(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0003653102.tif 000013
〔式中、Ｒ1は水素または式II
【化２】
0003653102.tif 000014
の基であり、
Ｒ2は水素または式III
【化３】
0003653102.tif 000015
の基であるが、基Ｒ1またはＲ2の少なくとも一方は式IIまたはIIIであり、
Ｂは塩基で、アデニン、チミン、シトシンもしくはグアニンから選ばれる天然塩基またはプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンもしくはＮ4,Ｎ4−エタノシトシンから選ばれる非天然塩基、あるいはそれらのプロドラッグ型であり、
Ｒ3は互いに独立にＯＨ、水素、Ｏ(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｆ、ＮＨ2もしくはそのプロドラッグ型またはＮ3であるが、Ｒ3基の少なくとも１つはＨではなく、
ＷおよびＷ′は互いに独立に酸素または硫黄であり、
ＺおよびＺ′は互いに独立にＯ-；Ｓ-；Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ；Ｃ1〜Ｃ18−アルキル；ＮＨＲ4（Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル）；ＮＲ4Ｒ5（式中、Ｒ4は上に定義した通りであり、Ｒ5はＣ1〜Ｃ18−アルキル、または式中、Ｒ4およびＲ5はそれらが結合した窒素原子とともにさらにＯ、ＳおよびＮからなる群の他のヘテロ原子を含有してもよい５〜６員の異項環である）であり、
ＸはＯＨ、Ｈ、Ｆ、Ｃl、Ｂr、ＮＨ2、Ｎ3、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ2〜Ｃ18)アルキニル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ6〜Ｃ18)アリール、Ｏ−(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ18)アルキニル、Ｏ(Ｃ6〜Ｃ18)アリール、Ｐ(Ｏ)ＹＹ′（式中、ＹおよびＹ′はＺおよびＺ′について上に定義した通りである）であり、式IIにおいてはＲ3とＸは両者で環状リン酸ジエステルを形成することができ、
ｎは５〜６０の整数である〕で示されるオリゴリボヌクレオチドまたはその生理的に耐容性ある塩。
【請求項２】
Ｒ2は式IIIの基でＲ1は水素であるか、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ式IIおよびIIIの基であるか、またはＲ2は水素でＲ1は式IIの基であり、後者の場合ＷまたはＺのいずれかは酸素ではなく、ＸはＯＨまたはＨである請求項１に記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【請求項３】
Ｗが酸素であるか、またはＺおよびＷがいずれも酸素である請求項１記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【請求項４】
Ｒ2は式IIIの基でＲ1は水素である請求項１〜３に記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【請求項５】
さらに細胞内取り込みに好都合な基、インビトロおよびインビボでレポーター基として作動する基、および／または、生物学的ＤＮＡもしくはＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対して、これらのＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と、結合もしくは切断により相互作用する基によって置換されている請求項１〜４に記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【請求項６】
合成５′および／または３′末端を有するリボザイムを生じる請求項１に記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【請求項７】
核酸の生物学的機能の調節または抑制、ウイルスゲノム機能の発現の選択的抑制およびウイルス感染症の予防および治療、癌遺伝子機能の抑制および癌の治療のため、一本鎖または二本鎖核酸への付加に基づく化学的ハイブリダイゼーションに使用される請求項１〜５に記載の式Ｉのオリゴリボヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、末端３′−３′および／または５′−５′ヌクレオチド間連鎖を有するオリゴリボヌクレオチド類縁体に関する。この修飾は、リボザイムを含めてこの方法で変化させた分子を、触媒活性を有する場合はそれを包含するそれらの性質に悪影響を与えることなく安定化する。
【０００２】
配列がメッセンジャーＲＮＡの暗号配列もしくはセンス配列またはＤＮＡの暗号遺伝子配列に相補性の核酸フラグメントは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。この種のオリゴヌクレオチドは、細胞培養系においてインビトロでまたインビボで、通常医学的治療の観点から、遺伝子発現の阻害に次第に多く使用されている〔１．E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90（1990）543-584; ２．J．Goodchild, Bioconjugate Chem. 1（1990）165-187; ３. L. Whitesell, A. Rosolen, L. Neckers, Antisense Research and Development 1（1991）343〕。
【０００３】
アンチセンス本体（antisense principle）のバリエーションには、
Ｉ．三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド：ＤＮＡ二重鎖に結合して三重ヘリックスの形成が可能で、転写の阻害によって遺伝子の発現を修飾する核酸フラグメント〔J. Chubb & M. Hogan, TIBTECH 10（1992）132-136〕、
II．リボザイム：リボザイムの標的ＲＮＡによる特異的結合後、標的ＲＮＡたとえばｍＲＮＡの切断からなる酵素活性をもつリボ核酸フラグメント、
がある。
【０００４】
生物学的系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用を可能にするためには、しかしながら、以下の条件が満たされる必要がある〔E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90（1990）543-584〕。すなわち、
１．一方では、それらは水に容易に溶解しなければならないが、他方では、親油性の細胞膜を容易に通過しなければならない。
２．それらは、細胞内での分解に十分安定、すなわちヌクレアーゼに安定でなければならない。
３．それらは、生理学的温度で細胞内核酸と安定なハイブリッドを形成せねばならない。
４．ハイブリダイゼーションは選択的でなければならない。ミスペアを生じるオリゴヌクレオチドに対する解離温度の差は後者を特異的に洗い落とすが可能なように十分大きくなければならない。
５．リボザイムの場合には、触媒活性が保持されていなければならない。
【０００５】
非修飾オリゴヌクレオチドおよび、とくに非修飾オリゴリボヌクレオチドは、広範な核酸分解的変性を受けやすい．これが、初期段階で、オリゴヌクレオチドが上述の要求によりよく合致するように、とくにヌクレアーゼ変性に対してよりよく保護されるように、その構造修飾の検討が行われた理由である。この目的で、多数のオリゴヌクレオチド類縁体が、時には莫大な合成のための努力を費やして、製造されてきたのである〔１．E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90（1990）543-584；２．J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1（1990）165-187〕。
【０００６】
最近、３′−３′−および／または５′−５′−末端連結オリゴデオキシヌクレオチドならびにそれらの類縁体で、核酸分解的変性に対する安定性が明瞭に増大することが明らかにされた〔１. H. Seelinger, A. Froehlich, M. Montenarh: Nucleosides＋Nucleotides 10（1991) 469-477; Z.H. Roesch, H. Seelinger: EP 0464638A2〕。今回、驚くべきことに、合成が極めて容易な同種類の末端連鎖により、
ａ）ヌクレアーゼに対してもっとはるかに不安定なオリゴリボヌクレオチドを安定化することもできること、
ｂ）リボザイム（特定の配列の要求があるオリゴリボヌクレオチド）の触媒活性を損うことなく、ヌクレアーゼに対して安定化することができること、
ｃ）化学修飾によってヌクレアーゼから保護されたオリゴリボヌクレオチドおよびリボザイムをさらに安定化することができること
が見出されたのである。
【０００７】
すなわち、本発明は、式Ｉ
【化４】
0003653102.tif 000002
〔式中、Ｒ1は水素または式II
【化５】
0003653102.tif 000003
の基であり、
Ｒ2は水素または式III
【化６】
0003653102.tif 000004
の基であるが、基Ｒ1またはＲ2の少なくとも一方は式IIまたはIIIであり、
Ｂは塩基で、たとえばアデニン、チミン、シトシン、グアニンのような天然塩基もしくはたとえばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4,Ｎ4−エタノシトシンのような非天然塩基またはそれらのプロドラッグ型であり、
Ｒ3は互いに独立にＯＨ、水素、Ｏ(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｆ、ＮＨ2またはそのプロドラッグ型およびＮ3であるが、Ｒ3基の少なくとも１つはＨではなく、Ｒ3は好ましくはＯＨ、水素、Ｏ(Ｃ1〜Ｃ6)アルキル、Ｏ(Ｃ2〜Ｃ6)アルケニル、Ｆ、ＮＨ2であり、
ＷおよびＷ′は互いに独立に酸素または硫黄であり、
ＺおよびＺ′は互いに独立にＯ-；Ｓ-；Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルコキシ、とくに好ましくはＣ1〜Ｃ3−アルコキシ、とくにメトキシ；Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、とくに好ましくはＣ1〜Ｃ3−アルキル、とくにメチル；ＮＨＲ4（Ｒ4は好ましくはＣ1〜Ｃ18−アルキル、とくに好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、とくにＣ1〜Ｃ4−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ-Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくはメトキシエチル）；ＮＲ4Ｒ5（式中、Ｒ4は上に定義した通りであり、Ｒ5は好ましくはＣ1〜Ｃ18−アルキル、とくに好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、とくにＣ1〜Ｃ4−アルキルであるか、または式中、Ｒ4およびＲ5はそれらが結合した窒素原子とともにさらにＯ、ＳおよびＮからなる群の他のヘテロ原子を含有してもよい５〜６員の異項環たとえばモルホリノである）であり、
ＸはＯＨ、Ｈ、Ｆ、Ｃl、Ｂr、ＮＨ2、Ｎ3、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ2〜Ｃ18)アルキニル、Ｏ−Ｃ(Ｏ)−(Ｃ6〜Ｃ18)アリール、Ｏ−(Ｃ1〜Ｃ18)アルキル、Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ18)アルケニル、Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ18)アルキニル、Ｏ(Ｃ6〜Ｃ18)アリール、Ｐ(Ｏ)ＹＹ′（式中、ＹおよびＹ′はＺおよびＺ′について上に定義した通りである）であり、式IIにおいてはＲ3とＸは両者で環状リン酸ジエステルを形成することができ、Ｘは好ましくはＯＨ、Ｈ、Ｆ、とくに好ましくはＯＨであり、
ｎは５〜６０、好ましくは１０〜４０、とくに好ましくは１５〜２５の整数である〕で示されるオリゴリボヌクレオチドおよびその生理的に耐容性ある塩に関する。
【０００８】
アリールは、この場合、たとえばフェニル、またはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシおよび／もしくはハロゲンで置換（１〜３個）されたフェニルを意味するものと理解すべきである。
【０００９】
式Ｉのオリゴリボヌクレオチドが好ましい．さらに、式ＩにおいてＲ2は式IIIの基でＲ1は水素であるか、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ式IIおよびIIIの基であるか、またはＲ2は水素でＲ1は式IIの基であり、後者の場合ＷまたはＺのいずれかは酸素ではないオリゴリボヌクレオチドが好ましい。
【００１０】
さらにまた、式ＩにおいてＷが酸素であるか、またはＺおよびＷがいずれも酸素であるオリゴリボヌクレオチドをとくに挙げることができる。
さらにまた、式Ｉにおいてその塩基配列Ｂ1、Ｂ2、・・・Ｂnがリボザイムの配列要求に一致するオリゴリボヌクレオチドをとくに挙げることができる。
【００１１】
これに関連して、とくに、ハンマーヘッドリボザイム〔たとえば、Uhlenbeck, Nature 328（1987）596; Haseloff, Gerlach, Nature 334（1988）585〕、ヘアピンリボザイム〔たとえば、Hampelら、Nucl. Acids Res. 18（1990）299〕、ヒト肝炎α−ウイルスリボザイム〔たとえば Branch, Robertson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）10163〕、ならびにＲＮアーゼＰに対する末端ガイド配列〔たとえば、Foster, Altman，Science 249（1990）783〕がとくに強調される。
【００１２】
とくに極めて好ましい式Ｉのオリゴリボヌクレオチドは、Ｒ2は式IIIの基でＲ1は水素のオリゴリボヌクレオチドである。
さらにまた、式Ｉのオリゴリボヌクレオチドにおいて、さらに細胞内取り込みに好都合な基、インビトロおよびインビボでレポーター基として作動する基、および／または、生物学的ＤＮＡもしくはＲＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対して、これらのＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と結合もしくはそれを切断する相互作用を示す基によって置換されているオリゴリボヌクレオチドを挙げることができる。
【００１３】
細胞内取り込みに好都合な基の例としては、アルキル基たとえば炭素原子１８個までのアルキル基、もしくはコレステリル、もしくはチオコレステリルのような親油性の基〔E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90（1990）543−584；J. Goodchild, Bio-conjugate Chem. 1（1990）165-187; B. Oberhauser, E. Wagner, Nucl. Acids Res. 20（1992）533; C. MacKellarら、Nucl. Acids Res. 20（1992）3411〕または、たとえば胆汁酸もしくは適当な受容体に対するペプチド（たとえば受容体を介するエンドサイトーシス）のような天然の担体システムを利用する接合体がある。
【００１４】
レポーター基の例には、蛍光基（たとえば、アクリジニル、ダンシル、フルオレセイニル）または化学発光基たとえばアクリジニウムエステル基がある。
核酸への結合および／または核酸の切断を行うオリゴヌクレオチド接合体の例は、以下の文献、E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90（1990）543-584; J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1（1990）165-187; Helen, Toulme, Biochim. Biophys. Acta 1049（1990）99に見出される。
【００１５】
接合体のパートナーは、とくに、アクリジン、プソラレン、クロロエチルアミノアリール、フェナンスリジン、アジドフェナシル、アジドプロフラビン、フェナジン、フェナンスロリン／Ｃｕ、ポルフィリン／Ｆe、ベンゾ〔ｅ〕ピリドインドール、ＥＤＴＡ／Ｆｅである〔Mergnyら、Science 256（1992）1681〕。
【００１６】
本発明によるオリゴリボヌクレオチドの特徴的な構造修飾は、鎖の両末端における変化、すなわち生物学的な３′−５′連鎖に変わる３′−３′または５′−５′連鎖のオリゴヌクレオチド内連鎖からなる。驚くべきことに、このわずかな構造修飾で、他の性質たとえば酵素活性に悪影響を与えることなく、ヌクレアーゼの変性に対してこの種の化合物が十分安定化されることが見出されたのである。
【００１７】
以下に述べるように、このわずかな構造修飾のみでは、生物学的オリゴリボヌクレオチドの場合とほぼ同じハイブリダイゼーション挙動を生じる．これはまた、これらの化合物の、遺伝子発現のインヒビターとしての一般的適用性も生じることになる。
【００１８】
式Ｉの化合物は、生物学的オリゴヌクレオチドの合成と同じ方法で、溶液中で、または好ましくは固相法で、必要に応じて自動シンセサイザーを使用して、製造される。したがって、本発明はさらに、式Ｉのオリゴリボヌクレオチドを製造するにあたり、(ａ)３′−または５′−末端リン(III)もしくはリン(Ｖ)基をもつヌクレオチド単位またはその活性化誘導体を、３′−または５′−末端遊離ヒドロキシル基を有する他のヌクレオチド単位と反応させるか、または(ｂ)同じ方法でオリゴヌクレオチドをフラグメントで組立て、(ａ)または(ｂ)によって得られたオリゴヌクレオチド中の他の官能性を保護するために一次的に導入した１または２以上の保護基を必要に応じて除去し、この方法で得られた式Ｉのオリゴヌクレオチドを必要に応じてそれらの生理的に耐容性ある塩に変換することからなる方法に関する。
【００１９】
末端が反転した３′−３′連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドの製造のための固相合成に使用される出発成分は、最初のヌクレオシドモノマーが５′−ＯＨ基を介して結合する支持体樹脂である。この成分は文献で既知の方法〔T. Atkinson, M. Smith, "Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait編、35-49（1984)〕によって製造された支持体樹脂、好ましくは、アミノ基で官能化されたシリカゲルまたは制御多孔ガラスを用いて製造される。それを、ヌクレオシド塩基および３′−ＯＨが保護され、予め５′−ｐ−ニトロフェニルスクシネートに変換されたヌクレオシド誘導体と反応させる。塩基保護基としては、好ましくは、アシル基、たとえばベンゾイル、イソブチリル、またはフェノキシアセチルが使用される。３′位はジメトキシトリチル保護基によって保護するのが好ましく、この基はM.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21（1980）, 3243-3246頁の記載に従って導入できる。
【００２０】
さらに連鎖の末端から２番目までのオリゴリボヌクレオチド鎖の組立ては、文献で既知の方法〔Beaucage，Iyer，Tetrahedron 48（1992）2223〕により、好ましくは５′−ＯＨ基がジメトキシトリチル基で保護されたヌクレオシド３′−リン酸エステルアミドまたはヌクレオシド３′−Ｈ−ホスホネートを用いて行われる。２′−ヒドロキシル基はtert−ブチルジメチルシリル基によって保護するのが好ましい〔M. Lyttleら、J. Org. Chem. 56（1991）4603; Scaringeら、Nucl. Acids Res. 18（1990）5433〕。２′−アミノ基（Ｒ3＝ＮＨ2の化合物の合成）は、トリフルオロアセチル基を用いて保護するのが好ましい〔Benselerら、Nucleosides & Nucleotides 11（1992）1333〕。用いられる最後の鎖のメンバーは再び３′−ＯＨ基が、好ましくはジメトキシトリチルを用いて保護されたヌクレオシド５′−リン酸エステルアミドまたはヌクレオシド３′−Ｈ−ホスホネートである。末端が反転してヌクレオチド間連鎖を有するこの種のオリゴリボヌクレオチド鎖の製造を以下に図解的に示す（末端に３′−３′および５′−５′連鎖を有するオリゴヌクレオチドの製造のためのリン酸アミダイトサイクル）。３′−３′または５′−５′連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドは同様にして製造される。
【００２１】
【化７】
0003653102.tif 000005
【００２２】
２′−修飾リボヌクレオチド単位の導入にも同様に文献既知の方法を使用した。たとえば、２′−Ｏ−アルキル ２′−デオキシリボヌクレオチド〔Iribarrenら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87（1990）7747; Sproat, Lamond，"Oligonucleotides and Ana-logues, F. Eckstein編、IRL Press刊、Oxford 1991〕、２′−Ｆ−および２′−ＮＨ2−２′−デオキシリボヌクレオチド〔Benselerら、Nucleosides & Nucleotides 11（1992）1333; Piekenら、Science 235（1991）314; Biochemistry 30（1991）9735〕である。
【００２３】
オリゴリボヌクレオチドは、以下の例４に記載したように、構造および配列分析のために、末端標識が行われる。これは、放射性標識、好ましくは５′−γ32Ｐ−ＡＴＰ／ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行われる。この放射性標識は、遊離の５′−ＯＨ基、すなわち生物学的３′−５′連鎖のみをもつオリゴヌクレオチドからヌクレオチド鎖の逆の末端に行われる。
【００２４】
３′−３′反転をもつ配列は両端に５′−ＯＨ基を有し、したがって場合によっては、両端がリン酸化される。
式Ｉのオリゴヌクレオチドは、核酸の生物学的機能の調節または抑制、ウイルスゲノム機能の発現の選択的抑制およびウイルス感染症の予防および治療、癌遺伝子機能の抑制および癌の治療のため、一本鎖または二本鎖核酸への付加またはそれらの切断に基づく化学的ハイブリダイゼーションに使用される。
【００２５】
本発明によって組立てられ、血清中に溶解された式Ｉのオリゴリボヌクレオチドの挙動は、そのインビボにおける安定性の尺度とみなすことができる。この一般的な試験は例４に記述する。本発明によるオリゴリボヌクレオチドは３′−５′オリゴリボヌクレオチドよりもはるかに分解が遅い。
例５には、ハンマーヘッドリボザイムの配列要求に合致する本発明のオリゴリボヌクレオチドが、非修飾リボザイムとそれらの酵素活性において相違しないことを示す。
【００２６】
例１：２′−フルオロ−２−デオキシヌクレオシド単位の合成(添付反応式１)
５′−Ｏ−(ジメトキシトリチル)−２′−フルオロ−２′−デオキシウリジン
０.５ｇ（約２mmol）の２′−フルオロ−２′−デオキシウリジンを、５０mlのシュレンクフラスコ中、１０mlの無水ピリジンと２回共蒸発させる。乾燥ヌクレオシドを２５mlの無水ピリジンに取り、室温で、０.６６ｇ（約２.２mmol）のジメトキシトリチルクロリドおよび１０mgの４−ジメチルアミノピリジンを加える。３時間後に、混合物に１mlのメタノールを加え、これをついで真空中で蒸発乾固した。残った油状物を５０mlのメチレンクロリド（酸化アルミニウム上で脱酸）に取り、５０mlの水で３回抽出する．有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥する。メチレンクロリドを蒸発させると、粗生成物が固体泡状物として残った、もっと高度にトリチル化された成分およびトリタノールを除去するため、粗生成物を、４０〜５０℃において、無水ベンゼン３０mlで浸出した。
０.７５ｇ（理論量の６７％に相当）の白色固体が得られる。
【００２７】
４−Ｎ−アセチル−２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン
１ｇ（約４mmol）の２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン塩酸塩を、１００mlのシュレンクフラスコ中、各回２０mlの無水ピリジンと２回および１０mlの無水アセトニトリルと２回共蒸発させる。乾燥したヌクレオシド原料を４０mlの無水ＤＭＦに懸濁し、０.６ml（約４.４mmol）の無水酢酸を加える。１日の過程にわたって混合物中に０.５ml（４.４mmol）の無水トリエチルアミンを滴加する。ついで溶媒を油圧ポンプの真空下に蒸発させる。粗生成物を５０mlのジエチルエーテルで洗浄し、ついで乾燥する。精製はカラムクロマトグラフィーによった（シリカゲル６０Ｈ、カラム４×１０cm、移動相０.１％ピリジン含有メチレンクロリド、勾配メタノール）。生成物は８％メタノールにおいて溶出する。
溶媒を蒸発させると、０.８３ｇ（理論収量の７１％）の生成物が残る。
【００２８】
５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン
４mmolの４−Ｎ−アセチル−２′−フルオロ−２′−デオキシシチジンを、１００mlのシュレンクフラスコ中、２５mlの無水ピリジンに取り、室温で、１.３ｇ（約４.４mmol）のジメトキシトリチルクロリドおよび２０mgの４−ジメチルアミノピリジンを加える。３時間後に、混合物に１mlのメタノールを加え、これをついで真空中で蒸発乾固した。残った油状物を５０mlのメチレンクロリド（酸化アルミニウム上で脱酸）に取り、５０mlの水で３回抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥する．メチレンクロリドを蒸発させると，粗生成物が固体泡状物として残った。粗生成物をシリカゲル６０Ｈ上（カラム２×２０cm、移動相０.１％ピリジン含有メチレンクロリド、勾配メタノール）クロマトグラフィーによって精製する。生成物はメチレンクロリド中３％メタノールで溶出した。溶媒を蒸発させると、１.３９ｇ（理論量の５９％）の白色泡状固体が残る。
【００２９】
２′−フルオロ−２′−デオキシヌクレオシドのリン酸エステルアミド
１mmolの保護モノマーを５mlの無水メチレンクロリドおよび１mlの無水ジイソプロピルアミンに溶解する。使い捨てのシリンジを用いて、１.２mmolのクロロ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィンをアルゴン下に滴加する。１時間後、変換は事実上定量的で、反応は０.１mlのメタノールによって停止できる。混合物を２０mlの酢酸エチルに取り、各回２０mlの飽和食塩溶液で３回抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させる。粗生成物を５mlのメチレンクロリドに取り、室温で４００mlの無水石油エーテルから沈殿させる。沈殿をフリット上に集めたのち、油圧ポンプで乾燥し、−２０℃に保存する。
【００３０】
５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン：
原料：０.５９ｇ（１mmol）の５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン
収量：０.６０ｇ（０.７８mmol、理論量の７８％）
５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−２′−フルオロ−２′−デオキシウリジン−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン：
原料：０.５５ｇ（１mmol）の５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−２′−フルオロ−２′−デオキシウリジン
収量：０.６１ｇ（０.８３mmol、理論量の８３％）
【００３１】
例２：
ＣＰＧ １０−１４００−支持体材料の３′−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシリボヌクレオシド単位による負荷（添付反応式２）
３′−Ｏ−ＤＭＴr−デオキシリボヌクレオシド ５′−スクシネート
混合物：１.０mmolの３′−Ｏ−ＤＭＴr−ｄＮ
０.８mmolの無水コハク酸（８０mg）
０.５mmolのジメチルアミノピリジン（６１mg）
無水コハク酸の、デオキシリボヌクレオシドの５′−ＯＨ基との反応は常に、５mlの無水ピリジン中触媒としてＤＭＡＰを用い、室温で一夜行った。反応完結後、溶液を濃縮し、ピリジンをトルエンとの共沸蒸留を３回行って除去した。残留物をジクロロメタンに取り、１０％濃度の氷冷クエン酸溶液および水で洗浄し、有機相をロータリーエバポレーター中真空下に蒸発させた。粗生成物を約３mlのトルエンに溶解し、２００mlのヘキサンで沈殿させた。
【００３２】
支持体の負荷
混合物：０.８mmolの３′−Ｏ−ＤＭＴr−dＮ５′−Ｏ−スクシネート
０.８mmolのｐ−ニトロフェノール（１１２mg）
２.０mmolのジシクロヘキシルカルボジイミド
３ｇのアミノプロピル化ＣＰＧ １０−１４００
保護されたスクシニル化デオキシリボヌクレオシドを、５mlの無水ジオキサンおよび０.２mlのピリジン中ｐ−ニトロフェノールの溶液に加え、ついで縮合剤としてＤＣＣＩを添加した．３時間後に反応は完結した。沈殿したジシクロヘキシル尿素をアルゴン下に吸引して濾去し、濾液をそのまま、１５mlの無水ＤＭＦ中官能化支持体材料の懸濁液に加えた。０.８mlのトリエチルアミンを加え、混合物を一夜振盪した。ついで、負荷された支持体を吸引濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄し、乾燥器中で乾燥した．非反応アミノ基を遮断するために、支持体を、15mlの無水ピリジン中１mlの無水酢酸および５０mlのジメチルアミノピリジンの溶液とともに、室温で１時間振盪し、ついで吸引濾過し、メタノールおよびエーテルで洗浄し、乾燥した。
【００３３】
例３：
２′−フルオロ−２′−デオキシウリジン単位および３′末端に３′−３′リン酸ジエステル連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドの合成
修飾されたハンマーヘッドリボザイム（表１）は、PharmaciaのGene Assembler Puls DNA Synthesizerを用いて０.２μmolの規模で合成した。この合成のための支持体は５′−ヒドロキシル基を介して結合したデオキシアデノシン単位によって官能化した。これにより、合成中にオリゴヌクレオチドの３′末端で反転構造が生じた。製造はリン酸エステルアミド法によるオリゴリボヌクレオチド合成の標準プロトコールによって実施した。
【００３４】
【表１】
0003653102.tif 000006
【００３５】
２′−フルオロ−２′−デオキシヌクレオシドのリン酸エステルアミドは、アセトニトリル中０.１２Ｍで使用した。連鎖延長工程においては、０.１mlのアミドホスファイトを０.３７mlのテトラゾール溶液（０.５Ｍ）とともに、支持体結合５′−ヒドロキシル基と反応させた。１２分のカップリング時間ののちに、標準のキャッピング、酸化および、次のカップリング工程の準備のための脱トリチル化を行った。カップリング収率は平均して９９％であった。
【００３６】
塩基に不安定な保護基の除去および付着部を切断するために、合成後、支持体をスクリューキャップ付きエッペンドルフ反応容器に移した。３２％濃度のアンモニアとエタノールの３：１混合物２mlとともに、５５℃で１２時間インキュベートを行った。上清溶液を分離し、−２０℃に冷却し、注意深く凍結乾燥した。乾燥残留物を、ＴＨＦ中１.１ＭのＴＢＡＦ溶液０.４mlに懸濁し、室温でさらに16時間インキュベートした。同じ容量のトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ＴＥＡＡ緩衝液）を加えて反応を停止させた。溶液を−７０℃に冷却し、注意して０.４mlに濃縮した。４０μｌの酢酸ナトリウム、１.４mlのエタノールおよび５μｌの酢酸を加えたのち、生成物を−２０℃で一夜沈殿させた。サンプルを遠心分離し、上清は捨てた。乾燥オリゴヌクレオチドを、アクリルアミドゲル（２０％、７Ｍ尿素）上に負荷するために、ホルムアミドブルーマーカーと水の１：１混合物に取った。生成物のバンドを確認し、切り出すために、ゲルはセロファンフィルムで覆った。溶出は、酢酸アンモニウム溶液により、４０℃で実施した。５時間後、溶液を上述のようにして沈殿させた。オリゴヌクレオチドを７０％濃度のエタノールで洗浄し、７０％濃度のエタノールに再懸濁し、−７０℃で保存した。
【００３７】
例４：
修飾リボザイムの安定性の血清試験における検討
リボザイムｐ５３ならびに修飾オリゴリボヌクレオチドｐ５３−IＮＶおよびＦｐ５３−ＩＮＶを、(γ−32Ｐ)−ｄＡＴＰ（比活性：４５００Ci／mmol）の存在下にＴ４−オリゴヌクレオチドキナーゼによって酵素的に放射標識した。３′−３′反転をもつ配列は５′−ヒドロキシル基を両端に有し、したがって場合によっては両端をリン酸化する。
【００３８】
標識リボザイムを新鮮なヒト血清で処理した。
混合物：１pmolのリン酸化リボザイム
２０μｌの血清
サンプルは３７℃でインキュベートした。以下に示す時間後に２μｌのサンプルを取り、フェノールで処理した。
ｐ５３：０、１、２、５、１０、１５、３０、６０分
ｐ５３−ＩＮＶおよびＦｐ５３−ＩＮＶ: ０、１、２、５、１０、１５、３０、６０、１２０、２４０分
フェノール処理サンプルを凍結乾燥し、９５％ホルムアミド負荷緩衝液に取り、２０％ポリアクリルアミドゲル上８Ｍ尿素と５５℃で電気泳動を行い分画化した。
Ｘ線フィルム上のバンドの強度をレーザーデンシトメーターを用いて測定した（図１参照）。検討したリボザイムの半減期（ｔ1／2＝Ｆｐ５３−ＩＮＶ：３０分、ｐ５３−ＩＮＶ：１分、生物学的オリゴリボヌクレオチド：＞＞１分；例５参照）は、末端反転の保護効果を明瞭に示している。
【００３９】
例５
２０マー基質オリゴリボヌクレオチド、ＳＢ−１ ５′−ｒ（GC CCC UGU VAU CUU UUG UCC）−３′を、(γ-32Ｐ)−ｄＡＴＰ（比活性：４５００Ci／mmol）の存在下にＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いて酵素的に５′末端を放射標識した。各種リボザイムによるＳＢ−１の切断反応は以下のように実施した。すなわち、反応条件は５０mMトリス塩酸塩、pH７.５、２０mM ＭｇＣｌ2、５０℃とした。ＳＢ−１基質濃度は０.０２５μM（０.０５、０.１および０.２５μMに変動）、リボザイム濃度は０.０２μMとした。３０分の経過中、サンプルを１分、５分、１５分および３０分に採取し、負荷緩衝液と混合した。サンプルは２０％ポリアクリルアミドゲル上（８Ｍ尿素）５５℃で電気泳動を行い分画化した。ＳＢ−１のバンドの強度の低下をレーザーデンシトメーターを用いてＸ線フィルム上で測定した。以下のリボザイムすなわちｐ５３−ＩＮＶ、Ｆｐ５３−ＩＮＶ（いずれも上記参照）、ｐ５３およびＦｐ５３を使用した。
【００４０】
ｐ53: 5′-r(AAGA UCUGA UGAGG CCGUU AGGCC GAAAC AGGG)-3′
Ｆｐ53: 5′-r(AAAGA fUCfUGA fUGAGG CCGfUfU AGGCC GAAAC AGGGA)-3′
ＳＢ−１の切断速度には、ｐ５３およびｐ５３−ＩＮＶの使用で変化がない。また、Ｆｐ５３およびＦｐ５３−ＩＮＶは同じ活性を有するが、ｐ５３の場合に比しファクターで約５低かった。
【００４１】
例６
基質の切断およびキネティックの測定
反応の初期速度の予備的な測定は、５０nM トリス−Ｃｌ（pH７.５）中、４０nM基質および４nM酵素を用いて行った。反応は１０nM ＭｇＣｌ2の添加によって開始させた。切断生成物の量は、５５℃で、１、２、５、１０および１５分後に測定した。この実験からおおよそのＫm値を決定した。初期反応速度のさらに正確な測定は、Suelter、C.H．(1985) “A practical Guide to Enzymology"、 J．Wiley，New York，231の記載に従って実施した。これには４０nM酵素ならびに２５nM、５０nM、１００nM、２００nM、５００nMおよび１,０００nMの基質によって行われる６つの別個の反応を要した。所定の時間間隔で２μｌのアリコートを採取し、フェノールを添加して反応を停止させた。サンプルをついで分画化し、変性ゲル（２０％ＰＡＧＥ、７Ｍ 尿素）上で分析した。
【００４２】
基質：ＳＢ−１（例５）
リボザイム：
ｐ５３−ＩＮＶ（例３）
ｐ５３−Ｆ(Ｕ,Ｃ)，ＩＮＶ: 5′-rArArArGrA fUfCfUrG rAfUrGrArGrGfCfCrGfUfUrArGrGfCfCrGrArArAfCrArGrGrG-3′-3′-dA-5′
ｐ５３−１: 5′-r(AAA GAU CUG AUG AGG CCG UUA GGC CGA AAC AGG G)-3′
【００４３】
キネティックパラメーターの測定
初期反応速度は、生成物の形成速度が直線的であった時点（４分後）における進行曲線の初期相について５つの異なる基質濃度で測定した。これらのキネティック測定の典型的な結果を図２に示す。本発明者らの実験では、反応は反応混合物への２価陽イオンの添加によって開始させ、したがって酵素コンホーメーションの形成は許されなかったので、反応開始後５〜１０分の潜時相が通常認められた。
以下の酵素パラメーターがEadie-Hofsteeプロットから決定された。
【００４４】
【表２】
0003653102.tif 000007
【００４５】
例７
標識
基質および酵素は、〔γ-32Ｐ〕ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標識した。導入されなかったヌクレオチドはフェノール抽出ついでエタノール沈殿によって除去した。
【００４６】
変性を測定するための試験
修飾リボザイムの変性のキネティックは、放射標識オリゴリボヌクレオチドをプールした新鮮、非希釈ヒト血清中に最終濃度２０,０００cpm／μｌに溶解して測定した。最初のサンプルを採取したのち、反応混合物を３７℃でインキュベートした。所定の時間間隔で１μｌのアリコートを採取し、反応をフェノールで停止させた。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、サンプルを、２０nM ＥＤＴＡ、０.０１％ブロモフェノールブルールおよび０.０１％のキシレンシアノールを含有する８０％ホルムアミド中に懸濁した。切断生成物は２０％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上７Ｍ尿素を用いて分画化した。
【００４７】
ｐ５３−１およびｐ５３−ＩＮＶのインキュベーションの結果を図３に示す。この図から、３′末端における反転構造はそれ自体、血清の存在下において、１０秒未満から数分まで、リボザイムの安定性の改良をもたらすことが明らかである。
【００４８】
実験は、１０μｌの非希釈ヒト血清中３７℃において、１pmolの非修飾（ｐ５３−１）および修飾（ｐ５３−ＩＮＶ）リボザイムを用いて実施した。ゲルの縁の数字は相当する長さの標品の位置を示す。
【００４９】
ｐ５３およびｐ５３−Ｆ(Ｕ、Ｃ)、ＩＭＶのインキュベーションの結果を図４に示す。この図から、非希釈血清中で４時間インキュベーション後にも、ｐ５３−Ｆ(Ｕ、Ｃ)、ＩＮＶでは変性は認められなかったことが明らかである。４８時間後にも、認められた変性は１０％未満であった。実験は１pmolの修飾リボザイムを用いて実施し、この場合、Ｆｐ５３は３′末端に反転構造を有し、位置Ｕ6、Ｕ8、Ｕ11、Ｕ13およびＵ20でフッ素化されている。ｐ５３−Ｆ(Ｕ、Ｃ)、ＩＮＶはさらに、シトシン残基Ｃ7およびＣ30でフッ素化されている。
【００５０】
反応式１：
２′−フルオロ−２′−デオキシシチジン−(Ａ)および２′−フルオロ−２′−デオキシウリジン−リン酸エステルアミド(Ｂ)の合成
【化８】
0003653102.tif 000008
【００５１】
反応式２：
３′−Ｏ−ＤＭＴr−デオキシリボヌクレシド５′−Ｏ−スクシニル−ｐ−ニトロフェニルエステルの合成および制御多孔ガラス支持材料の負荷
【化９】
0003653102.tif 000009
【００５２】
【配列表】
0003653102.tif 000010
【００５３】
0003653102.tif 000011
【００５４】
0003653102.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ５３−ＩＮＶの血清中における安定性を示すグラフである。
【図２】修飾リボザイムによる基質切断のキネティックス測定図である。
【図３】ｐ５３−１およびｐ５３−ＩＮＶの核酸分解変性を示す図である。
【図４】Ｆｐ５３−ＩＮＶおよびｐ５３−Ｆ(Ｕ、Ｃ)、ＩＮＶの核酸分解変性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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