(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮組織より分離培養した細胞を緩衝液で懸濁させ、破砕させた後の上清を回収することにより得られる表皮細胞抽出成分を有効成分として含有する培地にて毛乳頭細胞を培養することを特徴とする毛乳頭細胞の培養方法。
【請求項２】
表皮細胞抽出成分が正常あるいは株化表皮細胞培養物由来の成分である請求項１記載の細胞培養方法。
【請求項３】
表皮組織より分離培養した細胞を緩衝液で懸濁させ、破砕させた後の上清を回収することにより得られる表皮細胞抽出成分を有効成分とすることを特徴とする毛乳頭細胞培養のための培地用添加剤。
【請求項４】
表皮細胞抽出成分が正常あるいは株化表皮細胞培養物由来の成分である請求項３記載の毛乳頭細胞培養のための培地用添加剤。
【請求項５】
表皮組織より分離培養した細胞を緩衝液で懸濁させ、破砕させた後の上清を回収することにより得られる表皮細胞抽出成分を有効成分として含有すること特徴とする毛乳頭細胞培養のための培地。
【請求項６】
表皮細胞抽出成分が正常あるいは株化表皮細胞培養物由来の成分である請求項５記載の毛乳頭細胞培養のための培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、間葉系細胞、特に毛乳頭細胞の培養方法及びそのための培地添加剤ならびに該添加剤を含有する培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、生命科学の分野において、細胞培養技術は盛んに用いられている技術である。このうち、生体内で結合組織を形成している繊維芽細胞、毛乳頭細胞、脂肪細胞、歯髄細胞などの間葉系細胞の培養技術は、有用物質の評価系や生体モデル系、各種薬剤、粧香品の安全性評価系として広く利用されている。特に、毛髪の根元にある毛乳頭細胞は、毛母細胞と相互作用をして毛幹（いわゆる毛の本体）の成長に深く関わっていることが知られており、毛乳頭細胞の培養技術は毛髪の形成や成長の解明だけでなく、育毛剤の開発、評価、及び生体移植の材料を供するために不可欠な技術である。
【０００３】
これらの細胞を正常に培養するためには、培地中に別途、細胞増殖因子を添加することが必要である。細胞増殖活性を有する添加剤としては、一般にウシ胎児等の血清が用いられている。しかし、血清は特定不能のあらゆる種類の成分から構成されているため、生命科学分野で実験に用いた場合、原因と結果を論じる際に混乱が生じるという問題がある。また、血清を用いる場合、細胞増殖活性を発現させるためには通常、10％量の添加が必要であり、高価な血清を大量に消費しなければならないという点も問題である。さらに、血清はロット間の性能差が大きく、その選定に多大な労力が必要とされる。
【０００４】
くわえて、毛乳頭細胞については、血清成分のみを用いた従来の培養方法ではなかなかうまくいかず、細胞の増殖が遅いうえ、継代数も７代ほどに限られていた。これを克服するために、吉里らは特開平7-274950号公報において、毛乳頭細胞の長期継代培養法として、足裏表皮細胞及び／またはその培養上清とともに培養することを開示している。しかしながら、該特許においても、培養上清を用いるため、特定不能の成分が多数含まれているだけでなく、培養条件によりロット間差が生じるということが考えられる。
【０００５】
一方、生体内にあって細胞は、性質の異なる種々の細胞種間の相互作用の下で、維持増殖が行われている。特に、上記間葉系細胞により構成されている結合組織は、それと接する皮膚などの上皮組織等と互いに影響しあい、維持増殖を行っている。この相互作用をつかさどる液性因子しては、種々のサイトカイン類、細胞成長因子が知られている。特に、皮膚の上皮細胞である表皮角化細胞はインターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン８、腫瘍壊死因子、顆粒球コロニー刺激因子などを生産することが報告されている。これらの細胞外に産出される細胞外因子の多くは実際に、細胞培養を行う培地の添加剤としても用いられている。これに対し、細胞内因子により構成される表皮細胞の抽出成分については、メラノサイトの培養に用いられた例（R Halaban, et al. Ann. NY Acad. Sci. 548,180-,'88)があるのみで、間葉系細胞、特に毛乳頭細胞の培養に用いる添加剤として有効に利用された報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、間葉系細胞、特に毛乳頭細胞の培養に用いる有効な添加剤を見い出すことにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ロット間差が大きく、未知成分が多量に含まれる血清成分を、できる限り除くために、表皮細胞抽出成分について鋭意検討を行った結果、間葉系細胞、特に毛乳頭細胞に対し顕著な増殖促進性を有することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は表皮細胞抽出成分を有効成分として含有する培地にて間葉系細胞を培養することを特徴とする間葉系細胞の培養方法である。
【０００９】
また、本発明は表皮細胞抽出成分を有効成分とすることを特徴とする間葉系細胞培養のための培地用添加剤である。
【００１０】
さらに、本発明は表皮細胞抽出成分を有効成分として含有すること特徴とする間葉系細胞培養のための培地である。
【００１１】
【発明の実施態様】
本発明の表皮細胞としては、特に限定されないが、組織由来あるいは培養細胞由来のものが利用可能である。例えばヒトあるはラットなどの表皮組織や、それら表皮組織から分離培養した正常表皮培養細胞、並びにＨａＣａＴ細胞などの株化された株化表皮細胞細胞などが挙げられる。
【００１２】
また、表皮細胞抽出成分とは、該表皮細胞から抽出した成分をいう。該成分は例えば表皮組織より分離培養した細胞を、コンフレントに達するまで培養した後、細胞を回収し、適当な緩衝液で懸濁させ、超音波破砕機等で細胞を破砕させた後、遠心分離を行い、この上清を回収することにより得ることができる。
【００１３】
より具体的には、組織あるいは培養物からの細胞の回収には、トリプシン消化した後、生理的食塩水や市販のリン酸緩衝液（日水製薬社製）などを用いることにより行う。そして、この細胞溶液を遠心分離し、沈殿として表皮細胞を回収する。この表皮細胞については、リン酸緩衝液で数回洗浄した後、次の抽出操作に供しても良いし、遠心分離を行って沈殿とし、抽出操作を行うまで凍結保存しても構わない。
【００１４】
このようにして回収された表皮細胞には適当な緩衝液を加えて懸濁し、細胞破砕を行い、上清を回収することにより、表皮細胞抽出成分を調製する。緩衝液としてはリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を用いることができるが、特に限定されない。また、抽出に用いる緩衝液の量は、表皮細胞との体積比で、0.5 〜10倍量程度の範囲で適宜、選択すれば良い。細胞破砕方法としてはホモジナイザー、超音波破砕、反復凍結融解等の物理的破砕や、浸透圧ショック、酵素処理、界面活性剤等の化学的破砕、及びこれらを組み合わせた方法を用いることができる。
【００１５】
このようにして調製された表皮細胞抽出成分はタンパク質濃度を測定した後、凍結保存を行う。この時、必要に応じて凍結乾燥を行っても構わない。また、必要であれば、各種分離、精製装置を用いて、有効成分の濃縮、精製を行うことも可能である。
【００１６】
本発明の培地添加剤は、上記方法により得られた表皮細胞抽出成分を有効成分として含むもので、間葉系細胞の培養に用いるための培地に添加するものである。添加する培地としては、特に限定されないが、DMEM培地やEMEM培地が適用可能である。
【００１７】
本発明の間葉系細胞とは、組織学的には結合組織を構成する細胞であり、具体的には繊維芽細胞、毛乳頭細胞、脂肪細胞、歯髄細胞などが挙げられる。このような間葉系細胞は、動物から目的とする組織を摘出し、分離培養を行うことにより得ることができる。例えば、毛乳頭細胞では、ラット頬髭毛包より毛乳頭部を摘出し、コラーゲンでコート処理したシャーレに入れ、５％ＣＯ2 、37℃にて10％牛胎児血清含有DMEM培地で培養することにより得る。
【００１８】
本発明では、表皮細胞抽出成分を有効成分として含有する培地にて間葉系細胞を培養する。培養方法としては、適当な培地に表皮細胞抽出成分を 0.5〜100 μｇタンパク量／ml、好ましくは 5〜50μｇタンパク量／mlになるよう添加し、適当な培養条件において間葉系細胞の培養を行う。この時、別途血清成分を添加する場合は、血清成分添加量を0.5%濃度以下にまで下げることが可能である。例えば毛乳頭細胞の培養においては、表皮細胞抽出成分を50μgタンパク量／mlになるようDMEM培地中に添加することにより、別途添加する血清成分を0.5%以下にまで下げることが可能である。
【００１９】
【実施例】
次に、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１  表皮細胞抽出成分の調製
ヒト包皮由来正常表皮角化細胞（オルガノジェネシス社製）を 10ng/ml EGFを含むDMEM：HAM F12 ＝3:1 混合培地にて37℃、10% CO2 下で培養した。コンフレントに達した後、培養物をPBS で３回洗浄し、0.05% トリプシン-0.53mM EDTA溶液 (ギブコ社製) で覆った。細胞が培養容器から分離した時点で、PBS で細胞を収集し、回収液を1,000 回転で５分間遠心分離して、沈殿として細胞を回収した。この沈殿をさらに適当量のPBS で懸濁し、再度、遠心分離を行い細胞を回収した。この操作をさらに２〜３回繰り返して、細胞を洗浄した後、体積比で２倍量のPBS に懸濁し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を-80 ℃で１時間放置して凍結させた後、室温で放置し溶解させた。この操作をさらに１〜２回繰り返して、細胞を破壊させた。さらに、これを超音波破砕機にかけ、細胞を破砕させた後、遠心分離を行い上清を回収した。得られた上清を濾過滅菌し、波長280nm における吸光度によりタンパク質濃度を測定した後、-80 ℃にて凍結させた。こうして、表皮細胞抽出成分を得た。
【００２０】
参考例２  毛乳頭細胞の分離培養
実体顕微鏡下でラット頬髭毛包より毛乳頭を摘出し、牛腱由来コラーゲンＩでコート処理した35mmプラスチックシャーレ（コーニング社製）に 3個ずつ入れる。これを 5% ＣＯ2 、37℃にて10％牛胎児血清含有DMEM培地で培養する。毛乳頭から遊走してきた細胞がコンフレントに達したところで継代し、以後２〜３日ごとの培地交換と、約１週間おきの継代を繰り返した。実験には７〜８代目のものを用いた。
【００２１】
実施例１
参考例１で調製した抽出成分を培地添加剤とし、参考例２で分離した毛乳頭細胞を用い、培養を行った。すなわち、牛腱由来コラーゲンＩでコート処理した96穴の細胞培養用マイクロプレート（コーニング社製）に毛乳頭細胞を500 個／穴になるよう接種し、0.5%牛胎児血清含有DMEM培地にて１日間培養した。次に、参考例１で調製した抽出成分を0, 0.5, 1, 5, 10, 50μg タンパク量／mlになるよう培地中に添加した。さらに３日間培養を行った後、WST-Ｉセルカウンティングキット（同仁化学社製）にて細胞数の測定を行い、抽出成分添加時の細胞数を100%としたときの増殖率を算出した。その結果を図１に示す。これにより、 5〜50μg/ml添加時に約240%の増殖率を示した。
【００２２】
比較例１
牛腱由来コラーゲンＩでコート処理した24穴の細胞培養用マイクロプレート（コーニング社製）に毛乳頭細胞を5000個／穴になるよう接種し、0.5%牛胎児血清含有DMEM培地にて１日間培養した。次に、参考例１で調製した抽出成分を50μg タンパク量／mlに、牛胎児血清を10％になるよう培地中に添加した。さらに１日間培養を行った後、WST-Ｉセルカウンティングキット（同仁化学社製）にて細胞数の測定を行い、10％牛胎児血清添加での細胞数を１としたときの増殖比率を算出した。その結果を表１に示す。これにより、50μg/ml添加で10％牛胎児血清時とほぼ同等の増殖性を示した。
【００２３】
【表１】
0003675970.tif 000002
【００２４】
比較例２
牛腱由来コラーゲンＩでコート処理した96穴の細胞培養用マイクロプレート（コーニング社製）に毛乳頭細胞を1000個／穴になるよう接種し、0.5%牛胎児血清含有DMEM培地にて１日間培養した。次に、参考例１で調製した抽出成分を50μg タンパク量／ml、EGF を10ng/ml 、HGF を10ng/ml になるように添加した。さらに３日間培養を行った後、WST-Ｉセルカウンティングキット（同仁化学社製）にて細胞数の測定を行い、各添加物の添加時の細胞数を100%としたときの増殖率を算出した。その結果を表２に示す。これより、参考例１の抽出成分は10ng/ml のEGF 、HGF よりも強い増殖活性を示した。
【００２５】
【表２】
0003675970.tif 000003
【００２６】
【発明の効果】
本発明の表皮細胞抽出成分は、間葉系細胞に対して強い増殖活性を示すので、間葉系細胞を培養する際の牛胎児血清の代替品あるいは培地添加剤として利用することができる。
また、牛胎児血清と併用することにより、牛胎児血清の使用量を大幅に減少させることができる。さらに、この抽出成分は毛髪誘導に重要な毛乳頭細胞に対して顕著な効果を示すことから、養毛用組成物としての効果も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  毛乳頭細胞に対する増殖活性を示す図である。
【図１】
0003675970.tif 000004