(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一連のアミノ酸置換:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120K
を含むヒト成長ホルモン変異体。
【請求項２】
ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を30と100キロダルトンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項1のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項３】
上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項2のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項４】
上記ヒト成長ホルモン変異体が4と6分子の間のポリ(エチレングリコール)と接合している請求項3のヒト成長ホルモン変異体。
【請求項５】
請求項1のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸。
【請求項６】
請求項5の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項6のベクターを含むホスト細胞。
【請求項８】
請求項7のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産方法。
【請求項９】
(a) 請求項1のヒト成長ホルモン変異体のペグ化;
(b) カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンのアプライ;及び(c) ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出;
を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。
【請求項１０】
有効量の請求項1から4のいずれか一項のヒト成長ホルモン変異体を含む、患者における成長ホルモン機能阻害のための製薬組成物。
【請求項１１】
先端巨大症の患者のための請求項10の組成物。
【請求項１２】
患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ請求項10の組成物。
【請求項１３】
糖尿病性網膜症の患者のための請求項10の組成物。
【請求項１４】
癌の患者のための請求項10記載の組成物。
【請求項１５】
糖尿病性腎症の患者のための請求項10記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は1995年9月21日に査定された出願番号08/537,067の一部継続出願であり、1995年9月21日に査定された出願番号08/537,068の一部継続出願であり、それらの明細書は全体として参考としてここに取り込まれる。
発明の分野
本発明はヒト成長ホルモンの作用剤または拮抗剤としての使用のための特定の成長ホルモン変異体及びそれらのペグ化形態に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の説明
ヒト成長ホルモン(hGH)は正常なヒトの成長及び発達の調節の多くの面に関与している。この22,000ダルトンの下垂体ホルモンは、伸長成長(体形成)、乳汁分泌、マクロファージの活性化及びインスリン様と糖尿病誘発性効果、その他を含むたくさんの生物学的効果を示す。Chawla,Annu.Rev.Med.,34:519(1983);Edwards等,Science,239:769(1988);Isaksson等,Annu.Rev.Physiol.,47:483(1985);ThornerとVance,J.Clin.Invest.,82:745(1988);HughesとFriesen,Annu.Rev.Physiol.,47:469(1985)。これらの生物学的効果はhGHと特定の細胞受容体間の相互作用に由来する。子供における成長ホルモンの欠失は小人症を導き、それはここ十年以上の間にhGHの外因性投与によりうまく治療されている。hGHの遺伝学的及び翻訳後修飾形態の識別のため(Lewis,Ann.Rev.physiol.,46:33[1984])、hGHが臨床的に投与される場合それに対する免疫学的応答を特性指摘するため、そしてホルモンの循環濃度を定量するため、hGHの抗原性にも興味が持たれている。
【０００３】
hGHは胎盤ラクトゲン、プロラクチン及び成長ホルモンの他の遺伝学的そして種変異体を含む相同のホルモンのファミリーのメンバーである。Nichol等,Endocrine Reviews,7:169(1986)。hGHは広い種特異性を示し、クローン化された体形成受容体(Leung等,Nature,330:537[1987])またはプロラクチン受容体(Boutin等,Cell,53:69[1988])のそれぞれに結合する点においてこれらの間では変わっている。hGHに対するクローン化遺伝子は、大腸菌において分泌型で発現されており(Chang等,Gene,55:189[1987])、そのDNA及びアミノ酸配列が報告されている。Goeddel等,Nature,281:544(1979);Gray等,Gene,39:247(1985)。ブタ成長ホルモン(pGH)に対する三次元ホールディングパターンが、並みの分解能と精製で報告されている。Abdel-Meguid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6434(1987)。hGHの受容体と抗体エピトープが、本出願に対する優先出願及びCunningham等,Science,243:1330-1336(1989)そしてCunninghamとWells,Science,244:1081-1085(1989)に記述されているようなホモローグスキャニングミュータジェネシス及びアラニンスキャニングミュータジェネシスによって同定されている。
【０００４】
タンパク質-タンパク質界面の分子的詳細を示す多くの数の高分解能構造がある(レビューとしてArgos,Protein Eng.,2:101-113[1988];Janin等,J.Mol.Biol.,204:155-164[1988];Miller,Protein Eng.,3:77-83[1989];Davies等,Annu.Rev.Biochem.,59:439-473[1990]参照)。これらは接触残基を定義するが、それらに対するエネルギー論は定義せず、どのようにドッキングが生じているかも示さない。会合と解離に影響する接触残基の役割の包括的な理解は分子的認識プロセスの基本であり、合理的なタンパク質及び薬剤のデザインに対して特に重要である。
【０００５】
おそらく最もよく特性指摘されているホルモン-受容体複合体は、hGHとその受容体(hGHbp)の細胞外ドメインの間のものである。レビューとして、WellsとDe Vos,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,22:329-351(1993)参照。高分解能構造的及び突然変異的分析(CunninghamとWells,上記参照;Cunningham等,Science,254:821-825[1999])そして構造的分析(De Vos等,Science,255:306-312[1992])により、hGHの一分子がサイト1及びサイト2と呼ばれるホルモン上の独特の部位を用いて二つの受容体分子と連続的に結合することが示されている。
【０００６】
hGHの自然に生じている突然変異のメンバーが同定されている。これらにはhGH-V[Seeberg,DNA,1:239(1982);米国特許第4,446,235号、第4,670,393号及び第4,665,180号]及びhGHの32-46残基の欠失を含む20KhGHが含まれる。Kostyo等,Biochem.Biophys.Acta,925:314(1987);Lewis等,J.Biol.Chem.,253:2679(1978)。
ある研究者は通常Cys-53とCys-165の間に存在するジスルフィド結合を破壊するために、hGHの165位のシステインをアラニンに置換することを報告している。Tokunaga等,Eur.J.Biochem.,153:445(1985)。この単一置換はhGHの三次元構造を明らかに維持しhGHに対する受容体によって認識されるミュータントを提供した。
【０００７】
また別の研究者は固体樹脂支持体上でのhGHのin vitro合成を報告している。この研究者による第一の報告は、hGHに対する不正確な188アミノ酸配列を開示した。Li等,J.Am.Chem.Soc.,88:2050(1966);米国特許第3,853,832号。第二の報告は190アミノ酸配列を開示した。米国特許第3,853,833号。この後者の配列もまた不正確である。特にhGHは68位の後に付加的なグルタミンを持ち、73位はグルタミンよりむしろグルタミン酸、106位はアスパラギンよりむしろアスパラギン酸、108位はアスパラギン酸よりむしろアスパラギンを持つ。
【０００８】
以上に加えて、特定のモノクローナル抗体への結合を改変したハイブリッドインターフェロンが報告されている。Peptides:Structure and Function,Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium,Deber等,編(Pierce Chemical Co.,Chicago,Ill.,1985),pp.375-384中のCamble等,"Properties of Interferon-α2 Analogues Produced from Synthetic Genes"。ここで開示されているように、α-1インターフェロン由来の101-114アミノ酸残基またはγ-インターフェロン由来の98-114アミノ酸残基をα-2インターフェロンに置換した。α-2インターフェロンはNK-2モノクローナル抗体を結合する一方α-1インターフェロンはしない。α-1とα-2インターフェロンの間の27アミノ酸差異の7がこの領域に位置しているので、α-2インターフェロンのこの特定の領域が明らかに選択された。伝えるところによればこう得られたハイブリッドはNK-2モノクローナル抗体との活性を実質的に減少した。抗ウイルス活性をテストすると、該ハイブリッドは野生型α-2インターフェロンの活性と同等な抗ウイルス活性を示した。これらの領域の比較的小部分の置換もまた報告された。3から7アラニン残基のクラスターの連続的な置換もまた提案された。しかしながら一つのアナログ[Ala-30,32,33]IFN-α2のみが開示された。
【０００９】
ニワトリ卵白リゾチームの小ペプチド断片内のアラニン置換及び2A11または3A9細胞の刺激に対する該置換の効果もまた報告されている。Allen等,Nature,327:713-715(1987)。
他の者は結合性質が抗原結合ループ(Jones等,Nature,321:522-525[1986])またはDNA認識ヘリックスを含む二次構造の完全なユニットの置換によって操作し得ることを報告している。Wharton等,Nature,316:601-605(1985)。
【００１０】
ヒスチジン18及びヒスチジン21を含むhGHのスプライシングを受ける配列を含むアミノ末端メチオニルウシ成長ホルモン(bGH)の構造が示されている。米国特許第4,880,910号。付加的なhGH変異体が本出願の優先出願及び1991年6月14日に提出された共に継続している米国出願番号07/715,300と1991年8月9日に提出された07/743,614と1992年6月11日印刷されたWO92/09690に記述されている。一つ以上のアミノ酸でポリ(エチレングリコール)(PEG)に共有結合で付着されたGH部分を持つhGH変異体もまた開示されており(1993年1月7日に印刷されたWO93/00109)、それらの中にはPEG分子が41位のリシンに付着しているものもある。
GHと二つの受容体分子の間の1:2複合体二量体を開示するhGH変異体もまた1992年11月26日に印刷されたWO92/21029に報告されている。その変異体はその天然の構造において四つの両親媒性αヘリックスを含み連続的な順番で二つの部位を通じてその受容体と結合するモノマーポリペプチドリガンドである。リガンドがGHである場合、もし一つは野生型ホルモンのN末端約15残基内にあり、もう一つはヘリックスC内にある少なくとも2の残基でミューテーションが存在したならば、この変異体はサイト1またはサイト2内に導入されたミューテーションを持ち、サイト1はサイト1での受容体に対するリガンドのアフィニティーを増大するためにミューテートされる。
【００１１】
一価ファージディスプレー(Bass等,Proteins,8:309-314[1990])がhGHbpに対するhGH内のサイト1のアフィニティーを改良するために用いられ得ることが以前に示されている。Lowman等,Biochemistry,30:10832-10838(1991)。結合アフィニティーの適度の改良(野生型hGHより3から8倍タイトな)をそれぞれがサイト1中の四つの異なるコドンがミューテートされた三つの独立のライブラリーを分類することによって生産された。サイト1に対する結合アフィニティーをわずかに促進され、サイト2を結合する能力をブロックされたhGHミュータントは、単独のサイト2ミュータントよりよりよいhGH受容体の拮抗剤であった。fuh等,Science,256:1677-1680(1992)。さらに先端巨大症のようなGH過多の病気を治療する点で有用性を持ち得るさらによりよい拮抗剤を得るために、サイト1アフィニティーを改良することが望ましいであろう。
【００１２】
サイト1アフィニティーにおける付加的な改良は、ライブラリー当たりさらに多くの残基をミューテーションすることによって得られ得る。しかしながら約5より多いコドンを同時に無作為化する場合、全ての可能な残基の組み合わせを表すのを確認するのに十分なトランスフォーマントを生産するのは適しなかった。LowmanとWells,Methods:Companion Methods Enzymol.,3:205-216(1991)。タンパク質-タンパク質界面でのミューテーションは通常結合に対して付加的な効果を示す。Wells,Biochemistry,29:8509-8517(1990)。
アフィニティーにおいてさらにより大きい改良を得ることが望ましい。hGHとbGHのリシン残基が成長ホルモン受容体とのhGHとbGhの相互作用において関与していることが開示されており、構造-機能関係において特に41,64,70及び115位のリシンまたはアルギニン残基が関与していることが開示されている。Martal等,FEBS Lett.,180:295-299(1985)。ラジオリセプターアッセイによって減少した活性を引き起こすために、メチル化、エチル化、グアニジン化及びアセトイミジン化によってリシン残基が化学的に修飾された。
【００１３】
hGHとhGH変異体のin vivoでの効力をhGH受容体に対するアフィニティーによって、及び循環からのクリアランスの割合によって部分的に測定した。特定の他の治療上のタンパク質のin vivoでの半減期が、タンパク質をPEGと接合することによって増大されているが、それをここで「ペグ化」という。例えばAbuchowski等,J.Biol.Chem.,252:3582-3586(1977)参照。PEGはエチレン酸化物モノマー当たり3個の水分子を持つ非免疫原性非電荷ポリマーとして典型的に特性指摘される。PEGはペグ化タンパク質において増大した流体力学的ボリュームを提供することによって腎クリアランスを遅らせると考えられている。Maxfield等,Polymer,16:505-509(1975)。ある研究では、Katreと共同研究者(Knauf,M.J.等,J.Biol.Chem.,363:15064-15070[1988];Goodson,R.J. & Katre,N.V.,Bio/Technology,8:343-346[1990])は、PEG-インターロイキン-2のin vivoでの半減期が有効な分子量と共に増大することを示した。加えてペグ化は特定の治療上のタンパク質の免疫原性と毒性を減少することが報告されている。Abuchowski等,J.Biol.Chem.,252:3578-3581(1977)。
【非特許文献１】Chawla,Annu.Rev.Med.,34:519(1983);
【非特許文献２】Edwards等,Science,239:769(1988);
【非特許文献３】Isaksson等,Annu.Rev.Physiol.,47:483(1985);
【非特許文献４】ThornerとVance,J.Clin.Invest.,82:745(1988);
【非特許文献５】HughesとFriesen,Annu.Rev.Physiol.,47:469(1985)
【非特許文献６】Lewis,Ann.Rev.physiol.,46:33[1984]
【非特許文献７】Nichol等,Endocrine Reviews,7:169(1986)
【非特許文献８】Leung等,Nature,330:537[1987]
【非特許文献９】Boutin等,Cell,53:69[1988]
【非特許文献１０】Chang等,Gene,55:189[1987]
【非特許文献１１】Goeddel等,Nature,281:544(1979);
【非特許文献１２】Gray等,Gene,39:247(1985)
【非特許文献１３】Abdel-Meguid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6434(1987)
【非特許文献１４】Cunningham等,Science,243:1330-1336(1989)
【非特許文献１５】CunninghamとWells,Science,244:1081-1085(1989)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン(hGH)変異体を提供する:
H18D,H21N,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。
また以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン変異体が提供される:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A。
これらの置換はサイト1でのhGH受容体に対する結合アフィニティーを増大する。これら一連のアミノ酸置換を含むhGH変異体は、サイト2でのhGH受容体に対する結合を破壊する付加的な修飾の不存在下でhGH作用剤として機能する。
【００１５】
G120で異なるアミノ酸の置換は、サイト2結合を破壊する一つの修飾である。したがってG120でのアミノ酸置換を含むhGH変異体はhGH拮抗剤として機能する。本発明はG120アミノ酸置換が一連のサイト1アミノ酸置換の一つと結びついているhGH変異体を提供する。それゆえ一つの実施態様として、hGH変異体は以下の一連のアミノ酸置換を含む:
H18D,H21N,G120K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T(以下では「B2036変異体」という)。
もう一つの実施態様として、hGH変異体は以下の一連のアミノ酸置換を含む:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,G120K,K168A,E174A(以下では「B2024変異体」という)。
本発明のさらなる一面として、核酸配列、ベクター、ホスト細胞及びこれらのhGH変異体の発現のためのプロセスが含まれる。
【００１６】
本発明はまたマススペクトロメトリーで測定されるような変異体の分子量(以下では「真の分子量」という)を少なくとも約40キロダルトンに増大する一つ以上の化学的グループと接合したhGH変異体を含む。一つの実施態様として、hGH変異体をポリ(エチレングリコール)(PEG)のような一つ以上のポリオールに接合する。またPEGに接合したhGH変異体の生産方法も提供される。
本発明のさらなる一面として、本発明の拮抗剤hGH変異体の有効量を患者に投与することを含む、患者における成長ホルモン機能を阻害するための方法がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
好ましい実施態様の説明
変異体
ヒト成長ホルモン(hGH)のDNA及びアミノ酸配列が報告されている。Goeddel等,上記参照;Gray等,上記参照。本発明はアラニンスキャニング方法体系またはファージミド選択法のそれぞれを用いて生産された新しいhGH変異体を記述する。本発明のhGH変異体は野生型またはmethGHを発現可能ないかなる組換え系においても発現し得る。
変異体hGH配列表記は本発明のhGH変異体における現実のアミノ酸置換を定義する。変異体に対して、置換は野生型残基を表す文字(一文字コードで)、野生型配列のアミノ酸位置を示す数及び置換されたアミノ酸を示す第二の文字によって示される。例えばR64KはArg64がLysに変換されたミューテーションを示す。複数のミューテーションはコンマによって分割された一連の単一のミューテーションによって示される。
【００１８】
アラニンスキャニングミューテーション
一つの実施態様として、本発明はここでポリペプチドとその受容体の相互作用に関与するポリペプチド内の一つ以上の活性部位を検出するために、hGHの系統的な分析を利用する。該分析は組換えDNA法を用いて簡便に実施される。一般的にhGHをコードするDNAは便宜にホスト内でそれを発現するためにクローン化され操作される。hGHをコードするDNAはゲノムライブラリー、hGHを発現する細胞内のmRNAから由来するcDNA、または合成的に構築したDNA配列によって得られ得る。Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982)。
それから野生型hGHDNAをホスト細胞をトランスフォームするために用いられる適したプラスミドまたはベクター内に挿入する。原核生物はhGH変異体を生産するためのDNA配列のクローニング及び発現にとって好ましい。例えば大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC No.31537)、及び大腸菌c600とc600hfl、そして大腸菌W3110(F−,γ−、原栄養株性、ATCC No.27325)、枯草菌のようなバチルス、及びネズミチフス菌または霊菌及び様々なシュードモナス種のような他の腸内細菌科と同様に、大腸菌K12株294(ATCC No.31446)が用いられ得る。好ましい原核生物は大腸菌W3110(ATCC 27325)である。原核生物の細胞内で発現される場合、hGHは典型的にN末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。培地またはペリプラズム内の細胞外に発現される場合、hGHはN末端メチオニンを含んでいない。これらの例はもちろん限定することよりもむしろ実例となることを企図されている。
【００１９】
原核生物に加えて、酵母カルチャーのような真核生物細菌、または多細胞生物由来の細胞が用いられ得る。原則として、いかなる該細胞カルチャーも実施可能である。しかしながら興味は哺乳動物細胞において最大であり、カルチャー(組織カルチャー)における哺乳動物細胞の増殖は再現可能な方法となっている。Tissue Culture,Academic Press,KruseとPatterson,編者(1973)。該有用なホスト細胞系の例として、VERO及びHeLa、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、W138、BHK、COS-7及びMDCK細胞系がある。
【００２０】
一般的にホスト細胞と両立できる種由来の複製およびコントロール配列を含むプラスミドベクターがこれらのホストと連結して用いられる。ベクターはもともと複製部位を運んでおり、トランスフォームされた細胞において表現型選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列も同様である。例えば大腸菌は大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いてトランスフォームされ得る。Mandel等,J.Mol.Biol.,53:154(1970)。プラスミドpBR322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、それゆえ選択のための容易な手段を提供する。一つの好ましいベクターは本出願の優先出願(1989年10月26日に提出されたU.S.S.N.07/428,066)の実施例1に記述されているpBO475である。このベクターはファージ及び大腸菌のための複製のオリジンを含んでおり、それらはこのベクターを該ホストの間で往復することを可能にし、それによってミュータジェネシスと発現を容易にする。「発現ベクター」とは適したホストにおいて上記DNAの発現に影響することができる適したコントロール配列と実施可能にリンクしたDNA配列を含むDNA構築物をいう。該コントロール配列には、転写に影響するためのプロモーター、場合により該転写をコントロールするためのオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列及び転写と翻訳の終結をコントロールする配列が含まれる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純に潜在的なゲノム挿入物であり得る。一度適したホスト内にトランスフォームされると、ベクターはホストのゲノムとは独立に複製し機能し得、またはある場合にはゲノム自身に入り込み得る。現在ではプラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書においては「プラスミド」と「ベクター」なる語は時々互換的に用いられる。しかしながら本発明は同等の機能を果たし、本分野で既知であるまたは既知となる該他の形態の発現ベクターも含むことを企図している。
【００２１】
2つのDNAまたはポリペプチド領域に間の関係を記述する場合に「実施可能にリンクしている」とはそれらがお互いに機能的に関与していることを意味する。例えばもしプレ配列がシグナル配列として機能し、タンパク質の成熟型形態の分泌に関与し、大抵の場合にはシグナル配列の切断を含むのであれば、プレ配列はペプチドと実施可能にリンクしている。もしプロモーターが配列の転写をコントロールするのであれば、プロモーターは配列と実施可能にリンクしている;もしリボソーム結合部位が翻訳を許すように位置しているのであれば、リボソーム結合部位はコード配列と実施可能にリンクしている。
【００２２】
一度hGHがクローン化されると、部位特異的ミュータジェネシス(Carter等,Nucl.Acids.Res.,13:4331[1986];Zoller等,Nucl.Acids Res.,10:6487[1987])、カセットミュータジェネシス(Wells等,Gene,34,315[1985])、制限選択ミュータジェネシス(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415[1986])または他の既知の方法が、クローン化hGHDNAに対して、置換されている残基によって定義されるアミノ酸配列の変化のためにコードする変異体DNAを生産するために、実施され得る。適した発現ベクターと実施可能にリンクされた場合、活性ドメイン置換hGH変異体が得られる。ある場合にはhGH変異体の回収は、hGHの元のまたは変異体をコードするDNA配列と実施可能にリンクした適したシグナル配列の使用によって、発現ホストから該分子を発現し分泌させることによって容易にし得る。該方法は当業者によく知られている。もちろん望ましいhGH変異体のin vitroの化学的合成のような他の方法も該ポリペプチドを生産するために用いられ得る。Barany等,in The Peptides,E.GrossとJ.Meienhofer編,(Academic Press:N.Y.1979),vol.2,pp.3-254。
【００２３】
一度異なるGH変異体が生産されるとそれらは受容体と接触され、もし可能であれば受容体と各変異体の間の相互作用が測定される。活性ドメイン中のどのアミノ酸残基が受容体との相互作用に関与しているかを決定するために、これらの活性が同じ受容体との野生型hGHの活性と比較される。該分析で用いられるアミノ酸のスキャニングは置換されたものと異なるアミノ酸のいくつかであり得る、すなわち19の他の天然に生じるアミノ酸のいくつかであり得る。
ターゲット受容体は天然のソースから単離され得または本分野で既知の方法によって組換え法で調製され得る。実例として、受容体はMcFarland等,Science,245:494-499(1989)によって記述されている方法によって調製され得る。
【００２４】
受容体と元の及び変異体の間の相互作用はいかなる便宜なin vitroまたはin vivoアッセイによっても測定され得る。それゆえin vitroアッセイは受容体とhGHの間のいかなる検出可能な相互作用を測定するためにも用いられ得る。該検出は比色定量変化、放射性活性の変化、可溶性の変化、ゲル電気泳動及び/またはゲル排除法等で測定されるような分子量の変化の測定を含み得る。in vivoアッセイは例えば体重増または電解質バランスにおける変化といった生理学的効果を検出するアッセイを制限することなく含む。一般的にいかなるin vivoアッセイも、可変的なパラメーターが興味ある受容体とhGHの間の相互作用における変化を検出するために存在する限りで用いられ得る。
【００２５】
いくつもの数の分析的な測定が活性を比較するために用いられ得る一方、受容体の結合のための簡便なものはhGH変異体と受容体の間で形成される複合体の解離定数Kｄであり、それを野生型hGHのKｄと比較することである。一般的に置換によって置換された類似の残基当たりのKｄにおいて2倍の増大または減少は、置換された残基(類)がターゲットとの野生型hGHの相互作用において活性であることを示す。
【００２６】
想像されるまたは既知のアミノ酸残基がアミノ酸分析のスキャニングにかけられる場合、それらにすぐ近接したアミノ酸残基がスキャンされるべきである。3残基置換ポリペプチドが作られ得る。一つは想像されるまたは既知の活性アミノ酸であるN位でスキャニングアミノ酸、好ましくはアラニンを含む。他の2つはN+1位とN-1位でスキャニングアミノ酸を含む。もし各置換hGHが受容体に対するKｄに対して約2倍より大きい効果を引き起こした場合、スキャニングアミノ酸はN+2位とN-2位で置換される。少なくとも1つ、好ましくは4つの残基がKｄに対して約2倍より少ない効果をもつ各方向で同定されるかまたは野生型hGHのそれぞれの末端に到達するまで、これが繰り返される。この方式では特定の受容体との相互作用に関与する連続的なアミノ酸配列に沿って一つ以上のアミノ酸が同定され得る。
【００２７】
アミノ酸スキャンによって同定された活性アミノ酸残基は、典型的には受容体ターゲットと直接的に接触するものである。しかしながら活性アミノ酸はまた、他の残基またはH２Oのような小分子またはNa＋,Ca２＋,Mg２＋またはZn２＋のようなイオン種と形成した塩架橋を通じてターゲットと間接的に接触し得る。
ある場合には、一つ以上の残基でのスキャニングアミノ酸の置換が受容体とのその活性の分析を実施するのに十分な量の単離を許す濃度で発現されない残基置換ポリペプチドを引き起こす。該場合には異なるスキャニングアミノ酸、好ましくは等配電子アミノ酸が用いられ得る。
【００２８】
好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較的小さく中性のアミノ酸がある。該アミノ酸にはアラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。アラニンはβ-炭素以外の側鎖を除去し、変異体の主鎖構造を比較的改変しそうにないので、アラニンはこのグループの中では好ましいスキャニングアミノ酸である。アラニンは最も共通なアミノ酸であるので、アラニンはまた好ましい。さらにそれは隠れた位置とさらされた位置の両方で頻繁に見出される。Creighton,The Ptoteins(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)。もしアラニン置換が十分な量のhGH変異体を生産しなかったら、等配電子アミノ酸を用い得る。代わりに好ましさがこの順序で減少していく以下のアミノ酸を用い得る:Ser,Asn及びLeu。
一度活性アミノ酸残基が同定されると、等配電子アミノ酸が置換され得る。該等配電子置換は全ての場合で生じる必要はなく、活性アミノ酸が同定される前に実施され得る。該等配電子アミノ酸置換はいくつかの置換が引き起こし得る構造に対する潜在的な破壊効果を最小化するために実施される。等配電子アミノ酸は以下の表に示されている:
【００２９】
【表Ａ】
0003693668.tif 000002
【００３０】
異なる活性ドメイン内の活性アミノ酸残基を検出するために本方法がここで用いられ得る。一度この同定がなされると、野生型hGHに対する様々な修飾が元のhGHと一つ以上のターゲットの間の相互作用を修飾するためになされ得る。
【００３１】
特にhGHに対しては、本発明の例示は体形成受容体(hGHbp)との活性を決定する活性ドメインと活性残基が同定される好ましい実施態様である。本発明のこの実施態様を実施するにおいて、天然で生じているhGHと比較するとhGHbpとの異なる結合相互作用を持つアミノ酸残基置換hGH変異体を含むhGH変異体が作製または同定されている。いくつかはhGHbpに対するより高いアフィニティーとラットにおける体形成のための促進された有効性を持ち得る。他のものはhGHbpとの減少したアフィニティーを持つ。該hGH変異体はhGH作用剤または拮抗剤として有用であり、もし該変異体がhGHbpとの実質的な相互作用から遊離しておれば、hGHに対する他の受容体を刺激するためのより高い有効性を持ち得る。さらに、該変異体はhGHスタンダードまたはトレーサーとしてhGHのためのイムノアッセイにおいて有用である。ある変異体は抗hGHポリクローナル抗体を含むヒト及びマウス血清との反応性において有意な減少を持つものを同定し得る。他のものはhGHと同じhGHbpに対する結合アフィニティーをもつが、成長を刺激する増大した有効性を持つ。
肝臓由来の体形成受容体と相互作用するhGHにとっての活性ドメイン及び残基を決定する方法が本出願の優先出願(1989年10月26日に提出されたU.S.S.N.07/428,066)の図1に概略的に示されており、選択された部分が図2に示されている。
【００３２】
ファージミドディスプレー法
加えて変異体はファージミドディスプレーによって分析し得る。この方法は(a)hGHをコードする第一の遺伝子、天然のまたは野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第二の遺伝子を含み、第一と第二の遺伝子は異種のものであり、そして第一と第二の遺伝子と実施可能にリンクした転写調節エレメントを含み、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成し;(b)第一の遺伝子内の一つ以上の選択された位置でベクターをミューテートしそれによって関連するプラスミドのファミリーを形成し;(c)プラスミドを用いて適したホスト細胞をトランスフォームし;(d)ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を持つヘルパーファージを用いてトランスフォームされたホスト細胞に感染させ;(e)少なくともプラスミドの一部を含み、ホストをトランスフォームできる組換えファージミド粒子を形成するために適したコンディションの下で、トランスフォームされ感染されたホスト細胞を培養し、コンディションを少量のファージミド粒子だけが粒子の表面に融合タンパク質の一コピーより多くをディスプレーするように調節し;(f)少なくともファージミド粒子の一部が受容体分子に結合するようにファージミド粒子をhGH受容体分子(hGHbp)を用いて接触させ;(g)結合したファージミド粒子をしていないものと分離する工程より成る。好ましくはさらに本方法はhGHbpに結合する組換えファージミド粒子を用いて適したホスト細胞をトランスフォームすることと(d)から(g)の工程を一度以上繰り返すことを含む。
【００３３】
好ましくはこの方法においてプラスミドは転写調節エレメントのきついコントロールの下にあり、粒子の表面に存在する融合タンパク質の一コピーより多くをディスプレーするファージミド粒子の量または数が約1%より小さいように培養コンディションを調節する。また好ましくは融合タンパク質の一コピー以上をディスプレーするファージミド粒子の量は融合タンパク質の単一コピーをディスプレーするファージミド粒子の量の10%より小さい。最も好ましくはその量は20%より小さい。
【００３４】
この方法においては典型的には、さらに発現ベクターはポリペプチドの各サブユニットをコードするDNAと融合した分泌シグナル配列を含み、転写調節エレメントはプロモーター系である。好ましいプロモーター系はlacZ、λＰＬ、tac、T7ポリメラーゼ、トリプトファン及びアルカリホスファターゼそしてそれらの組み合わせから選択される。また通常該方法はM13K07,M13R408,M13-VCS及びPhi X 174から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファージはM13K07であり、好ましいコートタンパク質はM13ファージ遺伝子IIIコートタンパク質である。好ましいホストは大腸菌であり、大腸菌のプロテアーゼ欠失株である。本発明の該方法によって選択される新しいhGH変異体が検出されている。ポリペプチドとファージコートタンパク質をコードする核酸の間に機能的に位置している抑制的終止コドンを含むファージミド発現ベクターが構築された。
【００３５】
詳細には、hGH選択の繰り返されるサイクルが複数の選択サイクルのファージミド選択によって次第に高いアフィニティー結合のための選択に用いられる。リガンドポリペプチドにおける第一の領域またはアミノ酸を含むファージミド選択の第一周に引き続いて、リガンドポリペプチドの他の領域またはアミノ酸におけるファージミド選択のさらなる周が実施される。ファージミド選択のサイクルはリガンドポリペプチドの望ましいアフィニティー性質が達成されるまで繰り返される。この工程を説明すると、hGHのファージミド選択はサイクルで実施された。第一のサイクルでは、hGHのアミノ酸172,174,176及び178がミューテートされファージミドが選択され得る。第二のサイクルでは、hGHのアミノ酸167,171,175及び179がファージミド選択され得る。第三サイクルでは、hGHのアミノ酸10,14,18及び21がファージミド選択され得る。前のサイクルから任意のアミノ酸変化が次の選択サイクルの前にポリペプチド内に取り込まれ得る。例えばhGHアミノ酸置換174(セリン)及び176(チロシン)がhGHのアミノ酸167,171,175及び179のファージミド選択の前にhGH内に取り込まれた。
【００３６】
前述したことからhGHの結合ドメインを形成するアミノ酸残基は連続しておらず、ポリペプチドの異なるサブユニット上に属し得ることが認められよう。それは結合ドメインが結合部位で特定の二次構造を形成し、一次構造ではないということである。それゆえ一般的に、受容体との相互作用する可能性を持つためにポリペプチドの内側から離れて向けられた部位で特定の二次構造内のアミノ酸をコードするコドンにミューテーションが導入される。hGH受容体への結合を強く調節するhGHにおける残基の位置(Cunningham等,Science,1990,上記参照)が知られている。故にミュータジェネシスに適した代表的な部位はヘリックス-4上の残基172,174,176及び178を含み、同様に「非順列」二次構造で位置する残基64を含むであろう。
【００３７】
このファージミドディスプレー法では、一度hGH遺伝子が単離されると、Sambrook等,Molecular Biology:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York 1989に一般的に記述されているように、それを増幅のため適したベクター(好ましくはプラスミド)内に挿入し得る。いくつかのタイプのベクターが入手可能であり本発明を実施するために用いられ得る一方、プラスミドベクターは比較的容易に構築でき容易に増幅し得るので、プラスミドベクターはここでの使用に好ましいベクターである。プラスミドベクターは一般的にプロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製のオリジン部位及び当業者に既知である他の必要な構成要素を含む。
【００３８】
原核生物ベクターで最も共通に用いられるプロモーターはlacZプロモーター系、アルカリホスファターゼphoAプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター(lacリプレッサーによって調節されるハイブリッドtrp-lacプロモーター)、トリプトファンプロモーター及びバクテリオファージT7プロモーターを含む。プロモーターについての一般的な記述はSambrook等,上記参照の第17章を参照。これらは最も広く用いられているプロモーターである一方で、他の適した微生物プロモーターも同様に使用し得る。
【００３９】
ファージミドディスプレーのために本発明を実施する上での好ましいプロモーターは、融合遺伝子の発現がコントロールされるようにきつく調節され得るものである。本分野で以前に認識されていなかった問題は、ファージミド粒子の表面での融合遺伝子の複数のコピーのディスプレーがターゲットにファージミドの複数点の付着を引き起こすことであると考えられている。ターゲットが「キレート化」されるため、融合タンパク質の複数コピーが互いに非常に近接してファージミド粒子上にディスプレーされる場合、「キレート効果」といわれているこの効果は、誤った「高アフィニティー」ポリペプチドの選択を引き起こすと考えられる。複数点での付着が生じると、有効なまたは明らかなKｄがディスプレーされた融合タンパク質の各コピーに対する個々のKｄの産物と同じくらい高くなり得る。
【００４０】
ファージミド粒子の少量だけ、すなわち約1%より小さい量だけ融合タンパク質の複数コピーを含むように融合タンパク質の発現をきつく調節することによって、「キレート効果」を克服し、高アフィニティーポリペプチドの正確な選択を可能にすることが開示されている。それゆえプロモーターに依存して、融合タンパク質の単一コピーを含むファージミド粒子の数を最大化し、融合タンパク質の複数コピーを含むファージミド粒子の数を最小化するために、ホストの培養コンディションを調節する。
【００４１】
本発明を実施するために用いられる好ましいプロモーターは、lacZプロモーターとphoAプロモーターである。lacZプロモーターはlacリプレッサータンパク質laciによって調節され、それゆえ融合遺伝子の転写はlacリプレッサータンパク質の濃度の操作によってコントロールされ得る。説明としてlacZプロモーターを含むファージミドをlacZプロモーターに対するリプレッサーであるlaciリプレッサー遺伝子の単一コピーを含む細胞株内で成育させる。laci遺伝子を含む例示的な細胞株にはJM101とXL1-ブルーが含まれる。代わりに、ホスト細胞をリプレッサーlaciとlacZプロモーターの両者を含むプラスミドを用いてコトランスフォームし得る。場合により上記方法の両者を同時に用いる、つまりlacZプロモーターを含むファージミド粒子をlaci遺伝子を含む細胞株内で成長させ、細胞株をlacZとlaciの両者を含むプラスミドを用いてコトランスフェクトさせる。
【００４２】
通常遺伝子を発現したいと考えた場合、上記トランスフェクトされたホストに対してイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)のようなインデューサーを加えるであろう。しかしながら本発明においては、(a)遺伝子III融合タンパク質の発現を最小化し、それによってコピー数(すなわちファージミド数当たりの遺伝子III融合物の数)を最小化するために、及び(b)低濃度でさえIPTGのようなインデューサーによって引き起こされるファージミドの貧弱なまたは不適当なパッケージングを避けるために、この工程は省略される。典型的にはインデューサーを加えないと、ファージミド粒子当たりの融合タンパク質の数は約0.1である(ファージミド粒子の数当たりの全部の融合タンパク質の数)。本発明を実施するために用いられる最も好ましいプロモーターはphoAである。リン酸がプロモーターの活性をダウンレギュレーションするように機能する場合、このプロモーターは細胞内無機リン酸の濃度によって調節されると考えられる。それゆえ細胞からリン酸を枯渇させることによって、プロモーター活性を増大し得る。望ましい結果は2YTまたはLBのようなリン酸リッチ培地内で細胞を成育させることによって達成され、それによって遺伝子III融合物の発現をコントロールする。
【００４３】
本発明を実施するために用いられるベクターの他の有用な構成要素は、シグナル配列である。この配列は典型的には融合タンパク質をコードする遺伝子のすぐ5'に位置し、それゆえ融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかしながらある場合には、シグナル配列は分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の5'以外の場所に位置することが示されている。この配列は付着されたタンパク質が細菌細胞の内膜を通過することを狙っている。シグナル配列をコードするDNAは、シグナル配列を持つタンパク質をコードする遺伝子由来の制限酵素断片として得られ得る。適した原核生物シグナル配列は例えばlamBまたはompF(Wong等,Gene,68:193[1983])、MalE、PhoA及び他の遺伝子から得られ得る。本発明を実施するための好ましい原核生物シグナル配列はChang等,上記参照によって記述されているような大腸菌熱安定性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列である。
【００４４】
ファージディスプレー法を実施するために用いられるベクターのもう一つの有用な構成要素は表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、ホスト細胞に対して抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードするものである。説明として、アンピシリン耐性遺伝子(amp)及びテトラサイクリン耐性遺伝子(tet)がこの目的にために容易に用いられる。
hGHをコードする遺伝子(遺伝子1)と同様に上述の構成要素を含む適したベクターの構築は、Sambrook等,上記参照に記述されているような標準的な組換えDNA法を用いて調製される。ベクターを形成するために結合されるための単離されたDNA断片は、望ましいベクターの生産のため特異的な順序及び配向で互いに切断され、調製され及び接合される。
【００４５】
DNAは適したバッファーにおいて適当な制限酵素または酵素類を用いて切断される。一般的に約0.2-1μgのプラスミドまたはDNA断片が約20μlのバッファー溶液において1-2ユニットの適当な制限酵素と共に用いられる。適当なバッファー、DNA濃度およびインキュベーション時間と温度は、制限酵素の商品によって特異的である。いくつかの酵素はより高い温度が必要であるが、一般的に37℃で約1または2時間のインキュベーション時間で十分である。インキュベーション後、酵素と他のコンタミネーションをフェノールとクロロホルムの混合物を用いて切断溶液の抽出によって除去し、DNAをエタノールを用いた沈殿によって水溶性画分から回収する。
【００４６】
機能的なベクターを形成するためDNA断片を互いにつなぐために、DNA断片の末端は互いに適合していなければならない。ある場合には末端は制限酵素切断の後直接的に適合している。しかしながら制限酵素切断によって広く生じる付着末端をライデーションのために適合させるために平滑末端に最初に変換することは必要であり得る。末端を平滑にするために、DNAを適したバッファー内で少なくとも15分15℃で10ユニットのDNAポリメラーゼI(Klenow)のKlenow断片を用いて、4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で処理する。それからDNAをフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する。
【００４７】
切断されたDNA断片はDNAゲル電気泳動を用いてサイズ分離され選択される。DNAはアガロースまたはポリアクリルアミドマトリックスのそれぞれで電気泳動し得る。マトリックスの選択は分離されるDNA断片のサイズに依存する。電気泳動後、DNAを電気溶出によって、Sambrook等,上記参照の6.30-6.33部分に記述されているように、またはマトリックスとして低溶性アガロースを用いているならアガロースを溶かしそこからDNAを溶出することによって、マトリックスから溶出する。
互いにつながれるべきDNA断片(つながれる各断片の末端が適合するように前に適切な制限酵素で切断されている)は、大体等モルの量で溶液中に置かれる。溶液はまたATP、リガーゼバッファー及び0.5μgのDNA当たり約10ユニットのT4DNAリガーゼのようなリガーゼを含む。DNA断片がベクター内につながれるのであれば、ベクターは適当な制限酵素(類)を用いて切断することによって最初に直線化される。それから直線化ベクターをアルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼを用いて処理される。ホスファターゼ処理はライゲーション工程の間のベクターの自己ライゲーションを避ける。
【００４８】
ライゲーション後、それから挿入された外来遺伝子と共にベクターを適当なホスト細胞内にトランスフォームする。原核生物が本発明のための好ましいホスト細胞である。適した原核生物ホスト細胞は大腸菌JM101株、大腸菌K12株294(ATCCナンバー31,446)、大腸菌W3110株(ATCCナンバー27,325)、大腸菌X1776(ATCCナンバー31,537)、大腸菌XL-1ブルー(Stratagene)及び大腸菌Bを含む;しかしながらHB101,NM522,NM538及びNM539のような多くの他の大腸菌の株及び多くの他の種そして原核生物の属も同様に用いられ得る。上記挙げた大腸菌に加えて、枯草菌のようなバチルス、ネズミチフス菌及び霊菌のような他の腸内細菌科、及び様々なシュードモナス種がすべてホストとして用いられ得る。
原核生物細胞のトランスフォーメーションはSambrook等,上記参照の1.82部分に記述されているような塩化カルシウム法を用いて容易に成し遂げられる。代わりに電気穿孔法(Neumann等,EMBO J.,1:841[1982])がこれらの細胞をトランスフォームするために用いられ得る。トランスフォームされた細胞tetまたはampを持ち、ベクター上のtet及び/またはamp耐性遺伝子の存在のためそれらが耐性を示すことによってそれらが抗生物質上の成育によって選択される。
【００４９】
トランスフォームされた細胞の選択後、これらの細胞はカルチャーで成育され、それからプラスミドDNA(または外来遺伝子が挿入された他のベクター)が単離される。プラスミドDNAは本分野で既知の方法を用いて単離され得る。2つの適した方法はSambrook等,上記参照の1.25-1.33部分に記述されているようなDNAのスモールスケール調製及びDNAのラージスケール調製である。単離されたDNAはSambrook等,上記参照の1.40部分に記述されているような本分野で既知の方法によって精製される。それからこの精製されたプラスミドDNAを制限酵素地図および/またはDNAシークエンシングによって分析する。DNAシークエンシングはMessing等,Nucleic Acids Res.,9:309(1981)の方法、Maxam等,Meth.Enzymol.,65:499(1980)の方法またはSanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)の方法のそれぞれによって一般的に実施される。
【００５０】
ファージミドディスプレー法はここで融合タンパク質が転写の間生産されるようにhGHをコードする遺伝子(遺伝子1)を第二の遺伝子(遺伝子2)に融合することを企図している。遺伝子2は典型的にはファージのコートタンパク質遺伝子であり、好ましくはそれはファージM13遺伝子IIIコートタンパク質またはその断片である。遺伝子1と2の融合は遺伝子1を含むプラスミドの特定の部位に遺伝子2を挿入することによって、または遺伝子2を含むプラスミドの特定の部位に遺伝子1を挿入することによって成し遂げられ得る。
【００５１】
プラスミド内への遺伝子の挿入には、プラスミドが遺伝子を挿入すべき正確な位置で切断されている必要がある。それゆえこの部分に制限酵素部位が存在していなければならない(好ましくは制限酵素切断の間プラスミドが単一の位置だけで切断されるような独特の部位が)。プラスミドは上述のように切断され、ホスファターゼ処理され、精製される。それから遺伝子を2つのDNAを互いにつなぐことによってこの直線化プラスミド内に挿入する。プラスミドの末端が挿入される遺伝子の末端と適合していたならば、ライゲーションを成し遂げられ得る。制限酵素がプラスミドを切断し、平滑末端または付着末端を作り出すため挿入される遺伝子を単離するために用いられるならば、Sambrook等,上記参照の1.68部分に記述されているようにATPとリガーゼバッファーの存在下で16℃で1-4時間混合物をインキュベートすることによってT4DNAリガーゼのようなリガーゼを用いてDNAを直接的に互いにつなぎ得る。末端が適合していないならば、それらは最初にDNAポリメラーゼIのKlenow断片またはバクテリオファージT4DNAポリメラーゼを用いて平滑にされなければならないが、両酵素共切断されたDNAの突出したシングルストランド末端をうめるために4つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を必要とする。
【００５２】
代わりにヌクレアーゼS1またはマングビーンヌクレアーゼのようなヌクレアーゼを用いて末端を平滑化しうるが、両酵素ともDNAの突出したシングルストランドを切除することによって機能する。それからDNAを上述したようなリガーゼを用いて再ライゲーションする。ある場合には、コード領域のリーディングフレームが改変されるため、挿入される遺伝子の末端を平滑化することは可能でないかもしれない。この問題を克服するために、オリゴヌクレオチドリンカーが用いられ得る。このリンカーはプラスミドを挿入される遺伝子と連結するための架橋として機能する。これらのリンカーは標準的な方法を用いてシングルストランドDNAまたはダブルストランドDNAとして合成的に作出され得る。該リンカーは挿入される遺伝子の末端と適合する一つの末端を持つ;リンカーは上述したようなライゲーション方法を用いて最初にこの遺伝子とつながれる。リンカーの他の末端はライゲーションのためのプラスミドと適合するようにデザインされている。リンカーをデザインする場合、挿入される遺伝子のリーディングフレームまたはプラスミドに含まれている遺伝子のリーディングフレームを破壊しないように気を付けなければならない。ある場合には、アミノ酸の一部に対してコードしているような、または一つ以上のアミノ酸に対してコードしているようなリンカーをデザインすることが必要となり得る。
【００５３】
遺伝子1と遺伝子2の間に、終止コドンをコードするDNAを挿入し得、該終止コドンはUAG(アンバー)、UAA(オーカー)及びUGA(オパール)である。Davis等,Microbiology(HarperとRow:New York,1980),ページ237,245-247及び274。野生型ホスト細胞で発現している終止コドンは遺伝子2タンパク質の付着なく遺伝子1タンパク質産物の合成を引き起こす。しかしながらサプレッサーホスト細胞での成育は融合されたタンパク質の検出可能な量の合成を引き起こす。該サプレッサーホスト細胞はmRNAの終止コドンの位置にアミノ酸を挿入するように修飾されたtRNAを含み、それによって融合タンパク質の検出可能な量の生産を引き起こす。該サプレッサーホスト細胞は大腸菌サプレッサー株のようによく知られており記述されている。Bullock等,BioTechniques,5:376-379(1987)。融合ポリペプチドをコードするmRNA内に該終止コドンを置くためのいかなる許容される方法も用いられ得る。
【００５４】
抑制可能コドンをhGH遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第二の遺伝子の間に挿入し得る。代わりに抑制可能終止コドンをポリペプチド内の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質内の第一のアミノ酸を置換することによって融合部位に近接して挿入し得る。抑制可能コドンを含むファージミドがサプレッサーホスト細胞内で成育する場合、それはhGHとコートタンパク質を含む融合ポリペプチドの検出可能な生産を引き起こす。ファージミドが非サプレッサーホスト細胞内で成育する場合、UAG,UAAまたはUGAをコードする挿入された抑制可能トリプレットで終結するため、実質的にファージコートタンパク質に融合していないhGHが合成される。非サプレッサー細胞内では、ポリペプチドは、融合ファージコートタンパク質が不存在であるがそれにもかかわらずホスト細胞にそれを埋め込むために、ホスト細胞から合成され分泌される。
【００５５】
hGH遺伝子は一つ以上の選択されたコドンで改変し得る。改変はhGHの非改変配列または野生型配列と比較するとhGHのアミノ酸配列において変化を引き起こすhGHをコードする遺伝子内の一つ以上の置換、欠失または挿入として定義される。好ましくは改変は分子の一つ以上の領域内で少なくとも一つのアミノ酸をいかなる他のアミノ酸を用いても置換することによる。改変は本分野で既知の様々な方法によって提供され得る。これらの方法はオリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシス及びカセットミュータジェネシスを制限することなく含む。
オリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスはhGHの変異体に置換、欠失または挿入を調製するための好ましい方法である。本方法はZoller等,上記参照によって記述されているように本分野でよく知られている。略記すると、テンプレートがhGHの非改変または野生型DNA配列を含むプラスミドのシングルストランド形態である場合、hGH遺伝子はDNAテンプレートに望ましいミューテーションをコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、テンプレートの完全な第二の相補的ストランドを合成するためにDNAポリメラーゼを用い、それゆえオリゴヌクレオチドプライマーが取り込まれhGH遺伝子内で選択された改変がコードされる。
【００５６】
一般的に長さにおいて少なくとも25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが用いられる。より小さいオリゴヌクレオチドも用いられ得るが、最適なオリゴヌクレオチドはミューテーションをコードするヌクレオチド(類)の各サイドでテンプレートと相補的である12から15ヌクレオチドを持つ。これはオリゴヌクレオチドがシングルストランドDNAテンプレート分子に正確にハイブリダイズすることを確定する。オリゴヌクレオチドはCrea等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5765(1978)に記述されているもののように本分野で既知の方法を用いて容易に合成される。
【００５７】
DNAテンプレートはバクテリオファージM13ベクター(商業的に入手可能なM13mp18及びM13mp19ベクターが適している)由来のもの、またはVieiraとMessing,Meth.Enzymol.,153:3-11(1987)に記載されているようなシングルストランドファージの複製のオリジンを含むベクターのそれぞれであるベクターによってのみ生産され得る。それゆえミューテートされるべきDNAはシングルストランドテンプレートを生産するためにこれらのベクターの一つ内に挿入されなければならない。シングルストランドテンプレートの生産はSambrook等,上記参照の4.21-4.41部分に記述されている。
【００５８】
野生型DNA配列を改変するため、オリゴヌクレオチドは適したハイブリダイゼーションコンディションの下でシングルストランドテンプレートにハイブリダイズされる。それからDNAポリメラーゼ酵素、通常はDNAポリメラーゼIのKlenow断片を、合成に対するプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いるテンプレートの相補的ストランドを合成するために加える。それゆえDNAの一つのストランドはhGH遺伝子のミューテートされた形態をコードし、他のストランド(もともとのストランド)はhGH遺伝子の野生型の非改変配列をコードするようなヘテロ二重鎖が形成される。それからこのヘテロ二重鎖分子を適したホスト細胞、通常は大腸菌JM101のような原核生物内にトランスフォームする。細胞が成長した後、それらをアガロースプレート上にまき、ミューテートされたDNAを含む細菌コロニーを同定するため32-リン酸を用いてラジオラベルされたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングする。
【００５９】
すぐ前に記述した方法は、プラスミドの両ストランドがミューテーション(類)を含むホモ二重鎖分子を作出するように修飾し得る。修飾は以下のようになされる:シングルストランドオリゴヌクレオチドを上述したようなシングルストランドテンプレートとアニールさせる。デオキシリボアデノシン(dATP)、デオキシリボグアノシン(dGTP)及びデオキシリボチミジン(dTTP)の3種のデオキシリボヌクレオチドの混合物を、dCTP-(aS)と呼ばれるチオ-デオキシリボシトシン(Amershamから得られ得る)と組み合わせる。この混合物をテンプレート-オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にDNAポリメラーゼを添加すると、ミューテートされたベースを除くテンプレートに対して相同なDNAのストランドが生産される。加えてこのDNAの新しいストランドはdCTPの代わりにdCTP-(AS)を含んでおり、それは制限酵素切断からこのDNAを保護するために役立つ。ダブルストランドヘテロ二重鎖のテンプレートストランドに適当な制限酵素を用いてニックを入れた後、テンプレートストランドをミュータジェナイズされた部位(類)を含む領域を通過してExoIIIヌクレアーゼまたはもう一つの適当なヌクレアーゼを用いて切断し得る。それから部分的にだけシングルストランドである分子を引き離して反応を止める。それから完全なダブルストランドDNAホモ二重鎖を全ての4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ATP及びDNAリガーゼの存在下でポリメラーゼを用いて形成させる。それからこのホモ二重鎖分子を上述したように大腸菌JM101のような適したホスト細胞内にトランスフォームし得る。
【００６０】
置換された一つより多いアミノ酸を持つミュータントをいくつかの方法の一つで生産し得る。アミノ酸がポリペプチド鎖において互いに近接して位置しているならば、望ましいアミノ酸置換の全てをコードする一つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にミューテートし得る。しかしながらアミノ酸がそれぞれからいくらか離れて位置している場合には(約10アミノ酸より多くによって分離されている)、望ましい変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生産することはさらに困難である。その代わりに二つの代わりの方法の一つが用いられ得る。
【００６１】
第一の方法では、置換される各アミノ酸に対して別々のオリゴヌクレオチドを生産する。それからオリゴヌクレオチドをシングルストランドテンプレートDNAに同時にアニールさせ、テンプレートから合成されるDNAの第二のストランドは望ましいアミノ酸置換の全てをコードする。代わりの方法は望ましいミューテーションを生産するためにミュータジェネシスの2周以上を含む。1周目は単一のミューテーションのために記述されたようなものである:野生型DNAをテンプレートとして用い、第一の望ましいアミノ酸置換(類)をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートにアニールさせ、それからヘテロ二重鎖DNA分子を生産する。ミュータジェネシスの2周目はテンプレートとしてミュータジェネシスの第1周で生産されたミューテートされたDNAを利用する。それゆえこのテンプレートは一つ以上のミューテーションを既に含んでいる。それから付加的な望ましいアミノ酸置換(類)をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートにアニールさせ、その結果として生じるDNAのストランドはミュータジェネシスの第1周と第2周の両者由来のミューテーションをコードする。この結果として生じるDNAをミュータジェネシスの第3周においてテンプレートとして用いうる、以下同様である。
カセットミュータジェネシスもまたhGHDNAの置換、欠失及び挿入変異体を調製するために好ましい方法である。本方法はWells等,Gene,上記参照に記述されたものに基づいている。スタート時の物質はミューテートされるhGH遺伝子を含むプラスミド(または他のベクター)である。ミューテートされるhGH遺伝子のコドン(類)を同定する。場合により同定されたミューテーション部位(類)の各サイドに独特の制限酵素部位が存在する;しかしながらこれは必要条件ではない。もし該制限部位が存在しないならば、hGH遺伝子に適当な位置でそれらを導入するために、上述したオリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスを用いて該制限部位を生産し得る。制限部位をプラスミド内に導入した後に、プラスミドを直線化するためにこれらの部位で切断する。制限部位間にDNAの配列をコードするが望ましいミューテーション(類)を含むダブルストランドオリゴヌクレオチドを標準的な方法を用いて合成する。2つのストランドを別々に合成し、それから標準的な方法を用いて互いにハイブリダイズさせる。このダブルストランドオリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットをそれをプラスミドに直接的につなげるように、直線化プラスミドの末端と適合する3'と5'末端を持つようにデザインする。そこでこのプラスミドはhGHのミューテートされたDNA配列を含む。
【００６２】
受容体分子を調製しそれをファージミドと結合するために、精製した受容体をアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリル酸コポリマー、ヒドロキシアルキルメタクリレートゲル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性でイオン性キャリアー等のような適したマトリックスに付着させる。マトリックスへの受容体の付着はMeth.Enzymol.,44:(1976)に記述されている方法によって、または本分野で既知の他の方法によって成し遂げられ得る。
マトリックスへの受容体の付着の後、固定化したターゲットとファージミド粒子の少なくとも一部の結合に適したコンディションの下でファージミド粒子のライブラリーと固定化したターゲットを接触させる。通常はpH、イオン強度、温度等を含む該コンディションは生理的コンディションをまねる。
【００６３】
固定化した受容体に対して高アフィニティーを持つ結合ファージミド粒子(「バインダー」)を洗浄によって低アフィニティー(そしてそれによって受容体に結合していない)を持つものから分離する。バインダーは様々な方法によって固定化したターゲットから解離し得る。これらの方法には野生型リガンドを用いた競合的解離、pH及び/またはイオン強度の改変及び本分野で既知の方法が含まれる。
適したホスト細胞をバインダー及びヘルパーファージを用いて感染し、ホスト細胞をファージミド粒子の増幅に適したコンディションの下で培養する。それからファージミド粒子を集め、ターゲット分子に対する望ましいアフィニティーを持つバインダーを選択するまで選択工程を一度以上繰り返す。
【００６４】
場合によりファージミド粒子のライブラリーを一つの特定の受容体より多くと連続的に接触させ得る。それゆえhGHは一つの天然の受容体より多くを持つ:GH受容体とプロラクチン受容体である。プロラクチン受容体に優先してGH受容体に対するhGHの選択性を改変することが望ましいであろう。これは最初に固定化したGH受容体を用いてファージミド粒子のライブラリーを接触させ、溶液中に大変高濃度のプロラクチン受容体の存在下で結合が生じることを許容し、バインダーを選択することによって成し遂げられ得る。この場合、GH受容体に対するアフィニティーが野生型hGHのものより幾分低い場合でさえ、プロラクチン受容体に対する低アフィニティーを持つhGHミュータントが治療上の有用性を持つであろう。
【００６５】
hGH変異体の生産
本発明のhGH変異体は標準的な組換え法によって簡便に生産し得る。最も特異的には、hGH変異体はアラニンスキャニングの議論で上述したようなベクター-ホスト細胞系を用いて発現し得る。
一つの実施態様として、本発明のファージミドをファージタンパク質の存在しないhGH変異体を生産するために用いる。例えばpSO643及び誘導体は16C9のような非サプレッサー株において簡単に成長させ得る。この場合、アンバーコドン(TAG)が翻訳の終結を導き、遊離のホルモンを生ずる。hGH変異体をホスト細胞から分泌させ、以下に記述するようにカルチャー培地から単離し得る。
【００６６】
hGH変異体発現ベクターを含むホスト細胞を細胞成長とhGH変異体の発現に適したコンディションの下で培養する。特にカルチャー培地はホスト細胞が用いるのに適当な栄養素と増殖因子を含む。選択されるホスト細胞の成長に必要とされる栄養素と増殖因子は、多くの場合よく知られており当業者によって経験的に容易に決定され得る。哺乳動物ホスト細胞に対する適した培養コンディションは、例えばMammalian Cell Culture(Mather,J.P.等,編,Plenum Press 1984)及びBarnesとSato,Cell,22:649(1980)に記述されている。
加えて培養コンディションは転写、翻訳及び細胞区画の間でのタンパク質輸送を許容すべきである。これらのプロセスに影響する因子はよく知られており、例えばDNA/RNAコピー数;RANを安定化する因子;培地中に存在する栄養素、サプリメント及び転写インデューサーまたはリプレッサー;培地の温度、pH及び浸透度;及び細胞密度が含まれる。特定のベクター-ホスト細胞系において発現を促進するこれらの因子の調節は当業者の範囲内にある。
【００６７】
本発明のhGH変異体の生産に用いられる細胞培養法は、タンパク質の大規模または小規模生産のための多くのよく知られた方法のいかなるものであってもよい。これらには以下のものの使用が制限されることなく含まれる:流動化ベッドバイオリアクター、空洞ファイバーバイオリアクター、ローラーボトルカルチャーシステム及び攪拌タンクバイオリアクターシステム。hGH変異体は例えば、バッチ、フェドバッチまたは継続的モードプロセスで生産され得る。
上記のように生産された組換えタンパク質の回収法はよく知られており、用いられる発現系に依存して変化する。例えば、もし典型的にはそうであるが、発現ベクターが単一の配列を含んでいれば、hGH変異体は培地またはペリプラズムから回収される。簡便には、変異体は十分にプロセシングされたタンパク質(すなわち分泌シグナル配列を欠いている)としてペリプラズム空間に分泌される。しかしながらhGH変異体は細胞内にも発現し得、細胞溶解物からも回収し得る。
【００６８】
hGH変異体は変異体をホスト細胞の構成要素または培地から分離可能ないかなる方法によっても培地または細胞溶解物から精製し得る。典型的にはhGH変異体は、もし必要であれば、またはhGH変異体を診断用途にまたは治療用途に用いるならば、ペグ化に抵触するであろうホスト細胞及び/または培地構成要素から分離される。
第一の工程として、培地または細胞溶解物は通常細胞破片を除去するため遠心分離され、濾過される。それから典型的には上清を望ましい量に濃縮または希釈し、さらなる精製のため調製物のコンディションを整えるために適したバッファーにダイアフィルター(diafilter)する。hGH変異体のさらなる精製は典型的には、完全な形態のものからhGH変異体の脱アミド化形態及び短縮形態を分離することを含む。例えば、完全なhGH変異体は、N末端フェニルアラニンを欠失しているdes-phe-hGH変異体から分離され得る。
この実施態様の一つのバリエーションとして、hGH変異体は(1)スピニングカップシークエンサーを用いて少なくとも15残基のN末端または内部のアミノ酸を得るのに十分な程度に、(2)Coomassieブルー染色を用いて非還元または還元コンディションの下でのSDS-PAGEによって均質な程度に精製される。
【００６９】
以下の例示的な方法のいかなるものも、hGH変異体の精製に用いられうる:アフィニティークロマトグラフィー;アニオン-またはカチオン-交換クロマトグラフィー(例えばDEAE SEPHAROSEを用いて);シリカ上でのクロマトグラフィー;メタルキレートクロマトグラフィー;超濾過/ダイアフィルトレーション(ultrafiltration/diafiltration);エタノール沈殿;硫酸アンモニウム沈殿;クロマトフォーカシング;及び置換クロマトグラフィー。アニオン交換クロマトグラフィー及び疎水性インターラクションクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、hGH変異体(B2036及びB2024)の精製の例示的なプロトコールは実施例V及びVIに示されている。
【００７０】
hGH変異体の修飾
本発明は一つ以上の化学的なグループと共有結合で付着した(以下では「接合した」という)hGH変異体を提供する。該接合は非修飾hGH変異体より大きい現実の分子量を持つhGH変異体接合物を生産する。ここで用いられているように、「現実の分子量」なる語はマススペクトロメトリー(例えばマトリックスアシステッドレーザー脱着イオン化マススペクトロメトリー)によって測定されるような分子量をいう。hGH変異体接合物の現実の分子量は通常少なくとも約30kDである;好ましくは約35kDから約55kDの範囲である;そしてより好ましくは約40kDから約50kDの範囲である。一般的にhGH変異体接合物の現実の分子量は100kDを越えない。
【００７１】
本発明のhGH変異体接合物の使用に対して適した化学的グループは、好ましくは有意に毒性ではなく免疫原性ではないものである、すなわちhGH変異体接合物で観察されるいかなる毒性または免疫原性も、相当する非修飾hGH変異体より有意に大きくない(すなわち50%より低い)。典型的には化学的グループは非修飾hGH変異体に関連する毒性及び/または免疫原性を減少するものから選択される。加えて、化学的グループは非修飾hGH変異体の貯蔵および使用に適したコンディションの下で、貯蔵され使用され得るhGH変異体接合物を生産するために適宜に選択される。例示的な化学的グループとしては、例えば糖タンパク質で天然に生じている炭水化物のような炭水化物、及びポリオールのような非タンパク質性ポリマーが含まれる。
【００７２】
ポリオールは例えばWO93/00109,上記参照に記述されているように、リシン残基を含む一つ以上のアミノ酸でhGH変異体分子に接合され得る。用いられるポリオールはいかなる水溶性ポリ(アルキレン酸化物)ポリマーでもあり得るし、直鎖状または分枝状の鎖を持っていてもよい。適したポリオールには、1と4の間の炭素を持つアルキル基のような化学的グループで、一つ以上の水酸基の位置が置換されているようなものも含まれる。典型的にはポリオールはポリ(エチレングリコール)のようなポリ(アルキレングリコール)であり、それゆえ記述を簡単にするために、本義論の残りの部分は、用いられるポリオールはPEGであり、hGH変異体にポリオールを接合する工程を「ペグ化」と呼ぶ例示的な実施態様に関する。しかしながら当業者には、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーのような他のポリオールも、PEGに対してここで記述されている接合に対する方法を用いて使用し得ることは認識される。
【００７３】
PEGの平均的な分子量は約500から約30,000ダルトン(D)の範囲であり得る;好ましくは約1,000から約20,000Dの範囲である;そしてより好ましくは約4,000から約20,000Dである。一つの実施態様として、ペグ化は約5,000Dの平均分子量を持つPEGを用いて実施される(以下では「PEG(5000)」という)。以下の記述と実施例VIIのように、反応コンディションは約4と約6の間のPEG(5000)分子が接合したhGH変異体分子の生産を最大化するように調節される。もう一つの実施態様では、一分子のPEG(20,000)が接合したhGH分子の生産を最大化するように調節されたコンディションの下で、ペグ化が約20,000の平均分子量を持つPEGを用いて実施される。実施例VIII参照。この実施態様のバリエーションでは、それぞれ約10,000Dの二つの鎖を持つ分枝状鎖PEGが用いられる。実施例IX参照。
【００７４】
商業的に入手可能であり、本発明の使用に適したPEG調製物は、平均分子量にしたがって販売されている不均質調製物である。例えばPEG(5000)調製物は典型的には通常±500Dの分子量のわずかに変化している分子を含む。
タンパク質をペグ化するための様々な方法が記述されている。例えば、生理的に活性な非免疫原性構成物を生産するためにPEG及びポリプロピレングリコールにたくさんのホルモン及び酵素を接合することを開示する米国特許第4,179,337号(Davis等により提出された)参照。一般的に少なくとも一つの末端水酸基を持つPEGは、末端反応基を持つ活性化されたPEGを形成するためにカップリング試薬を用いて反応される。それからこの反応基は共有結合を形成するためにタンパク質のα-及びε-アミンを用いて反応し得る。適宜に、PEG分子の他方の末端をタンパク質分子のPEG架橋複合体の形成を減少するために、メトキシ基のような非反応性化学グループを用いて「ブロック」し得る。
【００７５】
hGH変異体のペグ化にとって、活性化されたPEGはサイト1結合活性を破壊しないコンディションの下で変異体と反応し得るものである。hGH変異体にとって、サイト2結合活性もまた保存されていなければならない。さらに作用剤及び拮抗剤hGH変異体にとって、接合体に毒性リンキンググループを導入する活性化PEGは通常避けられる。
適した活性化PEGは、たくさんの適宜な反応によって生産し得る。例えばPEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-NHS-PEG)をBuckmannとMerr,Makromol.Chem.,182:1379-1384(1981)の方法にしたがって、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いた反応によって、PEG-モノメチルエーテル(Union Carbideから商業的に入手可能である)から調製し得る。
【００７６】
加えて、PEG末端水酸基を例えばPEG-Brを形成するために臭化チオニルを用いた反応、それに引き続くPEG-NH２を形成するために過度のアンモニアを用いたアミノリシスによって、アミノ基に変換し得る。それからPEG-NH２をWoodward's Reagent Kのような標準的なカップリング試薬を用いて、興味あるタンパク質に接合する。さらにPEG末端-CH２OH基を例えばMnO２を用いた酸化によって、アルデヒド基に変換し得る。アルデヒド基をシアノボロハイドライドのような試薬を用いて還元アルキル化によって、タンパク質に接合する。
代わりに、本発明の使用に適した活性化PEGをたくさんの業者から購入し得る。例えば、Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,AL)は、メトキシ-PEGのスクシンイミジルカルボネート(「SC-PEG」)及びメトキシ-PEGスクシンイミジルプロピオネート(「SPA-PEG」;以下ではメトキシブロッキンググループの存在を示すために「M-SPA-PEG」として示す)に加えて、「SCM-PEG」としてM-NHS-PEGを販売している。B2036変異体をペグ化するためのM-SPA-PEGの使用は、実施例VII及びVIIIに示されている。Shearwater Polymersはまた、二つの10,000D鎖を持つ分枝状鎖PEG(以下では「NHS-PEG2(20,000)」という)も販売しており、その使用は実際例IXに記述されている。
【００７７】
本発明のhGH変異体のペグ化の程度は、相当する非ペグ化タンパク質と比較して、望ましく増大されたin vivo半減期(以下では「半減期」という)を提供するように調製され得る。ペグ化hGH変異体の半減期は、ペグ化の程度の増大と共に典型的には増大すると考えられている。ペグ化野生型hGHの研究において、二つのPEG(5000)を含む野生型hGH接合物は非ペグ化タンパク質より約4倍長い半減期を持ち、五つのPEG(5000)を含む接合物は約11倍長い半減期を持ち、そして七つのPEGグループを含む接合物は約18倍長い半減期を持つことが出願類によって観察されている。それらのPEG野生型hGH接合物の現実の分子量は、非ペグ化タンパク質の22kDに比較すると、それぞれおよそ33,48及び57kDであった。
【００７８】
ペグ化が比較的高い程度では、ペグ化hGH変異体の半減期の増大はサイト1アフィニティーの減少を示すサイト1結合に対する解離定数(Kｄ)の増大によって部分的に相殺されると考えられる。このアフィニティーの減少は、相当する有効性の減少によって伴われており、その有効性は50%最大の効果(EC５０)に必要とされる接合物の濃度の増大で反映される。PEG(5000)を用いてペグ化された野生型hGHの研究では、二つのPEG(5000)グループを含む接合物は非ペグ化タンパク質より細胞ベース二量体化アッセイにおいて約3倍低い有効性を持ち、五つのPEG(5000)グループを含む接合物は約170倍低い有効性を持ち、七つのPEG(5000)を含む接合物は約1500倍低い有効性を持つ。
【００７９】
サイト1結合は本発明の作用剤及び拮抗剤hGH変異体に対して本質的なものであるため、増大したペグ化は両タイプのhGH変異体の有効性を減少する。しかしながら、半減期の増大はペグ化hGH変異体のin vivo効力が相当する非ペグ化タンパク質で観察されるものと比較可能である、またはそれよりもよいと現在では考えられるために一般的に有効性の減少を補う。したがって、当業者は、非ペグ化タンパク質と比較して望ましい増大した半減期を持ち、未だin vivoで効力のある十分な有効性を維持した接合物を生産するために、hGH変異体に対するペグ化の適した程度を容易に決定し得る。
【００８０】
通常半減期は、少なくとも約5倍増大する;好ましくは少なくとも約10倍;より好ましくは少なくとも約50倍;そして最も好ましくは少なくとも約100倍増大する。加えてペグ化の程度及び部位は、PEG-hGH変異体接合物がSpencer等,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)に記述されているような平衡結合アッセイによって測定したところ、典型的には約400nM以下のKｄで;好ましくは150nM以下のKｄで;そして最も好ましくは100nM以下のKｄでサイト1でhGH受容体を結合することが可能であるようなものである。
【００８１】
本発明の作用剤PEG-hGH変異体はサイト1と同様にサイト2でも結合可能であり、それゆえhGH受容体を二量体化する。二量体化能力は例えばCunningham等,Science,254:821-825(1991)の方法にしたがって蛍光のホモクエンチングによって、またはFuh等,Science,256:1677-1680(1992)及び実施例XIとXIIに記述されているような細胞ベース二量体化アッセイにおいて測定し得る。適宜にFuh等の細胞ベース二量体化アッセイにおいて測定されるようなペグ化作用剤hGH変異体に対するEC５０は、約100nM以下であり、より好ましくは約50nM以下である。(おそらく利用可能なhGH受容体の画分だけが最大の応答を引き出すために二量体化されることが必要とされるので、EC５０は典型的にはKｄより低い。) これらの特徴にあったペグ化hGH変異体は少なくとも約40kDの現実の分子量を持つ。接合体の例としては、1分子のhGH変異体当たり約4から6、そして好ましくは5分子のPEG(5000)を持つ接合物が含まれ、1分子のhGH変異体当たり1分子のPEG(20,000)を持つ接合物が含まれる。
【００８２】
タンパク質のペグ化の程度及び部位は、(1)ペグ化部位の数及び反応性(すなわち第一級アミン)そして(2)ペグ化反応コンディションによって決定される。野生型hGHは活性化PEGと反応するために理論的には入手可能な10の第一級アミンを含む:N末端フェニルアラニンのα-アミノ基及び9のリシンのε-アミノ基。しかしながらhGH及びhGH変異体における第一級アミンのいくつかは比較的非反応性であり、標準的なペグ化反応は典型的には完全なペグ化より少ないものを引き起こす(例えば、野生型hGHの1分子当たり7から8PEG)。
タンパク質のペグ化の部位はまた、様々な第一級アミンの反応性によっていくぶん拘束される。例えばB2036変異体(K41)のサイト1ホルモン-受容体結合界面における潜在的なリシンは、M-SPA-PEG(5000)に対して比較的非反応性である。実施例X参照。それゆえ変異体分子当たりおよそ4から6のPEGを持つ、穏やかにペグ化されたB2036変異体調製物は、サイト1結合界面に潜在的なペグ化部位が存在しているのにも関わらず、サイト1でhGH受容体を結合する能力を維持している。
【００８３】
標準的なミュータジェネシス法をタンパク質中のリシンの数を改変するために用い得る。それゆえアミノ酸置換がリシンを導入または除去する範囲に対して、本発明のhGH変異体は野生型hGHより多いまたは少ない潜在的なペグ化部位の数を含む。B2036変異体は野生型hGHより一つ少ない9の潜在的なペグ化部位を含み、一方B2024変異体は10の潜在的な部位を含む。
さらにリシンを導入または除去するアミノ酸置換は潜在的なペグ化部位の位置を改変する。例えばB2036変異体では、K168A及びK172Rの置換はホルモン受容体サイト1結合界面でペグ化に有用な部位の数を減少する。G120の異なるアミノ酸を用いた除去は、サイト2でのhGH結合を妨害し、分子をhGH拮抗剤に変換する。この位置でのグリシンからリシンへの置換は、この部位でのいかなる残余の結合をも損なうサイト2での付加的な潜在的なペグ化を提供する。B2036変異体における第一級アミンの反応性は実施例Xに示されている。
【００８４】
ペグ化の程度及び部位はまたpHと同様に活性化PEGとタンパク質の相対的濃度のような、反応コンディションを調節することによって操作し得る。望ましいペグ化の程度のための適したコンディションは経験的に決定し得る。略記すると、標準的なペグ化反応は上記したパラメーターを変化させることによって調整される。例えば遊離アミノ基当たり相当するM-NHS-PEG(5000)の数が1から3に間で変化するhGH変異体ペグ化反応(0.05Mホウ酸ナトリウムバッファー,pH8.5内に10mg/mlhGH変異体を含む)は、以下に示される調製物を生産する。
【００８５】
調製物          PEG(5000)分子/hGH変異体分子
1                 2,3,4,5
2                 3,4,5,6
3                 4,5,6,7
(活性化PEGに関して用いられているように、「遊離アミノ基当たり相当する」なる語は、分子内の遊離アミンの数を掛けられたペグ化される分子のモル量と等しい活性化PEGのモル量をいう。) 制限されたペグ化を受ける調製物(調製物1のような)では、タンパク質は最も反応性の部位でペグ化され、一方もしペグ化がより拡大されれば(調製物3のような)、比較的小さい反応性の部位もまたペグ化される。
【００８６】
B2036のようなhGH変異体のペグ化は、いかなる適宜な方法ででも実施される。例示的な実施態様として、hGH変異体はM-SPA-PEG(5000)を用いてペグ化される。実施例VII参照。略記すると、個体のSPA-PEG(5000)を室温でhGH変異体の水溶液に攪拌しながら加える。典型的には、水溶液は反応が実施されるpH(一般的には約pH4-10)に近いpKａを持つバッファーを用いて緩衝される。pH7.5でペグ化のための適したバッファーの例として、例えばHEPES、リン酸、ホウ酸、Tris-HCl、EPPS及びTESが含まれる。pHは継続的にモニターされ、必要であれば調節される。反応は約1から約2時間継続することが可能である。
【００８７】
それから反応生成物を遊離M-SPA-PEG(5000)及びペグ化hGH変異体の高分子量複合体からペグ化hGH変異体を分離するため疎水性インターラクションクロマトグラフィーにかける。(高分子量複合体は、非ブロック化PEGが分子の両末端で活性化され、hGH変異体分子と架橋した場合に生ずる。) 疎水性インターラクションクロマトグラフィーの間のコンディションは、遊離M-SPA-PEG(5000)がカラムを流れる一方、いかなる架橋されたペグ化hGH変異体複合体も一つ以上のPEGグループに接合された一つのhGH変異体分子を含む望ましい形態の後で溶出するようなものである。適したコンディションは望ましい接合物に対する架橋された複合体の相対的サイズに依存して変化し、当業者には容易に決定され得る。望ましい接合物を含む溶出液を超濾過で濃縮し、ダイアフィルトレーションによって脱塩化する。
【００８８】
この調製物はhGH変異体分子当たり3から6の間のPEGを含むPEG-hGH変異体接合物の異種物の混合体を表す。一つの実施態様として、この混合物をペグ化hGH変異体のさらなる均質な調製物を生産するために、付加的な精製工程にかける。より特異的には、混合物をペグ化の範囲にしたがってペグ化hGH変異体を分画するためにカチオン交換クロマトグラフィーにかける。コンディションはPEGグループのより大きな数を持つより高ペグ化されたhGH変異体が勾配で早く溶出するようなものである。
【００８９】
この方式では、主に1または2の形態を含むペグ化hGH変異体のプールを得ることが可能である。以下で用いられるように、ペグ化hGH変異体の「形態」とは特定の数のPEGグループを含むPEG-hGH変異体接合物である。したがって、ペグ化hGH変異体の異なる「形態」とは、同じhGH変異体に接合されたPEGグループの異なる数を持つ。例示的な実施態様として、主に二つの形態、すなわちhGH変異体1分子当たり4または5のPEGを持つ接合物を含むペグ化hGH変異体のプールを得る(以下では「PEG-4/5-hGH変異体調製物」という)。それからこのプールを濃縮し、脱塩化し、そして以下に記述するように投与のため処方する。
【００９０】
治療上の処方での使用のためのペグ化hGH変異体を含む構成物は、異種でもあり同種でもありうる、すなわち単一のPEG-hGH形態を含む。典型的には組成物は少なくとも70%の1または2のPEG-hGH変異体接合物を含む;好ましくは少なくとも80%の1または2の形態;より好ましくは少なくとも90%の1または2の形態を含む。
【００９１】
治療上の処方
治療上の投与のための本発明のhGH変異体の処方は、凍結乾燥塊または水溶液の形態で、適宜に製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤と望ましい純度を持ったhGH変異体を混合することによって貯蔵のため調製される(Remington's Phrmaceutical Sciences,第16編,Osol、A.編,[1980])。非経口的処方は製薬学的に許容可能なキャリアーとユニット投与量の注射形態の(溶液、懸濁液または乳濁液)hGH変異体を混合することによって調製され得る。製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤は用いられる投与量および濃度で受容者に非毒性であり、処方の他の構成要素と両立できる。例えば、処方は好ましくは酸化剤およびタンパク質に有害な他の既知の化合物を含まない。
【００９２】
適したキャリアーには、リン酸、ホウ酸、HEPES、クエン酸および他の有機酸を含むバッファー;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(約10残基より小さい)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース及びデキストランを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物;EDTAのようなキレート試薬;亜鉛、コバルトまたは銅のような二価金属イオン;マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成カウンターイオン;及び/またはTween、PluronicsまたはPEGのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
本発明の処方は付加的に製薬学的に許容可能なバッファー、アミノ酸、膨張試薬及び/または非イオン性界面活性剤を含む。これらには例えばバッファー、キレート試薬、抗酸化剤、防腐剤、共溶媒等が含まれる;これらの特異的な例として、トリメチルアミン塩類(Trisバッファー)及びエデト酸二ナトリウムが含まれ得る。
【００９３】
加えて、WO89/09614に示されているGH処方を用い得、そこではhGH変異体はグリシン、マンニトール及びリン酸バッファーのようなバッファーを含む構成物に含まれている。この処方の例示的なバージョンは以下のものである:0.68g/Lグリシン、18.0g/Lマンニトール、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4。代わりに、hGH変異体をマンニトール及びグリシンを必ずしも含まず、ポリソルベートまたはポロキサマーのような0.1から5%(w/v)の非イオン性界面活性剤を含む液体処方に含み得る。この処方の例示的なバージョンは以下のものである:5mg/mlhGH変異体、8.77mg/mlNaCl、2.5mg/mlフェノール、2.0mg/mlポリソルベート20及び10mMクエン酸ナトリウム,pH6.0。
【００９４】
hGH変異体はまた持続放出システムで適宜投与される。持続放出構成物の適した例として、例えばフィルムまたはマイクロカプセルといった形作られた商品の形態で半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスはポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-グルタメートのコポリマー(U.Sidman等,Biopolymers,22,547-556[1983])、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277[1981];Langer,Chem.Tech.,12:98-105[1982])、エチレンビニルアセテート(Langer等,上記参照)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133,988)を含む。持続放出hGH変異体構成物はまたリポソームに封入されたhGH変異体をも含む。hGH変異体を含むリポソームは本質的に既知の方法によって調製される:DE3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985);Hwand等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本国特許出願83-118008;米国特許第4,485,045号と4,544,545号;及びEP102,324。もともとリポソームは脂質含有量が約30モルパーセントコレステロールより大きく、選択される割合は適宜にhGH変異体治療に対して調節される、小さな(約200-800オングストローム)単層上のタイプである。
【００９５】
hGH変異体はまた局所的投与に対しても処方され得る。適した処方は投与部位に依存して変化し、本分野で既知のものと異ならない。例えば、hGHは目に投与するため平衡化した塩溶液内に処方され得る。
治療上の投与に対するhGH変異体の処方は滅菌的である。滅菌は滅菌濾過メンブレン(例えば0.2ミクロンメンブレン)を通した濾過によって容易に成し遂げられる。治療上のhGH変異体構成物は一般的に、例えば皮下注射針によって穴をあけることが可能なストッパーを持った静脈溶液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【００９６】
hGH変異体は通常水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥処方として、封をされたアンプルまたはバイアルのようなユニットまたは複数投与容器内に貯蔵される。凍結乾燥処方の例として、5mlバイアルを2mlの滅菌濾過された0.5%(w/v)hGH変異体水溶液で満たし、その結果生じた混合物を凍結乾燥する。融合溶液を注射のための静菌水等を用いて凍結乾燥hGH変異体を再構成することによって調製する。
本発明のペグ化hGH変異体の処方はhGh変異体で一般的に上述されたように実施し得る。
【００９７】
治療上の使用
本発明はhGHの作用剤として機能する変異体及びhGHの拮抗剤として機能する変異体を含み、後者はサイト2-破壊的ミューテーションを含む。作用剤hGH変異体は哺乳動物の同化作用または成長を増大するのに有用である。成長とは通常の成長曲線によって表せられるような幼児、子供及び思春期の間の個体によって経験される伸長成長の発達の型をいう。それゆえここでいう成長は軟骨細胞によって由来する身長を生み出す骨板の成長をいい、骨の異なる部分に由来する骨芽細胞の成長とは区別される。通常の成長パターンの回復は、患者がより満足のいく成長曲線に近づくことを許容する。GHに比較的耐性であるが同化作用の効果を含む治療を必要とする患者の例として、ターナー症候群に罹患したもの、GH欠損の子供、彼らの成長部位が閉じる約2-3年前に通常の成長曲線の遅延または阻止を経験している子供、つまりショートノーマルな子供と呼ばれている子供、及びGHに応答するインスリン様増殖因子-I(IGF-I)が化学的に(すなわちグルココルチコイド治療により)または大人の患者においてGHに応答するIGF-Iが天然において減少しているような天然のコンディションによってブロックされている患者が含まれる。
【００９８】
免疫疾患もまた本発明の作用剤hGH変異体を用いた治療の影響を受けやすい。「免疫疾患」なる表現は、その脾臓サイズがあるべきものより小さいため、あるいは脾臓が部分的にのみ機能しているため、あるいは化学療法試薬のような薬剤が通常の免疫機能を抑制しているため、あるいは動物が機能的にIGF-I-(またはGH-)欠損しているため、または他の要因のため、動物と同様にヒトの免疫系が通常より小さい抗原に対する抗体応答をもついかなる病気をも含む。例として、高齢の患者、化学療法または放射線治療を受けている患者、重い風邪から回復した患者、手術を受けようとしている患者、AIDSをもつ患者、低ガンマグロブリン血症、一般的に変化する無ガンマグロブリン血症のような適した必要とされるB細胞欠損をもつ患者、及び例えばIgA欠損などの選択的な免疫グロブリン欠損、狂犬病のようなウイルスに感染し、患者の免疫応答より短いインキュベーション時間をもつ患者、及びディ・ジョージ症候群のような遺伝的疾患をもつ患者が含まれる。
【００９９】
作用剤hGH変異体は免疫機能を増大することにより哺乳動物の免疫機能を刺激するように機能し得るが、その増大は抗体介在または細胞介在のためであり、及び免疫系はhGHを用いて治療されるホストに異種のものであり、またはhGH変異体を与えられるホストに対してドナーから移植される(骨髄移植のように)。例えば該刺激は脾臓リンパ球数、脾臓T細胞群数(T細胞、CD４及びCD８)、または脾臓B細胞数のような脾臓細胞の増大した数から由来する、または胸腺細胞の増大した数から由来する。免疫系応答に含まれる他の細胞には、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ及び好中球が含まれる。加えて該刺激は免疫原に応答する抗体生産の増大のためでもあり得る。
【０１００】
本発明の作用剤hGH変異体は心機能を刺激するためにも用いられ得る。
B2036及びB2024のような本発明の拮抗剤hGH変異体は、GH機能の阻害が望ましい病気を治療するのに有用である。特に拮抗剤hGHを用いた治療に影響を受けやすいものは、GHの循環レベルの減少またはIGF-IのようなGH機能のメディエーターの減少が治療上の利益を提供する病気である。該病気には例えば巨大症及び先端巨大症のようなGH過多の病気が含まれる。巨大症は長い骨の成長がいまだ可能である思春期前のGH過多から由来する。
【０１０１】
先端巨大症は長い骨の成長が止まった思春期後のGH過多から由来する。内部器官、特に心臓の肥大と同様に、骨の異常成長と軟組織の膨張によって特性指摘される。先端巨大症は典型的にはGHを分泌する下垂体腫瘍によって引き起こされる。該疾患のホールマークは循環GHとIGF-Iの高レベルである。本発明のhGH変異体はGH機能を阻害することによって有意な治療上の利益を提供すると現在では考えられている。
【０１０２】
拮抗剤hGH変異体はまたGH機能の阻害が治療上の利益を提供する他の病気を治療するのにも有用である。例として、例えば糖尿病性網膜症及び糖尿病性腎症のような糖尿病及びその合併症が含まれる。糖尿病性網膜症は網膜の血管を形成する細胞の増殖、網膜の先端の新しい血管の成長(新生血管形成)、微細動脈瘤の発達、及び囲んでいる網膜組織内への体液の漏出によって特性指摘される。糖尿病性腎症の早期のホールマークは腎肥大とハイパーフィルトレーション(hyperfiltration)である。疾患の進行に伴って、糸球体間質細胞の散乱拡大(それは腎臓の濾過装置を補強する)が観察され、糸球体間質細胞数の無制限の増大を伴う。
【０１０３】
増殖的な新生血管形成を含む糖尿病性網膜症のような目の血管の疾患もまた、拮抗剤hGH変異体を用いた治療の影響を受けやすい。例として、早産児の網膜症、鎌状赤血球貧血と関連した網膜症、及び55歳以上の失明の最も一般的な原因である年齢関連性斑変質が含まれる。
GHレベルの減少が治療上の利益を提供すると現在では考えられている他の病気には、成長によってGHまたはGH機能のメディエーター(IGF-Iのような)に応答する悪性腫瘍が含まれる(以下では「GH応答性悪性腫瘍」という)。GH応答性悪性腫瘍の例として、ウィルムス腫、様々な肉腫(例えば骨肉腫)、及び胸部、大腸、前立腺及び甲状腺ガンが含まれる。
【０１０４】
本発明の拮抗剤hGH変異体は、変異体が結合する受容体を発現している細胞の成長を阻害する。広い様々な組織が該受容体を発現している。例えばGH受容体mRNAは、通常の胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、リンパ節由来の細胞系で、及びバーキットリンパ腫、結腸直腸のガン腫、肺ガン腫、リンパ芽球白血病及びメラノーマ由来の細胞系で発現されている。それゆえ本発明の拮抗剤hGH変異体は、変異体が結合する受容体を発現しているガンを治療するのに一般的に有用であると現在では考えられている。
【０１０５】
本発明の様々な目的のため、作用剤または拮抗剤hGH変異体は、非経口的なものを含めたいかなる適した方法によってでも哺乳動物に直接的に投与され、局所的にまたは全身的に投与され得る。特異的な投与経路は例えば、患者の病歴に依存し、hGH変異体を用いたいかなる認められるまたは予期される副作用をも含む。非経口的な投与の例としては、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹膜内投与が含まれる。
投与は継続的な点滴(例えば浸透性ポンプのようなミニポンプを用いて)、または例えば静脈内や皮下の手段を用いる注射によってなされる。一つの実施態様として、hGH変異体は皮下に投与される。投与はまた単一の巨丸剤としてもなされ得るし、遅放出貯蔵物処方によってもなされ得る。
【０１０６】
治療において用いられるhGH変異体構成物は、治療される特異的な病気、個々の患者の臨床上のコンディション(特にhGH変異体単独を用いた治療の副作用)、hGH変異体構成物の輸送部位、投与方法、投与スケジュール及び他の実施者に既知の因子を考慮に入れて適した医療上の実践に一致した方式で処方され投与される。それゆえ、ここで目的に対するhGH変異体の「有効量」(例えば先端巨大症を打ち消すための拮抗剤の有効量を含む)とは、該考慮によって決定される。
【０１０７】
一般論としては、投与量当たり非経口的に投与されるhGH変異体の製薬学的な有効量は、上記注意したように治療上の裁量を受けるが、患者の体重の約1μg/kg/日から約100mg/kg/日の範囲にある。通常この投与量は約0.01から約10mg/kg/日の間であり、ヒトに対してより一般的には約0.01から約1mg/kg/日の間である。継続的に与えられる場合には、hGH変異体は一日当たり1から4の注射または例えばミニポンプを用いて継続的な点滴によって、約1μg/kg/時から約50μg/kg/時の投与量割合で典型的には投与される。静脈バッグ溶液もまた用いられ得る。適した投与量を選択する鍵となる因子は、例えば長い骨の成長、抗体生産、脾臓細胞(splenocyte)数または胸腺細胞数、及び脾臓B細胞などの増加によって作用剤に対して測定されるもののような、及び例えば血清GH、血清IGF-Iおよび腫瘍成長等の減少によって拮抗剤に対して測定されるもののような、得られた結果である。
【０１０８】
一般的に本発明のペグ化hGH変異体は、上述したいかなる投与経路ででも投与され得る。しかしながらペグ化hGH変異体は非ペグ化hGH変異体ほど頻繁に投与される必要はないと現在では考えられている。非ペグ化hGH及びhGH変異体は、少なくとも一週間に3回及びしばしば毎日典型的には投与される。しかしながらこれらのタンパク質のペグ化形態は、およそ三日に1回から一月に1回、または典型的にはおよそ6-7日に1回から2週間に1回投与され得る。
【０１０９】
ここでhGH変異体によって潜在的に治療可能な哺乳動物は、ウシ、ヒツジ及びブタのような経済的に重要な哺乳動物を含む。ここで好ましい哺乳動物はヒトである。
以下の記述は例示として存在し、本発明の範囲を制限するために解釈されるべきではない。ここで用いられている全ての引用は、参考としてここで明らかに取り込まれる。
【実施例】
【０１１０】
実施例I
hGHのサイト1内の30の接触残基でのアラニン置換物に対する結合の速度論及びアフィニティーを評価した。固定化された受容体へのホルモンの結合による屈折指標の変化を測定するために、表面プラズモン共鳴に依存するBIAcoreＴＭバイオセンサーと呼ばれるバイオセンサー装置を用いた。本実施例では、アフィニティーが31の側鎖の4分の1より小さいものによって支配され、小パッチにおけるこれらのクラスターは接触エピトープの近くに存在することが見出された。それゆえ「構造的エピトープ」は「機能的結合エピトープ」よりかなり大きい。
【０１１１】
実験プロトコール
hGHのサイト1に存在する残基のアラニンミューテーションはCunninghamとWells,上記参照に記述されている研究から利用され、新たに部位指定ミュータジェネシスによって作製された。Kunkel等,Methods Enzymol.,154：367-382(1987)。様々なタンパク質がCunninghamとWells,上記参照に記述されているように生産され精製された。硫安沈殿の継続時間を1時間に伸長することによって改良された。
【０１１２】
hGHbp(WellsとDe Vos,上記参照)がPharmacia BIAcoreＴＭバイオセンサー上に固定化され、ホルモンの結合による屈折指標の変化が速度論的測定のため用いられた。会合定数及び解離定数が器械により提供されるソフトウェアーを用いて計算された。Karlsson等,J.Immunol.Methods,145：229-240(1991)。hGHbpを遊離チオールを経由してhGHbpを固定化することによってセンサーチップ上に別個の配向で固定化した。これは部位指定ミュータジェネシス(Kunkel等,上記参照)を用いて2の特異的部位の1にシステイン残基を導入することにより(S201CまたはS237C)成し遂げられた。hGHbpのチオール変異体を大腸菌で発現し均質に精製した。Fuh等,J.Biol.Chem.,265：3111-3115(1990)。これらのタンパク質をN-エチル-N'-(3-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)を用いてカルボキシル-デキストランマトリックスを活性化し、それをN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いて反応させることによってチップ表面に結合させた。NHS-エステルを2-(2-ピリジニルジチオ)-エタンアミン(PEDA)を用いて反応させた。残存した非反応NHS-エステル基をエタノールアミンの添加によって除去した。hGHbp変異体をおよそ1000Ru'sが結合されるまで(1.0ng/mm２；BIAcoreＴＭマニュアル参照)マトリックスと反応させた(50mM酢酸ナトリウム,pH4.5内に50μg/ml)。
【０１１３】
結合割合を各hGH変異体の増大していく濃度を注入することによって得られた結合プロフィールから測定した。5の連続的な希釈(それぞれ2倍)をhGHbpに対するアフィニティーに依存して200または1000nMホルモンで始めることによって作製した。20μl/分が最大の流速であった。高塩バッファー(150mMNaCl、10mMリン酸ナトリウム,pH7.4)を幅広い静電学的効果を避け、生理的イオン強度をまねるために用いた。非特異的結合を減少するため、0.02%Tween20もまた用いた。4.5MMgCl２を用いて20秒間洗浄することにより、マトリックスを再生した。これに示されるコントロール実験は全ての結合ホルモンを除去することで十分であり、マトリックスは結合速度論の有意な変化なく50回より多く再使用可能であった。
解離割合は5μMhGHミュータントを用いてバイオセンサーを飽和し、ホルモンの存在しないバッファーに切り替えることによって測定された。バッファー流速と再生コンディションは会合プロフィールを測定するために用いられたものと同様であった。潜在的な差異結合効果を、解離定数を計算するための各解離プロフィールの最初の10分だけ用いることによって最小化した。会合定数と解離定数の両者を、割合の方程式を解くためにPharmacia Kinetics Evaluationソフトウェアーを用いて決定した。Karlsson等,上記参照。
【０１１４】
同じバイオセンサーチップでの会合定数の三重の測定における平均標準偏差は報告されている値の±4%であった。異なるバイオセンサーチップの間で測定された値は60%まで変化する。しかしながら野生型のリファレンスがいつも含まれていたため、ここで報告される相対的値に対する標準誤差は同一のチップで得られた測定と同様である。hGH及び変異体の濃度はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後のCoomassieブルー染色タンパク質のデンシトメトリーによって測定された。この方法は±10%の正確性をもって置換とは独立なタンパク質濃度を提供するのと同様に、様々なホルモンの純度と完全性を確認する。CunninghamとWells,上記参照。それゆえ相関的会合、解離、及びアフィニティー定数における平均累積誤差は、それぞれ約17%、14%及び21%である。
【０１１５】
結果
hGHbpに対するhGHの結合を、hGHbpの変異体、(S237C)hGHbp[hGHbp中のSer237をCysに変換している]を混合されたジスルフィド結合を経由してBIAcoreＴＭバイオセンサー上のチオール誘導化マトリックスに固定化することによって研究した。図1A。S237C(hGHbp)ミューテーションはhGHに対する結合アフィニティーに影響せず、単一のチオール特異的蛍光プローブを付着するために用いられ、溶液中のhGHbpのhGH誘導性二量体化を引き起こした。Cunningham等,1991,上記参照。この付着は、もし第一級アミン基を通じたランダムな結合が用いられていれば得られるものと異なるマトリックス上のhGHbpの同型の配向を確実にした。結合反応の間に生じる屈折指標共鳴ユニット(RUs)の変化から、付着したhGHbpの量がPharmaciaから供給された較正曲線から計算された(BIAcoreＴＭバイオセンサーマニュアル参照)。
【０１１６】
過度のhGHが(S237C)hGHbp-マトリックスに加えられた場合、急速な会合と極端に遅い解離が観察された。図1B。RUの変化から固定化されたhGHbp当たり0.4のhGHの結合のモル比が計算された。表1参照。これはhGHが溶液中でするように固定化されたhGHbpを二量体化することを示した。図1A。さらにマトリックス上での二量体化がサイト2を結合する能力においてブロックされたhGHの非二量体化ミュータント、(G120R)hGHのhGHbpへの結合を測定することによって試験された。Fuh等,1992,上記参照。(G120R)hGHの飽和濃度が加えられると、約2倍量の結合されたホルモンを見出し、それは固定化されたhGHbp当たり0.7(G120R)hGHの計算された化学量論を持った(表1)。
【０１１７】
オン-及びオフ-レートプロフィールの分析は野生型及び(G120R)hGHの両者が同様の割合で会合することを示した(表1)。しかしながら野生型に対するオフ-レートは信頼できる解離定数を計算するのがあまりに遅かった。これらのデータは提案されている連続的な結合メカニズムと一致した;つまり両ホルモンは第一の受容体に同じ方法で結合し、それ故にほぼ同じオン-レートを持つ。しかしながら野生型ホルモンは第二の受容体に結合し、それゆえ解離が極端に遅かった。
【０１１８】
表1
BIAcoreＴＭバイオセンサーのチオールマトリックス上に固定化された(S237C)hGHbpまたは(S201C)hGHbpに対する野生型または(G120R)hGHの結合に対する動力学的定数。オン-レート及びオフ-レートプロフィールを25℃で測定し、hGH及び(G120R)hGHに対して分析した;同じバイオセンサーチップでのオン-レート、オフ-レート及びアフィニティーに対する平均標準誤差は、報告された値の17%、14%及び21%であった。結合の化学量論は以下の公式にしたがって図1B及び2B中のデータから計算した。
【０１１９】
【表１】
0003693668.tif 000003
【０１２０】
＊ND=検出されなかった。
【０１２１】
マトリックス上でのhGHbpの二量体化の複雑化なく、サイト1接触エピトープ単独でミュータントの結合をより詳細に調査することが望ましかった。hGH(hGHbp)２複合体のX線構造にしたがって(De Vos等,上記参照)、2のhGHbpがお互いにSer201で接触する。それゆえマトリックス上での二量体化はCysを用いてSer201を除去し、活性化チオールマトリックスに対して単一のチオールを経由してS201C変異体を付着することによってブロックされた。図2A。実際、飽和レベルのhGHを加えた場合(図2B)、固定化(S201C)hGHbp当たり0.84hGHの最大の化学量論(表1)が計算された。(G120R)hGHは(S201C)hGHbp当たり0.94の化学量論をもって結合した。チオール結合の正確な配置によって、マトリックス上のhGHbpが1:1複合体形成または1:2複合体形成のいずれかを許容するように配向することが可能であった。それゆえhGHbpに対してhGHの溶液結合性質は、BIAcoreＴＭバイオセンサー上で再生産され得る。(G120R)hGHは(S201C)hGHbp-マトリックス上でhGHと同じ速度論を持ち、(S237C)hGHbp-マトリックス上で(G120R)hGHのものと同じものを持つ。これらのデータは共に(S201C)hGHbp-マトリックスがサイト1単独に結合するためのhGHの変異体をテストする信頼性のある手段であることを示す。
【０１２２】
hGH上の隠れた側鎖をサイト1でhGHbpに結合すると溶媒に対する接近能が変化する側鎖原子を含むものとして定義した。溶媒接近能をサイト1を介して1のhGHbpに遊離または結合すると、hGHの表面上で1.4オングストロームラジウムプローブ(LeeとRichards,J.Mol.Biol.,55:379-400[1971])を回転することによって計算した。これらの計算のためX線コーディネートセットをhGH(hGHbp)２複合体に対して用いた。De Vos等,上記参照。この基準により、全てアラニンより長い30の側鎖が存在し、複合体化の場合同程度に隠れている。表2。
【０１２３】
表2
サイト1界面で様々な程度に隠れているhGH内の残基でのアラニン置換に対する相対的なオン-レート、オフ-レート及びアフィニティー。レートの測定は表1に記述されているように25℃でhGHbp(S201C)マトリックスを用いてなされた。
【０１２４】
【表２ａ】
0003693668.tif 000004
【表２ｂ】
0003693668.tif 000005
【０１２５】
１1.4Åプローブに対する接近可能エリアを、野生型ホルモンにおける各側鎖に対して、及びβ-炭素以外の野生型の隠れた原子に対して(アラニンミューテーションをまねるために)、そしてX線コーディネートを用いてhGHbpとのそれらの相当する複合体に対して計算した(LeeとRichards,上記参照)。De Vos等,上記参照。アラニンミューテーションに帰する隠れたエリアの変化は(遊離-結合)ｗｔ-(遊離-結合)Ａｌａの接近可能エリアの差異である。これはアラニン置換により除去された側鎖の部分であるため、β-炭素以外の隠れたものにのみ該エリアは用いられた。カッコで示されたものは、一度受容体が結合すると溶媒に接近不可能となるhGH内のβ-炭素以外の原子に対する各側鎖のエリアである。
２ファンデルワールス接触の全数は、hGH(hGHbp)２複合体の調査に基づいて接触側鎖β-炭素以外のいかなる原子のものであっても4.4Å以内の受容体原子の数である。接触距離の80%以上が3.8から4.2Åである。水素結合(h)または塩架橋(s)を形成する基をhGHとhGHbpの間の互いの3.3Å以内のドナー-アクセプターまたは相補的電荷ペアによって決定する。例えばH18の次のhN218はhGH上のH18とhGHbpのN218の間の水素結合を示す。mcは主鎖アミドに対する水素結合を示す。
３オフ-レートの相対的変化は以下から計算された:
【０１２６】
【数１】
0003693668.tif 000006
【０１２７】
(S201C)hGHbp-マトリックスをサイト1界面の30の隠れた残基でのアラニンミュータントに対するアフィニティーを測定するために用いた(表2)。多くのこれらのミュータントに対する結合定数を測定するためにラジオイムノ沈降アッセイ(RIA)を以前に用いた。CunninghamとWells,1989と1991,上記参照。BIAcoreＴＭバイオセンサーデータに対するRIAデータによって計算されたアラニンミュータントに対する野生型と比較した自由エネルギーの変化のプロットは、均一性に近いスロープとゼロに近い切片をもつ整った相関関係(R２=0.94)を示す。図3。それゆえバイオセンサーマトリックスで得られたアフィニティーデータはRIAによって溶液中で測定されたものと非常に適合する。これはマトリックスが規則的な結合アーティファクトを引き起こさないことを示す。
アフィニティー定数の平均標準誤差はRIAでは約30%であるのに対してBIAcoreＴＭバイオセンサーを用いると約20%である。hGHbpの二量体化のある物はRIAで生じ得、それはアフィニティーにおける規則的な誤差を導く;これは(S201C)hGHbp-マトリックスを用いて避けられる。
【０１２８】
30の隠れた側鎖のうち7のみ(L45,P61,R64,K172,T175,F176及びR178)がアラニン置換から引き起こされた結合自由エネルギーの全変化の約85%を説明できる。他の6(P48,E56,Q68,D171,I179及びR183)は本質的に残りの部分を説明できる(表2)。隠れた側鎖の他の8(M14,H21,Q46,S62,N63,Y164,R167及びE186)は、全アフィニティーに対して本質的に全く影響がない(それぞれはアフィニティーにおいて2倍より小さい減少を引き起こす)。隠れた残基の他の3(Q22,D26及びK168)は、結合アフィニティーに対して小さいが有意な影響を持つ。5の側鎖(H18,F25,Q29,E65及びE174)は、アラニンに変換した場合2から5倍のアフィニティーの促進があるので、現実に結合を妨害している。アラニン置換によって引き起こされる自由エネルギーの減少の合計(-14.2kcal/ml)は、BIAcoreＴＭセンサーによって測定されたhGHとhGHbpの間の結合の全自由エネルギー(-12.3kcal/ml)に匹敵する。
それゆえH18,Q22,F25,D26,Q29,E65,K168及びE174での変化を持ったhGHミュータントはhGHbpに対する結合アフィニティーを増大している。これらの位置で全てのアラニン残基を持つ変異体は、個々のアミノ酸変化の加法に基づいて野生型hGHのものの約200倍大きい結合アフィニティーをもつと計算される。ここで実施例IIのデータを統合すると、この組み合わせのミュータントの18位でのAsp及び/または174位でのSerもまた野生型hGHよりhGHbpに対して有意に大きな結合アフィニティーをもつと期待される。
オフ-レート効果はオン-レート効果よりはるかに大きい(表2;図4)。それゆえ、アフィニティーに最も影響する同じ7残基はオフ-レートでの増大のほとんどを説明する(25倍まで)。3のArg側鎖(R64,R167及びR178)のAlaへの変換は、オン-レートでの最大の減少を生み出すが高々約2倍である。2のGlu側鎖(E65及びE174)のAlaへの変換は、オン-レートでの最大の増大を引き起こす(ほぼ2倍の改良)。これは静電気的相互作用が受容体へホルモンを導くもっとも重要な側鎖の決定因子であることを示す。
【０１２９】
オン-レートに最も影響する側鎖は全てがオフ-レートに最も影響するものと同じであるわけではない。図4。例えばR167Aはオン-レートでは最大の減少を引き起こすが、オフ-レートでは埋め合わせ可能な減少を起こすのみである。アフィニティーを支配する側鎖でのアラニンミューテーションの多く(P61A,K172A,T175A及びF176A)は、現実に会合レートには何の影響もない。これらの実験から、各ミューテーションの加法から由来する、野生型hGHよりGH受容体に対する200倍より大きい結合アフィニティーをもつ好ましい組み合わせは、H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174Aをもつ。
【０１３０】
結論
該データは界面のわずかな一連の隠れた側鎖だけが結合において機能的に重要であることを示す。いかなる理論に限定されることなく、これは分析方法のアーティファクトではないと考えられる。第一に、hGH・hGHbp複合体の構造が解決され、サイト1で隠れている残基がhGH(hGHbp)２複合体でhGHに対するサイト1でみられるものと実際に同一である。De Vos等,上記参照。それゆえ構造的エピトープが機能的エピトープよりずっと小さいという事実は、1:2複合体に対して1:1で結合するという接触差異のためではない(それは接触エピトープを定義するために用いられるコーディネートセットである)。
【０１３１】
第二に、ミューテーション実験による側鎖の機能的重要性の分析は、構造的な妨害または異常な立体的、静電気的、または疎水性相互作用を強要することによってミュータントタンパク質が効果を過大視する予告をもつ。アラニンを用いた側鎖の規則的な置換は、構造をほとんど破壊しない。Wells,Methods in Enzymol.,202:390-411(1991)。アラニンミューテーションは付加的な好ましくないまたは好ましい相互作用を創り得る新しい原子を導入することなく原子を除去するので、判断するのが最も簡単である。アラニン置換により引き起こされる全ての破壊効果の合計(-14.3kcal/モル)は、全結合自由エネルギー(-12.3kcal/モル)を劇的に過大視することはない。これは該効果が個々の結合決定因子に局在し、全タンパク質構造または結合の態様を著しく変化することはないことを示す。多数の接触残基が与えられると、単一のアラニン置換が複合体における結合の態様を変化することもありそうになくなり、それは結合に付加的な効果を持つ二つのアラニン置換の数によって証明され、該部位が独立に機能することを示す。
【０１３２】
ホルモン内で隠れており、さらに受容体が結合する場合には隠れていない、アフィニティーに影響するアラニンミューテーションのいくつかもまた同定されている。CunninghamとWells,1989,上記参照。例えば、P5A,L6A,F10A及びV185Aはそれぞれ2から4倍アフィニティーを破壊する。これらの側鎖のそれぞれはサイト1エピトープを支配するが結合には直接的には関与しないヘリックス1とヘリックス4の間の接触を形成する。同様に、F54及びI58はアフィニティーを破壊するが第二のミニヘリックスに位置するループ領域に隠れている。このミニヘリックスはR64及び他の重要な結合決定因子を含む。それゆえ結合に対するマイナーな効果が構造的エピトープではないがその近傍でのアラニンミューテーションに由来する。しかしながらサイト1構造的エピトープから離れた試験された残基の大部分が、アラニンに置換された場合結合に対して検出可能な効果を持たない。CunninghamとWells,1989,上記参照。
【０１３３】
アラニンスキャニングデータは結合エネルギーの約85%を説明する界面で隠れた30の側鎖の7のみを示す。残りの全ては事実上6の他の側鎖によって説明され得る。ある残基は結合に対して重要であり、他のものはそうでない理由を説明し得る構造的なパラメーターの数を相関させることが試みられている。該残基は構造的エピトープの中央近くの小さな領域で結合クラスター(大抵ヘリックス4の末端に向けられている)に対して重要であると見出されている。機能的に「無効な」接触残基は、ヘリックス1の中央でヘリックス4の始まりの、周縁近くに存在しがちである。これはhPRL受容体に対するhGHの結合と(CunninghamとWells,1991,上記参照)、(Zn＋２・hGH)２貯蔵複合体の形成に重要な残基である。Cunningham等,Science,253:545-548(1990)。それゆえこのエリアはhGH受容体に対する結合における役割がほとんど明らかでない一方、他の重要な機能を持っている。
【０１３４】
他の規則的構造的相関関係は作り出すのがより困難である。ChothiaとJanin,Nature,256:705-708(1975)は隠れた表面エリアの変化は一般的に2のタンパク質間の会合の自由エネルギーと相関していることを見出した。アラニンミュータントのそれぞれに対して複合体の形成を生じる隠れた表面エリアの変化は、hGHとアラニンミュータントの間の遊離及び結合相での接触能の差異から計算された。表2。しかしながら側鎖をアラニンに変換した場合に結合の自由エネルギーの変化に対する結合の隠れた表面エリアの変化のプロットは、大変小さな相関関係しか与えない。図5A。ある場合には、接触能の変化に対する負の値が得られた。これはアラニンミュータント内の失われた側鎖が界面で空洞を形成し、それゆえさらなる表面エリアが複合体形成でカバーされ得るためである。隠れた側鎖を定義する基準であるβ-炭素以外の原子に対する結合に生じる側鎖接触能の変化もまた計算された(表2の第2列のカッコを参照)。さらに自由エネルギーの変化に対するこれらの値のプロットはよりよい相関関係を与えない。側鎖がアラニンに変換された場合のアフィニティーの変化に対するβ-炭素以外のhGHの原子によって形成されるファンデルワールス接触の数のプロットも、よい相関関係を示さない。相関関係は静電気学的相互作用の可能な側鎖を別々に考慮することによっても改良されない。
【０１３５】
HortonとLewis,Protein Science,1:169-181(1992)は、隠れた表面エリアと接触側鎖に対する原子溶媒和パラメーターの機能的なスケーリング(EisenbergとMcLachlan,Nature,319:199-203[1986])に基づいて、半経験的な方法を用いて15の異なるタンパク質-タンパク質ペアに対するアフィニティーを予測することができた。それゆえこれらの測定された原子溶媒和パラメーターは個々のアラニン置換から由来する自由エネルギー変化を彼らがいかによく予測し得るかを示すために評価された。ほとんど相関関係はなかった。それゆえ隠れた表面エリア、ファンデルワールス接触の数、及び測定された原子溶媒和計算値は一般的な結合アフィニティーに対する相関関係には有用である一方、それらはこのエピトープ内の個々の側鎖の役割の予測には貧弱である。
【０１３６】
概して静電気学的相互作用に対するエネルギー論は、酵素-基質複合体のミュータジェネシスから得られる見積もり値よりかなり弱い。チロシル-tRNAシンテターゼのミューテーションの分析から、電荷した水素結合ペアの破壊に対する自由エネルギーの損失は3.5-5kcal/モルであり、中性の水素結合ペアに対しては0.5-1.5kcal/モルである。Fersht等,Nature,314:235-238(1985)。hGH由来の7の側鎖がhGHbpと水素結合を形成している(H18,Q46,S62,K168,E174,T175及びR178)。これらの5は電荷水素結合であり(Q46,K168,E174,T175,R178)、しかしそれらをアラニンに変換した場合結合自由エネルギーの変化はそれぞれわずかに+0.1,-0.2,-0.9,+2.0及び+2.0kcal/モルであり、平均値は+0.6kcal/モルを与える。2の中性水素結合側鎖(H18及びS62)をミューテートすることに対するアフィニティーの変化はそれぞれわずかに-0.5及び+0.1である。3の他の側鎖はhGHbpと塩架橋を形成し(R64,R167及びD171)、しかしこれらはそれぞれわずかに+1.6,+0.3,及び+0.8kcal/モルの減少を引き起こすのみである。これらの値は+1.8から+2.3kcal/モルの範囲であるサブチリシンでの2の作製された塩架橋に対して見積もられたものより小さい。Wells等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1219-1223(1987)。それゆえ接触の強さはhGH-hGHbp界面で広く変化し、相互作用は小分子結合部位のものと比較した場合かなり弱い。
【０１３７】
タンパク質内部のミューテーションの研究から、各隠れたメチレン基が全ホールディングエネルギーに対して-1.0から-1.5kcal/モルの貢献をすることが見積もられている(最近のレビューとしてShortle,Quart.Rev.Biophys.,25:205-250(1992)及びそれの参考文献参照)。hGH内の疎水性側鎖の数をアラニンに変換することは、これらの研究から期待されるであろうよりずっと弱い効果を引き起こした。例えば疎水性側鎖でのミューテーションで見られる最大の効果はL45A,K172A(脂肪族部分のみ受容体と接触する),F176A及びI179Aに対してであり、それらはそれぞれ+1.2,+2.0,+1.9及び+0.8kcal/モルのアフィニティーにおける減少を引き起こす。さらに複合体形成に際してより高くまたは匹敵するほどに隠れた他のいくつかの疎水性基は、アラニンにミューテートされた場合ほとんど何の効果も持たない。
【０１３８】
要約すると、hGH:受容体複合体の1:2の著しい性質が見出されている、すなわちサイト1で隠れたhGH由来のわずかな一連の側鎖のみが、アラニンに置換した場合結合アフィニティーに影響する。それゆえアラニンスキャニングミュータジェネシスで定義された機能的エピトープは、隠れた残基またはファンデルワールス接触によって定義される構造的エピトープよりかなり小さい。サイト1エピトープ内ではないが近傍のいくつかの残基は、アラニンに置換した場合、たとえ間接的な効果によってでも結合アフィニティーに穏やかに影響する。最後に、ほとんどの機能的に重要な側鎖は、受容体に対するホルモンのオフ-レートを調節するが、オン-レートはしない。
【０１３９】
実施例II
目的
hGHのサイト1のどの程度のアフィニティーが促進されるのかを決定することが望ましかった。また、hGHのどの側鎖が結合アフィニティー--アラニンスキャニングミュータジェネシスによって同定されるようなアフィニティーを調節するもの、接触するために結晶学によって同定されるもの、または両者--を促進するためにミューテートされるべきかを決定することも望ましかった。最後にもしミューテーションが実質的にアフィニティーを促進し得た場合、それらがミューテートされたホルモンのオン-レートまたはオフ-レートのいずれに影響することによってそれをなしたかを知ることが望ましかった。
【０１４０】
概要
hGHの非常に高アフィニティー変異体を、合計で約10６タンパク質変異体をファージミド粒子に一価的にディスプレーしている5の別々のライブラリーから分類されたhGHのアフィニティー促進ミュータントを組み合わせることによって生産した。サイト1結合部位の全部で20の異なる残基がミューテートされた。アフィニティーにおいてほんのわずかな増大のみが各ミュータントの側鎖から寄与されたが、これらは結合の自由エネルギーの加法の増大を生み出した。このアプローチによって、野生型hGHより400倍もタイトに受容体を結合する15の置換をもつ一つのhGH変異体が生産された。
【０１４１】
物質と方法
(a) 一般的方法
制限酵素、ポリヌクレオチドキナーゼ、T７DNAポリメラーゼ及びT４DNAリガーゼをGibco-BRLまたはNew England Biolabsから得て、製品の説明書にしたがって用いた。Lowman等,上記参照、およびLowmanとWells,上記参照に記述されているように、ランダムオリゴヌクレオチドカセットをリン酸化し、アニールしそして構成物につないだ。Sequenase(登録商標)酵素をUnited States Biochemicalから購入し、シングルストランドシークエンシングのため製品の説明書にしたがって用いた。Sanger等,上記参照。
【０１４２】
hGHのいくつかの部位特異的ミュータントを、シングルストランドテンプレートを用いてオリゴヌクレオチドディレクテッドミュータジェネシスにより構築した。Kunkel等,Methods Enzymol.,204:125-139(1991)。M13遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインに融合した野生型hGHをコードするプラスミドphGHam-g3(Lowman等,上記参照)を、カセットミュータジェネシスに対する元となるベクターを構築するために用いた。一価hGHディスプレーファージミド粒子をエレクトロトランスフォームした大腸菌XL1-ブルー細胞(Stratagene)によって調製し、M13K07ヘルパーファージを加えた。VieiraとMessing,上記参照。
可溶性ホルモンをコードするDNA分子を大腸菌において発現し(Chang等,上記参照)、浸透性ショックを受けた細胞から硫安沈殿し(Olson等,Nature,293:408[1981])、Coomassie染色されたSDS-PAGEゲルのレーザーデンシトメトリーによって定量した。Cunningham等,上記参照。さらにいくつかの変異体をMono-Qカラム(Pharmacia-LKB Biotechnology,Inc.)においてイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０１４３】
(b) hGHファージミドライブラリーの調製
hGHのMinihelix-1(41-46残基)のミュータジェネシスのため、phGHam-g3において存在するAatII部位を、オリゴヌクレオチド#718(5'-GCC ACC TGA TGT CTA AGA AAC-3')(SEQ.ID NO.1)を用いて破壊した。独特なSfiIとAatII部位をオリゴヌクレオチド#782(5'-TTT GAA GAG GCC TAT ATG GCC AAG GAA CAG AAG-3')(SEQ.ID NO.2)と#821(5'-CAG AAC CCC CAT TGA CGT CCC TCT GTT TC-3')(SEQ.ID NO.3)をそれぞれ用いてpH0779を創るためにphGHam-g3内に導入した。後者のオリゴヌクレオチドはまた+2フレームシフトと49残基の後にTGAストップコドンを導入した。ランダムなカセットを相補的オリゴヌクレオチド＃822(5'-TC CCG AAG GAG CAG NNS NNS TCG TTC NNS NNS AAC CCG CAG ACG T-3')(SEQ,ID NO.4)と＃823(5'-CTG CGG GTT SNN SNN GAA CGA SNN SNN CTG CTC CTT CGG GAT AT-3')(SEQ.ID NO.5)から構築した。元となるDNA(pH0779)を制限酵素SfiIとAatIIで切断し、大きい断片を精製しカセットとつないだ。ライゲーション生産物を、LowmanとWells,上記参照に記述されているように、2の等量でファージミド調製物に対してXL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームし、1×10６の独立なトランスフォーマントをそれぞれ生産した。
【０１４４】
Loop-A(54-64残基)ライブラリーを構築するために、phGHam-g3に存在するAatII部位をオリゴヌクレオチド＃718を用いて破壊した。独特なAatIIとBstEII制限部位をオリゴヌクレオチド＃719(5'-AAC CCC CAG ACG TCC CTC TGT-3')(SEQ.ID NO.6)と＃720(5'-GAA ACA CAA CAG TAA AGG TAA CCT AGA GCT GCT-3)(SEQ.ID NO.7)を用いてpH0709を構築するためにhGH遺伝子に導入した。後者のオリゴヌクレオチドはまた+1フレームシフトと69残基の後にストップコドンを導入した。加えて独特なEcoRI部位を、以前のライブラリー(LowmanとWells,上記参照)由来の考え得るコンタミネーティングクローンに対して制限選択を許容するために、オリゴヌクレオチド＃536(5'-CGT CTT CAA GAG TTC AAC TTC TCC-3')(SEQ.ID NO.8)を用いて破壊した。ランダムカセットを相補的オリゴヌクレオチド＃803(5'-pCC CTC TGT NNS TCA NNS TCT NNS CCG ACA CCC AGT AAT NNS GAG GAA ACA CAA CAG AAG A-3')(SEQ.ID NO.9)と＃804(5'-pGTT ACT CTT CTG TTG TGT TTC CTC SNN ATT ACT GGG TGT CGG SNN AGA SNN TGA SNN ACA GAG GGA CGT-3')(SEQ.ID NO.10)から構築した。元となるDNA(pH0709)を制限酵素AatIIとBstEIIを用いて切断し、大きい断片を精製しカセットにつないだ。ライゲーション生産物を、2の等量でファージミド調製物に対してXL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームし、1.6×10６と1.0×10６の独立なトランスフォーマントを生産した。
【０１４５】
(c) hGHファージミドライブラリープール由来の組み合わせhGHライブラリー
Helix-1とHelix-4bプール由来のDNA(0,2または4周から選択された;Lowman等,上記参照)を精製し、制限酵素AccIとBstXIを用いて切断した。それから各Helix-1プール(F10,M14,H18及びH21でランダムにミューテートされた)を精製し、3の組み合わせライブラリー707A(非選択Helix-1プールとHelix-4bプール)、707B(2度選択されたHelix-1プールと2度選択されたHelix4bプール)、707C(4度選択されたHelix-1プールと4度選択されたHelix4bプール)を生産するために、各Helix-4bプール(E174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175,I179でランダムにミューテートされた)由来の小さな断片とつないだ。二重のライゲーションもまた、ベクターDNAの10分の1から2分の1を用いて作製し、707D,707E及び707Fとしてデザインし、それらはそれぞれ0-,2-及び4-周のスタートライブラリーに相当した。これらの変異体プールはまた早期のhGH-ファージミド-結合選択で得られたE174S,F176Yミューテーションを含んだ。Lowman等,上記参照。ライゲーション産物pH0707A-Fをプロセッシングし、XL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームした。コロニー形成ユニット(CFU)に基づいて、各プールから得られた独立のトランスフォーマントの数は以下のようであった:pHO707Aからは2.4×10６、pHO707Bからは1.8×10６、pHO707Cからは1.6×10６、pHO707Dからは8×10５、pHO707Eからは3×10５、及びpHO707Fからは4×10５。hGH-ファージミド粒子を調製し、Lowman等,上記参照に記述されているように2から7サイクル以上のhGHbp結合に対して選択した。
【０１４６】
hGHのいくつかの変異体をHelix-1及びHelix-4bライブラリーから単離した変異体を組み合わせることによって構築した。元となる変異体は各ライブラリー由来の3の最も強い結合であった:A=H10,G14,N18,N21;B=A10,W14,D18,N21;C=F10,S14,F18,L21;D=N167,S171,S174,Y176,T179;E=E167,S171,S174,Y176,I179;F=N167,N171,S174,Y176,T179。hGH-ファージミドDNAを精製し、制限酵素EcoRIとBstXIで切断した。それから各Helix-4b変異体由来の大きい断片を精製し、Helix-1とHelix4bの両者でミューテーションを持つ組み合わせ変異体を生産するために、各Helix-1由来の小さい断片につないだ。これらの変異体を、Helix-1(A,BまたはC)及びHelix-4B(D,EまたはF)ミューテーションのそれぞれのペアの組み合わせを示す、AD,AE,AF,BD,BE,BF,CD,CE,CFとしてデザインした。
【０１４７】
一連の5のオリゴヌクレオチドを、変異体BDにおけるファージ由来ミューテーションのいくつかを相当する野生型残基に戻すために用いた:D18H,N21Hに対して＃797(5'-CTG CGT GCT CAC CGT CTT CAC CAG TTG GCC TTT G-3')(SEQ.ID NO.11);Y176Fに対して＃798(5'-GTC AGC ACA TTG CTG CGC ACC-3')(SEQ.ID NO.12);A10F,W14Mに対して＃799(5'-CTC TCG CGG CTC TTC GAC AAC GCG ATG CTG CGT GCT-3')(SEQ.ID NO.13);N167R,S171Dに対して＃800(5'-TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC AGC-3')(SEQ.ID NO.14);T179Iに対して＃801(5'-CTG CGC ATC GTG CAG TGC)(SEQ.ID NO.15);A10Fに対して＃875(5'-CTC TCG AGG CTC TTC GAC AAC GCG TGG-3')(SEQ.ID NO.16)。 
【０１４８】
hGH変異体852dをテンプレートとしてBD及び以下のオリゴヌクレオチドを用いて構築した:F54Pを付加することに対して＃843(5'-CAG ACC TCC CTC TGT CCC TCA GAG TCT ATT CCG-3')(SEQ.ID NO.17);R64Kに対して＃844(5'-ACA CCC TCC AAC AAG GAG GAA ACA CAA CAG-3')(SEQ.ID NO.18);K41I,Y42H,L45W,Q46Wに対して＃846(5'-CCA AAG GAA CAG ATT CAT TCA TTC TGG TGG AAC CCC CAG ACC TCC-3')(SEQ.ID NO.19)。変異体852bをテンプレートphGHam-g3で同じオリゴヌクレオチドを用いて構築した。
【０１４９】
(d) ラジオ免疫沈降アッセイ
hGHbpに対する平衡化結合アフィニティーを１２５IラベルhGH、ラベル変異体BDまたはラベル変異体852dとの競合により、結合バッファー:50mMTris,pH7.5、10mMMgCl２、0.1％ウシ血清アルブミン、0.02％アジ化ナトリウムにおいてhGH変異体をアッセイすることにより測定した。Lowman等,J.Biol.Chem.,266:10982-10988(1991)。hGH-hGHbp複合体の免疫沈降を、MAb5と示されるモノクローナル抗体を用いて実施した。Barnard等,Endocrinology,115:1805-1813(1984)。解離定数をスキャッチャード分析により得た。CunninghamとWells,1989,上記参照。変異体BDと852dは、もしヨウ素で処理されるとホルモン-受容体界面を乱し得るF176Yを含む。しかしながらヨウ素化BDは結合に対して１２５IラベルBDと競合する非ラベルBDから区別がつかなかった(つけられなかった)。
【０１５０】
(e) 速度論アッセイ
固定化されたhGHbpへのhGH変異体結合に対する会合及び解離レート定数を、Pharmacia BIAcoreＴＭバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)の測定により得た。このシステムでは、hGHbpをバイオセンサーチップに付着したデキストランマトリックスに共有結合で結合する。一定の流速でこの表面を通過する液相でホルモンを一定の濃度で維持する。この装置はバイオセンサー近傍の屈折指標の変化のためSPRシグナルの変化を感受することにより、リアルタイムでマトリックス上に結合したタンパク質の量を測定する。LofasとJohnsson,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,21:1526-1528(1990)。
hGHbp(S201C)の変異体をマトリックス上の第二の受容体をブロックするため固定化種として用いた(実施例I参照)。hGHbp(S201C)を減少し、10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)を用いて、デキストラン層のEDC/NHS活性化を経て、及び2-(2-ピリジニルジチオ)エタンアミン塩酸(PDEA)(活性化チオール)化学を経て、バイオセンサーチップに結合した。試薬と手順はPharmacia Biosensorから得た。結合と溶出工程を0.05％Tween-20を含むPBSバッファー(pH7.4)で3-20μL/分の流速で実施した。
【０１５１】
マトリックスに結合したhGHbpの密度は絶対的なKオン及びKオフには影響するが、野生型hGHに対して2倍までは相対的Kオン及びKオフには影響しない。それゆえ異なるバイオセンサーチップを用いた場合、野生型hGHに対する速度論パラメーターは、その速度論パラメーターが異なるバイオセンサーチップで測定され得る異なる変異体と比較することにより野生型hGHに対する速度論パラメーターが標準化されるために決定された。そのように得られた相対的速度論値は、異なるフロー細胞でも一致し、計算されたアフィニティー測定値はラジオ免疫沈降アッセイの結果とよく相関した。解離レート定数を時間に対するln(Rｏ/Rｔ)をプロットすることにより得た;会合レート定数をホルモン濃度に対する[R１に対する(dRｔ/dt)の傾斜]をプロットすることにより得(Karlsson等,上記参照)、またはBIAcoreＴＭバイオセンサー速度論評価ソフトウェアー(Pharmacia Biosensor)を用いてホルモン濃度に対するln(dRｔ/dt)を測定することにより得た。平衡化解離定数、Kｄ'sをKオフ/Kオンとして計算した。Kオンに対するδオンとKオフに対するδオフという標準偏差を、2以上の一連の2倍または3倍の希釈(Kオン)または2以上の濃縮(≧5μM)ホルモンサンプル(Kオフ)を用いて測定することから得た。計算されたKｄ'sにおける結果としての誤差(ε[K])を、K=f(Kオン,Kオフ)の全誘導体を用いて以下の公式にしたがって見積もった:(議論についてはBevington,上記参照を参照)
ε[K]=[(δK/δKオフ)２(d[Kオフ])２+(δK/δKオン)２(d[Kオン])２]１／２  (1)
ε[K]=[(Kオン)−２(δオフ)２+(Kオフ)２(Kオン)−４(δオン)２]１／２    (2)
【０１５２】
結果
(a) hGH-受容体結合機能的エピトープ内の残基
hGH(hGHbp)２複合体の構造的分析(de Vos等,上記参照)により、第一の受容体が結合する場合にある程度隠れている状態にあるhGHのサイト1における30以上の側鎖が同定された(図6B)。これらのほとんどは構造的解明の前にアラニンミュータントとして試験されたが(CunninghamとWells,1989,上記参照;1991,上記参照)、第一のミニヘリックス(Minihelix-1)における4残基(K41,Y42,L45及びQ46)は評価されていなかった。それゆえこれらの残基をアラニンに変換し、結合アフィニティーにおける効果を[１２５I]-hGHを用いた競合的置換及び免疫沈降(CunninghamとWells,1989,上記参照)によってまたはPharmaciaから得たBIAcoreＴＭバイオセンサーを用いてそれぞれで測定した。両方法とも実施例Iで示されているように比較可能なアフィニティー測定値を与えた。
【０１５３】
Y42とQ46の側鎖は受容体結合において高く隠れるようになったが、アラニン置換はアフィニティーにおいて2倍の減少より少ないものを引き起こした(表3)。Leu45はY42またはQ46より受容体に対して少ししか接触しないが、L45Aミュータントはアフィニティーにおいて10倍の減少を引き起こした。Lys41は受容体のGlu127と塩架橋を形成する。K41AミュータントをコードするDNAはアフィニティー測定のための物質を得るためにはあまり十分には発現しなかった;しかしながらより保存的な変異体、K41QをコードするDNAは十分によく発現した。この変異体は野生型hGHの2.6倍低いのアフィニティーを持った。それゆえMinihelix-1領域はhGHサイト1内の機能的エピトープの明確な一部である(図6A)。これらのデータと実施例Iより、第一の受容体がサイト1に結合した場合に側鎖が隠れるようになる残基での少なくとも一つの置換(大抵アラニン)に対して効果を測定していた。
【０１５４】
表3
BIAcoreＴＭ(+)またはRIA(マークなし)によって測定し、Cunningham等,1989,上記参照によって測定されたように野生型hGHに対するRIA値と相関して標準化した、野生型バックグランドでのhGHアラニンミュータントの受容体結合アフィニティー。アラニンまたはグルタミンミューテーションを野生型hGHのMinihelix領域内の側鎖の寄与を試験するために作製した。構造的エピトープと比較した、hGH(hGHbp)２複合体の結晶構造から由来する、受容体とのファンデルワールス接触の数もまた示されている。
【０１５５】
【表３】
0003693668.tif 000007
【０１５６】
(b) ランダムミュータントライブラリーのデザインと分析
構造的及び/または機能的サイト1エピトープ内の4残基を無作為化した5の別々のライブラリーを分類した(図7)。4のランダムコドンに各ライブラリーを制限することは、ライブラリーサイズ(平均約1×10７の独立のトランスフォーマント)内にほとんどの考え得る変異体(約1×10６DNA配列から生産される約2×10５タンパク質配列)のサンプリングを許容した。
以前に、K172,E174,F176及びR178残基が無作為化され一価ファージミド粒子にディスプレーされた一つのライブラリー(Helix-4aと呼ばれる)を生産した。Lowman等,Biochemistry,上記参照。結合選択の2サイクル後、最もタイトな結合ミュータント(E174S,F176Y)は、野生型hGHの約5倍高いアフィニティーを持った。これらの2のミュータントをE174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175及びI179がランダムにミューテートされた第二のライブラリー(Helix-4bと呼ばれる)内に固定した。選択の6周後、野生型hGHより約8倍タイトに結合する5のミュータントを単離した。別々のライブラリー(Helix-1と呼ばれる)において、F10,M14,H18及びH21残基をランダムにミューテートした。選択の4周後、野生型hGHより3倍タイトに結合する4のミュータント(F10A,M14W,H18D,H21N)を単離した。
【０１５７】
ここで、ファージ選択研究をループ結合ヘリックス1及び2に拡大した。Minihelix-1内の4の接触残基(K41,Y42,L45及びQ46)を無作為化し、結合選択の2から7周後代表的なクローンをシークエンスした(表4)。スタートのライブラリー内の残基の頻度から期待されるものと比較して、いくつかの残基は与えられた位置で高く過剰に代表された。例えばクローンの約35％がQ46Wミューテーションを含んだ。これはライブラリー内のTrpに対してランダムな機会の生ずるより大きい7.6標準偏差ユニットであった。これは期待されるコドンの偏りとサンプリング統計を説明するので、コンセンサス配列を確立するために選択物のプールを記録するよい方法である。この基準によって、K41Rに対して穏やかな好み、Y42RまたはY42Qに対してわずかな好み、L45WまたはL45に対して強い好み、Q46Wに対してより強い好みがあった。
【０１５８】
表4
hGH-ファージミドライブラリーの分類後に同定されたコンセンサス残基。結合選択の2から7周後の全てのシークエンスされたクローンの中で分画された代表物(Pｆ)に基づいた、ファージミドディスプレーライブラリー由来の最も頻繁に生じている残基が示されている。予想頻度(Pｅ)は出発ライブラリーでの理論的に各アミノ酸に対するNNSコドンの数から計算された。標準偏差(σｎ)はσｎ=[Pｅ(1-Pｅ)/n]１／２として計算された。少なくとも2σｎによって期待される画分を上回ると見出された残基のみが、(すなわち[(Pｆ-Pｅ)/σｎ]≧2)示されている。Miniherix-1ライブラリーに対しては、n=17配列;Loop-Aライブラリー,n=26;Combinatorialライブラリー(Herix-1),n=68;Combinatorialライブラリー(Herix-4b),n=56。
【０１５９】
【表４ａ】
0003693668.tif 000008
【表４ｂ】
0003693668.tif 000009
【０１６０】
第二のライブラリー(Loop-Aと呼ばれる)をF54,E56,I58及びR64をランダムにミューテートして構築した。アラニン置換は、側鎖に依存するアフィニティーにおける4から20倍の減少を引き起こした(図6A)。R64は受容体と直接的に接触するたった一つの残基であるという事実にも関わらず(図6B)、全ての位置が通常野生型由来の異なるものである特定の残基に対する強い指向性を変化する温和性を示した。R64Kが最も好ましかった(クローンの81%で見出される);R64K単独では結合アフィニティーにおいて3倍の改良を引き起こす。Cunningham等,Science,247:1461-1465(1990)。今後好ましさの順番はF54P>I58T>E56DまたはE56Wとなった。
【０１６１】
これらのミュータントに対する結合アフィニティーを、hGHの最後と遺伝子IIIドメインの最初でアンバーコドンで翻訳を終結する非サプレッサーホストにおいて遊離ホルモンを発現することによって分析した。Lowman等,Biochemistry,上記参照。Minihelix-1ライブラリー由来の結合選択の3から7周の間でテストされた事実上全てのクローンが、野生型hGHより強いアフィニティーを持った(表5)。最高のものはK41I,Y42H,L45W,Q46Wであり、それは野生型hGHのアフィニティーの4.5倍の改良となった。このDNA配列は、百万のクローンにおいて一つの頻度でランダムに生じることが期待され、それはアフィニティー選択の能力を示す。同様の結果は、最高の単離物がF54P,R64K及びF54P,E56D,I58T,R64KであるLoop-Aライブラリーからも得られ、それらは野生型hGHを約5倍改良した。
【０１６２】
表5
(A)Minihelix-1または(B)Loop-Aでのミューテートされた個々のhGHクローンに対する結合データ。アフィニティー定数を１２５IラベルhGHに対するhGHbpの競合的結合によって測定した。野生型hGHアフィニティーについてはCunninghamとWells,1989,上記参照から得ている。hGHbpを結合するためのhGHのアフィニティーの倍の増大が、Kｄ(hGH)/Kｄ(ミュータント)の割合で示されている。いくつかのクローンは検出されなかった(ND)。同一のアフィニティーを等量の変異体(＋)に対して仮定した。偽のミューテーションを持つクローン(E65V‡;S57Y§;N47Y¶;P48S＠)が示されている。
【０１６３】
【表５ａ】
0003693668.tif 000010
【表５ｂ】
0003693668.tif 000011
【０１６４】
(c) 付加的要素を用いたアフィニティーの改善
付加的要素にしたがって、タンパク質の非相互作用部分でのミューテーションが、結合の自由エネルギーの単純な付加的変化を生み出すために組み合わされるべきである(Wells,1990,上記参照)。それゆえファージディスプレーライブラリーから単離された置換と組み合わせることによってサイト-1を通じたhGH結合を改良するため調査された(図7)。Helix-1ライブラリー由来のhGHの3の最もタイトな結合変異体(A=F10H,M14G,H18N,H21N,B=F10A,M14W,H18D,H21N,C=M14S,H18F,H21L)をHelix-4bライブラリーで見出された3の最もタイトな結合変異体(D=R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T,E=R167E,D171S,E174S,F176Y,F=R167N,D171N,E174S,F176Y,I179T)のそれぞれに接合した。全ての構築物を変異体Aを含むものを除いて野生型hGHの産出量に近づけた産出量で得た。変異体A及び組換え体AD,AE,AFは、非還元SDS-PAGEではダイマー(約44kDaのMW)、還元の場合にはモノマー(約22kDaのMW)で移動した。これらのタンパク質は付加的なCys残基を含んでいないが、それらが最初に非共有結合ダイマーを形成するのであれば、ジスルフィド交換が生じ得た。実際hGHはヘリックス1及び4での残基に関与する弱いダイマー複合体を形成することが知られている。Cunningham等,Science,253,1991上記参照。それにもかかわらず、これらのタンパク質はジスルフィドダイマーを形成したので、それらをさらに追求しなかった。変異体Cもまたジスルフィドダイマー形態で優勢に生産される;しかしながらCD,CE,CF組換え体は有意な量のダイマーを形成しなかった。
分析された全ての組換え体が元となる構成要素以上のアフィニティーにおける累積的な増大を示した(表6)。BD変異体は最も強いアフィニティーを持ち、それは野生型hGHの30倍タイトであった。Minihelix-1ライブラリー由来の最もタイトな結合変異体(K41I,Y42H,L45W,Q46W)と、Loop-Aライブラリー由来の最もタイトな形態の一つ(F54P,R64K)をヘキサミュータントhGH852bを生産するために組み合わせ、hGH852bのアフィニティーは野生型hGHの約40倍であった。これをhGH変異体852dを生産するためにBD組換え体に入れ込み、852dは野生型hGHより約400倍タイトに結合した。単純な加法を仮定すると、この変異体は個々の構成要素によるアフィニティーの改良の産物から由来して、hGHより約600倍タイトに結合するであろう;この計算値は本結果に合理的に近い。852d変異体は無作為化された20残基の5だけが野生型として維持されている(E56,I58,K172,T175,R178)。
【０１６５】
表6
組換えhGH変異体の平衡結合定数。結合定数をhGHbpとMab5を用いて１２５Iラベル野生型hGH、BDまたは852dのそれぞれの競合的置換によって測定した(CunninghamとWells,1989,上記参照)。結合アフィニティーにおける倍の改良はKｄ(hGH)/Kｄ(変異体)として表される。いくつかのアフィニティー(+)はLowman等,Biochemistry,上記参照から得られている。Helix-1変異体はB=(F10A,M14W,H18D,H21N)及びC=(M14S,H18F,H21L)である。Helix-4変異体はD=(R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T)、E=(R167E,D171S,E174S,F176Y)及びF=(R167N,D171N,E174S,F176Y,I179T)である。BD,BF,CD,CE,CFはこれらのミューテーションの組み合わせを表す。852b=(K41I,Y42H,L45W,Q46W,F54P,R64K)及び852d=BD+852b。
【０１６６】
【表６】
0003693668.tif 000012
【０１６７】
(d) hGHの組み合わせライブラリー
独立に分類されたライブラリー由来の組み合わせミュータントで見出された単純な付加にもかかわらず、複雑な付加がある近傍の置換に対して観察されている(例えばF176YはE174Sと相互作用する)。Lowman等,Biochemistry,上記参照。ヘリックス1からミューテートされたいくつかの側鎖は(F10,M14,H18,H21)、ヘリックス4でミューテートされたもの(R167,D171,T175及びI179)と潜在的に接触し得る。それゆえHelix1とHelix4bライブラリー(Huse等,Science,246:1275-1281[1989];Clackson等,Nature,352:624-628[1991])から由来する分類ミュータントに対する組み合わせアプローチを調査した。独立の結合選択を0,2または4サイクルでHelix-1とHelix-4bで実施した。Helix-1プール由来のDNAを同じ周数に対するhGHbpへの結合によって分類されたHelix-4b由来のDNAと共につないだ。それから3の組み合わせライブラリーを付加的な2から7サイクルに分類し、68の代表的なクローンをシークエンスした(表7)。
【０１６８】
表7
組み合わせライブラリーのホルモン-ファージミド結合選択由来のhGH変異体。非組換え体である野生型Helix4配列(-)をもつものを除いて全ての変異体が(E174S,F176Y)を含む。ライブラリー707A,707B及び707Eまたは707CをhGHbpに対する結合によって2から7サイクルに分類した(テキスト参照)。Pの下に掲げられている数は、シークエンスされたクローンの間でのわずかな発生を示す。#の下に掲げられている数は各独立の単離物を表す(例えばpHO714A.1が第一の配列である)。いくつかのアフィニティーはLowman等,Biochemistry,上記参照から得ている;等しい値は同一の値を持つものと仮定している(＋)。いくつかの変異体は>10%のジスルフィドダイマーとして表した(‡)。あるクローンはアンバー(SupE株においてTAG=Gln)コドンを含み(§)、あるものは偽のミューテーション、E174Nを含み(¶)、またあるもの(＠)は二つの偽のミューテーション(L15R,K168R)を含む。いくつかの変異体は発現されず(NE)または分析されなかった(ND)。
【０１６９】
【表７ａ】
0003693668.tif 000013
【表７ｂ】
0003693668.tif 000014
【０１７０】
全般的に、これら3の組み合わせ分類のいずれかから単離された最高アフィニティー変異体は、Helix-1とHelix-4bライブラリーの独立の分類によって以前に単離されたものと似ていた。Lowman等,Biochemistry,上記参照。例えばHelix-1ライブラリーから以前に単離された最高アフィニティーミュータントはF10A,M14W,H18D,H21N(Helix-1.B)及びF10H,M14G,H18N,H21N(Helix-1.A)であった;これらは野生型hGHよりそれぞれ約3.3倍及び2.4倍タイトに結合した。Helix1.A配列を組み合わせライブラリーA由来のクローンの60%で回収し、組み合わせライブラリーBを分類した早期の周で単離されたクローンの13%で回収した。Helix-1.B配列は組み合わせライブラリーBを分類した後期の周で支配的であった。これらのほとんどは異なるDNA配列を持ち、通常ヘリックス4で選択されたミュータントと異なるので、独立のクローンである。
【０１７１】
同様の結果はヘリックス4での選択物でも得られた。Helix-4bライブラリーを独立に分類すると、R167N,D171SまたはN,T175(保存的)及びI179Tを含む配列数が得られた。Lowman等,上記参照。これらは組み合わせライブラリーA,B及びCで選択される傾向にあるものと同じ残基であった。実際以前に単離された最高のミュータントの一つ(R167N,D171S,T175,I179T)は、組み合わせ分類で共通に単離され、特に後期の周で支配的であった。
組み合わせ手段によって分類されたいくつかの配列は、2の独立のライブラリーから選択されたものと全く異なった;しかしこれは統計学的な理由が生じ得る。例えばHelix-1及びHelix-4bライブラリーは約10６の異なるDNA配列を含み、もし(前選択なく)組み合わせられると、10１２のあり得る組み合わせを含み得る。トランスフォーミング効率は-10７の独立のクローン以下のサンプリングサイズが限界である。それゆえ同じ配列の選択はこれらのライブラリーで生じ得る配列の高多様性に顕著に与えられ、選択されたアフィニティーに穏やかな改良を与えられる。
【０１７２】
これらの単離物の数に対するアフィニティーを測定した(表7)。全てが野生型hGHと比較すると結合アフィニティー(2から29倍)を改良した。ほとんどがE174S,F176Yに改良され、スタートクローンの全てにおいてそれらは存在し、野生型hGHのアフィニティーに対して5.6倍の増大を引き起こした。Lowman等,Biochemistry,上記参照。最高アフィニティー変異体は分類の後期の周から一般的に単離され、そのプールにおいて高く豊富である。例えば試験された最高アフィニティーミュータントはクローン717B.1であり、それは組み合わせライブラリーBの分類の7周後に単離された。この単離物はそのプールで第3に代表的なクローンであった。特筆すべきは、D171Sの代わりにそれは保存的置換、D171Aを含むことを除いて、このクローンはBD変異体と同一である(表6)。驚くべきではないが、717B.1とBD変異体は匹敵するアフィニティーで結合する(それぞれ12pM及び10pM)。これらのデータは組み合わせストラテジー及び付加的ストラテジーは、アフィニティーの成功した最適化のための匹敵する溶液を産することを示す。
【０１７３】
(e) アフィニティー成熟における個々の側鎖の改良の試験
結合アフィニティーに対するファージ改良残基のいくつかの寄与を野生型hGHにそれらを導入することによって、またはアフィニティー成熟BD変異体における野生型残基にそれらを戻すことによって評価した(表8)。K41I,Y42H,L45W,Q46W変異体は、野生型hGHの4.5倍タイトに結合した。hGHにおける単一のミュータントのそれぞれはアフィニティーにおいて1.7から2.5倍の減少を引き起こした。これらはこの部位でのミューテーションの組み合わせがアフィニティー改良に対して重大であることを示す。これらの残基はミニヘリックス-1の一表面で近接した位置で存在する。
【０１７４】
表8
ファージディスプレーによって同定された個々の側鎖の寄与の試験。変異体の受容体結合アフィニティーをBIAcoreＴＭ(＋)またはRIA(印なし)によって測定し、CunninghamとWells,1989,上記参照によって測定されたようにhGHに対するRIA値に標準化した。ファージ分類後に見出された個々の側鎖の寄与を試験するためにポイントミューテーションを為した。アフィニティーにおける倍の減少をKｄ(リバータント)/Kｄ(元のもの)として表し、そこでは元のものがミュータジェネシスのために用いられるバックグランドである。
【表８】
0003693668.tif 000015
【０１７５】
BD変異体での置換によって引き起こされるアフィニティー改良を、個々的なまたはペア(残基が近接している場合には)のそれぞれで置換を野生型に戻すようミューテートすることによって試験した(表8)。これにより、9の置換のうち7が結合における大変わずかな改良のみに寄与していることが示された(1.1から1.7倍)。最も支配的な効果であるF176Yでさえ、結合における4.6倍の改良を与えるのみである。それにもかかわらず、F10A,M14W,H18D,H21N,R167N,D171S,F176Y,I179Tというオクタミュータントでのこれらの効果の産物は、野生型hGHに対してアフィニティーにおいて16倍の改良を予想する。これは付加的なE174Sを含むBD変異体に対して測定された34倍の増大に比較される。
【０１７６】
(f) 結合の速度論に対するアフィニティー成熟の効果
実施例Iでは、受容体結合に際してサイト1で隠れるようになるhGH内の残基で生産されるアラニンミュータントに対する結合の速度論を測定するために、BIAcoreＴＭバイオセンサー装置を用いた。ここで選択されるアフィニティー改良に対する分子ベースのよりよい理解のため、hGHbpに対する結合の速度論を測定するためにBIAcoreＴＭバイオセンサーを用いた(表9)。一般的に野生型hGH由来のアフィニティーが増大するにつれて、オフ-レートはオン-レートのわずかな変化と共に減少した。実際最高アフィニティーミュータント、852dに対する野生型由来の作用では、オフ-レートにおいて>60倍の減少があるが、オン-レートでは4倍の増加があるに過ぎなかった。(オフ-レートはあまりに遅くて正確には測定できなかったが、もしRIAとオン-レートによって測定されたKｄから計算すると、オフ-レートは野生型hGHより100倍遅いであろう。) hGH結合部位はhGHのホモローグ、ヒト胎盤ラクトゲン(hPL)内に以前に挿入された。これはhGHとは15%だけ配列において差異があり、〜2000倍弱く結合する。Lowman等,J.Biol.Chem.,上記参照。挿入されたhPL変異体は、hGHと同様の結合に対する速度論的パラメーターをもつ(表9)。アフィニティー成熟hGH変異体と同様に、この変異体は野生型hPLと相対的にオン-レート(約10倍)と比較してオフ-レート(〜100倍)でより大きい改良を示す。オフ-レートがファージ選択物の間で最も影響されるという事実は、分類が平衡に近づけるコンディションの元で実施されたことを示す。
【０１７７】
表9
hGH変異体の結合速度論。BIAcoreＴＭバイオセンサー測定を、PBSバッファー+0.05%Tween-20内の固定化hGHbp(S201C)を用いて実施した。BIAcoreＴＭバイオセンサーKｄを、hPLを除いてKオフ/Kオンから計算し、hPLに対してはKオンとKオフを測定しKオフを計算した(＋)。Kｄの割合はBIAcoreＴＭバイオセンサーデータにしたがったwt-hGHに対する結合アフィニティーの倍の増大を示す。hGHにおけるミュータントの組み合わせをローマ数字で表す。hPL(0274)はV4I,D56E,M64R,E174A,M179Iを含む。
【０１７８】
【表９】
0003693668.tif 000016
【０１７９】
結論
受容体と接触する位置にあるため、またはアラニンに変換された場合結合アフィニティーに影響するため、重要であると考えられるhGHの領域をランダムにミューテートした。それゆえ、これらのライブラリー由来の平均的なランダムなミュータントは野生型hGH由来の結合アフィニティーを劇的に減少すべきである。しかし選択の2,3の周のみの後では、単離物は野生型と同等及びしばしばより高いアフィニティーで結合した。単離されたクローンは通常野生型とは異なるコンセンサス配列を示した(表4)。
【０１８０】
アフィニティーにおける大変小さな改良なら、これらのライブラリーにおいて急速におよびほとんど限定的に集中して導かれた。例えばR64Kミュータントは単独で野生型hGHの約3倍タイトにのみ結合する(Cunningham等,1990,上記参照)。しかし結合選択のちょうど3周後、R64Kはライブラリーで支配的となった(表5)。同様にI179Tはアフィニティーにおいて1.7倍の改良のみに寄与した(表8)。しかしながらLowmanとWells,上記参照のHelix-4bライブラリーにおいて別々に分類され、またはHelix1においてミュータントと共に組み合わされて分類されると(表4と7)、I179Tはほとんど限定的に選択されることが見出された。アフィニティーにおけるこれらの些細な改良に対する強い選択は、プールにおける最高のアフィニティー変異体を回収するための本方法の能力を強調する。
【０１８１】
全ての変異体がファージにディスプレーされるわけではない(WellsとLowman,Current Opinion in Struct.Biol.,2:597-604[1992])。これは、誤ってホールディングされ、不安定なミュータントがプロテアーゼにより切断され、凝集し、または分泌あるいはファージ上での集合をブロックされるかのいずれかのためである。特定のDNAに対する強い偏向があるようには思われないが、hGHミュータントに対する選択が以前に注目されていたCys-含有ミュータントに対する明確な選択がある(LowmanとWells,上記参照)。同時にミューテートされるコドンの数は故意に4に限定したが(約10６DNA配列)、これはファージミドのスタートプール(約10７の独立のトランスフォーマント)においてそれぞれを代表させるよい機会であろうためである。
【０１８２】
第一の受容体によってサイト1で隠れるようになる側鎖の半分より少ないものが、アラニンに変換されると結合アフィニティーに有意に影響する[実施例1、図1A]。ミニヘリックス-1接触残基はこの良い例を提供する(表3)。Y42とQ46側鎖はより大きいファンデルワールス接触をなし、K41とL45の組み合わせより単独でより隠れるようになる。しかしY42AとQ46AはK41とL45でのミューテーションと比較して結合に対してほとんど影響をもたない。
これらの研究は、側鎖が受容体と接触する範囲によっては相関関係は容易には評価されないことを示す。これを評価するもう一つの方法は、野生型残基が受容体によって隠されている範囲と、結合選択の後野生型残基の保存性を相関することである。図8Aに示されているように、全般的にファージミドライブラリー由来の野生型残基の保存性と本質的に相関関係はない(R２=0.022)。これはまた図6Bと図6Cを比較することによっても明らかである。しかしながら3の最も保存的な側鎖(T175,R178,L45)は全て受容体との実質的な接触をなす。
【０１８３】
アラニンスキャニングミュータジェネシスによって評価されたようなアフィニティーにおける減少と、ファージ分類に引き続く側鎖の保存性との間に穏当な相関関係(R２=0.71)がある(図8B;図6Bと図6Cを比較)。おおよその直線一致性は(y=3.9+1.0x)にみられる。もし組み合わせライブラリー由来のデータを含めば、R167が加えられ、相関関係は0.65に下降する。保存性に対する機能的な重要性についての傾向は、構造を考慮に入れる以上に無作為化される選択される残基に対する構造的情報を考慮することを主張する。
これらのデータは、アラニンスキャニングミュータジェネシスによって決定された機能性が結合選択の後配列保存性によって決定されたものと同様であることを示す。しかしながら天然の変異体成長ホルモンの間の与えられた残基の保存性の頻度と、ファージ-ディスプレーライブラリー由来の結合選択に引き続く保存性の間に何の相関関係もない(R２=0.005)(図8C)。天然では、成長ホルモンに対する機能的な選択圧がin vitro結合選択によるものと一致していない。
【０１８４】
界面であれホルモン自体であれ、機能的に重要で高く隠された部位で選択された残基の多くが野生型残基または近いホモローグで維持されている傾向にある。例えば過度のファージ分類の後で野生型のように最も保存されている5の残基の全て(E56,I58,K172,T175及びR178)が、複合体において完全に隠されている;それらのアラニンへの置換はアフィニティーにおいて4から60倍の減少を引き起こした(CunninghamとWells,1989,上記参照)。これらの部位での置換が許容されると、それらは典型的には野生型残基と同等であった。例えば最高アフィニティー選択物は56位でAspまたはGluを、58位でベータ-分枝状残基を、172位でLysまたはArgを、175位でThrまたはSerを、178位でLysまたはArgを含んだ(表5;Lowman等,Biochemistry,上記参照)。
【０１８５】
受容体結合において高く隠されるようになる機能的に重要な残基のもう一つのグループがある(K41,L45,R64,D171及びI179)。これらを無作為化した場合、野生型残基と性質において同等な傾向にある改良された置換が見出される。例えばK41はしばしばArgに置換される;L45はおおきな疎水性側鎖をもつものに置換される;R64はLysに最も頻繁に置換される;D171は場合によりAsnに、時々Serに置換される;I179は通常β-分枝状残基に置換される(表4,5及び7;Lowman等,Biochemistry,上記参照)。それゆえ改良は界面で隠された機能的に重要な残基でなされ得る--それらは等配電子側鎖に向けられてまたは同等な化学的性質の一つである傾向にある。
【０１８６】
無作為化された残基の2は(H18及びE174)、アラニンに変換された場合結合アフィニティーを促進し、複合体の中に完全に隠れた。これらはほとんどいつも野生型残基よりも小さいものに分類された。例えばH18に対する好ましい置換はAspまたはAsnであり、E174に対してはAla,SerまたはThrであった。Lowman等,Biochemistry,上記参照。障害決定基と呼ばれるこれらの位置でのパッキングはエネルギー的に好ましくない。
もう一つのクラスの残基(H21,Y42,Q46及びR167)は界面で高く隠れているが、アラニンに置換した場合結合アフィニティーにほとんど、または全く影響を持たない。これらの残基はまれに野生型残基に戻って分類される。例えばH21はAsnに分類される傾向があった;Y42はしばしばArgまたはGlnとして戻った;Q46はTrpを好み、R167はしばしばAsnに分類された(表4,5及び7;Lowman等,Biochemistry,上記参照)。これらの隠れた残基で見出されるコンセンサスにもかかわらず、それらからなされるアフィニティーの増大は大変小さかった(表8)。それゆえ機能的に不活性な接触残基からアフィニティーにおける改良を得るのはより困難と思われた。
【０１８７】
残基のおおきなグループ(F10,M14及びF54)はホールディングされたホルモンの中で現実に隠れており、アラニンに置換された場合おそらく間接的な構造的影響によって、2から4倍まで結合アフィニティーに影響する。驚くべきことに、コンセンサス分類に示される根本的な置換はここで許容された(表4,5及び7;Lowman等、Biochemistry,上記参照)。例えばF54PはLoop-Aライブラリーにおけるほとんど唯一の溶液であった。Phe54はホルモンにおいて84％隠れており、受容体との接触をなすものから10Å離れている。ダブルミュータント(F54P,R64K)が4.8倍まで結合を改良し(表5)、R64Kミュータント単独では〜3の因子まで結合を増大する(Cunningham等,1991,上記参照)という事実にもとづいて、F54Pミュータントは約1.6倍の因子によってアフィニティーを増大すると見積もられる。残基10及び14は共に変化する傾向があり、それはヘリックス1でのそれらの近接した位置を仮定すれば驚くべきことではない。一般的に選択物におけるこれら2の側鎖の容量の合計は、F10プラスM14以下になる傾向があった。これはそれらのタイトにパックされた配列に一致する。
【０１８８】
機能的及び構造的なデータを組み合わせることによってこれらのミュータントの一般的な性質を合理化することは可能であるが、分類を通じて混入する異常なミュータントがいつも存在する。例えばI179はβ-分枝状側鎖(特にIleまたはThr)によってほとんどいつも保存的に置換されるが、I179Sもまた出現した(表7)。同様にL45は大きな側鎖(LeuまたはTrp)によってほとんどいつも置換されるがL45Aもまた見出された(表5)。もしそれらが倍にすることが可能であるとすれば、該変異体は結合アフィニティーを改良できないまたは弱めさえし得るのだが、バックグランドのレベルまで選択の多くの周を通じて許容されると期待できよう。
【０１８９】
これらの研究は一価ファージディスプレーを用いた結合界面のアフィニティー成熟に対するガイドラインを示す。アフィニティーの効率的な最適化に対する出発点は、関連した界面の完全なアラニンスキャンである。誰もが5または6のコドン以上を徹底的に探求することは容易にはできない(LowmanとWells,上記参照);それゆえライブラリーはアフィニティーを改良することを望み得る残基に焦点を絞る必要がある。コドン選択を限定することもまた可能である(例えばArkinとYouvan,Bio/Technology,10:297-300[1992]参照)が、これは有用な置換であり得るかどうかについての仮定をなす。もし仮定的に構造的界面の詳細な知識を持つならば、なすことに更に理由がある。
【０１９０】
アフィニティーにおける最も明確な改良が生じる残基は、最も結合に影響するアラニンスキャニングミュータジェネシスによって示されるものであった。例えば、アフィニティーにおける最大の改良はR64K,E174S及びF176Yから由来した。E174Aはアフィニティーを増大することがわかったが、R64A及びF176Aはアフィニティーにおける大きな減少を引き起こした。それゆえファージ分類において最も高く保存された残基はアラニンスキャニングミュータジェネシスによって最も重要であるものであるにもかかわらず、見出された変異体を未だ改良した。
機能的データは構造的データより最適化のための目標となる残基についてさらに重要となり得る。例えば受容体と接触しない(F10,M14及びF54)が、アラニンに置換されると結合に影響するいくつかの残基は、ランダムにミューテートされるとアフィニティーの増大を生み出した。さらに受容体と接触するが、アラニンスキャニングミュータジェネシスによってほとんど機能的な有意性を持たないいくつかの残基(Y42,Q46)は、ファージミューテーションがポイントミューテーションとして調べられた場合、アフィニティーを改良しない(表8)。
【０１９１】
理想的には、共なる変化を許容するために、同じミュータジェネシス工程で互いに接触し得る残基を無作為化するべきである。残基が接触部分に十分近い場合、共なる変化はHelix-1,Minihelix-1及びHelix4aライブラリーで見られた。組み合わせ手段によるライブラリーの分類は、ミューテーションが複合体に付加的影響を導き得る状況では特に有用である。例えばもし側鎖置換が大きな構造的変化を引き起こしたなら、それらは抗体における順応性のあるループであり得るので、組み合わせ分類はミュータントH鎖およびL鎖の最高の組み合わせに対してランダムに探求することによって改良を許容しうるであろう。Huse等,上記参照;Clackson等,上記参照;Collet等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10026-10030(1992)。
【０１９２】
それにもかかわらず、hGHにおける改良はライブラリー間及びライブラリー内の両者の単純な付加的影響によって生ずる傾向があり、側鎖が接触し得る場合でさえそうである。実際にこれは高アフィニティー変異体を得るために多くの残基を独立に無作為化し得、それらを末端に組み合わせ得ることを意味する。基本的にはそれは、側鎖間の相互作用は、結合受容体の自由エネルギーに対して、近傍のものであれしばしばほとんど影響を持たず、または有意な影響なく埋め合わせ得ることを示す。LowmanとWells,J.Mol.Biol.,234:564-578(1993)もまた参照し、それは全体として参考としてここに取り込まれる。
【０１９３】
実施例III
B2036変異体
さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定することによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化する」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大したアフィニティーを保護することであった。
それゆえ「スーパーミュータント」852dの生産のために上述したデータを用いて、さらなる変異体B2036を上述した方法を用いて構築した。852dは以下の置換を持つ:F10A,M14W,H18D,H21N,K41I,Y42H,L45W,Q46W,F54P,R64K,R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T。
対照的にここで構築された変異体(B2036)は以下の置換をもつ:H18D,H21N,G120K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。
【０１９４】
120位での他の置換も許容されるが、G120K置換をよりよい拮抗剤候補を生産するために加えた。拮抗剤を生産するためにいかなるアミノ酸もG120で置換し得る;より好ましくは置換はリシン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンまたはグルタミン酸である。R64K置換はペグ化からサイト1結合残基を保護するために省略した。同様にK168A及びK128R置換をホルモン-受容体サイト1結合界面でペグ化に有用な部位の数を減少するためにB2036に加えた。対照的に、G120K置換はペグ化のために付加的なリシンを入手し、一方で効果的なサイト2ブロックを生じる。
【０１９５】
852dにおける残りの置換はヒトにおける変異体の潜在的な抗原性を減少するために、B2036の構築から省略した。アフィニティーにおけるある減少は852dとの比較で予想されるが、受容体に対するB2036の予想されるアフィニティーは野生型より未だ実質的に大きく、拮抗剤としての使用に望ましい。
B2036は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによって852dと比較してヒトにおける抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する候補を生産することが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「スーパーミュータント」と比較して減少しているので、該候補はより最適にペグ化し得るであろう。
【０１９６】
実施例IV
B2024変異体
さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定することによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化する」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大したアフィニティーを保護することであった。
それゆえ、野生型成長ホルモンより成長ホルモン受容体からの遅い「オフ-レート」を持つ成長ホルモン受容体を生産するために、アラニンミューテーションを部位特異的ミュータジェネシスと組み合わせた。変異体B2024はそれゆえ以下の配列を持つ:H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120K。
【０１９７】
120位での他の置換も許容されるが、G120K置換をよりよい拮抗剤候補を生産するために加えた。拮抗剤を生産するためにいかなるアミノ酸もG120で置換し得る;より好ましくは置換はリシン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンまたはグルタミン酸である。
B2024は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによってヒトにおける抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する候補を生産することが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「スーパーミュータント」と比較して減少しているので、該候補は852dと比較してより最適にペグ化し得るであろう。
【０１９８】
実施例V
B2036変異体の生産
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。
方法
(a) 発現ベクターとホスト細胞
大腸菌においてB2036変異体の発現のため用いられるベクターはpMY233であった(図10)。プラスミドpMY223はよく特性指摘されたプラスミドpBR322が元になっており、hGH生産プラスミドpHGH4RとB2036コード配列がhGHコード配列に置き変わっていることを除いて同様である(Chang等,Gene,55:189-196[1987])。pMY223はテトラサイクリン系抗生物質耐性をコードするが、pBR322とは異なりβ-ラクタム系抗生物質(ペニシリン、アンピシリン等)に感受性である。
pMY223によってコードされるB2036変異体と野生型ヒト成長ホルモン配列の間のアミノ酸差異は、これらの部位でのコドンに沿って表10に示されている。
【０１９９】
表10
pMY223によってコードされるB2036変異体と野生型hGHの間の配列差異
【０２００】
【表１０】
0003693668.tif 000017
【０２０１】
B2036変異体をPstI-EcoRI制限部位内にクローン化された1106-bp発現カセットから発現する。発現カセットは23残基の熱安定性エンテロトキシン(STII)シグナルペプチドにフレーム内で融合したB2036変異体コード配列の単一コピーを含む(Picken等,Infection and Immunity,42:269-275[1986])。B2036変異体の転写は大腸菌phoAプロモーターによって向けられている(Chang等,Gene,44:121-125[1986])。翻訳開始部位はSTIIシャイン-ダルガルノ配列によって提供される。翻訳はSTIIシグナルペプチドで始まり、それは細胞膜を通過してペリプラズム空間へのB2036のトランスロケーションに向けられる。それからSTIIシグナルペプチドを大腸菌リーダーペプチダーゼによって除去する。成熟タンパク質はペリプラズムで正しい構造にホールディングし、両ジスルフィド結合が形成される。
【０２０２】
プラスミドpMY223はプラスミドpB2036とpHGH4R由来の断片の三方向ライゲーションによって構築された。より特異的には、B2036変異体コード配列を含むpB2036の565ベースペア(bp)NsiI-PvuII断片が、NsiI-BamHIバックボーンとpHGH4Rの405bpPvuII-BamHI断片にライゲートされた。
プラスミドpB2036はphGHam-g3(その構築はLowman等,Biochemistry,30:10832-10838[1991]に記述されている)としても知られているプラスミドpSO643から由来し、それは実施例IIに記述されているファージディスプレー研究で用いられるスタートプラスミドであった。pB2036はB2036コード配列がhGHコード配列と置き換わっている点でpSO643とは異なる。
【０２０３】
B2036変異体の発現のためのホスト細胞は、大腸菌33B6であり、それは大腸菌W3110の誘導体である(Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology,2:1190-1219[Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987]参照)。33B6の完全な遺伝子型は、ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC2 degP41(ΔPstI-Kan') IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(ValＲ)である。33B6の誘導体は以下に記述する。
スタート株、大腸菌W3110はF−とラムダ-耐性である大腸菌K-12の誘導体である。rrnDとrrnEの間の染色体の逆位を帯びることが示されている。
fhuA遺伝子(以前にtonAと示されていた)を、fhuA遺伝子内へのTn10の挿入に引き続き、Tn10の不正確な摘出によってW3110から欠失した。結果として得た株1A2はバクテリオファージT1,T5及びΦ80に耐性である。
【０２０４】
2の欠失ミュータントphoAΔE15とΔ(argF-lac)169を、proC遺伝子内にリンクしたTn5挿入物と共にP1コトランスダクションによって1A2内に同時に導入した。トランスポゾンの正確な摘出はproC遺伝子を復帰した。phoAΔE15ミューテーションはアルカリホスファターゼ発現を除去し、Δ(argF-lac)169ミューテーションはこの株、7C1のLac-表現型を与える。
deoC2ミュータントはデオキシリボースリン酸アルドラーゼを除去したものだが、それをP1コトランスダクションによって導入した。deoCローカスは一般的にスレオニン生合成ローカスにリンクしている。スレオニン栄養要求体をTn10挿入と不正確な摘出によって作った。それからスレオニン栄養要求体をdeoC2ミュータントで成育したP1ファージを用いてスレオニンプロトトロフィーに変換した。deoC2ミュータントの存在は結果として生じた株、16C9が炭素源として0.2％チミジン上では成育できないことによって確認した。
【０２０５】
ペリプラズムのプロテアーゼに対する遺伝子にミューテーションをもつdegP41(ΔPstI-Kan')をトランスダクションによって導入した。このミュータントはdegP遺伝子の一部分をカナマイシン耐性遺伝子で置換することによってin vitroで構築された。これはトランスポゾンではないが、カナマイシン耐性を用いて欠失株の選択が可能である。結果として生じた株が23E3である。
ilvG2096(Val')ミューテーションをホモゲノタイゼーション(homogenotization)によって導入した。このミューテーションは野生型K-12にバリンに対する感受性を引き起こすフレームシフトを繰り返す。23E3株をilvG2096(Val')マーカーとアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いてトランスフォームした。同時にプラスミドを失いilvG2096(Val')ローカスを得た33B6株をバリン耐性からアンピシリン感受性クローンをスクリーニングすることによって同定した。最終株、33B6のの重要な性質は、l1ファージに耐性であり、リン酸が枯渇した場合(それは産物合成を誘導するために用いられるコンディションである)、アルカリホスファターゼを過剰生産せず、プロテアーゼを欠きそしてバリン毒性に感受性でないというものである。
【０２０６】
(b) 発酵
B2036変異体の発現のためのpMY223ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pMY223細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。
1000-L発酵に必要とされるアミノ酸を以下の構成成分を無菌的に混ぜることによって調製した:
3.2kg 酵母抽出物;
24kg HY-CASE AMINO(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL);
50g メチオニン;
135L 脱イオン水。
以下の構成成分を3-5mMO２/L-分で流出可能な1000-L発酵槽に移した:
1.0L FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp.,South Charleston,WV);
1820.0g リン酸ナトリウム二塩基酸;
910.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物;
3500.0g 硫酸アンモニウム;
700.0g クエン酸ナトリウム二水和物;
1050.0g 塩化カリウム;
700.0L 脱イオン水。
発酵槽を121℃で30分攪拌した。冷却後、以下のものを攪拌された発酵槽内に無菌的に移した:
50kg 上記したアミノ酸栄養物;
7.7L 1M硫酸マグネシウム;
350ml 2.7％塩化鉄(III);
350ml 微量元素溶液;
2L 5mg/mlテトラサイクリンアルコール;
1L 50％グルコース。
3と5mMO２/L-分の間を供給するために十分な空気混和と攪拌で、発酵槽を37℃で稼動し、pHをおよそpH7.3で維持した(すなわち7.0と7.5の間)。
【０２０７】
33B6/pMY223細胞を、光学濃度(OD)が15の600nmで8-L材料として発酵槽に無菌的に移した。カルチャーの要求に合うように十分なグルコースを与え(しかし発酵槽内のグルコース蓄積を避けて)、空気飽和の30％以上に溶解酸素を維持して発酵槽を稼動させた。pHを15N水酸化アンモニウムまたは24％硫酸を用いてコントロールし、FERMAX ADJUVANT 27を気泡のコントロールのため用いた。カルチャーがODが600nmで20に到達したら、アミノ酸栄養物を約0.06kg/分で与え始めた。
接種後およそ32時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化した。それから細胞懸濁液を遠心分離によって回収し、顆粒に凍結した。
【０２０８】
(c) 細胞抽出物と純化
発酵回収物由来の凍結顆粒(以下では「細胞ペレット」という)を使用の前-60℃以下で貯蔵した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッファー(室温で6M尿素、0.02MTris,pH7.65)を、被覆された抽出タンクに攪拌しながらゆっくりと加えた。気泡形成を最小化した。ペレットの全てが溶液中にあるまで懸濁液を4℃で混ぜた。pHを8.0に調節し、溶液を抽出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物のリットル当たり3Lの水と10mlの5％ポリエチレンイミン(PEI)を攪拌しながら加えた。
抽出物をAlfa Laval AX213継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液を維持するために抽出物を継続的に攪拌し、遠心機内におよそ20リットル/分(LMP)の速度で与えた。上清を被覆回収タンクにおいて集め、温度を4℃に維持するようにセットした。抽出物が遠心機内で完全に与えられたら、およそ75Lの精製水(4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を回収するために遠心機内に与えた。
【０２０９】
(d) アニオン交換クロマトグラフィーI
純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.36L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0,4℃)で洗浄して平衡化した。それからカラムを純化した大腸菌抽出物と共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出した。カラムの注入、洗浄及び溶出を本実施例における全てのクロマトグラフィー工程についての標準的な流速で実施した。UV吸収溶離物の画分を集め、SDS-PAGEによって分析した。B2036変異体を含む画分をプールした。
【０２１０】
(e) アニオン交換クロマトグラフィーII
DEAE TRISACRYL LS PLUSプールをpH調節し、DEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量=1.47L/kg細胞ペースト)のカラムで精製した。DEAE TRISACRYL LS PLUSプールのpHを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0,4℃)で洗浄し平衡化した。それからカラムをpH調節プールと共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出し、UV吸収溶離物の画分を集め、SDS-PAGEによって分析した。B2036変異体を含む画分をプールした。
【０２１１】
(f) Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW(容量=0.43L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールのpHを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0)で平衡化し、pH調節プールと共に注入した。カラムを1カラム容量の平衡化バッファーで洗浄し、0.05MNaCl、0.05MTris,pH8.0でスタートし0.20MNaCl、0.05MTris,pH8.0で終了する直線勾配を用い、各バッファー3カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
【０２１２】
(g) PHENYL TOYOPEARL 650Mクロマトグラフィー
コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.50L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(1.2M硫酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量の1.5倍に等しい調節バッファーの容量を加え、約15分結果として生じた溶液を攪拌することによって整えた。それから溶液を室温に移した。カラムを0.22μインレットフィルターを通して3カラム容量の平衡化バッファー(0.75M硫酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡化した。それから完全に調節されたプールを0.3μ Pall Profileインレットフィルターを通してカラムに注入した。0.75M硫酸ナトリウム、50mMTris,pH7.2でスタートし、50mMTris,pH7.5で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バッファー3カラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
【０２１３】
(h) SEPHADEX G-25クロマトグラフィー
0.05MTrisバッファー内にB2036変異体を交換することによって、PHENYL TOYOPEARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30％に制限した。カラムを3カラム容量の平衡化バッファー(0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡化し、それからPHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.05MTris,pH7.2を用いて溶出した。280nmでのODが増大し始めたら、OD280がベースライン近くに落ちるまでプールを回収した。
【０２１４】
(i) DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー
SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バッファー(0.05MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。それからカラムをSEPHADEX G-25プールと共に注入した。カラムに対する注入リミットは樹脂のリットル当たり2gタンパク質であった。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各17mM,pH5.0)を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280が0.5の値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
【０２１５】
(j) Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィーによる濃縮
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをQ SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.07L/タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容量の0.1MHEPES,pH7.7を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをカラムに注入し、カラムを少なくとも4カラム容量のバッファーで洗浄した。カラムをおよそ2カラム容量の溶出バッファー(0.1MHEPES、0.22MNaCl,pH7.7)を用いて溶出した。溶離物の280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ちるまでプールを集めた。
【０２１６】
結果
B2036変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEによって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊離した。
【０２１７】
実施例VI
B2024変異体の生産
B2024変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。
方法
(a) 発現ベクター及びホスト細胞
pMY216はB2036コード配列の代わりにB2024コード配列を含む点を除いて、pMY223(実施例Vに記述されている)と同様にプラスミドpMY216を用いて大腸菌33B6でB2024変異体を発現した。 
【０２１８】
(b) 発酵
B2024変異体の発現のためのpMY216ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pMY216細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。
以下の構成成分を3-6mMO２/L-分で流出可能な60-L発酵槽に移した:
60.0ml FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp.,South Charleston,WV);
156.0g リン酸ナトリウム二塩基酸;
78.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物;
300.0g 硫酸アンモニウム;
60.0g クエン酸ナトリウム二水和物;
90.0g 塩化カリウム;
36.0L 脱イオン水。
発酵槽を121℃で30分攪拌した。冷却後、以下のものを攪拌された発酵槽内に無菌的に移した:
600.0ml 1M硫酸マグネシウム;
60.0ml 2.7％塩化鉄(III);
60.0ml 微量元素溶液;
120.0ml 5mg/mlテトラサイクリンアルコール;
90ml 50％グルコース;
6.0L 10％NZ Amine A(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL);
48L 脱イオン水。
【０２１９】
3と6mMO２/L-分の間を供給するために十分な空気混和と攪拌で、発酵槽を37℃で稼動し、pHをおよそpH7.0で維持した(すなわち6.8と7.2の間)。
33B6/pMY216細胞を、光学濃度(OD)が4の600nmで1-L材料として発酵槽に無菌的に移した。できるだけ長く空気飽和の0％に溶解酸素を維持して、カルチャーの要求に合うように十分なグルコースを与え、しかし発酵槽内のグルコース蓄積を避けて、発酵槽を稼動させた。形成されたいかなる酢酸も短時間(通常30分より短いが2時間を超えることはない)で再消費されるようにグルコースを与えた。pHを47g/LのL-ロイシンを含む12N水酸化アンモニウムまたは24％硫酸を用いてコントロールし、FERMAX ADJUVANT 27を気泡のコントロールのため用いた。
接種後およそ40時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化した。それから細胞ペーストを遠心分離によって回収し凍結した。
【０２２０】
(c) 細胞抽出物と純化
発酵回収物由来の凍結細胞ペーストを使用の前-60℃以下で貯蔵した。細胞ペーストを4℃でオーバーナイトで溶解した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッファー(4℃で6M尿素、0.02MTris,pH8.5)を細胞ペーストに加えた。細胞を攪拌し気泡形成を最小化しながら、ULTRATURREXホモゲナイザー(Tekmar,Cincinnati,OH)を用いてバッファーにおいてホモゲナイズした。温度を4℃に維持し、細胞の全てが懸濁液中にあるまで懸濁液を混ぜた。pHをおよそ8.1に調節した。溶液を抽出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物のリットル当たり1Lの水と20mlの5％PEIを攪拌しながら加えた。
抽出物をAlfa Laval BTPX205継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液を維持するために抽出物を継続的に攪拌し、遠心機内におよそ2LPMの速度で与えた。上清を4℃で受容タンクにおいて集めた。全抽出物が遠心機内で与えられたら、およそ5-10Lの精製水(4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を置き換えるために遠心機内に与えた。純化した抽出物を、伝導度が2.0mSより小さく測定されるまで精製水(4℃)を用いて希釈した。
【０２２１】
(d) アニオン交換クロマトグラフィー
純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.50L/kg細胞ペースト)のカラムと、連続的なDEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量=2.6L/kg細胞ペースト)のカラムで4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.02MTris-HCl,pH8.5,4℃)で洗浄して平衡化した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムを純化した大腸菌抽出物と共に注入した。カラムを溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラムから取り外した。B2024変異体は、pH勾配溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン、及びグリシルグリシン、それぞれ10mM,pH5.0)で、DEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラムから溶出した。カラムの注入、洗浄及び溶出を本実施例における全てのクロマトグラフィー工程についての標準的な流速で実施した。溶離物の光学濃度と画分のSDS-PAGE分析に基づいて、B2024変異体を含む画分を集めた。
【０２２２】
(e) Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW(容量=0.67L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールのpHを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃でpH8.5に調節した。平衡化バッファー(0.02MTris-HCl,pH8.5,)で平衡化し、pH調節プールと共に注入し、0.02MTris,pH8.5でスタートし0.10MNaCl、0.08MMES,pH6.5で終了する直線勾配を用い、各バッファー2.5カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
【０２２３】
(f) PHENYL TOYOPEARL 650Mクロマトグラフィー
コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.20L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(2M硫酸アンモニウム、0.04MTris,pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量に等しい調節バッファーの容量を加え、均一になるまで結果として生じた溶液を攪拌することによって整えた。それから溶液を室温に移した。カラムを2から3カラム容量の平衡化バッファー(1.0M硫酸アンモニウム、0.02MTris,pH7.2)を用いて平衡化した。それから完全に調節されたプールをカラムに注入し、1M硫酸アンモニウム、20mMTris,pH7.2でスタートし、精製水で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バッファー4カラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
【０２２４】
(g) SEPHADEX G-25クロマトグラフィー
0.02MTrisバッファー内にB2024変異体を交換することによって、PHENYL TOYOPEARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30％に制限した。カラムを3カラム容量の平衡化バッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化し、それからPHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.02MTris,pH8.0を用いて溶出した。280nmでのODがおよそ0.2に増大したら、OD280が0.2以下に落ちるまでプールを回収した。
【０２２５】
(h) DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー
SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。G-25プールを洗浄のため等量の水を用いて希釈し、結果として生じた溶液を均一になるまで混ぜ、それからカラムに注入した。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各10mM,pH5.0)を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280が0.5の値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
【０２２６】
(i) DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィーによる濃縮
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.06L/タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容量の0.02MTris,pH8.0を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをカラムに注入し、カラムを少なくとも2カラム容量の0.02MMESバッファー,pH6.5で洗浄した。カラムをおよそ2カラム容量の0.1MNaCl、0.02MMES,pH6.5で、引き続き2カラム容量の0.15MNaCl、0.02MMES,pH6.5を用いて溶出した。溶離物の280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ちるまでプールを集めた。
【０２２７】
結果
B2024変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEによって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊離した。
【０２２８】
実施例VII
PEG(5000)を用いたB2036変異体のペグ化
M-SPA-PEG(5000)をB2036hGH変異体をペグ化するために用いた。B2036変異体のペグ化を以下のプロトコールにしたがって実施し、それはまた野生型hGH及びB2024変異体のような他の変異体のペグ化にも適している。
【０２２９】
方法
(a) ペグ化反応
実施例IVで示されたように生産された精製B2036変異体をM-SPA-PEG(5000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)と反応させたが、それはB2036変異体調製物に固体として加えられた。該反応は一定の攪拌と共に室温で実施することが可能であった。略記すると、B2036変異体調製物を0.1MHEPES,pH7.7を用いて最終タンパク質濃度が10mgB2036変異体/mlになるように希釈し、室温での実施を可能にした。室温溶液のpHは約7.5であった。固体のM-SPA-PEG(5000)を攪拌しながら20g/Lの濃度にするために調製物に加えた。pHを7.5±0.1に維持した。反応はM-SPA-PEG(5000)の添加後2時間以内に完成した。
【０２３０】
(b) 疎水性インターラクション(PHENYL TOYOPEARL 650M)クロマトグラフィー
ペグ化B2036変異体調製物を条件を整え、それからPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.13L/gB2036変異体)を室温で稼動して精製した。ペグ化B2036変異体調製物の容量に等しい容量のクエン酸コンディショニング溶液(0.8Mクエン酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.7)を加え、室温で約15分結果として生じた溶液を攪拌することによって、ペグ化B2036変異体調製物の条件を整えた。少なくとも1カラム容量の平衡化バッファー(0.40Mクエン酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.5)を用いて室温でカラムを平衡化した。それから整えられたペグ化B2036変異体調製物をカラムに注入した。0.40Mクエン酸ナトリウム、50mMTris,pH7.5でスタートし、50mMTris,pH7.5で終了する4カラム容量直線勾配を用いてカラムを溶出した。カラム注入、洗浄及び溶出は本実施例の全てのクロマトグラフィー工程で通常の流速で実施した。画分を集め、SDS-PAGEで分析し、PEG-B2036変異体接合物を含む画分をプールした。
【０２３１】
(c) 超濾過/ダイアフィルトレーション
PHENYL TOYOPEARLプールをおよそ3倍に濃縮し、それから10kDの再生産セルロースメンブレン(Millipore,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、6容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0に対してダイアフィルターした。
濃縮の第一工程はPHENYL TOYOPEARLプールを用いた濾過オープンモードでの全リサイクルであった。リサイクルは与えられた濃度の3％より小さく濾過器中のPEG-B2036変異体の濃度を減少することを目的として約15分実施された。PHENYL TOYOPEARLプールの現実の濃縮は、UFモードで始められた(すなわちリサイクルタンクに向けられた残余物、及び排出物に向けられた濾過物で)。最初のリサイクルからUFモードへの移動は、フィードポンプ閉鎖及びフィードレートの変化または残余物圧の変化を除いて、自動的になされた。濃縮は残余物容量における3倍の減少が達成されるまで続いた。濃縮されたPHENYL TOYOPEARLプールを、DFモードで0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0の6容量に対してダイアフィルターした(すなわち、リサイクルタンクに向けられた残余物、排出物に向けられた濾過物、及びリサイクルタンクに移動したバッファーで)。UFモードからDFモードへの移動は、フィードポンプ閉鎖を除いて自動的になされた。
【０２３２】
PHENYL TOYOPEARLプールをダイアフィルター及び濃縮後、低圧ドロップ(ΔP)リサイクルを濾過を閉じたモードで全リサイクルにおいて実施した。残余物バルブはこの工程の間十分に開いた。フィードレートを5PSI圧ドロップを与えるように維持した。再循環を少なくとも10分なした。それから生産物移動モードをプールタンク内に超濾過系の内容物を移動するために用いた。移動は2工程でなした。第一の工程はメンブレンユニットでの単離と共に、バルブを通過したリサイクルタンク内の残余物の排出に関与した。第二の工程では、生産物をシステムから押し出し、プールタンクに入れるために低圧流の不活性ガスを用いて、超濾過装備が完全に空にされた。
【０２３３】
(d) カチオン交換(S SEPHAROSE FAST FLOW)クロマトグラフィー
さらにペグ化B2036変異体を、7gタンパク質/L樹脂を超えずに注入したS SEPHAROSE FAST FLOWカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを少なくとも3カラム容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて室温で平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体UF/DFプールをカラムに注入し、カラムを0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0でスタートし、0.25MNaCl、0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0で終了する7カラム容量の直線勾配を用いて溶出した。280nmでのODが増加し始めた後、画分を集めSDS-PAGEとマススペクトロメトリーで分析した。
【０２３４】
(e) 超濾過/ダイアフィルトレーション
S SEPHAROSE FAST FLOWプールを10kDの再生産セルロースメンブレン(Millipore,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、およそ10g/Lに濃縮した。濃度、低圧ドロップリサイクル及び生産物移動工程は、残余物容量において7倍の減少が達成されるように上記「超濾過/ダイアフィルトレーション」部分に記述されているように実施した。
【０２３５】
(f) SEPHADEX G-25クロマトグラフィー
4℃で稼動させるSEPHADEX G-25カラムを、処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にPEG-B2036変異体調製物を交換するために用いた。注入の容量はカラムの全層容量の25％に制限した。洗浄のためカラムを1カラム容量の精製水を用いて洗い、次いで少なくとも1.5カラム容量の処方バッファーを用いて平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体UFプールをカラムに注入し、カラムを処方バッファーを用いて溶出した。280nmでのODが0.5を超えたら、OD280がおよそ0.5以下に落ちるまで画分を集めた。それからSEPHADEX G-25プールを5.0mg/mlの濃度に処方バッファーを用いて希釈した。
【０２３６】
結果
hGH変異体当たりのPEGの化学量論をVESTECレーザー脱着イオン化マススペクトロメーター(PerSeptive Biosystems,Inc.,Framingham,MA)によって評価した。その結果は調製物が4及び5のPEG基を含む主要な接合物(PEG-4/5-B2036)を含むことを示した。
【０２３７】
実施例VIII
PEG(20,000)を用いたB2036変異体のペグ化
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがってPEG(20,000)を用いてペグ化した。
実施例Vに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内にバッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希釈した。60mgのM-SPA-PEG(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)を、チューブに計り取り、6mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で75分インキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。
結果として生じたPEG(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで25mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)にアプライした。カラムを室温で4.1mg/ml樹脂の濃度でPEG(20,000)-B2036変異体溶液と共に注入した。
【０２３８】
それから25mM酢酸ナトリウム,pH4.0から25mM酢酸ナトリウム,pH4.0中に0.5M塩化ナトリウムまでよりなる直線勾配の5カラム容量の各バッファーを用いて溶出した。画分を集め、Daiichiゲル(Owl Scientific,Cambridge,MA)を前もって注いだ2-15％ポリアクリルアミドを用いてSDSゲル電気泳動によって分析した。各B2036分子に接合した単一のPEG(20,000)分子を持つPEG(20,000)-B2036形態を含む画分をプールし、CENTRIPREP 10濃縮器(Amicon,Inc.,Beverly,MA)を用いて超濾過によって濃縮した。CENTRIPREP 10濃縮器をSORVALL RT6000B遠心機(Dupont Instruments,Newtown,CT)において16℃で8,000rpmで遠心した。残余物を除去し、CENTRICON 10濃縮器(Amicon,Inc)を用いてさらに濃縮した。濃縮機をSORVALL RC-5B遠心機で16℃で6500rpmで遠心した。
それから濃縮したPEG(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にバッファー交換した。
【０２３９】
実施例IX
Y-PEGを用いたB2036変異体のペグ化
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって2の10,000D鎖を持つ分枝状鎖PEG(PEG2(20,000))を用いてペグ化した。
実施例Vに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内にバッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希釈した。100mgのNHS-PEG2(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)を、チューブに計り取り、4mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で90分インキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。
結果として生じたPEG2(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで25mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)にアプライした。カラムを室温で2.75mg/ml樹脂の濃度でPEG2(20,000)-B2036変異体溶液と共に注入した。
【０２４０】
それから25mM酢酸ナトリウム,pH4.0から25mM酢酸ナトリウム,pH4.0中に0.5M塩化ナトリウムまでよりなる直線勾配の5カラム容量の各バッファーを用いて溶出した。画分を集め、Daiichiゲル(Owl Scientific,Cambridge,MA)を前もって注いだ2-15％ポリアクリルアミドを用いてSDSゲル電気泳動によって分析した。各B2036分子に接合した単一のPEG2(20,000)分子を持つPEG2(20,000)-B2036形態を含む画分をプールし、CENTRICON 10濃縮器(Amicon,Inc.,Beverly,MA)を用いて超濾過によって濃縮した。濃縮機をSORVALL RC-5B遠心機で16℃で6500rpmで遠心した(Dupont Instrument,Newtown,CT)。
濃縮したPEG2(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にバッファー交換した。
【０２４１】
実施例X
PEG-4/5-B2036のペグ化部位
実施例V及びVIIに記述されたように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製物のPEG修飾の部位を、トリプシンマッピングによって分析した。精製されたPEG-4/5-B2036変異体サンプル(1MCaCl２、0.1M酢酸ナトリウム、10mMTris,pH8.8内に1mg/ml)を、Kohr,W.J.等,Anal.Biochem.,122:348-359(1982)に記述されたように1:40(トリプシン:PEG-4/5-B2036変異体)のタンパク質重量比で、ウシトリプシン(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)と共にインキュベートした。トリプシンを時間0で加え、切断の4時間で再び加えた。37℃で8時間のインキュベーション後、リン酸をpH2になるように加えることによって切断を止め、サンプルを4℃で貯蔵した。
【０２４２】
切断サンプル(100μg)を、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液において、15×0.46cm C-18カラム(5-μmビーズ、100-Åポアサイズ;NUCLEOSIL,Alltech Associates,Deerfield,IL)に注入し、40℃で0.4ml/分の流速で120分0から60％のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。トリプシン処理ペプチドの溶出物を214nmの吸光度でモニターした。
【０２４３】
トリプシン処理ペプチドへのPEG基の接合を、非ペグ化タンパク質のトリプシン切断から生産されたクロマトグラムと比較して、クロマトグラム上での相当するピークのサイズの減少によって検出した。その結果は、最も反応性があるものからより少ないものへの第一級アミンの反応性の順序(元のペプチドの修飾パーセントとして測定された)は:
F1>K145,K140,K38,K158>K120,K70
であった。相当するトリプシン処理ペプチドの修飾変異体が検出されなかったことに基づいて、K41及びK115は非反応性であると決定された。B2036変異体中の168と172残基は、この位置でのリシンが異なるアミノ酸に置換されているため、PEGと反応できなかった。最も反応性の残基はサイト1では存在しなかった。実際野生型hGHに存在する3のサイト1リシン(K41,K168及びK172)は、非反応性(K41)またはB2036には存在しない(K168及びK172)。それゆえB2036変異体のペグ化はサイト1結合を直接的にはブロックしない。
【０２４４】
実施例XI
ペグ化B2036の作用剤活性の細胞ベースアッセイ
実施例V及びVIIに記述されているように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製物をFuh,G.等、Science,256:1677-1680(1992)とColosi,P.等,J.Biol.Chem.,268:12617-12629(1993)に記述されている細胞ベース二量体化アッセイにおいて活性をテストした。このアッセイで用いられる細胞を生産するために、フルレングスのhGH受容体を、hGHの存在下で増殖を誘導できるプレミエロイド細胞系、FDC-P1(Colosi,P.等,J.Biol.Chem.,268:12617-12629[1993])内に安定にトランスフェクトした。10％胎児ウシ血清と2-5nMhGHを含むRPMI培地において細胞を維持した。細胞を4時間hGHのない培地で取り込みを抑え、それからhGH変異体の増大していく濃度と共に37℃で10時間インキュベートした。細胞に4時間[＋H]チミジンのパルスを与え、溶解し、そしてニトロセルロースフィルターに結合した放射性活性の量によってDNA合成を分析した。Fuh,G.等,Science,256:1677-1680(1992)。B2036とPEG-4/5-B2036の両者とも、0.001から1.0μg/mlのhGH変異体の範囲のいかなる濃度でも細胞増殖を刺激しなかった。
【０２４５】
実施例XII
ペグ化B2036の拮抗剤活性の細胞ベースアッセイ
拮抗剤活性をテストするためにデザインされた研究において、実施例V及びVIIに記述されたように生産された非ペグ化B2036及びPEG-4/5-B2036変異体調製物を、11ng/ml組換えhGH及び増大していく濃度の変異体(10４細胞/0.2ml全アッセイ容量)と共にインキュベートした。組換えhGH刺激細胞増殖の50％をブロックするのに必要とされる変異体の濃度、すなわち50％最大阻害濃度(IC５０)を、両変異体について計算した。非ペグ化B2036のIC５０は0.19μg/mlであり、一方PEG-4/5-B2036のIC５０は13.01μg/mlであった。
別の実験では、PEG-4/5-B2036変異体調製物の拮抗剤活性をPEG(20,000)-B2036変異体及びPEG2(20,000)-B2036変異体のものと比較するアッセイを繰り返した(5×10３細胞/0.15ml全アッセイ容量)。これらのペグ化変異体を実施例VII、VIII及びIXのそれぞれに記述されているように生産した。各ペグ化変異体のIC５０を表11に示す。
【０２４６】
【表１１】
0003693668.tif 000018
【０２４７】
実施例XIII
hGH変異体のin vivo拮抗剤活性
IGF-Iレベルでの拮抗剤hGH変異体の毎日の注射の効果をアカゲザルにおいて研究した。テストされたhGH変異体は、G120K置換を含む変異体とB2036及びB2024変異体であった。加えてPEG(5000)の4から5の分子を持つこれらの変異体のペグ化形態をテストした。18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4に処方された0.25mg/kghGH変異体調製物の毎日の投与量を、治療グループ当たり2の若いオスアカゲザルに皮下に注射した。Amer.J.Primatology,11:53-62(1986)に記述されているように、IGF-Iレベルをイムノアッセイによって測定した。
【０２４８】
その結果が図11に示されている。hGHで治療された全てのサルについて投与後7日でIGF-Iレベルの減少が観察され、PEG-4/5-B2036で治療されたサルでは最も有意な減少が観察された。14日後、IGF-IレベルはG120K及びB2024変異体で治療されたサルでは治療前レベルに戻った。IGH-Iレベルの減少は、G120K及びB2024変異体のペグ化形態と、非ペグ化B2036変異体で治療されたサルでは観察された。PEG-4/5-B2036変異体調製物で治療されたサルの14日のIGF-Iレベルは、7日後のものと同じであった。21日のIGF-Iレベルは全ての治療グループで7日のIGF-Iレベルとほとんど同じであった。
【０２４９】
実施例XIV
PEG-4/5-B2036変異体調製物のin vivo拮抗剤活性:
単一投与量薬力学
IGH-IレベルにおけるPEG-4/5-B2036変異体調製物の単一注射の効果をアカゲザルにおいて研究した。実施例V及びVIIに記述したように生産され、18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4に処方された1mg/kgのPEG-4/5-B2036変異体の単一投与量を、若いオスアカゲザルに静脈内または皮下のそれぞれで注射した。偽薬は皮下に投与された0.5ml処方バッファーであった。IGF-Iレベルを実施例XIIIのように測定した。
その結果が図12に示されている。投与経路に関わらず、PEG-4/5-B2036変異体調製物で治療された全てのサルのIGF-Iレベルが投与後1日で減少し、投与後4日まで減少が引き続き、7日間の研究を通じて低く維持されていた。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】図1Aと1BはBIAcoreＴＭバイオセンサーに結合した(S237C)hGHbpへのヒト成長ホルモン(hGH)または(G120R)hGHの結合に対する反応(図1A)及び速度論(図1B)を表す。(S237C)hGHbpを1.2ng/mm２に相当する1220RU'sの濃度でチオール-デキストランマトリックス(図1A)に固定化した。結合プロフィール実施例では(図1B)、hGH(塗りつぶしていない印)または(G120R)hGH(塗りつぶした印)を、会合を追跡し化学量論を計算する結合ホルモンの限界量を確立するために、飽和濃度(>200nM)で注入した。飽和後、インジェクターループを解離を追跡するためにバッファーに切り替えた(矢印で示されている)。
【図２】図2Aと2BはBIAcoreＴＭバイオセンサーに結合した(S201C)hGHbpへのhGH(塗りつぶしていない丸印)または(G120R)hGH(塗りつぶした丸印)の結合に対する反応(図2A)及び速度論(図2B)を表す。(S201C)hGHbpを1480RU's(1.48ng/mm２)の濃度で固定化した。結合コンディション及びプロフィールは図1Aと1Bのものと類似している。
【図３】図3はRIA(y軸)またはBIAcoreＴＭバイオセンサー(x軸)によって得られたデータからhGHbpとの1:1複合体を形成した場合の、野生型hGHと相関的なhGHのアラニンミュータントに対して計算された結合の自由エネルギー(ΔΔG（ｍｕｔ−ｗｔ）)における変化の相互間系を表す。値は表2から得られた。
【図４】図4Aと4Bは接触残基でのアラニンミュータントに対するオフ-レート(図4A)またはオン-レート(図4B)における相対的変化を表す。データは表2から得られた。
【図５】図5Aと5Bはアラニン置換における結合アフィニティーの変化と隠れた表面エリア(Å２)の間の関係(図5A)またはβ炭素以外の接触側鎖における原子に対するファンデルワールス接触の数(図5B)を表す。塗りつぶした丸印はサイト1で受容体と水素結合または塩架橋を形成する界面で隠れた残基に対してであり、塗りつぶしていない丸印はそうでない残基に対してである。データは表2からプロットされている。
【図６Ａ】図6A,6B及び6Cはアラニンスキャニングミュータジェネシス、x線結晶構造またはファージディスプレーのそれぞれによって定義された受容体結合エピトープの比較を表す。  図6AはhGHサイト1機能的エピトープを表す。アラニンスキャニングミュータジェネシスにしたがって、受容体結合に関与する残基はhGH(hGHbp)２結晶構造から由来したhGHの画像モデル上に示されている。de Vos等,上記参照。アラニン置換(またはK41の場合にはGln置換)の効果は、M14,H21,F54,E56,I58,S62,N63及びY164を除いてBIAcoreＴＭ速度論測定に基づいて示されている。これらの部位ではBIAcoreＴＭデータは入手可能ではないかまたは結合に対してごくわずかな効果を示すのみであり、故に示される効果はRIAデータに基づいている。結合自由エネルギー(ΔΔG)の変化は-RTln[Kｄ(Alaミュータント)/Kｄ(hGH)]として計算された。黒い球は結合を改変する(ΔΔG=-1から-0.5kcal/モル)アラニン置換を示す。大きいサイズの4個の白い球はそれぞれ+0.5から1.0kcal/モル、+1.0から1.5kcal/モル、+1.5から2.0kcal/モルまたは+2.0から2.5kcal/モルまで結合エネルギーを減少するアラニン置換を表す。
【図６Ｂ】図6BはhGHサイト1構造的エピトープである。大きいサイズの4個の白い球はhGH(hGHbp)２X線結晶構造から計算されたようにアラニン置換による各残基でそれぞれ-20から0Å２、0から20Å２、20から40Å２または40から60Å２の溶媒接近可能エリアの変化を示す。
【図６Ｃ】図6Cは無作為化されたファージミドライブラリーにおけるhGH残基の保存を表す。ファージディスプレーされたhGHライブラリーにおいて一度に4位で無作為化された残基が示されている:ヘリックス-1[F10,M14,H18,H21];ミニヘリックス-1[K41,Y42,L45,Q46];Loop-A[F54,E56,I58,R64];ヘリックス-4A[K172,E174,E176,R178];ヘリックス-4B[R167,D171,T175,I179]。hGH結合のため分類した後の各位で見出される野生型hGH残基の画分[ここ及びLowman等,上記参照で報告されるデータ]は、黒い球のサイズによって示されている。最も小さい黒い球は0-10%保存されており、次に大きいものは10-25%保存されており、次に大きいものは25-50%保存されており、最も大きいものは>50%保存されている。
【図７】図7は受容体結合アフィニティーを促進するファージ由来ミューテーションと組み合わせるためのストラテジーを表す。最もよく選択されたものは野生型に対するアフィニティーにおける倍化と共に示されている。これらの変異体のそれぞれで見出される野生型由来のミューテーションの数もまた示されている(例えば4muts.)。ヘリックス-1、ヘリックス-4、ミニヘリックス-1またはヘリックス1とヘリックス2と連結したループにおけるそれぞれ4つのコドンで無作為化されたライブラリーが別々に分類された。Helix-4aで同定された2つのミューテーション(E174S/F176S)は他のヘリックス-4部位(Helix-4b;Lowman等,上記参照)での付加的な無作為化と選択のためのバックグランドとして用いられた。Helix-1とHelix-4bにおいて同定されたミューテーションをBD変異体を生産するために結び付けた;Minihelix-1とLoop-Aにおけるミューテーションを変異体852bを生産するために結び付けた。最後にこれら二つの変異体由来のミューテーションを変異体852dを生産するために結び付けた。
【図８Ａ】図8A,8B及び8CはそれぞれhGH構造的エピトープ、ファージ由来エピトープ及び発展変異体の間の関係を表す。野生型hGH残基が受容体結合のために分類されたhGH-ファージミドプール(Lowman等,上記参照)において現れた頻度についての自然対数がx軸に示されている。組み合わせたライブラリー由来のデータは示されなかった。logスケールは隠れた表面エリアとの比較から選択された。野生型残基が選択されたライブラリーの全てにおいて見出されなかったので、残基M14,H18,K41,Q46,R167およびE174はこのグラフに現れていない。  図8AはhGH-(hGHbp)２のx線構造との比較を表す。受容体-1結合により隠れたhGH残基の側鎖エリア([フリーhGH]-[hGH-hGHbp複合体]の溶媒接近可能エリア)がプロットされている。
【図８Ｂ】図8Bはファージディスプレー及びアラニンスキャニングミュータジェネシスの結果を表す。hGHにおけるAla置換の機能的効果がln[Kｄ(Alaミュータント)/Kｄ(hGH)]としてプロットされている。結合データは速度論データが入手できない場合を除いて、BIAcoreＴＭバイオセンサー測定から得られた。これらの非接触残基(F10,F54,I58)に対して、ラジオ免疫沈降法アッセイから得られたKｄに対する値を用いた。Cunningham等,1989,上記参照。
【図８Ｃ】図8Cは発展変異体の間の残基の保存を表す。ヒト胎盤ラクトゲン、hGH(20K)及びhGH-Vと同様に、サル、ブタ、ゾウ、ハムスター、クジラ、アルパカ、キツネ、ウマ、ヒツジ、ラット、カメ、ニワトリ、ミンク、ウシ、サケ、カエル及びマス由来の成長ホルモンのアミノ酸配列(Genbank,vol.75,1993年2月)を野生型hGHのものと比較した。プロラクチン発展変異体は含めていなかった。野生型hGH残基がこれらの変異体の間に現れる頻度の自然対数がプロットされている。
【図９】図9はファージ由来ミューテーションの加法を開示する。野生型hGHのものに対する結合の自由エネルギーの変化が構成要素ミューテーションに対するΔΔGの和と比較された。示されているポイントは(1)変異体BD vs.[BプラスD];(2)変異体852b vs.[ミニヘリックス-1プラスループ-A];(3)変異体BF vs.[BプラスF];及び(4)変異体852d vs.[BDプラス852b]の組み合わせに相当する。エラーバーはエラー計算の広がりを用いて標準のズレから見積もった。Bevington,Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences,pp.56-65(McGraw-Hill,New York,1969)。示されている直線はy=-0.94+0.60x;R２=0.96である。
【図１０】図10は実施例Vに記述されているような、本発明の拮抗剤hGH変異体(B2036変異体)を発現するために用いられる例示的なベクターのためのプラスミドマップを示す。
【図１１】図11はアカゲザルにおけるインスリン様成長因子-I(IGF-I)濃度に対する本発明の様々な拮抗剤hGH変異体の毎日の皮下注射(0.25mg/kg)の効果を示す。変異体のペグ化および非ペグ化形態の両者がテストされた。実施例XIII参照。
【図１２】図12はアカゲザルに静脈または皮下に注射されたペグ化拮抗剤hGH変異体(B2036)調製物の単一投与薬力学を示す。拮抗剤効果はIGF-I濃度における減少パーセントとして測定された。実施例XIV参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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