,（319-326）,（1989）.
試験せられるセルラーゼ変異体の各々を高い同質性に精製しSDS-PAGE分析における単一バンドを得た（割合A280／A260を前記1.5の如くチェックした）。
膨潤セルロースの調整：
材料：
５ｇのアビセル（Avicel）（商標）（Art.2331 Merck）150mlの85％オルト−リン酸（Art．573 Merck）400mlのアセトン（Art．14 Merck）
1.3ｌの脱イオン水（MilliQ）
１ｌのガラスビーカー
１ｌのガラスフィルターロート
１ｌの吸引フラスト
ウルトラターラックス（Turrax）ホモジナイザー
手順：
アセトンおよびリン酸を氷上で冷却した。
５ｇのアゼセル（商標）を水で湿潤させ、次いで150mlの氷冷85％オルト−リン酸を加え次いで混合物を１時間弱くかくはんしながら氷浴上に置いた。100mlの氷冷アセトンをかくはんしながら加え、引き続き混合物をガラスフィルターロートに移し、次いで３×100mlの氷冷アセトンで洗いそして各洗浄後に乾燥吸収した。
フィルターケークを２×500mlの水で洗いそして各洗浄後に可能な限り吸引乾燥した。
フィルターケークを再懸濁させ全量300mlとし次いで（ウルトラターラックスホモジナイザーを用い）同質性に至るまでブレンドした。
得られた生成物を冷蔵庫中で貯蔵した。
次の結果を43kDセルラーゼおよび変異体A162PおよびW62Pについてそれぞれ得た。
0003681750.tif 000023
表から明らかなように、両置換はアルカリ条件下基質無定形アゼセルに対する触媒活性を高めた。
例６
セルラーゼのLAS阻害
セルラーゼを異なる濃度のLAS（線状アルキルベンゼンスルホネート；Nansa 1169／P）を用い40℃で10分間インキュベートした。
残留活性を下記のCMCU法を用いて測定した。
LASを0.1Mホスフェート緩衝液（pH7.5）中に希釈した。
LASに対する500ppm，250ppm，100ppm，50ppm，25ppm，および10ppm，LASなし
セルラーゼを、10mlの合計容量中0，2 S-CEVU／mlの最終濃度に異なるLAS緩衝剤中で希釈しそして温度制御水浴中Ｉ分間インキュベートした。
次いで残留活性を、CMCU基質を用い還元糖を測定して２回測定した。0.5ml溶液の２個のサンプルを、同じホスフェート緩衝液中で調製した1.5mlの１％CMC溶液（ハーキュレス  クレ）と混合し、40℃で20分間インキュベートし、次いでPHBAH，２％NaOH中の酒石酸ナトリウムで停止させた。
0.5mlの同類のブランクサンプルを、停止試剤添加後CMC溶液に加えた。
サンプルを10分間冷却し次いで吸光度を410nmで測定した。
活性をブランクを減じた後に測定した。LASのない場合の活性は100％であった。図10において、43kDセルラーゼおよびセルラーゼ変異体A162およびR1158Eの残留活性がそれぞれ示される。43kDセルラーゼは「Wild」として示され、A162P変異体は「248」として示され、そしてR158E変異体は「280」として示される。
図面から明らかなようにA162P又はR158Eの置換はLAS（アニオン界面活性剤）に対しセルラーゼ安定性を増加する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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