(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴナドトロピンおよびグリシンと組み合わせたスクロースとの固体均質混合物を含む薬剤組成物。
【請求項２】
固体均質混合物が凍結乾燥物である、請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
ゴナドトロピンがＦＳＨ，ＬＨまたはｈＣＧである、請求項１または２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ゴナドトロピンが組換え体である、請求項１−３のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項５】
７５または１５０Ｉ．Ｕ．のＦＳＨおよび３０ｍｇのスクロースを含むか、または１５０Ｉ．Ｕ．のｈＣＧおよび４７．７５ｍｇのスクロースを含む、請求項１−４のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項６】
成分の水溶液を調製し、任意にそれらを容器内に分配し、成分を乾燥または凍結乾燥し、そして任意に容器内へそれらを分配することを含む、請求項１−５のいずれか１項記載の薬剤組成物の調製方法。
【請求項７】
溶液のｐＨが６．５から８．５の間である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
溶液のｐＨがＦＳＨ製剤に関しては７である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
溶液のｐＨがＬＨ製剤に関しては８である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ゴナドトロピン含有薬剤組成物に関する。さらに正確には、本発明はスクロース安定化ゴナドトロピンの組成物に関する。本発明のゴナドトロピンはＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、およびｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を含む。
高度に精製されたたんぱく質は経時的に不安定であり、たとえばラクトースおよびマンニトールのような糖と混合するか、さもなければたとえばアルブミンおよびグリシンのようなたんぱく質およびアミノ酸と混合して安定化するということは知られている。他の生物起源の高分子量化合物、たとえば海洋コロイド、デキストランおよび他の多糖類およびリン脂質はしばしば同様に十分に働く。いずれにしても、本発明のゴナドトロピンは腸管外投与されるので、これらの賦形剤は、これらのアレルギー誘因性またはその不十分な溶解性のために、そしてある場合にはこれらの強力な毒性またはこれらの効果の集合性のために注射用組成物には適さない。
凍結乾燥したたんぱく質の組成物は、エム．ジェイ．ピカール（Ｍ．Ｊ．Ｐｉｋａｌ），ＢｉｏＰｈａｒｍ，１９９０年１０月、２５〜３０に記載されている。ここには、たとえばマンニトール、グリシン、アルギニンおよびラクトースのような安定化賦形剤を用いて配合されたたんぱく質の例、たとえば成長ホルモンおよびリボヌクレアーゼＡが報告されている。
特に、非晶質状態の様々な物質たとえば、糖質の存在下にたんぱく質を凍結乾燥することが記載されており、これにより圧潰温度が上昇しそして凍結乾燥時間が短かくなる。しかしながら、著者によれば、全てのたんぱく質についての標準的配合物を予知することは不可能であり、最も良い配合物の選択は大変な選択作業を必要とする。
ドイツ国特許第３５２０２２８号には、マルトトリオースの繰り返し単位を含む多糖類を用いて安定化された配合物中の生物学的に活性なたんぱく質、たとえばリンフォカイン、インターフェロン、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、インシュリン、成長ホルモンが記載されている。安定剤としてのスクロースの使用は、たとえば米国特許第３，６３７，６４０号に記載されているように凍結乾燥したオルゴテインの配合物において公知である。国際特許出願第８９／１０４０７号には、Ｍ−ＳＣＦ（マクロファージ−コロニー刺激因子）のスクロースを用いた配合物が記載されている：国際特許出願第８９／０９６１０号には、代わって、アルブミン、デキストラン、ポリエチレングリコール、８０ポリソルベートＰＶＰ、ラクトース、トリアロースまたはスクロースでも安定化されたＴＮＦの配合物が記載されている。
ゴナドトロピンの注射用製剤は、これらを凍結乾燥して乾燥粉末を得ることを含む方法により得られうる。ゴナドトロピンは凍結乾燥工程の間に非常に変性しやすく、そしてこれらを室温で貯蔵する場合、より長いライフサイクルを維持することのできる安定な配合物を得ることが望まれる。
ヨーロッパ特許第４４８１４６号は凍結乾燥ゴナドトロピン含有製品について記載しており、これは二カルボン酸塩、たとえばクエン酸、酒石酸およびアスパラギン酸を用いて安定化されるものである。市場で見られるゴナドトロピンは糖を用いて安定化されており、たとえばｈＣＧはマンニトール（プロファシ（Ｐｒｏｆａｓｉ）R、セロノ（ＳＥＲＯＮＯ））を用いて安定化されており、ＦＳＨはラクトース（メトロジン（Ｍｅｔｒｏｄｉｎ）R、セロノ）を用いて安定化されている。
我々はここにおいてスクロースがゴナドトロピンの配合物、特に組み換えＤＮＡ技術で調製されたこれら糖たんぱく質の形のものへより良い安定性を与えることを見出した。
本発明の主な目的は、ゴナドトロピンたとえばＦＳＨ、ＬＨまたはｈＣＧと、単独または他の安定剤と組み合わせたスクロースの安定化量との固体均質混合物を含む薬剤組成物を提供するものである。
別の目的は前記薬剤組成物の調製方法を提供するものであり、成分の水溶液を凍結乾燥する工程を提供するものである。別の目的は、使用前に貯蔵するのに適しそして注射用物質のための混合物を再溶解するのに適する容器内に滅菌条件下に密閉された前記固体混合物を含む前記薬剤組成物の提示形を提供するものである。
別の目的は、注射溶液に再溶解された前記固体混合物のための溶液を提供するものである。有効成分の安定性における賦形剤の効果を評価するために、バイアルあたり１５０Ｉ．Ｕ．を含む組み換え体ＦＳＨの様々な配合物が様々な賦形剤とともに調製された：ラクトース、スクロース、グリシン、スクロース＋グリシン、ラクトース＋アルブミンおよびラクトース＋グリシン。すべての配合物は、ｐＨ７の燐酸塩緩衝液中で賦形剤を溶かすことにより調製されるが、ただしラクトース（１０mg）を用いた配合物は注射用のＨ2Ｏに溶かされそしてｐＨ６．４に調整された。
サンプルを４５℃で貯蔵し、決まった間隔での生物学的分析により試験した。表１および２は、バッチ１についての二週間後および四週間後（表１）の、およびバッチ２についての一週間後および三週間後（表２）の、異なった賦形剤の存在下に組み換え体ＦＳＨの二つの異なったバッチにおいて行った試験の結果を示す。
生物学的試験はヨーロッパ薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の規則にしたがって実施され、二回行った。ＦＳＨおよびＬＨについての試験は、“メノトロピン”専門誌に報告され、一方ｈＣＧについての試験は“絨毛性性腺刺激ゴナドトロピン”専門誌で報告されている。
その結果により、試験されたもののうち最も安定な配合物はスクロースを含むもの、すなわちスクロース単独およびスクロース＋グリシンを有する配合物であることがわかる。驚くべきことに、スクロースはゴナドトロピンの変性に対する効果的安定剤であることを示す。
本発明組成物に用いられる安定剤は、従って、スクロースを単独でまたは他の賦形剤、好ましくはグリシンのようなアミノ酸と組み合わせて含有する。特に組み換え体ＦＳＨおよび組み換え体ＬＨの安定性が研究された。
組み換え体ＤＮＡの技術にしたがって作られるゴナドトロピンは非ヒト起源の汚染因子を避けるために高純度化工程を経なければならず、そしてこの高純度により相当する尿由来のゴナドトロピンより安定性が低下することになる。
本発明の組み換え体ゴナドトロピンは、ヨーロッパ特許第１６０６９９号およびヨーロッパ特許第２１１８９４号に記載の技術にしたがって、相当する組み換え体ＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ（チャイニーズ  ハムスター卵巣）細胞にて発現させることにより調製された。
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組み換え体ＦＳＨ含有配合物の綿密な研究は、表３の割当にしたがって、それぞれａ）ラクトース、ｂ）スクロース、ｃ）スクロース＋グリシンを含む異なった組成物を用いて行った：。
凍結乾燥物の調製は、注射用の水（“ａ”配合物）または０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液（“ｂ”および“ｃ”配合物）中に賦形剤が溶解している溶液でゴナドトロピンのバルクを希釈して２００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度とし、ラクトース含有配合物についてはｐＨを６．４に調整し、スクロース含有またはスクロース＋グリシン含有配合物についてはｐＨを７に調整することにより行った。溶液を濾過し、賦形剤の残りの溶液で最終容量にし濃度１５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌとしそして凍結乾燥した。
これらの配合物の促進された安定性が研究され、これによりより高い温度（＋３７℃；＋４５℃；＋５０℃）でのデータから外挿することにより、室温でこれらを容器内に貯蔵する場合同じものの安定性を予測した。
ＦＳＨ配合物の促進条件下での安定性は、一定間隔で行われる生物学的活性試験を通して測定され、これは相当する表に報告されている。
ＨＭＧ（メノトロピン）の二つのアムプル製剤を標準溶液として使用し、第一は１０１．３Ｉ．Ｕ．ＦＳＨ／アンプルおよび８５．６Ｉ．Ｕ．ＬＨ／アンプルの生物学的濃度を有し、第二は１０３．１Ｉ．Ｕ．ＦＳＨ／アンプルおよび８２．３Ｉ．Ｕ．ＬＨ／アンプルの生物学的濃度を有する。濃度０．５；１．０および２．０Ｉ．Ｕ．／mlのサンプルおよび標準ＨＭＧ溶液を、連続する三日間一日当たり二回０．５ml／ラットを皮下注射することにより、各々５匹のラットからなる三つの異なった群へ投与する。各動物はさらに一緒に４０Ｉ．Ｕ．ｈＣＧの投与量を受ける。
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表４で報告されたデータは、５mlバイアルに、ラクトース１０mg（組成物ａ）、スクロース３０mg（組成物ｂ）およびスクロース２０mg＋グリシン１０mg（組成物ｃ）の存在下に、１５０Ｉ．Ｕ．／mlＦＳＨを含む組み換え体ＦＳＨの三つの異なったバッチの配合物に関する。試験は温度３７℃、４５℃および５０℃にて行われた。
全ての試験温度および三つのバッチ全てについてラクトース含有配合物に関する分解が著しい。これと対照的に、同じ温度にてバッチ１のスクロース含有配合物についてなんら著しい変化は見られない。第一のバッチに関するスクロース＋グリシン含有配合物について、明らかな変化は５０℃で観察されただけである。。残りのバッチのスクロースまたはスクロース＋グリシンを有する配合物について、ラクトース含有配合物のものよりもいくらか低い分解が観察される。
表５は、３mlバイアル中の１５０Ｉ．Ｕ．／mlＦＳＨおよび３０mgスクロースを含む組み換え体ＦＳＨ配合物の二つの異なったバッチ（バッチ１およびバッチ２）について生物学的活性データにより誘導されるさらに促進条件下での安定性データを示す。
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５０℃の温度で５週間、または４５℃の温度で１０週間、または３７℃の温度で１２週間貯蔵したバイアルにおいて研究を行った。ここでも、両方のバッチについて全ての試験温度でなんらの活性変化も見られなかった。
表６で与えられそしてギャレット法（ギャレット  イー．アール．（Ｇａｒｒｅｔ  Ｅ．Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，５１：８１１，１９６２）にしたがって表５の促進条件下での安定性データから推測される室温における安定性の予測は、ラクトース含有配合物についてそれぞれ４℃および２５℃で２年間貯蔵後に約３５％および８０％分解することを示している。
スクロースまたはスクロース＋グリシンを有する配合物については４℃で分解しないと予測され、一方スクロース含有配合物については２５℃で２年後にわずか６％の低下だけであると予測される。
安定性は、５０mgスクロース（組成物ａ）および５０mgラクトース（組成物ｂ）を有する組み換え体ＬＨ配合物（７５Ｉ．Ｕ．）のものを研究した。
組み換え体ＬＨ配合物の正確な組成を表７に示す。
Ｉ．Ｕ．で測定された生物学的活性試験を介して測定された３７℃、４５℃および５０℃で貯蔵されたこのような配合物の促進条件下での安定性の研究（表８）はＦＳＨ配合物についてすでに観察されたものを示す：スクロース含有製剤の分解は非常に低く、一方ラクトース含有配合物の分解はさらに明白である。
ギャレット法（ギャレット  イー．アール．（Ｇａｒｒｅｔ  Ｅ．Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，５１：８１１，１９６２）にしたがって表８の促進条件下での安定性データから推測される室温における安定性の予測を、表９に示す。
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分解は、４℃および２５℃で２年間貯蔵したラクトース配合物についてそれぞれ約２０％および８％であると計算される。スクロース含有配合物は４℃で２年間変化せずそして同じ配合物について２５℃で２年後わずか９％の低下が計算される。
研究はまた、５００Ｉ．Ｕ．／バイアルのｈＣＧを含む３mlバイアル中に安定剤としてスクロース（配合物“ａ”、３０mgスクロース）、ラクトース（配合物“ｂ”、１０mgラクトース）またはマンニトール（配合物“ｃ”、２０mgマンニトール）を用いた尿由来のｈＣＧ配合物においても行われた。
表１０には、５５℃の温度で貯蔵した前記ｈＣＧ配合物についての異なった時間で行った生物学的分析により導かれる計算値を示す。
ここでも、スクロースは、ｈＣＧ安定性を保持するために最も適した賦形剤であること、すなわちＦＳＨまたはＬＨの場合と比較して三つの配合物についての安定性の差があまり強くないとはいえ、マンニトールよりも一層良好でありラクトースよりも良好である賦形剤であることが示される。
薬剤製造の例
材料：高純度スクロースＰｈ  Ｅｕｒ，ＢＰ，ＰＨ  Ｎｏｒｄ，ＮＦ（メルク）；ラクトースＲＰＥ  ＡＣＳ（カルロ  エルバ）；分析用のグリシン（メルク）、分析用のＮＡ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ（メルク）、ＮａＨ2ＰＯ4．Ｈ2Ｏ  ＲＰＥ（カルロ  エルバ）；８５％燐酸ＲＰＥ  ＡＣＳ（カルロ  エルバ）；０．１Ｍ  ＮａＯＨ（メルク）；注射用水。
容器として、ゴムファスナー（フラダグラーダ  ペテナティ  アンド  ファルマグミ（Ｆｒａｄａｇｒａｄａ  Ｐｅｔｔｅｎａｔｉ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｇｕｍｍｉ），ブチル混合物）およびアルミニウム環を有する３または５mlガラスバイアル（タイプＩホウケイ酸ガラス）を使用した。
スクロース含有組み換え体ＦＳＨ溶液（各々１５０Ｉ．Ｕ．ＦＳＨを含む１，２００バイアル）の調製
スクロース（３６ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ（１．３３ｇ）およびＮａＨ2ＰＯ4．Ｈ2Ｏ（０．５４ｇ）を注射用水（１，２００ml）に溶かし、出発スクロース溶液を得る。組み換え体ＦＳＨ（１８０，０００Ｉ．Ｕ．）のバルクを溶液で希釈してＦＳＨ溶液を２００Ｉ．Ｕ．／mlで得る。
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ＦＳＨ溶液および残留スクロース溶液のｐＨを、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたはＨ3ＰＯ4を用いて７に調整する。ＦＳＨ含有溶液をデュラポア０．２２μm滅菌フィルターに通して濾過し、同じデュラポアフィルターを通して濾過した残留賦形剤溶液で最終容量までとする。この方法の間、溶液温度を４℃と８℃の間に保つ。
スクロース含有組み換え体ＬＨ溶液（各々７５Ｉ．Ｕ．ＬＨを含む１，２００バイアル）の調製
スクロース（５７．３ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ（０．９９ｇ）およびＮａＨ2ＰＯ4．Ｈ2Ｏ（０．６２ｇ）を注射用水（６００ml）に溶かし、出発スクロース溶液を得る。組み換え体ＬＨバルク（９０，０００Ｉ．Ｕ．）をスクロース溶液で希釈してＬＨ溶液を３００Ｉ．Ｕ．／mlで得る。
ＬＨ溶液および残留スクロース溶液のｐＨを、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたはＨ3ＰＯ4を用いて８に調整する。ＬＨ含有溶液を０．２２μmデュラポア滅菌フィルターに通して濾過し、同じデュラポアフィルターを通して濾過した残りの賦形剤溶液で最終容量までとする。この方法の間、溶液温度を４℃と８℃の間に保つ。
異なった賦形剤を含む溶液を同様な方法で調製した。
充填および凍結乾燥
３mlまたは５mlバイアルをＦＳＨ溶液１mlまたはＬＨ溶液０．５mlで充填し、凍結乾燥器に移し、そして−４５℃で少なくとも６時間冷却する。凍結乾燥を、０．０７減圧下に−４５℃の温度で始める。加熱を以下の計画に従って行う：＋２０℃で２０時間，ついで＋３５℃でサイクルの最後まで。
戻した溶液において、通常の品質管理を行った。
本発明を特定の例を用いて説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく変法を導入することができることは理解される。