(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
flt3−リガンド含む、患者の樹状細胞数を増加させるための組成物。
【請求項２】
さらに、GM−CSF、IL−４、TNF−α、IL−３、ｃ−kitリガンド、およびGM−CSFとIL−３の融合体よりなる群から選択される１種類またはそれ以上の分子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
flt3−リガンドを含む、感染症を伴う患者の樹状細胞数を増加させるための組成物。
【請求項４】
さらに、GM−CSF、IL−４、TNF−α、IL−３、ｃ−kitリガンド、およびGM−CSFとIL−３の融合体よりなる群から選択される１種類またはそれ以上の分子を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
感染症がHIVである、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
flt3−リガンドを含む、癌性または新生物性の疾患を伴う患者の樹状細胞数を増加させるための組成物。
【請求項７】
さらに、GM−CSF、IL−４、TNF−α、IL−３、ｃ−kitリガンド、およびGM−CSFとIL−３の融合体よりなる群から選択される１種類またはそれ以上の分子を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
造血幹細胞または前駆細胞をflt3−リガンドと接触させることを含む、造血幹細胞または前駆細胞を樹状細胞系列に推進する方法であって、但し、該方法を人間の体内で実施することを除く、前記方法。
【請求項９】
下記の工程：
（ａ）造血幹細胞または前駆細胞をflt3−リガンドと接触させて樹状細胞を生成させ；
（ｂ）（ｉ）樹状細胞を抗原特異性ペプチドに暴露するか、または（ii）抗原特異性ペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞を形質転換し；
（ｃ）樹状細胞が抗原を処理および提示しうるようにし；そして
（ｄ）抗原発現性樹状細胞を精製する
を含む、抗原発現性樹状細胞集団の調製方法。
【請求項１０】
工程（ａ）がさらに、造血幹細胞または前駆細胞を、GM−CSF、IL−４、TNF−α、IL−３、ｃ−kitリガンド、およびGM−CSFとIL−３の融合体よりなる群から選択される分子と接触させることを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
下記の工程：
（ａ）造血幹細胞または前駆細胞をflt3−リガンドと接触させて樹状細胞を生成させ；
（ｂ）（ｉ）樹状細胞を抗原特異性ペプチドに暴露するか、または（ii）抗原特異性ペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞を形質転換し；
（ｃ）樹状細胞が抗原を処理および提示しうるようにし；そして
（ｄ）樹状細胞が抗原をＴ細胞に提示しうるようにする
を含む、抗原特異性Ｔ細胞の調製方法。
【請求項１２】
flt3−リガンドを含むワクチンアジュバント。
【請求項１３】
ワクチン抗原に対する哺乳動物の免疫反応を高める方法であって、哺乳動物に免疫原量のワクチン抗原を投与し、かつ免疫原性を増強する量のワクチンアジュバントを該ワクチン抗原と同時または順次組み合わせて投与する工程を含む前記方法に使用するための、請求項12に記載のワクチンアジュバント。
【請求項１４】
flt3−リガンドを含む、臓器移植を受けている患者の樹状細胞数を増加させるための組成物。
【請求項１５】
有効量のflt3−リガンド、ならびにIL−３、IL−４、GM−CSF、TNF、ｃ−kitリガンド、およびGM−CSF/IL−３融合タンパク質よりなる群から選択されるサイトカインを含む、樹状細胞拡張培地。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、樹状細胞刺激因子、in vivoで免疫反応を促進する方法、ex vivoで樹状細胞を拡張する方法、ならびに精製した樹状細胞調製物、ならびにＴ細胞仲介およびＢ細胞仲介による免疫反応の操作に有用な樹状細胞集団に関する。
発明の背景
予防接種の目的は、抗原と再接触した際に速やかに拡張しうる適切な量の抗体および感作細胞集団の確立により、有効な免疫を付与することである。予防接種に際しての抗原との初回接触はレシピエントに有害であってはならず、したがって通常は病原性のない抗原との接触からなる。
能動免疫化プロトコールにしばしばみられる難点は、ワクチン抗原が強力な免疫反応を促進するのに十分な免疫原性をもたず、したがってその後の同一抗原による攻撃に対し十分な程度の防御力をもたないことである。さらに、弱い細胞仲介反応または抗体反応しか引き出せない抗原がある。多くの抗原にとって、強力な体液性反応と強力な細胞仲介反応がともに望まれる。
数十年にわたって、研究者らはワクチンの免疫原性を高めるために多様な化合物につき実験を行った。ワクチンの免疫強化剤（アジュバントとしても知られる）は、ワクチンに対する強力な免疫反応を促進する組成物である。さらに、免疫原性が比較的弱いある種の新規な組換え抗原には、アジュバントがより強力である必要がある。ワクチンのアジュバントは多様な作用様式をもち、免疫反応に量的かつ質的に影響を与える。このような作用様式は、Ｔ細胞の動態化、貯蔵所としての作用、およびこれらの細胞が排液性リンパ節内での局在化を維持するようなリンパ球循環の変更であってもよい。それらの様式は、抗原を免疫化部位に集中させ、これにより抗原特異性Ｔ細胞およびＢ細胞をより効率的に抗原提示細胞と相互作用させるものであってもよい。それらの様式は、Ｔ細胞の増殖や分化を刺激し、Ｂ細胞に異なるIgイソタイプの生成を高めるような作用を及ぼすものであってもよい。さらにアジュバントは、抗原提示細胞、特にマクロファージを刺激してその挙動に影響を与え、それらをＴ細胞およびＢ細胞への抗原提示のためにいっそう効果的にするものであってもよい。
樹状細胞は、特有の形態をもち、組織に広く分布する、数量の少ない不均一細胞集団である。樹状細胞系および免疫原性におけるその役割については、Steinman,R.M.,Annu.Rev.Immunol.,９:271−296（1991）に述べられている。これを本明細書に参考として引用する。樹状細胞は特異な細胞表面を示し、細胞表面マーカーCD1a+、CD4+、CD14-、CD86+、CD11c+、DEC−205+、CD14+、またはHLA−DR+の存在により確認できる。樹状細胞はMHC限定Ｔ細胞に対し高い感作能をもち、Ｔ細胞発育に際しての自己抗原提供と免疫化に際しての外来抗原提供の両方を含めて、in situでＴ細胞に抗原を提示するのに有効な経路を提供する。したがって、ex vivoで腫瘍や感染症のワクチンアジュバントとして樹状細胞を使用することにつき、関心が高まっている。たとえばRomani et al.,J.Exp.Med.,180:83（1994）参照。末梢血中の樹状細胞の頻度は低く、リンパ系臓器への接近は制限され、樹状細胞は最終分化状態にあるため、免疫刺激剤としての樹状細胞の使用が制限されてきた。樹状細胞はCD34+骨髄前駆細胞に由来し、樹状細胞の増殖および成熟は、サイトカインGM−CSF（サルグラモスチム（sargramostim）、ロイカイン（Leukine、登録商標）、イミュネックス・コーポレーション、ワシントン州シアトル）、TNF−α、ｃ−kitリガンド（幹細胞因子（SCF）、スチール因子（steel factor,SF）、またはマスト細胞増殖因子（MGF）としても知られる）、およびインターロイキンー４により促進できる。したがって、機能的に成熟した多数の樹状細胞の生成をin vivoまたはin vitroで刺激する物質の重要性は広い。
発明の概要
flt3−リガンド（“flt3−ligand"または“flt3−L"）は造血幹細胞および前駆細胞に影響を与えることが知られている。意外にも、flt3−リガンドが下流細胞や中間細胞、たとえば骨髄前駆細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ならびにCD34+骨髄前駆細胞および幹細胞に由来する樹状細胞の生成をも効果的に刺激しうることが見出された。本発明は、in vivoで樹状細胞を動態化する方法、ex vivoで樹状細胞を拡張する方法、および精製した樹状細胞調製物に関する。本発明による精製した樹状細胞調製物はワクチンアジュバントとして使用できる。本発明の態様には、flt3−リガンドで動態化した樹状細胞を用いて抗原特異性Ｔ細胞を調製する方法も包含される。
本発明は、in vivoにおける、たとえば患者の末梢血、組織または臓器中における、多数の中間細胞を増加または動態化させるのに有効な量のflt3−リガンドの使用を提供する。本発明は、CD34+細胞からflt3−リガンドによって多数の下流細胞または中間細胞（たとえば骨髄細胞、単球およびマクロファージ）を生成することに関するが、特に樹状細胞が目標である。患者の樹状細胞量を増加させることにより、それらの細胞自体をＴ細胞への抗原提示のために使用できる。たとえば抗原は、患者の体内に既に存在するもの、たとえば腫瘍抗原、または細菌性もしくはウイルス性の抗原であってもよい。したがってflt3−リガンドを用いてin vivoで樹状細胞数を増加させ、既存の抗原に対する患者の免疫反応を増強することができる。あるいは免疫化のために患者に抗原を投与する前、投与と同時または後に、flt3−リガンドを投与してもよい。このようにflt3−リガンドはワクチンアジュバントとして、in vivoで樹状細胞および他の中間細胞を大量に生成して、抗原をより効果的に提示することができる。全体としての応答は、免疫反応の強化および改善、ならびに抗原に対するいっそう効果的な免疫化である。
本発明は、ex vivoで大量の樹状細胞を生成する方法をも提示する。患者のCD34+造血前駆細胞および幹細胞を採集したのち、flt3−リガンドを用いてそれらの細胞をin vitroで拡張させ（ex vivo拡張としても知られる）、それらのCD34+細胞をリンパ系列または骨髄系列の樹状細胞に分化させることができる。得られた樹状細胞採集物を患者に投与して、抗原に対する免疫反応を強化および改善することができる。あるいは得られた樹状細胞をワクチンアジュバントとして用い、抗原投与の前、それと同時または後に投与することができる。
本発明は、ex vivoで大量の抗原提示性樹状細胞を生成する方法をも提示する。患者のCD34+造血前駆細胞および幹細胞を採集したのち、flt3−リガンドを用いてそれらの細胞をin vitroで拡張させ、それらのCD34+細胞を樹状細胞に分化させることができる。得られた樹状細胞採集物を次いでin vitroで抗原に暴露し、抗原を処理して提示させる（この操作を当技術分野で“抗原パルス処理（antigen−pulsing）”と呼ぶことがある）。抗原を提示する樹状細胞を調製するための別法は、抗原特異性ポリペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞を形質転換するものである。樹状細胞が抗原を発現すると、この抗原提示型樹状細胞を患者に投与することができる。
本発明は、抗原特異性Ｔ細胞のex vivo調製物をも提供する。多数の抗原提示型樹状細胞をex vivoで調製するための前記方法に従って採集した抗原提示型樹状細胞を用いて、患者により採集しておいた天然Ｔ細胞から抗原特異性Ｔ細胞を生成させる。生成したＴ細胞に適切に抗原が提示されたのち、この抗原特異性Ｔ細胞を患者に投与することができる。
本発明は、感染症を伴う患者の免疫反応を増強する方法であって、患者の樹状細胞数を増加させるのに十分な量のflt3−リガンドを投与する工程を含む方法をも提供する。
本発明は、癌性または新生物性の疾患を伴う患者の免疫反応を増強する方法であって、患者の樹状細胞数を増加させるのに十分な量のflt3−リガンドを投与する工程を含む方法をも提供する。この方法は、患者の腫瘍特異性免疫反応を高める手段を提供する。
患者の自己免疫寛容性を増強する方法であって、患者の樹状細胞数を増加させるのに十分な量のflt3−リガンドを投与する工程を含む方法も包含される。さらに、移植片ならびに移植した組織および臓器の生存を促進する方法も包含される。
本発明方法はさらに、有効量のサイトカインをflt3−リガンドと組み合わせて順次または同時に使用することをも包含する。このようなサイトカインには、インターロイキン（“IL"）IL−３およびIL−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“GM−CSF"）もしくはGM−CSF/IL−３融合体よりなる群から選択されるコロニー刺激因子（“CSF"）、または他のサイトカイン、たとえばTNF−αもしくはｃ−kitリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
本発明はさらに、細胞増殖培地、オートロガス血清、および単独または上記の群から選択したサイトカインと組み合わせたflt3−リガンドを含む、樹状細胞拡張培地を包含する。
発明の詳細な記述
本発明は、CD34+造血前駆細胞および幹細胞から多数の中間細胞タイプを生成させるためのflt3−リガンドの使用を目的とする。このような中間細胞タイプには、骨髄細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が含まれる。これらの中間細胞タイプの多数はin vivoで天然に存在せず、flt3−リガンドの投与により生成させることができる。このような細胞総数の増加により、宿主の免疫反応を増強することができる。本発明の他の態様は、このような中間細胞タイプを単離し、抗原提示細胞として使用すること、またはそれらをワクチンアジュバントとして使用することである。本発明は樹状細胞に関する態様を特に目標とするが、骨髄細胞、単球およびマクロファージなどの細胞タイプにも適用できる。
本明細書で用いる“flt3−リガンド”という用語は、米国特許第5,554,512号、欧州特許出願公開第0627487 A2号および国際特許出願公開第WO 94/28391号に記載された一群のポリペプチドを意味する。これらをすべて本明細書に参考として引用する。ヒトflt3−リガンドcDNAはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（米国マリーランド州ロックビル）に1993年８月６日に寄託され、受託番号ATCC  69382で受託された。この寄託はブタペスト条約に基づいて行われた。flt3−リガンドは前記に引用した文献に記載された方法により調製できる。
“IL−3"という用語は、米国特許第5,108,910号に記載された一群のインターロイキン−３ポリペプチドを意味する。これを本明細書に参考として引用する。これらのポリペプチドには、天然ヒトインターロイキン−３のアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列をもつ類似体、たとえば欧州特許出願公開第275,598および282,185号に開示されたものが含まれる。これらをそれぞれ本明細書に参考として引用する。“IL−3"という用語には、天然のヒトIL−３と共通の生物学的活性を少なくとも若干は示す、IL−３分子の類似体および対立遺伝子も含まれる。IL−３類似体の例は、欧州特許出願公開第282,185号に開示されている。他の形態のIL−３には、ヒトIL−３［Pro8Asp15Asp70］、ヒトIL−３［Ser8Asp15Asp70］、およびヒトIL−３［Ser8］が含まれる。本発明に用いるのに適したヒトIL−３タンパク質をコードするDNA配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から受託番号ATCC  67747で一般に入手できる。本明細書においてかっこ内のアミノ酸配列に関して用いた命名法は、どのアミノ酸が天然のヒト形態と異なるかを表示する。たとえばヒトIL−３［Ser8Asp15Asp70］は、アミノ酸８がセリン残基に変化し、アミノ酸15がアスパラギン酸残基に変化し、かつアミノ酸70がアスパラギン酸残基に変化したヒトIL−３タンパク質を示す。
“IL−4"という用語は、Mosley et al.,Cell 59:335（1989）、Idzerda et al.,J.Exp.Med.,171:861（1990）、およびGalizzi et al.,Intl.Immunol.,2:669（1990）に記載されたポリペプチドを意味する。これらをそれぞれ本明細書に参考として引用する。これらのIL−４ポリペプチドには、Mosley et al.、Idzerda et al.およびGalizzi et al.に記載される天然ヒトIL−４アミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列をもつ類似体であって、それらがIL−４受容体に結合し、IL−４受容体結合により開始する生物学的シグナルを伝達し、または抗IL−４抗体と交差反応することができるという点で生物学的に活性である類似体が含まれる。“IL−4"という用語には、天然ヒトIL−４の生物学的活性を保持するのに十分な天然ヒトIL−４分子類似体も含まれる。
本明細書で用いる“GM−CSF"という用語は、米国特許第5,108,910および5,229,496号に記載された一群のタンパク質を意味する。これらをそれぞれ本明細書に参考として引用する。これらのタンパク質には、天然ヒトGM−CSFのアミノ酸配列（たとえばATCC  53157またはATCC  39900として一般に入手できるもの）に実質的に類似するアミノ酸配列をもつ類似体であって、それらがGM−CSF受容体に結合し、GM−CSF受容体結合により開始する生物学的シグナルを伝達し、または抗GM−CSF抗体と交差反応することができるという点で生物学的に活性である類似体が含まれる。アミノ酸配列は、たとえばAnderson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6250（1985）に示されている。市販のGM−CSF（サルグラモスチム、ロイカイン（登録商標））は、イミュネックス・コーポレーション（ワシントン州シアトル）から入手される。“GM−CSF"という用語には、天然ヒトGM−CSFの生物学的活性を保持するのに十分な、米国特許第5,108,910および5,229,496号に記載された天然ヒトGM−CSF分子類似体も含まれる。GM−CSF類似体の例には、たとえば欧州特許出願公開第212914号および国際特許出願公開第WO 89/03881号に記載されたものが含まれる。これらをそれぞれ本明細書に参考として引用する。他のGM−CSF類似体もIL−３との融合タンパク質を構築するのに使用できる。潜在的グリコシル化部位を除去した特に好ましいGM−CSFタンパク質をコードするDNA配列は、ATCCから受託番号ATCC  67231として一般に入手できる。
“GM−CSF/IL−３融合タンパク質”という用語は、GM−CSFとIL−３のＣ末端−Ｎ末端融合体を意味する。これらの融合タンパク質は既知であり、米国特許第5,199,942、5,108,910および5,073,627号に記載されている。これらをそれぞれ本明細書に参考として引用する。好ましい融合タンパク質は、米国特許第5,199,942号に記載されたPLXY321である。
“ｃ−kitリガンド”はマスト細胞増殖因子（MGF）、スチール因子または幹細胞因子（SCF）としても知られ、1990年10月１日出願の米国特許出願第589,701号に基づく優先権を主張する欧州特許第423,980に記載されたポリペプチドを意味する。これを本明細書に参考として引用する。それらのｃ−kitリガンドポリペプチドには、欧州特許第423,980号に記載された天然ヒトｃ−kitリガンドアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列をもつ類似体であって、ｃ−kit受容体に結合し、ｃ−kit受容体結合により開始する生物学的シグナルを伝達し、または抗ｃ−kitリガンド抗体と交差反応することができるという点で生物学的に活性である類似体が含まれる。“ｃ−kitリガンド”という用語には、天然ヒトｃ−kitリガンドの生物学的活性を保持するのに十分な天然ヒトｃ−kitリガンド分子類似体も含まれる。
“アジュバントと”という用語は、ワクチン抗原に対する宿主の免疫反応を向上、増強または助成する物質を意味する。
造血幹細胞および前駆細胞の“ex vivo拡張”方法は、米国特許第5,199,942号に記載されている。これを本明細書に参考として引用する。すなわちこの用語は、（１）患者の末梢血採取試料または骨髄体外移植組織からD34+造血幹細胞および前駆細胞を採集し、そして（２）それらの細胞をex vivoで拡張することを含む方法を意味する。米国特許第5,199,942号に記載された細胞増殖因子のほかに、他の因子、たとえばflt3−リガンド、IL−１、IL−３、ｃ−kitリガンドも使用できる。
“免疫原性”という用語は、免疫原または抗原が免疫反応を誘発する相対効率を意味する。
“実質的に類似”という用語は、好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％が天然アミノ酸配列に一致する変異アミノ酸配列を意味する。一致率は、たとえばDevereux et al.（Nucl.Acids Res.12:387,1984）が記載したGAPコンピュータープログラム、バージョン6.0を用いて配列情報を比較することにより測定できる。これはワシントン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）より入手できる。GAPプログラムは、NeedlemanおよびWunsch（J.Mol.Biol.48:443,1970）のアラインメント法をSmithおよびWaterman（Adv.Appl.Math.2:482,1981）が変更したものを利用している。GAPプログラムに好ましい省略時解釈パラメーターには以下のものが含まれる。（１）ヌクレオチドに関する単項比較行列（同一については１、非同一については０の数値）、ならびにGribskovおよびBurgess（Nucl.Acids Res.14:6745,1986）の重みつき比較行列:SchwarzおよびDayhoff編,Atlas of Protein Sequence and Structure,国立生物医学研究財団,p.353−358,1979に記載；（２）各間隙につき3.0の損失、および各間隙の各記号につきさらに0.10の損失；（３）終結間隙については損失なし。変異体は保存的置換配列を含むことができる。これは、あるアミノ酸残基が類似の物理化学的性質をもつ残基で置換されることを意味する。保存的置換の例には、脂肪属残基１個が他の脂肪族残基で置換されたもの、たとえばIle、Val、LeuもしくはAla相互の置換、または極性残基１個が他の極性残基で置換されたもの、たとえばLysとArg;GluとAsp;またはGlnとAsn間の置換が含まれる。他にこのような保存的置換、たとえば類似の疎水性をもつ領域全体の置換も周知である。天然変異体も本発明に包含される。このような変異体の例は、オータナティブmRNAスプライシング事象または天然タンパク質のタンパク質分解性開裂により生成するタンパク質であって、天然の生物学的特性を保持したものである。
本明細書で用いる“ワクチン”とは、無害な形の抗原を含む生物または物質を意味する。ワクチンは、免疫性防御反応を開始させるように設計される。ワクチンは組換え体または非組換え体のいずれであってもよい。ワクチンを非免疫宿主に接種すると、その生物または物質に対する能動免疫を引き起こすが、疾病を起こすことはない。ワクチンは、たとえばトキソイド、すなわち無毒化されているがなおその主要免疫原決定基を保持する毒素と定義されるもの；または死滅した生物、たとえばチフス菌、コレラ菌および灰白髄炎菌；または生存しているが無毒な形の病原体である弱毒化した生物の形であってもよく、あるいはそれらの生物がコードする抗原であるか、または生存腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞上に存在する抗原であってもよい。
細胞集団からCD34+造血幹細胞または前駆細胞を同定および分離するための多様な細胞選別法が知られている。このような細胞タイプを同定および選別するための方法や材料は既知である。たとえば幹細胞や前駆細胞にみられるマーカータンパク質または表面抗原タンパク質に結合するモノクローナル抗体を利用できる。このような、造血幹細胞のマーカーまたは細胞表面抗原には、CD34およびThy−１が含まれる。１方法では、抗体をいずれかの表面、たとえばガラスビーズに固定し、幹細胞を含むと予想される細胞混合物と接触させる。これにより抗体は幹細胞をガラスビーズに結合固定することができる。あるいは抗体を細胞混合物とともにインキュベートし、得られた組合わせをこの抗体−細胞複合体に対する親和性をもつ表面と接触させてもよい。目的外の細胞や細胞成分が除去されて、比較的純粋な幹細胞集団が得られる。CD34マーカーをもつ幹細胞や前駆細胞は骨髄単核細胞の約１〜３％を構成するにすぎない。末梢血中のCD34+幹細胞または前駆細胞の量は骨髄中の約10〜100倍である。
本発明の具体的態様に関して、好適な幹細胞または前駆細胞の選別法の選択は、単離すべき細胞の目的表現に依存するであろう。造血幹細胞は、それらの物理的性質、たとえば膜結合flt3受容体を発現すること、または細胞マーカーCD34もしくはThy−１をもつことにより選別できる。これらの抗原のいずれをも認識するモノクローナル抗体は、米国特許第4,714,680号（本明細書に参考として引用する）に記載され（抗−My−10）、抗CD34はベクトン・ディッキンソン（ニュージャージー州フランクリン・レイクス）から市販され、抗Thy−１モノクローナル抗体はDalchau et al.,J.Exp.Med.,149:576（1979）（本明細書に参考として引用する）の方法で容易に調製できる。flt3受容体結合性タンパク質、たとえば抗flt3−モノクローナル抗体またはflt3−リガンドも使用できる。採集した細胞混合物を細胞結合性タンパク質を接触させ、この組合わせを目的細胞が細胞結合性タンパク質に結合するのに十分な期間インキュベートする。
静態幹細胞（qiescent stem cell）を選別するための別法は、５−フルオロウラシル（５−FU）などの代謝拮抗物質または４−ヒドロキシシクロホスアァミド（４−HC）などのアルキル化剤を用いて、分裂性の、より系列拘束された（lineage−committed）タイプの細胞に細胞死を誘発することである。幹細胞にほとんどまたは全く影響を与えない増殖因子の添加により、非静態細胞の増殖および分化が刺激される。その結果、幹細胞以外の細胞は増殖および分化し、５−FUや４−HCの細胞毒性をより受けやすくなる。Berardi et al.,Science,267:104（1995）参照。これを本明細書に参考として引用する。
造血幹細胞または前駆細胞の単離は、たとえばアフィニティークロマトグラフィー、抗体コーティングした磁性ビーズ、またはガラスビーズ、フラスコなどの固体マトリックスに固定した抗体を用いて行うことができる。幹細胞または前駆細胞の表面マーカーを認識する抗体を、他の化学物質部分、たとえばビオチン（固体支持体に固定したアビジンまたはストレプトアビジン部分により分離できる）、蛍光活性化細胞選別法（FACS）に有用な蛍光色素などに融合または結合させることができる。好ましくはイムノアフィニティーカラムにより単離する。イムノアフィニティーカラムはいかなる形態であってもよいが、通常は充填床反応器からなる。これらのバイオリアクターの充填床は、基質で均一にコーティングした多孔質材料から作成されることが好ましい。高い表面積−容積比を備えた多孔質材料は、細胞が充填床から流出するのを妨害することなく広い接触面積にわたって細胞混合物が流動するのを可能にする。代表的な基質には、アビジンおよびストレプトアビジンが含まれるが、慣用される他の基質も使用できる。基質は、それ自身の特性により、または化合物部分の添加により、モノクローナル抗体などの細胞結合性タンパク質上に存在する部分に対する高い親和性を示すべきである。モノクローナル抗体は分離すべき細胞の細胞表面抗原を認識し、一般にはビオチン部分を提示するようにさらに修飾される。ビオチンがアビジンに対し高い親和性をもつことは周知であり、これらの物質の親和性のためモノクローナル抗体は充填床の表面に分離可能な状態で固定される。このようなカラムは当技術分野で周知である。Berenson et al.,J.Cell Biochem.10D:239（1986）参照。カラムをPBS溶液で洗浄して、結合していない物質を除去する。標的細胞は常法により充填床から離脱させることができる。アビジンコーティングした充填床に固定されたビオチニル化−抗CD34モノクローナル抗体を利用した上記種類のイムノアフィニティーカラムは、たとえば国際特許出願公開第WO 93/08268号に記載されている。この方法の変法では、分離装置中の固定表面に分離可能な状態で結合した前記モノクローナル抗体またはflt3−リガンドなどの細胞結合性タンパク質を利用する。次いで、採集した細胞混合物にこの結合した細胞結合性タンパク質を接触させ、目的細胞を単離するのに十分な時間インキュベートする。
あるいは、細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体を発色団または発蛍光団などの蛍光標識で標識し、標識生成物の存否または量に従って細胞選別法により分離することができる。
採集したCD34+細胞を次いでflt3−リガンド単独に暴露するか、またはflt3−リガンドを下記のサイトカイン１種類もしくはそれ以上と組み合わせたものに同時もしくは順次暴露する:GM−CSF、TNF−α、IL−３、IL−４、ｃ−kitリガンドまたはGM−CSF/IL−３融合タンパク質。次いでCD34+細胞を分化させて、樹状細胞系列の細胞に拘束する。これらの樹状細胞を採集し、（ａ）免疫系、および抗原に対するＴ細胞仲介もしくはＢ細胞仲介免疫反応を増強するために、患者に投与するか、（ｂ）樹状細胞を患者に投与する前に抗原に提示するか、（ｃ）抗原特異性ポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換するか、または（ｄ）ex vivoで抗原に暴露し、次いで抗原処理を行わせ、患者から採集したＴ細胞に抗原を提示させ、続いてこの抗原特異性Ｔ細胞を患者に投与する。
より具体的には、本発明はin vivoにおける、たとえば患者の末梢血または他の組織もしくは臓器、たとえば脾臓における樹状細胞の増加または動態化に有効な量のflt3−リガンドの使用を提供する。患者の樹状細胞量を増加させることにより、それらの細胞自体をＴ細胞への抗原提示に利用できる。たとえば抗原は、既に患者の体内に存在するもの、たとえば腫瘍抗原、または細菌性もしくはウイルス性の抗原であってもよい。したがってflt3−リガンドを用いて、既に存在する抗原に対する患者のリンパ球仲介（たとえばＴ細胞仲介およびＢ細胞仲介）または骨髄球仲介免疫反応を増強し、これにより患者のＴ細胞への抗原提示をより効果的にすることができる。あるいは免疫化のために患者に抗原を投与する前、それと同時、または後に、flt3−リガンドを投与してもよい。これによりflt3−リガンドはワクチンアジュバントとしてin vivoで大量の樹状細胞を生成し、より効果的に抗原を提示することができる。全体としての応答は、免疫反応の強化および改善、ならびに抗原に対するより効果的な免疫化である。
flt3−リガンドの全身投与はワクチンアジュバントとして有効であるだけでなく、前記のようにそれ以前に存在していた抗原に対する免疫反応の増強にも有効である。たとえば本発明によれば、腫瘍保有マウスにflt3−リガンドを投与すると、少なくとも腫瘍の増殖速度が有意に低下し、高い割合のマウスで腫瘍が排除される可能性もあることが示された。これらのデータをより詳細に実施例３に示す。したがってflt3−リガンドはin vivoで抗原に対し効果的な免疫反応を起こす際に重要なサイトカインである。
flt3−リガンドは樹状細胞を生成しうるので、移植した組織や臓器の生存を助成するのにも利用される。同種（allogeneic）臓器または他の組織を宿主に移植する際に、それらが幹細胞、未熟な樹状細胞および成熟した樹状細胞をドナーから持ち込む可能性がある。これらの細胞をパッセンジャー細胞と呼び、これらの細胞は宿主の造血系に移植される可能性がある。さらに、宿主由来の幹細胞、未熟な樹状細胞および成熟した樹状細胞がドナーの臓器または組織に移植されるであろう。その際、宿主およびドナー組織に由来する未熟な樹状細胞がＴ細胞と“別の側から”相互作用するので、移植片と宿主の間に寛容性を確立することができる。このような相互作用には、樹状細胞が発現する主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）を認識するＴ細胞の抹消を含めることができる。こうして、ドナーの細胞は宿主を認識してそれと反応することができないように“スクリーニング”され（すなわち移植細胞対宿主病が起きない）、かつ宿主Ｔ細胞は移植片を認識してそれと反応することができないようにスクリーニングされる（すなわち移植片拒絶が起きない）。こうして相互寛容が達成され、移植片受容性が改善される。移植の前にflt3−リガンドを宿主またはドナーに投与すると、宿主またはドナーの樹状細胞数を増加させ、移植片の寛容性や生存度を高めることができる。
樹状細胞の増殖および培養には多様な培地を使用でき、その培地の組成は当業者が容易に決定できる。好適な増殖培地は栄養素および代謝添加物を含有する溶液であり、無血清培地または血清培地が含まれる。増殖培地の代表例は、RPMI、TC 199、Iscoveの改変ダルベッコ培地（Iscove et al.,F.J.Exp.Med.,147:923（1978））、DMEM、フィッシャー培地、α培地、NCTC、Ｆ−10、LeibovitzのＬ−15培地、MEM、およびMcCoy培地が含まれる。当業者に自明の栄養素の具体例には、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、還元剤、たとえば２−メルカプトエタノールまたはモノチオグリセリン、ピルベート、ブチレート、およびグルココルチコイド、たとえば２−ヘミコハク酸ヒドロコルチゾンが含まれる。より具体的には、標準培地はエネルギー源、ビタミンその他の細胞支持性有機化合物、培地のpH安定化作用をもつHEPES、トリスなどの緩衝剤、各種無機塩類を含有する。多様な細胞増殖用無血清培地を記載した国際特許出願公開第WO 95/00632号が特に参照され、これを本明細書に参考として引用する。
本発明のex vivo法のいずれについても、末梢血前駆細胞（PBPC）および末梢血幹細胞（PBSC）を当技術分野で既知のアフェレーシス法により採集する。たとえばBishop et al.,Blood,vol.83,No.2,p.610−616（1994）参照。要約すると、慣用される装置、たとえばヘモネティクス（Hemonetics）モデルV50アフェレーシス装置（ヘモネティクス社、マサチュセッツ州ブレーントリー）を用いて、PBPCおよびPBSCを採集する。たとえば単核細胞（MNC）約6.5×108個/kg（患者）が採集されるまで、４時間の採集を一般に週５回以下行う。細胞を標準培地に懸濁し、次いで赤血球および好中球を除去するために遠心分離する。２相の界面にある細胞（当技術分野でバフィーコートとしても知られる）を取り出し、HBSSに再懸濁する。懸濁した細胞は主として単核細胞であり、細胞混合物の実質部分は初期幹細胞である。得られた幹細胞懸濁液を、次いでビオチニル化抗CD34モノクローナル抗体または他の細胞結合性手段と接触させることができる。接触期間は、抗CD34モノクローナル抗体と幹細胞表面のCD34抗原が実質的に相互作用するのに十分な時間保持される。一般に少なくとも１時間の期間で十分である。次いでこの細胞懸濁液を、キット中に備えられた単離装置と接触させる。単離装置はアビジンコーティングしたビーズを充填したカラムからなっていてもよい。そのようなカラムは当技術分野で周知である。Berenson et al.,J.Cell Biochem.10D:239（1986）参照。カラムをPBSで洗浄して、結合していない物質を除去する。標的とする幹細胞は、常法によりビーズおよびCD34モノクローナル抗体から離脱させることができる。こうして得た幹細胞を、速度制御型フリーザー（たとえばクリオ−メド（Cryo−Med）、ミシガン州マウントクレメンス）で凍結し、次いで液体窒素の蒸気相中に保存することができる。10％ジメチルスルホキシドを凍害保護剤として使用できる。ドナーからの採集をすべて行ったのち、幹細胞を融解し、プールする。幹細胞、増殖培地、たとえばMcCoy5A培地、0.3％寒天、および濃度約200U/mLの拡張因子少なくとも１種類（組換えヒトGM−CSF、IL−３、組換えヒトflt3−リガンド、および組換えヒトGM−CSF/IL−３融合分子（PIXY321））を含有するアリコートを、37℃で十分に加湿した空気中５％CO2において14日間培養し、拡張させる。所望によりヒトIL−１αまたはIL−４を培養物に添加してもよい。最も好ましい拡張因子の組合わせは、flt3−リガンドとIL−３またはGM−CSF/IL−３融合タンパク質とからなる。
ヒトにin vivo投与するためには、薬剤として有用な組成物の調製に用いる既知の方法で、flt3−リガンドを配合することができる。flt3−リガンドを唯一の有効物質として、または他の既知の有効物質とともに、薬剤学的に好適な希釈剤（たとえばトリス−HCl、アセテート、ホスフェート）、保存剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、佐剤および／またはキャリヤーと配合することができる。好適なキャリヤーおよびそれらの配合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版、1980年（マック・パブリシング社）に記載されている。さらにそれらの混合物は、ポリエチレングリコール（PEG）、金属イオンなどと複合体形成した、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの高分子化合物に取り込まれた、またはリポソーム、ミクロエマルション、ミセル、単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラスト（spheroblast）中に取り込まれたflt3−リガンドを含有してもよい。このような組成物は、flt3−リガンドの物理的状態、溶解度、安定性、in vivo放出速度、およびin vivoクリアランス速度に影響を与えるであろう。
flt3−リガンドは局所投与、非経口投与または吸入投与することができる。“非経口”という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内への注射法または注入法が含まれる。これらの組成物は一般に、有効量のflt3−リガンドを単独で、または有効量の他のいずれかの有効物質と組み合わせて含有するであろう。組成物に含有される用量および目的薬物濃度は、目的用途、患者の体重および年齢ならびに投与経路を含めた多数の要因に応じて変更できる。動物試験により予備的用量を判定し、当技術分野で受け入れられている方法により、ヒトに投与するための用量を決定することができる。以下の記載を考慮して、flt3−リガンドの一般的用量は約10〜約1000μg/m2であろう。好ましい用量範囲は、約100〜約300μg/m2程度である。
上記のほか、以下の実施例を具体的態様の説明のために提示するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
樹状細胞の生成
この例は、flt3−リガンドを用いてex vivoで多数の樹状細胞を生成する方法を記載する。CD34+表現型をもつ細胞を前記に従って単離する。たとえばまず前掲の方法でバフィーコートの細胞を採取する。次いでバフィーコートから得た細胞をCD34特異性モノクローナル抗体とともにインキュベートする。次いで選別したCD34+細胞を、各20ng/mlのGM−CSF、IL−４、およびTNF−αの組合わせ；前記GM−CSF、IL−４、およびTNF−αの組合わせにさらに100ng/mlのflt3−リガンドおよび／もしくはｃ−kitリガンドを加えた組合わせ；または、100ng/mlのflt3−リガンドおよびｃ−kitリガンドの組合わせ；で強化したMcCoy培地中で培養する。37℃で加湿空気中10％CO2において約２週間、培養を続ける。次いで細胞をフローサイトメトリーによりCD1a+およびHLA−DR+発現につき選別する。GM−CSF、IL−４、およびTNF−αの組合わせでは、２週間の培養後に細胞数が６〜７倍に増加した。flt3−リガンドおよびｃ−kitリガンドの組合わせでは、細胞の絶対数が累加して12〜13倍に増加した。これはGM−CSF、IL−４、およびTNF−αの組合わせにさらにflt3−リガンドもしくはｃ−kitリガンドを加えた組合わせによる18倍の拡張、またはGM−CSF、IL−４、およびTNF−αの組合わせにさらにflt3−リガンドおよびｃ−kitリガンドを加えた組合わせによる34倍の拡張と相関する。細胞の表現型分析では、検査したすべての因子の組合わせにおいて、60〜70％の細胞がHLA−DR+、CD86+を示し、40〜50％の細胞がCD1aを発現した。flt3−リガンドの添加はCD1a+細胞の絶対数を５倍増加させた。ｃ−kitリガンドはこれらの細胞を6.7倍増加させ、flt3−リガンドおよびｃ−kitリガンドの組合わせは11倍増加させた。得られた細胞をMLRにより機能分析すると、flt3−リガンドまたはｃ−kitリガンドの存在により達成される細胞数は増加するが、生成する樹状細胞の刺激能には影響のないことが明らかになった。
実施例２
樹状細胞の拡張に際してのflt3−Ｌの使用
この例は、樹状細胞の拡張にflt3−リガンドを使用する方法を記載する。細胞を採集する前に、循環性のPBPCおよびPBSCを動態化するか、またはその数を増加させることが望ましい。動態化によりPBPCおよびPBSCの採集が改善される。これは、これらの細胞を採集する前に、患者にflt3−リガンドまたはサルグラモスチム（ロイカイン（登録商標）、イミュネックス・コーポレーション、ワシントン州シアトル）を静脈内投与することにより達成される。他の増殖因子、たとえばCSF−１、GM−CSF、ｃ−kitリガンド、Ｇ−CSF、EPO、IL−１、IL−２、IL−３、IL−４、IL−５、IL−６、IL−７、IL−８、IL−９、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、GM−CSF/IL−３融合タンパク質、LIF、FGFおよびその組合わせも、flt3−リガンドと順次または同時に投与できる。動態化した、または動態化しないPBPCおよびPBSCを、当技術分野で既知のアフェレーシス法により採集する。たとえばBishop et al.,Blood,vol.83,No.2,p.610−616（1994）参照。要約すると、一般的な装置、たとえばヘモネティクス、モデルV50アフェレーシス装置（ヘモネティクス社、マサチュセッツ州ブレーントリー）を用いて、PBPCおよびPBSCを採集する。単核細胞（MNC）約6.5×108個/kg（患者）が採集されるまで、４時間の採集を一般に週５回以下行う。採集したPBPCおよびPBSCのアリコートを、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で約1:6に希釈し、リンパ球分離培地（オルガノン・テクニカ、ノースカロライナ州ダーラム）上に積層することにより、顆粒球マクロファージコロニー形成単位（CFU−GM）含量をアッセイする。遠心分離したのち、界面のMNCを採集し、洗浄し、HBSSに再懸濁する。MNC約300,000個、改変McCoy5A培地、0.3％寒天、組換えヒトGM−CSF  200U/ml、組換えヒトIL−３  200U/ml、および組換えヒトＧ−CSF  200U/mlを含有する1mlずつを、37℃で十分に加湿した空気中５％CO2において14日間培養する。所望によりflt3−リガンドまたはGM−CSF/IL−３融合分子（PLXY  321）を培養物に添加してもよい。これらの培養物をライト染色液で染色し、解剖顕微鏡でCFU−GMコロニーを計数する（Ward et al.,Exp.Hematol.,16:358（1988））。あるいはSiena et al.,Blood,vol.77,No.2,p.400−409（1991）のCD34/CD33フローサイトメトリー法、または当技術分野で既知の他の方法で、CFU−GMコロニーを計数することができる。
CFU−GMを含有する培養物を速度制御型フリーザー（たとえばクリオ−メド、ミシガン州マウントクレメンス）で凍結し、次いで液体窒素の蒸気相中に保存する。10％ジメチルスルホキシドを凍害保護剤として使用できる。患者からの採集をすべて行ったのち、CFU−GMを含有する培養物を融解し、プールする。融解した細胞採集物をflt3−リガンド単独と、または先に挙げた他のサイトカインとの組合わせと順次もしくは同時に、接触させる。このようなflt3−リガンドへの暴露により、CFU−GMが樹状細胞系列へ推進される。この樹状細胞を患者に静脈内再注入する。
実施例３
抗腫瘍免疫反応の増強におけるflt3−Ｌの使用
この例は、in vivoでの抗腫瘍免疫反応の増強にflt3−Ｌを使用する方法を記載する。雌C57BL/10J（B10）マウス（ジャクソン・ラボラトリー、メイン州バーハーバー）に生存B10.2またはB10.5線維肉腫細胞５×105個を総容量50μｌで、腹側正中線位に皮内注射することにより注入した。線維肉腫B10.2およびB10.5系はB10由来であり、これまでに記載がある。Lynch et al.,Euro.J.Immunol.,21:1403（1991）参照。これを本明細書に参考として引用する。線維肉腫B10.2系はメチルコラントレン5mgを含有するパラフィンペレットの皮下埋込みにより誘発され、B10.5系は紫外線に長期暴露することにより誘発された。これらの腫瘍細胞系をin vitroで、５％FBS、2nM  Ｌ−グルタミン、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを含有するα−改変MEM中に維持した。組換えヒトflt3−Ｌ（１回の注射につき10μｇ）を総容量100μｌで１日１回、19日間にわたって（別途明記しない限り）、皮下注射により投与した。対照マウスには100ngのMSAを含有する同容量の緩衝液を同様に注射した。腫瘍サイズを腫瘍攻撃後の時間に対してプロットすることにより、腫瘍の増殖速度を測定した。腫瘍サイズをカリパスで測定した直交する２直径の積として計算し、特定の処理群内の腫瘍を保有するマウスのみの平均腫瘍サイズとして表した。各処理群につき実験終了時に、攻撃匹数と比較した腫瘍保有マウス匹数を以下のデータに示す。
表Ｉのデータは、腫瘍保有マウスをflt3−リガンドまたはMSAで処理した６回の異なる実験を編集したものである。MSA処理マウス30匹中１匹と比較して、flt3−リガンド処理マウス50匹中19匹に、完全な腫瘍後退がみられた（フィッシャー抽出試験によればｐ＜0.0001）。flt3−リガンド処理マウスの腫瘍増殖速度（腫瘍攻撃後５週目の腫瘍保有マウスの平均腫瘍サイズは60＋／−8mm2）は、MSA処理マウス（腫瘍攻撃後５週目の腫瘍保有マウスの平均腫瘍サイズは185＋／−17mm2）と比較して有意に低下したという所見も確認された（分散分析によりp.0001）。
0003631496.tif 000002
腫瘍サイズは対照と比較してflt3−リガンドによって明瞭に縮小した。したがってこのデータは、flt3−リガンドが外来抗原、特に癌に対する免疫反応の増強に重要なサイトカインであることを示す。