(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖上に置換あるいは無置換のフェニル基またはフェノキシ基を有し、その３位の炭素原子はキラル中心となり、その立体配置はＲ−体であるモノマーユニットで構成される、微生物を利用して製造可能なアイソタクチックなポリマー構造のポリヒドロキシアルカノエートであって、
該Ｒ−体のモノマーユニットのみで構成されるポリマー構造は、
（Ａ）：下記式（７）で示される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸ユニットからなるホモポリマー；
【化６５】
0003673711.tif 000086
（Ｂ）：下記式（６）で示される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットと下記式（９）で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットとからなるコポリマー；
【化６７】
0003673711.tif 000087
（Ｃ）：下記式（１０）で示される３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸ユニットと下記式（１１）で示される３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸ユニットとからなるコポリマー；
【化６８】
0003673711.tif 000088
上記（Ａ）〜（Ｃ）の何れかの構成である
ことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項２】
その３位の炭素原子は、キラル中心となり、その立体配置はＲ−体である、側鎖上に４−フルオロフェニル基を有するモノマーユニットで構成されるポリマーであって、下記式（７）で示される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸ユニットからなるホモポリマーである請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化５】
0003673711.tif 000089
【請求項３】
その３位の炭素原子は、キラル中心となり、その立体配置はＲ−体である、側鎖上にフェニル基またはフェノキシ基を有するモノマーユニットで構成されるポリマーであって、下記式（６）で示される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットと下記式（９）で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットとからなるコポリマーである請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化７】
0003673711.tif 000090
【請求項４】
その３位の炭素原子は、キラル中心となり、その立体配置はＲ−体である、側鎖上にフェニル基を有するモノマーユニットで構成されるポリマーであって、下記式（１０）で示される３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸ユニットと下記式（１１）で示される３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸ユニットとからなるコポリマーである請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化８】
0003673711.tif 000091
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ならびに、微生物を利用してかかる新規なＰＨＡを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
長年にわたって、石油由来の合成高分子をプラスチック等として利用してきたが、使用後廃棄されるこれらプラスチック等の処理が大きな社会問題となっている。石油由来の合成高分子は、分解されにくい利点から金属材料、ガラス等の代替えを果たしてきたが、大量に消費され、また大量に廃棄される昨今では、その分解されにくいという性質が逆に災いし廃棄物処理場に蓄積されることとなった。また、焼却処理を行うとＣＯ2排出量の増加となり、ある場合には、ダイオキシンや環境ホルモン等の有害物質の発生原因ともなる。
【０００３】
一方、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）に代表される微生物産生ポリエステル（ＰＨＡ）は、従来のプラスチックと同様、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができるとともに、石油由来の合成高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有している。従って、廃棄した際、微生物産生ポリエステルは生分解されることにより、自然界の物質循環に取り込まれるので、従来利用されていた、多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生分解処理を行うことで、燃焼処理を行う必要もないため、大気汚染や地球温暖化を防止するという観点でも有効な材料であり、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することができる。加えて、微生物産生ポリエステルに対しては、医療用軟質部材への応用なども検討されている（特開平５−１５９号公報、特開平６−１６９９８０号公報、特開平６−１６９９８８号公報、特開平６−２２５９２１号公報 など）。
【０００４】
これまで、多くの微生物がＰＨＢあるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されている（「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、（株）エヌ・ティー・エス発行、Ｐ１７８−１９７、１９９５）。このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、産生されるＰＨＡの組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００５】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス  Ｈ１６株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｕｓ  Ｈ１６、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１７６９９）及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている（特表平６−１５６０４号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平８−１９２２７号公報等）。
【０００６】
また、特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  ＡＴＣＣ２９３４７）に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３−ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。
【０００７】
特開平５−７４４９２号公報では、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００８】
特開平５−９３０４９号公報、及び、特開平７−２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の２成分共重合体が生産されることが開示されている。
【０００９】
特開平９−１９１８９３号公報では、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ１３８５２株（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＩＦＯ１３８５２）が、グルコン酸及び１，４−ブタンジオールを炭素源として用いた培養により、３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットとして持つポリエステルを生産することが開示されている。
【００１０】
さらに、ある種の微生物では、様々な置換基、例えば、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入されたＰＨＡを生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされ始めている。これら置換基が導入された微生物産生ポリエステルの事例は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ, １２８ （１９９５） ｐ２１９−２２８に詳細に記載されているが、例えば、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６５，１９９０、 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，５２５６−５２６０，１９９１、 Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，３，４９２−４９４，１９９１ 等では、シュードモナス・オレオボランスが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されており、３ＨＰＶモノマーユニットが含まれることに起因すると考えられる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００１２】
一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡは、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待できる。すなわち、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００１３】
このような置換基を側鎖に導入したＰＨＡの例としては、フェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡが挙げられる。
【００１４】
例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９５，１６６５−１６７２（１９９４）には、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１５】
また、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，３４３２−３４３５（１９９６）には、シュードモナス・オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、６−フェノキシヘキサン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸及び３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８−フェノキシオクタン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸及び３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸及び３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸及び３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００１６】
【表１】
0003673711.tif 000002
【００１７】
更に、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，３２−４３（１９９５）では、シュードモナス・オレオボランス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２９３４７株及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４２株を用いて、オクタン酸とｐ−シアノフェノキシヘキサン酸或いはｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ− ｐ−シアノフェノキシヘキサン酸或いは３−ヒドロキシ− ｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産に成功している。
【００１８】
特許第２９８９１７５号公報には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニットあるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造方法が記載されている。
【００１９】
これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行われている。
培養時間：一段目、２４時間；二段目、９６時間
各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
（１）得られるポリマー：３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐホモポリマー
一段目の基質：クエン酸、イーストエキス
二段目の基質：モノフルオロフェノキシウンデカン酸
（２）得られるポリマー：３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐホモポリマー
一段目の基質：クエン酸、イーストエキス
二段目の基質：ジフルオロフェノキシウンデカン酸
（３）得られるポリマー：３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐコポリマー
一段目の基質：オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質：モノフルオロフェノキシウンデカン酸
（４）得られるポリマー：３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐコポリマー
一段目の基質：オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス
二段目の基質：ジフルオロフェノキシウンデカン酸
その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２０】
また、シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）による生産の例が報告されている（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ３０, １６１１−１６１５ （１９９７））。
【００２１】
この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸（以下、ＮＡと記載する）と４−シクロヘキシル酪酸（以下、ＣＨＢＡと記載する）あるいは５−シクロヘキシル吉草酸（以下、ＣＨＶＡと記載する）の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００２２】
その収率等に関しては、ＣＨＢＡに対して、基質濃度トータル２０ ｍＭの条件で、ＣＨＢＡとＮＡの量比を変化させ、表２に示すのような結果を得たと報告されている。
【００２３】
【表２】
0003673711.tif 000003
【００２４】
ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍｇ／Ｌ）、
ＰＤＷ：乾燥ポリマー重量（ｍｇ／Ｌ）、
収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ（％）
しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００２５】
このように、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により製造しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００２６】
しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチル−ＣｏＡの生成に基づく炭素源及びエネルギー源の供給を期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチル−ＣｏＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８−フェノキシオクタン酸由来の３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸及び３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチル−ＣｏＡの生成に基づいた炭素源及びエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００２７】
このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００２８】
しかしながら、前記の方法で生産されたＰＨＡには、導入しようとする置換基を有するモノマーユニットと、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット（例えば、３−ヒドロキシオクタン酸や３−ヒドロキシノナン酸等）とが混在する。これらの中鎖長（ｍｃｌ：medium  chain  length）−モノマーユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに混在した場合、ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍｃｌ−モノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍｃｌ−モノマーユニットの混在は大きな課題である。この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍｃｌ−モノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離／除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリール基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシ基等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍｃｌ−モノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍｃｌ−モノマーユニット除去は極めて困難である。
【００２９】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、デバイス材料や医療用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡの提供、ならびに、当該ＰＨＡを微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、しかも高収率な製造方法を提供することにある。さらには、目的外のモノマーユニットの混在がなく、所望のモノマーユニットのみで構成される新規なＰＨＡの提供、ならびに、当該ＰＨＡを微生物を利用して製造する方法を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、特に、デバイス材料や医療用材料等として有用な、置換あるいは無置換のフェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を側鎖上に有するＰＨＡの開発を目指して、ＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する能力を有する新規な微生物の探索、ならびに、新規な微生物を用いて、所望のＰＨＡを製造する方法について、鋭意研究を進めた。
【００３１】
さらに、目的外のモノマーユニットの混在をなくし、効率的に所望とするＰＨＡを得られる方法を開発すべく、鋭意研究・検討を重ねてきた結果、微生物を培養する際、対応する原子団を有する原料のアルカノエートに加え、酵母エキスを添加した培地で微生物の培養を行うことによって、目的外のモノマーユニットを混在させることなく所望とするＰＨＡのみを選択的に生産できること、あるいは目的外のモノマーユニットの混在を少なくできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３２】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを製造する際、原料とするアルカノエートと酵母エキスとを含む培地で、前記アルカノエートを利用して前記ポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。かかる本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、より具体的に記載すると下記する形態で実施されるものである。
【００３３】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法における第一の形態は、
下記式（１２）：
【００３４】
【化２３】
0003673711.tif 000004
【００３５】
（式（１２）中、Ｒは、下記一般式（２）、一般式（３）、あるいは一般式（４）のいずれかで示される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
で表されるアルカノエートと酵母エキスとを含む培地で微生物を培養し、微生物菌体からポリヒドロキシアルカノエートを抽出して、下記式（１３）：
【００３６】
【化２４】
0003673711.tif 000005
【００３７】
（式（１３）中、Ｒ’は、上記式（１２）においてＲとして選択された基、
ならびに、このＲとして選択された基が、
下記式（２）で示され、ｑ＝ｑ0の基である場合、対応するＲ１を有し、ｑ＝ｑ0−２、ｑ＝ｑ0−４、あるいはｑ＝ｑ0−６の基、
下記式（３）で示され、ｒ＝ｒ0の基である場合、対応するＲ２を有し、ｒ＝ｒ0−２、ｑ＝ｒ0−４、あるいはｒ＝ｒ0−６の基、
下記式（４）で示され、ｓ＝ｓ0の基である場合、対応するＲ３を有し、ｓ＝ｓ0−２、ｓ＝ｓ0−４、あるいはｓ＝ｓ0−６の基、
から選択される少なくとも１つ以上の基である。
なお、ｑ0−２、ｒ0−２あるいはｓ0−２、ｑ0−４、ｒ0−４あるいはｓ0−４、ｑ0−６、ｒ0−６あるいはｓ0−６は、１以上の整数値のみを取り得る）
【００３８】
【化２５】
0003673711.tif 000006
【００３９】
（式（２）中、Ｒ１は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｑは、１〜８の整数から選択される；
式（３）中、Ｒ２は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｒは、１〜８の整数から選択される；
式（４）中、Ｒ３は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｓは、１〜８の整数から選択される）
で表されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。特には、上記一般式（１３）で表されるモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。
【００４０】
この方法においては、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートを一種類とし、対応するモノマーユニット、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含む、ＰＨＡを製造することができる。また、上述するように、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いることもでき、その際には、生成されるポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数を用いることが好ましい。一般には、式（１２）で表されるアルカノエートを５種類程度まで原料に用いることで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、５種類以上の多くの種類の原料を利用することも可能である。例えば、上記の一般式（２）、一般式（３）ならびに一般式（４）の三種をいずれをも含み、それぞれ３種類程度までを選択し、合計して、５種類を超える原料を用いることも可能である。
【００４１】
また、一般式（２）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ１、ならびに一般式（３）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ２は、オルト位（２位または６位）、メタ位（３位または５位）ならびにパラ位（４位）のいずれを選択することも可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換ベンゼン環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、ベンゼン環上パラ位（４位）に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。同じく、一般式（４）のシクロヘキシル環上、Ｒ３の置換位置は、１位、２位（または６位）、３位（または５位）ならびに４位のいずれを選択することも可能であり、加えて、ｃｉｓ配置とｔｒａｎｓ配置のどちらをも選択可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換シクロヘキシル環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、シクロヘキシル環上４位に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる方法で生産されるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【００４２】
本発明の方法において、微生物の培養は、式（１２）のアルカノエートと酵母エキスとを含む培地で一旦培養した後、培養された菌体を、当該アルカノエートを含み、窒素源を制限した培地においてさらに培養する、二段階の培養とすることができる。また、微生物の培養を、式（１２）のアルカノエートと酵母エキスとを含む培地のみで行う一段階の培養とすることもできる。加えて、利用する微生物を、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）に属する微生物から選択すると好ましい。好適に利用可能なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）に属する菌株として、例えば、シュードモナス チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１１）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１０）、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４０９）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４４５）を挙げることができ、前記４種の菌株のいずれかを選択するとより好ましい。
【００４３】
以下に、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法における第一の形態における、好ましい発明の態様を個別的に、より具体的に記載する。
【００４４】
本発明者らは、
下記式（１４）：
【００４５】
【化２６】
0003673711.tif 000007
【００４６】
で表される４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで、下記式（５）：
【００４７】
【化２７】
0003673711.tif 000008
【００４８】
で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）モノマーユニットからなるポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（ＰＨＰｘＢ）ホモポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【００４９】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法による、前記第一の形態に含まれる、一つの態様は、上記式（１４）で表されるＰｘＢＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＢＡを利用して上記式（５）で示される３ＨＰｘＢモノマーユニットの繰返し単位からなるＰＨＰｘＢホモポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００５０】
これまでにＰｘＢＡを基質とした、３ＨＰｘＢをモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産の報告例はなく、また、ＰＨＰｘＢのホモポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例もない。従って、上記方法で得られるＰＨＰｘＢは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【００５１】
本発明者らは、また、
下記式（１５）：
【００５２】
【化２８】
0003673711.tif 000009
【００５３】
で表される５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで、下記式（６）：
【００５４】
【化２９】
0003673711.tif 000010
【００５５】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）モノマーユニットからなるホモポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【００５６】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（１５）で表されるＰｘＶＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＶＡを利用して上記式（６）で示される３ＨＰｘＶモノマーユニットの繰返し単位からなるポリ−３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（ＰＨＰｘＶ）ホモポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００５７】
これまでにＰｘＶＡを基質とした、３ＨＰｘＶをモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産の報告例はなく、また、ＰＨＰｘＶのホモポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例もない。従って、上記方法で得られるＰＨＰｘＶは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【００５８】
本発明者らは、また、
下記式（１７）：
【００５９】
【化３０】
0003673711.tif 000011
【００６０】
で表される５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸（ＦＰｘＶＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで下記式（１６）：
【００６１】
【化３１】
0003673711.tif 000012
【００６２】
で表される３−ヒドロキシ−５−（フルオロフェノキシ）吉草酸（３ＨＦＰｘＶ）モノマーユニットからなるホモポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【００６３】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（１７）で表されるＦＰｘＶＡと酵母エキスとを含む培地で、ＦＰｘＶＡを利用して上記式（１６）で示される３ＨＦＰｘＶモノマーユニットの繰返し単位からなるポリ３−ヒドロキシ−５−（フルオロフェノキシ）吉草酸（ＰＨＦＰｘＶ）ホモポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００６４】
本発明者らは、また、
下記式（２３）：
【００６５】
【化３２】
0003673711.tif 000013
【００６６】
で表される７−フェノキシヘプタン酸（ＰｘＨｐＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで下記式（６）及び（２２）：
【００６７】
【化３３】
0003673711.tif 000014
【００６８】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）及び３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）ユニットからなるコポリマーを生産できる微生物を微生物を得ることに成功した。
【００６９】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（２３）で表されるＰｘＨｐＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＨｐＡを利用して上記式（６）及び（２2）で示される３ＨＰｘＶ及び３ＨＰｘＨｐモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００７０】
本発明者らは、また、
下記式（２６）：
【００７１】
【化３４】
0003673711.tif 000015
【００７２】
で表される８−フェノキシオクタン酸（ＰｘＯＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで下記式（５）、（２４）及び（２５）：
【００７３】
【化３５】
0003673711.tif 000016
【００７４】
で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）及び３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）ユニットからなるコポリマーを生産できる微生物を得ることに成功した。
【００７５】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（２６）で表されるＰｘＯＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＯＡを利用して上記式（５）、（２４）及び（２５）で示される３ＨＰｘＢ、３ＨＰｘＨｘ及び３ＨＰｘＯモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００７６】
本発明者らは、また、
下記式（２８）：
【００７７】
【化３６】
0003673711.tif 000017
【００７８】
で表される１１−フェノキシウンデカン酸（ＰｘＵＤＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで下記式（６）、（２２）及び（２７）：
【００７９】
【化３７】
0003673711.tif 000018
【００８０】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）ユニットからなるコポリマーを生産できる微生物を得ることに成功した。
【００８１】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（２８）で表されるＰｘＵＤＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＵＤＡを利用して上記式（６）、（２２）及び（２７）で示される３ＨＰｘＶ、３ＨＰｘＨｐ及び３ＨＰｘＮモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００８２】
さらには、上記の一連の態様に詳述した方法に加えて、
フェノキシ基を有する側鎖を所望とする基で置換した下記式（１２）のアルカノエートをモノマー成分の原料として、対応する種々の側鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を利用して選択的に生産することができる。原料として、かかる下記式（１２）のアルカノエートを利用し、下記式（１３）で示されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法も、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法による、前記第一の形態に含まれる。
【００８３】
【化３８】
0003673711.tif 000019
【００８４】
（式（１２）中、Ｒは、下記一般式（３）で表される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
【００８５】
【化３９】
0003673711.tif 000020
【００８６】
（式（１３）中、Ｒ’は、上記式（１２）においてＲとして選択された基、
ならびに、このＲとして選択された基が、
下記式（３）で示され、ｒ＝ｒ0の基である場合、対応するＲ２を有し、ｒ＝ｒ0−２、ｑ＝ｒ0−４、あるいはｒ＝ｒ0−６の基、
から選択される少なくとも１つ以上の基である。
なお、ｒ0−２、ｒ0−４あるいはｒ0−６は、１以上の整数値のみを取り得る）
【００８７】
【化４０】
0003673711.tif 000021
【００８８】
（式（３）中、Ｒ２は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｒは、１〜８の整数から選択される）
多くの場合、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートを一種類とし、対応するモノマーユニット、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含む、ＰＨＡを製造する。一方では、上述するように、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いることができ、生成されるポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数を用いることが好ましい。一般には、式（１２）で表されるアルカノエートを３種類程度まで原料に用いることで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、３種類以上の多くの種類の原料を利用することも可能である。
【００８９】
また、原料において、式（３）のベンゼン環上、Ｒ２の置換位置は、オルト位（２位または６位）、メタ位（３位または５位）ならびにパラ位（４位）のいずれを選択することも可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換フェノキシ基を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、ベンゼン環上パラ位（４位）に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる方法で生産されるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【００９０】
さらに、本発明者らは、
下記式（１８）：
【００９１】
【化４１】
0003673711.tif 000022
【００９２】
で表される５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで、下記式（９）：
【００９３】
【化４２】
0003673711.tif 000023
【００９４】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）モノマーユニットからなるホモポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【００９５】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、別の一つの態様は、
上記式（１８）で表されるＰＶＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰＶＡを利用して上記式（９）で示される３ＨＰＶモノマーユニットの繰返し単位からなるポリ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（ＰＨＰＶ）ホモポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【００９６】
本発明者らは、また、
下記式（１９）：
【００９７】
【化４３】
0003673711.tif 000024
【００９８】
で表される５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＦＰＶＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで、下記式（７）：
【００９９】
【化４４】
0003673711.tif 000025
【０１００】
で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（３ＨＦＰＶ）モノマーユニットからなるホモポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１０１】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（１９）で表されるＦＰＶＡと酵母エキスとを含む培地で、ＦＰＶＡを利用して上記式（７）で示される３ＨＦＰＶモノマーユニットの繰返し単位からなるポリ−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＰＨＦＰＶ）ホモポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【０１０２】
これまでに、ＦＰＶＡを基質とした、３ＨＦＰＶをモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産の報告例はなく、また、ＰＨＦＰＶのホモポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例もない。従って、上記方法で得られるＰＨＦＰＶは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【０１０３】
本発明者らは、また、
下記式（２１）：
【０１０４】
【化４５】
0003673711.tif 000026
【０１０５】
で表される６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで下記式（１０）及び（１１）：
【０１０６】
【化４６】
0003673711.tif 000027
【０１０７】
で表される３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）及び３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）ユニットからなるコポリマーを生産できる微生物を得ることに成功した。
【０１０８】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、更なる一つの態様は、
上記式（２１）で表されるＰＨｘＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰＨｘＡを利用して上記式（１０）及び（１１）で示される３ＨＰＢ及び３ＨＰＨｘモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【０１０９】
これまでにＰＨｘＡを基質とした、３ＨＰＢ及び３ＨＰＨｘモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産の報告例はなく、また、３ＨＰＢ及び３ＨＰＨｘモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例もない。従って、上記方法で得られる３ＨＰＢ及び３ＨＰＨｘモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【０１１０】
さらには、上記の一連の態様に詳述した方法に加えて、
フェニル基を有する側鎖を所望とする基で置換した下記式（１２）のアルカノエートをモノマー成分の原料として、対応する種々の側鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を利用して選択的に製造することができる。原料として、かかる下記式（１２）のアルカノエートを利用し、下記式（１３）で示されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法も、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法による、前記第一の形態に含まれる。
【０１１１】
【化４７】
0003673711.tif 000028
【０１１２】
（式（１２）中、Ｒは、下記一般式（２）で表される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
【０１１３】
【化４８】
0003673711.tif 000029
【０１１４】
（式（１３）中、Ｒ’は、上記式（１２）においてＲとして選択された基、
ならびに、このＲとして選択された基が、
下記式（２）で示され、ｑ＝ｑ0の基である場合、対応するＲ１を有し、ｑ＝ｑ0−２、ｑ＝ｑ0−４、あるいはｑ＝ｑ0−６の基、
から選択される少なくとも１つ以上の基である。
なお、ｑ0−２、ｑ0−４、あるいはｑ0−６は、１以上の整数値のみを取り得る）
【０１１５】
【化４９】
0003673711.tif 000030
【０１１６】
（式（２）中、Ｒ１は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｑは、１〜８の整数から選択される）
多くの場合、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートを一種類とし、対応するモノマーユニット、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含む、ＰＨＡを製造する。一方では、上述するように、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いることができ、生成されるポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数を用いることが好ましい。一般には、式（１２）で表されるアルカノエートを３種類程度まで原料に用いることで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、３種類以上の多くの種類の原料を利用することも可能である。
【０１１７】
また、原料において、式（２）のベンゼン環上、Ｒ１の置換位置は、オルト位（２位または６位）、メタ位（３位または５位）ならびにパラ位（４位）のいずれを選択することも可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換フェニル基を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、ベンゼン環上パラ位（４位）に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる方法で生産されるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【０１１８】
さらに、本発明者らは、
基質として４−シクロヘキシル酪酸（ＣＨＢＡ）を用い、ＣＨＢＡ及び酵母エキスを含有する培地中で、微生物を培養してポリヒドロキシアルカノエートを生産させ、菌体内に蓄積させると、そのポリヒドロキシアルカノエートは、モノマーユニット中に、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸（３ＨＣＨＢ）を高い比率で含むことを見出し、また、収率も十分に高いものであることを見出した。また、取得した３ＨＣＨＢを含むポリヒドロキシアルカノエートについて、精製処理を行うことにより、３ＨＣＨＢモノマーユニットの繰り返し単位からなるＰＨＣＨＢホモポリマーを分離可能であることを見出した。
【０１１９】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、別の一つの態様は、
３ＨＣＨＢモノマーユニットからなるポリ−３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸（ＰＨＣＨＢ）の製造方法であり、
下記式（２０）：
【０１２０】
【化５０】
0003673711.tif 000031
【０１２１】
で表されるＣＨＢＡおよび酵母エキスを含有する培地で微生物を培養する工程を含むことを特徴とする、下記式（８）：
【０１２２】
【化５１】
0003673711.tif 000032
【０１２３】
で表される３ＨＣＨＢモノマーユニットからなるＰＨＣＨＢホモポリマーの製造方法である。
【０１２４】
これまでに、ＰＨＣＨＢのホモポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例はない。従って、上記方法で得られるＰＨＣＨＢは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【０１２５】
さらには、前記の態様に詳述した方法に加えて、
シクロヘキシル基を有する側鎖を所望とする基で置換した下記式（１２）のアルカノエートをモノマー成分の原料として、対応する種々の側鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を利用して選択的に製造することができる。原料として、かかる下記式（１２）のアルカノエートを利用し、下記式（１３）で示されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法も、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法による、前記第一の形態に含まれる。
【０１２６】
【化５２】
0003673711.tif 000033
【０１２７】
（式（１２）中、Ｒは、下記一般式（４）で表される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
【０１２８】
【化５３】
0003673711.tif 000034
【０１２９】
（式（１３）中、Ｒ’は、上記式（１２）においてＲとして選択された基、
ならびに、このＲとして選択された基が、
下記式（４）で示され、ｓ＝ｓ0の基である場合、対応するＲ３を有し、ｓ＝ｓ0−２、ｓ＝ｓ0−４、あるいはｓ＝ｓ0−６の基、
から選択される少なくとも１つ以上の基である。
なお、ｓ0−２、ｓ0−４、あるいはｓ0−６は、１以上の整数値のみを取り得る）
【０１３０】
【化５４】
0003673711.tif 000035
【０１３１】
（式（４）中、Ｒ３は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｓは、１〜８の整数から選択される）多くの場合、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートを一種類とし、対応するモノマーユニット、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含む、ＰＨＡを製造する。一方では、上述するように、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いることができ、生成されるポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数を用いることが好ましい。一般には、式（１２）で表されるアルカノエートを３種類程度まで原料に用いることで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、３種類以上の多くの種類の原料を利用することも可能である。
【０１３２】
また、原料において、式（４）のシクロヘキシル環上、Ｒ３の置換位置は、１位、２位（または６位）、３位（または５位）ならびに４位のいずれを選択することも可能であり、加えて、ｃｉｓ配置とｔｒａｎｓ配置のどちらをも選択可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換シクロヘキシル環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、シクロヘキシル環上４位に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる方法で生産されるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【０１３３】
さらに、本発明者らは、
下記式（１５）：
【０１３４】
【化５５】
0003673711.tif 000036
【０１３５】
で表される５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）及び下記式（１８）：
【０１３６】
【化５６】
0003673711.tif 000037
【０１３７】
で表される５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）と酵母エキスとを含む培地で培養することで、下記式（６）：
【０１３８】
【化５７】
0003673711.tif 000038
【０１３９】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）モノマーユニット及び下記式（９）：
【０１４０】
【化５８】
0003673711.tif 000039
【０１４１】
で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）モノマーユニットからなるコポリマーを製造し得る微生物を得ることに成功した。
【０１４２】
すなわち、前記第一の形態に含まれる、別の一つの態様は、
上記式（１５）及び（１８）で表されるＰｘＶＡ及びＰＶＡと酵母エキスとを含む培地で、ＰｘＶＡ及びＰＶＡを利用して上記式（６）及び（９）で示される３ＨＰｘＶモノマーユニット及び３ＨＰＶモノマーユニットの繰返し単位からなるポリ−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸／３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）コポリマーを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする方法である。
【０１４３】
これまでにＰｘＶＡ及びＰＶＡを基質とした、３ＨＰｘＶ及び３ＨＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産の報告例はなく、また、３ＨＰｘＶ及び３ＨＰＶモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートの微生物生産に関する報告例もない。従って、上記方法で得られる３ＨＰｘＶ及び３ＨＰＶモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートは新規であり、本発明が提供する新規なポリヒドロキシアルカノエートの発明に含まれる。
【０１４４】
さらには、前記の態様に詳述した方法に加えて、
下記式（１２）のアルカノエートのうちから選択される、複数種の原料アルカノエートを利用し、対応する種々の側鎖を有するモノマーユニット複数種を含むポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を利用して選択的に製造することができる。すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法の第一の形態は、複数種の原料アルカノエートを利用し、対応する種々の側鎖を有するモノマーユニット複数種を含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法の態様をも含む。すなわち、
下記式（１２）：
【０１４５】
【化５９】
0003673711.tif 000040
【０１４６】
（式（１２）中、Ｒは、下記一般式（２）、一般式（３）、あるいは一般式（４）のいずれかで示される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
で表されるアルカノエートと酵母エキスとを含む培地で微生物を培養し、微生物菌体からポリヒドロキシアルカノエートを抽出して、下記式（１３）：
【０１４７】
【化６０】
0003673711.tif 000041
【０１４８】
（式（１３）中、Ｒ’は、上記式（１２）においてＲとして選択された基、
ならびに、このＲとして選択された基が、
下記式（２）で示され、ｑ＝ｑ0の基である場合、対応するＲ１を有し、ｑ＝ｑ0−２、ｑ＝ｑ0−４、あるいはｑ＝ｑ0−６の基、
下記式（３）で示され、ｒ＝ｒ0の基である場合、対応するＲ２を有し、ｒ＝ｒ0−２、ｑ＝ｒ0−４、あるいはｒ＝ｒ0−６の基、
下記式（４）で示され、ｓ＝ｓ0の基である場合、対応するＲ３を有し、ｓ＝ｓ0−２、ｓ＝ｓ0−４、あるいはｓ＝ｓ0−６の基、
から選択される少なくとも１つ以上の基である。
なお、ｑ0−２、ｒ0−２あるいはｓ0−２、ｑ0−４、ｒ0−４あるいはｓ0−４、ｑ0−６、ｒ0−６あるいはｓ0−６は、１以上の整数値のみを取り得る）
【０１４９】
【化６１】
0003673711.tif 000042
【０１５０】
（式（２）中、Ｒ１は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｑは、１〜８の整数から選択される；
式（３）中、Ｒ２は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｒは、１〜８の整数から選択される；
式（４）中、Ｒ３は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｓは、１〜８の整数から選択される）
で表される少なくとも１以上のモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。特には、原料とする少なくとも１以上のアルカノエートに対応した側鎖を保持するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とする製造方法である。つまり、複数種の原料アルカノエートを利用する際にも、ポリヒドロキシアルカノエート中に取り込まれうるモノマーユニットとして、選択された式（１２）に示すアルカノエート複数種に応じて、モノマーユニットの側鎖構造が各アルカノエートに対応した少なくとも１つ以上の側鎖構造を有することを特徴とするモノマーユニットを有する、特には、各アルカノエートに由来する各一種のモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【０１５１】
この方法においては、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートを一種類とし、対応するモノマーユニット、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含む、ＰＨＡを製造することができる。また、上述するように、原料となる式（１２）で表されるアルカノエートは培養時に複数種を用いることもでき、その際には、生成されるポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数を用いることが好ましい。一般には、式（１２）で表されるアルカノエートを５種類程度まで原料に用いることで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、５種類以上の多くの種類の原料を利用することも可能である。例えば、上記の一般式（２）、一般式（３）ならびに一般式（４）の三種をいずれをも含み、それぞれ３種類程度までを選択し、合計して、５種類を超える原料を用いることも可能である。
【０１５２】
また、一般式（２）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ１、ならびに一般式（３）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ２は、オルト位（２位または６位）、メタ位（３位または５位）ならびにパラ位（４位）のいずれを選択することも可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換ベンゼン環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、ベンゼン環上パラ位（４位）に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。同じく、一般式（４）のシクロヘキシル環上、Ｒ３の置換位置は、１位、２位（または６位）、３位（または５位）ならびに４位のいずれを選択することも可能であり、加えて、ｃｉｓ配置とｔｒａｎｓ配置のどちらをも選択可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換シクロヘキシル環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、シクロヘキシル環上４位に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる方法で生産されるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【０１５３】
以上に代表的な態様を示して、詳述してきたように、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法においては、原料として、アルカノエートの側鎖を所望とする基で置換した誘導体を用いることで、モノマー成分として、対応する種々の側鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を利用して選択的に製造することができる。従って、本発明は、かかる方法により得られる、下記一般式（１）で示されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートの発明も提供する。すなわち、本発明にかかる新規なポリヒドロキシアルカノエートは、下記一般式（１）で示されるモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートである。
【０１５４】
【化６２】
0003673711.tif 000043
【０１５５】
（式（１）中、Ｒは、下記一般式（２）、一般式（３）、あるいは一般式（４）のいずれかで示される基から選択される少なくとも１つ以上の基である）
【０１５６】
【化６３】
0003673711.tif 000044
【０１５７】
（式（２）中、Ｒ１は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｑは、１〜８の整数から選択される；
式（３）中、Ｒ２は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｒは、１〜８の整数から選択される；
式（４）中、Ｒ３は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−CN、−NO2、−CF3、−C2F5、−C3F7から選択される基であり、ｓは、１〜８の整数から選択される；
但し、上記一般式（１）におけるＲとして、
一種の基を選択する際には、
式（２）において、Ｒ１＝Ｈでｑ＝２の基、Ｒ１＝Ｈでｑ＝３の基、
式（３）において、Ｒ２＝ハロゲン原子でｒ＝２の基、Ｒ２＝−ＣＮでｒ＝３の基、Ｒ２＝−ＮＯ2でｒ＝３の基、
は、選択肢からは除外され、
二種の基を選択する際には、
式（２）において、Ｒ１＝Ｈでｑ＝３及び５の二種の基の組み合わせ、
式（３）において、Ｒ２＝Ｈでｒ＝１及び３の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝Ｈでｒ＝２及び４の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝Ｈでｒ＝２及び６の二種の基の組み合わせ、Ｒ２＝ハロゲン原子でｒ＝２及び４の二種の基の組み合わせ、
は、選択肢からは除外され、
三種の基を選択する際には、
式（２）において、Ｒ１＝Ｈでｑ＝３、５及び７の三種の基の組み合わせ、
式（３）において、Ｒ２＝Ｈでｒ＝１、３及び５の三種の基の組み合わせ、Ｒ２＝Ｈでｒ＝２、４及び６の三種の基の組み合わせ、
は、選択肢からは除外される）
まお、前記のように本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、一般式（１）で表されるモノマーユニットを一種類含むものの他、複数種を含むことができるが、目的とするポリマーにおいて必要とする機能、物性などを考慮した上、適当な種類数のモノマーユニットを選択すると良い。一般には、式（１）で表されるモノマーユニットを合計１０種類程度含むように選択することで、前記の目的を十分に達成することが期待できる。さらに、機能性、物性を微妙に制御することを目的として、１０種類を超える多くの種類のモノマーユニットを含む構成とすることも可能である。
【０１５８】
例えば、かかる一般式（１）で表されるモノマーユニットを複数種を含むポリヒドロキシアルカノエートを微生物に生産させる際には、原料のアルカノエートに対応するモノマーユニットの他、場合によっては、付随する炭素鎖の減少した副生モノマーユニットをも含むものとなる。従って、原料のアルカノエート自体は５種類程度であっても、それぞれ、副生物のモノマーユニットを含め二種以上のモノマーユニットを与える結果、合計して１０種類以上のモノマーユニットを含むＰＨＡとなるものも、本発明に包含される。さらには、例えば、上記の一般式（２）、一般式（３）ならびに一般式（４）の三種をいずれをも含み、それぞれ３種類程度までを選択し、合計して、１０種類程度の原料アルカノエートの種類となり、若干の副生物モノマーユニットを含めて、１０種類以上のモノマーユニットを含むＰＨＡとなるものも、本発明に包含される。
【０１５９】
また、一般式（２）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ１、ならびに一般式（３）におけるベンゼン環上の置換基Ｒ２は、オルト位（２位または６位）、メタ位（３位または５位）ならびにパラ位（４位）のいずれを選択することも可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換ベンゼン環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を原料に選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、ベンゼン環上パラ位（４位）に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適に用いることができる。同じく、一般式（４）のシクロヘキシル環上、Ｒ３の置換位置は、１位、２位（または６位）、３位（または５位）ならびに４位のいずれを選択することも可能であり、加えて、ｃｉｓ配置とｔｒａｎｓ配置のどちらをも選択可能である。得られるポリヒドロキシアルカノエートは、対応する置換シクロヘキシル環を有するモノマーユニットを含むものとなる。何れの異性体を選択するかは、目的とする機能性、物性に応じて、適宜選択されるものである。なお、前記の機能性、物性における相違が問題とならない場合、シクロヘキシル環上４位に置換基を有するものが、通常、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さの点において、無置換のものと遜色なく、より好適である。なお、かかる微生物により生産されるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマーユニットの３位の炭素原子は、キラル中心となるが、一般に、Ｒ−体のみから構成されるポリマーであり、従って、アイソタクチックなポリマーである。その結果、かかる微生物を利用する方法で生産できるＰＨＡは、生分解性を有するポリマーとなる。
【０１６０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＨＡの製造方法は、微生物を培養する際、培地に原料の式（１２）のアルカノエートに加えて、酵母エキスを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中にＰＨＡの原料となるアルカノエート以外の炭素源として、酵母エキスのみを添加することにより得られている。
【０１６１】
微生物によるＰＨＡの製造に際して、培地に酵母エキスを利用する例として、特開平５−４９４８７号公報に記載の、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）に属する微生物を用いた方法が挙げられる。しかしながら、この従来方法は、置換基を有しないヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする、一般的なＰＨＢ及びＰＨＶを生産する方法である。本発明の目的とするようなＰＨＡの生合成経路は、ＰＨＢ及びＰＨＶを生産する生合成経路とは独立した経路であることが知られており、特開平５−４９４８７号公報においては本発明の目的とするようなＰＨＡの合成経路における酵母エキスの効果については何ら言及がない。また、酵母エキスの効果も、微生物が一般的に生産するＰＨＢ及びＰＨＶに関して、酵母エキスを添加すると、単に菌体内のＰＨＡ蓄積量の増大が図られる効果があることを示すのみであり、増殖のために酵母エキスが添加されているわけではないことが明記されている。本発明は式（１２）のアルカノエートと酵母エキスを共存させることで増殖とともにＰＨＡの産生・蓄積を行うものであり、酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。さらに本発明の効果である、特定のモノマーユニットの優占化について何ら言及されておらず、本発明のように、微生物が生産するＰＨＡ組成における、フェノキシ基、フェニル基及びシクロヘキシル基を置換基として有する特定のモノマーユニットの優占化という効果は示していない。
【０１６２】
さらに、微生物によるＰＨＡの生産に酵母エキスを利用する例としては、前述の特許第２９８９１７５号公報に記載のシュードモナス・プチダを用いた方法が挙げられる。ここで開示されているＰＨＡの製造方法は２段階培養によるものであり、ＰＨＡの蓄積は２段階目の培養においてのみ、炭素源以外の栄養源の制限下で行うことが開示されている。この点で、本発明における、式（１２）のアルカノエートと酵母エキスを含む培地での１段階の培養のみで、所望のＰＨＡの合成・蓄積を行う方法とは構成／効果ともに全く異なる。また、特許第２９８９１７５号における酵母エキスの効果は、２段階培養を用いる際、１段階目の培養において、単に２段階目の培養に用いる微生物の増殖のみを目的としたものであり、１段階目は栄養源の豊富な条件下で培養されると明記されている。ここで、ＰＨＡの基質は１段階目には共存していない。本発明における２段階培養での酵母エキスの効果は、１段階目の培養において式（１２）のアルカノエートと酵母エキスを共存させることで増殖とともにＰＨＡの産生・蓄積を行うものであり、１段階目の培養における酵母エキスの発揮する効果が全く異なる。また、特許第２９８９１７５号では１段階目の培養に炭素源としてクエン酸、オクタン酸、ノナン酸のいずれかが共存しており、式（１２）のアルカノエートと酵母エキスのみを共存させる本発明とは、構成においても異なるものである。
【０１６３】
また、本発明中の３ＨＰｘＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する微生物の報告例として、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, ２９, ３４３２−３４３５,１９９６に記載の、シュードモナス・オレオボランスを用いた方法がある。しかしながら、このシュードモナス・オレオボランスを用いる方法は、８−フェノキシオクタン酸（ＰｘＯＡ）のみを基質として用いるものであり、本発明の、例えば、β酸化によりアセチル−ＣｏＡを生成し得ない、ＰｘＢＡを基質として酵母エキスと共に用いる方法とは全く異なっている点で、本質的な差異を持つものである。さらに、合成されるＰＨＡは、基質であるＰｘＯＡ由来の３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸及び３ＨＰｘＢの３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。それに対して、本発明の方法では、酵母エキスを用いることでＰｘＢＡ由来の３ＨＰｘＢのみをフェノキシ基含有モノマーユニットとして含むＰＨＡの製造についても可能となっており、この製造されるＰＨＡ自体も、前述の報告例と本発明とでは、明確に異なっている。また、ＰｘＢＡを基質とした、３ＨＰｘＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡの微生物生産の報告例はなく、また、３ＨＰｘＢのみをフェノキシ基含有モノマーユニットとして含むＰＨＡの微生物生産に関する報告例もない。
【０１６４】
以下に、本発明の製造方法をより詳しく説明する。
【０１６５】
本発明に用いる微生物としては、式（１２）のアルカノエートを基質とし、当該アルカノエートからＰＨＡを生産・蓄積しうる微生物であればいかなる微生物でもよいが、本発明者らの研究によると、シュードモナス属の細菌が良く、その中でもシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１１）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  Ｈ４５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１０）、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４０９）及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４４５）が好ましい微生物であることを見出した。なお、これらの菌株以外のものでも、当該アルカノエートを基質とした培養によって、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌のスクリーニングを行うことで、本発明のＰＨＡの製造方法に利用し得る微生物を得ることも可能である。例えばシュードモナス属の細菌としては、シュードモナス・オレオボランスを利用することが可能である。また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓｓｐ.）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）属などに属し、当該アルカノエートを原料（基質）として用いて、対応する３−ヒドロキシ−アルカノエートをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。しかしながら、生産能力などの点を考慮すると、上記の４種の菌株を好ましい菌株として挙げることができる。
【０１６６】
以下にＹＮ２株、Ｈ４５株、Ｐ９１株及びＰ１６１株についての詳細を示す。
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
培養温度                ：30℃
形態学的性質
細胞形態                ：棹菌、０．８μｍ×（１．５〜２．０）μｍ
グラム染色              ：陰性
胞子形成                ：陰性
運動性                  ：陽性
コロニー形状            ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
生理学的性質
カタラーゼ              ：陽性
オキシダーゼ            ：陽性
Ｏ／Ｆ試験              ：非発酵性
硝酸還元                ：陰性
インドール産生          ：陽性
ブドウ糖酸性化          ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
ウレアーゼ              ：陰性
エスクリン加水分解      ：陰性
ゼラチン加水分解        ：陰性
β−ガラクトシダーゼ    ：陰性
基質資化能
ブドウ糖                ：陽性
Ｌ−アラビノース        ：陽性
Ｄ−マンノース          ：陰性
Ｄ−マンニトール        ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン  ：陰性
マルトース              ：陰性
グルコン酸カリウム      ：陽性
ｎ−カプリン酸          ：陽性
アジピン酸              ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸          ：陽性
クエン酸ナトリウム      ：陽性
酢酸フェニル            ：陽性
King'sB寒天での蛍光色産生      ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育            ：陽性(弱)
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積  ：陰性（＊）
Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解        ：陽性
＊  nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
＜Ｈ４５株の菌学的性質＞
形態学的性質
細胞の形と大きさ        ：桿菌、０．８μｍ×（１．０〜１．２）μｍ
細胞の多形性            ：なし
運動性                  ：あり
胞子形成                ：なし
グラム染色性            ：陰性
コロニー形状            ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
生理学的性質
カタラーゼ              ：陽性
オキシダーゼ            ：陽性
Ｏ／Ｆ試験              ：酸化的
硝酸塩の還元            ：陰性
インドールの生成        ：陰性
ブドウ糖酸性化          ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
ウレアーゼ              ：陰性
エスクリン加水分解      ：陰性
ゼラチン加水分解        ：陰性
β−ガラクトシダーゼ    ：陰性
King'sB寒天での蛍光色素産生：陽性
４％ＮａＣｌでの生育    ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
基質資化能
ブドウ糖                ：陽性
Ｌ−アラビノース        ：陰性
Ｄ−マンノース          ：陽性
Ｄ−マンニトール        ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース              ：陰性
グルコン酸カリウム      ：陽性
ｎ−カプリン酸          ：陽性
アジピン酸              ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸          ：陽性
クエン酸ナトリウム      ：陽性
酢酸フェニル            ：陽性
＜Ｐ９１株の菌学的性質＞
形態学的性質
細胞の形と大きさ        ：桿菌、０．６μｍ×１．５μｍ
細胞の多形性            ：なし
運動性                  ：あり
胞子形成                ：なし
グラム染色性            ：陰性
コロニー形状            ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
生理学的性質
カタラーゼ              ：陽性
オキシダーゼ            ：陽性
Ｏ／Ｆ試験              ：酸化型
硝酸塩の還元            ：陰性
インドールの生成        ：陰性
ブドウ糖酸性化          ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ              ：陰性
エスクリン加水分解      ：陰性
ゼラチン加水分解        ：陰性
β−ガラクトシダーゼ    ：陰性
King'sB寒天での蛍光色素産生：陽性
基質資化能
ブドウ糖                ：陽性
Ｌ−アラビノース        ：陰性
Ｄ−マンノース          ：陰性
Ｄ−マンニトール        ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
マルトース              ：陰性
グルコン酸カリウム      ：陽性
ｎ−カプリン酸          ：陽性
アジピン酸              ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸          ：陽性
クエン酸ナトリウム      ：陽性
酢酸フェニル            ：陽性
＜Ｐ１６１株の菌学的性質＞
形態学的性質
細胞の形と大きさ        ：球状、φ０．６μｍ／桿状、０．６μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性          ：あり（伸長型）
運動性                ：あり
胞子形成              ：なし
グラム染色性          ：陰性
コロニー形状          ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色
生理学的性質
カタラーゼ              ：陽性
オキシダーゼ            ：陽性
Ｏ／Ｆ試験              ：酸化型
硝酸塩の還元            ：陽性
インドールの生成        ：陰性
ブドウ糖酸性化          ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ              ：陰性
エスクリン加水分解      ：陰性
ゼラチン加水分解        ：陰性
β−ガラクトシダーゼ    ：陰性
King'sB寒天での蛍光色素産生：陽性
基質資化能
ブドウ糖                ：陽性
Ｌ−アラビノース        ：陽性
Ｄ−マンノース          ：陽性
Ｄ−マンニトール        ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース              ：陰性
グルコン酸カリウム      ：陽性
ｎ−カプリン酸          ：陽性
アジピン酸              ：陰性
ｄｌ−リンゴ酸          ：陽性
クエン酸ナトリウム      ：陽性
酢酸フェニル            ：陽性
【０１６７】
以上の菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ'Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌｕｍｅ1）（１９８４年）及びバージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ' Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９４年）に基づいて検索したところ、ＹＮ２株及びＨ４５株は、シュードモナス・チコリアイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）に、また、Ｐ９１株は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に、それぞれ属すると判明した。従って、これらの菌株をシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株とそれぞれ命名した。
【０１６８】
一方、Ｐ１６１株は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）に属すると判明したものの、その菌学的性質から分類学上の位置を確定するには至らなかった。そこで、遺伝的性質からの分類を試みるために、図１２に示すＰ１６１株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定し（配列番号：１、ｃＤＮＡ ｔｏ ｒＲＮＡ）、公知のシュードモナス属微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列との相同性を調べた。その結果、Ｐ１６１株とシュードモナス・ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ）との間で、塩基配列の相同性が極めて高いことが判明した。さらに、Ｓｙｓｔｅｍ. Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.,２０, １３７−１４９ （１９９７）、及び、Ｓｙｓｔｅｍ. Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ., ２２, ４５−５８ （１９９９）に記載されたシュードモナス・ジェッセニイの菌学的性質と、Ｐ１６１株の菌学的性質との間で高い類似性も認められた。以上の結果から、Ｐ１６１株はシュードモナス・ジェッセニイに属せしめるのが妥当と判断されたため、Ｐ１６１株をシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株と命名した。
【０１６９】
なお、ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１１」として、Ｈ４５株は寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１０」として、Ｐ９１株は寄託番号「ＦＥＲＭＰ−１７４０９」として、Ｐ１６１株は寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４４５」として、通商産業省  工業技術院  生命工学工業技術研究所（生命研ＮＩＢＨ特許微生物寄託センター）にそれぞれ寄託されている。
【０１７０】
これらの微生物を、所望とするモノマーユニット導入用の原料、一般式（１２）のアルカノエートと酵母エキスを含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを製造することができる。
【０１７１】
本発明のＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、菌数や活性状態の確保のための培養などには、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地や栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、撹拌などの培養条件は用いる微生物に応じて適宜選択する。
【０１７２】
一方、微生物を用いてＰＨＡを生産・蓄積させる場合は、ＰＨＡ生産用の培地として、対応する一般式（１２）のアルカノエートを少なくとも含んだ無機培地を用いることができる。その際、ＰＨＡの原料となるアルカノエート以外の炭素源／エネルギー源としては、酵母エキスのみを添加することが特徴である。
【０１７３】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物の増殖に必須な成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、代表的な無機培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２１８，  ９７−１０６  （１９５６））、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【０１７４】
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０１７５】
Ｎａ2ＨＰＯ4：６．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4：３．０ｇ
ＮａＣｌ：０．５ｇ
ＮＨ4Ｃｌ：１．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
培養条件としては、例えば、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃で、好気条件下での振盪培養や撹拌培養が挙げられる。
【０１７６】
培養工程は、バッチ式、流動バッチ式、半連続培養、連続培養、リアクター形式など、通常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができ、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１７７】
例えば、二段階の培養工程を含む方法としては、一段階目では、増殖用炭素源として酵母エキスを０．１重量％から１．０重量％程度、及び、式（１２）のアルカノエートを０．０１重量％から０．５重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期に達する時点まで培養し、二段階目では、一段階目での培養終了後の菌体を遠心分離等で回収したのち、原料の式（１２）のアルカノエートを０．０１重量％から０．５重量％程度含んだ、窒素源が存在しない無機培地で更に培養し、培養終了後、菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法がある。
【０１７８】
また、酵母エキスを０．１重量％から１．０重量％程度、及び、式（１２）のアルカノエートを０．０１重量％から０．５重量％程度を加えた無機培地で培養し、対数増殖後期から定常期に達した時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出する方法もある。
【０１７９】
その際、培地に添加する酵母エキス濃度は、式（１２）のアルカノエートの種類、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を、０．１重量％から１．０重量％程度に選択して、添加するとよい。また、酵母エキスは、微生物の培養などに汎用される市販の酵母エキス何れについても、好適に用いることが可能である。また、酵母エキスに代えて、酵母エキスの成分を当然に含んでいる、酵母の凍結乾燥物を粉砕したものなどを用いることも可能である。一方、原料となる式（１２）のアルカノエートの濃度も、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を０．０１重量％から０．５重量％程度に選択して、添加するとよい。
【０１８０】
なお、先に記載したＹＮ２株、Ｈ４５株、Ｐ９１株及びＰ１６１株のいずれかを用いる場合において、酵母エキスに代えて、例えば、Ｃ6〜Ｃ12の中鎖脂肪酸（例えばオクタン酸やノナン酸等）を増殖用炭素源として用いた場合、添加されている中鎖の脂肪酸に由来するモノマーユニットが混在したＰＨＡが取得されてくる。具体的には、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸等の中鎖の脂肪酸を加え、原料として式（１２）のアルカノエートを添加した無機培地等で、対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、中鎖の脂肪酸と式（１２）のアルカノエートとを添加し、窒素源が存在しない無機培地で更に培養する方法を用いた場合が挙げられる。あるいは、無機培地中の窒素源濃度を１／１０程度に制限し、中鎖の脂肪酸と式（１２）のアルカノエートとを加えた培地で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して、所望のＰＨＡを抽出する方法を用いた場合が挙げられる。これら増殖用炭素源として、中鎖の脂肪酸を培地に添加する方法を用いる場合には、取得されるＰＨＡは、増殖用炭素源として添加されている、中鎖の脂肪酸に由来するモノマーユニットが混在しているＰＨＡとなっている。
【０１８１】
これに対して、本発明では、先に述べた通り、酵母エキスと式（１２）のアルカノエートとを含み、その他に炭素源を含まない培地で上記微生物を培養することによって、目的とする式（１２）のアルカノエートに由来するモノマーユニット以外の、不要なモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない、所望のＰＨＡが生産・蓄積される。
【０１８２】
本発明の方法における菌体からのＰＨＡの回収は、通常行われているクロロホルム等の有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１８３】
なお、微生物の培養、微生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
例えば、本発明にかかるＰＨＡの製造方法に利用される微生物は上記の４種の菌株以外でも、これら４種の菌株と同様の本発明にかかるＰＨＡ生産の生産能を有する微生物を用いることができる。
【０１８４】
上記の方法を利用することで、先に式（１）で示す繰返し単位を有するＰＨＡを得ることができる。このＰＨＡの数平均分子量は少なくとも１万以上であることが望ましく、１万〜２０万の範囲であることが好ましい。すなわち、このＰＨＡにおいて、ポリマーとして所望の特性を安定に得る上では、具体的には、ポリマーを構成するモノマーユニットの構造により規定されるガラス転移温度、軟化点、融点、結晶性、配向性などの特性を一定の範囲とする上では、少なくとも数平均分子量が１万程度となる繰り返し数を有することが望ましい。一方、加工等において、溶解操作などの処理の簡便性から、数平均分子量が２０万程度までであることが好ましい。通常、１万〜１０万の範囲とすると、より好ましい。また、本発明の製造方法で得られるＰＨＡの数平均分子量は、１万以上、おおよそ２万以上であり、前記のポリマーとしての安定した物性の発現を十分に期待できる範囲内にある。
【０１８５】
【実施例】
以下に、具体例を示し、本発明をより詳しく説明する。これらの具体例は、本発明における最良の態様の一例であるが、本発明は以下の具体例によってなんら限定されるものではない。
Ａ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（１４）の４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）を原料とする、式（５）で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（ＨＰｘＢＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（ＰＨＰｘＢ）の製造に適用した一例を示す。
【０１８６】
（実施例Ａ−１）
酵母エキス０．５％、ＰｘＢＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＰｘＢＡ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１８７】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０１８８】
表３に同定結果と平均分子量を示す。得られたＰＨＡは、そのモノマーユニットとして、式（５）で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸に由来するモノマーユニットのみを含み、ポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸であることが判る。
【０１８９】
【表３】
0003673711.tif 000045
【０１９０】
（実施例Ａ−２）
酵母エキス０．５％、ＰｘＢＡ０．２％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１９１】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表４に同定結果を示す。得られたＰＨＡは、そのモノマーユニットとして、式（５）で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸に由来するモノマーユニットのみを含み、ポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸であることが判る。
【０１９２】
【表４】
0003673711.tif 000046
【０１９３】
（実施例Ａ−３）
Ｐ９１株の培養菌体から回収したＰＨＡについて、核磁気共鳴装置（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００）を用いて、以下の条件で分析した。
【０１９４】
測定核種：1Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り）。
【０１９５】
その測定結果を図１に、また、表５に各信号の解析結果（帰属）を示す。表５には、下記する３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸この結果から、ＰＨＡは、式（５）で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸に由来するモノマーユニットのみを含み、ポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸であることが確認される。
【０１９６】
【表５】
0003673711.tif 000047
【０１９７】
Ｂ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（１５）の５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）を原料とする、式（６）で表される３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（ＨＰｘＶＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（ＰＨＰｘＶ）の製造に適用した一例を示す。
【０１９８】
（実施例Ｂ−１）  ＰｘＶＡの合成
三つ口丸底フラスコに、２４０ｍｌの脱水アセトンを入れ、ヨウ化ナトリウム（０．０６モル）、炭酸カリウム（０．１１モル）及びフェノール（０．０７モル）を加え、十分に攪拌した。この溶液中に、５−ブロモ吉草酸エチルエステル（０．０６モル）を、窒素雰囲気下で滴下し、６０±５℃で還流し、２４時間反応させた。反応終了後、反応液をエバポレーターで濃縮乾固させ、塩化メチレンに再溶解し、溶液に水を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後エバポレーターで濃縮乾固した。得られた乾燥物（反応物）に熱メタノールを加えて溶解させ、ゆっくり冷却して再沈殿させ、５−フェノキシ吉草酸エチルエステル（ＰｘＶＡ）を得た。この時点での、このエステルの５−ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、７２モル％であった。
【０１９９】
得られた反応物（エステル）を５重量％になるようにエタノール-水（９：１（ｖ／ｖ））に溶解し、１０倍モル量の水酸化カリウムを加えて、０〜４℃で４時間反応させ、エステルの加水分解を行った。この反応液を１０倍量の０．１Ｍ塩酸水溶液に注加し、沈殿物をろ過により回収した。回収した沈澱物（反応物）は室温で３６時間減圧乾燥した。得られた乾燥物を少量の熱エタノールに溶解させ、溶液を徐々に冷却して再沈殿させて室温で２４時間減圧乾燥し、目的の化合物である５−フェノキシ吉草酸を得た。この目的化合物の５−ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、５３モル％であった。
【０２００】
得られた化合物の核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）による分析を以下の条件で行った。
＜使用機器＞
FT-NMR：Bruker DPX400
1H共鳴周波数：400MHz
＜測定条件＞
測定核種：1H
使用溶媒：CDCl3
reference：キャピラリ封入TMS/CDCl3
測定温度：室温
図２にスペクトルのチャートを、表６に同定結果を示す。
【０２０１】
【表６】
0003673711.tif 000048
【０２０２】
この結果から、確かに所望のＰｘＶＡが合成されている事が確認された。
【０２０３】
（実施例Ｂ−２）  Ｐ９１株によるＰＨＰｘＶホモポリマーの製造
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５重量％、ＰｘＶＡ  ０．１重量％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＰｘＶＡ  ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０２０４】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、これを秤量した。菌体及びポリマーの収率を表７に示す。
【０２０５】
【表７】
0003673711.tif 000049
【０２０６】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。即ち、ＰＨＡサンプル５ｍｇを２５ ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、メインのピークは一本であり、そのマススペクトルから３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸のメチルエステル化物であることがわかった。また、その他の微量成分はＰＨＡのモノマーユニットとは無関係のものであった。ＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）及びメインピークのマススペクトルを図３に示す。
【０２０７】
また、得られたポリマーを以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜使用機器＞
FT-NMR：Bruker DPX400
1H共鳴周波数：400MHz
＜測定条件＞
測定核種：1H
使用溶媒：CDCl3
reference：キャピラリ封入TMS/CDCl3
測定温度：室温
図４にスペクトルのチャートを、表８に同定結果を示す。
【０２０８】
【表８】
0003673711.tif 000050
【０２０９】
更に、得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリマーラボラトリー ＰＬｇｅｌＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝７００００、Ｍｗ＝１２１０００であった。
【０２１０】
以上の結果より、本発明の方法により、ＰｘＶＡを原料とする、ポリ−３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸のホモポリマー、及びその製造方法が示された。
【０２１１】
（実施例Ｂ−３）  Ｈ４５株によるＰＨＰｘＶホモポリマーの製造
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５重量％、ＰｘＶＡ  ０．１重量％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０２１２】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、これを秤量した。菌体及びポリマーの収率を表９に示す。
【０２１３】
【表９】
0003673711.tif 000051
【０２１４】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。即ち、ＰＨＡサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、メインのピークは一本であり、そのマススペクトルから３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸のメチルエステル化物であることがわかった。また、その他の微量成分はＰＨＡのモノマーユニットとは無関係のものであった。ＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）及びメインピークのマススペクトルを図５に示す。
【０２１５】
更に、得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリマーラボラトリー ＰＬｇｅｌＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝６４０００、Ｍｗ＝１１６０００であった。
【０２１６】
以上の結果より、本発明の方法により、ＰｘＶＡを原料とする、ポリ−３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸のホモポリマー、及びその製造方法が示された。
Ｃ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（１７）の５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸（ＦＰｘＶＡ）を原料とする、式（１６）で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸（ＨＦＰｘＶＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸（ＰＨＦＰｘＶ）の製造に適用した一例を示す。
【０２１７】
（実施例Ｃ−１）  ＦＰｘＶＡの合成
三つ口丸底フラスコに、２４０ｍｌの脱水アセトンを入れ、ヨウ化ナトリウム（０．０６モル）、炭酸カリウム（０．１１モル）及び４−フルオロフェノール（０．０７モル）を加え、十分に攪拌した。この溶液中に、５−ブロモ吉草酸エチルエステル（０．０６モル）を、窒素雰囲気下で滴下し、６０±５℃で還流し、２４時間反応させた。反応終了後、反応液をエバポレーターで濃縮乾固させ、塩化メチレンに再溶解し、水を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後、エバポレーターで濃縮乾固して反応物を得た。
【０２１８】
得られた反応物に、熱メタノールを加えて溶解させ、溶液をゆっくり冷却して再沈殿させ、５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸エチルエステルを得た。この時点での、５−ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、６８モル％であった。
【０２１９】
得られた反応物（エステル）を５重量％になるようにエタノール-水（９：１（ｖ／ｖ））に溶解し、１０倍モル量の水酸化カリウムを加えて、０〜４℃で４時間反応させ、エステルの加水分解を行った。
【０２２０】
この反応液を１０倍量の０．１Ｍ塩酸水溶液に注加し、沈殿物をろ過により回収した。回収した沈澱物（反応物）は室温で３６時間減圧乾燥した。得られた乾燥物を少量の熱エタノールに溶解させ、溶液を徐々に冷却して再沈殿させて室温で２４時間減圧乾燥し、目的の化合物である、式（１７）で表される５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸を得た。この化合物の５−ブロモ吉草酸エチルエステルに対する収率は、４９モル％であった。
【０２２１】
得られた化合物について、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
＜使用機器＞
FT-NMR：Bruker DPX400
1H共鳴周波数：400MHz
＜測定条件＞
測定核種：1H
使用溶媒：CDCl3
reference：キャピラリ封入TMS/CDCl3
測定温度：室温
図６に1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを、表１０に同定結果を示す。
【０２２２】
【表１０】
0003673711.tif 000052
【０２２３】
以上の結果から、確かに所望のＦＰｘＶＡが合成されている事が確認された。
【０２２４】
（実施例Ｃ−２）  Ｐ９１株によるＰＨＦＰｘＶホモポリマーの製造
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５重量％と、ＦＰｘＶＡ  ０．１重量％を含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰｘＶＡ  ０．１重量％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０２２５】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、これを秤量した。菌体及びポリマーの収率を表１１に示す。
【０２２６】
【表１１】
0003673711.tif 000053
【０２２７】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。即ち、ＰＨＡサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、メインのピークは一本であり、そのマススペクトルから３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸のメチルエステル化物であることがわかった。また、その他の微量成分はＰＨＡのモノマーユニットとは無関係のものであった。３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸のメチルエステルのＴＩＣ及びマススペクトルを図７に示す。
【０２２８】
更に、得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー  ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリマーラボラトリー  ＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝６８０００、Ｍｗ＝１２００００であった。
【０２２９】
更に、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いて以下の条件で得られたＰＨＡの構造解析を行った。
＜使用機器＞
FT-NMR：Bruker DPX400
1H共鳴周波数：400MHz
＜測定条件＞
測定核種：1H
使用溶媒：CDCl3
reference：キャピラリ封入TMS/CDCl3
測定温度：室温
図８に1H−ＮＭＲスペクトルチャートを、表１２に同定結果を示す。
【０２３０】
【表１２】
0003673711.tif 000054
【０２３１】
以上の結果により、本発明の方法により、ＦＰｘＶＡを原料とする、ポリ−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸のホモポリマー、及びその製造方法が示された。
【０２３２】
（実施例Ｃ−３）  Ｈ４５株によるＰＨＦＰｘＶホモポリマーの製造
酵母エキス（ＤＩＦＣＯ製）０．５重量％、ＦＰｘＶＡ  ０．１重量％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０２３３】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、これを秤量した。菌体及びポリマーの収率を表１３に示す。
【０２３４】
【表１３】
0003673711.tif 000055
【０２３５】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。即ち、ＰＨＡサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、メインのピークは一本でありそのマススペクトルから３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸のメチルエステル化物であることがわかった。ＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）及びメインピークのマススペクトルを図９に示す。
【０２３６】
更に、得られたＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリマーラボラトリー  ＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝６７０００、Ｍｗ＝１１９０００であった。
【０２３７】
以上に結果より、本発明の方法により、ＦＰｘＶＡを原料とする、ポリ−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸のホモポリマー、及びその製造方法が示された。
Ｄ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（１８）の５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）を原料とする、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（ＨＰＶＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（ＰＨＰＶ）の製造に適用した一例を示す。
【０２３８】
（実施例Ｄ−１）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％とＰＶＡ０．０５％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２３９】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。表１４に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。
【０２４０】
【表１４】
0003673711.tif 000056
【０２４１】
表１４の結果から、菌体から抽出・回収されたポリマーは、ＰＨＡモノマーユニットとして、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸に由来するモノマーユニットのみを含むことが確認される。
【０２４２】
（実施例Ｄ−２）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％とＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＰＶＡ０．２％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２４３】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。表１５に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。
【０２４４】
【表１５】
0003673711.tif 000057
【０２４５】
表１５の結果から、菌体から抽出・回収されたポリマーは、ＰＨＡモノマーユニットとして、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸に由来するモノマーユニットのみを含むことが確認される。
【０２４６】
（実施例Ｄ−３）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％とＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＰＶＡ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２４７】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。表１６に、同定結果、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。
【０２４８】
【表１６】
0003673711.tif 000058
【０２４９】
表１６の結果から、菌体から抽出・回収されたポリマーは、ＰＨＡモノマーユニットとして、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸に由来するモノマーユニットのみを含むことが確認される。
【０２５０】
（実施例Ｄ−４）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％とＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＰＶＡ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２５１】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。また、このＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。表１７に、同定結果、平均分子量、ならびに凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、収率を示す。
【０２５２】
【表１７】
0003673711.tif 000059
【０２５３】
表１７の結果から、菌体から抽出・回収されたポリマーは、ＰＨＡモノマーユニットとして、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸に由来するモノマーユニットのみを含むことが確認される。
【０２５４】
（実施例Ｄ−５）
Ｈ４５株により産生されたＰＨＰＶについて、核磁気共鳴装置（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００）を用いて、以下の条件で分析した。測定核種：1Ｈ，13Ｃ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り）。その測定結果を、図１０に1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定結果、表１８にその帰属を、図１１に13Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定結果、表１９にその帰属をそれぞれ示す。
【０２５５】
【表１８】
0003673711.tif 000060
【０２５６】
【表１９】
0003673711.tif 000061
【０２５７】
この測定結果からも、菌体から抽出・回収されたポリマーは、ＰＨＡモノマーユニットとして、式（９）で表される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸に由来するモノマーユニットのみを含んでなる、ポリ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸であることが判る。
Ｅ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（１９）の５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＦＰＶＡ）を原料とする、式（７）で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＨＦＰＶＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＰＨＦＰＶ）の製造に適用した一例を示す。
【０２５８】
（実施例Ｅ−１）
まず、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，１７６２−１７６６ （１９９６）及び同，２７，４５−４９ （１９９４）の方法に従って、グリニャール反応により基質であるＦＰＶＡを合成した。即ち、５−ブロモ吉草酸を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、−２０℃、アルゴン雰囲気下で３Ｍ メチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液を滴下しながら加えた。約１５分間攪拌した後、１−ブロモ−４−フルオロベンゼンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下し、０．１Ｍ Ｌｉ２ＣｕＣｌ４のＴＨＦ溶液を加えた（温度は−２０℃に保持）。この反応液を室温まで戻し、更に一晩攪拌した。その後、溶液を氷冷した２０％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取して食塩で飽和し、エーテルで抽出した。更に抽出液を５０ｇの水酸化カリウムを加えた１００ｍＬの脱イオン水で抽出した後、２０％硫酸水溶液で酸性化して、沈殿部分を回収した。
【０２５９】
この沈殿部分を核磁気共鳴装置（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００）を用いて、以下の条件で分析した。測定核種：1Ｈ，13Ｃ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り）。その結果を図１３及び表２０に示す。
【０２６０】
【表２０】
0003673711.tif 000062
【０２６１】
（実施例Ｅ−２）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ＦＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２６２】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表２１に示す。
【０２６３】
【表２１】
0003673711.tif 000063
【０２６４】
（実施例Ｅ−３）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ＦＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ９１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２６５】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表２２に示す。
【０２６６】
【表２２】
0003673711.tif 000064
【０２６７】
（実施例Ｅ−４）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ＦＰＶＡ０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＰ１６１株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、ＦＰＶＡ０．１％を含む、窒素源（ＮＨ4Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２６８】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表２３に示す。
【０２６９】
【表２３】
0003673711.tif 000065
【０２７０】
（実施例Ｅ−５）
Ｈ４５株由来のＰＨＦＰＶについて、核磁気共鳴装置（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００）を用いて、以下の条件で分析した。測定核種：1Ｈ，13Ｃ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り）。その結果を、図１４、表２４、図１５、表２５に示す。
【０２７１】
【表２４】
0003673711.tif 000066
【０２７２】
【表２５】
0003673711.tif 000067
【０２７３】
Ｆ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、式（２０）の４−シクロヘキシル酪酸（ＣＨＢＡ）を原料とする、式（８）で表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸（ＨＣＨＢＡ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエートの製造に適用した一例を示す。
【０２７４】
（実施例Ｆ−１）
ＹＮ２株による３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡの生産（一段階培養）
酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ２株のコロニーを、酵母エキス０．５％、４−シクロヘキシル酪酸０．１％を含むＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２７５】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１００ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。表２６に、凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、ならびに収率を示す。
【０２７６】
【表２６】
0003673711.tif 000068
【０２７７】
ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍｇ／Ｌ）、
ＰＤＷ：乾燥ポリマー重量（ｍｇ／Ｌ）、
収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ（％）
上で述べた従来の報告例（表２）では、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡの収量は、培養液１Ｌあたり８９．１ ｍｇであったが、本実施例の結果は、その約２．５倍に上る収量を得ることができている。また、乾燥菌体当たりの収率自体も、大幅な向上がなされている。
【０２７８】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約１０ｍｇのＰＨＡを２５ｍＬ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、脱イオン水１０ｍＬを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水した後、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９８％が式（８）で表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸のユニットであり、２％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであった。また、シクロヘキシルメタノールが若干量混在していた。
【０２７９】
以上の結果より、本発明の製造方法により、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが得られることがわかる。本発明の方法における酵母エキス添加の効果が確認された。加えて、培養液当たりの収量、乾燥菌体当たりの収率の十分に向上しており、本発明の製造方法は、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットの含有率の高さ、収量の高さの双方において、高効率な製造方法であることが確認される。
【０２８０】
Ｈ４５株による３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡの生産（一段階培養）
酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上のＨ４５株のコロニーを、酵母エキス０．５％、４−シクロヘキシル酪酸０．１％を含むＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２８１】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１００ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。表２７に、凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、ならびに収率を示す。
【０２８２】
【表２７】
0003673711.tif 000069
【０２８３】
ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍｇ／Ｌ）、
ＰＤＷ：乾燥ポリマー重量（ｍｇ／Ｌ）、
収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ（％）
上で述べた従来の報告例（表２）では、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸由来のユニットを含むＰＨＡの収量は、培養液１Ｌあたり８９．１ ｍｇであったが、本実施例の結果は、その約１．３倍に上る収量を得ることができている。また、乾燥菌体当たりの収率自体も、向上がなされている。
【０２８４】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約１０ｍｇのＰＨＡを２５ｍＬ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、脱イオン水１０ｍＬを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水した後、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９７％が式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットであり、３％が３−ヒドロキシ酪酸に由来するユニットであった。また、シクロヘキシルメタノールが若干量混在していた。
【０２８５】
以上の結果より、Ｈ４５株においても、本発明の製造方法により、式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが得られることがわかる。
【０２８６】
Ｐ１６１株による３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡの生産（一段階培養）
酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上のＰ１６１株のコロニーを、酵母エキス０．５％、４−シクロヘキシル酪酸０．１％を含むＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２８７】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１００ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィルターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。表２８に、凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、ならびに収率を示す。
【０２８８】
【表２８】
0003673711.tif 000070
【０２８９】
ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍｇ／Ｌ）、
ＰＤＷ：乾燥ポリマー重量（ｍｇ／Ｌ）、
収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ（％）
上で述べた従来の報告例（表２）では、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットを含むＰＨＡの収量は、培養液１Ｌあたり８９．１ ｍｇであったが、本実施例の結果は、その約１．５倍に上る収量を得ることができている。また、乾燥菌体当たりの収率自体も、向上がなされている。
【０２９０】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約１０ｍｇのＰＨＡを２５ｍＬ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、脱イオン水１０ｍＬを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水した後、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９４％が式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットであり、６％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであった。また、シクロヘキシルメタノールが若干量混在していた。
【０２９１】
以上の結果より、Ｐ１６１株においても、本発明の製造方法により、式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸由来のユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが得られることがわかる。
【０２９２】
（実施例Ｆ−２）
ＹＮ２株による３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡの生産（二段階培養）
酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ２株のコロニーを、酵母エキス０．５％、４−シクロヘキシル酪酸０．１％を含むＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、Ｍ９培地よりＮａＣｌ及びＮＨ4Ｃｌを除いた成分の溶液に４−シクロヘキシル酪酸０．１％を加えた培地中に移し、３０℃で２１時間培養した。得られた菌体をメタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０２９３】
この凍結乾燥ペレットを秤量した後、実施例Ｆ−１と同様の方法でポリマーを回収した。このポリマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。表２９に、凍結乾燥ペレット、回収ポリマーの収量、ならびに収率を示す。
【０２９４】
【表２９】
0003673711.tif 000071
【０２９５】
ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍｇ／Ｌ）、
ＰＤＷ：乾燥ポリマー重量（ｍｇ／Ｌ）、
収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ（％）
上で述べた従来の報告例（表２）では、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸由来のユニットを含むＰＨＡの収量は、培養液１Ｌあたり８９．１ ｍｇであったが、本実施例の結果は、その約３．２倍に上る収量を得ることができている。また、乾燥菌体当たりの収率自体も、大幅な向上がなされている。
【０２９６】
得られたＰＨＡの組成を実施例Ｆ−１と同様の方法で評価した。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９９％が式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットであり、１％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであった。また、シクロヘキシルメタノールが若干量混在していた。
【０２９７】
さらに得られたポリマーの分子量をＧＰＣ（東ソー ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリマーラボラトリー ＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価したところ、Ｍｎ＝４９００００、Ｍｗ＝１０００００であった。
【０２９８】
以上の結果より、本発明の製造方法により、式（８）に表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸に由来するユニットを非常に高い割合で含むＰＨＡが得られることがわかる。本発明の方法における酵母エキス添加の効果が確認された。加えて、培養液当たりの収量、乾燥菌体当たりの収率の十分に向上しており、本発明の製造方法は、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットの含有率の高さ、収量の高さの双方において、高効率な製造方法であることが確認される。
【０２９９】
本実施例と実施例Ｆ−１を対比することで、予め酵母エキスおよび４−シクロヘキシル酪酸を含む無機塩液体培地で培養した後、集菌した微生物を酵母エキス添加しない無機塩培地中で培養するという手法を採っても、得られるＰＨＡは、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを非常に高い割合で含むという効果が達成されることが確認される。
【０３００】
（実施例Ｆ−３）
３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットからなるＰＨＡの精製及びそのＮＭＲ分析
実施例Ｆ−２で得られたポリマーから、混入しているＰＨＢ（ポリ ３−ヒドロキシ酪酸）成分及びシクロヘキシルメタノールと考えられる成分を除去するため、以下のような精製操作を行った。
【０３０１】
すなわち、ポリマーをアセトン中に懸濁し、６０℃で２４時間抽出した。遠心分離により上澄を回収し、沈殿した部分は再度アセトンにより抽出操作を行った。この操作を合計５回繰り返し、上澄を集めてエバポレーターにより濃縮乾固させた。乾固した試料を少量のクロロホルムに溶解させ、冷メタノール中で再沈殿させた。本操作を３回繰り返し、得られたポリマーを減圧乾燥した。得られた乾燥ポリマーを秤量したところ、２８１ ｍｇであった。
【０３０２】
このポリマーの1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲの測定を行った（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。1Ｈ−ＮＭＲのチャートを図１６に、その帰属を表３０に、13Ｃ−ＮＭＲのチャートを図１７に、その帰属を表３１にそれぞれ示す。
【０３０３】
【表３０】
0003673711.tif 000072
【０３０４】
【表３１】
0003673711.tif 000073
【０３０５】
この評価により、上記の精製操作により、混入しているＰＨＢ（ポリ ３−ヒドロキシ酪酸）成分及びシクロヘキシルメタノールと考えられる成分が除かれ、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットからなるＰＨＡが回収されたと判断される。
Ｇ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、７−フェノキシヘプタン酸（ＰｘＨｐＡ）を原料とする、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）ならびに３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）ならびに３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）からなるコポリマーの製造に適用した一例を示す。
【０３０６】
（実施例Ｇ−１）  ＹＮ２株によるＰ（ＨＰｘＶ／ＨＰｘＨｐ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、７−フェノキシヘプタン酸（ＰｘＨｐＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。６４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３０７】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３０８】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３０９】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３２に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを、図１８及び図１９にそれぞれ示す。
【０３１０】
この結果から、ＹＮ２株により、７−フェノキシヘプタン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）及び３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）の２ユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３１１】
【表３２】
0003673711.tif 000074
【０３１２】
（実施例Ｇ−２）  Ｈ４５株によるＰ（ＨＰｘＶ／ＨＰｘＨｐ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、７−フェノキシヘプタン酸（ＰｘＨｐＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。６４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３１３】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３１４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３１５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３３に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを、図２０及び図２１にそれぞれ示す。
【０３１６】
この結果から、Ｈ４５株により、７−フェノキシヘプタン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）及び３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）の２ユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３１７】
【表３３】
0003673711.tif 000075
【０３１８】
Ｈ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、８−フェノキシオクタン酸（ＰｘＯＡ）を原料とする、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）、３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）の三種に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）ならびに３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）からなるコポリマーの製造に適用した一例を示す。
【０３１９】
（実施例Ｈ−１）  ＹＮ２株によるＰ（ＨＰｘＢ／ＨＰｘＨｘ／ＨＰｘＯ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、８−フェノキシオクタン酸（ＰｘＯＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３２０】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３２１】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３２２】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３４に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）メチルエステルのマススペクトルを図２２、図２３及び図２４に示す。
【０３２３】
この結果から、ＹＮ２株により、８−フェノキシオクタン酸を基質として３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）及び３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）の３ユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３２４】
【表３４】
0003673711.tif 000076
【０３２５】
（実施例Ｈ−２）  Ｈ４５株によるＰ（ＨＰｘＢ／ＨＰｘＨｘ／ＨＰｘＯ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、８−フェノキシオクタン酸（ＰｘＯＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３２６】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３２７】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３２８】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３５に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）メチルエステルのマススペクトルを図２５、図２６及び図２７に示す。
【０３２９】
この結果から、Ｈ４５株により、８−フェノキシオクタン酸を基質として３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）及び３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）の３ユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３３０】
【表３５】
0003673711.tif 000077
【０３３１】
Ｉ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、１１−フェノキシウンデカン酸（ＰｘＵＤＡ）を原料とする、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）、３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）の三種に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）ならびに３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）からなるコポリマーの製造に適用した一例を示す。
【０３３２】
（実施例Ｉ−１）  ＹＮ２株によるＰ（ＨＰｘＮ／ＨＰｘＨｐ／ＨＰｘＶ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、１１−フェノキシウンデカン酸（ＰｘＵＤＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。６４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３３３】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３３４】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３３５】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３６に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステル及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）メチルエステルのマススペクトルを図２８、図２９及び図３０に示す。
【０３３６】
この結果から、ＹＮ２株により、１１−フェノキシウンデカン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）の３つのユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３３７】
【表３６】
0003673711.tif 000078
【０３３８】
（実施例Ｉ−２）  Ｈ４５株によるＰ（ＨＰｘＮ／ＨＰｘＨｐ／ＨＰｘＶ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、１１−フェノキシウンデカン酸（ＰｘＵＤＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。６４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３３９】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３４０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３４１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３７に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステル、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステル及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）メチルエステルのマススペクトルを図３１、図３２及び図３３に示す。
【０３４２】
この結果から、Ｈ４５株により、１１−フェノキシウンデカン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）及び３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）の３つのユニットのみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３４３】
【表３７】
0003673711.tif 000079
【０３４４】
Ｊ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）を原料とする、３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：ポリ−３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）の製造、あるいは、３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）と３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）と３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）からなるコポリマーの製造に適用した一例を示す。
【０３４５】
（実施例Ｊ−１）  ＹＮ２株によるＰＨＰＨｘポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２７時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３４６】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３４７】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３４８】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３８に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを図３４に示す。
【０３４９】
この結果から、ＹＮ２株により、６−フェニルヘキサン酸を基質として３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）のみからなるＰＨＡポリマーを生産し得ることが示された。
【０３５０】
【表３８】
0003673711.tif 000080
【０３５１】
（実施例Ｊ−２）  Ｈ４５株によるＰ（ＨＰＨｘ／ＨＰＢ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２７時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５２】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３５３】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３５４】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表３９に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）メチルエステル及び３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを図３５及び図３６に示す。
【０３５５】
この結果から、Ｈ４５株により、６−フェニルヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）と３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）のみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３５６】
【表３９】
0003673711.tif 000081
【０３５７】
Ｋ：
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を、５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）及び５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）の二種を原料とする、対応する３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）と３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）に由来するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）と３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）からなるコポリマーの製造に適用した一例を示す。
【０３５８】
（実施例Ｋ−１）  ＹＮ２株によるＰ（ＨＰＶ／ＨＰｘＶ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）０．０５％及び５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）０．０５％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＹＮ２株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３５９】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３６０】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３６１】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表４０に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）メチルエステル及び３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを図３７及び図３８に示す。
【０３６２】
この結果から、ＹＮ２株により、５−フェニル吉草酸及び５−フェノキシ吉草酸を基質として、対応する３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）と３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）のみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３６３】
【表４０】
0003673711.tif 000082
【０３６４】
（実施例Ｋ−２）  Ｈ４５株によるＰ（ＨＰＶ／ＨＰｘＶ）ポリマーの生産（酵母エキス一段階培養）
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、５−フェニル吉草酸（ＰＶＡ）０．０５％及び５−フェノキシ吉草酸（ＰｘＶＡ）０．０５％とを含むＭ９培地２００ｍｌにＨ４５株を植菌し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し、秤量した。
【０３６５】
この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのアセトンに懸濁し、室温（２３℃）で７２時間攪拌してポリマーを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してポリマーを得、これを秤量した。
【０３６６】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー・ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリー・ＰＬｇｅｌ・ＭＩＸＥＤ−Ｃ・５μｍ、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算分子量）により測定した。
【０３６７】
得られたポリマーのユニット組成は以下のようにして分析した。即ち、ポリマーサンプル５ｍｇを２５ｍｌ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍｌ及び硫酸を３％（ｖ／ｖ）含むメタノール２ｍｌを加えて１００℃で３．５時間還流し、更に水を加えて分液した後、有機層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ（Ｊ＆Ｗ社製）、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。菌体及びポリマーの収率、モノマーユニットの分析結果を表４１に示す。また、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）メチルエステル及び３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを図３９及び図４０に示す。
【０３６８】
この結果から、Ｈ４５株により、５−フェニル吉草酸及び５−フェノキシ吉草酸を基質として、対応する３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）と３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）のみからなるＰＨＡコポリマーを生産し得ることが示された。
【０３６９】
【表４１】
0003673711.tif 000083
【０３７０】
【発明の効果】
本発明により、微生物を用いて、鎖の末端に、置換または未置換フェニル基、置換または未置換フェノキシ基、置換または未置換シクロヘキシル基の何れかの６員環原子団が置換されている、ω−置換−直鎖アルカン酸を原料として、対応するω−置換−３−ヒドロキシ−アルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法、これら側鎖の末端に６員環原子団を有するポリヒドロキシアルカノエートの選択的な製造に好適な微生物が提供される。本発明の製造方法により、初めて微生物産生が可能となった種々のポリヒドロキシアルカノエートは、酵母エキスと原料のω−置換−直鎖アルカン酸を含む無機培地において、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）に属する微生物を培養して、原料のω−置換−直鎖アルカン酸に作用させることで効率的に製造できるので、生分解性を持つ、機能性ポリマーとして有用なポリヒドロキシアルカノエートとして、デバイス材料や医療用材料等の各分野への応用が期待できる。
【０３７１】
【配列表】
0003673711.tif 000084
0003673711.tif 000085
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例Ａ−２で得られた、Ｐ９１株の培養菌体から回収したＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】実施例Ｂ−１で得られた５−フェノキシ吉草酸に関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】実施例Ｂ−２で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についての分析結果を示す図であり、（ａ）はＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）を、（ｂ）はＴＩＣでのメインピークのマススペクトルを示す。
【図４】実施例Ｂ−２で得られたＰＨＡに関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図５】実施例Ｂ−３で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物の分析結果を示す図であり、（ａ）はＴＩＣであり、（ｂ）はＴＩＣでのメインピークのマススペクトルである。
【図６】実施例Ｃ−１で得られた５−（４−フルオロフェノキシ）吉草酸に関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図７】実施例Ｃ−２で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物についての分析結果を示す図であり、（ａ）はＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラフィー（ＴＩＣ）を、（ｂ）はＴＩＣでのメインピークのマススペクトルを示す。
【図８】実施例Ｃ−２で得られたＰＨＡに関する核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図９】実施例Ｃ−３で得られたＰＨＡを構成するモノマーユニットのメチルエステル化物における分析結果を示す図であり、（ａ）はＴＩＣであり、（ｂ）ＴＩＣでのメインピークのマススペクトルである。
【図１０】実施例Ｄ−５における、Ｈ４５株により産生されたポリ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定結果を示す。
【図１１】実施例Ｄ−５における、Ｈ４５株により産生されたポリ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定結果を示す。
【図１２】シュードモナス ジェッセニイ Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161；ＦＥＲＭ Ｐ−１７４４５）の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を示す。
【図１３】実施例Ｅ−１において、原料アルカノエートとして合成した、ＦＰＶＡの核磁気共鳴スペクトルの測定結果を示す図である。
【図１４】実施例Ｅ−５において、ＦＰＶＡを原料として、本発明の製造方法で得られたＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。
【図１５】実施例Ｅ−５において、ＦＰＶＡを原料として、本発明の製造方法で得られたＰＨＡの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。
【図１６】実施例Ｆ−３で精製された、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットからなるＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲのチャートである。
【図１７】実施例Ｆ−３で精製された、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットからなるＰＨＡの13Ｃ−ＮＭＲのチャートである。
【図１８】実施例Ｇ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図１９】実施例Ｇ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２０】実施例Ｇ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２１】実施例Ｇ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２２】実施例Ｈ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２３】実施例Ｈ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２４】実施例Ｈ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２５】実施例Ｈ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２６】実施例Ｈ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸（３ＨＰｘＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２７】実施例Ｈ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸（３ＨＰｘＯ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２８】実施例Ｉ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図２９】実施例Ｉ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３０】実施例Ｉ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３１】実施例Ｉ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３２】実施例Ｉ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸（３ＨＰｘＨｐ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３３】実施例Ｉ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸（３ＨＰｘＮ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３４】実施例Ｊ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３５】実施例Ｊ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（３ＨＰＢ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３６】実施例Ｊ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３ＨＰＨｘ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３７】実施例Ｋ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３８】実施例Ｋ−１で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図３９】実施例Ｋ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図４０】実施例Ｋ−２で製造されたポリマーから、ＧＣ−ＭＳ測定より得られた、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸（３ＨＰｘＶ）メチルエステルのマススペクトルを示す。
【図１】
0003673711.tif 000092
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003673711.tif 000099
【図９】
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【図１０】
0003673711.tif 000101
【図１１】
0003673711.tif 000102
【図１２】
0003673711.tif 000103
【図１３】
0003673711.tif 000104
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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