(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、抗脱毛症剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗癌剤等による脱毛に対して有効なペプチドを含有する、抗脱毛症剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の治療のために、抗癌剤が単独で、あるいは外科的除去及び放射線治療と共に広く用いられている。しかしながら、適切な抗癌剤の使用は癌の治療あるいは延命の上で有効とされる一方で、ある程度の副作用をもたらすことが避けられないのが現状である。脱毛症もその副作用の一つとしてかなり高い頻度で発生する。脱毛症は生命に直接関わらず、また身体的苦痛を与えないとはいえ、患者の心理状態に及ぼす影響はきわめて大きく、臨床の場においてその軽減が望まれている。
【０００３】
大豆由来のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕで表されるペプチド（ＭＩＴＬ）およびＭＩＴＬの配列を分子内に含むいくつかのペプチドが、免疫系の賦活作用（貪食促進作用、活性酸素促進作用、腫瘍致死因子分泌促進作用）を有する（特開平７−２２４０９３及び得開平８−７３３７４）ことが知られていた。本発明者らは上記ペプチドが、抗癌剤であるｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（エトポシド）による脱毛を抑制することを、過去に報告した（特開平９−２４９５３５）。
【０００４】
育毛を目的とする食品としては、アマチャヅルとカキノハと昆布の抽出物を含む食品が知られている。また、抗癌剤の副作用としての脱毛症状を抑制、改善または予防する事が可能な、ウーロン茶抽出物を有効成分とする経口脱毛症剤が知られている（特開平９−３０９８４０）。また、経口の育毛医薬品として、ＴｙｐｅＩＩ５αリダクターゼ阻害剤であるフィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）が知られている（Ｊ．ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９８）３９，５７８−５８９）。しかしながら、当薬剤は男性ホルモンの代謝に作用する薬物であることから、副作用が懸念されており、使用上の注意や制限が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、脱毛に対して、特に抗癌剤の副作用としての脱毛に対して有効であり、かつ安全性と有効性が高い、新規な抗脱毛剤を提供することである。個人差によって、最も有効な薬剤が異なる場合があるので、新たな抗脱毛剤を提供することにより、より広範な対応が可能となることが期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した様に、本発明者らは大豆蛋白質から得られる免疫促進性ペプチドであるＭＩＴＬが抗癌剤による、脱毛を防ぐことを報告した。その作用機構の解明の過程で、ＭＩＴＬによる免疫促進作用がｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）レセプターを介していること、およびｆＭＬＰそのものが抗脱毛作用を有していることを、初めて見出した。ｆＭＬＰは走化性ペプチドとして知られている既知の物質であるが、本発明以前に抗脱毛作用は知られていなかった。また、ｆＭＬＰのＰｈｅをＴｒｐに置換したペプチドである、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）もまた、抗脱毛作用を有していた。上記でいうＭｅｔはメチオニン、Ｌｅｕはロイシン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｔｒｐはトリプトファンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）の誘導体である新規ペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）である。この新規ペプチドは、特に抗癌剤の副作用である脱毛を防止する事に有効である。上記の脱毛防止効果のために、ＭＬＷを有効成分として含有する抗脱毛症剤を、調製することができる。ＭＬＷが抗脱毛作用を有する事はこれまで知られていなかったので、本発明によりこれまでにない機構による脱毛剤を提供することが可能である。
【０００８】
本発明の機能性ペプチドを併用投与することにより、副作用である脱毛を防止するべき抗癌剤として、植物アルカロイドのポドフィリン系化合物である、エトポシドを挙げることができる。また、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン等の他の植物アルカロイド系抗癌剤、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、テガフール、カルモフール、シトシンアバビノシド、シクロシチジン、６−メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、６−チオグアニン等の代謝拮抗系抗癌剤、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、ニムスチン、ラニムスチン、カルボコン等のアルキル化剤系抗癌剤、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、アクラシノマイシンＡ、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ3 、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ネオカルチノスタチン、オーロモマイシン等の抗生物質系抗癌剤、その他、Ｌ−アスパラギナーゼ、シスプラチン、エストラムスチン、ピシバニール、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、レバミゾール、ベスタチン、ホルフェニシノール等の抗癌剤も、本発明の機能性ペプチドを併用投与して脱毛を防止する抗癌剤として挙げることができる。
【０００９】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００１０】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１１】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１２】
次に医薬品として用いる場合について説明する。
ＭＬＷの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよく、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。ｆＭＬＰ及びｆＭＬＷについては腸管から吸収されないために、経口投与には適さないという性質を有する。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１３】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１４】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１５】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１６】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１７】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００１８】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１９】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２０】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００２１】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、新規ペプチドについて以下のように合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｌｅｕと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。
【００２２】
得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｌｅｕをカップリングさせた方法と同様にＦｍｏｃ−Ｍｅｔをカップルさせて、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−樹脂を得た。さらにｆｏｒｍｙｌ化する場合はこの樹脂と１ｍｍｏｌの蟻酸と１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを上記同様に反応させた。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて１時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２３】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ＭＬＷ）を得た。
本品をプロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ｆＭＬＷ）も同様に得た。なお、ｆＭＬＰについてはシグマ社の市販品を使用した。
【００２４】
（抗脱毛活性の評価）
検体として６日齢のＳＤ系ラットを用いた。この検体を以下の（Ａ）〜（Ｄ）の４群に分けた。各群には母親を一匹つけ、自由に哺乳させた。母親には日本クレア製の固形食ＣＥ２を自由に接種させ、飲水も自由にさせた。薬剤の投与は１日１回、朝１０時より１１時の間に行った。尚、ペプチドの投与は、腹腔内投与（ｉｐ）の場合には生後１０日目から４日間、経口投与（ｐｏ）の場合には生後６日目から８日間というプロトコールに従って、１日１回行った。エトポシドは、２０ｍｇ／ｍｌの注射薬を０．９％生理食塩水にて２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、腹腔内に生後１１日目から３日間連続して投与した。
（Ａ）エトポシド（日本化薬製  ラステット：抗癌剤）  単独投与群
（Ｂ）エトポシドとｆＭＬＰ  併用投与群
（Ｃ）エトポシドとＭＬＷ    併用投与群
（Ｄ）エトポシドとｆＭＬＷ  併用投与群
【００２５】
上記４群の投与検体について、２０日齢に、肉眼下観察により脱毛度を検討した。脱毛度の判定は、下記の基準に従って行った。試験結果を表１に示す。なお、表１に示す結果は、各濃度においてｎ＝４で試験を行った平均値である。
脱毛判定基準
０：０〜１０％脱毛
１：１１〜３０％脱毛
２：３１〜５０％脱毛
３：５１〜７０％脱毛
４：７１〜９０％脱毛
５：９１〜１００％脱毛
【００２６】
【表１】
0003723838.tif 000002
【００２７】
表１の結果より、既知物質であるｆＭＬＰは、１０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与により、抗癌剤エトポシドによる脱毛を完全に抑制した。また、新規に合成した物質であるＭＬＷは、３０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与又は１００ｍｇ／ｋｇの経口投与で、ほぼ同様の効果を示した。またｆＭＬＷは、１０ｍｇ／ｋｇ×４日の腹腔内投与により、やはりエトポシドによる脱毛を完全に抑制した。尚、ｆＭＬＰの抗脱毛効果は、ＩＬ−１（インターロイキン１）阻害剤であるＫ（Ｄ）ＰＴを腹腔内投与する事により阻害された。この知見は、ｆＭＬＰの抗脱毛効果はＩＬ−１を介していることを示唆している。
【００２８】
【発明の効果】
ｆＭＬＰ及びその誘導体ペプチドであるＭＬＷが、抗癌剤による脱毛を抑制する効果を有する事が示された。よって本発明により、そのペプチドを用いて新規な抗脱毛剤を提供することができる。