(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド及びポリサッカライドを含む混合液からポリヌクレオチドを単離する方法であって、つぎの工程を含む。
ａ）前記混合物を、ポリサッカライドとは反応するがポリヌクレオチドとは実質的に反応しない遊離の−Ｂ（ＯＨ）2基をもつポリマーゲルに接触させ、前記ポリサッカライドとの反応により、固状又は半固状のポリヌクレオチド含有ポリマーゲルを形成させる工程。
ｂ）前記固状又は半固状のポリサッカライド含有ポリマーゲルの密度が前記ポリヌクレオチドを含む混合液の密度と異なることに基づいて、遠心分離により、前記ポリヌクレオチドを、前記固状又は半固状のポリサッカライド含有ポリマーゲルから分離する工程。
【請求項２】
前記−Ｂ（ＯＨ）2基を有するポリマーゲルが、つぎの一般式（III）で表せる化合物であることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
［シリカ］−Ｒ1−Ｒ2−Ａ−Ｂ（ＯＨ）2    （III）
（ここに、Ｒ1は、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン（alkylidene）又は酸素（Ｏ）から選ばれたいずれかを表し、Ｒ2は、ＣＨ＝Ｎ、又は、（ＣＨ2）ｍから選ばれたものであって該ｍはゼロ又は１〜１０の範囲の整数であるを表し、そして、Ａは、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン、ポリエーテル、又は、アリーレン（arylene）から選ばれたものを表す。)
【請求項３】
前記ポリマーゲルが、つぎの一般式（I）で表せる化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
［シリカ］−Ｒ1−ＣＨ＝Ｎ−Ａ−Ｂ（ＯＨ）2    （I）
（ここに、Ｒ1は、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン（alkylidene）を表し、Ａは、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン、ポリエーテル、又は、アリーレンから選ばれたいずれかを表す。）
【請求項４】
前記ポリマーゲルが、つぎの一般式（II）で表せる化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
［シリカ］−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ａ−Ｂ（ＯＨ）2    （II）
（ここに、Ａは、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン、ポリエーテル、又は、アリーレンを表し、ｍはゼロ又は１〜１０の範囲の整数を表す。）
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドを単離する方法において、
前記Ａが、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン（alkylidene）、又は（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎであって該ｎが５〜１００の範囲の整数、又はフェニレン基（phenylene）、又はナフチレン基（napthylene）を表していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドを単離する方法において、
前記ほう酸置換ゲルが固状又は半固状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドを単離する方法において、
該方法は２層溶媒抽出系によってＤＮＡの単離を達成するものであり、ＤＮＡ水溶液が上層であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドを単離する方法において、
単離される前記ポリヌクレオチドが、植物由来であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチド及びポリサッカライドとの混合液からポリヌクレオチドを単離する方法であって、
前記一般式（I）に記載の遊離Ｂ（ＯＨ）2基を持つ重合化シリカゲルが使用されることを特徴とするポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド及びポリサッカライドとの混合液からポリヌクレオチドを単離する方法であって、
前記一般式（II）に記載の遊離Ｂ（ＯＨ）2基を持つ重合化シリカゲルが使用されることを特徴とするポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド及びポリサッカライドとの混合液からポリヌクレオチドを単離する方法であって、
前記一般式（III）に記載の遊離Ｂ（ＯＨ）2基を持つ重合化シリカゲルが使用されることを特徴とするポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが植物由来のポリヌクレオチドであって、該植物由来のポリヌクレオチドを単離する際に前記重合化シリカゲルが使用されることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを単離する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチド及びポリサッカライドを含む混合液からのポリヌクレオチドの単離に関し、特には、植物から抽出したデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の精製に関する。
背景
参考例を含む同時継続特許出願ＷＯ９２／０５１８１には、タンパク質を除去することによって、ヒトもしくは動物細胞由来のポリヌクレオチド（特には、ＤＮＡ）を精製することについて開示されている。
タンパク質は、遊離アルデヒド基又はケトン基を持ちクロスリンクされたシリカゲル（cross-linked silica gel material）と反応させ、２層溶媒系中で固状もしくは半固状物体となって除去できるようになっている。下層はクロロホルム層であり、上層がＤＮＡを含む水層である。タンパク質を含有する前記シリカゲルは、固状もしくは半固状の中間媒系として存在し、容易に除去される。前記クロスリンクさせたシリカゲルは、好適には、クロスリンクさせたシリカゲルを３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane）で処理し、ついでグルタルアルデヒドで処理することにより、タンパク質との反応性を有するアルデヒド基を導入することにより作製される。
しかしながら、多くの他の生物から取り出されたＤＮＡ中にはポリサッカライドは含まれていないものの、植物から抽出したＤＮＡにはポリサッカライドが不純物としてしばしば含まれている。これらポリサッカライドは、酵素阻害特性を持つことがあり、ＤＮＡは、例えば制限酵素による消化の如きの酵素消化処理を施されることがしばしばあり、後に、うまく酵素消化処理できなかった原因物質として証明されることがある。
従来、これらのポリサッカライド類を除去するために、多くの抽出法は、高価でかつ時間消費を伴う「塩化セシウム密度勾配法」を用いて行っていた。（ベンディッヒ  エージェイ．、アンダーソン，アールエス．、ワード  ビーエル．、植物ＤＮＡ、：リーバー  シージェイ．編、（１９８０）、ゲノム構造と発現、３１〜３３頁、ニューヨーク  プレノムプレス；マーレイ  エイチジー．、トンプソン  ダブリューエフ．、（１９８０）、ヌクレイック  アシド  リサーチ、８巻、４３２１〜４３２５頁；タイラー  ビー、パウェル  エー、（１９８２）、植物ＤＮＡとＲＮＡの単離、フォーカス、４巻、４〜６頁．）。
他の方法も報告されている。（デラポータ  エスエル．、ウッド  ジェイ、ヒックス  ジェイビー、（１９８３）、プラント  モル  バイオロ、１巻、１９〜２１頁；ジマー  イーエー、ニュートン  ケイ  ジェイ、（１９８２）、トウモロコシの苗木と組織から高分子量ＤＮＡを単離する簡単な方法、：シェリダン  ダブリューエフ、編、トウモロコシの生物学的研究、グランド  フォークス、エヌディー：ユニバーシティー  プレス、ノースダコタ大学．）。しかしながら、かかる手法は、一般的には、ある限られた植物種もしくは組織に対してのみ適用可能である。セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（cetyltriethylammonium bromide)の存在下でその溶解性を変化させることにより、核酸からポリサッカライドを分離する方法がまた報告されている。
しかし、この手法は、ＤＮＡの分解の原因が懸念される有機溶媒抽出を要求する。
本発明の目的は、ポリサッカライドを含有する混合物から、ポリヌクレオチドを単離するための一般的な方法を提供することであり、このことは、つぎの説明及び実施例から、本発明の他の目的とともに明らかとなるであろう。
発明の陳述
第１観点は、本発明は、ポリヌクレオチド及びポリサッカライドを含有する水性の混合物から、ポリヌクレオチドを単離する方法（過程）を提供することであり、該ポリヌクレオチドを単離する方法（過程）は、ポリサッカライドと反応するがポリヌクレオチドとは反応しない遊離−Ｂ（ＯＨ）2基を有しており、前記ポリヌクレオチドを含有すると固状ないし半固状となる特性をもつポリマーゲルに、前記混合液を接触処理する工程と、ポリサッカライドを含有して固状もしくは半固状になったポリマーゲルから前記ポリヌクレオチドを分離する工程と、を含む。
詳細な説明
ポリマーゲルは、使用する溶媒に不溶性である所定のゲル体であり、例えば、重合体シリカゲル（polymerised silica gel）、又はポリスチレン  ゲル（polystyrene gel）もしくはポリエステル  ゲル（polyester del）の如きポリアクリレートゲル（polyacrylate gel）を例示することができる。−Ｂ（ＯＨ2）基は、重合反応前のモノマー体中に存在するものである場合や、重合体上の例えばＯＨ基又はＸの如き官能基と反応させることにより導入されるものである場合がある。好適なポリアクリレートゲルは、ジヒドロキシボリールアニリノ−置換メタクリル酸（dihydroxyborylanilino-substituted methacrylic acid）と、１，４-ブタンジオール  ジメタクリレート（1,4-butanediol dimethacrylate）との共重合により作製でき、アルドリッチ  ケミカル  カンパニーから購入することもできる。
好適なポリマーゲルは、重合化させたシリカゲルである。−Ｂ（ＯＨ）2基は、重合化させたシリカゲルに直接導入できる一方、ＷＯ９２／０５１８１に記載されているように、シリカゲルに含まれる−ＣＨＯ基を修辞することにより導入させることが好ましい。この調整法は、シリカゲル中のアルデヒド基と、−Ｂ（ＯＨ）2を含むアミンとの反応を含むものであり、例えば、つぎに簡略化して示した式に従って調整される。
式Ａ
0003697637.tif 000002
ここで、Ｒ1はＣ2-6アルキリデン基（alkylidene）であり、Ａは、Ｃ2-6アルキリデン基、-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n-の如きポリエーテル、又はフェニレン基（phenylene）もしくはナフチレン基（napthylene）の如きアリーレン基（arylene group）である（但し、ｎは、通常、５から１００の整数である）。
前記アミンは、１又は１以上のアミノ基、及び１又は１以上のほう酸、−Ｂ（ＯＨ）2基とを含んでいる。
前記ほう酸置換シリカゲルを調整する場合、最終品は十分に洗浄することが好ましい。その理由は、化学試薬のいずれかが残存していると、抽出されたＤＮＡの制限分解を阻害するかもしれないからである。ついで、好ましくは、ｐＨを中性にする。
アルデヒド（ＣＨＯ）又はケトン（ＣＯ）基を含有するクロスリンク−シリカゲルは、ＷＯ９２／０５１８１に記載の方法で作製される。
ついで、上述したように、前記シリカゲルに対して、例えばつぎに示す簡略化して示された式Ｂにしたがって、ほう酸基（boric acid group）が直接導入される。
式Ｂ
0003697637.tif 000003
ここに、Ｘは、ＯＨ基、ハロゲン（好ましくはＣｌ又はＢｒ）、又はトシレート（tosylate）、メシレート（mesylate）もしくはブロシレート（brosylate）の如き残基（leaving group）であり、
Ａは前記と同様であり、
そして、ｍは０から１０である。
本発明の他の観点は、精製する過程において使用される物質を提供することであり、この物質は、遊離−Ｂ（ＯＨ）2基をもつ重合化させたシリカゲルを含んでおり、つぎの一般式（III）で表せる。
［シリカ］-Ｒ1-Ｒ2-Ａ-Ｂ-（ＯＨ）2            （III）
ここに、Ｒ1は、Ｃ2−Ｃ6のアルキリデン、又はＯから選択されており、
Ｒ2は、−ＣＨ＝Ｎ、又は（ＣＨ2）mから選択され、ｍは０もしくは１〜１０の範囲の整数であり、
そして、Ａは、Ｃ2−Ｃ6アルキリデン、ポリエーテル、又は、アリーレン（arylene）である。
本発明はまた、精製の過程で使用される物質に関するものであり、この物質は、遊離の−Ｂ（ＯＨ）2基を含む重合化されたシリカゲルを含み、前記（I）又は（II）に一般式で示した物質である。
重合化されたシリカゲルは、好適には粒径が２５０から４００メッシュのシリカゲルから作製される。
前記ほう酸置換ゲルは固状又は半固状であり、ＤＮＡを含有する溶液から分離させ易くなっている。しかしながら、遊離−Ｂ（ＯＨ）2基とポリサッカライドとの反応は、もとの形状であるにもかかわらず、ポリサッカライドとの反応によって固状又は半固状に変わった物質となり、該物質はＤＮＡを含有する溶液から容易に分離させることができる。
ほう酸置換ゲルと植物の抽出物中に不純物として存在するポリサッカライドとは、次の周知な機序にしたがって反応する。即ち、ほう酸は、１，２ジヒドロキシ代合物と反応し、例えばつぎの式Ｃにしたがって、環状ほう酸エステルが生成する。
式Ｃ
0003697637.tif 000004
幸い、吸着されたポリサッカライドを含む固状又は半固状の物質は、ＤＮＡを含有する溶液とは異なる密度をもっている。好適な実施例では、ＤＮＡの分離は、２層溶媒抽出系で実施され、ＤＮＡ溶液は上層として存在する。この場合、吸着されたポリサッカライドを含むゲル物質の密度は、上層と下層間の中間層として形成されることが好ましい。ＤＮＡを含有する水層（上層）を、下層が混入することなく完全回収するための、補助となるからである。
幸い、前記ゲルは、その表面に容易に除去できる凝塊（すなわち、ディスイ塊）を形成する。
本発明の技術内容は、ポリサッカライドを含有する水溶液から、ＤＮＡやＲＮＡの如きオリゴヌクレオチドを分離するための一般的な方法として適用される。
もし必要であれば、不純物として混在するポリサッカライドを除去する本技術内容は、ＷＯ９２／０５１８１で開示した方法においては、不純物として存在するタンパク質の除去前、もしくは除去後に実施する。
好適な実施例によれば、ＤＮＡを迅速に単離でき、高収率で回収でき、しかもその純度は高い。
本発明の実施例をつぎに示すが、これは例示にすぎない。
例１（重合化されたシリカゲルの調製）
乾燥シリカゲル粒（２５０−４００メッシュ）５０ｇに５％硝酸３００ミリリットルを加えて活性化した。１時間後、該シリカゲルを再蒸留水１０００ミリリットルで洗浄、ついで、減圧下でＨＰＬＣ用グレードのメタノールで洗浄した。
１０％３−アミノプロピリトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethyoxysilane）：（Ｃ2Ｈ5Ｏ）3-Ｓｉ-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2（ＡＰＴＥＳ）溶液、３００ミリリットルのｐＨを、６規定（Ｎ）の塩酸で３．５に調製した。ついで、この溶液を上述したシリカゲルに加えた。７５℃の水沿中に２時間放置、そして、再蒸留水５００ミリリットルにて洗浄した。ついで、この処理されたシリカゲルを１１５℃のオーブンに入れ、少なくとも５時間乾燥した。
２．５％グルタルアルデヒド：ＯＨＣ-（ＣＨ2）3-ＣＨＯ、４００ミリリットルのｐＨ値を７．０に調整した後、この溶液を上述した処理済のシリカゲルに添加した。撹拌下、室温で２時間反応させた。ついで、この重合化されたシリカゲルを、脱イオン再蒸留水、１０００ミリリットルで十分に洗浄した後、真空ポンプを使用してドレイン処理することにより、流動性をもつ粉末を得た。
例２（-Ｂ（ＯＨ）2置換シリカゲルの調製）
３−アミノフェニルホウ素酸・１水和物（3-aminophenylboronic acid monohydrate）（ｐＨ７）、３０ｍｇをエタノール２ミリリットル中に溶解し、この溶液中に、乾燥した重合化されたシリカゲル（ＰＳＧ）１．３ｇを懸濁した。このＰＳＧは、表面に遊離アルデヒド基をもっており、その調製は上述した例１、及びＷＯ９２／０５１８１に記載されている。前記懸濁液を、５０℃、３時間、マグネットスターラーで撹拌して混和し、ついで、室温で１夜放置した。本反応は中性条件で実施した。
前記生成物を、７００ｘｇで３分間遠心分離し、沈渣を５０ミリリットルの試験管に移し替え、該試験管に再蒸留水、５０ｍｌを加え、薬匙で丁寧に撹拌した後、１５秒間ゆっくりと転倒混和させ、そして、再び、７００ｘｇ、３分間遠心分離し、その上澄を取り除いた。この工程を、再蒸留水（トータル２００ミリリットル）を用いて４回繰り返し、ついで後述する１ｘＴＥ緩衝液（トータル１００ミリリットル）で２回洗浄、前記生成物を完全に洗浄した。
-Ｂ（ＯＨ）2置換ＰＳＧは、密封容器中に封入する前に、平らのガラス板上に広げそのままの状態で５〜１０分間、５６℃の恒温槽で乾燥した。
例３（グルコース標準液の測定）
方法：フェノール・硫酸  光吸収法
感度：２００μｌあたりグルコース−１〜６０μｇ（−３μＭから２ｍＭ）
終容積：１．４ｍｌ
ミクロ分析用キュペット：１ｍｌ用
コントロール液：１ｘＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス塩酸溶液を１ＭＮａＯＨで所望するｐＨにあわせる）
試薬：
（Ａ）：フェノール０．２５ｇを１ｘＴＥ緩衝液に溶解して全量５ｍｌとする（５％Ｗ／Ｖ）。
（Ｂ）：濃硫酸
（i）グルコース検量線（standard curve）の作製
１ｘＴＥ緩衝液，１００ミリリットル中にグルコース０．４ｍｇを含む２ｍＭグルコース溶液を調製し、４℃で保存した。
この溶液の夫々の容積（１５０、１００、７５、５０、２５、１０及び０マイクロリットル）を、１ｘＴＥ緩衝液でその全量が２００マイクロリットルとなるように希釈し、各溶液中に試薬（Ａ）、２００マイクロリットルを添加後、直ちに、試薬（Ｂ）、１．０ミリリットルを添加した。この時、試験管の側壁に触れないように注意する。
混合液を混和せずそのままの状態で、常温、１０分間、静値した後、１分間厳しく撹拌した。３０分間放置し、１．０ミリリットルミクロ分析用キュペットを用いて各グルコース標準液の吸光度を波長４９０ｎｍで測定した。
グルコース溶液に代えて１ｘＴＥ緩衝液を用い盲試験を同時に実施し、測定値を計算するためのコントロールとして使用した。検量線は、各グルコース溶液のモル濃度（ミリモル）に対する、波長４９０ｎｍの吸光度で作製した。
検量線は、直線性を示しており（相関係数（ｒ）＝０．９９９）、つぎの回帰式で表わせた。
Ｙ＝１．５６９６１６・Ｘ＋０．０２１０８１
ここで、Ｙは波長４９０ｎｍの吸光度であり、ＸはｍＭで表わしたグルコースの濃度である。
（ii）モデルとしてグルコースを使用した場合における置換ＰＳＧの結合力評価
１ｘＴＥ緩衝液中にグルコースを溶解して調整した１ｍＭグルコーース液、２００μｌ中に、-Ｂ（ＯＨ）2置換ＰＳＧをそれぞれ０、５０、１００、１５０及び２００ｍｇ添加した。
盲試験は、１ｘＴＥ緩衝液、２００μｌ中にそれぞれ等質量の非置換ＰＳＧを添加して実施した。
各混合物を、ティルト  シェーカー（tilt shaker）上にて、室温、２０分間ゆるく振った後、１３００ｘｇ、３分間、遠心分離した。その上澄をそれぞれ、２ｍｌ試験管に移し取り、各サンプルの容積が正確に２００マイクロリットルとなるように、１ｘＴＥ緩衝液で希釈した。
各サンプルに、試薬Ａ（２００マイクロリットル）添加混合した後、直ちに試薬Ｂを添加した。混合液を混和せずそのままの状態で、常温、１０分間、静置し、ついで、１分間激しく撹拌した。３０分間放置した後、１．０ミリリットルミクロ分析用キュペットを用いて、各サンプルの吸光度を波長４９０ｎｍで測定した。-Ｂ（ＯＨ）2置換ＰＳＧを添加した後、各溶液中に残存するグルコース量を、検量線の回帰式を使用して、波長４９０ｎｍの吸光度から算定した。この実験は繰り返した。
この実験には、２ｍＭグルコース溶液に代えて１ｍＭグルコース溶液を使用した。吸光度の範囲を制限するためである。
表１に結果を示したが、この結果は、前記置換ＰＳＧが溶液中の炭水化物の除去に有効であることを示している。置換ＰＳＧの量の増加すると、残存グルコースは、減少することがわかる。乾燥した置換ＰＳＧを５０ｍｇから２００ｍｇ使用した場合、１ｘＴＥ緩衝液で１ｍＭとしたグルコース溶液から４７−８２％のグルコースが除去された。ＰＳＧに吸着されるグルコース量は、ＰＳＧ５０ｍｇの添加に対応して、０．２から６．０ｍＭの範囲内でほぼ直線関係にある（相関関数（ｒ）＝０．９９３９）。
例４（-Ｂ（ＯＨ）2置換ＰＳＧを使用したトウモロコシ由来ＤＮＡの抽出）
冷凍トウモロコシ（−２０℃）を２分し、２〜３倍容のドライアイスとともにそれぞれ破砕した。ドライアイスを含む各トウモロコシ試料（０．５ｇ及び５ｇ）を、２及び１５ミリリットルの容積をもつ試験管にそれぞれ別々に移し、試料が溶融するまで、すなわち、５〜１０分間、常温にて放置した。試験管にリシス（lysis）緩衝液（４００μｌ及び４ｍｌ）と５ｍＭ過塩素酸ナトリウム（１５０μｌ及び１．５ｍｌ）をそれぞれ添加した。反応混合液を、まず、ティルトシェーカー（tilt shaker）上で、室温、２０分間、混合した後、５分毎にゆるく撹拌しながら２０分間、６５℃でさらにインキュベートした。ついで、常温となるまでこの反応混合物を法冷した。この処理によって、細胞の溶融と多くのタンパク質の変性及び部分消化が起きる。−２０℃に冷却したクロロホルム（５００マイクロリットル及び５ミリリットル）を前記リシスさせてなる混合物を加え、ついで室温で１０分間、ティルトシェーカーで振とうした。反応混合物を１３００ｘｇ、３分間、遠心分離した。フレシュなＰＳＧスラリー（１ｘＴＥ緩衝液、３０μｌ中に、フレシュなＰＳＧ、２５ｍｇ含有するもの）をそれぞれ１００マイクロリットル、７００マイクロリットル添加し、ついで、２０分間、ティルトシェーカー上で混合した後、スイング型遠心分離機にて、３分間、１３００ｘｇで遠心した。各チューブの上層を新しいチューブ（２ｍｌ及び１５ｍｌ）にそれぞれ移し替え、該チューブに４℃のエタノールの２倍容をそれぞれ加えると、ＤＮＡが沈澱する。各チューブ内のＤＮＡ塊を、滅菌ガラス棒を使用して１５ｍｌ容のチューブに移した。各ペレットは、最終的には１ｘＴＥ緩衝液、３ｍｌ及び２０ｍｌ中にそれぞれ再溶解した。
ＰＳＧ-Ｂ（ＯＨ）2を使用してトウモロコシから抽出されるトウモロコシ由来ＤＮＡの収量と純度を得るため、各サンプルの２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルの収量、及びＡ260／Ａ280は、測定された吸光度の値から算出した。
表２から、ＰＳＧ−Ｂ（ＯＨ）2を用いて、０．５ｇ及び５ｇのトウモロコシから抽出される植物ＤＮＡの収量は、それぞれ１２６及び８８２μｇであった。Ａ２６０／Ａ２８０の平均は、１．８１であり、この値からタンパク質を含まないＤＮＡが抽出されたことが示唆された（マニアティス．ティ、フリッシュ  イーエフ．サンブロック  ジェイ、（１９８２）、分子クローニング；ラボラトリー  マニュアル、コールド  スプリング  ハーバーラボラトリー、コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク．４５８〜４６０頁）。
0003697637.tif 000005
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