(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、Ｌ−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｇｌｙ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−アミノ酪酸、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｓｅｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｈｉｓ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｔｈｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｔｈｒ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｍｅｔ若しくはその誘導体とＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｌｙｓから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｇｌｎ若しくはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ若しくはその誘導体、またはＬ−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体［但し、誘導体は式（Ｉ）
【化１】
0005424530.tif 000039
（式中、ｎ１は１の整数を表し、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは水素原子を表し、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）または式（ＩＩ）
【化２】
0005424530.tif 000040
（式中、ｎ２は１の整数を表し、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表し、Ｒ４は水素原子を表し、Ｒ５はアミノ又はヒドロキシで表されるアミノ酸誘導体［但し、アミノ酸誘導体が式（ＩＩ）のみであるとき、Ｒ５はヒドロキシである］）で表されるアミノ酸誘導体である。］、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体［以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）という］を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）は、下記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない（アミノ酸群Ａ：L−アラニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−プロリン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−メチオニン、L−セリン、L−スレオニン、L−システイン、L−アスパラギン、L−チロシン、L−リジン、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−アスパラギン酸、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、L−4−ヒドロキシプロリン、L−3−ヒドロキシプロリン、L−オルニチン、L−シトルリン、L−6−ジアゾ−5−オキソノルロイシン、グリシンおよびβ−アラニン）］。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質、Ｌ−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｇｌｙ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−アミノ酪酸、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｓｅｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｈｉｓ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｔｈｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｔｈｒ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｍｅｔ若しくはその誘導体とＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｌｙｓから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｇｌｎ若しくはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ若しくはその誘導体、またはＬ−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体［但し、誘導体は前記式（Ｉ）または前期式（ＩＩ）で表されるアミノ酸誘導体である。］、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体［以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）という］を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）は、前記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない］。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
【請求項３】
以下の［１］または［２］記載のＤＮＡを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｇｌｙ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−アミノ酪酸、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｓｅｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｈｉｓ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｔｈｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｔｈｒ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｍｅｔ若しくはその誘導体とＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｌｙｓから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｇｌｎ若しくはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ若しくはその誘導体、またはＬ−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体［但し、誘導体は前記式（Ｉ）または前期式（ＩＩ）で表されるアミノ酸誘導体である。］、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）は、前記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない］。
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
以下の［１］または［２］記載のＤＮＡを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｌ−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｇｌｙ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−アミノ酪酸、およびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｓｅｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｈｉｓ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｔｈｒ若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｔｈｒ、およびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｍｅｔ若しくはその誘導体とＬ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｌｙｓから選ばれる1種のアミノ酸若しくはその誘導体、β−Ａｌａ若しくはその誘導体とＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−シトルリンから選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体、Ｌ−Ｇｌｎ若しくはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ若しくはその誘導体、またはＬ−α−アミノ酪酸若しくはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−アミノ酪酸から選ばれる１種のアミノ酸若しくはその誘導体［但し、誘導体は前記式（Ｉ）または前期式（ＩＩ）で表されるアミノ酸誘導体である。］、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法。
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
細胞が微生物の細胞である、請求項３または４に記載の製造法。
【請求項６】
微生物が原核生物である、請求項５記載の製造法。
【請求項７】
原核生物が１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取り込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失した微生物である、請求項６記載の製造法。
【請求項８】
原核生物が３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、請求項６記載の製造法。
【請求項９】
ペプチダーゼが配列番号４３〜４６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４３〜４６のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、請求項７または８記載の製造法。
【請求項１０】
ペプチド取込み蛋白質が配列番号４７〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４７〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、請求項７または９記載の製造法。
【請求項１１】
原核生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１２】
エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである、請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質をコードするＤＮＡを保有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を用いたジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。【０００３】  酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特許文献１〜４参照）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法（非特許文献２、３および特許文献５、６参照）が知られている。
しかし、タンパク質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。【０００４】
一方、酵素分子量がNRPSより小さく、補酵素 である4'‐phosphopantetheineを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ‐glutamylcysteine synthetase）、グルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase）、D‐アラニン−D‐アラニン（D‐Ala−D‐Ala）リガーゼ（D‐Ala−D‐Ala ligase）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（poly‐γ‐glutamate synthetase）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはＤ−アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。
【０００５】  Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することは知られているが、その他のジペプチドの合成活性については知られていない（非特許文献４および５参照）。【０００６】  一方、全ゲノム情報の解明されたバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（非特許文献６参照）におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関しては、ｙｗｆＡ〜ＦのＯＲＦを含むバシリシンオペロンを増幅するとバシリシンの生産性が増加することが知られている（特許文献７参照）。しかしこれらのＯＲＦの中に２種以上のアミノ酸をペプチド結合で連結する活性を有する蛋白質をコードするＯＲＦが含まれているか、含まれているとすれば、どのＯＲＦが該蛋白質をコードするかについては知られていない。【０００７】  ある種の微生物は２つのアミノ酸が環状につながった環状ジペプチド（ジケトピペラジン）構造を持つ化合物を生成することも知られている（非特許文献７、８および９参照）。ジケトピペラジンの生合成については、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｉｄｉｓｃａｂｉｅｓのＴｈａｘｔｏｍｉｎ生合成過程ではＮＲＰＳによってｃｙｃｌｏ−（Ｌ−４−ｎｉｔｒｏｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）構造が合成される（非特許文献１０参照）こと、およびバチルス属細菌のＮＲＰＳの一部のモジュールの作用によってフェニルアラニンとプロリンからｃｙｃｌｏ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ）が生成すること（
非特許文献１１参照）が報告されている。【０００８】  一方、抗生物質であるアルボノルシン（ａｌｂｏｎｏｕｒｓｉｎ）の生産株として知られているストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｕｒｓｅｉ）ＡＴＣＣ１１４５５株ではＮＲＰＳ酵素とは全く類似性のない蛋白質（ａｌｂＣ遺伝子産物）がシクロ（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン）［ｃｙｃｌｏ（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）］構造の合成を担っていること、ａｌｂＣ遺伝子を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓの培養液にｃｙｃｌｏ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｘｉｄａｓｅを作用させるとアルボノルシンが検出されたとの報告はある（非特許文献１２参照）が、ａｌｂＣ遺伝子産物が直鎖状のジペプチドを生成するとの報告はない。【０００９】  以上のように、バシリシン合成酵素群に含まれる酵素等が、アミノ酸およびアミノ酸誘導体から様々なジペプチド誘導体を生成する活性があることは知られていない。
【特許文献１】特開昭５８−１４６５３９号公報
【特許文献２】特開昭５８−２０９９９１号公報
【特許文献３】特開昭５８−２０９９９２号公報
【特許文献４】特開昭５９−１０６２９８号公報
【特許文献５】米国特許第５７９５７３８号
【特許文献６】米国特許第５６５２１１６号
【特許文献７】国際公開特許第００−０３００９号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）
【非特許文献３】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）
【非特許文献５】Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）
【非特許文献７】Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５９，２９３−２９６（１９９６）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２８，２９９９（１９７２）
【非特許文献９】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８６，２９−５３（１９９９）
【非特許文献１０】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８，７９４−８０４（２０００）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２２７７３−２２７８１（１９９８）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌ．，９，１３５５−１３６４（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明の目的は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチド誘導体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明は、以下の（１）〜（２６）に関する。
（１）以下の［１］〜［７］のいずれかに記載の蛋白質、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体［以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）という］を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）は、下記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない（アミノ酸群Ａ：Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン、グリシンおよびβ−アラニン）］。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［７］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［７］のいずれかに記載の蛋白質、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体［以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）という］を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）は、前記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない］。
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
［７］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質
（３）以下の［１］〜［５］から選ばれるＤＮＡを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法［但し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）は、前記アミノ酸群Ａから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物ではない］。
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号１８で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号３９または４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４）以下の［１］〜［５］から選ばれるＤＮＡを保持する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法。
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号１８で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号３９または４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（５）アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（Ｉ）【００１２】
【化１】
0005424530.tif 000002
【００１３】（式中、ｎ１は１〜３の整数を表し、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ１ａおよびＲ１ｂのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ２ａおよびＲ２ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ１ａＲ１ｂＮに隣接する炭素原子上のＲ２ａおよびＲ２ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにＲ１ａ及びＲ１ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ１が２または３である場合、２つまたは３つのＲ２ａおよび２つまたは３つのＲ２ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）または式（ＩＩ）【００１４】
【化２】
0005424530.tif 000003
【００１５】［式中、ｎ２は前記ｎ１と同義であり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ４ＨＮに隣接する炭素原子上のＲ３ａおよびＲ３ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびＲ４と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ２が２または３である場合、２つまたは３つのＲ３ａおよび２つまたは３つのＲ３ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
Ｒ４は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ４が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ３ａおよびＲ３ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ５はアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ（置換もしくは非置換の低級アルキル）アミノ、ジ（置換もしくは非置換の低級アルキル）アミノまたは脂環式複素環基を表す］で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体［但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（Ｉ）のみであるとき、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＩ）のみであるとき、Ｒ５はヒドロキシである］である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６）アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＩＩ）【００１６】
【化３】
0005424530.tif 000004
【００１７】（式中、Ｒ１ｃおよびＲ１ｄは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表し、
Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）または式（ＩＶ）【００１８】
【化４】
0005424530.tif 000005
【００１９】（式中、Ｒ３ｃおよびＲ３ｄは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、
Ｒ５は前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体［但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＩＩ）のみであるとき、Ｒ１ｃ及びＲ１ｄの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＶ）のみであるとき、Ｒ５はヒドロキシである］である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（７）アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（Ｖ）【００２０】
【化５】
0005424530.tif 000006
【００２１】（式中、Ｒ２ｅは置換もしくは非置換のメチルを表す）または式（ＶＩ）【００２２】
【化６】
0005424530.tif 000007
【００２３】（式中、Ｒ３ｅは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体である上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（８）アミノ酸またはアミノ酸誘導体がＬ−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンからなる群より選ばれるアミノ酸またはその誘導体である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（９）Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（８）の製造法。
（１０）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）が式（ＶＩＩａ）【００２４】
【化７】
0005424530.tif 000008
【００２５】［式中、ｎ３ａおよびｎ４ａはそれぞれ前記ｎ１と同義であり、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ６ａおよびＲ６ｂのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ７ａおよびＲ７ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ６ａＲ６ｂＮに隣接する炭素原子上のＲ７ａおよびＲ７ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにＲ６ａおよびＲ６ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ３ａが２または３である場合、２つまたは３つのＲ７ａおよび２つまたは３つのＲ７ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
Ｒ８ａは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ８ａが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつＲ９ａおよびＲ９ｂと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ９ａおよびＲ９ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ９ａおよびＲ９ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ８ａＮに隣接する炭素原子上のＲ９ａおよびＲ９ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびＲ８ａと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ４ａが２または３である場合、２つまたは３つのＲ９ａおよび２つまたは３つのＲ９ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１０ａはアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ（置換もしくは非置換の低級アルキル）アミノ、ジ（置換もしくは非置換の低級アルキル）アミノまたは脂環式複素環基を表す］で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造法。
（１１）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）が式（ＶＩＩｂ）【００２６】
【化８】
0005424530.tif 000009
【００２７】［式中、ｎ３Ａおよびｎ４Ａはそれぞれ前記ｎ１と同義であり、
Ｒ６ＡおよびＲ６Ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ６ＡおよびＲ６Ｂのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ７ＡおよびＲ７Ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ７ＡおよびＲ７Ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ６ＡＲ６ＢＮに隣接する炭素原子上のＲ７ＡよびＲ７Ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにＲ６ＡおよびＲ６Ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ３Ａが２または３である場合、２つまたは３つのＲ７Ａおよび２つまたは３つのＲ７Ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
Ｒ８Ａは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはＲ８Ａが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつＲ９ＡおよびＲ９Ｂと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のＲ９ＡおよびＲ９Ｂのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
Ｒ９ＡおよびＲ９Ｂは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ８ＡＮに隣接する炭素原子上のＲ９ＡおよびＲ９Ｂのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびＲ８Ａと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、ｎ４Ａ層が２または３である場合、２つまたは３つのＲ９Ａおよび２つまたは３つのＲ９Ｂはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１０Ａは前記Ｒ１０ａと同義である］で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
（１２）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）が式（ＶＩＩＩａ）【００２８】
【化９】
0005424530.tif 000010
【００２９】（式中、Ｒ６ｃおよびＲ６ｄは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表し、
Ｒ７ｃおよびＲ７ｄは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、
Ｒ９ｃおよびＲ９ｄは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、
Ｒ１０ａは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造法。
（１３）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）が式（ＶＩＩＩｂ）【００３０】
【化１０】
0005424530.tif 000011
【００３１】（式中、Ｒ６Ｃ、Ｒ６Ｄ、Ｒ７Ｃ、Ｒ７Ｄ、Ｒ９ＣおよびＲ９Ｄはそれぞれ前記Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ，Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄ、Ｒ９ｃおよびＲ９ｄと同義であり、
Ｒ１０Ａは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造法。
（１４）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）が式（ＩＸａ）【００３２】
【化１１】
0005424530.tif 000012
【００３３】（式中、Ｒ７ｅは置換もしくは非置換のメチルを表し、
Ｒ９ｅは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の製造法。
（１５）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）が式（ＩＸｂ）【００３４】
【化１２】
0005424530.tif 000013
【００３５】（式中、Ｒ７ＥおよびＲ９Ｅはそれぞれ前記Ｒ７ｅおよびＲ９ｅと同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（１）〜（７）のいずれか１つの製造法。
（１６）ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）あるいはジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）がＬ−アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニン、ならびにそれらの誘導体から選ばれる同一または異なるアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチドまたはジペプチド誘導体である、上記（１）〜（８）のいずれか１つの製造法。
（１７）Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（１６）の製造法。
（１８）細胞が微生物の細胞である、上記（３）〜（１７）のいずれか１つの製造法。
（１９）微生物が原核生物である、上記（１８）の製造法。
（２０）原核生物が１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失した微生物である上記（１９）の製造法。
（２１）原核生物が３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、上記（２０）の製造法。
（２２）ペプチダーゼが配列番号４３〜４６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４３〜４６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である、上記（２０）または（２１）の製造法。
（２３）ペプチド取込み蛋白質が配列番号４７〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号４７〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である、上記（２０）または（２２）の製造法。
（２４）原核生物がエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１９）〜（２３）のいずれか１つの製造法。
（２５）エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物がエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルスまたはバチルス・メガテリウムである上記（２４）の製造法。
（２６）培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを特徴とする、上記（３）〜（２５）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【００３６】  本発明により、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチド誘導体を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１はプラスミドｐＰＥ４３の構築過程を示す図である。
【図２】図２はプラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。
【図３】図３は、直鎖ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の発現プラスミドベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕおよびｐＡＬ−ａｌｂの構築過程を示す図である。
【図４】図４は、ｙｗｆＥ遺伝子発現強化型ベクターであるｐＰＥ５６の構築過程を示す図である。
【符号の説明】
【００３８】ｙｗｆＥ：バチルス・サチリス１６８株由来のｙｗｆＥ遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター遺伝子
ＰＴ５：Ｔ５プロモーター
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ｌａｃＩｑ：ラクトースリプレッサー遺伝子
ａｌｂＣ：ａｌｂＣ遺伝子またはａｌｂＣ類似遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】１．本発明の方法で用いられる蛋白質
本発明の方法で用いられる蛋白質としては、
［１］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
［５］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［６］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、および
［７］配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００４０】  上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｒｉｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００４１】  欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００４２】  アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１〜８、または配列番号３７および３８で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いてそれぞれの間で比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。【００４３】  また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００４４】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられる蛋白質がジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有するためには、配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１または３７で表されるアミノ酸配列との相同性が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有していることが望ましい。【００４５】  アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴ  Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００４６】  また、配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１または３７で表されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質もまた本発明で用いられる蛋白質である。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。【００４７】  配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。【００４８】  配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。【００４９】
アミノ酸配列の相同性は、上記したようにBLASTやFASTAを用いて決定することができる。
本発明で用いられる蛋白質が、ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明で用いられる蛋白質を製造した後、該蛋白質、１種以上のＬ−アミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体が生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
２．本発明で用いられるＤＮＡ
本発明で用いられるＤＮＡとしては、
［１］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［２］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［３］配列番号１８で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［４］配列番号３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［５］配列番号３９または４０で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、などをあげることができる。
【００５０】  上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号９〜１６、１８、３６、３９または４０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度、好ましくは０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号９〜１６、１８、３６、３９および４０のいずれかで表される塩基配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００５１】
配列番号９〜１６、１８、３６、３９および４０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば上記したように、組換えＤＮＡ法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
３．本発明で用いられるＤＮＡの調製
本発明に用いられるＤＮＡは、例えば、配列番号９〜１６、１８、３６、３９または４０で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属またはストレプトマイセス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号９〜１６、１８、３６、３９または４０で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００５２】  また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜８、１７、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明に用いられるＤＮＡを取得することもできる。【００５３】  取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００５４】  塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。【００５５】  上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号９〜１６、３６、３９または４０で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００５６】  宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。【００５７】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるＤＮＡを保有する微生物としては、例えば配列番号１で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
４．本発明に用いられる細胞の調製
（１）本発明に用いられる細胞としては、ｉ）上記３のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有するバチルス属に属する細菌、好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する細菌、より好ましくはバチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリスＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリスＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリスＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリスＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５からなる群より選ばれる株である細菌、ｉｉ）上記３のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有するストレプトマイセス属に属する細菌、好ましくはアルボノルシン合成活性を有するストレプトマイセス属に属する細菌、より好ましくはストレプトマイセス・アルボラスまたはストレプトマイセス・ノウルセイより選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７、ストレプトマイセス・ノウルセイＡＴＣＣ１１４５５またはＩＦＯ１５４５２、ｉｉｉ）モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記３の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞に導入することにより調製することができる形質転換体、をあげることができる。【００５８】  本発明に用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明で用いられる蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した細胞を取得することができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。【００５９】  該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核生物および酵母等の微生物の細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌をあげることができる。【００６０】  発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明に用いられるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００６１】  発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＷＨ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）、ｐＣＳ２９９Ｐ（ＷＯ  ００／６３３８８）、ｐＶＬＴ３１［Ｇｅｎｅ，１２３，１７（１９９３）］およびｐＩＪ７０２（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）等を例示することができる
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００６２】  さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］、シュードモナス属に属する微生物中で発現させるためのｔａｃプロモーター［Ｇｅｎｅ，１２３，１７−２４（１９９３）］、ストレプトマイセス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）なども用いることができる。【００６３】  リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明に用いられるＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００６４】  このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＰＥ４３をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００
、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバ��ター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アース
ロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることがでる。好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。【００６５】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。【００６６】  プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００６７】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。【００６８】  プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００６９】  宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。【００７０】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。【００７１】  昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００７２】  即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００７３】  バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００７４】  スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。【００７５】  植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００７６】  宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。【００７７】  酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を生産する細胞を得ることができる。
（２）本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記（１）の方法により調製される微生物において、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質（以下、ペプチド取込み蛋白質と略す）の活性が低下または喪失している微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物が好適に用いられる。【００７８】
該微生物は、例えば（ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または３種以上のペプチダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、上記（１）の方法によりジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する蛋白質を生産する能力を付与する方法、または（ｂ）上記（１）の方法により調製することができるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の、ａ）１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み蛋白質、またはｂ）３種以上のペプチダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法等のいずれの方法によっても取得することができる。
【００７９】  １種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の１種以上のペプチダーゼおよび任意の１種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは１種以上９種以下、より好ましくは１種以上７種以下、さらに好ましくは１種以上４種以下のペプチダーゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは１種以上５種以下、より好ましくは１種以上３種以下、さらに好ましくは１種以上２種以下、特に好ましくは１種のペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００８０】  該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノムＤＮＡ上に存在するペプチダーゼをコードする遺伝子（以下、ペプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取込み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、１種以上のペプチダーゼ遺伝子の塩基配列および１種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ペプチダーゼおよび該ペプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００８１】  ペプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付加がない遺伝子がコードするペプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなっており、通常は８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低下していることを意味する。【００８２】  微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。【００８３】  より具体的なペプチダーゼとしては、例えばエシェリヒア・コリに存在する、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＢ、配列番号４５で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＤ、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＮ、ＰｅｐＰ［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．（以下、ＧｅｎＢａｎｋと略す）ＡＡＣ７５９４６］、ＰｅｐＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６８５０）、ＰｅｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６９９１）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４２１１）、Ｄｃｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４６１１）およびＩａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７７２８４）など、バチルス・サチリスに存在すをＡｍｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０１２２８５）、ＰｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ９９３３９）、ＹｂａＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１０４）、ＹｃｄＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１０５）、ＹｊｂＧ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１０）、ＹｋｖＹ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１１）、ＹｑｊＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９９１１６）、ＹｗａＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ９１２３）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９７７３２、ＢＡＢ９７８５８、ＢＡＢ９８０８０、ＢＡＢ９８８８０、ＢＡＢ９８８９２、ＢＡＢ９９０１３、ＢＡＢ９９５９８およびＢＡＢ９９８１９（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などをあげることができ、ジペプチダーゼとしては、配列番号４３〜４６で表されるアミノ酸配列を有するＰｅｐＡ、ＰｅｐＢ、ＰｅｐＤおよびＰｅｐＮ、並びにＰｅｐＱ、ＰｅｐＥ、ＩａｄＡをあげることができる。また、配列番号４３〜４６のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて決定することができる。【００８４】  また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または挿入がない遺伝子がコードするペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取り込み活性が低くなっており、通常は８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低下していることを意味する。【００８５】  微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばＨＰＬＣなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体ＤＮＡ上でオペロンを形成する遺伝子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してペプチド取り込み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。【００８６】  より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばエシェリヒア・コリに存在する配列番号４７で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＡ、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＢ、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＣ、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＤ、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有するＤｐｐＦ、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６９）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６７）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６６）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７６５６５）、ＹｄｄＯ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５６）、ＹｄｄＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５７）、ＹｄｄＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５８）、ＹｄｄＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５５９）、ＹｄｄＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４５６０）、ＹｂｉＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７３９１５）、ＭｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４４１１）、ＳａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７６）、ＳａｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７５）、ＳａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７４）、ＳａｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７３）、およびＳａｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ７４３７２）など、バチルス・サチリスに存在するＤｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００２）、ＤｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００３）、ＤｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００４）、ＤｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００５）、ＤｐｐＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ４０００６）、ＯｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８７）、ＯｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８８）、ＯｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７８９）、ＯｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７９０）、ＯｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ３９７９１）、ＡｐｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５８）、ＡｐｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５９）、ＡｐｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３６０）、ＡｐｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５６）、ＡｐｐＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３５７）、ＹｃｌＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＢ１２１７５）およびＹｋｆＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＢ１３１５７）など、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＢＡＢ９９０４８、ＢＡＢ９９３８３、ＢＡＢ９９３８４、ＢＡＢ９９３８５、ＢＡＢ９９７１３、ＢＡＢ９９７１４、ＢＡＢ９９７１５、ＢＡＢ９９８３０、ＢＡＢ９９８３１、ＢＡＢ９９８３２（いずれも日本ＤＮＡデータバンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などをあげることができ、また、ペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番号４７〜５１で表されるアミノ酸配列を有するＤ��ｐＡ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｐｐＤ、ＤｐｐＦおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み蛋白質としてあげることができる。【００８７】  上記アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは３種以上９種以下、より好ましくは３種以上６種以下、さらに好ましくは３種または４種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。【００８８】  具体的なペプチダーゼとしては、上記したエシェリヒア・コリ、バチルス・サチリスおよびコリネバクテリウム・グルタミカムに存在するペプチダーゼおよびジペプチダーゼをあげることができる。また、配列番号４３〜４６のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。【００８９】  上記アミノ酸配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。
ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体ＤＮＡのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。【００９０】  微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。【００９１】  該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。【００９２】  上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。【００９３】  具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属またはバチルス属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。【００９４】  λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ  ジェネティック  ストック  センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結したＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。【００９５】  薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。【００９６】  ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）〕等をあげることができる。【００９７】  上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号５２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【００９８】  相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。【００９９】  上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。【０１００】  上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。【０１０１】  方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込んだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
５．本発明に用いられる蛋白質の製造法
上記４の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明に用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【０１０２】  本発明に用いられる蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物および酵母等の微生物、動物細胞、昆虫細胞等または植物細胞等いずれであってもよく、好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌、特に好ましくはエシェリヒア属に属する細菌、最も好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【０１０３】  エシェリヒア・コリ等の原核生物および酵母等の真核生物を宿主細胞として得られた微生物の形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【０１０４】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【０１０５】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【０１０６】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【０１０７】  動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【０１０８】  培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥＸＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。【０１０９】  培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【０１１０】  培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明に用いられるＤＮＡを発現ベクターに連結した組換え体ＤＮＡを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明で用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【０１１１】  本発明で用いられる蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、および生産させる蛋白質の構造を変えることにより上記方法を選択することができる。
本発明で用いられる蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【０１１２】  すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【０１１３】  さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明で用いられる蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【０１１４】  動物個体を用いて本発明で用いられる蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に該蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明に用いられる蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【０１１５】  植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明で用いられる蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。【０１１６】  本発明で用いられる蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された該蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明に用いられる蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【０１１７】  該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【０１１８】  また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【０１１９】  本発明に用いられる蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【０１２０】  このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜８、３７および３８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明に用いられる蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。【０１２１】  融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリンＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。【０１２２】  上記した融合させる蛋白質に親和性をもつ物質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリンＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチドまたは任意の抗体のエピトープを認識する抗体、例えばイムノグロブリンＧなどをあげることができる。【０１２３】  具体的には、本発明に用いられる蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産した場合には、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法など、Ｆｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産した場合は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）などに記載の方法に準じて融合蛋白質を精製することができる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【０１２４】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
６．本発明のジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法
（１）酵素的製造法
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の酵素的製造法としては、ｉ）上記１の蛋白質、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法、およびii）上記１の蛋白質、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法をあげることができる。
【０１２５】  ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を公知の有機合成の手法等を用いて修飾することによりジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を製造することができる。
上記製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、上記１の蛋白質の基質になるアミノ酸またはアミノ酸誘導体であればいずれのアミノ酸およびアミノ酸誘導体を用いてもよい。【０１２６】  上記アミノ酸またはアミノ酸誘導体としては、式（Ｉ）【０１２７】
【化１３】
0005424530.tif 000014
【０１２８】（式中、ｎ１、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ前記と同義である）または式（ＩＩ）【０１２９】
【化１４】
0005424530.tif 000015
【０１３０】［式中、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ前記と同義である］で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体［但し、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（Ｉ）のみであるとき、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも一方は水素原子であり、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＩ）のみであるとき、Ｒ５はヒドロキシである］をあげることができ、好ましくは式（ＩＩＩ）【０１３１】
【化１５】
0005424530.tif 000016
【０１３２】（式中、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ２ｃおよびＲ２ｄはそれぞれ前記と同義である）または式（ＩＶ）【０１３３】
【化１６】
0005424530.tif 000017
【０１３４】（式中、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ及びＲ５はそれぞれ前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体［但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＩＩ）のみであるとき、Ｒ１ｃ及びＲ１ｄの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式（ＩＶ）のみであるとき、Ｒ５はヒドロキシである］をあげることができ、より好ましくは式（Ｖ）【０１３５】
【化１７】
0005424530.tif 000018
【０１３６】（式中、Ｒ２ｅは前記と同義である）または式（ＶＩ）【０１３７】
【化１８】
0005424530.tif 000019
【０１３８】（式中、Ｒ３ｅは前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体をあげることができる。
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）としては式（ＶＩＩａ）【０１３９】
【化１９】
0005424530.tif 000020
【０１４０】（式中、ｎ３ａ、ｎ４ａ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａ、Ｒ９ａ、Ｒ９ｂおよびＲ１０ａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、好ましくは式（ＶＩＩＩａ）【０１４１】
【化２０】
0005424530.tif 000021
【０１４２】（式中、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄ、Ｒ９ｃ、Ｒ９ｄおよびＲ１０ａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、より好ましくは式（ＩＸａ）【０１４３】
【化２１】
0005424530.tif 000022
【０１４４】（式中、Ｒ７ｅおよびＲ９ｅはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができる。
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）としては式（ＶＩＩｂ）【０１４５】
【化２２】
0005424530.tif 000023
【０１４６】（式中、ｎ３Ａ、ｎ４Ａ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂ、Ｒ７Ａ、Ｒ７Ｂ、Ｒ８Ａ、Ｒ９Ａ、Ｒ９ＢおよびＲ１０Ａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、好ましくは式（ＶＩＩＩｂ）【０１４７】
【化２３】
0005424530.tif 000024
【０１４８】（式中、Ｒ６Ｃ、Ｒ６Ｄ、Ｒ７Ｃ、Ｒ７Ｄ、Ｒ９Ｃ、Ｒ９ＤおよびＲ１０Ａはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、より好ましくは式（ＩＸｂ）【０１４９】
【化２４】
0005424530.tif 000025
【０１５０】（式中、Ｒ７ＥおよびＲ９Ｅはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあげることができる。但し、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン、グリシンおよびβ−アラニンから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合した化合物はジペプチド誘導体から除く。【０１５１】  式（Ｉ）〜（ＶＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＩＸａ）及び（ＩＸｂ）の各基の定義において、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、モノ（低級アルキル）アミノ及びジ（低級アルキル）アミノの低級アルキル部分としては例えば炭素原子数１から１０の直鎖状、分枝鎖状、環状またはこれらの組み合わせからなるアルキルがあげられ、より具体的には、直鎖または分枝鎖状のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられ、環状のアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、ノルアダマンチル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．３．０］オクチル、ビシクロ［３．３．１］ノニル等があげられ、直鎖または分枝鎖状と環状との組み合わせからなるアルキルとしては、例えばシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロオクチルエチル等があげられる。なお、ジ（低級アルキル）アミノにおける２つの低級アルキル部分は同一でも異なっていてもよい。【０１５２】  低級アルケニルとしては、例えば炭素原子数２から１０の直鎖または分枝鎖状のアルケニルが挙げられ、より具体的にはビニル、アリル、１−プロペニル、１−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、２−ヘキセニル、５−ヘキセニル、２−デセニル、９−デセニル等があげられる。
低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数２から１０の直鎖または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、２−プロピニル、３−ブチニル、４−ペンチニル、５−ヘキシニル、９−デシニル等があげられる。【０１５３】  アリール、アラルキル及びアロイルのアリール部分としては、例えば単環性または２つ以上の環が縮合した縮環性のアリール、より具体的には、環構成炭素原子数が６から１４のアリール、例えばフェニル、ナフチル、インデニル、アントラニル等があげられる。
脂環式複素環基としては、例えば単環性または２つ以上の環が縮合した縮環性の脂環式複素環基があげられ、脂環式複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を１または２個以上含んでいてもよく、より具体的には、例えばピロリジニル、２，５−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、１，２−ジヒドロピリジル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラゾリニル、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノキサリニル、オクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、１，３−ジオキソイソインドリニル等があげられる。【０１５４】  複素環アルキルの複素環基部分としては、例えば芳香族複素環基、脂環式複素環基等があげられ、芳香族複素環基としては、例えば単環性または２つ以上の環が縮合した縮環性の芳香族複素環基があげられ、芳香族複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を１または２個以上含んでいてもよく、より具体的には、環構成原子数５から１４の芳香族複素環基、例えばフリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、インドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プリニル、クマリニル等があげられる。また、脂環式複素環基は前記と同義である。【０１５５】  アラルキル及び複素環アルキルのアルキレン部分は、前記低級アルキルのうち、直鎖または分枝鎖状のアルキルから水素原子を一つ除いたものと同義である。
隣接する窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になって形成される複素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む５員または６員の単環性脂環式複素環基（該単環性脂環式複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で少なくとも１個の窒素原子を含む縮環性複素環基（該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）等があげられ、より具体的にはピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル等があげられる。【０１５６】  置換低級アルキル、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換低級アルコキシ、置換低級アルカノイル、置換低級アルコキシカルボニル、置換アラルキル、置換アリール、置換アロイル、置換複素環アルキル、モノ（置換低級アルキル）アミノ、低級アルキル（置換低級アルキル）アミノ、ジ（置換低級アルキル）アミノならびに隣接する窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になって形成される置換複素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基としては、同一または異なって置換数１から置換可能な数の、好ましくは置換数１〜３の、例えばハロゲン、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、グアニジノ、ウレイド、シアノ、ホルミル、カルボキシ、アミノカルボニル、ジアゾアセチル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、モノもしくはジ（低級アルキル）アミノカルボニル、低級アルキルチオ、アリール、アラルキル、アロイル、複素環カルボニル等があげられる。ここで低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイル及び低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分、アリール、アラルキル及びアロイルのアリール部分ならびにアラルキルのアルキレン部分はそれぞれ前記と同義であり、モノもしくはジ（低級アルキル）アミノカルボニル及び低級アルキルチオにおける低級アルキル部分は前記低級アルキルと同義であり、複素環カルボニルにおける複素環基部分は、前記複素環アルキルにおける複素環基部分と同義であり、ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を表す。なお、ジ（低級アルキル）アミノカルボニルにおける２つの低級アルキル部分は同一でも異なっていてもよい。【０１５７】  上記アミノ酸またはアミノ酸誘導体として、好ましくはＬ−アミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（βＡｌａ）およびそれらの誘導体からなる群より選ばれるアミノ酸またはアミノ酸誘導体をあげることができる。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリ���トファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。【０１５８】  また、上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸またはアミノ酸誘導体としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｌ−Ｇｌｎまたはその誘導体とＬ−Ｐｈｅまたはその誘導体との組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、さらに好ましくはＬ−Ａｌａまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｇｌｙまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｌ−Ｍｅｔまたはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｌ−Ｓｅｒまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｌ−Ｔｈｒまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、Ｌ−Ｇｌｎまたはその誘導���とＬ−Ｐｈｅまたはその誘導体との組み合わせ、β−Ａｌａまたはその誘導体とＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢまたはその誘導体とＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせをあげることができる。【０１５９】  上記製造法において、本発明に用いられる蛋白質は、基質として用いるアミノ酸またはアミノ酸誘導体１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。【０１６０】  上記製造法において、エネルギー源として用いるＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチド誘導体の生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【０１６１】
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
（２）細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法としては、i）上記４で得られる細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）の製造法、およびii）上記４で得られる細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）の製造法をあげることができる。
【０１６２】
ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩ）を公知の有機合成の手法等を用いて修飾することによりジペプチドまたはジペプチド誘導体（ＰＩＩ）生成することができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸およびアミノ酸誘導体の種類、使用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドまたはジペプチド誘導体は、上記６の（１）の酵素的製造法のものと同様である。
【０１６３】  培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ１以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物などをあげることができる。【０１６４】  また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用いられる水性媒体としては、上記６の（１）の酵素的製造法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いた細胞の培養液も水性媒体として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、ＡＴＰまたは細胞が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。【０１６５】  さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどをあげることができ、本発明の製造法に用いる細胞が、アミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する限りにおいていずれを用いてもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤および有機溶媒の種類および濃度は、本発明に用いられる細胞が上記活性を有する範囲において任意に選ぶことができ、例えば界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられ、有機溶剤は、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。【０１６６】  細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸またはアミノ酸誘導体１ｍｇあたり湿細胞重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６５℃、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは３０〜４５℃の条件で通常１分間〜１５０時間、好ましくは３分間〜１２０時間、より好ましくは３０分間〜１００時間行う。【０１６７】  上記６の（１）または（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドまたはジペプチド誘導体の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
（３）ジペプチドまたはジペプチド誘導体を修飾することによるジペプチド誘導体の製造法
上記６の（１）または（２）の製造法において得られたジペプチドまたはジペプチド誘導体を、公知の有機合成反応［例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）、Ｒ．Ｃ．ラロック（Ｌａｒｏｃｋ）著、（１９８９年）等参照］またはそれらに準じた方法に付すことによって種々のジペプチド誘導体を得ることができる。【０１６８】  上記製造法における生成物の単離、精製は、通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことができる。
以下に実験例を示し、本発明に用いられるＤＮＡ、蛋白質および細胞の調製方法を説明するが、該調製方法は下記実験例に制限されるものではない。
実験例１  データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス１６８株由来のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］をクエリーとして、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡのデータベースであるＳｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡ配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。【０１６９】  その結果抽出された配列のうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１６７３（１９９１）］である配列番号３３、３４または３５で表されるアミノ酸配列をコードし、かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもののうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフと最も高い相同性（２９．１％）を示すものとして機能未知遺伝子ｙｗｆＥを選択した。【０１７０】 ｙｗｆＥの塩基配列を配列番号９、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実験例２  ｙｗｆＥ遺伝子発現株の造成
実験例１で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。【０１７１】  まず、バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ  ２３８５７）をＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。【０１７２】  パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１９〜２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣおよびプライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンを含む領域の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加したも
のである。またプライマーＣは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］のｔｒｐプロモーター領域の塩基配列の５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【０１７３】 ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてバチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを用い、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤ、鋳型としてｐＴｒＳ３０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡまたは１０ｎｇのｐＴｒＳ３０、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１７４】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域のＤＮＡ断片に相当する約０．３ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。【０１７５】  該溶解液それぞれ５μＬを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ、ＢＩＯ  １０１社製）を用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。【０１７６】 ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。【０１７７】  該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥが連結された発現ベクターであるｐＰＥ４３が取得されていることを確認した（図１）。
実験例３  ジペプチドの生産
実験例２で得られたｐＰＥ４３を保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３株）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０１７８】  終濃度６０ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎ、０．４％のナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で３分間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。その結果反応液中に１２０ｍｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成蓄積していることを確認した。【０１７９】  対照菌株であるベクターのみを含むエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３１株の菌体ではＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの生成は認められなかった。
実験例４  Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦと呼ぶ）を合成した。プライマーＥは、ｙｗｆＥの開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＦは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。【０１８０】  バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ  ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＥおよびプライマーＦをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１８１】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０１８２】  該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２ｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０１８３】  上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０１８４】  生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥが取得されていることを確認した（図２）。
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例５  Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実験例４で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。【０１８５】  反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。【０１８６】  反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ｎａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（１）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（１）の反応条件で反応させた。【０１８７】  反応終了後、上記実験例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例６  Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実験例４で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、表１に示すジペプチドが生成していることが確認された。【０１８８】
【表１−１】
0005424530.tif 000026
【０１８９】
【表１−２】
0005424530.tif 000027
【０１９０】
【表１−３】
0005424530.tif 000028
【０１９１】  表１の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実験例７  Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例４で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。【０１９２】  ２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。【０１９３】  反応生成物を実験例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実験例８  バチルス属に属する各種微生物からのｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号９で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。【０１９４】  まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。【０１９５】  パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＧ、プライマーＨと呼ぶ）を合成した。プライマーＧは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＨは、ｙｗｆＥの終始コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。【０１９６】  バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＧおよびプライマーＨをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰
り返すことにより行った。【０１９７】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０１９８】  上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０１９９】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。【０２００】  一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥに相当する遺伝子（配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２０１】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０２０２】  上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０２０３】  上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１６で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション  スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。【０２０４】  上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。【０２０５】  ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション  スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。【０２０６】  その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。【０２０７】  上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２０８】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０２０９】  上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０２１０】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５株由来、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。【０２１１】  ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２〜８および１に、該遺伝子の塩基配列を配列番号１０〜１６および３６にそれぞれ示した。
実験例９  Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実験例２記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２１２】  バチルス・プミルスＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号３１および３２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０２１３】  該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０  ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０２１４】  上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０２１５】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ７（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。【０２１６】  上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例１０  精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例９で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。【０２１７】  反応終了後、実験例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成、蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。【０２１８】  以上の結果から、実験例８で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例１１  ａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス・ノウルセイのａｌｂＣ遺伝子の塩基配列［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌ．，９，１３５５（２００２）］に基づき、ストレプトマイセス・ノウルセイおよびストレプトマイセス・アルボラスよりａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。【０２１９】  まず、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株とストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株を、それぞれ、１％グリシン添加したＫＭ７３培地［２ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、１０ｇ／ｌ可溶性デンプン（和光純薬工業社製）］、ＫＰ培地［１５ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌグリセロール、１０ｇ／ｌポリペプトン（日本製薬株式会社製）、１０ｇ／ｌ肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、４ｇ／ｌ炭酸カルシウム］に植菌し２８℃で一晩振とう培養した。なお、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株およびストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  生物資源部門［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）］（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より分譲を受けた。【０２２０】  培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の方法に従って該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
ａｌｂＣ遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号４１および４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＪ、プライマーＫと呼ぶ）を合成した。プライマーＪは、ストレプトマイセス・ノウルセイの染色体ＤＮＡのａｌｂＣ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｃｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＫは、ａｌｂＣ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢｇｌＩＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【０２２１】  上記のプライマーＪおよびプライマーＫをプライマーセットに、鋳型としてストレプトマイセス・ノウルセイまたはストレプトマイセス・アルボラスの染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＥｘ Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、５μＬのジメチルスルホキシドを含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２２２】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡをそれぞれ２０μＬのＴＥに溶解した。【０２２３】  該溶解液それぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、７００ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ファージＴ５プロモーターを含む発現ベクターｐＱＥ６０  ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０２２４】  上記で得られた各放線菌由来の０．７ｋｂ断片およびｐＱＥ６０由来の３．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。【０２２５】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ファージＴ５プロモーター下流にストレプトマイセス・ノウルセイ由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕ、およびストレプトマイセス・アルブラス由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ａｌｂが取得されていることを確認した（図３）。【０２２６】  それぞれのプラスミドに挿入された放線菌由来のＤＮＡ部分の塩基配列を塩基配列決定装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを使って決定したところ、ｐＡＬ−ａｌｂには配列番号３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号３９で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有され、ｐＡＬ−ｎｏｕには配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号４０で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有されていることを確認した。
実験例１２  菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実験例１１で得られたｐＡＬ−ｎｏｕまたはｐＡＬ−ａｌｂを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株またはＮＭ５２２／ｐＡＬ−ａｌｂ株）およびプラスミドを保有しないＮＭ５２２株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地が入った試験管（プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様）に接種し、３０℃で１７時間培養した。この培養液０．５ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地が入った２５０ｍｌ容の三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１時間振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０２２７】  終濃度１００ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる３．０ｍｌの反応液を調製し、３０℃で反応を行った。反応１時間後にサンプリングし、アセトニトリルを２０％（ｖ／ｖ）になるように加えた後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣによる分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＡカラム（ＹＭＣ社製）、溶離液として３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、２１５ｎｍの紫外吸収を測定する条件で行った。【０２２８】  その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株の反応液中には３６．７ｍｇ／ｌのシクロ（Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン）［ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）］の蓄積が確認されたが、エシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）はまったく検出されなかった。同じ反応液を以下の条件でＨＰＬＣによって分析し、直鎖ジペプチド（以下、単にジペプチドと称す）であるＬ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）およびＬ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ）を測定した。【０２２９】  両ジペプチドはＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣによる分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）、溶離液としてＡ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）を用い、分析開始後５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分経過したときにＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかけ、流動速度０．６ｍｌ／分、励起波長２５４ｎｍ、蛍光波長６３０ｎｍでジペプチドを検出する条件で行った。【０２３０】  その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株の反応液中には２１．９ｍｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅと１２．０ｍｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕが蓄積していることが確認された。また対照株として用いたエシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはいずれのジペプチドも検出されなかった。
このことから、実験例１１で取得されたシクロジペプチド合成酵素はジペプチドを合成する能力をもつことが明らかになった。
実験例１３  精製酵素を用いたジペプチドの製造（１）
実験例１２と同様にエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株を培養した。培養終了後、遠心分離によって湿菌体を取得し、６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄後、１０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁を４℃で超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液（１０ｍｌ、蛋白質０．８６３ｍｇを含む）をアマシャム社製Ｈｉｓタグ精製カラムに通塔し、１０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー１５ｍｌを通塔することによる洗浄を行い、ＨｉｓタグつきａｌｂＣ蛋白質をカラム内にて精製した。次にこのＨｉｓタグ付きのａｌｂＣ蛋白質を保持するカラムに、実施例２と同組成の反応液（反応液組成：６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる反応液）２ｍｌを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、３０℃にて、インキュベートした。２４時間後、同組成の反応液３ｍｌでカラム内の反応液を溶出し、実験例１２と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを定量した。【０２３１】  その結果、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）６．８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ２８．７ｍｇ／ＬおよびＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ１８．５ｍｇ／Ｌが生成していることが分かった。ＡＴＰを含まない反応液で同様にインキュベートした場合は、シクロジペプチド、ジペプチドともに検出されなかった。
実験例１４  精製酵素を用いたジペプチドの製造（２）
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実験例１３と同様の方法で酵素反応を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、１ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｐｈｅに置き換えた以外は実験例１３と同じ組成の溶液を用いた。【０２３２】  その結果、反応開始後２４時間で、それぞれ９．４１ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、７．８５ｍｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｅｕ、または５．２０ｍｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅが生成していることが分かった。
実験例１５  ｙｗｆＥ遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号８２〜８５に記載の配列をそれぞれ有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＬ、プライマーＭ、プライマーＮ、プライマーＯ）を合成した。配列番号８２の配列は、プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥのｙｗｆＥ遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について５’側にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号８３の配列は、ｙｗｆＥ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号８４の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列について５’側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号８５の配列は、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列を含む配列を付加したものである。【０２３３】  プラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥを鋳型とし、ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＬおよびプライマーＭを、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＮおよびプライマーＯをそれぞれプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇのｐＱＥ６０ｙｗｆＥ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む４０μＬの反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２３４】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＬおよびプライマーＭを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＮおよびプライマーＯを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域の断片に相当する約０．３ｋｂの断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡを２０μｌのＴＥに溶解した。【０２３５】  上記で得られたそれぞれのＤＮＡ溶液５μｌを用い、プライマーＬおよびプライマーＭで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＮおよびプライマーＯで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより、それぞれｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０２３６】  ０．２μｇのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥ遺伝子を含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。【０２３７】  該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥ遺伝子を含む発現ベクターであるｐＰＥ５６を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した（図４）。
実験例１６  ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損株の作製
エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］に従って作製した。【０２３８】  以下に記載のプラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号５３で表される塩基配列を有するｐｅｐＤ遺伝子、配列番号５４で表される塩基配列を有するｐｅｐＮ遺伝子、配列番号５５で表される塩基配列を有するｐｅｐＢ遺伝子、配列番号５６で表される塩基配列を有するｐｅｐＡ遺伝子および配列番号５７で表される塩基配列を有するｄｐｐＡ遺伝子、配列番号５８で表される塩基配列を有するｄｐｐＢ、配列番号５９で表される塩基配列を有するｄｐｐＣ遺伝子、配列番号６０で表される塩基配列を有するｄｐｐＤ遺伝子および配列番号６１で表される塩基配列を有するｄｐｐＦ遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡ上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する３６ｂｐからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号５２で表される酵母由来Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。ただし、ｄｐｐＡ遺伝子、ｄｐｐＢ遺伝子、ｄｐｐＣ遺伝子、ｄｐｐＤ遺伝子およびｄｐｐＦ遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡを合成した。【０２３９】  すなわち、ｐｅｐＤ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６２および６３、ｐｅｐＮ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６４および６５、ｐｅｐＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６６および６７、ｐｅｐＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号６８および６９、ｄｐｐオペロン欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号７０および７１で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。【０２４０】  次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＫＤ３ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μＬの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２４１】  それぞれの反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子およびｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）ｐｅｐＤ遺伝子欠損エシェリヒア・コリＪＭ１０１の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で培養することでｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株（以下、エシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。【０２４２】  プラスミドｐＫＤ４６は、λ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現はＬ−アラビノースにより誘導することができる。よって、Ｌ−アラビノース存在下で生育させたｐＫＤ４６を保有する大腸菌を、直鎖ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。【０２４３】  １０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−アラビノースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリＪＭ１０１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法により上記で取得したｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、大腸菌ＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＤ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３０℃で培養することで選択した。【０２４４】  選択したクロラムフェニコール耐性株を、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地、及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカし、３７℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、ｐＫＤ４６脱落株を取得した。【０２４５】  次に上記で得られたｐＫＤ４６脱落株をｐＣＰ２０を用いて形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択することにより、ｐＣＰ２０を保持するｐＫＤ４６脱落株を取得した。
プラスミドｐＣＰ２０は、酵母由来Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現は４２℃で誘導することができる。
また、上記で作製したｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子及びｄｐｐオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列が存在するため、Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。【０２４６】  さらに、ｐＣＰ２０は温度感受性の複製起点を有しているため、ｐＣＰ２０保持株を４２℃で生育させることにより、Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの発現とｐＣＰ２０の脱落を同時に誘導することができる。
上記で取得したｐＣＰ２０保有ｐＫＤ４６脱落株を薬剤無添加のＬＢ寒天培地に植菌し、４２℃で１４時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加ＬＢ寒天培地、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。【０２４７】  上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法（生物工学実験書、日本生物工学会編９７〜９８ページ、培風館、１９９２年）に従って調製した。欠損の標的遺伝子であるｐｅｐＤ遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号７２および７３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄｅｏｘｙＮＴＰを含む４０μＬの反応液を用い、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間からなる工程を３０回繰り返すことにより行った。【０２４８】  上記ＰＣＲにおいて、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をｐｅｐＤ遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリＪＰＤ１株と名づけた。
（３）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した株の作製
上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＪＰＤ１株をｐＫＤ４６で形質転換した後、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して、３０℃で培養することによりｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＪＰＤ１（以下、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６と称す）を選択した。エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６に、電気パルス法によりｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を導入し、エシェリヒア・コリＪＰＤ１／ｐＫＤ４６の染色体ＤＮＡ上にｐｅｐＮ遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片が相同組換えに
より組込まれた形質転換株を取得した。【０２４９】  次に、上記（２）と同様の操作を行うことにより、染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮ２と名づけた。
（４）エシェリヒア・コリＪＭ１０１の染色体ＤＮＡ上のｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子またはｄｐｐオペロンの欠損株は、上記（１）で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を用い、上記（２）と同様の方法により作製した。【０２５０】  上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号７４〜８１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号７４および７５で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＮ欠損確認用、配列番号７６および７７で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＡ欠損確認用、配列番号７８および７９で表される塩基配列からなるＤＮＡはｐｅｐＢ欠損確認用、配列番号８０および８１で表される塩基配列からなるＤＮＡはｄｐｐオペロン欠損確認用プライマーセットである。【０２５１】  上記方法で取得されたｄｐｐオペロン欠損株をエシェリヒア・コリＪＤＰＰ１株、ｐｅｐＮ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮ１株、ｐｅｐＡ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＡ１株、ｐｅｐＢ遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＢ７株と名付けた。
また、上記（３）の方法に準じて、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＢ遺伝子およびｄｐｐオペロンからなる群より選ばれる２以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。前記方法で取得されたｐｅｐＤ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＰ４９株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子およびｐｅｐＮ遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＤＮＢ４３株、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＤＰ３６株、ｐｅｐＡ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＡＰ５株、ｐｅｐＢ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＮ遺伝子およびｄｐｐオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリＪＰＮＤＢＰ７株と名づけた。表２は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。【０２５２】
【表２】
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【０２５３】実験例１７  ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み活性が喪失したエシェリヒア・コリを用いたＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａの生産性の評価
実験例１６で得られた各種ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損株を、実験例１５で造成したプラスミドｐＰＥ５６を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。【０２５４】  得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水）１ｇ／Ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ１ｇ／Ｌ、Ｌ−Ａｌａ２．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ２．５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）を試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。【０２５５】  該上清中の生産物をＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムにＯＤＳ−ＨＧ５（野村化学社製）を用い、溶離液としてＡ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、２０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８に調整）およびＢ液（酢酸６ｍｌ／ｌ、７０％（ｖ／ｖ）アセト二トリル、トリエチルアミンにてｐＨ４．８調整）を用い、分析開始後５分まではＡ液：Ｂ液＝８：２、５分〜２０分までは、２０分でＡ液：Ｂ液＝１：１になるようにリニアーグラジエントをかける条件で分析を行った。分析結果を表３に示す。【０２５６】
【表３】
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【０２５７】  表３から、２種以下のペプチダーゼが欠損した微生物、１種のペプチド取り込み蛋白質のみが欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量は低いが、１種以上のペプチダーゼおよび１種のペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物、または３種以上のペプチダーゼの活性が喪失した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量が大幅に増加していることがわかった。
実験例１８  ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたＬ−アラニル−Ｌ−バリン（以下、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌと称す）の生産性の評価
実験例１７と同様に、各種ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損大腸菌株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム１６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／ｌ、クエン酸（無水）１ｇ／ｌ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ１ｇ／ｌ、Ｌ−Ａｌａ２．５ｇ／ｌ、Ｌ−Ｖａｌ２．５ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ビタミンＢ１１０ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物２５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄・７水和物５０ｍｇ／ｌ、１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２に調整。グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後に添加）が入った試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。【０２５８】  該上清中の生成物を、実験例１７記載の方法により分析した。結果を表４に示す。【０２５９】
【表４】
0005424530.tif 000031
【０２６０】  表４から、２種以下のペプチダーゼが欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質のみが欠損した微生物はジペプチドを生産しないが、３種以上のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、または１種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
実験例１９  ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み系蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−Ｌ−グルタミン（以下、Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎと称す）の生産性の評価
実験例１７と同様に各種ペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、ｐＰＥ５６を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。【０２６１】  該培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびアミノ酸を含む８ｍｌの水性媒体（リン酸水素二カリウム１６ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、クエン酸（無水）１ｇ／Ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製）０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｐｒｏ１ｇ／Ｌ、Ｇｌｙ２．５ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｎ２．５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物２５ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．２に調整。Ｌ−Ｇｌｎは１０倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンＢ１、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸鉄・７水和物は別個に蒸煮後添加）が入った試験管に１％添加し、３０℃で２４時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。【０２６２】  該上清中の生成物を、実験例１７記載の方法より分析した。結果を表５に示す。【０２６３】
【表５】
0005424530.tif 000032
【０２６４】  表５から、２種以下のペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および１種のペプチド取り込み蛋白質のみが欠損した微生物は、ジペプチドを生産しなかったが、３種以上のペプチダーゼが欠損した微生物、および２種以上のペプチダーゼ遺伝子および１種のペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわかった。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０２６５】アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質に用いたジペプチド誘導体の酵素的製造法
実験例４で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素４０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、各１０ｍｍｏｌ／Ｌの表６記載のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応液の１００倍量の停止緩衝液（４ｍｏｌ／Ｌ尿素、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ・２ナトリウム塩）を反応液に加えて反応を停止し、酵素反応によりＡＴＰが消費される際に生じるＡＤＰ量をＨＰＬＣを用いて分析することにより、反応が進行していることを確認した。ＨＰＬＣによる分析は、カラムにＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（１５０×４．６ｍｍ、野村化学社製）、移動相に２００ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸および２００ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミンからなる溶液（ｐＨ６．６）を用い、流速１．０ｍｌ／
分、室温、２５４ｎｍの紫外吸収を測定する条件で行った。結果を表６に示す。【０２６６】
【表６−１】
0005424530.tif 000033
【０２６７】
【表６−２】
0005424530.tif 000034
【０２６８】
【表６−３】
0005424530.tif 000035
【０２６９】
【表６−４】
0005424530.tif 000036
【０２７０】
【表６−５】
0005424530.tif 000037
【０２７１】
表６−１はL‐AlaとL‐Ala誘導体、表６−２はL‐AlaとL‐Phe誘導体、表６−３はL‐AlaとL‐Glu誘導体、表６−４はL‐AlaとL‐Asp誘導体、表６−５はL‐AlaとL‐Lys誘導体を基質に用いた実験結果であり、基質として用いたアミノ酸およびアミノ酸誘導体の略称は以下のとおりである。
Ala ：L‐アラニン
Phe ：L‐フェニルアラニン
Glu ：L‐グルタミン酸
Asp ：L‐アスパラギン酸
Lys ：L‐リジン
Cl‐Ala ：β‐クロロ‐L‐アラニン
CN‐Ala ：β‐シアノ‐L‐アラニン
cyc(5)Ala ：β‐シクロペンチル‐DL‐アラニン
cyc(3)Ala ：β‐シクロプロピルアラニン
cyc(6)Ala ：β‐シクロヘキシルアラニン
Cl‐Phe ：4‐クロロフェニルアラニン
F‐Phe ：4‐フルオロフェニルアラニン
Ni‐Phe ：p‐ニトロフェニルアラニン
NH2‐Phe ：p‐アミノフェニルアラニン
Phe‐NH2 ：フェニルアラニンアミド
Kynurenin ：L‐キヌレニン
Glu(OMe) ：グルタミン酸‐γ‐メチルエステル
Glu(OEt) ：グルタミン酸‐γ‐エチルエステル
Glu(OtBu) ：グルタミン酸‐γ‐t‐ブチルエステル
Glu(OBzl) ：グルタミン酸‐γ‐ベンジルエステル
Asp(OMe) ：アスパラギン酸‐β‐メチルエステル
Asp(OtBu) ：アスパラギン酸‐β‐t‐ブチルエステル
Asp(OBzl) ：アスパラギン酸‐β‐ベンジルエステル
Lys(Ac) ：アセチルリジン
Lys(Boc) ：Boc‐リジン
表６に示すように、コントロールである基質無添加区、およびL‐Ala、L‐Phe、L‐Glu、L‐Asp、L‐Lysをそれぞれ単独の基質に用いた試験区でのADP生成量は0.02〜0.16mmol/Lであったのに対し、表６に示すアミノ酸およびアミノ酸誘導体の組み合わせでは、0.54〜6.43mmol/LものADPが生成していた。
【０２７２】  また、プロトンＮＭＲ分析により上記と同様の反応条件で反応させた反応液中に存在する化合物の構造解析を行った。ただし、反応に用いた基質アミノ酸およびアミノ酸誘導体は、反応液１、４、１０および１１は２０ｍｍｏｌ／Ｌ、その他の反応液は１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いた。
プロトンＮＭＲ分析は、Ｂｒｕｋｅｒ社製のＤＭＸ５００を用い、以下の条件下で行った。
温度：３０３Ｋ
標準物質：１ｍｍｏｌ／Ｌの３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−Ｄ４  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＴＳＰ）
媒体：反応液４、１０および１１は軽水、その他の反応液は重水
反応液中の化合物の構造は、α位のプロトンのケミカルシフトに基づき同定した。各化合物の濃度はＴＳＰの面積を内部標準とし、α位のプロトンのシグナル面積を元に算出した（表７）。ただし、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは濃度が低く、α位のプロトンのシグナルが重なり合うため、β位のプロトンのシグナル面積を元に算出した。なお、括弧内は、各化合物のα位プロトンのケミカルシフト（単位はｐｐｍ）を表す。【０２７３】Ｃｌ−ＡｌａおよびＰｈｅを基質に用いた反応液（反応液１）
Ｃｌ−Ａｌａ（４．２０）、Ｐｈｅ（４．０２）、Ｃｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（３．９３，４．５０）、Ａｚｉｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ［Ａｚｃ］（２．７３）、Ａｚｃ−Ｐｈｅ（２．５９，４．４７）
ＣＮ−ＡｌａおよびＰｈｅを基質に用いた反応液（反応液２）
ＣＮ−Ａｌａ（３．８７）、Ｐｈｅ（４．００）、Ｃｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（３．７１，４．４８）
ＡｌａおよびＣｌ−Ｐｈｅを基質に用いた反応液（反応液３）
Ａｌａ（３．７９）、Ｃｌ−Ｐｈｅ（３．９７）、Ａｌａ−Ｃｌ−Ｐｈｅ（３．９０，４．４３）
ＡｌａおよびＮＨ２−Ｐｈｅを基質に用いた反応液（反応液４）
Ａｌａ（３．７８）、ＮＨ２−Ｐｈｅ（３．９３）、Ａｌａ−ＮＨ２−Ｐｈｅ（３．９５，４．３９）、Ａｌａ−Ａｌａ（β；１．５５，１．３６）
ＡｌａおよびＫｉｎｕｒｅｎｉｎｅを基質に用いた反応液（反応液５）
Ａｌａ（３．７９）、Ｋｉｎｕｒｅｎｉｎｅ（４．１６）、Ａｌａ−Ｋｉｎｕｒｅｎｉｎｅ（３．９６，４．６４）
ＡｌａおよびＰｈｅ−ＮＨ２を基質に用いた反応液（反応液６）
Ａｌａ（３．７９）、Ｐｈｅ−ＮＨ２（４．０２）、Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（３．９０，４．６０）
ＡｌａおよびＧｌｕ（ＯＭｅ）を基質に用いた反応液（反応液７）
Ａｌａ（３．７９）、Ｇｌｕ（ＯＭｅ）（３．７６）、Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）（４．０５，４．１８）、Ａｌａ−Ａｌａ（β；１．５５，１．３６）
ＡｌａおよびＧｌｕ（ＯｔＢｕ）を基質に用いた反応液（反応液８）
Ａｌａ（３．７９）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（３．７６）、Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（４．０４，４．１８）
ＡｌａおよびＡｓｐ（ＯｔＢｕ）を基質に用いた反応液（反応液９）
Ａｌａ（３．８１）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（３．９８）、Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（４．０４，４．４６）
ＡｌａおよびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を基質に用いた反応液（反応液１０）
Ａｌａ（３．７８）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（３．７３）、Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（４．０２，４．１４）
Ａｌａおよびｃｙｃ（３）Ａｌａを基質に用いた反応液（反応液１１）
Ａｌａ（３．７８）、ｃｙｃ（３）Ａｌａ（３．８２）、Ａｌａ−ｃｙｃ（３）Ａｌａ（４．０８，４．２４）
Ａｌａおよびｃｙｃ（６）Ａｌａを基質に用いた反応液（反応液１２）
Ａｌａ（３．７９）、ｃｙｃ（６）Ａｌａ（３．７６）、Ａｌａ−ｃｙｃ（６）Ａｌａ（４．０２，４．２２）【０２７４】
【表７】
0005424530.tif 000038
【０２７５】  表中の「ｏｖｅｒｌａｐ」はシグナルの重なりによって正確な定量ができなかったことを示す。
上記結果から、本発明の製造法により、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質として、直接アミノ酸とアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチド誘導体が製造できることが明らかとなった。
【実施例２】
【０２７６】Ｎ−［２−（アセチルアミノ）プロピオニル］フェニルアラニンの製造
実験例６で得られたＬ−Ａｌａ−Ｌ−ｐｈｅ（１００ｍｇ，０．４２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）に懸濁し、室温でピリジン（１０ｍＬ）及び無水酢酸（１ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）を加える。室温で２４時間撹拌した後、水を加えクロロホルムで３回抽出する。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去することにより、Ｎ−［２−（アセチルアミノ）プロピオニル］フェニルアラニンを得る。
【実施例３】
【０２７７】１−｛２−［Ｎ−（（アセチルアミノ）アセチル）アミノ］−３−フェニルプロピオニル｝ピペリジンの製造
実施例２で得られるＮ−［２−（アセチルアミノ）プロピオニル］フェニルアラニン（１０ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１４ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）及びピペリジン（４０μＬ，０．４０ｍｍｏｌ）を加え５０℃で２４時間撹拌する。反応混合物に水を加え、クロロホルムで３回抽出する。有機層を１０％塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去する。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、１−｛２−［Ｎ−（（アセチルアミノ）アセチル）アミノ］−３−フェニルプロピオニル｝ピペリジンを得る。
【配列表フリーテキスト】
【０２７８】配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３４−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３５−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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