(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象となる特定成分に対して特異的に結合し、複数個の検出可能なビオチンを標識した標識抗体を用いて該特定成分の測定を行なう方法において、
（１）特定成分と前記標識抗体とを反応させ、抗原抗体複合体を形成させた後に、Ｂ／Ｆ分離を行なう事なく前記ビオチンをアビジン−ＨＡＢＡにより分析する。
（２）前記ビオチンをアビジン−ＨＡＢＡにより分析する時、抗原抗体複合体が形成された場合には、前記ビオチンの分析が立体障害によって阻害され、抗原抗体複合体が形成されない場合には、前記ビオチンの分析が阻害されることなく行なわれ、抗原抗体複合体の量に応じて、前記ビオチンの分析結果が決定される。
（３）特定成分の測定結果を求めるために、濃度が既知である特定成分を用いて（１）及び（２）の操作を行ない、前記ビオチンの分析結果と特定成分の濃度から検量線を予め作成しておき、検量線に基づいて、濃度が未知である試料の特定成分濃度が、決定される事を特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は抗体を用いて、抗体の有する特異的結合の性質を利用し、特定成分に対する抗体を使用して抗原抗体複合体を形成させる反応と、該抗体には標識物質を標識させておき、該標識物質を分析し、分析結果から特定成分の測定を行う方法に関するものである。更に詳しくは臨床検査において、免疫法を用いて行われる特定成分の測定に関して、通常行われているＢ／Ｆ分離をすることなく特定成分の濃度を求めることができる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗体を用いて特定成分の測定を行う場合、特定成分と特異的に結合する、標識物質を標識した標識抗体を予め、マイクロプレートなどの内表面に固相化しておき、抗原抗体反応の１次反応終了後にＢ／Ｆ分離を行い、２次反応として標識物質の分析により得られる信号から、予め作成された検量線を用いて間接的に特定成分の測定を行っている。
【０００３】
しかし、標識物質を標識した抗体を固相化する場合、多くの場合は９６穴のマイクロプレートを使用するが、固相化される抗体量はマイクロプレートの内表面だけで固相量が限られてしまう。抗原抗体反応も内表面でのみ行われるため、完全に反応を終了するためには、長時間反応を行わなければならなかった。
【０００４】
２次反応である標識物質の分析を行う前には、必ずＢ／Ｆ分離が必要となる。Ｂ／Ｆ分離は、洗浄液や洗浄機器を用いて行うため、測定者の負担も大きく緊急を要する測定には不向きであった。標識物質には酵素が用いられる事が多く、酵素反応は検出感度が高い反面、反応時間が長くなり、更に２次反応もマイクロプレートの内表面だけで行われるため測定終了までの時間が長時間に及んでしまっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗体による分析方法において標識抗体を固相化することなく抗原抗体反応を行い、標識物質の分析のためにＢ／Ｆ分離を必要とせず、更に標識物質の分析が短時間で終了し、測定開始から測定終了までの時間を短縮できる測定方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
測定対象となる特定成分に対して特異的に結合し、複数個の検出可能な標識物質を標識した標識抗体を用いて該特定成分の測定を行う方法において、
（１）特定成分と標識抗体とを反応させ、抗原抗体複合体を形成させた後に、Ｂ／Ｆ分離を行う事なく標識物質を分析する。
（２）標識物質を分析する時、抗原抗体複合体が形成された場合には、標識物質の分析が立体障害によって阻害され、抗原抗体複合体が形成されない場合には、標識物質の分析が阻害されることなく行われ、抗原抗体複合体の量に応じて、標識物質の分析結果が決定される。
（３）特定成分の測定結果を求めるために、濃度が既知である特定成分を用いて（１）及び（２）の操作を行い、標識物質の分析結果と特定成分の濃度から検量線を予め作成しておき、検量線に基づいて、濃度が未知である試料の特定成分濃度が決定される事を特徴とする測定方法。
【０００７】
抗体に標識する標識物質は、抗原抗体反応に続く２次反応として分析されるため、特異的にかつ短時間に反応することが必要である。アビジン−ビオチン反応は結合反応が瞬時にして終了し、更に特異性は非常に高い。抗体のビオチンの標識は、広く一般的に行われており、抗体中のアミノ基と反応するビオチンラベル化剤を用いると１０〜２０個程度のビオチンが標識できるため、標識物質に酵素を用いて酵素反応によって検出感度を上げる必要も無くなるため、非常に短時間に分析結果を求めることができる。
【０００８】
上記の抗体に、標識したビオチン量の分析結果を得る目的のために、アビジンと、２−（４´−Ｈｙｄｒｏｘｙａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（以下ＨＡＢＡと記す）を結合させたアビジン−ＨＡＢＡ溶液を用いる。アビジン−ＨＡＢＡ溶液は、アビジンとＨＡＢＡが弱い力で結合をしており、オレンジ色を呈している。ビオチン存在下では、アビジンとビオチンとの反応がアビジンとＨＡＢＡの結合よりも強いため、ＨＡＢＡとビオチンが置換されて、アビジン−ビオチン複合体と単体のＨＡＢＡのみとなって、５００ｎｍにおける吸光度が低下する。ビオチンとＨＡＢＡの置換が定量的に起こるため、アビジン−ＨＡＢＡ法としてビオチンの定量に用いられている。
【０００９】
次に抗原抗体複合体が形成された時に、アビジン−ＨＡＢＡが立体障害のためにビオチンと反応が起こらない事を以下に説明する。
１分子の抗原に対して、モノクローナル抗体であっても複数個の抗体が結合する場合がある。例えばＣ−反応性タンパク質（以下ＣＲＰと記す）は５量体構造を有し、モノクローナル抗体であれば抗原１分子が５つの抗体結合部位を有する。モノクローナル抗体の組み合わせによっては、更に多くの抗体が結合できる。特定分析物質である抗原と標識物質を標識した抗体とが抗原抗体複合体を形成することによって、抗原抗体複合体分子の表面に存在する標識されたビオチンとアビジンとが結合することができても、抗原抗体複合体分子の中に存在するほとんどのビオチンが、立体障害のためにアビジンと結合できない。そのためＨＡＢＡとビオチンの置換反応が行われずに、５００ｎｍにおける吸光度の低下が認められない。よって抗原量と吸光度との関係は、抗原量が少ない場合吸光度は低く、抗原量が多い場合は吸光度は高くなるため、抗原量に応じて検量線は右上がりとなる。
【００１０】
検量線が右上がりとなる反応系は、測定方法においては、１つの利点となる。この様な競合反応は一般的に、低濃度域では反応が強く吸光度が高くなり、高濃度では反応が弱くなって、吸光度が低くなるため検量線は右下がりとなる場合が多い。臨床検査項目では正常値が低濃度域にあって、異常値が高濃度域にあることが非常に多いため、右下がりの検量線の場合、低濃度域での測定結果の数値が大きくばらついてしまい、正常値と異常値を分けるカットオフ値が正常値に近いと、本来は正常値であるのに、値のバラツキによって異常値と判定されてしまうことがある。
【００１１】
検量線が右上がりであれば、低濃度域にある正常値は、バラツキが小さくなるため、測定結果の精度に与える影響が少なくなり、一方、異常値域でバラツキが大きくなっても異常値であることは容易に判断できるために、右上がりの検量線を使用することは、大変理想的な測定方法であると言える。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明を特定分析物質にＣＲＰを用いて、ビオチン標識抗ＣＲＰモノクローナル抗体によって行った測定を例として説明を行う。
（実施形態１）
本発明に用いる各種溶液の調整を以下に述べる。
（ビオチン標識抗体の調整）
抗ＣＲＰ抗体（ロックランド社製）溶液にＮＨＳ−ビオチン（同人化学社製）を添加し、室温に放置後、透析膜を用いて透析を行い、未反応のビオチン除去を行う。
【００１３】
（ＨＡＢＡ溶液の調整）
９．８ｍｌの水に１Ｎ−ＮａＯＨを０．２ｍｌ加え、２４．２ｍｇのＨＡＢＡ（ナカライテスク社製）を溶解させＨＡＢＡ溶液とする。
【００１４】
（ＰＢＳ溶液の調整）
１０ｍＭのリン酸ナトリウムと１５０ｍＭの塩化ナトリウムの混合液をｐＨ７．２に調整する。
【００１５】
（アビジン−ＨＡＢＡ溶液の調整）
１９．４ｍｌのＰＢＳ溶液に８ｍｇのアビジン（シグマ社製）と６００μｌのＨＡＢＡ溶液を混合する。
【００１６】
（ＣＲＰ抗原標準溶液の調整）
ＣＲＰ抗原（ケミコン社製）をＰＢＳ溶液を用いて、０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌのＣＲＰ抗原標準溶液を調整する。
【００１７】
（実施形態２）
上記の各種調整溶液を用いて検量線の作製を行った。
【００１８】
試験管に各濃度のＣＲＰ抗原標準溶液を２０μｌ採取し、４００μｇ／ｍｌに調整したビオチン標識抗体を８０μｌ添加し、混合して抗原抗体反応を３７℃の湯浴中で１０分間行わせる。次にアビジン−ＨＡＢＡ溶液を９００μｌ添加して攪拌を行い、室温にて３分間放置後、５００ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定する。
図１にＣＲＰの検量線を示す。
【００１９】
【発明の効果】
以上のように本発明の抗体を用いた測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要とせずに短時間で測定結果が得られる。また、緊急で特定成分濃度が必要となる要望に、十分答えられるため、生化学分析、臨床検査の分野において各種の特定成分の測定に用いることが可能である。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】前記実施例におけるＣＲＰの検量線である。
【図１】
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