(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
死亡昆虫のアセチルコリンエステラーゼの残存活性を測定し、該残存活性値から死亡後の期間を判定することを特徴とする、試料中に存在する昆虫の死亡時期の判定法。
【請求項２】
昆虫が液体試料中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体試料がビールである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
昆虫がハエまたはゴキブリである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の背景〕
【産業上の利用分野】
本発明は、昆虫の死亡時期の判定方法に関する。より詳細には、飲食品（たとえばビールその他の飲料、固形食品）等の試料中に混入した昆虫の死亡時期（ひいては混入時期）を判定するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
死亡昆虫が食品に混入していた場合、食品製造メーカーは消費者から苦情を受けることになる。その際、いつの時点で昆虫が混入したかの判定が、最大の問題である。特に、昆虫混入後の製造工程に加熱工程がないものについては混入時期の判定が非常に困難であった。
混入が認められた場合、製品の製造中に混入した場合と製品使用時（飲食時）に混入した場合によって、その取扱いが大きく異なる。つまり、前者の場合はメーカーが全ての製造工程を確認し再度このような混入事故がないようにすべく努力する必要があるのに対し、後者の場合はメーカー側の責任はなく消費者にその事実を伝えれば良いことになる。
本目的のために酵素化学的ないくつかの方法が提案されている。これらは、「食品・薬品の混入異物対策」（（株）新思想社発刊、発刊日１９８４年１２月１０日）の第１８２〜１９０頁に詳しく記載されている。それらの方法は昆虫が体内に持っている酵素活性を指標にするものであるが、その際に使用する酵素を選定するためには多くの条件をクリアしなくてはならない。この文献で提案されているカタラーゼおよびコリン・エステラーゼにおいてもいくつかの問題点がある。カタラーゼの場合は活性値が死後再度増加するという問題があり、またコリン・エステラーゼの場合は死後２０日以上経過しても活性の低下が少なく、耐久性が強すぎるという問題点がある。
【０００３】
〔発明の概要〕
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、昆虫の死亡時期を正確に判定するのに好適な酵素を指標とする新しい判定方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、昆虫体内に存在する数多くの酵素の中から（ｉ）適度な耐久性、（ii）昆虫個体間でのバラツキの少なさ、(iii）ビールのような酸性水中でも活性が残存すること、（iv）酵素活性が復活しないこと、を選択の条件として検討した結果、アセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣｈＥ）がその条件を満足させ実用化できることを見出し、この知見をもとに本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明による昆虫の死亡時期の判定法は、死亡昆虫のアセチルコリンエステラーゼの残存活性を測定し、該残存活性値から死亡後の期間を判定することにより、試料中に存在する昆虫の死亡時期を判定することを特徴とするものである。
【０００５】
〔発明の具体的説明〕
本発明方法は、上述のようにアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）残存活性を指標として試料中（試料内または表面）に存在する昆虫の死亡時期を判定するものであり、従来用いられていた他の酵素を指標とする方法と比較して極めてバラツキの少ない正確な判定をすることができる。
本発明方法における昆虫としては、一般にこれに属する任意のもの（たとえばハエ、ゴキブリ、ハチ、アリなど）が酵素測定の対象となりうるが、この中でも特に製造食品（代表的にはビール）への混入の苦情に関して主要なハエおよびゴキブリが重要となる。
本発明において対象となる試料は特に製造食品であるが、このような食品としてはビールをはじめその他の飲料、さらにはゼリーなどの固形食品でも使用可能である。
【０００６】
以下、本発明方法に従って昆虫の死亡時期を判定するための好ましい分析操作手順について説明する。
まず試料に含まれる昆虫を取り出し、洗浄液（好ましくは純水）で洗浄する。通常風乾後、適当な緩衝液中でホモジネートして抽出液とする。この際、ＡＣｈＥ濃度が高い頭部のみを切断して試料とする方がより好ましい。また、緩衝液としてはｐＨ６．５〜７．５の範囲で塩濃度が１００ｍＭ以上のものが好ましい。このようなものとして例えば食塩とトリトンＸ１００を含んだリン酸カリウム−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）があげられるが、この場合塩濃度が１００ｍＭ以上で１％（容量％）以上の濃度のトリトンＸ−１００を含んだ緩衝液であれば、酵素活性測定に支障を与えない限り成分の配合割合あるいは他の成分の添加など多少の変更があっても同等の緩衝液として使用することができる。
上述のようにして得られた抽出液中のＡＣｈＥの活性を測定し、この値を、あらかじめ同一昆虫、同一測定条件で死後経時的に酵素活性を求めておいた検量線（図１および２を参照されたい）に照らし合わせて死後の日数を判定すれば良い。
ＡＣｈＥの活性測定は、ＡＣｈＥ活性量を正確に測定できるものであれば任意の方法を利用することができる。そのような方法の具体例としては、例えばＣ14でアセチル基をラベルしたヨウ化アセチルコリンを抽出液と反応させて生じたＣ14酢酸をヨウ化アセチルコリンと分離し、このＣ14酢酸を定量することによりＡＣｈＥ活性量を測定する方法（The Journal of Neuroscience,3(9),1818-1823(1983 年）参照）などがあげられる。なお、酵素（ＡＣｈＥ）反応は通常２０〜３７℃の範囲の温度条件下で行なわれるが、上述のように同一条件のもとに検量線が作成される限り常温（２５℃）程度の温度条件でも正確な酵素活性測定が可能となる。また、用いる方法あるいは測定条件等によって、昆虫の重量による個体差が大きい場合は、蛋白含量あるいは重量等による補正をすればよい。
本発明においては、上述のようにして得られたＡＣｈＥ活性値を、あらかじめ作成しておいた検量線（たとえば図１および２参照）と照合させることにより、昆虫の死亡時期を正確に判定しひいてはその混入時期を判定することが可能となる。
【０００７】
【実施例】
以下は、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するものであり、これにより本発明が限定されるものではない。
実施例１
製品ビールに死亡した直後のハエを入れ、ふたをして２５℃下で保存した。２、４、６、８、１０日後にそれぞれ１０匹ずつ、１５、２０、２４、３０、６０日後にそれぞれ５匹ずつ取り出してサンプルとした。分析は１匹ずつ行なった。
まず、純水で洗浄して風乾した後、下表に示した抽出バッファー６０μＬを加えて全体が均一になるまでホモジネートして抽出液とした。
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抽出液を活性に応じて５μＬあるいは１０μＬとって、全体で１０μＬとなるように前記抽出バッファーで希釈した。これに表１に示した反応混合液を９０μＬ加えて３７℃、３０分間反応させた後、氷冷してから０．１ｍＭエセリン（関東化学社製）１ｍＬを添加、混合して反応を終了させた。この反応終了液をイオン交換カラムに通した。カラムはカチオン交換ＡＧ５０Ｗ−Ｘ−１２、Ｈ型、１００〜２００メッシュ（バイオ・ラッド社製）を２Ｎ水酸化ナトリウム中で４５分間、２５℃においた後、ｐＨ７．０に調製して直径０．５×０．８ｃｍポリプレップカラムに詰めたものである。カラムには反応終了液１ｍＬを流した後さらに０．１ｍＭエセリン１ｍＬを２回流した。計３ｍＬの流出液から１．５ｍＬを取って、５ｍＬのアトムライト（ニューイングランドニュークリア社製）と混合してシンチレーションカウンター（ヒューレットパッカード社製）で測定した。測定結果を図１に示した（図１はそれ自体検量線でありうる）。
昆虫個体間でのバラツキが少なく、保存開始時より１５日ころまで直線的に活性が低下し、その後の活性は非常に弱くなった。したがって、本分析法により昆虫の死亡後１５日以内であれば正確にその死亡時期が判定でき、その結果、昆虫の混入時期が判明できることになる。
【０００８】
実施例２
ハエの代わりにゴキブリを用いて、実施例１に準じて、１、２、３、６および３０日後のＡＣｈＥ残存活性を測定した。なお、重量の個体差が大きかった為、タンパク量による補正を行なった。バイオラッド社製プロテインアッセイを用いて、測定サンプル中のタンパク量を測定し、それぞれのＡＣｈＥ活性値をこの測定値で割って補正値を求めた。
この補正値の結果を図２に示した（図２はそれ自体検量線でありうる）。ゴキブリでもハエ同様に死亡時期の特定が可能であることが明らかとなった。
なお、上記の実施例１および２は酸性溶液であるビールを試料とする条件で酵素測定を行なっており、酵素活性保持という観点からはかなり劣悪な条件であると考えることができる。それにもかかわらず本条件で測定可能であったことから、他の飲料あるいは他の食品を試料とする場合についても測定できることは明らかである。
【０００９】
【発明の効果】
本発明によれば、試料中の昆虫の死亡時期を判定するにあたり、特にアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を指標として用いたことにより、すなわち、適度な耐久性、昆虫個体間でのバラツキの少なさ、ビールのような酸性水中でも活性が残存すること、酵素活性が復活しないことなどの好適な特質を有するアセチルコリンエステラーゼを指標として用いたことにより、従来用いられていた他の酵素を指標とする方法と比較して極めてバラツキの少ない正確な死亡時期の判定、ひいては混入時期の判定を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】昆虫がハエの場合（実施例１）におけるアセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の経時的変化を示すグラフ。
【図２】昆虫がゴキブリの場合（実施例２）におけるアセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の経時的変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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