(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの電極間に生体高分子を収容するカートリッジの各電極間に交流電圧又は直流電圧を選択的に印加する電圧供給手段と、
前記カートリッジを保持する保持手段と、
生体高分子をその反応性の違いに応じて分離して、該電極間に分布させる手段と、
該保持手段によって保持されているカートリッジに光を照射する照射手段と、
前記保持手段によって保持されているカートリッジからの前記照射手段によって照射した光を受光する受光手段とを備えることを特徴とする生体高分子検出装置。
【請求項２】
前記受光した光のエネルギーの２次元的分布を取得する光エネルギー分布取得手段をさらに備えていることを特徴とする請求項１記載の生体高分子検出装置。
【請求項３】
前記保持手段は、前記照射手段によって照射される光の光軸に対して直角な平面内で前記カートリッジを２次元に移動可能であることを特徴とする請求項１又は２記載の生体高分子検出装置。
【請求項４】
前記照射手段は、所定の単一波長の光を照射することを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の生体高分子検出装置。
【請求項５】
前記受光手段によって受光した光量から、生体高分子の存在量、塩基長、濃度、ハイブリダイゼーション率又はハイブリダイゼーション量を算出する演算手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の生体高分子検出装置。
【請求項６】
前記カートリッジ内でハイブリダイズされた生体高分子を一本鎖に解離する熱を前記電極に加える加熱手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至５いずれかに記載の生体高分子検出装置。
【請求項７】
光エネルギー分布取得手段は、前記受光した光の吸光度、透過率及び反射率のうちいずれかの分布を取得することを特徴とする請求項１乃至６いずれかに記載の生体高分子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質等の生体高分子の有無、存在量、又は濃度の測定を行うことができる生体高分子検出装置及びその検出に用いるカートリッジに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡ検出技術としては、ＲＩ（放射性同位元素）や蛍光等の技術を用い、ＤＮＡを放射性物質や蛍光色素等で修飾し、外部からの刺激によって励起させ、発光による応答を見る方法が一般的である。また、電気化学的に、ＤＮＡ二本鎖に特異的に結合する挿入剤を用いて、その酸化還元電位により判定する電荷検出法が考案されている。さらに、修飾等を必要としない方法として、表面プラズモン共鳴現象を用いた方法がある。電極にＤＮＡを固定化させる技術には、チオール修飾ＤＮＡプローブを用い、ＤＮＡ末端のフリーなチオール基の単分子膜が、金表面上に自己形成する作用を利用したものなどがある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
今までのＤＮＡ検出技術において、ＲＩや蛍光を用いた方法は、ＤＮＡを修飾する必要があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る生体高分子検出装置は、２つの電極間に生体高分子を収容するカートリッジの各電極間に電圧を印加する電圧供給手段と、前記カートリッジを保持する保持手段と、該保持手段によって保持されているカートリッジに光を照射する照射手段と、前記保持手段によって保持されているカートリッジからの前記照射手段によって照射した光を受光する受光手段とを備える。
【０００５】
また、前記電圧供給手段は、交流電圧又は直流電圧を選択的に供給することで、生体高分子を一方の電極に引き寄せたり両方の電極に引き寄せたりすることができる。
また、前記保持手段は、前記照射手段によって照射される光の光軸に対して直角な平面内で前記カートリッジを２次元に移動可能であることで、カートリッジ内各位置における生体高分子の存在を検出することができる。
【０００６】
また、前記照射手段は、所定の単一波長の光を照射することで、検出感度を向上することができる。
また、前記受光手段によって受光した光量から、生体高分子の存在量、塩基長、濃度、ハイブリダイゼーション率又はハイブリダイゼーション量を算出する演算手段をさらに備えることで、生体高分子の各種特徴量を測定することができる。
【０００７】
また、前記カートリッジ内でハイブリダイズされた生体高分子を一本鎖に解離する熱を前記電極に加える加熱手段をさらに備えることで、相補鎖生体高分子及び非相補鎖生体高分子のそれぞれの存在を検出することができる。
また、本発明に係るカートリッジは、下底面内側に第１電極を有し側面の少なくとも一部が透明で上底面が開放されていて生体高分子溶液を収容し得る柱状のベース部と、下底面外側に第２電極を有し前記ベース部の上側から内部にその途中まで挿入されて係止されるキャップ部とを備える。
【０００８】
また、前記第１又は第２電極には生体高分子プローブが固定されていることで、相補鎖生体高分子と非相補鎖生体高分子とを別々に存在検出することができる。
また、前記ベース部の柱状断面が正方形で、前記キャップ部の柱状断面が円形であることで、光の入射面が平面であるので、光の散乱を抑制し、キャップ部をベース部に簡単に挿入することができる。
また、前記ベース部の上部には生体高分子溶液が柱状の部分からあふれても外にあふれないように溶液溜を有することで、溶液をあふれないようにすることができる。
【０００９】
本検出装置では、サンプルＤＮＡを対面する電極間に注入するだけでよい。またこの技術では、ＤＮＡの存在量を物理的に測定することができるため、濃度等を測定することも可能である。さらに、本装置は電場による外力を対面する電極間にかけることにより、電極表面に固定化された一本鎖プローブＤＮＡとハイブリダイズしなかったサンプルＤＮＡを、前記プローブＤＮＡを固定化していない電極にひきつけることで、洗浄を必要としない遺伝子検出が可能となる。
また、この方法を用いることにより、反応したものと反応していないものを共に計測対象にしているため、より明確な結果を得ることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施の形態による生体高分子検出装置の構成を示す概略図である。装置は、吸光度、透過率、反射率等の光エネルギー等の測定を行うための光学系と、蛍光や放射性物質等の有機物、又は無機物でＤＮＡを修飾した場合の修飾部を検出するための光学系からなる。
【００１１】
吸光度、透過率、反射率等の光エネルギー等の測定を行うための光学系は、レーザー及び光源、スリット、フィルタ、回折格子、受光部等からなる。ディスプレイ２を有するコンピュータ１に制御部３を接続し、さらに制御部３によって制御されるレーザー及び光源４から発生した光は、フィルタ５で波長選択された後、光源スリット６を通過する。この光は、入射スリット７を通過し、回折格子８において260nm及び280nmに波長変換される。さらに、カートリッジ１１（図２で詳述する）直前に置かれた出射フィルタ１０を通過させる。カートリッジ１１内では、ＤＮＡが吸光するため、ＤＮＡの存在量に応じて光エネルギーが減少する。つまり、受光部１２では減少後の光エネルギーが得られる。結果の解析はコンピュータ１で行い、ある位置における入射光に対する受光部で得られた光エネルギーの減少分から、ＤＮＡ存在量の分布を求める。透過率はカートリッジ１１内に溶液を満たしてＤＮＡが全く存在しない場合に対する受光量の比として得られる。反射率は同様にＤＮＡが全く存在しない場合に対する反射光の光量の比として得られる。この反射率を測定するには反射光を受光する光学系が必要になる。吸光度は（反射率−透過率）として得られる。
【００１２】
蛍光や放射性物質等の有機物、又は無機物でＤＮＡを修飾した場合の修飾部を検出するための光学系は、レーザー及び光源、ピンホール、レンズ等からなる。レーザー及び光源１６から発生した光は、フィルタ２１を通り波長選択された後、レンズ２２によって集光され、焦点においてピンホール２３を通過する。ピンホール２３を通過した光は、測定部を焦点とするレンズ２４によって再度集光される。これによって励起された物質の示す光は、レンズ２４へと向かい、偏光ビームスプリッタ１７において、受光部１８側へ向かう。フィルタ２０を通り波長選択された光は、焦点においてピンホール１９を通り、受光部１８へ達する。受光部１８からの信号により、修飾部位の分布を解析する。
【００１３】
図２は、本発明の一実施の形態によるカートリッジの構成を示す図である。カートリッジ１１は、キャップ部２５とベース部２７からなる。キャップ部２５は、底面が開放されていて断面が大きな外円柱２５ａの中に同心円状に断面が小さな内円柱２５ｂが上底面で接合されている。内円柱２５ｂの底面全面には外側に電極２６を有する。ベース部２７は、断面が正方形の中空四角柱２７ａの底面内側に円形の電極２８を有し、上底面はＤＮＡ溶液を注入し、さらにキャップ部２５を挿入するために開放されていて、さらにその四角柱２７ａの上部にはＤＮＡ溶液が多少あふれても外部にあふれないように円柱形の溶液溜２７ｂを有する。カートリッジ１１には、両方の電極にＤＮＡプローブを固定化させたもの、片方の電極にＤＮＡプローブを固定化させたもの、どちらの電極にもＤＮＡプローブを固定化していないものがある。カートリッジ１１は、装置のカートリッジ挿入部に挿入する。装置には、カートリッジ１１内に電界を作り出すための電極が存在し、電源部から送られる直流電圧及び／又は交流電圧をカートリッジ１１内の電極間にかけることができる。
【００１４】
検出は、260nmの波長における吸光度、透過率、反射率等の光エネルギーを計測することによって行われる。測定方法は、複数の範囲による比較、又は、ごく微小な範囲をスキャニングすることによって行われる。これによって得られた、吸光度、透過率、反射率等の光エネルギーの分布を基に、電極間に存在するＤＮＡの分布を得ることができ、ＤＮＡの存在量及び濃度、ハイブリダイゼーション率、ハイブリダイゼーション効率等を測定することができる。
【００１５】
図７は、直流電圧を用いた場合のＤＮＡの挙動を示す図である。電極７１、７２間に直流電圧をかけた場合、ＤＮＡは電界方向に引っ張られ、一方の電極（この場合は電極７２）側に引き寄せられる。このため、電極７１にプローブＤＮＡ７３を固定してハイブリダイゼーション反応後に直流電圧をかけると、ハイブリダイズした相補鎖サンプルＤＮＡ７５は電極７１側に固定されて引き延ばされるが、ハイブリダイズしなかった非相補鎖サンプルＤＮＡ７６は電極７２側に引き寄せられて縮まった状態になる。この状態で各位置におけるＤＮＡの量を測定することでハイブリダイズした相補鎖サンプルＤＮＡ７５の量とその塩基長（ＤＮＡの先端がどこまで延びて存在しているかを測定する）、及びハイブリダイズしなかった非相補鎖サンプルＤＮＡ７６の量を測定することができる。
【００１６】
図８は、交流電圧を用いた場合のＤＮＡの挙動を示す図である。電極７７、７８間に交流電圧をかけた場合、ある範囲の周波数及び電圧により（本装置では106V/m、1MHz）、ＤＮＡは伸長した状態で、電圧をかける直前における位置から、より近くにある電極側に伸長した状態で引き寄せられる。カートリッジ１１にかける電圧を直流電圧と交流電圧とを繰り返し使い分けることにより、ＤＮＡの位置を制御することができる。本装置では、サンプル注入時にＤＮＡを電極間に引き寄せる段階、ハイブリダイゼーション反応前においてプローブ側にサンプルを引き寄せる段階、ハイブリダイゼーション反応後にプローブと二本鎖を形成しているサンプルと未反応サンプルを分離する段階のそれぞれにおいて電極間に直流電圧を印加している。また、塩基長等を測定時等のＤＮＡを分離させたまま伸長させるときに、交流電圧を印加している。
【００１７】
図３は、本発明の一実施の形態による生体高分子検出装置の概観を示す図である。装置本体２９の中に回転式カートリッジ挿入部３０を設けて複数のカートリッジ１１を装填して装置カバー部３１を閉める。これにより、測定対象となるカートリッジ１１を自動的に交換して次々にＤＮＡ検出を行うことができるようにしている。
【００１８】
図４は、板状カートリッジを用いた生体高分子検出装置の構成を示す概略図である。板状カートリッジの詳細は図５に示す。吸光度、透過率、反射率等の光エネルギー等の測定を行うための光学系は、レーザー及び光源、スリット、フィルタ、回折格子、受光部等からなる。レーザー及び光源３５から発生した光は、フィルタ３６で波長選択された後、光源スリット３７を通過する。この光は、入射スリット３８を通過し、回折格子３９において260nm及び280nmに波長変換される。さらに、カートリッジ直前に置かれた出射スリット４１を通過させる。板状カートリッジ４２内では、ＤＮＡが吸光するため、ＤＮＡの存在量に応じて光エネルギーが減少する。つまり、受光部４５では減少後の光エネルギーが得られる。結果の解析はコンピュータ３２で行い、ある位置における入射光に対する受光部４５で得られた光エネルギーの減少分から、ＤＮＡ存在量の分布を求める。
【００１９】
蛍光や放射性物質等の有機物、又は無機物でＤＮＡを修飾した場合の修飾部を検出するための光学系は、レーザー及び光源、ピンホール、レンズ等からなる。レーザー及び光源４７から発生した光は、フィルタ４８を通り波長選択された後レンズ４９によって集光され、焦点においてピンホール５０を通過する。反射鏡５１により板状カートリッジ４２方向に向けられ、測定部を焦点とするレンズ５３によって再度集光される。これによって励起された物質の示す光は、レンズ５３へと向かい、偏光ビームスプリッタ５２において、受光部５６側へ向かう。フィルタ５４を通り波長選択された光は、焦点においてピンホール５５を通り、受光部５６へ達する。受光部５６からの信号により、修飾部位の分布の解析をコンピュータ３２により行う。
【００２０】
図５は、板状カートリッジの詳細を示す図である。図５(a) に示す板状カートリッジ４２は、板材に微小幅、微小深さの貯留溝５９を設けて、貯留溝５９の両端に電極５７、５８を有する構造である。吸光度、透過率等を測定する場合、底面は透明である必要がある。測定は、吸光度、透過率、反射率等の光エネルギーを計測する。また、従来の蛍光による検出も可能である。
【００２１】
図５(b) は、ゲルを入れた板状カートリッジを示す図である。貯留溝の中間部にゲル６５を入れ、電極６１、６２を加熱可能にすることにより、時間差測定を行うことができる。これは、片方の電極６１に一本鎖ＤＮＡプローブをあらかじめ固定化させておき、プローブを固定化した電極６１側のウェル６３にサンプルＤＮＡ溶液を注入する。これらをハイブリダイゼーション反応させ、未反応サンプルを従来の方法で電気泳動を行い測定する。ゲル部６５のＤＮＡ及び修飾物質が対面する電極６２側のウェル６４に完全に流れ出たら、電極６１を加熱し電極６１付近のＤＮＡを一本鎖に解離し、再度、従来の方法で電気泳動を行い測定する。こうすることで、サンプルＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの塩基長分布及び存在量と、非相補鎖ＤＮＡの塩基長分布及び存在量を測定することが可能となる。
測定及び検出において、サンプルＤＮＡは何も修飾されていない状態でも可能だが、感度を上げるために、蛍光色素等の有機物又は無機物で修飾することで、外部的刺激等により、感度を上げることも可能である。
【００２２】
図６は、板状カートリッジを用いた生体高分子検出装置の概観を示す図である。装置本体６６の中に、複数の板状カートリッジ４２を電極(1)６７及び電極(2)６８にその電極が接触接続するようにして装填してスキャン部６９によって一括して光学的にスキャンする。通常は、ふた７０を閉めた状態でハイブリダイゼーションや電気泳動を行う。
なお、本発明は上記実施の形態に限定されるものではない。
【００２３】
上述の実施の形態ではカートリッジの断面形状を正方形としたが、正六角柱など他の形状でもよい。中を通過する光が散乱しないようにするためには透明で平行な平面を有することが望ましい。
また、電極にかける温度を種々に変化させてそれぞれにおけるハイブリダイズしたＤＮＡの量やハイブリダイズしなかったＤＮＡの量を測定することにより、ＤＮＡの一本鎖解離温度を計測することができる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質等の生体高分子の有無、存在量、又は濃度などを簡易に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態による生体高分子検出装置の構成を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施の形態によるカートリッジの構成を示す図である。
【図３】本発明の一実施の形態による生体高分子検出装置の概観を示す図である。
【図４】板状カートリッジを用いた生体高分子検出装置の構成を示す概略図である。
【図５】板状カートリッジの詳細を示す図である。
【図６】板状カートリッジを用いた生体高分子検出装置の概観を示す図である。
【図７】直流電圧を用いた場合のＤＮＡの挙動を示す図である。
【図８】交流電圧を用いた場合のＤＮＡの挙動を示す図である。
【符号の説明】
１    コンピュータ
２    ディスプレイ
３    制御部
４    測定用光源及びレーザー
５    光源スリット
６    フィルタ
７    入射スリット
８    回折格子角度調整部
９    レンズ
１０  出射スリット
１１  カートリッジ
１２  測定用受光部
１３  ＸＹステージ
１４  電熱器付きカートリッジ固定部
１５  電源装置
１６  検出用レーザー及び光源
１７  偏光ビームスプリッタ
１８  検出用受光部
１９  ピンホール
２０  フィルタ
２１  フィルタ
２２  レンズ
２３  ピンホール
２４  レンズ
２５  カートリッジキャップ部
２６  キャップ側電極
２７  カートリッジベース部
２８  ベース側電極
２９  装置本体
３０  回転式カートリッジ挿入部
３１  装置カバー部
３２  コンピュータ
３３  ディスプレイ
３４  制御部
３５  測定用レーザー及び光源
３６  フィルタ
３７  光源スリット
３８  入射スリット
３９  回折格子
４０  回折格子角度調整部
４１  出射スリット
４２  カートリッジ
４３  ＸＹステージ
４４  電熱器付きカートリッジ固定部
４５  測定用受光部
４６  電源装置
４７  検出用レーザー及び光源
４８  レンズ
４９  フィルタ
５０  ピンホール
５１  反射板
５２  偏光ビームスプリッタ
５３  レンズ
５４  フィルタ
５５  ピンホール
５６  検出用受光部
５７  電極１
５８  電極２
５９  貯留溝
６０  ゲル入り板状カートリッジ
６１  電極１
６２  電極２
６３  注入口１
６４  注入口２
６５  ゲル
６６  装置本体
６７  電極１
６８  電極２
６９  スキャン部
７０  ふた
７１  電極１
７２  電極２
７３  ＤＮＡプローブ
７４  バッファー
７５  相補鎖サンプルＤＮＡ
７６  非相補鎖サンプルＤＮＡ
７７  電極１
７８  電極２
７９  電極１寄りのサンプルＤＮＡ
８０  電極２寄りのサンプルＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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