(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
品種間の識別性の高い識別バンドＳ１３、Ｍ２ＣＧ、Ｍ１１、Ｂ１、ＷＫＡ９、Ｊ６、Ｆ６、Ｂ７およびＡ７からなる群より選択された識別バンドから抽出されたＤＮＡ塩基配列のフォワード側及びリバース側から８〜５０塩基となるように設計された対合プライマーとして、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号２）；Ｓ１３Ｒ−８（配列表の配列番号３）の対称配列；Ｍ２ＣＧＦ１７（配列表の配列番号４）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５）；Ｍ２ＣＧＦ５０（配列表の配列番号６）およびＭ２ＣＧＲ５０（配列表の配列番号７）；Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号８）およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号９）；Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１２）およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１３）；ＷＫＡ９Ｆ２０（配列表の配列番号１６）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１７）；Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号２０）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号２１）；Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号３６）およびＦ６Ｒ２０（配列表の配列番号３７）；Ｆ６Ｆ２１（配列表の配列番号３８）およびＦ６Ｒ２７（配列表の配列番号３９）；Ｆ６Ｆ５０（配列表の配列番号４０）およびＦ６Ｒ５０（配列表の配列番号４１）Ａ７Ｆ５０（配列表の配列番号４６）およびＡ７Ｒ５０（配列表の配列番号４７）；Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号３４）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号３５）；Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号３２）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号３３）；Ａ７−８（配列表の配列番号５４）の対称配列からなる群より選択された１〜４種類のいずれかを用いて、米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行い、品種間の識別性の現れるバンドのみを増幅させ、電気泳動により検出することを特徴とする米試料の品種判別方法。
【請求項２】
対合プライマーを、その融解温度の範囲が使用する対合プライマーの融解温度の平均値の±１５℃の範囲となるように選択すると共に、ＰＣＲ法のアニーリング温度を当該温度の範囲内に設定してＰＣＲ法を行う請求項１に記載の米試料の品種判別方法。
【請求項３】
米試料が、精米１粒または米飯である請求項１又は２に記載の米試料の品種判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、米試料の品種判別方法に関し、詳しくは籾、玄米、精米、米飯等の米試料からＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、選定した適正な対合プライマーの存在下でＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した後、電気泳動によって品種を識別する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
わが国では、消費者の良食味指向、米流通の規制緩和等により、良食味米が高価格で取り引きされている。
良食味米の選定基準としては、その品種や産地を基にした、いわゆる「産地品種銘柄米」が重視されている。食糧法の施行により、精米の品種、産地および産年が包装資材に表示されることになり、内容物の表示の正確さは、行政的にも産業的にも重要な問題である。そのため、精米の品種を科学的に、かつ簡易迅速に判別する技術の開発が求められている。
【０００３】
稲および米の品種判別には、従来は稲植物体の形、葉の色、玄米の粒型、酵素活性の多型（アイソザイムパターン）などが用いられてきたが、精米あるいは精米粉の持つ情報のみによって、類似品種間の識別を行うことは困難であると考えられていた。
農林水産省食品総合研究所では、農林水産省農業生物資源研究所や食糧庁検査課と協力して、精米からＤＮＡを抽出し、適正なランダムプライマーの存在下でＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡの分子量の相違を電気泳動によって検出する技術（ＲＡＰＤ（random amplified polymorphic DNA method）法による判別技術）を開発した。
【０００４】
しかし、この方法では、それぞれ別個の１０量体のランダムプライマーを１種類だけ加えて増幅したＤＮＡの多数の泳動バンドのうちから、識別性のあるバンドを選別して品種判別に使用するため、（１）ＰＣＲ法による増幅を使用プライマーの種類分だけ多数回行う必要があり、操作が煩雑で時間がかかる、（２）識別に用いるバンド以外にも多数の共通バンドが現れるため、複数のプライマーを混合してＰＣＲ法による増幅を行うことができない、（３）多数のＤＮＡバンドから選ばれた識別バンドのうちには、増幅反応温度やＤＮＡ濃度等の影響を受けやすく、識別性や再現性の十分でないバンドもある等の問題があった。
【０００５】
一方、犯罪捜査におけるＤＮＡ鑑定等で用いられているマイクロサテライト法は、個体同士の変異をも検出できる精密判別法であるが、反復配列間の微細な相違を検出するために、シークエンス用精密電気泳動装置等を必要とし、熟練を要しない、簡易迅速な品種判別手法としては普及が困難であるという問題がある。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】
本発明の目的は、米試料の品種を迅速、正確、安価、かつ熟練を要せずに判別する技術を提供することである。
すなわち、本発明は、従来技術の欠点を改良し、米の品種を判別するための検出作業を簡略化された操作で、短時間に、しかも検出の条件に影響されずに安定した結果が得られ、特別な装置や専門知識を必要とすることなく、米試料の品種を判別する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明の方法は、炊飯工程を経た後の米飯についても、精米等の場合と同様にして品種の判別を行うことができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、米試料から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ法により増幅産物を得、これを電気泳動により分離し、品種間の識別性の現れたバンドを切り出して決定した当該ＤＮＡの塩基配列に基づいて設計した対合プライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、当該識別バンドのみを増幅させて電気泳動により検出することによって上記目的が達成できることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、請求項１記載の本発明は、品種間の識別性の高い識別バンドＳ１３、Ｍ２ＣＧ、Ｍ１１、Ｂ１、ＷＫＡ９、Ｊ６、Ｆ６、Ｂ７およびＡ７からなる群より選択された識別バンドから抽出されたＤＮＡ塩基配列のフォワード側及びリバース側から８〜５０塩基となるように設計された対合プライマーとして、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号２）；Ｓ１３Ｒ−８（配列表の配列番号３）の対称配列；Ｍ２ＣＧＦ１７（配列表の配列番号４）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５）；Ｍ２ＣＧＦ５０（配列表の配列番号６）およびＭ２ＣＧＲ５０（配列表の配列番号７）；Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号８）およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号９）；Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１２）およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１３）；ＷＫＡ９Ｆ２０（配列表の配列番号１６）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１７）；Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号２０）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号２１）；Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号３６）およびＦ６Ｒ２０（配列表の配列番号３７）；Ｆ６Ｆ２１（配列表の配列番号３８）およびＦ６Ｒ２７（配列表の配列番号３９）；Ｆ６Ｆ５０（配列表の配列番号４０）およびＦ６Ｒ５０（配列表の配列番号４１）Ａ７Ｆ５０（配列表の配列番号４６）およびＡ７Ｒ５０（配列表の配列番号４７）；Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号３４）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号３５）；Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号３２）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号３３）；Ａ７−８（配列表の配列番号５４）の対称配列からなる群より選択された１〜４種類のいずれかを用いて、米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行い、品種間の識別性の現れるバンドのみを増幅させ、電気泳動により検出することを特徴とする米試料の品種判別方法である。
【０００９】
請求項２記載の本発明は、対合プライマーを、その融解温度の範囲が使用する対合プライマーの融解温度の平均値の±１５℃の範囲となるように選択すると共に、ＰＣＲ法のアニーリング温度を当該温度の範囲内に設定してＰＣＲ法を行う請求項１に記載の米試料の品種判別方法である。
【００１０】
請求項３記載の本発明は、米試料が、精米１粒または米飯である請求項１又は２に記載の米試料の品種判別方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明における米試料は、米を原料とするもの全般を意味し、ここでいう米とは稲種子を指し、籾、籾を籾摺りして得られる玄米、玄米を精米機によって精白して得られる精米等の他、これらを炊飯して得られる米飯も含まれる。
【００１２】
本発明の対象である米の品種について特に限定はなく、例えば「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「ゆきひかり」、「むつほまれ」、「キヌヒカリ」等のいずれの品種であっても対象として適用可能である。しかも、試料として用いる米の品種は１種に限定されず、２品種以上を混合したものであってもよい。複数の品種を含む米試料を対象として用いることにより、本発明の方法を１回行うだけで、被検品種のすべての存在を解明することができる。
【００１３】
これらの米試料は、粒そのままでも抽出が可能であるが、適当な粉砕機器、例えば超遠心粉砕機（レッチェ社製）やサイクロンミル（ユーディ社製）、乳鉢等によって粉砕して粉末試料とした後、以下の検出操作に供される。
【００１４】
はじめに、米試料からＤＮＡの抽出を行う。抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等を挙げることができる。
この中では、後記の実施例で示すように、ＣＴＡＢ法を用いるのが好ましい。例えば、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ  トリス塩酸、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を加えて攪拌し、５５℃の恒温槽に入れたのち、再び上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍＬを加え、３０分間静置しておくことにより、ＤＮＡを抽出することができる。
【００１５】
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱等の精製工程を加えてもよい。これらの工程の中では、クロロホルム／イソアミルアルコール処理が好ましい。この処理は、例えばＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌、遠心分離して得られる上清に、ＤＮＡ沈澱液を加えてさらにＤＮＡを沈澱させた後、遠心分離を行って得られたＤＮＡ沈澱物を１Ｍ  ＮａＣｌで抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈澱の後、ＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ試料液とすることができる。
【００１６】
続いて、ランダムプライマーの共存下に、上記の操作により得られるＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行う。これは、ＤＮＡのうち、次のＰＣＲ用の対合プライマー設計の基となる品種間の識別性を有する塩基配列を増幅させるために行うものである。
ここで、本発明におけるＰＣＲ法とは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の連鎖反応を指す。すなわち、鋳型となるＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの共存下で約９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を２０〜６０サイクル繰り返すことにより、約１００万倍に増加（増幅）させる反応をいう。
【００１７】
対合プライマーとは、品種間の識別性の現れる塩基配列を増幅させることができる一対のプライマーであり、上記したように、ＲＡＰＤ法に基づき、上記米試料より得られるＤＮＡからＰＣＲを行って得られる品種間に識別性のあるバンド部分の塩基配列を基に設計されるものである。
対合プライマーを得るためのＰＣＲにおいては、任意のランダムプライマーを用いる。ランダムプライマーとは、米試料から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増幅する際に、変性して一本鎖に分かれたＤＮＡに相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型ＤＮＡ複製の開始点となるプライマーを指す。通常は１０〜２０量体のヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーのことである。
ランダムプライマーとしては、通常用いられているものを使用することができ、例えばオペロン社から市販されている１０量体ランダムプライマーや、和光純薬社から市販されているＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）等を挙げることができる。
【００１８】
続いて、ＰＣＲで得られる増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これは、増幅産物のうち、目的とする対合プライマーを設計するための基となる、品種間の識別性の現れる塩基配列であることを示すバンドを検出するためである。
ここで電気泳動とは、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡが、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差によって分離され、これを臭化エチジウムによって帯状に染色し、紫外線照射等を行うことによりバンドパターンとして増幅ＤＮＡの相違が検出される操作をいう。
【００１９】
このようにして検出された品種間の識別性の現れたバンドから、次のようにして一対の対合プライマーを作製する。
すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出、回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増殖し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
【００２０】
決定された塩基配列から、対合プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型である米試料由来のＤＮＡのうちのランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している筈である。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲ法における対合プライマーの母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。
したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さとを有する米の品種判定に有用な対合プライマーを設計することができる。
【００２１】
本発明における対合プライマーは、互いに同一配列あるいは相同配列を有していることが望ましい。
また、プライマーのサイズは、好ましくは８〜５０塩基、より好ましくは１０〜２５塩基の範囲内であることが必要である。
後記の実施例から明らかなとおり、配列表の配列番号４８、４９、５１や５２に記載の塩基配列からなるプライマーのように、５０塩基より長すぎると、鋳型ＤＮＡとの結合性および結合後の解離が悪くなり、ＰＣＲ後にも識別バンドが検出されず、品種識別が困難になる。また、ＰＣＲでは、２種類以上の対合プライマーを同時に使用することがあるが、プライマーが長すぎる場合には、併用によるＰＣＲの簡易迅速化が困難になるので不適当である。
一方、配列表の配列番号５０や５３記載の塩基配列を有するプライマーのように、７塩基以下の短いプライマーの場合は、プライマーにより増幅された多数のバンドが出現し、品種間の識別が困難となるので、これも不適当である。
【００２２】
対合プライマーを選定することにより、最初のＰＣＲにおいてランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、第２次のＰＣＲにおいては、品種識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。
【００２３】
本発明者らは、上記のＰＣＲを行った結果、各種品種間に識別性の現れる数種のバンドを得た。その識別バンドと、品種識別性の関係を第１表に示す。
【００２４】
【表１】
第１表（その１）（各米試料と識別バンドとの関係）
0003685478.tif 000002
＊測定せず
【００２５】
【表２】
第１表（その２）（各米試料と識別バンドとの関係）
0003685478.tif 000003
＊測定せず
【００２６】
各バンドに由来して、種々の対合プライマーを得た。
（１）識別バンドＳ１３（１．８ｋｂｐ）
このバンドは、「きらら３９７」や「中生新千本」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「ひとめぼれ」等では見られない。このＳ１３から、対合プライマーＳ１３Ｆ２５（配列表の配列番号１）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号２）；Ｓ１３Ｒ−８（配列表の配列番号３）の対称配列を設計した。
【００２７】
（２）識別バンドＭ２ＣＧ（１．２ｋｂｐ）
このバンドは、１０量体のランダムプライマーに２残基添加したもので、「ひとめぼれ」や「日本晴」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「キヌヒカリ」では見られない。このＭ２ＣＧを基に対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７（配列表の配列番号４）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号５）；Ｍ２ＣＧＦ５０（配列表の配列番号６）およびＭ２ＣＧＲ５０（配列表の配列番号７）を設計した。
【００２８】
（３）識別バンドＭ１１（０．７３ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「ひとめぼれ」等から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「きらら３９７」では見られない。このＭ１１を基に、対合プライマーとして、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号８）およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号９）；Ｍ１１Ｆ５０（配列表の配列番号１０）およびＭ１１Ｒ５０（配列表の配列番号１１）を設計した。
【００２９】
（４）識別バンドＢ１（０．５ｋｂｐ）
このバンドは、「日本晴」や「ヒノヒカリ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「ひとめぼれ」では見られない。このＢ１を基に、対合プライマーＢ１Ｆ２５（配列表の配列番号１２）およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１３）；Ｂ１Ｆ５０（配列表の配列番号１４）およびＢ１Ｒ５０（配列表の配列番号１５）を設計した。
【００３０】
（５）識別バンドＷＫＡ−０９（１．６ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「あきたこまち」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「ササニシキ」では見られない。このＷＫＡ−０９を基に、対合プライマーＷＫＡ９Ｆ２０（配列表の配列番号１６）およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１７）；ＷＫＡ９Ｆ５０（配列表の配列番号１８）およびＷＫＡ９Ｒ５０（配列表の配列番号１９）を設計した。
【００３１】
（６）識別バンドＪ６（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「きらら３９７」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「ササニシキ」や「ヤマホウシ」では見られない。このＪ６を基に、対合プライマーＪ６Ｆ１８（配列表の配列番号２０）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号２１）；Ｊ６Ｆ５０（配列表の配列番号２２）およびＪ６Ｒ５０（配列表の配列番号２３）を設計した。
【００３２】
（７）識別バンドＡ７（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「あきたこまち」等の主要品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＡ７から、対合プライマーＡ７Ｆ１９（配列表の配列番号３２）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号３３）；Ａ７−８（配列表の配列番号５４）の対称配列を設計した。
【００３３】
（８）識別バンドＢ７（０．５ｋｂｐ）
このバンドは、「ササニシキ」、「むつほまれ」や「キヌヒカリ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「あきたこまち」等の主要品種では見られない。このＢ７から、対合プライマーＢ７Ｆ２２（配列表の配列番号３４）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号３５）を設計した。
【００３４】
同様にしてＦ６Ｆ２５（配列表の配列番号３６）およびＦ６Ｒ２０（配列表の配列番号３７）；Ｆ６Ｆ２１（配列表の配列番号３８）およびＦ６Ｒ２７（配列表の配列番号３９）；Ｆ６Ｆ５０（配列表の配列番号４０）およびＦ６Ｒ５０（配列表の配列番号４１）；Ｂ７Ｆ５０（配列表の配列番号４４）およびＢ７Ｒ５０（配列表の配列番号４５）；Ａ７Ｆ５０（配列表の配列番号４６）およびＡ７Ｒ５０（配列表の配列番号４７）の各種対合プライマーを得ることができた。
本発明には、これらの対合プライマーのうちの１〜４種類いずれかの組み合わせを用いる。
【００３５】
これらの対合プライマーは、上記したような一連の手順により、すなわち米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたＰＣＲにより品種間の識別性の現れるバンドを切り出して、クローニング、シークエンスして識別部分のＤＮＡ塩基配列を決定し、その配列と予想Ｔｍに基づいて本発明者らが設計したものである。
【００３６】
本発明では、このような対合プライマーを用いて、先に抽出した鋳型ＤＮＡと共にＰＣＲ法を行う。
対合プライマーを選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。その結果、本発明の目的とする米の品種判別が可能となるのである。
【００３７】
本発明においては、対合プライマーの２種以上を同時に添加して使用することが可能である。このような対合プライマーの混合使用とは、選択した２〜４種類の対合プライマーを、品種判別用のＰＣＲにおいて、同一反応に併用することを意味する。
従来のＲＡＰＤ法では、品種識別バンド以外に多数の共通バンドが出現するために、複数のプライマーを同時に使用することが困難であり、１回のＰＣＲには１組のプライマーしか使用できなかった。
本発明においては、上記のようにして得られた対合プライマーを使用することにより、それぞれのプライマーに対応する識別バンドのみが電気泳動で出現することになる。そのため、対合プライマーの混合使用が可能であり、従来のように１回のＰＣＲに使用できるプライマーは１組に限られず、品種識別を効率よく行うことができる。
各種の対合プライマーを混合使用することにより、プライマー毎にＰＣＲを行う必要がなくなり、１回のＰＣＲで多くの品種を正確、かつ簡便に判別することができ、品種判別に要する労力、時間、費用を大幅に減少させることができる。
【００３８】
このＰＣＲを効率よく進めるためには、使用する対合プライマーそれぞれの融解温度および該融解温度を考慮したＰＣＲのアニーリング温度の調整が必要である。
ここで、融解温度（Ｔｍ）とは、ＤＮＡの２本鎖がそれぞれの１本鎖に分離する温度をいう。一般に、ＰＣＲのアニーリング温度は、通常、使用するプライマーのＴｍ付近が適している。
本発明においては、対合プライマーの併用に際し、Ｔｍの類似した対合プライマー同士を選択して混合し、かつＴｍに近い適正なアニーリング温度を選定することにより、各対合プライマーを単独で使用した場合に得られる識別バンドを１回あるいは少数回のＰＣＲで得ることができる。
【００３９】
具体的には、使用する対合プライマーのＴｍの平均値と、各対合プライマーのＴｍとの差が１５℃（±１５℃）以内で、かつＰＣＲのアニーリング温度もその範囲内とすることが好ましい。
アニーリング温度を対合プライマーのＴｍの平均値よりも１５℃よりも低い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来識別バンドが現れない品種にも識別バンドが現れるおそれがあるため、好ましくない。一方、１５℃よりも高い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来出現していた識別バンドが消えてしまうことがあり、不適当である。
【００４０】
以上のようなＰＣＲを行った後、得られるＤＮＡを電気泳動によって検出することにより、品種特異的な識別バンドのみが検出され、品種の判別が可能となる。識別バンドのみが検出されるのは、ＰＣＲにおいては、対合プライマーが所定の品種特異的な識別部位のみに結合、増幅しているからである。
ＰＣＲで対合プライマーを２種類以上用いると、複数の品種の識別バンドが出現するので、１回で多数の品種の判別を効率よく行うことができる。
【００４１】
以下に、実施例等を用いて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
試験例１（第２次ＰＣＲ用対合プライマーの作製並びにそれを用いた米の品種判別）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「ゆきひかり」、「むつほまれ」および「キヌヒカリ」の１０品種の玄米を試験用精米機（山本製作所製、ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
【００４２】
精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、そのうちの６ｇからＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。
すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ  トリス塩酸、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍＬを加えて攪拌し、５５℃の恒温槽に入れ、上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍＬを加えて３０分間ＤＮＡを抽出した。
【００４３】
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌した後、遠心分離して上清をとり、ＤＮＡ沈澱液（１％  ＣＴＡＢ、２０ｍＭ  トリス塩酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて４℃で一晩静置してＤＮＡを沈澱させた。その後、遠心分離して得られたＤＮＡ沈澱物を１Ｍ  ＮａＣｌによって抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈澱の後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μＬに溶解してＤＮＡ試料液とした。
【００４４】
続いて、得られるＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μＬ、ポリメラーゼ（東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、反応用緩衝液（１２ｍＭ  トリス塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ２５ｎｇ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μＬを混合し、オペロン社のランダムプライマー３．０ｎｇの合計２０．７μＬとした。
反応装置はアステック社製ＰＣ−７００（０．５μＬ用ブロック）を使用し、変性（９４℃、７分）、アニーリング（３６℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で、４５サイクル反応させた。
【００４５】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。
検出結果の泳動写真（ＲＡＰＤ法）を図１に示す。図１において矢印で示した部分に、「きらら３９７」においてのみ、僅かであるが識別バンドが検出されている。
【００４６】
「きらら３９７」に現れた識別バンド（１．８ｋｂｐ）をゲルから切り出し、ヨウ化ナトリウム法でＤＮＡを抽出し、ガラスビーズ（宝酒造製  ＥＡＳＹＴＲＡＰ）に吸着させて回収した。
試料ＤＮＡを大腸菌に組み込んで増殖させ、アルカリミニプレップ法でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲで増殖し、ファルマシア社製、ＤＮＡ自動シークエンサー（ALF express）により塩基配列を決定した。
この配列に基づいて品種判別用オリゴヌクレオチド（対合プライマー）Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４を設計した。その塩基配列を後記の配列表の配列番号１および２に示す。
【００４７】
このオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして、「コシヒカリ」、「日本晴」、「きらら３９７」の鋳型ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。
「きらら３９７」について得られた結果を図２に示した。図から明らかなように、「きらら３９７」の識別バンドが検出されることが示されており、作製した対合プライマーを用いたＰＣＲにより米の品種を明確に検出可能であることが証明された。
【００４８】
実施例１（対合プライマー２種類を用いた品種判別）
「コシヒカリ」、「日本晴」および「きらら３９７」の３品種の試料玄米を、試験用精米機（山本製作所製、ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇから試験例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整して、ＰＣＲに供した。
【００４９】
ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、試験例１に記載した方法を用いてＲＡＰＤ法で有用であった１２量体プライマーＭ２ＣＧおよび１０量体プライマーＭ１１から、新たに２種類の対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）を設計し、これらを試験例１で作製した１組の対合プライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）と併せて使用した。
ＤＮＡポリメラーゼは、試験例１と同様、東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2   ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μＬを混合し、Ｍ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）の対合プライマー各０．５μＬ、Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）のプライマーを各０．５μＬの合計２０．７μＬとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
【００５０】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、試験例１と同様に、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果の識別バンドの有無を第２表に示す。
【００５１】
【表３】
第２表（２種類のプライマーの併用による３品種の精米のＰＣＲ結果）
0003685478.tif 000004
【００５２】
以上のことから、Ｓ１３のみでは識別不可能であった「コシヒカリ」と「日本晴」の品種識別が、Ｍ２ＣＧ対合プライマーとＳ１３対合プライマーを併用することによって可能となった。すなわち、２種類の対合プライマー（オリゴヌクレオチド）を併用することにより、１回のＰＣＲで３品種の精米試料の品種判別が可能であることが示された。
なお、Ｑ１６を対合プライマーとして用いた場合においては、「日本晴」の識別性が失われてしまい、使用が困難であった。
【００５３】
実施例２（対合プライマー３種類を用いた品種判別）
「コシヒカリ」、「日本晴」および「きらら３９７」の３品種の試料玄米を、試験用精米機（山本製作所製、ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇから実施例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整して、ＰＣＲに供した。
【００５４】
ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、実施例１に記載した方法を用いてＲＡＰＤ法で有用であった１２量体プライマーＭ２ＣＧおよび１０量体プライマーＭ１１から、新たに２種類の対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）、対合プライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）を設計し、これらを試験例１で作製した１組の対合プライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）と併せて使用した。
ＤＮＡポリメラーゼは、試験例１および実施例１と同様、東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水６μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2  ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μＬを混合し、Ｍ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）の対合プライマー各０．５μＬ、Ｍ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）の対合プライマーを各２μＬ、Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）のプライマーを各０．５μＬの合計２０．７μＬとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
【００５５】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、実施例１と同様に、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果の泳動写真を図３に、識別バンドの有無を第３表に示す。
【００５６】
【表４】
第３表（３種類のプライマーの併用による３品種の精米のＰＣＲ結果）
0003685478.tif 000005
【００５７】
図３から分かるように、各品種それぞれについて異なる部位に識別バンドａ、ｂ、ｃが出現する。これらは、各品種に特異的な識別バンドと、それを基に設計した３種類の対合プライマーに対応している（第３表参照）。
この結果より、３種類の対合プライマー（オリゴヌクレオチド）を併用することにより、１回のＰＣＲで３品種の精米試料の品種判別が可能であることが示された。
なお、対合プライマーＭ２Ｆ、すなわちＭ２ＦＦ１８およびＭ２ＦＲ２０（配列表の配列番号２６および２７）は、シークエンスからＭ１１Ｆ２０およびＳ１３Ｒ２４とプライマーダイマーを形成することが推測された。これらを加えた併用ＰＣＲでは、推測通り、識別バンドが現れず併用が不可能であった。
【００５８】
実施例３（対合プライマー４種類を用いた品種判別）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「アキニシキ」、「ヤマホウシ」、「朝の光」および「ミナミヒカリ」の１０品種の試料玄米を用いて、実施例２と同様にしてＰＣＲ用ＤＮＡ試料液を調製した。
すなわち、まず、試験用精米機（山本製作所製ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白後、各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整した。これを次のＰＣＲに供した。
【００５９】
ＰＣＲに用いるプライマーとして、実施例１に記載した方法を用いて新たに１０量体ＲＡＰＤマーカーＢ１から１種類の対合プライマーＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２および１３参照）を設計し、これを前記した３組の対合プライマー（配列表の配列番号１，２；４，５；８，９参照）と共に使用した。
ＤＮＡポリメラーゼは、試験例１および実施例１と同じ東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水２．７５μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2   ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μＬを混合し、対合プライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）各０．２５μＬ、対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）各４μＬ、対合プライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）各０．２５μＬ、並びに本実施例において新たに作製した対合プライマーＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２および１３）各０．１２５μＬの合計２０．７μＬとした。
【００６０】
反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。
検出結果の泳動写真を図４に、識別バンドの有無を第４表に示す。
【００６１】
【表５】
第４表（４種類のプライマーの併用による１０品種の精米のＰＣＲ結果）
0003685478.tif 000006
【００６２】
図４より、各品種試料について、別々のバンドが検出されていることが分かる。なお、図４中の「ヤマホウシ」（レーン８）についても、僅かなバンドが検出されている。このように、各品種に異なるバンドが得られるのは、第４表に示すように、各品種の４種類のプライマーに対する反応性が異なることに基づくものである。
この結果、４種類の対合プライマー（オリゴヌクレオチド）を併用することにより、１回のＰＣＲで１０品種の精米試料の品種判別が可能であることが示された。
なお、対合プライマーＢ７Ｆ、すなわちＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号３４および３５）も加えて試験したが、Ｂ１による０．５ｋｂｐのバンドと重なってしまい、併用効果が現れなかった。これは、マルチプレミックスでは、電気泳動における識別バンド位置が、互いに少なくとも０．０５ｋｂｐ離れていないと併用できないことを意味する。
【００６３】
実施例４（ＰＣＲのアニーリング温度の検討）
「コシヒカリ」、「日本晴」および「きらら３９７」の３品種の試料玄米を用い、実施例１と同様にしてＰＣＲ用のＤＮＡ試料液を調製した。
すなわち、試験用精米機（山本製作所製ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白して得られる各精米試料を、レッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整してＰＣＲに供した。
【００６４】
ＰＣＲには、３種類の対合プライマー、すなわちＭ２ＣＧ、Ｓ１３、Ｍ１１（配列表の配列番号４、５、１、２、８および９参照）をオリゴヌクレオチドプライマーとして用いた。
ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水６μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2   ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μＬを混合し、対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）各２μＬ、対合プライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）各０．５μＬ、対合プライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）各０．５μＬの合計２０．７μＬとした。
【００６５】
反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３８℃、６１℃または６５℃の３種類のいずれかで１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピッドＩＩを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。
アニーリング温度３８℃および６５℃の場合の各試料における識別バンドの有無を図５、６に示す。また、各対合プライマーによる識別バンドの有無を第５表に示す。
【００６６】
【表６】
第５表（３種類のプライマーの併用による３品種の精米のＰＣＲ結果）
0003685478.tif 000007
注１）ａ、ｂ、ｃはそれぞれ用いたプライマーの組み合せを表す。
ａ：Ｍ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）
ｂ：Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）
ｃ：Ｍ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）
【００６７】
図５および６より明らかなように、３８℃の場合は、各試料のバンドが多数出現し、品種間の区別が難しいのに対し、６５℃の場合は、「コシヒカリ」（レーン３および４）のみバンドが確認でき、他の「日本晴」、「きらら３９７」（レーン１、２および５、６）については、本来出現すべき識別バンドが出現しなかった。
一方、６１℃の場合には、第５表に示すように、各試料について異なるバンドが出現することが明らかである。
以上より、品種の識別のためには、アニーリング温度の調節が必要であることが明らかとなった。
【００６８】
実施例５（プライマーのサイズの検討）
「日本晴」および「きらら３９７」の２品種の試料玄米について、実施例１と同様にＰＣＲ用ＤＮＡ試料液を調製した。
すなわち、試験用精米機（山本製作所製ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白し、得られる各精米試料を、レッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整してＰＣＲに供した。
【００６９】
ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、６０残基の配列を有する長い対合プライマーＳ１３Ｆ６０およびＳ１３Ｒ６０（それぞれ配列表の配列番号４８および４９）およびＳ１３−７（配列表の配列番号５０）の対称配列からなる１組の対合プライマー（７量体）およびＳ１３Ｒ−８（配列表の配列番号３）の対称配列からなる１組の対合プライマー（８量体）を作製した。
これら３組の対合プライマーのほか、試験例１で作製した対合プライマーＳ１３Ｆ２５（配列表の配列番号１（２５量体））およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号２（２４量体））からなる対合プライマーを、それぞれ単独で使用した。
また、別の１組のオリゴヌクレオチドプライマーとして、Ａ７Ｆ１９の５’側およびＡ７Ｒ１６の３’側からそれぞれ６０残基の配列を有する長い対合プライマーＡ７Ｆ６０およびＡ７Ｒ６０（それぞれ配列表の配列番号５１および５２）およびＡ７−７（配列表の配列番号５３）の対称配列からなる１組の対合プライマー（７量体）およびＡ７−８（配列表の配列番号５４）の対称配列からなる１組の対合プライマー（８量体）、対合プライマーＡ７Ｆ５０（配列表の配列番号４６（５０量体））およびＡ７Ｒ５０（配列表の配列番号４７（５０量体））の４種類の対合プライマーを、それぞれ単独で使用した。
【００７０】
ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2   ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μＬを混合し、対合プライマー各１．０μＬ（合計２．０μＬ）の合計２０．７μＬとした。
反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３８℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
【００７１】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、実施例１と同様にコスモバイオ（株）製ミューピッドＩＩを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。
その結果、６０残基の長い対合プライマーＳ１３Ｆ６０およびＲ６０、Ａ７Ｆ６０およびＲ６０を用いた場合は、バンドが現れなかった。一方、Ｓ１３−７およびＡ７−７の対称配列である７残基の短い対合プライマーを用いた場合には、多数のバンドが出現した。いずれの場合も本発明の目的である正確な識別のためには不適当であった。
これに対し、Ｓ１３Ｆ２５とＳ１３Ｒ２４の対合プライマーおよびＡ７Ｆ５０とＡ７Ｒ５０の対合プライマーおよび各８量体の対称配列プライマーの場合は、１．８ｋｂｐおよび０．７ｋｂｐの識別バンドが「きらら３９７」で現れ、「日本晴」で現れず、品種の識別が可能であった。
【００７２】
実施例６（米飯試料からの品種判別）
「コシヒカリ」、「日本晴」および「きらら３９７」を試料とし、試験例１と同様に、試験用精米機（山本製作所製ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
精米試料１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍＬ容）に採り、脱イオン水３５μＬを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、ＲＣ−１８３、外釜に脱イオン水７５ｍＬ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。
【００７３】
ＤＮＡの抽出は、下記のように行った。
試料米飯各１粒をマイクロチューブに採り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有）３００μＬを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで、耐熱性アミラーゼ（シグマ製α−アミラーゼ、７９０Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加し、６０℃で１時間反応させた。
次いで、トリチラチウム・アルバム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー製、２０ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍＬを添加し、−２０℃で１５分間静置したのち、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）し、沈澱を得た。
この沈澱を、３００μＬのＴＥ（１０ｍＭ  トリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μＬを加え、回転攪拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
【００７４】
次いで、遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出した後、再び遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して上清を得た。この上清に５Ｍ  ＮａＣｌを６ｍＬ添加し、さらに冷却したエタノール４００μＬを加え、遠心分離を行って得た沈澱を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈澱を４０μＬの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料溶液とした。
【００７５】
前述の方法で精米１粒の炊飯試料から調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡの増幅を行った。
ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用し、プライマーは、対合プライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）、対合プライマーＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２および１３）の２種類を混合して使用した。
【００７６】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０．５μＬ、ポリメラーゼ０．２μＬ、反応用緩衝液２．５μＬ、ＭｇＣｌ2   ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ３μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μＬを混合し、配列番号５および６のプライマー各０．５μＬ、配列番号７および８のプライマー各０．２５μＬの合計２０．７μＬとした。反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
【００７７】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動は、実施例１と同様にして行った。
「コシヒカリ」、「日本晴」および「きらら３９７」の３品種の米飯から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。米飯試料の識別結果を第６表に、泳動写真を図７に示す。
【００７８】
【表７】
第６表（３品種の米飯試料の識別結果）
0003685478.tif 000008
【００７９】
図７より、各試料について異なるバンドが検出されたことが示されている。なお、「日本晴」（レーン１）については、僅かであるが、矢印で示した部分にバンドが現れている。これらは、各プライマーに対応する識別バンドであることが分かる。
以上より、本発明の方法は、精米のみならず米飯試料にも適用できることが示された。
【００８０】
実施例７（精米１粒による品種判別）
「コシヒカリ（日本）」、「一品（韓国）」、「バンニシキ（中国）」、「アマルー（オーストラリア）」、「タマキ（米国）」、「カオドークマリ１０５（タイ）」および「モトボイ（ベトナム）」の７種類の玄米各１０ｇをケット科学研究所製のパーレストによって歩留り９０％に精米し、各１粒を試料として用いた。
精米粒からの鋳型ＤＮＡの抽出は、日本ジーン社製ISOPLANTを用い、ＤＮＡ濃度を調整してＰＣＲに供した。
ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡（株）製 Taq polymerase （５Ｕ／μＬ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１１．５μＬ、ポリメラーゼ０．３μＬ、反応用緩衝液２．０μＬ、ＭｇＣｌ2 ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ１μＬ、dNTPs ２５ｍＭ）１．１μＬを混合し、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１６および１７）０．７５μＬ、Ａ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号３２および３３）０．３５μＬ、Ｓ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号１および２）０．２μＬおよびＪ６Ｆ１８およびＦ６Ｒ２０（配列表の配列番号２０および２１）０．１μＬを混合し、合計２０．７μＬとした。反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
【００８１】
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピットIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果の泳動写真を図８に、識別バンドの有無を第７表に示す。
対合プライマーＷＫＡ９およびＳ１３のみの使用の場合には、バンニシキとモトボイの２品種、アマルー、タマキ、カオドークマリ１０５の３品種の識別が不可能であった。これに対し、Ａ７およびＪ６の２種類の対合プライマーを加えることにより、上記２品種および３品種の識別も可能となり、使用した７品種すべての識別が可能となった。
【００８２】
【表８】
第７表    プライマーＡ７およびＪ６による精米のＰＣＲ結果
0003685478.tif 000009
【００８３】
実施例８（識別バンドＪ６の有用性）
試料玄米として「コシヒカリ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」を用い、対合プライマーとして、Ｊ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号２０および２１）を用いたこと以外は実施例７と同様にしてＰＣＲおよび電気泳動を行った。
検出結果の泳動写真を図９に、識別バンドの有無を第８表に示す。表から明らかなように、対合プライマーＪ６により、ササニシキと他の３品種との識別が可能である。
【００８４】
【表９】
第８表  対合プライマーＪ６による４品種の精米のＰＣＲ結果
0003685478.tif 000010
【００８５】
実施例９（対合プライマー４種類を用いた品種判別）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」および「あきたこまち」の４品種の試料玄米を用いて、実施例２と同様にしてＰＣＲ用ＤＮＡ試料液を調製した。
すなわち、まず、試験用精米機（山本製作所製ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白後、各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍＬとなるように、各試料ＤＮＡの濃度を調整した。これを次のＰＣＲに供した。
【００８６】
ＰＣＲに用いるプライマーとして、Ｂ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２および１３参照）、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１６および１７）、Ｍ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）およびＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）の４組の対合プライマーを用いた。
ＤＮＡポリメラーゼは、試験例１および実施例１と同じ東洋紡（株）製Taq polymerase（５Ｕ／μＬ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１４．８μＬ、ポリメラーゼ０．３μＬ、反応用緩衝液２．０μＬ、ＭｇＣｌ2 ２．０μＬ、鋳型ＤＮＡ１μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．１μＬを混合し、対合プライマーＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１６および１７）各０．１５μＬ、対合プライマーＭ２ＣＧＦ１７およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号４および５）各０．１５μＬ、対合プライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号８および９）各０．１５μＬ、並びに本実施例において新たに作製した対合プライマーＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１２および１３）各０．３μＬの合計２２．７μＬとした。
【００８７】
反応装置は、宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。識別バンドの有無を第９表に示す。
【００８８】
【表１０】
第９表（４種類のプライマーの併用による１０品種の精米のＰＣＲ結果）
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【００８９】
この結果、４種の対合プライマーを併用することにより、１回のＰＣＲで４品種の精米試料の品種判別が可能であることが示された。
【００９０】
実施例１０（３種類のプライマーの併用による品種判別）
「コシヒカリ」、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「日本晴」および「ひとめぼれ」の５品種の玄米を試料として、実施例６と同様にＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲに用いた対合プライマーはＭ２ＣＧＦ５０およびＭ２ＣＧＲ５０（配列表の配列番号６および７）、ＷＫＡ９Ｆ２０およびＷＫＡ９Ｒ２０（配列表の配列番号１６および１７）およびＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号３４および３５）の３種類を各０．２５μＬ用いた。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動は、実施例１と同様にして行った。米飯試料の検出結果の泳動写真を図１０に、識別バンドの有無を第１０表に示す。
【００９１】
【表１１】
第１０表（３種類のプライマーの併用による５品種の精米のＰＣＲ結果）
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【００９２】
以上の結果から、「コシヒカリ」、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「日本晴」および「ひとめぼれ」の５品種について、精米のみならず、炊飯された米飯試料にも適用できることが示された。
【００９３】
【発明の効果】
本発明によれば、識別性の高い対合プライマーによるＰＣＲを行うために、目的とする識別バンド以外のバンドが消失し、対象がコシヒカリ系統のような近縁種の場合にも、誤りのない正確な品種判別が可能となる。
【００９４】
しかも、本発明によれば、プライマーダイマーを生成することなく、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることのない、融解温度の近い複数の対合プライマー（８〜５０量対）を、適正なアニーリング温度で、同時に試料米のゲノムＤＮＡに添加してＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲの回数が減少し、品種判別が短時間で行うことができる。
【００９５】
さらに、試料米の判別操作を簡易、かつ迅速に実施できるため、分子生物学に熟達した経験者でなくとも、米の品種判別が可能である。
【００９６】
本発明の方法は、精米のみならず米飯も試料として用いることができるので、生産段階のみならず、流通・消費の段階における米の品種判別にも適用できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  試験例１のＰＣＲ（ＲＡＰＤ法）の結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜１０は、順に「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「ゆきひかり」、「きらら３９７」、「むつほまれ」、「キヌヒカリ」を示す。
【図２】  試験例１のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１、２はいずれも「きらら３９７」の結果を示す。
【図３】  実施例２のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１、２は「コシヒカリ」、３、４は「日本晴」、５、６は「きらら３９７」の結果を示す。
【図４】  実施例３のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１〜１０は、順に「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「日本晴」、「ヒノヒカリ」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「アキニシキ」、「ヤマホウシ」、「朝の光」、「ミナミヒカリ」を示す。
【図５】  実施例４のＰＣＲ（アニーリング温度３８℃）の結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１、２は「日本晴」、３、４は「コシヒカリ」、５、６は「きらら３９７」を示す。
【図６】  実施例４のＰＣＲ（アニーリング温度６５℃）の結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１、２は「日本晴」、３、４は「コシヒカリ」、５、６は「きらら３９７」を示す。
【図７】  実施例６のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカーを示し、１は「日本晴」、２は「コシヒカリ」、３は「きらら３９７」を示す。
【図８】  実施例７のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ（日本）」、２は「一品（韓国）」、３は「バンニシキ（中国）」、４は「アマルー（オーストラリア）」、５は「タマキ（アメリカ）」、６は「カオドークマリ１０５（タイ）」、７は「マスリ（インド）」、８は「モトボイ（ベトナム）」を示す。
【図９】  実施例８のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ヒノヒカリ」、３は「あきたこまち」、４は「ササニシキ」を示す。
【図１０】  実施例１０のＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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