(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１゜）生物学的材料に由来する液体試料（５）に存在する微生物を、その液体試料に存在するその他の固体成分から、（ｉ）サイズにより分離し、（ii）液体試料に存在する水と、前記液体試料に存在する溶解した物質を通さないゲルシステムを使用し、（iii）ゲルは、少なくとも、
（ａ）遠心分離中または遠心分離後に遠心管の中で微生物を培養する微生物培養基と光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬を含むゲルであり、水と水分吸収性の高分子粒子との膨張した状態の均等混合物であり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.05−0.2g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が90−320μｍであり、この混合物の水分は、その全部または一部が上記の培養基に由来する、展開層と呼ばれる第１相（１）を含むゲルシステム（10）を使用すること、
（２゜）前記液体試料（５）を、事前に前記遠心管（6a,6b）内に配置されている前記ゲルシステム（10）の上に導入すること、
（３゜）前記管（6a,6b）の内容物を遠心分離すること、および
（４゜）前記細胞学的材料に由来する前記液体試料（５）中の微生物の存否を、ゲルシステムの前記第１相（１）において、光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬により明かにすることの各ステップを含むことを特徴とする、前記の微生物の細胞以外の細胞を含む生物学的材料の液体試料（５）中の細菌と酵母から成る群の微生物の存否を検出するためのゲル分離技術を使用する方法。
【請求項２】
ステップ（４゜）の進行が、微生物を前記の培養基の中で、室温と45℃との間の温度で、細菌の場合には長くとも24時間、酵母の場合には長くとも36時間、増殖した後になされることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ステップ（３゜）の遠心分離が1000−5000gでなされることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１゜）において、前記のゲルシステムが、
（ｂ）前記の液状試料の中に存在している水とその試料中に溶解した物質を通さず、その中に、前記液状試料に含まれる、その大きさが５μｍより小さい不溶性の粒子を保持し、さらに、遠心分離の間、５μｍ以上の大きさの粒子は通過させ、（ｉ）ゲルまたは（ii）大きさが0.1μｍ以下の乾燥シリカまたはケイ酸粒子から成る吸着相と呼ばれる第２相（２）を含み、前記吸着層は、前記の第１相の上に位置し、前記液状試料中にある水を通さない均等混合物を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
前記第２相（２）が、水と水分吸収性の高分子粒子の膨張した均等混合物から成るゲルであり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.2−1g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が160−530μｍであることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
前記第２相（２）が、乾燥時の粒子サイズが0.1μｍ以下になるように微粉化され、水が存在する時にも膨張しない鉱物物質から成る層であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項７】
前記鉱物物質が、シリカ、ケイ酸塩、カオリンから成るグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
前記第２相（２）が、前記細胞学的材料に由来する前記液体試料に含まれ、ステップ（４゜）において、微生物が存在している時に光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬と反応することにより妨害となりうる汚染物質、細胞および／または脂質に対して、（ｉ）すべての汚染物質を阻止し、（ii）細胞を溶解し、および／または、（iii）脂質を減らす、１つまたはそれ以上の物質を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１゜）において、前記ゲルシステムが、
（ｃ）ステップ（３゜）の遠心分離の間、存在するいかなる微生物も通過できず、前記の第１相（１）が上にくるように、第１相の下に配置されるバリヤ相と呼ばれる第３相（３）を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】
前記第３相（３）が、微生物の増殖温度以上の温度で溶解する固体パラフィンであることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
前記第３相（３）が、膨張した状態の、水と水分吸収性の高分子粒子との均等混合物から成るゲルであり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.04−0.2g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が30−130μｍであることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（１゜）において、前記ゲルシステムが、
（ｄ）（ｉ）密度が水以下の不活性油であり、（ii）遠心分離の前には、（α）第２相（２）が存在しない場合は前記第１相（１）の上に配置され、（β）第２相（２）が存在する場合は前記第２相（２）の上に配置され、（iii）ステップ（３゜）による遠心分離の後には、前記液体試料（５）の水の上に配置される、保護相と呼ばれる第４相（４）を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（１゜）において、
（ｉ）円錐形の底部の付いた遠心管（6a）に収容されて、頂部から低部の順番に、
−前記第４相（４）、
−前記第２相（２）、
−前記第１相（１）
の相を含むゲルシステムが使用されるか、
（ii）円形または球形の底部の付いた遠心管（6b）に収容されて、頂部から低部の順番に、
−前記第４相（４）、
−前記第２相（２）
−前記第１相（１）と、
−前記第３相（３）
の相から成るゲルシステムが使用されるか、または、
（iii）底部に毛細管が具備された遠心管（6c）に収容されて、前記第１相（１）の上に前記第４相（４）が配置され、および／または、第１相（１）の上に第２相（２）が配置されたゲルシステムが使用され、遠心分離中に微生物の濃度を上げるために、第１相（１）の容積を、前記第２相（２）と前記液体試料（５）の容積よりも小さくすることを特徴とする請求の範囲第１項、第４項から第12項までのうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲルシステムが、少なくとも、
（ａ）微生物培養基と光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬を含むゲルであり、水と水分吸収性の高分子粒子との膨張した状態の均等混合物であり、この高分子粒子の（α）濃度が乾燥重量で0.05−0.2g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が90−320μｍであり、この混合物の水分は、その全部または一部が上記の培養基に由来する展開層と呼ばれる第１相（１）から成ることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法により使用することのできるゲルシステム（10）。
【請求項１５】
前記ゲルシステムが、
（ｂ）前記の液状試料の中に存在している水と、その試料中に溶解した物質を通さず、その中に、前記液状試料に含まれる、その大きさが５μｍより小さい不溶性の粒子を保持し、さらに、遠心分離の間、５μｍ以上の大きさの粒子は通過させ、（ｉ）ゲルまたは（ii）大きさが0.1μｍ以下の乾燥シリカまたはケイ酸粒子から成る吸着相と呼ばれる第２相（２）を含み、前記吸着層は、前記の第１相の上に位置し、前記液状試料中にある水を通さない均等混合物を含むことを特徴とする請求の範囲第14項記載のゲルシステム。
【請求項１６】
前記第２相（２）が、水と水分吸収性の高分子粒子の膨張した均等混合物から成るゲルであり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.2−1g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が160−530μｍであることを特徴とする請求の範囲第15項記載のゲルシステム。
【請求項１７】
前記第２相（２）が、乾燥時の粒子サイズが0.1μｍ以下になるように微粉化され、水が存在する時に膨張しない鉱物物質から成る層であることを特徴とする請求の範囲第15項記載のゲルシステム。
【請求項１８】
前記ゲルシステムが、
（ｃ）遠心分離の後、存在しているいかなる微生物も横切ることができず、上に第１相（１）が位置するように第１相（１）の下側に配置されている、いわゆるバリヤ相と呼ばれる第３相（３）を含むことを特徴とする請求の範囲第14項記載のゲルシステム。
【請求項１９】
前記第３相（３）が、微生物の増殖温度以上の温度で溶解する固体パラフィンであることを特徴とする請求の範囲第18項記載のゲルシステム。
【請求項２０】
前記第３相（３）が、水と水分吸収性の膨張した状態の高分子粒子との均等混合物から成るゲルであり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.04−0.2g/mlであり、膨張状態の時の（β）直径が30−130μｍであることを特徴とする請求の範囲第18項記載のゲルシステム。
【請求項２１】
前記ゲルシステムが、
（ｄ）（ｉ）密度が水以下の不活性油であり、（ii）遠心分離の前には、（α）第２相（２）が存在しない場合は前記第１相（１）の上に配置され、（β）第２相（２）が存在する場合は前記第２相（２）の上に配置され、（iii）ステップ（３゜）による遠心分離の後には、前記液体試料（５）の水の上に配置される、保護相と呼ばれる第４相（４）を含むことを特徴とする請求の範囲第18項記載のゲルシステム。
【請求項２２】
前記管には、管の円筒部分を毛細管に合体させる円錐形の内表面20が具備されており、円錐の角（α）は30゜以下であり、展開相がこの毛細管（７）全体の中に収容されることを特徴とする、請求の範囲第１項から第13項のうちのいずれかに記載の方法により有効に実行できる底部に毛細管が具備された遠心管。
【請求項２３】
展開相の中に存在する細菌のカウントすること、および／または、その展開相を回収することが可能な、請求の範囲第22項記載の遠心管。
【請求項２４】
（Ａ）頂部から底部への順番で、少なくとも保護相（４）、吸着相（２）、展開相（１）から成るゲルシステムの入った円錐形の底部を有する遠心管（6a）、または頂部から底部への順番で、保護相（４）、吸着相（２）、展開相（１）、バリヤ相（３）から成るゲルシステムの入った球形の底部を有する遠心管（6b）、または、毛細管に収容された展開相（１）、その展開相（１）の上に配置される保護相（４）および／または吸着相（２）から成るゲルシステムの入った底部が毛細管になっている遠心管、および／または、（Ｂ）前記の相の構成材料、微生物が存在する時に光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬、前記展開相（１）を膨張させるための培養基が入ったボトル、を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から13項までのうちのいずれかによる方法により有効に実行できる測定キット。
【請求項２５】
−血液培地スクリーニングと尿スクリーニングの分野において、血液試料または尿試料中の細菌の存否を検出すること、
−（α）光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬、および、（β）菌に対して特異的な性質を有する培養基を使用して、生物学的試料を含む展開層内の微生物の菌を同定すること、
−展開層に存在する微生物をカウントすること、
−カウントのために微生物を含む展開層を回収すること、または
−微生物菌の、ゲンタマイシン、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールの抗生物質に対する耐性を調べることを含む、請求の範囲第１項から13項までのうちのいずれかによる使用法。
【請求項２６】
ステップ（４゜）での展開が、微生物を前記の培養基の中で、室温と45℃との間の温度で、細菌の場合には１−２時間、酵母の場合には２４−30時間、増殖した後になされることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２７】
不活性油が、パラフィン油であることを特徴とする請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項２８】
不活性油が、パラフィン油であることを特徴とする請求の範囲第21項記載のゲルシステム。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、細菌と酵母からなる群に属する微生物の存否を検出するための新規方法に関する。この方法は、１個のゲルシステムおよびそれと類似のゲルシステムを使用して、分離、培養、展開をさせることを含む技術を使用している。
本発明は、さらに一方においては、新規な工業製品としての前記ゲルシステムに関するものであり、他方においては、前記方法の実施のための測定キットに関する。
さらに、本発明は、上記の方法とゲルシステムの微生物学（特に、細菌学または真菌学）分野、特に細菌による感染症（特に、尿感染と敗血症）の診断分野での利用方法に関する。
先行技術
細菌や酵母のような微生物の存否を検出したい場合に、特に、比色法で行う際には、下記の結果を考慮に入れる必要がある。
−真正陽性（TP）、
−偽陽性（FP）、
−真正陰性（TN）および
−偽陰性（FN）。
実際上は、TP、FP、TN、FNの結果から、下記の４つの理論値（百分率で表示）が定義されている。
−感度（Sen）、
−特異性（Spe）、
−陽性予測値（PPV）および
−陰性予測値（NPV）。
上記の数値は、下記の式で与えられる。
Sen＝100.TP/（TP＋FN）、
Spe＝100.TN/（TN＋FP）、
PPV＝100.TP/（TP＋FP）および
NPV＝100.TN/（TN＋FN）。
目的は、測定の有意性と妥当性を評価するためである。
一方では、比色検出または濾過技術が、尿中の細菌の存否を評価するために推奨され、すでに使われており、他方では、ゲル分離技術が、赤血球凝集の検知のために推奨され、すでに使われていることは知られていることである。
比色検出法について言えば、公報EP−Ａ−0496409において、グラム陰性菌の検出法として開示されている。この方法は、生物学的試料（特に、尿）に含まれる細菌を、多孔性担持材（孔直径が0.75−1.2μｍ）上で濾過して、その担持材に保持させ、その後、酸化還元比色試薬（特に、テラゾリウム塩またはレザゾリン）と菌のデヒドロゲナーゼを反応させることでグラム陰性菌を検出する方法から成り、ここでは、グラム陰性菌により引き起こされる還元反応はカオトロピック剤とアルキルグリシド系の非イオン性界面活性剤により阻止されることになる。
比色濾過技術に関しては、VITEK STSTEMS社（Hazlewood,Mo.）から販売されている「Back−Ｔ−Screen（Ｒ）（半自動型）」と「FiltraCheck−UTI（Ｒ）（手動型）」と呼ばれる試験法が特に知られている。
これらの試験では、試料に存在するかもしれない細菌を保持し、着色する目的で、展開剤をしみこませた濾過紙で尿試料を濾過することにより行われるが、この濾過を圧力差のある条件下で行うために、比較的複雑な装置が必要となり、さらに、この試験法の検出結果の誤り（FP,FN結果）の主要原因は、尿中に大量の赤血球、白血球および／または上皮細胞が存在することである（尿中に赤血球および／または白血球が存在していること自体がこの方法の欠点である）。
「Clin.Microbio.」（改訂、1988、１（No.2）、268−280）に掲載のM.PEZZLOの論文の（ａ）頁272（表３）と274頁（節：比色定量濾過）および「Med.Mal.Infect.」（改訂、1991、21（No.2）、83−88）に掲載のF.W.GOLDSTEINの論文の（ｂ）頁86（項：着色／濾過システム）によれば、これらの「Back−Ｔ−Screen(R)」と「FiltraCheck−UTI(R)」試験法は、（ｉ）迅速であり（１−２分）、（ii）細菌数が≧105CFU/mlであるときには有効であるが、（iii）細菌数が105CFU/ml以下であるときには不満足な結果が出るとしている。上記論文では、概略であるが、これらの２つの試験の両方を使用し、細菌数ごとに分けた場合の尿スクリーニング結果は下記の通りであるとしている。
≧105CFU/ml;Sen＝93−95％、Spe＝76−77％、PPV＝32％、NPV＝97−99％；
≧104CFU/ml:Sen＝85−89％、Spe＝81％、NPV＝84−86％；
≧103CPU/ml;Sen＝76−84％、NPV＝97−72％。
従って、細菌数が105CFU/ml以下の場合の測定信頼性を改善する必要がある。
赤血球凝集を検知するためのゲル分離技術に関しては、公報FR−Ａ−2577321とEP−Ａ−0454509が知られている。
公報FR−Ａ−2577321の開示するところによれば、赤血球凝集の生成または存否が、（ｉ）円錐の底部を有する遠心管の中に配置されていて、（ii）遊離血球のほうを凝集物よりも容易に通過させるゲル（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社（PHARMACIA FINE CHEMICALS,Uppsla,Sweden）より販売されている「Sephdex(R)G100 Ultrafine」という商品名のゲル）上で、赤血球を含んだ液状培地を堆積させ、緩やかな遠心分離をすることで検知されるようになっている。
EP−Ａ−0454509の開示する手順は、公報FR−Ａ−2577321で開示されたものに実質的には類似しており、ここでは、公報FR−Ａ−2577321で開示されたようなゲルの代わりに、２つのデキストラン・ゲル（EP−Ａ−0454509の３頁２−４行、４頁６−７行）の混合物から成るゲルシステムを使用し、緩やかな遠心分離を行う方法で、そのデキストランゲルのうちのひとつが、乾燥状態における粒子直径が20−50μｍの、上記で述べた「Sephdex(R)G100 Ultrafine」であり、もうひとつは、乾燥状態での粒子直径が13−23μｍの「Sephdex(R)HP Ultrafine」である。
EP−Ａ−0454509（３頁２−４行、42−43行、４頁14−15行）で開示されている情報によれば、このEP−Ａ−0454509で使用しているゲルには明らかに相が１つしか含まれていないように見える。
FR−Ａ−2577321とEP−Ａ−0454509で説明されているように、遠心分離を伴うゲル分離技術は、直接には微生物の存否の検出には適用できない。
特に、推奨されているゲルである「Sephdex(R)G100 Ultrafine」と「Sephdex(R)HP Ultrafine」は、緩やかな遠心分離［先行技術によれば、緩やかな遠心分離とは、1500gあるいはそれ以下、特に、1000g以下（特に、400−500gのオーダであり、EP−Ａ−0454509の４頁49行では、これを430gとしている）］がなされている間、細菌や酵母のような微生物を通過させないし、他の細胞から細胞を分離することもない。
発明の目的
本発明の目的は、生物学的試料の中に存在する、細菌と酵母からなる群に属する微生物の存否を検出するための新規技術を提供することであり、この新規技術により、細菌数が105菌/ml以下（以後、便宜上、１細菌/mlまたは１酵母/mlがおよそ1CFU/mlであるとして取り扱う）の場合にも、尿中の細菌の検出に関して、上記で述べた「Back−Ｔ−Screen(R)」と「FiltraCheck(R)−UTI」の試験法よりも信頼性の高い結果が出せる検出方法を提供することである。
この新規技術は、上記の公報FR−Ａ−2577321やEP−Ａ−0454509で開示されている技術とは違った技術であり、培養基を含むゲルシステムによる微生物分離の特別な技術を使用しており、そのために、遠心分離に先だって、標準寒天培地での微生物の分離や、増殖に必要な培養を行う必要はない。
発明の主題
本発明の目的は、ゲルシステムを使用することで達成されるが、このゲルシステムは、一方において、生物学的試料に含まれる微生物を、他の成分、特に、細胞、ペプチド、タンパク質から選択的に分離し、他方において、遠心分離がなされている間、適当な場合には、遠心分離と展開の後に、微生物を原位置（in situ）で増殖させるものである。
本発明の第１の特徴によれば、本方法は、前記の微生物以外の細胞を含んでいるかもしれない生物学的試料に含まれる、細菌と酵母からなる群に属する微生物の存否の検出のための新規法として推奨されるもので、ゲル分離技術を使用するこの方法が、
（１゜）生物学的材料に由来する液体試料に存在するかもしれない微生物を、その液体試料に存在するかもしれないその他の固体成分から、（ｉ）サイズにより分離し、（ii）液体試料に存在するかもしれない水と、前記液体試料に存在するかもしれない溶解した物質を本来的に通さないゲルシステムを使用し、（iii）少なくとも、微生物培養基と光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬を含むゲルであり、水と水分吸収性の高分子粒子との膨張した状態の均等混合物であり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度で0.05−0.2g/lであり、膨張状態の時の（β）直径が90−320μｍであり、この混合物の水分は、その全部または一部が上記の培養基に由来する（ａ）展開相と呼ばれる第１相から成るゲルを使用すること、
（２゜）前記液体試料を、事前に前記遠心管内に配置されている前記ゲルシステムの上に導入すること、
（３゜）前記管の内容物を遠心分離すること、および
（４゜）前記細胞学的材料に由来する前記液体試料中の微生物の存否を、ゲルシステムの前記第１相において、光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬により明かにする段階から成ること
を特徴とする。
上記液体試料の微生物の濃度が低すぎる場合には、ステップ（４゜）での展開は、微生物を前記の培養基の中で、室温と45℃との間の温度で、細菌の場合には、長くとも24時間（１−２時間が好ましい）、酵母に場合には、長くとも36時間（24−30時間が好ましい）増殖した後になされるようになっている。
本発明の第２の特徴によれば、前記ゲルシステムは、生物学的材料に由来する液体試料に存在するかもしれない微生物を、その液体試料に存在するかもしれないその他の固体成分から、（ｉ）サイズにより分離し、（ii）前記液体試料中の水および液体試料に存在するかもしれない溶解した物質を本来的に通さず、（iii）少なくとも、
微生物培養基と光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬を含むゲルであり、水と水分吸収性の高分子粒子との膨張した状態の均等混合物であり、この高分子粒子の（α）乾燥重量濃度が0.05−0.2g/lであり、膨張状態の時の（β）直径が90−320μｍであり、この混合物の水分は、その全部または一部が上記の培養基に由来する展開相と呼ばれる第１相（ａ）を含んで成る
ゲルシステムが新規工業産物として望ましい。
本発明のさらにもうひとつの特徴によれば、特に、
−前記のゲルシステムまたはそれを構成している相と、
−適当な場合には、微生物の凍結乾燥対照株および／または標準試料を作成するための培養基から構成された測定キットが望ましい。
最後に、本発明の別の特徴によれば、前記ゲルシステムとその方法は、微生物学分野、特に、（ｉ）細菌性感染の診断（特に、尿感染症、敗血症），（ii）微生物の同定、（iii）微生物の抗生物質に対する耐性の評価の分野で応用されることが望ましい。
【図面の簡単な説明】
添付図面は、本発明にかかるゲルシステムの入った遠心管を図示したものである。
−図１は、いわゆる展開相と呼ばれる単一相から成るゲルシステムの入った遠心管を示している。
−図2aと2bは、２つの相、図の底部から頂部への順番で見て、遠心分離の前に現れる展開相（2a）と遠心分離の後に現れる保護相（2b）から成るゲルシステムの入った遠心管を示している。
−図３は、２つの相、図の底部から頂部への順番で見て、展開相と吸着相から成るゲルシステムの入った遠心管を示している。
−図4aと4bは、図３のゲルシステムと類似したゲルシステムであるが、ここでも、保護相が含まれており、それが遠心分離の前に現れる場合（4a）と遠心分離の後に現れる場合（4b）を示している。
−図５は、３つの相、即ち、図の底部から頂部への順番で見て、バリヤ相、展開相、吸収相から成るゲルシステムの入った遠心管を示している。
−図6aと6bは、図５のゲルシステムと類似したゲルシステムであるが、ここでも、保護相が含まれており、それが遠心分離の前に現れる場合（6a）と遠心分離の後に現れる場合（6b）を示している。
−図７、８は、それぞれ、本発明による好ましいゲルシステムを示しており、ここでは、展開相の厚みが少ない。
−図９は、底部に毛細管を具備した、本発明にかかる遠心管の破断図である。
−図10は、本発明にかかる別の遠心管の正面図であり、この場合も毛細管が具備されている。
略語
便宜上、本発明を開示したテキストでは、下記の略語と頭文語を使用している。
Ala  アラニル
TB  テトラゾリウム・ブルー
CFU  コロニー形成単位
DIC  播種性血管内凝固
EDTA  エチレンジアミン四酢酸
FN  偽陰性
FP  偽陽性
Hyp  ヒドロキシプロリル;Hypは3Hyp（３−ヒドロキシプロリル）および／または4Hyp（４−ヒドロキシプロリル）を表す。
INT  ヨードニトロテトラゾリウム
Leu  ロイシル
Lys  リシル
MA  ４−メチルクマリニル−７−アミノ
MUG  メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコロニド
MW  分子量
NA  β−ナフチルアミノ
NADH  水素化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
TNB  テトラゾリウム・ニトロブル
NPV  陰性予測値
NTC  塩化ネオテトラゾリウム
OM  光学的測定
Phe  α−フェニールアラニル
Phg  α−ニトロアニリノ
pNA  ｐ−ニトロアリニロ
PPV  陽性予測値
Pro  プロリル
RT  室温（15−20℃）
Sen  感度
Spe  特異性
TN  真正陰性
TP  真正陽性
TTC  塩化トリフェニールテトラゾリウム
YNB  「YEAST  NITROGEN  BASE」という商標の印が付いた窒素源。
発明の詳細な説明
「生物学的材料」という語の意味はここでは下記の内容を指す。
−ヒトまたは動物の水様の体液、特に、尿、血液、血漿、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、
−任意の状態の水、特に、流水（泉、川）、よどんでいる水（池、タンク、水泳プール）、産業水（水道水、下水、特に伝熱流体またはエネルギー伝達流体として機能する循環水）、飲料水、
−飲料、特に、果実ジュース、沸騰性飲料、乳汁（前記）、ワイン、ビールのような、農産食品と水を原料にした飲料、
−動物および／または野菜を原料にした食品または食品材料、
−植物の抽出物、特に、水性、アルコール性、または、水性−アルコール性抽出物、特に、圧搾ジュース、または、水性抽出物、
−特に、膿、生検材料、便、痰、唾液、植物、植物の一部、土、砂などの固体または粘性の物（これらには、水を含むかまたは含んでない場合でもよい。）、
−一般的にヒトを取り巻く環境物質（それは一方では、特に土と水（前記）、他方では周囲空気）、例えば、稼動している劇場内の空気の細菌学的、真菌学的性質を評価するための例については後述する。
簡単に言えば、前記の生物学的材料とは、体液、食品、飲料、環境産物（植物やそれらの抽出物など）から成る群から選択されたものである。
実際的には、本質的なことではないが、本発明の検出法の最も最適な実施のための前記の生物学的材料としては、水系の物質を使用することが望ましい。従って、試験用の前記生物学的材料として（特に、粉砕、切り裂き、抽出、および／または水の添加により）液状の試料に変換されたものでよいし、または、最初から液状であるものでもかまわない。前記の液状試料としては、水系の液状試料が試験をする場合には好都合である。
ここで「細胞」という語の意味は、任意の生物学的細胞であり、細菌や酵母そのものではない。ここで「細胞性材料」という語の意味は、（ｉ）細胞、（ii）前記細胞の断片（特に、細胞壁断片）、（iii）細胞壁の内側の前記細胞の内容物、（iv）それらの混合物から選択された材料のことである。
本発明の方法による微生物の存否を検出の対象となる生物学的材料およびその液状試料として、これらの細胞性材料も含まれる。
さらに、一方で、情報として、
（Ａ）尿感染の場合には、患者の尿も含まれ、検出の対象となるのは下記のような微生物である。
−グラム陰性細菌、特に、エシェリキア・コリー（大腸菌）、クレブシェラ属菌（特に、クレブシェラ・アエロゲネス菌、クレブシェラ・ニューモニエ（肺炎桿菌））、プロテウス属菌（特に、プロテウス、ブルガリス、プロテウス・ミラビリス）、シュードモナス属菌（特に、シュードモナス・エルジノーサ（緑膿菌）、セラチア属菌（特に、セラチア・マルセッセンス（霊菌）、および／またはエンテロバクタ属菌（特に、エンテロバクタ・エロゲネス）。
−グラム陽性菌、特に、スタヒロコッカス属菌（ブドウ球菌属）（特に、スタヒロッコカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）、スタヒロッコカス・エピデルミディス（表皮ブドウ球菌）、スタヒロッコカス・サプロフィティカス）、ストレプトッコカス（連鎖球菌）、（特に、ストレプトコッカス・フェーカリス、ストレプトコッカス・フェシウム）、エンテロコッカス（腸球菌）および／またはコリネバクテリウム、および／または、
−酵母、特に、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（以前の名称はトルロプシス・グラブラタ）、カンジタ・トロピカルス、および／または、カンジダ・クルセイ。
これらは病原性（これらの菌は、敗血症とDIC［播種性血管内凝固］を引き起こす）であり、他方、
（Ｂ）細胞（特に、赤血球、白血球及び／または上皮細胞）、細胞性酵素（特に、尿中ウロキナーゼ、白血球エステラーゼ及び／またはホスファターゼ）、抗生物質（尿中に存在する微生物の検出を阻害または検出誤りを起こさせるもの）、ペプチド、タンパク質、色素、および／または細胞壁断片を含む細胞性物質。
本発明によれば、一方において、微生物を、前記生物学的材料に由来する他の不溶性固体成分から、遠心分離により、その粒子のサイズにより分離するために、前記生物学的材料の液体試料中の不溶性粒子が、ゲルシステムを通過するようになっており、他方において、前記微生物が検出可能となるように、一般的には、原位置（in situ）で増殖されるようになっている。
ここで「光学測定における検出のための変化量を提供する試薬（別名：比色試薬）」ということの意味は、細菌または酵母の群に属する微生物が存在している場合に、肉眼または比色計のいずれかで評価を行うことができるように光学的測定における検出のための変化量を提供する製品のことである。換言すれば、微生物が存在している場合には、その色を変化させる試薬であり、特に赤外線領域での、可視スペクトルの色変化、または、蛍光またはルミネセンスの変化を誘導する。
そのような「比色試薬」には、（ｉ）フェノールレッドのようなpH比色試薬、（ii）特に、ジクロロインドフェノール、レザズリン、またはテトラゾリウム塩（例えば、TB、INT、NTB、NTCまたはTTC）のような酸化還元比色試薬、（iii）Ｈ−Ｌ−Ala−pNA、Ｈ−Ｌ−Leu−pNA、Ｈ−Ｌ−Phe−pNA、Ｈ−Ｌ−Pro−pNA、Ｈ−Ｌ−Lys−pNAまたはＨ−Ｌ−Hyp−pNAのような色原体基質、または、Ｈ−Ｌ−Ala−NA、Ｈ−Ｌ−Leu−NA、Ｊ−Ｌ−Phe−NA、Ｈ−Ｌ−Pro−MA、Ｈ−Ｌ−Lys−MA,H−Ｌ−Hyp−MA、または、MUGフォスフェートのような蛍光基質、（iii）β−Ｄ−グルコシダーゼ、または、好ましくは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼのような微生物のオキシダーゼにより分解される基質、または（iv）ルシフェリン化合物のような化学的発光基質が使える。
酸化還元比色試薬は、主に、NADHおよびデビドロゲナーゼのような微生物に由来する少なくとも１個の還元物質との反応により、微生物の存在を示す化合物を酸化させる作用があるものである。このメカニズムは、下記に示されたレザズリンの反応に似た反応である。
レザズリン＋NADH→レゾルフィン＋NAD+
本発明において、好ましいとされる色原体基質と蛍光基質、つまり、Ｈ−Ｌ−Aal−pNA、Ｈ−Ｌ−Leu−pNA、Ｈ−Ｌ−Phe−pNA、Ｈ−Ｌ−Pro−pNA、Ｈ−Ｌ−Lys−pNA、Ｈ−Ｌ−Hyp−pNA,H−Ｌ−Ala−NA、Ｈ−Ｌ−Leu−NA、Ｈ−Ｌ−Phe−NA、Ｈ−Ｌ−Pro−NA、Ｈ−Ｌ−Lys−NA、およびＨ−Ｌ−Hys−NAは、微生物の産生したアミノペプチドにより分解される。公開PCT申請番号WO−Ａ−90/03726で記載されている、アミノペプチドにより分解されるその他のペプチド基質は、本発明でも使用可能である。
上記で示したように、本発明の推奨する方法であるステップ（１゜）で使用するゲルシステムは、少なくとも１個の、展開相（ここでは、便宜上、「第１相」または「第１層」ともいう）と呼ばれるゲル化した層で構成されている。この展開相は、遠心分離が行われている間、前記液体試料に含まれる不溶性の、大きさが0.5−８μｍの粒子を、その内部に（または、粒子が大きい場合には、低部表面上に）保持することのできるゲルを形成させるために、前もって水で膨張させた高分子基質から成る。
この展開相を構成している前記の高分子物質は、その中に、または、その低部の表面近くに、細菌（長さ:0.5−５μｍ、直径:0.1−２μｍ）と多数の酵母（直径:5−12μｍ）（但し、細胞ではない）を保持できるように、膨張した状態での（ゲルの状態での）乾燥重量濃度が、0.05−0.2g/ml（好ましくは、0.1g/ml）であり、しかも、直径が90−320μｍの膨張粒子の状態で存在していることが重要である。
実際上は、この展開相の高分子物質は、予め微生物増殖用の培地で膨張した状態にしておき、この培地には、上記で述べた光学的測定における検出のための変化量を提供する比色試薬が含まれている。
本発明で推奨する方法であるステップ（１゜）を実施するために使用する本発明のゲルシステムは、
前記の液状試料の中に存在しているかもしれない水とその試料中に溶解した物質を本来的に通さず、さらにその中に、前記液状試料に含まれる、その大きさが５μｍ以下の不溶性の粒子を保持し、さらに遠心分離の間、５μｍまたはそれ以上の大きさの粒子は通過させ、（ii）大きさが0.1μｍ以下の（ｉ）ゲルまたは（ii）シリカまたはケイ酸粒子から成り、前記の第１相の上に位置し、前記液状試料中にあるかもしれない水を本来的に通さない均等混合物を含む吸着相と呼ばれる第２相（ｂ）
を含んで成る。
別の修正実施例では、この吸着相（第２相または第２層）は、水と水分吸収性高分子粒子の膨張状態の均等混合物から成るゲルであり、この均等混合物の中の高分子粒子の乾燥重量濃度（α）が0.2−1g/ml、直径（β）が膨張状態で160−530μｍである。
この場合に、その吸着相は、前記第１相と同じように、ゲルを形成させるために予め水で膨張させた高分子物質（特に、デキストランまたは類似体）から成るが、この吸着相の場合には、前記液状試料の中の、大きさが0.1−0.5μｍの小さい不溶性粒子を、遠心分離の間、その中に（粒子が大きい場合には低部の表面に）保持しており、この不溶粒子は前記第１相を通過することはない（すなわち５μｍ以下）ものである。
さらに別の実施例では、この吸着相は、一方においては、乾燥状態での大きさが0.1μｍの粒子になるように微粉化された鉱物物質から成る粒子相で構成されているが、他方、この相は、特に、水が存在しても膨張することはない。この鉱物物質として、シリカ（特に、砂、石英、ガラス）およびアルミノケイ酸塩のようなケイ酸塩から選択すると好都合である。ケイ酸塩から選択する場合に、水が存在しても膨張することのない粘土であるカオリンが特に望ましい。
事実として判明していることは、粒子の大きさが0.1μｍ以下のシリカとカオリンのような鉱物物質は、液状試料に存在する微生物を通過させ、水と溶解物質を保持することである。
このように、この吸着相は、ヘモグロビン、色素（特に、尿感染の患者の尿中の微生物の存否を検出する時の尿中色素）、酵素、インヒビタのような、液状試料中の不溶固体粒子の通過を阻止し、溶解細胞の断片のような不溶粒子を保持する。例えば、これらの細胞断片は、溶解剤で処置した後でも、溶解剤が存在する状態でも保持される。この溶解剤としては、赤血球を溶解するためのサポインのような界面活性剤がある。
（１）この吸着相の高分子物質の膨張した状態での乾燥重量濃度が、0.2−1g/l（好ましくは、0.35g/l）であること、および、が膨張した状態（ゲル状で）で存在し、その時の直径が160−530μｍであること、（２）微粉化したシリカやカオリンのような鉱物粒子の直径が同じであることが重要である。
前記ゲルシステムに第２相がある場合には、それにはシステム内のすべての汚染を阻止し、細胞（特に、赤血球および／または白血球）を溶解し、微生物の存在している時に光学的測定での検出のための変化量を提供する前記の試薬と反応することにより、液状試料に含まれてステップ（４゜）を妨害する恐れのある脂質（試験用乳汁の清浄工程で出るような）を減少させることのできる、ひとつ以上の物質が含まれていることが望ましい。
本発明のゲルシステムに、前記の第２相がない場合には、前記の物質（つまり、汚染を阻止し、細胞を溶解し、脂質を減らす物質）が前記の第１相に含まれていることが望ましい。
推奨法であるステップ（１゜）を実施するための、本発明にかかるゲルシステムは、
ステップ（３゜）の遠心分離がなされている間、存在している微生物が横切ることができず、その上に第１相が来るように第１相の下側に配置される、いわゆるバリヤ相と呼ばれる第３相（ｃ）
を含んで成る。
前記第３相（第３層）は、高分子物質のパラフィンまたはゲルのいずれかである。パラフィンである場合には、微生物の増殖する温度より高い温度で溶ける固体パラフィンである。例えば、
−ステップ（４゜）に含まれる微生物の増殖培養が室温で実施される時には、30℃またはそれ以上の温度で溶けるパラフィン。
−ステップ（４゜）に含まれる微生物の増殖培養が37℃で実施される時には、45℃またはそれ以上の温度で溶けるパラフィン。
−ステップ（４゜）に含まれる微生物の増殖培養が45℃で実施される時には、50−55℃またはそれ以上の温度で溶けるパラフィン。
50℃またはそれ以上の温度で溶けるパラフィンを使用することが好ましい。この場合には、溶けた状態で、遠心管に導入されることになる。
バリヤ相がゲルの場合には、そのゲルは、水と水分吸収性高分子粒子の膨張した均等混合物から成り、その高分子粒子の乾燥重量濃度（α）は、0.04−0.2g/lであり、膨張した状態での直径（β）は、30−130μｍである。
前記ゲルは、第１相と同じように、ゲルを形成させるために、予め水で膨張させた高分子物質（デキストランまたは類似体）から成るが、ゲルを形成させるのは、遠心分離中に、ゲルの内部またはその上部の表面に、液状試料に含まれたより大きい（５または８μｍか、またはそれ以上の大きさ）不溶性の粒子を保持するのが目的である。
このように、バリヤ相は、その上部表面（固形パラフィンの場合）またはその内部（ゲルの場合）に細胞、特に、平均サイズが５−８μｍの赤血球、平均サイズが10−12μｍの白血球、平均サイズが20−50μｍの上皮細胞（特に、尿の場合）、平均サイズが40μｍの円柱様物質、平均サイズが20−200μｍの結晶状物質、および、細胞壁断片（特に、遠心分離中に、第１相または第２相と第１相の組み合わされた相を通過する時に溶解している場合）を保持する。
実際的な意味では、バリヤ相の性質の如何にかかわらず、前記液体試料に含まれる固体粒子は、粒子サイズの最大のもの（最も重い）と最小のもの（最も軽い）で形成される勾配に従って分散していく。
ゲルシステムにバリヤ相がない場合には、前記ゲルシステムを、円錐形の底部（文書FR−Ａ−2577321および上記のEP−Ａ−0454509で開示されているような）または毛細管のついた遠心管の中に配置することが重要である。この場合、最も重い固形粒子が、遠心管の底部に広がるが、上記で述べたように、微生物は、細胞のすぐ上に存在する状態となる。
バリヤ相のゲルを構成している前記の高分子物質の乾燥重量濃度は、0.04−0.2g/l（好ましくは、0.14g/ml）であり、その直径が30−130μｍで、膨張粒子の状態であることが重要である。
本発明によるゲルシステムにバリヤ相がある場合には、前記ゲルシステムを、特に円形または球形の底部の付いた遠心管に収容してもよい。
吸着相があると、液状試料の液体（主に水）が、遠心分離の前後で、展開相に接触することを防止できるという点でメリットがある。
吸着相とバリヤ相が同時に存在すると、厚みの少ない展開相を使えるというメリットがある。このために、前記の展開相に内部または低部表面の微生物の数がある与えれた容積の中で濃縮され、その比色測定（肉眼または比色計による測定）がより容易になるのである。
前記第１相だけあるいは前記第２相または第３相のうちの少なくともそのひとつを同時に有する、本発明にかかるゲルシステムは、前記の液体試料の液体を通さない。遠心分離の間、前記液体とその中に溶けた成分は、すでに述べたように、前記のゲルシステムを通過しないが、前記液状試料の不溶の成分はゲルシステムを通過して、大きさに従って分離がなされる。
本発明の推奨方法であるステップ（１゜）を実施するための本発明のゲルシステムは、
（ｉ）比重が水より小さい不活性油、好ましくはパラフィン油、で構成され、（ii）遠心分離の前は、第２相が存在しない時には前記第１相の上にあり、第２相が存在する時にはその第２相の上に位置し、（iii）ステップ（３゜）による遠心分離の後には、前記液状試料の液体の上に位置する、いわゆる保護相と呼ばれる第４相（ｄ）
を含んで成る。
保護相の油は、ゲルシステムの構成成分および液状試料の成分とは反応しない不活性のものであるが必要である。室温以下の温度で溶け、沸点が50℃以上、または55℃以上である油が特に推奨できる。パラフィン油が特に好適である。実際での適用では、この保護相の0.25−1mlを5ml遠心管に導入する。
本発明によれば、保護相には２つの利点・目的があり、その一つは、貯蔵中の脱水と汚染を防ぐこと、もう１つは、前記液体試料が遠心管に注入された時、その保護相の下に位置するゲルシステムの層の劣化を防ぐことである。
本発明のステップ（１゜）において、円錐形の底部の付いた遠心管で使用するゲルシステムは、その相が、頂部から底部への順序で、
−前記第４相、
−前記第２相、および
−前記第１相
の構造になっているか、あるいは、円形の底部または球形の底部のついた遠心管で使用するゲルシステムは、その相が、頂部から底部への順序で、
−前記第４相、
−前記第２相、
−前記第１相、および
−前記第３相
の構造になっているか、あるいは、毛細管の付いた遠心管で使用するゲルシステムは、その相が、頂部から底部への順序で、
−もし適当であれば、前記第４相および／または前記第２相、および
−毛細管の中に、前記第１相
が配置される構造になっている。
ステップ（３゜）の遠心分離は、500g以上または1000−5000gで行う（つまり、通常の遠心分離機を使用する場合には、その角速度は約2200−4500rmp）。遠心分離時間は少なくとも５分、好ましくは、10−30分である。本発明による遠心分離は、2000−4000gで、15分行うことが望ましい。
本発明にかかる前記の遠心分離は、一般的には、室温で行われる。
もし必要であれば、前記の遠心分離は室温と45℃との中間の温度、つまり、前記液体試料に存在しているかもしれない微生物の増殖のためのステップ（４゜）で想定されている培養温度に近い温度でおこなってもよい。
本発明のゲルシステムに保護相がある場合には、遠心分離中に、前記液体試料の液体が保護相を通過し、遠心分離後に、同様に通過した不溶固体成分を含まない前記液体が、前記保護相と吸着相（展開相が無い場合）または展開相（吸着相が無い場合）との間に位置することになる。
このステップ（４゜）の展開は、一方では、遠心分離中に起こり、さらに、適当であれば、他方で、室温と45℃との間の温度で微生物を培養した後にも起こる。微生物を増殖するために必要な培養期間は、一般的には、前記液体試料に存在する微生物（細菌および／または酵母）の当初濃度に依存する。
実際問題として、当初の細菌濃度が検出限界値（103菌/ml）よりも低い液体試料では、その培養時間は長い場合でも24時間（好ましくは、１−２時間）である。但し、比較的ゆっくり増殖するスタヒロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）の場合は例外である（スタヒロコッカス属菌の培養時間は約24時間が必要）。
当初酵母濃度が検出限界値（103菌/ml）よりも低い液体試料では、その培養時間は長い場合でも36時間（好ましくは、24−30時間）である。酵母の検出では、細菌の増殖を阻止するか、または、細菌を死滅させるために、上記の文書WO−Ａ−90/03726で記載されたような抗菌剤、特に、ゲンタマイシンを吸着相および／または展開相に導入することが望ましい。
展開相を膨張させるのに使える培養基には、例えば、ペプトン（５−20g/l）、糖（１−20g/l,好ましくは、5g/l）、酵母抽出物（１−5g/l）、ビタミン（10−20ml）のような炭素源、窒素源、微量元素と、これらのpHを6.0−8.0で安定させるための緩衝液がある。細菌用の培地としては、例えば、砂糖を加えた心臓−脳ブイヨンがある。酵母用の培地としては、細菌用のものと同様か、あるいは、YNB＋グルコース培地、サボラウド（Sabouraud）培地またはYNB＋マルトース培地（上記の文書WO−Ａ−90/03/03726で記載されているもの）がある。
グラム陰性菌に対しては、その培養基として使用して利点があるのは、心臓−脳ブイヨン＋糖であり、さらに、光学的測定での検出のための変化量を提供する好ましい試薬として下記のものを含む。
−最終濃度が0.05g/ml（0.2mM）のレザズリン、
−最終濃度が0.065g/ml（0.17mM）のフェノールレッド、
−最終濃度が約0.50g/ml（2mM）の色原体基質Ｈ−Ｌ−Ala−pNA、または
−蛍光基質Ｈ−Ｌ−Ala−NA（約2mM）。
この培地は、pH6.5−8.0で、リン酸塩またはトリス緩衝剤により緩衝処理されるが、適当であれば、下記のものを含む。
−二価のカチオン、特に、Mg2+、Ca2+またはMn2+から成るグループに属する活性化物質（例えば、30mg/lのMnCl2又はMnSO4）、
−ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドまたはファーストブルーBBのようなジアゾ化剤、および／または
−特に試験対象の前記液体試料中の酵素の存在と関連した二次反応の、１種類以上の阻害剤（例えば、尿スクリーニングの場合、尿中のウロキナーゼを抑制するアプロチニンとフォスファターゼを抑制するEDTA）。
実施には、これらの阻害剤は、展開相および／または吸着相に配置される。
グラム陽性菌に対しては、その培養基として使用して利点があるのは、グラム陰性菌に使用する前記の培地であるが、さらに、光学的測定での検出のための変化量を提供する好ましい試薬として下記のもの
−最終濃度が0.05g/mlのレザズリン、
−最終濃度が約2mMの色原体基質Ｈ−Ｌ−Leu−pNA、または、
−最終濃度が2mMのＨ−Ｌ−Leu−NA（約2mM）
を含み、pHが6.0−8.0であるように緩衝剤で処理されるが、適当であれば、上記で示された活性化剤、ジアゾ化剤および／または１種類以上の阻害剤も使える。
酵母に対しては、その培養基として使用して利点があるのは、pHが6.0−8.0になるように緩衝処理したYNB＋糖で、光学的測定での検出のための変化量を提供する好ましい試薬としては下記のもの、すなわち色原体基質Ｈ−Ｌ−Pro−pNAまたは同等物質、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、またはクロラムフェニコールのような細菌増殖を阻止する抗生物質である基本阻害剤がある。このような阻害剤は吸着相に入れてもよい。
本発明の長所や特徴は、下記の図面や例の説明によりさらに明かになるであろう。ここで示したデータ全体は、例示として説明したものであって、これに限定されるものではない。
本発明によるゲルシステム10は、円錐形の底部の付いた遠心管6a、または球形の底部が付いた遠心管6b、または毛細管の付いた遠心管6cに収容される。前記ゲルシステム10は、予め液状の微生物培養基により膨張させたゲルから成る展開相１と言われる少なくとも１つの層と、１つ以上の阻害剤を含ませることのできる、予め水で膨張させたゲルか、あるいは粒子サイズが0.1μｍ以下の微粉化した粒子層（シリカまたはカオリン）のいずれかである吸着相２と言われる１つ以上の別の層と、予め水で膨張させたゲルか、または、遠心分離中と培養中は固体であるパラフィン層であるバリヤ相３と、遠心分離と培養中は液体であるパラフィン層である保護相４から成る。
図１は、円錐形の底部の付いた遠心管6aに収容された単一層である展開相から成る、本発明によるゲルシステム10を示している。液体試料５は、この展開相１の上に注入される。遠心分離がなされている時は、前記試料の不溶の粒子は、この展開相の厚さ方向に移動していくが、前記試料５の液体と溶解した成分のほうはこの展開相を通過しない。前記の遠心分離の後では、最も重く最もサイズの大きい粒子は、遠心管6aの底部に拡散し、その底部には細胞がたまり、その細胞の上で、展開相１の低部の近くには微生物がたまる。
図１で図示されたゲルシステムは、一応、よい結果が出ている場合を示しているが、（ｉ）遠心分離がなされている間、展開相１のゲルが前記試料５に接触したままになっている点、および（ii）その展開相のゲルが、その接触の結果として前記試料６により希釈されてしまうという点で全体としては不満足なものである。
図2aと2bは、同じゲルシステム10の遠心分離の前（図2a）と遠心分離の後（図2b）の状態を示している。図１のゲルシステムと較べて見た場合、図2aと2bでのゲルシステムには、保護相４の構成成分であるる油（液体パラフィン）層が含まれている。展開層１が遠心管6aに注ぎこまれ、続いて、保護相４が入れられ、その後、これらを含むゲルシステム10が遠心分離により圧縮されることになる（2000−3000xg、10−20分）。その後、試験の対象である液体試料５が遠心管6aに注ぎ込まれる。遠心分離の前に、前記液体試料５は、保護相４（図2a）の上に広がる。
遠心分離がなされている間、前記液体試料５は、その試料に含まれる溶解性の成分と一緒に保護相４を通過する。図１で示されたように、固形の粒子は展開相１を通過するが、その場合、最も重い粒子が遠心管の底部に広がる。遠心分離の後は、液体試料５の液体部分が保護相４と展開相１との間に移動する（図2b）。
図2aと2bで示されたゲルシステムは、図１のものよりも明らかに優れているけれども、遠心分離の後の、いわゆる培養段階の間、液体試料５が展開相１と接触したままになっているという欠点がある。
図３は、展開相１と吸着相２の２つの層から成る、本発明によるゲルシステムを示している。展開層１が円錐形の底部を有する遠心管6aに注ぎこまれ、続いて、吸着相２が入れられ、その後、これらを含むゲルシステム10が遠心分離により圧縮されることになる（1000−3000g、10−20分）。その後、試験の対象である液体試料５が遠心管6aに注ぎ込まれる。前記液体試料５は、吸着相の上に広がる。
ステップ（３゜）の遠心分離がなされている間、液体試料５に含まれる固体粒子は、その粒子のサイズにより吸着相２および／または展開相１を通過するけれども、その液体試料５中の液体部分とその中に溶解した成分のほうは吸着相２を通過しない。
ステップ（３゜）の遠心分離の後、前記液体試料５の中の最もサイズが大きく、最も重い粒子が、遠心管6aの底部にたまり、図１、2a−2bに示されたように、その底部を広がる。
展開相１が、一方において、ステップ（３゜）の遠心分離の後、吸着相２により、前記液体試料５から分離され、他方において、その吸着相２が小さい粒子を吸収することは好都合である。
図4a［遠心分離の前のもの］および図4b［ステップ（３゜）の遠心分離の後のもの］は、本発明によるゲルシステムを示しており、これらは図３と類似しているが、保護相４と言われる油（パラフィン油）の層が、円錐形の底部の付いた遠心管6aに入っている点で相違している。展開層１が遠心管6aに導入され、続いて、吸着相２と保護相４が入れられ、その後、これらを含むゲルシステム10が遠心分離により圧縮されることになる（1000−3000g、10−20分）。その後、試験の対象である液体試料５が遠心管6aに注ぎ込まれる。前記液体試料５は、保護相４（図4a）の上に広がる。
ステップ（３゜）の遠心分離がなされている間、液体試料５は保護相４を通過し、その試料に含まれる固体粒子も、その粒子のサイズにより吸着相２および／または展開相１を通過するけれども、その液体試料５中の液体部分とその中に溶解した成分のほうは吸着相２を通過しない。遠心分離の後は、最も重く最もサイズの大きい粒子が、上で示した遠心管6aの底部に拡散する。
図５は、３層、即ち、（底部から頂部への順番で）バリヤ相３、展開相１、吸着相２を含んで成る、本発明によるゲルシステムを示し、ここで、層１はゲル、層２はゲルまたは粒子層のいずれか、層３はゲルまたは固体パラフィンのいずれかである。
バリヤ相３（固体のパラフィンを含む場合には、室温と50−55℃との間の温度で事前に溶解し、その後冷却したもの）、展開相１、吸着相２を連続的に球形の底部の付いた遠心管6aに注ぎ込む。これらを含むゲルシステム10が遠心分離により圧縮されることになる（1000−3000g、10−20分）。その後、試験の対象である液体試料５が遠心管6aに注ぎ込まれる。ステップ（３゜）の遠心分離の前に、前記液体試料５は、吸着相２の上に広がる。
ステップ（３゜）の遠心分離がなされている間、液体試料５、および、それにに含まれる溶解成分は、吸着相２を通過しない。他方、前記液体試料５中の固体粒子は、その粒子のサイズに従って、この吸着相、展開相、バリヤ相の組み合わされたゲルシステム10を通過する。バリヤ相３が固体パラフィンの場合には、大きく重い粒子は、このバリヤ相の厚さ方向に通過しないが、展開相／バリヤ相との接合部にその粒子のサイズに従って広がる。
層2,1,3の形状を図５のようにすることで（この形状は、図6a,6bのゲルシステムにも適用できる）、吸着相２とバリヤ相３との間に挟まれた展開相１の厚さを減少させることが可能となり、その結果、肉眼（色変化）または比色計のいずれかによる光学測定での色の変化量の読み取り機能を改善できるという長所がある。
図6a［ステップ（３゜）の遠心分離の前］と、図6b［ステップ（３゜）の遠心分離の後］は、本発明によるゲルシステムを示したもので、図５のそれと類似しているが、保護相４を構成している油（パラフィン油）の層を有している点で相違している。液体試料５の固形粒子は、図５のように広がり、ステップ（３゜）の遠心分離がなされている間、前記試料５が保護相４を通過できるようにする。吸着相２、展開相１、バリヤ相３（頂部から底部の順番で）の膨張ゲルに使用されている高分子物質は、デキストラン粒子が好都合である。
特に適した製品は、ファーマシア・ファイン・ケミカル社（PHARMACIA FINE CHEMICALS,Uppsala,Sweden）により販売されている「Sephadex(R)G」の製品群であり、
−吸着相２には、製品G25C、
−展開相１には、製品G25からG100であり、粒子サイズが、いわゆる粗いものから中程度のものとして、G25M、G50C、G50M、G75、およびG100（G100が望ましい）が、
−バリヤ相３には、製品G150からG200であり、粒子サイズがいわゆる中程度のものから超微細のものとして、G150、G150s、G200およびG200S（G200および特にg200Sが望ましい）がある。
デキストラン型のこれらの製品の特徴は下記の表Ｉの通りである。
0003648248.tif 000002
本発明では重要なことである、膨張状態の粒子サイズと濃度に関する特徴は、下記の表II、IIIにおける、好ましいゲルに関して記載されている。
0003648248.tif 000003
0003648248.tif 000004
表IIIで示されたゲルの最小・最大濃度に関しては下記のコメントがある。
（１）液体試料５の液体と接触しているゲル（すなわち、図１の層１、または図３、５の層２）の濃度がこれ以上高いと、前記液体試料５が遠心分離中に前記ゲルを通過してしまう恐れがある。
（２）すべてのゲルの濃度がこれ以上高いと、微生物の存否の検出に重大な障害となる。
（３）これらのゲルの少なくとも１つがこれ以上希釈された状態の場合には、液体試料とその下にあるゲルの間、または、２つの隣接するゲルの間に液の交換が起こり、検出の結果を誤らせる。
図１、2a−2b、３、4a−4bで示されているように、大きな粒子（赤血球、白血球その他の細胞）に、光学的測定での検出のための変化量を提供する試薬との反応活性がない時には、バリヤ相３を省略することが可能である。前記の試薬としてレザズリンを使用した時には、特にこのことがあてはまる。
液体試料５に存在する物質（溶解したもの、または粒子）に、光学的測定での検出のための変化量を提供する試薬との反応活性がない場合、または、ステップ（４゜）の進展中に、いかなる妨害も阻止される状況にある時には、図１、2a−2bで図示されているように、吸着相２とバリヤ相３を省略してもかまわない。
試験対象の液体試料５中に存在しているかもしれない微生物が、ステップ（３゜）の遠心分離の間に、展開相（相１の厚さ方向または相１と相３の間の接合面上または相１と遠心管6aの下側壁部のいずれか）に移動してしまった微生物の濃度が、展開相１において、光学的測定での検出のための変化量を提供する試薬の検出限界値より高い時には、ステップ（４゜）での原位置（in situ）培養による微生物の増殖は不要である。
他方において、遠心分離の後、微生物の濃度が検出限界値よりも低い場合には、遠心管内の前記展開相での原位置（in situ）培養による増殖は必要であり、その場合の増殖温度は37℃が好ましい。
6a、6b、6cの遠心管の材料は透明材料（プラスチックまたはガラス）である。本発明によれば、使用できる遠心管の材料はプラスチックで、モールド成形により製作されたものであることが望ましい。修正実施例では、前記遠心管は、その管の少なくとも末端表面の一部で、展開相１が詰まっている区域は透明にしてもかまわない。
本発明によれば、前記液体試料５に含まれる微生物の当初の濃度を基礎にした場合の微生物検出限界値は103であり、この値は、前述の「Back−Ｔ−Screen(R)試験」や「FiltraCheck(R)−UTI試験」で示されたような先行技術での限界値である105菌/mlより顕著に低い。
このような改良が可能になった理由は、本発明によれば、遠心分離中に移動した液体試料５内の微生物を、展開相１で（α）濃縮し、適当な場合には、（β）栄養培地で増殖させるからである。
展開相で微生物を濃縮する方法として、本発明では、容積が最も小さく厚みが最も少ない展開相１が使用されている。従って、遠心管の形状は、試験試料の容積の、展開相の容積に対する比率と正比例の関係にある微生物の濃度係数が最大になるように選択する。展開相の容積は、式Ｖ＝πR2h（ここで、容積Ｖの単位はml、半径Ｒと高さｈはcm）で与えられる。つまり、管の直径が小さいほど、濃度係数は増加する。例えば、管の半径を10分の１にすると、濃度係数は103倍となる。
さらに、遠心管6cを毛細管にすることにより、展開相内の微生物の濃度が増加する。
図７、８は、遠心分離後に現れる、本発明の好ましいゲルシステムを示している。図4bと類似の内容を有する図７の管では、相２と試料５よりも小さい容積を有する展開相１が、遠心管6aの底の円錐形の低部に収容されている。
図８の管6bは、その内容物が図6bの管の内容と類似しており、これにはバリヤ相３と展開相１を収容する球形の底部（直径は、管の残りの部分よりも小さい）が付いている。この底部では、低い位置にあるバリヤ相３と上部にある吸着相２との間に挟まった展開相１が最も小さい容積と厚さを有するようになっている。
例えば、図８において、高さが0.2cmの環状の展開相を形成させるために、容積が12ml、内径が1.35cmの透明プラスチック管に、容積が6mlの試験用尿サンプルを入れるとすれば、使用される相１の容積（Ｖ）は、π（1.35/2）２・0.2、即ち、約0.3mlでなければならない。目に見える色のついた環を得るためには、尿中の濃度係数（Ｆ）は6/0.3＝20ということになる。管の直径の10分の１よりも小さい点から陽性反応が開始した時には、展開相の有用な反応容積は0.003mlとなり、その結果、濃度係数は6/0.003＝2000となり、前述したように、濃度係数の感度限界値は103倍増加する。修正実施例では、管の低部の断面が10分の１に減少した時（10で除すると直径は0.135cmとなる）、容積Ｖは、0.3x10-2となり、係数Ｆは、環に対して102倍増加し、点に対して103倍増加している。
図９、10は、本発明で使用している、透明のプラスチック製（例えば、ポリスチレンまたはポリカーボネート）の遠心管を示している。6cの管には、毛細管に収容された展開相に存在する微生物をカウントできるという長所がある。
図９において、管6cには、低部に毛細管７が、管の軸方向に取付けられており、これが展開相を受け取るようになっている（参照番号１）。管6cの円筒形部分が円錐部20を介して毛細管７の開口部と合体されいる。展開相は、線22に沿って、毛細管の中に収容され、その円錐部20が毛細管７と交差する線に対応している。適当な場合には、保護相（参照番号４）および／または吸着相（参照番号２）が線22の上に収容される。管6cの外部円筒壁は、２本の足部（または拡張部）8,9の形で、毛細管と面した状態で、互いに正反対の方向で、下方に伸びており、管を直立させた時に安定性を与えるようになっている。これらの足部8,9は１つの台を形成し、それらの間に２個の窓が設けられ、毛細管の内部を、遠心分離と培養の前後に、肉眼または光学的デバイス（比色計、分光計など）により観察でき、細胞または酵母をカウントできるようになっている。
図10の管6cは、図９の管で説明したように、細菌や酵母をカウントできる構造になっていると同時に、内部の細菌や酵母を同定のために集められるようにもなっている。この管は、毛細管７、円錐壁20、内部円筒壁17、表面20と毛細管７の開口部との交差面と対応している線22から成る。円筒部17の開口部は管6cの軸あるいは番号11で示されるじょうごの形をした部分のいずれかと平行である。
図10において、管6cの上部の先端の近くの外部表面には、Ｏ−リングシール（特に、ゴム製）（図示しない）を収容できる１つ以上のみぞ14、15が設けられており、そのみぞのひとつ14は、２個のフランジまたは蓋12、13の間に、もうひとつのみぞは、フランジ13と管の外部表面16との間に配置されている。外部表面16には、環状の支台18が具備されている。フランジ12および／または13、および外部表面16から成る組立部は、円筒形のキャップ、特に、プラスチックのキャップで密閉されるようになっており、それは、管6cの外部上部から支台18までの覆うようになっている。足部または拡張部８、９は、図９の管で説明したように、遠心管を直立させておく支台としての働きがある。これらの足部の表面の外側を向いている側の一部が平らになっており、必要な場合には、この足部にラベルを貼れるようになっている。この足部８、９には、その外側表面部に１組の１列おきに交互に付いているみぞ19と凸部21が付いており、図10の6cの管（高さは低く、特に、30mm）が、遠心分離機側の別の管（大きい）の開口部に収容されるようになっている。
毛細管７の線22の高さに達する位置にまで入っている展開相に依存する細菌または酵母を、図９の管で説明したように、足部8,9の間に配置された窓から観察し、カウントできるようになっている。
図10で示した管の毛細管に収容されている展開相に存在する微生物を集める場合には、（１゜）毛細管に残っている展開相の上澄み液を廃棄するために管を逆にして、（２゜）Ｏ−リングシールをみぞ14の中に入れ、（３゜）管6cを逆さまにした状態（毛細管７が上を向いた状態のまま）のままで、フランジ12、みぞ14内に収容されているシール、フランジ13、表面16を含んで成る組立部品を、液体の回収培地を含む第２の遠心管の開口部に、第２の遠心管が支台18に接触するまで挿入し、（４゜）開口部の所で合体している２つの遠心管を振り、（５゜）当初は毛細管に入っている展開相を、第２の管の底部にある回収液に移転させるために、1000−20000gで２−５分間遠心分離する。
この手順により、微生物を、汚染なしに、しかも微生物を失うことなく、迅速に回収できる。この技法は、毛細管７に収容されている展開相を、シリンジによる吸引により移動させる技法よりも有効である。実際問題として、展開相を構成しているゲルの膨張高分子は、大きさが違うために容易にはシリンジ穴を通過しないのである。
修正実施例では、微生物を含む展開相を図９の管を使用して集めることのできる方法を採用している。その手順は、（1a）線22の上にある上澄み液を廃棄し、（2a）水性の洗剤液を加えを、管6cを密閉し振り、（3a）管を1000−2000gで、２−５分間、遠心分離し、（4a）上澄み液が無色になるまで操作（2a）と（3a）を繰り返し、（5a）無色になった上澄み液を廃棄し、水性の回収溶液を加え、管を振って発生した、大部分の微生物を含んでいる液体培地と展開相を別々に集めることである。
実際的な観点から、振とうする前および遠心分離する前に管6cを挿入した時に、展開相が毛細管内に留まっているようにするために、毛細管の内径が2.5mmまたはそれ以下であることが重要である。適切な内径は、1.2−2.3mmである。内径が2.0−2.2mmの場合には非常によい結果が出ている。
微生物の検出感度を改善し、展開相の効率的な回収をするために、下記の条件の少なくとも１つ、好ましくは、全部を満たすことが望ましい。
Ａ−毛細管の内径が2.5mm以下であること、
Ｂ−円錐部20の角度αが30゜（≦π/6）かそれ以下であること。つまり、この円錐部の母線が管の垂直軸にわずかに傾斜していること（傾き角はα/2またはそれ以下）、
Ｃ−毛細管の容積は0.6mlあるいはそれ以下（好ましくは、0.1ml以下）であること、
条件Ｂまたは条件Ｃが満たされない場合には、展開相の微量物、つまり微生物の微量物が、管の内壁、特に交差面22の部位に堆積する恐れがある。
例１
下記のものを、容積が5ml,内径が1.10cmの透明プラスチック遠心管に連続的に導入する。
−バリヤ相を形成するために、乾燥重量濃度が0.2m/mlで、膨張状態での粒子サイズが40−100μｍのG200S/蒸留水のゲル0.5ml、
−展開相を形成させるために、乾燥重量濃度が0.2g/ml,乾燥状態での粒子サイズが120−300μｍのG100/水性培養基のゲル0.25mlで、この培養基の成分が、
心臓−脳ブイヨン                       37g/l
グルコース                              5g/l
寒天（IX型）                            0.33g/l
pH                                      7.4±0.1
であり、0.05g/mlのレザズリンを含むもの、および、
−吸着相を形成させるために、乾燥重量濃度が1g/ml,乾燥状態での粒子サイズが40−110μｍのG25/蒸留水のゲル0.5ml。
ここで生成したゲルシステムを遠心分離により圧縮する（室温で、1000−3000g、10−20分）。修正実施例では、上記圧縮のための遠心分離を、上記の相のそれぞれの導入した後と、次の相の導入の前に実施できるようになっている。このプロセスにより得られたゲルシステムはすぐに使用できる。
例２
1mlのパラフィン油を前記例１により準備したゲルシステムの上に保護相として導入する。
これは、生物学的材料の試料の中の微生物の存否を検出するための装置を提供することになる。この装置は保存中安定している。
例３
下記のものを容積が5ml,内径が1.10cmの透明プラスチック遠心管に連続的に導入する。
−バリヤ相を形成させるために、（室温まで冷却した後）50℃またはそれ以上の温度で溶解したパラフィン（このパラフィンは溶解した状態で導入）の0.5ml、
−展開相を形成させるために、乾燥重量濃度が0.2g/ml,乾燥状態での粒子サイズが103−311μｍのG100/水性培養基のゲル0.25mlで、この培養基の成分が、
心臓−脳ブイヨン                       37g/l
グルコース                              5g/l
寒天（IX型）                            0.33g/l
pH                                      7.4±0.1
であり、2mmol/lのpH8.0でリン酸緩衝液で処理したＨ−Ｌ−Ala−NA（0.1M）を含むもの、および
−吸着相を形成させるために、乾燥重量濃度が1g/ml,乾燥状態での粒子サイズが32−129μｍのG25/蒸留水のゲル0.5ml、および0.06g/lのEDTAを含むゲルを生成させるために使用する蒸留水。
ここで生成したゲルシステムを遠心分離により圧縮する（室温で、1000−3000g、10−20分）。修正実施例では、上記圧縮のための遠心分離を、上記の相のそれぞれを導入した後と、次の相の導入の前に実施できるようになっている。このプロセスにより得られたゲルシステムはすぐに使用できる。
例４
0.25mlのパラフィン油を、前記例３により準備したゲルシステムの上に保護相として導入する。
これは、生物学的材料の試料中の微生物の存否を検出するための装置を提供することになる。この装置は保存中安定している。
例５
手順は例３の場合と同じであるが、展開相の形成において、G100を膨張させるために使用する水性培養基にも、ジアゾ化剤であるｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含有する点で異なる。
例６
下記のものを、容積が5ml,（円筒形の部分の）内径が1cmの透明プラスチック円錐形の底部を有する遠心管に連続的に導入する。
−展開相を生成させるために、乾燥重量濃度が0.2g/ml,乾燥状態での粒子サイズが103−311μｍのG100/水性培養基のゲル0.20mlで、この水性培養基の成分が、
YNB                                      6.7g/l
マルトース                              20.0g/l
ゲンタマイシン                           0.05g/l
シクロヘキシミド                         0.5g/l
pH                                       6.0
であり、2mmol/lのＨ−Ｌ−Ppro−pNA（カンジダ・アルビカンスが他のカンジダから区別できるように、カンジダアルビカンスに特異的である基質を含む培養基）を含むもの、および、
−吸着相を形成させるために、粒子サイズが同じ0.055−0.060μｍである微粉化したカオリンの0.5ml。
ここで生成したゲルシステムを、室温、1000−3000g、10−20分の条件で遠心分離して圧縮する。
このプロセスにより得られるゲルシステムはすぐに使用できるものであり、特に、カンジダ属菌の分離されてない群の中からカンジダ・アルビカンスを同定する目的がある。
例７
1mlのパラフィン油を、保護相を形成させるために、前記例６により準備したゲルシステムの上に導入する。生成ゲルシステムを、室温で、2000g、15分の条件で遠心分離して圧縮する。
例８、９
手順は例６の場合と同じであるが、細菌の検出に特異的に機能するゲルシステムの展開相を得るために、例１のレザズリンを含む栄養培地の0.20mlを栄養培地基として使用している点で異なる（例８）。ここで生成したゲルシステムは、例７の方法に従い、保護相から成るすぐに使えるゲルシステムを準備するのに使用される（例９）。
例10、11
手順は例６の場合と同じであるが、酵母の検出に特異的に機能するゲルシステムを作成するための展開相を得るために、栄養培地としてアスペルギルス属菌に特異的である栄養培地の0.02mlを使用している点で異なる（例10）。ここで生成したゲルシステムは例７の方法に従い、保護相を有するすぐに使えるゲルシステムを準備するのに使用される（例11）。
例12
１−4mlの滅菌した尿（この中に別の濃度を有する大腸菌株を導入しておく）または、大腸菌が原因の尿感染患者から採取した尿を、例１と５で準備したゲルシステムの入った管に導入する。濃度が105CFU/mlの大腸菌株を含む感染尿試料の場合には、室温、3000−5000gで20分間遠心分離した後、ピンク色のスポットをレザズリンで観察し（例１で準備したゲルシステムで）、赤い色のスポットをＨ−Ｌ−Ala−NAとジアゾ化剤との混合試薬で観察した（例５で準備したゲルシステムで）。展開相の中のこれらの着色されたスポットはその後拡散して、それぞれが、室温、37℃で、2.3時間後に色のついた環を形成した。レザズリンを使用して得られた結果が表IVに示されている。
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例13
50例（35例は、細菌性尿感染、15例は感染していない対照）から採取した尿バッチの補足試験を行った。各試験対象試料に同時に例１−５のゲルシステムを使用した。尿2mlを各遠心管に注入した。
室温で、3000−5000g、15分の遠心分離の後、37℃で24時間の原位置（in situ）培養して使用した。本発明にかかるゲルシステムを使用して、これらの尿試料を観察した場合には、前述した従来の「Bac−Ｔ−Screen(R)試験」、「FitraCheck(R)−UTI試験」の場合に較べて、感度，特異性，陰性予測値（細菌低濃度での）が改善した。得られた結果のうちのいくつかを、濃度が103菌/mlの尿試料に換算して得られた数値は下記の通りであった。
Sen（感度）      ＝95−98％
Spe（特異性）    ＝93−97％
NPV（陰性予測値）＝91−94％
例14
稼動している８劇場内の細菌の存否を評価するために、例２のゲルシステムを使用した。上部の開口部にじょうご状のフランジが付いている（付いていないものある）前記のゲルシステムの入った管（容積15ml）を、稼動中の劇場内のタービン入り口の近くの、地上から1.5mの高さの、最も近い壁から1mの位置に設置した。管とフランジの空気に触れる部分を、ピペットで蒸留水を流し込んで洗浄した。室温で、3000g、30分の遠心分離の後、37℃で24時間の原位置培養した後、稼動中の劇場内の周囲空気に細菌（主に、スタヒロ・コッカス（ブドウ球菌））が検出された。汚染されていることが判明したその劇場を消毒した。
例15
６箇所の稼動中の劇場の換気ダクトのフィルタ（セルロース膜）を切り取って、微細に切断した。得られた材料を蒸留水に混ぜて、その混合液の上澄み液の１−2mlを、例２と11で準備した遠心管にそれぞれ入れた。室温で、3000−5000g、15分の遠心分離を行った後、37℃で24時間の原位置培養し、観察した結果、稼動中の６劇場のうちの１劇場に細菌（主に、シュードモナス）を検出し、別のもうひとつの劇場では酵母（アスペルギルス属）を検出した。汚染されていることが判明したこれらの２劇場を消毒した。
例16
「不純物を除去」（即ち、脱脂）し、消毒した乳汁2.5mlを、カンジダ属菌で汚染させ（105菌/mlあるいはそれ以上の濃度）、例７で準備した遠心管のバッチ（１バッチは５種類の内容の遠心管）に下記のようにそれぞれ注入した。
−バッチA:カンジダ・アルビカンス菌の分離株
−バッチB:カンジダ・グラブラタ菌の分離株
−バッチC:カンジダ・クルセイ菌の分離株
−バッチD:種々のカンジダ属菌の非分離株（カンジダの別系統に関連しているカンジダ・アルビカンス）
−前記の不純物を除去し洗浄した乳汁を含む対照用バッチ。
室温で、3500−4000g、20分の遠心分離をした後、37℃で１−２時間の原位置培養し観察した結果、例７で準備したゲルシステムでは、ＡバッチとＤバッチの管で陽性の色反応が現れ、Ｂバッチ、Ｃバッチ、対照バッチでは陽性色反応が現れなかった。
例17
（中に存在する赤血球を溶解する目的で）予めサポニンに接触させた血液培養試料（感染患者から採取したもの）の１−3mlを、例４で準備したゲルシステムの入った遠心管に注入した。この管を室温、3000−5000gで15分間遠心分離した。37℃で１−２時間の原位置培養した後観察した結果、その遠心管内にグラム陰性菌の存在を示す陽性色反応が認められた。
修正実施例では、展開相または展開相と吸着相を組み合わせたものに抗生物質を入れ、ゲルシステムの入った各管には別々の種類の抗生物質が入るようにして観察すると、血液培地に含まれる菌の、通常において使用している抗生物質に対する耐性を評価することができた。
例18
牛肉を切り取って、微細に粉砕した。この粉砕試料に、等張液と細菌（細菌濃度が107菌/mlのスタヒロコッカス・エピデルミディス（表皮ブドウ球菌））を加えた。その上澄み液の１−2mlを集め、例２で準備したゲルシステムの入った管に注入した。この管を室温、3000−5000gで15分間、遠心分離し、37℃で24時間の原位置培養した。展開相の低部に色変化が認められ、この試料には細菌が存在することが確認された。
例19
下記のものを、毛細管（直径が2.2mm,容積が0.45mm）が具備された、高さ30mmの透明プラスチック遠心管（図10）に連続的に導入する。それぞれを入れた後、管内の各層を圧縮するために、管を室温で、1000−3000g、10−20分間遠心分離する。
−乾燥重量濃度が0.2g/ml,乾燥状態での粒子サイズが103−311μｍのG100/水性培養基（レザズリンを含む）のゲル0.045ml、および、
−0.5mlのパラフィン油。
その後、大腸菌による尿感染患者から採取した尿試料を入れる。室温で、300−5000g、20分間の遠心分離を開始してから１時間に、細菌が存在している時の特徴である着色化が認められる。
細菌の光学的に（分光計、デンシトメータ、または、比濁分析用の「MacFARLAND」装置を使用して）カウントする。適当であれば、既知の量の大腸菌を含んだ標準尿検査溶液を使用して測定する。
すでに説明したように、展開相は、水性の回収溶液を含んだ第２の遠心管により回収される。これは数種の抗生物質に対する細菌の耐性を評価のための耐性記録を作成するのに使用される。毛細管７の容積を0.02−0.03μｌに減らした場合に、特に効果的な結果が得られる。
本発明によれば、少なくとも、
（１）（頂部から底部への順番で）保護相４、吸着相２、展開相１から成るゲルシステムが収容された円錐形の底部を有する遠心管6a、または、（頂部から底部への順番で）保護相４、吸着相２、展開相１、バリヤ相３から成るゲルシステムが収容された球形の底部を有する遠心管6b、または、適当な場合には、展開相１と、この上に、保護相および／または保護相と吸着相の組み合わされた層が配置されているゲルシステムが収容された毛細管を有する遠心管6c、および／または、
（２）前記層の成分材料（単一のゲル、または、複数のゲル、粒子物質、固体パラフィン、および／または液体パラフィン）と、微生物が存在する場合には光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬、および、適当であれば、前記の展開層１の膨張に使う培養基を含むボトルから成ることを特徴とする測定キットが望ましい。
本発明にかかるゲルシステムとその方法を下記の目的に使用することが望ましい。
−特に、血液培地スクリーニングと尿スクリーニングの分野において、血液試料または尿試料中の細菌の存否を検出すること、
−（α）光学的測定において検出のための変化量を提供する試薬、および（β）菌に対して特異的な性質を有する培養基を使用して、生物学的試料を含む展開層内の微生物の菌を同定すること、
−展開層に存在する微生物をカウントすること、
−カウントのために微生物を含む展開層を回収すること、または
−微生物菌の、通常使用されている抗生物質に対する耐性を調べること。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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