(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＭ抗体の診断測定におけるリウマチ因子の存在に起因する干渉を除去する方法であって、
（ａ）該ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固相材料を含んで成る試薬を提供し；
（ｂ）該固相材料上に固定した該結合構成員が該ＩｇＭ抗体と反応して結合構成員−ＩｇＭ抗体複合体を形成する条件下で、生物学的試料と該試薬を合わせ；そして
（ｃ）該固相材料に結合したＩｇＧ抗体から該リウマチ因子を解離させるのに十分な量のリウマチ因子中和バッファーを該固相材料に導入する工程を含んで成り、但し該リウマチ因子中和バッファーのｐＨが３．０〜５．５であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
該リウマチ因子中和バッファーが、イオン系、非イオン系、および双性イオン系バッファーから成る群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３】
固相に固定された該結合構成員が、風疹ウィルス抗原である、請求項１の方法。
【請求項４】
固相に固定された該結合構成員が、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｇｏｎｄｉｉ）抗原である、請求項１の方法。
【請求項５】
該生物学的試料を該試薬と反応させた後、該リウマチ因子中和バッファーを用いて当該固相材料を洗浄する、請求項１の方法。
【請求項６】
ＩｇＭ抗体の診断測定におけるリウマチ因子の存在に起因する干渉を除去する方法であって、
（ａ）該ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固相材料を含んで成る試薬を提供し；そして
（ｂ）生物学的試料または（ａ）の試薬または生物学的試料と（ａ）の試薬の両方に、該固相材料に結合したＩｇＧ抗体へのリウマチ因子の結合を阻止するのに十分な量のリウマチ因子中和バッファーを導入する工程を含んで成り、但し該リウマチ因子中和バッファーのｐＨが３．０〜５．５である、前記方法。
【請求項７】
該リウマチ因子中和バッファーが、イオン系、非イオン系、および双性イオン系バッファーから成る群から選ばれる、請求項６の方法。
【請求項８】
固相材料に固定された当該結合構成員が、風疹ウィルス抗原である、請求項６の方法。
【請求項９】
固相材料に固定された当該結合構成員が、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｇｏｎｄｉｉ）抗原である、請求項６の方法。
【請求項１０】
該生物学的試料を該試薬と接触させる前に、当該リウマチ因子中和バッファーを用いて該生物学的試料を希釈する、請求項６の方法。
【請求項１１】
該試薬を該生物学的試料と接触させる前に、該リウチ因子中和バッファーを用いて該試薬を希釈する、請求項６の方法。
【請求項１２】
リウマチ因子を生物学的試料から除去する方法であって、
（ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固相材料と生物学的試料とを合わせ；
（ｂ）固相材料に固定した該結合構成員に特異的なＩｇＭ抗体（存在するとすれば）を該固定結合構成員に結合させて結合構成員−ＩｇＭ抗体複合体を形成させ；
（ｃ）該試料から該固相材料を分離し；
（ｄ）分離した固相材料を、当該リウマチ因子を該固相材料に結合したＩｇＧ抗体から解離させるのに十分な量のリウマチ因子中和バッファーで洗浄するが、但し該リウマチ因子中和バッファーのｐＨは３．０〜５．５であり；
（ｅ）工程（ｄ）後の固相材料を、該結合構成員−ＩｇＭ抗体複合体（存在するとすれば）に結合する抗体−酵素結合物に供して免疫複合体を形成させ；
（ｆ）工程（ｅ）後の該固相材料から未結合の物質を除去し；
（ｇ）該酵素の基質を該免疫複合体に加え；
（ｈ）該酵素と該基質との反応から生じる検出可能生成物の形成速度を測定することから成る前記方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）後に、洗浄し分離した固相材料から未結合の物質を除去する工程を更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
固相材料に固定された当該結合構成員が、風疹ウィルス抗原である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
当該固相材料に固定された当該結合構成員が、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｇｏｎｄｉｉ）抗原である、請求項１２の方法。
【請求項１６】
該固相材料が微粒子である、請求項１２の方法。
【請求項１７】
該酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１２の方法。
【請求項１８】
酵素の当該基質が、燐酸４−メチルウンベリフェリルである、請求項１２の方法。
【請求項１９】
リウマチ因子を生物学的試料から除去する方法であって、
（ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固相材料を含んで成る試薬を提供し；
（ｂ）生物学的試料または工程（ａ）の試薬または生物学的試料と工程（ａ）の試薬の両方を、該固相材料に結合したＩｇＧ抗体への該リウマチ因子の結合を阻止するのに十分な量のリウマチ因子中和バッファーで希釈するが、但し該リウマチ因子中和バッファーのｐＨは３．０〜５．５であり；
（ｃ）該結合構成員に特異的なＩｇＭ抗体（存在するとすれば）が該固定結合構成員に結合して結合構成員−ＩｇＭ抗体複合体を形成する条件下で、前記生物学的試料と（ａ）の試薬を合わせ；
（ｄ）該試料から該固相材料を分離し；
（ｅ）工程（ｄ）の該固相材料を、該結合構成員−ＩｇＭ抗体複合体（存在するとすれば）に結合する抗体−酵素結合物に供して免疫複合体を形成させ；
（ｆ）工程（ｅ）後の該固相材料から未結合の物質を除去し；
（ｇ）該酵素の基質を該免疫複合体に加え；
（ｈ）該基質と該酵素との反応から生じる検出可能生成物の形成速度を測定することから成る前記方法。
【請求項２０】
工程（ｄ）後に該固相材料から未結合の物質を除去する工程を更に含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
固相材料に固定された当該結合構成員が、風疹ウィルス抗原である、請求項１９の方法。
【請求項２２】
固相材料に固定された該結合構成員が、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｇｏｎｄｉｉ）抗原である、請求項１９の方法。
【請求項２３】
該固相材料が微粒子である、請求項１９の方法。
【請求項２４】
該酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１９の方法。
【請求項２５】
酵素の該基質が、燐酸４−メチルウンベリフェリルである、請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、診断測定法、更に詳しくは、生物学的試料中のリウマチ因子に起因する干渉を除去する方法に関する。
２．技術の考察
Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（トキソプラズマ原虫、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）は、ヒトを含む種々の中間宿主に感染することのできる偏性細胞内寄生虫である。感染した固有宿主（ネコ）が、糞便中にオーシストを排出し、これが、土壌中で急速に成熟し、感染性になる。中間宿主によって摂取された場合、胞子虫を形成し、急速に増殖して、より緩慢な増殖ではあるが感染性のブラディゾイトを含有するシストの最終的発生を見る。このトキソプラズマ症は、ネコの糞便またはシストに感染した加熱不十分の肉の摂取を介してヒトがかかる。
健常な成人の感染は、普通、無症候性である。臨床的形質発現のケースでは、最も普通の症候群は、鑑別診断を困難にする、ずらり並んだ他の症候群を伴うかもしれないリンパ節症である。他方、癌化学療法または免疫抑制剤により免疫妥協した成人およびエイズ患者においては、重篤から致死の感染が起こる。免疫妥協した成人の感染は、潜在性後天性感染の再活性化であると考えられ、他の部位の関与が報告されているが、通常、中枢神経系が関与している。
先天性トキソプラズマ症に帰するこの寄生虫の経胎盤伝達が、急性の後天性母性感染中に起きることがある。胎児感染の危険性は、急性母性感染が妊娠中に起きる時間の関数である。受胎前に得た母性感染は、胎児に対し、あるとしても非常に少ない危険しかさらさない。しかしながら、先天性トキソプラズマ症の発生率は、妊娠の進行につれて増加し、逆の言い方をすれば、先天性トキソプラズマ症の重篤度は、妊娠初期に母性感染をした場合に最も高い。特に、母性感染が３学期目に起きる場合、子宮内で感染した大部分の乳児は、出生時には無症候性であり、続発症が、後の人生で出現する。先天性トキソプラズマ症は、子宮内感染した乳児の約２０−３０％における重篤な全身性または神経学的疾患に帰し、約１０％は、視覚関与のみを示し、残り（約７０％）は、出生時に無症候性である。不顕性感染は、早産および引き続く神経学的、知能、および聴覚障害に帰することがある。
妊娠の予測研究は、感染の出生前診断に続く出生前治療が、先天性トキソプラズマ症の頻度および重篤度を減少させることを示した。血清学的検査を用いて、危険な状態の妊娠を鑑定することができ、妊娠の診断時に血清反応陰性である女性を、妊娠中監視することができる。血清転換は、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ感染を示し、母性感染が起きた場合に妊娠年齢を確かめる。
Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＭ抗体に特異的な血清学的検査は、先天性および急性後天性トキソプラズマ症の両方の診断に有用な助けである。ＩｇＭ抗体の水準は、急性後天性感染後、急速に増加し、数ヶ月後減少し始めるが、検出可能な水準で１年以上存続することができる。持続するＩｇＭ水準を、後天性感染の発生のずっと後に検出することができることから、１回の血清学的検査結果の使用は、妊娠の時期を確かめることが重要である場合には注意して用いる必要がある。これを、妊娠中にかかった急性Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ感染の診断に供する。Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに対する検出可能なＩｇＭ抗体の結果のみに基づく感染日の決定は、推薦されない。その決定は、低水準のＩｇＭ抗体が１年以上存続することができることから、臨床歴および以前の血清学を含むはずである。Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに対するＩｇＧ抗体の増加を測定する検査の使用は、感染の日時に関して更なる情報を提供することができる。
ほとんどの個々人における一次風疹感染は、典型的には、網膜丘疹性発疹、発熱、不快、およびリンパ節症によって特徴づけられる温和な自己限定疾患である。妊娠女性において、一次感染は、深刻な医学的結果をもたらすことがある。子宮内感染は、特に、妊娠の初めの４ヶ月の間に起こる場合、胎児を重篤に損傷する。先天的に感染した乳児は、先天性風疹症候群（ＣＲＳ）として集合的に知られる種々の障害の１つ以上を示す。これらの中には、出生時低体重、白内障、聾、先天性心臓疾患、および精神遅滞がある。
風疹は、典型的症候を有するが、臨床像は、非常に変化に富んでいる。この疾患は、症候のみから正確に診断することが、しばしば困難であるか不可能である。赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験の出現で、研究室は、急性および回復期のペア血清間の抗体活性の増加水準を示すことにより最近の風疹感染の血清学的証拠を提供することができた。しかしながら、ＨＡＩタイターは、疾病罹患の日から急速に増加することから、回復期の血清と比較する場合、タイターにおける著しい増加を検出するために急性血清を初期に採集する必要がある。更に、ＨＡＩタイターは、一次感染および再感染の両方の後に著しく増加することから、ＨＡＩを用いてこの２つを鑑別することができない。２−メルカプトエタノール処理または蔗糖密度勾配分別と合わせたＨＡＩ試験の使用により、単一の血清試料中の風疹ＩｇＭ抗体の検出が可能になった。単一の試料中の抗−風疹抗体のＩｇＭクラスを検出する能力は、ペア血清分析と関係するいくつかの問題を克服し、より明確な血清診断像を提供する。
一般に胎児に対して無害であると考えられている、免疫妊産婦の無症候性再感染は、検出可能なＩｇＭ抗体の非存在下でのＩｇＧ抗体の増加により血清学的に特徴づけられる。一次感染は、風疹ウィルス抗原に対する宣告されたＩｇＭ抗体応答と関係している。風疹ウィルス抗原に反応性のＩｇＭ抗体が、再感染後観察されてきたが、しかしながら、その水準は低く、全てのＩｇＭ測定法により検出可能ではない。妊娠時の急性一次感染の場合、ＩｇＭが、ほとんど１００％のケースで発疹の出現後４から１５日に検出されてきた。ＩｇＭ水準は、３６から７０日後に減少しはじめ、１８０日後には希に検出される。
風疹ＩｇＭ検出の臨床的有用性は、通常、妊娠女性の検査と関係しているが、妊娠していない個々人の風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体の検査は、急性感染の診断における有用な助けとなる。
特定の血清に存在すリウマチ因子は、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉおよび風疹に対するＩｇＭ測定において偽陽性の結果をもたらすことがある。この問題を扱うために、特定のＩｇＭ測定プロトコールは、陽性とでた検査した全ての試料を、リウマチ因子中和剤（ＲＦＮＲ）で処理し、再検査することを要求している。ＲＦＮＲはヒトγ−グロブリンで覆われた微粒子の懸濁液を含む。リウマチ因子は、ヒトＩｇＧ分子のＦｃ部分に親和性があることから、ＲＦＮＲは、リウマチ因子を吸収する。リウマチ因子陽性のヒト試料をＲＦＮＲと共にインキュベートする場合、リウマチ因子は、被覆した微粒子に結合し、結合したリウマチ因子は、遠心分離を通じて除去される。処理した試料を、次いで、ＲＦＮＲ法により引き起こされた希釈の影響を打ち消すために代わりの希釈プロトコールを用いて再検査する。再検査により、これらの試料が、ＲＦＮＲでの吸収後も陽性でない限り、特異的ＩｇＭ抗体が陽性とは解釈されない。
初めに陽性であった試料のＲＦＮＲでの処理および試料の再検査の必要性を排除することは望ましいであろう。
発明の概要
本発明は、生物学的試料中、例えば、ヒト血清または血漿中のリウマチ因子の存在により引き起こされる交叉反応性およびＩｇＭ免疫測定法における偽陽性の測定結果を排除する、リウマチ因子を含有すると思われるこれらの生物学的試料を処理する方法を提供する。
本発明の一つの態様において、本方法は、抗体及びその抗体に特異的な結合構成員、例えば抗原を含んで成る複合体を含有する固相材料に、リウマチ因子のＩｇＧ抗体への結合が切れ、検出相の診断測定以前にリウマチ因子を固相材料から洗い流すことのできるような程度まで、ＩｇＧ抗体に対する親和性を減少させるように、そのバッファーが、固相材料に結合したＩｇＧ抗体にリウマチ因子が結合するのに十分低いｐＨを有する、十分な量のリウマチ因子中和バッファーを導入して成る。しかしながら、リウマチ因子中和バッファーのｐＨは、固相材料に固定された結合構成員、例えば抗原へのＩｇＭ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＭ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉＩｇＭ抗体の結合が、不利に影響されるほど低くてはいけない。この特定の態様において、リウマチ因子中和バッファーは、代表的には、約６．５未満のｐＨを有する。リウマチ因子中和バッファーは、好ましくは約３．０から約５．５、更に好ましくは約３．５から約５．０のｐＨを有する。
別の態様において、本方法は、生物学的試料又は、その上に固定されたＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を有する固相材料を含んで成る試薬、または試料と試薬の両方に、固相材料に結合したＩｇＧ抗体との複合体を形成しないことにより、検出相の診断測定以前にこれらのリウマチ因子の混合物からの除去を容易にするような程度まで、そのバッファーが、その結果できるリウマチ因子を含有する反応混合物のｐＨが混合物中のリウマチ因子のＩｇＧ抗体に対する親和性を減少させるのに十分低いｐＨにするほど十分低いｐＨを有する、十分な量のリウマチ因子中和バッファーを導入して成る。しかしながら、リウマチ因子中和バッファーのｐＨは、固相材料に固定された結合構成員、例えば抗原へのＩｇＭ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＭ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉＩｇＭ抗体の結合が、不利に影響されるほど低くてはいけない。この特定の態様において、リウマチ因子中和バッファーは、代表的には、約６．５以下のｐＨを有する。リウマチ因子中和バッファーは、好ましくは約３．０から約５．５、更に好ましくは約３．５から約５．０のｐＨを有する。
いずれの態様においても、本発明の方法に好適であるバッファーの系としては、好ましくは約６．５以下のｐＫａ値を有するイオン系、非イオン系、および双性イオン系バッファーが挙げられる。本発明の方法に好適であるバッファーの代表的例としては、それらに限定される訳ではないが、酢酸、クエン酸、蟻酸、コハク酸、およびグリシンが挙げられる。
リウマチ因子中和バッファーを用いて、２つの方法の内少なくとも１つのＩｇＭ免疫検定法におけるリウマチ因子による干渉を排除することができる。一方の方法において、このバッファーを用いて、固相材料に結合した複合体を処理することができる。バッファーは、リウマチ因子と固相材料に結合しているＩｇＧ抗体との間の結合を切断し、リウマチ因子を溶出させる。他方の方法において、このバッファーを、リウマチ因子を含有すると思われる試料に、又はその上にＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固相材料を含有する試薬に、または試料と試薬の両方に直接加えることができる。試料と試薬とを混合する場合、バッファーは、試料および試薬を含有する混合物のｐＨを低くし、固相材料に結合する試料中のＩｇＧ抗体とリウマチ因子との結合を妨害する。
本発明は、参照により本明細書に含めるものとする米国特許第５，３５８，６９１に記載されているような自動連続および任意のアクセス解析システムを用いた用途に特に有用である。本発明は、ヒト血清または血漿試料中のリウマチ因子の存在によって起こるかもしれない偽陽性の測定結果を最小にする。本発明の主な有益性は、その簡便性ならびに自動連続および任意のアクセス解析システムにより実施される測定法の測定プロトコールにこの工程を組み込む能力である。本発明は、列を離れた初めに陽性とでた全ての試料をＲＦＮＲで処理し再検査する必要性を排除することを可能にし、それにより、測定法を簡潔にし、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原または風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体の存在を測定するのに要する測定時間を短くする。
詳細な説明
本明細書で用いた゛供試試料゛または゛試料゛とは、分析物を含有すると思われる物質を意味する。供試試料は、源から得られたまま直接、または試料の性質を変える前処理後用いることができる。供試試料は、例えば、血液、唾液、目の水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、滑液、腹膜液、羊水等のような生理学的液体のような生物学的源から誘導することができる。供試試料は、血液からの血漿の調製、粘稠な液体の希釈等のように、使用前に前処理することができる。処理方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、問題の成分の不活性化、試薬の添加等を含むことができる。生理学的液体の他に水、食品等のような他の液体試料を、環境または食物製品測定の実施に用いることができる。更に、分析物を含有すると思われる固形物質を、供試試料として用いることができる。ある場合には、固形供試試料を改造して液体媒体を形成させるか又は分析物を放出させることが有益であってもよい。
本明細書で用いた゛結合構成員゛とは、特異的結合対の構成員、即ち、分子の一方が、化学的または物理的手段を通じて二番目の分子に特異的に結合する２つの異なる分子を意味する。特異的結合対のこのような結合構成員の例としては、抗原および、その抗原に特異的に結合する抗体がある。特異的結合対のこのような結合構成員の他の例としては、第一抗体および、この第一抗体に特異的に結合する第二抗体がある。
本明細書で用いた゛結合物゛とは、検出可能部分に結合した結合構成員、例えば抗原または抗体を意味する。
本明細書で用いた゛検出可能部分゛とは、結合構成員、例えば抗体または抗原に結合した結合物の一部分を意味する。検出可能部分は、結合構成員とその相補的な結合構成員との間の反応を検出可能にする。検出可能部分の代表的例としては、酵素、放射線標識、フルオレセイン、および光を生じさせる化学物質が挙げられる。検出可能部分は、分析物に結合することができ、且つ可視的または装置による手段により検出可能であるシグナルを生じさせることのできるいずれかの物質である。本発明の用途に適した種々の検出可能部分としては、触媒、酵素、リポソーム、および色原体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素等のようなシグナル生成物質を含有する他の小胞が挙げられる。標識としての用途に好適な多数の酵素が、参照により本明細書に含めるものとする米国特許第４，２７５，１４９に開示されている。このような酵素としては、アルカリホスファターゼおよび西洋わさびパーオキシダーゼのようなグルコシダーゼ類、ガラクトシダーゼ類、ホスファターゼ類およびパーオキシダーゼ類が挙げられ、これらは、フルオレセインジ（ガラクトピラノシド）、ニトロブルーテトラゾリウム、３，５′，５，５′−テトラニトロベンジジン、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、燐酸４−メチルウンベリフェリル、燐酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルのような酵素基質、ＷＯ  ８８１００６９４およびＥＰ  ０−２５４−０５１−Ａ２に記載のジオキセタン類のような化学発光酵素基質ならびにその誘導体および類似体と共に用いる。好ましくは、検出可能な部分は酵素であり、最も好ましくは、酵素はアルカリホスファターゼである。
本明細書で用いた゛固相材料゛とは、不溶性であるか又は引き続く反応により不溶性にすることのできるいずれかの材料を意味する。固相材料の代表的例としては、ポリマーもしくはガラスビーズ、微粒子、チューブ、シート、プレート、スライド、ウェル、テープ、試験管等が挙げられる。
本明細書で用いた゛基質゛とは、適切な酵素により４−メチルウンベリフェロンのような蛍光化合物に変換することのできる物質を意味する。蛍光化合物を形成する速度は、反応混合物中に存在する酵素の量の指標である。酵素免疫検定法におけるのと同様に、酵素が検出可能部分である場合、存在する酵素の量は供試試料中に存在する分析物の量に相関する。従って、蛍光の大きさを用いて供試試料中に存在する分析物の量を測定することができる。
本明細書で用いた゛分析物゛とは、検出または測定される化合物を意味する。分析物は、少なくとも１つのエピトープまたは結合部位を有する。
本明細書で用いた゛リウマチ因子゛とは、ヒトＩｇＧに対して向けられる自己抗体を意味する。リウマチ因子は、もっともしばしばＩｇＭクラスに属する。それらは、主として、リウマチ様関節炎に罹患している患者に見い出され、偽陽性の結果を引き起こすことにより免疫検定を妨害する。リウマチ因子による干渉を特に受けやすい免疫検定法は、特異的抗原で被覆した固相材料が、特異的ＩｇＭ抗体を捕捉する間接的ＩｇＭ測定法である。ＩｇＭ抗体−抗原複合体は、抗ヒトＩｇＭ酵素結合物により検出される。
本明細書で用いた゛Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定法゛とは、ヒト血清および血漿中のＴ．ｇｏｎｄｉｉ特異的ＩｇＭ抗体の検出の定性法を意味する（例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム）。
本明細書で用いた゛風疹ＩｇＭ測定法゛とは、ヒト血清および血漿中の風疹特異的ＩｇＭ抗体の検出の定性法を意味する（例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム）。一次感染が疑われる状況においては、試料採集の最適期間は、発疹の発生後１から２週であると報告された。
本発明の意義および操作をより明瞭に理解するために、参照により本明細書に含めるものとする米国特許第５，３５８，６９１で述べられた型の装置により実施することのできる免疫検定法の性質を認識することが重要である。多数の型の免疫検定法を、米国特許第５，３５８，６９１で述べられた型の装置により実施することのできる。一般に、免疫検定法は、２つの主要なカテゴリー、均質系および不均質系に分類することができる。均質系および不均質系免疫検定法は、結合構成員対の第二結合構成員、例えば抗体に特異的に結合する、結合構成員対の第一結合構成員、例えば抗原の能力に依存する。検出可能な部分で標識したこのような結合構成員の一つを含んで成る結合物を、このような結合の程度を測定するのに用いる。例えば、このような結合構成員対は、抗原及びこのような抗原に対する抗体であってもよい。抗体を含んで成ることのできる結合物は、抗原との結合反応に参加するか又はこのような反応に参加しないかのいずれかである。反応後に検出および測定される検出可能部分の量は、供試試料中に存在する抗体の量に関係づけることができる。
不均質系測定法は、競合的免疫検定フォーマットまたはサンドイッチ免疫検定フォーマットで実施することができる。競合的免疫検定フォーマットにおいて、抗原を固相材料に固定することができる。固相材料に結合する検出可能部分の量を、検出測定し、供試試料中に存在する抗体の量と関係づけることができる。固相材料の例としては、ビーズ、粒子、微粒子等が挙げられる。
本発明は、主として、サンドイッチ免疫検定フォーマットに関する。サンドイッチ免疫検定フォーマットの一例において、抗体を含有する供試試料は、固相材料上に固定した抗原、例えば蛋白質と接触することにより、抗原−抗体複合体を形成する。固相材料の例としては、ビーズ、粒子、微粒子等が挙げられる。抗原−抗体複合体を含有する固相材料を、代表的には、例えば、検出可能部分で標識した第二抗体で処理する。第二抗体は、次いで、固相材料上に固定した抗原に結合している試料の抗体と結合する。次いで、未結合の物質を除去する１つ以上の洗浄工程後、色原体物質のような指標物質を、検出可能部分と反応するように導入して検出可能シグナル、例えば色の変化を生じさせる。色の変化を、次いで、検出測定し、供試試料中に存在する抗体の量と相関させる。また、種々の希釈剤およびバッファーも、微粒子、抗原、結合物、および化学反応に参加する他の測定成分の操作を最適化するために必要とすることを記すべきである。更に、例えば、第一抗体を固相材料上に固定する場合のような他の型のサンドイッチ測定法を用いることができることを記すべきである。
競合的またはサンドイッチ免疫検定フォーマットのいずれかで米国特許第５，３５８，６９１の装置を用いて実施することができる不均質系免疫検定法は、微粒子を固相材料として用いる、Clinical Chemistry,３４巻、９号、１７２６−１７３２ページ（１９８８年）に記載されているような微粒子捕捉酵素免疫検定法である。この論文は、参照により本明細書に含めるものとする。
微粒子捕捉酵素免疫検定法のステップ−バイ−ステップ記述は、米国特許第５，３５８，６９１の欄３５の６０行から欄４４の２２行に示されている。
本発明の方法の１態様を、以下の方法で実施することができる。初めに、生物学的試料を提供する。次いで、試料を、抗体に特異的な結合構成員をその上に固定した固相材料と混合する。このような結合構成員の一例は、抗原、例えば風疹ウィルス抗原、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原である。存在するとすれば、固定した結合構成員に対して特異的である試料中の抗体は、固定した結合構成員に結合して結合構成員−抗体複合体を形成する。本発明で特に目的とする抗体としては、風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体およびＴ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が挙げられる。次いで、好ましくは、固相材料と試料の混合物を多孔性マトリックスに供することにより、固相材料を試料から分離する。固相材料を、次いで、マトリックス上で十分な量のリウマチ因子中和バッファーで洗浄するが、このバッファーは、存在するとすれば、リウマチ因子が、固相材料に結合したＩｇＧ抗体から解離を起こすのに十分低いｐＨを有する。次いで、代表的には、バッファー、例えば中性のｐＨバッファーでマトリクス上を洗浄する方法により、更に未結合の物質を固相材料から除去するのが好ましい。固相材料を、次いで、固相材料上に固定した結合構成員−抗体複合体に結合する抗体−酵素結合物に供する。次いで、代表的には、バッファー、例えば中性のｐＨバッファーでマトリクス上を洗浄する方法により、未結合の物質を固相材料から除去する。この酵素の基質をマトリックスに加える。次いで、検出可能な生成物、例えば蛍光生成物の形成速度を測定し、試料中のＩｇＭ抗体の水準を測定する。本明細書で用いた゛固相材料に結合したＩｇＧ抗体゛の表現は、（１）固相材料に直接接合したＩｇＧ抗体および（２）固相材料に直接結合した結合構成員に結合したＩｇＧ抗体の両方を含むことを意図するものであることを特に言及する。
リウマチ因子中和バッファーのｐＨは、固相材料に結合したＩｇＧ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＧ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＧ抗体から成る免疫複合体へのリウマチ因子の結合を減少、更に好ましくは排除するほど十分低くなければならないが、しかし、固相材料に固定された結合構成員、例えば抗原に結合したＩｇＭ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＭ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＭ抗体の結合が不利に影響されるほど低くてはいけない。適切に低いｐＨを有する十分な量のリウマチ因子中和バッファーを用いる結果として、リウマチ因子を含有する生物学的試料は、ＩｇＭ抗体の測定で偽陽性の測定結果が出ない。
本発明の方法の別の態様は、以下の方法で実施することができる。初めに、生物学的試料を提供する。次いで、目的の抗体に特異的な結合構成員をその上に固定した固相材料を含んで成る試薬を提供する。このような結合構成員の一例は、抗原、例えば風疹ウィルス抗原、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原である。次いで、試料または試薬または試料と試薬の両方を、十分な量のリウマチ因子中和バッファーで希釈するが、このバッファーは、存在するとすればリウマチ因子が、固相材料に結合したＩｇＧ抗体に結合するのを阻止するのに十分低いｐＨを有する。次いで、試料を、固相材料を含有する試薬と合わせる。固定された結合構成員に対して特異的である試料中の抗体（存在するとすれば）は、固相材料に固定された結合構成員に結合して結合構成員−抗体複合体を形成する。本発明で特に目的とする抗体としては、風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体およびＴ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が挙げられる。次いで、好ましくは、固相材料と試料の混合物を多孔性マトリックスに供することにより、固相材料を試料から分離する。次いで、代表的には、バッファー、例えば中性のｐＨバッファーでマトリクス上を洗浄する方法により、未結合の物質を固相材料から除去するのが好ましい。固相材料を、次いで、結合構成員−抗体複合体に結合する抗体−酵素結合物に供する。次いで、代表的には、バッファー、例えば中性のｐＨバッファーでマトリクス上を洗浄する方法により、未結合の物質を固相材料から除去する。この酵素の基質をマトリックスに加える。次いで、検出可能な生成物、例えば蛍光生成物の形成速度を測定し、試料中のＩｇＭ抗体の水準を測定する。前に述べたように、本明細書で用いた゛固相材料に結合したＩｇＧ抗体゛の表現は、（１）固相材料に直接結合したＩｇＧ抗体および（２）固相材料に直接結合した結合構成員に結合したＩｇＧ抗体の両方を含むことを意図するものである。
リウマチ因子中和バッファーのｐＨは、その結果できるリウマチ因子含有反応混合物のｐＨが、固相材料に結合したＩｇＧ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＧ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＧ抗体から成る免疫複合体へのリウマチ因子の結合を減少、更に好ましくは阻止するほど十分低くなければならないが、しかし、固相材料上の結合構成員、例えば抗原へのＩｇＭ抗体、例えば抗−風疹ＩｇＭ抗体または抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＭ抗体の結合が不利に影響されるほど低くてはいけない。適切に低いｐＨを有する十分な量のリウマチ因子中和バッファーを用いる結果として、リウマチ因子を含有する生物学的試料は、ＩｇＭ抗体の測定で偽陽性の測定結果が出ない。
いずれの態様においても、本発明の方法に好適であるバッファーの系としては、約６．５以下のｐＫａ値を有する、イオン系、非イオン系、および双性イオン系バッファーが挙げられる。ｐＨおよびｐＫａの意味に関する更なる詳細は、参照により本明細書に含めるものとする、゛バッファー−生物学的システムにおけるバッファーの調製および使用のガイド゛Donald E.Gueffroy,editor,Calbiochem-Novabiochem(1975)に見い出すことができる。本発明の方法に好適であるバッファーの代表例としては、それらに限定される訳ではないが、酢酸、クエン酸、蟻酸、コハク酸、およびグリシンが挙げられる。
本発明に好適であるバッファーは、好ましくは約３．０から約６．５、更に好ましくは約３．５から約５．５、最も好ましくは約３．５から約５．０の範囲のｐＨを有する。リウマチ因子中和バッファーのｐＨがあまり低すぎる場合、目的の結合構成員が、複合体を形成するために結合しない。リウマチ因子中和バッファーのｐＨがあまり高すぎる場合、リウマチ因子は、固相材料に結合したＩｇＧ抗体に結合し、偽陽性の結果を出す。抗菌剤をバッファーに含有させることも好ましい。
使用中、リウマチ因子中和バッファーは、適切な水準のｐＨが得られる濃度で存在すべきである。リウマチ因子中和バッファーを用いて多孔性マトリックス上の固相材料上の結合構成員−抗体複合体を洗浄する場合、バッファーは生物学的試料により影響されないことから、バッファーのｐＨは変化しない。リウマチ因子が、固相材料に結合したＩｇＧ抗体のような相補的結合構成員に結合する場合、適切なｐＨを有するリウマチ因子中和バッファーにリウマチ因子を含有する複合体を供することにより、リウマチ因子を含有する複合体の分解を引き起こし、それにより未結合のリウマチ因子の洗浄除去が可能になる。しかしながら、リウマチ因子中和バッファーを、生物学的試料を含有する混合物中で用いる場合、生物学的試料は、混合物のｐＨの変化を引き起こすことがある。よって、この状況では、リウマチ因子排除のための環境のｐＨを調節する手段としてｐＫａ値を信頼するのが好ましい。試料中のリウマチ因子が、固相材料に結合した相補的結合構成員、例えばＩｇＧ抗体に結合しない場合、適切なｐＨを有する環境でリウマチ因子を維持することが、これの相補的結合構成員への結合を阻止する。
リウマチ因子中和バッファーの適切な濃度は、広い範囲にわたって変わることができることから、所定の測定法に必要とされるリウマチ因子中和バッファーの正確な量を述べるのは困難である。通常、結合構成員−抗体複合体を含有する固相材料を洗浄する態様においては、必要とされるリウマチ因子中和バッファーの量は、多孔性マトリックスの表面積に依存する。試料または固相材料を含有する試薬または試料と試薬の両方を希釈する態様においては、必要とされるリウマチ因子中和バッファーの量は、測定プロトコールの動力学、例えば試薬の容量に依存する。ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置により実施されるＩｇＭ測定、例えばＴｏｘｏ  ＩｇＭ測定および風疹ＩｇＭ測定において、リウマチ因子中和バッファーの適切な量及びそのｐＨを、既知の試料に対して検定することにより算定することができる。このような検定では、当業者により容易に実施することができる。
リウマチ因子中和バッファーは、いくつかの時点のいずれかで測定手法に導入することができる。例えば、バッファーは、手法の初めに、未処理の生物学的試料、または特異的結合構成員、例えば抗原が結合している固相材料を含有する試薬、または試料と試薬の両方に導入することができる。試料のみを希釈するのが好ましい。しかしながら、試薬のみを希釈する、又は試料と試薬の両方を希釈することも可能である。測定物のどの成分をリウマチ因子中和バッファーにより希釈するかに関係なく、リウマチ因子を除去する原理は同じである。当然のことながら、試薬のみを希釈する場合、リウマチ因子の試料からの除去は、試料を試薬と合わせるまで起こらない。あるいは、試料中の結合構成員、例えば抗体、と固相材料に結合した結合構成員、例えば抗原、との反応を介して形成した結合構成員対、例えば抗原−抗体複合体、を含んで成る複合体を含有する固相材料を洗浄するのにバッファーを用いることができる。
Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定および風疹ＩｇＭ測定における偽陽性の結果は、しばしば、ヒト血清または血漿中のリウマチ因子の存在により引き起こされる。Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定では、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原で被覆した微粒子および生物学的試料から成る反応混合物を、マトリックスに供した後、好ましくは約４．０から約５．０のｐＨでリウマチ因子中和バッファーをマトリックス上に供することができる。微粒子によって捕獲された抗−Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＧ抗体に結合していたリウマチ因子が溶出される。
風疹ＩｇＭ測定では、風疹ウィルス抗原で被覆した微粒子および生物学的試料から成る反応混合物を、マトリックスに供した後、好ましくは約４．０から約５．０のｐＨでリウマチ因子中和バッファーをマトリックス上に供することができる。微粒子によって捕獲された抗−風疹ＩｇＧ抗体に結合していたリウマチ因子が溶出される。
あるいは、Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定または風疹ＩｇＭ測定のいずれかでは、試料と目的の抗原で被覆した微粒子とを混合する前に、ヒト血清または血漿または他の生物学的液体を含有する試料を、リウマチ因子中和バッファーで希釈することができる。
Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定または風疹ＩｇＭ測定で代表的に用いられる微粒子捕捉酵素免疫検定法の細部に注意を向けると、それに結合した目的のＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を有する固相材料を用いることにより、ＩｇＭ抗体の存在を測定する。固相材料の一例は、目的の特異的抗体と結合することのできる抗原で被覆した微粒子である。試料を固相材料と合わせて混合物を形成させ、混合物をインキュベートし、それにより、抗原が目的の抗体と結合する。抗原で被覆した固相材料に結合したＩｇＭ抗体の量を測定することができるように、固相材料および供試試料を分離する。固相材料に結合したＩｇＭ抗体の量は、好ましくは、酵素で標識した抗−ヒトＩｇＭ抗体を結合物として用いる酵素免疫検定法により測定する。酵素基質と呼ばれる物質を、適切な酵素により、４−メチルウンベリフェロンのような蛍光化合物に変換することができる。蛍光化合物を形成する速度は、反応混合物中に存在する酵素の量の指標である。酵素免疫検定法におけるのと同様に、酵素が検出可能部分である場合、存在する酵素の量は、供試試料中に存在する結合物の量に相関する。従って、蛍光の大きさを用いて供試試料中に存在するＩｇＭ抗体の量を測定することができる。固相材料上の抗−ヒトＩｇＭ結合物の量は、典型的には標準曲線と呼ばれるＩｇＭ抗体の濃度の関数として酵素活性を示すプロットの手段により供試試料中のＩｇＭ抗体の濃度に関係づけることができる。標準曲線は、当業者に公知である検定物質を用いた測定を実施することにより作ることができる。あるいは、特にＩｇＭ抗体の測定の場合、単一の指標検定物質を用いて測定の切り捨て値を決定する。検定が有効であることを対照を用いて確認する。未知の水準のＩｇＭ抗体を有する試料を測定する場合、測定した測定シグナルを指標検定物質と比較し、測定したシグナルに対応する指標値水準が、試料中のＩｇＭ抗体の水準である。特異的結合構成員は、物理的または化学的方法により、好ましくは共有結合の方法または疎水性相互作用により固相に結合することができる。特異的結合構成員は、特異的結合構成員のいずれもが、引き続く反応および洗浄工程中に実質的に離れないような方法で固相に結合するのがよい。選択した特異的結合構成員および結合方法に関係なく、特異的結合構成員は、固相材料に結合した後に試料中のＩｇＭ抗体に結合できる必要がある。
本発明による固相材料は、微粒子に化学的または物理的に結合した、目的の分析物に特異的な結合構成員と微粒子との混合物であってもよい。本発明に用いることのできる微粒子は、好ましくはポリマー材料からできており、更に好ましくはスチレン単位を有するポリマーまたはアクリレート単位を有するポリマーから誘導された微粒子が挙げられる。微粒子は、好ましくは実質的に球状であり、約０．１μｍから約０．２５インチの範囲の半径を有する。これらの粒子を供試試料から分離する好ましい方法は、ガラス繊維のような多孔性マトリックス上での微粒子の捕捉を含む。
本発明の用途に好適な多孔性マトリックスは、いずれの好適な多孔性材料であってもよい。本明細書で用いた゛多孔性マトリックス゛とは、液体が、流れることができ、且つ容易に通過することのできる材料を意味する。多孔性マトリックスに好適な材料の代表例としては、それらに限定される訳ではないが、オレフィンポリマー、たとえば、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ化オレフィンポリマー、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ガラス繊維、セルロース、またはナイロンが挙げられる。
多孔性マトリックスの好ましい材料としては、０．３３ｍｍの公称厚さを有する゛ワットマン９３４−ＡＨ゛濾紙のような多孔性ガラス繊維材料、または使い捨てＩＭｘ▲Ｒ▼カートリッジおよびＴｅｓｔＰａｃｋTM（繊維マトリックス）装置（Abbott Laboratories社，Abbott Park,IL 60064）が挙げられる。このような材料の厚さは重要ではなく、供試試料の流動性のような、測定する供試試料または分析物の性質に基づく選択の問題である。更に、好ましい材料は、カタログ番号４Ｂ２５−２０（ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ試薬パック）および４Ｂ４６−２０（ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ試薬パック）でAbbott Laboratories社，Abbott Park,IL 60064からマトリックス  セルで商業的に入手可能である。
前に述べたように、酵素基質は、適切な酵素により４−メチルウンベリフェロンのような蛍光化合物に変換することができる。蛍光化合物を形成する速度は、反応混合物中に存在する酵素の量の指標である。酵素が検出可能物質である場合、存在する酵素の量は供試試料中に存在するＩｇＭ抗体の量に関係する。従って、酵素免疫検定法の酵素活性に起因する蛍光の大きさを用いて供試試料中に存在するＩｇＭ抗体の量を測定することができる。蛍光は、当業界で公知のいずれかの方法により測定することができる。例えば、蛍光分光計を用いることができる。蛍光スペクトルは、可視的分光計の手段により又は高集光力の分光写真器での写真によっても観察することができる。
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、特許請求の範囲で明確にしたような本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。
実施例１
トキソプラズマ原虫ＩｇＭ測定ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定フォーマット
トキソプラズマ原虫ＩｇＭ測定を、以下の手順によりＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置、即ち、米国特許第５，３５８，６９１に記載の装置により実施した。血清または血漿試料および１回の試験に必要な全ての試薬を、サンプリングプローブ（米国特許第５，３５８，６９１の初めの移動ピペッド  メカニズム参照）によりサンプリングセンター内の反応容器の適当なウェルにピペットで移した（米国特許第５，３５８，６９１の正面端のキャロセル４、試料カップ  キャロセル２８、反応容器キャロセル３６、および試薬パック  キャロセル３２参照）。反応容器を、直ちに処理センター（米国特許第５，３５８，６９１の処理キャロセル４６参照）へと移した。処理センターの処理プローブ（米国特許第５，３５８，６９１の二番目の移動ピペット  メカニズム参照）の位置に更にピペットで移した。
初めに、血清または血漿（１０μｌ）を、サンプリングプローブによりＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ライン希釈剤（０．１Ｍ燐酸バッファー、ｐＨ７．５）で１：２７の比率で希釈した。希釈した試料およびＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔ．ｇｏｎｄｉｉで被覆した微粒子（ＲＨ株）を含有する一部を、反応容器のインキュベーション  ウェルに送って反応混合物を形成させた。希釈した試料を希釈ウェルから引き出し、被覆した微粒子を試薬パックから引き出した。反応混合物を３５℃の温度で約８分間インキュベートした。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定用希釈剤（０．０５Ｍのトリス、２５％仔牛血清、ｐｈ７．５）を、反応混合物に加え、抗原−抗体複合体を含有する微粒子の一部を、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置のマトリックス  セルに移した。微粒子は、マトリックス  セルのガラス繊維マトリックスに付可逆的に結合した。マトリックス  セルを、リウマチ因子中和バッファー（ＲＦ中和バッファー、１００μｌ、０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ４．８）で洗浄して、存在するとすれば、リウマチ因子干渉抗体を抗原−抗体複合体を含有する微粒子から除去した。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体：アルカリ  ホスファターゼ結合物（結合物バッファー（０．０５Ｍトリス、５％マウス血清、ｐＨ７．２）中で１μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ）を、マトリックス  セル上に加え、その結果できた組み合わせを、３５℃の温度で約８分間インキュベートした。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
基質溶液、即ちアミノ−メチルホスフェート  バッファー（１．２ｍＭ）中の燐酸４−メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）、をマトリックス  セルに加え、４−メチルウンベリフェロンの形成速度を、蛍光反射率により測定した。蛍光生成物、４−メチルウンベリフェロンを、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置の微粒子酵素免疫検定（ＭＥＩＡ）光学アセンブリにより測定した。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼システムは、各試料および対照の指標検定物質平均速度に対する試料速度の比率に基づいてＴｏｘｏ  ＩｇＭ測定の指標値を算定した。
指標値＝試料速度／指標検定物質平均速度
前述の速度は、代表的には、秒当たり秒当たりのカウントで測定した、蛍光生成物の形成速度に基づく。０．５００未満の指標値を有する試料は、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定の基準によりＴ．ｇｏｎｄｉｉに対するＩｇＭ抗体が陰性であると考えられた。０．５００から０．５９９の指標値を有する試料は、あいまいであると考えられた。あいまいであると解釈された試料は、非常に低い水準のＩｇＭを含有するかもしれない。０．６００以上の指標値を有する試料は、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定の基準によりＴ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であると考えられた。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ＲＦ中和バッファー（抗菌剤を含有するクエン酸塩）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ被覆微粒子（蛋白質安定化剤を有するバッファー中、抗菌剤を含有）、抗−ヒトＩｇＭ抗体：アルカリ  ホスファターゼ結合物（蛋白質安定化剤を有するバッファー中、０．２％アジ化ナトリウムを含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定用希釈剤（蛋白質安定化剤を有するバッファー、抗菌剤を含有）、燐酸４−メチルウンベリフェリル基質（１．２ｍＭ、バッファー中、０．１％アジ化ナトリウム含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ライン希釈剤（０．１Ｍ燐酸バッファー、抗菌剤を含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置および他の商品を含む、測定に必要な物は、Abbott Laboratories社，Abbott Park,IL（カタログ番号４Ｂ２５−２０）から商業的に入手可能であった。
ＩＭｘ▲Ｒ▼測定フォーマット
Ｔｏｘｏ  ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＭ測定を、製造元の指示（カタログ番号７Ａ８２−２０）に従いＩＭｘ▲Ｒ▼装置により実施した。このフォーマットを用いる目的は、本発明の測定法が、当業界で周知の測定法と等しいか又はそれより良好に実施されることを示すことである。
この分析器は、その光源として水銀アーク灯を用いる蛍光分光器を含んで成る光学アセンブリを含む。この装置は、参照により本明細書に含めるものとするFiore等（Clin.Chem.,34/9:1726-1732,1988）により説明されている。この装置は、試料由来の抗体と抗原との反応の結果生じる複合体を含有する微粒子を捕捉する多孔性マトリックスを含むＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジ（Abbott Laboratories,Abbott Park,ILから商業的に入手可能）を用いる。結合したＩｇＭ抗体を、次いで、ヤギ抗−ヒトＩｇＭ：酵素結合物で検出する。この結合物に用いた標識は、好ましくはアルカリ  ホスファターゼである。微粒子を反応混合物から分離し、結合物を微粒子に加え、結合物を結合可能なＩｇＭ抗体に結合させ、微粒子上に存在する結合物の量を、燐酸４−メチルウンベリフェリルが４−メチルウンベリフェロンに変換する速度から決定する。試料中のＩｇＭ抗体の量は、ＩｇＭ抗体濃度の関数として４−メチルウンベリフェロン形成の速度の標準曲線から決定することができる。
ＩｇＭ抗体濃度に４−メチルウンベリフェロンの形成速度を関係づける指標検定物質は、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定で説明したものと似ている。当業者は、ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定に好適な検定物質および対照配合組成物を考案することができるであろう。
手短に言えば、血清または血漿試料を、ＩＭｘ▲Ｒ▼ＭＥＩＡバッファー（０．０５Ｍのトリス、ｐＨ７．５）で１：３０の比率で希釈し、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ被覆微粒子と混合した。反応混合物を３５℃で約８分間インキュベートした。
抗原−抗体複合体を含有する微粒子の一部を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置のマトリックス  セルに移した。微粒子は、マトリックス  セルのガラス繊維マトリックスに不可逆的に結合した。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体：アルカリ  ホスファターゼ結合物（結合物バッファー（０．０５Ｍトリス、５％マウス血清、ｐＨ７．２）中で１μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ）を、マトリックス  セル上に加え、その結果できた組み合わせを、３５℃の温度で約８分間インキュベートした。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
基質溶液、アミノ−燐酸メチル  バッファー（１．２ｍＭ）中の燐酸４−メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）をマトリックス  セルに加え、４−メチルウンベリフェロンの形成速度を、蛍光反射率により測定した。蛍光生成物、４−メチルウンベリフェロンを、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置の微粒子酵素免疫検定（ＭＥＩＡ）光学アセンブリにより測定した。
ＩＭｘ▲Ｒ▼システムは、各試料および対照の指標検定物質平均速度に対する試料速度の比率に基づいてＴｏｘｏ  ＩｇＭ測定の指標値を算定した。
指標値＝試料速度／指標検定物質平均速度
前述の速度は、代表的には、秒当たり秒当たりのカウントで測定した、蛍光生成物の形成速度に基づく。０．５００未満の指標値を有する試料は、ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定の基準によりＴ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が陰性であると考えられた。０．５００から０．５９９の範囲の指標値を有する試料は、あいまいであると考えられた。あいまいであると解釈された試料は、非常に低い水準のＩｇＭを含有するかもしれない。０．６００に等しいかそれより高い指標値を有する試料は、ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定の基準によりＴ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であると考えられた。
全ての陽性及びあいまいな試料、即ち０．５００より高い指標値を有するものをＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬（ヒトＩｇＧ被覆微粒子；カタログ番号１Ａ１４−２２）で処理し、再検査した。
結果
１．バッファーｐＨ最適化
３ロットのｐＨ４．０からｐＨ５．６の範囲のｐＨ値のクエン酸バッファーおよび３ロットのｐＨ７．５の燐酸バッファーを調製し、前に述べたＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定法を用いて４種の試料に対して評価した。ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ陰性の対照（ＮＣ）およびＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ陽性の対照（ＰＣ）を、Abbtt Laboratories社，Abbott Park,ILから得た（カタログ番号７Ａ８２−１０）。ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３、およびＲＦ４の試料については、リウマチ因子およびＴ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＧ抗体を含有する試料を調製した。これらの試料は、初めに、ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定により陽性であること、次いでＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬での処理後陰性であることを測定した。ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置と共にリウマチ因子中和バッファーを用いた検査の結果を、表Ｉに示す。
0003675837.tif 000002
0003675837.tif 000003
表Ｉのデータは、０．６００の陽性試料の指標分別で、リウマチ因子干渉を阻止するのに最も効果的であるクエン酸バッファーのｐＨ範囲は、ｐＨ４．０からｐＨ５．０であったことを示している。Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であった唯一の試料は、ＰＣ試料であった。４種のリウマチ因子陽性試料（ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３、およびＲＦ４）は、バッファーのｐＨがｐＨ５．０未満であった場合、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ抗原に対するＩｇＭ抗体が陰性であることを正しく証明した。
２．試料評価
Ａ．臨床的リウマチ因子試料
５種のリウマチ因子臨床試料を、ＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬（カタログ番号１Ａ１４−２２）による処理をして及びしないでＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定フォーマットにより評価した。更に、これらの試料を、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定により評価した。表ＩＩは、試料セットについて得られた指標値を示す。
0003675837.tif 000004
この実験の結果は、低ｐＨのリウマチ因子中和バッファーオンラインを用いたＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定が、ＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬オフラインでの処理を採用したＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定と類似した結果を得たことを示した。
Ｂ．調製したリウマチ因子試料
ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定で偽陽性試料を作るために、リウマチ因子を含有する９種の試料を、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ  ＩｇＧ抗体陽性試料とリウマチ因子陽性試料とを混合することにより調製した。更に、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定に用いたリウマチ因子中和バッファー（ｐＨ４．５）を、ＩＭｘ▲Ｒ▼Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ測定に用いたＭＥＩＡバッファー（ｐＨ７．５）に置き換えた。これらの試料を評価し、結果を表ＩＩＩに示した。
0003675837.tif 000005
この実験の結果は、ｐＨ４．５のバッファーでの洗浄はリウマチ因子を溶出するが、ｐＨ７．５のバッファーでの洗浄はリウマチ因子を溶出しないことを示した。従って、低ｐＨのリウマチ因子中和バッファーは、偽陽性の検査結果の数を最小にするのに役立つ。
実施例２
風疹ＩｇＭ測定ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定フォーマット
風疹ＩｇＭ測定を、以下の手順によりＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置により実施した。血清または血漿試料および１回の試験に必要な全ての試薬を、サンプリングプローブ（米国特許第５，３５８，６９１の初めの移動ピペット  メカニズム参照）によりサンプリングセンター内の反応容器の適当なウェルにピペットで移した（米国特許第５，３５８，６９１の正面端のキャロセル４、試料カップ  キャロセル２８、反応容器キャロセル３６、および試薬パック  キャロセル３２参照）。反応容器を、直ちに処理センター（米国特許第５，３５８，６９１の処理キャロセル４６参照）へと移した。処理センターの処理プローブ（米国特許第５，３５８，６９１の二番目の移動ピペット  メカニズム参照）の位置に更にピペットで移した。
血清または血漿を、サンプリングプローブによりリウマチ因子中和バッファー（ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ＲＦ中和バッファー、０．５Ｍサイトレート、ｐＨ４．５）で１：３０の比率で希釈した。希釈した試料およびＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ウィルスで被覆した微粒子（ＨＰＶ７７株）の一部を、反応容器のインキュベーションウェルに送って反応混合物を形成させた。希釈した試料を希釈ウェルから引き出し、被覆した微粒子を試薬パックから引き出した。反応混合物を３５℃の温度で約８分間インキュベートした。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定用希釈剤（０．０５Ｍのトリス、２５％仔牛血清、ｐＨ７．５）を、反応混合物に加え、抗原−抗体複合体を含有する微粒子の一部を、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置のマトリックス  セルに移した。微粒子は、マトリックス  セルのガラス繊維マトリックスに不可逆的に結合した。マトリックス  セルを、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ライン希釈剤（０．１Ｍ燐酸バッファー、ｐＨ７．２）で洗浄して未結合の物質を除去した。
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体：アルカリ  ホスファターゼ結合物（結合物バッファー（０．０５Ｍトリス、５％仔牛胎児血清、ｐＨ７．２）中で１μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ）を、マトリックス  セル上に加え、３５℃の温度で約８分間インキュベートした。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
基質溶液、燐酸アミノメチル  バッファー（１．２ｍＭ、５０μｌ）中の燐酸４−メチルウンベリフェリルをマトリックス  セルに加え、４−メチルウンベリフェロンの形成速度を、蛍光反射率により測定した。蛍光生成物、４−メチルウンベリフェロンを、ＭＥＩＡ光学アセンブリにより測定した。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼システムは、各試料および対照の指標検定物質平均速度に対する試料速度の比率に基づいて風疹ＩｇＭ指標値を算定した。
指標値＝試料速度／指標検定物質平均速度
前述の速度は、代表的には、秒当たり秒当たりのカウントで測定した、蛍光生成物の形成速度に基づく。０．６００未満の指標値を有する試料は、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定の基準により風疹ウィルスに対するＩｇＭ抗体が陰性であると考えられた。０．６００から０．７９９の指標値を有する試料は、あいまいであると考えられた。あいまいであると解釈された試料は、非常に低い水準の風疹ＩｇＭを含有してもよい。０．８００に等しいかそれより高い指標値を有する試料は、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定の基準により風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であると考えられ、一次風疹感染を示すことができる。
ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ＲＦ中和バッファー（抗菌剤を含有するクエン酸塩）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼測定用希釈剤（蛋白質安定化剤を有するバッファー、抗菌剤を含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ウィルス被覆微粒子（蛋白質安定化剤を有するバッファー中、抗菌剤を含有）、抗−ヒトＩｇＭ（ヤギ）：アルカリ  ホスファターゼ結合物（蛋白質安定化剤を有するバッファー中、０．１％アジ化ナトリウムを含有）、燐酸４−メチルウンベリフェリル基質（１．２ｍＭ、バッファー中、０．１％アジ化ナトリウム含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼ライン希釈剤（０．１Ｍ燐酸バッファー、抗菌剤を含有）、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置および他の商品を含む、測定に必要な物は、Abbott Laboratories社，Abbott Park,IL（カタログ番号４Ｂ４６−２０）から商業的に入手可能である。
ＩＭｘ▲Ｒ▼測定フォーマット
風疹ウィルスＩｇＭ測定を、製造元の指示（カタログ番号７Ａ２４−２０）に従いＩＭｘ▲Ｒ▼装置により実施した。この装置の操作については、前に実施例１で述べた。このフォーマットを用いる目的は、本発明の測定法が、当業界で周知の測定法と等しいか又はそれにより良好に実施されることを示すことである。
手短に言えば、血清または血漿試料を、ＩＭｘ▲Ｒ▼ＭＥＩＡ測定用バッファー（０．０５Ｍのトリス、ｐＨ７．５）で１：１０の比率で希釈し、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ウィルス被覆微粒子（ＨＰＶ７７株）と混合して反応混合物を形成した。反応混合物を３５℃で約８分間インキュベートした。
抗原−抗体複合体を含有する微粒子の一部を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置のマトリックス  セルに移した。微粒子は、マトリックス  セルのガラス繊維マトリックスに不可逆的に結合した。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体：アルカリ  ホスファターゼ結合物（結合物バッファー（０．０５Ｍトリス、２５％仔牛胎児血清、ｐＨ７．２）中で１μｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ）を、マトリックス  セル上に加え、その結果できた組み合わせを、３５℃の温度で約８分間インキュベートした。マトリックス  セルを洗浄して未結合の物質を除去した。
基質溶液、即ちアミノ−燐酸メチル  バッファー（１．２ｍＭ）中の燐酸４−メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）、をマトリックス  セルに加え、４−メチルウンベリフェロンの形成速度を、蛍光反射率により測定した。蛍光生成物、４−メチルウンベリフェロンを、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置の微粒子酵素免疫検定（ＭＥＩＡ）光学アセンブリにより測定した。
ＩＭｘ▲Ｒ▼システムは、各試料および対照の指標検定物質平均速度に対する試料速度の比率に基づいて風疹ウィルス指標値を算定した。
指標値＝試料速度／指標検定物質平均速度
前述の速度は、代表的には、秒当たり秒当たりのカウントで測定した、蛍光生成物の形成速度に基づく。０．８００未満の指標値を有する試料は、ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定の基準により風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体が陰性であると考えられた。０．８００から０．９９９の指標値を有する試料は、あいまいであると考えられた。あいまいであると解釈された試料は、非常に低い水準の風疹ＩｇＭ抗体を含有するかもしれない。１．０００に等しいかそれより高い指標値を有する試料は、ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定の基準により風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であると考えられ、一次風疹感染を示すことができる。
全ての陽性及びあいまいな試料、即ち０．８００より高いかそれに等しい指標値を有するものをＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬（ヒトＩｇＧ被覆微粒子；カタログ番号１Ａ１４−２２）で処理し、再検査した。
結果
１．バッファーｐＨ最適化
ｐＨ３．５からｐＨ５．５まで変化したｐＨ値のクエン酸バッファーおよびｐＨ７．５の燐酸バッファーを調製し、前に述べたＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定法を用い５種の試料を用いて評価した。ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ陽性の対照（ＰＣ）およびＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ陰性の対照（ＮＣ）試料を、Abbtt Laboratories社，Abbott Park,ILから得た（カタログ番号７Ａ２４−１０）。ＲＦ Ｐ４、ＲＦ ＦＹ３、およびＲＦ ＦＹ４の試料は、リウマチ因子および風疹ＩｇＧ抗体を含有する臨床的試料であった。これらの試料は、初めに、ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定により陽性であること、次いでＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬での処理後陰性であることを測定した。ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置と共にリウマチ因子中和バッファーを用いた検査の結果を、表ＩＶに示す。
0003675837.tif 000006
表ＩＶのデータは、０．６００の陽性試料の指標分別で、リウマチ因子干渉を阻止するのに最も効果的であるクエン酸バッファーのｐＨ範囲は、ｐＨ３．５からｐＨ５．０であったことを示している。風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体が陽性であった唯一の試料は、ＩｇＭ陽性試料であった。３種のリウマチ因子陽性試料（ＲＦ Ｐ４、ＲＦ ＦＹ３、およびＲＦ ＦＹ４）は、バッファーのｐＨがｐＨ５．０以下であった場合、風疹ウィルス抗原に対するＩｇＭ抗体が陰性であることを正しく証明した。
２．試料評価
Ａ．臨床的リウマチ因子試料
１５７個のリウマチ因子陽性の臨床試料を、ＩＭｘ▲Ｒ▼測定フォーマットおよびＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定フォーマットにより評価した。更に、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定に用いたリウマチ因子中和バッファー（ｐＨ４．５）を、ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定に用いたＭＥＩＡバッファー（ｐＨ７．５）に置き換えた。３６個の試料は、リウマチ因子陽性であるか又はあいまいであり、ＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬（ヒトＩｇＧ被覆微粒子；カタログ番号１Ａ１４−２２）で処理後、ＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定法により再検査した。低ｐＨ ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定フォーマットの効能を示すために、これらの３６個の試料も、試料を希釈するのにＭＥＩＡバッファー（ｐＨ７．５）を用いＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定フォーマットにより評価した。表Ｖは、この試料セットについて得られた指標値を示す。
0003675837.tif 000007
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この評価の結果は、４．５のｐＨを有するリウマチ因子中和バッファー中での試料の希釈が、リウマチ因子を含有する試料との予想される偽陽性反応を排除することを示した。ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定におけるＭＥＩＡバッファーの使用により、ＩＭｘ▲Ｒ▼リウマチ因子中和試薬（ヒトＩｇＧ被覆微粒子；カタログ番号１Ａ１４−２２）を用いたリウマチ因子中和を利用しなかったＩＭｘ▲Ｒ▼風疹ＩｇＭ測定で得られたものと同様の結果が得られた。
本発明の種々の改造および変形は、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者等に明白となり、本発明が、本明細書に示した具体的に説明した態様に不当に制限されるものではないことは当然のことである。