(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質および生物学的性質を有する精製ダニアレルゲン。
１）ダニ培養中の排泄物抽出液を分子量１０ｋＤ以上とそれ以下とに分画し、得られた分子量１０ｋＤ以上の画分を、サイズ４．４×７０ｃｍのウルトロゲルＡｃＡ５４カラムにチャージして、生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、ボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分群であり、かつ全溶出画分を４つに大別した場合の１番目の画分群（ＨＭ１）を得、該ＨＭ１を、４．４×７０ｃｍのセファローズ６Ｂカラムにチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、全溶出画分を３つに大別した場合の２番目の画分群（ＨＭ１−２）を得、得られたＨＭ１−２を、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にチャージし、素通りした画分に含まれる成分である、
２）約９０％の糖質を含む糖蛋白質である、
３）分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００である、
４）アレルゲン活性を有する。
【請求項２】
下記の理化学的性質および生物学的性質を有する精製ダニアレルゲン。
１）ダニ培養中の排泄物抽出液を分子量１０ｋＤ以上とそれ以下とに分画し、得られた分子量１０ｋＤ以上の画分を、サイズ４．４×７０ｃｍのウルトロゲルＡｃＡ５４カラムにチャージして、生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、ボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分群であり、かつ全溶出画分を４つに大別した場合の１番目の画分群（ＨＭ１）を得、該ＨＭ１を、４．４×７０ｃｍのセファローズ６Ｂカラムにチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、全溶出画分を３つに大別した場合の２番目の画分群（ＨＭ１−２）を得、得られたＨＭ１−２を、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にチャージし、０．１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いることにより溶出される画分に含まれる成分である、
２）約８３％の糖質を含む糖蛋白質である、
３）分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００である、
４）アレルゲン活性を有する。
【請求項３】
下記の理化学的性質および生物学的性質を有する精製ダニアレルゲン。
１）ダニ培養中の排泄物抽出液を分子量１０ｋＤ以上とそれ以下とに分画し、得られた分子量１０ｋＤ以上の画分を、サイズ４．４×７０ｃｍのウルトロゲルＡｃＡ５４カラムにチャージして、生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、ボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分群であり、かつ全溶出画分を４つに大別した場合の１番目の画分群（ＨＭ１）を得、該ＨＭ１を、４．４×７０ｃｍのセファローズ６Ｂカラムにチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、全溶出画分を３つに大別した場合の２番目の画分群（ＨＭ１−２）を得、得られたＨＭ１−２を、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にチャージし、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いることにより溶出される画分に含まれる成分である、
２）約７６％の糖質を含む糖蛋白質である、
３）分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００である、
４）アレルゲン活性を有する。
【請求項４】
下記の理化学的性質および生物学的性質を有する精製ダニアレルゲン。
１）ダニ培養中の排泄物抽出液を分子量１０ｋＤ以上とそれ以下とに分画し、得られた分子量１０ｋＤ以上の画分を、サイズ４．４×７０ｃｍのウルトロゲルＡｃＡ５４カラムにチャージして、生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、ボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分群であり、かつ全溶出画分を４つに大別した場合の１番目の画分群（ＨＭ１）を得、該ＨＭ１を、４．４×７０ｃｍのセファローズ６Ｂカラムにチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、全溶出画分を３つに大別した場合の２番目の画分群（ＨＭ１−２）を得、得られたＨＭ１−２を、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にチャージし、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いることにより溶出される画分に含まれる成分である、
２）約７１％の糖質を含む糖蛋白質である、
３）分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００である、
４）アレルゲン活性を有する。
【請求項５】
下記の理化学的性質および生物学的性質を有する精製ダニアレルゲン。
１）ダニ培養中の排泄物抽出液を分子量１０ｋＤ以上とそれ以下とに分画し、得られた分子量１０ｋＤ以上の画分を、サイズ４．４×７０ｃｍのウルトロゲルＡｃＡ５４カラムにチャージして、生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、ボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分群であり、かつ全溶出画分を４つに大別した場合の１番目の画分群（ＨＭ１）を得、該ＨＭ１を、４．４×７０ｃｍのセファローズ６Ｂカラムにチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画して、全溶出画分を３つに大別した場合の２番目の画分群（ＨＭ１−２）を得、得られたＨＭ１−２を、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にチャージし、１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いることにより溶出される画分に含まれる成分である、
２）約４８％の糖質を含む糖蛋白質である、
３）分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００である、
４）アレルゲン活性を有する。
【請求項６】
ダニ培養中の排泄物を飽和食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液により抽出処理し、得られた抽出液をゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の手法およびダニ患者血清ＩｇＧ、ＩｇＥを用いるＥＬＩＳＡの手法を組合せて分画することを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の精製ダニアレルゲンの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５いずれか記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はアレルゲン活性を有する精製ダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、その評価は今や確立されたものといえる。しかしながら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要とされる。
【０００３】
ダニアレルギー疾患については、屋内塵中のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種が重要であると報告されている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要ダニアレルゲンとしては、ダニ排泄物、ダニ虫体中に含有されている分子量24〜28kDの糖蛋白質（pI 4.6〜7.2)および分子量14.5〜20kDの蛋白質（pI 5〜8.3)等が報告されている[J. Immunol. : 125,587-592,(1980）／ J. Allergy Clin. Immunol. : 76,753-761,(1985)／ Immunology : 46,679-687,(1982）／ Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／ J. Allergy Clin. Immunol. : 75,686-692,(1985)等] 。
【０００４】
一方、本発明者らは、前記の主要ダニアレルゲンよりも高分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒスタミン遊離を誘発する成分が存在することを報告した（日本農芸化学会，62:411, 1988）。しかし、一部を除き、減感作治療用抗原として用いることができる程度までの精製は、未だなされていなかった。
【０００５】
ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験を併用するのが殆どであり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体価の測定値（相対値）をも併用する程度であって、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、屋内塵性ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが現状である。したがって、有効性及び安全性の観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、診断システムの確立が期待されている。
【０００７】
本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な新規な精製ダニアレルゲンを提供することにある。
即ち、本発明の目的は、ダニ培養中の排泄物から抽出しうる、アレルゲン活性を有する新規な精製ダニアレルゲンおよび当該新規な精製ダニアレルゲンの製造方法を提供すること、並びに新規なダニアレルギー疾患治療剤および新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的として、コナヒョウヒダニ排泄物の抽出液中のアレルゲンについて鋭意研究を重ねた。その結果、各種ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーとダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥ等を用いるＥＬＩＳＡ法とを組合せて分画することにより、各種の画分に含まれる糖蛋白質に強いアレルゲン活性を見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、下記の理化学的性質および生物学的性質を有する５種類の精製ダニアレルゲン、即ちＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍに関するものである。
【００１０】
（１）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．０１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約９０％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１１】
（２）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．１Ｂの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約８３％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１２】
（３）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ａの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約７６％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１３】
（４）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ｂの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約７１％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１４】
（５）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−１Ｍの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約４８％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１５】
また、本発明は、ダニ培養中の排泄物を飽和食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液により抽出処理し、得られた抽出液をゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の手法およびダニアレルギー患者血清ＩｇＧ、ＩｇＥを用いるＥＬＩＳＡ法の手法を組合せて分画することを特徴とする前記の精製ダニアレルゲンの製造方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は前記の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、ダニアレルギー疾患診断薬を提供する。
【００１７】
本発明において、各精製ダニアレルゲンは、それぞれ前記の▲１▼〜▲４▼の要件を満足する限り、単一の精製ダニアレルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンよりなるもの（すなわち、精製ダニアレルゲンの混合物の態様）のいずれでもよい。
【００１８】
以下、本発明の精製ダニアレルゲンについてより詳細に説明する。
即ち、本発明の精製ダニアレルゲンの性状は、次のとおりである。
（１）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約９０％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００１９】
（２）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．１Ｂ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約８３％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２０】
（３）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ａ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約７６％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２１】
（４）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ｂ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約７１％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２２】
（５）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−１Ｍ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約４８％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２３】
本発明の精製ダニアレルゲンの分子量は、セファローズ６Ｂゲル濾過法により測定する。糖含量が高いため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は不適当であった。
【００２４】
本発明の精製ダニアレルゲンのアミノ酸組成はすべて、次の操作により得られる。即ち、0.2%サンプル溶液２００μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解する。乾固させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミノ酸アナライザー（日立製作所）により定量する。
【００２５】
本発明の精製ダニアレルゲンの糖含量は、全中性糖をGlucose を標準としてフェノール硫酸法で定量した結果である。
【００２６】
アレルゲン活性については、ダニアレルギー患者に対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患者白血球ヒスタミン遊離試験、ドットブロットテスト等により判断する。
アナフィラキシー反応については、常法により、モルモットを免疫し、追加免疫時のアナフィラキシー反応について観察する。
【００２７】
本発明の精製ダニアレルゲンの製造方法としては、たとえば次のような方法が例示される。
ａ）粗ダニ排泄物抗原の調製
ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではないが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニのいずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で培養し、これを抽出処理する。
抽出処理は飽和食塩水および／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で30分間静置した後に、遠心分離(3000 rpm 、30分) を行い上清をプールする。この際、抽出溶媒としては他に、中程度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよい。例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。上清表面にダニ虫体が浮遊するのでこれを濾過して取り除く。プールした上清を濾過およびイオン交換水に対して透析したもの（粗ダニ排泄物抽出液）を出発材料とする。
次に、この粗ダニ排泄物抽出液を、例えば分子量１万カットの限外濾過膜（UF-20CS-10PS) に通し、この膜を通過しない高分子粗ダニ排泄物抗原と通過する低分子粗ダニ排泄物抗原に分画し、高分子粗ダニ排泄物抗原についてさらに分画を進める。
【００２８】
ｂ）高分子粗ダニ排泄物抗原から各精製ダニアレルゲンの調製
高分子粗ダニ排泄物抗原の分画は、
(i)  ダニアレルギー患者血清中のダニアレルゲンに特異的なIgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ排泄物抗血清、ウサギ抗ダニ排泄物抗体、排泄物抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) により測定することによる、各フラクションの抗原活性の測定(Immunochemistry: 8, 871,(1971))、 (ii) ウサギ抗ダニ排泄物抗血清を用いたラジオイムノアッセイによる、各フラクションの抗原活性の測定、
(iii)  皮内反応活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、
(iv) ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、
等のモニターの下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を適宜組み合わせて精製することができる。
【００２９】
例えば、具体的には高分子粗ダニ排泄物抗原をウルトロゲルＡｃＡ５４でゲル濾過する。その時の溶出液を、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性をＥＬＩＳＡ法によりモニターし、蛋白含量および２８０ｎｍの吸収をガイドに分画する。
強い皮内反応活性が認められる画分を、更にゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、デュアルモードクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精製手段を適宜組み合わせることにより本発明の精製ダニアレルゲンである活性成分を精製することができる。
【００３０】
例えば、まず、ウルトロゲルＡｃＡ５４で分画された各種の画分のうち、最も強い皮内反応活性を示した画分について、セファローズ６Ｂによるゲル濾過をさらに行い、溶出液を前記のようにＥＬＩＳＡ法により幾つかの画分に分画する。これらのうち、最も高い抗原活性を示す画分を用いてさらに精製を進める。
次には、一般に、イオン交換クロマトグラフィーを行うのが効果的である。本発明においては、アニオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーが効果的である。例えば、ＤＥＡＥ−トヨパールカラム（ｐＨ６．０リン酸緩衝液，１０ｍＭ−ＮａＣｌ）に活性画分をチャージし、ＮａＣｌ濃度を変えた同リン酸緩衝液を用いて溶出する。溶出液の分画は、ＥＬＩＳＡ法、蛋白質量、糖含有量等を指標として行う。
こうして得られる精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍの色および性状はそれぞれ白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のものである。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反応試験では、アナフィラキシー反応を誘発しないものである。
【００３１】
本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患治療剤として適用することができ、例えば減感作治療剤として有用である。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
【００３２】
前記の方法により精製された精製ダニアレルゲンは、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取するか、更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本減感作治療剤はそのままで、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を添加した配合剤として用いることができる。
【００３３】
本減感作治療剤は、通常の投与経路、例えば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。
更に、例えばトローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
【００３４】
本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血液、及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ精製ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量を測定する[ アレルギー：33,692,(1984) ／アレルギー：33,733,(1984)]。
【００３５】
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、
（i)  血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。
（ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
【００３６】
従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治療効果のモニターとしても有用である。
【００３７】
【表１】
0003729206.tif 000002
【００３８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
なお、以下の実施例において使用される各種分析方法については、一部を除き、実施例１０の末尾にまとめて記述する。
【００３９】
実施例１
高分子粗ダニ排泄物抗原の調製：
ラット、マウス、ハムスター用飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６±２℃、湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培地になるようにコナヒョウヒダニを飼育し、ダニ培養培地１００ｇに対して、飽和食塩水を１リットル加えてよく攪拌した。室温で３０分間静置した後、３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離を行った。この時、ダニ虫体は上清表面に浮遊するので、これを濾過して取り除いた。沈澱に再び飽和食塩水を加えて同じ操作を繰り返した。さらに沈澱に１０ｍＭリン酸緩衝液を１リットル加えて飽和食塩水の場合と同じ操作を繰り返した（２回）。得られた抽出液を水道水に対して一夜透析し、分画分子量１万の限外濾過（膜はUF-20CS-10PS，東ソー) により分子量１０ｋＤ以上とそれ以下に分画した。各分画を濃縮し凍結乾燥して、それぞれ高分子粗ダニ排泄物抗原および低分子粗ダニ排泄物抗原とした。
ダニ培養物２２．５ｋｇから、高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）１２４ｇを得た。これは、低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）を約０．２％含んでいた。
【００４０】
実施例２
高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）のウルトロゲルＡｃＡ５４による分画：
実施例１で得られた高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）９９０ｍｇ（濃度９９０ｍｇ／３０ｍｌ生理食塩水）をウルトロゲルＡｃＡ５４カラム(IBF, サイズ 4.4×70ｃｍ）にチャージし、溶出液に生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画した。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量を、そして２８０ｍμにおける吸光度をそれぞれ測定した。
これらの結果から、図１、２に示すように、これらのフラクションをＨＭ１〜ＨＭ４に分画した。ＨＭ抗原３０ｇから、ＨＭ１が６．４７ｇ、ＨＭ２が７．３６ｇ、ＨＭ３が７．４８ｇ、およびＨＭ４が０．２２ｇ得られた。
この４画分について、ダニアレルギー患者に対する皮内反応活性を調べた結果を表２に示した。
【００４１】
【表２】
0003729206.tif 000003
【００４２】
表２から明らかなように、ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３、およびＨＭ４のすべてがダニ陽性患者に対し強い皮内反応活性を示したが、患者のＩｇＧ、ＩｇＥともに強い反応をしめしたＨＭ１についてさらに精製を進めた。
【００４３】
実施例３
ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による分画：
ウルトロゲルＡｃＡ５４での分画で活性の高かったＨＭ１（９９０ｍｇ／３０ｍｌ生理食塩水）をセファローズ６Ｂゲルカラム（４．４×７０ｃｍ）にチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分けた。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量を、さらに２８０ｍμにおける吸光度をもそれぞれ測定した（図３および４）。
【００４４】
これらの結果より、図３および４の上部に示すように、ＨＭ１（５．６ｇ）からＨＭ１−１（０．７３ｇ）、ＨＭ１−２（２．８７ｇ）、およびＨＭ１−３（０．５７ｇ）の３つの分画を得た。このうち、主画分であるＨＭ１−２についてさらに精製を進めた。
【００４５】
実施例４
ＤＥＡＥトヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる、ＨＭ１−２画分からの精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍの調製：
ＨＭ１−２について、ＤＥＡＥトヨパールとＣＭトヨパールのいずれに吸着するかを調べたところ、ＤＥＡＥトヨパールに吸着することが確認されたので、これを用いてイオン交換クロマトグラフィを行った。
【００４６】
まず、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にＨＭ１−２（２００ｍｇ）をチャージし、溶出は、０．１ＭのＮａＣｌ、０．３ＭのＮａＣｌ、または１．０ＭのＮａＣｌを含む同一の緩衝液を用いて、流速３０ｍｌ／時で行い、素通り画分、０．１Ｍ画分、０．３Ｍ画分、１．０Ｍ画分に分画した。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量、２８０ｍμにおける吸光度をそれぞれ測定した（図５および６）。
【００４７】
図５のヒストグラムは、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定したウサギＩｇＧに対する各フラクションの抗原性を示す。また、図中の各フラクションの総蛋白質量および中性糖量は、フォリンローリー法およびフェノール硫酸法により測定した。
図６のヒストグラムは、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した患者のＩｇＧおよびＩｇＥに対する各フラクションの抗原性を示す。
【００４８】
患者ＩｇＧおよびＩｇＥおよびウサギＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡ法の結果より、同一画分に二つのピークをもつ０．１Ｍ画分および０．３Ｍ画分についてはそれらを各ピークで分け、それぞれＡおよびＢとした。ＨＭ１−２の２．６７ｇから素通り画分が０．５１ｇ、０．１Ａ画分が０．２７ｇ、０．１Ｂ画分が０．２９ｇ、０．３Ａ画分が０．５３ｇ、０．３Ｂ画分が０．３７ｇ、１．０Ｍ画分が０．１６ｇ得られた。
【００４９】
実施例５
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍについてのダニアレルゲン活性およびアナフィラキシー誘発試験：
本発明の精製ダニアレルゲンは、下記の実験によりアレルゲン活性を有し、アナフィラキシー誘発性は無いことが判明した。
【００５０】
実験例１
Balb/Cマウス（４週令）３匹の腹腔内に、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの各100 μg をフロイントの完全アジュバンド（Difco)と混合して注入することにより、０週目に初回免疫をした。追加免疫は２週目と４週目に行った。
マウスの血清中の抗ＨＭ１−２−ｅｆｆ抗体価等は、明らかな上昇が認められ、充分な免疫原性が認められた。従って、いずれも遮断抗体誘導能があり、治療用抗原として用いることができると判断された。
【００５１】
実験例２
モルモット２匹の腹腔内に、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの各水溶液１mgをAlumに加えて注入することにより、０週目に初回免疫をし、追加免疫は３週目に行った。対照は、モルモット１匹の腹腔内にAlumを加えた生理食塩水を同様に注入した。モルモットの血清中の抗ＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの抗体価は、明らかな上昇を認め、充分な免疫原性が認められた。しかし、３週目の追加免疫の直後の観察では、アナフィラキシー症状は全く認められなかった。このことから、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍにはアナフィラキシー誘発性はいずれも無いと判断された。
【００５２】
実験例３
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのアレルゲン活性をダニアレルギー患者に対する皮内反応試験で検定した。皮内反応試験の方法は、後述のとおりである。その結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
0003729206.tif 000004
【００５４】
実験例４
ドットブロットテスト（Ｄｏｔ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ｔｅｓｔ）
ＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍの０．００１％、０．０１％または０．１％溶液の各１μｌをニトロセルロースフィルム（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  ニトロセルロース、０．４μ、アマシャム社製）にブロットし、５％スキムミルク、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液に室温で１時間浸漬した。ついで、ＩｇＧ染色のために、ダニアレルギー患者のプール血清の１００倍スキムミルク希釈液をシート上に注ぎ、冷所で一夜インキュベートした。ＩｇＥ染色のためには、同血清の１０倍希釈液が用いられた。
【００５５】
このシートを０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を含む水溶液またはビオチンと結合したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体を含むＰＢＳＴ溶液中に室温で１時間反応した。ついで、後者については、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを含むＰＢＳＴ溶液に室温で１時間浸漬した。ＰＢＳＴで完全に洗浄した後、免疫反応をしたスポットは、シートを０．０３％の過酸化水素、０．０３％塩化ニッケル、０．０６％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含む５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）とともにインキュベートすることにより、検出した。
シートを乾燥した後、着色したスポットをポジティブの対照およびネガティブの対照として用いたｆ１（ダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ１）、ｆ２（ダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ２）およびＢＳＡと比較した。
【００５６】
その結果を表４に示す。表中、＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ着色した抗原濃度が０．１％、０．０１％および０．００１％であることを示す。
驚くべきことに、この実験では、代表的なダニアレルゲンであるｆ１、ｆ２よりもはるかに強い抗原性をＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのすべてが示した。
【００５７】
【表４】
0003729206.tif 000005
【００５８】
実施例６
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍのアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により測定した。
白血球ヒスタミン遊離試験は、後述のように公知の方法に準じて行った[ アレルギー：33，692,(1984)] 。その結果を図７に示す。精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのいずれにもヒスタミン遊離活性を認めた。
【００５９】
実施例７
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍについて、中性糖量はフェノール硫酸法により、また蛋白質量はフォリンローリー法によりそれぞれグルコース換算又はウシ血清アルブミン換算で表示し、その重量比を表５に示す。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
表５から明らかなように、これらの精製ダニアレルゲンは、ＨＭ１−２−１Ｍを除き、５０％以上の糖を含む点で極めて特徴的である。
【００６２】
実施例８
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍについてのアミノ酸組成分析：
各精製ダニアレルゲンについて、蛋白質の構成アミノ酸を後述の方法で分析した。その結果を表６に示す。
【００６３】
【表６】
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【００６４】
実施例９
減感作治療用抗原製剤の調製：
0.5 ％フェノールを添加した 0.9％食塩水を溶媒とし、実施例４で得られた精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液とした。
【００６５】
実施例１０
ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製：
ハンクス緩衝液を溶媒とし、実施例４で得られた精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とした。
【００６６】
以下に、上記実施例で使用した各種分析方法および特殊な材料について述べる。
（１）ゲルクロマトグラフィー
０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４（カラムサイズ４．４×７０ｃｍ）又はセファローズ６Ｂ（カラムサイズ４．４×７０ｃｍ）に、遠心分離で不溶物を除いた高分子粗ダニ排泄物抗原溶液（３．３％）を３０ｍｌ添加し、生理食塩水を２ｍｌ／分の流速で流し、３２ｍｌずつのフラクションに分画した。溶出液は、ＵＶ２８０ｎｍの吸収でモニターした。
【００６７】
（２）イオン交換クロマトグラフィー
１ＮのＨＣｌ、水、１ＮのＮａＯＨ、水、１Ｎのリン酸で順次洗浄したＤＥＡＥ−トヨパール６５０ｇを詰めたカラム（３．０×１３ｃｍ）を、１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化する。これに、同緩衝液に溶解したサンプルを加え、素通りする画分が溶出したのち、ＮａＣｌ濃度を変えて溶出を行った。
【００６８】
（３）ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）
ゲルクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの際の各フラクションの抗原活性、及びマウス、ウサギの抗体価の測定を本法で行った。
最初にＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（９６穴）に、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーでの各フラクション５０μｌ、またはマウス、ウサギの抗体価の測定の時には免疫抗原を重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）に溶かしたものを、５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。
溶液を吸引除去し、ウエルを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、２００μｌの１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液をウエルに入れ、３７℃で１時間インキュベートした（ブロッキング）。
【００６９】
ウエルを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用希釈用緩衝液で適当な濃度に希釈した血清（患者血清、ウサギ抗血清）を５０μｌ入れ室温で、１時間インキュベートした。
ウエルを洗浄後、希釈用緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標識の第二抗体溶液を５０μｌ入れ、室温で１時間インキュベートした。
ウエルを洗浄後、基質として０．１％のＡＢＴＳを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．３％過酸化水素を１００μｌ加え室温で反応させた。
反応時間は、１〜４０分（発色の度合いで決定）。続けて、１０ｍＭアジ化ナトリウム溶液を１００μｌ加えることにより反応を停止し、溶液の４２０ｎｍの吸収を測定した。
【００７０】
（４）皮内反応試験
サンプルを０．９％塩化ナトリウム、０．５％フェノール溶液に溶解しツベルクリン用注射器で、２０μｌをダニアレルギー患者の前腕、屈側皮内に注射し、約１５分後に現れた、赤疹、膨疹の長径、短径を測定し、その平均値で検定を行った。検定の基準は表７のとおりである。
但し、紅斑が１９ｍｍ以下でも膨疹が８ｍｍ以上ならば、陽性とする。
【００７１】
【表７】
0003729206.tif 000008
【００７２】
（５）白血球ヒスタミン遊離試験
イオン交換クロマトグラフィーの各フラクションのアレルゲン活性の測定を本法で行った。
１．洗浄全血球浮遊液の調製法
血液サンプル１０ｍｌを遠心分離（１４００ｒｐｍ、１０分）にかけ、血球と血漿に分ける。血球は、５０ｍｌの遠心管に入れ、ハンク緩衝液を４０ｍｌ加えて遠心洗浄（１４００ｒｐｍ、１０分）を行う。上清はアスピレーターで吸引除去し、得られた血球部分を後二回ハンク緩衝液で洗浄する。この血球をハンク緩衝液で１０ｍｌに定容し洗浄全血球浮遊液とする。
【００７３】
２．ヒスタミン遊離試験法
抗原画分をハンク緩衝液に溶かし、用いたい抗原濃度の４倍濃度の抗原液を調製する。この抗原液１００μｌにハンク緩衝液を１００μｌ、上記１で調製した洗浄全血球浮遊液を２００μｌ加え、３７℃で３０分インキュベートする。
ヒスタミンが遊離した上清を、１４００ｒｐｍ、１０分の遠心分離によって２００μｌ採取し、この上清中に６０％過塩素酸を１０μｌ加え撹拌後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）によって、除タンパクした上清１４０μｌを採取する。これをヒスタミン定量ＨＰＬＣにかけ、上清中に含まれるヒスタミンを定量する。
【００７４】
血球中に含まれる全ヒスタミン量測定のために、全血球浮遊液２００μｌに直接６０％過塩素酸４０μｌを加えて、血球を破壊する。これを、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離にかけ、得られた上清中に含まれるヒスタミンをヒスタミン定量ＨＰＬＣで測定し、総ヒスタミン量とする。また、非特異的に遊離するヒスタミン量を測定するために、抗原液の代わりにハンク緩衝液を用いてヒスタミン遊離試験を行い、コントロールとする。
【００７５】
（６）フェノール硫酸法（中性糖の定量法）
常法により、サンプル０．２ｍｌを試験管にとり、７％フェノール水を０．１ｍｌ加え、１０分間室温でインキュベートし、これに８５％濃硫酸１．２ｍｌを氷冷しつつ加えたのち、１００℃で１０分間加熱し、その後冷水中に３０分放置したのち、ＯＤ４９０ｎｍの吸収を測定する。
【００７６】
（７）フォリンローリー法（蛋白質の定量法）
常法により、サンプル０．２ｍｌを試験管にとり、アルカリ性銅塩溶液を１ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートする。これに１Ｎフェノール試薬液１ｍｌを加え、撹拌した後、室温で３０分間インキュベートし、ＯＤ７５０ｎｍの吸収を測定する。
【００７７】
（８）蛋白質のアミノ酸分析
０．２％サンプル溶液２００μｌを１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ2 置換をした密封試験管内で、１１０℃、２４時間加水分解した。乾固させた後少量の水を加え再び乾固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１ｍｌに溶解しアミノ酸アナライザー（（株）島津製作所製）により定量した。
【００７８】
（９）ウサギ抗血清
０．２％サンプル溶液５００μｌとフロイントの完全アジュバント５００μｌとを混合し乳化したものを、一週置きに、ウサギの前足の付け根のリンパ節付近に注射した。採血は、毎週、耳の静脈から行った。８週間免疫を続け、ＥＬＩＳＡ法により抗体価の上昇を確認した後、最終免疫を行い、その三日後に、耳から吸引により全採血を行った。
【００７９】
【発明の効果】
本発明の精製ダニアレルゲンは有効性および安全性の観点から有用な減感作治療用抗原であり、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤・予防剤として有用である。また、本発明の精製ダニアレルゲンは、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２において得られた、高分子粗ダニ排泄物抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過による溶出パターンを示す。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図２】図２は、図１と同様に、実施例２において得られた、高分子粗ダニ排泄物抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過による溶出パターンを示す。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図３】図３は、実施例３において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による溶出パターンを示したものである。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図４】図４は、図３と同様に、実施例３において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による溶出パターンを示したものである。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図５】図５は、実施例４において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１−２画分のＤＥＡＥ−トヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを示したものである。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図６】図６は、図５と同様に、実施例４において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１−２画分のＤＥＡＥ−トヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを示したものである。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図７】図７は、実施例６において得られた、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ  、およびＨＭ１−２−１Ｍについてのダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験の結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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