(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロテアーゼ部分が、サブチリシンＢＰＮ’の修飾アミノ酸配列を有し、前記修飾アミノ酸配列が、第一エピトープ領域、第二エピトープ領域、および第三エピトープ領域を含んでおり、前記修飾アミノ酸配列が、エピトープ領域の一つ以上において、一つ以上の部位におけるシステインによる置換を含み、少なくとも該置換は該第一エピトープ領域中で起こり、
（ｉ）前記置換が、第一エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の７０−８４部位に対応する一つ以上の部位で生じ；
（ｉｉ）前記置換が、第二エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の１０３−１２６部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
（ｉｉｉ）前記置換が、第三エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の２１７−２５２部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
（ｂ）各付加部分が、プロテアーゼ部分において存在するシステインの一つに共有結合し、および下記構造式：
【化１】
0003642735.tif 000023
［式中、Ｘは、ゼロおよび結合部分からなる群から選ばれ；Ｒ１は、ゼロ、第一ポリペプチド、および第一ポリマーからなる群から選ばれ；Ｒ２は、ゼロ、第二ポリペプチド、および第二ポリマーからなる群から選ばれ；Ｘ、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つはゼロではない］
を有し、該第一および第二ポリペプチドが、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、および果実を主体とした酵素からなる群から選択され、該第一および第二ポリマーが、ポリアルキレンオキシドからなる群から選択される、プロテアーゼ部分および一つ以上の付加部分であることを特徴とするプロテアーゼ複合体。
【請求項２】
Ｒ１が、ゼロである請求項１に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項３】
Ｒ１が、第一ポリペプチドである請求項１に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項４】
第一ポリペプチドが、サブチリシンＢＰＮ’の修飾アミノ酸配列を有し、前記サブチリシンＢＰＮ’が、第一エピトープ領域、第二エピトープ領域、および第三エピトープ領域を含んでおり、前記サブチリシンＢＰＮ’の修飾アミノ酸配列が、サブチリシンＢＰＮ’のエピトープ領域の一つ以上において、一つ以上の部位におけるシステインによる置換を含み：
（ｉ）前記置換が、第一エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の７０−８４部位に対応する一つ以上の部位で生じ；
（ｉｉ）前記置換が、第二エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の１０３−１２６部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
（ｉｉｉ）前記置換が、第三エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の２１７−２５２部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
結合部分の一つまたはプロテアーゼ部分が、第一ポリペプチドにおいて存在するシステインの一つを経て第一ポリペプチドに共有結合する請求項１または３に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項５】
Ｘが、ゼロであり、プロテアーゼ部分および第一ポリペプチドが、ジスルフィド架橋を経て共有結合する請求項１、３または４のいずれか１項に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項６】
Ｒ１が、第一ポリマーであり、Ｒ２が、ゼロおよび第二ポリマーからなる群から選ばれる請求項１に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項７】
Ｒ２が、ゼロである請求項１ないし６のいずれか１項に記載のプロテアーゼ複合体。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のプロテアーゼ複合体およびパーソナルケアキャリアを含むパーソナルケア組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対応する親種プロテアーゼと比較して減少した免疫原性を有するサブチリシンプロテアーゼ複合体および該複合体を含む組成物に関するものである。
【０００２】
発明の背景
酵素は、天然由来タンパク質の最も広範なクラスを占めている。あるクラスの酵素には、他のタンパク質の加水分解を触媒するプロテアーゼが含まれる。タンパク質を加水分解するこの能力は、クリーニング組成物、とくに洗濯用途に適切なものに天然由来およびタンパク質工学的なプロテアーゼを導入することによって典型的に開発されている。
【０００３】
クリーニング分野において、それらプロテアーゼのなかで主として広範に利用されているのは、セリンプロテアーゼである。これらセリンプロテアーゼの大部分は、細菌生物類により生産されているが、いくつかは菌類のような他の生物により生産されている。Siezenらの“サブチリシンのファミリー様セリンプロテアーゼ、スブチラーゼのホモロジーモデルおよびタンパク質工学戦略（Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases）”、Protein Engineering、Vol.４、No.７、719−737頁（1991）を参照。残念ながら、それらの天然環境に存在する野生型プロテアーゼの効力は、非天然クリーニング組成物の環境にしばしば移行しない。とくに、プロテアーゼ特性、例えば、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性、および基質特異性は、プロテアーゼの天然環境外での利用に必ずしも最適ではない。
【０００４】
いくつかの解決策には、非天然洗浄環境においてプロテアーゼの効力を高めることを目的として、セリンプロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変えることを行っている。これらの解決策は、全く逆の条件下で、熱安定性を高めるため、および酸化安定性を向上させるためにプロテアーゼの遺伝子の再設計および／または化学修飾を含む。
【０００５】
しかしながら、そのようなプロテアーゼは、哺乳動物には異物であるので、それらは潜在的な抗原である。抗原として、これらプロテアーゼは、哺乳動物において免疫原性および／またはアレルゲン性反応（ここではまとめて免疫原性応答として記載する）を引き起こす。実際に、セリンプロテアーゼに対する過敏化は、ヒトがプロテアーゼに日常的にさらされる環境において観察されている。このような環境には、製造用設備が含まれ、ここでは、作業員が放置されたダストまたはエーロゾルのような媒介物を通してさらされる。エーロゾルは、肺のなかにプロテアーゼの吸入を起こし得、最も危険な反応を引き起こすプロテアーゼにさらされる経路である。プロテアーゼ過敏化は、市場で起こることもあり、プロテアーゼ含有製品の消費者による繰返し利用が、免疫原性応答を引き起こし得る。
【０００６】
さらに、プロテアーゼの遺伝子の再設計および化学修飾は、洗濯用途に対して、より高度に効果的なプロテアーゼの継続的な追求に卓越しているが、そのようなプロテアーゼは、パーソナルケア組成物および軽質（ライトデューティー）洗剤に最小限に利用されている。例えば、石鹸、ジェル、ボディー洗剤およびシャンプーような製品にそれらプロテアーゼを存在させないための第一の理由は、有害な免疫原性応答を引き起こす前記のヒト過敏化の問題のためである。従って、免疫原性応答の刺激のないプロテアーゼのクレンジング特性をもたらすパーソナルケア組成物を提供することは非常に有利である。
【０００７】
現在、プロテアーゼに対する免疫原性応答は、それを起こす空気伝達物を避けるために化学的に修飾したプロテアーゼを固定化すること、粒状化すること、被膜化すること、または溶解することにより最少限化が可能である。これら方法では、空気伝達プロテアーゼにさらされた消費者に扱かっているが、製造中にプロテアーゼを含むダストまたはエーロゾルにさらされる最終組成物および作業員と一緒に広がる組織接触に関連する危険が今でも存在している。
【０００８】
医療分野において、改善には、依然として、別の方法を通じて酵素の免疫原性を減少させている。この方法は、酵素にポリマーを付けることを含む。例えば、1979年、12月18日発行のDavisらの米国特許第4,179,337号および1996年6月13日公開のOlsenらのＰＣＴ出願 WO 96/17929を参照。
【０００９】
プロテアーゼの免疫原性活性の減少することに向けられた一つの解決策としては、エピトープの免疫原性特性の軽減によるものである。エピトープは、抗体と結合することにより、または主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）を経て、Ｔ細胞へ処理抗原の提示により、免疫応答を呼び起こす抗原のアミノ酸領域である。エピトープにおける変換は、抗原としてそれらの効率に影響し得る。Walsh, B.J.および M.E.H. Howden、“エピトープマッピングの修飾に基づくアレルゲンの免疫グロブリンE（IgE）結合配列の検出方法（A Method for the Detection of IgE Binding Sequences of Allergens Based on a Modification of Epitope Mapping）”、Journal of Immunological Methods、Vol.121、275-280頁（1989年）参照。
【００１０】
本発明は、サブチリシンＢＰＮ’を含むサブチリシンとして一般的に知られているそれらセリンプロテアーゼが、サブチリシンＢＰＮ’に対応する７０−８４、１０３−１２６、および２１７−２５２部位アミノ酸において突出したエピトープ領域を有することを開示している。本発明は、プロテアーゼの免疫原性特性を減少するためにこれらのエピトープ領域の一つ以上を化学的に修飾した該サブチリシンを有する。そうしている中で、プロテアーゼの活性サイトは、最小限の影響を及ぼす。従って、本発明は、効率および活性プロテアーゼとしてそれらの活性を維持したままで減少した免疫原性応答をもたらすサブチリシン様プロテアーゼを発見した。従って、本発明のプロテアー複合体は、これらに限定しないが、洗濯物、皿、硬質表面、スキンケア、ヘアケア、ビュティーケア、口腔ケア、およびコンタクトレンズ組成物を含む数種のタイプの組成物に使用するのに適当である。
【００１１】
発明の要旨
本発明は、プロテアーゼ部分および一つ以上の付加部分を含むサブチリシンプロテアーゼ複合体に関するものであり：
（ａ）前記プロテアーゼ部分が、親種アミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有し、前記親種アミノ酸配列には、第一エピトープ領域、第二エピトープ領域、および第三エピトープ領域が含まれており、前記修飾アミノ酸配列には、エピトープ領域の一つ以上において、一つ以上の部位における置換アミノ酸による置換が含まれ：
（i）前記置換が、第一エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の７０−８４部位に対応する一つ以上の部位で生じ；
（ii）前記置換が、第二エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の１０３−１２６部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
（iii）前記置換が、第三エピトープ領域で生じる場合、その置換は、サブチリシンＢＰＮ’の２１７−２５２部位に対応する一つ以上の部位で生じ；および
（ｂ）前記各付加部分が、プロテアーゼ部分において存在する置換アミノ酸の一つに共有結合し、および下記構造式を有し：
【００１２】
【化２】
0003642735.tif 000002
【００１３】
式中、Ｘは、ゼロおよび結合部分からなる群から選ばれ；Ｒ1は、ゼロ、第一ポリペプチド、および第一ポリマーからなる群から選ばれ；Ｒ2は、ゼロ、第二ポリペプチド、および第二ポリマーからなる群から選ばれ；Ｘ、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一つはゼロではない。本発明は、さらにこのようなプロテアーゼ複合体を含むクリーニングおよびパーソナルケア組成物に関するものである。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の必須成分は、ここで下記に記述する。本発明の実施形態において有用な種々の任意および好適成分の非限定記述もまた含まれる。
本発明は、ここで記述される必要または任意成分および／または限定のいずれも含み、これらからなり、またはこれらから本質的になることができる。
全ての割合および比率は、特記しない限り、重量換算である。全ての割合は、特記しない限り、全組成物に基づいて換算されている。
全ての成分または組成物レベルは、成分または組成物の活性レベルを基準としており、また不純物、例えば、残留溶媒または副生成物は除かれるが、これらは商業的に利用可能な原料に存在してもよい。
ここで参照される全ての文献は、全て、特許、特許出願、および印刷刊行物を含んでいるが、これによって、これら全文を参考文献により取入れている。
限定はしないが、酵素を含む材料は商品名をここでは参照する。本発明の発明者らは、特定の商品名をもとに物質により限定する意図はない。商品名で参照されたものと同等の物質（例えば、異なる商品名またはカタログ（商品）番号をもとに異なる原料から得られるもの）に代替してもよく、ここでのプロテアーゼ複合体および組成物に利用してもよい。
ここで用いられる場合、略語がアミノ酸を記述するために使用されるであろう。表１は、ここで使われる略語のリストを示している。
【００１５】
【表１】
0003642735.tif 000003
【００１６】
定義
ここで用いられる場合、用語“変異”は、遺伝子配列およびそのような遺伝子配列によって生じるアミノ酸配列における変化を言及する。変異は、野生型タンパク質配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換、および付加を含む。
ここで用いられる場合、用語“親種”は、酵素、野生型または変異体を言及する。
ここで用いられる場合、用語“野生型”は、非変異生物から生産されるタンパク質、例えば、プロテアーゼまたはその他の酵素を言及する。
ここで用いられる場合、用語“変異体”は、酵素をコード化するヌクレオチド配列の遺伝子変異または野生型酵素自体の変異により、対応する野生型酵素のものとは異なるアミノ酸配列を有する酵素を意味する。
ここで用いられる場合、全てのポリマーの分子量は、重量平均分子量として示される。
ここで用いられる場合、本発明の複合体は、サブチリシンＢＰＮ’およびそれらの変異体を含むものに限らないが、全てのアミノ酸番号付は、配列番号１（SEQ ID NO:1）に示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に記載されている。サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、WellsらによるNucleic Acids Research、Vol.II、7911−7925頁（1983年）にさらに記載されている。
【００１７】
本発明のプロテアーゼ複合体
本発明のプロテアーゼ複合体は、プロテアーゼ部分および一つ以上の付加部分を含む化合物であり、該プロテアーゼ部分および該付加部分は共有結合を経て結合する。
【００１８】
プロテアーゼ部分
本発明のプロテアーゼ部分は、親種アミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有する。本発明の親種アミノ酸配列は、野生型またはその変異体のいずれかのセリンプロテアーゼである。ここで用いられる場合、用語“セリンプロテアーゼ”は、一つ以上のサブチリシン様セリンプロテアーゼの配列と、少なくとも５０％、好ましくは８０％のアミノ酸配列同一性を有するプロテアーゼを意味する。野生型サブチリシン様セリンプロテアーゼは、例えば、Bacillus alcalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus amylosaccharicus、Bacillus licheniformis、Bacillus lentus、およびBacillus subtilis 微生物により生産される。サブチリシン様セリンプロテアーゼに関する議論およびそれらのホモロジーは、Siezenらの“サブチリシンのファミリー様セリンプロテアーゼ、スブチラーゼのホモロジーモデルおよびタンパク質工学戦略（Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases）”、Protein Engineering、Vol.4、No.7、719−737頁（1991年）に見られ得る。
【００１９】
本発明で使用するための好ましい親種アミノ酸配列は、例えば、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、およびBacillus subtilisから得られるもの、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、およびA/S AlcalaseR（ノボインダストリーズ、コペンハーゲン、デンマーク製の商業的に利用可能なもの）、EsperaseR（ノボインダストリーズ）、SavinaseR（ノボインダストリーズ）、MaxataseR（ジストブロケード、デルフト、オランダ（Gist−Brocades，Delft，Netherlands）製の商業的に利用可能なもの）、MaxacalR（ジストブロケード）、Maxapem 15R（ジストブロケード）を含むサーミターゼ（thermitase）、および前述の変異体を含む。本発明で使用するために特に好ましいプロテアーゼは、Bacillus amyloliquefaciensおよびその変異体から得られるものを含む。本発明でプロテアーゼ部分として使用するために最も好ましいプロテアーゼは、サブチリシンＢＰＮ’およびその変異体である。
【００２０】
特に好ましいサブチリシンＢＰＮ’の変異体は、本発明で親種アミノ酸配列として使用するために“プロテアーゼＡ”として後述されており、それは、1991年7月9日発行のVenegasの米国特許第5,030,378号に、下記の変異を用いてサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴づけることが開示されており、その変異は：
（ａ）166部位のGlyを、Asn、Ser、Lys、Arg、His、Gln、AlaおよびGluから選ばれるアミノ酸残基で置換し；169部位のGlyを、Serで置換し；および222部位のMetを、Gln、Phe、His、Asn、Glu、AlaおよびThrから選ばれるアミノ酸残基で置換し；または
（ｂ）160部位のGlyを、Alaで置換し、および222部位のMetを、Alaで置換する。
【００２１】
さらに好ましいサブチリシンＢＰＮ’の変異体は、本発明で親種アミノ酸配列として使用するために“プロテアーゼＢ”として後述されており、それは、1988年1月7日に発行し、1994年12月28日に認可されたジェネンコアインターナショナル株式会社（Genencor International，Inc.）の欧州特許EP−B-251,446号に、下記の一つ以上部位において変異を用いて野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴づけることが開示されており、その部位は：Tyr21、Thr22、Ser24、Asp36、Ala45、Ala48、Ser49、Met50、His67、Ser87、Lys94、Val95、Gly97、Ser101、Gly102、Gly103、Ile107、Gly110、Met124、Gly127、Gly128、Pro129、Leu135、Lys170、Tyr171、Pro172、Asp197、Met199、Ser204、Lys213、Tyr214、Gly215、およびSer221；または上記の２つ以上の部位と、Asp32、Ser33、Tyr104、Ala152、Asn155、Glu156、Gly166、Gly169、Phe189、Tyr217、およびMet222から選ばれる部位における一つ以上の変異とを組合せた部位である。
【００２２】
本発明で親種アミノ酸配列として使用するための、その他の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体は、“プロテアーゼＣ”として後述されており、それらは、1995年4月20日に発行され、ジェネンコアインターナショナル株式会社（Genencor International，Inc.）に与えられた、WO 95/10615に、Asn76部位の変異と、Asp99、Ser101、Gln103、Tyr104、Ser105、Ile107、Asn109、Asn123、Leu126、Gly127、Gly128、Leu135、Glu156、Gly166、Glu195、Asp197、Ser204、Gln206、Pro210、Ala216、Tyr217、Asn218、Met222、Ser260、Lys265、およびAla274から選ばれる一つ以上の部位における変異とを組合せた野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴づけることが開示されている。
【００２３】
本発明で親種アミノ酸配列として使用するための、その他の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体は、“プロテアーゼＤ”として後述されており、それらは、1988年7月26日のEstellらの米国特許第4,760,025号に、Asp32、Ser33、His64、Tyr104、Asn155、Glu156、Gly166、Gly169、Phe189、Tyr217、およびMet222からなる群から選ばれる一つ以上のアミノ酸部位に変異を用いた野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴づけることが開示されている。
【００２４】
本発明で親種アミノ酸配列として使用するためにより好ましいプロテアーゼは、AlcalaseR、サブチリシンＢＰＮ’、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、およびプロテアーゼＤからなる群から選ばれ、最も好ましいのは、プロテアーゼＤである。
【００２５】
本発明によれば、親種アミノ酸配列は、本発明の付加部分の一つ以上と結合するために適当なプロテアーゼ部分（の前駆体）を提供するために置換アミノ酸を用いて一つ以上の親種アミノ酸残基を置換する。その置換は、本発明によって発見されたエピトープ領域の一つ以上において、一つ以上の部位で作られるべきである。本発明者らは、三つのエピトープ領域を発見し、それらは、サブチリシンＢＰＮ’に対応する７０−８４部位に生じるもの（第一エピトープ領域）、サブチリシンＢＰＮ’に対応する１０３−１２６部位に生じるもの（第二エピトープ領域）、およびサブチリシンＢＰＮ’に対応する２１７−２５２部位に生じるもの（第三エピトープ領域）である。本発明の別の実施形態において、プロテアーゼ部分は、エピトープ領域の二つ以上において、一つ以上の部位での置換（即ち、二つまたは三つ全てのエピトープ領域のいずれかにおいて生じる一つ以上の置換）を含む。さらに、本発明の別の実施形態において、プロテアーゼ部分は、三つのエピトープ領域のいずれかにおいて、一つ以上の部位での置換（即ち、三つ全てのエピトープ領域のいずれかにおいて生じる一つ以上の置換）を含む。最も好ましいのは、親種アミノ酸配列は、置換の少なくとも一つが、第一エピトープ領域において生じた親種アミノ酸残基の一つ以上を置換する。
【００２６】
置換が第一エピトープ領域において生じる場合、置換は７０−８４部位の一つ以上で生じ、より好ましくは７３−８１部位の一つ以上の部位であり、最も好ましいのは７８部位である。置換が第二エピトープ領域において生じる場合、置換は１０６−１２６部位の一つ以上で生じ、より好ましくは１０６−１２０部位の一つ以上の部位であり、最も好ましいのは１１６部位である。置換が第三エピトープ領域において生じる場合、置換は２１７−２５４部位の一つ以上で生じ、より好ましくは２３６−２５４部位の一つ以上の部位であり、最も好ましいのは２４０部位である。
【００２７】
プロテアーゼ部分と本発明の一つ以上の付加部分との選択的結合（即ち、エピトープ領域の一つ以上における選択的結合）を最もよく達成するためには、置換は（特有の）親種アミノ酸配列に存在しない置換アミノ酸を用いるべきである。この点においては、親種アミノ酸配列に特有であるいくつかの置換アミノ酸を、利用し得る。例えば、システイン残基が、サブチリシンＢＰＮ’に対する野生型アミノ酸配列に存在しないので、エピトープ領域の一つ以上において、一つ以上のシステイン残基を用いたサブチリシンＢＰＮ’の置換が、本発明にとって適当である。システイン残基が、親種アミノ酸配列のエピトープ領域以外で生じる場合、エピトープ領域において一つ以上の付加部分と選択的に結合可能にするために、それらの部位のいずれかにおいて、別のアミノ酸残基で置換するのがより望ましい。システインは、エピトープ領域の一つ以上における置換のための置換アミノ酸として最も好ましい。
【００２８】
その他の好ましい置換アミノ酸は、リシンを含む。置換アミノ酸がリシンである場合、親種アミノ酸配列のエピトープ領域以外に生じるリシン残基を、エピトープ領域におけるリシン残基の一つ以上の機能化を選択するような別のアミノ酸残基で変異することがより好ましい。例えば、リシン残基は、第三エピトープ領域に存在するサブチリシンＢＰＮ’の２３７部位に生じる。サブチリシンＢＰＮ’配列に存在している全ての他のリシン残基の部位選択的変異は、付加部分を用いた第三エピトープにおけるリシン残基の選択的機能化の後に行うとよい。これとは別に、エピトープ領域における部位は、ポリマー部分によるそれらの部位における選択的機能化の後にリシンを変異してもよい。
【００２９】
付加部分
本発明のプロテアーゼ複合体は、各付加部分がエピトープ領域の一つに存在する置換アミノ酸の一つと共有結合する一つ以上の付加部分をさらに含み、下記構造を有し：
【００３０】
【化３】
0003642735.tif 000004
【００３１】
式中、Ｘは、ゼロおよび結合部分から選ばれ；Ｒ1は、ゼロ、第一ポリペプチド、および第一ポリマーからなる群から選ばれ；並びにＲ2は、ゼロ、第二ポリペプチド、および第二ポリマーからなる群から選ばれ；Ｘ、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一つはゼロではない。
【００３２】
好ましくは１〜約１５重量％、より好ましくは約２〜１０重量％、最も好ましくは約１〜５重量％の付加部分をプロテアーゼ複合体に含む。
【００３３】
式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立したポリペプチド部分またはポリマー部分であり、Ｒ1およびＲ2は、同一でも異なっていてもよい。より好ましくは、式中、Ｒ1はポリペプチド部分であり、Ｒ2はゼロおよびポリペプチド部分から選ばれ、最も好ましくはゼロである。最も好ましくは、Ｒ1がポリペプチド部分であり、Ｒ2がゼロおよび同一のポリペプチド部分から選ばれ、最も好ましくはゼロである。より好ましくは、Ｒ1がポリマー部分であり、Ｒ2がゼロおよびポリマー部分から選ばれる。最も好ましくは、Ｒ1がポリマー部分であり、Ｒ2がゼロおよび同一のポリマー部分から選ばれる。Ｒ1およびＲ2の少なくとも一つは、それぞれ第一ポリマーおよび第二ポリマーであり、そのときＸはゼロでないのが好ましい。
【００３４】
ポリペプチド部分
本発明に記載されているポリペプチド部分は、二つ以上のアミノ酸残基を含有するものを含む。好ましいポリペプチド部分は、酵素を含むタンパク質から選ばれる。好ましい酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ（例えば、ＮＡＤＨレダクターゼを含む）、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ（例えば、グルコースイソメラーゼおよびキシロースイソメラーゼを含む）、リアーゼ、リガーゼ、シンテターゼ、および果実の酵素（例えば、パパインを含む）を含む。ポリペプチド部分としての使用に関してより好ましい酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、および果実を主体とした酵素を包含し、プロテアーゼが更により好ましい。
【００３５】
ポリペプチド部分として使用するリパーゼの例示は、下記の微生物から誘導されたものを含み、その微生物は：ヒュミコラ（Humicola）、シュドモナス（Pseudomonas）、フザリウム（Fusarium）、ムーコル（Mucor）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、アスペルギルス（Aspergillus）、カンジタ（Candida）、ジオトリチウム（Geotricum）、ペニシリウム（Penicillium）、クモノスカビ（Rhizopus）、およびバチルス（Bacillus）である。
【００３６】
商業的なリパーゼの例示は、、LipolaseR、Lipolase UltraR、LipozymeR、PalataseR、Novozym 435R、およびLecitaseR（全て、商業的に利用可能なNovo Nordisk A/S ,Copenhagen, Denmark製）、LumafastR（商業的に利用可能なGenencor,Int., Rochester, NY製）、およびLipomaxR（Genencor,Int.）を含む。
【００３７】
ポリペプチド部分として使用するためのプロテアーゼの例示は、セリンプロテアーゼ、キモトリプシンおよびエラスターゼ型酵素を含む。ポリペプチド部分として使用するために最も好ましいプロテアーゼは、本発明の“プロテアーゼ部分”の説明で上記に定義したような、セリンプロテアーゼを含む。
【００３８】
最も好ましいのは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペプチド部分は、上記のようなプロテアーゼ部分の定義とは別のものとして記載し、即ち、ポリペプチド部分が、上記のようなエピトープ領域の一つ以上において、親種アミノ酸配列の修飾アミノ酸配列を有する（親種アミノ酸配列は“第二の”親種アミノ酸配列と示してよい）。例えば、結合部分の一つ（結合部分がゼロでない場合）またはプロテアーゼ部分（結合部分がゼロである場合）は、ポリペプチド部分のエピトープ領域の一つに存在する置換アミノ酸の一つを経てポリペプチド部分に共有結合する。ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、同様に好ましくは、より好ましくは、および最も好ましくはをまとめて、上記のプロテアーゼ部分およびそれらに対応する親種アミノ酸配列に記載されているように使用する。
【００３９】
最も好ましくは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペプチド部分およびプロテアーゼ部分が、同一部分である。例えば、ポリペプチド部分およびプロテアーゼ部分が、ジスルフィド架橋を経て好ましく結合し、Ｘがゼロであり、最も好ましくはＲ2がゼロである。
【００４０】
ポリマー部分
本発明の付加部分は、ポリマー部分を含んでもよい。適当なポリマー部分の例示は、ポリアルキレンオキシド、ポリアルコール、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、セルロース、デキストラン、スターチ、グリコーゲン、アガロース、グアールガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、バイオポリマー、アルギン酸ヒドロシレート（alginic acid hydrosylates）、およびキトサンのヒドロシレート（hydrosylates）を含む。好ましいポロアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールを含む。好ましいデキストランは、カルボキシメチルデキストランを含む。好ましいセルロースは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含む。好ましいスターチは、ヒドロキシエチルスターチおよびヒドロキシプロピルスターチを含む。より好ましいポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。最も好ましいポリマー部分は、ポリエチレングリコールである。
【００４１】
Ｒ1およびＲ2は各々独立したポリマー部分である場合、Ｒ1およびＲ2は、好ましくは約０．５ｋＤ（キロダルトン）〜約４０ｋＤ、より好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、最も好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの合計分子量（即ち、Ｒ1の分子量とＲ2の分子量を足したもの）を有する。
【００４２】
Ｒ1およびＲ2は各々ポリマー部分である場合、好ましいＲ1およびＲ2は各々独立し、好ましくは０．２５ｋＤ〜約２０ｋＤ、より好ましくは約０．５ｋＤ〜約１０ｋＤ、最も好ましくは約０．５ｋＤ〜約５ｋＤの合計分子量を有する。
【００４３】
Ｒ1およびＲ2は各々ポリマー部分である場合、Ｒ1およびＲ2の分子量の比率は、好ましくは約１：１０〜約１０：１、より好ましくは約１：５〜約５：１、最も好ましくは約１：３〜約３：１の範囲である。
【００４４】
Ｒ1がポリマー部分であり、Ｒ2がゼロである場合、Ｒ1が好ましくは約０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、より好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、最も好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの分子量を有する。
【００４５】
結合部分
本発明で使用される場合、Ｘは（ゼロまたは）ポリペプチド部分またはポリマー部分に共有結合し、そして、プロテアーゼ部分のエピトープ領域の一つに存在する単一の置換アミノ酸にもまた共有結合する結合部分がよい。結合部分は、いくつかの低分子であり、即ち、約８００より少なく、好ましくは約４００より少なく、より好ましくは約３００より少ない分子量を有する分子のことである。最も好ましい結合部分は、システイン残基またはリシン残基、最も好ましいのはシステイン残基に共有結合できるものを含む。結合部分および関連する化学的性質の例示は、1995年8月29日発行のHarrisの米国特許第5,446,090号；1992年12月15日発行のMerrillの米国特許第5,171,264号；1992年11月10日発行のRheeらの米国特許第5,162,430号；1992年8月６日発行のShadleらの米国特許第5,153,265号；1992年6月16日発行のZalipskyの米国特許第5,122,614号；Goodsonらの“グリコシル化部位における組み変えインターロイキン２の部位指定ペジレーション（Pegylation）（Site-Directed Pegylation of Recombinant Interleukin-2 at its Glycosylation Site）”Biotechnology、Vol.8、No.4、343−346頁（1990）；Koganの“選択的タンパク質修飾のための適当な置換メトキシ−ポリ（エチレングリコール）誘導体の合成（The Synthesis of Substituted Methoxy-Poly(ethylene glycol)Derivatives Suitable for Selective Protein Modification）”、Synthetic Communications、Vol.22、2417−2424頁（1992）；およびIshiiらの“蛍光発光におけるスクシンイミド環の状態の影響およびピレンマレイミドで標識したαα−トロポマイシンの構造特性（Effects of the State of the Succinimido-Ring on the Fluorescence and Structural Properties of Pyrene malaimide-Labeled αα-Tropomyisin）”Biophysical journal、Vol.50、75−80頁（1986）に開示されている。最も好ましい結合部分は、置換（例えば、アルキル）または非置換スクシンイミドである。
【００４６】
製造方法
プロテアーゼ部分は、親種アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を変異することにより調製される。このような方法は、当業界においてよく知られており；そのような方法の例示を下記に挙げるが、これに限定されるものではない：
【００４７】
野生型サブチリシンＢＰＮ’遺伝子を含むファージミド（pSS-5）（Mitchison, C.および J.A. Wells“サブチリシンＢＰＮ’におけるジスルフィド結合のタンパク質工学（Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN）”Biochemistry、Vol.28、4807−4815頁（1989））を、大腸菌dutung株-ＣＪ２３６（Escherichia coli dutung- strain CJ236）に形質転換し、一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型を、Yuckenbergらによる“ウラシル含有ＤＮＡおよびファージミドベクターを用いた試験管内位置指定変異（Site-Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors）”、Directed Mutagenesis-A Practical Approach、McPherson、M.J.ed.,27-48頁（1991）により改良された、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Kunkelらの“表現型選択しない位置特異的変異の迅速性および効率（Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection）”Methods in Enzymology、Vol.154、367−382頁（1987））を用いて生成する。Zoller,M.J.,およびM.Smithらの“Ｍ１３由来ベクターを使用するオリゴヌクレオチド−指定変異：いくつかのＤＮＡ断片における点変異の生成のための効率および一般的な方法（Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Procedure for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA）”、Nucleic Acids Research、Vol.10、6487−6500頁（1982）に記載された方法により改変された位置指定変異プライマーが、（本質的には上記のYuckenbergらにより提供されるような）全ての変異体を生成するために使用される。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems Inc.）を用いて作られる。変異反応生成物を、大腸菌ＭＭ２９４株（アメリカンタイプカルチャーコレクションE.Coli３３６２５）に形質転換させる。全ての変異は、ＤＮＡ配列により確認され、単離したＤＮＡは、バチルス サブチリス発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（Saunderらの“ヒト副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のバチルス サブチリスからの分泌のためのシグナル配列開裂部分位の最適化（Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion from Bacillus subtilis of a 34-amino acid Fragment of Human Parathyroid Hormone）”、Gene、Vol.102、277−282頁（1991）、およびYangらの“バチルス サブチリスの中性プロテアーゼ遺伝子のクローニングおよび試験管内で誘導欠失変異を作るためのクローン遺伝子の使用（Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create an in vitro-Derived Deletion Mutation）”、Journal of Bacteriology、Vol.160、15−21頁（1984））。
【００４９】
発酵培養は下記の通りである。対象のプロテアーゼを含むバチルス サブチリス細胞（ＰＧ６３２）は、１０ｇ／Ｌグルコースを含むＬＢブロス１リットル中で、対数増殖中期まで成育させ、そして、全９リットル容のバイオスタットＣ発酵培養槽（Braun Biotech, Inc., Allentown,PA）中に接種する。発酵培地には、酵母エキス、カゼインヒドロシレート（casein hydrosylate）、可溶性部分加水分解スターチ（Maltrin M-250）、泡止め剤、緩衝液、および微量鉱物（Doi,R.H.およびM.McGloughlin,編“バシリの生物学：産業上への応用法（Biology of Bacilli: Applications to Industry）”（1992）参照）を含む。ブロスは、発酵培養継続の間、７．５の一定ｐＨに維持される。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）は、変異したプラスミドの抗生物質選別のために添加する。細胞は、約６０の吸光度６００（Ａ600）まで、３７℃で１８時間成育させ、生成物を回収する。
【００５０】
発酵培養ブロスは、純性なプロテアーゼを得る為に下記のステップを通じて提供される。そのブロースは、０．１６μｍメンブレンに接触させて流すことによりバチルス サブチリス細胞を取り除く。無細胞ブロスは、次に、８，０００分子量カット−オフメンブレンを用いて限外濾過によって濃縮される。ｐＨは、濃ＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）で５．５に調整する。プロテアーゼをさらにＳ−セファロースを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、そしてＮａＣｌ勾配で溶離することにより精製する。Scopes,R.K.,“タンパク質精製原理および実践（Protein Purification Principles and Practice）”、Springer-Verlag、New York（1984）を参照。
【００５１】
ｐＮＡアッセイ（DelMarらのAnalytical Biochemistry、Vol.99、316−320頁（1979））は、勾配溶離中に収集された画分に対して活性プロテアーゼ濃度を決定するために使用される。このアッセイは、プロテアーゼが可溶性合成基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリン（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際に、ｐ−ニトロアニリンが遊離する率を測定する。加水分解反応による黄色の生成物の率は、分光光度計４１０ｎｍにおいて測定し、そして、活性プロテアーゼ部分濃度に比例する。さらに、２８０ｎｍにおける吸光度測定は、全タンパク質濃度を決定するために使用される。その活性プロテアーゼ/全タンパク質比は、プロテアーゼ純度を与え、そして、保存溶液に回収される画分を同定するために使用される。
【００５２】
貯蔵中のプロテアーゼの自己消化を防ぐために、等量のプロピレングリコールをクロマトグラフィーカラムから得られた回収画分に添加する。精製手順の完了の際、保存プロテアーゼ溶液の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）で確認し、純粋酵素濃度を、トリプシン阻害剤タイプII−Ｔ型：七面鳥卵白（Sigma Chemical Company、St.Louis,Missouri）を使用した活性部位滴定方法を経て測定する。
【００５３】
使用するための調製において、プロテアーゼ保存溶液を、プロピレングリコールを除去し、緩衝液を交換するためにセファデックス−Ｇ２５（Pharmacia、Piscataway、New Jersey）サイズ溶出カラムを通して溶離する。酵素保存溶液中のＭＥＳ緩衝液を、０．０１ＭＫＨ2ＰＯ4溶液、ｐＨ５．５に交換する。
【００５４】
調製したプロテアーゼと一緒に、プロテアーゼ複合体を提供するために一つ以上の付加部分を一緒に発酵培養のために使用してもよい。付加部分に対する前駆体（付加部分に対する前駆体は、付加部分およびプロテアーゼ部分を含むプロテアーゼ複合体を形成するためにプロテアーゼ部分に対する前駆体と一緒に反応する）は、プロテアーゼ部分に対する前駆体と一緒に反応性の増加を活性化させるので好ましい。そのような活性化は、当業界では良く知られている。プロテアーゼ複合体調製の方法の例示を下記に示すが、これに限定するわけではない。
【００５５】
実施例１
【００５６】
【化４】
0003642735.tif 000005
【００５７】
エピトープ領域の一つに存在するシステイン残基を含むプロテアーゼは、下記方法を用いて上記図式に示されるポリマー部分と結合する（式中、“Ｐ”は、プロテアーゼ部分がチオール基を欠失した結果システイン置換を生じることを示し、ｎは、ポリエチレングリコールの繰返しモノマー単位の数である（例えば、ｎ＝７７））。
【００５８】
２１７部位におけるチロシンに対してロイシンの置換と、７８部位におけるセリンに対してシステインの置換とを用いたサブチリシンＢＰＮ’の変異体を用意する。変異体のリン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）でおよそ２ｍｇ／ｍＬ濃度を達成する。ｐＨは、さらに希水酸化ナトリウムで７．５まで上昇させる。変異体を、過剰に変異体にポリマーを活性化させる２５：１として、モノメチルポリエチレングリコールマレイミドと一緒に混合する。室温にて混合した一時間後、混合物のｐＨを、希リン酸で５．５に調整し、そして過剰なポリマーを除去するために分子量カットオフ限外濾過フィルターを通して濾過する。その濃度は精製したプロテアーゼ複合体を含む。
【００５９】
実施例２
【００６０】
【化５】
0003642735.tif 000006
【００６１】
エピトープ領域の一つに存在するシステイン残基を含むプロテアーゼ部分は、下記方法を用いて上記図式に示されるポリマー部分と結合する（式中、“Ｐ”は、プロテアーゼ部分がチオール基を欠失した結果システイン置換を生じることを示し、ｎは、ポリエチレングリコールの繰返しモノマー単位の数である（例えば、ｎ＝７７））。
【００６２】
２１７部位におけるチロシンに対してロイシンの置換と、７８部位におけるセリンに対してシステインの置換とを用いたサブチリシンＢＰＮ’の変異体を用意する。変異体のリン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）でおよそ２ｍｇ／ｍＬ濃度を達成する。ｐＨは、さらに希水酸化ナトリウムで７．５まで上昇させる。変異体を、過剰に変異体にポリマーを活性化させる２５：１として、ジメチルポリエチレングリコールマレイミドと一緒に混合する。室温にて混合した一時間後、混合物のｐＨを、希リン酸で５．５に調整し、そして過剰なポリマーを除去するために分子量カットオフ限外濾過フィルターを通して濾過する。その濃度は精製したプロテアーゼ複合体を含む。
【００６３】
実施例３
スクシンイミド保護ポリマーは、エピトープ領域の一つ以上に存在するリシンに選択的に結合する（式中、“ＭＰＥＧ”および“ＰＥＧＭ”は同一であり、モノメチルポリエチレングリコールを示し、“Ｐ”はプロテアーゼ部分が下記リシンアミン基を欠失することを示す）：
【００６４】
【化６】
0003642735.tif 000007
【００６５】
実施例４
カルボジイミド保護ポリマーは、エピトープ領域の一つ以上に存在するリシンに選択的に結合する（式中、“ＭＰＥＧ”および“ＰＥＧＭ”は同一であり、モノメチルポリエチレングリコールを示し、“Ｐ”はプロテアーゼ部分が下記リシンアミン基を欠失することを示し、ＸおよびＸ’はカルボジイミド部分、例えば、アルキル類を含有する側鎖である）：
【００６６】
【化７】
0003642735.tif 000008
【００６７】
実施例５
【００６８】
【化８】
0003642735.tif 000009
【００６９】
エピトープ領域の一つに存在するシステイン残基を含むプロテアーゼ部分は、下記方法を用いてアルキルマレイミドと結合する（式中、“Ｐ”はプロテアーゼ部分がチオール基を欠失した結果システイン置換を生じることを示し、“Ｒ”はアルキル基を示す）。例えば、Ｒ1およびＲ2がそれぞれゼロであり、そして結合部分はアルキルマレイミドから誘導される。
【００７０】
２１７部位におけるチロシンに対してロイシンの置換と、７８部位におけるセリンに対してシステインの置換とを用いたサブチリシンＢＰＮ’の変異体を用意する。変異体の２０ｍＬ溶液を、０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）でおよそ１ｍｇ／ｍＬ濃度に調製する。その溶液に対して、１．５当量のアルキルマレイミド（例えば、メチルマレイミド）をその溶液に添加する。その溶液は、およそ一時間、室温にて穏やかに混合する。結果として、プロテアーゼ複合体は、標準的な方法でその溶液から得られる。
【００７１】
実施例６
【００７２】
【化９】
0003642735.tif 000010
【００７３】
エピトープ領域の一つに存在するシステイン残基を含むプロテアーゼ部分は、下記方法を用いてダイマーを形成する（式中、“Ｐ”はプロテアーゼ部分がチオール基を欠失した結果システイン置換を生じることを示す）。例えば、プロテアーゼ部分およびポリペプチド部分は同一である（およびＸはゼロである）。
【００７４】
２１７部位におけるチロシンに対してロイシンの置換と、７８部位におけるセリンに対してシステインの置換とを用いたサブチリシンＢＰＮ’の変異体を用意する。変異体の２０ｍＬ溶液を、０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．６）でおよそ１ｍｇ／ｍＬ濃度に調製する。所望のプロテアーゼ複合体ダイマーを形成するために、室温にておよそ一時間、その溶液に酸素を通しながら穏やかに泡立たせた。結果として、プロテアーゼ複合体は、標準的な方法でその溶液から得られる。
【００７５】
分析方法
本発明のプロテアーゼ複合体は、下記の方法を用いて酵素活性および免疫原性応答について試験されてもよく、両方法とも当業界で知られている。あるいは当業界でよく知られている別の方法が使用されてもよい。
【００７６】
プロテアーゼ複合体活性
本発明のプロテアーゼ複合体のプロテアーゼ活性は、当業界でよく知られている方法によりアッセイされ得る。二つのそのような方法を下記に示す：
【００７７】
皮膚薄片活性方法
ＳｃｏｔｃｈR＃３７５０Ｇテープを使用して、ヒトの皮膚薄片を、テープが実質的に薄片で不透明になるまで、繰返し被験者の足からはがす。そのテープを、次に１インチ×１インチ平方に切り、別にして置く。１０ｍｍ×３５ｍｍぺトリ皿に、０．７５ｍｇ／ｍＬの対照標準酵素（例えば、サブチリシンＢＰＮ’）または試験させるプロテアーゼ複合体の２ｍＬを、０．０１ＭＫＨ2ＰＯ4のｐＨ５．５緩衝液に添加する。この溶液に２．５％ラウリン酸ナトリウムｐＨ８．６溶液１ｍＬを添加する。この溶液をプラットフォームシェイカー上で穏やかに混合する。既に用意されている正方形テープを、その溶液中に（薄片側を上にして）１０分間、穏やかに混合し続けながら浸す。その正方形テープを、次に１５秒間水道水で穏やかにすすぐ。Stevenel Blue Stain(３ｍＬ、Sigma Chemical Co.,St Louis,MO製の商業的に利用可能なもの）を、きれいなぺトリ皿の中にピペットで移す。すすいだ正方形テープを、３分間穏やかに混合しながらその染料中に（薄片側を上にして）置く。正方形テープを、染料から取り出し、二つの３００ｍＬビーカーの蒸留水中で、１回リンスあたり１５秒間で連続してすすぐ。正方形テープを、空気乾燥させる。対照標準酵素から得られた正方形テープとプロテアーゼ複合体から得られた正方形テープとの色強度を、視覚的にまたは色覚測定器を使用することによって比較する。対照標準酵素の正方形テープと比較して、より弱い色強度を示すプロテアーゼ複合体正方形テープは、より高い活性を有するプロテアーゼ複合体を示している。
【００７８】
染色コラーゲンの活性方法
ｐＨ８．６を与える０．０１Ｍ ＣａＣｌ2を含有する０．１Ｍトリス緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）５０ｍＬと、０．５ｇアゾコール（コラーゲン含浸アゾ染料、Sigma Chemical Co., St Louis,MO製の商業的に利用可能なもの）とを混合する。この混合物を２５℃で、プラットホームシェーカーで穏やかに混合しながらインキュベートする。混合物２ｍＬを０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過し、分光光度計で５２０ｎｍからゼロにおける混合物の吸光度を読む。対照標準酵素（例えば、サブチリシンＢＰＮ’）または試験されるべきプロテアーゼ複合体１ｐｐｍを、残りのトリス／アゾコール混合物４８ｍＬに添加する。対照標準／プロテアーゼ複合体を含む溶液２ｍＬを、２分間毎で合計１０分間、０．２ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過する。それぞれ濾過したサンプルに対して直ちに吸光度５２０ｎｍを読む。結果を時間に対してプロットする。対照標準および試験複合体の傾斜度が、サンプルの相対的活性を示している。より急な傾斜度は、より高い活性を示す。試験したプロテアーゼ複合体活性（傾斜度）は、対照標準活性（傾斜度）の割合として表示してもよい。
【００７９】
Ｔ細胞増殖アッセイ
本発明のプロテアーゼ複合体の免疫原性能力は、当業界でよく知られている方法または以下に示すＴ細胞増殖アッセイを用いて決定し得る。このアッセイは、Bung Poor Fardら、"インビトロおよびインビボにおいて、重複ペプチドを用いて定義したLol pI の主要画分のＴ細胞エピトープ（T Cell Epitopes of the Major Fraction of Rye Grass Lolium perenne (Lol pI) Defined Using Overlapping Peptides in vitro and in vivo）"、Clinical Experimental Immunology、Vol.94、111-116頁(1993)に開示されているアッセイのバリエーションである。
【００８０】
サブチリシンＢＰＮ’に対してアレルギーを示す被検体（プリックテスト陽性）および対照被検体（プリックテスト陰性）の血液を、このアッセイで使用する。各被検体からの血液（〜６０ｍＬ）を集めて、単核細胞をファイコール−ハイパック（Pharmacia, Piscataway, New Jerseyから入手され得る）を用いて採取する。細胞をＲＰＭＩ １６４０（Gibco, Grand Island, New Yorkから入手され得る）にて２回洗い、それから１０％ヒトＡＢ−血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Gibcoから入手され得る）を付加した完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁する。細胞をＵ底９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて０.２ｍＬの完全培地中、２×１０5細胞／ウェルの濃度で培養する。試験される潜在性抗原（陽性コントロールとしての不活性化サブチリシンＢＰＮ’または本発明のプロテアーゼ複合体とのいずれか）を約４０μｇ／ｍＬまでの最終濃度で添加する。培養物を、５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートする。５日後に１μＣｉ／ウェルのメチル−3Ｈ−チミジンを添加して、１８時間後に細胞を回収する。細胞による3Ｈ−チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウントによるＴ細胞増殖の測定としてアッセイする。
【００８１】
本発明の組成物
本発明のプロテアーゼ複合体は、それぞれの親種プロテアーゼに適切な如何なる用途においても使用できる。このような例の１つには、クリーニング組成物が含まれる。本発明のプロテアーゼ複合体の望ましい減少された免疫原性特性により、本プロテアーゼ複合体は、プロテアーゼの使用に最低限に利益ある用途において更に使用され得る。このような用途の例には、プロテアーゼ複合体が哺乳類の皮膚（とくにヒトの皮膚）と必ず密着した状態になるもの、例えばパーソナルケア組成物の使用が含まれる。
【００８２】
クリーニング組成物
プロテアーゼ複合体は、クリーニング組成物に利用されてもよく、これには、洗濯用組成物、硬質表面クレンジング組成物、皿洗い組成物を含むライトデューティークリーニング組成物、および自動皿洗い洗剤組成物が含まれるが、これらに限定されない。
ここでのクリーニング組成物は、有効量の本発明のプロテアーゼ複合体の１つ以上と、クリーニング組成物キャリアとを含む。
【００８３】
ここで用いられる場合、“有効量のプロテアーゼ複合体”などは、特別のクリーニング組成物に必要なタンパク質分解活性を達成するために必要なプロテアーゼ複合体の量を言及する。このような有効量は、当業者により容易に確認され、また多くの因子、例えば、使用される特定のプロテアーゼ複合体、クリーニング用途、クリーニング組成物の特定の組成物、および液体および乾燥（たとえば顆粒、棒状）組成物のいずれが所望されているかなどに基づいている。好ましくは、クリーニング組成物は、約０.０００１％〜約１０％、より好ましくは約０.００１％〜約１％、もっとも好ましくは約０.０１％〜約０.１％の本発明のプロテアーゼ複合体の１つ以上を含む。プロテアーゼ複合体が使われ得る種々のクリーニング組成物のいくつかの例は、以下でさらに詳述する。
【００８４】
本発明のプロテアーゼ複合体に加えて、該クリーニング組成物はさらに、プロテアーゼ複合体に適合する１つ以上のクリーニング組成物物質を含むクリーニング組成物キャリアを含む。用語“クリーニング組成物物質”とは、ここで用いられる場合、所望されるクリーニング組成物の特定のタイプおよび製品の形状（例えば、液体、顆粒、棒状、スプレー、スティック、ペースト、ジェル）に選択された如何なる物質をも意味し、これらの物質はまた本組成物に使用されるプロテアーゼ複合体に適合するものでもある。クリーニング組成物物質の特定の選択は、クリーニングされる表面物質、使用中のクリーニング条件（例えば、洗剤使用を通す）のための組成物の所望形状を考慮することにより容易に成される。用語“適合”とは、ここで用いられる場合、クリーニング組成物物質が、プロテアーゼ複合体のタンパク質分解活性を、プロテアーゼが通常使用状態の間に所望されるように有効とならない程度まで低下しないことを意味する。特別のクリーニング組成物物質は、以下に詳細に例示される。
【００８５】
本発明のプロテアーゼ複合体は、高度に起泡し良好なクレンジングが所望される種々の洗剤組成物に使用され得る。従って、プロテアーゼ複合体は、十分に配合された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、織物洗濯組成物などを提供するために種々の慣用成分と共に使用できる。このような組成物は、液体、顆粒、棒状などの形状であることができる。このような組成物は、約３０重量％〜約６０重量％ほどの界面活性剤を含有する“濃縮”洗剤として配合され得る。
【００８６】
ここでのクリーニング組成物は、任意に、および好ましくは、種々の界面活性剤（例えば、アニオン性、ノニオン性または双性イオン界面活性剤）を含有し得る。このような界面活性剤は、典型的に、組成物の約５％〜約３５％のレベルで存在する。
【００８７】
ここで有用な界面活性剤の非限定例には、慣用のＣ11−Ｃ18アルキルベンゼンスルホネート並びに一級およびランダムアルキルスルフェート、式ＣＨ3(ＣＨ2)x(ＣＨＯＳＯ3)-Ｍ+)ＣＨ3およびＣＨ3(ＣＨ2)y(ＣＨＯＳＯ3)-Ｍ+)ＣＨ2ＣＨ3のＣ10−Ｃ18二級（２,３）アルキルスルフェート［式中、ｘおよび（ｙ＋１）は少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムである］、Ｃ10−Ｃ18アルキルアルコキシスルフェート（特にＥＯ１−５エトキシスルフェート）、Ｃ10−Ｃ18アルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１−５エトキシカルボキシレート）、Ｃ10−Ｃ18アルキルポリグリコシド、およびそれに対応するスルフェート化ポリグリコシド、Ｃ12−Ｃ18α−スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ12−Ｃ18アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ12−Ｃ18ベタインおよびスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ10−Ｃ18アミンオキシドなどが含まれる。アルキルアルコキシスルフェート（ＡＥＳ）およびアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）が、ここでは好ましい。このような界面活性剤のアミンオキシドおよび／またはベタインまたはスルタイン界面活性剤との組合わせての使用も好ましく、これは配合者の希望による。その他の慣用の有用な界面活性剤は、標準的なテキストに列記されている。特に有用な界面活性剤には、Ｃ10−Ｃ18Ｎ−メチルグルカミドが含まれ、これは1993年3月16日発行のConnorらの米国特許第5,194,639号に開示されている。
【００８８】
洗剤クリーニング組成物に有用な広範な種々の他の成分は、例えば、他の活性成分、キャリア、ヒドロトロープ、プロセシング助剤、染料または顔料および液体配合物のための溶媒を含むここでの組成物に含まれることができる。起泡のさらなる増進が所望される場合、起泡増進剤、例えば、Ｃ10−Ｃ16アルコールアミドが、典型的に約１％〜約１０％のレベルで本組成物中に組み込まれることができる。Ｃ10−Ｃ14モノエタノールおよびジエタノールアミドは、典型的なクラスのこのような起泡増進剤を説明する。このような起泡増進剤の高度起泡補助界面活性剤、例えば、アミンオキシド、ベタインおよび上記したスルタインとの使用もまた有効である。所望される場合、水溶性マグネシウム塩、例えば、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4などは、さらなる起泡をもたらすために、典型的に約０.１％〜約２％のレベルで添加することができる。
【００８９】
ここでの液体洗剤組成物は、キャリアとして水および他の溶媒を含んでもよい。メタノール、エタノール、プロパノールおよびiso-プロパノールにより例示される低分子量の一級または二級アルコールが適している。一価アルコールは水溶性界面活性剤に好適であるが、ポリオール、例えば、約２〜約６の炭素原子および約２〜約６のヒドロキシ基を有するもの（例えば、１,３−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリンおよび１,２−プロパンジオール）もまた使用することができる。本組成物は、約５％〜約９０％、典型的に約１０％〜約５０％のこのようなキャリアを含み得る。
【００９０】
ここでの洗剤組成物は、好ましくは水性クリーニング操作での使用中に、洗浄水が約６.８と約１１との間のｐＨを有するように配合されることが好ましいであろう。最終製品は、典型的にはこの範囲で配合される。ｐＨを推奨使用レベルに調整する技術には、例えば、緩衝剤、アルカリ、および酸の使用が含まれる。このような技術は当業者によく知られている。
【００９１】
本発明の硬質表面クリーニング組成物および織物クリーニング組成物を配合するときに、配合者は種々のビルダーを約５重量％〜約５０重量％のレベルで用いたいと思うであろう。典型的なビルダーには、１−１０ミクロンのゼオライト、ポリカルボキシレート、例えば、シトレートおよびオキシジスクシネート、層状シリケート、ホスフェートなどが含まれる。他の慣用ビルダーは、標準的な配合書に列記されている。
【００９２】
同様に、配合者は、種々の付加的な酵素、例えば、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼを、このような組成物中に、典型的には約０.００１重量％〜約１重量％のレベルで使用するであろう。種々の洗浄性および織物ケア酵素は、洗濯洗剤分野でよく知られている。
【００９３】
種々の漂白化合物、例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩等は、典型的に、約１重量％〜約１５重量％のレベルで、このような組成物中に使用することができる。所望すれば、このような組成物は、また、テトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート等の漂白活性剤も含有することができ、これらもまた当業界で既知である。使用レベルは、典型的な約１重量％〜約１０重量％の範囲である。
【００９４】
汚れ遊離剤(soil release agents)、特にアニオン性オリゴエステル型、キレート剤、特にアミノホスフェートおよびエチレンジアミンジスクシネート、クレイ汚れ遊離剤、特にエトキシ化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレートおよびポリアスパラテート、増白剤、特にアニオン性増白剤、泡抑制剤、特にシリコーンおよび二級アルコール、織物柔軟剤、特にスメクタイトクレイ等は、このような組成物中に、約１重量％〜約３５重量％のレベル範囲で、全て使用することができる。標準的な配合書および公開特許は、このような慣用の物質の多数の詳細な記述を含む。
【００９５】
酵素安定剤もまた本クリーニング組成物に使用してもよい。このような酵素安定剤は、プロピレングリコール（好ましくは、約１％〜約１０％）、ナトリウムホルメート（好ましくは、約０.１％〜約１％）およびカルシウムホルメート（好ましくは、約０.１％〜約１％）を含む。
【００９６】
本変異体は、硬質表面クリーニング組成物に有用である。ここで用いられる場合、“硬質表面クリーニング組成物”とは、硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイル等をクリーニングするための液体および顆粒の洗剤組成物を言う。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、有効量の本発明のプロテアーゼ複合体の１つ以上、好ましくは約０.００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０.０１重量％〜約５重量％、さらに好ましくは約０.０５重量％〜約１重量％の本組成物のプロテアーゼ複合体を含む。１つ以上のプロテアーゼ複合体を含むことに加えて、このような硬質表面クリーニング組成物は、典型的に、界面活性剤および水溶性金属イオン封鎖剤ビルダーを含む。しかしながら、所定の特別製品、例えばスプレー窓クリーナーでは、ガラス表面に薄膜状および／またはむらのある残査を生成し得るので、界面活性剤は時として使用されない。
【００９７】
界面活性剤成分が、存在する場合、ここでの組成物の約０.１％程度で含まれてもよいが、典型的に組成物は、約０.２５％〜約１０％、より好ましくは約１％〜約５％の界面活性剤を含むであろう。
典型的に、本組成物は、約０.５％〜約５０％の洗浄性ビルダー、好ましくは約１％〜約１０％含むであろう。
【００９８】
好ましいｐＨは、約７〜約１２の範囲にあるべきである。慣用のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸が、調整の必要があれば使用することができる。
【００９９】
溶媒は、本組成物に含まれてもよい。有用な溶媒には、グリコールエーテル、例えばジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテル、並びにジオール、例えば２,２,４−トリメチル−１,３−ペンタンジオールおよび２−エチル−１,３−ヘキサンジオールが含まれるが、これらに限定されない。使用する場合、このような溶媒は、典型的に、約０.５％〜約１５％、より好ましくは約３％〜約１１％のレベルで存在する。
【０１００】
付加的に、高度揮発性溶媒、例えばiso-プロパノールまたはエタノールは、表面に対して本組成物の“十分な強さでの”塗布後に濯がれない場合、表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本発明において使用することができる。使用される場合、揮発性溶媒は、典型的に、約２％〜約１２％のレベルで本組成物中に存在する。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
本発明のその他の例示において、本発明の一つ以上の変異体を含む皿洗浄組成物である。ここで使用される場合、“皿洗浄組成物”は、顆粒状および液状に限らずに、皿類をクリーニングするための全ての形状の組成物を言及する。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
パーソナルケア組成物
本発明のプロテアーゼ複合体は、パーソナルケア組成物での使用にとくに適切であり、例えば、リーブ・オンおよびリンス・オフヘアコンディショナー、シャンプー、リーブ・オンおよびリンス・オフにきび組成物、フェイシャルミルクおよびコンディショナー、シャワージェル、石鹸、泡立ちおよび非泡立ちフェイシャルクレンザー、化粧品、ハンド、フェイシャル、およびボディーローション、モイスチャライザー、パッチ、およびマスク、リーブ・オンフェイシャルモイスチャライザー、化粧品およびクレンジングワイプ、口腔ケア組成物、月経の、およびコンタクトケア組成物である。本発明のパーソナルケア組成物は、本発明の一つ以上のプロテアーゼ組成物およびパーソナルケアキャリアを含む。
【０１０６】
説明するために、本発明のプロテアーゼ複合体は、下記参考文献に記載された組成物中の含有物に対して適当であり： 1997年6月24日発行のLinaresらの米国特許第5,641,479号（スキンクレンザー）; 1997年2月4日発行のWivellらの米国特許第5,599,549号（スキンクレンザー）; 1996年12月17日発行のHaらの米国特許第5,585,104号（スキンクレンザー）; 1996年7月30日発行のKefauverらの米国特許第5,540,852号（スキンクレンザー）; 1996年4月23日発行のDunbarらの米国特許第5,510,050号（スキンクレンザー）; 1997年3月18日発行のGuang Linらの米国特許第5,612,324号（坑にきび調製物）; 1996年12月24日発行のWarrenらの米国特許第5,587,176号（坑にきび調製物）; 1996年8月27日発行のVenkateswaranの米国特許第5,549,888号（坑にきび調製物）; 1995年11月28日発行のCorlessらの米国特許第5,470,884号（坑にきび調製物）; 1997年7月22日発行のGordonらの米国特許第5,650,384号（シャワージェル）; 1997年3月4日発行のMooreらの米国特許第5,607,678号（シャワージェル）; 1997年4月29日発行のCoffindafferらの米国特許第5,624,666号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1997年4月8日発行のBolichらの米国特許第5,618,524号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1997年3月18日発行のInmanの米国特許第5,612,301号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1996年11月12日発行のWellsの米国特許第5,573,709号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1996年1月9日発行のPingsの米国特許第5,482,703号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1994年4月12日再発行のGroteらの米国再発行特許第34,584号（ヘアーコンディショナーおよび／またはシャンプー）; 1997年6月24日発行のDateらの米国特許第5,641,493号（化粧品）; 1997年2月25日発行のBlankらの米国特許第5,605,894号（化粧品）; 1996年12月17日発行のYoshiokaらの米国特許第5,585,090号（化粧品）; 1990年7月3日発行のCheneyらの米国特許第4,939,179号（ハンド、フェイス、および／またはボディーローション）; 1997年3月4日発行のMcAteeらの米国特許第5,607,980号（ハンド、フェイス、および／またはボディーローション）; 1977年8月30日発行のRichterらの米国特許第4,045,364号（化粧品およびクレンジングワイプ）; 1994年10月12日公開のTouchetらの欧州特許出願 EP 0 619 074号（化粧品およびクレンジングワイプ）; 1990年12月4日発行のBrown−Skrobotらの米国特許第4,975,217号（化粧品およびクレンジングワイプ）; 1992年3月17日発行のSeibelの米国特許第5,096,700号（口腔クリーニング組成物）; 1991年7月2日発行のSampathkumarの米国特許第5,028,414号（口腔クリーニング組成物）; 1991年7月2日発行のBenedictらの米国特許第5,028,415号（口腔クリーニング組成物）; 1991年7月2日発行のBenedictらの米国特許第5,028,415号（口腔クリーニング組成物）; 1989年9月5日発行のDaviesらの米国特許第4,863,627号（コンタクトレンズクリーニング液）; 1988年5月24日再発行のHuthらの米国再発行特許第32,672号（コンタクトレンズクリーニング液）;および1986年9月2日発行のSchaferの米国特許第4,609,493号（コンタクトレンズクリーニング液）。
【０１０７】
本発明の口腔クリーニング組成物をさらに説明するために、医薬的に許容可能量の本発明の一つ以上のプロテアーゼ複合体が、歯または義歯からタンパク質性の汚れを除去するために有用な組成物中に含有される。ここで使用される場合、“口腔クリーニング組成物”は、歯磨き剤、練り歯磨き、ジェル状歯磨き、歯磨き粉、マウスウォッシュ、マウススプレー、マウスジェル、チューインガム、薬用ドロップ（ロゼンジ）、香粉（サッシェ）、タブレット、バイオゲル、歯の掃除用ペースト、歯科の治療液等を言及する。好ましい口腔クリーニング組成物は、組成物に対して約０．０００１重量％〜約２０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約１０重量％、さらに好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％の本発明の一つ以上のプロテアーゼ複合体と、医薬的に許容可能なキャリアとを含む。ここで使用される場合、用語“医薬的に許容可能な”とは、不適切な毒性、不適合性、非安定性、刺激、アレルギー反応等を伴うことなく、合理的な利益／危険率に同等で、ヒトおよび下等動物の組織との接触に適当な薬、薬剤、または不活性成分を意味する。
【０１０８】
典型的な、口腔クリーニング組成物の口腔クリーニング成分の医薬的に許容可能な口腔クリーニングキャリア成分は、一般的に、組成物に対して約５０重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５重量％〜約９９．９９重量％、より好ましくは約６５重量％〜約９９重量％含まれるであろう。
【０１０９】
本発明の口腔クリーニング組成物に含有されてもよい医薬的に許容可能なキャリア成分および任意成分は、当業者によく知られているものである。口腔クリーニング組成物に有用な広範な種類の組成物タイプ、キャリア成分および任意成分は、上記引用文献に開示されている。
【０１１０】
本発明のその他の実施態様において、口腔外の義歯を洗浄するための義歯クリーニング組成物は、本発明の一つ以上のプロテアーゼ複合体を含む。そのような義歯クリーニング組成物は、組成物に対して好ましくは約０．０００１重量％〜約５０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約３５重量％、さらに好ましくは約０．０１重量％〜約２０重量％の有効量のプロテアーゼ複合体の一つ以上と、義歯クレンジングキャリアとを含む。発泡性の錠剤等のような種々の義歯クレンジング組成物の形式等は、当業界でよく知られており（Youngの米国特許第5,055,305号参照）、義歯からタンパク質性の汚れを除去するためにプロテアーゼ複合体の一つ以上の導入が概ね適切である。
【０１１１】
本発明のその他の実施態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は、本発明の一つ以上のプロテアーゼ複合体を含む。そのようなコンタクトレンズクリーニング組成物は、組成物に対して好ましくは約０．０１重量％〜約５０重量％のプロテアーゼ複合体の一つ以上、より好ましくは約０．０１重量％〜約２０重量％、さらに好ましくは約１重量％〜約５重量％の有効量のプロテアーゼ複合体の一つ以上と、コンタクトレンズクリーニングキャリアとを含む。錠剤、液体等のような種々のコンタクトレンズクリーニング組成物の形式等は、当業界でよく知られており、コンタクトレンズからタンパク質性の汚れを除去するために本発明のプロテアーゼ複合体の一つ以上の導入が概ね適切である。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
セルロースおよび／またはポリエステルからなる織物吸収材シート上に上記組成物を、吸収材シートの重量に対して、約２５０重量％として含浸させる。
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