(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体。
【化１】
0003648763.tif 000008
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
【請求項２】
下記一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体。
【化２】
0003648763.tif 000009
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基を示す。）
【請求項３】
一般式（３）
【化３】
0003648763.tif 000010
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
で表わされるイミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）
【化４】
0003648763.tif 000011
（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基を示す。）
で表わされる糖誘導体とを、トルフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させて、一般式（２）
【化５】
0003648763.tif 000012
（式中、Ｒ1〜Ｒ4およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン中間体を製造した後、アルカリ存在下に加溶媒分解することを特徴とする一般式（１）
【化６】
0003648763.tif 000013
（式中、Ｒ1〜Ｒ3およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方法。
【請求項４】
一般式（３）
【化７】
0003648763.tif 000014
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
で表わされるイミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）
【化８】
0003648763.tif 000015
（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基を示す。）
で表わされる糖誘導体とを、トルフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させることを特徴とする一般式（２）
【化９】
0003648763.tif 000016
（式中、Ｒ1〜Ｒ4およびｎは上記と同じものを示す。）
で表わされるウミホタルルシフェリン中間体の製造方法。
【請求項５】
糖加水分解酵素によりウミホタルルシフェリン誘導体が分解されることによって発光する発光量を測定することにより糖加水分解酵素の酵素量を定量する方法であって、ウミホタルルシフェリン誘導体として下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体を使用することを特徴とする糖加水分解酵素の定量方法。
【化１０】
0003648763.tif 000017
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規かつ有用なウミホタルルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方法、およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質として用いた糖加水分解酵素の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応に基づくイムノアッセイの分野において、ラジオイムノアッセイに代わる分析手段として化学発光酵素イムノアッセイが注目されている。化学発光酵素イムノアッセイは、酵素が化学結合している抗体または抗原を用いて、基質となる化学発光物質を定量することによって、その抗体または抗原の量を測定する方法である。
【０００３】
化学発光酵素イムノアッセイに用いられ、酵素反応により発光する基質（発光基質）としては、ルミノール誘導体、シュウ酸エステル、アダマンチルジオキセタン誘導体などが知られている。これらの中でアダマンチルジオキセタン誘導体はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として利用され、発光量を測定することによりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を定量することができる（特開平２−１８０８９３号）。
しかしながら、アダマンチルジオキセタン誘導体は分子内に過酸化物構造を有しているので、光および熱による分解や、金属との反応によるレドックス分解を引き起こし易く、このため定量分析の誤差を招きやすいという問題点がある。
【０００４】
ところで、これまでに知られているウミホタルルシフェリン誘導体は、一重項酸素、スパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素と選択的に反応して発光することから、これら活性酸素の微量定量に有効であることが知られている。しかしながらβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの糖加水分解酵素の基質として用いても発光しない。また本発明のウミホタルルシフェリン誘導体と類似した構造を有するセレンテラジングルクロニドが知られている（Chem. Latt. 417-8(1987)）が、この化合物はグルクロニダーゼという特殊な酵素でのみ発光するため、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの糖加水分解酵素の定量に利用することはできない。
このため発光を利用して、糖加水分解酵素を高精度で定量することができる発光基質の開発が強く望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖加水分解酵素に対する基質として利用して発光させることができ、糖加水分解酵素の定量に利用することができる新規かつ有用なウミホタルルシフェリン誘導体、およびその中間体を提供することである。
本発明の他の目的は、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率よく製造することができるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方法、および中間体の製造方法を提案することである。
本発明の別の目的は、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を利用して、高い精度で酵素量を定量することができる糖加水分解酵素の定量方法を提案することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は次のウミホタルルシフェリン誘導体、その中間体、これらの製造方法、およびウミホタルルシフェリン誘導体を発光基質として用いた糖加水分解酵素の定量方法である。
（１）下記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体。
【化１１】
0003648763.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
（２）下記一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体。
【化１２】
0003648763.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基を示す。）
（３）一般式（３）
【化１３】
0003648763.tif 000004
（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基または炭素数７〜１９のアリールアルキル基を示す。Ｒ3は炭素数１〜５のアルキル基またはアルコキシ基、ｎは０〜５の整数を示す。）
で表わされるイミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）
【化１４】
0003648763.tif 000005
（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ4は炭素数１〜７のアシル基を示す。）
で表わされる糖誘導体とを、トルフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させて、前記一般式（２）
で表わされるウミホタルルシフェリン中間体を製造した後、アルカリ存在下に加溶媒分解することを特徴とする前記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体の製造方法。
（４）前記一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン誘導体と、前記一般式（４）で表わされる糖誘導体とを、トリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させることを特徴とする前記一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体の製造方法。
（５）糖加水分解酵素によりウミホタルルシフェリン誘導体が分解されることによって発光する発光量を測定することにより糖加水分解酵素の酵素量を定量する方法であって、ウミホタルルシフェリン誘導体として前記一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体を使用することを特徴とする糖加水分解酵素の定量方法。
【０００７】
一般式（１）において、Ｒ1またはＲ2で示される基の具体的なものとしては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、トリデシル基、ヘキサデシル基、イコシル基等の直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜２０のアルキル基；フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ナフタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基等の炭素数６〜２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、トリチル基、トリル基、キシリル基、クメニル基、メシチル基等の炭素数７〜１９のアリールアルキル基があげられる。Ｒ1とＲ2とは同一でも異なっていてもよい。
【０００８】
一般式（１）で表わされる本発明のウミホタルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光基質として利用する場合は、Ｒ1またはＲ2は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基またはフェネチル基であるのが好ましい。
【０００９】
一般式（１）においてＲ3で示される基の具体的なものとしては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基等の直鎖状または分岐鎖状の炭素炭１〜５のアルキル基；メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜５のアルコキシ基があげられる。これらの基がベンゼン環に結合する位置はどこの位置でもよく、またその数（ｎの数）は０〜５である。
【００１０】
一般式（１）で表わされる本発明のウミホタルルシフェリン誘導体を後述の糖加水分解酵素の発光基質として利用する場合は、Ｒ3はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基またはｔ−ブトキシ基であって、ベンゼン環の４位に１個、２および４位に２個、または２、４および６位に３個結合しているのが好ましい。
【００１１】
一般式（２）におけるＲ4のアシル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、ベンゾイル基などの炭素数１〜７のアシル基があげられる。一般式（２）におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3およびｎは前記と同じものを示す。
【００１２】
一般式（１）で表わされる本発明のウミホタルルシフェリン誘導体は、一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン誘導体と、一般式（４）で表わされる糖誘導体とを、トリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させて一般式（２）で表わされるウミホタルルシフェリン中間体（以下、単に中間体という場合がある）を製造した後、この中間体をアルカリ存在下に加溶媒分解することにより製造できる。
【００１３】
一般式（３）におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3およびｎは前記と同じものを示す。
一般式（４）におけるＸで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。Ｒ4は前記と同じものを示すが、アセチル基またはベンゾイル基が好ましい。
一般式（４）で表わされる糖誘導体の糖骨格としては、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノースおよびβ−Ｄ−グルコピラノースがあげられる。
【００１４】
一般式（３）のイミダゾピラジン誘導体と一般式（４）の糖誘導体との仕込み割合は、イミダゾピラジン誘導体：糖誘導体のモル比で１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：１０とするのが望ましい。このモル比が０．１未満の場合には生成する中間体の収率が低下する傾向にあり、一方１００を超えると反応終了後に未反応の糖誘導体が残存し、目的とする生成物の単離が困難となるので好ましくない。
【００１５】
トリフルオロメタンスルホン酸銀の使用量は、糖誘導体：トリフルオロメタンスルホン酸銀の仕込みモル比で１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：２０とするのが望ましい。またリン酸二ナトリウム塩の使用量は、イミダゾピラジン誘導体：リン酸二ナトリウム塩の仕込みモル比で１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：５０とするのが望ましい。なお、トリフルオロメタンスルホン酸銀は触媒として、またリン酸二ナトリウム塩はイミダゾピラジン誘導体の活性を上げるために用いられる。
【００１６】
反応溶媒としては、反応条件下で不活性であり、かつ生成した中間体からの分離が容易なものであるならばどのような溶媒でも使用できる。このような溶媒としては、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドあるいはこれらの混合溶媒などが適当である。使用する溶媒の量は特に限定されないが、出発物質の総重量あたり１〜１０００倍量であることが好ましい。また反応をさらに円滑に進めるために、脱水溶媒を用いることが好ましい。さらに反応系から水分を除去するために、反応条件下で不活性な吸湿剤、例えばモレキュラーシーブなどを反応系内に存在させることが好ましい。吸湿剤の仕込み量としては、出発物質の総重量あたり１〜１０００倍量とするのが好ましい。
【００１７】
反応温度は、通常−２０〜＋１５０℃、好ましくは−１０〜＋１００℃とするのが望ましい。反応は減圧または加圧下に行うこともできるが、常圧で行うのが好ましい。反応時間は、通常３０分間〜２０時間の範囲で行うことができるが、実用的には１〜１０時間になるように条件を設定するのが望ましい。また反応は不活性ガス雰囲気下に行うのが好ましい。
【００１８】
このようにして反応を行うことにより、一般式（２）で表わされる中間体が得られる。この中間体から最終目的物である一般式（１）のウミホタルルシフェリン誘導体を得るには、反応液からクロマトグラフィーなどの方法により中間体を単離した後、得られた中間体をアルカリ存在下に加溶媒分解して脱保護基化することにより得ることができる。溶媒としては、水；メタノール、エタノール等の低級アルコール；これらの混合液などが使用できる。
【００１９】
アルカリとしてはアンモニア、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、グアニジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセンなどが使用できる。アルカリの使用量は、反応液中の濃度が０．００１〜５Ｎ、好ましくは０．０１〜１Ｎとなる量で使用するのが望ましい。
加溶媒分解は−５０〜＋１００℃、好ましくは０〜＋８０℃で、０．１〜２４時間、好ましくは０．１〜１０時間行うのが望ましい。
【００２０】
反応終了後は、クロマトグラフィー、再結晶等の通常の手段により精製することができる。
このようにして得られた一般式（１）で表わされるウミホタルルシフェリン誘導体は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼまたはβ−Ｄ−グルコシダーゼの糖加水分解酵素の基質として使用して発光させることができ、これらの糖加水分解酵素の定量試薬として利用することができる。糖加水分解酵素としては、抗体または抗原に化学的に結合している酵素を用いることもでき、この場合は化学発光酵素イムノアッセイ用の定量試薬として利用できる。
【００２１】
糖加水分解酵素の定量は、反応媒体中で一般式（１）のウミホタルルシフェリン誘導体と糖加水分解酵素とを接触させ、このとき発光する発光量を測定し、予め作成した検量線を基に定量することができる。
ウミホタルルシフェリン誘導体の使用量は、測定試料中に存在する糖加水分解酵素１モルに対して、通常１〜１０18モル、好ましくは１０3〜１０15モルとするのが望ましい。
【００２２】
反応媒体としては、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは定量する糖加水分解酵素の活性が高く維持されるｐＨ値を有する水溶液または緩衝液などが使用できる。このような水溶液または緩衝液としては、例えば酢酸、炭酸、リン酸、ホウ酸水溶液；酢酸ナトリウム緩衝液、トリスアミノヒドロキシメタン緩衝液、コハク酸緩衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパンカルボン酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液等をあげることができ、使用に際しては単独もしくは混合物として用いることができる。
【００２３】
反応を行う際の温度は、通常０〜７０℃、好ましくは１５〜６０℃の範囲であることが望ましい。この温度範囲以外では、酵素の活性が低下するので好ましくない。
このようにして反応させることによって、糖加水分解酵素の作用によりウミホタルルシフェリンが分解されて発光する。発光量は市販の光電子増倍管を備えた化学発光測定器などを用いることにより容易に行うことができる。
【００２４】
このような本発明の糖加水分解酵素の定量方法は、基質として化学的に安定な前記ウミホタルルシフェリン誘導体を使用しているので、分析誤差を生じることなく、高い精度で酵素量を定量することができる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のウミホタルルシフェリン誘導体は新規であり、糖加水分解酵素の発光基質として有用である。本発明のウミホタルルシフェリン中間体は新規であり、上記のウミホタルルシフェリン誘導体の中間体として有用である。
本発明のウミホタルルシフェリン誘導体の製造方法は、一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン誘導体および一般式（４）で表わされる糖誘導体を出発物質として用い、これらをトリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させた後、得られた中間体を加溶媒分解するようにしたので、上記ウミホタルルシフェリン誘導体を簡単に効率よく製造することができる。
また本発明のウミホタルルシフェリン誘導体の中間体の製造方法も、一般式（３）で表わされるイミダゾピラジン誘導体および一般式（４）で表わされる糖誘導体を出発物質として用い、これらをトリフルオロメタンスルホン酸銀およびリン酸二ナトリウム塩の存在下に反応させるようにしたので、上記ウミホタルルシフェリン誘導体の中間体を簡単に効率よく製造することができる。
本発明の糖加水分解酵素の定量方法は、基質として上記ウミホタルルシフェリン誘導体を使用しているので、高い精度で定量することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１−１
６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（一般式（３）のＲ1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは１）０．１ｇ（０．３５ｍｍｏｌ）とリン酸二ナトリウム１．１ｇ（７．７５ｍｍｏｌ）との混合物中に、アセトニトリル５ｍｌおよびベンゼン９ｍｌを加えた後、モレキュラーシーブ４Ａを２．６ｇ加え、室温で１時間攪拌した。続いて２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（一般式（４）のＸは臭素原子、Ｒ4はアセチル基）０．１８ｇ（０．４５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸銀０．３７ｇ（１．４３ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気下に室温で２時間攪拌し、６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンと２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドとを反応させた。
【００２７】
反応終了後、セライトを敷いたガラスフィルターにより反応溶液を濾過した後、残渣をアセトニトリルおよびベンゼンで洗浄した。濾液および洗液の混合液から溶媒を留去し、次に塩化メチレン１５ｍｌおよび飽和炭酸水素ナトリウム−食塩水１０ｍｌを加えて攪拌した後、不溶物をガラスフィルターにより取り除いた。次に塩化メチレン層を分取した後、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を留去後、得られた油状物をシリカゲルカラム（３０％アセトン−ベンゼン）および中圧カラムクロマトグラフィーにより精製すると、中間体である６−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−（テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（２）のＲ1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは１、Ｒ4はアセチル基）が収量０．０８ｇ（０．１４ｍｍｏｌ）、収率３９％で得られた。
【００２８】
スペクトルデータは次の通りである。
ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：５８６（Ｍ＋Ｈ）+，２５６
Ｅｘａｃｔ  ＭＳ：５８６．１９９５
Ｃ28Ｈ32Ｏ11Ｎ3の計算値：５８６．２０３７
ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：
3450, 2970, 2940, 1745, 1605, 1560,
1495, 1370, 1245, 1225, 1060, 1035
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：
1.73(3H, s, CH3CO), 2.05(3H, s, CH3CO),
2.21(3H, s, CH3CO), 2.27(3H, s, CH3CO),
2.47(3H, s, CH3), 3.88(3H, s, CH3O),
3.93(1H, dd, J=6.4, 5.9Hz),
4.11(1H, dd, J=11.4, 6.9Hz),
4.18(1H, dd, J=11.4, 5.9Hz),
4.89(1H, d, J=7.9Hz),
5.10(1H, dd, J=10.4, 3.5Hz),
5.45(1H, d, J=2.5Hz),
5.62(1H, dd, J=10.6, 8.2Hz),
7.02(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
8.34(1H, d, J=1.5Hz), 8.94(1H, d, J=1.5Hz)
【００２９】
実施例１−２
実施例１−１で得られた中間体０．０５ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）にメタノール３．５ｍｌおよび濃アンモニア水１．８ｍｌを加えた後、４０℃で６時間３０分攪拌して加溶媒分解した。白色沈澱を濾取し、メタノールから再結晶を行うと目的の３−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（一般式（１）のＲ1はメチル基、Ｒ2は水素原子、Ｒ3はメトキシ基、ｎは１）が収量０．０３ｇ（０．０７ｍｍｏｌ）、収率７８％で得られた。
【００３０】
スペクトルデータは次の通りである。
ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：４１８（Ｍ＋Ｈ）+
Ｅｘａｃｔ  ＭＳ：４１８．１５５５
Ｃ20Ｈ24Ｏ7Ｎ3の計算値：４１８．１６１４
ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：
3450, 2930, 2880, 1605, 1565, 1490,
1405, 1240, 1090, 1080, 1010
ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：
3450, 2975, 2950, 1745, 1605, 1555,
1495, 1365, 1225, 1075, 1035
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6／ＴＭＳ：δ（ｐｐｍ））：
2.41(3H, s, CH3), 3.3〜3.73(3H, m),
3.82(3H, s, CH3O), 4.59〜4.68(2H, m),
4.97(1H, d, J=5.4Hz),
5.78(1H, d, J=5.4Hz),
7.06(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
7.95(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
8.77(1H, d, J=1.5Hz), 8.94(1H, d, J=1.5Hz)
【００３１】
実施例１−３
実施例１−１で用いた糖誘導体の代わりに２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド０．１７ｇ（０．４１ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１−１と同様に反応を行うと、β体のみが収量０．０３ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、収率１６％で得られた。
【００３２】
スペクトルデータは次の通りである。
ＭＳ（ＦＡＢ：ｍ／Ｚ）：５８６（Ｍ＋Ｈ）+，２５６
Ｅｘａｃｔ  ＭＳ：５８６．２０２３
Ｃ28Ｈ32Ｏ11Ｎ3の計算値：５８６．２０３７
ＩＲ（ＫＢｒ：ｃｍ-1）：
3450, 2975, 2950, 1745, 1605, 1555,
1495, 1365, 1225, 1075, 1035
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ：δ(ｐｐｍ)）：
1.82(3H, s, CH3CO), 2.04(3H, s, CH3CO),
2.06(3H, s, CH3CO), 2.18(3H, s, CH3CO),
2.46(3H, s, CH3),
3.70(1H, ddd, J=9.6, 2.5, 2.0Hz),
3.87(3H, s, CH3O),
4.06(1H, dd, J=12.4, 2.0Hz),
4.24(1H, dd, J=12.6, 5.7Hz),
4.94(1H, d, J=7.9Hz),
5.19(1H, t, J=9.7Hz),
5.29(1H, t, J=9.4Hz),
5.42(1H, t, J=8.7, 7.9Hz),
6.99(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
7.86(2H, A2'X2', J=8.9Hz),
8.33(1H, d, J=1.5Hz),
8.94(1H, broad s)
【００３３】
実施例２−１
１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６５０μｌに、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈されたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ水溶液２５μｌおよび実施例１−２で得られた１００μＭ  ３−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのジメチルスルホキシド溶液７５μｌを加え、４０℃で２０分間インキュベートした。反応溶液から５００μｌをサンプリングし、化学発光測定器（東北電子産業社製，ＣＬＤ−１００、商品名）により発光強度を１０秒間測定した。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003648763.tif 000006
【００３５】
表１の結果から、酵素の量に応じた発光量が観察されたことがわかる。そして、ｌｏｇ（酵素量，ｍｏｌ／ｔｅｓｔ）とｌｏｇ（発光量，ｃｏｕｎｔｓ／１０ｓ）との関係式は次式（５）
【数１】
0003648763.tif 000007
相関係数ｒ＝0.992
で表わされるので、発光量によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを定量することができることがわかる。従って、実施例のウミホタルルシフェリン誘導体はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの化学発光基質として有用である。