(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲｏｂｏとＳｌｉｔポリペプチドの相互作用を変調する薬剤を同定する方法において、
Ｒｏｂｏポリペプチド、Ｓｌｉｔポリペプチド及び候補薬剤を、薬剤が存在しなかったらＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用をなす条件下で組み合わせ、ここで、ＳｌｉｔポリペプチドはＲｏｂｏに特異的に結合し、これを活性化し又は活性化を阻害するものであり、
該薬剤の存在下でＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドの第２の相互作用を測定する、
工程を含んでなり、第１と第２の相互作用の差異が、薬剤がＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドの相互作用を変調することを示す方法。
【請求項２】
ＲｏｂｏとＳｌｉｔポリペプチドの相互作用を変調する方法において、
Ｒｏｂｏポリペプチド、Ｓｌｉｔポリペプチド及びＲｏｂｏ Ｃ末端欠失変異体を含んでなるＲｏｂｏ−Ｓｌｉｔ相互作用を変調する薬剤を、前記Ｒｏｂｏ−Ｓｌｉｔ相互作用を変調する薬剤が存在しなかったらＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用をなす条件下で組み合わせる工程を含み、ここで、ＳｌｉｔポリペプチドはＲｏｂｏポリペプチドに特異的に結合し、これを活性化し又は活性化を阻害するものであり、
Ｒｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用とは異なった第２の相互作用をなす方法。
【請求項３】
Ｒｏｂｏ−Ｓｌｉｔ相互作用を変調する薬剤が、細胞外ドメインを含んでなるＲｏｂｏ Ｃ末端欠失変異体である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願においてなされた研究は、ＮＩＨ助成ＮＳ１８３６６によって部分的に支援された。政府は本出願について発行されるあらゆる特許において権利を有しうる。
【０００２】
（緒言）
発明の分野
本発明の分野は、神経細胞機能を変調するための方法である。
【０００３】
背景
発達しているＣＮＳにおいて、殆どの成長円錐は、その移動の間に一又は複数回正中線に直面し、横切るか横切らないかの決定をする。この決定は静的なものではなく、むしろ成長円錐の歴史に従って変化する。例えば、ショウジョウバエ腹側の神経索において、介在ニューロンの約１０％がそれ自身の側にのみ軸索を伸長させ、ある場合には正中線を横切らないでその近くに延びる。介在ニューロンの他の９０％は最初に正中線を横切ってその軸索を伸長させ、それから回って他の側に長手方向に伸長し、しばしば正中線の近くまで延びる。一度正中線を横切ったこれらの成長円錐は、正中線の近傍であるにも拘わらず、またそれを横切る多くの交連軸索にも拘わらず、決してそれを再び横切ることはない。この横切るか横切らないかの決定はホウジョウバエに独特なものではなく、全ての両側性対称神経系の様々な正中線構造に共通である。
【０００４】
どのような正中線シグナル及び成長円錐レセプターが、成長円錐が正中線を横切るか否かを制御するのであろうか。一度横切った後、どのような機構によりこれらの成長円錐が再度横切ることが防止されるのであろうか。関連する問題は、中間標的としての正中線の性質に関する。そのように多くの成長円錐が正中線をそのように誘引性構造とするなら、なぜさまよわないで正中線を横切るのか。なぜ正中線から離れるのか。
【０００５】
このような系の成分をコードする遺伝子を見つけるための一つのアプローチ法は、正中線を横切る軸索が多すぎるか又は少なすぎる変異体についてスクリーニングすることである。このような大規模変異体スクリーニングは、ショウジョウバエで既に行われ、２つの鍵となる遺伝子：交連無し（ｃｏｍｍ）及び迂回（ラウンドアバウト）（ｒｏｂｏ）の同定がなされている（Seeger等, 1993; Tear等, 1993による概説）。ｃｏｍｍ変異体胚において、交連性成長円錐は、最初は正中線方向に配向するが、ついでそれを横切らず、代わりに螺旋を巻いてそれ自身の側に伸長する。他方、ｒｏｂｏ変異体胚は、あまりに多くの軸索が正中線を横切る点で反対の表現型を示す；通常はそれら自身の側にしか伸長しない多くの成長円錐がここでは正中線を横切るようで、通常は一度しか正中線を横切らない軸索が複数回横切るようである（Seeger等, 1993; 本明細書）。ｃｏｍｍ及びｒｏｂｏの二重変異体は、ｒｏｂｏ様の表現型を示す。
【０００６】
ｃｏｍｍとｒｏｂｏはどのように機能して正中線の横断を制御するのか。これらの遺伝子についての最初の論文（Seeger等, 1993）もｃｏｍｍのクローニングに関するもの（Tear等,1996）もこの問題を解決していない。ｃｏｍｍは正中線細胞に発現される新しい表面タンパク質をコードする。実際、ｃｏｍｍの論文（Tear等,1996）は、これからの研究が「Ｃｏｍｍの謎の機能にある光を投じる助けとなる」であろうという希望で終わっている。
【０００７】
米国特許出願第０８／９７１１７２号（Ｒｏｂｏ、新規ポリペプチドファミリー及び核酸、発明者：Corey S. Goodman, Thomas Kidd, Kelvin J. Mitchell and Guy Tear）は、ショウジョウバエを含む様々な種におけるｒｏｂｏのクローニング及びキャラクタリゼーションを開示している；Ｒｏｂｏポリペプチドとポリペプチドコード核酸がまた開示され、そのジェンバンク寄託番号がKidd等(1998)Cell 92,205-215に示されている。ｒｏｂｏは５の免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメイン、３のフィブロネクチン型IIIドメイン、膜貫通ドメイン、及び長い細胞質ドメインを持つ新しいクラスの誘導レセプターをコードする。Ｒｏｂｏはショウジョウバエから哺乳動物まで高度に保存されたＩｇスーパーファミリータンパク質の新規なサブファミリーを定める。Ｒｏｂｏ外部ドメイン、特に最初の二つのＩｇドメインは、ショウジョウバエからヒトまで高度に保存されているが、細胞質ドメインは、より多岐にわたっている。それにも拘わらず、細胞質ドメインは高度に保存された３つの短いプロリンリッチのモチーフを含んでおり、このモチーフはＳＨ３又はリンカーもしくはシグナル伝達分子における他の結合ドメインに対する結合部位を表す。
【０００８】
正中線を決して横切らない軸索に対して、Ｒｏｂｏは当初からその成長円錐上に発現される；正中線を横切らない軸索の大部分に対しては、Ｒｏｂｏは正中線を横切った後にだけその成長円錐に高レベルで発現される。ショウジョウバエにおけるトランスジェニックレスキュー実験により、Ｒｏｂｏがレセプターとしての機能に一致して、細胞自立的に機能することができることが明らかにされている。しかして、ショウジョウバエにおいて、Ｒｏｂｏは正中線横断を制御する門番役として機能するように思われる；高レベルのＲｏｂｏを発現する成長円錐は正中線の横断が妨げられる。哺乳動物におけるＲｏｂｏタンパク質は軸索誘導の制御において同様な形で機能する。
【０００９】
米国特許出願第６０／０６５５４号（神経細胞機能の変調方法、発明者：Corey S. Goodman, Thomas Kidd, Guy Tear, Claire Russell及びKevin Mitchell）は、ＣｏｍｍがＲｏｂｏ発現をダウンレギュレートすることを明らかにする異所性及び過剰発現研究を開示しており、ＣｏｍｍがＲｏｂｏ媒介正中線反発を抑制するように機能することを証明している。これらの結果から、正中線におけるＣｏｍｍのレベルと成長円錐上のＲｏｂｏのレベルが密接に関連しあって動的に調節され、ある成長円錐のみが正中線を横切ること、横切らない成長円錐が正中線にとどまらないこと、そして成長円錐はひとたび横断すれば再び横断することはないことが示されている。
【００１０】
関連文献
Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D.及びGoodman C.S. (1993) Neuron 10, 409-426; Tear G.等 (1996) Neuron 16, 501-514; Rothberg等 (1990) Genes Dev 4, 2169-2187; Kidd等 (1998) Cell 92, 205-215。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、脊椎動物Ｓｌｉｔ１及びＳｌｉｔ２（集合的に脊椎動物Ｓｌｉｔ）ポリペプチド、関連する核酸、脊椎動物Ｓｌｉｔ特異的構造及び活性を有するそれらのポリペプチドドメイン、及びＳｌｉｔ機能のモジュレーターに関する方法及び組成物を提供する。脊椎動物Ｓｌｉｔポリペプチドは、細胞、特に神経細胞の機能及び形態を調節することができる。該ポリペプチドは、形質転換した宿主細胞から、主題の脊椎動物Ｓｌｉｔポリペプチドをコードする核酸から組換え的に産生でき、あるいは哺乳類細胞から精製することもできる。本発明は、天然脊椎動物Ｓｌｉｔ遺伝子と特異的にハイブリッド形成できる単離された脊椎動物Ｓｌｉｔハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、特異的抗体等の脊椎動物Ｓｌｉｔ特異的結合薬剤、及び主題組成物の診断（例えば、脊椎動物Ｓｌｉｔ転写物の遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（例えば、神経細胞成長を変調するためのもの）及びバイオ製薬工業（例えば、免疫原、脊椎動物Ｓｌｉｔ遺伝子及びポリペプチドを単離するための試薬、リード製薬剤のための化学的スクリーニング用試薬など）における主題組成物の製造及び使用方法を提供する。
【００１２】
本発明はまたＲｏｂｏとＲｏｂｏリガンドの相互作用を変調する薬剤を同定し、ＲｏｂｏとＲｏｂｏリガンドの相互作用を変調するための方法と組成物を提供する。Ｒｏｂｏ：リガンドモジュレータを同定する方法は商業的な薬剤スクリーニングに特定の用途が見出される。これらの方法は、一般に、（１）Ｒｏｂｏポリペプチド、Ｓｌｉｔポリペプチド及び候補薬剤を、薬剤が存在しなかったらＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用をなす条件下で、組み合わせ、（２）薬剤の存在下でＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドの第２の相互作用を測定することを含み、ここで、第１と第２の相互作用間の差異が、薬剤がＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドの相互作用を変調することを示す。ＲｏｂｏとＲｏｂｏリガンドの相互作用を変調する主題方法は、Ｒｏｂｏポリペプチド、Ｓｌｉｔポリペプチド及びモジュレータを、モジュレータが存在しなかったらＲｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用をなす条件下で、組み合わせることを含み、Ｒｏｂｏ及びＳｌｉｔポリペプチドが第１の相互作用とは異なった第２の相互作用をなす。特定の実施態様では、モジュレータはＲｏｂｏ又はＳｌｉｔポリペプチドのドミナントネガティブ型である。
【００１３】
（本発明の詳細な説明）
主題の方法は、Ｒｏｂｏ：リガンドの相互作用を変調する薬剤に対するスクリーニング及びＲｏｂｏ：リガンドの相互作用を変調するための方法を含む。Ｒｏｂｏ活性化は、形態、細胞移動性、細胞−細胞相互作用等々を含む広範な細胞機能を制御することが見出された。ＳｌｉｔポリペプチドはＲｏｂｏポリペプチドの特異的活性化因子及び失活剤として開示される。従って、本発明は、細胞をＲｏｂｏ：Ｓｌｉｔ相互作用のモジュレータに接触させることにより、Ｒｏｂｏ活性化を変調する工程を含んでなる標的細胞を変調する方法を提供する。
【００１４】
標的のＲｏｂｏポリペプチドは、一般に標的細胞上に自然に発現される。ショウジョウバエ１、ショウジョウバエ２、線虫（C. elegans）、ヒト１、ヒト２及びマウス１Ｒｏｂｏポリペプチドをコードする例示的な天然ｃＤＮＡの核酸配列及びその翻訳物はKidd等(1998) Cell 92, 205-215及び米国特許出願第０８／９７１１７２号に記載されている。標的Ｒｏｂｏポリペプチドは、Ｒｏｂｏ特異的アミノ酸配列と結合特異性又は機能を有する機能的Ｒｏｂｏドメインを少なくとも含む。好適なＲｏｂｏドメインは、天然の全長Ｒｏｂｏの少なくとも８、好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも３２、最も好ましくは少なくとも６４の連続残基を含む。特定の実施態様では、ドメインは、一又は複数のここに述べる構造的／機能的Ｒｏｂｏ免疫グロブリン、フィブロネクチン又は細胞質モチーフドメインを含む。主題のポリペプチドは、特に担体タンパク質に結合されたとき、Ｒｏｂｏ特異的抗原及び／又は免疫原を与える。例えば、Ｒｏｂｏ及びヒトＲｏｂｏ特異的ドメインに対応するペプチドは、スカシ貝抗原（ＫＬＨ）に共有的に結合し、抱合体はフロイント完全アジュバントに乳化される。実験用ウサギを従来のプロトコールに従って免疫化して出血させる。Ｒｏｂｏ特異的抗体の存在を、固定化したＲｏｂｏポリペプチドを用いた固相免疫吸着アッセイによって検定する。ジェネリックなＲｏｂｏ特異的ペプチドは、整列化したＲｏｂｏポリペプチド配列に保存された領域として直ぐに明らかである。また、種特異的及び／又は免疫原生ペプチドは整列化において相違した細胞外又はサイトゾル領域として直ぐに明らかである。ヒトＲｏｂｏ特異的抗体は、非ヒトＲｏｂｏポリペプチドとの非交差反応性で特徴付けられる。
【００１５】
主題とするドメインは、Ｒｏｂｏ特異的細胞、特にニューロン変調又は阻害変調活性、Ｒｏｂｏ−リガンド結合又は結合阻害活性のようなＲｏｂｏドメイン特異的活性又は機能を提供する。Ｒｏｂｏ特異的活性又は機能は、簡便なインビトロの、細胞ベースの、又はインビボのアッセイ：例えばインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイにより、動物等（例えば遺伝子療法、遺伝子導入など）において測定することができる。結合標的は、天然の細胞内結合標的、Ｒｏｂｏ制御タンパク質又はＲｏｂｏ活性又はその局在化を直接変調させる他の制御因子；あるいは、抗体のような特異的免疫タンパク質といった非天然結合標的、又は以下に記載するようなスクリーニングアッセイで同定されるもののようなＲｏｂｏ特異的試薬であってよい。Ｒｏｂｏ結合特異性は、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、主題のポリペプチドのＲｏｂｏ発現細胞における陰性変異体として機能する能力、異種宿主（例えば齧歯類又はウサギ）におけるＲｏｂｏ特異的抗体を生じさせる能力等によって検定することができる。
【００１６】
同様に、Ｓｌｉｔポリペプチドは、Ｒｏｂｏポリペプチドを特異的に活性化させるか活性化を阻害するＳｌｉｔポリペプチドから簡便に選択される。例示的な好適なＳｌｉｔポリペプチドは、（ａ）ここに開示した脊椎動Ｓｌｉｔ配列、特にヒトＳｌｉｔ−１（配列番号：２）又はＲｏｂｏ発現を特異的に変調するその欠失変異体又はデフォルト設定を用いるベストフィット法により測定してここに開示した脊椎動物Ｓｌｉｔ配列に約６０−７０％、好ましくは約７０−８０％、より好ましくは約８０−９０％、より好ましくは約９０−９５％、最も好ましくは約９５−９９％類似し、天然のショウジョウバエＳｌｉｔ配列以外のものである配列を含み、及び／又は（ｂ）天然のＳｌｉｔコード配列（例えば天然ヒトＳｌｉｔ−１コード配列、配列番号：０１）又はそれに特異的にハイブリダイズする少なくとも３６、好ましくは少なくとも７２、より好ましくは少なくとも１４４、最も好ましくは少なくとも２８８のヌクレオチド長のその断片を含む核酸によりコード化される。好適な欠失変異体は、ここに記載したようなＲｏｂｏ結合又は活性化アッセイにおいて即座にスクリーニングされる。好ましいＳｌｉｔドメイン／欠失変異体／断片は、開示した脊椎動物Ｓｌｉｔ配列の少なくとも８、好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも３２、最も好ましくは少なくとも６４の連続残基を含み、特に上記のＲｏｂｏに対する上述のような担体タンパク質に結合しているとき、Ｓｌｉｔ特異的抗原性及び／又は免疫原生のようなＳｌｉｔ特異的活性をもたらす。好適な天然Ｓｌｉｔコード配列断片は、そのようなＳｌｉｔドメインをコードするのに十分な長さのものである。特定な実施態様では、Ｓｌｉｔ断片は、種特異的断片を含む；そのような断片は開示された配列のアラインメントから直ぐに識別される。例えば表１及び２にボックスで囲まない配列として示されているものを参照されたい。
【００１７】
表１．ヒトＳｌｉｔ−１（配列番号：０２）、ヒトＳｌｉｔ−２（配列番号：０３−０６）、ショウジョウバエＳｌｉｔ−１（配列番号：０７）、線虫Ｓｌｉｔ−１（配列番号：０８−０９）、マウスＳｌｉｔ−２（配列番号：１０−１１）及びマウスＳｌｉｔ−１（配列番号：１２−１４）のアラインメント。
0003685390.tif 000002
0003685390.tif 000003
0003685390.tif 000004
0003685390.tif 000005
0003685390.tif 000006
表２．ヒトＳｌｉｔ−１（配列番号：０２）とショウジョウバエＳｌｉｔ−１（配列番号：０７）のアラインメント。
0003685390.tif 000007
0003685390.tif 000008
0003685390.tif 000009
【００１８】
例示的なかかるヒトＳｌｉｔ−１免疫原性及び／又は抗原性ペプチドを表３に示す。
表３．Ｓｌｉｔ−１特異的ウサギポリクローナル抗体を生じさせる免疫原性ヒトＳｌｉｔ−１ポリペプチド：Ｓｌｉｔポリペプチド−ＫＬＨ抱合体は上述のプロトコールに従って免疫化した。
Ｓｌｉｔポリペプチド                              免疫原性
配列番号：２残基１−１０                          ＋＋＋
配列番号：２残基２９−４１                        ＋＋＋
配列番号：２残基７５−８７                        ＋＋＋
配列番号：２残基９２−１０９                      ＋＋＋
配列番号：２残基１３２−１４１                    ＋＋＋
配列番号：２残基１９２−２０５                    ＋＋＋
配列番号：２残基２５８−２６９                    ＋＋＋
配列番号：２残基２９５−３１１                    ＋＋＋
配列番号：２残基３１６−３３０                    ＋＋＋
配列番号：２残基３７３−３８２                    ＋＋＋
配列番号：２残基４０３−４２２                    ＋＋＋
配列番号：２残基４７４−４８５                    ＋＋＋
配列番号：２残基５６１−５７６                    ＋＋＋
配列番号：２残基６８３−６９７                    ＋＋＋
配列番号：２残基７６８−７７７                    ＋＋＋
配列番号：２残基７９８−８１３                    ＋＋＋
配列番号：２残基８８２−８９４                    ＋＋＋
配列番号：２残基９３４−９４６                    ＋＋＋
配列番号：２残基１０５４−１０６７                ＋＋＋
配列番号：２残基１１８１−１１９２                ＋＋＋
配列番号：２残基１２７３−１２９９                ＋＋＋
配列番号：２残基１３８３−１３９７                ＋＋＋
配列番号：２残基１４６８−１４７７                ＋＋＋
配列番号：２残基１５０８−１５１７                ＋＋＋
【００１９】
主題とするドメインは、Ｓｌｉｔ特異的細胞、特にニューロン変調又は阻害変調活性、Ｓｌｉｔ−リガンド結合又は結合阻害活性のようなＳｌｉｔドメイン特異的活性又は機能を提供する。Ｓｌｉｔ特異的活性又は機能は、簡便なインビトロの、細胞ベースの、又はインビボのアッセイ：例えばインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイにより、動物等（例えば遺伝子療法、遺伝子導入など）において測定することができる。結合標的は、天然の細胞内結合標的、Ｓｌｉｔ制御タンパク質又はＳｌｉｔ活性又はその局在化を直接変調させる他の制御因子；あるいは、抗体のような特異的免疫タンパク質といった非天然結合標的、又は以下に記載するようなスクリーニングアッセイで同定されるもののようなＳｌｉｔ特異的試薬であってよい。Ｓｌｉｔ結合特異性は、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、主題のポリペプチドのＳｌｉｔ発現細胞における陰性変異体として機能する能力、異種宿主（例えば齧歯類又はウサギ）におけるＳｌｉｔ特異的抗体を生じさせる能力等によって検定することができる。
【００２０】
一実施態様では、Ｓｌｉｔポリペプチドは、配列番号：０１又は好ましくはストリンジェントな条件下でその全長ストランドとハイブリダイズするその断片を含んでなる核酸によりコードされる。このような核酸は、配列番号：０１の少なくとも３６、好ましくは少なくとも７２、より好ましくは少なくとも１４４、そして最も好ましくは少なくとも２８８のヌクレオチドを含む。特異的ハイブリダイゼーションを実証するには、一般にストリンジェントな条件、例えば、５ｘＳＳＰＥ（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）バッファー中に３０％ホルムアミドを含むバッファー中で４２℃においてハイブリダイゼーションし、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄して結合させたままにすること（条件Ｉ）；好ましくは、５ｘＳＳＰＥバッファー中に５０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリダイゼーションし、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄して結合させたままにすること（条件ＩＩ）が必要とされる。配列番号：１のストランドとハイブリダイズする例示的な核酸を表４に示す。
【００２１】
表４．条件Ｉ及び／又はＩＩの下での配列番号：０１のストランドとハイブリダイズする核酸の例
Ｓｌｉｔ核酸                                ハイブリダイゼーション
配列番号：１ヌクレオチド１−４７                        ＋
配列番号：１ヌクレオチド５８−９９                      ＋
配列番号：１ヌクレオチド９５−１３８                    ＋
配列番号：１ヌクレオチド１８１−２２０                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド２６１−２９９                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド２７４−３１５                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド３５１−３８９                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド４５０−５９３                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド５２４−５４６                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド５６１−６０８                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド６８９−７２７                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド７０８−７３７                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド７３８−８０１                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド８０５−８５４                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド８５５−９０７                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド９１０−９５３                  ＋
配列番号：１ヌクレオチド１００７−１０５９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１１４７−１１６３              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１２５８−１２７９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１３７５−１３８９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１５８１−１５９５              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１６２１−１６３９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１７４４−１７５５              ＋
配列番号：１ヌクレオチド１９５１−１９６９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド２１５０−２１６３              ＋
配列番号：１ヌクレオチド２５２４−２５４６              ＋
配列番号：１ヌクレオチド２７６１−２７８０              ＋
配列番号：１ヌクレオチド２９８９−２９９９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド３１０８−３１１７              ＋
配列番号：１ヌクレオチド３３３８−３３５１              ＋
配列番号：１ヌクレオチド３５０５−３５１４              ＋
配列番号：１ヌクレオチド３８５５−３８６７              ＋
配列番号：１ヌクレオチド４０１０−４０２５              ＋
配列番号：１ヌクレオチド４２０７−４２１９              ＋
配列番号：１ヌクレオチド４３３３−４３４５              ＋
配列番号：１ヌクレオチド４５２１−４５２９              ＋
【００２２】
多くのニューロン細胞、形質転換細胞、感染（例えばウィルス）細胞等々を含む、非常に広範な細胞型が、開示された方法によって調節を受けるＲｏｂｏポリペプチドを発現する。Ｒｏｂｏ結合又は活性化の確認は、本明細書又は引用した同時係属出願に開示した結合アッセイ又は細胞機能アッセイにより即座になされる。従って、主題の方法のための適応は、軸索成長、腫瘍細胞浸潤又は遊走等々を含む、非常に広範な細胞型を包含する。標的細胞は、培地又はインサイツ、すなわち天然宿主内に存在していてもよい。インサイツ用途に対しては、組成物は、保定された血液又は滑液などの生理学的液体に添加される。ＣＮＳ投与に対しては、血液脳関門を横切る治療薬の移動を促進するために、手術又は注射による破壊、ＣＮＳ脈管構造内皮細胞間の接着的接触を一時的に開く薬剤、及びそのような細胞を通る転位置を容易にする組成物を含む様々な技術が利用可能である。また、Ｓｌｉｔポリペプチドは、直接的な注射又は吸入、局所的、例えばエアロゾルを介した気管内／経鼻投与、眼内、又はインプラント、例えば繊維、例えばコラーゲン内／上、浸透ポンプ、適当に形質転換された細胞を含む移植片などに受け入れられる。特定の投与方法は、繊維、例えばコラーゲン繊維、タンパク質ポリマーなどを治療用ポリペプチドで被覆、包埋又は誘導体化することを含む。他の有用な方法は、Otto等, (1989) J. Neuroscience Research, 22, 83-91及びOttoとUnsicker (1990) J. Neuroscience, 10, 1912-1921に記載されている。一般に、投与される量は、経験的に決定されるが、典型的には、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約１０から１０００μｇの範囲であり、濃度は、一般的に、投与される用量１ｍｌ当たり約５０から５００μｇの範囲である。安定化剤、殺菌剤などの他の添加剤を含んでもよく、従来の量で含有せしめる。
【００２３】
一実施態様では、本発明は、医薬的に許容可能な組成物を生成するために滅菌生理食塩水又は他の媒質、ゼラチン、油等々のような医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、主題のＳｌｉｔポリペプチドを投与することを提供する。組成物及び／又は化合物は単独あるいは任意の簡便な担体、希釈剤等々と組み合わせて投与することができ、そのような投与は単一又は複数回の投与でなされる。有用な担体には固体、半固体又は水及び非毒性有機溶媒を含む液体媒体が含まれる。他の実施態様では、本発明は、レシピエント宿主によって主題化合物に代謝的に転換されるプロドラッグの形で主題の化合物を提供する。ポリペプチドをベースとした治療に対する非常に広範なプロドラッグ処方剤が当該分野において知られている。組成物は、錠剤、カプセル、トローチ、粉末、スプレー、クリーム等々を含む任意の簡便な形態で提供することができる。医薬的に許容できる投与剤単位又はバルクのそのような組成物は種々の容器に導入することができる。例えば、投与剤は、カプセル、丸剤等々を含む様々な容器に収容され得る。組成物は、好適には、主題の組成物とは異なる他の治療又は予防剤と組み合わせ、及び／又は組み合わせて使用することができる。多くの場合、主題組成物と組み合わせて投与すると、そのような薬剤の効果が高められる。例えば、Goodman と Gilman, The Parmacological Basis of Therapeutics, 第９版, 1996, McGraw-Hillを参照されたい。
【００２４】
他の側面では、本発明は、Ｒｏｂｏ−Ｓｌｉｔ相互作用を変調する薬剤のためのスクリーニング法を提供する。これらの方法は、一般的に、Ｒｏｂｏ発現細胞、Ｓｌｉｔポリペプチド及び候補薬剤の混合物を形成し、細胞により発現されるＲｏｂｏの量に対する薬剤の効果を測定することを含む。該方法は、リード化合物の化学ライブラリーの自動化され、コスト効率が良く高スループットのスクリーニングに受け入れられる。同定された試薬は、動物及びヒト治験に対して製薬工業において使用される；例えば、医薬の開発のために活性を最適化し毒性を最小化するために、試薬を誘導体化してインビボ及びインビトロアッセイで再スクリーニングすることができる。細胞及び動物ベースの神経誘導／反発アッセイは、以下の実験部分において詳細に説明する。
【００２５】
開示した脊椎動物のＳｌｉｔポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系について最適化されたＳｌｉｔポリペプチドをコードする核酸の逆翻訳に用いられ（Holler等, (1993) Gene, 136 323-328; Martin等, (1995) Gene, 154, 150-166）あるいは天然Ｓｌｉｔコード核酸配列の単離に用いるための変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの産生に用いられる（"GCG"software, Genetics Computer Group, Inc., Madison W1）。Ｓｌｉｔをコードする核酸は、例えば、Ｓｌｉｔが変調した細胞機能などを伴う疾患のための候補薬剤の有効性などの機能性研究のために、例えば、トランスジェニック動物を発現及びスクリーニングするために、Ｓｌｉｔ発現ベクターで用いられ、組換え宿主細胞に導入される。
【００２６】
また本発明は、開示された脊椎動物ｃＤＮＡ配列の断片を含んでなり、特異的ハイブリダイゼーションを行うのに十分な脊椎動物ＳｌｉｔｃＤＮＡ特異的配列を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。このようなプライマー又はプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、そして最も好ましくは少なくとも９６ヌクレオチドの長さである。特異的ハイブリダイゼーションを実証するには、一般にストリンジェントな条件、例えば、５ｘＳＳＰＥ（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）バッファー中に３０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリダイズし、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄したときに結合させたままにすること；好ましくは、５ｘＳＳＰＥバッファー中に５０％ホルムアミドを含むバッファーで４２℃においてハイブリッド形成し、４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄したときに結合させたままにすることが必要とされる。また、Ｓｌｉｔ核酸は、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul等 (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol., 215, 403-410）などのアラインメントアルゴリズムを用いて識別することもできる。また、本発明は、デフォルト設定を用いるベストフィット法により測定してここに開示した脊椎動物Ｓｌｉｔ配列に約６０−７０％、好ましくは約７０−８０％、より好ましくは約８０−９０％、より好ましくは約９０−９５％、最も好ましくは約９５−９９％類似し、天然のショウジョウバエＳｌｉｔ配列以外のものである配列を含む核酸を提供する。特定の実施態様では、Ｓｌｉｔポリヌクレオチド断片は、種特異的断片を含んでなる；そのような断片は開示された配列のアラインメントから容易に識別することができる。
【００２７】
主題の核酸は、合成／非天然配列及び／又は組換え体で、非天然配列又は天然染色体に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した天然配列を含むことを意味する。開示した脊椎動物Ｓｌｉｔ核酸の核酸配列を含んでなる主題の組換え核酸は、そのような配列又は断片を末端に含み、天然染色体に結合しているもの以外の配列に直ぐに隣接（即ち連続）しているか、又は１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満の天然隣接領域に隣接しており、それは、末端又は天然染色体に結合しているもの以外の配列に直ぐに隣接している。核酸は通常ＲＮＡ又はＤＮＡであるが、変調された安定性などを提供するために、他の塩基又はヌクレオチド類似物を含む核酸を使用するのが有利なことが多い。
【００２８】
主題の核酸には広範な用途が見いだされ、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等々としての使用；Ｓｌｉｔ遺伝子及び遺伝子転写物の存在の検出において及び更なるＳｌｉｔ相同体及び構造類似物をコードする核酸の検出及び増幅における使用を含む。診断において、Ｓｌｉｔハイブリダイゼーションプローブは、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異型Ｓｌｉｔ対立遺伝子の同定における用途が見いだされる。変異体対立遺伝子は、高スループット臨床診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブの産生に用いられる。治療法においては、治療用Ｓｌｉｔ核酸は活性Ｓｌｉｔの細胞発現又は細胞内濃度又は利用能を変調させるのに用いられる。例示的なヒトＳｌｉｔ−１プローブとプライマーは表５と表６に示す。
【００２９】
表５．第１ロイシンリッチリピート領域に対するハイブリダイゼーションプローブ
0003685390.tif 000010
表６．ヒトＳィｔの領域に対するＰＣＲプライマー
0003685390.tif 000011
【００３０】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲｓ）は、既知のタンパク質との比較及びxxxFxxLxxLxxLxLxxNxIxxL（ここで、xは任意のアミノ酸である）なるコア配列の存在により予測される。ｓｌｉｔタンパク質では、ＬＲＲには、アミノ及びカルボキシフランキング領域と称される保存された配列が隣接している。これらのフランキング領域は他の既知のタンパク質にも見出されるが、ほんの僅かな場合のみ単一のタンパク質にアミノ及びカルボキシフランク領域が存在する。アミノフランク領域は、CPxxCxC[1-6x]GxxVDCxxxGL[2-4x]αPxxαPxdttx（ここで、ｘは任意のアミノ酸、[x]はアミノ酸の可変な数、αは疎水性残基を示す）なるコンセンサスにより定まる。小文字は特定の位置に高度に保存されていない残基を示す。カルボキシフラン機領域は、PβxCγCxα[1-5x]Wα[14-26x]RCxxPxxxxxxxαxxαxxxxF[1-3x]Cs[3-17x]（ここで、βはW又は疎水性残基、γはD又はN及びαは疎水性残基である）なるコンセンサスにより定まる。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）リピートは、CxxxxCxngxC[6-9x]αxCxCxxCαxCxxCxxxxxxなるコンセンサスにより予想される。いわゆる「９９ａａスペーサー」は、実際にはショウジョウバエタンパク質内の〜２００アミノ酸及びヒトＳｌｉｔ−１内の１７４アミノ酸である。この領域はラミニンＡ鎖のＧループに対して相同性を示す。
システインノットはジスルフィド結合が間に形成された６つのシステインの存在により定まる二量体化ドメインである。唯一の絶対的に保存されている残基は６つのシステインで、システイン２と３の間及び５と６の間以外は、その間隔は高度に可変である：C[x]C[1-3x]GxC[x]C[x]CxC。システイン２と３の間のグリシンはシステインノットのサブセットに存在するのみである。ショウジョウバエｓｌｉｔ及びヒトｓｌｉｔ−１の両方がシステイン５及び６の後に余分のシステインを有している：これは分子間結合となりうる。ヒトＳｌｉｔ−１遺伝子は、ショウジョウバエ遺伝子の全体構造を示し、アミノ酸保存はタンパク質の全長に沿って見出される（シグナル配列を除くアミノ酸配列と４８％の相同性；以下を参照）。ヒト遺伝子は第１のセットのＬＲＲのＬＲＲ２とＬＲＲ３の間に余分なＬＲＲを有している；第３のセットにおいて、ヒト遺伝子はＬＲＲ３とＬＲＲ４の間の余分なＬＲＲを有している。ヒト遺伝子は、ショウジョウバエｓｌｉｔの第７のＥＧＦリピートの何れの側にも２つの余分なＥＧＦリピートを有している。
【００３１】
ヒトｓｌｉｔ−１の単離
ＥＳＴデータベースの検索によりショウジョウバエｓｌｉｔの９９ａａスペーサー領域と相同性を有するＥＳＴ、ａｂ１６ｇ１０．ｒ１が明らかになった。このＥＳＴはヒト胎児脳ライブラリー（ストラタジーン）を探索するために使用され、ヒトｓｌｉｔ−１に対するクローンが単離された。
【００３２】
ヒトＳｌｉｔ-１予想タンパク質の特徴
シグナル配列：                          7-24
第１アミノフランキング配列：            28-59
ロイシンリッチリピートの第１セット：    60-179(6リピート)
第１カルボキシフランキング配列：        180-276
第２アミノフランキング配列：            277-308
ロイシンリッチリピートの第２セット：    309-434(5リピート)
第２カルボキシフランキング配列：        435-501
第３アミノフランキング配列：            502-533
ロイシンリッチリピートの第３セット：    534-660(5リピート)
第３カルボキシフランキング配列：        661-722
第４アミノフランキング配列：            723-754
ロイシンリッチリピートの第４セット：    755-855(4リピート)
第４カルボキシフランキング配列：        856-917
第１ＥＧＦリピート：                    918-952
第２ＥＧＦリピート：                    953-993
第３ＥＧＦリピート：                    994-1031
第４ＥＧＦリピート：                    1032-1071
第５ＥＧＦリピート：                    1072-1109
スペーサー：                            1110-1116
第６ＥＧＦリピート：                    1117-1154
「９９ａスペーサー」：                  1155-1329
第７ＥＧＦリピート：                    1330-1366
第８ＥＧＦリピート：                    1367-1404
第９ＥＧＦリピート：                    1405-1447
システインノットモチーフ：              1448-1525
【００３３】
ショウジョウバエＳｌｉｔとヒトＳｌｉｔ−１の間のアミノ酸同一性
第１アミノフランキング配列：            53%
ロイシンリッチリピートの第１セット：    52%(54%,67%,NA,38%,54%,50%)
第１カルボキシフランキング配列：        42%
第２アミノフランキング配列：            50%
ロイシンリッチリピートの第２セット：    60%(54%,58%,67%,71%,50%)
第２カルボキシフランキング配列：        62%
第３アミノフランキング配列：            56%
ロイシンリッチリピートの第３セット：    49%(46%,46%,42%,NA,58%)
第３カルボキシフランキング配列：        36%
第４アミノフランキング配列：            53%
ロイシンリッチリピートの第４セット：    48%(25%,58%,46%,63%)
第４カルボキシフランキング配列：        63%
第１ＥＧＦリピート：                    34%
第２ＥＧＦリピート：                    46%
第３ＥＧＦリピート：                    46%
第４ＥＧＦリピート：                    35%
第５ＥＧＦリピート：                    47%
スペーサー：                            22%
第６ＥＧＦリピート：                    40%
「９９ａスペーサー」：                  38%
第７ＥＧＦリピート：                    11%/NA
第８ＥＧＦリピート：                    44%
第９ＥＧＦリピート：                    29%/NA
システインノットモチーフ：              34%
NA:相同性リピートがないため該当なし。
個々のＬＲＲに対する数値を括弧で示す。
【００３４】
次の実験アッセイは例証のためのものであり、発明を限定するものではない。（実施例）
形質移入されたＣＯＳ細胞のリガンドスクリーニングのためのプロトコール
Ｉ．リガンドの調製
発現作成物：ｃＤＮＡコード標的ＳｌｉｔポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ部でタギングし、２９３発現ベクター（ｐＣＥＰ４：インビトロゲン）中にサブクローニングする。
形質移入：２９３ＥＢＮＡ細胞にＳｌｉｔ発現作成物を形質移入する（ＣａＰＯ４法）。２４時間の回収後、形質移入細胞をＧ４１８（ジェネテシン、２５０ｕｇ／ｍｌ、ギブコ）及びハイグロマイシン（２００ｕｇ／ｍｌ）で選択する。選択プロセスが完了すると、選択下でダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥ）／１０％ＦＣＳ中に維持する。
【００３５】
条件培地の調製：血清含有培地を、グルタマックス−１（ギブコ）及び３００ｎｇ／ｍｌヘパリン（シグマ）を伴うＯｐｔｉｍｅｍで置換し、細胞を３日間馴化される。該培地を収集し３０００ｘｇで１０分間スピニングさせる。上清を濾過（０．４５ｕｍ）し、２週間だけ４℃で０．１％アジドと共に保存する。
【００３６】
ＩＩ．切断レセプター（陽性の対照）の調製
発現作成物：細胞外ドメイン（膜貫通領域に対して直ぐＮ末端が切断）を含む対応するＲｏｂｏＣ末端欠失変異体を、２９３発現ベクター（ｐＣＥＰ４：インビトロゲン）中にサブクローニングする。
形質移入：２９３ＥＢＮＡ細胞にレセプター変異体発現作成物を形質移入する（ＣａＰＯ４法）。２４時間の回収後、形質移入細胞をＧ４１８（ジェネテシン、２５０ｕｇ／ｍｌ、ギブコ）及びハイグロマイシン（２００ｕｇ／ｍｌ）で選択する。選択プロセスが完了すると、選択下でダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥ）／１０％ＦＣＳ中に維持する。
【００３７】
条件培地の調製：血清含有培地を、グルタマックス−１（ギブコ）及び３００ｎｇ／ｍｌヘパリン（シグマ）を伴うＯｐｔｉｍｅｍで置換し、細胞を３日間馴化される。該培地を収集し３０００ｘｇで１０分間スピニングさせる。上清を濾過（０．４５ｕｍ）し、２週間だけ４℃で０．１％アジドと共に保存する。
【００３８】
ＩＩ．ＣＯＳ細胞の形質移入
２ｍｌＤＭＥ／１０％ＦＣＳ中３５ｍｍ皿にＣＯＳ細胞（２５００００）を蒔く。
【００３９】
１８−２４時間後、１ｕｇのＲｏｂｏコードＤＮＡ（ｐＭＴ２１発現ベクター中にクローニングしたｃＤＮＡ）を２００ｕｌの無血清培地中に希釈し、６ｕｌのリポフェクタミン（ギブコ）を添加する。この溶液を１５−４５分間室温でインキュベーションする。
ＰＢＳで細胞２Ｘを洗浄する。脂質−ＤＮＡ複合体を含むチューブに８００ｕｌの無血清培地を添加する。洗浄した細胞にこの溶液を上塗りする。
６時間インキュベーションする。１ｍｌのＤＭＡ／２０％ＦＣＳを添加することにより反応を停止させる。細胞に摂食させる。１２時間後に細胞を検査する。
【００４０】
ＩＩＩ．リガンド結合アッセイ
形質移入されたＣＯＳ細胞１ＸのプレートをコールドＰＢＳ（プラスＣａ／Ｍｇ）／１％ヤギ血清で洗浄。１ｍｌのニートな条件培地を添加し、室温でインキュベートする。
プレート３ＸをＰＢＳ（プラスＣａ／Ｍｇ）で洗浄。４回目の洗浄で、１ｍｌの５０％メタノールを１ｍｌＰＢＳに添加。ついで、１ｍｌメタノールを添加。排除し、１ｍｌメタノールを添加。
１ＸをＰＢＳで洗浄。１Ｘ ＰＢＳ／１％ヤギ血清を洗浄。
ＰＢＳ／１％ヤギ血清中二次抗体（アルカリホスファターゼに抱合した１ないし２０００抗ヒトＦｃ）を添加。３０−４０分室温でインキュベーション。
ＰＢＳで３Ｘを洗浄。１Ｘアルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を洗浄。アルカリホスファターゼ試薬：アルカリホスファターゼ緩衝液中４．５ｕｌ／ｍｌＮＢＴ及び３．５ｕｌ／ｍｌＢＣＩＰ（ギブコ）を調製。
１０−３０分インキュベーションし、ＰＢＳ中２０ｍＭ ＥＤＴＡで急冷。Ｓｌｉｔポリペプチドに結合した細胞は暗紫色の反応生成物の存在により可視できる。
パラレルなインキュベーションにおいて、陽性の対照が変異体レセプター条件培地の段階希釈を伴うＳｌｉｔ結合の滴定により提供される。
【００４１】
ＩＶ．結果：Ｒｏｂｏに対するＳｌｉｔの結合
細胞を発現するＳｌｉｔポリペプチドはＲｏｂｏを結合させることが示された。二次抗体が存在しＳｌｉｔ−Ｆｃ融合体が存在しない状態で対照ＣＯＳ細胞又はレセプター発現ＣＯＳ細胞では反応性は観察されなかった。Ｓｌｉｔポリペプチドが、二次抗体が必要ではない、アルカリホスファターゼに直接融合している作成物を使用して、結合がレセプター発現細胞に観察された。レセプター欠失変異体はＳｌｉｔ−Ｒｏｂｏ結合性を滴定し、阻害アッセイに対する陽性の対照となる。
【００４２】
高スループットＲｏｂｏ−Ｓｌｉｔ結合アッセイのためのプロトコール
Ａ．試薬：
−  中和物アビディン：２０μｇ／ｍｌＰＢＳ。
−  ブロッキング緩衝液：５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０；室温で１時間。
−  アッセイ緩衝液：１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ β-メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル。
−  ３３Ｐ Ｒｏｂｏポリペプチド１０ｘストック：１０−８−１０−６Ｍ「コールド」Ｒｏｂｏポリペプチド特異的Ｒｏｂｏドメインに、２０００００−２５００００ｃｐｍの標識Ｒｏｂｏ（Beckmanカウンター）を添加した。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−  プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌＰＢＳ中、１０ｍｇトリプシン阻害剤（BMB#109894）、１０ｍｇアプロチニン（BMB#236624）、２５ｍｇベンズアミジン（Sigma#B-6506）、２５ｍｇロイペプチン（BMB#1017128)、１０ｍｇＡＰＭＳＦ（BMB#917575）、及び、２ｍＭ ＮａＶＯ３（Sigma#S-6508）。
【００４３】
−  Ｓｌｉｔ：ＰＢＳ中の１０−７−１０−５Ｍビオチン化Ｓｌｉｔ。
Ｂ．アッセイプレートの調製：
−  １ウェル当たり１２０μｌのストックＮ-アビディンで４℃において終夜コート。
−  ２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
−  １５０μｌのブロッキング緩衝液でブロック。
−  ２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
【００４４】
Ｃ．アッセイ：
−  １ウェル当たり４０μｌのアッセイ緩衝液を添加。
−  １０μｌの化合物または抽出物を添加。
−  １０μｌの３３Ｐ-Ｒｏｂｏ（２０−２５０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍ最終濃度）を添加。
−  ２５℃で１５分間振とう。
−  ２５℃で更に４５分間インキュベーション。
−  ４０μＭのビオチン化Ｓｌｉｔ（アッセイ緩衝液中０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／４０μｌ）を添加。
−  室温で１時間インキュベーション。
−  ２００μＭのＰＢＳで４回洗浄して反応を停止。
−  １５０μＭのシンチレーションカクテルを添加。
−  トップカウントで計数。
【００４５】
Ｄ．全てのアッセイについての対照（各プレートに配置）：
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害における可溶性（非ビオチン化Ｓｌｉｔ）
【００４６】
この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているように、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。
【００４７】
【配列表】
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