(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光照射により蛍光物質から発する蛍光の一部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択して測光するように対に設けられた第一および第二の検出素子とを備えた蛍光検出装置において、
前記対をなす検出素子を、前記光分離素子に対し互いに光学的に等価となるように配置（前記光分離素子に対し互いに鏡像の関係となるように配置）し、
蛍光物質から発する蛍光を光分離素子に導く光路上に第一の集光素子及び第二の集光素子をその順に配置し、かつ第一の集光素子による蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第一の集光素子の像が前記第一及び第二の検出素子上に形成されるようにしたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１において、光分離素子はダイクロイックミラー，貼り合わせプリズムなどの部分反射ミラーであることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
免疫学的反応で結合した複合体が含む酵素の反応で容器内に生ずる蛍光物質又は免疫学的反応で結合した複合体が含む蛍光物質を光学的に測光する蛍光検出装置であって、容器内の蛍光物質を励起させる光を照射する光源光学系と、蛍光物質から発する蛍光の一部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択して測光するように対に設けられた第一および第二の検出素子と、蛍光物質から発する蛍光を前記光分離素子に導く光路上に設けられた第一及び第二の集光素子とを備え、前記対をなす集光素子は、第一の集光素子による蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第一の集光素子の像が第一及び第二の検出素子上に形成されるように配置して、前記対をなす検出素子が光分離素子に対し互いに光学的に等価（前記対をなす検出素子が光分離素子に対し互いに鏡像の関係となるような配置）となるようにしたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
請求項３において、容器内の測光対象物質が、免疫学的反応で結合した複合体に含まれる酵素の作用で生成した蛍光物質と、酵素の作用はうけずに蛍光を発する基準蛍光物質とであり、前記いずれか一方の検出素子は、反応生成した蛍光物質の蛍光波長を選択して測光し、いずれか他方の検出素子は基準蛍光物質の蛍光波長を選択して測光するものであることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項５】
請求項３において、容器内の測定対象物質が、免疫学的反応で結合した複合体に含まる蛍光物質と、蛍光を発する前記基準蛍光物質とであり、前記いずれか一方の検出素子は、複合体に含まれる蛍光物質の蛍光波長を選択して測光し、いずれか他方の検出素子は基準蛍光物質の蛍光波長を選択して測光するものであることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項６】
請求項３において、前記基準蛍光物質からの蛍光強度の検出結果に基づき前記生成蛍光物質からの蛍光強度の検出結果を補正する補正手段を設けたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかにおいて、検出素子で測光する光の波長選択を、光分離素子から検出素子へ至る光路の途中に配置した波長選択素子で行うことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかにおいて、光分離素子は、透過する光の波長選択機能を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかにおいて、光源像を前記容器内に結像させる集光素子を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫化学分析法，装置などに用いられる蛍光検出方法及び装置に関するものであり、特に、測定物質からの蛍光と基準物質からの蛍光を測光し、両者の測光結果から測定対象物の濃度を高精度に求めるために用いられる蛍光検出方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
免疫反応により結合した複合体に含まれる蛍光物質等の標識、あるいは標識によって生成される蛍光物質を利用して免疫学的な分析を行う方法が従来から知られており、このうちの一つである酵素標識蛍光免疫分析法は、例えば、測定対象物を含む血清と、酵素で標識した抗体と、固相に固定した抗体とを接触させて免疫学的に反応して結合した複合体を形成させ、酵素で標識された抗体のうちの複合体を形成していない未反応のものを除去した後、この複合体に含まれる酵素に対する酵素基質を加え、酵素反応の結果生成した蛍光物質の蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量する方法として知られている。
【０００３】
このような方式のための従来の蛍光検出装置は、光源とレンズを含む励起光照射用光学系と、少なくとも一つの検出素子，一つのレンズ及び波長選択素子を含む蛍光測光用光学系により構成され、測定物質（蛍光物質）から放出された蛍光を測光している。励起光（照明光）の進行方向については、蛍光の進行方向と光軸が実質的に一致する光学系あるいは光軸が直交する光学系が、測光セルの形状や回りの状態によって選択されて用いられている。なお励起光の進行方向が蛍光の進行方向と一致する光学系では、励起光と蛍光の進行方向が重なるため、ダイクロイックミラーなどの部分反射ミラーが用いられている。
【０００４】
ところで従来の検出装置では、試料表面のメニスカスの変化、泡の存在等により測定値が変動して測定精度が必ずしも高く得られないという問題や、測定物質の濃度が高くなると励起光が測定物質に吸収されて励起蛍光の強度が低下し、蛍光強度と測定物質の濃度間の直線性が失われるという問題があった。
【０００５】
この問題を解消するために試料中に測定物質と同じ波長で励起することができる蛍光基準物質を添加し、測定物質からの蛍光と、同一波長の励起光により蛍光励起可能でかつ測定対象物質とは異なる波長の蛍光を発し得る基準物質からの蛍光とを各々測定し、測定対象物質の濃度を求める方法が提案されている（特開平５−３８２９７号公報）。
【０００６】
この方法は、異なる波長の蛍光を利用することから二波長蛍光測定法と称することができ、例えばダイクロイックミラーなどの部分反射ミラーを用いて蛍光を二分した後、分離した各光をそれぞれ波長選択素子を通過させることで、測定物質からの蛍光と基準物質からの蛍光とをそれぞれ選択的にとりだし、それぞれの蛍光強度を検出し、基準物質からの蛍光の変化に基づいて測定物質からの蛍光の検出結果を補正するものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法により精度の高い測定が実現されるが、本発明者はより高精度の測定を実現するために、更に検討を進めた。そして上記した従来の二波長蛍光測定法で検出する二つの蛍光強度の信号の変化率が、多数測定するサンプル毎に必ずしも一定しないことを知見した。
【０００８】
この信号の変化率（変化の割合）が一致しない原因を検討したところ次のことが明らかになった。
【０００９】
すなわち、サンプル中の生理活性物質等の量を定量する例えば酵素免疫測定法を実施する装置では、酵素を含む複合体を比較的小さな容器内に存在させ、この容器の多数を所定の光学的測光ステーションに機械的，自動的に搬入させて測光するのが普通であり、測光ステーションに搬入された各容器を測光光学系に対して常に一定の位置にずれなく送り込むことは容易でない。特に多数容器の迅速処理が望まれる工業的な装置では、測光光学系に対して搬入容器の位置を常に一定の相対的位置関係に与えることは極めて困難であるから、位置ずれを招くことは一般に避け難い。更に、酵素基質を容器に分注する際に泡が発生することがあり、泡の発生を完全に抑えることは困難である。そしてこの位置ずれ又は泡の発生に起因する信号の変化の割合が、前記二つの検出素子で一致しないことがこの位置ずれの影響を完全に補正できないという問題を招く原因になっていた。すなわち、検出素子の位置のずれ、各検出素子の前段に設置することがあるアパーチャの位置のずれ、各検出素子の光軸とのずれ、各検出素子の感度ムラなどの物理的不等価性のために、前記の反応容器の位置のずれや泡の発生の場合に、検出信号の変化割合は二つの検出素子において同等にならない。
【００１０】
そしてこれは、例えば、基準物質について検出される蛍光強度が容器の位置ずれの影響を比較的大きく受け、他方の測定物質ではあまり影響を受けない場合を例にすると、同じ（補正式などを用いる）手順で補正した結果は位置ずれ分の影響を含むデータとなってしまう問題として把握される。
【００１１】
本発明は従来法のこのような問題を解決して、測光光学系に対する容器の位置ずれの影響を低減することができる蛍光検出法及び酵素活性測定法、並びにこれらに用いる装置の提供を目的としてなされたものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段及び作用】
前記の目的を達成する本発明の特徴は、前記した特許請求の範囲の各請求項に記載したところにある。
【００１３】
本願の請求項１に記載した蛍光検出装置の発明は、励起光照射により蛍光物質から発する蛍光の一部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択して測光するように対に設けられた第一および第二の検出素子とを備えた蛍光検出装置において、前記対をなす検出素子を、前記光分離素子に対し互いに光学的に等価となるように配置（前記光分離素子に対し互いに鏡像の関係となるように配置）し、蛍光物質から発する蛍光を光分離素子に導く光路上に第一の集光素子及び第二の集光素子をその順に配置し、かつ第一の集光素子による蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第一の集光素子の像が前記第一及び第二の検出素子上に形成されるようにしたことを特徴とする。
【００１４】
前記において「光学的に等価となるように配置」というのは、二つの検出素子からの出力信号の変化が同程度となるように（できるだけ変化の割合に差がないように）配置することをいう。
【００１５】
前記の「光分離素子」としては、請求項２で挙げるダイクロイックミラー，貼り合わせプリズム等の部分反射ミラーを例示することができ、要するに蛍光物質から発せられる蛍光の一部を透過し残りを反射するものであればよい。蛍光強度が十分に強い場合は光学ガラスや石英ガラスなどの透明板を用いることもできるが、一般的にはダイクロイックミラーなどの部分反射ミラーが蛍光を無駄なく検出素子に導くことができるので好ましく採用される。透明板あるいはダイクロイックミラーなどは通常光軸に対して４５°の角度で挿入されるが、厚さがあると光軸を偏移させるため、できるだけ薄いものが好ましく、一般的には１ｍｍ前後ものが好ましく用いられる。二等辺直角三角形プリズムを二個斜辺同士で貼り合わせた貼り合わせプリズムは、透過光の光軸を偏移させないことから特に高精度が求められる場合に適している。貼り合わせ面に多層膜を形成するなどの方法により、波長選択特性をもたせた光分離素子を用いることもできる。
【００１６】
「検出素子」としては一般的にはフォトダイオード、光電子増倍管等が好ましく用いられるがこれに限定されるものではない。
【００１７】
請求項１の発明の特徴の一つは、対をなす検出素子が、光分離素子に対して互いに光学的に等価となるように配置されているところにある。ここで、「光学的に等価となるように配置」というのは、光学的な条件のすべてが等価であることまで要求するものではなく、二つの検出素子からの出力信号の変化が同程度となるように（できるだけ変化の割合に差がないように）した配置関係にあることをいう。
【００１８】
この請求項１の発明によれば、一対の検出素子が前記配置関係にあることにより、一対の検出素子である第一及び第二の検出素子の変化割合が、すべての点に対して実質的に（可及的に）同一とすることができ（反応容器の位置のずれが生じた場合の照射光量の比を実質的に同一に変化させることができ）、蛍光物質から発した蛍光強度が、前記した容器の位置ずれなどの影響を受けることなく高精度な測定が実現される。
【００２０】
本願の請求項３に記載した蛍光検出装置の発明は、免疫学的反応で結合した複合体が含む酵素の反応で容器内に生ずる蛍光物質を光学的に測光する蛍光検出装置であって、容器内の蛍光物質を励起させる光を照射する光源光学系と、蛍光物質から発する蛍光の一部を透過し残りを反射する光分離素子と、この光分離素子を透過した光と反射した光の光強度をそれぞれ波長選択して測光するように対に設けられた第一および第二の検出素子と、蛍光物質から発する蛍光を前記光分離素子に導く光路上に設けられた第一及び第二の集光素子とを備え、この対をなす検出素子は、第一の集光素子による蛍光物質の像が第二の集光素子上に形成されると共に、第一の集光素子の像が第一及び第二の検出素子上に形成されるように配置して、前記対をなす検出素子が光分離素子に対し互いに光学的に等価となるようにしたことを特徴とする。光分離素子を第一の集光素子と第二の集光素子の間に配置することもできるが、この場合、第二の集光素子を光分離素子と第一の検出素子及び光分離素子と第二の検出素子の間にそれぞれ配置する。
【００２１】
また請求項４の発明は、前記容器内の測光対象物質を、免疫学的反応で結合した複合体に含まれる酵素の作用で生成した蛍光物質（以下「生成蛍光物質」という）と、酵素の作用はうけずに蛍光を発する基準蛍光物質とし、また前記いずれか一方の検出素子は生成蛍光物質の蛍光波長を選択して測光し、いずれか他方の検出素子は基準蛍光物質の蛍光波長を選択して測光することを特徴とする。
【００２２】
この発明において用いる酵素の作用で生成する蛍光物質、及び酵素の作用を受けない基準蛍光物質としては、例えば前述した特開平５−３８２９７号公報記載の物質を用いることができる。前者としては、例えば酵素（アルカリ性フォスファターゼ）の作用で４−メチルウンベリフェリルリン酸から生ずる４−メチルウンベリフェロン（生成蛍光物質）を挙げることができ、これはアルカリ性（ｐＨ１０）下で３６５ｎｍの波長の励起光照射で約４５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光を発する。これに対し、同条件下（同ｐＨ，同波長励起光の照射用）で約５５０ｎｍ付近に極大をもつ蛍光を放射するダンシル−Ｌ−アラニンを前記後者の基準蛍光物質として挙げることができる。
【００２３】
請求項５の発明は、容器内の測定対象物質のうちの免疫学的反応で結合した複合体に含まれる標識を蛍光物質としたことを特徴とする。
【００２４】
以上の各請求項に記載の発明における光源としては放電管、蛍光灯など適宜のものを用いることができる。また点滅式の光源を用い、点滅式の光源を用い検出素子（受光側）で同期検波することで外乱光の影響を除去することもできる。
【００２５】
また、各検出素子あるいは光源に近接して光路を制限するアパーチャを設けることも好ましい。例えば、一般に矩形形状の検出素子の近傍に検出面を小さく制限する円形形状のアパーチャを設けることによって、反応容器の位置がずれた場合の反応容器側壁からの反射光の変化の影響を軽減できる利点がある。
【００２６】
かかる構成により、試料、第一の集光素子、第二の集光素子及び一対の検出素子を前記配置関係とすることにより、反応容器の位置ずれが生じたときに第一及び第二の検出素子のすべての点に対して照射光が略同一の比で変化し、免疫学的反応で結合した複合体が含む酵素の反応により容器内に生成した蛍光物質等、および基準蛍光物質からの蛍光強度を、位置ずれの影響をほとんど受けることなく一対の検出素子で測光できる。すなわち、この発明によれば、経時的に量が変化しない基準蛍光物質からの蛍光強度の測光情報と、経時的に酵素活性により量が変化（増加）する生成蛍光物質からの蛍光強度の測光情報とを、二つの光学的に等価となるように配置した一対の検出素子により、位置ずれの影響を可及的に軽減して高精度な測光情報として得ることができる。
【００２７】
以上の本願請求項１〜５の発明において、検出光学系の光の波長選択は、光分離素子から検出素子へ至る光路の途中に波長選択素子を配置して行うことができ、また透過する光の波長選択は光分離素子にこの波長選択機能をもたせて行うこともできる。このような波長選択素子としては通常フィルターが用いられる。例えば、一方の検出素子の手前には測定対象物質の蛍光を透過し基準蛍光物質の蛍光を遮断するフィルター、他方の検出素子の手前に基準蛍光物質の蛍光を透過し、測定対象物質の蛍光を遮断するフィルターを配置することができる。フィルターは、バンドパスフィルターあるいはカットオフフィルターなどを挙げることができる。干渉フィルターすなわち干渉膜を利用したバンドパスフィルターは急峻な特性をもつため、蛍光検出器の波長選択に好ましく用いられる。また測定対象物質から出る蛍光と基準蛍光物質から出る蛍光のうち、長波長側の蛍光を選択するためには干渉フィルターだけでなく、カットオフフィルターを用いることができる。光源が波長分布をもつ場合には不要な波長を除去するために励起光源系の光路中に波長選択素子を配置することも好ましく、この場合には干渉フィルターあるいは色ガラスバンドパスフィルターを用いることができる。フィルターの特性は、単独のフィルターでもたせることができるが、光選択能をもった光分離素子と組み合わせてもたせることもでき、また複数のフィルターを組み合わせることで必要とする波長選択能をもたせることもできる。なお、上述した種々のフィルターの波長選択性は、要求される検出精度にもよるが、生成蛍光物質と基準蛍光物質にそれぞれ由来する励起光吸収により減衰した励起光に起因する蛍光をそれぞれ一方の物質に概ね由来するものとして検出できれるものであればよく、検出波長のみを透過させる厳格な波長選択能を求められるものではない。
【００２８】
また、以上の各請求項に記載の本発明においては、光源像を容器内に投影する集光素子、及び容器内の蛍光物質の像を前記した条件で投影する第一，第二の集光素子を、各光路中に設けることが好ましく採用され、前記第一の集光素子と光源光学系の集光素子とを共用する場合、あるいはこれらを別個に設ける場合のいずれも可能である。これらの集光素子としては通常はレンズが用いられる。レンズの曲率半径は像の位置に応じて適宜選択され、また口径は利用する光の広がりに応じて適宜選択される。レンズは二群構成となり、各群は単レンズでも複合レンズでもよく、また両凸、平凸などどちらでも使用でき、球面収差などを考慮して選択することができる。なお本発明でいう、像が形成されるとは集光素子上等において完全な像が形成される場合の他、完全に合焦していない、ぼけた像が形成される場合であってもよい。
【００２９】
なお、上記各請求項の発明は以上の構成に限定されるものではなく、適宜必要な構成を採用することができる。また、励起光の照射用光路と蛍光の射出光路の光軸を一致させる方式、これらの光軸を直交させる方式などいずれであってもよい。
【００３０】
以上の各請求項の発明において、基準蛍光物質からの蛍光強度の検出結果に基づいて生成蛍光物質からの光強度の検出結果を補正する補正手段は、種々の方式のものを用いることができ、例えば所定の演算式をプログラムしたＭＰＵ（マイクロプロセッサユニット）を利用して構成することができる。補正方式としては、演算方式の他、予め求めた検量線を用いる方式、記憶手段（ＲＯＭ等）に記憶した情報を読み出す方式など適宜のものを採用することができる。
【００３１】
また以上の各請求項の発明によれば、経時的に量が変化しない基準蛍光物質と、経時的に酵素活性により量が変化する生成蛍光物質とが共存している容器から射出される蛍光強度の測光情報を、光学的に等価となるように配置した一対の検出素子でそれぞれ測光し、本来量変化がないために蛍光強度が変化しないはずの基準蛍光物質について検出される蛍光強度の変化に基づいて、酵素活性で生ずる生成蛍光物質から発する蛍光の強度を補正して真の生成蛍光物質の量を求めることができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
実施形態１
図１は、本発明の蛍光検出装置（酵素活性測定装置）の一例の構成概要を示したものであり、図において１は光源であり、光源アパーチャ１２、波長選択素子であるフィルター９、部分反射ミラー（ハーフミラー）７、集光素子であるレンズ４を透して、容器１３内に光源像（光源そのもの又は光源アパーチャ）を形成（結像）させるように励起光を照射できるよう構成されている。
【００３３】
前記の容器１３は、測定対象の生理活性物質を含むサンプル、酵素標識抗体、固相化抗体の反応によって容器内の固相担体に結合固定された複合体を内部に有し、かつ該複合体中の酵素の作用を受けて蛍光物質を生成する基質が注入された状態で、図示しない搬送機構により図示位置に送り込まれて停止され、所定の測光操作が行われる。なおこの容器１３には、酵素の作用を受けない基準蛍光物質が予め容器内の固相に固定されているか、あるいは上記基質の注入時等の測光操作前に添加するか、基質液中に予め添加しておいてもよい。１４は容器１３中の蛍光物質を含む液を示す。
【００３４】
上記のように測光位置に容器１３が送り込まれ、光源１より励起光が照射されると、該容器１３内において、酵素の作用により生成累積量が漸次増加する蛍光物質と、酵素の作用を受けない基準蛍光物質が励起されて蛍光を発し、この蛍光は、上記レンズ４、部分反射ミラー７、レンズ５を通して、その蛍光の一部は部分反射ミラー８で反射されると共に残りは該部分反射ミラー８を透過する。
【００３５】
そして該部分反射ミラー８を反射した光はフィルター１０を通って所定波長の光が選択されてフォトダイオード２に投影され、部分反射ミラー８を透過した光はフィルター１１を通って所定波長の光が選択されてフォトダイオード３に投影される。
【００３６】
以上の構成において、本例の特徴は、蛍光物質から発する蛍光を光分離素子に導く光路上に配置したレンズ（第一の集光素子）４およびレンズ（第二の集光素子）５を、レンズ４による蛍光物質の像がレンズ５の上に形成され、かつレンズ４の像が、フォトダイオード（第一の検出素子）２およびフォトダイオード（第二の検出素子）３上に形成されるようにしたところにある。またこれらのフォトダイオード２，３の前に、アパーチャ（図示せず）を配置することも好ましく、例えば受光面が６ｍｍ×６ｍｍの矩形の検出素子の全面に直径５ｍｍの円形アパーチャを配置することで、反応容器の位置のずれによる反応容器側壁の影響を排除できるという効果が奏される。
【００３７】
本例によれば、一対のフォトダイオード２，３を上記のように配置することで、容器から投影光学系（レンズ４、部分反射ミラー７、レンズ５、部分反射ミラー８等）を通してこれら一対のフォトダイオードに照射される光は両者フォトダイオードのすべての点に対して変化する割合を実質的に同一（差を可及的に小さく）にでき、容器が測光光学系に対して位置ずれ（図１の例では、左右あるいは図の紙面に垂直な２方向で与えられる平面上での位置ずれ）を招いても、これによる信号変化率の違いを大幅に低減できる。
【００３８】
なお、上記のフォトダイオード２および３で測光された蛍光強度を示す信号は、図示しないＭＰＵに送られ所定の補正処理を行って、酵素の作用により生成累積量が漸次増加する蛍光物質の量、実質的には複合体を形成した酵素量を通じてサンプル中の生理活性物質の量が定量される。
【００３９】
また図１の装置のように投影光路の部分反射ミラー８の前段にレンズ（第２の集光素子）５を設置する場合の他、図４に示すように部分反射ミラー８の後段にレンズ５をそれぞれ設置しても同様の作用が得られる。なお図４において図１と共通する部材には同じ符号を付した。
【００４０】
実施形態２
図２に示される本例は、光源光学系と測光光学系の光軸が直交するようにした酵素活性測定装置（蛍光検出装置）の他一例の構成概要を示した平面図であり、実施形態１と共通する部品及び相互の関係については、共通の符号を付して説明は省略する。
【００４１】
本例における特徴は、細長い蛍光灯を光源１０１として用い、アパーチャ１１２、フィルター１０９を通して、上記レンズ４とは別のレンズ１０６を通して容器（透明材料からなる容器）１１３に励起光を照射するようにしているところにある。なお光源像はレンズ１０６により略容器内に結像（形成）するようにされ、レンズ４により蛍光物質の像がレンズ５の上に形成される、かつレンズ４の像がレンズ５により一対のフォトダイオード２，３の略検出面上に形成されるようになっている。
【００４２】
本例によれば、実施形態１と同じ効果が得られることに加え、一つの光源１０１を複数の並設した蛍光検出装置に共用できるという効果が奏される。
【００４３】
また図２の装置のように投影光路の部分反射ミラー８の前段にレンズ５を設置する場合の他、図５に示すように部分反射ミラー８の後段にレンズ５をそれぞれ設置しても同様の作用が得られる。なお図５において図２と共通する部材には同じ符号を付した。
【００４４】
【実施例】
実施例１
蛍光紙の中心部を直径２ｍｍφを残して周囲を黒く塗りつぶした紙を、図１に示した上方開放形状の内径８ｍｍの黒色カップの底部に、前記蛍光紙の中心部が中心位置となるようにして動かないように詰め、図１の装置（ただし光源としては細長い蛍光ランプを用いた）を用いて蛍光を測定した。
【００４５】
測定操作は、蛍光検出装置の測光光学系の光軸が、黒色カップの中心（蛍光紙の中心）と略一致したときと、カップを水平方向に位置をずらせたときの双方について測定した。
【００４６】
蛍光強度の測定は、フォトダイオード２の出力信号の変化、フォトダイオード３の出力信号の変化を検出し、両者の出力信号の比（二波長蛍光）の変化を、測光光学系の光軸が黒色カップの中心と略一致したときの値を１００として記録した。また比較のために、フォトダイオード２の出力信号（一波長蛍光）の変化を測光光学系の黒色カップの中心と略一致したときの値を１００として記録した。
これらの結果を図３に示す。
【００４７】
この結果からわかるように、比較の装置ではカップの位置を測光光学系の光軸から±３ｍｍ位置をずらせたときに、信号が８０％から７０％低下したのに対し、本発明の装置では、その信号の低下は５から１２％であり、位置ずれによる影響が大幅に低減されることが確認された。
【００４８】
実施例２
反応容器内に存在する上記生成蛍光物質と基準蛍光物質が、反応容器の位置のずれにより検出素子であるフォトダイオードの出力信号に変化する程度を調べるために次の試験を行った。なおこの試験の生成蛍光物質としては、アルカリ性フォスファターゼを酵素として４−メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ；基質）が変化して生成する４メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を用いた。
【００４９】
すなわち、黒色のカップ（反応容器）に、測定対象物質としての蛍光物質として上記４メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の４０００ｎＭと、基準蛍光物質であるダンシルアラニン（ＤＡ）の０．１ｍｇ／ｍｌを含む試料溶液２２０μｌを入れた反応容器を、酵素免疫反応測定装置ＡＩＡ１２００（東ソー社製）の間欠搬送機構の凹所に担持させて蛍光を測光するすために配置した測光光学系の測光位置に送り込んだ。なお本例では、反応容器の確実な嵌挿，取出しためにこの反応容器を搬送する間欠搬送機構の凹所の余裕（遊度（ガタ））を約１．５ｍｍ程度として与え、これにより、上記測光光学系の光軸と反応容器の中心位置との間に前記範囲の遊度に応じた位置ずれを生ずるようにした。
【００５０】
なお本例では例数を多数とするために、装置としては一本のランプ（光源）で同時に複数の反応容器内の蛍光物質を励起可能である図１の構成の装置を用い、同じ条件で構成した二つの測光光学系に対し同じ条件で調製した二つの反応容器を送り込む方式で試験を行った。
【００５１】
この結果、位置ずれの点を除けば全く同じ条件で測光を行った４ＭＵ（生成蛍光物質）の蛍光強度の変動係数（標準偏差／平均値）は、２３〜２４％という比較的大きな値を示したのに対し、該４ＭＵとＤＡ（基準蛍光物質であるダンシルアラニン）の蛍光強度の比の変動係数は１．０６〜１．８３％という極めて小さな値であることが確認された。したがって、例えば基準蛍光物質であるＤＡ（ダンシルアラニン）の蛍光強度に基づいて４ＭＵ（生成蛍光物質）の蛍光強度を補正するようにすれば、測定対象物質のデータとして検出した上記４ＭＵの変動係数を、従来の検出方法や装置に比べて、１／１０以下、上記試験例で言えば１／１６というように変動程度を極めて小さくすることが可能な高精度な蛍光検出を実現できることになる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば以下の効果が奏される。
【００５３】
請求項１の発明によれば、光分離素子に対して一対の検出素子が光学的に等価となるように配置されていることにより、蛍光物質から発した蛍光は二つの検出素子のすべての点について実質的に同一の比をとることができて、試料（サンプル）を入れた容器の測光光学系に対する位置のずれの影響を可及的に小さくした高精度な蛍光検出ができる。
【００５４】
請求項１の発明によれば、反応容器内の蛍光物質から発する蛍光を、光分離素子上に導く光路上に例えばレンズで構成される第一，第二の集光素子をその順に配置し、かつこの第一のレンズによる蛍光物質の像が第二のレンズ上に形成され、第一のレンズの像が第一，第二の検出素子の上に形成されるように構成することで、反応容器の測光光学系に対する位置のずれの影響をより一層軽減できるという効果がある。
【００５５】
請求項３、４の発明によれば、上述した蛍光検出装置を、免疫学的反応で結合した複合体に含まれる酵素の量を、この酵素の活性で生ずる蛍光物質からの蛍光強度を利用して有効に測定できる。
【００５６】
請求項５、６の発明によれば、励起光が蛍光物質に吸収される影響を含むが、経時的な物質量の変化がない基準蛍光物質からの蛍光強度の測光情報と、経時的に酵素活性により物質量が変化する生成蛍光物質からの蛍光強度の測光情報とを、二つの光学的に等価となるように配置した一対の検出素子によって測光することができるので、蛍光物質を収容している容器の光学系に対する位置のずれなどの影響を解消した測光情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態１の酵素活性測定装置（蛍光検出装置）の構成概要を示した正面図。
【図２】本発明の実施形態２の酵素活性測定装置（蛍光検出装置）の構成概要を示した平面図。
【図３】蛍光検出装置の測光光学系の光軸がカップの中心と略一致したときと、カップを水平方向に位置をずらせたときとのフォトダイオードの出力信号の変化を示した図。
【図４】図１の装置の変形例を示した図。
【図５】図２の装置の変形例を示した図。
【符号の説明】
１・・・光源、２・・・フォトダイオード（第一の検出素子）、３・・・フォトダイオード（第二の検出素子）、４，５，１０６・・・レンズ、７，８・・・部分反射ミラー、９，１０，１１・・・フィルター、１２，１１２・・・アパーチャ、１３，１１３・・・容器、１４・・・蛍光物質を含む液。
【図１】
0003716502.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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