(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器の培養面に接着して培養されている細胞の厚さ寸法を測定する方法であって、
前記培養容器内に前記細胞の厚さ寸法より深い深さに第１の培養液を貯留した状態で、前記細胞および前記培養液を貫通して所定の波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を取得する第１の撮影ステップと、
前記培養容器内に前記細胞の厚さ寸法より深い深さに、前記第１の培養液とは屈折率が異なる第２の培養液を貯留した状態で、前記細胞および前記培養液を貫通して前記波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を取得する第２の撮影ステップと、
前記第１の培養液および／または前記第２の培養液の未知の屈折率を算出する培養液屈折率算出ステップと、
前記第１、第２の撮影ステップにおいて取得された位相情報と前記第１の培養液および前記第２の培養液の屈折率とを用いて細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、
該屈折率推定ステップにおいて推定された細胞の屈折率を用いて厚さ寸法を算出する厚さ寸法算出ステップとを備え、
前記第１の撮影ステップおよび／または前記第２の撮影ステップが、既知の屈折率を有する基準物質を前記培養面に配置して該基準物質および前記培養液を貫通して透過した光を撮影することにより、前記基準物質を含む位置の位相情報および前記基準物質を含まない位置の位相情報をも取得し、
前記培養液屈折率算出ステップが、前記第１の撮影ステップおよび／または前記第２の撮影ステップにより取得された前記基準物質を含む位置の位相情報および前記基準物質を含まない位置の位相情報を用いて前記未知の屈折率を算出する細胞の厚さ寸法を測定する方法。
【請求項２】
前記屈折率推定ステップが、前記第１の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第１の平均値と、前記第２の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第２の平均値とを演算する位相平均演算ステップと、
該位相平均演算ステップにより演算された各細胞の位相情報の平均値の比率に基づいて、各細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、により構成されている請求項１に記載の細胞の厚さ寸法を測定する方法。
【請求項３】
前記屈折率推定ステップが、前記第１の撮影ステップにおいて取得された各細胞の最大位相情報の第１の平均値と、前記第２の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第２の平均値とを演算する位相平均演算ステップと、
該位相平均演算ステップにより演算された各細胞の位相情報の平均値の比率に基づいて、各細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、により構成されている請求項１に記載の細胞の厚さ寸法を測定する方法。
【請求項４】
前記第２の培養液が、前記第１の培養液に、屈折率の異なる他の培養液を注入することにより調製されている請求項１から３のいずれかに記載の細胞の厚さ寸法を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞厚さ測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養細胞を含む全体画像から細胞画像を抽出する方法として、例えば、特許文献１に示される方法が知られている。
この方法は、顕微鏡において、細胞のフォーカス画像に対して、光軸方向両方向にフォーカス位置をずらして取得された２枚のデフォーカス画像により、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対となる２つのコントラスト像からなる画像の差演算を行うものである。
また、フォーカス画像と２枚のデフォーカス画像とを用いて、物体の厚さ分布を測定する方法も知られている（例えば、特許文献２参照。）。物体を透過もしくは反射する光と参照光とを干渉させ、生じた干渉縞から物体の厚さ分布を測定する方法も知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２１８３７９号公報
【特許文献２】オーストラリア特許出願公開第２００４２０１１０９Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の厚さ分布を測定する方法では、細胞の屈折率が既知であるとして、位相情報から細胞の厚さ寸法を演算するものであるが、実際に、培養液を貯留した培養容器内に収容されている細胞は、培養中に、その状態が変化することにより屈折率が変動することが考えられる。そのため、屈折率が既知であるとして演算した細胞の厚さ寸法は、屈折率変動による誤差を含み、精度よく算出することができないという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養の進行に伴い細胞の屈折率が変化したり、未知の屈折率を持つ細胞種においても、細胞の厚さ分布を精度よく測定することができる細胞厚さ測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、培養容器の培養面に接着して培養されている細胞の厚さ寸法を測定する方法であって、前記培養容器内に前記細胞の厚さ寸法より深い深さに第１の培養液を貯留した状態で、前記細胞および前記培養液を貫通して所定の波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を取得する第１の撮影ステップと、前記培養容器内に前記細胞の厚さ寸法より深い深さに、前記第１の培養液とは屈折率が異なる第２の培養液を貯留した状態で、前記細胞および前記培養液を貫通して前記波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を取得する第２の撮影ステップと、前記第１の培養液および／または前記第２の培養液の未知の屈折率を算出する培養液屈折率算出ステップと、前記第１、第２の撮影ステップにおいて取得された位相情報と前記第１の培養液および前記第２の培養液の屈折率とを用いて細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、該屈折率推定ステップにおいて推定された細胞の屈折率を用いて厚さ寸法を算出する厚さ寸法算出ステップとを備え、前記第１の撮影ステップおよび／または前記第２の撮影ステップが、既知の屈折率を有する基準物質を前記培養面に配置して該基準物質および前記培養液を貫通して透過した光を撮影することにより、前記基準物質を含む位置の位相情報および前記基準物質を含まない位置の位相情報をも取得し、前記培養液屈折率算出ステップが、前記第１の撮影ステップおよび／または前記第２の撮影ステップにより取得された前記基準物質を含む位置の位相情報および前記基準物質を含まない位置の位相情報を用いて前記未知の屈折率を算出する細胞の厚さ寸法を測定する方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、第１の撮影ステップにおいて、透明な材質からなる培養容器の下方または上方から所定の波長を有する光を入射させ、培養容器、培養容器の培養面に接着させられて培養されている細胞およびその上方を覆っている第１の培養液を貫通して、上方または下方において透過してきた光を検出することにより、細胞および第１の培養液の屈折率に応じて位相が変化した光を撮影した位相情報画像が取得される。また、第２の撮影ステップにおいて、第１の培養液とは屈折率の異なる第２の培養液に交換して第１の撮影ステップと同様にして位相情報画像が取得される。
【０００８】
そして、位相平均演算ステップにおいて、第１、第２の撮影ステップにおいて取得された各位相情報画像から各細胞の最大位相の平均値が演算される。これらの位相情報は、それぞれ、細胞と培養液との屈折率差、光の波長および細胞の厚さ寸法の乗算により求められるので、屈折率推定ステップにおいて、これらの位相情報の平均値の比率を求め、第１の培養液および第２の培養液の既知の屈折率を用いることにより細胞の屈折率を推定することができる。したがって、厚さ寸法算出ステップにより、前記屈折率推定ステップにおいて推定された細胞の屈折率、光の波長、培養液の屈折率および各部の位相情報に基づいて、細胞の各部の厚さ寸法を精度よく算出することができる。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、培養過程において、細胞の状態が変化することにより細胞の屈折率が変動したり、未知の屈折率を持つ細胞種であっても、これを精度よく推定して細胞の厚さ寸法を求めるので、細胞の屈折率が常に一定のものとして厚さ寸法を算出する方法と比較して、より精度よく細胞の厚さ寸法を測定することができる。
上記発明においては、前記屈折率推定ステップが、前記第１の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第１の平均値と、前記第２の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第２の平均値とを演算する位相平均演算ステップと、該位相平均演算ステップにより演算された各細胞の位相情報の平均値の比率に基づいて、各細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、により構成されていることとしてもよい。
上記発明においては、前記屈折率推定ステップが、前記第１の撮影ステップにおいて取得された各細胞の最大位相情報の第１の平均値と、前記第２の撮影ステップにおいて取得された各細胞の位相情報の第２の平均値とを演算する位相平均演算ステップと、該位相平均演算ステップにより演算された各細胞の位相情報の平均値の比率に基づいて、各細胞の屈折率を推定する屈折率推定ステップと、により構成されていることとしてもよい。
【００１０】
上記発明においては、前記第２の培養液が、前記第１の培養液に、屈折率の異なる他の培養液を注入することにより調製されていることとしてもよい。
このようにすることで、第１の培養液を培養容器から抜き出すことなく、屈折率の異なる第２の培養容器を培養容器内に貯留でき、工程を省略して短時間に細胞の厚さ寸法を測定することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培養の進行に伴い細胞の屈折率が変化したり、未知の屈折率を持つ細胞種であっても、細胞の厚さ分布を精度よく測定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る細胞厚さ測定方法（細胞の厚さ寸法を測定する方法）について、図１（ａ）ないし図１（ｃ）および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞厚さ測定方法は、図１（ａ）および図２に示されるように、透明なシャーレ状の培養容器１の培養面（底面）１ａに接着性の細胞Ｓを接着させるとともに、細胞Ｓを完全に浸漬させるように屈折率が既知の第１の培養液Ｌ１を貯留して位相情報画像を取得する第１の撮影ステップＳ１、第２の培養液Ｌ２に交換する培養液交換ステップＳ２、細胞Ｓを完全に浸漬させるように屈折率が既知の第２の培養液Ｌ２を貯留して位相情報画像を取得する第２の撮影ステップＳ３、位相情報より求めた各細胞の位相の平均値を演算する位相平均演算ステップＳ４、位相情報の平均値の比率に基づいて、細胞Ｓの屈折率を推定する屈折率算出ステップＳ５および、推定された屈折率に基づいて細胞Ｓの各部の厚さ寸法を算出する厚さ算出ステップＳ６を備えている。
【００１３】
第１の撮影ステップＳ１は、図１（ａ）に示されるように、第１の培養液Ｌ１を貯留した培養工程のいずれかの時点で、これら培養液Ｌ１、細胞Ｓおよび培養容器１を貫通して所定の波長の光Ｌを透過させ、透過した光ＬをＣＣＤのような２次元的な撮像素子２によって撮影することにより行われる。撮影ステップＳ１は、フォーカス画像と２枚のデフォーカス画像とを用いた従来の方法によって、位相情報の２次元的な分布を示す第１の位相情報画像を取得するようになっている。
【００１４】
ここで、第１の位相情報画像は、第１の培養液Ｌ１の深さ寸法に応じたオフセット分等を含んでいるので、これを除去しておくようになっている。例えば、第１の撮影ステップＳ１において取得された位相情報画像を２値化処理することにより、細胞Ｓとそれ以外の領域とに区画する。そして、細胞Ｓ以外の領域における位相を第１の位相情報画像全体から減算することにより、図１（ｂ）に示されるように、細胞Ｓ以外の領域において位相がゼロとなり、細胞Ｓの領域のみに位相の分布を有する新たな第１の位相情報画像が生成されるようになっている。なお、図１（ｂ）には、細胞Ｓの特定位置における第１の位相情報ΔφＳ１が示されている。
【００１５】
培養液交換ステップＳ２は、貯留されていた第１の培養液Ｌ１を排出し、第１の培養液Ｌ１を洗浄し、第１の培養液Ｌ１とは異なる既知の屈折率を有する第２の培養液Ｌ２を供給することにより行われるようになっている。
【００１６】
第２の撮影ステップＳ３は、培養液Ｌ１，Ｌ２が異なる以外は、第１の撮影ステップＳ１と同様の条件により撮影を行い、位相情報の２次元的な分布を示す第２の位相情報画像を取得するようになっている。また、取得された第２の位相情報画像を画像処理することにより、図１（ｃ）に示されるように、培養液Ｌ２の深さに依存するオフセット分等の位相を除去した新たな第２の位相情報画像が生成されるようになっている。なお、図１（ｃ）には、細胞Ｓの特定位置における第２の位相情報ΔφＳ２が示されている。
【００１７】
位相平均演算ステップＳ４は、第１の位相情報画像および第２の位相情報画像のそれぞれにおける細胞Ｓ部分の位相情報の平均値Δφ１ａ，Δφ２ａを演算するようになっている。
ここで、第１の培養液Ｌ１の屈折率ｎＬ１、第２の培養液Ｌ２の屈折率ｎＬ２、細胞Ｓの厚さ寸法の平均値ｄＳａ、細胞Ｓの屈折率ｎＳ、透過させる光Ｌの波長λ、第１の位相情報の平均値Δφ１ａおよび第２の位相情報の平均値Δφ２ａとすると、以下の式（１）および式（２）の関係が成立する
Δφ１ａ＝（ｎＬ１−ｎＳ）×λ×ｄＳａ                                （１）
Δφ２ａ＝（ｎＬ２−ｎＳ）×λ×ｄＳａ                                （２）
【００１８】
細胞屈折率算出ステップＳ５は、式（１）の両辺を式（２）の両辺で除算することにより、以下の式（３）を得る。
Δφ１ａ／Δφ２ａ＝（ｎＬ１−ｎＳ）／（ｎＬ２−ｎＳ）                （３）
【００１９】
この式（３）を変形すると、細胞Ｓの屈折率ｎＳが、式（４）により算出されるようになっている。
ｎＳ＝（ｎＬ１×Δφ２ａ−ｎＬ２×Δφ１ａ）／（Δφ２ａ−Δφ１ａ）  （４）
【００２０】
したがって、式（４）により算出された細胞Ｓの屈折率ｎＳを用いることにより、厚さ算出ステップＳ６においては、式（５）により、細胞Ｓの各部の厚さ寸法を算出するようになっている。
ｄＳ＝Δφ１／（（ｎＬ１−ｎＳ）×λ）                                （５）
【００２１】
このように、本実施形態に係る細胞厚さ測定方法によれば、屈折率の異なる２種類の培養液Ｌ１，Ｌ２を交換して撮影することにより取得した２つの位相情報画像に基づいて、細胞Ｓの屈折率ｎＳを推定し、推定された細胞Ｓの屈折率ｎＳを用いて、細胞Ｓの各部の厚さ寸法を算出する。したがって、培養過程において細胞Ｓの状態が種々変化することにより細胞Ｓの屈折率ｎＳが変動しても、細胞Ｓの各部の厚さ寸法を精度よく算出することができるという利点がある。
【００２２】
なお、本実施形態においては、第１の撮影ステップＳ１と第２の撮影ステップＳ３との間で、培養液Ｌ１を屈折率ｎＬ１が既知の第１の培養液Ｌ１から、異なる既知の屈折率ｎＬ２を有する第２の培養液Ｌ２に交換することとしたが、これに代えて、第１の培養液Ｌ１に、異なる既知の屈折率を有する他の培養液を追加することにより培養容器１内に、異なる既知の屈折率ｎＬ２を有する第２の培養液Ｌ２を生成することにしてもよい。このようにすることで、第１の培養液Ｌ１を除去するステップおよび洗浄するステップを不要とし、短時間で第２の培養液Ｌ２を培養容器内に貯留することができる。
【００２３】
しかしながら、混合により屈折率ｎＬ２を精度よく調製することは困難な場合もあるため、図３（ａ）ないし図３（ｃ）および図４に示されるように、培養液追加ステップＳ２′において生成された未知の屈折率を有する第２の培養液Ｌ２の屈折率を測定し、測定された屈折率を用いて細胞Ｓの位相情報を測定することにしてもよい。
具体的には、図３（ａ）に示されるように、既知の屈折率および既知の厚さ寸法を有する基準物質３を培養面１ａに配置し、これら細胞Ｓ、基準物質３および培養液Ｌ２を貫通して所定の波長の光Ｌを透過させて、第２の位相情報画像を取得する。
【００２４】
第２の撮影ステップＳ３において取得された第２の位相情報画像は、例えば、当該第２の位相情報画像上において基準物質３を通る任意の一直線上の位相差情報を抽出することにより、図３（ｃ）に示されるように、多数の位相情報の一次元的な分布として捉えることができる。
【００２５】
培養液屈折率算出ステップＳ３１は、基準物質３とその周囲の位相情報を用いて培養液Ｌ２の屈折率ｎＬ２を算出するようになっている。
具体的には、培養液Ｌ２の深さｄＬ、培養液Ｌ２の屈折率ｎＬ、基準物質３の厚さ寸法ｄＣ、基準物質３の屈折率ｎＣ、透過させる光の波長λ、基準物質３の位置における位相情報ΔφＣ、その周囲における位相情報ΔφＬとする。基準物質３の位置においては、培養液Ｌ２の深さｄＬの内の厚さ寸法ｄＣ分だけ基準物質３が占有しており、その周囲においては深さｄＬの全長にわたって培養液Ｌ２で満たされている。
【００２６】
したがって、基準物質３の位置とその周囲とでは、基準物質３の厚さ寸法ｄＣ分だけ屈折率の異なる領域が存在するので、その屈折率差Δｎ１＝（ｎＣ−ｎＬ）および厚さ寸法ｄＣに応じた位相差Δφ１＝（ΔφＣ−ΔφＬ）が発生する。すなわち、
Δφ１＝Δｎ１×λ×ｄＣ                                              （６）
となる。
【００２７】
位相差Δφ１、基準物質３の屈折率ｎＣ、光の波長λおよび基準物質３の厚さ寸法ｄＣは既知なので、式（６）を変形して、
ｎＬ＝ｎＣ−Δφ１／（λ×ｄＣ）                                      （７）
により、未知の培養液Ｌ２の屈折率ｎＬ２を算出することができる。
そして、このようにして算出された培養液Ｌ２の屈折率ｎＬ２を用いて上記と同様にして、細胞Ｓの各部の厚さ寸法をより精度よく測定することができる。
第１の撮影ステップＳ１においても、同様にして屈折率ｎＬ１を算出することとしてもよい。
また、本実施形態では、各細胞の位相平均値により各細胞の屈折率を推定することとしたが、各細胞の最大位相の平均値を用いて、細胞群の細胞の屈折率の平均値を推定することとしてもよい。
様々な細胞種が混じっているときには前者が、単一細胞種の培養細胞を観察するときには後者が好ましいが、これに限るものではない。
【００２８】
本実施形態では、位相平均演算ステップＳ４において、異なる屈折率で求められた各細胞の位相情報の平均値から細胞の屈折率を求めることとしたが、培養液等の交換前後において個々の細胞を識別できる機構を設けておくことにより、個々の細胞の各部位における屈折率を求めるようにすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞厚さ測定方法を説明する図であり、（ａ）測定原理を説明する図、（ｂ）第１の撮影ステップにおいて取得された第１の位相情報画像、（ｃ）第２の撮影ステップにおいて取得された第２の位相情報画像である。
【図２】図１の細胞厚さ測定方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の細胞厚さ測定方法の変形例を示す図であり、（ａ）測定原理を説明する図、（ｂ）第１の撮影ステップにおいて取得された第１の位相情報画像、（ｃ）第２の撮影ステップにおいて取得された第２の位相情報画像である。
【図４】図３の細胞厚さ測定方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３０】
ｄＣ，ｄＬ，ｄＳ  厚さ寸法
ΔφＣ，ΔφＬ，ΔφＳ  位相情報
Ｌ  光
Ｌ１，Ｌ２  培養液
ｎＣ，ｎＬ，ｎＳ  屈折率
Ｓ  細胞
Ｓ１  第１の撮影ステップ
Ｓ２  培養液交換ステップ
Ｓ３  第２の撮影ステップ
Ｓ４  位相平均演算ステップ
Ｓ５  細胞屈折率算出ステップ
Ｓ６  厚さ算出ステップ
１  培養容器
１ａ  培養面（底面）
３  基準物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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