(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の気孔細胞を再生培地中で培養し、このようにして培養した細胞からベータ・ブルガリス植物を再生することを含む、植物の形成方法。
【請求項２】
植物がサトウダイコンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
再生がホルモンを含有しない培地上でのカルスの形式を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝材料を単離されたベータ・ブルガリス植物の気孔孔辺細胞またはベータ・ブルガリス植物の孔辺細胞濃度の高い細胞集団に導入し、この形質転換細胞または形質転換細胞集団から全植物体を再生させることを含む、ベータ・ブルガリス植物の遺伝子形質転換方法。
【請求項５】
細胞または細胞集団が老化した葉の中に含有される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
形質転換した細胞または細胞集団をマセレートして細胞懸濁液を調製し、これから植物を再生する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
気孔細胞を再生前にプロトプラストに変換する、請求項４−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
遺伝材料が抗生物質に対する耐性を示さない選択性マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築体であり、かつ形質転換された細胞または細胞集団を適切な選択試薬に暴露する、請求項４−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
形質転換を、孔辺細胞濃度の高い細胞集団につき実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
気孔細胞を形質転換の前または後に細胞壁の酵素消化によりプロトプラストに変換する、請求項４−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換法が、気孔細胞の懸濁液を微細繊維材料と混合し、これを遺伝材料の存在下で撹拌することを含む、請求項４−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
導入された遺伝材料が抗生物質耐性を示す遺伝子を含まないＤＮＡ構築体である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物の組織培養および再生方法に関するものである。より詳細には、植物細胞の遺伝子形質転換、それらの細胞からの全植物体の再生のための方法、およびこうして形成された植物に関するものである。特に本発明は、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の形質転換方法に関するものであり、これにはサトウダイコン、フォダービート（ｆｏｄｄｅｒ  ｂｅｅｔ）、テーブルビート（ｔａｂｌｅ  ｂｅｅｔ）およびフダンソウ（Ｓｗｉｓｓ  ｃｈａｒｄ）が含まれる。
遺伝子形質転換およびそれに続く再生は今日では多数の植物種にとって大部分がルーティン事項であるが、ある種は利用しうる多数の方法の大部分による形質転換によっても依然として扱いにくい。ベータ・ブルガリスはそのような例の１つであり、ある細胞における一時発現および特定の遺伝子型についての偶発的な成功にもかかわらず、トランスジェニック植物の形成のための簡単なルーティン方法は得られていない（国際特許出願公開第９１／１３１５９号明細書；ダルイン（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，Ｋ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０  ３０９−３１４（１９９２））。より詳細には、直接的な遺伝子伝達およびそれに続く再生のための方法はまだ公表されていない。サトウダイコンのプロトプラストの扱いにくさについては十分に立証されている（リンゼー（Ｌｉｎｄｓｅｙ）ら、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）の形質転換，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２３，Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＶ”Ｙ．Ｐ．Ｓ．  Ｂａｊａｊ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｌａｇ，ベルリン，１９９３）。インビトロでの細胞分裂に限界があり、また分化全能性コロニーは一般に低い頻度で得られるにすぎない（０．１％以下）。サトウダイコンの葉から単離されたプロトプラストは大きさおよび形態が多様であり、これは供給組織内に生理学的水準（インビボでの細胞の相対位置に起因する）および細胞遺伝学的水準（倍数性、細胞周期）の双方における高度の細胞不均質性が存在することを反映している。
従ってビートに適用しうる簡単な高頻度の形質転換法に対する要望が依然としてある。
細胞を効果的に形質転換しうるためには、特定の要件を満たさなければならない。第１に、挿入される遺伝子は、遺伝子の転写の駆動する有効な調節要素を含む構築体内に組み立てられなければならない。次に、構築体を細胞内へ輸送する方法が得られなければならない。構築体が細胞膜内に挿入された時点で、内因性染色体材料中への組込みが起こるか、または起こらないであろう。組込みの確率は特定の手段で改良しうるが、組込みは単に制御されない偶然の出来事である。最後に、植物に関しては標的細胞タイプは細胞が全植物体に再生しうるものでなければならない。
植物細胞は、硬い細胞壁の存在がその壁を通して構築体を挿入するのに対するバリヤーを与えるので、細菌または動物細胞より形質転換するのが困難である。
従って植物細胞の形質転換方法の選択は、標的植物タイプにとって好都合なものに限定されやすい（ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ），Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，編者Ｈａｙｗａｒｄら，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ発行，ロンドン（１９９３））。一般論として、形質転換するのが双子葉植物は比較的容易であるのに対し、単子葉植物は極めて困難であり、それに関して成功が報告されているのは数種類の方法があるにすぎず、しかも極めて低い成功率のものである。
植物細胞を形質転換すると主張されている１方法は、顕微鏡下でＤＮＡ構築体を中空の針から標的細胞内へ注入する“マイクロインジェクション”として知られる方法である。その方法の変法は、細胞壁を針で裂き、ＤＮＡを周囲の培地に添加し、裂け目を通して細胞内へ拡散させるものである。この変法は“マイクロプリッキング（ｍｉｃｒｏｐｒｉｃｋｉｎｇ）”として知られている。これらの方法は両方ともオペレーターによる高度の操作手腕を必要とし、かつ極めて時間がかかる。公開された日本の特開平３−１０３１８３号公報は、外来遺伝子を植物の表皮組織中に生じる孔辺細胞内へマイクロインジェクションにより挿入したのち、これらの細胞を培養しうることを示している。しかし孔辺細胞の生理学的研究はそれらが異常に高い細胞内圧をもつことを示しており、孔辺細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクションが実現可能であるかどうかという疑問をもつのは当然であり、またいずれにしろこの方法はマイクロインジェクションの原理的欠点、すなわちこの方法には極めて時間がかかるため一日に比較的少数の細胞に注入しうるにすぎないという欠点をもつ。この経路でトランスジェニック植物を単離したことを正確に記載したデータは提示されていない。
今日、遺伝子構築体の導入のための、特に単子葉植物細胞に対して最も有効な方法は、いわゆる“バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）”法であるというのは恐らく真実であり、この方法は高密度金属粒子（通常はタングステンまたは金）を遺伝子構築体でコーティングし、ガスの爆発的放出により標的細胞培養物へ推進する。この別法はマイクロインジェクションおよびマイクロプリッキングに固有の高い的中精度を断念し、短期間で多数の細胞に“当てる”のを可能にする迅速“ペッパーポット”方式を支持してスクリーニングのための多数の推定形質転換体を与える。
バイオリスティックス法は有効であるかもしれないが高価な機械設備を必要とし、試みられた他の幾つかの方法と比較すると迅速ではあるが時間はかかる。しかしそれは確かに衝撃毎に多数の形質転換事象を達成する。この方法の問題の１つは、膨張性のガスの一撃が標的組織に及ぼす影響である。他の問題は、推進シャワーで標的の特定領域にねらいを定めることの困難さである。この後者の問題の克服を補助するために種々のマイクロターゲティング装置が設計された（レダク（Ｌｅｄｕｃ）ら，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．，７，１３５−１４３（１９９４）；イグレシアス（Ｉｇｌｅｓｉａｓ）ら，Ｐｌａｎｔａ，１９２，８４−９１（１９９４））が、今日までトランスジェニック植物は形成されていない。
植物細胞をプラスミドＤＮＡおよびサブミクロン直径の繊維またはウィスカーと混合するのは、簡単かつ安価な代替形質転換法である。炭化ケイ素ウィスカーを用いる形質転換についての公表された報告が幾つかある。第１はブラックメキシカンスウィート（ＢＭＳ）コーン懸濁細胞内でのβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）の一時発現につき記載している（ケプラー（Ｋａｅｐｐｌｅｒ）ら，１９９０）。同グループが最近、ＢＭＳおよびタバコの安定な形質転換についての彼らの結果を発表した（ケプラー（Ｋａｅｐｐｌｅｒ）ら，１９９２）。このコーンの系において、平均３．４のＢＡＳＴＡ耐性ＢＭＳコロニーが細胞（３００μｌの充填細胞容量）の渦撹拌処理試料それぞれから、ＢＡＲおよびｇｕｓ−含有プラスミドを用いて回収された。これらの除草剤耐性コロニーの６５％がｇｕｓを発現した（ケプラー、グ、ソマーズ、ラインズ、コックバーン（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  Ｈ．Ｆ．，Ｇｕ  Ｗ．，Ｓｏｍｅｒｓ  Ｄ．Ａ．，Ｒｉｎｅｓ  Ｈ．Ｗ．，Ｃｏｃｋｂｕｒｎ  Ａ．Ｆ．）（１９９０）“炭化ケイ素繊維仲介による植物細胞内へのＤＮＡデリバリー”，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８，およびケプラー、ソマーズ、ラインズ、コックバーン（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  Ｈ．Ｆ．，Ｓｏｍｅｒｓ  Ｄ．Ａ．，Ｒｉｎｅｓ  Ｈ．Ｗ．，Ｃｏｃｋｂｕｒｎ  Ａ．Ｆ．）（１９９２）“炭化ケイ素繊維仲介による植物細胞の安定な形質転換”，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６）。植物細胞、特にトウモロコシの形質転換にウィスカーを使用するのは、米国特許第５，３０２，５２３号明細書（ゼネカ・リミテッド名義）の対象である。
形質転換の成功に影響を及ぼす因子は多数ある。外因性遺伝子構築体およびその調節要素の設計および構築は、植物核の染色体ＤＮＡ中への外因性配列の組込み、およびトランスジーンが細胞により発現される可能性に影響を及ぼす。外因性遺伝子構築体を植物細胞核内へ非致死的方法で導入するのに適した方法が必須である。重要なことは、全植物体を回収したい場合は、構築体が導入される細胞のタイプは適切な再生プロトコルが与えられれば再生しうるタイプのものでなければならないということである。
本発明は、再生しうる特定の細胞タイプの選択に関するものである。
本発明の目的は、特にサトウダイコンに関する植物形質転換方法を提供することであるが、これに限定されない。
本発明によれば、植物細胞を再生培地中で培養することを含む植物形成法であって、細胞が気孔細胞であることを特徴とする方法が提供される。
好ましくは気孔細胞はそれらの細胞を含有する無傷の器官内で再生されるが、細胞を最初に単離してもよい。
気孔細胞の好ましい供給源の１つは、単離された葉の表皮である。
本発明方法は特にベータ・ブルガリス種の植物、殊にサトウダイコンに適用される。
好ましくは再生法には、ホルモンを含有しない培地上でカルスを形成することが含まれる。
本発明は、遺伝材料を植物の細胞に導入し、この形質転換細胞から全植物体を再生させることを含む、植物の遺伝子形質転換法であって、細胞が気孔細胞であることを特徴とする方法をも提供する。
形質転換は気孔細胞を含有する無傷の組織につき実施することができ、好ましい組織の１つは老化した葉の組織である。
好ましい態様においては、気孔細胞は葉の表皮にあるものである。
気孔細胞を含有する組織をマセレートして細胞懸濁液を調製し、これから植物を再生することができる。
さらに、気孔細胞を再生前にプロトプラストに変換することが好ましい。
好ましい態様においては、遺伝材料は抗生物質に対する耐性を示さない選択性マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築体であり、形質転換された組織を適切な選択試薬に暴露する。
形質転換は、孔辺細胞を含有する細胞集団または孔辺細胞濃度の高い細胞集団につき実施される。
形質転換は細胞懸濁液につき実施することができる。
気孔細胞を、形質転換の前または後に細胞壁の酵素消化によりプロトプラストに変換してもよい。
好ましい形質転換法の１つは、気孔細胞の懸濁液を顕微鏡的繊維材料と混合し、これを遺伝材料の存在下で撹拌することを含む。
葉、幹および特定の生殖組織、たとえばやく（ａｎｔｈｅｒ）（ケンドラ（Ｋｅｎｄｒａ  Ｇ．），Ｐｈｙｔｏｎ，４，８３−９６（１９５２））の表皮層内に、孔辺細胞として知られる特定のタイプの特殊化した細胞が生じる。また葉が老化するのに伴って、他の細胞タイプは孔辺細胞より早く死ぬ傾向がある（ツァイガーおよびシュワルツ（Ｚｅｉｇｅｒ  Ｅ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ａ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８，６８０−６８２（１９８２）））。従って老化した葉は特に生存孔辺細胞に富む供給源である。孔辺細胞は葉の細孔、すなわち気孔の開口を制御する（総説については“Ｓｔｏｍａｔａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，著者ツァイガー（Ｚｅｉｇｅｒ）ら，１９８７を参照されたい）。孔辺細胞の単離法（たとえばクルゼ（Ｋｒｕｓｅ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９０：１３８２−１３８６（１９８９）を参照されたい）、およびそれらをプロトプラストに変換する方法（たとえばモーソン（Ｍａｗｓｏｎ，Ｂ，Ｔ，），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  １６：２０７−２１４（１９９３）を参照されたい）があるが、これらの方法は生理学的研究に用いるために開発され、一般に植物ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）を用いる（モーソン（Ｍａｗｓｏｎ，Ｂ，Ｔ，），Ｐｌａｎｔａ，１９１：２９３−３０１（１９９３）；タルボットおよびツァイガー（Ｔａｌｂｏｔｔ，Ｚｅｉｇｅｒ），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０２：１１６３−１１６９（１９９３））。孔辺細胞は、他の葉細胞より比較的厚く、硬く、かつ高いペクチン含量をもつ壁を備えた、小さな、独特の形状をもつ細胞である。気孔は２個の孔辺細胞間に形成される。２種類の基本的形状、すなわち長円形およびイネ科形（ｇｒａｍｉｎａｃｅｏｕｓ  ｆｏｒｍ）がある。“気孔（ｓｔｏｍａ、ｓｔｏｍａｔａ）”という語は一般に気孔のみでなく、気孔複合体を形成する孔辺細胞および隣接細胞をも表すために用いられる（ウェイヤーズおよびメイダー（Ｗａｙｅｒｓ，Ｍｅｉｄｅｒ），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｔｏｍａｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，ｐ．３，Ｌｏｎｇｍａｎｓ，ロンドン，１９９０）。本出願においては、本発明者らは気孔複合体の形成に関与するいずれの細胞をも意味するために、“孔辺細胞”という語を用いる。
孔辺細胞は培養においては分裂し得ないと長い間信じられていた（トラン・サン・ファン（Ｔｒａｎ  Ｔｈａｎｈ  Ｖａｎ，Ｋ．），“形態形成の制御、すなわち何が細胞群を形成するか”，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ  １８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＩＩ，編者Ａ．Ｆｅｉｃｈｔｅｒ，発行者Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン，ｐ．１５１−１７１（１９８０））が、最近の報文は少なくとも１種、ニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌａｕｃａ）についてはそうでなく（カップルズ（Ｃｕｐｐｌｅｓ，Ｗ）ら，；Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（１９９１），１４，６９１−６９７）、タバコ孔辺細胞プロトプラストから全植物体を再生しうることを示した（サーガル（Ｓａｈｇａｌ，Ｐ）ら，；Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９７，１９９−２０８（１９９４））。タバコは植物科学においてモデル植物として広く用いられており、それをモデル系として有用にするその特性の１つは、ほとんどすべての細胞タイプから再生するそれの性向である。従ってタバコ孔辺細胞が全植物体に再生する能力は全く意外というわけではなく、またタバコがこの能力を備えているという事実は必ずしも他の種が同じ特性をもつことを示すものではない。
文献中にサトウダイコンの表皮細胞からのカルス形成に関する２つの短い記載があり（コトウスカおよびロゴジンスカ（Ｋｏｔｏｗｓｋａ，Ｒｏｇｏｚｉｎｓｋａ），Ｂｕｌｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｉｓｈ  Ａｃａｄ．Ｓｃ．３２，１１−１２（１９８４）；コトウスカ（Ｋｏｔｏｗｓｋａ），Ｂｅｉｔｒ．Ｂｉｏｌ．Ｐｆｌａｎｚ．，６７，２０９−２２３（１９９２））、葉柄の表皮上における不定の芽生についての幾つかの報告がある（たとえばハームズ（Ｈａｒｍｓ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，２，９３−１０２（１９８３）；シュナイダーおよびグンター（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｇｕｎｔｈｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｆｌａｎｚｅｎ，１８２，４８５−４９０（１９８７））。いずれの場合も孔辺細胞が分裂およびカルス形成しうることを示す証拠は提供されなかった。
本発明の１態様においては、葉の組織またはその表皮層をマセレートし、消化して孔辺細胞を含有する培養物を調製し、細胞壁を消化してプロトプラストを形成し、プロトプラストを適宜な方法で遺伝子形質転換し、形質転換体を選択し、形質転換体から植物を再生させる。
他の態様においては、無傷の葉組織を外因性ＤＮＡ構築体でコーティングされた微粒子により衝撃することによって、葉の細胞をｉｎ  ｓｉｔｕ形質転換する。次いで衝撃された組織をマセレートし、他の細胞タイプよりはるかに弾性である孔辺細胞を回収し、それから全植物体を再生する。
さらに他の態様においては、葉の組織をマセレートし、孔辺細胞に富む細胞集団をそれから調製する。次いでこの富化した細胞集団につき形質転換を実施し、それから全植物体を再生する。形質転換の前に孔辺細胞をプロトプラストに変換してもよい。他の方法においては、表皮片を手で剥ぎ取り、それからカルスを形成させることができる。
孔辺細胞を体細胞ハイブリダイゼーション、サイブリッド形成（クレンス（Ｋｒｅｎｓ）ら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７９，３９０−３９６（１９９０））または形質転換に用いるのに特に適切なものにしているのは、他の細胞タイプと比較して孔辺細胞の顕著な弾性、ならびに孔辺細胞およびそれらのプロトプラストの予想外の分化全能性である。しかしその弾性は普通は細胞内へのＤＮＡの導入に対する潜在的バリヤーとして見られるであろう。本発明により、孔辺細胞を実際に形質転換しうること、および形質転換された細胞を次いで再生しうることが立証され、こうしてトランスジェニック植物を形成するために有効な方法が提供された。
本発明の重要な１観点は、従来は許容し得ないほど低い頻度でしか形質転換し得なかった種であるビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（リンゼー（Ｌｉｎｄｓｅｙ）ら、サトウダイコンの形質転換，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  ２３，“Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＶ”Ｙ．Ｐ．Ｓ．  Ｂａｊａｊ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｌａｇ，ベルリン，１９９３）の形質転換に本発明を利用しうることである。
本発明方法は下記工程のうち幾つかを伴う：形質転換、表皮の単離、孔辺細胞の単離、孔辺細胞からのプロトプラストの調製、形質転換体の選択、および形質転換体からの全植物体の再生。ただしこれらの工程を実施する順序を変更し、またある工程を省略することができ、それぞれの変法は一定の利点をもつ。
１．無傷の葉組織を形質転換したのち、この材料またはそれから単離した表皮層をマセレートして細胞懸濁液を調製し、次いで必要な場合には音波処理する。これらの処理の作用は、孔辺細胞以外の細胞タイプを優先的に破壊することである。孔辺細胞の濃度はそれらがこのような物理的応力に対して比較的抵抗性であるため高められ、次いでそれらを懸濁液から浮遊または濾過により回収し、そして全植物体を再生することができる。
２．方法１においては、挿入されるＤＮＡ構築体は選択性マーカー遺伝子を含むことができ、比較的一般的なものは抗生物質、たとえばカナマイシンもしくはハイグロマイシン、または除草剤の１つ、たとえばＢＡＳＴＡに対する耐性である。次いで葉に選択圧を負荷し、生存細胞のみを懸濁液中へ導通し、または全葉組織の懸濁液に選択試薬を添加した場合には、回収された生存孔辺細胞は形質転換細胞のみからなり、別個の選択工程の必要性がない。
しかし構築体は抗生物質耐性を示す遺伝子を全く含有しないことが好ましい。従って植物細胞に対する選択性マーカーは除草剤ビアラホスであることが好ましい。細菌段階での構築体調製物の選択は、好ましくはビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＧＰＤ遺伝子（イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ）を使用する。これはヒスチジン生合成を欠如する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ｈｉｓＢ株を機能的に相補し、最小培地におけるそれらの増殖を回復させることができる。組換え選択のためにこのよう栄養要求性相補系を使用することにより、大腸菌を植物細胞内へ導入する前に大腸菌内でのプラスミドの操作のために、細菌性の抗生物質耐性マーカー、たとえばベータ−ラクタマーゼをプラスミド中へ導入する必要性が排除される。
３．孔辺細胞の懸濁液を１の記載に従って調製することができ、この懸濁細胞につき形質転換を実施する。繊維性材料、たとえば炭化ケイ素ウィスカーと共に渦撹拌するのがこの場合簡便な方法である。形質転換は前記のように孔辺細胞濃縮物の富化の前または後に行うことができ、方法２をさらに採用することができる。
４．孔辺細胞懸濁液または富化した懸濁液を前記に従って調製し、細胞を形質転換の前に酵素消化によりプロトプラストに変換することができる。最後にプロトプラストから植物を再生することができる。プロトプラストを形質転換の標的として用いることにより、無傷の孔辺細胞に対しては効果がない可能性のある、特定の既知の形質転換技術を利用することができる。
５．最も簡単な態様は、機械的手段または手動で得られた無傷の葉または単離した表皮を形質転換し、次いで選択圧下に再生することによるものである。孔辺細胞以外の細胞タイプが再生しうることは知られていないので、これらは再生せずに単に増殖し、形質転換孔辺細胞が再生するであろう。部分的に老化した葉（主として生存孔辺細胞のみを含有する）が特に適切である。
外因性ＤＮＡ構築体を導入するためのこの方法は本発明に特に適切というわけではない：それは簡便なのである。しかし本発明者らは既知のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介によるプロトプラスト形質転換法を用い、次いで選択および再生することにより、トランスジェニック植物の形成に成功した。
本発明を以下の実施例において具体例により説明する。これらの実施例において用いる種々の培地を下記の表１に示す。
0003673276.tif 000002
0003673276.tif 000003
0003673276.tif 000004
実施例１
植物材料および増殖条件
［ホール（Ｈａｌｌ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１２：３３９−３４２（１９９３）およびペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９５，８９−９７（１９９３）に従う］。
ベータ・ブルガリスの無菌の苗条（ｓｈｏｏｔ）培養物を下記により得た：種子をＨ2ＳＯ4中で５０分間インキュベートすることにより滅菌したのち、それらを水道水中で十分にすすいだ。次いで種子を５５℃の脱イオン水に１５分間装入したのち、それらを５％次亜塩素酸ナトリウム中で３０分間インキュベートした。次いで無菌水道水中でさらに３回（５、１０および１５分間）すすぐことにより、殺菌溶液を除去した。
水寒天（水道水中の１．５％寒天）上で明るい所において２２℃で発芽させた。
無菌の実生をさらに培地Ａ上で４週間培養したのち、分裂組織を同じ培地上での継代培養のために取り出した。
苗条を３週間毎に継代培養し、その時点で分裂組織を取り出して新鮮な培地に乗せた。培養物はすべて明るい所で（１日１６時間、３０００ルクス）２２℃においてインキュベートされた。
実施例２
葉のプロトプラストの単離
［クレンス（Ｋｒｅｎｓ）ら，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７９，３９０−３９６（１９９０）に従う］。
無菌的に増殖させた３週齢のベータ・ブルガリスの苗条の培養物の葉から、下記によりプロトプラストを単離した：苗条の培養物から葉を取り、約１．５ｇ（乾燥重量）を９ｃｍのペトリ皿内で１０ｍｌの培地Ｂにおいて細断した。
培地Ｂを除去したのち、消化酵素を含有する１５ｍｌの培地Ｃに葉片を再懸濁した。
暗所において回転振盪機（４５ｒ．ｐ．ｍ．、振幅１１ｍｍ）上で一夜（約１６時間）、２５℃においてインキュベーションを行った。
粗製プロトプラスト混合物をピペットで１０回、緩和に吸入排出したのち、プロトプラスト懸濁液をナイロン篩（２９７および５５μｍメッシュ）で重力濾過することにより採取した。
プロトプラスト懸濁液を１２ｍｌの遠心管２本に装入したのち、プロトプラストを５５ｇで５分間遠心分離することによりペレットとして採取した。
上清を廃棄し、プロトプラストを洗浄し、そして１０ｍｌの培地Ｄ中で２回遠心分離した。
最後にプロトプラストを１０ｍｌの培地Ｅに再懸濁し、その上に１ｍｌの培地Ｆを慎重に乗せ、前記に従って遠心分離した。
上部１ｍｌの培地Ｆの層からプロトプラストを採取し、血球計数器により集団密度を測定した。
すべてのプロトプラスト培養物を２５℃において暗所でインキュベートした。
実施例３
プロトプラスト包埋
［ホール（Ｈａｌｌ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１２：３３９−３４２（１９９３）に従う］。
培養前にプロトプラストを下記に従って固定化した：目的とするコロニー形成密度（通常は３０，０００−１２５，０００／皿）を得るための既知数のプロトプラストを全容量５００μｌの培地Ｆに再懸濁した。
５００μｌの培地Ｇと十分に混合したのち、１０ｍｌの培地Ｈを入れた６ｃｍのペトリ皿上に懸濁液を薄い層として広げた。
室温で２時間のインキュベーション後に、アルギン酸カルシウムは凝固して薄いディスクとなり、次いでこれを取り出し、空のペトリ皿に移した。
実施例４
固定化した細胞の固定および細胞ファインダー用の培養物の調製
個々の細胞の位置決定および再判定を補助するために、培養物を下記に従って調製した：２４．５×４０ｍｍのカバーガラスをアルコール中で殺菌し、火炎処理した。
１滴（約５０μｌ）の培地Ｉをカバーガラスの表面全体に広げ、完全に乾固させた。
アルギン酸カルシウムディクスの中心領域（１０×２５ｍｍ）を鋭利な小刀で取り出した。
１滴の培地Ｇをカバーガラスに乗せ、その上に切り取ったアルギン酸カルシウムディスク片を乗せた。
アルギナートディスクの端の周りに、アルギナートおよびアガロース被覆カバーガラスの両方と接触するように、リング状の培地Ｉ（３５℃）を配置した。
最後に２滴の培地Ｉを用いて、カバーガラスに金製の電子顕微鏡検体グリッド２個を、一方は上中心に、他方は底の右側に固定した。
アガロースが凝固したのち、４ｍｌの培地Ｊを入れた６ｃｍのペトリ皿にアセンブリー全体を移した。
アルギナートディスクの残りを同様にこの培地に移したのち、皿をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ、商標）でシールした。
実施例５
細胞の位置決定および再判定
ステッパーモーター駆動式顕微鏡載物台を備えたツァイスＩＣＭ  ４０５倒立顕微鏡を用いた。専用コンピュータープログラムを用いて顕微鏡鏡載物台の動きを制御し、かつシステムを目盛り定めし、ペトリ皿内の個々の細胞の位置を１μｍの精度まで記録することができた。固定された基準点にある２個のＥＭグリッドの中心の位置を利用して、目的とする大きさおよび形態の細胞の位置を決定し、記録した。後日、再度目盛り定めするためにＥＭグリッドの位置をコンピューターに再入力したのち、半自動的にこれらの細胞の位置を再判定することが可能であった。
実施例６
サトウダイコンの葉のプロトプラスト調製物における細胞分裂に関与する細胞タイプ
分裂して生存可能なカルスを形成する能力をもつプロトプラストの２つの小集団が、ビートの葉の消化物中に同定された。しかしこれらのカルスは形態学的に異なり、１タイプのみが分化全能性である。
再生可能なタイプのカルスは極めて軟質で脆く、水分が多く、このためそれは容易に離散することを特色とする。このタイプのカルスの再性能は条件および遺伝子型に応じて異なるが、その最高は３０％であった。このカルスタイプの前駆体として同定されたプロトプラストは、極めて明瞭に識別される形態をもち、比較的小さく、重量オスモル濃度５１０ｍＯｓ／ｋｇの培地中で１日培養したのち測定して、直径１５−２７（モード２３）μｍである。これらの細胞は、少数の異常に大きなデンプン粒（通常５−１４個／細胞であり、８または９個／細胞が極めて一般的である）を除いて、可視細胞質成分をほとんど含有しない。これらのデンプン粒は細胞容積の約５０％を占める場合がある。これらの細胞の分裂は比較的緩慢に、平板培養の５−１０日後に起こり、種々の大きさおよび形状の多数のデンプン粒に富む細胞質を含む小型の細胞からなるルーズな構造のカルスが形成される。明瞭な液胞は見られない。
他のタイプのカルスは極めて硬く、密であり、通常は球形のコロニーを形成する。それは分化全能性であるとは思われない。このタイプのカルスは、直径２０−３０（モード２７）μｍであること、および多数の小型の不均一な大きさおよび形状をもつデンプン粒を含有する細胞質に富むことを特色とするプロトプラストタイプに由来することが見出された。一般にこれらの細胞は（平板培養の１日後に見て）既に細胞の中心に位置した核を備えていた。これらの細胞は早期に（通常は３日以内に）分裂し、急速に分裂して、顆粒性細胞質を含み、ただし明瞭に見える液胞を含む細胞からなる丸い小型のコロニーを形成する。
形態学的特性に基づいて、かつ部分的な表皮消化に従って、再生可能なカルスを生じる最初の細胞タイプは孔辺細胞に由来することが確認された。第２のタイプは維管束からの形成層組織に由来すると考えられる。葉肉プロトプラストは決して分裂しない。
実施例７
表皮の単離および再生
剥ぎ取り方法
葉（インビトロ材料および温室材料）の下側表皮（ｌｏｗｅｒ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｉｄｅ）を、弯曲した小刀を用いて手で剥ぎ取ることにより表皮ストリップを得た。これは空のペトリ皿内で、またはワットマン濾紙上で、または液体培地中で行うことができる（それは分裂期に実際に影響を及ぼすものではなく、主として１枚の葉から最大ストリップを得るための個人的な好みに基づく）。剥ぎ取り角度も、残留する葉肉細胞数も、細胞の培養または孔辺細胞が分裂する能力には影響を及ぼさない。
剥ぎ取り直後にストリップを培地に装入する。ストリップのいずれの側が培地と接触するかは問題でない。より重要なことは、培養当たりのストリップの濃度である：単離工程後に液体表面が少なくとも約９５％はストリップで覆われていなければならない。培養中にストリップが捩れ、らせん状になり、場合により沈むであろうが、それは細胞分裂に影響を及ぼさない。
表皮ストリップは、上記の条件が満たされる限りペトリ皿（直径５および２０ｃｍ）内およびミクロウェル内で培養された。ストリップは２８℃において暗所で培養された。
分裂を数種類の培地中で観察した：Ｋ８ｐ、ＭＳ、ＰＧｏおよびＢＵＬ。しかし最良はＰＧｏ培地であり、これは白色の脆いカルスを９５％以上の培養物において形成した。最も重要なことは、この培地がホルモンを含有しないという事実であった。ホルモン（ＢＡＰ、ＮＡＡ、２，４−Ｄ）を含有する培地は分裂頻度を改良しない。しかし２，４−Ｄが培地中に存在すると（０．２−２ｍｇ／ｌの濃度で）、高濃度の硬質タイプのカルスが観察される。このカルスは再生することができず、白色の脆いカルスの形成を部分的に妨害するので、硬質カルスが全く−またはごく稀にしか−出現しないＰＧｏ培地を用いるのが最良である。
３０以上の異なるサトウダイコン遺伝子タイプを試験し、すべてが白色の脆いカルスを少なくとも１回は形成した。白色の脆いカルスの形成は材料の種類（インビトロクローン、実生、温室材料）によるのではなく、またこの材料が増殖した培地（ＭＳ、ＭＳ／２、ＰＧｏ＋ＢＡＰ）も孔辺細胞が分裂する能力には影響を及ぼさない。
表皮ストリップを暗所で２８℃において４−５週間培養する。得られた白色の脆いカルスをＰＧｏ＋ＢＡＰ（１ｍｇ／ｌ）培地に移し、さらに同一条件で３−４週間培養する。次いでこのカルスを同一培地、またはＰＧｏ＋ＢＡＰ（１ｍｇ／ｌ）＋ＮＡＡ（０．２ｍｇ／ｌ）、または同一の２種類のホルモンを含むＭＳ上で２０−２２℃において１６−８時間の明暗サイクルにより継代培養する。２−３週間後に最初の再生体を回収することができる。後者の２培地において最大数の再生体が見られた。
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実施例８
表皮の単離−ブレンディング法
手による剥ぎ取りは極めて冗長であり、時間がかかるが、ブレンディング法（プロトプラスト単離プロトコルに用いられるもの）は大量の表皮小片を生成する。ただしブレンダーは選択性がより低く、かつ多量の小さな葉組織屑（および主として硬質タイプのカルスを形成する細胞）をも生成する。
ＰＧｏ培地においては白色タイプのカルスが数例認められたが、それは表皮片を用いた場合より一貫性が少ない。他方、ＢＵＬ培地はより適切であると思われる。
プロトプラストの単離に際してはアァイコル（Ｆｉｃｏｌｌ）の存在下でブレンディングを行う。泡立ちを避け、かつ単離時間を短縮するために、ブレンディングに際しては同様に直接に培地（ＰＧｏおよびＢＵＬ）を用いて作業した。やはりＢＵＬが最良ではあったが、ＰＧｏを用いても良好な結果が得られた。
ブレンディング法により調製された表皮ストリップを実施例３に記載したと同様に培養した。
実施例９
孔辺細胞プロトプラストの単離および培養
クレンス（Ｋｒｅｎｓ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９０：１３８２−１３８６（１９８９）の方法により得られた表皮片を、培地Ｄに溶解した２％セルラーゼおよび３％マセロザイムの溶液中で一夜消化した。ただし異なる遺伝子型にはわずかに異なる酵素混合物が必要である。実施例２に記載した洗浄および精製プロトコルののち、孔辺細胞が高度に富化されたプロトプラスト集団を得た。これらの方法により、最高８０−９０％の孔辺細胞プロトプラストを含む集団が得られた。次いでプロトプラストを実施例５に詳述したようにアルギン酸カルシウムに包埋し、パラフィルムでシールした６ｃｍのペトリ皿内で４ｍｌの培地Ｊ中において培養した。培養物を暗所で２８℃においてインキュベートした。これらの培養において孔辺細胞コロニー形成率２５−５０％がルーティンに得られた。
実施例１０
ＰＥＧ−仲介によるプロトプラストの遺伝子形質転換
この例において導入されたＤＮＡは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子、および選択性マーカー遺伝子として、サトウダイコンが普通は感受性である除草剤ビアラホス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）すなわちホスフィノスリシンに対する耐性を示す配列を含む、プラスミドｐＰＧ５からのものであった。
用いた方法はクレンス（Ｋｒｅｎｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：７２−７４（１９８２）が記載したものであり、下記の特定のパラメーターを用いた。ＰＥＧの最適濃度は２０％であったが、これより低い濃度も安定な形質転換体を形成した。ＰＥＧのタイプは特に重要ではないことが認められた。試験したすべてのＤＮＡ濃度で安定な形質転換体が見られたが、５０μｇ／５００，０００プロトプラストを最適濃度として選んだ。インキュベーション期間は１０−４０分であった。
下記の表１は得られた結果のうち若干を例示する。
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上記の例すべてにおいて、ＰＥＧ濃度は１３．３％であり、ＤＮＡ（ｐＰＧ５）の使用量は５０μｇであった。
形質転換後に、ビアラホスを０．２５ｍｇ／リットルの濃度で含有するアルギナート培地にプロトプラストを移し、４週間培養した。この時点までに形質転換した孔辺細胞カルスは明瞭に識別され、単離し、再生培地に移すことができた。
実施例１１
葉の組織の遺伝子形質転換
この例において導入したＤＮＡは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子、および選択性マーカー遺伝子として、サトウダイコンが普通は感受性である除草剤ビアラホスすなわちホスフィノスリシンに対する耐性を示す配列を含む、プラスミドｐＰＧ５からのものであった。
２種類のサトウダイコン遺伝子型（ＢＯＡ１１３およびＢＵＭ２と表示）の無菌的に増殖させた植物から葉を切り取り、背軸面を上にして、０．６％寒天で凝固させたデグリーフおよびヤコブスの培地上で平板培養した。５枚の葉のうち３枚をそれぞれ９ｃｍのペトリ皿に用いた。
金粒子（直径１．６μｍ）を、除草剤ホスフィノスリシン（ビアラホス、ＢＡＳＴＡ）に対する耐性を与えるホスフィノスリシンアセチルスランスフェラーゼをコードする遺伝子（選択性マーカーとして）およびβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）をコードする遺伝子１コピー（検出用マーカー遺伝子）を含むプラスミドでコーティングした。粒子を塩化カルシウム／スペルミジン沈殿法によりコーティングし、１００％エタノールに再懸濁した。１０μｌアリコートをデュポンのバイオリスティックＰＤＳ１０００／Ｈｅ遺伝子銃の個々のマクロキャリヤー上にピペット分注し、シリカゲル結晶で乾燥させた。
用いた衝撃パラメーターは下記のとおりであった：ラプチャーディスクとマクロキャリヤーのギャップ約１．６ｍｍ（１／１６インチ）、マクロキャリヤー移動距離６ｍｍ、ラプチャーディスク圧力約６９０−７５８０ｋＰａ（１００−１１００ｐｓｉ）、ターゲット距離５、８または１２ｃｍ、およびターゲットチャンバー内の部分真空７１１ｍｍ（２８インチ）Ｈｇ。
衝撃後に葉を２３℃で２日間培養したのち、ｇｕｓ遺伝子発現の組織化学的位置測定のために５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）で染色した。染色後に葉を９５％エタノール中で６５℃において２０分間脱色した。ｇｕｓ発現を示す細胞を“呈色ユニット（ｃｏｌｏｕｒ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）”（ＣＦＵ）と命名した。両方の遺伝子型につき全表皮ＣＦＵ中の孔辺細胞ＣＦＵの頻度は２０−４０％であった。
実施例１２
カルス培養および再生
２１日後に、その時点で見えるミクロカルスを含むアルギナート片を、２０ｍｌの培地Ｋを入れた９ｃｍのペトリ皿に移した。培養を暗所で前記に従って行った。
直径約１−２ｍｍの大きさに達する脆くて水分の多いタイプのカルスを別個につまみ取り、２０のグループで新鮮な培地Ｋ上において培養した。この階段でＰＣＲ分析および組織化学的ＧＵＳアッセイの両方により、形質転換体の存在が確認された。
２週間の間隔ですべてのカルスを新鮮な培地に継代培養した。
再生体が個々のカルスの最初の８週間の培養に際して出現した。最初の苗条が見えて、約２ｍｍの大きさに達した時点で、皿を２５℃、１５時間の昼間長さの明るい所（３０００ルクス）へ移した。
長さ約４ｍｍの小植物体を、１５ｍｌの培地Ｋを入れた別個の培養試験管に移し、前記に従って明るい所でさらに継代培養した。
実施例１３
発根および土壌への移植
小植物体が４葉期に達した時点で（普通は５−６週間後、１つの継代培養は３週間後）、１５ｍｌの培地Ｌを入れた培養試験管にそれらを移し、前記に従ってさらに培養した。
少なくとも１本の根が長さ１ｃｍに達した時点で小植物体を培養試験管から取り出し、流れる水道水下で洗浄して寒天片をすべて除去し、温室内の９ｃｍの鉢中の土壌に移植した。
小植物体を透明なプラスチックカップで覆って湿潤環境を７日間与えたのち、それらは保護せずに生育することができた。
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