(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母若しくは胞子性微生物を殺し、又はその成長を阻害する組成物であって、ハロペルオキシダーゼ及び少なくとも１つの下式の抗菌活性増強剤を具備した組成物：
0003723209.tif 000026
ここで、Ｒ1は水素、無置換であるか、またはヒドロキシ若しくはアミノ置換された１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、または無置換であるか、またはヒドロキシ若しくはアミノ置換された７から１２の炭素原子を有するアリールアルキル基であり、Ｒ2は、水素、または１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である。
【請求項２】
ハロペルオキシダーゼが、ミエロペルオキシダーゼ、エオシノフィルペルオキシダーゼ、またはこれらの組合せである、請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
抗菌活性増強剤が、グリシン、およびアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、フェニルアラニン、チロシンのｌ−若しくはｄ−エナンチオマー、およびこれらのアルキルエステルからなる群より選択されるα−アミノ酸である、請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項４】
ハロペルオキシダーゼが、ミエロペルオキシダーゼである、請求の範囲第２項に記載の組成物。
【請求項５】
液体担体中に少なくとも０．０１pmol/mlのミエロペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第４項に記載の組成物。
【請求項６】
０．１pmol/mlから５００pmol/mlのミエロペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第５項に記載の組成物。
【請求項７】
０．５pmol/mlから５０pmol/mlのミエロペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第５項に記載の組成物。
【請求項８】
液体担体中に少なくとも０．００５μmol/mlの抗菌活性増強剤を含有する、請求の範囲第３項に記載の組成物。
【請求項９】
０．０５μmol/mlから５０μmol/mlの抗菌活性増強剤を含有する、請求の範囲第８項に記載の組成物。
【請求項１０】
ハロペルオキシダーゼが、エオシノフィルペルオキシダーゼである、請求の範囲第２項に記載の組成物。
【請求項１１】
液体担体中に少なくとも０．０１pmol/mlのエオシノフィルペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第１０項に記載の組成物。
【請求項１２】
液体担体の１mlあたり０．１pmolから５００pmolのエオシノフィルペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第１０項に記載の組成物。
【請求項１３】
０．５pmol/mlから５０pmol/mlのエオシノフィルペルオキシダーゼを含有する、請求の範囲第１１項に記載の組成物。
【請求項１４】
１０nmol/mlから１０μmol/mlのブロマイドを更に含有する、請求の範囲第１１項に記載の組成物。
【請求項１５】
過酸化水素、またはオキシダーゼに対する基質の存在下でパーオキサイドを産生することができるオキシダーゼを更に含有する、請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項１６】
オキシダーゼに対する基質の存在下で、１分につき、１mlあたり１００pmolから５０μmolのパーオキサイドを生成するのに効果的なパーオキサイド産生オキシダーゼを含有する、請求の範囲第１５項に記載の組成物。
【請求項１７】
インビトロで酵母若しくは胞子性微生物を殺し、又はその成長を阻害する方法であって、パーオキサイド及びクロライド若しくはブロマイドの存在下で、該微生物を請求の範囲第１項〜第１６項の何れか１項に記載の組成物と接触させることを具備した方法。
【請求項１８】
酵母若しくは胞子性微生物の成長を阻害するための薬剤の製造において、請求の範囲第１項〜第１６項の何れか１項に記載の組成物を使用する方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１項〜第１６項の何れか１項に記載の組成物を含有する殺菌−滅菌溶液。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項に記載の殺菌−滅菌溶液であって、０．１pmol/mlから５００pmol/mlのミエロペルオキシダーゼ、エオシノフィルペルオキシダーゼ又はこれらの組合せ、並びに０．００５μmol/mlから５０μmol/mlの、グリシン、およびアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、フェニルアラニン、チロシンのｌ−若しくはｄ−エナンチオマー、およびこれらのアルキルエステルからなる群より選択されるα−アミノ酸を液体担体中に含有するもの。
【請求項２１】
請求の範囲第１項〜第１６項の何れか１項に記載の組成物を含有する、コンタクトレンズの殺菌若しくは滅菌に使用するための眼用溶液。
【請求項２２】
請求の範囲第２１項に記載の眼用溶液であって、０．１pmol/mlから５００pmol/mlのミエロペルオキシダーゼ、エオシノフィルペルオキシダーゼ又はこれらの組合せ、並びに０．００５μmol/mlから５０μmol/mlの、グリシン、およびアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、フェニルアラニン、チロシンのｌ−若しくはｄ−エナンチオマー、およびこれらのアルキルエステルからなる群より選択されるα−アミノ酸を液体担体中に含有するもの。
【発明の詳細な説明】
本発明の分野
本出願は、１９９１年２月２１日に提出された米国特許出願シリアル番号０７／６６０，９９４の一部継続出願である。
本発明は、酵母及び胞子の形態の微生物を殺傷するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、系の抗菌活性を増強する薬剤及び殺菌性を増強するハロペルオキシダーゼの組み合わせを用いた方法及び組成物に関する。
本発明の背景
ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１４４８４に開示されているように、ミエロペルオキシダーゼ及びエオシノフィルペルオキシダーゼのようなハロペルオキシダーゼは、パーオキサイド及びハライドの存在下において、望ましい微生物を除去すること、又は標的微生物の環境において宿主細胞及び正常叢のような媒体の他の成分に重大な損傷を与えることなく、標的微生物に選択的に結合し、且つその成長を阻害するために使用されうる。三重のペルオキシダーゼ及びエオシノフィルペルオキシダーゼは、基質として適切なハライド共同因子（Ｘ-）及び過酸化水素が存在する場合、天然系において微生物の殺傷活性を示すことがすでに知られている（Klebanoff, 1968, J. Bacteriol. 95:2131-2138）。しかし、ハロペルオキシダーゼ結合の選択的な性質並びに治療、研究及び工業的応用のためのこれらの系の利用は、最近認識されてきたばかりである。新たに開発されたハロペルオキシダーゼの選択的特性によって、病原性微生物のような標的微生物が、正常叢のメンバーのような所望の微生物に対する結合能よりも大きい結合能をハロペルオキシダーゼに対して有している場合、標的微生物は、所望の微生物によるハロペルオキシダーゼの結合がわずかに起こるか、又は全く起こらずに、ハロペルオキシダーゼを選択的に結合する。パーオキサイド及びハライドの存在下で、標的に結合されたハロペルオキシダーゼは、ハライドの酸化を触媒し、標的微生物表面で、一重項の分子状酸素（1Ｏ2）へのパーオキサイドの不均化を促進し、所望の微生物又は生理学的媒体に対して最小の付帯的なダメージで、標的微生物を選択的に殺傷する。従って、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１４４８４に開示されているように、ミエロペルオキシダーゼ又はエオシノフィルペルオキシダーゼは、ヒト及び動物対象の治療又は予防的な処置における殺菌剤として使用され、宿主細胞及び宿主の正常叢に対して、最小の付帯的なダメージで病原性微生物に選択的に結合し、これを殺傷する。
該系はまた、in vitroでの標的微生物の成長を阻害するための消毒又は滅菌製剤に使用されうる。特に生物医学的装置が、引き続きin vivoで使用される場合に、包帯、外科用器械、縫合器、カテーテル、歯科用器具、コンタクトレンズ等のような生物医学的な装置が、殺菌処理され、対象の宿主細胞を損傷することなく、標的微生物の成長を阻害するような適用に使用されうる。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１４４８４で開示されたハロペルオキシダーゼ殺菌系には、病原性微生物の治療において高い効果があることが見いだされているが、酵母及び胞子を形成する微生物は、ハロペルオキシダーゼ抗微生物活性に対する免疫を相対的に残している。
微生物のライフサイクルの胞子の段階は、代謝の休眠状態及びその成長期における微生物を破壊するであろう環境因子に対する耐性によって特徴づけられる。胞子の発芽の最も早い段階は、膨張及び休止状態から活発な代謝へのシフトによって特徴づけられる。植物の生長、例えば発芽及び最終的には再生が起こる。
細菌性の内性胞子及び菌性胞子の発芽は、代謝の増加及び減少された熱及び化学反応剤に対する耐性の減少に関係する。発芽が起こるためには、周囲環境が発芽及び育成を維持させるのに適切であることを胞子が感知しなければならない。アミノ酸ｌ−アラニンが、細菌性胞子の発芽を刺激することが報告されている（Hills,1950,J,Gen Microbiol 4:38;Halvorson and Church,1957,Bacteriol Rev 21:112）。ｌ−アラニン及びｌ−プロリンも菌性胞子の発芽を開始させることが報告されている（Yanagita,1957,Arch Microbiol 26:329）。
グリシン及びｌ−アラニンのような単純なα−アミノ酸は、代謝の中心地位を占める。α−アミノ酸のトランスアミノ化又は脱アミノ化で、代謝及び成長に必要な糖原生成又はケトン生成の炭水化物及び窒素が得られる。例えば、ｌ−アラニンのトランスアミノ化又は脱アミノ化で、糖代謝の最終産物であるピルベート（pyruvate）が得られる（Embden-Meyerhof-Parnas Pathway）。ピルベートデヒドロゲナーゼ錯体によるピルベートの酸化は、アセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ、Ｈ+、及びＣＯ2を与える。アセチル−ＣｏＡは、トリカルボン酸回路（クレブス回路）の開始剤基質であり、これはまた、ミトコンドリアの電子伝達系に供給される。アセチルＣｏＡはまた、脂肪酸合成並びにステロール合成の根本的な炭素源でもある。単純なα−アミノ酸は、発芽及び引き続いて起こる代謝活性に必要な窒素、ＣＯ2、糖原生成及び／又はケトン合成の等価体を提供しうる。
Zgliczxnskiら（1968, European J. Biochem 4:540-547）は、ミエロペルオキシダーゼが、過酸化水素によってアミノ酸のクロライド依存酸化を触媒し、アンモニア、二酸化炭素及び脱カルボン酸化され、脱アミノ化されたアミノ酸に対応するアルデヒドを与えることをを報告し、Straussら（1970, J. Reticuloendothel Soc 7:754-761）は、そのように産生されたアルデヒドが、殺菌剤として供与されうることを仮定した。しかし、Paulら（1970,Infect Immun 2:414-418）は、α−アミノ酸グリシン及びｌ−アラニンをミエロペルオキシダーゼ−過酸化水素−クロライド試験系に添加すると、Escherichia coliの殺傷が実際に阻害されることを報告した。更に、Klebanoff（1975,Semin Hemat 12:117-142）は、１００ｍＭのアセトアルデヒドが殺菌活性に必要であることを報告した。これらの発表データとは逆に、驚くことに、酵母及び微生物の胞子形態に対するハロペルオキシダーゼの殺菌作用が、抗菌作用増強剤として供給される幾つかのα−アミノ酸と組み合わせて、微生物をハロペルオキシダーゼで処理することによって十分増強されうることが、新たに見いだされた。
本発明の概要
本発明に従えば、過酸化水素及びクロライド若しくはブロマイドの存在下で、微生物をハロペルオキシダーゼ及び少なくとも１種の抗菌作用増強剤と接触することを具備した酵母又は胞子微生物を殺傷するか、その成長を阻害する方法及び組成物を提供する。適切な抗菌活性増強剤には、幾つかのα−アミノ酸が含まれ、好ましくは下式の化合物である。
0003723209.tif 000002
但し、Ｒ1は水素、無置換であるか、或いはヒドロキシ若しくはアミノ置換された１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、又は無置換であるか、或いはヒドロキシ若しくはアミノ置換された７から１２の炭素原子を有するアリールアルキル基であり、Ｒ2は、水素、又は１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である。一態様では、本発明の方法及び組成物は、in vitroで酵母及び胞子微生物を殺傷し、医薬用製品若しくは材料をを殺菌若しくは滅菌するために使用される。他の態様では、該方法及び組成物は、所望の微生物を除去すること、又はホスト細胞を有意に損傷することなく、ヒト又は動物対象の抗菌処理及び抗酵母処理に使用されうる。ハロペルオキシダーゼの抗酵母及び抗菌胞子活性が、幾つかのα−アミノ酸の存在下で有意に増強されることが見いだされた。更にパーオキサイド及びハライドが存在する場合、標的に結合したハロペルオキシダーゼ派、ハライド酸化を触媒し、胞子を形成する微生物の表面において過酸化物の一重項分子酸素の不均化を促進し、標的微生物を殺傷する。ハロペルオキシダーゼ活性は、添加されたα−アミノ酸の一部の脱アミノ化、脱カルボキシル化を触媒し、アルデヒドを与えるようであるが、このようなアルデヒドは、このような低濃度で殺菌作用に十分寄与するようには思われない。α−アミノ酸は、ハロペルオキシダーゼで生成された次亜過塩素酸と一重項分子酸素を消費することによって、殺菌作用の穏和な濃度依存性競争阻害を示す。
十分に増強されたハロペルオキシダーゼ抗酵母及び抗胞子活性は、ヒト若しくは動物の治療若しくは予防的な殺菌処理、及びin vivoでの成長した微生物、酵母、並びに細菌及び真菌性の胞子を殺菌及び滅菌するための応用において、本発明の方法及び組成物を高度に有効にしうる。
本発明の方法及び組成物に使用するのに適したハロペルオキシダーゼには、エオシノフィルペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）が含まれる。本発明の代表的な抗菌活性増強剤には、グリシン及びアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンのｌ−若しくはｄ−エナンチオマー、及びこれらのアルキルエステルよりなる群から選択されるα−アミノ酸が含まれる。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、広範囲には、ハロペルオキシダーゼ及びハロペルオキシダーゼの殺菌活性に対して酵母及び微生物の胞子形態を不安定化する抗菌活性増強薬を使用し、酵母及び胞子を形成する微生物を殺傷若しくは抑制するための方法及び組成物に関する。本発明の実施において、酵母及び微生物の胞子形態が、該微生物をパーオキサイド及びブロマイド若しくはクロライドの存在下で効果的なハロペルオキシダーゼ及び抗菌活性剤、即ち幾つかのα−アミノ酸の所定量と接触することによって殺傷若しくは抑制され、該微生物の成長を阻害するか又は殺傷する。１つの特に好ましい態様において、本発明の方法及び組成物は、殺菌及び真菌を含めた広範囲の病原性微生物に対して増強されたハロペルオキシダーゼ抗胞子活性及び抗酵母活性を示す殺菌剤として使用される。宿主組織との接触に使用するためには、殺菌系は、病原性微生物に対して選択的な親和性を示す二酸素化を行うハロペルオキシダーゼ酵素の使用を基本とする。有効性の高い殺菌作用は、関連した宿主組織を破壊すること若しくは正常叢を崩壊することなくそのまま標的微生物に向けられ得る。即ち、殺菌作用は標的微生物に選択的であり、これに制限される。
相応に処方される場合、ハロペルオキシダーゼ増強剤の製剤は、材料及び装置を殺菌すること及び滅菌にさえも使用される。有効性の高いハロペルオキシダーゼ増強剤の処方は、製剤をin vitroで殺菌若しくは滅菌するように供されうる。過酸化水素の有効な期間に限りがあるので、ハロペルオキシダーゼ増強剤の処方は、宿主組織度接触する前に材料若しくは装置の殺菌及び滅菌さえも保証するのに十分有効であり得る。これらの有効性の高い処方の使用に関連した正常叢及び宿主組織に対する何れの可能な毒性もパーオキサイドが消費されたときに無くなり、処方により処理された材料又は装置を、毒性を除去するための追加の洗浄をすることなく、そのまま宿主組織に接触させることができる。
本発明の代表的な組成物は、（１）エオシノフィルペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）及び／又はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、（２）過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）若しくは等価な過酸化物、又はＨ2Ｏ2の生成のためのオキシダーゼ、（３）オキシダーゼのための基質、及び（４）グリシン若しくはｌ−アラニンのような抗菌活性増強剤を具備する。
現時点で好ましい１つの態様において、本発明は、in vitro、特に、包帯、外科用器械、縫合器、カテーテル、歯科用器具、コンタクトレンズ等のような生物医学的な装置を殺菌若しくは滅菌する必要があり、該装置を引き続き宿主組織と接触させる様な適用において酵母及び胞子性微生物の成長を阻害するための方法及び組成物を提供する。本発明の方法及び組成物はまた、in vivoでの酵母又は胞子を形成する微生物による感染を治療若しくは防止するのにも使用される。
本発明で有効なハロペルオキシダーゼは、ハライド：過酸化水素オキシドリダクターゼ（例えば、国際生化学連合（the International Union of Biochemistry）のＥＣ  Ｎｏ．１．１１．１．７及びＥＣ  Ｎｏ．１．１１．１．１０）として定義される。ここで、ハライド、即ちクロライド若しくはブロマイドは電子供与体若しくは還元剤であり、パーオキサイドは電子受容体若しくは酸化剤である。過酸化水素から一重項分子酸素のハライド依存性の生成を触媒し、標的微生物に選択的に結合するいずれかのハロペルオキシダーゼを本発明で使用しうる。現在特に好ましいハロペルオキシダーゼには、ここで示されるような、エオシノフィルペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）及びこれらの組み合わせが含まれる。抗菌性増強剤に含まれるものは、ここで詳細に説明されるように、酵母及び胞子微生物に対してオキシダーゼハロペルオキシダーゼ系の殺菌能を著しく増加する。これは、該増強剤がハロペルオキシダーゼ系の殺菌作用に対してこれらの形態を不安定化するためである。
本発明の抗菌活性増強剤は、酵母及び胞子微生物に対するハロペルオキシダーゼ抗菌系の抗菌活性を増強する試薬であり、該系のハロペルオキシダーゼの逆の効果又はこの方法及び組成物の使用環境で望まない効果を生じない様な濃度で使用される。現在の本発明の好ましい活性増強剤には、下式のα−アミノ酸化合物が含まれる。
0003723209.tif 000003
但し、Ｒ1は水素、１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、又は無置換であるか、或いはヒドロキシ若しくはアミノ置換された７から１２の炭素原子を有するアリールアルキル基であり、Ｒ2は、水素、又は１から６の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である。ここで使用される、アミノ酸は、先に示されるようにこれらの酸で形態であってもよく、又は下式で表されるこれらの双性イオンの形態であってもよい。
0003723209.tif 000004
Ｒ1及びＲ2はの意味は先に説明したとおりである。また、該アミノ酸は、ｌ−若しくはｄ−エナンチオマーの配置のいずれかであり得る。代表的なアルキルＲ1基には、例えばメチル、ヒドロキシメチル、イソプロピル、２−イソブチル、１−イソブチル、ヒドロキシエチル及びアミノブチル基が含まれる。代表的なアリールアルキルＲ1基には、例えば、トリル及びヒドロキシトリル基が含まれる。現在特に好ましいアルキルＲ2基には、メチル及びエチル基が含まれる。代表的な本発明の抗菌活性増強剤には、グリシン並びにアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、フェニルアラニン、チロシンのｌ−及びｄ−エナンチオマー、並びにこれらのアルキルエステルよりなる群から選択されるα−アミノ酸が含まれる。現在最も好ましい抗菌活性増強剤はグリシン及びｌ−アラニンである。
胞子壁の特徴及び厚さが、一重項分子酸素及び次亜過塩素酸の致死作用に対する防御を行う。真菌性胞子に関連して、α−アミノ酸で誘導される胞子の発芽は、酸化剤に対してより影響を受けやすい生長した形態を与える。加えて、本発明の抗菌活性増強剤は、Candida albicansを含めた酵母の生長した形態のオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷も増加させることが見いだされている（下記の表１参照）。この現象は、酵母の成長及び発芽のα−アミノ酸に依存した促進及びハロペルオキシダーゼによる殺傷に対してこのような代謝的に活性な形態の増加された感染性に関連しうる。一つの他の可能性は、α−アミノ酸、又はその代謝産物がＨ2Ｏ2を生成することができる真菌性オキシダーゼに対する基質として作用することである。この他の可能性は、ハロペルオキシダーゼで媒介されるα−アミノ酸の脱アミノ化−脱カルボキシル化によるアルデヒド産物が、成長及び発芽を誘導するか、さもなければ幾つかの生命維持に必要なプロセスに影響するかもしれないということである。
本発明のハロペルオキシダーゼ組成物の殺菌活性には、パーオキサイド及びブロマイド若しくはクロライドが反応し、次亜ハロゲン酸塩を形成すること、及びパーオキサイドと次亜ハロゲン酸塩とが反応し、一重項分子酸素を生成することが含まれるので、本発明の組成物の活性は、抗菌活性部位における適切なパーオキサイドとハライドの存在に依存する。幾つかの状況では、パーオキサイド（例えば、過酸化水素）は、例えば天然に存在する菌類の活性によって殺菌活性部位に存在し得、十分な量のクロライドが転換反応の共同因子として作用するように生理学的環境に存在する。これらの状況では、追加の過酸化物又はハライドを投与するか、又は本発明の組成物に含ませる必要は全くない。他の状況では、過酸化水素及び／又はハライドを微生物処理の部位に供与する必要がありうる。従って、本発明の組成物は、更に、所望であればパーオキサイド若しくはin vitro若しくはin vivoでパーオキサイドを生成することができる試薬並びにハライドを包含しうる。
本発明の方法及び組成物で有効なパーオキサイドには、過酸化水素、下式のアルキルハイドロパーオキサイド、
Ｒ−ＯＯＨ
但し、Ｒは水素又は１から３の炭素原子を有する短鎖アルキル基である。
ホウ素過酸化物（boroperoxide）若しくは尿素過酸化物（ureaperoxide）の様な無機過酸化物が含まれる。有機過酸化物の酸化剤活性は、以下のように、一般にＲ鎖の長さが増加するにつれて減少する。
Ｒ＝Ｈ＞＞ＣＨ3＞ＣＨ3ＣＨ2＞ＣＨ3（ＣＨ2）2
本発明の組成物に使用するための現時点で好ましいパーオキサイドは、過酸化水素である。過酸化水素はまた、in vivo又はin vitroで過酸化水素を発生することができる薬剤を本組成物に含有することによって、抗菌活性の部位で利用可能である。この目的のために特に有効な試薬には、例えばコレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びガラクトースオキシダーゼのようなオキシダーゼが含まれる。
in vivoで適用するために本発明の組成物に、過酸化水素を直接に含める場合、使用量は、好ましくは最大の殺菌活性が得られるようにデザインされる。宿主細胞及び組織並びに正常叢のダメージは、高いＨ2Ｏ2にさらす間に直接の接触を避けることによって防止することができる。従って、液体処方に含まれる場合は、本発明の組成物は、液体組成物１mlあたり約１nmolから約１０μmolの過酸化水素、好ましくは液体組成物１mlあたり約５nmolから５μmolの過酸化水素、最も好ましくは１mlの液体組成物あたり約１０nmolから約１μmolの過酸化水素を含有しうる。in vivoで過酸化水素を発生することができる試薬、例えば過酸化物を生成するオキシダーゼは、抗菌活性の部位に存在する過酸化水素の量の機能的な制御に特に有効である。このような試薬は、安定した低レベルの濃度のＨ2Ｏ2を提供し、維持することによって本訴生物の抗菌活性を最大化する。従って、使用されるこのような薬剤の量は、該薬剤の性質及び所望の効果に非常に依存するであろうが、抗菌活性の部位で利用可能なハライドのタイプ及び濃度に依存して、１分につき、１mlの液体あたり約１pmolから約１μmolの定常状態レベルの過酸化水素を生成できることが好ましい。処方が、殺菌剤で無菌にした溶液として使用されうる場合、オキシダーゼ及びその基質は、要求される無菌期間にみあった相対的に高い定常状態濃度のＨ2Ｏ2が得られるように調製しうる。殺菌により無菌化する作用は、オキシダーゼ基質が使用し尽くされると停止される。つまり、オキシダーゼ分解の速度に関連する。
抗菌性に対しては、Ｈ2Ｏ2を産生するオキシダーゼとして、例えばNocardia erythropolisから得られるコレステロールオキシダーゼを使用することが現在特に好ましい。原核性の細菌とは異なり、親菌類はステロールを合成する。実際に、アンホテリシンＢは、真菌の膜ステロイド、例えばエルゴステロールの結合に少なくとも部分的に依存する。エルゴステロールは、他のステロールが存在するが、ほとんどの真菌類の支配的なステロール構成要素である（Weete,1973,Phytochemistry 12:1843）。Nocardia erythropolisから得られるコレステロールオキシダーゼは、Δ5−３β−オール及び５α−３β−オールを、ケトンを生じるように選択的に酸化する（Smith and Brooks, 1974, J. Chromatography 101:373）。例えば、以下の通りである。
コレステロール＋Ｏ2−コレステロールオキシダーゼ
→コレステノン＋Ｈ2Ｏ2
エルゴステロール＋Ｏ2−コレステロールオキシダーゼ
→エルゴステノン＋Ｈ2Ｏ2
このNocardiaオキシダーゼは、相対的に熱に安定であり、５０℃で触媒活性を保持する。これは、４から９のｐＨ範囲で活性であり、ｐＨ７で最大の活性を有する。これは、１．４×１０-5mol/リットルののMichaelis定数（Ｋｍ）を有する（Richmond, 1973, Clin Chem. 19:1350）。
ハロペルオキシダーゼは、これがＨ2Ｏ2と供に存在するか、又はＨ2Ｏ2を生成するオキシダーゼと組み合わせると、殺菌性である。しかし、オキシダーゼとしてコレステロールオキシダーゼを使用すると、オキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼの菌類の殺傷性は、Ｈ2Ｏ2の生成単独から予想されるよりも大きい。殺菌作用におけるこのコレステロールオキシダーゼ依存性の増加は、真菌性ステロイドのオキシダーゼによる消耗から生じる真菌膜の完全性の崩壊に部分的に関連しうる。真菌類はまた、内因性のＨ2Ｏ2を生成するステロールオキシダーゼを合成する。
本発明の方法及び組成物に使用するのに適したハライドは、ブロマイド又はクロライドである。個々の応用で用いられるハライドの使用、選択、及び量は、殺菌剤組成物に使用されるハロペルオキシダーゼ、所望の治療効果、パーオキサイドの利用可能性及び他の因子のような種々の因子に依存する。ハロペルオキシダーゼがミエロペルオキシダーゼである場合、ハライドはブロマイド又はクロライドであり得る。クロライドが、該ハライド共同因子として制限されない十分なレベルでほとんどの生理学的媒体に存在するので、外来源からのクロライドは一般に不要である。外来源のクロライドが必要である場合は、使用されるクロライドの量は、好ましくは、生理学的条件に近い溶液の１mlあたり、約１０μmolのクロライドから約１５０μmolのクロライドの範囲である。ハロペルオキシダーゼがエオシノフィルタルオキシダーゼである場合、クロライドは、共同因子としては相対的に効果的ではない。従って、好ましいハライドはブロマイドである。液体組成物に含まれる場合には、本発明の組成物は、液体組成物の１mlあたり、約１nmolのブロマイドから約２０μmolのブロマイド、好ましくは１mlの液体組成物あたり、約１０nmolのブロマイドから１００nmolのブロマイド、最も好ましくは、１mlの液体組成物あたり、約１００nmolのブロマイドから約１μmolのブロマイドを含有する。
パーオキサイドに対するハライドの割合は、効果的な殺菌剤環境を形成するための重要な考慮事項である。従って、上述のように、微生物の攻撃部位でのハライド及びパーオキサイドの効果的なレベルを保証することに加えて、最適の殺菌活性を提供するハライド：パーオキサイド比で、本発明の方法を実施することが好ましい。例えば、ハロペルオキシダーゼがＭＰＯであり、ハライドがＣｌ-であり、パーオキサイドに対するＣｌ-の比が、殺菌活性の環境において約１から約４０，０００、より好ましくは約５０から約４０，０００、最も好ましくは約２００から約４０．０００の範囲を維持できることが好ましい。ハライドがＢｒ-である場合、パーオキサイドに対するＢｒ-の比は、好ましくは、殺菌活性の環境において、約０．１から約４，０００、より好ましくは、約０．５から約２，０００、最も好ましくは約１から約１，０００の範囲に維持される。
本発明の方法及び組成物は、広範囲のスペクトルの胞子性微生物の成長を、好ましくは正常叢へのダメージを最小にして阻害するために使用されうる。ここで使用される「胞子性微生物」の語は、細菌又は真菌の胞子形態を含むことを意図する。胞子を形成する微生物は周知であり、例えば、Bacillus sps.及びClostridium sps.のような細菌、並びにAspergillis sps.、Fusarium sps.、Trichophyton sps等のような真因類が含まれる。
ここで使用される「正常叢」の語は、共生レベルで健康な宿主内又はその体表面に通常生息する細菌を意味する。正常叢には、例えばヒト対象の口中、腸内、又は膣内の細菌の酪酸ファミリー、例えば口中のStreptococcus（緑色（Viridans））、および母乳が与えられる乳児、外生殖器、前部尿及び膣内のLactobacillus sp.（例えばTissier's bacillus及びDoderlein's bacillus）が含まれる。宿主の正常叢を構成する微生物は周知である（例えば、Principles and Practice of Infectious Diseases, supra, New York, pp.34-36及び161）。本発明のハロペルオキシダーゼは、正常叢に優先して多くの病原性細菌及び真菌に選択的に結合する。in vivoでの適用において、宿主は、該宿主から正常叢を除去するのに効果的でない量のハロペルオキシダーゼで処理することが好ましい。殺菌−消毒のためのin vitroでの適用において、十分に高い濃度のハロペルオキシダーゼを、全ての成長及び酵母形態を完全に殺傷することを保証するために使用しうる。このような条件下で、宿主組織及び正常叢のダメージは、宿主組織と接触される前に、Ｈ2Ｏ2又はＨ2Ｏ2−生成系の消費によって防止される。
本発明の組成物は、効果的な量のハロペルオキシダーゼ及び抗菌活性増強剤を、パーオキサイド及びハライドの存在下で含有し、酵母又は胞子性微生物を殺傷するか、又はその成長を阻害する。該組成物は、都合よくは液体担体として提供される。該担体が、ハロペルオキシドの選択的な結合能力又は酵素活性を十分に妨害しない限り、いずれの液体担体でもこの目的に使用することができる。この他には、該組成物は液体に溶解したときに活性化される固体形態で提供されうる。本発明の組成物は更に、先に詳述したように、パーオキサイド又はオキシダーゼのようなパーオキサイドを生成しうる試薬を含有しうる。オキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ系は、二成分処方として構築するのに向いている。該二成分の一部分は、オキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ及び抗菌活性増強剤、例えばグリシン若しくはｌ−アラニンを含有する溶液を包含する。該二成分の第二の部分は、オキシダーゼに対する基質、例えばコレステロールオキシダーゼの場合は、コレステロール、又は分子状酸素、Ｏ2を含有する。該基質は、例えば固体ウェハーの形態で提供されうる。物品、例えばコンタクトレンズの殺菌に対しては、コレステロールウェハーを該品目と供に単独で殺菌容器に置き殺菌する。コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ、更にはグリシン若しくはｌ−アラニンを、殺菌を開始するために添加する。この組成物は、コレステロールの溶解並びにオキシダーゼによる利用を促進するためにアルコールを更に包含しうる。この系は、十分なコレステロールが反応を進行するために存在する限り、殺菌活性を維持するであろう。
in vivoでの適用に対して、殺菌組成物は、ヒト及び動物対象を含めた温血動物に何れかの効果的な薬学的許容しうる形態、例えば局所的な洗浄、経口又は坐薬投与量形態で、局所、バッカル（buccal）、又は鼻腔内スプレー、又微生物感染の部位に活性なハロペルオキシダーゼを輸送するのに効果的な何れかの他の方法で投与されうる。投与の経路は、好ましくは殺菌組成物の感染性微生物との直接の接触を得るようにデザインされるであろう。
局所的な適用に対しては、薬学的に許容しうる担体は、液体、クリーム、泡、ローション、又はゲルの形態をとり得、更に、有機溶媒、乳化剤、ゲル化剤、加湿剤、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、防腐剤、時間放出剤、及びマイナーな量の保湿剤（humectants）、封鎖剤（sequestering agent）、色素、香料、並びに局所投与に対する薬学的組成物で一般紙使用される他の成分を含有しうる。
経口又は局所投与のための固体投与量形態には、カプセル、錠剤、ピル、坐薬、粉末、及び顆粒が含まれる。固体投与量形態において、本組成物は、少なくとも１種の、蔗糖、ラクトース、又は澱粉のような不活性希釈剤と混合され得、更に、湿潤剤、緩衝剤、腸溶性コーティング、及び他の当業者に周知の成分を含有しうる。
本発明の他の態様では、本発明の組成物は、医療機器、コンタクトレンズ等であって、特に該装置又はレンズが、患者若しくは使用者に接触して使用されることを意図する場合の殺菌又は滅菌のようなin vitroでの適用に対して特に設計されうる。このタイプの適用に対して、本組成物は、液体又は泡の形態で提供され得、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、及びこのタイプの組成物に一般に見いだされる他の成分と供に提供されうる。本発明の組成物は、微生物感染を防止する部位に本組成物を放出するために、縫い糸、包帯、及びガーゼのような吸着材料に含浸されるか、又は繊維（staples）、ジッパー及びカテーテルのような固相材料の表面にコートされうる。このタイプの他の放出系は、当業者に容易に明らかになるであろう。
本発明の組成物内のハロペルオキシダーゼ及び抗菌活性増強剤の実際の量は、成長期の微生物並びに酵母及び胞子性微生物を殺傷するのに効果的な量のハロペルオキシダーゼ及び抗菌活性増強剤を処理部位で得るように変化しうる。実際に、選択される量は、処理の性質及び部位、所望の応答、抗菌活性の所望の持続及び他のファクターに依存する。一般に、ハロペルオキシガーゼがミエロペルオキシダーゼである場合、本発明の液体組成物は、１mlの液体組成物あたり、少なくとも０．０１ピコモル（pmol）のミエロペルオキシダーゼ、より好ましくは１mlの液体組成物あたり約０．１pmolから約５００pmolのミエロペルオキシダーゼ、最も好ましくは１mlの液体組成物あたり約０．５pmolから約５０pmolのミエロペルオキシダーゼを含有するであろう。エオシノフィルペルオキシダーゼの同様な投与量が使用されうる。必要に応じて、幾つかの適用では、同じ組成物中にエオシノフィルペルオキシダーゼとミエロペルオキシダーゼの両方を含有することが望まれうる。本発明の液体組成物は、一般には、少なくとも０．００５μmol/mlの抗菌活性増強剤、即ちグリシン及びアラニンのようなα−アミノ酸を含有し、より好ましくは０．０５μmol/mlから５０μmol/mlのこのような抗菌活性増強剤を含有する。
パーオキサイドの生成のためのオキシダーゼ、該オキシダーゼの基質、及びハライドのような他の成分には、所望であれば、先に詳述したようなものが含まれる。加えて、本組成物は、一回の処方として処方されうるか、又は特別な適用で望まれるような、使用中に、後で混合するための二回の処方に分割されうる。一回の処方に対して、ハライド、オキシダーゼ、オキシダーゼの補欠分子族、オキシターゼの還元基質、又は分子状酸素のような、適用部位で利用しうる系の成分に要求されるものは、早期の反応及び系の成分の消耗を防ぐために処方から除外されることが好ましい。
例示として、コンタクトレンズ溶液に使用するために適した組成物は、１から２０pmol/mlのエオシノフィルオキシダーゼ及び／又はミエロペルオキシダーゼ、０．１から１μmol/mlのグリシン、０．０１から１０ユニットのグルコースオキシダーゼ、及び５０から５００mEq/Lのクロライドと０．１から１mEq/Lのブロマイドを含有しうる。上記組成物は、嫌気性の条件下で１から１０μmol/mlのグルコースと混合され、完全な製剤は、液体殺菌剤又は滅菌溶液として使用されるまで嫌気性が保持される。空気、即ち分子状酸素にさらされると、該処方の殺菌−滅菌作用が活性化される。
上記のことは、以下の代表的な例と組み合わせてよりよく理解されうる。該例は、例示の目的で提供されるものであり、制限を意味するものではない。
例
例１
細菌、酵母及び真菌性胞子のオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷に関するｌ−アラニンの影響
細菌、酵母及び真菌性胞子のオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷に関するｌ−アラニンの影響を以下のようにして測定した。インキュベーション培地を、Nocardiaerythropolis（Richmond, W., "Preparation and Properties of a Cholesterol Oxidase from Nocardia sp. and Its Applicaton to the Enzymatic Assay of Total Cholesterol in Serum, "Clin. Chem. 19(12):1350-1356（1973）に従って調製した。）から得た０．１ユニット（即ち４μｇ）のコレステロールオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）、１００mEq/LのＣｌ-、及び１mEq/LのＢｒ-を含有する５０mMのアセテートバッファーから調製した。インキュベーション混合物を、Sraph. aureus、Cand. albicans、及びAsperg. fumigatusの１×１０7の細胞を該インキュベーション培地に接種することによって調製した。８．５％のエタノール中のコレステロールを１mM（７μmol/ml）の最終濃度までインキュベーション混合物に添加した。該インキュベーション混合物の最終容積は１mlであった。この混合物を２２℃で４時間インキュベートし、次に、微生物をプレーとかした（S. aureusは、トリプチカーゼ大豆寒天上でプレート化し、C. albicansとA. fumigatusはサブローデキストロース寒天上でプレート化した。）。約２４時間（A. fumigatusに対しては約７２〜９６時間）後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、微生物の生存の尺度として計測した。結果を表１に示した。
0003723209.tif 000005
表１に示されるように、コレステロールオキシダーゼにＭＰＯ若しくはＥＰＯの何れかを加えると強力な抗菌系が得られる。この組合せは、１mMのｌ−アラニンの存在下で１０7のStreprococcus aureusを殺傷する。しかし、コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ系にｌ−アラニンを含めることが、Candida albicansの酵母形態及びAspergillus fumigatusの胞子の完全な殺傷に必要である。
例２
Asperfillus fumigatus胞子に対するハロペルオキシダーゼ
殺菌作用に関する可能なアミノ酸抗菌活性増強剤の影響
ｐＨ６で、１００mEq/Lのクロライド及び０．１mEq/Lのブロマイドを含有する５０mMの酢酸ナトリウムバッファ中の５．６mMのグルコースのインキュベーション培地において、各試験に（コレステロールオキシダーゼに代えて）以下の表２〜８に示される量のグルコースオキシダーゼを含有させた以外、ハロペルオキシダーゼの殺菌作用を増強する試薬としての種々の可能なアミノ酸の影響を例１の手順に従って測定した。以下の表２〜８に示されている可能なアミノ酸活性化剤は、０、５、０．５又は０．０５μmol/mlの最終濃度まで混合物に添加され、該インキュベーション混合物に約１×１０7のAspergillus fumigatusの胞子を接種した。この混合物を、周囲温度で９０分インキュベートし、次いで例１で説明したようにプレート化した。該プレートを３５℃で一夜成長させ、次いで更に２日間成長させた。コロニー形成単位を微生物の生存の尺度として計数した。脂肪族アミノ酸、グリシン、ｌ−アラニン、ｌ−バリン、ｌ−ロイシン及びｌ−イソロイシンを上記のように試験した。結果を表２に示した。
0003723209.tif 000006
表２に示されるように、試験された脂肪族アミノ酸は、A. fumigatus胞子に対して、エオシノフィルペルオキシダーゼ及びミエロペルオキシダーゼの両方のハロペルオキシダーゼ抗菌活性を十分効果的に増強することが示された。また、グリシン及びl−アラニンは最も大きな増強効果を示した。
ジカルボキシルアミノ酸及びアミド、ｌ−アスパラギン酸、ｌ−アスパラギン、ｌ−グルタミン酸及びｌ−グルタミン、並びにイミノ酸、ｌ−プロリン及びｌ−ヒドロキシプロリンを上記のように試験した。結果を以下の表３に示す。
0003723209.tif 000007
表３に示されるように、試験されたジカルボキシルアミノ酸又はイミノ酸は何れも、任意の試験濃度において十分なハロペルオキシダーゼ活性増強効果を示さなかった。
ヒドロキシアミノ酸、ｌ−セリン及びｌ−スレオニン、並びに塩基性アミノ酸、ｌ−リジン、ｌ−ヒスチジン及びｌ−アラニンを上記のように試験した。結果を以下の表４に示す。
0003723209.tif 000008
表４に示されるように、ヒドロキシアミノ酸、ｌ−セリン及びｌ−スレオニンは、両方ともA. fumigatus胞子の得押しのペルオキシダーゼによる殺傷を十分に増強した。一方、ｌ−スレオニン及び塩基性アミノ酸、ｌ−リジンは、ミエロペルオキシダーゼ抗菌活性を増強するのに効果的である。塩基性アミノ酸、ｌ−ヒスチジン及びｌ−アルギニンは、十分な抗菌効果を示さなかった。ヒスチジンは、一重項分子酸素と非常に反応的であり、そのままで、胞子の発芽を刺激するその能力を遮蔽するハロペルオキシダーゼ作用の強力な競争的阻害を起こすことが予想されるであろう。
硫黄アミノ酸、ｌ−システイン及びｌ−メチオニン、並びに芳香族アミノ酸、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−チロシン及びｌ−トリプトファンを上記のように試験した。結果を以下の表５に示した。
0003723209.tif 000009
表５に示されるように、硫黄アミノ酸はエオシノフィルペルオキシダーゼ又はミエロペルオキシダーゼの何れの抗菌活性を増強するのにも効果的ではない。芳香族アミノ酸、ｌ−フェニルアラニン及びｌ−チロシンは両方ともA. fumigatusのエオシノフィルペルオキシダーゼ及びミエロペルオキシダーゼによる殺傷を十分に増強することを示した。これらの硫黄及び芳香族アミノ酸はまた、一重項分子酸素と相対的に反応的であり、胞子の発芽を刺激するこれらの能力を社婦負するハロペルオキシダーゼの作用を競争的に阻害しうる。これは、ｌ−フェニルアラニン及びｌ−チロシンが、低濃度で処理されたときに、最も効果的であるという理由の説明となりうる。
アラニンのエナンチオマー配置並びにアラニンの異性体配置及び誘導体化の影響を上記のように試験した。結果を以下の表６に示す。
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表６に示されるように、アラニンのｌ−及びｄ−エナンチオマーは、A. fumigatusのミエロペルオキシダーゼ及びエオシノフィルオキシダーゼによる殺傷を増強するのに非常に効果的である。一方、β−アラニンは、十分な増強効果を示さなかった。同様に、ｌ−アラニンのメチルエステルは、十分な抗菌活性を増強する。ｌ−アラニン−ｌ−アラニンジペプチドは、十分な増強活性を示さなかった。
スレオニンのエナンチオマー配置の影響も上記のように試験した。結果を表７に示す。
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表７に示されるように、スレオニンのｌ−及びｄ−エナンチオマーは、A. fumigatusのミエロペルオキシド及びエオシノフィルペルオキシダーゼによる殺傷を十分に増強した。
α−アミノ酸を増強するα−ケト酸を用いた効果を、ｌ−アラニン及びピルビン酸、並びにグリシン及びグリオキシル酸で上記のように試験した。結果を以下の表８に示す。
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表８に示されるように、ピルビン酸及びグリオキシル酸はｌ−アラニン及びグリシンの活性増強効果を示さなかった。
例３
他の抗菌系に関する抗菌活性増強剤の影響
一般の抗菌性化合物、ニスタチン（nystatin）及びアンフォテリシンＢの抗菌効果に関するｌ−アラニンの影響を測定するために、例２のハロペルオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼの代わりに、ニスタチン又はアンフォテリシンＢをもしい、０（対照）又は１０μmol/mlのｌ−アラニンを用い、微生物としてFusarium monilifomeを用いて例２の手順を行った。結果を以下の表９に示した。
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表９からわかるように、ｌ−アラニンの添加で、Fusarium moniliformeのニスタチン−依存性の殺傷が倍加するが、Fusarium moniliformeのアンフォテリシンＢ−依存性の殺傷は効果的でない。
上記の手順を、殺菌化合物、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）及び次亜過塩素酸（ＮａＣｌＯ）と、Aspergillis fumigatus及びFusarium moniliformeを用いて繰り返した。結果を以下の表１０に示す。
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アンフォテリンＢと同様に、ｌ−アラニンと組み合わせて使用した場合に、過酸化水素又は次亜過塩素酸の抗菌性の十分な増強はみられなかった。実際に、ｌ−アラニンは、パーオキサイド、特に真菌類の次亜過塩素酸塩による殺傷を阻害するようである。このような条件下で、ｌ−アラニンはおそらく、競争的な阻害剤として作用する。
例４
追加の微生物のハロペルオキシドによる殺傷に関するｌ−アラニンの影響
Fusarium moniliforme,Tricophyton rubrum及びCrytococcus neoformansに対するハロペルオキシダーゼ抗菌活性に関するｌ−アラニンの影響を、これらの微生物に対する試験について、０（対照）又は１０μmol/mlのｌ−アラニン及び２、１０又は５０pmolのミエロペルオキシド若しくはエオシノフィルペルオキシドを用い、例２の手順に従って測定した。結果を以下の表１１（F. moniliforme、ＡＴＣＣ＃３８１５９）、表１２（T. rubrum、ＡＴＣＣ＃２８１８８、１８７５３及び１８７５８）及び表１３（C. neoformans、ＡＴＣＣ＃１４１１５）に示した。
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表１１に示されるように、ミエロペルオキシダーゼ及びエオシノフィルペルオキシダーゼは、ｌ−アラニンの存在下又は非存在下で、両方ともFusarium moniliformeに対して非常に効果的であった。実際に、ＥＰＯは、グルコースオキシダーゼの非存在下で効果的であることが見出された。表１２に示されるように、ｌ−アラニンの存在下でエオシノフィルペルオキシダーゼを用いてTrichophytonが完全に殺傷される。一方、ミエロペルオキシダーゼによる十分な殺傷の増強が得られる。
表１３に示されるように、ｌ−アラニンはまた、Cryptococcus neoformansのエオシノフィルペルオキシダーゼによる殺傷を十分増強する。一方、ミエロペルオキシダーゼ活性のいくつかの増強が見られた。
例５
Candida albicansに対するオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ抗菌活性に関するコレステロールオキシダーゼの濃度の影響
各試験で、指示されたようにNacardia erythropolis（０．１ユニット＝４μｇ）から得た異なった量のコレステロールコキシダーゼ、１０pmol（１．４μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は１０pmol（０．７μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）、１００mEq/LのＣｌ-、及び１mEq/LのＢｒ-並びに１mMのｌ−アラニンを含有する５０mMのアセテートバッファーを含有することを除いて、Candida albincansに対するオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ抗菌活性に関するコレステロールオキシダーゼの影響を例１の手順に従って測定した。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳをバッファーとして用いて、６．７とした。最終懸濁液には、８．５％エタノール中、７mM（７μmol/ml）のコレステロールを含有した。最終容積を１mlとした。３７℃で２時間インキュベートした後、微生物をサブローデキストロース寒天上にプレート化した。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として表した。
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表１４に示されるように、完全なの殺傷は、０．０２５ユニットのコレステロールオキシダーゼと１０pmolのＭＰＯ及び１mMのｌ−アラニンで観測された。ｌ−アラニンの非存在下で、０．１ユニットのコレステロールオキシダーゼと１０pmolのＭＰＯで観測された。同様の結果が、ＥＰＯがハロペルオキシダーゼトして置換された場合に得られた。
例６
細菌に対するオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ抗菌活性に関するコレステロールオキシダーゼの濃度の影響
例５のC. albicansに代えて、Escherichia coliを用いて、例５の手順を行った。各試験は、１００mEq/LのＣｌ-、１mEq/LのＢｒ-及び１mMのｌ−アラニンを含有する５０mMのアセテートバッファー中に、指示された量のNacardia erythropolis（０．１ユニット＝４μｇ）から得たコレステロールコキシダーゼ、１０pmol（１．４μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1899201）又は１０pmol（０．７μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）を含有した。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳをバッファーとして用いて、６．７とした。最終懸濁液には、８．５％エタノール中、７mM（７μmol/ml）のコレステロールを含有した。最終容積を１mlとした。３７℃で２時間インキュベートした後、微生物をトリプチカーゼ大豆寒天上にプレート化した。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表１５に示した。
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表１５に示されるように、完全なＭＰＯ及びＥＰＯのによるEscherichia coliの殺傷が、１mMのｌ−アラニンの存在下若しくは非存在下で試験された全てのコレステロールオキシダーゼ濃度（０．０１２５から０．１ユニット）で観測された。同様の結果がStaphylococcus aureusで観測された（データは示さず。）。
例７
コリンオキシダーゼを用いた細菌、酵母及び真菌性胞子のオキシダーゼ−ハロオキシダーゼによる殺傷
０．２ユニットのコリンオキシダーゼをＨ2Ｏ2を生成するオキシダーゼとして使用した以外、例１の手順を行った。この場合、１００mEq/LのＣｌ-、１mEq/LのＢｒ-及び１mMのｌ−アラニンを含有する５０mMのアセテートバッファー中にAlcaligenes sp.から得た０．２ユニット（即ち２０μｇ）のコリンオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）を含有した反応が指示される。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳをバッファーとして用いて、７とした。コリンの最終濃度は、１５０mM（１５０μmol/ml）であった。最終容積を１mlとした。２２℃で４時間インキュベートした後、微生物をプレート化した（S. aureusはトリプチカーゼ大豆寒天にプレート化され、C. albicans及びA. fumigatusは、サブローデキストロース寒天にプレート化された。）。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表１６に示した。
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例８
ラクテートオキシダーゼを用いる細菌、酵母及び真菌胞子のオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷
Ｈ2Ｏ2を生成するオキシダーゼとして、０．２ユニットのラクテートオキシダーゼを使用した以外例７の手順を行った。この場合、１００mEq/LのＣｌ-、１mEq/LのＢｒ-及び１mMのｌ−アラニンを含有する５０mMのアセテートバッファー中にPediococcus sp.から得た０．２ユニット（即ち５μｇ）のラクテートオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）を含有した反応が指示される。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳをバッファーとして用いて、７とした。ラクテートの最終濃度は、１５０mM（１５０μmol/ml）であった。最終容積を１mlとした。４時間インキュベート（２２℃）した後、微生物をプレート化した。S. aureusはトリプチカーゼ大豆寒天にプレート化され、C. albicans及びA. fumigatusは、サブローデキストロース寒天にプレート化された。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表１７に示した。
0003723209.tif 000021
例９
アルコールオキシダーゼを用いた細菌、酵母及び真菌性胞子のオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷
Ｈ2Ｏ2を生成するオキシダーゼとして、０．２ユニットのアルコールオキシダーゼを使用した以外例７の手順を行った。この場合、１００mEq/LのＣｌ-、１mEq/LのＢｒ-及び１mMのｌ−アラニンを含有する５０mMのアセテートバッファー中にCandida boidiniiから得た０．２ユニット（即ち２１μｇ）のアルコールオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201)又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）を含有した反応が指示される。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳをバッファーとして用いて、７とした。アルコールの最終濃度は、１５０mM（１５０μmol/ml）であった。最終容積を１mlとした。２２℃で４時間インキュベートした後、微生物をプレート化した。S. aureusはトリプチカーゼ大豆寒天にプレート化され、C. albicans及びA. fumigatusは、サブローデキストロース寒天にプレート化された。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表１８に示した。
0003723209.tif 000022
ＭＰＯ若しくはＥＰＯと組み合わせて、コレステロールオキシダーゼ（表１）、コリンオキシダーゼ（１６）、及びラクテートオキシダーゼ（表１７）は、ｌ−アラニンの存在下若しくは非存在下で、Staphylococcus aureusを全然に殺傷する。アルコールオキシダーゼを用いると（表１８）、ＥＰＯでは完全に殺傷されるが、ＭＰＯでは、ｌ−アラニンを用いても用いなくても部分的にのみ殺傷される。
Candida albicansは、コレステロールオキシダーゼ（表１）及びコリンオキシダーゼ（表１６）とＭＰＯ若しくはＥＰＯによって、ｌ−アラニンが存在する場合のみ全体的に殺傷される。ｌ−アラニンが存在しないと、殺菌活性はほぼ５０パーセントの殺傷まで制限される。ラクテートオキシダーゼ（表１７）及びアルコールオキシダーゼ（表１８）は、ｌ−アラニンの存在下又は非存在下で、ＭｐＯ又はＥＰＯによるCandida alvicansの殺傷の推進に効果がない。
ｌ−アラニンの存在下で、コレステロールオキシダーゼ（表１）及びコリンオキシダーゼ（表１６）の両方が、ＭＰＯ又はＥＰＯによるAspergillus fumigatus胞子の完全な殺傷を補佐した。しかし、部分的な殺傷のみが、ｌ−アラニンの存在しない場合に観測された。不完全ではあるが、ラクテートオキシダーゼ（表１７）及びアルコールオキシダーゼ（表１８）の両方とも、ｌ−アラニンの存在下においてＥＰＯを用いた場合９０％以上が殺傷され、ＭＰＯを用いた場合５０％以上が殺傷される。ｌ−アラニンが存在しないと、ラクテートオキシダーゼ又はアルコールオキシダーゼの何れもAspergillus fumigatus胞子のＭＰＯ若しくはＥＰＯによる殺傷を補佐しなかった。
例１０
Bacillus及びAspargillus胞子のコレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼに関する可能な活性化物質の影響
微生物学の文献には、胞子の発芽及び成長期形態の活性化剤として供されうる幾つかの物質が開示されている。分生子胞子の発芽には、グルコース、ホスフェート及びアミノ酸が必要であることが報告されている。ｌ−プロリン若しくはｌ−アラニンがアミノ酸の要求を満たしている。他のアミノ酸及びビタミンは影響が少ない（Yanigitam, 1957, Arch Mikrobiol 26:329）。
幾つかの他の有機化合物が、発芽を刺激するのに必要である。これらには、フェネチルアルコール（Lingappa et al., 1970 Arch Mikrobiol 72:97）、クマリン（Weber and Hess, 1974, The Fungal Spore, p.178, Wiley-Interscience）、及びフルフラール誘導体（Sussman et al., 1959, Mycologia 51:237）が含まれる。
Bacillus cereusの内因性胞子のコレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼに関するｌ−アラニン及びｌ−プロリンの影響には、１００mEq/LのＣｌ-、及び１mEq/LのＢｒ-を含有する５０mMのアセテートバッファー中に０．２ユニット（即ち２．８μｇ）のNacardia erythropolisから得たコレステロールオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）、及び指示された量のｌ−アラニン若しくはｌ−プロリンを含む。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳバッファーを添加して、〜７に調整した。コレステロールの最終濃度は、８．５％エタノール中で５mM（５μmol/ml）であった。最終容積を１mlとした。４時間インキュベート（２２℃）した後、生き残った微生物をトリプチカーゼ大豆寒天にプレート化した。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表１９に示した。
0003723209.tif 000023
３０分のインキュベーションの後、ＭＰＯ（２０pmol）を用いるコレステロールオキシダーゼ（０．１ユニット）は、ｌ−アラニン若しくはｌ−プロリンを活性化剤として用いてBacillus cereus胞子を完全に殺傷する。しかし、何れの増強剤物質も用いなくても完全に殺傷される。インキュベーションの期間を長くすることが必要であるが、同様な結果がＥＰＯと供にコレステロールオキシダーゼを用いて得られる。ハロペルオキシダーゼが存在しない場合は、ｌ−アラニン又はｌ−プロリンを添加してもコレステロールオキシダーゼの殺傷活性は十分に増加しなかった。オキシダーゼ−ハロオキシダーゼの殺傷に対するこれらの細菌の内因性胞子の直接の感度は、ｌ−アラニン又はｌ−プロリンの何れかの効果が３０分程度の早さまでに観測される全殺傷を覆い隠す程度に大きい。
Aspergillus fumigatus胞子のコレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼによる殺傷に関するｌ−アラニン、ｌ−プロリン、クマリン及びフェネチルアルコールの影響を、反応が、１００mEq/LのＣｌ-、及び１mEq/LのＢｒ-を含有する５０mMのアセテートバッファー中に０．２ユニット（即ち２．８μｇ）のNacardia erythropolisから得たコレステロールオキシダーゼ、２０pmol（２．８μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は２０pmol（１．５μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）、及び指示された量の試験される物質を含む以外先の手順に従って測定した。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳバッファーを添加して、〜７に調整した。コレステロールの最終濃度は、８．５％エタノール中で５mM（５μmol/ml）であった。最終容積を１mlとした。指示された期間のインキュベーション（３７℃）の後、Aspergillus fumigatusをサブローデキストロース寒天にプレート化した。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として以下の表２０に示した。試験された４つの可能か活性化物質の内、ｌ−アラニンのみがＭＰＯ若しくはＥＰＯと供に用いるコレステロールオキシダーゼの殺傷の力を増強した。ハロペルオキシダーゼが存在しないと、何れの活性化剤もコレステロールオキシダーゼの殺傷活性を増強しなかった。
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ｌ−アラニンを処方に含めると、胞子及び成長期形態の両方に対してオキシダーゼ−ハロオキシダーゼの抗菌作用を大きく増加させる。ｌ−アラニンは、アミン窒素、ＣＯ2、アセチル−ＣｏＡ、並びに発芽及び成長に必要な還元等価体及びハロペルオキシダーゼの作用に対して真菌類を不安定化するようなものを提供するように思われる。ハロペルオキシダーゼによる殺傷で先に示したように（表３）、ｌ−プロリンは、増強剤物質としては効果がない。
例１１
固体形態での（１）コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ及び（２）コレステロールよりなる２成分の殺菌剤
コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼ系を、（１）コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼと抗菌活性増強剤ｌ−アラニン、並びに（２）固体ウェハーの形態のコレステロールよりなる二成分処方として構築した。該コレステロールウェハーは、コレステロールをエーテルに溶解し、該コレステロール溶液を表面上にあけ、エーテルを蒸発させることにより調製される。得られたコレステロールのシートを約１０mgの適切な大きさの矩形に裁断した。
コレステロールウェハー（約１０mg/ウェハー）を、Aspergillus fumigatus胞子を含有する試験管に置いた。コレステロールオキシダーゼを、ＭＰＯ若しくはＥＰＯを用いたコレステロールオキシダーゼ及びこれを用いない試験管に加え、殺菌作用を開始した。該系を、ｌ−アラニンを用いた場合及び用いない場合、並びにエタノールを用いた場合及び用いない場合で試験した。エタノールを加えて、コレステロールの溶解かを促進するその能力を試験した。コレステロールの溶解性が増加することは、オキシダーゼに対する基質として利用可能なコレステロールが増加することを意味する。一旦開始されると、該系は、３０分から１時間の範囲のインターバルで、周囲温度（２２℃）においてインキュベートした。反応には、１００mEq/LのＣｌ-、及び１mEq/LのＢｒ-を含有する５０mMのアセテートバッファー中に０．１ユニット（即ち４μｇ）のNacardia erythropolisから得たコレステロールオキシダーゼ、１０pmol（１．４μｇ）のブタＭＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#-1899201）又は１０pmol（０．７μｇ）のブタＥＰＯ（ExOxEmis, Inc., Sam Antonio, Texas, U.S.A., Lot#1929201）を含む。ｐＨは、５０mMのＭＯＰＳバッファーを添加して、〜７に調整した。コレステロール基質は固体ウェハー（約１０mg）の形態で存在した。この場合、反応には、１０μmol/mlのｌ−アラニン及び１０％のエタノールが含まれる。最終容積を１mlとした。指示された期間のインキュベーション（２２℃）の後、Aspergillus fumigatusをサブローデキストロース寒天にプレート化した。結果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）の計数として表した。ＮＤは実験がなされなかったことを示す。結果を表２１に示した。
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表２１に示されるように、エタノールとｌ−アラニンの存在下で、ステロールオキシダーゼ−ＭＰＯ処方は、３０分で胞子の１０倍の殺傷を起こし、１時間、２時間及び４時間で完全に殺傷した。ｌ−アラニンは、ＭＰＯ−依存性の効果的な殺傷に必要である。エタノール及びｌ−アラニンは存在するが、ハロペルオキシダーゼが存在しない場合、コレステロールオキシダーゼは、４時間のインキュベーション後のみではあるが、穏やかな効果を有する。最も効果的な処方は、エタノール及びｌ−アラニンと供に用いたコレステロールオキシダーゼ−ＥＰＯである。完全な胞子の殺傷が試験間隔の全てにおいて観測された。
エタノールを含めると、試験された全ての処方で効果が大きく増加した。１０％のエタノールの存在下で散発的な作用が早くなり、より激しくなる。このエタノールの効果は、コレステロールオキシダーゼの活性の増加をもたらす固体コレステロールの増加した溶解性によって生じる。この結果はまた、１０％エタノールが、コレステロールオキシダーゼ−ハロペルオキシダーゼの機能に有害な効果を有さないことを示す。処方に、適切な量のエタノール若しくは他の無毒な溶媒を含めると、コレステロールの非存在下で系の滅菌の維持が補助され、反応混合物の貯蔵寿命が改善される。
本発明の方法及び組成物の種々の修飾及び適応は、上述したことから当業者に明かであろう。このような何れの修飾及び適応も、先行技術によって排除される範囲を除いて添付したクレームの範囲内にあると思われる。