(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式Ｉ（式中、ｘ１およびｘ２は、同一または互いに異なるハロゲンであり、Ｒは、低級アルキルである。）で表わされる化合物またはその塩を有効成分として含む、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパクとの相互作用の阻害剤。
【化１】
0005424960.tif 000004
【請求項２】
前記式Ｉにおいて、Ｒがメチルまたはエチルである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記式Ｉにおいて、ｘ１およびｘ２はともに塩素または臭素である、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記化合物が、下記の式ＩＩの化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【化２】
0005424960.tif 000005
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に定義される式Ｉの化合物またはその塩を有効成分として含む抗炎症剤。
【請求項６】
前記化合物が、請求項４に定義された式ＩＩの化合物である、請求項５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
フロントタンパク質、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５が関連する炎症性疾患の治療用である、請求項５または６に記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパク質との相互作用の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体ＣＣＲ２およびＣＣＲ５は三量体Ｇタンパク質共役型７回膜貫通型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）であり、ケモカインが結合すると、受容体に共役している三量体Ｇタンパク質が活性化され、遊離したＧサブユニットがホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を活性化・先端部への局在化が誘導される。活性化されたＰＩ３Ｋによって低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ・Ｃｄｃ４２の活性型の先端部への局在化が誘導され、細胞の進行方向で葉状仮足、糸状仮足の形成、細胞の尾部では収縮という細胞の極性が生じ、細胞遊走を可能にする細胞骨格の再構成が行われる。
【０００３】
フロントタンパク質は、ＣＣＲ２のＰｒｏ−１２−Ｃ末側領域（細胞内Ｃ末側領域）に直接且つ特異的に会合する細胞質タンパク質であり、ＣＣＬ２刺激後にＣＣＲ２とクラスターを形成する。
【０００４】
２０種類あるケモカイン受容体のアミノ酸配列の相同性による系統樹解析を行なうと、ＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５は非常に高い相同性を有し、細胞内Ｃ末端領域のアミノ酸配列で比較した場合にも、ＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５は最も近い位置に存在する受容体である。フロントタンパク質はこれらの相同性の高いＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５の両者の細胞内Ｃ末端領域に結合する(特許文献１)。このことは、いわゆる酵母ツーハイブリッド法（以下、「Ｙ２Ｈ」と記す。）により明らかになった。ＣＣＲ２にはＣ末端領域の異なるＣＣＲ２ＡとＣＣＲ２Ｂという２つのアイソフォームが存在し、ＣＣＲ２Ｂは細胞に広く発現する主要なＣＣＲ２のアイソフォームである。
【０００５】
様々なＣＣＲ２部分欠損変異体発現ベクター２０種類以上を網羅的に作製し、Ｙ２Ｈを用いてフロントタンパク質との結合活性を解析した結果、ケモカイン受容体ＣＣＲ２Ｂの細胞内Ｃ末端領域のうち１６アミノ酸がフロントタンパク質結合領域であることが判明した（＝ＣＣＲ２  Ｐｒｏ−Ｃ）。この領域のペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞系にてフロントタンパク質−ＣＣＲ２の相互作用を再構築することができた。さらにＣＣＲ５のＰｒｏ−Ｃ領域もフロントタンパク質との結合活性を示し、両受容体がＰｒｏ−Ｃ領域を介してフロントタンパク質と結合することが示唆された。上記フロントタンパク質のアミノ酸配列については、後述の配列表の配列番号１および２に記載されている。
【０００６】
ＣＣＲ２ＢおよびＣＣＲ５は関節リウマチ、多発性硬化症などの炎症性疾患や、神経性疼痛との関連、癌などの病態形成への関与が示されている。ＣＣＲ５は細胞遊走における役割のみならず、ＨＩＶ−１ウイルスの宿主細胞への感染する際の補助受容体（コレセプター）としても機能する。Ｒ５ウイルスは感染の初期に優位を占めるウイルスであり、進行に伴ってＸ４ウイルスが出現する。したがって、Ｒ５ウイルスの感染を阻止することは感染の初期段階でＨＩＶ感染拡大を抑制するために重要である。これらの既知のＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ５関連疾患においてもフロントタンパク質が関与する可能性は十分考えられる。近年では、うっ血性心不全（非特許文献１）、前立腺転移癌（非特許文献２）、間葉系幹細胞ホーミング制御（非特許文献３）など様々な疾患および生体現象へのフロントタンパク質の関与も報告されている。
【０００７】
ＣＣＲ２ＢおよびＣＣＲ５に限らず、ケモカイン受容体を標的とした抗炎症薬で上市されたものはいまだないのが現状である。抗体や低分子アンタゴニストによって細胞外でケモカイン・ケモカイン受容体の機能・相互作用を阻害するというアプローチがとられている。ＣＣＲ２ＢおよびＣＣＲ５は動脈硬化症や多発性硬化症への関与が示され、低分子アンタゴニストや中和抗体の臨床試験が進められている。ＣＣＲ５は関節リウマチの滑液においては，ほぼ全てのＴ細胞がＣＣＲ５を発現しており、抗ＨＩＶ薬として上市されたマラビロックについては関節リウマチを対象とした臨床試験も行われている。ＣＣＲ２Ｂ又はＣＣＲ５の細胞内情報伝達機構を阻害することは、ＣＣＲ２Ｂ又はＣＣＲ５特異的に細胞内でシグナルを制御する分子はこれまで見つかっていなかったため行われていなかったが、フロントタンパク質がＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５と相互作用し、細胞遊走シグナルを促進するという本発明者らの知見によって初めてそのようなアプローチが可能となったと考えられる。
【０００８】
ｓｉＲＮＡによる阻害実験については、非特許文献４においてマウスプレＢ細胞株にフロントタンパクに対するｓｉＲＮＡを導入し、ＣＣＲ５に対する細胞遊走が低下することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００３／０７０９４６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ  Ｃａｒｄ  Ｆａｉｌ．  １３（２）：１１４−１１９，  ２００７
【非特許文献２】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０４：１５８７−１５９７，  ２００８
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ５：２（６）：５６６−５７５，  ２００８
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８３：６３８７−６３９４，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
フロントタンパク質とＣＣＲ２Ｂ又はＣＣＲ５との相互作用を阻害する物質は、これまで知られていなかった。そこで、本発明は、このような阻害作用を有する新しい概念の抗炎症剤を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
フロントタンパク質とＣＣＲ２Ｂ又はＣＣＲ５との相互作用を阻害する物質を見出すために、既知の多数の化合物群を試験し、それらの化合物群の中から、有効な阻害作用をもつ化合物を見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、第1の態様において、下記の式Ｉ（式中、ｘ１およびｘ２は、同一または互いに異なるハロゲンであり、Ｒは、低級アルキルである。）で表わされる化合物またはその塩を有効成分として含む、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパク質との相互作用の阻害剤を提供する。
【００１４】
【化１】
0005424960.tif 000002
【００１５】
その実施形態において、上記式Ｉ中のＲは、メチルまたはエチルである。
別の実施形態において、上記式Ｉ中のｘ１およびｘ２はともに、塩素または臭素である。
【００１６】
さらに別の実施形態において、上記化合物が、下記の式ＩＩの化合物である。
【化２】
0005424960.tif 000003
【００１７】
本発明はまた、第２の態様において、上記式Ｉで表わされる化合物を有効成分として含む抗炎症剤を提供する。
その実施形態において、上記化合物が、上で定義された式ＩＩの化合物である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の抗炎症剤は、フロントタンパク質、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５が関連する炎症性疾患の治療用である。
【発明の効果】
【００１９】
細胞内の特定のフロントタンパク質と特定のケモカイン受容体ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５との相互作用を阻害することによって、該ケモカイン受容体が惹起する種々のシグナル経路のうち、限定された経路を阻害することが可能になる。これにより細胞外でケモカイン結合による受容体活性化そのものをブロックするよりも副作用の低減が見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】この図は、式ＩＩで表わされる化合物によるフロントタンパク質とＣＣＲ２間の相互作用阻害活性を示す図である。
【図２】この図は、ＴＡＸＩＳｃａｎ法の概念図である。
【図３】この図は、遊走活性阻害試験の結果を示す図である。
【図４】この図は、遅延性過敏症モデルマウスにおける足裏の肥厚度を示す図である。式ＩＩの後の括弧内の数字は投与した式ＩＩの化合物の濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図５】この図は、毒性評価試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜有効成分＞
本発明の阻害剤および抗炎症剤の有効成分は、上記の式Ｉで表される化合物またはその塩である。この化合物またはその塩は、フロントタンパク質とＣＣＲ２Ｂとの相互作用を強く阻害する特性を有する。
【００２２】
式Ｉの化合物において、ｘ１およびｘ２は同一または互いに異なるハロゲンであり、Ｒは、低級アルキルである。
【００２３】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のいずれかであり、好ましいハロゲンは、塩素または臭素である。
【００２４】
また、ｘ１およびｘ２のハロゲンは、同一のハロゲンであてもよいし、または互いに異なるハロゲンであってもよいが、同一のハロゲンが好ましい。
【００２５】
低級アルキルは、炭素数１〜６の飽和または不飽和の直鎖または分枝アルキルであり、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、プロペニル、ブチル、ブテニル、ペンチル、へキシルなどを含む。好ましい低級アルキルは、炭素数１〜４の飽和の直鎖アルキルであり、より好ましい低級アルキルは、メチルまたはエチルである。
【００２６】
式Ｉの化合物の具体例は、上記の式ＩＩの化合物である。この化合物は、式Ｉにおいて、ｘ１およびｘ２が塩素であり、Ｒがメチルである化合物である。
【００２７】
式ＩＩの化合物は、Ｅｎａｍｉｎ（エナミン）社（ウクライナ）から市販されている物質であり、商品番号（ＥｎａｍｉｎｅＩＤ）はＴ５２２３２４４である。
【００２８】
さらにまた、式Ｉおよび式ＩＩの化合物の塩は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物と任意の酸または塩基との塩であり、酸または塩基は製薬上許容可能なものであればいずれのものでもよい。酸は、無機酸または有機酸であり、無機酸には、非限定的に、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの酸が含まれ、また、有機酸には、非限定的に、例えば酢酸、プロピオン酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸などの酸が含まれる。一方、塩基には、非限定的に、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属を含む塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが含まれる。塩の形成は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のフェノール性水酸基もしくは環状アミノ基と当量の酸もしくは塩基とを適当な溶媒中で接触させることによって行うことができる。
【００２９】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物の製造については、例えば、一方の塩化ベンゾイル誘導体と他方の複素環化合物とのＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応によってケトン化合物を誘導することができる。
【００３０】
＜組成物＞
上述したように、ＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５は非常に高い相同性を有し、細胞内Ｃ末端領域のアミノ酸配列で比較した場合にも、ＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５は高い相同性を有する受容体である。フロントタンパク質はこれらの相同性の高いＣＣＲ２ＢとＣＣＲ５の両者の細胞内Ｃ末端領域に結合する(国際公開第ＷＯ２００３／０７０９４６号)。また、ＣＣＲ２ＢおよびＣＣＲ５は、(慢性)関節リウマチ、多発性硬化症などの炎症性疾患や、神経性疼痛との関連、癌などの病態形成への関与が示されている。一方、フロントタンパク質もまた、うっ血性心不全、前立腺転移癌、間葉系幹細胞ホーミング制御などの様々な疾患に関係することも知られている。
【００３１】
また、炎症疾患は、マクロファージや単球などのエフェクター細胞が炎症局所に過度に集積し、活性化することで組織破壊が進むと考えられている。これらのエフェクター細胞の走化性を特異的に活性化する細胞内タンパク質がフロントタンパク質であり、その機能を阻害することによって、細胞が炎症局所へ移動することが抑制されるため、ＣＣＲ２ＢやＣＣＲ５が関連する疾患の炎症を抑制することが可能になる。
【００３２】
本発明の式Ｉまたは式ＩＩの化合物は、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニング法で得られた、ＣＣＲ２ＢもしくはＣＣＲ５−フロントタンパク質間の相互作用阻害物質であり、細胞遊走を阻害する能力を有している(後述の実施例１及び２)。細胞レベルでの実験では、細胞毒性による機能低下も遊走阻害の原因として考えられるため、この可能性を排除するために細胞毒性の評価も行い、細胞遊走阻害能を確認している(後述の実施例３)。すなわち、式Ｉまたは式ＩＩで表わされる化合物は、上記相互作用を強力に阻害し、かつ細胞毒性試験も通過しており、式Ｉまたは式ＩＩで表わされる化合物による遊走阻害は上記相互作用の阻害によるものであることが証明されている。
【００３３】
したがって、本発明は、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはその塩を有効成分として含む、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパクとの相互作用の阻害剤を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはその塩を有効成分として含む抗炎症剤を提供する。
【００３５】
好ましい式Ｉの化合物は、式Ｉにおいて、Ｒがメチルまたはエチルであり、ｘ１およびｘ２はともに塩素または臭素である化合物である。より好ましい式Ｉの化合物は、式ＩＩで表される化合物である。
【００３６】
本発明の式Ｉまたは式ＩＩの化合物は、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパクとの相互作用を阻害するために、あるいはそのような阻害を通してフロントタンパク質、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５が関連する炎症性疾患、その他の疾患を治療するために使用することができる。
【００３７】
そのような炎症性疾患およびその他の疾患には、以下のものに限定されないが、動脈硬化、慢性関節リウマチ、多発性硬化症などの難治性炎症疾患、うっ血性心不全、転移癌、神経性疼痛などの、ＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５が関連する疾患やフロントタンパク質が関連する疾患などが含まれる。
【００３８】
本発明の阻害剤は、医薬として使用されてもよいし、あるいは研究用の試薬としてＣＣＲ２ＢまたはＣＣＲ５とフロントタンパクとの相互作用を阻害するために使用しうる。
【００３９】
本発明の式Ｉまたは式ＩＩの化合物を、医薬としての上記阻害剤または抗炎症剤として使用する場合、それらは経口投与または非経口投与のいずれの投与経路で投与されてもよい。非経口投与には、例えば静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、直腸内投与などが含まれる。
【００４０】
そのための製剤は、特に制限されないものとし、例えば固体製剤、顆粒製剤、粉末製剤、溶液製剤、懸濁液製剤、乳濁液製剤、注射用製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、カプセル製剤、サシェ製剤などの種々の剤型を含む。
【００４１】
このような製剤には、上記の有効成分のほかに、種々の添加剤、例えば賦形剤、担体、希釈剤、崩壊剤、懸濁剤、乳化剤、遅延放出用ポリマーおよびコーティング剤、着色剤、香味剤などを含むことができる。このような添加剤としては、製薬上公知のあらゆる剤を使用できるものとする。
【００４２】
有効成分の用量は、患者の年齢、性別、状態（重篤度)、体重などに応じて変化させうるし、そのような用量は、担当医師が決めるべきことである。しかし、上記の効能を発揮する限り、および毒性を有しない限り、いかなる用量であってもよい。そのような用量は、製剤の種類によっても異なるが、例えば１投与単位あたり約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量である。
【実施例】
【００４３】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明の範囲は、実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
フロントタンパク質−ＣＣＲ２相互作用の阻害活性
フロントタンパク質のＣ末側配列を含む転写因子の結合ドメイン融合タンパク発現ベクターであるＧＡＬ４  ＢＤおよびＣＣＲ２のＣ末側配列を含む活性化ドメイン融合タンパク発現ベクターであるＧＡＬ４  ＡＤを、リチウム酢酸／ポリエチレングリコール形質転換プロトコル（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６８（１９８３）を参照）によって、酵母株Ｙ１９０に形質転換した。このＹ１９０／ＦＮＴ−ＣＣＲ２酵母株を対数増殖期まで培養した後に、０．５％Ｗｅｓｔａｓｅ処理を１０分間行ない、酵母を一過性にプロトプラスト化した。ヒスチジン欠損培地に酵母を懸濁し、３−アミノトリアゾール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を終濃度５ｍＭとなるように加え、これを９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへアプライした。その後、式ＩＩで表わされる化合物を５０μＭとなるように添加し、２４時間培養を行って、吸光度（８００ｎｍ）を測定し、相互作用阻害活性をＹ２Ｈで検証した。ＤＭＳＯを加えたコントロールに対して式ＩＩで表わされる化合物の添加により５０％程度の相互作用抑制が認められた（図１）。
【００４４】
［実施例２］
細胞遊走能の抑制
ＴＡＸＩＳｃａｎ法（Ｎｉｔｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ；３２０，１５５−１６３（２００７））を用いて、式ＩＩで表わされる化合物による細胞遊走能の抑制活性を評価した。
【００４５】
ここで、ＴＡＸＩＳｃａｎ法とは、ＥＣＩ社が独自に開発した細胞遊走能解析（ＴＡＸＩＳｃａｎ）システムである。ＴＡＸＩＳｃａｎシステムとは、最新の微細加工技術を駆使して作成したシリコンウエハーチップを用いて、一定の走化性因子の濃度勾配を形成させ、その勾配依存的な細胞の水平方向への遊走活性測定が可能なシステムである（図２）。このシステムを用いて得られた画像を解析し、方向性（遊走細胞が遊走因子高濃度側に対してどれだけ方向的に進んだか）を定量化した結果、式ＩＩで表わされる化合物による処理によって濃度依存的に方向性が抑制された（図３）。なお、図３における相対値は、式ＩＩで表わされる化合物の濃度が０％のときの直線的な細胞の進行具合を１００としたときの進みにくさを示したものである。なお、ボイデンチャンバー法では、式ＩＩで表わされる化合物のＩＣ５０は、１５μＭであった。
【００４６】
［実施例３］
動物での有効性評価試験
ヒツジ赤血球１×１０６個をマウスに腹腔内投与することにより免疫を行い、足蹠（足裏）の皮下にヒツジ赤血球２×１０８個を再投与した際の足蹠の肥厚を測定することにより、誘導される細胞性免疫応答の強度を測定した。式ＩＩで表される化合物をＤＭＳＯに溶解し、生理食塩水で１０倍希釈した溶液５００μｌを足蹠への再投与の３０分前に腹腔内投与し（２０、１０または５ｍｇ／ｋｇ）、足蹠の厚みをノギスで測定した。
【００４７】
ヒツジ赤血球を再投与していない側の足蹠の厚みに対する肥厚の程度をＤＭＳＯ投与群と比較したところ、用量依存的に肥厚が減弱し、抗炎症効果が認められた（図４）。
【００４８】
［実施例４］
毒性評価試験
Ｊｕｒｋａｔ細胞にベクターｐｃＭＧＳ−ＮＥＯを用いてＣＣＲ２を導入して得られたＪｕｒｋａｔ／ＣＣＲ２細胞に、式ＩＩで表される化合物（１００、１０、１または０．１μＭ）を添加し、４８時間培養後、ＷＳＴ−１法にて細胞生存率を測定することにより、毒性評価試験を行った。
【００４９】
その結果、方向性の完全な低下が見られた１０μＭにおいても細胞毒性は認められなかった（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明における式ＩＩで表される化合物は、副作用が少なく、また、マウスとヒトで種差が小さいため、実験動物であるマウスの試験結果がヒトにおいてもそのまま適用することができる。このため、従来の抗炎症剤とは異なる新しい概念の抗炎症剤としての応用と利用が期待できる。
【図１】
0005424960.tif 000006
【図２】
0005424960.tif 000007
【図３】
0005424960.tif 000008
【図４】
0005424960.tif 000009
【図５】
0005424960.tif 000010
【配列表】
0005424960000001.app