(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、このペプチドのカルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体、薬学的に許容されるこのペプチドの塩類、またはこれらの２種類以上の混合物を有効成分とする、ヘパリン血液凝固阻止作用に対する中和剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、ヘパリン中和剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は特定のアミノ酸配列を有するラクトフェリン由来のペプチド等を有効成分とし、副作用のない新しいヘパリン中和剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
含硫多糖体であるヘパリンは、汎発性血管内血液凝固症候群の治療および血液透析、人口心肺、その他体内循環装置使用時、並びに血管カテーテル挿入時の凝血防止等の目的で広く使用されている。一方、手術時にこのヘパリンを用いた場合には、その強力な血液凝固阻止作用による術部の出血傾向を抑えるため、塩基性ペプチドであるプロタミン等のヘパリン中和剤が手術後等において用いられている［ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オブ・セラピューティクス(The Pharmacological Basis of Therapeutics) 、第７版、１３３８ページ、マクミラン(Macmilan)社、１９８５年］。また、プロタミンは、インシュリン投与の効力を持続させるためにも使用され［ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オブ・セラピューティクス(The Pharmacological Basis of Therapeutics) 、第７版、１４９０ページ、マクミラン(Macmilan)社、１９８５年］、あるいは抗血栓性医用材料としてヘパリンを固定する場合にも使用されている（特開昭５８−１８０１６２号公報）。
【０００３】
しかしながら、プロタミンは、フィブリノーゲン等のタンパク質および血小板に結合し、それ自体が血液凝固阻止等の副作用を有し、また抗原性も問題となっていた。そこで、これらの欠点がなく、しかも副作用のないヘパリン中和剤が待望されていた。
プロタミンの他に、ヘパリンに結合する物質としては、生体内物質の酸性繊維芽細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子等が知られており、最近では脳から分離した５９個のアミノ酸残基からなるペプチドが発見され、細胞増殖剤、創傷治療剤、骨疾患治療剤としての可能性が示唆されている（特開平５−３３９２８７号）。また、フィブロネクチン、アンチトロンビンIII も分子内にヘパリン結合部位を有し、それらの部分と他のペプチドを結合させ、そのペプチドの機能を変化させる試みもなされている（特開平２−３１１４９８号公報、特開平４−７７４９９号公報）。
【０００４】
一方、種々の微生物に対して抗菌作用を有するペプチドについては、多数の発明が開示されている。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効なホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号公報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３５９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１３７４４号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示すペプチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有効なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公報）、グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭６０−１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９号公報および特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性菌に有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７号公報および特開昭６３−１７８９７号公報）、その他北米産カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平２−５３７９９号公報）、蜜蜂の血リンパから単離した抗菌性ペプチドド（特表平２−５０００８４号公報）、ロイヤルゼリーから単離した抗菌ペプチド（特開平２−２６８１９８号公報）等がある。
【０００５】
ラクトフェリンは、乳汁および唾液、涙、粘膜分泌液等のヒトを含む哺乳動物の体液に存在する鉄結合性タンパク質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス(Journal of Pediatrics) 、第９４巻、第１ページ、１９７９年］。また、ブドウ球菌および腸球菌に対して、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有することが知られている［ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第６７巻、第６０６ページ、１９８４年］。さらには、ラクトフェリンがヘパリンに結合する性質を利用して乳からラクトフェリンを分離精製する方法（特開昭６３−２５５２９９号公報）も開示されている。
【０００６】
この発明の発明者らは、ラクトフェリンの抗菌性に着目し、哺乳類のラクトフェリン、アポラクトフェリン、および／または金属飽和ラクトフェリン（以下、これらをラクトフェリン類と記載することがある）を酸または酵素により加水分解した物質が、望ましくない副作用（例えば抗原性）等がなく、しかも未分解のラクトフェリン類よりも強い耐熱性および抗菌性を有することを見い出し、既に特許出願を行った（特開平５−３２００６８号公報）。
【０００７】
また、この発明の発明者らは、ラクトフェリンの分解物から強い抗菌活性を有するペプチドを単離、若しくはそれらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそれらのペプチドの誘導体を合成し、２０個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−９２９９４号公報）、１１個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−７８３９２号公報）、６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９７号公報）、５個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４９８２９６号公報）、３〜６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９５号公報）を、それぞれ既に特許出願した。
【０００８】
さらに、乳汁の生理活性ペプチドには、成長ホルモン、細胞分化増殖因子等の他に、カルシウム吸収促進ペプチド（フードケミカル、第１１巻、第３３ページ、１９８８年）、オピオイドペプチド［ホッペ・ザイラーズ・ツァイトシュリフト・フュアー・フィジオロギッシェ・ヘミー(Hoppe-Seyler´s Zeitschrift fur Physiologische Chemie)、第３６０巻、第１２１１ページ、１９７９年およびザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(The Journal of Biological Chemistry) 、第２５４巻、第２４４６ページ、１９７９年］、アンジオテンシン転換酵素阻害ペプチド（フードケミカル、第１１巻、第３９ページ、１９８８年）、胃酸分泌抑制作用を有するペプチド（特開平５−２６２７９３号公報）等が知られている。
【０００９】
この発明の発明者らも、ラクトフェリン類を酸または酵素により加水分解した物質と同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはこれらペプチドの誘導体に脳の保護作用（特願平４−３２７７３８号公報）、ラクトフェリン加水分解物に上皮細胞増殖因子による繊維芽細胞増殖を促進する作用（特開平６−４８９５５号公報）および神経成長因子産生促進作用（特開平５−２３５５７号公報）があることを見い出し、それぞれ既に特許出願した。
【００１０】
しかしながら、これらのラクトフェリン由来のペプチドが、血液中でプロタミンと同等のヘパリン中和作用を有し、しかもプロタミンの様な血液凝固阻止作用を持たないことは知られておらず、文献にも記載されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から明らかなように、副作用が少ないヘパリン中和剤が待望されていたが、未だに優れた物質は、知られていないのが現状であった。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、副作用が少なく、少量で有効なヘパリン中和剤を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者らは、へパリンの血液凝固阻止作用を中和する物質を検索していたが、ラクトフェリンを加水分解して得られるペプチドが、安全かつ副作用も少ないことを見い出し、この発明を完成した。すなわち、この発明は、前記の課題を解決するものとして、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、このペプチドのカルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体、薬学的に許容されるこのペプチドの塩類（以下、これらをまとめてペプチド類と記載することがある）または、これらの２種以上の混合物を有効成分とする、ヘパリン血液凝固阻止作用に対する中和剤を提供する。
【００１３】
以下、この発明の構成および好ましい態様について詳しく説明する。
この発明のヘパリン中和剤の有効成分であるペプチド類をラクトフェリン類から製造する場合、出発物質として使用するラクトフェリン類は、市販のラクトフェリン、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートした金属飽和または部分飽和ラクトフェリンであり、市販品または公知の方法により製造した調製品を使用することもできる。
【００１４】
この発明において使用するペプチド類は、ラクトフェリン類の分解物から分離手段によって得られるペプチド、このペプチドと同一のアミノ酸配列、相同なアミノ酸配列を有するペプチド、これらのペプチドの誘導体、これらのペプチドの薬学的に許容される塩類またはこれらの任意の混合物であり、公知の方法により化学的に合成することもできる。これらのペプチド類は、例えば、前記特開平５−９２９９４号公報、特開平５−７８３９２号公報、特開平５−１４８２９７号公報、特開平５−１４９８２９６号公報および特開平５−１４８２９５号公報の各発明に記載された方法によって得ることができる。
【００１５】
前記の方法によって得られるペプチドは次のアミノ酸配列を有するペプチド、その誘導体または塩類を望ましい態様として例示できる。例えば、配列番号１、２および２７のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類またはその誘導体（特開平５−７８３９２号公報）、配列番号３、４、５および６のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類またはその誘導体（特開平５−１４８２９７号公報）、配列番号７、８、９および３１のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類またはその誘導体（特開平５−１４９８２９６号公報）、配列番号１０から２１のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類またはその誘導体（特開平５−１４８２９５号公報）、配列番号２２から２６、２８、２９および３０のアミノ酸配列を有するペプチド、その塩類またはその誘導体（特開平５−９２９９４号公報）である。
【００１６】
前記ペプチドの薬学的に許容される塩類としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩を例示でき、誘導体としては、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。
この発明の治療剤は、公知の方法により注射剤等に加工することができる。
この発明のヘパリン中和剤は、年齢、症状等により異なるが、ヘパリン１０００単位当たり少なくとも１０〜１５ｍｇの割合で非経口的に投与できる。
【００１７】
次に試験例を示してこの発明を詳しく説明する。
試験例１
この試験は、ヘパリン血液凝固阻止作用に対するペプチド類の中和効果を調べるために行った。
１）試験動物
体重２９〜３３ｇのｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ社から購入）を、無作為に１２群（１群１０〜１２匹）に分けて使用した。
２）試験方法
マウスをクロロホルム（和光純薬工業社製）で麻酔し、胸部を切開し、ヘパリン（最終濃度５Ｕ／ｍｌ）および参考例１と同一の方法により製造した配列番号２６のペプチドを予め充填した注射器（テルモ社製）で心臓から血液を採取し、この血液を試験管（ファルコン社製）に移し、３７℃の水浴に静置した。採血時から試験管を傾斜しても流出しなくなるまでの時間（凝固時間）を測定し、凝固時間が６０分以下の場合を有効と判定した。また、対照として、ヘパリンおよびプロタミンを充填した注射器で採取した血液についても同様に凝固時間を測定した。なお、配列番号２６のペプチド、硫酸プロタミン（和光純薬工業社製）およびヘパリンナトリウム（小玉社製）は、注射用生理食塩液（大塚製薬社製）に溶解または希釈して使用した。
３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。なお、ＥＤ５０は、対数確率グラフから読取った数値である。表１から明らかなように、配列番号２６のペプチドは、ヘパリンの血液凝固阻止作用を中和し、その効力は硫酸プロタミンとほぼ同等であった。なお、他のペプチド類についても同様の試験を行ったがほぼ同じような結果が得られた。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
試験例２
この試験は、クエン酸ナトリウムの血液凝固阻止作用に対するペプチドの中和効果を調べるために行った。
１）試験動物
体重２９〜３３ｇのｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ社から購入）を、無作為に３群（１群８匹）に分けて使用した。
２）試験方法
ヘパリンの代わりに最終濃度５０μｌ／ｍｌの１０％クエン酸ナトリウム溶液（扶桑薬品社製）を予め充填した注射器を用いたことを除き、試験例１と同一の方法により試験した。
３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、参考例１と同一の方法により製造した配列番号２６のペプチドは、クエン酸ナトリウムの血液凝固阻止作用を中和しないことが認められた。なお、他のペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同じような結果が得られた。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
試験例３
この試験は、ペプチドの血液凝固阻止作用を調べるために行った。
１）試験動物
体重２９〜３３ｇのｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ社から購入）を、無作為に１３群（１群１０〜２０匹）に分けて使用した。
２）試験方法
予め、参考例１と同一の方法により製造した配列番号２６のペプチド、硫酸プロタミン（和光純薬工業社製）またはプロタミン塩基（シグマ社製）を充填した注射器を用いたことおよび凝固時間が６０分を超えた場合に有効と判定したことを除き、試験例１と同一の方法により試験した。
３）試験結果
この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなように、配列番号２６のペプチドの血液凝固阻止作用は、硫酸プロタミンおよびプロタミン塩基よりも弱いことが認められた。なお、他のペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同じような結果が得られた。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
試験例４
この試験は、ペプチドの急性毒性を調べるために行った。
１）使用動物
６週齢のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ４群（１群５匹）に分けて使用した。
２）試験方法
参考例１と同一の方法で製造した配列番号２６のペプチドを、体重１ｋｇ当り１０００、２０００または４０００ｍｇの割合で注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、体重１００ｇ当たり４ｍｌの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。
３）試験結果
この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなように、このペプチドを１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、このペプチドのＬＤ50は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低いことが判明した。なお、他のペプチド類についても同様の試験を行ったが、ほぼ同じような結果が得られた。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
参考例１
市販のウシ・ラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製水０．９ｍｌに溶解し、０．１規定の塩酸でｐＨを２．５に調整し、のち市販のブタペプシン（シグマ社製）１ｍｇを添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１規定の水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソ−社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソ−社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。
【００２６】
上記のペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。またＤＴＮＢ［５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイック・アシド）］を用いたジスルフィド結合分析法［アナリティカル・バイオケミストリ−（Analytical Biochemistry ）、第６７巻、第４９３頁、１９７５年］によりジスルフィド結合が存在することを確認した。
【００２７】
その結果、このペプチドは、２５個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸がそれぞれ結合した、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有していることが確認された。
参考例２
ペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製。ＬＫＢＢｉｏｌｙｎｘ４１７０）を用い、シェパ−ド等による固相ペプチド合成法［ジャ−ナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ−・パ−キンＩ（Journal of Chemical Society Perkin  Ｉ）、第５３８頁、１９８１年］に基づいてペプチドを次のようにして合成した。
【００２８】
アミン官能基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸［以下Fmoc−アミノ酸またはFmoc−固有のアミノ酸の名称（例えば、Fmoc−アスパラギン）と記載することがある］に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成に用いた。ペプチド鎖を製造するためにＣ−末端のアスパラギン残基に相当するFmoc−アスパラギン無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウルトロシンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列のＣ−末端から２番目に相当するFmoc−アルギニン無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定されたアルギニンの脱保護アミン官能基にカップリングさせた。以下同様にして順次グルタミン、トリプトファン、グルタミン、およびフェニルアラニンを固定した。全部のアミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、９４％ＴＦＡ、５％フェノ−ル、および１％エタンジオ−ルからなる溶媒でアセトアミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を行ない、高速液体クロマトグラフイ−によりペプチドを精製し、この溶液を濃縮し、乾燥して、ペプチド粉末を得た。
【００２９】
前記のペプチドについてアミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析し、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。
【００３０】
【実施例】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
注射用水（大塚製薬社製）１ｍｌに、参考例１と同一の方法により製造した配列番号２６のペプチド粉末１ｍｇおよび塩化ナトリウム（和光純薬工業製）９ｍｇの割合で溶解し、水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）および塩酸（和光純薬工業社製）でｐＨを約７に調整し、濾過滅菌し、常法により１ｍｌずつアンプルに充填し、注射用のヘパリン中和剤を製造した。
実施例２
注射用水（大塚製薬製）１ｍｌに、参考例２と同一の方法により製造した配列番号１０のペプチド粉末１０ｍｇおよびＤ−マンニット（和光純薬工業社製）４９．５ｍｇの割合で溶解し、リン酸緩衝剤粉末（和光純薬工業社製）の水溶液でｐＨを約７に調整し、濾過滅菌し、常法により１ｍｌずつバイアル瓶に充填し、凍結乾燥し、注射用のヘパリン中和剤を製造した。
【００３１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明は、ペプチド類を有効成分とするヘパリン中和剤に係るものであり、この発明によって奏せられる効果は次のとおりである。
（１）副作用が少ない。
（２）耐熱性があり、水に可溶性で、水溶液中で安定なため、薬剤として安定である。
（３）ペプチドは抗菌作用を有するので、製剤化に当り防腐剤を使用する必要がない。
【００３２】
【配列表】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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