(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、４、６、８および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコード化する単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号：２で示される配列を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコード化する単離されたＤＮＡ分子であって、但し、
ａ. アミノ酸２２０位のアラニンがバリン、トレオニン、ロイシンおよびシステインからなる群から選択されるアミノ酸で置き換えられており；または
ｂ. アミノ酸２２１位のグリシンがセリンで置き換えられており：または
ｃ. アミノ酸４２６位のチロシンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、バリンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸で置き換えられている、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸２２０位のアラニンがバリンで置き換えられている、請求項２記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸４２６位のチロシンがシステインで置き換えられている、請求項２記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号：６で示される配列を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコード化する単離されたＤＮＡ分子であって、但し、
ａ. 配列番号：６のアミノ酸１６６位のアラニンがバリンで置き換えられており；または
ｂ. 配列番号：６のアミノ酸１６７位のグリシンがセリンで置き換えられており：または
ｃ. 配列番号：６のアミノ酸３７２位のチロシンがシステインで置き換えられている、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたＤＮＡ分子に操作可能に結合されたプロモーターを含む発現カセット。
【請求項７】
請求項６記載の発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを使用して安定に形質転換された宿主細胞であって、該宿主細胞は前記ＤＮＡ分子を発現し得る宿主細胞。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含む植物細胞であって、前記ＤＮＡ分子は前記植物細胞中で発現され、そして自然に生じるプロトックス活性阻害量の除草剤に対する許容性を前記植物細胞に付与する植物細胞。
【請求項１０】
請求項９記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１１】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤に対して許容性である植物の製造方法であって、
ａ. 操作可能な植物プロモーターを操作可能に結合した請求項１ないし５のうちの何れか１項に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセットを用意し；
ｂ. 前記発現カセットで植物細胞を形質転換し；そして
ｃ. 前記植物細胞から植物を再生する
ことを含む方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の植物または請求項１１記載の方法により得られる植物と、不所望の草木との集合体に、有効量のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤を施用することからなる不所望の草木の生長を防除する方法。
【請求項１３】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤に対して許容性である植物を製造するための、請求項１ないし５のうちの何れか１項に記載にＤＮＡ分子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、全ての真核生物に共通な生合成経路におけるプロトポルフィリノーゲンＩＸからプロトポルフィリノーゲンＩＸへの変換に関連する酵素活性の操作に一般的に関するものである。一つの面において、本発明は植物、植物組織および種子における除草剤耐性の発生に適用される。別の面において、本発明は動物、特にヒトでの上記酵素の活性における損傷の診断および治療の開発に適用される。
クロロフィルおよびヘムの産生を導く生合成経路は多くの共通の段階を併有する。クロロフィルは全ての緑色光合成有機体に存在する光捕獲色素である。ヘムはヘモグロビン、チトクローム、Ｐ４５０混合作用オキシゲナーゼ、パーオキシダーゼおよびカタラーゼの補助因子であり（例えばLehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York(1975)参照）、そしてそれ故に全ての好気性有機体のために必要な成分である。
クロロフィルおよびヘムの生合成における最後の共通な段階はプロトポルフィリノーゲンＩＸからプロトポルフィリンＩＸへの酸化である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本明細書では「プロトックス」と記載する）はこの最後の酸化段階を触媒する酵素である（Matringe等, Biochem. J. 260:231(1989)）。
プロトックス酵素は酵母サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）（Labbe-BoisおよびLabbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, B. H.Dailey編所収, McGraw Hill:New York, pp.235-285（1990））、大麦エチオプラスト（JacobsおよびJacobs,Biochem. J. 244:219(9187)）、およびマウス肝臓（DaileyおよびKarr, Biochem. 26:2697（1987））を包含する多くの有機体から部分的または完全に精製されている。プロトックスをコード化する遺伝子は２種類の原核生物、大腸菌（Escherichia cili）（Sasarman等, Can. J. Microbiol. 39:1155（1993)）およびバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）（DaileyおよびKarr, J. Biol. Chem. 269:813（1994））から単離されている。これらの遺伝子は配列類似性を併有せず、それらの予測されるタンパク質産生物もアミノ酸配列の同一性を併有しない。大腸菌タンパク質は約２１ｋＤａであり、そして細胞膜と結合する。バチルス・サブチリスタンパク質は５１ｋＤａであり、そして可溶性で細胞質活性である。
現在、公知方法を用いて高等真核生物（すなわち、動物、植物およびより下等な真核生物、例えば酵母、単細胞藻類、原生動物等以外のその他の全ての多細胞核生物）からプロトックスコード性遺伝子の単離を可能にするプロトックス酵素についてほとんど知られていない。
特に、新規タンパク質および遺伝子の単離のための標準的方法の多くは、それらが同じ機能を有する公知タンパク質および遺伝子に対して一次構造（すなわち、アミノ酸およびＤＮＡ配列）がかなり類似しているであろうという仮定に基づいている。そのような標準的方法は核酸ハイブリダイゼーションおよび保存されたアミノ酸配列モチーフに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による増幅を包含する。これらの方法は、公知の原核生物のプロトックス遺伝子およびタンパク質の間にさえ顕著な構造的類似性がないので、原核生物のプロトックス遺伝子に限定されている現在の構造に関する情報を用いて真核生物のプロトックス遺伝子の単離のために有用であるとは期待されない。
より高等な真核生物からその他の代謝経路における生合成遺伝子を単離するために使用された別の試みは問題となる活性を欠く微生物突然変異体の相補性である。この試みのために、より高等な真核生物からのｃＤＮＡのライブラリーは、微生物宿主におけるｃＤＮＡの発現を導き得るベクター内でクローン化される。ベクターは次に形質転換されるか、または突然変異微生物中に導入され、そして表現型的にもはや突然変異体ではないコロニーが選択される。
この戦略は、ヒスチジン生合成（例えばWard等に対する米国特許第５２９０９２６号およびＷＯ９４／０２６９０９号, その全体が参照により本明細書に編入される）、リジン生合成（例えばFrisch等, Mol. Gen. Genet. 228:287（1991））、プリン生合成（例えばAimi等, J. Biol. Chem. 265:9011(1990)）、およびトリプトファン生合成（例えばNiyogi等, Plant Cell 5:1011(1993))等のいくつかの代謝経路に包含される高等真核生物から遺伝子を単離するために使用された。しかしながら、プロトックス活性に欠けると考えられる微生物突然変異体が利用できるにもかかわらず（例えば大腸菌（Sasarman等, J. Gen. Microbiol. 113:297（1979））, サルモネラ・チフィムリウム（Xu等, J. Bacteriol. 174:3953（1992））およびサッカロミセス・セレビシアエ（Camadro等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724（1982））、真核生物のプロトックス酵素活性をコード化するｃＤＮＡを単離するためのこの方法の適用は、利用可能な情報に基づいて到底予測できなかった。
これにはいくつかの理由がある。第一に、例えば微生物宿主の使用優先性と一致しないコドン使用性のために、真核生物のプロトックスｃＤＮＡ配列が突然変異微生物において適当なレベルで発現され得ない。第二に、例えば活性が翻訳後の変性、例として微生物により行われないグリコシル化が必要ならば、クローン化された真核生物コード性配列からの主要な翻訳産生物が機能的ポリペプチドを製造し得ない。第三に、例えばタンパク質が微生物宿主が特異的に欠いている特定のオルガネラ膜系に通常標的化されているならば、真核生物タンパク質は微生物宿主における活性コンホメーションをとらない。この最後の可能性は、相補性アッセイにおいて使用される微生物宿主に存在しないオルガネラと植物細胞中で結合する植物プロトックス酵素の場合に特にあり得る。特に、植物プロトックス酵素は葉緑体エンベロープおよびチラコイド膜の両方に結合し(Matringe等, J. Biol. Chem. 267:4646(1992))、そしておそらくＮ−末端転位配列および成熟ポリペプチドの固有の特性の両方を包含する翻訳後の標的化機構の結果として膜系に到達する(例えばKohornおよびTobin, Plant Cell 1:159(1989);Li等, Plant Cell 3:709(1991);Li等, J. Biol. Chem. 267:18999(1992)参照)。
プロトックス酵素はある種のヒトの疾病状態において役割を果たすことが知られている。異型ポルフィリン症、神経精神病的徴候と皮膚病変の両方と特徴とする優性常染色体失調に罹患した患者はプロトックス活性のレベルが低下している（BrennerおよびBloomer, New Engl. J. Med. 302:765（1980））。ヒトプロトックス酵素およびその対応遺伝子に関する知識の欠如の故に、この疾病の診断および治療のための選択は非常に限定されている。
不所望の草木、例えば雑草または作物中の植物を防除するための除草剤の使用はほとんど普遍的な実施になっている。関連する市場は１年で１億ドルを越える。この大量の使用にもかかわらず、雑草防除は農業従事者にとって顕著で費用のかかる問題のままである。
除草剤の有効な使用は適切な処理を必要とする。例えば、適用の時間や方法および雑草植物の生長段階は除草剤での良好な雑草防除の獲得に重要である。種々の雑草の種は除草剤に耐性であるので、有効な除草剤の製造の重要性はますます増加する。
不幸なことに、より高い効果、より広い雑草スペクトルおよび土壌におけるより早い分解を示す除草剤はまた、より大きい作物植物毒性を有し得る。この問題に適用された１つの解決策は除草剤に耐性であるか、または許容性である作物を開発することだった。除草剤に耐性の作物雑種または変種は該作物に対する損傷の危険性を伴うことなく除草剤の使用を可能にする。耐性の開発は、除草剤に対する作物の感受性の故に、該除草剤の使用が従来妨げられるか、または限定されていた（例えば発芽前の使用）、作物への除草剤の適用を可能にする。例えばAnderson等に対する米国特許第４７６１３７３号は種々のイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に対して耐性の植物に関連する。この耐性は変更されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素により与えられる。Goodman等に対する米国特許第４９７５３７４号はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を阻害することが知られている除草剤、例えばホスフィノトリシンおよびメチオニンスルホキシミンに耐性である突然変異ＧＳをコード化する遺伝子を含む植物細胞または植物体を関する。Bedbrook等に対する米国第５０１３６５９号は植物をスルホニル尿素除草剤による阻害に対して耐性にする突然変異アセトラクテートシンターゼを発現する植物に関連している。Somer等に対する米国特許第５１６２６０２号はシクロヘキサンジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパノン酸除草剤による阻害に許容性の植物を開示している。この許容性は変更されたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）により与えられる。
プロトックス酵素は種々の除草剤化合物のための標的として機能する。プロトックスを阻害する除草剤は多くの異なる構造の分子を包含する(Duke等, Weed Sci. 39:465(1991);Nandihalli等, Pesticide Biochem. Physiol. 43:193(1992);Matringe等, FEBS Lettt. 245:35(1989);YanaseおよびAndoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70（1989））。これらの除草剤化合物はジフェニルエーテル｛例えばアシフルオルフェン, ５−〔２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ〕−２−ニトロ安息香酸；そのメチルエステル；またはオキシフルオルフェン, ２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾール（例えばオキシジアゾン, ３−〔２, ４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル〕−５−（１, １−ジメチルエチル）−１, ３, ４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２, Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリム, Ｎ−（４−クロロフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド、フェニルピラゾール（例えばＴＮＰＰ−エチル, エチル２−〔１−（２, ３, ４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ〕プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、およびフェノピレートおよびそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体を包含する。これらの化合物の多くは、基質類似体として明らかに作用して、酵素により触媒される通常の反応を競合的に阻害する。
プロトックス阻害性除草剤の作用の予測される様式は葉緑体におけるプロトポルフィリノーゲンＩＸの蓄積を包含する。この蓄積は、パーオキシダーゼ活性によりプロトポルフィルタンＩＸに酸化される細胞質へのプロトポルフィリノーゲンＩＸの漏出を導くと考えられる。光に暴露されると、プロトポルフィリンＩＸは細胞質における一重項酸素の形成を引き起し得る。この一重項酸素は順にその他の反応性酸素種の形成を導き、その場合、急速な細胞死を導く脂質過酸化および膜破壊を引き起し得る（Lee等, Plant Physiol, 102:881（1993））。
全てのプロトックス酵素が植物プロトックス酵素を阻害する除草剤に感受性であるわけではない。大腸菌から単離された遺伝子（Sasarman等, Can. J. Microbiol. 39:1155（1993））およびバチルス・サブチリスから単離された遺伝子（Dailey等, J. Biol. Chem. 269:813（1994））によりコード化されるプロトックス酵素の両方はこれらの除草剤阻害剤に対して耐性である。さらに、フェニルイミド除草剤Ｓ−２３１４２に耐性の単細胞藻類クラミドモナス・レインハルドチイ（Chlamydomonas reinhardtii）の突然変異体が報告されている(Kataoka等, J. Pesticide Sci. 15:449(1990);Shibata等, Research in Photosynthesis, Vol.III, N. Murata編所収, Kluwer:Netherlands. pp.567-570(1992))。これら突然変異体の少なくとも１種は、該突然変異体が選択された除草剤阻害剤に対してだけでなく、プロトックス阻害剤のその他の種類に対しても耐性である変更されたプロトックス活性を有するように見える(Oshio等, Z. Naturforth. 48c:339(1993);Sato等, ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke編所収, ACS Press:Washington, D.C.(1994))。阻害剤Ｓ−２１４３２に対して耐性である突然変異タバコ細胞株も報告されている(Che等, Z. Naturforsch. 48c:350(1993))。
本発明は、好ましくは高等真核生物である真核生物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。特に、本発明は植物またはヒトを起源とするプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。
本発明の範囲内で好ましいのは、双子葉植物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子、特に配列番号：１、３および９で示されるようなアラビドプシス（Arabidopsis）植物由来のものである。
単子葉植物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子、特に配列番号：５および７で示されるようなトウモロコシ植物由来のものもまた好ましい。本発明の中で特に好ましいのは、双子葉植物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子であり、該タンパク質は配列番号：２、４および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。単子葉植物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子もまた好ましく、該タンパク質は配列番号：６および８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明により与えられる情報を用いて、真核生物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素のためのＤＮＡコード性配列は標準的方法により得られ得る。従って、その他の態様において、本発明はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性をコードする真核生物ＤＮＡ配列またはそれぞれのｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成し得るプローブ、および本発明に係るプローブを用いて真核生物中に前記ＤＮＡ配列を検出する方法を提供する。
本発明はさらに、発現カセットおよび本発明に係る真核生物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードするＤＮＡ分子に操作可能に結合された、プロモーター、特に植物内で活性であるプロモーターを実質的に含む前記発現カセットを有する組換えベクターを包含する。本発明に係る発現カセットはさらに前記ＤＮＡ分子に操作可能に結合されたシグナル配列を含み得、該シグナル配列は葉緑体またはミトコンドリア内で前記ＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質を標的化することができる。
さらに、本発明は、植物内で自然に生じるプロトックス活性に対して通常阻害性であるレベルでの除草剤による阻害に耐性であるか、または少なくとも許容性である変更されたプロトックス活性を有する植物、植物細胞、植物組織および植物種子を提供する。特に、本発明は、前記変更されたプロトックス活性が野生型プロトックス酵素の過剰発現によるか、または除草剤許容性プロトックス酵素をコードするＤＮＡ分子の発現により与えられる植物を包含する。前記除草剤許容性プロトックス酵素は、真核生物または原核生物に自然に生じるプロトックス酵素の改変された形態；または前記植物に自然に生じるプロトックス酵素の改変された形態であってよく、また、前記除草剤許容性プロトックス酵素は原核生物に自然に生じてもよい。本発明により包含される植物は単子葉植物および双子葉植物を包含するが、特に雑種（ハイブリッド）植物を包含する。プロトックス阻害性除草剤に対する可能性のある標的である植物、特に農学的に重要な作物、例えばトウモロコシおよびその他の穀類作物、例として小麦、オート麦、ライ麦、モロコシ（ソルガム, sorghum）、イネ、大麦、アワ（キビ, millet）、芝生および飼料草類（turf and forage grasses）等、並びにワタ、タバコ、サトウキビ、テンサイ、油料種子ナタネ（アブラナ, ｏilseed rape）およびダイズが好ましい。
本発明はさらに、本発明に係る植物の増殖性材料、好ましくは保護コーティング、特に除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バクテリア剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれらの混合物からなる群から選択される薬剤からなる保護コーティングで処理された植物種子を含む。
本発明はさらに、自然に生じるプロトックス活性を阻害する濃度での除草剤による阻害に対して耐性の、または該阻害を許容するプロトックス酵素を含有する植物、植物細胞、植物組織、および植物種子およびそれらのトランスジェニック後代の作出方法に関する。前記耐性または許容性は真核生物に自然に生じるプロトックス酵素の変形された形態、または前記植物に自然に生じるプロトックス酵素の改変された形態、または原核生物に自然に生じるプロトックス酵素、または原核生物に自然に生じるタンパク質の改変された形態であるプロトックス酵素をコードするいずれかのＤＮＡ分子を前記トランスジェニック植物に発現することにより得られ得る。
本発明の一つの特定の態様は、除草剤に耐性である改変されていない原核生物のプロトックス酵素をコードする構造遺伝子に操作可能に結合された、植物内で機能する適当なプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ植物、トウモロコシ組織またはトウモロコシ種子およびそれらのトランスジェニック後代に関する。
本発明はさらに、改変されていない真核生物のプロトックス酵素をコードする構造遺伝子に操作可能に結合された、植物内で機能する適当なプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換されたトランスジェニック植物、植物細胞、植物組織および植物種子およそれらのトランスジェニック後代の作出に関する。これは、除草剤による酵素の阻害を克服するのに十分に、植物における改変されていないプロトックスの過剰発現を導く。
本発明はまた、野生型の変更されていないプロトックスの活性を通常阻害する濃度での除草剤による阻害に許容性の変更されたプロトックス酵素を発現する植物の作出を包含する。この態様において、植物は耐性プロトックスをコードする構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換され得るか、または除草剤耐性系を単離し、特徴づけ、そして生長させることによる直接選択法により作出され得る。
本発明はさらに、植物内で自然に生じるプロトックス活性に対して通常阻害性であるレベルでの除草剤による阻害に対して耐性である変更されたプロトックス活性を有する植物の集合体に有効量のプロトックス阻害性除草剤を施用することからなる不所望の草木の生長を防除する方法に関する。上記の様式で保護されるべき植物はプロトックス阻害性除草剤に対する可能性のある標的である植物、特に農学的に重要な作物、例えばトウモロコシおよびその他の穀類作物、例として小麦、オート麦、ライ麦、モロコシ、イネ、大麦、アワ（キビ）、芝生および飼料草類等、並びにワタ、タバコ、サトウキビ、テンサイ、アブラナおよびダイズである。プロトックス阻害剤と呼ばれる除草剤はアリールウラシル、ジフェニルエーテル、オキシジアゾール、イミド、フェニルピラゾール、ピリジン誘導体、フェノピレートおよび該フェノピレートのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体からなる群から選択されるものである。
本発明はまた、プロトックス酵素の組換えによる創出方法および組換えにより創出されたプロトックスを使用する方法を包含する。従って、本発明はさらに、未改変または改変真核生物プロトックス酵素をコードする構造遺伝子に操作可能に結合された、それぞれの宿主細胞において機能する適当なプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された宿主細胞、特に植物細胞、動物細胞、バクテリア細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される細胞を包含するが、該宿主細胞は前記ＤＮＡ分子を発現することができる。
本発明はさらに、プロトックスの活性に影響を及ぼす新規除草剤をスクリーニングするため、および除草剤耐性プロトックス突然変異体を同定するために精製プロトックスを使用する方法を提供する。
特に、本発明は、植物からのプロトックス酵素の活性を阻害する能力に対して化学物質を検定するための方法であって、
（ａ）前記プロトックス酵素およびプロトポルフィリノーゲンＩＸを第１反応混合物において、前記プロトックス酵素が前記プロトポルフィリノーゲンＩＸのプロトポルフィリンＩＸへの変換を触媒し得る条件下で一緒にし；
（ｂ）前記化学物質、前記プロトックス酵素およびプロトポルフィリノーゲンＩＸを第２反応混合物において、前記第１反応混合物の場合と同じ条件下で一緒にし；
（ｃ）前記第１および第２反応混合物を約３９５ないし約４１０ｎＭで励起し；
（ｄ）前記第１および第２反応混合物のケイ光を約６２２ないし約６３５ｎＭで比較する；
ことからなり、
前記第２の反応混合物のケイ光が前記第１の反応混合物のケイ光に比べ著しく低いならば、前記化学物質は前記プロトックス酵素の活性を阻害することができる、前記検定方法に関する。
本発明の別の態様において、細胞の集合体中に存在するプロトックス阻害剤に耐性の改変プロトックス酵素を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）前記プロトックス酵素の未改変体を阻害する量で前記プロトックス阻害剤の存在下に前記集合体を培養し；
（ｂ）増殖が阻害されていない細胞を工程（ａ）から選択し；そして
（ｃ）工程（ｂ）からの選択された細胞中に存在するプロトックス酵素を単離および同定することからなる前記同定方法を提供する。
変更されたプロトックスをコードする遺伝子は植物細胞形質転換法における選択性マーカーとして使用され得る。従って、本発明は未形質転換植物から当該導入遺伝子で形質転換された植物、植物組織または植物細胞を選択する方法であって、以下の工程：
（ａ）植物、植物組織または植物細胞を植物により発現され得る当該の導入遺伝子、およびプロトックス阻害剤に耐性の変更されたプロトックスをコードする遺伝子で形質転換し；
（ｂ）このようにして形質転換された植物または植物細胞をプロトックス阻害剤を含有する培地に移し；そして
（ｃ）該培地中で生き残る植物または植物細胞を選択することからなる方法を包含する。
本発明はさらに、プロトックス遺伝子の存在および形態を検出する、および有機体（生物）におけるプロトックス転写物のレベルを定量ためのプローブおよび方法に関する。これらの方法はプロトックス酵素の変更された形態またはプロトックス酵素の発現の変更されたレベルと関連する疾病状態を診断するために使用され得る。
一つの面において、本発明はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本明細書では「プロトックス」と記載する）、プロトポルフィリノーゲンＩＸからプロトポルフィリンＩＸへの酸化を触媒する酵素の真核生物の形態をコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）からのプロトックス酵素のためのＤＮＡコード性配列および対応するアミノ酸配列は配列番号：１−４および９−１０として示される。トウモロコシプロトックス酵素のためのＤＮＡコード性配列および対応するアミノ酸配列は配列番号：５−８として示される。
プロトックス酵素をコードするあらゆる望ましい真核生物ＤＮＡは本発明に従って単離され得る。真核生物プロトックスコード性配列を単離するために教示される一つの方法は実施例１に示される。この方法において、プロトックス酵素をコードするｃＤＮＡクローンは、当該真核生物から誘導されるｃＤＮＡクローンのライブラリーから、プロトックス酵素活性を欠失している突然変異宿主生物に該活性を供給する能力に基づいて同定される。この方法に使用するための適当な宿主生物は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得るものであり、そして上記方法のためにプロトックス活性を欠失している突然変異体は利用可能であるか、または容易に生成され得る。そのような宿主生物は大腸菌（Sasarman等, J. Gen. Microbiol. 113:297（1979））, サルモネラ・チフィムリウム（Xu等, J. Bacteriol. 174:3953（1992））およびサッカロミセス・セレビシアエ（Camadro等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724（1982））を包含するが、これらに限定されない。
また、真核生物プロトックスコード性配列は本発明により教示されるアラビドプシス・タリアナプロトックスコード性配列（配列番号：１, ３および９）およびゼア・メイズプロトックスコード性配列（配列番号：５および７）に対する配列相同性に基づいて、十分に公知の方法に従って単離され得る。これらの方法において、公知プロトックスコード性配列の全てまたは一部は、選択された生物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集合体（すなわちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在するその他のプロトックスコード性配列と選択的にハイブリッド形成するプローブとして使用される。そのような方法はプレート化ＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成スクリーニング（プッラークまたはコロニー；例えばSambrook等, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press発行,(1989)参照）および公知プロトックスアミノ酸配列間に保存された配列ドメインに相当するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによる増幅（例えばInnis等, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press発行（1990））を包含する。これらの方法は特に、プローブ配列が誘導される生物に関連する生物からのプロトックスコード性配列の単離に適している。例えば、アラビドプシスまたはゼア・メイズコード性配列をプローブとして用いるこれらの方法の適用は、その他の植物種からのプロトックスコード性配列の単離に特に適していることが予測される。
本発明により教示される単離された真核生物プロトックス配列はあらゆる所望の目的に適合する標準的遺伝子操作法に従って操作され得る。例えば、全体のプロトックス配列またはその一部はプロトックスコード性配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるプローブとして使用され得る。種々の条件下での特異的なハイブリッド形成を達成するために、そのようなプローブはプロトックスコード性配列間でユニークであり、そして好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、そして最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである配列を包含する。そのようなプローブはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の十分に公知の方法により選択された生物からプロトックスコード性配列を増幅および分析するために使用され得る。この方法は所望の生物から別のプロトックスコード性配列を単離するために、また、診断アッセイとして生物中にプロトックスコード性配列の存在を決定するために、そして変更されたコード性配列を特定の悪い状態、例えばプロトックス活性のレベルが低下している、神経精神病的徴候と皮膚病変の両方を特徴とするヒトにおける優性常染色体失調（BrennerおよびBloomer, New Engl. J. Med. 302:765（1980））と関連づけるために有用であり得る。
プロトックス特異的ハイブリッド形成プローブはまた、ゲノムプロトックス配列に対するプローブの選択的ハイブリッド形成に基づいた標準的方法を用いる選択された生物のゲノムにおける天然の真核生物プロトックス遺伝子を地図に位置づけるために使用される。これらの方法はプロトックスプローブ配列内に同定されるか、または包含されるＤＮＡ多型の同定、および２つの多型の親系のハイブリッドの自家受精から誘導される地図作成集団における公知の地図上の位置のその他のマーカーに対するプロトックス遺伝子の分離を追跡するための上記多型の使用（例えばHelentjaris等, Plant Mol. Biol. 5:109(1985), Sommer等, Biotechniques 12:82(1992);D'Ovidio等, Plant Mol. Biol. 15:169(1990)参照）を包含するが、それらに限定されない。あらゆる真核生物プロトックス配列はあらゆる真核生物からのプロトックス遺伝子の地図を作成するためのプローブとして有用であることが予測されるけれども、好ましいプローブは選択された生物に非常に近似する生物からのプロトックス配列であり、そして最も好ましいプローブは選択された生物からのプロトックス配列である。この方法によるプロトックス遺伝子の地図作成は育種のための植物において特に有用であると予測される。例えば、除草剤耐性を付与する突然変異プロトックス遺伝子の遺伝子地図の位置を知ることにより、フランキング（flanking）ＤＮＡマーカーが参考となる遺伝子地図から同定され得る（例えばHelentjaris等, Trends Genet. 3:217(1987)参照）。新規育種系中へ除草剤耐性の形質を遺伝子移入する間に、これらのマーカーは各戻し交配の後に反復親に依然として存在するプロトックス結合フランキング染色体ＤＮＡの範囲を追跡するために使用され得る。
プロトックス特異的ハイブリッド形成プローブはまた、標準的方法、例えばノーザンブロット分析を用いて生物中のプロトックスｍＲＮＡのレベルを定量するために使用され得る。この方法はプロトックス活性のレベルが低下している、神経精神病的徴候と皮膚病変の両方を特徴とするヒトにおける優性常染色体失調（BrennerおよびBloomer, New Engl. J. Med. 302:765（1980））のような特定の疾病状態と関連づけ得るプロトックス発現の変更されたレベルを検出ための診断アッセイとして有用であり得る。
宿主生物における酵素の組換え創出のために、プロトックスコード性配列は選択された宿主のために設計された発現カセット中に挿入され、そして組み換えられて創出される宿主中に導入され得る。特定の制御配列、例えばプロモーター、シグナル配列、５’および３’非翻訳配列およびエンハンサーの選択は当業者の知識の範囲内である。特定の読み枠に結合された個々の要素を含む得られる分子は宿主細胞中に形質転換され得るベクター中に挿入されてもよい。適当な発現ベクターおよびタンパク質の組換え創出方法は宿主生物、例えば大腸菌（例えばStudierおよびMoffatt, J. Mol. Biol. 189:113(1986);Brosius, DNA 8:759(1989)参照、酵母（例えばSchneiderおよびGuarente, Meth. Enzymol. 194:373（1991）参照）および昆虫細胞（例えばLuckowおよびSummers, Bio/Technol. 6:47（1988）参照）に対してよく知られている。特定の例はプラスミド、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン, カリフォルニア州ラジョラ）、ｐＦＬＡＧ（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社, コネチカット州ニューヘブン）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン, カリフォルニア州ラジョラ）、およびバキュロウイルス発現ベクター、例えばオートグラフィカ・カルフォルニカ（Autographica californica）核多角体病ウイルス群（ＡｃＭＮＰＶ）のゲノムから誘導されるものを包含する。好ましいバキュロウイルス／昆虫系はｐＶＩ１１３９２／Ｓｆ２１細胞（インビトロゲン, カリフォルニア州ラジョラ）である。
組換えにより創出される真核生物プロトックス酵素は種々の目的のために有用である。例えば、それは試験管内でプロトックス酵素活性を供給するために使用され得る。公知除草剤化学物質がプロトックスを阻害するか否かを決定するために、その標的が同定されていない前記化学物質を試験管内で検定するために使用され得る。そのような試験管内での検定はプロトックス活性を阻害し、そしてそれ故に除草剤候補体である化学物質を同定するためのより一般的なスクリーニングとしても使用され得る。また、新規阻害性除草剤並びに酵素の除草剤許容性体を合理的に設計する目的で、組換えにより創出したプロトックス酵素は公知阻害剤との結合をさらに特徴づけるために使用され得る。
典型的には、プロトックスへの阻害剤効果は約３９５ないし４１０ｎＭでの励起の後、約６２２ないし６３５ｎｍでのケイ光を測定することにより決定される（例えば（JacobsおよびJacobs, Enzyme 28:206(1982);Sherman等, Plant Physiol. 97:280(1991)参照）。このアッセイはプロトポルフィリンＩＸがケイ光色素であり、そしてプロトポルフィリノーゲンＩＸが非ケイ光色素であるという事実に基づいている。タンパク質抽出物は選択された細胞内画分、例えばエチオプラスト、ミトコンドリア、ミクロソームまたはプラズマ膜から分画遠心法により調製される（例えばLee等, Plant Physiol. 102:881(1993);Prado等, Plant Physiol. 65:956(1979);JacksonおよびMoore, Plant Organelles. Reid編所収, pp.1-12;JacobsおよびJacobs, Plant Physiol. 101:1181(1993)）。プロトポルフィリノーゲンはJacobsおよびJacobs（1982）に記載されるようにプロトポルフィリンをナトリウムアマルガムで還元することにより調製される。反応混合物は典型的には１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７. ５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、約２ＭプロトポルフィリノーゲンＩＸおよび約１ｍｇ／ｍＬタンパク質抽出物からなる。種々の濃度、例えば１ｍＭ、１００ｕＭ、１０ｕＭ、１ｕＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭの阻害剤溶液は酵素反応の開始前に酵素抽出物に添加される。タンパク質抽出物が添加されたら、ケイ光は数分間追跡され、そしてスロープのスロープ（反応速度）が線型の領域から計算される。ＩＣ50は対照反応に対して阻害された反応のスロープ（勾配）を比較することにより決定される。
本発明もう一つの態様は、阻害剤耐性プロトックス突然変異体を同定するためのアッセイにおけるプロトックスの使用を含む。典型的なアッセイは以下のとおりである：
（ａ）プロトックスおよびその基質プロトポルフィリノーゲンＩＸの第１試料を、プロトックス阻害剤からなる第２試料の存在下に保温し、
（ｂ）工程（ａ）からのプロトックスの酵素活性を測定し、
（ｃ）突然変異したプロトックスとその基質の第１試料を同一のプロトックス阻害剤を含有する第２試料の存在下に保温し、
（ｄ）工程（ｃ）からの突然変異したプロトックスの酵素活性を測定し、そして
（ｅ）突然変異したプロトックスの酵素活性を突然変異していないプロトックスにより得られる酵素活性と比較する。
反応混合物および反応条件はプロトックスの阻害剤を同定するアッセイ（阻害剤アッセイ）と以下の変形の除き同一である。第１に、上記のようにして得られたプロトックス突然変異体は阻害剤アッセイの野生型プロトックスに対する反応混合物の一つに置き換えられる。第２に、野生型プロトックスの阻害剤は両方の反応混合物中に存在する。第３に、突然変異した活性（阻害剤および突然変異したプロトックスの存在下での酵素活性）および突然変異していない活性（阻害剤および野生型プロトックスの存在下での酵素活性）は、酵素活性における顕著な増加が突然変異していない活性に比べた場合、突然変異した活性に観察されるか否かを決定するために比較される。突然変異した活性は適当な基質および阻害剤の存在下での突然変異したプロトックス酵素の酵素活性の尺度である。突然変異していない活性は適当な基質と阻害剤の存在下での野生型プロトックス酵素の酵素活性の尺度である。顕著な増加は測定法に固有の誤差範囲より大きい酵素活性における増加、好ましくは阻害剤の存在下で野生型酵素活性の約２倍の増加、より好ましくは約５倍の増加、最も好ましくは約１０倍以上の増加として定義される。
プロトックスを阻害する除草剤は多くの異なる構造の分子種を包含し（Duke等, Wees Sci. 39:465(1991);Nandihalli等, Pesticide Biochem. Physiol. 43:193(1992);Matringe等, FEBS Lett. 245:35(1989);YanaseおよびAndoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70（1989））、ジフェニルエーテル｛例えばアシフルオルフェン, ５−〔２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ〕−２−ニトロ安息香酸；そのメチルエステル；またはオキシフルオルフェン, ２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾール（例えばオキシジアゾン, ３−〔２, ４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル〕−５−（１, １−ジメチルエチル）−１, ３, ４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２, Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリム, Ｎ−（４−クロロフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド、フェニルピラゾール（例えばＴＮＰＰ−エチル, エチル２−〔１−（２, ３, ４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ〕プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、およびフィノピレートおよびそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体等である。
特に重要なジフェニルエーテルは次式：
0003673925.tif 000002
（式中、Ｒ＝−ＣＯＯＮａ（式II）、−ＣＯＮＨＳＯ2ＣＨ3（式III）または−ＣＯＯＣＨ2ＣＯＯＣ2Ｈ5（式IV;Maigrot等, Brighton Crop Protection Conference-Weeds:47-51(1989)参照）で表されるものである。
当該のその他のジフェニルエーテルは上記式中Ｒが次式を表すものである：
0003673925.tif 000003
（式IVa;Hayashi等, Brighton Crop Protection Conference-Weeds:53-58（1989）参照）。
当該のその他のジフェニルエーテルは次式で表されるものである：
0003673925.tif 000004
（式IVb;ビフェノックス, Dest等, Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31(1973)参照）。
重要であるのはまた、一般式：
0003673925.tif 000005
（式中、Ｑは次式：
0003673925.tif 000006
で表される基を表す）で表されるイミドとして公知の除草剤の類
（Hemper等（1995）“Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale等編所収, Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., pp.42-48(1994)参照）
そしてＲ1はＨ、ＣｌまたはＦを表し、Ｒ2はＣｌを表し、そしてＲ3は場合により置換されたエーテル基、チオエーテル基、エステル基、アミノ基またはアルキル基を表すものである。また、Ｒ2およびＲ3は５または６員の複素環式環を形成してもよい。特定の興味深いイミド除草剤の例は次式で表されるものである：
0003673925.tif 000007
（Miura等, Brighton Crop Protection Conference-Weeds:35-40（1993）参照）
0003673925.tif 000008
上記化合物の除草剤活性はProceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds（British Crop Protection Council）（式Ｘおよび式XVI）、Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds（British Crop Protection Council）（式XIIおよび式XIII）、米国特許第４７４６３５２号（式XI）、そしてAbstracts of the Weeds Science Society of America vol.33, pg.9（1993）（式XIV）に記載されている。
最も好ましいイミド除草剤はアリールウラシルと分類され、そして参照により本明細書に編入される米国特許第５１８３４９２号に開示されるような一般式：
0003673925.tif 000009
（式中、Ｒは（炭素原子数２ないし６のアルケニルオキシ）カルボニル−炭素原子数１ないし４のアルキル基を表す）を有する。
重要であるのはまた以下の一般式を有する除草剤である：
0003673925.tif 000010
（Weiler等, Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.29-34(1993)参照）;
0003673925.tif 000011
（Van Saun等, Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.19-22(1993)参照）;
次式のＮ−置換ピラゾール：
0003673925.tif 000012
（国際特許公開ＷＯ９４／０８９９９, ＷＯ／９３／１０１００およびScheringに対する米国特許第５４０５８２９）；
Ｎ−フェニルピラゾール、例えば：
0003673925.tif 000013
（“The Pesticide Manual”, 9th ed., C.R.Worthing編, British Crop Protection Council, Surrey(1991)の６２１頁参照）；および
３−置換−２−アリール４, ５, ６, ７−テトラヒドロインダゾール（Lyga等, Pesticide Sci. 42:29-36(1994)）。
プロトックス活性に対して通常阻害性である除草剤のレベルは当業界で公知の施用比率を包含し、そしてそれは外部要因、例えば環境、時期および施用方法に部分的に依存する。例えば式ＶないしIXで表されるイミド除草剤の場合、特に式ＸないしXVIIで表されるものの場合、施用比率は０.０００１ないし１０ｋｇ／ｈａ、好ましくは０.００５ないし２ｋｇ／ｈａに及ぶ。除草剤のこの投与比率または濃度は所望の作用および使用される特定の化合物に応じて異なり得、そして当業界で公知の方法により決定され得る。
本発明はさらに、許容性が変更されたプロトックス酵素活性により与えられる、植物、植物組織および植物種子において自然に生じるプロトックス活性を阻害する除草剤に耐性の上記植物、植物組織および植物種子に関する。代表的な植物は上記除草剤がそれらの通常意図される目的のために施用されるあらゆる植物を包含する。好ましいのは農学的に重要な作物、すなわち重要な被子植物および裸子植物、例えばワタ、ダイズ、アブラナ、サトウダイコン、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、ライ麦、モロコシ、アワ（キビ）、芝生および飼料草類等、飼草等である。
「変更されたプロトックス酵素活性」とは、自然に生じる活性を阻害する除草剤に耐性である植物に自然に生じるもの（すなわち、人間による直接的または間接的な操作の不在下で自然に生じるプロトックス活性）とは異なるプロトックス酵素活性を意味する。変更されたプロトックス酵素活性は、野生型除草剤感受性プロトックスの発現を増加させることにより、変更された除草剤許容性真核生物プロトックス酵素を植物に発現させることにより、植物において除草剤耐性であるプロトックス酵素の未改変または改変バクテリア体を発現させることにより、またはこれらの方法の組合せにより本発明に従って植物に付与され得る。
高められた発現により変更されたプロトックス酵素活性を達成することは、除草剤により引き起こされる生長阻害を克服するのに少なくとも十分な植物細胞におけるプロトックスのレベルを導く。発現されたプロトックスのレベルは一般に本来発現される量の少なくとも２倍、好ましくは５倍、そして最も好ましくは少なくとも１０倍である。高められた発現は野生型プロトックス遺伝子の多重コピー；プロトックス遺伝子内のプロトックスコード性配列の多重出現（すなわち、遺伝子増幅）または植物細胞における内因性プロトックス遺伝子の非コード性制御配列における突然変異に起因し得る。そのような変更されたプロトックス酵素活性を含む植物は植物における直接選択により得られ得る。この方法は当業界で公知である。例えばSomers等の米国特許第５１６２６０２号およびAnderson等の米国特許第４７６１３７３号およびそれらに引用された文献を参照。これらの植物はまた、当業界で公知の遺伝子操作法を介して得られてもよい。
除草剤感受性プロトックスの高められた発現はまた、プロトックスをコードする同種または異種の構造遺伝子に結合された、植物細胞内で関連構造遺伝子の発現を起こし（駆動し）得るプロモーターを含む組換え体またはキメラＤＮＡ分子で植物細胞を安定に形質転換することにより達成され得る。「同種」とは、プロトックス遺伝子が標的植物細胞と分類学的に同一な生物（有機体）から単離されることを意味する。「異種」とは、プロトックス遺伝子が標的植物細胞と分類学的に異なる生物（有機体）から得られることを意味する。同種プロトックス遺伝子はバクテリアまたは酵母の栄養要求突然変異体を標的植物からのｃＤＮＡ発現ライブラリーと相補性試験を行うことにより得られ得る。例えば実施例１およびSnustad等, Genetics 120:1111-1114（1988）（トウモロコシグルタミンシンターゼ）;Delauney等, Mol. Genet. 221:299-305（1990）（ダイズピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ）;Fisch等, Mol. Gen. Genet. 228:287-293（1991）（トウモロコシジヒドロジピコリネートシンターゼ）;Eller等, Plant Mol. Biol. 18:557-566（1992）（アブラナ葉緑体３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ）;Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:1731-1735(1991);Minet等, Plant J. 2:417-422（1992）（ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ）およびそれらに引用さいた文献を参照。その他の公知方法は、例えば特定の核酸プローブと交差ハイブリッド形成する配列のための、高等植物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを含み、また、特定の抗体プローブと交差反応するプロトックス酵素の生成のための発現ライブラリーをスクリーニングすることによる方法を包含する。好ましい方法は大腸菌ｈｅｍＧ栄養要求突然変異体をトウモロコシまたはアラビドプシス・タリアナｃＤＮＡライブラリーと相補性試験を行うことを包含する。
植物または植物細胞において機能し得るプロモーター、すなわち関連構造遺伝子、例えば植物細胞におけるプロトックスの発現を起こし得るものの例はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓまたは３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ二重プロモーター；ノパリンシンターゼプロモーター；病原体関連（ＰＲ）タンパク質プロモーター；リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモーター等を包含する。好ましいのはイネアクチンプロモーター（McElroy等, Mol. Gen. Genet. 231:150（1991）、トウモロコシユビキチンプロモーター（ＥＰ０３４２９２６；Taylor等, Plant Cell Rep. 12:491（1993））およびタバコ、アラビドプシスまたはトウモロコシからのＰｒ−１プロモーター（Ryals等の国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００００２参照, その全体が参照により本明細書に編入される）である。その他に好ましいのは、３５Ｓプロモーターおよび高められた、または二重３５Ｓプロモーター、例えばKay等, Science 236:1299-1302（1987）に記載されたもの、およびｐＣＧＮ２１１３中にクローン化された二重３５Ｓプロモーター（ＡＴＣＣ４０５８７として寄託され、その全体が参照により本明細書に編入されるＥＰ−Ａ０３９２２２５に開示されているもの）である。プロモーター自身は当業者界で理解される操作に従って、プロトックス発現を高めるためにプロトックス強度を操作するように改変されてもよい。
シグナルまたは移入ペプチドは作用の所望部位に発現プロトックス酵素の転位を導くために本発明のキメラＤＮＡ構築物においてプロトックスコード性配列に融合されてもよい。シグナルペプチドの例は植物病原体関連タンパク質、例えばＰＲ−１、ＰＲ−２等に自然に結合されたものを包含する。例えばPayne等, Plant Mol. Biol. 11:89-94(1988)参照。移入ペプチドの例は葉緑体移入ペプチド、例えばVon Heijin等, Plant Mol. Biol.Rep. 9:104-126(1991);Mazur等, Plant Physiol. 85:1110(1987);Vorst等, Gene 65:59（1988）に記載されるもの、およびミトコンドリア移入ペプチド、例えばBoutry等, Nature 328:340-342（1987）に記載されるものを包含する。葉緑体およびミトコンドリア移入ペプチドはプロトックス酵素活性がミトコンドリアおよび葉緑体内で典型的に生じるので本発明では特に有用であると理解される。使用のために最も好ましいのは、葉緑体におけるプロトックス酵素活性がプロトックス阻害性除草剤の作用に対するものが主である考えられるので、葉緑体移入ペプチドである（WitkowskiおよびHalling, Plant Physiol. 87:632(1988);Lehnen等, Pestic. Biochem. Physiol. 37:239(1990);Duke等, Weed Sci. 39:465（1991））。種々の細胞画分、例えば液胞コードされたタンパク質の局在化を導く配列もまた包含される。例えばNeuhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10362-10366(1991)およびChrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21-53(1991)参照。上記文献の関連する開示はそれらの全体が参照により本明細書に編入される。
本発明のキメラＤＮＡ構築物はプロモーターの多重コピーまたはプロトックス構造遺伝子のプロトックスの多重コピーを含み得る。さらに、該構築物はマーカーのためのコード性配列およびその他のペプチド、例えばシグナルまたは移入ペプチドのためのコード性配列を包含し、各々はＤＮＡ分子内でその他の機能要素を有する適当な読み枠内にある。そのような構築物の調製は当業者の通常の技術レベル内である。
有用なマーカーは除草剤、抗生物質または薬剤耐性、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、グリホセート、ホスフィノトリシン等に対する耐性を包含する。これらのマーカーは形質転換されていない細胞から本発明のキメラＤＮＡ構築物を有する形質転換された細胞を選択するために使用され得る。その他の有用なマーカーは可視反応、例えば着色反応により容易に検出され得るペプチド酵素、例としてルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである。
変更されたプロトックス酵素活性はまた、変更されていない自然に生じる形態（すなわち組換えＤＮＡ方法論を介して直接的に、または人間による選択育種を介して間接的に操作されることなしに真核生物において自然に生じる形態）を阻害する除草剤に対して耐性の変更されたプロトックス酵素をコードする、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加または欠失を有する単離された真核生物プロトックスコード性配列の改変体の生成または同定を介して獲得され得る。そのような酵素をコードする遺伝子は当業界で公知の多くの戦略により得られ得る。第１の一般的な戦略は微生物上での直接または間接突然変異誘発法を包含する。例えば、遺伝子操作可能な微生物、例として大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエは例えばＵＶ光またはエチルもしくはメチルメタンスルホネートを用いて生体内でランダム突然変異誘発に暴露され得る。突然変異誘発法は例えばMiller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1972);Davis等, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1980);Sherman等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1983);および米国特許第４９７５３７４号（Goodman等）に記載されている。突然変異誘発のために選択される微生物は通常除草剤感受性真核生物プロトックス遺伝子を含有し、そしてこの遺伝子により与えられるプロトックス活性に依存している。突然変異誘発された細胞は未改変プロトックス酵素を阻害する濃度での除草剤の存在下に増殖される。阻害剤の存在下での突然変異誘発されていない微生物に比べより良好に増殖する（すなわち阻害剤に対して耐性を示す）突然変異誘発された微生物のコロニーはさらなる分析のために選択される。クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅のいずれかによりこれらのコロニーからプロトックス遺伝子が単離され、そしてそれらの配列が決定される。変更されたプロトックス酵素をコードする配列は次に微生物に戻してクローン化されて、阻害剤耐性を付与するそれらの能力を確認する。
真核生物プロトックス酵素の突然変異除草剤耐性対立遺伝子を得る第２の方法は植物における直接選択を包含する。例えば、植物、例としてアラビドプシス、ダイズまたはトウモロコシの生長阻害に関する上記したようなプロトックス阻害剤の効果は阻害剤の増加する濃度を含む単純な最小塩培地のプレート上に当業界で理解される方法により殺菌された種子をプレーティングすることにより決定され得る。そのような濃度は百万あたり０. ００１、０. ００３、０. ０１、０. ０３、０. １、０. ３、１、３、１０、３０、１１０、３００、１０００および３０００部（ｐｐｍ）の範囲内である。顕著な生長阻害が再現性よく検出され得る最低の投与量が引き続く実験のために使用される。
植物材料の突然変異誘発は耐性対立遺伝子が選択された集合体に生じる頻度を高めるために利用され得る。突然変異誘発された種子材料は化学的もしくは物理的突然変異誘発または種子または化学的もしくは物理的突然変異誘発または花粉等（Neuffer, Maize for Biological Research. Sheridan編所収, Univ. Press, Grand Forks,ノースダコタ, pp.61-64（1982））の種々の供給源から誘導され、それは次いで植物を受精させるために使用され、そして得られるＭ1突然変異種子が収集される。典型的には、アラビドプシスのためにＭ2種子（レーレ・シード, アリゾナ州タクソン）、すなわち化学物質、例えばエチルメタンスルホネートで、または物理的手段、例えばガンマ線または高速中性子で突然変異誘発させた種子から生長させた植物の後代種子が耐性を選択するために適当な濃度の阻害剤を含む最小塩培地上で１００００種子／プレート（直径１０ｃｍ）までの濃度でプレーティングされる。プレーティング後７−２１日、生長を続け緑色のままである実生を土壌に移植し、そして生長させて成熟させ、種子を形成させる。これら種子の後代は除草剤に対する耐性が試験される。耐性の形質が優性であるならば、種子が３：１（耐性：感受性）で分離する植物はＭ2世代で耐性に対しヘテロ接合であったと予測される。全てが耐性種子を生じる植物はＭ2世代で耐性のためのホモ接合であったと予測される。無傷種子でのそのような突然変異誘発およびそれらのＭ2後代種子のスクリーニングはその他の種、例えばダイズ（例えば米国特許第５０８４０８２号（Sebastian）参照）に対して行われ得る。除草剤許容性がスクリーニングにされるべき突然変異種子はまた、化学的または物理的手段により突然変異誘発された花粉との受精の結果として得られ得る。
２つの試みは、耐性の遺伝子的基礎が変更されたプロトックス遺伝子であることを確認するためになされ得る。第１に、阻害剤に対する耐性を示す植物からのプロトックス遺伝子の対立遺伝子は下記の配列番号：１、３、５、７に示されるアラビドプシスおよびトウモロコシプロトックスｃＤＮＡ配列における保存領域に基づくか、またはより好ましくは、耐性対立遺伝子を生成するために使用される植物からの未変更プロトックス遺伝子配列に基づくプライマーでもってＰＣＲを用いて単離され得る。コード性配列における突然変異の存在を決定するために対立遺伝子を配列決定した後、対立遺伝子は予想上の耐性付与対立遺伝子が形質転換された植物に阻害剤に対する耐性を付与する能力が試験され得る。これらの植物はその生長が阻害剤に対して感受性であるアラビドプシス植物またはあらゆるその他の植物のいずれかであってよい。第２に、プロトックス遺伝子は公知の制限断片の長さ多型性（ＲＦＬＳ）に対して地図作成され得る（例えばChang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6856-6860(1988);Nam等, Plant Cell 1:699-705（1989）参照）。耐性の形質は同一マーカーを用いて独立に地図作成され得る。耐性がプロトックス遺伝子における突然変異に起因するならば、耐性形質はプロトックス遺伝子の位置から区別し得る位置に地図作成されるであろう。
プロトックスの除草剤耐性対立遺伝子を得るための第３の方法は、植物細胞培養体における選択による。植物組織の外植片、例えば当該植物の胚、リーフディスク等、または活発生長するカルスまたは懸濁培養体はヘムを欠く規定された培地上、実験室環境において使用するのに適している阻害性除草剤または類似の除草剤の増加する濃度の存在下で増殖させる。増殖の変化する程度は異なる培養体において記録される。ある種の培養体において、阻害剤の通常の阻害性濃度の存在下でさえも増殖し続ける急速に増殖する変形コロニーが生じる。そのような急速増殖変形体が生じる頻度は組織または細胞を除草剤に暴露する前に化学的または物理的突然変異誘発物質との処理により高められ得る。プロトックス遺伝子の予想上の耐性付与対立遺伝子は単離され、そして上に記載されるように試験される。除草剤耐性を付与するものとして同定される上記対立遺伝子が次に最適発現のために操作され、そして植物中に形質転換され得る。また、植物はこれらの対立遺伝子を含む組織または細胞培養体から再生され得る。
第４の方法は、バクテリアまたは酵母における野生型除草剤感受性プロトックス遺伝子の突然変異誘発、それに続く、ヘムを欠くが阻害性濃度の阻害剤を含む培地上での微生物の培養、そして阻害剤の存在下で増殖するコロニーの選択を包含する。より詳しくは、植物ｃＤＮＡ、例えばプロトックスをコードするアラビドプシスまたはトウモロコシｃＤＮＡがプロトックス活性を欠く微生物内にクローン化される。そのような微生物の例は大腸菌、サルモネラ・チフィムリウムおよびサッカロミセス・セレビシアエ栄養要求突然変異体、例えば大腸菌ＳＡＳＸ３８株（Sasarman等, J. Gen. Microbiol. 113:297（1979））, サルモネラ・チフィムリウムＴＥ２４８３またはＴＴ１３６８０株（Xu等, J. Bacteriol. 174:3953（1992））およびｈｅｍ１４−１酵母突然変異体（Camadro等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724（1982））等を包含する。形質転換された微生物は次にすぐ上に記載したような生体内突然変異誘発、または当業界で公知の種々の化学的または酵素的方法のいずれかによる試験管内突然変異誘発、例えばナトリウムビスルフィット（Shortle等, Methods Enzymol. 100:475-468(1983);メトキシルアミン（Kadonaga等, Nucleic Acids Res. 13:1733-1745(1985);オリゴヌクレオチド指向性飽和突然変異誘発（Hutchinson等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:710-714（1986）;または種々のポリメラーゼ誤組み込み戦略（例えばShortle等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592(1982);Shiraishi等, Gene 64:313-319(1988);およびLeung等, Technique 1:11-15(1989)参照）に暴露される。通常の阻害性濃度の阻害剤の存在下に増殖するコロニーは採取され、そして反復線条接種により精製される。それらのプラスミドは精製され、そしてプロトックスを欠く微生物中にそれらを形質転換することにより阻害剤に対する耐性を付与する能力が試験される。この試験に合格するプラスミドからのプロトックスｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列が次に決定される。
除草剤耐性プロトックス対立遺伝子が一旦同定されると、それは栽培植物における最適発現のために遺伝子操作され得る。これは当該栽培植物における最適発現のための耐性対立遺伝子のコード性配列を変更することを含んでいてもよい。特定の栽培植物において最適発現を達成するためのコード性配列を変性するための方法は十分に公知である（例えばPerlak等, Proc. Natl. Acsd. Sci. USA, 88:3324(1991);Koziel等, Bio/technol. 11:194(1993)参照）。最適発現のためのプロトックス対立遺伝子の遺伝子操作はまた、適当な制御配列（すなわちプロモーター, シグナル配列, 転写ターミネーター）を操作可能に結合することを含む。好ましいプロモーターは高レベルの構成上の発現を付与するもの、より好ましくは除草剤による損傷に感受性である組織における特定の高レベル発現を付与するものである。
組換えＤＮＡ分子は当業界で理解される多くの方法で植物細胞中に導入され得る。当業者は方法の選択が植物のタイプ、すなわち形質転換のために標的化された単子葉または双子葉植物に依存することを理解するであろう。植物細胞を形質転換するための適当な方法はマイクロインジェクション（Crossway等, Bio Technique 4:320-334(1986)）、エレクトロポレーション（Riggs等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606（1986））、アグロバクテリウム介在形質転換（Hinchee等, Biotechnology 6:915-921(1988)）、直接遺伝子移入（Paszkowski等, EMBO J. 3:2717-2722(1984)）、およびアグラシータス社（ウイスコンシン州マジソン）およびデュポン社（デラウエア州ウイルミントン）から入手できる装置を用いる弾道粒子加速（例えばSanford等の米国特許第４９４５０５０号；およびMcCabe等, Biotechnology 6:923-926(1988)参照）を包含する。また、Weissinger等, Annual Rev. Genet. 22:421-477(1988);Sanford等, Particulate Science and Technology 5:27-37（1987）（タマネギ）;Christou等, Plant Physiol. 87:671-674(1988)（ダイズ）;McCabe等, Bio/Technology 8:736-740（1990）（イネ）;Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309（1988）（トウモロコシ）;Klein等, Bio/Technology 6:559-563（1988）（トウモロコシ）;Klein等, Plant Physiol. 91:440-444（1988）（トウモロコシ）;Fromm等, Bio/Technology 6:923-926（1988（ダイズ）;Datta等, Biotechnology 8:833-839(1990);Gordon-Kamm等, Plant Cell 2:603-618（1990）（トウモロコシ）をも参照。
さらに本発明の範囲内に含まれるのは、上記の方法により形質転換されたトランスジェニック植物、特に稔性のトランスジェニック植物、およびそれらの無性および／または優性の後代であって、植物に自然に生じるプロトックス活性に通常阻害性であるレベルでの除草剤による阻害に対して依然として耐性であるか、または少なくとも許容性であるものである。非常に好ましいのは、植物に自然に生じるプロトックス活性に通常阻害性であるレベルでの除草剤による阻害に対して耐性であるか、または少なくとも許容性で雑種植物（ハイブリッド植物）である。
本発明に係るトランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であってよい。グラミナセアエ（Graminaceae）科、例えばロリウム(Lolium)、ゼア(Zea)、トリチカム(Triticum)、トリチカレ(Triticale)、ソルガム(Sorghum)、サッカラム(Saccharum)、ブロムス(Bromus)、オリザエ(Oryzae)、アベナ(Avena)、ホルデウム（Hordeum）、セカーレ(Secale)およびセタリア(Setaria)植物等の単子葉植物が好ましい。
特に好ましいのは、トランスジェニックトウモロコシ、小麦、大麦、モロコシ、ライ麦、オート麦、芝生草類およびイネである。
双子葉植物の中で、ダイズ、ワタ、タバコ、サトウダイコン、油料ナタネおよびヒマワリが本発明において特に好ましい。
「後代」という用語は、トランスジェニック植物の「無性」および「有性」的に作出された両方の後代を含むものと理解される。この定義はまた、公知方法、例えば細胞融合または突然変異選択により得られ、そして最初の形質転換された植物の特徴的性質を依然として有する全ての突然変異体または変種を、形質転換された植物材料の交雑および融合産物と共に包含するものと理解される。
本発明のもう一つの対象はトランスジェニック植物の増殖材料に関する。
トランスジェニック植物の増殖材料は有性的または無性的に生体内または試験管内で増殖され得るあらゆる植物材料として本発明に関して定義される。本発明の範囲内で特に好ましいのは、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、卵細胞、接合子、およびトランスジェニック植物から得られるその他のあらゆる増殖性材料である。
植物の一部、例えばトランスジェニック植物に由来する花、茎、果実、葉、根または本発明の方法により前もって形質転換され、それ故にトランスジェニック細胞を少なくとも一部含むそれらの後代もまた、本発明の対象である。
植物増殖材料〔果実, 塊茎, 穀粒, 種子〕、特に種子が市販製品として販売される前に、所望によりバクテリア、菌類または動物有害生物により引き起こされる損傷に対して保護を与えるための薬剤分野で慣用の担体、界面活性剤または施用促進助剤を含んでもよい、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バクテリア剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれら調剤の何種類かの混合物からなる保護コーティングで通常の方法で処理される。
種子を処理するために、保護コーティングは塊茎または穀粒を液体配合物に浸漬するか、または塊茎または穀粒を混合水和剤または乾燥配合物でコーティングすることにより種子に適用され得る。さらに、特別な場合において、植物に対する適用のその他の方法は、例えば芽または果実に方向づけられた処理が可能である。
本発明に係るプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性を有する真核生物からのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本発明に係る植物種子は、種子処理化合物、例えばカプタン、カルボキシン、チラム（ＴＭＴＤ, 登録商標）、メタラキシル（アプロン, 登録商標）およびピリミフォス−メチル（アセテリック, 登録商標）および種子処理に通常使用されるその他のものからなる種子保護コーティングで処理されてもよい。
従って、本発明の別の対象は、栽培植物のための植物増殖材料、特に種子処理に通常使用される種子保護コーティングで処理された植物種子を提供することである。
除草剤耐性プロトックス対立遺伝子は栽培植物が再生され得る栽培植物または植物細胞培養体における直接選択を介して得られる場合、対立遺伝子の遺伝子操作および植物中へのその形質転換の必要なしに、それは、除草剤許容性作物を開発するための伝統的育種法を用いて市販の変種中に移動されてもよい。また、除草剤耐性の対立遺伝子は単離され、最適発現のために遺伝子操作され、そして所望の変種中に形質転換されてもよい。
プロトックス阻害剤に対して耐性の変更されたプロトックスをコードする遺伝子はまた、植物細胞形質転換法において選択可能なマーカーとして使用され得る。例えば、導入遺伝子で形質転換された植物、植物組織または植物細胞はまた、植物により発現され得る変更されたプロトックスをコードする遺伝子で形質添加され得る。このようにして形質転換された細胞は、形質転換された細胞だけが生き残るプロトックス阻害剤含有培地中に移される。選択剤として特に有用であると考えられるプロトックス阻害剤はジフェニルエーテル｛例えばアシフルオルフェン, ５−〔２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ〕−２−ニトロ安息香酸；そのメチルエステル；またはオキシフルオルフェン, ２−クロロ−１−（３−エトキシ−４−ニトロフェノキシ）−４−トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾ−ル（例えばオキシジアゾン, ３−〔２, ４−ジクロロ−５−（１−メチルエトキシ）フェニル〕−５−（１, １−ジメチルエチル）−１, ３, ４−オキサジアゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えばＳ−２３１４２, Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリム, Ｎ−（４−クロロフェニル）−３, ４, ５, ６−テトラヒドロフタルイミド、フェニルピラゾール（例えばＴＮＰＰ−エチル, エチル２−〔１−（２, ３, ４−トリクロロフェニル）−４−ニトロピラゾリル−５−オキシ〕プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピリジン誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、およびフェノピレートおよびそのＯ−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体である。上記方法は変更されたプロトックスコード性遺伝子で形質転換され得るあらゆる植物細胞に適用可能であり、そして当該のあらゆる導入遺伝子と共に施用され得る。導入遺伝子およびプロトックス遺伝子の発現は植物細胞上で機能する同一プロモーターまたは別のプロモーターにより駆動され得る。
本発明は以下の詳細な実施例を参照してさらに記載される。これらの実施例は説明のためだけのものであり、特記しない限り限定を意図するものではない。
寄託
以下のベクター分子は米国イリノイ州６１６０４, ペオリア, ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５のアグリカルチュラル・リサーチ・サービス, パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）, ノーザン・リージョナル・リサーチ・センターに以下の日付で寄託されている：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のプロトックス−１はｐＷＤＣ−２（♯Ｂ−２１２３８）として１９９４年４月５日に寄託された。
ｐＦＬ６１ベクター内のプロトックス−２はｐＷＤＣ−１（ＮＲＲＬ♯Ｂ−２１２３７）として１９９４年４月５日に寄託された。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−１はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−４（♯Ｂ−２１２６０）として１９９４年５月２０日に寄託され、配列番号：５に示されている。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−１はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−４（♯Ｂ−２１２６０Ｎ）として１９９４年７月１１日に寄託され、配列番号：５に示されている。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−２はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−３（♯Ｂ−２１２５９）として１９９４年５月２０日に寄託され、配列番号：７に示されている。
ｐＦＬ６１ベクター内のプロトックス−３はｐＷＤＣ−５（ＮＲＲＬ♯Ｂ−２１２８０）として１９９４年６月１０日に寄託された。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のｐＭｚＣ−ｌＶａｌはｐＷＤＣ−８の表記の下、１９９４年９月３０日に寄託され、そして寄託番号ＮＲＲＬ♯２１３４０が付与されている。
ｐＦＬ６１ベクター内のｐＡｒａＣ−２ＣｙｓはｐＷＤＣ−７の表記の下、１９９４年１１月１４日に寄託され、そして寄託番号ＮＲＲＬ♯２１３３９Ｎが付与されている。
実施例
本実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当業界で十分に公知であり、そしてT. Maniatis, E. F. FritshおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1982）およびT. J. Silhavy, M. L. BermanおよびL. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984)に記載されている。
実施例１：大腸菌突然変異体の機能的相補性によるアラビドプシスｃＤＮＡコード性プロトックス遺伝子の単離
プラスミドベクターｐＦＬ６１（Minet等, Plant J. 2:417-422（1992））内のアラビドプシス・タリアナ（ランズバーグ）ｃＤＮＡライブラリーが得られ、そして増幅された。ＵｎｉＺａｐラムダベクター（ストラタジーン）内の第２のアラビドプシス（コロンビア）ｃＤＮＡライブラリーが購入され、そしてファージストックの大量生体内切除によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドとして増幅された。大腸菌ｈｅｍＧ突然変異体ＳＡＳＸ３８（Sasarman等, J. Gen. Microbiol. 113:297（1979））が入手され、そして２０ｍｇ／ｍｌヘマチンを含有するＬ培地（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ）上に保持される。バイオラッド・ジーン・パルサーおよび製造業者の条件を用いるエレクトロポレーションによりプラスミドライブラリーがＳＡＳＸ３８中に形質転換された。細胞が１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬアガー上に約５０００００形質転換体／１０ｃｍプレートの濃度でプレーティングされた。細胞は３７℃で４０時間、弱光下で保温され、そして外因性ヘムを添加せずに増殖する能力に対して選択された。ヘム原栄養体はｐＦＬ６１ライブラリーから４００／１０7の頻度で、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔライブラリーから２／１０7の頻度で回収された。プラスミドＤＮＡは配列分析のために２４コロニーから単離された。２４の各々はＳＡＳＸ３８中に再び形質転換され、そして相補性である能力が確かめられた。
配列分析は推定上のプロトックスクローンの２つのクラスを示した。９つが「プロトックス−１」と表記されるタイプからなっていた。各々は同じ遺伝子から誘導され、そして２つは全体の長さのクローンだった。ｃＤＮＡは長さ１７１９ｂｐであり、そして分子量５７. ７ｋＤａのタンパク質をコードする。Ｎ−末端ペプチド配列は約６０個のアミノ酸からなる葉緑体導入ペプチドの特性を有する。ＧＡＰプログラム（Deveraux等, Nucleic Acids Ras. 12:387-395(1984)）を用いるデータベース探索はバチラス・サブチリスｈｅｍＹ（プロトックス）タンパク質（HanssonおよびHederstedt 1992, Dailey等, J. Biol. Chem. 269:813（1994））との相同性を示す。２つのタンパク質はｈｅｍＹタンパク質の提示されたジヌクレオチド結合性ドメイン（Dailey等, J. Biol. Chem. 269:813（1994））を含み、高い相同性の領域と５３％の類似性、３１％の同一性である。
その他の１５のｃＤＮＡクローンは「プロトックス−２」と表記されるタイプのものからなっていた。これらはまた、単一遺伝子から生じるように見えた。明らかな全長ｃＤＮＡは１７３８ｂｐの長さであり、そして分子量５５. ６ｋＤのタンパク質をコードする。アミノ末端はミトコンドリア導入ペプチドのいくらかの特徴を有する。プロトックス−２タンパク質はプロトックス−１に対して限定された相同性（５３％の類似性, ２８％の同一性）を有し、そしてバチラス・サブチリスプロトックスに対して限定された相同性（５０％の類似性, ２７％の同一性）を有する。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のプロトックス−１はｐＷＤＣ−２（♯Ｂ−２１２３８）として１９８４年４月５日に寄託された。
ｐＦＬ６１ベクター内のプロトックス−２はｐＷＤＣ−１（ＮＲＲＬ♯Ｂ−２１２３７）として１９９４年４月５日に寄託された。
ｐＷＤＣ−２内に包含されるプロトックス−１およびｐＷＤＣ−１内に包含されるプロトックス−２をコードするアラビドプシスｃＤＮＡは以下においてそれぞれ配列番号：１および３として説明される。
実施例２：大腸菌突然変異体の機能的相補性によるトウモロコシｃＤＮＡコード性プロトックス遺伝子の単離
ラムダＵｎｉＺａｐ内のトウモロコシ（Ｂ７３同系繁殖体）ｃＤＮＡライブラリーがストラタジーンから購入され、そして大量生体内切除によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換された。注文製造された第２のＵｎｉＺａｐトウモロコシｃＤＮＡライブラリーがクロンテックから購入され、そして同様にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに変換された。トウモロコシからの機能的プロトックス遺伝子の選択はアラビドプシスライブラリーに対して実施例１に記載したものと同様であった。
１０7の形質転換体中に２つのヘム原栄養体がストラタジーンライブラリーから単離され、再び相補性が示され、そして配列決定された。これらのｃＤＮＡは同一であり、そしてアラビドプシスプロトックス−１の相同体であることが示された。このトウモロコシクローンはＭｚプロトックス−１と表記され、不完全である。ｃＤＮＡは１６９８ｂｐの長さであり、そして推定上の成熟プロトックス酵素をコードするのみであり、導入ペプチド配列がなく、そして開始性メチオニンコドンがない。遺伝子はＡｒａｂプロトックス−１に対してヌクレオチドレベルで６８％同一であり、そしてアミノ酸レベルで７８％同一（８７％類似性）である（表１に示されている）。
１０7の形質転換体中に１個のヘム原栄養体がクロンテックライブラリーから得られ、再び相補性が示され、そして配列決定された。ｃＤＮＡは完全であるように見え、２０６１ｂｐの長さであり、そして５９ｋＤａのタンパク質をコードする。このクローンはアラビドプシスプロトックス−２のトウモロコシ相同体であり、そしてＭｚプロトックス−２と表記される。遺伝子はＡｒａｂプロトックス−２に対してヌクレオチドレベルで５８％同一であり、そしてアミノ酸レベルで５８％同一（７６％類似性）である（表２に示されている）。トウモロコシクローンはアラビドプシスクローンより長い３０個のアミノ酸であるＮ−末端配列を有する。アラビドプシスクローンとの場合のように、２種のトウモロコシプロトックス遺伝子間の相同性は相当に低く、２種のタンパク質配列の間ではわずか３１％の同一性である。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−１はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−４（♯Ｂ−２１２６０）として１９９４年５月２０日に寄託され、配列番号：５に示されている。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−１はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−４（♯Ｂ−２１２６０Ｎ）として１９９４年７月１１日に寄託され、配列番号：５に示されている。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のＭｚプロトックス−２はＮＲＲＬにｐＷＤＣ−３（♯Ｂ−２１２５９）として１９９４年５月２０日に寄託され、配列番号：７に示されている。
実施例３：公知プロトックスコード性配列に対する配列相同性に基づいた追加プロトックス遺伝子の単離
ファージまたはプラスミドライブラリーが１０ｃｍペトリ皿上に約１００００プラークの濃度でプレーティングされ、そしてプラークの濾紙吸い取り（リフト）が３７℃で植物の一晩生長の後に行われる。プラークリフトは、プライム・タイム・キット（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社, コネチカット州ニューヘブン）によるランダムプライマー法により32Ｐ−ｄＣＴＰで標識した配列番号：１、３、５または７に示されるｃＤＮＡの１つとプローブ試験が行われる。ハイブリッド形成条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０. ５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７. ０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃である。一晩のハイブリッド形成の後、濾紙を２Ｘ  ＳＳＣ、１％ＳＤＳで洗浄する。陽性にハイブリッド形成するプラークはオートラジオグラフィーにより検出される。単一プラークまで精製した後、ｃＤＮＡ挿入物が単離され、そしてそれらの配列がケイ光色素（アプライド・バイオシステムズ社, カリフォルニア州フォスターシティ）で標識したジデオキシターミネーターを用いる連鎖停止法により決定される。
上記の標準的実験プロトコルはその他の真核生物、特に高等植物種からの公知プロトックスコード性配列に対して実質的に相同なプロトックス遺伝子を得るために当業者により使用され得る。
配列番号：２および６に示される配列によりコードされるそれぞれのタンパク質の予測アミノ酸配列のアラインメントは表１に示されている。配列番号：４および８に示される配列によりコードされるそれぞれのタンパク質の予測アミノ酸配列のアラインメントは表２に示されている。
0003673925.tif 000014
同一残基は２つの配列間の垂線により示されている。アラインメントはDeveraux等, Nucleic Acids Res. 12:387-395(1984)に記載されたＧＡＰプログラムを用いて行われる。
0003673925.tif 000015
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実施例４：アラビドプシスｃＤＮＡライブラリーからの混入酵母プロトックスクローンの単離
プロトックス活性を有する稀なｃＤＮＡを同定するための作業において、ｐＦＬ６１アラビドプシスライブラリーの第２のスクリーニングが上記のように行われ、数百の相補性クローンを再び得た。これらのうち約６００を格子プレート上に個々に付着させ、そして２８℃で１８時間保温した。２回の濾紙リフトが製造業者の指示に従うコロニー／プラークスクリーン（ＮＥＮ）膜上で行われた。プロトックス−１およびプロトックス−２ｃＤＮＡはそれぞれEcoRI/XhoIおよびNotIでの消化によりそれらのベクターから除去された。挿入物は１. ０％シープラークＧＴＧ（ＦＭＣ）アガロース中でのゲル電気泳動により分離され、切り出され、そしてランダムプライミング（ライフ・テクノロジーズ）により32Ｐ標識された。１セットのリフトは各プローブとハイブリッド形成された。ハイブリッド形成および洗浄条件はChurchおよびGilbert. 1984に記載されているものと同様であった。
プロトックス−１またはプロトックス−２に対するハイブリッド形成を明らかに示さなかったコロニー（〜２０）は液体培地中で増幅され、そしてプラスミドＤＮＡは調製された。ＤＮＡはNotIで消化され、複製試料は１. ０％アガロースゲルに通され、そしてジーン・スクリーン・プラス（ＮＥＮ）フィルター〔ニュー・イングランド・ヌクレアー〕上にサザンブロットされた。２つの公知プロトックス遺伝子のプローブは上記のように標識され、そしてハイブリッド形成された。これらはプロトックス−１またはプロトックス−２ではない２つの同一クローンだった。このクローンは非常に増殖が遅いけれどもＳＡＳＸ３８突然変異体に再び相補性を有することが示され、そしてプロトックス−３と表記された。
ｐＦＬ６１ベクター内のプロトックス−３はｐＷＤＣ−５（ＮＲＲＬ♯Ｂ−２１２８０）として１９９４年６月８日に寄託された。このコード性配列はアラビドプシスｃＤＮＡライブラリー中に少量混入物として存在する酵母ＤＮＡから誘導されることが決定された。ｐＷＤＣ−５中に包含されるプロトックス−３をコードする酵母ＤＮＡは下の配列番号：９に説明されている。
実施例５：バクテリア系におけるプロトックス阻害性除草剤に対する植物プロトックスクローン感受性の提示
プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８、プロトックス−２／ＳＡＳＸ３８およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｐ／ＸＬｌ−Ｂｌｕｅの液体培養体をＬａｍｐ100中で増殖させた。各培養体の一部１００マイクロリットルを種々の濃度（１. ０ｎＭ−１０ｍＭ）の式ＸＶＩＩのプロトックス阻害性アリールウラシル除草剤を含有するＬａｍｐ100培地上にプレーティングした。２組のプレートを弱光下または完全な暗所中、３７℃で１８時間保温した。プロトックス+大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株はあらゆる濃度で除草剤に対して感受性を示さず、類似の除草剤に対する天然のバクテリア酵素の報告された耐性と一致した。プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８は明らかに感受性であり、１０ｎＭと低い阻害剤濃度によりほぼ全体的にバクテリアのローン（lawn）が消滅した。プロトックス−２／ＳＡＳＸ３８はより高濃度（１０Ｍ）の除草剤でのみ感受性であった。両方の植物プロトックス株への除草剤の影響は弱光下で非常に劇的であったが、暗所中に全体的に保持されたプレートにも明らかであった。除草剤の毒性はプレートに２０ｍｇ／ｍｌヘマチンの添加により完全に除去された。
２つの植物プロトックス株間の異なる除草剤許容性は、酵素感受性における固有の相違よりむしろこれらの２つのプラスミドからの異なる発現に起因するようである。プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８はプロトックス−２／ＳＡＳＸ３８に比べあらゆるヘム欠失培地中でよりゆっくり増殖する。さらに、Ａｒａｂプロトックス−１／ＳＡＳＸ３８に匹敵し得る増殖速度を有するＭｚプロトックス−２／ＳＡＳＸ３８株はまたより低濃度（１０−１００ｎＭ）で除草剤に対して非常に感受性である。酵母プロトックス−３クローンの初期の特徴はそれが除草剤感受性であることを示した。
実施例６：大腸菌発現系におけるプロトックス阻害性除草剤に対して耐性の植物プロトックス遺伝子の選択
バクテリア系における植物プロトックス酵素の阻害は植物遺伝子における除草剤耐性突然変異を探す大規模なスクリーニングのために有用である。液体培養体からのプレーティングにより行われた初期投与量応答試験は、高濃度の除草剤でさえも高頻度の「耐性」コロニーを生じた。この耐性は再形質転換／除草剤感受性アッセイに基づいてプラスミドを産生しなかった。プロトックスプラスミドのＳＡＳＸ３８突然変異体への形質転換および除草剤含有プレート上への直接プレーティングはこのバックグランド問題をほぼ全体的に減少させる。
植物プロトックスプラスミドは化学物質の公表された方法（例えばナトリウムビスルフィット（Shortle等, Methods Enzymol. 100:475-468(1983);メトキシルアミン（Kadonaga等, Nucleic Acids Res. 13:1733-1745(1985);オリゴヌクレオチド指向性飽和突然変異誘発（Hutchinson等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:710-714（1986）;または種々のポリメラーゼ誤組み込み戦略（Shortle等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592(1982);Shiraishi等, Gene 64:313-319(1988);およびLeung等, Technique 1:11-15(1989)）を用いる種々の方法で突然変異誘発される。全体のプラスミド突然変異誘発からの予期されるアッププロモーター突然変異体は野生型ベクター中へのコード性配列を再クローニングし、そして再試験することにより解消される。より高い発現が除草剤の不在下でより良好な増殖を導くだろうということがわかれば、コード性配列突然変異体のための可視スクリーニングもまた可能である。
バクテリア系において除草剤耐性を発現するあらゆる植物プロトックス遺伝子は最適発現のために操作され、そして本明細書に記載された標準的な方法を用いて植物に形質転換される。得られる植物は次に除草剤と処理されて、導入されたプロトックス遺伝子により付与される耐性のレベルが確認および定量され得る。
実施例７：植物における除草剤耐性微生物プロトックス遺伝子の発現のための構築物
バチラス・サブチリス・プロトックス遺伝子ｈｅｍＹのコード性配列（HanssonおよびHederstedt, J. Bacteriol. 174:8081(1992), Dailey等, J. Biol. Chem. 269:81（1994））および大腸菌プロトックス遺伝子ｈｅｍＧ（Sasarman等, Can. J. Microbiol. 39:1155（1993））のコード性配列が標準的条件および公表された配列から設計されたフランキングプライマーを用いてＰＣＲ増幅により実験室株から単離された。これらの遺伝子はプロトックス酵素の除草剤耐性の形態をコードすることが知られている。
重複ＰＣＲ融合の標準的方法（Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons社（1994））を用いて、両方のバクテリア遺伝子は異なる２つのアラビドプシス葉緑体導入ペプチド配列（ＣＴＰ）に融合された。第１がアセトヒドロキシ酸シンターゼからのＣＴＰ（ＡＨＡＳ, Mazur等, Plant Physiol. 85:1110（1987））であり、これは葉緑体のストロマ中への移入を可能にする。第２がアラビドプシスプラストシアニン遺伝子（Vorst等, Gene 65:59（1988））からのものであり、２裂移入ペプチドを有する。このＣＴＰのアミノ末端部分は葉緑体中へのタンパク質を標的化し、そこでカルボキシ末端はそれのチラコイド膜への経路を定める。４種全ての遺伝子融合はアグロバクテリウム形質転換によりトランスジェニック植物の作出にために設計された二元発現ベクター内の２Ｘ３５Ｓプロモーターの後ろにクローン化された。
アラビドプシスおよびトウモロコシプロトックスｃＤＮＡの単離に続き、プロトックス−１またはＭｚプロトックス−１からの葉緑体移入ペプチドはまた２つのバクテリアプロトックスタンパク質に上記と同様の方法で融合されてもよい。
上記ベクターは次いで所望の植物種に形質転換され得、そして得られる形質転換体は除草剤に対する高められた耐性がアッセイされ得る。
実施例８：キメラ除草剤耐性プロトックスを産生するアラビドプシス／バチラス・サブチリス遺伝子間のドメインスイッチング
除草剤耐性であり、かつ植物に有効なプロトックス酵素活性を与えることができるプロトックス遺伝子を生成するために使用され得る１つの試みはバクテリアおよび植物プロトックス遺伝子の一部を融合することである。得られるキメラ遺伝子は次に植物細胞に除草剤耐性プロトックス活性を与え得るものがスクリーニングされ得る。例えば、アラビドプシスおよびバチラス・サブチリス（ｈｅｍＹ）プロトックスペプチド配列は高い相同性の領域を有してかなり共直線性である。ｈｅｍＹコード性配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化され、そしてＳＡＳＸ３８中での除草剤耐性プロトックス活性を発現する能力が試験される。プロトックス−１／ｈｅｍＹキメラ遺伝子は融合ＰＣＲ法を用い、次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に戻し結合されて構築される。初期の交換はタンパク質のほぼ中央部にある。これらの融合は相補性によりプロトックス作用が試験され、そして次に無傷プロトックス−１およびｈｅｍＹ対照と共に除草剤上にプレーティングすることにより除草剤耐性がアッセイされる。
実施例９：植物プロトックス遺伝子の過剰発現による除草剤許容性植物の作出
トランスジェニック植物にアラビドプシスまたはトウモロコシタンパク質を発現するために、適当な全長ｃＤＮＡが、下記のとおりにｐＣＧＮ１７６１から誘導された植物発現ベクターｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ中に挿入された。ｐＣＧＮ１７６１はユニークEcoRI部位で消化され、そして２種のオリゴヌクレオチド配列：5' AAT TAT GAC GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3'（配列番号：１１）および5' AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3'（配列番号：１２）からなる２本鎖ＤＡＮ断片に結合された。得られるプラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸはカリフラワーモザイクウイルスからの複製３５Ｓプロモーター（Kay等, Science 236:1299-1302(1987)）およびアグロバクテリウム・チュメファシエンスのｔｍｌ遺伝子の３’非翻訳配列の間に位置するユニークEcoRI、NotIおよびXhoI部位を含んでいた。このプラスミドは消化され、そして完全プロトックスｃＤＮＡを有するようなプロトックスｃＤＮＡを生じるプラスミドの一つの制限酵素消化から得られる断片に結合される。このプラスミドから、複製３５Ｓプロモーターとアグロバクテリウム・チュメファシエンスのｔｍｌ遺伝子の３’非翻訳配列の間に挟まれたアラビドプシスプロトックスｃＤＮＡからなるXbaI断片が切り出された。このXbaI断片は二元ベクターｐＣＩＢ２００中に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列間に位置するそのユニークXbaI部位に挿入される。ｐＣＩＢ２００プロトックスと表記される得られるプラスミドはアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣＩＢ５４２株中に形質転換される。例えばUknes等, Plant Cell 5:159-169（1993）参照。
ニコチアナ・タバカム・キサンチ−ｎｃ栽培変種（Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc）のリーフディスクをHorsh等, Science 227:1229（1985）に記載されるようにｐＣＩＢ２００１ＧＰＤを有するアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣＩＢ５４２に感染させる。１５の独立したリーフディスクからのカナマイシン耐性苗条を根形成培地に移し、次に土に移植し、そして得られる植物を成熟するまで室温で生長させる。これらの植物からの種子を集め、そしてカナマイシンを含有するＭＳアガー培地上で発芽させる。各々の独立した一次形質転換体からの多数の個々のカナマイシン耐性実生を温室内で成熟まで生長させ、そしてそれらのを種子を集める。これらの種子をカナマイシンを含有するＭＳアガー培地上で発芽させる。
排他的にカナマイシン耐性実生を生じる植物系は挿入遺伝子に対してホモ接合性であり、そしてさらなる分析に供される。１５の独立したトランスジェニック系の各々のリーフディスクは紙パンチで切り出され、そして種々の高まる濃度のプロトックス阻害性除草剤を含有するＭＳアガー培地上に載せられる。
３週間後、各系からの１０ディスク２組が重量測定され、そして結果が記録される。野生型の非形質転換植物に比べより除草剤に対して耐性であるトランスジェニック系がさらなる分析のために選択される。
ＲＮＡはこれらの系の各々の葉から抽出される。各々独立したホモ接合系からの全ＲＮＡおよび非トランスジェニック対照植物からの全ＲＮＡがホルムアルデヒドの存在下でのアガロースゲル電気泳動（Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York（1987））により分離される。ゲルはナイロン膜にブロットされ（Ausubel等, 同上）、そして放射標識されたアラビドプシスプロトックスｃＤＮＡとハイブリッド形成される。ハイブリッド形成および洗浄条件はChurchおよびGilbart, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995（1984）に記載されているものと同様である。フィルターはオートラジオグラフ化され、そしてプロトックス導入遺伝子に相当する強いＲＮＡバンドが全ての除草剤許容性トランスジェニック植物系において検出される。
プロトックス過剰発現系の耐性をさらに評価するために、植物を温室内で生長させ、そして種々の濃度のプロトックス阻害性除草剤で処理される。
実施例１０：タバコ細胞懸濁培養体の増殖
培地：
ＭＸ１：この培地はMurashigeおよびSkoog（「ＭＳ」, T. Murashige等, Physiol. Plant. 15:473-497, 1962）大量塩、少量塩およびＦｅ−ＥＤＴＡ（ギブコ♯５００−１１１７；４. ３ｇ／ｌ）、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌピリドキシンＨＣｌ、１０ｍｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、２−３ｇ／ｌショ糖、０. ４ｍｇ／１２, ４−ジクロロフェノキシ酢酸および０. ０４ｍｇ／ｌキネチン、ｐＨ５. ８からなる。培地をオートクレーブにより滅菌する。
Ｎ６：この培地はC-C. Chu等, Scientia Sinica 18:659（1975）に記載されるような大量元素、少量元素およびＦｅ−ＥＤＴＡ、および以下の有機化合物：ピリドキシン−ＨＣｌ（０. ５ｍｇ／ｌ）、チアミン−ＨＣｌ（０. １ｍｇ／ｌ）、ニコチン酸（０. ５ｍｇ／ｌ）、グリシン（２. ０ｍｇ／ｌ）、およびショ糖（３０. ０ｇ／ｌ）からなる。溶液はオートクレーブされる。最終ｐＨは５. ６である。
注意：大量元素は１０倍の貯蔵原液からなり、そして少量元素は１０００倍の貯蔵原液からなる。ビタミン貯蔵溶液は通常１００倍原液が調製される。
ニコチアナ・タバカムＳ３株〔HarmsおよびDiMaio, J Plant Physiol 137, 513-519, 1991〕の懸濁培養細胞を液体培養培地ＭＸ１中で増殖させる。培地ＭＸ１を２５ｍｌ含有する１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに予め７日間増殖させた細胞培養体１０ｍｌを接種する。細胞を暗所にて１００ｒｐｍ（１行程２ｃｍ）の軌道シェーカー上２５℃で保温する。細胞は一部の試料を新鮮培地中に接種し、約９０％の細胞懸濁体をデカンテーションまたはピペット吸引し、そして新鮮培地を置換して所望容量の懸濁体とすることにより７日毎に継代培養する。新鮮重量５−８グラムの細胞塊が２５０−３５０ｍｇの細胞の接種から増殖１０日以内に得られる。
実施例１１：固化選択培地上に細胞をプレーティングすることにより除草剤プロトックス阻害剤に許容性のタバコ細胞培養体の作出
実施例１０におけるように細胞を予備的に増殖させる。細胞を沈澱させるか、または５００ｘｇでの短時間の遠心分離により細胞を集め、そして使用済培養培地を除去する。細胞を次に新鮮な培養培地で希釈して、細胞プレーティングに適当な細胞濃度、約１００００コロニー形成性単位／ｍｌを得る。プレーティングのために、小容量の培地（約１ｍｌ）中の細胞を所望濃度の除草剤含有固化培養培地（ＭＸ１, ０. ８％アガー）の表面に均一に広げる。培地約２０−３０ｍｌが１０ｃｍペトリ皿あたり使用される。適当な阻害剤濃度は投与量応答曲線（実施例１４）から決定され、そして感受性野生型細胞のＩＣ50に比べ少なくとも２倍高い。
選択培地上に広げられた細胞を含有する培養プレートを通常の増殖条件下２５−２８℃で暗所にて、細胞コロニーが形成されるまで保温する。細胞コロニーが出現したら、所望濃度で阻害剤を含有する新鮮培地中に移す。
上記の方法の好ましい変法において、まず、培養細胞の予備増殖懸濁体が固化培地の表面上の少容量の液体培地中に広げられる。約４０℃で融解されたままである温かい液体アガー培地（１. ２−１. ６％アガー）の等容量が添加され、そして培地が固化する前に、細胞が培地表面上に均一に広がるようにプレートをゆっくりではあるがすぐに攪拌し、そして細胞とアガー培地を混合する。
また、細胞は選択培地の表面への展開に先立ち融解アガー培地と混合される。この方法は細胞が選択培地の表面上の固化培地の薄層内に閉じ込められ、そして固定される。これにより、全容量２０−３０ｍｌ中に細胞を閉じ込めることに比べ細胞のより良好な通気が可能となる。
実施例１２：液体選択培地中での細胞の増殖による除草性プロトックス阻害剤に許容性のタバコ細胞培養体の作出
実施例１０におけるように培養された細胞を所望濃度の除草剤プロトックス阻害剤を含有する液体培地ＭＸ１中に適当な細胞濃度で接種する。細胞を実施例１０におけるように保温し、増殖させる。増殖速度に適度に依存し、所望の阻害剤濃度を有する新鮮培地を用いて、７−１０日後、細胞を継代培養する。
使用される阻害剤濃度に応じて、細胞増殖は阻害剤がない場合に比べより緩慢になり得る。
実施例１３：プロトックス酵素を高められたレベルで有するタバコ細胞の作出
プロトックス酵素を高められたレベルで有する細胞培養体またはカルスを獲得するために、懸濁培養体またはカルスを１工程毎の様式で徐々に増加する濃度の除草剤プロトックス阻害剤に移す。特に以下の工程が行われる：
実施例１１のプレーティングされた細胞から出現する細胞コロニーは、懸濁培養体を形成するために、実施例１１に記載の選択において使用されるものと同一濃度のプロトックス阻害剤を含有する液体ＭＸ１培地中に移される。また、実施例１２の選択された細胞懸濁培養体は実施例１２に記載の選択において使用されるものと同一濃度のプロトックス阻害剤を含有する液体ＭＸ１培地中で継代培養される。
培養体を１週間間隔で１−２０回継代培養し、そして次に次のより高濃度の除草剤を含有するＭＸ１培地中で継代培養する。細胞をこのより高濃度の除草剤を含有する培地中で１−１０回の継代培養のために培養する。細胞を次いでさらに次のより高濃度の除草剤を含有するＭＸ１培地中で移す。
また、実施例１１の選択されたカルスの一部を所望除草剤濃度に補足された固化ＭＸ１培地に移す。次いで、固化培地が使用される以外は上記と同様にして、より高濃度の除草剤に移される。
実施例１４：懸濁培養体における除草剤投与量依存増殖の測定
投与量応答曲線を得るために、異なる濃度の除草剤での細胞の増殖が決定される。除草性プロトックス阻害感受性野生型タバコ細胞Ｓ３および除草剤許容性選択またはトランスジェニックＳ３および除草剤許容性選択またはトランスジェニック細胞の懸濁培養細胞を実施例１１に記載の液体培地中高い細胞濃度で２−４日予備増殖させる。細胞を洗浄して使用済培地を除去し、除草剤を含まない新鮮培地を添加して所望の細胞濃度（約１５０ｍｇＦＷ／懸濁液ｍｌ）を得る。約２５０−３００ｍｇＦＷ細胞を含有する細胞懸濁液２. ５ｍｌの試料を次に１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れられた所望除草剤濃度の液体培地約３０ｍｌ中に接種する。各フラスコに同じ量の細胞を接種するように注意する。各フラスコは等容量の培地を含む。各除草剤濃度あたり３−６本のフラスコが接種される。除草剤濃度はゼロ（＝対照）、０. １ｐｐｂ, ０. ３ｐｐｂ, １ｐｐｂ, ３ｐｐｂ, １０ｐｐｂ, ３０ｐｐｂ, １００ｐｐｂ, ３００ｐｐｂ, １０００ｐｐｂ, ３０００ｐｐｂおよび１００００ｐｐｂから選択される。接種された細胞のいくつかの試料はフラスコあたりの接種細胞量を決定するために接種からある時間に採取される。
細胞は次いで２８℃に調節された条件下暗所にて１０日間増殖のために保温される。各フラスコの内容物を真空吸引装置に取りつけた濾紙ディスク上に注ぎ、液体を除去し、そして相当に乾燥した新鮮細胞の塊を獲得することにより細胞が集められる。新鮮細胞の塊の重量が測定される。試料の乾燥重量が乾燥後に測定されてもよい。
細胞増殖が決定され、そして１０日以内の細胞獲得量として表現され、そして下の式に従って除草剤不在下で増殖した細胞に対する百分率として表現される：（除草剤増殖細胞の最終量−接種量×１００÷除草剤なしで増殖した細胞量−接種量）。ＩＣ50値はプロットしたデータ（相対的細胞量対除草剤濃度）のグラフから決定される。ＩＣ50は細胞増殖が対照増殖（除草剤不在下で増殖した細胞）の５０％である除草剤濃度を意味する。
この方法の変法において、実施例１１および１３において得られるような、除草剤耐性細胞培養体から誘導されるカルスのいくつかの部分片は異なる除草剤濃度を含有する固化カルス培養培地に移される。相対的増殖は２−６週の培養期間の後に、カルス片の重量を測定し、そして除草剤なしの培地で増殖した対照培養培地と比較することにより決定される。しかしながら、懸濁法はより精度が高いため好ましい。
実施例１５：交差許容性の決定
細胞が類似体またはその他の除草剤に対する許容性を示す範囲を決定するために、増加する濃度の選択された除草剤中で細胞を増殖させることにより実施例１４が反復される。細胞の相対的増殖およびそれらのＩＣ50値が比較のために各除草剤に対して決定される。
実施例１６：除草剤許容性表現型の経時的安定性の決定
細胞培養体の除草剤許容性表現型が時を経ても維持されるか否かを決定するために、除草剤含有培地から除草剤を含まない培地に細胞を移す。除草剤の不在下３ヵ月の間、適当な間隔（懸濁培養では７−１０日；カルス培養では３−６週）で通常の継代培養を行って、細胞は実施例１０に記載されるように増殖される。既知量の細胞を次に除草剤含有培地に戻し、そして１０日間（懸濁培養）または４週間（カルス培養）培養する。相対的増殖が実施例１４に記載のように決定される。
実施例１７：コーン胚盤組織からの胚形成性カルスの誘導および培養
雌穂が近交系Ｆｕｎｋ２７１７の自家受粉コーン植物から受粉１２−１４日後に集められる。包皮が除去され、そして雌穂を、良好な水和性のために数滴洗剤を添加した市販のクロロックス漂白剤の２０％溶液中で振り動かすことにより約１５分間殺菌する。雌穂を次に滅菌水で数回すすぐ。その他の全ての工程は殺菌空気が流れるフードの中で無機状態で行われる。長さ１. ５−２. ５ｍｍの胚がスパチュラーで穀粒から除去され、胚軸を下方に向けて２ｍｇ／１２, ４−ジクロロフェノキシ酢酸（２, ４−Ｄ）および３％ショ糖を含有し０. ２４％ゲルライト（登録商標）で固化されたＭＳ培養培地上に載せる。
胚形成性カルスは胚の胚盤組織上に培養２−４週間以内に約２８℃で暗所にて形成する。カルスは外植片から除去され、そして２ｍｇ／１２, ４−Ｄを含有する新たな固化ＭＳ培地に移される。胚形成性カルスの継代培養は週毎に反復される。胚形成性形態を有するカルスの部分のみが継代培養される。
実施例１８：除草性プロトックス阻害剤に対して許容性のコーン細胞培養体の選択
ａ）胚形成性カルスを用いる選択：実施例１７の胚形成性カルスは、２ｍｇ／１２, ４−Ｄ、３％ショ糖および増殖を遅延させるのに十分な量であるが、培養体の胚形成性に影響を及ぼさないプロトックス阻害剤を含有し、そして０. ２４％ゲルライト（登録商標）で固化されたＮ６培地からなるカルス維持培地に移される。除草剤許容性突然変異体の頻度を高めるために、培養体は選択の前に、実施例１４において決定されるような増殖阻害が検出される濃度よりほんの少し低い濃度での、化学的突然変異誘発剤、例えばエチルメタンスルホネート、または物理的突然変異誘発剤、例えばＵＶ線で予備処理されてもよい。培養体は暗所にて２８℃で保温される。１４日後、増殖するカルスを同一組成の新鮮培地に移す。タイプＩＩの形態の脆い胚形成性カルスとして知られる所望の胚形成性形態を有する培養体のみが継代培養される。１週間毎の新鮮培地上への２ないし１０回の継代培養を行うことにより培養体を増殖させ、それにより最も迅速に増殖する培養体のみが継代培養される。その迅速に増殖するカルスを次に実施例１１に規定されるような適当な濃度でプロトックス阻害性除草剤を含有するカルス維持培地に移す。この除草剤濃度でカルスが十分に増殖する時、通常約５ないし１０週間の継代培養後、カルスは３倍濃度の阻害剤を含有するカルス維持培地に移され、そして十分に増殖する培養体が得られるまで継代培養される。この方法が初期の適当な濃度の１０倍高い濃度でプロトックス阻害剤を含有する培地を用いて、そして再び２０倍および４０倍高い濃度の除草剤を含有する培地を用いて反復される。
十分なカルスが作出された時、胚成熟および植物再生に適当な再生培地に移される。使用される除草剤濃度の各々で増殖する胚形成性カルスは再生培地に移される。
ｂ）胚形成異性懸濁培養体を用いる選択：コーンＦｕｎｋ近交系２７１７の胚形成性懸濁培養は実施例２４に従って確立され、そして２ｍｇ／１２, ４−Ｄを含有する新鮮液体Ｎ６培地に１週間毎に継代培養することにより維持される。除草剤許容性突然変異体の頻度を高めるために、培養体はこの時点で、実施例１４において決定されるような増殖阻害が検出される濃度よりほんの少し低い濃度での、化学的突然変異誘発剤、例えばエチルメタンスルホネートで処理されてもよい。選択のために、培養体は、２ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび増殖を遅延させるのに十分な量であるが、培養体の胚形成性に影響を及ぼさない濃度の阻害剤を含有する液体Ｎ６培地に移される。培養体をシェーカー上１２０ｒｐｍで、暗所中２８℃にて増殖させる。１週間毎に、培地を除去して新鮮培地を加える。培養体をそれらの増殖に応じて培養培地で希釈して培地５０ｍｌあたり充填細胞容量約１０ｍｌに維持する。各継代培養の際に、培養体を検査し、そして所望の脆い胚形成性の形態を有する迅速に増殖する培養体のみがさらなる継代培養のために保持される。上記Ｎ６培地中での２ないし１０回の継代培養の後、培養体は週毎の継代培養あたり少なくとも２ないし３倍、増殖速度が増加している。培養体は次に２ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび最初に使用されたものの３倍濃度の阻害剤を含有するＮ６培地に移される。増殖する培養体はこの培地中で上記のような継代培養がさらに２ないし１０回反復される。所望の脆い胚形成性形態を有する迅速に増殖する培養体がさらなる継代培養のために選択される。迅速に増殖する培養体は次に２ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび最初に使用されたものの１０倍濃度の阻害剤を含有するＮ６培地に移され、そして所望の脆い胚形成性形態を有する増殖する培養体を継代培養する工程は、迅速に増殖する培養体が得られるまで、２ないし１０回の継代培養が反復される。これらの培養体は次いで２ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび最初に使用されたものの３０倍濃度の阻害剤を含有するＮ６培地に移される。
上記除草剤濃度レベルで選択された各々の胚形成性懸濁培養体から植物の再生のために、培養体はまず０. ２４％ゲルライト（登録商標）で固化され、そして２ｍｇ／１２, ４−Ｄを含有し、場合により培養体が増殖された濃度の阻害剤を含有するＮ６培地上に移され、胚形成性カルスを生成する。胚形成性カルスは、十分量のカルスが再生のために得られるまで新鮮カルス維持培地上で継代培養される。所望の胚形成性形態を有する培養体のみが継代培養される。
実施例１９：選択されたカルスまたは懸濁培養体からのコーン植物の再生
植物は実施例１３の選択された胚形成性カルス培養体から、新鮮再生培地に移すことにより再生される。使用される再生培地は以下のとおりである：２, ４−Ｄを欠くＮ６培地からなる０Ｎ６培地または０. ２５ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび１ｍｇ／ｌキネチン（６−フルフリルアミノプリン）を含有するＮ６培地からなるＮ６１、または０. １ｍｇ／１２, ４−Ｄおよび１ｍｇ／ｌキネチンを含有するＮ６培地からなるＮ６２（全てが０. ２４％ゲルライト（登録商標）で固化されている）。培養体は明所（１日あたり１６時間, 白色蛍光灯から１０−１００μアインシュタイン／ｍ2秒）にて２８℃で増殖させる。培養体は新鮮培地上に２週間毎に継代培養される。３ないし８週間以内に小植物が生長する。少なくとも２ｃｍの高さの小植物が固定カルスから除去され、そして根形成促進培地に移される。異なる根形成性培地が使用される。該培地は通常量の塩または半分の量まで減らされた塩、１ｇ／ｌまで減らされたショ糖を有し、生長制御化合物を含まないか、または０. １ｍｇ／ｌα−ナフタレン酢酸を含有するビタミンを欠くＮ６またはＭＳ培地からなる。根が一旦十分に形成されたら、小植物はバーミキュライト、ピートモスおよび園芸用土からなる鉢混合物に移される。移植の際に、全ての残りのカルスが切り取られ、全てのアガーがすすぎ落とされ、そして葉はおよそ半分に切除される。小植物は最初何日かは湿度を保ちそして遮光して生長させるために透明プラスチックカップを被せて温室内で増殖される。順化植物が再び鉢に移され、そして成熟まで生長させる。肥料のペーター２０−２０−２０〔クレース・シエラ〕は健常な植物生長を確実にするために使用される。開花すると、植物は受粉、好ましくは自家受粉させる。
実施例２０：植物形質添加ベクターの構築
多くの形質転換ベクターが植物形質添加のために利用可能であり、そして本発明の遺伝子はあらゆるそのようなベクターと組み合わせて使用され得る。使用するためのベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換のための標的種に依存する。ある種の標的種のために、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいかもしれない。形質転換において通常使用される選択マーカーはカナマイシンおよび関連抗生物質に対して耐性を与えるｎｐｔＩＩ遺伝子（Messing & Vierra, Gene 19:259-268(1982);Bevan等, Nature 304:184-187（1983））、除草剤ホスフィノトリシンに対して耐性を与えるｂａｒ遺伝子（White等, Nucleic Acids Res 18:1062(1990), Spencer等, Theor Appl Genet 79:625-631(1990)）、抗生物質ハイグロマイシンに対して耐性を与えるｈｐｈ遺伝子（Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931）およびメトトレキセートに対して耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子（Bourois等, EMBO J. 2(7):1099-1104（1983））を包含する。
（１）アグロバクテリウム形質転換のために適当なベクターの構築
多くのベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンスを用いる形質転換のために利用可能である。これらは典型的に少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を有し、そしてベクター例えばｐＢＩＮ１９を包含する（Bevan等, Nucl. Acids Res.（1984））。以下に２種類の典型的なベクターの構築を記載する。
ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築
二元ベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１はアグロバクテリウムと共に使用するための組換えベクターの構築のために使用され、そして以下のようにして構築された。ｐＴＪＳ７５ｋａｎはテトラサイクリン耐性遺伝子の切除を可能にするｐＴＪＳ７５（Schmidhauser & Helsinki, J. Bacteriol. 164:446-455（1985））のNarI消化により創出され、次にＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのAccI断片（Messing & Vierra, Gene 19:259-268(1982);Bevan等, Nature 304:184-187(1983);McBride等, Plant Molecular Biology 14:266-276（1990））の挿入が行われる。左側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界、植物選択性ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカー（Rothstein等, Gene 53:153-161(1987)）を含有するｐＣＩＢ７のEcoRV断片にXhoIリンカーが連結され、そしてXhoI消化断片はSalI消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎ中にクローン化してｐＣＩＢ２００を創出する（ＥＰ０３３２１０４, 実施例１９〔１３３８〕もまた参照）。ｐＣＩＢ２００は以下のユニークポリエンカー制限部位を含有する：EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaIおよびSalI。ｐＣＩＢ２００１はｐＣＩＢ２００の誘導体であり、追加の制限部位のポリリンカー中への挿入により創出された。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおけるユニーク制限部位はEcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaIおよびStuIである。ｐＣＩＢ２００１はこれらのユニーク制限部位を含む他に、植物およびバクテリアカナマイシン選択、アグロバクテリウム仲介形質転換のための左側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界、大腸菌およびその他の宿主間の移動のためのＲＫ２誘導ｔｒｆＡ機能、およびＲＫ２からのＯｒｉＴおよびＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーはそれら自身の制御シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために適当である。
ｐＣＩＢ１０およびそれらのハイグロマイシン選択誘導体の構築
二元ベクターｐＣＩＢ１０は植物内の選択のためのカナマイシン耐性をコードする遺伝子、左側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含有し、そして広い宿主範囲のｐＲＫ２５２からの配列を含み、大腸菌およびアグロバクテリウムにおける複製を可能にしている。その構築はRothstein等, Gene 53:153-161(1987)により記載されている。Gritz等, Gene 25:179-188(1983)により記載されるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を含むｐＣＩＢ１０の種々の誘導体が構築されている。これらの誘導体はハイグロマイシンのみでの（ｐＣＩＢ７４３）、またはハイグロマイシンおよびカナマイシンでの（ｐＣＩＢ７１５, ｐＣＩＢ７１７）トランスジェニック植物細胞の選択を可能とする〔Rothstein等, Gene 53:153-161(1987)〕。
（２）非アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターの構築
アグロバクテリウム・チュメファシエンスを使用しない形質転換は選択された形質転換ベクターにおいてＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、そしてその結果、これらの配列を欠くベクターはベクター、例えばＴ−ＤＮＡ配列を含有する上記のようなもの他に利用され得る。アグロバクテリウムによらない形質転換法は粒子打ち込み（particle bombardment）、プロトプラスト取込み（例えばＰＥＧおよびエレクトロポレーション）およびマイクロインジェクションを介する形質転換を包含する。ベクターの選別はその種が形質転換される好ましい選択に大きく依存する。以下にいくつのかの典型的なベクターの構築が記載される。
ｐＣＩＢ３０６４の構築
ｐＣＩＢ３０６４は除草剤バスタ（またはホスフィノトリシン）による選択と組み合わせた直接遺伝子導入法に適している。プラスミドｐＣＩＢ２４６は大腸菌ＧＵＳ遺伝子に対する操作融合されているＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターを含有し、そしてＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは開始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含有する。これらの部位は、ＡＴＧを除去し、そして制限部位SspIおよびPvuIIを生成するような標準的ＰＣＲ法を用いて突然変異された。新たな制限部位はユニークSaII部位から９６および３７ｂｐ離れており、そして実際の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れていた。ｐＣＩＢ２４６の得られる誘導体はｐＣＩＢ３０２５と表記された。ＧＵＳ遺伝子は次にSaIIおよびSacIでの消化によりｐＣＩＢ３０２５から切除され、末端をブラント化し、そして再び結合してｐＣＩＢ３０６０を創出した。プラスミドｐＪＩＴ８２はジョン・イネス・センター（ノーウィッチ）から入手され、そしてストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのSmaI断片が切除され、そしてｐＣＩＢ３０６０のHpaI部位（Thompson等, ENBO J 6:2519-2523（1987））中に挿入された。創出されたｐＣＩＢ３０６４は、除草剤選択のためのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるｂａｒ遺伝子、増幅耐性のための遺伝子（大腸菌における選択のための）およびユニーク部位SphI, PstI, HindIIIおよびBamHIを有するポリリンカーを含む。このベクターはそれらの自身の制御シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。
ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築
ｐＳＯＧ３５はメトトレキセートに対する耐性を付与する選択性マーカーとして大腸菌遺伝子ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲは３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子（〜５５０ｂｐ）からのイントロン６〔Lou等, Plant J. 3:393-403, 1993;Dennis等, Nucl. Acids. Res. 12:3983-4000, 1984〕およびｐＳＯＧ１０からのＧＵＳ非翻訳リーダー配列の１８ｂｐを増幅するために使用された。大腸菌ジヒドロフォレートレダクターゼＩＩ型遺伝子をコードする２５０ｂｐ断片はまたＰＣＲにより増幅され、そしてこれら２つのＰＣＲ断片はｐＵＣ１９ベクター骨格およびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１（クロンテック）からのSacI−PstI断片と一緒に組み立てられた。これらの断片の組み立てにより、イントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと融合して３５Ｓプロモーターを含むｐＳＯＧ１９が創出された。ｐＳＯＧ１９におけるＧＵＳリーダーのメイズ・クロロチック・モトル・ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列での置換により、ベクターｐＳＯＧ３５が創出された。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を持ち、そして外来配列のクローニングに利用できるHindIII、SphI、PstIおよびEcoRI部位を有する。
ｐＳＯＧ１０
このβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現ベクターはクローンテック・ラボラトリーズ（カリフォルニア州パロアルト）から購入したプラスミドｐＢＩ１２１から誘導された。トウモロコシ（メイズ）Ａｄｈ１遺伝子のイントロン６はBennetzen等, Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 81:4125-4128（1987）に記載のプラスミドｐＢ４２８からＰＣＲによりオリゴヌクレオチドプライマーＳＯＮ０００３およびＳＯＮ０００４を用いて増幅された。
0003673925.tif 000017
ＰＣＲ反応生成物は、各ＰＣＲプライマーの５’末端に付加されたBamHI部位を切断する制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化された。得られるＤＮＡ断片はアガロースゲル上で精製され、そしてＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子の間にあるｐＢＩ１２１のBamHI部位中に連結された。連結されたＤＮＡは大腸菌中に形質転換され、そしてＡｄｈ１イントロン６をＧＵＳ遺伝子と同じ配向で有するクローンが制限消化により同定された。
ｐＳＯＧ１９
このジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現ベクターは、BourouisおよびJarry, EMBO J. 2:1099-1104（1983）に記載のプラスミドｐＨＣＯからのＤＨＦＲ遺伝子にｐＳＯＧ１０の３５ＳプロモーターおよびＡｄｈ１イントロン６を融合することにより誘導された。３５ＳプロモーターおよびＡｄｈ１イントロン６はプライマーＳＯＮ００３１およびＳＯＮ００１０を用いてｐＳＯＧ１０からの断片のＰＣＲ増幅により産生された。
0003673925.tif 000018
得られた断片は制限エンドヌクレアーゼPstIおよびBspHIで消化され、そしてアガロースゲル上に精製された。
ＤＨＦＲコード性領域はプライマーＳＯＮ００１６およびＳＯＮ００１７を用いてｐＨＣＯのＰＣＲ増幅により産生された。
0003673925.tif 000019
得られた断片は制限エンドヌクレアーゼNsoIおよびSacIで消化され、そしてアガロースゲル上に精製された。
上記の２つの断片は制限エンドヌクレアーゼPstIおよびSacIでの消化およびｐＢＩ１２１のＮｏｓターミネーター領域およびｐＵＣ１９領域を含む３ｋｂ断片のアガロースゲル上での精製によりｐＢＩ１２１から調製されたベクター断片中に結合された。上記３方向結合により、３５Ｓプロモーター−Ａｄｈ１イントロン６−ＤＨＦＲ遺伝子−Ｎｏｓターミネーターが正しい順序および植物内での機能的発現のための配向で融合された。
ｐＳＯＧ３０
このＧＵＳ発現ベクターはLommel等, Virology 181:382-385（1991）に記載のメイズ・クロロチック・モトル・ウイルス（ＭＣＭＶ）リーダーの３方向結合による３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子非翻訳リーダー中への挿入により、ｐＳＯＧ１０から誘導された。
１７ｂｐＭＣＭＶカプシドタンパク質リーダー配列と適当な制限エンドヌクレアーゼとの両鎖が合成およびアニーリングされた。得られる二本鎖断片はBamHIおよびNcoIで消化され、そしてアクリルアミドゲル上で精製された。
ＧＵＳ遺伝子コード性領域はＰＣＲによりプライマーＳＯＮ００３９およびＳＯＮ００４１、そして鋳型としてｐＢＩ１２１を用いて増幅された。
0003673925.tif 000020
これらのプライマーはNcoI部位をＧＵＳの５’末端に、そしてSacI部位をＧＵＳの３’末端に付加した。得られる断片は制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびSacIで消化され、そしてアガロースゲル上で精製された。
ＧＵＳ遺伝子は制限エンドヌクレアーゼSacIでの消化および制限エンドヌクレアーゼBamHIでの部分消化によりプラスミドｐＳＯＧ１０から除去された。得られるベクターは、３５Ｓプロモーター−Ａｄｈ１の後方のコード性領域を再挿入するためのBamHI部位およびSacI部位を有するものであるが、アガロースゲル上で精製された。
上記の３種の断片は３方向結合で結合されて、全てがｐＵＣ１９ベクター骨格内にある３５Ｓプロモーター−Ａｄｈ１イントロン６−ＭＣＭＶリーダー−ＧＵＳＮｏｓターミネーターの構造を有する遺伝子融合体を生じる。
ｐＳＯＧ３５
ＤＨＦＲ選択性マーカーベクターは、ＭＣＭＶリーダーがＤＨＦＲ遺伝子の非翻訳リーダー内に挿入されて翻訳を高めることを除いてｐＳＯＧ１９と同一である。それは２段階で創出された。第１に、ｐＳＯＧ３２（３５Ｓよりむしろ改変Ａｄｈプロモーターを含むことを除いてｐＳＯＧ３０と同一であるベクター）内のＧＵＳコード性領域が、ＧＵＳをNcoIおよびSacIで切除し、そしてNcoI−SacI断片としてＤＨＦＲ内に結合することによりｐＳＯＧ１９からのＤＨＦＲコード性領域と置換された。これにより得られるベクターｐＳＯＧ３３はＡｄｈプロモーター−Ａｄｈ１イントロン６−ＭＣＭＶリーダー−ＤＨＦＲコード性領域−Ｎｏｓターミネーターの遺伝子構造を、プロモーターとイントロンの間のBglII部位およびコード性領域とターミネーターの間のSacI部位と共に有する。BglII−SacI断片は制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル精製により単離され、そしてｐＳＯＧ３０のBamHIおよびSacI部位中に結合され、ｐＳＯＧ３０のＡｄｈ１イントロンＺ６−ＭＣＭＶリーダー−ＧＵＳコード性領域をｐＳＯＧ３３のＡｄｈ１イントロン６−ＭＣＭＶリーダー−ＤＨＦＲコード性領域と置換した。
実施例２１：植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物における発現が意図される遺伝子配列が適当なプロモーター後方で、かつ適当な転写ターミネーターの上流にある発現カセット内に最初に組み込まれる。これらの発現カセットは次いで実施例１９に記載した植物形態転換ベクターに容易に移入され得る。
プロモーター選択
発現カセットに使用されるプロモーターの選択はトランスジェニック植物における導入遺伝子の空間的および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモーターは特定の細胞型（例えば葉表皮性細胞, 葉肉細胞, 根皮層細胞）または特定の組織もしくは器官（根, 葉または花等）において導入遺伝子を発現し、そしてこの選択は導入遺伝子の発現の所望の場所に影響を及ぼすであろう。また、選択されたプロモーターは光誘導またはその他の時間制御プロモーターの下での遺伝子の発現を駆動し得る。選択されたプロモーターが化学的に制御されてもよい。これは、所望の、そして化学的誘導剤で処理された時にのみ、導入遺伝子の発現を誘導する可能性を提供するであろう。
転写ターミネーター
多くの転写ターミネーターが発現カセットに使用するのに適している。これらは導入遺伝子後方の転写の停止およびその正確なポリアデニル化に関連する。適当な転写ターミネーターおよび植物内での機能が公知であるものはＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンダーゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳ  Ｅ９ターミネーターを包含する。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方に使用され得る。
発現の増加および制御のための配列
多くの配列が転写ユニット内から遺伝子発現を高めることが見出され、そしてこれらの配列は本発明の遺伝子と組み合わせて使用され得、トランスジェニック植物におけるそれらの発現を増加させる。
種々のイントロン配列は特に単子葉植物細胞において発現を増加させることが示されている。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンはトウモロコシ細胞中に導入された場合に同族プロモーター下で野生型遺伝子の発現を顕著に高めることが見出されている。イントロン１が特に有効であり、そしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Callis等, Genes Develop. 1:1183-1200（1987））との融合構築体において発現を高めることが見出された。同じ発現系において、トウモロコシｂｒｏｎｚｅｌ遺伝子からのイントロンは発現の増加において同様の作用を有していた（Callis等, 同上）。イントロン配列は植物形質転換ベクター中に、典型的には非翻訳リーダー内に容易に組み込まれている。
ウイルスから誘導された多数の非翻訳リーダー配列は発現を高めることが知られており、そしてこれらは特に双子葉細胞において特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ, 「Ｗ配列」）、メイズ・クロロチック・モトル・ウイルス（ＭＣＭＶ）およびアルファルファ・モザイク・ウイルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列が発現の増加に有効であることが知られている（例えばGallie等, Nucl. Acids Res. 15:8693-8711(1987):Skuzeski等, Plant Molec. Biol. 15:65-79(1990)）。
細胞内での遺伝子産物の標的化
遺伝子産物を標的化するための種々の機構は植物に存在することが知られており、そしてこれらの機構の機能を制御する配列はある程度詳細に特徴づけられている。例えば、葉緑体への遺伝子産物の標的化は種々のタンパク質のアミノ末端に見出され、そして葉緑体移入の間に切断されて成熟タンパク質が得られるシグナル配列により制御される（例えばComai等, J. Biol. Chem. 263:15104-15109（1988））。これらのシグナル配列は異種遺伝子産物に融合されて葉緑体への異種産物の移入が行われ得る（van den Broeck等, Nature 313:358-363（1985））。適当なシグナル配列をコードするＤＮＡはＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および葉緑体に配置されることが知られている多くのその他のタンパク質をコードするｃＤＮＡの５’末端から単離され得る。
その他の遺伝子産物はその他のオルガネラ、例えばミトコンドリアおよびペルオキシソームに配置される（例えばUnger等, Plant Molec. Biol. 13:411-418(1989)）。これらの産物をコードするｃＤＮＡはまた操作されて、これらのオルガネラへの異種遺伝子産物の標的化を行うこともできる。そのような配列の例は核コード化ＡＴＰアーゼであり、そしてミトコンドリアに対する特異的なアスパラギンアミノトランスフェラーゼ同族体である。細胞のタンパク質本体への標的化はRogers等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516(1985)に記載されている。
さらに、その他の細胞画分への遺伝子産物の標的化を引き起こす配列は特徴づけられている。アミノ末端配列はＥＲ、アポプラストおよびアリュウロン細胞からの細胞外分泌への標的化に関係する（Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783（1990））さらに、カルボキシ末端配列と一緒になってアミノ末端配列は遺伝子産物の液胞標的化に関連する（Shinshi等, Plant Molec. Biol. 14:357-368(1990)）。
当該導入遺伝子配列への上記の適当な標的化配列の融合により、あらゆるオルガネラまたは細胞画分に導入遺伝子を導くことが可能である。葉緑体標的化のために、例えばＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、またはＧＳ２遺伝子からの葉緑体シグナル配列は導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧに枠単位で融合される。選択されるシグナル配列は公知切断部位を包含し、そして構築された融合体は、切断が必要とされる切断部位の後にあらゆるアミノ酸を考慮すべきである。ある場合には、この必要性は切断部位と導入遺伝子ＡＴＧとの間に少数のアミノ酸の付加または導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸の置換により行われ得る。葉緑体移入のために構築された融合体は試験管内で転写された構築物の試験管内翻訳、それに続く以下の文献（Bartlett等, Edelmann等編, Methods in Chaloroplast Molecular Biology所収, Elsevier. pp.1081-1091(1982);Wasmann等, Mol. Gen. Genet. 205:446-453（1986））に記載された方法を用いて試験管内葉緑体取込みにより、葉緑体取込みの効果が試験され得る。これらの構築法は当業界で十分に公知であり、そしてミトコンドリアおよびペルオキシソームに等しく適用可能である。導入遺伝子の発現が必要とされ得る標的化の選択は与えられた経路の出発点として必要とされる前駆体の細胞の配置に依存する。いくつかの場合においてミトコンドリアおよびペルオキシソームであり得るけれども、通常は細胞質または葉緑体である。導入遺伝子発現の産物は通常、ＥＲ、アポプラストまたは液胞への標的化を必要としない。
細胞標的化に対する上記の機構は同族プロモーターと一緒になってだけでなく、標的化シグナルが駆動するプロモーターとは異なる発現パターンを有するプロモーターの転写制御下で特定の細胞標的化目標を示すための異種プロモーターと一緒なって利用され得る。
実施例２２：双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換法は当業界で十分に公知であり、そしてアグロバクテリウムに基づいた方法およびアグロバクテリウムを必要としない方法を包含する。非アグロバクテリウム法は外来遺伝子材料のプロトプラストまたは細胞による直接的な取込みを包含する。これはＰＥＧまたはエレクトロポレーション仲介取込み、粒状弾丸仲介伝達またはマイクロインジェクションにより行われ得る。これらの方法の例はPaszkowski等, EMBO J. 3:2717-2722(1984), Potrykus等, Mol. Gen. Genet. 199:169-177(1985), Reich等, Biotechnology 4:1001-1004(1986), およびKlein等, Nature 327:70-73（1987）に記載されている。各々場合において、形質転換された細胞は当業界で公知の標準的方法を用いて全体の植物体に再生される。
アグロバクテリウム仲介形質転換は、形質転換の高い効率および多くの異なる種でのその広い利用性の故に、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。アグロバクテリウムにより容易に形質転換される多くの作物種はタバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、油料種子ナタネ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファおよび一般種（ＥＰ０３１７５１１（ワタ）, ＥＰ０２４９４３２（トマト, Calgenに対し）, ＷＯ８７／０７２９９（ブラッシカ, Calgenに対し）, 米国特許第４７９５８５５号（一般種））を包含する。アグロバクテリウム形質転換は、共在Ｔｉプラスミドまたは染色体にある宿主アグロバクテリウム株により保有されるｖｉｒ遺伝子の相補性に依存し得る適当なアグロバクテリウム株への当該の外来ＤＮＡを有する二元ベクター（例えばｐＣＩＢ２００またはｐＣＩＢ２００１）の伝達を典型的に包含する（例えばｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１のためのＣＩＢ５４２株（Uknes等, Plant Cell 5:159-169（1993））。アグロバクテリウムへの組換え二元ベクターの伝達は組換え二元ベクターを有する大腸菌、プラスミド例えばｐＲＫ２０１３を有し、そして標的アグロバクテリウム株へ組換え二元ベクターを移動させることができるヘルパー大腸菌株を用いる三親交雑法により行われる。また、組換え二元ベクターはＤＮＡ形質転換によりアグロバクテリウムに移送され得る（Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988)）。
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は通常、植物からの外植片とアグロバクテリウムの共培養を含み、そして当業界で十分に公知プロトコルが続く。形質転換された組織は二元プラスミドＴ−ＤＮＡ境界間に存在する抗生物質または除草剤耐性マーカーを有する選択性培地上で再生される。
実施例２３：単子葉植物の形質転換
ほとんどの単子葉植物種の形質転換はまた今では容易になっている。好ましい方法はＰＥＧまたはエレクトロポレーション法を用いるプロトプラスト中への直接遺伝子導入およびカルス組織中への粒子打ち込みを包含する。形質転換は単一ＤＮＡ種または多数のＤＮＡ種（すなわち共形質転換）を用いると理解され得、そして両方のこれらの方法は本発明に使用するのに適している。共形質転換は複雑なベクター構築を回避し、そして当該遺伝子の未結合位置を有するトランスジェニック植物を作出するという利点を有し、後続の世代において選択性マーカーの除去を可能にする選択性マーカーは望ましいとみなされるべきである。しかしながら、共形質転換の使用の不利な点は別々のＤＮＡ種がゲノム中に組み込まれる頻度が１００％より低いということである（Schocher等, Biotechnology 4:1093-1096(1986)）。
特許出願ＥＰ０２９２４３５（チバ−ガイギーに対する）、ＥＰ０３９２２２５（チバ−ガイギーに対する）およびＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギーに対する）はトウモロコシの優良近交系からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧおよびエレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換、および形質転換されたプロトプラストからトウモロコシ植物の再生の方法を記載している。Gordon-Kamm等, Plant Cell 2:603-618（1990）およびFromm等, Biotechnology 8:833-839(1990)は粒子打ち込みを用いるＡ１８８誘導トウモロコシ株の形質転換のための方法を公開している。さらに、出願ＷＯ９３／０７２７８（チバ−ガイギーに対する）およびKoziel等, Biotechnology 11:194-200（1993）は粒子打ち込みによるトウモロコシの優良近交系の形質転換のための方法を公開している。この方法は受粉後１４−１５日目のトウモロコシ雌穂から切除された長さ１. ５−２. ５ｍｍの未成熟トウモロコシ胚および打ち込みのためのＰＤＳ−１０００Ｈｅバイオリスティクス装置を利用する。
イネの形質転換はまた、プロトプラストまたは粒子打ち込みを利用する直接遺伝子導入法により行われ得る。プロトプラスト仲介形質転換はジャポニカタイプおよびインディカタイプに対して記載されている（Zhang等, Plant Cell Rep 7:379-384(1988);Shimamoto等, Nature 338:274-277(1989);Datta等, Biotechnology 8:736-740(1990)。両方のタイプはまた粒子打ち込みを用いて容易に形質転換可能である（Christou等, Biotechnology 9:957-962(1991)）。
特許出願ＥＰ０３３２５８１（チバ−ガイギーに対する）はプーイデアエプロトプラストの生成、形質転換および再生のための方法を記載している。これらの方法はダクチリスおよび小麦の形質転換を可能にする。さらに、小麦形質転換はVasil等, Biotechnology 10:667-674（1992）にＣ型長期再生性カルスの細胞中への粒子打ち込みを用いることが記載され、そしてVasil等, Biotechnology 11:1553-1558（1993）およびWeeks等, Plant Physiol. 102:1077-1084（1993）に未成熟胚および未成熟胚誘導カルスの粒子打ち込みを用いることが記載されている。しかしながら、小麦形質転換の好ましい方法は未成熟胚の粒子打ち込みによる小麦の形質転換を含み、そして遺伝子伝達に先立つ高ショ糖または高マルトース段階を包含する。打ち込みの前に、いくつかの胚（長さ０. ７５−１ｍｍ）が３％ショ糖を含むＭＳ培地（Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497(1962)そして暗所での操作を可能にする体細胞胚の誘導のためには３ｍｇ／１２, ４Ｄを含有させた培地上にプレーティングされる。打ち込みが選択された日に、胚を誘導培地から取り出し、そしてオスモティカム（osmoticum）（すなわちショ糖またはマルトースが所望濃度、典型的には１５％で添加された誘導培地）上に載せる。胚は２−３時間原形質分離され、そして次いで打ち込まれる。標的プレートあたり２０個の胚が典型的であるけれども重要ではない。適当な遺伝子含有プラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４またはｐＳＧ３５）を標準的方法を用いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈澱させる。胚の各プレートはデュポン・バイオリスティクス・ヘリウム装置でもって、標準的８０メッシュの篩を用いて〜１０００ｐｓｉの破壊圧で打ち込まれる。打ち込みの後、胚は約２４時間回復のために暗所に戻される（依然としてオスモティカム上）。２４時間後、胚はオスモティカムから取り出され、そめして再生前に約１ヵ月間静置される誘導培地上に戻される。約１ヵ月後、生長する胚形成性カルスを有する胚外植片を再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／リットルＮＡＡ, ５ｍｇ／リットルＧＡ）に移される。該再生培地はさらに適当な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合には１０ｍｇ／ｌバスタそしてｐＳＯＧ３５の場合には２ｍｇ／ｌメトトレキセート）を含有する。約１ヵ月後、生長した苗条は半分の強度のＭＳ、２％ショ糖および同濃度の選択剤を含有する「ＧＡ７ｓ」として知られるより大きい滅菌容器に移される。特許出願０８／１４７１６１は小麦形質転換のための方法を記載し、そしてここで参照により本明細書に編入される。
実施例２４：大腸菌発現系においてプロトックス阻害性除草剤に対して耐性の植物プロトックス遺伝子の選択
トウモロコシ葉緑体プロトックス酵素をコードするプラスミドｐＷＤＣ−４はランダム突然変異誘発ＸＬ１−Ｒｅｄ株（ストラタジーン, カリフォルニア州ラ・ジョラ）中に形質転換される。形質転換体は５０ｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬ培地上に３７℃で４８時間プレーティングされる。形質転換された細胞のローンがプレートからかきとられ、そしてプラスミドＤＮＡがウイザード・メガプレプ・キット（プロメガ, ウイスコンシン州マジソン）を用いて調製された。この突然変異株から単離されたプラスミドＤＮＡは２０００ヌクレオチドあたり約１個の無秩序な塩基変化を含むことが予測される（Greener等, Strategies 7(2):32-34(1994)参照）。
突然変異プラスミドＤＮＡはｈｅｍＧ突然変異ＳＡＳＸ３８（Sasarman等, J. Gen. Microbiol. 113:297（1979））に形質転換され、そして１００ｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬ培地およびプロトックス阻害性除草剤の種々の濃度を含有する同一培地上にプレーティングされる。このプレートを３７℃で２−３日保温する。野生型菌種を有効に殺す除草剤濃度の存在下で増殖する全てのコロニーからプラスミドＤＮＡが単離される。単離されたＤＮＡは次にＳＡＳＸ３８中に形質転換され、そして再び除草剤上にプレーティングされて耐性がプラスミド由来であることを確実にする。
突然変異ｐＷＤＣ−４プラスミドＤＮＡが再び耐性コロニーから単離され、そしてプロトックスコード性配列がEcoRIおよびXhoIでの消化により切除される。切除されたプロトックスコード性配列を次に突然変異誘発されていないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に再びクローン化し、そして上記と同じ方法でプロトックス阻害性除草剤に対する耐性が再び試験された。
この方法は、耐性、例えばアッププロモーター突然変異体（すなわち耐性が未改変プロトックスの高められた発現を引き起こす突然変異に起因する突然変異体）を付与する非コード性配列突然変異を解消し、そしてその耐性がプロトックスコード性配列における突然変異に起因する突然変異体のみを残す。この方法によって同定される全ての予想される除草剤許容性プロトックス遺伝子のためのＤＮＡ配列が決定され、そして突然変異は野生型ｐＷＤＣ−４プロトックス配列との比較により同定される。
上記の方法を用いて、ｐＷＤＣ−４配列（配列番号：５）におけるヌクレオチド４９８のＣをＴに変換する耐性突然変異が同定された。この突然変異を有するプラスミドはｐＭｚＣ−１Ｖａｌと表記される。この変化はアミノ酸１６６（配列番号：６）のアラニンに対するＧＣＴコドンをバリンに対するＧＴＴコドンに変換し、そしてバクテリアアッセイにおいてプロトックス阻害性除草剤に対する少なくとも１０倍高い耐性であるプロトックス酵素を導く。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター内のｐＭｚＣ−１Ｖａｌはアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションにｐＷＤＣ−８の表記で１９９４年９月３０日に寄託され、そして寄託番号ＮＲＲＬ＃２１３４０が与えられている。
同様の戦略が種々のベクター内のアラビドプシスプロトックス−１遺伝子の除草剤耐性体をスクリーニングするために使用された。同定された１つの耐性突然変異はｐＷＤＣ−２配列（配列番号：１）におけるヌクレオチド６８９でのＣからＴへの変化である。このプラスミドはｐＡｒａＣ−１Ｖａｌと表記される。この変化は、アラビドプシスプロトックスタンパク質配列における該当する位置での、アミノ酸２２０（配列番号：２）のアラニンに対するＧＣＴコドンをバリンに対するＧＴＴコドンに変換する、上記のｐＭｚＣ−１Ｖａｌ突然変異体と同一である。
第２の耐性遺伝子はｐＷＤＣ−２配列（配列番号：１）におけるヌクレオチド１３０７でのＡからＧへの変化を含む。このプラスミドはｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓと表記される。この変化は、アミノ酸４２６（配列番号：２）のチロシンに対するＴＡＣコドンをシステインに対するＴＧＣコドンに変換する。ヌクレオチドの位置１１１５−１１１７（配列番号：５；配列番号：６のアミノ酸位置３７２）でのトウモロコシプロトックス−１配列体における該当するチロシンコドンはこの酵素の除草剤耐性体を生成するために同様に突然変異されてもよい。
第３の耐性遺伝子はｐＷＤＣ−２配列（配列番号：１）におけるヌクレオチド６９１でのＧからＡへの変化を有する。このプラスミドはｐＡｒａＣ−３Ｓｅｒと表記される。この突然変異はｐＡｒａＣ−１における突然変異に隣接するコドン位置で、アミノ酸２２１（配列番号：２）のグリシンに対するＧＧＴコドンをセリンに対するＡＧＴコドンに変換する。ヌクレオチドの位置４９７−４９９（配列番号：５；配列番号：６のアミノ酸位置１６７）でのトウモロコシプロトックス−１配列における該当するグリシンコドンはこの酵素の除草剤耐性を生じるために同様に突然変異されてもよい。
上記の全ての突然変異は除草剤アッセイにおいてプロトックス阻害性除草剤に対して少なくとも１０倍高い耐性であるプロトックス酵素を生じる。
ｐＦＬ６１ベクター内のｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓはアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクションにｐＷＤＣ−７の表記で１９９４年１１月１４日に寄託され、そして寄託番号ＮＲＲＬ＃２１３３９Ｎが与えられている。
実施例２５：ランダムスクリーニングにおいて同定される位置でのその他の除草剤耐性コドン置換
ランダムスクリーニングにおいて除草剤耐性として同定されたアミノ酸はその他のアミノ酸と交換され、そしてバクテリア系における作用および除草剤許容性が試験される。アラビドプシスプロトックス−１配列のオリゴヌクレオチド関連突然変異誘発がトランスフォーマー・部位関連突然変異誘発キット（クローンテック, カリフォルニア州パロアルト）を用いて行われる。アミノ酸変換が配列分析により確認された後、突然変異プラスミドがＳＡＳＸ３８に形質転換され、そしてＬ−ａｍｐ100培地上にプレーティングされて作用が試験され、そして種々の濃度のプロトックス阻害性除草剤に対し許容性が試験される。
この方法はアラビドプシスプロトックス配列（配列番号：１）のヌクレオチド６８８−６９０のアラニンコドンおよびヌクレオチド１３０６−１３０８のチロシンコドンに適用される。その結果は、ヌクレオチド６８８−６９０のアラニンコドンがバリン、トレオニン、ロイシンまたはシステインのコドンに変換され得、作用を保持する除草剤耐性プロトックス酵素が得られることを示す。結果はさらに、ヌクレオチド１３０６−１３０８のチロシンコドンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはトレオニンに変換され得、作用を保持する除草剤耐性プロトックス酵素が得られることを示す。
実施例２６：種々のプロトックス阻害性化合物に対する耐性突然変異交差許容性の提示
単一の除草剤に対する耐性に対して選択された耐性突然変異プラスミドがその他のプロトックス阻害性化合物のスペクトルに対して試験される。野生型プラスミドを含有するＳＡＳＸ３８株がある範囲の濃度の各化合物上にプレーティングされ、各々に対する致死濃度を決定する。ＳＡＳＸ３８における耐性突然変異プラスミドをプレーティングし、そして野生型プラスミドを含有するＳＡＳＸ３８株に対して致死性である濃度より少なくとも１０倍高い各化合物の濃度で生き残る能力が計測される。
交差許容性試験からの結果は、同定された突然変異体の各々が種々のプロトックス阻害性化合物に対する許容性を付与することを示す。特に、結果は、１）ＡｒａＣ１−Ｖａｌ突然変異が限定される必要はないが式IV, XI, XIII, XIV, XVおよびXVIIを有するもの等のプロトックス阻害剤に対する耐性を付与すること；２）ＡｒａＣ−２Ｃｙｓ突然変異が限定される必要はないが式XI, XIII, XIV, XVおよびXVIIを有するもの等のプロトックス阻害剤に対する耐性を付与すること；３）ＭｚＣ−１Ｖａｌ突然変異が限定される必要はないが式XI, XII, XIII, XIV, XV, XVIおよびXVIIを有するもの等のプロトックス阻害剤に対する耐性を付与すること；４）ＡｒａＣ−３Ｓｅｒ突然変異が限定される必要はないが式IV, XII, XIII, XIV, XVおよびXVIIを有するもの等のプロトックス阻害剤に対する耐性を付与することを示す。
実施例２７：植物プロトックス遺伝子の過剰発現による除草剤許容性植物の作出
野生型および耐性突然変異体ＡｒａＣ１−Ｖａｌ遺伝子の両方からのアラビドプシスプロトックス−１コード性配列は部分的EcoRIおよびXhoI消化により切断され、そしてｐＣＧＮ１７６ＮＸ植物発現プラスミド中にクローン化される。２Ｘ３５Ｓ−プロトックス遺伝子融合体を含有する発現カセットはXbaIでの消化により切断され、そして二元ベクターｐＣＩＢ２００内にクローン化される。これらの二元プロトックスプラスミドは真空浸潤法（Bechtold等, 1993）を用いてアグロバクテリウムへの、次いでアラビドプシスへのエレクトロポレーションにより形質転換される。形質転換体はカナマイシン上で選択され、そしてＴ２種子は多数の独立した系から作出される。この種子は種々の濃度のプロトックス阻害性除草剤を含有するＧＭ培地上にプレーティングされ、そして発芽および生き残りが計測される。野生型または耐性突然変異体プロトックスのいずれかを過剰発現する多重トランスジェニック系は、空のベクター対照に対して致死性である除草剤濃度で非常に多数の緑の実生を生成する。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
本明細書に記載された本発明の種々の変形は当業者に明らかとなるであろう。そのような変形は添付の請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：  チバ−ガイギー  アクチエンゲゼルシヤフト
（Ｂ）通り：  クリベックシュトラーセ  １４１
（Ｃ）都市：  バーゼル
（Ｅ）国  ：  スイス
（Ｆ）郵便番号：  ４００２
（Ｇ）電話番号：  ＋４１  ６１  ６９  １１  １１
（Ｈ）ファクシミリ番号：  ＋４１  ６１  ６９６  ７９  ７６
（Ｉ）テレックス番号：  ９６２  ９９１
（ii）発明の名称：  真核生物におけるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ酵素活性の操作
（iii）配列の数：  ２０
（iv）コンピュータの読み取り可能な形式：
（Ａ）媒体の形式：  フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：  ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）使用したＯＳ：  ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：  ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＃１．０．Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号：１に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  １７１９
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ３１．．１６４４
（Ｃ）他の情報：  ／ｎｏｔｅ＝「アラビドプシス・プロトックス−１ｃＤＮＡ；ｐＷＤＣ−２からの配列」
（xi）配列の表示：  配列番号：１：
0003673925.tif 000021
0003673925.tif 000022
0003673925.tif 000023
（２）配列番号：２に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ５３７
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列の表示：  配列番号：２：
0003673925.tif 000024
0003673925.tif 000025
（２）配列番号：３に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  １７３８
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ７０．．１５９６
（Ｃ）他の情報：  ／ｎｏｔｅ＝「アラビドプシス・プロトックス−２ｃＤＮＡ；ｐＷＤＣ−１からの配列」
（xi）配列の表示：  配列番号：３：
0003673925.tif 000026
0003673925.tif 000027
0003673925.tif 000028
（２）配列番号：４に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ５０８
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列の表示：  配列番号：４：
0003673925.tif 000029
0003673925.tif 000030
0003673925.tif 000031
（２）配列番号：５に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  １６９８
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ２．．１４５３
（Ｃ）他の情報：  ／ｎｏｔｅ＝「メイズ・プロトックス−２ｃＤＮＡ（全長ではない）；ｐＷＤＣ−４からの配列」
（xi）配列の表示：  配列番号：５：
0003673925.tif 000032
0003673925.tif 000033
0003673925.tif 000034
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（２）配列番号：６に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ４８３
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列の表示：  配列番号：６：
0003673925.tif 000036
0003673925.tif 000037
0003673925.tif 000038
（２）配列番号：７に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２０６１
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ６４．．１６９８
（Ｃ）他の情報：  ／ｎｏｔｅ＝「メイズ・プロトックス−２ｃＤＮＡ；ｐＷＤＣ−３からの配列」
（xi）配列の表示：  配列番号：７：
0003673925.tif 000039
0003673925.tif 000040
0003673925.tif 000041
0003673925.tif 000042
（２）配列番号：８に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ５４４
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列の表示：  配列番号：８：
0003673925.tif 000043
0003673925.tif 000044
0003673925.tif 000045
（２）配列番号：９に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  １６９７
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：  ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：  ２９．．１５０１
（Ｃ）他の情報：  ／ｎｏｔｅ＝「酵母プロトックス−３ｃＤＮＡ；ｐＷＤＣ−５からの配列」
（xi）配列の表示：  配列番号：９：
0003673925.tif 000046
0003673925.tif 000047
0003673925.tif 000048
（２）配列番号：１０に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ４９０
（Ｂ）配列の型：  アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  タンパク質
（xi）配列の表示：  配列番号：１０：
0003673925.tif 000049
0003673925.tif 000050
（２）配列番号：１１に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ４１
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸを構築するために使用されるオリゴヌクレオチド
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１１：
0003673925.tif 000051
（２）配列番号：１２に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ４０
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸを構築するために使用されるオリゴヌクレオチド
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１２：
0003673925.tif 000052
（２）配列番号：１３に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ３１
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１０を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ０００３
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１３：
0003673925.tif 000053
（２）配列番号：１４に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ３１
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１０を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ０００４
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１４：
0003673925.tif 000054
（２）配列番号：１５に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２６
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１９を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００３１
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１５：
0003673925.tif 000055
（２）配列番号：１６に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２４
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１９を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００１０
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１６：
0003673925.tif 000056
（２）配列番号：１７に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２４
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１９を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００１６
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１７：
0003673925.tif 000057
（２）配列番号：１８に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２３
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ１９を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００１７
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１８：
0003673925.tif 000058
（２）配列番号：１９に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２８
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ３０を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００３９
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：１９：
0003673925.tif 000059
（２）配列番号：２０に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：  ２４
（Ｂ）配列の型：  核酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  他の核酸
（Ａ）種類：  ｐＳＯＧ３０を構築するために使用されるプライマーＳＯＮ００４１
（iii）ハイポセティカル配列：  Ｎｏ
（iv）アンチセンス：  Ｎｏ
（xi）配列の表示：  配列番号：２０：
0003673925.tif 000060