(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、
前記基体上のマイクロカンチレバーアレイと、
前記マイクロカンティレバーの少なくとも１つに配置された少なくとも１つの電極を含み、
前記電極は、予め選択された生物学的分子に結合する能力を有し、高さおよび幅が約１０−９〜１０−１０メートルである、
生物学的分子を検出するためのセンサー。
【請求項２】
前記電極が、複数の電極である、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記電極のそれぞれが、同一の化学組成を有している、請求項２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記電極の少なくも１つが、該電極の他のものと異なった化学組成を有している、請求項２に記載のセンサー。
【請求項５】
前記電極が、外部コーティングを有している、請求項２に記載のセンサー。
【請求項６】
前記コーティングが、同一の化学組成を有している、請求項５に記載のセンサー。
【請求項７】
前記コーティングの少なくとも１つが、該コーティングの他のものと異なっている、請求項５に記載のセンサー。
【請求項８】
前記電極の少なくとも一つの形状が、該電極の他のものの形状と異なっている、請求項２〜７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項９】
前記電極が前記基体上にクラスターとして配置されている、請求項２〜８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１０】
前記クラスターがアレイを形成するように間隔をあけて配置されている、請求項９に記載のセンサー。
【請求項１１】
前記電極の電気化学的性質、幅および間隔が、前記生物学的分子上の一つの部位を補完し結合する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１２】
前記電極がナノワイヤ−に接続されている、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１３】
前記センサーをコントロールシステムに接続するインターフェースをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
前記生物学的分子がタンパク質である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１５】
マイクロコントローラーをさらに含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項１６】
前記センサーの温度を制御するシステムをさらに含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項１７】
前記電極に結合した生物学的分子の濃度を決定するためのレーザーをさらに含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項１８】
前記電極に結合した生物学的分子の濃度を検出するための圧電検出器をさらに含む、請求項１７に記載のセンサー。
【請求項１９】
前記生物学的分子がＤＮＡであり、前記電極が直線状ＤＮＡ分子のＤＮＡ塩基対を補完し結合するように互いに間隔をあけて配置されている、請求項１に記載のセンサー。
【請求項２０】
前記生物学的分子がＲＮＡである、請求項１に記載のセンサー。
【請求項２１】
流速制御システムおよびレーザー検出器をさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２２】
マイクロコントローラーおよびディスプレイをさらに含む、請求項２１に記載のセンサー。
【請求項２３】
X−Y蛍光レーザーリーダーに受容されるよう適合させた、前記基体のための支持構造体をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２４】
少なくとも１つの電極はオングストロームレベルの精度で製造され、該センサーの表面は、あらかじめ選択されたタンパク質の３次元形状を正確に補完するものである、個々のタンパク質を検出するための請求項１４に記載のセンサー。
【請求項２５】
前記センサーが、１種類の金属で作られている、請求項２４に記載のセンサー。
【請求項２６】
前記センサーが、異なった金属で作られている、請求項２４に記載のセンサー。
【請求項２７】
前記センサーが、タンパク質特異的レセプターを形成する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２８】
前記センサーが、X線回折研究又は核磁気共鳴研究から得られた情報に基づいて作成されている、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、1997年11月12日に出願された米国仮出願第60/065,373号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本出願は、一般的に、溶液中の単一の生物学的分子を検出し、特徴付けるための方法および装置に関し、より詳細には、個々のタンパク質、タンパク質混合物、DNAまたはその他の分子をチップ上で検出し、特徴付けるための方法および装置に関する。
【０００３】
発明の背景
個々のタンパク質または複合生物学的分子の特徴づけと定量は、医学、法医学、軍事といった離れた分野で非常に重要である。例えば医学においては、所与のタンパク質の存在および濃度を、疾患または前疾患(pre-disease)の診断に用いることができる。軍事においては、例えば起こりうる細菌戦状態において非常に重要である、自然環境に所与の病原体が存在するか存在しないかを知らせるために所与のタンパク質を利用できる。
【０００４】
生物学的サンプル中の個々のタンパク質または分子の検出は、現在のところは複雑で、一般に高度な大型の装置が必要である。
【０００５】
所与の生物学的分子を特徴付けるための、いくつかの技術が近年開示されてきている。最初にPCT国際公開第WO 90/15070号に記載されたような、Affymetrixによって構築された高密度DNAチップにおいて成功をおさめている。
【０００６】
「バイオセンサーおよびインターフェイス膜」と表題が付された米国特許第5,624,537号には、タンパク質受容マトリックスと1個の電極が開示されている。
【０００７】
「溶出された連結体（ligate）用コレクターを有する表面プラズモン共鳴検出器」と表題が付された米国特許第5,395,587号には、プラズモン共鳴検出器を用いた固定化リガンドを測定するためのシステムが記載されている。
【０００８】
「プロタミン反応性ポリマー膜電極」と表題が付された米国特許第5,607,567号には、膜電極が記載されている。
【０００９】
「生化学的スイッチを有する薄膜センサー」と表題が付された米国特許第5,328,847号には、特異的認識生体分子を有するバイオセンサーが記載されている。
【００１０】
「バイオセンサー」と表題が付された米国特許第4,777,019号には、生物学的モノマー用のバイオセンサーが記載されている。
【００１１】
「複数部位検出装置」と表題が付された米国特許第5,532,128号には、所与の生物学的分子を検出するための、電極と組み合わされた試験ウェルが記載されている。
【００１２】
「アミノ酸電気センサーとともに使用するための、ラテックスポリマー粒子上に固定化された酵素」と表題が付された米国特許第4,983,510号には、ラテックスポリマートラップを有する電気センサーが記載されている。
【００１３】
「データメモリーを有するバイオセンサー」と表題が付された米国特許第5,384,028号には、メモリーモジュールを有する膜バイオセンサーが記載されている。
【００１４】
「抗体が共有結合したフィルム免疫バイオセンサー」と表題が付された米国特許第5,567,301号には、抗体バイオセンサーが記載されている。
【００１５】
「生物学的に活性な物質を含む膜を有するバイオセンサー」と表題が付された米国特許第5,310,469号には、膜バイオセンサーが記載されている。
【００１６】
「液体中のアナライトの定量的測定手段」と表題が付された米国特許第5,019,238号には、液体のイオン濃度を連続的に試験するための手段が記載されている。
【００１７】
「血液アナライザー用の電極ユニットおよびパッケージ」と表題が付された米国特許第4,981,572号には、血液を分析するための電極と装置が記載されている。
【００１８】
「血液の臨床緊急チェック項目測定用装置」と表題が付された米国特許第4,452,682号には、血液中の複数の要素を測定するための装置が記載されている。
【００１９】
「化学物質測定装置」と表題が付された米国特許第4,568,444号には、溶液中の化学物質を定量するための電極が記載されている。
【００２０】
「連続モニタリングのための免疫アッセイ装置」と表題が付された米国特許第5,281,539号には、2段階免疫アッセイ装置が記載されている。
【００２１】
「レセプターベースのバイオセンサー」と表題が付された米国特許第5,192,507号には、アヘン剤（opiate）を検出するための、ポリマーフイルムをベースとしたバイオセンサーが記載されている。
【００２２】
「電気的、光学的および機械的信号を利用したバイオセンサー」と表題が付された米国特許第5,156,810号には、薄層バイオセンサーが記載されている。
【００２３】
「電気化学的免疫センサーシステムおよび方法」と表題が付された米国特許第5,494,831号には、免疫学的バイオセンサーが記載されている。
【００２４】
「バイオセンサーおよびそれを用いた定量的分析方法」と表題が付された米国特許第5,332,479号には、生物学的に活性なレセプターを有する、電極ベースのセンサーが記載されている。
【００２５】
「バイオセンサーならびにそれを用いたサンプル液体中の基質を定量するための方法および装置」と表題が付された米国特許第5,582,697号には、基質とオキサイドレダクターゼとの間の還元の測定に基づくバイオセンサーが記載されている。
【００２６】
「微小（micronic）生物サンプル分析のためのシリコン半導体ウエハー」と表題が付された米国特許第4,908,112号には、検出器能力を有するマイクロキャピラリー分離装置が記載されている。
【００２７】
「バイオセンサーを用いることによるサンプル液体中の基質濃度を測定するための方法」と表題が付された米国特許第5,409,583号には、2段階バイオセンサーが記載されている。
【００２８】
「ポリマー化脂質二重層中に再構築された膜タンパク質由来のバイオセンサー」と表題が付された米国法定発明（Statutory Invention）H201では、バイオセンサー中に細胞膜を組み込んで使用する方法が記載されている。
【００２９】
上記の技術は一般に、１つのタイプの分子または２〜３の異なるタイプの分子の検出に使用される。これらの技術はどれも、非常に多数の異なったタイプのタンパク質、タンパク質変異体、または他の生物学的分子を、一つのチップ上で同時に検出および定量することを可能にするように特に適合させたものではない。さらに、先行技術はどれも、いずれの生物学的結合剤、合成プローブもしくはテストウェル等の複合マイクロ構造体（complex micro-structures）を用いることなく、タンパク質特異的な電気的レセプターをチップ上に直接構築するのに適した技術を提供していない。
【００３０】
本発明者らはここに、個々の分子もしくは複合分子をチップ上で検出し、特徴付けし、定量するための、新規で、より小型で、より迅速でよりコスト効果が高い技術を開示する。本明細書に記載された技術は、新規DNA配列決定方法としてもまた役立ち得る。
【００３１】
発明の概要
1つの態様において、本発明は、混合物中の異なった分子構造体を識別することができるセンサーを提供する。この装置は、複数電極クラスター形態のナノスケール結合部位が構築されている基体を含む。各々の結合部位は、基体の表面上に広がるナノメートルスケールの点を含んでいる。これらの点は、好ましくは、化学的結合部位に似た3次元電気化学的結合特性を付与するために空間的に配置されたナノ電極である。このように、結合部位は、標的分子上の相補的結合部位に対する、または標的分子自体に対する選択的親和性を有している。
【００３２】
1つの態様においては、結合部位は基体上にアレイとして配置されている。1つの態様においては、アレイの各部位の、空間的および電気化学的特性は同一であり、単一の標的分子に対するアッセイを提供する。別の態様においては、ナノ電極アレイの領域は、数種類の分子種の同時検出および定量のための、電気的および／または空間的に別個の結合部位のグループ化されたアレイを有している。
【００３３】
さらに別の態様においては、電極および周囲表面に用いられている材料は、好ましい固有の電気的および化学的特性に基づいて選択されている。
【００３４】
ナノ電極アレイは、液体を維持可能なチャンバー中に含まれていてもよい。数種類のアレイが単一のチャンバー中で使用されていてもよく、数種類の異なるチャンバーが単一のチップにおいて使用されていてもよい。
【００３５】
さらに別の態様においては、ナノ電極アレイおよびチャンバーは少なくとも1つのマイクロ流体送達分離システム（分析されるタンパク質または他の分子の大きさおよび電気的特性によって送達と分離の両方を可能とするマイクロキャピラリー等）に取り付けられている。
【００３６】
別の態様においては、マイクロコントローラーまたはマイクロプロセッサーが、ナノ電極からの信号を分析するために、および／または、分子またはタンパク質の流体工学分離の時間を調節し、制御するために設けられている。
【００３７】
別の態様においては、ナノ電極アレイを有するチップは、電子温度制御システム、例えば所与のナノ電極と分子との結合形成速度論または電気化学的親和性、ならびに、分子の流体速度論および分離を変化させるサーミスターを有する熱電デバイス等に連結される。
【００３８】
別の態様においては、ナノ電極はDNA配列決定のための直線状マイクロチューブ内に配置される。
【００３９】
このように、本発明の目的は、非常に高い充填密度の半導体チップ技術を用いることにより溶液中の小さな生物学的分子（タンパク質等）を分析するための、および、DNA配列決定のための、新規で迅速な方法を提供することである。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、タンパク質、DNAまたは他の分子を自動分析するための装置中にチップ全体が容易に組み込み可能であることを確保することである。
【００４１】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、一部は、最近の技術における進展（走査型トンネル顕微鏡（STM）の利用等）により、１の原子層または２〜３の原子層からなる超小型構造体をシリコン等の半導体表面上に構築できることが示されたという事実に基づいている。これらの構造体の大きさから、それらは一般にナノ構造体（1ナノメートルまたはnmは10-9m、1オングストロームまたはÅは10-10m）と称される。これらの構造体は直径を2〜3オングストローム程度に小さくすることができ、これは小タンパク質のストークス半径（約25〜35Å）をはるかに下回るものである。これらの構造体は、異なる化学元素を用いて構築でき（または構築物にかける電圧は選択的に変化させ得る）、そして、構造体の空間的分布、高さ、幅および形状も変化させ得るので、これらの構造体はクラスター中に、「分子電極（その電気的特性および立体的配置は、分子（好ましくは生化学物質、最も好ましくはタンパク質）の外部3次元形状および電気化学的特性に正確に対応して構成可能）」として特異的に機能するように構築することができる。それ故に、これらのクラスター夫々が、個々の電気的タンパク質「レセプター」（または検出器）として機能し得る。非常に多数のこれらの分子電極を単一のチップ上に配置することができるので、その結果得られるアレイ（ここで「ナノ電極アレイ」と命名する）は、単一のチップ上での数多くの異なる種類のタンパク質の検出、特徴付けおよび定量に用いることができる。この技術を変更してこのチップを用いてDNAの配列決定をすることもできる。
【００４２】
図面の図1を参照すると、結合部位のアレイまたはクラスター24が形成された基体22を有するマイクロエレクトロニクス分子センサー20が示されている。基体22は、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムヒ素または他の半導体等の任意の数の物質を含み得る。図面の図2を参照すると、空間的に分散して1つのパターンを形成している複数の電極26a、26bおよび26cを有する1つの結合部位24がより詳細に示されている。このように、各々の電極26a、26bおよび26cは、この特定の実施態様においては、隣接する電極から横方向に間隔をあけて配置されており、基体22の主表面28からの高さは異なるものであることが分かる。
【００４３】
分子モデリングおよび実験データを通して、結合部位のトポロジーおよび電荷が、標的分子の相補的領域を選択的に認識し結合するのに必要な電気的および形態的特性をもたらすように調整されることは理解されるであろう。図2に最良に示されているように、タンパク質30（これは、そのタンパク質に特異的な規定の形状を有する）が、3つのナノ電極26a、26bおよび26cからなる所与のナノ電極クラスターに結合している。より完全に説明すると、各電極は僅かに異なる電気化学的特性を有し得るが、それは電荷および／または化学組成の差異によるものである。これらの個々の電気化学的特性は、タンパク質の溝（grooves）に存在するアミノ酸または原子の電気化学的親和性に適合するのみならず、溝自体の形状も補完するものである。したがって、適切な補完特性を有する分子が、電極間のギャップを架橋している「レセプター」24に結合した場合、電位の変化が生じる。この変化を適切な電気回路を通してモニターすることにより、標的分子の存在の指標を得ることができる。
【００４４】
本発明の最も好適な実施態様においては、結合部位24はナノスケールの形状寸法を有する。図2において表示されているとおり、主表面28から電極26bの頂部までの距離は1.9ナノメートルであり、電極26bの幅は0.7ナノメートルであり、電極26bと26cとの間の距離は1ナノメートルである。一般に、各電極は典型的には、高さは0.2〜約3ナノメートルであり、幅は約0.2〜約2ナノメートルである。本明細書においては、「ナノ電極」は、原子スケールならびにナノスケール構造、すなわち2Åから5ナノメートルのものを含むものとする。各クラスター24には、典型的には約2〜約8個の分離された電極が存在する。電極26a、26bおよび26cは、真性またはドーピングされたいくつかの材料、例えば金および白金および銅およびその他の電気金属等から形成され得る。金が特に好ましい。また、例えば酸化亜鉛で被覆された金、またはチオール基で被覆された金のように、1種類の材料で電極を形成し、その外部を異なる材料で被覆することも適当であり得る。
【００４５】
電極は、金で形成され得る小導電性領域またはワイヤによってそれぞれ独立して電源に接続され得る。図2Aには、電極26a、26bおよび26cにそれぞれ電気的に接続している個々の導電層34a、34bおよび34cが示されている。誘電層36は個々の導電層を電気的に分離させ、誘電シース38は個々の電極を電気的に分離する。種々の個々の電極には異なる電位をかけることができること、および、異なるクラスター由来の電極を、例えば層34a等の１つの層に電気的に連結することができることは理解されるであろう。CVD、熱成長、イオン注入等の従来の薄膜形成技術を用いて種々の層を形成できることも理解されるであろう。
【００４６】
近年、電気的「ワイヤ」が単一の原子から製造できることが示されている（例えばLeo Kouwenhovenによる総説"Single-Molecule Transistors", Science, Vol. 275, 1896-1897頁, 1997年3月28日を参照されたい。その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのワイヤは、多数の異なる方法でマイクロチップ製造工程の一部として、ナノ電極の付着の前に付着し得る。ナノ電極は走査型トンネル顕微鏡により直接的にチップ上に付着することができる（Kolbら、Science, Vol.275, 1097-1099頁, 1997年2月21日に記載の通り。その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる）。数多くの他のチップ製造方法（例えば種々の異種リソグラフィー技術等）が用いられ得る。
【００４７】
別の態様においては、ナノ電極は、いずれの電気的ワイヤまたは導電層にも接続されていない。この場合には、タンパク質または他の分子の結合は、単に個々のナノ電極クラスターの形状および化学的特性に依存するのみである。所与の分子の所与のクラスターへの結合の検出は、電気的なもの以外の手段、例えばDNAチップ技術のために用いられるものと同様の高精度X-Y位置蛍光リーダー、または共鳴によって行い得る。
【００４８】
ナノ電極がワイヤに接続されていない（すなわち「ライブ(live)」電極ではない）場合には、いくつかの用途においてはナノ電極は所与のクラスターにおいて相互接続されている（interconnected）。この場合には、クラスターは相互接続されたピーク（peaks）と溝（grooves）を含み、これらはより大きな構造（すなわち1ナノメートルから10ナノメートル以上）を形成するであろう。この構造体は、標的分子の実際の生物学的レセプターと正確に適合するか、または、分子全体を分子の3D形状の少なくとも1/3と適合する3次元「レセプター」にフィットできるように調整され得る。いくつかの例では、分子の全体形状に応じて、その構築されたレセプターは、標的分子の実際の生物学的レセプターに対応する部位を必ずしも含んでいなくてもよい。
【００４９】
分子のナノ電極レセプターへの結合または吸着のいくつかのタイプが起こり得るが、それはナノ電極の化学組成、電圧、測定されるべき化学物質に依存している。結合力には、共有結合、静電結合、水素結合およびファンデルワールス結合が含まれ得る。
【００５０】
要求される検出のタイプに依存して、個々のクラスターの個々のナノ電極は必ずしも異なった電気金属から成る必要はない。なぜなら、ナノ電極の空間的な分布および高さは両方とも変化させることができ、所与の用途での特定分子検出にはこれら2つの変数で十分なこともあり得るからである。いくつかの用途においては、各電極は、所与のクラスターにおいて選択的に荷電され得るものであり、それによってナノ電極の電気物理的特性を変化させることが可能である。
【００５１】
センサー全体は、コンピュータ制御操作を用いて構築することができる。ここで、ナノ電極のスペーシング、高さ、幅および組成は、選択された分子の3次元形状およびマッチする(matching)電気化学的特性に正確に対応するように調整され得る。さらに、所与の分子に対する所与のレセプターに対応するナノ電極クラスターの位置は、製造工程の間に決定されるので、この位置情報を用いることにより付着または結合を検出することができる。例えば、多数の異なるクラスターを有する大型ナノ電極アレイを構築し、溶液中での結合を可能とし、次いでアレイを、DNAチップと同様の方法により高精度X-Yリーダーで読みとることができる。ナノ電極のコンピューター制御での製造により、作成されるチップの同一のコピーもまた可能となる。
【００５２】
チップ表面上に構築される幾何学的構造体は、x線回折研究から得られた結晶化タンパク質表面のマッチするイメージと正確に対応するように作成できることも理解されるであろう。よって、ナノ電極アレイクラスターは、結晶学上のデータを用いて直接的に構築でき、そしてその結果得られるチップ上の表面は、所与のアレイ上でタンパク質特異的結晶化に好ましいものとなるであろう。
【００５３】
別の態様においては、複数の同一レセプターを同じチップ上に構築することが可能なので、この技術を、所与の分子を検出するためのみならず、同一のクラスター中の結合速度を測定することによりサンプル中に存在するこれらの分子の量を正確に評価するためにも使用することができる。
【００５４】
図3を参照すると、互いに向き合った、マイクロチャンネルまたはナノチューブ60を形成する2つの部分ナノ電極アレイが示されており、タンパク質70等の小さな分子のその内部の通過が可能である。タンパク質70が、電極74、78および82から構成されるレセプターの形状と適合する場合、タンパク質の物理的結合により、前記ナノ電極のすべてにおいて同時に検出され得る電気信号の一時的な微小変化（minute change）が生じるであろう。電気信号の強さは、例えば研究が必要な分子のキャリア溶液に導電体（conductant）を添加することによって変更可能である。一方、ナノ電極自体を小電流で荷電することができ、その微小電流は所与の分子の付着により変化するであろう。ナノ電極およびアナライトの電気化学的特性、温度および流速に依存して、結合はコンマ何秒しか持続しないか、またはそれ以上持続し得る。それ自体における持続時間は、もう一つの重要な変数であり、サンプル中に存在する分子のタイプの検出および定量に使用することができる。
【００５５】
いくつかの用途においては、マイクロチャンネル60は、測定するタンパク質の大きさに合う、種々の特定の大きさのチャンネルのネットワークの一部を形成することができる。これらのチャンネルの各々は、モレキュラーシーブが備えられていてもよく、それによりある特定の大きさのタンパク質または分子のみを通過可能としている。チャンネル自身もまた、分子を分離し、所与のクラスのタンパク質または所与の分子量の分子を測定するために特に作成されたナノ電極アレイを有する所与の検出チャンバー中へ分子を送達するための手段として機能し得る。この場合には、アレイの夫々が測定するタンパク質の大きさに対応した大きさのナノ電極を有する。このチャンネルのネットワークの一部として、特定の機能を有する特定のチャンバー（細胞溶解チャンバー等）を加えることができる。他のチャンバーは、必要に応じて用いられ得る特定の試薬で満たすことができる。
【００５６】
別の用途においては、マイクロチャンネル夫々には1個のみまたは２〜３個のナノ電極クラスターが設けられており、タンパク質混合物はそのチャンネルのそれぞれを通過するように流れる。次いで、各マイクロチャンネルにおける流速を制御するマイクロコントローラーまたはマイクロプロセッサーの助力により、各ナノ電極クラスター由来の信号を、以下の検出変数：タンパク質分離速度（タンパク質の大きさおよび電荷に基づく）および所与のクラスター各々の保持時間（分子の形状および電気化学的特性に基づく）の累乗を組み合わせて測定する。事実、所与の分子が所与のレセプターにマッチすればするほど、それはより長い間結合する。各々のナノ電極において電気的信号を精巧に制御および測定することは、（他の変数（サンプル流速、温度等）の制御と同様に）マイクロコントローラーまたはマイクロプロセッサーの助けがあってのみなされることは明白である。
【００５７】
図4を参照すると、DNAまたはRNAの直鎖状断片110の所与の塩基対間の距離に正確に一致するように変化させたスペーシングおよび電気化学的特性を有する電極90のナノアレイが、直線状マイクロチューブ100内に構築されている。この場合には、ナノ電極は、2つの変数のみ：DNAまたはRNAの特定の塩基対をマッチするナノ電極に位置特異的に結合するために好ましい精密なスペーシングおよび電気化学的組成（高さではない）を使用して構築される。ここで応用された原理は、DNAはマイクロチューブ内を流れる時には直線状分子として挙動することが知られていること；およびこの流速は正確に制御および測定することができることである。さらに、10個のDNA塩基対間の距離は正確に34Åであり、120に示されているように、ナノ電極は3.4Åの倍数正確に間隔をあけて配置することができる。ナノ電極のスペーシングおよび電荷および／または組成を変化させることにより、そして連続して配置されたナノ電極の導電率の変化を経時的に測定することにより、位置特異的ナノ電極の信号のタイミングに基づいて配列全体が作製される。次いで全DNA（またはRNA）配列が、マイクロチューブ中の流速を制御することもできるマイクロコントローラー（またはマイクロプロセッサー）の助力によって再構築される。
【００５８】
タンパク質変異体の分析
DNAの突然変異または他の変化によりタンパク質中のアミノ酸の置換が生じる。次いで、これらの置換によりタンパク質中のコンホメーション形状変化が生じ、非機能性であるか、または異なる特性を有するタンパク質が生じ得る。タンパク質の3次元（3D）構造は、X線結晶学または核磁気共鳴（NMR）に基づいて精密に推論できるので、タンパク質変異体の3D形状もまた同じ方法を用いて作製できる。このように、所与のクラスのタンパク質のタンパク質変異体の全スペクトルは、上記のナノ技術を用いて測定し、定量することができる。これは、各々のタンパク質変異体のコンホメーション変化が、所与のナノ電極クラスターの、ナノ電極の形状、分布および電気化学的特性を変化させることにより提示され得るためである。事実、アレイの構築はコンピュータ制御可能であり、対象のタンパク質（およびその変異体）の推定3D構造を、チップ上の全てのマッチするレセプターのマイクロ構造体（micro fabrication）にマッチさせる情報をリンクしている。これらの変異体を上記のように測定し、定量することにより、このアプローチは、直接的DNA配列決定の強力な代替法を提示する。というのは、発現される所与の遺伝子の可能性のある突然変異産物はすべてチップ上で直接測定することができるからである。他の利点は、このチップが完全に再利用可能であることである。さらに、単一のチップ上に構築可能である超高密度のナノ電極アレイが得られたので、多数の遺伝子に関するタンパク質変異体の全スペクトルを、同一チップ上で一度に測定できる。事実、技術の改善により、全ての実在するヒトタンパク質およびそれらの変異体は、理論的には1cm2の単一チップ上で測定可能であり、そのようなチップ上に構築できるレセプターの数は、理論的には10億を越えており、これは現存する技術のいずれをも1000倍上回る改良である。
【００５９】
タンパク質の分離
上述のとおり、分子の分離は非常に小さいチューブ（マイクロキャピラリー、マイクロチャンネルまたはナノチューブ）に前記分子を流すことによって行われ得る。ここで、より小さい分子は、より大きい分子（これはチューブの表面との摩擦および弱い結合相互作用により保持される）よりも速く移動する。得られた結果は、電気泳動と等価であるが、スピード、コストおよびマイクロキャピラリーの再利用性といった利点を有している。
【００６０】
図5を参照すると、サンプル投入ポート132および任意の試薬マイクロチャンバー134（それ自体は任意の投入ポート136に接続されている）に通じている長ループを有するマイクロチャンネル130が示されている。マイクロチャンネル130が生物学的分子を大きさと電荷で分離し、一方マイクロチャンバー134が外部の試薬もしくは溶液の選択的投入を可能にする。各々のマイクロチャンネル接合部（juncture）での流れおよびon/off位置は、外部マイクロポンプ（図示せず）によって、熱キャピラリー作用によって、または電位の変化によって、電気的に制御することができる。マイクロチャンバー134に到達後、アナライトはマイクロチャンバー138a、138b、138c続いて138d（各々は、大きさおよび密度が異なるナノ電極クラスターを有する種々の電極アレイを保持している）にうまく流れる。この特定の設計においては、ナノ電極アレイは、マイクロエレクトロニクスマルチプレックシング（micro-electronics multiplexing）または制御領域140（これはインターフェイス142に接続されている）のすぐ隣に設けられている。連続マイクロチャンバー内の連続ナノ電極アレイと反応した後、サンプルはポート146により排出される。マイクロチャンネルおよびマイクロチャンバーは、シリコン表面自体にエッチングしてもよく、ガラス、ダイヤモンド、プラスチック等の材料の表面に別に設けて、それをシリコン表面に取り付けてもよい。
【００６１】
この設計は、数多くの異なったやり方で変更可能であり、図5は、チップ上に設けることができるマイクロチャンネル、ナノ電極アレイおよびマイクロエレクトロニクスの多数の可能な組み合わせの一つのみを説明するものである。上記のとおり、分析される細胞またはウイルスの溶解を可能とするチャンバーをチップ上に含めることもできる。また、マイクロチャンネル中の、方向性のある流れを逆にすることができ、各々の接続しているマイクロチャンネルは電気的に選択的に開いたり閉じたりすることができることも示されるべきである。このように、試験が完了したとき、全システムを加熱してタンパク質を変性させることができ（および／またはナノ電極中の電位を逆転させることができ）、続いてシステムを溶液でフラッシュしてナノ電極アレイを洗浄し、チップを再利用することができる。
【００６２】
このように、完全な統合されたタンパク質分離および検出システムを単一チップ上に構築することができる。ナノ電極アレイ、マイクロチャンネルおよびマイクロコントローラー（またはマイクロプロセッサー）を組み合わせることの重要な面とは、分離時間（ポート132へのサンプル注入から最初の検出まで）および所与のナノ電極レセプター上の保持の長さが、個々のタンパク質若しくはタンパク質変異体の特徴づけのための重要な変数であるということである。例えば、このシステムは、既知のタンパク質、続いて既知のタンパク質の混合物を、試験されるサンプルを注入する前に注入することによって較正できる。所与のナノ電極レセプターに達するまでにかかった時間および異なった電気的レセプター上での結合の長さは特定のタンパク質（またはタンパク質変異体）に特異的であろうし、次いで各々のタンパク質についての信号特異的特性をメモリーに保存し、試験されるサンプルのものと比較することができる。
【００６３】
図5は統合化した設計を示しているが、タンパク質分離構成要素および電子的構成要素は外部に設置することもでき、チップは、インターフェイスを有する単一のチャンバー中に包合された単一のナノ電極アレイを有するシンプルなものであってもよいことは明らかである。次いで、このチップ（使い捨てでもよい）をより大きなモジュール中に上記構成要素とともに挿入することができる。また、以下に示すとおり、他の検出方法も用いることができ、それに従ってチップの設計も変更されるであろう。
検出
【００６４】
ナノ電極アレイ上での、アナライトの結合または吸着を検出できる方法はたくさんある。図6を参照すると、ナノ電極アレイ上での吸着による信号の検出のひとつの方法は、電気的信号によるものである。この場合には、所与のアレイの各々のクラスター中の1以上の電極が「ソース」160として用いられ、一方残りのクラスター165が「シンク（sink）」として用いられる。アナライト（タンパク質を指す）が吸着されると、それは電流（ピコアンペア）の流れを図6に示すように変化させる。電極は酸化物の層170によって絶縁されている。AC法を用いて、電流の望ましくない作用を回避することができる。
図７を参照すると、結合の検出のための第２の方法は、共鳴法を用いるものである。この方法においては、ナノ構造体が構築される。例えば、1ミクロン未満の次元でのナノプレート180が構築される。この構造体は支えのない自立構造（free standing）であるかまたは片持ちされている。ナノ電極レセプター24の同一のセットが、続いてこの表面に設けられる。この構造体は、MHzから低GHz領域において共鳴周波数を有するように設計されている。アナライトの流れがこれらの構造体を通過するために、それらがナノ電極構造体に相補的な構造を有している場合は、それらはカンティレバー（cantilever）上で長い時間を費やす。換言すれば、アナライト分子はナノプレートとの衝突する。いずれかの相補的な性質がアナライトと基体との間に存在するならば、アナライトは衝突の間、表面上でより長い時間を費やすであろう。このことは、構造体にレーザーダイオードを発光し、位置感受性フォトダイオードを用いて反射信号を検出することにより光学的に検出できる。フォトダイオード中のAC信号は構造体の共鳴反応を示す。信号が強ければ強いほど、結合した生物学的分子の濃度が（すなわち溶液中の分子の濃度が）高い。他の検出技術（例えば容量性（capacitive）、圧抵抗性（piezoresistive）、圧電性、電子トンネル（electron tunneling）等）もまた用いることができる。
【００６５】
構造体は、圧電要素を使用する機械的手段により、共鳴反応へ励起させることが出来る。この技術においては、ナノプレート構造体は、AC信号を用いて振動可能である圧電材料に取り付けられる。共鳴において構造体は、最大振幅で振動する。構造体はまた、正方波電力パルスを使用するダイオードレーザーをモジュレートすることにより、共鳴へと励起可能である。正方波には全てのフーリエ成分が含まれているので、構造体の共鳴周波数に相当する成分もまた存在するであろう。
【００６６】
これらのナノ電極は、幾何学的構造体上に非常に小さい熱質量（thermal mass）（例えば、ナノプレートは幾（many）ピコグラムまたはそれ未満のオーダーの熱質量を有する）で構築され得るので、それらをマイクロ秒からミリ秒の時間枠で加熱および冷却できる。この事実は、周期的な方式で、アナライトを吸着または脱着させるために利用可能である。しかしながら、表面とアナライトとの間に相補的構造が存在する場合には、脱着時間のスケールは異なるであろう。
【００６７】
外部検出器の使用
別の検出用途においては、サンプルと反応し得る状態となった全チップは、DNAチップと同様のやり方でX-Yレーザー中読み取り装置中に置かれる。この場合、チップは各々のクラスターの位置を正確に読み取ることを確実とするために、高度精密ホルダー中に取り込まれる。検出は蛍光によって、例えばクラスターに結合したサンプルを蛍光性分子もしくは標識抗体と反応させた後に行われてもよい。
【００６８】
検出はまた、レーザー脱着イオン化質量分析法（mass spectrometry）等の他の手段によって行われてもよい。
【００６９】
ナノ電極の構築
ナノ電極アレイは、ドーピングされた半導体基体上に、スキャンプローブを用いたナノリソグラフィー（nanolithography）により構築することができる。この方法においては、金属クラスターは、溶液からか、またはSTM/AFMチップからのフィールドエバポレーション（field evaporation）のいずれかにより付着される。チップと基体との間の電場は非常に高い（109V/m）ため、多くの金属をフィールドエバポレートすることができる。溶液においては、多くの金属を電気化学的に表面上に付着させることができる。半導体表面は、絶縁体となるよう酸化させることができる。
【００７０】
ナノメートルスケールの溝（trenches）および線を、溝を作る酸化物エッチング溶液中のSTMチップを使用して、半導体表面上に作成することができる。溝の深さは、その場所でチップによって費やされた時間とチップ上の電圧に依存する。このように、ナノ電極は付着によって構築可能であるのみならず、エッチングによっても構築可能である。溝はまた、上記の説明通り、タンパク質を分離するためのチャンネルを作成するために用いることが可能である。
【００７１】
ナノトランジスタをチップ中に直接構築して、検出を容易にし、検出器の密度を増加させることができることもまた注目されるべきである。ナノトランジスタは、チップ製造工程全体において、ナノ電極の付着の前に下層(sub-layer)として構築することができ、またはチップの隣接部分上に位置させることもできる。
【００７２】
上述の原理は、ナノ電極アレイのマイクロ製造および応用において可能である、幅広い用途を説明している。例えば、サンプルの投入（input）から、モニター等の外部装置へ送られた出力信号の検出までの全体システムは、単一チップ上に構築でき、このときマイクロチャンネル（サンプル分離および送達）、小型イオンポンプ、サンプル検出、内蔵型（built-in）マイクロコントローラー、温度制御のための方法等が用いられる。チップは測定装置（例えば医師の診察室またはフィールド検出器で利用されるもの）中に挿入できる。非常に大きなナノセンサーアレイが用いられた場合は、マイクロプロセッサーまたはいくつかのマイクロコントローラーを利用して、上述の機能を制御することが好ましい。いくつかの用途においては、大型アレイは外部レーザー読取装置と共に使用され得る。この場合、アレイはDNAチップと同様の方法で使用できる。このときチップ全体は、サンプル全体と反応させ、洗浄し、次いで外部読み取り装置中に挿入される。この方法を用いて、チップは便利なハンドリングカセットに構築されてもよい。
【００７３】
開示を完全とし、また明確とするために、特定の実施態様について本発明を記述したが、添付のクレームはそれらに限定されるものではなく、本明細書に記載した基本的な教示の範囲内に明らかに含まれ、当業者が思い付く全ての変更および別の構築を包含するものと解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、異なったナノ電極クラスターを示しているナノ電極アレイの遠近概略図である。
【図２】  図2は、タンパク質特異的な電気的レセプターおよびそれに適合するタンパク質の側面立面概略図である。
図2Aは、タンパク質特異的な電気的レセプターおよびそれに適合するタンパク質の側面立面断面図である。
【図３】  図3は、マイクロ流体工学チューブ内のナノ電極アレイの側面立面断面図であり、特定のタンパク質がそれに対応するナノ電極レセプター上に捕捉されたことを示している。
【図４】  図4は、DNAを検出するための直線状ナノ電極アレイを有するマイクロチューブの模式的側面立面断面図である。
【図５】  図5は、ナノ電極アレイを有する組み立てチップ、マイクロ流体工学送達システムおよび関連するエレクトロニクスの断面図である。
【図６】  図6は、ナノ電極レセプターの側面立面断面図であり、特定の分子が前記レセプターに結合したときに破壊もしくは改変された電場を示している。
【図７】  図7は、数個の同一のナノ電極クラスターを有するカンティレバーナノプレートの図である。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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