(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である 二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液からなる化学発光用試薬。
【請求項２】
二種以上の緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、エタノールアミン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
二種以上の緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
化学発光物質が、ルミノール又はその誘導体である、請求項１〜３の何れかに記載の試薬。
【請求項５】
化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である 二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いることを特徴とする、パーオキシダーゼ活性又は過酸化水素の測定方法。
【請求項６】
二種以上の緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、エタノールアミン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
二種以上の緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項５記載の測定方法。
【請求項８】
化学発光物質が、ルミノール又はその誘導体である、請求項５〜７の何れかに記載の測定方法。
【請求項９】
化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である 二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いることを特徴とする、パーオキシダーゼ結合蛋白質の測定方法。
【請求項１０】
(1)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、(2)過酸化水素含有緩衝液と、(3)pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キット。
【請求項１１】
(1)と(3)で用いられるpＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、エタノールアミン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
(1)と(3)で用いられる緩衝剤が、ほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸及び炭酸塩から選ばれるものである、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
化学発光物質が、ルミノール又はその誘導体である、請求項１０〜１２の何れかに記載のキット。
【請求項１４】
請求項１〜４の何れかの試薬を用いて化学発光反応を行わせることを特徴とする、化学発光増強方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の利用分野】
本発明は、例えば血清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を測定する際等に使用される化学発光用試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】
化学発光を利用した特定成分の分析・測定は、その測定感度が高いため特に微量成分の測定の際に良く利用されている。最近では、この測定感度を更に上げるために測定時間を長くして、その間の総発光量を測定することも良く行われている。
【０００３】
しかしながら、化学発光による発光量は、時間と共に減少するのが一般的であるので、測定時間を長くしても総発光量はそれ程大きくならない場合、言い換えれば、測定感度はそれ程上昇しない場合も多々あった。
【０００４】
尚、化学発光を利用した測定用試薬中には、化学発光の感度を増加させるために通常増感剤と呼ばれる成分が添加されている場合もあるが、上記の如き現象は、このような成分を添加した試薬を用いた場合でも生じていた。
【０００５】
そのため、簡便に且つ効果的に化学発光の総発光量を更に増加させ、感度の高い測定を可能ならしめる化学発光用試薬の開発が望まれている現状にある。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、その課題は、簡便で且つ効果的な化学発光用試薬並びにこれを利用した測定方法の提供にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記した如き課題を解決するため、本発明は、(1)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含んでなる、pＨ9.0〜10.0の溶液からなる化学発光反応用試薬、の発明である。
【０００８】
また、本発明は、(2)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いることを特徴とする、パーオキシダーゼ活性、過酸化水素又はパーオキシダーゼ結合蛋白質の測定方法の発明である。
【０００９】
更にまた、本発明は、(3) a)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キットの発明である。
【００１０】
更にまた、本発明は、(4) ▲１▼化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、▲２▼過酸化水素含有緩衝液と、▲３▼pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キット。
【００１１】
更にまた、本発明は、(5)上記(1)の試薬を用いて化学発光反応を行うことを特徴とする、化学発光増強方法の発明である。
【００１２】
即ち、本発明者らは、上記した如き課題を解決するために鋭意研究の結果、従来の化学発光用試薬の緩衝剤を、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤とし、そのpＨを9.0〜10.0に調整することにより、従来よりも更に化学発光の総発光量を増加させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明に係る化学発光物質としては、通常この分野で用いられるものであれば全て使用可能であり特に限定されないが、その具体例としては、例えばルミノ−ル、例えばイソルミノ−ル，アミノエチルイソルミノ−ル，アミノエチルエチルイソルミノ−ル，アミノプロピルイソルミノ−ル，アミノブチルイソルミノ−ル，アミノヘキシルエチルイソルミノ−ル等のルミノ−ル誘導体等の、アルカリ性下、酸化されて化学発光を生じさせるルミノール系含窒素複素環式化合物や、例えばアクリジニウム塩、ルシゲニン等の酸化されて化学発光を生じさせるアクリジン系含窒素複素環式化合物等が挙げられるが、好ましくはルミノ−ルまたその誘導体である。これらの使用濃度としては、通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すればよく、特に限定されないが、具体的には、使用される化学発光物質の種類により若干異なるが、通常化学発光を行わせる際の濃度として１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは３０μＭ〜３ｍＭ、より好ましくは１００μＭ〜１.５ｍＭの範囲から適宜選択される。
【００１４】
本発明に係る増感剤としては、通常この分野で用いられるものであれば全て使用可能であり特に限定されないが、例えばp-ヨードフェノール、4-ヒドロキシケイ皮酸、4-(4'-チアゾリル)フェノール等のフェノ−ル誘導体、例えば1-ブロモナフトール等のナフト−ル誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシフェニル)オキサゾール等のオキサゾ−ル誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾール等のチアゾ−ル誘導体、例えば4-(イミダゾール-1-イル)フェノール等のイミダゾ−ル誘導体等が挙げられる。また、これらの使用濃度としては、通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すればよく、特に限定されないが、具体的には、使用される増感剤の種類により若干異なるが、通常化学発光を行わせる際の濃度として０.１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１００μＭ〜５ｍＭ、より好ましくは０.２ｍＭ〜２ｍＭの範囲から適宜選択される。尚、これら増感剤は二種以上組み合わせて用いても良い。
【００１５】
また、本発明に係る緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものの中から、pＫa値が20℃で8.0〜10.5、好ましくは8.3〜10.0であるものを二種以上適宜選択して用いれば足りる。pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤の具体例としては、例えばほう酸塩、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールアミン等のアミン系緩衝剤、例えば5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BICINE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩衝剤、炭酸塩等が挙げられ、より好ましいものとしては例えばほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、炭酸塩等が挙げられる。これらの使用濃度としては、通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すれば足りる。具体的には、使用される緩衝剤の種類により若干異なるが、通常化学発光を行わせる際の２種以上の緩衝剤の合計した濃度として0.05Ｍ〜1.5Ｍ、好ましくは0.75Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは0.1Ｍ〜0.6Ｍの範囲から適宜選択される。また、これら２種の緩衝剤のモル比としては、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的を達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、通常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜選択される。
尚、化学発光の増強効果を考慮すると、緩衝剤のpＫa値は、20℃で8.3〜10.0であることが望ましい。
【００１６】
本発明の化学発光用試薬は、例えば以下の如くして調製される。
即ち、上記した如き化学発光物質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如き濃度となるように溶解させた、pＨが9.0〜10.0の溶液を調製すれば、本発明の試薬となる。
【００１７】
本発明の化学発光用試薬は、化学発光物質が酸化されて化学発光を生じさせる化合物を含むものであるので、当該試薬と、例えば過酸化水素、過塩素酸塩、酸素、過マンガン酸塩、ヨウ素等の酸化剤と例えばパーオキシダーゼ、例えばヘモグロビン等のヘム化合物等のパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせて反応させることにより、化学発光を生じさせることができる。
【００１８】
従って、本発明の化学発光用試薬に更に上記した如き酸化剤を含有させることにより、パーオキシダーゼ活性の測定に使用できる試薬となる。
【００１９】
尚、このような試薬により測定可能なパーオキシダーゼとしては、その由来は特に限定されず、例えば西洋ワサビ、パイナップル、イチジク等の植物に由来するもの、例えばカビ、酵母等の微生物に由来するもの、例えば動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が好ましく挙げられる。また、活性測定を行う際のパーオキシダーゼは、それ自体（未修飾のもの）であっても、例えば抗原、抗体等と結合させたもの等でも何れにても良く、特に限定されない。
【００２０】
これら試薬を用いて、例えば西洋ワサビ等に由来するパーオキシダーゼ活性を測定するには例えば以下の如く行えばよい。
即ち、上記した如き化学発光物質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如き濃度に、また、適当量の酸化剤、例えば過酸化水素を0.1〜10ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭとなるように溶解させた、pＨ9.0〜10.0の溶液を発光溶液とする。次いで、これとパーオキシダーゼを含有する試料とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定する。別に、発光溶液と所定のパーオキシダーゼ活性を有する標準液とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定し、パーオキシダーゼ活性と化学発光量との関係を表す検量線を作成しておき、得られた試料についての化学発光量を検量線に当てはめ、試料中のパーオキシダーゼ活性を求める。
【００２１】
また、抗体等と結合したパーオキシダーゼ活性を検出するには、例えば以下の如く行ってもよい。
即ち、測定対象物質を含有する試料をニトロセルロ−ス膜にブロットし乾燥する。その後、これをマスキング処理した後、測定対象物質に対する抗体を反応させる。膜を洗浄後、その抗体をと結合し得る抗体と結合したパーオキシダーゼを反応させる。洗浄後、膜を前記発光溶液に浸し、例えばポラロイドフイルム、Ｘ線フィルム等のフィルム上で露光させ、生じる発光像よりパーオキシダーゼ活性を検出することができる。
【００２２】
また、本発明の化学発光用試薬と上記した如きパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせて用いれば、例えば過酸化水素等の酸化物の測定を行うことが可能となる。
このような試薬を用いて過酸化水素を測定するには例えば以下の如く行えばよい。
即ち、上記した如き化学発光物質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如き濃度に、また、適当量のパーオキシダーゼ活性を有する物質、例えばパーオキシダーゼを0.1〜２u/mlとなるように溶解させた、pＨ9.0〜10.0の溶液を発光溶液とする。次いで、これと過酸化水素を含有する試料とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定する。別に、発光溶液と所定濃度の過酸化水素を含有する標準液とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定し、過酸化水素濃度と化学発光量との関係を表す検量線を作成しておき、得られた試料についての化学発光量を検量線に当てはめることにより、試料中の過酸化水素濃度を求めることができる。尚、測定対象となる過酸化水素の由来としては特に限定されないが、例えばオキシダーゼ反応により生成されたもの等が好ましく挙げられる。
【００２３】
また、本発明の試薬を用いれば、例えば血清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を高感度に且つ精度良く測定することが可能となる。
即ち、上述した如く本発明の試薬を用いれば、パーオキシダーゼ活性や過酸化水素を高感度に且つ精度良く測定し得るので、従来のパーオキシダーゼを標識酵素として用いる酵素免疫測定法や、オキシダーゼ反応を利用した微量成分の測定法に本発明の試薬を組み合わせて用いれば、これら公知の方法により測定可能な微量成分については、より高感度に且つ精度良く測定することが可能となるのである。
【００２４】
本発明の試薬を用いて化学発光を行わせた場合、反応後の化学発光量は従来のものよりも著しく増大し、しかもその効果は長時間持続するため、測定時間を長くした場合にはその総発光量は従来のものよりも著しく増大する。化学発光物質、増感剤及び、そのうちの少なくとも一種のpＫa値が8.3〜10.5である二種以上の緩衝剤を含んでなる、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いて化学発光を行わせるとこのような現象が起こるとは全く意外なことであった。
【００２５】
本発明の、a)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キットは、パーオキシダーゼ活性を測定するために好適なものであり、その構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたとおりである。
【００２６】
本キットの、a)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液とは、通常１〜10：１〜５、好ましくは１〜４：１〜２の割合で混合されたものが、パーオキシダーゼ活性測定用試液として用いられる。
【００２７】
上記a)の溶液中の化学発光物質の濃度としては、通常２μＭ〜100ｍＭ、好ましくは60μＭ〜40ｍＭ、より好ましくは200μＭ〜６ｍＭであり、増感剤の濃度としては、通常0.2μＭ〜100ｍＭ、好ましくは200μＭ〜20ｍＭ、より好ましくは0.4μＭ〜10ｍＭであり、緩衝剤の濃度としては、二種以上の緩衝剤の濃度の合計として通常0.05〜1.5Ｍ、好ましくは0.075〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。
【００２８】
また、上記b)の過酸化水素含有緩衝液としては、過酸化水素を0.2ｍＭ〜100ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜10ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは8.5〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールアミン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BICINE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度としては通常  0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
【００２９】
尚、上記a)の試薬とb)の試薬のpＨは、a)の試薬とb)の試薬を前記した如き所定のの割合で混合して調製される発光溶液のpＨが9.0〜10.0となるように適宜選択される。また、このようにして調製された発光溶液中の２種の緩衝剤のモル比としては、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的を達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、通常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜選択される。
【００３０】
また、本発明の、▲１▼化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、▲２▼過酸化水素含有緩衝液と、▲３▼pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キットも、パーオキシダーゼ活性を測定するために好適なものであり、その構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたとおりである。
【００３１】
本キットの、▲１▼化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、▲２▼過酸化水素含有緩衝液、▲３▼pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液とは、通常１〜10：１〜５：１〜５、好ましくは１〜４：１〜２：１〜２の割合で混合されたものが、パーオキシダーゼ活性測定用試液として用いられる。
【００３２】
上記▲１▼の溶液中の化学発光物質の濃度としては、通常３μＭ〜150ｍＭ、好ましくは90μＭ〜60ｍＭ、より好ましくは300μＭ〜９ｍＭであり、増感剤の濃度としては、通常0.3μＭ〜150ｍＭ、好ましくは300μＭ〜30ｍＭ、より好ましくは0.6μＭ〜15ｍＭであり、緩衝剤の濃度としては、通常0.05〜1.5Ｍ、好ましくは0.075〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良い。
【００３３】
また、上記▲２▼の過酸化水素含有緩衝液としては、過酸化水素を0.15ｍＭ〜15ｍＭ、好ましくは0.75ｍＭ〜7.5ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは8.5〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールアミン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BICINE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度としては通常  0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
【００３４】
更にまた、上記▲３▼の、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液としては、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を通常0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.5Ｍ含むpＨが8.5〜11.5、好ましくは9.0〜11.0の溶液が挙げられる。尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良い。
【００３５】
尚、上記▲１▼の試薬と▲２▼の試薬と▲３▼の試薬のpＨは、▲１▼の試薬と▲２▼の試薬と▲３▼の試薬を前記した如き所定の割合で混合して調製される発光溶液のpＨが9.0〜10.0となるように適宜選択される。また、このようにして調製された発光溶液中の２種の緩衝剤のモル比としては、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的を達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、通常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜選択される。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３６】
【実施例】
実施例１．
（発光溶液）
▲１▼トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.1Ｍ、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸(pＫa=8.06)0.4Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲２▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、炭酸ナトリウム(pＫa=10.28) 0.08Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲３▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.35Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
（操作法）
パーオキシダーゼ（POD）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（兎由来、ダコー社製）の所定希釈溶液の１μｌ(POD含量で537.5pg〜2.1pg)をニトロセルロ−ス膜上にブロットし室温で乾燥後、所定の発光溶液に浸した。１分後にニトロセルロース膜を取り出し、ポリ塩化ビニリデンフィルムで包み、20分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後に暗室にてＸ線フイルムに対して５分露光させた。このフィルムを現像、定着し、その発光像より検出可能なＰＯＤ量を求めた。
結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0003702545.tif 000002
表１の結果から、本発明の試薬を用いることにより、長時間に渡って化学発光を維持することができ、６時間経過後でも67.2pgのＰＯＤを検出可能であることが判る。
【００３８】
比較例１．
（発光溶液）
▲１▼トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲２▼ほう酸(pＫa=9.28)を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
（操作法）
発光溶液として上記のものを用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可能なＰＯＤ量を求めた。
緩衝剤としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いて得られた結果を表２に、緩衝剤としてほう酸を用いて得られた結果を表３に夫々示す。
示す。
【００３９】
【表２】
0003702545.tif 000003
【００４０】
【表３】
0003702545.tif 000004
表２及び３の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5である緩衝剤を一種のみ用いた場合は、長時間に渡って化学発光を維持することができず、本発明に比較してＰＯＤの検出感度が大幅に低下することが判る。
【００４１】
比較例２．
（発光溶液）
▲１▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリエタノールアミン(pＫa=10.78) 0.15Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲２▼トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.1Ｍ、トリエタノールアミン(pＫa=10.78) 0.15Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲３▼クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.04Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲４▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.2Ｍ、りん酸(pＫa=7.22) 0.1Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
（操作法）
発光溶液として上記のものを用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可能なＰＯＤ量を求めた。
結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】
0003702545.tif 000005
表４の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5である緩衝剤を一種とそれ以外の緩衝剤とを組み合わせて用いた場合は、長時間に渡って化学発光を維持することができず、本発明に比較してＰＯＤの検出感度が大幅に低下することが判る。
【００４３】
比較例３．
（発光溶液）
▲１▼ε-アミノカプロン酸(pＫa=10.98) 0.1Ｍ、トリエチルアミン(pＫa=10.78) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲２▼クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリエチルアミン(pＫa=10.98) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
（操作法）
発光溶液として上記のものを用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可能なＰＯＤ量を求めた。
結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
0003702545.tif 000006
表５の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5の範囲外である緩衝剤を二種組み合わせて用いた場合は、長時間に渡って化学発光を維持することができず、本発明に比較してＰＯＤの検出感度が大幅に低下することが判る。
【００４５】
実施例２．
（発光溶液）
▲１▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.4Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
▲２▼ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2  2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。
（操作法）
所定の発光溶液300μｌとパーオキシダーゼ（POD）標識抗兎ＩgＧ抗体（豚由来、ダコー社製、パーオキシダーゼ含量 134pg/μl）１μlとを混合し、所定時間経過後の化学発光量(Kcpm)をルミノメ−タ（アロカ社製、ＢＬＲ−２０１型）で測定した。
結果を表６に示す。
【００４６】
【表６】
0003702545.tif 000007
表６の結果から明らかな如く、本発明の発光溶液である▲１▼を用いた場合には、長時間に渡って化学発光を維持することができるが、従来の発光溶液である▲２▼を用いた場合には時間の経過と共に化学発光量が激減することが判る。
【００４７】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、例えば血清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を測定する際等に使用される化学発光用試薬を提供するものであり、本発明を利用することにより、簡便に且つ効果的に総化学発光量を従来のものよりも著しく増大させることができ、例えば生体由来試料中の微量成分の測定等をより精度良く実施し得るという効果を奏するので、斯業に貢献するところ大なる発明である。