(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応させ、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を独立に検出することを特徴とする１，５−ＡＧの測定方法。
【請求項２】
酵素（Ｅ1 ）としてグルコースデヒドロゲナーゼ、酵素（Ｅ2 ）としてピラノースオキシダーゼをそれぞれ用い、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）の指標としてＮＡＤＨを検出し、グルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）の指標として過酸化水素を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糖尿病の診断マーカーである１，５−アンヒドログルシトール（以下、１，５−ＡＧと略記する）の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースは、糖尿病の診断マーカーとして古くから知られている。特に血糖値の測定は糖尿病診断あるいは治療効果の判定にもっとも頻繁に行われる測定項目であり、酵素法、電極法など種々の測定方法が実用化されている。
【０００３】
一方、１，５−ＡＧは、ヒト髄液、血漿、血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において著しい濃度低下を来たすことが報告されている化合物であり（赤沼安夫、戸辺一之：日本内科学会誌、８０巻、１１９８〜１２０４頁、１９９１年）、近年、糖尿病の診断マーカーとして使用されている物質である。
【０００４】
従来の１，５−ＡＧの測定は、ガスクロマトグラフィー法によって行われていた（検査と技術、２１巻、No. ６、４０７〜４１２頁、１９８２年）。しかしながら、この方法は、被検液の処理として１，５−ＡＧのラベル化が必要である上に、測定に長時間を要し、多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。
【０００５】
また、最近ピラノースオキシダーゼという酸化酵素を利用して１，５−ＡＧを定量する方法が開発された（特公平５−４１２３８号公報）。しかしながら、この方法では、ピラノースオキシダーゼがグルコースに対しても反応するため、血漿を検体とする場合には、血漿中に共存する多量のグルコースを除去するための前処理が必要であり、操作が煩雑であった。
【０００６】
特開昭６３−２９４７９９号公報には、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試料を液体クロマトグラフィーで処理してこれらを分離し、ピラノースオキシダーゼを固定化したバイオセンサーを用いて、両者を同時検出する方法が開示されている。しかしながら、この方法では、グルコースおよび１，５−ＡＧを分離するための特別な分離カラムや、ピラノースオキシダーゼの固定化といった、煩雑でコストのかかる工程が必要であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、かかる実情に鑑み、従来よりも簡単かつ低コストで１，５−ＡＧを測定することができる、酵素法による１，５−ＡＧの測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
酵素法による１，５−ＡＧ測定がグルコース共存下で難しい理由は、１，５−ＡＧのみに特異的に反応する酵素が見い出されていないからである。しかし、グルコースのみに反応する酵素、およびグルコースと１，５−ＡＧの両者に反応する酵素はいずれも知られており、これらを組み合わせることにより、グルコース除去という前処理なしで非常に簡便に１，５−ＡＧを測定することができる。
【０００９】
酵素反応は、酵素をＥ、基質をＳ、生成物をＰとすると下記式の反応に従って進む。
【００１０】
【式１】
0003670687.tif 000002
この反応において、Ｓ1 のみを基質とする酵素Ｅ1 と２種類の基質Ｓ1 およびＳ2 を基質にする酵素Ｅ2 を同じ系で反応させたとき、それぞれの基質が各酵素に対して過剰に存在すれば次式の各反応は、独立に進むと考えられる。
【００１１】
【式２】
0003670687.tif 000003
いま、Ｐ1 、Ｐ2 、Ｐ3 の生成速度をそれぞれＶ1 、Ｖ2 、Ｖ3 、各反応のミカエリス定数をＫm1、Ｋm2、Ｋm3、最大速度をそれぞれＶmax1、Ｖmax2、Ｖmax3とすると、各々の酵素反応速度式は、Michaelis-Menten式から次式＜１＞’、＜２＞’、＜３＞’にと書き表される（［Ｘ］はＸのモル濃度を表す）。
【００１２】
【式３】
0003670687.tif 000004
故に、［Ｓ1 ］は、＜１＞’式から、［Ｓ1 ］＝Ｋm1・Ｖ1 ／（Ｖmax1−Ｖ1 ）と求められ、また＜２＞、＜３＞の生成物Ｐ2 、Ｐ3 を共通の検出系で測定すれば、Ｖ2 ＋Ｖ3 が測定でき、
【００１３】
【式４】
0003670687.tif 000005
から、［Ｓ2 ］を算出できる。従って、＜１＞、＜２＞、＜３＞の３つの素反応について、あらかじめＫm1、Ｋm2、Ｋm3、Ｖmax1、Ｖmax2、Ｖmax3を決定しておき、同時反応系において、Ｖ1 とＶ2 ＋Ｖ3 を独立に測定することができれば、Ｓ1 、Ｓ2 共存系において各々の濃度がわかることになる。
【００１４】
本発明は、上記の考え方を発展させたものであり、従来達成できなかった、グルコースと１，５−ＡＧが共存する試料中の各々の濃度を測定することができる画期的な方法を提供するものである。
【００１５】
すなわち、本発明による１，５−ＡＧの測定方法は、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応させ、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を独立に検出することを特徴とするものである。
【００１６】
本発明方法において、酵素（Ｅ1 ）としてグルコースデヒドロゲナーゼ、酵素（Ｅ2 ）としてピラノースオキシダーゼをそれぞれ用い、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）の指標としてＮＡＤＨを検出し、グルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）の指標として過酸化水素を検出するが好ましい。
【００１７】
本発明方法において、以下に示すように、酵素（Ｅ1 ）とグルコースの酵素反応速度式（１）、酵素（Ｅ2 ）とグルコースおよび酵素（Ｅ2 ）と１，５−ＡＧの各々の酵素反応速度式（２）（３）のミカエリス定数Ｋm11 、Ｋm21 、Ｋm22 、および最大速度Ｖmax11 、Ｖmax21 、Ｖmax22 をあらかじめ求めておき、生成物（Ｐ1 ）の生成速度Ｖ11および生成物の合計（Ｐ2 ）の生成速度Ｖ21＋Ｖ22を測定することによって、（４）式および（５）式から、グルコースおよび１，５−ＡＧの濃度を算出する方法である。また、一般的に、酵素反応では、反応液のｐＨ、イオン強度、温度などの種々の条件によつ反応速度が変化するので、１，５−ＡＧの濃度算出式（５）にしかるべき補正係数を乗ずることによって、１，５−ＡＧの濃度を算出してもよい。
【００１８】
【式５】
0003670687.tif 000006
本発明方法において、クルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素には、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４７）ヘキソキナーゼ（ＥＣ２，７，１，１）、グルコキナーゼ（ＥＣ２，７，１，２）などが用いられ、グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素としては、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１０）、ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１１）などが用いられる。また、これらの酵素の比活性は高いほど定量にとって良好であることは言うまでもないが、必ずしも最高純度のものを要求するものではない。上記酵素の組み合わせとしては、後述の実施例から明らかなようにグルコースデヒドロゲナーゼとピラノースオキシダーゼが良好であるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明方法において、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素とグルコースとの反応の結果生じる生成物の検出系としては、グルコースデヒドロゲナーゼの場合には、例えば、生成するＮＡＤＨの３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法がある。また、ヘキソキナーゼあるいはグルコキナーゼを用いる場合には、生成するグルコース−６−リン酸をさらにグルコース−６−−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＰと反応させることによって生成するＮＡＤＰＨの３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法がある。一方グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素とグルコースおよび１，５−ＡＧとの反応の結果生じる生成物の検出系としては、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１，１−３−１０）、ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１，１−３−１１）を用いる場合には、例えば生成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび種々の過酸化水素検出試薬と反応させ、比色定量する方法がある。また、生成する過酸化水素の代わりに消費する酵素量を任意の方法で測定しても良い。また、上記グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素と、グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素とによる生成物の検出を吸光度を用いて測定する場合には、各々の生成物の測定波長において互いに干渉しない組み合わせ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを用いるＮＡＤＨを検出し、ピラノースオキシダーゼを用いメチレンブルーを検出するという組み合わせが極大吸収波長が大きく異なるため望ましい。
【００２０】
本発明に用いる緩衝液の例には、リン酸緩衝液、Tris、MopsなどのGoodの緩衝液などが挙げられ、これらの緩衝液のｐＨは、酵素反応の最適ｐＨ領域、好ましくは、５〜８に調整される。反応温度は、十分な酵素活性が得られかつ酵素の失活の恐れが少ない２０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。
【００２１】
また、本発明において定量しようとする試料は、グルコースと１，５−ＡＧが共存しているものであるならば、なんら制限されず、一般的に体液と呼ばれる血漿、血清、尿、髄液などが挙げられる。また、体液中に共存する蛋白質を除去した試料なども用いられる。
【００２２】
以下に実施例を示し本発明をより詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
実施例１
＜グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた時のグルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmax の測定＞  メルコテストGlucose キット（関東化学（株）、ＬｏｔＮｏ．Ｄ３０３０）を用い、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmax を以下のように測定した。Ｄ（＋）−グルコース（試薬特級、和光純薬（株）、ＬｏｔＮｏ．ＡＰＧ４６８２）をダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．２５、０．５０、１．００、２．００、５．００および１０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メルコテストGlucose キットの酵素／補酵素を付属の緩衝液で規定量に溶解した。上記各濃度のグルコース溶液３ｍｌに酵素／補酵素液０．１ｍｌを添加し、３５０ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪拌下タイムスキャンした。上記各グルコース濃度での反応速度をグルコース濃度に対して、Lineweaber-Burk プロットし（図１）、このグラフの直線の傾きと縦軸切片から、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコースとの酵素反応のＫm11 を０．０１５６、Ｖmax11 を０．０７９９ｍＭ／ｍｉｎと決定した。
【００２４】
＜グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素としてピラノースオキシダーゼを用いた時のグルコースおよび１，５−ＡＧとの酵素反応のＫm 、Ｖmax の測定＞
Ｄ（＋）−グルコースをダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．２５、０．５０、１．００、２．００、５．００、１０．００および５０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１，５−ＡＧ（生化学用、和光純薬（株）、ＬｏｔＮｏ．ＴＷＱ５０１９）をダブルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．２５、０．５０、１．００、２．００、５．００および２０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。ピラノースオキシダーゼ酵素液として、ピラノースオキシダーゼ“ＴＡＫＡＲＡ”（３．７７Ｕ／ｍｇ）（宝酒造（株）、ＬｏｔＮｏ．１３ＴＡＤＹ（Ｉ））ペルオキシダーゼわさび製（１００Ｕ／ｍｇ）（生化学用、和光純薬（株）、ＬｏｔＮｏ．ＰＴＪ７７２３）、高感度過酸化水素測定試薬ＤＡ−６７（１０−（Carboxymethylaminocarbonyl）−３，７−bis （dimethylamino ）−phenothiazine sodium salt 、生化学用、和光純薬（株）、Lot No. ＲＳＮ９３９１）を、濃度が３．１Ｕ／ｍｌおよび１５５０μＭになるように、McIlvaine 緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。上記各濃度のグルコースおよび１，５−ＡＧ、３ｍｌに上記のように調製した酵素液０．１ｍｌを添加し、６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪拌下タイムスキャンした。上記各濃度のグルコース、および１，５−ＡＧとピラノースオキシダーゼとの反応速度を各々の濃度に対して、Lineweaber-Burk プロットした（図２、３）。このグラフの直線の傾きと縦軸切片から、ピラノースオキシダーゼとグルコースとの酵素反応のＫm21 を０．００１９、Ｖmax21 を０．０１６９ｍＭ／ｍｉｎ、ピラノースオキシダーゼと１，５−ＡＧとの酵素反応のＫm22 を０．０２４８、Ｖmax22 を０．０１０４ｍＭ／ｍｉｎと決定した。
【００２５】
＜種々の濃度で共存するグルコースおよび１，５−ＡＧの濃度の測定＞
グルコースおよび１，５−ＡＧを、それぞれ、以下の表１のような最終濃度になるように、ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に溶解した。上記のように調製したグルコースデヒドロゲナーゼ酵素液とピラノースオキシダーゼ酵素液を１：１に混合した。次に、各グルコース・１，５−ＡＧ混合サンプル３ｍｌに、グルコースデヒドロゲナーゼ、ピラノースオキシダーゼ混合酵素液０．２ｍｌを添加し、各々、３５０ｎｍ、６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪拌下タイムスキャンし、各サンプルの反応速度を測定した。結果を表２に示す。この反応速度と上記のように予め決定したＫm 、Ｖmax から、下記式により、それぞれの濃度を計算し、補正係数＝３．５を乗ずると、表３のような結果となり、算出された実測値は良く一致した。
【００２６】
【式６】
0003670687.tif 000007
【表１】
0003670687.tif 000008
【表２】
0003670687.tif 000009
【表３】
0003670687.tif 000010
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、糖尿病のマーカーであるグルコースと１，５−ＡＧを同時に測定することができ、両方の指標により、糖尿病の診断を容易にかつ確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応ミカエリス定数Ｋm および最大速度の決定方法を示すグラフである。
【図２】グルコースとピラノースオキシダーゼとの酵素反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示すグラフである。
【図３】１，５−ＡＧとピラノースオキシダーゼとの酵素反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示すグラフである。
【図１】
0003670687.tif 000011
【図２】
0003670687.tif 000012
【図３】
0003670687.tif 000013