(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製対象のタンパク質分子と、配列番号１で表されるデキストラン結合ドメイン又は配列番号１における少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有しデキストラン結合活性を有するデキストラン結合ドメインとを融合させてなる融合タンパク質を含有する溶液中に、架橋性デキストランを含む吸着体を混合し、その後、上記溶液中から取り出した上記吸着体を、分子量5〜70[kDa]のデキストランを含む溶液中に混合し、該溶液中に上記融合タンパク質を溶出させることを特徴とするタンパク質の精製方法。
【請求項２】
上記デキストランを含む溶液中に、20mg/mlの濃度でデキストランを混合することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の精製方法。
【請求項３】
上記融合タンパク質を含有する溶液中に上記吸着体を混合する際に、当該溶液を高塩濃度とすることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の精製方法。
【請求項４】
上記融合タンパク質を含有する溶液中に上記吸着体を混合する際に、当該溶液中に精製対象以外の共雑タンパク質と上記吸着体との非特異的吸着を阻害する阻害剤として、分子量５０００以下のデキストランを添加することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項５】
上記融合タンパク質は、精製対象のタンパク質分子とデキストラン結合ドメインとの間にリンカー配列を介在させてなることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の精製方法。
【請求項６】
上記デキストランを含む溶液中に溶出した融合タンパク質を、上記リンカー配列を特異的に切断する酵素で処理することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的のタンパク質を簡易に単離することができるタンパク質の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
研究対象となるタンパク質を簡単に効率よく入手することは、分子生物学、生化学をはじめ、薬学及び医学において非常に重要であるばかりでなく、生化学産業や製薬産業といった様々な産業において重要なことである。従前においては、生体の組織、器官及び培養細胞といった生体材料から目的のタンパク質を単離/精製する手法が主流であった。この場合、生体材料の取り扱いが煩わしく、また、目的とするタンパク質の存在量が僅かであるため、高純度で大量に目的とするタンパク質を得ることが困難である。また、目的とするタンパク質が多量に存在する場合であっても、目的とするタンパク質と物理化学的性質が類似する他のタンパク質が混在する場合が多く、目的とするタンパク質のみを容易に単離/精製することは困難であった。
【０００３】
一方、近年においては、組換え遺伝子と宿主細胞とを用いた大量発現系を利用して、目的とするタンパク質を組換えタンパク質として多量に得ることが可能となっている。組換えタンパク質を得るためには、先ず、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングする。次いで、発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。そして、宿主細胞内で発現ベクターにクローニングされた遺伝子を発現させることによって、当該宿主細胞内で目的とするタンパク質を多量に生成することができる。
【０００４】
また、この大量発現系を用いてタンパク質を精製する場合、いわゆる付加タグを利用する方法が知られている。すなわち、目的とするタンパク質と付加タグとを融合してなる融合タンパク質を宿主細胞内で大量発現させる。その後、宿主細胞の溶解物を吸着体を含有するカラムに流し、融合タンパク質における付加タグを吸着体に結合させて当該融合タンパク質を分離精製する。
【０００５】
ここで、付加タグとしては、ポリヒスチジン、グルタチオントランスフェラーゼ、マルトース結合ドメイン等が使用されている。 しかしながら、これらの付加タグと目的とするタンパク質との相性が悪い場合には、融合タンパク質が発現しなかったり、発現しても封入体を形成してしまう。このような場合、宿主細胞の株を変更したり、培養条件を検討したり、付加タグの種類を変更することで、これらの問題を解決できることがある。特に、付加タグの種類を変更することによって、融合タンパク質を確実に発現させることができ、且つ、封入体の形成を回避できる場合が多い。したがって、目的とするタンパク質を精製する場合には、多種多様の付加タグを準備しておくことが好ましい。
【０００６】
また、上述したような付加タグを用いた場合、融合タンパク質を吸着体に結合させた後、付加タグの種類に応じた溶出剤を作用させて吸着体と融合タンパク質とを分離させている。溶出剤としては、イミダゾールやグルタチオン等の生理活性物質を使用している。したがって、分離精製後の融合タンパク質は、これら生理活性物質を含む溶液中に存在することとなり、透析等により当該生理活性物質を除去した後に使用されなければならない。しかしながら、生理活性物質の除去を目的とする透析等には非常に時間がかかり、また、透析等の工程を経ることによって目的とするタンパク質の活性が劣化してしまうおそれもある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述したよう実状に鑑みて案出されたものであり、全く新規な付加タグを用いることによって、溶出剤として生理活性物質を用いることなく、目的とするタンパク質を迅速に精製することが可能なタンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明に係るタンパク質の精製方法は、精製対象のタンパク質分子と、配列番号１で表されるデキストラン結合ドメイン又は配列番号１における少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有しデキストラン結合活性を有するデキストラン結合ドメインとを融合させてなる融合タンパク質を含有する溶液中に、架橋性デキストランを含む吸着体を混合し、その後、上記溶液中から取り出した上記吸着体を、デキストランを含む溶液中に混合し、上記デキストランを含む溶液中に上記融合タンパク質を溶出させるものである。
【０００９】
また、本発明においては、上記デキストランを含む溶液に、分子量５〜７０[kDa]のデキストランを含むものであることが好ましい。
さらに、本発明においては、上記デキストランを含む溶液中に、２０mg/ml以上の濃度でデキストランを混合することが好ましい。
【００１０】
さらにまた、本発明において、上記融合タンパク質を含有する溶液中に上記吸着体を混合する際に、当該溶液を高塩濃度とすることが好ましい。
さらにまた、本発明において、上記融合タンパク質を含有する溶液中に上記吸着体を混合する際に、当該溶液中に精製対象以外の共雑タンパク質と上記吸着体との非特異的吸着を阻害する阻害剤を添加することが好ましい。
【００１１】
さらにまた、本発明において、上記阻害剤の1つとして、分子量５０００以下のデキストランを用いることが好ましい。
さらにまた、本発明において、上記融合タンパク質は、精製対象のタンパク質分子とデキストラン結合ドメインとの間にリンカー配列を介在させてなることが好ましい。
さらにまた、本発明において、上記デキストランを含む溶液中に溶出した融合タンパク質を、上記リンカー配列を特異的に切断する酵素で処理することが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るタンパク質の精製方法を詳細に説明する。
１．融合タンパク質の発現
本方法においては、いかなるタンパク質であっても精製対象とすることができる。本方法では、先ず、精製対象のタンパク質（以下、目的タンパク質と呼ぶ）と、デキストランに対して特異的に結合するドメイン、すなわちデキストラン結合ドメイン（以下、ＤＢＤと呼ぶ）とを融合させてなる融合タンパク質を調製する。
【００１３】
ここでＤＢＤとは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるもの、或いは、配列番号１における少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有しデキストラン結合活性を有するものを意味する。ＤＢＤは、所定の口腔細菌（Cariogenetic streptococci）が産生するグルコシルトランスフェラーゼのドメインである（Abo.H.ら、J. Bacteriol. 173: 989-996, 1991）。
【００１４】
また、本方法において、融合タンパク質が目的タンパク質とＤＢＤとの間にリンカー配列を介在させたものであっても良い。ここで、リンカー配列としては、タンパク質加水分解酵素等の酵素により、特異的に認識されて切断されるような配列を挙げることができる。例えば、リンカー配列としては、トロンビンが認識して切断するような配列番号２に示すアミノ酸配列や、ファクターＸ（SIGMA社製）及びファクターＸａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が認識して切断するような配列番号３に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【００１５】
融合タンパク質を調製する際には、融合タンパク質を発現する発現ベクターを作製し、当該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養する。この発現ベクターは、プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子と、必要であればリンカー配列をコードする塩基配列と、ＤＢＤをコードする遺伝子とを有している。発現ベクターとしては、プロモーターの下流にＤＢＤをコードする遺伝子と、必要であればリンカー配列をコードする塩基配列と、目的タンパク質をコードする遺伝子とをこの順で有するものであっても良い。なお、ＤＢＤをコードする遺伝子の一例を配列番号４に示す。
【００１６】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、通常の遺伝子クローニング法を用いて調製することができる。具体的には、Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されているような方法を用いて、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
【００１７】
また、ＤＢＤをコードする遺伝子は、例えば、Abo.H.ら、J. Bacteriol. 173: 989-996, 1991に記載された方法を用いて調製することができる。また、例えば、グルコシルトランスフェラーゼを産生する口腔細菌（Cariogenetic streptococci）の染色体DNAライブラリーを調製し、この染色体DNAライブラリーからグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有するクローンをスクリーニングし、スクリーニングしたクローンからＤＢＤをコードする遺伝子を調製することができる。
【００１８】
発現ベクターを構築する際に使用可能なベクターとしては、例えば、pUCシリーズ（宝酒造株式会社製）、pETシリーズ（Novagen社製）、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、pCALシリーズ（STRATAGENE社製）、pYES2（Invitrogen社製）、pYEUra3（Clontech社製）、pFastBac1（Gibco社製）等を挙げることができる。これらベクターに上述した目的タンパク質をコードする遺伝子及びＤＢＤをコードする遺伝子を挿入する際には、従来より公知の組換えDNA手法（Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）を適宜利用することができる。
【００１９】
また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、昆虫細胞及び動物細胞等を利用することができる。これら宿主細胞は、発現ベクターの種類に応じて適宜選択することが好ましい。言い換えると、使用する宿主細胞の種類によって、ベクターの種類を選択することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターとしては、pUCシリーズ、pETシリーズ、pGEXシリーズ、pCALシリーズを用いて構築することが好ましい。
【００２０】
宿主細胞を形質転換する方法としては、従来より使用されているいかなる方法も使用することができる。例えば、大腸菌をコンピテント細胞とした後にヒートショックを与えて形質転換する方法や、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
【００２１】
形質転換した宿主細胞を大量に培養し、当該宿主細胞の内部に融合タンパク質を発現させる。発現ベクターにおけるプロモーターとしてlacプロモーターを用いた場合には、培養液にイソプロピル1-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）を添加することによって、lacプロモーターの下流の融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させることができる。また、T7プロモーター(DE3遺伝子を有する宿主細胞を用いる場合)、tacプロモーターを有するベクターを用いた場合でも、IPTGを用いた同様な発現誘導が可能である。
【００２２】
２．融合タンパク質の回収
融合タンパク質の発現を誘導した後に宿主細胞を回収し、回収した宿主細胞を緩衝液中に溶解させ、超音波処理等により溶菌させる。溶菌させる際には、超音波処理に限定されず、従来公知の手法を使用することができる。例えば、リゾチーム/DNase法、プレンチプレス法を挙げることができる。
【００２３】
宿主細胞を溶菌した後に溶液を遠心分離し、上清を回収する。回収した上清に架橋性デキストランを含む吸着体を混合する。ここで、吸着体は、ビーズ状、デンドライド状等のいずれの形状/形態のものであっても良い。例えば、取り扱いの容易性からビーズ状の吸着体を使用することが好ましい。架橋性デキストランを含むビーズ（以下、デキストランビーズと呼ぶ）としては、例えば、Sephadexビーズ(アマシャムファルマシアバイオテク社製)、Sephacrylビーズ(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を使用することができる。
【００２４】
デキストランビーズを添加した後に攪拌して放置することによって、ＤＢＤを有する融合タンパク質をデキストランビーズに吸着させることができる。このとき、上清液中に含まれる共雑タンパク質を除去することが好ましい。例えば、上清液中の塩濃度を高くすることによって、デキストランビーズに吸着した融合タンパク質以外の共雑タンパク質を除去することができる。また、上清液中に精製対象以外の共雑タンパク質とデキストランビーズとの非特異的吸着を阻害する阻害剤を添加することが好ましい。阻害剤としては、ポリオキシエチレン-p-t-オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤や低分子量のデキストランを挙げることができる。この阻害剤を上清液中に所定の濃度で存在させることによって、デキストランビーズに吸着する融合タンパク質以外の共雑タンパク質を除去することができる。
【００２５】
ここで、低分子量のデキストランは、融合タンパク質におけるＤＢＤに対して比較的に親和性が低いことから、低分子量のデキストランを上清液に加えることによって、デキストランビーズに吸着する融合タンパク質以外の共雑タンパク質を除去することができる。ここで、低分子量のデキストランとは、分子量が5000[Da]以下のものを意味する。低分子量のデキストランとしては、例えば、デキストランT1（Fluka社製）を挙げることができる。
次に、遠心分離等によって上清液からデキストランビーズを回収する。デキストランビーズを回収する際には、遠心分離だけでなく、自然放置といった手法を用いることもできる。
【００２６】
次に、回収したデキストランビーズを洗浄する。例えば、デキストランビーズに緩衝液を加え、よく攪拌することによってデキストランビーズを洗浄することができる。この洗浄に際して、上述したような、塩及び/又は界面活性剤を添加することによって、共雑タンパク質を除去することもできる。また、この洗浄は、複数回行うことが好ましく、例えば5回程度行うことが好ましい。
【００２７】
次に、洗浄したデキストランビーズを、デキストランを含む溶液中に混合する。これにより、デキストランビーズに結合した融合タンパク質がデキストランビーズから乖離する。そして、溶液中からデキストランビーズのみを除去することによって、融合タンパク質を精製することができる。
【００２８】
ここで、融合タンパク質の回収にSephadexG-100ビーズを用いた場合には、デキストランとして５〜７０ｋＤａの分子量のものを使用することが好ましい。分子量が５〜７０ｋＤａのデキストランを用いた場合には、融合タンパク質の回収率を向上させることができる。言い換えると、分子量が５ｋＤａ未満のデキストラン又は分子量が７０ｋＤａを越えるデキストランを用いた場合には、融合タンパク質をデキストランビーズから乖離させられないことがあり、融合タンパク質の回収率が低下してしまうおそれがある。
【００２９】
また、デキストランビーズを含む溶液中に、２０mg/ml以上の濃度でデキストランを混合することが好ましい。当該溶液中のデキストラン濃度を２０mg/ml以上とすることによって、融合タンパク質の回収率を向上させることができる。言い換えると、当該溶液中のデキストラン濃度を２０mg/ml未満とした場合には、融合タンパク質をデキストランビーズから乖離させられないことがあり、融合タンパク質の回収率が低下してしまうおそれがある。
【００３０】
一方、融合タンパク質を含む溶液中には、デキストランを含むこととなる。しかしながら、デキストランは、不活性物質であるため、融合タンパク質を含む溶液中に存在しても、当該融合タンパク質に対して悪影響を及ぼすことはない。したがって、積極的にデキストランを除去する場合を除いて、上述した工程によって融合タンパク質を精製することができる。
【００３１】
なお、デキストランを除去する場合には、透析やクロマトグラフィー等の手法を使用することができる。具体的には、融合タンパク質におけるＤＢＤが酸性ドメインであるため、陰イオン交換樹脂、例えば、DEAE-Toyopearl650M（東ソー株式会社製）に融合タンパク質を吸着させ、デキストランを除去することができる。なお、陰イオン交換樹脂に吸着した融合タンパク質は、NaCl等の塩により溶出させることができる。溶出に低分子量のデキストラン（例えば、分子量５KDa）を用いた場合には、これを透析によって除去することができる。
【００３２】
また、目的タンパク質とＤＢＤとの間にリンカー配列を介在させた融合タンパク質を精製した場合、当該リンカー配列を特異的に切断する酵素で処理することによって、目的タンパク質とＤＢＤとを分離することができる。例えば、配列番号２のリンカー配列を介在させた場合には、精製した融合タンパク質を含む溶液にトロンビンを添加して処理することによって、目的タンパク質とＤＢＤとを分離させることができる。その後、デキストランビーズでＤＢＤを回収することや目的タンパク質の等電点等の性質を利用したクロマトグラフィーを行うことによって、ＤＢＤを除去して、目的タンパク質を高純度に精製することができる。
【００３３】
また、上述した説明では、本発明に係るタンパク質の精製方法をバッチ式に行う例を挙げたが、本発明に係るタンパク質の精製方法は、以下に説明するように、タンパク質を連続的に精製する、いわゆるカラム式に行っても良い。
すなわち、上述したようなデキストランビーズを内部に充填したカラムを準備する。そして、融合タンパク質を発現する宿主細胞を溶菌した後、回収した上清をこのカラムに通す。これにより、カラム内部のデキストランビーズに融合タンパク質を吸着させることができる。続いて、カラム内部に存在する共雑タンパク質を除去する目的で、所定の緩衝液等をカラムに通す。次に、デキストランを含む溶液をカラムに通すことによって、デキストランビーズに吸着した融合タンパク質を溶出することができる。
【００３４】
このように本発明に係るタンパク質の精製方法は、カラム式を適用しても目的とする融合タンパク質を精製することができる。なお、カラムから溶出した融合タンパク質を含む溶液中には、デキストランを含むこととなる。しかしながら、デキストランは、不活性物質であるため、融合タンパク質を含む溶液中に存在しても、当該融合タンパク質に対して悪影響を及ぼすことはない。したがって、積極的にデキストランを除去する場合を除いて、カラムからの溶出によって融合タンパク質を精製することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本例では、種々の分野でモデルタンパク質として用いられている緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein:以下、GFPとよぶ）を目的タンパク質とした。
【００３６】
１．発現ベクターの構築
図１に示すように、pUC18（宝酒造株式会社製）におけるlacプロモータの下流にＤＢＤをコードする遺伝子が連結されたDBD/pUC18（Abo, H.ら, J. Bacteriol. 173: 989-996, 1991）を準備する。このDBD/pUC18における、lacプロモータとＤＢＤをコードする遺伝子との間（マルチクローニングサイト）にGFPをコードする遺伝子を連結し、図１に示すようなGFP-DBD/pUC18を構築した。
【００３７】
２．形質転換
宿主細胞として、プロテアーゼ欠損株である大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社製）を用いた。この大腸菌BL21(DE3)株を、GFP-DBD/pUC18を用いてヒートショック法により形質転換した。
【００３８】
具体的には、大腸菌BL21(DE3)株を20mMのβ-メルカプトエタノールと混合し、氷中で10分間放置した後に、GFP-DBD/pUC18を加えて氷中保存した。氷中保存30後に、42℃で30秒間加熱処理し、その後2分間氷中保存した。42℃のSOC培地を加えた後、37℃で1時間振とう培養した。この菌体培養液をクロラムフェニコール及びアンピシリンを含むLBプレートで37℃で一晩培養した。
【００３９】
３．形質転換細胞の培養
形質転換した大腸菌BL21(DE3)株を、アンピシリンを含有するLB液体培地で、37℃で12〜16時間振とうしながら前培養した。次いで、500mlのTPM培地に前培養液2.5mlを加え、適宜吸光度を測定しながら37℃で培養した。そして、波長600nmにおける吸光度が0.5に達したところで、0.5mMのIPTGを添加して20℃で3時間培養を続けた。なお、IPTGの添加により、lacプロモーターの下流の遺伝子の発現が誘導される。
【００４０】
このとき、培養液を目視により観察したところ、薄緑色を呈していた。また、培養液中の大腸菌BL21(DE3)株を蛍光顕微鏡（OLYMPUS IX50）を用いて観察したところ、菌体全体にわたってGFP由来の蛍光を発していることが確認できた。なお、大腸菌BL21(DE3)株において、封入体は形成されていなかった。
【００４１】
４．融合タンパク質の回収
培養液を、4℃、7500×gで2分間遠心分離することによって、大腸菌BL21(DE3)株を集菌した。回収した大腸菌BL21(DE3)株を、緩衝液A（組成：10mM Tris-acetate(pH8.0),1mM Mg-acetate及び150mM K-acetate）に懸濁した後、遠心することによって、大腸菌BL21(DE3)株を集菌した。集菌した大腸菌BL21(DE3)株は、明瞭な黄緑色を呈していた。
【００４２】
次に、回収した大腸菌BL21(DE3)株を、5mM EDTA及び1mM PMSFを含有する緩衝液Aで懸濁した後、超音波処理を施して溶菌した。次いで、4℃、10000×gで30分間遠心分離した。ここで、遠心分離によって得られた上清画分（以下、上清Aとよぶ）が鮮やかな黄緑蛍光色を呈していることを確認した。得られた上清画分の電気泳動パターンを図２におけるレーン１に示す。
【００４３】
次に、上清AにSephadex G-200を最終濃度で2.5％加え、ローテーター上で4℃を維持して30分間放置した。その後、4℃、2000×gで20秒間遠心分離することによって、沈殿画分としてSephadex G-200を回収した。次いで、回収したSephadex G-200に過剰量の緩衝液Aを加えてよく混合し、その後、同条件の遠心分離を行って沈殿画分としてSephadex G-200を再び回収した。この洗浄処理を5回繰り返すことによって、Sephadex G-200に非特異的に吸着した共雑タンパク質を除去した。
【００４４】
次に、洗浄処理後のSephadex G-200を緩衝液Aに懸濁し、分子量18000のデキストラン（SIGMA社製）を10mg/mlとなるように添加し、よく混合した。その後、4℃、2000×gで20秒間遠心分離することによって、Sephadex G-200を沈殿させ、黄緑蛍光色を呈する上清を回収した。回収した上清を、SDS-PAGE/CBB染色（図２におけるレーン２）及びデンシトメトリーで解析したところ、融合タンパク質の純度は95%を越えていることが判った。
【００４５】
５．他の例
GFPの代わりに赤色性蛍光タンパク質（Red fluorescent protein）を目的タンパク質とした以外は、上述した例と同様にして融合タンパク質を精製した。最終的に回収した上清をSDS-PAGE/CBB染色により解析したところ、図２におけるレーン3に示すように、融合タンパク質が極めて高純度に精製できたことが判った。
【００４６】
６．融合タンパク質の吸着量の検討
Sephadex G-200に対する融合タンパク質の吸着量を検討した。具体的には、Abo, H.ら J. Bacteriol. 173: 989-996, (1991)に記載されているグルコシルトランスフェラーゼ（GTF）とDBDとをそれぞれ、従来公知の手法により精製し、所定の濃度の溶液をそれぞれのタンパク質について調製する。そして、緩衝液Aで懸濁した各種容量のSephadex G-200とタンパク質とを混合する。混合溶液をローテーター上で4℃に維持した状態で30分間放置し、その後、4℃、2000×gで60秒間遠心分離することによって、Sephadex G-200を沈殿させ、上清を回収した。
【００４７】
回収した上清に含まれるタンパク質濃度を、BIO-RAD PROTEIN ASSAY(BIO-RAD社製)を用いて測定した。そして、Sephadex G-200を混合しないで測定したタンパク質濃度と回収した上清におけるタンパク質濃度との差から、Sephadex G-200に吸着したタンパク質量を算出した。Sephadex G-200に結合したタンパク質量とSephadex G-200の量との関係を図３に示す。
【００４８】
図３から、デキストランビーズ（Sephadex G-200）1mlあたり、GTFは30μmole（4.1mg）が吸着し、DBDは70μmole（2.1mg）が吸着することが判った。また、インキュベーション時間を３時間として同様な実験を行ったところ、GTFは103μmol（14.2mg）、DBDは97μmol（2.9mg）が吸着した。これらの結果より、上述した手法によって、デキストランビーズに対して融合タンパク質を十分に吸着させることができ、当該融合タンパク質の精製を十分に行えることを立証することができた。
【００４９】
７．共存する試薬の影響
デキストランビーズに融合タンパク質を吸着させるに際して上清Aに各種試薬が存在した場合、吸着特性に如何なる影響があるかを検討した。具体的には、デキストランビーズとしてSephadex G-100を使用し、各種試薬を含む上清A中でSephadex G-100に対するDBDの吸着率を測定した。結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
0003673852.tif 000002
【００５１】
表１から判るように、各種試薬を含んだ状態であってもSephadex G-100に対するDBDの吸着率はほとんど低下していない。それどころか、0.1%Tween20を除く各種試薬を上清Aに含ませた場合、Sephadex G100に対するDBDの吸着率は向上している。このことから、デキストランビーズに融合タンパク質を吸着させるに際して緩衝液Aに各種試薬が存在した場合、融合タンパク質の吸着率を向上させることができ、より多量の融合タンパク質を精製することができることが判った。
【００５２】
８．混合時間と精製効率との関係
上清Aに含まれる融合タンパク質をデキストランビーズに吸着させるに際して、上清Aにデキストランビーズを混合した後のインキュベーション時間と融合タンパク質の回収率との関係を検討した。具体的には、デキストランビーズとしてSephadex G-100を使用し、インキュベーション時間を0〜15時間に変化させ、それぞれの場合で回収した融合タンパク質量を測定した。上清Aに含まれる融合タンパク質の全量に対する回収できた融合タンパク質の量を百分率で算出した。結果を図４に示す。
【００５３】
この図４から判るように、インキュベーション時間が長くなるのに応じて、融合タンパク質の回収率が向上している。また、インキュベーション時間を十分に設定することによって、融合タンパク質の70%以上を回収できることが判った。この結果から、上述した方法によれば、宿主細胞で発現した融合タンパク質を高収率で回収できることが明らかとなった。
【００５４】
９．融合タンパク質の溶出に用いるデキストランの検討１
デキストランビーズに吸着した融合タンパク質を溶出させる際に使用するデキストランの濃度について検討した。具体的には、融合タンパク質を吸着させたSephadex G-200を含む緩衝液Aに添加する分子量18000のデキストラン（SIGMA社製）の濃度を変化させ、それぞれの濃度で溶出させた融合タンパク質量を測定した。結果を図５に示す。
【００５５】
この図５から判るように、分子量18000のデキストランの濃度を高くするほど、融合タンパク質をより多量に溶出させることができる。特に、デキストランの濃度を20mg/ml以上とした場合には、融合タンパク質をほぼ最大に溶出することができることが判った。
【００５６】
１０．融合タンパク質の溶出に用いるデキストランの検討２
デキストランビーズに吸着した融合タンパク質を溶出させる際に使用するデキストランの分子量について検討した。具体的には、融合タンパク質を吸着させたSephadex G-100を含む緩衝液Aに、様々な分子量のデキストランを添加し、デキストランの分子量と融合タンパク質の回収率との関係を検討した。このとき、デキストランの分子量は、1KDa（Fluka社製）、5KDa（Fluka社製）、10KDa（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、18.1KDa（SIGMA社製）、70KDa（Fluka社製）、150KDa（Fluka社製）、500KDa（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、2000KDa（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、5000KDa（polyscience社製）のものを用いた。結果を図６に示す。
【００５７】
図６から判るように、分子量が５〜７０ｋＤａのデキストランを使用した場合には、融合タンパク質の回収率が高い値を示している。この結果から、Sephadex G-100から融合タンパク質を効率よく精製するには、分子量５〜７０ｋＤａのデキストランを使用することが好ましいことが判った。
【００５８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、デキストラン結合ドメインを付加タグとしてを用いることによって、溶出剤として生理活性物質を用いることなく、目的とするタンパク質を迅速に精製することが可能なタンパク質の精製方法を提供できる。
【００５９】
【配列表】
0003673852.tif 000003
0003673852.tif 000004
0003673852.tif 000005
0003673852.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で作製した発現ベクターの構築を説明するための図である。
【図２】上清A（レーン１）、溶出したGFP-DBD融合タンパク質を含む上清（レーン２）及び赤色蛍光-DBD融合タンパク質（レーン３）のSDS-PAGE写真である。
【図３】Sephadex G-200に結合したタンパク質量とSephadex G-200の量との関係を示す特性図である。
【図４】インキュベーション時間と融合タンパク質の回収率との関係を示す特性図である。
【図５】デキストランの濃度と溶出されたタンパク質量との関係を示す特性図である。
【図６】デキストランの分子量と融合タンパク質の回収率との関係を示す特性図である。
【図１】
0003673852.tif 000007
【図２】
0003673852.tif 000008
【図３】
0003673852.tif 000009
【図４】
0003673852.tif 000010
【図５】
0003673852.tif 000011
【図６】
0003673852.tif 000012