(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ，ｉｎｔ）領域及びａｔｔＰ領域（宿主染色体への組込み部位）と、
乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性領域と、
大腸菌(Escherichia coli)由来の複製開始領域と、
クローニング部位とを備えたことを特徴とする
ラクトバチラス・カゼイ菌の染色体への外来遺伝子の組込みを可能とするラクトバチラス・カゼイ菌用ベクター。
【請求項２】
次の化１に示した制限酵素認識切断部位の配列を備えたことを特徴とするラクトバチラス・カゼイ菌用ベクターｐＭＳＫ７４２。
【化１】
0003653345.tif 000011
【請求項３】
ラクトバチルス・カゼイに請求項２に記載のベクターｐＭＳＫ７４２を導入して得られる形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus casei) （以下、「Ｌ．カゼイ」と記す）菌の染色体上への、外来遺伝子の組み込みを可能とするベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、乳酸菌特にＬ．カゼイ菌を宿主とするシャトルベクターについて、いくつかの報告があるが、その殆どが、プラスミドとして形質転換するものであり、安定性の点では、満足すべきものではなかった。
【０００３】
一方、Ｌ．カゼイ・シロタ株である YIT9018株や YIT9029株は、広く、乳酸菌飲料や発酵乳において使用されているが、特に、抗腫瘍活性、血中コレステロール低下作用、血圧降下作用、抗潰瘍効果などの優れた生理作用を有していることが明らかになっている（特開昭５５−１１３７１８号公報、特開平４−５２３６号公報、特開平５−２５０５５号公報、特開平６−１１６１５５号公報）。
【０００４】
このような、Ｌ．カゼイ菌に、遺伝子組み換え技術を応用して、外来遺伝子を導入しようとする場合は、プラスミドベクターを利用するのが通常であった（特開平２−１２８６９２号公報、特開平３−２５９０８６号公報、特開平４−５８８９０号公報参照）。
【０００５】
しかし、プラスミドベクターでは、安定性に課題があり、さらに優れた方法が求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一方、Ｌ．カゼイ YIT9018株には、溶原ファージφＦＳＷの存在が知られている。φＦＳＷはゲノムサイズ４１．５ｋｂの環状順列構造をとるテンペレートファージであり、溶原化に際しては、キャンベルタイプの部位特異的組み換えによって、そのファージゲノムが染色体に組み込まれ、プロファージとなることが解明されている。
【０００７】
本発明は、従来の乳酸菌用プラスミドベクターの安定性の課題を解決することを目的とし、特にＬ．カゼイ YIT9029株において染色体への組込みを行う組込み型ベクターを得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るラクトバチラス・カゼイ菌用ベクターでは、Ｌ．カゼイYIT9018 株の溶原ファージφＦＳＷ由来のｉｎｔ領域及びａｔｔＰ領域と、
乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性領域と、
大腸菌(Escherichia coli)由来の複製開始領域と、
適当なクローニング部位とを備えたものである。
【０００９】
本発明のｉｎｔ領域とは、部位特異的組換え酵素（所謂インテグラーゼ(integrase) ）をコードする領域を指す。インテグラーゼは、Ｉｎｔタンパク質，ファージＤＮＡ挿入酵素等とも呼ばれ、ファージが宿主菌に感染後に生産するタンパク質の一つで、ファージＤＮＡの特定部位ａｔｔＰと宿主菌の染色体上の特定部位ａｔｔＢとの間で相互的な部位特異的組換えを起こし、ファージゲノムが菌染色体に組込まれるのに必要な酵素である。また、ｘｉｓ遺伝子産物と共にファージの切り出しにも働く。本発明においては、このｉｎｔ領域としてＬ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来のものが選ばれた。
【００１０】
また、ａｔｔＰ領域とは、宿主菌の染色体への組換え部位を指す。テンペレートファージ（溶原性ファージ）は宿主菌の染色体上の一定の部位（ａｔｔＢ）に組込まれる。例えばファージが宿主菌染色体に組込まれる場合に、環状のファージと染色体ＤＮＡとが、各々の付着部位を介して、組換えを起こし、８文字構造を生じた後、合一体を形成する。ａｔｔＰ領域はファージ側の組込み部位である。
【００１１】
薬剤耐性領域は、形質転換体の検出の際のマーカとして働く。従って、乳酸菌のみで機能する薬剤耐性領域と大腸菌でのみ機能する別の薬剤耐性領域とを各々有してもよく、乳酸菌と大腸菌との両者で機能する１つの薬剤耐性領域を有してもよい。
【００１２】
複製開始領域は、大腸菌由来のものが選ばれた。これは、外来遺伝子のベクター中への導入するは、大腸菌とそのベクター系（所謂、ＥＫ系）で行う。この場合、この複製開始領域は宿主菌である大腸菌内部での良好な複製が行われることを確実なものとしている。
【００１３】
クローニング部位は、外来遺伝子を挿入するための制限酵素の認識切断部位を指す。尚、外来遺伝子の挿入によって、例えば前述のｉｎｔ領域，ａｔｔＰ領域，薬剤耐性領域，複製開始領域を分断しない部位が選ばれる。
【００１４】
好ましいラクトバチラス・カゼイ菌用ベクターとして、図１のｐＭＳＫ７４２を、好ましい形質転換体としてラクトバチルス・カゼイにこのベクターｐＭＳＫ７４２を導入したものを開示する。尚、このｐＭＳＫ７４２は生工研菌寄第１５６９５号として、生命工学研究所に平成０８年０６月２０日付けで寄託されている。
【００１５】
このｐＭＳＫ７４２は、4031bpの大きさで、Ｌ．カゼイYIT9018 株の溶原ファージφＦＳＷ由来のｉｎｔ領域及びａｔｔＰ領域を有している。薬剤耐性領域として、Enterococcus faecalis 由来のエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子を有している。このＥｍ耐性遺伝子は大腸菌と乳酸菌との両者で機能する。また、クローニング部位として、制限酵素 XbaＩ，BspHＩ， KpnＩ， HpaＩ等の認識切断部位を有している。
【００１６】
【発明の実施の形態】
Ｌ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷにおいて、ファージゲノム上での組み換え部位は、 1.3kb XhoＩＤＮＡ断片上に限定されていることが知られている（文献１：M.Shimizu-Kadota & N.Tsuchida. J.Gen.Microbiol. 130: 423-431,1984.) 。本発明では、安定性を高めるため、プロファージの染色体組込み型のプラスミドベクターを開発することにした。
【００１７】
本発明においては、Ｌ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷについて、先ず、ファージゲノムの 1.3kb XhoＩＤＮＡ断片を含む約3.8kb の領域のＤＮＡ塩基配列を決定し、オープンリーディングフレーム(ORF) の検索を行った。
【００１８】
その結果、分子量最大45K の蛋白質をコードできるＯＲＦが見いだされた。既知タンパク質のアミノ酸配列との類似する領域を検索したところ、各種のファージ、トランスポゾンの部位特異的組み換え酵素と、全体または部分的に高い類似性が見られたので、このＯＲＦがφＦＳＷのインテグラーゼ(integrase) をコードしていると考え、ｉｎｔと命名した。
【００１９】
次に、ファージゲノム上の組み換え部位（ａｔｔＰ:1.3kb XhoＩＤＮＡ断片上に存在）及び、染色体上の組み換え部位（ａｔｔＢ) を明らかにするために、φＦＳＷ溶原菌におけるプロファージ組込部位（ａｔｔＬとａｔｔＲ）を含む領域をＴａｉｌ−ＰＣＲ法を用いて増幅し、そのＤＮＡ塩基配列を明らかにした。
【００２０】
続いてａｔｔＢを含む領域についてもａｔｔＬとａｔｔＲから推定されるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、ＤＮＡ塩基配列を明らかにした。ａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢの構造を比較すると、４０塩基の相同領域が見いだされ、これをコア配列と名付けた。この部分で部位特異的組み換えが起きていることは明らかである。ａｔｔＰコア配列は、ｉｎｔ遺伝子下流に存在した。
【００２１】
φＦＳＷのｉｎｔ、ａｔｔＰ領域を含むＤＮＡ断片を、 YIT9029株で複製できず同株で発現するエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子を持つプラスミドｐＭＳＫ７２１上に挿入後、テトラサイクリン耐性遺伝子を除去して、プラスミドｐＭＳＫ７４２を得た。そのＤＮＡを同株細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。このプラスミドｐＭＳＫ７４２はＥｍ耐性の形質転換体を約１０3 ／μｇ・ＤＮＡの頻度で得たが、ｉｎｔを欠損させるとＥｍ耐性の形質転換体を得ることができなかった。従って、Ｅｍ耐性の形質転換体を得るためには、ｉｎｔが必須であることが明らかとなった。
【００２２】
Ｅｍ耐性形質転換体におけるａｔｔＢ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造をＰＣＲ法等により調べた。その結果、調べた全ての形質転換体において、φＦＳＷ溶源菌の場合と同様のａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造を確認したが、ａｔｔＢ構造は確認できなかった。
【００２３】
従って、上記組換えプラスミドは、φＦＳＷゲノムの染色体への組込みによるプロファージ形成と同様の機構によって YIT9029株染色体上に組込まれることが示された。更にテトラサイクリン耐性遺伝子を加えた形のプラスミドでも、同様に染色体への組込みが見出されたので、φＦＳＷのｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を持つプラスミドは YIT9029株において染色体への組込み型ベクターとして使えることが明らかとなった。
【００２４】
【実施例】
前述したことを実施例で詳しく説明する。
１．材料と方法
(1) 使用菌株と培地
Ｌ．カゼイ YIT9029（φＦＳＷ非溶源菌）及び YIT9018（φＦＳＷ溶源菌）株はＭＲＳ培地（Difco,USA)を用いて３７℃で好気条件で生育させた（液体培地では静置）。必要な場合は培地に２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを加えた。
【００２５】
(2) ＤＮＡの調製と操作
Ｌ．カゼイ YIT9029株より染色体ＤＮＡの抽出は、文献２（M.Shimizu-Kadota, T.Sakurai & N.Tsuchida. Prophage origin of a virulent phage appearing on fermentations of Lactobacillus casei S-1. Appl. Environ. Microbiol. 45: 669-674, 1983. ）に示された方法によって行った。φＦＳＷファージＤＮＡも、この文献に示した方法でファージ粒子より調製した。大腸菌(E.coli)からのプラスミドＤＮＡ抽出は、プロメガ(Promegasa) 社製のキット「WizardTM Minipreps DNA Purification System」を用いた。クローニング等のＤＮＡ操作は文献３(J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989) を参照して行った。
【００２６】
(3) 形質転換法
Ｌ．カゼイ YIT9029株の形質転換は文献４(M.Shimizu-Kadota, H.Shibahara-Sone & H.Ishiwa. Shuttle plasmid vectors for Lactobacillus casei and Escherichia coli with a minus origin. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3292-3300, 1991.) に示すエレクトロポレーション法により行った。尚、この方法でYIT9029 で複製できるpH4611のＤＮＡをYIT9029 に導入すると常に１０5/μg ・DNA以上の頻度で形質転換体が得られる。E.coliの形質転換はTOYOBO社製のJM109 コンピテントセルを用い、同社プロトコルに従って行った。
【００２７】
(4) ＤＮＡ塩基配列の決定とその解析。
塩基配列を決定すべきＤＮＡがプラスミドの場合はそのまま用いた。また、ＰＣＲ産物の場合は、直接行うか宝酒造社製SpinBind DNA Recovery Systemを用いてアガロースゲルより精製した。プライマーは、１７マー以上のものを適宜合成した。反応は「ABI PRISMTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PerkinElmer社製）」を用い、373S DNA Sequencerによって行った。塩基配列の解析にはソフトウエア開発社製「GENETYX ver.9.0」 と「GENETYX-CD バイオデータベースソフトウエア ver.29.0」、及びデータベースとして「National Center for Biotechnology Information社製Entrez Release 21.0」を用いた。
【００２８】
(5) ＰＣＲ法
YIT9029株やその形質転換体におけるａｔｔＢ，ａｔｔＬ，ａｔｔＲの検出には、各々ＩＮＴ２５とＩＮＴ２７，ＩＮＴ２０とＩＮＴ２７，ＩＮＴ２１とＩＮＴ２５プライマーを用いた。このＩＮＴ２０，２１，２５，２７プライマーの詳しい塩基配列は、後述の配列表の配列番号１又は配列番号２に示した塩基配列の一部である。ＩＮＴ２１は配列番号１の塩基番号（存在位置）2501-2520 までの２０塩基のプライマーであり、ＩＮＴ２０は配列番号１の塩基番号（存在位置）3144-3163 までの２０塩基の相補鎖のプライマーである。また、ＩＮＴ２５は配列番号２の塩基番号（存在位置）884-903 までの２０塩基のプライマーであり、ＩＮＴ２７は配列番号２の塩基番号（存在位置）1463-1482 までの２０塩基の相補鎖のプライマーである。
【００２９】
被検菌一晩培養液を当量の１M Bis-Tris(pH7.2) で洗浄後当量の蒸留水に懸濁したもの１８μｌに生化学工業社製 N-acetyl-muramidase SG(500 μg/ml) を１μｌと蒸留水８．５μｌを加えて１時間反応後、Toyobo社製の KOD polymerase キットを用いて（全量 50 μl ）反応（98℃15秒、60℃５秒、74℃30秒を３０回反復）させた。ＤＮＡ塩基配列既知の部分と未知の部分の境界領域の構造を増幅できるＴａｉｌ−ＰＣＲ法は、宝酒造社製「LA PCR in vitro Cloning Kit 」を用いて行った。
【００３０】
２．結果とその検討
(1) φＦＳＷゲノム上の部位特異的組換えに関与する領域のＤＮＡ塩基配列
φＦＳＷが溶原化する時、キャンベルタイプの部位特異的組換えによってそのファージゲノムがφＦＳＷ非溶原菌染色体に組込まれプロファージとなることは、サザンハイブリダイゼーションにより周知であるとされている。
【００３１】
図２はＬ．カゼイYIT9029 のテンペレートファージφＦＳＷのゲノム制限酵素地図である。唯一の SalＩ切断点を起点として地図上時計回りに位置をｋｂで示す。部位特異的組換えを起こすファージゲノム上の位置は、図２に示す制限酵素地図上で１３．８ｋｂと１５．１ｋｂに存在する２つのXhoI切断点の間に限定されている（文献１）。この領域におけるＤＮＡの塩基配列を決定しオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の検索とその翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列の類似領域の検索から（データは示していない）、プロファージの染色体組込みに関与する領域として更に制限酵素地図上で位置を示す数字（ｋｂ）が大きくなる方向が考えられた。
【００３２】
そこで、更に、そのXhoI断片の約２．５ｋｂに亙ってＤＮＡ塩基配列を決定した。ＤＮＡ塩基配列を決定した領域を図２の太線で示す。その結果を後述する配列表の配列番号１に示す。
【００３３】
配列番号１はφＦＳＷＤＮＡのｉｎｔ，ａｔｔＰ領域とその近傍のＤＮＡ塩基配列及び推定されるｉｎｔ遺伝子産物を含んでいる。ｉｎｔ遺伝子開始コドンとして可能性のある３箇所の[Met] が確認された。第１の[Met] 位置は、塩基番号（存在位置）1509-1511 にあり、第２の[Met] 位置は、塩基番号（存在位置）1716-1718 にあり、第３の[Met] 位置は、塩基番号（存在位置）1776-1778 にある。これらのすぐ上流には、各々リボソームＲＮＡと結合する可能性のあるポリプリン領域（ＲＢＳ）が確認された（塩基番号（存在位置）1493-1499,1704-1708,1764-1770 ）。
【００３４】
ｉｎｔ遺伝子終止コドンは塩基番号（存在位置）2691-2693 の「TGA」 である。また、ｉｎｔ遺伝子下流には、逆方向反復塩基配列（ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ）が確認された（塩基番号（存在位置）2700-2714 と2716-2729 に対して2753-2764 と2770-2784 ）。尚、配列番号１に示した塩基配列のうち、主な制限酵素名及びその認識切断部位は、次の通りである。 PvuＩ（塩基番号（存在位置）1-6 ），BssHII（塩基番号（存在位置）493-498,2826-2831 ），EcoRＶ（塩基番号（存在位置）1503-1508 ），BamHＩ（塩基番号（存在位置）1770-1775 ）， XhoＩ（塩基番号（存在位置）2311-2316,2455-2460,3844-3849 ）， Eco52Ｉ（塩基番号（存在位置）2866-2871 ）， XmnＩ（塩基番号（存在位置）2880-2889 ）， FspＩ（塩基番号（存在位置）3757-3762 ）。また、後述するが、ａｔｔＰコア配列は、塩基番号（存在位置）2857-2896 である。
【００３５】
また、塩基番号（存在位置）2501-2520 までの２０塩基のプライマー（GCTCCCTCACATCCGTATCC）をＩＮＴ２１プライマーとし、塩基番号（存在位置）3144-3163 までの２０塩基の相補鎖のプライマー（GCATAAATCAGCCGTTTGCG）をＩＮＴ２０とした。
【００３６】
(2) ｉｎｔ遺伝子
ＤＮＡ塩基配列を決定した領域についてＯＲＦの検索とそれらの翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列の類似領域の検索を行った。図３は配列番号１のｉｎｔ及びａｔｔＰを含む PvuＩ(1) -XhoＩ(3849)領域におけるＯＲＦの検索結果を示す説明図である。図において各フレームで長い縦棒は終止コドン、短い縦棒は開始コドン（ATG 又はGTG ）を表わしている。上３段の翻訳方向は図で左から右を示す。２００塩基以上のＯＲＦには名称（ＯＲＦ１〜８，ｉｎｔ）を付した。主な制限酵素切断点と、ａｔｔＰコア領域も示した。
【００３７】
図３に示すように、塩基番号1509番から2690番目までに大きなＯＲＦが見出された。このＯＲＦの翻訳産物（配列番号１に示す）と既知蛋白のアミノ酸配列について類似領域を検索した。その結果、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) のファージL54aのプロファージ組込みを担う部位特異的組換え酵素（インテグラーゼ）（文献５；Z.H.Ye & C.Y.Lee. Nucleotide sequence and genetic characterization of staphylococcal bacteriophage L54a int and xis genes. J.Bacteriol. 171:4146-4153,1989. ）と全体に亙り高い類似性が見られた。
【００３８】
図４は推定されるφＦＳＷのインテグラーゼ蛋白（第１の[Met] （塩基番号（存在位置）1509-1511 ）より翻訳開始の場合として示す）と、スタフィロコッカス・アウレウスのファージL54aのインテグラーゼ蛋白のアミノ酸配列の比較を示す説明図である。図において、「＊」は同一アミノ酸、「．」は性質の類似しているアミノ酸を示す。また、保存性の高いドメイン(domain)１とドメイン２の領域を四角で囲った。
【００３９】
また、図５は各種ファージ、トランスポゾンのインテグラーゼに見出せる保存性の高い２つの領域（ドメイン１及びドメイン２）のアミノ酸配列の比較を示す説明図である。図において、４つの代替不可のアミノ酸を＊で、特に保存性の高いアミノ酸にアンダーラインを付した。また、φＦＳＷのアミノ酸配列でコンセンサス配列と一致する場合はアンダーラインを付した。
【００４０】
図５に示すように、各種ファージやトランスポゾンの部位特異的組換え酵素integrase の間では、ドメイン１，ドメイン２と呼ばれる２つの保存性の高い領域が見出されているが（文献６；L.Dupont, B.Bizent-Bonhoure, M.Coddeville, F.Auvray & P.Ritzenthaler, Characterization of genetic elements required for site-specific integration of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus bacteriophage mv4 and construction of an integration proficient vector for Lactobacillus plantarum. J.Bacteriol. 177: 586-595,1995 ）、このＯＲＦの翻訳産物にもその領域に合致するアミノ酸配列が見出された。
【００４１】
そこでこのＯＲＦがφＦＳＷのインテグラーゼをコードしていると考え、ｉｎｔと命名した。ｉｎｔの翻訳開始点としては、すぐ上流のリボソームＲＮＡ結合領域の有無と後述のプラスミド挿入の実験から配列番号１に示す第１，第２，第３の何れかの[Met] が考えられた。各々の場合に推測されるＩｎｔ（ｉｎｔ遺伝子産物）の分子量は第１の[Met] を翻訳開始点とすると４５ｋ，第２の[Met] を翻訳開始点とすると３７ｋ，第３の[Met] を翻訳開始点とすると３５ｋであった。また推定等電点はいずれの場合も９．８であり、塩基性でＤＮＡに結合できる蛋白であることを示唆している。また、翻訳領域のすぐ下流にはステム−ループ(stem-loop) 構造を取ることのできる逆向き反復配列が存在した。
【００４２】
ＯＲＦ８（Ｎ末端側の塩基配列は未決定）の翻訳産物は、エンテロコッカス(Enterococcus)属細菌の自己溶菌酵素（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase，Accession No.P37710,P39046）や、リステリア(Listeria)属細菌の細胞侵入性に関与する蛋白（P60,Accession No.Q01837,Q01839,Q01838 ）といった、グラム陽性細菌の細胞壁溶解に関与する蛋白との部分的な類似が見られた。
【００４３】
図６はＯＲＦ８のコードできる蛋白とエンテロコッカス・フェカリス由来の自己溶菌酵素（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase) のアミノ酸配列との相同性を示す説明図である。図において、「＊」は同一アミノ酸、「．」は性質の類似しているアミノ酸を示す。尚、図において決定されているＤＮＡ塩基配列から推定できる最初のアミノ酸を１とした。図に示す通り、ＯＲＦ８はφＦＳＷが増殖する時に宿主の細胞壁を溶解する機能を持つ酵素の構造遺伝子である可能性があることが確認された。
【００４４】
(3) ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢ領域の染色体の単離と構造
φＦＳＷが溶原化するとき、キャンベルタイプの部位特異的組換えによってそのファージゲノムがφＦＳＷ非溶原菌染色体上の特定部位に組込まれプロファージとなることが知られている。即ち、ファージ制限酵素地図上の１３．８ｋｂと１５．１ｋｂのXhoI切断点間の特定の部位（ａｔｔＰと命名）、及び染色体上の特定の部位（ａｔｔＢと命名）で切断と再結合が起こるはずである。
【００４５】
そこで、ａｔｔＰ及びその近傍のＤＮＡ塩基配列は決定されているので、溶原菌（YIT9018 ）におけるａｔｔＰ相当部分（ａｔｔＲとａｔｔＬと命名）をＴａｉｌ−ＰＣＲ法を用いて単離し、そのＤＮＡ塩基配列を調べた。その結果を図７に示す。また、ａｔｔＲとａｔｔＬのＤＮＡ塩基配列から作製したプライマー（ＩＮＴ２５(GATGGAAACCGTTGTCTGGG)と、ＩＮＴ２７（TCGCGATGTCGTTTATCCCC））を用いて、φＦＳＷ非溶原菌であるYIT9029 におけるａｔｔＢ領域の存在をＰＣＲ法により確認した。確認されたａｔｔＢのＤＮＡ塩基配列も次の図７に示した。尚、YIT9029 にはａｔｔＲ、ａｔｔＬの構造は確認されなかった。
【００４６】
図７はａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢに見出される相同領域とその近傍のＤＮＡ塩基配列とを比較した説明図である。ａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢの構造を比較すると、４０塩基の相同領域が見出され、コア配列（四角で囲んだ）と名付けた。この部分で部位特異的組換えが起きていることは明らかである。このコア配列の長さは他のキャンベルタイプの組込みを起こすファージの場合よりかなり長い点に特徴がある。また、制限酵素認識部位等、パリンドローム構造が見出される。また、図においてコア配列の左側もかなり塩基配列の類似度が高い。
【００４７】
配列番号１に示した通り、ａｔｔＰコア配列は、ｉｎｔ遺伝子近傍の逆向き反復配列のすぐ下流に存在していた（配列番号１；塩基番号（存在位置）2857-2896 ）。これは、他のキャンベルタイプの組込みを起こすファージの場合と共通することが確認された。
【００４８】
一方、φＦＳＷ非溶原菌であるYIT9029 におけるａｔｔＢ領域を含むＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号２に示す。尚、配列番号２に示した塩基配列のうち、主な制限酵素名及びその認識切断部位は、次の通りである。 PstＩ（塩基番号（存在位置）1-6 ）， XmnＩ（塩基番号（存在位置）1190-1199 ）， Eco52Ｉ（塩基番号（存在位置）1208-1213 ）。また、ａｔｔＢコア配列は、塩基番号（存在位置）1183-1222 である。更に、前述のＩＮＴ２５プライマーと同じ塩基配列（２０塩基）が、塩基番号（存在位置）884-903 に、また、ＩＮＴプライマーの相補鎖と同じ塩基配列（２０塩基）が塩基番号（存在位置）1463-1482 に、更に、後述するＯＲＦａｔｔＢの終止コドンは塩基番号（存在位置）1257-1262 の「TAA・TAG 」である。
【００４９】
また、図８は配列番号２のＯＲＦ検索の結果を示す説明図である。図において各フレームで長い縦棒は終止コドン、短い縦棒は開始コドン（ATG 又はGTG ）を表わしている。上３段の翻訳方向は図で左から右を示す。更に、この領域の大部分に亙るＯＲＦ（ＯＲＦａｔｔＢと命名、Ｎ末端領域のＤＮＡ塩基配列は未決定）の翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列について類似領域を検索した。図９は配列番号２のＯＲＦ（ＯＲＦａｔｔＢ）の翻訳産物とバシラス・ステアロサーモフィルス由来のグルコース 6- ホスファターゼ・イソメラーゼＡ及びＢの蛋白とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【００５０】
ＯＲＦａｔｔＢとBacillus stearothermophilus 由来の Glucose 6-phosphate isomerase A及びB (Accession No.P13375,P13376)と、全体に亙り高い類似性が見られた（図９）。プロファージの組換えが起こった際、このＯＲＦａｔｔＢは、翻訳産物のＣ末端の１アミノ酸がＰｒｏからＬｅｕに変化するだけでａｔｔＲ上に殆どが保存されていた。従って、例えGlucose 6-phosphate isomerase などＯＲＦａｔｔＢが宿主の生育にとって必須の遺伝子であっても、φＦＳＷの溶原化に際して失活しない可能性が示唆された。
【００５１】
(4) ラクトバチラス・カゼイ菌用ベクター
プラスミドｐＭＳＫ７２１（文献４(M.Shimizu-Kadota, H.Shibahara-Sone & H.Ishiwa. Shuttle plasmid vectors for Lactobacillus casei and Escherichia coli with a minus origin. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3292-3300, 1991.) ）は、Ｌ．カゼイ YIT9029株で複製できず、 YIT9029株で発現する薬剤耐性遺伝子［Enterococcus faecalis 由来のエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子］を持つ。このプラスミドｐＭＳＫ７２１に、φＦＳＷ由来のｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を含むＤＮＡ断片を導入して、プラスミドｐＭＳＫ７４２を得た。
【００５２】
図１はプラスミドｐＭＳＫ７４２の制限酵素地図である。図に示す通り、ｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を含むＤＮＡ断片としてEcoRV(1506)-FspI(3759)の部分を持つ。得られたプラスミドｐＭＳＫ７４２をＬ．カゼイ YIT9029株細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。
【００５３】
その結果、ｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を含むＤＮＡ断片として、PvuI(3)-FspI(3759)及びEcoRV(1506)-FspI(3759)の部分を持つプラスミドはＥｍ耐性の形質転換体を約１０3/μｇ・ＤＮＡの頻度で得た。一方、ｉｎｔを中断するBamHI(1771)-FspI(3759)の部分を持つプラスミドでは、Ｅｍ耐性の形質転換体を得ることができなかった。従って、Ｅｍ耐性の形質転換体を得るためにはｉｎｔが必須であることが明らかとなった。
【００５４】
従って、ＯＲＦ１〜６はＥｍ耐性形質転換体を得るためには不要である。尚、ｐＭＳＫ７４２においてはｉｎｔ遺伝子の翻訳開始点として(1) の[Met] を用いたとしても、EcoRV 切断後ベクターと連結することによりリボソームＲＮＡ結合領域になり得る配列(....'5GGGGGATCCGTCGAATCATG3'...) が見出せる。
【００５５】
Ｅｍ耐性形質転換体におけるａｔｔＢ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造をＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列決定により調べた。その結果、調べた全ての形質転換体において、φＦＳＷ溶原菌の場合と同様のａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造を確認したが、ａｔｔＢ構造は確認できなかった（データは示していない）。従って、ｐＭＳＫ７４２等のプラスミドは、φＦＳＷゲノムの染色体への組込みによるプロファージ形成と同様の機構によってYIT9029 染色体への組込みによるプロファージ形成と同様の機構によってYIT9029 染色体上に組込まれることが示された。
【００５６】
ｐＭＳＫ７４２にEnterococcus faecalis 由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を連結した型のプラスミドでも、同様に染色体への組込みが見出されたので（データは示していない）、ｐＭＳＫ７４２はYIT9029 において染色体への組込み型ベクターとして使えることが明らかとなった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、外来遺伝子を挿入したプラスミド自体が宿主菌の染色体上に組込まれるので、安定性が高いという効果がある。特に、Ｌ．カゼイ YIT9029株において染色体への組込みを行う組込み型ベクターを得ることができるという効果がある。
【００５８】
【配列表】
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【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＭＳＫ７４２の制限酵素地図である。
【図２】テンペレートファージφＦＳＷの制限酵素地図である。
【図３】配列番号１のＯＲＦの検索結果を示す説明図である。
【図４】φＦＳＷのインテグラーゼ蛋白とファージL54aのインテグラーゼ蛋白とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図５】各種ファージ及びトランスポゾンのインテグラーゼに見出せる保存性の高い２つの領域（ドメイン１及びドメイン２）のアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図６】ＯＲＦ８でコードされた蛋白とエンテロコッカス・フェカリス由来の自己溶菌酵素（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase) とのアミノ酸配列との相同性を示す説明図である。
【図７】ａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢに見出される相同領域とその近傍のＤＮＡ塩基配列とを比較した説明図である。
【図８】配列番号２のＯＲＦ検索の結果を示す説明図である。
【図９】配列番号２のＯＲＦ（ＯＲＦａｔｔＢ）の翻訳産物とバシラス・ステアロサーモフィルス由来のグルコース 6- ホスファターゼ・イソメラーゼＡ及びＢの蛋白とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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