(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina) 。
【請求項２】
クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ・ミヤシタ・エト・チハラ（Acaryochloris marina Miyashita et Chihara)株。
【請求項３】
アカリオクロリス属に属し、クロロフィルｄ生産能を有する微細藻類を培養し、得られる培養物からクロロフィルｄを採取することを特徴とするクロロフィルｄの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）及び該微細藻類を用いたクロロフィルｄの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロロフィルは、植物や藻類、細菌に含まれる緑色のポルフィリン系色素であり、石けん、油脂、砂糖菓子、酒類、化粧品、香水、皮革製品などの着色剤として広く用いられているほか、フィトール（Phytole ）生産原料、写真感光剤、ガソリンに添加するアンチノック剤、消臭剤、医薬品など多種多様な工業製品原料として用いられている。これらの用途は、クロロフィルａおよびｂにおいて開発されてきたものであるが、クロロフィルｄにおいても同様の用途がある。また、クロロフィルｄは他のクロロフィル色素とは異なる色調を有している。
【０００３】
これまでクロロフィルｄの生産には、大型紅藻中に微量に含まれるクロロフィルｄを抽出生成する方法、クロロフィルａを過マンガン酸カリウムによって酸化し、酸化生成物から抽出分離する方法が使用されてきた。
しかし、前者では、海藻中に含まれているクロロフィルｄ量が極めて微量であること、また、その存在が不安定であることから工業的に有用なクロロフィルｄ量が得られなかった。また、後者においては、クロロフィルｄを効率的に生産することが困難であった。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロロフィルｄを生産する微細藻類アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）及び該微細藻類を用いたクロロフィルｄの生産方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行い、パラオ諸島沿岸において、共生藻類を有する群体ホヤ（Lissoclimun patella)を採取し、このなかからクロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻アカリオクロリス・マリナ・ミヤシタ・エト・チハラ(Acaryochloris marina Miyashita et Chihara）を分離し、かかる微細藻類を用いてクロロフィルｄを採取することに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina) 、及びアカリオクロリス・マリナに属し、クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ・ミヤシタ・エト・チハラ（Acaryochloris marina Miyashita et Chihara)株（以下「本株」という）である。
【０００７】
さらに、本発明は、アカリオクロリス属に属し、クロロフィルｄ生産能を有する微細藻類を培養し、得られる培養物からクロロフィルｄを採取することを特徴とするクロロフィルｄの生産方法である。
なお、本株は（株）海洋バイオテクノロジー研究所において Acaryochloris marina として保存管理されている。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、広く太平洋海域から採取された海洋生物又は海水から分離され、クロロフィルｄ生産能を有する微細藻類及び該微細藻類を用いたクロロフィルｄの生産方法である。
まず、本株の藻類学的特徴について説明する。
【０００９】
１．本株の選抜手段
本発明者は、パラオ諸島沿岸において、共生藻類を有する群体ホヤ（Lissoclinum patella ）をスキンダイビングによって採取した。このホヤをメスで半分に切断し、共生藻類が密集している場所にピペットを刺し込み、共生藻類液を採取した。あらかじめ孔径0.2μm のメンブランフィルターでろ過した外洋海水を透明容器に入れて栄養塩を添加した培地に、共生藻類液を添加し、25℃、12時間の蛍光燈の光照射、12時間の暗条件のサイクル下に置いた。２ヶ月後、培養容器の底に出現した微細藻類コロニーを分離し、希釈法を用いて純粋培養株を確立した。培養株の含有する脂溶性色素をメタノールで抽出し、分光光度計による吸収スペクトル測定、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における保持時間測定等によりクロロフィルｄ生産能を有する株を選抜し、本株を得るに至った。
【００１０】
２．本株の藻類学的性質
Ａ．形態的性質
(1) 細胞は、球形からやや楕円形で、直径1.5〜2.0μm である。単細胞で、単一または凝集体を作り、鞭毛を持たず運動性を示さない（図１）。なお、図１は本株の光学顕微鏡写真である。
(2) シースで覆われている細胞も、観察される。特に群体を形成している細胞塊中の細胞は、シースに覆われていることが多い（図１）。
(3) 細胞内には、核がない。また、膜に包まれた又は膜に結合した細胞内小器官は存在しない（図２Ａ；）。図２Ａは電子顕微鏡写真であり、グルタルアルデヒド−オスミウム酸２重固定のものである。また、図の右下のバーは0.5 μm を意味する。
【００１１】
(4) チラコイド膜は、細胞の周縁に沿って数枚から十数枚べったり押しつけられたように存在しており、葉緑体膜は存在しない（図２Ｂ）。図２Ｂは電子顕微鏡写真であり、グルタルアルデヒド−過マンガン酸カリウム２重固定のものである。また、図の右下のバーは0.5 μm を意味する。
(5) チラコイド膜上には、フィコビリゾームのような蛋白質顆粒は存在しない（図２Ａ、Ｂ）。
(6) 細胞壁はグラム陰性を示す。
(7) カルボキシソーム様の細胞内顆粒が存在する（図２Ａ、Ｂ）。
【００１２】
Ｂ．含有色素
クロロフィルｄ、クロロフィルａ、ゼアキサンチン、α−カロテンの主要色素および他の微量色素を有している（図３）。
【００１３】
Ｃ．生理学的性状
(1) 光合成能：        光合成による光独立栄養生育ができる。
(2) 窒素固定能：      窒素源非存在の培養液では生育ができない。
(3) ビタミン要求性：  なし。
(4) 生育ｐＨ域：      ｐＨ6.5〜10（至適生育ｐＨ８）（図４）。
(5) 生育温度域：      20〜35℃（至適生育温度30℃）（図５）。
(6) 生育塩濃度域：    0.5〜５％ NaCl（至適生育塩濃度３％）（図６）。
なお、図４、図５及び図６の縦軸は、植藻後10日目の培養液の懸濁度（720nm)である。
【００１４】
Ｄ．生殖様式
本株は、無性生殖で増殖する。有性生殖は観察されていない。
３．本株の属及び種の決定
本株の分類学的特徴を示すものに色素組成がある。本株は、球形の原核藻類で主要光合成色素としてクロロフィルｄ、クロロフィルａ、ゼアキサンチン、α−カロテンを含有する。これまでに知られている原核藻類には藍色植物門、原核緑色植物門がある。藍色植物門は主要光合成色素としてクロロフィルａ、β−カロテン、フィコビリン蛋白質を有することを特徴とし、原核緑色植物門は主要光合成色素として、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、β−カロテンを有してフィコビリン蛋白質を含まないことを特徴としている。本株の色素組成は、この両者のどちらにも属し得ない。
【００１５】
以上より、本株は主要光合成色素としてクロロフィルｄ、クロロフィルａ、ゼアキサンチン、α−カロテンを含む原核藻類であることを特徴とする新門新網新目新科新属新種藻類であることから、本株をアカリオクロリス・マリナ・ミヤシタ・エト・チハラ（Acaryochloris marina Miyashita et Chihara)と命名した。
【００１６】
４．本株の生産するクロロフィルｄの分光学的性質
本株の生産するクロロフィルｄは、メタノール中で400、455及び697nm の吸収ピーク（図７Ａ）、アセトン中で688、448及び393nm の吸収ピーク（図７Ｂ）、ジエチルエーテル中で686、445 及び390nm の吸収ピーク（図７Ｃ）を有しており、分光学的性質は報告されているクロロフィルｄのものと一致する。
【００１７】
５．本株の生産するクロロフィルｄの構造
本株の生産するクロロフィルｄの構造は、クロロフィルａの２位のビニル基がフォルミル基に置換された構造と一致する（図８）。
次に、本株を用いたクロロフィルｄの生産方法について説明する。
上記クロロフィルｄは、本株を培養し、得られる培養物からクロロフィルｄを採取することにより得ることができる。
ここで、「培養物」とは、培養懸濁液、培養藻類若しくはその破砕物又は培養上清液のいずれをも意味するものである。
【００１８】
本発明に用いる培養液は、藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、ビタミン、微量金属塩等を含む培地が挙げられる。この培地に本株を植藻し、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で12時間の光照射、12時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。培養温度は、25〜30℃で行う。なお、培養７〜60日後の藻体を回収し、色素成分を測定する。
【００１９】
培養によって得られた藻体を同量のメタノールに懸濁し、遠心分離後上清を得る。沈殿した細胞を再懸濁、遠心分離及び５〜30分マイナス20℃で保存を繰り返すことにより上清液を得ることができる。
回収された上清液にジオキサンを添加した後、冷却した蒸留水を沈殿物が生成するまで徐々に添加し、沈殿物生成後５〜30分マイナス20℃で保存し、次に、遠心分離して上清を除く。沈殿を80％アセトンに溶解し、遠心分離により不溶物質を除去し、上清にジオキサンを添加した後、上記と同様に蒸留水の添加、冷凍保存及び遠心分離を繰り返し、上清を除く。沈殿を吸引乾燥し、クロロフィルの粗抽出物が得られる。
【００２０】
粗抽出物からのクロロフィルｄの精製は、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等）を適宜組み合わせることにより行うことができる。例えば、DEAE-Sepharose CL-6Bを担体とするカラム、及びSepharose CL-6B を担体とするカラムの２つのカラムクロマトグラフィーを用いて行なうことができる。
【００２１】
クロマトグラフィーにより溶出したクロロフィルｄ分画を分取し、吸引乾燥して最終的にクロロフィルｄを得る。
得られたクロロフィルｄについては、液体クロマトグラフィー分析にかけ、さらにメタノール、アセトン、ジエチルエーテルに溶解して吸収スペクトルを測定することにより、純度分析を行うことができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
〔実施例１〕
岩手県釜石湾より採取した海水を偏平なガラスフラスコに入れ、これを加圧滅菌した。これに孔径0.2μmのメンブランフィルターでろ過した濃縮液を最終濃度が表１に示す濃度になるように添加し、液体培地とした。
【００２３】
【表１】
0003725916.tif 000002
【００２４】
これに本株を植藻し、通気性のある栓をし、液中に空気を通気し、二酸化炭素の供給と攪拌を行なった。このときフラスコの周囲から蛍光灯で約100μEm-2s-1の強度の光を12時間照射し、12時間暗くして培養した。温度は、28℃付近に調節した。培養10日後の藻体を回収し、色素成分を測定した。
その結果、１mlＰＣＶ（packed cell volume; 充填細胞容量）あたり、10.3mgのクロロフィルｄが含まれていた。
【００２５】
〔実施例２〕
大量培養し遠心分離によって回収し冷凍保存しておいた藻体、約25mlＰＣＶを、同量のメタノールに懸濁後、遠心分離して上清を除いた。沈殿に、メタノール約50mlを加え細胞をよく懸濁した後、−20℃の冷凍庫内に５分放置後、再度よく懸濁してさらに５分間、−20℃の冷凍庫内に放置した。これを遠心分離して、沈殿が混ざらないように上清を採取した。沈殿には、さらに25mlのメタノールを加えてよく懸濁し、遠心分離後沈殿が混ざらないように上清を採取し、前記上清と混合した。これに約12mlのジオキサンを添加した後、あらかじめ氷上において冷却しておいた蒸留水を徐々に添加し、沈殿物が生成した時点で添加を止め、−20℃の冷凍庫中に保管した。10分後、遠心分離して上清を除いた。沈殿を50mlの80％アセトンに溶解し、遠心分離により不溶物質を除去し、上清に7.5mlのジオキサンを添加した後、再度、あらかじめ氷上において冷却しておいた蒸留水を徐々に添加し、沈殿物が生成した時点で添加を止め、−20℃の冷凍庫中に保管した。10分後、遠心分離して上清を除いた。沈殿は吸引乾燥し、乾燥下、冷暗所で保管した。これをクロロフィルの粗抽出物とした。
【００２６】
粗抽出物からのクロロフィルｄの精製は、DEAE-Sepharose CL-6Bを担体とするカラム、及びSepharose CL-6B を担体とするカラムの２つのカラムクロマトグラフィーを用いて行なった。以下にその詳細を述べる。
(1) カラム担体の前処理とカラムの調製
DEAE-Sepharose CL-6B（Pharmacia Fine Chemical 社製）の懸濁液50mlを蒸留水で洗浄し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0)に懸濁して酢酸型にした後、蒸留水で洗浄し、順次アセトン−水（１：１）、アセトンで洗浄した。さらにアセトンで洗浄した後アセトンに懸濁した。これを内径２cmのガラスカラムに高さが2.5cmになるよう充填し、DEAE-Sepharose CL-6Bカラムとした。
【００２７】
Sepharose CL-6B カラムは、Sepharose CL-6B(Pharmacia Fine Chemical 社製）の懸濁液100mlを蒸留水で洗浄し、順次アセトン、アセトン−ヘキサン（１：２）、アセトン−ヘキサン（１：２）、ヘキサン−２−プロパノール（10：１）、キサン−２−プロパノール（20：１）に懸濁、ろ過し、ヘキサンに懸濁した。これを内径２cmのガラスカラムに高さが30cmになるように充填し、Sepharose CL-6B カラムとした。
【００２８】
(2) 分離
クロロフィルの粗抽出物を３mlアセトンに溶解して、DEAE-Sepharose CL-6Bカラムにかけ、アセトンでキサントフィル色素を溶出した後、移動相溶媒をアセトン−メタノール（７：３）に替えて、クロロフィルを溶出した。溶出したクロロフィルを吸引乾燥し、ヘキサンに溶解した。これを Sepharose CL-6Bカラムにかけ、ヘキサンで展開し、クロロフィルｄ分画（最も緑色の濃い分画）を分取し、吸引乾燥してこれをクロロフィルｄとした。
【００２９】
この方法によって、25mlＰＣＶの藻体から120mgのクロロフィルｄが得られた。
得られたクロロフィルｄの純度分析における液体クロマトグラフィー分析結果を図９に示した。この分析においてクロロフィルｄ純度95％（ＨＰＬＣ面積比）を得た。さらに、このクロロフィルｄサンプルをメタノール、アセトン、ジエチルエーテルに溶解して吸収スペクトルを測定した。
その結果を図７に示す。これら吸収ピークの波長値は、クロロフィルｄの吸収特性値として報告されている値と一致した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、クロロフィルｄ生産能を有する新規微細藻類アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）が提供される。また、本発明によりクロロフィルｄが得られる。
クロロフィルｄは、クロロフィルａやクロロフィルｂとは異なる色調を有することから、石けん、油脂、砂糖菓子、酒類、化粧品、香水、皮革製品などの着色剤として広く用いることができる。フィトール（Phytole ）生産原料、写真感光剤、ガソリンに添加するアンチノック剤、消臭剤、医薬品など多種多様な工業製品原料としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本株の顕微鏡写真（生物の形態）。
【図２】本株の電子顕微鏡写真（生物の形態）。
【図３】ＨＰＬＣの結果を示す図。
【図４】本株の生育ｐＨ域を示す図。
【図５】本株の生育温度域を示す図。
【図６】本株の生育塩濃度域を示す図。
【図７】本株の生産するクロロフィルｄの吸収スペクトルを示す図。
【図８】クロロフィルｄの化学構造式を示す図。
【図９】精製クロロフィルｄのＨＰＬＣの結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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