(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工塩基対を含む核酸を複製する方法であって、以下の式Ｉ：
【化１】
0005424414.tif 000025
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）、および／または、以下の式ＩＩ：
【化２】
0005424414.tif 000026
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、
【化３】
0005424414.tif 000027
または
【化４】
0005424414.tif 000028
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、置換もしくは非置換アリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ｄｓ、前記式ＩＩで表される塩基、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法。
【請求項２】
鋳型鎖が、塩基Ｄｓおよび／または式ＩＩで表される塩基を有するヌクレオチドを少なくとも２つ含むＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
機能性置換基を結合した人工塩基を、核酸の複製反応によりＤＮＡ中に導入する方法であって、
以下の式Ｉ：
【化５】
0005424414.tif 000029
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
複製基質として、以下の式ＩＩ：
【化６】
0005424414.tif 000030
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、
【化７】
0005424414.tif 000031
または
【化８】
0005424414.tif 000032
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、置換もしくは非置換アリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い；
それにより、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸が生成することにより、機能性置換基を結合した人工塩基がＤＮＡ中に導入される；
前記方法。
【請求項６】
鋳型鎖が、塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを少なくとも２つ含む核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
鋳型鎖において、塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３（Ｄｓ）Ｎ４Ｎ５Ｎ６−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ１がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ３がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ４がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ５がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ６がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法であって、
（１）以下の式Ｉ：
【化９】
0005424414.tif 000033
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を含有する核酸プールに対して、複製基質として、以下の式ＩＩ：
【化１０】
0005424414.tif 000034
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、
【化１１】
0005424414.tif 000035
または
【化１２】
0005424414.tif 000036
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、Ｚで置換されたアリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い；
（２）生成した核酸の中から、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を、前記式ＩＩで表される塩基が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に回収する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸が、塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを少なくとも２つ含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸において、塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３（Ｄｓ）Ｎ４Ｎ５Ｎ６−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ１がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ３がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ４がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ５がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ６がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
（１）以下の式Ｉ：
【化１３】
0005424414.tif 000037
で表される塩基を有するヌクレオチドを含み、そして５’−（Ｎ）ｎ（Ｄｓ）（Ｎ）ｍ−３’（配列番号３）、ここでｎおよびｍはそれぞれ独立して１ないし１０から選択される整数である、で示されるランダム領域を含むＤＮＡライブラリーを調製し；
（２）複製基質として、以下の式ＩＩ：
【化１４】
0005424414.tif 000038
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、
【化１５】
0005424414.tif 000039
または
【化１６】
0005424414.tif 000040
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、Ｚで置換されたアリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて前記ＤＮＡライブラリーに対して核酸の複製反応を行い；
（３）塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し；
（４）（３）で回収した核酸に対して、（２）および（３）の工程を繰り返し；そして
（５）得られた核酸の配列を決定する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法により得られる核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高選択・高効率で複製が可能な人工塩基対、および当該人工塩基対を含む核酸の複製方法に関する。本発明はまた、機能性置換基を結合した人工塩基を核酸の複製反応によりＤＮＡ中に導入する方法に関する。本発明はさらに、核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法に関する。本発明は、さらにまた、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、Ａ−Ｔ（Ｕ）およびＧ−Ｃ塩基対の自己相補性により増幅し、並びに触媒およびリガンドとして機能する。しかしながら、天然型のタンパク質における２０の異なるアミノ酸と比べて、天然型の核酸においては僅か４つの異なる塩基からなるヌクレオチドで形成されているという数の制限が、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の機能を限定している。非天然型塩基対システムは、核酸の塩基の種類を増やして遺伝情報を拡張することができるので、この問題の解決法となる（非特許文献１−５）。非天然型塩基対としては、ポリメラーゼ触媒反応により、ＤＮＡおよびＲＮＡに特別なヌクレオチド類似体の部位特異的導入を可能にする高い特異的相補性が要求される。これが可能になれば、天然に存在する塩基の数により制限される現在の遺伝子工学が、非天然型塩基対システムを使用する新規技術により取り替えられ得る。【０００３】
非天然型塩基対を作成する最初の試みは、Ｂｅｎｎｅｒらにより行われた（非特許文献６−７）。彼らは、天然型塩基対の水素結合パターンとは異なる水素結合パターンで、イソグアニン−イソシトシン（ｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ）およびキサントシン−ジアミノピリミジンのような、いくつかの非天然型塩基対を開発した。最近これらの非天然型塩基対が、該塩基対を含有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅（非特許文献８−９）、および配列解析（非特許文献１０）に適用された。しかしながら、忠実度は比較的高くはなく、そして／または面倒な方法が必要とされる。【０００４】
次いで、Koolらは、天然型塩基に類似の形を有するが、塩基対合において水素結合を形成する能力を欠く疎水性塩基を合成した（非特許文献１１−１２）。これらの疎水性塩基は、ＤＮＡポリメラーゼにより選択的に認識されたことから、複製においては、水素結合相互作用よりむしろ塩基対間の幾何学的な形の相補性が重要であることが示唆された。最近、一連の疎水性塩基対がRomesbergらにより開発され、そして大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにより、これらの塩基対がＤＮＡ中に相補的に導入された（非特許文献１３−１５）。しかしながら、疎水塩基は、複製において、形の相補性に従わずに、疎水性塩基間で非特異的導入が生じた（非特許文献１４）。【０００５】
水素結合パターンおよび形の相補性の概念を組み合わせることにより、本発明者らは、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（ｓ）と２−オキソピリジン（ｙ）との間（特許文献１、非特許文献１６−１７）、並びに２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖ）とｙとの間（特許文献２、非特許文献１８）の、非天然型塩基対を開発した。ｓおよびｖの６位の大きな置換基は、天然型塩基との好ましくない塩基対（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）を効率的に抑制し、そして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、鋳型中のｓまたはｖに相補して、ｙおよび修飾ｙ塩基の基質（ヌクレオシド５’−３リン酸）が部位特異的にＲＮＡ中に導入された。この特異的転写は、機能性のＲＮＡ分子を開発する手法として実用化が可能であるが（非特許文献１９−２１）、複製におけるｓ−ｙおよびｖ−ｙ塩基対の選択性は、転写における選択性と比べてそれほど高くはない（非特許文献１６、１８）。【０００６】
複製で実用化レベルに近い人工塩基対は、米国のＳ．Ａ．ＢｅｎｎｅｒらのＰ−Ｚ塩基対（Ｐ：２−アミノ−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オン；と、Ｚ：６−アミノ−５−ニトロ−２（１Ｈ）−ピロリドン）（非特許文献２２）、米国ＥｒａＧｅｎ社のｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ塩基対（特許文献３、および非特許文献９）、そして本発明者でもある平尾らのＤｓ−Ｐａ塩基対とＤｓ−Ｐｎ塩基対（Ｄｓは、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基、Ｐａは２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基、Ｐｎは２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基をそれぞれ意味する）（特許文献４、ならびに非特許文献２３および２４）が報告されている。しかし、ＢｅｎｎｅｒらやＥｒａＧｅｎ社の人工塩基対は複製における選択性が低く、ＰＣＲのサイクル数には制限があり、微量のＤＮＡの検出が難しい。また、平尾らの人工塩基対は選択性は高いが、その複製には特殊な基質を用いなければならず、ＰＣＲの増幅効率もそれほど高くない。
【０００７】
ＰＣＲ増幅１サイクルにおけるＤＮＡ中の人工塩基の保存率は、ＢｅｎｎｅｒらのＰ−Ｚ塩基対が９７．５％、ＥｒａＧｅｎ社のｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ塩基対が〜９６％、そして本発明者らが以前に開発したＤｓ−Ｐａ塩基対とＤｓ−Ｐｎ塩基対がそれぞれ〜９９％である。人工塩基対のＰＣＲにおける保存率が９７．５％の場合には、２０サイクルのＰＣＲを行った場合、最終的に増幅されたＤＮＡ中には６０％程度（０．９７５20＝０．６０）しか、人工塩基対が存在していないことになる。したがってＰ−ＺやｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ塩基対は、微量のＤＮＡを用いる核酸の複製／増幅反応を利用した各種技術への応用は難しい。また、これらの人工塩基対を含むＤＮＡのシーケンシング法も実用化レベルでの報告は無い。【０００８】
本発明者らがこれまでに発明したＤｓ−ＰａやＤｓ−Ｐｎ塩基対は、２０サイクルのＰＣＲで増幅されたＤＮＡ中に８２％（０．９９20＝０．８２）存在することになる。しかし、核酸の複製／増幅反応を利用した各種技術に応用するためには、Ｄｓ−ＰａとＤｓ−Ｐｎ塩基対よりもさらに高い保存率を有するものを開発する必要がある。またこれらの人工塩基対を組み込んだＤＮＡをＰＣＲ増幅する場合には一部特殊な修飾基質（γ−アミド三リン酸誘導体）を使用する必要があり、操作が煩雑になる。また、ＤＮＡ中の人工塩基対の位置をシーケンシングにより確認できるが、人工塩基対近傍の天然型塩基対の配列に依存してシーケンシングの結果が乱れることがあり、汎用性を高めるためには改善の余地があった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００１／００５８０１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／０２６１８７号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第ＵＳ２００７/０１０５０９９号明細書
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００７／０６６７３７号パンフレット
【非特許文献１】Benner, S. A., Burgstaller, P., Battersby, T. R. & Jurczyk, S. in The RNA World (eds Gesteland, R. F., Cech, T. R. & Atkins, J. F.) 163-181 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999).
【非特許文献２】Henry, A. A. & Romesberg, F. E. Beyond A, C, G and T: augmenting nature’s alphabet. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 727-733 (2003).
【非特許文献３】Moser, M. J. & Prudent, J. R. Enzymatic repair of an expanded genetic information system. Nucleic Acids Res. 31, 5048-5053 (2003).
【非特許文献４】Bergstrom, D. E. Orthogonal base pairs continue to evolve. Chem. Biol. 11, 18-20 (2004).
【非特許文献５】Benner, S. A. & Sismour, A. M. Synthetic biology. Nat. Rev. 6, 533-543 (2005).
【非特許文献６】Piccirilli, J. A., Krauch, T., Moroney, S. E. & Benner, S. A. Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet. Nature 343, 33-37 (1990).
【非特許文献７】Switzer, C. Y., Moroney, S. E. & Benner, S. A. Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine. Biochemistry 32, 10489-10496 (1993).
【非特許文献８】Sismour, A. M. et al. PCR amplification of DNA containing non-standard base pairs by variants of reverse transcriptase from Human Immunodeficiency Virus-1. Nucleic Acids Res. 32, 728-735 (2004).
【非特許文献９】Johnson, S. C., Sherrill, C. B., Marshall, D. J., Moser, M. J. & Prudent, J. R. A third base pair for the polymerase chain reaction: inserting isoC and isoG. Nucleic Acids Res. 32, 1937-1941 (2004).
【非特許文献１０】Ahle, J. D., Barr, S., Chin, A. M. & Battersby, T. R. Sequence determination of nucleic acids containing 5-methylisocytosine and isoguanine: identification and insight into polymerase replication of the non-natural nucleobases. Nucleic Acids Res. 33, 3176-3184 (2005).
【非特許文献１１】Morales, J. C. & Kool, E. T. Efficient replication between non-hydrogen-bonded nucleoside shape analogs. Nat. Struct. Biol. 5, 950-954 (1998).
【非特許文献１２】Kool, E. T., Morales, J. C. & Guckian, K. M. Mimicking the structure and function of DNA: Insights into DNA stability and replication. Angew. Chem. Int. Ed. 39, 990-1009 (2000).
【非特許文献１３】McMinn, D. L. et al. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. J. Am. Chem. Soc. 121, 11585-11586 (1999).
【非特許文献１４】Wu,Y. et al. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: optimization of interbase hydrophobic interactions. J. Am. Chem. Soc. 122, 7621-7632 (2000).
【非特許文献１５】Ogawa, A. K. et al. Efforts toward the expansion of the genetic alphabet: Information storage and replication with unnatural hydrophobic base pairs. J. Am. Chem. Soc. 122, 3274-3287 (2000).
【非特許文献１６】Fujiwara, T., Kimoto, M., Sugiyama, H., Hirao, I. & Yokoyama, S. Synthesis of 6-(2-thienyl)purine nucleoside derivatives that form unnatural base pairs with pyridin-2-one nucleosides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2221-2223 (2001).
【非特許文献１７】Hirao, I. et al. An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins. Nat. Biotechnol. 20, 177-182 (2002).
【非特許文献１８】Mitsui, T., Kimoto, M., Harada, Y., Yokoyama, S. & Hirao, I. An efficient unnatural base pair for a base-pair-expanded transcription system. J. Am. Chem. Soc. 24, 8652-8658 (2005).
【非特許文献１９】Kimoto M. et al. Site-specific incorporation of a photo-crosslinking component into RNA by T7 transcription mediated by unnatural base pairs. Chem. Biol. 11, 47-55 (2004).
【非特許文献２０】Moriyama, K., Kimoto, M., Mitsui, T., Yokoyama, S. & Hirao, I. Site-specific biotinylation of RNA molecules by transcription using unnatural base pairs. Nucleic Acids Res. 33, e129 (2005).
【非特許文献２１】Kawai, R. et al. Site-specific fluorescent labeling of RNA molecules by specific transcription using unnatural base pairs. J. Am. Chem. Soc. 127, 17286-17295 (2005).
【非特許文献２２】Yang, Z., Sismour, A.M., Sheng, P., Puskar, N.L. & Benner, S.A. Enzymatic incorporation of a third nucleobase pair. Nucleic Acids Res. 35, 4238-4249 (2007).
【非特許文献２３】Hirao, I., Kimoto, M., Mitsui, T., Fujiwara, T., Kawai, R., Sato, A., Harada, Y. & Yokoyama, S. An unnatural hydrophobic base pair system: site-specific incorporation of nucleotide analogs into DNA and RNA. Nat. Methods 3, 729-735 (2006).
【非特許文献２４】Hirao, I., Mitsui, T., Kimoto, M. & Yokoyama, S. An efficient unnatural base pair for PCR amplification. J. Am. Chem. Soc. 129, 15549-15555 (2007).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高選択・高効率で複製が可能な人工塩基対、および当該人工塩基対を含む核酸の複製方法を提供することを目的とする。本発明はまた、機能性置換基を結合した人工塩基を核酸の複製反応によりＤＮＡ中に導入する方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法を提供することを目的とする。本発明は、さらにまた、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、人工塩基Ｐｎの１−プロピニル誘導体と、人工塩基Ｄｓとの組み合わせは、これまでに開発された人工塩基対Ｄｓ−ＰａやＤｓ−Ｐｎの組み合わせと比較して、核酸の増幅反応において高い選択性を有することを見出し、本発明を想到した（Ｄｓは、７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基、Ｐｎは２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基、Ｐａは２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基をそれぞれ意味する）。
【００１１】
従来の人工塩基対Ｄｓ−Ｐａを用いた複製では、好ましくない塩基対形成であるＤｓ−Ｄｓ、Ａ−Ｐａを防ぐためにＤｓとＡの修飾基質（ヌクレオシド  ５’−γ−アミド三リン酸；以下、γ−アミド三リン酸と記載することもある）を用いることにより、高い選択性でのＰＣＲ増幅を達成できた（I. Hirao, et al., Nature Methods, 3: 729-735 (2006)）。その後、人工塩基Ｐａを人工塩基Ｐｎに変えると、好ましくない塩基対Ａ−ＰｎはＡ−Ｐａよりも形成されにくくなることがわかり、Ａの修飾基質（γ−アミド三リン酸）を用いず、ＰＣＲ増幅が可能となった（I. Hirao, et al., J. Am. Chem. Soc., 129: 15549-15555 (2007)）。しかし、人工塩基対Ｄｓ−ＰｎのＰＣＲ増幅では、Ｄｓの修飾基質（γ−アミド三リン酸）がまだ必要であった（WO 2007/066737）。これは好ましくないＤｓ−Ｄｓの塩基対形成の効率がＤｓ−Ｐｎの塩基対形成の効率よりも高いためである。【００１２】
そこで、基質ＰｎとＤＮＡポリメラーゼとの親和性を高めるためのπ電子系の置換基の一つであるプロピニル基をＰｎの４位に結合させた誘導体を開発した。そして、この基質を用いることにより、Ｄｓの修飾基質（γ−アミド三リン酸）を必要とせず、Ｄｓ、Ｐｎ誘導体、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの各塩基について、通常のデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸体を基質として用いたＰＣＲ増幅が可能であることを見出した。また、Ｐｎに結合したπ電子系の置換基の先には、種々の長さを有するリンカー部分を介して、機能性化合物（アミノ基、蛍光色素、ビオチンなど）を付加した人工塩基についても、同様に核酸の増幅反応において高い選択性を有することを見出した。その結果、本発明に想到した。【００１３】
以上、本発明の理解のために本発明を相当するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。【００１４】
本発明は、以下の態様１−１９を提供する。【００１５】
態様１：  人工塩基対を含む核酸を複製する方法であって、以下の式Ｉ：【００１６】
【化１】
0005424414.tif 000002
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）、および／または、以下の式ＩＩ：【００１７】
【化２】
0005424414.tif 000003
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、【００１８】
【化３】
0005424414.tif 000004
または【００１９】
【化４】
0005424414.tif 000005
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、置換もしくは非置換アリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される］
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ｄｓ、前記式ＩＩで表される塩基、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法。【００２０】
態様２：  鋳型鎖が、塩基Ｄｓおよび／または式ＩＩで表される塩基を有するヌクレオチドを少なくとも２つ含むＤＮＡである、態様１に記載の方法。【００２１】
態様３：  複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、態様１または２に記載の方法。【００２２】
態様４：  蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。【００２３】
態様５：  機能性置換基を結合した人工塩基を、核酸の複製反応によりＤＮＡ中に導入する方法であって、
以下の式Ｉ：【００２４】
【化５】
0005424414.tif 000006
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型鎖として用い；
複製基質として、以下の式ＩＩ：【００２５】
【化６】
0005424414.tif 000007
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、【００２６】
【化７】
0005424414.tif 000008
または【００２７】
【化８】
0005424414.tif 000009
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、置換もしくは非置換アリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い；
それにより、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸が生成することにより、機能性置換基を結合した人工塩基がＤＮＡ中に導入される；
前記方法。【００２８】
態様６：  鋳型鎖が、塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを少なくとも２つ含む核酸である、態様５に記載の方法。【００２９】
態様７：  複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、態様５または６に記載の方法。【００３０】
態様８：  鋳型鎖において、塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1Ｎ2Ｎ3（Ｄｓ）Ｎ4Ｎ5Ｎ6−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ4、Ｎ5、Ｎ6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ3がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ4がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ5がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ6がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、態様５〜７のいずれか１項に記載の方法。【００３１】
態様９：  蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、態様８に記載の方法。【００３２】
態様１０：  核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法であって、
（１）以下の式Ｉ：【００３３】
【化９】
0005424414.tif 000010
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸を含有する核酸プールに対して、複製基質として、以下の式ＩＩ：【００３４】
【化１０】
0005424414.tif 000011
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、【００３５】
【化１１】
0005424414.tif 000012
または【００３６】
【化１２】
0005424414.tif 000013
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、Ｚで置換されたアリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い；
（２）生成した核酸の中から、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を、前記式ＩＩで表される塩基が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に回収する；
ことを含む、前記方法。【００３７】
態様１１：  塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸が、塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを少なくとも２つ含む、態様１０に記載の方法。【００３８】
態様１２：  複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、態様１０または１１に記載の方法。【００３９】
態様１３：  塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸において、塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1Ｎ2Ｎ3（Ｄｓ）Ｎ4Ｎ5Ｎ6−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ4、Ｎ5、Ｎ6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ3がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ4がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ5がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ6がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、態様１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。【００４０】
態様１４：  蛍光色素がカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、態様１３に記載の方法。【００４１】
態様１５：  人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
（１）５’−（Ｎ）n（Ｎu1）（Ｎ）m−３’（配列番号２）、で示されるランダム領域を含むＤＮＡライブラリーを調製し、ここでｎおよびｍはそれぞれ独立して１ないし１０から選択される整数であり、Ｎu1は第一の人工塩基である；
（２）Ｎu1と人工塩基対を形成する第二の人工塩基Ｎu2を有するヌクレオシドを含む、複製基質を用いて前記ＤＮＡライブラリーに対して核酸の複製反応を行い、ここで、Ｎu2は機能性官能基を含んでいる；
（３）Ｎu1とＮu2の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し；
（４）（３）で回収した核酸に対して、（２）および（３）の工程を繰り返し；そして、
（５）得られた核酸の配列を決定する；
ことを含む、前記方法。【００４２】
態様１６：  人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
（１）以下の式Ｉ：【００４３】
【化１３】
0005424414.tif 000014
で表される塩基を有するヌクレオチドを含み、そして５’−（Ｎ）n（Ｄｓ）（Ｎ）m−３’（配列番号３）、ここでｎおよびｍはそれぞれ独立して１ないし１０から選択される整数である、で示されるランダム領域を含むＤＮＡライブラリーを調製し；
（２）複製基質として、以下の式ＩＩ：【００４４】
【化１４】
0005424414.tif 000015
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、【００４５】
【化１５】
0005424414.tif 000016
または【００４６】
【化１６】
0005424414.tif 000017
であり、式中
ｎは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され；
Ｙは、Ｚで置換されたアリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である］
で表される塩基、塩基Ｄｓ、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて前記ＤＮＡライブラリーに対して核酸の複製反応を行い；
（３）塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し；
（４）（３）で回収した核酸に対して、（２）および（３）の工程を繰り返し；そして
（５）得られた核酸の配列を決定する；
ことを含む、前記方法。【００４７】
態様１７：  複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸ではない、態様１６に記載の方法。【００４８】
態様１８：  態様１６または１７に記載の方法により得られる核酸。【００４９】
態様１９：  以下の式Ｉ：【００５０】
【化１７】
0005424414.tif 000018
で表される塩基（以下、Ｄｓと記載する）を有するヌクレオチドを含む核酸であって、塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1Ｎ2Ｎ3（Ｄｓ）Ｎ4Ｎ5Ｎ6−３’（ 配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ4、Ｎ5、Ｎ6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ3がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ4がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ5がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ6がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される条件の少なくとも２つ以上の条件を満たす、前記核酸。
【発明の効果】
【００５１】
人工塩基Ｐｎの４位にπ電子系を有する置換基を結合させた誘導体と、人工塩基Ｄｓの人工塩基対を開発した。そして、この人工塩基を用いることにより、人工塩基を含む核酸の複製反応において、全ての塩基（Ｄｓ、Ｐｎ誘導体、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの各塩基）について非修飾のヌクレオチド  ５’−三リン酸をも複製基質として用いることが可能になった。また、本発明の人工塩基対の核酸の複製反応における保存率は非常に高いため、種々の核酸の複製／増幅技術への応用も可能である。さらに、Ｐｎに結合したπ電子系を有する置換基の先には、種々の長さを有するリンカー部分を介して機能性置換基を付加することができるため、本発明の人工塩基を用いて機能性置換基をＤＮＡ中に位置選択的に導入し、かつ導入されたＤＮＡ自身を複製することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、Ｄｓ、Ｐｎ、ＮＨ2−ｈｘ−Ｐｎ、ＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎの構造を示す図である。
【図２】図２は、クレノウ断片を用いた一ヌクレオチド挿入実験の模式図、およびその結果を示すグラフである。
【図３】図３は、人工塩基を含むＤＮＡの高効率かつ高選択のＰＣＲ増幅を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する実験の模式図、ならびにその結果を示す表およびシーケンシングピークパターンである。
【図４】図４は、ｄｄＰａ’ＴＰおよびｄＰａ’ＴＰをシーケンシング反応に用いた場合のシーケンシングピークパターンである。
【図５−１】図５−１は、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰをＰＣＲ増幅でＤＮＡ中に導入する実験の模式図、およびその結果を示す電気泳動写真である。
【図５−２】図５−２は、ＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰをＰＣＲ増幅でＤＮＡ中に導入する実験の模式図、および増幅したＤＮＡの配列を解析した結果を示すシーケンシングピークパターンである。
【図６】図６は、複数の人工塩基を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅実験の模式図、ならびに、その結果を示す電気泳動は新および増幅したＤＮＡの配列を解析した結果を示すシーケンシングピークパターンである。
【図７】図７は、外来ＤＮＡが混在する条件下でのＤｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅および単離実験の模式図、ならびに当該実験の各段階における増幅された核酸のシーケンシングピークパターンである。
【図８】図８は、外来ＤＮＡが混在する条件下でのＤｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅および単離実験の模式図、ならびに増幅され単離された人工塩基対を含む核酸のシーケンシングピークパターンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。【００５４】
人工塩基対
本発明の人工塩基対は、人工塩基Ｄｓと人工塩基Ｐｎの誘導体とで形成される塩基対である。【００５５】
人工塩基Ｄｓは、以下の式Ｉ：【００５６】
【化１８】
0005424414.tif 000019
で表される。【００５７】
人工塩基Ｐｎ誘導体は、以下の式ＩＩ：【００５８】
【化１９】
0005424414.tif 000020
［ここにおいて、
Ｒは、−Ｘ−Ｙ、【００５９】
【化２０】
0005424414.tif 000021
または【００６０】
【化２１】
0005424414.tif 000022
であり、式中
ｎは、１ないし１２、好ましくは１ないし１０、より好ましくは１ないし８、さらに好ましくは１ないし５、から選択される整数であり；
ｍは、１ないし１２、好ましくは１ないし１０、より好ましくは１ないし８、さらに好ましくは１ないし５、から選択される整数であり；
ｌは、１ないし１２、好ましくは１ないし１０、より好ましくは１ないし８、さらに好ましくは１ないし５、から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され、好ましくは−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−もしくは−Ｃ≡Ｃ−、より好ましくは−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−であり；
Ｙは、−ＣＨ3、−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、置換もしくは非置換アリール、−ＮＨＣＯ−Ｚ、−ＣＯＮＨ−Ｚ、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｚ、−Ｏ−Ｚ、−ＣＯＯ−Ｚ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ、−ＣＯ−Ｚ、および、−Ｓ−Ｚ、からなる群より選択され、ここでＺは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される］
で表される。【００６１】
式ＩＩで表されるＰｎ誘導体において、置換基Ｘには、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素との親和性を高めるため、π電子系を有する置換基が選択される。【００６２】
式ＩＩで表されるＰｎ誘導体において、置換基Ｒの−ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）n−、および−ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）l−部分は、リンカー部分である。【００６３】
式ＩＩで表されるＰｎ誘導体において、置換基Ｙは機能性置換基部分であり得る。本明細書において、機能性置換基とは、化学修飾を受けることが可能な官能基、化学反応に関与できる反応性官能基、検出を可能にする標識物質、分子の捕捉・分離を可能にする官能基、など、何らかの機能を有する置換基をいう。【００６４】
置換基Ｙが、化学修飾を受けることが可能な官能基を含む場合の例としては、置換基Ｙが−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＳＨ、であるとき、および置換基Ｙが置換基Ｚとしてアミノ酸を含む場合等が挙げられる。【００６５】
置換基Ｙが、化学反応に関与できる反応性官能基を含む場合の例としては、置換基Ｙが置換基Ｚとしてキレート剤を含む場合等が挙げられる。キレート剤はその近傍に存在する核酸やタンパク質の鎖の切断に関与することができるので、人工塩基を有する核酸に新たな機能を付与することができる。【００６６】
置換基Ｙが、検出を可能にする標識物質、または分子の捕捉・分離を可能にする官能基を含む場合の例としては、置換基Ｙが置換基Ｚとして蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸またはペプチド等を含む場合が挙げられる。【００６７】
本明細書において、蛍光色素とは、蛍光を発する分子であれば特に限定されないが、好ましくは５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ），５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ２’、４，４’、５’、７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ２’、４，４’、５’、７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’、４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’、４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）、およびそれらの誘導体からなる群より選択される。より好ましくい蛍光色素はＦＡＭまたはＴＡＭＲＡであり、さらに好ましくはＦＡＭである。フルオレセインおよびローダミンは、一般的に開環型およびスピロ型の二通りで表記される。【００６８】
蛍光色素を有する式ＩＩの塩基を有するヌクレオチド又はヌクレオシドは、蛍光色素の種類に応じて核酸の検出を行うことが可能である。例えば、ＦＡＭの吸収極大波長は４９３ｎｍ、蛍光極大波長は５２２ｎｍである。また、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は５５３ｎｍ、蛍光極大波長は５７８ｎｍである。ＤＡＮＳＹＬの吸収極大波長は３３５ｎｍ、蛍光極大波長は５１８ｎｍである。ＨＥＸの吸収極大波長は５３５ｎｍ、蛍光極大波長は５５６ｎｍである。ＴＥＴの吸収極大波長は５２１ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍである。５−ＲＯＸの吸収極大波長は５６７ｎｍ、蛍光極大波長は５９１ｎｍである。６−ＲＯＸの吸収極大波長は５７０ｎｍ、蛍光極大波長は５９０ｎｍである。また、これらの蛍光色素に対する抗体も当該技術分野において知られているので、そのような抗体を利用して蛍光色素が結合したヌクレオチドを含む核酸を捕捉、分離する手段として、蛍光色素を利用してもよい。【００６９】
ビオチンは補酵素Ｒとも呼ばれ、ビタミンＢ群の１種である。ビオチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、置換基としてビオチンを有するヌクレオチドおよびヌクレオシドは、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ビオチンが結合したヌクレオチドを含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、当該核酸を捕捉、分離するのに利用可能である。【００７０】
抗体に結合する化合物は、抗体に結合する物質であれば特に限定されない。抗体に結合する化合物の例としては、ジゴキシゲニン、アスコルビン酸、ベンゾピレン、等が挙げられる。【００７１】
光架橋剤は、光照射により架橋反応を生じる物質であれば特に限定されない。光架橋剤の例としては、ベンゾフェノン、アジド、トリフロロメチルジアジリニル、等が挙げられる。【００７２】
アミノ酸は、天然型の２０種のα−アミノ酸であってもよく、また、非天然型のアミノ酸であってもよい。【００７３】
ペプチドは、２個以上のアミノ酸がアミド結合により結合した物質をいう。ペプチドを構成するアミノ酸の数は特に制限されないが、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜８個であってよい。【００７４】
キレート剤は、金属イオン、放射性物質、などをリガンドとして配位するものであれば特に限定されない。キレート剤の例としては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トランス−１，２−シクロヘキサジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、等が挙げられる。
特に好ましい態様において、本発明の人工塩基Ｐｎ誘導体は、
ＮＨ2−ｈｘ−Ｐｎ：  ４−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール−１−イル基；または
ＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎ：  ４−［３−［６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−ニトロピロール−１−イル基；
である。【００７５】
人工塩基対を含む核酸の複製
一態様において本発明は、人工塩基対を含む核酸を複製する方法であって、Ｄｓおよび／またはＰｎ誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ｄｓ、塩基Ｐｎ誘導体、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Ｄｓと前記式ＩＩで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法、を提供する。【００７６】
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、「核酸塩基」は、天然型の塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにその誘導体、そして人工塩基をも含む概念である。本明細書において「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルと作っている化合物をいう。より好ましくは、一、二、または三リン酸エステルである。【００７７】
本発明の方法において、鋳型鎖はＤｓおよび／またはＰｎ誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である。鋳型鎖核酸は、ＤＮＡであってもよく、またＲＮＡであってもよい。鋳型鎖は、ＤｓまたはＰｎ誘導体を１つだけ有していてもよく、少なくとも２つ有していてもよい。鋳型鎖はまた、ＤｓおよびＰｎ誘導体を同一の鋳型鎖に有していてもよい。鋳型鎖が有していてもよいＤｓおよび／またはＰｎ誘導体の数の上限は、特に限定されないが、例えば、２０個、１５個、１０個、５個であり得る。【００７８】
本発明の方法において用いられる複製基質は、Ｄｓ、Ｐｎ誘導体、および／または天然型の塩基を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド  ５’−三リン酸である。本発明の核酸の複製方法は、Ｄｓ−Ｐｎ誘導体の塩基対形成の保存率が高いので、複製基質として非置換デオキシリボヌクレオシド  ５’−三リン酸を用いることが可能である。また置換デオキシリボヌクレオシド  ５’−三リン酸を用いてもよい。置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の例には、γ位のリン酸の水酸基がアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基およびフルオロ基からなる群より選択される基で置換された誘導体、γ位のリン酸に蛍光色素が結合した誘導体、α位のリン酸がチオリン酸である誘導体、等が挙げられる。好ましくは、置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸には、γ位のリン酸の水酸基がアミノ基で置換された誘導体、すなわちγ−アミド三リン酸誘導体は含まれない。【００７９】
本発明の方法において、核酸の複製反応とは、鋳型鎖核酸に対する相補鎖を酵素的に生成する反応を意味する。核酸の複製反応には、ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素による反応が含まれる。限定されるわけではないが、ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、核酸の複製において好ましくない非特異的な塩基対形成を防ぐために、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、クレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、からなる群から選択される。限定されるわけではないが、逆転写酵素の好適な例としてはＡＭＶ Reverse Transcriptase ＸＬ（ＡＭＶ−ＲＴ）（Life Science社)、Ｍ−ＭＬＶ Reverse Transcriptase（Promega社）、ＨＩＶ Reverse Transcriptase（Applied Biosystems社）、が挙げられる。【００８０】
本発明の方法における複製反応は、公知の方法に従って行うことが可能である。【００８１】
本発明の核酸の複製方法は、Ｄｓ−Ｐｎ誘導体の塩基対形成の保存率が高い。１０-20ｍｏｌレベルで存在する鋳型鎖についても、本発明の核酸の複製方法によりＤｓ−Ｐｎ誘導体の塩基対形成が保存された形で増幅し、検出することが可能である。【００８２】
別の態様において本発明は、本発明の核酸の複製方法を利用して、機能性置換基を結合した人工塩基をＤＮＡ中に導入する方法を提供する。すなわち、本発明は、機能性置換基を結合した人工塩基を、核酸の複製反応によりＤＮＡ中に導入する方法であって、Ｄｓを塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ｄｓ、塩基Ｐｎ誘導体、および／または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い、それにより塩基Ｄｓと塩基Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸が生成することにより、機能性置換基を結合した人工塩基がＤＮＡ中に導入される、前記方法、を提供する。【００８３】
本発明の人工塩基Ｐｎ誘導体は、上記構造中置換基Ｙで示される機能性置換基を有する。Ｄｓを塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対して、本発明の核酸の複製方法によりＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を生成させることにより、機能性置換基を結合した人工塩基をＤＮＡ中に、位置特異的に導入することができる。【００８４】
人工塩基対を含む核酸の選択的な検出・回収
本発明の人工塩基Ｐｎ誘導体は、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基を有していてもよい。これらの機能性置換基をＰｎ誘導体が有する場合、これら機能性置換基の性質に基づいて、本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に検出および／または回収することができる。本発明において、人工塩基対を含む核酸の検出および／または回収が可能な機能性置換基を有する人工塩基の例には、式ＩＩで表されるＰｎ誘導体において、置換基Ｚとして蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、またはペプチド等を有する場合が挙げられる。【００８５】
機能性置換基として蛍光色素を有する場合、蛍光色素の種類に応じて核酸の検出を行うことが可能である。また、蛍光色素に結合する抗体を利用して、本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することもできる。【００８６】
機能性置換基としてビオチンを有する場合、ビオチン−アビジンの特異的な結合を利用して、本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することができる。また、化学発光物質や蛍光色素を結合したアビジンやストレプトアビジンを利用することにより、機能性置換基としてビオチンを有する核酸を検出することもできる。【００８７】
機能性置換基として抗体に結合する化合物を有する場合、抗体との結合を利用して、本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することができる。また、抗体との結合を利用することにより、機能性置換基として抗体に結合する化合物を有する核酸をＥＬＩＳＡ等の手法により検出することも可能である。【００８８】
機能性置換基として光架橋剤を有する場合、光照射により本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸と担体などを架橋して、当該核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することができる。【００８９】
機能性置換基としてアミノ酸を有する場合、そのアミノ酸に結合する抗体との結合を利用して、本発明の方法により得た人工塩基対を含む核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することができる。また、抗体との結合を利用することにより、機能性置換基としてアミノ酸を有する核酸をＥＬＩＳＡ等の手法により検出することも可能である。【００９０】
機能性官能基としてキレート剤を有する場合、適切な配位子を介して人工塩基を含む核酸を捕捉および分離することにより回収することができる。また、適切な配位子を介して、人工塩基を含む核酸を検出することも可能である。【００９１】
機能性置換基としてペプチドを有する場合、当該ペプチドに結合する物質を利用して、本発明の核酸の複製方法により生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に捕捉および分離することにより、回収することができる。当該ペプチドに結合する物質は特に限定されないが、抗体であってもよい。ペプチドに結合する物質が抗体である場合は、ＥＬＩＳＡ等の手法により、人工塩基対を有する核酸を検出することができる。ペプチドとそれに結合する物質の組み合わせの具体的な例としては以下の組み合わせが挙げられる。ペプチドがヒスチジンタグ（（Ｈｉｓ）6（配列番号５７））である場合は、ペプチドに結合する物質はＮｉ−ＮＴＡであり得る。ペプチドがグルタチオン（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン）である場合は、ペプチドに結合する物質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり得る。ペプチドが、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号５８））やＭＹＣタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号５９））の場合は、ペプチドに結合する物質は、当該タグに結合する抗体である。【００９２】
このように、本発明の核酸の複製方法においては上記のような機能性置換基を有するＰｎ誘導体を利用することにより、生成したＤｓ−Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に検出および／または回収することができる。【００９３】
よって、別の態様において本発明は、核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法であって、人工塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸を含有する核酸プールに対して、本発明の核酸の複製方法により核酸の複製反応を行い；そして、生成した核酸の中から、人工塩基Ｄｓと人工塩基Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を、Ｐｎ誘導体が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に回収する；ことを含む、前記方法を提供する。【００９４】
また、別の態様において本発明は、核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に検出する方法であって、人工塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸を含有する核酸プールに対して、本発明の核酸の複製方法により核酸の複製反応を行い；そして、生成した核酸の中から、人工塩基Ｄｓと人工塩基Ｐｎ誘導体の人工塩基対を含む核酸を、Ｐｎ誘導体が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に検出する；ことを含む、前記方法を提供する。【００９５】
本発明の方法において、核酸プールとは、複数種類の核酸の集合をいう。核酸プールに含まれる核酸の配列およびその長さには制限がなく、多様な配列、多様な長さであってよい。核酸プールは、少なくとも１種の人工塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸を含有する。【００９６】
本発明の方法は、多様な配列、多様な長さの核酸の集合である核酸プールの中から、人工塩基対を含む核酸を複製し、そして選択的に検出および／または回収することが可能であるので、人工塩基を導入した核酸による真贋判定技術に応用可能である。例えば、製品が本物であることの証拠として人工塩基を含む核酸を大量の外来ＤＮＡと共に製品のタグに組み込んでおき、組み込まれた人工塩基を含む核酸を検出可能なレベルまで増幅し、増幅した人工塩基を含む核酸を検出および／または回収して配列を確認することにより、真贋判定を行う技術に応用可能である。【００９７】
人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択の核酸複製を可能にする人工塩基近傍の天然型塩基の配列
本発明者らは、複製における鋳型塩基と複製基質環での人工塩基対の形成の効率と選択性は、ＤＮＡ中の人工塩基対近傍の天然型塩基の配列にも依存するとの仮説を立てた。そして、実施例２で後述するように、核酸複製反応において効率よく核酸が増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列についてin vitroセレクション法の手法を用いて調べた。その結果、核酸複製反応において効率よく核酸が増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列を見出した。【００９８】
よって、本発明は、本発明の方法において、鋳型鎖における人工塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1Ｎ2Ｎ3（Ｄｓ）Ｎ4Ｎ5Ｎ6−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ4、Ｎ5、Ｎ6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ3がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ4がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ5がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ6がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、鋳型鎖を用いることをさらなる特徴とする方法をも提供する。好ましくは、上記（ａ）−（ｅ）の条件を少なくとも３つ以上、より好ましくは４つ以上、さらに好ましくは５つすべて、の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。あるいは、上記（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。【００９９】
あるいは、本発明は、本発明の方法において、鋳型鎖における人工塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1'Ｎ2'Ｎ3'（Ｐｎ誘導体）Ｎ4'Ｎ5'Ｎ6'−３’（配列番号４）の配列を含み、ここで、Ｎ1'、Ｎ2'、Ｎ3'、Ｎ4'、Ｎ5'、Ｎ6'は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1'がシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ2'がアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）；
（ｃ）Ｎ3'がアデニン（Ａ）；
（ｄ）Ｎ4'がグアニン（Ｇ）；および
（ｅ）Ｎ6'がアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす、鋳型鎖を用いることをさらなる特徴とする方法をも提供する。好ましくは、上記（ａ）−（ｅ）の条件を少なくとも３つ以上、より好ましくは４つ以上、さらに好ましくは５つすべて、の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。あるいは、上記（ａ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。【０１００】
また、本発明は、人工塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸であって、人工塩基Ｄｓの近傍の配列として、５’−Ｎ1Ｎ2Ｎ3（Ｄｓ）Ｎ4Ｎ5Ｎ6−３’（配列番号１）の配列を含み、ここで、Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ4、Ｎ5、Ｎ6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ3がシトシン（Ｃ）；
（ｃ）Ｎ4がチミン（Ｔ）；
（ｄ）Ｎ5がチミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）；および
（ｅ）Ｎ6がグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす前記核酸、を提供する。好ましくは、上記（ａ）−（ｅ）の条件を少なくとも３つ以上、より好ましくは４つ以上、さらに好ましくは５つすべて、の条件を満たす核酸であってもよい。あるいは、上記（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす核酸であってもよい。【０１０１】
あるいは、本発明は、上記人工塩基Ｄｓを有するヌクレオチドを含む核酸の相補鎖である、人工塩基Ｐｎ誘導体を有するヌクレオチドを含む核酸であって、人工塩基Ｐｎ誘導体の近傍の配列として、５’−Ｎ1'Ｎ2'Ｎ3'（Ｐｎ誘導体）Ｎ4'Ｎ5'Ｎ6'−３’（配列番号４）の配列を含み、ここで、Ｎ1'、Ｎ2'、Ｎ3'、Ｎ4'、Ｎ5'、Ｎ6'は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件：
（ａ）Ｎ1'がシトシン（Ｃ）；
（ｂ）Ｎ2'がアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）；
（ｃ）Ｎ3'がアデニン（Ａ）；
（ｄ）Ｎ4'がグアニン（Ｇ）；および
（ｅ）Ｎ6'がアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）；
からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす前記核酸を提供する。好ましくは、上記（ａ）−（ｅ）の条件を少なくとも３つ以上、より好ましくは４つ以上、さらに好ましくは５つすべて、の条件を満たす核酸であってもよい。あるいは、上記（ａ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選択される少なくとも２つ以上の条件を満たす核酸であってもよい。【０１０２】
人工塩基を含む核酸の配列決定
人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列決定は、Ｄｓ−Ｐａ塩基対を用いておこなうことができる。【０１０３】
平尾ら（Nature Methods, 3: 729-735 (2006)）は、Ｄｓの相補塩基であるＰａのプロピニル誘導体の基質（ｄＰａ’ＴＰ：  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド  ５’−三リン酸）の有無によるシーケンシングパターンの違いを利用した方法を報告している。この方法は、例えば、ｄＰａ’ＴＰを加えずにＤｓを含むＤＮＡのジデオキシダイミネーター法によるシーケンシングを行うと、鋳型ＤＮＡ中にＤｓに相補する塩基の部分でシーケンス反応が止まったピークパターンを与える。一方、ｄＰａ’ＴＰを加えてシーケンシングを行うと、反応は進行するが、蛍光標識化したＰａ’のジデオキシダイターミネーターは加えていないため、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓに相補する塩基の位置のみ、シーケンシングのピークが消えたピークパターンを与える。これら２つのシーケンシングパターンを比較することにより、人工塩基を含むＤＮＡ配列を決定する。しかし、この従来法では、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓ近傍の天然型塩基の配列によっては、ｄＰａ’ＴＰを加えない場合でもＤｓ部分に天然型塩基の基質が誤って取り込まれる場合がある。この場合はシーケンス反応が進行してしまい、きれいなシーケンシングのピークパターンが得られない場合がある、という課題があった。【０１０４】
そこで、本発明においては、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓの部分でシーケンシング反応を完全に止めるために、プロピニル基修飾のＰａのジデオキシ誘導体基質（ｄｄＰａ’ＴＰ：  １−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド  ５’−三リン酸）を利用する、人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列決定方法を提供する。Ｄｓを含むＤＮＡ断片のシーケンシングを、ｄｄＰａ’ＴＰを加えてジデオキシダイターミネーター法で行うと、Ｄｓ部分にｄｄＰａ’ＴＰが確実に取り込まれ、天然型塩基の基質が誤って取り込まれることを防ぐことができる。このことにより、Ｄｓ以降のシーケンシングのピークが消失するピークパターンが得られる（図４ａ）。また、ｄＰａ’ＴＰを加えてジデオキシダイターミネーター法で行うと、Ｄｓに相当する位置のみシーケンシングのピークが消失する（図４ｂ）。この２種類のシーケンシングを比較することにより、Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列情報を、Ｄｓ近傍のＤＮＡ塩基配列に依存せずに得ることができる。【０１０５】
人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法
一態様において、本発明は、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法を提供する。すなわち、本発明は、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
（１）５’−（Ｎ）n（Ｎu1）（Ｎ）m−３’（配列番号２）、で示されるランダム領域を含むＤＮＡライブラリーを調製し、ここでｎおよびｍはそれぞれ独立して１ないし１０から選択される整数であり、Ｎu1は第一の人工塩基である；
（２）Ｎu1と人工塩基対を形成する第二の人工塩基Ｎu2を有するヌクレオシドを含む、複製基質を用いて前記ＤＮＡライブラリーに対して核酸の複製反応を行い、ここで、Ｎu2は機能性官能基を含んでいる；
（３）Ｎu1とＮu2の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し；
（４）（３）で回収した核酸に対して、（２）および（３）の工程を繰り返し；そして、
（５）得られた核酸の配列を決定する；
ことを含む、前記方法、を提供する。【０１０６】
本発明の方法において、Ｎu1とＮu2の人工塩基対の組み合わせは、人工塩基対の組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは、
ｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ（特許文献３、および非特許文献９）；
Ｐ−Ｚ（Ｐ：２−アミノ−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オン、Ｚ：６−アミノ−５−ニトロ−２（１Ｈ）−ピリドン）（非特許文献２２）；
ｓ−ｙ（ｓ：２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン、ｙ：２−オキソピリジン）（非特許文献１６−１７）；
ｖ−ｙ（ｖ：２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン、ｙ：２−オキソピリジン）（非特許文献１８）；
Ｄｓ−Ｐａ；
Ｄｓ−Ｐｎ；および
Ｄｓ−Ｐｎ誘導体；
の組み合わせが挙げられる。なお、上記組み合わせのうちの前者がＮu1である場合は後者がＮu2となり、一方で後者がＮu1である場合は前者がＮu2となることは当業者に容易に理解されるであろう。【０１０７】
好ましい態様において、本発明の方法における、Ｎu1はＤｓであり、Ｎu2は本明細書中式ＩＩで表されるＰｎ誘導体である。【０１０８】
本発明の方法において、得られた核酸の配列を決定する工程は、人工塩基を含む核酸の配列を決定することが可能な方法のいずれかを使用して行うことができる。Ｎu1とＮu2の人工塩基対の組み合わせが、Ｄｓ−Ｐａ、Ｄｓ−Ｐｎ、またはＤｓ−Ｐｎ誘導体、の組み合わせである場合、上述のｄｄＰａ’ＴＰを用いる方法を好ましく使用して得られた核酸の配列を決定してもよい。【０１０９】
本発明はまた、本発明の、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法により得られる核酸をも提供する。
【実施例】
【０１１０】
以下、実施例によって本発明を具体的に設営するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１１】
本実施例において、下記の記号で表される官能基／化合物は以下の通りである。【０１１２】
Ｄｓ：  ７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基
Ｐｎ：  ２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基
Ｐａ：  ２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
ＮＨ２−ｈｘ−Ｐｎ：  ４−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール−１−イル基
ＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎ：  ４−［３−［６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−ニトロピロール−１−イル基
ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ：  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール  ５’−三リン酸
ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ：  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−［６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−ニトロピロール  ５’−三リン酸
ｄＰａ’ＴＰ：  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド  ５’−三リン酸
ｄｄＰａ’ＴＰ：  １−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド  ５’−三リン酸
また、Ｄｓ、Ｐｎ、ＮＨ２−ｈｘ−Ｐｎ、ＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎについての構造を図１に示す。
【０１１３】
実施例１：クレノウ断片による一ヌクレオチド挿入反応の反応速度定数の解析
複製における人工塩基Ｐｎの１−プロピニル誘導体とＤｓによる塩基対形成の効率と選択性を調べるために、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片によるヌクレオチド挿入実験を行い、反応速度定数を解析した。【０１１４】
一ヌクレオチド挿入実験を、文献に従って行った（Kimoto, M., et al., Biotechnol. Lett., 2004, 26: 999-1005; Petruska, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 6252-6256; Goodman, M. F., et al., J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1993, 28: 83-126; Morales, J. C., et al., Nat. Struct. Biol., 1998, 5: 950-954）。具体的には、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識されたプライマー（２０−ｍｅｒ、5’-ACTCACTATAGGGAGGAAGA-3’（配列番号５）または、5’-ACTCACTATAGGGAGCTTCT-3’（配列番号６））と鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ、5’-AGCTCTNTCTTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3’（配列番号７）（Ｎ＝Ｄｓ、Ａ、Ｇ、Ｃ、あるいは、Ｔ）または、5’-TCGAGANAGAAGCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3’（配列番号８）（Ｎ＝Ｐａ、あるいはＰｎ））を、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＤＴＴ、および１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中で、９５℃で加温した後に、４℃へ緩やかに冷却することによりアニーリングを行い、鋳型鎖とプライマー鎖の二本鎖を形成させた。このプライマー・鋳型二本鎖ＤＮＡ溶液（１０μＭまたは２μＭ）を５μｌずつ分注した後，これにエキソヌクレアーゼ活性を持たないクレノウ断片（ＫＦ ｅｘｏ-、Amersham USB）の酵素溶液（２μｌ）を加えて、３７℃で２分間インキュベートし、ＤＮＡ・酵素複合体を形成させた。この溶液に３μｌの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸もしくはγアミド三リン酸溶液（塩基は、ＮＨ2−ｈｘ−Ｐｎ、Ｐｎ、Ｐａ、Ｄｓ、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのうち１種）（１μＭ−５ｍＭ）を加えて、３７℃で酵素反応（１−２８.２分間）を行った。１０μｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む９５％ホルムアミド溶液（停止溶液）を加えて７５℃で３分加温することで反応を停止させた。【０１１５】
反応溶液（１０μｌ）には、１μＭもしくは５μＭのプライマー・鋳型二本鎖、２−５０ｎＭの酵素、及び０.３−１５００μＭの基質、を使用した。反応溶液（１０μｌ）にはまた、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ及び０.０５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡが含まれる。【０１１６】
反応溶液に停止溶液を加えた後、その溶液（０.５μｌ）をローディング溶液（脱イオンホルムアミド：２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むブルーデキストラン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）＝５：１、３μｌ）と混合し、９０℃で２分加熱し、氷上に置いて急冷した。そのうちの０.５μｌをシークエンスゲルにロードし電気泳動を行った。シークエンスゲル（３６ｃｍ ＷＴＲ）の組成は、６Ｍ尿素、８−１０％ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）、０．５×ＴＢＥである。泳動用緩衝液は，０．５×ＴＢＥを用いた。Ｒｕｎ Ｍｏｄｕｌｅは、ＧＳ Ｒｕｎ ３６Ｃ−２４００である。泳動時間は約１時間とし、反応産物のピークパターンの解析及び定量は、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウエア（バージョン３.０）を装備した自動ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで解析した。【０１１７】
未反応のプライマー断片、および一ヌクレオチド挿入されたＤＮＡ断片のピークの面積から、一ヌクレオチド伸長されたプライマーの割合を定量し、Hanes-Woolfプロット（Goodman, M. F., et al., J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1993, 28: 83-126）により酵素学的パラメーター（ＶｍａｘとＫｍ）を算出した。なお、Ｖｍａｘの値は、酵素濃度を２０ｎＭ、二本鎖ＤＮＡの濃度を５μＭに標準化して求めた。【０１１８】
結果を図２に示す。鋳型鎖中のＤｓに対するＰａ基質の取り込み効率はＶｍａｘ／Ｋｍ＝６．２×１０4、また鋳型鎖中のＤｓに対するＰｎ基質の取り込み効率は３．７×１０5であった。これに対して、プロピニル基を有するＰｎ誘導体の基質（ＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）を用いると、鋳型鎖中のＤｓに対する取り込み効率が７．４×１０5となり、鋳型鎖中のＤｓに対するＰｎ基質の取り込み効率よりも約２倍高くなった。さらに鋳型鎖中のＤｓに対するＤｓ基質の取り込み効率は２．０×１０5であり、プロピニル基を有するＰｎ誘導体基質のＤｓに対する取り込み効率のほうが高くなった。さらにプロピニル基を有するＰｎ誘導体基質の天然型塩基に対する取り込み効率は、Ｄｓに対する取り込み効率よりも低いこともわかった。したがって、ＤｓとＰｎ誘導体による人工塩基対は、複製において、Ｄｓ−ＤｓやＡ−Ｐｎの好ましくない塩基対よりも効率よく形成されるようになった。【０１１９】
上記の実験の結果、π電子系の置換基であるプロピニル基を有するＰｎ誘導体の基質が、人工塩基Ｐｎの基質よりも効率よく、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓに対して選択的に取り込まれることが明らかとなった。これまでのＤｓ−Ｐｎ塩基対では、基質Ｄｓが鋳型Ｄｓに対して取り込まれるのを防ぐためにＤｓのγ−アミド三リン酸誘導体を用いていたが、Ｐｎ誘導体の基質が鋳型Ｄｓに取り込まれる効率は、基質Ｄｓが鋳型Ｄｓに取り込まれる効率よりも高くなった。その結果、Ｄｓ−Ｐｎ誘導体の塩基対の複製では、γ−アミド三リン酸誘導体を用いる必要が無くなり、簡便な人工塩基対を含むＤＮＡの複製系が開発できるようになった。【０１２０】
実施例２：人工塩基を含むＤＮＡの高効率かつ高選択のＰＣＲ増幅を実現するためのＤＮＡ中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列決定
複製における鋳型塩基と基質間での人工塩基対の形成の効率と選択性は、ＤＮＡ中の人工塩基対近傍の天然型の塩基の配列にも依存するのではないかとの仮説を立て、ＰＣＲで効率よく増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列を試験管内進化工学（in vitroセレクション法）の手法を用いて調べた。【０１２１】
（２−１：In vitroセレクション）
具体的には、ランダム配列のＤＮＡライブラリーを用いる進化工学の手法を用いて、以下の手順で高効率かつ高選択でＰＣＲ増幅可能な人工塩基近傍の天然型塩基配列を決定するin vitroセレクションを行った。まず、Ｄｓを含むＤＮＡ断片を、人工塩基Ｄｓの両側の天然型塩基のそれぞれ３塩基をランダムにした一本鎖ＤＮＡ（５５−ｍｅｒ； 5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGG-NNN-Ds-NNN-CCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’（配列番号９））をＤＮＡ合成機により化学合成し、これをゲル電気泳動で精製して作成した。このＤＮＡ断片（２ｐｍｏｌ）を鋳型にして、天然型塩基の基質（ｄＮＴＰｓ、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）と人工塩基の基質（ｄＤｓＴＰ、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）、そしてＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０.０４ユニット／μｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２００ μｌであり、反応緩衝液の組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  TritonX-100である。５’側プライマー（5’-GATAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号１０））および３’側プライマー（5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１））は各々１μＭの濃度で、また各天然型塩基の基質ｄＮＴＰ（０.３ｍＭ）、人工塩基の基質としてＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２.５ μＭ）とｄＤｓＴＰ（５０ μＭ）を使用した。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、６５℃で４分を１サイクルとした。１０サイクルのＰＣＲ増幅後、全長のＰＣＲ産物を１０％ＰＡＧＥ−７Ｍ尿素ゲルによる電気泳動により精製し、２６０ｎｍの吸光度から回収されたＤＮＡの濃度を算出した。【０１２２】
増幅されたＤＮＡ断片（一本鎖ＤＮＡで約２０ｐｍｏｌ相当）と２０μｌの抗ＦＡＭ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、インビトロジェンから購入）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、最終容量１００μｌ）中にて氷上で混合して１時間放置した。この溶液をミリポアのマイクロコンＹＭ−１００を用いた限外濾過により、抗ＦＡＭ抗体に結合したＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎが取り込まれて増幅されたＤＮＡ断片を単離した。この溶液をフェノール・クロロホルムで処理し、水層のエタノール沈澱によってＤＮＡを回収した。こうして得られたＤＮＡの全量から、その約１ｐｍｏｌを、次のセレクションのラウンドのＰＣＲ（２００μｌスケール、反応条件は上述のものと同じ）の鋳型に用いた。【０１２３】
ＰＣＲ増幅とそれに続くＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎが取り込まれた断片の単離の操作を１ラウンドとし、合計５ラウンドのセレクションを行った。５ラウンド後に得られたＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を以下の方法１と方法２でその塩基配列を解析した。【０１２４】
（方法１）５ラウンドのセレクション後のＤＮＡライブラリー、そしてＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０.０２ユニット／μｌ）、５’側プライマー（5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号１２））および３’側プライマー（5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１））を用いて、５０μＭのＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ及びｄＤｓＴＰの存在下でＰＣＲを８サイクル行い、全長のＰＣＲ産物を電気泳動で精製し、これをＤＮＡシーケンシングの鋳型にして、シーケンシング反応とその解析をおこなった。【０１２５】
ＤＮＡのシーケンシング反応は、全量２０μｌスケールにて、市販のBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）のCycle Sequencing Mix  ８μｌにプライマー（４ｐｍｏｌ、5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3’（配列番号１３））とＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片（およそ０.３ｐｍｏｌ程度）、ｄＰａ’ＴＰ（４０ｐｍｏｌ）を加え、２５サイクルのＰＣＲ（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分）を行った。未反応のダイダーミネーターをCentri-SepTMスピンカラム（Applied Biosystems）で反応溶液からとり除き、残りの溶液を減圧下で乾燥した。残存物にBlue-Dextranを希釈したホルムアミド溶液を４μｌ加えて、その一部をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより解析した。解析に用いたゲル組成は、７％ポリアクリルアミド−６Ｍ尿素ゲルである。配列のピークパターンは、Applied Biosystems PRISMシークエンシング解析ｖ３.２ソフトウエアを用いて解析された。【０１２６】
（方法２）５ラウンドのＰＣＲとセレクションの操作後、得られたＤＮＡの一部をPremix Ex Taq（タカラ）を用いて、人工塩基の基質を加えずに８サイクルのＰＣＲ（９４℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃１分）を行い、そのＰＣＲ産物を用いて、TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter（インビトロジェン）でクローニングした。個々のクローンを、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）により通常のシークエンス反応を行い、ＤＮＡシークエンサー（モデル３１００、Applied Biosystems）で前後それぞれ３塩基のランダム領域部分を解析し、６６クローンの配列を得た。【０１２７】
結果
方法１のシーケンシングパターンから、５’−ＣＮＡ（Ｐａ）ＧＮＧ−３’（配列番号１４）、すなわち５’−ＣＮＣ（Ｄｓ）ＴＮＧ−３’配列（配列番号１５）（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのどれかを示す）に収束していることがわかった（図３：方法１として示されるシーケンシングピークのパターン）。  また、方法２でクローニングして得られた配列中の各部位でのそれぞれの塩基の出現頻度を調べると、図３中の方法２の表に示したように、方法１と同様に、５’−ＣＮＣ（Ｄｓ）ＴＮＧ−３’配列（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのどれかを示す）（配列番号１５）が得られた。このように、人工塩基対に隣接する塩基のみならず、人工塩基から５’側と３’側の両側の３番目の塩基もＰＣＲの効率と選択性に依存していることがわかった。【０１２８】
（２−２：In vitroセレクションの結果とＤＮＡ配列の解析）
実施例２のセレクションにおいて、方法２の塩基配列解析法によりクローニングして得られた配列のＤＮＡ断片（Ｓ１−Ｓ８、（それぞれ、配列番号１６−２３））、および得られた配列を人為的に変えたＤＮＡ断片（Ｎ９−Ｎ１２（それぞれ、配列番号２４−２７））をＤＮＡ合成機で作成し、それぞれのＤＮＡ断片のＰＣＲにおける増幅効率と人工塩基の選択性を調べた。【０１２９】
ｄＤｓＴＰとＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰの共存下、５’末端が32Ｐで標識されたプライマーを用いてＰＣＲを１５サイクル行い、その産物をゲル電気泳動で解析した。具体的には、ＰＣＲの反応スケールは２５μｌまたは５０μｌで、反応液の組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  TritonX-100である。５’側プライマー（5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号１２））および３’側プライマー（5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１））は各々１μＭ使用し、各天然型塩基基質ｄＮＴＰ（０.３ｍＭ）、人工塩基の基質としてｄＤｓＴＰ（５０μＭ）ならびに ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２.５μＭ）、そしてＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０.０２ユニット/μｌ）を用いた。ＰＣＲのサイクルは９４℃３０秒、４５℃３０秒、６５℃４分を１サイクルとした。鋳型に用いたＤＮＡ断片の濃度は０.６ｎＭである。１５サイクル後のＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動し、増幅されたＤＮＡのバンドをバイオイメージャーＦＬＡ−７０００（富士フィルム）により、検出・定量した。プライマーを32Ｐで標識した場合にはその放射活性をイメージングプレートに露光して解析した。またＰＣＲ増幅によりＤＮＡ中に取り込まれたＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎ由来の蛍光は、ゲルを直接ステージ上に載せ、蛍光解析（レーザー：４７３ｎｍ、フィルター青色励起用Ｙ５２０）モードで検出した。その結果を表１に示す。【０１３０】
【表１】
0005424414.tif 000023
この実験では、増幅されたＤＮＡのバンドに由来する蛍光強度を測定してＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰが取り込まれている効率を調べるともに、増幅されたＤＮＡのバンドに由来する32Ｐの強度を測定してＤＮＡの増幅効率を調べた。それぞれの値は、セレクションに用いた最初のライブラリー（Pool）を基準にした相対強度として求めた。前者のＦＡＭの蛍光強度の測定（Relative fluorescence intensity incorporated into DNA）は、増幅されたＤＮＡ中の人工塩基対の存在量に依存し、後者のラジオアイソトープの測定(Relative efficiency of DNA fragments amplified by PCR)では、増幅された全ＤＮＡ量の相対値を示す。したがって、前者の値を後者の値で割った値（Fluorescence intensity/Relative amplification efficiency）がそれぞれの配列中における人工塩基対のＰＣＲにおける相対的な忠実度（選択性）を示す。【０１３１】
セレクションによって得られたＤＮＡ（Ｓ１−Ｓ８（それぞれ、配列番号１６−２３）
）は、高い頻度で、５’−ＹＮＣ（Ｄｓ）ＴＹＧ−３’配列（Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）（配列番号２９）を含み、ランダム配列のＤＮＡと比較してこれらのＤＮＡのＰＣＲ増幅効率は１.６倍から２.０倍向上した。また、ＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎの取り込み効率も、ランダム配列のＤＮＡと比較して１.９倍から２.９倍向上した。さらに、人工塩基対の忠実度（選択性）も、これらの値と相関関係にあり、人工塩基対のＰＣＲにおける選択性とその効率が人工塩基対の近傍の天然型塩基の配列に依存していることがわかった。【０１３２】
この５’−ＹＮＣ（Ｄｓ）ＴＹＧ−３’配列（配列番号２９）を基準にして、各部位の塩基を別の天然型塩基に置換することにより、さらに効率の良い配列に最適化できることがわかった。この最適化によって得られた５’−ＴＡＣ（Ｄｓ）ＧＴＧ−３’配列（Ｎ１２；配列番号２７）は、セレクションで得られた５’−ＣＡＣ（Ｄｓ）ＴＴＧ−３’（Ｓ１；配列番号１６）や５’−ＣＣＣ（Ｄｓ）ＴＴＧ−３’（Ｓ２；配列番号１７）配列とともに、ＰＣＲの増幅効率と選択性のどちらにおいても高い値を示した。【０１３３】
以上より、人工塩基対近傍の天然型塩基の配列をランダムにしたＤＮＡライブラリーを用いたin vitroセレクション法により、ＰＣＲで高選択・高効率で増幅可能な人工塩基対を含む配列を見出すことができ、さらにこうして得られた配列を部分的に他の塩基に置き換えることで配列を最適化できることがわかった。【０１３４】
実施例３：人工塩基を含むＤＮＡの塩基配列決定法
人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列決定法は本発明者らがすでに報告している（I. Hirao, et al., Nature Methods, 3: 729-735 (2006).）。このＤｓ−Ｐａ塩基対を用いた従来法では、Ｄｓの相補塩基であるＰａのプロピニル誘導体の基質（ｄＰａ’ＴＰ）の有無によるシーケンシングパターンの違いを利用していた。たとえば、ｄＰａ’ＴＰを加えずにＤｓを含むＤＮＡ断片のジデオキシダイミネーター法によるシーケンシングを行うと、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓに相補する塩基の部分でシーケンス反応が止まったピークパターンを与える。一方、ｄＰａ’ＴＰを加えてシーケンシングをおこなうと、反応は進行するが、蛍光標識化したＰａ’のジデオキシダイターミネーターは加えていないため、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓに相補する塩基の位置のみ、シーケンシングのピークが消えたピークパターンを与える（図３ｂ）。従来法は、これらの２つのシーケンシングパターンを比較することにより、人工塩基を含むＤＮＡの配列を決定する方法である。【０１３５】
しかし、この従来法では、鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓ近傍の天然型塩基の配列によっては、ｄＰａ’ＴＰを加えない場合でもＤｓ部分に天然型塩基の基質がとりこまれてしまうことがあるためシーケンス反応が進行してしまい、きれいなシーケンシングのピークパターンが得られない場合がある。そこで、本願発明においては鋳型鎖ＤＮＡ中のＤｓの部分でシーケンシング反応を完全に止めるために、プロピニル基修飾のＰａのジデオキシ誘導体基質（ｄｄＰａ’）を化学合成し、これを加えてシーケンシングを行った。そしてこれによりＤｓ近傍のＤＮＡ塩基配列に依存しないシーケンシングパターン（Ｄｓに相補する塩基以降のピークが消失するパターン）を得ることができた（図３ａ）。
【０１３６】
なお、プロピニル基修飾のＰａのジデオキシ誘導体基質（ｄｄＰａ’ＴＰ）は以下のスキームに従って合成した。【０１３７】
【化２２】
0005424414.tif 000024
工程（ａ）：１−（２−デオキシ−５−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒドの合成  
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド（２４９ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）（I. Hirao, et al., Nature Methods, 3: 729-735 (2006)）を無水ピリジン (１０ｍｌ) に溶解させ、塩化トリチル (１．１８ｇ，４．２１ｍｍｏｌ) およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン (１．１１ｍｌ，６．４０ｍｍｏｌ) を加え、室温で２９時間、その後５０℃で１.５時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：酢酸エチル＝１００：０→１００：３、その後ジクロロメタン：メタノール＝１００：２）で精製し、目的物（３９５ｍｇ，８０％）を得た。【０１３８】
1H NMR (DMSO-d6)  δ 9.51 (d, 1H, J = 0.59 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.50-7.23 (m, 15H), 7.12 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.67 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 5.32 (d, 1H, J = 4.6 Hz), 4.32-4.22 (m, 1H), 4.00-3.90 (m, 1H), 3.25-3.10 (m, 2H), 2.40-2.28 (m, 1H), 2.28-2.15 (m, 1H), 1.95 (s, 3H).
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス)   C32H29N1Na1O4 [M + Na]+ について: 計算値, 514.1994；実測値, 514.1992.
工程（ｂ）および（ｃ）：１−（２，３−ジデオキシ−５−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒドの合成
１−（２−デオキシ−５−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド（３９２ｍｇ，７９７μｍｏｌ）のアセトニトリル溶液に、アルゴン雰囲気下、４−ジメチルアミノピリジン（９７５ｍｇ，７．９８ｍｍｏｌ）およびクロロチオギ酸フェニル（４７０μｌ，３．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。２３時間後、反応溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン中、５０−６７％  ＣＨ2Ｃｌ2）、中間体を得た（１９３ｍｇ，若干の不純物を含む）。この中間体のトルエン溶液（１０ｍｌ）に水素化トリ−ｎ−ブチルスズ（１６５μｌ，６１２μｍｏｌ）およびα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（１５ｍｇ，９２μｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下５時間還流させた。反応溶液を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン中、５０−８０％  ＣＨ2Ｃｌ2）で精製し、目的物（８４ｍｇ，５８％）を得た。【０１３９】
NMR (DMSO-d6) δ 9.52 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.50-7.23 (m, 15H), 7.12 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 6.53 (dd, 1H, J = 1.6, 6.6 Hz), 4.26-4.20 (m, 1H), 3.25-3.19 (m, 2H), 2.45-2.32 (m, 1H), 2.10-1.80 (m, 3H), 1.94 (s, 3H).
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス) C32H29N1Na1O3 [M + Na]+ について：計算値, 498.2045; 実測値, 498.2072.
工程（ｄ）：１−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒドの合成
１−（２，３−ジデオキシ−５−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド（８２ｍｇ，１７１μｍｏｌ）を８０％酢酸（１０ｍｌ）に溶解させ、室温で３時間、その後５０℃でさらに２時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、水で共沸を行った。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2中、０−１％  ＣＨ3ＯＨ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（水中、３５−８０％  ＣＨ3ＣＮ，１２分）で精製し、目的物（３１ｍｇ，７８％）を得た。【０１４０】
1H NMR (DMSO-d6) δ 9.45 (d, 1H, J = 0.91 Hz), 7.95 (s, 1H), 7.10 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 6.47 (dd, 1H, J = 2.2, 6.8 Hz), 5.04 (t, 1H, J = 5.3 Hz), 4.20-4.10 (m, 1H), 3.69 (ddd, 1H, J = 3.4, 5.7, 12.0 Hz), 3.54 (ddd, 1H, J = 4.0, 4.9, 12.0 Hz), 2.46-2.32 (m, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.96-1.78 (m, 3H). 
13C NMR (DMSO-d6) δ 179.94, 130.80, 130.56, 127.11, 105.87, 87.74, 85.38, 82.80, 73.91, 62.32, 34.73, 24.58, 4.30. 
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス) C13H16NO3(M + 1)について: 計算値, 234.1130; 実測値, 234.1137.
工程（ｅ）：１−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド  ５’−三リン酸（ｄｄＰａ’ＴＰ）の合成
１−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（１−プロピニル）ピロール−２−カルボアルデヒド（２０．８ｍｇ，８９μｍｏｌ）に無水ピリジン（９０μｌ）および無水ジオキサン（２７０μｌ）を加えて溶解し、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンの１Ｍ  ジオキサン溶液（１００μｌ，１００μｍｏｌ）  を加えて室温で１０分間攪拌した後に、トリ−ｎ−ブチルアミン（９０μｌ）およびビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（２７０μｌ）を加えて１０分間攪拌した。１％ヨウ素／水／ピリジン溶液（１．８ｍｌ）を加え、室温で１５分間攪拌し、５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（１３５μｌ）を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水（５ｍｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。これをDEAE Sephadex A-25カラムクロマトグラフィー（１．５×３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ−１Ｍ溶液）およびＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％−１５％アセトニトリルの０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）で精製し、目的物を得た。
【０１４１】
1H NMR (D2O) δ 9.21 (d, 1H, J = 0.76 Hz), 7.62 (s, 1H), 7.04 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 6.49 (dd, 1H, J = 2.8, 6.8 Hz), 4.30-4.24 (m, 1H), 4.09 (ddd, 1H, J = 3.2, 6.3, 11.4 Hz), 4.00-3.90 (m, 1H), 3.04 (q, 18H, J = 7.3 Hz), 2.45-2.30 (m, 1H), 2.10-1.92 (m, 2H), 1.97 (s, 3H), 1.95-1.75 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.12 (t, 27H, J = 7.3 Hz). 
31P NMR (D2O) δ -23.28, -10.98, -10.98.
MS (ESI) C13H17N1O12P3 [M-H]- について：計算値, 472.00; 実測値, 471.94.
実施例４：機能性置換基を結合した人工塩基をＰＣＲ増幅でＤＮＡ中に導入する方法とその検出・単離方法
(４−１：人工塩基を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅）
Ｄｓを含む断片（５５−ｍｅｒ）にプライマーと人工塩基の基質（ｄＤｓＴＰとＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰあるいはＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）を加えて、１５から４０サイクルのＰＣＲを行った。【０１４２】
ＰＣＲの反応スケールは２５μｌまたは５０μｌで、反応液の組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  TritonX-100である。５’側プライマー（5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG -3’（配列番号１２））および３’側プライマー（5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１））（各々１μＭ）、各天然型塩基の基質ｄＮＴＰ（０．３ｍＭ）、ｄＤｓＴＰ（５０μＭ）、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２．５μＭ）あるいはＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（５０μＭ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２ユニット／μｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの１サイクルは、９４℃３０秒、４５℃もしくは４２℃３０秒、６５℃４分で行った。鋳型に用いたＤＮＡ断片の濃度は、０．６ｆＭ−０．６ｎＭとした。ＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルによる電気泳動で分離し、その産物のバンドをバイオイメージャーＦＬＡ−７０００（富士フィルム）で検出・定量した。プライマーを32Ｐで標識した場合にはその放射活性をイメージングプレートに露光して解析し、またＰＣＲ増幅によりＤＮＡ中に取り込まれたＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎ由来の蛍光は、ゲルを直接ステージ上に載せ、蛍光解析（レーザー：４７３ｎｍ、フィルター青色励起用Ｙ５２０）モードで検出した。【０１４３】
ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いたＰＣＲでは、鋳型濃度が０．６ｎＭ（２５μｌスケールで、１５ｆｍｏｌ）の場合には１５サイクル（アニーリング温度は４５℃）で増幅産物が確認でき、鋳型濃度６ｆＭ（２５μｌスケールで、０．１５ａｍｏｌ）の場合には３０サイクル（アニーリング温度は４２℃）で増幅産物を確認することができた。すなわち、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いた手法では、１５ｆｍｏｌ量のＤｓを含むＤＮＡ断片が１５サイクルのＰＣＲにより約３００倍に増幅され、０．１５ａｍｏｌ量のＤＮＡ断片の３０サイクルのＰＣＲでは約１０7倍に増幅された（図５−１）。【０１４４】
また、塩基配列の解析では、鋳型濃度が０．６ｆＭ（２５μｌスケールで、０．０１５ａｍｏｌ）であり、ＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いた４０サイクル（アニーリング温度は４５℃）のＰＣＲで増幅された産物をゲル電気泳動で精製した後に、その配列をＤＮＡシーケンサーで確認した。シーケンシングの方法は実施例２−１の（方法１）および実施例３を参照。その結果、４０サイクルのＰＣＲ増幅を行っても、ＤＮＡ中にほぼ完全に人工塩基Ｄｓが保存されていることがわかった。また、ＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いたＰＣＲでは、０．０１５ａｍｏｌ量のＤｓを含むＤＮＡ断片が４０サイクルのＰＣＲで約１０8倍に増幅され、その塩基配列も確認することができた（図５−２）。【０１４５】
(４−２：複数の人工塩基を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅）
複数の人工塩基を含むＤＮＡ断片がＰＣＲで増幅可能かどうかを調べるために、Ｄｓを２つ含む断片（６０−ｍｅｒ、６２−ｍｅｒ、６５−ｍｅｒ、６８−ｍｅｒ）を鋳型にして、プライマーと人工塩基の基質（ｄＤｓＴＰとＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰあるいはＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ）を加えて、１５サイクルのＰＣＲを行った。【０１４６】
用いたＤｓを２つ含むＤＮＡ断片を以下に示す。【０１４７】
Ｄｓを２つ含むＤＮＡ断片 (60-mer)の配列（配列番号３３）：
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Ｄｓを２つ含むＤＮＡ断片 (62-mer)の配列（配列番号３４）：
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Ｄｓを２つ含むＤＮＡ断片 (65-mer)の配列（配列番号３５）：
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAATAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Ｄｓを２つ含むＤＮＡ断片 (68-mer)の配列（配列番号３６）：
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAACGATAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  TritonX-100である。５’側プライマー（5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号１２））および３’側プライマー（5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１））（各々１μＭ）、各天然型塩基の基質ｄＮＴＰ（０．３ｍＭ）、ｄＤｓＴＰ（５０μＭ）、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２．５μＭ）あるいはＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（５０μＭ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２ユニット／μｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの１サイクルは、９４℃３０秒、４５℃３０秒、６５℃４分で行った。鋳型に用いたＤＮＡ断片の濃度は０．６ｎＭとした。ＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルによる電気泳動で分離し、その産物のバンドをバイオイメージャーＦＬＡ−７０００（富士フィルム）で検出・定量した。ＰＣＲ増幅によりＤＮＡ中に取り込まれたＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎ由来の蛍光は、ゲルを直接ステージ上に載せ、蛍光解析（レーザー：４７３ｎｍ、フィルター青色励起用Ｙ５２０）モードで検出した。また、塩基配列の解析では、ＰＣＲによる増幅産物をゲル電気泳動で精製した後に、最終濃度５０μＭ  ｄＰａ’ＴＰを用いてシーケンシング反応を行い、その配列をＤＮＡシーケンサーにより確認した。シーケンシングの方法は実施例２−１の（方法１）および実施例３を参照。【０１４８】
ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いたＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅後産物の電気泳動を行うことにより、増幅されたＤＮＡ中に取り込まれたＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎの蛍光から、人工塩基を含むＤＮＡとして検出することができた。２つのＤｓの間に挟まれる天然型塩基の数をそれぞれ、４塩基（配列番号３３の配列を用いた場合）、６塩基（配列番号３４の配列を用いた場合）、９塩基（配列番号３５の配列を用いた場合）、１２塩基（配列番号３６の配列を用いた場合）とした場合での増幅効率を比較すると、２つの人工塩基が６塩基以上離れていれば効率よく増幅効率することがわかった（図６：ゲル電気泳動写真）。また、ＮＨ2−ｈｘ−ｄＰｎＴＰを用いたＰＣＲでは、シーケンシングパターンの解析を行うことにより、１５サイクルのＰＣＲ増幅をおこなっても、ＤＮＡ中にほぼ完全に人工塩基Ｄｓが２か所とも保存されていることがわかった（図６：シーケンシングパターン）。【０１４９】
実施例５：外来ＤＮＡが混在する条件下でのＤｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲとそのシーケンシング（１）
人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅では、その相補鎖ＤＮＡ中にＦＡＭ−ｈｘ−Ｐｎを取り込ませることができるので、抗ＦＡＭ抗体で人工塩基対を含むＤＮＡ断片のみを単離することができる。このことを確認するために、本実施例では、プライマー領域は同じ配列であるが、それ以外の配列が異なる３種類のＤＮＡ断片と人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片が等量ずつ存在する場合について、以下の実験を行った。【０１５０】
同一プライマー配列をもつ天然型塩基のみからなるＤＮＡが混在する状態における、人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅とその産物のＤＮＡシーケンシング解析を行った。【０１５１】
同一のプライマー配列を両側にもつ４種類のＤＮＡ断片（１種類はＤｓを含むＤＮＡ断片）の配列を以下に示す。
DNA1(55-mer)（配列番号４５）: 
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA2 (55-mer) （配列番号４６）:
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACACATGGAACTGCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA3 (55-mer) （配列番号４７）:
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATGCAGACTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA4 (55-mer) （配列番号４８）:
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACTTGATCCGTATCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
これらのＤＮＡ断片（各断片の最終濃度０．１５ｎＭ）の混合物を鋳型にして、ＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２．５μＭ）およびｄＤｓＴＰ（５０μＭ）、各天然型塩基の基質：ｄＮＴＰ（３００μＭ）を用いて、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼで１５サイクル（９４℃３０秒、４５℃３０秒、６５℃４分）のＰＣＲ（５０μｌスケール）を行った。増幅後のＰＣＲ溶液からその２０μｌをマイクロコンＹＭ−３０（ミリポア）を通し、さらに緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で洗浄し、溶液中に含まれる未反応の基質を除いた。この溶液（３０μｌ）を予めストレプトアビジン磁気ビーズ（４ｍｇ／ｍｌ溶液を１０μｌ、New England Biolabs）に固定したビオチン修飾された抗ＦＡＭ抗体（１ｍｇ／ｍｌ溶液を１０μｌ、インビトロジェン）と混ぜ、氷上にて１時間インキュベートした。溶液を除いた磁気ビーズを緩衝液（１００μｌ）で２回洗浄し、次いで１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を２０μｌ加えて７５℃で３０秒間加温し、ビーズに結合したＤＮＡを溶出した。シークエンス反応は、溶出されたＤＮＡ溶液を１０μｌ用いて、ｄＰａ’ＴＰ存在下（最終濃度２μＭ）で行った。また、コントロールとして、抗ＦＡＭ抗体による精製前、即ちＰＣＲ直後のサンプルの一部をゲル電気泳動により精製し、その産物を用いてシークエンス反応を行った。【０１５２】
図７に示したとおり、ＰＣＲ直後のサンプルをそのままシーケンスを行うと人工塩基を含む断片は、その他の配列に埋もれてしまうが、ＰＣＲ産物から人工塩基を含む断片を抗ＦＡＭ抗体で単離した後にシーケンスを行うことにより、Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列を解析できる。したがって、同一のプライマー配列を両端に持ち、しかし人工塩基を含まない外来のＤＮＡ断片が混在しても、上記手法により、人工塩基対を含むＤＮＡ断片のみを単離し、そしてその配列を決定することができる。【０１５３】
実施例６：外来ＤＮＡが混在する条件下でのＤｓを含むＤＮＡ断片のＰＣＲとそのシーケンシング（２）
本実施例では、Ｄｓを含むＤＮＡ断片（５５−ｍｅｒ、０．３ａｍｏｌ）に天然型塩基のランダム配列からなる１００−ｍｅｒの断片を１０7倍量加えてＰＣＲ増幅（３０サイクル）を行い、人工塩基を含むＤＮＡ断片のみを抗ＦＡＭ抗体で単離することにより、Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列を解析することができる例を示す。【０１５４】
Ｄｓを含むＤＮＡ断片（５５−ｍｅｒ）の配列を以下に示す（配列番号４５）：
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
このＤＮＡ断片（最終濃度６ｆＭ）に天然型塩基のランダム配列からなる１００−ｍｅｒのＤＮＡ（最終濃度６０ｎＭ）を混在させ、人工塩基の基質にＦＡＭ−ｈｘ−ｄＰｎＴＰ（２．５μＭ）およびｄＤｓＴＰ（５０μＭ）、各天然型塩基の基質にｄＮＴＰ（３００μＭ）を用いて、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼで３０サイクル（９４℃３０秒、４５℃３０秒、６５℃４分）のＰＣＲ（５０μｌスケール）を行った。この溶液から２０  μｌ分をCentri-SepTMスピンカラムで処理して、過剰の基質を除いた。得られた溶液を最終濃度で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液（４０−５０μｌ）に調製し、この溶液を、予めストレプトアビジン磁気ビーズ（４ｍｇ／ｍｌ溶液を２０μｌ、New England Biolabs）に固定したビオチン修飾された抗ＦＡＭ抗体（１ｍｇ／ｍｌ溶液を５μｌ、インビトロジェン）と混ぜ、氷上にて３０分インキュベートした。溶液を除いた磁気ビーズを緩衝液（１００μｌ）で１回洗浄し、次いで１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を２０μｌ加えて７５℃で３０秒間加温し、ビーズに結合したＤＮＡを溶出した。溶出されたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて、ｄＰａ’ＴＰ存在下（最終濃度２μＭ）でシーケンシングを行った。図８に示したとおり、大過剰のランダムなＤＮＡ断片が混在する場合でも、ＰＣＲ産物から人工塩基を含む断片を抗ＦＡＭ抗体で単離することができ、そして、その後シーケンスを行うことにより、Ｄｓを含むＤＮＡ断片の塩基配列を解析することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明の人工塩基Ｐｎの４位にπ電子系を有する置換基を結合させた誘導体（Ｐｎ誘導体）と人工塩基Ｄｓの人工塩基対を用いることにより、人工塩基を含む核酸の複製反応において、全ての塩基（Ｄｓ、Ｐｎ誘導体、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの各塩基）について非修飾のヌクレオチド  ５’−三リン酸をも複製基質として用いることが可能である。また、Ｐｎ誘導体には機能性置換基を付加することができるため、本発明の人工塩基を用いて機能性置換基をＤＮＡ中に位置選択的に導入し、かつ導入されたＤＮＡ自身を複製することが可能である。さらに、本発明の人工塩基対の核酸の複製反応における保存率は非常に高い。これらの特色を活かして、微量のＤＮＡを扱うin vitro セレクション法や、ＤＮＡによる認証技術等、種々の核酸の複製／増幅技術への応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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