(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の導入遺伝子を含有する組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせであって、
ａ）5'LTR、キャプシド形成配列、gagおよびpol遺伝子、並びに3'LTRを含む組換え偽レトロウイルス配列であって、ｅｎｖ遺伝子が完全にまたは部分的に欠失され、ｅｎｖ遺伝子のレベルで該導入遺伝子により置換された組換え偽レトロウイルス配列、並びに
ｂ）エンベロープタンパク質をコードする配列を含む核酸配列であって、該配列はプロモーターに依存し、かつ３’末端でポリアデニル化部位と隣接する核酸配列、
を含み、
前記組換え偽レトロウイルス配列および前記核酸配列は、互いにトランスに相補作用することかできることにより、宿主細胞が、ｅｎｖ遺伝子の欠如した欠陥のある感染性ウイルスを産生することを可能にすることを特徴とする、組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項２】
前記ａ）の配列及び前記ｂ）の配列が、２つの別個のプラスミドに保有されていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えベクタの組み合わせ。
【請求項３】
前記配列ｂ）が、前記ａ）の組換え偽レトロウイルス配列の発現を制御する領域の外にあるという条件で、前記ａ）の配列及び前記ｂ）の配列が同じプラスミドまたはウイルスベクタに保有されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えベクタ。
【請求項４】
前記配列ｂ）がＬＴＲの外にあることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えベクタ。
【請求項５】
前記プラスミドがさらに、１または２のＡＡＶ  ＩＴＲ配列を、ＬＴＲの上流、または上流と下流に含有することを特徴とする、請求の範囲第３項に記載の組換えベクタ。
【請求項６】
前記エンベロープタンパク質をコードする配列を含有する核酸配列が、さらに該配列上流に、欠陥のある組換えレトロウイルスの相同配列を具備することを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第５項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項７】
前記欠陥のある組換えレトロウイルスの相同配列が、ｇａｇ遺伝子のすべてもしくは一部、またはｐｏｌ遺伝子のすべてもしくは一部から選択されることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項８】
前記発現される導入遺伝子が、自殺遺伝子であることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項９】
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）であることを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１０】
前記組換え偽レトロウイルス配列がモロニーゲノムＭｕＬＶに由来し、その５’または３’のＬＴＲ配列が野生型、突然変異体またはその組合せを起源とすることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１１】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列がウイルス起源であることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１２】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列がＭｕＬＶ、ＶＳＶ、ＨＩＶおよび狂犬病ｅｎｖ遺伝子をコードする配列から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１３】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列が細胞起源であり、膜タンパク質をコードする配列からなり、特異的リガンドへのウイルス粒子のターゲティングを可能にすることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１４】
前記膜タンパク質がＣＤ４型の受容体をコードするタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１５】
前記ｅｎｖ遺伝子が、そのカルボキシ末端がモロニーエンベロープの膜内配列に由来するキメラタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第７項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせ。
【請求項１６】
標的細胞、またはヒトもしくは動物組織中での導入遺伝子の発現を可能にする、宿主−ベクタ系であって、細胞株として樹立された真核細胞よりなり、該細胞に、
ａ）5'LTR、キャプシド形成配列、gagおよびpol遺伝子、並びに3'LTRを含む組換え偽レトロウイルス配列であって、ｅｎｖ遺伝子が完全にまたは部分的に欠失され、ｅｎｖ遺伝子のレベルで該導入遺伝子により置換された組換え偽レトロウイルス配列、並びに
ｂ）エンベロープタンパク質をコードする配列を含む核酸配列であって、該配列はプロモーターに依存し、かつ３’末端でポリアデニル化部位と隣接する核酸配列、
が形質転換されていて、
該組換え偽レトロウイルス配列および該核酸配列は、互いにトランスに相補作用することかでき、宿主細胞が、ｅｎｖ遺伝子の欠如した欠陥のある感染性ウイルスを産生することを可能にすることを特徴とする、宿主-ベクタ系。
【請求項１７】
前記ａ）の配列及び前記ｂ）の配列が、２つの別個のプラスミドに運搬されていることを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の系。
【請求項１８】
前記配列ｂ）が、前記ａ）の組換え偽レトロウイルス配列の発現を制御する領域の外にあるという条件で、前記ａ）の配列及び前記ｂ）の配列が同じプラスミドまたはウイルスベクタに保有されることを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の系。
【請求項１９】
前記配列ｂ）がＬＴＲの外にあることを特徴とする、請求の範囲第１８項に記載の系。
【請求項２０】
前記プラスミドがさらに、１または２のＡＡＶ  ＩＴＲ配列を、ＬＴＲの上流、または上流と下流に含有することを特徴とする、請求の範囲第１８項に記載の系。
【請求項２１】
前記エンベロープタンパク質をコードする配列を含有する核酸配列が、さらに該配列上流に、欠陥のある組換えレトロウイルスの相同配列を具備することを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２０項の何れか１項に記載の系。
【請求項２２】
前記欠陥のある組換えレトロウイルスの相同配列が、ｇａｇ遺伝子のすべてもしくは一部、またはｐｏｌ遺伝子のすべてもしくは一部から選択されることを特徴とする、請求の範囲第２１項に記載の系。
【請求項２３】
前記発現される導入遺伝子が、自殺遺伝子であることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２２項の何れか１項に記載の系。
【請求項２４】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）であることを特徴とする、請求の範囲第２３項に記載の系。
【請求項２５】
前記組換え偽レトロウイルス配列がモロニーゲノムＭｕＬＶに由来し、その５’または３’のＬＴＲ配列が野生型、突然変異体またはその組合せを起源とすることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２２項の何れか１項に記載の系。
【請求項２６】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列がウイルス起源であることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２２項の何れか１項に記載の系。
【請求項２７】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列がＭｕＬＶ、ＶＳＶ、ＨＩＶおよび狂犬病ｅｎｖ遺伝子をコードする配列から選択されることを特徴とする、請求の範囲第２６項に記載の系。
【請求項２８】
前記ｅｎｖ遺伝子をコードする核酸配列が細胞起源であり、膜タンパク質をコードする配列からなり、特異的リガンドへのウイルス粒子のターゲティングを可能にすることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２２項の系。
【請求項２９】
前記膜タンパク質がＣＤ４型の受容体をコードするタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第２８項に記載の系。
【請求項３０】
前記ｅｎｖ遺伝子が、そのカルボキシ末端がモロニーエンベロープの膜内配列に由来するキメラタンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第２２項の何れか１項に記載の系。
【請求項３１】
前記ｅｎｖ遺伝子または前記組換え偽レトロウイルス配列を含有する配列が、ウイルスベクタによる感染により導入することができることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第３０項の何れか１項に記載の系。
【請求項３２】
前記ウイルスベクタがアデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の系。
【請求項３３】
前記組換え偽レトロウイルス配列およびｅｎｖ遺伝子を運搬する配列が、リポソームのような運搬体に包み込まれ、形質転換により細胞に導入されることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第３３項の何れか１項に記載の系。
【請求項３４】
前記形質転換可能な細胞が、宿主細胞または標的細胞であることを特徴とする、請求の範囲第３３項に記載の系。
【請求項３５】
前記真核細胞が株として樹立された細胞であることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第３０項の何れか１項に記載の系。
【請求項３６】
前記株が３Ｔ３株のような繊維芽細胞株、またはマウスミエローマ細胞もしくはＶＥＲＯ細胞のように懸濁液として培養することができる株から選択されることを特徴とする、請求の範囲第３５項に記載の系。
【請求項３７】
前記使用される細胞が、鱗翅目（Lepidoptera）細胞であることを特徴とする、請求の範囲第１６項ないし第３０項の何れか１項に記載の系。
【請求項３８】
癌を治療するための遺伝子治療に使用するための医薬品であって、請求の範囲第１項ないし第１５項の何れか１項に記載の組換えベクタまたは組換えベクタの組み合わせを、活性成分として含む運搬体を含むことを特徴とする医薬品。
【請求項３９】
癌を治療するための遺伝子治療に使用するための医薬品であって、２重形質転換を受けており、且つ、請求の範囲第１５項の宿主-ベクタ系により表される真核細胞を、活性成分として含有することを特徴とする医薬品。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新しい遺伝子構築物から組換えレトロウイルスを産生することによる、特にある範疇の細胞（例えば、癌細胞）、またはウイルスに感染したある細胞の排除に応用される、新しい遺伝子治療の方法に関する。
キラー遺伝子（killer gene）または自殺遺伝子（suicide gene）による遺伝子治療の概念は、１９８６年以来多くのアプローチにより開発されている。この方法は、細胞による非毒性物質または毒性物質の変換を可能にする、遺伝子の発現を含む。遺伝子治療の概念は、標的細胞中で発現されると不活性な物質が活性物質に変換（また、この逆）され、その結果ある機能が破壊（自殺遺伝子の例）されるか、または回復される任意の遺伝子に、応用及び改変することができる。
以下の全てにおいて、自殺遺伝子へのこの概念の応用は、これが実験的に利用することができれば、より具体的に開発される。本発明の方法を、発現するとある物質を活性化または不活性化の方向に修飾する効果を与える、あるタイプの導入遺伝子（transgene）へ応用することは、当業者の能力の範囲内にある。
Ｉ型単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）は、自殺遺伝子に関して最も多くの研究の対象となっている酸素である。
この酵素は真核細胞には毒性がなく、アシクロビル（aciclovir）（ＡＣＶ）またはガンシクロビル（ganciclovir）（ＧＣＶ）のような、あるヌクレオシド類縁体を、一リン酸含有分子（この細胞キナーゼは通常不活性である）に変換することができるという特徴を有する（G.B.Elion,J.Antimicrob.Chemother.12:9-17(1983)）。次にこれらのヌクレオシド一リン酸は、細胞酵素によりヌクレオチド三リン酸に変換され、これをＤＮＡ合成に使用して、伸長過程を阻止して、それによって細胞を死滅させることができる。従ってこのヌクレオシド三リン酸類縁体は、分裂している細胞にのみ毒性がある。
従ってこのタイプの条件的（conditional）毒素から得られるすべての利点は、遺伝子治療（特に癌に対して）に応用すると、理解できる。
まず条件的毒性のみが、そのような導入遺伝子を産生して、自殺遺伝子を標的細胞に伝達することができる偽ウイルス粒子を産生する、安定な細胞クローンを生成することができる。確かに、ＡＣＶまたはＧＣＶの非存在下ではＨＳＶ１チミジンキナーゼは毒性がないため、これらの薬剤の非存在下で細胞を培養するだけでよい。
次に、治療で副作用が発生した場合は、ＡＣＶまたはＧＣＶの投与をやめれば、導入遺伝子による毒性は直ちに停止する。さらに、ヌクレオシド類縁体の投与量を調整することにより、導入遺伝子を強く発現する細胞を選択的に破壊し、一方で遺伝子の発現が弱い細胞を保持することができる。この分裂細胞に限定される毒性は、特に癌細胞の治療に対して大きな利点である。
最後に、インビトロおよびインビボの実験データは、ＨＳＶ１−ＴＫを発現していないがこれと接触している細胞も、ＡＣＶによる処理で破壊されることを示している（「代謝協力」または「傍観者効果（bystander effect）」）（Moolten F.L.,1986,Cancer Research,46:5276-5281およびCulver K.W.et.al.,1992,Science 256:1550-1552）。
この作用の機序はまだ理解されていないが、ヌクレオシド三リン酸類縁体が「ギャップ結合」（"gap junctions"）を介して、１つの細胞から別の細胞に通過している可能性もある。
レトロウイルスは、外来遺伝子を真核細胞（特に、ヒトの細胞）に移行させるのに最適の細胞と思われる。
しかし、レトロウイルスを治療目的や特に遺伝子治療に使用する場合の必須の前提条件は、その使用の安全性を確認することである。
遺伝子治療におけるレトロウイルスの使用の主要な危険性は、注目している細胞集団または組織内で再構築された野生型ウイルスが広がる可能性があることである。
そのような増殖により、レトロウイルスゲノムが感染された細胞のゲノムに多重挿入されて、あらゆる種類の遺伝疾患を引き起こす可能性がある。
この種のアプローチは、最大限可能な数の標的細胞に到達する問題があり、従って最大限可能な数の癌細胞に到達し、一方ウイルス増殖の制御を可能にする、この系の能力の問題がある。
この種のアプローチは、ウイルス増殖の制御にを確実にする一方で、可能なかぎり最大の標的細胞にまで伝播させる問題すなわち、この系の可能なかぎり最大の願細胞にまで伝播させる能力の問題を生じる。
目的の導入遺伝子を有し、欠陥のあるレトロウイルスのみを産生するパッケージング細胞株を開発するために、今日まで多くの方法が確立されている。このような細胞株の開発は、これらの系により与えられる安全性のおかげで、遺伝子治療におけるレトロウイルスの利用が大幅に増大した。
最初に使用されたベクタは、異なる種での使用を可能にするために両種向性（amphotropic）のエンベロープを有し、その増殖を防ぐために欠陥のある、偽レトロウイルス粒子に運搬されるレトロウイルスである。最初の天然のウイルスは、そこからシス作用性配列とトランス作用性配列が分離されて、２つの欠陥ゲノムを生成した、モロニーマウスウイルス（Moloney murine virus）である。
実際のウイルスベクタは、必須のシス配列（転写と組み込みの制御のためのＬＴＲ、カプシド形成（encapsidation）に必要なｐｓｉ配列、ウイルス複製に必要なＰＢ配列）を保持する。ウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が欠失しており、原則としてそれ自身のプロモーターまたはより強力であるかもしくは制御し易いプロモーターの支配下に置かれた、標的細胞中で発現される導入遺伝子により置換されている。
レトロウイルス遺伝子のｇａｐ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは、しばしば、ＬＴＲとＰＯＬＩＣＥ  ＤＡ ＭＡＴＨ８ＡｗＦＩＮＰ配列を欠陥した、別のウイルス（時に、ヘルパと呼ばれる）に組み込まれる。その発現は導入遺伝子のカプシド形成を可能にするが、ウイルスゲノムの増殖や完全なウイルス粒子の形成に必要な遺伝子は除かれる。
ヘルパのプロウイルス型は一般に、ベクタの宿主としても作用し、また、それが欠如する機能のヘルパとして作用する、マウス細胞株（例えば、繊維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３）のゲノムに組み込まれる。ベクタの形質転換後、細胞株は欠陥のある感染性ウイルス粒子を産生することができる。しかしこれらの粒子は、形質転換される遺伝子（導入遺伝子）のみを含有し、標的細胞内における完全なウイルス粒子の再構築に必要な情報を含まない。従ってこの系は、最初の感染後のウイルスの増殖を防ぐように設計されている。すなわち、導入遺伝子を有するウイルスが、ヘルパタイプの情報（ｇａｐ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）の欠如した細胞に侵入するとその産生は停止する。
従って通常は、パッケージング細胞株は、欠陥のある感染性ウイルス粒子が再構築されるように、ウイルス粒子内に存在するウイルスゲノムに対してトランスにヘルパ情報を提供することができる細胞株である。
欠陥のある組換えウイルスの産生を可能にする異なるパッケージング系が、以下の文献に記載されている：
−  特許出願ＥＰ0,243,204号は、標的の真核細胞の膜を通過するために、任意の物質をパッケージングするための手段としてのレトロウイルスの使用を記載している；
−  特許出願ＷＯ89/07150号は、両方プラスミドが異なるウイルス遺伝子（ｅｎｖ、ｇａｐ、ｐｏｌ）をトランスに発現するが、２つのうちのいずれもＰＯＬＩＣＥ  ＤＡ ＭＡＴＨ８ＡｗＦＩＮＰ配列を含まず、これらの細胞株中のウイルスの産生が104〜106CFU/mlである、レトロウイルスパッケージング細胞を記載している；
−  特許出願ＷＯ  90/02806号、ＷＯ  90/12087号、EP0,476,953号、ＷＯ  93/04167号およびＷＯ  93/10218号は、それ自身がパッケージング細胞株により産生されるレトロウイルスベクタを用いる、インビボの遺伝子導入について記載している文献である。
構築物に関する多くの文献と、これらの特許で引用された応用の多くを本願での引用文献として本明細書に含ませる。
最近の進展により、腫瘍の治療のためにベクタ産生性パッケージング細胞株を直接導入することによる、インビボの遺伝子導入が使用されるにいたっている。例えばレトロウイルスＴＨＫ−ＨＳＶ１を産生する細胞の定位（stereotactic）注入により大脳の微視的な実験的腫瘍の除去に続くＧＣＶによる治療が、クルバー（Culver）らにより報告されている（Science 256:1550-1552,1992）。
同様に、本出願の何人かの出願人は、ラットにおいて、組換えレトロウイルス粒子を産生するマウスの繊維芽細胞の直接注入による、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子のインビボ導入により、ラットの肝腫瘍が大幅に小さくなることを証明した（Caruso M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7024-7028,1993およびYves Panis et al.,C.R.Acad.SC.Paris.,Tome 315,Series III,p.541-544）。これらの論文は驚くことにさらに、この種の方法により、インビボで導入される細胞の数は確実にＴＫ−ＨＳＶ１の１０％未満であることを承知しながら、悪性腫瘍の中の癌細胞数が大幅に低下することを証明している。
この効果は、前述の代謝協力により説明できる。
従って導入遺伝子を運搬するウイルス粒子の産生を可能にするパッケージング細胞株のこの系は、遺伝子治療での使用および特に条件的遺伝子発現での使用に極めて有望である。
しかし、前述に引用した多くの文献中で開発され記載されたこれらの系は、以下のような限界を有する：
１）  これらの細胞株の低生産性（感染性力価は、106PFU/ml以下）、正常のレトロウイルスＭｏＭｕｌＶは、約108PFU/mlを産生し、アデノウイルスのようなウイルスは約109である；
１）  この方法の第２の限界は、接着性細胞株である繊維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３を使用することである；これは、ウイルス粒子を含有する細胞上澄液を使用する時は利点であるが、一方形質転換された細胞株自身を医薬として使用した時は欠点となり、インビボで注入された細胞株は、この場合、ｉｎ ｓｉｔｕ（その場で）組換えウイルス粒子を産生する；
３）  第３の欠点は、この系の安全性の利点の反対側であり、もしパッケージング細胞株によりｉｎ ｓｉｔｕで発現されたウイルス粒子が、分裂細胞中に目的の導入遺伝子を導入させることができるなら、以後の増殖はこのレベルで阻止されることである。これは増殖を阻止するため、導入遺伝子の導入の効率を限定する。
従って、目的の遺伝子を運搬する組換えウイルス粒子の産生の自己維持を可能にする、一方で、選択した時に以後の増殖を制御して、必要な安全性条件を保持（すなわち、野生型でのウイルスの増殖の完全な制御）できる系を設計することが重要である。
本明細書において以下では、「導入遺伝子」とは、標的細胞中で発現される遺伝子を意味し、これは本例中では自殺遺伝子型である。
導入遺伝子はまた、サイトカインや治療目的の分子でもよい。
「組換え偽レトロウイルス配列」という用語は、この配列がエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子以外の、偽レトロウイルス粒子発現に必要なすべての遺伝子を含有し、おそらく１つまたはそれ以上の導入遺伝子を含むことを意味する。
「宿主細胞」という用語は、同じプラスミドに運搬されるかまたは運搬されなく、また、医薬として使用されるかまたは欠陥のある組換えウイルスを産生するのに使用される、２つの組換え核酸配列を含有する細胞を意味する。
「標的細胞」という用語は、導入遺伝子の導入により処理することが好ましい細胞を意味する。
本発明は、標的細胞、またはヒトもしくは動物組織中での導入遺伝子の発現を可能にする宿主−ベクタ系を構築することで、前述の既存の系の限界について述べ、これを克服することを可能にするが、本発明は細胞株として樹立された真核細胞よりなり、以下のもので形質転換されていることを特徴としている：
ａ）図１ａに示すように、ｅｎｖ遺伝子が完全にまたは部分的に欠失され、ｅｎｖ遺伝子のレベルで該導入遺伝子により置換され、その結果導入遺伝子が、野生型モロニーウイルス中のｅｎｖ遺伝子と同様にスプライスされた転写物で発現される、組換え偽レトロウイルス配列、
ｂ）ｅｎｖまたは膜タンパク質をコードする配列を含む核酸配列であって、この配列はプロモーターに依存し、適宜該導入遺伝子と組合わされ、３’末端でポリアデニル化部位と隣接し、図１ｂで示される配列（該組換えウイルスゲノムと該配列は、互いにトランスに相補的で、該宿主細胞が、ｅｎｖ遺伝子の欠如した欠陥のある感染性ウイルスを産生することを可能にする）。
上記のａ）の組換えウイルスゲノムおよびｂ）のｅｎｖ遺伝子を有する核酸配列は、２つの異なるプラスミドもしくは形質転換系、または同じプラスミドもしくは形質転換系に運搬されるが、ただし、ｂ）配列は２つのＬＴＲの間の偽レトロウイルス配列の外に位置している。単一のプラスミド上の構築物は、図４ａで示される。
両方のアプローチに共通の特徴は、ａ）配列およびｂ）配列のための２つの別々の支持体または単一の支持体は、ψ配列が欠如したｂ）配列は決してパッケージングされず、従って宿主に産生されるウイルスはこれが欠如していることである。
さらに後者の場合、ａ）およびｂ）配列を有するプラスミドまたは前記図１ａの偽レトロウイルス配列を有するプラスミドは、該配列の発現の持続の安定性を増強することを目的とする他の組換え配列を含有してもよい。これらの相補的な配列には、例えばＡＡＶウイルス（アデノ随伴ウイルス）のＩＴＲ（逆末端反復配列を意味する）がある。このような構築物の例は、図４ｂに示されている。
第１の組換え偽レトロウイルス配列はｐｓｉ配列を有し、単独で形質転換された時は、ｅｎｖ遺伝子を含有する第２の配列とは独立に、すべての第１の配列を有するウイルス粒子の宿主細胞による産生を可能にするが、エンベロープが欠如していることから感染性はないため、１つまたは２つのプラスミドが運搬する前記２つの組換え配列を有する宿主細胞は、パッケージング細胞株にたとえることはできないことは、この系では明らかである。
従って細胞は、正常または組換えウイルスベクタの宿主のように挙動し、前述のヘルパの添加またはトランスの同時発現なしに、ウイルス粒子の産生を可能にする。
プロモーターに依存し、ポリアデニル化配列を後ろに有するウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子をこの宿主細胞に加えると、この宿主細胞でこの遺伝子が転写そして次に翻訳され、続いて以前のもの（および図１ａに示される）と同じゲノムを有するウイルス粒子の再構築が可能になる（ただし、これらは今度は標的細胞に感染性することができるエンベロープを有する）。再度ｅｎｖ遺伝子が加えられ発現される場合のみ、これらの感染性ウイルス粒子は、標的細胞に感染後、感染性ウイルス粒子を産生することができる。
同じプラスミド支持体により運搬されるか、又はされない２つのＬＴＲおよび１つのｅｎｖ遺伝子で境界が設定される組換えレトロウイルス配列を有するという特徴を有する本発明の組換えプラスミドにはまた、標的細胞へのその導入を可能にする系を組合せてもよい。これらの系にはいくつかのタイプがあり、例えばウイルス、または細胞への遺伝物質の導入を促進する適当な運搬体（vehicle）がある。適当な運搬体は、生体膜を横断することができることで定義され、特にリポソーム、陽イオン性脂質、ポリスチレン誘導体、不活性アデノウイルスまたは弾道法（ballistic method）でもよい。
リポソームは、細胞に核酸とウイルス粒子の両方を包括および導入させるのに使用されている（R.Philips et al.,(1994)Molecular and Cellular Biol.Vol14 No.4,p 2411-2418）。これらの運搬体は、それが含有するプラスミドの形質転換の効率は非常に低い。目的の治療用配列の発現の増強と長期化を可能にする配列を、本発明の偽レトロウイルス配列に加えることは、組換えプラスミドトランスポーター／担体として、または医薬品の製造の中間的手段として、医薬品の活性成分として、使用することを可能にする。ベクタを含有する運搬体によりこうして形質転換された細胞は次に、目的の遺伝子をコードするがエンベロープ遺伝子の欠如した欠陥のあるレトロウイルスを産生する細胞に、自身を形質転換し、欠陥のあるウイルス自身は、他の細胞に再感染してそこで再び目的の遺伝子を発現することができ、ｅｎｖ遺伝子が任意の可能な方法で添加されない場合は、この段階でサイクルが停止する。この細胞は、宿主−ベクタ系の細胞であるか、または前記で定義した標的細胞である。
本発明はまた、１ａに記載の偽レトロウイルス配列を含有する前記で定義した運搬体、図４ａと図４ｂに記載の同じプラスミド支持体上で分離または集合された、組換え偽レトロウイルス配列の上流および下流に、好ましくはｅｎｖ遺伝子を有する組換え配列の下流に、随意ＡＡＶウイルスのＩＴＲを有する、１ｂに記載のｅｎｖ遺伝子を有する組換え配列に関する。
より一般的には：
−  感染性ウイルス粒子の作成に必須の遺伝子が、目的の導入遺伝子で置換されている、
−  この必須の遺伝子が同じベクタの上に存在するか、または別のベクタの上に存在するが、ウイルスプロモーターには依存せず、および
−  この遺伝子産物はトランスで作用し、欠陥のあるウイルス粒子の再構築を可能にする、
任意のウイルスベクタは、本発明の一部を形成する。
このタイプの非レトロウイルス構築物の別の例は、Ｅ１Ａ遺伝子が目的の導入遺伝子で置換されており、欠陥のある感染性ウイルス粒子を再構築するようにＥ１Ａ配列がトランスで発現される、欠陥のある組換えアデノウイルスの再構築である。
本発明の構築物の基本的な特徴は、これが宿主細胞内、または標的細胞内で感染性ウイルスを産生することを可能にするが、産生されたウイルスは、導入遺伝子を発現することができるが感染性粒子を産生することはできないことである。
前述の偽レトロウイルス配列の場合は、ｅｎｖ配列は、レトロウイルス配列の発現を制御する領域の外にあるであろう。
発現される導入遺伝子が自殺遺伝子、特に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）またはサイトカインの場合、この系は後述するように特に有用である。
本発明の宿主-ベクタ系において、組換え偽レトロウイルス配列は、５’または３’のＬＴＲ配列が野生型由来であるか、または異なる突然変異体、またはその組合せに由来する、モロニーウイルスＭｕＬＶのゲノムから得られる。例えば、突然変異体のｍｏｖ３、ｍｏｖ９およびｍｏｖ１３（Caruso M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7024-7028,1992）由来のＬＴＲ型構築物がある。
宿主細胞による産生されるウイルス粒子中にカプシド形成される核酸配列（図１ａ）は、「野生型」レトロウイルスゲノムに極めて近く、パッケージング細胞株とウイルス遺伝子のトランス相補作用性により、当該分野の前述の従来技術の系で得られるものより高力価が得られるという利点がある。
例えば後述するように、従来技術ではパッケージング細胞株の最小力価は１０6のオーダーであるが、この系では１０6〜１０9の範囲の力価であり、好ましくは１０7〜１０8pfu/mlの範囲である。
本発明の宿主-ベクタ系の第２の特徴は、宿主細胞は、エンベロープタンパク質をコードする配列を含む核酸配列と同時に形質転換され、このタンパク質はウイルスまたはレトロウイルス起源であり、または膜もしくは細胞質タンパク質である。
「同時に」とは、偽レトロウイルス配列と、エンベロープ遺伝子をコードする核酸配列の、２つの配列が、宿主細胞中で同時に発現され、このため形質転換を１つまたは２つの構築物中で同時にまたは連続的に行うことが可能であることを意味する。
選択されたエンベロープ遺伝子は、偽レトロウイルス配列と相同性があり、すなわち例えばＭｏ−Ｍｕｌｖ由来であり、相同の偽ウイルス配列の再構築を可能にするか、または別のウイルス由来であり、別のウイルスの例としては、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、またはギボン（gibbon）白血病ウイルスがあるが、これらに限定されない。この遺伝子はエンベロープタンパク質に転写および翻訳される時、エンベロープがＶＳＶ（またはＨＩＶ）エンベロープであり、ゲノムはＭｕＬＶおよび導入遺伝子のＬＴＲ、ｐｓｉ、ＰＢ、ｇａｇおよびｐｏｌを含有する、偽ウイルス型の再構築を可能にする。
最後にｅｎｖゲノムは細胞起源であり、特異的リガンド（特に、ＣＤ４タイプの受容体）上のウイルス粒子のターゲティングを可能にする膜タンパク質をコードしてもよい。
さらにエンベロープは、そのカルボキシ末端がモロニーエンベロープの膜内配列由来であるキラメタンパク質でもよい。これらの膜配列は、ウイルス粒子の表面のエンベロープタンパク質の濃縮に関与していることを示す実験データが存在する。これらのキメラ分子では、ウイルス粒子の表面のキメラｅｎｖタンパク質の発現の効率は増加している。
これらの異種偽ウイルス型の発現を可能にするこの宿主-ベクタ系の第２の利点は、感染能力を失うことなく超遠心分離によりこれらの偽ウイルス粒子を、適宜精製できる可能性があることである。これにより、力価が109PFU/mlと高いウイルス懸濁液を得ることができる。
図１ｂで後述するｅｎｖ遺伝子を含有する核酸配列は、任意のタイプの手段（物理的手段、またはウイルスまたはレトロウイルスベクタを用いる）により形質転換することができる。既知の物理的手段の中には、微量注入、リポソームまたはいわゆる弾道法または衝撃法がある（Kriegler,M.Gene Transfer and Expression;A Laboratory Manual;MacMillan Publishers Ltd.;1990）。
形質転換は、ウイルスベクタおよび特にアデノウイルス中にこの核酸配列を組み込むことにより行われる。
後者の方法の利点は、ウイルス増殖に完全な支配を有しつつインビボで自己維持できる系を、正しく配置できる可能性である。
確かに、導入遺伝子として自殺遺伝子よりなり、例えば腫瘍中に注入される宿主-ベクタ系は、分裂細胞をｉｎ ｓｉｔｕで再感染する組換えウイルス粒子を発現するであろう。
これらの細胞は次に、ウイルス粒子を再発現するであろうが、これらの粒子はウイルスゲノムがエンベロープ遺伝子によってトランス相補的になっていないため、感染性はないであろう。
ｅｎｖ遺伝子を含有する組換え発現ベクタがこの段階で注入されるなら、新しいトランス相補性が発生し、このサイクルが再度繰り返されるであろう。１つは分裂細胞にのみ感染することができる偽ウイルス粒子により、もう１つはすべての細胞に感染することができるアデノウイルスによる、２重の形質転換が必要なため、こうしてこの系の安全性は保持される。従って、分裂細胞のみが、共形質転換され、トランスでウイルス遺伝子を発現し、そして標的細胞に感染することができる偽ウイルス粒子を産生することができる。
従ってこの系は、特に洗練された方法で、標的細胞に例えばＴＫ自殺遺伝子を形質転換し、この遺伝子の発現を可能にして、これを含有する細胞に、ヌクレオシド類縁体に対する感受性を与えることができる。エンベロープ遺伝子の共形質転換は、この同じ標的細胞により、エンベロープ遺伝子に欠陥のある同じ組換え偽ウイルスゲノムを含む感染性粒子の産生を可能にする。
従って、ｅｎｖ遺伝子を有する配列が外から提供される限り、必要な回数このサイクルを繰り返すことができる。標的細胞中で１回のウイルス複製の後、この系は、感染性粒子の産生、非感染性粒子の再感染および産生を停止させる。
このサイクルの全体は図２に記載されている。
本発明の宿主-ベクタ系の第３の利点は、細胞株がこのタイプの両種向性ウイルス粒子を産生することができるなら、任意のタイプの真核細胞を細胞株として樹立することができることである。
モロニーウイルスの組換えウイルス粒子を産生するのに従来から使用されているＮＩＨ／３Ｔ３株に加えて、本発明の宿主-ベクタ系は、懸濁液中で培養することができる細胞株の使用を可能にする。例えば、マウスミエローマ、ＶＥＲＯ細胞または昆虫細胞。
懸濁液中の細胞を用いる明らかな利点は、遺伝子治療で使用される医薬品の調製のための工業的応用にある。このような調製物には大量の細胞が必要であり、これは接着細胞よりも懸濁状態の細胞において、はるかに容易に得られる。
宿主細胞としてＶＥＲＯ細胞を選択することは、一方では霊長類由来であり、従って系統樹的によりヒトに適しており、他方では天然の抗体や補体の作用に対して耐性があることにある。これらの細胞は最終的には、ワクチンの産生に広く利用され、特に、不活性化または精製工程をほとんど被らないウイルス（例えば、狂犬病に対するウイルス）の産生に利用される。ウイルス粒子産生宿主細胞として使用されるいくつかの細胞は、該粒子が補体により不活性化されないという性質を有する。これらには、特にヒト細胞株またはアメリカミンク（vison）より得られた細胞株がある。
宿主細胞として鱗翅目（Lepidoptera）の細胞またはより一般的には昆虫細胞（双翅目（Diptera）を除く）を選択することは、遺伝子治療において医薬品として使用することができる宿主-ベクタ系を作成するのに多くの利点を有する：
−  これらは真核生物に感染するウイルスのウイルスエンベロープタンパク質を産生することができるが、これら自身はこれらのウイルスにより感染されない；
−  昆虫細胞は哺乳動物ウイルスを産生しない；従ってこれらに関するウイルスの安全性の試験は減少する；これらの細胞は、ヒトに対する病原性を有する可能性のあるウイルスにより感染されない；従ってこれらの細胞は、ウイルスの安全性の観点から、ヒトでの使用に際してより安全である；
−  昆虫細胞は懸濁液中で成長し、従って大量に培養することができる；昆虫細胞は、組織内で動くことができる；従って、腫瘍に注入された場合、これらは注入部位から離れた所に偽ウイルス粒子を動かし送達することができる；
−  強いプロモーターである、昆虫細胞に対して特異的なプロモーターを使用することができる；例えば、高発現レベルを有するバキュロウイルスを使用して、偽ウイルス粒子数を増加させることができる；
従ってバキュロウイルス由来のいくつかの強いプロモーターがある場合、異なる形質転換遺伝子の間の組換えの危険性を低下させるために、複雑な作成を行うことができる。
これらすべての利点のために、昆虫細胞（両種向性偽ウイルス粒子を製造できるように、随意遺伝的に修飾される）は、本発明の宿主-ベクタ系の作成のための好適な手段である。
当業者は、標的細胞中で発現したい導入遺伝子によっては、ｐｓｉ配列、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および導入遺伝子を有するレトロウイルスゲノムを用いて、エンベロープ遺伝子のトランス相補性を可能にし、そして時間的および区間的に制御できるｅｎｖ遺伝子の添加により増殖を可能にする、適当な発現ベクタと、適当な宿主細胞を用いて、構築物を産生する方法を、場合により知るであろう。
本発明の宿主-ベクタ系のもう１つの有用な改良は、ｅｎｖ遺伝子を有する核酸配列中に、ＨＳＶ１チミジンキナーゼ遺伝子または任意の他の条件的自殺遺伝子を組み込むことにある。この改良により、自殺遺伝子は異なるタイプのプロモーターに依存して標的細胞中で発現され、従ってこの自殺遺伝子の発現により細胞に与えられるヌクレオシド類縁体に対する感受性を増加させることができるため、この改良は、治療の効率を向上するとともに、系の安全性を向上させる第２の要素である。
ヒトの治療での使用のウイルスの安全性の問題に対する特に有用な改良は、
−  宿主細胞が昆虫細胞であって、哺乳動物ウイルスを産生せず、
−  プロモーターに依存して使用されるｅｎｖ遺伝子を運搬するベクタは、ｅｎｖ遺伝子の上流に、宿主-ベクタ系で使用される欠陥のある組換えレトロウイルスと相同の配列（例えば、ｇａｇ遺伝子のすべてまたは一部、またはｐｏｌ遺伝子のすべてまたは一部）を含有する、場合の宿主-ベクタ系の使用である。
レトロウイルスによる相同組換えが、宿主が内因性レトロウイルスを含有する系（例えば、マウス細胞）が起きるなら、機能のないレトロウイルスが産生されるため、この系は有用である。この組換えは、これに由来する組換えゲノムもまた欠陥があるように起きる。ヒトにこのタイプの細胞を注入しても、ウイルスの観点から全く安全である。
同様にこの系では、宿主-ベクタ系で昆虫細胞を使用しても、相同組換えは起きず、昆虫細胞は哺乳動物レトロウイルスを含有せず、従って治療目的の注入は、本発明の欠陥のある組換えウイルス粒子のみを産生させ、相同組換えに由来し従って感染性であるウイルス粒子を排除することを可能にするであろう。
本発明はまた、以下の工程を用いることよりなる、遺伝子治療のための導入遺伝子を発現する方法に関する：
ａ）一方では、ｅｎｖ遺伝子が完全に欠失しており、例えば該ｅｎｖ遺伝子のＡＴＧのレベルで、導入遺伝子に置換されている偽レトロウイルス配列を、そして他方では、プロモーターの制御下にエンベロープタンパク質をコードする配列を、適宜導入遺伝子とともに、かつ３’末端でポリアデニル化配列（上記の２つの配列は、１つまたは２つのプラスミド型のベクタに運搬される）が隣接して、その構造中に含有する核酸配列を、真核宿主細胞に形質転換することにより、宿主-ベクタ系を作成し、
ｂ）該系を、導入遺伝子が発現される細胞と接触させ、
ｃ）適宜、ｅｎｖ遺伝子を含有する上記の配列を再度標的細胞中に移行させる。
本発明の方法において、偽レトロウイルス配列は、モロニーウイルスＭｕＬＶから直接得られ、５’または３’中のＬＴＲ配列はｍｏｖ９、ｍｏｖ３またはｍｏｖ１３のような特異的ウイルス種に由来し、これらは野生型、突然変異体または複合起源でもよい。
同じ構築物中に２つの配列を有する場合には、ｅｎｖタンパク質をコードした該配列は、偽ウイルスの５’と３’の２つのＬＴＲの外側にある。
本発明の方法において、導入遺伝子は治療目的の遺伝子であってもよく、特に上記した様に発現した時にその細胞内でヌクレオシド類縁体への感受性を与えるＨＳＶ１のチミジンキナーゼ遺伝子の様な自殺遺伝子であってもよい。
本発明の方法において、ｅｎｖ遺伝子を含有する配列は、該遺伝子をコードするレトロウイルス配列から、そして特にＭｕＬＶのｅｎｖ遺伝子、または例えばＶＳＶ、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、ギボン（Gibbon）白血病ウイルスのような異種ウイルスのｅｎｖ遺伝子をコードするレトロウイルス配列から選択される。再構築されたウイルス粒子は、そのエンベロープはそこからｅｎｖ配列が得られたウイルスのエンベロープタンパク質よりなり、ウイルスゲノムはＭｕＬＶ由来であるハイブリッド粒子であることは言うまでもない。
本発明の方法は、ｅｎｖ遺伝子を含有する配列（この配列が、偽レトロウイルス配列も有するプラスミド中に含まれる場合も、反対に後者の自立性ベクタ中に含まれる場合も）が、任意の適当な方法で、特にウイルスベクタ（例えば、アデノウイルス）により、または物理的方法（例えば、衝撃法、リポソームの融合または微量注入法）により、標的細胞に導入されることを特徴とする。前述のように、ウイルス粒子の発現は分裂細胞中でのみ、かつモロニーウイルス由来の偽ウイルス粒子とアデノウイルスベクタ由来のエンベロープ遺伝子のトランス相補作用により達成されるため、アデノウイルスの使用は完全な安全性を確保しながら、この方法を高収率で行うことを可能にすることは言うまでもない。
本発明の方法の有効な変法の一つは（特に、形質転換手段としてリポソームが使用される場合）、その機能が、偽レトロウイルス配列そして特に導入遺伝子の発現を安定化させる機能である、２つのＬＴＲの外の１つまたはそれ以上の配列の添加である。
これらの配列の例は、ＡＡＶウイルスのＩＴＲ（逆末端反復）配列である。これらの配列は、発現される配列の何れかの側（特に上流）に存在する時、該配列の発現の実質的な安定化を付与することができる（Philips et al.,前述、およびFlotte T.T.et al.,Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol,1992 7:349）。
このタイプの配列とは別に、発現のレベルおよび／または持続期間を増加することができる任意のタイプの配列を、当業者は選択することができ、前述の２つのタイプａ）とｂ）のヌクレオシド配列の外に、形質転換のベクタまたはプラスミド中に組み込むことができる。
より一般的には本発明は、遺伝子治療のための導入遺伝子の発現を可能にする方法に関し、図１ａに示す一般的構造を有するレトロウイルスゲノム（このゲノムは、ウイルス粒子の発現に必要なすべての配列を有するが、該ウイルス粒子に感染性を与えるエンベロープ遺伝子が欠如している）と、他方でその配列中に細胞性またはウイルスエンベロープを含有する核酸配列を、標的細胞に同時に形質転換することを特徴とし、こうして形質転換された２つの配列のトランスの同時発現は、感染性であるがそのゲノム中に該ｅｎｖ遺伝子が欠如した組換えウイルス粒子の発現を可能にする。
この２つのタイプの核酸配列のトランスの同時発現は、宿主細胞中で行われて、遺伝子治療で使用することができる宿主-ベクタ系の産生を可能にするか、または治療すべき標的細胞中への同時注入として、または最後に運搬体（例えば、リポソーム）にカプセル化することにより、行われる。
ｅｎｖ遺伝子を有する配列が、偽レトロウイルス配列の５’および３’ＬＴＲの外にあるなら、この発現は、配列が２つの異なる構造に運搬される場合も、または同じプラスミド構造に運搬される場合も、達成される。
ｅｎｖ遺伝子を有し、プロモーターの支配下で発現される第２の核酸配列を、必要に応じて添加することにより、使用される系の反復性は当業者に明らかとなるであろう。
本発明はまた、トランスでの発現が、真核細胞に導入遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を産生させる、２つの核酸配列を、真核細胞への共形質転換により得られた前述の宿主-ベクタ系の、遺伝子治療での使用に関し、この使用は、破壊される標的細胞中の自殺遺伝子の発現に有効に応用される。
この同時発現は、図１ａおよび図１ｂに記載の配列の２重の形質転換により、または２つのタイプの配列（１ａと１ｂ、その例は図４ａに示されている）を有する単一の構造の形質転換により、達成される。
もしこの単一の構造がさらに、発現のレベルと持続時間を増加させる配列（例えばＡＡＶウイルスのＩＴＲ配列）を有するなら、その使用は特に形質転換の手段としてリポソームを使用する場合に特に有効であり、こうしてこの技術の有効性が向上し、遺伝子治療で使用される宿主-ベクタ系の製造の中間体として、または遺伝子治療で使用される医薬品の活性成分として、組換えプラスミドを有するリポソームの使用を可能にする。
ＡＡＶのＩＴＲは、１つが５’ＬＴＲの上流に位置し、他方がポリアデニル化配列（ＰＡ）の下流に位置する（図４ｂに示すように）時、最大の作用を示す。
最後に本発明は、遺伝子治療で使用される医薬品に関し、これらは活性成分として、図１ａと１ｂに示す核酸配列とともに２重に形質転換される真核細胞を含有することを特徴とする。本発明の医薬品の活性成分はまた、一方で、ｅｎｖ遺伝子が例えばその開始コドンのレベルで、発現されるべき導入遺伝子により置換されているウイルスゲノムを有する、感染性組換えウイルス粒子よりなり、他方でその構造中でプロモーターに依存し、適宜例えばチミジンキナーゼ遺伝子をコードする配列が隣接するｅｎｖ遺伝子を含有する核酸配列よりなっていてもよい。
同様に本発明は、組換えＤＮＡ配列（その１つは、レトロウイルス５’および３’ＬＴＲの間の偽レトロウイルス配列よりなり、ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子および治療目的の遺伝子を含有するが、ｅｎｖ．遺伝子が欠如し、他の配列は最初の配列の外にあり、ｅｎｖ．遺伝子とポリアデニル化配列を含有し、プロモーターに依存し、適宜、目的の遺伝子をコードする配列が隣接する）を含有するリポソームを活性成分として含有することを特徴とする。有効な実施態様において、組換え配列を有するこれらのリポソームよりなる医薬品は、これらを有するプラスミドは、目的の遺伝子の発現を増強することができる配列、特に２つのＬＴＲの間にあって、該医薬品の効力を増強する配列よりなる。
本発明の医薬品のための目的の遺伝子は、チミジンキナーゼの遺伝子であることが有効であり、これは発現されると、これを有する細胞に、ガンシクロビルまたはアシクロビルのようなヌクレオシド類縁体に対する感受性を付与する。
当業者は、ルーチンの実験により、このタイプの宿主-ベクタ系の可能な変法のすべてを実施することができるであろう。
このような変種またはその同等法は、請求の範囲に記載の本発明の一部を形成する。
以下の図や例により、本発明をより詳細に例示する。
−  図１は、同時に形質転換される２つの核酸配列の作成を示す。
この図において、
図１ａは、欠陥のある組換えモロニーウイルスであり、灰色の領域はモロニーウイルス由来の配列であり、黒い背景の上にあるＸ遺伝子は導入遺伝子を示す。
図１ｂは、ウイルスエンベロープまたは膜タンパク質をコードするＹ遺伝子を示し、５’でプロモーターおよびおそらくレトロウイルス配列が隣接し、３’でポリアデニル化配列が隣接する。
図１ｃは、念のために、野生型モロニーウイルスの配列を示す。
−  図２は、標的細胞中への欠陥のある組換えレトロウイルスゲノムの再導入を可能にする、欠陥のある感染性ウイルス粒子の産生の、トランスの同時発現の原理を示す。
この模式図の最初の部分で、図１ａで示すタイプのベクタが、宿主細胞中に導入される。（この導入は、形質転換、またはこの模式図の最後に示す欠陥のあるレトロウイルス粒子で感染させることにより達成されることに、注目すべきである。）図１ａに示すベクタのこの発現の結果は、そのゲノムはこのベクタ由来であるが、表面にエンベロープタンパク質を有さず、従って非感染性であるウイルス粒子の産生である（この模式図の第２の部分に示す）。
ｅｎｖ遺伝子を有する、図１ｂに示すタイプのベクタは、次にこの細胞中で形質転換することにより発現される。次にトランス相補作用により、ウイルス粒子の表面でエンベロープタンパク質を発現させるが、これらのウイルス粒子はｅｎｖ遺伝子が欠如したままである。
−  図３は、導入遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を産生する細胞の生成から、腫瘍へのｉｎ ｓｉｔｕの注入およびエンベロープ遺伝子を用いるｉｎ ｓｉｔｕ相補作用による感染性サイクルの永久化までの、治療の模式図である。左の欄は、すでに図２に記載した欠陥のある組換えウイルス粒子の産生を概説する（細胞は、インビボで腫瘍内に注入される）。ｉｎ ｓｉｔｕで産生される欠陥のある組換えウイルス粒子は次に、腫瘍細胞に感染することができる。次に導入遺伝子の治療効果がこれらの細胞で発現され、形質導入された腫瘍細胞は、導入遺伝子を有するがエンベロープが欠如したウイルス粒子を産生する。図１ｂのベクタが連続的に添加されない場合は、このサイクルはこのレベルで停止する。
図４ａは、２つの（偽レトロウイルス配列とｅｎｖ．配列）配列が同じ構造により運搬される、プラスミド構築物を示す。
図４ｂは、ＡＡＶウイルスのＩＴＲが５’ＬＴＲの上流で及びポリアデニル化（ＰＡ）配列の下流に添加される変法である。
導入遺伝子は両方のケースで、ＨＳＶ１チミジンキナーゼ遺伝子である。
図５は、本発明の系の効率を示すのに使用される特異的な対のベクタを示し、図５ａは、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を含有するベクタｐＮＰ−２、および以下の例３に記載のモロニーウイルスｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドｐ ＣＲＩＰ ＧＡＣ−２である。
−  例：１ウイルスエンベロープに欠陥のある治療用遺伝子を有するモロニーウイルスの作成
使用したベクタは、レトロウイルスベクタｐＭＡ２４５由来であり、これはモロニーウイルスＭｕＬＶ由来であり、ジャエニッシュら（Jaenisch et al.,1981,Cell 24:519-529）の樹立した、異なるＭｏｖ種（Ｍｏｖ−３、−９および−１３）からクローン化されたＭｕＬＶ断片から作成された。
この遺伝的作成は当業者には容易である。感染性モロニー・プロウイルスを有するプラスミドを、出発物質として用いる。このようなプラスミドは適当な細胞株（例えば、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞）に形質転換すると、形質転換された遺伝子構築物由来の野生型モロニーゲノムを有する、感染性ウイルス粒子を生ずる。このゲノムでは、エンベロープをコードする遺伝子が、治療用のタンパク質をコードする遺伝子で置換される。この作成は、この遺伝子が「野生型」エンベロープ遺伝子と同じ、スプライシングされた転写物から合成されるように行われる。治療用の遺伝子の発現効率のために、かつレトロウイルス粒子の産生効率のために、治療用の遺伝子は、そのＡＴＧコドンが正確にモロニーｅｎｖ遺伝子のＡＴＧの位置に来るように、置換される。治療用の遺伝子は、相補的なＤＮＡからより容易に得られ、従ってイントロンを含まず、またポリアデニル化配列が欠如している。この遺伝子作成は、これはモロニーウイルスの天然のスプライシングを保持し、これはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子のタンパク質読みとり枠を保持し、そしてモロニーウイルスの３’ＬＴＲの完全性を保持するようなものである。ＤＮＡの酵素的消化と次の適当な断片の結合により、当該分野の技術では全遺伝子作成が行われる。これらの技術は、Maniatis et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manualに記載されている。必要であれば、クローニングに適した制限部位が存在する末端で遺伝子断片を作成するために、ＰＣＲまたは他の適当な増幅法を用いる。
またもし必要であれば、感染性モロニープロウイルスを構成する異なる遺伝的断片は、異なるプラスミドに分布している短い断片に分解され、適当な方法で再集合するように、これらはより容易に扱われる。最後に、必要であれば、遺伝子構成を行うのに必要な制限部位を導入するために、または正確な位置で異なる遺伝子を置換するために、部位特異的突然変異誘発を使用することもできる。この遺伝子構成の最後に、細胞（例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３）に形質転換されると、野生型のモロニーウイルスのように発現されるプラスミドが入手でき、従ってゲノムがプロウイルス自身よりなるウイルス粒子が作成される。感染性プロウイルスと新たに作成された欠陥のあるプロウイルスとの間の相同性のために、異なるＲＮＡの合成は、最適化された比率で効率よく起き、このため細胞に産生されるウイルス粒子の数は、野生型ウイルスのそれと非常によく似ているようになる。従ってこのウイルス粒子の数は、通常のカプシド形成細胞株（ここでは、異なるモロニーウイルス構造遺伝子は、異なる遺伝子構築物により運搬され、ウイルス粒子のゲノムを構成するレトロウイルスベクタは、異なるプラスミドの上にあり、その構造とサイズは野生型モロニーとは非常に異なる）により産生されるものよりかなり大きい。こうして産生されるウイルス粒子はエンベロープが欠如しているため、感染性がないことに注目すべきである。このエンベロープタンパク質は、ベクタ（その作成は後述される）を用いて、細胞中で独立に提供される。
−  例２：ｅｎｖ遺伝子を有する核酸配列の作成：
この細胞中に、通常のプロモーター（例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＰＧＫのようなハウスキーピング（housekeeping）遺伝子、またはあるタイプの細胞に特異的なプロモーター、従ってこれは使用に際しさらなる安全性を与える）の制御下で、膜発現遺伝子を含有する、新しい遺伝子構築物を形質転換することができる。この発現ベクタはまた、異なる遺伝子構築物（成長ホルモン、β−グロビン、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列など）から得られたポリアデニル化配列を含む。膜遺伝子は、モロニーウイルス自身のエンベロープ、またはウイルス粒子に捕獲されその表面で発現される別のウイルスのエンベロープでもよく、またはウイルス粒子の表面にも存在する細胞膜タンパク質でもよい。異なるレトロウイルスにより組み込むことが可能なＣＤ４分子については特にこのことが言える。
別の実施態様は、その細胞内部分はモロニーウイルスのエンベロープの細胞内部分由来であり、細胞外部分はウイルス粒子のよりよいターゲティングを可能にする膜タンパク質であるような、キメラ膜タンパク質の作成である。モロニーエンベロープの細胞内領域の存在により、ウイルス粒子の表面でこのキメラエンベロープのより効率的な発現がおそらく確保される。
この第２の構築物はまた、エンベロープ遺伝子自身以外のモロニーウイルス由来の配列は含まないように産生される。より正確には、これは、以前の遺伝子構築物で欠失していた配列が含有することはない。こうしてこの発現ベクタと前述の欠陥のあるレトロウイルスの間の組換えの可能性は大幅に小さくなり、この組換えにより今度は感染性モロニーレトロウイルスが産生されるであろう。これらの遺伝子作成はまた、前記した当該分野の技術に従って行われる。
−  例３：それぞれ例１と２で作成された２つの配列のトランス相補によるウイルス粒子の発現：
これらの構築物を用いて、ミエローマ細胞ｐｓＸ６３Ａｇ８またはチミジンキナーゼの欠失した３Ｔ３ＴＫ細胞を感染させる。
下記の実験は、２つの対照実験と２つの試験よりなる：
バッチａ）：細胞は形質転換されない選択培地の第１の対照、
バッチｂ）：細胞は、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ＬａｃＺ）を含有するプラスミドで形質転換される、形質転換の効率の第２の対照、
バッチｃ）：細胞はプラスミドｐＮＰ−２のみで形質転換され、ＴＫは発現されるが、欠陥のある組換えレトロウイルス粒子の産生を介しての増殖はない、試験。
バッチｄ）：細胞はプラスミドｐＮＰ−２とモロニーウイルスＭｏ−Ｍｕｌｖのｅｎｖ遺伝子を有するプラスミドで共形質転換される、試験。
３．１  プラスミドの説明
−  図５ａは、プラスミドｐＮＰ−２（これは、１９９５年２月２０日にＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ−１５４１で寄託された）を示す。これは、Ｍｏ−Ｍｕｌｖ ＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子を含有し、下流に突然変異したｅｎｖ遺伝子ＡＴＧの下にＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を有する。その全サイズは１０．３８Ｋｂである。部位Ａｆｌ ＩＩＩ（８．６０Ｋｂで）とＥｃｏＲＩ（１０．２１Ｋｂで）を示してある。
−  図５ｂは、第２のプラスミドｐＣＲＩＰ ＧＡＧ-2を示す。これは、ＭｏＭｕｌｖ配列、ψ−、ｇａｇ−、ｐｏｌ＋、ｅｎｖ＋を含有する配列中にＭｏＭｕｌｖｅｎｖ遺伝子が組み込まれ、下流にＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ配列がある構築物の例である。
３．２  形質転換
３Ｔ３ＴＫ細胞は、形質転換されない（バッチａ））か、または前述の条件下で形質転換される（バッチｂ）、ｃ）およびｄ））。
バッチｂ）で、発色基質を用いて形質転換の効率が明らかになる。このために細胞をＩＰＴＧ（Ｌａｃオペロンの誘導体）の存在下で培養し、２４時間の最後にｘ  ｇａｌの存在下で、発現されるβ−ガラクトシダーゼにより切断されると色が青に変化する。従って細胞中の青色が存在することは、形質転換の存在を示す。
バッチｃ）とｄ）においては、細胞はＨＡＴ選択培地の存在下で、２４時間または５日間培養後、細胞の増殖を考慮すると、ＨＡＴに耐性の非常の多くの数の細胞が存在することが予測される。
３．３．  結果
１）形質転換の効率：使用される条件下で、プラスミドＬａｃＺによる形質転換の効率は、形質転換された細胞の約５％の値を示す。
２）２４時間目直後の選択により得られるクローン。プラスミドｐＮＰ−２単独の形質転換では、非常に小さいサイズの約１０クローン（クローン当たり２０〜５０個の細胞）以下が見られる。ｐＮＰ−２とモロニーエンベロープをコードする遺伝子による形質転換では、小さいサイズの約１０クローンと、かなり大きなサイズの３８クローン（クローン当たり＞２００細胞）も見られる。
３）５日目にＨＡＴ選択後に得られるクローン。ｐＮＰ−２単独での形質転換では、小さいサイズの数クローンが見られる。ｐＮＰ−２とプラスミドｅｎｖ．の形質転換に対応する培養皿では、非常に大きい数え切れない数のクローンが観察され、全体では培養皿上で約４分の１がコンフルエンスの状態に対応する。
３．４  結論
１）プラスミドｐＮＰ−２は機能性であり、ＴＫ遺伝子の発現を可能にする。
２）２４時間目直後に、ＴＫ遺伝子を効率的かつ安定に培養細胞内に移動させることができる、組換えウイルス粒子が産生される。
３）５日後、得られる安定なクローンの数の大幅な増加が観察される（しかし、この実験で定量することは困難である）。
−  例４：ｅｎｖ．遺伝子が欠如しＨＳＶ１チミジンキナーゼを有する組換え偽レトロウイルス配列と、上流のプロモーター及び下流のｅｎｖ．遺伝子とに依存するｅｎｖ遺伝子とを有する、単一のプラスミドの作成。
前述の方法により、例えばｐＢＲ３２２のような通常のプラスミドを、基本骨格として使用する。図４ａと４ｂに示す構築物を産生し、こうして組合せたプラスミドを乳化し、リポソーム内に包み込むか、または宿主細胞または標的細胞内への侵入を可能にする任意の他のベクタと組合せる。
−  例５：例１、２、および３に記載の構築物で得られる宿主-ベクタ系から、確立された腫瘍で得られた結果：
こうして作成されたこの宿主-ベクタ系は、１０8粒子/mlの力価で感染レトロウイルス粒子を産生することが観察された。
この力価は、チミジンキナーゼの欠損したマウスＬ−細胞の感染によりチェックし、Caruso M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7024-7028,1993に記載の方法に従って感染させた。
その結果、宿主-ベクタ系およびこの系を活性成分として含有する医薬品を補助とする遺伝子治療により、インビボで細胞を処理する方法は、前述の異なる点に関して先行技術と比較すると特に有効であるようである。すなわち：
−  放出されるウイルス粒子の生産性（従来のパッケージング細胞株の生産性より、少なくとも１〜２ｌｏｇ大きい）、
−  本系を用いる医薬品の産生の工業的実施の観点からの操作性：本宿主-ベクタ系は、懸濁液として培養することができる、従って大量培養が可能な宿主細胞を使用する、
−  標的細胞の観点からの本系の効率の上昇：導入遺伝子を有する感染性ウイルス粒子の産生は、ベクタまたは任意の適当な手段の助けにより、ｅｎｖ遺伝子を有しそのプロモーターに依存する核酸の添加によりインビボで繰り返すことができる反復工程であるため、この系は阻止することができ、そのため、ｅｎｖ遺伝子の添加を止めることにより組換えウイルス粒子の増殖を停止させることができる。これは、例えば自殺遺伝子の場合に、可能な腫瘍のサイズまたは破壊される細胞の数に従ってヌクレオシド類縁体を添加することにより、破壊される細胞の数を制御することが可能である。
−  最後に、この系は、ウイルスの安全性を保持し、任意の他の条件的発現系に応用でき、使用中の柔軟性を与える。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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