(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピキア・パストリス（Pichia  pastoris）KCTC  0500BP。
【請求項２】
酵母細胞で活性なプロモータ配列と、該プロモータに連結され、ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列とからなるプラスミドベクターを製造する段階、
ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有するピキア・パストリスKCTC 0500BPを前記ベクターで形質転換させる段階、そして
該形質転換された酵母細胞を培養する段階、
を含んで成る、微生物からラクトフェリンポリペプチドを生産する方法。
【請求項３】
前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列が、ラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドの融合ペプチド形態をコードする配列である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列がラクトフェリンポリペプチドを単独でコードする配列である、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野及び背景技術
ラクトフェリン（lactoferrin ）は、糖タンパク質であって、殺菌性、成長促進、鉄分運搬活性、免疫調節及び膜の受容体に対する特異的反応性など、生理・生物学的な特徴を有する。
【０００２】
ヒトラクトフェリンの構造は、681 個のアミノ酸残基から構成される。2 個のローブ（lobe）中、1 個のローブのドメイン間に鉄分と結合する鉄分結合部位が存在する。そして、ラクトフェリンに由来するペプチドまたはポリペプチドは、抗菌性及び安定性面でラクトフェリン自体よりも一層優れた性能を有していると報告されている（米国特許5,304,633 ；5,571,697 ）。よって、ラクトフェリンポリペプチドは静菌効果、細胞増殖促進効果又は炎症阻害効果などの特性を有するため、幼児用の調剤などの添加剤として、または、動物飼料若しくは医薬剤としての応用が期待されている。
【０００３】
ラクトフェリンポリペプチドは、主に牛乳の乳清から分離されていた。最近、ポリペプチドを遺伝工学的な方法により大量生産しようとする研究が行われている。Ward氏及びPiddington氏は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）でグルコアミラーゼプロモータを利用して、組換ラクトフェリンを2g／l の量で発現させた（Ward、P.P.等、Bio ／Technology、13:498-503(1995)) 。Qianwaは、サッカロマイセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）のケラチン（chelatin）プロモータを利用して、酵母インベルターゼとヒトラクトフェリンとの融合タンパク質形態に発現させる方法により、1.5 〜2.0mg ／l の組換ヒトラクトフェリンを得たと報告している（Qianwa Liang等J.Agric. Food Chem. 41:1800-1807(1939)）。サッカロマイセス・セレビシェにより合成された組換ラクトフェリンは糖単位が付加され、その収率は一定ではなかったと考察されている。遺伝工学的技法を利用してラクトフェリンまたはその抗菌ペプチド誘導体を生産する場合、発現されたラクトフェリンまたは抗菌ペプチドは宿主微生物の成長を阻害するか、若しくは、宿主微生物を死滅させることがある。そこで、抗菌ペプチドを融合タンパク質形態に発現させる方法が報告されている。米国特許5,571,697 には、ラクトフェリンに由来する抗菌ポリペプチドをアスペルギルで融合ペプチドとして発現させたと記載されてある。
【０００４】
発明の概要
本発明はラクトフェリンポリペプチドを微生物から大量生産する方法を提供する。
本発明はラクトフェリンポリペプチドを微生物から単独で大量生産する方法を提供する。
本発明はラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する新規の微生物株を提供する。
本発明はラクトフェリンポリペプチドを生産する微生物株を提供する。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明者等は、大韓民国チュンチョン道地域で採取した醤油、味噌及びワインなどの試料からラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する株を探索し、その中から優れたラクトフェリンポリペプチド耐性株を選定して、株を同定した。
【０００６】
本明細書において、特別な限定がない限り、ラクトフェリンポリペプチドは、ラクトフェリン、該ラクトフェリンに由来する抗菌ペプチドまたは抗菌ポリペプチドの全てを意味する。なお、ラクトフェリンの起源は特に限定されず、例えば、ヒト、ウシまたはブタなど、多様な哺乳類動物から由来される。
【０００７】
本発明の微生物はラクトフェリンポリペプチドに対して極めて耐性であるため、該ラクトフェリンポリペプチドは本発明の微生物により融合タンパク質として又はペプチド自体として製造されうる。
【０００８】
更に、本発明の微生物はラクトフェリンポリペプチドの大量生産だけでなく、宿主細胞の増殖遅度の低下又はそれを殺生することに基づき大量生産が困難とされたその他の抗菌ペプチドの大量生産にも利用できる。
【０００９】
本発明は更に微生物からラクトフェリンポリペプチドを大量生産する方法に関連し、この方法は：
酵母細胞で活性なプロモータ配列と、該プロモータに連結されてラクトフェリンポリペプチドをコードする配列とからなるプラスミドベクターを製造する段階、
該ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する酵母細胞を前記ベクターで形質転換させる段階、そして
該形質転換された酵母細胞を培養する段階、
から成る。
【００１０】
本発明に係る酵母細胞は、サッカロマイセス、アスペルギルス、ピキア及びカンジダ属の細胞から選ばれうるが、ピキア属細胞が好ましい。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記ラクトフェリンポリペプチドをコードする配列は、他のペプチドに融合された融合ペプチドまたはラクトフェリンポリペプチドに幾つかのアミノ酸が付加された配列をコードする配列、または、ラクトフェリンポリペプチドのみをコードする配列であってよい。ラクトフェリンポリペプチドと同一のポリペプチドをコーディングするなら、改変配列も利用できうる。
【００１２】
また、本発明は、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子を包含するプラスミドベクターを包含するピキア・パストリス細胞に関するものである。
【００１３】
本明細書の実施例で使用された全ての制限酵素及びその他の酵素はBoehringer  Mannhein  Biochemical 社製を利用し、オリゴヌクレオチドプライマはInvitrogen社製から入手し、アミノ酸、酵母窒素ベース（YNB ）、酵母抽出物、ペプトン及びグルコース等の培地構成成分はDifco 社製を利用し、ヒトラクトフェリン及びその他のタンパク質電気泳動等に使用される試薬はSigma 社製を利用した。
【００１４】
また、形質転換には、E.コリTop10F' 及び本発明に係る菌株ピキア・パストリスSJW-28が使用された。
【００１５】
なお、本明細書に記載された培地の組成は次のようである。
・YM培地：酵母抽出物0.3%、麦芽抽出物0.3%、ペプトン0.5%、デキストロース1%、寒天2%。
・YM-L培地：YL培地1ml 当たりにラクトフェリン−ペプシンの加水分解物1mg を添加した培地。
・YPD 液体培地：酵母抽出物1%、ペプトン2%、デキストロース2%。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態に対し、図面を用いて説明する。
【００１７】
実施例１  ラクトフェリンポリペプチドに対して耐性を有する宿主微生物の選別
先ず、ワイン及び醤油などの試料をYM-L培地に塗り付けてラクトフェリンポリペプチドに対して抵抗性を有する微生物を1 次選別した。
【００１８】
次いで、ラクトフェリンポリペプチドに対する2 次抗菌力を検証するために、H.Wakabayashi 氏(Hiroyuki Wakabayashi 等、J.Food protection. 55(4):238-240.6(1992)) の方法を施した。即ち、前記1 次選別された株を入れた培地上に、ラクトフェリン加水分解物を浸した紙ディスクを載置して培養した後、透明ゾーンの形成可否を観察した。このとき、前記ラクトフェリン加水分解物は、ラクトフェリン1mg ／pH2 のグエン酸緩衝液1ml をペプシン（10unit／ml）により37℃の温度下で4 時間の間処理して得た。このようにしてラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗力の優れた菌株を選別し（図1 ）、SJW-28と命名した。次いで、PI-CHE  kit 及びN.J.W. Kreger-Van Rij. 1987. The yeasts; a taxonomic study third revised and enlarged edition, Elsevier に基づくその他の微生物同定方法を利用して同定を行った。この株（SJW-28）は、1998年7 月8 日付で、大韓民国大田広域市ユソン区オウン洞52番地所在の生命工学研究所付設遺伝子銀行（KCTC）に寄託し、寄託番号KCTC  0500BPを付与された。
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
実施例２  ヒトラクトフェリンポリペプチドのサブクローニング
図2 に示された方法により、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子を包含する発現ベクターを製造した。即ち、下記のプライマA （forward ；35mer ）及びB （backward；30mer ）を利用して、ヒトラクトフェリン遺伝子が入っているpRL100（North Dakota State University, Dep. of Biochemistry, Molecular Biology Laboratory ）でポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を行ってラクトフェリンポリペプチド遺伝子を得た。ここで、前記プライマA 及びB は、ヒトラクトフェリン塩基配列中、システインのジスルフィド結合を包含する次のような配列を増幅するようにデザインした。
【化１】
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【００２２】
pRL100に由来するラクトフェリンポリペプチド遺伝子配列及びアミノ酸序列は次のようである。
【化２】
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【００２３】
最終的に増幅されたラクトフェリンポリペプチド遺伝子配列及びアミノ酸序列は次のようである。
【化３】
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【００２４】
以上のように増幅されたラクトフェリンポリペプチド遺伝子及びpPIC9 （Invitrogen社製）をSnaBＩ及びEcoRＩでそれぞれ処理した後、それらを連結して発現ベクターpPIC9 −LFP を得た。次いで、pPIC9 −LFP をE.コリ（E.coli）Top10F' に形質転換させた。アンピシリンが入っている培地に塗り付けて成長するコロニーを形質転換体として選別した。
【００２５】
実施例３  SJW-28によるヒトラクトフェリンポリペプチドの生産
Chang 氏（Chang, D氏、Guide to electroporation and electrofusion, Academic Press. p501 (1992) ）の方法により、エレクトロンポレーションしてSJW-28にpPIC9 −LFP を形質転換させた。即ち、SJW-28をYPD 液体培地でOD6001.3〜1.5 まで培養した後、培養液500ml を遠心分離してペレットを集めて100ml のYPD に再懸濁させた後、pH8.0 のHEPES （N-（ヒドロキシエチル）ピペラジン-N' （2-エタン- スルホン酸））及びジチオスレイトールをそれぞれ20mM、25mMになるように処理して30℃で15分間反応させ、更に、1Mのソルビトール0.5ml に溶解させた後、40μl を取ってSaI Ｉで切ったpPIC9 −LFP100mgと一緒に、予め冷却させたギャップキュベット（gap cuvette ）に入れて氷の中で5 分間反応させた後、1500V 、25mAでエレクトロポレーションさせた。エレクトロポレーションを行った後、直ちに冷たい1Mのソルビトール750 μl を入れて、YM培地に100 μl ずつ塗り付けた。次いで、YM培地で成長する形質転換体のゲノムDNA を精製し、前記プライマA 及びB を使用してPCR 反応させて、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子が挿入された菌を最終選別した。
【００２６】
ここで、前記形質転換体が生産するラクトフェリンポリペプチド遺伝子序列及びアミノ酸序列は次のようである。
【化１】
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【００２７】
前記最終選別された形質転換体をYPD 培地でOD6001.3〜1.5 まで培養した後、LB寒天培地にE.コリJB  109 を均等に塗り付けた培地上に、前記形質転換体培養液を浸した紙ディスクを載置させて培養した後、透明ゾーンの形成可否を観察し、その結果、抗菌活性があることを確認した（図3 ；M ：pPIC9 に形質転換されたSJW-28、1 ：形質転換体、2 ：形質転換体）。
【００２８】
実施例４  SJW-28による韓牛ラクトフェリンポリペプチドの生産
既知のラクトフェリンのアミノ酸序列に基づいて、次のようなプライマを作成した。
【化５】
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【００２９】
韓牛ラクトフェリンのcDNAを鋳型として用いるPCR 反応を行って、韓牛ラクトフェリンポリペプチド部分が包含された220bp 程度のDNA 断片を得た。韓牛ラクトフェリンポリペプチド遺伝子及びpPIC9 （Invitrogen社製）をそれぞれXho Ｉで処理した後、それらを連結して発現ベクターpKLFC を得た。該pKLFC をE.コリTop10F' に形質転換させ、アンピシリンが入っている培地に塗り付けて成長するコロニーを形質転換体として選別した。制限酵素処理及びPCR 反応により、前記韓牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA が正方向に入ったプラスミドを選別及び分離して、配列を確認した結果、報告された牛ラクトフェリン遺伝子中の一部の序列とほぼ類似することが分かった。ここで、本発明で得た韓牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA 序列と既知の牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA 序列とを比較すると次のようである。塩基の異なる部分に下線を付した。
【化６】
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【００３０】
前記実施例3 に記載された方法により、韓牛ラクトフェリンポリペプチドのDNA が正方向に入ったプラスミドをピキア・パストリスSJW-28にエレクトロポレーションにより形質転換させた。前記正方向プライマ及び逆方向プライマを使用してPCR 反応を行って、ラクトフェリンポリペプチド遺伝子の挿入された株を最終選別した。前記最終選別された形質転換体をYPD 培地でOD6001.3〜1.5 まで培養した後、LB寒天培地上の試験菌に接種して均等に塗り付けた培地上に、前記形質転換体培養液を浸した紙ディスクを載置させて培養した後、透明ゾーンの形成可否を観察し、その結果、抗菌活性があることを確認した。その結果を図4 （A ）〜（F ）に表す。ここで、図4 （A ）はストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）KCTC 3065 、図4 （B ）はシュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aerogenosa）KCTC 2004 、図4 （C ）はエンテロバクター・アエロゲノス（Enterobacter aerogenos）KCTC 2190 、図4 （D ）はエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109 KCTC 2427 、図4 （E ）はサルモネラ（Salmonella）、図4 （F ）はエッシェリヒア・コリo157:H7 、に対する抗菌活性をそれぞれ示したものである。
なお、図4 （A ）〜（F ）において、C はSJW-28、3 及び6 は形質転換体をそれぞれ示したものである。
【００３１】
本発明に係る方法を適用すると、ラクトフェリンポリペプチド及びその他の抗菌性ペプチドを微生物から大量生産し得るという効果がある。
【００３２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係る微生物のラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写真である。
【図２】  本発明で使用された発現ベクターの製造方法を示した概略図である。
【図３】  本発明に係るヒトラクトフェリンポリペプチドを発現させた形質転換体のラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写真である。
【図４】  （A ）〜（F ）、本発明に係る韓牛ラクトフェリンポリペプチドを発現させた形質転換体のラクトフェリンポリペプチドに対する抵抗性を示した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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